Биотехнология. Часть 1. Физико-химические свойства ферментов: Учебное пособие

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра биофизики и биотехнологии

БИОТЕХНОЛОГИЯ Часть 1

Физико-химические свойства ферментов Для студентов IV курса

Составитель: Т. А. Ковалева

ВОРОНЕЖ 2001

РОЛЬ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В ФОРМИРОВАНИИ МОЛЕКУЛЫ БЕЛКА Вся сложная организация биологических систем основана на способности кинетически контролировать химические реакции, причем биохимические превращения, обусловливающие брожение, дыхание, синтез различных соединений, осуществляются с помощью ферментов-катализаторов белковой природы. Молекулы белков представляют собой компактную конструкцию из одной или нескольких полипептидных цепей, которые благодаря дисульфидным мостикам, водородным и ионным связям, а также гидрофобным взаимодействиям совершенно определенным образом располагаются в пространстве, т.е. имеют при данных условиях определенную конформацию. Лишь 20 - 21 тип аминокислот встраиваются в полипептидную

цепь

посттрансляционной

в

ходе

модификации

трансляции, некоторые

причем из

них

в

результате

реакций

превращаются

в

другие

аминокислотные остатки (цистеин - в цистин, серин - в фосфосерин и т.п.). Аминокислотные остатки с гидрофобными цепями различной геометрии (Ala, Cys, Glu, Val) позволяют сформировать в белковой молекуле компактное внутреннее ядро, организовать гидрофобные контакты с лигандами. Глицин выступает в роли связующего звена в полипептидной цепи, обеспечивая минимальные стерические препятствия при вращении и размещении соседних групп. Гидрофильные нейтральные аминокислоты (Ser, Thr, Asp, Gln) участвуют в образовании системы водородных связей, обеспечивая гидратацию белковой молекулы. Аминокислоты с боковыми цепями, обладающими кислотными

свойствами,

обусловливают

присутствие

отрицательного

заряда

на

поверхности белка. Серин и треонин способны к образованию эфиров фосфорной и органических кислот и служат местом присоединения углеводных компонентов в гликопротеидах. Основные аминокислоты (His, Lys, Arg) участвуют в ионных взаимодействиях как внутри полипептидных цепей, так и с другими молекулами. Кроме того, боковая цепь лизина имеет реакционно-способную аминогруппу на конце, и в нейтральных растворах способна принимать протон. Имидазольная группа гистидина составляет часть активного центра многих ферментов и может связывать ионы металлов. Гуанидиниевая группа аргинина в большинстве случаев протонирована и выступает как центр связывания фосфатных групп. Остатки цистеина открывают возможность участия белка в окислительно-восстановительных процессах, а также образуют дисульфидные мостики - дополнительные факторы стабилизации белковой структуры. Образование цистина приводит к возникновению ковалентных S-S связей между удаленными участками

полипептидной

цепи

или

между

двумя

полипептидными

цепями,

разрушающимися

при

обработке

белков

избытком

восстанавливающего

агента

(меркаптоэтанол). Фенильная боковая цепь фенилаланина и индольное кольцо триптофана также способны вступать в гидрофобные взаимодействия. Водородный атом азота индольного кольца может участвовать в образовании водородных связей с другими группами, локализованными

внутри

глобулы

белка.

Пролин-α-аминокислота,

содержащая

вторичный амин в пирилидиновом кольце, позволяет полипептидной цепи изгибаться и складываться. Ионные группы располагаются главным образом на поверхности белковой молекулы и сольватированы посредством водородных связей или ион-дипольных связей с молекулами воды. Эти группы придают поверхности белка положительные или отрицательные заряды и тем самым обусловливают электростатические свойства белков в растворе. Иногда ионные группы присутствуют и в неполярных внутренних областях белковых глобул и между ними возникают электростатические взаимодействия. Например, в молекуле дезоксигемоглобина такие связи возникают между остатками аспарагиновой кислоты и аргинина, расположенными в двух различных α-цепях. Остатки тирозина и цистеина могут быть погружены в гидрофобные внутренние области белков, поскольку их неионизированные R-радикалы могут участвовать в гидрофобных взаимодействиях или в образовании водородных связей. Глицин отличается от других аминокислот отсутствием R-группы, поэтому остатки глицина могут располагаться как в гидрофобном окружении, так и на поверхности белка. Причем наличие этого аминокислотного остатка делает полипептидную цепь более гибкой. Многие реакционно-способные группы часто окружены остатками глицина, что облегчает доступ субстрата к функциональным группам фермента. Хотя неполярные алифатические и ароматические аминокислоты формируют пространственную

структуру

белков,

участвуя

во

внутренних

гидрофобных

взаимодействиях, некоторые R-радикалы этих остатков могут располагаться вблизи поверхности глобулы. Например, некоторые остатки тирозина, находящиеся на поверхности белка, взаимодействуют с различными химическими реагентами на фенольную группу, тогда как другие находятся в гидрофобном окружении внутри молекулы и потому нереакционноспособны. Химические возможности функциональных групп белковых аминокислот резко обогащаются за счет образования пространственно организованных ансамблей первичной,

вторичной,

третичной

и

четвертичной

выполнение свойственных данному белку функций.

структуры,

обеспечивающих

ОСОБЕННОСТИ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ФЕРМЕНТОВ Наличие вторичной, третичной и четвертичной структур определяется первичной структурой, которая обусловлена, в первую очередь, планарностью пептидной связи, все четыре атома которой лежат в одной плоскости. Причем связь N-C укорочена по сравнению с таковой в алифатических аминах (связь в R-NH2 имеет длину l=0,147 нм), что может свидетельствовать о сопряжении связей N-C и С=О и перекрывании их электронных оболочек, сопровождаемом сдвигом электронной плотности от N к C. В 1957 году Полинг Л. и Кори Р., основываясь на данных рентгеноструктурного анализа, показали, что вторичная структура белков может быть представлена в виде αспирали, γ-спирали и β-структуры (типа скрученного листа). α-спираль характеризуется следующими параметрами: высота витка - 0,54 нм, период идентичности вдоль оси макромолекулы - 2,7 нм, в который входит 18 остатков. Все пептидные группы соединены между собой водородными связями типа 5→1, при этом группа С=О i-го остатка связана с N-H (i+4)-го звена. В замыкаемый водородной связью цикл входит 13 атомов, а диаметр цилиндрической поверхности, на которой расположены все α-углеродные атомы, - 1,01 нм. Таким образом, в 1 витке α-спирали находятся 3,6 аминокислотного остатка, причем совмещение остатков происходит при повороте на 100° и перемещении вдоль оси на 0,15 нм. γ-спираль содержит 5,1 остатка на виток с высотой витка 0,5 нм и проекцией остатка на ось 0,09 нм, имеет водородную связь типа 7→1, которая замыкает кольцо из 19 атомов. По модели Полинга Л. и Кори Р. β-структура напоминает складчатый лист, поддерживается поперечными, межцепочечными водородными связями между С=О и N−H группами разных полипептидных цепей. В поперечном связывании принимают участие все пептидные связи и возникает совокупность цепей, образующих слоистую структуру.

Причем

полипептидные

цепи

в

β-формах

не

имеют

плоской

трансконформации. β-структуры могут образовываться и в отдельных полипептидных цепях в результате систематических изгибов. Были рассмотрены все возможные конформации в минимумах торсионных потенциалов вращения Сα−N и Сα−С и сделаны выводы, что α-спираль и β-форма отвечают наиболее предпочтительным ориентациям смежных пептидных групп. При учете только торсионного потенциала γ-спираль, по оценке Полинга Л. и Кори Р., менее стабильна, чем β-форма, на 8,4 кДж/моль. В отличие от компактной α-спирали γ-спираль представляет собой более рыхлую цилиндрическую структуру с отверстием 0,25 нм.

Поиск подхода к предсказанию трехмерной структуры белка начали несколько десятилетий назад, но и в настоящее время практически во всех исследованиях предпринимаются

попытки

найти

эмпирические

корреляции

между

природой,

последовательностью и конформационным состоянием аминокислотных остатков в белковой молекуле. В большинстве работ эмпирические правила выводятся путем статистического анализа белков известного пространственного строения, используются моделирование, стереохимические подходы и другие экспериментальные и теоретические данные физико-химических методов. Показано, что для стабилизации α-спирали наиболее существенна природа остатков в положении n, n ± 3, n ± 4. Установлено, что находящиеся в этих местах полипептидной цепи неполярные аминокислотные остатки группируются на одном краю спирали и тем самым обеспечивают как устойчивость самих спиральных сегментов, так и образование благоприятных межспиральных контактов путем создания гидрофобных ядер. Было проанализировано распределение аминокислотных остатков на N- и С- концах, а также в средней части полипептидной цепи, и показано, что гидрофобные остатки аланина и лейцина обнаруживают тенденцию находиться во внутренних витках αспиралей, а остатки с отрицательно и положительно заряженными боковыми цепями концентрируются на N- и С- концах, а также рассмотрены механизмы свертывания полипептидных цепей в белках при учете только ближних взаимодействий. Показано, что в процессе элонгации или же сразу после биосинтеза самосборка белковой цепи в нативную конформацию начинается с образования α-спиралей, которые в дальнейшем определяют направление свертывания окончательной структуры. При рассмотрении аминокислотного состава 135-ти β-изгибов в структурах восьми белков было показано, что к аминокислотным остаткам, имеющим наибольшую склонность образовывать повороты цепи, относятся Ser, Thr, Asp. Считается, что зародышевыми конформациями при самосборке молекулы белка являются спиральные и вытянутые вторичные структуры. Стабилизация отдельных регулярных структур на ранней стадии самоорганизации определяется главным образом индивидуальными свойствами аминокислот, а устойчивость объединенных вторичных структур на последующей стадии - взаимодействием соответствующим образом расположенных полярных и неполярных остатков. Стабильность конформации каждого участка цепи в свернутой форме молекулы обусловлена силами его взаимодействия с гидрофобным ядром и молекулами воды.

Показано, что к спиралеобразующим аминокислотным остаткам можно отнести Gln, Leu, Phe, Ile, Met, Val, Lys, Ala, His, Arg, Ser, к спиралеразрушающим - Asp, Tyr, Gly, Pro, Cys и к индифферентным - Gln, Trp. Таким образом, гидрофобные остатки, как правило, стабилизируют α и β формы. Почти все короткие гидрофильные и все заряженные аминокислотные остатки характеризуются дестабилизацией регулярной вторичной структуры, причем изгибы и петли

обогащены

этими

R-радикалами.

Распределение

гидрофобных

групп,

благоприятствующее формированию α- и β- участка в развернутой цепи, одновременно обеспечивает их способность встраиваться в компактную глобулу. Анализ данных литературы показывает, что макромолекулы белков обладают не всегда четко выраженной вторичной структурой. Наряду с регулярными участками полипептидных цепей имеются разнообразные изгибы и петли. Причем два или три соседних по цепи структурных фрагмента образуют элементарные комплексы. При сворачивании протяженных β-структурных участков полипептидной цепи, когда крайние отрезки ее смыкаются, формируя между собой систему водородных связей, β-форма утрачивает характер локального образования. Так возникают супервторичные структуры, энергетически предпочтительные агрегаты вторичных регулярных структур, и домены, представляющие собой обособленные, состоящие из супервторичных структур, глобулярные области. Суперспирализация может осуществляться приблизительно с равным успехом при параллельном и антипараллельном направлениях аминокислотных последовательностей. В конформациях супервторичных структур,

глобулярных составленных

белков возможна

реализация 12 видов

путем двойных и тройных комбинаций α-

спиралей и β-форм. Chotia C. показал, что в изучаемых им белках имеет место лишь 5 из 12 видов супервторичных структур: (αα), (ββ), (βα), (βββ), (βαβ). При этом разделяющие супервторичные структуры нерегулярные участки, которые, как правило, превосходят по своей длине упорядоченные фрагменты

полипептидной цепи, не были учтены.

Установлено, что в нативных конформациях

глобулярных белков супервторичные

структуры не обладают какой-либо предпочтительностью перед структурами, состоящими из одиночных α-спиралей и β-форм и нерегулярных участков. Относительное содержание вторичных структур изменяется в очень широких пределах, причем доля нерегулярных участков оказывается весьма значительной. Молекула карбоксипептидазы имеет размер 5,0х4,2х3,8 нм и почти сферическую форму. Общее число аминокислотных остатков - 307. Из них 115 входят в α-спиральные

структуры, 45 - в β-структуры, 147 - в структуры, которые можно назвать нерегулярными. α-спирали расположены в левой части молекулы, а β-формы образуют одну из сторон активного центра, причем 4 цепи параллельны, а три антипараллельны. Правая часть состоит главным образом из неупорядоченных участков. Она содержит дисульфидный мостик, находящийся на расстоянии 2,0 нм от атома Zn. Фиброин

шелка

Bombuk

mari,

содержащий

44%

глициновых

остатков,

характеризуется наличием антипараллельных складчатых слоев, причем все глициновые остатки направлены на одну сторону слоя. Кератин и аналогичные белки могут иметь две конфигурации - α и β-форму. Характерным свойством рентгенограмм α-кератина являются сильные меридианальные рефлексы, отвечающие расстояниям 0,51 и 0,15 нм. Этим данным соответствует система α-спиралей, скрученных совместно. Предлагали различные модели, отличающиеся числом совместно свитых спиралей: семиспиральный кабель, трехспиральный кабель. Величина оптического вращения кератина пера трехспиральной

структуре,

β-форма

кератина

[α ]

280 D

= −430 соответствует

характеризуется

экваториальными

рефлексами, отвечающими 0,97 и 0,465 нм, меридианальным рефлексом 0,33 нм и аксимальным рефлексом 0,11 нм. Эти результаты соответствуют складчатому слою или подобной структуре. Наибольшее число различных структур предполагалось для коллагена. В данном белке около одной трети остатков составляют остатки глицина, пролин и оксипролин 25%. В коллагене каждые три полипептидные цепи скручены и образуют тройную βспираль, причем под влиянием оксипролина это как бы ломаная спираль. Каждая пептидная цепь коллагена имеет около 1000 аминокислотных остатков. Полная трехспиральная единица составляет тропоколлаген, причем тропоколлагеновые структуры уложены в волокнах коллагена ступенчатым образом. Поэтому расстояние между фибриллами коллагена 60-70 нм. Создание количественных методов компьютерного определения вторичных структур, усложнение методов корреляционного анализа, увеличение количества исследованных белков с помощью рентгеноструктурного анализа свидетельствуют о несостоятельности традиционного представления о пространственном строении глобулярных белков как о наборе регулярных вторичных структур. Такое представление, возникшее в начальный период структурных исследований ферментов, оказалось справедливым лишь по отношению к регулярным компонентам фибриллярных белков и ограниченной группе глобулярных энзимов. Большая группа белковых молекул существенно иррегулярна на

большинстве своих локальных участков. Представление о том, что у гетерогенной полипептидной

цепи

наиболее

компактными,

энергетически

предпочтительными

оказываются только регулярные структуры, не подкрепляется какими-либо физическими соображениями, противоречат экспериментальным данным и результатам теоретического конформационного анализа. У белков, характеризующихся нерегулярным расположением вдоль полипептидной цепи боковых радикалов, масса которых составляет 2/3 массы всей молекулы, пространственные структуры с регулярными формами не могут во всех случаях обеспечить максимальное число внутримолекулярных контактов и поэтому не могут быть всегда самыми стабильными. Сложнейшая система взаимодействий боковых цепей специфична для каждой природной аминокислотной последовательности ответственна за практически беспредельное многообразие трехмерных структур белковых молекул и их динамических конформационных свойств. В настоящее время изучены трехмерные структуры нескольких сотен белков, среди которых большинство состоит в основном из нерегулярных участков, а ряд белков (тРНК-синтетаза, агглютинин и др.) вообще их не содержит. Входящие в белки вторичные структуры сильно искажены и лишь весьма условно могут быть отнесены к регулярным. В среднем, менее 50% аминокислотных остатков оказываются включенными во вторичные, условно регулярные структуры (∼ 30% в α-спирали, ∼ 20% - β-участки). Также не отвечает известным фактам утверждение о доминирующей роли водородных связей в стабилизации α-спиралей и β-структур. Полипептидные цепи могут принимать вытянутую конформацию с образованием водородных связей между участками одной и той же цепи или находиться в одной из нескольких спиральных форм. Иногда данный белок принимает то одну, то другую конформацию. Довольно характерным примером такого рода служит α-спиральный белок с низким содержанием серы, входящий в состав волос. При растягивании волос α-спирали раскручиваются и переходят в β-конформацию, причем вместо водородных связей внутри одной и той же цепи образуются водородные связи между цепями. В глобулярных белках происходит соответствующая перестройка системы водородных связей и гидрофобных взаимодействий между боковыми группами. Одни конформации, термодинамически возможные для глобулярного белка, более устойчивы, чем другие, и обычно белковая молекула

принимает

одну

из

наиболее

энергетически

выгодных

конформаций.

Конформационные изменения в белках, по-видимому, облегчаются тем, что некоторые группы, взаимодействующие за счет водородных связей, находятся преимущественно во внутренней гидрофобной области молекулы белка. Обычно все “внутренние” атомы водорода, определяющие возможность образования водородных связей, взаимодействуют с донором электронов. Однако, как правило, таких групп больше, чем доступных атомов

водорода, что приводит к конкуренции электроотрицательных центров за протоны и создает основу для инициации конформационных изменений, определяющих биологическую функциональность белковых молекул.

ДОМЕНЫ И ИХ РОЛЬ В СТАБИЛИЗАЦИИ ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ФЕРМЕНТОВ В глобулярных белках протяженность участков вторичной структуры ограничена, так как система водородных связей в воде достаточно уязвима, поскольку и группы NH, и карбонильные группировки могут взаимодействовать не только между собой, но и с молекулами воды. К тому же кооперативность водородных связей в рамках отдельного ее элемента невысока. Устойчивость α-спиралей заметно возрастает при понижении полярности среды путем добавления органических растворителей. Таким образом элементы вторичной структуры приобретают устойчивость после объединения их в компактную

белковую

глобулу

за

счет

повышения

кооперативности

системы

нековалентных взаимодействий. При этом значительная часть полипептидной цепи оказывается погруженной в среду с полярностью гораздо меньшей, чем у воды, и большее число внутримолекулярных водородных связей скрыта от воздействий воды. Следовательно, вторичная структура как устойчивое образование существует только в рамках трехмерной и компактной белковой глобулы, образующейся при свертывании полипептидной цепи в пространстве. Третичная структура - основа функциональности белка. Поэтому она требует точной пространственной организации больших ансамблей, формирующих активные центры ферментов, эффекторные центры белков, зоны связывания с биологически активными веществами. При рассмотрении связей, определяющих стабильность третичной структуры, необходимо прежде всего отметить гидрофобные “силы” сцепления, а также связи между боковыми группами аминокислот и дисульфидные мостики. При этом выделяют 4 типа взаимодействий (рис. 1). Третичная структура белковой молекулы определяется свертыванием полипептидной цепи в компактную трехмерную систему (в случае ферментов это, как правило, сферическая глобула). Причем полипептидные цепи стремятся свернуться так, чтобы во внутренней части молекулы спрятать как можно больше гидрофобных боковых цепей аминокислотных остатков. Наряду с этими связями в стабилизации трехмерной структуры участвуют также и дисульфидные мостики.

Внутри белковой глобулы реализуется не менее 90% возможных водородных связей, соединяющих между собой и с главной цепью множество функциональных групп боковых цепей аминокислотных остатков (рис. 2). Очевидно, последовательность аминокислотных остатков в полимерной цепи “кодирует” строго определенный тип вторичной и других структур белка. Это означает, что для молекулы белка существует лишь одно состояние (или их ограниченное число), когда свободная энергия как функция пространственного строения обнаруживает минимум своей величины. Для многих белков третичная структура эквивалентна полной пространственной структуре, причем в этом отношении каждый белок уникален. Нативная третичная структура находится в динамическом равновесии с другими возможными конформациями, что зависит от рН, состава и температуры водной среды. Поскольку гидрофобные R-группы перемежаются с полярными боковыми радикалами других аминокислот, то для реализации гидрофобных “сил” сцепления необходимо внедрить некоторые из полярных групп внутрь белковой глобулы. Существенное влияние на процес формирования третичной структуры оказывают ионогенные R-группы, особенно аспарагиновой и глутаминовой кислот, аргинина и лизина, для внедрения которых внутрь белковой молекулы необходимы значительные затраты энергии. Поскольку ионогенные и неполярные боковые группы не отделены друг от друга в полипептидных цепях глобулярных белков, можно предположить, что при нормальных пропорциях аминокислотных остатков число стабильных конформаций ограничено. Нативные конформации могут быть отобраны в

процессе эволюции. Поэтому

сохраняются те аминокислотные последовательности, обеспечивающие устойчивую пространственную структуру, которые в кристалле или в растворе с определенными пара-

Типы взаимодействий, определяющих третичную структуру N H

CO O − O R

H

R +

NH 3

O

O−

C

C=O

В од ород н ая свя зь м еж д у п еп тид н ы м и груп п ам и

В од ород н ая свя зь м еж д у б ок овы м и цеп я м и

И он н ая свя зь

Г ид роф об н ое взаим од ействие

Р ис. 1 .1 .1 . Водородные связи, возникающие между функциональными группами боковых цепей аминокислотных остатков

 О   СН2  С6Н4ОН --- О = С  СН2  СН2  тирозин

 СН2

глутаминовая кислота

Н Н    СО  N  Н --- О  СН2  аспарагин

серин

Н   СН2 СН2 СН2 СН2 N  H --- O = C  СН2 СН2   Н NH2 лизин

глутамин

рис. 1.1.2. метрами среды сохраняют свою компактность и способность к биологической функциональности.

Образование третичной структуры - процесс кооперативный, основанный на различных типах нековалентных взаимодействий. Дисульфидные связи не определяют характер свертывания полипептидной цепи, но стабилизируют конформацию молекулы после процесса свертывания. Они образуются самопроизвольно, когда вследствие взаимодействий

боковых

радикалов,

определяющих

правильное

скручивание

полипептидной цепи, соответствующие SH-группы оказываются рядом. Глобулярные белки различаются по плотности упаковки третичной структуры и по содержанию в ней гидратационной воды. Каждая ее молекула способна участвовать в образовании четырех водородных связей с другими молекулами воды. В результате возникают протяженные квазикристаллические льдоподобные структуры - додекаэдры, образованные

молекулами

воды,

соединенными

водородными

связями.

Внутри

додекаэдра образуется полость диаметром около 0,5 нм, в которой могут быть размещены гидрофобные R-радикалы полипептидной цепи. При этом они оказываются скрытыми от контакта с окружающей молекулу водой. Необходимо отметить, что уменьшение поверхности соприкосновения гидрофобных групп с водой облегчает возникновение между ними гидрофобных “сил” сцепления. Главным методом, с помощью которого определяется третичная структура белков, является рентгеноструктурный анализ кристаллических образцов. Основной вклад в разработку рентгеноструктурного анализа белков был внесен английской школой кристаллографов (Дж. Кендрью, М. Перутц, Р. Филипс, Р. Ходжкин и др.). Первым белком, трехмерная структура которого была изучена Дж. Кендрью, оказался миоглобин. Его

молекула

состоит

из

153

аминокислотных

остатков,

образующих

одну

полипептидную цепь. К свернутой цепи присоединена порфириновая плоская гемогруппа с атомом железа в центре, с которым взаимодействует молекула кислорода. 75% аминокислотных остатков составляют восемь правых α-спиралей, остальные входят в неупорядоченные участки, причем обрыв α-спиралей в миоглобине происходит, как правило, вблизи остатков пролина, серина и треонина. Молекула напоминает сплющенный у полюсов эллипсоид размером 4,4 х 4,4 х 2,5 нм, α-спиральные участки ее упакованы так, что в целом формируется глобула. В глобуле имеется внутренняя полость, где помещается гем, атом которого взаимодействует за счет координационных связей с шестью атомами, каждый из которых отдает электронную пару его орбиталям. Эти шесть атомов расположены по углам октаэдра. Четыре положения в координационном многограннике заняты атомами азота порфириновых колец, пятое атомом азота имидазольного остатка боковой цепи, шестое - занято атомом кислорода в оксимиоглобине и остается свободным в дезоксимиоглобине. Помимо координационных

связей с железом положение порфириновых колец стабилизируется гидрофобными взаимодействиями с большим числом гидрофобных остатков, как бы выстилающих полость, в которой эти кольца расположены. Лизоцим куриных яиц имеет одну полипептидную цепь из 129 аминокислотных остатков, молекула - в форме эллипсоида размером 4,5 х 3,0 х 3,0 нм. Высокая стабильность фермента обеспечивается наличием 4 дисульфидных мостиков, между двумя половинами

молекулы

находится

“щель”,

в

которой

происходит

связывание

олигосахаридов. Стенки “щели” образованы, в основном, боковыми цепями неполярных аминокислот, обеспечивающих связывание гидрофобных структур субстрата, но включают также и полярные R-радикалы, которые способны образовывать водородные связи с ациламинными и гидроксильными группами субстрата. Размер “щели” позволяет разместиться 6 остаткам моносахаридов. К настоящему времени использование современной компьютерной технологии совместно с новейшими физико-химическими методами

исследования

позволило

расшифровать

трехмерную

пространственную

структуру более 2000 белков. Характеризуя третичную структуру белков, следует отметить, что на поверхности молекулы распределение зарядов у разных белков может быть достаточно однородным, так как области чередующихся положительных и отрицательных зарядов обладают меньшей энергией, чем кластеры. Однако распределение зарядов в кластерной форме встречается довольно часто и определяет выполнение биологических функций. Так, молекула цитохрома с имеет на своей поверхности положительно заряженные R-радикалы лизина в виде кластеров. Глутаминовая и аспарагиновая кислоты формируют кластеры отрицательного заряда, представляющие собой центры взаимодействия с партнерами по дыхательной цепи. Кольца ароматических остатков гембелка окаймляют канал, по которому электрон транспортируется к гему и обратно. Таким образом, распределение зарядов на поверхности молекулы способствует связыванию различных лигандов, приводя к предпочтительным ориентациям в сильных электрических полях. Необходимо подчеркнуть, что резкой границы между гидрофобным ядром и поверхностным слоем молекулы не существует. Нередко возникают на поверхности гидрофобные участки: в олигомерных белках контакты между субъединицами могут быть достаточно стабильными и иметь частично гидрофобную поверхность, необходимую для взаимодействия с другими субъединицами. Это особенно характерно для структуры мембранных белков или липопротеидов, а также для белков, совершенно нерастворимых в воде.

В третичной структуре молекул белка боковые цепи гидрофобных аминокислотных остатков, образующие внутреннее ядро, не свободны, а достаточно плотно упакованы, приближаясь к кристаллу. Значение средней плотности упаковки во внутренних областях рибонуклеазы S примерно равно 0,75, что лежит в пределах, найденных для кристаллов типичных небольших органических молекул. Например, для кристаллов Gly-Phe-Gly плотность упаковки равна 0,749. Кристаллы белков содержат большое количество растворителя (воды), иногда свыше 60% общей массы кристалла, что способствует динамичности трехмерной структуры. Надо отметить, что в областях, соседних с активным центром, плотность упаковки снижается, так как более рыхлые области обладают большей гибкостью и определяют стабильность аминокислотных остатков активного центра. Представление о пространственной организации белковой молекулы не только в виде целой компактной глобулы, но и в форме нескольких слабо связанных между собой областей, неоднократно обсуждалось в ряде работ. При описании третичной структуры лизоцима выделяют несколько компактных глобулярных блоков, участвующих в поддержании и формировании трехмерной структуры доменов, формирующихся из различных отрезков одной и той же полипептидной цепи. Четкой корреляции между доменной организацией и молекулярной массой белка не существует. Например, молекулы бактериохлорофилла (∼ 330 остатков), карбоксипептидазы (∼307) и субтилизина (275) представляют собой цельные глобулы, а структуры значительно меньших белков лизоцима Т4 (144 остатка) и протеиназы 13 (186) состоят из двух доменов. Различают два вида доменов с непрерывной и прерывистой полипептидной цепью, из которых наибольшее значение имеют домены с непрерывной цепью. Элементом, цементирующим структуру домена, является ядро из 8-18 остатков, служащих матрицей для укладки полипептидной цепи домена и обеспечивающих быструю спонтанную сборку всей структуры белка. Домены составляют подуровень структурной организации белка на пути от вторичной к третичной структуре и пространственное оформление достаточно крупных белковых молекул при биосинтезе белка проходит, вероятно, через стадию формирования доменов. Показано, что третичная структура α-химотрипсина включает два домена, каждый из

которых

имеет

цилиндрическую

форму,

образованную

шестицепочечной

антипараллельной β-формой. Молекула протеолитического фермента папаина имеет также 2 домена, каждый из которых образован гидрофобным ядром. В N-концевом домене ядро содержит два остатка валина, два - изолейцина, один - лейцина; в С-концевом - два

остатка валина, два - лейцина, пять - изолейцина, два - фенилаланина. Между доменами, соединенными непрерывной пептидной цепью, устанавливается ряд гидрофобных контактов. Во впадине, разделяющей домены, расположен каталитический центр, причем образующие его функциональные группы размещены в обоих доменах. Существование доменов объясняют спецификой механизма самопроизвольной сборки белковой аминокислотной последовательности в нативную конформацию, отмечая при этом большую распространенность доменной организации ферментов и важность изучения для установления зависимости между структурой и функцией. Для выявления и сравнения структурных доменов были предложены карты межостаточных контактов, представляющие собой диаграммы, на обоих концах которых нанесена аминокислотная последовательность белка, а на пересечении идущих от остатков горизонталей и вертикалей указаны расстояния между соответствующими атомами Сα. Одинаковые расстояния соединяются линиями, и карта приобретает контурный вид. Сходные особенности вторичной структуры четко выделяются на такой диаграмме. Причем α-спирали “выглядят” прямыми с тангенсом угла наклона, равным -1, для антипараллельных β-слоев тангенс угла наклона равен +1. Схематические структурные карты показывают, свертываются ли цепи с образованием доменов, которые выступают на диаграмме как кластеры близких контактов, далеко отстоящие от таких же групп. Так, в лактатдегидрогеназе обнаружены 4 домена. Первые два имеют сходную структуру и служат для связывания одной мононуклеотидной части кофермента. Такие же домены обнаружены в растворимой малатдегидрогеназе, в глицераль-3-фосфатдегидрогеназе и в алкогольдегидрогеназе печени, причем положения динуклеотидсвязывающих доменов в первичной структуре различаются. Однако в ряде случаев для одинаковых доменов, встречающихся в различных ферментах, нельзя указать одинаковую функциональность. Так, фосфоглицераткиназа имеет сходные по строению с лактатдегидрогеназой два домена, хотя они участвуют в связывании АДФ. Протеолитический фермент субтилизин, не взаимодействующий с нуклеотидами, имеет в своей третичной структуре домен такого же типа, как и в лактатдегидрогеназе. Для пространственной структуры белков, включая и плотно упакованные участки, характерна определенная динамика. По-видимому, наличие доменов создает структурные предпосылки для большей, чем в рамках единой пространственной структуры, внутренней гибкости, подвижности белковых молекул, достигаемой за счет смещения доменов относительно друг друга.

Динамика третичных структур белка была рассмотрена в работах М. Карплуса (1986). Он применил метод молекулярной динамики для определения подвижности остатков в структуре ингибитора трипсина, выделенного из поджелудочной железы быка. Сила, действующая на атомы или аминокислотные остатки, определяется по формуле:

Fi = − ¦ ∆Vij ,

(1)

j

где

Fi - сила, приходящаяся на каждый атом или остаток; ∆V -потенциал взаимодействия между i-м и j-м атомами. ij Для свободных атомов или молекул массой mi, каждая сила, согласно закону

Ньютона, вызывает ускорение

ai :

Fi = mi × a i

(2)

Оба уравнения решают совместно для всех i атомов при малых значениях приращения времени. Затем, используя мощные ЭВМ, рассчитывают новые положения атомов и повторяют все вычисления. Результаты этих расчетов показывают, что среднеквадратичное отклонение аминокислотного остатка от положения, полученного методом рентгеноструктурного анализа, составляет 0,1 нм. Это значительная величина (в масштабе молекулы), которая указывает на то, что молекула белка мобильна и проницаема для низкомолекулярных веществ. Например, молекулы кислорода, очевидно, способны проникать во внутренние области белка и тушить флуоресценцию большинства остатков триптофана. Показано, что по характеру влияния боковой цепи на конформационную свободу основной

цепи

монопептидного

участка

(−СОH−CαHR−CONH−)

20

природных

аминокислот можно разделить на 4 стереохимических типа: Gly, Ala, Val и Pro. Первый и последний типы представлены только остатками Gly и Pro, третий - Val и Jle. Все остальные 16 остатков составляют тип Ala. Это означает, что их основные цепи имеют близкую конформационную свободу, совпадающую со свободой изолированного остатка Ala. В целом поверхностный слой молекулы более мобилен, чем внутреннее ядро. Так, значительной подвижностью характеризуются хорошо гидратированные боковые цепи лизина, а также петли нерегулярной структуры на поверхности белка (до 1 нм). В белках наблюдается частичная и обратимая деспирализация регулярных остатков за счет локальных флуктуаций системы водородных связей и других нековалентных воздействий.

В настоящее время описаны следующие типы движений в молекуле белка: 1. Атомные флуктуации - несогласованные перемещения отдельных атомов, повороты на 20-60° вокруг простых связей пептидного скелета и боковых групп (амплитуда 0,001-0,1 нм); 2. Коллективные (согласованные) перемещения групп атомов (от нескольких до сотен, амплитуда 0,001-0,5 нм); 3. Индуцированные внешними факторами изменения конформации (амплитуда 0,051 нм). Источником первых двух типов движений могут быть тепловые колебания, движения третьего типа происходят за счет энергии взаимодействия белка с теми или иными лигандами. Динамическое поведение аминокислотных остатков, формирующих гидрофобное ядро, приводит к тому, что молекулы воды и атомы водорода могут перемещаться и располагаться внутри пространственной структуры, несмотря на квазикристаллическое состояние. Необходимо отметить, что функциональные группы активных центров ферментов оказываются менее подвижными, чем окружающие их участки полипептидной цепи, что обеспечивает, по-видимому, точность их взаимодействия с субстратом. Грибные глюкоамилазы – это гликопротеиды, имеющие мультидоменную структуру. Фермент, выделенный из Aspergillus awamori, характеризуется наличием Nтерминального

домена,

гликозилированного

состоящего

участка,

из

имеющего

440 70

аминокислотных аминокислот

и

остатков,

О-

С-терминального

крахмалсвязывающего домена (100 аминокислот). По данным рентгеноструктурного анализа с разрешением 0,22-0,24 нм, каталитический домен имеет 2 N-гликозилированных участка, причем контакт между N-гликозилированными цепями и полипептидом стабилизируется остатком маннозы с помощью водородной связи или ионизированными молекулами воды, чем и определяется стабильность фермента и возможность образования надмолекулярных структур. Наши эксперименты показывают, что глюкоамилаза из Aspergillus awamori имеет четвертичную структуру, представленную димером из двух субъединиц (М.М. 53,6 кДа). Поверхность О-гликозилированного домена характеризуется наличием маннозы, связанной с Ser-453, Ser-455, Ser-459 и Тhr-457. Углеводные фрагменты участвуют в связывании молекул субстрата и его аналогов и локализации молекул Н2О, которые определяют взаимодействие одиночных звеньев углевода между собой и способствуют повышению стабильности фермента. О-гликозилиро-ванный домен имеет остатки Glу перед и после С-конца, которые представляют собой изгибы,

определяющие взаимодействие крахмалсвязывающего домена с каталитическим и соответствующую ориентацию молекулы субстрата. Гликозилирование предотвращает скопление молекул субстрата в связывающих центрах и обеспечивает стехиометрическое связывание. В связывании молекул субстрата участвует прежде всего Тrр-120, входящий в состав первого подцентра. При модификации этого аминокислотного остатка с помощью генно-инженерных подходов молекула фермента утрачивала каталитическую активность. Взаимодействие с Тrр-120, участвующем в формировании щели активного центра, приводит к втягиванию молекулы субстрата в щель активного центра и сопровождается искривлением гликозидной связи. Роль функциональных каталитических групп играют Glu-179, Glu-400 и Asp-55. Щель активного центра имеет нескомпенсированный отрицательный заряд, эти группы занимают определенное положение и сольватированы. Молекула субстрата, внедряясь в полость активного центра, перемещает кластер молекул воды из активного центра в менее полярную среду, что благоприятствует ионизации Glu179. Выведение молекул воды, располагающихся в активном центре, освобождает полость активного центра для молекул субстрата. Результаты наших экспериментов также показывают, что такие ингибиторы, как нитрат, салицилат и перхлорат дигидрохинолина эффективны потому, что, в отличие от субстрата, уменьшают отрицательный заряд активного центра. Методом рентгенострукгурного анализа определено, что 7 молекул воды связаны с подцентром 1 и 6 из них перемещаются вместе с молекулой субстрата, покидая активный центр через узкий канал. Тrр-120 играет ключевую роль в стабилизации центров связывания. При фотоокислении глюкоамилазы в присутствии метиленового синего, кроме гистидина подвергается воздействию индольное кольцо триптофана и тирозина. Эти воздействия не приводят к потере каталитической активности нативного фермента. По-видимому, О-гликозилированные участки крахмалсвязывающего домена прежде всего взаимодействуют с молекулой субстрата. При дегликозилировании глюкоамилазы и модификации Тrр-120 каталитическая активность исчезает полностью. При исследовании структуры комплекса акарбозы с глюкоамилазой, включающей 1 – 471 аминокислотные остатки

и

535

центров

связывания

молекул

воды,

установлено,

что

Тrр-120

взаимодействует с подцентрами 1 и 2 и с Glu-179 при помощи водородных связей. Причем связывание глюкозного остатка с подцентром 1 не сопровождается изменением ∆G, а взаимодействие с подцентром 2 приводит к отрицательному значению ∆G, что и обусловливает независимое связывание глюкозных единиц субстрата с каждым из подцентров активного центра. Комплексообразование субстрата с "аффинным" сайтом

глюкоамилазы представляет собой нелимитирующие стадии в каталитическом цикле. Взаимодействие с подцентрами 1 и 2 способствует изменению конформации фермента. Если при направленном мутагенезе Аsр-55 превращается в Аsn, то глюкоамилаза теряет каталитическую активность. Предполагается следующий механизм разрыва α-1,4гликозидной связи в молекуле крахмала под действием глюкоамилазы. При образовании фермент-субстратного комплекса с участием Тrр-120 и O-гликозилированных участков крахмалсвязывающего домена происходит ионизация Аsр-55 и Glu-179, причем акцептором протонов является ОН-группа нередуцирующего конца молекулы крахмала. Напряжение гликозидной связи приводит к появлению конформации "полукресло" и сопровождается гидролизом. Перенос протона и изменение конформации фермента обеспечивают физическое ограничение скорости реакции гидролиза крахмала. Ферментсубстратные комплексы могут быть продуктивными и непродуктивными, причем в продуктивном комплексе молекула субстрата занимает 1-ый подцентр, а расщепляемая α1,4-гликозидная связь располагается между каталитическими группами активного центра. Гидрофобные аминокислотные остатки, выстилающие полость центра, способствуют более жесткой фиксации субстрата.

ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА ФЕРМЕНТОВ В белковых молекулах, масса которых превышает 30 кДа, как правило, имеется не

одна, а несколько полипептидных цепей, которые уложены в отдельные глобулярные частицы (субъединицы). Субъединичные глобулы могут существовать и в свободном состоянии, но в результате взаимодействия целого ряда более слабых сил (водородная связь, гидрофобное или ион-ионное взаимодействие) происходит их упорядоченная упаковка в четвертичную структуру. Термин “четвертичная структура” был предложен в 1958 году Берналлом Дж. как необходимое дополнение к понятию о первичной, вторичной и третичной структуре белка. Субъединицы в составе белков были обнаружены Сведбергом Т., который считал, что все белки построены из определенного числа небольших стандартных субъединиц. В 1965 году Моно Ж. предложил понятие протомер для обозначения субъединиц, формирующих путем ассоциации с целым числом идентичных единиц четвертичную структуру. Детальное изучение четвертичной структуры белков было осуществлено впервые Перутцем М. и Кендрью Дж. Анализ данных литературы показывает, что общее свойство четвертичной структуры и большинства форм надмолекулярной организации белков состоит в том, что их основой

служат белок-белковые взаимодействия. Межсубъединичные контакты представляют собой систему нековалентных взаимодействий. Ковалентные дисульфидные связи для стабилизации четвертичной структуры используются крайне редко, например, они соединяют легкие и тяжелые цепи в иммуноглобулинах. Исследование четвертичной структуры ряда белков показывает, что, кроме гидрофобных взаимодействий, значительную роль в стабилизации белковых комплексов играют водородные связи, прочность которых увеличивается вследствие низкой диэлектрической проницаемости среды внутри глобулы, а также возникающие вновь вандер-ваальсовы взаимодействия. Водородные связи объединяют в одну довольно протяженную структуру βскладчатые листы контактирующих субъединиц. В алкогольдегидрогеназе, конканавалине А и инсулине образование пар субъединиц приводит к формированию β-слоев. Причем на поверхности молекул в области контакта обнаружено довольно много водородных связей. Например, в четвертичной структуре алкогольдегидрогеназы в зоне контакта возникает 8 водородных связей, оксигемоглобина - 5, α-химотрипсина - 9. Высказывается предположение, что комплексообразование проходит в 2 стадии: 1. Взаимное проникновение гидратных оболочек, приводящее к нарушению упорядоченной структуры растворителем; 2. Взаимодействие белковых глобул. Большое значение для стабилизации четвертичной структуры имеют гидрофобные силы сцепления, возникающие между гидрофобными R-радикалами и участками на поверхности взаимодействующих субъединиц. Установлено, что при взаимодействии различных субъединиц, катализирующих не связанные друг с другом реакции, возникают мультиферментные комплексы. Причем, если отдельные глобулярные структуры являются частью одной и той же полипептидной цепи, то они образуют мультиферментный конъюгат, подобный структуре мономерного фермента, состоящего из различных доменов. Каждый домен имеет активный центр, катализирующий свою химическую реакцию. Иногда такие коньюгаты удается разделить на составляющие ферменты путем мягкого протеолиза. Если белок состоит из двух тождественных субъединиц, имеющих одинаковую первичную и третичную структуру, его относят к олигомерам (алкогольдегидрогеназа из печени). Белки, четвертичная структура которых характеризуется наличием различных субъединиц, организованы сложнее. Иногда только один тип субъединиц участвует в катализе, а остальные выполняют регуляторные функции (сложный фермент). Как правило, области контакта субъединиц упакованы так же плотно, как и внутренняя часть

молекулы, а расположенные на поверхности группы образуют ионные и водородные связи и определяют стабильность четвертичной структуры. Большинство олигомерных ферментов - димеры и тетрамеры. В гибридных тетрамерах субъединицы не идентичны по первичной структуре и функциональным особенностям, хотя и могут катализировать одну и ту же реакцию. Например, в молекуле гемоглобина полипептиды двух типов образуют тетрамер α2β2, причем субъединицы различаются по аминокислотной последовательности, но выполняют одну и ту же функцию - обратимо связывают кислород при помощи гема. Триптофансинтетаза имеет четвертичную структуру также α2β2, но субъединицы имеют активные центры, катализирующие совершенно разные биохимические реакции. Поэтому ее относят к мультиферментным комплексам. Белки, имеющие тримерную четвертичную структуру из трех

субъединиц

(аденилаткиназа,

уреаза,

аргиназа,

фосфо-2-кето-3-

дезоксиглюконатальдолаза, гистидиндекарбоксилаза) могут принадлежать к классу симметрии с3, т.е. они должны быть гетерологическими кольцами. Анализ данных литературы показывает, что в тетрамерных белках расположение субъединиц может варьировать от планарного (размещение по вершинам квадрата) до псевдотетраэдрического. На поверхности каждого протомера имеются в первом случае только два, а во втором - три участка связывания. Пентамеры построены по типу гетерологического комплекса, представляющего

собой правильный пятиугольник (

аргининдекарбоксилаза ). Для гексамерных белков характерна октаэдрическая упаковка, а также плоские гексагональные структуры. С

помощью

электронной

микроскопии

четвертичной

структуры

пролингидроксилазы из куриного эмбриона установлено, что молекула фермента может быть представлена как в виде одного шестиугольника, так и в виде столбика из четырех гексамеров. В последнем случае фермент не обладает истинно замкнутой структурой. Многие распространено

авторы

отмечают,

шире,

чем

что

квазисферическое

планарное.

Так,

строение

гексамеров

глутаматдегидрогеназа

быка,

глутаматсинтетаза хлореллы, α-уреаза характеризуются частично “шахматной” упаковкой субъединиц. Лейциноаминопептидаза из хрусталика глаза быка имеет четвертичную структуру

в

виде

деформированной

треугольной

призмы

с

двумя

типами

гетерологических участков связывания в каждом протомере. Все

октамерные

ферменты

могут

иметь

плоскую

или

квазисферическую

(кубическую) форму, состоящую из двух четырехчленных гетерологических колец. Так, риболозо-1,5-бифосфаткарбоксилаза из хлоропластов состоит из восьми больших и

восьми

малых

единиц.

Молекула

гемоэритрина,

переносящего

кислород

у

беспозвоночных, имеет форму куба. Совместное использование электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа дало возможность расшифровать четвертичную структуру сложных ферментов. В ряде работ было показано, что в состав фермента аспартаттранскарбамоилазы входят 12 субъединиц, причем 6 из них выполняют каталитическую функцию (С), 6 - регуляторную (R). С-субъединицы объединяются в тримеры, расположенные один над другим, а Rсубъединицы находятся на поверхности молекулы. Две каталитические субъединицы имеют симметрию с3 и по форме напоминают треугольник. Они не контактируют между собой, поэтому в отсутствие регуляторных субъединиц реакция не происходит. Молекула фермента, состоящая из нескольких слоев, имеет в центре полость, заполненную растворителем. Процесс формирования четвертичной структуры происходит в соответствии с законами термодинамики. Силы, способствующие объединению субъединиц, должны быть скомпенсированы так, чтобы активные группировки, имеющие тенденцию к ассоциации, не оказались экспонированными наружу. Межсубъединичные контакты часто содержат ионные пары, которые устанавливают электростатическое взаимодействие между противоположно заряженными функциональными группами. При этом возможно возникновение целых систем (кластеров) - пространственно сближенных разноименных зарядов. Среди аминокислотных остатков, обеспечивающих ассоциацию субъединиц, 67% являются неполярными, 20% - полярными, 13% - несут заряженные группы. Формирование четвертичной структуры из трех и более субъединиц протекает с промежуточным образованием агрегатов меньшего размера. Причем агрегация первых мономеров облегчает присоединение последующих и имеет кооперативный характер. В ряде работ показано, что существует критическая концентрация белка, при которой все молекулы представлены протомерами. При концентрациях, больших критической, содержание мономеров в растворе остается постоянным, а все дополнительное число молекул способно к полимеризации. Присоединение первого мономера характеризуется благоприятными с термодинамических позиций условиями, тогда как дальнейшее взаимодействие с протомерами становится все менее и менее выгодным. Свободная энергия напряжения на 1 субъединичный контакт распределяется между всеми субъединицами, приводя к однородной структуре, или она может накапливаться в определенных местах. Если увеличение напряжения при агрегировании субъединиц достигнет большой величины, то размеры цепи будут определяться тем числом мономеров, при котором дальнейшее связывание дополнительных участков становится

энергетически невыгодным. При формировании линейных и спиральных ассоциатов in vivo могут существовать и более сложные механизмы. Поэтому переносить наблюдения, сделанные in vitro, на процессы жизнедеятельности следует с большой осторожностью. В клетке могут существовать специфические области, где начинается и заканчивается полимеризация. К тому же внутриклеточная среда обладает различными физикохимическими показателями, что и способствует полимеризации в одних областях и подавлению данного процесса в других. Поэтому характерной особенностью белков с четвертичной структурой является их способность к самосборке. Из всех функциональных качеств четвертичной структуры наиболее значимыми являются регуляция каталитической активности ферментов, построение родственных, но не идентичных молекул, из одного и того же набора субъединиц, обеспечение множественных

взаимодействий

белка

с

протяженными

структурами,

а

также

формирование из сравнительно небольших глобулярных субъединиц пространственных образований

весьма

сложной

конфигурации,

обеспечивающих

специфические

функциональные возможности белка. Использование ферментов имеет большие технические перспективы и уже сейчас они применяются в качестве биокатализаторов в десятках отраслей промышленности и сельского хозяйства. Преимущества ферментов состоят в следующем: 1. Ферменты действуют в весьма малых количествах, расщепляя при этом огромные массы субстратов. Например, 1 г пепсина способен расщепить 50 кг яичного белка; амилаза слюны проявляет свое действие при разбавлении 1:1000000; пероксидаза катализатор некоторых

окислительно−восстановительных

реакций

-

действует

в

разведении 1:5000000, а 1 г кристаллического реннина заставляет денатурироваться 72 тонны молока. 2. Молекулярная активность, показывающая число молекул субстрата, которое превращает за 1 минуту 1 молекула фермента, для многих ферментных белков достигает десятков и сотен тысяч, а для каталазы - даже несколько миллионов. 3. Скорость ферментативных процессов легко регулировать, изменяя температуру, степень кислотности, количество вносимого катализатора. 4. Ферменты действуют в "мягких условиях", не требуя сильного нагревания или охлаждения, больших количеств химических реактивов, высокого давления, вакуума, которые часто бывают необходимы для проведения различных химических реакций. 5. Ферменты обладают высокой специфичностью действия. Они могут заставить реагировать

только

одно,

строго

определенное

вещество,

не

изменяя

других.

Специфичность

ферментов

особенно

ценна

при

технической

обработке

сырья

биологического происхождения со сложным составом. 6. Действие ферментов можно легко прекратить денатурацией. 7. Все ферменты - природного происхождения и нетоксичны, что важно для многих отраслей легкой промышленности и медицины. 8. Сырье для получения препаратов ферментов дешево и доступно. Подчас это отходы различных пищевых производств. 9. Способы промышленного получения ферментов сравнительно просты. Анализируя

изложенное

экспериментальные

выше,

исследования

можно

сделать

заключение

структурно-функциональных

о

свойств

том,

что

ферментов

проводятся специалистами в области энзимологии, иммунологии, молекулярной биологии, молекулярной генетики и, как правило, недостаточно связаны между собой. В результате значительно снижается их эффективность и они лишаются единой направленности при изучении принципиальных вопросов химической и пространственной организации ферментов. По мере все более глубокого понимания ключевого значения ферментов в процессе жизнедеятельности исследование их претерпевало коренные изменения, связанные с нахождением зависимости между их химической структурой, т.е. аминокислотной

последовательностью,

и

пространственным

строением

белковой

молекулы. Причем строгое физико-химическое изложение основ ферментативного катализа и широкое привлечение данных по исследованию структурно-функциональных свойств энзимов приобретает особую значимость.

Список рекомендуемой литературы 1. Введение в прикладную энзимологию / Под ред. И. В Березина, К. Мартинека. – М.: МГУ, 1982. – 382 с. 2. Попов Е. М. Структурно-функциональная организация белков. – М.: Наука, 1992. – 260 с. 3. Степанов В. М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. – М.: Высш. шк., 1996. – 334 с. 4. Шульц Г. Е., Ширмер Р. Х. Принципы структурной организации белков. – М.: Мир, 1982. – 354 с. 5. Попов Е. М. Структурная организация белка. – М.: Наука, 1997. – Т. 3. – 603 с.

6. Фридрих П. Ферменты: Четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. – М.: Мир, 1986. – 374 с. 7. Кретович В. Л. Введение в энзимологию. – М.: Наука, 1986. – 336 с.