Diagnóstico microbiológico : Texto y atlas color

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Koneman

Diagnóstico microbiològico Texto y Atlas en color 6a EDICIÓN

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El Est igma del Dr. VaPorEaD

http://landsteiner.blogspot.com

El Estigma del Dr. VaPorEso

Koneman Diagnòstico microbiològico Texto y Atlas en color

Koneman Diagnòstico microbiologico Texto y Atlas en color 6a EDICIÓN Washington C. Winn (h.) M D, MBA

Elmer W. Koneman, M D

Director, Laboratorio de Microbiología Clínica Fletcher Allen Health Care Profesor de Anatomía Patológica University of Vermont College of Medicine Burlington, Vermont, EE.UU.

Profesor Emérito University of Colorado School of Medicine Denver, Colorado, EE.UU.

Stephen D. Allen, M D Profesor de Anatomía Patológica y Medicina de Laboratorio, Indiana University School of Medicine Director, División de M icrobiología Clínica, Ciarían H ealth-M ethodist, Indiana University and Riley Hospitals Jefe, Laboratorio de Microbiología Clínica Roudebush Veterans Affairs Hospital Patólogo, W ishard Memorial Hospital Indianapolis, Indiana, EE.UU. William M . Janda, PhD, (ABMM)

Profesor Adjunto de Anatomía Patológica Director, Laboratorio de Microbiología Clínica University of Illinois Medical Center Chicago, Illinois, EE.UU.

Gary W. Procop, M D , MS Jefe de Sección, Microbiología Clínica The Cleveland Clinic Foundation Cleveland, Ohio, EE.UU. Paul C. Schreckenberger, PhD, D (ABMM)

Profesor de Anatomía Patológica Director, M icrobiología Clínica Loyola University Medical Center M aywood, Illinois, EE.UU. Gail L. Woods, M D

Profesor y Director Médico de Laboratorios Clínicos Departam ento de Anatomía Patológica University of Arkansas for Medical Sciences Little Rock, Arkansas, EE.UU.

—»FniTORIAL MFnir;A — (^ p a n a m e r ic a n a ^ ) BUENOS AIRES - BOGOTÁ - CARACAS - MADRID - MÉXICO - PORTO ALEGRE e-mail: [email protected] El Estigma del Dr. www.medicapanamericana.com VaPorEso

Dedicatoria En m em o ria de n u estro s colegas y ex co au to res

Herbert M. Sommers, MD

V.R. Dowell (h.), PHD

Profesor de A natom ía Patológica N orthw estern University M edical School D irector del L aboratorio de M icrobiología N orthw estern M em orial H ospital Chicago, Illinois, EE.UU.

Jefe, R am a Bacteriología de Anaerobios H ospital Infections Program Centers for Disease C ontrol A tlanta, Georgia, EE.UU.

Prólogo Se ha dicho que la microbiología clínica es tanto un arte como una ciencia. La información científica relacionada con las caracte­ rísticas metabólicas, fisiológicas y genéticas de los microorganis­ mos ha proporcionado las bases para las pruebas de identificación de aislamientos en el laboratorio clínico. El reconocimiento de la morfología microscópica y macroscópica característica de los microorganismos se considera la tarea esencial de la microbiolo­ gía clínica en la selección inicial de las pruebas más apropiadas para identificar cepas clínicas. Sin embargo, el proceso de identi­ ficación de la causa de una infección es mucho más complejo. Es iniciado por el médico del paciente que evalúa sus antecedentes, los signos y síntomas y los hallazgos físicos, lo cual sugiere un diagnóstico tentativo de infección que a su vez conduce a la reco­ lección de las muestras que se consideran con mayor probabilidad de confirmar el diagnóstico. Es esencial que el microbiólogo clí­ nico trabaje con los médicos para establecer pautas de recolección de muestras según la causa y el sitio de infección sospechados. Es también responsabilidad del microbiólogo clínico asegurarse no sólo de que las muestras se recojan y coloquen correctamente en un recipiente sino también que se las transporte hasta el laborato­ rio lo antes posible. Dado que las muestras son recogidas por diversos profesio­ nales de la salud, tam bién es esencial que el microbiólogo clí­ nico establezca criterios para rechazarlas ya sea porque se las recolectó mal o porque la prueba solicitada no es apropiada para la muestra remitida. En estos casos es im portante la comunicación entre el médico y el microbiólogo, para que se remita otra muestra y para que el microbiólogo instruya al médico acerca de cuál es la más adecuada. Una vez recibida la muestra correcta, el microbiólogo debe haber establecido pautas de procesamiento para que se reali­ cen las pruebas procedentes. Los técnicos del laboratorio deben estar capacitados para distinguir entre la microflora endógena y los posibles patógenos debido a la tendencia habi­ tual de los médicos a adjudicar importancia clínica a todo dato que informe el laboratorio. Asimismo, se debe ser pru­ dente en la selección de los microorganismos que se somete­

rán a antibiogram as y en la selección de los antibióticos eva­ luados. Como si los problemas que acabamos de mencionar no fue­ ran suficientes, el laboratorio de microbiología enfrenta otras dificultades impuestas por las restricciones crecientes en los costos y la centralización de los laboratorios. Las primeras exigen el ejercicio del máximo cuidado en la selección de las pruebas y los procedimientos utilizados en el laboratorio, mientras que la última plantea problemas en el transporte de las muestras y la comunicación. El objetivo de Diagnóstico microbiològico de Koneman es proporcionar la información científica necesaria para com­ prender las manifestaciones estructurales, fisiológicas, pato­ génicas y clínicas de los microorganismos que causan enfer­ medades infecciosas y presentar pautas y procedimientos para el diagnóstico de laboratorio de estas enfermedades. El texto proporciona enfoques detallados de la recolección y el trans­ porte de las muestras, los procedimientos para su procesamien­ to, las pruebas utilizadas para la identificación de los microor­ ganismos, y gráficos y cuadros que mencionan las reacciones de esas pruebas. Se intercalan gráficos, cuadros y figuras que des­ tacan los puntos claves del texto. Se proporcionan además microfotografías en color de los microorganismos y fotografías de colonias en medios sólidos que ayudan a reconocer la m or­ fología característica de los microorganismos. Como tal, este libro es la guía más extensa sobre diagnóstico microbiològico y su lectura debe ser una exigencia para los médicos especialistas en enfermedades infecciosas, patólogos, microbiólogos clínicos y auxiliares de laboratorio.

John A. W ashington Presidente Emérito, D epartam ento de Anatomía Patológica Clínica Jefe de Sección Emérito, Sección de Microbiología Clínica Cleveland Clinic Foundation Cleveland, Ohio

Prefacio Esta s e m t-didón un progreso continuo en nuestro intento por comunicar a nuestros lectores el campo cada vez. más complejo y estimulante de! diagnostico mierohjoJtigico. Knter K aneiidi^ uno de ¡OS autores fundadores y el propulsor de las otras cinco edidones, ha deridido no continuar corro amor coordinador. En reconocimiento a sus enormes contrihu* ciones* ?ii& compañeros unánimemente insistieron en cambiar e] nombre del libro por el de D iagnóstica mkrobiftlógicQ-, tarto y ¿4lJtrs m cftfof ¿fe Knneman. Pi :or,ldor, de modo que su experiencia sigue Rétulo pane importante de la obra. Damos aquí la bienvenida a dos aurores nuevos: Gary Procop y Gail Woods. Su amplia experiencia aporca '‘aire fresco'* y otras pers­ pectivas al trabajo; algo siempre importante para el crecimientocontinuo de cualquier libro, SE bien la ur^nizajeiun general del icxio sigue siendo similar a la de Lis cdicion» anteriores se han realizado algunos cambios importantes para reflejar la n » u » l« ti dinámica de nuestro campo. Los capítulos i y 2, la introducción a la microbiología clínica, se han (evískío pata poner m am r énfasis cu todo el campo y algo menos de atención en la bacteriología, Se ha agre* fiado una lámina en color que ilustra los artificios de los frotis enn tinción de üram y se destaca la importancia de conocer I» que no es real. La información ampliada sobre gerendomientui y regulaciones del laboratorio de diagnóstico mictu-biológico refleja la realidad del ejercicio medico moderno. Además, liemos tratado las cuestiones "‘sparc*" más d iíid ks pero de importanda critica que enfrentamos hoy todos loa mKTobiüloj;us clin i COSÍ ¿Qué conseguimos,. cuándo lo conseguimos y en que medi­ da lo conseguimos? Con recursos económicos y humanos cada ve? más escasos» estas dificultades han cobrado tanta relevancia como la* cuestiones científicas más tradicionales, En esta edición se presta mucha atención a las técnicas tradidnnales que mantienen su vigenda en tos Liborprorit^ clinictis» pero la importancia cada v « mayor de leus métodos innumológicos [cap. 3), y sobre rodo de las técnicas moleculares jcap„ 4)+ H jsm ÍÍl

u n a n . il is i x r x h j u U iv c í «Jl* s l i p r i i i c i p í i m , .l>I l u j i i i í l i I i .i

amplía cobemira en cada capitulo que trata sobre ellos, En tos casos err que el enfoque inmunulógíeo o el molecular se convjriietun en La regla de los laboratorios diagnósticos,, el texto Éue actualizado pora que reflejara estos cambios. Se ha eliminado o condensado la explicadon de los métodos obsoletos o que se están torna eido rápidamente arcaicos. l a introducción a la bacteriología, que sigue siendo el eje de los laboratorios clínicos, continúa corno -capítulo í y sienta las bases para los Capítulos posteriores sobre este Vasto Campo, El capítulo sobre las especies de Hucttiophiíus se ha integrado con la explicación de otras bacilos gramnegflrivos con requcriim itin­

tos nutricionales especiales. Por el contrario, la consideración de los acrinomiceios aerobios, un grupo bacteriano cada vea más complejo, se ha separado de la descripción de otros bacilos grthlpositivos. En respuesta a la frecuencia creciente de envío* de ccropsi n i t ­ rosa los laboratorios diagnósticos para su identificación se ofre­ ce una explicación más detallada sobre la identificación de garrapatas en un apéndice con láminas nuevas en color, l j filosofía del libro Mjjjue siendo la misma: nuestro objetivo es proporcionar una explicación extensa pero práctica de la ciencía y el arte del diagnóstico microbiológico, taramos convenci­ dos de que es esencial integrar los problemas y las dificultades clínicas con las herramientas que utilizamos cu el laboratorio para proporcionar la información necesaria para tratar a los pacientes. El beneficio del paciente es el eje del ejercicio médico tanto en la consulta clínica como en el laboratorio. También cre­ emos que es necesario proveer una documeutadón rigurosa de las fuentes primarias que sustentan la inform ación concisa. Este texto títá destinado á dos grupos de lectores. El primer grupo son los estudiantes de microbiología y de medicina, sobre todo los interesados e n las enfermedades infccdosas. El lib r o proponcioivi una revisión extensa para estudiantes graduados» residentes de Anatomía Patológica y becarios de enfermedades infecciosas, Para los estudiantes de pregrado la cantidad de material puede parecer abrumadora, pero es resultado de los eonocimi euros actuales. La dedicación del docente es esencial para guiar al estudiante que- se inicia, quien contara luego con los medios Convenientes para aplicarle» en su ámbito de ejerci* eso o su lugaf de trabajo, en lugar de una infomiítcion intro­ ductoria superficial y desactualizada pata la biblioteca. El otro grupo, igualmente importante* lo constituyen los pro­ fesionales del laboratorio para qu¡enes el texto puede represen­ tar la primera fuente de capacitación actualizada o de resolución de problemas de la práctica clínica, A fin de fpdlitaf la comprensión de los temas, sepumo* utili­ zando cuadros* gráficos detallados, recuadros con resumen de texio v nuirtt-rosas lluirracionai, muchas a todo color, t^ida capirulo comienza con un bosquejo detallado: el capitulo en una mirada. Estamos m ui agradecidos a los distinttis nieninrcs» colegas y estudia mes cuyos planteos nos han estimulado e inspirado. Nos encontramos particularmente en deuda con John A, Washington quien generosamente preparó el prólogo para esta edición. Recordamos siempre a dos ex coautores ya desa» parecidos, VrR„ Daivcll (hd y H erb cn Sommers. N o hubiera’ m us podido lograr este libro sin su tra lia jo fundam enta, en ediciones anteriores. Como reconocimiento a su c o la b o ra ­

ción» dedicamos esta edición a su memoria.

B Estigma del dr.V aFbrE so

A gradecim ientos En primer lugar, estamos en deuda con nuestros colegas de los laboratorios de microbiología de nuestras respectivas ins­ tituciones por el im portante papel que desempeñan en nues­ tra vida profesional. Ellos nos han planteado desafíos, nos han inspirado y educado. Esperamos que este libro sea un medio de devolver en pequeña medida sus contribuciones. Además, agradecemos a los miembros de nuestras familias su tolerancia mientras intentábam os cumplir con los plazos cuando podríamos haber estado con ellos. Su apoyo y aliento

en el hogar constituyen una parte integral de nuestras activi­ dades laborales. Quisiéramos reconocer la guía editorial y científica de J. Stephen Dumler, James Versalovic, P. Rocco Lasala, D eborah R eardon, Ann C roft, Linda M arler y Janet Reynolds. En particular agradecemos a Fred. W. Westenfeld, Frederick C. Patterson y Jean A. Siders sus colaboraciones sustanciales en esta edición y en las anteriores, las cuales se hubieran visto considerablemente disminuidas sin su aporte.

Indice resumido C a p ít u l o 1

C a p ít u l o 8__________________________________

In tro d u cció n a la m icro b io lo g ía: P arte I: El papel del la b o ra to rio de m icro b io lo g ía en el diagnóstico de las enferm edades infecciosas: guía p ara la p ráctica y el tra ta m ie n to

Bacilos g ram n eg ativ o s curvos y ferm en tad o res o x id asa positivos: cam p ilo b acterias y v ibriones 372 i

C a p ít u l o 9 C a p ít u l o 2 In tro d u cc ió n a la m icro b io lo g ía: P arte II: G uías p ara la recolección, el tra n sp o rte , el procesa m iento, el análisis y el inform e de los cultivos a p a rtir de m u estras de localizaciones 66 específicas

O tro s bacilos g ram n eg ativ o s co n requerim ien407 to s n u tricio n ales especiales

-

Especies de N eisseria y M oraxella catarrbalis

539

C a p ít u l o 1 2 129

C a p ít u l o 5 B acteriología m édica: ta x o n o m ía, m o rfo lo g ía, fisiología y virulencia

527

109

C a p ít u l o 4 M icro b io lo g ía m olecular

L egionella

C a p ít u l o 11

C a p ít u l o 3 El diag n ó stico de la b o ra to rio p o r m éto d o s inm unológicos

C a p ít u l o 1 0

C ocos gram p o sitiv o s: P arte I: E stafilococos y cocos gram p o sitiv o s relacio n ad o s 593

C a p ít u l o 1 3 161

C ocos gram p o sitiv o s: P arte II: E strep to co cos, en tero co co s y b acterias “ sim ilares a 639 S trep to co ccu s”

204

C a p ít u l o 1 4

C a p ít u l o 6 Enterobacteriaceae

Bacilos gram p o sitiv o s aerobios y facu ltativ o s

C a p ít u l o 7 Bacilos g ram negativos no ferm en tad o res

289

728

X

índice resumido

C a p ítu lo 2 2

C a p ít u l o 1 5 A ctinom icetos aerobios

817

C a p ít u l o 1 6 B acterias an ae ro b ias

1191

C a p ít u l o 2 3 836

C a p ít u l o 1 7 P ruebas de sensibilidad a los an tib ió tico s

P arasito lo g ía

D iag n ó stico de infecciones cau sad as p o r virus, C h la m yd ia , R ickettsia y m icro o rg an ism o s relacio n ad o s 1271

902

A pé n d ic e 1 C a p ít u l o 1 8 M icoplasm as y ureap lasm as

975

1016

C a p ít u l o 2 0 Infecciones p ro d u cid a s p o r esp iro q u etas

1361

A p é n d ic e II

C a p ít u l o 1 9 M ico b acterias

E cto p arásito s y o tro s in v erteb rad o s en el la b o ra to rio clínico: u n a guía breve

A m ebas de vida libre

1377

P r o to c o lo s

1382

1076

L á m in a s

en c o lo r

C a p ít u l o 21 M icologia

1102

Í n d ic e

a n a l ít ic o

1-1

índice C a p ítu lo 1

Introducción a Ja microbiología

______ 1

Parle

I : E l p a p e l d e l la b o r a t o r io t k m ic r o b io lo g ía en el d ia g n o s tic o d e la * e n fe rm e d a d e s in fe c c io s a s : g u ia p a r a la p r á c t ic a y e í t r a t a m ie n t o 1 in tr o d u c c ió n Llosa mle nsos del lib ra El mundo m las eoT&rmiífadss Iniecciosas

LAS TRÍADAS DE LAS ENFERMEDADES tm C C tO S A S El a ge nía Infeccioso Clases de agentes Infecciosos tnleracciones entre huéspedes y agsntes iflt e o s K i FurcEúFi de los agenses infecciosos m la naiuraleza Virulencia El ambiente El ituésiieil míe elide Deíensa humaraí innata (no celular) Defensa celular Innata Tipos de iiillamatiófl Doícns.3 celular inniumter ia adapta Uva Peiensa no celular inm unitaria adaptatba (humoral) Sienas y sfritmftas únicos de infección Efectos Indinemos de los agentes infecciosos en seres humanas FASES P E I CICLO DIAGNÓSTICO Fas t pie analítica Recolección de 1.a rn uestra Transporte d i la muestra Recepción de la muesl/a y observaciones preliminares Criterios para «1 racliazo de tas mifesiras HslaciGiv íostfl'eficacia en la rasa preanalftica F a it analJHca Examen microscópico (Procesamiento' de las muestras IrrtsrprcSaclóii tic t e c u ltiv as

Procedimientos pam la identificación preliminar de las bacterias aisladas Identificación de m croorgantsmos diferentes de t e bacterias AnüDb. agrama Relación costc-eficacia en la fase analítica Faie posa nal ralea Informe de ros resultados 1íitiraodón con ios epldeoi lótogos Análisis, de las resultados Conservación de las muestras y d i los registros

2 2 2 2 3 3 4 4 4 5 6 7 7 7 B fi a 9 10 10 10 14 14 14 15 15 15 26 33

37 39 39 39 43 43 44 44 44

ASPECTOS ADMINISTRATIVOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Regulación estatal Hesitori de riesgos Seguridad del latoraiorto Normas y regtameniaGlones generales íe seguridad Fr«:auekin es habituales ue seguridad! Agente: biológicos P-tcaucioncs nniveréate Envío fie muesiras. y de- abantes etwlóflioos Peligras no N o li# ® ?

flioterrorisma Aseguramiento de calidad Control de calidad Componentes de un programa de control de calidad Control oc los aparatos do: laboratorio Control fie lo? medio® de cultivo, reactivos e in sumos

¿5 45 47 46 46 41 50 52 56 56

56 56 59 60 £0 61

C apítulo 2 I n t r o d u c c i ó n a la m ic r o b io lo g í a _________________ 66

Parte II:

Guías para la recolección, el trans­ porte* el procesamiento, el análisis y el informe de los cultivos a partir de muestras de localiza­ ciones específicas 66 INFECCIONES DEL APARATO RESPIRA TORIO Infecciones de Jas vías re; pira lorias altas Flora e n d o n a Faringitis Qüas In tensiones de ü cavidad bucaí diferentes de la laringitis. iníecciuríKí de la nasofaiinjje y tu llio s nasolaríngeos Otitis media y sinusitis Epiglolitis LarirgiHis Otras infecciones de las vías respira lo rías altas Infecciones de las vías respiratorias bajas Traqueobrmquiis Bronquiolrtis f-Jeumdfiía Neirmonia erfinhea Em pierna Neumonía en pobladores especiales Recolección de muestras para el diapnésticc de las Inacciones de las wias respuagrias bajas Prut has de laboratorio y diagnóstico de neumonía

B Est igma del d r . VaFbr Eso

67 67 67 70 71 72 73 73 73 73 73 73 74 74 74 75 75 75 76

X II

índice

INFECCIONES DEL TUBO DIGESTIVO Infecciones intestinales Síntom as clínicos Recolección de m uestras de heces Consideraciones epidem iológicas en la evaluación de los pacientes con gastroenteritis Infecciones del tubo digestivo alto Síntom as clínicos Obtención de m uestras del tu b o digestivo alto

INFECCIONES URINARIAS Signos y síntom as clínicos Factores del huésped Recolección de m uestras de orina para cultivo M uestras de orina del c h o rro m edio de la m icción Otras m uestras de orina de m icción espontánea Recolección a p a rtir de catéteres Punción suprapúbica Cultivo de m uestras de orina Pruebas de cribado para infecciones urinarias Pruebas de cribado para bacteriuria Pruebas de cribado para piuria

INFECCIONES DEL APARATO GENITAL Infecciones de transm isión sexual U retritis y cervicitis Úlceras genitales Infecciones genitales transm itidas por otra vía diferente de la sexual V aginitis y vaginosis Infecciones de los genitales internos fem eninos Com plicaciones sistém icas de las infecciones genitales Diagnóstico de las Infecciones genitales D iagnóstico de uretritis, ce rvicitis y va g in itis D iagnóstico de ulceras genitales y verrugas venéreas Recolección de m uestras genitales

INFECCIONES ÓSEAS Y DE LAS ARTICULACIONES Presentación clínica Diagnóstico de las infecciones óseas y de las articulaciones

INFECCIONES DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL M eningitis Encefalitis y abscesos cerebrales Diagnóstico de las infecciones del sistem a nervioso central O btención de m uestras Evaluación de la respuesta in flam atoria y de las técnicas de m icroscopía Detección directa de antígenos y de ácidos nucleicos D iagnóstico serológico D iagnóstico por cultivo

HERIDAS, ABSCESO Y CELULITIS Presentación clínica Diagnóstico de infecciones de heridas, abscesos y celulitis Recolección de m uestras Examen m icroscópico de las m uestras C ultivos

INFECCIONES OCULARES Presentación clínica C onjuntivitis Q ueratitis Uveítis y e n d o fta lm itis

77 77 77 79

Diagnóstico de las infecciones oculares R ecolección de las m uestras Examen m icro scó p ico C ultivos

INFECCIONES DE LA SANGRE 79 80 80 80 81 81 81 81 82 83 83 83 83 84 84

86 86 86 86 86 87 87 87 87

88 88 88 89 89 89 90 90 90 91 92 92 92 92 93 93 94 94 94 94 94 95 95 95 95 95 95

Presentación clínica y patogenia Bacteriem ia y septicem ia Tipos de bacteriem ia Infección intravascular Bacteriem ia y sepsis asociadas con los catéteres Recolección de hem ocultivos C ontam inación con flo ra de la piel Cantidad y o portunidad de los cu ltivo s M edios de cu ltivo Sistem as de procesam iento de hem ocultivos S istem as m anuales de hem ocultivos S istem as de h em ocultivos por lisis y ce ntrifugación S istem as de h e m o cu ltivo s autom atizados e inform atizados Estudios com parativos Consideraciones especiales M icro o rg a n ism o s con requerim ientos nutricionales especiales y endocarditis B acteriem ia y sepsis asociadas con los catéteres Tejidos y biopsias

96 96 96 96 96 96 96 96 98 98 98 98 100 100 101 101 101 102 103 103 103 103 104

C a p ítu lo 3 El

d ia g n ó s tic o d e la b o r a t o r io p o r m é to d o s i n m u n o l ó g i c o s ____________________________________________ 109

ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS: DEFINICIONES BÁSICAS ANTICUERPOS MONOCLONALES TIPOS DE REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO UTILIZADAS EN EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Reacciones de precipitación Fijación del com plem ento e inhibición de la hem aglutinación Reacciones de aglutinación

11 0 111 112 112 114 115

MÉTODOS DE INMUNOANÁLISIS EN FASE SÓLIDA

117

Enzim oinm unoanálisis para la detección de anticuerpos Métodos enzim oimunológicos de captura de anticuerpos para la detección de IgM Enzimoinm unoanálisis enzim áticos para la detección de antígenos

117

TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA Técnicas de inmunofluorescencia para la detección de antígenos Técnicas de inmunofluorescencia para la detección de anticuerpos

120 120 123 123 124

C apítulo 4 Microbiología molecular_____________________________ 129 ÁCIDOS NUCLEICOS-LAS BASES DEL DNA Y DEL RNA Estructura del DNA Estructura del RNA Función del D N A -alm acenam iento de inform ación Función del R N A -transferencia de inform ación

130 130 130 131 131

índice Lectura (tra n scrip ció n ) e interpretación (traducción) del código genético

Métodos tradicionales de detección A nálisis de electroforesis en gel Southern Blot Detección enzim ática de productos a m plificados A plicaciones clínicas Hibridación inversa A plicaciones clínicas Secuenciación de DNA Secuenciación tradicion a l de DNA A plicaciones clínicas Secuenciación por síntesis (pirosecuenciación) A plicaciones clínicas A nálisis de m icrom a trlce s A plicaciones clínicas

131 132 133 134 134 134 135 135 136 136 137 137 139 140 140 141 141 141 141 142 142 142 143 143 143 143 143 143 144 144 144 145 145 145 145 146 146 147

AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN TIEMPO REAL

147

MÉTODOS DE AMPLIFICACIÓN DE SEÑALES Sondas de ácidos nucleicos A plicaciones clínicas Captura de híbridos Aplicaciones clínicas DNA ram ificado Aplicaciones clínicas Hibridación in situ A plicaciones clínicas

AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Bases de la reacción en cadena de la polim erasa A plicaciones clínicas Otros métodos de am plificación de ácidos nucleicos A plicaciones clínicas M odificaciones de la PCR RT-PCR A plicaciones clínicas PCR de am p lio espectro A plicaciones clínicas PCR m ú ltiple A plicaciones clínicas PCR anidada A plicaciones clínicas

ANÁLISIS POSAMPLIFICACIÓN

Métodos de detección de productos de am plificación en tiem po reai Verde SYBR Sondas de hibridación A plicaciones clínicas

TIPIFICACIÓN DE ESPECIES Tipificación no basada en la am plificación E lectroforesis en gel de cam po pulsado Tipificación basada en la am plificación PCR-RFLP rep-PCR A plicaciones clínicas de la tip ific a c ió n m icrobiana

CONCLUSIÓN

147 147 148 150 151 152 152 153 153 154 154 154

X III

C a p ítu lo 5 Bacteriología médica: taxonomía, morfología, fisiología y virulencia______________________ 161 TAXONOMÍA: CLASIFICACIÓN, NOMENCLATURA E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS Denom inación de las bacterias Identificación fenotípica de las bacterias Criterios filogenéticos para la clasificación de las bacterias

MORFOLOGÍA Y FISIOLOGÍA BACTERIANAS BÁSICAS Forma y tam año de las bacterias Estructura nuclear, replicación, transcripción y traducción de DNA Citoplasma M em brana citoplasm ática Estructura de la pared celular bacteriana Pared celular de las bacterias g ra m p o sitiva s Pared celular de las bacterias gram negativas Pared celular de las bacterias 'á c id o -a lco h o l resistentes” Endosporas bacterianas Estructuras de la superficie bacteriana Cápsulas Flagelos Fim brias (p ili) Intercam bio genético y recombinación en las bacterias Requerim ientos para el m etabolism o y el crecim iento bacterianos Carbono D ióxido de carbono Oxígeno N itrógeno Factores de crecim iento Cinética del crecim iento celular bacteriano M etabolism o bacteriano general y generación de energía Ferm entación U tilización del piruvato

FACTORES DE VIRULENCIA BACTERIANOS Y PATOGENICIDAD

162 162 162 163 165 172 172 176 176 177 178 180 182 183 184 184 184 185 186 186 186 187 187 187 190 191 191 191 193

Definiciones y conceptos Requerim ientos para la patogenicidad Factores de virulencia de los m icroorganism os A dhesinas Agresinas Exotoxinas y endotoxinas Superantígenos bacterianos

195 195 197 197 197 198 199 200

C a pítulo 6 Enterobacteriaceae

204

CARACTERÍSTICAS DE LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA 206 Características de las pruebas de cribado U tilización de hidratos de carbono A ctividad de la c ito crom o o xid a sa R educción del nitrato

206 206 209 209

X IV

índice

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA DETECTAR LA FERMENTACIÓN DE HIDRATOS DE CARBONO

209

Uso de agar hierro de K iigier y agar triple azúcar-hierro Principios bioquímicos

210 210

SELECCIÓN DE MEDIOS DE AISLAMIENTO PRIM ARIO

211

Sustancias quím icas y compuestos utilizados en m edios selectivos M edios de aislam iento selectivos M edios de aislam iento de alta selectividad utilizados fundam entalm ente para m uestras gastrointestinales Medios de enriquecim iento Pautas para eleg ir m edios de aislam iento selectivos

CARACTERÍSTICAS DE LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DIFERENCIAL Producción de indol Prueba del rojo de m etilo Prueba de Voges-Proskauer Utilización de citrato Producción de ureasa Descarboxilación de lisina, ornitina y arginina Producción de fenilalanina desam inasa Producción de sulfuro de hidrógeno Motilidad

TAXONOMÍA DE ENTEROBACTERIACEAE Clasificación de E nterobacteriaceae por tribus Características claves para la identificación de las especies más comunes Tribu Escherichieae Tribu Edwardsielleae Tribu Salmonelleae Tribu Citrobactereae Tribu Klebsielleae Tribu Proteeae Tribu Yersinieae Tribu Erwinieae Otros géneros nuevos de E nterobacteriaceae Características de identificación de Enterobacteriaceae más nuevas im po rta ncia clínica de Enterobacteriaceae más nuevas

MÉTODOS DE CRIBADO PARA LA IDENTIFICACIÓN RÁPIDA

211

212 214 215 215 215 216 217 217 217 218 218 219 219

220 220 220 225 225 240 241 249 250 255 258 262 263 263 263

SISTEMAS DE CODIFICACIÓN NUMÉRICA

269 270 271 271 271 271 272 273

Lectura de los códigos de octales en registradores de códigos numéricos Frecuencia de aparición estim ada Cálculo de probabilidad Resolución de las discrepancias

274 274 274 274

Equipos com erciales para pruebas de cribado M edios de agar cromogénicos

SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN CLÁSICOS M atriz en tablero de damas D iagram as de flujo Esquemas computarizados

SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN EN EQUIPOS COMERCIALES DE DETERMINACIONES MÚLTIPLES Aspectos generales de los sistem as com erciales disponibles Sistem as de identificación específicos API 20E S istem a ID BBL Crystal E nteric/N onferm enter

274 276 276 276

Sistem a Rapld onE E nterotube II M icro-ID M icroplaca Biolog GN2 S istem a M icroScan S istem a Sensititre

SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN SEMIAUTOMÁTICOS Y AUTOMÁTICOS M icroScan W alkaw ay Sistem a Vitek Sistem a de autoidentificación para gram negativos Sensititre Sistem a Phoenix Sistem a OmniLog ID

C a pítulo 7 Bacilos gramnegativos no fermentadores

Parte I: Metabolismo de los no fermendadores METABOLISMO FERMENTATIVO Y OXIDATIVO Vía de Em bden-M eyerhof-Parnas Vía de Entner-Doudoroff Vía de las hexosas monofosfato de W arburg-Dickens

SEÑALES INICIALES DE QUE UNA CEPA AISLADA DESCONOCIDA ES NO FERMENTADORA Falta de pruebas de ferm entación de la glucosa Reacción de citocromo oxidasa positiva Falta de crecim iento en agar de MacConkey

PRUEBAS UTILIZADAS EN LA IDENTIFICACIÓN DE NO FERMENTADORES Utilización de glucosa M otilidad Producción de pigmentos Hidrólisis de la urea Reducción de nitratos D esnitrificación de nitratos y nitritos Producción de indol Descarboxilación Hidrólisis de esculina Tinciones para flagelos M étodo de Leifson M étodo de Ryu Técnica de preparación húm eda M o rfo lo gía de los flagelos

Parte II: Taxonomía, características bioquímicas e importancia clínica de los géneros de no fermentadores relevantes en medicina MICROORGANISMOS MÓVILES CON FLAGELOS POLARE Pseudom onadales Fam ilia P seudom onadaceae Género Pseudom onas-g rupo rRIMA I Fam ilia B urkholderiaceae Grupo rRNA II Género B urkholderia-grupo Pseudomallei

Género Ralstonia y género Cupriavidus Género Pandoraea Género Inquilinus Género Lautropia Fam ilia Comamonadaceae G rupo rRNA III G rupo A cidovorans G rupo Facilis-Delafieldii Fam ilia Caulobacteraceae G rupo rRNA IV G rupo Brevundimonas-Diminuta Fam ilia Xanlhomonadaceae G rupo RNA V Género Stenotrophomonas F am ilia Sphingomonadaceae Género Sphingomonas Fam ilia Oceanospirillaceae Género Balneatrix Fam ilia Oxalobacteraceae Género Massilia Género Herbaspirillum Fam ilia Alteromonadaceae Género Shewanella -g ru p o p ro d u cto r de su lfu ro de hidrógeno Género Alishewanella - g ru p o halofílico Fam ilia Halomonadaceae Género Halomonas Fam ilia Methylobacteriaceae Género M ethylobacterium Género Roseomonas Especies sin nombre

Laribacter hongkongensis

MICROORGANISMOS MÓVILES CON FLAGELOS PERITRICOS Fam ilia Alcaligenaceae

311 315 315 315 315 315 315 316 316 316 316 317 317 317 318 318 318 318 318 318 320 320 320 321 321 321 321 321 322 322 323

324 324 324 Género Alcaligenes 324 Género Achrom obacter 327 Género Bordetella 328 Género Kerstersia 328 Género Oligelta 328 Fam ilia Rhizobiaceae 328 Género Rhizobium (antes Agrobacterium ) 329 Fam ilia Brucellaceae 329 Género Ochrobactrum MICROORGANISMOS INMOVILES Y OXIDASA POSITIVOS 395 329 Fam ilia Flavobacleriaceae Chryseobacterium, Em pedobactery grupos sin nom bre de CDC 329 332 Weeksella y Bergeyella 332 Género M yroides 332 Fam ilia Spbingobacteriaceae 332 Sphingobacterium y Pedobacter 333 Fam ilia Moraxellaceae 333 Género Moraxella Género Psychrobacter y grupos de oxidantes engónicos 334 (EO) de los CDC 336 Fam ilia Neisseriaceae 336 Género Neisseria 336 Grupo de bacilos G ilardi 1 MICROORGANISMOS INMÓVILES Y OXIDASA NEGATIVOS 337 337 Género Acinetobacter

Grupo de NO-1 de los CDC Bordetella holm esii (G rupo NO-2 de los CDC) Grupo EO-5 de los CDC

Parte llh Consideraciones para la recuperación y la identificación de los no fermentadores NIVELES DE SERVICIO EN LA IDENTIFICACIÓN DE LOS NO FERMENTADORES PAUTAS PARA LA RECUPERACIÓN DE LOS NO FERMENTADORES IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES M ÁS FRECUENTES

338 338 338

339 339

Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Stenotrophomonas maltophilia

339 340 340 340 341

MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN QUE UTILIZAN PRUEBAS CONVENCIONALES

341

Esquemas de identificación de W eyant (CDC), Gilardi y Pickett Enfoque práctico de la identificación de los no ferm entadores Procesos computarizados

EQUIPOS COMERCIALES Tubo Oxi/Ferm Sistem a API 20E Sistem a API 20NE Sistem a Rem el N/F Sistem a Crystal Enteric/Nonferm enter Sistem a RapID NF Plus Sistem a Biolog

SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN AUTOMÁTICOS Sistem a Vitek Legacy Sistem a Vitek 2 Sistem as Microscan W alkaw ay-96. W alkaw ay-40 y Autoscan-4 Sistem a Sensititre AP80 Sistem a Phoeni

SELECCIÓN DE UN SISTEMA

341 342 342 342 345 345 350 350 356 356 357 358 358 358 358 359 359 359

C a p ít u l o 8 Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y

vibriones

372

Parte l! Bacilos curvos: Campylobacter, Wolinella, Arcobacter, Helicobacter y

bacterias relacionadas RESEÑA HISTÓRICA CLASIFICACIÓN DE CAMPYLOBACTER Y TAXONES RELACIONADOS Especies de Campylobacter Campylobacter jejuni, subespecie jejuni Otras especies de Campylobacter Exespecies de Wolinella y Bacteroides incluidas en la fa m ilia Campylobacteraceae Género Arcobacter Género Helicobacter

H. pylori

372 373 373 374 374 377 381 381 382 382

XVi

Índice

Espedes de Hettcobacter di Importanísa métto Especies de Hettcobacter no íiu manas

303 304

Otros bacilos flramnegativos m icrote rútilos

SüM

m m i m m i ó H D m m r m d e c a m p ilo s a c t e r e s

V BACTERIAS RELACIONABAS lía rtif ícaiEbn rápida de Can pilo batieres a partir de colimas v muestras de hites Pruebas dríerentes cultiva Métodos de defecciúfi directos

Cultivo y aísla mi en to <3e HeUcottactsr pyioit Muestras para #1 aislamiento ce f i pytori Prchcedimianta- de aislamiento identificación de H. pyiürt Pru«y de ureasa en blopsta (prueba CLÜ) Pruebas no mvasws para el diagnóstica de la infección par H. pyipn Precisión de las pruebas invasivas y no invasivas pira el din ástico de la infección por H. pySotí HeNeobacíeres enieron eg^áticos

384 3Si 385 305

305 305 3Rñ 306 30$ 308 307 307

P a r t e I I : F a m ilia s tlts V i b r i w u u e a e y A em m o tm d a cea e FILOGENIA DE VIBRIO NACEAf

317 3B7

Gínero Vibrio Tajíertornía Descripción y síndromes clínicos asociadas de especies de Vibrio de Importancla humana Métodos de aislamiento de Vibrio en el laboratorio CaracteraacWn bioquímica e idsnüflcaci&n d i latwralorio ce las tspeots de Vibrio GÉNEROS LISTO HELIA, FHGTÜBACTER1UM

307 397

FSHEWANELLA

309 393 394 397 397 397

AEROME]ÑAS ÍTLESIQMDNAS Género A erm anes Taxorvomia Injportafttía clínica Especies de #n sanguijuelas medfciraies Aislamiento enel laboratorio de especies da Aeromonasa partir de muestras cínicas Identificación de tata ratono de especias de Aemnwnas

396 399

Género PlBisomonas

399

Aislamiento s itíantilicacifin de labóratelo GÉNERO CHR 0 MO BACTERIU M

399

397

397 393

401

Capítulo 9 (J ir o s b a c ilo s g r a m n e p a r iv o s c o n r e q u e r im ie n to s n u r r i a o m l e s e s p e c ía le s ________407 ESPECIES DE HAEMOPHILUS Taxonomía de Haamapfittus y microorganismos relacionados Hiamophifns influenzas Vacu ñas contra H. in flu títa t 11pe h infecciones causadas per especies de Haemophütis Meningitis ipiglolítls Otitrs media Sijíusltjs 8íon(|uitis y enfermedad pulmonar obstructiva trónica

4G7 409 409

3 12 415 4 í5 416 417 417 417

Neumonía Saeítriomia y sus complicaciones i nfecaosas EndDcardstis Infecciones urogenitales* matar ñas y perunaiaies Infecciones oculares f« brü purpú rifa hrasifefta ÚSras mfeccio nes por HaemapMus infkienzae Hwmophitus parainflutniaa Haemoptittus apfínpNius i Ham nphHm paraplmpliflus Oirás especies de Ham tpltüus HaamoptuSus tititreyi Diannnslico de laboratorio de las Infecciones par NtimopfiltúS Examen direelo de musitas canicas Culi hro de especies de Identificación de especies de Hagmophilus Diagnóstico de laboratorio de inlecclón por Haem plfiitis ó o e n fi SensiülUdan a ios^nMblólicot d i lis especies de Haemophlfta ESPECIES DEACTIN0M CILLU5 Atílnabacílim wtinum feetemeonítafts Importancia clínica Ca racteríslíeas de los cultivos s WuiMíkaciíkn Se nubilidad a los and Múfleos AtíinobaciHus ureae ActínobacíMas tiominis Especies de animales en el genero Aetinobaciilus ESPECIES DE PASTE U RELL A Y MAN HHEI IVíIA Taxonomía y características del. género PasteureHa Fasleurtlía mutíocida I mporíanoa clínica y virulencia Ciiüctóríilos de ios cultivos e identilícacián Seositiilidad a los mllftldlicos Olías especies de ftuttwfJJaaislad» de Iniestíanes humanas Pa$tevreN& pneüfnoteep'CJ (-'Acimobatiflus pnenmotropica' J Pasteüreiia acragsnes ('ActinabadmtS asrogenes'} Pasteareila dagúlitis Pjsteuréite a rtis y M i u m A stúrvatis PstfMrtlia b&ítyae PasteureHa cahaiii PasieureMs gaüinsivm Especies de M annftem iai artes coir pie Jo “ Pasteureifa ftñemotftíca/Pastwrefte g r a m im a tíf) CAFIDIOBACTERIUM HOMIMJS Taionamla Importancia clínica Caradorislieas de los cultivos & tdenülicaciAn SensibiUdid a las airifMttlcoi EIMHELUCORROOENS T^jonomía y nlrulireia Importancia clínica Características de les cultivos e ideniiiica£i4n Sensibilidad a Los snü&iáilítos ESPECIES D E KIHGEUA K S U nO N E lL A Taxonomía importancia clínica características de ios cultivos e ItíentíStaclúrt Sensibi 1ida d a les anli bLólicaj

B E stigrm del dr.V aFbrE so

4iS 4i S 41® 4 19 419 419 420 420 421 421 421 422 422 422 423 427 426 429 429 430 430 432 434 434

434 434 434 436 436 436 437

44 D 443 443 443 443 444 444 444 445 44& 445 445 446 44B 44S 447 447 44B 449 4-19 449 45D 451

Índice XVII ESPECIES HUMANAS DE CAPKQCYTÜPHAGA Taxonomía Importancia ti míe a Características de I ds tuitivos e identificacién SensíbitEdad a los antibióticos ESPECIES CANINAS DE CAPNÜCYTOPHAGA Taxonomía Importancia clínica Caraclerfiticas de los cultivos e identificación Sensibilidad a los añil biscos ESPECIES DE DYS GOMO MOMAS GRUPOS EF-4A y EE-48 DELOS CDC ESPECIES DE SIMQNS1ELLA STMEPTOBACILLUS KÍONILIFORMIS Taxonomía Importancia clínica Características fiel cultivo e identificación sensibilidad a los anlibiOticos ESPECIES DE E5RUCELLA Epidemiología (fe la btucelosis Taxonomía de ¡as especies de encella Virulencia de ¡as especies de Bmeslis Espectro clínico de la dtu :elosls Diagnóstico senlúglDQ de la brucelosis Aislamiento y caradertsllcas de los cultivos Identificación de espades de in s t ila Tratamiento de la brucetosis FRANGI SELLA TUL AREN SIS Epidemiología de la lutaremla Resanan histórica v taíonamia Virulencia de ñ tu tiw u ls Espectro clínico de la lularomla Aislamiento y características de las curnvos Diagnóstico serolúglce dé la tul anemia Tratamiento de la Utaremia e s p e c ie s d e m m n im Taxonomía y e pide mióle oía de Jas especies íe Bartonella Importancia clínica de las especies de Bárionefla Fiebre de Oroya y verruga peruana Fiebre de trincheras "clásica" y 'urbana' Angiomatosis bacilar Pellosls Fiebre y bacteria mía Endocarditis Enf«-JiriEdad por arañazo de flato Olías infecciones Defección, aislamiento e Identificación de especies de Barlúnelte Tip-os de muestras Cultivo Tinción de Gram y morfotogía de Jas colonias Métodos da ¡densificación DJagjsúStitO serológitn de las infecciones, par Bartonella Sensibilidad a los am ibiúllcot in vitro ESPECIES D E m m Taxonomía e importancia clínica Aislamiento e identificación Sensibilidad a los antibióticos ESPECIES DE BORDETELLA

451 451 451 452 452 453 453 454 454 454 455 456 456 456 456 457 458 451 459 459 461 461 462 463 463 465 467 467 467 463 469 470 471 472 472 474 474 475 476 477 477 47B

47&

479 433 431 431 491 432 432 462 434 436 417 487 467 467 467

Antecedentes y tatonomia de las especies de B ortítislla Epidemiología de la tos ferina importancia clínica de Bonttíetta p ttla n is Vacunal centra la tos ferina importancia clínica de otras especies de B ú ttM ifis Bottíateifá pJrtpertüssts Büróefeífá bfúnchitípUca Bq,rtíffWfe hinsi SonMefía holrnesii B&fú$Má trtfíohtm Aislamiento e Ldenlilicación de tas especies de B ú td tta llt Muestras y medios ds cultivo Ruetws de Jnífiynofliíoresceaeta directa Características de les culturas e identificación Huecas técnicas para la detecrión y la Idofltllltaclfri de Barúttelte parttítsís Pruebas serolúglcas para el diagnostico de la los ferina Tratamiento da (a Jos tirina Pruebas de sensibilidad a los antibióticos de las espacies de BorttBtella

m 489 499 m 493 493 493 494 494 494 494 494 495 496 497 496 499 499

C apítulo 10 523

L e g ia n e lt e TAXONOMÍA y c a r a c t e r ís t ic a s d e l g é n e r o LEGION ELLA ESPECTRO CLÍNICO Y ANATOMOPATOLOGO DE LA LEGIOHELDSIS Factores predisponentes Aralo mía patológica y patogenia ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS Y ECOLÓGICOS DELA LEGIONELOSIS Incidencia L w g lg m lta a u en el noedloambiinle Hábilals nalurales Hibliüis acuáticos criados por si hombre (artillcfaies) Legionelnsls en viajeros Erales Inhospitalarios de legioneiasls DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Selección, recolección y transporte de muestras clínicas Examen diredo íe muestras dioicas Exámenes macroscópico y microscópico de materiales teñidos Examen microscópico de matonees feflld os InntgnfllluorBcenpqií di-recta |1FD) Dalflcción de antigend en orina y 3íqu t e corporales DETECCIÓN DE LEGIONELLAS EN MUESTRAS CLÍNICAS Aislamiento de espetries de Legiorttlfá de muestras clínicas Biopsia, Extirpación quirúrgica y tejido di necropsia Liquido pleural y asp-rados transí raqueares Procadimiamp íle descontaminación por lavado ácido para espato y otras muestras contaminadas HQííiQCuttivaSi identiticación de especies de LagioadHa Sensibilidad a Igs antibióticos y tratamiento lism wnolluc re í cencía indirecta Diagnóstico molecular

B Est igma del d r . VaFbr Eso

524 525 526 52® 527 527 527 527 527 52S S2& 529 529

530 530 530 530 530 531 531 531 531 531 532 532 532 532 53-4

X V III índice ESTUDIOS MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL Aiálamiertlí! íe H 0 M Í Í 3 de mueskas ambientóles Tlpílicaciín de cepas de Laglom lla

534 534 535

C apítulo 1 1 Especies de N e íss e rkt y M a m x e ílg c a ta rrb a lis 539 TAXONOMÍA DE LA FAMILIA NEISSERIACEAE Y DE LA FAMILIA M ORAXELLACEAE 541 CARACTERÍSTICAS GENERALES SEL GÉNERO NEIS SE RIA 542 IMPORTANCIA CLÍNICA DE LAS ESPECIES D E NEISSERIA 546 N tá u r ia gonorrltoffje 5A6 Epidemiología 546 Infecciones* causadas por N. QQñQrtltQMt 54? N ifttñ rte m n in g ititilt 550 Epldemioíopla 550 Inlectlows «usadas por N. meningittfis 552 ProfiLajcis meningocócica y vacunas memngocócicas 554 ü Ir.3s es pedes Ce Heisscrii 556 IMPORTANCIA CLÍNICA DE MOHAXELLA CATARRKALIS 557 AISLAMIENTO DE ESPECIES DE NEIS SER IA 559 tf.5iss£J7J ganofrho&a S59> Frotls directos teñidos. con Grati 559 Hecolectínn do li muestra 560 Transponte se la muestra 5601 Medios dé chivos seieíiiwosr án&cijiaelén 8 incubación 562 N ttm r to m n ín g ltid is 562 Seguridad en si laboratorio 562 Frotis diñados tenidos con. Gram y pruebas d-rectas para artíganos capsularas £63 Recolección y transporte de la muestra 563 Alslanulento e incutiatión 564 IDENTIFICACIÓN O í ESPECIES DE NEISSERIA 564 M ortetoffa de las col oaíis 564 Tinción de Gram y prireía de la oxidase 564 PnjeUa He SiipsrcuoP 564 Diferenciación de otras mlcroo rijan limos en medios selectivos 565 Crlterhas presirnilvos para ¡a Menlllicacirin de N. {¡oFtorrtioeM 565 Pruebas. de identificación para eipeelea de Ntlssttia 565 Pruebas, de utlEUaclAn de hidratas de carbón® 565 Medio OTA eonvenemml con ¡nfclralos. cüe carbono 565 frueha fápsda de utlHiaciófl d^ hidratos dt carbono 566 Prucha RIM-flefaserfe (método rápido de Idenlifcatión de Neissera) 566 Oíros melados da uPíacHjn de hidratos da carbono 565 Pruebas cromogénicas de en rima sustrato 566 Go n o c h e s II® 566 PacliCfifd Neissertí* 56? Métodos limunofúfliMS para la confirmación de «irttkes de N. gononhóS-M 567 inmunof luorescercia directa con antauerpos monstíoniles, 567 Pruc bas de cofi CtttghjKnactffl 5GB Proeta GeroGsn II 563 Sistemas da Identificación de multlpruibas S68 Prusta de la sonde de DHA jara la COtlHrmídÓn del culfivo ¿c ft, gonútrlmeas 569 Pruabas de aniplilteacíén e hibridación do ácidos nucleicos pira Nr n to o tríiM S i 569

Métodos moleculares para la detección de H. nteningititiis CARACTERÍSTICAS DEL CULTIVO DE ESPECIES O FN EfSSEflíA

M alsstrli ganorthona Ntlsssrfa memgIMs O tr» especias de JWsteswfa ticbm fat Atorase™ añores Ñmsssfki /tarascare Neissetü suttfíava Ellovariedades, N evería mucosa y Nei&ssm sicca Nüisscf'j púSysaCúhsrtá Sííbe&pedes de Ndsseria etartpjfa tiaissefia gooorrhcese suhesperio kochii {'iiísisssns kpefot") Eapetses de N$i$$&ríi fio humanas y alípicaa CARACTERÍSTICAS DE CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE MORAXEILA CATARR HALIS SENSIBILIDAD DELAS ESPECIES DE NEISSERIA A LOS ANTIBIÓTICOS Neissaria gomirtimae Nefsseria mningitUfís SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS DE MÜRAXELLA CATAR ñ HAL IS

571 571

571

574 575 575 575 575

575 575

576 576 576 576 577 575 576 530

C apítulo 1 2 C o c o s B r á m p O s itiv O S ______________________________ 593

Parte I: Estafilococos y cocos gramposítivos feladtitiados 593 TAXONOMÍA DE LOS ESTAFILOCOCOS Y DE LOS COCOS GRANPOSmVOS RELACIONADOS 594 IMPORTANCIA CLÍNICA DELOS ESTAFILOCOCOS Y OE LOS COCOS GfíAMPOSITIVQS RELACIONADOS 595 StophflKüKBS w m s subesp ecle aureus 595 Estafilococos coaguiasa negaiivos BCis Stíptvtoeocfüs epitiemtfts 606 Staptylúwccus saproplrytivas suoesp&tíe upmpñylíQJS 6fl& Otros eslanlooMQS coagiulasa negalivos 610 Especies de M ic ro tm tits f asneros rsladonidos 610 Rcthla n n ttltiQ in o n 611 AISLAMIENTO Y DIFERENCIACIÓN PRELIMINAR OE LOS ESTAFILOCOCOS Y DE LOS COCOS GRAMPOStTlVOS RELACIONADOS 611 Frotis. diremos con linción fe Gram 611 Aísla mi ento db mu estras clínicas 611 Morfología Je las colonias 611 La prueba ds la cala lasa 612 Método* para ladilerejiciacióji de mleracDcos v C StalilQ C O C D S

€12

Fermentación di la. gl ¡¿cosa Sensibilidad a la lisasüfina Producción de ácido a partir da giicerol an presencia de eritromicina Sensibilidad a la luraiolidona Prueba do la oxidasa modilicada Sensibilidad a ba baetmeina IDENTIFICA CIÓN DE STA.PH YLO CO CCU S AUftEUS Prucís de la coaguiasa en portaobjeles

612

B Est igma del d r . VaFbr Eso

B12 6t3 613 613

61 3 614 614

índice X IX Prueba de la coagulas a en tubo €14 Pioecdi míenlos allemalivos para la p-nielifi de la o aguí asa £14 Aglutinación del lile * 614 Hemag luünación pasiva 615 PrUíb&SC&nllrmaJfiras adicie-nales 616 Prueba de la desoüimíiüruclfiasa {DNAsaj 616 Prueba. de la endon ucleasa I drmoestable 616 Fermentación del manilal G1G Oíros métodos para la Identificación de Stapfiytococcas Si/fStf í 616 Frailas rápidas para la detección da resistencia a la rnelcúlina- 616 Difcrencíacién de les estafilococos toa gula sa positivos de origen velerinario 617 IDENTIFICACIÓN DE ESTAFILOCOCOS COAGULABA NEGATIVOS 617 Métod&s de Idenlíllcicirin convendo na les 617 Producción de fo s te s a p r§ la iijenteficacián de Slaphylococcus epkiarmldfs 61 a AciMelad pirjühíiünii arilarridasa 620 Sensibilidad a la pclijniíina B 620 Prueba twnrtina dascartroxilasa (ODC) 623 Producción de amasa 623 Producción de scetoína 623 Sensrisiíidad a la deleioMmina 623 Sensibilidad a la navabiacina para la identificación de SlapliylocaEcas saproptiylteus 623 Sistemas de idenlificaclilo comerciales 624 Rapidez Sepan 624 API SlapíHDENT 624 API Siaph 624 API I&32 SEaph 624 Tarjeta parala IdemAleación de g ramposlliwo j V iltk (GPIJ 625 Panrg! Mipr&Scan Rapid Pos Comino 625 Panel Me rosnar) PoS ID 625 Sistema BBL cristal pa¡ra la Identificación de oiamposiEivos ítiP) 625 sistema staf ia-R 626 Slaph*Zym 626 Mlcrobacl S'apiiyicco&cal i2S €26 Sistema da Identificación mteto&lana 626 Sistema de idenlificación Bioiog nifcíQPTale 626 r^áfodcs moleculares para idenllllcación y lipificaclón de estafilococos. 626 Identificación de Mícrccoctüsy especies relacionadas 629 lilanülicaeidn de fíolhiá fiii/tlfaginase 623 EHFOQUE PARA LA IDENTIFICACIÓN OE ESTAFILOCOCOS EN EL LABORATORIO 629

Capítulo 13 Cocos grampositivos________________________ 639

Parte II:

E s tr e p to c o c o s * e n te r o c o c o s y b a c te r ia s “ s im ila re s a 5 t r e p t o c o c c u s * CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS ESTREPTOCOCOS ESTREPTOCOCOS pHEM OLÍTtCOS DEL GRUPO A (STHEPTOCOCCUS PYÜGENES) Facieres de virulencia Importancia clínica

639 641 641 641 646

ESTREPTOCOCOS &HEMOLÍTICDS DEL GRUPO B (STflEPTÜCflCCUS W] ALACTIAE) Factores de virulencia Importancia clínica ESTREPTOCOS p -H E M U T IC O S DE LOS GRUPOS C Y G ESTREPTOCOCOS h-HEMOLÍTICOS DEL GRUPO F OTROS ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO DE " COCOS PIÓDENOS" STREPTQCQCCUS PNEUMQMAg Facioíos do virulencia Vacuna* aniiiHumocócica*

Imperlancia clínica ESTREPTOCOCOS VIRIDANS GRUPO ANGINOSO:STHEPTOCOCCUS ANGINOSUS, STREPTQCGtXUS CÜNSfELLATUS Y STAEPTQCCCCUS INTER MEDI US ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO D: EL ÍLCOMPLEJO STREPTOCÜCCUS BOVIS/STREPTOCOCCUS EQUINUS" Y ESPECIES RELACIONADAS ESTREPTOCOCCUS SUIS OTROS ESTREPTOCOCOS VlRtDANS AISLADOS EN ANIMALES OTROS ESTREPTOCOCOS ESPECIES DE ENTEROCDCCUS Taunomía Factores de vimlenda Importancia d ftlra Género Meiissocaccus BACTERIAS "SIMILARES A STRERDtOCCUS ’ Esp eci es de Ablotmphfo y de Granuticaiella Esp eci es de Añfücoccas y Helcacaccus Especies de Leucanosluc Especies de Peaioeoccui y TeífB gem cm m Especies de Gemslfo Especies de Vagocxcos Especies de A llolocoavs Especies de Gfabicatella Especies de Fiicklsm ia Especies de Dolosinramitunr. Ignavifiranum y Oolesltoctus Especies de Erírutfcflftrwí Géwro Lactosocciis AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ESTREPTOCOCOS Y BACTERIAS SIMILARES A STREPTOCOCCUS " FrotIb dInetos con Unción de Gram Medios de Cultivo Hemólisis en agar sao ere

64 9 &491 650 654 &5S 615 656 656 657 65S 660

682

663 665 666 666 66? 667 667 667 671 671 671 671 672 673 673 674 674 675 675 675 675 675 676 676 676 67?

Técnicas de detección directa diferentes del cullivo para sslteplocticos (MíemeI¡tieos del grupo A en muestras laríngeas 677 Técnicas de detección directa diferentes del cultivo para eílreplútúcfil |Jhemo lili eos del grupo B y Sirvplocúúm p titu m a itú S76 Morfología de las colonial y prueba de la calaiasa 671 Reconocimiento y taraeterUacrón preliminar da los islteptococoj y las bacterias "ilmlEirea a Stnptamutf' 660 Idenlificacien presunliva de eslraplacecos 6BQ Sensibilidad a la bacitricina 6B0 Sensibilidad a 1ri m&top rirrt-s uliarruaiíoxazíjt 682 Prueba de CAMP y predicción de pigmento 682

B Estigma del dr.V aFbrE so

XX indita HIdráiisis ce hipunto de sed o Prueba de büls-eseitll na Prueba fle tolerancia a la sal (caldo da NaCi ai 1,5%) Prueba na la Isucina aminopeptidasa {LAP; Prueba de la piríüiidQnü arilafflidisa íPYFty SenspbUidad a la optoquina Prueba d § solu ni licad en b¡l ii Pruebas come re la ta de líe m lllc ación p r e s u m í IdertlfLcaclón s«roló|jlca de eslrejlosocus jS-btm olifcos Prueba d& la pretípítlra capilar Coagluflnactón Ag'iitiníciñn cei látax Identificación serDiogicr- da 'SbeptocoetutpaemnontiiB Características bioquímicas p a n la Identificación de estreptococos afrupables Identificación de fas estreptococos vtridans Grupo S i l g á i s Grupo Mitls Grúa o Mutnns Grupo Salivados Grupo Afl^inoSüS Grupo Boufs Idenlíticactón de Streptecotan suis y oíros estreptococos aislados en animales I de nitlicacló n de esp eel es d i iflieracacz&s I¡leililicattón de espacias de AMotrophia y E unuH cateiij IdenMicacton de espseles de Aerorocctisy HtftOCCbS Idenltlicacidn de especies de Leaeottosim. Pfitictoc-cus y Tetngefmcccus Idenlílicacidn de especies de Esmalta tJcnlilieaclín de especies íe Vagococcus IdenMicactán de especies de Alloíococcus, Glohicateíla, Fackfsmls, Dolosígraaoimt tgmvígmmm y Oolosicoccus idenlilíeádín de especies de Lasiceoem Sistemas comerciales para (a IdtrriilEcacióri de estreptococos, enleracoEOS y bacterias "similares a Stttptacneciis" seleccionadas API Rapid Strep Sistema de idsntiFícación para Qrampositivos BEL Grysial fta p id tD 3 2 S lre p RapID &TR Tarjeta ch identificación para grampos'[¡vos Vitelo iGPíj Panal combinado d e valor critico para gramposltlvos Mlcroscaa

o32 664 604 684 084 €64 634 661 685 665 685 685 BE5 636

666 616

6SB 638 C3S 638 693

693 693 697 69“ 693 703 703 70Q 709

706 769 709 704 710 710 710

C apítulo 1 4 Bacilos flramposltivos aeróhips y facultativos 728 ESPECIES DE LISTIRIA KLISTERIA MONOC/TOGENES Taxonomía dal género Listeria Fadcres ce virulencia de L. monwyteg6u$$ Ep Ídem tota gía de> L ntortoeyíogants Importancia clínica da L. luonocytogBnes Aislamiento de i . /nQnacytugenBs Ce muestras clínicas Idanlilfcarian da especies de Listen!) Sensibilidad a las a itffflíftlc o if traTamienio de las inlecciones píor 1 ís fflrif Pitagenicldad de otras especias de Listaría

726 729 730 731 731

733 733 736 736

ESPECIES DE ERYSIPELQTHRIX: EflYSIPELOTHRIX RHUSI0PATH1AE KfRYSIPELOTHRIX TONStLLARUM TaiDiomia del género Erysipetoihrtx Pactares de virulencia de £ riiotiú psíhtie Importancia clínica de £ rh o tto p a th lu Aislamiento a identificación da £ rhmiapaitiiae Sensibilidad de £ ritosfopattiiae a los antibélicos ESPECIES DE BACILLUS Y GÉNEROS RELACIONA DOS Taionomíá y disección taxonómica del panera Bacittus Bacilltts anihrazis Epidemiología del carbunco Facieres de virulencia de 1?. anthrtcis Preseníactonos clínicas de! carbunco Tratamiento del carbunco PrevencifáR del carbursco BícHhts caraos Factores de virulencia di B. careas Gastroenteritis por 8 tersas infecciones opcriunistas por espíeles de Bstíitus 0acte riemla y enciocarditls Infecciones en hufspide-g inmurvgcompjoirietidgs infecciones oculares Infecciones musco lóestiueléticas infecciones hospitalarias seguridad en el labora torio, recolección de muestras y procesamiento Wslamíenlo t Identificación ce especies de Badllus: el " grupa B jcilftis cerros' \ B, Bntímcfs> B, cereus, B. Ihorifígiensisy 9, mytDides) Sensibilidad! de las especies de Sk M üs a íes antlbiítlcw ESPECIES OE COñYNEBACTERIUM inlrodoccién y toionomía Identiricsclúnde especies de Gorynetiscieriam y bacterias carinefarmcs Pruebas de stnsibifldad a los anlitalóticos de las especies íe C o trn tb a tttrím f bacterias coilnelornnes Miembros del género Cstym!sMÍ€t}üm aisladlas ufe seres Hl maros Coiynebacífffíuir,1dmycofetüfn C otym baaar/m épftH w rw Gotyvst&Gterwm je¡fi£>tim Corymbücteriuin psewJpúiphthGriíiaim CoQ-'ngiwcferíjjm striatum Qorvnekáilwiüfvi ureaiytiCum Esp ecies de C o tjfítta tíir ím as ociad as can an Im ales Especies do Corynñbacterítsm aisladas en ios alimentos y el reiGdloambienle 0 TRAS BACVERJAS CQRINEFORMES Especies de Atiinobasatitm Especies de AdinonyEBs aisladas en seres ti amanes Especies de Actinomycss aisladas en los anímalos Especies de Arcanabacteriam Especies de Artratacísr Especies de ir t r •Hutíatóítn Especies tfe Cathliomortas, C eilaloslm isrobfm ii Oarskavia Especies de Dem atocter Especies da ExiBüotectBmm Especies ce Leifosonia

B Est ignna del d r . VaFfer Eso

736 736 737

737 738 738 738 738 739 739 ?40 740 741 74! 741 74 1 741 7*2 74? 742 743 743 743 743

7U 74& 746 746 750 759 759 7G0 7S0 769 769 769 770 770 771 ??\ 771 772 778 779 779 785 786 ?9D 796 790

Especies de M k r a b a c l E r i u m {AurtQbactsrium) Espire íes de R M tifs i "timílarss 9 f í o t W (grupa 4 de Im CDC} Especies de Turlcelta GARO MEO ELLA VAGINALIS Taxonomía y moiiología ce talar Factores de virulencia de G. vaqim Ui Importancia clínica de G, taglnolfs Aislamiento a idenlilitación Sensibilidad a los a nlJbi plicas ESPECIES DE LACIO BAC iLLUS Taxonomía y epidemiología importan da clínica Aislamiento a toeritificscjon Sensibilidad a los anlibipíricos

792 793 733 795 795 796 796 797 799 m 799 789 tCu £01

C apítu lo 1 5 A c lin o m ic c to s aerobios

617

ÍNTfíQDUCCiÓN, CLASIFICACIÓN Y TAXONOMÍA GRUPO NOCARDIOFORME

817 819 61 § 820 G2t 122

Noeanfia

Epidemiología, analomta patológica y patogenia Enfermedad el inio RüDdococcíis Epidemiología, anaiomia patológica y patogenia

122

Enfermedad cliníoa Otras bacterias nocardiotormet

£22 822

m

m

o m o m e m

s

y

t e r m o m o n ú s p ú r a s

M in o n a iv ra Epidemiología Enfermedad el lnfea y anatomía patotág tea Mocanfiopsls ESTREPTGMiCFTGS strsptsmycés ACTINOMICETOS TERMÓFILQS OTROS A C m o m C E T Ü S OtTSkO ViH U tm atw M to s Tiopberyma wftippfei Historia y taxonomía Ecología Enfermedad el ln*ca y anatomía patolóQto DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LAS INFECCIONES CAUSADAS POR ACTINOMICETOS AEROBIOS Aisíam lento primal lo Diferenciación de Nocaitfia de oíros géneros de atlin omito tos as rubios rdejiliflHC lón de acMnopleetos lenrnúlüds Identificación de Trvpheryma wblpplef Sensibilidad ln vitro de Noc3rtii3 y bacterial, relacionadas a les antibióticos y lral¿mianlo de las Infecciones

622 622 822 £23 m £23 £23 624 824 624 £24 624 824 824 825 825 825 833 833 833

C a p ítu lo 1 6 B a c te r ia s a n a e r o b ia s FORMAS DE INTERACCIÓN DE LAS BACTERIAS Y EL OXÍGENO

83$

837

Tolerancia al ojtigeno 038 Poie id al de o;id orredu tm n 338 HÁBITATS 339 CLASIFICA CIQN TAXONÓMICA Y NO MEZCLA TURA 339 INFECCIONES HUMANAS 340 AISLAMIENTO DE BAC JEMAS ANAEROBIAS 049 Selección de Fas muestras para cultivo 849 ReeolecciAn v trartEporie de las muestras 849 Hemocultivos para anaerobios (resumen de las pautas pira el caldo írad icionál y los sisle mas ínatru mentados} B43 Examen directo de las m Bienales clínicos 850 Selección y uso de ios medios BSl SISTEMAS ANAEROBIOS PARA EL CULTIVO DE BA CTERIAS ANAEROBIA S 353 Técnicas de Jarras anaerobias 153 Uso Cu la cámara do anaeratiiosís 835 Sistema de capa extendida por rodamiento (roll-streak} 356 Bolsas pláslk&s anaerobias 856 Uso de la f&rra contoneara anaerobia 056 INCUBACIÓN DE LDS CÜL TIVOS 857 INSPECCIÓN DELOS S U B C U im O S DE COLONIAS 858 PRUEBAS DE AEROTDLERANCIA SÓ9 INFORME PRELIMINAR DE LOS RESULTADOS 859 DETERMINACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS Y OE CULTIVO PARA LA DIFERENCIACIÓN DE AISLADOS A NEROBIOS 859 Mendicación presuntiva 859 liso Ce med los de agar di ferenioi ales 060 Placas Píesumpto 860 Placas de servs ¡bridad a los antibióticos 862 Caracterización da anaerobios usando pruebas bioquímica? convencionales en tobos grandes 862 Procedimientos allemaUvn 863 La prueba d& NaQier y l¿ prueba de CAMP pa/& C. períringefís N>3 filicrosistEínas comercia i es 353 Etjulpos comereíales para la idenllllcadón de anaerobias desnués de ih a ia t de incubación aerobia 663 DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS METABÓLICOS POR CROMATOGRAFÍA OE GAS-LÍQUIDO 864 Identificación de ácidos grasos volátiles 06Análisis (fe ácidos no woláliles 366 Controles de la cromatografía de gas-liquido 366 IDENTIFICACIÓN OE BACTERIAS ANAEROBIAS 867 Bacilos gramnegativos no {armadores de esporas 876 Clarificación y nomenclalurg 876 Identificación preliminar o presuntiva! del grupo de Bacteroitícs. Frsmtelk, Perpfíyiomanas y Fusobsticritím 870 Identificación de cocds anaerobios 681 Identificación de bacilos grampositivos anaerobias no formadoías d& espí ras 8S2 Especies -de Propionibact&riüm 032 Especia de Biftdabscfwjism 035 Especies de LsctobmBas 83S Especies de 8SS Especies de Etfbatferiéim 886 Mabiiuwus y v a g in a ta ta nana B&6 Olrcs géneros y especies ds baciíos gramposilivos anaerobios na f a miad días ú e esporas 339 Identificación de especies de CfQstritfitim 339

B Est igma del d r . VaFbr Eso

X X II

índice

C lostridios h istotóxicos involucrados en m ionecrosis clo stridiana o gangrena gaseosa Otros clo strid io s en diversos cuadros clínicos C lostridium difficile asociado con enferm edad intestinal B otulism o Tétanos

889 893 893 895 896

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD DE LAS BACTERIAS ANAEROBIAS A LOS ANTIBIÓTICOS

896

Métodos de evaluación de la sensibilidad de los anaerobios a los antibióticos

897

C a p ít u l o 1 7 Pruebas de sensibilidad a los antibióticos RESEÑA HISTORICA RESISTENCIA BACTERIANA A LOS ANTIBIÓTICOS V ariables que intervienen M ecanism os de resistencia Transporte de a n tib ió tico s a través de la pared celular y las m em branas celulares A ntib ió tico s que interfieren en la fo rm a ció n de las paredes de las células bacterianas: p-la cta tá m ico s y g lucopéptidos A ntib ió tico s que no actúan sobre la pared celular Interacciones entre los m ecanism os de resistencia

EL LABORATORIO COMO GUÍA DEL TRATAMIENTO ANTIBIÓTICO PRUEBAS PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD INHIBITORIA DE LOS ANTIBIÓTICOS Indicaciones Elección de la prueba Selección de los antibióticos Estandarización M edio de cultivo pH Suero C oncentración de cationes A tm ósfera Tem peratura Inoculo A ntib ió ticos C ontrol de calidad Garantía de calidad Interpretación de los resultados Selección de los antibióticos para el informe A ntibiogram a por m acrodilución en caldo A ntibiogram a por dilución en agar A ntibiogram a por difusión con discos D esarrollo de un pro cedim iento estandarizado para pruebas de difusión con discos Interpretación de los resultados C ontrol de calidad Lim itaciones A ntibiogram a por m icrodilución en caldo Sistem as com erciales V itek® (B ioM érieuxV itek, Hazelwood, MO) y M icroScan® (Dade International, W est S acram ento, CA) Prueba del e p silóm etro (Etest®; AB Biodisk, Suecia)

902 903 903 904 904 906

910 918 919 919 924 924 924 924 930 930 930 930 930 931 931 932 932 932 932 932 935 935 937 938 939 939 942 942 943 945 945 945

PROBLEMAS ESPECIALES CON LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD fi-lactam asas Especies de Staphylococcus Especies de Haemophilus

Neissería gonorrhoeae Moraxella (Branhamella) catarrhalis Especies de Enterococcus p-lactam asas de espectro am pliado Especies de Staphylococcus A n tib ió tico s p -la ctá m ico s (especies de Staphylococcus resistentes a la oxacilina) V ancom icina M acrólidos, lincosam idas y estreptogram inas F luoroquinolonas Especies de H aem ophilus Penicilinas C loranfenicol Cefalosporinas T rim e to p rim -su lfa m e to xa zo l Streptococcus pneum oniae P enicilina y o tro s a n tib ió tico s p -la ctá m ico s R esistencia m últiple M acrólidos y lincosam idas N eissería gonorrhoeae N eisseria m eningitidis Especies de Enterococcus A ntib ió tico s a m in o g lu có sid o s A n tib ió tico s p -lactám icos i V ancom icina Listeria m onocytogenes Streptococcus pyogenes (Streptococcus p-hem olítico del grupo AJ Penicilina E ritrom icina Fluoroquinolonas Streptococcus agaiactiae (Streptococcus p-hem olítico del grupo B) Estreptococos viridans Otras bacterias gram positivas Pseudom onas aeruginosa, Burkhoideria cepacia y Stenotrophomonas m altophilia en pacientes con fibrosis quística Pruebas de sensibilidad directas

C a p ít u l o 1 8 Micoplasmas y ureaplasmas TAXONOMIA DE LOS MICOPLASMAS Y LOS UREAPLASMAS FACTORES DE VIRULENCIA DE LOS MICOPLASMAS HUMANOS IMPORTANCIA CLÍNICA DE LOS MICOPLASMAS HUMANOS M ycoplasm a pneum oniae M ycopiasm a hom inis y U reaplasm a urealyticum M ycoplasm a genitaiiu m

949 949 949 952 952 952 952 957 957 957 959 960 962 962 962 963 963 963 963 963 965 965 965 966 966 966 966 966 968 968 968 968 968 968 968 968

969 969

975

976 979 980 980 981 986

índice M ycoplasm a ferm entaos M ycoplasm a penetraos M ycoplasm a pirum M ycoplasm a prim atum M ycoplasm a sperm atophilum Infecciones hum anas debidas a especies de M ycoplasm a de origen anim al Especies de M ycoplasm a hem otróficas

CULTIVO DE MICOPLASMAS HUMANOS A PARTIR DE MUESTRAS CLÍNICAS Consideraciones generales Recolección de la m uestra M edios de transporte M edios para cultivo de m icoplasm as Aislam iento e identificación de M ycoplasm a pneum oniae Detección de M ycoplasm a pneum oniae por procedim ientos que no utilizan cultivos Aislam iento e identificación de los m icoplasm as genitales Detección de m icoplasm as genitales por procedim ientos que no utilizan cultivos Sistem as com erciales de cultivo para M ycoplasm a Aislam iento de m icoplasm as en m edios de cultivo de habituales

PRUEBAS SEROLÓGICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES POR M Y C O P L A S M A P N E U M O N IA E PRUEBAS SEROLÓGICAS PARA LOS MICOPLASMAS GENITALES SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA Y TRATAMIENTO DE LAS INFECCIONES POR M Y C O P L A S M A DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE LAS INFECCIONES POR ESPECIES HEMOTRÓFICAS DE M Y C O P L A S M A EN ANIMALES

987 990 991 992 992

Seguridad en el laboratorio

1020

RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS

1021

Muestras respiratorias Hemocultivos Muestras de heces Otras muestras “ es té rile s ”

1021

992 992

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL AISLAMIENTO Y LA IDENTIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS

993 993 994 994 994 945

Preparación de las m uestras Digestión y descontam inación Centrifugación Muestras de m édula ósea y m uestras de biopsia Otras m uestras líquidas Tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes

996 997

1000

1001

MÉTODOS RÁPIDOS PARA ESTABLECER UN DIAGNÓSTICO

998 1000

1003 1004

1007

1016

TENDENCIAS ACTUALES EN LA TUBERCULOSIS CLÍNICA

1017 1017

Uso de técnicas m oleculares Uso de instrumentos autom atizados Uso de m edios de cultivo en caldo Inoculación de m uestras clínicas en m edios de cultivo con base de agar Uso de /7-nitro-acetilam ino-hidroxipropiofenona (NAP) Aplicaciones de la crom atografía gas-líquido y la crom atografía líquida de alto rendim iento Uso de tubos de hem ocultivo con sistem a de lisiscentrifugación

Sensibilidad de los frotis ácido-alcohol resistentes Crom atografía gas-líquido y crom atografía líquida de alto rendim iento Uso de m edio del cultivo en caldo

SISTEMAS DE DETECCIÓN AUTOMATIZADOS

C apítulo 1 9

TENDENCIAS EN EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LA TUBERCULOSIS

CULTIVO DE MUESTRAS PARA EL AISLAMIENTO DE MICOBACTERIAS M edios de cultivo M edios de cultivo no selectivos para el aislam iento de m icobacterias Medios de Cohén y Middlebrook Medios selectivos Incubación

Micobacterias Aumento mundial de la incidencia de tuberculosis Impacto de la coinfección por HIV y Mycobacterium tuberculosis Personas con riesgo de tuberculosis Enferm edad rápidam ente progresiva Im plem entación de un control de la infección y m edidas epidem iológicas más intensivas

X X III

1018 1018 1018

1019 1019 101 9 1019

1019 1019 1020 1020

LABORATORIO CLÍNICO

1020 1020

Optim ización de la detección y la identificación de m icobacterias

1020

Sistem a BACTEC AFB Mycobacteria Growth indicator tube (M G IT, tubo indicador de crecim iento de m icobacterias) y MGIT 960 Sistem a de detección de m icobacterias MB/BacT Sistem a de cultivo ESP II BACTEC M Y C 0/F LYTIC

1021 1022 1022

1023 1023 1023 1026 1026 1026 1027 1029 1029 1029 1030 1030 1031 1031 1031 1032 1032 1032 1033

Sistem a Septi-Chek AFB

1033 1034 1034 1035 1035 1035

IDENTIFICACIÓN DE MICOBACTERIAS MEDIANTE MÉTODOS CONVENCIONALES

1036

SISTEMAS DE DETECCIÓN MANUALES

Tem peratura óptima para el aislam iento y velocidad de crecim iento Producción de pigmento Acumulación de niacina Reducción de nitratos a nitritos Hidrólisis del Tween 80 Actividad de catalasa Actividad de arilsulfatasa Actividad de ureasa P irazinam idasa Captación de hierro Inhibición del crecim iento por la hidracida del ácido tiofeno-2-carboxílico Crecim iento en cloruro de sodio al 5 % Crecim iento en agar de MacConkey

1036 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1037 1038 1039

CLASIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS

1039 1042 1042 1042

Identificación de laboratorio de m icobacterias y síndrom es clínicos relacionados

1042

X X IV

índice

Revisión de las especies de M ycobacterium : características del laboratorio y correlaciones clínicas C om plejo Mycobacterium tuberculosis Fotocrom ógenos E scotocrom ógenos No fo to c ro m ó g e n o s Especies de crecim iento rápido Otras m icobacterias

1043 1043 1045 1047 1051 1055 1056

Enferm edad clínica 1095 D iagnóstico de la boratorio 1096 S P IR IL L U M M IN O R (FIEBRE POR MORDEDURA DE RATA) 1097

C a p ítu lo 21 Micología________________________________ 1102

DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LAS MICOBACTERIAS MEDIANTE MÉTODOS MOLECULARES 1056

PACIENTES CON RIESGO DE CONTRAER INFECCIONES M IC ÓTICAS 1104

Métodos de am plificación de señales Sondas de ácidos nucleicos H ibridación in situ Métodos de am plificación de ácidos nucleicos A plicaciones com erciales Ensayos dom ésticos de PCR, incluida la PCE en tie m p o real Análisis posam plificación H ibridación inversa S ecuenciación de DI\IA A nálisis de m icrom atrice s Tipificación de cepas y huellas m oleculares de DNA

Signos y síntom as generales que sugieren infección m icótica 1104

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD TRATAMIENTO A CORTO PLAZO Recom endaciones de la American Thoracic Society

RESUMEN

1058 1058 1058 1058 1058 1060 1061 1061 1062 1063 1063 1064 1067 1068 1069

C a p ítu lo 2 0 Infecciones producidas por espiroquetas

1076

TAXONOMÍA 1076 TREPO NEM A 1077 Treponema p allidum subespecie p allid u m 1077 P eriodo de incubación 1077 S ífilis p rim aria 1078 S ífilis secundaria 1078 S ífilis latente 1078 S ífilis tardía 1078 E pidem iología 1079 Inm unidad 1080 Treponema pallid u m subespecie pertenue 1080 Treponema pallid u m subespecie endem icum 1080 Treponema carateum 1081 Diagnóstico de laboratorio de las enferm edades treponém icas 1081 Pruebas sexológicas 1082 innovaciones: pruebas provisionales y en fase de investigación 1084 B O R R E LIA 1085 Fiebre recurrente 1085 E pidem iología 1085 Enfermedad clínica 1086 D iagnóstico de laboratorio 1086 Enferm edad de Lyme 1086 Epidem iología 1088 Enfermedad clínica 1090. D iagnóstico de laboratorio 1091 L E P T O S P IR A 1094 Leptospirosis 1094 E pidem iología 1094

CLASIFICACIÓN CLÍNICA D E LA S INFECCIONES MICÓTICAS Térm inos comunes en m icología

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES MICÓTICAS Recolección y transporte de la m uestra Procesam iento de las m uestras Examen directo Preparación en fre sco para estudio Selección e inoculación de m edios de c u ltiv o Incubación de los cu ltivo s para hongos

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA LA IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE AISLAMIENTOS DE HONGOS Im portancia de la identificación del género o la especie en el laboratorio Identificación del género y la especie de los principales grupos de hongos Especies de Zygomyces y z ig o m ico sis ' H istopatología de las infecciones causadas p o r zigom icetos

1104 1105 1106 1109 1110

1110 1110 1111 1113

1116 1118 1118 1118

1120

HONGOS FILAMENTOSOS HIALINOS E HIALOHIFOMICOSIS 1121 Especies de A spergillus y aspergilosis Presentación en el laboratorio M o rfo lo gía de las colonias Características m icroscópicas

Aspergillus Aspergillus Aspergillus Aspergillus Aspergillus

fumigatus flavus niger terreus nidulans

H istopatología D iagnóstico m ediante técnicas sin cu ltivo Otros hongos filam entosos hialinos de crecim iento rápido Características de las colonias Géneros de hongos filam entosos hialinos productores conidios en cadena Especies de Penicillum Especies de Paecilomyces Especies de Scopulariopsis Identificación de hongos filam entosos hialinos productores de conidios en racim os Especies de Acrem onium Especies de Fusarium Especies de Gliocladium Especies de Trichoderma Identificación de los géneros de hialohifom icetos productores de conidios aislados Especies de Scedosporium

1121 1122 1123 1123 1123 1123 1123 1125 1125 1125 1126 1129 11 29 1129 1131 11 31 11 31 1132 11 32

1132 1133 1133

1134 1134

Indice

XXV

EspflC^s de Cí\ry$maomm 1135 Patrones ce crecimiento Ja las levaduras en agar harina Especia; ds Sepedonim _______________________________ U 35 da mai7_____________________________________________ 1165 Escocés dé B esuvem _________________________________ 1136 CHRQMaqar__________________________________________ 1165 iPFNTfFICA a ñ a OF L OS QFRMA TÓFITOS im tafírt/tt .v b .r.w ______________________________________ HEZ Idenlijicaci6n da áspides de M im tp o tvm ________________ 1139 Candína troptcpJis _____________________________________ 1168 Micmssiowm caifís____________________________________ 1139 Candida psntssHosis___________________________________ 116S btíctúsporunt qypstunt__________________ ;_____________ 1T€0 C tn d k jt k e fy r ¿ g w c g fo frg g jg fe j _________________________ 1168 Míemsootvm mhum__________________________________ 1 T¿Q Otras esseacs d& Candida patógenas emenaantes___________ 1163 Idenlilicaclórt da eupedEi úe rró-ftpjjflffjri_________________ 1T4Q Espacies dé Candida y carvjidiasis________________________ 1169 ItichQphyian mentííifüf.nylm___________________________ 1 1¿ü Espades que proauctn ftlfas verdaderas___________________ 1170 Espacias p e na producen filTas verdaderas________________ 1170 TriGhQphytúrt mhrum__________________________________ 1T41 Tficáúphyíún ¡oniuríins________________________________ 1141 Criptococnsis y CnvtocóccüS m atúm ans_________________ 1170 7]r.icfa7o/Ti-7on vhTJTifpyym_______________________________ 11¡32 □iaflrwjstico nrediant-o- tecmcas sin cultivo__________________ 1174 Eptfermophytm flcccosum_____________________________ 1142 Otras levaduras da Importancia médica que na le riman hitas 1174 Diagnostica medianía técnicas sin cultivo__________________1142 Candida iTort\iot;$:s) ghtsmtit____________________________ Il? 4 HONGOS DIMORFOS_________________________________ LLiS ESWieS do R h o jo low *________________________________1174 Esp-acigs da Sxcchiroipvces_____________________________ 1174 BíaslomycBS ¡iermzitttéfs jrjyajtnmlrarii__________________ 11 ¿5 Pregentacirin en af lahflrairn-lo___________________________ 1f4fi thn tí lahflralftrln___________________________ IM S Hlstoplasma eatisulatom a hlsloplasmcsls_________________ 114ft waffíMn.TP'/i'flimycw wemeckú ___________________________ 1177 Preswntanton fin lahnrairvrlii___________________________ 1149 Sistemas comerciales para la Identificación de levaduras 1173 D ijriDtLiCn mediante técnicas sin culWfl 115 i Pruecas dfi senSiínl Idsií a Jds aoUmicúUcas Sffotoitítix sctieückü ir csanrotrlcosli______________________ U 52 [ a n H T u r m ln r a m a l_______________________________ 1176 PfaRenladflnenfitiahftialftrlii___________________________ U 5 2 OtAGNÓSTiCQ SERQLÚGiCO DE LAS ENFERMEDADES Disanfetlco iriBtflantfi técnica sin«íIIIvd__________________ US2 MlCÓTiCAS_________________________________________ u £ ü p M Z Q ttid lc itfis bta$t¡tcfl$!$ y cara cotcldicflo micosis_______1152 EftsaDlaclfiQJieJaJiwatnilQ_____________________________ 1154 Diagnóstico irieatotB técnicas sin cuijas__________________ 1155 C A P IT U L O 2 2 Hornos óemaiiáceos___________________________________ U 5 I P a r a s ito lo g ía ______________________________________ 1151 Ana nías rfe la faeoh If-amieosls____________________________1158 PresEniacIfinátJabftratofln______________________________1153 RIESGO Y PREVENCIÓN DE LAS INFECCIONES Macjcconldli» can tablones tranneraalea v iQHOltudInales PARASITARIAS 1154 (murflofiHttl _________________________________ USÉ M M ÍE E S lM Ú M S CLÍNICAS DE LAS ENFEfíMEDADES Iw m m ds AOmtrfa__________________________________ HS3 PARASITARIA S 1101 Esdwíbs ds U to s M rn ________________________________ USB RECOLECCIÓN. TRANSPORTE Y PROCESAMIENTO Especies de S tm o tw iim _______________________________115G D E LAS MUESTRAS 1 105 Especias de EMcoczttm_________________________________1159 Mueslras íeeales 1195 MBcrccoBidiai enn tabiques tianaveraslea_________________ l_tJJ Püt^ejvaci^i rtt; mi.i:s1rerac!ldca!i________________________LLÜÉ Especies de Bmofaris __________________________________ 1159 Examen visuai_________________________________________1195 Especias de Dwcftsimi_________________________________ 1159 FMr.psaTniRnIríflñ mLrqjlr3R dt> h^r.R-: rftni^n fi-n:r¡riiR. Especies de C v rv itlitis _________________________________ 1T59 para ■el éstamen de huevos v parásitos____________________ 1196 Especias dfl ütSBrohilum _______________________________ HS9 Examen de miiettrai inlcslJnales na le cal es________________12DQ Wac roconid las ade nacen de modo individual 0 Eiarnenrfa m iifiiaaitJilB lfllB illiiila _____________________12I1J per co nid iadún aspee ial 1159 ESDUlQ______________________________________________ 1£Q1 Especies de iV.tg.Hp5Pü-ra 11SO OriJiav líquidos corporaigs______________________________ 1201 Especies de Pftcmj ____________________________________ 1_!§0 Biopsias v aspirados flg ignúos___________________________1201 Especies de Chaetomitrnr_______________________________ 1160 Raspados o biepsia dí cúinea 1201 AGENTES D£ CROMOMICOSIS Y MfCETQMAS__________ M Q Biopsia de múscuta____________________________________ 1201 CttdogbjtlopSan (Clstíosporium} carrianii_________________11 62 Sangre______ __________________ __________ __________ 1202 P M í t m o * rtfftfFWBfl)________________________________ 1162 IDENTIFICACIÓN Y DIFERENCIACIÓN OE PARÁSITOS iSfla phlUÍCPñQfá rtch a ftb Jjl_________________________________1162 Ciclas vitales Je parásitas humanos______________________ 1203 fa M g M M jw J w o f____________________________________ 1163 PROTOZOOS INTESTINALES___________________________ 12Ü5 Exophtals jsairsstrnat___________________________________l i £ l Amibas intérnales____________________________________ I2D5 IDENTIFICA CIÜN POR EL LABORATORIO DE LEVADURAS 1161 Amebéasg V fn to m o e ta histoM la________________________1205 Tüfto cermiftal_________________________________________ 1HS5 Entanwetta h¡stoMic.i v Entifnnfíba ccti___________________ 1S06 Preparación» a oarlir da agar harina tfa mair______________ Qi;^nást:co serolóq ca ú i amebiasis________________________________ 1207

B Est igrma del d r . VaFbr Eso

X X V I índice E n tm oetnt ttistotytfca no patógenas: F n tm o e ü J >M íkv

Dras aT-eoas ¡nlssfrnalfis Prntfijfms ria rlar.rfiraKmn irvieria Flageladas irtG st'n a íü s Gisfíüst fámbfía ütrog flagelados intestinales C ¡lindos: Bafantidinm cali CncEÍriins

CñcVtosportáíum p jn v m C vciospofs c á v tíü m n s is

isoscora beíh Espacies da Sároteystís Fito Mlcrospotam. eisneeias da Mícrosparidium NEMATODOS A s t a r U iii y A searis iu m b tict)ltla &

TticoceteEosis fTrichufiasís} y Tríchufis ím tiíura Enterabius v e rm ic u la ris jjiic ro iJ Llrcinafias Estronoiiomiasis v SW M Ytotoet s te itm lis Especies di Tfithostrúmftlos

<235

1209 1209 1210 I2 i O 1213 1213 1914 1214 121 ? i? m iftift 121» 122Q 1 222 1222 -223 1224 122É

C if t t í t r í a pftU iftpiñG iisis C Fsm pos

im

Tsertia s o lfa m v f o e r á u g i j e t i

DintoHübMtrríum temar tea la gigante de los peces Espodes de H fm m o ítg is PiüYlidiüm caninum TREMATODOS EsquiíStqsQmas

FjscloJa hepatica y iastíotopsis bttski CSonorthts sím m ís p a m M h n u s wesiermafit PARASITOS D I LA SAXGBE.Y LOS IL lin ú S Paludismo H a te sla Hem of!apelados: especies de L s ls h m a flia v d i TfYDanoscma Lflsnm an lasls v T rica n a M m ia sls

Filarlas v fllarlails Q .i*am easajtJj»tfwca«a « t o a DfdeüncitLasJa Dirofikrla.sts

ginest 15uiMe^ pPr^ero1pzg Tmopfssma mid>¡ PMutmcvstis ikoveci [n fc c c lon&s pa ra sita ria s per otras larvas t it ila r e s Tóquinosjs

1231 i?32 1333 1234 1234 1234 123fi

i?aa 1231

1233 1?J1

Diagnóstico de infecciones causadas p a r v ir u s , C h h m y d i a , R ic k e t t s ia y m ic r o o r g a n is m o s r e la c io n a d a s INTRODUCCIÓN Revisirin histérica Evolueidn d e la s té c n ic a s de c u ltiv a s Cb I u Ia f e s Evolución ds los servidos da diagnóstico virotúsico Nivele &de scrvícin TAXONOMIA Y NOMENCLATURA MANIFESTACIONES CLÍNICAS DE LAS INFECCIONES VIRAIFS nrtnmiíii Trini* Paran iioiri rus Viras Daraintl Lienza Vtras de la narotrciíis Virus íiíl sarampión Viras slneilial respiratoria Otros pararri)i&vm PICAritas/iras ainhjLQüirjis ¿aiiaiüfjs F iln y ifiís

Toaavinis Bunvavlrus Virus de la enteradllls de C<ternla HantavLrus Vlnisfla ia pasiroentertlts humana fln taMirim Loiicivir^ A s U ttv iü is A d e ñ É M in iS J jitijjtfiS C'.nronatfim .í

12M 12 A k

I2áa 1243 12SQ 12ñl 1252 1253 1253 I25Z

1?57

Larva mpgrans vlso&ral L^íva m»gíans cutánea - rojearíaAnisakiasis

1IS I 1259 1253

finfttnftSnmLasfc

1?&1

Angic-strungiPasis Hidat dosis [ervfcririuc^d hjdaUflita o üaiinocccasisj ^pactes ce Moltíceps -Cgniirosis Esparganci^s. Spíromctfj nunscno.-d'js DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DELAS INFECCIONES PARASITARIAS FÁRMACOS UTILIZADOS CON FRECUENCIA EN EL TRATAMIENTO DELAS ENFERMEDADES PARASITARIAS

Capítulo 23

iPBfl i?fii 12EI 1PP1 1263 1286

CíJUnIttií Rstmvtms Hfl^sstflhiS Virus dsl h e r D K S im ó le Citoisoalomis Vlius ds Epstein-3srr V iru s ilü ÍA u a iirflla -T A s tB t

Heroestfirus h.mijnci 6 y 7 herpestifus híinunci B Viius Q fldcníiiilíüi PoníirLs Papüvavirus Virus del papiloma Virus dfiJ poiliema ParWCvirtJS Virus d i la s h e p a titis Virus d&la hepat¡ii& A Virus de la hepatrtis B Virus de t» hepatitis G Virus de la hepatitis D Virus dala hepatitis E Ettfermfdatles causadas par priores (encefalopatías espongina mes tro ni ni si lites)

B Est igma del d r . VaFbr Eso

1271 1273 1223 127ÍS 1223 1574 1?74 1277 1277 Í2 M 12¿i 12áá ]2 M 1?3fi 1?3fi 12&B 1233 1283 1290 m i 123! 1291 1291 1293 1233 1234 1234 1234 1234 1234 1234 1233 m i 1301 1302 1302 m i 1302 1303 vm 1304 1305 1335 133E 1507 1307 1301 13ÜB 1309 1309 1309 1309

Indice x x v i l

DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES VIRALES Obtención de rmeslias cara el diacnóslico Transporte y ccnservación de las muestras Afs.r3 miÉütln dfi hirirfi fin cultivo Preparación y man ten i mié nlb de cultives celulares Cdnlammaíií n rlf! CulÜuat Miniaras Aspa oles técnices de les cultivas celulares Seleaciún (Te cuhivos. celular» nata el aislamiento de virus Siembra c Incubación de cultivos celulares Detección de viras e Idc-nliljca ción provisoria Efecto citopátko Hemoiluiin.:io cín y hemadSOrciófl Miííoscacia 6 o:íC3 Microscopía eleclronsca Diferenciación biooufmica taacladAn mu las «luto* Detección de anlioenos virales. Arialactos y alteraciones no causados poíiriius lifedificación definitiva de los aislamientos Conservación de los aislamientos virales R e s u m a n ¿If 5a dplfirnilin 6 i ríe nlilienr iñn rin las v in ie r»n cutthra DETECCIÓN DIRECTA DE VIRUS EN MUESTRAS CLÍNICAS Detección de (sierpes ce inclusión per microscopía áplica Detección de partículas virales con microscopia electrónica Detección inmi.nnln uca do anlioenos virales Víixis resairatones Vsrus del úruDo h-3rn^E Olios virus Tí cuicas me i aculares Virus de la inmimodalioenda hkmana Virus de la teBBftitfs C Virus de la tiepstllfs B Virus del oaDlloína. Humano Parvo* Irus flt& Virus del Mío Occidental Virus del n&roes simóle (Stomeiialovirus FntmMiufi Coronavlrus ddsíndrome respiratorio aau)Oflf*w JSRAGl Qtras infecciones vi ratas Selección da pruebas para el díatmóslica rápidu DIAGNÓSTICO SEROt ÚGlCO DELASINFECCIONES VIRALES Virus de la Inmuno delicie ncl a humera Virus de la hepalilii B y vires de Epstein-flar? Virus de La hecatilis A Virus de la tieeatífe C Parvovlras Viius del herpes simple Vires os la varice la-ios tet Cilomsgalavirus Vires del Hile Occidental Rubéola Cofonavirus del 5-RAG Anticuerpos IgM

131? 1312 1316 im 1316 1S1ÍI 1320 1321 1323 132-5 1324 132-3 1316 1329 1329 1329 1329 1329 1331 m z

m t 1334 1335 1336 1336 1336 133R 13315 1R3Z mn 1338 1339 111P m%, 1339 1339 113 P 1339 1341) 1340 is jn i?un 1342 1344 1344 13í4 1344 1344 1345 1345 1345 1S4S 134S

Prpcedimientoi saral-ppicos diversos Diagnoslico de oirás infecciones virales PriiFhas dfl íaiuihltíriad i líi-s arliviralHX INFECCIONES POR ESPECIES DE CKLAMYDM Chiárfíífdiá trachomsiis Características el ¡nicas y epidemiología fltitanniAn rl« imjPí,tniF: Aislamjenlc de Cfílamyúu tfachomatis en cultivos celulares Datecoóm directa de Cbfáfnfília fraotomafeen muestras tlihiras. Diaíjne&lico serc-i^OiCO Oíros métodos de diagnóstico Diagnóstico de abuso sesual C M tm tdia osittetl Cftfátftyiia pnéamnnlss INFECCIONES POR RICKETTSIA. CQXIELLA. F H R IlfH IA KANAPI ARMA fíickBttsti y C oiítlfa Cáracte;isiitas cínicas v Midemioiooia Ootendóni de muestras Aislamiento de Píetettsij v Gowffo en cultivo Detección directa de antiasno v ácido nucleicos en inifflslipí nlinlpac Diagnóstico seroioolco Especies rte B tllc b ti v Ananfosma

1345 134& 1346 134G 1346 1347 1347 1347 1348 1343 1340 f 340 134& n is 1349 1349 íasn 1351 iavi 1351 1351

A p é n d ic e í

1361

A p é n d ic e I I

1377

P ro to c o la s Pin Tomín 1*1 Caíalas;! n fti ftfiiftr.olrt 1 í Priiflhfl d-ft soluta "iflüri rn hílis, 1 3R3 Protocolo 1 3 Prueba do la coagulisa en portaobjetos 1344 Protocolo 1-4 Prueba del indol 1^ñ Prnlnmln 1-5 PriiRha rln la cirnrfnraíi nitiiiam 1 .W P ilotólo 1-8 Prueba PYft 138Í prDíscolo 3-1 Prueba de lijación úelcomplemaíib (FC) 13SB Protocolo 3-2 Prueoa de jniiaiciGTi de \a hemapiuti nación (1HA>1390 Prolocois 6-1 ú-Klrodenil-li-D-galactopiranósido 1391 Protocola 6-2 ^ hciií r.i" r: l1ü dvnin?.- -n:l ;ar.n?nn^ n^r-.Hrales 1392 Protocolo G 3 Hd¡3 di maülo 1393 Protocolo 6-4 Prueba da Vcgas-Proskauer 1394 Prntdídn F,-h Htilí7srdrtn rlsl íitmlrn; 13SJfi Prntfif nln 6-6 Pniüha rlf h iira.TiM' rrnJFnn.nn.-fl 13S7 PrntacoloS-' 0íSC3;rt5OKl1aÉa5; 13M 1401 Protocoló 6-8 Pemln Inni na rte^ü mi nr-üi Protoco'o 7-1 Pr.jeba do dachn-fcrnr-nt?.: m (Huoh v L^-lsoni 1402 protocolo 7-2 ri iCiOfl [i.irs 1ü:k!qs 1403 Protoco o 7-3 Miiorescencla-desnitrlíficacióo 14HS Protocolo 7-4 Pru&ba de hidrólisis de la. escuiina 14D6 Pmtoeftto 8*1 Pfiffiha W,MP UfltL Protoco o SM Pu.ítwi de reeueflmientos (1& faclor ^ v V 14(19 Protocolo 11-1 Prueba d'i trtlEi^aclún ráoida de h UraTos detarbeno para id denVicaciOn es esoec es de Neisseria 141IP 1411 PlütDCG.ü 12-L Pmeha ríe liinmllflnna con dlsnn

B Estigma del dr.V aFbrE so

X X V III in d [» Prorncoio i?-2 Pmaba ds la nni^iocina lili Protocoto 13-1 Prua bes da sflnsibil iriad a a bantrarina v SXT 1413 Protocolo 13-2 Prus l>?. de la bllisescullna, 1413 Protocolo 13-3 Prua ha de sensi tildad a Ea optcqmna 1414 Prrttncnflra tü-4 Prnwhía rlR tnlsrarr a t* 1414 Pr-ctncoün 1¿l-1 Colüracitn de a/ül rte metteno de Loe'rtr 14lS 1416 Protocolo 14-2 Medio con suero de Loeffler Protocolo M '3 A0,ir ds Tinsdales (moa Hitad o por Moore y Parsom) 141? 141B Protocolo 1 4-4 Aasir sanar# elslin.i teluríto Protocola 15-1 H drtlísls la xantina, hiooifantlivi ti tosí na v casaba 1ÜB ProlMOi0 17-1 Prueba de sensibilidad por difusión con disco IBdutr-Klfyy) para Oaeierlassln requarlmientos ntitrlctonates 1420 «ceciales Protocolo 17-2 Realización de las pruebas ííe sensibilidad nór microd.liícirtn en aldo con bacterias sin reauenmlenlos nutriclonalss fes-o^ciales 1421 Protocolo 17-3 Prueba de diiusltto ale gradiente [Etest} c a n sensibilidad hantsrfcnia 1422 Protocolo 18* 1 Cotoración de 0 lene para la IdeirUtaacIGn d^ mlcwiasmas 1423 Protocolo 1 B-2 Prueba de la ¡Hemidsorcíón para ía Identificación u n de Myúúpfiéms prteupwfiiae Protocolo 1S-3 Prueba de cloruro marañoso mea M ía la íé 2á Idemlficatlón de (¿m iasm a wesivtiüum Protocolo ia-4 M?dio [jijry aislamiento de M sqgptm w 1425 m m rn G tm Protocolo 18’5 Medio- ostra aislamiento de micoplasmas 1427 « á lta te Protocolo 16-6 Prueba de reduraúst del letraidUo para la 1420 Idenllílcaclúii presuntiva de M ywptasrw pnettmniae Protocolo 1S-I D¡g2£i:ón y cfescontam ¡nación; rtface1il-t1429 tistelna’bldrOMdo de sodio (NALC) 1431 FjoIdcoId 19-2 Coloraciones con carbol Fucsina Protocolo 1 S 3 CoíoracSfln fluorescente: auramina 0, 1433 aoramina-rodamina Protocolo 1 9 4 Prueba NAP (p-nlIfo-a-acetilaminQ-p1434 hidrojdproplof anona); (i ACTiC) 1436 Protocc’o 19-5 AfiFsullalasa Protocolo 19-6 IMarminacion ds la íd ^ots actividad 1437 de las micobacterias

P-ntncolo \fl-7 Catalana a Protocolo 194 Desarrollo en agar da tf seConVay Protocolo 1 M Inhibición j>or la hidrszitfa del ácido tlOtSJi'2-cartiOiííliCO (T,H 1 [jQ/mlS Protocolo 19-10 Ca&Caciúíí dé h;eir& P-flltlCfllO 19-11 A::i:fflII laclan ríe nlídm Protocolo 1&-12 Reducción de nitratos mkiobacterias Protocolo 19-13 Plrajlnamldasa Protocolo 19-14 Tolerareis al cloru ro de sodio: m Ico&acte ñas P ntcfjñin rn-tñ Hulrúlisls ríe tvm n -M Pmprimin i <m k jjí&asa. r.:.eot]acterias Protocolo 19-17 Sorteas de DNA oara la ideni flcacidn ds micobacterlas Protocolo 19-13 Disección, identllsadón y priMbas ds sensibilidad a fármacos de ¿í tuberoifosls por métodos racllcwTHiTrlrsnfi Protocolo 2 M MicioscoQía en campo oscuro ce lesiones gsrulales Protocolo 20-2 Pruetsa sérica en ponaobisios del Venereal Djsmsb Research labe rato r/ (VDRL) Protocolo 2D'3 Prueba rápida da reagina plasmática (RPR) en tarjeta Protocolo 20-4 Prtiete de absoícián de anticuerpos líflinoflÉmicos fluoíftscerftES ÍFTA-ABS) Pínlocnln ??-1 Tknkas de concaetraciún ds el aislamiento de paréaos intsiinaies Prcrtrnlo ZZ'2 Técnica de SnplOn tricrómica para troils de heces PíGleciolci 22*3 Frspars& ón de frotis de sangre de gola tina y de yDía gruesa Piotoccío 2 24 C^lbracién del ócutór in¡crométricó Pintona[q 22-5 Preparaaúfi con cinla adhesiva de cslulosa para el eKamEn de o>our05 PjLíl.’üDük] £3-1 PrííL'bj d i hsm-atísDP&,rki DiagraT-o. h-\ FOrmubs da conservarites de Heces usados hibltualmfltrte:

liS fi 14M liü 144? 144? 1444 1445 1446 1447 144fl 1449

UM usa 1454 14S7 Ufel UF-5 14E9

1471 1473 H?4

1475

Lam inas cu color Indico an alítico

B Est igma del d r . VaFbr Eso

I-l

Lista de láminas en color

Láminas en color 1-1____________________

Láminas en color 6-4__________________

Evaluación por tinción de Gram de frotis de esputo

Características diferenciales de Ettterobacteriaceae

Láminas en color 1-2____________________

Láminas en color 6-5

Diversas coloraciones urilizadas en microbiolo­ gía

Peste humana

Láminas en color 1-3____________________

Sistemas de identificación comerciales

_______________

Láminas en color 6-6__________________ Identificación presuntiva de bacterias basada en la observación de la morfología celular en pre­ paraciones de frotis teñidos

Láminas en color 1-4

________

D ificultades y artefactos en la tinción de G ra m

Láminas en color 1*5____________________ Identificación presuntiva de las bacterias basada en la observación de la morfología de las colo­ nias

Láminas en color 6-1____________________

Láminas en color 7-1___________________ Características importantes para distinguir los bacilos gram negativos no fermen (adores

Láminas en color 7-2___________________ Pruebas utilizadas en la identificación de baci­ los gram negativos no fermenta dores Láminas en colar 7-3__________________ Morfología de las colonia!; y microscópica de algunos bacilos no fermentado res

Identificación presuntiva de

Láminas en color 7-4__________________

Enterobactcriaccae

Morfología de las colonias y microscópica de algunos bacilos no fcrmciitadores (continua­ ción)

lám inas en color 6*2____________________ Aspecto de Jas colonias de Enterobacteñacea? en agare* de MacConkey y EME

Láminas en color 6-3____________________ Aspecto de Lmerohacteriaceae en placas de agar XLD y HE

Láminas en color 7-5__________________ Morfología de las colonias y microscópica de algunos bacilos no termentadores (continua­ ción)

B Est ¡gma del d r . VaFbr Eso

XXX

LIS TA D E LÁMINAS EN COLO R

Láminas en color 8-1

Láminas en calor 1Z-3

Identificación de laboratorio de especies de C^mpytijbdcter

Identificación de estafilococos (continuación)

láminas en color 13-1 Láminas en color B-2

______________

Identificación de laboratorio de Vibrio cbaierae y otras especies de Vibrio

Láminas en cofor 9-1

________________

Identificación de estreptocíjcos

Láminas en cníor1S-2______ Identificación de estreptococos y enterococos

_____________

Identificación de especies Je H¿temophiíus

Láminasen color 13-3___________________

láminas en color 9-2

Identificación de estreptococos y enterococos y bacterias similares a estreptococos

___________

Identificación de especies tic Haemophitus (cuntmuacion}

Láminas en color 13-4___________________

Láminas en color 9-3____________________

Identificación de enteroencos y estreptococos del grupo Virìdans

Especies de ActifiobaciUííS, Cardiobacterium y Eikeneíia

Láminas en color 1 4 -1 __________________

Láminas en color 9-4__________________

Especies de Listcria y Erysipelothtix

Especies de Kingelia, Capttocytopbaga y Dysganamanas

Láminas en color 14-2___________________

Láminas en colpr 9-5_______________

Láminas en color 14-3___________________

Espeeies de Pasteurella^ Bruce fía y Rt>rdetelia

Especies de Corynebacterium

Especies de Erysipelothrix y BaciHus

láminas en color 10-1___________________

Láminas an color 14-4__________________

Diagnóstico de laboratorio de la legión d o s is

Especies de Corynebacteiium {continuación)

Láminas en color 11-1_________

Láminas en color 14-5___________________

Identificación de especies de Neisseria

Especies de Coryttebaeteritím [continuación]

Láminas en color 11-2___________________

Láminas en color 14-6___________________

Identificación de especies de Neisseria y Moraxeila catarrbaíis

Especies de Corynebacterium, Arcanobactermm y Breiñbacterium

Láminas en color 12-1___________________

Láminas &n color 14-7___________________

Identificación de estafilococos y especies rela­ cionadas

Especies de Rotbia, Ceilulosimicrobium^ Ceiiuíojtjoniis/Microhjctcmtm y Lactobacilhts

Láminas en color 12-2

láminas en color 14-8___________________

Identificación de estafilococos

Especies de Lacíobaciitus y Gardnerelh

B Est igma del d r . VaFbr Eso

USTA DE LAMINAS EN COLOR

XXXt

Láminas en cnlnr15-1

Láminas en color 21-1___________________

Identificación de bacilos gramposinvos aerobios y anaerobios facultativos

Morfología de las colonias de especies de Zygomycetes y especies seleccionadas de Aspergillus

Láminas en color 16-1___________________ Identificación de bacterias anaerobias: bacilos gram negativos

Láminas en color 21-1___________________ Morfología de las colonias de hongos filamen­ tosos hialinos aislados con frecuencia

Láminas en calar 16-2___________________ Láminas en color 21-3

______________

Identificación de bacterias anaerobias: microor­ ganismos grampositivos no forma dores de espo­ ras

Morfología de ]as colonias de hongos filamen­ tosos dematiáceos aislados

Laminas en color 16-3___________________

Láminas en color 21-4__________________

Identificación de bacterias anaerobias: clostrid ios

Morfología de las colonias de dermatófitos

Láminas en color 21-5__________________ Láminas en color 16-4

Morfología de las colonias de hongos dimorfos

Identificación de bacterias anaerobias: ckwtridios {continuación}

Láminas en color 21-6__________________

Láminas en color 16-5___________________

Morfología de las colonias de levaduras aisla­ das con frecuencia

Identificación de bacterias anaerobias: uso de placas cuadrantes Prcsumpto y discos en agar sangre para anaerobios

Láminas en colar 18-1___________________ Micoplasmas y ureaplasmas

Láminas m color 19-1___________________

Laminasen color 22-1___________________ Artificios: “Nadie conoce los escombros que yo he visto™

Láminas en color 22-2___________________ Amebas/flagelados intestinales

Identificación de laboratorio de Mycobacterium tuberculosis

Láminas en color 22-3___________________

Láminas en color 19-2___________________

Láminas en color 22-4__________________

Identificación de laboratorio de especies de Mycabacterimn distintas de M. tuberculosis

Cocddius

Láminas en color 19-3___________________ Manifestaciones clínicas de algunas enfermedad des micobaeterianas

Láminas en color 20-1___________________ Diagnóstico de laboratorio de enfermedades producidas por espiroquetas

Flagelados

Láminas en color 22-5___________________ Nematodos

Láminas en color 22-6

______________

Ccstodos

Láminas en color 22-7___________________ Tremátodos

B Est ¡gma del d r . VaFbr Eso

X X X II

LIS TA D E LÁMINAS EN CO LO R

Láminas en color 22-8____________

Láminas en color 23-2__________________

Plasmodium

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia y Ehrlichia

Láminas en colar 22-9____________ Ba besiosi s/leishma n iasis/tri panosomi

Láminas en color A-1___________________ Identificación de garrapatas

Láminas en eolor 22-10___________ láminas en color A-2________ __________

Filarías

Identificación de garrapatas y otros artrópodos

Laminas en color 2 2 -n ___________ Parásitos cisillares

Láminas en color A-3 Identificación de otros artrópodos

Láminas en color 23-1_____________ Inclusión

v ira l

B Est ¡gma del d r . VaFbr Eso

wm

CAPITULO

Introducción a la microbiología Parte I: El papel del laboratorio de microbiología eo el diagnóstico de las enfermedades infecciosas: guía para la práctica y el tratamiento Introducción Lincamientos de! libro El mundo de tas enfermedades

infecciosas

La tríada de las enfermedades infecciosas El agenle infeccioso

Clasesdeager-leainf-eccioscts fcileraccioresenfirehuéspedesyaaen&s Infecciosos FurciiS«delossaniesiríeociosos enlanslurcie/a Virulencia El ambiente El huésped infectado

Defensahuraa! innata{nocelular) DefensaoeXJlarinn^a Tipodeinflantóñ Defensaüesuteif ¡nmunitariaad^ptetiva Defensanocelularituminiiariaadaptáis (humcal)

Signosysíntoma: clínicasdeinfección Electosincfcr^caoedelosagentes ¡iteodosasensereshumanes

Fases del ciclo diagnóstico Fase preanaiítica ft&otecoünctelamuesna Transportedefemuestra ñeceptíúncte lamuestray observadores preliminares Criteriosm # recíiaK ds las muestras ftelacíúncoEtci-efcaciaenlalase preanaiítica Fase analítica

E)^n microscópico ProcesamientodeUsmuesljas interprelacióci delasaltivas Procedimientosparalaidemificacón preliminardelasbacteriasarladas Identificacióndé-microorgarranos diferentesdelasbacterias jM fc p m a

Reiacióooostfrditfciaen¡afaseanaSfeca Fase posanalftrca

iiflormedeiosresuíados ttaaedán con los epideriíDlagos

Anáfisisdeiosresultados Conservación(telasmuestras yeíblosregistros

B Est igma del dr. VaFbr Eso

2

CAPÍTULO

i

Ir t r a d u e t ló f l

a la

m ie r D liD lo g ia :

Parte I

Aspectos administrativos del laboratorio de microbiología Regulación estatal G estión de riesgos Seguridad del laboratorio

Nonras y neg^imsntaciones generales de seguridad PrBcauciooes habituales de seguridad Agentes biológicos

f nvio (te rruéárfó y dé agentes diotógras P e lig ro s no b l o l ^ c w

B íoierrorism o

Aseguramiento de la calidad Control de calidad CiMiiponentes de un programa de co rroí dé calidad C o r ír a l de los a p a r a o s del la b o ra to rio

Control de las medios de cultivo, reactivas e insumas

PrecatEBnes mversales

In fr o d u c c ió n

Líniaitii«ji^i der libio

H ay casi lanías form as de observar el m undo de las en fer­ medades infecciosas com o cantidad de agentes que la * p ro vo ­ can. En. este lib ro n m centrarem os en la d e la c ió n e id e n tific a ­ c ió n de los agentes infecciosos en el la b o ra to rio c lín ic o * segui­ d o de ln detetm irtaeión. de La sensibilidad n tes aiteihió|icú& cuando corresponda. D esde el punto de vísta conceptual, el lib ro se d iv id e eri tres secciones. Los primeros, dos capítulos cubren lo» p rin cip io s generales de las enferm edades in fe c c io ­ sas y el la b o ra to rio diagnó stico . E n la segunda sección* se pre­ sentan las técnicas inm uno-lógicas y m o l t c i t t e que tienen aplicación casi universal. Por ú ltim o , la tercera y m is am plia sección es un « te n s o an álisis de tas grupos de g e n te s in fe c ­ ciosos y las enfermedades que generan. E n un ca p ítu lo separa­ do ■{
El mundo de las enfermedades inleccjosas D urante lo m ayor parle de la existencia de la hum anidad, las eníermedades infecciosas han sido la causa predom inante de enferm edad y de m uerte, que no sd lo han restring ido el bienes­ ta r de las personas sin o que. además, han cercenado la prospe­ rida d social. Recién en e l sig lo XX las m ejoras en las c o n d ic io ­ nes de vida* la sanidad y las intervenciones m édicas lograron que las suciedades desarrolladas em ergieran de la devastación provocada po r las enferm edades infecciosas. [^Lm eatablem ente, los beneficiarios de estos progresos se concentraron en los países más rico s. E l desafío paro la com unidad, m undia l es hacct e stcn sn tTs estos Ingrns a tod o el género humano, Hacia la década de 1^50, los avances de ¡9 m edicina m o der­ na y de la salud pú blica parecían tan im presionantes que m uchos cie n tífico s prominente?' se vie ro n im pulsados a prede­ c ir el co n tro l de las enfermedades infecciosas y la erradicación de plagas, co m o causas de m iseria en toda la T ierra. W illin m H , Stewart„ un ciru ja n o general dé los Estados U nidos, a firm ó en 196'.*: “ Es tie m p o de c o n c lu ir el capítulo de las enfermedades infecciosas1*. Es lam entable que m uchos hom bres subios sub­ estim aran la capacidad de adaptación de lus diversas y num e­ rosas form as de vicia t|ue com parten el planeta con nosotros,

tanto agentes infeccio sos c o m o deiHedadores; p o r e je m p lo , los artrópodos. Tam poco p u d ie ro n vislu m b ra r las consecuencias, negativas inesperadas de los p rin cip a le s avances m édicos que pro lo n g a n la vid a, a veces con e le c tro devastadores sobre tas m ecanism os de defensa del huésped, Lejos estuvieron tam bién de apreciar lo s efectos de la incursió n hum ana en e l m edioam b ie nte o las consecuencias de los dcs-pTuzamientos i [restrictos de plantas y anim ales, in c lu id o s tas seres hum anos, alrededor del m undo, C o m o resultado* la lis ta de nuevas enfermedades infecciosas o de enfermedades reactivadas que han resultadouna plaga para k hum anidad a p a rtir de aquellas predicciones erróneas es larga y sigue creciendo. E n e l cuadr» 1-1 se p re ­ senta tina enum eración parcial.

la tríada (fe fas enfomwdatícs infecciosss Para entender las enferm edades infecciosas el estudiante debe e o n s id tra r las interacciones entre lav tres partes qu e in te r­ vierten: 1. E l huésped in fe c ta d o * Este huésped sera casi siem pre un ser hum ano, en nuestra perspectiva an trop ncen lrica . Los ve te ri­ narios se ocuparán de lo s huéspedes anim ales, m ientras que utt botánico se ocupará de las plantas. El huésped infectado puedo, incluso , ser un agente infeccioso. 2. t í o agente in fe ccio so . Ésta designación es la descripción más am plia para diversas form as de vid a que inleraclüan írtlim am enre con oirás, 3. El a m b ie n te . E l am biente natural, inanim ado y anim ado*es esencial para el m a nten im ie nto de la m ayoría de lo s agente-» infcecicpsos y para su Gramslliisión de un huésped a otro. Una entretenida y m uy educativa visió n de estas relaciones que m erece la pena leer ha sid o presentada p o r E. W, Konem a n ^ e n E í iH tv eXtreimt cíe/ m um xLüpiéf: tas fw c lc ritix 1 [f t'.T rtiíj j f i k is fo n th donde el autor hace un relato fa n tástica sobre una asam blea de bacterias íjue se reunieron para exponer sus quejas respecto del “ g iro ” que los seres hum anos im p u sie ro n a sus relaciones y pone ópatas arrib a” nuestra v is ió n Ira d icio n u l del m undo. Cedrie M im s , el d is tin g u id o m ic ro b ió lo g o briíántccv. preparó un relato más tra d icio n a l, lam bién m u y interesante* sobre la

B Est igma del d r . VaFbr Eso

La trigdn do las enfermedades infocdosus 3

CllS Uno 1 - 1

E n f e r m e d a d e s i n f e c c i o s a s r t r i r a n t a n M i d i j i $ p a i á g e n n s id c n lif tc f ld o f d e s d e la l ‘c o n q u L s la d r lias t t t f e n M d a d e s tn le e riM n s**'* AG EN TE

AÑO 1977

EN FER M ED A D ES

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1997

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Enferm edad arsfdraldrin.: rticaiinpwnfcíalitjs

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N uívu paríanle de- lu gri pe aviar tu -seres ta r ta ñ o *

2001

M f tip n m n w in B humano

En ierra edwl Tf'fi.M'.nona

2009

C n ro ra iiiiu

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1 í.4«TJht ríwii’riVrtVii.nc'.i de J o s tp h flfri-Kirií.

d ilu c id a c ió n de las co m plejas miCTCcnexiónes entre los s í ie i humanos y los. agente* infecciosos. Esta obra ha sid o a c lu a lim ú a p o r üus c o k gas y « un excelente m odo tic e x p lo ra r el fas­ cinante lem a de la patogenia. ^ El agente Irrfo celoso CIASES DE AGENTES INFECCIOSOS L o *a g c n le s intccekisos pueden d iv id irs e en un núm ero f in i­ to de típt,w. La m a yo ría de e llo * v i ven ert fo filla c o n tie ­ nen lo d o 3o ncccsario para el m a nten im ie nto de su especie y son conocidos com«> m ic ro b io s . Los agentes infecciosos, tra ­ d icio n a le s son las bacterias., los hongos, los parásitos y los viru s. f . Las b a c te ria s com prenden e l m ayor núm ero de especies patógenas para los seres h u m a ro s. Son o n a n is m o s u n ic e lu ­ lares y co ntien en D N A y K K A , pe to no esiáa diferenciadas en núcleo y citoplasm a; se reproducen p o r fisió n binaria. E xisten unas pocas ram illas de bacterias que carecen de ¿dgUaius estructuras necesarias para 9a ncpticociún y dehert mtcruclDOT con la célula del huésped para reproducirse. las más sobresalientes son M r t K í t f c m í , A m p ia s rn a ta c ta e y Chfamydiaceae. 2 . Lus hOBROS 4»« agentes unicelulares o m u ltic e lu la re s que presentan un núcleo y un cito p la sm a d e finid os. Las levadu­

ras son hongos unicelulares que se reproducen por fisión binaria. Los m ohos u hongos fila m en to so s son organismos multicelulares más complejos que ve reproducen en lumia vea Liada y asexuada. Algunos hongos tienen fases levaduriíbnne filamentosa, y se denominan hongos dismúrücua. 3. Los pnrúsitng son un gnipo grande y complejo de microbios. Entre ellos se incluyen ¡os animales unicelulares,, como los prolOTOOü. y los organismos multicelulares muy complejos <|uc tienen ó ran o s y te jid a bien definidos, corno el tracto gaairuinlestinLd y Ioü sistemas genitales. Algiuioa de cato* parásitos son, en efecto, pequeños animales. Otros, por lo general Jos protozoos, carecen de fas catnicru m i necesarias, para mui reproducción Independiente y deben obtener del huésped las sustancias que necesitan. 4, Los virus comprenden un gran número de agentes infeccio­ sos que, hablando estrictamente» no son microbios porque carecen del equipamiento genético completo para su propia propagación. Salvo taras excepciones contienen D N A o K N A , pero no ambos. Por lo tanto, deben infectar otra forma de v iila , cortaa seres hum anos, a ním ales, jilüiata.% bagiieijaK, c incluso, otros virus. Representan la forma más simple de un ájente infeccioso. IjOs microbios se reproducen por m u l t i ­ plicación i después de la división de su material gentílico se dividen en dos formas nuevas idénticas. Por el contrario, los viius se reproducen por rcplicución, bucen copras de .sus áci­

B Est igma del d r . VaFbr Eso

4

CAPÍTULO 1 InlTOduccióna la microbiología: Parle I do> nucleicos., lue^i t Uc )i“ tu u l los ru c a o s gcnom as se em paquetan en la m ia in d iv id u a l d e n lro de los lim ite s de la célula infectada.

Además etc los agentes infecciosos. tradicionafes, miemhros niiis evolucionados tlel reino animal. eiirtio los inseclos, pueden Considerarse una fonuu de pará^itus si su existencia chlí rela­ cionad, u cu forma íntima co» un inicüpcd. En el otro txiicnni, los. priones complül ámente no convencionales, no contienen ácidos nucleico* y, por consiguiente, n« pueden replicarse de acuerdo con lus leyc* eMii Mecidas de la naturaleza, No obstan­ te, su estructura proteica anormal deriva en un proceso similar a una infección con un ciclo de replicador!, INTERACCIONES ENTRE HUÉSPEDES Y AGENTES INFECCIOSOS Si un ágeme in fe ccio so v m i liuéhped coexisten y nin gun o de ellus se beneficia u se perjudica, el piOcesa *e denomina e»-

m e n s n lis m o y « i agente. com en sn l.

Si el ajenie infeccioso obtiene un h í nélLCio de su liLH.“sj>¿ril« pero tus k euuwi dufinHel Líbente infeccioso se denomina sapró* filo, Si el agente infeccioso y el liiiés|)od obtienen un beneficio ti el encuclillo, el proceso se denomina simbiosis u m utim lisiou. Por otro lady, si el huésped es dañado por el agente infec­ cioso con beneficio de este último el proceso se denomina parasitism o y el agente infecciono, parásito (un uso PineraI de la palabra más allá tic h d a s * de b>s age nies ¡¡iíoccuimis conocidos locho parásitos). Todos 1ljs tipos de ayenLes infec­ ciosos pueden ser purás-atos. C uando |
tcn en fo rm a e* trácelo la r y pueden crecer i a v ilro en ausencia de células, ü » m ic ro b io s intífleclulare s facultativos, pueden tre c e f iu v i tro en jo s cn c ia Je télalas:; in v iv o crecen en fu rn ia im ra e e lu b r o e x tra c d u la r, pero a m enudo tienen m u: rtla C iún especial con los m aenífagos, Los agentes Infecciosos niiraeelulares estrictos eafteen de aiisunas estm eturas iice e va rijs par^l una v i Lia e.M ra e e lu la i, p e r e c í ro q u icjv n una cé lu la luiésped que les, s u m in iiirc lu.s ele riien uis requeridos. Rs,ias relaciones se resurgen en el cuadro 1-2.

FUNCIÓN DE LOS AGENTÍS INFECCIOSOS EN LA NATURALEZA A unque lus v f d i mns de los e f e c t o s nocivos de los agentes infecciosos, tengan ima ■.isi6 n diferente, fsK w no tienen |a fu n ­ ció n de hacer penosa la vida de Eos ?.eres humanos. I jis t>:icierias son carnívoras y un com ponente eseneiul en fu degnul¿ien')n de los tejidos m uertos. Adem ás, desempeñan un papel p rin c i­ pal en m u c h js rcaeeiesnes quím icas en la iM lu m le w > han sido utilizadas para larcíts U n desagradables com o l¡i de^eontam m ac Í£ ji de loft tlemuTLes lóiieos». P
VIRULENCIA tai v in d ín c ia es la suma de las earíieten'siieis que le dan n\ n^eme inTecciONo una semeja en la bnuillú co n in i su.s h tiís iic des elegidos (o víctim as). es un fenOuienu de tud o u lu d a i existen grados m uy variables de \ iru lcn cia , 1.a m a vo ria de los análisis -.obre la viru le n c ia se centran en los táetm es íu ic m b ia nen, pero, en tea I i dad, lo más im p ona nte es el balance enhe los ires m iem bros de la iriad-üt. El o rg anism o m á i v iiu lu n io no L a u sa ii enferm edad si iio tiene an-’ecso a un huésped \nluerghle dehido a un¡i de c^ias diw m zoo e>:

Los agentes infecciosos también establecen numerosos tipos de relaciones con ¡.u* huespedes a nivel celular, I osmicrobios «le vida lihre (algunas bacterias. ios ¡ionios, j, los pañis itos) exU-

Cuadro 1-2

1, El cfrgEJui^inocsi’ te c n u u compartimento ambiental dit'erenle del hue.sjücd |hhlei]LÍid. Después de que se iJitcrrUOLpid eí ciclo del virus de la llchn? am arilla en lo s mosquitos urba­ nos, la Transmisión de la entenneí.¡iid tleluvo hasta que los

Kflücium» entre los apenia Ififrrdusnw j sus buL^iH-ilesa nivel emular

RKIVÍtON Indqiencl encía

ItUüKflllhu^ fii lliiJljni',

ACKNTKS INKKC.I'«IÍMIS

EjKMIrt.OS

[ j mnynrin.il; Iim hueleníx, Iiiiiigí>í ■■ ; .juásidis

S fítphi flKlHTH-l.

Ci.'fiiw b:,'icn.i-.. mil'oékicI itt_i ^, tísrflLhs hcin^v'

Irg itm e tln , HnicriSii \ f tffrík ítliJ rú/Ul O íbéfc'lilüiíl.

¿ i «Vj’-sjl1c/4jl i Lir. í"'iirjii!r, iVj. ,t .'■hvv-■'■di, p ülXKDUOi. hd IJI inil.sl’.

KO/lfl lS^1iL-1Mi i1"fí>.i r!silrit’fiu Iht ritticln

CMn;‘.s hwte-ins. hiniJCis y omU>n>.sv: ^irus

/.flri/rtfüi, A ntiplttum i; Ttnrrjiíttiftarj yondii: v¡ri^ tnfhinuw

B Est igma del d r . VaFbr Eso

La tríada de las. enteím adades i nfecclosas 5 sei** humanos ingresaron en un, c ic lo de l í e t e am arilla, hasta emoncex desconocido,con especíenle mosquitos que vivían e n la sel va. 2. Todos los huespedes disponibles han dcsorrolliidn una in m u n id a d protectora. Por e je m p lo , m u cha * infeccio nes vira le s que generan in m u n id a d pro tectora, co m o la del viru s ile l saram pión, se '’eon sumen” luego de que ludas ks. personas susceptibles h-üii ■‘¡Uti infectadas. S ó lo «Icspuís de que crezca una nueva generación ¡Je in d iv id u o s no In fe c ta ­ dos, y p o r Jo tan [o vulnerables* puede o c u rrir una nueva epidem ia.

humanos, puetlen infectarse en forma letal, pero otros huéspe­ des vertebrados pueden no enfermarse o hacerlo sflo de mane­ ra leve. La virulencia puede ser el resultado de factores que. v ir tualmeale operan en cualquier etapa del proceso infeccioso-. Si se piensa en términos más amplios. la virulencia debe incluir características más allá de las que propician el desa­ rrollo de la enfermedad t i l un huésped infecudo. En el cua­ dro 1 -3 s£ resumen algunos ejemplos, Los lectores que deseen información más detallada pueden encontrar referencias exce­ lentes

Por t i co n tra rio , un organism o que no causa enferm edad o que lo Iwee sólo en fo rm a leve en persona!? m m unocom peienics (c s e n c jilm c u if de baja viru le n c ia ) puede p ro vo ca r ¡una enferm edad devastadora en alg uien cuyo sistema in m u n ita río esté co m p ro m e tid o . Se podría argum entar que los agentes infecciosos lit is e x ito ­ sos u n í Iuüi que tienen la.s m ejores eiinitcgia.s de s u p e n iv e tie ia . que in c lu ye n una viru le n c ia m ín im a o aúpenle. Sobre todo para los paltSgcruw m irjccIuU iTt'-i esrriem s, un ágeme que [ l e ^ i i t p rápidam ente a su huésped p ro nto quedará e x clu id o . C ito » ejemplo, &e ha establecido Uria ]iij>.i-ic-.j-, jieerea d i que el virus de E p stcn i-B a rr está diseñado para perm anecer en los lin ío c i* tos de m em oria y ha de sarro llado estrategias para re d u cir los efectos negativos sobre su huésped.ILS in em bargo, un org anism o puede ser virulento pata su huésped hum ano, pero so b re v ivir porque tiene tusa rela ció n perm isiva to n oíros huespedes. En otras palabras. los. seres

El ambiente

C ita d lo 1 4

F a c í a i s d e v i r u l e n t a «¡kM ^ im naiIn s

C A T E C O ltU S ap eiv iv ciid j

Ii I íspcrln) de huéspedes de algunos agentes infecciosos se limita a los seres humanos. El mantenimiento de estos oT^anismu* requiere el acceso a un nuevo i)u¿S|KtJ vulnerable y la capa­ cidad de sobrevivir dunmlc la transferencia. Por lo lauto, los fletóles ambientales son relativamente de poca importancia. No obstante» la mayoría de los agentes infecciosos tienen una fase -en la eual viven librea en el medioamfrienle, infectan huespedes no humanos o pasan a través de un vector, casi siem­ pre ar» artrujxido, eOffC vatios huespedes vi?nelv*nlvs. A lm ilas de estas interacciones pueden ser extremadamente complejas, con múltiples transferencias a través de diferentes fases del ambiente; por ejemplo, los numerosos estadios de desarrollo de un parásito en una serie de huéspedes animales, EL ambiente es el vínculo entre el agente infeccioso y el huésped final. La transferencia a un nuevo huésped requiere

F A C T O R D E V IR U L E N C IA cb

ti n jeJluaun bielde

RepLieüCióii

u w m IuIji

en a in d u i i!e vida Li!■j ~

E JE M P L O Esp ceics A t L t ' t i t i t i r ü i i

R csjo^nc la □ la clMcracuin

\1rut de Ijl viru cb

Fonti-v-í. rañvvle^ que r « « l t n tunear un hur^pcd sensible

f ’crcjtrifl de

Aj£$8iit.iún j¡ un '(--l Li -i q jc |ju£i)£ LlansitiiUr l.i ¡r/c c ciú n

li t d ¡ £ I f i ¡ a n c L t U M i crt la> ^aíJuputui

[.iM -i de «• 11", i1 |iiil¡ni( ii1i 'i ai£¡ciirf‘i inJlimatüi^df.

| cniMKkliüas

Des/lnjeiLkki I r IrjLdtnb

Pi L'l-i j

Dc'Jnjpcttwi de leiiidni

1 n .i .i -n de 11 - v n s t i i suui^uü

pnr A s p r r f

D a a ru cciñ i d t linfocitos

V in tt ite Ij inm unm lefcieiírt

man:!

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Lkíll'U > CJfStoLl UÜf^BiOD E f -.ira¡gil da R o r r r í i a i v r a m i

¡n ii Lnilusa i de T r y ffü t

L ocalizad nn iMTíirríul-ir es? TnaenSfiFns

M s f í i b a c t e ñ w f t m b r ir ir f - w t

CiinFiflBínieiiiuín un utiu ir i r e nuble

L-- i.-.i! i j -.ii. i.i.-i . iniruiídutir en

V inu w k d a - ^ t l c r

kes!i«n cf& ¡i km antihiíViees

R k i s T^k ¡

TtLLfL‘iícTCnLÍLiillriinUtniiJrjn c tic u /

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de r u r u d t t jm f f í m m ¡ fip n jg flire«

Viitilis: iua ,.li!ljkt b r i i c f i

m k .njv

ilio s espúnaicsi . Ilts

l!>f¡t S-1": *rI^

K íH iiH ieia a los fifwlQrcj R cmwihicíj § Iíií, í-pcnlc ■ aaiLinfeccwM*’. Be*i>.tendí • ]ns. í^ientcs íiurtmnití';

P tim d e m w x

y anls^plipfís

P n c c c i y t'ijnTwldebfdu hfn «¡k ,Míjiiyií.i j, metk:¡1]fin IslnK d f h inmiuTindrñi'imrta hums-na; íib*mrg,ntovinii

B Est igma del dr.V aFbrE so

6 CAPÍTULO 1 ¡introduce i ¿n a la microbiología: Partí I

C uadro 1 -4

V ía s d i tra n s m is ió n y p M r ta s é e « m rw la « am ane * r if lo s agentes in fecciosos

FU EN TE D EL A G E M E

M E C A N IS M O DE ENTRAD.V

PUESTA DE ENTELADA

Ser hu.iuncM iir^tuJij

E IK .V Il'L O

RespinM jiu

Mi-j-. ¡ni íluejLftj

Ser huniuni:» ¡ti Ic^ntlii

f ' ,ri .-l'ií.í ,tiTrrh ,

í ‘yl;infj|

V in n (3rl lirrp fr íim iilc en lem ]pc6acíw'c>.

S»7 hwmuno in k ttw ln

SelacuPivs KííUalfs

flíniEii:

S íiilh ; g iw im rs

lSc i

S ccrK h)n« n r jk i -n íii&infannjeíii tu c ij el dju

O oiLu

Cnnjur.livitls fiLirleriand -n varal

Sei tiunuiio tnrr^imki

TFirnsfuaiiío ile pnduslciE (te tu Mn^w

TünVIKDlDI

\lru n iif te Itepüiicih

Ambienie enmtaini nilnt

Alimentos i^ig u ii

{TaUrncnles.li rut

V jtójejids enLéntDü h!Klenanos

hiamuiiíp LnífccuJi.! o paciímc

y v tn k i

.'Sirb kfire enníajiiiníiJií

-NcnihlKii'ns- km s de .lirc

Rcspir irsna

FníírmedfcJ de h*t legw nw k^

Aiiiinu* ttíc tííik i

Vil irütfdU! ;:s í k Jilllinutcs

Cuidiie.i

Fbbt*

■Tiuroaríil.i i' Cn LiiJu

Pk jtju hLtir y-ii: 'JIM;:-,

Cifláneji

Enl^Tiiied. 1 üu L ."ir

P;iv ier/c-

.Anpirjcion 4í la SUía cndflgínu

R í’ Pir.i m j

N ciunonij b v tc rlu a

[' lu lene:

D ^ÉdiirueiíÍB cjf lü flursl Lraleílifflfli u b n > ^ dtf ü;l pared

G,i-iC'.>iiT:e>iLii,it

PeriLoíiitiühícteriafiii

OJ'du

CJCiLi ■jciclS.j . Ii4l Cci:'ijj'ij

inr<srm¡il ifafiLuis 1'.i., ic i:El'

Süj{i JLILHI de Las (la-lcnu.^ iIo J l* L hhjkjTjirlill!i± -pílIn m idirt i suvés J f ks crru-iifu J í Euíiaqnsiri

una puerta de entrjd;i. En el cuadro I -4 se resumen Jas vías de transmisión y las puertas tic cnlrada más, comunes. Un. d w m i \ni i-i se definen alguno*, de los términos, u tiliza d o s paja ümviihir enfermedades infecciosasen la población. Elhutspsd ifilcciado l ’na vi'-/ que l u in d iv id u o lia sido ¡mfcciadOn ,se p m d tic en diversa:* respuestas en d huésped, L .¡ rcspueMu puede w i I w a li/a iL i cu el s itio de b in fe c c ió n
Recuadra 1-1

c a te g o ría s de las aM erm ed atiea ¡n rtc e io ia »

K ijferiiii-djd, tr’ü.iiMjibijlilL: aTteejúa 40c na itiJLi'iiiití pottJí jidqiLÍDi Js

UDU fucitic cjttffn::,. .I ním a insaiinnda Enferm edad c o n l^ lM A : ofcceina 41» punte vsx irw in ilid ? t k mi ye . j «leu

JniW-dí5rt btn>f(ika¡ ¡iiímlí^h qu¿ « pfr«hj« enmd cvntccixrKta * I» ín irtV ftid íd w&lfcai U l r m n h d ÍJiFetritrns*:

pnrm i b ío iU fnicnm qn< í?

"«tHit-a o twiltipltca Infnxbiío !m «hiH píttiilíiílí; InleiUfím Ljiue *£ Jitjiiitfe ea sin eiacru ik ■■■■'! 'MÍ [ B Í t c d é n o p o r f m b t i ' ¡a fe re i^ n « n v n p w r k iiic isijii L u i k f c n u i c«riii|Wunn’ üJjL’, í isaj^ida pnr m Agcnup d e hiys. í i m lc u n a q w m p m e « ,-irL i

infevcitMi fti una p tr ín n « n a I h l H í U l tu b d ín ta : mfcorióti que jirotkcÉ: r « |W íH i ¡rHviuniruia p ; »

ik» 'teonjji díni(™ Htnml»jr*i llasreda wiiA-iirtn adflfomJiiía1

el

a lte ra ció n a n o rm a l de los te jid o s n órganos causada por ei daño □ la d e s lm ccin n d el le jid o . La tn Jlam aeió ii lic n e rom pnncntcs rinm iinilarios y no Inmunitariov tin c¡idaca<¡n, I¡i d efensa puede ser cetuLir o no cduLir (luiinoraJ) li! s u fijo "*tiis" se utiliza, p a la in d ic a r in fla m a c ió n ; Lüandu se lo asocia con tm sitiu ana rrimico» describe un pmeeso de enfermedad. Por ejemplo, la

□pendido s es un proceso inflamatorio qtte afecta el apéndice, mi-eniros que la hepatitis es |a in fa m a c ió n del kígadn y la e n d o eauUlK «s la ÍJlLliuniid^n -ilel eiah iuard¡í i fcl rev^.m tinlciHO *lv las ciinajíib d d c o razó n ).

Lu inmunidad innata 3 lu inmunidad adaplulivj son les das brazos principales de Sa respuesta íírmmriilaíus,lw:T-*Lii! La res­ puesta iiiiKiui es* la mas prim iiha de ambas. Propoiemnn una iespues(a mmeditUa contra ln.\ n iiu o b itit invasores. sin tener cu cuenta m carácter inmuni Latió. L ü í receptores que hacen contacto entre et invasor y Ja célula defensora son compuestos denominados, leei ¡lias. L]ue ><* eueueniran amplíame me distri­ buidos en la natumleza. La respuesta innata está limitada |>w la Talla de un sistema de amplificación de d e fe iM i especlflcas. En su lu.car. las defensa^ in líalas envían sendes qne ac|ivan el secundo brazo- Ik inmunidad a d a ptati1. u. Para utilizar una analogía militar1. la respuesta mmiinitaria innata es con»* para ti le con una patrulla de frontera con poca. dolad ón de armamento»» i|u c e n v ía -henales a Iih¡ rangos superiores del e je rc ito re g u lar cuando d e le c ta que un in vaso r ha c m ia d o los lím ites nacionales,

La respuesta in m u n ita ria a d a p la liv a es i n m u ito ló c ¡cántense esp ecífica. Responde a co m po nentes que delecta c o m o ni> p ro ­ pios o "cxlrarltis" m e d ían le lu m u ltip lic a c ió n del n ú m en * de defensores t tm arm as csp ceíficw i d irig id a s contra on determ i nado cnendgo, Es decir, se ¡ufopni para c o m b a tir c u n tía llccli a m en a za rnttj d e fin id a , en \ e / de reaccio n ar en fo rm a u n iv e r­ sal a todas la-» am enazas, U n a \c¿ t¡tie -e activó , la respuesta iilm u n ila ria u d a p la tiva sirve c o jiu j m isión de ciH tuol p ara el resta de la cam p a ñ a hasta la v ic to ria . 3a derrota u. o ca sio n al­ m ente, un em pale.

B Estigma del dr.V aFbrE so

La tríada da las unfeím edados Infooeicsaa 7 DEFENSA HUMORAL INNATA (NO CELULAH) La defensa m is básica en esw categoría es el m uco hllc revisie tuda* las superficies mucosas (p e j„ el m uco gástrico o la sustancia tensioaetiva fsu iín cta n te ] que reviste Ja m em brana p u lm o n a r) y los liq u id o * que barren los potenciales patógenos hacia afuera i p. ej , el flu jo del líq u id o b ilia r, las lagrima?, y la orin a)- A dem ás, cie rtos com puesto» a iu ib a n cn a n o s , com o la liso zim a , pueden ayudar a d is m in u irle e l núm ero de bacterias. P o r ú ltim o . algunas defensas "p rim itiv a s ” o hhp ic ín jn u n ila ría 5 ‘ L desempeñan nn papel im portante en la defensa del huésped. Estos com puestos se denom inan en fo rm a general reactantes de fase aguda.'* líl p rim e ro que se iite m ilic ó . en 1930, fue la pro teína C recidiva, que reaccionaba eoji el p o lis a c irid o del neu­ m o co co C. La vía alternativa del sistema del com plem ento es una defensa tem prana contra algunas infecciones bacterianas unlC-s de que se desarrollen los antkucipaü específicos, Finaliticiiií, las defensas celulares innatas producen diversos imníU' [adores inflamatorios entre los que se encuentran los tjuimioatractantes para otras células, inflamatorias. F-sltii compueslos son et medio por el cual una célula se comunica con otra y se denominan d to d ru u (a veces mencionadas, comoquimiocinas o liníocmos).11 La primera dtiseina que se descubrió (¡nterleucniii I o IL '])„ el principal mediador responsable para la res­ puesta febril, es si nteti/ada por los nionoeitos y los macrófa| 0 5 . 1 Como se describe más adelante, las atocinas también eumplcn una fundón preponderante en la respuesta inmunOaria fld a p ta iiv j, DEFENSA CELULAR INNATA Las células primarias no inmunitariac son los macrófago* fijados a ios tejidos (histioellos), sus contrapartes circulantes ímonocilosi y los nculrúfilos polimorfonuclear?*. Los macrofagos dé lejido son las defensas primaria* contra algunos ajeoíes infeccioso' invasores. Por ejemplo, los macrófago* alveola­ res suii muy eluclivos pura dusediar Ips bactcriui inva.vorasi mientras ljuc los organismos que pueden sobrevivir en los macróíagos tp. cj., micobaeterias o especies de L rg iú tic ila ) tie­ nen «na ventaja compelí ti va, Los macrúfagos ti sol ares del hígado, el by/.n y Icis ganglitis fnnnan el sistema relicuUwildotdial: son críticos para la diroi tuición de panículas circulantes, como tas agentes infeccioso;* de la xingie. Los pacientes a quienes se les ha eliminado el bazo o cuyo hígado <*siá dañado tienen un mayor riesgo tic contraer iníeceiunes bacterianas scri as. Unta segunda defensa celular es un sistema efcelor constitui­ do por las células- tja íu fíd k ifle r (N K ). Este si Mema es activo principalmente conLra los imenxirpunismus. Por último. pero no menos importante, las barreras físicas de la piel. el aparato respiratorio, el tubo digestivo y el aparato genitourinario llenen un importante papel en la resistencia a las infecciones. Las terribles consecuencias de los procesas infoc* ciosos en Jas tiendas por quemaduras son el testimonio de la eficacia de la piel. La barrera física de! aparato respiratorio se complementa con la acción de los cilios ubicados en su super­ ficie que eliminan de él los materiales extraños. Esta defensa en furnia conjunta tur» el revest[miento no celular se denomina “escalador mueocílíar".

TIPOS DE INFLAMACIÓIP Inflamación aguda supurativa (o purulenta). Urw infección aguda supurativa evoca una respuesta en la cual se forma pus. El pu

es un m aterial líq u id o que contiene gran núm ero de células in fla m a to ria s y que tiene una densidad que escede 1.013. La células com batientes in icía le s y dom inantes son los n e utró filos p o lim u rfu n u c le a re s *1 Luego, los m aerófagos ingresan en el ¿rea para ayudar en la lim p ie z a de lo s desechos y los fib ro ­ blastos pueden activarse en el proceso de cica triza ció n |fib ro sis o te jid o cica triza l). E l té rm in o c e lu litis se u tiliz a a m enudo para d e s c rib ir la a fe cta ció n del te (ido co n e ctivo subcutáneo la x o en el cu al se dispersa el exudado p u ru le n to entre las capas d e l te jid o in v o ­ lu c ra d o , N c e rv s U hace re fe re n cia a la m u erte c e lu la r o u lu d is o lu c ió n d e l te jid o , la c u a l puede ser ocasionada p o r la a c ció n de e n z in m d e stru ctiva s o p o r la re s tric c ió n de nutfie n íe s en ese s itio , d e b id o casi siem pre al blo q u e o del flu jo sanguíneo. Absceso es el té rm in o que se u tiliz a cu and o los n c u tró filo s segm entados se u b ica n en un área no d e lim ita d a de in fla m a c ió n supuran iva, c o n la resulta nte d e stru c ció n del te jid o , La in lla tn a d ó n purulenta es un m arcador de las infecciones causadas p o r las bacterias y algunos hongos, aunque ciertos viru s y parásitos tam bién pueden provocar utsa respuesta in fla * m a la ria supurativa o aguda. S in em bargo, los- abscesos son casi exclusivam ente causados p o r bacterias y algunas levaduras. La respuesta in rm in ila ria hum oral suele ser im p o rta n te en las infecciones supurativa*. tnffanuctón gtattuiamsldsí. L a in fe cció n granulom atosa es un iu b típ o d e in fe cció n cró nica en la cu a l se form an granulom a*. U n g ra n u lo m a puede d e fin irs e com o la cuneen! ración focal de ntacrófagos o lu s tilíc ito s grandes activados que tie n e n una capacidad aum entada de fagocitosis y d ig e stió n de partículas e\trañas. Estas cé lulas tam bién se denom inan "c p ilc lio id c s ” porque en ocasiones se alin ean de m anera que se asem ejan u las células e p ite lia le s escamosas. Los maenófagos suelen agre­ garse para fo rm a r células gigantes m u ltin u clca d a s. O tros co m ­ ponentes ce lu la re s d e l g ra n u lo m a son lo s linfOCilOs y los fib r o b la s ta , Ln activa c ió n de los rnacíó Fagos se produce ptar m e d io de los pto d u cio s de los I infoc i ios In m u n o ló g ie a m e n ic específicos. C iertos granulom as contienen un. lip o pariieuhtr de necrosis, la n e m is is caseosa, en la cu a l el te jid o tiene una consistencia s im ila r al queso, (Cabe destacar cuán a m enudo los patólogos lian u tiliza d o las analogías con los alim entos para describir los pitxjesoü dé liih enfermedades l. L a presencia de células s?i y antes m u ltinuclcadas y la necrosis caseosa son curoeterísiicas de la tuberculosis,, peno tam bién pueden verse en osras infeccionen, sobre todo en lias provocadas por hongos d is m ó iilc a s , Si él gra­ nulom a es -sólido y las células están intactas, se lo deseóte co jno no neerosan Le o no caseoso. Los granulom as se encuentran en las infecciones p o r lUÍCObacterias j hongos y en algunas infecciones bacterianas y para* sjtariüS. H| cam élalo m m im itiirm de Ion ¡ffu n u ln m is es h in m u ­ nidad m ediada p o r células. inftamaciáa iinínhistiociticz A lg u n a s infecciones,. en especial las causadas por iir u s r desencadenan una respuesta in fla m a to ria com puesta por lin fo c tto s y m aerófagos. lisia n involuenadjui la 1respuestas in m u n ita ria s hum oral y celular. Inflamación utópica. Las reacciones alérgicas e s titi m eiliEatis p iir un gru po d ife re n te de células: ios eosináííios* los ba sófilos s Uh mascttciLos (h a só lilo s lija d o s a los tejidos.I, E l alcrpcno e s ti­ m úlam e puede ser quím ico,, co m o la hierba y el polen, que afectan a las personas alérgicas durante los diferentes periodos e sta cio n a le s/3 C iertos p a lé e n o s , sobre Unto l.ss parásitos, desencadenan unu respue.sta in fla m a to ria m ediada p«r los co*.¡rjó filo s.

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

8

CAPITULO 1 Introduce i áa a la microbiologra; P alé i

DEFENSA CELULAFt

MUNITORIA ADAFTATWA

L a “ estación cé n it u F d í las defensas ¡nm uniU iiias es el finfo c llo , del cual c w s tra dos clases principales. L o s ¡M o c ito s Ü y las cé lulas plasm áticas son responsables de pro d u c ir anoCuerpos in rn u n o ló g i camenl e específicos y com ponen el sh ie ■iia Jnmundano humoral. Sin embargo, el “intimidado^' (Icl sistema ¡m»unitario esc! linfocito T, que conforma la inmunidad celular. Los linfócilos T se dividen en I ) línfocitos h e tp e r (fe n o tip o C D 4 ), nespoiisaMe-¡ de la memoria ¡¡nmunitaria y de la secreción de las croci­ nas que modulan la respuesta inmunilaria, y 2) los ]infinitos supre&orcs i fenotipo C D S j, que m ii cilotóxicus y responsables de la clitnjnación del material celular extraño (p, cj.„ las cclu¡as infectadas por virus). Los Imfocilos s u p r io r e s a veces se los menciona en forma alarmante como ■•línfocitos T asesi­ nos.” A su ver,, los I i refocilo* C IM se dividen ere células de tipo 1 (Th I ) y de tipo 2 (T i2 ) de acuerdo con las ciioeinas que secretan-

DEFENSA NO CELULAR 1KMUNETARIA ADMTMIM (HUMORAL)

Eslas defensas hum-urales son conducidas V producidas p o r cé lulas m m u n ila ria s especificas. E l so fislie a d o sistema de c o m u n ica ció n qué co ordin a la activida d de lodas las defensas, del huésped se co m po ne de sustancias qu ím ica s producidas por los ¡[refocilos denom inadas e itn c in a s .: ' Las cito cin a s tam ­ bién actúan co m o efectores m oleculares de los. li ilib a to s c ito tó x ico s . O tra defensa hum oral im p orta nte es el sistem a del co m ple­ m e nto, que consiste en una cascada de enzimas que da co m o resultado un g ru p o de com puestos (C 7 -C 8 -C 9 ] co nocido en fo rm a co n ju n ta cent™ c o m p le jo de ataque.117,116 Estos co m ­ puestos son m o léculas electoras críticas en ¡a defensa co n tia cie rtos patógenos, co m o los m cninjjocnccis. E l siste mu del co m ple m en to fu n cio n a en fo rm a s im ila r al si cierna de la coa­ gulación. L o s com ponentes in term e diario s del sistema, ere par­ tic u la r C3a y C 5a. son extrem adam ente im portantes co m o quim ioatrociantes, es d e cirh recluían las diversas celólas ¡aflam a* lo ria s hacia el s itio de. Ka infección, El sistema del com plem ento tiene dos ramas que c o n v e le n en C 3 ; más a llá de ese punto, la vía es la m ism a. L a rania clá> sica es in m u n o ló g ica m cn tc especifica; lo s com pl ejos, de am ígenos y sus correspondientes anticuerpos desencadenan su activación. La rama alternativa (antes co n o cid a co m o sistem a de ía pfoperdina) y el sistema de u n ió n a las ¡cetinas, m is recientem ente reconoejdo, no son i nm unalógicam ente especí­ fic o s y form an partéete la respuesta inm unitaj-ia innata. E n ocasiones, la respuesta in m u n ila ria se puede desviar D urante el desarro llo n o rm a l el sistem a in m u s ita rlo reconoce los constituyentes del huésped c u n o ‘ "pro p io s", fenóm eno de nom inad o to le ra n c ia .n E l problem a surge cuando los c o m ­ ponentes no rm ale s d e l le jid o se consideran p o r e rro r l ‘extrañess" o “ tío p m p in s ” y son atacados. La fie bre reum ática es el e je m p lo clá sico de un daño no in te n cio n a l, que ocurre cuando la respuesta in m u n ila ria confun de la m io sin a de las fibras d e l m úsculo cardíaco con la proteína M de S tr e p tv a w v x pyvRe* n e x , que es m u y s im ila r** Además» a m enudo hay un "d a ñ o c o la te ra l" cuando el te jid o norm o! se daña o in c lu s o se destru­ ye durante el proceso de e lim in a c ió n de! ágeme invaso r o d e l ¡tumor. Esta respuesta anóm ala se conoce co m o a u to in m u n b dad,46 L o s defectos en el sistem a in m u n ita ria Inn ato tam bién pueden ciiusur enferm edades serías y respuestas in fla m a to ria s anóm alas.’ 7

El sistema ¡mmtreitarm es el resídunlo del contm l de kw agen­ tes, infeccioso', y la vigilancia de los cambios n e o p ü s ic w de lab células. No podem os-sobrevivir sin él y mus encontram os líenle a un gran riesgo cuando está com prom etido, ya sea por defectos naturales o por producios quím icos, lis io s ú ltim o s pueden p ro ­ venir del ambiente o pueden adm inistrarse en form a terapéutica, dado que son necesarias para la atención médica. El ejem plo cla­ sico es el huésped receptor de un órgano trasplantado. Para evi­ ta r que e| cuerpo rechace el órgano extraño,. el sisiemn inm undario debe suprim irse, al menos en fo rm a tem poraria. Durante este proceso. las «tefensa'H contra los m icrobio s i avtLsorts y U s células inmorales se cncuetilran coiupromciidus. a veces «m cwisecucneias im previsibles.111 L a co m p le jid a d del sistema in m u n ita rio es m u y adm irable, Su co m p lic a ció n es asom brosa y aún no se com prende p o r com pleto. El le c io r interesado p e d e re fedr^e a varias re v isio ­ nes excelentes sobre este terna.1' 1:7^ - ^ SIGNOS Y StMTOMAS CLÍMtCOS DE INFECCIÓN Los signos y síntom as de in fe cc ió n pueden ser generales o síslém icos o bien, focales o localizados en un órgano o un sis­ tem a determ inado. Los. primeros m édicos griegos y rom anos reconocían cuatro signos principales de la in fla m a ció n :

1. Dolor 2. Calor 3 . Rubor (enrojecimiento!

4. Tumor (tumefacción) Los mecanismos subyacentes que predisponen a eslos signos no se han dilucidado aun por cúmplelo. El mecanismo llsiopatológieo inicial es la di Litación de los vasos sanguíneos causa­ da por una compleja cascada de aminas vasoaclivas y olios mediadores []u ím ic o ü L a liherición local de mediadores quí­ micos da como resultado 15 aumenlo del flujo sanguíneo con congestión capilar y venosa (calor y rubor* y 2.1 aumenlo de la permeabilidad de los vasos que lleva a la extravasación de los líquidos, la sangre y las proteínas hacíalos espacios extracelulares (dolor y tumor), Los ncutiólilos segmentados son atraídos p o r las sustancias, quimiotácticas hacia el tfreade irritación y se escapan a través de la vasculutura permeable hacia los espacios estirácela! u«s {formacion de pus). signes jf síntomas generalas o sistím ie ot tía infttctófí. En la fase agw la de Ia in fe c ció n , t i paciente puede preseniar fie bre (a m entido aba j en píeos), e scalo fríos, ru h o m a e ió n ívasodilatació n i y pu lso rip id o . Los pacientes con infecciones subagudas o crónicos pueden padecer stnlom as m ínim os o vagos, co m o lie b re lese interm ite nte , perdida de peso o fa tig a y cansancio. Las reacciones tóxicas a lo s producios bacierlanos pueden p ro ­ d u c ir eccemas o reacciones hcm orrágicas en la pie l o bien diversos signos y síntom as neurom useulares. ca rdiorre spira torios o gasiroíniüesTinales, que son los prim eros indicadores de una in fe cció n subyacente. Las radiografías muestran infí lirados pulmonares, engrosa' miento fibroso del revestimiento de la^ cavidades, presencia de gas y tumefacción de los tejidos, blandos, masas radiopacas o acumulación de líquido dentro de las cavidades o los órganos. Los parám etros de labünjsorio que sugieren in fe cció n en io s pacientes eon síntom as m ín im os o incipien tes son elevación de I» velocidad de sedimcniACión g lo b u la r (e rilro std im e n ca ció n K leu cocitosis o m o nocitosis en sangre p e rifé ric a y alteraciones en las proteínas plasmáticas. O tros indicadores pueden ser la elevación de Jas f g lo b u lin a s; la presencia de ciertas proteínas

B Est igma del d r . VaFbr Eso

La triada de las enferm era Jes infecciosas B

reactivas, como la prcteíni C reactiva, o la pniductirtui de amicuerpos tipo-específicos. Signos fosales tíe infección Los signos principales de inflama­ c ió n son un j . m anifestació n inequívoca de ¡tirceciún I ík u J. Puede observarse e n ro je c im ie n to local¡¡/.aJo, calor y tu m e fa c ­ ció n o una m asa tum orosa si se presentan en tas superficies esternas, o-se detectan en, las radiografías con otras técnicas no invasivas (e c o g ra fía . m m o í;rafm co m p u terizad a, resonancia

magnética, etc.). Si las terminaciones nerviosas estén Irritadas o estiradas por la masa que se es pande o por sustancias qu (m i­ cas irritantes, se puede sentir dolor en el área inmediata u en otros sitios a través de las vt'ai eferentes complementarias í conocido pomo dolor “‘referido" J, U n s e n o eorx t f c i í f i n i B s y los exudados purulento* son también indicadores de un prtK’e>o inílamatorio o infeccioso localizado, Cualquiera de ettot. signos y síntunius señala]] ¿I médico la necesidad de obtener material para examen microscópico directo y cultivo. hn el capítulo 2 se detallan los stgnos y los síntomas especí­ ficos de infección qiic se manifiestan en diversos aparatos íres­ piratorio, g&siromieslinal. urinario, genital y oíros).

EF1CT0 S INDIRECTOS Ol EOS «E N T E S INFECCIOSOS EN SE RES H IW W ÍD S

L íis luchas que ios seres humano* laemos librado contra los agentes infecciosos han generado mucho* cambios en nuestra impronta genética. Iil desarrollo del sistema, mmunilurío ca el ejemplo más espectacular c importante, pero se pueden encon­ trar otros. El paludismo es una de las infecciones más preva­ len tes y devastadoras del mundo* aunque no es común en los Estado# Unidos. Es posible que la aparición de la hemoglobina S, que redunda en una infección meuos grave por Ftasmodium fa lc íp a r u m j* sea un cambio adaplativo, Lamentablemente, cuando desaparece la exposición a la íafeceión, las consecuen­ cias negativa* de esta hemoglobina, puestas de manifiesto como anemia drepariocíüca. son relevantes. De manera similar, la entrada de memzoítos de F. Wetü a Eos eriuocitu.s requiere el anl/gcno Duffy de grupo sanguíneo. A pesar de que es un antígcnO prevalente, el reconocim iento de este fenómeno biológi­ co p ro p o rcio n ó las herram ientas para Ja creación de vacunas que bloquean la em rad a de los parásitos causantes del paludis­ mo en ¡sus eílúlas diana.*'

CICLO DE DIAGNÓSTICO

El m M co interpreta k w in fo rm e s e ¡n s lríu yti

ei' irata memo apropiado

F ig u ra 1- t Pi ípTKkrico rtípic? > de lafr
B Est ¡gnna del d r . VaFbr Eso

10

C A P IT U L O 1

In lr D d u ttiD n a [-3 jn ic ra b ia lc g ia : Pan® (

Fases del cicla diagnóstica

Ks útil considerar lew carmenes de laboratorio como una secuencia de diverso; sucesos (fig. M ) Tr ydi dona! me me, Eos mkrobióh^os, al igual que olios bioquímicos. xe concentraron lis la* luctiiciLitiiiü científicas, La fase analítica. En la actual iJad, está claro que los sucesm que ocurren antes tic la medid™ i (use prcüjinlitica.) j luego de que b deteiminación científica se haya completado i fase pnstanalítica) son san importantes como la eMcmud de la medición, ES conlioj del funcionamiento a travos del! ciclo completo es parle de] aseguramiento de k cali­ dad pan el laboratorio,*1 como se analizará más. adelante en este capítulo, Fas* prandíllca RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA U n a vez que se sospecha una en ferm ed ad in fecciosa deben orden arse las pin ch as apropiadas, Los enfoques diagnósticos posibles son; e l c u ltiv o , la « .k iecd ó n s e m í t i c a de anlígenos t> anticuerpos. o la detección m o lecu lar de ácidos nucleicos. C o m o se a n a lu a rá en los cap ítulos 3 y 4, se utiliza cada vez con m a y o r fre c u e n c ia lu d e t e c c i ó n d i r e c t a d e lo s a t i i í g c n m y Ion ácidos n u cleicos en las muestras clín icas, c o m o tam b ié n ln ap licación de este enfoqu e para la ktentin eacióri de los, m k r o organism os disididos. En la m a y o ría de las ¡nsfituc jones y co m un idades, los patólogos, ios m i c r o b i ó l o g o s \ los a u x i l i e s de lab o rato rio c o la b o ra n con ios m éd ico s en la selección de las m u é y ras adecuadas p a o el cu ltivo y en I:l ele c c ió n de ios prue­ bas; apropiadas para lo g rar La m á x im a e fic ie n c ia de a i slam ien to y detección de los m icro organism os. Los adecuados reco lecció n y transporte de una m uestra al la b o rato rio p w a SU a n á lis i* en un paso c ritic o y principa! crt la con llrTm ición d e que d eterm in ad o m ic ro o rg an ism o es fespon* H iblc de un« c n frn n c d n d in r e c c io ^ .* 11 U n a m al w c o le c tiid n p u e d e im p e d ire l a U la m ¡e n lo d e lu sag en ie .sin feccio so s ¡ni portanlesL m is aún, puede co n d u cir a terapias incorrectos c

induM» perjudiciales en el eaw de que el iratamientu se dirija eOrttm un mÍLJixjrganis,mn comensal o contaminante- Por ejem­ plo» presuponer que K fe ito ivtía ¡m cuiH trntae, un reconocido agente causal de la neumonía, como sti nombre de especie lo indica, se aisló del espino de un pacienií con neumonía clíni­ ca. Se sabe que KtvhswUa [aftthjén coloni/a la nasofaringe. Si el esputo de esle eaM hipotético fue mal reco­ lectado y consisle principalmente en saliva, el aislamiento de K. pnetuntm iae podría no reflejar la verdadera Causa de tu neu­ monía, .sino simplemente la colonización de la naso-faringe. El iratamíemu podría ser inadecuado « sólo e(lca¿ ^.üt causalidad si lacspccte bacteriana que causa 3a neumonía tiene el mismo patrón de sensibilidad a los antibióticos que X. ptm um uñüe. Si el agente cantal hubiera siefo P x íu d m im a t acrugiuota* el ira* (amiento hubiese «ido equivocado. Esta simaeión teórica o c u ­ rrió realmente en Pensil van ia en l*J76. Los concurrentes a |a convención anual de la Legión Americana de Pcnsilvania se infectaron en el hotel de la con ven ción en Filadelíla, pero se enfermaron luego cuando regresaron a sus hogares,. Fueron tra­ tados con antibióticos ineficaces contra bacilos entéricos que colonizaban las; vías aireas alia*. El patógeno real. Í ^ j 'm e tía p tm tn itip h ü o . no '.e conocía en ese entonte* y, lamentablemen­ te. se uttllüo un enfoque terapéutico equivocado sobre la base de ios inconducentes resultados de laboratorio. 11

A eontim iaciem se enum eran los p rin c ip io s que hay que tener en enema para la recolección Je la m u lit a : í. El m aterial debe provenir det s itio real de la la fttc lá a y m ú le ú * terse scjf üft m ínim o áe eeotem imeióñ de fes tejidos, é¡vanos y sacradonas adyscanlaz. P or eje m pía. los hisopados de garganta para la búsqueda de estreptococo* deben to m a n e de ¡a fosa peritonsrlar y de la pared p o ste rio r de la faringe., evitando el c o n la d o del hisopo con otras ureas de la boca. IX’ he tam bién reducirse al m ín im o Sa co ntam inación del esputo o Je hw nitiestíiiS Lie la.v Vías iiérCüS bajas; Cíhi secreciones o io fu rín g c a v O lías situaciones en que una muestra recolectada en forana inadecua­ da puede c o n d u c irá un resultado erróneo son; a. N o cultivar la son» más profunda de una herida o el dre­ naje de una cavidad sin tocar la piel adyacente. b. Limpieza incorrecta del icjidn periurctral y penneal antes de recolectar una muestra de orina lIcI cbonro medio de la micción obtenida en condiciones adecuadas de higiene en una mujer. c. Contuminaciórt de una m uestra Je endom etrio con secre­ ciones vaginales,

ti No acceder a la pane profunda de un absceso con agujas o cánulas de aspiración.

S * H r t a n « Cto ¡n ia q c ié n

Figura 1-2 n¡j|ciiA(IÍLK» tic fiebre litni Je i (*•* CiiJ eÍSu V W'Fi.'tügÍÉ.

En general, los hisopados no constituyen un método adecua­ do de recolección de muestras en la mayoría de los casos: debe» ría alentarse la utilización de punciones y aspiración a iravés de agujas y catéteres. Los recipientes protectores para descartar los objetos cortopatizantcs deben f . « accesibles, y ser aptos para la eliminación tle Las agujus cual el fin de reducir el riesgo de accidentes, 2, Se tffíííT SítffWíffT tes m rnpos óptimos Se recolección de maes­ tras para proporcionar la mejor oportunidad de ncoperár tos tftkrüorganismos que son agentes cautiles. El eonw im ienio de la ev lución natural y de la fisiopatología de los procesos infecciosos es importante |Mra determinar el momento correcto de ia reco­ lección de mueslras. A pesar de que la fiebre lifoidea abora pico común eit los Esünlos Unidos, ln progresión del proceso infeccioso en esta enfennedad es un ejemplo ilustrativo de la importancia de reeoleet ar las roye sitas adecuadas en diferentes

B Est igma del dr.V aFbrE so

Fas&s dol cicla diagnóstico momentos {fig. I-2 ). La bacteria causal puede allana? en forma óptima en muestras de sangre durante k primera semana de e n f e r m e d a d . El cultivu Je Iteces o de Mina es cati siempre po­ sitivo durante la segunda y la lercera semanas, L is aglutininn.fi scrieu* camicntfln o aumentar lLilc;i3j:cr k segunda semana, alcanzan un pico u la quinta semana, y se pueden delectar du­ rante varias semanas después de la remisión clínica de La enfer­ medad, pero no se las sude utilizar cor ñ u » diagnostico# en tys laboratorios modera ns. No deban recolectarse muestras clínicas para cultivo duran­ te 24 horas, cu especial esputo u orina. porque el nesgode con­ taminación o íte soforecrecímienlo de las bacterias, corren*ales de cJ |■i■.!-.> crecimiento es mayor que ¡si m éqitui una muestra única y se envía al laboratorio. 3 La miiBslra ¿fsho obtenerse en una cantidad iufinante- para fa reaftiHiin de ios anitlsfs renteriúos. Se dehen establecer gufas para definiré] volumen de material requerido para los análisis.. En la mayoría de k s infecciones bacterianas activan se produ­ ce suncienic cantidad de pus o secreción purulenta de mudo que el volumen no deberla significar un problema. Sin embar­ go, muchas veces, un médico que no lo sabe puede enviar una mue&ira pequeña y descartar el resto del material,

En las formas crónicas o leves de infección, puede ser difícil obtener material suficiente* Ll envío al laboratorio de un hiso­ po seco o de una mueslra escasa de secreciones con la espe­ ra rla de poder aislar algún patógeno es a menudo un ejercicio inútil] y„ posiblemente, de un costo considerable para el pacien­ te, O Lo que es peor adrt. ve puede considerar de muñera incorreeta que k lesión ito estaba infectada basándose en un culti­ vo falso negativo. En forma frecuente se envía al Laboratorio una muestra de 0.5 m L o írtenos de un material rotulado COmú "esputo1' O “lavado bm nqulaT y se sol te iLa» pruebas de rutina, tinciones para bacterias ácido-alcohol resistentes y cultivo pura hongos. Eslas muestras puedeo no reprcscnlar las secreciones pul coci­ nares del sitio de la infección } et pequeño volumen puede resultar insuficiente para pcrmslir la realización de todos Jos procedimientos requeridos. Se pueden suministrar tubos que contienen medios de transporte como solución fisiológica (no nutritivo) o caído de fosfato, levadura y glucosa íP Y G i (nutrí lívo), El medien puede inocular d]rectamen1e cualquier cantidad de materia] que pueda recolectar, /W , la muestra ]mede dividirse en el laboratorio p a r a in o c u l a r l a en numerosos medios de aislamiento primario. En algunas instituciones, se proveen varios tubos cada uno de los cuales contiene los medios, de cul­ tivo Optimos para el aislamiento de mieobaClCrius, hongos v virus. Si las secreciones que se obtuvieron son mínimas, eS médico deberá elegir el lubo bajándose en las consideraciones clínicas. Cuando el [amallo de Ea muestra es demasiado pequeño i'jr j cumplir con Los requisitos en forma apropiada, es conveniente comunicarse con el médico para establecer las pnoridades de cultivo. K1 informe ilebe indicar que el material enviado para análisis ent escaso. 4, F j j j asegurarla recuperación óptima da las microorganismos se daban otiíizar dispositivos de rscoigcclon de maestras, re tipiantes y medios de cultiva apropiados. Se deben utilizar recipientes esté­ riles para k recolección de Ea mayoría de las muestras. Eis importante que estén diseñados para facilitar esa recolección, sobre todu ui el paciente debe turnar su propia muestra. Los frascos de hoc:i angosta no son útiles para muestras fie esputo o de onna. Los recipientes también deben tener tapas que cie­ rren en forma ajustada para evitar los derrames o la contami­ nación durante el transporte,

11

F ig u r a 1 -3 CVíenparuL-um ;Ll itlücütfQS tlr uiui iirtieu IíkhV i ¡iLltíCildá. tfhunilLíls pi'-r lupirectún i p u o e hisopada. L a ¿^pdración diijích l un su llivu purn í f StaphpiiíoQceiti co^guluíEi p t U ju t h III e i1 a f il« w o (o m b jfn « ai»l(5 en fti awESIra recfitectaJa cíhi el hi'-npn. p tm e>mhu m e /e lu k » e ü n (Uras-budcria^de y fli.trq rw iU m dnuH e. L i imlHptrctidtün eos el ispúm do Iw ¡ n c w J i^ ; l-s [fetm ninscicin d fl -íip nific.idn del h iIN v a del hi«np;n1n rx iw h S r n ú iie i. :»uii í h pnewnttu -ifc un patógeno p rtE tK Íal,

L o s h is o p o s se u t i l i z a n p u r a o b t e n e r d if e r e n t e s ti p u s d e m u e s t r a s p a n e u lt i v o í s in e m b a r g o , s u e le n s e r m e n o s c o n v e ­ n i e n t e ; q u e o ír o s m é t o d o s p a r a la r e c o le c c ió n d e m u e s t r a s , p o r | o 1 ¡m !o , e n la m e d is la d e l o p o s ib le ,

d e b e d e s a le n t a r s u n s o .

S i se lo s u t i l i z a , h a y q u e t o m a r c i e ñ a * p r e c a u c io n e * . L o s h is n p o t d e a lg o d ó n p u e d e n t e n e r ¿ e id o s g ra s o s te s id u a le s y e l a l g i n a ln d e c a lc io p u e d e t ih e r a r p n id u c t-n s t a i i c o s q u e in h i b e n e l c r e c i m i e n t o d e c ie r t a s b a c t e r ia s c o n r e q u e r i m i e n t o s n u t r ie io t i a le s c s p c e iid c s

ífastitiiotts).

H n g e n e r a l s o n p r e f e r i b l e s lo s h is o ­

p o s c o n p u n ía s d e p o l i é s t e r i l e D u c r o n * o t le R a y ó n . N o se d e lw p e r m i t i r q u e la s m u e s t r a s e s té n e n c o n t a c t o c u n e l íiis o p o m a s t ie m p o q u e eL n e c e s a r io . A d e j t t ü i d e l a t o x i c i d a d , la c a p a e id a d d e lo s h k o p n s d e a b s o r b e r \ lu e g o l i b e r a r L j í m u e s t r a s v a n a c o n e l m a le ria E u t i l i i ^ d o e n s u f a l í k a c i ó n . L íW h is o |K is L le b e n e o lit c a r s e e n uri m e d io Lte íra n s p u c L e í t t í i l u n r e c i p i e n t e E iú iiic d o p o r a e v i t a r q u e la s b a c t e r ia s se s e q u e n y m u e r a n . S e h a d e m o s t r a d o u n b u e n a is l a n i i e n lo d e k

m a y o r ía

d e la s c s p c c ic s b a c t e r ia n a s e n e s to s tu b o s h a s ta h o ra s o m ás lu e g o d e la r e c o le c c ió n d e La m u e s t r a . L a u t il i n a c i ó n d e tu b o s q u e c o n d e n e n m e d io d e t r a n s p o n e « m i s ó t i d o d e S t u a r t o ile A t i n e s , c o n c a r b ó n o s in é l , L tu n b ié n s o n ¿ t ile s p a rtt m a n t e n e r lo s h is o p o s d e c u l t i v o J u ra n L e e l tr a n s p o r t e . E x i s t e n a lg u n a s e x c e p c io n e s a e s ta rv o r m a liv a L o ^ m u e s t r a s d « ra s p u d o de? p ie l o d e c o r te s d e u ñ a s p a ra e l a is la m ie n t o d e h o n d o s d e m m t o t 'ít f c o s d e b e n e n v ia r s e s e e n s e n u n r e c i p i e n t e l i m p i o p an L e v i l a r e l s o b r e c r e c i m ié u to d e la s b a c t e r ia s . L o s h is o p a d o s d e g a r g a n t a j i j j . i a is la r u ie n t u d e S u c p t o c o c c im p y o g c n e i p u e d e n e n v iu r s c e n m e d io - d e tr a n s p o r te ,, p e r o e l a i s l a m i e n t o d e e s ta b a c t e r ia ■ ■resistente a k s e q u e d a d " m e j o r a s i s e e n v ía e l h is u p u s e c o p o r ­ q u e m u e r e n n tta s b a c t e r ia s q u e c o lo n i z a n La o r o f a r in g e . L a c a p a c id a d p a r a r e c o le c t a r c a s i c u a l q u i e r m u e s t r a c o n u n h is o p o es u n p r o b le m a a ú n m a y o r q u e la t o x i c i d a d y La r e t e n ­ c ió n d e m n l e r ia L M i e n t r a s u ri a s p ir a d o o u n a b i o p t i a g a r a n liz a n « n :i m u e s t r a q u e p u e d e g e n e r a r r e s u l t a d a in te r p r e ta b le s ^ p o s i* t i v o s o n e g a tiv o s , u n h is o p o p u e d e h a b e r s e u t i l i z a d o p a r a l o m a r u n a m u e s t r a d e un p r o c e s o i n t l a i n a t u r i o o d e l a l l o r a ttu e c o lo -

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

12

CAPÍTULO 1 Inlrüduttlún a la miCTQÍiiQlogia; Parle I

S is ie ir m « r t u n r iis c p o

F ig u r o 1-4 Sis&'sms <:o Inmsjkiflú il¿ hs^íjJkH EL .(■slCim tlUs MiH|' II' Lcclsl j lío LiiL '.I iil Ii lii'M¡v cit un luKi dr Lrarnp.nl? l|uü ptifitj«nc i.in jn e J i a "iiq nulrifiret |iaí^ ihaíifcúLr b humedad ijinhjdi. & íiwifM.'íiciáliJj mi n^iímaSiinjiaroíMi Jlh tn an tinten [lHv.i (ahijiik.fr ftilteisu ui«c>de kn htwfH^ puede uiiLiíüfu! pj.1 j cuEtitu y l-I stk »:ilíi •]isSO|Hk :i¡iíj iClJÍ/ut un írtiEÉv dirítüu.

n t/a . A v e te s , el verdadero patógeno puede estar escan d id o <m una nucíala íte b a d e ria s que se [lim aro n c¡ni un hisopo, p e n i es: cusí im pos i 1>I¿ t^car seguro. S e puede lle g a r d interp retar trlt ifl caso J l l u m itru ü i^ a n ia n iü que c¡> uil patógeno iSoeumenliKk)

critcrira m: cu m ­ plen rara vez. En la figura 1*3 se com p aran los resallados del v nuncu co tn n iz a a seres huuuuiDK, pu.rc i eso s

tu llid » itc un usp irw k) \ d e un h i^ ip o t ld r n w iid h¡[|<>.

Rs posible liaeer un. fro tis y un c u ltiv o a pa rtir Je un único hisopo si el portaobjetos se Ramea para esterilizarlo antes de que se prepare el extendido. S in embargo, mucho* laborato­ rios requieren -l[llc se envíen dfis hiMspLss, uní» pafj el frrtlií, y o tro para el cu ltivo ^ de modo que haya material adecuado para ambos, hn ese caso es im p ó rta m e proveer shlema*. de

CuacTra 1 - 5

transporte con dos hisnpíis ;il personal a u x ilia r para e v ita r que envíen un único h is o p e e n un p ed id a de exlertrtido y de cu ltivo (íig - 1*4}.

Un p articular; se desaconseju lu o b ten ció n de m u e s tr a con hisopos p a re c í a is la m ie n to d e b a íte r h s anaerobias; en c a m b io , para este fin ^e recom iendan E i aspiración con a^uja y je rin g a . Las m uesiras reeoleetadas deben siem pre protegerse de *tt exp osició n al o xig en o am b ien tal v e v ita r que se sequen hasta que puedan procesarse en el laboratorio . L o s sistem as de trans­ porte seleccionados para las muestras an a erobias se enu m eran en tíl e u id n 'j 1-5.

Se requiere educación e o n lin u a para im p e d ir la u iU ^ a c ió n erró n ea de los hisopos^ que eons! ilu y e un h á b ito m uy arraiga-

R i t i p i r n l » p u n í e l t n i n s p u r t i ' d e m u e s t r a s Jin u c ru b ísu i

F U N IU M JvNTO í j H E S t K IF C R JN

R E C IN E Y T E Jen n ^ a j a flija pura s^inrndnn

t JW ciihU uIík frescm » b s mifcrMri'. túlQ ilk* pueden Irjmptirfciwtf ;i] ]abcin,1nn« liten*» de í s p í J t r ctm eu iJj^ lo U'í burtHii-ii*. de l.i lífinpu <e in^rrluj ] j pumu, li; la i^puja f n «n Haj^ín e^líriJ CMe prnuciliiibífic-D l‘ i «ui ¡ J i ■ M.iki 7>j U m uesíra puínk; s í i UJtn>puix;idiiüL luinancoiiti sm ík iu u u . E sU p n l íi k s h e í lujod¡fcti»¡(W i d iJ n I j prntiíihilirtm! de m m im n ió n de Hl V por herida^ t r r t lii nprj>

Tühn fi triiiLii uíll[VhlLi

Tul>.is n friLSL'i^ nri[H illj n i * cu iU trn ei un rtinfiu sííú iu ílklsX ucu n iin ú sfe rj evn 5J-; ik C O ,L UU .ijrcnir ittJii-ftM y t i ácidit iikv « ■ Jjiu rin » [ w i d i r uau <%eñ^l vibiul de B tu n t+ íc s is . El tuJia w nli !i/.i priflfift.iSme-nrL1 para b infere ion tic m nifH iat « i hisopix.; |i k fra
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B Est igma del d r . VaFbr Eso

Fases del cicla diB goóstito 13-

tío. L a educación se puede r e í i l i j i r m ediante instrucciones de reco lecció n de m uestras im p u n id ad por la d irecció n de los sers icios dcE la b o rato rio . a lra i¿ s de b oletin es in fo rm a tiv o s o cumenLaricis en los m fo m lc ü d e muu.sUas que MI KliiI L ili iü d u en hisopos.

Kn el quirófano no existen motivos que justifiquen la obten­ ción de muestras con hisopos. -Se Jehe lle v a r n cabo una eampaóu paru eliminarlos del quirófano y evitar su re intruso. Un medio ú til para lograr este objetivo es b comunicación con los enférmelos del quirófano. Fu la Vcrmont University diseñamos un método propio para la recolección de muestra* en eE quiró­ fano, porque no están disponibles comcicialmcnte los recurso* adecuados. En el laboratorio se preparan frascos ampolla riles que contienen una rosca cu la parle superior cotí un dia­ fragma Je guirta. Liri el íbuJu del fraseo sC colína una eapj Je i gada de agar no nuiritivo paja mantener la humedad. Luego se |o coloca en un envase adecuado para ponerlo en el autoclave; de este modo, un asistente puede colocar el envase esníriE sobre la bandeja de instru m entació n en el q u iró fa n o . El ciru ja n o puede inyectar el m aterial 41 Iravés deII d ia fra g m a de gúrUCi u co lo car e l ic jiJ o d en tro del frasco am p o lla lue^u Je desennusear La tapa. E l te jid o se encuentra en un am biente lo suficiente* m ente anaero b io y. p o r lo tanto, e l sistem a es perfecto para el a islam ien to de m ic rw rjtü m s tn tw anaerobio* >■ra e u lia tiv o *. Sin la p ro tección del envolturio* el fraseu ampuEla sirve Como m ed io g en eral de transpone (fie . I -5).

í ’unlquieni que ‘¡ca el sistema de íranspnrlc utilizado. ln prin­ cipal tarea es reducir al mínimo la demora emre la recolección de la muestra, y su inoculación en el medio. Por eje 1apio, si se utilizan los hisopados nidales para el aislamiento de S íiigclhi de pacientes con disenteria bacilar, el material recolectado debe inoculare directamente sobre la superficie del medio de MacConkey o en un caldo partí enriquecímiento de gramnega­ tivos. La leí i Ei nación de un medio de mantenimiento o de trans­ pone puede poner en peligro cE aislamiento de cierlu.s cepas. Las secreciones uretrales o cervicales que se obtienen para el aislamiento de N e isie ría gemarrhoene también deben ser ino­ culadas en una superficie Je agar chocolate y en uno de los numerosos metí ¡os de cultivo selectivos. Ln su defecto, se puede utilizar un sislema de transporte comercial que incluye una tableta de lu generación de CO-, íD P B B L ' Jembcv' sysicm; EJD, J-Vankliri Lakes, NJ) para el aislamiento de jV. g tw o rrhfietw. Hn tirrma similar, las muestras de las vías aéreas aftas para el aislamiento de B tm íe íe lh pertuxsis deben inocularse sobre agar Rordet-Geugou. carbón Regan-Luwe^ recientemen­ te preparado, i.j un medio equivalente a la cabecera Jel paciente o en la clínica, a menos que ve utilice un medio de transpone adecuado (contó el medio Regan-Lmve). 5r Cuantía sea poslbfi, ésten o tM n m e (os cultivos antes ífe ia administración de las snfltióikns. Se recomienda la obtención de los cultivos útiles de jinrscribir los antibióticos, sobre tmk> pura el ásilamiento de Jos microorganismos que son muy sensibles a ellos, como los estreptococos [3-hemolíticos de bis muestras de hisopado de garganta, ,V. lirtrutrH uifutr de las muestra-s del apairato genitourinario o lia e ttitip fitlits ittfíu en ztit o A". m eninfiititiis Jel líquido cefalorraquídeo. La administración de antibióticos no impide siempre el aislamiento de los microorganismos de las muestras clínicas: en estas circunstancias. obtener una muestra puede ser mejor que no hacerlo, en lamo \ en cuanto los médicos entiendan que los resultados deben analizarse con cierto reparo. £, Fff muchas instjnctis., ad$más d i tos tuitivas se deben realizar frotls. bfh froús proporcionan Una información e\lrem.‘idamenle útil que complenvenia al cultivo. Fn ciertah situaciones el fro-

F lg u ra 1-5 .Si■ll- iu Je : i ^ j i e u t a t a a l í b i ü a o aniKTDbükni. 5c ciéira un írüsffi miifvílin eí-fl una wpu a iw íb quf cfínietK u-n<íiíif'níniailí gi'rn:L I ‘iu l ..|?i tic ugaf tn c l 11ni-Ji.h ülj] [ijsj.ujnifH.il L maruLerK Ui hiunedad;; un inJL« jA i# Jc lAidnniJ'JüLLi'jrt tt\ el ¿ca/ Lihlka v ¡«luEmciiCe tu (w igfM ciriiii ja tamtVsfpa- Kl trasen atupolla A ci-nri í-n.- mi ;i.¡u :ii' s á r je lo que itw> líj 3ji 3ii á era* LS d d Jijifragjiiji de £(.nm □ fraww arapolip n íim iicnc isn íru f menlo J r icjuío qur colocrt (ferina ¡JeL írafen -impi i| l i JpNtnpaJn n t E;i
tis es mucho más útil qoe el cultivo, como en el casn de¡ espu­ to expectorado. Los es tendidos permiieo la determinación de la tiaturaleíia inflamatoria de una muestra e indican si los rebultados de i cullivn tienen signiRcado clínico. Por ejemplo, la muestra de una herida que 110 contiene ncutróíilos polimorfnnuclcnrcs y da un cultivo positivo de fltiru bacteriana mista no puede considerarse vilida. Ls muy jstohable que los médi­ cos que confían en los resulta Jos de este cultivo se sientan decepciona Jos. Además, las tinciones de Gram indican la floru microbiana presente- t"n frotis que tiene mueboí; bacilos geamncgalivos. que no pueden crecer en un cultivo aerobio clínico indica que las condicionef, dei cultivo no eran las óptimus O que Los mienta organismos no eran viables. I^ts condicionen de cultivo subópttinas incluyen una atmósfera incortecta de incubación (a,ftacrotño5)o un medio incorrecto tonanismos con requerimientos nutrid anules, especia les como L L gkm eiia o BúfídeiútUi)* Los ínicrobios pueden no ser viables como consecuencia de una terapia am¡microbiana apropiada o de una respuesta inflamato1i a cfiCa¿. E-U-t, r e ^ l m i n ;n li u :¡ u n c ! i c .iU itu tc s h u b ic l i a n J i : v iibü >kj L '\ ie ^ u

que un laboratorio iüfllice sólo los análisis quo le han sido soli­ citados Más adelante se comentaran Ins mecanismos para intensificar el uso apropiado del laboratorio en la fase preanalllbca. 7, Ei recipiente de cultivo deba oslar miniado an torna a tíe cu id í Cada recipteme de cultivo debe tener una etiqueta legible, con la siguiente información mínima: Nombre del paciente Número de identificación del paciente Fuente de Ja muestra Médico Fecha y hora de la recolección

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C A P ÍT U L 0 1 Ifiiroducción 3 ¡s micrabie!agía: Parre I

Utilice el nombre completo del paciente yeviie las-inidales, Ei número de identificación debe .ser el número del hospital, del consultorio o de la clínica. l.i dirced™ de su casa o el número de 1 seguro social. segim las circunstancias. El numbre del medico o del contacto en el consultorio es necesario por si se requiere alguna consulta o adelantar orí informe. UI origen de las muestras debe anotara para que, si ¡n necesario. se seleccione un medio especial de cultivo. La fedia \ hura de la recolección deben aparecer en la etiqueta para determinar su procesamiento a ¡tempe*. Otra información útil es el diagnósti­ co clínico \ la historia de tratamiento con antibióticos del paciente.

Recuadro 1 -2

M e d io d e tra n s p o rte d e S tu a rt

O í s » ) Je CílTWfi dppHÍ1í)ij¡g f a r iW di-^dÍPí ñlífid e moimpoítiicD TksltwLrt» de sitáis) Ocruro de cald'ü, E% er. a|3á Owuim ik in^gncski, Í*S- en agua ,Sujü. litktiiaiia «KiSiditá sufidento pam pñ « U

02 s I25g

1É Ití# 1L

TRANSPORTE DE U MUESTRA

El objetivo principal del transpone de la m u^ifü para djagnfrílico, ya sea dentro dd hospital desde la clínica o su emío pur correo hacia un laboratorio de referencia, es mantenerla. dcrl(n> de lo posible, de la muñera m<í» parecida a su catado ori­ ginal. El C tin iciif and L itb tm ilo ry Slaridanis Instilutc (CLSIplrt ha creado di%ersas guias pura los fabricantes de los dispositivos para la recolección y d irsirünfKkrif de muestras Los. peligros para Tas |wí vinas que mani|hiliiti las muestras ní reducen si los dispositivos de recolección cierran en forma ajustada y se colo­ can dentro de recipientes de protección adecuados. Para nvn Tener la integridad de la muestra se deben evitar las condicio­ nes ambientales adversan como la euposicidn ai frío o al calor e* iremos. lus cambios rápidos de presión (durante el Lran-sportc aéreo} o d secado excesivo. Si se estima una demora pro» Jangada basta el procesamiento de la muestra (p, cj,. más de 4 días), es preferible congelarla a -7 0 °C, Para períodos cortos de alnucenamienio, un congelador con temperaturas de -2 0 °c puede ^er Ü1il para algunas mué^ras siempre que el aparbito no sea del tipo que no produce escarcha. Muchos vjrókigos creen que la» muestras para cultivo de virus (y los aislamientos viruI¡_->J Eí.iEj'jLi deben ulnuieEnjru u Jlíi C"V Las muestras de esputo que se recolectan principálmenle para el ai si amiento de micobacterias %hongos en recipientes de propileno o pfllictileno pueden enviarse sin ningún ycundiciuuarmemio posterior. N o se deben utilizar recipientes de vidrio para esitar nnuras durante d transporte. La mayoría de las muestras, líquidas deben ser transportadas al laboratorio lo antes posible. En un hospital, se recomienda un máximo de 2 hora* entre la r e c o l e c c i ó n y el envío d e la muéstía."40 Este lím ite de tiempo resulta un problema para las muestras que se loman en el consultorio medico. Si nn es ptisjhle su ir a n s ^ m rápido, se pueden utilizar recipientes con una pequeña cantidad de ácido bórico para el transporte de orina. De manera alternativa, las muestras de orina pueden refrigerarse hasta 24 horas untes de mi cultivo. Para la mayoría de las otas muestras se puede utilizar un medio de mantcnimiento o transpone, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los medio* de irani|torte empleados con mayor frecuencia son SLuart. Amíes y Carey-BUiir frecuadro 1-2), listos medios sun esencialmente soluciones amortiguadoras (bu íte m con hidratos de carbono, peptonas y oirns nutrientes, sm factores de enreimiemo, diseñados para mantener la viabi­ lidad de las bacterias durante su transpone pero sin permitir su multiplicación. Se les agrega lioglicolutodc sodio como reduc­ tor para mejorar d aislamiento de las bacterias anaerobia* y la pequeña cantidad de agar les proporciona una consistencia sejtn sólida que evita la oxigenación y el derrame durante el transporte, Para enviar a laboratorio^ dictantes muestras en las que se sospecha la presencia de niieobncterüas, se recomienda

una d ilu c ió n de borato de so dio c o m o conservante,'* Pura el aLslani tentó de cie rtos viru s, co m o lo s del herpes, un buen m edia b u ffe t de transporte es sacarosa-fosfato-glulaniato. En a lg u n o * ceñiros tam bidn se u tiliz a n con ¿ s ito lo s hisopos C u ltu rc lte * para ei transporte de m ueslras para aislamientos: v ira le s .107

RECEPCION DE LA MUESTRA ¥ OBSERVACIONES PRELIMINARES En la m ayoría de los Laboratorios clín ic o s se designa un área para la recepción de las m ocsiraií. U ís observaciones ¡metales y la m a n ip u la ció n deben realizarse en una cabina de seguridad b io ló g ica (\¿ase más adelante) debido al riesgo de que d pe r­ sonal pueda s u frir tina in fe cc ió n a d q u irid a en el la b o ra to rio a pan ir de muestras que co nticn cn patógenos. El personal debe vestirse con indum entaria de p ro te cció n adecuada, bata, guan­ tes de gom a y, en ciertos casos, máscaras de protección, Están precauciones se tom aban antas s é lo cor» las muestras» -que lie» vaban etiquetas de p e ligro . Sin em bargo, es im p o sib le d e te rm i­ nar sí v n paciente está infecta do con un «pente tra nsm isible o si una muestra contiene un patógeno m uy contagioso. Por lo tanto, es prudente tener un cuidado especial cuando se m a n i­ pulan tudas las muestras- (cuidados universales). E l procesam iento de las muestras in c lu y e : l j el registro de los datos fundam entales en un cuaderno o base de daios de o r­ denador, 2 ) el exam en visual y la evaluación de si se cum plen Indos lo s c rite rio s para aceptarla i véase la sección inm ediata ad eljiU e sobre los c rite rio s para el rechazo de una m uestra) y 3) para ciertas muestras, el esamen m icroscó pico de los m o n ­ tajes directos o las tin cion es de Im fro tis para establecer un d ia g n ó stico presuntivo. CRITERIOS PARA EL RECHAZO DE LAS MUESTRAS En todos los laboratorios se deben establecer los cnterios para el rechazo de las muestras que «o son adecuadas para el cultivo.11- A pesar de que existen normas generales y de que Lis agencias acreditadas hait establecido los estándares, cada di lec­ tor de laboratorio debe decidir los parámetros por utilizar, según las condiciones locales, Se deben verificar Itiv formula­ rios de pedido y las etiquetas de las muestras para corroborar que se incluya luda ¡a información fundamental y que ésta sea coherente. Ante un problema, la recolección de una nueva muestra es lo mis recomendable. 55 la muestra no puede lomarse nuevamente, se debe buscar a una persona responsable para adoptar las medidas pertinentes. Se debe incluir un comentario en el informe final en el cual se indique que la muestra fue recibida con nn problema tespecífico) y agrcguíel

B Est igma del dr.V aFbrE so

Fases del ciclo diagnóstico 1 S nombre te q u ien resolvió ese problema. Sí es posibiedeierminar el tipo Je muestra. puede aceptara que en ciertos casos ws incluya, en el infamic: “la m uñirá parece ser..!': de 1o contra­ rio, se la debe rechazar. Siempre que haya discrepancia. se Jebe bacer un informe escriio Je cóma se nnnejó la siiaaeiún y de lew nombres de las perdonas que se contactaron, en la parte Je atrás de la solicitud Jel estudio, en el cuaderno de regisiro o en la bii^iC de datos del oí Jenadisr. En el recuadro 1-3 se enumeran los lipos de muestras y los pedidos de cultivo» que deben aparecer en una lista de recha­ zos y [[ti e no deben procesarse. Cuando se rechaza una mucura. debe contactarse a la perso­ na que la envió y ponerla ni tanto sobre La situación. Se debe intentaren lo pasible no rccliaor las muestras difíciles de reco­ lector nuevamente, como el líquido cefalorraquídeo o tos lava­ jos. bronquiales. Si no se puede resolver un problema en forma expeditiva se deben realizar los cultivos paro evilur la pérdida de La integridad de lu muestro, La decisión sobre informar O no los rctuilLadoSi so puede tomar con posícriorkLuL Si correspon­ de, las eoEiJicbncs te la muestra se deben incluir en el infor­ me. Luego, el médico tendrá la responsabilidad sobre la inter­ pretación del informe a la luz de los datos disponibles.

Recuadnq 1-3 Tipos de muestras o solicitudes de cultivo que deben recbaTarse 1. Cualquier m i.v-ím recibida en formad. La üi nl j acv p eL d o pudr mu vtt Ij '

i¡i(ic«Crui LidriJes c*'n uii

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iu'rix¡xi ilc cXpti*
mcil i jnpniTh tí? I hfir.O l:"n estii* riiranslM CUif. í !

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cortado en iÍíh con una euLhiLh o «jera esnénl y ve turaurd una jnw N ra d? lu poreitíd más inlema Jteni su cultivo 2. Li-> íBpülúi IfeJLiULL[áii:ij dLujiilc 2 4 Jlíicj^. ILvdiíjLjl c n U r Ij lóíLLí-

iniiv«ri6n v ln^ nHim ns indñüuak^ ijuc nmltrnfn un4 ¿h;i iíoiwciiírri.-ión i r mirmcir^ruiiunrm 'ir Li» miiLat(nt« '¡nu it’ nk-s 1‘U tI"1- eoncntiBdES

Los criterios de rechazo Jehen enumerarse en forma clara en las directivas de los servicios del laboratorio. Se tebe instruirá! personal dei hospital sobre la importancia del envío de muestras aptas pira el cultivo. Además, se deben p u b lic a r los problem as reeurrenies y sus soluciones en los bolelines del laboratorio y en
1. I.th riiiiis. tü ^vniuitiní^ *L^I yyfllí> Lnkmv. Jel canal «u|iiwL u ik1 jit ú p u ij Ij JcLru'. ¡.1:1 de Aj'j’tv jrriu ^ o m t r r k i t t a e ]kw Lm^ i-'in J l Cji 1 1 1 4 . HinTpai3ri úpi^n e in i* Jn ppR miiltiples w licilodes, p w ejemplo] “aeTíhhnis, Mrun'oiíitH-M.,

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lu k n .u liííi'."

5. H emin en un reeipieme irsadeetado, r.m esMnl II i.‘hhie;i’ pniu^l-í. erk d euul Je lu inueitri se lu Jeminitiüó. Cu;Ü4“Jtíí ie4,'[|H¡eme con fillro^ioan tfue tcttjtJ ü» e M q de petLjJía biülúj»ÍLiu

Fase analllira SUMEN MICROSCÓPICO Se han enfaiizado las razones por las cuales se debe realizar el examen microscópico de los materiales clínicos.47

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7- Lu» nHcslrn.1 cpic c^un ^ tim e iM e i:i,H)t«nLlntidxx cunuj' La puiu: en L-rkltinju Jj pudenda Je niaicnulcb ^tnSo», como bario, culoranles umlrwjrttw « h b & ikíik 4iiim¡e«% olcoui S. ].it, «.ieuieiiiei lüiüLStrdK tur mm atvpuHIct pirx n ilti'i» Bnaeroh4n<; l.i'La^n ¡iL-jrieíi",- tinna del elKHTW medro. ^ íe íiiíiie » pmsiáiiLvt pur tCi'.i|..-4.LLL'nk Ll jJi:.Ltl cCrLÜ. Lleves íeXi'cplai. paru d UEsIjjoLniUh iIj c^|\zJ e

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1. LEI nú m ero y el porcentaje de neuEróíihtá scgntcnlados que eslán presentes indican la m ag m tu d y el tip o de respuesta in fla m a to ria . L a calid ad de la m uestra se puede validar. 2. La observación de bacterias, elem en to s m iceliales, form as de levaduras, estrucluras de parísiüvs r* iiielusiLonei v íra le * puede proporcionar in fo rm ac ió n su ficien te para la e la b o ra ­ c ió n Je un JiagnóstLCO presuntivo inmediato.

3. £1 eximen microscópico di redo puede también proporcionar evidencia inesunUYu Lnroedlsia de la presentía te bacterio* anaerobia^. Can esLas daLas en la manu, el médica puede tcimar ana decisión mas racional s o b r e el EralaniienEn antimi. crobiano Inicial.

C C IT tO

C. d iflic ilti C , p e ifrin g fn i, C, t t p t ifuar), tMM'ifíiJíj-i de ilpfKtrtmpi i» «loriom r*. inueslns (Je Íw iíife. nariz u ^ fü<- fíina'- ivorariii^eíis rexctpwt Ljs otraildj» \fc un lejiilu prufunio duranti; u¡n¿i Limara piel mperficial y Ltiltlv»» JeL LULibUzniL-

EE examen por microscopía de contraste te tase o de campo oscuro de material sin tinción Je muesuas húmedas es útil pura demostrar movilidad y la resislenLia Je e.^pi ruquetas y endoüpara*. Las tinciones te Ciernsa, de Wnght o naranja de acridina pueden ser de ayuda paja la observación de formas bacieri^-

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

16 CAPÍTULO 1 Inlrntfucdfin a la microbiología: Parte |

Ciia d rO 1 - &

K d o c ió n w s t t w tlií'n c ia w Ja í i « p i m n a l í l m i f c I r » p n i c h i »

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íw :' >■■ ’ -■■■, l — ■■ *ivi■ ■ piíjflS

A C C IÓ N

FU N D A M EN TO

C O M E N T A R IO S

Cultivo leleels1™ J l’ LCR. (mis kna-

Dj¡c» rtilduntcntaiiCú p&eitúiek irtiíHirHxrompctcnta, que fiemen valor-es m im a le i en las pruebas químicas y « i el KiMcejUú «le tí!a la s en el LCR

C ijp Ñ t m - s u r a e tffin m tu u puedr «aiwiT inrcecM * c r t o i » ’wn pilencueisi» tn ?l LCR

C i j Ielvl' td e eu tti de U ’1¡ ¡tura «!Í£übatM£ftaiHl

üaj!> líiüJtílfiiCTllM^íl pa^rSUts iiilíiiilHKVinpíEíriEe^ q ^ í In fecí salores iMOmudt» da la* jT u ek is ijiiEmicah y en el w ie n if i de g í ¡--j 1¿h tn ti LCR

&i Ijis puWwiwwi í w i b«iu riipsgy tfc tobcrcu tom el nfiwlínunibi puede icr •■úit *pei*n<

Cultivo « le c tiv o J t heces para feswleréuw* ci Jinülbi * pañi biBítos y fcifípitiK.^'^

Baje» renJmirentíi t r jsjeíenite-ü que (tais s r ie hrrsjúraljyackij. durante más
Ciílir.'Li híIüíeívü de iMpifódUñ; em lu ru fiifiilj^ uíapuuis, e.KficLtOISMifil’1*

líiereTWíiiu ért el aiilaitiienio J e fiera citrfandngeiitonljmlnarue si mí ^lise: s l. i u iátd e IfJ tílu liji eputf Líale* pavi me-reouí. por eamjH> de bajo- .ii n px-mo

L.™ ínvMCi^hJmne» iuui aplicad» i ir ít i i enhsmnk rkfciwrrtK

LKilirwión le Lectiva de caldas de cutísvo é ? apoya para. Ií k cuHivcib taeteriaam

C tiitdaJ cuciiuxiaM c -cnrcpCn para biopsias d e I c jid » y ciertos liquidos. com a ]Me:c mies m n desvíos de LC R o que ten w tw iid os a diülist» peritorwal e rtM ci

Los raidos de culli^o pueden uljli;arse en ctra i litJjd o D H s,i tuimiiMn cuando uíi rakrocireiiaiiMU pieseote en Trolji no k rccupecu en Las pbeui. B a t o inim.a deben ip lk 'iíT í íi mue^irifi de iupcrtieies raued^as

No vtiü'mr prvcNw de s.TvS?fcwü ■bacterial!» en L C R "1lcl

E k ik k >tcrK.ihiMiSM] y f“i[ircilwn4U(l que limilnn qi utlUdtd

Cullirvo selectivo de líquida pe rHn real

Pdtlnki J e iiilim lH iln íte r-a^if.cM i - y pcífUrs sk « h iü N ' li.Li.i preJevi^’ r1. -.’n jHKiffnftü enn jicritnrhU uniqilp» n^i (^iqdindü tn u comunictid)

C uHíw s indic«)u ^ ca i^niu niiis |viMum(pmmmiüa Im’K* rispa eijxiiirinc») y * r periamili* i^ n irú L i en el k^pila.1

Culiivo « le c tiv o de raues^n* sfe faringe

S lF t p t o c Q t f u ip y f ly t n t í f& el pnncipal Jípente eliol^ M d de la bringiti i; et ' cullLio de nUlTiai'1 cimj múltiples iB6d¡s.s( rfiiktkleieenitf íw íw rclin ít lu jírm iín íin l í k i

L oseu h rop arH Crxn >t t to e t í nin»t tíi/ji1ii t t to e . ¡ U r ia it f w jfiPíw/rAcíivr i n i r u j del t e r ¡» j wiuple deben solkitune ísp e a rk ín tfJin e sr M 4prtlpjjtiln. A T n u * r Í * u lr r w a t t h r /im iy !¡ tm lm n ¿ u ix n íuiinjfilrbf n ni Aus üMiyi'fi&i V liJoIcslitii Ie%, peni se idsLi él» Aieiiids .inUw jo r a .Sfavi^nrarnu p y tf $ e r e i

Culisva w Ilv Iiv» de hysicrisBi aiuie fufas*,

La» cvlLivooulq jrsiicpntrtru üsbcrí.m TGalii'Br%c en. forma > nlt'MI.ÍIII.-J Kj' ii Crt It t Idlis » l(t|UldLDf n^UItLCl.Ky'fWii

Su n . a lE ilb a riiiliilfm ck ar-irro h i^ 4H muestras de s Lik k ijue p u a k n e*iar ísunanjiaaslis, a m floni de la* BiUMna» u hw e*

Lim itar Li ir a .ucrecLa del eullmh

1j j RiunlTiut J e Jj.iiii ’e. nrinu j hci'idu* ic limitan i una eida H iawás. fe* m uesm í, de m linucaii a Un«. ü líe i iiilLivtn. (1 li n 2Q1tul. |-ts£ cultivo) ca J a 2 4 had jn

Se debe Mtjesic el c u lá w c a n una Iito jcq lib . tw> nj-r,í " de Jü a " 1 hiriH 11 irTijH.i rtqiiíh.ifei fia: j evaluar la p n i u n D U A l)

Limitar Ea fÉcaaeKia de e%ámenee de huevos y p u e r to »

El r e a Jjs ie a íü é p a lit ife 1 » is im e iic i de G la n lú a *m < i mi'mmo luepo Etc i m m iieílrw . Ii« rúales cfefceriri fecijIectarM.' en dti-s iLlenu»

P tf« M i«s p ifisiiK ’ ¡Hte.slli’a lcs protuitlfuienJc sen udecuadu1 r e a t a r mefins de tres f^ímeíw^

Luiticar t i fttfí wrteijj tte pwrtM'i Iraní C. d i$ K Í t r * '

K«Aniiirillcnio 1ufgc de üiis eiftüKAfei iw^ iiiviki cüitM Tr.fn im.j

U fflLw j ;li p n id u s de DMA poa3 viras del herpes himple m L c n |ft* lw

Rendiinieoici máiSütMS sL el feeuenlo-ífe célu-las < a LCR « rn m u l y na luy rvulencias de leskinei Incales pcw reaonuncisi r.i.i unei c j

Se d ncribirm u eid fpcione*. e ip « ü tlm íd tt en niños

Liniilar el tavfu de iDucjIra* dupU' ea:l:i< del ini muí « tib fn si lili-.lili.: d ii

Ullil'H^r |^s irnastltajt u aclccupinij la mjc|irf rrsursíi j . {lu u d i» « o lu EÍArjdpi de (jn u tiit ti tlempn d * tran«pnMí)

Si exinte cuuk|ilici imxilKluiühiE en lutptc »c ceCctc i la equivalencia de lac. m u m m , «Misuhar con d médicú anie^ i.IlJ prDííssuúeíiti.i: euajido sea duduso, p iu x o a rlu ík ¡nrr»sl;ií
Limitar lii rereltvsrto de- rmieslru* ■líe un iltki ru¡ eilrril J e iiCni J e un penrido detifliito

1 ir. Iiir laü ir.wMraK nenien :i la e^aluaCUM pfcViJ; Sr k tnut^un aijftiieíte ha ?n 1' L u x l I j J i en un medio y « prescruaii dikneíinas H ism sciate e a i la msaeütia cíi^iii J . coimilisir <•«» el médkg iRi’ rea de Us dccícneií futuras

Pf^iMnvai Lis al iiiÉni'nj p-.'t 24 tuina-., [MiÉsen'K tas plncai ¡ixK ulodasqijf s e * evaluadas de nuuien incofr^ileta iwr un periudu! dediaiáo fp e j.. 1 lífesJ

Me rattiv.gr pimíin de antfwrics imoaric* permanesiícíi'1"

R ech niw ta miwsmi p w * m li™

]nji)fniar ;|l m^tMen «jpie rfcbc rvRiiHmr J j íi Hiui

LCR —liy w d v íijú l¡ J f ra c,Tiitiei r ^Jnjl rr^i.'i c ' * i l r í Idf*l"

d r L,-^h1mlJ‘üt fl.F Kl^h'ri'Al-Uir1'1"

Id tst igma del d r. VaHor hso

Fases d&l ciclo diagnóstico

B ecuadro 1-4

S iste m a de c la s ific a c ió n d e B a rü c tt p a ra la e v a lu a c ió n da lá c a lid a d d e las m a e s tra s de e s p u to

S'iilrttít» ik ltfUOn»nins | mpI~c:;ilkijhi eEü haju ^ iiiiih ' ii I hi 1ID X) c tu 10-23

(¿rudo 0 vi +2 +1

IV^rna-a (Su imitLi V áib ™ rtc cíltilfts fpiU'lialrs pnr cump) fir hujíi m n in t« |ttl> 0 10-25 >25 Toral*

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‘ i m trrrr ti t t f [V'-Eldfcjí fjl¿trír*Jr( x ph-jJ rKjí 1%.i 4|V tilr r tie r ftir J f 2 $ 11 4ÍJ carr.-

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tías que s í riñen d é b ilm e n te o que tienen poco contraste con el m aterial de Sondo.

También se puede utilizar la Lmdón de Gram directa sobre los mulerialcs clínicos pana determinar si una muestra es icpresejitMiva del sirio de infección. Esta ríe-nica mí aplica pata la eraluación de las muestras de esputo. A partir del número de células epiteliales escamosas y de neutrií filos segmentados, de Las mueíiir;Ls de espillo tíflidas con íim m en forma di recia. Rütrict»5 disertó un t ie r n a ife graduación para evaluarlas {recuadro 1-4). Ln este sistema se le ajenan námerus vos a un lio lis en d que sí- uhscrvan células epiteliales esca­ mosas, 3o cual indica lu eonlatniitocián cotí secreción orofaringea (saliva). Cuando se observa ln presencia de neulrútlilos seg­ mentados se le asignan números positivos, que indicar, la pre­ sencia de inflamación activa. La magnitud de esta calificación rtcgaüvii y p ositiva depende de la can tid a d relativa de células

epiteliales y neutrófilos segmentados, como se observa en el esquema del sistema d i graduacion de Bariett, Un puntaje final de fl o menor indica la anuncia de respuesta inflamatoria o hi presencia de contaminación significativa con saliva y, por lo tanto. invalida ia muestra. En la lAmina en color 1-1 se obser­ van ínierofotogrcifías que ilustran este sistema de graduación en preparacio nes de espulo enn tinción de G ra m . Murray y Washington71 propusieron un sistema similar {recuadro 1-1), El número elevado de células epiteliales en los grupos ] a 4 de este sistema indica contaminación con secre­ ción w orofaríngew c invalida la muestra- Sólo las muestras de!

Recuidro 1-5 Sistema de clasificación de Murray y Washington para la evaluación de la calidad de lAS muestras de o&puto C tlitla s

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L ca co clta a

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17

grupo 5 se consideran clínicamente relevantes. Bn un estudio clínico. Van Eooy]l5 recomendó ijue las muestras de esputo que contuvieran más de 25 neutrófilos se accpten para el cultivo aun si tenían mas de 30 « M a s epiteliales (grupo 4}. Este criterirj sugerido de evaluación ha sid o valo rad o mediante su aplicación a muestras apareadas de secreciones respiratorias nhtentda^ pnr cxpccioracirin y p o r aspiración translraqueal. una t á n ic a que evita la contam m adón con la flora de la orotarinfic,* El sistema de graduación de los esputos no puede aplicarse si se sospechan infecciones pulmonares causadas pormicobacterias, la mayaría de Ins híingos, especies de Lpgioneíla y viras. Además, el signiñeadn de la presencia de neuirófito* polímoríonueleares se altera en algunas sil naciones: I) cuando el paciente está ncutropénic» a causa de una enfermedad o de un trcnamiéiUó, 2) «.-uundíf el paciente no presenta una fespuesta inflamatoria eficaz y j ) cuando un cuerpo extraño causa irrita­ ción de la superficie de h mucosa. La neumopenta puede ser el resultado de una deficiencia hereditaria o de que tas células inflamatorias o sus precursores se destruyen por un proceso de enfermedad o por la quimioterapia parj el tratamiento de una enfermedad. Ln ciertas condiciones* la capacidad de los ncutnfifilos de migrar hacia el -sitia de b infección esli disminuida. Es poco probable que el microbiólogo clínico pueda determi­ nar si un paciente está neulropénico a partir de la información ijue le proporcionan ios módicos. Una Je las excepciones t|ue aún no se comprende con claridad, es la movilización deffc¡en­ te de los «utrólilos observada en la infancia.í4 La edad exacta a la cual se puede instalar una respuesta de neutróftlos comple­ ta no esta bien definida, pero en el caso de niño& muy peque­ ños ('menores tk 2 meses) las decisiones de reclin ar una mues­ tra o de evaluar un aislamiento en forma incompleta no debe bajarse en la ausencia de rirtiudlilus en [a muestra, Las dos situaciones en las que un cuerpo exLranO mL»düica la iaiterprelaciñn acerca de los neutrón los son la presencia de un catdler endotnutueal en las vías aireas bajas o la de un catéter permanente, como un Catéter de Foley* en el tracto urinario inferior. En cada una de estas situaciones la aparición de neutrófilos en la m uestra puede r e fle ja r irritación eau_sada por el catéler en lugar de un agente infeccioso (a pesar de que ambos factores pueden c^tar ptesentes), Hn las vías aéreas, la iníbmAción piücde originarse tic una infección local (traqueítis) en vez Lie una neumonía, incluso si hay un elemento infeccioso. En el tracto urinario inferior, la presencia de leucocitos no puede uti­ lizarse como indicador de infección clínica importante si se ha colocado un cat-cler en d J u g a r , o inclusa, si se realizaron: cateterismos en forma intermitente.** La infección sintomálica es el ractof determinante para el tratamiento de una infección del tracto urinario en el paciente con cateterismo crónico (véase cap. 2). La presencia de ncutrófilo& en muestras respiraIn ri as no puede utilizarse comu ¡ndicadcicr de ncumuríu; este diji^nóslii^t '-j,- r^jdiyú t-rt fL'jriniL clím cii y o d in ^ r^ fie a ., c o m o kc anali/a en el capítulo 2 . Técnicasdv mitiUKopÍB, Se pueden utiltíar diversas técnicas en el examen tnicroscópico directo de la muestra clínica para demostrar la presencia de microorganismos o para observar cieñas característica* bioquímicas, fisiológicas o sítológicas, 1.4Ls técnicas más comunes en los laboratorios de inicmhjolo^fa clínica ye enumeran en el cuadro 1-7. Como el índice de refrac­ ción de las bacterias y de otros microorganismos e& similar al del medin de montaje* c^tns nn snn visibles cuando se Ins exa­ mina con lux brillante. En consecuencia, se puede necesitar cierta manipulación de la fuente de lu/. A menudo, es de j|ran ayuda reducir la cantidad de luz que ingresa en el campo a tra­ vés del cierre del iris d d diafragma, lo cual aumenta el eon-

B Est igma del dr.V aFbrE so

c a p I tu lo 1

1i

C uadro 1 -7

l ir t r o ju c d ó i a la in ic ro ljio iG g ia : P a n s i

T é cn ica s p o ro *1 a n á lis is d ire c to fie m u e stra s n o teñidas.

M É T O D ftS V M A T F k l \L H S

TÉCNICAS

p k t M H jS I lO

w n mjlucÉi'in fW iJóictfli Par-a íkierifisaaT la actividad M ím ic a 'Je k it nnoKicirJa n . vinos. tu lliu llKiviÜtlaki y Pea*'Civil es -.i cicflua CLomnjüc nxtk\ 0,8 5 '. Uluo-jh Pi
uiíijnx rv 11 rciicliViiJad wffl’lcl^iea clínica suenas

t'ülvtHihjeici*

í*p íir :? k iis . [ > i" últim o inclu ye ¡ii rviKVí^n t ) : hinthj.«Nr1 CapsLiIflt ilc Nrlldcl J lu x ia ¡MJ-a addti[Lfiftir

M c í d j puafin.1

vélsíI u u

iV a ip ir )

iJifírrfiW s l*p*V' i

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rirtif \iítiena'ph. íns itijltirriiur

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en el pi'i L.il'I"'j l ¡i-i-s

ProrcdlraieMlu d t la t a l* “ rurvi l’ n rL ti'bj0i n ;i.:23 ^ciCil j£riK\a feste e i

La ¡preparan. ¡>>n «te I» pcui uru^vu s m c puna el n u u n p pr* *|>»>.i!»> *)■}? U p rfjia rw a r>n con « ilu c ii n

S e cuftfcía

L(i¿ po.juCñd LlmIIhIjJ de IIK/lU ^iiíatijLi-í j.^ll-

n-ii j |ttJf J r r d í| rehunlí Jrl pre¡¡|n en b m pcTtlfit pnff íiM* (W [Ji'iart'jtros pnia £Qta ututia. Se coloc-an I a> l w -

en. í^cífHviiqurf em^re m enor d lstw M ita dcH da at peso del i latweolijeíüs y puede injírase lm de

Lerlta lie i’ Bii

( "1 . ■*í i|‘ ¡rltJSi

fiicn m ás piulando-dem tra de l.s giila. l i j a té tn ici. se

ruhnKihjel4K(r d rn trn de Lina peifucña gailii d r agua

Jwilunt'n o jíe w M i:/- Ij :::j .i jlilU - V a s tliilj

nüLi/a ¡k t lo

ctiin. r lk 4ó £ ílí. Sé ;m iírtc et runuoliicrin >■se pre>j<:Hi.i M^hie el tuhrflflb^siua. «uuiihki ta _hm¡i dd l,.i s¿i>,(Mflsiúa hww fjuíij ¿fnnis dcS f-CFiup del p ríílln Kt pdnLfihjrroi
un píSTt^cihjfln ti? vidrio fxun un p w . UU» (.t ¡iil J

c fa cv w i

P irp jc u iL 'iijn Cün W ülii S d w k i n yodjdfi A : Lu^dl:

Crinaos de jodo, í j

de- íMa-mos. ¡ti i¿ -i il. L))^vrrr| Kl eniifuü > jJic¡L.«iur lensajncnrc cr¡HJ,k> de yodo ha^u «u Jj^iliiKk'ici. Filnar j ^ikinlir fn

Agua ítíslalada. 1 (W

íííik t íi Lpira

el fsnidio de la n k *ilh h d

buclenaiia

L-: j?« j 11.11.i■_i■.in c o n -is].> Miele: u‘ i li /j r-'/ n i pardlelci

>•I i»íitii iii'tf lie \+l j e v a ill ju f cu-el ccfiD'-O d r l ji

^n iii-

tin a pcejLicfiu C iin lK la l de n u lc rlu reesit ti i>ln.i ciLüLvrial se

con ¡s prrjwríir'i'Sft ck ^«fiiíw r ¡i-.|íí^ícíi <-oajndi"> -e l'oten a Lifíns ii-.rs;fialfs |'*iií |¡i I,'Hím.|
mewla en urer gistj de hsIu ííó r y ix J jiL i en >in portaohjclc>i. Hjsld w i Ic jv Is jiuCa (larmeir blkl NUKpcrttiiiii j m eiiht.-.

ik pfíHnxtn ^ nlme^Tii ck h cln iirtos in to tiruile». El j n l i i rifte-íl íiHL-feity k n urgártulfht íflíTtCÍtOp(ai.ÉiLáT¡.

íei un (rulifif^ijíln-i Mibre 11 puta Luegn, el |ycpra,lu

r c t de m aiw rdqifí ih.hh jtijs Ideales de ih-uisli¿üí

L* ptí^iraciín wrn

nn puc4cn nlNl¡74rtí íh otím-

p ljji) de Ids jiiepar^fionís

solucirti f i ^ k ^ k a

iilLi íH / elli ÉJOn Ijp á r l aptetadht.

■I;.J, ■L|ee él sisdn pafedii^ la n^isiLUad Je hueleri^^

t>iliac ] 1 o ra agus ¿crtt"! de u v jr

y SrainnitlíPí i t |iniA]ri«M

¿itamirli JiWCLjfTWnTf «Mi fil IM Üi í l exaiMI) sí neicunttK u y* i t t k w j nfLiliiKar una pnejmriiiftn

tímip^ímnnt’ncc pin nn e^aüUcv futun>. loo borde-- ilrl cuhiftihjrioH ftiÁ k ii $cll&rw con umi mcicla du pnraJina■.á'icliiia

Pc«1i(i*>jeHrt de vidrio. 7.3 n 2,5 cm CuÍrtoT? ¡ctuíi P rrp ü j'& cM a u i a bU d iktd ci d e p iiliT ú a í k O IÍl H h ln Jsid o de |wU!4o. ID£f (jcui.thi;i PtictiiüJrifcDiJi de tidriu , 7,5 X, 1 ,5 ein fíibcv*

L a fiurjui je iú n c m K O K se liliI lu í ¡\u.i ií^ ísJíi en k ¡t“i« a-u ta ils1 ¡‘•lemciflí!'» tiín j icn^ e a fiu r ^ n íto hiucowjv ^ruesjj? o riiucstr-us qu et;o cikn ^ ju i mutcriaS í|ll-jhlí¡1'.i-,i-. c a ra o cm-iudas d f piel. Ltüiav o |e lr« LI

KíH I disim ile el IliíhJu de iiw e jiit t y, |^ r lu unto, d t ^ n it i ^ a r u . k»> ctcm iciite* G t a f k w y k ti l i ^ c m^1eviiÍ£AErx

Se |*je[:kua uau suspeii^aün et-n Id « tc a m M s,k piel. uJUh. o pfU-* en uiu f üui ¿k K ()H *1 HJ‘-* Se enliwa un cuhrtti*iicuis jotwe la ptía y w deja b VcmpeniLuru «nibKDle jw r alíeJedaí de nkedia hor-i Ei prejMr.iJn k ¡puede -enSenrar sWheinciKe a l.i llama ck: uñ uidLlifro Baeseri ¡wrüiiecle'

nff íl priK?su 4je cl^ifle^Wn Ncili^n-i: Li pr?puc^n»i Ex.immni' con el miemní opio para vi^ ati tar h ife tüngie..-- si es^ ilJA

í i r j í i t T K ™ eran tipia china ‘Etnij ekitru íP eltk iiii1 !

I- t prifiafíCíiHie^ ltui lintii china n uifmkinai
ci

ili a . J e mui hiH, m.icniíic|anjinirw¡ I j s gráuijU^

J^ijjER^inu. (.ynnuliiir)* J^tJrL^skrlLH de vitlfiu. 7.5 * 2,3 sim

ñiH.ss de la linla c h ira u la n i p ^ r w d in un I midu urmiLipai'Li cu m ia el Cual luí eLifliuliu eldJ'ah M.in fJcí-

CyliITnts|fl1(i«

lf< i!i' vún.||urar i ‘.Ir» r|oi?c;' se nliliv •.

íhs.L.1 éñ

S e i,íTHnlu?íi lits r Jiiin ir e el lújniün ^elaluniKniiilísii u í »

nftjtslrá liquida paru u « i. cn(rií: tiu lq u itr iriU 101x 0 ai1.mt» en el sedjmtnlLi S í emykionn una pccniciin ra u tiíljíl riel H '.l:ui.'lili1 drrtíin J e mi 1.1 fi^ a de, Liaila e h liu u 1.

11•••.1 u

it+ íc un pM üH +jctr^ }■sí cubic con en cutirettijctos. No re lig a r L rinulsaíVt de- conrasu ctmasdailn ptu«:Ln la.

la viMidúdi'iójL ilc Us gruniks cúp^ul» «li

fltp lr*|b|<Mtiiia jíued^ hlii^uQjrM: piir ocm plelu I .\amuuir

Cn y ^ n n r ú f nr*rfarimmt t h

p| iw p a ru ln . dim tiim TiH e’ c m ?1 mknw«rp¡L->. pmnid(»«l

li-|;jiíki CCfüi(Vra<|IJ ••

i.Efij, r
ohjcijvu tic Itf y. pira. La hd^neda IniLial > el iJujelL^ü de UI Jt p a rj l i ecm^irnuMJUHi ib sunpcelia de c n lc ru i^ a n ii-

mos encup^uladfK Eiutóiititi en turupíj tmcuni M ic m iL ^ iñ e^kiii^dís «wi h a cofl-

El iiiiálKi% en eurtipo nsctnv w o‘il ,-mpara vi^iulí^r líe riy í mierforganisflKH delk&K* q.ue --Lin mvhihfci.

dcnsadL'n de Lui::tn' tKtCuru Prwtaritijefrw de ■ciJncK, 7.S V 2,5 cm

eci el c.u jn cn iaiáen>scúpíei.i e<m 4 i¡npt« hralUhic i-|HJcn y me Iqnm u'ün lt>«i ^fart diekbllilil. Eitú mílOiil

Ciihneíitijeloü

w u ü k t * siibr-í tí«Jii «1 liu tn u u ra e lrin J- ff^i-jfu*|iieL» ciLt;bwcK»» i-ifilfriiCDS m une s í lia

-íl 11Ufj ÚfJ fi %i1 d LÍp O

PíiI íIIhh njil ic^jñ rcí a nKpndnres. J« c ín ic a

Se pMiCflí dp| pal íenle ]u secnva'u p.!ca hs exaniunadj.. Tin

el caw de un charx ci,». 1¡i vusirj tle la ^íjwiílcie k ra^isy n « i l r,i-,!:.eií y tuii¿ | s^ l|L.!A íi LiuiEicLtii dej i :i j ^

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celrca m *s jí un fH m s^ jeii"^. R e a li/ir un d re o lo siihre un

LiiIricvlijcCu» dan m u omxl Iíü de p¿riHfia-% ¿telina y t i lu*c j j stHnrí? la j.v*a

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iniilL'riaJ

! r •r"i ;i? f mfj p-Jí f 11¡ftrr<

\ ln7cl.) p an íi| u «v i'sclin i íOviJrJtJMil

B

E s t ¡gnna d e l d r . V a F b r E s o

20

CAPÍTULO 1 Inlrüdueción a la micrahiolagfar Parte I

Cuadro 1-0

ftn d a n e i bialiqgccuí camuitL-% isiilii.L rtjsen h a c tír lo lii^ a

T IN C IÓ N A h í ] J e m e U le w d e L w KIí t

INGREDIENTES

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A $ua ik*Utai¿i

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ier.-n-eiisí ¡¡umita V l-i>]c|j [h is iic i íiu

ICHiJjN' NH,

V i.,'Il-:.i de |.tJK-Luu i henameli Ijiar-nrowtHni lina I

^"írjleft de fetKiam Ak'otiol dílicm. 9 3 ^ O blato de NH+ Atü-i destilada Yüdiíro de Giam Yivltaii df jK>tilb trislakis, sk Ai IU •.ll Spl 1J..' 1

•2 g 2 0 n i. í.í .k g loo mL 2 i t9 IDO inL

LtecoLmote Acrtanfl Akx'lwl rtii™ , 9 5 %

H b L u lii de Z ¡jfW -N tíL im paja K il f e s áeidü-akobof rtiis-

tíraei

0

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Car hiiíij tam a (mruniiwínfíndiiwTBivtj

HUuTw.'Euüll»

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Lhl-i« una linrL'Wi simple y á m t i iiíiliia d íi jur» u u v^rietW de mkrcKirfwii^ ftH.kí. üé m ili/a e^waficjm enlt; fur» detectu baclerúsi en froti* de líquido «■fu lum quúlpi rsi n w i de dr rhhiii^iLii feajicrtaiu

Thaeitfn
”

P R O P Ó S IT O

tu , / ■Ni \ CHj

5 0 mL 50 mL

Esta e» uiu h r í í m diferente ii b se ulüLui ¡w a dcmin^trir 1i r p ro p i« l» f« de tin d m de bcicSeria,!.. ifc Unió lipt* Luí b.* ¡fi i¡is

retienen el

cvdnraiiK vinlcHi de ¡¡en cim a luego de la ítaiáorMriiki y se observan de t o l c r u u l

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satisfecha p o r com pleto, D ado que d osigen e suele tener m a y o r a fin id a d p a r el hidrógeno que m u c h a i colorantes, se retiene c o lo r en presencia de aire, Esto pe rm ite La u tiliz a c ió n de cie rto s colorantes, com o el azul de tnetileno. co m o indicadores de w iik id n - n ü lu c d lin en cwifoieiiu;* a n a m ib io s* dudo que el iru lk a d o í <se vuelve in c o lo ro cú. a u tc n e iii de oxigeno.. En términos generales, los colorantes se clasifican como ári­ dos o hásieos; esta denominación no indica neeesariajinime su pH de reacción, en solución., niño en cambio, si un» parte signJ* ficaiiiü de I» inolécula es amónica tatitfrriat Desde el pernio de vista práctico, los colorantes básicos tiñen estructuras aci­ das, m m o la cromatica del núcleo de tas células; los coloran' íe s ácidos reaccionan con sustancias b á s ic a s , como las c s i t u o turas citoplasmdticas. Si en un ¡wreprado se quieren leftir las estructura*, del ndclc» y del citoplasma,. se pueden utilizar com* bi naciones Je colorante* ¡fcidos y básicos- Un ejemplo común es Da hematoxílina (básica) y la eosma (ácída). o coloración H y E, utilizada para el análisis de cortes de ¡ejido, W fffa ctá n és ealontaíss en fn tm b io fo ffo . Es convenidm e que los o

microbiólogo* realicen m análisis microscópico directo de las muestras enviadas pura cultivo. Esto no sólo le puede propor­ cionar al médico un rápido diagnóstico presuntivo, sino aJe más, la detección de tnicíoorpariisnios especíñens puede servir como ¿uía para seleccionar el medio de cultivo adecuado y suministrar un valióse control de calidad comparativas con los jliüliunkntOü úblüitidos. E rl el c u a d ro 1 *9 se cftUtticrari, sobre una selección de muestras que se envían en forma habitual a los laboratorios Je microbiología, los hallazgos positivos de vanos procedimiento* de tinción y las enfermedades asociadas, A continuación se hace una breve descripción de las tinciones más utilizadas. Ttnción JÍff Gran. l.u tin ció n de G ram , descubierta hace poco más de H K laños p o r tta n s C h nstia n G ram , suele u tiliza rs e para el exam en d ire c to p o r m icroscopía Je las muestras y los subc u ltiv o s feo el cuadro l - í se puede h a lla r la fó rm u la )- E n el! recuadro 1-6 se e x p lic o el p ro ced im ien to de la tin ció n ,

F.I violeta de genciana (cristal violetal es el colorante princi­ pal* se une a la pared bacteriana luego del tratam iento con una solución dé bil de yoduro, que actúa co m o m ordiente para lija r el colorante. A lg una s especies de bucierlas, co n » co n se cu e n c ia de la naturaleza q u ím ica de sus paredes, celulares, tienen la capacidad de retener el vio le ta tic genciana aun luego d e l tra ta­ m iento con vn decolorante orgánico, co m o la m ezcla de partes iguales de acetona y alcohol e tílico al 95% . Las bacterias que retienen el colorante aparecen de co lo r azul-negro cuando se observan con el m icrosco pio y se d e n o m in a g ra m p o sitiva í. C iertas bacterias pierden e l colorante p rin c ip a l vio le ta de gen­ ciana cuando se las trata con el decolorante, debido tal vez al alto contenido de lip id o s de su pared celular. Estas bacterias cam bian de co lo r, tom an la c n tra c o lo ra c io n de safranina y aparecen de c o la r ro jo vistas con e l m icrosco pio : son las gram negativas (lám ina en c o lo r 1-2A l, Se puede m e jo ra r 1» visuali­ z a r á n de cie n o s ba cilos gram negativos con requerim ientos nulneionates especiales m ediante el agregado de 0,05% de carM fu e s in a ni contracolorante safranina. Esta reacción de O ram puede em plearse para hacer id e n tilica cio n e s presuntivas cu an­ do he la u tiliz a en¡ fo rm a co n ju n ta con la observación de la m o r­ fo logía (cocos y bacilos) y c o n la d isp o s ició n bacteriana, F fic d ly h i i r e v i r a d o , la * a p l i c u e i o t w B c o m u n a d e l a t i n c i d n d e fira m .4* 1 j.is , c o c o s g r a m p o s i t i v o s dispuestos en grupos sugie­ ren estafilococos; la d isp o s ició n en cadena in d ica estreptocch to s - L ó * d ip lo c w o s g f (impositivos.. con fo rm a de lanceta son característicos de S ircp tu ta cL u s pn eum onia e cuando se ]m observa en los fro tis de m uestras de espinos;, estas característi­ cas no pueden utilizarse com o diagnósticas ers otras muestras ya que la apariencia de los eiafterococos es sim ila r. L o s d ip lo cocos g ra m n e g a tivo i turri Sonados son característicos de ¡as especies de Neisseria. Los bacilos grandes gra m po sitivo s denotan especies de B a c iltu s o C ta s tn tiiu m \ los bacilos peque­ ños gra m po sili vos sugieren especies de L i. w r ia o alguna de 1» corincform en (djfW roides) si se observan ordenam ientos s im i­ lares a las le t r a s ch in a s". L o s b a cilos gjram ncgativu* curvos en

B Est igma del d r . VaFbr Eso

2 2 CAPÍTULO 1 Introducción a la

C u a d ro 1 - 9

Partí I

U ia ^ ™ * !* ™ d e e n fe r m e d a d e s iiift'cciosti.*; p o r a n á lis is d i n c i o de m u e s tr a * d e c u ltiv o

H A L L A Z G O S P O S IT IV O S

M U ESTRA S

E W E U M E P A D S IT U E S T A

P R Ü f E D I \ D E M D D E L A B O R A T O R IO

Culi ¡vh.p faringe v

P ir n ™

Ti i>,'krm J e {.¡uní

Ifelicad ® bacilas i^annpoíiilL'Mjji plrofnúrikoü en ■mu dMpMci'-iri jü m iln r i letras cMbhm

TinrhÁn enn ¡urul ik mctilciu»

EtariLm teñidos tU: a®i] c h r a ; (mjh prinuk^ meíaasam U cM pííwniiWTi»

hirin gitk enrejuncñcicB a ju d j

Técnica de fluorescencia dirima ra e üiwícuerpo íluegu-tk 4 - é b o m de LiKiilMCLti*. rrq cjhfesiJE IavUI-HírtH)

fo c o s tfncakfeftwkrs í'u ir v ^ íiu r s ; iisaf cflulm lí) p,íí-![i'.k.n y Eígativ-Li* an uaiii da,udü

F jjfeifífd á d ¿ t Vincíiit

Tirisit&i J é Ci .iri'i

PrEHencú de b .x.d fj giamne^alivni y K.iciIím ilel* jiw tos t n n io t ia n i l t c ^ ü irri

Tbcidci líe CIrártl

Vísriíslánl i l f lip H * haílíttórttK; X l/ r p I f x - iK C V X p r ir M m t m w c cun lJ :í-,u Iií, p a rlu u ü rriL c n li: 4jagn«nU:as

[ulw rtulínis Miousis. puLmofflr

Tukíóji p arab n cik » ácído-aiefibnil ncíinMiMS T u xi& i ifc Grata, Üttttón de W jigbt-G ism sa u h la rm i iJe c;d cu Flúor Tmttóm i!k‘ C ln H -U 'u ^ rt

B ík íIíh ¿ciiio-alcoboJ r«¡t<etw(N Le» * t n trntuc ida, «nhlohifi», I-i f-i* v e n ü d ? n n n cu^rpfsi iJ? f'rwctificw;^

Cclultús huclcTÍnna

T u v io ii ilc Grrni

Mai la ia il d e Lipas hacLetiafim ,; u u p i c h i d e espe» í l r i anaem hi®

G a n ¡re i« ja-üd^a i m -ionf

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directa « hi Milucíflii 1: ■■loUlipnn Dltíwin. i2í í-iRPU in líid íH ii it iín bafiSus .k id u jJn 'ln 'l f í u s l í i lI l'í üntsdr h - .i íl i

"Grúnuhw HJlítirowjs'’ Ü lfik a iliK t fÜajocntu*. r a jin ilm le v prur.poM 'hviM ; Lü p .rv c ^ M jfü r ti'iij %erd¿tHjflK|»e jk idl 1 jlC ü lh i ILM Slen’ Lí

Mk'etDJiu euntkvkico

Pfq.iirjLÍuii d ,i iji.L.3 cimi loluciiin fc ju lú jiic a TindAn de Gram sí n K H tjjE j i u l í I l- .i Ig.*d6fl rlt ].ii.ii 'ftí-iiií

GriaüloQ b l j j i t « r ^ ris ic ífe íi is^ruh Hilas |imdiidefi.s con tameínccjón focal, d cUm iilm p O fm

Meninjj’iri' b w te rip n H

Tinción de C¡ram

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L lc t 'fii Liri.>íiriíi£í*s

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Líquido cefaloioijuidftv

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Jiirtt ha/Lin 4» aJ^u ItltLl de tld íu ! eilBCriílidu de tas CÚfiaiLii hacieriaíias

Msitengísis criptocícLí .i

Tinta rh iiu o prcpazsKsén con mgnssina

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Liste nu>ls

TiiteiiJfl de (jJam J’ r i f ji i b ii'-a ilc l.i ¿uta t n v r ij

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TLix-ida de Gftiin ü ij &c Ló íi de Wn^fH-GiPirnta

S e u iliJijfa i ú ¡c v & lu ja s eís bfC'tw.i'>ti

InídTcifán b a r tc r in iu

TunciAn $e G ra m

Variedad de sijxw Imislf Eianns

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Gflu'aa s p iíília lc i cubifilas culi nim huv ilus (íV /lt^j.1 L'Jfji'f'} t) pH v a jtm l > 'SJ

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Pjrúsrujo s » fu íii« ih . pajudí-ww. TiaeíOn de W jig lc o Je G ienbu JnpannHKniasíit. HIjirimis Examen en « n p o ow uni TiauifS»üc 'A’ü.'lit éiiíe OieiosM Kuiitlira uñULtO dií s jr^ T r ¡iníic ?>|nd^du pus» L MvJlkaJa lie atóixil ílíi 1ií:li-

m ueslras de heces d iarrcic as indican esp ecie* de o si [fun hién se ven íw raan de sacacorchos. su^Leren. especies de C w fíftylobacler. L os bacilo s ^ jw m ic s a liw s son las baclerias que se cncuenlran con m a y o r fre cu en c ia eti lu s labui-Jtoruj* c lí­ nicos e in c lu y e n E n it'm b ü a e riú c c tie . bacilos no fe rm e n ta d o res, especien tic H flctn np h üu s y una varied ad cnu re q u e rim ie n ­ tos n u iricio n ales especiales. En la lám ina en c o lo r M in c lu ­ yen im ágenes seleccionadas de tinciones de G ra m , las cuales se analiz-arán to n m a y o r dc[«tle en una sección p o slcrío r de este capítulo^

tinCiñn d i Gram e* un proeedímicnlo engañosamente simple. Puede realizarse en forma nipjda y fácil. Sin embargo, la preparación e interpretación de los frotis es ¡uro lema. Es fcjjfjncid una euníidqnjhlc e\jK ‘ricHCLj } an cuidadoso cnireiia-

iK q w in n Jt

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PixrdaiLtS’ iíiej jn.i.'i j í j j l ’í (piU3HUkJiitiLL hi±n;stit R»ma*í c itm rd u lw fü : injpiini-rvrtjnHs o DiierontiijiD^

■TIIL-Hiii parsi Mi cj CLil4.titVi i rrrv
i u i UIi I

N'' ]ií

hará ian bien.como alguien tjue mira re eul armen h- Ijis liivgiones y tiene la oportunidad de cotejar los hallazgos morfológico* con los- lesulmilo»
B Est ignna del d r . VaFbr Eso

24

-5

i

c a p it u l o

Introducción a la micro biología: Parta l

d ific u lta d e s . En el cu a d ro t - H 5 se re su m e n ¡lIl’ u iiíis de Lis “ tra m p a s " c lá s k r a que puede p re se n ta r la tin c ió n de G ra m . Lu re g la e se ncia l es que la rn te rp rc iu c id n fin a l debe hacerse sobre la base d e l c o lo r de la em elón, la m o rfo lo g ía b a cte ria n u y Ljh v a ri am es que se m im o e n . P am o c im p lic a r pún m iji fn s in ia c ió n , d ive rso s :tr[ífa c5 0 ü pueden aseinejarM : u Ion Hgentes in fe c c io ­ sos v ser in fo rm a d o ii de m anera e rró n e a co m o nibcrobios, En la lá m in a en c o lo r 1-4 se íIij -oucl alg u na s de csEa.s p o s ib le s fu e n te s de e rro r. S i se c o n s id e ra la p o s ib ilid a d de ¡un a rte facto * u no e s tra te g ia lis le ñ ir o tro t'rtlEÍH c o n n a ninj^i de a c rid in a Iv^a se rn^s ndclanleü: cem esa E inei^n se p u ed e e sla h le ce r si la e s iru u iu ra a m lic n c D N A . y p o r lo ta n to , es b io ló g ic u . A peMsr de i|ue e l p io e e d i m ie n to es sim ple,, e l pasu de c a m b io de c u lu r puede o c a s io n a r p ro b le m a s si no se re a liz a de m anera adecúada. S i se u iil i/ a aeelona ervmn ile to ltir a n tc . debe tenerse e^pee ia l e u ld a d o p o rq u e a ciú ft en i'n n fla muy nlipjdii- E l c a m b io de c o lo r in s u ílc ie n te puede c o n tro la rs e o b se rva n d o el n ú c le o de las cé lu la s in fla m a to ria s ;, si ¿stas n o están co m p le ta m e n te e m m n e g n liv M , e l c a m b io de c o lo r Jel fr o lis no se re a liz ó en fo rm a adecuada. L a LÉnica receta p a o d e le cta r u r c x c c k o en el c a m b io de c o lo r es ¡a c o m p a ra c ió n entre la re a cció n de G ra m y la m o rfo lo g ía J e Id ba cteria . Si e l p ro g ra m a de asegnram ie n to de la c a lid a d (véase máü a d e la n te ) in c lu y e una re v is ió n de los frn tís que nn se c o rre la c io n a n c o n los c u ltiv o s , es p u sib le d e te cta r e l eainbit? de e o lú f íttú d e cu u d o y Im-, arieíaLU )^ no híicSesidnos- que se in t'o rm a ro n tle m anera e rró n e a y el, o b s e r­ v a d o r puede a p re n d e r d e l e r r o r I j i lu ic ió n de G ra m ta m b ié n puede a p lica rse a la td e u iífie a ci-ún de iuemosi do bacterianas, ccm w irtc o m o n a s , larvas de e s tm n g iln id e s , q u iste s de P w cu íu o c yjrís jttv%vci (car¡Ni¡)y tro ftm >L[G i de Tnxopitismci gomíü, aunque no es la n Kennible COm f o irá s tin c io n e s especiales que se m ilit a r para \tsu alt7.a r estos m ic ro o rg a n is m o s . Esias diiieíNafi a p lic a c io n e s d e m u e stra n la v e rs a tilid a d de 3a tin c ió n de G ru m .

Recuadro 1-6 T é c n ic a de la tin c ió n de Gram _ ■ •

L. R c j¡I¡i:¡; u n

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n u t n i a l p j j . i le -J ir e c n i tu ic ió n

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u - z L l í l - . :■! d u r a n t e

a lg iu u ii ¡r a n o la i) í .

C n lu ía le c o n

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d e

recu b rí b

p q r i (b n d íip i y

s u p « r fifie

g e n c ia n a .

4. Luc^v i l f t mlnutu (se puede tÉiüms r iein>- Uenipo con jl.ji.ina- w>!lc ía iw s j üc « p u M c iín ul cutorMiite viu fcia d e jKiw ianu, l4 *c

víiirenle ttin agita é iM iluda o N ifie r 5 . C u b ra

l'J

fr a tis

c n n

S u íT a r a c n r í. ¡a v e b . S S ujseLe e l í r e J i n

M jtiu e É flíi t n d a d a c o n

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G r a in

d u r a n ic

¡ m ín a la .

ag u a fu lp n r j

e l d ed n

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vutwiljcic c<*i una-' -¡iiiJis di" (Jewrtunum afcOlwJ-íje'eliJis, Imsu. h¡ü j

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v l ü t e L i . E . v ! l> n u l Lc U n U a i

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O STWFMH 7 . L a v í í - í i t a j¡tia c n r tfiw i¡e p i r a . N ik i'.'k í. C u b r a m in u lw B. Q itix ju c

L u v tf d

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y e iilr u jiiÉ

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V z r t k uL c l i l ! h í i p u t t e

p u l a L Í i i l u l 'i i I . | j j j

ptraiiru que l'I cmcso de aj.ua d/cíie y ti m seque Q. Examina el irtidn hija d ohjet3«*dc LOOX (de inmersión) de lio d ií

un m k n 'K c u iiiu , [ jis h u c iín *)* fiam iH H íirtvax s í ic fc n de w i G K Ú 1 K

bt bacltri&s ¡¿rasmi^jtivas spancixn de cutor ro*a a rojo

eas. Lamentablemente* las bacterias no siempre leyeron el i^ ijib L E E ic n r ii.

l.ih ¡,

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b it iín g íu ;

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t ' r i l i i ' - n j i i n i i ’- n t t 'i.

Jutsm para tácitos ácido-atcohoi resistentes Las micobactcrias cíián rccuhiertas c
p n tr

lien y líeseos de aprender de ¡os errores pueden superar las

Cuadra V IO

ÜUiculLidc& en la inttrpnlack'n de \-¿ tinción de Gram

m h c r o i }R G \ nl<;m o

PWaENT,\ClÓN CLASICA

SnipFamvrnr pnrtimcvtjijr

Kpbeocos, pan»pwLljvíM crin Coro* alaT£*JíM. ^rmej-Jinle^ a N’irm* de lnni.eí¡i haákií.

V,\ RIANTE l>E PRESENTACIÓN

Püevlf icr mal ¡MfrpfrtJidii cnmfl wns míTtb de

fu r ti» .

Espccips de Acinttobocírr

CixnhatjUw tniruies^cis

Cocos

COMENTARIOS n n iT is s f j;u .T iJ s i m k s

hiede confundiiHe liwi úsiwlml^ Je Srí!¡*rti41 míornurM' ti'iii'.' 1'i.iuí ¿Mlnncfulllrm: hjK'at l‘3 ftrtii. p:in coinpn^t«r pre^ivui de micnsH't¥¡ir¡■lí-.jni'.' l|il-' Jliüul>!nLi i Ij.'-, líiniuh álüircuilsi, ¿jS euJcí im han tidr> vid» cu b i espcci» de S'cühítiti

f r a m tie ia E iv D í

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Smptot'ot'eui pneíimon¡ae e la furnia de num las tflMnMi f'uvclcintc'itc el cníkLil vuélela Jurunlf üti.iilurjii(^l n m

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nunilL-.s priunpu.uLivi»% ín lintléití

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C l' I l i L is

ismhfc

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c L £ ir ; ,in

PViL-di: nmíuiL-üií’ie uní hs^lt» la [firma ile e^ un indidode t|iie el ur^aílsmo e^fnrnpMiüvi?: otm» ctastiidRi» y nivcici, dp ttmitlm siufdrn umhiín apamcren fnrnui ’-irJn.i¡;ur Piiftle d.niftindirse creí aniñe ¡m; d mnurics y la í^íiiu lo- dMin^uen de lis bjrtefias

B Est igma del dr.V aFbrE so

Fases del ir cío diagnóstico

ten el cambio de color con sol ten Les orgánicos fuertes, como el Acidc-alcohoL Eli consecuencia, S6 las, conoce como bacilas ácido-alcohol resistentes, uri fcrrtticno demerito por primera vez en l £81 p o rZ ic h ly Nedsen. Para esta tinción ¡*e requiere un tratamiento especial con el fin de que el colorante primario, la caito!fucsina, penetre el material ceroso de los bacilos ácido-alcohol resistentes. En la técnica convencional de Zichl-Ncelsen se mili ¡ía el calor. Luego de que la superficie del frotis que se va a teñir se cutiré con una capa de carbol fucsina, se llamea por debajo del porta­ objetos con Ja llama de un mechero Bunsen hacía adelante y hacia atrás. EJ fruto se calienta hasta que se observa la presen­ cia de vapor, justo antes de que hierva., La modificación de la Unción para bacilos ácido-alcohol iesiitenw i realizada por Kinyoun se denomina ^método trio",, porque se utiliza un detergente tensloaclivo, como Ter¿í¡Uil“, en lugar del trata* miento eon calor. C o n c u a lq u ie ra de estas tin c io n e s . lo * b a c ilo s le íd o -a lc o h o l resistentes aparecen de c o lo r ro jo c o n tra un fo n d o ve rd e o azul, según e l c o n tra c o lo r u tiliz a d o Ilá m in a en c o lo r 1-2 B ). A pesar de que eMe m é to d o es s a tis fa c to rio para la m a y o ría de las o iic o b a e ic íia s , cie rta s cepas de b a cilo s á c id o -a lc o h o l resistentes d é b ile s de especies de rá p id o c re c im ie n to (c o m p le jo Mycobac¡t'ntmi fíjrttfiiiim/chelaniie) s t pueden te fiir m e jo r c o n e l m é to ­ d o de Z ie h l-N e e ls e n {en e l c a p íiu lo W se encuentra un a n álisis m á s d e ta lla d o ), A d e m á s , n e n a s baeteri as. co las especies de N w tw tkh m uestran de m anera ca ra c te rís tic a u n a d é b il o p a r­ c ia l U n ció n para b a cilo s S d d tis ilc o h u l resistentes.

Tinciones por fla&tesceatía. El isotioeianato de íluorcsccína í H T C ) y el Kesionaío de tetramelilrodamina ¡T M R i) son dos fluonvrom os uli liza Jos con frecuencia» que en SU estado exci­ tado por acción de la lu í ultravioleta o visible de corta lo n p u d de onda cimfcn ondas de. luz en el espectro visible con una absorción máxima de 490 nm y 555 nm, respectivamente. Es­ tos; Fluorncromos se unen químicamente con divenus proieíraiü, como antígenos y anticue fpos, y funcionan como una etiqueta o marea a través de la cual se pueden visualizar las reacciones irtmunliaríaü en frotis directos de líquidos biológicos o secrccioncs, o en cortes de tejido*. La variación en la relación fluorocromo/prolcínn de ios diferentes rendiros permite lograr una óptima tinción de los objetos deseados cor un mínimo de fondo no específico. El desarrollo actual de los anticuerpos moñudonales, que son monoespecfficos para sus, ¡uulgciH* respectivo*, condujo a la preparación de reactivos fluorescentes para la detección directa o indirecta de numerosos patógenosr ChtfltJiyfíiQ m irfm tiw m , especies de tegirm pfin, Trepnnpmo p a llid u m . Toxopíasma g m iiii y varios vinas, como varicelajíóMei. herpes simple, influenza, cttornegalovinis y slocitial rcsp ¡rateario+ entre otros. Líi microscopía de fluorescencia es una técnica minuciosa que requiere on microscopio de alta calidad. Ha combinación adecuada de los objetivos, condensadores, de campo brillante y oscuro, un arco de mercurio o una fuente de itu ultravioleta halógena y ]a combinación adecuada de los filitús de excitación y barrera o supresión,-1 Lm. objetivos acromáticos son apropia­ dos para la mayoría de las aplicaciones excepto en inve&tigaci.Vn, en que pueden requeriríc lentes apocromiticas de mayor coito f a l c a n z a r el máximo de iluminación y resolución, Para un rendimiento óptimo es crítica Ja selección de portaobje­ tos y cubreobjetos de grosor adecuado y la utilización de acei­ tes de inmersión y líquidos de mamuje de baja fluorescenciaLa elección de los li liras para el microscopio de fluorescen­ cia también es decisiva para un trabajo exitoso. Se requieren cuatro filtros en forma secuencia!! 1) uno que absorba el calor

25

(para evitar el dailo al filtro excitador). 2) un filtro excitador con no ancho de banda de onda apropiado para la longitud de onda de la luz que produce el fluoiocromo excitado, 5} no fil­ tro que absorba el color rojo ¡w a bloquear cualquier luz roja que emitan los filtros de excitación azul y 4) un filtro barrera ptira que absorba cualquier luz residual de excitación inciden­ tal de corta longitud de onda (que dañaría los ojos del operador del microscopio) y que permita sólo el pasaje de la luz visible de mayor longitud «fe onda. El rendimiento sufriptimo de un microscopio de fluorescencia se del>e a menudo a la mala selección de la combinación de los filtros. Los fabricantes de microscopios proporcionan la información y el ascsoramicnto de modo que los usuarios puedan obtener un rendímicitt» ópti­ mo. Hoy se comercializan, con un precio aceptable para la mayoría de los laboratorios clínicos, los sistemas de fluores­ cencia que utilizan Ll epiluiilinación, 2) 1¡impura* halógenas de luz azul que no requieren transformadores de alto costo y 3) fil­ tros de interferencia con máximos picos de absorción COn Ion Iiuides de onda visibles más largas. Tinciones con iín o ro cw m s p m ntfcob¡ciertas. Para demostrar la presencia de bacilos teido-alcohoL resistentes se pueden utili­ zar los fluorocromos colorantes auramina y rodamina. Los bacilos aparecen de color amarillo, rojo o naranja cuando se lo» observa eon el microscopio de fluorescencia {.según la combi­ nación de filtros y los colorantes utilizados] y el fondo es oscu­ ro si se empica permanganalo de potasio como contracoloración (lámina en color I-2CJ, La utili ¿ación del procedí miento de fluorescencia facilita el examen de lo* froto» sobre todo con un objetivo de 25 X. Este objetivo proporciona un aumen­ to lo suficientemente bajo como para examinar campos microscópicos amplios, y lo suficientemente alio para ver los lui utos de luz amarilla que emanan de las bacterias fluores­ centes (lámina en col^r 1-2C ). Se puede ulilJ zar mayor aumen­ to para confirmar los objetos sospechosos observados con la lente de 25 X. b tin c ió n para b a cilo s á c id o -a lc o h o l resistentes se puede u tiliz a r ta m b ié n para la id e n tific a c ió n de m ic ro o rg a n is m o s d ife re n te s de la s m k o b u c te ria s r Los, o v o c ito s de las especies de C ñ p iíiip o rid iu m y de h o s p im t b v íii. dos m ic ro o rg a n is m o s coec íd c o s que han re su lta d o im p o rta n te s agentes e tio lo g ie o s de Jas g a stro e n te ritis , son á c id o -a lc o h o l resistentes y pueden detec­ tarse c o n fa c ilid a d en p re p aracio ne s de heces te ñ id a s de m a n e ­ ra adecuada (lá m in a e n c o lo r I-2 J ). Hataefi dñ i t t i d lt i t L a tinción con naranja de acridiita (XA ) se

está utilizando eada vez más en ¡os laboratorios de microbiolo­ gía para detectar bactflna<; en trnU =-, preprirado'í de líquidos y exudados, en los cuales se espera que las bacterias se hallen en baja concentración (10' a l(V unidades fonitaduras de colunias H ÍFC Fm L] o están atrapadas dentro de un denso agregado de desechos del fondo, lo cual dificulta visualizarlas mediante los procedimientos de tinción convencionales. Hn un principio, la tinción con NA fue utilizada por los microbiólogo* para demostrar la presencia de bacterias en muestras de tierra. En forma .similar a cuando se aplican colorantes fluorocromos para si estudio de los bacilos ácido- alcohol resistentes, los trotii leftidos con N A y examinados büijo Igjr ultravioleta pueden ser explorados de manera más rápida y eficiente con hajo aumento (100 > se examinan con aumento de 451) < o mayor cuando se visualizan formas sospechosas. Esta tinción detecta bacterias vivas y muertas,, perú no indica si son grampositivas o gramnegativas. Una vez que la bacteria se ha sido detectada utilizando la tinción con N A , se debe aplicar tinción de Gram para establecer sus características diferenciales de tinción (lámina en color 1-2D).

B Est igma del d r . VaFbr Eso

26

CAPÍTULO 1 linirodiscciún a l i m itroblol^gív: Parte 1

R ecu ad ra 1 -7

P r e p a r a c i ó n -de u n a U n c i ó n Ñ A

Itixmtirnfri-- NA ■ni piilra 2íi nip. taífer acntiiu de «*l*n 2*50 ml.t HCI 1 M

Parpana tów del rettt’tñ'»: ng,rc|ar 20 bie de NA en ¡iiilvii fJT liacket Chcnrie'at C«. Philrp'hw!'!’ NJj n- JW mL de hifler«*lasii d; ?wtio(Mu ciAr iJf rrwrva |(N mL ik 2 millar |M| CHXOONa.SH, O y 9C«mL de ] M K C lL c lis a I M¡debeapegaueea«uitldad iiiikienic puramantener b ctnciAi diferencial Je la* bacterias contal el fondki ck iIhkIioe.41La joSuetón ikbe wr alfflaoc&ada est iuu hvfííb «tfw caramelo- n m ambiente,. Ptmfdi.imr¥|jia.- I j tiiwiéfi --e resida. cuhricnin eon^leisunente la

rficis

iBcl íw N k del n u ü H a l par» « f f w:innijuaSi% p c rv in m c iite fite s e c á is a| jiL tt

y íijiado cun rneUnul, con el coinrante NA limante 2 ikípuIm. wppfclo por ü it

o j s a p u en fílen te. I j » p ú rtaob jd ú * fcrihdM « secan

y esawiEnan ra í un micjDiccsjHü e-p ip ad o con una fuente d f luz

ii Imvi i Jeia

Ljmei y col', encontraron que la tinción con N A es más sen­ sible r¡ue :.i i k Gram purg. detectar bacterias en los sedi memos de L C R - sobre ludo cuando os-lJiii présenles bacterias granuiegativas.'*' ] j i tinción con NA también es útil para el análísisi de rmics' tn w de orina en busey de bucterjuria '•¡ginfieativa.4* En el aeetiadrn 1-7 >e esquematiza la preparación de la tinción con NA. Aiaí dé tafuitíina yamlóe mettfenó. E l a/Ltl de io lu id in u , un c o lo ­ rante m u y re la c io n a d o c o n e l a/,m a y e l azul de ¡n c tile n u , *c m ili/..! p .ifü te ñ ir ¡m p ru n tis de b io p siü s de pulninísn y íro tis de secreciones re s p ira to ria s pura la d e te cc ió n de Pneunxiry.nis Jirmeci (carírií) en N irrnu rájiWL'i Las tin c io n e s con a íu l de n ie l i leño m; pueden le s li/ a r sn b ie sedim entos de líq u id o c e la * lo ira q u íd e o ert fo rm a c o n ju n ta cun la tin c ió n de G ra m . L a s bac­ terias g rjm rtirg a liv a * / / tnflui'nzw j iV. mcnm^iúdis, :1o suelen re s a lla r sobre e l fo n d o te ñ id o de ro jo en Iíi tin c ió n de Grrm'0.111 d azu l de m e n le n o , Eos le u ci*ctln s |K>IÍ3iioi t'onueleiLrt:s se LitV:» de a¿ul > lu s b a c lc ria s que tu n ih ié u se Uñen d t ii¿ u l ín le n st> M in uní? fá c ile s de tk r c c ln r contra, e l i(]]ldi> u n id o de " r i i c la ro (lá m in a en c u lo r ! -2 L ). La tin c ió n c o n a /n i de me ti leño debería co n sid e ra rse un c o m p le n ie n lo de la lin c ií n d e í ira in tLr» los L ib o ra to rio s d o n d e la ta ita de accedo n i m ic n ts c o p ift *Ilnuorescein:L;L im p o s ib ilita la u ti I I/iiL’ it'm Jel p ru e c d im ie n to de iíriL lk jll uüíJl N A . BItfíCO J ÍÍ H ie ttftíO f, E\ blanco de lj:l poJlúor, u n c o lo ra n li; s t í c í j lon> u iiIíü íh Iu en la in d u s tria para b lo iiq u e a r id a s y papeles, tien e dos propiedudes t]iic Jo hacen tllil en m re m b to lL ^ ía ; l ) la u n iñ ii a 1os polisttcáridos e^n y nim ias |1 l-,l o p i ~ i íespLieffít;üim e iiie j la c elu lo sa j .i I I i|miiinaJ > 2 ) la llu o rc accn e ta cujind o c s e \p n t ^ ln a |u / ullruv so le u de le n titu d e s de und.i !a r e j y a l.t I li / v isib le de lo n g itu d de onda fo n ;i. Hl b lan co de ca le n tlLltir es n n ii vísIíomi lin c u m < o r H itóm e roí un ] ia n ly d iíi^ -e iiin rá p id a de hongos en preparados 3im ondos, Iro lis j cortes de Ic iid ri. i.k b k lo a L^ue la pa.l‘ed nelulor de lo^ liu ilg A V l i i pJatli js es ric a en q u itin a , Ésta tin c ió n ha sido litil pTin^ipalincntn

en ta detección d» levaduras, hitas y >cudohiíah en raspados de fie l y de nuicosas C'uaiido se lo mezcla con ladro*ido de fustasio al 1 , se puede realizar ln búsqueda rápida de deriHatofilos er? los moni a je * de raspado de piel- Las estructuras fúnpicas, m uestran un color ^crde m a tu a jia briJIante ri nn b! a n ­ co n/uCado fan tasm al, según \w loj\gttud de onda ite la lu z de

exciuicitin y de |ji combinación de filtros utilizada, cuando se los observa con el itiicro.scopiu bajo Iu¿ tiltraviuleta (lámina en color I- 2F). Los hongos se diferencian con facilidad de los deseehnsdcl fondo, las células y los fragmento1! de ¡ejidos. El blanco de cafcoílúor tiene corno ventaja adicional que los cor­ les de tejidos pueden teflirse Eud|o con ácido periódico de SchiiT CPAS], melena mina argéntica de Gomori (G M 5 ) u otras tinesones. especiales sin interferencia, si se desea la confirma­ ción de los hallazgos o disponer de t’rotis permanentes. La tée* nica es rápida y proporciona una buena definición de las finas estructuras fiitigtcas y un mejor co n traje respecto del fondo que la unción con azul de anilina en lactofcnol ampliamente Lili (izada.!> TímMads im pngttaciáit arfiinltea. Ciertas baeteiias, por ejemplo las espiroquetas {incluido el agente etiológico de la enferme­ dad de Lyjiie. B u nrU u iíu r^d o rfe rf) y Ins pei|ueño.s micfmn.eanismos con forma de bacilo asociados eors la enfermedad del arañazo de gato {Barftm eUtt hm selae y fiaiftm elU i q ttinfaita). no se tiñen con Jos métodos convencionales. Estos mteroof£anismos so^i m i» delgados píira ser sisualiíados por ntieroseopia de campo brillante, no se encuentran presentes en concen­ tración suíicieme tum o para ser detéeiadi» o so composición química no interactúa con los colorantes, La microscopía de campo oscuro ha sido m ili/ada p a n rdemifrear Tn’p tm fttw patíúlutn, el agente eiiológico de la sitiii^ v oirás espiroriueías no trepon¿micas, corno L tp u ts p in t mterroncm*. el agente cau­ sal de la lepiospirosis. Una Eimiiacidn del procedimiento de campo oscuro es. la necesidad de examinar enseguida las mues­ tras húmedas que contienen sniemorgaju^moí, v[vo.i ya que la visual i zíieicin de la bacteria en movimiento es esencial para su delección.. La tinción argéntica *e ha sido utilizado juara obser­ var estos microor|iai|]íimos en corles de tejido v se dispone de reactivos mmunofluerescenles para la detecetón de algunos palócenos. como T. paUMmip. Las tinciones de ímpregmiei^n argéntica de Warlhifl-Stan}1. Djelerle y Steinei se lian utilizado durante aílos para demastrar la presencia de cspinKjuelas en corles de tejidos fijados cu fw rnoL Estas tiEcniuav se lualizar en ftinna uquivalcnU.*. TtBGiQn te Wtf§ht'Wsni$a. | ;i líneión de Winght-Giemna suele utilizarse pata icíúj ItB elementoscelulaie^de tos fn>Lisde san­ gre periférica, llene poca utilidad pára teñir bacleria?. pero .-c Utiliza pilrtcipalmctite para detectar las faunas de kvuduns ínt mee lularcs de H istoplastnit capm ialam o los amusiigotcs Entracc hilares tic las especies rie I-riih n u m fa o rn p tm a X fm a rruzi (lím ina en color l-2 G i. También es Lie utilidad |>ara demostrar eieitas inclusiones virales inlracelulares t véase cua­ dro I B ) Asido paryódiso de ScMfL L a lim -ió n co n áL-ido p e rió d ic o de S c h iff se h»s.a en la o x id a c ió n de las bes-osa-'. y I ük he^osam inas p o r iifc d io tlc l á c id o perv r tJ íc li . que m in p e sus a n ilh 's Lie p ira riosa v p roduce d i a ld e h id o s que re a ccionan con e l re a ctivo de S c h iff, (isie es un c o lo ra n te trifc n ilm c ta n o p re p a ra d o a p a rtí: de fu c s in a b is ic a o jí-ro s a n ilin n m edíante la re d u c c ió n con a cu lo s u lfú ric o 1.a m a y o ria de Las sustancias q tie e o iltie n e il he vosas o tícsosLim inas son PAM ^xisiti^a s y se lifle n de c o lo r ro jo c o n U a un fu n d o verde o azu l de a cu erd o con la co u tra c o lo ra c ió n u llli^ a d jt. F.sta I i lic ió n se n ú liz a en Jornia m us fre ­ cuente pu.ni d e m o s ira r Li peresencia de h o n g o s en cortes de te ji­ dos (lá m in a cu c o lo r I ^ H í

PROCESAMIENTO DE LAS .MUESTRAS Una v c i recibida la muestra para eidtlvo en el laboratorio de mienihioUigía, se deben tomar las siyuienlcs decisiones;

B Est igma del d r . VaFbr Eso

Fases dtil etdo diagnóstico 27

1. Seleccionar el medio de cultivo primiirio apropiado para la muestra en partieu lar. 2. Determinar la temperatura y 9a aimósfera de incubación para el aislamiento Je lodos los micruotgartisrtiOH potertciilinenic importantes. ?, Determinar cuál Je los aljamiemos que se recuperaron «n el medio primario requieren caracterización posterior. 4 . Establecer lo necesidad de realizar el antibiograma, N o se puede esperar q u e u n ú n ic o e n fo q u e c u b ra todas los necesidades de los la b o ra to rio s y d e l ítrn h iio c lín ic o . E l pn>loc o lo u lilí/a d o en. un hospital de 5 0 cam as de una c o m u n id a d tu ra ] d ife rirá d e l que *e em plea en u n g ra n c e n tro m é d ic o co n m ú ltip le s d e pa rta m en to s. S in e m b argo. Lodos re co n o cen las d ific u lta d e s de m a n te ne r la c a lid a d d e l s e rv ic io fre n te a la dem anda cada vez mas e xígem e en la c o n te n c ió n de los costos. L o s d ire c to re s y lo s sup erviso re s deben e lim in a r g ra n parte del tra b a jo sin nele-vaiieia. c lín ic a que se re a liz a b a c u e l pasudo. Se espera que los (te m p o s d e l ’ lp a n c u itiv o H (la s o lic itu d in d is c ri­ m ina d a Je c u ltiv a s de todos las s itio s accesibles d e l c u e rp o co n Sa esperanza de a is la r nn pató g e n o) se hayan te rm in a d o . D u ra n te las d & a ila s pasadas m u ch o s m ic ro b ió lo g o s lia n tra ía d o de e je rc e r lo que B urielL lla m a ''c o n tro l del p ro ce sa m ie n to ’ V '‘re s tric c ió n d e l p ro ce sa m ie n to c in fo rm e Je m aestras pana t u i ­ tiv o só lo a a q u e lla s que p ro p o rc io n a rá n una in fo rm a c ió n p re vi* s ib le m e n tc ú til'V Selección lie! medio para m cultivo primario. E n un la b o ra to rio d ia g n o s tic o se re q u ie re n só lo unos p o cos m edí lis de uso d ia ­ rio . C o m u n m e n te se u tiliz a n p la ca s de aaar. L a in o c u la c ió n de c a ld o s de c u ltiv o para e l a is la m ie n to p rim a rio de m ic ro o rg a ­ n ism o s de be li m ira rse a a le unos tip o s de m uestras p a ra las cu id e s se ha d e m o s tra d o la u tilid a d de e-sius c a ld o s s u p k m c n L a riíis : véase cu a dro L-6). En Id m a y o rfj de lo s la b o ra to rio s se ha a b a n d o n a d o la p rá c tic a de in o c u la r de ra tin a e l c a ld o de iLog l ico l a lo p a ra e l a is la m ie n to de a n a e ro b io s o c n tn u un p ro c e ­ so de e n riq u e c im ie n to para re cu p e ra r p a tó g e n os de las heees. b u casi todas Las c irc u n s ta n c ia s he l a is la m ie n to de un m ic ro o r­ g a n is m o en c a ld o de c u ltiv o lu e g o de 4 o 5 dia s de in c u b a c ió n

tendrá muy poca relevancia clínica. Lu incubación de los cal­ dos, ilc c i;||i vo ¡>i>r p e río d o s p ro lo n g a d o s lambién lle va aL ¡jíklamiento frecuente de contaminantes. ! Los aislamientos bac­ terianos en muy baja Concentración rara vez son s ig n ific a tiv o s y el tiempo prolongado de aislamiento suele dar información irrclcvanlc para el iralaniienlo eficaz del paciente, tln algunos la b o ra to rio s se in o tu lu O Los c a ld o s Je c u ltiv o p a r j cie rta s muestras» pero sólo se Jos examina si no se delecta crecimien­

to en b 4- placas Je agar o si las bacterias, cuya morfología se observó en un irruís, directo de un material «le un paciente,, no se aislaron en el agar. En algunas situaciones los ca ld o s de c u ltiv o son ú tile s o in e lu íio c s e m iu lfií. E l c j m m is ubvin ea el hem oculiiM T, en e l cual la rti.ivuii'ia lIc las vetees se espera lsil único patógeno y n o llora

co m e n sa l. O tras .lim aciones clín ica s cu m p le n cení esifw p rin c i­ p io s y en ellas los caldos de c u ltiv o pueden ser útiles: la p e rito ­ n itis bacteriana espontanea íp rim a ria ) [opuesta a la p e rito n itis q u e se produce 1Liego de la rotura de una viscera a b d o m in a l;,4 las in fe ccio n e s p cn lo n e a lcs en pacientes que re cib e n d iá lis is p e rilo neaE y la a rtritis séptica."16 L o s m edios pueden >cr se le ctivo s o n o se lcc ttvtw . L o s m e d io s oo s e le c iiv m ni» co n tie n e n in h ib id o re s y en e llo s pue­ den cre ce r la m a y o ría de lo s rrú e m u rg u n ism o s que se aíslan en los la b o ra to rio s c lín ic o s . E l m e d io no s e le c tiv o m ás u tiliz a d o es e l a g a r sangre «le c a n te ro a l y ¿ y se lo in c lu y e en e l c o n ju n to de los m e d io s de a isla m ie n to p rim a rio s para casi ludas las niues-

irús clínicas, Para el aislam iento de íIu e m u p iiiliM ¡rtfluenrae se necesita agar sangre de caballo, agar sangre de camero con adi­ tivos, como I soV ítoI c X® fo un suplem ento similar que incluya nieounarnida adenina dinucleútido jN A D j y un producto deri­ vado del tierno) porque no tiene cfe cli* inhibitorio!; sobre el crecimiento bacteriano \ es una fuente rica de factor X El agar chocolate también es importante para el aislamiento de A1r í í J V r ía g i m a r r f w m e .

O agar sangre puede hacerse selectivo mediante el agregado de antibióticos o inhibidores químicos. Es una regla general que |ns agares con inhibidores: no deben utilizarse solos. porque sue­ len inhibir [os organismos Je interés, sólo menos que a lu otra llora. Muchas veces la inhibición es súlo parcial, por lo tanto el crecimiento en un agar selectivo no debe tomarse como prueba Je que se aisló el microorganismo Jiana- Por ejemplo, los cntcrococos y las levaduras a menudo crecen y producen pequeñas colonias en el agar de MaeConlsey Sobre lodo si la formuladón no contiene violeta de genciana. TambiCn se puede lograr que nn medio sea diferencial mediante el agregado de ciertos colóranles u otras sustaneütH químicas y obtener asi algunos indicios acerca de la identidad del microorganismo aislado. En el cuadro l - l [ se resumen algunos de los medios inhibidores y diferenciales preparados con agar. Técnicas para ía transferencia y eí cultivo d# muestras clínicas Una vez que una muestra "superó" los numerosos criterios Je rechazo y fue aceptada para í.u cultivo, se deben transferir cantidades adecuada» de év|a a [tis medios Je cultivo va des­ critos, Esta actividad suele llevarse a cabo cié un área d d laboratorio diseñada para tal fiatransferencia de todas las muestras a Jos medios de cultivo debe realizarse en una cabi­ na «le segundad biológica (véase más adelante). La mejor política es manipular todas Las muestras como si fueran alta­ mente infecciosas. Se debe exigir que el personal utilice guaníes de goma cuando manipula la mayoría de las mués iras: el uso de una máscara de cirugía es opcional, ya que no es necesario para gran parte de los procedimientos que se rea­ lizan en el laboratorio de diagnóstico mtcrobiológico (excep­ to para la micobaeleriologfa). El área de inoculación debe cMar equipada con n>dos lo^ implementos necesarios y se debe contar con reserva de medios de cultivo. Para un almacenamiento prolongado, la mayoría de los medios deben refrigerarse. pero se Lo^ JeN: templar :i icm peratura ambiente puru su im.x:ulaeión. A pesar tic vjue el personal que iralisija tiempo eomplcm en el área de organización puede conocer de memoria Itis medios de cultivo que requiere cada lepo de muestra, es esencial tener los pronwolus adecuados y las. instrucciones cscrilas en un tiolelín Je anuncios o jochí idus en el manual 4.1c ptdíiieas v procedimietitos pul a Las personas que realizan estas tareas cu forma ocasional. Se debe procurar que el procesamiento de las mucslras sea llevado a cabo por personal bien entrenado, lu jo un.; caricia %tipcrv isióo [.os errores o los juicios cqui voeado.s que se eorneien durante esia fa^c Jel ciclo de diag­ nóstico pueden anular toda la pericia profesional que w? pueda aplicar en la leclura e Lntcrpretneíón de los cultivos. Los microbiólogos y los técnicos expertos a menudo no pueden llegar a un diagnostico definitivo porque se seleccionó un medio inadecuado o incorrecto para mía muestra, Técnfos pata t i M it in de tas maestras. El cqui |\¿mienlo necesa­ rio para la inoculación primaria de las muestras e* bastante simple. Se reeomíendu el uso de un ansa o anua recta de inoeu’ Iación de Niehrome* o de platino d'ig. l-fti, con un extremo insertado en una empuñadura cilindrica para t'aeniiar su uldi-

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

2B

C A P ÍT U L O 1 In l’ ü litcc ic n a la tiricrobJoF^ag ¡a: Parto I

Ctrad.ro 1-11

A p r a ( liir n 'm 'k ib c inhihidvn.'s u lilir Jilos ron r.ia»or fm ru c n d ji

M i \ R IN H IB ID O R í h H IH F K R E N C IA L lP .1

COMPUESTOS a g r e g a d o s i i : o i »»

M IC R O O R G A N IS M O S M IC R O O R G A N IS M O S IN H IB ID O S K N K IQ U E C IIX M

CO M EVTARJO &REFERF.NC1A DE C A P Íli'J .O

Bt)¿¡ igritxíf.'i ¡ii1jw -.:u 1¡ií,l (Flor.) CE. Di

Jíuktf HmLi.lIes jEl l,-itilirLa >t)i

hCü^pctLi Je 1m hzi:[c:ia:r

i i i j ] • ■¿z iim S tntiiSfi fran ífpi

E,.i 1 I. - c.Lüsiyr? ■;! i.-;:. .miuMi' l!l' jj fragiti-t

C-'unffj-UA}1 Jh

&OLHn¿iCÍfcL hhíi'siHuchh, mj|iMi n^, cdm M nt. pi>]iro>*iim ü (Ti

Ktyyortu de

C’^.vi y-' l/ifmn 1r ft

Lii iflnifetfi^fi n 42 ' C tam/hi¿n « Ire tknu a r , jtJHM

CCTA [t. D)

í'ictosaiifl. Cefasilina Ii;: Fruaou |[Jj

Mayoría
ChtMFltíhlK iSitih Üf

{'oljm iH am-anllas: muy inhitaiinr

C H íK lM ajar (D)

Varios 1 D i

Nl> rnn d:H|*Kiihki

Viirh»

n tTilnr ■AJtií,rir l;i itLrnlLllL'iH.~rin dí Lis R rim lu

C1NCIJ

f ’ ffíLilt^lina, líja-íanL JKWJhtfk'UlJl I ¡

Mayomi ú r Ií -. ta rtw m

Eís [k v ip í Je tf-rtNiiií li^fL'cwi de . lt r'rirfKirfan

Varins. Funnolaü iiuv-í di^sorahlf^

CXÁ (l)

Columna ¡L'ÍlKl nj-iI id■YHh 11 ■

b;n;lrtiJi fnnrtní^.ül ¡Vas

friieienav ¡¡nL-frifMTiÍEÍxüs

Se irahifhtrri bi aruvoi i;i^r b» rL'poN.dc íf^rti^'/w vrraj J aJ^unu ef|U'- de 5- w n u

ER1H i l j »

EcwinnE); e-winj. a/u3 de jnrti-le- linden^ ^rampíwirivjii ruj. Ja-. Iomj_ tacaima íD j

B¡Klfn¡K .T;iniii«t1ivT’

IJ^Lfíimínle- íílL\’h'£mnhitii-d(ir): Un i.il^UDLSÍÜUIn íímtlíldíLUniCS l t Jj/UlPHj ii ‘.Kmtria pníJuceneoJoíiiawuní iwgTO IbK íf mwinai.líir^ de PacuroiSn nmSD Y m inla íríiilmKMfJ'irjrtJt ü^¡»cs-;rv HJdmitwt ni Jus ríTmtiHjpJoK-^ di' lanm;ih: |nt fticmct ícmtfnUdrtm üf ladosi injmo Eseheriehia m if q i ‘tliu ililu i.e:É1>f |iri"JliLtll l'i| :l l-.i VC1l!l cacacUifaiifl)

JIdlJLirn cnlárim (1 CELi i 1, D.I

S.ji!#"í haliartlh <|]r hidíi'i.L •< HiKkjidi 2ra.nifHTh.i[|xii« sJEiíEoj. ii/ul Je t>;ortlfltitw*]. ílBvitlii ¡kHlI é iP¡ líi■\cil r.ici’. de Mtdin. dtram anrtniCT t& i ¡llh» pai'a Jj piH.’niüLtLúJL lJ huLt'um • £■>1

F^gjenw eniÉrifl»*

MíKkwJínscrilc nhihktor. k * ícnixTiíidi.n^ 4í Ijliu 'o [kkohhu, Minina) pmdiiccn colmita.'i vcfdo; los jm»duLiurcv de -^Sfiiíf de hidnt'^crn i iwlíjjii Ctíkxiiu iberas

LK V [1)

Kammkina. vjüx'úinj^jQS ii)

Bucrl^ frjmríg^dvníi Bihrkríjo aOTfci«í fractci i .ls ptisií|’c>s¡ q\ . iv, urupri him, p.irtu Ll..r nnaeriiWa! mcnle B a ctrp^dtf

Se ii“pef4J hjn.Lur hínn'liíjda. tonw f-itei iÍL lIj niilijiinlo.; cji mcJio ju jo tn 'íeteccicirarse Fnt?n.x:nim rc^i ■t la vinonnid na

tiluvCLiptiey [I, Ü}

Ín tcí b]lij.nB». lHüLiI iiLiíJcia ll): íLtfrfr^i, mjo rvftnro r | >>

B.íicIctí

Mnikrardainenci! inhlhiJur (■.deciiwh; Iik fcnm’nLiiAne-t de bduMa pn.idi.i«.-LiUmiah mj¡n; enJn íIi^mmLMei liiiir.u¿iK:¡iint'ft >irt en.'ttal tLi kca

M a n ild -u l ll» H

NaC.'l Ci I*.

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CliJRinlciiimt, ■-i-hiiiL.xin'j'.l.i l J > DLi. [cñíUL l ll 1Jusk-. sjpniHliri!^ Ly iljufla!. fifflúgeaií!. fún^iwníí

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rejo fefKtí [jSh B^ieiu'b £4 itmeKa[|vqM baClírbü ^|-»Dpt«»3l.Í%4i% LjLi>r ii< sean .SrjTfJn/íifvirt-u.',

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PlHl'íytl'Hlt LTlüírifl.K»"

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i.fPS tiísfllococüi CiJJfbljsü ntffldltKi iimí?n cii ...■_[ ^fll, ¡rji) nu :¡:rnbRiLiii rrurJLid

Drrmaiüfiius. b,^nfi,» dütn ín líT *

r~lj!tiuiüui

B Est ignna del d r . VaFbr Eso

Fsses dtl ciclo diagnústco 29

Cuadro t-11

A [ 9 n » diferenriate** ínhíhídrurs utilÍAadns con, rnpjíitr ftvcuvnciu (cw rilj M ICH O O UQ NISM CKS SU C BO O R C A M SM O S tM Ü BIEU Js EN RIQ U EC IO O S

,WiAH UNEtl&llKJlt 113 l'} D IF E R E N C IA L til»

c i IM PU ESTO S A t;t£ í*A D lM í íl O 1J1

PC (.PirJUÍmilUHIiU fíteriAiiJi'¿fii/j] i 'tji«i (¡¡7) íl, m

VOnleui üc gfiitiiifu. u lh l'iSiiifL's pnra liü fle H ** gp .m p tw i!¡v¡i'. U i; filt1JnkiL itj Jt, Lii:j j l j Líiilí p jij haeitrin jír;ur^riec¿hvis r] piruv i t3.i

i1!*..•JLJi ..fj/rr m ú . f h\Ii DjRtfi ij” ^Lrtnifiniu^j,'. ¡tt rnjyiíriu dff Iji'i íij ^ ic-

PU A th

K-'Uik’iiI aN^hol | B1

B á Ltu ri.h

V ij'iti.-k r i t a - S F ii x t lI ii iSIHi rl. Di

S i l « hilianc^. verd e h n !D »sc f]fc

ttaacríu'. ^Tunip.^Li^

pamnepiüi'.ai

C O M EN T A ÍU Q S/H EFLIIESC U U E C A l'iT L L O A|c,i 'clrt.iihULiul; Lis n>limijs i'.tr^L-, ras si'i miaifilvlaTtifíih: {'«ix’düici f'.i. j ít . ú e p ú c lu

Baetfnas íiam prnitivu-H ñlti^fl>« i'n^r-.u • •

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Sortiil- !• M icCank^ |l, D)

Siles h ü iiK '. v id líla da g e fi£ i» a i ■Ti; snrHínl. mjo r í UItk' 1]1|

TCBS li. Ol

Hacrfu i ' ¡$r¡niifivihvüis Li É-speíic-i Je Wí-i-w 1iftsu1Utí> íc sínlk, ciíruiii •!.• uij-.i-tíj J _■J j 1 hjLdiniD LLldlM. 1pLlTj tlV.líriiJi frimiwgariva^ (ti. hnl¡.iri>r NJ.CI [u t j Itw-teriss pfam pDMti-

Dutarids gftnijkKítñui 1si 1-"1:
Ajmu p-^rii búiqtJíJi de Í7. -uíi pmduCIml de v-enUnvin * t i- í '■ [H.1l"il."■ ■¡urnim uJifvi df saci' m u iip j:n .i/ n julLmiiICns. l u é:,|Sí ít ^ i[iic util¡¡ejui vhir«M- 3par«'^i m uía

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/■juii'in. Lu mués ¡.ya puede ser inoculada de difcrcnlcs maneras s*obre Ja superficie del agar en 3a piuca de Pttri, una de las cua­ les, se muestra en la íigum 1-7, La inoculacido primaria puede níaJmirM? t h-ip u 11 jiihm. un Eiisopu u uIto disposilLtu adecuado, Un.ii ve/ que se realizó el iinículo prim.irio, m: puede uliJirur un 11 -¿rt o uti un>J recta para espcueif el material dentro de lo* cuaIro cuajbmttK de Ja placa, como se muestra en la figura 1•&, LI jnriculo se siembra en o iría con un movimiento hacia atrás y hacia adelanLe dentro de cada cuádrame girando la placa en ángulos de íX^. lil aiisu-u el atisj recia debe esterilizarse entre Jas sucesivas Sembrasen estría en cada cuadrante. E l prepósi­ to de ente proceso ea diJuirSdfieicntemcnlc e] inoculo sobre la superficie tlel medio con agar de irianer.i de obtener colonia* de lucicnas biei> aisladas. COmn'idás cotilo unidades forrriadofits de colunias (L-FC), Las colonia:. ji:dadaj> pueden sobeiiltivarse de manen individual cu otro medits para obtener poblacio’ nes puras de mlcnooi^anisino1; pura su estudio posterior. Cuando se siembran en csiría en una placa de agar sangre los hisuplidos laríngeos enviados para la búsqueda de csireploco tos. se deben rcaü^ir imllEipleá punzadas est Ea'. ¿teas de itto-

culación para desenmascarar las tiemoLsmas lábiles a Ja pre­ sencia de oxígeno, In cuuJ aumenta la dilección de csinepmcocos fl-henioliticos. También se deben Mimergii' en la pro] undidaJ del agar ki> pequeños fragmentos de tejido que se em iaron paip el aislamiento de liori^o^, E l cree imiento raicuil de muchas especies de htíliijos se \e fiivoreeido por la atmosfera ímcíoaerotila que se encuentra debajo de la superlirie del agar. Kn la figura 1-V se muestra la técnica de siembra en estría ulíJizada para inocular el agar para el recuento semkuuntilali vo de colonias. Las uusps Uc iuDCutaciíni desechabJcs de plás­ tico o de materiales diferentes del hierro (Nielinmic tj de plaJsno), calibnwlaí para contener 0.01 o OJXII inL de líquido, ^e '■uniergcn cu una inu£sGm de orina nci eentrifugada, Luego, se reí ira el ansa con cuidado y se coliga el volumen ecnipldu suhre Lj superficie cBcl agar haciendo una estría u través del centro. El inoculo ms esparce de modo uniforme en áneulos icflos respecto de Lp pnmcpi estría; Juego se gira la placa W y se «paree el mácula hasta cubrir la ^ n c i c completa, En ¡ilgunih lalwatorios. se inoculan tíos placas, una con el ansa de a o i mL v 3a otra con la de 0JD0J mL. lo cual se utiliza como

B Est igma del d r. VaFbr Eso

30

Ca p i Tu LO 1 Inlrodüccidm a [a microb ivlog ía: Parte i

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filiHTJs il.' ülilu'iLi’jIunj iiNi:ihtrr rtjli'NlUs tteieienWa*:11-sH:-iilii^.

control tic calidaJ. A pesar de que lus Lindas Je inoculación ■están calibradas fMfíi toniísr el volumen de orina establecido. h\ c x i i c t i l L i ü lie lie una iasa tic e n m r d e ± 50 ' » isufa rc U s Je í c u j í i d o se utiliza el ansa de 0,00] m L.1La loma de muestra en posición vertical de un recipiente pequeño puede sóln c < i n i c n c r el flftíílíl -1 voluniL-n ¿ s t í L b E e e i d ú : m ieoim q u e I j toma de m u i;s [r - j. hori­ zontal en un Angulo d e 4.V" de un red pienLe g r a n d e p u e d e c o n ­ t e n e r 150% del volumen. Uvs r»kn>bmloj;
A<>mL cíe colóranle íi unía cubeta con 2 mL de agua que luego se lee en un espeeirorotóíTieiro a S W ¡m o 2 1 en forma mattomílriea, anulando el lje íiIh ü cu el peso de un diseo de papel de tlluro ubicado sobre la bandeja de uaa balanza analítica muy sc-nHiblCn cuando se Le u^rega un ansa de aijuii. Existen dis-pn«ilivOS piiv.L Itininr un iniVutr:! e.sljrtdüf ll pjrlLr de iOueblruíi líquidas.” Luego ik 18 n 24 horas de incubación be estima el número de bacterias en una muestra de orina mediante el recuento de cnlnnias Sobre L j superficie del aiiur. Como se clluWira en la figura l-IOHhay aproximadamente 5í) colonia?. Si se ulilifñ un ansa de (1,001 mL pan inocular el medio, el mi mero de cokyniaü ilelje multiplicarse por 1 0f)0. FOI lo tunta, el reaicoto du esta Upara e i 50 U0Ü L'f-C/mL.

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B Est ignna del d r. VaFbr Eso

Fases del ciclo diagnóstico 31

Las técnicas semicuami cativas se utilizan má*a menudo con las muestras de orina. pero también se han empleado par» otros tipos de situaciones. 1j j cuantiFiotcfón de bacterias aisladas de Eas vías aéreas Ijajíts por técnicas de broricoscopia puede ayu­ dar ea ta interpretación Je eslos cliltin K 111Cuando Ja5bacterias están presenies en concentraciones mayores de 10-10* UPC, la probabilidad de que sean el agente causal de la neumonía es uuiyor que cuando se encuentran en menor cantidad. Se ¡lumk evitar un trabajo considerable m no ¿e realiza el anillas de los recuentos bajos que Corresponderían a flora contaminante de la faringe. l3ara evaluar Ja probabilidad de que Jos catéieres ¡ntravasculares sean la fuerte de una fracleriemia, suelea emplearse lew cultivos icm¡cualitativos A pesar de que se han utilizado numerosas técnicas, el enfu^ue más usual es hacer rodare! seg­ mento amputado del catéter sobre ¡a superficie lie] agar"1Si Ioü recuentos muestran mis de 15 colonias bacterianas, existe- ana asociación estadística entre el aislamiento de la bacteria y ln bactericmía relucionadá con tos catéteres, l-n este enfoque, el catéLer se CKtiae coa el objeto de realizar el análisis. La euantifícación Je las bacterias en una muestra de sanare obtenida a través de un catéter intravascular permanente se lia utilizado, además, para determinar el papel det catéter en un proceso infeccioso.^ La euantificación también puede ser de utilidad er* virología para determinar el significado de un v ía is , como citomegalüvinjs7 que puede provocar una infección pcrsistcnlc,1 Ademas, puede controlarse la eficacia de la Lpnmitilerupia aniivirjl a tra­ vés del seguimiento de la cantidad de viruh presente.'’' Muchos de los análisis cuantitativos para las enfermedades virales (car­ cas virales) emplean la detección molecular en lujj|;tr de los cul­ tivos. Los medios en los tubos paeden ser ltí|u:dos, scmisélidos {0,3^ a 0.5% de agar) n sólida a 2^ de agar). E l agar semisíllido es adeeaado para ensayos de movilidad. Un íabo con Caldo puede inocularse con los método* que se muestran en la figura 1-11. E l tubo debe indinarse en un ángulo aproxima­ do de JO 3y el ansa de inoculación con ta muestra debe tocar la superficie interna del vidrio, justo |xlr arriba del punto donde la superficie del caldo forma un ángulo agudo. Cuando el mho de cultivo retoma a su posición vertical, el área de inoculación queda sumergida por debajo de ta superficie. Lo> directores de laboratorio y IOS JiUpí rvíSiOres de ñiicitihiübgíü deben determi­ nar que muestras deben transferirse a caldos de cultivo de ruti­ na i véase cuadro I -6). E l agar “ en pico de flauta” ten tubo inclinado) se inocula punzando primero la profundidad del agar y luego haciendo una estría sobre el agar inclinado desde ahajo liada arriba con un movimiento de S a medida que se retira e! ansa recta de ¡no culación (figs. ] -S2 y 1-13). Cuando se inocula un tubo de agar semísólido para ensayos Lte movilidad, es importante que el ansii recta de inoculadOn se rdliic exactamente por d mismo siliu en que se pun/.ó el medio. Un movimiento en abanico puede dar como resultado un patrón de crecimiento a lo largo de la lífle& de punción que puede interpretarse en l'ormn erró­ nea como movilidad bacteriana. Ciertas muestras pueden necesitar centrifugación o til Erado para concentrar cualquier microorganismo présenle. Las mues­ tras densas y mucosas de esputo pueden hacerse más líquidas con jV*acetilcisreína (Mucomysf1', WelESpring Pharmaceutical Corp.. Neplune, ISJ) para facilitar ta siembra en estría sobre 9a superficie del agar. Las muestras de esputo que se procesan para el aislamiento de las especie.', de Aíycabüticríuin deben también sraiarsc con hictrÓKtdo de sodio para reducir et sobre-

Fjgura 1-1D Piara flnlíle de ap:ir «uipi-a^ar d i M nfonke? pnedameíile t-^tri-jiJ-JL paca un rwufiil^ «m icuantilíli^ du rotan i;u CH/ircuTx e ilustra ¿n la

fisura l-cí A^níKVdi. ■[WPSirandHmfnlCL 50«4oniüt n fad¡L IwkxJe l;i r&Kü, £¡ \c útilm i jxirj la \ÍL-iLihi j. jq estría en lü Ií ihhIkíuii j l u de ¡hucsiIjljmii de (t

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de las bacterias con Laminan Les. QLras muestras que se envían para el aislamiento de micobacterias. como la orina o la suspensión de buces, tam bién pueden ser Iratadas b reve m en ­ te con NaOH para eliminar las bacterias colonizantes. De maneta similar, se pueden utilizar antibióticos para controlar el crccimicnlo bacteriano en el medio de cultivo y en las monocapas de células que se empican para el aislamiento de v ira s, Los líquidos corporales, como Jos obtenidos por EoracemesK y paracentesis, primero deben dejarse sedimentar, lueeo de lo c re cim ie n to

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B Est ¡gima del d r. VaFbr Eso

32

CAPÍTULO 1 IntrDdiiccicn éi la mier-abialnqiii. Paite t

2. L j s relaciones scmicualitali'Yus Je los tipos bacterianos ais­ lados se pueden ver en una placa de apar pero se pierden en un caldo de cultivo. ?. F'l írmis di recio. latí importante pura deienmnur lu naturale­ za inflamatoria de una muestra, y los upo* de bacterias pre­ sentes. se pierden si se iiuicuki lu muestra completa eit un caldo,

F ig u r a

1>13

T ó c n lriie l? tn>?ulacKMi en auar lr.-_-;ii¡:l .I■:i « n j u n p n s a n c lp . ( A l

v u * « li% i¡= iw ij ili; 2 0 m m t k l f c a d ú t k l Col».), S i s í t w ii e l fo íid n del lubci p u e d e inp r c u r atrs ■= in v *l¡d a r

I 'í t U l Í i í j « n p n ) J u n ü i 4 h i t e l u | i s r e n p i e ü t i í í l a i l i i I h m ¡ i

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Ctuí ía-* iilsuuiMus de sedim eillo se esmirifugati |wu concentrar tLiulqiiiuT buCleria que pudiera (¿star prevente. Se deben ptoput

cmníi r frascos de hemocuftivo para inocular en forma direíla cieñas rmic-striis. cornil yq si: anatirá. Hsla p n íclica es aito u s-

da en laí pocas situaciones en las que se esperan pequeras canúdades de un único patógeno. Ein oLran situaeioneü Jebe desa­ lentarse e.sin prtieiiea por numerosas razones: I. .SI *e encucnlrao presente?; especies bacterianas mistan, las bacterias que crezcan más rápido sobrepagarán en mlmeio a sus ¡lurierituui que creccu más lentamente.

Fig u ra 1-13 T^jiLlh |\íu ¿¡t iiixuEocLúiidE '.i p iu ívn JId ^ Id í L¡n in-u ^in un

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Lus muestras de líquido Cefalorraquídeo, en particular para el aislamiento de Cri'pfoctKt'iix iit'i/ftirriumx, deben centrifu­ garse y p.Lrte deE sedimento transferirse al medio de cultivo apropiado; n preferiblemente. se debe pasar el líquido por un filiro tnicrohinlógico de 0,45 pin para atrapara Iüih levaduras más ¿¡randes que pudieran esiar presentes. Lus NlkLriHir£ulii>irio.s JitlerLil en su LuiiLp>i:]'aLiJrü. óptima L^e incubación. Csi los laborulorios pequeilns que cuentan con recursos limitarlos, ;l vcecs no es. posible- ilisponer l£c las Icmperal Liras óptimas rie incubación para el ereeimienio de ¡odns fos airamiento* clfnk,n>s. La muyorfu de los microorganismos (.teteo u 35 C. jiy] 1c.» unió, i-u dispone du ui] solcf incuba­ dor., éste debe fijarse a J5 'C. Jueluso Jos mieroorganismús como Cfímpy fobacter jfjuni- que crece en f'nrma óptima li 42 tTt\'criin ii 35 i ' si se lo^ inccth^ p^r 24 n boraf- mds, Si ti embargo, en esie caso se pierde el efecio diferencial <.k ta i-iL iilVL.-ii-'-M :cni]'L-i iLtinai i i í .i u i k ' s en l;is llííu’ oLí¿lh biittClias no LTceen. LL crecímcenlo de la mayoría de tos microorganis­ mos se ve fnvoneeido en una atmósfera de V7v a XW'.\ de C G ;. Si se ilÉ^pt^ne sóln de aire- amhieoly.1. es decir cié un iucnbaílor ■nin C'í>,. ]oí¡ nihos y las placas de cutían pueden ubicarse en una jarra de ariaerobiosis |ior «tinción con unii veta y colocar entonce* ti>du tiste diiposiuui uii iucubaciún. Pur el eontroriu, se puede nwnlencrunn atmósfera de ,iirc ambiental en cm meohádñr é(]n t’O, uokícando los cutlivos itcniro de una jaira t"óo la ta]iss muy ajudiada íes adecuada una jarra o cámara ile anaensbinsis). Sin emltirpo, tiay que lener en cnenla que un microorganismo como C. jejuni. que requiere unjt tensión reducida de oxígeno Ltel 5^ o menor, tendrá Üiticutliwtc^ p;ira crecer en una jarra de anaerx>biosis por cnlinciñn de una vela, en la cual ta concenttaeión ilí oxfjicno se eitcnenira en el rango (fc l(K í. Muí-hus nüeruorguiii.sdnos crecen en forma óptima dentro de un estrecho rango de lemperanira; olios llenen un espectro teíativpmenle amplio denlm del ¡iu\sl piedcr aislarse- Ya se rnen;cionó la temperatura óptima de crecimiento de C. jejtmi s de 42 T . t^j mavdij'ij de Itti 3u>n«os crecen a 30 'C . sin emllarpu. ptbeden ser aislador a temperatura ambiente o a 35 CC en el oiedio ¿idecuaiEú. Yersirtia entrnicaliticí! crece de manera ópti­ ma apenas por encima íte la temperatura ambiente. N'o obstan­ te. la mayoría de las cepas también, crecerán :l 35 C\ aunque la^ colonias pueden ser pwiueflas o recpierii un periudu de iaiculiacíúji adicional de 24 iaoras. S^?r consiguiente, no es habituaJ que la disponibilidad de una única estufa de incubación compnimcta Incapacidad Ltel mierobióloigodeaisEar la mayoría de las bac­ terias de importancia clínica. En los grandes laboratorios donde existe poslbílltlad de coniar $w\ varias te rnperaturjs de ¡imulueión. el aislumiento de los rnieíoot^ankmos es. u menudo, rnás rápido j la apariencia de las colonias se asemeja inás a ta roorfologi'a verdadera, Fn ocasiones, la incubación a temperatura ambienie pnr un pcrícnto prolcuígado puede ser necesaria para deuiosllar cieilas eai'aetúlísticas tlinquímicas O físicas* como la. pnjJueeiÓLi de un pigmento y la movilidad.. E^tos ajustes se aprenden con ln experiencia y p*T ensayo y enw. Aun mas importante que ur¡i tempernluni espceilíeaíleincubución es. prohablenicntc, evitar las EluclUaciones en h lemiieralura íte la c&lufa- Se debe cúiiinílar esa temperatura de modo

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

Fases del ciclo diagnóstico 33

muy cslLTiclo con fluctuaciones no mayores, de ± 1-2* de un día para otro. üts estufas -de incubación deben ubicarse y prote­ gerse de manera que Jas perillas tic c<>mrol no puedan ser fácil­ mente alteradas ¡m i el pírsoned de limnplemt durante las horas en que el laboratorio estd cerrado. También es importante el control Je la humedad mienta de la estufa. La mayoría de Los microorganismos crecen al máxi* md cuando la humedad es de 70% o mayor y Eos medio» de cultivas tienden a deteriorarse más rápidamente cuándo -se secan de manera inapropiada, E l aislamiento en pan te ufar de1 IL jn litri. y en menor medida, de jV. xoH rtrfhóeae requiere una atmósfera de alta humedad, La mayoría de las estufas com­ pradas durante tos últimos aóos contienen reservónos de agua mediante los cuales se puede controlar la humedad en Ea cáma­ ra de incubación. De lo contrario, se pueden ubicar sobre los c;Lun|cü recipientes abiertos de boca nncha. nun agua ]iaj i que proporcionen, por evaporación la humedad necesaria. También se debe controlar periódicamente ¡as esluías para verificar que no se príKluz.can derrames que pasan inadvertidos y que pue­ den piLxiucií contaminaciones «i una acumulación de .stisutncias químicas de los reactivos que inhiban el crecimiento bac­ teriano,

F ig u r e 1- H

n a c a d e a p a r , t a m a l h a s h I u í i u m U íh I j c u r t U S a m u e s tr a d e p i í l ,

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e r i h i í q u e e ^ c íw icw ikim » c s p t o d u c - iii’i (¡m iS i^ n p w t u a m e b ^ d e v i d a l i k í .

INTERPRETACIÓN OE LOS CULTIVOS La interpretación de tos tullidos primarios después de 24 a ■t® homs de incubación requiere una habilidad eunsiderahle. A panir de la observación inicial el microbiólogo debe determi­ nar h flaturídeía dé las colonias aisladas y decidir Si se requie­ ren otros procedimientos. Los parámetros relevantes son Ea?. características y el número relativo de cada tipo de colonia que se aisló en el cultivo en agar; la pureza, la reacción de Gram y la morfología de las baclerias en cada lipo de colonia; y los cambios en el medio, Eos cuales reflejan la actividad metabolica de las bacterias en las colonias adyacentes. Durante el proceso de obtención de Lis muestras de los pacientes o de su m anipu lación en el lab o rato rio se putden

introducir microorganismos extraños del ambiente o de la ñora propia del individuo que manipula d cultivo. íVvr ejem plo, en

Eos hemocultivos es frecuente el hallazgo de flora de la piel que debe interpretarse con cuidado, Además, se pueden introducir ■ ‘ conlnminantes" en el proeeso de fabricación y manipul;ieión de los productos m ierobiológicos, enmn las placas de agar. Puede ser extraño que una colonia aparezca en Ea segunda o la tercera área de siembra en eslria de la placa, sin que haya erecido en la ¡torta de Inoculación inicia I, Estas colonias pueden ignorarse aunque te les debe prestar especial atención a los patógenos importantes que son “ contaminantes" puco comu­ nes. Un problema mayor se presenta cuando desamóla una tínica colonia de un microorganismo de la pieE, como Sujptiylücotcat coagulosa negativo, en la zona primaria Lie ¡noeu¡ación, EilLsLc, por supuesto un tercio o un cuarto de probahit i dad de que un contaminante de la placa se encuentre en la primera zona. Si Ea muestra e*; crítica. como liquido cefalorra­ quídeo, y se conservó en el laboratorio, puede inocularse nue­ vamente sobre la superficie del agar. Aunque no es apropiad:! ignorar la cepa aislada en estas circunstancias, corresponde adjuntar un comentario donde conste (pie aisló una única colonia y que no fue nuevamente aislada en la muestra. Luego, el módico puede reunir la evidencia del laboratorio y clínica ante» de hacer la interpretación final del significado. A veces se presentan situaciones arípieas. Por ejemplo, se pueden aislar microorganismos mixtos que se asemejan a la floni propia de las vías aereas altas de un sitio normalmente

estéril. Es difícil evitarla Fyjspechade que alguien ''estornudó” sobre la pUea. pero la evacuación posterior dependerá del aná­ lisis de todos los factores, quizás incluso enfullando con el módico. Ln la figura 1-14 se muestra un fenómeno de labora­ torio muy inusual. Caraciamiicas macroscópicas ¿fs las cütoniaz La determinación de las características generales de las colonias suele realizarse u través de la inspección de la superficie de la placa de agar. Liste análisis se realiza sosteniendo la placa en una ruano y observando la superficie del ajiar para veriíieiar lu pTcseneia de crecimiento bacteriano (fie, 1-15). Las placas de cultivo están­ dares tienen un diámetro de IIHtmrn y son adecuadas psifá sos­ tenerlas con una mano. Debe estudiarse cada placa con cuida­ do, porque la bacteria que se aísla inidahncntcdc las muestras se encuentran a menudo en un cultivo mixto y puede haber pre­ sentes diversos tipos de colonias. Las colunias punlifomies de bacterias de crecimiento lento pueden pasarse por alio entre colonias más grandes, sobre lodo si hay una tendencia de cre> cimiento a esparcir**: s¡*bre la superficie de la placa. Dormite el examen, las placas deben ser inclinadas en varias direcciones, bajo iluminación directa bnltantc. de manera que la luz: se refleje desde varios ánjiulos. Se recomienda la utiliza­ ción de una Enpa o de un microscopio de disección para ayudar en la iletecdón de las colonias pequeílas o inmaduras y mejo­ rar la observación de sus características (lig. 1-16). I_j s placas de ag.Tr sangre deberían examinarse con un transiEliminador de luz brillante por detrás para detectar las reacciones de bernólisis en el ug¿ir íftg. 1-17), La figura 1-18 contiene términos e ilustraciones útiles para la descripción de las colonias bacterianas. En Eos recuadras 18 a E- IE> se esquem atizan guías ad icio n ales

Aunque son difíciles de describir en forma específica, los olores producidos por la acción de ciertas bacicrias en Eos me­ dios de cultivo sólidos v líquidos pueden ser muy útiles en la identificación tcnlaliva de Ins rnicnswrrganismos involucrados (cuadro 1-Í2J. H.I olfaleo siempre deh»e realizarse con precau­ ción. levantando la tapa de la placa de Petri levemente para

B Estignnadel dr.VaFbrEso

34 CAP iTULü i

1ittr&ducc \6a a la mi trotl ol 3gia: Parte J

f igura 1-17 Ti^nku paru eE jM Iü ís dí I crecimiento ife las ¡.•ultMiia* cji Ea ciiperficicdc ütu p|j<-i de apir hHüt^wJo la lsFi™ vanilw Í3, Bita (fcmc^e* úliJ

pjralu ev¡Jum;¡£ín Je Ito prop¡CÉ.Mik:* hínüJfistastk l« cuíhuiíu? j^igur «ningrc

ntcGrtcM

Figura 1-15 TrénicJ riLr'«nilis»* de ^ superficie Je b p|ac-i ¿la ?£3F p¡» ntcdiuJcl reEfcjo dtrecioy oblicuo ík la Liv..

Figura 1-18 T ía iió i puía el Jirálisi'. ¡Jet neeinuetfHu de Ij ^ lliIm l .h cit Ls Hipcrtlcic de unn placa ¡fe -íipr que uJilúa uní ferUe de ntaru»,

Figura 1-10 ElusLi^uuúch de lü v m ji futíaL3- imidtriégka* Je Ej í culccúas. lt> íi

ct :i-irvil íL' de Iqí [dnniiKM de rada una.

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Fases del ciclo diagnóstico 35

Recuadro 1'<6 Características utilizadas para la ideridllec­ ción de las colonias bacterianas Jiffít.jiíia; Ji,íiiK-|,r«k i.rl linl íliwrn •■ ■

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JpíH'rfK-rí': brillante. mate. otfoü I>trKÍdtHt: cjh kí, tran'sliicUb. inuiipurentc. tíra*. CnmtrcwKrñi: umluo«n o maniccnt*, vhf<»fc. fnanJtwajKHa, qucliridtfa, meras 1"i Ííui Jr djimAurÁi

í

i iLuniruj j -j* ¡ i j r

Recuadro 1-S Reoedones en medlo r¡gar utilizadas en la Identificación de las bacterias HiTiólinh

en a g a r b in a r e

A l f a : ü t a r i í i e je i i J n [ ' j j ' . u l

OIdm s earaeicrú ticú s de l(K mienDhios stilecciün»dns+

M IC RO BIO

iPl-.ror.j- pji)|iJi:TTtie, clüruUir. fikfncntou , im piJar, riztiide, jiívih m I.i AYnwPfto; p ljd i elev*tb, rn - n n . pwlviniFi.Tnic (en- ím na de alrwJinda), en íwrnia ik Miün. umbi lkitki Murgtn IborJe de la cotonía): Liso tí ojcIinluí. «miüiiIjíIu. lobuLudü, cu n íd ci filajncíiiow>. tibcpeüpadü t'.if-'t

Cuadro 1-12

I_ ^,oi¡.-ic j í i c J l - J ' , i d e U t l'.iN ' ii.j.-, « rtv

O IÍÍR

AtkftiigfiITT ftiiftih't 1txioruns 1

A ii-imivl.iií^ rceién L^nnaJis

Cnijm KF-J de It» CTTX’

Kimiliir □bh [üdumiLix de mair

ÜsflUL'ILTi líe (.'iUrdiibl

A IctüJLda

t-^^ieciet ie Orm/npríir

A cíil^itln ^Tunn-

Cltritrídiiun difficilr

A ]njd:idL>. Iilvl -i

EAfwri*' ifc

I3FO

lrrutü

Eikfttríta fflw rfífli

A lejiu

r.'-fiL'. iL-. ifc Htirjinfj’hiiui,

A i'cLije húnlnk»

tL-Hf'icLiíi de jVr.H.i,'íJd j

A wkiLlu l í) íI nstíliu

ftvrirurfibi imiitjwifin

l^m píBlí lin iliili

iV|jP£,'jfrr;irpt>i-H.-i:Bj- tirhJe-í*■ i1'riri

I tmuJ

timptuJe Ikicítrtm d?) pifmeuUnltVi

A lie

lispceieí

A

íh iífM h rn e

P.hrudontoiiLii
A

ju f L l lÍ lT UVJIS

EL-vptt'ics de S tfA jfJb a m i

A tal/aditsud»

F.-spce-ieí i k SiwpitrfTifíTii

A muireea

E>pc^iei Je Sirtphmkes

A ^ íciu cun nwlm

ic

Pttirir.w

quctitad^

sm v ¡ u n b ¡ v d e « r fo t f ;il ^Frcle d e l i n e d j o ; c n A i n » i l ( l ; i ! e r ils u s v itm

üuctat B íu l hm ü de (laiiftiin n n

L a m p in a

d i l¿ u n ffí de^iKliw de la* l i i I i i .

* t'jnw i jHiíWMTOWium* '1'1^ k'#viLr ri itiin ¡ntniTrttan to

"« tt «lüBiíftwJi

pebfwhusi w AiiíhIm.

n ía s d e b i d o j L tU ¡^ J l - t i » « I ü ix H ld - s

G u n n : tü «mMffis en el medio iLfcdcdor de I d culonii; sin Ibis o e a iT M n d e o i d o r í k I b s e r i t t í ic i i m A l i a p itin m I t t lu i k I inLv UltfM ttpftüia tluncüiaC dnbclM i: ¡i3tiHkSiU>r>üú l j \ p íI m iL m , C o d tafia « j a i n d a t o n a d e b a o S M » . c o m p le t a c d I t p e r i f e r i a

P r t(tu c d 6n de inism fnnre en m n tk t s c íir l-'i .■ i

.-I I-

I

II

-I. »■!*.!.- p ii dU L .-I LU l Jl lili 1J l lu I i ir c i) l‘ 1

lia fla P iú c i l n i i i ñ

Rimemos ffc iín tM je n tc ^ Fipinemiw ci-ie n i y difunden íonliiiBd íii*

a k s e o k in H i'.

e n ¡ijy ir y e m a d r h u e r o L f d t u u s a : tm & iL- p r e c i p i t a d o e n l-I n iñ ü n q u e r u d e a Las L fíjü p lü s

LipASK "aipa potada". uní píllenla irldis^ence denhu e Lnmrdi,mmentc alrededor d ; ]»s eolflnins visible por itSIcJü de lu lu* Protewlisifr joña, claia que mdfli tas endemias,

Recuadro 1-10

Cam ilos en íes medios diferenciales

V u ic M c d í m u r a , i n d i c j i l i w s d e p l t y <s|i*k in g r e d ie n t e s s e i n f l u y e n r n k it m e d ir » t h f r r e n f i a lc s . cU* '¡ie m ^ r a en p l K f l ,. n in -en r o m o i n d i r a d e r e s d e a O iv i.I w W s n m i r r i n c v i '. j Hyud-in -i Ui id e n íific -K -k w i d e It»?

aislamjensusi twílerátKH

detectar el olor. Se dehe advertir al personal ele] laboratorio que algunas especies pueden infectar a las persona* y no deben ollalearse nunca. Si se sospecha la prebenda de Bacilius onthpacis, Francisella tulurcmis. Burkholíterüt pst'tidwmifci, cspcctcs culón ¡35 díscrim* y ilt I41 nicción sobre el medra. Estas características ion útiles para scltcí:rí]n[ir otnis mcdiüü diferenciales y ensayos spropiadns para D¡>mpletar la identiRcaeifin de los aislamiento*. Rn el cua­ dro I- U se enumeran algaaos de tos tipos tío colonias que se cncucniran en forma más freeuctilc, junio con los grupos de bacierías que se asocian con cada una, los ensayos udicionalcs tjue ít rétjiiitrcn pani ln idcntificacídn definitiva y la referencia de la imagen correspondiente a la lámina en color 1-.^. Ln Inspección inicial de las colonias ]w u la identificación preliminar de la^ bacterias es unu de lus puitiin piineipali:s del diagnóstico micnobioEógico y se analiza en detalle en los eapísliIüs k í j i u tcnies tíedicados a Iíis gnipns cspccífieos de hactcrias y de oems mieroorganisnins patógenos.

Difstsfícfscfón {¡e distintos tipas maitoingía bacteriana en tos culti­ vos PTJjííffs, Cuando las placas de ajar son sembradas para el aiskamientL» de balerías, c.s fácil selccciunor las colunias aí sla-

B Est ¡gima del dr.VaFbrEso

36 CAPÍTULO 1 Introducción a Pa misrDtnatagia: Parte I

Cu2d f O

1 -1 3

l á e a t i D u t c M f i p r e li m i n a r d e la s b a c t e r ia s p o r la s L i p o í d e c a ía n la s

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das par» su subcullivo. Sia embargo, en ocasiones el citáttumiUi rimesi ra tal amontonamiento que es difícil elegir colo­ nias individuales aisladas. Ante esta cvcniuaüidiid. los micunb ió lo g o s Cueallan con varios reCür*>OS (CU&díO 1 - 1 4 1 ,

Examen de las Unclenes de Gram de los úuílttóí Las impresiones preliminares.. basadas en la «bservacirín de las carafterí.siícas de las colonias Hpueden confirmarse mediante el estudio de los frotis teñidos con Gram* una técnica de rcaliMciún basiante simple. La pane superior y el cemro de Ja colonia que se va a estudiar se locan primero ton el estremo de un ansa de inocu­ lación recta, cuidando de no tocar el agar adyacente 1'íig. 1-19}. La parte de ¡a colonia que conforma la maestra se- emulsiona en una pe[|pcñ:L gol ¡a de aguan a lu d a n tiüiolópica iohrt uit por­ taobjetos para dispersar las bacterias individuales (fig. 1-20), Luego de que el portaobjetos se secó al aire, se fija Ja película

°C

bacteriana a la superficie del vidrio cosí calor, pasando rápida­ mente el portaobjetos cuatro o cinco veces a través de la llama de un mechero Runden o cubriendo el fitHis con metanol o eianol durante algunos minutos. El frotis fijado se ubica sobre un soporte para ¡iación y se realiza ta tinción de Gram como se describí; en el recuadro 1-6. El írotis teñido debe examinarse con el microscopio utila­ yando un objetivo de inmersión (las bacterias grampo&itiv&R. aparecen asnles: las grarmiegatLvas aparecen Tojas o rosas). Oirás tres caracterial icas son ulules para realizar la identifica­ ción preliminar de las cepas aisladas; 1) el tamaño y la forma de las bacterias. 2) el ordenamiento de las bacterias y 3) la preuncia o ta pérdida de estructuras! específicas u orp anillos (esporas, giítnulos metacromáticos, cuerpos de iocluw«n n otras características).

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Fases cfal ciclo d¡sgnóSt¡tO 37

ClííUltD 1-14

Técnicas tk prcpuraciún de aíslamienlus puros ¡i partir cte culm ní miMus DESCRIPCIÓN

T É C N IC A ^u/hcu líivii tlinfclfi

Tocar

ton oridadn

l a s u p e r f i c i e t k lu

lücvcüJh h ir lu piMMa (k L-:ii ¿l.i.M ifs iílPtUlítfiArv (flt) Un ¡Irtí4il; PMnaC urw r iu 'v i p Iji'L -j p a r a e l á L i l j n b i i n l i r i

Uso íle mftJnw wtftdvn1- Subculnvar la m lunu ü í inicriS m íht un j .'.i i q u e in h in ¡r¡¡ d

c n c c i m l e n i l c t i L .■ 1 j k

e(ií«iiis nfl^síadas; por íjéh»í>K miíhmiIL i\ j j L i l I u l i E l í f t t L í l l I l t j i i l j V ó M i h l ú l i a ¿ f u i

ifc MaeConkey para sepaiari-n de cocer

^lanipk^bii^or» lisu i!c v js id iiLia^ quLirn-

cas intiihidoru? iíKorporada* dertLro de] agar ItllljlOpO ■* Un irk'dlU

U lfl J í ffihíPs LÍ£ uíiriDirttlcüfi íHíiilúgu ü: una

[l|«4l íl? ifíir qiK C»>TTliejM aOtittftlCt», pero

Sut^ullzvjj la cutunk de interiS wjbfle un agai qut comcjiga n.ntihüSiic’os; o iik 4o iw íik ijiiíiTVkm que Lnlnhifán el ciBclmieiitoíle Lis «dM UH IMJ df Sfiiíljt

Suhnüll5^Ji la (itlñíuLi 4¡f irltóríU w*í£ l;i u rp c i fl'jic de un¡j p lo L j ctin a y a r y u liit ii:

un diwo irnpre-íflítdo tn anuhiíkic^ di^eñaJn [m m inhil^r L bucieria mu Jk^Lid.)

figura 1-13 Técnica [mj j nnThir uní colonia bacEcriüBa üisliuki con un uinu tclI ji

ro n rl dbjrLií de re a] i i a i

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tukiLull ¡'.ui en Hiím mt-Jiu.

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bEóiietj^ eipecJTicufe ames de que m: eueme con Li identificación final o eE antibiograma. Para realizar la idenLíuación prc ¡¡minar de un aislamiento bacteriano,. cí microbiólogo debe evaluar cada una de esta^

características, En ta lámina color 1-3 se muestra una serie de miaofoto^rafías de varias tinciones que ilustran rmmcrowoN tipos de morfología y ordenanlitóles espacióle!» de las bacterias que se encuentran con mayor frecuencia en los Eaboratorios c lí­ nicos. Con I» información que se obtiene de] análisis de las cotofib* Ijacleriajiax y la [irhiiói: de Grují i di; liHt fralis fjaeterijnoH, el microbiólogo puede orientarse hacia Ion ensayos particulares que le permitan realizarla identificación correcta. Por ejemplo, una cotnnia Eicmolítica amurilla cremosa y elevada presente en un agar vin fic ijue consiste encocas ^TániposiiLvos a¡jnipado\ es muy probablemente Staphylococcus (véase liimna color 13C), Una enloma (J-hcmoIílíca (t¿uth1úcida puntifbrme sobre agar sangre formada por cucos jxramptj^jILvok organizados en cadena es muy probable que sea un estreptococo (véase Lámina en color I-3D), .Sin embarco. los microbiólogos aprenden enseguida n no basar» sOlo en el examen de la tinción de Gram de los Irotis porque lits reacciones Je tinción pueden ser variables, sobre Uttlsj en d u iM j úc Jíi_h tuloniíw muy jóvenes o muy viejas. Lu morfología de las íiaccerias en una Unción de Gram es característica cuando los frotis se preparan de un caído de stiheultívo fne.KLo (4-íj horas). sn«ineíilo en el cual las bacterias se encuentran en la tase logarítmica de crecimiento A menuda, cuando |oü tTútiü ve prepanm de cotonías que etecen en la superficie deE agar, Ea morfología en la tinción de Gr-jm es menos canctcifstica. Los microbiólogos deben pKípontioníLr a los nicdicw tanta infonnación prclinsinar como sea ptuiblc. Ein ciertos ea'jt.vs especiales, como cuando se observan bacterias en un liemocultivo o directamente en LC R. esta información preLiminar pueble «:r lo suficientemente útil para indicar el tratamiento con unli-

PFIQCE01MIEMTQE PARA LA IQEHT1F1CACI0N PRELIMINAR 0£ U& BACTERIAS A:S LADAB La mayoría de Las ensayas ul il i/¿íúits pjia de le rmillar Ia actividad bioquímica o ruétubo!icu de las bacterias con el pro­ pósito de identificar una cepa, aislada sé teali/Jin medíame la inoculacidn de la ccpa aisladu pnniaria en medios de pruebas

Flgurs 1-JO [Vcüil'j para Ij prcparectórt de un ti in is [i;ini lu riccióu
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B Estignnadel dr.VaFbrEso

36

C A P ÍT U LO 1

I r i n r t utctón i la m icro bio logía: Parts I

dilerendaleíoen soluciones. La observación inicia] y la infcrpKLKidn tic luí medio de cultiva deben utilizarse para dctciminar st el o tos microorganismos aislados merecen identifica­ ción posterior y si se debe realizar d antibiograma. Procedimientos bioquímicas diractos para la Identificación bacteria• fíi fMlifífMf. Se pueden realizar cierta”. observaciones prelimi­ nares u un ensayo rápido directo Mibre; las cokffliaü seleccionaduv Con Frecuencia, una bacteria puede identificarse hasta un nivel de utilidad clínica basándose soto en estas dclennlnacio­ nes. Por ejemplo, las propiedades de utilización de la laeiosa de le* bacilos gramnegal¡vos pueden evaluarse directamente sobre el agar de Müct'onkcv observando ía pigmentación raja de las. colonias; ia producción de H_S puede detectarse en los aguíes de HcMwu y X L P observando un cciHto negro en las. colonias. Ibnbiéti se puede sospechar la descarto*ilación de la lisma cuando se adviene erteimiemo de colonias en el agar XLTX Un halo rojo alrededor de la colonia, c|ue indica una variación a pH alcalino, revela fei descaibox ilación de la lisina, A continuación se describen los ensayos dircclos que pueden realp/ltrse íCllW colonias aisladas que se recuperaron a partir de placas de cultivo primario: Prueba de la catalasa. Se culoca® unas golas de peróxido de hidrógeno al 3^ directamente sobro la colonia. La rápida efervescencia indica la producción de oxígeno mokcular y un resultado positivo (véase protocolo 1-1). Puede ser difícil obte­ ner resultados e*aclns si el ensaye] se realiza en colonias que crecen sobre placas de agar sangre deludo a la presencia de p e n n it a en los crilnxitos. Stn embargo, la reacción de peruxidasu que producen los eritrocitos es laidíw y débil y puede diferenciarse con ficilidjd de 9a reacción inmediata y fuerte­ mente activa que causan las bacterias catalasa positivas. Ln prueba de !;t caíalas* se usa muy a menudo par» diferenciar Jo* estafilococos (positiva) de los estreptococos (negativa) o las especies de B adtlus (positiva) de las de CtuM ddm n iertium {negativa}, fn ieh a de solubilidad íic> Ii hulllg,. Se utilizan dos métodos, para determinar la solubilidad de la bilis. A modo de análisis inicial, se colocan unas golas de una solución tic dcsoxicolalo de sodio al lü rc sobre las presuntas colonias de Sírepíovuccm' pnammniae. Las col nnias de neumococos se lisan por Completo y desaparecen luego de unos SO minutos ¡véase protocolo M ). Esta prueba ca a veces difícil de interpretar.; el ensayo en iubo es müs di recio. Se puede resuspender un inóculode la colonia bacteriana desconocida en una solución de dcsuxicoJato ai tO‘í í sales biliares) hasta que se alcanza imbidez. La clarificación de la turbidez luego de una intubación de 3Ü a til) minutos a 35 =C indica la solubilidad de la bilis (véase protocolo 1-2> En forma simulinlnea se debe efectuar un ensayo de control cor SfreptíHiMX-us viritiüM, que no se disuelve en la bilis. Como alternativa, se puede realizar un ensayo rápido de aglutinación de partículas de látex para neumococos. Prueba de ln coagutaia en portaobjetos. Se emulsiona una colonia que se presume de Staphyi&coccwi en una jiote de plas­ ma de conejo sobre un portaobjeto de vidrio. Lu agregación de las bacterias dentro de los 2 minutos indica la presencia de coa­ gulase unida y constituye un resultado positivo de la prueba (véase pnnocol» 1-3), Luego de una prueba de la coagulan en portaobjetos, con resultado negativo debe realizarse una prueba de la coagulasa en tubo convencional, También se pueden mi* Ii in ri as prueba* de agluli rtic ión para la detección de la proteína A de estafilococos como un marcador de Staphytvcmrcua aureux. Muchos laboratorios basan ia identificación de los esiafilooocos en la presencia o la ausencia de coagulas». En ese caso, el informe debe indicarla presencia de estafilococos ciwi-

gulasa positivos o negativos, en lugar de u» nombre específico de especie i p. ej.. S. «ujíu.tK Prueba de Ja mancha directa de ludid. Se transfiere una pequeña porción de Ja colonia que se va a ensayar desde un medio no seleclivo, como agar sangre 0 ehoeolalc. a una Eira de pipe! de liltro previamente saturada con el reactivo de Kovac o una solución de /j-dimclilammocinaniuldchfdo (PA C A l. La aparición inmediata de color rnjoeojl el reactivo de Kmac indi* ca la presencia de indol y la prueba es positiva (víase protoco­ lo ] ”4). El PACA es más sensible que el reactivo ele Kovac y la rápida aparición da color azul indica una reacción pnsiiiva. En muébos laboratorios, aparecen luego de 24 horas de incubación en el agar de MaeConkey colonias de aspecto >ceo. lactosa positivos y mancha de indol jpositiva, sobre iodo en aislamien­ tos de las vías urinaria i, que se identifican presuntamente como £. cnti y casi nunca se realizan otras pruebas posteriores, En esu.w casos, la prueba de la mancha de indol debe efecniaise sobre colonias que están creciendo en placas de agar sangre en paralelo, debido a que la pigmentación de las colonias lactosa positivas en el agar de MaeConkey dificulta la interpretación de la reacción de color. Prueba de la chocronuNodclstsu. Se extiende una psirte de la colonia que so va aen^ayar sobre un áiea Je una tira (tira k prue­ ba de oxidasa impregnada con el reactivo, La aparición inniedi ala de c»lcr a/ul indica actividad de citocTOmO oxidasa y un resultado positivo de ia prueba |véase prolocolo 1-5). La pinc­ ha de citocromo oxidaba es de utilidad para la calegori/.ación inicial de muchas especies bacterianas que liciten diferente morfología de colonia. Se puede descartar que las colonias oxi­ dasa positivas pertenezcan a las Enlerobaoleriaeeae. las cuales son uniformemente negativas. Las. especies bacterianas que producen ciloeromo ose¡data incluyen la* especies de PU 'liúnuma.K, Psetelumúntls y Prueba de M U G , Se pueden utilizar otras pruebas dirceüLS para el análisis inicial de ciertos niicrOoij^anismcB a partir de cultivos primarios, lo cual ofrece mi posible ahorro en procedi­ mientos de diferenciación que insumen mas tiempo ) son eoslosoSu La prueba de ML1G (4-meiihLmbtrtferil-l^-D-gluturonidiisa). una de ellas, se basa en la capacidad de un mierTOrgunismu desconocido para píoduets p-glueuroiüdaua. Esta prueba puede utilizarse como análisis preliminar de fe. cati en lugarde la prueba del indol. Se inocula una suspensión concentrada del niK'nK^iiamsmo desconocido den lio del reactivo MUG. que ha sido tesuspendido en labro o inipregn^do cu discos dcsbídrauidot.. Si lu p^lucurontdasa está présenle, el reactivo fluoresce debido a la liberación de 4-mctLlumbelifcTona. También puede detectarse indol mediante el agregado del teactivo de Kovac al lubo de M UG, lo cual convierte esta praeba combinada en un jnélodo de valor pata el análisis de los bacilos entéricos ¡fermenladorcs de lactosa. Pruebn de PY R . El sustrato L-pimOlidonil-fl-naftilamida
Mentifíttefótt ú« tos toctirtos según fas especies y setecvfón de ¡as características diÍErencielÉÁ La caracterización final de una cepa bacteriana ais!,ida dcscontiíida suele lograrse mediante el ensayo de sistemas eii/irnátfcos característicos para cada espe-

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

Fases deE ciclo diagnóstico

cíe. Emos Oleínas de enzimas, se detectan por la inoculación de pequeña porciones de una colonia bacteriana bien aislada dentro de diversos medios de cultivo que conlicncn sustratos específicos c indicjídorc-a químicos.. A través de ellos,. el rmciobi; ilntiu puede dCLBlur Cambios en el pEI LÍel medio pniviicados. por la utilización de Eos sustratos químicos o cambios de color causados por productos deri vados específicos. El mlcn>biólogo clínico debé seleccionar grupo** apropiados d i carac­ terísticas diferencíale!, que le permitan la identificación de cada grupo de bacterias. Uno de los mayores avances en el diagnóstico microbiológico ha sido la miniaturi zación de Los sistemas bioquímicos, de modo que se pueden examinar múl­ tiples características de manera expeditiva y a un costo relati­ vamente bajo. Anees dé estos progresos. se realizaba un núme­ ro pequeño Je prueba* en tubo* o placas, seguidas de análisis basados en ios resultados iniciales. Este proceso era lento* cos­ toso y mis proclive al error que los enfoques modernos/7

IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DIFERENTES DE LAS BACTERIAS

Mongas. Las levaduras comparten muchas características con las bacterias y,, en consecuencia, se aplican enfoques similares. Se puede mili zar la rrueba de la tire la (incluida la vcTsifa

rápida) para examinar microorganismos aislados, de muestras respiratorias. debido a que el patógeno más frecuente (Crypioc&ccu5 twofortiutns) produce ureosa, mientras que b levadura comensal aislada más a menudo (especies de Candida) no coatiene esta encima, salvo raras excepciones. L'is levadoras se identifican por sus características murfológieas. además de por la asimilación u fermentación de los hidratos de carbono. FÍara la identiticactórj de las levaduras suelen empicarse venaciones de los enfoques que se aplican para las bacterias. Sin embargoJa base de La identificación de las ceras de hon­ gos filamentosos es el esiudio morfológico de los caracteres reproductivos ases nales. La.1 ; pruebas bioquímicas tienen un papel secundario. Miüabacterias. Dado que se trata de bacterias especializadas. el enfoque pata su identificación es similar al de las bacterias. No obstante, bs prut-bai bioquímicas tur hI ucLlo mis difíciles en el ea^o de las micobacterias que de las bacterias convenciona­ les, La mayoría Lie lo* di red ores de los laboratorios eliden enviar las muestran u laboratorios especializado* o utilizar téc­ nicas de biología molecular con sondas moleculares específicas para la identificación de las especies aisladas con mayor frecweneia. Psrtsflas. Salvo raras eveepe iones, ¡a caracterización de Ins parásito* se efectúa por medio de estudios morfológicos. Es muy raro que se realice cE cultivo de los parásitos. Viras, Dado que se traía de patógenos inlracclularcs estríelos, los vinis requieren un enfoque diagnóstico muy diferente. Las iCcnteas predominantes útil imdas píir» ti diagnóstico virológieo son Ell caracterización de antfgenos y la de le idos nucleicos. ANTIBIOGRAMA En muchos aspectos, la determinación de la sensibilidad de un patógeno a un antibiótico determinada es b tarea más impórtame que se realiza en los laboratorios de diagnóstico microbiolócieo. En el recuadro 1*11 se resumen algunos de ¡os factores que deben evaluarse cuando se considemn los ansí ho­ yamos* Los anlibio^ranias se usan muy a menudo como gafa para el tratamiento de las infecciones bacterianas y mícobactcrianas

R«tuadttM-n Factor Aid^mwnto S í rnihi M Ji'J

SicLs.'iíiiin clirtic-3 Ksl Íl VÍAfíS ít intpr|'i¥l-iv-|i.ífl

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Factores que- lolluyen en et anliblogram^ Crberln ¡’jiripínn pístrninsl íl? nn;i rrnií Jra cjith! ípn1 h iV‘.fnxnin» iL,i»r.'vi!i.i ¡ ' i•• i j S ií !>■.•.]. ! lile ¡u.1.1j^unbes inÍLCCKVius \ .i.iL¡h.:,irtjc£w In-livnricin d ! rnií:imu mi -unwirhu DtifkiHiiLNlühd dL-LTiiíncis vjJuUJ^v. para ;,i lL 11: IL-:|UlLÍlLinl' j ' ::■.1Hl.-_J,n L*1.1.I^J Üc] ¡ÉainMJo

(véanse caps. 17 y 19). La tarca del microbiólogo clínico es asegurar en el mayor grado posible, que el ensayo se realice sobre el aislamiento apropiado y con los mélodos válidos. Rl camino más fácil es ceder ante Ea insistencia tic on médico que requiere un ensayo sobre una cepa j m Ea cuat no existen eslñndiuBsde interpretación, pero el microbiólogo debe resistir La tentación de hacerlo. Kn cierta* situaciones *e puede requerir un análisis de sensi­ bilidad para bacterias anaerobias, hongos y virus, pero no es necesario realizarlo en forma sistemática. 51 se analizan estos agentes, es importante que un medico experimentado, capuz de interpretar Los insultados de manera apropiada, participe en la atención del paciente. Utilización Ú9 ios resultados det antlbmima para el control da calidad ti* ios datos tía Itfentffíeatíón bacteriana. Algunas bacte­ rias presctllni) una sensibilidad predíídLíle u ebrios ¡iMibiótieos y no necesitan ensayarse. Muchas mis tienen patrones de sensibilidad característicos que no s<m lo suficientemente absolutos como para obviar el ensayo, Sin embargo, estn-r patrones pueden utilizarse como control de la caracterización taxonómica. Tor ejemplo, fCtebsidía pneuiHfMtfüe es casi siem­ pre resistente a Ea ainpicilmar pero sensible a las cefalosporiñas de primera generación. Por el contrario, las especies de EnierubacHtr suelen ser resistentes a ambos grupos de antibió­ ticos, sSi una bacteria se identifico como Enterobocter, rcrocs sensible a estos agentes, se deben poner en duda estos resul­ tados. Se deben rc|jetir los ensayos pura caracterización y sensibilidad, dado que uno, ambos o ningún resultado podrí­ an estar equivocados. De manera óptima se debería utilizar un método diferente del que se empleó at principio para rep etir la prueba.

RELACIÓN COSTO-EFICACIA EN LA FASE ANALÍTICA En la lase anuliric.fi. 1^ reeurKns puctfcn uti]i^nr-vc ül1inancra eficaz, si se presta particular atención a algunas de las írcas de esta fase. Es posible utilizar protocolos abreviados pitia La identificación de ciertos microorganismos (cuadro 1-15). E l NCCLS ha proporcionado recomendaciones de consenso para ciertos enfoques.86 En el euadro 1-16 se resumen otras tormas para optimizar los recursos. K1 fundamento de estos enfoques se eeniiiL en los resoltados que pueden Interpretarse en fru-ma corree (a y que conducirán al mejor tratamiento para el pacien­ te. EJel principio cnnccpluLil c í pensur que las muc^tru* pueden rgrupnrse en dos categorías amplias: 1) aquellas a partir de las cuales se m'slen rigentes que son muy probablemente patógenos y 2) aquellas a partir de las cuales se aíslen agentes que no pue­ den interpretarse con confianza. Si un microbiólogo Le presta

B Est igma del d r. VaFbr Eso

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CAPÍTULO l

Cuadro 1-15

íntrojEiccmii a ta micrflbíalogía: Parte I

i* • 'i'

Id c n ü n c B c iÁ i abnr*toda d*¡ bu bacterias y Im bongos

S m M a fr N

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PH O TO O O LÜ B E P R U E B A S A B R E V IA D O

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W 'A-ip. ,* ,,_i..,i:

1IÍE K T IF 1CA C IÚ N

Cnnronceadi'tk nn íihiiriilinU’c. oÉJom negativo (5-hemriitjcoct] íizíit sanare Je carnero*

Sin psnebaí «dieionalrs

Esthrrkhiti ííjíj

CiíamUííMÉMEX, fii>siíiníK.Ismt-e, Olláasa B tfíirl^ . n* benV>lílKn ín Azul %uúgrc «le cumcTi). ícmxHLMl»r l!c Latto»*

PV R w fa liv j

ü íc b n ii fta o jii

Ci»init££i«w«. bu ■aixiÉkludh-. ü^JJuíii ík ¡:j i K í i . iuf l^-swteicu d i iigar ^Hnpe 4e surneis», un lermíntaJnj-ík fjieintg*

M í'ü pü-.ilavj

E:i L'it€• í i"fcl'il l tíii

Bactlcií, fcquefk'ps o cncolKttta» tfrjmítf gati1 !in .«\laik» ite n u tria s f&jiiraii5f¡j.H « Je IftjgiLki lid iliirtt^úífti.. cigciitigcnin íii «.^ar c.'lKx.iütaljr ei-n í"v de L’O |*ru ras cu ¿¡su s,in_"T¿: de i uraccu"

E'hitbii. rJ|)ttla p.iru urlíe^i^ dí pcsríirlPíil K fg Jth l

Diplueutiii grafiihci¿IUVin. u &ii Lu j . puutiVuk. i-irnrttiriitu cii lijar c ta c d íie y .if.ir Svinpr de cunero*

Pcucha túpuls de nlcRcu de buliralu n DN \ti3 posíví ',a

Mamzeilei cutariiiali},

Ib cik if pnm wfíitiiim . (uitíim Eiqga'ivrn., iiíf fcnricFiürtíHr'i de IhAku, íx íi , iiiiitníci ibtiíidjaLí en ^ « rclu v iriilE o an^re CÍÍ CWTKÍfP*

Smlái¡ (vniitrva,

Pnr/fí>u.i l.wíjijn.f

Bacilos graíüwífflivííí. oaickKa negaiivoi, fio fciRKnudom de l»ti(K¡L eTmFnííTUri sbundanr* en agarciKiíolaíe o ip tr sangre li* l^ilÍECttí"

Indcl negativa; «iB ib le

Bacilos íli.hi'.i:vl;..i;ía i . oaicUu Qegaiivui. íiu fumtceitidkireji de ih ltK ik emimicnln atrureJanle en B$ar ehwndafg n j^ar *4Ti¡ire ík cartwcw*

P w tu * tfíjtabUii rnJ.il iicgaii>u¡ lesiva ate i «mpurLLina: matutea ik ih í ^ bi rmisin-Ji jk m íüia

ttacikfe ¡muwfailJfes* uiidjw i ríc^abVOs, nu f-eni*í)Ls4<.»e> dí luclmu, LicL:mk’ i:ti' ih.ii.djr.lc en ¡ijfaj1c l:iv
tiKli.il ne^ ili'.n: 3 n.i: nuUpsa ]xhl1K_j; mulliría nejji

Putífus priwrri

H*irk^ íi-jrm h u m a o s , c^ida'* (Msáitvci, aicm i típico^s íi vas ChíuíitiJ , jnarírjLHj.ÍLi [Épica de Las n»ldn¡_> ftir■ 11>i rrteli.li.tu., vetJif/rftjLí'réi.e.gtft, itrüCLiiífe)*

S hi piwN'- «lifif>rtak'i

pufUfLurirncic arru\rnít.'sfs {|íl< ai'l JtilWnM'S pr-.íl cumuuu lÍ£ Ac.ntmtxitu, |hjciL;ii mjí rim.l-ire-.

Cueva grajiipoartmM en afnquiDiecfUiK: catatavá |Xn.i1itiHb¡ Cfllucimií cnenws« opacas «man Ikauh en ajar iangre defajnero feolurockín k x d I vuJ ü rn flgarthotolílej*

C l..i¿ i¡Ix -j . l' ií V/u etsligulssa Je 4 ¿m ™ fn Suhsi poHlivas

C'W'> jfnimpcwiliviK en p¡J!V\ n (¿aUtnin t'prljs; ealdiiia iW^jtiVLri ü j.-.:..>ii:dii:-.,i,ili’ (s H iEíVi^ lUÍí i í ;íth, i'.r ¿I-te liwl líteos el: 8$ar sangre dr farneio'

PYR pirtíTi^

E ip n ift ile frtrííW B i^ i: íl ír u 4«« del enteiKuei ii. *üevmudo en La> de wi; ^il h I ■ J ud Mjrgkr: qpe el -SKil^micrud pn«k « tí de ■raipn fin irá

C úc« ^rjlsutf^ hívs^ íri fiüfíS » cad era coras; caslw # ncfaí(vos: tiiu.úüe iré una iwna «[tcc lu de fl hcimUuib. *■

pruttu rapóla de liLéfélKh de hipiar.r.;i pükilLva; pfiiéki de Ea biüehíIki C a MH pofiiíiva; o a^lunnaci^n tfe lilev cois oiilh'ocrpiw ebpecírwcm. positiva

ÜmjnípcíHTJü lí^ítJü! i'idrí ígEíipj B i: lo* ejueioeucuh (HscnKhlíijeuíi puede i er hipumo poaici-

Chjíos gruJrtfumicivi'H «d f-Mt\ otiLlem i! íL«as¡ canalla ftegaruvi^: u-benwJftkuü ea a^aí sasgre ife camero: cokünias lípicuncnlc nnn-p<íss d-cn frrrcu fc-dicnsm "11

MaíKíHs úe hilrt n í¡<4iíWidsd ífc bilib-ín íutHj jwsilrvai t'r.vurn's.idi'' p^nilivcr, rí'iirt i' Ti de luvf.j/'.iu tilfs ü lil |XhlÚ^jJ e ajrlulcnfvniai de 1 \cx Cin anlivue nn e»pecjiku)i püsJtíva

Ííc+^rrtfvliript pnt'Tt^+tírJlt

O w eran]XMi4l«K «Mi jiííres £>cattTia*; eaialaM nqjiUvfiM P-benui]i(ji:uci en j l jj ’-j j i -.’ic de vomciu lMI u ;i j JKMld «nclu de hercálkh; ídkvtps u^naimejitc: sx^ca^i y pwjueiü^ -rn «flmTiirt enm Id tKahtfiú.s*

PYK pt'siliva t1uglulimKJÚrt df Ií K í . í ' irj jn liilIH W Í'p e fíü in i pmilLYUi

S frfp tttw fu r ¡•yitgfHf \(^rupt*

B u tite grjmjK^Ki'iys petiueflo»; uiidaia asfar puüíatfe>, c«n «puréncíp A ‘'Mwihiwsíii p i c s h i ' u -p?iu de rtmín" en a ^ r hiñere
SLi pruct'Ji fidieioaaleü

Eikdtf i'k) cvrnukn i

j

anipicilLiu

infiumyae (ni;, ■puedr dlfcrcjioanir ■de //fj^flíifiJjjiij iN?/Nt4ujrtts, i¿n paiiJ|W » Juiipjmn jjoun cnrrt-.'iiiji

Prvlekh Iftimbtfii

jiern dai piKariva lu fHU?fc¡ df !la iinm íía de iíidcill

Slitphy taive t u i ammr* iSi¿ rpAyUx. k t j j a «..uugulahi rara ver. wroü ntaliloporTK pueikn Mr paMlsviaii en una e cri.ni prueba, «k 1.l c a iL il a-sii

tw . pcK> rtmNén sern P¥R pumitivuw

tL’|;¡*k külíiijnnlrs de emicnM.'oc'ííi |Í iieii;ui¡ iio/iis- tieitch dsíe íeme m.irtísla¡í:ia de « ilo n i» y pfM m aii aglisUHiL-1-'■]1liCJllíVu

fí'jvirmunf

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

Fasss del ciclo d ¡agnóstico 41

Cviad ni 1 -15

Id n ilU io tu n n a lirci k ü u de las liad triitü ¡r lu í HihUiu í fforií.) Pít OTO COLO DK PKLIEBiUü A B R IiM H.I>r>

SITUACIÓ N

IIJfiS T in C A C lO S

I.'j l ¡kis. icjjuiüib, LhtLHJLibiMjikTi j»ruiiiiicj|j.l3VU» ton grandes eutoaiú* O L iyiid^ú j|l~i[ Minare ar’urrti+iti'i y un [amfuiít ¡dmilaí tu afires LK Y j ElllL. sin Ltwci ni .Liiip cíi iijaf ■ . ti i .Ví CO..*

Ko iüfi ehíiicíaJes. :.ií praeluiihlk'bjiiikí.: pKdc d iír c e-orno e^idearía ndlciuiul ei ptiiiún dídise(»h (resLUmrii 5 pOlk»IÍIW. Pff¡i-1eTKLi 3 torumirijii; serisit^lidad u ri Ffimpirimn

Cnjpis

Badlu* prjifinfíiffjn'N ídspriirrftis. tlelpkliK. f^nniTgfmíSC avlMrfs de ii¡ ij ii «le |mii u «|»lcKcnlsk en ugar sianurr iu)¡tcnj1*ju. mj| Lid'úluctiLO M aguf s-iti ^rifcirtiiínrT>«i apar rhütñlaie 5
MaiÉcba

htit4ií¿rirrtti/i\

Ruviln*. gramnrgBiros¡ cr*>nia^ r«iifeíw r* ¡ Piml en apnr^r^re jip-i?robiy >— 4±45t B IX l¡uqgLi 4c al n*;r*'i hurus tic intubíMíSfl; mii vrc^i • micntn írs ttc,ir cbim’ble en $r4 í í ) : p«in1 ■ en c! ccitlnj uk: la cdesiti por pfoAtcttfi) <15 l^S*

(

tauilns swiiiijcsailwo; cwnluúilárcN pe /hiJ u Iít ü j) eo ujmr l,KV; (x & wiuk pe^pwli»! transición u cipacscn apu PA P [inintJbiy; i¡n vreciinfcnluwi íienr^tuvulaií cu CO/

Sir¡ necesuLut de p-roch;^ üLic<ünale>;

H í|kí¡ci de P rrv M filti: F m eo rfíla jjttrí'pufí'JJiJ Ü b rannftlJ. de ifldLil e* pmhivj

EJ:(fiUi^ fnmncfíIpvlis pennJcflus; Cnlninia, pcqueilis crimsLálk Iji u upatat en ugar ílA P miufmho crni íluwvK'uih' i.l fúfú Lidnll ■ ksju lu/ UV de [iH¡j!i[oá de isridi lur^a; un irrtedmiento cil ajjür dhKok\t en Y * CO /

M ji f-'i

E,-k|Mk:H!s de f\>rf*k\ rrwiiMnn

Paíilfrt £ram n$£aíiMín; Llílfmlns; cotraniu pUnai, tr^n^piircnm ^ic fiECK^vít li hnytitfn «1 A£xr ffAP SIKiíffttilKí; Mil C[&'iinbMb>dd üpaf Í.K V; sin Ltctirtdeiiiü en¡ ajjiir choenlaie iii'.uI liJ.' en 3flí CO,. *¡iit¡il:oii itryiiii^tkt. urcawi paúrivos*'

Si5i TKXc^kliJ dp pruíihirt .[iicionplü^

fia r í eI níd r i u rf n i y ií™ s

Di plociXfK fTsmTK^advn'; dímirním: cíilnniat ps-qwcñi^ « 1 mmi fr transparentes .i «piwns en 44t.nr BAP «luerubki con fluktfeicerwui mj-i hajn toí UV de (r-n^inii de oikU fcirf.i. sin (,iwir»¡Mi1» en. J£*r RBJi; -iíií mdnsiHiluen ¡u¡jr d u é la le « i 5rí CO. *

Sin ncvc'iidüHi te prvwhii, j^ücifinrilr*

b.spccíE1' de VtílJim tltrt

HhLtlüUs j^JhiJiiKi'ihüi n trt 1 h ^ 1 c u Je t^iV i, dt eAimuo^ idoihí cqIíodíu i> 2 miui IneguliRS e.m uiu /.
Si?! nt\!fs .!. ;' iV |Mjúh¡is AilliHAtUlüü

( ‘íii-tlriihlm l

Rjiíilin. InsnljüKiiísUH! ddjttdaí ñ u biittfiaLwn, exulta* sul4entiiiule«. aetimieíinj I íh í ühundinie enu^ur UAP ¡jjiitenjlíio: sin aeonuciHú er; L K V n Büli; «lin circimieniP t i urp^r frunntae ™ í',i- t'fl,; ím h lu í Hfjrai i,k nuUil nef^Hii"

Sin mx'csrÍMl dv ptus Híi* j J i ci□ii:ili.'s

Ct/i

HacLlfrti frjm iujaiivüt lííI¿¡h.1l1\ «mi «spum üiiNtvwnnales; ttAH'menrH' e^ui'Jeane en iitjr BAP unaerdüiú \ t ú ehuLLiLme en 5ri CO,; cjtrjtLius íiq n iiifli

Sin ntS't'iuUd di peUS^üs íHlin^nqlí^

(

Bjh"iltv; fnrnjKxHi'Ori p|fnnwTt]c«í í^rinefornu^; triííniias pt^iK-fisri. f J ii 2 mmi tipiáis MLineo^iulK cu ipat UAP andeii'btu. c^viulu-¿i po'.ilirai; nunelui di- |[wVi| [W.íl-jvj'*

Sin níve^tdiLÜ da pnichi» jdicifmíile^

S'rr i ■i

LciAduras en hra^icióii*

TVnebi de gduniüJbl 'n en tubii pjsilivt en < í horas-; ■npRpccunN iii.cí IÍüííj, iSc-idc Itis i.'nlonm'i en meJioíjiie eiJí|!iiért# ^,in£eí ÍJ| rn^rtilet 4Ji hofftt de LncjI u . l. 'I;

C c r a l íiiic rii!h ¡i an^

L««adunN en brutivión esTdricaiL u, n»ouJ>j luLonlíii msm.uA-*

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* .rJi (yjtUr or’ jjVjf n'iYjnifíjJrA. h^ii'i n M n u d E Li rrir.w^ M".

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

42 CAPÍTUL01 Intradiieelin a ia microbiología: Parte I

CliadfD 1-18

A lg u nas estrategias sugeridas pura optim izar tus id m lin cD cíim cs en t i la b o ra lu ria L ftJT E JÜ O P R Ü P U E ST O "

c a t e g o r ía

StjeMras irjK-adjTi Je u.i Je io ikj n térí! dcnliDilc un peifoJo detubtíú

R ífe jif cu Its M.j¡u;írtirs Lcs-iluiriiie pievu; w U> ihiuüjéjí n-ui-.nsí icKvuL&rm en fl media y « otüen'üfiJB d-ifeiineias suM aitulíveo* Ja raiLsfiUii (¡rifirul, eonsütiir e] ndduo Ak.tn.'a íLc Jd^nudones ruiun»

l'lnm miVii ifc un litw w e
Inkínnuj rdnw ílom mi\ta prüiputitiva/^njrruic?iUv.1

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e1-icm íliJn ni un

h t u ^ h i i r p i'n in u in íla m ^ ic iñ n ti Lin d i s p o n i b i li d a d d e fír> lis I p íid r w ^ L in

QtW l Flora mixta un iíew inj e especialmente íl ík rcrnriiJn en un p »M )(¡4 d e in-n^n-Miín m w lcrjJji a¡ •¡e^írj

InKmsiHi ccimo STijra m ío* frira|v.mtiv,V|irarTHiegi)!tva, aJju nijrua ccrnieirtino ]u rj cojsullju de-iUtu-tk los 10 djjn pot el pnxBsmiue-Jnu liltatLer

Fiara rtü v tii J e

J:11■ .■ ■ 1jl..u LJ iklefltdjcK D Ó D d e luí |Mlr.>cnl«i pticilunuiunLc V íj (iidcncLa Je llufH idiy U : rraJp?nf el iinlihic^ram-i ei [moéflo» prcdoiiunanu' n adjumar un i'omeiiufJo mhreüuUMiJtirfun el 1sbur^umo seerei Je La* pnükiv Je «nsthilitUíí

ti-i siriu n--: > e s í é r t í . espníeLiJtiiefiLe iL í í - se-juaudu usi ü :l prevncij do irtrlamifi
Aulqiniurilíi

itc k v q d u fiiH d e c u l t i v o s fhí^U m iL in iiocli.TjjL^

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flCtitL-dbej L 41 p n ir ük

í í l i p o h íc n ih lj e»i l

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d í Lihng ifcl L^irra msdkt dvL lu mi*:Jiíüifne t u l e im t H i r t i r

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príT^nniin^iin.14i [\ < n if n u je ^ tr a s «huiro medsn d y fu m i^ c in n n b b fn id ii en c p r 'd iL 'ii.in n a á r h i t L f ii c o d e un c a i¿ L £ r p e i m » / T i t í

l l u r a m u ^ i « m u q u n ic u p u l c r a d r í i r i a j dL*]

PrescnL-ia ele- liara vjfn u l nuiu

P|i>l _i niiXlaa J |%iiljr

nüs,ií ^r4inp«^jtii-i-^Kinui^Lii^->. -aJjysIii LuitfflasíaUiiy

^ i p i u í n d d - 1 ) f t p i t a b m ^ i t n 'c i r t u cm*i u n r a l d e r ¡| w : K íu -í^ tT -a rh k ,

auriwiHra eUnit¡miep¿Hr irHMeaJ^ ; el patictic? ik> un on ítw pcniunenic •■ 11 il 1 11,|i:'<:il LnhtirjtiTriiH -;i i1'. ¡•.k :.,iiIi' Siente un v.Lk'lu'i iH^iiufienli? % iicccsiia terapia artüitiicnH iiu

ptnflBñoKc

LUmdii^ i k

Inftimm mitins

nfcr lici

Ew ihií el psli^eno prftliMnHiáiMe. *ljuriie ya comeniuiu 4)ue inJique Le jueMDLIil de tliH i TniSlIL

lfll^m iW tlo ’;i p esencia f> ausencia ik I(h i^aií^en*^ ^u/inslcs dttumcnflaAis que x eihi>rmijiL nw}iw iW un K nJuki' ju t d c^hi^u: p ej.. ü vrW d B ifW flí^ ftifíT ií.v . Sírt'phvíKctif a xí t f j rt w leu mtijere' en cJatl f é r t il? , S tfY ftiiti'ito i 'i i i f v y t f j i f m f i, $ttJtph\bi\-(n-. m tm/ficT r»j s e syip íclil vn síndroOtc ó? shóck r.iiicetl >' ■i.v:fi!hjTii'. kan vffl se m Ísrisíi Ijs ¡tnicK*« ilf wpxih'.híSaTl Ln1s^ivp:%i, &il:ia

l r t ^ n - , 11. r^iriKi. rt^ ra

mis4a p r D m p n titis 'V p m n n e ^ D lL S 'j,, lu f|■J n1J r íl-^l ftin V ÍH la rirt [IfLiCesaiilknlK* ( jllC íliif

u :e n c u c L ' rnrfiA LillJl n r fi d 1:11h1 T'a111 hLn!
Aklamicntu Jl- butiertii nisí ic a^Jíiejuri j ¿idftnítpÁlhAs iriríiJti'iíüí ^ ^f,jfíiiY¡S.¿ jvirrflT^jJ'i'.-í ii p jrriT d e « p u k M

PíLveóei Li,m y ¡Jrobficaclfiii e míiirawr tL o i l t i J u síU» :-¡ s; ci^ucaUM! un flr £ iiiiit.m p e n u n a t i n . 'i i i n d e ( ¡n i m n m c i i i n i l J i i l e a u K 'i s i l a . m neulnjñlui polLrqerfL^tiic(ctpc4

* 1.r un- Itiit? ¡-nw™ ji.t.'tJT 'íji' A¿, mr * - n n » j íTiJil^T'-vj itd .w Jio a^r.uni'/ ii! mdili* J J Avjrilí. f'rcwr'i <\f UtSptiíM1J'r juj.ií' híiLií f/ttUaíJi^l1rr'1i
igual mención a te don calegonas, es muy probable que se hayan malgastado muchos recurso* en muestras de sijiniOeaLk) «íl LlLlíms >que Iíw uiuCMíiiüi mas imptHiuijiiís sean ¡»ubeslmiadai. La función de cada microbiólogo es lomar las dcci-sione* deI lahcTTJíftrio, de acuerdo con é I entorno Joca!. Una primera consjíteracióni e^ evilar informar r r ® M * que püedím ir n e ifr é ia rs í Je manera ensaca. Un inftmne Je "fl^ra mixta; interprctaeiwi dificultosa’ es* pn.i'bahle que estimule ln, recolección de otra muestra (con la esperanza de que sea mejor) o c-l irdiamiento dtl paciciik* sobre la base de lo* patógenn; que probablemente sean la cjmswj lie la infección particular, Ponerle el nombre a mu iiMcn.Kjffganísnw.1 y i-liwJc.» que de hecho e> flora colon i/ante o COtl[43tipfunfitc k da ¡il ñiieroejr^aiii^tuo nia^or relevancia de la que merece. £l pregado de fe* resultado* def ímtibingrnma complica .mn más l-i sil unción. Se puede unlt/ar una analogía con el héi-lnil para i lucrar los errores mis comunes;

1. Muestra, enviada en hisopos; primer ¥
4. Usted está fuera de juego [nut]La pregunta que surge csr "¿Que es flora hucleriana miata?“ . Para lomar ia dccisiíin, que debe hacerse en turma itido idual para cada muestra, son esenciales el sentido común y una sóli­ da base en 1tw principios del diagnostico tiucrotiiológieo. Por ejemplo. .íjrt-'ptimai■ i-j-j-.í pytn¡t'rt* v es un patógeno importante, mis allá de cuítalas otras especies estén presentes; en cualquier colonia fMieniolítics debe cnalujtMí la presencia de aniígcno de c^rrúpioeoeoí je j grupo A. Como una guia, Schrcclienhcrger y Miller propusieron la “ Regla de m K T ™ ” S u f r i e r o n que sé deben evaluar uno o dw patógenos poleociates, incluso en prc-

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Fa$*s dei ^íqío diagnóstico 43

senda de flora comensal pero no se deben evaluar tres, o más patógenos potenciales. Lu guía de ta “Regla d i ires" es una atilda, pero se debe utiIL/jur un criterio lógico. Por ejemplo,, la regla no debe aplicaisc en forana automática a una muestra de tejido de bjopsia, 1«lui­ dos de aspirado o pus. En el aparato urinario, una mezcla de tres o más microorganNim» de cualquier variedad sugiere «mijiniautiüo con flora vacinal o períoca];, aun cuando un pai6* geno polencial sea parle de la m eicla y no predomine,, es d ifí­ cil confiar en que el análisis proporcionará información válida, A veces, la rcladón cuarttiiativa de Ins m iciW K p n i^ M i cu la memela puede proporeionar un indicio. Si uno n prabablemenle dos microorganismos predominan claramente, es. razonable evaluarlos c informar además 1» presencia de flora ¡mixta. Cabe deslacar cjue cuando un microbiókign examina una placa de agar y determina que hay una mezcla de tipos de bac­ terias. en realidad está observando una mezcla de tipos; de colo­ nias bacterianas (diferente» morfologías de colonias). Eslas oülonias visualmente diferentes suelen representar disiinias especies (o incluso géneros), pero también pueden representar variantes fenntípicas, de mierooi^aniftitias, con un solo gdioiipo, La única manera de estar seguro de que se. aislaron múlti­ ples especies de bacterias es identificarlas a todas, y por supuesto, para ese momento ya se hahrú completado el trabajo, E li la práctica, debemos aplicar nuestro criterio para decidir ti las colonias son lo suficientemente diferentes como para que se justifique la caractcrizadún del crecimiento como una meada o reconocer que a veces es posible equivocarse. Un enfoque sensato en estas situaciones es ofrecerle al médi­ co la oportunidad de solicitar que se evalúen los aislamientos o iniciar un diálogo preventivo o través Je uní irifonue verbal tele­ fónico o de una contunicadén cscrila en d cuaderno de regis­ tro del laboratorio. Un modo sencillo es conservar tas placas

Cuadro 1-17

sobre las cuales se solicitó una consulla o Las que contienen llora m ina. Si cada día las placas se separan, se encinten (con una cinta adhesiva) y se guindan durante siete días, las. muéstras vencidas pueden descartarse con facilidad. S i surge una discusión y se continúa con la evaluiiciófi de esa muestra, el microbiólogo tendrá una posición más segura si conservó la muestra que si la descartó. Las técnicas y la interpretación de Eos procedimientos ante­ riores se tratarla con m is detalles en los capítulos siguientes. En la era de los costos restringidos, es imperativo tpw los microbiólogos apliquen sus. habilidades de observación y la uit1¡/.ación de algunas características, seleccionadas para identifi­ car las especies bacterianas en forma presuntiva cuando sea posible. El desarrollo tic este lLsesto sentido' ¡iücrobiolúgict? puede ser también útil para verificar los resultados obtenidos a ponir de equipos de diagnóstico comerciales o de dispositivos automáticos, En ocasiones, los números de b¡ otipo que infor­ man estos sistemas están en desacuerdo con las características de las colonias, ]a morfología en la tinción de Qraai o Iüs prue­ bas bioquímicas de manchas. Se debe «alizar un estudio con' linuú para evitar Ickk informes emftrttos. Fase posara liliea INFORME DE LOS RESULTAD DS

Los informes con los resultados de ¡os cultivos inieroblológicos se deben em itir en cuanto h información útil esté dispO» nible, Cada director de laboratorio debe establecer tos resulta­ dos que deban considerarse “ urgentes" o "valores de alerta". Asimismo, algunos resultados pueden considerarle "importanies"„ pero no necesariamente "urgentes” . En el cuadro 1-17 fie enumeran algunos resultad^ ‘•uluientes" e ‘"importantes" típi­ cos, Ls cimfección de este lipo de lletas varía mucho, rie acuer­

lisia sugerida d# infcrrim-s “ u rfttrttf1& ‘importantes”*

INFORMES •‘URGENTKS"

INf-l Jtrtl (LS «IMPORTANTES”

HímMulüffffi (5í>sLiíi/os

TrjiJc . y líquiitin pi'uHvmquc iu» Mían unpc n: Iíl|iii jo tt^ldrriijuSíkH.1

CulEh miJe líquitlv «JilurTOiiídm pwftiwíte

Rüí^crst.ií f-emlcj

Frolis postiivos pan bacilos ¿cido-alcohol IfsíilEnlfi

Oirís jmtÍ'iiIíw pasiiLmw que iu> F3í¡

Híyc&lMirlerütni iuhernrliaiú

Fíiíh^ o .m ifc Uatumiiión scaudI

fcapíLíw Je pimfluxtüm, cspwwilmciUe P. faicSpiMH

Slwptsifwití tÁXtfltxrHWii « afíti * lo de cullswi iie prepiiitn

Sireproroccm pyagriun n partir de kUw ilCUfrMlfliierne ftüfrir u-síe c>npfn j;er.r.il

Smpt'KfK'Cití pyrigMt 1 3 parar de un cultivo (sínico

StvfMMfitíin it/mláciMpa ¡Mnii de un ■ítuojcaíuI de wem¡ mujer «litaraiáda de > .L:rjiiíji-■

PíiwiieRtK ‘►iMfeüfHKithrn

Vinib Jet bcip» simple a partir ¿c un aálu» gcnilU J e «na mujer emhanH&da áe léntúno

H('[i;ír=‘, uhiüiirf'.í-. p-,.-.j|¡nv,

¡as-especies,*

¡.te] prvsouij-

AiK^enm pfsiÜMM o pitiíluí de deidot nudeicM «sil 24jJ b&üinKtanKQlc &ubrc íiljcv.i ¿ h.Llinkj', * ¿jh? Siflan 4infmitlpá' ntttrmdny

MMftAjftfiiAgiít Mittiéa í'iu*Su
B Est ¡gima del d r. VaFbr Eso

44 CAPITULO 1 liitroduccií-n ü ]j minio biología: Pane i

do con factores como la capacidad ii¿ los sistemas lLíí informa* cióla de la santatudón y L relación que se establece entre los mé­ dicos y el taboralorio. Además de Ias calchonas definidas, et médico puede tener Ili oportunidad de solicitar li i l resultado sohre algún cultivo en Jornia idaídmien en el momento en que *,e solicitó el exjmeu. Los resultado^ “ urgentes" siempre se deben informar por lekTono a lu persona que al pójente. Los resultados "importantes" puedan informarse por teléíonu, fax ordenador o papel. La principal consideración es que tocias las partes comprendan las reglan Si todos los resultados del laboratorio están disponibles de manera inmediata y conveniente j>ara los usuarios Je Lljs- servicios del Ealx¡¡ratoiio. |ot> médicos van .t encontrar mucho md^ ventajoso obtener todos lew resultados,

flecuadro 1-1?

Parnmftros do¡ desc-mpcñO'dol la&o-rotofio y dr- tos recitados clin león

Ailrlídad

partiíneiíiM

tlemíK.nllk'i'K

E;v :iik ' ii di.ts. t'=dr mtiealris'clMeaa V n lth ñ ü fra m a

1Tvi-mucia i' BiiP de aislanHenln de “ firsíin^mn a? l.i piel'' v i'iM.im iMiMes' 1rix-wjicii y U vi üí aiví.K» ^c l jIúh » üaiíüi Fncem’-nt'ia ¡ i j m í 1-jM.iiiiicmo Lk!1 pntCEH lll H Añiláis Jcl ricinpo de re^ftieuu líkthal lL- un 1j t ’H j U t o í i L I

Rpí-Urtlfli de" j-nnucftUji- de síniihtlidad di: [Hló ¡J,ílK)< KiiJIfnittli'is it! > i ii]>ir[;in^i.i

e x ce p to lo s Liri^enLc.s, e n fu rm .i e le c tró n ic a . S ie m p re í]u e Ltn

informe pueda ^er visto por personal no autorizado, dehe a^c£unir mí la eonítdeneialidad de EmdaHKdel ji-aciente: purejemplo. cm Lar los laxes sólo a los aparatos de recepción seguios. Es de buena práctica tener un protocolo para Ins informes tele­ fónicos JonJe se LM ^po>L'Llecjeic quién puede recibirlos en caso de que ¡a persona que asiste al enfermo no se encuemre disponi­ ble; üste prolocolo debe ser aceptable para el médico y para el personal del laboratorio. Cuntí) ptiEítiej; del laboratorio ie deben jea!i¿aJ- iilfofffles puntuales preliminares y provisionales. Por ejemplo, los ir>foirmes preliminares sobn? los cultivos negativos deben emitirse dentro Je Jas 48 horas. Hi momento de emisión del irtlonme ini­ cial para otros iíjnh de agentes variará de acuerdo con la telnculad de crecimiento; por ejemplo, en furnia semanal ¡jara lus nucnbacterias. dos veces la pnmera semana y luego semanalmente pitra tus hongos. L u informe provisional de tul “'cultivo negativo" puede ser de ayuda. ya que el médico puede desear evaluar nuevamente el ca>o mientras estíi pendiente e3 informe final, Lo* informes finales deben emitirse lo ante^ posible; pai-L la mayoría Je los cultivos bacLcrian
JHTEMCCIÜM CON LOS EPIDEMIÓLOGOS

Los microbiólogos desempeñan un papel importante en el resguardo de la salud de ins pacientes y. en general, de En salad pública. "** Cienos agentes, infecciosos deben informarse por ley a las autoridades de salud pública* la iiMa varía según ¿I c.sLuüii y debí.- c.star disponible en el laboratorio. LEI informe debe ser escrito o, cada \e¿ más. enviarse por vía electrónica, Dentro de una institución se debe estimular ana relación similar con Ins epidemiólogos del hospital 1o del sistema de atención de salud h. Los epidemiólogos deben revisar ciertos resultados de laboratorio en forma rebullir. Además, fus micrt*biólogos deben permanecer alertas i rente a Los patrones poco comunes de aislamiento que merecen una mención a| epide­ miólogo p.ira que los entisitEere para una investigación posterisiT. A veces, b;i caracterización molecular de un aislamiento puede aumentar la calidad de las investigaciones epidemiológi­ cas. Las pruebas adickmiilcs deben liaeciic Idealmente O CU uil laboratorio de reíerrneia, segün la eapjH.idj)Ll profesional tle cada, Jugar.

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Eli direetor es rtHpoítidble de lu eomunieaeión ef>n Eos médi eos acerca de ciertos parí metros importantes snhre el funeinnamicnlo deL laNiramrio i revuadrci L-I2), En eondieione.s ópti­ mas esta eniuLinicaL'ión debería tenerle con los niíJieos en

forma individual n e<m grupos de médicos íp ej , crupns pur especinlididj. si Ioís sjsteEJiah Incales *lc información lo pemiiten. 1.a herrainienia iinal de control de ealidaiL para los médi­ cos es recibir una ficha de registro que dclalEa Li holicstud dLr estudia v lo® rciuEi^dos de suh puuiLiJiies -fp. ej., ta frecuencia y la tasu de análisis po^iiivosj en comparación con Ea Je utras médicos .Se desalienta el diseño de este tipo de informes por­ que es difícil asegurar que l profesionales que se comparan atiendan a e1111 "o-- de pacientes que son serdiJileramenle equi­ valentes. Los estudios sobre eE tiempo de respuesta elotial de Ull Laboratorio (UtnutTvwuI ñm r, TAT) stm mas prtiblemtíULOh en microbiología que en Otras aréas del Laboratorio a causa de las demoras inherentes a Ea generación de los resultados microbiológicos, Cierto* análisis, como el examen directo d^ mues­ tras dínica^. *e prestan ]iar¡* e^aluyr el tiempo Je respuesta ¡¿InEsal. Se deben Suministrar en Jornia anual los resúmenes de los resultados del antihiogiairm,

CONSEFVACIÚM DE LAS MUESTRAS Y DE LOS REGISTROS Se deben seguir las guías locales y nacionales para el almaccnamienin de las solicitudes y de los informen Estas difieren seeun el ti]iode muesLía s la situación clínica Los líquidos cunéales es i¿riles o l¡>s tejidos deben mante­ nerse a temperalura ambiente o en heladera Etusra que eE etiltivn ^e hay:i evaluado píir completo^ d IkiuíJo cefalorratiuideo tlebe Conservarse a temperatura ambiente iíebitlo li Ili iLLbiEiilad i[Ue presenta Nrixst>ritf rw fíinfiitiiiH li -I " f ! )e manera ideal. eE tejido debe ser congelado a -70 ’C para ".ti futura utililición, aunque esto puede ser dificultoso pal a mué líos laboratorios. A menudo, no es necesario volver al congelador. Sin embargo, en ocasiones, lo* liolíIíses siguientes (p. ej., luego de la revisión histológica del tejido* pueden sugerir la necesidad de detectar micobacterias. viras li hongos luego de tina ^ilicitud inicial sólo de tullido bacteriano, r» □sus situjeiunes., el tejido e-uti^eLado représenla ua recurso invalorable con el cuat se pueJe tubcener un diagnóstico etiológieo esiwcífico y pueden reali/iir los ensayos de s¡ensihili¡J;nl afffop'iailns, Los aíslan tientos de los beoioculti^Ds deben mantenerse durante al menos dias. De manera idcaL. lodos Los cultivos pessitivos deben relertersc durante un período (p. ej., 7 días 1 pam permitir sll evaluación posterior: por ejemplo, su tipifica­ ción molecular, o la nealisración de otras prueba de sensibili­ dad, si la clínica del paciente lo indica. Una ve/ más el man­ tenimiento a -70 ’C de aislamientos impurtantes o pi^eo co~

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

Aspactos administrativos del laboratorio de micratíologia 45

muñes es un lujo, pero es muy úiil. 51 [os aislamientos se con­ servan, se d cbtd realizar una cuidadosa y rigurosa limpieza de los cul tivos para mantener espacio pura el almacenamiento de los fmurus íLiilaenicnti^. Se describieron diversos nténodos para el almacenamiento de los aislamientos microbianos,1*-’ N'usoito* encontramos que un método simple y eficaz lIc pre­ servar ¡Jim ¡os aislamientos de bacterias con requerimientos nutrieionaks especiales j de levaduras, es el simple hecho de colocaren un frasco ampolla eitéril un bloque Je agar cortado a partir de una phca* que contiene colonias intactas en su superficie. Los bongos pueden mtmicnerse como “ cultivo* acuosos-1ti temperatura ambiente. Los virus deben congelarse a -70 *C.

Aspectos administrativos def laboratorio de miEwbiologia El objetivo de este Litro se centra en la ciencia de la micro­ biología aplica Ja al diagnóstico y el tratamiento de las enferm^daiks infecciD&m. ML:j cttibargu, en I j piriícrica es impasible separar lo* asuntos de la microbiología -de la ciencia. Una de las virtudes de los laboratorio* inkrobjológicos es la sofistica­ ción de los sistemas de suporte para la implementaciún de los pruiicsus eiciüífieus, Los laboratorios de investigación llenen mucho que aprender sobre el mantenimiento planificado y los

rigurosos controles de calidad de los laboratorios de diagnósti­ co. Se guiitra aj lector por una estensa exploración sobre la teo­ ría y fia práctica Je la gestión de lubonUorm-11 Fleguiacií ii estatal En los Eslados Unidos, el gobierno participa en casi Lodos los aspectos de evaluoctói] tlel laboratorio. A pesar de l|L1L; algatías, cuestiones se relacionan directamente con conjuntos de reglamentaciones específica;»» todo^ los aspectos Je la gestión de laboratorio derivan, de una u otra forma. Je leyes estaca les. En muchos casos. Ion líderes Je la industria de los laboratorios privados y académicos establecieron el marco de Lrabaj;» y defi* nteron los estándares, que luego fueron adoptadas por el esta­ do y aplicados a tojos jos laboratorios. En el recuadro 1-13 hc eittnnerati las agencias federales y Lu; agencias no guberna­ mentales involucradas en las reglamentaciones médicas y de los laboratorios. La autoridad que regula el alcalice Jel laboratorio clínico deriva Je la Clínica! L¿ihnmlifry ímpTvremciit A tf of 1967 íC L IA 'íi?, Ix y Je mejoramiento Jci laboratorio clínico del año I9ft7). F.sla legislación autoriza la reglamentación de los labo­ ratorios clínicos comerciales y de los hospitales, Durante vein­ te afiu*i los laboratorios de otras instituciones estuvieran e.Kentus. Las rtlórmas de la CHnicui Labonuoty Impimvment

RcLiiaitio 1-19 Entidades relacionadas, con la práctica médica y de laboratorio Entidad

Area de respaniabilidad

CrnLrr tur M tsik^e aui M tJicaid Services [C M S)

EbLabl^.^ I í i rtgSus jtara Ij wnhJiLaCH^n, Ifceflría t uttfpcteiíiÉi J t Icm laJKcrrüicrriov; tljn Jíh H sj1-ds reembolso para tos ven- ¡cií» Medktre

CVntfn fnr D S& se Ccwtrol and ríCMüHion fCDC]

feticipan en !:i me^ndzKi^fi de la cd n ^ kiiilal de fca*-pnii^L^ propimniKlin las nKuciKnlMÍN.fiei s d n Jn crs
Tam%i* pina el hiírtrrnsn’.míi rVjLi'.mj] [ílvíIuCc 4»f (lgru(KJ[oiu| Htalcb and S;ik-u iMltlSH»; una Jiviiifta J l1loa CDC íXtupaLkHiyl llenlllh ;inJ Safely A d iilJ iiis im n o n i Ü S H

k c i p p n u í i t E d e la s T E g l a m í m l a i r i n n ^ s M i h r c p n i l c ’ i v j i i n . d e p v l i £ m x c g u i m i c i K

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VsiífJ.’n'í AHairs líspatrnent

Rí>l>.vnsilj[e ¿le ]¿i siIl-J y el tiieiKHj: de h» letemaK*.. Lneluida la red. nuckjiiaJ de lu;khp|lj|i;s VL'liniLJI-,

iBlÉtíHíliiruJ Air Transpurl AswdUiSl i LATAi

OijWii/ícitVi intfmKitHiDl de Cnunsprartitr^ ninfos: indnlucrada en Iil itfnmiitgjcfiki Je Iíin ítalas pur,i el erviu se^um(k Ith a|;enlí> LnfetxinwiH piv vía aerea

C lininl and IjK ir.lM n , SLarktarJv

Íkjaíu^ji-irtt'i 4ntlun|anu aürjHfímnni. indysiria-l y ¡ubmuiirrenUil; ’.n nhjciivt' es «urjo*

InM ;liik* 1'CL.SI:- (aiilca, KuliifruJ

CwnmiTlet for Clínica! l.-nboraon, Standar* [K C G ^ U Ameritan M cd ifJ A ssíhtuílcio

ÍAMAü ItrinftCiMnmmiQn fw Uu? Ac.'Ci'cdiCaCKSi of 1tcjhtkjxrc OTganiratiíiFK (JC A H O j

■ .ir eLdcicmpcmi da? Uii tübúfafiürtsli; dunqut es una iiisjjn L'^ ru in l<üi -,l:slt_. ms lecomeraHidcmes a nienud*.>ie vudve evilndiies de L.i ^njcciea del hbofworifs

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46 CAPÍTULO í Introducción a la microbiología: Parle I

Cuadro¡1-18

C ATEG O RÍA Cooiji-lejLdid í I.j

C tf^ o K a » de la com plejidad de Las p r u t l» de lubontiwrlo según C L IA ’ffi h tQ LiH R tM ítST C ftí D E L PER SO N A L

iín s o o s

Los in;i-. s.s j i U'm : el cqumilmi f n w i Sí «j I4,3te ?ipg. talara

Se Itl¡Uil~! l

IV iutIhbm L|Itc requieren Mhilidad aKdfitca. y «Lieflfl pÉTu rU un ni ■ .e 1meifcTT

M udin n[m . [Hn; rcqDteic ciiü LiuiniL-ricii que -je pucilc reiüjjtf i la ve/ que trabaja

S p T.'qüiLTr

El «am en mk'nwcnpi-

Se fletan ckfinir lii^ ü í upierjfclíi-

S í VZqVhCÍC H f CMTlflfKindP

D ESC R IPC IÓ N PnKtaí ÍIUC TíyüiííCO li mayof IwiMiilstd yeiiljtica y tritírio

CLTcnrplfjuliJ nusderada

lí-di^i-U |K« np rn d d m

t¥uíte« de eSíflíjáD

ou re iliiM Íu p tí der¡p& gTXJpñí. (te Tiwdkne:

Pruebas simpte- que rus «i prabsble que ten* g;m cm w ocBiias

tjs-i A n i r i n (Pjrc ü F tc re A C Y )

CONTRO L DF. CALIDAD Se íccajcíc

L u itttscbnA .!•: a lu y muiktada, ».■ ■nmj'kjiJihl no ae cM &idflaii

cu íu ct.mjiiBLt» pruebas Je eienciiHi Se

iL'ie

Knkre 6iP4 fómju]» víimplcjiL

jftra, rJleífO íar las priielW: en nit'^kí. ite

Se reíjujefe si

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r*?¿: peí s f puriic a i iHri-i méembraj ufel

Mini|»am

c o m e n t a r io s

jidud

Na se icjfuiere

É ^ C IH Í SÍ ■« PCSÚiíWl de mane™ irKwrrcm

Se defrefi sep úr lu inflru«H> nw d d s*riGWIlí

A la m i yorí¿ de le* trabajadores ik loi labcntoiios k s Lleva rrK iík tlie n p ii comprender p11 -l qué vde lu psnu realjíar uiui prwe+'i si w ia respuesta ükw jtw Iíí nc o u h racigdii Jpñn

ítiru tdvmcr J|iúnk¡Lh >i m ii dtL.iU/^1 ¿ iiy a tt J tltutdt i " £i ni."?: i -<MtJizari á M e J it't-J S tn L e i |<M$é- .Uinf ■■.Vi >i.. rfeí.hAj.jfi -./i hix'upptntic.j-i/i

4niím dW nfj &f/98¿f {C L [A ’JÍS, Ley de mcjúKiinieDlo del laborarorio clínico tte 1988) extendieron el mandato para incluir a los laboratorios estatales. de salud pública y Jos laboratorio* de litó consultorio médicos que rvuli^n análisis para infirme* Ja d tí humanas. Lus análisis Curt fines ik utvcsritiación (los resultados no se aplican ¡a la atención del paciente) y de medici­ na veterinaria rio se encuentran bajo el alcance estalal. En la reglamentación de la C L IA rHK se establecieron vari lis categorías de análisis (cuadro 1-18): además, existen muchas dras reglamcntucionc-s,, según Jj categoría en la cual, se ubique el análisis. Los Cerne rs fo t Diieüse Cvutíml and Pnw ntion (CDC) tienen a su caigo la larca de asignar cada análisis a una eateioría compleja. Un gropo de consejeros formado por indi­ viduos del estado, la industria, grupos médicos* laboratorios clínicos y tte salud publica y consumidores aconseja al catado subme estas decisiones (C finicai Ltibom fory ímprvvetneM Ádvisory Committee 1CE.I AC. Comité consejero sobre el sncjnramicnto del Laboratorio clínico]). Un las reglamentaciones se delinean las especificaciones detalladas sobre la calificación del personal, los ensayos de. aptitud iptvjtciency) y el control de calidad para todos Eos labo­ ratorios no exento*que nCali/an análisis,. Han surgido numeroso* consecuencias de las reglamentacio­ nes de la C L IA 4HH. L La mayoría de los médicos han dejado de realizar todos los análisis excepto los más básicos parque las reglamcntacinmes imponen requerimientos considerados demasiado ago­ lpantes. 2. Existe una presión constante por parle de los grupos médi­ cos (que no son palólogos) pura que las reglamentaciones sean mis flexibles y permitan 3a realización de análisis más complejos sin controles estrictos,

2. Los fabricantes se esfuerzan para que sus instrumentos y producios se ubiquen en la categoría de las pruebas de exen­ ción. de modo que puedan comercializarlos directamente con los médicos como si suples pruebas *in los rieuroww requerimientos de control y documentación.

Acreditación i inspección dei laboratorio. La reglamentación de la C LIA 'Rfc otoiga las licencias a los laboratorios luego de la ins* peeción realizada por inspectores eslatales o por otras tsrgaiiizaciunes que hayan sido “acreditadas” por los C M S porque cucntaa con los estándares equivaJenles, o aúr. más estrictos. La Jotní Cm tm ivim for the Afmntitatitm Hratthcanr Organizations (JC A H O ) y e| C a f í r g t t i f A m e r i c a n P a ih fih y g h is (C A P) sofidos organizaciones muy utilizadas por los laboratorios clínicos para la acreditación y Ja inspección. En todos b caso», el laboratorio debe evaluarse en fonua bienal. Los laboratorios que utilizan la JC AH O . se encuentran casi siempre cu hospitales y su inspec­ ción se realiza al mismo tiempo que la del hospital. En esrecaso. los inspectores son ''profesionales” por lo general con una pre­ paración médica o de enfermería en lugar de tener un entrena­ miento específico en laboratorio Clínico. E l C A P fue la primera organización que evaluó a los laboratorios untes de la participa­ ción del estado en este proceso. A l principio, Ja acreditación era voluntaria y .%*■veía como una forma de educación para la mejo­ ra del propio laboratorio. Su filosofía se basa en la evaluación por pon». Cada laboratorio que se inspecciona debe suministrar un equipo pora inspeccionar a su vez a otro laboratorio similar, Por |o tanto, los inspectores son profesionales de laboratorio y "voluntan os'*. Cutfct organización que inspecciona a Los laboratorios tiene m conjunto de estándares para evaluar, im cuales deben m enviados a los C rinen fv r Meditare ■£ Medita id Sen icct (C M S) para su aprobación, En algunos estados se debe realizar,

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AspoeJos administrativos dsl laboratorio de micrabkriogia 47

a d e m á s . la a c r e d ita c ió n a m e u n a a g e n c ia e ^ ta ia l si Tit> tie n e le la c io n e s c o m e r c ia le s c m e se e s ta d o .

el la b o r a n t -

Ensayes de aptitud (profielency). Umi parte tuodamental de la acreditación continua es la participación en Jos ensayos cíe apti­ tud, Se envían muestras desconocidas a los laboratorios partícijwrtiw en forma periódica- El laboratorio ta* evalúa y envía los resultados a lu agencia de ocrcdJUcí(5n, luego de lo cual £ í(« tcutilidos &on evaluados ¡ü ¡e lc otorga una calificación. Una vez más, el C A P inicié osle protocolo mucho» años ames que la C U A “67, Hoy, las reglas, ton establecidas por el estado, aunque entisie derla libertad para trabajar dentro de ella';. Los mejores programa* proporcionan una experiencia de capad laddn (.orno parte de los ejercicios. E l CHnicaí and Lú}k>miún Sfantitmís ínstitute (C L S J) ofrece una guía para mejorar d fun­ cionamiento tld laboratorio a Iw vís de Ira «ispyns de aptitud.}f Si no se cuenta con una fuente externa de ensayos de aptitud para un atiaJilo, se debe crear en d laboratorio otro método que permita determinar su desempeño- Existen diversos métodos, entra dios el intercambio de inuestras entre laboratorios y la elaboración de un panel de muestras problemas dentro del mismo lataraiorio.’' En la C U A ’«« se codificaron alguna* reglas aparentemente obvias; el protocolo para lo* ensayos de aptitud debe ser lo m is parecido posible al que se utiliza paiu lai muestra» clínicas (incluida lu participación del mismo personal que realiza el ensayo} y el personal del laboratorio no puede comparar los resultados antes de enviar las respuestas' en otros palabras, se Loman precaucione» para evitar el falseamiento de dalos. CilfücacSósi ásl personal En la reglamentación de la C L IA ‘88 pura los laboratorios que realizan análisis reglamentados se proporcionan especificaciones detalladas para el personal de Lodos los niveles del laboratorio, Mtmafnóepiocetiftntenios. A pesar de que no existen prescripdone* rígidas paiu la preparación de las políticas y los proce­ dí intentos escritos, se deben seguir ciertos principios generalcs.!í Se deber ejAablcccr > scgi-ir claramente las políticas. Los procedimientos deben incluir los principios del análisis y las referencias, así como las instrucciones para su rcali/adón. Los manuales deben estar disponible" para iodos los trabajadores que necesiten consultarlos. ReffUerliníilítOS tfe espido. Las reglamentaciones no especifican en Forma detallada los requerimientos de espacio, En cambio, indican que debe ser adecuado para realizar el trabajo en iVuina satisfactoria. Sin embargo* se describieron guias informales para los laboratorios generales7' y para los laboratorios de microbiología -' que pueden ser titiles cuando se construye una nueva instalación o para evaluar la adecuación de un laborato­ rio ya instalado. laboratorios de referencia o de derivaciónt Es un laboratorio puco üomón que puede satisfacer todos los requerimientos de los médicos. Algunas muestra deben enviarse a un laboratorio especializado para su ana Ii sis posterior,'* La selección de uno o m is laboratorios de referencia no debe hacerse en funna casual, Los candidatos posibles deben evaluarse en conjunto con el personal médico adecuado. E l precio no es el único determinante o incluso d factor más importante. La selección debe someterse a reval paciones regulares, CofííidMtfHíúiíl dei páctenle. La fiffílth fnxurtinrf fttrtability fíiat Accoanitíbilitv A l t of 19% (H IPA A . Ley de portación y rcsponiubiEidad del seguro de salud de 1996) proporciona un resguardo para Ja confidencialidad de la información y pemú* Se que los pacientes tengan acceso a.sus registros médicos, Sin embargó, la reglamentación dd C LIA "HH para los laboratorios reemplaza las requerí tinentos del H IPA A. Los resultados dd

laboratorio pueden ■ser informado-, a individuos autorizados la persona que requirió el análisis o quien es responsable de la uti­ lización de los resultados. En algunas jurisdicciones pueden aceptar pedidos de análisis dilectamente de los pacientes, Gestión de riesgos La mayoría de los centros de salud están actualmente invo­ lucrados en la gestión de riesgos. De hecho, muchos hospitales y clínicas han establecido oficinas formales para esa gestión, completamente financiólas y con personal para ayudar a redu­ cir al lutniiw las probabilidades de accidentes y de prácticas de alto riesgo que les puedan causar daño a los empleados y a los pacientes, A pesar de que d mayor ímpetu para esta práctica puede estar dirigido hacia lu reducción de los costosos pedidos de compensación de los trabajadores o a los procesos judicia­ les de mala praxis, en un sentido más amplio. Jos esfaefHB puestos para la. gestión de riesgos están destinados a garantizar un entorno de trabajo sepuro y un ambiente en el cual los pacientes puedan recibir la última tecnología médica sin temor a ser dañados.J ' La persona a caqjo de la gestión de riesgos, trabajando en conjunto con el comité de aseguramiento de la calidad, es asig­ nada para investigar los casos en los cuales d tratamiento de la calidad eae por debajo de los umbrales establecidos o las situa­ ciones en las cuales los empleados o los pacientes puedan estar expuestos a un riesgo indebido. Después de revisar los detalles de la situación con los representantes adecuados del departamentó involucrado y de recabar tos datos necesarios. Ia perso­ na a cargo de la gestión de riesgos envía un infam e conciso d comité dd aseguramiento de la calidad conjunto con las reco­ mendaciones para las acciones correctivas. E l diálogo entre la persona a cargo de la gestión de riesgos y el director de! comi­ té continúa hasta que se concreta un plim de acción apropiado. Luego se controla que el departamento involucrado cumpla eon los planes de acción correctiva. A pesar de que el mayor esfuerzo de la gestión de riesgos está dirigido hacia la atención del paciente, d Laboratorio dínieo participa en verificar que todas las operaciones dd [aburatorio cumplan ¿ou el total de lis prácticas y políticas de (a ilisti limón, Si los equipos o insEjuiticntos se dañan debido a un incendio o a un accidente eléctrico, si el personal se lastima o si los trabajadores contraen infecciones serias en el laboratorio, el flujo de trabajo se puede deisíírjaniiur y, en consecuencia, los informes de laboratorio se retrasan. Por lo tanto, la gestión de riesgos del laboratorio está relacionada principal mente eon la implementación y el control de las prácticas seguras de labo­ ratorio, dirigida más híkcia tos empleados que a los pacientes. La respoiKibilidad de un daño recae claramente sohre el empleador, m cuando la negligencia que condujo a ese daño sea responsabilidad del trabajador,''1pnre^M razón, Ip-s p^p-oñas que se ocupan de la gestión de riesgos insisten en llevar a cato cúreos de educación orientados bada la seguridad y en revisar que todas las, reglas y reglamentaciones pertinentes a la seguridad del laboratorio sean implcmcntadas y seguidas El aspecto financiero es otra área importante a la cual Sus per­ sonas que se ocupan de la gestión de riesgos le prestan cada vez más atención R w ien reglamentaciones estrictas para los conllietos de interés. Jas facturaciones fraudulentas y los, incentivos ilegales para loa negocios (como las comisiones clandestinas), L » facturación de los programas estatales (el seguro estatal de enfermedad. Medicare y el programa de asistencia estala! pitra individuos sm recursos, Medicaid)dehen utilizar un conjunto de códigos de pruebas, denominados Códigos de Terminología

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4S CAPÍTUL01 fnlrodLiCCl-fin a la mitrebioltgít: Parte I

de Procedimientos Actuales fCum nr Pnweduml Termmok^y, CPU- Muchas «ras a¿iegprudsmis; también utilizan «¡esis c ó Ji­ gos. La. American Medical A.ssot:iaiiun i A M A ), q ue tu sido designada por el Estado para esta larca, revisa y publica anual­ mente estos códigos. Cualquier persona u organización puede participar en el ingreso de datos para la construcción de los códigos* pero el comité operativo de la AM A se forma a partir de sus sociedades constitutivas, En el campo del laboratorio médico éstos son del C A P y de la Am trhm Societyfiw CUnimi PuShníctgv i A SC Pl. Secundad del labcraloria Á pesar de que la responsabilidad legal de proporcionar un ambiente de trabajo següto es de los directores de los hospita­ les y laboratorios, los empleadores deben laminen compartir la responsabilidad de adherirse a los. eLlándares di-1seguridad deli­ neados en el Manual de Seguridad del Laboratorio, de avisar al supervisor acerca buscar atención medien inmedia­ ta ante cualquier accidente polencíalmente relacionado con el trabajo,*1 Se debe designar a una persona en el laboratorio como res* ponsable de la seguridad* cuyos deberes son verificar que los estándares de seglaridad y las guías se encuentren escritas y publicadas, informar a los empleado* acerca de esos estándares a irav& de cunaos programados en forma regular sobre seguri­ dad del laboratorio y de reuniones informativas del servicio. £ Impkmemar un sistema en el lugar para controlar el cumpli­ miento, EJ responsable de seguridad trabajará de manera estre­ cha con la persona a cargo de Ja gestión de riesgos para reconciliar y corregir cualquier brecha en las conditcta* o irregulari­ dad que se descubra.

da. Las sandalias y el calzado del tipo abierto no ofrecen ¡a protección adecuada al pie y por lo tanto, no son aceptables. Está prohibido fumaren el laboratorio, Los dedos, los lápi­ ces y otros implementos no deben introducirse en la boca. No deben permitirse bromas ni payasadas. 4. Las lentes de contacto, en especial las de tipo blando, absor­ ben cienos solventes y pueden ser un peligro si ocurren sal­ picaduras o derrame*. Se aconseja a ¡os empleados que no las utilícen en el laburateriu oque usen anteojos de segtsridu,d cuando trabajan con materiales cársticos n infecciosos, 5. lío se permite comer ni guardar alimentos o bebidas en el laboratorio o en frigoríficos que se utilizan para muestras o materiales de laboratorio. Se debe designar específicamente un frigorífico para guardar comida y bebidas, 6. Está absolutamente prohibido pipetear con la boca cualquier material.. Se cuenta con numerosos sistemas de ayuda para hacerlo. 7. El personal del laboratorio que tenga infecciones en la piel, infección respiratoria agudo u otras enfermedades contagiosus debe evitar el contacto con las pacientes, #, Es importante que los trabajadores del laboratorio conozcan las características de unlns los. materiales en uso y, por lo tonto, puedan tomar las precauciones adecuadas durante su utilización y su desearte. Se requiere que los fabricantes proporcionen estos detalles en las hojas de información sobre la seguridad del material. Estas hoja» deben estar accesibles para todos los miembros del laboratorio. 9, Se deben colocar las etiquetas y los signos apropiados en todas las muestras o instrumentos y en toda* las áreas del laboratorio donde sea necesario p ro mantener un ambiente de trabajo -seguro, 10, En el cuadro l- l1) se resumen los tipos y lo* niveles de des­ contaminad ün^ Es impon ante que coincida el tipo de desinfección o esterilización cotí el peligro biológico- * " v

NORMAS V FEGLAMEHTACIDNK GENERALES DE SEGURIDAD

Se let advierte a los traNjadorei; del laboralorio qtie nt> s
PRECAUCIONES KABÍTUWES DE SEGURIDAD

CentrtfugMifa 1. Antes de centrifugar algo, verifique que los tubos, el frasco ampolla o las botellas no se rompan. Reemplace en forma periódica los cojinetes de goma que se encuentran en el fondo de las camisas, portatubos y elimine los idrios TOtOS que puedan haberse acumulado. 2. Asegúrese de que la centrifuga se encuentre correctamente balanceada antes de usarla. Verifique Los anillos porucamisas y las camisas portatubos para estar seguro de que los pesos coinciden. 3. Espete que |a centrifuga so detenga por completo antes de abnr la tapa para retirar las muestras. Utilice sólo el dispo­ sitivo de freno para lograr que 1a rotación se detenga en forma más rápida y completa, -i. SE se rompe un tubo en la centrifuga, primero apague el instruniento, espere al menos 20 minutos antes de abrir la tapa y luego de colocarse una máscara y guantes, limpie comple­ tamente y desinfecte el interior de la centrífuga, 5. Cada centrífuga debe limpiarse totalmente con el desinfec­ tante adeCUado al final del día» eolito parte del programa de mantenimiento de rutina, Se debe realizar el mantenimiento preventivo de todas las panes de la centrífuga bajo un eronograma regular apropiado, ó. S¡ se centrifuga material potcneiaimentc infeccioso, la mues­ tra debe colocarse en un contenedor cerrado (wbtw de cen­ trifuga con lapa),

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Aspectos administrativos del laboratorio do microbiolcgía 49

Cuadra 1-19

S1V ÉL i

Tipo* de ttesccniLum iniLCJoit*dr-inlcu

C A T EG O A Ia ETA/FtM Lfci ¡íi levóme bma>jc(il,-iísu

ik i

» E r fe r iliíir iíin ''

C A T ÍtiO R ÍA Ü JC

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^■(«npíiesEih, de Li;:.i tiKiI» Kuuflftiurtu

. T IF O D E C)Rt¡AN t5M O S iJjaen as Md^nuiLs-ia

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U U M p lA K tüjieelei de Jtej/jhtfaaiiraiiu

V¡f!úh c revuelto* a Je fani-irw (k Ph-W'^wm.t míduimi Vira» (k Fi miriLimXlSilíueiKia humjju \ snj‘-. del herpí"-. iimjilc \ tic Lj >llfípáÚlb D '• C C«wia%ires 2

DciLuféccautc tospicnlnrio L'jd wiivtóail fUherculcckU

DesinícctuHí de niwt imenneJiG

CoraputueB de uaemio ciutenuno ciLin ¿SIlíh I io U fejurfm iodófosw: (ifsxIurtrK in-t «¡nJlcricn cítiso»

Espcíicfe íte AjptrxMui Espetks d i Ctindiiki

Virus rhi envutllus unk il'.íTi-i i¡i i pe^yueíVn

lEmeruMiinia lüfk'iV'iniH

Micohactcriat

,tívt‘cbciclrtiimt fnhfwuíitsi.1, Bcpccicu ifc Bncffins

3

F-MerUiwite/ dcüinfcctMite «Se ultn nivel

DexinfL^'l^itíc J ü aJlm niv«l

CTJutjrplrichHít; peróM ..|, t lie |;.dríipeffNi

I-ispans bdcbenJiíiM

4

biteri liüK'irtn

Estéril iración

Ó iiio deetLIieinoL JlModlIVt

Todas Jns aérenles

* ¿Ítf HjrUlt) ,J 1¿i&t íiji rt ¿«M tfk « íí 1(4*1 rrffmmcio. mAdiptadn i.V ¿nr irfavivvítx :lJ\

Í-JU»uJ]plllibMii i tfur fluían á Aj* Wí-rtírt tf* *íl rdVil ¡aftfíor. lili fUÍ-Mr* fYM.JiJrrt UAil iWUUrUi'Üffl iiftt/U, 1JiLi.slt*it til

Agujas y material tía vidrio 1. Deseche todo eí material di; vidrio astillado y rutü en conte­ nedores adecuados. 2. Levante los vidrios rotos con urti cepillo y una pala;, no tilili* ce las manos, 3. Las artículos de vidrio no deben desecharse en el Lavabo o auelUsA éS un cubo de basura donde se arrojan pápele.1 ;. Los vidrios puede» producir cortea en las dedos y las manes de las persona* que los retiran, O ekn calncaisc en urt «pnlenedor diseñado pifa objetos, corlantes. 4. Las agujas y tas laoccbu fpunzantes) utilizadas deben colofiaisc en lus contenedores apropiados para aflijos usadas pira poder descartarlas en ffintia segara, Esttw contenedores de objetos punzantes se deben controlar v cambiar penuMiórnente para evitar su llenado excesivo. 5. Evite, en lo posible, sacar tas agujas de las jeringas o cam­ biar las agujas de las- jeringas. La práctica de cambiar la aguja antes de inocular la sangre obtenida por venopunción dírtlro de los frítSCOs dehím ocultivo ha sido abandonada en la mayoría de lus, bospitale^.

SeguriifBá eléctrica 1. Tndo d personal debe conocer la uhiesicidn de ln
3. Lus lomaconienlcs no deben estar sobrecargados Nunca uti­ lice enchufes múltiples. 4. Todo cable o equipu eléctrico que se enchufe debe tener cable y enchufe con descarga a ncrni. Todas las descargas eléctricas., aun las que causan hormigueos pequeflos, deben investigarle de inmediato, 5. Los alargues deben utilizarse sólo si cumplen con todas las políticas y los procedimientos del hospital

Precauciones en ei corredor L Abra las puertas lu cia el corredor con precaución. Debe tenerse cuidado con las puertas vaivén, Si hay una ventana en la puerta, mire hacia, afuera para estar seguro de que el corredor eslá libre nnies de abrir la puerta. 2, Mantenga ]a derecha al acercarse a la imerseccidn del tocredor y al utilizar las escaleras. Camine, nunca com en Ioü vesl íbu los, holntaciones y los hueco* de lu> ««■calen». Lus eüpejos ubicad» de manera apropiada proporcionan imáge­ nes del posible tráfico en los corredores que se cruzan. 3. Tenga cuidado con la eventual presentí a de objetos peligro­ sos en el vestíbulo, como camas, c a n » o mesas, y con los objetos que se encuentran en el suelo, cuino sujetapapeles, cables eléctricos, baldosas flojas y líquidos derramados, Se debe utilizar sólo un lado del corredor para el almacena­ miento temporal de un equipo móvil.

lenfítemiento de objetos 1. Las lesiones de la espalda se encuentran entre las causas m is frecuentes de enfermedad debilitante entre el personal. Evi-

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50 CAPÍTULO i Introducdón a la mtoolilologitt Parte I

ie levantar tibieras pesado* cuando sea pttslble. Siempre con­ siga ayuda. 2. Si Jetes levantar objetos sin la ayuda Oc otra persona, lome las siguientes precauciones: íi , fr.slarhien afirmado. Munlener una distancia entre los pies de alredeítnr de 25 em, b. Doblar las rodillas para lumat rl objeto. c. Mantener e l ú b jcu ) cerca d el cuerpo y sostenerlo en fu n ru firme, d. Mantener ios brazas y la espalda tan estirados como sea posible y Levantar el objeio hacia arnba estirando las piernas.

Manipulación tíe miwstta* y derrames ¡I. Las muestras deben recolectarse en recipientes seguios con un cipo de cierre adecuado para e\ iiar los derrames y Jas filiruioncH. Se deben tratar todas Jas muestras como si fueran peligrosa.'-,. 2. Se deben cubrir las cortaduras en las manos con vendajes adhesivos adecuado!;. Utilice guaníes deseeliabies si ¡a acti­ vidad involucra el comacio con sangre» suero, plasma u utrOs líquidos o tejidos. J . Si UH contenedor |ircsc;ilj evidencia de nilufzu filtración o mancha, coloqúese guantes y transfiera la mayor cantidad de muestra posible a un segundo recipiente estéril. También transcriba cualquier información peni nenie del viejo reci­ piente al nuevo. 4. Las prescripciones que están contaminadas con sangre deben rechazarse. Manipúlelas uílu con guantes si su procesa­ miento es necesario en uíta emergencia. Notifique ¿1 solici­ tante que este tipo de materiales contaminados representan nn peligro para la salud. 5. Lávese exhaustivuihenic las manos con agua y jabón varias veces por día, sobre todo después de manipular muestras antes de salir pora lomu alguna col ací&n.. 6. Los derrames se deben manejar según la itn w te ía del mate­ rial involucrado.

Manipulación tís ttemettos y materiales peligrosos 1, Deje apañe en el laboratorio cienos lavabos para el descar­ te ite muestras de sangre y orina. No se debe permitir el lavado de tas nminiM en esios lavabos, 2. Las, bolsas para materiales biológicos peligrosos (así rotuIndas) deben útil izarse pana descartar todas las muestras poteneialinenle contaminadas, tubos con sangre, recipien­ t e de muestras, pipetas, puntas de pipetas, recipientes de reacción, tapones y otro material da este tipo. Se debe dejar suficiente espacio en la parte superior de modo mil que la boba pueda cerrarse fácilmente y uscgurarli oon una batida elástica, Es una buena práctica la utilización de doble bolsa para los desechos peligroso». .1. Descurte el material ite vidrio y punzante en los recipientes de pared rígida apropiados. Cuando estos recipientes se lle­ nan, deben sellarse con cinta y colocarse en las cajas pura desechos rotulados para su descarte correcto, 4. Retire las bolsas para materiales biológicos peligrosos lle­ nas a las áreas de desechos designadas, en furnia tan fre­ cuente eoeiin sea necesario durante el día para evitar su acu­ mulación. 5. Sumerja el material de \ idrio no deseeJiable cootaminíidoen soluciones desj afectantes. Enjuague con ¡abundante agua y póngalo en el autoclave antes de uti tirarlo nuevamente.

fi. Al (1nal del día o después de un derrame se deben desinfec­ tar las superficies de trabajo con un producto eficaz contra los agentes que pueden contaminar ei sitio, Todo equipa­ miento que se retire del laboratorio debe primero ser des contaminado. Además, las cabinas de flujo laminar de seguridad biológica deben desconlami fiarse (debe hacerlo preferentemente un técnico acreditado en el cuidado de este equipamiento i antes de realizare! mantenimiento o de cam­ biar los filtros.

ASENTÍS BIOLÓGICOS Clasificación sis tas agentas biológico*. Los CDC y el Nasuma! Ittsitíate o f lítcihh clasificaron los organismos ínfcedostrs den­ tro de grupos de nesgo,w que se resumen en el cuadro I *20. EJ documento se puede obtener en la oficina de impresiones del gobierno o en el sito de Internet: (hnp^iv^'u-.edc.gov/od/ohs/ biosílyfombl4/bmbl4toi:.hLm). Contención física áe ios peilgtos biológicos. Las barreras físicos para las infecciones en el laboratorio pueden clasificarse en personales o institucionales. Las barreras personales son la higiene personal fp ej., instalaciones separadas pao |ti> a li­ mentos o para el lavado de manos) y el equipo de protección í p. e j, protectores Cuntía salpicaduras, gafas, guantes, camisolines y máscaras). Las burreras institucionales jkhi estructurales íp_ ej., instalaciones uparuias. puertas y cerraduras) y tecnológi­ cas (p, ej.. manipulación y filtración do! aire), Ijos cabinas de seguridad biológica (C S B J *.ciii tm componente crítico en la protección de los trabajadores. Es importante tener en cuenta que Jas C SB y las eurhpartah para el manejo de los productos químicos son diferentes. Es posible construir una C SB que pueda utilizarse como campana para el manejo de kw- produc­ tos químicos» pero sólo ciertos tipos de C SB se aplican a este uso. Las campanas para manejo de productos químicos no deben utilizarse para la manipulación de agentes infecciosos. En et cuadro 1-21 se resume la clasificación de las C SB y se las esquematiza en las figuras l-2t a 1-25. La mayoría de io% laboratorios clínicos utilizan CSH de tipo li para procesar las muestras y trabajar con los aislamientos, en especial los que presentan peligro de generación de aerosoles. Hoy es poco común que se utilicen las C SB de tipo l, y las de Sipo 111 no sue­ len utilizarse en los laboratorios de diagnostico, b.n Jxs, cabina^ decíase 11n III el aire se dirige,, de un modo laminar, a través de la superficie de trabajo desde la parte superior de la cabina v reduce la contaminación de Jas muestras con agentes que for­ man aerosoles. Estos dispositivos se denominan cabinas de flujo laminar de seguridad biológica. El flujo laminar hacia ahajo también protege el área de trabajo del aire no filtrado que es empujado a. través de la apertura frontal en las cabinas de ela.se IL el aire que ingiera frontalmentc es dirigido por el flujo laminar hacia el sumidero ubicado debajo del área de trabajo donde este se filtro antes de confluir con el flujo laminar que se desplaza hacia abajo. Lfn técnico acreditado debe validar la velocidad ilel flujo del aire en las C SB de clases í y II al menos una vez. por afro o cuando se realiza algún trabajo de reparación. Además, la cabi na debe ser descontaminada por un técnico acreditado ajiles, de efectuar cualquier manipulación que comprometa un área con­ taminada (p. ej.. cambio de Jos filtros» reemplazo o reparación de los motores o traslado ile la cabina), Con respecto a los riespes habituales de infecciones en los laboratorins de diaguósiico, y a pesar de que la mayoría de los agentes que .se encuentran en un laboratorio clínico pueden causar enfermedades a los trabajadores del laboratorio, ¡sólo un

B Est ¡gima del d r. VaFbr Eso

Aspectos flffminlstraljii/os del1laboratorio de microbiología 51

Cuadro 1-20 N IVEL DE BIOSECUEUDAD (EtSLi

C1ttel0cacid¡ii dt los- agentes totolOglces «R vn ei rtssfuo* ; -fJ.v f>..t -rfcjfc-.! . - , . CLASES líK AOÜTTLS

EJKM PlJO S DtLOÜAUENTlLS

1

Kms í nata ifue Cll Icfl ICL'üJJ3cflúóLe írt. iitíjSfta SMüs

y

Se asíKÍJL c(in enfeime«res humííTx»-! - lií^Jl',!! fhJJ'-U, [ljcila, mgtjUlAn i.i e*.pfcktó¡i iíc (IVI1SÍM4S

Em enéüetffM i*..< tE'Ihvím- efe Gtm M t Camplejn (ti ijwi

A|%nhm cudúfmi» a l"'.'. I l'.4V VÜU (IILCIIt ij.1 inuiHiiiMi'iil cu KmNíi Laeiferntediri pu«tf iftwr aNiKeniendin s«i¡i' i' lelilíes,

Aísí fnirrú*nairj Vljlib- ifeí Nitu ftLldcrafal

AgeBffs t> e'.ÍHip». spe pre%4Dtan aliti rittjo 4® rnlii nvaatl?\ ujiitfHiuciL tn ccngu !□ udi, ¡níscriono de [jl h.-ra'Liri u-l¡üc se fRTisrjíítfri por üenjKri O rlrr. rriociLmmJDi. LMJ1 Un Jl'

Arf naviují í |ik fin> ílHeeo fiebre hfflH*rrLinLii [p, i j Uuu, Junfd. ^ísCbufra) Filmnruí qw prniucesi fltlvjí: hennxrí^
3

4

■iÍB'íSrírt Virus- üki inanes, «implf

^V '

PRÁCTICAS

-

1 ., ■>

|í‘. í r; j

EQUIPO 1>E S^ U IU D A Ii (tWKKKKAS I-RIMARIAS)

"'V . ■■: \r J ' 3-

1 :*pj

INSTALACIONES 1BA1RKRAS SECUNOARlASl Sí reqinÉifí tin;i r'ii'.-'.jüii .ilncrT.L htjd LiViibu .HUpcrii i:

t’rairicá' írticfrihíüM'ii" l j .1 * c.“,Lj[’vLsrc■ .

No s# rei^iitítn

BSL-L ÍTViv * ]]miydo » Sipicw de »dverte»icli de h¡.>lú ¿ic« * l’fiXiimi 1'iüís LTin «Jijetr^ pun?^ ni.Titan1» ■ MluilllI tóe lwiMej;iin>. -J_í«.Lijl.l* tfellílJ la dtMCflLuniíutufei tk Ins rcsidEHTis y l¡i« |¿J J lLl-Jh de Vl^lLuiim nK:i1ií;i

C ití ik t laise I o ti u otra- dls- BSL-t rafii: pwiilvoi Je «oLtnfitfn ftiiia * DiipOllitliljdlKl tlt «31 ■t¡|p74hJ(K pin HuhsKrla^c muiifulatíuitei, de Iim Gis que L-:iiis;n ií^picMiieK o óciijSts’ch de üiairt.dlc.'i jnrcfficKm tn J |u;ij|(es y ^r-,11"l1> .■mr. Jl," Si cura innvJii se k>requiera

Prjftioii HSE.-2 mis' de «iMkhs Uw widiim * Df scojHuminaotúii dt ia inAimcrriani de líJ*orul«H) «rilfri-ife ir n l;i 1n ;mi t-,n:i * Muíltn. (t¿ iJJíi'o iniicLat

CSH Js 1O 11ISntníJ. dii p i’i'.i'.iiH J ltí--iLj uLilt^utjus, |:,in EL^Jaí, ü.r-í mani|Kilat:iDiKs. efe loe»afenc.-s que cansos saJ^cadur»-a jem*4jle'- de mitenulo inFccíicHUEi. ppjJ. gTnnlipcI'vnv, piajites, y prattedúa de I^cuté lü iiJ li m lo n.,..'|U!-.TS

HS[^I fp&*\ *• Scpaisttal Íínka tic Jys tiinlríki'rL'i l3c «emo * Fuenaíi íLh Ut^ ifeí JjJbtuMüríLi

Priricaft BSL-? más + CjunHo ile iiJumcnImi4 il + thieto »l s»lir * ti J'.is ]□&m&Lcrioks, se descorraminan ciuiullp^Blep Lkl lugir

Tod»s los rtfocfdiinitntuM se ¡levan a cito en una CSB «fe cUse (][ eten (ÍH Ue claw 1 li 11ímnbiTsí4ii «i® mi pcisaoal de prm£m pua-itiviL cchd itaitfcirawniTfp de ai» uut cubre el cyeipo per «MnpldD

íiSL-3 fíiáy, * lidifidii se|?aniíly o Hisa

Iuí/t:n;ítíitj,Li * Ae«íM.i COflUkUaiH1 ■ 11íL!brIITUM'¡ 31 FranciirMa tttlcrrmi* * tV" 1■

■ fimplfii ^sfenHi.í ik ahi’:(ecimácDUi y eKpuhiúB de .1(1^ y de vacin y dí^diti* Lu¡ i:ilili i ,:i * ChTM í«|»erii™eíi«i5. e™laente eti Ii ieferc:KÍar'

dcstumxhla BSL.' IJ.' >■"1 1J >■l' 11 i i il' L .Vi:' f.-r t f l j ^ 1d ^ tl ./ i t'}‘ [■.: i >■' . J j ~ i ri, , f wNÍVtf J t j f p i í i i t j d d í l f B t t t ñ l V J l l j t í P J ' f J i J i J I l A ? J F n f t j^ .a u i ÍB tL ñ i^ Jlfii.'áíM ll'l , R Í d J . sualfi' tfríú. « l¿ W * fJW F f ipftvr J í tftt/'frW ,¡i>nwUl 61 J'i^ íílri'.i 1/- ,Tt(’W riJ.fi f J í m J w th r r n í r n # íf .< . f t f s r « f j w i K r í i í rn flf t J r n n vt 2 w i^dim un n h fi rupfríarm m éf' t i mmtpaíüit r * lr i w r q w r u •thrqpr rrtrimrti ai i w i m 1. S t tttiika « u ríanfiá’aritm 1i'ii.rjj itld liffrülti .y-J r Irij rv A j n, ¿w Jnfwém FM-Jh nn ¿¿ i ... r M"! ■r iV.'Ii1' t J - 11. .'J É.T in\¡. 'jr¡ jliííiDMdti-¡Ar I j refcrrnm w.

numero retal idamente pequeño de eJlos las producen. M iller y tul-s,1* descrihicrtin una experiencia de 25 afios con infícróncu humanas adquiridas en el laboratorio en el Nuíim al Amnud Distase CttUtr (M A D Q en Ames, lowu. una institución donde se realizan investigaciones, Mitin; cnfemwtJa.'dch. comunes del ganado y de las axes de corral. El nivel de riesgo para los írabajswhires es probablemente algo mayor que el promedio tic los Liberatorios clínicos. Entre 1960 y 1985 se infunTiiirrjn al NADC 128 cxposLcion.es en laboratorios s¡ organismos ¿oomü* tifus; e¡¡to derivó en ,34 infecciones asociadas con el laborato­ rio. La bmeelosis representé el -i7% de ios asm : la leptospi-

I V - iu W lV J .

rosts,. el 27<3¡K y las micohacieriosis. un 9 % t [ja especies de S a ln u m e íta y de Chlmiydiü d virus de la enfermedad de Newensile (uit patógeno no humano) y te especies tlcTrúiiophyton representaron las um ii infecdomes adquiridas informadas al NADC. Las lt) infeccione* adquiridas con mayor frecuencia en el lahttralorio que ¡.urgen a partir ds esludios acumulados ¡son: 1| brucelosis, 2) fíebre-Q, 3) fiebre tifoidea, 4) tularemia. 5) tubereuloij.s, fii tifus,,, 7) Lepatiriii irtfceeinSj, Sj encefalitis equina venezolana* 9) cocetdioídomicosís y 10) psiiacosís_asi.',¿u í Alguna* de estas infecciones son difíciles de evi-

B Est igma del d r. VaFbr Eso

52 CAPÍTULO 1 [Introducción a la miEfüaioiügíai Parte l

C u a d ro 1 -2 1

JIPO

CM ¡H irldtffl de b i ribinos de segicridjid biafó|*íca VELOCIDAD EN LA APERTURA FRONTAL

R\m oNlJ tru n o s ip t a c m TÓXICOS

PATRÓN DEL FLUJO DE M RK

MVKIJKS ÍJF. MOSEnt'RIDAD

PROTECCIÓN DI- l'KtlDOl.TOS (MUESTRAS)

Clase | frsuU" uMsrtri

24 tíí>

LriUr*Ja fpsnlüJ; pane poUínor y mitai j ttuvis tLe lilini Je alta. cJVlw^líj iHEPJi 5 Íflí, 1-21J

Nü

Z í

Srf,

Clase 11 Tipo ,4

34 fí5|

7*)¡f di necireutad^n ;i í/actSJc tilmi HFÍH; f spe-1iJr>a ere*¿s-ite íilUm- tfETPA ífl|. 1-231

Nrt

2. ?

Sí

G n II Tljhf SI

33Dtl(V>

%Y'r de rreireuladí¡n a iravés Je filntSí ítejos ni^deíj",ntari J1IZÍ1\. cMpeJiJu fx,[ lUtódii) de fduih llt:lJA 1iJjdi j' «jfiíluílíis rigidín ltl¡. 1-2Í i

2.?

Si

ci bsc ti Upo h l

330 C]£»l

S¡n nrcirtuinciiSn; cipelidn jntjl por medio de filtro IfliFA y CuraJufKH rf;iüt>s Cfij. L-W)

Sí

2. 3

Sí

Cbac II Upo BJ

330(1»)

III II11 - Ilir; i l.J :j 11A, pclu et ÜJLe e.lpelldíi K elimina i ínvr*. de ihi espacio de presión m^iuími y v lleij por vundnetos ríKrnW

St

2,3

Sí

X4

Sí

Ooscllt

Mn

ProrélLi tk tíHK%iflíie^. iSp y expeli­ do de aire u tr¡n¿j de do* filíms HIPA ífij, [-151

Sí

'h m & h ií* Li trfavntiii*'.

lar, aunque el ohjetivo debe ser siempre cero infecciones. Sin embargo. en algunas circunstancias nn es difícil visualizar los nitMJitiü pura evitar I j i infeL'clpiií.i. al iiifnos en retrospectiva. Por ejemplo, un estudiante tic auxiliar médico contrajo fiebre tifoidea con complicaciones ¡«ego de trabajar con Salmonelfa typhi como un microorganismo «lesawwKln ** AOn peor, el 22% de los auxiliares de laboratorio presentaron liasaoenteritis por ShigetUi somm, La tipirtcaciOn de los aislamientos reveló que (odas las cepas eran idénticas a una que se le había dado a un estudiante como desconocida Algunos agente? que no debieran encontrarse en un laboialorio clínico a voces pueden causar infecciones en lo? investigadores" “ •* cuando se realiian manipulaciones que producen aerosolci sin h con­ tención adecuada.

PBEMUCIMESUHIVERSMJES Irónicamente,, los trabajadores del laboratorio tiene un ries­ go mucho menor de infectara? que sus colegas médicos. Numerosas rajones explican este fenómeno. Los pacientes estornudan y tosen: las placas de cultivo,, nn A menos que en el laboratorio se realicen procedimientos que generen grandes cantidades de ncrusylcs, el riesgo parí los trabajadores es bas­ tante bajo. Los médicos \ los enfermeros utilizan con mayor frecuencia objeto’? curtopunzímies. como instíumemos y agu­ jas, Rn la medicina moderna los mayores riesgos infecciosos son los patógenos transmitidos por la san&rc. Uña v tí rt*ís, es irónico que )<ís in-itrubiAlugus tengan menui lic ^ u que sus colegas de otra* áreas del laboratorio, como química y hema­ tología. donde diurinmenTr se procesan numerosas muestras de sangre. Las infecciones de laboratorio más importantes son

las producidas por el virus de la mmunodeficienda humana (Hl V ]r el virus de la hepatitis B y el viras de la hepatitis C. En la mayoría de los hospitales, el viras de la hepatitis C es el más prcvaleiate. debido a tjüe se cuenta con una vacuna eficaz: con­ tra el vims de ta hepatitis B y a que la incidencia de Hl V en la población general es baja Es impórtame que se cuente con una vacuna eficaz, contra el virus de la hepatitis H. porque el riesgo de un trabajador no inmunizado de contraer esta infec­ ción CS mucho mayor que la de adquirir ana inlcfciófi por el virus de la hepatitis C o el HIV. Los CD C,H ]í el C L S P v los trabajadores de los labwaloriiw1 h-in establecido recomemlaeiones- para reducir a| mínimo la» infecciones transmitidas por vía sanguínea, En el cuadro ] -22 se resumen los riesgos de contraer los principales patógenos transmitidos por esa vía.3’ Como casi nunca es punible predecir quiénes vun k>K indivi­ duo*, que pueden ser Fuente de riesgo, &urgió el concepto de pncaudnocs Q n k rü a b . Esto significa que L » b muc.su-j se considera de riesgo. Lu especificación de que algunas muestra* son riesgosas incrementa la posibilidad de que se genere una filis» sensación de seguridad. U s CDC y el 0511A Kan establecido las siguientes precau­ ciones universales:1' 1. La sangre y los líquidos corporales de todos tos pódenles deben ser m;i ni pululos como materiales infecciosos. Todos |o> paciente* deben presumirle como infectados por H IV y por otros patógenos de transmisión snnguintii. 2, fitdas la* muestras de sangre y los líquidos corporales deben colocarse en un recipiente adecuado, co« ana capa segura para evitar el derrame durante el transporte.

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AspccSas adrttirtiStráLi^s ci-l labOraíünC do micfobiolog ¡a 53

A—

Airs arntuente

j Alfa ambiente r n Aire patencia rrfirte “ “ contaminado'

m

Aíra potenclalmam*

““

contaminado

] Aire filtrado

I I Aire mirado ■ —1a it& H de HFPA

a tr a v é s d e

HE PA

Vista lateral Fhgura 1-21 Uiscñu dr ur.i LÜ*ir:i l í e * efundid fnuU»fiLLJí tic í! j w J L.\laj eahiam Je presión nc|üliV4 toman uire dri ambientehicLa L-i-cbíhbb aúna vrik> c id jJ de 2-t m/min <75 pie* Lineal» por m iiwto) y ili minan el nirc p iijh í.c de un lili™ HUMA hana rí srnfaeni-e <» hacia el «klcrior pw Trípili de un CdrtdüCL u . ¡ V i l | i i i i l c j t .- lu n iu c ^ E c ü , i L

l .i f n n 1 j j r . i i i j . j : . 5 n n * i r l n i a L c n u l p i r ^ n l c

c u el

lu » üinhiñiit iMéde w ilin t& i |u q gaaanqiA químicas (ta ifa s o radiológicas hálen -si v e É L i l m l J t L t i j i e l c i E c t í i J r . A i L i p U f J u

di:

L l i f e f c n C B C U i ™ ..

3. Todjs Iíii personas que procesan ¡nuestras de sangre y líqui­ dos corporales fp. üj., quienes quitan las lupus tk lo> tubos ton vacío í deben utilizar guante* y protección facial o n c ­ eara, antiparras o gafas), sl se espera que ¡a sangre o los líquidas corporales salpiquen. 4. Los trabajadores deben cambiarse los guantes y lavarle lis manos cuando concluyen con el pruccsamicnio de las mucsITAA. Los tf ahaj adtite s nunca deben pipetear Cun ta boeaj deben ulilizar dispositivos mecánicos, 0. Iu tiliz a ció n de agujas y jeringas debe llmitaise a las situa­ ciones en (uj¡ cuales nu existe otra aEiernaiiva. 1, l,a^ superficies de trabajo del laboMorio deben deseoniaíninarhc con la* sustancias químicas germicida apropiadas Juego de un derrame de sangre u otros líquidos corporales y cuando se h¡i w n clu iá tcn l las larcas, IS. Los materiales de Lrabajo yue se utilizan en lu* ¡mitigas de laburauirji] deben descontaminares ames
Vista lateral Figura i ‘ t i isw & od eu riacihin aíleset'urid M h cilG viad etlaseltA J-.Ma^ cabina* Cuntan ture Jc l jnshicurt: I u l l d I j . calina a lííVtrs -de su a heti nía. Irtinli.il fA.í ¡i'iiülnwrlff a una velim iIaJ de -h irVitnil I.TS p li* lufcjakh ['“ ir nmiuEnl Lacuu c»íc fie un LunipurUiDcnUjilDt^ ú UaTci de un tilín» H U 'A . ucij. pirre d íl aire, por lct gcntral el 1W4-. circula pnr el lugar de trabajo: ti ¡une refiuirtemc he eíiintiu a uiivéh de un fikiu IIE P A
mddifican si es necesario. Kn gtnenLl. e| pucrenle del cual se obtuvo la muesira dehe ser estudiado para determinar si existe algdn riesgo, inicnlm que al trabajador accidentado se lo debe estudiar a to largo del lieinpo j>nra establecer ai se infecid En cieñas situaciones es Jipriípudu una irtrttunÚEaciún pdsteridr a la esposición o quimioterapia nnliviral profitáctica, Cabe des­ tacar sjue se debe presl&f principal alcnción a la prevención, de mttdtt que ei problema Je un ace idenle nunea se pftícn(er La prevención puede realizarse por medio de la innUni^ciéd del personal en riesgn y de la reducción de la exposición a Iüh ele­ mentos eonopunzantes ¡agujis, hojas de bisruri„ vidrios nitris, e le j. (]ue snn las fucnlcü más comunes de accidcnles, Limpiéis líe tas derrames de materiales infecciosos. E l protoco» lo recomendado para ta lim piéis de los ni al eriales Infeccio­ sos es:^ L U lili 7í\t gttames íprcferenlemcntc guaníes gruesos, resis*

tenlev u la* pinchaduras), canii^ine» y Tná^cjiras, 2. Slcxislen liadmenLos de vidrio u oíros objetos* deben climinanvc sin tocarlos en forma directa. Utilizar protectores de calcado impermeables al agua si el derrame es grande.

B Est igma del d r. VaFbr Eso

54 CAPÍTULO 1 Introducción a Ea miernbtolngía: Parta I

í] Aire ambiente ] Aire contaminarlo Aire liHrado a Iw te de HE PA Vdsta miera!

Viata Irontai

Figura 1-23 U lníiu)ü : u i U i í'jIiiiu i «Sí tc^uuilj¿biobógkude ilasc IJ DI [ » i í i s tübiiki» romun aire tfel ircibitrile Ikk i* k cabina a tm é» Je su ibírtuíA fror.Ul a u p víIís^IíLmI de ¡11(J nd/rniq {[ÉSO pie* Ii.ir.dr; [>nr mqnurtríj. 1-uepn rincidu fpnr jft JJprairtj e| ilKE') ;■[m is Je on su m icro 4A.J y "[h it el n impirl irkmH' (D i, pujijn4 v * Iravé.s Je liis llllnis HfLPA 114 j I J ¡Hiles i5e ser uipúlidu lí jl. j través Jl- tifi fililí» H M ’A (H). Jc iliu de Iflfl Liifrlik U is Luti p ic M Ííl nej'ftri ¡i IklCLí el «XlíntW . &chídLm la m-inrina rctbfüli^iiin íc pueden uaiLiur tamidadeí limitadas de iin-ianíin* q uím ú» dt Jiajc* íiivcl y ajenies hiniíijiroF El trabajo puede i f r v ¡i través ií# lio visnr ib vjslrut t;C). Acüptadi de Li referciKLs".

□ Aire arribante □

Aire poleroalments contaminado

□ Ai» Mirado

atm vés do HEPA

V i d a lateral

V lsla fronlal

Figura 1-24 Di.seik.i- de uoa citrina-de K¡|iJn4ai3 tn-ük'i^ucja. J r l1u .sc II B2. & U » cabina* Umum jüic del Jireihiiepíie huci.1 la cibiiui uiratt^i ilc mi jbcRurt frontil (A) ye] íiiir ís ITcHü.La □] cnmpiLiiJiíifnifi 4F.l de Ja caJhina anfe< de eliminarlo ¿i file n a a ir^vís «Ur un tilrm HhPA (O y in tiitíma ele wmdiKtmvcin j'W'íiiníi nerahEn ftxnnu vniultípeacL ajre«fcS Bnafekiiie ingresa« la cabina 4 tnuís ds Ui&.■ifunila oun^a (H) y uti íitiíu líLF'A (Di, luego de lacuii «J aire p sjíJiw U ¿lu jo a ir» 4 i «tí área Je inhajúy Litigo sejunu w ji la cnmcpip Jel flujo de ulidu en el L-ítaiparti-mcrtro iE)de h cabina til tratajo piafe vcpp u trivís Je iirt visor de vidrio (Ki. ?is pueden uiiti/ar íustarKias qulmkus É t k ú en ts u c ftin e a ü qúí iw» reeirealá el dire. Adaptada de Lu referen™**-

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Aspectos administrativos del laboratorio de microbiología &5

C

j

Aire em pente

Aire ptHencialrnenLe

□

contaminado AiiC I il'iiüO a travé s do H E P A

V isla ira ntsl

F ig u r a

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tic t i m e ir a i< S d e

1 -2 5

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Vista lateral

I I I . E ls ld c c h in d J u t i c H i m

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a m e s < te í c í í i p f l i d n

I l l U í ^ í i '- ’ d e n t a n t e

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d e g r u ñ a , p o tif Íe s m a l i n o s

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u j i d e u n filtr n

a ijü v ü s
ú p t n k i u r .^ u J c f i

H F iP A

(te rc io de

« K l a t i a n i i c i i H ] ( E l i . 1 .a

> i s i c r r i d > < l f “ i s a j e L - - ¡ ¡ .;i '. i i l

4, Cubrir el derrame con malcrié absorbente y pregar un desinfectante conL'cnlrjitlcj. Luego de esperar 1(1 rtliiiülOS, proceder a la limpieza. 5, Si m: hubieran generado aerosoles por ejemplo, de un lubo de centrífuga roto, apagar h tenlriftiga, pero dejarla tetra­ da al menos pur 30 iil¡[lllL(]?- para permitir quu los aeroso­ les se asienten. 6r Absurber tu mayur e¡mLid;ud del derrame cotí materiales desechables antes de precederá la desinfección. l r Limpiar el sitie.» de derrame de lodws U)% materiales vribluj ll-cdtc ccnlamiínolci con una solución acuosa de drtifgenlc o con una solución de blanqueador at 1(1'Í-.

C u ad ro \ l t

r o m » u n í

Caja

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8, Descontaminar el sttio cotí un dcsin feclante apntipiadci (véajie cuadm I-iy). 9. Absorber et material des infecíante y enjuagar el m i io con ¡agua, Finalmente, secar para evilar resbalare. 10- Desechar iodos los materiales en urt reciptcnle pura ohjetui biológicos peligrosos. Si se derramó un agente que requiere medidas de bi «seguri­ dad de nivel 3 ÍB5L-3) fuera de la cabina de seguridad biolú¡sica, evacuar el úrea durante al menú* 6í> inmotos y nutiíkaf a las autoridades c^rre*pocdienlesr

EST A D O D E L P A C IE N T E F IE N T E DE LA M U ES T R A S A N G U ÍN E A y J-JitcAp

L j l d l r i h - n l r « .c t l a i i d tfu IL m

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Sí¡Lt[H.l3Í(ÍVU

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Swoconwrsl&i

O JÍfr

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mfnrtí ¡par ¿ufi,vi tiV Ju ; 'jnrji.w *i*'i um[ wjtljft

B Est igma del d r. VaFbr Eso

56 CAPÍTULO i

IjrirodukIÓei a la mi cmtío Ijg ú ; Pa ríe 3

FNVÍ0 DE KJESTRté Y DE AGENTES ETlOLÓGECÜS Tinla¡* lu<¡ rnueslraii microhiológiCus que titean transportarse a iranís del correo de los Erados Unidos deben embalarle bajo uritri-uílejilaiuentacLuiie-i espídifieridiLH puf eE Departamenío de Transporte (DOT) y la Internaíwml A ir Tmfixpart rinn ti ATA), 3-os organismos aislados (agenies etioLc'jgjeusJ que no >um de nivel de biosegnridad I (véase cuadro E-2ÜI y las muestras paru diagnóstico* las cuales se espera raionublernenle que contengan ageules cliológlens. deben emhiliinc y rum­ iarse en forma apropiada. Las mucuras se deben preparar pan* que sopnrlen choques o cambios de prestito que puedan lener lugar durante la manipu­ lación y ocasionar el derrame del contenido. Un recipiente con una fiEtraeifai no sólo predispone a la muestra u nuu posible contaminación* sino que puede también eiponcr a. quienes lo manipulan y al personal de recepción a agenies paiiígentis. En la figura 1-26 se ilostra el embalaje y el rótula adecuados de los agentes etiológicos. El recipiente primario (tubo pura el aníSliü ¡ h,

f r a n c o a n i ' j o l L ) d c l i e l- s Lj j

la p a d íi n in

u i i .l

L ap a h e rtir á lie a y

rodeado por suficiente material de embalaje para absorber los líquidos en caso de que ocurra una filtración. A su ve¡t, se lo debe colocar en un recipiente secundario henméiico, preferen­ te mcnle de melal y con tapa de rosca. Los recipientes primario y secundario se colucan Juego en una caja esterna de embalaje

de tableros íle fibra, cortón corrugado o potieírttíeno. Eil hielo seco se considera material peligroso. Una caja de cartón para envío que contiene lüelo secu como refrigérame de una muésira, debe rotularse “ M U E ST R A M É D IC A C O N G ELA D A CO N I I I E L O S E C O '1. El embalaje debí haecrse de lal mane* ra que pueda escapara el diósidn de carbono gaseoso para evilar la acumulación de presión que: pueda ocasionar la rotura del recipiente. El hielo seco debe uhtearse afuera Jel recipiente secundario junto con un materia! que amortigüe tos golpes para que el segundo recipiente sio quede suelto dentro del necipieníe estenio a medida que el hielo seco se sublima. Ademán lIc la diquela con la dirección, el recipiente es temo debe tener pegada una etiqueta que indique lo* agentes ettológicosflmateriales biomídiuos (con su logotipo en rojo cuntía foudo blanco) y también tma advertencia para el transportador, como se muestra en la El gura 1-27, PELIGROS PIO BIOLÓGICOS

So tm ü t químicas I. JJebe realizarse un plau de higiene químico para el labora­ t or i o. S e encuentran disponibles las guías para el trata111 ¡enlode los desechos del laboratorio."1

Rücipftniü primario qu-B cmlicnc el cultivo MaleUai Uo embala fe

d,bso#OerHe

Reciptrilt □acundano

Cinta

«I G0U3 RegiSlrü de la mu«5lni ÍHSM 3H J3)

flec^aoN? dfc eiivio

E l tíJü íd E A

CtlIíVÍl 1aLilC'iai rre embalóle ubíitJÍJíiríLo

Eíiqua-íi

de tJnoceiíin

SECCION TRANSVERSAL ÜE UN EM BA LA JE APROPIADO

Figura 1-£$ Tccnicíi íufecHKta pnra cmh-ilar rn^friikí. mn pclifm h1lllí^jfk^,■

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

Aspectos adminialfatizas del la becario do rnicrobiolcgfn 57

2. Punto de inflamabilidad: las sustancias Combustibles volátil tes Lsberan vapores sobre la superficie del líquida. II! pumo Je inflamabilidad es la temperatura miís baju posible □ ¡li cual se produce una suficiente concentración de vapores para que se enciendan. Las sustancias, volátiles se conocen en forma conjunta coma in(lamables. La clasificación basa­ da en el punto de Lnlian labilidad y el punto de ebullición es:: a. Inflamables 1) Clase LA: punto de inflamabilidad.. < 22 °C : punto de ebulición, c 38 *C 2) Clase IB: pumo de inflamabilidad. < 1 1 CC: pumo de ebulición, > 3R 5C 3) Clase 1C: punto de inflamabilidad. > 21 °C ; punto de ebullición, < 38 °C b. Combustibles l> Clase MIA: pumo de inflamabilidad. >6(1 C y <94 °C 2} Cl+isc IIJD ; purlo ele inflam abilidad, > 94 En el Laboratorio de microbiología se pueden encontrar diversos materiales combustibles, aunque no en las canti­ dades que se utilizan en algunas otras áreas, Un peligro particular es «I dielil éter, que puede formar peróxidos explosivos lueiTu de su exposición j I aire. El iíterse utiliza en algunos procedimientos de concentración de parásitos. Hoy se dispone de otras alternativas a este procedimiento para evitar tal peligro. Si es necesario utilizar íter. debe almacenarse en la menor cantidad posible y de manera odfiCuada. 3. Lis sustancias químicas corrosivas se definen como agentes, que tienen un pH < 2 J o > 12,5 o que pueden corroer el acero (SAB1020J mis de 0,6 cm por año a una tempera! um de 5 J4 ®C, En el laboratorio, tos corrosivos más comunes son. los ácidos fuertes, como el ácido clorhídrico. Se deben utilizar transportadores de botellas que contienen ácidos concentrados en cantidades mayores de 500 mi„ 4. Las sustancias químicas incompatibles (.identificadas de ese modo en las hojas de información sobre la seguridad del material) no deben ul itizarse o almacenarse juntas. 5. Las latas y cabinas de almacenamiento seguro deben ubicar­ se lejos de las fuentes, de color. llama. chispas y salidas. Las áreas de almacenamiento deben estar ventiladas en turnia adecuad ¡i y ser Je acceso limitado al perenal. 6. Tudas los reci pienlcs deben esüir claramente iolulüdo.> com a. Contenido h. Advertencias de peligm c. Precauciones especiales d. Fecha de reeihisWprepaíado e. Fccln de apertura/puesta en uso f. Fecha de vencimiento g. Fabricante 7. Encaso del derrame de una sustancia química Ilíquida:"” a. Determinar la naturaleza del peligro, si es necesario con%u!i4if la J-iojí Je información sobre la seguridíd del mate­ rial. SI el derrame es una emergencia evacuar el área. Si el material présenla peligro de encenderse, eliminar todas las fuentes de ignición. b. Notificar ¡d personal apropiado y obtener más ayuda si fuera necesario. Identificar cualquier necesidad de dispo­ sitivos de protección personal, c. Confinar el derrame en un área lo mis pequeña posible. d. Neutralizar los ácidos con carbonato disódicn. Neutralizar los álcalis con ácido bórico a¡ 1%. Para grandes cantida­ des de ácidos o bases enjuagar con abundante agón Luegn de la neutralización. e. Limpiar cualquier área salpicada por el derrame.

D i s f - V j c j 'i c n i s p r e v i a t i f r q w i r K i l i p e r « I J A T A

S u matizúrDn Id s r0£¿am srtíieiartíi!* parA -'iMSrCS’Kla.S p e l^ D S B S

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Figura 1*27 Lu^u-upu Je t aperné ec«>k"igk‘u ;> "aviso j| lijii^xnuenr' que

ikbc ídúij-irtc til íl exu-riúr do euiLquicr patjattí que LonttndJ inivirid^i peí¡frases u infeuciíw&s.

f, Para derrame* de Líquidos inflamables y lóiicos, miliitíir absorbentes para reducir la presión de vapor y evitar la ignición del líquido. 8. Desecho de Jas sustancias químicas: a. Utilizar guaníes de goma, delantal de goma y gafas. b. Eliminar todos los objetos presentes en ei lavabo desig­ nado para desearle. Dejar correr agua íria. de modo que no salpique dentro del lavabo. e, Verter lentamente el Liquido lo más cerca como sea posi­ ble dei drenaje, sin salpicar. Sólo se pueden descartar en el drenaje del lavabo cantidades menores de 500 mL. d. Luego de finalizare] descarte, dejar que conLsnúe asmendo agua limpia dorante varios minutos. e. Descartarlos solventes orgánicos solubles en agua (meta* nolLacetona l como ya se describió. Para los líquidos orgá­ nicos iosoLubLes, sdlo se pueden descartar de esta forma cantidades menores de ]fX) mL. Para cantidades mayores, se debe consultar con la oficina de seguridad del hospital o con la oficina de seguridad y salud ambiental local, 9, Peligros radiactivos: en et pasado, los laboratorios utiliza­ ban sustancias radiactivas, en especial, para Los inmunoanííltsis. Estos procedimientos han sido reemplazados casi por completo por Uis enzimuinmunuutrélisis, Si en el labo­ ratorio se Utiliza algún material radiactivo. se deben seguir las reglamentaciones apropiadas de manera estricta. Casi siempre hay un oficial de seguridad institucional para Los materiales radiactivos, a menudo en el Deparuuncntu de Radiología. lUr Carcinógenos^ se debe prestar especial atención a los tenias de seguridad para este (ipo de sustancias químicas que se ha demostrado que tienen cierto potencial neoplásico, a

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59 CAPÍTULO t InlroduccLón a ja mierabiología: Partí I

veces sólo cu animales de labor-alono, En el laboratorio Je microbiología. c] compuesto que mis probablemente se encuentra en esta categoría es el formal debido. La fnnrnBna es una soLmcídui C’s,tat>ü3?a»dsi comerchiI de formalctehído, utilizada como «ilucióm al 10% en Ituffer (4-% fomiaklehído). ES fbrmaldchfdo es combustible y un, carcinógeno potencial, T reglamentaciones loeJes. para d .ilmjccoa miento, oso y desecho de l formaldehfdo difieren. E l área Je trabajo debe estar bien ventilada; m debe utilizar preferen­ temente una campana tkí encape para M 4 fifia » químicas, E l Cülitjjí e*/Am eritar Fuihüíügisis exige el control de los vapores de formaldchído en el ¡área de trabajo; si se en­ cuentran niveles aceptables no se necesita repetir la prue­ ba* a menos que cambien Jas condiciones. I L Mercurio: el mercurio elcroenlal es un importante peligro rwrd Ja salud. En el laboratorio de microbiología se lo encuentra en los termómetros y en aguaos reactivos taja­ dores paira los; fio lis de parasitología. A pesar Je que sólo se hallan Involucradas pequeñas cantidades, mucha* insti­ tuciones han elegido, de manera voluntaria.o debido a leyes 1-ocales, eliminarlo por completa.

Incendias 1. O d a empleado del hospital es responsable de evitar los Incendios y de ayudar a reducir id mínimo los. siniestros que tus ocasionan. 2. Mantener las áreas de trabajo libres de basura acumulada ^ de materiales inflamable* Los comedones, los pasillos y tas escaleras deben mantenerse sin obstrucciones que puedan impedir Ja salida o agregar combustible a un incendio, 3. Conocerlas fuentes de ignición,. las Llamas abierto^ los ele­ mentos de calor y los generadores de chispas (motores, inte­ rruptores de Iu í , fricción y estática). M is del 22^ Je los incendios -de los hospitales son causados por instalaciones v l^ lr ía í defectuosas. 4. E l personal debe estar instruido acerca de las diferencias y el uso de los extintores par® la* cuatro clases. Je incendios: a, Clase Ai incendios que involucran materiales «urihusi ibles ordinario^ corno madera, papel tela y plásticos; utilizar un cilintor de agua a presión (tipo A), h- Clase 11; incendios que involucran líquidos inflamables, como alcoholhnafta, querosén y grasa; utilizar un extintor de dióxido de carbono (tipo B). c. Clase C; incendios que involucren e q u i p o s eléctricos en Sos cuales puede existir peligro de electrocutarse debido a la conductividad eléctrica; no utilizar nunca un extintor de agua; utilizar un cutíntor de kusiatkíos químicas secas (tipoC). d. Clase D: incendios que involucran mclalcs combustibles como magnesio y potasio. Se requieren técnicas especia­ les. Llamar de inmediato a la estación de bomberos local. 5. Las mantas para Incendios se utilizan para sofocar la vesti­ menta incendiada, envolviendo a la víctima con ellas. Si la vestimenta *e incendia, tleherá ser arrojada al piso y apisona­ da para sofocar el fuego contra el piso. N ú corra en busca de una manta; la corriente de aire sólo ventilara las llamas y dará como resultado un accidente má^ serio. De manera similar, una manta pan incendios debe utilizarse con la víc­ tima sobnf el piso, envolver a la persona parada Con una manta sólo creará una chimenea para las llamas. 6- Cumpla con todas las reglamentaciones locales para los incendios. Participe en los simulacros periódicos que se rea­ lizan en el hospital. Cada empleado dehe conocer el proce­

dimiento del simulacro de Incendio y la rula de evacuación de su área del laboratorio. BiúterrflTismo

La probabilidad tic que los terroristas utilicen agentes quí­ micos. biológicos o radiactivos ha sido real durante muchos años, pero adquirió un nuevo significado luego de: 1) la tragedía en el World Tráete Center y 2) el Jesc abrimiento Je ¿artas em iadas a travos del sen icio pwtal que contenían esporas de ántrax. En la actualidad se requiere que unios b laboratorio limiten cjcrtos agentes a un uso absolutamente esencial y que le proporcione al gobierno un inventario de ellos. Además, cada laboratorio debe preparar un plan de contención pora ocuparse del biotermrismo, M uy pocos laboratorios de diagnóstico tie­ nen a mano alguno de estos agentes seleccionados (véase recuadro 1-23). La responsabilidad principal de ocuparle de La mayoría de estos microorganismos recae sobre los laboratorios de referencia, 1m laboratorio* de salud piiblic;i y otros labornUítíOi del gobierno, E l principal trabajo de un laboratorio diag­ nóstico es reconocer la posibilidad de estar ante uno ule estos agentes mencionados durante el procedimiento normal de ruti­ na pl realizar su tarca; luego se lo envía a una, dependencia de apoyo designada y se notifica a las autoridades correspondien­ tes, Si se sospecha terrorismo, la investigación tomará carácter delictivo. Ln el cuadro 1-23 se resumen las categorías de los posibles agentes de biotemuismo."1 En los Estados Unidos, el plan Uuckihnl de preparación para el terrorismo contempla una cutegorizjción de los laboratorios en niveles mül tiples con una responsabilidad gradual para eva­ luar las posibles amenazas- La clasificación de l os laboratorios se detalla en el cuadro 1-24, Las cuatro categorías originales se compendiaron en Jrer..LAseguramianlo de la calidad E l sello de los buenos laboratorios clínicos es prestar cons­ tante atención a la calidad del trabajo. E l aseguramiento de la calidad es el amplio paraguas que cubre muchas actividades. A -.cec-.. parece que los nombres de los programas cambian con tanta frecuencia como io* de las bacterias. Las denominaciones Je mejoramiento de la calidad o mejoramiento total de la cali­ dad han dado paso al aseguramiento de la calidad, pero en todos Jos casos el mensaje básico es que lo> microbiólogos Jelien mirar constantemente ln que están haciendo y mejorar los procesos. El control de la calidad es un procedimiento tra­ dicional y se analizará por separado. El aseguramiento de la calidad puede lograrse en forma interna o realizarse como pswte de un programa externo Se encuentran disponible* las guías naeiotudes de c»nsenso.M Debe comprender tudas las fases del cielo de diagnóstico.*1 En la sección de acreditación del laboratorio se discuten muchas de las características de un programa de aseguramien­ to de la calidad, que incluye los programas de eaJidad como un aspecto Crítico. Las actividades internas, abarcan la documenta­ ción del desempeño clínico de ¡as ensayos [que deberá reali­ zarse para cada prueba nueva que se introduzca en el laborato­ rio) o la documentación de la utilización del laboratorio por parte de los médicos. Se debe documentar el desempeño del personal técnico en cada tafea de la que son responsables. Se debe evaluar la equivalencia de las observaciones morfológicas entre los técnicos que realizan las mismas tareas, Se requiere la evaluación formal de la; competencias de todo el personal que realiza las pruebas de laboratorio {Incluidos los enfermeros y

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Aspados édminisltatlvos del labofltlorlo de microbiología S f

Cuadro 1*23 C la& ifltu d ú n i k lits ajan tes biakigfct*» * quím ico» ta n p u ten d al p a ra terrarfem u ■.1■ " k1 * -,;., 1 -K ' ' ¡f" ■ ■■J -!.-r h1 \-■At L .I^j *r ■> - J.' c a t e g o r ía d e l a g e n t e

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D ES C R IP C IÓ N D E L A C A T E G O R ÍA * F ifiln x n u diienniiUHlo o vxmmiiiilo penalti .i penflíu * C w si iUtí m&rtalidi*l cen (vwwftnl ld¡*j p»r* pn gr*n irepacUtera la saSuál piihlk¡L * l’Ucdc «uñar pdr:m pdtitim j ¿llcj.iLiúr. m jl liLY * RtquJen especial aeonva para la preparación «le la salud ¡Mlblic-a

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i Viruela [Yin» de h vimelaf * ftn ath ts iu tim d * [cii+ftinct» ■* Y criin ia pesh.i (p o li) ■ToJqifiatLt Ckntridiurn btítuli'iam {lsiíluliníihH) » FtíwciwHñ nttorennit Oularaniaj * Filíft'iíu iívin u Martaug, y vinjh íJboli) * jUerutvimib tk Dcfcre km > i í .¡í if j * O i.rid fo b a m ftji [lictnT Q>

* Moderadamente ígeil 4e chsírolnií * M u tk m Ja morlútiiliul y huía muiUilidiKl

■ Eü|5« ics 4 e B ra crtta (IbrlsteluMS 1

* Rk iI uíc rd un jDcrcmcnto cit la *Í£¡Jafi£Ú dc-cnfímHKlaJ»

* B w lch o ltk ñ a

imqrnnol « Alfüvinií [ f . *j . viras de Is crMtfaüoraelitií det Ewc y del Oewe) * l'iM u tiiifk b u de tU cíM it etm iuatítn (.«MBilia de ¡ricuuiji * Ttóiailí! Je C lo iM d tltt» pr/frúigtit> * Eirieroiüilna B dee^caricvoew » Esfseí íes, de Ik ílm m etia » S h ifr íiíi ds tmwriiit i E icüríiifA íd (tyü COIS7:EfTP * H/irw iÍK *k n w * C n p u jsiK ifiiíta m püfwtm

C s tc p u rlj C

Agojtei nchi^eiibn owit * JljifCra'liitlílad. * tic lit il ¡IriTiuLvirtti ¡f dnci!iiiLj>::i>lL * iNflecicja) a.- j.h .1 mmfailitlad. nhHt&JiibHl c im pai'lij en U Kl lu J 7 OI lílL’ü

■ V iiu't iN’ijtha.

■H,ir.l;tl, ii'js i VifiL'iJc b ficbté bctfiiMiajrici thuüUiclidd (xc ganapubn * Vílu.ttk Jb m nífiJiUk Lí.üimi. LiJ-L ¡;ii t _L'iita¡i^j.i * V líüx tk la ftehrt am anl U * \{\'CPi?\vntri¡irT\ n4> frai(f*m sniilnrrtbL>1rtlie

Adiif'lalr' üírJji fuitrr/KÍa?'.

Im médicos;) para todo* los ensayas que no sean de exendén, E l examen pnetfc ser de diferentes manera: observaeidn direc­ ta, exámenes escritos o prueba* l,de campo" utilizando mues­ tras del laboratorio. Se laact publicado las gufe de consenso nocional pura implcmedor estos prugruma.s.s‘ La evaluación del desempeño del laboratorio se puede mejo­ rar comparando el desempeño propio con el de lo i pares mediante un programa externo. El Ctrilege t*f Arntrivuti ñithalogists ofrece dos programas de c¿le tipo.,32H! E l paiú' HKHW ene se elige para la evaluación, « denomina indicador. El pnmer programa. llamado Q-Ptobes» consiste en estudios transversales sobre un nema en particular, como la frecuencia en la que un microorganismo propio de ¡a piel se halla en los hemocuilivos* Cada 1aboratorio participante envía sus resulta­ dos Je! estudio que se hun realizado de acuerdó Cutí un proto­ colo definido. Estos resultados se analizan con cuidado y se elabora un informe que se entrega a [(«3c» los laboratorios par­ ticipantes. Por el contrario. el programa de Q-irackü es el contra] reite­ rado de m número limitado de indicadora definidos como úti­ les para establecer el desempeño de un laboratorio. Púr ejem­ plo, el tiempo global de respuesta de un laboratorio para un determinado anal ico puede anal i/¡irse a lo largo del tiempo. Pm lo tanto» es posible graíiearcl desempeño en relación con sus pares, Comn yu se dijo, un laboratorio puede también evaluar su desempeño en comparación con el de sos pares a través de la

participación; en Ion «sayo* de aptitud.^»* En nn comienzo, el Cnltvge o f Am erican Fu tfm h g ix ts proporcionaba iskh ensayos como una herramienta de educación pnra el mejoramiento del desempeño de los laboratorios. Luego de la, reglamentación de ];1k dos leyes de C L IA , pasaron a. Ser una ¡parte obligatoria pan el funcionamiento del laboratorio,

Coniral ds calidad E l control de calidad en un sentido estríelo consiste en la evaluación continua y sistemática del trabajo para asegurar que el producen final se encuentra conforme a los limites de preci­ sión y de esaelitud tolerados- previamente establecidos,* Los directores y supervisores de los laboratorios isciuuk-s deben darse cuenta de ipie el control de calidad es sólo una faceta del amplio terreno del aseguramiento de la calidad. Los interesa­ dos pueden acceder a los requerimientos del CoUege of Ame* ritan Paitwlogíxix purra el control de calidad (y también para la seguridad y oíros temas importantes dentro de la gestión de la­ boratorios) obteniendo la Lista de Comprobación General de Laboratorios del sitio de Inicmct del C&Ht$e of American tñaítuihftisis íhttpWwww.cap.fírg), Rl control de calidad en mi C rio lo g ía o más un arte que una ciencia: involucra elementos intangibles, como el sentido común, el buen criterio y Ta atención constante a Jo» detalles, Los programas se deben organizar teniendo en cuenta objetivos bien definidos,

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60 CAPÍTUL01 intradutelan a Ii mitroblologii: Parle i

Cuadro 1-24

Clm iliudún «k* los bbAhittrkií la* ulticrado^ en 1» iaveitiitiidúu áe ttrruristiiD biolúgjui u químico 1 ■ ■■ - -•. ;íi ‘.W: ;r*-'tL*

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» (hU¿s tí y CJ

■Cipiíidad central para el aulimientu y la cirocterittKrióii <Jea|frntc<. áe birteíTuriuiHJ síleockraadoy * PlríaM Srfts'kkfs Jar¡j J-cdU-.U l¿i tatvuicu de ntUestias Jte leí SahíMLi 1tmos de un iskel mayor * Capacidad ¡^anzadu pira la identificación rípidi de agentes seieei'Luiiados. mediante técnicas Je n ilo i^ y k u Im u Iattíi * Pnrtici|ii su e! dtswTolto rfe pnidw y en ln esnolu.ación

* Laiimngtimii. ik >-aluü ptíNica Iwslss * Laboraorkis. eseajtükí. Je ulta oive] * Ccauaa médicch MddéfuLeuk

c ráüiiL-i ü.i

* Niveles redi jJiúí ik'inaifKM.ia y suliaii.ai.iKi * Í l:u(.¡ü.iJ píuiL jjl :i5s¡?. JiicAnduk

•tlf-üpj-idrOlü de LJkirjliMiLB, ealaldbt •1.j .Kt_!ui :i3h aL*«d¿rtlJH» (|tle operan cu un dtü nivel 1c Liínlcntián hiijn l >nIni!i»ni il l!

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AtfnpMtfo dt Ij rr^rvwii' '.

C O M P O N E N T E S O í UW P R O G R A M A Ü E C O M T R O L D£ C A LID A D

Un programa básico de control de calidad para mknbSott»' gía enumera varios elementos específicos que se deben consiiterar al implemeniar las d iv o s » fase* Je un programa. B a rile lf ideó y analizó diferentes niveles ite uelivtdades. que comprenden desde las más bfoicas h«üi» Ia6 más a v w » d » . Utilizando su esquema» un. supervisor puede seleccionar el nive] de actividad que es apropiado para el personal y el volu­ men de trabajo ea un laboratorio determinado La comí sidn de acreditación e inspección de Iak laboratorios del Cüllege of Am trtcaii Ptithobgists (C A P ) ha establecido los estándares pura la acreditación de los laboratorios clínicos, entre ellos una lista de comprobación pwa bt ^pcocidi) de Sos laboratorios Lie ndcmhioln^a. Esta l isia le brinda a los super­ visores una valiosa guía para realizar la evaluación punto por punto de las necesidades de cont rol de calidad, L i» regíamentaciones estatales de la C L IA 'fifi incluyen muchas de estos requerimientos, l-a* roglamentacloneü están en constante revisirin y pueden ser modificadas. Por ejemplo* en enero de 2CXW. el CM S publi­ có la modificación a las reglamentaciones subte “ ctMlrol de calidad equivalente''. Esta modificación permite reducir te fre­ cuencia de ciertas tareas de conlml de calidad luego de la vali­ dación áe «a laboratorio que ha cumplido con un criterio defi­ nido. Algunos de los cambios son mis esigenl.es que los que solicitan algunas calificadas agencia* de acreditación, comu el CA P; otras !□ son meaos. Por ley, las agencias calificadas deben tener estándares que son al menos tan exigentes como el CM S, pero mis estándares pueden serlo aún más. En un comienzo, se debe seleccionar un coordinador de control de calidad., Se deben establecer con claridad las sihligadones del coordinador j conferirle la autoridad apropiada para que pueda tratar en forma eficiente ios problemas, cuando 6iUiti surjan, Es responsabilidad del coordinador establecer los estándares mínimos de control de calidad que el laboratorio debe alcanzar y esquematizar los diversos pasos que se deben seguir para moni tari zar y vigilar a diario todas las facetas del programa.

El coordinador debe contramarque todas las actividades estén claramente descritas eti un manual de control de calidad, en el cual también se deben esquematizar;: L Los detalles de todas las prácticas de control de calidad, como los procedimientos y los esquemas para controlar el funcionamiento de los equipos. 2. E l control rk tíxlús los medios y reactivos en cuarto a su reactividad, fecha de vencimiento y patrones de reacción apropiados frente a Im organismos de prueba. 3, Todos los resaltados de los ensayos de aptitud. Se deben diseñar los formularios adecuados puní recolectar los datos con un formato de columnas de números» gráficos o diagramas, de modo de poder detectar cor rapidez cualquier elemento que esté fuera de los valores esperados. El coordina­ dor debe revisar también todos los registros de control y verifi­ car que Midas las mediciones que se encuentran fuera de los valores esperados y que las acciones correctivas resultantes estén claramente anotadas. A continuación, se realiza un breve repaso de los numerosos componentes de un programa de con­ tra! de calidad.

CONTBCl Df LOS APARATOS OEL UHOfWTÜfiEO En todos los laboratorios de microbiología se debe esta­ blecer sin programa de mantenimiento preventivo para ase­ gurar el funcionamiento adecuado de los equipos eléctricos y mecánicos. Los aparatos deben revisarse a intervalos» prees­ tablecidos;, se deben reemplazar ciertas partes de ellos luego de un tiempo de uso especificado, a pesar de que no parez­ can gastadas. Rn el cuadro 1-25 se muestra una lista breve de algunos aparatos, el procedimiento de control que se debe (levar a cabo y la frecuencia y los limites de tolerancia. Se deben asignar las tarea* entre los miembros del persona! del laboratorio para asegurarse de que todas las inspecciones se lleven n cabo y que se registren todos los datos de manera exacta en cuadros o en el manual de mantenimiento, fe

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Aspoctos administrativos del laboratorio do microbologia 61

Cuadro 1*25 Procedimientos tit vigilancia del control de calidad del «pjípamícntii nilnrobiolrifllco ukk^ k mnánrncntc EQUIPAMIENTO

PROCEDLVHEVTO

t.ÍMITf.S PE TOLtHANClA

CRONOGRAMA

Rerñfciadcva Qwijeladore*

R cjtilra

do tcmpcríHirs * Rcfbimste traipcratuira*

[íiarirto (wiairníf> DijffwoeoiHin.uo

CllLÍJl

Re;iitnt*k (emperatera*

ftiariftin L-CraltWUC

35S i i °C

LLsliiíai ¿CO,l

McdkidO i!cl coumilUí ik CO, LTiCi ik- un .iSíiIÜ.íkÍM de ¡pasCS mi ¿uíúéltí fi un dhpotUM FyKic1

DialK» Odi» 'iecc-, |K'i Jij

S -líF i

D-üAiit*»Je íipw |«T»KHÍ*t¡^lPí)íM

licp iím J : icmpcraipra*

P ic b

36-?B rjC 55-57«C

Hinques (te cikiüCamkfito (5 M «pes térmictH)

Repiduxte lefiipenlura*

DLaimi

s 1 -Cdfll tijuJ-i

AUHWtflVlJHL

Prtefia en» (ira dr espora íBffí j'ÍÍJíT ¿mawihttiüvphilui k

Pur in memH -.irtT^an11nenrf

Sin orcimiento de eipanj.'í en tos salvulin'oa sreSica üii eaasiyo t-síéjil

Mfdwlnreí de pB

l-'tuetiit ™ wiiKJíimrs «k c-JituíctófL de ptí

C(m cinda. y^»

± 0,1 (inKtidf'i tk ptt deJ estíirntar

Janas de *M fríib ÍPiii

Tira cen indicador u u l de metales*

Coa esd i

Un camtiii) de a o l« de la tira de añil a Moneo indica Ny.i Temion de Ü ,

Cliíi í w i iic CÍMitMnitt rwrt- tipo B

Realizarlo periódiesmeiste

E l crefimkfito tiiáka muy baja teiMiJu de O . Es-io se uriltza -sélü cuando m requiere™ K K iria de O, emetnadamearie haja

SnlucM n can indicado* ilriü d r

Cuntir,luí n Ju n r .

tas snlucifuneB p*rrpiw!íwi ij»c«JnnjA y [j lesuiión

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CiatfífiiüJLS

[ ÁnLrnl Je te Vid ilio n a Lttti u :i tocrfrtelTn

McflM£«lin?J3Eí

Cubtnas de secundad

MetticKSn de y «floculad del aire j trui-fa de ¡3 ip c iliiu íront ¡il3

Sem eitnJ -u aiMJÍHK*.r¡riil

Alte flujo de aire por minuto ± 5 ft/niin

- í'ViJg EMNdflMFP ¿f iíp¡n¿riVirRr-pSfl dffar wr nilibriMfa rtmtrn imLenwm*t/™n t k t n : ' AudurinJi St-n/ri’mm Cl>.. P j Í'A. •' Jt- Altvtf ¡Mrfñitntxl Cv. Cfclífljfíi IL

importante detectar de inmediato fas» tendencias ascendentes o descendente*, pan» qué se puedan Jomar las accione* co­ rrectivas antes de que se produzcan emires veri o?,. Se debe determinar j registrar en forma diaria con un termómetro calibrado por La Burean úf Sraatiards o con uno que se huya controlado enn un termómetro calibrado, la temperatura de las estufas de incubación, refrigeradores, congeladores, ba­ ños. de agua tennosiaü/ados y los bloques de calememiiTiio (bloquea térmicos). Se debe determinar también en forma diaria la ctínceulratrión de CO . en Ijk estufas con atin giera de COr Se debe establecer la cuma de cualquier lectura que se encuentre fuera del rango estipulado por el control de cali­ dad y corregir de inmediato el defecto.

CONTROL BE LOS MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS E INSUMIOS

Todos los medios y reactivos se deben revisar frente a los controles apropiados para csiabiccer su correcta reactividad. Se rccuuocc q u e muchos de Huí. medios comerciales moderaos se realizan cun un alio grado de calidad o conñabilidatL Se han creado recomendaciones de consenso para tas necesidades locales del control de calidad.'54 Los pocos medios que pueden tener prOblemwí -ocasionales tp. e j, agar chocolate, el medio para Ceitipylrttwcter jejuni y el a|ár de Th^vcr-Manin) deben someterse a pruebas de control cu cada laboratorio. No existe necesidad de probar muchos ulros medios, si el fabricante pro­ porciona la documentación que demuestra que se observó en ellos una correcta reactividad.

B Est igma del d r. VaFbr Eso

62 CAPÍTULQ 1 Iilnxtucddr a la mi croWeto gia: Parte I

Citadlo 1-26
MI £■RtH>HírANrJSJiK)!r 11F, ^ONTHOL JÍfpn^pJíhrartJJ.tilet p,rupj X .í pneiimoaiar

JíivACCIONEíi KSPKRAPAS 3(lpwtdik, p-lwniítiíifc f ’iw irriKEbn adcgv^tLii
Apu bilis-cwuliiu

E'jKtiM- & ñlJfflíW lM a-hs:i™][1icflj Sf/rfiiK-ocru-: rn del grupo D

CieámieoUí j J c íiu J iül uwtüSin cratíDiicstuL kiii cainbknk ccJ-n j¿'¡. ntcdiii

A” ji

iltu:nn>frl¡rttu- infSucjLiiir JVfiiií’FÍa gt'rwrrñfHrar

(.'j-.'-L11L1■ -T.111J'iu'.tuj'.» CnrLirnkijh} adenuuLii

A¡,;jj ui Li. tk, Chiihlcrtieti

Fr\)Ino, mirafriüx Khhfiríht pntumttniae É'.inrJnrní hímch

OirujJeturwrUc hw¡l fpinitiví.» í *il’u %ic ¡lauta ipilI |sjtlíu! 1 Aniafilio (IK^ucLvl1 !]

Apa* dUMO ite Simmttns

jfjitfunuwuíir E, H'r-’ÍJ

Cre>-;¡míenlo 0edaruul iposiUMKi» Sia crftioiientu, pnnuiKn vertfc IrrrgíitJvp)

A|üií risdna tripíkaia. itTA) Cfexlrusa

jV. gciflwríVh'rtfr Bríuifrutnclla ¿ularrhtiii.i

Affiaanlk» fpu^itlvm Sío Láimbiú J l cliUw

Sacan»

FiSihfrli lint ro)\ K i¿t>ni>rtiint'ar

Anunlki ipoílii’iOj S iú ..¡iriifon J; eulií i'fK^¡s!ivu|

Msituó

fcípwiei de ^Thfintti'Ufí. q Ar mfningitirli'i /¥, xvwriimvf

Am-Hilld rp™iivrjl Sil lí-ijniltwj i.k cuLor (iKjiKivO')

Ijldosa

iV.

Itidítinicsii iV ]taanrrh(Wiit

Aoun lio (pcnilhii l Sin enmísn ik cnhn (Oc ííHtoJ

U&iiu descMboüLasas

K, fMrMÍWplfÍRf tíHCRfllBrt^r jrtíwatir

Amtddp (pcálivg) Arrurilln (.ncjiUiv-ol

At^tniín tüihíJstslusui

E. ííuhíc*tc rroltw minihilit

AxulixJo CpUhílkVOj1 Aiti^ii IIli (itejríKiYn'l

Orn-illHA

I1nfúvtnlw K, fl-flrtJBJrtKUctf

A/ulüJy < jxis4li^ti> Anurilln ([k íb Iíto)

[tesimiiitB.JiiuvIwn ( |)pto>a1

Stt ra¡ai mttrtrj,.íjiv /_ i ItMü

YjLtrwdr dsaifitutulSA I;uJm;híi:.sí HCI 1 N) Sia luiy J l Llarnficx.'Lrkíi

Afar píHinu-l/ul Je mcUlemj

E dCjíf K pttenmo¡mv SHÍftflhtflt.ltKfi

t'rídfflienlo JrtJeotíin, fmlJii vípJe nttHko CrecliHienlo «bcuaJcj. tokfisas violetu. sin, bitllo CrajmlcfUa adíxuiidcii tolraim IramspamiíES ([ActouL ncgaüi'ol

Ajar emitios tfc McLtoeii

ialmantUa wphmxi'.utri S JttCH/l1 E fttfi

CqIohuk verdea con cemjm negmi CliLouuis verdín LransptMeotói Cr«ifnienlin Ic^cmcnlc inhibido, coloni» nirmjH

Ii'.l-,.i| idc Kovncí

E. rtiVr ^ pílrtíisie.iflíirf

Eüjo. (positivoJ Skn ccjLim rajo <íwjisrtii t>J-

A|pár bdenu Uc Klijkr

E LVt/f 5íJr.gf/kí fcwwiip jP.kíítt'íwiTiSTIiJUüfJTJ.flTlülJkí Sa¡>wmrí¡it

Fíbo de fiáisU átnkh'íomlif écílNj Pbo de tUniL» ¿kitLina/roiulo jciiíu Pko de fktiti «k ulifU'aífótttta üWi Sí.jw Piro de flauta ilcalinefando rvegro

A^ir-lúÍJU-bsrrTO

S f\phis-\é*fr¡{?)¡ Shtjtrifo flr.iTit/i ñ mrmMií

Pko de íliwtB j kjrjiiLi H.S *t Pico de flauta nobu. fomln imarjllí> Pko de ilasita nijtí. íoaidii anianlkí fContinúe, f

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

Aspectos admínisliativos dei laboratorio do microbio'ogín 63

Cuadltl 1*26

l'n n ln d de validad de los [n ed ia utíBzpdn» luis IIW J'W frKWüriji: w^pubmihk de ctKilrut suyLTidnsy itlíd M ttf

tífwríwfai'í icont.l MKDIO

M ICRÍXW CJ4KISM .OS UK CO VTttoi.

Apír de MjjlClmiIucy

K. totí I* mmiHiu

HKACCtONKS ESPERADAS

liip sifs de Eftt?w\wui

C'i^i i i.L-. rtmnlas (lacUKU puxiUvn) G^CTTliíV inpnlnpK, sin dispensUm Sin cneciim?i>1o

K. aAs

_Siji crrebtisínU»

K par amimffir

CrcdmienlD adíctlaihl, lilil IJü'-iÓViS)

¡\ mintbilin k‘. jme'umnnm

McUn- Lili 1 Ilh.imLi '.i.ii SLn butik» |¡luitii<Mi»cii la M ría üt lietnhru, íapgBEivcij

Ai iiwtitfvcfrr !u*$¡

Rojp ¡it ajrt^r k» ríKLjvm Sin ette lugo liwplim i)

MflltlÚSID (ajJaJ gygirtktfóuksji

Caldo u agar Jiicraiú

fc ítJÍÍ

Cnx-imk'Sttt ademado Sin- £í(üLÍffliííiEi.3

tmi1rofcíM>l-p-§a!artopiranfo14o (ONPGi

■Srí'míwí 'tmímfaí'rrit VítJ1 »nnfUa typhimuriimi

Amarillo (pcuMliro) ínrrolwo (negprivo'!

] rr.iJjJjitiiM 'J-r^iiiMusj

K nurubilii

VrrJe iadict-usuií 10fl- Fed,) SÍ!* cnlcT VfTic1(w g íi™ )

Aprssngre fenitftil jfcríw l

Eip «L« de Srftyjhfc'ftfVfaf

F rflii Agar Sult)wairiht-Shi/teifo 1SS 1

S. rypÍKtntiwÍMm

Csbnius ircuíord*, cintro negro S:u lm kíh .íhuü

T culi

Apar silcwn-lfMTiiMk^^R ÍX L P j

• htimllir d? Afi. r/ís.- 'fL^t

Cuadro 1*27 m e d io s

o

H\ pnmaÜOI E. ct*i

Ü(iji5 C*J¡íJ&tiir rciCíi^flSl

Esperé* (kLHfíiawnfila t". LÍ)Íi" Eip H iti de Shijidt*

Cíl|PTWB< ITlfAl rjisin» pDRtFTo)

SÍRl JCS-MTUU'J i IKgaljv(}|

OlDr.i¿M iimsrilJds [¡uíkiires pusitivu) CíjiojiJíLi iTttnijiajeoKi |nenaIív j I

Cvtljp! afAmt rnnii»i'ii¡iw4t>jriit. AnÍKiifo 14dr ■irtutir dr 2003.

Curtirá! de calidad d r rcantivits y inctlíns ü eltu ío n ad o s1 FRECUENCIA

k e a c t iv iw

Tindripi de fíram

Cadü r»ue^ri k * í dt ffllfirtifHW

Otnis tinciones na ¡Eismmf^i ieas, íioinniwio-

Cada úv£ ■.|,.’L* u «uta

fluorescaní^-

CONTROLES

y si rruírK* ^m m ílutííHé

ulili^j y ¿uda hul'it? lulí, n.uijLi’ i ;k' Jaili

1'l5KÍCW> flixif'wccntct

Cadii ^fí que íc uriHua

Ssifisw tic- n!(>ni;ri-’Pi nhi d í caíalas, €oagii-

Cftda itU^u

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* gnmptaiciKH. y siammsMiivps

id,id üpn^piodj hl<-icí*¥jd,iii «pmpiula

nú'-L-irm díf fcne l>¿ú'iiü

CimCrúl*!» fullJtLvtii y A¿£j1ÍV4»¡

lu a. ox¡i£tu>B. huatrarlm. epcaf'iiisfci , X a V a íí\ Anusufircra {SiiítrtOMHa y Shr^Uai

C ¿d j rtiunu It*!, íiürtkíh] de hite n enrió cuinci» te prepa­ ra ii ¡«I»!* y una vpa ííida f» rrie£É$. tu ln n c a h v

Písn&nles. pouiLvns, j

fl-1iCt*nruiin

í’adadU que w útil ir*

Cmuroki pííJii^ c>f- y iwgativíw

|i Ijv L iilu tj i.liJin.s.'Lfim h

Cbííi nuevu !■>'-. nÚRifm de lote c»coríu

CiMírnlíü |>niJl¡vni y iiepMiv<>íi

SiHtHÍas Je fcfeiíiís nMflejpiií

Cíhk Jí.i que k uülija

Cuatrobes [m íJiív ü í y

TjñCjiiftí^ AKH

Cati-i di.í «|se m utili/Ji

Concroks, pnsJrivün y ncgativíM.

ArrabiojiFama

Hian.uni'irü « teipnnp[|n«i:ir si «m pL1 cm i t i «rrlWK» Jrfasc tag>. 17i

nrginismns Bfetifiindot

(I¡fs rfflfes * (lítníftííiM )

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bcjiMívírí

H*tn *£r i4 ift actutnrtfr ílW.Í

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

64

CAPÍTULO 1

Introducción i la microbiología: Parte I

E 11 *1 cuadro 1-26 se lis-tam los organismos sugeridos y los resultados aceptable* p aij lrts mediosde cultivo u t j ] M c o n mayor frecuencia cu los laboratorios elídeos. Ea los labórala rite se pueden mantener organismos, de reserva para control de calidad a través del subcallivo de tas cepas bacterianas que se aíslan cuino parle del trabajo tic raima, Cotos alternativa. y más conveniente, se pueden comprar microorganismo!-. de reserva en colecciones de Cultivos, enma ATCC iAmeñcan Type Cnlíerr Cftlitctíon. 12301 Paiklaivn Dr,, Rockvilk* M P )o promotores comerciales. Et fabricante o el laboratorio local debe controlaren cada lolc de medios de citllin v su reactividad conocía y su capacidad como sustrato adecuado para el crecí miento bacteriano. Los iubos de cultivo, las placas, con media y los reactivos deben presentar una etiquen que indique en forma tiara el con* tenido y las fechas de preparación y de vencimiento. Se debe hacer referencia a los tubos de cultivo, placas con medio y reactivos "codificados* de manera que aán d personal que no pertenece al laboratorio pueda interpretar el código. Se deben definir en forma precisa las reglas de control de calidad que se aplican a los antibirgramas. Cada lote de ntedio en tubos o en placas debe ser sometido a un control de esterilidad, sobre todo aquello* a los cuales m: les agredan componentes luego de su esterilización. E l control de «¿¡entidad debe realizarse en forma visual y por subeultivo. Por ejemplo, ciertos medios selectivos pueden suprimí reí efecimiento visible de ciertas bacterias: sin embargo* pueden apa­ recer microorganismos viables en el subcultivo. E l medio pre­ parado también debe ser observado en cuanto a la presencia de otros signos de deterioro, como cambio de color torbidez, evi­ dencia de congeladofdesoongelado y estado de hidratación. La frecuencia con la que se deben realizar la» praehíi- de control dé calidad sobre Jus medien» y ld> reactivos (incluidos l«h reactivos para .scmlogía) está clammente definida por varias agencias de acreditación. F-n el cuadro 1-27 se muestran algu­ nas de la* reglas pora et control de calidad de medios y reacti­ vos, Las tefiomcndactones para el COOtn^l dé Calidad IK> MUI estíticas. Es importante seguir las recomendaciones actúale*, a! menos en paite, poique es ptubublc que los cambios representen menos trabajo en lugar de más trabajo,

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Mitin. VtMV. a Ki^KirtkAr|»i'H'HíSrH'fclí. I i ¡.*5-4fr

16. Coilcr fot Dímtííc C«nln.*l. AppcmSUi C. Bímc «id expuadeü H3V pvMeji|MMiTe MSfWTt Ktííirw Hcp M i I ¿U* KR-11 i:4í-M , IC in t e l.! I"* r I >.•••:J a Ciioaol UpdviiHl U S. pubLii: li(.i'ih ütvsj* l - i i i J-.-lirií-v l'i; llie nuiu|$ciúnil í?r uc^ Bpat.uiiyl cxpf^olrs I:■ l!II V HCV anJ IIO aiiJ [rLdftkT '.m ri i’ k i i ■ fop pi>ir'iort

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sj.'sjiyní Wini fíwito f « eo*o® lhil‘*HftlwS pKyitwnls, I Cien innena MtJ IW H H IR fl. I9S. Hyr«i PH . í l t i lu n fftJiH l (Hí*nm iftft u iA ) «m m cru íí hiei-i.1 mh- i-t dLigKtHti jjf ciihclec n Lu e J uJrdiüD. I Clin .Uii.-iLfaial 1944-,1b. IÍHS- ]ft4fi JJ. fn M rIM l «i al. J.¿g K 4 iiU 'm 'd »caw ils^nplitei t«í.m epi-Joiuc Oí |
__ J i^iiocplibiilMv tu p u U m

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B Est igma del d r. VaFbr Eso

a la microbiología Parte II: Guías para la recolección, el transporte, el procesamiento, el análisis y el informe de los cultivos a partir de muestras de localizaciones específicas Infecciones de) aparato respiratorio

Infecciones del tubo digestivo tnfeocione& intestinales

Infeccion es de las vía s respiratorias

Sánfoms clínicos

altas

Hccoluccíín de niucstras da heces

Rota endógena

Consid^acitxies ¿p idemi .M g i-a s

ea ia evaluación de ios pacsenfe$ con gsstrDen'eritis

Fa rin g e Giras infecciones efe la caridad bucal

Infecciones d t l t u b a d i g e s t i d a lio

diferentes de fefaringls

fnleccbnES efe la nasoíaritige y culiws

Síntomas dinicos

fia s e te r^ s

OtterxkSft de muestras del tubo digestivo a lo

M í medís y sinusitis Ep glotitis

Infecciones urinarias

LaringNis Oleas ínfeedunes rte las vas. respiíaiü^s

S ig n o s y s ín to m a s clínicos Factores del tiuéspe d

altas

Infecciones de las vía s respiratorias

R e c o le c c ió n de m u e stra s de orina

bajas

p ara cultivo

ToqueobrflnquiÜS

Muestras d3 orina dsl cJicrno medio da la micción

Bronquio^tüs Neumonía tJaifrv^nía crónica

Emp^ema

Oirás (nuestras de orina de micóún espontánea Recolección a parir del catétar Punción supiapúbca

Neumonía en pobladünss especies Recolección de muesfas para íl diagmistico d£ las in ls c c iím de las vá s respiratorias bajas Pnietwts de laboratorio y diagnóstico deneum ena

C u ltivo de m u e s tra s d e o rin a P rué Das de c rib ad o p ara infecciones urinarias Pruebas de cri bada para baüriuria Píijcbas de cri bada para piuría

B Est igma del dr. VaFbr Eso

infecciones del aparato respiratorio 67

Infecciones del aparato genital Infeccion es d e tra n s m is ió n sexual UrEtriSsy o&rvicitís Ü lt t íK D w r la lK Infecciones genitales tra n sm itid as p o r otra v ía diferente de la sexual

Vbginíis y vayinosis Infecciones líe les genitales inflemos lameninos C o m p lic a c io n e s sistém icas d e la s infecciones genitales D ia g n ó s tic o de las infecciones genitales Dagnásfico de uretritis, cerocitis y raginitis

Examen micrcsccpiro de las musirás Cultivas

Infecciones oculares Pre senta ción clínica

ConíuiUNitis

OuíTittlj Uwelfoyendoltelmitis D ia g n ó stic o de las infecciones oculares

(tewteocifa cíe i® muesuas Exigen rmi^oscúpco CuBwos

D u p l i c o de úlceras genitales y wrrugas wnéfeas Recolección de m u e c a s geniales

Infecciones óseas y de las articulaciones Presentación clínica D ia g n ó s tic o de las infecciones ó seas y de las articulaciones

Infecciones de li sangre Presentación clínica y patogenia B a c t e r ia y Mfcicania

lnleoctin in t o s a r iir Badef iemia y sepsis asetiaías c a í Tos íatéteíes

Infecciones del sistema nervioso central

R eco lección d e h em G enitivos

M en in g itis

Corttamiiadún

En cefa litis y a b s c e so s cerebrales

Can! dad y oportunidad de ios c u ltte

D ia g n ó s tic o de las infeccio nes tíel sis te m a n e rvio so central

Medios de cultivo

Q M k ü ó íi de muestras

mu

(toa de i¿ piel

Sistemas de procesamiento de hemocultivos

Evaluación cíe la respueso inflamatoria y efe las técnicas de microscopía

Sistemas ranales da twnooflivo

Detección dilecta deantígems y de ácidos rtuclfccos

Sisfwa efe toocu liivo por lisis y oentrifugación

Diagnóstico sercilfrj.ro

Sidéreas de hemoojltivfl aüorttlzadtt e Intomaliados

DiignástiDD porcultivo

Heridas, abscesos y ceIulitis

Estudios comparativos C a n c e r a c io n e s especiales

P re se n ta c ió n clínica

MiüODrganñanüs con requerimiEniDS nutriücralES especiales y endocarditis

D ia g n ó s tic o d e infecciones de h e rid a s , a b s c e so s y celulitis

Bacterienrá y sepsis asedadas con las « f l o r e

Recatección de muestras

n este capítulo csiwtíarcmoN los pa-sos necesarios pata d diagnostico de las. infecciones. Rd cada una de la* siguientes secciones se presentarán los signos y los iiil ij -, de Jn* inrcuL-iLPihia que in vo lu cra n lo s p rin cip a le s sislemas de Órganos. Se describen los procedimientos para La recolección» el transporte y el procesamiento de las muestras. La información se resume en el Cuadro 2-1. En Olía» palabras, en chít capítulu se armlizará L Tuse praanalíúca de] cid » diag­ nóstico. Las fases posteriores se coosidcranvn sólo brevemente, ya que se tratan en los capítulos siguientes.

E

infecciones del aparato respiratorio Et aparato ifüpitaiorio se divide en las \ ias respiratorias alcas lia iianz, la garganta. Ja arofaringe y la nasofaringe) y las vías

Tej-Jdosybtopsias

respiratorias bajas tía laringe, Isa tráquea, los bronquios, los broncjuíolos y los sacos alveolares de los pulmones). Rara este análisis, el oído medio (que se conecta con la parte praicrinr de la faríngea través de ¡a trompa de Eustaquio), las glándulas salivales (comunicadas eon la cavidad buen] por medio de con­ ductos. excretores) y los senos paranasálcs {conectados con la cavidad nasal por medio de conductos de drenaje) ¡*c conside­ ran paite de tus vías rcspiraujria.'i altus. Infecciones do las vías respiratorias altas FLORA ENDÓGENA E l diagnóstico de fas infecciones de tas vías respiratorias altas es complicado debido a la presencia de la mayoría de los patógenos en personas sanas sin de síniomns. Incluso S. progew í Suele hiiSia^c en pequeños cantidades en ¡a garganta de individuos a&intomáricos. Ija principal excepción a esta regla es

B Est igma del d r. VaFbr Eso

68 CAPÍTULO 2 liriroífiietiÉff a la mierotiislflgia: Parte II

í' — ■L."~í. 8■ ■ ■»"' ~ 1 • ■ ■• ■ ' : i f. Cuadro 2*1 U lugnórtfo» de in feccio n esb acterian as en d k tln b K partes

-■ > cíl-I

% cuerpo

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E S P E C IE S K A C TK W A N A S p o t e n c ia l m e l v t e a s o c ia d a s

S IT IO P E IN F E C C IÓ N Aparata KupiTogorio

SIG N O S Y SÍN T O M A S Vfas rfspwrítwi^s bJEae, sen*!*;.paramales: M o r de c-abeo D ü I. r y ciirtyerimier.la del íreu malar R w íK ífriílí: de kivs srntre j«nnasutaí. nivel de üüqunfci o cnpiiMmieiuo de 9a iHíihh jiu

M U E S T R A S r \ K k C U LT IV O Ajodo: Hisopado nasofaríngeo lavado de lo» senos panM iulH tmr.iíríSi: Lavado de ](« «nips puiiiuHilw Muestra de. biopua ¡¡uirúifiísi.

V la i JripifjiLüíLii oitu, ^ B lp u li y 1ari¡:uc. EEirqccjn;iEii!L! y-«demude itucuM Eauiáilii inijfdalibü JwnniKi'ki (fe acudumembraiia Edema de la úvuda Cubierta geisdera de tu len£tia/*iengua rn fresa'1 A J i i m f n ú . ' Je Im ganglio* e n v id a

illiúpadu de lu ÉkttrtjJje fk!%l£lír7 ( LiN'.tpjiSo de tus amígdalas. (aW ei-is)

Vías respiratorias. bajas, pnlmanet ytiroii-

Esputa» (escasa ncwperaeiéiO 3uH re

mm Til’ : Pnlcir Je pwl!» l)n iA

pniEuNU

Hisopado Jüi*tifUtÍHp?0

SecK-dooci por bronM W if N Aipiroilu SrjtóTraqjcid Atfnridoo hiojKia ¿fe putrnófi

CwdriiMieMk pt>Jm«iar Ertsrtsjines y T?níw Ptiiain«Ki6n de- le í wni»lr* T*spmtf»»i9* Maride?: lecaliTaduantc ib pémiréíii Ir'illl irados radk!gráfk(K Lesione* ea Ja cavidad Emfwtpa Oiihí EUcd;«>

■Üu-pucu . i l-í i sen ik j v p(trúfenla Dolor pfoJutuiü tn el oído y la mjítdifryia IK iÍW de eabíza pwwanre Ifriterr-j y prnl.iui.s6is de I j i:ii::iibriLnu.

SlHtpttW6£ttt.i fWt&ümóñiitf S r « jW M k í. fnipo A ^-temp/driaíci SB|pbj^»M3£ífJ tlbflM Hrttmpphilu* s^ífw isw &peci?K ete Mebattlfa y otm E m\í>flibia, it'r¡í¡L
S m p rcírw’f « pn tumo nr |iw « d í W>TíJ&¡rrtfJrí»nt f-'it.wtfHtrtenvm r w íí’flftrai, Przvatflla m tftm w jp m cw y irtros u u e m tii» Especie* de Btmkftlki

Ajudo: Ni? cultivar Hisopado narsofarúngeci A í |53i j .üu «k flncMhram tlmpínica C nía feo: Drenaje de! measo esíema

Agudo: ¿’trrjníffl'fUTtojr fH\rwita7SÍM J ttflpi esmepiococ os Hú¡ra¿>phAií inflnea&u CM nca! f*fíwJí*mrMiaj u^nijjjwxa tip cciís de Pnxc'us H ji.i.cijJ’. uiULívt'iiLh

tvJla ¡ch estímM®o y di:i*feniv ■GastsilU y rtfeni«d4d tdrtTVtp¿fatta

Ei^ipi ú i-i'jj il-ji ■ ■ >JuoctemsJ

Hfiñ'tjbitc if t pyiori

[riletljnfl tleljjaiiip j¡' $¡n>e>[>: DLiffttn Diicilietía Pispi1en5u

Muestras de heces Hisopado raetal o- nucu recial 11¿mocil ] tivo f:Debse Sif oide *)

C í j m p y t r ^ K i t r y otrá* cspKies de Camfrylufantcr Espccícx efe S^loMm^Iln «fe Sitigflla

1iri:]>ánjLLj

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CO N L A S IN F E C C IO N E S

MiítíHsa SnnpiinuferU* P o l« uJbdnnwinal txni í^licm

Es(htr\chia c.t-j'j í-cq’n^

tvssgíascisi'

Viirjci y otras e^pecics sfe Wftrfa Especies de Yfrrlr\in Ctetsmrfum difficite fderacritocién J r la cüuduil

ítWWÍHwii I

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

[nfcccior.cc dol aparato espiratorio

C u ad ro M

ftia g n fe lta u í e

69

í n í r t c í o n h b A d c r i m t t i i « i t d ú t i i t l u s ¡p a ir lc s d r l c u t r p o (e t m t .)

E S r E C I C S B A C T E R IA N A S F O T E N C 1 A L M E N T E A S O C IA D A S S IG N O S V S Í N T O M AS

S IT IO D E IN F E C C IÓ N

A p u m E u u n n u riu

¡iiíee u i& re V üsiuíil.

M U E S T R A S PAH A C IT T IV O

O r ir u - d e l c h o r r o m e d io < b t e ctsícímSu

P ia ñ a

O rin a . o b t e n id a jv>r c u t i e r a n »

D im ú a

P u ji d ü r i i-.ifirapuhic-ri

C O N L A S IN F E C C IO N E S

E lite rxshüi-tr r ía f « c E t f h r r ic h ia c a li E s p e c i e j d e K te h n tík i E s p e c i a s d e P n o im i

H t m a n ir ía H a l a r y M itt ib U id id a k p rta íd A .

E i p t c i c i d e JE m w íiw flo f h j

fa p t a jitú h tc o f t s f e i k t a m c n b a ja

P lr u iJ w n r in a a o í n i ji r t o - I d

S U ip hy tvcoccxx « i r i r o s . S. ¿ p id r m iá it

In fe c c ió n m a l

y £. tu p M p h y tk u s

D o la r d e e s p a ld a -fc m i^ iiljiliid a la. L u m p r c u d ú d e l d n ^ iilo tí t H f t W i T í h r t l

A p t í t l l jl

}ÍL in il'[tr i. SE crcciisiu rs, tr e ír u Jc ís : s e r o s a

i k c f t L L c ^ .^ M r c t r i k s

N e iis e n u j j c i w r n k K S í

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S ú b e n u iw v io s r t c t u n a i

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Si-s& o d e K e m i ji M liu n i y v ú rd m i

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L ú t f r ia m o iK v jtd g tn r s

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E s p e e ie i. de fhtrnT¿-fúi/!ii.r

S e c n c i d n c o n h i B l i v a l: « c r o m o p u ru len ta.

S m n r - c i m e i puruLt t j Ij s

B n r o je r i r n i n i t B « w iju n n v a J n h ip e re n u a U

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S ip p h } to e iK iiv m r t u s S tn p io c o c c v s p v N n w i i u S m p ín c o r c u s p y o ge n e t t ‘nt¡MÍonhwiiU w f U f t iM m i M ó i m a e d e i n m e it i jíi n )

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P k -n *. fe h n te » E v .'l l a í t í a ü

S iip iu e a i d i a c o {e n d tK im d iL w }

S d ílg i e . J l,', t í If t » LUl Ll'r'.ir,. rB]KUT SC gÍJI MUI neCBMBÍO

t 'ü jju u i L i üidja p r i m a r » M 'v fm ih iv jii

& i’in íjl f a t s 'I « i d n W íd | l l s l Gj

i k in fe c c ió n : P r r r ii i i i a t - p i d y d i k w ( «

t i f E i e k f t ; iiir r p t íK iK i ^ C n c p c f A : in d a s l u « d a d »

L íq u id o « fiItm a q u íL le n i

A . 1L U . f f i e i f b tsáC iik n

S . p fíth n u fh ta f

■ 'I f a iK w s p a s - e n a M i l l ü " e n la s u fia s

A p a r a to re sp á rsio riD

Staph^loCtír t t t í úurirK t

M a le s ta r

P k t-o m b U g .ú

U ü f t - b t w r K K ft ü K fn c f

ík l^ i/ d n

O í n w i w f í píatiM jf ilz iw r t

H en d aS;

/ / (w m tp é ilu s jV i/ fu fn ^n r

ApaTUH) u r in a r io

fOmtfüitííj

B Est igma del d r. VaFbr Eso

70 CAPÍTULO £ Introducción a la microbiología: Parte ll

Cuadro 2-1

niagnñsifcn de te h e d o n rs h M t r c t e en distintos p a rtw det cuerpo ito n L }

S IT IO D E IN FEC C IÓ N

SIG N O S Y SÍN T O M A S

M U E S T R A S PA R A C U ET IV O

E S P E C IE S B A C T ER IA N A S F O T E N C IA L M E 'V T E A SO C IA D A S CO N L..VS IN F E C C IO N E S finip-i H.SCRK í(BipeíiiEs4í Haftrbiphituf. A ctm etw illtt* aamsm'vCfiftiKOf^iüms. CiífcIk4kuveriws Etktfulfn fermdfttt ) fqieíiei: df KiHgffía) i véase cap K1 EfA:Heí'i.:hiíi c a li y (.serai li^ IiÍú m ti .S,,a1 J rmJtWít|J ryfriÚ tiatit-m dti/rts.trJíií y m ris bacseriü ajUCfufalíM

U n id »

JlMt'ns V di fi l L I jVI'. -i r -.

Sreírcinnci: trro'ias c>p iiii h iim *. Ateeews' iUtKiíiáMm u íUMUUCuMn F i n n j .j c L i s r .i c n í D y edsini! CcFpitsiniin (Íísin aci™ de- fin ) Dolor tllecraeján o fLirmécién de sentís

A ^ i j n i d n i ; íle- d r v n u j i í '

r i i l U n i ^ ..V j i i n l t u J u t

A js jM fiiJa

B n r n j e c 'i s n i c M P y w í l o r

B íts p ííi lia n v in J

[)olnr durartle el mírvimifrilnSenubiLidad a la pm júa durante; 1* ¡m¡-

A^illütfc taesm o aspirada J i ' inédulu éüca

(tÍÜ.: L«ÍTl K ; n J ! - ,v r j ! i i i :

u u s I t i .K 'r t i i H i L i i

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Sistpky írTC fs íy- 11 r iw rrm S tn p toetx cu r p y ^ o v s E s p c c i n ¡ t e CimiriJiio** c t p c c i c ü d i BaciM Pütti ¡r c ' t w h j w t f r i n S R !IÍP l|lÍH S

E/iMtiíluli'Wfiúc'tii* i'xmduimrnai urnifiim jia Ti » r v L ’ aps í l f K /itrm fiivrfíf ü

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SkiffhylíK'tK c¡ u uiíTt¿i< Hdtittriphiltil StHfMDcaceai p w g e fíts V t 'd j .h í 'r t d ftrMvrrhütítr Sire/UMott 1fí pitei f w « ira& i T . n e íTiJr-i i r¿e rú;tr r* i w tU fítitS ük

Neisseria gmmrrhoeae* que se encuentra sólo vomo una inf«ciún -tic transmisión sexual. La flora Jé laomfaringe de las per­ sonas sanas se m |X 'iw principalmcnlc de Sttvptacawus vtrií/art-j, estreptococos [ü-heinolíncos. StaphylacGceus aurcus. Haemttphiíus injluenzae* UtreptacoCeus pneumoniae. Mwaxeltu cafarrlxiiis. muchas bacterias anaerntiai, como especies ctü Fustibacteritan y ArfirtunJuTi isttítliu levaduras, COHIO Candida o M m ndenovims y virus del beqi« simple: iodos ellos habitan las vías respiratorias aliassincauar enfermedad. En los individuos enfermos que son internados en un hospital, la fiara endógena cambia de grampositiva {predoild n*A|ei»cntc estreptococo) a ¿nuilnegativa (Eiiterobaeieriaceae y espe­ cies de Psentdomonas)*1s La razón de esle cambio parece ser la perdida de la fibinitciina, ana prote fría que aumenta la unión tic Uh haeierias grampositivas a Da superficie de ¡as células cpitcliaJes de la orofaringc.!H ',IL FjVRIWGÍTIS

farjngiiiR aguda es la infecctón respiratoria alia más comiin. Por mucho, el pilógcno más importante w Strtp iiK w w s pwftettf j [Streptocam is p-heñid ftico del grupo A ). Las infec­ ciones virales son la otra causa común de faringitis,35 Fsrln flitis $$tr9piQCÓtiC3 La faringitis ptsT SlrepífHtK-Cti^ pyoge-

ne* puede sospecharse clfntcamenie cuando un paciento presenw inflamación y edema de 9a mucosa faríngea, dukir de gar­ ganta* dificultad para tragar y síntomas secundarios como fie­

Myr
bre. cefalea, adenupalías cervicales anteriores do lorosas a la palpación y, en ocasiones, erupción euíánea cgcarlaliformc, También pueden observarse caudados purulentos en la faringe posterior y las amígdalas. La presentación clínica de la faringi­ tis esireptoedeica y 3a de la no eslreptocrtdca en genera] se superponen.* A jjesar tic que el %nó.M ¡ci» se ha sustentado casi en forana exclusiva cu criterios clínicos, la opinión predo­ míname es i¡ue rtsuliu imponible determinar la cattsa de la enfermedad a partir de estos en tercos y, por lo santo, se requieren pruehíii de laboratorio.11 Una menrihaua finne, fTlii'iiiosa y gris fM&eudoniembranaw>+ los exudados purulentos provenientes de abscesos a fístulas y las ulceraciones tic las mu cusas sugieren una enfermedad infecciosa diferente de la laringitis estreptocrtcica aguda >, en consecuencia, se necesita un enfoque diagnóstico distimo del que se requiere para la enfermedad esirepiocúcica. Los estreptococos fj-hemolíticos diferentes de los del grupo A (grupos C y ü ) causan síntomas similares, pero más leves que las cepas del gmpn A P Éstos no prevenían una asociación can lá fiebre reumática como secuela no infecciosa. A pesar de que las cepa* del grupo A pueden hallarse a veces en pequeñas cantidades en la orofaringe. I » cepas cnlcmizanies reculares son las de los grupos C y G. Por lo lanío, al aislamiento de estos microorganismos es más difícil de interpretar, Si se los aísla Oümu un cultlvo puro o como la llora predominante, es razonable informar su presencia con una nota que indique su¡ significado clínico y la intcrprctacion.

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JnJecdones del apaiafo respiratorio 71

EL estudia dfc referencia para el diagnóstico de ln faringitis es* irepiocóciea es e! cultivo bacteriano en agar sangre de camero, En k» |¿ibonitnrú »¡, It». cciissi lionas y Jas clínicas se militan pruebas rápidas para la detección de antéenos de estreptoco­ cos dd grtlpo A, La mayoría de los e n s a y o s tienen alia espedfieldad, pero la sensibilidad! no es Ea suficientemcnie buena como para confiar en un resultado negativo.-' Por consiguiente, se debe realizar un cultivo bacteriano luego de una prueba rapjda negativa. La principal ventaja de ¡as pruebas de antéenos es que permiten el tratamiento rápido del paciente y con ta que se reduce el tiempo de la dolencia y d paciente puede retomar antes a ]a escuela o al trabajo. La frecuencia de las secuelas no infecciosas {fiebre reumática y glomemlonefritis) no es mayor si sólo se utiliza el cultivo convencional para el diagnóstico. Las pruebas rápidas de antígero agregan costos, muchas de ellas se clasifican como moderadamente complejas (víase cap, l ) e implican una inversión adicional de tiempo y esfuerzo de] personal clínico. Esiste escaso justificativo para su real ilación en un laboratorio central, dado que el paciente ya habrá regre­ sado ¡i su tasa para e! momento en que esté el resultado. Cada médico debe determinar la utilidad de la realización de las pruebas* de antígenos Difteria. En la actualidad, la difteria es muy poco común en los. Estados Unidos.15 Se trata principalmente de una infección de los piños que » presenta como brotes esporádico*. pero tas adultos también pueden infectarse,. -sobre todo en los grupos s4>ciüecondmictT.s ruis bajos.1,1 La gruesa membrana blanco aculada o gris que cubre la faringe posterior, con Importante edema de los tejidos subyacentes y adyacentes, casi .siempre .se difertencia con facilidad del intenso eritema de Ja faringitis cstrepiocrtciea aguda. El diagnóstico se realiza por medio del cultivo de ia membrana en el medio de LoelTler o el medio selectivo de tílutitó. Es preferible que las muestras para el cul­ tivo de Corynebacterium iUpfittriae se envíen a un laboratorio de referencia o de salud publica (véase cap. 14). Faringitis por Ananotacterlvm haematrtiatm. Esta baeieria cansa faringitis aguda que se asemeja en gran medida a lu faringitis cstreptocúcica; incluso muchos pacientes presentan una erup­ ción escorial] forme Suele afectar a los adolescentes y adultos jóvenes, a diferencia del estreptococo (i-hemolflieo que pea lo general causa enfermedad en los niños pequeños.-' ÁKamibaciertum (antes denominada Cinytwbacterium) barnmtyrtaun se- aísla nte[or en agar sangre humana que en agar sangre de camero, pero puede aislarse en un laboratorio clíni­ co. S i no se (Gülita una tinción de Grajo o una prueba de catalasa puede tomarse como un estreptococo que no pertenece al grupo A (véase cap. 14). Faringitis gunwóctca. La infección de la orofarfnge por Ntrii-ferki %mmrhim¡e es casi siempre asintomática, pero se pueden presentar síntomas clínicos y asociarse con La enferme­ dad diseminada,-1' Se debe sospechar en mujeres y varones hc!flHi«e*u¿ileN que pmelLcan &exr> ara|. L*»s ipfihens deheO tiV nuiniear al laboratorio esta sospecha para que la muestra se siembre en un medio para el aislamiento de gonococos, Faringitis virvL La causa viral más común de faringitis es el virus de Bpstei n-Barr. Luego de una fase piodrémiea febril incspecifica uene lugar una faringitis aguda con amigdalitis exudados blancos y imfadettopatías cervicales, Pueden obserarsc petequias en el paladar.15 Posteriormente el diagnóstico se hace mas obvio por la presencia de los signos y los sínto­ mas sístemiens de la monnnuelensjs infecciosa, enmo altera­ ciones hematofógicas, hepaioesplennmejalia y linfadenopatía generaliZadar Las primeras élapas dé ta faringitis pueden suge­ rir enfermedad e.sireptoeócica. pero en los adolescentes y los

adullo* jóvenes la infección suele ser sintomática. E l diag­ nóstico es urológico. Se puente observar una enfermedad similar como parte de un síndrome rctroviral agudo, causado por el vjrus de la inmunodeflcieneia humana, pero el comien/jííc s más aguda y no hay caudado. En el síndrome rctroviral agudo es común la presencia de una erupción maeulopapular, que rara vez aparece en Ea mononucleosis infecciosa a menos que se administre ampicilina. E l adejiovijii.s causa una faringitis aguda que se asemeja mu­ cho a la faringitis estreptocócica. A menudo se presenta, ade­ mas, conjuntivitis, lo cual es un indicio de .su citología i liebre faringeoconjuntival). Algunos serotipos de sirus CossíicIcíc A provocan una faringitis aguda con vesículas en la faringe pos­ terior como parte de la enfermedad de mano, pie y boca. Esta infección es común en los niños y se diagnosticó con facilidad en forma el filien pmr la aparición de vesieLilas cutáneas y muco­ sas. Lu faringitis por virus del herpes simple se describió en adulios jóvenes, pero esle virus seeneaemra en personas asintomáticas, al igual que el adenuvims, Lnel capítulo 2 3 se ofre­ cen más detalles acerca de Las Infecciones vírales. Oirás infecc/mes que causan faringiiix Se describió a Mrcupfas* mu pneumoniat y Chhimvdm pneuuum iac cutlio agentes cau*sales de faringitis, pero provocan más a menudo enfermedad en las vías respiratorias bajas. Las especies de Candida, sobre todrt Candida «tfricons, produce elid idos cremoso^ constantes cuando infecta la oroftfinge, pero mi causa una Farmjriiis ostensible. Citoniegalovirus puede causar un síndrome de mononucleosis infecciosa y numerosos virus respiratorios pue­ den producir dolencias en 9a Faringe como parte de una enfer­ medad respiratoria aguda. A pesar de cjnt hay cieno desacuerdo en la lirgralury médi­ ca. Hatmüphilus iajlucm ae y SitiphyUKWtUi atttvuí son con sideradcei por la mayoría de los microbiólogos flora colonizan­ te y no cómo agentes ciblógicos de faringitis. Se pueden ai ¡lar en un cultivo cuando la causa verdadera de la faringitis es un ágeme que no se ha buscado, como un virus, Por esta razón, la solicitud de “ cultivo completo faríngeo" debe desalentarse.. La prueba que se debe solicitar es "'cultivo de eslrcptooocob'' o ■'búsqueda de estreptococos**, OTflAS INFECCIONES DE LA CAVIDAD BUCAL DIFERENTES DE LA ñUUHGmS La gingivitis y las caries dentales son causadas por bacterias, pero son iiteralidas prinC ipálmenle par los i idun lólogos v no por los médicos. En la actualidad, las infecciones bacterianas de las cavidades nasal y bucal, diferentes de la faringitis, son poco frecuentes, Debido a la imposibilidad de recolectar una mues­ tra para cultivo de la superficie de estas cavidades sin incluir abundante llora endógena, los cultivos baelcriuiKíü de estas lesiones no generan resultados interpretables. u gingivoetirmiaims ulcerativo necrosante (infección de Vinccnt. angina de Vineent o "boca, de trinchera’') es una infec­ ción siníigica causada por múltiples bacterias anaerobias de la cavidad bucaL Hoy en dfcu rara vez se la observa y el cultivo no está indicado. Esta enfermedad puede estar acompañada por sepsis e infecciones metastásieas; sin embargo, se deben obte­ ner hemocultivos en los casos en los que se la sospecha. La observación de bacilos fusiformes gramnegativos o espiroque­ tas en los finolis teñidos con la tinción de Gram. preparados a partir de una lesión de úlcera bucal o gingival, es útil para el diagnóstico presuntivo de angina de Vmceni, Las, cultivos de 1? boca y de la cavidad bucal pocas veces nin de ayuda debido a la presencia de numerosas bacterias anaerobias comensales.

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CAPÍTULO 2 Introducción a la micrabiílogía: Parto II

Llls especies de Cí¿prtúf>7apfuigd, bacterias fusiformes qUe suelen encontrarse cfi Es ofofaringe. también fueron asociadas con ulceraciones da Ea mucosa Luí luJ y con hemoeultivos posi­ tivos, sobre lEidn en Los paeicnlcs con neutropeniu grave.™ Estos, microorganismos, pueden aislarse llcí lijando medios selectivos para i\eis.vria debido a su resistencia a vancomieina, cotíslina y tri metoprima. Mediante tu útilización de estos medias selectivos, Ruinmcns y cois,1 1lh aislaron especies de CapniH VIi’phifXii en el ^ñíf dé ]<>S Cultivos de OrOfarirtge en com­ paración con sólo el b% de los aislamientos obtenidos en las placas de agar chocol ale sembradas a la vez. Si lu historia clínica derribe una úlcera en la mucosa de la cavidad bucal que existe desde hace mucho tiempo y que no cicatriza, se debe considerar la posibilidad deque se trute de la diseminación cutánea de una enfermedad fungtea sistémica. Se puede solicitar una biofwia de tejido estudios hisiok^gicrO!; v examen directo. Las especien de Candida, en especial C atbi* í o í l s . pueden causar manchas l.ilaticüH en la mucosa bucal o compitunetef tm área mis extensa de la cavidad con la forma­ ción de un exudado grueso, de aspecto similar a la cuajada, que se puede diagnosticar por la observación de seudohifas y blastoeoddios en hmtadón en un frotis det cridado teñido con la tinción de Gratu,

El virus del lierpes simple, caí i exclusivamente el seroilpn 3. puede provocar una gingivoestomutitis aguda como parte de la infección primaria. En la mayoría de las personas, la exposi­ ción a este virus ocurre durante ta niñez o la juventud, Las legiones vehiculares aparecen en la piel del rostro y en la muco­ sa de los labios, pero se pueden extender dentro de Ea pane anterior de la boca. E l diagnóstico se debe realizar por la demostración de células infectadas en un frotis teñido (prepa­ rad ón de T¿anck) o par cultivo. Ñ&wtecdón de cultivos tirffígsffs, Hl método correcto de obienet una muestra de hisopado faríngeo se ilustra en la figura 2-1. Se debe enhocar una lili brillante dentro de la cavidad bucal, por encima del hombro de Eli persona que tuina lu muestra, de modo de llevar el hisopo hasta la faringe posterior. Se le indica al paciente i]»e incline ta cabeza hacia atríis y respire profundo. U l lengua se presiona con suavidad con un bajalengua para visual i¿rar la* fosas amigdalinas y ta faringe posterior. El hiso­ po .se extiende entre los pilares amigdid inos ¡kh detrás de la lívida. Se debe tener cuidado de no tocar las paredes laterales de la cavidad Hitcal o la Icngun para redecir al mínimo la con’ taminación con bacterias comensales. Cuantió el paciente pro­ nuncia un L,a V largo facilita la aleación de la üvuTa y ayuda a cviiar las atvadas. Las áreas amigdalinas y la pnte posterior de la faringe debett frutarse con firmeza con el íii.sopo. Se debe también tomar una muestra de todo esndado pnmlcnlo. Luego de la recolección, el hisopo debe colocarse de inme­ diato dentro de un tubo estéril o en 0 (n> recipieme adecuado pnrii transp
Figura 2-1 TfCnif-* de cultjvm farinp.m. Se Le arui íl j ul |i.il:lii:ó l|Mt abra hic-n L Nx'u }■qut diga "¿hr1, Se Aprime ili forma delicada la lengua con un bajBkdfua y w fuiji un hiMjpc» Mitiir la liñuda hwiu 11 porción posterior Je 1» Í*rtítse. S í fa u ti hísepo ton un rnovimitmo de tmniitci suave per la n m q u e s e e im jí- iH íu por d f i r i ^ úe lü ú v u la y entre lew [ r iL u c i B E iu giL d in L n .

La infección más frecuente de la nasoíarinee es el "resfriado común” , causado casi siempre por uno de los mis de 100 serolipos ríe rinovirus. Esta infección rara ve/ pone en riesgo la vida, aunque ¡diora se reconoce que las vías rcsptralorias bajas e incluso ni mus sistemas paeríen afedaise,7' SiJl embargo, el resfria do común es La principal causa de morbilidad y dada la grsm cantidad de días laborales que se picnle en esta afección se convierte en un problema económico relevante. Hl hecho-de que muy pocos de nosotros hemos lenido tuberculosis o fiebre SieniorrúgieLi, fhrto de que Lodus hemos sufrido un resfriado comdn ilustra la ubicuidad de esta infección- El síntoma prin­ cipal es la rinitis (goteode la nariz). No se prewnta fiebre como pane tic la infección, Ln nece­ sarios pi>rn|Ue la enfermedad es autolimiiadia y no se dispone aún de un tratamiento específico. La 0 bl ene ion de muestras nasofaríngeas es de muy poCO valor práciico, excepxo en algunas situaciones definidas. Los hisopados nasoftm'ngeos son de valor limitado pata establecer el diagnóstico de oti(k medía aguda2" 5o sinusitis baeteriaita.55pero .son la muestra de elección para el aislamiento de fiúí'di'it'iiu peiiu.sm. el agente eriológ.icode la ios f er i na, Los

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Infecciones del aparato respiratorio 73

hisopados y aspirados nasofaríngeos son igualmente eficaces para el diagnóstico de infecciones respira loria?, vírales,*3 aun­ que algunos virólogos prefieren los aspirados pora el aisla­ miento del virus sincilial respiratorio. Las muestras nasofaríngeas se obtienen por visuala¿aeión directa con iluminación frontal. Con ei pulgar de una mano se levanta o ni suavidad la puma de h miri/ Se humedece con agua o solución salina estéril 3a punta cfc un Id sopo nasofarín­ geo pequeño de alambre flexible y se introduce en forma suave en una de las narinas. Se guía e¡t hisopo hacia atrás y hacia airi* ba a lo largo dd tabique nasal hasta sentir una clara resistencia que indica que se llegó a la parad posterior de la faringe. Se retira con suavidad el hisopo, Si durante Ih introducción se encuentra unairesistcneia indebida, .se debe intentar coa la «afí­ na apuesta. Se deja el hisopo en contacto con la pared posterior de Li ttaañfariflge durante 15-31) segundos si el paciente puede tolerar la molestia.

OTITIS MEDIA Y SINUSITIS

E l oído medio y los senos paranasales se comunican con la vía aérea superior por medio de conductos, Las infecciones, principalmente causadas por virus; y bacterias, se producen cuando los patógenos que se encuentran en 3a nariz y ia gar­ ganta acceden a lew oídos o los senos que suelen ser esteril^u .K BjN |iW yjjm respiratorios y cie rta bacterias, ccimn Sti#pfitc4)Cciix paeumtmi-ae, MúraxtUa camrrhutis j Hút'tttOphiius mjíuetmw, causan infecciones: agudas.11* Cuando la infección se convierte en crónico, los bacilos granuiegaiivos aCrtibitiN facultativo*, lus, bacterias anaerobias y lus hongos adquieren un papel relevante y la infección es polimicrobia* na.6**1Es casi imposible obtener una muestra que pueda inter­ pretarse de manera adecuada mediante el muestreode las vías aéreas. La toma de una muestra para cultivo de estas estructuras es dificultosa. Por fortuna, los patógenos en las infecciones agu­ das se pueden predecir; por lo tanto, es posible iniciar una tera­ pia con antibióticos sm necesidad de procedimientos invasivos. En [os proceros crónicos, se requieren pittcedinüenoH íiivasivus o abordajes quirúrgicos.

EñGLOrms

La cpiglotítis bacteriana aguda* principalmente causada por HiKnmphüus inJIitrnzitK cipo U .:ftf ch una infección potcncialmente mortal, peto que lia sido casa erradicada con la vacuna­ ción. Et «tema de la cpiglotítis puede obstruir la vía respirato­ ria a menos que se realice una traqueostomía. La mayoría de los historiadores creen que George Washington murió de tina epiglotitis atilda, que fue tratada mediante el sangrado repelió livtk,lí] E l iiiás joven de su» Ircs médicos qUCrfa. probar ta técni­ ca de la iriMjLicüiiumfa n i’i&rt desarrollada, pero fue refrenado en sus intenciones por sus superiores '‘Filis sabios”. El diag­ nóstica de cpiglotítis se debe hacer por sus manifestaciones c lí­ nicas, ya qme si se toca la cpigloti» para obtener una muestra puede agravarse la obstrucción. Cuando íiúemophifua mjftrcfi* zftt es el agente ctiolágico de la cpiglotnis, los hcmoeulnvos suelen ser positivos.

LARINGITIS la laringitis aguda y, más a menudo. Ja laringotraqucobronquitis (emuff) son causadas principalmente por los vinas respi­ ratorios. Otra causa común es Mvcaptústna pntumtMiúe.a

OTRAS INFECCEOtíES DE U S VÍAS RESPI RATOfítAS ALTAS Las infecciones de los tejidos blandos de la cabeza y el cue­ llo suelen originarse en Ja cavidad bucal y son causadas por mieroorgniiburras que nocmidmcrtlc residen allí- Los abscesos v las infecciones del espacio rctrofaríngeo (angina) son compli­ caciones de las amigdalitis y faringitis esixepEocódcas. Esto puede dar como resultado la compresión de la vía aérea, lo cual representa una emergencia médica,1® Las muestras de abscesos pcnaanigdalinos se obtienen pear aspiración perculánea para evitar 1a coniaminación con la llora oro faringe a. De manera similar, las infecciones dentales se pueden enten­ der a los tejidos blandos adyacentes, lo cual origina un absccm> o dentro del hueso, osteomielitis. Arírntrfíi.vcej isratlii. tin componente de la llora de la ofofaringe de algunas personas» puede causar infecciones crónicas del cuello que supuran (actinom kosís)."111 Se debe recolectar material del seno que está supurando por aspiración o por legrxto: un hisopo no es ade­ cuado para obtener "^granulos de azufre" (concreciones) en los que se concentran ¡las bacterias. En. forma alternativa, se puede colocar una gasa sobre el seno que supura para recolectar los granulos que quedan así arrapados en la trama de la tela, El material de drenaje puede colocarse en una placa de Petri, diluirse con agua y examinarse para la búsqueda de las concre­ ciones. Sí los gránalos están aplastados, la observación de baci­ los giamposiitvos ramificados establece el diagnóstico. E l gra­ nulo aplastado puede luego cultivarse en condiciones anaero­ bia* pora determinar La causa específica. Históricamente, las mieobaclerias también causar linfa den o palias cervicales y los ganglios a menudo drenan hacia ta superficie de la piel (escrófula >. Estas, Ii nfadenopatías Süfl cau­ sadas por lo general por Mvcobacicrium b o v t i , que ingresa en. el organismo a través de la orofaiinge luego de la ingesta de leche contaminada. La pasteurización erradicó esa infección. La linfadenopatía tuberculosa suele originarse luego de una enfermedad pulmonar primaria. La infección por núeobacierias de los ganglios cervicales actual más comtin es causada por el complejo Myeoixtclarititíi avium (M A C ) y afecta principal­ mente a los niños pequeños,"1A diferencia de otras infecciones pof rnicobacterias que requieren tratamiento antibiótico, la in­ fección por M AC est los niños puede tratarse en forma eficaz mediante la escisión quirúrgica de los ganglios afectados. En el pasado, la infección más frecuente de las glándulas salivales era la parotiditis, pero fue erradicada gracias a ta efi­ cacia de la inmunización. Las infecciones bacterianas son poco comunes. Infusiones de las vías respiratorias Lajas l-as. vías respiratorias hajas están formadas por todas las estructuras que se encuentran por debajo de la laringe: tráquea (IraqueítísL bronquios y fimnqvínlm (brcinc^uillx y t>runc|iiiul¡lis) y los espacios aíreos díctales (neumonía).

TRAQUEO BRONQUITIS

Las infecciones agudas pueden ser causadas por bacterias o por virus. En los niños predominan las infecciones virales y por micoplasma,w Los síntomas sotl ios, fiebre y producción de esputo en grados variables. BonitwUn ¡.wsnMslx o B. pamprrluwúf cwasan una enfermedad diferente caracterizada por un estridor inspiratorio; B. p a m p e rtu s s is suele producir una enfer­ medad más leve.*1San embargo, el estridor característico de la tos ferina no se present a en las fases iniciales de la enfermedad. Los episodios ile apnea (¡usencia de respiración) son comunes*

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CAPITULO 2 brtroducciún a la micrablolagta: Pane II

pero m* letales. E! adenovtrus puetk □ u ^ ru n síndrome simi­ lar aunque su pape] etiológico es controvertían. ChUwiydla pnew nvm v. un patógeno reconocida m is recientemente, puede causar bronquitis ag«tía y neumonía, L;ii IraqueóbronquiliH, trónica es similar en los unlomiB :i la enfermedad aguda, pero es más prolongada y menos, intensa. Las Nucierias son la c-uumi m is frecuente, en ü^pceisil Strepn*tm m pnciammitte, fínrmaphiius influencie no encap^lilados y M u r a x c iU t ctuarrhalis. La enfermedad aguda prolongado puede cursar solapada con hrnn(|ii)ti's crónica. Mywpkimm pnettmaniae fue ca*í siempre aaociado con los crónica, pero hoy sí sabe que Bórdete lía per¡ussis puede causar enfermedad crónica en, los niños de mayor edad, adolescentes y adultos ’ J’ Chiamydta p/rcumuntat puede producir una enfermedad crónica,1H Las infecciones virales no íuclen diagnosticarse con el apoyo del laboratorio a menos que. la enfermedadl sea lo tuílcienemente grave coma para requerir hospitalización. La loes ferina y la infección por Chfamydia se diagnoslíean por cultivo o, cada vez más,, por métodos moteen lares, A menucio, se evalúa la bronquitis crónica a través tlel cultivo de esp ío ai la enfermedad es lo suficientemente grave- Se deben hacer sólieilud.es eipceiíiies si se consideran Bordadla, Mycoplaxma o Chínmydia,

B R om u n im s Las infeccionen de las vías aéreas nías pequeñas próximas a Tus conducios alveolares son casi siempre producidas por virus y por Mvcoptaxma pneumeañoe,11•*•-,a La bronquial itk afecta principalmente a los laclantes y a Jos niños pequeños y suele ocurrir durante el invierno- Despula de un perfado prodrórilíco de infecciones respiratorias, principalmente rinitis, los sínto­ mas predominantes son la tos, «J jadeo y el estridor (por difi­ cultad respiratoria), El diagnóstico diferencial incluye el asma y ta obslrueción por fXras causas* comn cuerpo* «xirjiñm 1ji enfermedad es auiolimíi¡MÍa y requiere el diagnóstico de labo­ ratorio sólo si el paciente estli lo ¿ufici entímenle enfermo como para necesitar hospitalización. NEUMOKIA La neumonía, La infección más seria de lias, vías respiratorias, se localiza en los espacios aéreos disiales, desde los conductos alveolares hasta los sucos alveolares, Los síntomas son fiebre, tos, producción de esputo en ¿fados variables, dianea (falta Je aire, dificultad respiratoria) y dolor ea el pecho. Este dolor puede ser difuso, vago y constante o Localizado e intermitente, que se acennra con i a respiración profunda si hay pleuritis. La disnea suele indicar que los hronquíolos terminales y los alve­ olos están afectados en un proceso neumónico más extenso, Los signos íísicos que señalan la afección de las vías respirato­ rias bajas son estertores y ronquidos» alteración del murmullo respiratori o y mande? localizada a la percusión en im casos de neumonía lobular."1 La neumonía ha sido d ív iM en torios tipos: neumonía atípica. neumonía aguda y neumonía trónica. Además, la neumo­ nía por aspiración, ios abscesos de polmón y el empiema requieren una consideración especial. Por último, desde el pumo de vista de la atención del paciente, la neumonía se puede clasificar como neumonía del paciente ambulatorio (“ paciente que deambula"’) y neumonía que requiere hospital] zación; neumonía adquirida en la comunidad y neumonía adquirida en el nosocomio; neumonía en pacientes inmnnosu-

primidns: neumonía en padenies ton íibrusis quJstica y neu­ monía de los CAiíeinos de la vida, Lu diferenciación entre la neumonía lobular, causada en general pw Sfneptwotxmtmettinoüíüc (neumococos) y KlebtitUa pmianamoe sCWtipo 1 (neumonía de Fricdlanderj y la neumonía mullí ídcaL causada por curas bacterias,, es de poca utilidad clínica dada La gran superposición entre ambos patrones. E l tipo de neumonía es el resultado de la combinación de factores microbianos y del estado de los mecanismos de defen­ sa del huésped. La mayoría de las neumonías surgen como resultado de la inhalación del patógeno respiratorio o de Sa aspiración (casi siempre microscópica y üubelíttlea) de las secreciones de las vfos. respiratorios altas. A sí como cambia la flora que coloniza la orofariiigc, también lo hace la naturaleza de los microorganismos que infectan el pulmón. ttoam pfi a-r/p/ca. Lu neumonía atípica se definió en la década de 1930 ciw w una Infección «Je las vías respiratorias bajas que no se asemejaba a las lesiones conocidas clásicas. La principal diferencia es que en la neumonía atípiea la producción ríe esputo es mínima. La infección es a menudo más leve que en la neumonía clásica, aunque esto na siempre es así. Los prin­ cipales patógenos causales de la neumonía atípica son lf » w plasma pneumoniae, Chtamydia paeuaumúte y las especies de LeghneUa, ÁteüfftQfliÉ ayuda. La neumonía aguda del paciente que nn csií mi croado (neumonía adquirida en la comunidad ! es una com­ binación entre lu neumonía atípica j lo clásica causada por las haelerias de la urofaringe, E l patógeno "c l& ico " más impor­ tante sigue siendo eí neumococo: otras bacteria* son fitwmnphiíus influencie ten la actualidad predominantemente por cepas no tipificadles» y Moriixelin rumrfkw w aun?»*,1* Los cambios en los agentes clíológicos reflejan las modificaciones en la naturaleza de la flora que coloniza las vías, respiratorios altas (v& se cap, 1). Nemaonia par aspfmcfáti A pesar ule que la mayoría de las neu­ monías son causadas por la aspiración del contenido de la oíd* faringe, la aspiración masiva origina un cuadro distinto de la neumonía focal y afecta diferentes partes del pulmón según el paciente este de pie o acostado (lóbulo inferior y segmento superior del kHwlo superior). Los microorganismos que infec­ tan al paciente no hospitalizado son mía mezcla de bacterias aerobias (principalmente grampositivas} y smícrobi«as.* En el paciente hospitalí^adn, la neumonía por aspiración se correla­ ciona con la colonización de las vías aereas superiores por bac­ terias gramnegativas. KEUWIQNÍA CRÓMICA Corrw su nombre lo indica, el curso de la neumonía crónica es prolongado. Los síntomas son menos alaíittaMes que los de la neumonía aguda. Como resultado, el diagnóstico puede demorarse semanas o mc^es, debido a La presencia de Afeminas y signos no específicos, como fiebre leve., malestar resentirse

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Inficiones dül aparato respiratorio 75

íflftm lp 'l y pérdida de peso que pueden ser las únicas ntanifcsiucLones de la iAfañO n. Las agentes etiológicos de las neu­ monías canicas son Eos mieabacterius y los hongos, pera Jjj, inTeccíonn bacterianas subyacentes también son importantes. Las especies de Cundida nn se encuentran entre la lisia de los. patógenos pulmonares encep» como pane de una candidiasús diseminada. en los pacientes inmun(MU|)riinhJiu|L AtScíSúS f>tíifí10trdft&. E l atece» pulmonar, muy relacionado con la neumonía, por aspiración, a veces es denominado abscc^ so gangrenoso de pulmón debido al olor fccakndc de las tutele rias anaerobias que lo infcvtsn,11"'E^a formación del absceso -se encuentra también en relación con los factores de virulencia de los gérmenes. Staphyl&caceux uuntu.%, Etuewtkicteriut'tat y tos espesies de Pseudommas causan a menudo lesiones desunen vas, Es característica Ja invasión de los vasos sanguíneos por cierto*, hotígos, principalmente especie* de A*pen¡iIIus y Iftv cigomicetos. SÍ se produce una trombosis puede ínlciumpiise la oxigenación de Ion tejidos y sobrevenir muerte, en un proceso que se denomina infarto. rscm hm m m aeFv^iiww también puede causar vasculitis. Cuando un ajenie infeccioso y la trom­ bosis están presentes en forma simultánea, el proceso se deno* mina infarto séptico y es muy destructivo Jj» tmmhosis puede ocurrir in &¡iu o puede ser el resultado de un coágulo que viaja a través. del torrante sanguíneo hacia el pulmón (embolia). Los granulomas son otro tipo de lesión destructiva (víase cap, I >„ en general producidos por micotacterias, en especial Myctfhactrrium tubt'fruiasis y por hongos di amórficos, en par­ ticular ffistnplmma captulaivm, fli«.vj«myce* tkntm Uidh y CiK'ciíIittideA íntirlitís* EMPENU La inflamación ele la pleura (la membrana mcsutelial que recubre el pulmón y la pared internadel tórax! es común en la dcttinoflCii (plcure-ifn) y puede producir un exudado de líquido (derrame pleural),1 Si el derrame: pleural se infecta, et pus vis­ coso da como resultado el empiema, Las causas son las mismas que las de la neumonía bacteriana. Su curación puede obliterar la cavidad pleural.

NEUMONIA EN POBLACIONES ESPECIALES La neumonía en las personas mayores es, de mayor riesgo que en los adultos jóvenes, pero la lista de patógenos asociados es. similar, con S, pmeu/twniac como el patógeno más frecuen­ ta líliffli H,jy «¡c rrCcirtndd que ciertos patógenos, coano el * irus sineitial respiratorio, que se creía que eran agentes etiológicos de la enfermedad en los niños, también infectan a los adultos y a las personas mayores. Los pacientes inmunosuprimidos están expuestos al riesgo de sufrir infecciones por muchos patógeno* que no cuelen cau­ sar enfemiedadct en las persona» inmunocompctcmcSr lilíllí estos patógenos oportunistas se encuentran los parásitos, como tbxopiusmtigondih viras, incluidos el eitomegalovirus; hongos como la« especies de Aspergillus. cigomicetos. aeqfamtatm y Prteumacysiis jim w ci (carinU) y nueubaeterias* como el complejo Mycohffctcriafn avtmt.-Los. pacienten con fibrosi* quísiiea son una categoría espe­ cial de enfermos/3En «1 curso de su enfermedad estos pacten* íes se infectan con una serie de patógenos: Sfttphyhcocvus üitrcus, Haemaphilus influaizpe y Pseudonwnas cwrugmosa* Las cepas, de Pseudónimas aentginosa en la tibrw is química presentan un carácter mucoso característico que en otros pacientes ¡te observa con mucho menor frecuencia,, Más recien­

temente, ttvrtímlderia crpacitt, Stenofmphomimts müítophiiia (ambas consideradas antes especies de P.wudotmmas) y las especies de A (ailifiFfici se han eonvcnidu ea la principal preo­ cupación en la fibrosis quístka porque causan Infecciones difí­ ciles de tratar y los patógenos se diseminan con facilidad de una persona a«tra, Lu enfermedad hroncopulmonar alérgica -ea causada muy a menudo por Aspergilím fumígalas.** Este patógeno versátil, aunque upurtunisiu, puede producir una enlettnedad invasiva en bs ¡p¡mentcs ínmuttosuprimidos, micctomas (bolas fungacas) en cavidades preexistentes, así como una reacción in muni­ toria en individuos con predisposición atópica (alírg ica).^ 63 En las aspergilosis alérgicas, las bifas se encuentran en Im espa­ cios aéreos donde causan una reacción inflamatoria pero no invaden los tejidos,

RECOLECCIÓN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO OE LAS INFECCIONES DE LAS VÍAS RESPIRATORIAS BAJAS

Esputo. E l espato expectorado representa la muestra más sim­ ple y más económica para el diagnóstico de las infecciones de lu* vías respiratorias tajas, b utilidad de esta muestra es terna de considerable debate dada la dificultad de algunos pacientes para movilizar las secreciones y la frecuencia con la cual la muestra se contamina con la flora de la orofarinpe cuando pasa a través de la taca At Sin embargo, citando la muestra se reco­ lecta en forma cuidadosa puede proporcionar información útil para el tratamiento inicial de la neumonía adquirida en la comunidad.’*5 Se debe instruir al paciente acerca de la recolección adecúa’ da de la muestra de esputo, en ve/ de saliva. S i los pacientes se cepillan los dientes y hacen gárgaras con agua justo antes de obtener ta muestra se reduce el numero de bacterias contamíFiantes de la orofaringe. Spada > COls,"r“ demuslraron una dis­ minución de 1 log ea la concentración promedio de bacterias contaminantes de 3,6 ± 7,5 X 10* 3 3,7 ¿ 7,2 X til en muestras de esputo de pacientes que fueron obtenidas inmediatamente después de realizar un simple lavado bucal. Se debe evitar la realización de lavados bucales o gárgaras con productos que puedan contener sustancias antibacterianas. Una ves recolecta­ da la muestra, dete enviarse enseguida al laboratorio en ver de dejarla junto a la cama. Es preferible obtener muestras de espu­ to temprano por la mañana poique contienen secreciones que se juntaron durante la noche y en las cuales es tnás probable que se concentren las bacterias patógenas. Se dete desaconse­ jar la recolección de muestras durante 24 horas debido a que no solo hay mayor probabilidad de contaminación, sino que. ade­ más, fas bacterias patógenas que pueden estaren alta concen­ tración en una muestra pueden diluirse con el agregado de la* muestras siguientes más acuosas. Cuando ¡a producción del espulo es escasa, puede ser eficaz. la inducción a iravé* de la nebulización con solución salina para producir una muestra mis representativa de las. vías raspiratórias bujas, Debe evitar­ se el uso de "solución salina para inyecciones" yaque muchas preparaciones condenen sustancias anLibacterianas."'" Para la recolección de esputo existen en el mercado disposi­ tivos especiales que comercializan las compañías que proveen insumo* p:ir:i laboratorios o se puede utilizar un fraseo de boca ancha estéril con una ¡apa de rosca ajustada. Para evitar la con­ taminación desde el exterior del recipiente, se le debe indicar al paciente que presione el honlc por debajo del labio inferior para recolectar toda la muestra expectorada.1 Aspiración méatraqueil Se puede obtener urtw muestra introdu­ ciendo un catéter a través de la laringe dentro de la tráquea. Si

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76 CAPÍTULO 2 Inlrodiiccián a la microMalogla: Parle II

el luhtí está en su lugar e> e*isie urw traqueotoraía, 3a aspiración de las secreciones traqueales es simple. A nicntulci se presume que la aspiración endotraqucfll evita algunos de Sos preMemas, de ccmlímitiaciái dd espulo expc-clira­ da. De hecho, la inlubaeíón introduce la posibilidad de conta­ minación )¡a que las secreciones. bucales pueden escurrirse hacia ahajo por el lubu endotrai|ucul, Por l.o lanío, estas mues­ tras deben interpelarse con las mismas consideraciones que se llenen en tuertea para ei cvpulocxpcclunidn Se ha sugerido que los cultivos cuantitativos de los aspirados traqueales pueden proporcionar una mejor información (véase más adelante la explicación üObrce] lavado broncoalvcolar)-*1La técnica cu«nútairva incl'jvc ln reali lició n tic una dikieión del esputo que ya ha ¡sido licuado cnzimátieanicnte sin-te^ de su siembra sobre una placa dé agar. Un enfoque scmiciuiniiuuívo más simple, en el cual el esputo ’é lava dos veces con solución salina y se vse(li­ bra en esleía sobre el agar de manera usual ( véase cap. 11 se correlaciona muj bien con la técnica cuantitativa. Esta técnica no ba si dn adaptad» ampliamente, pero ia mayoría de Iw labo­ ratorios la utilizan (aunque pocos realzan los pasos de lavado). Aspiración fwsteirfagea (íra¡mtntQtsea& La aeración iraiislaríngea ca una técnica invasiva tfüe se introduje» pora evitar les pro* h lemas de contaminación. Las dificultades técnicas en la rcali raición ;ifdecuuda del procedimiento y sus complicaciones han reducido la frecuencia con la cual se lo aplica. Broncoscopla rígida Con el hroncoseopto rígido se pueden tomar muestras sólo de fas vías aereas centrales. A pcsai de que es adecuado para los calliw s de micobaclerias. no es apropia­ do para los microorganismos que colonizan la orofarmjce e infestan las vías respiratorias bajas, Hoy en día rara ve/ se Util i/a. Brmeoscapijflexible. La bíoncmcupia con fibra óptica es una técnica utilizada con frecuencia para la obtención de biopsias. lacados y cepillados tra ns-bronqn iales* sobre todo en pacientes con abscesos de pulmón o sospecha de otras infecciones pul­ monares profundas, La técnica de cepillado bronquial uiili/a un catéter doble telescópico recubicrto con polieiilcnglieol en ei e.iTrtmo dista.1 para ln protección de un pequeño cepillo bronquial, Esta técnica se recomienda para e! aislamiento óp­ timo de bacterias aerobias y anaerobias facultativas y estrieluh, (fcNtle las legiones pulmonares profundas.™ Se pueden obtciKt distintas muestras de las lesiones focales luego de la localización fluoroscópica de ta punta del hroneoscopicu, Las muestras que no se pueden cultivar en forma inmediata deben, colocarse en un medio de transporte y mantenimiento para su envío al laboratorio. E l éxito de este procedimiento depende de Eo siguiente: I) obtener suficiente material de cepillado desde los bronquíoLos dislates y los alvéolos para realizar varios troris. 2) preparar un juego completo de tinciones espe­ ciales y múltiples cultivos y 3) buscar mó* de un tipo de mi­ croorganismo. Lavado brancaalvaotar. E l lavado broncoalveolar involucra la inyección de JO a 5(3 mL de solución fisiológica a través del broncoscopio de fibra óptica que se introdujo en las ramifica­ ciones bronquial ares pera tenca v I j solución salina luego se aspira y se env ia para realizar los fnolis y los cultivos. Lus cul­ tivos scmícuantilalivos p cuantitativos de las secreciones, respi» rallarías obtenidas por roediode las técnicas de cepillado bronquial protegido y lavado alveolar «í recomiendan para el diag­ nóstico de neumonía en pacientes ¡utubados que se encuentran coa respiración asistida™ Los microorganismos presentes en concentraciones muyeren de i O1a 10* unidades tomadoras de colonias. (UFCVm L y las muesirais que presentan hneierás intracdulares en más del 25 de las cítalas inílamaiorias son

indicadores de neumonía que requiere tratamiento específico. Lamentablemente, ia experiencia con la microbiología aunúCativa de las secreciones respiratorias ha sido bastante varia­ ble,’’*1Un grupo de investigadores encontró alia especificidad si se utilizaba un valor de cone de 30'' UFCVrtiL para los líquidos obtenidos por medio de lavado broncoalveolar» pero con una sensibilidad del 33Í5-, debido sobre todo a la iiuplcmcnlación previa de una terapia con antibióticos^* Estos autores eundu* yernn que con esta eonccnlmeión bacteriana la neumonía puede diagnosticarse con facilidad, pero un resultado negativo ucs excluye el diagnóstico de neumonía. PitWfQn y blopsía pulmonares. La aspiración percu tanca o la biopsia por aguija pueden realizarse a ciegas o por medio de una guia lluoroscópica* particularmente si se presenta una lesión localizada.'''' La biopsia de pulmón a cielo abierto es el piwe* Oimiento rnás invasivo y se reserva sólo para '■isuaciones en las cuales han fracasado las otras medidas. Cuando los cultivos son negativos o no aclaran el diagnósti­ co pueden ser útiles ciertos procedimientos adicionales para determinar la fisiología de las infecciones respiratorias. Los heinoeultivos ve deben obtener siempre durante la fase aguda de la neumonía. Se puede aislar Sirvpiucoci-ux pntrumtmiae a pan ir de la sangre en 25* 30*5 de los pacientes con neumonía neumocócica, a menudo cuando los cultivos de esputo son negativos.1** Si no se produce esputo es Risible detectar am (geno* bacterianos de Legtottelta jtnewnophifiti serogiupo 1 y de Sttvpiw cactus pneumaniae en mucMrjs de «irina.',|u<' El antígeno puede eseretarse dtiranle días, semanas o incluso meses; por lo tanií), no ensayo prsüiEjvo no documenta en abwluio um infec­ ción recienie. Se retiñiere una ctrnelircióti c u id a d a con ¡a información clínica.

PRUEBAS DE LABORATORIO V DIAGNÓSTICO DE NEUMOHÍA

El diagnóstico eiiológioo de la neumonía es una tarea con­ junta que requiere lu pwlicipaeÉñn del niLcrtubiOlogo, et i jdk>logo y el médico clínico. E l diagnóstico de neumonía es clíni­ co y k realiza utilizando la historia clínica, el estetoscopio y ¡a^ radiografías de tóra*. Con tí junas excepciones importyuccs, como el aislanuento de MyufhuítctiutH tuhctvitbiis> 9a neumonía no se diagnostica en el laboratorio de microbiología. U rt mcdictH que envían una muestra de espntu al laboratorio sin lener el diagnóstico clínico en su mano están solicitando una información confusa o que incluso los desorientará. Una vez establecido el diagnóstico de enfermedad, el laboratorio puede ayudar a definir la eiiuloiíla y a seleccionar et tratamien­ to adecuado."^ Las mucuras de esputo deben procesarse lo antes posible después de su recolección. Se ha encontrado una disminución considerable en el aislamiento de mierooiganisinos a piiftir de Eliueslras de esputo que -se conservaron refrigeradas durante 20 horas,1*3a pesar de que se afecta el número o la calidad de las células epiteliales y de los neutrófilos segmentados. También "C halló una disminución en el udmerode baeilot, tuhereulo&o* v iables que se puedeti aislar de una muestra de espulo despufis de conservarla a temperatura ambiente durante varios días,®*1 aunque la coneentración de los bacilos dcido-alcohol re si sien­ tes que se obtervó luego de la tinción para bacilos ileido-alcohol roistentes no se redujo hgsia después de ln* 20 días. La calidad de la muestra de esputo debe determinarse utili­ zando uno de los sistemas de graduación que se describieron en el capítulo L Evi%ie oontrtwersia acerca del valor de informar una identificación bacteriana presuntiva sobre la base de los

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Inl&ceiones del Cubo di ge sirve 77

criterios morfológicos. BarleEt y cob.1J sugirieron pur primera ves. que las categorías de bacterias piMifan definirá con exacti­ tud por mediu di: ]j morfología que >C observo eil luí- frotis de esputos teñidor con la Unción de Gram. Few ejemplo, se reali­ za la identificación morfológica de los estafilococos, "bacleroides-haemophilus", y de bacterm de morfología mi uta mn un 75% de exactitud si las muestras de e*puiu su.ii de alta caJklad Se ha demostrado2"’1que la enumeración seinicuanLitativa de las bacterias en una muestra de esputo teñida con tinción de Gram nn puede reproducirse de un técnico a Litro (o incluso cun t’J mismo técnico que examine el írotis en ocasiones repetidas) y que estas estimaciones deben ser informadas. Una explicación posible pura esta observación es la variabilidad que se encuen­ tra entre las distintas zonas de los frotis. Por otra parte, un infórme mis optimista indica, que lus tinciones de Gram de las muestras de espulo de alia calidad, realizadas en una población seleccionada de adultos con neumonía adquirida en Ea comuni­ dad, le pueden proporcionar al medico suficiente información para comenzar una lempia empírica con untibióLíeos. Cualquiera que sea el caso., se requieie una considerable expe* rienda de parte deí observ ador y una correlación regular de Icsü resilladas do labumtorio con los indicadores clínicos ¡míe^ de otorgar valor a la interpretación de la tinción de Gram de una muestra de esputo. Una herramienta útil pur*i el ascfununicnlo de la calidad es la comparadón de las: tinciones de Gram y los cultivos. Si los micitm>r¡íanistnos que se observan en el friáis nn crecen en el cultivo o si los que crecen en cantidades moderadas o altas no se observan en el frotis, Éste debe ser revisado. La tinción de Gram es relativamente poco sensible {deben estar présenles unas 10* UFC/mL pura poder visualizarlas); por lo lanío, pequeñas cantidades de bacterias; en el cultivo pueden no ser visibles en e1 frotis, Si el frotis no lue interpretado de manera correcta, se lu tlebc re v^ r nueroiDCüie junto al observador. lo illuiI sirve emito aprendí/.aje, Si la iflttriW líeión del frotis fue correcta, puede ser un indicio de que se deben considerar otras estrategias además, del cultivo. Hl sistema de graduación pura las muestras de esputos no se aplica a las infecciones de las. vías respiratorias bajas causadas por especies Lie Le/tkfnefla, micuJwcterias., hongos y virus. Estas Infecciones no siempre generan respuestas purulentas, con células inflamatorias. La determinación sfimicurtnEiluEiva de los bacilos tuberculo­ sos que se observan en Eos frotis teñido* con 3a tinción Jcidoaleoliol resistente en los exámenes secuenciales de esputo es útil para determinar lu clicacia del tratamiento citn antiluberculosos. Una disminución de 4+ a 1+ o escasos o incluso ningún bacilo luego de 4 a 6 semanas de tratamiento indica una buena respuesta al fármaco y puede utilizara pant determinar et motílenlo seguro de enviar al paciente a su liogur. La importancia de los microorganismos que &e aíslan de ttimíilrai fcupícnlniq* dehe cvwlunnic siempre ii U lu¿ de la información clínica. La interpretación de Ins cultivos ile espu­ to es muy difícil, ya que no son específicos ni sensible* en la evaluación de las infecciones de las vfas respiratorias bajas, I .entino y Lueks|C* han ¡mesto de manifiesto, de manera sucin­ ta, este problema basados en su experiencia a partir de un estu­ dio lie Ü34CI pacientes con ■rnspccha de neumonía (recuadro 2-1). También puede ser difícil establecer la etiología bacteriana de lu bronquitis aguda o crónica, puesto que muchas especies bacterianas pueden hallarse como llora normal o comensales de las vías respiratorias (cuadio 2-2). El aislamiento de Sineptocaccus pneumonKiel KUbsteíhi pneumonía*„ Ifaemvphilas influenzae y M (tratefía {Branhametta) catíirríuj!i<Ecoma

Recuadro ¡í-1 Interpretación dei cultivo de es pulo: observaciones de LenUno y Lucks1* E. Aj^kiwiJu el 'isteiini tle cU ü I h e íó c i lu. « iI mIji J dd íspwiliilii 1. ct JSS- Jtf Ids (.ulrivrr. Je H>,pu(ú nfiihidm en laboralnntn nn

IMsiiilacheada U? tiilkfaíJ y ríflílawn prttKlpalowffle ■* 1j%«creckjue1 ' tatole*

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evidencia^ ndpri|miKiLí,i> de Hpuui «tMíoiiins de pLK' lentes v jh

vi.i tLi riL'iin'MinTi nii fuerure de <;i.|TC4.tDrnL5LÍi] prcíundü i nu.ev:unEnte ri'llejiuHnn más Lis

facnlc*

4, S O b d I0.h'rt d*: t(^ |iaórfiles quepfi;duJeiiiiHJrt v‘'[HJ|í* Wj |^rí>Nii-

tu- ívisÍ4Ií neunbwiiu 5, fsiVfci d K S | de Lw paciente» tm ncumonM pnW ujím i e ^ in i

[mfuJefltp

niicTooiganismos predominantes de las seeTceioncH respiratO' rias. sobre todo cuamEL! los froiis teftidos con Gram apoyan sai presencia o los microorganismos también se alelan a pan ir de tos hcmocullivo& stuiul tañeos, corrobora «.u papel en la apari­ ción de la neumonía iiguda,**-^’ Pura aumcn|¿ir el rendimiento en la detección de ciertos microorganismos, en particular Pneumncysth jirttveci it-annii}, pueile ser necesuria la recolec­ ción de muestras ile esputo inducido, Eueüo de la nebulización con solución salina. S i se sospecha de infecciones pulmonares causadas por rnicobact-erLíi, hongos, parásitos humanos O virus, se deben utilizar técnicas especiales para aislar los agentes etiológicos, como se ík'icnbe en los capítulos dedicados a cada uno de estos grupos de microorganismos. A pesar de que el aislamien­ to de ciertos hongos, como los hongos dimorfos patógeno?, suele indicar enfermedad, otros bongos, como las especies de Aspergidas, deben aislarse en forma repetida a pan ir de mnes' tras sucesivas antes de ptxJer confirmare! diagnóstico. La pre­ sencia de hitas de bongos es menos probable que represente una contaminación amhieiiul. lil diagnóstico de neumonía v iral se realizará con mayor frecuencia en pacientes inmunmupriniidos y en niños que se encuentran lo suficientemente enfermos como para requerir intcTnación, Los hemoculiivm. la detección de antígenos urinario?; y las tánicas cuunlitutivas de eullivo ya fueron ejtplieados. Hoy se cuenlu con técnicas moleculares modernas para el diagnóstico rápido vira] y de las infecciones por micobacterius; es poco probable que en ttn futuro se amplíe el número de situaciones en las cuales se aplican estos enfoques. Como estrategia úlil se ha propuesto lu niedieión de un recepu>r desencadéname solu­ ble que se expresa en las cílulas mieloídes,w pem los resulta­ dos promisorios requieren confirmación.

infecciones tíe! tubo digestivo lalBccicnes Intestinales: SÍNTOMAS CLINICOS

El síntoma más común que *te presenta en tas infecciones del (uto digestivo bajo es la diarrea.1** A pesar de íiuc ésta es difí­ cil de definir en forma cuaJitliativa, lo.s pacientes saben cuándo han tenido un nómero de deposiciones mayor que el normal y cuándo L l l í heces tienen un aspecto mis blando o más líquido que el usual. La diarrea puede acompañarse por dolor abdomi­

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CAPÍTULO 2

tnlmrtuceión a la iriicrobjologla: Pírts II

_ — " Cuadro 2-2 Srlrctiéit dr lu fiara contaoi] y de tnt |ut¿QHHH piitrnelak^ tlel ¡ipumla respiratoria

FIjOKA COMKKSAI, liüfitpUKKDi W^-tKmolEbrcis EmffUantüt p-h«m.ilJiKüi. difcrenles Je las dd f njpii A F s , JX f if i Je C w dto h r üMafildCMJs Eipaaís de C a s/1¿üftTL“Je riovn (dJíieiuitles] /fiüi-winjí/pj/ifT pminfSutrMK t%p«;ies de h'fi.nohi

PATÓGENOS POTENCÍALES Aík'nnvinj’i Anaeíi’tmü foonie pirte de uilü infrectón m iita h & iñ ld e llt i pétrif.rth Ctúam\íírir pru■ cwrami uit i Srluniríiiii puthiri C í /1 i f 1ífr-l l i et i"!«It J f ; V1¡ite: f il ir Ctyptt HTttTW.S itrwft^TT)ans t’iinreie^ü.lii^ir.ií L iiM fr t b ji N rítice/M

Huenwptrtlui.\-/hit’ni¿w Vir.i-- i b f l b e r p t f t j - i m p l e Hspwíes ífe IsRÍt/iwWn Mf/vxtihf ínter/ iviif tispfiziq's i!t? bhc'<»fc£rrífnim >ípnftjr»muíar MLvtiviruS V pmnuMUiiEUs Ntihicrfil Jf h i i.si f r i u

/Mtfifflrti'jan.í j\rtn'*t r fftrnñul /‘icr+i/r^wJíjLjí ciífUfrAfliJ S w p k y fo i

í K t ’ M .V í í l J f l ' f P T

■SKrryUBflíHmMp*itnrt\nttiflr S tr tp ü H ií4i pyflü/tnet (^ru(MA)

nal y cólica!. Je intensidad variable. La "gasiroenlerilts*' es un termino utilizado para describir varios tipos tic infección gasL m iis lc s lin d b o j j .

La “disentería” es un, término utilizado para describir el cua­ dro en el cual la diarrea se acompaña, por dolor abdominal coa cóficos y tenesmoÍieníión ttolurosa antedi paso tk las heces}. Lu JisenUría es el resultado de la acción de niktwr^iitiüiinh "‘cntcrninvasiYos1" que penetran la mucosa e inOaman la pared ¡me^inal. A menudo, lav heces comienen células ir»flam¡MGtia'« y ¿lób ulo rojos y puede también observarse sangre. En el extremo opuesto Je esle espectro ¡>e encuentran los sín­ dromes dlarreacos profusamente ocuosíw no dolorosos causados p ir virus y cienos pur&sitos y bacterias. Los síndromes diarrei* eos acuosos y más agudo> se resuelven en forma espontánea al calió de una semana. Si tos. síntomas persisten sin mnguna explicueion, se deben considerar tos parisÍMs. Corno Gúinliú hmbíki y oirás etiologías no infecciosas. Las heces producidas durante una infección pcir Gianlia snn a menudo hediondas, grasosas y flotan en el agua La fiebre emérita représenla una cíiWgoría especial y, |fcif Uuiúna, puco común. E¿le ^mlnime está causada put Salmotieilti typlti, aunque otras especies y scrovares de Salmonella también pueden ocasionar una enfermedad similar. La fiebre entérica se caracteriza por fiebre, dolor de cabeza que al prin­ cipio remite y luego se hace constante, dolor abdominal, csplcnomegalia, bradieurdia (pulso lento) relativa y leucopema. U diarrea no c í pnirrúnenlc; de hecho* el estreñimiento puede SCt mis común al principio de la enfermedad. Además, algunos patógeno1 » invasivos pueden fila r asociados con enfermedad sísc^mica c infección melastáslca en otros órganos, sobre todo en tos pacientes en>n enfermedades subyacentes, como las hepatopaiías crónicas. Cierros agentes infecciosos están asociados enn determinactos- factores de riesgo o eaTHeien\iieas clínicas. Algunos agen­

tes., como mkrosporidio, se encuentran easi exclusivamente en los pacientes mmunusuprimidos. Casi siempre, Ctosiridiiuit dijpcUf causa enfermedad sólo en los pacientes que fueron ira’ tactos con antibióticos que alteran La flora ga-stroiniesTinal TKffmaL Muchos de agentes se transmiten por atimealos y ajjua cmiiaminada/* En el eu^hlro 2-3 se resumen los principa­ les .sirulruniej. de la» cn rem icluk» tlel tubu lü^cm lw hujo. En la mayoría de las comunidades, los agentes que se iden­ tifican con mayor asiduidad en las. g&'íltttemeTiiis son CampyhrfmcTt'rjt'jtini. especies de SuÍMttHflla, Glaniui faatfiliü, rolavirus y norovirus i virus similares a Norwulk, para lo* cuales no se cuerna aún con pruebas de laboratorio),'"' Sin, embargo, cuando todo está hecho y dicho, el rendimiento diagnóstico a parí urde los coprocultavos en la mayoría de los laboratorios d i­ oicos es un desalentador 1.5% a 5hó% .38t Algunos agentes, que causan gastroenteritis requieren traía» miento inmediato; por ejemplo, las especies de Shigelfai pora tiims no existe tratamiento específico. por ejemplo los \ jjvis; en oíros casos el tratamiento esta indicado sóJo si se presenta una enfermedad con complicación n Rehre entérica. por ejemplo. las especies de Salttwneítu. Es muy probable que los médicos indi­ quen eoprocullivps anlc alguna de las siguientes situaciones:1 I El paciente tiene síndrome de inmuuodeftdencin adquirida 2. ES paciente ha viajado recientemente a un país en vías de desarrollo. 3. Presencia de lacees con sangre. 4. Presencia de diarrea duramc más de tres días. 5. ¡ja diarrea requirió rehidratación intravenosa ó. Hay liebre. Los laboratorios difieren mucho en la sofisticación de los métodos de Análisis de las muestras de heces. En un estudio realizado en 38K laboratorios elinicos durante 1999, la mayoría

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In fe c c io n e s d o l tu b o d ig e s tiv o

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--------------------------------------- ------------------ — ----- ■ ---- ---------- -— *— ‘--------- -------------U.ladro 2-3 l ‘rín cíp iiÍLs hínduimo^ di- Lis (•asIrMt'nlfritM y líb ra le s rtiitló iy c i» más «.'tmiunc* S ÍN D R O M E

B A C T E R IA

V IR U S

P A R Á SIT O S E n ta im rfra

Diarrea infUirraCorii i K'Uudj ú íic s ittd n

Especiee de S h is f í k , £ c r í i «¡le raimas íívíl E. c& ll t á a i y lc ííll’jl.ijk lL S á lM v ttflltí m w ñ f í d ix C iW ifT y U h tii'itr jf jw n ii Ifíbnn p a ra tv ig m itffti’ i .i.'.. C...•.■jJ'.i. .. i.;íj: d i UlJM

Ninguna

Uinnva im ifl3l;ini;irnnu

h ínilí*-irét'üt.^j|áííií!i1£ i-i4¡

Ncwtft'yits, JBUiii i- f í h r d t a iünJyHtt, rus. «JeaLivinis C ry p itü p tin J itíM t ttil¿lks>, nHttuVÍ f k it k u r i, lim p t r n i rus, rl i'. he i! i, C y c /o jp o ra

otÉf(M |iiqLiLivi, VlftfíEJ í'hf>le rae, C lu ilr id ix m n-rrtrn; i'i'rif, il¿K'iítítx nrrrirj,

DÚKKft CCUl 1 21S'ci l : io_LiJ « ilé n s i^ inrtii ida fie­ bre e^sénca

S iilm cfneíls lyp hí. íjSia&rtpixljÉS»

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de los microbiólogos examinaron las mutí(r
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C O M EN T A R IO S

A íft'U ct ,h!c' lula ddfUd ctd i^ l; p«de kiihi-r leureciíUR m «»iiu¿]e*reb eít ios híte>

tartalea pueden set más cíkaces que las muestras de heces para el aislamiento de ciertas cepas de Shigelia, ya que estas microorganismos son sensibles al enfriamiento y al secado. También se ha informado que In* hisopados reciales son m is eficaces para el aislamiento de C&siridíum dífficile en pacientes hospi­ talizados.1*1E J hisopo debe ser introducido un poco allá del esfínter ana], evitando el contacto directo con La materia fecal del recto. Lo* hisopos deben ner inoculados de inmediato en el medio de cultivo o colocados, en un sistema de transporte ade­ cuado pira evitar que *e sequen, Los hisopados rectales tam­ bién son necesarios para el diagnóstico de la infección gonocíScicti rectal.

CONSIDERACIONES EPIDEMIOLÓGICAS EN LA EVALUACIÓN DE LOS PACIENTES CON GASTROENTERITIS

Se debe realizar* una historia médica detallada que incluya los viajes recientes, el consumo de alimentos o agua potencialmente contaminada y la presencia de enfermedad sim ilar en amigos o familiares. fcn particular se deben rejistrar lo* viaje* a países Fuera de los Estados Unidos, donde ciertas enfermeda­ des asociadas con diarreas pueden ser endémicas, La causa más común de la “diarrea del viajero" (también llamada ‘“revancha de Moctezuma", hvicnm de Delhi’' y otros nombres pintores­ cos) es £. cotí cnleTotmigénica,1pero oíros patógenos impartanas, como Btttítnoeha histolytií'a son también habituales fuera de los Estado* Unidos. Lu mala calidad de! agua y de los aíb ¡u

le e lím e n lo s

de

elLi rú e n lo s,

ta -escasa

d ih p o n ib ü iJ jt l

de

almacenamiento en frío y la contaminación a partir de las personas que preparan los alimentos ponen en peligro a Uwí viaje­ ros. Sin embargo, en e-stos tiempos del comercio global, que­ darse en casa tampoco Implica estar libre tle riesgo. Se han informado gastroenteritis epidémicas como resultado del con­ sumo de alimentos contaminadas.** S e trata casi siem pre de vegetales o frutas que no se cocinan antes de consumirse y que han sido importadas de otros países. Por ejemplo, se detectó un broté OTUll¡estatal de infección por Cydospom proveniente de frambuesas importadas de Centroamériea sólo despufs de que se acumularon los informes en los centros nacionales de refe­ rencia l!lh Es importante recordar que las bacterias habituales de

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CAPITULO 2 introducción a ia mimbiología: Parta íl

80

Cuadro 2-4 tanctartindc in fvtriw k gwln>inii*stinai» era raciones espec Sfkws iv u r r titt

A t íE N T E íS ! iM ttC Ó O S C N - S i

V i a j a r í f c n H H jtu le ru y b e t v r

H iit n J ic T lss/r¡h!úi

iU- -irnixi.-. líe rn <¡r 11lililí E & p e c i c i d e .Srj¡ m w r í f a . e s p e c i e s d e

p r c w íiK t iis lá c t e o s

C 'u m ) ) \ k > h i L ! í t r c ' j p e t i c j i k Y tT ± ü \ ¡ti. L i í r o iit C o v ia

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totafü, c i f a n ^ d o i w i s . Candida

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J i p a s e s d í 1 VVÍ-jt íi >, Jio c n v f n t s .

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te de

la h c p u u U H A

las aves de cornil (que se mueren üürjnie i«i cocción j pueden causar enfermedad si los alimentos erados , -como tos v ^ e ia b . entran en contacto con las tablas de picar o los mostradores utilizados para su preparación. Ciertas, loulid idcs. ámbitos clín i­ co» o alimentos se relacionan particularmente w n patógenos específicos (cuadro 2-1), Sin embargo. es posible cualquier crnnbinftcirtn, incluso aquelj as no descritas antes, loque subrá­ yala importancia de realizar una historia clínica cuidadosa y de informal los cabos o k a v lv rid íib de salud pública. Infectionís Sel tubo digestivo alto

El tubo digestivo alio está formado por el esófago, el estó­ mago y el duodeno próxima! (desde la orofaiin^e hasta el íntcstino).

SÍNTOMAS CLÍNICOS La esufyuilis está asociada con dificultad y dolor al tragar (disfagia) y con dolor que se irradia hacia la espalda. La mucosa gnstroesofágieji está expuesta a alio nesgo de ulcera­ ción, Los agentes infecciosos más comunes son Candida fílítíciinit y ei viras del herpes simple; «irtHii producen enfer­ medad erosiva. Cüando el estómago y la unión gastruesofagiea se encuen­ tran involucrados. los síntomas son an-orexia, sensación de náuasas (en ocasiones cno vómitos profusíos.1 y dolor en el a M o men superior, tábido al pH muy hijo del ácido gástrico, el

99,931 de las bacterias que se ¡¡agieren mueren luego de ,10 minutos de exposición* por lo tanto* la gastritis, debida a la in­ vasión directa del estómago es rara, En consecuencia, ta infec­ ción gastrointestinal yiiq, c% causada más a menudo por viras y tos inos bacterianas, E l ácido gisirieo también desempeña un papel importante en la protección del tubo digestivo bajo con* ira las infecciones bacterianas. La terapia con antiácidos, ipe neutraliza el p ll gástrico bajes., \ ia gaatrcetoinía. en la cual ie elimina la mayor parte de la mucosa fomwdoia de ácido* predispoiten a las infccciimci entéricas por diversas especies bac­ terianas. Guerrant™ describió que la dosis de V. rht*lemr requerida. para Causar una infección en perdonas SíO¡ti\ (10’’ microorganismos por m ililitro) se redujo a sólo lOVmLen vo­ luntarios ll las cuales se les administró bicarbonato para neutra­ lizar la acidez gástrica. Se ha asociado Ht'íicohtirter pyíari (antes CtmpyMwciéípyíoni con la gastritis y la tile era péptica.1,2ITl|-:s* K3 microor­ ganismo tiene una propiedad bioquímica ilnica de hidrolizar en forma ávida y rápida la urea y de liberar iones amonio. Se pre­ sume que las bacterias se rodean de una nube alcalina que posi­ bilita. %u supervivencia en «I ambiente muy ácido de ia mocosa gástrica. La etiología infecciosa de la úlcera péptica permane­ ció sin conocerse durante tanto tiempo porque isla no presen­ taba lus sigrH.ís y los síntomas, clásicos de una enfermedad infecciosa. E l bal largo de esta infección ’no infecciosa” Im abierto nuevas, perspectivas en el espectro de las enfermedades causadas por Los microorganismos. Un factor principal délas infecciones gastminiest inales altas es la ingesta de microorganismos o toxinas bacterianas puefar¡nadas que se encuentran cu alimentos y bebidas-, conocidas, enmn intos ieaeión por alimento*. La gastritis aguda y a menu­ do fulmíname, acompañada por debilitamiento general y vóm i­ tos, luego de la ingestión de alimentos muy contaminados Cwl microorganísmos* como SmpkykH'mrcus nurcta. especies de SaítnoHtifa, Cfostridium perfrmgens y Bacifltis netvus, no es el resultada de la invasión bacteriana directa de ia pared gástrica. 'Sino que es consecuencia de la acción emética ilm?L-i:i. que tas neuratojunaa. preformadas ejercen sobre el componente central Je t sistema nervioso autónomo, OBTENCIÓN DE MUESTRAS DEL TUBO DIGESTIVO ALTO

La obtención de muestras gástricas para cultivo es muy poco frecuente y se limita o algunas situaciones cuyo diagnóstico es imposible por otros medió!.. Las bacterias causales de una into­ xicación aguda por alimentos se pueden aislar det material del v Cotilo, Se realizan biopsias gástricas pora detectar fféfiaih ttavr¡n l
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Intencionas ui.narias

paciente i fuego ■se le índica que trague la cápsula. En alrededor de 30 a 60 minubH, cuando la cápsula alcanzó el duodeno superior, se retira con cuidado 3a cuerda, se extrae Cualquier muco»jdad adherida a ella y se coloca -sobre ia superficie de un portaobjetos para su examen directo coa el microscopio,

Infecciones minarías E l aparato urinario se divicie en una porción superior* com­ puesta por los riñones, la pelvis renal y los uréteres, y una por­ ción inferior, compuesta por la vejiga urinaria y la uretra. Las infecciones urinarias alias suelen ser ascendentes; es decir, mí originan en la vejiga y ascienden a través de los urdieres; hasta ks riñones Normalmente, la válvula vesicouretral evita el reflujo de la orina desde la vejiga hacia los uréteres, Las, personas cofl anomalías urogenitales o con sobredistensiórt 4c la vejiga debido a obstrucciones del flujo tle salida, mal funcio­ namiento ncurogcruco o presión del ulero agrandado durante el embarazo. son muy sensible.1;a las infecciones urinarias ascen­ dentes. Las infeccionen de la pelvis renal (pielitis) y del riftón (pídoncrrilis) son las complicaciones más frecuentes. Las infecciones pueden ser agudas -o recurrentes con dalo inflama­ torio crónico, La» infecciones urinarias alfas rara ver son el resultado de lu diseminación ¡hjT *ía safl|iiíiMai de Urta bacteria derttrOde lattirteza renal en pacientes con septicemia. Las manifestaciones comunes ,sou los áhsocsüsi ttiuldrocales o la pieloncfrítis supu­ rativa, A veces, las infecciones urinarias se dividen en dos catego­ ría»: no complicada» y complicadas'"1-'"7 lin una mujer joven sin enfermedad subyacente urinaria o si sím ica las inrecdoitcs no complicadas son la cistitis aguda o la pielonefriiii Si el diagnóstico es cistitis, se puede instituir una terapia empírica con antibióticos sin recurrir al cultivo, dado que Escberíchia tv>/r es responsable de casi (odas estas infecciones. Para demos­ trar que el proceso es inflamatorio ye debe realizar un análisis de orina o una prueba para csterusa, kucocitaria: si los neutrófiltís polimoffonuelciircs están ausentes, se debe efectuar un cultivo antes de comenzar el tratamiento con antibióticos. No es necesario realizar tm cultivo de seguimiento ¡“ prueba de cura” ) a menos que los sintonías persistan. La cistitis o Ja picloncfritis en los 'varones, los niños, ios pacientes cateterizados en forma crónica y las mujeres con in­ fecciones recurrentes, anormalidades urológicas o entermedalIcs subyacentes se consideran una infección «im plicada Se requiere análisis de orina y urucultivo pata la cistitis ctMiipl¡ca­ da y para iodos ios casos de pieloncíritis.^''" •'

Sipos y síntomas clínicos Las principales manifestaciones clínicas de las infecciones dtaü Suri ¡lebre Ca iriClíUdo con (SCUlOfríoS] y dolor en el flanco. La frecuencia, la urgencia y Ja disuria son muy suges­ tivas de infecciones de la vejiga urinaria y de Ja uretra. Sin embargo, en algunos pacientes con pielonefritis u otra* infeedunes urinarias altas los primeros sintonías son compatibles con ios de las infecciones urinarias bajas. La diferenciación es importante porque ei enfoque de la terapia con antibióticos para estas dos entidades es distinto.-171-*1' Las infecciones urinarias bajas suelen comprometer la veji­ ga O la uretra, Los sintonías son similares para las infecciones en ajnbuS lucaliíocioncs, por lo cual algunas veces el pnrcc&u se denomina .síndrome uretral agudo,7’* Las manifestaciones Urinarias

BU

clínicas usuales son la micción frecuente y sin dolor de peque­ ñas cantidades de orina turbia {frecuencia v disuria) y malestar o dolor suprapóbica La vagmitis en la mujer y la prnstaiitis cu el hombre pueden causar síntomas similares, pero casi siempre se pueden diferenciar en forma clínica. El diagnóstico es paniculamicnte difícil en las personas mayores, cillas cuales puede rao haber fiebre ni leucocitosis durante la infección. Se d isc u te m u c h a sobre el s ig n if ic a d » de ki fa a ú 'c riu iia a*¡httomálica, A pesar de que este fenómeno lia sido documentado en muchos tipos de pacientes y escenarios clínicos, la necesi* dad de tratamiento de la hacteriuria se presenta sólo en algunas situaciones clínicas; embarazo, mujeres que están siendo some­ tidas a procedimientos genitourinarias invasivos y receptores de trasplantes renales durante el período postrnsplanle inme­ diato.11' Factores tfil htiásp€if La prevaleneia de las infecciones urinarias varia con el géne­ ro y la edad del paciente. En los recién nacidos; y los liteiaiitcs, son más comunes en los varones con una prevaleneia global dei 1^, La mayoría de estas infecciones se asocian con anor­ malidades cungcnitov En los niños en edad escolar existe una mayor prevaleneia en ¡as mujeres,2™ fcsta relación permanece constante en la adultez. En ciertas condiciones, como el emba­ razo o la diabetes, se observan altas tasas de incidencia dé infecciones urinaria!». En los ancianos, se puede esperar un mutílente de infecciones urinarias tanto en, las mujeres (M - l como en los varones (10%). en los cuales cnisien condiciones predisponentes, por ejemplo, uropatías obstructivas en la prós­ tata. escaso vaciamiento de la vejiga por prolapso uterino y procedimientos que requieren insucinwniadón, lanío en hom­ bres como en mujeres. Sin embargo, las mujeres sexuaJmente activas son por mucho la población con mayor riesgo de tener una infección del tracto urinario sintomática o una hacteriuria asintomática '” *-A pesar de que la infección asintomática en este grupo no produce problemas mídicos .serios, puede ser un marcador de infecciones sintomáticas futimis.5®* Las mujeres .son más sus­ ceptibles que tos hombres debido a la longitud más cona de la Uretra. Los patógenos usuales son la flora bacteriana perineal que se otipma en el tubo digestivo, sobre todo si la bacteria tiene factores que facilñan su unión al epitelio urinario. Hl coito facilita la entrada de las bacterias en la uretra, femenina. Un segundo grupo de individuos que se encuentran en ries­ go de infección urinaria son los pacientes cateterizados en forma c ró n ic a .U n cuerpo extraño, como el catéter urinario permanente, garantiza su colonización a los 5 días de su colo­ cación. La bacteriana asinlomática resultante no es dañina por sí misma, peno expone al paciente a la aparición de infección sinionidlicfu como pielnnefritji y sepsis urinaria. Cuando el paciente también sufre de demencia, como muchos ancianos, puede -¡er difícil determinar si |a infección es sintomática. En ausencia de liebre o leucocitosis, los tínicos indicadores pueden ser cambios sutiles en la personalidad o en el estado men­ tal, Estas características las pueden detectar mejor las personas que asisten cotidianamente al enfermo que el médico, quien ve aJ paciente en forma intermitente, Resolección de muestras de tirina para k j Iüío E l aparato urinario normal no suele, contener bacterias, c«n la excepción de ta mucosa uretral que presenta rmeroflora,'" La orina puede contaminarse fácilmente can bacterias dclcon-

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82 CAPÍTULO 2 Introducción a la mltícbiol&gia; Paría: It

Cuadro 2*3- Cierta (tura cw ntitíil ? parágfnos pntenei^tes «Id a rru to urirtariu FLORA COMENSAL

PATÓUENOS POTENCÍALES

tjiftrpUMOw* iti|j hciri(i|i'lk(ts

r^vh’^-JcvrrNf* HfrQíyTifwnADlY

EtJ»L-|;ÍS it? HmiUílt

Hsptcifls di /■."nrí’rTh'í'h-Lirv

E*i*filigúeos ccNgiriaíane£iiiiir'Ui

& If rrihtictfnafHM-

DiRemitir»

1Is|'-i.^ s4a /'hí.j..r.'j¡,í íi.jt

liipccic^ a.' ij.,; liJitif íiittt

y!tutk¿ifi jPJrir ui Staphyitvth-rvr tpüiemtóix fhurnbrr^ aiKilIHK.) íf^Vl l,tof'AíVi itípHrphyik-H-l ímujciiM }óvfnc?i

'IMck« Cu*>wtucKMim«uvaljJkuai tUktijmptiMn Ui umr, «Ciu/in&vi i*i urmti J-¡tttrtí',¡tí-ntr¡ti ¿II i' T^ii. 7.milVtvpjr¿J>

dncto vaginal y del perineo, ocon lu flcir» bacteriana propia de la uretra En tí] cui^u2-S se enumera unj selección de mien>yrfanismos considerados. contaminantes o patógeno» potenciate» l I l ' I □paralo urinario.

MUESTRAS OE 0R1KA DEL CHORRO MEDIO DE L* MICCION

Las muestras de orina se recolectan del chorro medio de la micción en condiciones adecuadas de higiene. En las mujeres,

esia técnica iequ Leie indicaciones precisas. del personal para lograr mejoren resultados.p Primero se limpia el área periuretral y el perineo con dos o crcs pullas de gasa embebidos en aaiia jabonosa, utilizando un movimiento hacia adelante hacia atrás, seguido de un enjuague con solución solio» o ajeo» esléril. Bradbury obtuvo evidencia de que la limpieza incorrecta del área peri uretral y del perinen en Id* mujeres punte no afec­ tar lu calidad (le ¡ai» muestras de orina del chorro medio para cultivo. A pesar de esta sugerencia, recomendamos llevar a

A

cabo esle procedimiento de limpieza cuando se recolecta una muestra de orina para cultivo en las mujeres, Los labios vaginales deben mantenerse separados durante la micción espontánea y descartar los primeros mililitros de orina deben ser descartados dentro de una bacinilla o en el inodoro para eliminar las bacterias de la uretra iflg, 2-2é, E l ebwro medio de la orina se recolecta entonces en un recipiente estéril de biK'a ancha que pueda cerrarse con una tapa ajustada. La limpieza con agua jabonosa no suele requerirse para los hom­ bres; en üu lugar Se limpia el meato uretral Inmediatamente anie’i de la micción espontánea, con lo cual la recolección de la muestra del chumo medio de orina es sujlcicaie. Es frecuente que se les solicite a los pacientes atendidos en el consultorio médico o en una clínica que obtengan su propia muestra de orina. Esta práctica es aceptable si se le dieron al paciente las directivas precisas para la recolección adecuada de la muestra. Se recomienda Imprimir lias instrucciones sobre una taricta que el paciente pueda considerar después de escuchar las instrucciones verbales, Cmndn el p-inente no parece com­ prender o cuando el idioma es un impedimento. la enfermera o el asi siente del consultorio deben leerle las instrucciones punto por punto o proporcionarle asistencia dilecta pura recolectar la mUeslnu En el recuadro 2-2 se muestra un. ejemplo de una tar­ jeta con estas insirucciones. El cumplimiento del procedimiento de recolección de orina puede controlarse a lo largo del tiempo teniendo en cuenta la frecuencia con la cual el recuento d-¿ colonias de las muestras •se encuentra en un rango enire I0ÍXJ0 y 100000 UFO m L* L a mayoría te Ios pacientes tendrán recuentos de colonias que se encuentran fuera de] rango, Los pacientes m infección no ten­ drán bacterias, o bien el recuento será inferior a 10- UFC/mL. Los pacientes infectados tendrán un recuento de 1£H)00Ú UFC/mL o tiijs. La frecuencia de un recüenlo intermedio itu debe exceder el 5*106* si el procedimiento de recolección de la muestra es. correcto, Las muestras deben procesarse dentro de las dc,*s btras de la recolección para obtener recuentos de colo­ nias exactos. E l equipo de recolección de orina B-D"'¡Bcclcn-Dickinson, Cockeyaville, M D i, diseñado para mantener la población bac­ teriana en la orina a temperatura ambiente durante 24 huras, es tan c fin a/, como la conservación de las muestras refrigeradas durante toda la noche.i; A pesar de que se puette notar cieña

e

Figura 2-2 RcwIwluíiI <Jk«>rh« dd. dhom» mal» tu LutiJk’kmes Je hifkne jtltit'UiidiLS. (Ai Se «purart Jo* Mui» C0n las dciIra y « Umpa iva ua ofi^taú de g-isi at I □* ] 0 CPUmnbjSiJí- enjabún ifftlí (B'l Se recolecta 1.1pewiAn fSMftw ifc la flfirwcn «n reclíneme etfiíTrl..

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infecciones urinarias

Recuadro 2-2

InEtrucc ¡orles para la obtención de muestras de orlnn riel chorro m edio en condiciones de higiene ed rcu ed as (m ujeres)

1 . t j u í l j i - ,l I j n y u

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1111l t r i i >1.

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LL»liv,ar una iíh Ii LL. lu ril.1*, Jtfj-ik p ó 'iíilí iLat'íi'i i j urttado

2. Sqpaiars'nn una nu.ru» h»s IjJiiLh, vagimlcn. \ inarlEsirHrlm ¡rd inlí|l-

1r,i' mí traliía unn sni'íiii.i Fíi ha¡dérti£*.'irtl y írvnlew¡ii i Je U

ouoúfLm .1. L'i'nukh- AiíQurii\í Je J.iv-jr j mjiupíur hien ¡ínCet de reeolMt.ir la mtksrradi huiili. LUill^r cadj mu di; k*i canero apfoito* tviéril» Je LU * 10 luí eatítcftidúj, uri LÍFi jjbdH u'-iik. piLvai üi íjv MLüdJcLnle hadu uirás. Luvai- cb Ik I->s plEíqíucL Je lo [te") tnri

ñiLi'hmih i cuidado 4-. Ki'.juajaf. De^puis lL? haber Lawuki con J.is ¿p'iMios GnjatKHiadi», ciüiULiir cOrt ua Jp iiilSí hÜJBnJLi cíMiel ItibJfiij HWhlBLkljtú J l-aJclame tirela lira*. No uralirar nmjiiin ap.iiiin míi* de una ic? ¡v M jim c a c i' s^ u R u lih h H Libio*. vngiiultv y U.-| ir l .iít t¡is primeras ilc jvina cfi el ¡nixi.ií0 . SfW KBír e! rtL:|iÍL-fl.le Jc l laici enenio \ pcítuilirque |j o riiu icnidiieiicc c j í é j d ciLltu il: ¿ J e h H ifai el rtaptpnw ís pedirle j k f iHfcrtKrt qb(! lt» Miga

el recuento de colonias luego de un almacena­ miento prolongado, este sistema se recomienda para el trans­ porte de muestras de orina tuyo procesamiento se retrasa hasta 24 horas. Los sistemas de transporte que incluyen ácido bórico (el cual se encuentra entre loa aditivos del equipe de recolec­ ción de orina B-D? ) pueden ser un mciodo alieniaEivn para la recolección de muestras en el domicilio o en lugares alejados. Jcsvkes y a partir de un estudio que incluyó a 84 niños, «incluyeron que h recolección de orina e n deído bórico redu­ cía al mínimo La contaminación, a pe?¿ir de que el crecimiento de loa posibles patógenos también podía inhibirse en un peque­ ño numern de casos, la recolección de una muestra válida de orina det chorro medio obtenida en condiciones adecuadas de higiene para cul­ tivo de hombres ancianos can incontinencia que residen en gcriálricus lambién representa un problema. Nicalle y cois*7* informaron haber diagnosticado con éxito las infecciones uri­ narias en este gtupu tte pacienies utilizando un dispositivo de recolección externo que consiste en un condón estéril y una bolsa para orina que se lleva en la pierna, Antes de colocar el condón se Limpiad glande con jabón y agua j se enjuaga con solución calina estéril, La bolsa pam orina se examina cada IÜ a 15 minutos hasta haber obtenido la muestra. Dado que las contaminaciones con hajt* recuento de bacterias eslín preseníes; en eusi el 50% de los pacientes, se requiere el traslado rápi­ do de la muestra ai laboratorio y la inoculación inmediata en el medio de cultivo, Los recuentos bacterianos mayores de 10* UPO m L, wbrc lodo üi se obtienen en dufi rtcolccdones pllcssjvas, tienen una alta correlación con otras indicadores de infección urinaria. lLis d iinLición l1 ]j

OTRAS MUESTRAS DE ORINA DE MICCION ESPONTÁNEA

E l objetivo d!e recolectar el chorno medio es obtener una muestra de orina que liaya estado retenida ert ta vejiga y des­ cartar la parte inicial de la m icció n que ha estado en contado con la uretra y se encuentra presumíbtcmcnlecontaminada con la flora weiral, >Sin em balo, si se investiga una urtniiij»hla por­ ción inicial de la orina de micción esponuínea ts la que real­

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mente interesa. De memera (dienitiiiva (atcmjtie mis doloresa). se puede introducir un hisopo en la urclra dislai para tomar la muestra. La ucilidad principal de las muestras de orina de mic­ ción espontánea es el diagnóstico de metritis causada por N f iberia ^rmurrhiieui- y Chkimyttiti ¡rticht¡rrttílis.IW Sin embargo, si se considera el diagnóstico de pruslatitis aguda, tas secreciones prostálicu-s sm) el material d< ■L-iectiún. La técnica mis cdehúii c\ el cultivo diferencial de la orina luego de un masaje prostálico. Un aumento de 10 veces en et recnenio bacteriano luego del masaje prosístico sugiere el diagnóstico.** RECOLECCIÓN A PARTIR DEL CAltlíH

Uebe evitarse en la medida de lo posible la colocación de un caJtélcr c*m ci único prapósilO de obtener unsi muestra de Wina debido al riesgo de introducir patógenos bacterianos, Ln un estudio que incluyó a 105 mujeres con .sospecha de infección urinaria, ® los rebultados de l«s cultivos de las mucHlrus de orina del chorro medio obtenida en condiciones adecuadas de higiene no difirieron en cuanlo a sensibilidad, especificidad o udores predietivos positivos o negativos de tos de las muestras obtenidas en paralelo por medio de un cal&ér de efttl^ulu y salí* da (catéter L y O) recolectadas inmediatamente después de las rmseslnis del ehc>ní> rnedin. La colnc^ci^n de un ctftctcr se debe refringir a tos pacientes que son incapaces de emitir una mues­ tra del chorro medio adecuada y debe realizarse prestando meticulosa aleación a la asepsia de la técnica. Los primeros mililitros de orina del catéter deben descartarse para eliminar cualquier microorganismo que pueda haberse atojado en la punía del catéter en su Ir^nsitu a Iravés de La uretru. Uis muesiras de orina pueden obtenerse de un calélcr per­ manente utilizando una aguja 28 y una jeringa. Se debe asegu­ rar lq desinfección del arca donde se icaüce la purtciún- La urina puede aspirarse a través* det coLcclo: de gumu hlnnda cjitrc el catéter y el tubo de rccotceción. Las muestras no deben ÉihienerM.- tte las bolsas de lecokccíóit tlel catéter, A pesar de que se ¡mema utilizar pañales húmedos o bolsas como medio* de recolección de orina en los laclantes, es un ^ran desafío interpretar los resultados obtenidos de estas muestras. Las pun­ ías de I e ís calelen;s de Fdley n,c> stin adecuadas para el cultivo ponqué se encuentran siempre contaminadas con microorganis­ mos uretrales o colonlzajites.^

FUNCIÓN SUEWÚB1CA La punción suprapLlblea se reserva, casi en tonina exc lustra, para tos recién nacidos y tos niños pequeños. En la figura 2*3 se ilustra esta técnica. Esie precedí miento se realiiía me)or cuando La vejiga cstií llena. Para llevar a cabo e&ta prdetiea, se desinfecta la piel suprapiábica que se encuentra &óbre la vejijía y se colocan en el lugar campos quirúrgicos estériles. Se inyec­ ta en forma subcutánea un anestésico (p. ej., I 1?*- de Udocaína MCI) en et sí lío donde se hari la punción. Con la punta de un bisturí quirúrgico aguzado para punción, ae reali¿a una [K;quefia incisión en la epidermis. A través de esta herida se introdu­ ce delicada mente dentro de la vejiga una aguja para punción espinal tle bisel Címo y calihre IH y se aspiran 1[) mL de orina con una jeringa. Cultiva de muestras de orina Se requieren medios selectivos y no selectivos, Casi siempre e* suficiente una combinación de agar sangre de camero al

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Sd

CAPITULO 2 Intrúduccl4n a h m¡trabia legia; Parle II

bajos. El si^niíicudo de las infecciones asociadas con M w '"recuentos bajos de colonias" se ha documentado sólo en muje­ res infectadas par bacilos emiéricos. I j contaminación es. una cuestión para tener eo enema cuando se evalúan cultivos con bajos recuentos de colunias. Los resultados de un estudio en el que se utilizó un ansa de 0,01 mL mostraron un incremento de muestras contaminadas de un I9 % .J1 En estos casos es apro­ piado conversar con el médico sobre lu estrategia por seguir. Pruebas de cribado para in!e«sones urinarias

Figura M ^pir-u ¡ñn wpnpvbicfl de Iíi wjijH uriiuuia. Sr dirige w u uguju f rt li'rm-T pmtfinwii ifepsms rtc bi vrjips nrirwuii jacto jwr nurin» de Ea tf*iíKi<¡ fiih u M L L a Liriiu wr p L c Jc uhlcncT «m i lt- i icritifu-

y de asar de MacC'onkey para el andamiento de los microorga­ nismos que se enumeran en el cuadnt 2-5, U k microbiólogo de tos laboratorio*. que JijtM e ii principal ríteme a p;»c¡irutes am iralatados, un Jas cuales, el p alógeno má* esperado c* i-'íc:ti?-

rkitiu cotí4 prefieren utilizar agar eosina-azul de metileno do que se pueda real i/ar el recuento senucuamitalivu Je culo* nías después cte la inoculación. E l criterio mas utilizado pam determinar sj se dehe realizar las pruebas de identificación y el antibiograma de un aislamiento determinado e s un recuento de colonias mayor o igual a W UFC/mL. Cuando el recuento de c o lonias se enqvcntR entre J0 ‘ y DO'' UFC/mL. o cuando se afolan especie* múltiples, el director de cada laboratorio debe decidir, caso por caso,, si se efectúan o no las pruebas de identificación y el antibiograma. Algunos micmbiólugns utilizan 10* UFC/mL como pimío de corte, ya que tas, ansa* calibradas tienden a suliestimar el recuento * , colonias. De manera similar, en algu­ nos laboratorios se requiere un cultivo puro. mientras que eri otros se evalúan dos patógenos (para un mayor detalle sobre la evHlurcióti de los cultivos mixtos víase cap, 1). Los cultivos de muestras de orina obtenidas del catéter o íuprapúbicas suelen analizarse ca detalle, aun con bajo recuen­ to de colonia» o con el afilamiento de múltiples tipos de micro­ organismos. Los recuentos, de colonias de bacilos entéricos gramnegativos, tan bajos como 1ti- UFC/mL pueden ser sigmlicativos en mujeres con síndrome uretral agudo;1 l,?í< mu embar­ go, d médico debe ¿visar al laboraiotio sobre tos casos sospe* cbososn tildo que la* técnicas scmicuantitalivas de cultivo de orina no están diseñadas, para detectar recuentos de culonias tun

Ln bibliografía referida a las pruebas de cribado p.ira ioíeo ciones urinarias es voluminosa, contradictoria y confusa. Es útil considerar que las pruebas de eribadu pare hucteTiuri-i son una tarea muy difcrcnle de aquellas paro inflamación.Jií Ambas se considerarán por separado. Con la excepción tic algunas situaciones en las cuales la bacteriuria siotomillica es, clínicamente importante* el objetivo final ds interés es la infección urinario sintomática. Machos estudios w iliran la presencia de Mi2 bacterias como una alter­ nativa a este objetivo final, pero esta estrategia es desacertada, Quizás es m is útil pensar en el problema en los mismos térmi­ nos utiJizados para describir el abordaje de la neumonía. E l diagnóstico de las infecciones urinarias se realiza por medio de la evaluación de los síntomas clínicos o por la presencia de una respuesta inflamatoria, Una ve?, documentada la infección, el cultivo microbiológico es «til para determinar la etiología de ««¡a infección.

PRUEBAS DE CRIBADO PARA BACTEBÉURIA

Ij presencia tic bacteriuri» en concentraciones que sugieren infección urinaria puede determinarse; m e d ia n te el chamen microscópico da la orina, las pruebas de detección de produc­ tos bacterianos y el cultivo. Ninguna de estas pruebas detecta recuentos bajos de colonias en orina cor la sensibilidad ade­ cuada. Examen micrnseápicü. 1.a tinción de Gram es un método 'econó­ mico pora estimar la bacieriuria, Ln un estudio se demostró una sensibilidad d e l'M ít y una especificidad del para detectar recuento* de colonias de al menos JO1 UFC/mL cuando se observó al menos un miernofgam.smo por campo de inmersión en una muestra de orina no centrifugada.*1 * Esta esü’ategia tiene la venlaja tic que se puede caracterizar la reaclividad de Gram de un microorganismo. Sin embargo, la tinción de Gram de una muestra de orina no se utiliza en la mayoría de los laboratorios clínicos como prueba de cribado parque la revisión metódica de los frotis es un trabajo demasiado arduo, Se lia informado que el examen de muestras de orina centrifugadas ,sin tinción étimo parte tlel análisis Lie urina tiene una sensibilidad similíU' a la tinción d¡¡ Gram de una muestra de orina no centrifugada,^ pero esta experiencia no es universal y La mayoría de los médi­ cas nu dependen del análisis de orina para la detección de bac­ teriuria. El examen microscópico con moderado aumento para diferenciar las bacterias de raras partículas en preparaciones sin teñir puede ser un desafío. Una herramienta útil de asegu­ r a liento de la calidad es la comparac ión de los resultados del cultivo cao ¡as del análisis de orina:. Pruebas para productos bacterianos. Una estrategia comtln para determinarbacieriuria es la utilización de una lira de inmersión impregnada con un reactivo fLira reactiva), diseñada par»detec­ tar la presencia de nitritos en orina (pruebas de Grics») y para estimar indireclamemc el número de neutrólilos segmentados mediante la detección de la actividad de la esíerasa leu cocí ta-

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Infacciorwt urinarias 65

C u ad ro 2 -6

F i a r a i » i i h í i > i i I v a g e n t e s r t í n l jó g i c f H s v l i x d m i n r i o s d í 'l j p a r a l o ^ v n i t a i

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CiitiAmydm tracfüm iaíis, N r iiz f r it i % (m n rrii('rtir

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N r iix f t in f¿tjn¿trrl¡m!í¿t, í " í j w j j , J r i i

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t n t a t - i í i n fflív u i aeri+ > ifK u ia«ff*K iíi l u i p f n d jn t c ) ; $i¡tp itt< t n t m j l t j , L is íe riit t>H>piot j 1agen r j , JÍJ/ i'jíriV íh n H t jí t r i i ’icJín iU í jr rjrtjfi'-i'j (dSJ/pdekDDíS i'Litt d L .p ú b ü m u * ja ik u n c e p tiv e R b i1lTJJ|iti*ne,mS

[r.lLL. i:,'i:i-,i íi i l é n l k .i>lc:i

V i r u s (fe !a Lc.iüLii u i ! L '! k i c i i . i i i i n i m n a

[ k t t í jI d r (fu tra d a g e n Mal

i K i V ) . v i f iK d ? la h t j x t á t i í B . vjrvm d e In h e p a ti^ s.

ría {Ames*, Elkbart, IN ; ChciiLslrips*, Biodvitaniics/B0eliringcr^Mannbeitn, ludurtjpulis, E l fundamento de ta prue­ ba de nitritos es que lu mayaría de las infecciones urinarias son causada* por miembros de 1» familia E flfm ifc irrfn k m

(sobre todo, EAtiurívkia to li) que reducen a tos nitritos. Esla prueba carece de exactitud cuando se la utiliza sola.,ílW l Se pueden observar resultados falsos positivos si el transporte de las muesiras, fi¿ dtmfifA y. en irc’iíii-L’ij'uen.riJb, se pnr>diicí Ltn sobrecrecimiento de las bacterias reducloras de nitratos, o por inlcífcrcntia de fármucus. También pueden ób^Cívafse resalla­ dos falsos negativos si el microorganismo que cansa la infec­ ción no reduce nitratos (p. ej., cspccicsde Entemcocnts)o vi el paciente realiza una dieta sin vegetales, con lo cual pierde una impórtame fuente de nitratos. Ua sensibilidad de ta combinación de la lira reactiva de nitrilo-esteraw leucoeitnria con la bactciiuria de lü 5 UFC/mL eslá en el rango del 79-93ÍÍ-, con acia espeei Acidad jprovi madn del Ü Í'y flflí.m-3M En un estudio multi céntrico en que se analizaron 29? niuealruj, de Orina Con recítenlo^ de colonias menores de ICF UPC/mL^15 la tira LM detectó el 81% de t e cosos, Sin em balo, en un sufegrupo de 204 muestras de pacientes que además de recuentos de colonias menores de I0 4 UFC/mL pre­

C

sentaron piuría (es decir, inflamación y bacterias) la tasa de detección se incrementó al l55íír. Una estrategia alternativa es la detección de catalasa, que es producida por la mayoría de Ion patógeno* urinarios. comer' ciaJ izada como Un aereen1 (Diatech Diagnostica A llílon, M A L Esta prueba parece funcionar tte manera similar a los nitritos y presenta las mismas desventajas. Si los patógenos en un pupo particular de pacientes producen catatara, una prueba nepltva de catalasa escluye de marteia efectiva una hactcriuria con alto recuento de colonias; no brinda ninguna ventaja adi­ cional con respecto a la prueba de csterusa leütMJdiuuria.Jll3,t Detección sis baclsritíria por tuitivo. E l cultivo convencional es una estrategia simple y económica para el cribado, A pesar de que requiere 24 b a r» de incubación, la decisión de trata­ miento rara vez es urgente, Algunos médicos pretieren inocu­ lar una muestra de orina utilizando un sistemn de cultivo laminar (dtp atufe) en su consultorio, en lugar de enviarla al laboratorio- E( sistema de tuitivo laminar (SO LAR-CU IT®; Solar Biologicals» Ogdenstiurg, N Y; U rieult", Orion Diagnos­ tica, Esp w . Finlandia) consiste en una paleta recubierta a cada iades con agar para aislar bacterias grampositivas y graninegativas, La paleta se sumerge en 9a orina, se escurre, se

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86 CAPÍTULO 2 IjtlrflúiiÉtiin a Ib líilcmbidlogía; Parte 91

t i l oca nuevamente en su contenedor y se incuba, La cuant id­ eación del crecimiento se obtiene por comparación con una cartilla. Los sistemas de cultivo laminar no son pruebas de dispensa; el médico que los utiliza debe cumplir ron lo» requerimientos de las pruebas sin dispensa, incluso si no se realizan pruebas de identificación bacteriana ni antihjo^r&ma. La ventaja de esta estrategia esí su simplicidad y la economía para las muestras negativas,. La desventaja es la dificultad de obtener iubcultivos para la evaluación siguiente de Jas colo­ nia*. En la era pos-CLIA 19SS (véase cap. 1.1 muchos médi­ cos prefieren mandar di reclámenle la muestra original a un laboratorio de diagnóstico,

PRUEBAS DE CRIBADO PARA PIURIA

La esteras» leucocilaria (L E ) es producida por Iir netllrtüJilos polmiorfonucteares. Usía tira reactiva impregnadj ton una solución buffer que contiene un esleí deí ácido indoxil carbuxil ico y una sal de diazomo, puede utilizarse para detectar la actividad de esterasa Leucocilaria en lu orina. Una veaiaja de prueba o que tos IcucudUiK reo necesitan estar viables para delectar la uaividad LE, Citando se reai i¿a wjfa. esta prueba se correlaciona con un rceuenlo de 10 o más leucocitos por campo de alto aumento (W BC /H PF) en la orina, con una sensibilidad del K&íf y una especificidad del 94^# }** Los hallazgos de prue­ bas de l.H falsas positivas pueden ser el resultado de los alíos niveles urinarios de ácido ascórbieo o albúmina {> 300 mg/dL) y de 3a presencia de preservantes y detergentes. Lu mayoría de ios resultados fidsos negativos se encuentran cuando el «¡Míen­ lo de leucocitos en orina está en, un rango marginal de 5 a KWeampo de alto aumento. En un estadio realr/Mo por Kierhegaaid v cois.1"'' se describió que el 3-5r4? de las muestras de orina pasaron de positivas (30 W BC /H PF) ít negativa? i 10 W BC/H PF o menos) cuando la orina fue demorada en ei trans­ porte por i 3 horas. Por lo tanto, 3a prueba de L E puede reliejar mejor la piuría que el recuento inieiu*cópicn de ntrutrófilo^ cuando es imposible controlar el intervalo entre la recolección y el procesamiento. Una opción útil para ofrecerle a los médicos es realizar un cultivo de orina sólo si la prueba de esteras» Icucocilaria es positiva tes decir, si hay un proceso inflamatorio). Sin duda, esta estrategia no es adecuada en las. pocas situaciones ca las cuales la bucieriuria asintomática tiene relevancia o si el paciente está neulropénico. Si el paciente presenta los síntomas de una infección urinaria aguda se debe ofrecer ta opción de ordenar un cultivo de ímrw m is allá de I li presencia de piuría documentada o no.

Infecciones tíeí aparato genital El aparato genital esti formado por óiganos externos e inter­ nos en ambos sexos. En los varones, tos genitales ¡memos son los tcsifcuioü, el epiJídirrtú, las vesículas seminales y la uretra fia próstata se analizará más adelante!. Ln las mujeres, los genitales miamos wn los ovarios. las trompas de Falnpio. el aiero i principal mente el endonictrio), el cuello uterino y la vagina con sus glándulas accesorias, Los genitales, externos son el pene en los ■varones y los labios en las mujeres. Las infecciones se pueden dividir de manera conceptual: infecciones de transmisión sexual, infecciones del periparto y vaginitis. En el cuadro 2-6 se resumen la flora comensal j líos patógeno* comunes del aparato geniial.

Infecciones da transmisión seiual4 uREm m sYCfHvicm s

E l agente ctlológico miís coimin de los infecciones de transin isirio se-jinal es Chtamvdm fraeitouufHs. que causa uretritis y cervicitis. En el hombre los síntomas que se relacionan princi­ palmente con ta uretiifis so» et dolor durante la micción y la secreción uretral. Puede existir infección as¡moni:U¡ca. pero es menos eomúfl que en las mujeres. En éstas., además de la areIritis aguda, una manifestación habitual de infección es la cer­ vicitis mucopumlenta distintiva. La complicación más seria de estas mlccciones es la enfermedad inflamatnria pelviana, que causa una cicatriz, inflamatoria de las trompas de Palopio qUc conduce a la esterilidad y a los embarazos eetópicns. En el caso especia] de C. imchvnmtis, Ea infección puede ser asintarnática, por lo tanto, para evitar estas serias eompl icaciones es necesaria su busqueda en las mujeres scsualmcnle activas/5 ÚLCERAS GENIALES

Viftfí del herpes simple. Varios agentes infecciosos* la mayoría de transmisión sexual, causan lesiones ulcerosas en los genita­ les estemos o internos-1'* Por mucho. el m is cornurs es el virus del herpes »¡iuple, La infección inicial suele ser aiintoniitÍea,F y en un pequeño percentaje de mujeres y hombres se produce la liberación nsiniomática de virus.l,í De hecho, la tasa de pro­ ducción de virus para una infección clínicamente evidente y para una asintomática es muy sim ilar.111 La enfermedad sinto­ mática suele acompañarse de lesiones vesiculares con una ba.se critcmatosa en el glande del pcnehla vulva, el perineo, las nal gas o el cuello del útero. Las vesículas son dolorosos, se pue­ den ulcerar j estar acompañadas de síntomas sistémicos, corno fiebre, malestar, anorexiu j adenopatías inguinales bilaterales blanda*. EL virus del herpes simple tiene dos serotipos i)uc causan infecciones que ditienen epidemiológica y clínicamente. El tipo I produce primoinfeeción en laclante*, niños y adolescentes. Las infecciones son principalmente en la mitad superior del cuerpo, pero un tercio de las infecciones genitales son causado* por este scrolipo. Dado que puede infectar el aparato genital por medio de autoimiculaciórt a partir de secreciones orales, la transmisión sexual no es necesaria. Por el contrario, la adquisi­ ción del virus tipo 2 se asocia con la actividad sexual y su pre­ sencia implica contacto sexual con una persona infectada. La prevulcncia relativa de los dos serotipos presenta variación g«> gráfica,** Lamentablemente,, en los Estados Unidos la infec­ ción con el tipo 2 está en aumento. ” ■La presencia o la ausen­ cia de síntomas luego de una infección con virus dd herpe* simple tipo 2 sé modifica por la presencia de anticuerpos pree­ xistentes contra el tipo 1 y puede estar influida por las carac­ terísticas de la cepa qtte infecta. El virus Je l herpes simple establece falencia en los ganglios espinales luego de la infección primaria. Sj la cepa que infecta es de tipo 2, la reactivación es más común y ta cnientiedad es más grave que si infecta la cepa de tipo I . En ambos casos la frecuencia de las recurrencias disminuye con el tiempo.|M 0tf3súlcetss genitales. Además del vinas del herpes simple tipo 2y oíros síndromes de úlcera genital son; sífilis, chanemide (causado por ¡íaemopkiists tiucrcyi).3’! Jinfogranuloma ven£n¡o ícausado por los serotipos L l, L2 y L3 de Chfamydía trochonniíixi,1*5 granuloma inguinal {causado por Culvmnwutixwrrrium gmnuionwttis) y iraunia.íi: A diferencia de tas úlceras, causadas por el \ inas del herpe s simple, los chancros siftiíticos son dolorosos y tienen bordes indurados con urts base limpia. Por ofro lado, a diferencia de los chancros sifilíticos, las tílce-

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Infecciones de! aparato genital 87

ras chancroides no tienen bordes indurados. La pústula prima­ ria del linfügranuloma venéreo puede asemejarse a la lesión del virus del herpes simpúe; sin embargo; esta última suele reconocerse ptw lu presencia de adcnupatfa inguinal necrosañte bilateral masiva. Lu lesión primaria del granuloma inguinal es utt nódulo subcutáneo que eíwitm a la. superficie, a pan ir del cual se desarrolla una lesión granulomato&a elevada, indolora y rojiza. Lamentablemente, a pesiar de que en lu mayoría de \m áreas de los Estados Unido» estos agentes que causan úlcera genital son relativamente poco comunes, cada vez son más habituales. Sobre todo la sífilis4" y el chancroíde5S,-,,M deben considerarse diagnósticos diferenciales en ciertas áreas geográficas y en cienos grupos de pacienten, En particular, el chancroide puede estar subinfomsado.246

cir la secreción característica con mal olor,2** E l aisIaríuentEi de G, mxinatis en ausencia de llora anaerobia mista y síntomas d e vaginnsts. b a c te ria n a c o n s titu y e p ro b a b le m e n te flo r a n o rm a l vaginal. Se describió que la vaginosis bacteriana™ (definida sobre la base de los criterios el [Picos) rio se encuentra en el 55% de la«i m ujeres de lüs CUale* se aisló C. vaginúfis. Se enfaliza, la importancia del reconocimiento clínico de la vmginosis bacteriana y de establecer un diagnostico de laboratorio."hEn un estudio que incluyó a 49 mujeres con parto prematuro, de un subgmpo de 12 que presentaban vaginosis bacteriana concuiTcntc, 8 (07% ) tuvieron un aumento de 2,1 veces del riesgo de nacimiento prematuro antes de las 3 7 semanas de gestación. L a vaginosis bacteriana también se asocia con bajo peso al nacer.

iniaractiattes entre las ülcetas gnilítes y I» Mmíén m el rlrm

JHFECCIQHE5 DE LOS GENITALES INTERNOS FEMENINOS Estas, infecciones son el resultado del ingreso de la llora vaginal en el aparato genital superior.*111J Por lo lanío* los agentes etiológicos son una me?cta de bacterias aerobias y ana­ erobias, Se ha documentado con claridad una asociación entre Aciitwmyees ism elii y endometritis en Im mujeres que utilizan dispositivos intrauterinos plásticos, 1Se estima que la etiología involucra la formación de un nido tle carbonato de calcio en d plástico, en et cual crecen las especies de A rií»(w > m . Ia s mujeres que utilizan dispositivos tle cobre rara ve/ se infectan, quizá porque d metal es moderadamente bucteriostálieo. La presencia de A , israciíi se asocia con infecciones más crónicas y persistentes. El papel de las especies de Mycúptústna y de Lis especies de Ltreaplasmaen las infecciones genitales es contro­ vertido. En el periodo posparto, la fiebre e incluso la sepsis (infec­ ciones del puerperio) son una consecuencia común de una infección.™ Las infecciones más devastadoras son causadas por Cltatntiium pfTfnnffnjr, casi siempre como consecuencia de un aborto ilegal con instrumentos no estériles y por Strvpjch cütxwi pyagetiss. ta principal causa de fiebre puerperal. Uno de los hilos de la epidemiología y del control de las infecciones (ue el estudio de lu fiebre puerperal realizado porScmmclweis, quien demostró que los médicos que no se lavaban las manos llevaban ta infección desde la sala tle autopsias, a las pacientes embarazadas.127 Los médicos le respondieron con ostracismo: aún hay, luego de un siglo, el personal médico no lia aprendido la simple lección de realizar el lavado adecuado de manos.

líe ia ¡¡tmucaúsliciencia Iw.’naaj fftíVjL Los pedentes cun úleeos genitales di? diferentes etiologías tienen mayor riesgo de con­ traer M1V. Por otra parte, es mis frecuente que Jos hombres, infectados con H IV liberen virus, del herpes simple Upo 2 que loa tiu infartados {aun si estos últimos, tienen conductas homo­ sexuales)30 y. cuando presentan lesiones ulcerosas herméticas,, también más probable que liberen itclhamenlc H I V por el apa­ rato genital,*11 Verrugas venéreas. El virus det papiloma humano (H PV ) produ­ ce exctecencúb exoltricas en el epitelio escamoso de la piel {verrugas comunes y verrugos plantares) y de lu superficie muco­ sa de los aparatos respiratorio y genital.14" Las verrugos anogenitales sintomáticas suelen estar causadas por los genotipos ft j 11, E l condi loma acuminado es una excrecencia similar a ima cnUflor que aparece en la superficie de laa, mucosas húmedas, por tu común en la vulva, la vagina y el ano, Las lc»rr'"^5 qucratóslais y las pústulas lisas aparecen sobre la piel seca teñiros que las “ verrugos, planas” asinloiruiticas se pueden encontrar en úreas blandas n secas. Las lesiones remiten casi siempre en forma espontánea sin tratamiento» pero lu infección latente o súbclíniea es común. Las manifestaciones más serias de la infección por H PV son la displnsia celular y la ncoplasla, producidas por cier­ tos genotipos, en particular las tipos 16 y 18.a Infecciones genitales iranam lltita por aíra vía diferente de la sexual VAGINITIS Y V A G IN O S IS

Un cieno número de agentes infecciosos causa vaginitis, peno los irritantes no infecciosos también pueden provocar inflamación, en especial si la mucosa vaginal se encuentra airó* fiea.1"* A menudo, la enfermedad compromete lu vulva iulíydvugiuitis) y las infecciones mistas son frecuentes. Las pnsen[aciones clásicas se desenlien más adelante. Lamentablemente, ios síntomas se superponen y no es posible establecer uo diag­ nóstico clínico definitivo.211 B necesario determinar el agente etiológico por análisis miembiológicos. Casi la mitad de \m iiifiu e iK jiK i vag.Lnu.1cs no tiene» uria eliüLegiu que se pueda

demostrar,241

Tricfiomnnas vagineih produce clásicamente una secreción amarilla verdosa o amarilla espumosa y ablandante que se acu­ mula en el fórrnx vaginal posterior, Lu secreción típica de la candidiasis es más grocsa y sim ilar al cuajo y la mucosa vagi­ nal tiende n ser eritema lusa. E l urente más común es Candida ñlbkans, pero en ocasiones otras especies de Candida y aun ntrcis géneros Infecían la vagina. Vaglmtis tittd riifíi tiunlntrella vaginalis* que en ur. principio se pensaba que estaba asociada con la vaginosis bacteriana, actúa en realidad de maneta sináxica con bacterias aerobias del género Bnctemkfe.%, ñ'ptococcm y MabUunctu para produ­

Complicaciones sislétnicas da las H k c íem h geniteta Las infecciones de muchos sistemas de órganos pueden lle ­ gar a la sangre, lo que da como resultado una infección dise­ minada y Mita enfermedad m cla&tásica distante. En las m ujeres los agentes infecciosos genitales, también se pueden diseminar U través de la C a lid a d pLiilüneal y las toxinas pueden producir efectos cxtragenitales luego de ser absorbidas por 1a mucosa, A friw n a gwmrrhmm, trepáneme* pallidum y muchos otros agentes que causan infecciones del aparato genital superior son patógenos que se diseminan por vía sanguínea. Cfdata\dw trachomatis y Neisseria Ronorrhoeüe producen una períhcpatitk conocida como .síndrome de Fiti-Hugh-Cunis,,iujLft Haetttophiltt.i dmrüyf*1 y ios serotipos de C. tr^uhomeiiis asociados coro el linfngranuloma. veninto1'* se diseminan a tos ganglios regionales» donde producen legiones edematosas, dokwsas y que supuran denominadas bubones ícomo en la peste bubónica). Además, los granulomas del linfogranuloma venéreo pueden hallarse en La mucosa rectal en individuos que

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88 CAPÍTULO 2 Introducción n la microbiolagiar Parte II practican coito ¡ina] pecepljvo,rtM" Rl gfurmloina jngujnal, lanlbién cm iM ido como dtonovanosis. hü ü iu a liníadcnopatía regional,,1* pero algunas vanantes de la infección pueden pro­ ducir eicalriccs y dar coma resultado un hinquen linfático, tinfedema c inclusa elefantiasis de lew, scnitólei exlemos.35 Kara se observa Jnfiovanosis cxtrn^eniidl en alguna otra ¡Hite

del ctierpt,*,—1Por úlliinoT como ya se mencionó, t\ virus del herpes simple migra u través de lw¡ nerviiys periféricos a los ganglio sacros, La reactivación del tifus puede dar couno resultado meningitis aséptica y también enfermedad genital recurrente, Las infecciones gemíales pueden, además, afectar at Telo y al recién nacido. Algunos agentes infecciosos, principalmente ios virus* atraviesan i a placenta e infectan al íélo en desarrollo.*1' Rstas infecciones congenhas incluyen el virus de i» rubéola, citomegalovims,. parvovinm. virus de la maricela íótfcr y H IV y también TüXí*phismd g&rnlií y Te^kwertiü pttifUaf». Omv, úfenles uJ neonata durante el paru» vaginal (o en el ulero si una infección ascendente causa conoamniouiiis), Estos agentes infecciosos» principalmente bacterias,, incluyen Ne^se­ na giwtirrfmeae (conjumivhíü), Chlamydiu trmhtmntrs (con­ juntivitis y neumonía neonatal) y oíros agenta asociados con sepsis neonatal, predominantemente virm Jel herpes simple,14,1 Sireplocotvus of¡alüctifíe, Esdieriehia t oli y Usieríu moaocy-

Diagnóstico de las infecciones genitales DIAGXÜSTIGG DE URETflmS, CERV’.CITIS Y VMSEMITIS ÜrtWfft fcsrvíeitii. JLa estrategia tradicional de diagnóstico de la urerrilis □unucócica es examinar un frotis tenido con la tin­ ción de Gram para la búsqueda de diplocncos gramnegativos in(raceluJí)R^¡ con forma de bizcocho. A pesar de que el sfn to­ ma característico de presentación en Jas mujeres puede ser una secreción uretral* las manifestaciones clínicas suelen sci más complicadas y pueden presentarse diferentes grades de ecrv icii¡>¿ cxiuhtivu, vAg¡nit¡^, palpingiti* y enfermedad inftamaloria pelviana» Para establecer el diagnóstico en una mujer no es suficiente el examen Je un frotis de exudado cervical o uretral tefiido con tinción, de Grum» ya que la morfología y las earaeterísticas de tinción de otras especies bacterianas imitan a los gonococos. Por lo tanm, la tinción de Gram se recomienda sólo para los hombres con secreción uretra].1" El diagnóstico definitivo requiere el aistamienlo del agente etiológico en cultivo o la demostración da antígenos o Je úti* dos nucleico* bacterianos. Se recomienda el cultivo (una mues­ tra con deíumtntíieprtn en custodia! cuando se considera aboso sexual o que puedan surgir pmbahles preguntas medieolegales debido a ta absoluta especificidad de este enfoque. Las cstralc' gias de diagnóstico molecular han superado a la detección de mitígenuts. É l diagnóstico molecular es mis sensible que el cul­ tivo de C\ íraehornos¡i y equivalente al de h\ gonorrhoeae^ V9Qtatfí& Hl método más rápido y económico para el diagnóstico de las infecciones vaginales es una preparación en fresco de las secreciones. Es posible detectar levaduras de especies de C&ndi4a, T*'it:hentton(is vagifiaiis móviles (sólo si la muestra se examina enseguida) y ¡as células claves de la vaginosis bacte­ riana a través del examen microscópico de una gota tle secre­ ción sin teftir. La vagjntwis bacteriana puede diagnosticarse de varias maneras» Es probable que los niveles elevados de activi­ dad de sialidasa en la secreción vaginal sean el resultado de la actividad enw m ítica de las especien de ¡iartemides y de Prevotethi,- La elevación del pH de la secreción vaginal |ior encima de -L5 Junto con alia cantidad de G. vaginalis (determi­ nada por medio de una sonda específica de D N A J^ a i son otros

mareadle* nliles p«ra confirmar el diagnóstico, C w k y Cois M encontraron que la persistencia de un pjf elevado, los niveles altos de poli aminas y de ácidos grasos en. la secreción vaginal y los recuentos bajos de células claves de la vaginosis eran ano­ malías residuales valiosas para predecir la recurrencia de vagi­ nosis bacteriana. Las Cíluías claves de la vaginosis son células del epitelio vaginal «cubiertas con bacierias que le producen un cambio en su índice de refracción; son el resultado de una íluru vaginal alterada ptvscntc en la vaginosis bacteriana. Fíe describieron porcemajes de falsos positivos tan alios corno 18 .^ debido a que otras hactcnas también pueden adherirse a las células epiieliale-s. Se describió un 10# tle falsos negativos por fa inhibición de 3a unión 'de las bacterias a la superficie celular por acción de Ja IgA, Sin embargo» cuando la piueba de células claves de la vaginosis se combina con la prueba de pro­ ducción de aminas [w hijf test), se logra un valor predictivo negaiivo del 99% r adecuado para descartar vagirosla bacteria­ na en pruebas de cribiido. La producción de aminas se detecta mezclando volúmenes iguales de secreción genital y KO H a! lü íf; la pcrecpción de “ olor a pescadoKt indica un resultado positivo,1' 1E l examen microscópico «Je las células claves de 1a vaginosis se puede ra li/ a r ctm un moniujt húnicdo o con un fiotis teíiido, utili/ando las tinciones de Fapanieolaou tPap) n de Gram. También es dti! pat a el diagnóstico Ea observación en el cambio de la Oorm de bacilos, grampositivos característicos í especies de iMcUfbaeiltw) a flora mixta,154Como ya se anali­ zó, el culi ivo no es úiif pam el diagnóstico de vagrnosis, Por extensión, tampoco lu son los métodos erj/imitieos o molecu­ lares para demostrar ciertas baelertas seleccionadas conw Ú. vBginaíix* Si no es posible examinar una muestra rápidamente» existe un méiodo conveniente y sensible para el diagnóstico de las infecciones por T. w^tnií!i\. El SnPoucli T V Test1 (Binined Diagnosiicv Wlnte City, D R) consiste en un medio nutritivo en una bolsa plástica Después de colocar la secreción vaginal, la bolsa se sella. Luego, puede examinarse en forma inmediata como una muestra húmeda o incubada para la observación periódica posterior de los trofoicoíLos móviles, A ptsar de que es menos sensible que el cultivu o que una preparadón húme­ da (en la cual la movilidad de los parásitos facilita su delecc i % los tricomi^nidos pueden vjsusbwrse con tinción de Gram o de Pap, E l cultivo de los- patógenos bacterianos tiene un papel limi­ tado en. el diagnóstico de vaginitis. En las pacientes con. infec­ ciones perosientes o iccunoitcü, se puede utihrar el cultivo de hongos pa*a poner en evidencia un pequeflo nUrneno de levadu­ ras que no se observaron en el examen directo del frotis»

DIAGNÓSTICO DE ÚLCERAS GEMIALES Y Vi RRU GAS VENÉREAS

Et diagnóstico de úlceras genitales puede realizarse por microscopía directa, microscopía de imimnofluowsccncia. métodos Eiolccularcs o cultivo, según el micrcwrganismo y la situitción clínica. Se puede tomar una muestra de las úlceras herpétieas para cultivo viral o para demostrar la cilopaEOlogia característica. El virus del herpes simple produce células gigantes mulliíiuclcadas eon inclusiones intracelulares, que pueden visual i/.arae luego de ana tinción de Wrighl (o tinción de Wright*Giemsa), tinción hematoxilina-cosina o tinción de Par íproeba de T/anclj, Como ahcrnaliv». se pueden utilizar reaciívos de inmnnofluoíreseencía o inmunoperoxidasa para Icñüi antkfcnos virales en las céllui.ih epiteliales o para demos­ trar la presencia del antígenn en un eníimoinmunoanálisis»31.

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Infecdones óseas y dé las erücu Liciones

Lo* cuerpos de Donovan del granuloma inguinal pueden m u sitarse (con dificultad] medíanle la tinción de Has buciertas intrncelularcs en lah células monjonucleares, utilizando la tint-iátt de W rijjht (ü una tijoivaJeflle}, hematoxilina-cosina (utilizada principalmente para lew estudios histológicos de las tónpsias.) o la tinción de P a p , L a Técnica disnea para el diagnóstico del cEnncroide utiliza agar sanare de conejo que no * encuentra disponible en ln muyarfu de los labuTitiDfli» de diagnóstico m icrobiológico.1^ Por fortuna,, Htíc/nophitui (íitcrvyi puede cultivarse sobre una variante del agyr chocolate enriquecido que se útil¡2 4 para jVm .trn« gotwrrfttíeur.wtm Si no se cuenta cois el medio modificado, se pede d ilu ir con agar chocolate enriquecido. Huenttrphilu.i ducrtyi e i lábil y no sobrevive bien duramc el Itansporte. Sin embargo, si se utiliza un medio de transpone estándar como el medi o de Amics y se refrigera la muestra, se puede aislar la hocleria con aceptable exactitud.** E l Linfogranuloma venéreo suele diagnosticarse por serologfa, peto se puede cultivar CMatnydia trtichümnm a parlir de matersal obtenido de nn ganglio linfático regional que supunJU31* E l diagnóslseo de sífilis primaria se reali/a casi siempre por medio dd micno&eopio de campo oscum iwlwf la muestra obte­ nida por raspado de la base de Éa ditera.” 1E l raspado debe exa­ minarse de inmediato porque la visualización depende de la v ia b ilid a d de lu* Lreponcm&s móviles. También se cuenta eon reactivos para iTununnflunrcsccnuia para Tnrptuwma paltidum producidor por los Cettters for Disease Control and Prevention (C D C ), per» no está asegurada su disponibilidad continua. Con estos inactivos de inmunofluoresoenelaes posible teñir un frolis seto luego de ü|i transporte al laboratorio,111 También se puede realizar el diagnóstico scrológico» pero aun el procedi­ miento de la fluorescencia pant treponema previa absorción del anticuerpo (FTA -A BS} puede ser negativo en las primeras eta­ pas de la infección. Si se considera una sífilis y las pruebas ini­ ciales ion negativo*, se debe itulLm r el seguimiento del pacien­ te eon pruebas scrológico estándares. E l diagnóstico de las. verrugas venéreas debe efectuarse eon técnicas moleculares ya que el vinis del papiloma humano no crece en tuitivo celular y las respuestas seroJónicas no son con­ fiable^. Si se sospecha una veringa, venérea se debe avisar al laboratorio para que realice la determinación de los genotipos de “bajo riesgo” (para neopla&ia cervical}, sobre ind» le» tipos 6 y I t.J,B Les genotipos, de riesgo moderado a alto se investi­ gan,. más a menudo, como forma de evaluar las etapas precur­ soras del cáncer cervical. RECOLECCIÓN EHE MUESTRAS GENITALES

ReatSectfóñ de muestras uretrales maseülfnss. Cuando la secre­ ción uretral es escusa y no se observan di piñoneos intracelulares en una muestra ai azar, puede ser útil la recolección de una muestra a la maltona temprano antes de orinar. EE exudado puede obtenerse del urilicio uielml mediante la estimulación por medio del masaje suave de la uretra; si el materia! no se obtiene Utilm ente. se puede introducir la punta de un pequeño hisopo de. algodón, taVÚn o PaCIOtl® 001 supone de plástico 0 de aluminio 3 a 4 cm en la uretra anterior. Et hisopo debe de ¡ai se en el lagar durante algunos segundos para que las fibras se embeban ea el exudado. Si se está obteniendo una muestra fiara el cultivo de Chfarfydia el hisopo debe rularte 36ÍÍ' para obtener algunas células epiteliales. Los fabricantes proporcionan equipos de recolección diseña­ dos para cada ensayo comercial. Si se idiliían métodos de amplificación de ácidos nucleicos, la orina es la muestra ade­ cuada más simple de obtener y más aceptable para el páctente

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que e! hisopado uretral. Se recolecta la primera, pane de la orina, que contiene las células epiteliales y las bacterias qae han sido arrastradas, a diferencia de la recolección de la mues­ tra de orina del choro medio que se «quiere para el diagnósti­ co de cistitis, Los fabricantes de los equipos vanan en cuanto a las; especificaciones que recomiendan para el cultivo. Recolección tía muestras (¡efíitiíes femeninas. En las mujeres con signos y sfsilumas de infección genital aguda es común obtener muestras del cuello uterino y de la uretra. Las muestras c e n í’ cales se recolectan con la ayuda de un espéculo luego de e li­ minar el moco cervical con un hisopo grande. Para obtener la muestra, se recomienda la utilización de un Iiísojki m is peque­ ño con un c a l» de plástico y una punta de Dacron* o pul ¡ás­ ter.IBI La punta del hisope* se inserta unos milímetros pasando el orificio cervical, se rota cosí finucra para obicnsr el exuda­ do y 9*i» células, cervicales y se retire c<wi cuidad» de no mear las paredes laterales del conducto 1 agitial Las muestras uretra­ les se pueden obtener mediante la estimulación por medio de un masaje suave de la uncirá seguida de la recolección de la secreción o, si no se observa secreción, insertando un pequeño hisopo urogenital en la uretra y dejándolo en el lugar dorante unos segundos para saturar las fibras con el exudado, Al igual que en el caso de lo* hombres, la muestra de orina es satisfactoria pata el diagnóstico de infección en las mujeres. A pesar de que es algo menos sensible que las muestras cervi­ cales, es menos invasiva y puede obviarse la necesidad de un examen con espéculo. Las recomendaciones específicas varían según el fabricante. Las secreciones vaginales pueden aspirarse o recolectarse cuu un lásupo. Es difícil obtener muestras dd tracto supetrior desde abajo sin contaminar la muestra con flora vaginal. Las muestra* de endnmctnn se obtienen mejor por medio de la ¡aserción de un hisopo a través de un catéter perforado angos­ to que se introduce en el canal cerv ¡cal. tomo se muestra en la figura 2-4. Mediante esta (¿caica, hay menor posibilidad de contaminación de la muestra con secreciones de! orificio cerv i* cal o deJ conducto vaginal.1*1 Para la obtención de muestras de las trompas de Falnpio o de los ovarios, es necesaria una laparoscopiao un abordaje quirúrgico. Hesóiecclón de maestras Je úlceras ¡rerutefes. Las úlceras, deben limpiarse para eliminar ios desechos de Ja superficie y las bac­ terias contaminantes. Para el examen de campo oscuro o la pre­ paración de frotis, se debe utilizar una hoja de bisturí pira ras­ par ¡a base de Ea ulcera y transferir el material a un portaobje­ tos. Para el cultivo he puede utili/at el lavad» de la base de la úlcera o un hisopo de algodón."1" Si se encuentran vesículas intactas, se- puede utilizar un hisopo para recolectar el liquido para las preparaciones de T u m * o para el cultivo del virus del herpes. Los hisopos para el cultivo bacteriano pueden colocar­ se en los medios de transporte de Amies o de Siuart.

infecciones óseas yds fas artlcutectones Presentación clínica

Las infecciones de los huesos y de las articulad unes pueden presentarse como consecuencia de la diseminación de un pató­ geno microbiano a través del torrente Sanguíneo, por diseminación directa a pan ir de una infección adyacente o por introduc­ ción desde el ambiente por un trauma. E l microorganismo patógeno m is común en la diseminación baetersémica es Staphylococau tmíviis, pero otros gérmenes pueden también alcanzar el esqueleto por esta nnaf como Horre!ia burgdorfirri [enfermedad de Lymel y Ins agentes de micosis sistémica.

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90 CAPÍTULO 2 Introducción a (a microbio logia* Par» Él

(SPS), el aniicoagulantc que vuele agregarse a los fraseos de hernucultivo. luegu del transporte al laboratorio, eJ líquido sin coagular hú puede procesarde Lj manera habitual- Si en el labo­ ratorio se recibe un líquido articular coagulado. no se puede realizar el recuento de células, pero se puede homogenei/ar el fí4|:ulsT puní realizar la tinción de Gram y el culi ivo. Es eseneial incluir agar chocolate (ruando se cultiva liquido anicular ya que los patógenos predonúnanics son las baterías con requeri­ mientos nutricionales especiales \fastidious). E l hemocultivo puede ser útil para el aislamiento de patógeno* en las infeccio­ nes que se piensa que se originaron por una hactcrwírtúa.57 Rn ocasiones, el aislamiento de Sttiphyhi'ttccm aartrus de sangre en ausencia de un origen claro es el primer indicio de raleo* mieliñs vertebral.

Las inrcCcátulcs más cumuncs del sistema nervioso Central

Flgum S-4 Trénicj ík

ío IN^s

ciKkwutrifK A traéis ds vn espéculo, «

m s í n a u n c a c in s c t a La a l n ¡ n u r c i L t í r v k a l y v ¡ n i í r i i J i ^ f t u

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i » ■.l-.'-iUn i.l-: Ln s.,it¡.|.i.| f E s k ia jiiJs 4 evLbr I,- L>.»num]rtaLiún dd íiim ^w p;sr titilad a con la piirevl v j ¡¡ítuaI o k aheriuiu cervical.

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(SN C) son encefalitis (cerebro), mielitis [medula espinal), enee* i'alomielitis y meningitis (.membranas que recubren el ccnírhrt* y la médula espinal i. A menudo, la meningitis y la encefalitis (Míenin£rteM£fal jl is) sOfl p-ítlC del WÍsHH» proceso infeccioso. Con menor frecuencia, las iiifecciones de los tejidos blandos ( p. ej,, abwesocpidural) y de los huesos {osleomielitisl adyacentes pueden afeclar el sisteirui nervioso central. Las infecciones del sistema nervioso periférico, entre las cuales se encuentran la neurohofncliosis (una cariante de la enferniedad de Lyme), la lepra y la luhereulosis, son poco frecuentes.

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infecciones que se nriginan en el (ejido adyacvnlc w cusí siempre pol imicrobianas e incluyen baeierius anaerobias. 3li^ lesiones ttaumiticas reflejan la flora del ambiente que se i mi De­ dujo en el mojnenlo de la lesión. Los. síntomas de la artritis, aplica son fiebre, dolor y edema de la:s) artiaila¡:ión(esj afectada La osteomielitis puede a*oví:irs¿ pon dolor lutittl y lu sensibilidad a la prc*irtn y OGn res­ tricción de los (iio^imicnto&J17 Se pueden preservar en ambos ¡ s i t i o s síntomas .sÍNlcmicns, Si el hueso afectado pertenece .i un miembro, et problema es evidente, En lu osteomielitis vertebral aguda se prevenía a menudo sensibilidad a la presión puntual sobre lu vértebra afectada. Sin embargo, si lu infección es subaguda puede haber dolor de espalda no localizado o ningún sín­ toma local, sobre todo en los ancianos.*' La osteomielitis puede hacerse crónica, micninü que es mcncwc probable que h urtriiis vépsiea llegue a la cronicidad. Diagnóslicn da las infecciones óseas y de Ijs animila-ckones El diagnóstico de nstcomieUlis debe huccnsc por m edio de lu biopsia quirúrgica dlel bueso afectado, 5íe puede aspirare! liqui­ do de una articulación séptica para com en miero«eiipie« t> pao cultivo. Fjl líquido articula* coagula eon facilidad: por lo tanto. se necesitan esti^egias especiales, El líquido puede ino­ cularse di redámente en francos dn hem-neuhivo,JUA; o dentro del sis-tcmai [scdítcof . ' un métudo para el iuhlitrtjáento de ua único patógeno. En forma alternativa, puede inocularse dentro de un tubo estéril que -contenga sultanato módico de polisneto!

M enlnolllx

L o s pacientes con meningitis aguda pueden experimentar en un comienzo, un síndrome similar a la gripe con dolor y rigi­ dez deí cuello, dolor de cabeza, fiebre baja y letargía. La alte­ ración inesperada del estado memal en pacientes ancianos, débiles o inmunosuprimidos puede wrr el íímco indicio tle la infección. Se pueden observar diversos «radíts de ooníusldn, agitación, destírieniación o coina. Los. signos de irritación meníngea son el signo de Brudzinski positivo trehistencia o la iltu é n pxviva del cuello) y el signo de Keniíg pítóiltvo (incapaeidad de extender las piernas cuando el muslo se encuentran en un ángulo de W eon ríspccl» al iixwxii. La rrtefldngilis snbjguda o clónica causada por luberculosis o infecciones fiLigieas puede piescnlarsc eon si^nus de presión Liliraeraneuna aumensada (edema papilar, náuseas y vómitos) y cambios menlales, como desori enlacian, eon fusión t cambios en lá persemalidail y esupw,'*4 El líquidu eefaloriLiqüídeo normal es cristalino corno el agua, presenta menos de cinco linloeilos pcir m ilílilro, con una con­ centración de gllup>íia Je entre 15 y ItXi mg/dL setúnel valor de glucemia, una concentración dé proieinas entre de 14 y 45 mgAlL y es e^teril. Las alteraciones eláíieas atribuihks a la ineningiiis ve resumen en el cuadro 2-7. Las infecciones bacte­ rianas, que suelen acompañarse por un recuento alto de neutró-íilos potimorfonucleures, u menudo se denominan meningitis sépticas o purulentas, mientras que las infecciones sin una respoesía pronunciada de neuiiófilos tsmeobaeterianas, virales y la mayoría de Jas infeeeiones fdngLeasl se -denominan meningi­ tis asépticas.^' Si bien el término común “ meningilis espinal" no es inespeto. n*> es informativo porque es poco usual que se infecte un cínico segmento de las meninges; se lo utilizu a menudo para la meningitis fneningocócica. pero obviamente cualquier agente puede afeelai las meninges raquídeas.

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Iinfecciones del sistema na rvioso canlral 91

Cuadro 2-7 AfaludotieS dfel líquido •Ltl ulihl-!'j 11 LIidi n rtl l,i UUnin^ití1» PA RÁ M ETRO

BA C T ER IA S

M IC O BA C TERIA &

HONGOS

V IR U S

NtttírffiLp* pílimarfofiBcfcares

Aurn*nfAíkv¡ o muj1iumemBdos

Auirseatafimi

Aumtnladc»

Al principia síisraKs a tLí-, .iílvsii hí;i-. ujtfctual Sücütptc ¿Hvcrcies

Mmocito*

VaxisWe

Varíjblf

Vniiaftle

UíualrTwwf pne'.ení^

C\lu£*ill

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D^ju

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Alta

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Hl^ d ii

Los agentes» infecciosos pueden acceder al SNC a ira»és del larrente sanguíneo o por dkm irtadíSB directa de estructuras adyacentes, E l virus del herpes y el virus de la. rabia llegan al SNC por diseminación retrógrada ascendente por los nervios periféricos desde (os ganglios espinales, ruta poco usual para otros agentes. La meningitis tiene mayor prcvaleneia en ciertos grupos de edades o en pacientes, eon distintas enfermedades subyacentes. En el rcesen nacido suele ser el resultado de una infección adquirida intráútert » dunutlC el parto Vaginal.1"™ I.0S TtlifTOonanismos ais-lados m is a menudo son Snvptwr&rcuf agalac­ tias y Exchtrkhiu cvl¡: con menor frecuencia se aíslan U stciia momcytogtnes, varios miembros de Entenjbüaeriüctme* espe­ cies de Pxeudomanox, Fíambacterimti mfningoxepticum,. Si(tphylococcuí auttus y otra*, bacterios anaerobias;, por razones, que se desconocen, Citrvbaeter koseri i diversas) puede causaruna meningoeneefalirhdevastadora en el recién nacido.™ E l virtiA del herpes simple lip o l produce sepsis y meiunjems en recién nacidos luego de, m adquisición durante el parto vacinal.36 NeilSería rneningiritiix cansa in feccion es en lodos Jos grupos etarios. Haemnphilm ¡nflucnztie tipo B e s la causa más común de tnemrtgiús bacteriana aguda en los mílue de cnlre 6 meses y 5 aAm. pen> esta infección ha sido casi erradicada, por una vacuna eficaz. La meningitis por Sirepiocot-ctís pMutm*ntM se produce a partir tic la bacteriemia o de la diseminación de la infección desde los senos adyacente* o del oído medio. Su pfítmumiüit es la causa más frecuente de meningitis bac­ teriana en los adultos, N, memngiñdh es también común en los adultas jóvenes, En los ancianos, la meningitis sigue "las ciLsdes de! hombre de Shakespeare'', las patógenas del periodo neonatal hacen su reaparición. Además, se presenta uno alta prevalerse ia de E. coli y de otros bacilos gramnegativos|IW y i', agalactia? es tumbiín un factor importante.^ La causa principal de las meningitis vírales en todas las edaJes son los enterovim s.^ Un gran número de viras transmiti­ dos por medio Je garrapinos y mosquitos (virus transmitidos por artrópodos o arbovirus) son causas infrecuentes de enfer­ medades de] SN C, aunque ia reciente aparición del virus del Ni lo Occidental en los Estadas Unidas bu despertado gran ínteres,“ • CrypfftcmrHZ neoformans* Usteria y Mycobactériun* labeirulm h causan formas indoloras o crónicas de meningitis en individuos, sanos y en aquellos enn las defensas altóradjis. La meningitis aséptica recurrente {meningitis de MoilaTeti es causada típicameme por el \ims dd torpes simple.-' pero el diagnóstico debe realizarse medíanle técnica* moIcctülüR», £. eu/r* K. pimmumiüe y lo» estafilococos se ais-

EX C IT C IO M ES PiKdcn estar íiü íín teí « i CrjpirtCtH'.iiii Hfflfofm jü

PUcjJ í . « r baja en inftccHMKri. pisr vires (k l terpes viropÍT

tan muy comúnmente de pacientes con meningitis poslraumá[icH a psKíniirdrjtlca, Alrededor del 51M de las meningitis agu­ das asociadas con derivaciones vent Aculares i shunt) son causa­ das por estafilococos coagulasa- negativos.1^ N fícgtefiaJodien, una ameba de vida libre, causa mcnincoencefalitis necrosime sobre todo en la» personas que nadan en aguas cálidas y saladas,1** Encefalitis y abscesos «retíralas Las infecciones más. serias del SNC son los absceso* cere­ brales y la encefatitte.ITta4-W]La causa más común Lie encefali­ tis son los virus, aunque también la producen otros patógenos, como Mycnplamta pneanwfiiae, Se desconoce el «gente eco­ lógico de la mayoría de los síndromes encefalíticos,*1lil virus del herpes simple tipo 1 es la causa documentada mis frecuen­ te de las encefalitis esporádicas. El virus se reactiva y viaja de manera ascendente por el nerv io olfatorio hasta el lóbulo tem­ poral del cerebro, donde produce una encefalitis neetusante, distintiva por su ubicación anatómica. Es poco probable realizar eS diagnóstico en ausencia de evidencia de enfermedad del lóbulo temporal o de pleocilosis (respuesta Inflamatoria] en el LC R. aunque se han documentaJo excepciones, sobre lodo en los ninos.u' El virus de la varicela zóster « ra ve/ causa ana encefalitis localizada, casi siempre ocurre en un paciente con zóster oftál­ mico luna reactivación de ia infección, a menudo varios. iflOs después Lie la varicela), El virus viaja en forma ascendente por ei quinto par craneal y causa una infección necrosante, ronchas veces con vasculitis y presumiblemente con pequeños infartos vasculares,1^ Incluso, la presentación clínica puede ser similar a la de un accidente cenehmva&cular no infeccioso. Otros lipns de encefalitis esporádicas o epidiímicas afectan el cerebro en forma difusa* la información clínica y radiográfica no es diag­ nóstica de una etiología en particular, por lo cual reelí-rar se mediante técnicos minobiológicns o moleculares. La rabia, por tur! una muy puco común, suele ser mortal; si se asocia con la mordedura de uri animal, el diagnostico es obvio, pero dado que no siempre el contacto con un anima] es evidente es posi­ ble que el diagnóstico no pueda realizarse hasta el momento de la autopsia Muchas veces se aíslan bacterias anaerobias de los abscesos. Las especies que se encuentran más a menudo son: estreptoco­ cos jitiuwobioss PorphyrQtnumi'. Hwiaitinügenicti. especies de Bticltfuidesy Fusohaclcrium nucleaiam, especies de Eubat:t^ríum y PropianilMcteríuin «mes. l.as bacterias aerobias que se aíslan eon mayor frecuencia incluyen estreptococos W f-hernoliliCLW. Swphylococaa (« r a í, Sfreptocm na pitmmtimhw y

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CAPITULO 2 InfrodueGÉQn a la microbiología: Parle li

bacilos gramiwgativos, &uenrínnteriaceíie y microorganismos nn fermenuitivos. También pueden general abscesos ccrcbrEdes las especies de Nocaním y eE hongo dcmatiácco Clatiosporium bantuinum fXytnhypha kantiana] (antes Ctadiaporium tnchmí/é'.o130 Una encefalitis necruarte puede surgir como lesuhado de In extensión de hongos cigomicetos desdi; uní seno hacia el inlw iw del «jo o el cerebro, sobre twlc en pacientes con rwwplasia o inmunosupresión o en paciente* diabólicos que pre­ sentan cetOucidusis.1" Los abscesos cerebrales pueden ser el resultado de la diseimnación bacteriana, en particular en paciente* cun endocardi­ tis bacteriana (por lo general un único microorganismo). |l,‘t o cu forma directa desde nn seno adyacente o del nido medio (41 menudn poli microbiana i infectados.1” Stttpioeotttit viritlatix efl su m&yíirfa S£ aíslan cOtOO parte de una infección pfilimicrobiana. pero un estreptococo en particular» conocido como "S/rf/tfiJcocciu m itk rr o como gnapo de Streptococcus trnginú.ua/cünstcllüíítsy causa abscesos como un patógeno único en varios órganos» incluido el cerebro/ Numerosas infecciones parasitarias pueden cauiflí infliccio­

nes necrosante o una lesión masiva cerebral. Eslns parásitos son las especies ActtHihtmtHüba y otras amebas de vida libre, m Titmkj soíium y otros cisticertüs.111 y Taxapíastm gom fii." E l 1'paludismo cerebral causado por Pfo,muHÍwm fokipum m . e.s una complicación a menudo mortal en la cual se bloquean Im capilares ceretiraleiJ11® Oi&prástitt da las Inficiones t$\ lístUMa íierriesfl' central obtención demuestras Las muestras, de SN C para cultivo incluyen el LC R tobicnido por punción subduml, aspiración ventrieubi o punción lam­ ba* i. tos abscesos cerebrales (obtenidos por aspiración) y eS tejido cerebral {oMenido por biopsia quirúrgica), En la figura 2-5 se ilustra la técnica de punción lumbar. La muestra más común de SNC «pe se recibe en el laboratori# es el LCR obtenido por punción lumbar Por lo general» se emían ires tubos separados que cofliicncrt LCR; Tubo 1 para el recuento de diluías y las tinciones diferenciales , Tubo 2 para la tinción de Gram y el cultivo. Tubo 3 para la determinación de proteínas y glucosa o para estudios especiales, como V D R L i,\btereai Distase Research Liboratory\ tina prueba ucral^ica para sífilis)» atllígeno de criptíKoetiü o citología, según la slEiiación clínica,

EVALUACIÓN OE LA RESPUESTA iÑFUSMATOfilA Y DE LAS TÉCNICAS DE MICROSCOPIA Se debe irnptementar una estrategia ordenada para el proce­ samiento y el cultivo de las muestras de LCR- El «am en de los frotis de sedimento de LC R tenidos y la realización de fas puja­ bas de detección directa de antfgenos pueden ser útiles para establecer un diagnóstico presuntivo y proporcionar una guía para la selección tk los medkif de cultivo» A, menudo se pue­ den delectar los microorganismos en los frotis de LC R teñidos ton tinción de Gram o cuñ azul de metíleno ú se encuentran en concentraciones de ai menos H^-IUVmL. Lu tinción con azul de metileno parece ser m is sensible que la tinción de Gram» pero la observación de la reacción de Gram o importante. Pitr lo lanío, se recomienda la preparación en paralelo de les frotis teñidos con tinción de Gram y con azul de meiilcrio. Muchas veces, |os microorganismos gramnegativos se oibsm n mejor en los frotiR teñidos con azul de metileno porque la tuición azul intensa de las bacterias facilita su diferenciación respecto de

[os desechos del fondo.'” La siifranina tifie el fondo de tojo en la tinción de Gram, lo cual tiende u oscurecer cualquier bacte­ ria que se tiñe de rosa. E l agregado de 0,05% de fucsina al con iracolorante safranina mejora la tinción de los microorganis­ mos gramnegativos. Smalley y Bradley * sugirieron que la prueba de esterasa leucocitari» (E L ) puede sustituir el recuen­ to celular en bs Líquidos corporales en los cuates se sospecha la presencia de bacterias, En un estudio que incluyó 63 líqui­ dos, pcriloncaJcs, positivos por cultivo, el 87,3% de ellos mostró una reacción E L positiva. En seis de las nueve muestra» de líquidos pirriloneales positivas por cultivo j negativas para la prueba E L . se aislaron sólo unas pocas colonias de estafiloco­ cos coagulasa-negativos. que resultaron aislamientos de signi­ ficado clínico dudoso. D cLoder y Auerbaehw informaron una sensibilidad global dc| Sd»4% y púa especificidad del 9R, 1% al utilizar la prueba de E L en tira de inmersión (tira reactiva.) en muestras de LC R recolectadas de 81X1 pacientes con sospecha tle meningitis. La sensibilidad de la prueba de E L en los ca­ sos de meningitis bacteriana con cultivo positivo fue sólo del 73%. Estos autores concluyeron que la prueba de E L es un ensayo adicional, pero que no sustituye al recuento de células ni a Ea determinación de parámetros químico^ en el LC R en la evaluación inicial de. la meningitis bacteriana.

DETECCIÓN DIRECTA DE WróEHOS i GE ACIDOS NUCLEICOS El entusiasmo inicial del diagnóstico rápido de la meningitis bacteriana mediante la detección de antígenos bu sido atempe­ rado por la experiencia más reciente.32* Cuando se realizaron las pruebas de aglutinación de partículas, tic lites, para W, iV jflttenyie tipo b, Streptococcus agalacttae, Neisseria memngitttlix y S. jWfitrttflTtiae en 1 340 muestras de LC R obtenidas de pacientes con sospecha de meningitis aguda bacteriana, se detectó antígeno en &ólo 27 muestras.721 Los resultados positi­ vos de detección antigénica son sólo de ayuda en el sratamíenlo de los reden nacidos cotí infecciones por estreptococos del grupo I I Estos autores, consideraron que ta prueba de taies, nu presentaba una relación costo-eficacia favorable. Además, los ocasionales falsos positivos de la aglutinación dan como resul­ tado un inaceptable escaso Valor prediciivü de un resultado positivo. La utilización de estas pruebas disminuyó de manera notable y su uso no se recomienda. Por el contrario, la detección directa de antígeno de cripiocoüos en el LC R es casi tan sensible como el cultivo y ha reemplazado en la mayoría de los laboratorios a La prueba de liria china que carece de sensibilidad. Se han creado pruebas de aglutinación de partículas de late* y equipos de eníimommunoBoállsis. En un estudio que analizó 2l& muestras de LC R , entre las cuates se incluyeron 16 casos retrospectivos y 6 prospectivos de eriptococosis conocida, se utilizaron dos equipos de aglutinación de panículas de látex con un HKWfc de sensibilidad en comparación con el cultivo?3 En-ocasiones se observaron pruebas falsas positivas, corno consecuencia* al menos en parte, de la presencia de factores similares al faclor reumaioideo en las muestras de LC R. El tratamiento de la muestra con pronasa disminuyó las reacciones incspeeítícas, pero no las eliminó por completo,2" E l tratamienio con pmnasa aumenta la sensibilidad de las piuebas de aglutinación de partículas de látex en muestras de suero pero no en muestras, de LC R ,lírT Se han creado E^cnicas moleculares para ©I diagnóstico de ciertas infecciones, sobre iodo las causadas por virus del her­ pes simple y ínterovirus.MVW A estas pruebas se las está empe/iimh* a considerar el procedimiento de referencia debido a mi

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infecciones del sistema r&ervloso central 93

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Figura 2 -5 TíttiKa ¿ t jtwficiúd IuítiMí. Se iecuoíl» í l pncicnEr K 'hrc '.ii ctixbiili?, « k i las iim I iI I » ílciiiH ia

á n in íííta £3 itíííi de lo ííil ;iiiiií. lumbar. ■B i Se el apufiio enue Ib vfnebub lu rcibaie* L3 y L4

IT.H *] (Ifíln fnJkí usanza guant!?* fxtíriki y (C) « d ilip e la apuja p q ilíH l CH*t C*Ih1*J0 enln; d proc^su e x p in m u , ü tr a v é s «té k r t I í^ íu o é q U h i i i 'r j c » r i n ¡ ú ; s

C


ma]fw sensibilidad y rapidez dü detección, aunque aún no son habituales en los laboratorio de diagnostico.. DIAGNÓSTICO SEHQLÓGICG La scincjlt»j5.Lü e.H una herram icnlíi disgaúsiica de U lliíd itJ p¡m i d viru t del NÜO O ccidcíitaJ. Lu detección Je lg.M cu el L C R es

el método de elección en los Laboratorios donde la prueba se realiza bajo cstnctn control.3*151* La serologia tiene un papel secundario pura otros ajenies ctiológicos de encefalitis viral, CDtttO oíros virus líartstnjtjdns p[>r anrLÍp[>ili>ü, que stsn difíciles de cultivar. Lamentablemente, carece de utilidad en las infec­ ciones más comunes, Cdfflu tas c¿LLiK;ttlas pnr virus del herpes simple, enteroviras, hongos y bacterias,

DIAGNOSTICA PCR CULTIVO £1 cultivo es el procedimiento de referencia para hongos y bacterias. Sin embargo, el cultivo de virus a pan ir de LC R en

los cosos de encefalitis se encuentra limitado por la disponibi­ lidad restringida. el lento crecimiento de Los enterovirus y la Í7icLp:u»l:ut de aislam iento del virus del herpes simple. Para lo* agentes virales se prefieren los métodos moleculares. La pregunta más importante en el caso de ta meningitis es si se encuentra presente un ¡igente bacteriano que podría ser iniiadn cutí antibióticos; es consecuencia, el cultivo bacteriano es esencial Cuando se preparan las muestras de LCR para cultivo* deben centrifugarse para concentrar las bacterias que puedan estar présenles.También se recomienda (¿centrifugaciónparad ais­ lamiento de M yeobaeítrium ¡ubtrtrulosis en les casos en los que se ap ech a meningitis lubcrculosa. Se debe procesar un volumen iota! de al menos ñ m ir (que no necesariamente debe recolectare mdt» de una sola ver.) para aumentar la probabili­ dad de aislar micobactcrias,^ Corno uaa altemaliva a la cen­ trifugación para el aislamicnlo de cripioeocos. el LC R puede pasarse a través de un filtra de 0,45 jaita (Millipone* BedfonJ MA) con el objeto
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94 CAPÍTULO 2 Introducción 9 la raicrattologta: Parte 11

deben. colocarse boca abajo sobre la superficie del agar y moverse a una nueva ubicación cada ires o cuatro días para per­ mitir la detección del crceimicnio de colonias. ü ia y y FcdorLo publicaron, una cnxlem c revisión w bK las estrategias para el diagnóstico de labonlohode la meningitis.Lfli

H e rid a abscesos y eelufilfe Presentación clínica

Uno de itis indicadores fimdauteiilales d i I» sepsis local es \a acumulación i!c pus dentro de un ¿ibsCevn o que exuda desde ana fístula o de tina superficie mucoeailnea. También pueden encontrarse diferentes grados de enrojecimientos dolor y lum** facción. Las infeccione* di te* hórrida* e*iertias incluyen M asociadas con utia lesión traumática o eon úlcera* por ¿ecúbilo (escaras ►J*' picaduras o mordeduras de animales o de perso­ nas/'- quemaduras1' ' o cuerpos- utm ñdi en la piel o las mucosas.

Las heridas internas y los abscesos pueden asociarse con apendieitis, colecistitis. celulitis, infecciones dentales, micomielitis, empiema, artritis séptica. sinusitis u «iras infeccionen internas. Muchos de estos procesos son uitrahospital arios ladquirtdo.s qn ccnlmsi de salud), conlraídos Juega de procedi­ mientos invasivos, manipulaciones quirúrgicas o colocación de prótesis. Otros derivan de ta diseminación sanguínea a pan ir de sitios primarios de infección, For ultimo, puetfe existir ln disemi nación directa de hacia ias desde sitios adyacentes Je iníec* cián o por la fotura de una viscera, en especial, el intestino grueso. Las bacterias anaerobias suelen w r us* problema enandr» el sitio de infección ¡¡e encuentra adyacente al intestino o cuando la herida está contaminada eon flora fecal. ^ Ciertüü bacterias se asocian con situaciones clínieas particu­ lares. Pastfutvífa mulíwüla se encuentra en herida* causadas por mordeduras de animales,*5111 PséHtltmitiHüs twmgmimi es un patógeno común cuando se produce una herida penetrante en et pie en personas que usan ¿apulillas.11* P.iembmonm aeruginma. las especies de Candida y diversos hongos fila­ mentosos juprescnLLa an problema particular en las heridas por quemaduras^rLl además, el ssrus del herpes simple también puede causar infecciones serias en esins pacientes. ' Las bacte­ ria guamposiiivas aerobias 1incluidos SsapftyiMtn'cu't auwus y Srrvfftvcffccuí pyogenes}. las bacterias anaerobias estrictas y los bacilos gramnegativos aerobios suelen causar infecciones en los pacientes, dúibclttiti*.1'~ Muchas heridas y abscesos son polimicrobianos. sobre todo los ftriginadoK pttr eoniíumi nación fecal, escaras e infecciones en pacientes diabólicos. Existe una considerable controversia acerca de la identificación y la realización del antibiograma de □islarriiciutis m últipla, incluso ú la muestra es una biopsiade te­ jido. Los problemas inherentes a la toma de Ha mucura dificul­ tan la certeza de que tudas las especies patógenas se hayan ais­ lado, Un ejemplo instructivo de e^te fenómeno es un esiudio .sobre los; abscesos, en el cual se realizaron cultivos múltiples de eada muestra durante un período de 24 hora s; 11Je 37 cepas anaerobias tntale* no se aislaron de la siembra en placa ini* cial,1-' Por lo lamo, -se puede instaurar una terapia empírica basada en los patógenos probables esperados en una situación clínica particular.'* La celulitis es u.na infección del tejido blando que se dise­ mina a través de los planos del le ¡ido conectivo co tugar de pro­ ducir una lesión circunscripta, como se presenta en los absce­ sos. A menudo es posible observar el enrojecimiento y sentir el

calor y la tumeaccinn pnr medio de la palpíieirtn de la piel que li cubre.Sl Los principales agentes eti alógicos de la celulitis son los estafilococos y los estreptococos, pero en ciertas sitúa* dones también pueden estar involucrados bacilos gramnegati vos y bacterias anaerobias, Dlai]nóstica de infecciones de heridas, abse&sos y celulitis RECOLECCIÓN DE MUESTRAS Las Ivcridas superficiales suelen estar colonizadas por bac­ terias m iibiíM ule1»; a menudo la muestra obten illa con un bise*, po no refleja la verdadera causa deE proceso de infección. Los métodos de elección para la recolección del material por exa­ minar son la hiopsia de tejido, «I raspado de una herida que supura o el aspirado del líquido o pus loeulado de la parte pro­ funda de la herida. El sitio deE cual se tomará la muestra pan Cultivo debe descontaminarse primero con jabón para cirugía v etanol al 709! o isopropanol. luegio de lo Cual la herida se lava bien eon solución fisiológica estéril y se seca. Antes, para transportar la muestra se utilizaba la jeringa con la cual se rea­ lizaba el aspirado cubriendo la aguja con el capuchón. Este procedimiento se desaconseja debido al riesgo de transmisión sanguínea de algún virus mediante un accidente con 1a aguja. La ayuja puede eliminarse en furnia segura utilizando implemeatos diseñados para este propósito' y reemplazarla por un capuchón de jeringa que no es cortopunzante. Si por algún motivo se prevé una demoro superior a los 30 minutos para el procesamiento de la muestra, ésta deberá transferirse a un reci­ piente de transporte (víase cap. I). Si se obtuvo una cantidad de líquido um pequeña que toda la ¡nuestra se encuentra den­ tro de la aguja, se coloca con cuidado el capuchón, se lo ase­ gura y se transporta la jeringa con la aguja en un recipiente a prueba de pinchaduras jumo con una nota que aclare que den­ tro del comenedor hay una aguja. En el laboratorio, la ajuja puede enjuagarse con ealdo de cultivo para extraer el materia! por cu.ll i1,ar. Si no se puede obtener cE material con una aguja y una jerin­ ga, se puede tomar una muestra de la s u p e rfic ie S i bien ms uti­ lizan comunmente hisopos también se lian útil imdo partos y papeles de filtro. Se debe rcaliiur una lim píela cukladow. del sitio, como ya se describió (a pesar de que 11 0 todos tos estu­ dios demostraron una diferencia significativa en sus resultados entre heridas lavadas y no lavadas?. Puede ser necesario sepa­ rar los bordes de la tienda con el pulgar y el índice de una mano (Utilizando guantes estériles) o realizar Un pequeño curte COn una hoja de bisturí en un absceso cerrado antes de introducir 1a punta del hisopo en el interior de la lesión con la otra mano, Se debe tener la precaución de no tocar los bordea adyacentes de piel, ^e coloca entonces de inmediato el hisopo en un recipien­ te apropiado de transporte, Es posible, pero poco probable, que en un cultivo de material obtenido de la superficie no se aísle una bacteria patógena que se halle en. lo profundo de una herida; es mucho rriü* probable que se aíslen microbios íoloaisüíirttfes además de los paiógenos verdaderos Sin embargo, los hongos y los ¡rus (sobre lodo en las heridas por quemaduras) pueden aislarse sólo de bíopsias de lejiduSe puede inlcntar ta aspiración de material de un ¿rea de celulitis con la inyección previa de solución salina éstenI y sin ella, pero los resultados casi nunca son satisfactorios, S i bien las hiopsias por sacabocados pueden proporcionar mejores resultados, la experiencia con este método es limitada.'51,1 Los hemocultivos no siempre .son útiles en esta situación clínica.’ 1 En general, se define la estrategia sobre la base del conoeimienio empírico de los patógenos que se espera encontrar en una situación clínica determinada.

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Infecciones oculares 95

EXAMEN MICROSCÓPICO BE LAS MUESTRAS Se debe realizar la tinción de Gram a indas las muestras (véase cap. 1). Las claves, nuirrol^kas de la etiología pueden sugerir otros procedimientos diagnósticos mis alld de los requeridos por c] médico (p. cj,„ cultivos para bacterias anaero­ bias u hondos). Si se recibe una binpsia de (ejido, el examen histológico dehe incluir las tinciones para bacteria* y hongos y el examen de una tinaón de hcmatoxilinu-eos ina para la bu»' ijucüa de inclusiones virales.

CULTIVOS Se deben utilizar medio», selectivos y m selectivos enrique­ cidos para aislar las especies bacteriana* eugónieas y con requerí miemos nuiri dónales especiales, Si se obluvo material de aspirado o tejidu es adecuado utilizar cultivo para bacterias anaerobias. El cullivo micr«b:o lógico cuantitativo se recomienda pata tos cultivos de heridas con el objetivo de determinar el signifi­ cado tle los aislamientos, predecir la probabilidad de una sep­ sis en una herida por quemadura y determinar la probabilidad! tic que la herida cicatrice fácilmente. E3 cultivo cuantitativo de una biopMa de tejido e* complejo, oneroso e insume mucho tiempo; el tejido se debe pesar en una balanza analítica, liomogeneiaar en una cantidad conocida de caldo de cultivo, hacer diluciones en sene e inocular en múltiples placas de agar. Estas maniobras son difíciles de reuli/ar en la mayoría de tus labora­ torios, Está claro que la infección por Strcpíococctts pyagews es clínicamente importante. cualquiera que sea Ea cantidad de bacterias presentes.1" Ijos investigadores no han tenido un cri­ terio ¡unánime en el respaldo que le bar dado a esta estrategia. El problema es aún más complicada debido a la evidencia de que una biopsia única no proporcionará un cuadro exacto de la tiara microbiana de Lis heridas trónicas.^45 Hay datos que avalan el uso de cultivos de superficie en lugar de hitqKÚs/" Dr manera similar, los cultivos semicuanti.lativos (que se realizan de rutina mediante la siembra seriada en estrías en cuadrantes de placa* de agar) han proporcionjtdo irtfocTrttietón de que ésta es equiialenté a las estrategias cuanti­ tativa*. mis dificultosas.™ Sin duda, si no se aísla ningún microo rg a n ism o . un c u lliv o c u a lila liv n b rin d a la m is m a ¡n fu rrtia c ió n

que un cultivo cuantitativo.

Infecciones oculares Presentación clínica

Lsis ademes infeccioso» pueden alatar cualquier parte del ojo, tanto desde afuera cuinu desde adentro. Líls infecciones externas suelen involucrar las estructuras superficiales. lo con­ juntiva v la córnea, a menos que ha; a octimdo una lesión pene* Erante que introduce mkronr^iinpsiTHJ» en el gM ** ueular. CONJlWTWmS

Ea conjuntiva <$ uña memhrana delgada que cubre el párpa­ do (conjuntiva palpehral) y que se repliega sobre la superfi­ cie esterna del globo ocular o escleral tea (conjuntiva bul bar}La córnea central no está cubierta. La conjuntiva es la diana de muchojf microbiini, la mayoría de los cuales se encuentran en las vías respiratorias alias. La inflamación (conjuntivitis) produce enrojecimiento fojos rasados), picazón y secreción, que puede ser mucosa y purulenta.11" 11 Los exudado* en las infeccione» bacterianas son muy pegajosos y con incrustacio­

nes, por lo lauto, los párpados pueden pegarse entre si. Tam­ bién se puede desabollar inflamación aguda no infecciosa en pacientes eon alergia estacional. La conjunlív ¡tís es muy conta­ giosa; la infección puede pasar con facilidad al ¡uro ojo o a otras personas por contacto (p, ej,. refregar el ojo infectado y luego el ojo sano). Los patógenos, bacterianos más comunes >¡on Siaphyfoeoteus atinas, Haemophittts injlutn7M. StrepHtcocvm pnt'mmme y Pseudónimas aemgitwsQ. La conjuntivitis aguda también puede ser causada por dos patógenos de transmisión sexual, C h ta m v fiiii tra c h o n ia tis y N e is s e ria g a n a r r iu ií'ü i\ que pueden afectar a adultos sexualmente activos o a recién nacidos que adquieren la infección durante el parlo vaginal. La etiología viral ntós común cv adenov tras, que puede causar enfermedad epidémica con faringitis o sin ella (fiebre farmgoeojtjiandval epl* démica)* QUERATITIS La queratitis. inflamación de la córnea, es una infección mucho más serta que la conjuntivitis. En lugar de la molestia temporal que se presenta en la coajontiviiis, la queratitis puede producir uña cicatriz; y llevar á la ceguera, Rs causada por indas las clases de agentes infecciosos. E l agente bacteriano más común es StaphxioctK'cus amvua.™ Los hongos filamentosos, ert especia] las especies de Fusarium j de A i{vr%iU uj. y las levaduras, snás a menudo las especies de Cundida, causan una lesión que puede asemejarse a la infección bacteriana, lo cual retrasa el diagnóstico y el tratamiento apropiados.144 El virus del herpes simple puede causar una lesión ulcerativa denomi­ nada queratitis dendrítiea, debido al patrón arborescente de las lesiones.'47 E l virus de l i varicela üóiter reactivado (herpes! puede producir una queratitis sim ilar si afecta la rama ocular del nerviu trigémino (quinto par craneal).-71 En las perdonas Oque utilizan lentes de contacto, las especies de Acamhiirtun'ha (una ameba de vida libre) pueden producir lesiones ulcerativas muy dolorosas,’w La queratitis intersticial, que ocurre cuando los vasos san­ guíneos crecen dentro de la córnea desde la conjuntiva, es la causa medial mas. común de ceguera. E l [racoma es una forma de querai oconj untivitis crónica provocado por f . tmrhttmafj'.v.13 La legión cicatrizal que surge como resultado de la enfer­ medad recurrente aféela a 6 millones de personas en el mundo. I.a Bfrrfc/ Trmhotm Tlmíimive tiene como objetivo eliminar esta infección tratable para el año 2Í12Ü- En ciertas regiones de África, un parásito de las lilarins, Q n c h a a e m t ro/i'NÍJu, que se transmite por la mosca negra (especies de produce una respuesta inflamatoria aguda cuando los gusanos que migran mueren, lo que genera la ceguera del río.106Otros agen­ te; cliológicoü de la queratitis intersticial son Treponema palíitlum (sífilis J„i<4 Mytrobactcríum ieprae (lepra) y M. tahtm rbs ií ttuherculoiií). La queratitis { y la ceguera) también pueden ocurrir por lesio­ nes t*u infecciosas, como un traumatismo, por la radiación ultravioleta (razón por la cual no hay que mirar directamente al sol, sobre todo durante un eclipse) y por condiciones que dis­ minuyen las lágrimas, que lubrican la córnea. UVEÍTIS Y EHÜOnALWITIS Las infecciones más erases son las q u e afectan el interior del ojo. Las infecciones adquiridas por vía endógena llegan al ojo por vía sanguínea. Pueden ser responsables una gran variedad de bacterias, hongos y virus. Las infecciones adquiridas por vfa

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96 CAPITULO 2 InlmtfuCCiún &la misruDiolojfa: ?arte II

exógena suelen relacionarse con traumatismos penetramos en el iijo, ¡La» infecciones posquinirgittis representa o una catego­ ría especial. Diagnóstico de las tal(«iQfl« oculares BECC LECCIÓN DE LAS MUESTRAS La conjuntivitis se diagnostica por medio de un hisopado de la conjuntiva afectada que se coloca en un medio de transporte apropiado. E l oftalmólogo toma de manera, adecuada las ihuktnas correspondientes a leídas las oirás infecciones. La querati­ tis se diagnwiiea por medio del raspado de la lesión; si se «wpccha una etiología bacteriana o Mügka. ,t menudo el médico inocula la muestra directamente en el medio comes ptmdicnteLas muestras ¡ara el diagnóstico itc eñdofliitmiliv deben re(0* lecurse en forma quirúrgica,

EXAMEN MICROSCOPICO Se deben realizar Ixs liticioncs de Gram, con blanco de calcollúor o de Wright según et patógeno que se sospeche. Si se obtuvo una muestra en forma quirúrgica se deben realizar las tinciones, apropiadas jwira Tos agentes infecciosos.

CULTIVOS

El medio adecuado pata inocular ílepende de In estimación que el médico haya realiz^ido '■obre el agente etiológieo más probable. Para ciertos patógenos, como los agentes de la sífilis, la lepra y 3a oncoccrciasis, el diagnóstico debe realizarse por microscopía y scrología.

infecciones de la sangre hnfstnteciún clínica y patogenia

BACTERIEMIAY SEPTICEMIA El sutijo "-emiaH líate referencia al sistema circulatorio. La hacieriemia. la fungetnia y la viremia son estados en los que tas bacterias, los hongos y los virus* respectivamente, circulan a través del sistema vascular. Los signos y los, síntomas pueden estar presentes, pero son variables. La ausencia de signos y sín­ tomas en los pacientes define un trascorro denominado l'silenciosofl o "suheliíiko". Por el contrario, lu septicemia {sepsis) es llei síndrome clínico earaeteriiÉido por fiebre, escalofríos, malestar, taquicardia, hipcrventilación y unicidad o postra­ ción La septicemia ocurre cuando Iíls bacterias circulantes ve multiplican a una velocidad tpe excede su eliminación por los fagocitos. Los síntomas aparecen como consecuencia de la pre­ sencia de (ominas microbianas o ciiocirta-s producidas p ir las células iiiílamatoriLis.' w ífov se tiras,idera que una serie ule im portantes e ve n ir inmunosupresores se producen después, de la i nmunoetl ¡mutación de laseiioetnas,1-'1Un componente impór­ tente de Ja sepsis mortal es la falla muli ioigdmica. pero et meca­ nismo patogénico que lleva a la muerte ayn se desconoce. La sepsis se ha asociado tradicionalmenle con las baclcms gramnegativai, que condenen endotoxmas.J1lN Ss embargo, ahora se sabe que las bacterias grampusitivas también pueden causar el síndrome «.le sepsis,6 1 TIPOS DE BAGTiFHEMlA 1.1 baeterieinia puede ser transitoria, intermitente o continua, lo t|ue refleja los divenuos mecanismos por Jos cuales la bacte­ ria ingresa en el lómente sanguíneo. La baeicrieniía transitoria

se produce cuando los microorganismos, a menudo miembros de la flora normal, ingresan en la sangre a irakés de un trauma mínimo de las membranas (p. c j, cepillado de los dientes, esfuerzos durante las evacuaciones intestinales o pitieedimicn' tos médicos). *** La bacterieniia iniermi tente ocurre cuando Im bacterias de im sitio infectado se liberan en horma periódica a la sangre desde un absceso cxlravasculur una celulitis disemi­ nada o infecciones ele las cavidades del cuerpo, como empie­ rna, peritonitis o artritis séptica. La bacteriemia continua sude presenfarse cuando Ja inlección es intravascular, conw en las infecciones del endotclio (endocarditis bacteriana o aneuris­ mas) i? pur dispositivos infectados (fístulas arterioveníisus, ca­ téteres mlraartcrialcs o cánulas permanentes}. Sin embargo, el origen de los microorganismos no puede determinarse en hasta un tercio de tos casos. La hacteriemia puede ser el resultado de urta infección en un órgano o de un tejido íbaeleriemia secundaria). No obstante, a menudo, el sitio primario no es evidente íbaeteriemia primaria). En esta siluudkm, es posible que una bacteriemia transitoria no pueda ser eliminada en forma eficiente por tos mecanismos de defensa del huésped. A l menos, en el caso de Staphylocaccus entrena la bacteria colonizante de la nariz parece ser el origen de la infección sistém lca,^ Lus. factores que desencadenan la dise­ minación desde las narinas anteriores aún se desconocen.» pero la diseminación hacia la piel y la infección ulterior de las herí* da* « de Ins disposjti\cK intrava-sculares. es una posibilidad. Cuando Da infección de un órgano se disemina hacia la san­ gre (p. ej., neumonía bacícríómica por neumococos), la gruvedad de la infección aumenta y el pronóstico para el paciente empeora.^1 Por el cemnario, la hacieriemia puede producir la diseminación de la infección en otéanos distanie.s. fenómeno denominado 'infección metastásica”. La bacleriemia también se puede clasificar conw adquirida en la comuaidail o intrahospi talaría Puede ocurrir en personas inmunocompetcntes o inmunodeprimidas. Rl tipo de niicitiorganismos y el pronóstico varían en gran medida, según estos factores y la edad del paekn^c,w■ ,í-’",, -M Se pueden ai-dar diversas bacterias giüiitpositivjs71 y gjamnegativas*7 de la sangre. Dorante las últimas décadas se lia observado un claro cambio ea la naturaleza de la flora infec­ ciosa. Con el tiempo ha disminuido el número de aislamientos de bacterias anaerobias, mientras que se han incremeniado Los aislamientos de levaduras \ de ehlalil< vocí i* cuagula&a-ttúgativos de importancia clínica.1” Debido a razones aun no diluci­ dadas, tas baclcric.'mias causadas; por baeilúS gfaiJ'irtégaÉii'Os HO íermenfadores son más a menudo poli clónales i mis de un tipo molecular) comparadas Con las hacterieltlius causadas pt»r oíros bacilos gramnegativos.w Algunos microorganismos específicos tienen un significado clínico diferente, CUníriiímm septicwn suele asociarse con en* fermedad neoclásica. en particular con el carcinoma de co­ lon,141’ y puede producir un absceso mciiMásico a distancia, De manera similar, la bacteriemia por SireputcocL-ui bovis se aso­ cia a menudo eon endocarditis y eon enfermedad colón ica, incluido el carcinoma de colon,1'' Con poca frecuencia, epihkIios de bacleriemia por CfasfntUnm perfñngeu\ dan corno resultado urta hemólisis intensa s repentina, que puede resullar rápidamente m ortal^ la causa de la hemóli sis son las lobinas de CI(KStridium. pen» aún se desconoce por qué lu Itemólisis mortal se preseola sólo en una pequeña proporción de las bacteriemias por Ctflstrittmm petfringenx. f a c t o r e s te fiesoo y pronóstica, Numerosos mecanismos partieipatiei) la eliminación de los mierturganismos del torrente san­ guíneo, En los individuos *anps e innumacomputentes, uiia.

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Infeccionas de la sangre? 97

entrada repentina cte bacterias se clarifica de la sangre al cabo de 30-45 minutos. El hígado y el bazo cumplen un popel prin­ cipal en la eliminación de |¡u bacterias, mientras que lew neutrófiOos intraviículw ei tienen sólo una función menor La# bac­ terias encap&uiadas &on más «ilfíecles de eliminar,, pero existen anticuerpos específicos (opsoninas) que aumentan su elimina* ctón,JI Lew pacientes débiles, intmmñdcficienles o inmunndepri 111 idos. lienen un mayor riesgo porque la* bacterias pueden permanecer en la circulación durante hora». Weinstein y cu li, han investigado otras factores d e iitíj¡Q .itt E n su estudio que incluyó 50*0 episodios de bacteriemia y fun­ gem i a. la mortalidad total fue del 4 2 ^ la mitad de eslas m u e r­ tes atribuidas dina.-lamente a la seplÉcemia- Kn el cuadro 2*8 se muestran los factores de riesgo y las tasas de mortalidad reblevas para cada uno, Bryan1? también destaca los cultivos positivos que identifican una población de placientes con riesgo de m u erte; lo,? p a c ie n te * con c u ltiv o s p ositivos tienen 12 veces

mas probabilidad de m o rir durante la hospital iaació n que aque­ llos- con cultivos negativos. A partir de esta experiencia, es imperativo que el laboratorio realice tas he mocuftlws en forma conocía e informe tos resultados eiactos lo antes posible. La detección a tiempo de la bacteriemia y de Ea fungcmla, seguida dé la identificación rápida de los patógenos- y la deter­ minación del antibíograma, pueden, tener gran importancia

Cuadra 2-3

diagnóstica y pronostica. La mortalidad por septicemia puede ser del 40% o mayor en cienos grupos de pacientes hospitali­ zados,J1* A pesar de que las enfermedades subyacentes son determinantes, impertíanles de los desenlaces fatales, cerca de 9a mitad de las muertes pueden atribuirse en forma directa a la infección,17Se ha demostrado que el comienzo rápido de una terapia con antibióticos adecuada es importante para evitar Ea morbimonalidaJ,jil El tratamiento inicial se debe basar empí­ ricamente en los patógenos mis probables y en los patrones típicos de sensibilidad a los antibióticos, E laboratorio de mí* erobktlogja desempeüa su papel más importante cuando el pa­ tógeno real o ei anübiograma son diferentes de los que el médi­ co había indicado en tonrui empírica, La mortalidad de los pacientes tratados de manera apropiada es significativamente menor que la de los que recibieron antibióticos no eficaces,1!< > La pronta corrección de] curso de acción elegido de manera empírica depende de la rápida, información que proporcione el laboratorio. Además, de todos los aspectos importaníes rela­ cionados con la calidad, también la velocidad en 3a provisión de los resultados tiene influencia en el aspecto económico,11 Cualquier acción que reduzca las complicaciones y acorte la hospitalización dará como resultado no sólo un ahorro econó­ m ico para h institución sino que lambiera m ejorará Ta atención del paciente,

Tusas dr murtal Idad y f ic lu r » de

CONDICIÓN Edad d el iMfifntí20 21 '40 41-50 >?u üfiti 1ÍL Ku íciTr>Ep.|a4ki^«-

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IflPuEcienck N-roplasín

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98 CAPÍTULO 2 (ninaducción e la mi cía biología: Pa ría II

INFECCIÓN WTFtAVftS-CUUifl

Lu infección in lu vu ^ u k más común es la endocarditis.. es decir, La infección del recubrimiento cndotcliaJ del cora­ zón, La división anterior de la enfermedad en forma aguda y subaguda ya no se considera útil. A pesar de que casi nxíos los ntiiTiHirjíiinisniíK pueden alguna ve* producir endo­ carditis. la mayoría tic los micr(»r«üniíin(Ri asociados &oti grampositívos. E l más importante es, SttiptcK'oeeits viriJatu de ¡a cavidad bucal y Slaphylacoccus auncits. Los pacientes de ma­ yor nesgo son aquellos que prevenían enfermedades de¡ endocardio y los que se eneuewran en tratamiento odontológico,” Hace años, el daño al endocardio solía surgir como cunsccucncía de la fiebre reumática. Con la desaparición virtual de esto enfermedad, las anomalía* congcnitns o del desarrollo, cpno h de b válvulu bdcúspide aórtica y el prolapso de 9a válvula mitra I, Kan cobrado mayor importancia. Un trombo de tilín na y plaquetas sobre lu superficie erosionada del endocardio sirve como ni ¡o (k anclaje para las bacterias que ciftulan transito­ riamente en la sangre (p. e).„ luego del cepillado de los dien­ tes]. Ciertos microorganismos, en partía)lar los estreptococos y Itis cnicmctKxiK» tienen una capacidad exacerbada de adherir­ le a eslos in>r¡ihiM.w Los trombos > las bacterias asociada* for­ man excrecencias fdebelaciones) que pueden visualizara por medio de una radiografía o tina e c^ jifía . Lus trombos nu infectados y los infectados causan endocarditis manmtíea e inlíffliiw,i. respectivamente A pesar de que las bacterias gTaropíisimas son los agentes elioEógicos más comunes tic la endocarditis, alguno» bacilos gramnegalivus con requerimientos nutrieionalcs cspccialcs j algunos hongos*-1^ pueden causar la infección. Es muy pro­ bable que las bacterias gramnegativas del grupo H AC EK [Hoem¿>phHua apfrwplufas. ActiflObatilltts m 'iim m re fe in ro ntiutm. Eiketulla w rw d a if y Kin&dfu km^ur) infecten las válvulas cardíacas. Uw liotljlos y alguiios, de estos bacilos granuicgaiivcti se destacan por su propensión ci formar grandes vcjgciacÑvws que se pueden romper y viajar por la circulación a sillos alejados (embolia Aplica). En la mayoría de los casos, ta endocarditis compromete La parte Izquierda del corazón, que es el laclo de alia presión del sistema- Sin embargo, si las bac­ terias se inyectan directamente en el sistema venoso, como ocurre eon la inyección intravenosa efe drogas ilegales, puede producirse una -endocarditis del lado derecho. a menudo causa­ da puf ae ru g im n a.' : En una minoría de pacientes con signos y síntomas de endocardilis es difícil o imposible el aislamiento de iift agente ciiológieo (endocardios eon cultivo negativo), Las enfermedades que causan endocarditis mardntica pueden ser responsables, pero cienos inieruorjjaniKmns no jíí aíslan fácilmente median­ te las lócnica» de hemíx-uliivu convencionales. Entre estos agentes se encuentran Chiamydia pnfwtonwc, Caxktln bnmeii¡ (fiebre Q,i v las especies de ítantmeUa. 7~r pera pueden asociarse con menor frecuencia rrtms agentes „ como las espe­ cies de LeftkmeUtt. Les pacientes qu~ poseen implantes recientes de dispositivos iutravasi-u lare s suelen infectarse per bacterias que son preptas de la piel, a menudo estafilococos coagulasa-negativos y difteroideso, más esporádicamente, alguno de lo^ que causan infeccio­ nes de las heridas* como bacilos gramncgalLvos. Si«f*h\loaHxm tiumus u hongos.'1' La endocarditis de b válvula protésica se presenta en el 3-6% de los pacientes que reciben implantes mecánicos o bioprotésicos (válvulas hechas de tejido ;mimnl];300 la infección se puede dividir concepuiahrtenie en la etapa temprana « 60 días después de b cirugía) y b tardía. En la etapa temprana pitidmninan los microorganismos de Ja piel

j las heridas. En la etapa tardía se encuentran los mieroor|sanismos que infectan los válvulas nativas. Las complicaciones más serías de la endocarditis son Ja rotu­ ra de una válvula cardíaca con la resultante falla cardíaca y la enfermedad metostásica causada por la embolización de peque­ ños fragmento* de vegetación infectados. Un problema parti­ cular en b endocarditis es la descompensación cardíaca repen­ tina causada por Stapfniót^titcun autvus, que puede representar una emergencia quirúrgica, Como consecuencia de uaia embo­ lia séptica renal y cerebral, se pueden presentar falla renal y accidentes cerebrovasculaies, respect i emente.

BACTÍRIEMtAY SEPSIS ASOCIADAS CON LOS CAlfíERES Como resultado de los avances tccnnlójueos que permiten el uso seguro de catéteres vasculares permanentes surgid una clase especial de infección intravascular. Los catéteres pueden ser sólo la puerta de acceso para las bacterias que colonizan la piel adyacente ál punto de carrada o pueden aduar como un cuerpo entraño que alberga mscrocolonias bacterianas. A partir de las infecciones asead as con lew catéteres se pueden pre­ sentar sepsis y enfermedad m clastásieagrave/'3,En Iespáden­ les con enfermed
C0NTAHIHAC1ÓH COH FLORA DE LA PIEL Se deben tomar toda* las precauciones para reducir ,al mfnimo b eontaminacaóíi de los tiemocullivos/1- El aislamiento de las especies de Corynthactcrium. de PropímifKictenuin a^rv y de especies de Bad ilas diferentes de B. antnacis es casi siem­ pre contaminante, La mayoría de los aislamientos de bacilos gramnegtilsvo?, levaduras. csEreptoeoctjs fi-henmlíticos, Sirtp* formen,t ptíenmomae, especies de fu ífw c flc fiií y St&pisyhcoccus twnrwi tienen significado clínico. Los aislamientos más problemáticos son los estafilococos coagulasa-negativos, ya que cada vez estas especies son agentes cliológieos serdaderos de la bacteriemia. pero adeinis son flora endógena de la piel.

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Infecciones de ta sangre 99

Hn todos tos laboratorios de microbiología se debe realizar fn forma regular el control del aseguramiento de la calidad para determinar la incidencia de muestra.-, contaminada^ Deben estar contaminados menas dd 3*? de Ion bemocultlvosr Bates y cub.^s estimaran l¡liu un LaeuhjuIUh o cuiilaminadLS puede llevar a un aumento del 2Ú-3Ü& en la facturación de la hospitalización de un paciente dcbidtf a tina estadía más pro­ longada pura el irainmierto antibiótico intravenoso y las prue­ bas adicionales que se deben real I¡dar. T*imbiér> desliaron la necesidad de efectuar hemocultivos pareados para dciecluj pn> hables contaminaciones si solo una de las muestras resulta ptisniva. Si la técnica di.- recolección de." I:t muestra es biiL-tia y se reduce lu contaminación. el costo de Eos contaminante* es aceptable.*1" Se puede desalentar el uso inadecuado de antibió­ tic o pnr medio de una política de laboratorio en la que a los j.ilií^iilu^ únicos de estafilococos cougulasii-iiegativüs tío se les realice de rutina el anlibiograma. Weinstcin sugirió varias estrategias parí esta determinación.-"3 Se han propuesto diversos enfoques para establecer si una cepa de SutphykKfnnm coagulasa-negalivo representa una con­ taminación. Lamentablemente, ninguno funciona liten. El número de frascos jH>AÍtiv
Figura 2-6 T íín to U e dcíhjfgrwi*! ju rj Dc!iHKHtü'iTHiiltiJJíni:bujia a^u|¿ y unj jm íígji L-Mt£ril Jjpliea mi n.Hii'4)üflt en el .niie'hfi7i.i. jsof fiK-ima dfl ^irio «Imide se v,i u ríáli zar U veiwpuncLón. |w a diitendrr Ebs vxmuí. «ntevuNLil» El ^¡1¡d Alt jirf' ínmente preparndo « n tinturude ¡f«ki y alcohol. Se c*tme Ep sinp c con ¡ínnpa y aguja y ^ in>4s;ta íIíh Ik í un fras^ lie hcmixTilíivci 4ipnjpi*Jíí. Se deben utilizar guante* de Lites durante el procaHmiento.

Los tiemocultivos pueden obtenerse tiEi libando una aguja y una jeringa ffig. 2-6) o mediante un sistema cerrado, que consislc en un frasco al vacío y un tubo de recolección con doble aguja, Se desaconseja la obtención de muestras para hcmoculti* vo de calieres tniravenos^ o intraatteriales permanentes- A pesar de que algunos autores han observado una buena eoneEacíón entre ios cultivos tomados a través de catéteres o mediante vcnopunción* la mayoría de ]os Investigadores han encontrado un riesgo significativamente mayor de aislar microorganismos de la piel si se reco le cta la m uestra, de un catéter intravualular.w,“ El tln de recolectar la muestra de un catéter intravaíscular es evitarle al paciente las molestias producidas por una venopuncÉón: sin embaEgo. eí aislamiento de an estafilococo csiaguLaAa negativo puede realmente ocasionarle una molestia mayor como consecuencia de las venopuncioncs adicionales que deberá padecer para que se determine la significación de esle aislamiento Cñn[mveri(d0-íl 1»>i se utiliza luí Catéter intravascular, se deberá recolectar por venopuneión una segunda rfluestnt de hcntoeulliv-n para ccimparación. La práctica de cambiar las agujas luego de realizada ta venopunción y antes de inyectar la sangre en los frascos de cultivo ha sido remplazada por la inyección directa con la agujEtoriginal de flebotomía, debido a las infecciones por H IV o hepalitis que se pueden adquirir como consecuencia de los acdtientes pof punción con agujas. La mayoría de las investigadores que han csiudiado este tema concluyeron que no existe una dlferencía significativa en Ifts lasas de contaminación de los beniocultivos cnire Eas muestras de pacientes en jeringas a las cuales se les cambió la a.gLija para su inyección en los fraseos de c u l­ tivo y aquellas a Eos que no se les cambió/*-1 En un metannálisis sobre esie lema, se evidenció una mayor frecuencia de contaminación cuando las agujas no Éueron cambiadas, pero el riesgo de adquirir una infección ^tral de transmisión sanguínea en más Empollante que los beneficios obtenidos con el cambio de agujas,

Un factor importante en Ea calidad de Ja recolección del hemocultivo. a menudo subestimado, es el entrenamienio de los extracc ión Isl as. Muchos investigadores han demostrado que un equipo de extracción islas entrenado puede obtener hemo-

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CAPÍTULO 2 Introiuíciúi a la mícrDtiialQfEfr Parte II

c u lti™ con menor contaminación que la operable por azar, sin importar sil eiivel de educación.131 |h

CANTIDAD Y OPORTUNIDAD D llQ S CULTIVOS El número de muestra que se recolecta tiene menor impoitanda que «1 volumen iota! del bemoeultívo. Muchos «ludios han documentado Iíl importancia dd volumen: la mayoría eilá de acuerdo cor» el frillazgo de tm incremento en el rendimiento cuando se uiili/aii aproKimadimicntc 30 mL de: sanare en adub tos.’11Si se envía un grupo de dos fraseos con LO mL de sangre cada uto», se nGeestuiáit dos grupos pura satisfacer el criterio de uní Limen. Sí Ins fraseos contienen cada uno 5 mL o si el médico no inoculó el suplemento completo de sangre, se debe­ rá utilizar Lina cantidad mayor de fraseos para satisfacer las requerimientos de volumen, Una excepción puede ser Ea neu­ monía adquirida en la comunidad en ninas üsmw, en la cuvl puede ser íuf^icnic un umeo calm o 4íefTnlii*>.í,rr En un estudio hospitalario sobre prácticas de cultivo. Sehifmait y cois.244, describí emn que la iihjideneia de hemocuU Uvos aislados lema un rango de 1% o 99% con una mediana cte 26Q . Estimaron qué sf podían pasar por alto alrededor de 18 (NKI episodios de bacteriemia debido i la recolección de un volumen inadecuado de sangre. Además, ha]laron que entre el 2056 y el 30cft Je loshcmoculíivt» aislados no estaban clfnieanieme indicados y que ia mayoría de los restantes eslaban indi­ cados por médicos que desconocían que un cultivo aislado no era suficiente. La intervención dirigida y 3a edacaciísn global redujeron los hemocultivos aislados dcl-lO1# al 24l»r en un hos­ pital y las lomas demuestras innecesarias del 38^ al ] 2.5% en otra institución, Lamentablemente, las mejoras cu el desempe­ ño curtió am scLittnda de b educarión duraron poco: sí requiere un control constante (p, ej.. como parte de un progra­ ma de aseguramiento de la calidad en curso). Como ya se des­ cribió, los hemocultivos aislados prevenían el problema adicio­ nal de que los ai'ilsimicnl-ns lidíeos, de estafilococos toagulasanecalivos son difíciles de interpretar. Las muestras para los hemncultlvoi se deben obtener, >i es pasible. antes de Ja utilización síslím ica de antibióticos, SI el tratamiento ya lia comenzado, las muestras aiín deten oblo nerse, pero los resultados negativos deben interpretarse con c u ija JiL Los linean ienJ os tradicionales indican que si se sospecha una infección iniravascular y una bacteriemia continua, se deben lomar múltiples muestras en diferentes tiempos. En la actualidad hmuchos « (M c iA t a creen que no es muy ventajoso espaciar los. cultivos en el tiempo. La liebre es a menudo una respuesta retrasada respecto del ingreso de las bacterias en el tórrenle sanguíneo; por lo tantnh (¡ene ¿nítido tecolecior las muestras lo antes posible iras la aparición de la fiebre. Se deten realizar al menos dos venopuneioncshpero se pueden recolec­ tar de una sola vez (oclas tas muestras necesarias {usualmente dos o tres grupos, cada uno con dos fraseos), Después de recolectar un volumen de sanare adecuadoe ini­ ciar e| tratamiento con ai)tibidliei)i4no se gana nada recolec­ tando m is mueslras liasta que se conozcan los resultadas del cultivo inicial.w La práctica (te indicar cultivos dianos no dete aceptarse. La mayoría de los aislamientos bacterianos se oh lienen por medio de los sistemas de moni toriz ación continua den­ tro de las 12 Ssoras; por lo tanto- es razonable esperar al menos itcü días ante* de recolectar nuevas muestras. Una buena regla sostiene que es preferible considerar nira posible causa en lugar de repetirá ciegas un enfoque diagnóstico no productivo. Sin embargo, si cambia la condición clínica estií indicada la reco­

lección de más muestras. La "bacteriemia intercumente?i (culti­ vos positivos y síntomas nuevos o persistentes en presencia del tratamiento antibiótico) sugiere la posibilidad de una resisten­ cia a los antibióticos > es un signo de peor pronóstico,'111Sin embargo, cabe recordar que la utilización de los medios pura hcmoculiLvomás recientes que contienen resinas para eliminar los antibióticos puede dar como resultado la aparente persis­ tencia de los patógenos- el estado sintomático del paciente es de importancia crucial. MEDIOS DE CULTIVO

Loa medios, utilizados en lus hemocnliivra son polivalente* y enriquecidos nutrieionalinemc. Suelen emplearse hidrolizado de soja o iripticasa soja, pepíima suplemcniadan infusión de cerebro y corazón,, agar CoLumbia CNA y ios caldos firucelta. Todos se comercializan; «n embargo, las variaciones en la composición de un mismo tipo de medio entre los diíeremes. fabricante dificullan establecer comparaciones y sacar cottelusiones acerca del rendimiento comparativo para el crecimiento bacteriano de cada uno, Lll mayoría de los. medios de hemocultivo que se renden contienen polianetol sultanato sódico ¡íiP S ) corno am icoagu­ lante en concentraciones que varían entre 0,025*# y 0,05 fí-. Además de sus propiedades anticoagulauLes fia anticoagulación es el efecto deseado debido a que ciertas bacterias no cre­ cen bien dentro de wn coágulo, donde la fagocitosis de los¡ neotrifilos y de Los macrófagos permanece activa i, el SPS inactiva a los neutróíitos y cierkw antibióticos, c
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Meccic-ncs de la sangro

nos, un La política
. 'i-* L | 1,'í i --- ’i ■.. V ... ■ ¡ Recuadro 2-2 Guío para la obtención de hcmoeulllvoi' !-■ ■'-i -v-'.... ... ■> , .• ' ■'■-• ■ WeylmaUe un Enjpn tle HtnBcitmirtiJK ín tran iiJ» delw nec»leclJir u»J(»n liis henuxuHiHW de x 'u írju eon ln^. jwcHlhidIih íraublecid».». Se ilíh í LiHíinclir lu fn.'v'Dcrh Ld d i prtibaMe» ^c-ciuiniiei.inLr^ en lw L\¡tu»w nvnlrcihU»*; jxw caita rntarabro del grupo ik imanefu jp!* puedun ntíjfliar 'U desemjieí^ L l - 1’ l i c n i s H . u I L i l i . , j - L ü ii J i i J i c j i l m

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Je reeoteceido een ale!^-,. De^e-arUrudeu. Iitv iihiL-ins eisififiuii^mrcs en i¡n reeipwríte esa proirt'eiórj No írr/jrd -ngre^i de tri saiifiní l-:i Env 1Jl l«1 ■n,"-.i's iihM iLhl-i -ul lahurmiiiHi tvanHi!^ |H«cibl<

■■.-IJiífirüiii.i J í .'j írfrfYjíh Uí'v.

SfíJífTO Síprtiif® dp Qtofd El Sistema Signal1 * de O xoiJ íOgJensburg. N Y) es un Esterna Je hemocidiivo de frasco único que uiíli/j la producción de ("O, pata detectar el crecimiento bacteriano temprano, El fraseo de hemoeuldvo principal es üimil:ir u los utilizados en otros sistemas con caldos sin embar­ go, el Eterna emplea una segunda cámara Je plástico, conocí’ Ja como cámara Je señal, con una aguja larga que llega hasta eL fondo det frasco. Luego de inocular La muestra de sangre ijue se va a cultivar Jenlro del frasco principal, se torteeUi la cáma­ ra de señal por medio de la inserción Je 3a a^uja u trates del lapón de goma y se lia ubica por debajo de la superficie det me­ dio de cutiivo. Las bacterias producen CO, cuando crecen y metaboLizan. EL aumento de presión insultante empuja el líqui­ do dentro de Ili cámara Je señal. que puede visualizarte direelamentc y. aJemas „ utilizarse para preparar una tinción de Gram y un subcultivo. Este sistema ha sido evaluado de manera favo­ rable.1*’^ 1' Sin embargo, sigue siendo un problema el mayor numero de resultados falsos positivos y et menor aislamiento de bacteria.'; anaerobias respecto de tu normal. Weinstcin y cois.’14encontraron un mejor rendimiento en el aislamiento de micTKwiqianismns con frascos recién diseñados que tienen un mayor espejo superior para el gas. v tjue se agitan. Sistema ds hemocultfm BBL Saptlc-Cbek1'. F1 sistema de uear bifásico en portaobjetos Scptic-CLick® (E D Dia^nostic Systenis, Sparks, M D ) también utilizado ampliamente, consta de un fra-sen de cultivo estándar que contiene caldo con infusión de cerebro y corazón o caldo tnpticasa soja. E l frasco está diseñado para conectarse a una segunda cámara de pláslico que contiene una palela con la superficie recubierla de agar. D espuís de inocular el primer fr-ascu COA la muestra de sanare

por cultivar, se enrosca el “ portaobjetos" contenido en !a cá­ mara plástica; este ponaobjetos tiene una paleta de tres super­ ficies recubiertas con tiras de agar chocolata MacConkcy y malta, E l primer subcultivo se rcali/a luego de 4 a 6 horas de incubación a 35 C'C inviniendo el frasco» lo cual permite el ingre.su del medio en la cámara que L'nnlieue al portaobjetos y. por lo tanto, moja las superficies recubicrtas eon agar. El fras­ eo se pone entonces nuevamente en posición vertical y se con­ tinúa con la Incubación. El frasco se puede invenir a interva­ los regulares para reinocular las superficies de la paleta eon agar.

l t ¡ I t ^ - s n v j c . i lI í ; u r u ' ü ' k u n c J . Ü

Éi:>ni vJn'j que pmJrij tralimiailn cim ujilillHikjcLh ,» ju .üiJ m UiU iflteeeión LII Ini M^rírtá ■ .I ■rirgLifilr; r>iKtria Lhkk iLhir-L-piir

ftíuolertar un niúnem sufieiratií

101

SISTEMA DE HENlOCULtlVO FQfl LlSIS V CENTRlfUGACJÓW

Wtmpale isatiit/ImlMtor Microbio! SjrcfeuV7; El sistema IsolalüT*. ampliamente aceptado como mélodo alternativo de hemoculüvn, es muy útil para el aislamiento Je los microorganismos con lequerimicrUn-i nutricíonaícs cepeda|es y de creerniicnto lento. Es el método de elección para aislar hongos fjlamemcwos i mohos), bongos dimorf os. Maías&ezia fu ifu r y especies de Se ha observado una reducción en d pro­ medio de aislamiento de levaduras de 4t9 días cuando se útil i' za un sistema bifásico caldo-agar convencional a 2.12 Jías con eS Isolalüf*. El tiempo promedio de aislamiento de Histoplasma rajmulcilum utilizandu este sistema es de 8 días contra 24.3-1 días requeridos con el sistema bifásico convenciunul. Se ha díK'umcnlado un incremento global del 36.6ÍÍ- en la tasa de aislamiento de hongos a panir de bemoeultivoí; cuando se utili/a el sistema Isolator*. Este método debe tenerse en cuenta cuanJo se sospecha la presencia de otros microorganismos con icqUerintieatus nulriciomilcs espeeialcs, como litirloneihi hen. t í ' i í f s o b r e lodo si los sistemas convencionales dieron resultados negjiivíis. El Isolamr Mietobial System1' tWpmpolc Laboratories, Princeton, N J) es un tubo especial que contiene

B Est ¡gima del dr.VaFbrEso

102 CAPÍTULO 2 irtrflíNCíión a la m ^ ro b M a ; Psiie ll

saponina, una sustancia química que lisa los eri Irrito s y los leucocitos. Se agregan de 7,5 a 10 niL tic sangre en el tubo; ó Le se mezcla varia* veces par inversión, de modo de completar Li reacción de tisis. Luego se coloca el tubo en una centrífuga con roiorilí Angulo fijo y se centrifuga a 3ÍK) rpm duranic 35 roínutos para concentrar cualquier microorgfliti etiio que putOj estar plísenle. Después Uc la centrifugación se aspira el ¡sedimento y se sube altiva en el medio apropiado. Enisic una versión peque­ ña que no requiere centrifugación, utilizada para recién nacidos y niños pequeños; se debe desalentar o prohibir la utilización de la versión pediátrica en adulto* ya que se cultiva un volumen insuficiente de sangre.. E l sistema Isolator* es también el método de elección cuan­ do ¡ve requieren bemocUllivos cuantitativos. Las CFU/mL pue­ den calcularle a partir del volumen de sangre procesado y el número de colonias presentes en la superficie del agar.1** Ll principal problema en la utilización del sistema Isolaíor es un irtetcmcmo de dos a ücIjo veces de la contaminación en rela­ ción eon los sistemas convencionales* Se ha sugerido que la con­ taminación puede reducirse por inedio del uso de placas, de agar ■sacas, la desinfección del área de trabajo y el procesamiento de tus muestras; en una cabina de Unjo luminar vertical1lfc Examen ¡fe los sistemas manuales. Ltw f'Fa*tt)$ tle Iwmoculiivo se deben incubar a 35 ' C y examinar visualmcntc paia observar el crecimiento (hemolisis, producción de gas o turbidez) durante las primeras 6 a 18 horas iHustcriora a la recolección de Jas muestras. Pura los sistemas que utilizan caldos convencionales, s® deben examinar los Irascos contra tubos «le lu z fluorescente o eo-ñ lu,?. transmitida incandescente. La superfieie de la capa de single sedimentada debe examinarse debido a que pueden detectarse colonia* separadas. Se deben realizar suhe altivos ¡i ciegas en agar chocolate de todos los frasees de hemoeultivo (se excluyen los de agar-caldo y ¡os de sistemas de monitorizaeión continua) dentro de las 12 a 24 hora:-, de la recolección de la muestra, a partir de cual las placas se incuban en forma aero­ bia en una niin¿Rfrni de 5-1
SISTEMAS DE H£MQCDLT1V0AUTOMATIZADOS E INFORMATIZADOS La introducción de los sistemas de hemoculrivo de lectura continua, automatizados e informatizados representa an impor­

tante avance en la práctica de la microbiología clínica. Tres de los sistemas más utilizados en Im Estados Unidos son: BaclY Á Icrt' (Organon Teknika„ Durham N C ). BA C TEC 9 2 4 W 9 iar tüD Diagnostic Svslems) y T R E K E S P Culture System 11® (1‘RfCK. Diagnostic Systems* Cleveland* OH}. Cada uflo de estos si tenias lé alerta al microbiólogo que un cultivo es [Jüsith'o, fuego tle lo cual se pueden retirar los Irascos de interés pafu realizar una tinción de Gram y un subcultivo. E l medio que se selecciona para el subcultivo puede eligirse sobre la base de la reacción de Gom y de la morfología de lew gér­ menes, Si no se visualizan microorganismos. se debe realista* un subcultivo a ciegas y retomar el fraseo al sistema para que continúe su incubación. Numerosos estudios han demostrado que se ticcesjta ineubiíí los frascos sólo durante 5 días cuán­ do se utilizan los sistentus de munitorizución cunlinuu. Tal vez en un futuro sea posible reducir aún m.is el tiempo de incubación.3-' Stslm t dt htmcultlvo BacTMlerf, El sistema BacT/Aleri:1 se ha impkmentado en muchos laboratorios clínicos ya que fue el primer sistema de moniturimeion continua de bemoeultivos que se creó y que se puso en práctica en los Erados Unidos. Catín frasco de hemocuitivo tiene capacidad para 11> mL de sangre, Dado que ios microorganismos crecen en una mezcla de sangre y caldo de cultivo, se libera CO.. Un sensor químico sensible al CO,* separado de la mezcla de sangre-caldo de cul(ivo por medid de una membrana unidireccional permeable al Q L está unido al fondo de cada fraseo. En presencia de C G , el color del sensor vita del verde al amarillo, a pesar de que el detector sensible a lu lu¿ que se encuentra dentro del instru­ mento reacciona antes de que -^e evidencie el cambio de color. Cada frasco que se coloca con el fondo hacia abajo dentro de un pocilio receptor en la unidad de procesjuniento está identi­ ficado por un código de barra %grabado en su etiqueta, el cual es examinado por el ordenador para realizarla correlación con ios datos de identificación del paciente. Cada unidad de proce­ samiento es una cabina det tamaño de m pequeño refrigerador que cumple en sí misma la tunesón de incubador agitador y dispositivo de detección hcon una capacidad de 240 o 120 fras­ eos, según el modelo. Se pueden conectar lusta cinco módulos bajo el conüol de un mismo ordenador, lo que da comoresullado un iota! de 1 440 fraseos que pueden controlarse en forma conjunta. Los pocilios están organizados en dos illas dentro de un estante horizontal que se agita suavemente hacia adelante y hacia atrás cu an d o la puerta de la unidad está cerrada. Como cada estante contiene 2t) frascos, una unidad para 240 frascos contiene 12 estantes. A intervalos, de 10 m inutos, los diodos (uno para cada pocilio) emiten un haz de luz que se proyecta a través de un filtro de excitación > se refleja en el seosor sensi­ ble al C (T en el fondo de cada frasco. La luz reflejada se dirige a través de un Filir» de emisión hacia un detector fotosensible que, u su vez. esta conectado a un compilador del ordenador, Tan pronto como se acumula suficiente CO, en el fraseo como para alterar el sensor, se genera un “ alerta” v ¡sítale o audible y el ordenador marca de inmediato la posición del frasco positi­ vo. Los irascos positivos se pueden retirar enseguida y conunuar con su procesamiento. Se puede obtener, en cualquier momento, un grátleo en la pantalla del ordenador para monito­ ria*! el progreso en la producción de CO,. Sisfí«W t í» t o m o s o t iiw B A C T E C B I sistema BA C T EC ' estl compuesto por aria utádad formada por una estufa de incu­ bación. un Agitador y un dispositivo de detección, de aparien­ cia similar al sistema PaeT/Alett* Esiste en dos tamaños: el modelo M240, que tiene capacidad para 241) irascos* > el 9120. con capacidad para L20 fraseos. Se pueden conectar hasta

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Infecciona* de la sangra 103

cinco módulos at mismo ordenador que controla la unidad de procesamiento. De maneta similar ai sistema RacT/Alerl®,. a d a frasco (¡ene un Jim » sensor unido a la superficie interna del fondo del frasco. La úmea diferencia operativa entre el sis­ tema BacT/Alcrt* y el B A C T EC * es -que este ultimo utiliza, floureiwcncia en lugar de luz- espectral para detectar los cambioi en la concentración de CO ,cn la mezeia de «¡anpc-caldo de cultivo. Como el CO, se produce en cada frasco, su sensor emite una Im fluorescente que pasa 4 través de un filtro de emi­ sión en. dirección hada un diodo sensible a ln lu¿. Los frascos se ubican eon el fondo hacia abajo dentro de los pocilios recep­ tores que son rnoniion/ados una ve* cada 10 minutos La leetura íiccüitl del voltaje del diodo se compara con la lectura pre­ via. S i el canto» del voltaje excede un valor de variación pre­ establecido* el microordenador matea el fraseo como positivo. En la pantalla del ordenador se indica la posición del fraseo positivo de minio tal que se lo pueda retiñir paru s,u procesa­ miento postenor. Se puede obtener nn gráfico que ilustra el progreso de la producción de CO, en cualquier momento durante la incubación. sistema tt$ eutUM TREKÉ&PÍP. El sistema de hemocultivo E5EP' (T R EK Diagnostic Syslems, Cleveland, O H ) difiere de los ¡*1^ temas BjurT/Alert® y BA C T EC 9240/9120" en ios si guíenles aspectos; 1) la producción de CO, se monitoriia en forma manoméirica^ 2) se mon¡¡lotiza el consumo y la producción de é¡üs y 3) se detectan los cambios en la concentración de H ,y O,,, además de CO,E1 sistema É S P está también compuesto por una unidad de procesamiento ('orinada por una estufa, un agitador y un dispo­ sitivo de detección. Actualmente existen sistemas para 128 o 384 frascos, aunque se puede unir más tic un módulo aun orde­ nador central, Después de la inoculación de hiisiu 10 mL de sangre venosa, cada irasco se ajusta a un adaptador dcscartable, que incluye una aguja que atraviesa el tapón del frasco de cul­ tivo. A continuación, se coloca cada frasco en una posición definida sobre una bandeja, de modo que el! adaptador se una directamente a una sonda sensor ubicada en la parle superior de cada posición. Una vez. alineado el frasco adecuadamente„ la presión del gas présenle en la parte superior se monitoriza en forma continua. Se toma una Eeciiira cada 12 minutos. Cuando el cambio en la lectura excede un valor de variación preesta* bEeiido, se entiende una lu í que indica ta posición de todo frasco positivo. La lectura puede suceder durante la fase de consumo de H , y 0 3. E i consumo de O, se acelera en el momento en que los microorganismos que se están replicando ingresan en la fase log de crecimiento. Por lo tanto, se puede obtener una lectura temprana durante el periodo de incubación, ante* de qae se produzca una cantidad deleitable de CO ,. La delerminación de varios pases es una ventaja teórica del sistema ESP, sobre todo para la detección de Eos microorganismos a-sacandítieos que pueden producir una cantidad instiásclente de CO„conw para ser delectado por el indicador. Sin embargo, el rendimiento del medio que .
otro. Como las mejoras en la formulación de los medios, en la sensibilidad de los detectores y en ti diserto de los instrumen­ tos son continuas, tos resultados de un estadio realizado hace unos meses no siempre refleja las técnicas actuales. Por lo tanto, cuando el director y el supervisor del laboratorio deben decidir si se iraplementará un nuevo sistema, deben evaluar los comentarios publicados y orales de otro* colegas que han utili­ zado el sistema y las necesidades de su laboratorio, Las ventajas de la motmoimción eonitnua de ios sistemas de hcmucullLvo son la disminución de la carga de trabajo del laboratorio, la disminución de resultados falsos positivos y de scuílnbaclcricmius (debido ¡a la menor manipulación y muestreode los frascos) y el aumento significaiivo de Ea velocidad de dilección y de la lasa de aislamiento nsictoiiano. Las des­ ventajas incluyen una base de dalos limitada parí algunos sis­ temas. la selección reducida de medios, el gran tamaño de los equipos (para los laboratorios en ios cuales el espacio físico representa un problema) y, por último» pero no menos impor­ tante. el costo. La disminución de la carga del trabajo del labo­ ratorio se tíehe principalmente a que el tiempo del personal téc­ nico puede dedicarse al procesamiento sólo de los cultivos positivo* en lugar de a la carga y descarga Je los aparatos o al subcUülivo y observación de m ucuras en su m ayirfa negativas. Se debe realizar un ajusie en los horarios del personal ya que los cultivos pueden volverle positivos en cualquier momento del día. E l director de cada laboratorio debe decidir las horas en Las cuales el instrumento requiere atención. ConGideracinnes especiales

MICROORGANISMOS CON REQUERIMIENTOS tllllfiICIOMALES ESPECIALES ¥ ENDOCARDITIS A pesar de que La mayoría de los patógenos se detectan en poeus dfas, üfsuatjs microorganisnius con requerimientos nutrid anales especiales crecen lentamente, Algunos de ellas producen endocarditis. En consecuencia, es. conveniente pro* Longar el 1 lempo de incubación más allá del período de rutina cuando ei médico lo solicita. Un problema adicional es que algunos patógenos no generan suficiente cantidad de CO. para accionar el detector. Una maniobra útil en cualquiera de estas situaciones es realizar una tinción con naranja de acridina a ciegas de muestras de los Irascos de cultivo luego de una incubación de 7 dfas o del periodo íninl de incubación, Se prefiere la linctón de naranja de acridina a 9a tinción de Gram porque es más ¡sensible y el frotis se puede examinar mSs rápidamente. BACTERIEMIA f SEPSIS ASOCIADAS CON LOS CATÉTERES Se han adoptado dos estrategias básicas para el diagnóstico de las bactericmias, asociadas con los catcleics: una requiere lu eliminación del cateter y la otra, no.117 La sugerencia inicial para el diagnóstico, y probablemente el enfoque más común aún boy. fue un procedimiento seroicuantilativo.|w En esta técnica, se hace rodar la punía del catéter por la superficie de una placa cte agar y se real 12 a ei recuento de las colonias resultantes luego de la incubación de la placa durante toda la noche. Se estableció una asociación estadíülicamente significativa entre un recuento > 15 1JFC con La sepsis asocia­ da con Los catéteres, confirmada luego por otro» investigadores. Se describieron vuiucioncü a este procedimiento que incluyen el cultiva de varios segmentos del catéter, la sonicación de La punta y et. lavado del interior,236pero la simplicidad del proco dimiemo original atrajo a. lia mayoría de los microbiólogos.

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

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1 06 CAPÍTULO E Introducctón a la mlínfolplügíít Parta ll W t. Élthlsnp flf: iJiwhjjti l l S4fnificaiKC of rjlhcacr apciIruTE* Im u l t¡ml IP77;W.-¡7rSiL ?jM. VakuMtw 1^ SífliiqMnniíMi'r'ínri h m m í m -.fHiiun ir m n iim 11 Iti» Mirrctfib-il in£3L36l79].17W. 2 % : -i ui V lk f k E . rl al. MulthJííitei ¿ i uf f t í Al< [tttrcsf Eriieru*Imi» PCR tttrt *|i|l trtthafnpiiLil [ W ím u fipitevK u|*ti it-rffino mcn¡n-|¡[if. 1 Clin Micmliir'l

11?■. '¿V'rintíin KIF. ft ni dm iral imjH'rfara. p r í idkr^ify-in|; jnsr ^lijih}h>' m d iw -]j !íü Ic w i bk>wl vulTum tVfebHthM uF SrÜBoSeu íf lJ tJnrftí Ovem ipJi f.iram-h.>jlini [land « r n 1 a onnt^lh'niiil refeienL'-F rrdllx'd. J Clin M wfi^ini iv í k iia ¡w z n * # :. .H t W íin= iíKl M í^ fi «I tb í^ U n itu l ^ ^ li|ÍL Jn « fl| [bi^ihc H í -kJ

2r,37. 3 Í?, V m ifevk I. H t i i t t J u n r r f<\ t iw i. líilhL-fc^ii ¡:i.l ifii£A£*UÍ: ítíiH ^irs, A B ) Cfcn E * M tfiiB ;[i^ * Q :w i2 jiM V ks^ Ii A t'i vJ r'- Ltilnfii ■<*> |*,i«[!í: ■ . íi' dml.kjibiLmMi cuiluie :■« hoilxrul pil ■ Iwpdrr;. piK'hiüny fcirfiír/nhíi L W rfH íl:l,[7. in llir K:V>dN'(l l'tW-.Jri'NI. L ili Iñfrt Di^ :iH i'M xrtü}fi¡ ^.AiSiikSIM ' ^'iü Li IT C . rl «I. N j ^ J tu unir n*- a “om Iíc v í 4■r-' c^irin l^ tM i Atfn-i-

|S Fo|| i M(4 2WI «44-11-16 A H .U n g p in iiá i W. ( I j I PrDtliclk hc.nl i-ritat .V El% ) JM n l I^ M 3 ^ 1 D T 4 lí. '<JL.fAi V. ¿C jI. lili: talediljr d ü if jiisíire # ifsi lur eü1> dH KlxM 4l unnii> m u Infrcúm in cHUkh Jiftlucntí-s l9W.lftlrc4l. .^i2 W *tl A. ti al C rtii- J JinLlirtj! l'Í kimpliL i ini? innDjjf jnen. J InTeeL Díl 12; I >jfi-Suppl ÉJ H U . V ¿ lJ A. el oJ. ArrKtivriion v i prni IjI lurf*. ' ^piplr* '■¡" t ' Ijp í 7 ¡h fq-ii|™ lema tic ’.c n p jih c p n M u u N t ig l J M o l 2 0 H U 4 1 :ttl- 4 ». H H . nl.l E R . Sinusirii in chi Idrcn K Fr^cl J M u í I I *■ *2.1. 1). W ol^rfCi. JJi>ip|>fi.k l iine xuafili nj in luulniLiluiy womoi niidtlfjuu iliaa-valdi \cim i*. L-jíirtrfm fiirrt Afln KhiOrí M íí J I'í* u: 1S: | Wi-17J. ¿I Ib. MI.. HajjFCi M. F m ^ iil jq J Jir ih il iir.jxKi oí íilirjH w ri'c Mocd rullu í; LiCícl Üi» JliJl:A.V:JWi-2¥íí. 'fijiinsi jw . ¡rl ni CrtaWtlu'ii--. fof sfrtinm r-í-Wni octtncM rt;':jn. rexf-i ■“itd ¡k w í h x Icm l cj'^iLi-^ iinii «cal« pyrltn*ptnilii ir> n m n Infntniq^ r-ii'H'i’-'' íüí*. i-rly »r ílllS A i Clw W fe rJli I *<»;:■* Í4.%-%K. ,í1)>l W jrrn SS, Alll/n í[> riim rilTvnh'i^Tm cM nilljl^i'ílTj IfirnrL"- i í f ’r('nñ.-.if(TViíii(T ¡TirívliíHi-. i\ ni J Cl'jn FU Ih:| I 'kífi.Hi,.? I y5IH. ,HJ). w j Jw^iL^d JA ll.e i ni. Lkiftr^ni i'l ^ijri¡rWirn tuLipriunJ ty munmícipic fiu m u imt tfDEBW L é M r i Iftftm S JS J j'V . ÍL'J. WuurjLLVijkhíTi li, ISurkc^ I. lirc a i1^ c e Jü ljiJíIjs llI a Lirpc Lmrji:ujJl> Lc^tilD^ I#-kji¡ijI IJs l) | I - ¡irrviru (H 1 liI rfi'-in^'. M ^ liW f rm A iiW lt ) IW h ;í¡ ■*I-H.'¿ I I I . B . j'ir W f , Ssri.l¡ IM- A Sí.iik liI* 57 L iu t üTi.:ljnnfirl'i:íi-iÍL bvlj . >6 ) irarpc.v..ilil^rt^ |u ii¡jI [Yrnjre^.

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El diagnóstico de laboratorio por métodos inmunológicos Anlígenos y anticuerpos: definiciones básicas Anticuerpos m o n o G lo n a le s Tipos de reacciones a ntíg eno-anti cuerpo útil iza das en el diagnostico serolúyico Radones de pecdptoción

Ficción ótf eon$iensniíi e rrtiibbón de la hÉmajiu: rci:iDíi

F t o i enes de agialirauón

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fi/MDS£a2í[rBinmuna:ó3iKsdecapJLra de

ani ¡cuerpos pare ¡a detección de JgM Enzfmoinmiinüanáüas para la rielecdón da antigcnos

Tácnl cas ¿g ¡nmunofínorescencía Técnicas, tíe inriH^BftuürescHtda para

la dfelBCDDfl d i Aligeras Técnicas de imHjnDCuDrescercia para la rfeleídón de aniicuerpos

Métodos de inmunoanáiisis en fase sólida EnzirrairmmBnáliGis para ¡a detección tte anltcueípos

n Isis IcihoniinriciH Je micrafaifllngú clínica, d cultivo de1micmnpini<Miios u partir d i muestras. clin íeas es aún el prsncLpaL método de diagnóstico de los enfermedades infecciosas. Durante la*, Jé c jJa s de [Sí-Ml y 1950 las icenicas serotúgieav uomu la inniuíiíKÜfustán de Ondin y de Ouchlerkiny, creadas en el ámbi­ to lIl; 1:l invehí iyacidn, fueron ünipkiucnl&das en esas laborutnriw- Mus tarde, üc pudie­ ron en práctica ¡atros métodos basados cji conceptos ¡mmunotójEbcrc bíisií*vc, la del complemento paradocumentar en forma retrospectiva li; respuesta inmurtiiitrip. de] Itvtaped u ta infección. L a iLpuriciófl del FadioÉnnitJiionníilisis. el crtzimoininuiiüLüulisji y Lj tocología de los hlbridomas ha modificado por completo el papel de la aerología en el diagnostico de tas tfRÍcniicdi'Jes infecciosas, Mediante el esfuer­ zo de muchos. científicos y personal de bboralorio, los mélíxloü creados oiij; iraímen­ le para la detección de anticuerpos han sido redis.eñíidoq para lograr la detección direc­ ta de ;tn.íi£erms microbianos en muestras de p;w;ientcs. Las ttfcni^is inmunuscrulúgicíM jvllcv+ls ¡han expandido el papel lLl-I tabnrjilorio en lu íacflíiún det paciente y han lugrudo constituirse como herramientas dLugüúüiÍcnsiunplÍÉüiMnijc aecpiadLiis jkjt birxjuímivm y medicus. Sin embargo, estas técnicas tienen su fundamento en ciertos conceptos inmunológieos básicos. Luego de un bteve Típaso de estos conceptos, estudinremos las apSicaciones iníi.s recientes de la inmunoserología en Ea atención del paciente.

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110 CAPÍTULO 3 Eí diagnóstico de laboratorio par métodos trununalógicos

Aniigenos / anticuerpos: definiciones básicas Un anlígcnn es un:i sustancia que induce La formación de anticuerpos en un animal que se inmuniza contra cllu en parti­ cular. Casi .siempre, et unlfgcno es inmunogétiico. es decir, puede estimular I4 loimaciím de anticuerpos, y unirte de mane­ ra específica, eon Ins anticuerpos, que se formaron contra él- N'o todas las estructuras moleculares que componen «n antígeno son igualmente inmunogínicas; las que 3o son y son reconoci­ das por los anticuerpos se denominan determinantes anlígÉ> nlcijat InmunudumijiaateÁ o cpílopos. Las características úni­ cas de coda antígeno dependen de Los tipos y de las secuencias de aminoácidos de una pruteína, de la composición química y estructural de los polisacáridos, glucoproieínas y ácidos nuclei­ cos y de sus estructura". secundarias, tercianas y cuaternarias. Diferentes tipos de moléculas pueden compartir determinantes ¡MU¡genieos y ser reconocida por anlicucipw dirigidos contra esos determinante*. Pur ejemplu. lu porción C l de h cadena liviana de « ñ a s clases de inmunoglobulinas íse analizan más adclantej contiene determinantes antigénicot; comunes i|ue per­ miten que sean reconocidos por lo* mismos anticuerpos. E.st.is combinaciones untígcno-anticuerpo se denominan “ nrucúvidad cruzada'’. Las. reacciones cruzadas, de los anticuerpos con antígenos comunes o muy rdacionudtK pticden ser de importancia ctínica en algunas enfermedades, Por cjemirio, se considera que la lesión cardíaca que ocurre por la enfermedad cardíaca ic Lunática puede estar relacionada con la reactividad cruzada de los anímenos, de superficie de Jos estreptococia |$-tiernolíti eos del grupo A y varias porciones antigéníeas del tejido del miocardio. cl endocardio y las válvulas cardíacas-, det wculcnui deí miocardio y del músculo n ijv d ílic o {■véase cap. I 2 )_i*u^ En este imidck», lus anticuerpos que se demarro!tan durante una faringitis estreptocodea aguda pueden luego unir­ se a estos epítopos det tejido cardíaco con reactividad cnimda. lista unión activa La cascada del complemento, fo QtlS da CÜÍT10 resultado un darlo al músculo cardíaco y a los tejidos adya­ centes. mediado por el sistema innmuitarin. Se comidera que un mecanismo similar conduce a la glnmerulonefritis posesireptocóciea. Los anticuerpos producidos contra los estrepto­ cocos del grupo A “ ticfritogénicoi" pueden, reaccionar contra y) tejido renal y causar dáfiu glomerulat: de hecho se descri­ bieron muchas similitudes entre los estreptococos del grupo A y el tejido renal bumano>,st Además, Los anticuerpos monoelonales producidos contra el tejido glomerular humano tam­ bién reaccionan en forma cruzada con algunas prntefnas M de los estreptococos, del grupo A, lo cual sugiere que los meca* ni si nos de patogenia de estas secuelas posc^rreptoeócicas rou similares.'1 Los anticuerpos pertenecen a un grupo de moléculas de glueoptotcfnas relacionadas cstíuctwalmcnre que se llalla» en la sangre y en loa líquidos extruceluíares conocidas en sw conjun­ to como inmtmngjijbiilinas (Igi. Estas moléculas Min produci­ da* por b linfocitos B que eupresan Ig de una única especifi­ cidad unidas a su superficie. Cuando los receptores antigénicus de estas células encuentran cl ligando apropiado, los linFueitus B proliferan y comienzan a se^retai anticuerpos solubles contra el antígeno diana. Las células plasmáticas producen, en forma individual, grandes cantidades de moléculas únicas de anticuerpos que llenen la misma especificidad «te unid» al antígeno. Ademán, algunos linfocílos U funcionan como célalas proccsadoras de antJgcnns, que presentan luego Les atttígenos a los linfocitos T, estimulan así la producción adicional de anti­ cuerpos e inducen la respuesta inmunitariá celular, - I_a génesis

de la respuesta inmunilaria humoral y celular y las interaccio­ nes que derivan en la producción de anticuerpos específicos están más alM del alcance de este libro y pueden encontrarse cu otras fuentes abocadas a la inmunología y La mmnnogcnctica,J* Las inmunoglobulinas (Ig) pueden dividirse en cinco clases basándose en su estructura; IgG, Ig M , IgA , Ig l) e Igl" (fig. 3- 1)- Las moléculas de IgG tienen un peso molecular de alre­ dedor de 150 kilodaltñiis (kDaj, e.stán formadas por dos cade­ nas Livianas y dos cadenas pesadas y tienen dos sitios para la unión del antígeno espednen (.siltos Fab), La regk>n (te la molécula que no >e une al unlígeno. compuesta por porciones de 3¿js dos Cadenas pesadas, ht denomina légiiítL Fe. Lil-, molé­ culas de dase IgG son transportadas a través de La placenta en forma activa y proporcionan nn mecanismo de inmunidad pasi­ va si recién nacido en un momento en el cual sus mecanismos imunitarios están aún en desarrollo. Las IgG >e dividen en cua­ tro subclases; ígGr IgGr lgC 5c IgG^.^ La IgG, es la principal inmunogldlmilina del suero y puede fijar y. en consecuencia, activar complemento. IgG» e IgG. son las principales inmunoglobulinas que se producen en respuesta a los antigenos polisacarillos y. por consiguiente, a las bacterias: cncapsuladas, como Srtffiíoi t'Lcets fMcurjHnime y fiitvnwpk¿ftix itijluenzuc tipo b. La IgG se produce en mayor cantidad durante 9a respuesta inmunitaria secundaria y es muy tm|jnrrante en la neutral ila ­ ción viral. Las moléculas de ígM tienen un peso molecular aproximado de 9Í0 kDa y esián íorniada^ por cinto montane­ ros, cada uno de los cuales se u5K¡nteju a una molécula única de IgG. Las cinco estructuras monoméiiens se encuentran unidas unas con oiru!> :i través de puentes disulluio en la región Fe de cada monómero, y por una molécula de 15 kDa llamada cade­ na J. necesaria para la agregación de la estructura pcntsuitéric a ,1' La IgM es ia primera clase tle inmurtoglobulina prodtici«la pur cl feto y Ja primera en aparecer en la circulación luego de una irmuni¡ración o infección.1* Esta especie de anticuerpo tumbicn tiene La capacidad de fijar complemento, La aparición de IjíIVÍ en sttent es transitoria y su presencia "-uclc indicar infección rccicntc. Sin embargo, las icipucM » de IgM p«c«)en obwrvjirse durante la reactivación de infecciones virales laten­ tes y durante Ior fenómenos de reinfección con el mismo agen­ te o eon aquellos cstrectiaiiwnie relacionados.”* Además, Ins uuücuerftaut IgM pueden peisiMic durante semanas y meses, según la capacidad inmunogeníea del agente y la inniunocompelencia del huésped. A diferencia de la IgG, la IgM no atra­ viesa La placenta, de manera que la presencia de IgM contra un agente infeccioso (p. ej.. rubéola) en la sangre fetal o de cordón indica una infección adquirida en forma congcniu u pcrinatal. La IgG aparece en suero a las 4 a ó semanas de la infección y suele persistir (oda la vida. Los anticuerpos IgA se pueden encontrar como monórneros ( Ifil) kDa) o dímerus t^íXlfeDa) y repreíientan alreded«»r del 15% del total de las ininunugkibulitta* séricas. La IgA es la principal clase de anticuerpos que se encuentra en Ins supcrficics mucosas y en las secreciímés- e^lnicclulures tp. ej.Hcalostro, saliva, lágrimas, mucina y secrecio­ nes de los aparatos intestinal, resprmtonsí. y gcnilal}, Líi IgD presenta una esiruciara nimilur a la IgG, eon un peso molecular de 175 kDa y comprende sólo alrededor del 0.2$' del total de las ínrmuuoglobulinos séricas. Esta clase de anticuerpos se encuentra principalmente en la superficie de los línfocitos tí inmaduros y actúan como receptores celulares de antígenos. La IgF es una inmunciglobulina de 190 kDa y en el suero sólo -e encuentran rcilos de ella. L j IgE Se une a lu í HiastOCilDS y basófilos de manera no cw aknie á Itavís de su región Fe. La unión del anifgeno a Ea ígB activa la desgjanulación de esas células y conduce a ta síntesis de mediadores pepiídieus Lie

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Anf¡qu¡?rpos niDriüÉLir; Lilúi 111

3 - 1 C a i c s J e iiiic r jiiü u lu K i ílilj» h u n o ji^ ji. L i a j.íiIilLh:i|7u& jic íIc ih x l : i j e íf lr t i eU lliftl r r i z A l t i i J c ^ y Ju j:l m.iiíjLl- -,. iÍ.‘-ILii¡LilI'..ií1j-. ]j¡Ci_ ]¿ ¡M . Ip A . EgD c I l E La iirikLut cscnK.tijr¡i! Ntiieji dt ífr- miíinkns de cadi tlasí CflflstSlf tn A.Vi i^iíís de |*JLp¿fíiii3fH (doi cafenas p e ^ y »r puenr^ lS¡>uíÍu[..¡, y o jl! ¡ i ú n iJ jil p r f s f ii'.i lIu s m Ijiis ác uiuf'm j.1 AJ^uiulia 1l|h>i Je l|! L Íc ik il □ t f ü i li!M '|x i:¡l':i(c s Q lfliL 'U llu J ti lLj.i£rrui J c ú IjJ-VE. p ie fu -u L'cHnpUfKD-

Figura

Ic m iE lilr ETb l; A |

hipeise nubilidad, En consecuencia. los an,Eicuenx*¡ Ij B cum­ plen un papel |3rinti|ial en las reaeditnes alérgicas fp_ ej., anafilíiAiá). Estos anticuerpos tajnbián puede» estar elevados en cJ suero de manera transitoria o persistente durante ciertas infec­ ciones intestinales por helmintos.6* En el laboratorio clínico, el diagnóstico seroklgico Je las infeccione* causadas por hacíerias. virus, hongos o parásitos se Iüjíííi a través de J,t delccciún de anticuerpos específicos en las rnucslrus de sueri) obtenidas de los pacientes. Coma ya se men­ cionó* la IgM es k primera clase de anticuerpos que aparece liie^o de una infección y. en con‘¡tenencia, el diagnóstico serolúgico de ana infección rceicntc puede lograrse mediante la realización tic una prueba específica para IgM sobre una mues­ tra única de suero obtenida durante la fase temprana del cureu clínico de la erjfermcdnd. El diugnósEien de las infecciones recientes también puede realizarse mediante la detección de anticuerpos de tipo IgG en muestras pareadas, La primera muestra debe obtenerse dentro de Los 5 a 7 días desde la apari­ ción de Eos síntomas, mientras que la segunda muestra se toma durante la convalecencia dentro de las 2 a 4 semanas posterio­ res, Un aumento del titulo de anlicucrptis de cuntrn veces o mayor entre En muestra del período agudo y la de convalecen­ cia .sugiere infección reciente o intcncurrenle- lil título de anti­ cuerpos se define como la inversa de la dilución det suero que aún da un resaltado positivo que indica la presencia de anti­ cuerpos. Por ejemplo, si la dilución reactiva mis alia de una muestra obtenida durante ta fase aguda es de 1en R (Eludo de É) y La muestra de la convalecencia es reactiva hasta ana dila­ ción de 1 en 64 (título de 64), la segunda muestra presenta un tíiulo Je más de cuatro veces. el de lu primera (S x 4 = 32, y M > 32). Este aumento sugiere que La infección ocurrió en el pasa­ do reciente. Lu utilización de un aumento del título de cuatro vetes para señalar infección reciente se basa en la variación normal de Ja prueba y se manifiesta cuando se analizan ¡as

muestras de la fase aguda y de la convalecencia con el mismo ensayo al misino tiempo, Se pueden analizar muestras únicas de suero para determinar el estado inmunitario de un individuo frente a ciertos agentes (p. cj.,. rubéola, varicela zósler); en estos casos, la Tvalización de ]ji prueha pnede incluir 1W solo los controles positivos y negativos sino, además, otros sueros de reactividad conocida que Miran como calibradores para la interpretación de los resultados* El di j i ' iiómícu sCrúliiyieu de las entenrtCrdades infecciosas es distintivamente retrospectivo, dado que dehe haber transeumdo algún tiempo entre la infección con el agente y la presencia de una respuesta inmunilana delcctablc. Sin embargo, las prue­ ban scrológicas ban ampliado su alcance at incluir no sólo la dclccciúr de anticuerpos en suero, sino también ta detección de uTuíycTiiLUi en diversas [íjm> .*í de muestra, Hn el t ísk >del capitulo abordaremos en términos generales los mátodas de detección üenulógica de anliciKipw; y de antígenos. Las aplicaciones específicas de estos métodos se analizaría en lo* capítulos siguientes.

Anticuerpos monacloftalñs Los antígenos constituyen un ''mosaico'"’ de determinantes antigénieofi dada su nal!irale/.a de maLTUvmüItfeulaH Can estruc­ turas primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. Una consecueitcla natural de los principios y técnicas de la ¿enología bási­ ca, ha sidLs el intento de '‘¡iurifit-ür" anlíjjcntjs para redimir la hetciogcneidad de los anticuerpos que se desarrollan contra ellos. Raru ve/. se encuentran moléculas de antígenos con un ■único epftopo; por el contrario, pueden ejíisrit cientos o inclu­ so miles de posibles determinantes antigénicos sobre ta super­ ficie de una célula o dentro de una mezcla de otras sustancias. Cuando eslas mezclas de antí^cnus se inyectan en un animal se

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112 CAPÍTULO 3 £1 UiapntailCD di laboratorio por métodos inmm&ioskcs estimula un número equivalí me de clones cte lmfocilos. A pe­ sar de que cada clon produce un anticuerpo especifico. el rebul­ tado es una mezcla muy heterogénea de moléculas de anticuer­ pos, cuya especific idad y afinidad a menudo se desconocen y es difícil de controlar en&t los diferentes lotes. Cuando estos antísueros poligonales se utilizan en los. iiMemas de ensayos inmunoldgicos concernientes a agente* infecciosos, se puede observar «actividad cruzada porque los determinantes ¡unigé­ nitos son compartidos por diferentes especies o las mutacio­ nes pueden haber llevado a la evolución de epüopos lo sufici ente mente relacionados en especificidad para producir reac­ ciones cruzadas detcelabLcs. Los intentas para producir anti­ cuerpos puros u través de En absorción cun antígenos que gene­ ran reacciones cruzadas o de preparar ant isueros ^clónales" a partir de amisuems “poticlonaJes” por medio de técnicas como la cromatografía de afinidad en columna, han tenido éxito sólo parcial A medida que la ciencia de las pruebas serológieas tac evo­ lucionando. se vislumbró que la disponibilidad de un anticuer­ po con alto grado de homogeneidad molecular y con especifi­ cidad para un único epítopo anligéimco sin reactividad cruzada resolvería muchos. de lo* problema* encontrados en La utiliza­ ción de los anticuerpos |*)líekniares, Los antlcuerpoi ntonotíoualts, el producto de un único clon de liníbeíios, subieron gradualmente como un subproducto de las investigaciones sobre fusión celular y de ¡as técnicas de producción de hibridornas desarrollada* por Kohlef y Mihtcin f' Gracias a su des­ cubrimiento, boy es posible aislar líneas clonadas de litiFucitos individuales que producen molécula* de antícuerpus únicas y monoespecífk[u¡. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales hacen referencia a especies moleculares de inmunoglohulinas uniforme* y homogéneas en Lugar de a una serie heieragénea de inmunoglobulinas, mino la que se produce durante 9a respuesta inmunitario. La característica principal de esta téc­ nica no se basa en que se puede realizare! aislamiento de una linca única de células que producen anticuerpos monoelonales, sino que esEos linlucilos de ratón pueden '"fusionarse "eon wlu]as de n lie loma de niLÓH p.ua producir células híbridas con don propiedades inherentes; 1) la capacidad de producir anticuer­ pos monoespeeílicos (adquirida de lo* linfocitos parentaJesj y 2} ta capacidad de crecer en forma permanente en cultivo (La característica de "inmortalidad" adquirida de las células de mieloma). Por lo tanlo* los aislicucipos monuc fonales indivh duales pueden ahora producirse en fonna continua y casi ina­ gotable. Lu pnKlucciún de anticuerpiLs monoclonales involucra los deie pasos que se enumeran más adelante. En el recuadro 3-1 se encuentra la información adicional y Ion deinlles con relación a estos pasos; 1. Selección del anJijean (no es necesario que este puro}. 2. Inmunización del animal. 3. Fusión de los linfocims espíemeos del animal con l;is célu­ las de mieloma. 4. Purtnación de los híbridos productores de anticuerpos. 5. Clonación de tos hibridomas aislados desieodo^b. Cribado de anticuerpon mediante la m ili/ación de técnicas de selección. 7. Producción en masa de anticuerpo* unonw tonales. Se han producido anticuerpos monocionales contra muchos antígenos clínicam ente relevantes. pero las aplicaciones actua­ les de chiiví an 'iene ijhk son demasiado numerosas para detaliarlas (n¡ttí.tDI Lm microbiólogos deben estar al día cun las f)Ublic.jLÍune?i itctuaiizada> paril determinar qué avances en Cila

árta pueden sér útiles piífd aplicar en sus laboratorios. Se han desarrollado ¿jfttkiiefpo.s munoclonales p¡«a una amplia varie­ dad de virus,, bacterias, parásitos y hongos, que se utilizan hoy para preparar reactivos y conjugados que forman parte de muchos «quipos cte piuebas de inmunofluorescencia y enzimoiníntinoartállsis comerciales. Además de ta detección direc­ ta de las estructuras anügénieas microbianas ip. ej., polisaeáridos capsulares, antígenos ck proteínas de membrana externa), ¡os anticuerpos rttortoelonalts hart sido también desarrollados para la detección de Los faetones de virulencia producidos por los ]nicrooi^anísmost como las ios mus generadas por las espe­ cies de Sfrigeita, las fimbrias que median La adherencia de Escherwhb cali uropatógena. las enEcrotosinas producidas por algunos seiotípos de E. cvli y las toxinas A y B producidas pur Ctaslridium éijfirite, entre otmsrJ,-UJVJ)!f-líl Ésta estrategia introduce una manera totalmente novedosa de m irar la relación entre los microorganismos y las enfermedades infecciosas. En lugar Jel enfoque convencional de la detección e identificación de- Iw microorganismos* estos i cacti vos permiten la detección específica de factores de virulencia que pueden estar comparti­ dos por varias especies bacterianas asociadas eon un conjunto de síntomas determinados Por ejemplo, puede ser más impor­ tante comieer que una Eoxinu entéricu es l.i causa de la diarrea hiperosmóLica que recibii la in Formación de que el paciente está infectado por especies a Shi%ciht o por una cepa de E. cotí enteroroxigéniea.

Tipos tie reacciones de antigeno-anticuerpo uHtizatías en eí diagnóstico se relógico Feactiijnes dp precipitación

E l tipo hiLsico de reacción ant ígeno-uutieuerpo es la reacción de precipitación. Esta reacción se presenta en los Eternas de ensayos que permiten que la libre difusión del untÍEcpo y del anticuerpo enfrente a uno con el otro, En sm punto critico de mtfltíaí, en que las concentraciones s^n óptiifias. m: forma un [i iecL 111tado visible compuesto por amí^enos y muicuerpos combinados. En un sistema de difusión simple, el anticuerpo se incorpora en un gel de agar dentro del cual se difunde el antígeno, En el métalo de inmunodifusión en tubo (üudin), el antígeno se siembra sobre ei agar que contiene el anticuerpo \ se forman una o más lineas de precipitación en las zonas de equivalencia. "'B n La ifliflunod(fusión, radial. se incorpora el anticuerpo en un agar que forma una capa sobre un portaobje­ tos, Luego <e coloca el material que contiene el antigenn den­ tro de uu poci lio circular curtíuloeii el agaiV Durante la iricutaicíón el antígerto difunde denlro del a¡jaf > forma un anillo de precipitación. El cuadrado del radio del añil lo es directamente proporcional a la cantidad de antígena presente en el niaicríal de estudio, L’tilizando una dilución seriada del antisuero es po­ sible deienninar de manera semieuantitatun las coneemraciones de ¿mlfgeiio comparando Sos diámetros, de la reacción de precipitación producidos por una solULión de jjilfgerwj de con centraeión eorkoeida con el diámetro del anillo producido por la solución en estudio.*11 ' El procedimiento de mmwnodilición convencional uidi/ado con nmyoi: frccuítV-'ia th l.i dohle difu­ sión, En esta técnica el antigeno y el anticuerpo se colean en pocilios adyacentes y se difunden uníi hacia el oe™. Luceo. se forma una línea de precipitación entre los pocilios cuando se alcanzan las concentraciones de equivalencia lai doble difu­ sión puede requefir una incubación de hasta 48 horas antes de obtener un resultado interpretable. La contruinniiunoclcctro» foreste (C IE ) utiliza la técnica de la doble difusión, pero apli-

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114 CAPÍTULO 3 El diaQncsilco cte latí óralo rio por méta oes Inminológlctn ca una corriente eléctrica que pa&a a través de la matriz de suporte de agLirosa para ucclcnirla migración del anlígenrj y del jntkuerpo uno hacia el oír». Estos métodos pueden utilizarse tanto para la detección de anticuerpos como de antéenos pre­ sentes en los. líquidos corporales. Una precaución para tener en cuenta durante la realización de tus procedimientos de precipitación es reconocer la posibilidad de reacciones falsa* pegarías debidas a Ins fenómenos de pro zona o postzona. Si el anticuerpo se encuentra en exceso {es decir, en unaconcentración demasiadoelevada en relación con el antígeno disponible) tiene lugar Una reacción falsa negativa íprozunn) porque nu se establecen los entramados moleculares que forman el precipitado visible. Por et contrario, las reaccio­ nes de píjstzona ocurren cuando el amígeno se encuentra en exceso y se saturan las >iik »s de unión del anticuerpo con nutígenu, de manera que rtu mí forma el entrañado molecularcara-temtico de la reacción de precipitación. Cuando se prevén altas concentraciones de antíce no o anticuerpo, se pueden evitar los falsos negativos debidas a los fenómenos, de pnv/irta y ponzo­ ña, le^peeilvámente, realizando pruelra repetidas eon dilucio­ nes dríadas de Ias muestras. La zona de equivalencia se define como el rango de la relación de reactivos t|ue du como resulta­ do la máxima precipitaeióoi dé |o> antigenos v Iüs ¡ulicCuCrpusi. Todos los métodos descritos anteriormente fueron mil izados para la detección de antígentís bacterianos en líquidos corpotales,, con» el liquido ccíalorraqufilen (LCR);, sin embargo, la C IE fue cl único método aceptada en la pnklica clínica debido ll la relaLiva rapidez. de la prueba (3Ü-6ÍJ minutos), No obstan­ te, aun este método lia sido reemplazad» por los procedimien­ to* de prueba rápida de agluíinaeiíin y tle eoíiglutinación i víase trufa adelante>. Los híítodos Lie doble difusión se utili/an toda* vía como avuda paiu el diagiiósiku de infecciones fúngica* sistcmicas, sorna aspcrgüosis, blastnmi cusís, hisíopla&inusis j coccidioidomicogb íp. ej.r pruebas de inmunodifusión para hongos |.J"M bn la inmunodiItisión para hongos» se hacen tracclonar l<* antígemvs purificados a partir de los patógenos fúngjeos sistemicos con los sueros del paciente y de los controles que conheneq nntji'ucipcK en trisa prueba ele doble difusión. E5 desarrollo de líneas de precipitación de identidad con los sue­ ros de los o m lm b positivos y con el suero del paciente indi­ cáis la presencia de anticuerpos ajitifóngicos. La presencia o ta apseiqcia de ciertas» bandas de prccipitLiumn (p. cj.„ bandas H y M observadas en la infección por Hiaiopiamia cüpmfaíum, bandas ¡uitiantígeno A en la infección por fíiflstctwtycex ríentmtiírrfi.i3 pueden tener dignificado diagnóstico y prandstico para cl iraianiienLO-"™ ■ “ Si bien estas piuebas. tienen alta especifi­ cidad. presentan una sensibilidad inadecuada j un utilización ha sido eclipsada por nuevos métodos serológicos íp. ej., detección de antéenos, radioinmunoanalisis, aglutinación de partículas de látex, enidmoininunoanálisis) v moleculares, íamplificación de ?e«a)aM w w i.m .ie La. mmunodifusión también es la base de la prueba de exoantígenns para, la identificación de patógenos fúngicos sistémieos. En este método, se aplica ana mezcla de agü¡i y Merthiolute* durante algunas horas sobre el agar en pico de flauta- El extracto acuito obtenido se concentra y se hace reac­ cionar en una prueba de doble difusión con aniiüuems contra tí, capmbtntm, H. dvmatiúdix, C. imiuitis y especies de Aj/trrgüias jumo con lo* controles de antígenos adecuados. Traü 24 horas de incubación se examina la placa de nimuniMlifusión para delectar las líneas de identidad ent/e el extracto micelial. los ariisueros fúndeos y Sos antigenos control para cada microorganismo. 15A pesar de que püc método aún se aldiza para la identificación de patínenos t'Cngicns sistemicos, la disponibili­

dad de sondas de ácidos nucleicos para estos agentes propor­ ciona ciertas ventajas, como la ul ili ¡Eadón de Colunias más nue­ vas y me nos maduras, resultados coa un valor de corte más cla­ ros, un tiempo total de respuesta del laboratorio más rápido y una identificación específica, ríWJQ,-,w Filadón del cúmptertieistD « lnWWel6n

la he ¡nagiull nación

Durante las últimas tres décadas, los métodos semldgieos para el diagnóstseo de las enfermedades infecciosas han cam­ biado en forma significativa. Los métodos más antiguos inclu­ yen la ÍSjatJón del complemento (F C ) y la inhibición de lu hem iíglutinacion ( IU A J . 17*1 M Arnbas pueden utilizarse para La idmlifieación de antigenns virales (cu general, para In idcnTifl-

cación de virus en cultivos de ¡ejidos) o para detectar anliclaerpub. en el suero de tos p¡tcicrtlu y ers otros tipos de tnuestias (p. ej., LC R ). E l |ifi:r>ctpÍo de la prueba de FC es bastante sencillo (fig. 3-2), Para
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Tipos do reacc ones antfgs no-anticuerpo utilizadas an el diagnóstico serologEco 115

Etepa 1

KA

o

Anticuerpo

o

© Comptamento

Antiftefií)

{Unión Arj'Ac)

[Ein unión Ag^Ac)

o

i

o_

H C£)

//*

Complamento

Fijada

ñ

Cnmpkemanto

no lijiLücí

<9

ELapa 2

Erodios ceca&leitos da ■intküDi'poa

Vi&ta macroscópica

del fcndff dpi tulw

doñee se reame

Sirt

riemCli&ia

l-i prueba

Vi&la in.n:rci5cép¡HJ He molisis

del fondo del tuDo donde

lg

realizó

la prueba

Figura 3-2 Pmehci de jijaciíwi del complemcnio Jin Ii etapa, uno w mcrcUin amígen*». SHiikiicipci j complemcnm Si rt armígenn y ct ¡KiCiiii muy |xx;¡i% >inin^inkj célula Müliincnbi•

ihi en el venentdeL ífind» deí llihn, Agtác: íwiHjjeriíí-iinilifneipti Kedi1»uj*ti>de Letand US, Címicíl Viniicigy Rlidelfp: Sau-mim, 144*

medíame Iíl (Sdciminatirin «.te ur» aumento de cuatro veces o más lid título de anticuerpos que inbitic la capacidad del virus de ujiluLinar a lus crilruCÍUK- A pesar di; que la deicecititl de anticuerpos antinubíota y oirás agentes viriles se realiza ahora por medio de aglutinación de partículas de ldtcx4enzimointrmnnanálisis o mniuníjfluorcsecnd a indiiccUi cth la mayoría de los ii(»s|)jtules, la ]||a adn ve Lulltaa en algunos laboratorios de sul liJ p úl11iLa v de referencia pora vigilanda y diagnóstico (p. cj.. aerología para Ftaviviridac, Bunyaviridac, al fuvirus}.1’ 1El pnK«d¡mlct!ln de la IH A se deücribc en eJ pmhKitlu 3-2, ReacrciDnes de aglutinación Las reacciones de aglutinación se pueden definir eonno la agregad fin ¡nmuiKjqufmica especifica de panículas (etitrodiw . panículas de láte*. eslalllococos) recubíertas eon antígenos i>eon anticuerpos que pueden ulil izarf-e pura iteieeiaf anúcuerpui o antigeno^ suJulíki. respectivamente. Lira anli^enei o anticuerpos están unidos a cst*ü panículas por fuerzas elcelricas iEiiiátnoleculares o por medio de uniones covalentes. !-■ agrulinücirtn de estas panículas portíidfi'ras opera como un indiCttdür de Sasirneracd-unes anlí^eno-Emlicuerpu tienen ]u^ar

?iobre 9a superficie de eí,n.>H ponadmes, En un principio ye licílizabun lus critrtK'iuw tom o píprtnd<.irch. Estas células tenían que ser ¡ratadaíi. can icidci lúnicu u niruj> ügcnles pjtrn esLahilizúi sus jnembranas y luego formolizadas para aumentar !a absoreidn no especitiea de pépiidos, proteínas y poSisaciiridos, Hor ejemplo^ en la pnteba de hemagüittinación pasiva í l ] H A } para la deiecd^n de anticuerpus de ruW nla, los eritrocitos son Lraljdüb con rormaldchído-pinivalo aldebfdu para que el virus de la rubéola pueda ser adsorbido sobre la superficie
moléculas, de IgG- ¿-«s aiiií"en<w, utrucj Uw pt]]iünc¿ridu* e«n>plejos y las proteínas, podían lainbién unirse a las esteras de a trav6 i de Icts gnipos sulfato que están presentes en su superficie como resultado tlel proceso de fabricación. En la actuLLlidad, las esferas de látex son las portadoras m is uliliza-

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116

CAPÍTU LO 3 El dia^nási iCe (te laboral í rid par mÉ tedas ir muñológicos

00 o O o °

q ■Anticuerpos

í

1

(Unión Ág/Ae)

•H,

V'líus hemagxj&nanie vivo

(S¿fl unión Ag.'AcJ

1

Q

A

A

o

Etapa 2

[Vista macroscópica

(Visia macroscópica

dtíi jando üéI tubo

del (orado lJi.-i (g&a donde se rapizó la prueba)

dondo sú rearmó ia prueba) Sin hemogluEinacián (irihl&iciárt de fa beirviglut nación)

M#magíutmad*n

Figura 3^3- | j jimrfsj dr mliihidín ifc Id heiraplriEruciiin w realista rr i* » crpp,n, En ln ™¡ib¡ uno. se merdan v¡nn bfiinagIsrinunifs y uiitcutriw . En la trapa la h c i ’M g . h ' t i l U h ' i f t l -ite IüM c i i t r w i H H . S i n i Id L ^ L q ia lÉibft U n A M iC la C if h i^ n u m- mthtm n I"'- ' i n i s n i m i p v r r T u i n r c e i i ¡ i d i t m y ^ ¡ . l u h n i u i le w m l n i c i h i i r n l a c l j p o i l n x . L j j h e m a g l u t n i . a í t A i i a p u e v e v m i t i n l iu i:ji|xi u "■cubierta” Je pequen^» ¿{¡«gado». en ¿1 í m i J o Jd tuba. Lj > oíhild» no «plutLiiAij»- bfldlnsenum fonudifefo un hnuti en ¿1 üdivo dd fondu dd iut>n. l J í j í , s t f a ^ L i c ji a n l u s c í k l í i K .’ i l u s . S i c r t ] ¡ i c l a ¡ u i i m i Un» • u i i i u i l c f p i s i * * l u t £ n a I l i s v i c u s , ¿ s l i i h m u í i u l i j f c i i b i K y J h t p u e J c n ] T i * U i t Í r

Ketlihujii5¡:i a? [jc tir K in S í ’ SirLcal Yim Jngv. Kíl-PJlelEií: S ¿'iuiiJítk.

djiütn lus ensayas de jigluiinaeirtm. Las pruebas de aglutinación de partículas de látex suelen realizarse sobre portaobjetos o im­ pelas de cartón rccubicrtas con plástico. Las esferas t&e láiex TVeubiCrtas dútl unticuejpos espeeíileus ¡asn la base Jl' las prue­ bas de aglutinación de partículas fie láte^í pira el amigeno tle criptúcucn* (C A LA S1 -*, Merulian Diagnosite, Cincinnaii. t i l 3; f r y p LA lniemational BiologicaJ Lahsr Cntnhuiy,. NJ: Pastoras Ciy ptwuceui'11. SanoH-D iagnóst ica PaHteun Mamcsla-Cuqueite, Francia}, los enrayo?, de aglutinación de partículas pana la detección dircctn ule cstreptoeneo* Je I j;nip;> A en mues­ tras Je hisopado faríngeo, productos, comerciales para el agru* pumiemo serológieode lo* est teploc neos [i-bemol Í! icos ÍP e j, Streptex , Abtoott-Murcx, Abbott É3iirk. EL) y equipos utilizados para La detección Je anlígentts capsulares Je bacterial en rOüChtros Jl' LC R y suero.™*-*4**11"-11' Las partículas de látex línnibiín pueden conjttcnrsc con aniígcnos y, por lo lamo, permiten utilizar su aj¡lulin;tdíí»l pan Ja deiecftón cu5íIÍtpiÍ!Víl de aniiLuerpus. Se 4_-fiiiieruiu]i/.LLii equipos de aglutinación de partícu­

las Je láte\ para la Lleiecetón Je anticuerpns eontra diversos Liücnlcv entre otrns rutihulu, CLttimegaloviritsy virus de U ^dúceta ióster.'"l|,:j'1' Estas pniehai son eunienientcs. ripidaSp l'áetles de realizar. Jetee tan anticuci-pus de EipL»s leCü e IgM y son hasiante coniparaHild^ en sensibilidad y especificidad eon otrosí métodos de detección de anticuerpos. I.as pruebas de ug1uLinaei«m de partículas de lálex se u[ itizan principal mente pyra ddcriuinar el csEeuío ínniunilitrion atitnnie pueden Ecner ¡netwr validez en Las mircstras de suero que pneseíitaii títulos L'ercurms, a| nalnr Lie ciarte que suele ■separar el esLadu “ inmune" Je l "no inmuneH,llJ I-' Liís esiufdoúüCós lam inen imedcn utiliicarse tumo agentes pcirtuduras. Llis cepas de Jf^ifiv/O Tcdíi miren* (p. ej., ATCC 1249S i tienen alto contenido de profeína A en la pared ccLuhir. Hita prtiteín-1 puede u n ir en fo rm a e sp ecífica la región lrcde b l¿ t’r ) Llejar a Las regiones Fab disp4>nibles pant unir al ^ntígeno.41 Debido a la naturaleza de la proteína A \ ;i su inEeraeciini eon las moléculas tic ígG cdfiio un |.M>ri,ad
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Métodos do inmunoanáii sis in i&se sólida

glutinación de estafihvoeOH. se util¡í¿a sobre iodo para la detec­ ción, de antfeerHW y es el método empleado en algunos equipas cuiillj Jales piiíci et ajíropatnicnto seiuJó^ieo de los cstorptoco* eos fl-hcniolLLeos.--1 Después de realizar la extracción de antígemos desde los organismos por métodos químicos o físicos., se mezclan los estail loeneos recubre rtos con ¡anticuerpos con dicho «xlráelo. La aglutinación visible de los estafilococos indica una pincha positiva/' Las prueba* cihiijaíííiIus de cusí* glutinación se encuentran también disponibles para la confir­ mación de los cultivos tle Neisseria gnnarrhnrae íPhadebaet GC Monoclonal Antibody test5, Karo Bio Diagnostica AB, Huddin^t. Sueda: Cojjogen F . New Hori¿ons Piapiostics. Columbio. MDr.*”5 Las reacciones, de aglutinación son mas sensibles que las de precipitación dehidn a 1» naturaleza directa de la ¡interacción antígenn-portador-anticuerpck Dadas; la sensibilidad y la capa­ cidad de producirá en diluciones mus elevadas, permiten la rea]j/.acÉón de medie iones seni ¡Luán lita! ivas de aOtíjieti-nSi y anticuerpos. B» el caso de los. anlieuerpos, los resultados semi* cuiiniTuitivos se pueden obtener determinando la mayor dilu­ ción del suero que produce una reacción de agí urinación visi­ ble. Los cambios en los títulos de aglutinación en lav muestras obtenidas durante Su fase aguda >de eomalcccnda pueden pro­ porcionar tm di agnóstico seroldeico retrospectivo de ñutiera similar a los métodos de FC o ÍH A . ^ Para los ensayos, de determinación seinieuamilaiiva de U* concern:radón de anl fíe­ nos, ve puede comparar el titulo lina I en una muestra de un paciente (p, ej-, LC R ) con el titulo de ¡aglutinación final obte­ nida paru diluciones seriadas de luij, preparodón de Un ajilíeeufi de concentración conocida, Los. títulos de muestras seriadas pueden leuer una i nfluencia directa sobre la arene ino del paciente y su manejo clínico. Por ejemplo, en la mertiti^ilís por Cr\piiH o- t'Mí ticofonnanz. los títulos düuiecicJHes de antéenos poUsacárulrts capsulares en LC R esü.n di red uniente tu lacinia­ dos con la respuesta terapéutica ,J l’or el contrario, el aumento o la persistencia elevada «.le títulos tle antígenos son un marca­ dor de peor pronóstico que indiea infección |Wis isiente. leLOntntC o recaída. Olro cipo de reacción de aglutinación es la base de uní lée­ me a denominada microscopía electrónica inm unilaria íM E l)* que se ulilt/a para detectar en tbnna visual agenies virales que no • ’ •£*pueden cultivar. como el virus de la hepati­ tis A y algunas de los nueu»s agentes de hepatitis en muestras de tlltradi.fi de heces. ■ ' Se mil izan anlieuerpos ant ivirales específicos para producir la agregación de los virus; estos a^re^adn^ se observan por medio del microseopinelceirónico mas fácilmente que los \\tjones dispersos individuales- La aglegación inmunoespccífica de las partículas sil ales- aumenla la detección por microscopía eleelrónica de los agentes vítales líHl a I 1NM) vw<s y permite en consecuencia la detec­ ción de títulos i;m bajos como IIP u 10" panfculaslmL de llF irado de heces.

Melados de inmmoanáffsfa m fose sólida Endmolnniuiouialiste para ta detección ds anticuerpos

El “ inmuntunálL^is cu Cjisc sólida" hace referencia a la unión del ¡intigeno o de! anticuerpo a una variedad de materiales sóli­ do*, como pi v i líos de mk'rfltnbs de polieslirenoo esferas de plástico. Por ejemplo, l<» iiimuitoanátbis crt I'üsc sólida disei\adns pora la detección de anticuerpos en una muestra descono­ cida tienen los antígenos unidos a la fase sólida (fie. 3-4). La reacción inicial ocurre cuando la muestra que se va a estudiar

117

Artiíg&na da rubéo a

Y ////////A PppIlOJ Ihi nisroDlaci] Aguaitó tfe le mu^-lra

1

Antipíserpps en^mibéolg AñUgünc

íubác a

vz ///////// U&^de/Agmgr:dq. delconlugatto

Anií-ig cenjugaea con enr.ma

i l ! 7

rp IT l l~l .- An'icuorpos anlirrubccla

\

Anisgafte de rubéola

W T/ Uft^íide,!'A9reg«Ja del cromógeno

Ctomófléno ^

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-rn n n ^

ewjirgatfa con tnoma

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Anticuerpos antraiteola

. Amigero ce njbéofa

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>s_________________________________ y ' Figure 3-4 l^ncitipiLh del tiiíimoinnuinuruli'-is ílílA j. Jisu

ll^ e ri ul p n cciU m icn lii Jp I l.\ p:«.. U Jílc u d c in lie anlitriicrpíVh ^ « n iirifI i ¡ rin M la nih& riil l.i>s iifllíje tim punl'ie^ivH d íl viuis J í ruHí-tila sf ^1-' ' h fit ¡s ln\ !>•> l~¡11■ .iv de uc:lí ick i Li|’]i.a. Luí cl I, ic cl .vucrL' > m: inL'uha. fíi e^tan prfttnc-^ Iit¿ jitíí^ líiis iv ; :iii[iftiityv\|;i ^ unt-n =¡1 □ iilí^ ivs. F.iu^lp ilt) p js in jf Iuv&Il». m iJ ÍlÍlh h il iiiinuiKtiilsSliuLiaj.s LuadhiinLiiUñ nirtjüüjJtH . cu¡n

una fin M í pii-yn 2), ]3npuc« de un segpníV>¡«vado, k

ui? njscrucii

4I71ÍEL1I-ÁI ¡LU 4.JL'líl'.'lÍtLli.4.f . Í-C í^ t ijU Ej. IC4.ltlTJl LMptL Jrr'C jLL 'irttl !L J. lie Id^h-HK-

h?rn-i i.1c i'vh fwvilln imliiiJkiil y |X>J l:h-4111SJ31JiT¡Lln ■ _1-.ll h.r,

¡iim:r|'ftr;in ks rt^iilM;líH tic Jif fFiiLLtm jhlSllj^LlS } [K^I¡V4h j| t|l¡

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11S CAPÍTULO 3 El dlftgnfctFro ds labcratnrifl por método* Innunotógicoi

>c ¡«cuba en contacto con Luí fase sólida duranle sus tiempo determinado, b ü anlicucrpo» cspedficus se unen al nntígeno inmovilizado. Luego, La mezcla de reacción sé Lava para elimi­ nar cualquier material extraña. <e agrega una anliglohcdina conjugada eon una "marca” y se incuba en el tuto de reaccitm. Cu los procedimientos de radio!mn isnouna lhi> (R IA ), la marca L'M Ui1 isótopo radiactivo (p. íj.T ” P ° iliicttlfas qtk en los métodos de enzintommunoanálLsis (E ÍA ), Ja macea es una enzima, En Jos sistemas de ESA que «e comercializan para la Jd ccti^ n de anticuerpos humanos. el conjugado suele ser una ininunoglobulijia anliJtnmana de cabra marcada con fosfa­ taba alcalina o con pe cosidas del rábano picante. Si se lia pro­ ducido Ll reacción inicial antígeno-anticuerpo. la antiglohulina (con su marca radiactiva o enzimática) se une al anlicuer­ po. El puso final de eslos ensayos es la denseción de la activi­ dad radiad iva o ciizimállty, Esto se rea!¡¿a. LvspccLiviunciilc. con un contador ib centelleo que detecta mniiiüiu-s ¡1 o y y por medio dd y y regado de un vustniUi cnzimíl ico, (jw suele producir un producto final coloreado que se delecta en forma vímihI n p«r esj^eirufotomeiría- Una reacción positiva indica que d anticuerpo estalla présenle en la muestra une inal y la intensidad de la reacción es proporcional a la concern ración del anticuerpo de esa muestra- En la figura 3-4 « observa un diagrama Je un F IA para la detección de am icuerpos aritirruhéola. Los anticuerpos conjugados utilizados en las Eócnicas de E l A no acidan sólo por interacciones an« ¡genn-an! ic ucrpo, como se de muestra con el uso de avidina. esmeptaii id ina y biotina, Lu avidina y la cslrcpluvidina sor glucoproteinas purificadas a pan ir de d a n de huevo y de Sfrrjiftm ytts uvitifaH, res­ pecto ámenle- La Molina es un componente del complejo B (Vilanimu B7). Las moléculas Je avidina pueden unir esteqoiométrieamente los residuos de biolina, de manera si mi lar a una interacción anticuerpo-antígcno. En Lis HtA. sé puetle utilizar eoitlo conjugado una ¡ilolmlina amihulltula produeiLh en cabra que tiene unida moléculas tic biofilia pura detectar anticuerpos humanos que ie encueniran unidos ¡i un anlfgeno fiiado u lu fa*c molida Luego de un paso de lavmlo. íc agrega la avidma (o esiteptavidina) mareada con ln enzima- ÍX'spnís. de la menta­ ción y el Infido, el agregado del sustrato en/imático genera un piuducto linaL coloreado, De manera allertiativa. Ja antiglobuli­ na bioriniluda puede detectarse por medio del agregad» de avidina sin marear y luego de un paso de lavado* por el agregado de la enzima luoünilada. ¿sia ve une a la avidina y después tte y ii lavado, el agregado dd sustrato end mítico genera un pro­ ducto final eoloreadoLa mayoría de los R IA uiilizan un sistema de ensayo tipo competitivo. En La prueba cuantitama para anticuerpos, el sislema en fase sólida se estandariza primeria ntiLibando un anlígeno no marcinlL) unido y una concentración esiátiilúr Je anto cti«r|)u marcado con un radiactivo. La muestra desconocida que contiene el anticuerpo {no mancado) que se quiere delectar se agrega al m ieiiu de ensayo. La cantidad de uní ¡cuerpo marca­ do que se desplaza de su unión al unligeno es proporcional tu cantidad de anl ieuerpo no mareado prewnte en Ja iHuesiru desconuuidai. L a i concentraciones de anticuerpo en las, muestras, desconocidas se cslablccen por comparación con una curva estándar que se efectúa determinando el grado de inhibición de la unión del anticuerpo marcado mezclado con diluciones Lie anticuerpos cuaniificados no marcaos. Cuando se detectan antígenos por este método se ap'ka una estrategia similar» excepto que « utiliza un antígeno mareado ppraeumililicai el antígeno lihrc en la mués ira. IL] R IA ha alcanzado amplio uso en las área* de química clínica, endocrinología clínica j toxi-

cología, pero no se le lia encontrado una aplicación signiptaüva en el área de lu microbiología clínica. A pesar de que tiene una sensibilidad y UJU especificidad excepcionales, el desarro­ llo de las lécnricas de R IA en los laboratorios de t e servicios de patología clínica modenti se encuentra limitado debido al problema inherente a la eliminación de los desechos radiaclivos y :i La ineMabilidad de ciertas radionúcLidos, En los ¿llirnos 1Ü años, los equipos comerciales de pruebas de L IA para la delección de anticuerpos en sueno se han vuelto más accesibles j.cn muchos casos, han suplantado a procedimientos míis latxv liosos y prolímgadu& como la PC y La IHA [Jara Ja serología víiaL-t-lí:;,IJI>l'tJ,ul* :,|íl Los métodos de E l A son los disefíos recomendados para Las pruebas serológica^ más nuevas, como las pruebas de cribado para la detección de anticuerpos amiHIV-1 y anli-HIV-2.*+ Los procedimientos scrológieoi pura La detección de anlícueqiiLs Lfasados en la lecnología de CIA también lian sido mndificadns enq el objeta de inerememar su utilidad como herramientas de diagnóstico específico o métodos de pinchas eonlrmaiorias, Un ejemplo de este ii|H> de m^ antiCUeí[>t^artl¡-MIVL están presentes se unirán a !t>s antígenos virajes espedí teas l ; u c üu cilvuculiiin «■oliie Éa tira. De.spués del lavado, lus dry.> se incuban con anticuerpos antihumano producidos en eahra que se encuentran conjujginlos con petmidasíi del tábano ]iicante o fosfaiasa alcalina. Tías oto) puso de lavado, se agrega el sus* trato cnzimutico a 5a tira. En este momento apareceran hundas Coloreadas sobre la liia eti aquellas ipeas donde imdalmenlü ha ocurrido la reacción antígeno-anticuerpcK La posición de estas hundas y la comparación con km puirones lSí nutiéssras de con­ trol positivas permiten cstabtcccr la reactividad de una muestra diMcmiiniada con lo^ £t^l¿gello^ vimÍLis c&pceíficus y real iZar Ea interpretación. *" Las técnicas de inrnoníUmnstcnencia nm hiín pueden ui di/.ir­ se para evaluar la especincidinl de tos anticuerpos contra (rtros agentes infecciosos. Por ejemplo, los L IA que se utilizan para delectar anticuerpos contra el viius del Iterpes simple (H SV ] no pueden diferenciar los anticuerpos üspcíiílcos amÍ-M5ÍV-1 O anti-HSV-2 (p ej.hVidas HioMérieiií-Viicfc, Hazel^otxl, MO; Bio WhitisiJíer. WaJkersville, M D l/ lais irruidos de LninunoI raniferetícia pueden uíilixar^e para tli terendar infecciones pre­ vias coii Ü SV tipo l o tipo 2 analizando la reacción del suero de pacientes contra membranas preparadas eon antígenos de H$V I o HSV-2 y buscando las reacciorH-s positivas cim ar|íteltfjs antígenos quemmi especffictis del virus.1Los métodos de iiiniunolrunsfcreneJu también se h,m utilizado para detectar anlieucrpos específicos antivjni* de mb6,ila en casos con yospecha de rubéola eongénita.1*- La lecnolo^ía de inmunotranstérencia lambién tiie evaluada tomo una prueba de tliseíio para el d«agjjÓNiieo de síriis.Lt Utiti/aivdn este ensayo, la presencia de ardi-

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Métodos de ínmunoanálisis en race sólida

cuerpos dirigidos contra amtgenos inmunodelermiriantes de Treponema políidto» con peso molecular Je 15.5:: ¡7l44l3 y 47 IT>:¡ es Jiajinósliea de h¡TiEis adquirida cuando se utili/a un ™ ¡u^adu anii-l^G.1" 1Cuando se utiliza mi conjugado anti-lgM para revelar Iop complejos antCgenoími ¡cuerpo unidos a la membrana. cl procedimiento de mmijriniran&íerencia resuíia un ensayo sensible y específico para el diagnóstico de sífilis enngéiiila."4Dada Ili relaliva baja sensibilidad del E IA y de las téc­ nicas de ininuiiDÍluDrcKcnciíL cl procedimiento de transferen­ cia Western lambién ha surgido ce.uno cl método m ás sensible y tApícíficü pam -el senid iagnóstico de la enfermedad de- Lyme, caucada por Rorrcfia bttrgdotferit y se ht? cslablccklo ii crilerio diagnóstico basado en el puinVi d i bandas ottoírViwJo en la membrana de inmunotramfercíicia,I**íMt A -eaasa de La gravedad de S-:l enfermedad por HIV- L y de la necesidad de realizarían diagnósl ico específico, lantn lossisicmas de El A enmn la prueba de inmunotraflsfereneia para la detección de anl ¡cuerpos sin(i-HlV-| tian su frid varias modifi­ caciones desde sll ¡inplemenLidón en 19K4.I]" En mi ]trindplo, tus fabricantes de los equipos de pruebas diagnósticas utiliza­ ban Usados preparados de cultivos de líneas celulares de ]infoCUO& T ¿iííécMlIl1& Crtrt HIV-l COrtlO luenle de antí^ertO |iut:l los E IA de primera generación y puní los procedimientos de inmunotransíenmela., Se observaron reacciones biológicas t’ul^Li’' posiLÍvll'i debido a lu reactividad de los aniieticrpus dirigidds contra Ins proteínas de IJL A lantigeno Icucocilario humano) que expresaban las líneas celulares linfojdes militadas para el crecimiento det virus.30''1 " Más larde. « oNuviemn aniígenns recombinunles a través de la clonación Je genes virales en se­ tentas tle expresión tpie útil izaban plásmidos como vectores, en bacterias o levaduras La utilización de estos anlígeitos dio como rcsullado el desarrollo de pruebas con aún mayor especi­ ficidad t[iie los ensayos Lie primera generación, ei^ decir, HEA de secunda generación. Sin embargo, en eslos ensayos, las reac­ ciones cruzadas con antígenos baclcrianus o de levaduras conlaminantes podían ser la causa de reacciones falsas positivas. La purificación y la sccuencí ación de aminoácidos de tos antígenos retrovirales condujeron a la utilización de peptidos sin­ téticos como ¡mif^emis en e] procedimiento de li)A (ensaya detectar los anticuerpos antí-lilVr | en pudente* Infectados por cepas virales muy divergcnles, enrrti HIV-l del grapíi O, -hS : |A Mientras que los ensayos de primera y segunda generación delectaban priue ipálmenle ]gCk Üos Je tercera genenición detectan todas las clases de anticuerpos (IgC. L M e I^A) antlHIV-I presentes en el suero o la saliva. Los E IA de tercera generación para HÍV-] también dili eren ligeramente de Jos ensayos anteriores en su metodología; Uis anifgen^s virales sinLuíticos lijados a la fase sólida “ capturan” prtnieio los anticuer­ pos anti-HIV-l y luego ésto* son detectados pur medio del a^rvgadd de aalíeeno de HIV-l mareado con encima en lu g ar de tina anli£lo^u]ina mancada con enzima.^ üebido a su alta especificidad, los ensayos baHados en amígenos sirlúlicos pue­ den dii'crencijr fácil medie los antiojerpe» anti-HIV-1 Je los anti-HIV-2, L a Jisp^mibdidad de antjgcnns rccnjublnailles y sintéticos, que producen reacciones sensibles j especílicas también cundujo ¡il desarrollo Je nirevas pruebas de cribado y suplementa-

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Fig u ra 3-5 Téeak'n de u jb s Ic (« k ia Wcstcru ( iljr.utjiíi N tti) puiu Ij ikiüi.c¡ün d i nnlicurr|>n^ anli-HlV-1. t f i íl | » w L ttK viru i íiK k k x fn c u h iv d m h Ii» IiiLij'jil, m punl'iLjrt [kliiiljIieiuiiLc y v.' mulilLlti ;l un.i ¡:kLlipl^m sk eiLj;c| il_potioerilumiili plano. S í seftanut au las pniitfikiu. y jlixuiTi^t-ÍTiJi ^imites jtor p «D nn'lfculjr. Lu ti p&io 2, les unlí^cniH p R tc n lo en d ^el mhi "traradíndm’" pía1elertmEnrc^k a uqp. d? ilitrncclulm n. Ili ti|i|. lu cfn L %e ttsia «ll urí-s U n tlnis wm íím ntcís ÍHutnidíis liiLi’íi.i >) enra lü.v m uídrat pnr r v lü J L jr í Mkm.i.1. T r j i cl In v a d a p j r ji cljiTun;i5 cl i iu lc n u l n o unddu. te a ilk ia c u i

im eonjugadn maríado ucn eflrinu Cpa.su 4i, hl í i h iju í ¡uln \f une a l i - anti’ ^iw ipi» de Lu uiuttuu de »uetu«|üc r f Uaictuú * Ij lifiL [>rs¡;uci de u iiv |h»u d í iD^ühi, w adicicirw í l mitrnnp c-npimfiLiefl eromogcnic^ y se acervan h.wd ai colwTudfe »u iw U tlru cu kh kiciiH Je Kaslivldad tu ic iJ de kta antkbcfi-

JHWI. En ^Uc Jt3¡jrranL¡i, h-mwiitnq ta crjutiviiíjiJ fi7! £A. eJ^-. A lD S Utktkigy, D a jiK h ii, TrtJlm cntr imJ Pri;i.<ínciíin. 2j. ■r-l FilcMlílfia: LiffiLuooíltf L*>t:H LIH

B Est ¡gima del d r. VaFbr Eso

120 CAPITULO 3 El riizgnnslica da libaralorin par matadas inmunclágiccs

rias para la detección de anticuerpos anU-HlV-l/HIV-2. Se han cre«Jü E l A rápidos pw inmunotransfcnencia en puntos fdot bht) (10-15 minuto&'l militando aniígenos sintéticos y recomtiinanlcs. En esios ensayos, los antígenos virales, están unidos a una membrana en un caducho de reatvión Si los anticuerpos están presenles en el suero por ensayar se unen a los antígeno-, sobre la membrana, Luego de un paso de lavado,, se agrega a! cariucho de reacción una anti-lgGÁgM banana conjugada ton una eitxiittu. S] en el pus» previo se unieron lus untirueipús, el conjugado sé une al complejo anlígenn-ariticuerpo. El conjuga­ do que no se tmi(t se elimina por medio de un nuevo paso de lavado y el agredido del susixatn de ia enaima da como resul­ tado una reacción de color directamente sobre la membrana. Lis mayoría de cslos ensayos tienen manchas de control positivas y negativas sobre la membrana para indicar si la prueba se rea* lizó correctamente y establecer su valide?.. Uno de estos ensay iK la prueba SU D 5N Abbtm-Mures), ha sido aprobida por la PDA iFikrd ittid Druj; Aihnittismtikm) como prueba diagnósti­ ca para La detección de anticuerpos anli-HIV-1. Se ban dc¡uirrollado otras pruebas de inmunotransferencin en punios que detectan anticuerpos anli-HtV-D y anti-HIV-l*7La aplicación de antígenos. sintéticos purificados ea un pairan de lwfHl?i<¡ sobre liras de niduceJitlosa ensambladas en un supone plástico también condujo ul desarrollo de ensayos suplementarios de segunda y de tercera generación ‘'similares a la transferencia Western” que pueden utilizarse en logar del procedímiento de in rrti»rtfnr,ir»ste«rtcia basado en lissdos virales Estas pruebas se denominan ininunoanálisis en líncn,Ti,]U* Los méliSdos de E ÍA que uíitkan unlígeiios rccombinanles o sintéticos también están revolucionado el enfoque tradicional del laboratorio « l el diagnostico de otras infecciones, como Ja provocada por el vjnJ^í de Ppmein-Barr y la sífilis.'1"'ivY

Métodos eiEimcinmiínológicos de captura ds anticuerpos para la delección di IgM Los métodos de EIA para anticuerpos delectan principal­ mente lgGr Sin embarco, se |H>cden uiili/ar rñéu>dos j;le detec­ ción Je IgM específicos para liifettiidiir b infeccione* recien* tes de las pasadas, y vi que las IgM están presentes silo en la fase temprana de la mayoría de las infeccione*. Lo* métodos específicos para la detección cte IgM obvian I.) necesidad de analizar la presencia de Igti en muestras obtenidas durante la lase aguda y |a lase de convalecencia de la enfermedad. En las infecciones con genital, Ja detección de IgM específicas en maestras de sangre letal o neonatal índica infección activa en lugar de anticuerpos iransplacentarins, Tiempo atrás. los E IA diseñados para la detección de 1gM ulíSkaban como conjugado un anti-eyerpn anti-lgM mareado con unu enzima. Sin embargo, si en la misma muestra se encuentran presentes IgG e IgM, las moléculas itlís pequeñas y numerosas de IgG compiten eficaz­ mente por la unión cot) el aniígeno lijado a la íase sólida, lo que produce la falla de unión del conjugado anti-lgM y un rebullado falso negativo para la detección de IgM en la piueba. Ademas, el Factor ncumatoideo presente en la muestra también puede inlert'erir en el ensayo. Este factor w comporte de antiCiiL-pptH. principalmente de clase IgM, dirigido* contra las IgG de cualquier cspcciJicidad. St la muestra de suero contiene IgG y factor reumatoádeo, las moléculas IgG específicas mis pequeñas se unen al antígeno de la fase sólida y el factor rcm til ¿lo ideo, a su vez, se une a la IgG El agregado de un. conju­ gado antMgM marcatto da como resallado su unión al factor reuitiatoldeo, con la consecuente generación de un resultado falso positivo cuando se agrega el sustrato de la encima.

Se han creado iwmero^ss métodos para separa? te IgM de las IgG con el objelo de detectar IgM en las muestras de suero. La cromatografía tic intercambio iónico en columna y la ilin a­ ción por guíes sepan* las clases de inmunoglobulinas basadas en la carga y el (amaño de las moléculas, respectivamente. Utilizando soluciones bufffer de fuerza iónica variable, se puede eluir IgM de estas columnas y separar asi las IgM de las IgG. Oíros procedimientos para separar estas moléculas basándose en el tamaño es la centrifugación en gradiente de sacarosa, dado que ¡a$¡ molécula* de IgM lo atraviesan ames que las moléculas más pequeñas y livianas de IgG. Las muestras de suero también pueden tratarse con anticuerpos ant i-IgÍJi Ln que da como resultado la unión de IgG dentro de los mmunocumplejos y se eMta así que reaccionen en los ensayos para la detección de IgM, La proletna A del estafilococo, ya sea mez­ clada en forma directa con la muestra de suero o incorporada en una columna de filtración por giles, también puede utilizar* se para "unir” moléculas de IgG presentes en tas muestra* de pacientes. Sin embargo, estos métodos de separación tienen oíros problemas técnicos, Ninguno de los métodos es total­ mente eficaz; para separar IgM de IgG, por lo tanto, la interfe­ rencia de la IgG con la detección de IgM puede aun seguir constituyendo un problema incluso luego del premtamíeimi de las muestras. Además, todas csíj* técnicas dan corno resultado la dilución de Ja muestra de suero, Dado que Jas IgM pueden encontrarse en niveles muy bsijos. la dilución de la muestra puede ocasionar resultados, falsos negativos $n pruebas de detección, aunque realmente se encuentren presentes anticuer­ pos específicos del tipo IgM contra ese agente. La disponibili* dad de pruehas de laboratorio precisas y confiables para la detección de IgM es de gran importancia para el diagnóstico del síndrome de rubéola congéniia. j a que eJ feto Irene un nes­ go sustancial de sufrir serios daños, Et método de elección para la detección de IgM es el de "'captura de anticuerpos” (véase flg. 3-6), En esta modificación. IgG dirigidas contra Jas. IgM se unen a 3a fase sólida. La incu­ bación de la muestra da como resudado que lod.is tus IgM pre­ séntesete la muestra se unan a las Igti innwvilifadas- Luego Je un paso de tesado. m agrega cí antígeno específica al pocilio de la micnaplaca, uniéndose a las moléculas de anticuerpo IgM que presentan iu especillcidad aniigénica particular 1:1 agrega­ do posterior de un anticuerpo IgCS dirigido contra olro cpftopo del antígeno Conjugado con una eiiíima cwnüiiee ei la marca­ ción enzimática Indirecta de las IgM específicas contra el antí­ geno. lo cual se v is u a liz a ramo un p ro d u cto fin a l coloreado cuando w adiciona el sustrato de ln enzima, E l factor reuma* toideo o hss anticuerpos de clase IgM ton otra especificidad anligíniea no unen el conjugado que produce et producto final coloreado. EiiaitioJnmumanjlliJs nata la detección de antígenos

Los d¡scflos de los EIA también pueden modificarse puara detectar antígenos en lugar de anticuerpos. En este caso* un anticuerpo de “ captura’’ se fija t la fase sólida ífig, ;l-7sr |.a incubación eon una muestra que condene al antígeno deriva en la unión del amigeno al anticuerpo Luego de un paws de lava­ do, la inculíaeión con anticuripos marcados con enzima (o con biotiiia) dirigidos contra un segundo epfiopn del antígeno deri­ va en La unión de este anticuerpo conjugado. Después del lava do, se agrega el sustrato enzimático |o la enzima conjugada eon avidina). El agregado del sustrato cn¿iinfrien genera un jiroductu final coloreathi. Los métodos de en/imoinmunoaniilisis para la detección de antígenos se han utilizado para la cldcc-

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Métodos de inmunoanatisis en tese sólida 121

Sueio du paciente,

que posiblemente oonílerie IgM especifica se Bxpcie a la tase súlida recubierla con IgM antihumana

incubact¿
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1

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________ L „ .... ■urógeno víimi eeriK»<JoIncijbftradn, tampíto

Factor retimpfcrtiK? Sgh.4 q íg M no especifica

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Figura 3«B E n n m ra in rn u riü a B álL íii d e (¡iftL ia i!t EgM RE sisCru ¿ í l psiclenrv y i i ¡lu i'Je m a te rie r (¡fM « r a p a r a n u n i fa se s ó lid a n n ru ñ iiirli c<>n jnliLiiETpE» anLiIgM hiUDaiid. Qtklqukr [*M p re se n te tn d w t n e* '■tkpQiF*d*'" o u n id a «lúk a iu L c iittp u s artt¡-[(tM twm au. L íe p a s ú s sulKwctiKCirun él crtvjw («hrtrtrt üe anríffiw viral conocido, iinticucrpnf .mrivLiin ifldKttk» con en/inu j suMrutui rf ccjJi^jq poru «feiemrinur lu c ip e L iík -K lu d de |j luM « ip L iin d u . Lu 1¿M L-i|*utuIi de cípeciflcüUHl jpn>r,mJj producirá un rcMtlGudo linal cotí tinihio de colar La IgM capturada de mili tipetifuridaJ. inUwüo cl f*:b>r rcurnaLOMfco, no Jch cri pw
B Estignnadel dr.VaFbrEso

122 CAPÍTULO 3 El dlagirósto de laboratorio por mítodos inmuno lóg icos

Ac - Efisima

Sustrato---------- Color visible

í

Ac - Enzima

PlgUhfl 3-7 T&dícíí (fe fuú itih.“Ínnuini.nin¿J¡&il Je tr^wni (fe nnli^ciW ¡SiCj ChiiUH$dra TtafktMtítiix En esia lárnica, Id*, .mlc-ruprpírs dinguli* rm lca «I atUfftfti.i'qoe-sctiUlefedeteiecflJ'MMiclCíi 9 una u * t Molida, Las iiiíumlíl* iJ¿ Iüm*ppijcm ili? Invatlm <-n.Uvfrv:,;”Cr'i >e -jj^gjn al p to llíi ¡x.iv« 11. L u i fanyüLíis pníHiTires «n h mu^trj. ucotfemiil üoh J,ísp tu fiJa ?" por los aniicuerpo1; dr la f u e rw.'i■ 1 l L i . Lur!:o d e t l n p u n u « f e I j . - j . J l ' . v - j .Ik h h U i e l JLlk'-LKfpo ABlklnai'ii di a ¡|im está eciTijufailü ion ir » ín?*ma (pasa 2? y que re*cc¡i,ipii en™ d iunti-

grfiu iíiliJú a k=i-iMiiie4S£irpi.fi tfe ht fas* 1-élkLs, [kipmís * otro |klw -tfe [aira­ da if ííiík'ii tílti rl íiulTPtn fuTÍmitigo

í| y ir delicia im «iltw 11 ■ ■ ■hI-r

eión de antígenus bacterianos de numerosos agentes en diver­ sos tipos de muesiras. por ejemplo, antígenos capsularen de S. p n e ttT H o rtia e -, ti. i n f i n t a : a i' tipo y jV. m m i n g i t k h ' i en LCR» anligenos ile Legian-efíit y í. pm?urhttttiw en orina, toxinas similares a, Slüga. producidas por E. culi cntcrchcniprrígjca, tuxina* do Chsindiam tlijfii'ite en muestras de heces y aniígenos de clamidia en muestras cnd¡oecrvicales-:h'-u t'*:)ÍT-1 En virología, se han desarrollado método de RIA pana la de­

tección directa de rotavltftJü en lilinuln dehcccü. para virus sin­ cida! respiratorio en muestras de las vías. aéreas, bajib y para 3a detección tic anlígcno p24en suero duranlc la infección prima­ ria aguda por 1M La disponibilidad de pruebas de E IA para la detección de antígenos de Eniianw ha hisíolyíica/tUspt\rH Gkmtut iamirfit1 y Cnptforjwrirfritm par1 éirn direci ame rete en muestras de heces, ha. hecho que esta téc­ nica diagnóstica se conserve con muy pocas innovaciones desde h iTnplcirentqcíón de l-i preservación de las muestra y las Técnicas, de iiiK ién .3" ’■" 1411,1' En micología» las dos tínicas, pruebas actuales de ía detección de aniigeno son la prueba para anlígcno de Hisíoptasma y de Ta criplococos,4*1*®1” 2 El E IA para cripioeows Prem ier’ (Mcrídiun Diagnuslics. CincinnatL Ü I [j utiliza una inmunoglobulina polklunjJ de cupiura y un anticuerpo raonoclonal de dclccción y puede realizarse sobre ptutíini^ de LC R y de Micro sin rtqucnr pasos de preitaiab miento.^ En la figura 3-7 w prefería un diagrama de un ensaj« típico de captura de aatígeno para la detección de Chíamydt’tj tnxhmntitis. Otro variante significativa para ta detección de aniígenos por R IA es el cn7ÍmoinmuTi«iná]«sis sobre membranas de ni troce-' 1‘jlosa, Estas membranas sirvert para ahsorher aniígenos de una mticMra clínica. E l agregado de ctmjugado y .susIra lo en fo n u sccucncial da como resultado lu aparición de un producto «te reacción coloreado directamente sobre la membrana. Una ven­ taja de estos ensayos es la preieneia de controles positivos talemos sobre la membrana junio con ta reacción de prueba. Estos; controles mí utíliían para detcnaínar si la prueba se rea* li^ócn romia cíorreda y se deben observar l « resultados espe­ rados del control «¡torc la membrana para considerarla válida. Actualmente se cuenta con pruebas de E IA sobre membranas pura Isadetección diitelii de eslrepÉsKOcos dél gnipo A en Tñuestras de bisí>pad.í»s laríngeos, de virus sineitiaE respiralonn e iuflueníá en secreciones de las. vía* aérea-s bajas, de rtnavirus en miiesUras de hcecs y de C. intcíum atit en muestras ettdocervicales, A pesar de que esta* pruebas proporcionan un resul­ tado rápido, numerosos esltiíiios han indicado ijue son un 152í)ES- inertus sensibles y que tienen nrcnor empecíficidadi|ue las pruebas de E IA de detección de ontígeno en microplacas. los ensayos de inrmmofluorcseencia. los métodos de sfcieeción molecular (p. cj.. rrtrlixlos de sonda directa o de amplificación) o ci cultivo,*1 ^ 11*1 por ejemplo, el E IA C b n ic v * para La dilección de C, tmvhwmfís (W « ¡K ile Lahorainries. Crjnhury, N Jj ba demostrado un rango de. sensibilidad enue 62% y 959E* y de especificidad enme 86*9% y 99% comparado con el cultivo celular. Ins ensayos de sonda directa y la reacción en cadena de ía po]imemsa.1 ?ÍJ!-,a ,íl l-a mentir sensibilidad deesie ensayo itiüica que nn se detectarán enne el v el 38% de Tiiv infecciones por clamidias, mienlras que la bajacspccillcidad sugiere que e«ta prueba puede no sei útil para el diag­ nóstico de FSilinu de las infocciortcs par clamidias, Síibre tfxlü en las poblaciones de baja prevaleneia.1-’ Otra melificación lie lo® EIA para la tkicceión «te antígenos ssm kis inttmnaanálisEs ópticos (O IA , por su sigla en inglés) [uiíj la detección de estieplocoL-os del grupo A en muesfms de hisopado® faríngeos i B instar®* Bw lder, CO) (véase lámina en color 13-1j. Esic enrayo se ncaliatu sobre un portaobjetos que permite la v i&ualización directa de un camhio físico en el grosor de imas [ielíenlas delgada^, que se forman corno resultado de Im reacciones de unión entre cl anticuerpo de cupiura sobre el pmlapbjeios y el wilígcitti de la muestra. Después de lo. extracción dei anitgcno del hisopo* se agrega al extracto un anticuerpo íuiliestreptococn del grupo A nwsreado con una eiPima. Esta me/cla setolítcd sobre el ponantojetos para permitir que el com-

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Técnicas do inmijnofluQrBscencía

piejo antígciKwantiCLicrfKi se una a los anticuerpo* antier reptococo del gmpo A que se encuentran sobre el pítrtanbjelew. Tras una incubación de dos minuto:», se agrega el sustrato de La enzi­ ma. Después ilcl lavajo, JSC lee la rcurcron emntiilaildu él tono de l.i la/ i|uc se refleja desde L superficie de] portaobjetos. La presencia de antígeno de estreptococo en la muestra se deleimir a porla apuriuidíi de u iisl mancha púrpura, mientras t|ue la con­ servación de un color dorado sobti: el portaobjeto!» dd reacción índica la ausencia de antéenos. La sensibilidad y Lu especifici­ dad de la prueba Slrep A O IA lic ite n un rango de SI lb Q y de a respectivamente.*^-'*1lí Desde el lanza* miento de la prueba O IA pora estreptococos del grupo A, se comercializan también ptuebns O IA para lo detección de estre^ iikuius det ú.rup» D y C. iruthamatis. I£ii una evaluación del OIA para C. im dm nttíis realizada por Paie y cois, se informó ana sensibilidad y una «spcáficitbd del 7J.RL.V y del Í(KK¿, res* peciivarnente. cuando se la comparó ci¡n 9a PC R.IW Para la detección de estreptococos del grupo B en muestras vaginales, ninguna de las pruebas rápidas (O IA . otros E ÍA y aglutinación de partículas de Látex) demostró suficiemc sensibilidad pata detectar bajos niveles de colonización cuando se las comparó con los tiiéií«Jos Je caldo recomendados por los CDC.1 1' 14" En consecuencia, ninguno de chines métodos ac recomienda como prueba de cribado en mujeres embarazadas para detectar la colonización por estreptococos del grupo B,

123

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Técnicas de inmunafluarescencia La mmunotluorc&eencia brinda una alternativa a los meto* dos de E l A para la dirección y localización de antígenos para el diagnóstico de enfermedades bacterianas, filngicas. parasi­ tarias y virales. Esta tícniea también puede tu ilibarse en la detección de anticuerpos para el diagnóstico retrospectivo de enfermedades infecciosas. Lu fluorescencia se define como h radiación de energía cuando la huí de corta longitud de onda Ha longitud de onda de "e?(citaci.fin") exciia los electrones de una molécula a un estado de energía mayor por un tiempo muy corto. Cuando el electrón regresa al estado de prccsc ilación o KisjI, Ll energía se libera como luz de una longitud de onda más larga, hn Los ensayos de inmunofluoieseeneia, el ani ¡cuer­ po específico está conjugado con tm compuesto capaz de fotoese ilarse y luego (luurece tpor lo general, derivados de isotiucianato de fluoRsceína |FITC| o rodaininn), lo que da como resallado un trazador sensible con una reactividad inmunológi ca inalterable El antisuero conjugado se agrega a las células o tejidos [pie hc encuentran srtbrc un pomaubjcios. se une a los antígeno*, y Corana así un intnunncoinplcjo estable. Lus molé­ culas que no reaccionaron se eliminan mediante e] lavado, luego el preparado se seca y se c*amina con un microscopio de fluorescencia equipado eon la fuente de lu? y los liltrox de barrera apropiados. Lo» antígenos unidos en forma específica a los anticuerpos fluorescentes pueden tld c c lm coma objetos brillantes color verde manzana o amarillo anaranjado contra un fondo oscuro, según el lluonocromo utilizado, l.a.s técnicas tnmunoflnorescenies pueden ser directa?, o indirectas. Las pruebas de inmunofluoresecncia. directa generalmente se pue­ den utilizar puro la detección Je antígenos j anticuerpos -(es decir seíoloefa). Técnim stsr ¡ninimofisi Broscentin para la detección de anligeare Las técnicas de ínmunonunresecncia directa flF D ) ífig. 3‘Sj implican la aplicación de un conjugado murudu sobre e)

rcscefr», Lw cn |lt 3b inevb-w^in >'f [ Íavíijn, rl pnrinnhjc-tfM (C ^sqniina para

«nuT (mi píiiTrnw'; i,k Rui'ccüiwncia «iRKt«r»vin-¡i

tnatcrial que se quiere examinar, seguido de un período de incubación de 15-30 minutos en un ambiente húmedo de 35 a 37 °C pura permitir que ocurra b reacción antígcno-aniicucrpo. después Je un paso Je lavanln pgiraeliminar el conjugado no unido, el preparado se seca al aire y se monta pata su observación con un microscopio con la fuente de luz y los fil­ tros
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Técnicas de n.Tiunü'lucrasccnc::! 125

ron erwima ip. eju pernxidasa Je L rábano picante)., en lugar de utili/ar reactivos mancados con fluorucromn. Las pruebas que utilizan conjugados con encimas producen un prctlpíldu Cukv i lj .llLl» que se observa con un microscopio óptico cu ' ul\ li de con un microscopio de fluorescencia, La mayoría de los Latit>rutonas que utilizan 1F! para realizar t.i scralcgiu analizan inieialineiiie tos. sueros en diluciones l:No I rlíLS i se obtiene un resultado positivo, se preparan diluciones al doble y cada dilu­ ción se prueba por IF1 hasta que se alcanza una dilución de puníl» final. L j im eriu de Ell dilución cuás, llI[ll que inosLió Jlut>resccncia es cl título cíe esa. muestra pura cl anticuerpo en cues­ tión. Hn la Itguru 3-10 se muestra un procedimiento de EF1 para la detección de anticuerpos anti-CMV. E l diagnóstico de ciertas infecciones virales, cuino la infec­ ción por cl virus de Epsiein-BaiT fE B Y ), w i caliza totalmente por medio de la detección serologiea de antígenos y anticuer­ pos porque cmc vinas no crece cu el cultivo de lineas celulares en monocapa uti|i/;tLlJs hahitualmente en los laboratorios de microbiología. EE E B V es un mieníhro de Va familia Herpé.vvi* ridae y causa tnonoaiuclcosis infecciosa. La respuesta específi­ ca contra la ii\ftc£Íút) está Cim ítíílziitlj por 3a aparición secuencia! de ciertos anticuerpos, como l¿M e EgG anti-VCA fantígerKi de eápside ^imlS y anticuerpos antiaiHÍgenri nuclear de Epslein-Barr ilfBNAs y aíiEfj>eno temprano (E A ) (víase cap,

223, Durante la fase aguda de la infección aparecen la IgM anliVCA y luego Ea IgG unii-VCA, en tanto los anticuerpos amiEBN A están atocines durante la infección aguda, aparean du­ rante 3^ í’íísl’ de cuíkvalccewia y hc mantienen durante luJj 1j vida, Por b tanto, la presencia de anticuerpos anti-EBNA en el suero- indica una infección pasadü en Idjrur de una infección actual. Como el EBINA se encuentra en bajos niveles en las células infectadas con EBV. pura su detección se utiliza a menudo la prurba dr itiniunrdliirtrusrerrcEa unt¡cumplenirri­ to (A C lF ) (fig. 3‘ H ).111 En esta prueba, m: utiliza una Eínej celular (infoblástica infectada por E B V como fuente de anlígc­ no. Para esle fin suelen utilizarse las células Kaji ya que expre­ san sólo antígeno E B N A l VCA no se expresa y EA se delecta pocas vetes,-' Estas células se fijan en cl portaobjetos y reaecujrlajl Cun el .sLcm del paciente. Si lüs¡ anticuerpos especÉfico.s anti-EBNA estin presentes se unen al antígeno nuclear. Luego de un pasn de lavado, las células se cubren con complemento Si los anticuerpos específicos; anti-ERNA reaccionaron en eE prinver paso, el complemento se une a los inmuiweomplejtw. Tras «tro paso Je lacado, las células se cubren con anticuerpos un LÍcomple mentó conjugadas con ílunrehceína. I ra observación de fluorescencia nuclear revela La presencia de E B N A , que indica infección pasada por EBV. La prueba de inmunofluorescencia antieomplemenco A C ÍF se utiliza también para determi-

PbrtaobjútQS cm 1
titubación, onjuagua

________________________I________ Pasa 1

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Anttecmpfemento rmicatlt? eon nuoreseftlna. Incubación,. enju3£wa

Pafrcn 3

FluOresear^Xh

Sin ffunrescencia

Figu ra 3-11 liunumiíliitircsccfida arnit^mpkmcnro. En cl faMi I, Jcw anitcuorrA w espotHH a e í Idtí^ Ln1«Ctwjiií< fiiaJisen un pdTtaoti|íiíK, tin el |w » 1, w a íiciciM ciMnplIniicnla ifUtf' «C une a tai «OIH|iteÍ(H4inLígCIKI-d.ll(k'IMt|K> ( A l - ►tulntjjk» en cl pasi» I. En, cl juk» 1, *c utbLiuiki ^nlhJuuifiLciiLicnlLi iiuucdiki l : i > h ili*?' reso(£fla que m? inie al w tp ta re ttl» unidn vn «I p»mi 2 y jm^kr nhvíni^rvr lí flunrrícencia, S i en fl pa<* 1 Ins «nnmrrpo^ <* iw»n. fl Hnnpl(fncnM no piicsfc iljiiic cu cl pjaü 2 y cl dJitbuLniiplcnicjiCLi mahraJu «»! HuiHc^círui iw puede urirsfl en el [niw .1. pur U» Unlu. ni) se g b c n t fluí.ífh
B Est ignna del d r. VaFbr Eso

126 CAPÍTULO 3 El diagnóstico da la baralmri opor mitod es litmu naIcgicas

nuj el catado inimmiurio, pura delectar iinlicuerpos unti-CMV y para desmvilrar scruconverriión luego lIc uda innlUAkiciún COn una vacuna virxd (p, c j „ viras v^rk cJ:l-/óste 11.V " *fc•’■"* Útm enrayo de ínmunntluore.scenciia denominado prueba de anticuerpos riuort^cenles contra antígenos de membra­ na (FA M A ) es de elección |Kira delcrtliinurel estadu iiiriiuiiiurio cQDiTtt tic iU * viriLs, como virus. ^ iccIa-A ^ lür (V Z V ). sobre túdo por su extremada sensibilidad.46-1^ En este ensayo, se realizan diluciones senadas del suero de] piicieníc en poci­ lios tte niicrcplacas y « agregan células de culi ¡yo infectada* con \ 7 V a luis diluciones del suero, Luego de la incubación* la inicroplsca HC centrifuga para forjar la í«i:di mentación du la* células en el Pondo de los pocilios y se realizan dos lavados, coa pasos de centrifugación intermedie]*. 5 c agrega a cada pocilio urna dilución dé trabajo de un anticuerpo íg G antihu­ mana conjugado con fluoreseefna y se incubé- Luego de unos poceps piUHii de lLivuJu/iL-tihtíifupEiL-íüh, se cosechan las cclulaü,

se fijan, al pocilio de un portaobjetos FA y sq examinan cor. «» itiÍLTOMLOpic.i de fluorescencia. La prueba FAM A es má^ sensi­ ble que la FC o el E(A , pero requiere para su realí^ciilm célu­ las vivas infecíanlas pJ*, “ 1A pcsjtr de que las, lijen ijas. Je IFD son mis laboriosas, una ventaja distintiva es la capacidad de observar en forma directa los filcmenlop celulares de fondo en cienos procedimientos de dctceddn direela de ¡intífienos que permite determinar si la muestra es adecenta. Por ejemplo, dado que C. (mdtirrmm infecta prclcrcntcmcnte las células epitelia­ les cilindricas cervicales, la presencia de células epiteliales pavjmento&aa y/o de oculrofílw sepnentudoK, critnxilOK y moco indica qut la muesurt es inadecuada para realizar el diagnóstico. 1v i muestras adecuada* prevenían una preponderancia de c¿ lu­ las epiteliales cilindricas y cúbicas intactas. Esto se puede deter­ minar por medio de La praeba de anticuerpo fluorescente directo e incluir dentro del informe de laboratorio, fo que le permite aS médico evaluar la evidencia clínica de ifiícccitin por clartiidias. así como ta posibilidad de que un rehilado negativo refleje en realidad una recolección, inadecuada de muestra cndoocrvieal. Esto no se puede determinar con pruebas que no son visuales, como Im RIA de capturo de aniígenu para Ckfujttyifía iretchitnwti* y la mayoría de los ensayos moleculares.

REFERENCIAS I Addu PC . MatitfiM I1M. Sln w *l JM -1 al R%'4|i.u»iíiof ú « n iw » r« llS ) un':.'ble írvinpr-lintrfJ |ninmnfl1«tK iie h u ) Il-t [rjd.uüu íjp ii S'.üj n a l; en nt ili» l. i Clin ;

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nrphricii. anJ in ru m iil himnn -^nirn uhk;h Lfms reim wnih p ru p A ,iríp lo L « c i' IJCnürivrtikVi «IpJ. fu lb il i, h iíK k iijlj|i,i|i. t Lnfr Cbli. M rJ I .A W -Í L.V

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PCR anidada

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Aplcacicnes clínicas

Estructura del DNA Estructura del RNA

Función deí OMA—Alrriacenarnservío de información

Función del RISTA-Transíerencía de información Lectura (transcripción) 0 inteipitíadón (IrÉduCdlán! [te! gódíjD genéÜcn

A n á lis is p o s a m p lific a c íó n

Métodos tradicionales de delección Análisis de electro!uresis en QdfSaÉiúm bíot Detección ¿nímdiiía oe productos amplificados

Aplicaciones clínicas Hitindación inversa Api caricias clínicas

M é t o d o s de a m p lific a c ió n ! d e s e ñ a le s

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Sondas de ácidos nucleicos Ap ¿cationes clínicas Captura de híbridos paciones cürtcas □NA ramiíicado ApBcactones clínos Hibridación in situ Ap!H3 CÍ(WKS clíróc® A m p lific a c ió n d e á c id o s n u c le ic o s

Bases de la reacción en cadena de la polímeras Apscacíonas dinas

Otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos A r c a s te clin cas Modificaciones de la PCR RT-PCR

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Secuenciación de DNA Secuanciaclón trad-coral de DIM Api ad eres dínicas SHXienciaciún por sintáis íjDtroseojencíacíóíi) Api adunes clínicas

Análisis de micromatrioes Apiadares dínices

Amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real Métodos de detección de productos de amplificación en tiempo real Verdes™ Sondas efehibridación Aplicaciones clínicas

Tipificación de especies Tipificación no basaba en la amplificación EM iofaests en gté decampo ptiladc

Tipificación basada en la amplificación

jflíilicaclones clin cas

PG frfllfP

PCR de ampliuesj^eciro-

rep-PCR

Aplicaciones din cas

Aplcaraones tífnfcas efe & lipificaciún

PCRmútlípte Aplicaciones dinicas

m icfotrá

Conclusión B Est igma del dr. VaFbr Eso

129

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CAPÍTULO 4 MfcrQbiQlúgia molecular

os microbiólogos siempre han buscado \ continúan buscando formas más rápidas y eficientes pora JeteeIsr y caracterizar microorganismos. Las técnicas moleculares, inliúduLndlí en íl laboratorio mictfobiülógieo clí­ nico ya hace tiempo* han sido una de las herramientas más poderosas- hasta la fecha, La migración de método* de diagnóstico molecular modernos desde los laboratorios de investigacióa de -ciencia básica hacía los laboratorios clínicos comen­ tó hace mis cíe ona década, Estos ensayos han revolucionado el laboratorio rntcrobíológíco y han cambiado la forma de detectar, caracterizar y cu alificar los microorganismos d ¡rec­ iamente en muestras biológicas y a partir de cultivo*. En los últimos quince años, estas técnicas han progresado désete aque­ llos ensayos laboriosa y engorrosos hasta las pruebas sencillas y rápidas que, en algunos casos, permiten obtener los re cita ­ dos dentro de la hora de iniciado el ensayo, directamente de la muestra cl [mea, Los. ensayos moleculares utilizados por los primeros micro­ biólogos moleculares se usaban para delectar microorganismos con requerimientos nutrieionales especiales { fa ftid in u s ) o no cultivables o para determinar la causa de brotes significativos. Sin embargo* como estos ensayos se vol\ ieron cada ve?, más sencillos y írtenos Coloso* selos ha empleado paralis detección y la caracterización de mierütirganjiinoí, muelo más comunes. La microbiología molecular puede separarse en mes catego­ rías. La primera es la detección de microorganismos sin el uso de la amplificación de ácidos nucleicos. Estas aplicaciones uti­ lizan la amplificación de una señal generada (por lo general luz o color), que resulta de la hibridación satisfactoria de una sonda de ácido nucleico con la molécula diana de ácido nuclei­ co. La segunda es la detección, la caracterización y, en algunas instancias, la cuanlifieaCión de m iín w r^ B tu ^ usando uno de los varios métodos de amplificación de ácidos nucleicos dis­ ponibles, Por último, los métodos moleculares se han usado extensamente para determinar cl parentesco cnire micruoT£anionios {tipificación de especies). lo que los ha convenido en una herramienta crítica para Dos epidemiólogos hospitalarios y de la salud pública, Todas estas tecnología, de una manera u otra, utilizan la química Je los ¿litios nucleicos, Por lo tanto, comenzaremos este capítulo eon un reposo de las, bases de los ácidos nucleicos,, No sería práctico, y escaparía al alcance de este libro,, repa­ sar todas los ensayos moleculares usados en la identificación £ investigación cl manejo de microoi^gajiisi'nos. Po- confuiente, se describirán con detalle las pruebas que demostraron mayor utilidad en el laboraioriu clínico, las que están disponibles en el mercado, y algunas nuevas particularmente promisorias. Ahora existen muchos tipos de amplificación de ácidos nuclei­ co*, La denominación reacción en cadena de la poli merasj (PC R ). aplicada para la precursora de las- pruebas de am plifi­ cación de ácidos nucleicos, y que se usa a veces en un sentido genérico en este texio, reemplaza al término amplificación de ácidos nucleicos Esto se hizo para darle praciicidad y fluidez »1 testo, pero el lector deberla saber tjue también es factible el uso de otras tipos de químicus para la amplificación de ácidos nucleicos.

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Ácidos nucleicos - tas bases d d DNA y det RNA Estructura del DNA El ácido deso*inihnnuclcico (D N A ) es una molécula la^ga compuesta pof dos hebras. Cada hebra de DMA eS un polímero, lo que significa que está compuesta por subunidades similares

repetidas. Estas subunidades repelidas o "bloques" de DNA son nuckótidos memofosfatos. Las dos hebras que componen la molécula de DNA tienen una dirección determinada por su quí­ mica orgánica y se orientan en direcciones opuestas. Las dos hebras de una molécula de DNA intacto inieractúan a íravé* de los puentes de hidrógeno y se denominan complementarias. La con figuración básica del DNA se representa en la figura 4-1, Hay cuatro clases de nucfeóiidnsi inoflofosfatosquc forman el DNA. denominados de acuerdo con el tipo de base que contie­ nen. Cada nucleóiido monofosfano está constituida, u su ve*, por lies moléculas: el azúcar desosimbosa, un fosfato y una base nuelentídicu fflg. 4-2), El esqueleto de cada mía de las dos hebras de ¡a molécula de DNA se compone de moléculas de azúcar desoximbosa y fosfato alternadas que se unen de modo cm'aknte. Las bases, nuclcotfdica-s se entienden a partir de la molécula de azúcar hacía el interior de lo pane central de la mo­ lécula de DNA de doble cadena, La* posiciones y orientaciones de los ácidos nucleicos se determinan por convención de acuer­ do con ia numeración del átomo de carbono de las moléculas de azúcar. La base nuclootídica se adhiero al azúcar en la posición I ’ del carbura). Las moléculas de fosfato que forman un puente se adhieren a los carbonos 3’ y 5\ y te dan a la hebra una orien­ tación particular, cuya importancia se aclara más adelante en este texto. Las cuatro bases nuclcótidas. presentes en el DNA son las moléculas de pinina. adenina (A ) y guanina (G l, y las de pirimidina* ti mina (T ) yeitosina (C). La [rutina ademna presen­ te en una hebra de DNA tbima dos puentes de hidrógeno con la pirimidina tintina en la hebra opuesta de DNA. Estos nuelcdiidwi se dice que .son cortiplcmenturkis. De mwk) similar, la gua­ nina en una hebra de DNA forma, tres puentes de hidrógeno con la citosina complementaria en la hebra opuesta de DNA, La estructura del DNA suele representarse, por rayones de simplicidad, como una escalera en ¡a que los peldaños están formados por las bases complementarias de las dos hebras, de DNA >lo** laterales representan Isl.*i moléculas alternadas de azú­ car fosfata (fig. 4-3). El DNA en los seres vivos no raiste como una molécula lineal excepto tal vcü de modo temporal. Ame* bien, es una supcihÉlice: la longitud fotal de la molécula de DNA suele ser mayor que la longitud de la célula que la con­ tiene- Por consiguiente, el DNA ddie estar superenrullado de manera que iodá su extensión pueda estar empaquetada en espacios muy pequeños. La estructura reíd del DNA es la doble hélice cib ica descrita por Jamen, Waison y Frasels Otcfc, en 1953 (http^hobelprize.otg/mcdicíne/lauicates/1962/). Las dos hebras de DNA mantenidas juntas por puentes de bidmgetu), como ya se describió, existen como una molécula helicoidal le­ vógira. con surcos mayores y menores, E l conocimiento de la esírucmra básica del DNA y de la replieación de esta molécu­ la fue fundamental fiara cl desarrollo de las puchas basadas en la amplificación de ácidns nucleicos que ahora se Utilizan cuil fre­ cuencia.

Estmrtuta tfel RHA Existen muchos tipos de mulóculas de RNA en la célula pero nos limitaremos aquí a las formas más comunes, que son el RNA mensajero (inRN A ), el RNA de transferencia (¡R N A ) y el RNA rihosómico ri’RN A ). Las suhunidadcs repelidas de RNA stifi similares a las de DNA, E l R N A también es un polí­ mero. pero de cadena simple o roonneatenario. El esqueleto de esta molécula también se compone de moléculas de fosfato y azúcar alternadas, pero cl aaiiear del RNA es ribosa. Como el DNA, las bast* nucleotídicas están unidas de hkhJ o covalente a la molécula de azúcar. Sin embargo, en el RNA la base nuele-

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Acidas nucfEices - Las bases del DNA y del RNA 131

otidica ti mi na esiá reempEa7ada por ia E*ase uracilo. Aunque lu m ayoría de las m olículas de RNA son monocatrnariaN, pueden plegarse sobre s í y fomuu pulules Je hidrógeno com plem enta rinsk, Jl: tal modo que se urigina uru cstrurtUftL secundaria.

Fundón del ÜNA-Aimacenaimknto de iníantiación Los senes que codifican Ea gran mayaría Je las proteínas funcionales y eülAKIuruItí Je lu célula cslun Lunlenidos en eE DMA crotnosómico. Si Ea célula requiere más prolcina para su citoesqueleto o si necesita más de una enzima para metaboEizar lifi azúcar, puede prnílucir más si abre. Ice y usa el mensaje en el DNA (véase la próxima sección}. Por lo [¡mío. se ha sugeri­ da q u e el DNA c.s L j. copia hellogfíííica de la c é l u l a . una ¡analo­ gía. peni nenie. Cuando una célula se divide, la célula nueva también: debe tener una copia del DNA para preservar su estructura y sus fundones. lis impórtame entender las bases Je la replieadórc Je l DNA prsrque nmchcis de eslos principios se usan en la PCR y en aE«;unos otros mítodos Je amplificación de áetdns nucleicos. La rcplicaeíón del DNA comienza con el aflojamiento de la molé­ cula de DNA superen rollóla, Luego, la porción más linea! de la doble hélice se separa parcialmente en dos hebras compo­ nentes. Es como .si loa peldaños, de ta "escalera" de DMA estu­ vieran serruchados por Ea mitad y las dos perdones lalcmtcs de J.i escalera se separaran (ñg. 4-4). La DNA belicosa es ana enzima impelíanle para separar las dos hebras de DNA. Una limitación en la síntesis de DNAr que se lleva a cabo por la DNA poli moma, es que oeune sólo en dirección 5L a 3\ Por lo lartlo, Lau m>I;i hebra de DNA puede hacerse de un moda continuo en esa dilección. Como se sintetiza de modo continuo y más rápidamente que Ea opuesta, esta hebra denomina cmnduLiorj (adelantada). La hebra retrasada se replica en secciones* debido a que el extremo 5‘ csüriS dis-punibte pan la síntesis sólo después que la DNA bel icasa haya realizado su función, Las. porciones discontinuas de US’A que se sintetizan en La hebra retrasada se ligan o se liinden una con otra por acción de Ea DNA ligaba, que por último hace de la bebra retrasada una hebra continua de DNA. El resultado final en la replicadón del DNA t i la creación de dus hebras hijas a partir de unu motécula de DNA madre (fig, 4-5), Cada una de las moléculas hijas nuevas Je DNA se componen de una bebra de la medícala de DNA madre u origen y una hebra sintetizada de nuevo que es complementaria de la bebra madre. Cada una de las moléculas de DNA bicatenario recién sintetizadas son parejas perfectas de la molécula de DNA madre, a menos que suceda un emir en la leptieacinn. La rcplicaeión del DNA debe preceder a la divi­ sión celular, de modo que cada nueva célula formada tenua un complemento completo de DNA. HUj I I ^

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düsüxlrnbasa altemadcs.

Las liases nucl^otideas se ftiítlendoni dosdo ios azúcanes hacia la cara ¡nterra do l^s ncióculas

(Je PNA bicglBrtánas

Ck>s hebras Ou un peiimero de-a&do nucleico desoíirritra&a quo intoadlar (eomplomartfariaa) tormén ln molécula ríe DMA da ccbe hebra Figura 4-1 bsCrUrtnfa sk-l f>NA t-u e^InMuri. ¡Jet PfíA Itit desalía CrtDO uiul M e bdkc, lil l?Sr\ o un [wImuctu feicjMniriti 41*5 se cunipniii: d« h w I ^ k I i k ptrnin

Función del HNA - TransEerencia de InrormasiDn LECTURA (TRANSCRIPCIÓN) E INTERPRETACIÓN (TRADUCCIÓN) DEL CÓDICE) GENÉTICO Los lícLlJos nucleicos y las proteínas de la célula inieractúan en la formación de proteínas 11 ul*xas. que forman ia estructura y realizan las funciones celulares. La primera etapa en Ea sínte­ sis proteica es ia 1 '1reC£Critun’\ u Inirtücripciem, del mensaje genético de modo que pueda ser transportado al ribosoma. El mensaje, que estó codificado por el DNA, se tranteribe en ta forma de una molécula de RNA, que se denomina (con acierto) O

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El esquelelo Je taa n-obías do OíJA constó de tosíalos v azúcar

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Figuré 4 - 2 JiUiilcfitiüjL'ashlc UNA y KKA. L » CUílUfi hases imctH>c(ílH-iH pre^t-rs en fl riNA stnri nuknínn íA j y puniría. itii. y unihan ion [mtina^ y ámtjilL [T J cLlüllna (Ch l|LíC w i |*¡:3Ci:i L l jlÍJi? (U) esli prrunLc cn el flNÍA jh lugur Je Liminx

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132 CAPÍTULO 4 Mícrabíalagía niDlecutar

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Figura 4-3 I >.ilnijii simplilL-c^jdc* lU;] IíS'A. E^i iitmple¡d eslruaura dd DNA u_-icprmrntj «uijdificüd.i cutirniHUCSlruetniri similar n una c^calenk, en ln i¡ue kis peldaño*. fsr,in icpnrscntadmfrHTCí la^ bases de nucleón Jim ii.nní*riWillaliw . Esl» se simplifUu mi* ,iiin > 1» hebra tujMiMY Je DNA *c rcpcrsTiiu en una. diiTíción 5’ a.v y ln j^ ín rtn de ti hetoi c^mplínurniun? *? da ¡htí sohwjileiidiiii

RNA mensajero (mRN'.U, R s 1 l > sucede Je modo similar a la síntesis del DNA, pero utiliza un grupo diferente de cnyimas, La hebra del DNA se Jesenntllu y se crea un:» molécula Je KNA mom milenaria que es complementaria con los genes (|ue se lum transcrito. L>to puede sufrir un proceso adicional u nt> (procesamiento Eratiscripciona]),, se^ilik el tipo de célula en lil que acurre. Luego, el mensaje se lee o el código genético se traduce por la maquinaria celular. Eslc proceso involucra íXrw tipos de moléculas de RNA. Coniü [RNA, rRNA y diversas pro lCÍii^is, L¡i traducción Jel mensaje en una proteírw sucede en una superestructura complicada compuesta por proteínas y rRNA denominadla ribo*oma. F.l mRNA se asocia eon el rilxv s,oma y se procesan tres bases al mismo tiempo. Estos segmentos Je tres pares iLe bases se llaman codones y codifican un aminoácido particular. Los codunes Jel mRNA son comple­ mentarlos de tos anticodoñes Je una porción del iRN A. Los tRNA particulares iraii-spurian o translieren aminoáeklos parti­ culares al rihosoma, el sitio de la síntesis proteica. Las molé­ culas de aminoácidos se sinian de mudo que tos enlaces peptidicos puedan (orinarse mediante l:t acción de en/.inuis entre etlos. P
Molqeula madra original

Pntrwra generación do nnlncuins n^as

Métodos de amplificación üe sen ales Ijíts m¿Leídos de am plificación de seriales, descritos combinan algunos tipos de ácidos nucleicos, por lo general una sonJa, con la generación ¿ke una aerial, L a señal suele am plificarle

Segunda generación ríe nnjiéejlas h^as Figura 4-5 PriducUw de rcplieaciGn A;I DNA- Cuda uju Je ta_s ihoI& uIjií hijíií. í U' DNA ile Li priinfra jewniirinr vi’nhrne- litiíi hebra dí la mctlccul-í müJre s una lK'hr;i nxiifn iiitiíii/^ula. l>i-% de La>t :iinl^i'uLi> hijai de l.i m^ u«

¡nletj/^lj^

Figura 4*4 K erliíBíiníi dd DN-S L a re fllí^ ld n ic lD N A s td tH irn ílliic n tíi dircLLH ti 5 ‘ a .v . ftir |i> I ü é US tflH Jlfl™ , Li J*rhia O üttJuctm a íx fc F jp l^ L il.

m:

siuccruia continuamente, miíninis que ta nfuesu ihc-Hri rerrasjdto sí sinfcí[j/-¿i en iíiüBeiilLH JcBUiniMiiJus írajinciiRii de Ok.uulii

mediante una reacción enJ.intdtica, Sin emhapgo, la señal
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Mdlüdos de amplificación de servales 133

Fig u ra 4-6 t^iucui;! l!í Ui i-vin-t ri p^'h-h-i y ilf L. u ^ .h u vi«i T-;n I j ftfifcsfliiatiíííi i n-ri-v U s ic i, <1 míinaye p iflílk tt ,?n cl l)K .\ m líV W lllV

O (l.iriM - 1 -iht1 |ir:U|M.'Tj¡l(i'ÍIH4l ^IL iLl H N A

í m R N A L i,|jl* v

ILICEI^uj f m

u m c h u r * I su.str.iin i'.ji j. 1;l [ludu^ciL'rii hi,.i l ■*i-

nlKiAn lIu pfüLíiiUi ¡I [íjnir (VI i
^

itURMA

x

r i I I

Transcripción

■I

Traducción 'RNA que se va daspuos que: su a/nlfioácUo ífl agrega a la cadcra.

O

?RNA que ' cva un

- Ammoacídd? = IRMA

nucleico, captura tle híbrido* DMA ele cadena ruirtilicadu e hi* hn dación in sjm Se considera «¡tu; 1;i amplificación de la siífliil «jn memw sen­ sible l[Uc los utálodra de amplificación Je ¿cidos nucleicos. U n a ext.j|kiiHi pudría ser la J'ISEE, en lis cual puede irfcnl ¡fi&Lrte un;i única eripia de una matéenla diana en una eran pnhln'ició(t tle tura* células, l>Li ¡ipliuidtín de l;n H SH ts muy Olii cr» siniestras ifc un immfu [jaioMyieji i>en iniv si i¡¿acido, en las cua­ les un-ü. Nubp*>bladón mentís Je células puede tener importando clínica. La» técnicos de ujnplificaciótii de .señales tienen varijíí vcnlajas *obrc I« í métodos de nmpliílcíitinn de ácidos nucid' cu- Rn t Li¡iip;irjL¡LPiL lsiti exios mítodux [finJicionales, i? h inuclto menos piuhnhfg que las técnica-, de ¡amplificación de seña­ les Jen resultados fabos positivos por contamLnadtin. Sin eiTíharyí], se hn infúranaJo la emnjnii nación de la señal o cl derrame de ana señal fuerte JewJe una cámara Je reacción hacía una Utlyaccnle.

linúas di ácidos nucleicos

I .li-h stjokdas de ácidos nncteieos fueron lus primes ov ensa><>s que jiasatun a ser comunes en mucEius laboratorios. Las sondas* Llamadas \c-euPinhev£), eslán Jis|K)jJÍhles en el ¡JiLTuado pmira Li dcicccion Je numerosos mLcroaijianismos a partir de Genh »b c® fSan Diego, CAI. lisias mn sund:i\ tle DNA que- con­ tienen una i i . -i i a qginiiolunimisecme v i | l í i : tienen como Man­ co cl rRNA üd microüTi'iLmsmo de ínteres, que es un objelivo Útil [xlfLjUe el fRNA está presente cii luav if CailliJud que lüs genes rl>N,-\ que lo codifican, Est-n es un ejemplo de ampliltCaciLirt binlógíta «» de uinpLificución ile un ik'Ltlo nucleica c¡ue suceJe durante el curso nn-mial de los evenios cciuEitres o secundario ul crecí miento Jc l niicroorgujiisino. Esla píopicJLLd quíniien, es mil para diferenciar la smiüa hibridmla Je la no liiljriduJa. Cu^ndü el lulsridu DMA RNA estulJe se (rata eon lirs. reaetl^ iis dcckicveirtn pnn i -.tii -. se produce lu Su/ secunJil-

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134 CAPÍTULO 4 Microbiología molecular

ría a una nsacdón química. La presencia de una cierta cantidad de luz. que excede un valor umbral predeterminado se conoide' ra una reacción posilna. t indica la presencia del rnicimorganismo para el cual sé diseñó la sonda para hibridar

APLICACIONES CLÍNICAS La* sondas genéricas AccuPrnhe* están disponibles pora la detección directa de bacterias en muestras clínicas o como un iréKnio rápido y cspccíficu tic idcnlificacidn de iiiicrociigaTiismtts «fl cultivo, Los pnxiucltfSi disponibles para la detección directa de bacterias en muestras clínicas son los productos PACE (Gen-Probe* Inc.» San Diego, CAji paia ti detección de M xcwarrhocae y C, tracltonutíin, y una prueba para la detec­ ción directa dé ¡¡uvptnrtHrua del grupo A. Hn el momento de su mtftxlueción» los ptoduenn PACE replantaron m avance it^niñcalivo cu s&tuibilidad comparados con los cultivos de estos pirógenos too requerimientos nutrición nles especia­ les 1 Sin embargo, estos productos son alga menos vencibles, npre ¡lis pruebas de amplificación de ácidos nucleicos con las cuales ahora deben campet¡rrJ,,]lww El ensayo de Sirrpwcotrífi el grupo A es una prueba fácil de usar que tiene cusj la misma sensibilidad y especificidad que el cultivo. Aunque el prmlddo puede ver má* costoso que los materiales necesarios para el cultivo, el ahorro en el irebajo manual requerido para las prueba* de subcultivo v eonJirmaeión» como la aglutinación de lúte*, hoce de la prueba directa |»r¡i StrvpbWKWS del £ru|io A (Ccn-Pftíbe) una opción atractiva»'* Hoy en día, las sonetos genéticas parecen una opción úlil para la ¡ilenüíkadón rápida de una variedad de microMganiirnnsen culiivo, muchos de lo*, cuales requerirían pruebas com­ plicadas y cuya eonJirmaeión lleva mucho tiempo. Las más Lió­ le-, de ellas en muchos laboratorios lian sido las, de identifieación rápida para micobaeterins y el hongo dimorfo. Se encuen­ tran en el mercado las. sondas genéticas para el complejo A/ti »iKn-t<>ritm lufuivuhsit. M tauMatí. M, y del complejo Mr avium-fnfmcdhílar?,'-1 Tairibiéil .se dispone de sendas genéticas pata f-iixHrpkwaa Cüv.snlíiítiíH. BÍQSi&rttvcr.v denuutiiidis y Coi'í'Uikmfrs itmnitiy, H uso de estas sondas para la camelen ¿ación ilc culi ivos que conlienen micobícteriasu hongos snspecho?,os de ser dimorfos disminuye siguillealivamculc el tiempo insumido para la identificación en el laboratorio clínico cuando se compara din los métodos tradi­ cionales. A pesar de que son más caros* estos métodos puede ahorrar dinen ai laboratorio si se considera el costo je los materiales más la Ulano de obra.. También se cuenta con una variedad de AccuProbtíS para la áJentifi catión de ciertas bacterias en cultivo, listo* incluyen pruebas para ( ump\-hrÍHn‘m\ .Strtptocmrsis del grupo A 3 del grupo B, H ü a t í o p h H m in f l t w n r m . S i r e p t t K m í n s { N t r u m t n m e . Siapfnlm 'vn'\n mtresa, Us téría rt¡om>cylogon*, > ,V. aonori'/iDfflc.*11 Cuandtj se rcali/art a partir de cultivos, estas pruebas tienen una sensibilidad > un» especificidad entre el yflít y el Ln ventaja de usar estos ensayos es el ahorro de tiempo; su desventaja es el costo mayor. Captura da híbridos La captura de híbridos (Digene, Gaitheniburg, M D) es una técnica de amplificación de renales i|ue consiste de la retención (captura) de un complejo molecular DNA-RNA (un híbrido) en un tubo o placa de mieituítulacsón (fig.4-7), Primero se proce­ sa la muestra para preparar el UNA. Las sondas de RNA usa­ das son complementarias a la molécula de DNA del microor-

U«nisino en estudio, La detección de un complejo híbrido DNA-RNA es útil, porque este complejo esiste sólo de modo transitorio cu la naturaleza, en el principio de la transcripción. Si el complejo no está presente, la muestra, se considera nega­ tiva. EL híbrido DNA-RNA, si está píeseme, se introduce en un tubo o en et fondo de una placa» cuyas paredes lian sido recu­ ló crias con un anticuerpo inunocluiiat que reconoce un híbrido DNA-RNA. Este ¡aMi cuerpo captura e inmoviliza el complejo de modo que tos otros constituientes, de ¡a muestra clínica pjitcesada pueden eliminarse por lavado. Luego, se agrega otro anlisueipo que también reconoce al complejo DNA-RNA» pero este anticuen*? está marcado con una molécula capaz de gene­ rar una serial en forma de luz. Se ccinsidera una reacción poMtiva citando la luz supera un cierto umbral.

APLICACIONES CLÍNICAS Existen ensayos de captura de híbridos (H C } dispcmibles en el mercado pura ladeLccción de Im subtip^ís del virus del papi­ loma humano íH P V >de alto nesgo» AW m ítíij jfíVtíírrAfWaí y Citkmíydía ímchomafte, y citomegalovíms iC M V ). La pruebw para tli>V de alto riesgo se ha eoinertído en un ensayí) suple­ mentario importante para las mujeres con diagnóstico cito lógi­ ca de células escamosas «típicas de significado indeterminado ÍA SC U S), Un meTOitnÉliíis demos¡ró que (a prueba HC11 tenía una sen&ibilidad mayor y una especificidad equivalente en comparecíón enn el Papanicolau repetido para la detceeión de ncoplasia mtracpiteláal cervical de lipo 2 tNiC-CIN 2) o mis grave, cuyo Papanicolati inicial fue interpretado enmo A SC Ü S .7 Además, fue incorporado a las recomeraíacjones del American Cnllegc of Obstetricians »md OyncctJlogisb corno un auxiliar para el cribado citológico en mujeres mayores de M) uAosrLa solide! de esle ensayo surge de su elevada sensibili­ dad y alio valor predletivn negntivo.^Algunos lo han encon­ trado comparable con la PCR; m embargo, oíros lo consideran un poco meiitks sensible/' "Aunque éste es un enrayo eMrcinadumente ji iI» se ha CLLcStiOiiado tanto su vensitriOdad corno mi especificidad.11-^1j De Cnemous y cois, mostraron que algunas de las reacciones falsas positivas ton este ensayp *e debiewn a reacciones cruzadas de sondas con subtipos U PV de hiijo ries­ go, tnienlras que otros autores lo explican como '‘eomanunación de señal" o derrame de senal llLintcscemc desde ptmis fuertemente positivos a un poio adyacente que contenídi mues­ tras negativas,'10 Kesta píTr determinar el papel que tendrán la detección molecular > ■la elasiíicacif'm del HPV en tos evámene^ peri¿klico> para mejorar la detección de displasla y carelnoi-na las mujeres. No ohstame, según parece, tais pruebas para el H PV seguirán vigentes, I ai captura de híbrido también se usó con es ito para la detec­ ción de A'. litHiorrltttruv \ C. (nKinitmnis^ ^ 211'Jrt-1^ S ü infor­ mó que este ensayo es mis sensible que el cultivo. So que no resulta sorprendente dada la naturaleza de requeri miemos espe­ ciales de esios, patógenos, y más sensible que Ioí, analui* de sondas geníticas»CJ Ttxlavía no se ha realizad^ una eofl|>aración rigupisi entre ln captura de híbrido para [adetección de ,V» XifmJtrhtNrüc y C. tniihomalix y ÍOíí ClHa)OS de amplificación de ácidos nucleicos, La técnica de captura de híbridos puede también utilizarse para delectar CM V y HBV en la sangre La prueba HB V es un ensayo cualitativo, mientras que la de captura de híbridos para CM V es cuantitativa:.1"' La cantidad de .señal generada en el ensayo es proporcional a la cantidad de virus presente fíe puede calcular la carga viral cuando los datos generados se usan junto con los estándares cuantitativos provislm por el

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se

~JK;inrdro ql!,l~ ~~ VERS,ANiT H1V--L lli~'A 3A] ~B!!'}~f [}i~~no,. I·&~S.11uryiml,!n. NY} es U~ en~!l)'OI;!l!t!umm~'e n:p,mctu:,ible ~oo Ulil llImgo. :llililf',;:iJI am[tH~ 0:5=.500 I~XtP.i:J~de N:l:V~ I"RNA}. q,~]i~~. Oln ·p.tardJ 1i.lJmedici.dln ~.illOOl1~j[Liltl\?a de. ~a C'W'ga v,un;'1 dc: H[V.~ :1 •. ~I\'l.eiusoeuuil~do SI:' k, i;;.tJii'fl(;iut.iJ il;Ofi I[r] FCR.~if:,wtsenp~s!i!. ~nl¥c.:r~ m.odo i!lhlili~lIir:,~Illl: e:valu~ioo.es; ~:ElI!JIII:b~iim;[rkilS;d~' ~.oo. VERSA~1j' ~l-[ep:lJtul~isB DNA 3ij]!y VERSA Nf HC'\! RNA ],;(J ·eiIllCI(iln~r..MQrIi que: leM:rus .PfLJetjo;ft~ :~I estll mectlii.1llogia e:l~~n rtp'.rudn{~ib'Jli...'l.5, 'tOO{lIli. un 1""J1[1g,O; ~lun~jmi,c.ilJ:Hilf"P~ILfi:y d~!fi'LOiilitrr.:lnJn S~,Ii

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B Est igrra del dr. VaRx Eso

136 CAPÍTULO 4 Mteróbií logia molseulár

d a s .* ;,V7’ Aunque la sensibilidad tle las pruebas tle bD N A puede ser utu poco menor que lu de ¡a PC R , existe una buena correlación entre las cargas vírales geni? rudos. por estos ensayos díferenies.W;M 1

Hibridación in sifu Durante muchos uno:- %e utilizó la hibridación in situ en lu

patología molecular pan delectar translocaeiones cromosómicas
recientes han demostrado la faclibilidad y tas pcssLhlB venlafilh de los ensavos irii situ un e| laboratorio de mÍLTi>ÍJÍoL(ii¡fa Algunos de hjs primeros ensayos de hibridación in shu se irsarun para la detección de viras mediante la hibridación direc­ ta de una somla de oligonuclei'nido y tos ík’idos nucleicos vira­ les Ir itis sf nfilfcamn para confirmar lis ideniidad de ua vim s particular asociado con cierto eFeclo clLológico fp. ej- C M V como causa de tina inclusión Lntnxnuclear lipo A de Cuudr^r), así ío m o piira diferenciar \:rus que producen, efectos crtopáiieos directos (p. ¡j., H K V y VZV).-- lisia técnica también puede utilizarse para diferenciar los subtipos de H K V de alio riesgo y de bajo riesgo,1” También se lia demostrudu que lu hibridación :in situ es Uila técnica iltíl para establecer la presencia de pierios virus en algu ñas ncnplasiai, «romo d H P V en Ils displusias o carcinomas espinooelulaies cíe cutdtu merino, o el virus de bjistcin Barr l E Q V lt ii los, trastornos, linfoproh lenitivos posírasplante y en el (infam a de Bu rM tl. \ el herpes virus humano K (H M V -S| en el sarcoma de KaposLm3SiJft'™ La observación directa de las. células snt’eciíKlas, eon virus en cl foco de la paitiJnjjfa ¡iy»d:i a confirm ar el papet ctiológicn del micmnrgumsioo detectado con la tníerm edud. Aunque la detección de viras mediante l-i hibridación in situ ha sido de gran utilidad en cl laborukwiti de patología molecular, el uso de estas técnicas no es común en los laboratorios de virología clínica, I j hiliridiiuón i n silulam bién puede usarse para la deiceeién de baeteíias, micobactcrias, hondos y parásitos. En talen tusos, cl rR N A microbiano puede usarse eumo üititi diuna de Ll sonda 4c bibridíción, nsto puede sét* más vemajoso que una DMA di min pi>r dos rizones. Prim ero, hay muchas más copias de rR N A en laech ila i|ue copias de ^enc> codiruiulos fxir Lis i ilx)stjinas (rD N A ), lo que aumenta la hensibilidad del ensaso, Segundo, lu preseticaü de rR N A señala la presencia de u n o r^ mvmo viable, ya que la detceeién del D N A , en particular por rmíiodot como la P l ’k , puede hacerse incluso después que el tsrianis.mo nn es \iahlc (p. cj,H micruor¿anismus muertos por trulani ienlcui anlim itrobiartts}.

Antes de la introducción relativamente reciente de h F1SH en cl labítraTnri» dt; micfobiúlpfía clínica, estas tecnica> fueron U^aLias por microbiólogos det medíoiLmhicnlc para identíljear y coniar Í^kmt-lki. £. cotí y otras batierijs en mucslras de aguu y biopelíeulas.^3"7'^ Lisí como por tilltrobiólo^ns vuiciiiiariiH para esludiar diversas enfermedades. ^ r En hí&topalologia

molecular se usd la hibritlíición in sint para itivesii^r bcitier ¡r*Ion en las bíopsias gústrieus, Chtuniyiliu en una Varie­ dad de estados de enfermedad y Lexivm.Uu pfu'umophihi en pn> parados fijados de muestras rcspirnloria$.6íl]i-m i-J-ll-lüi Hl ohjeio de algunas pnicbas ha sido lograr o»» rápida CaraCleri/ación demicdhiicteruis uilieTitulosLisomuLihcrculHJfiafr, La¡* niicobacierias son candi Jal as excelentes para :>u idcntiJlcación p u l m e todos tunleculares, p o rq u e a lg u n a s de ellas ruusuLt enfermedades graves y son tle crecímienlo lento en lo®, cultivos (M tiifwmito.iis'h y algunas tienen retinen míenlos nutrición si­ les espeeiaks fW. gtw vense y Al, haemophifwn) o no se desa­ rrollan en medios artiFitiaícíi f¡Vf fcfwtt:), Lu F IS Ií que utiTi/ji sorkLii hílsridxs líc á c id o s nuelÉieos-péjitido.M ’ie u.scSmo tiuenos resultados para la idenlitlcación rápida de M. iiibcnulosix en íniris de cultivos micnhaclerianos y direclamente «n muestras respiraloriiiS que eonlienen butilos acido-alcohol ro^lentV1,111 También se uwaJ’on aplieaciones u i siiu li'aLlieionates en secciones liislológicas para identificar en forma definitiva M, lepra e * También loslioneos y los parásitos fueron caracterizados por medio de hibridación in súu. Se describieron ensayen p;ir¡i la ¡deiirifieoeión Lie lispetjies i L A tf^t-ffiUus, cu\ a irriporlunua c!i(¿ dada por lu ereeieiitt nuturiedad de mohos tubicudos h iali­ nos no A spvtfiilhi^. como F m iífim s y Pseudatie.ieheriii, que son patógenos para los seres humanos y tienen perfiles de sen oibilidad amilúiLgicits dherem^s, tíe f,v-, de la ñiuyoríá de las csjxícícs IJí--l í 3,0 ÉsIl»s son especialmente intpoiilaníc^ cuando el niaterijl collado no fue sometido para cultivo o si fryea'.a el ertcinncrtlo del moho en el euhisL*.. t.a hibridaci'in Lr\>|tK3g^n¡L"a in íitu, que u(Lli/j el mé|L»dfl de aLilplLlie.3ción de ^¿ñal de la liriLinida. también *e a]>licó para el diagnós­ tico di Iereneial histológicamente dificultoso cnlrc levaduras y fotim s slmiltíres a levaduras en tejidos Im inunoi.111 listos iLiéLudtín fueron menos sensibles que lu tinción de metenammu de piala para la detección de ulguno-¡ de los bongos, pero deinostraion el I tKIV ile esLiedlicidad eon idem ificación especlilcai de especies. Otro ¡songo que se ha estudiado usando hibtidítcióu im silu es í ’neumocystis / t o m íc ^ 'E ! uso de esta técnica paru lu dcteeeiún de esiow bou eos, pueden ictier algunas ventajns, porque se puetlcn delectar tanto la forma quistica CL’íino irotoíoi’U'j. en ve7. de hó]f» la forma qnhEic^, que e-^ lo que sucede con algunas lincíones liistOL|uímtca.sPcíhtio la tinción de melcnamina lEc pipía de Gomori (GM-S).

APUCACIONES CLÍNICAS La mayoría de tos Lrabajos respecto del uso de hibridación in situ para ta detección Je míen (organismos en mucitras clínicas fueron realizados en laboratorios de patología molecular, a menudeen muestras fijadas incluidas en parallón, S-in embar­ go. cs|n i&ntu'.i es promisoria por I.jS expi;CI¡iLH;iv tjlit; despiéi'tujHfj su utilización habitual en cl laboratorio de m icrobiología clínica- Junücn v cois. ' 1 v K ejitpf j cuLs. publicaron simutlá neamente arnVuloh que investigan el uso de la hibridación in ■útil para la tdendíicación rápida ífc niiemnTganisnnios presejiie^ en Irascos tle liem ocutilvos posiilvc^i. Se usrt una varicLlail de sondas, nulas ellas dirigidas cmUra secuencias específicas pré­ senles de rR N A bacteriano, Algunas sondas reconocen «eneros y tan ii lias decir, todos los estafilococos o todas las enterobacterias rcspeciivamentej, mieniraftqtLt otras (nerón específi­ cas ppra espeeiei, particulares (Sruf*hyttn:t>ti.ui aitrem o Flu 'iw it-fiíü la tí). La mayoría de esta--, sondas fuerutt extreílUIdamentc precisas para la identificación bacteriana en los bemoeullh'os pfisifivos Una característica atractiva de estos ensayos

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Amplificación de ácidos nucleicos

137

fue que la elección de Lls sondas, de hibridación in suu a uultvr¿ir puede hacerse sobre Ea ba^e de lo* hallazgos do la tinción de Gram. Otra característica impostante fue el iiem|x» requeri­ do para !a detección. i^ue pudo ser líe üélu 2-3 Im is. Kjenipf y cois. compararon el tiempo insumido por la identificación con la hibridacMÍTi in situ respecto de los rpetodos trndiciunates; pjtra ello estudiaron I I ? liemoeukivoH positivos, Encontraron un ahnma de tiempo apim i nítido de 26 horas puní la identifi­ cación de estafilococos (ÓÜ de 62 idcnlideados por hibridación ¡n situ fiSH ]). 46 horas para estreptococos (19 de 21) Ldenttiicados por ISHp y 4(1 horas para bacilos gramnegativos C2S de Jtl idendficados por IS H i.1’ Concluyeron que con un nú meto limitado de sondas pañi Jtibridación in situ se ]>iw.lria ideruificaí' ISLCUUSH Jel 9Ó ,Í% t.k- los heillWvIÚVns |*]smvOs dentro de las 2,5 horas, tnienuas que ei cultivo convencional tomaba entre u n n y 3 d j p i . |Ti

La hibridación in siiu también se usó para la defección di rec­ ta de bacterias patógenas a partir de muestras clínicas, Ho^ard! y cois, la utili¿aron para detectar c identificar tas bacterias comúnmente jírc-sentcs en 3a1» secreciones respiratorias de pa­ cientes eon fibrosas quística.Mh Re-aliviaron pruebas pura Pít'jjib/momia fít'ru&irtflsa. fíurkholderiit ccptuia. Sii'iwiwphoim r ,f r Hc/rmnphifax injhtenzíu- y SipphyltK-tit-rtM auiTu.% usundo hihridaciAn in situ. Estos ensayos realizadas directamente sobre muestras clínicas demostraron 90íí de sen­ sibilidad y IOWí de especificidad comparados eon los unitivos, incluso en el medioambienle complejo de Jas secreciones res­ piratorias de páctenles ton lib ráis quística. t'is imaginable que una hatería de sondas de hibridación in sim pueda ser úlil para la detección de patógenos que están por lo común adieta­ dos con enfermedades particulares, como meningitis bacleriana v neumonía adquirida en Ij Comunidad Se ha desarrollado y está disponible en el mercado olro método de IStLquc usa una sonda híbrida de ácidos nucleieov píptidoi íPNA) en lugstrdc una sonda de DNA. Las sondas de ácidos nuclc icos-pe piídos tienen propiedades que ¡pueden ser más ventajosas que Las sondas Je DNA eon respecto a Ja pene­ tración. cuando Ea hibridación se realiza sobre miemorganio­ nios intactos, y para una diteflfrtL'iación mayor. en particular de polimorfismos de nucCuótidos simples,'^ AdvanDx lWoburn. M A ) ^s un proveedor de fus equipos PNA ISE1 pura Ea detec­ ción rápida de ¿'. Kü/ cffi Cundida albicatts \ E.faentdix. Varios estudios lian analizado usEas pruebas ■ , se las encontró útiles para diferenciará uun'tts Je eslafilocoeoscoagulasa negativos en fraseos de hemocultivos positivos que eonlienen cocos grampositivos en racimos en la tinción de Gnin. " I.j hibridación in si tu también ha resu Je¡uLo útil para la iden­ tificación rápida j lo diferenciación d<¿ legaduras clínicamente impfrianiics en cultivos de sangre posilivnK Kempíy eals Jifc retKiaron C. (lUm urs, c ftiiibmru, C, Xrtf.Tr/ y ('■ jxtnijuiltt'ir', usando cuuiro w>ndas ISH. De modo similar, se uliii/ó el ctisaviii FISH PNA |Kira Candida albkun.s { Advan Da) para diferenciar ( ' albicans Je levaduras no C. albicam cu cultivos de sLíEiyre pLisitims''1 4-Kh. Ks irripurtante Ea diferencia­ ción rápida y precisa de legaduras, ponqué es muy probable que algunas especies no Catulititi ultíiaftis. como C. i*infanta y C. kntxeir sejn resistentes al fl lil nna/Ljl. un fdrmttCO habitual en el uatamiento de las infecciones por C. uibicuitj . 4’ La hibridación in sitn con PNA y la tradieinual también se han u^ado pura la diferenciaCiiVi nipida tic mícohaclcrias, Hl interés ert la identificación de esuih nitennn'jianisniLís mediante métodos moleculares es indudable porque Sos miembros de este j;rupíi Causan enfermedades graves (M. laben'tifnsi.s), muchos de ellos son de crecintiento lento y, al menos «no, Af,

Figura 4-6 nsil rtíA para CtHklktít albkwí. La Irvaíur^ y (a scmJLihiia ¡fte rJiij l i rrr.it^tran lhím Iiii

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ifprac, no crece en medios artificiales, l.a Eiibj i dación in situ SC útilljó para diferenciar M, tubeiridusis de micobaderins no 1ubercij losas en culihos ctm de^trtollo positivo, js í cocho en forma directa en Irotis positivo*: para la tinción ácido-alcohol re&hLente \ en secciones histológicas.1'1' "J La confirmación de Af. icptm- en cortes histológicos también kc ha Engmdo cim hibridacidil bri silu.’ Aunque se describieron algunos u^-os de la hibridación in si tu para el estudio Je parásitos y de enfermedades parasitarias, su aplicación es todavía liiniiaJa,libi£>logfa clínica. Según la disfhinibilsdad de 3í >s producios comer­ cia Le*., esta lecnoJogL'a pinlria influir en la manera de practicar Li microbioLogía clínica, LL escaso tiempo [iura la detección y La capac idad de seleccionar sondas para usar de actieniti1con los datos de la tinción de Gram ü Con las características de La pobtncián de páctenles en estudin |,t h^cen alntcliva eomn ins­ trumento di¡jj;ilós[jCo-

Amplificación de ácidos mídeteos Bases úb Ja reaccici en cadena; de la pul.mensa La reacción en cadena de la polimcrasa, descrita por Kary Muí Lis cu 19^3. aplica la bioquímica básica de ta replicación de3 DNA eon et ohjetivo de arnpliliear una pínc¡L>n particular de DNA.- ^ 15 La porción de DNA que >e amplifica por lo gencmt contiene información úlil desde el punió de vista diag­ nóstico, La mezcla de PCR consta del DNA diana pata la amplificación ) la mezcla maestra. ÉsLll a su ve/, se compone de cebadores de oEigonuetcótidos Je DNA, los cuatro nnel eói i dos trifosfatos. DNA polinierusa termiiestable. cloruro de mag-

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

138

C A.PÍTU LO 4 Míe rabia logia molí cul ar

tiesto y a ^ u a o uno solución reguladora. L a reacción en cadena tle la poli m en sa consiste en tres fases repetitivas, lo que cons­ tituye la base de la pOrCÍún “ reacción en ca d íT u " del nombreRstqs tres fases son; l> desnaturalización del D M A (o La sepa­ ración de J as. dos hebras de R N A ), 2) hibridación de! cebador y J ) extensión del cebador (la porción de La reacción donde suce­ de la síntesis de D M A ),

La desnaturalización de ta molécula de DNA molde n la se­ paración de las dos hebras individuales que componen La molé­ cula de DNA bicatenaria madre es la primera etapa de Ea PCR. Esto se acompaña por la elevación de la temperatura de Ea mez­ cla de reacción hasta aproximadamente 95 X , A esa tempera­ tura, el DNA hicatcnario se separo cri dos hebras simples. Esto sucede porque la energía térmica rompe los puentes de hidró­ geno que mantienen tas dos hebras de DNA jumas a icmpefaluns mis bajas. Se prefiere la desnaturalización térmica tle DNA a Ia desnaturalización química porque es fácilmente reversible por cnfriamicntrí. La próxima etapa de la PCR, (a hibridación del cebador, comienza cuando lu mezcla de reacción se enfría y 3<wcebado­ res oligonydeótite. que se eitcoentraii a los lados de la zona por amplificar, se hibridan con Iüs hebras simples de En molé­ cula de DNA molde. Los oligonucleólidos cebadores son frag­

Molécula de dcDNA original

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11

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mentos conos de DNA. por 3o común de entre 12 y 2ü nucleótidos de largo, necesarios para iniciar o cebar la reacción Je üíntc-HÍH de DNA. L’n cebador llene oí mismo sentido que !□ behm superior de DNA y se denomina cebador directo (farii'dtt/h como se señala i.fig. 4-9^ mientras que el turo es det mismo sentido que la hebra opuesta de DNA y se llama ceba­ dor inverso. Los cebadóles se hítaridan con la diano mediante el tradicional apareamiento, de ba.ses de Watson y Criefc; asi, la temperatura de hibridación del cebador pudría ser menor o iguaE a Ea Tir o lemperatura de fusión, de Los cebadores usadns; en Ea practica, lo TM es la temperatura a La cual se hibridan Los cebadoresCuando se elige un grupo de cebadores, se deben conside­ rar diversos factores técnicos, muchos de Los cuales están uhora incluidos en los programas informáticos de diseño de cebadores. De enios factores se ocupan Im científicos indus­ trióles.. micimos que los usuarios adquieren en el comercio los equipos paro ta PCR. La mayoría de los delaltes deí diseño del cebador exceden et propósito de este libro; sin embargo., algu­ nos punios merecen una mención, especial. Si se desea nn pro­ ducid Je amplificación de DMA simple, también conocido corrtu ainpficóre Iuü cebadores deberían elegir.se para liilmdur con una región simple de la molécula de DNA de interés. Es

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Arip i^eaciar eitpanendal efe la PC R Figuro 4-9 Rfnceifln en c*il?nji (lf tu pilinirrasi. 1.3 i^aníicki ira L-Jtkhii de la poliflTic'rj.íii un cictn rqsdidM> Je (le^nalur.Ji/aclita línnicd. Iuhfn.lj£i¿líi yeittnsiíri ik U» cebadura j ü v 6 de la iuxMtfi de la DMA |iuliiik(dM luijiií nu sí fnu£iüi)L L i reacción deriv* cu k jimdirci:ii.iii cx-piincnrij] de rikii&utiu, nuevas de DNA. cl ¡inncipin y el final ;k I ík tüaks w ctaicmúiMn jwr la*. prKiannr'i (I* ínt diuntiit e mvewns.

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Ampl ficaciá n da áci dos nucleicos

importante que los cebadores no bibriden con oirás Arcas di- la molécula del mismo organismo y con él DNA Je otras espe­ cie! que puedan estar présenles en la preparación de la mues­ tra. Por ejemplo, si el microbiólogo molecular está intentando detectar Legitmeíkrpneumophiía en muesiras clínicas, debería elegir una región única para este microorganismo que no esté presente en et genoma hum&no, Fistn mí ha lograd® con éfiito medíanle Ij *eílali ¡¡ación Jet jíen potería ador de infectividad del macrófago (tnip}< que contiene regiones únicas suficientes para diferenciar L pntumophila Je otras bacterias, y no es un constituyente dd genoma humano.-**-1"" La reactividad tni7.ada con et genoma humano podría consumir de modo no espe­ cífico tos cebadores y las bases de los nucleólidos trifosfatos en la mezcla de reacción, y podría derivar, en el peor de los casos, en una PCR falsa positiva, según el sistema de detec­ ción usado. L i presencia de tos productos de la amplificación por PCR suele determinarse por et examen de los producios obtenidos por dectroforesiü en ¿el y leflidos ton bromuro de etilo. Lj pnisetteia de una banda ÚüÍc j en el gel es una huen a evidencia pitrEimiiiáJ.' de la especificidad de la reacción. La presencia de bandas múltiples sugiere que los cebadores no son específicos o. que Ijsü condicione* rigumsa* de lu reacción no son óptimas (fig. 4-10). En algunos casos„ ta especificidad puede mejorarse con un cambio en Ea.s condiciones de la reacción, como la con* ceníración salina u la tcmpcrelura de fijación Je l cebador. Lo m¡Ss fije iI de cambiar es la temperatura de hibridación del cebador. 1j. especificidad de la unión de I™ cebadores a 3a mnldcu’ Ea de DNA diana aunteniafd conforme la temperatura de hibri­ dación usada se aproxime a la T Jt de los cebadores, miu condi­ ción mis exigente, La síntesis de tina hebra nueva de DNA complementaria a la hebra madre de DNA se lleva a Cíbü pí)r la acción de La DNA polimerasa después de que se completa la hibridación del ceba­ dor. Bil descubrimiento de una DNA polímeras* temmesiable facilitó -el cielo de esta reacción en un tubo cerrado, sin necesi­ dad de agregar una enzima nueva después de cada poso de des­ naturalización térmica del acido nucleico. La DNA potimerasa sintetiza la hebra complemcnlaria nueva a una lasa aproximada de 25 ph/segundos. R-sie Líalo en importante para determinar cuán larga podría ser por último la fase de extensión, que se ba:»¡i en ta longilud del amplíeótL Una vez transcurrido el tiem­ po necesario para permitir la extensión completa del ampl icón h la mezcla. de reacción se vuelve a ciclar a 9 í ®£ para otro cielo de ia PCR. Así, la porción diana de una molécula de DNA se amplifica expone ncíaEme-nCe- para formar millones de amplicones. Usté ' incremento exponencial de ta región diana del DNA expliea la gtan sensibilidad de la PCR y la capacidad de Jas pruebas diag­ nósticas que asan lates métodos para detectar un muy escaso ndmen) de patógenos. Esta sensibilidad exirema ckplica i¡mib¡¿n el ¿■rfeii cuidado que se defc1t^ncx tuundo Uubajd con DNA amplificado^ poique cada rnolécuia amplificada, ú se libera en el medioambienle, j>odn.ra contaminar una muestra clí­ nica (contaminación con amplicón) y dar lugar a Lina reacción falsa positiva. Aunque pare/ca que una única copia del DNA diana deberta ser detectable por FCR, existen en la practica numerosos inhibidores de la PCR en |a.s mueslras clínicas que limitan la sensibilidad de estos ensayos. Aun cuando La extrac­ ción del ácido nucleico nn se trale eon detalle aquí, es probable que el proceso de preamplificadón de las muestres clínicas, para eliminar de clEas a Los inhibidores y prepararlas para la amplificación det ácido nucleico, sea tan importante conto la reacción dü amplificad ¡Jn en sí misma.

139

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n o p t kk jinfil iik iir iíi ule áeklos nwtlficos ti lot echadom w hitimlan con un M[i<> ajicmacn^ nse unen mire M y forman ilímcros Je tík n k if I j impli-

fkación I» (spítíOíJ y íiw.

-te(r'íKnJi'r pnwleii nculnt:ir^iz mettijinc un

Jtwnm « ís a jii cuiiJikkiso j Ia (iptim iwciín de las cpraíirinrst^ -,1c reatciín. Los carriles ] j5 iinhrttrua iniptilkíw iiiri iw ctp tvfíltj pcr« M«n m i’, üirnrj ik fJi {1 cqrni ? t flt c iü t r t,

APLICACIONES CLÍNICAS La introdacción de Itt PC R en el laboratorio diagnóstico repncscnlLí un aviuiee .significativo en medicina. Las pruebas baüadas en P C R les permitió a tos EaNi'ratonsi.'i:!! deieclar inifTK h>r^anÍMnos que M* podÍBrt

CUlIlVÍHkíS. ;l:s¡' COmO IfiS

con requerimientos nutrieinnates especiales o de crecimiento lenlo. Sin embargo. Eos primeros inétud(K ^nara dctectar los pro­ ductos de EaPCR fueron Saboriososy consumían baslante tiempcí (véase "'Análisis de posamplificacicin", más adelante). Pitr ln taino, estos ensayos se reservaban sólo para los patógenos más importanles. L,a aparición tic la-^ plantillas de K Tlí aulomalizadas y semiautomatizadas y Los métodos cada \c¿ más fáciles y conveniente^ de delcetión ilicrementaFun el Omj de CsLas lécnteas para una variedad más acnplLa de patógenos. L\l:-í tudos lub microorganismos de mieras etínico han sido detectados y estu­ diados por K 'R . Además d t J j detección* la i aL"K provee al mvesugador de una lierrainienta para examinar la presencial) la ausencia de ele­ mentos genéticos particulares dentro de las poblaciones, y, cuando se acopla con la seeucrteiación de DNA. permite anali­ zar la composición y variabilidad de los tifie s en estudin. U i IK-’R tianscriptasa ii ’sa ( véise mas adelante i p^ntule detec­ tar virus RNA y me Ja respuesta genética (el m R N A ) de los orgirtisrrtüS y las cé s eucajíonteji a diversos eíilímulos.

Las pruebas comí la H3A. están disp de transmisión suau diomtttis'™'"'- Autu, £TJn .sen.sibilidad, q

ales, que han recibido la aprobación de "des para detectar dos Je tas bacterias aás comnnes: N\ gm orrli& eíiít y C tm-

ion extremadamente útiles debido a íu íxcedc p
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140 CAPITULO 4 Nicn Díalegra molecular

son perfectas.'Su especificidad fio es del |U0%, lo que signi­ fica que en una poblad ón de luja prevaleneia el valí* prudicti* vo positivo es subópüinu y pueden oeurrír resultados íu lw positivos para los que se recomiendan pruebas confirmato­ rias, Además. Ja pritcba de PCR para N. tornar,rhvae disponible en «1 comercio, tamo corno h prueba que usa amplificaeidn con desplazamiento de hebra (véase mis adelante) han mostrado tener la capacidad de reacción cruzada eon ciertas especies de Neisseria no gomocéctca. que podría causar una reacción talca posili™ .1viiSf' Las pruebas de PCR Liprnb:niiis por la FD A se encuentran en cl mercado para Ea identificación lápi­ da de \f. wfwFEnhtm en secreciones respiratorias con frotis positivos para bacilo ácido-alcohol resistente.'"-™ Las modifi­ caciones aprobadas por 3a FDA que trían PCR de ciclo rápido están disponibles para la dclccción rápida de Strvptacwctts del grupo 0 j S. nureifi resísiente a lu rnetidlina {véase ■'Amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real” , más ade­ lante l Los ensayos aprobados por la FDA que usan PCR-RT (vease más abajo) están disponibles para 3a dclccción y cuan tifieación de virus, de RNA, como HIV y H C V Exilien otros, ensayos aprobados por ¡a FDA \ una amplia variedad de reac­ tivos específicos. del análisis (ASRi JisponiMes en el mercado y c(|uipos sólo para uso en ínvesiigadón i RUO ) para el estudio de diversos patógenos humanos, □Iros raétDdas de □mplirícacíún- de ácidos nucleicos

Se han ideado varios, mélodos de amplificaeión de ácidos nucleicos, algunos para evitar los pagos de patentes de la PCR. Se encuentran disponibles cerniere ialíñeme equipos diagnósti­ cos para varios patógenos microbianos. Uno de los primeros que se comercializó liace poco tiempo,. usó la reacción en cadena de la 1igasa, Este método fue cl primer ensaco cf....mplificnición de ácidos nucleicos que resultó ampliamen tsado para la detección de A‘. gmmrrí«Katm\ C. tmvhonmth. Los métodos no PCR que están disponibles en la actualidad en el mercado son «1 de amplificación basada en Li secuencia del ácido nucleico (NASDA) íbioMérieus,. Durham, N O y Ja amplificación de la transcripción con fármacos (T M A ) (O cij P robé, San Diego. A)„ que básicamente son la misma técnica y el de amplificación con desplazamiento de hebra IS D A i (B D Diagnostic Systems^Sjiwks. M D) La reacción en cadena de la ligasa en su forma más pura es en realidad una reacción de amplificación de señal que se sus­ tenta en 3a unión o conexión de dos sondas que se hibridan en contigüidad sobre la hebra de DNA molde. Esta técnica, cuan­ do se combinó con la extensión limilada por DNA polimerasa. fue la base de los productos Abbott i prueba LiCa N cisitria gütMrrfuvtíe o LCjl Chhmydio trachomtitis, Abboit París, IL ) para la detección de A’. ginu/rrhot‘tu>y C. rmchorttaiis, El uhj del sistema de dos sondas es necesario pura que la ligaba con­ tribuya y su excelente sensibilidad. I j i desventaja de este ensa­ yo fue la falta de un control interno. No se tratara esta tecnolo­ gía mis adelante debido a su ausencia en et mercado comercial. Tanto NA USA enmn TM A «w ensayos disponibles en el mercado que conslituyen ejemplos de amplificación mediada por transcripción, Estas pruebas isoióniiicas usan Eres en/inlas: transtciiptasa inversa (RT), RNasa II y RNA polímeras* dependiente de DNA T7. La encima RT hace una copia de eDNA de la molécula diana, que por 3o general es RNA. El cebador que se usa para crear la hebra del DNA complementario a la molé­ cula de RNA diana contiene Ea secuencia de unión a la RNA polbnerasa T7 sobie el extremo 5' de la molécula, Luego se bidrolijra la porción de RNA del híbrido DNA-RNA por Ja

acción de |¡i RNasa H Después ,se une el secundo ceñidor \ crea Ui hebra complementaria de ]# molécula de DNA, con lo cual se ctrinpleiíi la molécula de eDNA. Es|a molécula tiene la secuencia de unión a la KNA polunerasa T7 incorporada y sm 'f como molde para Ja RNA polimerasa T ?, la cual iranscrilie mimemsas copias de RNA, que pueden detectarse medíante varí lis tnéii'nJus. Lji amplificación con desplanan! iemo de hebra es una reac­ ción isotérmica que se basa en la capacidad de la DNA polimerasa paras desplayar una hebra de DNA en el sitio de una mella monocatenarií» y proceder a la replicación del DNA o amplificadla en este ensayo. Esta técnica, aunque eficiente, requiere condiciones especiales y cndunueleasas que ¡•eneren una mella en una sota de las hebras de la molécula de DNA bical enano, en vci de pnxlueir un emlc a través de las dos hebras del DNA, que es 3a forma de acción para la mayoría de las endunucleasíLS de restricción. APLICACIONES CLÍNICAS Se dispone de pruebas comerciales aprobadas por la FD a para 3a detección de N. gMmrrhoeür y ('. fw h tiin n u ' que usan TM A > SDA,J Akduniau y cois, analizaron mis de 3 500 mues­ tras de orina utilizando la prueba BDPiobeTec-SDA1' (BD Biosciencc) c informaron una sensibilidad del W í i , una especificidad del un valor predictivo poslnen del K4.tf% y un valen" predictivo negativo def Ccjh respecto a los diferentes ensayos de amplifieacitin, estos autores, comu otros, reconilciidau la necesidad de confirmar los í estillados positivos, dado el vakir predi el ivn positivo. Lm prueba BDPmbeTccSD A 1' tiene un control de amplificación interno, que es i'nil para identificar reacciones poEencialmente falsas negativas secundarias» a la inhibición tfc la amplificación. La linea de productos A PT IM A fGen-Probcí esta aprobada ptw la FDA, se encuentran en el cortuinrlo las pruebas TMA para la detección de iV, gtm ufrhwítr o C. tmchtumiiis. Gay dos y eiils, eslUüi¡u\nY et ciisüju A H 1 M A ti lü eiiPro lvj y cotiipa,raron su sensibilidad y espccificklad «q juaesíras de escobilla­ do endocerv ical con respecto a los estudios de «rinuJ‘MPara C. tmchmtiütw encontraron una sensibilidad y especificidad de bis, escobillados emkKcrvieates JeI (l4,2^r > el W M r ctwnparadas con una sensibilidad y especificidad de la primera muestra de orina del y4.7^ y él 9B.ÍK5?. Para Ar„ ,i;tJ«íJirrAi:ífííC eneontraron urtu sensibilidad y especificidad de esjobill.ido.s crdueerVieaJes del W ,2 % y el W J**-, y una sensibilidad y especificidad de las muestra^ de la primera orina del 91,3% y el 9 ^ .^ , respeetivameiiie, La* i^nebas APTIMA no tieneít un control mierno para Lj amplificación*, sino que usan un sistema de captura de la diana» con el que, según Gardos, y cois., se elimina virtual mente la inhibición y no se requiere un control interno, La prueba Nudisens HIV-l QT es un ensayo aprobado por la FDA que usa la tecnia N A SB A para tnedlr las cargas virales de HIV. La prueba Nudisens CMV ppti? parad cunirol de los niveles de CM V fue retirada del mercado por ia FDA. Esta se comparó con una antigenemia de CM V ea nn estudio de recep­ tores de trasplante de médula ósea y se cncontre"» que es wn sus­ tituto accesible de la prueba de aiu^eaeinia, mueh» nvis labív [iosa.14" Se están haciendo ensayos con una prueba basada en NA SBA para 3a desección rápida de cnterovirus en líquido eetaloiraqufdeo (LCR). Se han disertado diversas pruebas de preparación casera usando la técnica N A SBA y el Basic Kit [bioMérieu?0 ttue valida estas pruebas y que están dispEUiible?, en el cciniereio. Éstas han sido muy útiles para la detección de ^ñus de RNA, como las; emerovirus s el virus del Nilo Occr-

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142 CAPITULO4 Microbiología molstular

realizar ’.l medíanle sondas múltiples tomo Souifttrit f?lo¡ o en/imoinmunoensayo (E IA ), por sccueflriación dd ampl icón o por análisis de nJicronnitrivcs.“‘•'11-J1' El análisis de Ia curva de fusión posamplirieadón es. un mótodu nuevo pura redi/ar lu diferenciación limitada seguida a una PCR en tiempo real y de amplío enpecMu (véase 'Amplificación Je Acidos rtueldco* en tiempo real'', más adelante 1La limitación de esta i & n b es que cuanto mayor sea el grupo del ensayo diseñado para la detección, es mas probable que la reacción también deicelc inkroorgaíúsmtis relacionados desde el punto de vista filogenéüco, pero epue no necesariamente son parte del grupo fie inte­ rés. Por ejemplo, se usa una PCR. i le amplio e s p ir o para la detección de todas las mijeobaclerias clínicamente importantes, rcm también amplificará el mismn segmento tic DNA de muchas otras bacterias ru-.r- en C-C (guanina-eiiosina) que están muy relacionadas con este grupo. Estas limitaciones se pueden abordar con hueiun resultados mediante el uso tk sondw de alta csperilicklad; sin embargo. algún as limitaciones de esic lipo de aplicudúis persisten. Cuando se amplifican Inicioorganismos múltiples haj un consumo anticipado de los ceba­ dores de PCR, Además, a menudo es difícil obtener informadén útil de la secuencíadón de DNA porque resultará una seeueiiLia me/dada carente de sentido. Jl menos que se pueda identificar una secuencia conservada en el grupo de interés que no estd presente en los microorganismos contaminantes.

APLECACrOhES CLÍNICAS Algún grupo de JtiicriHJtganisiiiQS relacionados, miembros de los que tienen ínteres clínico, son candidains para la PCR de amplio espectro. Como ya se mencionó, los cebadores de amplio espectro han orto útiles puní detectar los en terovirus que caucan meningitis aséptica.’ J:*Una limitación de algu­ no* ensayos de amplio espectro pura la detección de enterovirus es la reactividad cruzada de los, rinoviíLis.1 Ehlo ni) debe* : [.i n itn . s f i t u l j

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|wm puede hal>er reaedones falsas p o s itiva si se annlÍ7an. por ejemplo, secreciones resplraiorias.

Posiblemente las moléculas diana mus usadas para las. PClí Je amplio espectro han sido los genes que cintifiean las sulnanidodes ribosúmieas írD N A} parasitarias, filípicas y bacterianas.ia,Mr '* Estos eene'ison «liles pitra la PCR de amplio espectro, así como para la eategorización taxonómica de microorganismos laminé tienen ionio regiones variables comió altamente conservadas. Las icíimiCN conservadas son sitios excelentes para ios cebado­ res de amplio espectro. mientras que las regiones, variables qye « entienden entre ellas, pueden usarse como sitios diana para sondas espedficas, de especie o pueden contribuir para, (a Secueneiación de DNA, Estas aplicaciones se han utilizado para determinar Ij causa de ineniilgiúí» bacteriana» endocarditis infecciosa y bacteriemia en pademeücon endocarditis infeccio­ sa y ni ras infecciones bacterianas,,t)13lí Como en el caso del cultivo, la presencia de bacterias contaminantes es un pp> btema para la interpretadún de Ion resultados de urna PCR de amplio cspeeiioJ ; 4 Nu es vorprendeme que este Upo de propuesta* hayan sido usadas por diferentes grupos para |a identificadón de micobacterias.',w,i:"-cU El an;ílÍHÍH pmampUfkaeitfu más común ba sido la secuenciación de DNA; ■'in embargo. también se obtuvieron buenos resultados para la identificación con sondas múltiples y análisis de nticraniiainccj,. Los sinos diana del rDNA constituyen la base de muchos de los sistemas da identificadón basados en secuencias usados comúnmente. El sisiema de identificación microbiano M¡en iSet¡.

disponible en el mercado, asa los cebadores de amplio espectro para dirigirlos al ItiS rDNA bacteriano y a la repión D2 rDNA fúugica (Applied Eticsystems. Foster City» C A ). Después de la amplificación de la PCR dd bongo o bacteria desconocidos, se obtiene la secuencia y se ln compara, eon una base de datos -que mantiene y scluaUiBi el proveedor. Esm base de datos ha sido evaluada por diversos grupos con respecto a su utilidad «d la identificación molecular de una variedad de patógenos, desde bacterias hasta detuialofilos,^ líJ |3,-:i,:H*a*li3ÍI,i Se han usado oims genes ciiana que,, copio Jos genes I6 S rDNA. ecmtienen regiones variables y regiones Jiramente conservadas, |wni la identificación ule microorganismos. Estas, día mis alternativas para la tdenliíieadón mediante PC R de amplio espectro incluyen ln RNA polimerasa (tjw fi). las proteínas del choque lérmieo 0up) y el fac tor de elougaejióri Tu La earaeterijación de microorganismos, en panicalar de micobaeterias. mediante el gen rpoB presenta un interés peculiar, ya que el análisis de este gen también proporciona información m il respecto a la resistencia de las miéohacierias a la rifatltpi-

PCH MULTIPLE

La PC R múltiple es un método alternativo a la PC R de amplio Cspedro para la deSecdón de patógenos onjiliplcs, En los ensayos simples o múltiples» hay grupos de cebadores múltiples que se usan eo una PCR múltiple* cada uno de los cuales sude dirigirse a un patógeno particular. Ensayos, múltiples mas complejos pueden usar combinaciones de grupos de cebadóles específicos de espede y de amplio espectro, por ejemplo. La ventaja de las reacciones múltiples es que se pueden detectar numerosos patógenos en una reacción única. En algunos casos, uno de los grupos de Cébudores inclui­ dos en las reacciones de aniplificacEtiii puede estar dirigido cimtra un gen humano, como p>globiiia q ácido nucleico que. ha sido agneítadn a la muestra: éstos funcionan como controles de amplificnción internos para la reacción *■* La amplificación de un control interno es importante para Qsegumrque la reac­ ción de amplificación no estaba inhibida y ayuda a garantizar la exactitud de los resultados negativos Él ensayo PCR conipetilivo cuantitativo es un método para obtener un resultado cuantitativo y es un upo de reacción tnúltiple,1IWJ,1Í í*as limita­ ciones sfc la PCR múltiple son en gran parte secundarias a las interacciones entre los diferentes oligonudeótidos. que com­ prenden la sensibilidad de la reacción, en particular cuando se compara con las reacciones de amplificación individual. El dNeito de ensayos múltiples altamente eficientes que tengan interacciones de oligonutleótidos mínimas es complicado. APLICACIONES CLINICAS

Muchos, ensayos múltiples se diseñan píira detectar microorgait¡.sim« diferemes que causan el misino tipo de enfermedad. Por ejemplo, se lian desarrollado ensayos múltiples para detectar .1 pnt'mnimiae, l l influencie y N. menmgitidts. las causas más comtines de níeningilis bacterianas.1 Se describieron ensavos mdlíipleA para la detección de ¡os agentes ¥Íra!es de la meningi­ tis y la meni ngoencefalitis.5'* 5* ^ ' PCR imilliplcs um particularmeiiie útiles cuaml¡» el número de patógenos posible es lim i­ tado. Los ensayos múltiples también se han usiálo para detectar y diferenciar los poliomavirus que infectan a seres humanos, las bacterias qué éüüsíb ¡nfeoctón dd oído medio, bs agentes de Ja neumonía bacteriana típica y de la atípiea, y las» causas de las irtfecdones del aparato respiratorio.ÍXSM

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Análisis posamplificaciéo 143

Por intermedio de Prodesse* (Wankesha, VVI >. se encuentran disponibles comercialmente diversos ensayos múltiples. Ejemplos de estas pruebas son los ensayos múltiples que detec­ tan los virus (espiratorios comunes (K e j& ip b i y las caucan­ tes de lu neumonía bacteriana alípieu (Pncumoplot®),311 E l Adenoplex" detecta la amplia variedad de subtipos de adenovinis que mfectdr'i a ion seres hum^niiK.

PCR ANIDADA lu PCR anidada es una modificación de la PCR diseñada pan aumentar la sensibilidad de la reacción tlel ensayo, Esta modificación comía* de Jos grupos de cebadores dirigidos con­ tra la misma diana,*--11* E l primer grupo Je cebadores se desa­ rrolla de la numera usual, mientras que el segundo grupa son cebadaros situados internamente o anidados con respecto al primer grupo. l,a prcipLic^iiú tradicional para PCR anidada fue realizar un número de ciclos» de PCR* por lo general menos que Im que euotendria una instancia completa. y Luego abrir el vpso tic reacción y agregar el segundo grupo, anidado, de cebadores?ui.t&¿w Como se puede imaginar, el m ajar problema de esta metodología es la contaminación con amplicón en el laborato­ rio y la consecuente pérdida de especificidad del ensayo como prueba clínica, Recientemente se Imn infantado ensayo* des­ critos como reacciones PC R anidadas de urna única etapa, donde ambos grupos de cebadores se agregan en el vaso de reaedún inicial y se realiza una PCR extendida. Éstos se han realizado en un formato Immogéneo o en tiempo real (véase m is adelante) y han demostrado un incremento de la sensibili­ dad sin contaminación con amplicón,177Las ventaja* de estos tipos de aplicaciones más al 14de las fujfriones. no anidadas, ea el laboratorio de rutina toda™ tienen que probarse, pero po­ drían usarse en el futuro para detectar moléculas en muy hojas cantidades.

APLICACIONES CLÍNtttS La PC R anidada se usó en numerosos ensayos de PCR en un intento por mejorar la sensibilidad del ensayo> resultó valiosa para Ea detección de microorganismos que pueden estar en escasa cantidad en ¡a sangre y los tejidos, como Rickettiia, Bartm elfa y microorganismos similarc5.j,|*jrj También se disü' ñó para la detección de herpesvirus y enterovirus a partir de IX7R y se usó en el examen directo de la sangre cano mu modo de determinar la causa de la bacteriemia,wafi,:!51~AA:2 Los ceba­ dores de k PCR anidada también pueden usarse en una reac­ ción múltiple para detectar herpesvirus diferentes, como virus del herpes simple (H SV ) y C M V /'2Esta modalidad también se usó para detectar M. ¡uhf fru iste , que puede plantear problemas para los sistemas iIé detección basados en la amplificación de ácidos nucleicos cuando hay escasa cantidad de bacilos.-'”

Análisis póSamptifiMción Después de que se completa la reacción de amplificación de ácidos nucleicos, debe analizarse el producid de amplificación, Lu* mitos los de análisis del producto amplificado van desde la simple determinación det (amafio del amplicón y la presencia tle *%ún otro producto de amplificación mediante electrófono sis en gd hasta la determinación de cada nucleótido que com­ pone el amplicón mediante la secuenciación de DNA. Algunos métodos de análisis posamplificación, como los ensayos de protección de hibridación y los polimorfismos conformaciana-

Ics de doble hebra no se tratan aquí, mientras que oíros, como e! análisis de polimorfismo de longitud tle fragmento* de res­ tricción ÍR F L P ) se tratan más adelante en la sección sobre tipi­ ficación microbiana. Métodos tradicional» de detección ANÁLISIS DE ELECTRQFGRESIS EH GEJSOUTHEfíN BLOT

La eleetrnlbrcsis en gel ea una de las formas más simples de adquirir información acerca del amplicón. Se pueden usar dife­ rentes tipos de geles para la eledroforosis en gel, pero a menu­ do se usa un gd si mple de agarosa, Este gel es rectangular y tiene huecos o pocilios «re a de un extremo, Se lo coloca den­ tro de una caja de gel y se cubre con buffet: hay sistemas de eleetri>fynp.sis «¡i gel más nuevus de un único u&o que uo nece­ sitan la adición de buffer. Para realizar ia electro foresis en gel, Eos productos de amplificaeión se mezclan con una caiga de colorante, que es un líquido teñido, viscoso y denso. Esto ayuda al usuario a visualizar la colocación de fa me/da en el interior del pocilio cuantío se procesa con pipeta. Después de la carga, se. pasa una corriente continua a través del contenido ilc la ca ji dü gel y el DNA cargado negativamente migra hacia el ánodo. Los trozos más grandes de DNA se retrasan por la matrir. de gel comparados con las porciones más péqUéftas de DNA, Por lo tanto, la separación de DNA mediante ckctroforc&is en gel se debe en gran parte al tamaño, lia grupo de molé­ culas de DNA de diferentes tamaños conocidos* que por lo general se describen como “ escalera" {hiddfr), se coligan en el primer carril carriles y se desplazan en forma simultanea con la* muestras Mediante una comparación visual de la migración de los amplEcones de los carriles de las muestras leí área deba­ jo del pocilio) y ia migración de Lu moléculas, de DNA de tamaño variable de la escalera, el operador puede estimar cl tumafiode las moléculas de DNA amplificadas. La presencia de una banda única del tantalio esperado es una buena evidencia preliminar de la especificidad de la reacción de amplificación. Pero- los interrogantes persisten: “¿Cómo se puede eslar seguro de que eE producto amplificado es el pro­ ducto deseado y no el producto de amplificación no específico ■que justo por casualidad es del mismo tamafioT1-La respuesta a esta pregunta usando los métodos tradicionales se alcanzó mediante el uso de. sondas específicas de oligonucleólidos y realizando un Southern blot. Resumiendo, después de la clcctroforesis, en gel, el producto amplificado se transfirió a papel de nitnucclulusa y se agregó una sonda de oligoaocleótido radiomarcaiio. Luego de un tiempo de hibridación apropiado y de etapas siguientes etapas de lavado para eliminar Ea sonda no unida, se expuso el papel a una película de rayos X . Sí el ampiacrin esperado estaba presente, 9a sonda radiomarcada hibridaria a su secuencia complementaria en el amplicón y produciría un ítrea de exposición sobre la película de rayos X . Si el amplicón hubiese sido el resultado du amplificaeión no específica, la sunJa nsi se uniria y se eliminaría por lavado, y la película de rayos X no contendría un área de es posición en desarrollo. Este procedimiento requirió dos o tres días para completarse, fue técnicamente complicado y su aceptación en cl laboratorio c lí­ nico no fue satisfacluria.

DETECCIÓN enzimática de productos amplificados La tecnología de eníimommuriuensayo como mátodu para detectar el producto de amplificación «presentó un gran avan­ ce cu la detección rápida de productos de amplificación espe­ cíficos,*-'1iJt reacción en/imática para la detección de produc­ tos amplificados se reali/a en placas ele 96 pocilios. Se pueden

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i 44 CAPÍTULO 4 Microbiología ntoi«curar

del amplicón terrón necesaria M él iwHiucto ik amplificación J’ucmí secundario a una PCR de amplio espectro. Una piüjMie»la eUu} clicaüei, inmovilizar tudas 1js sondas de inLcrc-H en una tira de nitrocelutosa y luego aplicar el amplicón a 1a tira y deiennin&r qué somla híbrida con el amplicdn &¡n» se deno­ mina hibridación inversa iK'trque el amplicón se aplica a la Mjrulu que esta ii3iHovil¡/.uJu en la lira de rtii™]u|[ja que CS lo opuesto a eóniu se realiza el Southern bhn. 111 ensayo tam­ bién tiene Ja ventaja de que ma ana reacción eromogénica, en ve/, de radiactividad para delectar la hihridaeión (fig. 4- 12). APLICACIONES GLtMCAS La tócnica de hibridación inverea está disponible en el mer­ cado como línea de ensayos con sondas tLipA®) (Jnno^enetics» Gene. Relgium, and Nayer Diagnoscics, Taityiíi^n. N Y ) o tiras de tran^Feremeia en, manchas (d o i b io t) punios (Roche Molecular Diagn«?stics. india nápolis. IN ), Este tipo de técnica u1il i/.ó pinta diferenciar los distintas subtipos genéticos del virus de la hepatitis C {gencHipificación del H C V), una prueba que provee información importante de pronóstico y tralamien|(l .itAí43i2*7 gg encontró que el IN N íM JF A HCV ll (fiayer) era comparable con la secuenciación de DNA J1 La hibrida-

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enximat. (A ) Aquí, se usuuu stHitla de captura p in m a ic rtl anipluin4i p«r Iflrafci rcviiu estol «m y r^ód rmUmil aTnpliCkLbJn rn r'peefñm (ISi Luegi', íl iimpliciin itíítm J^ ^ íJcItvM
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oligonucleóiidos hihridados, Situimbargn, el resillado final es que Ja sonda hibrídada que no lia sido eliminada por lavado genera una ^enal de luz o «le calar ~ (lija.. 4-11). E l uso de una sonda de nligorueleótido alimenta la especificidad de la reac­ ción, miectEraí q¡ne el enlace con una reacción enzimdlien aumenta la sensibilidad de la reacción.1'* La cantidad de señal generada c.s pniporciuna] a lii caniitkl de .implicón presente. Cuando se usa con estándares calibrados, se puede obtener información cuantitativa,

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APLICACIONES CLÍNICAS Muchos de lew si ¡demás disponibles en el mercad» utun una reacción colon métrica para la detección de jos pmduetns amplificados. Hubo una conversón rápida deíde el Souihern b M muy Jabonoso j que insume mucho tiempo tiiwia la detec­ ción enzimáüca i|tic siguió a la Introducción «te cs.iu técnica. Esic melada de dciccciúit kc usa en varios sistemas com ercia­ les. y eon una variedad de productor í|aim icns de am plificación de EÍeÉdcw. nucleicos, U ü dítfftS de carga Viral cuantitativa, que se generan con regularidad ussando esln* sistem a, se obtienen mediante cncü técnica.

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Hibridación inversa

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Análisis posampiiíicaciún t45

eión inversa íambiiín resultó útil p^ra la detección de las muta­ ciones más tomones presentes en el gertoma del H IV que te cunEicren resistencia a ]o„s agentes aitüirelw iílllc^.101'7-106,114 El Lil"A 1es mucho más fácil de realizar que la secuenciación Je DNA. enn análisis pospruohü más simples. Sin embargo, a diferencia de la secuenciación de DNA, la hibridación inversa tiene en cuenta una contribución de sólo las secuencias para las. cuales liay sondas y no permite evaluar mutaciones nuevas, que podrían ser tanto silenciosas como clínicamente importantes.:s" La tiibíidsción inversa también se usó para detectar aJ IÍP V e identificar los subtipos que están asociados con un riesgo ele­ vado de displacía y posterior carcinomallíi’ial2l42,1Jíl’J1J Ade­ más de las aplicaciones vimlógicas. ia tecnología ele hibrida­ ción inversa se utilizó pura identificar mientan: icrías, ho»gos dr importancia medica y mutaciones asociadas con resistencia micobacteríana a La h fa m p íc in a .^ ^ ^ '^ '^ .^ ’- H ^ J " ^ ^ Aunque son sumamente esaclos, los LiPA® micobaetcrianos fungieses y para rifatnpicina son Costosos y m están disponibles en Iti.s lisiados U iiidoj,.

Seeuerclaclún de DNA La secuenciación de DNA pura el anfllisis de un producto amplificado es ahora un método común Je análisis pusamplificación. Aunque útil, es una técnica más complicada que la hibridación con SL^ndas simple y u menudo requiere que el operador tenga experiencia en alineamiento de secuencias, edición de programas informáticos y bases de datos genéticos. Es muy valiosa cuando se analiza un guipo de microorganis­ mos para determinar las áreas de conservación y vaiiabiEidaJ dentro del ampl ic<mobtenidas por PCR de amplio cspcctro, E l análisis de esas regiones variables se conviene luego en una herramienta ti til para la identificación Lie microorganisTambién ha resultado eficaz para el análisis de mutaciones geni ticas dentro de los genomas virales, que pueden ser poli modiMntis de [¡Lidmiidd único (SNP) y conferir resistencia a un fármaco antiviraL*11

SECUENCIACIÓN TRADlClOMAL DE DNA

La secuenciación tradicional de DNA. una herramienta usada alguna vez sólo en laboratorios de investigación, se ha convertido en una práctica habimal en muchos laboratorios de microbiología molecular y *te patología molecular. Esta técni­ ca, que usa Ili secueitci¡ición tradicional de Sanger o secuencia­ ción por terminación., funciona mediante la Incorporación de didesoj-inudeótidos en una hebra creciente de DNA. Cuando se incorpora un didesoainucleótidoen Ea bebra de DNA. esta ya no puede extenderse. El aníilisis de los fragmentos de DNA que resultan, que son tan numerosos como los nucleótidos que

F ig u n á í - 1 3

componen la hebm. proporciona información de ta secuencia. En et parado, eslo se hacía con grandes volúmenes de gel ver­ tidos entre dos pEucas de vidrio y moléculas indicadoras radiac^ tivos. Hoy en día, eslos métodos han sido modificados pan usar moléculas indicadoras marcadas COO flUOíescencia con un sistema de gel más práctico para el usuario oblen con clectraíoresis capilar (líg. 4-] 3). La secuencia de regiones largas de DNA, de más de cien pares de bases de longitud, puede deter­ minarse fácilmente por estns rrítrdns.

APLICACICÜES C4ÍKICAS

Una Je las aplicaciones de la secuenciación Je DNA en el laboratorio de m icrobiología m ulccular ea la genutipificamión

del H I V ^ ^ Eslo se ha hcchn para determinar, en un pifíente particular. Ja presencia de mutaciones adquiridas en el genoma del H IV que podrían conlenr resistencia a Eos agentes amirreiruvirates. Es un ensayo complicado y que consiste en la extracción del R N A del H IV , stgüida de l uatro c nsayos de RTPCR, cada uno de Los cuales se continúa con ía secuenciación Sanger. Aunque la determinación de nuclcólidos está en gran pane automatizada en muchos de esms sistemas, todavía se necesitan algunos análisis de secuencia manuales de las secuencias generadas. La secuenciación de DNA tambión se usó para demostrar mutaciones asociadas eon ta resistencia en C M V y para dclcnninar el genotipo de H C'Vr,:’3,l!W',17í-2ü,“!J7 La secuenciación de DNA también se aplicó con buenos resultados para la identificación de bacterias, micobacterias, Nocarttia. y hongos. Los genes que codifican las subunidades ribosónúcas de esos microorganismos s.on los mis usados para la identificación basada en la secuencia. Uno de los usos más comunes de esta propuesta ha sido pam identificar las causas de la endocarditis bacteriana.10’ 1" em balo, la identificación basada en la secuencia se utilizó para determinar el agente causal de otras diversas infecciones, incluidas la sinusitis y las infecciones urinarias,17-^' Esta técnica está revolucionando la forma en que se identifican microorganis­ mos de crecimiento lento, como micohacterias y nocardiji.tív^tíUíM Siií* 'l'arnbtén se |¿L utilizó para la identificación Lie Eiongos p a t ó g e n o s , A i^sar de que los genes Je l rDNA son los ni¿s usados para La identificación basada en la secuencia, otros genes también han sido validos para ln carac­ terización de microorganismos, como ios genes rfwB, fi.t/s v ¡uf, entre oiíos.” ^ ” 171-11™ 81

SECUEKCIACIÓM POR SINTESIS (PIR OSE CUENCI^CIÚH) La pirnsccucnciación es un método relativamente nuevo de secuenciación de DNA, que es la secuenciación pm síntesis, en contraposición con Ea secuenciación por terminación con dide-

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CAPÍTULO 4 MisratiiDtagia molecular

soxímicleólido tisecuenci ación de Sanger."*-3*1-5*2 Esta lécniea se utsliíó tilensunerle en cl análisis de polimorfismos da nuclcúlido Úníeu (-5NP) ¡lsücÍiiüui «m LTLfefTnedade-s genéticas y plasiasTcomo también para, la identificación y diferenciación de microorganismo?; '^ ]Wi ^ A diferencia de la sccn cnráíán iradkional jHif terminación, se basa en l-¡a incorporación de nucleótidos en la hebra de DINA recién sintetizada. En resumen., la molécula de DNA amplificada por PCR, en la que una tic sus hebras contiene una hümina terminal que se une al echador, se inmoviliza en el podllo de Ll miempUiea. Hl proceso eres» un» hehra simple- El cebador de seeuerteiación y los. reactivos se agregan a continuarión de la adición automatizada de cada uno de los cuatro nuclcótidos. Si el nucleótido agregado es cl juró* Jiirao necesario para el crecimiento de la hebra, se genera pirofosfato (un subproducto natural de la incorporación de nncleótidosjn que produce luz a través de reacciones cnzimática^ M ed irte el registro que el instrumental obtiene de esta lu/. se determina la secuencia (fig, 4-14), Las limitaciones primarias de la seeuenciación por síntesis son su capacidad para generar sólo secuencias relativamente cotias (-30 pb). Iím problemas que ocasiona una secuencia cuando está presente la estructura secundaria extensa y una incapacidad para caracterizar eon exactitud regiones que con* tienen más de cuatro nucleótidos iguales en tándem (hotnopolimcms). Las veníalas son la facilidad de uso {la reacción tle secuendación sucede en una placa de pocilios), que la secuencia generada está presente en el contento, es decir en el medio, y que pueden usarse secuencias conocidas como una sccuíftciación control. La clave del uso de la pifosecueneiaeíjn para k identificación de microorganismos es conocer Eos genes específicos que proporcionan información suficiente para la cliferenctación de los rnicnwrganisinos; de interés.

lerías que causan infecciones en recién nacidos y de- bacterias: que causan meningitis, La pifosecueneiaeión hw sido óiil pura identificar hongos de importancia clínica, nncardías y mieobjetenas."^ Medialineníe una PC R de amplío espectro que usa como diana la porción de 1*S rDNAque contiene la región A hipervariable demostraraos con la piruiccuenciación urtu excelente diferenciación de. la gran mayoría de micobacterias de importancia clínica a tra­ vés, del análisis de una región que se compone de sólo 30 ptvuVarios grupos de han demostrado que la región A hipertariable es. útil para la diferenciación genética de rnicohacEej*iav7l'lu ja De modo similar, se han usado como diana [mkíones del gen de 1ftS iDM A que brinda información taxonómica para los especies Nccarúia y se han obtenido resaltados ckcc* lentes. ” i|J Esta técnica también ha sido valiosa para la diferenciación de loa virus. Se ha desarrollado m ensayo para determinar el genotipo de H C V utilizando pirosevuenciación.4Este tn íM u se ha usado para diferenciar los políomavirus obtenidos de teji­ dos humara» y líquido» corporales.i8 Muchas, de Las aplicaciones de pirnseeuenciación descritas por los laboratorios de microbiología clínica usan una P t’R de amplio espectro para los microorganismos de interés, seguida por la iov^ sii^ d éii de una región variable compacta que hrinda la información genética. Existen muchas posibles aplicacio­ nes de la secuenciación por síntesis para el diagnóstico de enfermedades infecciosas o para la caracterización de los microorganismos in reclames y el huésped. Estas aplicaciones pueden incluir la identificación de Ira agentes causantes de la infección y la detección de mutaciones genéticas asociadas con resistencias. Además, la caracterización de SN P u otros polimorfísimos ¿enéticos que pueden aumentar el riesgo de infección en el huésped también se puede determinar por esta técnica. Lamentablemente, todavía no se cuenta con equipos comerciales., de modo q u e l o s usuarios deben confiar en ios ensayos artesanales o de elaboración casera, eon lo que se lim i­ ta la difusión de esui lécnica.

APLICACIONES CLÍNICAS Se están introduciendo aplicaciones que usan seenenciación por síntesis en el laboratorio de microbiología clínica. Las apli­ caciones en investigación incluyen Ea identificación y la tipifi­ cación de bacterias, como H e lits a lk H 'ie rp y ltm y L i t í t t i u oumíoí-yt&fitnesi tambiéc se han utilizado para diferenciar bacterias en ¿¡ropos clínicamente imponantes,llflií?",,ffl así como para estudiar la resistencia a linezolid en los enterococofi.JlftOtros usos útiles para la clínica serían la identificación rápida de tone­

ANÁLISIS PE MICRQMATRiCES Una gran variedad de micromatrices, a menudo conocidas como ‘"chips génicos0 fueron usadas durante muchos años en las ciencias básicas- para diversos propósitos, incluidas las

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Figura 4*14 Secuencia. de DMA. pur panhetueneiaiítórL E^tc puufmnu fue generado a pulir Je i u nm'cslf.s dlnwlo 4 U? CMAniH hflrtli* áe¡du-.ilcvhcil [ímml-tiEn. Stí «i3ÍJ¿ lina PCR CIl tiempo KOI 5í£U¡íIh [W ]ñrüt«llfIl«Í4CÍÍi*l ¿UlC la pnFÍhilidvl 0IM HitwnruIcKi [ . I J iHrueiKLJ £mepuii, í^ir fm-YLtrtÉ ti* Ja A hipsrvaruhlt dd g,en I 6 S rDNA, ¡dcMificó el aisJxmixnto t\mi> ,tf. m t r a c e f íit íü n .

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Amplificación de ácidos múdeteos en tiempo real

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enfermedades infecciosas,llJ4 '' Estos dispositivos detectan una multitud de señales en forana simultánea. y pueden usarse pura úcleclar diferencias genCticas (DM A) o diferencias en la expre­ sión ím RN A ).11 Exterminan qué genes se expresan y cuáles están silenciados en respuesta a diferentes estímulos. Estos descubrimientos demostraron su valor en una amplia variedad de trastornas, desde infecciones hasta cáncer. Los productos de I» jimptüficaeidn de ácidos nucleicos, que pueden ser«l resultado de PC R de amplio espectro o RT-PCR. se aplican a las mitro matrices, Éstas «ansian de miles de sitios de hibridación, cada nao de los cuales provee información con respecto a la composición de nucleólidos del amplieón. La señal generada desde las micrornatiiccs puede ^ír fluorescente o eléctrica, E l principal avance de las micromatrices es su capacidad para analizar mi les de reacciones de hibridac ión en forma siwuKánea. Esta característica también contribuye a una de sus mayo­ res limitaciones. e decir, ¡a cantidad de datos generados a par­ tir de una sola micromatriz puede ser abrumadora para el usua­ rio y por io general requiere ordenadores y programas infor­ máticos avanzados para e| análisis de los datos. El costo del análisis de mieramalriccs también hace prohibitivo su uso de rutina por ahora. Aunque eon seguridad las micromatrices se usarán cu el estudio de enfermedades infecciosas, el futuro de esta técnica er el laboratorio de microbiología clínica todavía no está deiemii nadn

de energía térmica, sea más rápido. El segundo avance técnico estuvo dado por el desarrollo de una mezcla de reacción homogénea,2®1es decir, una mezcla en la cual las moléculas Huonv génicas que se usan para la detección de los productos amplifi­ cados están presentes dentro del mismo vaso de reacción en el cual ocurre la amplificación. Además, una contribución de la fluorescencia de esas moléculas se oblicué, bubilualmenle, me­ diante un instrumento una vez por cielo de amplificación. Por lo general estos ensayos se denominan como PCR de tiempo ceal porque la amplificación se desarrolla durante la reacción PCR en "tiempo reaT. Este tipo de detección del amplieón representa un avance importante en la química de los ácidos nucleicos, porque es más rápida que ios métodos tradicionales de detección del amplieón, Además, hay una reduedón signifi­ cativa en la probabilidad de contamtaadón del amplieón en el laboratorio, porque el vaso de reacción no tiene que ser abier­ to para analizar el amplieón. Se dispone de diveisas platafor­ mas para la amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real,'14 Además de la PC R en tiempo real, la reacción N A SllA ha sido modificada a un formato en tiempo real con la defección qué usa señales moleculares (véase más adelante). Existe la posibihdad de modificar alguna tecnología de amplificación de áci­ dos nucleicos a formato de tiempo real.

APLICACIONES CLÍNICAS Los formatos de mieftttnalriccs se han usada en diversos descubrimientos: para identificar bacterias, macobacterias, hongos y xárus; para detectar los determinantes genéticos de la tcs isienda. para, estudiar la respuesta del huésped a la infección y para descubrir nuevo* fármacu* que curen laj. ¡nfeccionc>L-u‘,|JMT*|jW-nft ** Con respecto ai IH V, esta técnica ha sido provechosa para el estudio de 9a expresión génica viral y de los cambios en el perfil de expresión célula-buesped después de 9a iníect¡ón,!*,'JllJJ*JM J*-‘ A pesar de su valor para la investigación, las micrntnatrices todavía no han sidu introducidas en el uso habitual del labora­ torio de microbiología clínica y no están disponibles aún en el comercio para el diagnóstico de pacientes con ([afecciones, Su posible utilidad en el laboratorio de microbiología clínica está puesta de manifiesto en el título de un artículo reciente: “Chips con todo: micromalrices de DNA en enfermedades jnfeetfn5os” 1,11 Queda por ver cómo y cuándo esta técnica se volverá accesible para el uso cotidiano.

Existe una variedad de moléculas lltiorofénicas que pueden usarse para la detección de ácidos nucleicos amplificados en una reacción homogénea o en tiempo real. Éstas, pueden ser no específicas y detectar cualquier ácido nucleico amplificado, o específicas, lo que significa que son oligonucleótidos e híbri* dan con una secuencia específica presente en el amplieón. Se tratarán tanto la detección no específica del amplieón usando verde SY13R ram a los tres métodos pnás usados de detección específica del amplieón. Éstos son el TkqMan® (Applied Biosystems* Foster City, C A J o sondas de hidrólisis, las sondas tic transferencia de energía de resonancia fluorescente (F R E T ) y te balizas moleculares. También se dispone de otros tipos de moléculas detectorus. pero su tratamiento excede el alcance de este libio.

Amplificación de ácidos mcfñieús en tiempo real Dos avances tecnológicos derivaron en el desarrollo tk 3a amplificación de ácidos nudíicm en tiempo real, E l primero í'uc el desarrollo de métodos de intercambio de calor más rápi­ dos (calentamiento y enfriamiento rápidos) de la cámara de reacción.4"' La l’C R tradicional, por ejemplo, sucede en Urt cicludor con bloque, en el cual el bloque se compone de ¡neta! o de algún otro material sólido, La velocidad a Ea que el bloque sólido puede calentarse o enfriarse a las temperaturas: necesa­ rias para la PC R limita la velocidad a la cual d ciclo puede avanzar. La introducción rápida de aire calentado y la dim inu­ ción de aire caliente (enfriamiento) que puede lograrse median­ te instrumentos ventiladores en tiempo real peora re -queei ciclo de reacción avance con más rapidez. Los volúmenes de reac­ ción más pequeños también contribuyen a que el intercambio

Métodos de detección de productos de ampllffcatlún en tiempo real

UTHDE SfBR E l verde S Y B R I es un colorante que se une al surco menor del DNA bicutenurio y que emite muy poca fluorescencia en ^li estado no unido, pero produce una fluorescencia considerable cuando está unido al DMA (fig. 4-15), Esta propiedad to hace útil para determinar la presencia de un producto DMA am plifi­ cado. Muchas moléculas de verde S Y B R se pueden unir a uri amplieón único, de modo que se conviene en un método sensi­ ble para la detección dd ampl icón. Además, es mucho menos costoso que las sondas específicas de oligonucleótidos que se marcan eon fluoróforos. La detección da amplicones usando verde S Y B R es úiil para optimizar la PCR (determina la conccntneiortcs óptimas de sundas y M g Q J. También lo es para determinar si la amplificación ha sucedido antes de un. método definitivo de análisis posamplificación, como la secuenciación de DNA o el análisis de micromatrices. Su desventaja principal es su inespccificidad. Estas moléculas tlctecloras se unirán a cualquier DNA de doble cadena, ernic ellos los producios de amplificación no específicos y los d micros de cebadores. Este método de detección carece íto la especificidad lograda con et USO de una sonda de oligonucleótidos (descrita más adelante).

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148 CAPITULO 4 ríicrob ielogia molecular Figura 4-15 Química Je l verde SYBR. El eobí-ua?f \wde SYBR T <í une ü subco m«ior de! DNA de dtfbtí M iJeiij. Cuandu el U SA es de cadena ampie

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9 Estado tíkíSJjnido

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Vüfde S Y B R

Por esa razón, nunca deberá usarse la detección con verde S Y B R como tínico métodode detección en un (aiNiyo dínicn

SOND^SDE HIBRIDACIÓN

Pueden usarse diferentes tipos de sondas de oligonucledtidos marcada f“ >r fluorcsccncia parala detección, del amplicón en un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real. Las tres que triaremos son las más usadas y cubren Isas aspec­ tos más imporlanles de la química, de detección en tiempo real. Ella-s shíi TaqMan* « sondas de hidrólisis, las sondas transpor­ tadoras. de energía de resonancia fluorescente (FRRT), y las bjli¿4S mulecubtreg, TaqMm a sorrrfas rfe M ftffftJs Las propiedades qti [micas de de­ tección de TaqMan o de las sondas de hidrólisis se basan en la actividad exomiclcasa 5‘ a 3‘ de la DNA polimeraa. Esta fun­ ción de DNA poliinetasa hidroliza cualquier micleótido que pueda unirse a la porción monucalenaria de la molécula de DNA por la cual la hebra complementaria. esta siendo iinitii* ¡rada, Rn la naturaleza, esto ayuda a asegurar que se incorporen sólo Iw nuclcéñdos apropiados en la hebra de DNA recién «nteuíada, TkjMan o lás caraclerUtíca* químicas de las sondav tle liiduílids aprovechan esia propiedad de la DNA polimeraa para generar una señal dctectabie. La sonda de hidrólisis se tnarca enjj urta molécula de fiwnjfim » y una del extintor. En ausencia de la diana específica, esta molécula se pliega en un dedo grado, que coloca «3 extintor muy cerca del ti uoró foro de modo que la mayor cantidad de alguna seflal fluorescente emi­ tida se. absorta de inmediato. Cuando esta sonda se une a la porción complementaria del DNA que ha sido generada por los ciclas previos de PCK.se hidiülua por la DNA polimerasa { flg, 4-1ó), Esta hidrólisis, facilita la difusión dd fluoróroro tejos de la molécula extiritora y la generación de lu/, que, por no estar «tin g uid i, es detectadle. Sondas sis tra n th fS ftite & in tra to
el amplicón, con una brecha de dos a cinco nueleótidos entre ambas. Ij i sonda que se uhiea corriente amha del par tiene una molécula de ílunrtsceína adosada a| extremo T y puede ■deno­ minarse radícula donadora. La secunda sonda en, el grupo F R H T cülá situada co rrien te abajo era rcia cirin con la primera sonda, tiene una molécula aceptara, por lu general LC640 o LC705 cuando se usa con cl sistema Li ghtC ’yeler en el estremo 5 de la molécula, y puede llamarse molécula aceptnra. Se pue­ den usar otnus moléculas aceptaras. pero deben tener la propie­ dad de ser excitadas por la longitud de onda de la luí que emite la fhujTcsceína u otra molécula donadora y, a su vez. emitir lu;

D fJA pQíi^ierasa

Figura <-1f Oufratía de luM.Hitda.d6 l..4l Ln ptüwuniJihl de ta nwIfrnU ersciníflra I0 ,i 1* nittlráila. Eiikrnucmte anih«c4idtK»ib« a ta «nmla ik hkdr^LMS ía I jc Ul, d e rá en u ilí fluüreítcoLSu de ftmdu mr-inu 1.B- La hidnAtMÍ' *lc f i l J ínpiía pwr ] j u ttiv iíLiJ de pcnnurlriMiL de la ÍJ^fA pnLimen sm. s.'i'isiy

swp,te
rrauMcida cr^cLiHcira. * Inodu que li f1uowsetik.'ia putilf mctifcr cumtkv rl íliieffiitorn se escata Je raxk» apropkaiki.

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Amplificación de ácidos nucleicos en foropo real 149

de otra longitud de onda tieleclahle. Además-» el estremo 5‘ de la sonda que ccmilcnc el accplor debe estar fusfurilado para impedir la cMensión de la sonda durante 3a PCR. La detección con las. sondas FR ET funciona de lo siguiente manera; si está presente ¡a secuencia de hibridación de la $onda apropiada en el amplieón Ja s sondas FR ET se Ii ibridarán eon ella. A l mismo tÍempoHla molécula donadora (la fluorcscdna) es excitada por la energía luminosa que el equipo introduce en el sistema.. Cuando la molécula dondota enditada vuelve a su calado de energía inicial, libera lu? de «na longitud de onda particular, Esp lu? liberada esetra a la molécula aceptora más cercana 11X640 o LC705). lo que completa la transferencia de energía de resonancia. La molécula aceptara ca a su vez- excitada a ua estado de mayor energía. Cuando la molécula aceptar? retoma a su estado de energía inicial, libera energía que ea delegada por ti sistema {fi£. 4-17). La detección que usa la química hadada en FR ET es por su naturaleza muy específica. porque la única forma de recibir la señal de energía final es porque .suce­ den euauo reacciones independientes: la hibridación de los dos cebadores que producen la amplificación y la hibridación de cada una de las sondas que producen la detección (fig. *1-18>. Las sondas FR ET también le permiten al asumo realizar un análisis de La curva tic fusión posumplificacíón. Eslo Cb posible por la naturaleza de la interacción 4c la sonda FR E T y parque, a diferencia de las sondas Taqmau,. I l l s sondas FR ET no se hulpolfean duranle la detección. E l lector recordara que los enlaces de hidrógeno «mi responsables de la hibridación entre las sondas de oligunucteólidos y la hebra de DNA complemen­ tario, Cuando la energía térmica que se agrega al sistema exce­ de la energía de los enlaces, éstos se romperán y la sonda ‘Tun­ dirá’' el DNA complementario diana. El punto en el cual la mitad de las moléculas de sonda están unidas y ta otra mitad está sin unir e sd puní» de fusión » T H del olijunucleóildn. Et análisis de la curva de fusión se rcali¿a después que se completa la PCR. Al principio. Ja me/ela de reacción se enfría a un punto muy por debajo de la 1‘Mde las sondas FREI* indivi­ duales de modo que ambas hibridarán si eslá presente el DMA amplificado apropiado. En « le punió, se introduce en el instrLb mentó un impul&o cKcitdioriu de longitud de onda luminosa, y se genera una seftal a partir de la «acción de FR ET que se pro­ duce entre las sondas yuxtapuestas. En el próximo paso* la mezcla de reacción se calienta lentamente mientras se toman medidas, continuas de la fluorescencia, Cuando in m ejcla de reacción alcanza y finalmente excede la T de las sondas FRET, habrá una pérdida precipitada de mcüuJ fluorescente (fig. ¿■19). La primera derivada de la pendiente de esta curva es un

Figura

A Estada desunido

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Figura 4-17 Trunilieraicia de enei£Íupütr io ¡manúuflin h-olci: ¡t. SmiJKn*:sariatdr*: «radas Ruvcadn» c« i un íluoráfon» para Inorar una tarisfciencia de energía de rehuiiBiicla íluufeateiUe (FR ET ). (A ) La UicigiiuJ de oihla de eaeilic íñ i l í 'J í d íl Dynrófaro donador íf lí eleva el «rtafn de encinta de ln nwtéy ii|j. y se (m.xIlIuC ih ll «MÍS!<j*| tF2i- E sM (lU

p| Itm ^ tU JU a c q X u r Sáü

LUajtda la» mxkJjü im esiáú fódfuljjadai porque tío estín muy certa uiu de metí (B ) Cuando las d » aunda* ae mbrtdan y se ^wo.nrmri conm consecuen­ cia de un qurcaflúeino de base4,de Wauoti y CiWk, el EluoidlbitP datumift ei*£ círca del fluofóf&ro acejiror La luz emitida ¡mj el fln¡i.TrtífiT«i dnudor cxeiiada
de la si ni Ja

pico (fig. 4-19). La linea perpendicular que puede dibujarse a través del cenlro de este pico représenla la derivada de T'M. Existen al menos (res usos importantes para el análisis de la curva de fusión, Primero, debería haber una temperatura de fusión relativamente predecible para el uitiplicón esperado, que podría confirmarse usando estándares conocidos. La demostra­ ción de la temperatura de fusiéti adecuada le ayuda al usuario a confirmar que la identificación es correcta, en lugar de obte­ ner medíanle la amplificación y la detección una identificación errónea de un organismo relacionado desde el punto de vista

4-18 Hcacrinnes poativRK y nrgnrivüsde P C R en Nem-

fwi lid - L i% f i s io n e i p u »iim » m ueslran un iik k h ic iiIc expum Biual (ni. !¡i flüi^esepnciJ., im enirns que Jm re«?fin rw t w jit is ; l -, í i

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H u L R V .iL i;n c ia .

pfíimtro de erelos

B Est igma del dr.VaFbrEso

150 CAPÍTULO4 Microbiología molicular

F lg u rfl 4 - 1 Í Cun,™ de fiftifa (A ) y dirigiría sie Ij t,ujY4 rpku» Je fuiiuo

en- H ule una muestra jnwliva

j

una ncjrativa en ana PCR en üemp^í real

que debatía ShipA>£w*'irM* dMn'ur 4 f uim ln espertGcú.

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3Í.S SM 3 J fftí B.+ «,$ íflA T9.C K,? T&.4, *f.í Temperatura (*CJ

TemperaJuna. fC )

taxonómico. De este modo. el análisis de la curva de fusión posamplitícación puede usure pira diferenciar organismos esirechamenic relacionados. Psir úllimo. la detección de nueleritidos mal apareado» entre las sondai FR ET y m concspon* diente silio de hibridación de la soiada, similar a la usada para la diferenciación de microorganismos, puede usarse para delec­ tar otros SN P clínicamente importantes, eonx> los que pueden conferir resistencia a los antimicrobianos o aquellos en cl hués­ ped que pueden denotar sensibilidad relativa a la infección. BatíZBS íliQÍBCtthm 11] pnHimo lipo de molécula detectaría que se tratará es la baliza molecular. Esta molécula, igual que la SOIttla TaqMan o la sonda de lúdrólish, contiene una molécula fluoróforo y una molécula estimara. Sin embargo, la baliza nxilccular es, mayor que las sondas. de hidrólisis típicas y no se tudroliza por (a DMA polimerasa para lograr fluorescencia en presencia del amplicón apropiado, lista molécula, en forma de "paleta" o "jpüukia1'. lisne una configuración en tallo y bucle rfig, 4-20). La putctóii del bucle es la parte de la molécula com­ plementaria a una parte específica det amplicón. El tallo es aína estructura de ácidos, mieieico* complementarios diseñada para mantener la molécula cerrada (en lia configuración de paleta), en ausencia de un amplicón especifico. Los dos extremos respecti­ vos de ta baliza molecullar y de la molécula sonda son los siúim donde se adosan las moléculas de tluoróforo y «U n io n , E l fluorófora. esiá yuxtapuesto con la molécula uiintora cuando la baliza está cerrada (cuando no está en presencia del amplicón apropiado). Cuando Ja baliza está ante el amplicón apropiado, la termodinámica Favorece la hibridación con cl amplicón a pesar del estado cunado, scmiautolühridado. Cuando la baliza mole­ cular se híbrida, el fluoróforo se separa drl extintor y la fluo­ rescencia puede ser detectada por el equipo. i-as. curvas [Je fusión pueden lograrse con balizas moleculares, pero es mucho

más difícil obtener 3a misma calidad de resultados de curva de fusión que la obtenida con las sondas FRET, Puede parecer difícil para cl microbiólogo molecular elegir (¡lié itpo de molécula tfaieesora usar para un ensayo de amplil!* caciOfl de íscitlo nucleico en tiempo real. Esto puede e^iar dio lado en paite por el tipo de instrumental que Juay en cl labora* lorio. Por ejemplo, ú se adquiere un SmartCycler* o EasvQ'1, serla preferible una baliza molecular, mientras que para el LightCyclei* son preferibles las propiedades de la sonda FRET, Lasplataforma* A B I' (Applied BiosysWms, R is lc rC ily .Í?A ) y Roche (C O B A S5 TaqMan 48® (Roche Diagnostics, Indíand* polis* lN)u.san sondas de hidrólisis. Algunas plataformas. c0“ mo la Rio(orGeac>{Corbett. Corbett, Australia). son indistintas desde el punta de s isla bioquímico y soportan cualquier quí­ mica de sonda. Se pueden lograr los mismos tiñes (delección tle microorganismos) mediante diversas, maneras. E l otro factor importante eis la detenninurfón del tipo tle honda para usaren un segmento particular de DNA es la composición de nucleótidos. de ese segmento. Entre los factores que pueden influir en la selección de la sonda se incluyen el contenido G-C de la región y la presencia de estructura secundaria, entre otros. APUCACIQUES CLÍNICAS La amplificación de íeidos nucleicos en tiempo reaL en especial la PCR en i tempo real, ha contribuido de m«h» signi­ ficativo a la imple mentación de ensaye* en tiempo real para una amplia variedad de microorganismos de importancia clín i­ ca, La mayoría de los microorganismos detectados en el pasa­ do por medio de la PCR sradieional se han detectado reciente­ mente usando formatos en tiempo real. Estos ensayos se han usado para detectar patógenos con requerimiento', muridona-

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Tipificación de especies

les especiales que por lo general se estudiaban con PCR y paría otro» agentes más comunes de enfermedades infecciosas. Los ensayos en tiempo ical para virus de DNA incluyen prue­ bas. para virus de herpes, adenovírus, viras de la virada v p a iw virus B|9,enm : El análisis de la cur­ va de i'usión pcsamplificttción se- ha usado para diferenciar HSV upo l
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nas de «Mas pívehas están disponibles como equipos de reacti­ vos con especificidad de análisis (A S R ) o sólo para uso en Luv es­ tilación (RUO j. Se describieron numerosas pruebas que delectan bacterias y los genes asExiadí,™ ton la resistencia. Dos ensayos de PCR en tiempo real Ima recibido apu?obaci<Sn de la FD A para utilizarlos en el sistema SmaitCyeler: un ensayo de Streptococcus dd imjpo H para ja detección preñáis! dúdame el embarazo y un ensayo reciente para investigar la colonización por Staphyfo* m w awTVS resistente a la meticillna (W R SA ). Entre l « equipos comerciales de ASM disponibles jjara !a detección de bacterias ejstán líos equipos para fintemeaccia (en especial, enterococos resistentes a 3a vancorrucina tV R E]K Staphyfococats y M RSA . Psetuiotmmas y Bacillus antkmcia. Ademls. la liscmlttfa especial iiaUu repleta Lie, ejemplos de ensayos de amplificación en tiempo rcúj para la detección y diferenciación cte diversos microorganismos y genes asociados c«m la resis­ tencia, Muchos de estes ensayos usan como diunas microorga­ nismos tradicionales que no crecen en un medio artificial o que son extremadamente difíciles de cultivar, como las especies de J! wftippeliL Ríete asm y Burtonella.**|hJ'" 1 E l análisis de la curva de fusión po^amplificución también se usó para diferen ciar las especies más comunes de Bartow fía (fig. 4-21). La PCR, en los formatos en tiempo real,, se ha vuelio imis accesi­ ble y más fácil de usar, y se está aplicando a bacterias que no se encuenlran comúnmente y a sus mecanismos de resistencia. Por ejemplo, la PCR en tiempo real ha resultado un método confiable y más rápido para la diferenciación de S. aureus de estafilococos e«agulasa negativos en frescos de hemocultivos positivos eon cocos grampositivos, y es un método confiable para la determinación de resistencia a la oxacilina en esos S. mtreus aislados. " 1 Entre los ensayos, en tiempo real paía hongos se incluyen los ensayos para microorganismos que no pueden cultivarse en el laboratorio de microbiología clínica de rutina, como P. jiw w c c i, y pura lo» di; cicuniicTiUj lento, cultio tí. uufHUbta n .i& iw .i*«iuhu* otras aplicaciones ion U detección de bongos filamentosos (mohos) invasivos y de infecciones por le­ vaduras en pacientes mmunodeprimidos y la detección de otros patógenos fúngicns dimorfos sisiémicos, como Caccidiaides im m itLs y P en icÜ U um «wm
20

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151

G * C — 30 I I T *A 1 t A#T 1 t

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Figura 4-20 Lu buíitu. mokcubr ínc dncnjíld paiu
inplifiFüdii ik una Pl'R tic amplíe* e'íwítrip para 5nfm*tttía S* comperte ifc J l DKlnlHh» y lieiK oim«nifipjnttón laJIo-tade- liiJ# estructura ¿bit* «1 llUH’íiiihin'j íú de lu nvHfcilla fjtltnlciKt di1 ilmwpiceniHa CibiklA Ljl baii/üJduLtculif IM «ai liI jiJ :Cj. mn mi iluda, petedia (lí lU t ® negativa.). Cu-iiiüdíi esiá praíiue rl ampbcán apropiado. la KflnMtinámica toorect la bíhridjcldi] j pe^ur de Itt oonB^uracidn *e híbrid» j' la rtuw^K'MKij, íc Isj.cc pfTí ifábk ptirqtíe el llisofiifoTO \c sepaini dd «ulialor.

liado varkss ensayos en tiempo real para ia detección rfpsda de Af, tvherrafasis direclamente de muestuts clrnicíts, Shresiha y cois, descrihiewn un ensayo LighiCycter* que ddeda y dife­ rencia M. uJtetvub.üK de inicobacterítei no tuberculosas usando tuifilisis tic curva de fusión posampliíicaciiin-MÍ También hay ensayos cxcelcnls pena la detección de M, tuberculosis para quiénes utilizan SrnartCydcr* y Tj*qManV? Se han desa­ rrollado ensayos para la detección rápida de lesistencria a fíirmacos de uso frecuente, como isoniaeitta y rifampicina.-^^1'31La detección e identificación de parásitos también se logró mediante cn&ay*» de jinpLiGcjción de ieidOS iiucteicu^ en tiempo real- Se deserdueron ensayos para la detección rápida del parásito Tumpbmw gfmdii, de ntm modo difícil de Je te * iarr'* IH'lpa Otras aplicaciones son la detección de parásitos en las heces, como Cryplospandiutn y imeresporidia, Ja tdenttficatión de parásitos iLsulares, como Leühm anb y Tripatmsoma* y la detección y difeienciacidn de las especies, de Ptasmodium, entre otres muchas aplicaciones

Tipificación de especies Los epidemiólogos y los microbiólogos hospitalarios pueden

necesitar determinar el parentesco entre bacterias u bongos, de la misma especie para saber si la transmisión del inieroorganisfflto sucedió de una manera en la que puede aplicarse el con-

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

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CAPÍTULO A JlicFDNolpgta nolBCilnr 0,40'

Figu ra -4-21 Analtas de ki urea. ile fUMÚii prniituplsíu^tidii £J «tihsis (fe ts m am .i idéete ü sim f^ira diínírtciar * ü * íiís ésti*-

Contic* f i í r t a i M f f i ftf lr l-J t j l í

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trol de !□ infección. Por ejemplo, si se ;jísl:i Pifw im tpm s atrit ■ £ipirm de cuatro beWs en la unidad de cuidados intensivos neonatales, el epidemiólogo de] hospLlnl puede desear saber si son Isi-s mismdN especies bacterianas que han s-k.li.>icryjViferkl^s. desde un pumo de origen o si son espceLcs diferentes y la infee* ción ocurrió por simple azar. La determinación de que todas las bacterias i» i) de ]u misma. especie retuerza la e\ idencia de que hay un pumo común de origen de transmisión y de que existe nn problema en las técnicas o en la higiene del personal que puede corregirse. Los métodos feaolípícos de tipificación de cspceics antece­ dieron a los métodos gcnotípicos, pero mucho* de ellos cane­ cen del alio grado Je discriminación qu e se puede lograr con la tipificación genotípica. Algunos otros, como la tipificación por bacteriófagos. requieren un alto gradode esperiaUzación dé Im expertos y el mantenimiento de recursos considerables (culctCjones de bacteriófagos). E l perfil de sensibilidad bacteriana^ aunque no tan definitivo como algunos de los métodos geooiípicos de caracterización, es valioso» y usa información que a menudo es accesible pwque l&s pruebas de sensibilidad se rea­ lizan para filia r lo terapia. Es probable que las bacteria* que tienen muy diferentes perfiles de sensibilidad ani imicrobiana n» sean idéntica* y, por Id lamo. no se justifica I» tipificación genotípica de especies, que es más costosa. Los primeros intentos moleculares para demostrar parentesco «fflw grupos diferentes de bacterias se cumplieron cotí estudia de hibridación DNA*DNA simples. Los grupos, de bacterias con olio* grados de homología de DMA,, como Jos delennina­ dos mediante estudios de hihridación DNA-DNA. se conside­ raran más relacionados, que los grupas que tenían poca homo­ logía en cl DNA cuando se lu» comparaba entre si. Para la mayoría, estos estudios confirmaron la validez de la prueba fe notípica. Por ejemplo, los estudia de hibridación entre Stapityiocorcus y M irTw w nts. que son de ¡a. misma familia, pudie­ ron demofhtrar mayor honmlogía que una comparación entre Staphyhk.'-ofciis y Psemírntanas. Lqs plúsmidos son pequeños moléculas de D KA circular que están presentes en muchas bacterias y existen en forma independiente del DíNA cromosómieo. Son importantes porque pue­ den conlener genes responsables de la virulencia, incluidos los que- imparten resistencia a los antimierobdanos. También pueden difundirse de una bacteria a otra medíanle la conjugación y r pur lo Santo, diseminar esos genes. E l desarrollo de las técnicas de electroforesis que permiten la separación de los plá*rnídw del DNA cromüsómico y la diferenciación de los plisinidos entre sf hizo posible la caracterización de los plasnúdos como una

forma primitiva de tipificación de especies. La caracterización de plásmidos fue uno de los primeros métodos usados para determinar el parentescoenate especies. Se describieron muchos m^Jodos genéticos para analizar el parentesco de lus mierocaganismos, Eotne ios métodos que no se tratarán aquí pero que han sido útiles se incluyen la ribotipd fteación, el análisis de DNA polimorfo amplificado aleatorio (R A PD ), } xpnligatyputg, eulre oíros, I.cj>> metodus de tipifica­ ción molecular pueden « r categ órico s como aquellos que requieren amplificación de ácidos nucleicos pura el p io rn o de tipifieación (métodos basados en la amplificación) y aquellos que no ('métodos basados en la no amplificación!. En este capí­ tulo se describirá un método hatada en la no amplificación; lu elecíroíoresis en gel de campo pulsado (P fQ E l, considerado por muchos el estándar pitra la tipificación microbiana. Se iraLáíáti dos niéioduü de lip ilicjcióu breado» ert la antpILfieaeión: PCR-RFLP. que combina las ventajas de la PCR, eon la tip ifi­ cación por polimorfismo de longiiud de fragüienion de resln jción. y Rep-PCR. uny técnica niladvaitienic nuevo, disponible en el nsereadu que usa. con el propósito de tipificar, elementos genético* repetitivos que se encuentran namralntenle en las bacterias. TiplflHción no basada «n la amplificación

ELECTRDFQRESIS EN GEL DE CAMPO PULSADO IiS,islert nurtieruuas métodos de tipificación Lie especies, eocl variaciones en el grado de discriminación de detección, en el costo y en la facilidad de uso, Muchos se basan en cl u*o cié un grupo de encimas llamadas endonucleaías de restricción, Éslas son calim as que escinden naluralmenle DNA bieatcnario. basudas en seeuerlL'iitó particulares llamadas sidos de rcilrieekjrt. Distintas encimas producen escisiones basadas en diferentes secuencias y una variedad de endonucleafas de rosiricdóti se encuentran dispiínibles en el mercado. Cuando las enzimas eseindei) cl DNA. los dos extremos producidos pueden >er romtw o ieñer prominencias llamadas extremos aitiEsñ m Cuan­ do se extrae de los organismos el DMA del plásmido o el eromosómieo taielenano y se esponen a una o más endonueleasas de restricción >se escindirá de aeueolo con las erudonucleasas de restricción usadas y el mlmeru de sitios de roslricción pre­ sentes en el DNA, Los fragmentos ‘de DNA que resulten varia­ ran en tamaño y pueden separarse medíanle eleelnjluitais en gel y visualizarse por tinción con bromuro de etilo, Ésic es un análisis K FLf. Es probable que los snÉcnx>r|anistnos con cl mismo patrón R FLP eslén estrechamente relacionados, mien­ tras que aquellos con patrones R F L P muy diferentes So estén

B Est igma del d r . VaFbr Eso

Tipificación de especies menos. Aunque los pal rene* KFI A* snn altamcnle rcprciduci blcíi y muy exactos, es posible que surjan ¡írcihIciiIhIH en la determi­ nación de ciento!, de fragmentos de UNA que pueden niigi liar­ se después de Ij diytxLúci que produce lu cn/inu de restric­ ción. E-U PFCiE, fue ideada cuino una manera di; simplilkar La tipificación RF1.I! I .a PFfiH es considerada por muchos la forma estándar de la tipi.llene ión de especies, eon lu cual deberían compararse los nuevos métodos. Resumiendo. e-sta lócnic:j comienza e^m la cAlracción del DNA eruinusólliieci badtcrianu de lus es|>ecies dí interés. que se exponen a una variedad de endonucleasas Je n/sirÍLvió». Id lipo de endCHHlckaha de il-sIiíl-cíiin Usada suele instar determinado por el tipo de bacteria que se analiza, basado en ueiu investigación previa que ha demostrado la eficacia de c sias eim 11 ia •*. Coi no se efcpuso antes. las cndonueleasas de restrice ion cortan el DNA cromosómieo en íl iversos fragmentos, según el míinem de sitios de restricción de tfj hebra parti­ cular. Los fragmentos del DNA eromosómieo se separan luego usando un Lipo especializado de electioforesis, El perfil de icstricción ertmiosómico resultante de la PFG E buetc producir 520 fragmentos ton tamaños i[itL' varían uniré 3t> y SiíJCJ kb'“' " (tig. 4-22). Estos fragmentos se visualizan, se fotografían y se someten a aTi-.it¡sis de imagen. Luego se utilizan programas de computación para desemiinar si hebra> en análiüis son distiii^itibl es o indistinguibles y el grado de detección. li l proceso hit sido denominado huellas del DNA íD N A finf;erfmnt¡ufi} cuando se combina el proceso de KE’LP eon 3a transferencia Smnliem hlot y la hibridación de sondas.1^ Tipili-caciftn basaOa en ln amplificación V iii« ¡nétddíw posamplificación lío análisis pueden ufarse para l:i tipificación microbiana; el análisis del polimorlismo de conformación monucutenaría. Ion polimorfismos de longitud de fragmentos aiupl¡rrc¡KEt>H, la PCR cebada ai biirari ¡miente. el análisis de EIFLI1 deE producto de la PCR íPC R *R FLP) > d análisis de |ns elementos repetitivos presentes en genomas bacleríanos obtenidos por PCR (rep-PCR), Hl desalié de estos métodos exceden a el alcance de este libro, fmr lo que Lralüremos brevemente los dos tipos de análisis iikís recientes; lJCKR F L P V fep-FCR, eumo ejemplos di; ni¿En »s bu-sudus en amplificación de tipificación microbiana.

PCH RRP Al lie iupo LjLau las cndonucleasas de restricción pueden usar­ se para ligar el DNA eromosómicodc la bacteria, eiias L’ii^iiiias üimhién pueden uiili/íirse par¡t escindir et amplieón. I.a se lee ^

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153

cWn de la £>las endonucteasas nsadíis eon PCR-RFLP delte ser cuidadosa iw^iue et amplieón es mucho mis |km|lh.-íI o que el eroiiLosiíiiia hauteJiiiniS y □>. liieilOi piobuble que COELten^a siliosi de re&trteci&n azarow>s, La^s eníinias a risenudti se eliden hafiindose en el eonoeimienEO ppev io Je ¡oí; sirios de rissirieción que están presentes de modo variable en Ii>s ampiteóme y. por lo lanloHpueden usarse pan la comparación de hebras. Hl lamano del diiiplkóEi y el número lEc posibles sitios tic restricción que puede cnnlener imponen limitaciones; a las c«paclí£l(ÍeS difererteitidoras tic esta luciiolutíía. Rl análisis ds' K F L Í3 tfel producto abreniílo pnr PCR se rcjili/a \nn lo eoiELLin ntedi:Ltire ensayos dirigidos contri el rDNA. Cuando se analiza por R K LPel pmdui’to obtenido p*.ir PCEí de un enrayo dirigido ni iDN'A, ‘-u puede IJílhicii ribolipifiepeíiin E’CR. IcLcluiiO eujjidu se anali¿j el rDNA, es importante usar como dianas áreas particulares, para lograr información espetilica de lipo 1 ' PCR-RI I .P w lia usado pura lijiilu ar rodíiv los lipuN de miermirganismo’., incluidas baclerias como espe' eics de Cuwjt'. htbtttw \ BorneUu > hongos atípico^ como Pijrttm wvM ii jim i'tri " 1,1 Además ^le las comparaciones de especies, los pul roñes de IKrR-RFLP ve pueden usar \m:\ la identificación de microorganismos. Este tipo de aplicación se basa en el uso de cebudojes de PC R altamente específicos. |-sin lécniva. por ejemplo, se ha uiwadci |Kiru iilciiEilictU1 bacicrias con lequeriiiiicritÉis nulriciLitiales c^pceiales, cspceics de Dftrkmt'íla. y parásitos diliciles de identificar, como nnquiloslorna-y íilarias. 1 ""l'ambicn lia sidd valiosa pura l:i dife­ renciación. de especie?; tte íVíicurtíia, lo cual es imponanre desde el punto de vista clínico ilcbido a las diferencia» en la sensibilidad a lu* antiniicrubianos dentro de este grupo.-3"^"* U>s genes i5£i ribosnniicns qise -.e puclEcii u^ar para PCR-RFl-P iOll lüí gents ilí nl.irireiiiniijiiru í y ".>:•<-iv , :,rii[í. comn rpulí, O algún gen que pueda contener información específica de especic p^ira uu jrnjpi-i particular tic micnjorganihmos (Eos ¿enes que cLHjtifiean las enzimas responsable de la hidrólisis del hipurato de Ciimp\lotnsí;ii'r jvfuni). in

íÉp-FCñ Los elementos re|M:lLtivos del DNA del gennnia pniearifuite etmsiiiuyert la ba-^e para et rcp-PCR Eíto^ cEeuientos repetiti­ vos suri los sitios de liibiidaeiún de lus echadores usadifs en el rcp-PCR. Por ampl ideación de la PCR. estos cebadores, com­ plementarios a las secuencias repeiirivas. intercaladas, generan Trajínenlos de DNA de tamaño variable que pueden separarse porclec[mfnn?i¡Hen fciel lílfi. 4-23). Los patrones ckxlmJ’utclteus pueden usarse ]i;u-ü: determinar ct pnrenl-estíci de Eas especies bacterianas que -^e comparan. Se puede usar un único grupo de

1U0

- . 1 -------------- - I -------- - — I ------ i . 1 - 1 I

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Aislamleiílo c-lmoD

Esccf & de la masída i Especie d« la masetMa 2 Especia ccnua! r1í?l labgnaTírxj Figura 4-52 .Vi*ltnn?niii :11 ■ :■L-ni L-■i df Jtitfa'iirrilbi muítoríJtt 10 ¿ináLisit ti# upa íf j» p in fA iífii de Mi^hwüíAr J nAilamwntn clínii'ni ftitf ncnFrlcairueate indisuj^uible de dov nrj)j.s dilficairts dc.sJr cJ puniii Ul- vihj, tuiiurfg'cLLi de iT . nhicuiiki , di-l ¿;itn iU,11^ 'Itiilc prni-rs cliviinirnlí dis^Jnlie b op-’d e oinlznl j|í| Lihi*.pHwirt

B Estignnadel dr.VaFbrE so

1S4 CAPÍTULO 4 Micrabiologíi rcolicutar

1 2 3

Figura J-23 Rcp P£:R de cípan visitó * de SwpltykxvvcTi-f, fit «kíIím* de

t3

los flafniíniM ítífjrríiíi>ffi]Hfja ire fwiioaesi de las bandas que se prntoeen cú c] ¿c. I Ü '| u.rL, de ttrp-PCR. L j íSLuJii {ll^tU 1\ ur uta nefcMML'u l

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cebadores para «na variedad s y para Identificar especies de fkjrtotitHa."'*2**

APLICACIONES CLÍNICAS PE LA TIPIFICACION MICROBIANA

Las comparaciones genética * (le microorganismos se han itsadn para investigar brotes o epidemias en hospitales, ciuda­ des c incluso paJses.ncH | P 7 Es común que |w a investigar huirte?* hospitalario], se empleen métodos de íipificaeión genética. Se sospecha una posibilidad de brote cuando la frecuencia. tic ai h1 armenio de un microorganismo patógeno excede la propone¡fin usual de recuperación basal. Esto puede ser caí un luuar cu particular como por ejemplo el oísmero de M RSA aislólos de sangre en el hospital en general o en umi «cía cu particulur. o puede ser* cl número de Sulmoneilas uJslaJ . lh informadas. para un recuente del departamento de salud. Debido a la fragilidad de los recién nacidos prematuros, cslaf- técnicas suelen empleante para investigar tiltiles en las unidjde.s de cuidados intensivos neonatal cs.1H"7 ' ' * Los métO’ dos de tipificación molecular lambien se iis^n pan investigar Jas infecciones causadas por bacterias resistentes a los and mierobianos.BMi'1 En algunos casos, se los utilizó para deter­ minar el punto de origen di- un tinne. lo s brenes y 1li trannmisHÍii de Sí. iulmn:ukmix mí estudian .¡ menudo usando métodos de tipificación mofcsiili t * '" ,J W “ -W J“ F,n los Rslados Unidos, los epideitliólugus eslió Colaboran­ do en todo el país para presentar Ja información, obtenida de la tipificación estandarizada de especies de hud crias que causan enfermedades inansmiddaH por alimentos, en una base de datov pública TuLcjotiiiI en ua pro» tama denutninad-o PliíseNet. Se presentan los pationes de huellas del DNA por PFG Ed c partí cipames de los jtl estados. PulseNei se diseñó como un siste­ ma de alarma temprano para (as enfermedades transmisibles por alimentos. Se puede obtener nlás información acerca de

este efifucrio nacional para pesquisar y reducir en forma rápi­ da estas enfermedades en www.cde.gov/pulsenet.

Conclusión hl número de aplicadorles moleculares para la delección y earaclcEizaeión de Lodo tipo de microorganismos aumenta cada año y son muchos los comerciantes interesados en la aproba­ ción de sus producios par parte de la FDA. Estas aplicaciones incluyen numerosos métodos de amplificación de señal, que en muchos casos pueden no ser tan sensibles como Ja PCR. pero que son simples de usar, pueden ser menos costosos y sobre ellos, no pe>a la sombra de la posible contaminación del ympJicdn. Los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos y los método* para detectar los pnvductos de amplificación han evo­ lucionado rápidamente en la década pasada, que culmina en las aplicaciones de ht PCR en tiempo real y de técnicas similares. Por úlLmo, el uso de- la tipificación genética de microbios para demostrar et parentesco entre los microorganismos continúa proveyendo información ii:ii con respecto a la transmisión de enfermedades infecciosas, Los métodos estándares* como la PFG E. siguen siendo útiles, pero los ensayos basados cri l.i sim­ plificación, como la rcfi-PCR. ahora disponible en el mercado, cneorttiuiárt pKjbabJeirtÉíitc su nicho debido a su utilidad, la facilidad de uso y el breve tiempo de realización.

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-I-1:4.^4-4117

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CAPÍTULO 4 «¡efotjiploiía re tic u la r

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CAPÍTULO 4 Microbiología malccuSar

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Bacteriología médica: taxonomía, morfología, fisiología y virulencia

Taxonomía: clasificación, nomenclatura e ideníificaííidn bacterianas Denominación da las bacterias identificación fenatfpica de las bacterias Gritarids fitagenéticos para la clasificación de las bacterias

Morfología y fisiología bacterianas básicas

Intercambio genético y recombinación en las bacterias Requerimientos para el metabolismo y el crecimiento bacterianos Cafoono Dióxido de cafCano

Oxígeno Nitrógeno

Faaimdecrecimiento Cinética del crecimiento celular bacteriano Metabolismo bacteriano general y generación de energía

Forma y tamaño de las bacterias Estructura nuclear, replicación, transcripción ytraducción del DNA FemiEiitarifin Citoplasma Utiízacióndel piruvaig Membrana citoplasmát ica Estructura de la pared celular bacteriana Factores de virulencia Pared celular de las techas grampQSJiivas Pared celular efelas taclias gramnegalivas Pares celular las ta fia s áci-do-aicDho?

Endosporas bacterianas Estructuras de fe superficie bacteriana

Churas Fimbrias pi)

bacterianos y patogenicidad Definiciones y conceptos Requerimientos para la patogenicidad Factores de virulencia de los microorganismos

Alesnas Ejcotoxinas y sndntoxinaa

Supéramenos bacterianos

B Est igma del d r . VaFbr Eso

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162 CAPÍTULO 5 Bacterio! agía mí (tica: taxonomía, morfología, flslolasjia f virulencia awtdos miLs de Jres. siglos desde que Lceuwenhocli nbw rvm por primera w - las, bacterias V leus próloici­ os con su microscopio primitivo, se ha acumulado una gran cantidad de conocimicnta «cerca -ele] mundo baclciiano. ] .< iv e j cfc'K i fg¿Ln isiifiLi ^ :,e encuentran en todos los ambiente*, incluido i el suelo. el agua y el aire. Son celjucís de participar en tudas las funciones vitales que se observan en. las formas tk vida superiores- más complejos y esiin en asociación con el □rabienle inerte y tan las demás formas vivientes. Por <>uí acti­ vidades en estos ambientes, son una pane integrante det equi­ librio de la vida. Los procesas genética y bioquímicos que oc«rreti en todas las formas de vida se lian dilucidado usando mierouc^ani^moí y sólo- ahora se están apreciando por cumplí!te» sus innumerables fundones en tos ciclos del mcdioumbicnti:. Por razone^ de espado, los siguientes capítulos se ocupan de un número relativamente pequeflo de mieroorjíamhmns cap. ices di causar patologías y cntetiiiédadcs en lo1-senes humanos. Hacia Hílales del siglo m , Louiis Pastcur derribó de modo experimental el mito de la generación espontánea y Robert Koch, entre otros, demostró que ¡os mietuuijjjivisiriLiN podíun causar enfermedades infecciosas, como carbunco y tubérculosis. Aunque las técnicas actuales permiten apreciaciones más. dim itís de la virulencia y la pulugcnieidad microbianas, haciendo que los posluladt» originales de Kuch sean casi ina­ plicables, estas principios Fundamentales loib1.la son la base que explica la conexión inequívoca entre microorganismo* y enfermedades infecciosas. Los postuladas de Koch. <¡e reseñan en el recuadro JS-1.

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Taxonomía clasificación, nomenclatura e identificación bacterianas La taxonomía de las bacterias se refiere de modo específico ¿i ires.conceptos básicos: clasificación. nomenclatura c identifi­ cación. La duüiñcaaiín es cl proceso de división sistemática tic los organismos en grupos; Ja especie es eJ nivel de división mínimo y el más definíItu*. La clasificación también se relíete ü] EJgrupumienlO de las espccíes d e su d a - en generus m ed ian te familias, ¡órdenes, clases y filos. Históricamente,, surgieron es­ pecies nuevas, a partir del nccunocimiento de ccpac, que tienen earactemiiicns fenotípicas diferentes de microorganismos simi­ lares ¡p. ej., otros miembros de la (amilia E nItw ibacíerw iriié). Estos aislamientos se comparan luego con otros organismos usando una gran b a te ría de pruebas foiotfpieas, Las Liplicaeiones actuales de las técnicas moleculares i'p, ej.. hibridación del DNA, sscuenciadon del DNA y ampliftcncidn basada en la reacción en cadena ik la polímeras |PCR1> han permíiitlo a los

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F o e id & d w de Koch

fe. UnmlCfnWfMtisniti a*Jü debe esiar prevente en todos Líh casos tle una enfenucdid irvreoflt^ tkfcmiuiiuda. 2. Lov mirnfWHTn.ni«,TTtcw pwdCD * r jásIu JtH en (Tilleilfaa,

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esa «radu de flafenneílad. J. La jnreulKión tkl micrwrgiiniimn aislad» t h í d j Ies siwMpuhteK (Sfufluee uni. enferaediií liniilar. 4. Oi nasrttui Lú3i;iii™#gíEai¡^fflo Míxiadfl- enn le cnf(umí¿Ud puede ser atilK Íirír jnncstiBi irpreMiititros de wimalev inffdasJ™ tle n»d<*

í:SfCTÍmefiCáS.

taxonoimslas idcnlificar secuencias microbianas características y otras elementos que csiüblcCen el parentesco genético entre diferentes microorganismos. Se podría preponer una nueva taxonomía babada en comparaciones sistemáticas de rasgos fanotípicos, quimiotanonómicos, y genéticas., F:l proceso fie denominación de Eos microorganismos .se establece mediante reglas de nomenclatura, Dénuminaclén dé las bíderlas

Ltts míenlos pesr codificar la taxonomía y la nomenclutuni de las bacterias comeruamn fnmiulttienlen principios del xx con lus trabafos de Clicsterh Ducbanjii y otactó.1" ' 1Hir En esc momento se irunicitm l«» üomitú de mícmbmlogos interesa­ dos en organizar la taxonomía bacteriana, para decretar leyes retaekimidas con la %j)lífl»ción de los nuevos nombres y estabkcer procetlitiúctiií^ con el (i ti de uunbiar l«i nomerrclaium (véasfi recuadro 5*2). Eslai debates dieron lugar a la publica* ción del Código ItHentiicianal tk- Nomenclatura da Bacit iius en l'MK. Lli revihión üeeuenciál de este documento fue publi­ cado por el Internationa l¡ Commiltee of Systemaise Eiactenology en I45H. E47Í y jqyi.iw.rai prioridades y las nielas pañi la denotajnación de Lttía bacteria se estables-serón eri jjrinci]rii> eS l u d i mayo de 1 ^5 3 ; el 1 " de enero de 1980 se publicó la prbaiera "Lista aprobada de nomines bacteria nos” en el ínw fM tiatKii Journal tif Sxsttm otif titM t'ñoiogy (U S B )|:J Lista lista fue íuegn enmendada y publicada nuevamente en I9S9 1 " Las ediciones trimestrales dei IJSD (ahora llanunlo Itiíentatíonal Journal uf Symenitufc and ISvohiirtMün M i avbiotofty. IJSEM i difunden listas con lew nombres de las nae vas especies (listes de validación}. Las descripciones de las bacterias nurnas |meden publicarse en IJS E M o en otrn^ revis­ tas extranjeras y nortcamerícanus. Si- la descripción se publica en una revista que no sea IJS E M . cl nombre y la referencia a la bibliografía que Contiene su descripción pueden aparecer düspuús en unu iista de validaeiún de U SíiM . Al comienzo dei nuevo milenio hall apaiecido 4 >14. Jiom hrede csjwrcies procariontcs en ia ,LL¡sta aprobada de nontbres bacterianos” de IJS E M , O en las Lisias de validación de IJSEM .™ -13» tíace poco, se byn propuesto nombres para especies ucUtalmente no cultivables, pero que bao sido caracterizadas por métodos molectdarcs (véase más a d e la n te C u a lq u ie r investigador puede proponer slesigilíieidfiii. Je rme^íts especies o rttiiíoines de las es.i'iíente.s, w los criterios puja la publicación incluyen el nombre de las cs]jccies nuevas íde acuerdo con las regías cita­ das en el reCuadní 5-2Jj la descripción detulliada de les caractertsticas genéticas, bioquímicas j morfológicas tic] rnkríiorgi!nismo, y la designación de un cultivo vivo emito la "cepa tle referencia", Csta cepa de refeiencia se depostia en ta„s ctricceiojtcs de cultivos de referencia (p. ej.n la Am critiin Tjipii' Ctiltiirv CollrtliDn 1A T C ] y la Nm liiittl Type Culture C o ll« tl« i [N T C C li asi las nmevas especies estafan dispnmbles para mntK invessig^duíe^ Se |X>n
Lins pnved imientes de identdic;tción fenolípica eiintinúan stentlo el principal ntítthdo de identificación de 1 a mayoría de

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

Ta nonomia; clasificación, nomendatuia e identificación bacterianas 163

RlDItfdr'D 5-2 Reglas de lo nomendalura de las bacterias 1. luLsiiJ m’Jii iUI ek'i lÍiil-CíKPCdt1 jísra Lti i:iL*rnut^2ii¡]i:ii¡». Cudoi1 luj «ais %ív’ miii iju;i U *p¡upfl-J :vlh:. ticnj pfieieidad el lLghíüUtkj ten mi» OAtydcdjtl IV iulnIci íshuhtoI. ntimbr^ lynsTin^li^ y aa'pr.irii". palien -^r ¡i¡lr* i^ák'jr lai rfmil¡ad^tv( Íahn;rL:l:^ nrVciiLi.^ (jí. ej., AUrincva-ui níifj'j ha *i Jo cüTiihijif(b aAflcrórm m añUdu). ■L' 2 . L u k n om bre» q u e in tb iic a B a erras o a iM M ftu U k «febea i

3-Todo» toi nombre» están calaíta o "luiuiAidnC" ilttMiSa 5 . L a « g u n d i p & lhbfa (especie uepáteas e a p e d lk u ] ie e s trib e «m

n .m ú d a la .

h H noffllw d«l ys5&ewny de la espeek>, ¡neíiíiciiifKltsi jumaos, catsd la tupeck. rtiin mtna^adcsü o ra. híLwjí cuando apmsem trsipríssos. 7. Hl iUKnfMHcorren» «le una «pede o tai designacMiuti UMNirfmicM supennties s* dnetmiiiM |»r la jHihliaejrtii válida, ta le^címuIsMt dd iwrahre eon resf ^ d i i 9 t u realas «le n ufucn tcM u ia. y I», p riú fk ts d Jg p u t i l i m i A i . S, Loa nocnlbf» dd género y la espedí que «parecen en e] InUmaticnji JtantetTvf5yUt»yttic *mi Eiviwwitttry Sfíamhfngy. IJS& f) ífitrnwljncfite ftfHHdflfMUr JrHtrruil AÉ 1.1(3m.nvrt£u luti Las. n¿iliftnK:', a. C u a n d o se ira iK lie re una ¿ tp e á e de un g én ero a n o , e i u tr e r o de c q m i e w re rk n e |p . t | „ L a m p y ló h u tfr p p la r í w c o n v im é ra f it iit o b a a e r j n f a r í ¡ .

b. Si w cis^M'riiJii ijiíc una cepa tfc rtfereíK u ti; realidad pertenece a otro ¿éneru, el gáner» Je Eatepe. Ul-reíereíieiii rio ac ctMisiífeni válisd-i < : SJ Lái: nh¡tHMiftu¡ti^iK? w Induje til J**s o üiáj géne^^ ú iktM Jfe o riiá» dirviaiíavj(u:e> de eapijcie, el tiotiiKi; de] g^iifUi/i'Niwck t)ue ee>itwae Ij ce¡m de reíefeíifii ctmcu «comidera el nomlw valito

las. cepas ¿iLsíadws. en cl Iflfeorítorin ele micm-hiología clínica (viíjlsí recLiuLlro 5-3). Iil üüfuüricü principal d i identiíicnciún f'ilíi en cl tjcnírrti y I» copeck1, sin prm’iir:¡r devenhir lajerirquín ii ];t quí pericnece un mitiYHNr^iüino UaJo. ñn la aclualláuJ. |4ü «MiLiertia" t;tíii>niimicos. turno kw publitJnkK «n cl volumen 4 (I9H4-I9&9) de la l^Iílhíii dül Manuut de Itai:fcritriaf;fa Sísrtittiirkü tic Str^fx, Ja edición tk 1994 Jc i Afamad de Bacteriología de Hergty, y vjri<w manuiiks y te\ i m de laboratorio muestran agnipamuMHC* de hacieriiiíi en LiLtq.ytrías no ji;riárt[uti;a\ lüüjJas cMri clamen te en caractcrislicüb fcrnu[ípic;Ls.mj ’7 J-V l M('TEn cl prefacio üc la cüíciún de 1994 dd Jlfeififflí de flacteriofaaín Determinativa de B o )fn ; J G. HtslL el director en Jefe,, esmbleee que “ el ardenamienso del libra es x'&tnctanH'nii* fenotípico; no st* imcnui nfnecer una etusifiCfltLÓn natur^E. HL <mdeo debido uiilit^rio y pmjenrii ayu­ dar a la identificación ¡Je Tas b a c le n a s "E n es-tc oontexlo, una definición opumtíva du una especie es uu conjunto de cepas que coniparien muclias características íenasípieas. Uaa cepo bfleleriana ^ deriva de un unien inicracu^anisnio nislado en CLilnvo, y la cepa dtt rtíerencta de una especie representa un ejemplo invariable de hi especie en cuestión v es pane de una colección ile ctdll^o» Ip, í j „ ATCC), L^jt^ cipecie^ eMáti ¿isjjijiaJai a lu í ¡jétitniAi dtíriiiido'i oturfulügicu y bLoi|ti]] oicainente, que a >u vez, eslin asignados a familias, eada una de las cua­ les también llene caraclerfsticas morfolditicas,. Iisiológica^ y biwjíiinúcs^ detcrminatii^. íladoque las eímtrnncrüia^ y deeisiímci taxonómicas sen ajbilrada> \nw un eotniié, el eoiuseimiento inJividual 3 los seseos intiudufidin en esla infancia hücca t|ue lia clasiliLiflL'idn fertülípiea pi»r cneinu de Ijü eutegoríus d« c^pccicKi « ti nlgn arfaiim-rin,,1M La?- reglas «k natnencl.L^ (ara implican un chunfitiactín jcrJrcpiica; sin einUtr^o, cs-Uss esquemas de clasifcaLuin no jetiinjuiea lian s,ido aeeplaJos |n»i' añc^„ como convención tonoiudmica. En con&eeucjicia, Los nombres de Sa*i liitnilias (ienfirt [-l'I ieriniñad«ñers latini/aiiu* -ffffflf (la familia fíruen)batirriat-tttt\ la familia Ncin%criaceiteh liw numbres de las órdenes tienen icmn racionas -ales íonfcn Eubacieriülís) \ el nnmhjc de las tribus icnnitlan en -eae (p, cj.^ ia tribu Prafm í), La incorporación a una base de dutns de ordenador de la información fenotípica de los sistemas de identificación disponibles en el mercado ha proporcionado úna (írgani/aeífin hivicmásiea de gran cantidad de dalos fenoti'picos acumulados. Nú existe duda de que e-íto^ slimn^ tontinua-

rán aCMinuiándose pora, servil al laibnralorin clínicn como -cl principal méiodo As identificación de Jas bacterias. Sin embar­ co, la aparición «te técnicas genélicas coninndentes y sofisticadíih ha converüdo la clasificación bacteriana jeringuíca tío sólo

en tina ponihilidínJ sino en un hecho inevitable. CfJierlcs litouenéticoj pan la clasificación de las bacterias Dado que la secuencia de nucleótidos de DNA es ónica para esjiecies inilivsduales de nticrtxtr^anismiw, el análisis del p^trenlesco de los ácidos nucleicos microbiano* fue reconocido tomo uju pt]\ible herrjtnienlu pitra descifrar la iaJuiflOjnía y la nomenclahira bacterianas. En un. principio, «] DMA fue striaJi/adtí por me conten i d« en (¡ + CW i iHirectilaje lie guariíisina + eilosina). Sin embafgor e.sie unálisis csiá limitado |Htr el hecho de -que dm organismos eon secacneiav dhcréenles de DNA pueden tener conlcnidos similares de G r C íl'.|JJt Con posterioridad, se encontró que ln hibridación UNA-DNA tenernba información mis útil, Rl D KA bicatcnario puede sepa­ rarse en sus dos hebras constitutivas medíanle la exposición al calor «1 a eoncenlraciones salinas altas. El enfria miento o la dis­ minución de ia cuileeniraciófl salina hura que lus dos hebras se vuelvan a emir o se hiliriden en Jas furnias de doble Jjcbi a jhif apareamiento especifico de bases (véase mis adelantep. E l grado en que las dos hebras simples de DNA se vuelven a unir es un» medida indirecta de su parcme&CoJ-1 " Usando esta técni­ ca, se etieontró que los microorganismos con cerca dlcl 15% o mas ile errores de apareamiento en la secuencia no se voh ían a unir en condiciones ideales; así. Jo.s DNA de rnÍLTUorganismcn psHin rcLieionado» no se Id bridarán, Como eí>nsecuencia. la bibndsui^i DNA-DN A ha si di i más uiil para la comparación de especies o subesfweies de miercjorganíimos. En este contex­ to, Dita especie bncterktna puede definirse como ua grupo de bacterias que muestran un párenle*^ de DNA ma>»r d¿l 7075 SF eon 59í« o menos de diver^eneia en las secuencias de nueleótidm.1" 3--’ En la década de I *>7 0 . Icjs gcnctislaü comenjíanon a itivotigar las secuencias de RNA riboMimieo eomo un mínxio para demostrar el parentesco microbiano. Este trabajo se centró en la molécula de IAS rRN A . que es una parte de la subunidad 3ÜS del ribosama bacieriano (véase más adelante). Esta motéculti de l 5(X>a I «DO nucleóiidosde liKigitud se aiílticon 1'aci-

B Est igrma del d r . VaFbr Eso

161

C A P ÍT U L O 5

ñ E tu a d ra D-3

Bacteriología médica: taionom ia, morfcilagia. lis ¡elogia y virulencia

Má-todos para lu cara-ctEtteaolón de ni ici 0 0 1 y a n te n ’ os c 11 cl luLarutoricj do m icro b io lo g ía Clínica

1. niaifiiInKÜi celular •Incluye cl Lunuuli lc tullir, tu. Fumu celular y la dis 1ribiK¡-.ln ii* L-, c£]ubi una* fiii» leipscl» a atnu. C íiid a ír t it H dr linriíin- Se relieie par li>i-crr.r.n ¡iI:k Eincianes y l.i .ic-icliv-:lIl-.ílinl res i í. nlt pera puede trclmr lo á & * n p á ¿n de nütw cañeteristiE» miciwciApica*., como Ijk p m flK ti de esporas, gratulo?. m etBcrom íLicíM ^ vacuo'-.*. 3. Movilidad- Lu UKWvUjilutJ puede □feservBfu en el jn k L K iw o p io c d B una p t e p u n a t a büjncdj 0 per LDoeuljWhSji en i!.wd.o* de nuAilkUJ seluiW'lidos.. 4. Prncnein o « u k w ík de repara*- I j presencia de cipnni es p,inkubrmen1e útil para idcmificar ftwrtíM, CloxtritUnm y especies relndomdus L » cípom pir Inigrnrral * pueden distinguir en la» tinciones (te Círin: ct prcpai^rone'. hdiued.'i'- ¡pimíaslincm Kf expeatka* p n esporas mhi h w K ih ik i.

3.

í. C urK lerbtlcai. de crecimiento,

il Ripld^i de crcdmtcalo- Lu mayoría de lu iiiicHKKgajÑJiiiCrí aislados en el lulioraloriro clínico k JesuroIltD detUnde 1 a 1 dítis. Sin embuda, ciectus bactciiaa. íp. #]., aciiiMMÚL^BM, mi .- u ta u trifó ) y hem e.» puedéa iliív u i uí¡ tiempo LOA&iderabLíiRfiHe Iñigo, h d f bii ttlúOlftt en rl rmedJci ilr- r™rmiM'nld- L*t hui-!r:i - >an'im en mj $ip^írH>til fliettiíVí de «lltivO SuMiáfiS, Cnfl e*]WÍei*tÍ*. ta mnrfñlngtí i í la*eufcsrtiaa orí vario* medios asupiadi tum i _j- proi;tu.-» ríf - i- íp. cj.. «Sútlm. cjULímii a menudo c.\ svíkkMe la CHKiedjadín del fínen» Je mBUWEganisirw» que U? dcíjrnnlljui .up arlirjt muestras dplzm. r C oilU dvim RlmacTrncas Jpliinfet pwrn ri línam ilhi- l«ns. rr.icnu'ijainsrnsTs [iü#den vaiwteríf«r par xuv rf(|urnn:¡e|il(w p*ra el OTÍgrnn y, Hepln ese rniuerimienla. m pueden clanAcax conoacn>hi<^ írequieter O-l. fumlEaEivi^ (pueden crecer en presencia ojiumiicui de (X jb w tie n iU w i (necimíenlo dpümafn aiucocu de O-L El cieciinkaLi» de Ea aiayork de 1 ■microcrEumunob tambafn w esiirtiuld por diúxjdti de «[bono. > cl «RciRikato de tei>capttofOicM depende- del COj íp. ej.. rsp ífio de S t i s t f ■<. Otros mjenHrjBnismoK. comoeiperiM de Cmtpylobacitr, pi^drn neresilar utmdsícríi* cwi teníidn de Oj lev*™eflwdkmiíiuHa: son los micrwsei^ñloi. d. Ientpt-rcjLui.il ijplmid de crteliitlenlti—L<.i mu\udj Jr Un. mxoxir^aniinjus ai%l-bJk>» -cu lo> lúbonlocioi. clímcoí üeren un dessriulli.» Apiuii^ u 35-37 X 1. La capacidad pau c a c ti ,i rariai eenipei ütuiij» puede ser tdiil pjra, c4iyLieriy4ir inkeoor^onisnias (p. ej., Cimpsinlkimtr. cieñas miectueterins tybweulHWitf>, e >tnrfnlHifif^ dr ti* ***l" ln* «t medlns dkfífrneJahs,, setfdivfl* j no aeleeti^ow U n lahoracorim elfnifín inocubo mitescrM en medir* n& s d K tP H 1 ^elecii^u^ jiLiíü la^ru ]¡u tonJiciuaes úpliiinu ik aidantientude inkrwr^¡mÍMiui> i punir de yn« niue^Crd. Lt*» medios s v le d i^ uvmi ^enlesunLimicrobidnoi ip. cj.. eulj&iina y Jclitu tulidíxico en a£¡tr |CNA]j o coloraaus y u lr» tiEJarei fp. ej., a^ur de MacCenkcy; o^car de azuL de míliícno-eosiiu) para iflhjhir el ■crecimiento de algunos miejroisianiFnKi? y permitir et de otros. Adcmúc, glgnnrK mediw selectivos ^rq» tprnhiífi ditereneiales, loque ^tfraftrj L|ue 1as catantes, que *e desmolí jji en un medio Jada tienen un.i ujiurieneia que muésIra una o ^iinjs caraclerí^Uo o tur-iaerMici1-íenolipicas. cUve. i.d.uL(crl»ui.d> tij^ev su^ivícn Id posible ideniidaií de t-os nüciwt^unbmci^ fp. ej.» Ut^ evlomu iivv»lur4S de l«í especies Shigtíhi no- fciincntadoms Je u tiiL'UiMi íícíhí a Lir-, ífiJofiLíii rojas ik £. to li feimcutadoras de la Uichowi en de MncCtMtltej' t. ñ, C «n d rF l«lla » hlgqnlimicA4> Juiun m i Lamniftitogía cnlnAial y celular y el alieno de lai cfilaraas en mednrn diferenciales y «lectivos, las pnwhas er.?im íüns y biuquímfea» Lbmkin lu ba» por» la mayoiíi de lo» pwMdtiinieiH» rodk*d»en ]ck iittMnuurtin Je nnJcmMc>lot(a «IrniLi. \m p n e«i, lai tuna:»tíi.i¡Liii biijquiinicas ye reil cien a Eu fomvición de dis-úndos linukí bdotiuiEniew Js «Btrjtos definidor la prí.nliKeiL'in de fckta a partir (te vprio^ hidnks i*. 7, P n é » Nenti<í|¡it'ikK- i,is pnwhíis %en>ldEÍ«* p«ni la n.len[ll1cM>ílrt> httienaiu JfTvotucrafl la daecckín ií í ínrfeetini (nedLiow inmuncmiilislfi eniimáito» o fliwrcwcitiH Ítíip. J>. [->' mckN.li is de iilcnliíkacidci AcmU^ÍLik LliilK l:i pueden (Liarte |ura niidicnUtf idciU(iflcrclSa pitra amli^eBO» ílups lares y Msorrítituj. por |t»#teneral mUiM pif iijfhiilnacWn. en potianhjeuii aatÉ^er^i etpeciftúi Je y upo. 1. A n illd id e leo pml-uclfls finales m eljilrflicoj v de euin^iaritEv? e ftru d iL ^ lp dd itifcraurj;jirtist«iif- El unilíii i -de lus ¡rnuJuLtui Sinatci loctubúlíL-ua a renltm ¡nilirci'lJiapnM tnn htilcK k»« si^lfmziiL de i.lc»l]jk'üi:¡(in hartrnuna, en Int. tiialc ' un pccHlDftn fin.iJ i = il*[¡iHC>Iil.’í * pn idi.ee Uní carinbi.[? deceiliah-le en lis indifiidnrdc i-lfún Upo, Sin wiHiiiTpi, anáEiws t^ioHíiii FMedér K t R Jllu d » JH-* üiam ntíritdiri, eíiuutel an jtlili ilt a n a t a p if ll g^íefía il# ICquidús de cultivo con caldo» atoados despuí> de La cxlnm ón eort vjtw i C h entes i.t|¡i4nlftieítívrilí? únl p*ru La IdímLSweWn de y e»f»c:k de kkiciciianaerobias. Loa etiudlt's iitijntiot,i\oikuniiOí fp, ej., «afiisi» de peptide^liKanoi y membrana externo de U pwed cetulu, camprnidun lipidien de b pared celular, deleccí^R de romponfntes del tranqMwte elecD^nkcK wmn cMnnnpnix. y ipeqa<|MiMmaii pnr eromrtoppíTi líipudu «le alm pnr»na efeitinuro¿füt'y de guri-lfi^tiidn) tambkn mhi dúles pcio no habituales en la iraynrfB de los Jatimnodo^. El undIHfc tle la. pared cvlular w h i u»dt»Con Iw ta * KUllMdüs en alpuam labeidLorioa IhbpiiLilarka como un nWLodo p.n,i tu difeirncj¡M.-idn e identific^^iún de las mkvlwcarias y mieriH>ííi*niíCnnfl ictaeiitnadus. í. Aiiúllu^de gaih'llcii Jitulteular- Lo* kiícoiIpi moleculuíes ¡nclu-yen el eontenido «te G 4 C^. la hiKrkLwi.4n PNA-PfíA y Ja sceiieneíacifti!. Je !m«e» de UNA. Aunque no Fe los usa de modo ru-linnno en líi^ bbnra.1unnlí hn'pitBbnnv, permiten el desarnilln de pnhehas Lcin lindas mUIivíi.Il-, en murlKKi bhiirjtHíntfe jiara la nkDLiiüwu&n de mieotuclerias-. cLamidms. Iwnpo? sin to Jo » y al^UnaAbaCKljjA. L » líeinkaí dé *mpHfleííWíi Cp. cj., jeatsclftii cu cadena de b IKiliineruJ. jeaeciiSll CA eadena de la li^dM,. amplifictKita de] ili vpl.iy:im:cn£ii de ln lieKnL y ainplUicucLtm. basada en li acL-uciu-ia de drlJdH ih ld d «n ) Luíilbiin esliii siendo usadas en tatonimiips clínicos para la «kleccinn direclí dr Chfomydift tracl\immth y y r in m a Rimfnimmr y púa las iteteenDiAjiíimm tle Lvir^n viral cu |'mcicíites con infección eí por Hl V-1 y hepatitis C.

ÉidíLtf d e ÍOS m ic r o o r g a n is m o ! ; bnctcriarHis y cumplí: e l mismo papel funcional y cslrcíturál en todas \m c f lulas haeierianas, Lun RN'A rihmrtiiúcoh de la >uhtiiiid¡iJ pequeña lian permane­ cido altamente wnscrvudm durante la evolución; lab municio­ nes CI1 CStO hceucncia d i bases alLainenle conservada suelen ser leíale* y los nueroof^amsmos con. esta? mutaciones no sobreviven ni se propagan. Adesn&¡, como etfas moléculas son 1111» pane Integral tle un complejo, es decir, cíe la estructura que contiene la proíetna (el ritwsoma baelerianoX ta innsíercnda hurizoníal de los rRNA a otros. orgunisiro* es rara. Mediante el

aníllsis, de secuencias de nucleótidns de] líiX rRNA se pudie­ ron determinar las relaciones íi («genéticas y la evolución de (iircfsws organismos a partir de ti|Vi>h amecesore* comune*™ 13! análisis de la secuencia dd RNA riboiiSmicd es el útil para determinar eí parentesco cnlre micronrganismm en categorras inferiores ul género, aunque esia léeniea ha sido usada para validar la existencia de diferencias ferwifplcas enere géne­ ros y espedís muy relacionadas. La> cepas Je la mis ma espe­ cie pu¡r le genera] muestran similitudes mayores del 97ít en las secuencias <Jd rRNA . 1' 1

B Est igma del dr.V aFbrE so

Morío! li gíd y küoioyia jacliírsanaa básicas

Desde mi inicio. ]fw estudios de sícuenciadón del RNA de la subunidad [VEjue^ii han teiiuln gruí impacto en lu sistemática bacteriana. Hacia luíales tic la díeada de 1V70. los análisis dd IOS rRN A Je diversos grupos bacterianos (bacterias mclanogéníc» {productoras de mciano|. bacterias halófilas, bacterias tcrmoaeidófdus, ere.) revelaron que esos microoigani sinos eran complesamente diferentes de otras bacterias y de los eiicaiiontc> y dcfmicrun la división del inundo bacteriano en dos domi­ nios \m¡hwi \ Bacteria- y reforjaron Ij separación fi luyen l ; tica de los eucarkínles en un tercer dominio: Eukuryota. El desarróllenle la sevuencucmn del DMA a fines deesa década y lü líe nica la reacción en caderui de la |>t>]pinerasj (PC R) de Ui iranscripinsa inversa j mediudos de la década de 1980 permitieron la amplificación v la seeuenciaciún del rDNA de la Hühüitidad pcqiicftu. l n estudio extenso y tu catalogación de esas, secuencias en las décadas de Ü^Htli} 1 W í) forman las bases del esquema de clasificación filogcnérico pmpncslo,^ La pubhcac ni» posterior de la segunda edición ilel M am ut de Bw ierw loiifa Sinfemáiira de fírrg w mareó una divergencia lomptula con ia primera edición en m esquema de clasificación filcigcnclieq. Rl mundo proeariomc se d iv id í en d<w iurnioios -Arrhava v liuhaetérig.'14, Los niicrnorgani atrios eucariontes se ubican en el dominio Eukaryota. .1 rv/Nftva y Bm u-rut evolu­ cionaron probablemente de un onanismo antecesor, corno >c evidenció pnr y mil iludes cu las secuencias de aminoácidos de grunde.s moléculas reguladoras \ estructurales y enzima, incluida.*! las adcndsmirifosfialusas v kw turloreii de elongación que funcionan en la síntesis de proteínas.1^ incluye dos ramas principales: Euryarúkñtota y Crem rekaeata. U Etuvtin.'htie<>tti incluye las bacleñas mclanogenicas, las bacterias redaetnrafi de sulfulo, las baclcria-s hidótlhis (requieren sal| y las tcrinnacidófilas (con üii crecimiento óptimo a SQ-füKL’ a pH menor de 5j aerobias. y las bacterias hipeitcriunlilas ana­ erobias, CwrwrrhiU'rftti son unías lermúnius (tur* un creci­ miento Optimo a 50-6U "C). organismos l|ülv son hcteiótiofo.s redactores de azufre u onanismos aerobias capaces de oxidar azufre w «eok sustratos orgánicos o inorgánicos. Aunque Aivfaitt'ii son s¡rnl lares a Erdm ierín en tnmnAo, estructura nucleoide, erec¡míenlo celular y división, difieren en varios aspectos, E l iamafio *ic! genoitta de D thictvim (0.6-12 a 10** pares de bases) puede .ser más de [res Vcccs el Je Airltaca f 1-4 * ISJe pares de bases). Atvhaea tienen paredes celulares compuesiís de proteína y carecen del peplidoglueano murvínn encontrado en Eultatierhj, Aunque amhns grupo* tienen rihnsomas 7t)S. los Je A rthacu son insensibles a ta inhibición de la síntesis proteica ]Jor estreptomicina o eloranfenieol. pero, c u n i u Eiiktirw ta, stm ie rts ib le s u I j in h ib í L ió ri p or t».\iii¡a d iflc rica. Características opuestas se obtienen en Euim aerim , Resumiendo, Aiviarnt comprende las hsicierias (jue M>n “ e\irenióíílos” del nsedkiuinbienle: no contiene patógenos burn^ios. De acuerdo con la guia de la segunda edición del Manual dr Bm trriotogin Sixm ttúiifti tfc Btrgex. los ruEcroorganismoi del dominio Kiibítí-fersi! (o dominio ¡toneria, coma lo >ei5ahi Bcrgey) se dividen en 2.1 divisiones o Ríos.” La mayoría Je estos filos se componen de especies medioaiubienlales, como las bucteriiis ftiiosinliítieas « las Eenhólilus. Los p4i[Eigcnr>s humanos se distribuyen en siete filos di feninles, Lu mayuría ile las baclenas gramncgativaN de importancia clmíca pertenecen al fio PrTifwibuaeriit. t|uee>i<í dividido en cinc» clases. Jesignudas O-, pl-. y-, 5- y C-I*roltobacter¡u. Tuda* Lls lucletian eniéricus, lu ntayoria de las e.spccicí oo fermentativas, tocos y cocobaciios gramnegativos de requerimientos nuirkionales especiales, y los Cumpyfaiwcter pertenecen a varias clases ilenlrodel filo PntieolHiaeria. lil filo Firmicures incluye tire*'

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clase* que comprenden clostridim, eubaelerias. mic?o. E l Jilo Aetimhactrria incluye lo* «eiinuinitcTus aerobios anaerobins y los micruoT^áíiismcis rclaeionados, ios cocos graniposilivoR y oíros géneros de bacilos grampositivos l'aeuIlativos. Los tilos Cfitamydiae y SpirwlM ifte* conlienen las clamidias y las bacterias espiralndas (p, ej.,. Bnnvim . Tirf**ncimi ;l Ltpim pirti). E l Ello Bactem tihíes contiene mieroorpani sinos del grupo BuritroUles (Bai'taw des. Parphywmonas y Prt'votella). nsft'iiboeterias, ípingobacienas y bacila jrumitegaiivos no léritieiiiadopes relacionados. E l rilo i'uutham rki esia compuesto ¡>or las fusohaeterias y el giíjieiu Sirqtiobad f h i . En el recuadro 5-4 se poijwciona un resumen cmnpleiu del nyevu esquema de elasifieaeión de lus inierourgnnísmos asociados con los seres humanos y sus enfermedades que apa* reecrá en la prójima cdieión del \fanual de Bacteriología SisteutdtU « tte tferxey.“ A pesar l£c1énfasis actual en los mí lodos moleculares jíara la clasificación, los criterios fenol ipieos conlimían siendo la forma principal de idenúficwión bacteriana en el Uboralorio de tnicrohiologia clínica. Con los niénxlos señalados en el recuadro 5-3, junto eon variew esquemas de identificación y bases tic óbitos asistíiliis por ouienador* la mayoría de ¡las bacterias uisludas en el laboratorio clínico pueden incluirse en un sistema ta*
Morfología y fisiología bacterianas básicas Lus huirleriqsi son pnKarionles, mientras que los hongos, Iti’i protozoos y Olrt)s OrganisiOus son encanóme*. Las células Cucar¡imtes eonLieoen un núcleo con uua membrana que encie­ rra milliíples cromosomas, mientras que las células pn>caiino­ tes tienen un cromosoma único (nucleoide) que no está ence­ rrado en una membrana nuclear. Las células cucarionlcs tam­ bién llenen diversos orgúnulos í^uhcciulareH cois funciones especializadas, como las mitocondrias (los lueares de ia respi­ ración acrobíii? y los cloroplaslos \los lugares de la fotosíntesis en la i pluoius verdes), En efeeio, estos urgúnulDs subcclul-ircs CYdíucionaron probablemente a partir de procatiuntes que ingresanm en las células eucuríona-s y desarrollaron relaciones simbióticas con ellas: después de un tiempo, debido a la perdi­ da de las funciones metabrtlieas asociadas con la vida libre,

B Est ¡gima del dr.V aFbrE so

1ÉG CAPÍTULO 5 BaclsriciImédica: taiaíicmía, rr-oríalcgia. lisiolsgia y virulencia

R e c u a d ro 5 -4

DO MIN ID BACTERIA Filo Jll I

C la s ific a c ió n Jérrirt]Líttra d a l a s b a c te ria s d e im p o r ta n c ia c lín ic a ílM . '. M í iir ii íf t B a e S M Í& io g ia S is te m á tic a B e rg ty ^ te g u n d ii e d ic ió n

.! *

PfúlíobaitaríÉ l¡1. Ata. ha.- SHIU ItHll ia.LELrí B11 Orden []

Rtdtfttiürlfs Familia 1 Faj:i¡ Ilü 33

Orden IV

Orden V

Qidcti VT

J,íptlS|lU,<w™wiJKlilis " Erumilia 9 CapIvbetrtfriaJe'; t'.u: ii !j;¡ 1 “ ñ lriiu tiu le i1 Familia | F in A in SI l-ami lia III

Fiurlilia V Lt Erjjni.lbd IX

C i r a IJ

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■’B urttltoMírluIcí" Familia | FwBUia H Familia IV

FaibLlia V O íd » IV

Orden V

C ía * III

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Otden 111

' ‘NciiscriiJcf’' Familia 3

■‘NiuDMBiKMiadalti'" Familia Jl

JLXajilh
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ftfckrttsiiit itJíG taera 3 El/rhl lililí LI.V ( k'ULTH ' 3

K b itlliíü ÍLhrticími

"SpiünpOalfuiitadineac'' Gínpm ]

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f'm ihthaflrritM r/ii' LüJjiljí ' |íl

Hrt1LtuiJj'íí ií.ifMj v

ftk iztiki/K-fííf ffiÉKAl 11 BarttnruHtKfíu ÍJ*fl1CTP 3 B m rtüactae GÍJieft* I Gánen III “bnitHrtii n>bia£vae<" G Í k t o 11 " McUl'l l^il- lk 1i.^'L.Lw" Gdnitfu 3 G feen illE

"BiirUtoMeriaetaí" ¡ to c to ] "■RalllDníaCDiiÉHL üchch ) 1 Atfnh}¡efUM'¿af lieneí-L' 1 ÜCJICTLI II G l^ p o 311 Odncra IV
AHfüfaKittiMtt Bartontlki B iu lé II ú OehmbíaítüiH flflpia \ letfiyía faar 1í ríi mi kfluamgiKut

lint klxftderlíi KaiíJsma A k n iíjitn ti A íArtVrtúfctiiL'lí' r Bvnírirlttr Tayfañrlfü Citfnptnrtfifli

Afcfajt'JTÍflorap G^ncin I üínero TI Genero V I G & uro IX

hffii.irrifi A fy ñ fih EAtitella K k t íf lb

Spm tíaetat ÍWnífLi I

Spirittim

"XarahoBioiiadaccae" Chinero I Género V ||

XatHhmtemaa SlfR í if rr.iptz¿mi a n i r

Ca rdk&Q rt rra ri e mf Género E Género IE

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C-üriJutbiic.lt: ritan ¡¡uffunetta

B Est igma del dr.V aFbrE so

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188

CAPITULO S' flacler alcgic má dita: laiono mía. marta logia, lismlogía y virulencia

R e c u a d ro 5 -4

C l^ s e c a c i ó n j n r á r q u i t a d e fa s; b a c t e r i a s d e I r n p o r t a n c l a c l í n i c a d e l jt í t a t iu a l ts $ B a c t e r i o l o g í a s t s - t é m u U c a ú e a * 9 u n ila * & & & * ffio n M

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D O M IN IO BACTERIA F i t o XII

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G é n e r o II

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B Est igma del d r . VaFbr Eso

' 1

Morfología y Fisiología bacterianas básicas 169

Recu ad ro 5-4 -J- '\-m£ Ríe XHS (iü t m

C la s ific a d o r» je rá rq u ic a d o tas bocto-rias du im p o rta n cia c lín ic a d sl M a n u a l <Je B a c tir to lQ Q f a S is te m á tic a tto M p w seg u n d a a d ic ió n . ( c o a t ) ••• ", í j —L J = ■ «-r .1 - . L . ■i— "r Ij ■-'—£_!¿—■■ *■L-.--=!'■—i— .—‘— —fe i~lhi,h l> Mlhl n m f tt ff f lif, iw . “ B if íiir Ollfclk 1

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Oénero tí O t w n Ul Oéotro |V G íik io V ffllKTO V I G¿dffU V II G íru ro V in PlVfílO CO fíW t fiH3 Ríncm 1 GCncn> UT CíT,ryin;itorJHiríW

Anphdkseíitus Exifiuobacterítfm CnfcJUbttrfliMi H idíifm -iN t» SíKífMIWCfKCttt St^büí'Ulw! Virgüwrifíws

OéociP 1

C an o p h ím m

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fíim o a x tm Knrthkt

Fwniliu. IV

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Familia V I

tiín fll) ll “ 5-1 vli\ I íjc:wtr a Gü ik iu 1 Género II Género 11[ GéneroIV “S punJadn-hat, i1Ia :cae*” Gcntm 1

f íf lW 11 nouuVQ

Fm ttta v ie i

Oíilcn ti

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"Raenitwilliwrac'' G ín ro 1 G í i k j í j ITI Oéwro iv “A lit jtliis K i lluecaqr C^nern ]

Smpti^tuceccus G tv \fla M&tnK'tkTa.'i 5aílw >i:rtttia SfW inlQ tiniw iiltrX Mfífinncfíccm ñ a n h u iN u s A n en m ib atitíu fi B m ifh K iH tíf A lieyfiobBcittitf

Láiclcihm rfkuriíie GAhefft 1 G&WTO 11

F td b c Q ta u

GÉncns ]

AtTOHKmS

Género 11 Género 11[ g íik jü r v Género V Género V I

Abietrrjphitl D ah u ifo ccm Eretüe *oíx .'í ’tu F U tllM k ) GfobíetJKila fRnavigroNkm

JLrjrJtibnrrJfa-T

FaaltLlia. SI

Fw u lie III

Farollin. UV

GUrero V II " C iiD jb K jfli reme” Gánen? J Oímar»!. tH G¿nCT4 V “E íi teroc w w tw je” Género 1 Género II Genero 111 GéneroIV

Ccjnv. 't m i i'tj :
/IfitmvrmTw: Dolos igranulu m

Em o tw h uu

Mtfkstxncati JcrtUJlCÍHftm.T US

\ÍtgtX'lfCí‘Hl

B Estignnadel dr.VaFbrE so

170 CAPÍTULO 5 Buetarfilagí! médica: taionoinía. mortal agía, flslolatta y virulencia

HBCU&jjU 5-4 ■

1

CJa^lílcflctón Jerárquica de le* brcterlra de Impo f T a m n i r A v i L i n W É á>rli r i rip% rrf*.nn-P 1 "-!"V ■ ■„ . E'eryey, segunda edición M é á m k

i

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Finnicutss [il. nav. Familia Y

“ I, nuqim lt.m jog " CüiiL-m i

Género ]t Género líl FimULa VI

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Género I O ín m ll

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ActlasbaeleFla M ídase V

.^ctífK^ocWriAM

O tJ c ji í

Aetiniiwtwtiüíti

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Actm/HHfriruar F a im J ia 1

SíMpUreoCtUS

l 4¡caxí>ctui

Acti/wm ^ ftsífAt G é n e ro I

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O é n s fr o H

AftBwéoflIÍJBÍ

G é n e ro U l

AKanobacieriim M iiifilu n u i

G é n e ro

SubetJt-iíVE

Lc&ctitii'tfiKOmociKCus W tiis tlla

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.IfícTi 'i Tjirri>jj'j
Fsnsiúa I

Atirrnffír&irt'Jf G é n e ro n

M km c vtx m Arth/vbacter

üfnrrn V G é n e r o - V|]

K am rifi Mtvferpnkwski

G é n e ro IX

Rr'tfm

G é n e ro X

ShWtíatVÚCCUS

G é n e ro J

F iin ü u II

Bmihet'f^riíie-tw G ín e ro I

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Funklii IV

B m ib o L 'iM m i

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■Cri'íaií'miViLij

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■GéMMi n F á f t iiijá V

ÍJénrniH tfhtblú& at (ÍL :H L f< - I

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LnjuUCV I I

DrnaáctMtí-tit K%rjK-:v4üi

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G ítw ^ rv Familia V E|

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JJfc rrjóirííi'ríam

Génere 31 ra n e ro III

AfrorPiTMí Ajrrofflicfj

G c n c J i’ ] V

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G fm w V I

CjJúíitífttfrJuW

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Ijcñciti 11

SkfrtWítíiki

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C ¿ iu t u I

S^feféoí'Séríam

B Est igma del d r . VaFbr Eso

Morfología V teoiogía bactenanas básicas 171

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S ri\ctszi icx f¿n' N eva /d ia

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Otlam KÜalés F-milia I

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Género TI fyjn tnipinjcror G¿nan I

Strputtiia Lepkupim

B a tíe ro id e le s itl nov

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“*($nrl«nmtilMK Fj!ni-ií r F*m ilii ni Familia TV

tiurifn*¡r{fVfflrr tunero I

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Ptirpftymmmüi

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PteiittcSla f O ■JfriíJiitfJ

B Estignnadel dr.VaFbrE so

172

c fi,piTulo 5 Bacterio idqla roéd iea: 1a» a omIs4merfoioqiís. titJol ogia y vími ene lo

necyadro 5-4 Fito xiv CLj.fcL' t]

ClflsLfíc^elóo jerárquica de i^ig &er$iey, ^eyunda edición {cent.}

(íe- Importaneia clínica det Afínüflí tfe Sacterlologra Sistemática tis

¿ftHUflNlfrTerlil- non; ■ |Flii>ab*i.ttrLij'L FJintilij T

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Fila KXI

Fhi iiiffoarj'fíhirc.'tftW (■¡«ícr* I CiCnero ll GciIkiOtil Gííieio V (iduciif Kl\ ' VEj- 1m il ii-rir" fíiincrih 1

Giimerif 3 ' Hí-MhMrtcníKtac' (JéfiL-r* i

SpfdirgíilxiriitiuTii i lfíiblU -¡t'f

Futolntttrtii ILI. n&u ■LKus
'' E:uswilüt' lí?n aEcs'' E^imulH 1

” lim ihw rienw :íiif'’ Ciénero J ( J i-.i j i i -VE

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desarrollaron rasguh o aLrihuitus que bcncficiarun a los or^ani^mos 'Lhucspcdes’\ Las células eucariontes y las prv^arionLc^ difieren Misiajícialmcnii: en muehaji ulnas cjuUdcríslicas, Las cuales se resumen en el cuadro 5- 1

rias de acuerdo ton Jas estructuras de la pared celtdar, como te verá más adclanle en este capítulo. Lo estructura de una célula baelmana genera li/adu {lanío groitipusitiva temiu gnunncgaliva) se representa en la figura íi-l.

Forma y tamaña da las bacterias

Estructura nuclear. replicación, Eransciijición f traducción is\ DMA

Lai células bacterianas: son üc diversas formas y tamaños. La mayoría de las bacterias tienen D.2-2 JJm de diámetro y I -fi Jim de longitud. aunque muchos microorganismos medioamtoientaLesi pueden medir basta t(K> fim. Epuíafrijiciutn Jish tlw tiii. la bacteria más grande que ve haya descrito. vi%e cu el intestino de un pez, y mide 600 (am por SO Una,* Las bacterias tienen cmirn morfologías Jiásicas: células esféricas O-CílCOS' células en forma de hasiones o bacüits; células en forma de espiral o espirilus: > e d u b en forma de cuma o vibrios. La disposición de los cpLtts en pares-, cadenas o nuiimus define lo* lie microorganismos llamados diplo^ocns, estreptococos y estafi’ Jococus. respectivamente (fig. 5-1), Lew microorganismos en furnia de ha^nes pueden ser regulares en morfología, pueden ser algo más cortos (“ cocobacilarESi*’! o pueden aparecer en forma de clava o ptesa E1‘'corincícutncs"j. Las células en forma Ul: coma p.>r Lo general definen ana caraeLerísliea Ejásiea de ciertas especies Cp. ej., cspeclc*. de Ví/trio). Lo mismo es váLiito para otras bacterias espi raladas ip. cj... Campytobarler. Hffiinhttt-lgr. Honriut y eüjwcies de Tn^iHrrnrtr). ¿II EljS que Ea. forma en espiral puede ser lai a
Las características heredables de todo organismo viviente están determinadas por 3a cstnietuni dd material gcncíicn, El material genético dé una célula individual está compuesto por ácido dLMi^lt-rihnnucItttii |1)NA| org4in¡?ad() en cromosomas únicos o míiltiptcs, Por lo general, cl maleriaJ genético se men­ ciona conm el genoma dei organismo. Fn la gran mayoría de 3ra proeaTLOntcs, el g.ennma compuesto por un cromosoma eircuíar, único, cerrado en forma cójateme de DNA de ttobíe hebra ídhDNAl; en algunos microorganismos íp. ej , Borrelia btirgdtuferi- Imn estreptuSllicetus) Csld picscntc ct DNA IsrtcaL^ En Afr/iflcw y ftjcfe-w. ck1c emmnsnma circular nn eslá unido poi una membrana, sino que está Libre en el citoplasma en una porción central aislada de la célula bacteriana llamada nucle­ oide/'' El DISA celular bacteriano tiene un peso molecular de casi 10* kDa, mide de 300 a 14 00 pin de longitud y está prcicníe en Ja eéluLa en. un estado üu per-enrollado (la molécula de doble hebra gira sobre sí misma como una banda de goma enrollada). Los genes individuales se actsmíxJan en el cnamosorna en forma Lineal. Hl nucleoide representa alrededor del EÍHe lEl: I volumen edutjr, ¿lunqui: e| DNA es siihi cl dd peso de Ea célula. En Escherichiu c
B Est igrma del d r . VaFbr Eso

Morfologfa y fisiología bacterianas básicas 1 7 3

Cuadro 5-1 Propiedades de |a j células rucarhrU s y p iw a iio n lts CARACTE-RÍSTl UAS

CÉLULAS PRCICA KIONTFN i Fl IB,-\€TFRIAS(

C fil .LILAS 1;UCAKÍ iINTES

Cdmpov princi/jjlí".

t3¡i¿1iínav, atfíífl :i*iil '«AiiuMn-

Alga^, Snifigiii. pftvloynos. pluisas. snirralc^

Pared titular

CttoUrne pcjifidiniluaffii,!. Itpidoí, pnriscínas-

Autisnle: eusndm e*-1á ¡w<ín1e prwitifnc qjBÍHmL* patnili-n

AlHCIlld OS’A ifc dohlo hetna ciscul-ir. « ttíJo. íini™ liapUOiilr Onnriniun. con mRNA de vida ciwj y pulimboH.«Tía ( i A^scuie?

ñ c ta k Múltiple^, cn.iíiw'Miira^ lineales Dipk-ifc. hapk'ide (hi.'Higwl' DIsíiintiflun-cL riR^A de tangn vida trirviKTipiuín cl uikáeu y lHJix:kl'?ín
F.smx’wra miciear M l;I ihr.ulu lic.truL Cromcvíomai rUstlía Tran H'rijicií'fi^rüstsKviísi

Cilafilumi Ri btnoffidi htitoctulñoa (.‘■cirnplfjn de Unl^i Retlknlu eatJupLüfBiiticü Mcftibnusii l;[ f Ijsniilit a

Jr

PtttCfiieOíhS[.5Q5 + 3flSi Aaiento Ai^nle Auw^ik Plcefcflie: füifoljpidüs. no eattmlfi tei.«f Amenle

ftcsenltí: toS [6íiS +-«!SiPfCKHito I*íe«?isie5 Píesenlr Pnewnie: fos-h'olípidíi» j nwrrik* (cnlewtnK cigciuen>l)

\1 lt,'iLi .IjkE

l'sgfin» (xjrnpfcs)

l'lajpliis fcHunplcjth?): %¡e'L*.l>jpiikk». (itrui án¡udú» Je liK'niiiani'm coiDplejcK

(ierosmciím «le energía

Awciadj o*n l.i ntctrlhRinn cilmpljminjlk’a

M ¡írxnwíníti

Acuate 1innícwaf u)

P j P M 'n t e

IrrmsmhKi de ¡m r; ptii-imiJwo crnnrK4i4nkt.K n*5d¡j,[Hc uun’.forrTHvkii. (ran«Jm,v»6 n lt lU'.L'.iísq

rifiHHb JijJnide íonruda ¡i partir tk cílvtís fírnup:ilís lu | '! n i i ! c i . 1- in r iu iU K lIj. ! i íí í s t a Ou [u o w ib in a : iii1 il IffWiH'a

Tpsl¡^ri*w

Urccm hinj ci fVv'ínfrra in■■■'Ki
Je modo continuo. El cromosoma también parece esuií jülicri(3o a la o ra ¡merma de la membrana celular en cierta pamos. En los racimantes, cl material genético se organiza en varios cromosomas dentro dd núcleo. Los cromosomas están, a su w , asociados con varias proteínas básicas llamadas historias, que ajudan a estabilizar b fóim clua eromotiÓTniej. I jík emmowma?; de los cucariontcs estan separado* del resto del matenal celular ¡3muí una membrana nudcar, t|u¡; w cncopcme de uno bicapa lipidien similar en composición o Ea incmhraiu celular. L i membrana nuclear también contiene poros que per­ miten el pasaje Je molécula* pequeñas h.n'ia ndcntm y afuera del núcleo. Las ácidos nucleicos de toda* las, bacterias. como los de otras organismos, están formados de políiuicteótidos (un polittliím qüC se í-TJTtipcrtü Je micLcúlidbs) que constan de Ire* com­ ponentes llig . 5-í): 3) un azúcar cíclico de cinco carbonos íribuia en RNA: desoxlrrituwa ért DNA). 2) una to e , purina íadenlnaH guanina) o pirimidina leitosina, (ituiim. ufadle»), unida ol átomo de carbono r de la puntosa por un enlace Nftlicoísídico y 3) un tíi*f'ato ÍPOjJ unido ai carbono 5 ‘ de la pentiisfl pw uu enlace fosM icstcr, La milnd de las desoximbinas están unidas medrante grupos fosfatrtí alternados para fwmar una cadena que tiene un enrollamiento helicoidal característico y las toases están dirigidas hacia cl ojs ccnlral de la espiral. Tal estructura forma una hebra simple de ácidu nucleico (süDNA’í, La estructura del DNA de doble hélice* resulta de la mrefacciíln taire dos liebras simples complementarias de ácido nucleico. I j coniplemunlatjedad chá asociada con la secuen­

Plcscrslcs

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i!c r e p r r a Jiíe c íik l ütMT.

cia de toases en uno helmt simple y las píenles de hidrógeno que encuentran entre la-s bases específicas en la helwa com­ plementaria ífi£. 5-1). Las buw;* purina ron adeiüna (A ) y p in in o iti) y las» bases pirimidina son cilnsina (C ). limimi (T ) v uracitn (U ) (fig. 5-3). La purina adenina se aparcará sólo ccm la pinmidina ti mina. mientras que Ja purina guanosina se apareará específicamente eon la pirimidina citrin a. Las cade­ nas antiparalelas de »D N A se itKnillenen juntas pw tres enla­ ces de hidrógeno entre C y G y dos puentes de hidrógeno entre A y T (véase fie. 5-4). El DNA. nativo existe como una hélice de doble hebra, mientras que el RNA existe en forma de hebra Himple como RNA mensajero (m RN A) y en formas de doble hebra parciales en las moléculas de R N A rlbosémko {rR N A } y R N A de transferencia (iR N A ), En todai las especies de RNA.

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5-3). La secuencia de las bases purina y pirimidina en el DNA eortsiiLuyc ei código gentílico, con codoncs específicos fue* secwrrciitó de [lares de iwsesí-qwe codifican aminoácidos e>pt‘ tífictó. El RNA mensajero de hebra simple fmRNA) se ¿imetia pan ir dd DMA de doble hebra durante el proceso de transcripeüín por una RNA poltmerasu. dependiente de DNA, en el que una hebra complementaria de mRNA se sinietk-a con la hebra codificante del jsD N A como moble. Luego, el mRNA se asocia con los rl baso mas, que üin los lugares de síntesis proteica. Los eiicarmntcs y Iíw procariontcs contienen un gmn núme­ ro de ribosomas. En los prtwanontes. los rihosomas tienen 70S mientras que en los. cueariontcs tienen SOS. La ‘'5“ hace refe-

B Est igma del dr.V aFbrE so

174 CAPITULO 5 fias! 2 riologia medica: toiano mía. «ortología, lifldiogia y virulencia

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Espiriüo üpo^TrííM^exM

Espirita hpc-J.epÍL's^na

Figuro 5-1 McrícvJnpía háskn de diFiiriUs hacieras

rcnciu 1 una unidad Svedbcrg, medida indirecta del laniaio del ribosema determinado por su velocidad de sedimentación cuando se lo somete a una fuerza ultracentrífuga. El ribo-soma bacteriano de 70$ tiene un peso molecular de alrededor de SO leDa v e.xis-ie en un estado ásncudn como dtvs subu nidadas llamadas 30S y 50S. La subunidad 30S contiene ¡as especies lf>5 RN A . mientras ¡a subunidad SOS contiene los RNA 23S y 5S; jurtlas^ las. saburtidades también contienen cerca de 50 proteínas ribosémicas. E l ácido ribonucleico nbosómico {rR N A ) comprendeel 70‘fc del (OtaE de RNA celular, El RNA celular remanente se encuentra como ácido ribonucleico de transferencia i 3RNA. 169E>) y ácido ribonucleico mensajero (mRNA. 14%). Mienlisb se acoplan con un inRNA que fue transcrito de un DNA, las isuhunidades ribosómicas 5OS y MJS forman el riboüoma intacto de TOS encontrado en las células bacterianas. Los agregados 4c ribosomas-mRNA, llamado» polirribusontiw o polisomns, contienen todos los. componentes del sistema sinte* limador de proteínas; los pollsomas son esencialmente cadenas de ribosotnas de 70S fmonémeros) unidos al RNA mensajero (rnRNA), Las (listonas o proteínas de tipo liistuna que sirven para estabilizar los polipeptidos nacientes sintetizados por los poli-HuCrm-'t sí.- han üueonirado recientemente sólo en pequeñas cantidades en asociación con el DNA de ku'htrichiti cotú mientras que es bien conocida Li presencia de proteínas pi díami na íp, ej-, pnlreseina 0 e^permidina) con DNA bacteriano. E l mRNA es “ decodificado'* en asociación. con va­ rios ribosomas en un complejo poljscwna-niRNA,, cu cl cual cl «parcam ltnta de bases i-ndim-anrieodón sucede a través de moléculas de di NA durante el proceso de traducción. Las moléculas del RNA de [nuinferencia contienen anlkodutits

específicos que corresponden a los endones del mRNA y tam­ bién portan el aminoácido correspondiente enlazado c il forma cora lente. E l complejo aminoácido-iRN A interaedla con el ri* hosoma de míxl» que L.e forma un enlace pepiídico entre el aminoácido en el tRNA y el peplidiM RNA naciente. La ¡meracctón del aminoácído-lRNA+los ribosomashel trifosfato de adenosina (A T PJ y varios, cofactciei deriva en la formación de urta cadena polipepiídica específica. Así, el código genético presente en el DNA se traduce en moléculas de proteínas o enzimas que. a su vez,hcaialiran Ea, sfti testa y la degradación dé íi¡m1«,s los otros cpinpunenics celulares. La síntesis de nuevas moléculas de DNA. llamada replieación. sucede por el desenirciHamrcmo y desprendimiento de la molécula de dsDNA por una eitzima DNA gtrasn. y la síntesis de las hebras comple­ mentarias de DNA por una DNA polimerasa dependiente de DNA. Cada molécula nuera de dsDNA contiene una hebra simple del DNA original. La relación qnlre la rtp IifK ÍÍn de DMA, la transcripción del RNA y la traducción del código genético en proteínas se resume en la figura 5-5. Además de su utilidad para determinar el parentesco genéti­ co cutre las bacterias (véase más adelante), la seeuenciaclón de moléculas de RNA ha revelado secuencias de nucleótidcis que son únicas para, especies individuales. Como esius .secuencias únicas también están altamente conservadas y exisien en copias múltiples dentro de los ribosomaft de una célula bacteriana. los uljgtfiuclcótidos sintéticos que se pueden h¡ bridar con esas secuencias unica¿ pueden utilizarse para detectar c identificar bacterios. Tal propuesta Jarrón la base de la tecnología de son­ das de ácidos nucleicos para la detección directa de Naitsttria gonoyrhni'ne y Chfamutia Michamaríit en muestras clímEstas sondas también pueden aplicarse a, micrüür-

B Est ¡gnna del d r . VaFbr Eso

Morfología y fisiología bacterianas básicas

175

C ip ria Momüiana axioma

Tgfique

Pepliclügtucanq de \ñ pared oeiuíar

T1^ de tfíMiaíún

d¡#íM&l:dogiucarto Sitio de adhesión

Cuerpo áe inclusión

Membrana ciloplasruiatba

Capa S

R¡t» som^í Lipopiflteína Cuerpo do iñcíu&ión

E j pació p#ni3asmálioo

Flagelo

Mónita rana

Pralainas

oloplaismaitíÉ

*

Ribosorras

FldQÉlO

superficie

GramnH’Bativa

Gram positiva

Figura 5-2 B^ucm-ti general h|Hll repretenna ti eone traniwrciL de una célula hac-ieriajia. I.j mirad i/quMnía J e cxia figura ilcs^nhc la L-hUiiLiura líe uru h^ctcna pnnipoiiliva: Ji mita-J tkredu niLK-sm h í^Lnttl ura Je uu k^Kria gramnegaiiia.

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rriK-s.i) ciclim . u u hase purina u piriniiiiiíla unida ai jlcicnu de carlnmu 1'drJ acúraj pnr un cn lx * V-gliuínMtIic'n, j un grupo íi^t itn «ini-ilo ut C-iirboiut 5 J ii líti^4ir pw un vnlüwtf fu*rudi&lex Tiunhkn w muestran laí-«uuüHHas Je li» ik * ían.-* punras lucilina y juaninai y Uin iiv\ pirunitlimis IdtCsina, limina y u tk iIvI,

B Estignnadel dr.VaFbrE so

176 CAPÍTULO 5 Bacteriología mid lea; tHonumia, morfaloaía, NsMugi» y virulencia

Guanlnn

5«H,

s'CH,

í Figura 5-1 Eji¡ h ovilit-iilj di DMA. luí dos ImiI'cjs de pulinjitLL'niJui ik l ttflA hkacfurio son “ami pendchO cs.ki'ir, el «kimnio Á'-ÍJK tic uiu hebra c í dJyjeefl.it jI íilíc tim íi'- P Je ti bchfü e-DnipIciuaiujiLi L ilí ha.>e>. i|ue están •dirig.idLtñ hacia cL eje e«ural de li tu-ltce, w tiírw n. lai de* heNrrií de |wlinu(Is íH iJ^ ¡untiu nwdwuile pwnwv dv liidnliKim rtljli^nvnbc delálcs. L j íijáji na ajwSVJLCEin l a ü m ifl 2 :n@ili;m1i! d r i 'p:i«nSir«
ganimtos recuperados en medios, d i cultivo como método de identificación.''’'^ 1

Citoplasma El citoplasma es un gel amorfo que contiene enzimas. iones y una variedad di- gránulas, mochos de Jas cuales representan reservas tle alimento y energía. Las enzimas citoplasma;¡cas de las células prucariontes funcionan en Ira dos proceso*: anabó­ lico y catabólico, y muchas de ellas. están asociadas con la caía interna de la membrana celular tvéase más adelante). Las célu­ las procarmrces canecen de org¿nulos subcclulwics unidos- a ln membrana separados, mientras que Jas célula-* eucarionies eonlienen diversas ^ E jiic L u r ií subcclulares (iftilocohdrías. retícu­ los ciK lo p b m Jticw , etc,), compuesto* o unidos por m«nibr«hli>, bicapa de fosFudípidtscS. Los gránulas ü i oclu sio n es Cito* plasmad cas intracel alares representan acumulariones de reser­ vas* alimenticias (pnliiái'árídffi, Ijpidm o poli Irosj'atoa). |.tis números y tipos de gránulos de almacenamiento varían con el medio v el estado Funcional de las célalas, Iil almidón, es ul principal produel© de almacenamiento en las especies N c is s e -

riti y ChstriitUm . ntienlras que cl. glucógeno es el material onis impórtame da almuccnamienM ert las. bacterias coléricas, Las especies Btíditux y PwadíuMoiuts acumulan el Jílr1 ^ o mis. de su peso seco tomo un lipidio de elevado peso molecular llama­ do polí-p-hídratibotlmlo. U » polímeros de alto peso mole­ cular de polilosfalo conocidos como ¿ranulos títetacruiiiátiro5 o velutina se encuentran en especies de CütynclmeietiMn, Yersinia pestis y Mycobartenum, Estos granulos aparecen de coUir rojizo cuando í,e tillen con azul de metileno, Las inclu­ siones incraciinpiüMiráiica.s que se encuentran principalmente entre las, bacterias medioambientales incluyen lo* nup tieiosomas y las vesículas de g;ií, Los mapncfosomus están com­ puestos. par varias formas de hierro y le dais al microorganismo un eje magnético que le permite orientarse con relación al campo magnélico terrestre. Las vesículas de pis permiten a los tnieruorgaEtamHs mantener lu flotación a cierto nivel en un mcdioambicnlc acuoso. Ambas inclusiones los habilitan para ajustar las ubicaciones en respucMu a las condiciones de desa­ rrollo y concennaciones de nutrientes. 1:1 UNA CKErck'rümosdmico suele estar présenle en í l elííi* plüsmu de los proeariontes en la forma $i Por ki generaL no se enetrentraji en los eucarioiucs; sin embarco, algunos «>r^án.ukw subcelulares eueariontes [p. c¡., niitocondrlas) contienen moléculas de DNA que m asemejan a plúmidm haclcrianos. Los plásncidi?'- mún tapacen de replicarse ert fum u BulrinOrtia, se hínslaj] metlianle L pTKtgtnie de células haelerianas, y pueden contener la jnforrnatkVi geti^iLca de di venís estructuras o funciones relacionadas u n la viiolencia hacieriaru, como los genes para, la resistencia antimierobiana, la virulencia relaebnada con las adhesi nast Da producción de tosí ñas y la resistencia a los iones de meule.s pendras. Algunos plísm idtJs, H um áis pláKniiilni ciKiJugaliwK,ouliHciin eiuiitms que facilitan la transmisión de plánmidos a otrus cií!ulas bacterianas. Algunas baclerias tam­ bién paeden tener tramposones y secuencias de wcvnKws de DNA que se insertan en sitios diterenles no « In ­ domados lanto en el cromosoma como en un plásmida, La inücreit^n de estos elementos en el DMA no requiere que la secuencia base del transposdn sea homologa con su silio de iíiicrcida (veíase rtiás adelante).

Membrana eitoplasmáílGa EL uitopliisruj de todai Iíu células IuicLl ] ¡ljcIill?. GsÍ lí rodeado poruña membrana. La membrana citoplasmática bacteriana se ubica dentro de la capí de peptidoplucano de la pared celular en las bacterias grampositivas j adyacente al espacio periplismicoen las hacterias gramnegativas feilado más adelante). La esiruclur,j básica de la membrana cituplasmálica es una btcapa fosfol ipídicu en la cual eslan enclavadas varias proteínas constiiuventes. La membrana está compuesta por 3Ü-60& de foafoiLpidos y iil-70% de pniteinas por peso, La mayoría de la.s membrana^ celulares bacterianas contienen fosfatidilglicerol, fo^/ELlidilClanulamina y difosfalidilglicerul; no contienen estemies (ip. c¡-. coleslcml o crgohtqml). Las únicas e^Ccpcione-s proeaiiontes .son los micoplasmas y los ureaplasmas, que incor­ poran esteróles del medio de crecimiento hacia el interior de hiis membrana* celulares. Los ácidos grasos que componen la |mmvíóíi lipidica de la bicapa fosfol ipfdica por lo general contíüticn esqueletos de 15a Í8 J iojuíss de carbono y son satura­ dos y monoinsaturados.

B Est igjma del d r . VaFbr Eso

Morfología y fisiología batferianag básicas 177

fteplieación ONA

i

9

DNA hija

o

Transcripción AminDácrdos |baf f IFN A

faa*

ATP (o-nürgía)

y / fimlmas cartas

mRNA 11 1 II 1.11 l il i ir

Insole i-pn de la £ nlesis proteica

i Elorajactán ds [a cade-na peplidica ilictsnpsde elongación

i

rRNA

Oomp'iojMi con pfoienvss

Terminación do la 5Ínto&i& prolcica flibDsomas

1 Pagamiento del péplKfe para asumir la conformación socu^dann y terciaria

riboiúmiees

prcieiña níJiivi! Figura S-$ Rcplitackln.. tr;inv;rs|vpin y ir*Aitt'irfn NAw replica por um DNA polinícela rJN/Vdcpcndicnte pdia ptndiinr Ak itkhJíciiIiis nle IlíJA dr dnhle hphra (dst)NA. l"J cixlirn {«wHt'n *n e-| Js-fíNA w fflfs.ii p n ppi4ucir un RNA Je hrijo sirapU1llyinadn kNA nwnajen: (iclRNAhdilianlc Lrl pmwi Je Crjíi^rifujiniii. ];[ R?í^ df ItaiiiréruniiiL ItíNA-J y e] RNA ÍFRNAt üSaihpín ¡WtranMinhcrl. Kl fRNA h-i:::¿ ■.•¡impli:jo i íiifl jwfflfhtm «p ccA k u para «w iiiiniir a i fune la ¿siiunva. dd riUmiímiLi. □ mRN V firtrtti ¿«ítpJfjüs can la* fihüUMHii para cMijttiiuif Jck polram ai. que ■mih íl ruíü Je b sSnreMs proteica. En cl poJisoma. los, cndon»«pcdflúM pur¿ Si" amlnüdíHíiíVi nUi', iJu:ik-s s í rcuinicrn |*w lit< and«idones e-n las mnldiiilás ik 1 RV.\ por flparfümictini de hases cipcscfficíb. Lin ctnJi>nf< c*p íti¡ííi^ ™rr*¡poiiikn Jl difcrrirto anniiK>i’kJns iwiJ<*4 n Ins mn|¿tíu.|aA <ít nminn[*il-rRpiA. Pum rtí la^ eiupa^ tk iradücviún. w iiihiu U síiUcsik proteica, las c^aütiiu^ ptilipqSiJkas « üljrf,iin y la ’.íníeiJi termina nm U litieranrin de uru rrnslAruI» de piWtfna-

Lu membrana culldai de lu-s prouifiunici cumplí: \ Lirias fun­ ciones que cst;'m relegadas a I<w organillos inlracitoplasmálicos «specialiíadrt's w l<w oneani^moH eucsriomes. U i membrana celular bacteriana contiene enzimas que son activas ert la fnsforilación oxidativa y en la respiración celular, en ki bnisínteis de Ifpidus complejos y pepiidogTiicsirws, en la replieaeión del DNA y en La biosíntesls de la membrana externa en las bacte­ rias gramnegaiivüv En bs baclrrí^ ÍDEninipicas, kjs cvtnt-Críi aMX’iadns, cor [a captación Je lu/ también ocurren en la mem­ brana celular. Ésta con Lícik la maquinaria para la ¡síntesis, y la sí-treeítíi) Je cn/inus y [uxinas lijieieriunas y provee una barre­ ra aislante a lra\£s de la cual se puede crear energía en forma de un gradiente de iones ci potencial
l idias y liisac jiidds) liiü'ia cl Liitcriur Je l citoplasma. Tales pru teínas específicas transponadoras awciadas con la membrana SC dej|<]in¡nan iH T in f m í,

rtím jü iim aü , que son i^ a^ iria-

ciones de la membrana ciioplasmática i[Lie se emenden hacia eE interior dd citoplasma, pueden funcionar para aumentar la accesibilidad de b superficie de la membrana para las tn/imis celulares anabólicas y cacabólieas. También pueden actuar en la replieación ck:] UNA y en la separación rtel DNA tic doble liebra en las células en crecLmiemo activo. Sin embargo, cieña evidencia sugiere que los mcso&omas pucJen .ser artificios provocadospof las técnicas de fijación que ¡»e utilizan en la ub*ervaciún Coíiel microscopio clucCrtiiijco.

Estructura de la pjred celular bacteriana La pared celular bacteriana provee lu rigidez cstrucluoL le CLirifiért la ínniia a |a célrlCa y Cutisliiuye una barrara física con­ tra el ambiente exterior. E l componente rigido de la pared celu-

B Est igma del d r . VaFbr Eso

17& CAPÍTULO 5 Bacteriología médica: taioaamia, morlologia, íisioio-pia y virulencia

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lar de las bacterias, se compone de peptíd^tucsuin,, el cual se encuentra en todas las espedes bacterianas excepto ios micopl asmas y los ureaptasmas deficientes de pared d u l3 r. Esta estruciura consta de un esqueleto de hidratos de carbono alter­ nados de N ^ a c t t i i g l u c m a m i n a y á c i d o N w e l i l m u r ñ n k i * que forman m enlate ES-1.4 {fig, 5-6V 3A los residuos de to d o N ucetilmutfUnico se unen, medíame un enlace peptídico con cl grupo lacillo en cl C3, tetrapéptidos cortos, por lo general, compuestos riC''r cadenas corlas idénticas de p- y L-amincidí dos. Éstas cadenas corlas contienen aminoácidos poco usuales que no se encuentran en las proteínas, incluidos 1os iOmeros ¡> de alarm a y el D-ácido gluiúmico ibocicriai gramposilivas). e] Suido iM M fdbitiiauiii mélico (m m vD A P) u lisiiiü (bacterias gromnegativas), Algunos de estos tetrapépúdos están,, a su v « . unidos cn ln sí por péptidcw con™ que forman entrcem/amlentos entre las hebras de peptidoglLicano adyacentes ívéase fig. S-7). Los tipos de aminoácidos encontrados y los genios de enlrecmtamientu son Éumponenies variables de la cslruclura del peptidoglueano, Por ejemplo, en S t a p h y t ü c o c c u s a u m m . la mayoría de los residuo* eslán entreerwados con las hebras ¡adyacentes por Cinco residuos glicina, lo que le proporciona una estructura a U pared celular rf&ida, bastante apretada (fig. 5-7A ).144 En las bacterias gr¡unneg¡itiviiv como E. cali, el entrecruzamiento está directamente entre el »t«
Élea¡lína” ifc peptidoglueano y e] residuo ryalanilo terminal un la hebra adyacente (fig. 5-7B), Hl grado de entreeruzamiento determina si. una esiruciuni de pared celular se denomina “ com­ primida" {muy c n litc rim b ) o "lasa". Entre Sai bacteria* grampo&ilivfó. exilien muís de EüCl químiotipus de peptidoglU' cano que difieren por tener \arios aminoácidos sustituyentes unidos al grupo lucrilu del ácido JV-acetilmunímieci o que tie­ nen diferentes unidades; de enlace que comprenden los puentes iuterpeptídícos..11* Pequeño» cambios en el quimiotipo de la pared celular pueden suceder por la exposición a elevadas con­ centraciones salinas o a agentes uní ¡microbianos activos para la pared como la meticjlsrsa.lv l'rj La biosínresis de la pared celular es un proceso continuo, Lo& polímeros de peptidoglucann nuevos se exportan desde ta célula y se unen a los polímen» de la pared preexistentes en la cara interna medíante proteínas de unión a In peníciliitH.nj] iis a ] m iim ii tiempo, ul peplidogl ucano más viejo super­ puesto ¡i las estructuras recién sintetizadas, se elimina continua­ mente mediante auioltaina* de la pared celular, Los anlÉmíeoiv blauos como las penicilinas y lasceralospcrinus inhiben el crecimienio de la célula bacteriana mediante la anión a las proletrias de unión a la penicilina, con lo cual inhiben la renovación del polímero en la cara interna de la pared. La hidrólisis auto» líiien continua de tos materiales peptidnglucanos mús viejos causan el adelgazamiento de la pared que finalmente deriva en la tisis celular. 71-tn

PARED CELULAR OE LAS BACTERIAS GftAM POSITIVAS

La pared celular de las bacterias gram poini^s (fig, 5-8A ) tiene un espeso* ile casi SO nm y está compuesta en su mayor parte por inrias capas de peplidoglucanoL en efecto, desde cl 4fl% Elista más de! B
B Est igrma del d r . VaFbr Eso

Morfología y fisiología bacterianas básicas 179

A Peptidoglucano de StBphyÍQCQvevs w rc u s /

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MurNAc GlcrVAc

t-Ata I ü -GIu íNH1 l -Lys I O’Am _ " (Qiyís

MurNAc I v-Ala I d-GEu^MHj L'Lys n-Ala l o-Ala

GfcNAe

ADfevtáiutas: GltNaC: W‘¿icel¡!glücaidirr: nti, MurNaC: ácido A^aeéttftlurái'núa; A Jíj aláfiina; Glu>NN:. iao^ulamina: Lys; iisina; Gty glicina.

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Peptldoglucano de E s c h e r lc h ia c o t í MurNAc

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GIcNAc / MufNAc GIcNAc

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L-Ala-D-Glu-nwsc-DlAP-^Aía . MurWAc 1 X 1 D'Ala-/TTesoDAP"Q»G!u-L=Ala GIcNAc MurNAc

Abrf>v
-licl pfpcidogkK-aJW ill ÍWj-'fr'riW'-'HH ■« rJlírr.u.1 i A l i

En los dtstinios grupos, de bacteria* gramposiiívas paió^eftas- también pueden cslar presentes ulras cMiuctunu tic la pand celular ijue: snn determíname-* impunantes de virulencia. Por ejemplo, la prolcína M , un factor de virulencia bien rccoiHuidtt de los v«(n$fHncncnü p-htfinolíliais del grupo A, e.siá asociada eon los ácidos teicoicoa en la pared celular estrepiocrtcica y se entiende hacia cl exterior de la pared como un* proteitui de la fimbria (véase cap. 12'j.4* E l gmpu de iinLígcnos, de las estreptococos (J-hernotíticos de los grupo» A„ B . C, F y G también son poüxaeíLridt]* ;íddt>s no icicuicns que se encuen­

i •’ir (I).

tran en Id pared celular El polisaeirido ( ’ hallado en las pare­ des cclutares de pneumonía* es un ácido lipoicicnieo cvrnplcju eompuesio por ribical y fosfato «asiituidii en tnrios punios con N^acelil-D-£aJaclosamina» OgUreosa,. iV-acei il -2>4-diaminin-2.4.6-tiidesn* rhc&osa en un enlace fT-gluemídko y colina en isa enlace diéstef.^ Las paredes celulares de las bacteria* grain-positivas (y de algunas yrDJtineguiIviLs) tienen también un componente llama­ do capa>S. Esla capa se compone de moléculas de prolcína o ghieopniicínii de 50* 1301cDa de peso nioleciilar que se teúnen

B Est ¡gima del dr.V aFbrE so

160 CAP ÍTULO 5 Bsclerialog la médica, taianam ia, moríale gis. f¡si o'ogia y v imlene¡a

RoiisaraixJo específico do la pared colu-ar ArA ícfenp o Ácií*0 teiCOi» de la pared ceiu’ar

Núcleo - IP S

Á C id tl n p J l U l C u c ü

di lo mtiffltjraíia KDO L ¡pide A Frote na poiina

Patítjdoíjlucaíio Lií>oprct5Ína PiQ^ína A OWP

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Grempo^lUwfi

Figura 5-& Estrucluru *k la pared telidur Je tweierii» gramptwtii^Ji ÍA ) y jwwniMfAiwuk (II), Kt?Q: tSr»’ie*ci^iw(ulwiwííK I-P5" lipoptMi^Kdíúto

en la .superfÉLic esterna del uiyanimitj y fbmian cilnis:turas mediante entrccnizamicntos hexagonales,. cuíidrado^ u oblicuos.1^1^ E l material de la eapa-S puede constituir mis del 2D5fc de la prowína celular iota]. Observada con el microscopio íteCtíÚniCíí. parece tutu “ cupa'" eitra ¿n la parle superior de la pared celular. La* técnicas Ju mkimcopia í leetrónica con con­ gelación y frac Luía han mostrado capas-S en espertes dq fíncillits;, LGPtohacWiis, Clastridium, Campylobacler y Aeramonos. Estas capas rueden funcionar para pmteger y] organismo de medíoamtsiemes hostiles y rigurosos, En los microorganismos patógenos» la capa-S puede inhibir ln fagoci­ tosis o impedir la unión de la jnmunoglobulina y el comple-

S Í/ C - C H , RO“ CH QI y RO — CH f PfÜ— CH i h£c — o Acida teicolco tipo rib'rtol

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In üi>. A la ¡iqukrda se mufslra rl ácido tórniífl ntaKfll: a la derecta el -Scidn teicwicn g.licerol. Loa j il s i í I u c í w k j Je ¡mipu® “ R" incluir lhílhicx í í Lccei uFigur* 5 Í r'-in^ ilihhÍí Im Kidtis Itíctmclh de t’jí.lcií.i' y i jen

alantna o o Iísíjki ■ >enlarf* í?-g¡IucrH.id*íQi4 cftn ¡jliittisa, galicosa c» /k'-MCftl-

piucosamina.

menta Ahora *e sabe t|ue en B ul1¡¡tui unthracis la capa-S es el principal anlígcno de la pared celular de esc microorganismo y que junio con la cápsula y Jas dos toxinas puede contribuir a la virulencia.” PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS CRAMNECATIVAS La pared ce]utai* de tos bacterias gramnsgativas (véase fig. 5-KBt cü mis delgada que la d i las bacterias graimposJtivas. pero es más compleja desde el punto de vista estructural. Inmediatamente □fuera de la membrana diluplasfnSlica está el e5pacto periplásmico Este espacio contiene enzimas degradativas (fosfatase alcalina, pmteasa?;.. nncleosidásas, [}-tactamasas y aminnglucúsida fo&forilasas) y proteínas transportadoras y de unirtn específicas para vitaminas, aminoácidos y iones. Una capa única de pt-plido^lucano gruesa forma cl ti«inte externo del espacio pcriplfcmico, Como lu capa de peptiduglucoito ei, s6]o una capa gruesa» el entrecruzamienio sucede con tas hebras de pcpiitkiglucanu adyacente* man que c<>n las capas de peptidoglucrano más profundan o mis externas a la superficie celular individual. Los entrecruzamáentos .se forman desde el £rupo carboxilo del residuo J>.a|anma terminal c t i una cadena al grupo arfiino libre de un residuo íh íju -DAP en una cadcna ad­ yacente (fig, 5-7B). La capa de pcplidíiglucaitu de ían bacterias grjmnegattvaí es bástanle “ laxa” , es decir, tan sftJo la mitad de las cadenas peplfdieas anidaba lo» residuosdd ácido Af-acelílmurúniico estíín en realidad involucndw en el EnUrcLruzLiinÉenit>. Ademán, et cTttfKiuzunietttQ dentro del pcptidoglucano sucede directamente desde el letra pe[Hijo muramiJit en una cadena de pcpiidoglueano hasta el letrüpcptido muramilo de una cadena peplidoglucartí] adyacente (no puentes interpepltdicoíí como en to figura 5-7A),

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CAPÍTULO 5 Bacteriología mééiea: taxonomía, morfotógia, rieioíogiay virulencia

polhacáfiito central está bastante corbwvailu Ocntio tle un géikeio dudo, pero puede variar de una tspccíc a otro. Las cade­ nas. laterales O •específicas se unen al polisacárido central y son responsables de la c&pecifiddad antigénica tic las cepas indivi­ duales. Estas cadenas cnniicnen un nü tuero variable (.mis de 40} (Je unidades oligosacáridas repelidas compuestas por tres a cinco monosafcáridos cada, una, Son u C y D„ respectivamente.. U i disociación del LPS de Ja membrana. externa se puede lograr en forma pardal por el tratamiento de suspensiones de células con ácidoelilendiam inotelraacéticolEDTAl.quc forma qwelufos con los cationes dlvalentes de la membrana externa. Un tratamiento posterior con tisozima hidrolisi la capa de peplidbglucanu de las bacterias gramnegativas y las células se pue­ den Usar, La integridad de I;* membrana externa depende de los iones calcio y magnesio, una de las principales razonen para la inclusión de est» iones «a el medio que se osa jjar¡i probar la sensibilidad antinikrabíana. Algunas bacterias eramuegativas [p, ej,, Haemaphilusinjluení/aei Ñcisaería gpnotrhoeaf y Bardetefía perneáis) tienen liponllgosaedridns {L O S ) en ve? de LPS en sus paredes célula' res*2’1® Hl LOS contiene Ifpido A y un centro de oligosacárido que contiene KDO, peto tic tiene un untígeno O polisacárido de cadena larga como se cncucotra ert cl LP S de las bacterias enlérica»,'* Hilíia motícula*, feUiiilare» a etuJoííraiñas. tienen una extensión de actividad biológica, cnlrc ellas la toxicidad general. Ja pi rogetúeidad y la capacidad particular de inducir la mitogtnictd&d y la activación polklonal de los células B,M L;i variación antigcnica de N- gnnorrhoe4tt se debe en parte a la alta frecuen­ cia de la modulación estructural de los l,()S t C|ue afecta la adltcrencia gonocóeica a las superficies de las mucosas y la sensibili­ dad a la acción bactericida del suero humano normalJ l" La membrana externa gramnegativa también contiene fosfolipidos y proteínas. Los fosíhlípidos son similares a los encon­ trados en Ja membrana ciioplasmálaca e incluyen tbsfatidilctanolamina y fosfatidilgliceroL Las proteínas también consiimyen una porción importante de la membrana esterna, l^as i|ue están presentes en mayor concentración se llaman proteínas principales de lu membrana i'x lL ríij (O M Pj. Estas proteínas se dividen en tres grupos principales. Las prii teínas porió&s forman canales <jue atraviesan la membrana esterna a través de Sos cuales los malcríales de tejo peso molecular íp. ej., amínoácidos. ¿Oteares, ioneSl pueden inglesar en el espacio pertplásmiu>. Muchas de estas proteínas poriuas tienen una estructura ‘'trímero" tires proteínas idénticas que constituyen un poro en furnia de rosquilla), Las porinas también ayudan a llimitar el pasaje de algunos agentes aniimicrobianos bada el interior de ta célula. Las proteínas iransm cntlirana son proteínas no potiius que ati’a i iesan la membrana exlema, se extienden a tra­ vés del peilplasma y están asociadas con la capa de pepfidoglucono de Ja pared celular Pueden funcionaren la producción y secreción de exoenzimas, el transporte de proteínas especifi­ cas. la adhesión a tai superficies o ]a Limón de los agentes aiiii-

microbianos con sus dianas cu la superficie celular íp. ej,, las proteínas de unión a Ea penicilina). Las proteínas periféricas son responsables del transporte transmembrana de moléculas cjue son demasiado grandes para, entrar por la porioa. La mayo­ ría de estas proteínas son componentes ele Im sistemas da perrneasas específicas de sustrato (p. ej., cl sideróforo une y lia n v porta hierro hacia cl interior de t« eífula). lipoprotcínas (véase antes) son las proteínas más pequeñas de la membrana extema y estabilizan la pared celular mediante un enlace enva­ lente eon el peptidoglucano. La estructura de la pared celular bacteriana tiene una impor­ tancia práctica y directa para los rnieroti iólogos porque su úpo es en gran parte responsable de la reacción de la tinción de Gram . Esta tinción diferencial divide la mayoría de las bacte­ rias en dos grupos: barteríits girsinposilim s y bacterias grum ntgatim s En el procedimiento de tinción de Gram, las células 1) se tiñen con violeta de genciana (cristal violeta). 2) se traían con yodo para formar trn complejo de violeta de gendaña y yodo dentro de lu célula, 3) se lavan con un sálvenle orgánico (alcohol-acetona) y 4) se tiñen de nuevo con el colorante de contraste rojo safranínn. En las; bacterias grampositivas, el complejo de vinicia de genciana > yodo es reteni­ do dentro de la célula después del lavado con alcohol-acetona porque la gruesa capa de peptidoglucano no permite que sea extraído de la célula. En las bacterias gramnegativas. el com­ plejo de violeta de genciana y yw lti des^parcCé de la Célula fias células se decoloran) debido a la rotura de la membrana externa rica en líptdos causada por «I solvente orgánico alco­ hol-acetona, Estus células decoloradas deben ser sometidas a una tinción de contraste para observarlas con la luz del micros­ copio; esta "contras inción,Hestá provista por la «aframna, Las bacterias gramposilivas aparecen azul-violáceas observadas con el microscopio, mientras que las gramnegativas se tiñen de rojopOr la lincio» de Confiaste Cuii safraJIiña. Algunas bacterias gramnegativas carecen de ta estructura compkja de la pared celular descrita, Loa rnjcmnfganismns del grupo íytñphaxti-FIitxifHH'ttr- navohticlt't mm tienen mem­ branas externas que contienen ornilina-aminolípidos y sulfonolípidos como cuín ponentes principales, jumo con grandes cantidades de ácidos grasos de cadena ramificada con cadenas laterales de número impar de Atomos de carbono. Los An kara carecen de una estructura peptidoglucajto y en su Itkgar tienen un '‘seudopeptidoglucano* compuesto por proteínas, ésteivs de gl ice rol y ácido A?-aeetUtalosaininurónico (el /JlfJO-DAP \ el ácido jV-acetilmurómico están ausentes.). Algunos Archaea mduüD carecen de este peptidoglucano rtidimentafio y tienen en su lugar una pared celular delgada que consta de proteínas o polisaeáridos sulfatados.

PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES

Una modificación de la pared celular gramposiiiva se obser­ va en los microorganismos pcrtettedeüEes a 3oü géneros M^cobut’h'rimn. N w ardía y Corynehacicrinm, en los cuales los ([pidos constituyen el 60% del peso seco de la pared, Estos microrganistnos eonticnen moléculas llum Bibí áeídoü micélíCns en sus paredes- celulares. Los ácidos nucólic® son ácidos grasos EHtidíox] lados, ct-susti luí dos grandes qsiese encuentran como ¿acres unidos a los polis^cáridos tle la pared celular.1* Los ácidos micólicos, varían en cl número de átomos de caifanno; aqaellofSi con 30 carbonos (C30) se encuentran entre las corinebaclerias yácidos ccH-irnemtcolénicoR), los que tienen ¡W) carbonos iC50) se encuentran en especies de Pfvamfht (ácidos nocáulicos) y los de 90 earhunob (C9Ü) o más constituyen los

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Meriología y fisiología bacterianas básicas ácidos im «Micos arcomr*i.dos en el género Mvcoiiacterimn, En Mycobuvieritm luiwiruftisis, el ácido micólicoó»6T'dimlco!Jltrehalosn o conocido corno factor cordón íilg. 5-11A ), Esta molécula está asociada eon la v irtdeneia de M. tubera/ituis y tiene un arttplio espectro de aciividades biológicas, como la citotoxicidad de la membrana celular, ta inhibición de la mi* ¿ración de células. poJimorfonudearcs. la inducción de ¡a for­ mación de granuloma. Ia wlyuv«#cin, la aciividad anitiumwfal y la capacidad pura ac(ivar la rula del complcínenlo allemaiiva. La membrana celular de las micobnctcrias es similar a oirás membranas bacierianas eicepio en que contiene nuanósidos de foafntklilinffidtn'l y li[wnarnbmfini únanos. Por fuera de la membrana e^té la capa de iKpiidofilucarw que se compone de JV-acetilgluco&aimna en un enlace |l-L*t con ácido Ar-gSweolilmuriimieo.1* U í capa de muruínn esiá eni recruzada por puentes tetrapepti'dicos que contienen residuos L-alammu D-glutamato y m fjn-IÍAK Algunos de los residuos de ácido W-glucolilmuiámaco cüijn unidos por enlates fosfodiéster a una capa supeipuesta tic tnacromoléculas pcdísacárídus de cadena ramificada llamada-, urabinuftaiactiittas (contienen por mitades arubinosa y galactosa). Los resillaos de aeabinosa alejados de esta ca p se iinen a los ácidos mkólicos superpuesta, l-w¡ cadenas hidrocarbonadas de los leídos ¡nicálleos están intercalada* con la de |cn otro* I (pidos y gl ueolfpidos uM>c¡adns eon la pared! celu­ lar, los cuales incluyen los grupo* ac iterase* corte (C l2 a C-0) 3' mediaros |C24 a 0 6 ) y los, sulfnlípidos trehalosa (fig. 5-1 IB ). Los suifólípidos de írehalosa,. tipificados como el sulMfpido principal de M lubetrnlosií IJA fi'-lelraariltreh atn ^ • t u ir a io . están, asociados con 5a virulencia micobactertana en que esas molócitlas pueden actuar pitra impedir la fustán li siníima-fagosoiíia posterior a la fagocilos» de las células micobaclerianas., con lo cual les permite a los microorganismos sobrevivir como panfilos intraceluJaics facultativos. Las capas de arabinoplaciano y ácido mi cólico de la pared sobre­ salen de la membrana plasmática a través del peptidoglueano y son sustiiuidas por fofolipidos (munósidos de fosfatidillinositol) y lipopolisacáridos íliponrabinomananos.) que se unen a La can externa, de la membrana celular mtcobuCiefíánfl. Esias molécu­ las producen un enlace no cociente eníre la membrana y la pared celulares Las proteínas afldad» en ia pared celular de lo_s micobacierias están involucradas en la biosíntcsis y cons­ trucción de los polímeros de la pared y algunas también fon» donan como porinas, Los microorganismos ácido-alcohol resistentes se liften de rojo con ej colorante básico fucsina fenicada (carbol fucsina] y son resistentes a la decoloración con alcohol-ácido. Debido a la hidrofobicidad de la pared celular micokietejiana, la penetra­ ción del colorante hacia el interior de la célula se mejora con ej tratamiento con calor (método de Ziehl-Neelsen} o eon la incorporación de detergente en el colorante (método de Kinyoun). La resistencia a la decoloración por aleobtil-óeido ("ácido-alcohol resistencia11) eslá asociada con los residuos, de icido inieóli£(>arahin0 |alactan0' que constituye la mayor parte de ios constituyentes de la pared exteriores a la capa de peptiduglucano, Los lípidos soluble* conlrihuyen cun las propieda­ des de ácido-alcohol resistencia de las c¿lulas micobaclerianas pero no las determinan porque la extracción de esos Itpidos dis­ minuye la ácido-alcohol resistencia pero no la destruye. I.;» rotura mecánica de la pared celular y la extracción de sus lípidos con álcalis etanólicos que eliminan tanto los 1ipidos libres ciitilu los esterilizadas. destruyen las propiedades de ácidoalcohol resistencia de estos microorganismos, lo que indica que el contenido M al de lípidos de la pared celular es responsable de estas propiedades de tinción.

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Figura 5*11 Enmelara inilcxukr de Jíp iM ra j^ iilifiid m cr^útf « J im en La FSJZL-a «Lld ií de JlÍJrt'¿tírTíHunI íuÉrmfjQíJi (A I Ei.'.’tultura fflülccüljf iltl mciímt ¿Lir-di tíi.fr'-'djCTidcfJLlirelialcisa.h producido por \Íti\U.útit-¡rriurti u ih tK if hf.úx. -.Hj Ektnicbua ti^ K u lu i iicl AidídfjiiJu pd¡ii^ ¡fid3 (2.3s6,É¡‘-l«[iKilif£-

halota-2‘-sulíál»^ de Jll. rjr/vini^M.

Endosti-oras b»tei3H3S l^s. etidospoos Kcm cslructiiras esféricas u ovalen formadas den tro de cieñas especies bocierianas que -representan un esta­ do latente o "de reposo” en el ciclo de crecimiento del micro™ organismo, Emre las bacterias de importancia clínica las enídosporas son fomiLidas por bacilos grampositivos aerobios pertenecientes al genero B a d ila s y otros géneros relacionados, y por ¡os grampositivos anaerobios del generes Cloitridivm . En esto* jénems, las endnsporas se forman en respuesia $ la carencia nutricional dentro de la célala bacteriana \egetativa.. Son muy resistentes a los efectos dañinos del calor, la deseca­ ción, la presión y muchos dc»DÍ«tanlc» químicos, Son nece­ durante 15^20 sarias temperaturas de esterilización { 12Í.I minuioü) para matarlas. Se cree que ta resistencia al calor se debe a las cantidades reducidas de agua en el núcleo de la espo­ ra. Rl tamaño, la forma y la ubicación de bis endospiwas inci­ pientes en las células en fase colación.iría tic Clostridium , fía d llu x y especies relacionadas es útil para la caracterización e idcnlificnción de ciertas especies dentro de estos dos géneros (véanse caps. 12 y 13). Las endosporas pueden ser esféricas, sübtsfétttas u tsvales, pueden diferir en su ubicación dentro de la célula (central,, terminal o subtemünal) y pueden abultar la Célula o no, Peir lo general. n« se tiñen con los métodos habi­ tuales de Unción, como la Unción de Gram. y aparecen como cuerpos no teñidos, refringen tes en los frotis. Con cl estímulo de ciertas condiciones medioambientales., corno el agotamiento de los miirienies íglpcosa, nitrógeno o fosfato) o la exposición a temperaturas o poieriLialcs de oxide> TTcduCCtLHi sutóptjmos, el material nuclear se divide en dos

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CAPITULO fj B acterio !:^ médica: taiDnomía,, morfología, lisialagh

nucleoides, y m o se separa del dtro por una membrana o tabi­ que.4,7 Luego el tabique crece y el núcleo de la espora se englobo en tina membrana doble. Entre las dos membranas* se deposita una capa esterna o corteza que comía en principio de material peptidoglucano, La corteza se etign>s& y acumula ¡unes calcio debido a la aaivjditJ Je quelacírta de una tnolécu* la particular llamada icldu diplculínico. El centro está prolef ijo por la concentración elevada de iones calcio que éntrelazan estrechamente cl material pepiidíiglm-ano y loJa cl agua disponible en la espora se expulsa. Se depositan varias capas- de la cubierta (una sustancia similar a la queratina que es rica en puentes disutfumi y la endospora se libera en el momento de la muerte y lisis de la célula vegetativa propendíora. Las endosporas pueden permanecer viables por largos períodos. Cuando se ubica « i un medioambíente favorable en presencia de algún estímulo (,amitKi4cíd¡Tí. hidrate* de carbón» y agu»), la espera crece. FW eslo-i estímulos, las ¿n/imas se activan, degradan la corteza de la esputa y liberan t i material peptidoglucano, los iones calcio y cl ácido dipiculínico. Cumien/a la síntesis de RNA, seguida por la síntesis de proteínas y, por último, la sín­ tesis de DNA. De allí resulta una nueva célula vegetativa. Etirotlura* de la aupertitse bacteriana CÁPSULAS Alguna* bacterias tienen una cápsula esterna a b capa, cxierifif de Ja pared celular. La cápsula puede ser delgada o gruesa y asociarse con firmeza o laxitud a la cara «tem a de la paral celular. La asociación laxa también « denomina capa mucilapinosa o filwneáliz. Por lo general, cl materia] capsular es de nalundcza polisaLJÍnda y pueden ser polímeros de monosaCbSridos. im ples (jlucanos, dexlranoi, lévanos) o heleropoüi^icáridosque contienen azúcares tanto penlosas como heaoSas. mis ríbitol. gliccn.il u otros azucares alcoholes. También están pre­ sentes. a menudo los fosfatos. En la mayoría de Ins easuS. la cápsula se sintetiza en. La membrana celular; los componentes ec ^imcliran y c*pr»rtan bnein el cxlctior tfc la célula mediante un sistema de ''transporte'1de lípidos ¡soprenoides. en el cual los componentes se unen al material capsular “ cebador" ya antes presente sobre la superficie de la célula. En algunos casos, como la cápsula de jilucano de Sír^pUKurcun la cápsula es sintetizada por una clase de enzimas exiraceíulares asociadas con la pared celular llamadas j^ucosiltransferasas y fruciosiílnm sferasaJ” La acción de estas enzimas, en una dieta eon sacafüsu crea una matriz ramificada de glurunu Lnsoluble que interaetúa de modo especifico con la superficie de Ins dientes y con tos receptores en ln célula de S mtttan'i. L j for­ mación pusterioí Je ácidos a partir de la sacarosa de ta dieta y de los depósitos intraecl ulares de glucógeno por S. mutam y otros microorganismos conduce a la formación de las caries dentales.*143 La cápsula bacteriana cumple varías fundones: protege a la célula de la desecación y de los materiales léxicos dei medio­ ambiental (p. cj.. iones de niélales pesados* radicales libres) y promueve la concentración de nutrientes en la superficie eefular bacteriana debido a su naturaleza poliamóniea. Además, desempea un papel en la adherencia de las bacterias a las célu­ las y superficies de las mucosas. Este adherencia es requerida por muchos microorganismo^! para producir infecciones en huéspedes apropiados (se verá más adelante). Algunas cápsulas bacterianas funcinnun para proteger a tas, células de la fagoci­ tosis (en ausencia de anticuerpos anticapsularcs) de los leuco­ citos polimorfonucleanes. El material capsular por lu general es antigénictt v la detección sewlsígiea de la cápsula constituye la base de la prueba de hinchazón capsular Je NcuFeld (cap.

y virulencia

12). que puede U^afte para identificar w i » subtipos de bacteiias, patógenas humanas importantes, comí» S. pnt umtmíac, H. irijhicjnzüc tipo L Kíeksiclht pneumoniae o scrogrupos de M'fjwcrár Mt'fíittgitidis. Hl material capsular de muchos micro­ organismos * sintetiia en abundancia y se desprende hacia cl líquido circundante lanío ln vivo como iri vi tro. Este material puede dulce lar*: en vatios líquidos corporales (p. cj-, sueiu, líquido cefalorraquídeo y orina) durante la infección por baete riws cncapsuladas c identificarse de modo específico mediante eleetfoforesis o pruebas A aglutinación para obtener un diag­ nóstico rápido (v¿asc cap, 3),1" En los últimos aíos. la estructura capsular de Shtpfnfi*coeexr.v tíunrna lia sido un área de interés uniu para la ciencia experimental como para los microbiólogos clínicos. Más del W,:í- de las variedades de S. aunux aisladas en el laboratorio clínico son encapilladas, y estas cápsulas se han dividido san»* lógicamente ei> 31 tipos. ír especies relaeionadus, la cápsula es de nalunilcxa pulipeptídicQ. B acitha anítffaris. la causa del carbunco, está encapsulado Santo en teji­ dos infectados como Cuando crece en medios que contienen bicarbonato o en un rneditMmbienlc con «nás de] 5 % Je COr Tajilo la lotmaciún de lu cápsula como la producción de la toxi­ na se “ activan” por estas condiciones de cultivo» que reflejan tas mis-mas ciimcenl'nicinncR de CO. y bicarbonato encontradas en los tejidos infatados con B, uníhrneisV- La cápsula de li, anlhracLi .se Cumponc de cadenas de Cí*pe piídos de DHgluláuiico unidos que se extienden desde 50 a 100 residuos por cade­ na.14-'1 La presencia de cápsula cuntiere a B. anthracix resisten­ cia a Ea fagocitosas.w

flagelos

Los [ágelos bacterianos son apéndices filamentosos largos que surgen de la membrana ci toplasma: tea y se extienden a tra­ vés de ta pared celular hacia cl medio circúndame. Son res­ ponsables de 3a movilidad celular. Los flagelos, pw lo general, se encuentran en los bacilos gruinnegaiivos, aunque también se encuentran en los bacilos grimposiltvns tp. cj., especies de U íím tí] y los cocos (algunas especies de Etuerticori'ux, espe­ cies de MfCíJt'(Jccr«‘) móviles. Los flagelos difieren en número ^ disposición en las células. Las bacterias con un único flagelo potar se. denominan nionolricas: aquellas con dos o más flage­ los que se originan en un polo o punto son loFolricas: las que tienen un único flagelo ubicado en iliis puntos diferente*» o polos se llaman, anlitricas. y las que poseen dos o más flagelos en dos puntos o polos, de la célula se llaman anfilofut ricas. Los organismos que tienen flagelos que surgen por encima de la superficie celular integra se denominan perííricns Hn las bacterias gramnegativas. se ha demostrado que los flagelos tienen una estructura compleja que consta de tres par­ tes: cl filamento, cl codo o gancho y el corpúsculo b&sal cfig. 5-12). EL filamento flagelar tiene un diámetro de 13-17 nm y

B Est igma del d r . VaFbr Eso

Ml rlulüyia y fisiü ogiQ bacl-onanas básicas

una longitud variable, Esta compuesto p^r subftbrillas parale­ las de la subunidad de ííW O kDa de la proteína Maxell na, que inleractúu fCritkLii un cilindro hueco. El filamento Ci iCJIllirigído y forma una h e le v ó g ir a mientras sale de lo ocluía. La íljgdina, licru.' ta capacktad de autoeflsñfflblarse. Losmonómeroí d i la proteína se sintetizan y pasan a Través de la lu/ de[ cilindro En el estremo creciente de la hélice del ílageSn-, el monómuro sufre un cambio confortnacional y it agrega al extremo dista! del flagelo. E l codo está compueslo per Pira pro[cínn ij iMitin y aet l'i;s curta una -Lrítanla1’ dd la cual emerge cl filamento flagelar, E l codo permite k\ trun amisión de un movjmíenlo rotatorio desde el corpiIseuEo basal hasta el lilamente!, IIL curpúseulu bastil esití compuesto por isriiltcí^ complejos conectadas pi:r imi.l estructure cu IbuTLj líe vá.siago. Los anillos M , S, P y L están anclados en la membrana., e! espacio periplasmático, el peptidoglueano y el poltsaedndo de la membra* na exterior respectivamente. Al menos 10 proteínas componen la estructura del anillo estertor en las bacterias gramnegátivab. U i estructura anular unida u la membrana celular rola psiiiv-jsh(a estructura flagelar es menos compleja y está compuesta por dos anillos-. Una estructura anular conecta el flagelo con h membrana plas­ mática, mientras que Easegunda estructura anularse insería en la gruesa trapa Je peplidagLuLancs. Varias especies de flagelados también pueden alterare] tipo antigémen expresado que producen los ti ágelos: este prncesvis se conoce como fase de variaciún.121 E^o se refiere a la capa­ cidad de los microurganismos. de ejqn esar da.s tipos de llatscLus en Forma alternada. La fase de variación sucede par la CApresjón diferencial de genes emmusíSrnico,s que nidifican da\ pro­ teínas ílagelina estructuradas de modo diíerente. Hite fenóme­ no fue reconocido por primera ve/, en bacterias gramnegativos entáricas, como especies de Su■hmmtttíii, pero lambían ocurre en oUas especies^ como Al ganarrhoeae ívéase más adelante). Los antígenos flagelares de tns bacilos gramnegativos se deno­ minan antígenns H. por el término alemán háiich que significa ‘'respiración” Algunos microoiganismostienen estructuras fla­ gelares muy modificadas. Las especies vibrio tienen la morfo­ logía flagelar típica, pero el flagelo está encajado en una vaina ot rehuida en la membrana esterna de la pared celular. En las. espiroqueta^ cl flagelo no pm.tm.ye hacia el medio exterior sino que s;e ubica dentro de tina vaitia hada afuera ^iél CílindnT proloplaMiiútico del cuerpo celular del ni¡croo^araismo. Este endoÓagelE] ofilum tnlv yxial se origina en un polo de la dilu­ ía y se enrolla alrededor del cuerpo celular por dentro de Eu vaí na. Otms ttrgáiKths tocomafíms. Algunas bacLerias gmrancgaiívuh mueblraa Eu ^jue í¡e coEiooe como ‘'movilidad iEesliíanie'n. Este tipa de anovllidad es lu mdi evidente euaada hss urgajiismos están en contacto eon tina superficie. En microbiología c lí­ nica, la movilidad desligante .se observa en las especies de CüjNunytopíiaga, que s¡>n parte de la llora nonnal de la omla­ ringe humana y que en ocasiones ve aíslan en procesos ittfcedusas (tap. 9j„ Los csiudios ton FfavpbacteriNrrt jafvtsanii y otros nttcrooíganismos del grupu Cflophagu-Flavabactcñum* Biíctemidcs sugieren que lu-s pniteínas i>glucoprotcínas ublc^T dín-denlm de la membrana extema se adineren al sustrato y que (jiras proteínas dentro de la membrana celular recogen las foer-

185

F í-amenSo

ceda

Fig ufa 5-13 Rsiíilíiiríji [h ir ntii- niMi-Híjua elterii

J r ur Hádelo de n na ku -

Ec e i ü . p i u t ü S t i i a j J S i L

?as motrices protónicas que causan que las proteínas de la superficie se muevan a lo largo de ''carriles'’ dentro de la capa de peptidog]iicana“ í:i Otros estudios también han demostrado la presencia de soirunolípidos particulares en la membrana externa de las bactcrtíis deslizantes que están ausentes en matantes no móviles de la mi^mu especieJ Uíando mutantes no mótiles espontáneos, inducidos químicamente y pifr 1ran¡'puíiíinc.s, se lian idenLifieady varios genes y opciones lio rclacioaados in vo lu crad o s eti la m o v ilid a d d e s liza n lc / 1 FIMBRIAS [PELIJ Las fimbrias ej pil i slíh apéndices pequeños encnnlrados en la superticic de muchas bacterias sraranegatlvas y algunas griimpíisitivas. Aunque las terminas JLp ili" y “ fimbrias'" se h:¡n usado de modo intercambiable, el iltlimo se utifií-í ahora pa­ ra describir algunos apéndices similares a pelos no flagelares, mientras que el primero se uLili/a para denotar las fímbrtus de b.uLleria.s gramncgal ivas que fundón un en la transferencia de DNA desde una oéluEa a atrn durante el pmeeso de con)U‘ gación (pili SÉiuaL.1. 1-as fimbrias esiAn compuestas \mv una proteína llamada fimbriímn Co pilina), que tiene un diámetro

B Estignnadel dr.VaFbrE so

186 CAPITULO S Bacteriología mlrtict: tainnatnla, martalagia, fislolo^Ea y viruJ^ncia

de 3 a 25 siiii y 10 a Zfljjnule longitud. í j i finihrilina producida cía las bacterias tíramiscl ü é l í es. una proleína SLibuniiariu de 37 .i 20 kDa Je pew> molecular. Las proteínas forman tubos huceo*, que se originan en la membrana celular, pero que emecen de tos corpuscuLos basales y tos codos de los flagelo*!. Las subunúladc* de la rnUcínii de lus fimbrias se agregan ei ta base de lu esiruclun. \ riotín cl extrem o, m n iii se observa cb Ift HÍw-

tesj-s flagelar. Los pí Li sexuales e*íán involucrados cu ta cojisiitueión de apareamienlGí específicos pata cl intercambio de mjleríiil genético durante ta conjugación y son también sitios tlf adhesión de Im bacteriófagos. Las fimbria!- funcionan. además. como oi^inulos celulares pura lu fijación ii tas células o alus superficies de la* mucosa-i, que son faiiles para esta función de fijación y se conocen co n » ükdhfSlilftS. La ítVflyerta de hit adhesinas exhiben Una unión similar a la de la [cetina con tos residuos carbohidratos termi­ nales (p. ejL m¡mosah.w Por ejemplo* la adherencia de las bac­ teria?- entérica!» a la superficie de las mucosas que está incdiadü por piluiri dr tipo 1 (específico líj lifHij o comunes ie jpuede inhibir por preíncubación de las bacterias coa mañosa. Esta se fija a la ¡nirekíii terminal de la adhesina y bloquea la adheren­ cia: por lo Canto. los pili de tipas I se denominan sensibles a la it>jnjli son más grandes y más etiatas Et gonouK-» tiene un gran nómejode yenes que codifi­ can pruSeimas de fimbrias distintas desde et punto de vista ¡iitligénieo y cstrocturaL las cuales sufren tamo ta fase de variadota como lu vnríaclon naligfiitca (véase cap. y). En la fase Je variación, enire el estaJo con pili ) sin pili. los genes ¡til <{»unes estructurales de las fimbrias) no se expresan o las pro­ teínas de tas fimbrias no se pueden formar en fimbrias nuncionales. ELn Ea variación antiflénicah los tipos de fimbrias nuevos pueden surgir debido a Los episodios de recomhinación entre los 20 ¿enes de fimbrias prese ni c?» en el genomu bacTeriautitábido a ta íap-iCiduJ lie una variedad gonocócica única para prtxlueir antlgeinís de fimbrias múlliplcs íintigínieamenle dis­ tintos, cl USO de las fimbrias como antí^crios eandidatos para vacunas anti^onocóricus lia sido en eran parte infructuoso.1"' Sólo ttn número limitado de especies dé histerias gmmpoMtivaü. incluidos alguww csticpttKíKOR, eoriacbacterias y espe­ cies de ¿í'fíVuJWfiHtrf rnuesiraji fimbrias en la superficie celular, AL'í/j'roj'tJ VL'iL'J y .^í'i'-j'wwiví’í.t nai'sliuiilií bacilos gratllpií.siii«Pi facultativos encontrados en ta cavidad. bueaL muestran dos tipos de fimbrias Las fimbrias Je- upo t median la adhe­ rencia bacteriana a la su|*¿rfieie ile los dientes mediante la intenicción c«m las proteínas acidas riea.s en prolina de ta sativa*

mientras que las fimbrias de sipo 2 median la adherencia bac­ teriana a lois estreptococos bucales y a varios tipos de célalíui mamiferas. como lo& leucocitos polimorfonueieaieí y los eri tit)CÍlOS.w r’ %1 ^ Estas fimbrias de tipo 2 se unen a residuos galactosa o jV-ace-iilgalaeiotsa uiírtu en ta superficie de Iw estreptococos bucales congregados o con los oligosacáridos de las gJucoproCeírtas de 1a membrana cclulai- de los mamífe­ ros.: ír 1|!í A diferencia de tal fimbrias Je las bacterias L-mmi-egativas, las de las cspccics Acíium ncetes se unen de modo envalente a la capa de peptidoglueano de la pared celular. ^ La capacidad tic las especies de /IcíñírWFyivr hucales para adherir­ se a tas células, de la mucosa y congregarse con los csireptocoeos cariogénicus fací Cita la formación de la biopclícuta ta ini­ ciación de ta placa dental Se ha demostrado tjue los cuatregados Je fimbrias de y cistre-ptoeociís bucales resisten ta fagocitosis s la muerte mediada por células polimoríbnucleares. y ta unión tle j4rfwwf«vtyrr.t a los PM N libera los mediadores la inflamación. Las fimbrias cumplen un papel clave cu la capacidad de estos patógenos pcriwlontaks para COlífUizar e iniciar ta infección. Intercambio gcnc'.lco i rettMnibiimsIán en U& tiacterin La tuplieaeiúll badütiatla it- plttaluct! puf fisión binaria, un proceso asexnal que no involucra la recombinación y deriva en la generación de tíos células hijas que son idénticas a tas célu­ las de origen- Sin embargo, varios grupos
B Est ignna del d r . VaFbr Eso

Morfología y Flsiotogna bacterianas básicas

1B7

S Transífucción

A Translormackm

__ El bactcrfétago /f S^W) áfíl infecta

+ FragmBníos da DN'\

rnsmúfiéifiieo dá-y balería tforttJito

Hecaplnr c jo t

El lago COntlOfíHQ algo dt¡ GNA batttP ’inií

Badana

¡p e l e t e

Dadeiia itortíLT-ite (F-J

Ü..I -I.: íoecptora (F-)

Cornado por pilí scauaJ

Eaeierta r-ccoptora

un la reyliíacitíii Separación

de células

El fengo qu* conten# DMA bactenflno Enfada otra célula: inyecta DMA "dc,riin1oT

Célula bacteriana irartaJomiatia

ftoclerLa mcaplom

irañauada

rraomtriflrtnta

Figura 5-13 Menuiiunnfl cl? trxKlcrcRcü jípíc;i en bu hacteriis hn irncrajip-nimKH piutlcn iiUmmnK: -.r mUcrin! p?nrri„-n jw ulpinnde Ith nvs pn^sciv [riLnNlnniuiir'ji IA . 1rj.il■ .lIl^jl-■ljhi ii ..-JíjiiIc: hiii:1cni¥¡ij;,(.i iD) y un (í,7.t

corrienlc eléctrico que induce laemradtt de DNA en las u^lulas UaeítrinnaA, La truiiídiicdén se icfíere al ifitcreajiilviu Je información genetica rücdmnie (bacteriófagos ífi|, 5 !3R.ü= | .1 s hielericfagus (o simpSeruciiic ’*íagus''i virus que imtecian a bs bur­ lerías. Algunos bacieriái'agns son líikos; es decir, después de infectar k célula bacteriana. (<>> gene* regul;tdoro del bíiclcriófa^ij "'loman pHJüesiúii’' de la inaquiiiiiria bEusintéikd celular, lo que Eleva a la expresión de los penes estructurales del faco y la producción tic nuevas parteen Lis de l ago que se Iiberan. con lisis > ■m uerteá‘ la hocieria huésped. Con bacteriófagos mode­

rados. el materia] genético del bacteriófago se incorpora al DMA ik la célula huésped como un "profago" y n? Teplica jumo ei?n cl ctDtinjMjma bacUrriam». Tales baelefiófat»u.s tarablén se llaman bacteriófagos lisogénkos. v la célula bacteriana iafee la¡t!u. con eslv Jago se dice tpe cstd Lüiiigctiii/ndu.. Mi'(liun[p inducción por exposición a ciertos producios químicos (p. ej,. mitomidua C ) si a ¡rradiación ultravioleta. un baeleriófago lis*vgénicií puede ser inducido li iniciar la pioducciiH) de lago» nue­ vos (el fago se conviene en ” lítieo"L La escisión del DNA del haeieriisÍMgu del j.runi]ma celular baclcrium.) d;. pwir resultado algunos bacLeri-ñlagosijttc contienen no sólo genes, específicos,

B Est igma del d r . VaFbr Eso

188 CAPÍTULO S Badana logia iródica: taxonomía, irorfo logia. fisiología y virulencia

de fago» sitio también genes de la célula huésped ad> scentes sil sitio de integraciún del DNA del fago en d cromosoma bacte­ riano, La irjnsfertncia de inl'nmmcíón jjcrwlwsi durante la mmsducción puede ser genera]irada o especializada. La tninsduo ción generalizada se refiere al empaquetamiento accidental ti aleatorio del DNA de la célula huésped en la cápsidc o Mcabe¡tii" de Li pariícn]a. de íagi». La liberación de lu puntada de fago madura en la lista celular y la posterior infección de otra célula bacteriana deriva en la immdueciórt del “ DNA donante" de I» hue tena huésped orijartaJ en el “ receptor". La recínnhiníición del DNA irunsiliieido cotí una región íiotnóloga en el cmniosoma de la célula receptora provoca Ja integración y expresión posierior de los gene* trarfiducidus, La transducdón general izada sucede eon una frecuencia de un fago tramductor por cada LÍP n I0L; panículas de fago prnducklas en la inducción del estudo tisogenizadn, y alrededor del I*2$ de la longitud total del genoma de la célula huésped puede transferirse por este meca­ nismo. Lu Iransduecidki especializada es el empaquetamiento de genes específicos de la célula huésped en el proíago transduetnr, Este tipo de transducción sucede con fagos moderados que tienen >irnK de Integración cromusómicos específicos, como el bacteriófago UttuixJit. Sólo loa genes celulares del huésped que flanquean el genoma del fago integrado iienen la oportunidad de incorporarse al genoma del bacteriófago en inducción desde el estado lisogenico. Se produce un fago trans* ductor especializado por cada 30* a 1(1®' partículas tic fago nue­ vas siguientes a ln inducción. La conjugación es cl único mecanismo de Intercambio' genétieu entre bacterias que requiere el contacto entre células (fig. 5- I3C). Las bacterias gianinegalivas que participan en la conjugación tienen un plasmado llamado plú&midn F (“ pifo mi­ do de fertilidad"). Este plfcmidy condene un operiSn de genes llamado región ira que codifica el pili sexual {o p¡i¡ conjunti­ vo) y otras moléculas involucradas en la conjugación,11 El pili i^[w,-i;d¡7nd:i funcioni» cíinin un i'chícitld pani estahlcíXT COlUincto con «ira célula bacteriana. Una ve/ establecido- el c<mtoeto, el pili sexual aparentemente se retrae, con loque acercan ambas células. El pili también puede actuar como un conduelo a laves del cual pasa cl DNA durante el proceso tle conjuga­ ción. Lai células que tienen plásmido F sí denominan F+„ mieiUms que las que carecen de él se denominan F-. Una vez que se ponen en contacto una célula F-i- con una célula F- por el pili, sexual, el plásinido circular F comienzü a leplieaise. Durante este proceso, una de las hebras simples dei DNA del plásnmlo u transfiere hacia el interior de ln célula receptora. La hebra ■simple «c replica a medula que entra en la célula ítíet:piula: el resultado final síin dos células que contienen los plá>midos conjuntivos completos Has dos célula^ s«n F+). En algunos microorganismos, el plusmido F se integra en el germina de la célula huésped en sitios de integración espires ti­ cos en los cuales escin presentes Ins secuencias de nucleón dos homólogos. El establecimiento de una conexión mediante el pili F y la conjugación ulterior deriva en la transferencia de al­ gunos genes del plásmidu F mán el material genético de lis célu­ la huésped que esta adyacente al sitio de integración del pLasmidu E L^s células que tienen un plásmido F integrado se denominan células 11fr {high-frtqut'ttcy tveüinbituttiuni: reeoinhinac iones de alia frecuencia)- El apareamiento entre las células Hfr y las células F- da lugai a la transferencia de parte del genoma F mis algunos genes celulares del huésped desde el donante, b s células receptoras F ■por lo general permane­ cen F- después de la conjugación porque sólo parte del plás» mido F de la célula donante Hfr se transfiere a la célula recep­

tóla durante cl prxeso de conjugación, Pot lo tanto, estas célu­ las receptoras no tendrán cl operón completo necesario para i|lte ULUitd la conjugación. La rccombinación enlrc el material genético de la célula donante y las regiones homólogos en la receptóla F- permile que el DÑA dóname se exprese en la cé­ lula receptora. La célula donante pennanece Hfr, ptirque el cro­ mosoma de la célula huésped (que contiene cl plJsmido F iuti> grado) se replica dwranlc la transferencia dd DMA genómico de hebra simple de^dc la célula Hfr hacia la célula F-. Eníre las bacterias gram positivas, Efitcwí'otxtiF JarcúH* tansbiéri es capaí de inletX'auihijr pl/ismidos mediante la conjugación, Sin embargo, 1¡) transferencia de genes no se i^xluce □ través de los pili, sino poruña caagregaclón de lus nticruorganismos en respuesta a feroníonas producidas por la bacteria donante.31 Cuando se exponen a células libres de plásruidos; (o a filintdcis de euliivm de células libres de plásmidos), las célu­ las que contienen plasmidos pr^vlucen feiomonas codificada^ por el plásmalo llaii»«idiis sustancíns de aRre^ución. Estas sustancias ü*»ii pequeños pép:idos (siete a ocho aminoLLidusi y ac­ unen a los sitios que están presentes en ambas células, donan­ te y receptora, y causan la agregación bacteriana. La agrega­ ción conduce al establecimiento tle conexiones ¡ntereeluSaTC^ necesarias para la trajismisiún del plüsmido Un dalo interesan­ te es que los entcrococos que contienen plásmidos y sustancias de agregación similares responden sólo o las lerontonas de las células que tienen plásmidos dilerentes y, p.>r lo tamo, produ­ cen sustancias de agregación diferentes. Hasta hoy se dcscribwn'n 18 fcromonjrs sexuales de pjfornidos diferentes/* Además de estos mecanismos de transferencia génic-a, pue­ den participar tMros elenierjlos genéticos en los ^uersos de neeomb inación que afectan las características y la patogénica dtul de los iniemorganisrnus. Los «ItmcilliRil gruí ticos litlA V posiMcs son porciones de DNA que pue*leti insertarse en sitios diferentes nu relacionados de un cromosoma bacteriano o pías* mido- Debido a que estas inserciones ocurren ai azar, se pue­ den generar imitaciones por discontinuidad en la secuencia del gen. Se describieron en h. r¿ y en una amplia vailetlatJ otras bacterias. Al contrarío de ios mecanismos ya descritos, no se requieren regiones de secuencia* de ácido nucleico hitniólt»gas- para que esos elementos se reeombinen, Los elementos genéticos sranspnsablcs se dividen en dos grupos: ¡as s«iiencias de inserción y los transpi^sones. Por lo general, las secuen­ cias de inserción y>n pct|ueñas porciones de DNA que trans­ portan genes que codifican sólu su propia trasposición: la e>. presión de estos genes no está reconocida y la inserción a menu­ do es fcnotípicamente ‘'silente"/' Los ttm upúHiiKi si»n mis grandes \ codifican al menos una función que es recrmocible como una alteración fenoltpica. conKi la adquisición de resULl'ijljlí aririmicrubiaíia. Los transposones desenlosen las bacte* rías gramnegativas entéricas conlienen genes para la resistencia a los antimi-CTnhianos ip. ej.. ¡wwHnoghicósídos. teiraciclina, cloranfenicol) y genes estructurales para la to&ína teranoestablc producida por algunas cepas de t\ culi enieroto^igéDica.4Entre las bacterias gíümpositi^as de importancia clínica, se descri* biercmt trans posones que portan genes de residencia para el eloranfenico!, la telraciclina y laeritrtMnicina en Cítiffrifiiwrv fringm s y Cfattridiftw diflscUe.^-'"1' Requer míenfos para el metebolismd i el eré;imiertlo li^Eledinos CARBONO Las bacterias se pueden dividir en dos grandes grupos sobre la base de sus requerimientos de carbono. L a ' bacterias litótroías o aulóLmfas y las bacterias nr^anAtrafas o hEterólro(¡15, Las bacrerias litotróficas pueden usar dióxido de carbono

B Est igma del d r . VaFbr Eso

Morfología y üitotogía bacterianas básicas

anaerobias que no se mueren por exposición a] oxígeno. Los ¡u»irnb |q* rflcuhutfros son capaces- de crecer bajo ambas condicioitci, aerobia y anaerobia. El crecimiento de lus aero­ bios estrictos depende por completo del oxígeno. Los «rcunismas n tim u tr^ itu s crecen mejor con concentraciones bajas de oxígeno; las concentraciones altas de oxígeno pueden ser inhibitorias. Ln uentbkj'i facultativos v estrictos. la asimila­ ción de la glucusa da lugar a la generación JinaJ del radical libre superóxido (O /). El SM|Wiixid« se reduce, pttr li iicdún de la enzima superoxidúdismulasa. a oxígeno gaseoso ÍD ,) } peróxi­ do de hidrógeno Posteriormente* et peróxido de bidnV geno tóxico generado en esta reacción se convierte en agua y oxígeno gaseoso por la enzima catalasa, que se encuentra en bacterias facultativas y aerobias, o por varias peroxidasas, que se encuentran en \arias anaerobios uciotulenuiies.

como la simes fuente de carbono y sintetizar a pan ir de til las cadenas carhonadiis Je todos sus meiabottins uránicos. Para crecer sólo requieren agua. sales iiiorgúiicj;» y CO-. y su ener­ gía proviene dle la luz (bacterias fotolildtrofas* o de la oxida» cion de una o mis sustancia-1 ; inorgánicas (bacterias qiüm jobeó* irtifLi'■,].. 1j.iv bacterias organótrofas son incapaces de usar CO, como única fuente de carbono, pero lo requieren en una forma orgánica., torou I*1jjlueuwi. Pata uiiits bacterias lieieiotróncas, tina porción del complícalo orgánico que si)ve como fuente de energía kimhién w usa p;ua la síriftisis de compuestos orgáni­ cos requeridos por el organismo, Una amplin variedad de sus­ tancias tamban pueden ser usadas coma fuentes e\eki<¡3vaí. a pai'ciaTes de carbono por diferentes especies l>aetefianas. Fjitne las bacterias mis versátiles e-stiín las especies de Pseuífomunas, algunas de las cuales pueden usar m:ís de 100 compuestos orgánicos diferentes como única fueme lie carbono y energía. Las relaciones entre las fuentes de energía, las fuentes de car­ bono y Fus donadores de electrones jisira la geneme ion de ener­ gía se resumen en cl cuadro 5-2.

NITflÚGEHO

Los. átomos de nitrógeno de biomolóculas importantes {ami­ noácidos, pariuas, pirimiditUí) píovienen de los iones amonio La generación cte iones amonio comienza con la reduc­ ción del rs\ atmosférico a N IL 1{ion amonio o amoniaco, NH,,í. Luego el ÑrK / se asimila en macromolículas más complejas por la rata de los compuestos clave ¿Julam aio y glutamina Cierta! especies de bacterias, (especies Rhizabiuni y Aznlohacie r f y algas azul verdosas son capaces de afijar" el N, atmos­ férico en uno forma orgánica más fácil de usar, Debido a la fir­ meza del triple enlace de] N¡, la fijación de nitrógeno requiere el aporte de energía celular en forma de At'P y un potente reductor. Ll proceso está catalt¿ado medíanle un sistema mullicnzütiJlicO complejo dclíumimulo cuíripleju nitiugcniLSJ. En la mayoría de los organismos fijadores de nitrógeno, la ferredosina reducida es la fuente de electrones:

DIÓXIDO DE CARBONO Algunas bacterias usan cl dios ido de carbono atmosférico corno la principal fuente de carbono para las reacciones biosinleticas- La ene tg fu pitre cambiar esta utilización puede pro­ venir de la energía lumínica (bacterias fetuiitátrofas) o de la oxidación de moléculas inorgánicas (bacterias quimiolitiítrofas). Los microorganismos que requieren una fnetue orgánica de carlmn» también requieren algo de CO, para ciertas vías sin* tilicas de macromolécijlas. como ta biosíntcsis de los Acidos grasos E l dióiidp de carbono para estas reaccione* sueles obte­ nerse de Ja degradación de sustratos orgánicos, que sucede al mismo tiemjw que las reacciones biosintí ticas.

N* + fc + 12 ATP + 12 H,0 -* 2 M il/ + (2 A PP ■ +I 2 Pr + 4H'k

OXÍGENO li! requerimiento de oxígeno de una bacteria particular refle­ ja el mecanismo usado para satisfacer sus necesidades cncrgé ticas. Sobre la base de sus requerí míen tos de oxígeno las bac­ terias pueden dividirse en cinco grupos. í,os micrt'iofganismns anaerobios estrictos crecen sólo en condiciones de intensidad rcductorn elevada y para las cuales el oxígeno es tóxico. Los niicpoorgínismoH mtwmWtt! aerotíileranttf: son baci crias.

Cuadro 5-2 FucmU'» d|> t-úiiim o y

189

L i capacidad de fijar nitrógeno se constata principalmente en las bacterias del suclu ya mencionadas. Sin embargo, algu­ nas especies bacterianas que producen enfermedades humanas, cunto K, pniumonútc y ciertos clostridios del niedioaiubiente íp ej.,, ChsltUiítm pasteuritmicum) limtbicn fijan nitrógeno airllüí íe riiu .

de lu í hactL-rtas

T IFQ T JE StP LO S

F l'E X T C lSl M EN EBG ÍA

FUEVTEtS? P E C VHÜOMl

iMitolilóIraf'is BiiUcriiii vcr&s ikl u^íifíc Híiíieriití piirpiif«;q^ itíl filtre

U

CO,

FutlMHUIkitlullH |l.KÍC;iJ’ plijSílJS fíU SBlflilLlMh

Luz

QuhnkilltíilniRK IkiMKims ikt tJdrt5fo*o. hiaai^s dd íiíut'rp y T^Ktfri-i1 * ^-üp^trincjiWn';

Reaecii'ncs Je nv.iitüeidfTLíJuteidti

ÍO ,

t'rticipi»3M>s IflCífil^ki.r1 '(H

IJuUi>k*rTti*rK;iiri3rLjt.

Rí^iiurse^ de i^LdaciúnneddL'L'iila

Ci.MnpiwMO!! tcginsci^

CnmpoiestíHi íw^ánkíM I f Lulhfxí y de .j :I -.i :!,'?

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DONADORES DE ELECTRO N ES CompueSos isiürpánkr't Ct¡:S. Si

tNTisinieirs

Corcipix&K^ nr^inlctri

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iudra!»

B Est igma del d r . VaFbr Eso

199 CAPÍTULO5 Bacteriología médica'taíonomía, moriotogía. lisio logiavvirulencia

Los ione- amonio lumbién pueden gcutiarsc |H»r reducción de nilralus. lisio se cumplc por tíos mecanismos fisiológicos distintos. La reducción ttsimUnloria de nitrato es un proce­ so en cl cual cl nitrato se reduce a nitrito e hidni* ¡lamina, que luego í.e convienen en amoníaco por asimilación. La rtrtuceWn díslihiJatoria de nil rato en. cuando el niinnosir^e como ym aceptar de electrones aJternalivo al oxígeno { respiración anícrohiaji NO. a N, san los pruducKw más c
nLas gíu la imito d ed iid ri^ im vit, g lulirainB sintetnsa y árido glutániicn síiilasa (fig, 5-14). Los productor finales de es til s reacciones son la glutamina y el ácido glulámico. que luego se convierten en donemos csErucl uralcs de otras reaceiones Iviosi mélicas para la síntesis de vanos aniiuoéetolos. ptirtfiiis. pirim¡dinas y olros compuestos nitrogenados necesa­ rios ílig. 5- 14L FACTORES DE CFECIMJEMTTO Estas suMandu?. imunucten el crecimiento de los mieroornanismos y se hall mu iti vivo cu diversos líquidos corporales y tejidos e in utraen extraelus de levadura y pr-uduesus de iasanetc. E*ttw, tildones incluyen las vitaminas del complejo B, los numerales, ciertos nmiTimeidos, las pininas y las pirimidinas.

0

¿~OH 1 C-0 I H-C-H 1

«-oesagíi.jEa?aio

H-C-H

] c-o 3 OH

AminaáeiOíis

W áD PH . □LUTAM ATO

IJESHIO-FIOeíit'tAg-A

ATP---" J

NADP

slcn#1asa

A D P 4 P,

Odu’Lírr'ia Fig u ra 5-14 S L cJ I iu IIsliiii-■ ■.LsimtirALÍiiit t t iilin [iciiis n ic tliw lfla ' c r^ n u i

unMrn eorit icc j Ij jiim’-iirinn di* iLTunoácidnti y piwk

r;-e&icg¡Lfta¡?ato ntcEj.hu, ¡M iii^iuiu dcshüjOLL-iUvi y l I iJ-Ij i í i j I li

1-.-%bo «itif-iiis ciiri-

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B Est igma del d r . VaFbr Eso

192 CAPÍTULO S Bacterloiogia médica: teronomía, nportología. (Itlalogia y virulencia reaccionas bit^inléficas. En estos pn^usos. !ji energía de la hidrólisis Je los enlaces químicos es capturada ai los enlaces, fosfato de alta encipa de adiiuisintr ¡fosfato (A TPl. Estos enlaces abastecen la activación v la continuación de oíros even­ tos bioquíinicns Usando esta energía se sintetizan la pared celular hieteriana. \ns proteínas,. los ilcídt» nucleicos y mía* twacrtHMo-léüuljí. ícgiilailuras v estructurales. La utilización de Los hidratos de carbono por Ins bacterias y las condiciones en las cuales neume s¡m caraeterí'itieas clane para la earaeteri/acirtji genere! de las bacumns. Muchas pruebas realizadas en ¿1 lalMratnrin J¿ microbiología clínica implican la detección de tos producios finales del metabolismo en líquidos Je cultivos acolados, lanío a través de indicadores de pH en el medio como por cn.irrwt5igrjí'ía de jia*-líquido. La capacidad de un miciuiirgartiHnwdfldoparn, producir ácido a partir de diversos hidratos de carbono (p, ej., maltosa, sucrosa. manil^L mañosa) refleja

Jai capacidades enzimiticas de estos organismo* parj convertir en principio lates hidratos de carbono en glueosu, que es el punto de partida para el catabolismo de los hidratos de carbo­ no, tanto aerobio como anaerobio, La utilización de la glucosa en condiciones anaerobias se denomina fermenláciúti. La fermentación sucede mediante la llueóli&is írantbicii llamada vía de Embden-MeveríiofFam ns o \ía de la liexosadifusfalo). cuyo producto final es el ácido pinívieo t>el piruvuto, lan vía glucolílica de la glucosa at pinivnio se reserva en la figura í- lf». Esta vfa requiere dos moléculas de ATF para la fosforilación inicial de la glucosa a j í Lwcom-6-fosfato y la fosforilación posterior de fractusa-6-fos­ fato a fructosa- 1,6-difosfato, Durante la ghicóJi-si*., se genera ATF ea dos pumos de la vía. tom o resultado de la conversión del ácido 1,3-difosfogbcérico a ácido 3-fosíb^licerico, la ener­ gía preveniente tle la oxidación de un grupo aldheído se con-

COOH

2. DO

Gpicosa

ÁbÍÚQpktMGO

CH, I c

COOH ¡

CHj OPO j H j

2 COPO^Hj,

Áctíft fo$foer\QJpiní)(too

CH, C.'ucosd-Éi-íasfeío

y -

,0 2H,t

COOH 1 2 CHO P 0,H ;.

Árklo S-lbsfogíksá.'ico

CH-OH C H .O P O ^ /

X ChjOH frmctoM'6'k>stato OH ATP AD P

Acido 3-fcslagiicérica

C

CH¿OPOSH? ÍH.DTO.H,

O

COOH I 2 CHOH ¡ CHaOPQaH,

C O O PÜ - H ,

Ftuctosfr i, 6~$t'o$wo

2 CHOH

Ácüfo t.&Gitestogb'céfKQ

CHjOPOjH, OH

CHjOH CO I CH jOPO j Hj Di^'droxídcetúñil

\

2MAOH, Hrtm i CHOH

ZNA!>, 2HjP0*

c h 3-o -p o , h ;

J-tes&l}i
B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

194 CAPITULO 5 Bacteriología médica: laxanDinia, morfDlagía, ftslolpifía y virulencia

CH jO -PO jHf

COOH

O. OH

ATP ADP

H -C-O H

HAD

H O -O -H ( N=C~OH

NADH + H’

H -C -O H Gíucosa^-íctsiaJo

h£c —o —po 3hs Afilífo B’^íteglucófiieo

CH.OH C- 0 C- H I I * HO -C-H H -C-O H l I CHa- o - P 0 3Ha h-c-oh

CH.OH I ..

c=o

Tíansceíoüsa

h- c

H -C-O H I H - C “ OH I H jC - Ü ’ PQjH*

GiieepaideWde3-rosíaia

h

íransceloiaM TrantoIdoiaM

T,'a.nsDlcGla3.^

C=0 H O -C-H H-C-O H H2C - Q - P O 3H5 X>,üiQsa-S-1osfñt'i5

-o h

- c - oh

H2C - 0 “ P 0 aH2

Se^ohgpnjlíM-7-fwlglo-

CH-OH

co .

RlbuloM’S-ltBíalfl

0 C-H 1 H-C-O H I H -C -O H I H:C - 0 - P 0 3H2 Eírtrasa-i-ío&tetcs

H O -C -H H“ C“ OH I HzC - 0 “ P 0 sH2 K-lufesa-S-tasiflla

H-C-O H t H-C-O H I H¿C—O—PO^Hj Rfcosa’S-tosiat'O

Fípura S-lf. b vía «le fes pemusj^ ínsísn.

A lfil tías bacterias pueden oxidar fonniulo directamente y producir gas. hidrogena v CO,. La naturales;! y la cuntidiJ de esios producios. Acidos dependen del organismo. Vía 4-Fermenturión del bulancdiol. Las baelenas que usan esla vía tienen uita eiUimu que eoudensi dos moléculas de pimvaio (cada una con tes? carbonos} « i CO, y un interme­ diario de cinco carbono* Llamado tt-acctoaccíatn,, Luego, cl a-aceloacetato se descarto* ila enzLmáticamente y forma aeeloína {acetilmetilcartiinoH. En presencia de ipnes hidró­ geno, la aceloína se reduce j 2.3-hulanediol. Esta reacción de reducción es. Icntamenlc reversible en et aire en eondiciumcsulcnlinas; ] l acelofrta que se s,ihLcíizj puede dclcelarse por la adición de «*maítoS, Hslo es la base de la prueba de V o g K -Prm kiu erlV Pj, que nía ft-naüol en presencia de álcali para delectar acetnína. Esta vía se observa en el grupo K ltb sielití’Emetolun'tet^SerraHtÁ-Hítffíiii de Da familia Erncmbacleri uceac. La cum icm n de atgn de! piruMitu en 2r3‘buianed¡ol reduce la cantidad de ácido respecto de la vía acido mixta descrita anlcs y es responsable de la reacción del rojo ilt m tliln (M R j osado \\\t¿ separar E, coli y m k fo organbinw. relacionados, (M R +ArP-> del ^rupn KlebaieifuEfibetBbarlér-Semiiia-Hdfnttt [M R -/VP +)„ Vía 5—Fermentación del tnitonpL Esia vía de fermentación se observa entre las miembros del género CUniriíiimn. Ksíos

microorganismos tienen un enzima que condensa dos moldcu (as de aueli 1-CoA fíHTnadas a partir de pjmvaLo para for­ mar aeeioaeetil-CoA. Esta molécula se reduce en forma escalonada a butiril-CoA. que puede ser luego hidroÜMda a ácido butírico j ATP, De modo alternativo, el wcetMcelatu libre se libera y dcscarbuxila para producir CO, y aceto* na. que se puede reducir a alcohol isopropílieo, En los Latw> ratorios de microbiología clínica que realizan trabajos de referencia con clostridLos. se delectan productos de fermen­ tación volátiles y no volátiles median le análisis por croma­ tografía de gas-líquido de preparados de cultivos en caldo. La detección de estos produCio.s iinaltíi rttclaból ¡CuS-ei útil para la identificación de género y especie de e\ías bacterias anaerobias. Vía 6~Fermentactán del áefdn propkmko. Esie es tm tipo de rcaceidn cíclica en la cual el oxalaceUito se forma de dióxido de carbono, piruvatn y ATP usando una cucnrJ ma que ennúene hialina. E l oxülacclaio se reduce a malato, se convierte en fumarato y luego se reduce a ácido succiníeo (surcinaio^ La (fescabrailaclófi del suca nato tteriva en la formacfcto de ácido propiónieo fproptonatoL Esta ^Ja se obscrv a ni tancEIra gramnegativos anaerobios dei género Búcíeraittes y en las. especies Pn^hm ifaKiem m . que son bacilos no Tomadores de esporas, anaerobios y gramposilivas.

B Est ignna del d r . VaFbr Eso

196 CAPÍTULO 5 BaeletioIagía médica: taronomia, morralapiai,. tlsJolaf la y tundeada AGRESIVAS Para sobrevivir y multiplicarse dentro del huésped» muchos micro* irgan ismm producen diversas- sustancias que Ií'n pcnniten evitar o evadir Im mecanismos dé defensa del huésped. Estas suslarteias, llamadas agiesinas. incluyen cápsulas y sus­ tancias muciluginnsas extraed ulares* hidratas de carbono y proteínas tte superficie, enzimas. toxinas, y «Eras moléculas pe­ queña*,. Las estructuras capsulares de algunas bacterias les per­ miten a ios microorganismos evitar la fagocitosis por impedir la interacción entre la superficie celular bacteriana y las odlulw> fagcieítieus [>por ocultar los componentes de superficie ce­ lular bacteriana c|uv de otro modo podrían interactuar con células fwgsKiikafs o complementa y conducir a sil ingestión,Jtíí-ilí'JJ3 Los anticuerpos específicos dirigidos contra el material capsu­ lar conducen a U apwnizactón de los míctrorgaiLijmra, Después de la opsonizarión. las bacterias cncapsuladas son ingeridas rápida y fácil rúenle y destruidas por tas células fagocíiieas. Algunos microorganismos producen cápsulas que son similares en estmetura a los tejidos del huésped y. pnr lo tanto, no son reconocidas como cxlnüas por La vigilancia inmunilaria. De «sia lórma, tales microonptnismos pueden evadir Las defensas de! huésped. Por ejemplo. Jas cápsulas de E. cali K1 y de los mcnmgococos del grapo B cstrin compuestas por ácido iV-aecLilntforamínico. con uniones « ’2,K parcialmente (í-accliladiv p e es di mi lar a! ácido itetirarnfnko encontrado en el teji­ do del sistema nervioso ce rural.11 Los mtemuígiinjxnHJS que tienen cápsulas que se comportan como agrcsiius son S. fíVFPUf, S, pneunwniae, jV- meningitidis, fi, \njhwnzfte lipis fc. K. ¡mi'uimmktr, estreptococos p-heniolíocos de Eos grupos Á y 0, y B. Algunas bacterias tienen proteínas de superítele que -cvtu­ pien funciones en la adherencia yen la virulencia. Por ejem­ plo, Lti proteína M de los estreptococos del grupo A desempe** fia muchas funciones en ln patogenia de la infección con estos ttiierooi^gamsmos. como adherencia, « s ile n c ia » La ís^wm ais, invasión in tricelular deterioro de la función del úniiplemento y cfcclos lítieos en Jos Leucocitos polimorfonuclcai B s W u , b proteíña A, una pro tt í na de Ij pared celular de S, aurewi, se une a las moléculas de inmunoglobulina ttgíTj por su región Fe. Como La fagocitosis mediada (la opson ila ­ ción) es dependiente del receptor Fe, la procedía A puede Interferir en este proceso. La presencia de prole (na A también puede inhibir la activación del complemento cerca de la pared celular esiafilocdcb por encubrir las mitades de pepndogjucano que se sabe que son avivadoras dd complemento. Alguna* balería» producen proseabas que pueden IndíOlizare inactiva? inmimugíobulinas secretorias (lg A ).irN Esta inmunoglobulina actúa en forma local para impedir la adherencia bacteriana; pnr lo tanto, la hidrólisis de la LgA pnr la proteasa bacteriana fomenta la colonización de la mucosa tvéase cap. 3). Algunas agresinas actúan después de que ha ocurrido la fa­ gocitosis por interferencia en lu fusión fagosomu/lisusuma y en la actividad del sistema de la niícloperoxidasa. Las micobaeterias y las: h n iccb se Captan a una existencia intracclular den­ tro de las células huésped mediante la elaboración de vasta ncías que impiden Ea destrucción de los microorganismos, En las rmcphacterias, esto se debí: a la presencia de micósidus y sul* folípidos asociados con la pared celular que se incorporan en la cara interior del fagosomn e impiden La fusión fagosomafliso'i(»ma,'-n íAxteria uuuuh'Stofgenvs exprthsi Lsrta proieína ríe superficie llamada talem aJina que se urtc a los receptóles glucupruieína en las células epiteliales y lu permite al míLfutH^a nismo interna! izarse en una vacuola unida a la membrana

Luego* cl microorganismo produce una hemolisina llamada listerinlhina O, que se intercala ert la iití-m^rana de la v&cunla y causa ln formación de p o r o s Más larde, L mmcicyitfgfnei eiitni en el citoplasma de la célula, donde continúa creciendo, de modo que escapa del ambiente iónico con el fagusoitia. S. aurev.% segrega calatas \ supcróxido dísmulnsa. que inhiben la tleslnjcci<%i del í*gan.ismo mediante el sistema de la mido» peroxidasa de las células fugocítieas. Atujada iteniro de las células fagneít icas mediante esios mecanismos laiuhlén contri­ buye a la virulencia protegiendo a los organismos de la des­ trucción por anticuerpos específicos y complemento. La exis­ tencia i ntraedu] ur también tiene una influencia importante en la terapia. Las infecciones con microorganismos como especies de Una tUa y Frunchcita mUtrennii dehen ser tratadas con hsjiibiúiicos que actúen de modo intnieekdar tp. ej.. letrJcili­ nas. aminogluodsidos) para afee lar a estos micrt juigaui smos protegidos1\M M acbas Sacterias producen eniimas í» toxinas o tienen eonstítuyenles celulares con efectos léxicos o necrosanies en las células del huésped y en otros componentes del sistema tnmunítario. La Icucocidína y la if-hcinolisina producidas por S. atnvu.\ causan esfericidad y tumefacción de los puHmurfuuucleares y de los maeróiagos expuestos^ seguidas de desgranula* ción. rolura nuclear y lisis celular/^ Bl lipopolisacárido de las bacterias gramrnepiivas puede retrasar la respuesta inflaman* liaa^uda. v le?i jteriliite al IllieltangaJItsmi.] esiablceeme dcmro dtal huésped con relativa facilidad. La porción A lipfdtea de cndotoüina. en particular, puede activar el complemento y esti­ mular La liberación de varias citneinas (interleucina[lL|-2, ILb. IL-íí, factor de necrosis lunitoral «, [TNF'Cíj'l que Llevan a las manifestíwsínies clínicas del shnrk cndmónko, como liijxneustÓEi, coagulación intravaseular diseminada v muerte. Las bac­ terias grampositivas tienen polímeros de peptidoglueano en la pared celular y ácidos tcicoicos de membrana que pueden cau­ sar una liberación de citocin¡is similar y precipitar síntomas ¡júnales, a los del shuck séj.Kieo. Algunos irtk ivillanism os tie­ nen otras propiedades vinculadas eon la superficie celular, como el LOS y eiertaj. proteínas de soperficie que les. olorean resistencia a los efectos bactericida* de! suero humano normal (p. ej-, jV, gom irrhotitt j,|W ‘o Esue propiedades pueden facili­ tar la disetn inación tfe las bacterias a través de la circulación sanguínea y linfática, y conducir a una infección sistemica o a la .siembra de foccre inJcccioscK en lu cares distantes del sitio de infección inicial. Las propiedades invasivas de algunas bacterias se atribuyen a l.i cfabiki^clóa de éO/ini^s que actúan de lonJíie^tracelulat ü. aurtas. S. pneuiltünUtr, estreptococos del giupo Ü y Pnrphnihüctem m eiarf.í producen una enzima llamada hinitironuLuliusLi lo hjalunmidasa| durante la fase de crecimiento exponencial. Esta enzima promueve la diseminación del microorganismo a través del tejido conectivo por despedímerizackin del ácido hiaLuiónico, la sustancia fundamental respon­ sable de la adhesión célula-célula."1 Los estreptococos del grupo A y los estafilococo* también elaboran enzimas que hidroli^an los coágulo* de fibrina (estrípt*ílttasa y ^(aflhn d&itüa). que facilitan la diseminación de microorganismos en Jos tejidos,""113C. pet fringtx y otros cli’stridios íC fmtofytkwn, C. seplifum, C. Mudefíii, C- nm-yi y C. faUax) producen citotoxínas, citolisinasHcolagenasas, fosfoLipasas, hialuronidasas y dcstixiTTtbonucleasas que permiten a estos micnuníanismos colon i/ar tejidos sin viialidtsil, degradar la mairi./ de colágeno del músculo y del lejido conectivo, y fací Litar la propagación de Dos in[cr(.it>],i'atiismos en esos tejidos para causar fast'ius y gangrena gaseosa.^1

B Est ¡gima del dr.V aFbrE so

Factores de virulencia bacterianos y patogenic?dad 199

E l hierro es ur nutrieme esencial para mucho* microorga­ nismos y ur requerimiento pao la virulencia de algunm patégenus baeiefiamís. A es» respecto, lus bucierías patógenas productivas han desarrollado formas de obtenerlo del mcdiuambicntc o de kis tejidos del huésped, en Ins males. el hie­ rro libre se maní ¡ene en bajas concern raciones por estar unido a las proteínas transfenina y taclofemna. Los microorganismos recogen esle hierra medíanle la producción de sklerófurus. moléculas pequeñas que funcionan como quelantcs de hierro de efevada, afinidad. Por lo lamo, la producción tic skieró Irnos St‘ considera un helor de virulencia..^ Oíros organismos han desamo!] adr>proteínas de transpone como iraas-ferrina o lactofemna. de las cuales se extrae y Iransptuta cl hierro hacia cl im eriíjrde Eaa células.111 Tunio Ár, gottorriuvae como N, memngitidijí tienen ret eplores de membrana externa paria unir trans(cnina humana, lactofercina. y hemoglobina y proteínas de unión periplasmóiicas para extraer hierro de los transportadores a los que esia unido y transportarlo al ínterin eelLilar-'u w l*I-H Además. 3a producción de muchos producios microbiano* extrocelulares, incluida lus¡ toxinas, v regula parcialmente 4 nivel transenpeional por las eonecmraeiones de hierro ea el medio circúndame. Por ejemplo, la aprc«i(ín del gen cstnictu* ral fi-íago para la toxina difié rica en t'<0 fyrt¿finrtsri!im diphihrriae sólo sucede cuando el hierro se convierte en el sustrato lírnitintó del crecimiento (véase más adelante),31" 1151 Aunque los plasmados por sí mismos no son factores de v iruIcircia. los genes que codifican muchos. de los productos celu­ lares, bacterianos responsables déla virulencia suelen residir en ellos, Lo’» factures tt {plásnndm que contienen genes que codificar la resitencia a los agentes antimicrubianos) pueden considerarse de virulencia porque la adquisición de resistencia a los agentes antimicnobianos- fomenta el crecimiento conti­ nuado y la diseminación de las infecciones bacterianas a pesar de las intervenciones terapéuticas. Algunas bacterias también contienen plásmido* que codifican pili sexuales y transferen­ cias cromosómicas.. Estos dos factores le permiten a un micro­ organismo transferir material genético (la introducción de un pldsmido. de un cromosoma o de ambos) a otmsi organismos. Los plásmalos también pueden porrar genes que codifican un antígenos de colonización, resistencia a] suero, quelación y transporte de hierro, producción de toxinas y bemolísimas., y meeani&müs de supervivencia in irjcd u kr indefinida. Los plástoidos que contienen genes de resistencia han sido descritos, en muchos gtamncgaliws (iodo el género de f-Mtembacterim'eae, P.iriiefmmmix. Vibrfa. Ftvim frrlla, CóRipyfobttttfr. Hormaphilus. N em tría y Bactcrvides) y grtunpoiitivob (|i. cj.. Stapftytocaccta* SíKpttjCf*C£¡a\ Lntrtocaa'its, Bacitiits, Clt/siridium y Cfiryiwhocteriuml.

EXOTOKtMA^ Y ENIDDTOXINAS Las toxinas de origen hacleriunu se dividen en dos grupos; exotoxmas y endotoxinaí. Las exotoxiruu bacterianas son las límnus biológicas más potentes conocidas y se producen en su mayor parte por bacterias grampositivas, aunque algunas bacte­ rias gnimnegaiívas lambiéii las elaboran. Las exotoxinas son sustancias de naturaleza proteica y son termdábilcs. Debido a que son proteínas, muchas pueden ser inactiva das o destruidas ¡Hir erwiin»* proteolñieas Por otro lado, algunas cxotm inis se activan sólo des^iués de una hidrólisis iwrciaJ (‘'corte") por enzi­ mas proteoli'licaí. í'véase más adelante). La actividad tóxica. de. muchas c ilio s iñas puede ser destruida por tratamiento con Pornuil debido (desarrolle de ¡ovoides i y neutralizada por anti­ cuerpo* específicos. E l aprovechamiento de estas propiedades

condujo al desarre] Lo de Jos toxoides del tétanos y la difteria que se usan para la inmun i¡ración activa conm estas enfermedades. La* eMtoxiita* bacterianas se dividen en dos grupos. E l pri­ mer grupo consiste en toxinas dtolítieás, que actúan en ios membranas celulares para causar la formación de poros y la tisis posierior de la célula. Ejemplos de estas toxinas son las siete ente notoxinas de S. aitttus y las estrcptolisinas S y O producidas por estreptococos del grupo A. E l segundo grepo con­ siste en dos subunidades: A-B o toxinas bipartita»- Estas tosíñas contienen una subunidad B (o de unión) que se adhiere a tui fccéptur especifico du la célula huésped, y una subunsdad A (o activa), que pasa hacia el interior de la célula e ínteractúa con la diana. Estas toxinas son la toxina del cólera de V. cfwtenur. ta toxina Shiga de Shí%ellu dvsenferiue. la tos toa pertussia pío* duddj por fl. períussis y la toxisia díñéiica producida por C. dtptuhenar lisíigcni?í,dor Cieñas enfemietlades, como el téta­ nos,. el hoíulUrno, la difteria y e] cólera» se deten casi por com­ pleto a los efectos de las toxinas en mis órganos y tejidos diana. El tétanos es causado por los efectos- sisiémicos de la neuro (w n ad «l tétanos., la lubina producida por Cim itidiuM tófani. Suele ocuirir como resultado de ln infección de una herida por C wtam o más rara vez, pnr la inyección de materiales,con­ taminados erm células vegetativas o esporas de C\ letani. H La neurotoxinadel tétanos se libera en Ha lisis celular después, del crecimiento bacteriano en condiciones anaerobias íp, cj.. en heridas punzantes profundas). La toxina se traduce en principio como un pÉplido «imple de alrededor de 1SÜ kPa. En la libera­ ción dé la célula bacteriana, el pepe ido tos ¡na es escindido por ■enzimas proteo![ticas para formar una cadensi liviana (L . JO ID h I y una cadena pesada ili. KM) kDa) unidas por un puente disulíuro; en condiciones rcductoras. los dos peptidos se sepa­ ran en dos cadenas L y H. E l siiio de unión al rcocpltir de la molécula de toxina incaeia se halla en la cadena H. La cadena L se imema y se mueve de^de los nervios periféricos hacia el sistema nen Loso central por iransporte axóníeo retrógrado. Cuando la toxina tetánica alcanza las neuronas en la medula espinal, el cerebro y el cerebelo se lija rápidamente a su recep­ tor, un gangliósidtj que contiene ácido esteárico, eslingosina. glucosa, galactosa. ,V-aeenlgljeosainina y ácido Af-acelil neuramínieo (ácido siálico]. Fl efecto espasmogéníco de la toxina obedece a su acción en los reflejos presinápticos que involu­ cran ineritcurofliui de la ruédala espinal. La toxina bloquea la inhibición postsinápltca normal de ln$ neuronas motoras espi­ rales siguiendo impulsos aferentes por impedimenró de libera­ ción de Ujs neunHraiismisores inhibí üníos (ácidii TNiminotoJií3ico. glicina), Este bloqueo sinápriuodc las neuronas uemralts da ptw resultado bipeítontu tiiuscular c liiperreflexlLL La sensibilidad resultante a los impulsos eícitnlorios, no controlados por mecanismos inhibí torios, produce la parálisis etpüsüca característica del tésanos.u E l hetulLsnioes el resultado de la ingestión de toxinas fum a­ das pur Clostridium btmíhnm que se desattolla en los aliroentos: el principal vehículo son las frutas y verduras enlatadas de modo inadecuado (por lo general caseras), los condimento* y los producios de pescado. Es una intoxicación sisténüca resul­ tante del desarrollo de C. ixuitftnmt y la producción de toxina en las heridas, informado durante la* décadas de I9B0 y 1990 como una complicación de infecciones de heridas en usuarios de drogas pajcnteralesJ™ C. botuUnum también puede coloni­ zar et tubo digestivo de los recién nacidos y producir toxina en ese sirio íhcnulisino infantil).” -** La toxina se acumula en las células de C. batulitmtri dorante la germinación de la espora y el desarrollo de la célula v e g e ta tiv o , pero sólo se libera en ta lisis celular. Los microorganismos déstntü- com^> C. fr¿nul¡-

B Estignnadel dr.VaFbrE so

200 CAPÍTULO 5 Baclertatogía médica; taxonomía, mcrinloqra, llsá-alogia virulencia

num se congregan en Ires grupos que depemtvn dé su* secuen­ cia;:,. de ¿enes para 165 rRNA; C btnvtinum tipos B , E , y F, Cboitílirtum tipos C y D y C, batulinum tipos A„ F y ¡1 . C, botaHnum tipo O se agrupa de forma independiente de lera otros y también se llama C. ^ e n tin e w w .^ ^ Estos gropos correspon­ den a siete tipos. serológlco* de toxinas de C. btmltmm (cipos A , B. C-1. D„ E, F y O [asociado con C. argentineme])* y cada uno producc una toxina específica tic tipo desde et punto de vista ¡luuuttológíco.11? Las toxinas (le los tipos A ,B , E y F son las que afectan a los seres humanos Las toxinas botul fricas originales son proteínas lábiles y forman complejos con proteínas no toxina» para estabilizar las moléculas.114 Lu toxina bomlínica se produce como tina prolefna progenitora con un peso molecular de casi ISO kDa. Estas toxinas se producen conso moléculas inertes que se activan después de Ja p ro c lis is , pero la escisión proteolftica es inter­ na. a las moléculas pepüdicas y las toxinas no cambian su peso molecular después de la activación. Por lo tanto. Ja toxina acti­ va se compone de una. cadena liviana (L ) de 50 kDa y ana cadena pesada (II) de KH) kDa conectadas por un pue nte di sul­ furo. Después de la absorción en el tubo digestivo, Ja toxina alcanza las neuronas sensibles fen las- uniones neuromuscnlare» y en las sinapsis autonómica* periféricas) por el torrente sanguíneo. A llí se une a las terminales presinSplicas, donde bloquea la liberación de acetilcolina de las terminad cines del nervio fiiotoreúlinéfgieo. HL botulisirio se caracteriza por com­ promiso de los. pares craneales, debilitamiento descendente y bilateral, y parálisis de los músculos esqueléticos, y se acom­ paña de fatiga, disnea, náuseas, visión borrosa, alteración del habla, dilatación de las pupilas, retención urinaria, parálisis fl acida general de los músculos esqueléticos y parálisis respi­ ratoria,12 La difteria es otro ejemplo de ir a enfermedad que se debe a la acción de una toxina. Pero sólo te cepas de C iiiphtheriat que contienen un bacteriófago lisogcnico {p-vorinefiigo) pro­ ducen la toxina diftérica. Los genes estructurales pan la toxi­ na (llamado gen iox) constituyen una parte del genotna del bac­ teriófago La expresión del gen im esld regulada por un repre­ sor activado por hictro y la producción de la toxina sucede sólo cuando el ¡hierro se convierte en el sustrato limitante para el crecimiento.llT 1,8 En presencia de hierro (F c í+), cl represor forma dimeros activos con Fcí+, que .se unen al promotor del ¿en m í e inhiben la expresión del gen tox, Cuando Fc: * se. convierte en limitante., cl dimero Fe3*/rcprcsor se disocia y permi­ ten h transcripción y la traducción del gen ia*.*1,1*1 La molécula de toxina se forma por C. diphtkeriat en aso­ ciación con la membrana celular y se segrega dé la célula como un péptido 'im ple que se compone de 535 aminoácidos con un peso molecular aproximado de 5S kDa. Por una protcólisis suave, el péptido simple se escinde en dos cadenas principales, designadas A y B , conectadas por puentes dísulfuro. E l pépiido A es un pépiido de 21 kDa que contiene la actividad enzimátiea de la molécula que inhibe la síntesis proteica, mientras que el péptido B es un fragmento de 37 kDa que contiene Un dominio de unión al receptor C-terminal y un dominio ttanslueador mtcniix E l péptido B es responsable de la unión de la molécula de toxina a su receptor diana. En la unión a la célula diana mediante el péptido B , la toxina entra en la célula por endocitosfr mediada por el receptor. EE p il bajo dentro del ¿ndosomu desencadena la translocación del péptido A (mediante la interacción con el péptido que transloca dominio) hacia el citosol; en ese momento los puentes disulfuro se tCjJueen, se litera el péptido B y cl péptido A se vuelve enzim íti­ camente activo. E l péptido A inhibe ln síntesis proteica por la.

adenonibos ilación del factor 2 de elongación, (EF-2) una enzi­ ma que se requiere pata la translocación del polipeptidil-tRNA desde el sitio dei aeeptor hasta et sitio del donador en el ribosoma eucarionte,f* El grupo adenonibosilo se transfiere desde el nieotinamida adenuta dinucleótidn (N A D ) hasia el factor 2 de elongación por la subunidad péptido A de la toxina, con pro* ducción deEF-2 inactivo: N AD ' * EF-2

' ^-> fldenorribosilíosíato: de la toxina

complejo EF-2 4 nicotinamida + E l tratamiento de la toxina intacta con formalina produce un toxoíde que no se puede separar en Jas subunídades A y B , Por lo tanto, el toxoide carece de la capacidad de catalizar sus efec­ to.-* intracelulares tóxicos: sin embargo, retiene su antigenicidad. La inmunidad a la difteria suele estar mediada porta pre­ sencia de Liiuieiicrpm cuntía la toxina. Todos los signos y los síntomas del cólera causado por V cholerae resultan cíe la pérdida rápida de líquidos desde el imeviino. El aumentu de secreción electrolítica está provocado por una cnleroloxina proteica. La cnlcrotoxina de 84 kDa con­ siste en una subunidad de unión (subunidad B ) compuesta por cinco monómeros idénticos de 11.5 kDia y una subunidad bio­ lógicamente activa (subunidad A ) de 27 kDa. E l modo de acción de la toxina del cólera se describe en el capítulo 8 . Por otro lado, las eadutuxinro se producen sólo por bacte­ rias framneg.ativiLS y están compuestas por lípopolisacárido (L P S ). E l LP S. como ya se describió, es un componente estruc­ tural de la membrana externa gramnegalrva, que représenla los determinantes anitgénieos somáticos CO). Las endotoxina^ son termoestahles, no se destoxifican por tratamiento con formaldebido y se neutralizan sólo en forma parcial por anticuerpos específicos. Cnmpandas COrt muchas de tas eXMOXinnfi, las endotoxínas son de menor toxicidad, Aunque las cnekHoxinas pueden escapar hacia los líquidos circundantes (como "burbu­ jas" sobre la superficie de las bacterias gramnegativas), la célula íntegra por lo general retiene la mayor porción de la actividad tóxica. Las actividades tóxicas y biológicas de la endotoxina son amplias. Giatidadcs del orden de rtanogramoíi de endotoxina causan fiebre en los seres humanos y la liberación de piró­ genos endógenos. Grandes dosis provocan hipotensión, recuen­ tos bajos de- leucocilo-s poíimuifonueleures y pla^uesas pnr aumento de la migración de estas células hacia las paredes de los pequeños vasos sanguíneos, hemorragia y, a voces, coagu­ lación iniravascular diseminada debido a la activación de los mecanismos de la coagulación. La endotoxina también es milogénica para los linfocilos B y estimula la liberación de varias citocinas desde los macréfagoü.

SLperaatigGnos bacterianos Otros grullos de toxinas pM cieas extracelulares, como laü producidas por 5. .ümjvííií o Sos estreptococos [í-hemolíricos del grupo A. son capaces de unirse a péptidos estructurales en los receptores de los Imfocitos T huésped yen los antígenos de hístocompatibilidadclase 11 délos rnactófagos. Esta unión induce la liberación de citoclnas. W rias proteínas extracelulares de $ . tiurcus. como ta rosilla I del síndrome de shock tóxico (TSST> I ), las enterólos inas eituñloeócicas A y B , y las loxinaí e&trtptocícicas del grupo A actúan como "¡mperantfgenosL1 e inducen niveles elevados de proliferación de células T. rápida liberación de IL-2 y TNF-ct. y causan shock.1* Los

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

202 CAPÍTULO 5 Bacte río Iágil médica: taxonomía, mortal ug ia, lisiolojiís y vi rotonda 6* hUffii-tíS, MStfclliSt A M . ( liFTiií R (ij¡ f ln is ^ I k ifiit ji-t^vcd »H .ÍTWjWíWWJH MiiidM ulR K ü iltalv patjMicelkMid* acfunvUil íimi -ni vinücHte leiiirip nf i b lin a c c llu ltf ^IvKDitliiirLdr-íIcr^iofli niuihic. Inlrcc Inm un ly ^ iW íJlíS -

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1^1|LÍ f.ni- | Tfcw B*t I«5; M7;Üi-UT76 K m ilüar [ J L Rotacmwin DC S ik Íh h mai,n.iniAlc«*iln jw.I VBvlm rt' ui iiKr-wrr ¡l*r pal j-ijir^; -.-.‘iffiji -ti-i- i -i l-.lII «pv(3rpe ui-MfinesK- «I '¡mmih and mugti m a iu *rf í t ^ élLi <¡!*H7,u Inmim IM7«;:>HIQ.Í.2H.

77. K iic ; NR. I I l* JO . « I n Bcip ty''' M j W Ií nf SjOfAMiijii IIiu lt^ A i^ v, Vi.il, L. f e j J 'I T n 'T i - :

i&lMi.mí A U¡'il|g[H, U S i .

7H. Kruc££j m i, B jib itn IT. The runih' a F lw lm iL AD Tnhwyliláig fiírinnini. Clin M iotJ mltIR o IW A .W - ÍT . 7W- l i k n M , M n ljü r f H. ÍTftay^l» H. fL * l IllH m slifi mu-,1 b f ^ n t k lM(Tfn»l tairíaff Ili r|»ildl£ li iI ji AÚ U ltrA .J O IH U)l£{fM lfJI J.ik- «pitlflial £CÜ». Ildi.il JjltUWia lW tK Í7 :W 4 J. Híí E n.-»(i'l 5^3 i] K i\ 11r. hl, l*li :■_■!■ L fl l'i. 11i'L-:'1UiI •i ■![ Í J l Trrrj >H111 ■f. Hrw 1 V i' Tl MI itJK a líiiim e iich repeal Hgmu i i kUÍAcitnl :u pruinMc ialm uik/aÜuiL In fK l J ei.isiiísi i ¡y, 1 .4 - 1- u r , | <. r i l ü j f i I>1 h l t ü n r t - T i i l i l i f l f p f « n l u f i í .V j i e iiw th á r x f J V fc d E L flfr ^ l m Jfc > 2 M 3 7 . M3. I íp B í' B«4aiiiin*nl ctertíMiiíaiMiAi>J Jw Hac»in-hhKlum|nileln m.'m tífin t t h - i

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Paíhii^eiiÉsk. IjnrxkHT AcaAntik: P ir a . E9 l^ iw [X . S ln ir t"L 5[p j^ ia AS. ct ii. -TlilfKaittjihMiiircl u ■ nrince in fíi'irríiíiu iH ¡irfI* e n i,iíÍÉ Í ..in T n llM * lr¿iia|xi!n.4a LhjL jtc lI u ií Ií ic lilc J Lu T 11-1-*! I Jcw ii CIm f í J iirm pfrfrinpmr AffliffiKri'i^ IW H j-íj! [ JAÍ-1M T, H-J, H flM ií [, T{í*k»dfl N, V nd iítan a M . M o lm lir rliM D rlc rií'Jiíc i and ffiM sii, Hfluljiis- of Ihz ^lg» rcai'j*!. '»hKl» i ' ipt»;pp«ilj|icrti in Jlx i/Jut ® 3 * w ts JB ^ tc rto l W m T lflJ3 - T J0

■>1 M avui I IJtiTlííli HFl A üireo FE. V iraljisfí I mIímí w ppIjhíkc Iwrkt? x ^ d a rtifti rn ü c i O J O V i iP B V i r ú . K 'í J f l « í n m j p i f s í f i . I B I S

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fiti Muí l l L WcrtK R tlnschol! A Oran parad ve jn il<, c-T I J i n p K tnw inif plnm id* íidin fiTJrJThtH'trnpJim'-uÑi; ik ln lK Q uí i nr»-¡incrl^in ¿k n w r* m pFD I jrml in^HI cicw m í « rtif r.'-ril«kfi o írtin p fcrn ri ínn*|> M ol < ¿frt¡cn fl líW frM ífrítf- o iT . 67. tlilch rai VD, Slrpeclcy T?A Borlrrinl '■rxw fw in itk n » a imdilÑNl rc ll ¡Si' i*'iat N jlu ic (Li.iftJ-.toh ]M 0 £ a itH - W 7 íwl, Hn|IÍPg$tt4 t-'i-H-teli V A . ScrtMP- íVim ffe''r im vrr iJ» tnjuencc r j typf ñ M p ro u n o í IW fnuip A 'licptococcui: repelAu-c rtroelurr in J mcinbTBiF ■Khor. ¡ L W C h r m IW&.2&t;l*77-lótiti. (W . H í * JK j, K m * N R Sníaih P H A , S im k j I T . W iH j± n „ Í¡T . ¡n is t u u i i ni' tte iíü íiM 'iw e IHM&miitíTBjí.inh C J. tljJiim iíu W illLai a ¡1 W íIJuju. IW * . 7(1, H 'ii«|fíi'ri Vi, ’i hr. "u m S C .p m ra \F, cl n! Pihn im l iw ii p ilui hKleriii? «IbeiLrffi^LivinMy -m-l fnnílin* nwiFTli*-"i. £"tl J IM h ^ T ilP íi W(n 71. Huana/inu SiW, .Sfc&jtute M i. Climing and ch*Mcli!rixali<«i irf tibe n m M k itu - T im i

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1029

301. O ib - Jo M ii S.ITw L K tk 'A ñ d Badcriii. LVíjuniiifcn: llM i rin Jiija v 19 i í ]HJ. P^iiiv ES. Y k v U . L íit i f’Á, ft i i CíHKipwinhti oí O ííi- lw fr fíU A ¡ro lv h-H? snd cullunc fui (he ileteeliicn üf A riid eríj x¿ rtittrth á t*tMdi dndiH^n'lJil p[^^i > i ^||. | (_'l*i .Vlimstoil ]W |a3í»i3-SH3. V I’ : Pjrhvljr M I f tr * fi"m « ii r r i r ^ T F 'í . 1 1 1 and llar ImíI siinvbc idatim iliip. lu: F ítí. Kl). etL JtodLiuih4i.su uravinoiii. llietJp pirtuii i l-'jutMfECn^Efc «fl4 l> )í«5f H k « i. H ,: C ftC Prt*. (wi.-l'^j-m 3Qj. h r M ti S7, Cuitj- A R n A l, ft si The vifiiai m^íümü» uf üi«ch.«h^l un ih$ nujAsiiy ur iu’J L i . «Andales Ih ibic lu miK I-jL-.'J JipwiiipiMiKharjili: Mvn as u sHirfjcc a «u FEM S M k-w tal L ta aimj KlS- Pimí t k Vcnwr A . B-ltatAik LC. c<*1 ta n to L ^ a «rpmrfJUÜI-taniJin^ ( hwIc bi tu »hí *pJNÍ3® q s e d *uiT,^r í¡;ira' .1 Í K X iri Aclid &f¡ USA IW 4-. Í J J490- IJ'J-t. HKÍ. F lilK I R , \ b ty H ^ P , ñ h rk in iB A .l'IíI.E h IiL tilt fL'iríunrlhin^l) ú'lini.1 f iJiíip r n ' thtJ h?- S 'riitfriii mr*rx)íit¡
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1 9 1 2 .1 3 : I S 7 - I W

3 JÍK IW 103-21(1. 9.1. h(cttfidc M I, K im p rM J. üc^rJjfniEm l ur lnhDNM> ívt 1lp? p rtrtk EflMIippl-ll^li nflhe flid in ^ lw lm L ílS t’> *T^ JT J Í f^IB'rvHJI1 J Bartm ol l'títóiLlüiíS-'í ííílP

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% . M^tiiTi» R íJE . Sclifarcr K l|. I l m iu m iij ait-v j pitipo^: J ijit r^ ifJin g |!h;ptvp(Ttif* oí puMtivr l» a or pm c^iolFi, lni J St.’í I Q,irlmq| I W j t í ' 17^-17»> W Munny ROE, S4Aíket*nnül E. T m im k m ' c mrtc: uup'kTiiEiüaiiLa oí due pruvLiiKul ^Kiu,-,. f « mompfileielii d tífnijrti iwíXíafHDKr- f-n I S u r Bacierlcl IWS;45 ISfc. ItNJ, MuirDJf "E FVi|.ítUITi OI Srlkrt* E kklMiGii-slkHii í I h! i lu rtria i ¿dkili ut php.AclKJ.iá in f fca’iríuT cfefariu pí[rifll|in-hu híin| |*r
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K r^ in i^ FMJ.'S^IitíEn.^^pídJ^ IJI^A uptA^-m irfi*-mi.¿.'tj',Wj liunAlLdruau(n. Piur S i l Acud Sn U SA 197i?:7h:í72.97á ü-Liirtiiii Y p p . Mitjc'nitai V, Snfíiti F|IA , *d<- í.pfí’L^til llil uí h ii ufrlat «pntev ful 1 íis l Jlnnninl lMKÜ;.ll5t,22ÍL41íl. Slíinufls VH P M cfim tin V, SnpüK PF1A. n li .lirpr^Ttl I mI hw.irn*l h)j « é-«. jln a u l^ ifiJilw ii. Wj.WhiDpKao DW.' Alf^riM ll fm ^llkhitiKiliiur. JíftJ. S |fjiri:(1 Jlevtmdpe Tl Elacleriat.'l Ijj-irr. I™ ic k 'VÍimihijol l*<*f^7:3í.t.2MJ. Sncalh P IlA . cd. IrricrTuLÍDiHit Ccilc uf riim nirlrtm - (H" EIh -Wfí^. 194fl i h » ú i WMf íu iijw ii. IXT. AmrTlL-Jrt V ^ lílj tywí. S n r s lh P l:l \. e d . I n t e r m lif u iu l í> -.k c! ¡'¿jm em iittFV ■■•< Bwíi'ülsl SW2 rfli L*(it1 U'uthiiifJbcm. KT: A m nirm Six iclj ftir M iiivKi4ifC} Í'W2 SlICMh m ,A Mllff NS. Mttrpe MK. H fJl JÍJ, «d. B h j a ’» Mmual ,.r (fetermin*!»* HiiTCfioli^i, VlI 2 S ild n c n Will i™ i W l'lin s l^íü

B Est ¡gnna del d r . VaFbr Eso

Características de las pruebas de identificación presuntiva

Descarboxilación tíe Usina, omitína y arginina Producción de fenilaJanlna desaminasa Producción de sulíuro de hidrógeno

Características de las pruebas de Gribado

Motilidad

Urrl izacón (fe hidrate de caitarci Adivifeú de cíoaonwwlíbsa

Taxonomía de

Reducción del nitrato

E M e r o b a c t e r ia c e a e

Medios de cultiva utilizados para detectar la fermentación de hidratos de carbono Uso de agar ítierro tíe Kligler y agar tnpte azúcar-hierro Principios bioquímicos

Tribu Salmofísíieae Tribu Cjfrphicferasp

Selección de medios de aislamiento primario

TnCi.j KtetefeflSK

Sustancias químicas y compuestos utilizados en medios selectivos Medios de aislamiento selectivos Medios de aislamiento dé alta selectividad utilizados principalmente para muestras

gastrointestinales Medios de enriquecímíenlo Pautas para elegir medios de aislamiento selectivos

Características de las pruebas de identificación diferencial Producción de indol Prueba del roja de metilo

Clasificación de EntafobactBiíaeeas portnbus Características claves para la identificación de las especies más comunes Tribu Escherichieae Tribu Edwdsiefleae

Tribu fróteme

ílrtXI Y&W'W Tnbu Eminfeae Otros géneras r nevos de

BjfoobactsfixBaB CaractoEsficas de ídenliíkaaén ds EnterobatÉrídceae mSs nuevas Importancia clínica de EritffvbactenaGdx más nuevas

Métodos de cribado para la identificación rápida Equipos comerciales para pruebas de cribado Medios de agar cromogénicos

Sistemas de identificación clásicos

Prueba de Vo^es-Proskauer

Matriz en tablero de damas

Utilización de cífralo Producción da u reasa

Diagramas de flujo Esquemas computerizados

B Est igma del dr.vaFbrEso

Características 0$ las, pruebas de idenlilieación presuntiva

Sistemas de codiiícación

Sistema RapJO on£

numérica

Enrerorube 11

Lectura de los códigos ds octales en registradores de códigos numéricos

Micro-ID

Frecuencia de aparición «tim ada

Sistema MicroScsn

Cálculo de probabilidad

Sistema SsnsHitre

Resolución de las discrepancias

Sistemas de identificación en equipos comerciales de determinaciones múltiples Aspectos generales de tos sistemas comerciales disponibles Sistemas de identificación específicos

iViioroptaca Cioiog GN2

Sistemas de identificación semiautomáticos V automáticos fyiiCFOScan Walkaway Sistema Vitek Sistema dé autoidentif ¡catión para gramnegaUvos Sensititre

API 20E

Sistema Phoenix

Sistema delDBBL Crystal EntertoTlontermenter

Sistema OmniLog ¡O

t » biteilos tü-junieeativos peneilecLenles ii E n ie m ln ti túñacenc son las bnc!cii¡» que se recuperan con ma­ yar frecuencia en la* mvCStr** dioicas, Ampliamente dispersos en la naturale/a, esleí, microorganismo* se encuen­ tran en la liciru y el agua. sobre las- plumas y. como lo indica et nombre de la familia, cu cl tubodigestivu de sí-íes tilíntanos y de animales. Antes del advenimiento -de ios antibióticos- la qui­ mioterapia y la» medida inmuncwupresoras. las enfermedades tnfeccimas- ptoducidM ]W liirtemharierim’pae estahítn bailante bien definidas. Se sabía que lo*' síndromes dÍÉirreicos y disentericos, acompañados por liebre > septicemia en los caso* daros de fiebre tifoidea* eran provocados por especies de Stilmonviht y Shigeüii. También, que los casos ciánicos de neuitiorua, ca­ racterizados por En producción de espillo rojo ladrillo o en "jatea de ¿rositas", eran causados por el bacilo tfc Friedlaniter {Kíebsiríki fHiramiuiUi?). Ext kerit;t\m di ve isas especies de Pruteus y distintos miembros del grupo Ktebiieila -Enierv • bacter se aislaban de Las herid:ts (numáiLcas pontami nadas enn tierra o material vegetal o de las incisiones de herida* abdomi­ nales luego de intervenciones quirúrgicas ^jiHimhicc-Minales. Por lo tanto. los miembros de Entembitcieriafeae pueden eslar implicados en casi cualquier lipo de enfermedad infec­ ciosa y recuperarse de cualquier muestra recibida L’ I! el luhnralorio Los pacientes inmunodeprimidos o debilitados son muy « n sables a las infeccione* adquiridas co el hospital, ya sea despuds de la colonización con cepas sunhicntales o iue^o de píoccdirrticmos mVn.n.nL's, comn catcEcrismns. brortercapopia. colposcopia o biopsias quirúrgicas, en los cuales se traumatizan o seccionan Im mucosas. E l slwck endotúijco es una manifestación potencial meóte letal de La infección por bacía ias. gríuimegiitivas, entre ellas, Entembacteriaceac. La endomsina es un polisacárido eomptejo y farmacológicamente aciivo contenido en el imerior de la pared celular de las especie* gnirnncgutivav Este lipopolisaeúrido está estructurado en ires caps: ] i>una porción evienía variable de hidruios de carbono que determina Ja especificidad antígenka O (p. ej., distinlos scrolipos de Stflnmneüa). 2'l un corazón intermedio de poLisaciridt] que es eslrueluralmenle

L

205

similarenirm las especies j J ) una psiieión I ipúdica central muy conversada denominada lipído A. Se lian demolírado capenmentalmente los eíecl, inel u.w>pc-LjurñzLH de endoio'tinsl. MlÍ3 promisorio en el diagnóstico de la sepsis por gramnegalivos es el desarrollo de anticuerpos numoe tonales, que se |HJeücil utili­ zar en el innlunoensayo cnzimjUco u oirás, itxnicav para la detección del h'pido A. Los efectos íarmaeolópicos de la -endotojiina pueden atribuirle principalmcnic al Hipido A. el cual es muy anl ifénico y liene determinantes comunes a rodas Las cepas de hiicilos granne^ativ’üs. Ptír to [unto, la ilelCCclóo del lípido A circulante en los pacientes eon sepsis puf ^ramne^atívos, utilizando un anticuerpo moricvlanaL podría establecer un diapiiivtien con el tin de implementar UO Iralamientopresunlivonnles de aislare identiliesir el microorganismo causal. Los microbiólogos deben estar alemos a la aparten in de cual­ quier emembaeteiia resistente a múltiples antilLuóticos. Los mecanismos por los cuales se puede desarrollar resistencia jedetallan en el capítulo 17. La resistencia a los antibióticos puede evolucionar en cepas clínicas que ames eran sensibles metliame la iransTerencia de plílsmitlos coni*cidos corno faeiores R o plásrnidos R. Las, haeierias eaicricas tíiatnnejíativas tie^ nen casi siempre un plrlsnudo R grande y único que codifica la resistencia a varios antibióticos. Un porcentaje creciente de cepas de ios géneros EnteroUacttr, Sermtia, Klehm lla y Prrn tdtftda* ademas de alconas cepas indol punitivas de 1‘nnewt y cepas resistentes a La ecfaltftina de £st fitrtidtht cotí , tienen [1kictajTULsas qae imparten resistencia cnüUida u muebo* unlibíóticnsi ]J'lactámicos.4Wj,-'n I jis encimas inactivadoras a mcnuiU»

B Est igrma del d r . VaFbr Eso

206

CA P ÍTU LO 6 Enlsnbacletiaceae

están mediadas par vía eromosómica y pueden ser responsabies de Ih resistencia “inlcrcuircnte" en pacientes tmtadoü por

miembros de las enterobaeterias demuestran las. sígnenles ca­ racterísticas:

septicemia. Las pruebas de sensibilidad por difusión en disco no siempre detectan cepas resistentes, sobre ( lm5o cuando -se c^ntúan las cefalosporinas:; por lo tamo, puede estar indicado un procedimiento de dilución «n caldo. No sólo es imporeíinEe detectar estas cepas pura tratar al paciente afociado, sino que es Fundamental, además, para la vigilancia de huí infecciones hos­ pitalarias, En las prtí*3ni» secciones de esto capítulo se expli­ can los síndromes clínicas específicos Je gÉneron y especies, individuales.

Características de las pruebas de identificación presuntiva ¿Cuáles son tos indicios iniciales de que una cepa descono­ cida aislada de «na muestra clínica puede pertenecer a EmeMhucifriacene'? En muestras distintas de las, heces, un. pre­ parado teñido con Gram puede poner en evidencia células de bacilos u coeobaciloü gramnegativos cortos y pictóricos que varían en ancho de 0,5 a 2 ím y de 2 a 4 ím de largo (véase lámina en color 6-1A ). Sin embargo, no es posible diferenciar las especies sólo sobre la bstóc de la mtjrfulogía en la linCión de Gram, La morfología caracierísdca de las coIüíiíjs de un m iauar* ganismo que crece en un medio sólido puede proporcionar un segundo dato. En Sos c m típicos, algunas miembros de hmemhoneriace^e producen colonias relativamente grandes, gris mate, secas o mucoides en agar sangre ovina, y estas últi­ mas sugieren cepas encapsuladas de Kiebsieiki pittutnoniae {\caic láminaen color6-IB y C). Lahcrrtdlisiien agar iuiigrc es variable y no es característica. Las colonias que aparecen como una película delgada o como ondas (fenómeno conocido como trepada) sugieren que el microorganismo es móvil y probablemente una es]>edc tfc Pnneu v (v ía » lámina en color 6 -I D). Las colonias que aparecen rojas en agar de MaeConkey o que: tienen un brillo verte en agar cosina-azul de meti leñó (véase lámina en color 6-2) indican que el microorganismo puede formar ácido a partir de lactosa en el medio. Si n embargo, la diferenciación de las enterobaclcrias se basa principálmenle en la presencia o ausencia da diferentes enzi­ mas codificadas por el material genético del cromosoma bacte­ riano. Estas enzimas dirigen el metabolismo de las bacterias a So Sargo de una de varias vías que pueden detectarse mediante medios especiales utilizados en técnicas de cultiva- En vino. Se incorporan al medio de cultivo sustratos sobre los cuales pue­ den reaccionar estas enzimas, junto con un indicador que puede detectar la utilización del sustrato o la presencia de productos metaWslicM específicos. Mediante la selección de una serie de medios que miden diferentes características metabólieas de los microorganismos por evaluar es posible determinar uí) perfil bioquímico para Ea identificación de una especie. CacacleristicES de la? pruebas ce cribada La identificación definitiva de las enterobaeterias puede requerir una sene de pruebas bioquímicas. Se puede evitar un tiempo considerable y una posible identificación errónea si se efectúan algunas observaciones preliminares paira asegurarse de que el tnicrourganismo que se evaluará pertenece a este gpupo. Si se traía de un microorganismo gramnegativo de otro grupo,, puede ser necesario utilizar un conjunto diferente de características que se emplean comúnmente para la identifica­ ción de las emerobacterias. Con pocas excepciones, todos los

* Fermenten la glucosa (véase lámina en color fi-lE y F). * La cilocromooxídasa es negativa (vÉase lámina en color (> IG ). * El nitrato es reducido a nitrito {véase lámina en color 6*1 H }.

UTILIZACIÓN D I HIDRATOS DE CARBONO Es frecuente que los microbiólogos del laboratorio se refie­ ran a todos los hidratos de carbono como azucares Es convenienie en un sentido operacional. aunque se comprende que Ion alcohole!) poliédricos^ como dulcitol y manitol. o las sales ca* liónieas de acetato o taitrato no son hidratos de carbono y, por lo lauto, no son verdaderos azucares en un sentido químico. El término fermentación también se empica en forma laxa para hacer referencia a la utilización de hidratos de carbono por Las bacterias, con términos como fermentudnnis de lactosa y no termentadoras de lados», Por definición, la fermentación es un proceso metabólieo de oxidomducelón que tiene lugar en un medioambienle anaerobio y, en lugar de os (geno, u n uusiraW>Orgánico sirve como sccptor final de hidrógeno (eledoiwsl, En los sistemas de prueba* bacteriológicas, este proceso se delecta observando cambios de color en los indícadoies. de pH a medida que se forman los productos ácidos. La acidificación de un medio de prueba puede ocurrir a través de la degradación de los hidratos de carbono por vías disi inías de la fermemaeién o puede haber ingredientes diferentes de ln* hidratos de carbono en algunos medios que conducen a productos finales ácidos. Si bien I b mayoría ifc las. bacterias que tttclábulü&n hidratos de carbono son anaerobios facultativos, es posible que la utilización no siempre esté en condiciones estrictamente anaerobias, como se observa en la producción de productos áci­ dos por las colonias de bacterias que crecen sobre la superficie de loa medios de agar. Aun cuando es posible que no todas las pruebas utilizadas para medir la capacidad de un microorganis­ mo para degradar enzimilicamente un "’aiácai” en productos ácidos sean "‘fennentativas''. así se denominarán en el texto por conveniencia. Principios bátieoí óe tafetfflMtación. Los esiudios de Pasteur de mediados del siglo XD£ sobre la acción de las levaduras en el vino proporcionaron la base de nuestro conocimiento actual de la fermentación de los hidratos de carbono. Pasteur observé que algunas especies de bacterias eonlami ñames producían una caída en cl pH del vino {un sustrato hidrocarbonado} a partir de la producción de distintos ácidos. Foco después surgieron des­ cripciones completas de las vías femientalivas por medio de las cuales se degrada un monosacárido como la glucosa. Medíanle una serie dfi escisiones glucalílieas V transformaciones eíi/_Emáiieas, ta molécula de glucosa se dividido en tres compuestos de carbono, el más importante ¿le los cuales c$ el ácido pruvicu, La secuencia química medíame la cual La glucosa se con­ vierte en ácido pirúvico se conoce como vía de EnibdtmM cyerhoff (íig. 6-1}, Muchas bacterios* entre ellas todas las entembaeterias, fermentan la glucosa a través de esta vía para formar ácido pirúvioo; sin embargo, la forma enmr» se adiciona ácido pinlvieo varía según la especie de bacteria. U » destinos alternativos del ácido pinlvieo son cl resultado de distinlas vías de fermentación, que arrojan productos bastante diferentes (véase fig. 6- E). Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que mctaboliz-an y por los tipos y las cantidades de ácidos produci­ dos, Estas diferencias en la actividad enzimáüca son una de las

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

Características do las pruebas de identificación presuntiva 2 0 7 Figura &d Fcmcntadfo de Ij eturosa |i»irj. fomur ¡piru^iu ívíj J í Embíkn-McjfCThlufl y los Llfrttimrw^ÜcnwtjwM lícL ¿CMf» ¡alivien.

GLUCO SA

GLUCO SA é - FOSFATO

FflUCTOSA S- FOSFATO

FRUCTOSA 1.B DI FOSFATO

■GLIGERALDE HfDO-a-FOSFATO Ácido pnopiónica Ackíd ÍArmico--- + ■COr ÁeKJo succi'fikcc -

ÁCIDO piRÚViCO

Aqetil-CoA--- Ácido acético

Acelatóehfdo

Ac^tii-metii Alcohol etílica

ACIOQ LÁCTICO

(juwtqi'íi?) 2,3 tsutlUmgljcol (byianedlot)

principales earuct ensilas pi>r las cuales se reconocen las diver­ sas especies, Es importante que los estudiantes de microbiolo­ gía comprendan que en la formaciún glucolíticade ácido pírúv ino se genera atleníwimrifosfalo {ATP} a expensas. de lu reduc­ ción tic adcnina nicotinamida dinuclcótido (N A D ) a KADH¿. Por cada molécula de glucosa que se fermenta para formar ácido pirúvico» se consumen cuatro iones hidrogeno a través de Ui reducción de dm NAD a dos NADH:. Dado que cl NAD total en La célala es muy limita Jo, 1a femienlaeión tesaría muy rápidamente si cl N A D JI, no fuera reoxidado en cl metübolismo ulterior de ácido pirüvico. En ta figura 6-2 se muestra la fermentación de tres moléculas de glucosa por medio de dos v/as alternativas Por ejemplo, la fermentación de glucosa por Eschgñchixi culi ocurre por lu \ ín de fermentación du ácidos mixtos y conduce a la producción de gran cantidad de ácidos acítifn, láctico y fórmico enn Linn acentuada caída del pH en eE medio de prueba. Ksro se delecta medíanle una prueba de rojo de milito positiva (véase fig, 6-2). Por otra parte* las bacterias del grupo Ktebsieila-Efflervbactrr-Hqfhia-Serralia metaboli­ smo c I ácido. pí ni vico prtníJpLilmeiiie □iriivdít Je ía vin Je ] huiiEenglicoL, con producción de acetil medlcarbitiol (acetoína) y una prueba de Voges-Proskauer (V P } poshiva (viéase fig, ft-2í. Obsérvese que los principóle» productos torminales en esta lilúma vía son alcoholes y sólo se produce una pequeña cantidad de ácidn, pnr ln tant-n, ta prueba de rojo de m í ti lo suele ser negativa para este grupo de microorganismos. K1 ¿as tute resulta de las bacterias termentadoras es fundamentalmente una mezcla de hidrógeno y dióxido de carbono que se Turma a través de lu e lisió n del ácido pirúvie¡>. Es un principio general yceptado que cualquier bacteria que forma gas en cl medio de prueba de hidratos de carbono debe formar primero ácido, lo Cual es evidente a partir del cí-quema de la vía

Ácido buiínco

corbinol

buiilicn

de [■mhden-Meyenboff que se muestra en la figura 6-1. Es mejor delectar el gas ulili/ando tin medio de fermentación de hidratos de carbono en caldo en el que se colocan pequefios tubos» Durham invertidos (véase lámina en color 6-lF). Se pueden detectar incluso pequeñas camidades de gas, que se acu­ mulan como burbujas en el fondo de los tubos Duitiani Algunas especies de enterobacterias carecen de 3a enzima líenlo fórmico deshidrogenaba y no pueden escindir el ácido fórmico; en consecuencia, no forman siquiera pequeñas canti­ dades de CO,. (p. cjJ+la mayoría de lúa especies de Shigrila)* Por el contrario, los microorganismos que utilizan Éa vía de! hutilcogí icol (que son Voges-Proskauer-positivos) producen grandes cantidades de CO; (véase fig. 6-2J. Por lo tanto, estan­ do se observa abundante de giis. se delion constdentf tus mk*:»bros del grupo A'ft'Iil¡ffSiJi-EnIijrt>bucíer-líu/riia*Scrra11¿j como pmhahlc i den! iFicaciÓTi r La formaeion de alcohol elílien por parle de los microorganismos es de suma importancia comer­ cia] en la elaboración de bebidas alcóhoiicas y reactivos orgá­ nicos: sin embargo, tiene una utilidad limitada en !a identifica­ ción de tíaetciins poi et laboratorio. La fermentación bacteriana de lacnofia es más. compleja que la de glucosa. Lu lactosa, es un disacárido compuesto por glu­ cosa y galactosa, conectadas por un enlace de oxígeno conoci­ do como enlace galaelodidlee. Con la hidrúlbus,, esle enlace se corla y libera glucosa y galactosa. Para que una bacteria metaboliee lactosa, deben prescuüaníc dos cnriTrus: I ) la fj-galyc(ósido pemteasa, que permite el iranspone de an fi-galactósido, como lactosa, a través de 3a pared de la ctfhila bacteriana y 2} la (Í-pa]ac|oHÍdjsu, necenaria para hidrolj jar el enluce (J-ga]actósido una vez que cl disacárido ha entrado en Ea cólula. La degradación ádda final es el resultado de la degradación de glucosa como se muestra en la figura 6-3.

B Est igma del d r . VaFbr Eso

208 CAPÍTULO 6 Ertmtáflffartaca# ;3) G ucüsá

-12H (&>Acido pin^cg ------1

J

Fefmeütncióm dol outiionglicoi (3) (2 ) \ {2] Ac¿d& 3 CO, acético AcatcJicttto \

Fermentación di ápdw nuslM (3) íl)

[2]

44H , Aleono) étnica

(Él Acido fórmteo

a co,

A

AcelilírvoMtarbinct 4 6H (acato(na) I------(lj 2,3-butilanglicd

CO,

H,

N&itol + Creatina

Un pH c 4,4 Mnvi&rte &i indieactór Compleíi rojo (prueba do Uog&s-Fraskauflr pDEitrva) Sene de r&Kdenes r"

■ ■

da iojo de metí Id Cücr rdfd (prueba de» rojo do motilo posíirvaf

.-■ *

Raacfflfin en un paso Figura 6-2 Vias & ¿ddcw rmiuns y hnulíiidliciii tle farmíniaekiíi ií« la, flüíw a.

Como La fennentac iún tic La lactosa finalmente projiijuc por medio de la degradación de glucosa a través de la vía de Embdcn-MeyenholT. cualquier microorganismo incapaz de metaboliyjLr glucosa no puede formar ácido a partir cíe lacios*. Esto esplica por qué se omite la glucosa de las fórmulas de los medias de aislamiento primario tumo el pgor de MacConke)' y cl agar

LACTOSA g lu co sa

í -

Énlaeo ft-gelsci^sfdo

GALACTOSA.

eílH-Ltíil-uiLil Jn n ic lilc r u ; si

fi-gar&ctásHfo peimeasa

g lu c o sa

[l"ga:úctosidasa GLUCOSA +GALACTOSA

GALACTOSA U GLUCOSA

S

Pared de te ráhJa bBcterianá

t A aD ü PIWJViCO

I Ac id o s m ixto s

Figura 6-3 FenWrtiCiAs hraetiiitade la Incisa' |i. tare***, rkucrinrin enmpve.nu pornoolÉculas de ¡jIulusj ¡f üjIílL - v i anidan por u-n enlate (1 j¡;iI;wi-.'ímLJií, se difundí J d? la pwpd da la orluln harterianu. hnjo SM Í.^ dfi ln ll-g¡ilaLíiisiiljMj p rnutasa. Si li badc-ndi pn J u t c ]J-¡íaliltt to ld a n . la lv:Ui^i en Jiilnnlir.ada paru (m Ju d f eIlK'UJJ y p lx tO U . La gtu^na a lur^is irtmfcklLj'iKta «uno s* rnufiiíB n i la figura 6-L

ta

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nm iticn»,

p erd ería ht h-"ifrit=

dad para detector la capacidad fermeniadora de lactosa de la* bacterias de prueba. En el medio de prueba^ et parámetro de fer­ mentación de lactina e* la detección di; prodUtcfón de ácEdü- Un microorganismo no Termentador de Lactosa es aquel que carece de utui o de ambas enzimos necesarias para el metabolismo de la lactú^ o que carece de la capacidad para aiacar la glucosa. Se crcc que Eos denominados fermcnladores tardíos de lactosa soíi microorganismos que muestran actividad de (l-gaiactosidasa, pero una actividad perezosa de fi-galacujMdu pcirnc^a. P 'ftfM ttM Í& r* y piveb* d$ ONPH E l o-nitrofernl-fl-D'galnciopimnrtsido lO N K i) es un compuesto estniciuralinenre similar a la lactosa excepto en que Lu glucosa ha sido reemplazada por un pupo o-nitrofeililor Eslu manipulación ¿ügo ingeniosa de la molécula lumia lu base para la prueba de ONPG, que se bqsqueja en el protocolo h-L Ésta prueba detecta la enzima p-galaetosidasa mucho más nípidamenic que la prucha para la fer­ mentación de lactosa que describimos ames. Esto es útil para identificar Los íermentadorns tardíos de Lactosa que tienen una deficiencia de ^-galacldsido permeasa. El ONPG penetra en la célula bacteriana mis fácilmente qrue ta lactosa y. bajo la acción de la p-gafactosirtitsa, se hidroliía en galactosa y rt-nitrofenol (víase protocylo h-1), Et o-níifofertol un m fflúfow incoloro cuando está ligado a u-^alactopiranúsido pero es amarillo en su forma libre (no ligada) (véase lámina en colur 6-4A). Se comercializan labletas pnra pmeha de ONPG que se pue­ den reconstituir rápidamente agregando una pequeña cantidad de agua y cuyo uso es conveniente en el laboralorio. Los miero-

B Estignnadel dr.VaFbrE so

Medies de cultivo utilizadas pana delectar Sa fermentación da hidratas de carbono 209

organismos con una actividad fuerte Je f^galactosidasa pueden producir una prueba positiva pocos minutos después de lu ino­ culación del medio. La prueba de ONPG es m u y útil para la detección de actividad de [J-gaEaetusidusa en Eos fcrmcmtadoícs tardíos de lactosa, cenia algunas cepas de E. cvíi< en las cuales la diferenciación de las especies de Shigeltfi {salvo ciertas cepas de S- xm nei} puede ser difícil. 1-a pruebo también es útil paro distinguir algunas cepas de a p c c íu de Cim tbüiíer y Salmonella ser. Arizonac (ONPG positivas) de la mayoría de las especies de Saim m eita (ONPG negativas). La prueba ONPG no es un Sustituto de U determinación de ];t fermentaci6n de lactoia porque sólo se mide la enzima ^ulactaüidasa.

NO FERMENTADORES Sin íwmflíilaeifln

Pico do flauta s*c*üno/ profundicé;] alalina

pH = 7,4

^ — NO FE BWENTACKJRES DE LA U C TQ SA

ÜEXfROEA

IDOÍI

Pico (Je tarta áekfcs/ profundidad acida ñuiKxicn intaal

MIXTOS

ACTIVIDAD OE CITQCRDM'DDXIOASA

Cualquier microorganismo que muestra actividad de citocromoosidasa fuego del procedimiento y las condiciones de prue­ ba señalados en cl protocolo 1-5 es cactuido Je las enlcrobacicrias, La reacción de color en desarrollo debe interpretarse detvuo de les 10 a 20 segundos porque muchos microorganis­ mos, incluidos algunos miembros seleccionados de Eas enterobacterias, pueden producir reaccione* falsa* positivas tardiw». Si es. dificultoso interpretar la reacción de U ritocromooíidaso se deben evoJuor tanto los microorganismos oxidasa positivos como lososidasa negalKos. Se utilizan masa menudo por con veniencia goteros comerciales, de CLCoeromooiiidasa. Las reac­ ciones de color son claramente visibles en 10 segundos. Si se utilizar en cl laboratorio ansas o alambres inoculadores metá­ licos para transferir bacterias al reactivo oxidasa, los fabricadas con ^cero inosiLíable n N'iehrotne® pueden producir neaccíorici. falsas positivas debido a pequeñas cantidades de ó*ido de hie­ rro sobre la superficie encendida del metal.. Este problema puede evitarse utilizando ansas mocu (adoras de plástico o píatino o mediante palitos aplicadoncs de madera o hisopos de algodón para realizar la prueba de ojddasu, Se utiliza princi­ palmente tetramctil-p-fcmlencdiamina. m£s que cl derivado di metílico, porque el derivado es más estable, nüis sensible y menos tónico {véanse protocolo 1 -5 y lámina en colnr fi- IG ). REDUCCIÓN DEL NITRATO Todas las enterobaeterias, con excepción de ciertos biotipos de ftw w ea agglomí'rúns y ciertas especies de Serraría y reducen el nitrato a nitrito. Como se necesita un peri­ odo variable de incubación (3 a 24 horas, según el sistema apli­ cado) para realizar la prueba de reducción de nitrato, no suele utilizarse para cl cribado preliminar de cepas bacterianas des­ conocidas. M ¿í bien, lá prueba se utiliza cu la mayaría de Esjk laboratorios para confirmar la clasificación conecta de un microorganismo desconocido o como auxiliar para determinar lu identificación de especies buclerianas. Erl cl protocolo G-2 *e detalla Ea prueba Je reducción de nitrato. Cualquier medio basal que facilite la proliferación de microorganismos y (iue contenga una concentración de 0, 1% de niirato de potasio (K N Q j es apropiado para esta prueba. El caldo de nitrato y el acar nitrato en un tubo inclinado son los medios más utilizados en Ins laboratorios clínicos- Como la encima nitrato reduetasa tiene una actividad másima en condiciones anaero­ bias, Zobeil ha recomendado cl uso de agar semisólido,3'* Los medios semisólidos lambían aumentan el crecimiento de muchas especies y proporcionar» el medioambiente anaerobio necesario para la activación enzimática. E l agregado de polvo de cjnc a tridas las reacciones negativas, enrno se muestra en cl protocolo ó'2, debe ser un procedimiento de nnína, La mayoría

FERMENTADOF DE LACTOSA

^SUCROSA?

Pito <3* harta ¿cido^ piofundiCcía ácida C Figura 6-4 Tres upu* uCnrruIcs Je reaLiLiaic v prodiU-idui ¡hit Lai harten ¡n l;lc crean il» ¡ipíJ hierro B e llo s nci fÉfirtfrtr±i.w¿:i qu¿ itt» pisfcifefl piixiuur blmJus «i pulir Je la. ¡i:: i:íi::iLi;.i.cji U? Ja. |:Iik.usj u tú Jjv-Ujqu. :iu cu sir ningún fa/nMo en ti medio irtjwwriradü por blanco) (B l Acidificación i niciil ifc Id pivíundidjul >Iíi juirle inclinada y pende fluum lL I jeh.-Jk» (dm r w « íitiTí.1 .i ptr las h¡k'(en¡r< que l'rimrnlun l.i gluonj, peni l¡i piiTf ir*-!m¡ulu ru^icilif ¡iii^'iiüibír.ie ±pH dtáli&ú li i noiidj \c fúnskui íiílíúlls iW linBü j ¡unir «le U dfwsrtKn ilación Píidativn df lop pípndcw- (deñvndDs: tlf pirttírea tn rl niítLn i caca de la lupcrÍLcie. (C> AcsJiricacióis prrniitiiri^ecdiiiplcldiie L pri> íuratídiiij y cl pico de fln iu dfl Tubo por Im Jw n e rí» que fermentan k tHtnu.

de los mieroorgiinismos que reducen los niüotos lo bucen den­ tro de las 2 J horas; algunos pueden producir cantidades Jeteo tables dcntrD de las; 2 bnras. Schrcckcnheiger y B I í k v ÍC descri­ bieron una prueba de nitrato rápida.4*4 Tanto la a-naftilamino como el ácido sulfanfiico son relativamente Inestables., de modo que su rcacüvklad debe determinarse a hiérvalos frecuentes mediante la evaluación con microorganismos positivos y nega­ tivos en Eos controles. El compuesto diazonlo que se forma a partir de Ea reacción del nitrato reducido y los reactivos lambién es relativamente inestable y el color tiende a borrarsel en conseeuencijL, se debcu reallia r Ee-ctmos puco después de a^re^ar los reactivos {véa&c lámina en coEor 6-1H).

Medias de cultivo utilizados para detectar ta fermentación de hidratas ds carbono Se pueden utilizar rtislintos medios líquidos o de agar para medir la capacidad de un microorganismo de prueba para utili-

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

21 0

CAPÍTULO S £nt$rpt}aci$rtaee¿$

zar hidratos Je carbono en forma fermentativa. E) hidrato de carbnno c¡Etc se va a ^valuar, como Ja glucosa. es esterilizado mediante un. filtro y se agrega en condiciones asépiicas a un medio elemental hasta una concentración final iJe 0 J- lhC ^ L La fórmula típica de un medio elemental de fermentación con Lle­ ne triplicaba (RPL.i. líl g: cloruro de sodio. 5 rojo IcnoL U,i.5J 8 e y aeua destilada hasta igualar 1 L. La Iripticasa es un hidmlisado cíe caseína que sirve enmo fuente ííc carbono y nitrógeno; el cloruro de sodio es un estabilizador osmótico j cl rojo teño] es un indicador de pH que vira al amarillo cuando cl pH del medio cae por debajo de ó.fl- En la lámina en cnlor G-IF se itustran las: reacciones de fermentación acida en medio de caldo púrpura. Todas las entembacterias crecen bien en este tipo de medio y la fórmula base utilizada depende de t;i prefe­ rencia personal. Además de provocar un cambio de color Ji=] pH cu Los medios de cultivo de fermentación. la producción de pcidus jniítíis, en especial ácido butíricn, li menudo ocasiona un olor félido y acre en el medio de cultivo. Cuando se delecta esie olor, se debe sospechar de inmediato la presencia de cnterobactcrias (además, las bacterias anaerobias producen produc­ tos mctabólicos característicos con olores definidos). Usa de agar hierra de Kllgler y agar Iriple aiúcar-hicrra

En la práctica. los microorganismos capuces de fermentar la glucosa se ddecian observando las reacciones une producen cuando crecen en ayar hitrm de Kligler i KLA ? o agar iriple azú­ car-hierro
Recuadra 6-1 A g a r h iErro rfe KligE&r Estracrp de VMmrw*, i Eu rjrto de levadura. 3 g PefKúna. t i § PqHÜIMl cfc piowosj. 5 p L k &h i , 10 j Glucosa. 1 fl SuEfalo ferruw), 0,2 f

ncirum

««Ip*, 3 E

Tiwulfaltufc \ík ,|hs. U„> £ Ap.i:. L i p F¡,ijn r-crml, 0,0-J y Apvm d^-í.tsL*flq ln*a;L í ^ u I:lt 1 t, píi Fíih I. t.-l

están distribuidas de manera uniforme tanto en la pote ion incli­ nada como en la porción inferior (profunda) del tubo. Sin embargo, la lactosa esid presente en una concentración 10 veces la de la glucosa {asimismo, la relación de La sacarosa con la glucosa es de 10:1 en el medio de agar triple azúcar'hierro). Esta relación 10:1 es importante para comprender los princi­ pios bioquímicos que se explican más adelante. El sulfato terroso como delecíor de sulfuro de hidrógeno es algo menos sensible que otras sales férricas o ferrosas; por consiguiente, puede babel1 discrepancias en las lectura?, de sulfuro de hidró­ geno entre agar hierro de Kligler y agar triple azúcar-hierro y otros medios de prueba (véase lámina en color 6-4E Jr Et indi­ cador rtijo íenol es amarillo por ílebajn de un pH de 6 ,S. Como el pH del medio uninoculado está amortiguado a un pH 7,4, las cantidades relativamente pequeñas tle producción de ácido conducen a un cambio visible de colur. Principios bioquim icus

L»s principios bioquímicos subyacentes a las reacciones observadas en agar hierro de Kligler o agar triple azúcar-hierro se muestran en la figura 6-4. Obsérvese que el agar fundido se deja solidificar en un lubo inclinada. Esta configuración condu ­ ce esencialmente a dos cámaras de reacción dentro del mismo tubo, Líl porción inclinada del agar o pico de flauta, expues­ ta en tuda su superficie ul oxígeno atmosférico, es aerobia; la porción inferior, denom inada parle ¡nfcrínr o profunda, esd protegida del aire y es relativamente anaerobia. Cuando se pre­ paran l**s medios es importante mantener de igual longitud la porción inclinada y la profundidad, de unos 3 cm cada una, de modo k|ue se preserve el efeetn de dos cámaras. Los tubos de agar hierro de Kligler y agar triple azúcarhieraí se inOCulán con un alumbre recio y largit. Lu Colonia de prueba bien aislada recuperada de una placa de agar se loca con el estremo de La aguja de inoculación, el que luego se punza en Ea profundidad del tubo, extendiéndolo ho-sia dentro de 3 a 5 mm de su parte interior. Cuando se rciim eJ alambre de inocu­ lación de Ea profundidad del lubo> se raya la superficie inclinada con nn movimiento de atrás hacia adelante. Los tubos ino­ culadas se colocan en urta estufa a 35 °C- durante IH a 24 horas. Las folugrafias que se muestran en las láminas en color 6-1E y 7-1A evidencian las reacciones que se describen en el recuadro 6-2. Así, como ^e mueslra en la 11gura &-4A y en la lámina en color 7-1A. -sin férmentaejón de los hidratos de carbono no se forman ácidos y La prudücción de aminas en La porción incli­ nada. junto con los buffers alcalinos, tiñe de color rojo Hxlo cl mcdiei. Las bacterias que causan este iipo de reacción se cono­ cen como no fcrmmr&rioms (véase cap. 7). Si se inocula el tubo de agtir hierro de Kligler con un micro­ organismo fermeritador de glucosa que no puede utilizar lacto­ sa. se ptiede obtener sólo una cantidad relativamcnie pequefia de la conceniraeión de 0, lífc de glucosa en el medio. Al princi­ pio, dulance las primeras H a 12 horas de incubación, incluso esta cantidad de ácido puede convenir el COfor de la pintfumlidjL.1 y ile la purcióu inclinada ul arnariLlo. Siu embarco, en las horas siguientes, el aporte de glucosa se agota por completo y las bacterias comien7an la degradación o*¡¡dativa de los amintv ácidos dentro de Da poción en pico de flauta del tubo donde hay oxígeno. Esto libera las aminas que pronto contrarrestan las pequeñas cantidades de acido presentes en la porción incli­ nada: para las 1B a 24 horas, la totalidad del pico de llauta vira a un pH a leal inn y el color retom a al rojo. No obstante, en la profundidad (porción anaerobia) del tubo, la degradación de aminoácidos es insufle ienie para Contrarrestar el íciil» forma-

B Est igma del d r. VaFbr Eso

S o’gccíoP' do medios do orstamionto prima rio 211

Recuadro G-2 Reacciones en KlA Pica ilí ih.iLii.u álcallACuPrDrurdldJd alcalina fH.'Kl Mb hay rtMTficnlnir'ii.in clc histqjlasci Je cjichtinn. |í*Ln e» comLlcriiLi™ Je Lt% h-iiEL'n:: ■ raí i í m v n i .

c « * t n f‘ i , n

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t i r n i $ m t i ?rj

Pico ds fliuts aLc¿l LiD
ii.i \

'.!l SkiiiflLt

Pita de liadla alÉallno/Fnclundrjad atu.s [negra| 4K/Affl£) G liu tm fcmvDtadaí lu io u

im

fmntnrrulj, w jwixfcice suEfü¿D de ludrójc-

nn F.vlit t 'i LarTn. lLTi'-[^-i' lIi,- tus Í k ilIltI j\ l|lji:

11c. ¡líiIIhMIUII IjuTMu ijLtf J'Hi-

dttveii *uJlunnfe hiUr(h£«n
Pin de llaula acidoifronuidiffad acida (ii'A) Cjliuri i« i v L actu ca <«j s u ta K im i?nn T 5 I ) tciM cn taiL iN . L s íu e s L'.at'.M .IcrfrÜu

¡ de Li*i uriEiÑmiiiJX qiic 1'cmsfinlni la lacKVta. cíuiw E rch rrífk iá c n ii y l u p ¡ | 't * ií i¡ * s l I í ' I « ^ - i i r i p l t i j » K t f M t i i f l - t i n t e r v b a r t & r

do y cl medio permanece amarillo. Por lo Santo, la reacción akalina-pien de üauia-acida-profundidad en agar hierra Je Kligler (o agar tripla azúcar-hierro) es un indicador inicial importante de que cl microaigiinismo en prueba no es fermtnlador Je [a luetusa (víam e fig. fs-415 y Lámina en eulejr fi-1TiJ. Si se inocula el tubo de agar hierro de Kligler con un inicioorganismo fermentador de la lacíosa, incluso cuando se agote por completo Ja glucosa después de las primera* K a ü horas. t:i fermeniaejón enmirtda mientras ti ¡microorganismo pueda utilizar lactosa (presente en 10 veces lu concentración Je glu­ cosa), En consccucncia, cuando se exomina cl lubu at fnul Je 18 íl 24 horas, sigue ocurriendo la producción de ácido a partir Je la fermentación Je laclosa y utnto la porción incliriaiL:a como la profundidad se presentan am&rillas. Jo que conduce a una reacción ácida-pordón inclinada-ácidu-profundidad [víanse fig, 6-4C y lámina en color 6-1E), \1uehr lo tanto» en agar triple azüeai'hierTO la rtitetíúti Mírd deida-áckLi (.similar a los coniformes como £ culi), pero en agar hiem> de Klieler. lo reacción aeni alcalinaácida Sim ilar a un no termentador de lacto^a^ lín consecuen­ cia, cuando se evalúan muestras íle heces para Saimonefia, Shigtüü y Yersitiiii. algunos autores podrían argumentar que el agar hierro de Kliglcr es preferible al aa.nr triple azúcar-hierro. Pa n la detección de sulfum de hidrógeno, que es incnlcsrn. el medio debe incluir un indicador, bl tio^ulíato de sodiú es la fuente üe átomos s£c azufre en la mayoría de los medios titili* /adoupijrsi lu producción de sulfuro de hidre^eno, Las sales de

Hientt (sulfato ferro:*) y eirraro amónico Térricoj incorporadas en los luedioá de cultivo reaccionan cníonecs para producir un prce ipil ¡ido nejím inscilublc (suifum fenrao). Se necesita un medicsqmbientc ácido pan» que un micrtmirganismn produzca sulfuro Je hidrógeno y, p¡it ln Utni«. ac Jebe proveer una fuen­ te de hidiogenlñneft. Ctuno la jKireión ji^d'unda de los lubos de agar hierro de Kligler y agar triple azúcar-hierro se vuelve □ lÍJll con ia f^rmcnLicinh Ju Ea glucosa (aumenlatt huí hiJrogenionesl» el ennegrecimiento -¿uele obsenarse primero o está limitado allí, sobre todo con Eas baclerias no ícrmcnladoras de laclosa (víase lámina en color N 1 K), l^or consiguiente una porción profunda negra debe leerse como ¡Seida aun cuando el umaiiLEu habitual sea ustüreeido por el precipitada negro. E l □gar hierm de Kligíer y el .a^ar triple a^úcar-hiém) son menos sensibles en la detección de sulfuro de hidrógeno qiie otros medios que coniienen hierro, como medio para mmilidad del sulfuro irnlnJ (i-case [íiminia en color Ó-4BJ, Si es pdsihlc c^clirir el mkn«irganisnwí de Jasentóttrtwciírips alltes Ue e.slabEecer urui .serie extensa Je pruebas biuqujmicas, se ahornará un tiempo y un trabajo considerables. Cuando se sos* pcchü cepas itií/ria,\r Pitxia* tfiofíiia, Ví^no ) hístt'unrilii, que son oxidaba positivos.

Selección de medios de aislamíenlo primario DcIkP Util P/áfifc inedia de eultitro seléL(ilKM paia jisiaf |aü especies importantes de bacterias de muestras que pueden albergar una mezcla de microorgimismtvs, F'ani t|ue 3a selección meional. Iris microbiólogos deben cítmtcer la composición de cada fórmula y el objetivo y la concentración relativa de cada sustancia química o compuesto incluido. Por ejemplo, no es. suliciciue saber que se incluyen sales bilí aires en las fórmulas de algunos medios selectivos para inhibir cl crccimicnlct de grampositivos y algunas de las especies ík: baclerias gramneg.jitivüs enn requetimiencos nuirieionales especiales, por ejem­ plo. el ajjar para 5ü¡moti£Í!ü -5h¡-I j b-2 í¡e comparan Ion. medios más utilizados en la práctica clínica. La.s fórmula# son complejas e incluyen ingredientes ujc no sólo inlilbcn el crecimieruto de ciertas especies hactcrianas \.selectivos}, sino que también detectan varias características bioquímicas de líis microorBanismos presentes en la muestra (diferencial i. Sustancias quimicas y compuestos ultliiados en medios selectivos L il e l recuadro

f i -3

JIC enum eran lo * tipos g enerales

.E l-

su s­

tancias químicas y compuestos utilizados en medios selectivos, con breves comentarios sobre la Junción de cada uoo Lie ellos.

B Est ¡gima del d r. VaFbr Eso

212 CAPÍTULO 6 EnlamludwrtxMaB

Cuadro &■1 .Vítdlos diferencial» selectivos pora Ln recuperación de Entfroítaiiftiactae

MRIHO

FÓRMULA

A¡j lu Je MacCockey

PtfffiMUl Pitli^icF'Li'iiii L k iw i

>s c a s r lá rtU b i t a

cdcrrfc-ÍA y B)

Sales tallüTCi

ClíJfMm ifc-SíKlb Agar ntLinm Vudeta de getKuiiu

\uuii. ÜSMijuJj >¡r,lj

l7£ H 10i L3* 5E U.5* <M» f. njn] $ iL

pH final.?,3

OllJWnVO F, INGREDIENTES DIFERENCIALES

REACCIONES E INTERPRETACIÓN

El agar de S L u C u ity ei u i medio de siem­ bra düftreíidal patu la sekfñiün y rccupcracii'ni de EhMffútKlrriae+ae y bacilos g.ran>nejaiiucni enr¿rleos reí a¿ nuiados. La» \dc% biliaret- y «I vioku ik yon ¡ iii.i inhiben el «iKiBHCTito de las hocteiiai sramiHnitivui y algunas hacicnat gramnegativas ron reqoerimlenflui BüUicijünaleíi espeseiales La lactina n rl únicu hiilfflu de L--irhi>ruí L ili

L ia fermcnlodore^ íuertei Eípitüs df la kwto siü. como ¡ilgynai especies áe fjcAí'rifAiW . KJf-MrWtVj y producsii cfldoqLss m J oí mikmdEi po/ una zona Lk hilis preíjjii taila Los feTOBT^wtoiei. Iert«í. d (téí>ilr<: .ic 3» laeíoss. fim o CitrrtKrter. trmidencia, Sertmhí y flafitia. pue4feB píím um er

feulis'izh qien fenraenlan laeinsa prjdiiLiM

criolita di Umbral virlííUli Se1rojo. détinlfi

SiitmnmeBa y Ski/pltei, curt r¿ids t q.txpi.ign□ eü , f n.nJiii.xzi L u l n : ; ; ; , |]:ci'IoImv u lr.in.tpj.

a j'jw e it ¡aculara» o in iupu rea li»

(víase- l/unira, «i cíilof (v2C a Fj

,0f 31 5i ¿í n St

Pept«u Ljftos-í

^acarcMfl* Dipotailo, pot AH.iT :r_:i V A /iíI ríe tnrhLer™

A p a Cintilada tiasfci pH (íhbL 7.2

0.4 g OuOWjí I L

nMüil'V, L_n 24^41 Ji

Ateuiua «pwts * rmifití. EdwaTfbirita.

ncu L m íriijti pf*r iJ(1k ijo J e p}| é.bíj i pj'T.ir

nías de tvirteriai l¡ lk es íeriiiraitan lactina

m ctikj» lEM D )

iiK D lott» (k ip a é t de 24 !i ú ILecrainenLc

.i lu íiiilt. l i i í ó i i lIc- c o lín _Li;_c L :I'.L lj.Jk t ru jü

de ta pnsdwdña de ÉcUJcis miíins |j^ (usln-

A.’lí eosifjd jmi de

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Era k liímiíiit isi tdhx 6^1 ss im ie^ n tcNhiKpiescuciriv^ que raue^tr jh citas leflrelonPi drvfrmí

b íis

El agir EMD es un medio «te ikmta éifcr?Bj L « toHmiís rennenudono tuetl» ilpiciu 4e ln en especia] iLiflterieimt riiJi, pro» eisl que -sepuede írtiEiziren tngardcl nsi^-r dgten nnlrm-ijii. Brfm vs no fe-rrsieraalflrei ík l^jícrwi, rffltÍBfMiita y aíul de rttftileníH LnJiilMn a ¡as featietó ¡erajniXJMtivaí, y can que Incluyen Pnjum, .Siíírín-.wíííií y Ski/iftla, priulm^r enkmiu (rwispqrertes resfuaimKnitsí oiKrkíuíMks eipedíles &c¡ combinan pin íomsw un jirwijjtiuin en pH tfrrfiiua eritfmciti¡ric¿i, mi íerirefiHiidnr de lili icidn. ln que también «rve truno indicadores ’Sücsmsa y no nnu! j EMB de lí-Tilie. que ídlo li«l» lw(n«4, da rivi-.'. ¡fnir--, mil «n papnli?lfl whi f-5 m n d iiie a d a Vm«c lámina en tfilcw fi-2 MaL*ÜL'nrtey . l i Íífetlililí Jriudiikásld u n ib iá l dcictüa lecmeiiUdkMie» Jl- la iacuroia.

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d t ifi'fo-fiúfm - fh tgiu m tidififtida t a

junmug

omnrmeArftt f l a g t 1Ü J9 Je L tv iM .

M eisscs da aíslamienlD selectivas

En 1905 MacConkcjf3” describió por ptimerj v c í un incdi-o di rcmtciul ücIk iív o (ü££if fojo neutro-sales biliares) que niilia»Apara ais-lar bacilos enténons gjamnegalivos í Íc miies.tras qué contenían mcxclas ik especies haelcriartftü, Iwiíisa y el ¡»dic«ulor rojo neutro en este medio eon cl fin de propor­ cionar un medio visual poní detectar la utilización de lactosa por cl microorganismo de prueba. En ese momento, todos tos bacilos gramnegfttivos no esporoladoü se denominaban aún microorganismos entérico*; sin embargo,, lew triicrobiíMogíis habían recunucido que algunas especies eran más. patógena» para el ser humano que otras. Los patrones de utilización de hidratos de carbono <íc varias especies de bacterias ya se cono­ cían íi principin* del siglo xx y Ja fermentación de la lactosa, en particular, fue reconocida como un marcador importadle para diferenciar ciertos paiófenoi enc&itos, Holt-Hams y Tcaguc757describieron en 1936 un medio con eo&tna y aiu] de mclllcno como indicadones para diferenciar entte colonias fermentadoras de lactosa y no fcrmcEilaclora.s de lacrosa. Se Lnduyn en el medio sacaít>sa para detectar a los miembros del

grupo culifunnc que fermentan la garosa más fácilmente que la lactosa. Lo» agares ele MpcConkcy y cositH-uul de mctileno son sólo mndcradatitente inhibidores y están ideados para evitar el crecimiento de las bacterias gramposilivas en los cultivos mix­ tos. Se inhiben también muchas especies de microorganismos gram negativo* con requerimientos nutiicionales especiales; sin embargo, todas las enicrobwteriiB crecen bien. En el cua­ dro 6-1 se comparan las fórmulas, los ingredientes inhibidores y las características diferenciales clave para los agares de MacConkey y cosina-azul de mctilcno, Hace podo, los investigadoreü del Bccton-Dickinson crearon una nueva fórmula de agar de MacConkey. MacConiey lll, para mejorar la recupera­ ción de enteiobactcrias sensibles al CO,- Si bien se recomien­ da la incubación aerobia para el agár de MaeConfcey, en muchos laboratorios de microbiología clínica se incuban todas las placas primarias que incluyen agar tle MacCookey en una estufa cosí 5% de CG: para mantener todas las placas juntas, El problema reside en que algunas cepas de enícnobacteriai no crecen o muestian inhibición parcial cuando son incubadas en CO. debido a una disminución en el pH de] medio. Bu un estu-

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Selección da mecios da aislamiento primario 213

C u ad ra B*2

M i 'íü ík s a llu n tu lL -

M E D IO

FÓ R M U LA

Ag-dí Saim m tHaStu g rlfr (S S )

E iln f lu fe vaturtu L ulI u u hilMhfs Citlíllu d i ÜCdÍD TfrnNilíalo j !c so-dro Ckntfo fímsMT A jb t Roja ntsuro Vende brill sirte Ag«s ttrpSilwij t«st» j i J I final. 7.4

psiro la rvcu.pL-m d'ón de £ rt¿( rof>ac(t r ia i
5g 5g 1 Ü1 JE «►5 i fl.5 j Ü.5 l i t 12-5? aeu K M W i 1L

O B JE T IV O E JN C B E D ÍE M T E S

R E A C C IO N E S

D IF E R E N C IA L E S

E IN T E R P R E T A C IO N

ES S S es M IKiediii alamente electivo íu nau laJu pítfa m Liliir cL eicciáfettlu fe j j mayoría d í les raieíuwjjardsmoH celifonrif * y petiraiár d erceinijeiitD de especies de

Cüalqukr te ta n a ijue fermeiMa la káCEúSJ que ¡jin e te adqükie c*]üf i uj.j p « d rojo uu-

SubnuHtíLi y Skifielht p tú w jiia ix * é t ikiks,Im rniibiiniliiSn y clínica» La alfc» cow^ntrni-mn en «ole* hjliw«x y « 1

tro. Algaras ecpaq rs r« de Jíiiftwvwita m son ftnrKEtsdiM i* de ¡a Lactosa y las. LoJurtus pueika simulad E ie lu tk ím ¿n 6 E l rretiznicnlo slc empeines, de co Ci iTi'lihir.r. t y l;u íDlériEílJi ¿p.iré'r‘<ín inCülCi'-

dtraio fe sodio inhiben ¡odas la* harteriaj 1 raenpos i(ivas ^ m uílw * m íwwrjnm vnnpi ¿ram nq(PlFv™. Hldntdsia k«s edifernues La la r io * CN rf unirá bi'bslLuJá esirlit'Tira y «1 wjK> ijíu-íígís * i ¡ewiiiiad# p « s la ds vkIm

ras oren -eentrp*; nepros drhido a 3» pmdwcciñtt tk jtalfujt»ilc hldrAgcnu especies de Shigetía muestran bihi (ntií^t v m a tk y eftloni** Lnoalrtrat eif» » r t É f « íÍW j« [iJ AlgwM-s.

m^vífcs de FfritetJt l^esí

apa rere r. en el agar SS nci- v jnwewen hacií

TkfiulfRto 'le sodio « una fwrrt« de botítc,, ('líaUfjjCT hatftena qnt prwkraea p s sutftifo de liiilróger.ü es iteUs-tada el precJptladju iií-gío foraudo con fí cisrato férrico (itLau ■

arritta.

viiftWítH ^oeo it'hh il'tt* i La alta teiisinv¡da£ út\ ntm S S p irn d e níl y^d de un iñ ó íu l* ÜppviiwiM A f ai eiwcri«ii úr E flU w ji LHEl (Víase Umina en 6 -! 3E y F )

i2 g ^s

a jignr i|fi (-1 upa f 6 mral> nvwnEe ifjirnacb eJj * Mt niNa U?r*tla p i:iJ li-

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ristra iHumpf La -i Hí! correrrCración en m ks biÜHics i ntii-lx si ca^rifraenln dfe mdas >B* •wt^niis ipan^io*i(iva& y rrtLmli ?l ■CiwiimflnhJ dt cepas *fc purdvn pcwftKÍr fcidoe 9 partir fe L-t» hidraroa d t fflitsjrso y 1 1 fucsina árida que r e a ™ ™ «iri d ju ü I de IjíTwJ phhlucfl <üfi Li'U< jriiuiCLtiüfti LUdnü'i ikscLtnilt ¿I p)t

£ 1 tícMul&'ki de sndM es w u iw n lc de uailre y #1 g » s u ic id e NcLtísípo el ite im a ó o f& i

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fenom cafeH» lápidas d# la^ioia ftúnio y E. evj'jl mMi ilihihitkM ..... |.irdueciL c
A Iju ju ü eobnlas. de Hútm ántlíú físn verde «uladas, tfpiewW sLi piv rf g u su[fiim de hictrigcm Si\igffla Jippii^rí nLÍA le n l»1 ¡jue ¡Sakw Hiftla y cl CtsJí'r 'c Ik t t i tiw i4 p triíe rií de ¡a wCí^iia Algianis reprn de P m w son a lp t inhibid»^ f e «kloitia» qur desarreglan mu » tran^panenics (vq üc.iiii y ciiást l’nllaimeH, o aeirnsai de a^pác'u l|_ l Lsk irij|H&¿'ic% de Ju tb jfw iftf u S itifitltfi V íase la Minma e r i« lB r

ci L;iuan> J£ aisüttix) fórrU» (M latlvunM iat icdubld) A ja f illin a ikina

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SiKinn^a C lu n w de mk Ihj E rra s te fe levadura Rojo fejidl Afjsw PtowMEülíüv de *w Ly TlDHllfltC di” r.'-’J ¡'.1 Cumio A ju a desellada lu su pH j llj J , 7A

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t-.l Hgu X I.[Ji es nnHihakir u¡:l cr-ccl■sucniM de k it biujUa cLililcíincx^-jc cl a^a: EE]'! y íu f i k Jiii> p ju delectar S h ififllm en

Ijos mKKHicgaiitsnMH eexon K c a li y alpinas LSj.’t . u •fe IC lfb iitS íi’& U e iíJm í itT pucfetíi

lw «*i dsfrpuí* í M sprwpesnraifrflwen u iífe psr* gramnepíJtiii'iií

iJucir cvloniat amunllvs b n (l« m . La» totojuM de mnKhas espcí;K& de FftsUm también son amarillas. Casi todas Ea» «-pe­ nen fe SflÍJtwfiWls pcíidijco EotonÍEB rojas, la mayorta tcm « m ragms por *1 gas ¡ailíium de hadrdggBiu Sfñ g tita, Previdencia y nüidlak eaptidofe Pm iriis na Lililí,r;i:i nin|urh> dé U>l l'ildl ífc ■ -L.I t>11|j|j V ¡M'.i'.luLCIl CBkfll±> truns¡1i¡L:' i :|x

Las sales biliares cd cumcxDliaciAA reUtivacr^nif ttfijüeianvBrtesi apífiK medim en, mejMS! M ilctlivu ((lie hM d n n i» r tKlUtfhK « 1 ííie LÜJ-dElK E ^ i'lín fres iiidrflua d i E'^rburiu para Ja pru dixxii^n deáridn j el mjti feanl e « d indica* ikw '.Le 1 pt C L l ?i i iJ l : iK íffaáii nu;, pusiCis an ptua lú iaa, comci la ixaymia lie las-eipecíes de

Llilirar rr.iv fe un hidrata de «nrlxKia } ¡ipi

Al|er»as c<-Aq-u2% fe C itm iw tfr stm armn

Saím tnefla. jnAdlJCn» Colütnias íinunJtentaf: imcjaJes ii partir de Uí n:il i^-a:. i■ .:n d? ^iU-.-j y cotmnim n.ijas lelarJid m • p trlir d¡' la ck-sCprhiS|jL?irión fe lisirw Él wsfefiH de detecniín tk sulfura de lisitró^enu es siinil.iT al ik t agat H E

tlm las cora erntrn» ™ p w : msictus « p c c ir: fe Prof-rm k»i amanllenias o traasLikklas £cn cenrrcs negros, f e &olrnuifldfts son Pdías cí-íti -eeíaroK nepn« Vfese 1a limiraa en ral-mr 6 -J

B Est igma del d r. VaFbr Eso

214

CA PÍTULO S Eotmbatterinent

■.cías ommicasy utilizados-i.en madios e&lfldivo* ■ ■ } ■ “ compwutoe " ■r *ir-r.;?-zr t. .. _ i.i;: ■L.

^ r
U

K

HirfwlizurftK fíw iiu w íp. q .. pcptanai, intníidiL’k tvmc-. cipim-:i^ y «seína); Ln pnKrtn» w o escindid» puriridoK o enzirau rn rniiracdcido* y p íp u il^ q u f [tuak-o se» utilizaíkiii por las tactenus ijwa proveer ct carburo y d rurü^riu necesuii» para d metaboli»no bacterial». fHdnn jj A 1liw íw jw : Jivtinu » dltacirido» (p. cj., lactosa» socarrea y ouhou). b o o m (dcitrou) y pcntaM» (iflosa) se Incluyen co isí&15di s c k d im eos dos dbjetjrma: 1) pran w r tu n o » iw p o d u d c carinao para energía y 2) scrrircom o jastrafcra ta reacrinoes bkx|irinik% pon» la idcntificaruJn de miawtrpni>-mís ífescwidckK,

fíiifftn; se vtílUwn p rin c ip íe m e rústanos nKmowWkaiíiy iü «.Mico* íi

cqjüitmuJiN. Lm tvfflfcr» provéete 1) un ptie*l*ble parad ¿ :=- r irni» m lie lev» micnmiqianLfinm y 2) un pl I de rcJermCij. caiirutar para ai|üEÍk»i ffledjnE en. U» >ciia.fex se dEil’/jii ra^JciífiC* fiocti'* « alCaljíuii. pires jdcnEifirtr nn^m

nrjpBiiETW*. E n r/n i

(TW ií'rttPJ (p, ej.. saílitte, sUéMe. s litfa w n w s vliuRfnJcCK J O M K IO t Je lev**l»»)- íe

s U |M « « íIib i^ íííe lm is n f t íf o naeilUis [lata I(,vu|vr¡w

la i cl i! , L ., . jrin Je l :.. ■ 1 . js j >:n . LjiL-c !a rraviirú dí Ju» miembro* de este grupo crecen bhicIUm. hdiihtíhre*; 4l«tow* «wyinwios pm&tn *enir jara lulfchfoel «ectmtawde «ira* especie* hacserimw nn desertas, loque c**rvkrwíl med» en m■' tivu: I] culu™ti«. aiáttaiají. íp, ej.. *enk MUmhbcy 2) iKiiiki p e sa d a ífta m iw t, )| ws-iajicja» tjutalcw íp- cj, M át 4weu. drsoyi«»ltio. Wlleniie y Ifc o h o ] fenilerflksa) y 4 ) a fe n te s i^-uL'MdtktM{|i. c j., rte o r á á fla . m lin in a , v a n c a m id n a y d m « n fe itíc u )l. S b í t%ia«er.'> j a c » n * i^ rdffltím non Lmpnrtun ni¡Li

jflU rt «nn (c^iicriiLixs.U'h r.*jlrijiun:úc>, cnpcuaJiri. Lu» ciiriqui'c ¡m íenlos S-é u ü h u n ra q u is j ir.cnL- d*.j para

tes pira determinar U idectivábd del iw S n c t id cual e*tín pmteaidas.

fiuUroáans J r pfi; la fucriwL d am l de raed lena, el rojn> neutfu, el najo ftnv] y d v íric o & tw m ivreiol «m indivadom utiiLcadin a memdo en Im medio* de prueba pura medii t e anntiH nde}dI resaítmie» M ipetabaBum» luH.-ten>ii» de « M m lfw k » tuMmiM. 0/jm mdtcodom: k pueden inrEuir otn» ¡neti»daie« p in detectar pnxtactmi b u M ia n » cüpedfkRi fp. e j. íoma fénic™ y ferro** pan k deteecida de sal­ tan» de IñlrdffeBa). O fW i íifíir.Míi'ift K' j m t m 'í a t ífitáitk'os. ift um iTonUoinenie j f jj. ud j^ebuliKiM) de ya á l| i nij.i ^juc. cb ounueoteMioiiei vanlsdií ue u|re^i&ikn.

■tmliücdúl4 socale udiiILBiauiu. Sé uiiLiami rt*M«facii)«i de i -2% pura Im mediiM Jf uauhtu; íú uiULua OMUCfietiariuua
i\n s<í ikrnmsir^ L|ttc ti medir>de MacConkcjf lll proporu iona.

ufia mejor rcctipcraciún y un mayor tamaña cHc cy]tmi«s. Uinlo cuando se jncubu con aire coma con CO,, en cnitiparudim cun ci iagur de Matí-"(Wk£)'.íB L i decisión entre e! uso de íl^m de MueConkcy o íutíst comna-azul de mrtHewi iJcpcrnic en gran parte de la preferencia }>ír^>n>:l. fmrqnc las especie* tle Ibat cenai, tute miíü*an Ucima pueden difcroneiQrse con amhoi,. E l agar de MocCunkny ™ntiene mío rteuifo eomo indicador de pH y4en consecneneia, lai cokimas mclütmliíadoras de laeuwj aparecen ntssnhs pw la pltuJuCCi^n de íieidtH mixu^s ívéas*; lántina en -2A y 13}. Las bacterias productoras de ácidos fuertes, como £'. iv ü . forman colonias rojo profundo con un pccctpiladtí msado di Tumi en ci agar que ndca las colunias causado por Ja ptecipiiflcíón de Iss ftíleF, lidiares en ¿I meJin que oeune con un pH Kiijo iiféuse lámina en color fw2AJ. Las bacterias que pnxluccn áci•dws máíi U^hiles funnan cotonías rosa cluru u eolonias que son máselarah en Ea periA-ría y que tienen centros rosados» y e! agar i|ue rodea a las colonias se mantiene clirrn (véase lámina en color6-10 En ^gareosina-a^iii di* eíietileiio. las bacterias produelora^de ácidos fwenés Fnnnan colunias, que llenen un brillo metálico fv&LhC lámiiid en color 6-2C y I>J. La aparición del briSlo, íausadu jnir la precipitación del colorante en las colo­ nias. es. muy sugestiva de í. cali, aunque «tms productores de jciAiis fuenes, como Ítr.ífrtw ememcülmaít pueden tener un ¡ispeen» similar.. Medios ilstamlentu de alia selECtlvidad utlNtados principaimfltte para mueslras gistroiratesii nales Los niediíís se convierten cu altamente selectivos al agregar distintos inhibidores a aus* fórmulas, en general en conccnlraeiones mavores que en cl ngar de MacConkejí o el agar eosU ttii^azul de metilo no, Estos medirts se utilizan sobre iodo para inhibir cl crecimiento de tl.
miten que alguuab especies de Saimón?Hit y Shigvtfa crezcan en Ihi^ muestras de hcces, Se explican aquí varios medios selectivos formulados para su uso en laboratorios clínicos. Los más utilizados son agar para Süfm oneihi-Shisefifí (SS). agar xilasndfcína-dc40\icoLalQ v ngar entérico de Hekíoen. los cuales se describen en el cua­ dro b-l. La decisión de cuál de estos medios selectivos se usa para la recuperación de los patógenos entéricos de las heces depende tamo Je la preferencia personal como de la esjK-eie pi»r ■selec­ cionar. En general, estos incdiOfi sí utilizan en cl laboratorio clínico para la recuperad nn tic especie* Sal»v*neib y Shigcfla de muestras de heces diarreicas, o en laboratorios de sa­ lud pública para investigar la posible contaramacion fecat de los suministros de alimentos y agua. Cbsj (od«s las espceics de Sutmomiia crecen bien cu presencia Lie sales biliares, lo cual explica por qué la vesícula biliar a mentido sirve co jiw reservona pam portadores humanos. Se agregan sales biliares a Ins medios «lectivos porque otras especies de bacilos entéri­ cos, incluidas algunas de Jas cepa-* con requerimientos nulncionalcs in4s c^pceiales de ShtgeU
B Est igrma del d r. VaFbr Eso

Características de las pruebas de identificación difárenc¡3l 215

mos que producen sulfuro de hidnlgeno fnnnan pigmento negro que comienra en el ceniro de las colonias (véase Linuna en color ÍP-3C1. El agar xilosadisína-desojucolato también eorh tiene Ib ina, Eslo «. irn p o M c ponqué muchas «spccks de SahiantliQ fermentan [a xilosa y„ por consiguiente, inicintmente producen íil principio colonias amarillas en agar vilosa. lisína-deso* icolato, pero como estas mismas especies también descarboxilan lisina, las colonias revierten a rosadas una ve/, que se consuma La pequeña cantidad de filosa en ei medio. La laclosft y la sacprtKa, agregadas en exceso, impiden que lo* colifúmes 31sitia positivos revienan en forma similar Como la descarboxilación de lisina conduce a la formación di1aminas fuertemente alcalinas, puede aparecer un halo rosa claro alre­ dedor de las colonias en agar fcilcisa-Eisina-desuxkolaio (véase llm itU Cti color 6-ÍC). Las colonias negras sin halo msad» son más sugestiva» de una cepa produeiora.de sulfuro de hidróge­ no de I as especies de Pntírwr (véase lámina en color 6-3D». Lo» hidratos de carbono en agar emético de M in e n schs k Ithü. sacarosa y .salicina.^ Los microorganismos capaces ele fermentar estos hidratos de carbono también forman colonias milgrilla* (véase lámina en cnk;r 6-3E); las cepas asacarolíticus producen colon ias translúci das o verde cl aro tvéase lámina en color 6-3F). Las hacleriii lactosa negativas y 'sacarosa negati­ vas que acidifican la Glicina pueden producir colonia!» anaran­ jadas, E l agar entérico de HcJitocn también contiene sulfato férrico; por lu ümto, las colonias que producen sulfuro de hidrógeno aparecen negra*. Los agares sulfilo de bismuto y verde brillante son medios allómente selecóvnfc que no se usan con frecuencia en los laboratorios clínicos. Es difícil preparar­ los y sis tiempo de conservación es muy curto (48 a 72 horas!. Estos medios están ideados específicamente para recuperar Saimónf¡ía lyphi de muestras de heces y son muy útiles cuan* do se evalúan muchas pacientes en áreas endémicas 0 duranie una epidemia. Las especies de Sttlmfmetía i.S. ryphi en panícu­ la*) pueden sosfwhBrw: en estos medios debido a la tendencia a producir colonias cení un brillo negro

Los dos medios de enriquecimiento más utilizados son caldo se temí n y caldo para gramnegativos. El caldo selenita es más inhibidor dd crecimiento de £, iv li y oíros bacilos gfwnncgí»* livta eméticos que el calilo páiu grumnegalivos; por consi­ guiente. se adopta mejor a ta recuperación de especies de Saitmmelia ti Shigella de muestras muy conlami nadas, como lieces o productos residuales. Sin embargo, cl caldo paragramne*paliuis se utiliza más a menudo en los laboratorios clínicos porque ts menos inhibidor del crecimiento de muchas de las cepas con requerimientos nulrieionules muy especiales de especies de 5hi$?Ha, El enriquecimiento de muestras de mate­ ria focal en Caldo para gramnegaltvns dorante 4 a 6 horas y luego el subcultivo en agar entérico de HeMoen o agar silosalisina-dcsoxicolaio es ] a técnica óptima pora la recuperación de especies de S í jjjeWa en los caios en que se sospecha disentería bacilar. E n el c uadro 6-1 se resumen las fdmvulas J las caracte­ rísticas sobresalientes de estos dos medios de enriquecimiento. Paulas para iliplr neciosda aislamiento sete«M* Los medios enumerados en los cuadros 6-1 a 6-3 y las dis­ tintas combinaciones en las cuales se pueden utilizar pueden ser algo confusos. La siguiente es una guía para seleccionar medios que puedan ser óptimos en la recuperación de las enierobacterias de muestras clínicas. Parn muestras diferentes de heces o hisopados reciales, suele ser suficiente una combinación de agar de MacConkey o agar CPsina-ftiUt de melilenu y agar sangré. Por lo general no se requieremnedios con mayores propiedades inhibitorias porque la diversidad de flora comensal o de microorganismos conta­ minantes es relativamente baja en la mayoría de los muestras no entéricas. Se puede realizar un subcultivo hasta un medio más inhibidor en liw casos en que se consi riere necesario, Para las muestras fecales o los hisopados rectales, se debe seleccionar solo un medio para cada uno de los grupos enume­ rados en los cuadros ( h II y 6-2. Se sugiere el enfoque seEUilado en el recuadro í>-4,

Medios de enrfqueclmleiilo Como su nombre lo indica, un medio de enriquecimiento se utiliza para aumentar el crecimiento de ciertas especies bacteriadas, mientras se inhibe el desarrollo de microorganismos no deseados. Se los suele utilizar en los laboratorios clínicos para la recuperación de especien de Sattnmrtfo y Shigetfa de muestras de heces. Los caldos de enriquecí miente son muy di ile i para la recuperación de microorganismos de las heces de por­ tadores. de Salmamtb o de pocienlcs con infecciones ligeras por ühigelfü en los cuales la cantidad de microorganismos puede ser tan sólo de 200 por gramo de heces., (fr. cotí y otros bacilos entéricos pueden alcanzar concentraciones masivashde hasta i CP por gramo de heces). U n

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principio de que Jf
Características de ias pruebas tía identificación diferencial Si bien es posible una idenliíicución preliminar de Iei« emerobacterias sobre la base de las Características de las colonias y las teaeciones bioquímicas en los medios dé aislamiento pri­ mario, una identificación mejor de las especies requiere la determinación de características fcnolípicaa adicionales que reflejan el código genético y la identidad singular del microor­ ganismo por evaluar. El objetivo de esia explicación es repisar los elcmenlos sobresalientes de ¡as pruebas que miden estas caractcrlsticas fenolípicas y que ve utilizan es* forma habituad en los laboratorios cínicos, felá orientación es necesaria para que el personal del laboratorio adquiera un conocimiento fundñmcmal de los principios subyacentes a estos procedimientos eon él lindé reconocer y corregir cualquier incongruencia bio­ química,, problemas con los tu llio s mi&ios o técnicas defec­ tuosas. No es posible explicar las distintas pruebas diferencíalos y los numerosos esquemas disponibles para la tdcniifieación Isnál de las enterobaeterias. Sin embargo, varias de las pruebas más utilizadas en los laboratorios clínicos para medir las carac­ terísticas meiabóücas por rnetlio de hts cuales se pueden identi­ ficar todas las especies de enterobaeterias salvo ulgiaias raras u atípicas se enumeran en el recuadro 6-5. Ya se ha explicado la utilización de hidratos de carhon» y Ja actividad de ONPG.

B Est ¡gima del d r. VaFbr Eso

21 & CAPÍTULO 6 EntemhJcteriasBJF

CmNos de tn rkiuetltnkntD p ara 1* rccuptraelóJi üe T í? itt:ro h ¡¿ c ¡trim .m c •-i

Cuadra 5-3

O B JE T IV O t IN Ü R E D IE M IS PtraRE^N C ÍA LA S

FÓ RM U LA

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5g

PtptüMU

l.i

KEACCIO NKS í ’ iN TKH Pktm Vl lÓN

Se recD iiuendid Li*ld¡ode seJauta E- pura el

lli^LhincsLu de sjLinLinicLiUi Je ]ji iiililvL'uí ínrtlrt hEL'tfi, úfiiLi tfi deihfíh&i- L|UL' [¡ciiciL

Lac&HH

lu líiutiUii, el caldo yt vuelve mib¡i>

Sfknnj íivíicí

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l>wíaHf ukJu'u

30 É

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p}J fi.ri*l, 7.0

r . . i - .lIl-IL ÍL U ‘■■-kJiiL Li C i ¡ l : il jh ¡ d - . 'I . L J f E .1c 'll í V ¡ c f l ¿ ¡ t

r a l i y il? c’trms I s i c il n í c u J ifn rr n r '., in d u ií& is

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rv b i í k y vr i v i 'iK iiic n d u unu p n iíf u n J id u J i l í v e r t id o iJs e e n t u m ln m H i 5-van

Pcp:Ll III J r püliptpHOllJ (. ÜLk '.lMI

Ek'íüdi- n h ¿o^fniTtKiíui rebiivameníe hujw de dr-snx ico-lain. ft caldo paca grainnrgativni 15■ ■nif[fc>* inliibiJcir H. rnti y üLfi'H CftlLfar-

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[|>CS. t-iJ ItUyCfí* lie l-L\L~C|fcLt de .'•■faitetía

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crcccit h:en. El dc-ii 'S im lj'ii y l ] cilraV w>n ■phihalmes de las badinas rn in p h iii i a ■ >

Fos-faioFiwnc»ptHáticp

14 S

{ !l I 'i l i Ll d e mjiíIu

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¿íjnl L'ii ILuuui et cnscimimlD Je al^iaiuii

A^U3 líc^LÜliJj. -iLI-.U

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espx ifi de F tü w a ti jio riisunrí eí-lirnuk cl il-fíLiñiit-nlii dé rVjh5Cií^ ik Shllm im ttiú y

pH Jínal.

Gama I a í rotiformes ü -enra llera ¡ntíMinnE L|U£ LfH pa[Á£CIH ri L'I

JL u r p.iru .Vi íir.1ii ■ r¡'r i11'.i .Viij .; i m'.j I.Í.ÍI

43 sulílcn

cIf bhEppid«n K n Jj h ti vituTMkULJiTiPcrCH] ifc] taWo d*iranie U

rn u c lM * i.cpw'í Je- .W je c tffl

Cl h>e J ¡ o fu n tiim j n icjn j en n m d icin n ci

Clljl- |-JTil grjmnegiEivns

AljiutiiLi lunfas deipuéa Je ii Liucul^'t^n Lon

L j c o n c e in r a c id íi c k i :.*Jj í k ntó rtiiol scfcre la

¡xrc|'j;iu.i-.Vn puciLc j:m üuLi[ lis p[C'.Lp¡LuJij

váíLbk, lo que Ln suelve icifacis^iKHwlo para *l¡ UMJ l-l l jM íi purJi gram ncfulivm ú'C i iJr;u JLi [uru ín neciiprm cinfi Je

(k 5 a fr* v ií’í/fl y

^ñj'.kTili'jr cuajidncstín en pequenui^ camtida•Jc:i lii itmnUa.% Je itLilcí ia f-DLüJ

rj

puíde tolwbc [iLlbia^Q 4 dfl Ílíilü

J f 3a iitociiliicitf'ii. y <¡* tteomitnJa U sali-

eudiLvoert *íar i'wr^ eind(i«h ifc Hctuicii a K L D 1 Jííi'.r a ifeL nÚR-ma p sfo d o

ShfiitíSii. urubú l jpuees. ik («mciiurd ituidiKJ

Producción de tndoi Hl ünÜHsl es (jjio de Jcw pm-dLicíos de Llcgnutariún rfeí metahol¡sino d íl aininíjácÉdrt íríprálano. I.a=q haclerús que lienen la ínziina iripiofanasíi pueden escindir cí iripi^ííinn y furxlucir asi indoS, ácido pinívico y amoníaco, El iiuEt^l pnitídL- dut^ctar?»e tn id mcdiíi de pruchü¡ del iripnofatiu ohiwvalido cl Jcsurrolio de un color rojo después de Agrcíyr un a sn]uci¿ii que conúcrtc ^-dimcii]iimin[3bcnK;LLdehido (p, ej. „ feactivode Ehrliehfl de Kíivacj. L,a bioquímica y Los detalles de hi jiruc^sidel indol

se csiiuemaii/iin en la figura 6-í y el protocolo ]-4, respccú^[Hcnrc y ü]i la lámina c¡i colof 6-4C se tnucslra una reproducción. Lii cieccián enlrc los rcacthns de Khrlicti y de Eiov;ic de­ pende Lte hi preferencia persi>iul. El reaciivo de KJulteh es inái sensible y e& eí preferido euajidy íc evalúan bweitos no fermentadorei o arueraíijos en los cuuics ln pniducciún de ittdúl es mínima. Coeuo el indol es soluble en eomjiueíío's or,eáRÍcf»!i. se debe ngrejiar vilcm» O Clotofonflo al uiedin de- prueba ames ile agregar el reaenvo de Ehrlteli. E-^te paso de extracción es menos eritleo para el reactivo de Ko^ae porque í.e utilitu alco­ hol amílico como dilujenEc íjlc uidi^a jIciitiL»! dñicú con reactívn de Ehrlich).

flecuadro 5-4 Sei&cckúfi de un medio para mussiras lecales o hisopado recial ! Irwhnjl Lr l.i ntiif-ln ..iin. iT ir-LTir.;-n'ri 1,1pl.íca lk vnr ik Mirt'cipkíJ n J í ir EM6 píifíi d ¡írlinaria de tudi*. la?, «pccie^ ík bwtliffi.

Recuadra 6-5

¡irrinuK'y^Uii^ cpiciiui-.^ ’

hix'ubr dáreiri*nii?nie u r:i jís ira ¡II-a jir s í Lectiva ile e^p^ri-TM Lie WmmrM

XI

D n U F f’.ira Ia Jarre e iña

h .Viív-.-'h

U iiL ji.v k m J e

íywÍquLi:cr m u peqücflü purejúA J l Lj JLlUtSUb tu a U»d Lnoouladftn rii;ii iljn k de LüJdo Je í« k íiL IJ i.»J)il 1 g riin n riC1»IÍV4>s. S i W u it lijj *ík mt:i suk-ul:i',;i7 rti lija r Hí- (k'ritií'i ik tai ^ i | ; Lwííis: ■'i ■< iilili/ ,! t;ik h ip a rt íu m fH 'fitriíih ,

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de citruin

EttiditeLihi ito u i.u ‘d Lk-^M jlxm l.^i.M l lLl- i i -i li-i. om llína J ¡ifjin in a

! j prí'H.'ns. i r<í k u í ím ^ Jí» líe p iK í.n !-ir 4 . In c u b a r t c d í K tos cu lE tvijs J e p U cu ^

tudralíiF ík- c -irtm o n

Alm 11: i de iMiitnnfeiHl-B-l»-Ei l. t-rt^iritm'iNftt»K.3NH¡) Ptl'hJ ikohii Je liiJ uE Rii|m .L-n,. de Vnfí^-Knwl;ji.uer ¡T^ilaiceidn .\? ¡^enlitieulaatH iirsI |Jt ím f n i]i

Q A i -r m f J r íf l; c o iu ie s lío ü b o r a lw iín «M e [ s w i n*» m t c d i z a en f u m u 3 ¡s I r u ^ lit 'a it til. ii. i '

Pruebas utilizadas para m edir la s caracterís­ ticos anatabóllcds do E n t G t & b a c t G r íñ c e a c

3 5 nC <|utqnie 2 4 a J a lnsrsíh,.

‘H'v.is ¡m i.i I.. pr'cL'h^ hlixpjimjcii li vrmtó

fr-alnCL-huí d t ieniliilniiiiva JísajiiinjLM t F-¡■.-lIj l

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¡njífiiri) de íiiJiiv¡ieii<>

M íitdidad

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

Caractemslicas do las pruebas de identificación tíMerenetóJ 21?

Pmslja del ro|t da metilo En la figura 6-2 se ílustm un esquema símpltfiUHlo que muestra sólo dos vías alternativos (ácido mixto y tiutilenglicol) para cl metabolismo det piruvato formada a partir de la fer* mcnlacián de I» glucosa. Las h#cierÍ5*s que siguen fundamen­ talmente 1a vía de fermentación íleida mista producen a menu­ do el ácido suficiente como para mantener cl pH por debajo de 4*4 (cl valor critico de color de ácido del indicador de rojo de metilo). La prueba del rojo de metilo proporciona una caree lerísiica útil para identificar especien bacteriana* que producen ácidos fuertes a partir de la glucosa. En el protocolo !>3 se muestran Im detalles de la prueba del rojo tic metilo. La prueba, según su descripción original, requiere 48 a 72 hora de incubación antes de obtener un resul­ tado válido, tiempo inaceptable para la mayaría de los labora* torio* de nticrobiologft, Baity y cois.5* describieron una modi­ ficación que se puede leer en 18 a 24 horas. Se utiliza una alí­ cuota de 0,5 mL de caldo con un inoculo relativamente impor­ tune del microorganismo de prueba. Se agregan una o dos golas de reactivo de rojo de metilo después de IÁ a 24 horas de incubación a 35 T ’ y la aparición del color rojo indica una prueba positiva (víase límina en color 6-4C’). La modificación de Eiarry es. tan precisa como la prueba original y aliona un tiempo considerable. Prueba de Uoges-Pimltauer Los, detalles tle la prueba de Yoges-Proskauer. que se mues­ tran en cl protocolo 6-4, mí basan en ta conversión del aceliltncu|carbinol (uectoína) en diaceiilo a través de ia acción de hidróxidode sodio y oxígeno atmosférico. El diaccrilcsc convierte en un complejo rojo bajo la acción catalítica de a-naftnl y creatina (víase lámina en color 6-4D). en la figura 6*2, i|Ui¡ la formación de acetoína y buúlcnglicol es una vía alternativa paía el metabolismo del ácido pirúvico. Las bacterias que utilizan esta vía, como cier* tas cepas dentro dél grupo k ie b sie lla - E n te n >h acter-Serra(:u Hafitia, producen sólo pequeñas cantidades de ácidos mixtos que pueden ser insuficientes para descender el pH del medio de rojo de metilo lo suficiente como para producir un cambio de co­ lor En cnnsecaencia, la mayoría de Jas especies da entírrobac* teñas V o g e s - M iw r pasativas, con raras excepciones* son rojo de metilo negalivas y viceversa {véase lámina en «olor y D)..

ÜUl lición de tilralo El principio de la prueba de utilización de citrato (protocolo Ó-5) es determinar la capacidad de un microorganismo para uti­ lizar citrato de sodio corno única fuente de carbono para metabDlisnui y tnximicniu. U f¿iiny]u original, descrita por Kowr* en i 923, era un medio de caído que contenía fosfato amónico sódico, fosfato monopitásioo, sulfato de magnesio y crlrato de sodio. Se omitieron las proteínas y los hidratos de embono como fuentes de carbono y nitrógeno. Hl parámetro de evalua­ ción de la prueba de Koser era la presencia o ausencia de turbidez visible después de la incubación del microorganismo de prueba: este parámetro en realidad era una medida de la capa­ cidad «Jet mietwrgjJüisiSH’i pala utilizar embono a partí* de) cílralo de sodio para producir el crecimiento suficiente como para volverse visible,, Sin embargo, pronto se reconoció que podría ocurrir tina ruibideK incspecífica en el medio de Koser. 5immons*w resolvió este problema agregando agar y azul de

Figura 8-5 R rn iu í iéíi de indol por lis hielen*» productora h, de mplP&iHffa ] es ysiu ds li» pwdactiw inmoJiatíH de degradación (M fenródíl ¿icido p iitm co yrl «ronfat») comí» Maullado de la ttaauntaifesKia del tri^ófiao. Puede « r « m íd u d í Ií fn^c ocdpm del medioporct cIítoW hk» y -detertníln porei n{T*$Ad<>de- reac­ tivo dt Ehrlich i dimetilAiiiiiwtMiuatdebldD).

bromotimol a ia fórmula de Koscr, lo que proporcionó un pará­ metro de color mis sen&ible. Se vierte en un tubo de ensayo c inclina el medio de agar citrato de Simmons, Se siembra en estría un pequeño inóculo de una colonia de crecimiento del microorganismo de prueba en la superficie de la porción incli­ nada de agar. Cuando el inóculo es demasiado grande, los com­ puestos orgánicos pecfnrtnados dentro de las paredes celulares de las bacterias moribundas pueden liberar suficiente carbono y nitrógeno como para producir un resultado falso positivo en la prueba. Cuando se inocula una serie de tubos de medios de cultivo diferencial con un microorganismo desconocida e* importante sembrar en estiía primero el medio de citano para evitar el traspaso de proteínas o hidratos de carbono desde los otros medios. La producción de un color azul en el medio de prueba des­ pués tle 24 lloras de incubación a 35 ®C indica la presencia de productos alcalinos y un resultado positivo en la prueba de uti­ lización de citraio (véase lámina ea color 6*41», SI se utiliza carbono del citrato de sodio, también se extrae hidrógeno del fosfato de amonto contenido en el medio y se libera amoníaco.

B Est ¡gima del d r. VaFbr Eso

218

CAPÍTULO S EnhrotectoriawM

En rasiones. se derecto un crecim iím o visible a So-laígo Je lu línea de siembra en estría ante* de la conversión del medio u un ccilar azul. Este cree«miento visible también indica un resultan­ do positivo ilii lii prueba. M alumno» acetan.' y muc-iMo ¡.an otras radicales amónicos utilizados con frecuencia con si im de determinar la capacidad de las bacterias pitra utilizar estos oonipwütlaü simples coirio única lueníe de. cafteno. En otra ¿poca los sanilarbtas y epidemiólogos utilizaban cl aí-Tficiimo IM V iC (ipdol, rojo de metilo, Vo^s-Pnislínucr y eiiratfl) para referirse ;i las pruebas necesarias ¡mea delectar la cosnranúnaciAn fecal de ios alimentos y el agua. Los funciona­ rios tle salud pública han utilizado durante muel los luIos li Eschtrrh'hiti coit para, indicurcontHiiinadón fecal. Ettirrubacter sfm jm f.T produce colunias en medios de aislamiento pri­ mario que a menudo no pueden ser distinguidas de E. eo íi . Sin embargo, el aislamiento (te f {jfmgenw de alimentos y agua potable jh i siempre significa contaminación FecaE porque el iiiicDOíganismi) está ¿rundido c» cl nudo, los p¿iMo.s y Ea materia vcgelatim Por consiguiente, es necesario un conjunta de características ItÍni<|ll luí í-lli-, para diferenciar Isíh dos m knn organismos. Las pruebas. IM V iC fueron adopladas para cum­ plir este objetivo. La mayoría de Il« cepas de £. a*tf son indol ptiísili^i«in y roju de metilo ]iostl ivas, y las de VfeLgej.-Proslcaiier y citraio huí negativas. En condiciones típicas, &. itrn i¡¡ew sp ío duec exactamente reacciones opuestas {véase lámina en color 6-4C y Dk Si bien las caractcríslicas individuales incluidas en I» serie IM V iC si; siguen militando en los sistemas de idenldiotciOr bacteriana, se emplean |itvas veces Cflino conjunto <¡e pruebas específicas, En vista de ia complejidad de diferenciar más de 11M1 cipecics de enterobaelerias que se presentan en la próxima sección, cabe hacer notar que existió uno é|>oca en la cual las principa­ les decisiones en microbiología eran relativamente simples y se piH&m c>.mmir sólo,sobre- la base de cuatro pruebas hjík)uímicas de filuil re¡ilinación. Producción tía trreasa Los microorganismos que tienen la enzima urcasa hidrolizan la urea, liberan amoníaco y producen un cambio de color rojorasado en cl medio (via.se- lámina en color h-4E'L Ln el proto­ colo ft.fi « detall» la prueba de urcavj, Se delten «Halar itnportanies diferencias entre el caldo urea de SumM y eE usar urca de Ou istensen, Hl caldo de Stuart tiene muchos bufiers de salcSi de fosfato a, pll de fi,í. Iil niíeriHiígunis-mn de piucba debe foraiar cantidades bastante grandes de amoníaco antes de que el sistema buft'er se vea superado y el pH del medio se eleve por encima de H,0 para prodttcír un eambitj«l»ecL)|or en el indicador Por lo tanto, es un caldo casi selec­ tivo para especie* de Pmleus. Ll apar urca de Chrislcnscn11' nene menos bufiers que el caldo urca do Sluun y contiene peptonas y glucosa. Este medio enriquecido favorece eE crecí miento de muchas especies
aminas formadas por ta. descartmnilaejon ovidativa de Im ami­ noácidos en la porción expuesta al aíre del medio. Oescarbuidlatlón de Usina, ornltlna y arg^nina

Misivas especies de fruterías tienen encimas capaces de descarboxilar aminoácidos específicos en el medio de prueba, Los enzima* dcscarboxilafeis. eliminan una molúeula de CO, de un aminoácido jwsra íbrniaj’ aminas de reacción alcalino. Los siguientes son los aminoácidos evaluados nK’is a menudo y Sus productos de degradación de las aminas, Liíána —» cadavei ína Omilina

> putrcscina

ArginirNt —> cilrulina

Se describieron iilgunos- sistemas de prueba para medir esta propiedad, sohre la base de la detección de un cambio alcalino del pri en el medio de prueba o la medición directa de los pro­ ductos de reacción. Por ejemplo, se pueden detectar aminas tesultnnles de la seacción de descaiboiilación eon cl reactivo Ninhydiin 1 después -de la esiracción del cultivo en caldts con cloroformo. Ésta ea la reacción Carlquist reluliv-amettlf semiWc,r,! utilizada más a menudo pata detectar la actividad de descarbojtdasm débil de muchos de los bacilos gramnegativos no 1'ermentJKkircs y ciertas especies de bacterias anaerobias. La aetividod de de^corboxilasa de las cnleroLmlertas se mide principalmente en los laboratorios de microbiolo°íu clí­ nica enn caldo de descarboxilasa de Molkir. 'iK En cl protocolo 6-7 se muestran los detalles de esta prueba. El parámiíim de la reacción es la producción de nn cambio alcalino de pH en el medio y eE desarrollo de color violeta azulado después de Ea incubación con cl microorganismo de prueba {vease lámina en color 6*4Fl. Obsérvese en la fórmula de M olkr incluida en el protocolo h-7, <;ue el meílirs se encuentra amortiguado a pH en el indicador de ¡iH. y no se requiere un ambiente anaerobio ni ácido, sin embarco, no se (.rnede utilizar este medio para delectar actividad de lisina dcssarboAitusa en ciertos miembros del gixspo Kh'bsMfa-EntcrviHU'fcr ScrntfmHiijtua, Ins cuales produccn aectilmetilejibinol, que ímerfiere en el cambio alcalitKJ final ^kl pH y conduce a interpretaciones falsas negativas. Las modificaciones de este medio forman la base del agar seuii sólido indol-omitina (M IO ) para mol ilidftd '' utilizado en laboratorios de microbiología clínica. Tamhién se describen métodos rápidos para detectar actividad de rarnitma rj y EifiinaMI desearbox.ilasa en miembros de las enrerobaclerias,

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Características ds las prui&as de identificación! d iíaw ceJ

Pt ü í acción de suiruro da hidrógeno

K # a r k y tife 1* 1describieron un medio ¡sólido de lisína descurliMilii'iji basado Mibre Iü fórmula d¿ Falkuw» que iiacluye ciirilii artiitiúai férrico y tiusullati? (kiTií Tu deleccióti de sulfuiu de hidrógeno. Este medio es agar luerrudisina (LEA), üiili* zadn en muchos laboratorios, como auxiliar par» la identifica* ción de espacies de Saimtmelfa, ln mayuría de las cuales son tanto sulfuro tle hidrógeno positivas coira Usina desearbo*ila¿y pcisiliiw. Una porción profunda negra y un pico de flauta * ioleta eoft L ÍA íiíin prácliomcnle indicativos de es-peeicv de S iiim im cU a , O ird ventaja de L IA cn que algunas especies de Pm fííh y Pir/vtcíciu ia, ambos de tas, cuales desaniman los amino­ ácidos en lugar dedeHcartHmlarlos. pueden ser detecladas por la aparición de un color rojo en cl pico de flauta (véase lámina en eulut 6*4G)* La prueba de lisinndescarboxllasa es útil pora diferenciar especies de Citmhat'ter lactosa negativas ([)<)#■pcisjtivns) de cspC- ies dt: S a h jjf m t 'iia

La capacidad do cíe lias especies baocriduas para liberar LL/ufre de Icis aminoácidos que contienen azufro u oíros com­ puestos en forma de H ,S es una característica impórtame para ml identificación. Los medios ruis utilizados, para Ja detección de H :S y las fuentes de a/ufre y los indicadores de sulfuro se enumeran en cl cuadro 6-4. En el recuadro 6-6 se menciona La secuencia de pasos que conduce n la producción v detección de H¿S. Las diferencias para detectar la pcoducciún de H,S en los diferentes medios son cl resultado de una alteración en una o más de cstars condiciones. 1*1 H,S detectado en un medio puede no ser detectado en otro, y es necesario conocer el sistemo de prueba utilizado cuando se interpretan protocolos de identifica­ ción. Rl medio S!M es más sensible t^nc K IA para la dilección de H ;S, ílebido tal ver a ta cófl£i*ieittla semisóiida de K IA . la auReiicia de hidralnsde cartcno pata suprimir la formación de HjS v el uso de hierro peptoni/ado conw indicador í véase lámina en coler ó-dBj. Por i]|ro lado, el KIA es más sensible que el agar triple azíicar*h3crro porque se crec q¡uc ia sacarosa ’supnnK: los mecanismo* cníimáticns respoias^bles de la pro­ ducción de H?S. El aceiato de pltnno es el indicatior más sensible y debe emplearse siempre que se evalúen bacterias que prssduccn sólo pequeñas cantidades de ii 3S, Lamentablemente, cuando se incorpora acetato de plomo en medios de cultivo, también inhibe el crecimiento de muchas bacterias con requerimientos nuindonales especiales, sobre lodo Síls que pueden requerir un sistema de detección sensible. Estos microorganis­ mos- pueden ser evaluados para La producción ite IL S colocand*,» una lira de papel de filtro impregnada en acétalo de plotnu debajo de la tapa de un tubo de cultivo con medio K ÍA . Así, es posible utillTar la extrema serBihilidfui del indicador de « ¿ ta ­ to de plomo sin incorporarlo en forma directa en el medio. Con todos ¡os sistemas de detección de ttjS^ el parámetro es un sulfuro insolublc de un metal pasado, que produce un preci­ pitado negro en el medio o en la lira de papel de filtro. Como debe haber iones hidrógenos disponibles para la formación de H-.S, el emblanquecimiento se observa primero en los medios de prueba en los cuales la formación de ácido es itUixhnu. es decir, a lo largo de la línea de inoculación, dentro de las pro­ fundidades de los medios de agar inclinado o en los centros de las colonias que crecen sobre las. superficies de ajpir

peni I lvíls i, ('a s i lorins, |qs cepa** de

Sbixeilti ¡twmt'i i más del 9£#>¡i tienen actividad de ornñina desi’arboailíLsa. mientras que sólo algunas cepas de 5. boydH (2.5%) mucsirun esta aeiivídad: S. nhstntetia? y S.flex iifri son omilitu negativas. Tal vez Isi prueba de orniiina descarboxilasa sea más útil pwa diferenciar algunas c*pvdesdc Kiebsieifa Cía mayoría de las especies son negativas) de las especies de Ememfmaeí (la mayoría de las cepas son positivas}. Producción líe teirilatanina desamrnasa I ja determinación de fenilal añina desaminasa es litil para la diícneiid ación inicial de especic» de Pnrifiis. MoiganetUt y Pmvsdem m de otros bacilos gra mnegal Evos, Solo miembros de estos géneros y ulgumis aislad«', relativamente rain* del grupo Entenrfweter rienen la enzima responsable de la desanimación oxid.u1iva de fenilutanirta. J.n prueba se realizn tácilpneme, como se sefialó en el protocolo 6-$. Se puede delectar ácido fcnilpirávico imn tóJo en 4 hojas s; ¡>c ulili/a un inoculo impór­ tame; sin embargo, en general se recomiendan I® a 24 horas de incubación. E l media de prueba de fenilulunina utiliza c íin c lo de levadura como fuente de carbono y nitrógeno. Los eximetos de carne o los hidroli/.ado& proteicos comieron can? idados ^«iiiudiiv de feri.il.danina de pmduoción natural que ¡pueden con­ ducir a icsultados incongruentes. La aparición de un color verde luego del agrcgsdrs de un reactivo de elnrura férrico es inmediata V fácil dé visualizar (v ía s e lá m in a en eolnr

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219

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B Est igma del d r. VaFbr Eso

220 CAPÍTULO 6 Enterobactíriaceae

He LUad I u D-G C Orna s e producá H .S

li LlftcJüLJi'hl tic lüLJjcu t (iu ilif J l ba c n U s iu i « HikiIíIJíIUp |>ol J j iU.ckmi i riy¡:|l !l II . h l , !•. ra.in.i

2 -\uipl m-iTi-i iií v i.im (S i . -ii

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idn ImJri'Bíis- ¡H i pan Ierran H s

I Ufteteiíki ik H,S por tirara, bismutoo plumo para pmducir saUlta kfenhMéi ik jíiíiú J cs pasado» l|Lx° jpiircv'fii mino un ptcvipiUdo iw jíhj

m m iú La motilidad bacteriana es otro determinante importante para Lj identiticaeión Final de una especie. I,lis hacleriaü se mueven por medio de flagelos., cuyo número y Localización varían entre las. especies. Existen tinciones llagelares para esta determinación (véase cap. 7), La motilidad bacteriana se puede observar colocando una gota de medio *le caldo de cultivo en va portaobjetos micros­ cópico y observándola directamente cocí un microscopio. Exis­ ten cámaras colgantes para gotas donde es posible- ver el pre­ parado con mayor aumenlo sin el jxrEigro de descender Tos objetivos sobre ia gota Contaminada, Esta técnica w útil ira i obre todo para delectar Ea motilidad de las especien de bacte­ rias <]tic no crecen bien en medios de agar semísólido. Sin eiTl&aEgO, las emerobsicterias erectn bien y se mi ti o n ináseom limíteme tupos que comieren ¡sg-Lir semifluido. Los medios para motilidad tienen concentraciones de agar de Gf4% o mcnoreSr Con conceritracioncs mayores, cl gel es dema­ siado firme como para permitir que los tnícrúorgidiismos sedls* penen enn libertad, l,os medita combinados, como el S lM iu1 o el ¿tgar M lO ,ltí 1ienen un uso amplio en los laboratorios de microbiología clínica ponqué se puede medir más de una carac­ terística en cl mismo tubo. Se debe Interpretar primero la praetui tic ruciiilÉckuJ porgue el agregado do un reactivo de indo] puede oscurecer tcis. resultados Como cl medio S1M y el agar V1 IO tienen un fondo ligeramente turbio, las inteqpítMaciones pueden ser difíciles con especies ¡bacterianas que crecen lenta­ mente en estos medios. En estos casos, se recomienda un medio parj ¡>njehj de inutilidad (recuadro 6-7} pür^ut sostiene ei cre­ cimiento de la mayoría de Ins bacterias con requerimientos nuirieiludes cspwiales y nene un aspecM ciarO como el crista!, La prueba de motil idad ve interpreta haciendo un examen macroscópico lEcI medio para una ¿an a difusa de crecim iento 4ue se propagu desde la línea de inoculación (véase lámina en color 6-4H) Se han recomendado la1» sales de tcirarolin en un medio piara motil idad como auxiliar para la defección visual del crecimiento bacteriano, Esias sales son incoloras pero son convellidas en complejos de fomtazán rojo insolwbles p»r las pnipicdíideü Tedut ttuas de la* bacterias en crrcimiertto. Eu Urt medio de prueba para motilidad que contiene tetrazoiiohIr aparieión del color rojo ayuda a rastrear lu propagación de bacte­ r i a desde la linea de inoculación*. Sin embargo, estas sales pue­

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M d d to d e p r u e b a p a r a m o tlllc fa d (£ d iv a r c f » y E w ln g )

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den inhihir ciertas baclerias eon requerimientns nulric ion ales especiales y no >.e pueden utilizar en iodos tos casos. Enríe las entcrobaclcriiis, algunas espedes de Shigtlia y Klebsielia son unifórmenseme inmóviles. mayoría de Jas espeeics móviles de enten^bacleriqí pueden detectarse n “C; sin. embargo, Yvrsima enienríofitiríit en Ja cual las pirUeínas ílugelares se desarrollan más rápidamente a temperaturas inferiores, es iitiivil a 22 (ücmpcraiuxii oinbtenlc) pero ruj u 35 nC- íJ.itefia mtmtKyto^t'nci es otra especie íijcteriajiii L|ue rcijuien: incubaeión a temperatura ambiente antes de qtie desarrolle motilidad. Pscutfoínonn'í {¡eruginosa, un microorganismo que sólo crece bien en presencia de oxfgeno, pnxUiee ima película ite propaEaeión sobre la superficie Je a¡í¡jí pjta tnoiilidad y no muestra la extensión en abojnco característica desde Ea línea de inoeu' lauitíEi jw>nque no crcec en la^ pLTrciíineíi más profundas defi­ cientes de oxígeno JeJ tubo,

T axo rjm is

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Enterobacteriaceae

La aplicación de nuevas lecnolo^úm al estudin de la tax.nEU> ItlÉa de l¡>". mLeiPOrganismos tía cunducitlo a un ráp id o uiamenlo en la cantidad Lie géneros y especies de bacterias que se ajustan a los criterios generales de las cnterubacterias. lili 1972. Edwaids y E^ing N1 describieron 11 ¿íénerus y 26 especies pertenecientes a las cntcnobaetcnas.. En E985, Famier y cois.14'" describieron 22 L’énenn [jue comprendían especies y grupiis entéricos Hn esie capítulo se describen 31 ^ej>ertis y Ll1? especies, hiognjpos y pnptís cruóricos sin nombre de cnlcrobacierias. Claslíiuciún de Sntm ttacttm ceae par irluus La división de las entenobacieria-t en tribus nn se útil 17.a en la edición actual del M ü iíu ü Í da Ber$t\ ni en la clasificación de los Ccntcrs for Dlsease Control and f'revenljon (CDC| poique los autores creen que el uso de tribus carece de importancia diaenóítica y úene una importancia taxonómica cuesimnahie. tiste argumento es válido desde la perspectiva de la clasificación IHira. No obstante, para los lectores de este libro que son nuevos en d campo de la mien>biolojifa y que deben orientarse en las complejas y confusas enterobiLcteríos. el concepto de tribu propvicitn par Ewing^’ iicnecierta.s ventajas pjtra 1« enseñan^ y el aprendizaje lisiamos de acuerdo eon Fwim¡ en Ljae su esquema, si bien imperfecto, representa un buen compromiso entré las LLLAunumías práctica e ideal. El concepto de tribu proporciona u los estudiantes y a to^ profesionales un método conveniente para aerupar los principíile.s géneros dentro de la familia que comparten reacciones bioquímicas similares y que tienen una importancia diagnósti­ ca similar. Creemos cuinveniente que los miL'inbióUjgus en ejer­ cicio mantengan una base fimie de conocimiento apoyada en la morfología, la fisiología y lu biticiilímÉLa de las haL-lerias de ¡ni|K>rtancia médica. Además, es necesario m em orar ciertos patrones fenotfpicos que permiten el fáeit subagnipamiento y ¡j reunión Je especies relacionadas. Esu orientación es muy importante cuando los micrdbiólygfis uiiliían sistemas cuineEciafes semiaulomátkos y automáticos con identificación computariíada, ponqué sirve corno control de calidad para validar Ea información generada por los inslrurtlenlos. El concepto (.le tribu Como criieri<,f para aprerider las etferobactarias cumple bien estos objetivos y es et abijrJajc elegido en este iibro para enseñar las características clave de los gínems establecidos de las cniemhacterias. hn el cuadro 6 -? <<e menctoíiau las especies actuales incluidas en los géneros establecidos,

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Taxonomía tío Srrtemíiacteriacwe 221

Cuadro 6*5

C am bias n n c n tr s im|Ntrtante.v ín tii-i «i'iu'j'os cslabk-ciclot de c n trro h jclcL i :l^

N UEVA D ESIG N A C IÓ N

D ESIG N A C IÓ N P R E V IA

iribú I: F jth t r it N n r

Lsíiuridm í'píi Ej i i'ji'm/rnj i'Lf/i Ln«.’L¡Mi FjfhttiM d irilumi

AHjifcsccni-DiijMr NtocvTM fsjvc^ s

Esthitmhia biaücttiltíiie tú -frr¿J fe TfUtí Tilii

liilt]litt'alLi«sín Ni1

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CifiEpt» cajtepcn 1]

Eíclurkhiu mlnfrit

GniptKiiLít*™ 1 GivpiAFl : (3 rispo Al nú i

C O M EN T A M O S ■Snrbiliil 44-i f » r ^ n pan «m O f» Tw J íh la* ¡t*¡p«n« wn» mitbilol M ADiwctfgcnsJh tacto?» iMqpth a* Co tundía]e incntfvik* Akicím Iai píw enftmwAnd 4t¡Mmr¡*«n l « niñas de Rinft¡u4í»¡h- lnJi>l rwptfí'■M. fcnnfflííl «1 I>JÍ1jríto l fum JUN U U’í-llnwd Supaiaila J f H alvri fHH prueba J« v p «gativ* ^m cufijitrasa ifiucstras hunuini't Aislada co tuve-. d i curaracíiat !í* ftiúiicniravíi Oflftb > beetv UwAU i+h S iiitto í (-►, I.AQ EiLtloM (-¡íl pew QNPO (* } t-as hendxs j. Jas liecci tuci ln muetlcui ntáv i rocucntcs Cim pigtnrrfla nmari U«>-, «mM (*ju i-), LAO La majrWHV (fe pmie«i«n de Iterüis hunurm^. H4* itel í l f * ifc lo» eqss.^ tienen un JirruriJlu La-i cuaiTO empecí^ iir S!\tgtiíLjíiibríi ¥ iifb «i «para ilfLí iíMndianrc m e t íw n Jó fic iw . í. w¡rinA ti- f-tíiiána (+)

Skigfíla

Trjlm 11: Edwtfdiitnnw

EJwrdsít-Hj ítífdii

1F.ii1ii lihJdflld ,ir-viíiifmir''t{fi'i'ií fifujTíí Araiíir.'ii j

F%odu«JI k!Kk>l \ ilhiildjníC H SI, ftnil^rtun b glud.Ha V ll IILíUlivi Jvm ihi miDiml, lacLosi, aicamia ni arabnimí. Sl- eníiu*n.ii3ift en anuiiíiles .Ir t ^ ii^ tria p.-rclgít.!-! cipflrMaiiHJ Py¡íde p raks ir Infosdcnís Je I m b rrié a i) danv^ indfil i+j. H .S (-). runiiül, 5¿c-afo«i v amUnosa {+Jl .íc cnmefitra-cn vlTaorai. fui Cs Uaa l l |i ,l l Ii i i i .^ Iili:raí-i IchIdI 1 n i í l. d iU ii cit rv¡»ltl.*s j aj^uJi. Vafvn j i ■ ■ “üjr.i-ri i:l:■.cr. t a is liiioiíjiak

EiÍH’anlnellti fcDTLi Isngmpft 1 HiiwiL'inhiftín hítíStinae &Jh?iir)isAclfa u nriun

Nn ¿itladu en lwtmniis; pujskjre ^-píKríRj? ertíricít «a el pe*

r jiUi

S. rhnfrrut'iuii í Tyfrfn -í- fi¡lf.r{¡i4ix

S í m•iiutk'ríl«ju-r Uiiltn U» (Mjbg^ikmHl
Ilriliu IVt &ncter Avrwtt'wmcui

Ltrinen íumiSonaucm

Cin>tnncitr immitx

CwnihiL n f especie pconnúca ft

CiwéüLiíí ftim en

Cj'jTrJíih.rff tiniaiúiüuittii bioyru[Xi i

H,5i (—X ídlCoJ i +). uJumtal <->. nsLw ulfH -j. Se cncuM*» fufuJamcricaimeTiEC en b « « lu iiiaíus. muy p Kuj vtcc» sr iiO j in li ^unp£ H_S c indo" ™ iíafiü,Mfa. «dinrailul rtul>HHCü (-> Alsluki (*b hft.ís íignt*onm y liLTridai y de m im aJa y alíñeme* Se encLcnlu 1ui.^Ij i:ie-ichíii:ir:iii: tu buüisi h unaíiii. La.-» cepa.’n t t Itluj^ugiu E íccmmuui la¿K.'uhJMi. la rálla u ii,cl jll j ii^bJ-D ulLi.i.'iiKlit y Eá nielihima j

Tribu l i l i Sir/mpiTíífcír-r

Stilmrmftíti

í tlTTSHicU r tr,ru?M¡n C itntbiicirr gülíni

Ciirt>ÍMtctrr ¿ ^peLic gtínúnucj ] U

Ciimhtirirr íriferí

tr1»frv-r

C ilK ita e ttr mnrlmint

C¡I*4mI( ir? JÍVtm a CiffT'J'HUH'r espce|f ¡peminMGa 1!

Ctirtfoiatr nMliñtwm

Cim>ÍM.te* especie geatíiifciui 9

Ciiwtwi’lfr ifiilúkii

Ciiffthmn-r especie geminuca Ü

C itru h a tifr urríwirttir

Cjínrt’u i nrr ftfKi.ie getiúNfckj 7

CitrvbKier wwhíw

CifnybiKifr especie j?enfuñica 5

mcni« i«.*f g^ncp» í‘ «nvliiiii,

1^ releim os a U «

jmvm;

i.ttiÍonti»L it j. niaJouUü ( t Jl Se eacuentrucB «jiiul, ía u c m . fmiíi. f^písn y becida,«i C illij. turatk juljiíiL!: iti> H-'lmijLjL H .S f-í ¥*riableHifídol l.+j, rutoBimt (~f. itialDiwaro (- ) Sé «(Ltfútm lietcs m-..ii ¡..iii.;i‘. y ’.ji'iiie Ji,S (-i», iuiid i-), aduhiiul (-), is iííl 'ijjl .í [+ l l.'.u; ralcroorjuijíno ta suio jti-.jji.ln --»< »l»>«1 riiL jnrL-. H .S (-Il indril i+), jtdaitiiol (->, n tk n n i+ S , jív«nnicntn ct t a r * . «jigre y linkli.% hunuvw H S (-tlr bhJdl C■). üJi'i::l»jl ( \. irtnlimalii-1■+). Se cjiLUuiitra cti heii i y cifiiiu hutn>tjía.f y tú kn alinfamlm E l H £ y el iihhd hhi viriahln. klfuiikU <-j, nvtkmajn (-). A u l ^ ^ Ik í í s y íit'iÉK ImiDAibM y de snLuíale* y á)ime«uN

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

222

CAPITULO 6 fflterototferfícvw

C u ad ro B-S

<'a m b tM recientes jm p tirta a tfü en Iim g éneros H ila b lc r iá K de e n te rn b a c le ria s \ c a n t.'t

IT C EV A D E S IG N A C IÓ N

D E S IG N A C IÓ N ' P R E V IA

C O M E N T A R IO S

h h tln ii'H tl l'f cJí'ld! -/lliJÍ, ■ .

C a h rcruiiic^hiíteriuM i t¡.ratiufam atá

Ni jiucd í KcrL'ulbiLidHt en Ijin jjm de iu Iüvís LTnten£kmi.1ra Ag-cnlc t uu n í

K fc & H fl Kct rtt lJíh:yj

K ^?jcliir/W>trl’J r iriilií l-H

ck*i iraM jpm a inguinal M Ui A lsl¿m icnun:ltnJ«j tCLVuenii >UO <-.-.-1. AjhLinbir^lLi tl.iiu.’!? iJítUcJiCr

Tribu V ; K .lr b iW I« r

K h f u it f itf p» 1‘iuhjin¿m

siiliutjicsu';

p n n m ttm w t KSrf>iif‘H
K it Mñ fttfl ■¡Kflff iílr'

£ i pa h-iin|iiimirjini^ii|f iim tivin lr; ^ fii»i .«mrvriM»' l^rixlurt’ fuliCti alíL,»4kC';'k un Nvi^iimu dt'iHnniiiistV

K ltin T iilu rh in o tc lfii uMirtit

C tp i friiM^uítnitíinBiLfc ¡JtKtl^n Je A. /u vu ™ iü jí

K írirx rfiifi |jnt|s ? 47

djnl gr:ifiLll(iEB;iM1£i SM lOCÍJl (QDKI i ííHK-«líTnlinJ H ID i i-.# t. Ai en sjr.|i¡rc, nniki, íspitn t y hLtií!.if
ttz aen af K te & ú e lk t tír¿eurriL‘ñíeie luh^bcC ii rh iijí* .'.clfm irw íiY K tsa a ttffía r'rrriih ú rn lw c ti

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K tl& litritri pm rthit-is fi. ci

A ñ ljiitiv en ii.•t;i v

C>-f*v‘í 2

H aO ttilclU i f ’fm tlIH 'ltt

.■'H.ihJj J lis l lín in n ■]uinan«>ii jdniet

ffle fr& ltilti ffflWiifflP

Air' -.Mn'iü p iü fíti' f'h i K a o u litU a ic ir í.tíc i tu

K íc k s ícMíl ti-m UttMi

í r f t íU fb tí í ¡ íijiiivi i A fM i' H ^íshanLifíiíii ii IrtS W ÍH í fjjtijiii- li^lcrn^lK-M dv ni¡LiHSi(];;irtitii|Lis c|J lt if|i
friHTOÍhií frj- «w FKgeiKf ’^LiuipIcjo fjiKndfat'rcT t^fisfTKrüTLÍ '

L m tM il (fC ffa o & l

nLc 1^ |¿fLjVKv

de tlik id & iijci ilí PN A llEG ) 1IG X II! hu sitlil (rjnsf-’riJn al nLozvth pcncP) fl|infi>4 ¡r %'^hfhi .W .im r ri^ n . 1j.k itix'M.Kirrune'cfCKi* qup >tw

Efv\i* '"'1 mirlítVrcfí

E.AÜ neji1m>B

Triple d c«a ib (w itih j nc^jnvjsi.” ! y que

butiesi pijiruienh» uíiíbii!lo tr jji id ciu tíi^ Ll^ ca vi ¡uniJ<.i cojuc £. a ^ k *JTTH:rdÍLf fiti:¡ nñ,* ir ir r

hu^mijKi- !

Gnipti 10

L’fcw ¡hiogrupffi. l.m drí h-ktfinfci 1 l'rrw ntan l i sw im sa •? I:i rstinrisJi. [■.t l ' n^cJ j^-'ííl'aünL l.us dtl hn^rupi' ' ro irn iu n cl iJ-fffbirLil pent hü Lj -lüC^ll'Sd 911 U salijIL^X Jllk ! W .LJ,lllfl]H l l'LwtinwM .l iFlrn lr il^-l U|:ild.

f- jtiw fr titw r fiirw jg m ít* twTunifci- ¿

Iliip ■ . .3 '1.i¡ £pií?-t il h'Jt 'í t f j i ^!:■■.tria £

E lr li r't’fn ir.lcr l cJfk íJiH.urJiííÉ

jt il. -Ii ji, liunuiidA [tcrii ssi: es uknuü i

í.tlií E .

iWN.ít'iTinv p u « li im^dunr ¡.ulprmiíp hsinisna BNujuirnifiantnli siniitur a t" r t v«:ir<J>Tiii V 1uh-*-»,

Íkufu-frnírhru 17 C iim lhM iirJ alfp*;i.i

íT/h jraiii t llji riwijfV.. f

2

lihiLu) l l tiiiaLmü^jLibnuw JiiLf^ L’mifik.Jifc'ciiJuLiw'i E . U t \ i^ iv . L V J ( , +. +i, iidiimcnl. int'sir^'l. v ib ih il. rañíin^n v itjcI íitEtw n cp ih iiit.

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Ulipii/n

],A 0 f-t-.-.-Ki, l.'r^ i^ i -i-1 luspi^ Se tru Lii: ntríi lu cl ííí-JiijaiTitwLTiK y en ¡¿i cirina y cl ufuraU» rc*-puj i .’ i i^ i5e h» .scics jMirunuk. S-: buti leLjjiC fiiJo jíip¡t' « c fw c n

L n irn - fa iitc r hirm ulcc ht*

Cjru pn c-ntdriúú 1S

].AÍ> t- t.+ l H ¡OflUl'iniiilTtírlf TTins L-rcL-^nn li f.'. nríirit'iTií-rjíir.'i. t uica

Á íslu iicjito ii Li,Núun::u*Ji;?n en E n iir r iM it it ircrrrAirrÉÍjriT

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Sr eni'lh.'nUu írt «glM y t|icl« V l'^n svvupcrJtli»«'r]Ki% « i lie rtJiv y fciln hummij E^trVtilMIIICIiii; Iplat itítudii k'i>n C. i'Jfiin iJf L i EiiaJilwCt jM*tiiáj ?íi itiucstrus c lh k a s

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Taxonomía de Entercósctenac^as 223

C u n a M u a r d c n t e s im p u r la n l e s , c ii I m « ú i n i k c s t a l iJ c c ir t ^ <Ju e n t e r a b w t o t t o Ít m í.f

C u a d ro 6 -5

N I 'E V A l > m t ; N A C IÓ N

Em ttolM utrf ttinip rtsskfxill’i

D E S I^ N A C J Ú N P R E V I *

EtiL iütí¡j mimpTtssufúü't

C O M E N T A R IO S E u tíília ilU ín le (¥lA7ÍmKKki -m n F flm v n t N o k : e iu ix n lr a a ifiocs& m i h 'ri. l^j1, bmfi.itiJ’i

H fiif n>h tii'tff ¡ fi'j inin

í!i I.J p itÍH íl

1 m u í + i , scti.-j(áirti£i. i £ . q ttju H .M , se d iíe re íie jo it per su e re t buten!*» co CliIlLi «le t i j j i t i m Je jvu*¡:<>. Ia p iu d lx -e rtn cid á c i-li1 a p -n iií i lr l in>i-¡i¡ii%¡in| y b íu lia \le jvmJuecirirt Je áddsí ¡i p an ir
Unta nítkKrtfr AitL'Jiittrj

Fjiirn ih jr< sr irín n ra e crm fii-j mem n W^vaTiliri

r/iJi'n ¿J ¿ ilrri

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f , ■*•). PSpTüwnla jm a r illu h n lb u ilí a í í

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L a íH u s u f-). L a £ ) l + . - . + j . C Y fta i 3 5

1 2 í rC . £ií e s itu íM ia

C | u o ts b l^ u úiaU 'u itfeüL í misi ik ú v o

rikuciiEüH c S iiik i^ . iv^w ctiJnM filc l w « , í-r» r^ a u rv

íic-i í h ídiigw -, íspusci, i i f i M y h e n íia í Jfcj/rtiij

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iyhfiuinhitcterium pmttux fonu ni¡x> 3 ftiíiín iírt «tgj tarnt-rans

/ u rf rfíínTíT+r ii};^íttrnriun,T HG X til

ü íW iiiid iu ib tL't Jd ¿’í^ 'W trf IH itlcf itír Pim ZVd iW tiitM lif

a í ^LJI <][nÍLditliM llr

cíl Jw IriaTiüi. J ií plIChCJItbcU Idsi t i u W i's . ifctflde C 'tV é

•. IL I .:1-»huL\,L. 111," ÍJS

I_AC> (—i— ?. ^ilgumis ]HJtfden tener p i^m rn li» a m a rillo Ai^liufo cu la « u p c ifi-

y c! a¡ciu . > (Jicbie-n Je Uw ¡eres íiujdiuius

c k J e Ltasi p ^ ia u s . la i

ítwridjSs. ío jiq í-, o rin a. ¿rDanos ¡ s t e m m > de- L -o *fln im iik i

ftin tW f

Klartigcnn d r la* plaiuits. ptndnoc la r n t n r w d a d d r t anaaiá

JEíJífrt^iM'ffr1

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Em in i.r untarua Pm inks a rr'Jm m iT F tíitiíx ti rim a

jN u í v : i -

f'i.tl.'fl fj iittfK H ii

EiitcfTfi/íH 'ltr üf.^rtflíw'nJnd

c-oi-de*-

A i'iljtila en mapíiisrtrsa!' co Japón

HG Ht

Ai%L&k en lü p c c fitic h de flhKiUm.

kijM.'>. í C í í j Ii(iIil«U4í& >

S t fia m iu Je P. tijtfh'm em w ["'■* re-JsxiH$fi de ^‘itic -iliiu gicgamui ftiTT-ij'-VfJ

b-^ftCCJC W kW I

A is l siLi c¡n niaAdannait e » J a p ln

Pí.t\Jrfi'i'j .íífiiir r ir i iiahcspcuie

i . . ' i n ú i i t a a riii

C a u u i u u h ilIlu en las l i c i ^ de] u n jiic n c u l i Je m n tu \ üScL in ijo p c r b tlii

1/■n'Ifl.Vf litfw u nif

A jifT '-; 4'. jk í*! iEí’ I nian.-]nl.i:!iiifTi|n Jt-I Aiu[/ J f SleVruri

H ip o . ir ÚUCV'JI

A i -.L..l_i en c l KueU» en ÍA |n n i

.u fn vrrírj fia E lw o f r r jr t í

Se ¡Ktroesfl si S. n a fK ftttta íarih iB csa-ncg ativci). PjlL’tgcrm de Jus insevtov. tm-

iV n raría íw rrtnn/ihiílfl

se cadmink^Ei c q i t í ¡anlaJüi ¡? eis h m i a í t ^ ..Virri i / í .j _fíu iirf¿r

F,l liíh lly l Ixittlia! ssjiíi h w hípf»s

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-in^fiqii de |im hpjjLW.

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pik,*vi v e « % e i| m»c>Jn)« t'tiaícAK Ih u m jiiis "Srm fctw ” fo tificeia

f ío e\ i eüinK'isií uau e s p a ie d i ■£l,¡itü iii:í¡'. M k iLüor^acüiinsy del ¿i^uíl p ím s i c c h a i i l i d j en muesüris. h u m a iu i. p n i£ ip a ll(n « iíe i k b íik b s

'irrtiifíil ¡jrifflí-'lir

\ < t e v : £ m p o i l c f r r n i r i a itq u ffitt'rrM

A k la d » «q e l nwdíoajM hi^itie y d i itiuísiLfas el um-j.* thicUMas, N n ptiiilt? spf Jirercuci&Ju ú i

m uínifrn.« i k l "jiru p ij i'. ¡H fittfticItBS" p u r lia pfüeluib

hmhijyjle? tífU fiu d i ” S rm ilu i

lii¡tiffiir¡e n 'rr'

(■jtlen J w ííí r i¡<j\íz_f¿rrw jiT l>i ícruiiCch liíuiífl^fciii < k n li» d s ¡ú n fííic /ií^«rf¡«.‘Wtó

4 'nrtsisu ír t í í u i f ' grtipiiK ilé h'ív;id¡u u1r de |>N-A. ijiW' ifli l u ^ n ís jh íc K s atuWuL J tiH irli iiadufi SrrNjrj'iu prnleutna jJiíny y ,V y rin trífi "Ju [ V j 11- ^-3 h cptirafo pm Iííü p n K K h )lio (|llim ic«u b a h itiL ik i. D iA c te d t S. m a r r r w v iu fNW i r t I. üraWjliTsa (+>. Se curtulinca ericiv» “‘gfsupi .V (iq urjatim t'~ Ohíasa | ■«-), y c la liiia |+>, 1 -ara h ijK K U .f-) 4ulrp» espolies mui fKisilj**'»

S trftítíú niiirrfxrsm i

AnliUdM íiUd t lu ú -D ÍI t l t I í H I c

Stn rtfiú (vitínfem I v i r t l p c i | í r r r t r if a w hm frrtf Kíh 2.

\ l p 111aL1 t L f i i p ru tlik jc r p jg n ic n l» ru^i»

O k u íl h k Í h U i I y n n is p i, tirra lo r n h*» 1 en «iTiiiliiu, . w v h u y r4(uHbiL puM livu y e¡. ]x fd u [n iiu n lfli)C iile ü N ü I i en rspuiíi E l }¡iD£fnp> 2 es- en-g itlH i ( w n

trfi, K ic o ^ n n c i y ha atdo re>tu-

p r o t in f c ’--irPgrc j (fqaidm- c rfilo rT a i|u íd e o

ítm t:ia pfomathica

ftíc f+ 'fjW i ^

íh ib ^ í

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Puede teipei p i ^ i o t i o rojm. .^ lu iJ a

c íl c I

s u e ]u .ü |U ii >■ rtfHJtu.

EnHcnudaoneii'? rin » cu m ite tin ti

ff'jVUTJtJffíi

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

224

CAPÍTULO B fabnrbacferta»»

C u ad ro 6-5

C a m b io s n rc íe n lrs iin p w rtH n l^ i r n fcw jjímcrw*.

. .

.

.

n u e v a d f _s i í ; n a c i 6>

tíi- id t t r ü b u c t ír íM U-t/nL)

... líK S K fN A t 1Ó N P M E V IA

íú M K N r A k ia s

S ífra fw pfütfum ik udflaí su b típ ccjí firfitfííirHH-nlafif

V éaw Eimp-i de Sem tm {
fío pwadc i« [ &cppnukt
Í í m i tra i/ uia i i*nmns-

SíT/ntia p-m ftfsm íirtilani '■.ih«s¡WtnÉifiilitim-H'Ü SÚÁi£ JjfU j» ifc S fn a iia /iqtff/ffír*tr

Aislada .-ti pdaflla*, roedores ulvajec. i iíh c h *; y agua perruM aún m mues­ tras c IIdílius huirmntui.

fo rn jrtj m bnkita

Se pruduec pi|iiwnliü rojo, fatO S «h c i aii-todu- fifi w r«i h.inníK'^

Trib u V I: Fm tfi-at Pn*Icu3 humen

P fíw jn ntJuarii b io f fu&d 3. DMA £I3jjkt y

]! ,S (+í. iíidmfc i>.L salKina y cículina son <••)•

P lM cü i rtirttibihi

19.S l+). i iilIi M i.- X HifTiitiru (+). AiiUmicnCu clínicu ñcnieiilc'

F tr'lfm rmjf^torífiar

Nn w c a n u ik « < iii pnr aiMníiiitrHf^ ihnnüaivi>í. A im tla ■iñlcun Je r t a s v ?v ^ y inucri^

P iv ífu c iffm tfri

P w tru t iiífj(íJn ,vhit^ rup f ]

H^íWh.'WiieDrí' JífacicrntiLln d.m; P, i'jrJ^gm tr cxHfHp cn¡ qise ei ifidül ci-L í—Jl, csLiiliiH í- J y nr^islcriiSc ul ckjfüfifci’iu il

/'rt-ijfjti vüíjríírtf

Pu n tas viíffidíi.í Mctgmpn 2

H;ü i+j, indol í+j_ oimíinu f-h AUliinicniít^lniiLLs fnrs.-Lcr.lJ. [r.iií’-l. áiiLi.in_i v c^culinoi sysn peni^ñm. C oniltleC T tiíutru í-ífwtie^ prnílKumerirc ^qvn<(kH n^( \e i^nhh Siupoü de DNt\ 3. 4*5y< i (ntM ¡ +.Í. pem k»Ik)[¡ii4 y ^^ulípa [->. pj T>NA ? ha vidn dewvm irjíki recienseiuf n » Pnpfáw

P¡mi-as %n lfism hiognipo 3

A h fT ju jíiSiii marg-anii tuhí'SJiCk.'-ie ríhVjíüflrr

P/vitm h tú r& x li

ffl&rgüfít'Hfí

I3,S (- J, IkiTiik irirnii i«» y mreíLidíid u ib * v^riptí^s.. trsfinJm j <-J- l%ndLcc in fecslo o» de Ij í . i í j i unniinafi y es culHv^é^de WM,ick>í dtnd s-itra ¡Jíl cucrpii. Cbnücnir ciudm bitignpui l¡c -.i jü u J'. i:-, A a 1? hn!f rapíi 1

-ul-cí|V^¡r Aítir^tm rUa

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B Est ¡gnna del d r. VaFbr Eso

Taxonomía dü Enierotmctoriticeao 225

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CaradjerísL'cas claves para la idHrtiJic^ción de las tsp ciis más comunes Eli cl cuadro 6-6 « í muestran las earaaerísiicas claves de identificación militadas para separar los Antros establecido!* de entcrobacterias en siete tribus. Los estudiantes deben estu­ diar 651® cuadro y aprender a categorizar un aislado desconoci­ do en una de w as tribus sobit las hases de las reacciones que se observan en estas pruebas claves. Las siguientes observacio­ nes ayudarán a los estudiantes a U i i c w la» «pedes más comunes. Los miembros de Escherichieae llenen las siguientes ícac* clones claves: indol positivos, rojo de metilo positivos» Voces PTO^kauer negativos y c ¡trato negativos (el ejemplo clásico de los fermentadores de Je idos mixtos). Sun negativos para todas las otrus pruebas bioquímicas claves: sulfuro tle hidrógeno, fcmlalanina dcsaminasi y urca, Obsérvese a partir del cuadro 6-6 que las especies de Skigelta son similares a las de Escherichio. salvo en que sao negativas para el gas CO¿ y Ja motilidad, Edwunisiélléae son similares a Escherichitttié salvo para 9a propiedad de ser sulfuro de hidrógeno positivos, Los estudian­ tes pueden pensar en Ednttrdstelia tañía corno £, cotí sulfuro de hidnSgeno positivo, Saimanflieae se asemejan a W h W . sulla, salvo en que son indo! negativos y dtrato positivos. Cürobactar fmmdis es similar i Safmondld salvo en que es lisina negativo. C. kmuri difiere de C- fieundit por ser sulfuro de hidrógeno negativo c sndol positivo. K khsirliea? están compuestos par miembros Vngc*hiMkauer positivos de las enterotiacierias. Como se muestra en el cuadro 6-6 y se ilustra en la figura 6-2, la mayoría de los miembro* de esta iribú producen cantidades abundantes de CO,, tanto que la porción profunda de los agares inclinados K 1Á y TSI a menudo es empujada hacia arriba basta mitad de camino en el tubo -Obsérvese que lis especies de fClebstetía son Inmóviles y que Ftmtoeae es triple descarboailasa negativo (lisina negativo* arginiua negativo y omítina negativo). Protecae están separados de todos los otros en virtud de ser femlahmina dcsaminasg positivos, una característica exclusiva de esta iribú. La, reacción de la urea para las especies del géne­ ro Pwteuii y Moiytimellu ) una de las especies de Pro videncia (P. fííf^ r/í) es fuertemente positiva. Arabas especies de P*v-

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leas mencionadas en el cuadra 6-6 son sulfuro de hidrógeno positivas y muestran motilidad ascendente Yersínieae representados aquí por la especie ai slada más fre­ cuente, Y- entervcofiiiva. son muy similares a los miembros de E rtü trk h ica c, rawpio co que Y, enienKotítt&i suele ser urea positivo. Los estudiantes pueden pensar en H aiterocoíiiica como £ cotí urea positivo. Obsérvese que la motilidad de Y. entetocolhiat es negativa a M 'X' pero positiva a 22 °C En el recuadro 6-K se muestran las reacciones clave i|uc deben recordar los estudiantes. Cuando sea necesario confir­ mar la idcndJicnción de una enrcrabacteríii común con un patrón bioquímico inusual o cuando se sospeche una especie poco común, será necesario consultar el cuadro 6-7, que pro* porciona las reacciones a 47 sustratos bioquímicos de toda* las especies de entcrobacterias que tienen nombre, TRIBU ESCHBtm EAE Los dos géneros dentro de esla iribú son Escherichia y Shigtfía. Como primera reflexión, estos. dos grupos de bacte­ rias no parecerían estar relacionados debido a las diferencias en las características de crecimiento y el aspecto e n ¡o* medios de aislamiento entérico {£, coli característicamente fermenta 9a lactosa, las especie* de Shigetía, no). En general, £, cotí es bio­ químicamente activa en comparación con ta especies de Shigetía, que tienden a ser inertes. Sin embargo, E, coH y las especies de Shigetía están estrechamente relacionadas desde el punto de vista genético; de hecho, las cuatro especies de Shigetía y E coii foiman una s o l a ctpccic sobre la b a« de esm. dios de hibridación del DNA,4" Sin embargo, como las especies de Shigetía se asocian con un espectro específico de enferme­ dad (disentería bacilar) y, como existen en el ccmercio ami­ gueros para Ja tipificación específica que permite separar £. rali de Shigetía. seguiremos clasificando Jas especies de Shigttíc en un género separado, al menos por ahora. Empero, los estudiantes deben observar que puede ser difícil diferenciar ciertas cepas de E- cali fcrmentadoras tardías de glucosa, inmó­ viles y bioquímicamente inactivas de Im especies de Shigetía y que algunas raras cepas de especies de Shigeilti $S. Jlexnen) también producen gas a partir de la fermentación de la gluco­ sa. El espeeiro patogénico de £, cotí es mucho mis amplio que cl de las especies de Shigetía y las cepas toxigdnicas de E. coli

B Est ¡gima del dr.VaFbrEso

CAPÍTULO 6 E n ttn te tíe rto tM e

22B

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B Est igma del dr.VaFbrEso

Taxonomía do EnlürobEctariacoao 227

Recuadro 6-B

Hechos chaves para recordar en la Id en tifica­ ció n de

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pueden causar síndromes disenterifonne& indistinguiblets de Ln shigelosis. En algunos casos. pueden ser necesarias las pruebas scrológicas paríi diferenciar ciertas cepas, estrechamente rela­ cionadas. Las características clave do Ezcherichicue se ptoporeionan en el cuadro 6-6, Género Esclmlctila. E. cali es ln especie ik bacteria recuperada coai mayor frecuencia fifi Itüs. laboratorio* clínicos y lia sido incriminada en enfermedades infecciosas que afectan casi li cualquier tejido y sistema or^únic» humano. Qs uno de los microorganismos más frecuentes involucrados en la sepsis pnr gramnegativos y en el shock inducido por endino* inas. Olrdí infecciones habituales producidas por E. rv)/í son las tic Iíis vías tinnürito y la de las heridas, la neumonía en ios pacientes hos­ pitalizados inmuno-suprimidos y la rncuíngtisis en. Iüü recién nacidos. E. cali se semliptfica snhn; la base de sus antígenos
totalidad de ln superficie celular.3**Además de tas seis dase-, de E. coli diameieüg¿nieas mencionadas, existen otrai clases po­ tenciales, cunto i", coli productora de tonina citoletal distensora (CDT) y la E. coli despendedora de ceLulas (CDF.C) no carac­ terizadas atin en foittia completa.1^ Si bien existen ensayos para identificar todas las eaiegorias de E. tYJjff que producen gastroenteritis. en la mayoría de los casos no es necesario identificar un patógeno específico de E, coli en un paciente pañicutar. E n casi todos Jos pacientes con £aslrm:n[criíis debida ;l /:. caíi La diarrea se resuelve anlcs de buscar atención médica n luego del tratamiento con antibióíicos empíricos administrados para oirás diarreas bacterianas. Por lo tanto, con excepción de los ensayos para la detección de E IÍE C (explicados luego), no se realizan en foima habisuaE en trL laboratorio clínico ensayos fenotípicos nL serolipitlcación d!e £. ra li para et diagnóstico de las cepas dianeicnEéuicas. Fitopatología de K fí/íín te m h tflio rrá g íe a (EH E C l. No se conoció la importancia clínica de EH EC liasLa I9S2Tcuando estos microorganismos fueron asociados con dos trastorno;, cuya criología se desconocía hasta ese momento; la colitis bemorfdfijca1* y et s-índrome urím icohtniülítico -157 i Vea.se reeuadret de correlación clínica fi-1). E. cali OI_S7:H7 fue el primero de los seroüpos productores de tosina SKiga del que se supo que producía enfennedibd liuinana. Se denomina así por­ que «presa el 157 antígeno somático (O ) identificado y el seplirrtu antígeno Llagclax (H ). Entn? las cfa^Clerist¡Cas más imporsantes de virulencia de E. cotí ÜI57:H7 esíá su capacidad para producir una o más toxinas Shiga (también denominadas verncitotontnas. antes conocidas como toninas similares a la Stiiga). La toxina Shiga 1 ( S u I) es indistinguible de la toxina singa producida por S h ig e lS n ily ic n t c n u c tipLt 3. La Cuaina SKéga 2 <Stx2) es una ntoléeula más diver^ense que tiene mti Lti pies variantes (Stx2, ,Sts2e, SixXd. Su1ef Ílist2f) esiTeeh^ mente refactonadatt en re sí pera con una relaódn rtiás disiante con Stx L. Algunas cepas de L, culi 0157 pioducen sólo St.\L. &óío S[x2, oiienEras L[ue íjLioh prcKÍoeen ambas. E.as toxina-H no im p li­

can riesgos equivalentes de producir síndrome urémico-hemolítico ü is cepas que producen sólo Stx2 acarrean cl riesgo máximo: las cepas que producen sólo Sis I tienen cl riesgo más bajo, mientras que Las cepas que elaboran ambas toxinas aca­ rrean tm ries£u mtcimedio. Ambas luxinas están compucsuis píir cinco subunidades B y una sota subunidad A. La sutainidad B se une a globoiriaosjlceramida un gluc*](pido hallado en ^radt»s variados en las membranas de las células eucarionles, La subunidad A es una citotoxinu pótenle yes responsable de la lesión eclular. La producción de toxina SbÉga no es por si sola suftciente para producir enfermedad- Otros factores de virulencia identificados en E. co tí0157 incluyen un plásmido de virulencia de 60 M l)a (pO 1 571 y ti Icx^us de borramicnio del enterre it o (LO E), El pldsmidü de 60 M Da codifica unaenlerobemolisina (designada EIIEC-M lyl que puede permitir que E. c ir íi 0157 utilíce la fíemoglobuia liberada por la acción de EHEC-Hly como rúente de hierro, eslimulando aií e] erteimicnlo de E. coli 0157 en el in¡estino.Jtlí El E.EE contiene genes para uua molécula de adhesión {intimina) y para otros i'ae Lores importajites para la producción de lesiones de fijaciónbonamicnto. Las manifestaciones clínicas de la infección por E- cali O l 57 van desde la portación asintomdtica hasta diarrea no sanguinolenta, colitis lierttfirrá£Lca. síndrome uránicoEicmolítieo y muerte. El período de incubación varia de uno a S días, cun un intervalo pnjmedio de 3 días antes la e?iposición y la enfermedad. La mayoría de los pacientes con colitis bemoríágica se recuperan dentro de los 7 días. En los casos tíjiicosk la entermedad comienza con cólicos ahdominaEes y diarrea no

B Est igma del d r. VaFbr Eso

CAPITULO 6 Entetítbatiariasaa*

226

Cuadro 6-7 Rnirdones bioquímica de especies con nuiulin; j1{>ni)]ivi sin nm bjrr ck- lu TamUla EnimbacttrUueae

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sanguinolenta, L«s brees pueden tomara: sanguinolentas Luego Je L 1 2 días y la camidad de s-angre varía desde algunas peque­ ñas cttriaN hasta heces que constituyen casi por completo san­ gre, Se presentan vómitos en el 30-60% de los casos y la fiebre ds leve ti tüLí uuscíitc.’3' Se ha comunicado síndrome urcmicohemolítico luego de una infección urinaria por E H E C í,ILtíM sin embargo, debido « su bajá previdencia, no parece justificado realizar pruebas de rutina de los aisladm urinarios ú¿ E. a*ü sarbiíol'tiegattvos. para la presencia de tcixitia S h ig ifl7MJ En Tu

actualidad, no -se recomiendan los antibióticos para cl tratamiento de las infecciones por fi. coti O I ^7 dehido a la preocu­ pación de que su uso aumente [a producción de toxinas ShigaLos |cncs para «tas toxinas son codificados por bacteriófagos y los antibióticos que producen inducción de bacteriófagos Ip. ej.» fluDroquinolottas. trimeEaprima-sulfúmetoxaMl y funízü-li(kina) pueden aumentar ta expresión de Slx. Un vista de estas cuestione^ se recomienda üi los l^hcjraíísrios no comunicar los n&iilLado» de la sensibilidad ¿i los anütiiólico» pura los aislados

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B Est ¡gima del dr.VaFbrEso

238 CAPÍTULO 6 EitlerotacleriaceaB

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Broscto y co]5.,7! Según erteucíitas recientes de canastas de mercado, E. cofi OJ57 H7 está presente en el 1,0-2,5% de las muestras de carne y cíe aves, M ié n m presínla eon menor frecuencia en muestras de cordero y cerdo en Los supermerca­ dos,, »u¡n(|lie esios aislados pudrían surgir por conuirinación secundaría en el área de cara Leerías, En los E std a i U nidos, lus casos tendierort a úcumrcn ¡os dos últimos lerdos del ano y en los estados limítrofes con Canadá, La infección persistí en Eos rescmirius animales en parte poique el microorganismo sobre­ vive en cl ¡nielo durante largos períodos. Oíros animales, como cerdos, ovejas* ciervos y conejos, también portan EH EC y muchos oíros alimentos y et agua se pueden cúmaunmar eon las heces de animales infectados. Como resultado *c pmdiije-

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CjlfeiniL'dad Li_iiLit i hCejrt-ul-a rnü^üiife aító’Ka rtw fiíte líi-e y ¡xico-ti r. npr» vómiw, [jn, (kPfiSK;n.iíics hielen ser s,La j^njirc intH-Tinriijiiu ;l ru Ic llliiiíu h rccaftM S f refiiw ?,! primipa.ihí n‘j ¡le niñint m dia< nra Lu nuyMÍ.1 de loi puLjenleh lif iiea di.iiie.i iiw x a niií i^aísgre ni leiictvitrrs íccaks

ron brotes en los (¡tic tuvieron participación suministros muni­ cipales de agua,5** carnes de venado,401* vendaras crudas., reque­ són,*1 sidra de manzana41 y brtHcs de alfalfa.W'WT Además, como cantidades increíblemente bajas de esiw mieroorganis* mos pueden causar eidcrmedad* han ocurrido infecciones por transmisión entre ¡personas en familias y guarderías, entre Iih miñas durante las visitas a granjas lecheras ,'n en zoológicos donde se puede locar a los animales' 1:1 y cuite individuos esputslON á aserrín y «iros materiales del suelo en ferias ífc exposiciones de anímales.4*'' Si bien 0157:H7 es cl prototipo del serotipode EHEC en los Estados Unidor, %e fian reconoci­ do en otms países otro* di si míos, serolipos como U2fi:H3 K CMS.:M2 1 , OHMHH2. O l 11:NM íinmdvill y O [45:NMrlU- ^

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Taxonomía de EnterobaciGfraceaQ 239

RECUADRO DE COFIRELAGÍOHES CLÍNICAS 6-1 Colitis hemoírágico y síndrome urcmico-hcm^lilico EZI iCjidretuc u r ¿ u u j nolitin: li es uiu cnFítiucJad irumlHjtkj Je la NULrtrt 3ííí;uLüLuí a i L n j l i n LiC tao l Ili l í I u I j £ ItJi^ lJl)iL Cri c l Ú l il l |M ÍItu rtn i k

üaRa. S e tk iir u por u iti n ín á i de canwKrihTic^i: I ) ijw ic iír ti ú ¡ triin id iír»

rr^|inRiCathn Lgnwjnia. hcmoinka niicnqii^iupjrieaj. 2) raJumOn Jf l rrcucudy J í p]jk|gcLis 1tn!mt>i>CÍlL^ii;nLn> V Jh lnsuris.icjh.-ij iciiiil que

pdiw en c'YkJcPKtii pfw un ínñicc tlu fitirifU m pk^wn-iUr tííucpíh» y

volumen uriaariD htijn. Kl «fiKlnicnc urérraocwheinDlfticti« la rama jinnci¡iál lIl ¡n ^ iík ie n d a renal ugihlá en Iü í ilJItm . En hU furnia mi> fiecucule, í^ ií Mntlmnc est í pnntfídu pw um enJem ieJaJ diaiKÍL-i i{ve m pre^nu ícin clnJnr il-l-.n-.in.il tirn^K?, v^VmLlfH j d iL n v j « fu n 3 , l j tliiim 1:! :ii9q;.i iw

tnígcnEscrta^ sanpílfloknra» o vuelve Miuunwljjtta y, a |k ,'.lu Je Las (HUfhli de U itirjv lus. é LDcM licucfi puei firtwü i>IbD^lUkl. l i i l í n K iju n lu tk l i p s n j M'nlDiuui ».- (k'n úriin u t Jililh heuM iiTiinii-j I rl

b t tasos más tn iio . p ie ó i ooim r

u ih

colitis is4|i*¿n»im eíwi jvrfnríddn.

Ln ¿íü-jm* pucJe-ntev mputJi desunvllur un;i eilemeLi cutfmka hw^dr Ib. oúLíu.-v Liqufm iciL L j s n iiu m ijid iii^ n ii^ O l E C i;o la Ú £ in d ú u ctlin u g ru cM i li In v c - i i k U itprrnüLnt'Hi J l Iímiíicii:'i dil.-u-w. ¡i*hfv 4." Iij.il ii-iv V

hyrcannttntrt jmiftLitviLXtM'i ima murin tm iecN enlíe HHBC" y la saperfk k de lü tó lu ta i éjiteliale^ iniltttiiiiicv E l ücmutiiIIu ik Je lijaluí:i y bum m iejiloicquleit muchos jm esque se kvilLian wbcr un islote de pnrogerJcidíid craDiDsóiiücode .?ü kfrdenflnunsdb Icvui* de bAmimim[n ckíl i-rthrni.'gHi. tjuegn Je lacotnriiMcirtri, F.HE-r inittuce icüuiua Shi|!u (jlie w Icj-i'-Oitc;!!! «q Ll l irvtLliu: ión, Luí v u faciSi U.Jd'» pi»r el iiipicso itrujisrr.il’"íí--i¡'.:i ■du ncuU^Qlui. Utiji w j Ln U ^íül-uIj^i.'ci. I.i H iiiili Shifii viajj haíaa las jiAnnos. dowb es transteriíJa y m une a Erar« d i J;k «ibunidacks li lU; la khXLrkd a rteefUer» pwa ¿ I tteisu^» ¿bltH.»U¡jaMxiikictLUHida tOb,}.sobré ]¡»üí]uUis Jiin a ^lulás. cndwlíljaJc* £lLimcnal*n!s y^ lu lm epilelpotes tutwlMTH E.ikrjp Iíi Icuíjhii í1^ iii!crruk 7ud:k y Jirife al Kll'cnlo f-ndojitasaiálkív. d im lí i:i -«-iiNinidnd A única inactiva enyjmitieiü ü i b loa flth « 0 i» ¡s¡ y ¡ífttd L fe Mdiibici^u de- h iJoLíhb, i w u d c j y «bfto lt L iiIji

E^U> LUndilci! u b luiilcbL-Liúd Je I » Lvlillu.» th ¡IiM £ ]¡a lf»

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CMUpliclfitL Esti «flcucflcin de Jt’tpODeíimicaboA luií.ir ¡i lo-. ^igrHHel;1iiem Jet HÍmlranrifr tnéjnkn-fscflmJrtiei-i mediada par toxina Sliija I j eñwadadt! b lición eoftdiicí *l

4* fitirliM, lu íp e prLMjiM^^iwvlwiiítiiisi

d e liiv l api Ja re s y c u a lla f iü f a E i) de c riLiu d U is, tU in tlc i' itlIeriLiD í U n t c u í kes

sumís cbnskM. E l riJritJmfiLHtrtlih y íj 4Ífii£-jm.i di* Imi erlimciUfel. Ileva ii bü é r ilm C ilm 1ra^rneillunlus íip io c >«te la, U A M n b lh u n ú |i[lc a H liCKM fljfhifda

W (.unmumi de pbíjUeUi? hhp« crvtnt>(,>vta^cfiiii y 1»anímb. jurus ^hi el ífcjg wmgvinpj m iringidp en 5c» riñones deriva en inM ifiricncií rénflU4*7 S'í' nln.ci.sri tratimierto rornjmjlhadn fuera de Li a^i^trnru de l-.l htamlensci Mniihi^KC de li>, nifl-.w «w LnfeiKida jhk E. uji'í OI ?? Ii7 auniEiifui L'i fio ^ tn k iíü Jnjiae ardniLa>-JieaKil£uicü y. pm lu (uatü, ■i.-lv írt itiliííC Evrt Iíi aclltíilklad se m li/gn Itl^ riiip n ivtn . pun des4n^llür iuiikTwnnw c^Jetlícu* tdn&ü bs hOJiiAus SbJ^acoü el fin de bloquea--suurm^n 4 Fji’. e¿3ubs cndoteLule» y la» snilopos suitíticw de Iw r«ep4onn de Ch, que v |Nicdni «dm iriitrar por vh oral, atmnar b^ tnvinss en el intrrtincvy nil_i j s f hu injpeMi lii Li cíicu ü k íA i^ 1 ‘

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O] 11 es la >egunda ST EC no-01 57 en frecuencia comunicada en los Estados Unidos,62y una de lus mi* frccwnlcs en Euro­ pa ,“*■P¡ira saber mis sobre las infecciones causadas por EH EC se pueden consultar lu* revisiones de Kaper y O 'Brien ,2-'4 Mead y Griffin.3í5 Natam > ■Kapcr/* Püton y Patón,™ y T a n ™ D rfim A n de í . tn li en(frt)lie mntrágica, El aislamiento de E- a>íi OI57-H7 silo es posible durante la la¡*e a^tia de la enfermedad > ■los mlerourgarnsmos pueden no delectarse 5-7 días despees del iriirio. Como la mayoría de las iideceiones por EH EC son cansadas, por t . coii senotip© Ül57:H7> los aborda­ jes actuales de laboratorio se ba^an en la detección de cepas productoras de la lobina Jihiga o Ea detección, del senuipo O I57:H7. Loa métodos: actuales pura la deíeccitfn pueden resu­ mirse así; ]) ensayos para la detección del scrotipo O l 57 ;w--l-s-J'J'-n toninas S Uh direeijunente de las heces; 2} siembra directa en agai de MacConkey sorbitol íSMAC),-** ceflxitnarSMÁCJ™ SNfAC complementado con ecímma y tclurilo (CT-SMAC )3’4 o medios que contienen 5-brotilo-5cloro-3>inJox.il-3-d-¡¡]ucuromda1* 7 o 4-mc(ilumbclifcril-|&-1> glucuronida"* y 3) separación inrcJuitiainágttéiiea utilizando esferas revestidas con anticuerpos específicos de 0157, segui­ da de cultivo bacteriológico.11^ * Muchos laboralorios en los Esculos Unidos y en otros sitios utilizan agar de MacCunkcysojIjíioI (SM A C ) para identificar el fenotipo de fcnnerHíigión lenta del ¡>orbilol ísorbitol negativo a las 24 hora*} de 0157:117. El ugar SM AC contiene d-sorbí tol al VA- en lugar de laclosa pan diferenciar las cepas de E. coii sorbíiúl negativas [las colo­ nias aparecen incoloras, similares a las colonias lactosa negati­ vas en aj¡ar de MacConkey regular). Luego los aislamientos sospechosos son confirmados eon antisucros Ol57:H7 especí­ ficos. Sin embargo, csle medio no delecta otros scroúpos EH EC sorbiiol-positivos. Qims métodos de detección como medio cromogtínkn y mí todos E L IS A para la detección de toxina SMga son mis sensibles y específicos pero mucho mis caros que $ M A C laMTf' La incorporación de estsi prueba en cl laboratorio de microbiología de rutina implica un costo adicio­ nal importante y es pnsihle que- los lahootorios deseen timilaf las pruebas a los pariente* con máximo riesgo. Kehl propuso una mlninevisiín sobra el papel del laboratorio en ei diagnós­ tico de infecciones por EH EC .^ ’ E^pcLÍes distintas de jE. cali, ü u cepas designadas en la clasificación de los CDC como E. coH inactivas ?or anaerógeñas (no producloras de gas), lactosa negativas lo tardías) e in­ móviles. Estas cepas se conocían ames como seroiipo Alkalestens-Di spar, E. ufhcríii ea urtu especie recién deicritia de enterobaelerins indoi negativas, o-soibitol negativas y laclosa negativas aisla­ das en heces dtatreícas de niños.-11 Como c*tas cepas nt] eslía incluidas en las bases de daios de Jos fle m a s comerciales actuales, se la* idemtílea más a menudo como Hüfniu, SaíanHulia, E u iw ridtiti cali o Yerstnia mektri.* £. albertü se usemejapiincipalmente a £ evii inactiva^aunque no se aseme­ ja al gmpo Alkalesecns-Dispar debí des a su capacidad l1^ ducir ¡ía.s a partir de lí-glucosa. Puede separarse de £>. íiíim sobre la bu^e tle in asimilación de acétalo. Ea prueba de VogesPfoskaucr negati va y la falta de crecimiento en cianuro de pota­ sio IKCN ). Además, F„ plbertii muestm rc^eciones d íb ilti a moderadas a i.-ppoiineaminopeptidasa (PY R ), miemnis l|uc H. aivei es presa una actividad l'uerte de PY K .' Se debe aconsejar ül personal del lab^iTatorio t^ue las cepas aisladiis en niueiílnis de heces que proporcionen una identificación negativa en pri­ mera instancia para H, d lw i y que sean L-ramno^a negativas, nsilíKa negativas y VogcS'Pro&kfiuer negativa^ deben evaluarse mejor para descañar E. víbenii.

B Est ¡gima del d r. VaFbr Eso

240

CAPÍTULO 6 EnfBrobsctBriacgae

E. feryusm ii {anles grupo entérico 10 de los CDC) fue recu­ perado de sangre. vesícula biliar, orina y heces; sin embargo» no se ha establecido aún su icnpoiüítcij clínica.*1* Ife'nií lstlin Se diferencia de E. caU por la1»pruebas de sürhiiol negwjvá y hctwis negativa» pero adonitol positiva y celobiosa positiva. E, hermanil íanles grupo entérico IS de ios CDC) fue halla* do principalmente en heridas, esputo y heos humanos.m De los ocho cepas aisladas en el University of Illinois Medica] Cfliilef, cinco han sido de mueslfas de heridas, que incluyeran cuatro heridas de la» piernas en pacientes con celulitis y una herida de un dedotk la mano y se lia aislado una cepa en «riña,, senos maxilares y sangre. Las cepas aisladas tk las heridas estaban mezcladas con otras especies de patógenos;, sin embar­ go, las de sangre, crina y senos paranasalcs estaban presentes como cepas (micas. Ginsbetg y DaumllW comunicaron la recu­ peración de £ hermana de sangre, liquido cefalorraquídeo {LC R ) y líquido pcritorveal de un recién nacido séptico con perforte ión intestina!;, no obstante. w recuperaron « t e microor­ ganismos de la sangre y el papel palofínico en. este paciente fue incierto, EJ único caso documentado de enfermedad invasiya causada por £. hermanü es de un recién nacido con una infección bacteriana ifc un cefalohematuma eon meningitis documentada mediante cultivo de múltiples muestras de LC R y líquido aspirado de un cefalobemaionta en crecimiento.13* Las cepas de E. hermami tienen pigmento amarillo y son indo] positivos y sorbí[[j! negativas.111Com o£ hermanu son sortario] negativas, parecen bioquímicamente similares al serolipoOlíV de £1 coli, E. rttiñera tantes gnupo entérico I de los CDC) tiene alta propensión a producir infección» en las heridas humanas, sobre iodo en los braaos y las p ie rn a s ,q u e pueden condu­ cir a osteomielitis.-^ Además» existen comunicaciones de uro» sepsis y bacteriemia relacionada con catéteres intravenosos causad» por E, v#fw r«, Se observó un caso de bacleriemia por E. vulnerís en un lactante de 40 dfas en el Umvcisity of Illinois Medical Center, Más del 50# de las cepas tienen pigmento amarillo y son tanto indol negativas como snrbitol negativas. EL b iftec, aislado del tubo digestivo de las cucarachas, ts indol negativo y no fermenta la lactosa. No ha se ha asociado con infecciones humanas, E, wfecfírhttxyiaia ta sido asignado a un género nuevo como Ltdervia údm'arttJxyUnü.^ En el cuadro 6-9 se muestran las diferentes reacciones bioquímicas para las especies reconoci­ das de E.Tphen'cÍEfPG ifím SEiiplla, Los especies de Shigelhi pueden sospecharse en cultivos porque son no fermeniadoras de lu lacios» y tienden a ser biíHtuímlcameme inerte*. En los casos típicos. no produ­ cen gas a punir de hidratos de carbono, con -excepción de eiertos biogrupos de S. flejeneñ que sor. aerógenos. Poca* cepas de 5. sotmei pueden fermentar lentamente la lactosa i 2%} y la sacarosa ( t ■£-1y la mayoría de las cepas pueden descatboxilar omitina, características m» compartidas por otras especies de Skifidlíi. Existen cuatro subgrupos mayores y 43 senjtípos icconúd* dos de SMgtUa como se muestra en et recuadro 6-9,™ La cSasi* fkaeión de los CDC combina S. dysmteñae tgmpo A), S.fltxm ri (grupo B \y S. boydíi (grupo Cj como "Skifteikt serognjptüs A, B v C" debido a sus similitudes bioquímicas. Debido ii la presencia de actividad de omilína descaíboxiSasa y f^galactosidasa, la mayoría de las cepas de £, somtci son bioquímicumente distintas de Luí otras especies da Shi^i- tla La incapacidad para fermentar el manilol distingue a S. dysenteñae. En el cua­ dro 6-10 se incluyen las carKterfttfc» diferenciales de la¿s

cuatro especies de Singella. Cuando se sospechan especien de Shigtlla, las cepas aisladas, tfe las muestras de heces de pacien­ tes con diarrea deben ser catcgorizada-s bioquímicamente y las espccics deben confirmarse mediante pruebas serológicas, En un futnm cercano, quizá sea posible delectar especies de ShiRelta y cepas enieminvasivas de £'. cotí utilizando sondas de DNA seleccionadas para detectar los plásmidns de virulencia K spanubh de codificar los productos genéticos que inician la penetración celular y la invasión de la pared intestina] .J1 Incidencia y fuentes de Jas infecciones por Shtgdlü. La shigelosis es la mis contagiosa de las diarreas bacterianas. Los seres humanos sirven como huésped natural, la enfermedad es transmitida por Ja vía fccal-oral y se requieren tan sólo 200 microorganismos viables para producir enfermedad. Se comu­ nican entre 20 ÜOU y 30 01X) casos de shigelosis anuales en los Estados Unidos.Jft*5. sonnci es el setwipo asociado con mayor frecuencia con diarrea en esc país y representó el 77% de Im serogeupos de Sitiadla comunicados a los CDC en 2Ü01 ,s Los síntomas relacionados con la infección por S. .mnnei tiuride» a ser leves y algunos pacientes pueden estar asintomátieos, ¿ ítywnteriae es La especie recuperada menos a menudo en los Estados Unidos» pero es el serotipo más %iralcnto y el semlipo más frtcueme aislsrdo en los países en vías de desarrollo. Es posible que la idea de que las? espedes de 5higrifa siguen estan­ do limitadas al intestino y que ninguna invade los linfáticos intestinales ni se extiende a otros óiganos ya no sea pertinente, Pmw y cois.1-1 comunicaron la recuperación A S.jlexneri de un absceso csplén ico en un páctenle con diabetes, loque indi □ que se pueden hallar sitios extrainlestinalcs de infección. Las muestras distintas de heces de donde se han aislado espe­ cies de ShiiiHSci incluyen hígado, ganglios linfáticos mesentériros, LCR, liquido sinovia!, lesiones vaginales, pulmones» sacos- conjuncivales, raspwftjs corneales, sangre, lesiones cutá­ neas del cuerpo de] pene y orina,*U71 Las infecciones de las vías urinarias debidas a especies de Sfu ae íla eti adultos son excepcionales, Se h:i comunicado vaginitis por Sia%elia con infección de las via* urinarias asociad» o sin ella en n i f t a v prepúberes.-^Algttnas pacientes euperimenuin una sccretidil vagi­ nal sanguinolenta que puede confundirse con gonorrea.Ji* La mayoría de los casos de vulvovagLnitis por Shigrfla son causa dos por S- flexneri ^ TRIE J EDWAfíDSiEll£A£ Eiin-tiftiiiéifcíi€‘ fueron denominados inteialinetíte grupo Asakusa por Sakazaki y Muíala en l% 3 *M y grupo BaithoInmew por King; y Adler en 1 % 4 .^ Rwmg y cois, sugirieron el nombre Eíínwúiiefíette a i l96.VlfJI en honor del sobresaliente microbiólogo norteamericano P. R. Edwanls. Edwardsifiletw consiste en un género, Ednvincisiclla, que lí-crlc ires especies; sin embargo, sólo E. tarda tiene importancia medica. Los pno» eipaLes reservoriosen la naturaleza son los reptiles (sobre todo v fboras, sapos y tortugas) y Jos peces de agua dulce. Las carac­ terísticas claves que sugieren ¿ tarda se proporcionan en el cuadro 6-6 . Una característica clave de tarda es h producción A; abundantes cantidades dé sulfuro de hidrógeno. Salvo por esta característica, la bacteria tiene propiedades bioquímicas simi­ lares a las de Escitehcfita cofi. E l microorganismo también se asemeja a algunas especies de Ctu oiracter y Sabnonclla por su producción de sulfuro de hidrógeno en agar triple azúcar hie­ rro y su falta de utilización de lacios», Ema falta de fermenta­ ción de lactosa y muchos otros hidratos de carbono es la base pasa el nombre de la especie tarda. Una especie similar de £

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Taxonomía ao Enterobacteriacea# 241

Clia dro &’9 pru eba

D ib n n d a d ü n d r la s especies d o itm d e l gritan» tird u rich ia

m o g u lM iC A

1nct.il li-iní -Jr ¡iiu'.it.i Vugcs-E^n^lk.rjcf dU K> 1 i'.iivx dcscarb^ikBfli Ar^iniifli.» i¿ili¿iJr"|iM f.Vnin'na lít'í í .itIki^ bI»^ OSPtü

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«nTÍ-sui t nt^aiiufi. r»Mb e-^-titihU flOWhttii.' ^ tí iíf \epá* ¿«wJur-isi.

tanla que es sulfuro de hadm^ems rogativa, pero manilo) pt>sí(iva, sabrosa positiva y ambinfoldo posiiíva. lia sido designa­ da ' F.. ¡urda biojjrupo I ” .1*11 Este bjotipo pinjas ^eees se encuentra en la práeliea de laboralorio y aún nu parece (ener importancia clínica. ¥.. Arnii h¡j sitio cilada cnmti causa de di di utas infecciones extr^i nteMirtiles,1J?'4aa Las más frecueriies son las infecciones de heridas como resultado dt! iraumatKmo. a menudo relacio­ nado ron meeidenles acullicos. LtmhíÉn son frecuentes tos ahsreso* que pueden ennducú » baeleríemia o mionccro&Í5 .ISl Siete pudenies en un cstudii» mvicnjn enfermedades tifoideas, una con sideración diferencial impórtame porque £. tañía puede amular SatínemeHa fypht en culiivo.11’ La mayoría de Iuk comunicaciones de enfermedad entérica describen una ga^tnw emciiiis leve que nwjcirj sin iraurnicnto al e-ahu de 2 a «lía*. Sin em balo, VnMepittc y c o ls ^ comunicaron un caso de dia­ rrea prolongada en un laclante de 2 meses de vida en el cual E. Sarda ¡(del m ism o hiO£T*Ll|>n aislad o de tirt p¿?. de fiíUunO Tropi­ cal en cl hogar del paciente) fue eÉ imico patógeno potencial aialud^. Miirsh y Gurbaeh1,77 C L M u n icjru n el aislamienln de E, larda de las beceí- de un paciente con diarrea sanguinolenta y hallaigíis sigmdidnscópiens de múltiples úlceras clónicas y en» grmamienio mucoso compatible con enfermedad de Crohn Hl paciente se volvió asinlomálico después de 2 días de trata­ miento antibiótico. Se lia considerado que la disponibilidad de hierro itgula Iíi gravedad de la infección por £ kitda-'*' ■ 'l ' La sobrecarga de taenw, candida por tru^-nini ccrrmt critrocilm fulci formes, leucemia y c im m « ¡istmia con septicemia por E. También se ha comunicado infección por A", tanta relaciomtda con prótesis vasculares.111 *i-1 Se eree tpje oculten en ¡os icresi humanos brotes de infceeicmcs asinlomálicas ]iíff fz. tardet y « ¡nformn al menos uno de estos brotes entre siete niftos y un maestro en «na guardería de Florida,1 Sc describieron otras dos especies del genero EthuttdisdhL Grimonl y cois.-'1'7 describieron £', fioíhim tt. aislada inicial’ mente en. uvei, reptiles y en cl agua. EkJLsí espee i»; también fue aislado en heces hum ané sin embargo, no se conoce que pro­ duzca diarrea, líawke y c o k :M describieran Ü, u'tohtri. un microorgani sirvo u|ue ha sido aislado Krik» en peces y, en |a

actualidad, nn tiene importancia cl irisa, Kn el cimscSttci M I se nmeülni la carartenzaekJt) bioquímica de las especies de EtiwtíftlxtefTu

TRIBU SALMOmiEAi SaffíHtripIieflp contienen un único género, SahmmelSa y reci­ ben el nombre dei microhirilo^oestadounki^nse D. E. Sidnion Las üaltnonelas tienen antígenos somáticos (O ) que son lipoptilisacándw y antígenos flagelares (II) que Mm proteínas. S, typiii tiene también un anlígcno capsular o de virulencia (Vi). Desde el punto de vissa de Ins pruebas bioquímicas, suelen -.er

RECUADRO DE CORRELACIONES CLÍNICAS 6-2 In fe cc ió n p o r SfrigeH* ^di a cnt e rífl b a c ila r) F l i&inin» 'Misen le n V íne iA í IÍ/^iíhi jh t Hipócrates pir.i indicar uc Irwlur*

no fflDclerinuhí pir Incite (áCiflri InDcuenre tle heves que ckttUébhI ■:

}■mvo «eoipiiSndis pjr teoeijau-.j ^íeM^rtr» Jijlífrosa.*1 Lw ™ humanos canstiftipen el único huésped nalura] púa y la urf«£Íún orum por ingfí7i4rt. Ej diwalerí* lucilar m le mli%tRui«mi«iMc de las i¡¡ meas huKráiui y unadests inffinanlle de lun «dio 10-100 huncnas pnsíuc í etilcth u d jil M U."> Aiíultih saiM i.1*1 Lii liítíCi la d t i i i b .«.iIOAj ío íl JoUlf llhilAlltRár ilú lirt y lia iHitlgjdN p ilx:U ¡ií.)Jü 'i CvflaldstyCrt lu* «ÍOIO-

ítus tetfkpntrtH nfe rfflfnenies d¿n * í *".lt

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dnalc?i dt 1 .t 3 (Íí¡h. niovImiÉAinrt iitiM iital** ne ttmiai» itwm^ frecuín^T h tu iuntídad tk ira dep.üúiiiHKt aisn:i(*uvc. ptrola prts serwirf üí- «nn§re toji M lb aie y í u « 'ü cti las b e » ! y t-L iaieja^ iiíiiessh } (esftn*T7i"t. df drt'í5c4ci¿fi| indican la f t » divMáricsi de Ln enfcrmcil*! lo i|iw wu|¡eneque pn*hnhlenrKTitr tu cvunidii la [wnrtmriiín hmlenATM en el tBlMühk Se ctetofi iü s fK lu j infeedMies por Sitiadla co Icm bm tu eunauu lib ía Jl- «iíírui«í
B Est igma del d r. VaFbr Eso

24.2 CAPÍTULO^ EnlerehKlsrtíwat

Cuadra 6-10

U W m tn-Lac¡rm de las especies dentro del uúitm i S h i^ e lla

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JcTioTiiiri.iT ^ [cus scn>LÍpo.s sóEo en su hospedes I y ahundonrt

lodos los nombres de semiipos existentes en Eas otras subespecics. Los CDC siguen esla practica \ ulilizan nombres para los scrolipos cu la Mihespecie I y fórm ulas anl ig.iín ica,s para los serulipoi sin nombre descritas después de 3966 en I lls subcspth

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especie, pero pueden serrarse en siete ibones que represen­ tan seis auJjgjupns, Lu úiiiea excepción o S. hünftttrí, tuilcrs conocido como subgénero V. u] cual por la Etibridaeión de DNA-DNA es una cspccic d istmia.-1 1 Pnr lo lanto, existen, dos especies y seis subespecics de S. enlenca en cl sistema actual utilizado por los CI3C (recuadro 6-1U- En el cuadro 6-12 se proporcionan las característica* diferenciales de las especies y las .subcbpccics de SahttoiieHa. Ntmenclstura tie Salmonellae. Desde 1966, la OM S comenró a

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tumo lacio s negativas como saeanp¡;i negativas Las característica.’i claves pur las cualc.s mí puede M^fK-L'liar cl “Client SaliaofwUc se proporcionan en cl cuadro 6-6 , Clasificación t?ff Síilmarell ¡re. Desde el mtimeriTij del primer ais­ lamiento de microorganismos tiel grupo Saímoneifa, comuni­ cado en i KM por GalTky Wactenum npfiiJ.TLim} y en 1886 por Salmón y Smicli iStthnonefla chofemesms) cl desarrollo de la nomenclatura de 1ll*, salrnuriclus ha sílIu muy complejo y c.s lu í tema de debate (recuadro 6-10|. Las saknonelas son las entero* bacterio* más complejas, con más de 2 JíHI senaipos descritos cu el esquema actual de KaulTmarin-Wlute.4' 0 Antes del I 11 de julio de I9R,% se utilizaban tres especies de Saímwielfo pura comunicar resultados positivos: etnttrnuiítiji, S. ívpiii y S. ¿ttíeritiilis. y la mayoría de losserotipos pertenecían a esta itllima especie. En la actualidad, todas las especies y siihgmpos

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cics II, IV y V I y S. fwngttrí. Para Icrs seroüpns con nombre, destaquemos qUü lio aurt especies separada*. cl numbit con seiotipo no se escribe en bastardilla y la primera letra se pone en mayúscula. En Lu pnmtTJ mención Lie un senil i[jo el nom­ bre del género se rta seguido por la palabra ‘’serolipo" o por ia abreviatura "ser" y luego el nombre tic! seros ipo {Salm anítla serotipo o ser. Typhimurium). Ulteriormente. el nombre se puede escribir curt cl ¡jéúcru üc^uidu dirCLiamelIte pof el nombie del serotipo Salmón?}tu Typhimuriwm o -1 ?, Typhimvrium {recuadro 6-1 2 ). liii la práctica envidian a. las cepas desconocidas de muestras clínicas que sean sugestivas desde el pumo de vísta bitiquímico de especies de Sutnnmcihi se eonftrmaiL u ti libando antisuc’ ros policlonalcs que contienen anticuerpos caraira todos Jo* subgmpro principales. Ijoí subcullivos de cepas eonñrmadas se remiten li lübaraiom'ft de -HLLlLtd piíbliea, donde las designacioties de los serón |His \\v ej„ s. ^erotipo T\ pitiminí uní) se hacen sobre la base de Iíls reacciones scrológícas a los delermiiiantcs O y 11 . ístontificación ds Salmaaella typliL Si bien la mayoría de los serotjprvs de SatmoftcUij no piLedcn str disiinsuidON mediante itaccion.es bioquímicas, un serotipo, denoniinado S. typhí. tiene algunas earÉiclerístieas. blLK^uímieas singulares que pcrmilen di­ ferenciarlo de otros scrolipos. Primero y suite ioik> CH-td la ubüervacidn de l|UC algunas cepas lIc S. tvphi producen sóln una pequen,u e^niidLid de suiftií-L] de liidm^iíño, el eual se suele observar como una cuna semilunar de precipitado negro que ra forma en la Jiiterfíi/ ik la porciín inclinada y el eMrcmoen hn mcdiíK. Kl.\ y TSl (lámina cu culur 6-4B). AdeíilLes. ac observa que las cepas de S. lyphi son menos aciivas bioquímicamente que los serntipns rnqs t'xccstcnlcs y espcciticamenlc sun negati­ vas en las siguientes reacciones; cífralo de Stmmon; omiltna desearboxilasa: i»as provenienle de glueowi; femientatiún de ducilol. arabinosa \ Tamnosa; y uiilizacitln de inucato y aeetato. En ecrnseeiicriáii, lí^chioi i|ue lu mayoría de lus laboraio^ rins pueden jealizLir un ínt'onue preliminar de S, ryphi o de esjvcies de Sffinvutetía distintas de S. typin mientras ^e cspei^L la conOrmación serolngiea es|XM:iTtca del laborainrio local de salud pública. ínciftettcia y ttísnt$s tft lis satmcnelosisr La salmorclosis es una cuu%a importante de crlcrmedad entérica baCieriiolíl lanío en seres humanos como en animales Kéase recuadro de correla­ ción clínica 6 *.í>. Se estima que ocurren 1.4 millones ¿le casos anuales de salrtionelnsis en seres tiunlanos en los Erados

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Taxonomía de Eníerobacteríacsae 243

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Unidos, ]o que conduce a 16 ÍXH) hospiialijaciones y casi a ftíK) muertes,^ Alrededor de 35 íKHJ de eslos casos son scn>tilipiceém por ¡migratorios cíe salud pública y Ins re&uliados mui transmitidos electrónicamente a Ins CDC. Las infecciones humanas por salmonclas son causadas principalmente por la ingcsiión de aliinenlos, agua o leche contaminados con excrcmenlon humanos o amtrNtles, Ihu* S4ilmor£lfó snn patri^ens^ primarios de los animales inferiores (p, ej,. aves de corral, vaca?,, cenúíw, mascotas, ave.s, ovejas. locas, huiro*, lavarlos y víboras), írli: constituyen la l eu mi: prindpaJ di: ialmonelosis no tifoidea en los senes humanos. Es interesante dcslaccu que ct hornhiu l*ü el único mervcjriu conoctdti dr S. typhi. Si hitín la incidencia de fiebre tifoidea ha declinado en los países desa­ rrollados. siguen oeurrietHJo brotes e ^ irM c o s , Ert los Estados Unidos se comunican alrfdodnr de 4í>;S catos anuales.77 Cerca dd 5Üft de lai epidemias de salmonclnsis ion cl resultado de

la transmisión poi aves y producios avícolas contaminados. Las salmonelas en las heces de las yaItinas contaminan la superfi­ cie de Ins huevos o penaran tnlemamenle a través de ¡nietas linas. En gallinas con infección ovárica. los microorganismos pueden contaminar las yemas. La Ley de inspección de pro­ ductos de huevos de m O requiere Ln pasteurización de lodos (o* ppmluClOH (je ;t]!i hW vnx y la innjvicclrtn supervisada federal de los huevos con cáscara para detectar grietas. Históricamente. S. Typhimurium ha sido el serotipo más comunicado y representa un poco más del 20% de los aislados comunicados por ano a Los CDC. Los tres senoiipos más fre­ cuentes de SíihrttmrHn en 2ÍMII fiiérnn T\¡phimfjrium (22^), E liten Lidis £1H%) y fNevsport t tO'S-], que representaron el íO'fr de unios los aislados. II! hm e máü jtrarnie tle salm»neloh¡(»pnTvetlíenle Lie fuente liniea üh Ili hisUtfia de Ins lisladoa Unidos fió Ú00 casos con firmados por cultivo eon datos cpidcttuolújn-

Recuadro 6-1 & Taxonomía y nomenclatura de Iüí, sai mondas

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fiflFnjiLij,^ pntijÑiw^ du Im «em ipntlt Safm ¡»trlln definid*^ y m^nlcniik1-por el Cintro Cooperativa ¡iura Scfínnciii e Invoti.gM'Wfi snhrc S^ftam tfUti de 1» Orpni ?;ic ion Mundial de lo SnluJ tOMS] en fl Ptntcur Enchute de KimV Fnncia Se nvcnctnnan h» nuow w^ipo^-cn lat nctiialíznciflim anuales del esquema de KauíTnumbWJi«e.J,CAI Hn es*e íMjibíma, la« límemelas afnipan [A. H .f .f v .) «ohn» la base de los xnt^tnrN O ■¡npiáricns y se M jh d L v iik l) c i l *crtiIr|fcRi 1 1 . i , 3 , r lL '.l |Mi m in ¡u i l íji c l u v i f t a p c l a r e ? i. Ili q U c u H i d t c r a lo a t c i i t ^ i q K i h i l o i g i l a d i l t A . EJ. t ’ ,, ( 1 , C | , e n e . t 'i b i d . fte(Li(l]H» J d l i ^ u b r iwihe un ntraibrc. Luí prinimu íiInhHKlu. cKibkrm iKKi3íbiK% que iiklíüdlun id cafenLwduJ. el uniina] Jcl cuü mí aLslalia el inkiMorganLuiH) íp. íj., Sahuontfía vroripp Typhí, SubmutMi »rr4ipii CholirnKuinrii c unhm, En k) actualidad. N nranbm nuc^tx « dan scí an U kvnlid4d scográficd de dnnde ‘í í l ’.Lti pur pniriiTíi \-¿/ tSafmtwdfa C iiu d í. ,'>ci,rwi.iíTn'í.j ■ímtipi.i tfc^ekmd, ele.). Inoalmeme. íada scrtKijKi fue «.w idaBda uru especie >epiíruda íp. ej.. 5. tiMciiAr. S. * iefehmtlt', »ia cuiliurfu'. lii L «.'LiuliddU tMueundütiiiu u titiu de _ -MOcnpclica deLo» csludliu dj iducida del UNA tu.ii demiiNtrudu quL IftU v ti» cepa» de SuItntmeHay (lh1u« Un ien.ilipii> de “Árr^and" fumun un unjpii ilnicu 4* h)bri.lat:B6il Jet DNA eon -.irle *utigrru|n», ran ttóepcióo de.!. (snhim^tíi V» dcS c|iic ha ckrtí^iwV» mediarte hilridamón DNA-UNA qnf forma una pipcrie dt^ini5i.,í,1 ,l'iH4'H Cnpim y fW m iya 1lv twoinniíJa tusmn lu lip i Je Soimmflkt, Hivh.i pnNirido.l lsutui dí'igiM iiíkv de espsiií píiru li»* ■ ’íh HihjnipD ciwisldamJuí.csoraprendidoí en no iknkv gnipu ik" lubniluidB. Sin emblilH, et munAife "d » ]e riftiiij" puede contlucir j, enfunidn. dada que m: reíkie Imito j una especie cuniu a mi •cmlipn, r 'f tunut. fii íl s i' Omi^retn IniíniiH ■■■■iu| .1.- \1.. »'±i~i.-.|. t¡¿^ ,k 1QS6( #1 5»mK««iiiíi ¿ *1* HiMnifeiMcriM del CiMniiá d« Ranietkolopfji S b E R iilin recrm eiiJá tinánimemente eunibi.Lr laespecic tipo de Sat/ntmríla a V. nwffh'n, iiofnhrc t|ue no st hahta uíMaiiIo ¡iiucs íciiskí venuaritdad.''-1En L987L U Minen y FugruIF1- pnw iHiirai una "ponencii deopiiúfrT j la Ccmú^tán JuJinial del Cocuilí Inremudorbd de UdcccfioforEÍa Saaleuiáliea ik «pie d. fcner?5íiJnNiJih,í'/d eonsiiliera idlo en una q x ix *Sa¡mtmtiIa u rn tin r., pira incluir úcie H É e fm n , 5. typiú, S ¡yF&imufiw* v S. m ttríiU ü fiKntn ineluiih*i en S. fnteríca B^tn nectHiicndacifti fue ndopradii p íf fcv¡ C W ’ y nuchm «rc*s lahm lcinoi. Sm cmturfo, d ^ ik H ite ueia btiga dem«a, l.i Corriakk Jutitciiii nc$ri la xqlivitul xvbn la b*sé de ipie Iíi iondidOn de StiímiuIUt ieratipo Tjfptú tic labí-a siih» truaida de jnamera «Jeauda en lu pru^uctla tle Le Minwc y ■* fiitahta precmi|iiidm pnret hedu» de que st udoíHüdm 5- rttierk®, ‘■f nfflirfan nSuBnewriítf K w tijw l^ flii eomo fi tníeríca tiih íftsu rn im n i wn.ii ijm TjptiP y psdriii srromitida n pnríihn p * !•« m édinn.^Pnr lo Innto. el Cm iilé Judicial Eq^ammtd que v retuviera 5 íboit'mttuít i.inrM.1 éffwiie Up? h^ílima mieíilríK ' f e^ix'rsihy una solicitud rwrrgkla pon una op¡aia6fi.',p:,-,,PJ* Le MLucir y PcpofT^ Umbiín puopuMemn en E9K7 dennmlnur a h» wete HibfíiieTiJide StílimitMtlü e^mo jubespetiei. hubeípecie L II. lita. Illh . IV, V ^ V1J. M il recienKoieitíe, Eujjéb>'^ propuMi que eJ ^énens S abaonelía «Murta en ireii cip aifs dcnontinikJaü S. bongttri. S. t-m ítm i y i typhí. Tauahián propino ititidit 1 rrircncicr ea teiv üiiteipecin: A t ia t t ic a iiihe^pecie entenui. S. entfñra H^tespsjie a ti: m u é , H. enU-ñcü suK-speeie íNíin;r»íKW, S- r/tttrint uibeipvie Jhrutb'iK»*, fi rrJrrk ú tnhtísgieeie iniUcu y S. fníenfíj si,lvsfi«.'ie sufttfvme. Hastüd ramMiln en que ftib li^ enci; libm. el Cnoité Jud^Ld no ^ liaíiu pri>nüih;mdLfM#re esia uliiiiu pmpbL-MJ.

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B Est igma del d r. VaFbr Eso

244 CAPÍTULO6 Efitembactertacaíe

pre puede proteger contri Iíts estragos de las enfermedades mfeeeío^as que pueden IK.HITIÍ en epidemias súbitas y masivas. L i saímonclosis también se ha asociado con el contacto directo o indirecto con reptiles (p, ej,. lagarto*. víbonu*. tortu p s). Los reptiles están colonizado! comúnmente pnr Sitlmt)rtelhi y eliminan el microorganismo en forma intcrmilcntc en las hcccs.'11 Durante comienzos de la década tk 1970, las pequeñas lortugus untM?otas constituyeron una fuente importarte de infec­ ción por salmonetes en los Estad® Ll nidos, En l'JTS, la Eüod and E)nis AdnnnUtratii»n prohibió la distribución y la venta de tortugas pctiucflu*:. b iiiw condujo a la prevención de IW (KW casus de sahtiHTnelü»is por Siit emhíirgo. desde 198(i. la |:h^|hiIh! id id de las iguanas, y otio> reptiles que pueden transmi­ tir infecciones u los saes humanm ha provocado uti aumento de te incidencia de infecciones pnr salmnncla'i enn scTfitipns en­ contrados en los reptiles."■ lw Iíw datos actuales sugieren con creciente certeía que los Mitlbios íp, ej,, ranas, s^pos.. tritones y salumanürasi uunhién pueden representar un riesgo de salmo nelosis para los seres hinnantis...’1'* DlobaUiiüitiii:. se estima qiÉu los contactos cotí reptiles y anfibios explican, 741XK) 16^,} de las infecciones por \>thmmeík «jue ocurren cadt año en los Estados Unidos.'1'1 Comn ios nifíos pequeños tienen un mayor riesigi» de desarrollar sal m ondáis asociíKte enn reptiles y jnfihios con complicaciones pdencíalmeiHe graves tp. ej.» septicemia y mcoingilssl e& muy importante reducir te exposición de los 1ew> [antes o los niños menores de 5 años a esos .mímales, Por esta razón, ios repiil^s y anfibios debéh ser rnanlenidns akiádos de las casas duade habiten niños menores de 5 artos o personas inmuntidcprímitliv y no se debe permitir su pennaneneia en las iruardcrías infantiles, EmergBftm de Salmonvltea iJiaítirresisleníes. Durante la década de 1990 apaieeió en Los Estados Unidos una cepa muliirresistcntc de 5. Tvphimuriunt lipo detinitivti H)4 íD T I(I4> cjue es resistente a cinott Bfitibíóticos íainptcílina, cloranlenieoL estrep’ tnnticina, sulfametosazcil y ¡etracidina).1'1* En una encuesta ñau innti.1 llevada ll cabo por lt>s CDC ert el año 2ÍKM), el 5(Ki' de tes cepas de S, ryphimumtm fueron resistentes a uno o más fármacoH y el tenfa un psurúis de pnistencia a eincu fífiliacos earadiiif-stico del fago tipo DT104,7T Asimismo, desde ha surgidn S, Newpnrt enmo patógeoo mtiliinesistcnte

ftétuadro EM1 Cí^áüícacíúr de las espsctei V subeepe* el** do Sñtttv&iióHa Existen tk » rspcíics- de Sitbntmetia. S. entérica, «|uc LiM np icnk te s

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Xalmi-uufía fawijiirr Curien M ihísp cfií V )

t-iKs cjilí indicaban que sí infectaron en realidad lf¡t's 0CX3 a 2OTÍMM1 p crbculus) u lL IT L Ú e il 1985 en Illit U íis J |ns É M jjd in eir=-

cúndanles y luc rastreado a una válvula defectuosa en una lírma comercial impórtame de suministro de leche.^ Desde I W l harr ocurrido var«s hrole-. de S, EmcritiilK en ln* Esladns Unilfcv; am(Ciados Cun lin e v tls e im cásea ra.*'*-'1^ 1 ’ S e c u iiik i que c] Ú.Q19& de todo* Ion huevo? con éuscara contienen 5. EntcriticUs. En consecuencia^ Ioí alimentos que contienen hue­ vos ínfudns ti subeocidns lp ej.. parche de huevoo helado case­ ro, sídsia holandesa, aderí/o pan eiuateda üeL César, mayone­ sa casera \ tortillas liquidas) plantean un ri^go leve de infec­ ción por £ Enler¡lult>.hBJf;i En 1994^ un brole de infección pi»r S. Eatetitidis fue relacionado w n una marca de lielado de dis­ tribución nacional, So documentaron enfermedades en 41 esta­ dos v se esnmo que hc habían cnfcntiaJo m¡H de 2tX> (KM) per'*onac; [-a incidencia de enfermedad por S. Enterfüdis y la cantidad de cüUls brotes en ln* Estados Unidos Iw disminuido casi un 50% entre mediados de I 9W y 1999.*1' Fura reducir aún man la incidencia de estas infecciones. el Consejo presi­ dencial de seguridad en Icis alimentos Lmunem el |0 de dÑriern¡hreík' Lyy9 sin plan eon e3 objetivo de transicic^n de reducir la*, infcceinues pnr S, Entíritiiiis asociadas coi) I w w al JK^i- en 2005 y ile eliminarla^ un 20 IC).W Esitte brote» sirven como recordatorio constante de que Ja tecnología moderna no siem­

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Taxonomía de Enlervbadenaceae 245

R&cuodro (5*12 Nomcsietetyra -de Selmonetía en upo en lea

CDC HOMEHCUTUIU ACTUAL GE POSICIÓN TAXONOMICA Oteen tfmilintillai • ispeas: itahUrdilla).

ü eníip w Im n jn iiy ú x u li.

SÍJI k l'U l Ji'I.H

Ñiilrrfrirlítl . e n ie r i t it , s^uc in c llv c li*> m iK - íjk u o í.

II. llL . Mb, IV y Vttongorí (r a s ■.u h ríp w if V i - La pramera reí g;« w oM CwItt un

gico. A i ^Iíh Im jw-tr primeni ve/ en IM.lv en repiiles cníenin»! w Anhuiii. ^ U denomdnó principio “especie do Stilm m elhi lip u D ar-Ls-sjlíU iíii, varÍLdad de A riK » tiii"'.w M is Lju Jc sc [a J i v dngLLKÍ un ^em lipo del |é n «ro S a h ít m e t ía sobre la hiLse de t^ lu d io s Je h
] lüs «lí-Tislipus de S íiltittw llii ]]« pueJuin ser cli^li ng Liidos j)tnr neaLeíotiei Eiitjquídnieaü, S tih m m eíh i e u íe r ic u isutehpeeie a r íc a ­

JüíjwwJíí stmüpt (*E>

puede difefejiciíu’>e con facilidad porque tiene reacción jnKjñvft ai mylnnaln > mígaliva, aE iradas las cepas non O SG F f»\siliiva>. Coin(5 ruMiIlaükt de csla> reuccioncs bioquínticíis sin^ulareh, se puede hacer fácil mcnle unu designas; ion correcta de los Neriiipíjs. mediante ]a rnuytui'a de los. sisienus de iüeniiUcación tximert ia Icn, Para U tinpanjineia e]£niíca véiwc el reuuadm ik* oomeliKÍdn tlíniea íí-4.

TjrpMinunuill,. Sitjmnnti!t¡ [D 5íltli I*, Satmwtlki i EEh Éáhlof>

Adem ás de Los m edios clásicos ya explicados (véanse cuadro1'

« n U ip o . si nombre ifchc ir p rco a íiJn por ¡ia píbtH -* "'ürrmís.pci._ n ” « t "

- L n '«ffiH!ip-K -■■Hn [Kinshj^ltw en mtt* c o p e c k * I y desLjíiud<.t? p or I ü fi.VniiUIj¿ nntifHÍfikM en la’. « jh rtp w iíiL 51,

Eli,. IV y V| y i jwwijnji íp. íj.,

- b*i mtfmíwcH de- la* Muhftped** IL IV y V I y 3'. fríjrt^tüpr ceudücLi mis hürübnjs ii k it rr v ib x ru d a lllc i de E9ft6
Tnr*\l'|Vf»M“,lil"

am purU nlc.liaa 200]T 53 de i 2Si uiíbdUH de 5. Ncwport ety. üt isK’m? cMadmi nidcn*e de mííniioriití^pnn de resime rucia a los ami Módem (disponible en w ww.‘.edc.go\y namis^iMdex.hlim;i fueron, rcüist-cme^ ul minos a 4 de lo* 17 agalles antibióticos evaluados.1^ Infeccionesdebidess Salmón ella enlejica subespecieafizonat Saim o n ctía t n ic rittt subespecie íjrf'ctviu^ se asemeja a lew salmo­ nete* desde cl pimío de vista aniigemco, clínico y epi denudó-

m e

Nueves íitétúáos de tew fittaeióñ y a títíe r íiu iú ñ de Salm«ii«1lae 6 -i ¡i 6 -’vl. su díHírribierinl nucin» medius d^uirudos j riK]eetes de SafanMclta de \¡i<muestras fecales M fdliis ^ídpcliviK y di fermrialéis. Kslos medios incluyen nnvt>biuun;Merde brillan!e-|¡Suei.)'ia tN BG i, 1f agar imv,iliiüciJiíi^^tde bril[Link>|i.lÍL,ero]daeliísa (N B G L j."' medio de sit(is[(-IÍHÍrui Tci^itol 4 í XL.T í |¡!*■ y medio de Rapp^ptirt Vasúliailis. seinisdlido niíhüfIcndo{ M SR V ).5?- ' •1*"■Las lónnu* las y las propiedades tlileren-eimles de estos medios se p n ifítrcioflafi en el cuadra 6-13-

CUADRO DE CORH ELACION ES CLINICAS 6-4 SeimoneUt Atinase |jn pqxilrk w)1?ns íwfc* fci* # * # . nndtituyfn e-1frf.ici¡Hd nMn'mi* nutimil d>.uS. A it™ i*í. pem!«

’%l ■ * lf -T pií■,•i. ■ I ►■' ’ Lp"■i : . Ljp'Tf fe i— ■ -'cif *■« CUADRO DE CORRELACIONES CLÍNICAS 6-3 Infección p o r S U m t M llt

huminn^ l¡n

t iirral v citrn*

uwiiimiik» U m hK ip h ,is f ^ í r u í iJ o la í n f e n w w M ]x>? í í t ó ro¡r I ji ¡nltcdán hinTuwmdíte ctevJirafcniDr la in^í^tigaciñíi út hm j^wENt

cf!wii.i«i dw> re^Silet v avf?¡ é í cíto iI y pmdiwtu*.de Smj^u. V uk» nHf. '■si-

padum hiJUMniíirkaiu infeivído por J. An3fiPKM «n

vrKMMfi-

Cvh \ ivi.'i.'r.ipí. Iliv piMÍLjvwiK II.1;.'i, del cm^u!iu»4te «..ipuila* de pnLvci íTé Ni!» f w t í o i iJ iK iiig v ir c w l » u p a * (fe ¡J ife w rttt p.w ¡H ilm m fíto |JJ I t j H ' í n w te rilti. la n rJiíífe 'iU tk 'ii in;U firCilCfiM. qtf£ VliWj. Jcm Ic titlj illa n ta Lcmc ii#«lu uitü fulnwiuuite. lupumpajudu pnr ftrhre Jc w jr (n id o s v iirjid in de

n«itnt)> y víVralP^ 2)batl«i
iu n rJr Lj ^:liál 9o& h.'nvL'ü Iri -’W h- lunUn n t ¡¡Krt'cm f lo * ünpíui.'tlItí'Li'rí píK ffi^m s y 4 j ui: « m í o tld p m a d o r í n t l tju e la-v piírwKias c o n u ru ín fe c ¿tán previa, an-ribee tn la pui S . t o p h i, p u n k e sc ju ir e x e rtte d o cL üülhixm-

w n i-.n t.u -n Lu I LL-1 K t» u un a flo tfe k iM É i de b ic m iiiiid ii « k k n m m o iíi» . Son rig o |Mc«tcvp«HiM la i c o n M iit k v io iiK d e«c]K N lacKkca p fK itiv « L d í 5 . M ine*## qyt p n .Jik.ie ii liiiilt r ic in in y iin riiiiiiiic l - ^ ^ ' Si k m jrt i v n í.i ilib .- íl . (b u o cifiit lie ^ c fu i Lh-iuni puüdtm i cri muí^ik « liquidij erfíJLíTikjufdctt, iu

M l a j ^ a c i i las h re c i planreari'a en jic o M c a u en Li n ia j r t 'f j de Im la ln o fla rim (th id o b la, dim licud A- su a s fc íla con d de fim scii-lLÍm m ei lio íw a prfciiLiiws píeneoiis ¿L ila * muetírds fet jk s .

% (K w j inHtiip urh» df |lk
J h Uíi fasu lüal ifc itLiiCfLJCiltrrrlii, |h.i<S. ,JLri¿L±il2t en U*i iiiOu « o

mLcnüfcíJLa ¡hijo Je mu tunilln de ieiii_br.1^.1.ni:h ib «rrpiimtcH de Necva Ilethl, Indsir ^ Iil íl itwo de* (a enlenncdail v^iria gasínseni^ri i«s Is.' ni ■ . hu¿Ui Bítuc «fliéiwA y aípiicemia con jBfwcida lcw*líji*(b y es hinitar il c-Jii4ijk> par «Hh iír-tfüpús ife Sutln^Mtílit. Keraa y cois CMakAkariMt ijfuc r í puedf nhvpk'ariiiia gacnmcniíntH cu ci»k|Hifrgrupo ftarín y ^ ..if:n,-:i‘r i» por dolor «ibdoinml twlkt). «Hurita (■' menudo *niou). náuteas. i> iin*- e hui^meímifli líi¡tf,'w En aíneíul. Ifidjím eaeí tiri^li/nilxla y duro «le uno a 5 día*. Piiede h¿|fuieuu «(itW m ia. pmv w? lia iiifrwuido o í auttfii- .1 de ¡aswfteniencw ¡Se pneuime quereurre una jnleecidii toealiMibj cu dLveesüi iLiím hi^ íu Iitm ¿obu) cbcdíhlu. biaíwi, Mgudo, ptiluiád. anJealaciuití! j, (¡eateula hilias luego tk la. hw.'terieiitLi, .iurv.ije ew niíiiijrre es áncumemala. Tumluín han crniunicadoeisos hieu dircumemialfis «fe WiBriMÉsLcUib.' -fEs pftí('J>Je ^lic la p feijltaisli de l&s infecríiaBe* liuHwmw cau&ftkh. por S. Afuoiuc m i lutoeotuiuiic-^li p » ip f lo» »(iumiut» ^aíivoiaíf^rifiak-s suelea sw iííts . Si a «uturgo. esie junt^enn dehe wr eim^ideralin en in> Jiapnósiiem d^ferak ialeínfe Sk paizieaiies wn sepsái y (eririi cjíii e que i-cni-n uaiA^dceiLe» ifc ifitM^-HLi ihJim íe-jstiL«, ¡ni eipcdiJ víK saí Sr ddse recomendar rsn lencr reptiles, sota lodo en l-as ckso m i menores de 5 J

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

246

CAPÍTULO 6 fflfem tatfw frH »

Cuadra 6*13

N w ra t medios p a n la r n u p a d á n de fü p tciK -de Saímm w Ua de i » tm n

M ED H Í Agar nowtercin¿-vrde l'«*i!l.inic-f.l 1..1-J H.NBG)

FÚ K M I I.A

P R IN C IP IO V IN T K ItP R m C I^ K

A|¿:if [fip)k’á“'-i ■mja, Jfl g CiirtLíii ■mdBk'it infrien. 13 g TLoisíiIFíiif* sA í co [vm 4 }si.i™ i5 ¡¡ Kojr» fenoJ i.'iaJ sádica II 80 ravj fUltlTIUl. 1 g Vtnh íwiS!.i’iif , 7 r ij NciWfti'i.uiJki, [(( mu Agüa .K-vl-l.-.ti a 1 1 f i l riioj. 7 J

] ¡i\ «.Lilufiuis dtf 'iittrixmcHiJ ujiarecun Li<mny in icial ccm ¿’cnEn» nucLriüns dCctiluf negín iúlíllM f V ínilüfMl irLí-IísSíJiik ü y íisrtik’ hIítMJli s 1.1^rwliU'' i. n'ih d«í ii S \ilfilkSi, ’iií rr'ifLfjíijaüLiliij y lula Jürt^í kísifeiLc ií¡c i'ljru d iSa eisci iriedHi alreáeikT de cada ct'icrflu. I.o í colrthm i» san ¡nkihuLn n mi praiJwfn (.nfcwiiiK tk-1urgru. Alguojis ctpk.< df <’tsrfltHtrtfrfrvutiiiri pn>i[LHTn nanita'’ irMh'ílFigHiHr< Je ln< íspes-ir» thr

A^ar rwftfíMUiina-vtrde hril|inDt-f|Bcni|-l|k:lD u lM JC il.t

Ag\u tnpnca>a ^'¡a.

g ("j4»1ci nnuiflkfl férrico, t 5 í; T ^ líu to tódicoL 5 ii bvtm k, Hl1f CjliaitiL. ID mlVpnJc hn 11arele, 7 nig. Nlimk'iiikuu, lf) rny Ayya. ií^slilaj.1 j] I L

Lii-ifcLcteHift dí e-íitíjjfi’-de .‘M liw dfJitf '‘t t-dMi la pruiíiKíbn de H;S. que (ÍW||[UÍ-P # cdosi^t FK^rm, S«li1 lilfift LHU fw itm irio ^11Ji ciimii¡mÍ2 K.S c(w cink'TUL'i qii^ ¡iroJiven ¡wido 1 [w tsrdf fjicerol -n l 5(lo«4 , pnnjue m p li hijn» aralerHerc íb ln feTOci^n dte H,S. EsEo cundujcr V L.^»lciri¡i4 iinKiInRi p¡int Lp mijurin lie lü típ c fif* (le Pmrfina y C M u cb i

A|fárn1í li.iiHhíth

ftppikngijct'üe, H) ( PípUMuL 5 £ IHvracw*b: lcvidur,i. 2 p. DenMlculjto ijklku. 3 ¿ fiojft reuma, BJttí g 5.3tp»«iniv4-iVi»* i-i nJiilil-P- i^ptiMupirciKiMtJi». 0.1 fi Ajiíif, 15 g A pis destilada hs^ia 1 1,

D fie a j in o p d d id *k de .'■v¡mtmti¡n |i?ir4 ir^BboUur jj|¡*.‘i'l Lil» uLilücüín )u>|m:bO!KU en «%Uf iticdm sms Lási sinhptc nrja» lsti ILnnicti <7>mfncvna k'an'ndAd iri«fccada de sales Nliarts jw ji iithihr k» culiíumiet

Agar SM-ID-

L j iteBttkki de «ficcki. iL’ íj^ híjií-H j je ki-ui sute la femaeiiJo de icnin Entrado ifc carne de v h , 3 g BktpOli1i.mii. Ci ii a jvaflirde fím jm nptu % ™ in auwnria de jí-giiLnrarüdckmik, Ln^ sercUpus. tiiiK tu de Ic'vyiJwni. » £ ■Je SufrMMtito ¡pp.iJLMfn h jIm íb rojo rs.MmJ4f* (a tori ujt buide ¡íülrs HíI íjuth. 4 £ meíi|oni)hinknrra-’ que fs« cotiíomnei h’fmHii rtrnt frfnrrii ‘v?rdf. arul o Ruju rmjtro. M IS f tiohrtij khi ptwii]'. w paia p-^a¡ii4li.h>id«« u w iriunfiesKrs ínt'ulurt*!. f pn!ien¿ un.i ii.inliiJ.ul mi sJprada de uüci h ilijir^ para inh:hir a hw. rsuiiciTrív [\,tá a Verde hnllfinit. Ij. í mí CQdfOflMJ SuvtnKH tpiwn^pefpn | !ja].k;|iipirqp¡kidnj. If, |7 ^ GlvClkM lIU S^ÜL^ 12 K Su%lr.jk»tm tr.'jciui 1 fjjliKupuaiiiinidi»). U.Dlft *■ SíwWio I. ü g Ayaí, L3J % Apiu desalada hashi ! 1, pEi fin.il. 7,6 i 0,2

Mediu ifc K^ppifKKlVisadla.!» wmLfiélkla mrNlil'ic-jftm iM riRVj

TtipeoM .A^ f

lítiltntfririkf

ItiJndiKtiio lia. iJ'J J r rawina, 134> g Cínrum tk fcidiík. 7. Mi g.

FcifilD d U d rig iiB p itiú n , 1.47 g dorum dc m ipienoírnnBiAm íiL lO.^í jí □sulfilo ik ^enk 0c irciJaquiii, 0JÜ7 ít Apuí, 1.1 |r Aguí de%id '..:.-i h i -'a L L. TJl'VuIilik.'iili imjIuIlMi sil -'■■ da «Eenl inñdn i|¿ 1 iriL P il tífcd 5.2 ± 2 X iJfi*a-hsriM-!)tír*!Ím14 (XLT4)

Protowu pcpüHia H ^n; n1--. 1.* g Eatncta Jl" LcvMjía íkicw. 3.0 £ [ -liii-nüi. .VO g XíloSü, lí cil'wíl 3.75 “ 1JCtDSD B;k1(»„ 1 ‘i g SaC M ttD t,tu . 7.Í p CiirMn amíVistp fírn tr, 0,H g Ti
Sijhií,; U ha-^e A¡S feBdnMfli ^(leí llW ’lintetnCI asi-cndtfi'i; Jfl lü hüi-Kti^v, má^dcb. (espedm Jr Sahmvtrlío y uIta^I cti L^HU.irrrirH'LLHW]. IcJucidu de apji ])¡:\piaS. áe Ij mizul^eirin se «mu ■iíIíki Ls pía£« pan deietiaj huLiccéks iHNr iU 'j'\v:íi cor™ uit bai.i dí cret'Liumto qix -c pri’-jiüía árvSc íl piinln de m»cvl¡ii i'«n Jwijjinal Se tnfnm «uKnlti'^K. JH to n k de r.iignt ¡-Jo pafü í;nn1iuliir la pure/a. y pura pcjIíait jntírha^ (wnLuíniii;jih y %(fcc n jfiij1 ' IjtK v£il:f.irm«s u'ia nlhihiJi?-. pcir il» 1 C* .'rtlliii.k'KWi jlt1 LUiiMnlíi ik: la pi.'Mi íLiij-inilijLa, Vade tic si Ju q U iU l tu .lI\ílli il ü 41 41 V

lirs^bcs

Íh ll ei un tníüio aLumeíitcíelet ci^o que nisciiuje cl deioike-ln^ de Muliij que >£ f&L'UL’fl:ra en el igar X I ]J por el ^ufínciarde aniéako T«í(iiiaI *t. t i iija/ X l.'l i itibiSfre gwf «nnipkDD el i-recinii'fnN» de Iwlitf. las te ie n iu síJitifH-^icUitó _v hijus|y*i, £ ¡iúihe km l 0 fiienejueiiie el e(ee¡nihnn l»ilr mm'hax twreria- jrtm n cfiH L^ . que incluyan Pmwirí. t»n tcnli™ nepra Jb|tuOs di; una i'iLi.ib;á;iiJVh t|í í-iiki la Hik:|M l.isí iiiUffliaS tlf Satmnnfliti ITT S-pt^iri^iM «rminotri negras tí de eeniro iwpru eon uru perifolla amurilla de^iés de l?-24 baiD líe inPutacKVi. rtefw í?. de una im;ubiLÍi5n nmClnuu. Iu k A o d íu w vuelven uMilplelarFKiitG ne|ra^

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Taxonomía He Ént&obaeieriaceñB 247

Cuadra 6-11 Nuetas mrdim p tn lu (eaititnd&a di; egpectaí de-' Suím^m'Hn de b heces tCvnt.f IÓR.MU1A

Mi'rrtn

PRINCIPIO E m E R T K E T A C IÚ V

« r^iJus y pijih íwneíntpj* mignu. R;ihi ctipm Jr KiítpísitJhIij í|*j« nn

Ayuji destilado Im Ma 9 L pH irruí. M r C Ü

prddium II~H mw^lriim ciJ i-a iíN' pii*h‘; ;*¡inunUo r "aitos ire pueden u i d iíc ie & iiiá _ - -

M ntliO A 1 ÍC m ixli r.. M'.'i k L ír t í:J¡í>

n r jj- L n v n c ^ t l-

Lk>k.iU«UWahrWI

A i í .i: l t i _ l ; i k ú ú y ii-'w , 1 0

de

!-■■ u i l i i i i u i t i l » ' i l . n . ■ iitrL iv a m - i i i l ] » t a i l h i i i l c v

tm e lk t du u i b i J ! » j/ u .l c '. «iCah -ctilo'idlM .'tci ja s d a n l i iU kiuia u r d ía s .

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i «rginrn», d,í f A d Ju r « p frl í^lj. il, 1 ^

J e uní- p w n iic-isi e M C ffH w ^ v i'ír K i) p iv d e « a e-M ÍP didj iiiu \ io « M * r i» e i-

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\e p o n in a ustnmpcpum-ii ¡u n í d ir Im O jIiru. J ’ !e LHKnipiit'iln JitarudD

>.,i> U ,i i : . i , l i . h ' i ' i

I íi iilfa fi-in íriin n t s L ^ i h l a p y k h - i f r i i i t y d if t r t í i K - v rfi c k U d e fc

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¡fiitiijtre en d m e ia M lin » Itiíie m w i ¡i

L 'h is lid iiii, ü .l g

t t u í l t l f l . a l a n ir u i r ..'. i r r : i . . : r o g K i n s d h l r di.' i:r i i .':.L i it< .s l .i n n i .i . E a B in L c r o c

L-iii?lni'ulfia,0.1 g

cLdn p u e^ k t i f l i i i a J i f j lu i n h ^ i L i o n tle ] c r-i^ in a ie flin M

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de l-i inrtruaW n«

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i -Ueinü. i>.l f L-jrietk>Ji¡rt4i. A.OOS g I -knihdnnin?. O.É j l. píHilüLi, 0,1 y L - < l* tíh ;l f t , l

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L.-ltaiMMItlL. Ú.l g

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ísLkinhia., «Mí I g

U reo k\ 0,(U j CitlH ÍM . U.OI £

Adeniíia, íM>l ¡c flír a C n J e

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Sulfato Je Ena^.riü'üij, <S, i i¡ S t l í í j t P j.it'iinL-H.'Vi. 1

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EulncH » de le vjd u r¡LÜ ,J ¡j F iX 'am de hidrogeno díjw lúiK O , 7 g

Futíala de düihíiójen» pudsiti.i, 2 |£ Mí>vl.i Je i-mmi ■L'rnm 1‘Jrniit j j k W co lírriLift, ELÍ g

¡i C H J f-C a J .rU £ 1 FTC , CKÍC £ A eljj dí^M-atí-i hm a I I Irm cdim k'-. a^ rcyjiki» dnpúc$ de I¿j »(cnli¿a>:M)iii

ile s íis a im ln ra cfc

(t,S g

Ln funornLTiiciiiJi ÍLrul ik ■taíwfjLirw. i ¿túi en ífíir d c

a D.125 irifcVJ. 'P e n > y c o k '" h

Cpsmnpep^in.'L 2Í j

I jií fípr< íf?. üo Saftn&uítii ifan m i como «?lctn¡« re4nr malí a clim i»

S;ilmnJiílla CixinKi^Uli

M í A'Ij Je t-p'iTid^erHi^ th„T-l ^

l i u l t f | ’i i : t !■I ! t u j u

A^ldEts ■nJubidiXL'i. L>.(G ¡l

X u r J c a ju r ^ i l a s l í j t j i - n ■iL’.T lr

A£JTr CS S

hiürMli^n ninj’urMi tk‘ U»í vrunpueNits CTtirtniféPiííii piuñ^A i^^hhi^ilM iilis |.irl4 f táriDiU t f i 6 -ÍE J. Hl

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ClISOMjtgj.r, París Phainiu! < J M r r b Y lr J iih -

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C\it»hK¡rT jre^ki» y-olm ci'lit'mnnís jp^rtterv LiHTyuúUmini

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Metilo* craauigéiiicos. Los iusloTos. crLtiiiiütkdv umnuígii* nicos. son ctsjinpuesSos que actúam con» s-uslralai para, enzimas espwítícas- y cambian de cnlur dcbitlu a ln accií m de la tarima snhre ef ^uslmto |Eí|. 6 -(S). Hl pfiroer rneiiio de eüte tipd fue el a p r de Kiiinbach que utiliz» un silsiriIo ci\>ni4>gcn¡co par¡í PjjiiL u c líis L d iJiü

I X ‘ C jü I, 5 -b i i htki-4- l lo n i -1 -i i i divU I -|li-[?-^atac Lo-

piranpsido) ¡«stlo- con prcrpifenglicol, que es fcrmcnlado p 3r Las eipecies de Haimantlta para, generar Acidos11 El ajar de Ramhuch. es idíamente específico; sin embargo, no deiecia S. TVpfir ni 5. Paratj ptii A .1” UK’,V* El agüT SM-TD es similar al de Rambach salvo en que tnizurpora dos siüttfülrss. eiutnogénktM' X ’Gal, para |l’ga]ycHwid:isa y X fíLLT, para |i glucítsidasa, Hl medio SM -II) detecta lanío el «roüpo T)'píii como Varatyplii

A lj^ u n iu i i m i i n i r i r f unLdiiiM - í^ liij iíi»

> L j | - t > . , 11-»; | L j .‘ i V . i l i í f í l i

_m.iis |'.¡ kiulJht crcuxtE^niá poi'a SaUmmtUa (SCM : Oxoid. Basin^siake. R a il» Unido) coolunc dos iuatratn-v cromogénicos. E! primero es Magenta-cap «5-tramo-óeloro-3-1 nártl ileapn |aE(3], <jne en hjdTt^i?aiU> p.ir LLidi/a Ins eroims crecen enmí^ eolnniíis ¡ncolont^.^ El medio A RC (medio ri[VeTOflU£¿itiCi») mili/si diLEidC'LósiJo (C ÍIE- O A U , ie uiil i/a para dcicclur microorjíanLsmos p^nd^Jctore^ de |l>£a]aciosÍdas^ que aparecen eomo colonias riegrusen presencia de hierro, RL ^cgunjr» Misir^tti, í-hn'mo-J-

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E s t ¡gnna del d r . V a F b r E s o

24G CAPÍTULO S Enterobacierfaceje R eacció n crom ogénica CROMÓGEMO

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SUSTRATO CROMQGÉNiCO WVIÜIDO PCR INZUÍA BACTERIANA ESPECÍFICA

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H SUSTRATO CRQMOQÉNEO

■CRGMÜFGRC' LIBRE D ESPU ÉS DE LA REACCIÓN ENZÍMÁTICA

LOS SUSTRATOS OE CROMÓTORO S E OXIDAN Y PRODUCEN UN COLOR IHSQLUBLE

Figura 6*6 Rcx’i'n lltRKl»*le^li’C-i Li** '■us.rruiiis iinifk'i.fks [€Ti.unóiyc!U>0 Lihetall tumpuniciik ik1ditclcirtirt CuUmcs ik-[i;.fs de Li dcjcra-lR-nimpor en/ímu tuclc rianaft opse ífH'av

tloru-.Vinüiílil-tjt- i) j:a Iueí opi iai i¡>sLiimi,X-a-Gal), es, Itldroliza* do por especies de Salttumeitti que se presentan como colonias verdes.X|UÍ'' u ’ Pcrry >' cois, modificaron más larde el medio A BC con la incorporación de alta fosta lina (árido i -atanii-L¡LminoeiiUn^liiniook un “'sustrato suicida" que ayuda a la recu­ peración tk especies Stítitnonetkt al inhibir cl crecimiento Diagnoslics Sparks^ M D) es un nwilio ciornujiémeo ■u=]^cii\a» más nuevo í|mc milita uitsi mez­ cla de cramógenns i sustratos patentados) que detecta actividad de enrasa de espccies para La recuperación di recta de Sütnm fikt de las heces.42* Eslos autores recomiendan militar SM dD para cl aislamiento de S. Tvphi que no es delectado en apar N B G L. \?1onners y cois, ^Mtrvatonque lo» abares SM ID y Rumbaeli eran mueho más específicos que el agar para salm aneb sbigeUx y el agar de Hcktocn.^ Dusdh y A li’u egg trtmpuniíort seis medios (agar entérico de Hektoen |H E|r agar de Ramhach, medio SM-IO. agar XLT4. agar N B L ü y medio M SRV) v llegan™ A La COncIlíSidn de que M SRV era el má-sscnsitnlc para el airamiento Je samoncks no tifoideas de las heces; sin embargo, estos autores observaron que la paturalejca sem isólida del medio era una d « ventaja y requiere una mani­ pulación cuidadosa en c¡ laboratorio. Señalaron que XI.T4 (¿nía una sensibilidad comparable con H (i y una espcciJieidaíl de casi el I OO% f puede coniiderar&e tirta atlcmad va para e] aislamienli» de .sjlmonelas de Jas heces.m Pcrez v cois.'0 com­ pararon cuatro medios cromogénicos (medio ABC, agar para salnranefrA CO M PASS. agar para salmonelas CHROMagar y

agar 5 M 'ID )to n alarde Hektoen ctnivenciunal ert 916 mues­ tra» Je heces, de paciente» interaadíKi en tre» hmpiialesDespués de 48 horas, de incubación, la sensibilidad ames \ des­ pués del enriquecimiento en caldo de sel en ito fue del 6 l5 fí y del S9 ,l% con el m edioABC.de] 77.1$- > ■del W con agar CüM PASS, del 66t7 % y el B 9 J * eon CHRÜM ílíJW . del 68,8*» y del BS.?'?- eon agar SM-1D y del 85.4^ y del 98.4% con ugur de Hcktoen, rcnpcctivamcnic. Sin enriquecimiento, después de 24 horas de inoculación, se detectó enlw el 45,8^r y cl (»2.y> de lodos los aislados de Snhsmwlirt, según el medio utilizado. Hckioen fue signifLiMtivjmenlc más sensible que los cuatro meditíh en^mogenious. mienlras t|uc las sensrbilidtHks de los cuatro medios cromoídmeos no fueron muy diferenlcs entre si. Con enriqueeiinienio y le o período de íncutiacíÁn de 4 i horas, et agar de Hektoen nuevamente tuvo la sensibilidad mis alta í9R.4í'i
B Est igma del d r. VaFbr Eso

Taxonomía do Efítefobaeteriacüas 24&

7-ajníno4-me[ilcurmarina (7A M O . EJ área NPA en la tarjeta tic prueba se Impregna con nitrufeniialanma. La desanimación del reactivo se reconoce poique se produce un color pardo ana­ ranjado cuando se agrega la soluá¿n que desarrolla NPA (hidntaido de sodio 0,25 M), La falta de actividad de PVRasa y NPA en Iüs especias. . q en DNA n RNA eromo.sómico harán que el trabajo epidemiológico y diagnóstico en micro­ biología sea mucho más riguroso en el futuro. Estas técnicas se CAplkan Con más detalle en el capítulo 4 IRIBU ÜTROBACT£fl£AE En Ciim b o r tercaf se incluye un géncm - C i t m f w y I ] especies. El género Cüm haaety la especie C.frettndti fueron designados en 19.12 por Werkman y C ilion. En 1970 Frederiksen describió una nueva especie a la que denominó C. kostri. En 197L Youngy cois, propusieron cl nombre L tn n e a mahnaUca para, un grupo similar de microorganismos, y en 1972 Ewing y Davís describieron C diwrsus. Prederitesen examinó la» tres cepas, determinó que eran feaotípicamente similares y propuso restablecer el nombre C km tri como nombre válido para el tasón-J?h En 1993, Brerracr y eols-, uti­ lizando estudios de relación de DNA,, mostraron que los microorganismos identificados como C .Jn tindii consistían en un grupo heterogéneo que representaba varias especies genéti­ cas,11 EN,te trabajo condujo al establecimiento tle 11 especies

genómlcas dentro del género Ciimbucrer, como se muestra en el cuadro ó-14, Las características que sugieren que una cepa aislada puede: pertenecer al género- Crr/rJWfe-r se proporcionan en cl cuadro 6*6, Las características clave que diferencian a C. fretm üi y otros miembros H^S positivos de las raímemelas son el creci­ miento en KCN (las especies de Salmmtettfi son negativas}, la ausencia de actividad de lisina descarboidlrtsa (las especies de Sülttiutieltü son positivos) y la hidrólisis de G N K I (las especies de Salmenclla son negativas). Lu diferenciación bioquímica entre las especies de Citrobncíer se muestra en el cuadro 6-15. Las cepas humanas de todas las especies genómicas salvo G inserí se han obtenido predominanlciTkrtie de heces,sl Farmer y cois,1” que revisaran cepas remitidos a los C D C citaron a C, frvundit como posible causa de diarrea (aunque la mayoría de ios aislados fecales no parecen esm asociados eon enferme­ dad) y como causa de casos aislados de infecciones eilraintestinales. También citan una posible asociación entre C. kmerí y brotes de meningitis y abscesos encefálicos en recién nacidos y comunican la recuperación de C. amabmticm de algunos hemoealtivos. lauda y eolsr en el Mic rubial Distases Laboratory en Berkeley, California, informaron que C.ftvtítutii fue 1a especie mis frecuente identificada de ioüik los sitios cor­ porales excepto Lias heces. En las muestras gastrointestinales, se ubicó en cuarto lugar pu-r detrás de C voungae. C ferstfiíJ y G nrrininmi?**' C. freumtü ícomplejo) ha sido cntriiinicadocw causa de enlcnnedad gastrointestinal asociada eoa el queso Brie importado' 1y se informó el aislamiento de una cepa que transporta el arttígetio de E. coíi OI57 ,33C. kastñ lia sido aisludo principalmente de muestras de urina y del aparato respirato rs o ,T a m b ié n se señaló eon frecuencia creciente C. inse­ rí como causa (te meningitis esporádica y epidémica en recién nacidos y lactantes pequeflos.-11^ ^ 7^™ ^6Se observan absce­ sos encefálicos en el 7S9f» tle los lactantes con meningitis por C- f a í J í r i , tina providencia muy superior a la publicada para otras bacterias que producen meningitis.3*-175 Un tercio de los lactantes con meningiiiü por C. koserí muere y al menos cl 75% de los; supervivientes tienen un deterioro neurolrtgieo grave.® 1 Otras publicaciones corroboran ia tendencia de C kmerí a pro­ ducir meningitis y abscesos encefálicos, sobre todo en asocia­ ción can el bacilo gramnegativo anaerobio Premtelfa mtlaninogcTJÍcü.,<‘‘1]' - C. scdiakii se aisló en la sangre y cl líquido cefalorraquídeo de un laclante prematuro de 5 días con sepsis, meningitis y un absceso encefálico tratad» en el University of Illinois Medical Center.Stó Iil ni fio fue (muido con «mpicilina,

Cuadrú 6*14 EipcdH unlciiun:» j adualti dcnLn* del j'éxtciv Cilmbacter i . - - i ' - - í i ;íe Ji-rrs V ,ttjí •••-A : •• ■+' >' 1

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DESIGNACIÓN ANTRUiOii &e t.a e s p e c ie C-ivmp-fcjo(\ fttut'J»

C, díwmu Cj iiTiriUTEijJdL'üH C. iifmtknUtiíi'Tíij.

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E^reciis g e n Om ic a

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B Est ¡gima del dr.VaFbrEso

25® CAPÍTULO 6 EniBrabacteriBctiaB

Cuadra 6-15 ]>¡fe-reiil*i.teíi'ui tte ts pc-cíes dtntríj dd ¿íiílihi dirahútlér*

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C1TRORACTER c. c intSakii todenáúm

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BIOQUÍMICA

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*.'Jkinfjs, )¡',i'ñíÁ‘i Hrr/iHtf UJ y. tJi.» *: Wi-¡¡i máfílt fptrsp i - 'u t f i r»«¡i A'iyrm w^inltrav* l>1i-lfit'i-iír n^fit pVJtrííHTji

piperacilmn v cefbtauima. Hacia el día 14 et laclante se enconatraba ctínicamente cslahlc y cl tratamiento vr cambió acefotaxinia intravenosa y cotñm ow ol oral- Fue dado Je alta después de & semanas para completar 2 semanas más de tratamiento con cotrimoKazol oral en e! hogar. A los cinco meses y medio una [ortografía compuiarizada del cerebro mostró la wMtlucián de todas las cavidades de lo* abscesos. Otras cepas, de C sédtfíkii en la UnivcrsHy « f llliitob han sido recuperadas 4c orina y un injerto artcriovtnuw infectado de la piern». De ¡3 C bruukii identificados en el University oí Illinois Medical Cenlcr, 5 se recuperaran de tirina, 4 de líquidos, perimneales. 1 de una heri­ da abdominal h2 de muestras endolraqueales y I de una mues­ tra bronquial. Las cepas de C. Jarme ri aisladas en Li Univcrsily of Illinois se oblu*ieron íl partir de heces, mina, tejido de la pared abdominal y líquidos ueuOsüs. Bmekfler y cois, comuni* carón un caso de bacteriemia por C. farm erí en un niño con sín­ drome de intestino corto que sufrió un episodio óptico j\*kjo después del comienzo de una infusión de nutrición parenteral total (N P T V 1 Sólo se han recuperado tres cepas de C. x ilia tii en L'niversilv nf Illinois de t e fLíenles, .separadas: orina, líquido periiotieal y la punta de un catéter venoso central. La mayoría de las cepas de C. ymngae lian sido aisladas en mucs«ras de orina. C. rtideitiiam sólo fe skKi aislado de roedora y produce urna enfermedad en los Latones de laboratorio conoci­ da como hiperpUasia murina colónica transmisible.^*440 JLa idenLificaeiüii de especies de Citmhtrcier st ve obstacu­ lizada porque las nuevas especies no están incluidas aún en las bases de datos de la mayoría de los sistemas comerciales de identificación, Pura ayudar a los laboratorios a determinar lila nuevas especies de CfjpioÍJdclfTKO^tlamy cois, publicaron ana clave dicotomica que utiliza pruebas bioquímicas eonvenci uñates, Rt patrón de sensibilidad de las cepas aisladas también ofrece un ausiliai para la identificación. C. kmert tiene un jiatrén de sensibilidad a los antibióticos similar a Kttbsivlla {resistente a aropicilinay licureiliim), mieniias.que C. ftvundii tiene un patrón más típico de espeeies de Entera* htJtier (resistente a ampicilina y a las cefalosporinas de pri­ mera generación).

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TRIBU K Lm m EA E La iribú Klehitelleae incluye cuatro géneros mayores -K te b iite if ti' E n a m b ú a z K H a f n ia y r m i i c i - cada uno de los cuales abarca varias especies que son pirógenos manifiestos y oportunistas dd hombre. Se ha agregado un quinto nuevo géne­ ro, PtmtMa* para adoptarse a la reclasitícación de los microor­ ganismos antes llamados Entemhacter aiffitomemm biotipo X III y denominados ahora Fantvea Las carac­ terísticas elave.s que subieren que unu cepa desconocida perte­ nece a Ktehxiflteae se muestran en el cuadro 6 -6, En el cuadro 6*16 se presentan las diferencias bioquímicas entre los princi­ pales género:* y especies dentro de ta tribu. Cémm Klsbsleiüít. Cl género Klehsiella recibió ese nombre en hufliií a Eilwin Klcb.v un microbiólogo ulemán Jé fines del siglo xes. El bacilo conocido ahora como KícbaieUa también fue descrito por Cari Pricdlandcr y durante muchos años cl “ bacilo de Friedlander" fue bien conocido con» causa de una neumonía grave y a menudo fatal. K. trneunumiat es ia especie tipo del gíneio, Canibios taxonómicos en cl género KIcfnicHd, En 2íX>1+ Drancourt y cois.1*- realizaron un análisis comparativo de las secuencias del rRNA de 165 y los genes rpnB (que codifican la subunidad fi de la RNA poltmerasa bacteriana) de las cepas tipo de nueve especies de Kfebsielhi, Sus hallazgos confirmamrt que Klebsietle es heterogénea y está compuerta por espe­ cies que forman ites agrupamientos ñléticos. E l grupo I com­ prende K. pneumonía? subpespccics pneumoniae* rhinosetem* ijttííís y Qtpemtr y K, xrwmhtntafis: el grupo íí contiene K, &rnii!timiks¡t ti. K. pftutiicalu. A". tnrisam i y A'. íerri^ena y el grupo III contiene A', oxytaca,117 Sobre la base de esta evideneia prepusieron que el géne^í KU'hswihi fuera dividido en dos géneros: KMmetta y RatrnUélla {nombre en honor del bacte­ riólogo franeíf, Didier RaoulO y que K. axytoca delie quedar como un luxón monofiléticon Las especies ineluidas en el grupo 1mí iniinticiiün ea el género Kícíxsieíki, mientras que las inclui­ das en cl gropn II mui transferidas al nuevo gínCff» Rtíouiteita.' Granicr y cois, mosfrarort además que el taxón K, axymra esta dividido en do» ciados., que corresponden: a díw

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

Taxonomía de tnte.rp£>flcteJTflo&se 2S1

Cuadra 6*16 THferesiciacppn de V» fice n » y «pieles principaks dtntnj dt ta tribu W r& jídW

PRUEBA BIOQUÍMICA*

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grupos genéticos,.denominado!» <mü-1 y osí-í.*0»™ Por ülumo, Cafyfíwtfííobiu:tem an Rram tlom atis, cl precinto agente causal de la dojioVuitasix. lu sido nttlasi tiendo cuino KirbsicUn gram lr m m n s sobre Ja base de los datos ñ]ogeEi€tieos,1-,3 L

Las especies de Klelrnelfo y Ranaftella euin ampliamente distribuidas en b naluraltza y en el tubo digestivo de lm seres humanos y de Im mímales. Se debe sospechar una especie de Kírbstefla cuando se recuperan colunias grandes cotí una consjstcnna mncnitie en las placas de ^i^lvmicntn primario. En agar de MacConltey, las colonias ilpicamenle « preseman grandes, mucoides y rujas, y <] pigmento rojo suele difundirse en el agar circundante. lo que indica fermentación de be Lusa y producción de ¿eidn, Sin embargo,, nn todas las cepas, son mucoides y algunas especies de gnfembucfn pueden simular estrechamente a las especies de Klchsietla en las pruebas de cri­ bado, Toda» las espevíes de KfchsieUtt y Ravultella son inmó­ viles y Ea mayoría no dcsearboAilun la onütina iR. unuthinttlvtica es onritína-positiva), características positivas en la mayoría de las especies de Entcnybíicíer. Muchas cepas de KíehsielSa y Ram ltelhi hidmlizan lentamente la urea y producen un color rosa claro en cl cultivo en pico de flauta con aear urea de Christensen, Se puede uliliíui la producción de indo] a partir del (ripíóiano para separar las dos especies principales. K, pneuinitrti¿n> es íitülol negativa y K, ajytootf es indo] positiva Ciertas cepas no producen esLis reacciones clásicas, le» que llevó a nombrar varias especies adicionales (cuadro 6-17J. K. pneumonía»' se recupera eon mayor frecuencia de mues­ tras clínicas y puede producir una forma clasica de neumonía primaria. Se encuentra rara \ci en la orofaringe de las, personas sanas (tasa de portación del sin embargo, se puede presentar una previdencia de basta un 20^ en bis paciente* hospitalizados. Essa cnlonizaeión puede ser la cau^a deinostra

ble de las infecciones pulmonares que suelen ocurrir en pacien­ tes con trastornos debilitantes como alcoholismo,, diabetes m cllitUs y enfermedad pulntcinari jbsLrtleliVa crónica.43* La neu­ monía tiende a ser destructiva, con necrosis y hemorragia extensas, y conduce a ln producción de c*putti que puede ser viscoso, mucoide y rujo ladrillo, o Fluido y de aspecto "similar a La jalea de grosella". En los casos graves se pueden observar abseesns, pulmonares, enfermedad Cavitariu crtSniea, hemorra­ gia interna y hemoptisis. I.a pleuritis es habitual, lo que « p l i ­ ca pof qué el dolor pleurilico se observ a en un K(tf* de tos pacientes. A' ¡meutmmiae lambían puede causar di >6inta$ infec­ ciones ex.lrüptdmuiaares, como enteritis y meningitis (en lac­ tantes). infecciones de las vías urinarias (en niños y adultos) y septicemia A. azartuie y K. rhmosttuficumiiis son aislados infiecuenies considerados actualmente ¡subespedes de A*, piietitttmtue: sin embargo, cada u n » de clItus se asLM.'ia con un cspcclnt singular de enfermedad. A', oznenat se asocia con rinitis atroftea, un insumió denominado oetna c infecciones purulentas tle las, mucosas nasales, Jantla y cols.=Jí también han informado un CJ.-I.J de Eil>Sce.su corneal eausadu pur K. ol&etrtic- Las comuni­ caciones det aislamiento de K, vsat'twe de sangre, orina y teji­ dos blandos sugieren que el espectro de enfermedades causa­ das por este microorganismo es más amplio tle lo que se creía.1*7 Ar. rkinoschnvtm ti produce la enfermedad granulomatosa rinoescleioma, una infección do la mucosa ¡espiratoria, la orofnrmge. la nariz, y los senos paranasales, Se deben reali­ zar correlaciones clínicas cuando se recuperan estas especies en cultivos pan determinar su importancia médica en los. easc^s individuales. Aun cuando estas dos especies ya no son consi­ deradas más verdaderas especies sino, mis bien, cepas bioquí­ micamente inactivas de ¿ pneumoniaej1* pensamos que la

B Est ignna del d r. VaFbr Eso

Taxonomía de Entarchacimiaccao 253

rodos Je lejido o muestras de tríopsia examinadas con Unciones Je Giemsii y tk* Wright. Para aumentar lu cipeeitieidud de3 diagnóstico. be han utilizado tinciones de Dlqicrle, WarihinSiany^n1 y Giumsa rápida (Dtff Quiclí).-1'* Se ha comunicado una reacción en cadena Je la pohrnerasa (PC R ) para la detec­ ción de donovanosis en muestras geiiilales.,;L1J La azitromicina ha aparecidocomo fármaco de elección y áebe militar cuan­ do se confirma.o sospechad diagnóstico.151 Género Enterad acter. Como muchas cepas dd genera £'íi/twIw cttr producen gran cantidad de gas, durante muchos años la especie tipo fue denominada Aerokaclrr tíemgertf,\r Lti desig­ nación del género fue cambiada por EnwTviwcter por Hormaectic y Edwards en 196D.’:'*,, Hay Jó especies induidas en el género Eniembacier. Un desarrollo reciente ha sido la eliminación de tino cte los. hitntipos de E. agghmerans y su ubicación en el género ConlU género, tinfi nrinn'ffr tiene Ij:» cüimeierfsticas generales de KiebsiiUtnc* pero puede ser diferenciado Je h mayoría de tas csjxseíqs de fítcbsielfa pa«jw? sim inmóviles- y omití na posi­ tivos. Ert el cuadro 6*IH se presentan las características bioquí­ micas que permiten diferenciar las especies de importancia médica. E. y E. t'iüiicag son Jas especies halladas más a menudo en las muestras, clínicas, Sq distribuyen ampliamente en el agua, las aguas cloacales, el suelo y las verduras. Horman

Cuadro M l

parle de la flora entóriea comensal y se cree que no ocasionan diarrea, aunque se hit aislado una cepa J e £ cfofícae pruduclora de una Iiiniilu similar a Sliiga Je las heces de UU lautame cutí síndrome ur¿mico-hemolírieo.,H También se asocian eon dis(incas infecciones oportunistas que afectan las vías urinarias y respiratorias y las heridas cutáneas: en ocasiones, producen septicemia y meningitis.117 £. stikii-áfcir. conocido como E . cloacar de pignwnlo amarillo,IBj ha sido hallado en varios casos de meningitis y sepsis neonatal.3^1 Se comunicaron tasas de mortalidad dé tesra on lo que indica que puede ser al (ámeme vimíeniO- Algunas publicaciones recientes han ligado la infec­ ción por £. sakazfikii en recién nacidos con fórmulas de leche en polvo contaminadas.1 ^ 4W E l pigmento amarillo brillante fpaiticulármenle intenso si tes cultivos se incuban a 25 *C) y la naturaleza "reíisiente" de las cokmists ¡huí tes primeros indi­ cios de la presencia de cale microorganismo iFtintocú úgfi¡v~ u\cratts también produce un pigmento amarillo, en general menos intenso % a menudo .sólo después de la incubación tar­ día a temperatura ambiente h El patrón de dcscarhux.il asa de /,, saktiTfíkii i prueba Je lisina negativa, argininu ptaiiivu y nmiiina positiva) ayuda a diferenciarlo de E. aem^mvs (Usina posi­ tiva. arginina negativa y onütina positiva) y de P. aggifímcmm (lisina, arruina y omitida negativa)- además, £ M tk n ^ L k u m i fermenla el sorbí ml, ai contrario de fe', cioacat, que sí te hace.

Diferenciación d e espedí* rk- taporlafida clínica en ti genera Em m étitur' ■

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B Est igma del d r. VaFbr Eso

2S4

CAPÍTULO B EtttaroklKtofat***

f . ger^m-iac produce infecciones de las vías orinarías y *c han aislado «tras Cepas cu cl apaftil» res piral orio y la Ainigíc.^1 Desde el punto de vista bioquímico es más cercano a £, w j}r w í (prueba de Usina (wsitLmKarginina negativa y oraitma r^siítval. pero es ruenemenie ureasa positiva. Puede ser dife­ renciado, además, por las. reacciones negativa* en adonitoL ¡ nosilol y soibiloL mientras que E. oeroaavs muestra pruebas positiva* con las tres reacciones. Se ha notificado que E. (xrmt'jTjgívmí (antes Llamado Erwinia (am *m $tna, Em tm M eiít taxiome y grupo entérico 19 de Los C D Q EtfcH1 causa distintas infecciones clínicas, que inclu­ yen «vlcumiclili» después tic una fractura abierta,^ 1 infcccidn de heridas.41-1 sobre iodo después de un traumalismr» grave o lesiones por aplastamiento.* infección Je las vías urinarias^'^2* y bactcnicmia y neumonía.*-' Lai características bio­ químicas claves son sus. micciones» lisina negativa, urgininu positiva y «mitins positiva j su» reacciones. negativas a udonitoi, inosiioh sorbiioL ntlnosa y mclibiosa, Los pruebas de laclosa son negativas pero las de ONPtr. positivas, y hemos obser­ vado que las colonias que Crecen en agar de MacConki-y de^anotlan ceñiros violetas de^wés de uní irab&ción prolongada. E. ashuriuc (untes datilado grupo entérico 17 de ln* CDC u Citmbacter atípicoj es bioquímicamente similar a E, vloacaei sin embargo. CS singular entre Lis cspccics üe Eittembac1*rpar ser inmóvil y Vbgcs-Fro-skauer negalivo. Se lo encontró co di&lim.ts fuentes Jmuuin.is, wm o Hit¡¡re. orina, heridas, iniciv res­ piratorio y heces.'1 Se infonnó un caso de neumonía cxtiahos' pitalaria causada por E. tuburiae.m2 Hemos observado una criación cunsidcryblc en La capacidad (k los sistemas comer­ ciales para ñleimiflcar en forma carecía esta especie. E, amnigenm es fundamentalmente luí microorganismo del agua que ha sido aislado en muestras humanas.1^ Se informó en Fonda «ubre un caso de septicemia, postransfusional causa­ da por E, fifflrttjffjiiw^ 1 k. hnrmawhct es una nueva especie de Entewbtwttr que recibid ese nombre en 1989 fHsr B ie n io Homtaeche* tin mierobiólogo uruguayo, quien (con P. R. Edwardh) propuso y definió el género Enierobat-icr.'*' Antes conocido como grupo entéri­ co 75, desde el punto de vísta bioquímico es m is cercano a Etuyhifüe íalHJt’Li E. tuncéro^Hus), salvo en que es urea posití vo„ sacarosa positivo y csculina negativo. Se han notificado cepas aisladas en sangre, esputo, heridas, oído, vesícula biliar y heces- En marzo de I r los investigadores de Sos CDC identificaran un hioie hospital ario de septicemia por B honrweche¡ en una unidad de cuidados intensivos neoninatev Cinco lactantes tuvieron heinuculiivos positivos y otro lactante- tuvo una traquetlis por ese microorganismo. Ea otros cuatro lactan­ tes isc identifico colonización, No se informó tle ninguna muer­ te, l,«s cultivos ámbieotales mostraron que el microorganismo estaba presente en tres estufan de incubación v en el pomo de una puerta. ‘,,w Se comunicó un brote de infecciones del loríente sanguíneo por E. (u/rtnon'ht'i en lre-s unidades de cui­ dados intensivos neonatales en Rio de Janeiro. La revisión de las historias clínicas para los procedimientos previos puso de manifiesto la nutrición parentela! como único procedimiento en común. 171 Se ha visto un caso de baetcricinia recurrente cau­ sado por E, honrvm'hei en el Llniver.sity of Illinois Medical Center en un paciente de 2 años, con un ncuroblartoma que afectaba un ganglio linfático supraclav¡colar irquierdo. la glán­ dula suprarrenal y un ganglio linfitko periumlvilical. En L9$ I, *e definió el grupo entérico 69 de Los CDC para un grupo de cepas con pigmento amarillo semejantes desde el punto de vista bioquímico a E. ckvicae. Ln 1W6. se describió ErtTt?MÍHtciír kflhri como nueva cspccie de emerobacterias

semejantes a Entembticter cloacae*** y similar al grupo entéri­ co 69, pena que eran negativas en 3® pruebas de VP, fermenta­ ción de adoniioí y producción de pigmento ¡im dllt), Los estu­ dios de hibridación de DNA realizados en los CDC y en el National Insiimie of Health, Tokio, llegaron a la conclusión de que las especie^ del grupo entérico 69 son variantes bit*£Uí¡nicos de E. kobti con pigmento amarillo,™ m La mayoría de las cepas de E,. kohei fueron aisladas de muestras clínicas que incluyeron sangre, espuio, fauces y ürina.l"n4J4, Ememfmeirr roimnii es una nueva especie popuesta para un grupo de microorganismos denominados Grupo MU I 42 i se reftere al Naiicmal fiuiiiiitc of Health,. Tokio),¡í' Las cepas de E, tfinvwíi son negativas pam 1isitia y omitina desearbotilnsus y aiginina dihidn>lasa; pt^r l« iant«( desale el punto de visia fenolípico se asemejan mis a Ftimoea t i ü t f l o n Las prue­ bas útiles para la diferenciación de F, üg^iamenim son la utili­ zación negativa del uiaEonato y la fermentación de dulcito] y sorbitol (ambas negativas pala P eig^Iumcrans). De las, nueve cepas estudiadas, ocho fueron aisladas de muestras clínicas: «riña (cuatro5. esputo (dos), sangre tuna) y pus funaK pero su importancia clínica se de-sconooe.^ Olrus cuatro especies fE. mtennediia, E, dissffh'ens. f- nimipnssurafis y £ jüvnniu) se encuentran en el madioambientc y como patógenos de tas plantas y sólo pocas veces han sido halladas en muestras clínicas humanas. No se sahd'a que £. iittermedim (antes £ mtemwtfíum y Grupo H i se presente­ ra en seres launanos hasta 1987 cuando Fíats, y cois, comuni­ caron cuatro cepas de E. intermedias que habían sido aisladas de una herida en m pie. sangre» heces y bilis.4* M is reciente­ mente, D 'liara y cois, notificaron e] aislamiento de £ intermediits de La vesícula biliar de un paciente eon colecistitis que también dio Sircptocotcm grupo D y StaphyfococcM coagulasa negattMiv'-' eípeeies de Entembactex junto con algunos otros miem­ bros de la familia Eritembacteriacefíe iC .jrew d ii, ei^jccb de Sti'ftilhL Morgwkihi rñw^ufítí \ especies de Providencia}, portan un gen para la P-laclamstsn codificad» cromosómieamente que puede ser inducido por ciertos antibióticos* aminoá­ cido* o líquidos corporales.*" Al contrario de tas p-lactamasas mediadas por pUainidos* estas enzimas no son expresadas nor­ malmente, Sólo bajo influencia de un inductor o luego de una muiación cl gen se: activa y lacniim a se espresu. Por lo tanto, es preocupante que los microorganismos que albergan genes para P-lactamasas inducibles puedan mostrar una falsa sensibi­ lidad si son evaluados en un esiadu no inducido. Reeiemenicnle, se han descrito métodos, para la detección de resistencia debido a p-lactamasas induciblcse;n Eslc tema se explica mejor en el capítulo 17. Género Pan'uea. A comienzos de la década de I97ühF aggku ruenw.i (Luego denominado Erilembarter agglamemn.%) fue tvs[X)nsnble de un brote nacional de sepJceinia cansado por líquidos intravenosos contaminados,^ E l nuevo género ftoniútíi fLie creado en I*)1Í9 y la especie tipo fue F aggtottu*ra«ts.*** Bstc laxón incluye las ccpa£ tipo anteriores de Enfenttmcler «gtifomenms, Envinia heiinada y Erwmiti mlk~ títte. PtinliH.il deriva de una: palabra griega que significa Híde todos los tipos de fuentes", que describe así a estas bacterias que provienen de fuentes geográficas y ecológicas diversas. Se ha aislado una segunda especie, F. dispersa, de las superficies tic plantas, semillas, seres humanos y det modwambtentc, Ambas especies muestran pruebas de triple de-scarboxilasa negativas (lisina negativa, argimna negativa j omitina negati­ va), pero pueden ser separadas por ¡a salicilina, la cual es posi­ tiva para ft íiRKlomíTtirts y negativa para F. disperm.Mi Se des­

B Est ¡gima del d r. VaFbr Eso

Taxonomía de Enlsrobáúienaú&añ 255

cribieron otras cinco especies que se encuentran en cl sucio y las plantas (véase cuadro 6*5), GétittO HaTnla. N. atvei, arnés Entembncter hafnia, ís ia unisa especie del género Hafnia. Las. características bioquímicas son similares a fas de (as cspccics de Etxtembacier salvo en que IL alvei no produce ácidos a partir tic Igü siguientes h ito w de carbono: lactosa, sacarosa, meJibiOsa, raimosa, adonitu], surtiitoi, dueitol e i nositü! (néase cuadro 6-16). ti. atvñ puede ser distinguido de algunas especies de Sermtia porque no produce lipaáa ni desüximbdnuclea&a. También hemos observado que, al cunlrurio de dirás especies de Etitcrvkacteriactíti. esle micraoigaacsttiü' despide un fuerte olor a heces humanas. No está ¡bien definida la importancia clínica de atw L Eí micro* organismo ha sido recuperado de las heces humanas en avisen Ci» de síntomas. Se lian comunicado casos ainados de infec­ ción en personas con IL tüvei en heridas, abscesos, espoio. orina, sangre y tntvs sitios. En uno de nuestros laboratorios (Univeftilv of Jllinois) se aisló It. ahei en cultivo puro de mu» herida de (tos, en un pariente Inejo de la cirugía torácica, Existen pruebas como para sugerir que H. nivel puede ser una causa nueva de gastroenteritis bacteriana aguda iae sugiere

comunicar a los miembros de este grupo contó '“grupo de Sem itin iiquefaciensT. Este grupo se diferencia de S. marcesceiu jKjr su capacidad para fermentar L-arabinosa, S. m tidcih corno su nombre lo indica, produce colonias que tienen pigmenlo rojo pero pocas veces son aisladas de muestras clínicas humanan. Ursua y cois, informaron sobre un caso de 5, ntbldaea aislado de la bilis y la sangre de un paciente con un carcinoma de las vías biliares que se sometió a procedí miento^ invasivos.-181S. odorífera produce un olor a suciedad y hume­ dad. similar al de las pipas sin pelar. Se describen dos Mogfupos, E l biogrupo I da pruebas de omití na positiva, sacarosa positiva y niíieiusu positiva y se uísla pTcdotiiiñaiútímente del esputo; sin embargo, se informó que produjo sepsis grave en pacicnlcü ancianos e inmunodcprimid« , MJj11 y sepsis a.wiada con catéteres en un adolescente con talasemla mayor que había .sido csplencclomizado.1™ E l biognuf» 2 muestra estas tres pruebas negativas, y fue aislado en sangre y líquido cefalorra­ quídeo.!^ Las cepas de S. ptrmuthh-u pueden tener pigmento rojo y han sido aisladas en muestras de suelo, agua y esputo humano. Aunque por lo general no se lo considera causa de infecciones humanas graves, algunas comunicaciones recicnte* han mostrado que puede ser un patógeno importante que pniduce osteomielitis crónica»2 infecciones de heridas’-116y bacteriemia adquirida en la comunidad4'*1y hospitalaTia^^1^ 2-1 "' y ha sido aislado del líquido p^riioneal de un paciente con colecis[iiis.™ S- Jíw iriti tiene un biibir.it natural, en los higos y la avivpa de los higos.3” El aislamiento de esta especie de muestras humanas c i excepcional y suele acompañarse por el antece­ dente de tu ingestión de hic’os.13^ 1id & entonmphita es un pató­ geno de los inscclos y no se ha comunicado nrnpin aislado humano, " S " foniicvia no es realmente una especie de Sem tihi y es probable que sen reclasillcadon Es un microorganismo del ag.ua aislado pocas veces en muestras clínicas humanas, sobre todo de heridas,1 ^■u^ 1£ fomh'úía fue aislado en la sangre de un paciente con una neoplasía digestiva en cl Univeraly of Illinois Medical f'enter,

THIflU PRÜJmAE Pmtpme comprende tres géneros: Pmtem, Morganelia y Pmvhieiu'ia. En el cuadro 6-6 se presentan las características que sugieren que un microorganismo pertenece a esta tribu. Q Tíufay e«ís. han revisado Ea clasificación, la identificación y la importancia clínica de Protceae.m Géngw Proleus, Los estudios de relación del DNA han aclarado la clasificación de los microorganismo* dentro de Fróteme. En la Eictualidad. el género Pmeus comprende cinco especies con nombre; /’ Kittyutls. P. nitmbitia. P. mvxofücten.% P. pemieri y P, hauseri, y tres especies genómicas sin nombre que antes eran identitlcadas como miembros dei hiogmpo 3 de P, iytg
B Est igma del d r. VaFbr Eso

256 CAPÍTULO 6 Efíltroíacterlaceat

Cuadro 6-19

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D iferenciar l¡ün de especies de im portancia dínhra en rf gfoeru Srm sífir

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EJ género Pm fíw se encuentra en el suelo, el Agua y los materiales con contaminación fetal. Las especies de PmtÉus muestran el rasgo característico de la motilidad ascendente, ciuc se observa en agar no inhibidor (p, cj., placa de agar san­ gre) como una propagación undulan» ¿ I microorganismo a Iruvds de la totalidad de la superficie dei agar (véase lámina en color 6-ID ). Siempre que se observe este movimiento, se deben sospechar especies» de Prntem P, mimbifis ts la especie aislada con mayor rceucneia en los senes humane», sobre lodo Comu agente causal tanto de infecciones Urinarias cunto de herida.-». R va lg a ris se recupera más comúnmente de sitios infectados en huéspedes inmunosuprimidos, sobre todo los que

radas que son designadas grupo» DNA
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de rr/HiJt q u t dejn n ra o ríe w .!

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Taxonomía d i Enterobacteriscs& e

por relación de DNA contiene los biogrupos E y F y dos tercios dd biogrupo G (denominado biograpo G-2). 11 grupo 1 por relación de DNA contiene al tercio restante dei biogrupo Cl (denominado biognipo G-1). Como G-1 y G*2 son fenotípicamente indistinguibles, Jensen y cois, propusieron dividir M. múrgutui sólo en drn subespecies sobre la base de la fennenia* ddn de la tnehalosa,2™ A/, mersanii que son incapaces de fer­ mentar la irehalosa son designados Af. morganii subespecie tmrganü y los que pueden utilizar trchalosa son designados M, mnrganii spbCspecie rífrum, ¡M. mürgümi es una causa tanto de infeccionen de las vías un nanas como de las heridas y ha sido implicado como causa de diarrea. Las infeccione» graves comunicadas como causadas por M, inorgami incluyen un caso de meningitis en un pacien­ te con SID A 1** y un caso de meningitis y absceso encefálico en un lacrante de 8 días.™ Como se muestra en el cuadro f>-6 , et patnftn de prueba de citrato de Simmóns negativa, sulfuro de hidrógeno negativa y drriilina deíotfboailasa positiva es earaC' turístico dd género. En el cuadra 6-21 se ofrece ta diferencia­ ción bioquímica de las subespecies y los biogrupos, Géttm Providencia, Se reconocen actualmente cinco especies de Providencial P. fitcniifurien.% P- ttm trtii, fi m ig frí y las especies recién descritas fi rw úgianii229 y P htimkachmP* Todas las especies del género Providencia desaniman fenilalanina. pero sólo fi rvttgerí hidroliaa siempre la urea. En el cuadro 6-22 se muestran las diferencias bioquímicas de las especies, Salvo por producir infecciones de las vías urinaria?», para tas cuales Pender ha citado varios brotes hospitalanos,•M, las infec­ ciones por especies ds Previdencia son infrecuentes y están limitadas a comunicaciones de casos esporádicos. Todas las especies pueden ser aisladas de las heces; sin embargo, sólo fi alcaiifaciens puede asociarse con enfermedad dianeica, habi’ tualmenie en los nidos,347Hickman-Breitner y cois,13 designa­ ron P. msiigitinií a lo que anteíí se¡ conocía como fi afcali/fi' cicns btiogntpo 3. Este microorganismo también se aisló en las heces; sin embargo, su papel en la enfermedad diarreica sigue siendo cuestionable. Se ha comunicado una nueva especie, fi heimbachate. en las heces de pingüinos y en sin feto abonado de vaca,’3* Existe sólo una notificación de tnfeccicSn humana por fi hcimbachae* obtenido de las heces de una mujer de 23 años con diarrea ídiopattca.^ 1

reciben regímenes prolongados de anlibtólm , Como se sertaIh en c] cuadra 6-20, P. vuigaris tía una pmebu tk indol positi­ va, micntn.'i que fi mimbilix du una prueba de indol negativa, Por lo tanto>la realización de una prueba de indol rápida en una cotonía cíwi molimiento característico, puede dar una identifi­ cación presuntiva, rápida de P mimbifíy o fi lufgorit. ü n nue­ vas especies fi pemerí2'^ y fi myjuifoneft.f también son indol negativa?, pero pocas veces se encuentran en laboratorios d á t­ eos. {cl líSiiino es un patógeno de las larvas de lagartos y no ba sido aislado en muestras humanas). Por lo lando, a los fine* prácticos, el aislamiento de una especie de Pmieus indol nega­ tiva puede identificarse presuntivamente como P. mirabüis. Casi todas las cepas d£ fi mirúhili.t son sensibles a, ampicilima y celalosporinas, mientras que P. vuigaris es resistente; por consiguiente, la mayoría de los pacientes con infección clínica* de los cuales se aísla una especie de Pm icití indol negativa* pueden ser miados eon una de las penicilinas o ccfalosporinas de amplío espectro fi. pm m ri se alm eja cMiccJiamente j fi vuigaris pero diíícre de él por las pruebas de indol negativa, salicilioa negativa y escullo a negativa y por no producir sulfuro de hidrógeno en TSI. Cuando se sospecha fi penum, se debe realizar una prue­ ba de sensibilidad al cloranfenicol a los fines da la identifieaciún. fi jieantri es resistente al doranfemeot. mientras que otras especies de Proteas indol negativa* son sensibles (véase cuadro 6-2Ü).314Las infecciones humanas por P. p tm trí doeu mentadas han estado li muidas príncipemente a las vías urina­ rias y a la* tiendas de abdomen, ingle, cuello y tobilk».2WJ71 En una comunicación, se describió un paciente con leucemia que sufrid una bacteriemia por fi pcnmrí con «n absceso subcutá­ neo simultáneo dd muslo, loque demostró ci potencial invasi­ vo de esta bacteria.ÉM Se aconseja a los microbiólogos sospe­ char de cualquier colonia de P vutgom que sea indol negativa y sulfuro de hidrógeno negativa porque posiblemente pueda ser de fi patinen. Géñero Morgantlla, Sobre la base de los estudios genéticos rea' tizados por Rrenncr y cnlü, en I97&, et micmoiganhmn antes designado Pr&itus mnrgartii fue reasignado al nuevo género Moryoneíítfcomo Ai- morgtatfi.^ Los estudios de tensen y cois, mostraron que M. morgattii puede ser separado, además, en tre* grupos y siete biogrupos por relación de D N A.™ El grupo 1 por relación de DMA contiene los biogrupos I a D, Ei grupo 2

Cuadro 6-21

257

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B Est igma del d r. VaFbr Eso

258

CAPÍTULO 6 Entambacteriaceae

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¡tM lv i cnfiCníiAwcír fír nr^ficiKWl,J ¥ tifte j* t¡¡z n \t\.

TRIBU YERSINÍEAE Tres cspccics de PastrnrrUo, que incluyen el agente causal de Ja peste humana, P. pestis, fueron asignados, antes a un nuera género, íersim a. en Ja octava edición del Mmms! de Bergey y colocados en las cnterohaeterLas. E l nombre pora cl género YerAinia proviene del bacteriólogo francés Aicxandci Versan, quien en 1984 identifico por primen ve?, el microorga­ nismo denominado ahora Y. pestis. En el cuadro fi-6 « preven­ ían lis. características claves de Yers'tmeae Aunque las especies de Yentnta califican desde <1 punto de vista bioquímico para lu inclusión en I » cnieiwbacLcrks,. las células parecen pequeñas y cocobuci lares en los frotis teñidos con Gram y pueden ser pequeñas y puntiformes en el agar de MaeCnnkey, sobre todo para ciertas cepas de Y. pestis y Y. }>$é!¡dofub?n-¡iU>sis, EL crecimiento óptimo ocurro entre 25 y 32 *C. Las colonias tienden a ser putiti formes luego de 24 horas de íiKutiiici^n e-F» agar wunjgre ov ¡na Si M continúa la incubación a temperatura ambiente, despartí de -IX Jwsm pueden observar­ se colonias bleocogrisáceas convexas; que miden ¡ a 2 mm de diámetro. Género /irsinla,. Ytrsíma es el único género en Yersinivae. Se incluyeron tres especies; K pcsih. Y psem lvtubafuiosis j K citíeiacoiitica, cuando cl género fue transferido a las ctiWnibacterias. En 1980. se propusieron tres especies nuevas para cepas que antes eran subgrupos (te Jr' emewcotitfca:yL*,-SJ< ni Y,[ frederikwnii es-el nombre dado al biogrupo con. prudu de ramCOiíi pusillwL" 1 Y. hitermedia es la designación de e&as cepas atípieas que fermentan ramnnüa, rafino&a y melibosa^ y Y. krisiemeníi es el nombre para el biogrupn previo eon proeha& de Y. eníercotíríca sacarosa negativa y irebalosa positiva." En la actualidad. ífllo m: ha mostrado indudablemente que el géne­ ro Ycrsittiii incluye l l especien; sin embargo. vólo tres (K peíSis, Y. pseudoíttbercufoxL; y Y cntctvcctiiticu) son patógenos humanos. Una especie, Y. ruekeri, un patógeno de los pecw del que no 4e safre que produzca híccción humana, probablemen­ te será cambiado a un nuevo génera,]-,g En el cuadro 6-23 se incluyen las caiacterístieas diferenciales de estas distintas especies. lts te — Y. pestis* peste e» una enfermedad infecciosa de la antigüedad que persiste en los tiempos nwxlcrmw, Y pestis que sufre un ciclo vital obligado pulga-roedor-pulga. produce la peste bubónica, una enfermedad loonética rápida y soinaincntc fatal responsable al menos de Eres pandemias que ocurrieron en los siglos v-vj, vm-xiv y KK-XXl (recuadro 6-13).*”

Epidemiología, Y- pestth es endémica en vamos me dores* cntie ellos ratas, ardillas terrestres. perros de las praderas, talo­ nes y conejos, Se presentan dos formas epidémicas de la enfer< medad: la pesie urbana, que ise mantiene en Da población de ratas urbanas y la peste ¡selvático* que es endémica en 17 catados del oeste (fig. 6-7) y es transm itida por perros de las praderas, rato­ nes. conejos y ratas. E l microorganismo es transmitido de nn roedor a otro o del roedor al hombre por las pulga*;. Los casos humanos han concentrado en dos reglones principales de Jos Estados Unidos: 1 ) un ¿tea del sudoeste que incluye Nuevo México, noreste de Amona. sur de Colorado y sur de Utah, y 2) una región de la creta det Pacífico localizada en California, Orcgón y ueste de Nevada (fii| 6-7).“ Durante 1988-1002, se comunicaron I 12 casos humanos de peste en 11 estados del oeste, La mayoría (97) sufrieron, exposición en cuatro estados fMuevo México. Colorado. Arizona y California],|ii Cerca del BUft de estas exposiciones ocurrieron cu ambientes peridomésticos, sobre todo los que proporcionan abundante alimento y albergue para roedores infestados pr>r pulgas \ susceptibles a la pcs?e- Las infecciones domésticas ocurren cuando las personas, los animales domésticos <en especial los gatos) y los roedores peiidoinístico? llevan pulgas a la casa y exponen a mis perso­ nas. Los galos domésticos a los que se les permite vagar libreírteme en áreas donde ocurre la peste en los roedores tienen nn riesgo elevado ik infección y. por lo tanto, aumeman el riesgo de la transmisión peri doméstica l i los seres humanos. Los ate’ eesos bucales se desarrollan en los gatos infectados, por medio de los cuales tran&mileri ¡a peste directamente a los individuos a través de los lamidos, los arañazos ti las mordidas.4*1 Entre i <¿77 y 1998. se comunicaron 23 casc^ humanos de pe ste trans­ mitida por gatos en los estad® ilcl Oeste y cinco de los que >.e enfermaron fallecieron,11" Los viajeros pueden contraer la peste en un área y enfermar­ se en otra área donde la peste no es endémica (peste peripatéti­ ca). Si bien es rara, es más probable que la peste peripatética tenga un desenlace fatal debido a demoras terapéuticas o a diagnósticos equivocados en arcas donde los profesionales de la salud pueden estar menos familiarizados con la enferme dad,1011En el estado actual de una mayor conciencia de un posi­ ble acto de terrorismo, los casos peripatéticos también podrían confundirse con los que surgen por la liberación intencional de las bacterias de la peste, (Véase recuadro ó* Id), Síndromes clínicos. Se reconocen tres formas clínicas de pesie: bubónica, septicémica y neumónica. Las formas ^epíicémica y neumónica suelen ser secundarias a la forma teutónica

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Taxonomía de Eoierobactenaceae

C u ad ro 6-23

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D iferen ciación de espedes dentro del ge tw rc Ic fjJiiM

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PirJii] (^ffrrATiij dr fifi TTfeiwm.fas"'" y 9im¡ Jntniti. Tcufiis Arf ¿wwhmj w nutílarinm "C, + hi rtii? \i/ ífjsiíf wWt ji mili Jf crfkii nfgamiLi; L‘‘ ff-tiVá- J f <»,jriJí pjajn.tí'i,

la clüqI es La más frecuente en los Estados Unidor í véase recua­ dro 6-13), 1-3 peste bubónica se catacleriza por tumefacción de los ganglios linfáticos cervicales* afilares e inguinales, según I» ubicación Je la puerta de entrada de las bacterias. La disemi noción tiematágena de las. bacterias a otros órganos y (ejido?, puede producir coagulación intravasEular y shock unduló* ico, lo que causa un cambio de color oscuro en ías extremidades (lámina tn colar 6 -SA' recuadro de correlación clínica Diagnóstico de laboratorio. Ij, confirmación de laboratorio de tolas ¡as íormas de peste se realiza medíanle métodos microbiológico o mediante la demostración serológiea de los iftulus de antíjjcnus o anticuerpos, Nucstrus eulegus del Departamento de Salud de Colorado han observado que los hemoculiivos son positivos en un ftOír Je l<w pacienies con pesie bubónica y en el IOÜ^> de los páctenles eon pesie septicémica. Las tinciones de Gram elimina en color ó-í B i de aspi­ rados de bubones muestran bacilos gramnegativos en ceicu de dui tercios de los casüs y las tire iones de Wrighl-Giemsa (lámina en color J de frotis de sangre periférica a menudo muestran la tinción bipolar caraelerísliea de las jersinias. Las colonias tienen crecimiento lento en medios comunes y se dice que tienen cl aspecto del cubre repujado cuando ¿e lu ubsenu con cl estereoscopio (lámina en color 6-5D). La reacción en agar T SI en 24 horas es similar a ta observada con especie* de Pnxtrur?ítu (producción de leídos débiles en Ea porción incli­ nada. con pocos cambios o ninguno en el extremo). Se ba cre­ ado una prueba diagnóstica rápida que utiliza una prueba sim­ ple con liras reactivas y anticuerpos monoelonales para delec­ tar el anltgcnóFl, una prmema específica de Y,peíais. La prue­ ba produce resultados confiables en 35 minutos y podría ayu­ dar a controlar la enfermedad en los paites en vía¿ de desaíroib v laL vc¿ acelerar Ij detección y ci trjIamicnLn de Ea infec­ ción durante una ataque biotemonsta.IU* Infecciones cinisad»s pnr Y. psf»dniubcrcishtsh. í! p.seuáotubcpcidosix también es endémica en una amplia variedad de animales, que incluyen aves de corral y es responsable de lin­ fadenitis mescniérica. sobre iodo en nióos en Iíjs cuales se manifiesta una enfermedad- clínica que simula una apendicitis.ITJ| Ij í forma sept icé mica de infección ocurre pocas vecen y

Sf> ri-1lnV.uj'.i r

¡énfMaihiff,

se describió principalmente en pacientes con un trastorno sub­ yacente» como cirrosis hepática, ticm ocrom aíosis o diabetes, con una mortalidad de hasta un 75% a pesar del Untamiento antibiótico.2*1 Se han informado raros casos de infección de tas vías urinarias y prostatilis crónica.323’331 Se desconocen los vehículos y las fuentes de infección. En v irtud de su similitud con K cníewcoiitica, se presumió que es un posible palógeno transm itido por tan alim entos, p i.™ ja evidencia CsuS limitada ^ algunos brotes sugestivos y dos brotes más grandes, uno en Canadá ligado a lecbc pasteurizuda117 y uno en Finlandia debi­ do a lechuga romana rastreada hasta una granja que utilizaba □gua ra.) IraLada pañi cl riego por aspersión de los Campos.14®

Figura fi»? C ssíi» i.ic pc*4c. por cMiiodoiMble de los

LTniJuv, 1970-

3001 y¡ten ít. Ccnlcj-s- íuc

(."iuiLihI lu iJ

PtmicdliurS.

M M W R 1 4 X 1 0 .5 1 :7 1 5 -

72Ü.

B Est igma del d r. VaFbr Eso

260 CAPÍTULO 6 [ntQ rvfactfiriJceja

CUADRO DE CORRELACIONES CLÍNICAS 6-5 Peste humana

RfiCttSdr? 6-13 He sena histórica do la peste ________________________________________________________

CüártJo iúí intrrnliaí
I j k ttn ppmlernias iiüiynreH wCTTrrrnn enn ífe fifW nñií*. cada i-:i ck‘ rilas al rmul ik un.idpík.^ iusLíírica impcTtaníL' !a ¡ i-^injana ■ i h ules Je I.LAiiiri_l--.".!.. !. i iiuciír £ fiiuJe^ ik Li L J j J M n lit I jtwid«nia raoJcma í>I 'írnain^ de I ¡ tr¿¡ acias] PrwiKTü piiridímla. La p,--iíjLMtni n Sji-5-U. n.>iurv¥n'.■: >:• I

i uvti > ■ .■'¡i-Ji i’-i i -'i' re u'f 'lh. ui en d *¡liu i ii ctül de iiile a /■■«. q .r puede d '•■i' i Je b mordedura ik lapu(jLJ, dlurrciise .at^iiLfatu í j d |ul rniii! j fom o rMuh vdrt pikNten ijua ocer i r « Sumí i - ílfnic;is d¿ pretí

humana:

¿uipí/ador nMaonu del bipki vi, dJeclii &loi puÍMS medtknijiftH ifcMk

HuIhhih-ü: ;vri< I >.k n n in iin ú rj tic T ’ lias n n w n n ftd ci¡*l& 4 E la |ñCa>-

l
pa>p¡sgaii

532 hnsLi 5Q5J i'HL‘ijji.1 illÍti de KiO itiUlLinci dr niucjlrs. Cuiucjiti i en F.jíipftí y rut fili-ipágLi a ipnP&dú Xl^diit drienrL S f-.Lin.ifVj \1^iti:nráni!2.

I ¡ paagÉI.M l-n-

iLih iriflifn nti- ea k ui d e [cuál frecuentó i, Id unta u d

.. i.fIh ■Un íig lLii iii4.'i['inirr ■¡.

Dfesp i-.' - 1,1 ' «pjfttnblS *“ a í I 4l55K-fiLJ-i ■ ■ -.in ’t'rnn t i c kIttS Je S-12 ii.ii -.. I ..■••.j a fc c L u |> ,'iL: i. ■!' .i ksdti e l i l i u i ^ I i l i i i i l l J . ■

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Mar V fp n, se pmpapn a Üiniia y ínulmenlc aFeclís Ivdat U nepfin de Lur-i:>í iriin Brriiiíla, E'CJishn.TLla J «k'CiibnUil I nti^alde

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tu", n.mdujeii.111 u44 | |4 f¡] nraeíleU, ^uüh i^'í Iii peslí H'jHikcnskii primarü (49 |l3%] caso» v EE|22%T muene^i j la peMv neumónica pilmari.i Í7 12' í | tavis y J [í7L'rJ msiencii-í, Sicre ca^ y ujki muerre mt IÍIGÍI.M1 diMifieadCn '■

tJilidí. .iil; ri- jí. ÜJ thugiiiiíi'ütD diíercD cijj mclü>í Jad n in iK 1ik Kf>-e. ¡L..L.'. 1iu jl ........... .

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Linn febril t‘n un pjiuknK jm[rii..ln 4.mi uit h u M n dthe MJjeflr pcAtn o nilanmia: « ptiede ha«r Mcilmcnle d d.w.gínVlK'fi IwíEfnLilítgtíTj ^on un L-lLíniíiJu ■■ eiil[i\i?dd J .; i - , ■ Jr lili I iraliralínlo! rcfjpu pnnurú: essrfpriimiTFrwii utilim ilécEnaUvainente gentiuiUL'itüL leuuvteiinnso l Ilu bíiI ciiíco J SJl.s.:.*r.i ii.J-l ,lV .Sii’iv.lTi '.h .

Uls principales prutíhj.s bk>qüíiHica?t l|ül tlií'ürcuciüii ¡i K /wkí/drjjiwmí/íu'íjf dic Y. ttittm í'olííú'n ¿on uniiíina dcscart»Jii3a&a. saciirosii > scirtiilo]. Y. pseudalubercttlosix gs nctiaiivo para tas tres, miecunLs que Y. cnicntíofiiint es positivo (cuadro 6-2 .1 ). IníercinTits cnu^idaK pfir Y. ententcoíitica )' rnleroí'otiii* ¡ o estlg atiigTÜ^nvnl^ Jinlribuida en reservcíriiiiH ^Luálicüw y iiniiiuíIcs, y los cerdas silben como ivmtvoiío principal pau las eepas jiíitágciifls hiinumai^ Rs Iü cspccic mis írtcucntc de Yfrxinia li isi lhlJll en muChtm tlírtic.is. La puena Je en [radii l‘i)

Ini lerc'i humanos es la vía digestiva «ira,! y ta infección rscume en el íleon SenTiinjJ, que d4.-s.Lle iíJ purilti de vifiia anatómico esiá adyacente al afieiulice. El microorganismo adhiere al ñeon, lo penetra y pniducc ilcílis terumud. linfadenUis > ■ciUTruCíililiü ayuda, con itianircitactotiLii secundarias Je eiite ma nudoso, poliartritis*-^ v, nicnos a [jiemido, .KepLiccniia1|lfl y cndoeamli(is,|,jL |,zi ftcpiitettiiíi p('r Y, m fentivilifira se casi éícLusivamenle con pacienleí. que lieneji una s^reearpi de hierro o aquellos tratados con el agente tiuclante del hierro dcsí'eroxaniina,^ Líjs pacicnscs cor sobrecarga de hieno v 3 -lalaicmia tienen un riestni muy aumentado [Je sufrir una yers.inifH¡is gtuve aun cuando s,u carga co^xira] de liierro (como lo indica el nivel de feiritina en sucio) csIl4 silo modcradameric ílev^tla y no e.sicn rtsjjbiejido traianüento que la me del hierro."■Ejiiiten sciü liftyariedíixics (1 A. IB . 2. 3, 4 y 5) y nuá de SO ¡¡crojirupos. de K aitfnycohtica; hífi cmharun, -^ólaeincn, designadas 0; 1.2 í):5,27i íl:H y 0;9. suelen considerarse patt'jgenaí jmra los

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Taagnamia do E n le r o h a d c r in c ú a c

Recuadro 6-14 Epidemiología, diagno&tico, tratamiento v pre-v&nelón y comunicación «f& la pflsle [ Yerstnia pesíte) fp-id$mig'ii:¡¡3 La pístE

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pgtle IiuKmiíl'íI, Lí lilvr.ii: ión ¡iibencÚMul Ip. íj.. L'I Lerniritrnu) w H uitiitu»rii pnrKtpjl meme pomo p c ft rii-uiminiep.

HfiEla;ijí5 cunees * I^üs tijiios y Ifrt -ilntintiüi juduytfj liehíL*, í-ü-'.ikifrfoí, maletT«r £ * » ,

rul. isdlnafa^ia y ed J¿a. * f\in (iiimenr,-

de- nn-ll-i un i li i¡ nfcnhtrs ihuNiVi•: l(*í p n alsn t im

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sere* humanos,^ El btogrupo ! A cj/tLe de los determinante* de virulencia de las aisladas invasivos y se lo considera na palófcno,4* Los biogrupos restantes son de origen humano y pueden ser divididos en el hiogrupo i lí, que sí encuentra sobre

261

iodo en ios, tibiados Unidos y los biogrupos 2-5, hallados en Huji^ku y en otros sitios. Neubaucr y cois. propusieron 3a divi­ sión ¡le Y. i'nti-iiJVtiiiHiu en dos swbespectes: li! eiiltm caUlicü subespecic rfiitrrvcoiitica pura el biogrupo li y i: fírrcrocín/iría i subespocie palaearetica para 3as biovariedades europeas.11-1 Azociacittn de Y. enlerocotiHca con reaedanet pttf tratafusión Y. etiterwolitica fue recuperada de una unidad <.te sunl¡a- de dolante remitida al Laboratorio de htfjqrcibioüojíd del Univcnky of Jllinots flo^pltal pura cultivo luego de una rcaeeiún translujiional. Se prirscniaron cscaJofñoi y un síndrome simular at shock en el receptor de una unidad de sangre conlaminada itespmís de unu irunsfusióti de unos MS rnL Tumbién se informaron casos sirniiiircs en otros sieios, lo que iludirá la capacidad de esle microorganismo para crecer con teinpcraluraü frías.1J Enlxi .1 noviembre de PjKÜ y nuvlembrt." de 1996, Jos CDC comunicaron 21 casos de sepsis por transid s iones de erilrodíos eonlama nados eon Y. emeTocoíitica^ La investigación de estos casos llevó a ia conclusión de que ia conlaminaciún de b sangre fue el resultado de uoa bacteriemia ii^iiiiLüjnJliea p or}. ¿it(tn>cüí¡tica en Los donanlcs de sangre en cl momento de tn donación. Arduino y colsJ1 demostraron que fni^Tmnriiiica. cuando se inocula en unidades de eoncenirado-i de erilnjciEos y m; utrnaccnu a A °C puede proliferar y prLwluuir endunixiiiij duspues de una fuse d.e muastk de 1 a 3 se­ manas. Está claro u partir de estas comunicaciones que Y. etb terocofitíra debe btt!>e,irK.c siempre que se sospeche una hacteriemiij o un:i ¿ndotoxemií asociada nm la trstislusión. Para más deíalLes, remiltmos al lector al ¡iHiculo de revisión de Wagner y colsav>i Anosindán de Y. enterraulílicu cor* le preparación castra cíe m e n u d o s i¿ r c e r d a . Un !üb p a ís e s d ond e 1! e n l c m c u l i U c u SC

hn convertido en una causa :mpcrtaníe de diarreai Ü:? es el üerntipo predominante, y los cerdos pareccn cnu^cituir cl pnncifval ceser^orio para ln infección.^ Un;i revisión las cepas elínicíis dii K étiiem culitíía remitidas al Jaboralorio d¿ referen­ cia para Jí'rríiarfi Je lo^ CDC desde 1970 basta 39ÍWJ y desde 1986 hasta 198U mostró un cambio en et scrollpo predominance de Y. fTjfemcvlith'a en tos H-stínlus Unidos desde thS hmsia 0 --1 . 6 sie cambio coincide coín un brote de gasiroeirteritis cau­ sada por Y. tnfenK'oÍJtica seroljpo en AlLaJita desde noviembre de 198Ü tiaitu enero de I^KS. lil hruic involucró a 15 puticnlcs (lodos norteamericanos negros), de los cuales E4 eran laeicintes (edad medianil, í mestis}. Hn lodus ellos se dil'í-urTiciltó una enfermedad dianeica febril, que ^e asoció firme­ mente con Ui preparación cabera de menudos de ccrtti» (ñilestino grueso). Aunque ninguno de Eos lactantes iuvo eoniacio directo con los menudos crudos, casi en todos los casos las per­ sonas Ljue cuidaban □ Ion niños presentaron antecedentes de haber limpiado esos menudos.^ Se cultivó Y. eniemcoliiica de recipiente* cernidos de menudo* de cerdo, de t«s contactos doniísLicos del caiAt > de los rccipicmes de fus menudos .nUmridtw eri los supermercados lóenles. En 10 de las 12 familias e.\pueslusr los menudos lucpon preparados para la comida del Día de Acción de tiracias, Navidad o Año Nuevo. Lina ene uesi;l realizada a una cade mi de atmacencs en Atlanta mostró que 3a venta de anetiudos de cerdo estíi limitada en gran purte al período de uctubre a enem y jk-anAa un pico en noviembre. Los datos proven icnlcs de otras cneucstns apoyan la asociación entre la preparación de menudos de cerdo durante cl período de visaciones desde el tríade Acción de Gracias husia Navidad y los casos de Y. e/iiennofilica y sugieren que sejustillcu el cri­ bado de rali na de K mj'emriífxjít uen lül:ulw.>s hohpi tules, stiln-eiodo en tas enmunidades de ra^a negra, y especialmente en 3os niños menores de un año,*'"'1--11 '■**Híiv mfonnación sobre

B Est igma del d r. VaFbr Eso

262 CAPÍTULO 6 Bftsrütucttriicese

la preparación segura de menudos de cerdo en hltp^/wvvw.ph. dhr.stateJga,u5/cpSlncwiíoct02/l 03 I02,&html,1"Recuperación de Y* enlenocotiticn dr muestras ciúticas. La mayoría de la?» cepas de Y. entemcolitrca crecen en agares enté­ ricos electivos y <e presentan como pequeflas colonias lacrosa negativas en agar de MaeConkcy y agar SS en 41 horas. En algunos lab&reiorios, las placas de agar cíe M^cColike)' ingeuladas eon muestras de heces de las cuales se sospecha que albergan especies, de Yenintu son incubadas de rutina a tempe­ ratura ambiente. E entenreatmea* en particular* puede aislarse mejor de las mue&Uas de heces incubadas a 25 t . E l enriquecimienlü por frío de [os muestras muy comurainadas. w kio los heces, incubando los cultivos a 4 *C durante una a 3 semanas, en solución satina con huifer de fosfato antes de subeultfvarlos en medios entéricos, también aumenta la recuperad ún de Y. títíiertHxdírictiJ14Weissfdd y Smnenwinh1® comunicaron que cl pretratamienlo de las heces eon hidrúxído de potasio al 0,5% en una relación 1:2 durante 2 minutos, seguido de la siembra en agar entérico conducía a la recuperación del número máximo de aislados de Yetsínia. La superioridad del agar cefajtodinairgasdn-novobiocina (C1N) pata la recuperación de Y. cuíetth cvtiiim de muestras tfc heces que contienen 10 * unidades formadoras de col inri as ra menos también ha sido infoimada por Heaú y cois.51' E l uso de métodos de enriquecimiento por frío y medios, de cultivo especializados,, como agar ClN, para la recuperación de Yersinia no suele ser necesario porque, en casos de enterocolitis, los microorganismos no se encuentran Con fm cu ctitia en cniwzerUnu: lunes lu laliviunentc alLas. No se recomienda et uso de agar EM B porque JK cntcmcolitica es sacarosa positiva y aparece como un col ¡forme en este medio. Puede hallarse un problema similar con el uso deTSl. que tam­ bién contiene sacarosa. Identificación de Y. enlcrocolitica. K entemmUüca es más bioquímicamente reactiva a temperatura ambiente que a 37 *C. Nuestra esperienda en el Univemly of Illinois Hospital ha sido fitus [«s aislados de Y, enfmu oíitku m suelen dar una ¡üentíücación aceptable cuando son estableados en el sistema Vitek o el A P I 2QE a una temperatura de incubación de 37 X , Sin embargo, bandas de A PI ZOE incubadas a temperatura ambien­ te proporcionan una identificación aceptable. Este dato ha sitio confirmado en publicaciones recientes,1^ Neubauer y cois, compararon las pruebas A PI ZOE. A PI Rapid 32 ID E y de base en F C ít y observaron que A P I 2DE proporcionaba la máxima sensibilidad tanto en el nivel de género como de e s p e c ie .U n estudio posterior del mismo grtipo observó que la tarjeta Vitefe GNI identificaba las yersinias eon «eia exactitud dd 96.3% a nivel de género y una es actitud de 57,498: a nivel de especie.3*7 SI bien no se consiguen fácilmente antisueros que se pueden utilizar realmente para cepas de scrotipn de K entemctdilicú., Farmer y cois, describieron cuatro pruebas simples que se pue­ den utilizar para la detección de serotipos patógenos. Estas pruebas son la prueba tic la pirasinamldasa. fermentación, de satidlina-hidrólisis de eseulina, fermentación Je o-júloaa y et agar rujo Congo-oxalafó de magnesio (CR-MOX) utilizado para determinar la captación de colorante rojo Congo y el ereeimienio calciudcpendiente a 36 *C.,M Semihilidad de Y. entemcolltka a ios antibióticos. Y, enterncoiiiscü serogrupos 0: 3 y 0:9 pueden producir dos p-laciamasas mediadaa por cromosomas, lo que conduce a resistencia a ampidlma, eeíalotma y carhenicílma. Las cepas serotipn 0:S «in sensibles a ampidlina y variables a carbeníciílna y cefalOSpofirtflS- Las pruebas in vilro no son confiables y la admi­ nistración de célalosporínas de amplio espectro combinadas con un ciminoglueóstdo parece eficaz para la mayoría de las

infecciones extraintesiinales, incluida la septicemia,11'’ l.as fluoroquinolonas» solas o con amiitogluüósidns, o Iuí oefalospomas de amplío espectro, también parecen eficaces.1™ * Trimctopríma-suLfametoxazol muestra eficacia in vi tro pero tiene poco efecto sobre el curso clínico (duración] de la gasinoenteritis por Y. entemmSitka.t in Otras e s p e c ie s d e Yersinia, Y. frederiksetm nc aísla más comúnmente de agua dulce, alimentos y suelo no irrigado y fue recuperada, pocas veces de muestras humanas. Este mi 0100150.nismo puede re c u p e ra rs e de muestras de h e ce s utilizando agar res de MacConkcy o SS incubados a 25 ÉC durante 48. horas y pocas veces se necesitan técnicas de enriquecimiento por frío, Se cree que forma paite de La flora comensal y no produce dia­ rrea, Farmer y cols.14í citan algunos cepas aisladas en humanos, remitidas a los CDC, obtenidas
B Est igma del d r. VaFbr Eso

Taxonomía de Entetobactóriaceae 263

Otros géniros fuimos de Eñíatübatísrlitsit

E l cuadro 6-24 es una lisia Je las ¿siete s descritas más recientemente y menos frecuentes de cntcrobactcrij», Las designaciones de Los nuevos géneros y especies han evolucio­ nado tle estudios, de hibridación del DNA y caracterizaciones bioquímicas realizadas en cepas atíp b s remitidas a los, CDC y otros laboratorios de referencia para identificación y clasifica­ ción. Muchos de Id» nombres de estos nuevos géneros, se apticwon a rtp « bacterianas que. en un momento, fueron desig­ nadas a grupos entéricos atípleos en ios CDC, Varios grupos entéricos quedan sin nombre pero probablemente logren esta’ do de glnero en el futuro cuando alcancen una cantidad sufi­ ciente de cepas. CARACTERÍSTICAS DI IDENTIFICACIÓN DE ífíTEROBACnm CEAE MAS HUEVAS

Las características claves, de identificación de vanos de los géneros más nuevos se enumeran en el cuadro 6-25. El apren­ dizaje de los género* más nuevos no es demasiado difícil « se recuerda que la mayoría de estas bacterias represe oían cepos atípicas estrechamente relacionadas con gnipon bien estableci­ dos. Por ejemplo, lo* laneros estrechamente relacionados Birfiíiiiííc/Ííi™ y Kiuywm '1,7 se presentan fenotípieamente como É'fiíí eiirato positivo**; en el cuadro 6-Í5 se incluyen las características específicas por las cuales pueden ser dife­ renciados. Las. bacterias pertenecientes a C(?rfffwi:,Ljl* se ase­ mejan a Sermíia porque son lipasas positivas y son resistentes a ccfalotina y colistina; sin embargo^ al contrarío de Serrana, no hidrolizan la gelatina ni el DNA, Ewinxeila,™ Rahneila'™ y Tafumella'-- iniciulmenie serán agrupadas con /fanronr aggfon t é r a m porque son lisina negativas, omitina negativas y ar]ginina descarbnxilasa neja!¡vas. Los géneros Yakeneftazn y O bes1 imitoteseritt t n * son similares a Hiifniit alveL Moelttmttif221puede ser considerado Pmvidenda fcmlalanina negati­ vo, lactosa positivo y Leminotvllá223 puede ser pensado como especies de Pmteus fcmlaloniria y ureasa negativas, Mediante el uso de esta orientación, se facilita algo la identificación. U « patrones de reacción de esto^ nuevos géneros y especies han sido incorporados en los archivos de códigos numfirícos de ia mayoría de los sistemas de identificación compularizados. Por |o tanto, sus nombres, pueden aparecer en las comunicado nes generadas por ordenador de muchos sistemas comerciales. En estos casos, puede ser necesario controlar visualmente tas reacciones individuales para determinar su exactitud y evaluar las característicos adicionalc-s utilizando el cuadro 6-25 y los cuadros ampliados publicados par los CDC y reproducidas aquí en et cuadro 6-7. En general, una cuidadosa correlación de la actividad bioquímica con los patrones de crecimiento y la aparición de colonias en medios de agar es suficiente para su lurreclb identificación. No se puede exagerar et hecho de que los estudiantes y los microbiólogos deben mantener una orientación fundamental pobre la morfología» la fisiología y la bioquímica de las bacterias, para realizar identificaciones pre­ cisas. IMPORTANCIA CLÍNICA DE ENTERQMCTER1ACEAE MÁS NUEVAS La nueva Clasificación, los cambios aparentemente intermi nubles en la. taxonomía de las bacterias, y el agregado frecuen­ te de nuevos géneros y especies podrían ser desalentadores para los estudiantes de microbiología y también para los ins­ tructores Sin embargo» Fanacr y col', llevaron a cabo un estu­

dia de las puniuociones de los. biogrupes no clasificados remi­ tidos para su identificación a Jos CDC y han ordenado el desur­ den en un informe primordial que resume todos los géneros viejos y nuevos de enterobuclcrius conocidus hasta enero de 1985,IH Como señalan estos investigadora, hasta el 35% de lo das las enterobacterias aisladas en laboratorios clínicos son &• eheriehia cotí, Kfeb&íefta pneumoniae y Prvteus m irabilfir, más del 99% de las cepas pertenecen sólo a 23 especies, lo que deja menos del I % como incidencia de aislamiento de distin­ tas especies rtciírt designadas, Por lo tanto, las bacterias enu­ meradas en el cuadro 6-24 pocas veces se encuentran en h mayoría de los laboratorios clínicos; sin embargo, como afirmó también el doctor Farmer. existen al menos tres rajones de por qué estos nuevas especies de enterohaderias son importantes para los. microbiólogos clínicos: 1) algunas especies producen infecciones humanas graves, 2 ) otras aparecen en muestras clí­ nicas, pero su papel causal en la enfermedad es incierto y 3 i muchas son bioquímicamente similares y por lo tanto» pueden ocasionar problemas en la identificación. La importancia clíni­ ca tle las especies más nuevas que han sido aisladas en mues­ tras clínicas humanas se resume del siguiente modo. El género RutiiaiixeUa contiene ahora siete especies (vdnse cuadro 6-24] que se prcseman en forma frecuente y abundante en Jos intestinos de caracoles, babosas y otros moluscos*’31 Algunas cepas han sido aisladas en muestras de suelo y de agua bebible no contaminadas, aguas superficiales, aguas cloacales, suelo y heces, pero no haii sido aisladas de muestras clínicas estériles primarias.3'3-'1 Se informaron dos cepas clínicas de microorganismos similares a B. govmíciede muestras de orina y de una herida en la pierna en Bélgica , Las cepas fueron bio­ químicamente indistinguibles de B. gaiiniae, pero la secucneiación del gen 163 RNA tío fue decisiva.1*4 CVdWj ha sido aislado en muestras respiratorias,^ sangr íjm,jiMji6 un ahseeso eserotfll.^ una úlcera cutánea111y tejido pulmonar.iaf Sin embargo, en la mayoría de los casos no se probó uu papel etiolftgjcn para C edea cti estas infeCciertcs. Ewingellti tífíterivatut se describió en 1983 y recibió ese nombre en honor del bacteriólogo estadounidense WíUium Ewing.-H Li» cepas originales provenían de muestras clínicas humanas, que incluyeron esputo, sangre. laringe, heridas de dedos del pie y pulgares, orina y h e c e s . E. americana ha sido implicado en baclcriemia.:i,s-m baeteríemia relacionada con catéteres,5''1 un brote de bacleriemia hospitalaria1® y un brote de seudobacleriemia asociada con tubos, no estériles para la recolección de sangre.1,J -13También se asoció con coloniTación de heridas»51 conjuntivitis31* y peritonitis en un paciente sometido a diálisis pcriloncal.’™ El género Kiuyi'era contiene en la actualidad cuatro espe­ cies (véase cuadro 6-24J,-'--1 Las cepas originales de especies de Ktiryvem pmvinieron de muestras clínicas y del medíoamhiente. Las fuentes humanas más frecuentes han sido esputo, seguido por orina, teces, faringe y &aagfe.tt? Las fuentes am­ bientales observadas fian sido aguas Cloacales, suelo, alimen­ tos de cocinas, agua» leche y la pileta de un hospital.J,í Sólo existen algunas comunicaciones de infecciones graves por especies de Kíuyvcra que involucraron las vías urinarias.4,1'1la vesícula biliar/75, el tubo digestivo1-^1y el tejido blando del antebrazo luego de un corte con un cubo de basura.*1** Además, ss comunicaron casos de hacieriemia relacionada con catéte­ res^ y mediastinltis y baeteríemia luego de cirugía a corazón abierlOr*"i L l importancia c lín ic a de Ledcrria a d e c a rh a x y la U t es incierta, pero se informaron cepas aisladas en sangre, esputo, orina, heces y heridas de bu manos. Hn el

B Est ¡gima del d r. VaFbr Eso

264 CAPÍTULO 6 Eotmbatístíaceíi

Cuadra 6-2-1

S íin u s p.cn n m j especlüscn la fam ilia L~jU fM >búCt*rÍ4<*‘i t ’ ' t . 1 -7_■-< !|SS9BlaW B9S¡BH rS■ ‘«m ? ■1

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M íi etxcanu ikxlc t l puiHu ilc V iili tiui|jjn:jL-> >j K ín n sro. L j» r^ri,iLiii£x ¿ li v e s ™ IM ViC i - , L A Q K ,+j. &nc?rnsa (-í, A id ri» en agua. Nn « C(kmuni«n cepa* »KI¡hJíis ííi hurtlWrt* Aixladti en J:n jUuIkcm,; l/ u;i. sucLi> \ «crea íiuci'-^m 'V. A ls IjJíi rn jiguj y \uí Id

tígrtstn

Í'h Jíi'jíh í- Ííj h nu trn ir BultiáaJreiki /fttmgmiiíic

B uniaaxttla Buitiauxttta íkw + íiíí

Eapcvts tiucvu ,lG fljp ü F‘ { Jir.p ■ •L'TlílniTI é| “Grupí? P " Grupo entérico M Especie mievi Grupo enlérico 59

SHiTfflftwWi v a m b o itlia e

Espwie nueva

C fd ta ta tia u m t

1*0 íufu1 irriíf l» ij-sait-fryfifl üavis"

BvUUiHMflla x a r m e t

C td tc ta ¡a p o ta C r J c in i neSeri (V lífffíi tipccie 3 C id K m especie 5 C é d e rm «pede 6

“C nI íc h i í5po™t4J' "lüpecie *ie C fdecea (KlT* ''Especie de C f d r w i oqw MU11, J'E^wcis tk; C t d t r t a «p a 032"

Aislado cd mijluswis A lMj J c in nuliuUui Similar a ftinrruíA d f iLioI'Jíuji. capujo y NlciJj:-, .’tií-LJ" ln c u x u lít

«xcepw en 411* es anginiiia pírsuiwe, AisLkjfl «n y ¿dÍJIhñUu

CWrfiptf n a^pneja a ¿fm iíü í síwi upasa (+3 v nfKSirennw 1 rtíli-yuts y i^Motin». pnv íl o*p. C 4am ae% » !¡l E^p^k mis írf , w nir H (%pvt; del aparato reapiiatMlOi Immaíig Akilalrjcn híJMaLiitliMut d£ pudíhlcsicaB L m JU ^ lil val'.ular Atvladocn cvpulu y mto^c cacdíaca rn la iu«rop b Hendadc los dedos dsl pie

ñ n m a d ia a m rn ra n a

Grapo entírtun -W

IM ViC [-*tt ht h+j, LAO Lu.cq»s> pueden hübrr sido rta ific K l» asid» i,xits(í E *\ttifti\ií fe? tix tk *n rrm .i penoi ¡Jiikícn por >sr ara3>Laon i-'t. A iiJiJo Je iwriddi! y hemMul'li^m

K tw p tm use afirma

Grupoíí.ifiL-iu j

fi'fevwra íocM tih t K I*p *era e ry fie rtic tiu

Espeek aueva Gíu,po eatérfc» 1

Se alm eja a t \ tierfr saiepioen t|ue t i maloBuio. escuLlaa y dim o 1 » ?-Pip w aiu ™ ktai ojcuro sn mídiooqiK no ■KiatiHien isrigre Ln fwsiic raui^ íiresecntc et el esputo ssuridrj pnrmna, Heces y í«ngrc Aisl-jJm en raoLuscots Súnikr a K. tticorbata eiteplo en que etw* y fcrmcnlfl Ea |]ocm uu5 "CJ

M ittyvrm fcuriw A P

Grupo acéren íl E ip íc lí Ue iWüjíivríi UtrUfKf 3

Aislado en e-ipam y faringe lnimap.ü

¡jecirrria adeairboxytata

G rlifíí fiíiEfi'itú 41 üxi-fi erk Afct tiiik.'YafiiU.'yíü íü íinienibaLtet upjtkm iem m H G X I

IM ViC I . M ) í ^ g m e f t i a í i í í i amarilla & isemeja « £. l» I í ci>a|sr de MdL€tMÍ,¿y i EM B Se ha jj^luJú en tina w kdad de raum isi clLü^-a&. .ili-in;^c¡>v. i¡|u y en el medio jmbiíi\n:

Lernrrvrtllü fjrin wpiíjí

Grupo citín tu 57

h fm im r tlk i n
G n jp jí"tír*;n Í7 Crispo entfric& 51

ID A <-(, LAU IM ViC ( ,t |. AiilzhJa efl Ihm * y orLia hoiuuki l|ual (|ütf L gnm fnaii esetpiopní IM VIC

MíJélic-rcllít m 'jLiiríirrrjó

Grupo CBifiko 4ft

0 ^fwwtarr#riBji* bwpupo 2

Fttrvobacn ritm p ro ttm

S í parece * K. a rfi en un *wdi» ejnfix» TMV¡C - M . LAC) (-.-.-i. Uw iliíí y ucam ti (+) ea m pnM ilfiW H a Wi'iKAJnain

rtHiífbanantenH

Me»*r luni enmwninulA ccpa« *i<1adas«A huraaeios Cm caminante trecueme ck Lan eervfM rtu. rit^ e tecumMiic «¡uuadu es uicti'bióu a 3b °C t h) q ted iJk iilliisii idimtifínLiún

B Est igma del d r. VaFbr Eso

Taxonomía tte EntérobaciGriaceae 265

C u ad ro & - 2 4

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L n l f t v t / a i t t ' r i n n - u e ( C a u t .) ^

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recuperó L adetarbipxylatú en cultivo pura de la sangre ele un tercer pncknlc coi» insuficiencia renal crónica que recibía hemodi ¿lista, Lcminorctia fue aislado de heces y o rin j.^ Bfckbcr y ec»l&,J* revisaron Los registros médicos de 14 pacientes de ¡os cuales se

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266 CAPÍTULO 6 Entarúbattoritaat «"i

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Métodos de cribado pare, la ideotifiación rápita 269

Aislaron especies de Lcminoretfa y clarificaron el 43^ de loa casos como patógenos definitivos,, cl 29% como patógenos probables y el 2 !% corno patógenos posibles, Los síndromes clínicos fueron infecciones de las vías urinarias (seis pacien­ tes). infección de! si lio quirúrgico (tres) y bacieriemia prEinari£i„ peritonitis, infección del aparato respiratorio e infección de Jo» tejido» blandos, cada una en un paciente, En un c a » de baeteriutia «sintomática. la cepa no tuvo importancia clíni­ ca.w Las especies de Lcmmoretía se presentan como culunias lacios a negativas sobre medias de siembra primaria y dan un pico de flauta alcalino y una reacción ácida débil con H,S en el extremo de T SI después de 4® horas. Al igual que tan espe* fies de Pnrlcu.*. las especies de Iju ain a reila son 13,S ¡unitivas, O-manosa negativas y lirosina positivas, pero ai contrario de PrtftfiiSi son lirca y fcailalajiinu Desalivas y L-urubinusa púsi Erras, MneilcirUa uisrem^emh fue bailada eriginariaroenie en muestra* de heces humanas, sobre lodo en el esiacto de Wiscoiisíil3ií También se aisló de agua y animales y de muestras clínicas distintas de heces* como de vesícula biliar11'-*13y de un aspirado bronquial4'" Sin embargo, la mayoría de las cepas han sido aisladas ds heces humanas y existen pruebas de que se asocian con diarrea humana.2*1 En agar de MacConkey, las colonias aparecen rojas brillantes ton bilí» precipitada a su alrededor; por lo Lj/itoT&on indistinguibles de las colonias de £. co tiP 1 Stock y cois, comunicaron que M. wiscafííensir es naturalmente sensible a doxiciclína. minociclina. todos los aminoglucósidos. muchos betalactámieos. todas las íluoroqusnolonas. los inhibidores de las vías deí Eblato, cloranfenicol y nitrofuranloína* 1 Las especies de Pkinprhahdm son [es Únicas bacterias b io luminiscentes terrestres (la biolumimscencia bacteriana se observa sobre lodo en la» cspcci.cs marinas), La clasificación dentro del pinero es compleja, se reconocen en la actualidad tres especie*: P. Inmintscam {antes, Xettorhübdus {utniní^ cem), P. temperatti y P. asymbwíicatÉ1'l7A y varias subcspecies (cuadro 6-24). Las especies de Pfmtorivibdus habitan cl inleslino de algunos tiematodos patógenos de los insertos, donde establecen una relación simbiótica. Las especies de nemalodos de este iipi> pueden invadir las larva* de los insectos suscepti­ bles y libeiar especies de Photorhabdas. Las bacterias pxolífe* ran y matan las larvas del insecto.|m(jg« ncmatodo» patógeno» de los insectos que albergan especies de Phütarhabdfis se utili­ zan como hiopeslicidas en algunos países, incluidos los Estados Unidos y Australia. En estos últimos se comunicaron 12 infecciones humanas por especies de Pfwtorfiabdus. que pt enlucen más a menudo infecciones de la piel y los tejidos blandos y poras veces bacteriemia.1U |4tól2 Las colonias se for­ man sobre SA P después de 24-4fl, horás tanto a 35 °C como a temperatura ambiente, enn una tendencia a ■ ‘elevarse".™ La característica defíniiixia es la presencia de luminesoencia débil, que se puede ver a simple vista en condiciones de oscu­ ridad total. Gem nl y cois, señalaron que es fundamental per­ mitir que los ojos del observador se adapten a Ea oscuridad durante 10 minutos,1* En Ja actualidad, las especies, de Phafmkuhdiw ño aparecen en las. bases de datos para MicrtiScan Rapid ni en paneles para toda la noche o en las tar­ jetas de Vitek G N I +, To cual conduce a identificaciones equi­ vocadas cuando se utiliza» estos sistemas.1™ El genero Rahnelia consiste en tres especies estrechainente nsljicjunswlw: M- eqm tilis y dos especie» genóraiess que no puede n ser diferenciadas fenotipicamcnte de JP. oquatHh y, por lo lanío, reciben los nombres vernaculares de Malmetía especie genómica 2 y Rahnetta especie genómica 3.13 El hábitat natu-

rtil de Rahnetía aqutKiUs, como su nombre lo indica, es el agua, y la mayoría de cepas aisladas en la colección original de los CDC fueron encontradas en cte medio, excepto dos en seres humanos (una en una quemadura y la otra en el líquido de lava­ do bronquial de Wt paciente con IHV).=»De las pocas publica­ ciones de casos de R. aqitatiUs, la mayoría describe infecciones en pacientes inmunodeprimitios. Además de las cepas tk los CDC. otros han comunicado el aislamiento de esie microorga­ nismo en esputo (en un paciente eon leucemia Jinfocítica eró’ nica y enfisema)*1” en las vías urinarias (en un paciente con trasplante renal),? en una herida quiitiigica posiblemente debi­ da a una fuente hospitalaria* 4 y en sangre de pacientes ínmunodeprimlílns6tAfi-lfcJ 'lw:a,e inmunocompetentos.™ 1fí, aquatitís también fue aislado en verdor»» (fundamentalmente zanaho­ rias} adquiridas en supermercados™ y ha sido Identificado como agente causal de ra olor ahumadoffcnólico (debido a la formación de guayaco!) en leche chocolata reingerida y echa­ da a perder,®' De las cepas originales de Tatumelía ptysatí estudiadas por los CDC, 30 se aislaron en esputo* 6 en. cultivos faríngeos,. 3 en sangre y I de cada una en un aspirado traqueal, un tubo de ali­ mentación, faringe, heces y o r i n a . informó de un caso de 7. ptyxeo.% obtenida del hemoeultivo de un recién nacido con una presunta sepsis."® Existen tres diferencias notables entre T, ptyjxvs y otrus miembros de las emcrobarteims: 1) las cepas producen tina zona grande de inhibición alrededor de la peni­ cilina: 2) tiene una tendencia a morir en algunas medios de laboratorio, como agar sangre, dentro de los 7 días y 3) habi­ tualmente sólo se observa un flagelo (polar, subsolar o lateral) por célula.” 1 Trabultiflb guamewfc. antes conocida como grupo entérico 90, es HsS positiva y se asemeja bioquímicamente si Saltnonttía sobgnipos 4 y 5,Hí Se han aislado cepas en polvo de aspiradora. suelo y heces humanas; sin embargo, no existe ninguna prueba de que produzca diarrea. Su principal interés para, ei microbiólogo clínico puede ser su posible identificación equi­ vocada como una cepa de SatmoneUa (véase cuadro 6-25). Yokenella mgcnsburgei fue identificada originariamente como NIH biogrupo9 por los National Instiiutes of Health en Japón5” y más tarde &e observé que eran idéntica» a "tío sa rtía trabulsir (pupo entérico 45) nombrado así por los trabajado­ res de los CDC .81-31 Como el nombre K rcgen&bttrgd tiene prioridad sobre “ K mtbuísii ” en virtud de la publicación ante­ rior, el uso del último nombre se ha suspendido. En Las. comu­ nicaciones originales. Y. tvptMtbutjiei había sido aislada en el tubo digestivo de insectos y agua de pozo, y en muestras clíni­ cas; humanas, que incluyeron heridas de los miembros» vías aéreas superiores, orina, heces y líquido de la ro
Métodos úB cribado para ta identificación rápida fiscfitrichia colit la bacteria aislada con mayor frecuencia en los laboratorios clínicos, a menudo es identificada en forma presuntiva si una colonia seca, osidasa. negativa y femientudora de lactosa en agar de MacConkcy da una reacción de indol positiva (cuando es evaluada en una colonia que crece en medios no inhibidores, como agar sangre), sobre todo si el

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270 CAPÍTULO S

£nttrQbacttriKea*

microorganismi:* hn sido aislado en cultivo puro.^ La prueba de indíi] lambifJrt se ulili/,a en muchos 1 abaiaUürids para ana deter­ minación rápida Je especies do Prut cu* en movimiento a partir de placas de aislamiento primariD. 13 Qadri y cota describieron una prueba de urcasu rápida ( 2 m inuloí),^ lá cual pcxlfift utili­ zarse para separar tos posibles patógenos de las heces que requiere» otras pruebas bioquímicas del grupo PrafeitiPmvitiencia-MorRanella no paKigcro. Taylor y Achanzar infcirmajxin cl uso de la prueba, de calailasa {cün H hO’ al 3% ) ■como auxiliar en la identificación de enterobaclerias.4,,i Bsio^i autores observaron reacciones enérgica* de tataEasa con 5errüíiür Fmtens y Providencia: reaeciuncB moderadas con Salmútteilú, Enlembacter, Klebsielia y algunas Escherichio., y reacciones débiles cotí Shigeíla y U mayoría de Escherichia. C^rmmicamn cl uso de la prueba rápida de cata] asa para el Cri­ bado de enlomas sospechosas en medios eméncos que imitan los patógenos fecales. Las colonias de Serva lia, Pmteus, Pro* videncia o Psetidomortas son eliminada* con rapidez por las reacciones racr« ¡tas de calaJasa, al cunlrariude los, salmonelas, que dan reacciones débiles a moderadas o las shigelas, que snn negativas y, por lo tanto, están marcadas, para otras investiga­ ciones. Cfoester y Moí4íQW¡Ujlj han comunicado sobre La acti* vidad de calalosa de muchos de los miembros más nuevos de las enlerobaeterias y recomiendan además cE uso de U activi­ dad de calidas*! comu prueba complementaria rápida. Mulczyk y Szewczuk*-'1 sugirieron que la pnieba para la i.-pirrolidonil peptidasa íP Y K ] litne gran valor para diferenciar entre las cepas complejas de Sfdmonélttí y Clim bacier fteutuíti. Oíros autores también señalaran el valor del uso de la prueba de PYR para reparar cepas de Saltnonella y E. cali {ambas negalivas para cspccics de Citiubacter (PYR+ ),IWíH Yí>rí¡; y eols.5,1- pre­ pusieron Ju algoritmo para Ja identificación rápida de t'. coli

sobre la base de pruebas realizadas en cl lugar para siAidasa. indül y F Y R y Ia observación de fermentación de lactosa en agar de MacConkey o E M B y La presencia o ausencias de (Shcmólisis en BA R (íig, 6-S). Su algoritmo permibó la identifi­ cación de Es mayoría de las cepas de E. coli sospechosas con una esaditud mayor del 99*2? y una reducción del 75^ en el costo de Los reactivos y el tiempo de los léemeos, asi como una dtsmi nucían en el tiempo hasta la comunicación- Sin duda, cualquiera de eslos enfoques tiene validez en una era de res­ tricción de costos y ame el deseo de recibir enseguida los resal­ lados de las pruebas. Equipos comerciales para pruebas de cribado Varias compañías han comercializado equipos de detección para la identificación de E, cofi: Ü.CÜLl SL’KEKN , M UG LHsk, y BiiciiCard E. cofi (Remel, Leneia* K55; Lyfo-Kwik OM I (M icroBioLog ¡es, $t. CEsiud, M N ) y ColiSereen (lliirdy Diagaostic* Santa María CA). Estos sistemas de prueba se basan cu el hatlaígn de que la mayoría de las, cepas de E. cnli son rápidamente indol positivas, ONEr positivas y M U G {4metiEumbeliferil-p-D-glucurmida) positiva,11^-” La hidrólisis de M L'G ¡ibera 4-melilumbclircrona. que es altamente fluores­ cente cuando se visualiza bajo luz LTV de onda Sarga, Un uso Interesante de La prueba M UG es evaluar los aislados de £, coli para la detceciíVn de cepas serolipo OI57:H7. qae sfsn las cepas similares a .Shiga que producen toxina asociadas con colitis liemonágiea. Este scrolipo especifico es tanto sorbitol ncjiativo como M UG negativo. Tambiín .se cuenta con el sisiema RapID SS/u (Remel). que consiste en un giupo de 12 pruebas cromogénicas de sustrato único seleccionadas para identificar rápidamente las bacicriás

Esquema pura un* ^Jeniílteación rápitfa de E- esfi

Realizar prueba PYR

Figura 6-fl Eiiqucma efe- identificación para ln ^paRci^n (fe £. cviií de om« hacilivi indot poiidvDs, i»ida«B iKfjti'XKH-, UAP; pUKiiOe xdBp-t; HMB: etKififta£u] (fe mctilenoL MAC; *gar efe Mwr-Omkc^; ML“G: -J-íiHMílimibiLiftfil-IS-D-gJuccmjniílaL F Y F : c-ptmnLidnnLl-íi-nanLUmiJa; ID: idcnLific^i-Lúii. (M^xUlícHk) (fe Ynrte MK et d- J Clin M invh ül 2 ü m :.lS:3 3 W -J^ 5 .J'’

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

Sistemas de ¡dcniifiacson clásicos 271

M iadas con m iynr frecuencia en U t ínfixciancs «Lcl iracmuri­ nario CE coli, especies de Frwteus, especies de KlebsM la, especies, de Serrafía, especies» de Enw níim w f, especies de Pseuiiotmmtj, estafilococos coagulosa negativos,. enteroeseos y otras). Las respuestas. están disponibles entie 30 minutos y 2 horas,, según el sistema utilizado y la actividad bioquímica de Ea cepa por evaluar, Otro sistema denominado OM P y NGP WcC'Tahs (R E Y Sciencific Products, Round Rock. T X ) «insis­ te en tíos, tabletas de sustrato que en conjunto proporcionan ocho pruebas enzimálicas las cuales, combinadas con uraa.vü, identifican cerca del 95% de las enlerobaeterias. Las tabletas son [«hidratadas en una suspensión bacteriana y los insultados están disponibles en 2 a 4 horas, Haidy Diagnostica (Santa Maria. CA) ofrece Eniem5creen4, un sistema ónico de detec­ ción en tubo para el cribado de especies de Salmtmeila y ShiRrlta en heces. Este sistema detecta Usina dcsominaso. lissna dcscarboxjlasa, H¿S y urca en una configuración cu un tubo de ufla sola inoculación. Medios ife agar cromofténicos E l agar cromogénieo contiene sustancias artificiales (ero mógenos) que cuando son hidrolútadas por enzimas micro­ bianas especificas producen compuestos coloreados (Iig. fi­ fi). Bit la-, láminas en color 6-5E a H se ilustra el aspecto de distintos lipos de colonias, Kilian y Bülow fueron los prime­ ros en utilizar medio cromogénico selectivo para la idenrificación directa de f . ca lí en cultivo primario dé orina.2** En la actualidad, se comercializan varios medios cromogémcos que permiten ta identificación directa de E w i¿ fi m im h iiis , y ■especies de Entepococcus: CPS ID2 tbfoMérieu*;, Hazeiwood, CHROMagar Orienlalion (BD Diagnostica Sparki, MD; Hoidy Diagnoütics. Santa María, CA.) Rainbow UTJ (Biolog, Haywsfd, C A P1’71Ui y Ctimnwgenic UTI (Oxoid, Bmingstofce, Reino Unido). JT-?I-I,B En las evaluaciones de las múltiples fór­ mulas: de estos medita, las tasas de detección y las usas de identificación san muy similares.IT-71 111En un estudió elusode agar eromagdnko permitió uaa reducción > 50& en el tiempo de inoculación y una reducción 5* 20% en el tiempo de investígación.lw Rara extender la identificación o otras especies, se pueden combinar las características de las colonias en agarcromogénieo con praebav confirmatorias de uso fácil en cl lugar que puedan ser realizadas en segundos en tiras de papel o dilec­ tamente en el medio de agar.'1 '* Sin embargo, una advertencia es que los. ¡rótulos tomados de placas de agar emmogénico pueden no ser apropiados para las pruebas de sensibilidad con ciertos sistemas de examen automáticos. Reisnery Aystin mos­ traron que las pruebas de sensibilidad directamente del medio CPS ID2 condujo a bajas tasas de error para lodos los antibióti­ cos evaluados utilizando ul sistema Vitek l.cpacv (bioMérieni. Ha/elwoqd, M OM 1* Los laboratorios que utilizan medios croniogénifiós deben controlar con el fabricante dt instrumentos para determinar la compatibilidad del uso de íjkjcuIos del a^ar cromogénico paia las pruebas de sensibilidad a los antibióticos en el sistema que se utiliza en su laboratorio.

Sistemas úb identificación clásicas Los sistemiis para Ia identificación y la denominación de los microorganismos son computerizados o manuales. Antes de ex­ plicar la derivación y ins aplicaciones de los sistemas de codi­

ficación numérica, revisamos dos esquemas manuales de iden­ tificación bacteriana que se sipen utilizando: 1} la mauiz de cuadrículas o en tablero de damas y 2) los diagramas de flujo ramificados o dicocómieos, Milrii en latiera de damas El cuadro 6-7 es un cuadro de identificación amplio formu­ lado por Farmei y coli, utilizado en los CDC para identificar todas las especies con nombre* los biogrupos y ios grupos enté­ ricos sin nombre de las entcrobacicrins- Esie cuadro es uta ejemplo clásico de la matriz en tablero de damas y demuestra sus ventajas y desventajas. La matriz es grande y tiene 4® características bioquímicas para 30 géneros, 129 cspccics* biogrupos y grupos entéricos sin nombre. Los números en los cua­ drados que se intersecan representan el porcentaje de cepas que son positivas o reactivas contra las distintas pruebas bioquími­ cas. (enumeradas en las columnas verticales). En general, una reacción sé considera positiva st el 90% o más de las cepas son reactivas, negativas si el 10% o menos de Eas cepas no produ­ cen un resultado y variable m el 11-89% de las reacciones son positivas. La capacidad para determinar tanto las reacciones positivas cómo negativas para las distintas características a medir en esle tipo de sistema de identificación conduce a un alto grado de exactitud diagnóstica. La principal desventaja de la matriz en tablero de damas es el [«lio que involucre el apa­ rcamiento punto a punto de las distintas reacciones contra los derivados de los medios de prueba y la construcción de patro­ nes que se aparean mejor con un. género, una especie o un bio grupo específico. tl¡ayramas Ce fiujn Los diagramas de flujo fueron ideados para reducir el tedio de leer matrices en tablero de damas y facilitar la probable identificación bacteriana rastreando una sene de puntos de ramificación positivos y negativos en un algoritmo dicmóntico (Jlga. <>S y fr9). Con el advenimiento de ios instrumentos auto­ máticos y de loa sistemas de identificación empaquetados que se basan en análisis computan zados de las distintas reacciones de las características por medir, ahora ios diagramas de flujo se utilizan menos en los laboratorios clínicos. Un problema con el diagrama de tl lj jo fia sido la posible imprecisión si la reacción en un punto de. ramificación dado es aberrante (aifpicu para la especie), mal interpretada o el resultado de las reacciones de un cultivo mixto. Muchos diagramas de flujo se construyen para repetir los nombres de algunas especies en varias uniones para adaptara a las reacciones que pueden ser inenot del 100% o que se encuentran en una cuiegorfa variable (Ojí. 6*9). Sin embargo, esta protección construida no siempre se aplica a las reacciones que son mal Interpretadas, medióme un sistema de detección de tin instrumento automático o mediante el ojo humano. En muchos laboratorios de microbiología se está utilizando una modificación de csie enfoque para el cribado preliminur de las especies bacterianas halladas comunmente que se asocian eon síndromes de enfermedades infecciosas específicas. York y cols,ilS presentaron un esquema simple para, la identificación rápida á t £. coli en agar EM U « agar de MacConkey ( fig. 6-8)Para validar este esquema, cinco laboratorios recogieron secuene ial mente I Üfs4 cepas frescas y clínicamente impoitantes con criterios centrales de microorganismos indo) positivos, oüidasa negativos que no se propagaban en BAP. De las 1064 cepas evaluadas, 1 000 fueron E. eoí¡ y 64, no £u eoli, Utili-

B Est ignna del d r . VaFbr Eso

272 CAPITULO 6 Etitmbatitrítceas

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F ig u r a 6 - 9 h ^ u n m p i f a d c i i l m L i t d c p iitíf tc ilú N iíim ¿ jíli! u

ZjirnJo este esquema, tres ceput nn E. cali fueron ideDúricadai como £. Citli, para una tasa de error del 03%. Se necesité un iota] de 13 equipo* de ídéiitifieíieirtri. 657 prueba* PYR y 1 13 prueba* MUG para idcniifitítr t 000 cüpas de E. culi coa. cl nlgoñtmo.511Los autores mostraron que cl uso de este sistema rápido atorro recursos de Uboratnria, proporcioim identifica­ ciones oportunas y arroja pocas- identificaciones erróneas. El NCCLS ha establecido una pauta (M35-P, A bbrtriaied I& n iificatw n of Bacteria amt Yeaxt; Prttpvsed Guidrlw e) que descríbc pruebas que pueden utilizarse para identificar ¡ilgu* nos bacilos gramnegativos aerobios y cocos gramposrtivosh algunos anaerobios aislados comúnmente y tres especies de le va d u ra s CoitK] h* snétodos descritos en ]a paula Enojan resultados muy precisos -alcanzando «n nivel de cotífiabilidad igual o mejor que las pruebas bioquímicas conven­ cionales actuales» stslemas multiprucba y sistemas automáti­ cos- Va ideniifieacirtn resultartre no requiere el adjetivo "pre­ suntivo” que califica h ideniilkacián resultante, i’l |énero y la especie (o sólo cl género, según Id designe cl algoritmo) pueden ser comunicados sin ninguna polabr» caüRcailora.?1 * Se temiie a los profesionales de laboratorio al documento de N C C LS para los detall tes metodológico» sobre las pruebas ele­ gidas y para obtener más información de la que se présenla aquí.Mí

Ia.%Iié c é i L l ^ ir u r id i* K M j l -l A f|»ailjt;r¡dn,

Era el laboratorio de ■nierohiolngía -del (Jmvenciiy af Itlünais Hospital se emplea un algoritmo que utiliza un tubo de K J A y L ÍA (com pkÉiieíKadocw irl pióísno pitra la deieccitiu de indol) para ia detección de p¡itó|teiiOÉ entóneos en las litccs (fig. 6-9). Los procedimientos bioquímicos y K io ló |k o s definLtjvos se realizan sólo en. cepas ccm rcaecioncs que se presumen po^iíi:-

ves^ lo que ahorra el costo de efectuar identificaciones con equipos más coslosus. Aílertiil^ de ahorrar el costo de esijílileccr paneles comercia­ les de pniebiist estos esquemas dicotóioicos acoplados con algunas pruebas bioquímicas económicas y observaciones ofre ­ cen una ventaja adicional sobre lo* sistemas auiomáiiem, ya que requieren pensamiento, razonamlenlo y conocimiento por p-irlf del estudiante o del microbiólogo, que no se reducen a ser observadores pasivos.

Esquemas computarlzados LJiüBA SE (B io R A SE, líoslon) es u i paquete de un, progra­ ma infoimático de identifieatiún numérica inlcD silicaJa por ordenador para utilizarse en ondenadmes pensiónales que per­ mite al usuario crear, aetualizury manipular canlidade» ilim ilA' das de bases de
B Est igma del d r . VaFbr Eso

Sistemas ale codificación numérica 273

Cuadro 1^26 C A Q T m lÁ il hiiuria de la* reatTkines ¡te un rtlktiHiKHnlkffln ím 'iiniiíldu til riiiq banda d* A P I 10-E C A R A C T R U ls T IC A

RKACC1ÓN

OHPC

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Arjiníti* L.isin.i OmirLtu

*-

CilrpLo

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U lN \ K R S IÓ N

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[ 0

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1010I00Ü0I111 i 10]I LOO

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Aunque tos oa liñ a re s estíirt construidos para recibir irtj biude date*. a partir de los cuales calcular resultados significa­ tivos, la mente humana no puede manipular con eficiencia la lógica binaría: por lo lauto, los códigos binarios deben ser con­ vertidos en sistemas matemáticos más simples pora poderlos udtizar La conversión del sistema de dos dígitos tbinario) en pn sistema tle nebo dígitos (octal i sirve a este proposito. Para comprender ta conversión de ios números binarios en octalcs* visualice una serie de tres bombillas de luz. Al encender o apa­ gar diferentes luces, es posible lograr un total de «icho combi­ naciones, cada unn de las cuales puede mt representada por uno de ocho números que varían del ft al 7FSi se apagan todas Iáls luces i;-), ta combinación--- e& equi\ alenté al octal 10, Sí

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ilíutfim* de hridFrigtran tJreBiia TriptóTw» Jc tlM lú tt

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VüíCS-ftosfcwICT G?lflt¡i]SL

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GLucchjd. Maratnl Inu'iUíJ

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EliBnitfKa üumur^i M c lU m

Anii¡Ji!jr.:i

* * *

A iab¡ n>.•••,;! {Jsid íM

-

puede i lustrarse utilizando la secuencia de características en la banda AP! 2ÜE {btoMérieus) como punto ik referencia y con­ versión tle las reacciones PíkíiIvj.h y negativas en números binarios (cuadro 6-26], Si se leen los números binarios que se muestran en el cuadro 6-26 de arriba hacia abajo y se reorgani­ zan borijomalmente. se obtiene el siguiente número binario de 21 dígitos:

t 1 1 1 0 u

base de
sólo se enciende £ + ji el bjlbo de la izquierda, la combinación + — es equivalente al nctal I . El wt&l 2 está representado por el patrón binario — + —> el octal 3 por el patrón + +■ En el cuadro 6-27 se muestran Im equivalentes.en w t a b de las ocho combinaciones de un número binario de ifts dígitos. Para ilustrar c ó m o se pueden convenir los números binarios mayores de tres dígitos en sus equivalentes de ocíales, utilice cl número binaria que obtuvn de las reacciones de A P I 20E: 1010IOOO0I 111 i 10! 1300

Dividida de derecha a izquierda (los números binarios, se leen de ese modo? en subgnipos de ¡res'

ío i orneiqo u i n i on

iüo

Ahora convierta cada suberupo de iras dígitos en su equiva­ lente en uctalc* utilizando ¡a fórmula del cuadro 6-27

101 oto 000 l l l 111 011 100 5 20 77 6 1

Sistemas decodificación numérica La identificación tle las enterobactertas y muchas. otra* Fainilias y grupos de bacterias ha sitio facilitada por cl uso de siste­ mas de identificación automáticos y en paquetes, que la realiza mediante códigos numéricos comjMitarádDü. Un «M igo numérico es un sistema por cl cual tas distintas caractcrfsltcas de iilenlificación tie tas bacterias son traducidas en una secuen­ cia de números que representan una o más especies bacteríaíiíls. I-l hecho de que la iderttificarián de los microorganismos w hsne sobre una serle de reacciones bioquímicas positivas y negativas facilita la jiungriimucidi) compubrizada porque ki lógica de los ordenadores también se construye sobre una secuencia de entradas positivas y ncplivos. utilizando un siste­ ma numérico binario. Hn la Eógsea binaria existen sólo dos números: “íT (inactividad! y ’T 1 (actividad). Como se puede conjeturar rápidamente, las características de identificación, de ¡os microorganismos pueden ser traducidas con facilidad en «Mineros binarios asignando u n 1,11 ’ a ludas las reaccione* puni­

tivas y un "0” a todas las reacciones negativas. Este enfoque

Es mucho mús fácil recordar e1 número 5207 7Gl y más sen­ cillo su ingresft en el ordenador que cl número binario

10101000011111101I 100.

Cuadro 6*27 HIVAKIO

t'(¡n*crs$ún o r a l del código b i n a r i o F Ó R M U L A D E C O N V E R S IÓ N

_ _

< S? + CH + O =■

*— ■ - + 4 * — * * - *

14

-+ + + + +

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OCTAL <1

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o + j +o » ] * 1 * 0 SE 0 + o f 4 « i 4 n * j ■ U 4 a + 4 m

4

l + 2 * a 3

?

5 í*

B Est ¡gima del dr.V aF brE so

274

CAPÍTULO B Cotertítatitriseott

Una forma más sciH-i ll«t para recordar cómo convenir cada tripletc binario ca su. equivalente en ocial correspondiente es asignar los siguientes valores (nuevamente la lectura de derecln a izquierda! un valor de 4 a una reacción positiva para ¡a primera prueba eni cada triple te, un valor de 2 a una reacción positiva fsara la seguíala prueba en cada tripfae. un wak>r ile ] a una reacción positiva pura la tercera ¡prueba en cyda tripletc y un valor de 0 a cualquier reacción negativa (véase cuadró 6-27J. Listos derivadas de aciales se conocen como núnwnn Motípicos, es decir, un representante numérico de una serie de caracrerisüea-s ferKx:ípLciis expresadas por una especie bacteriana par­ ticular y exclusivas de ella. Es importante que iodos ¡os ^uc uti­ lizan los números, biotípicos, sobre todo quienes enseñan a los estudiantes, comprendan que cada número en cl sistema de octales representa tres cameierísiieas bit»] ufmicas y que el pro­ pio número représenla un patrón de reacciones positivas, y nega­ tivas. ExlSlC él gran peligro de que los microbiólogos modernos consideren las números biotípkm eurno cifras mágicas que pueden leerse de gráficos o colocarse en ordenadores pata obte­ ner una identificación automática de microorganismos, Eo que lince perder (te vista nn sólo las itisccioncs bioquímicas que representan, sino también los principios bioquímicos solue l(>s cuales se tosa la disciplina de L l microbiología. Lectora dé los cddlgcs tte ocíales en regsin ¿ores de códigos numéricos: Todos los fabricante» que comercializan equipos de Identifi­ cación publican registradores de códigos numéricos en los cua­ les se comparan cientos de números bioLÍpicos eon una o más especies bacterianas, que son singulares para ese numero. Por ejemplo, para el número biotipico 5207761. derivado del con­ junto de reacciones A P I 20E utilizadas en el ejemplo anterior. x enumeran las siguientes especies ene) índice de perfile* del A PI 2ÜE: Stsrraiicj manc-refru;: identificación aceptable; 5, rnarxcctrrtrxL Í/243 ii ,í ntbufiur 1/2,BS&. Kl mensaje en el Indice de Perlíl de API para el número l»iotípieo J20776I para J- ¡n u w .w tn s "Identificación aceptable" indica que se puede comunicar Á Esta evaluación se basa sobre un cálculo eompul aricado de la probabilidad por­ centual de que i", marren:ens sea la identificación correcta comparada con todos los otros miernoíganismos ingresados en la base de date». Frecirenc ia cié aparición eslimadu

Las cifras de frecuencia enumeradas con cada nombre de una especie individual (en el ejemplo anterior, 1/243 para .^í, MKrnre'íceíM) indican la cantidad de cepas seleccionadas en fonda aleatoria que tendrían un núiticrj biotípieu similar a la cepa por estudiar En otras palabras, si se evalúan aleatoria' mente 243 S. murcescem, existe una posibilidad de I en 243 de que se encuentre este patrón bioquímico exacto,, Mientras que mse evalúan 2 859 S. rubúktea selecciuriuda* al a/or. e*i>te utia posibilidad de 1 en 2 859 de encontrar una cepa de este biotipo exacto. Esta cifra no indica directamente 3a probabilidad por­ centual de que una de estas especies sea la corréela., de modo que el usuario no puede determinar a panir de este estadístico el grado de viabilidad de una de las elecciones cálculo de probaSIlliJaú La identificíwión de un microorganismo desconocido con un. número biolipicodado se basa sobre cl cálculo de la probabili­

dad porcentual entre el número hioiípico desconocido y cada taxón almacenado en lu memoria del ordenador. Los registra­ dores de códigos que enumeran cifras porcentuales de probabi­ lidad son. más útiles para lomar decisiones cotidianas en el laboratorio. Se puede comunicar cualquier identificación con una probabilidad del 90% o mayor, las que están cerca del 90% pueden ser identificada* fácilmente con una o dos pruebas adi­ cionales y es probable que aquellas con porcentajes de proba­ bilidad muy bajos se descarten. E l uso de mensajes como “ identificación excelente", “ identificación aceptable'*' y "iden­ tificación muy buena" en eE sistema A PI implica que existe una probabilidad porcentual del 90% o mayor. Sin embarco, cuan­ do cl mensaje (describe una identificación como ^cuestionable1* o "'dudosa” y no se da la probabilidad porcentual, el usuario no puede hacer ninguna evaluación referente a la probabilidad de que un desconocido represente cierta especie. Para los estu­ diantes y los microbiólogos que están internando comprender este concepto por primera vez, en el cuadro 6-38 se ilustra un ejemplo que ayuda a calcular la probabilidad porcentual y la frecuencia de aparición. flL-solucic n de las discrepancias

Debemos señalar que todas las respuestas derivadas de los sistema* de identificación computerizados, ya « a que «p re­ senten o no el ÍJ055- o más de confianza, deben interpretarse junto con otra información disponible sobre el microorganismo tb H n iiK klo-la morfología de las colonias, las reacciones en distintos medios de aislamiento, la morfología celular en la tin­ ción de Granif leu resultados de las reacciones bioquímicas pre­ suntivas, los patrones de sensibilidad a los antibióticos y el CttnlCiTQ clin ien. Cuando ocurren discrepancias, puede ser necesario ú*n&li&& los tubos, las cámaras de reacción o las microcú¡Hdas donde han ocurrido las reacciones. En mucho* casos, la interpretación v isnnl de ciertas reacciones puede diferir de la delectada por los instrumentos. Cuando es recalentado, el nuevo número blotípico puede indicar una identificación bacteriana alternativa que es mucho müs acorde eon las observaciones preliminares > complementarias. Ademis, cualquier especie dada puede tener varios números biociptcos porque tinao reacciones individuales pueden ser variables. En consecuencia, designar a la* especies bacterianas por cl número biotipico puede tener v«lor epidemiológico para reconocer la aparición de grupos de aislados similares en un contento de práctica dado, Por ejemplo, la recuperación de muchos E. coli de un medioambienle determinado o de una serie cte cultivos puede tener un valor limitado: sin embargo, saber que todos los microorganismos tienen cl mismo número biuíípico puede ser invalorable. Asf, es posible rastrear a los agentes, que producen brotes hospitalarios o epidemias comu’ miarlas baste una fuente común, E l análisis, de los biotipos tam­ bién puede Conducir a un mejor conocimiento de la relación entré la virulencia dé la* variantes bacterianas y la presencia o ausencia de c iertas característicos bioquímicas.

Sistemas de identificación en equipos comerciales de determinaciones múltiples El concepto de combinar una serie de medios o sustratos diferenciales en un solo sistema,, seleccionado para ayudar a identificar miembros de un grupo de bacterias, es un desarrollo lógico. De hecho» la disponibilidad dé mhternas de klentilka-

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

Sistemas do iftentificncfón en «quipos comerciales de deleirninacsonet múltiples 275

Cu aíra 6-2B

Cátenlo üt La rncuenda
L i identificación dr un perfil dewanoádo » hd*a sobre cl cálculo ds protaftiLidad entre d perfil desconocido y cada espedfr de riÜci'iiotKafilMIlí ilu w w iw JiJ ea la rocnwria del Paru evalsiai su conocdmiciiio de Id frecuencia dtí íparlejúo 3 L pcubabUisEal poecetauaL leiuelvael siguiente ejerapl» Para ínciNtnr li tip lk ik 'iít de les rfk’ules. cada ejemplo *c b u silo w thí l-lluíu pruebai bioquímicai y c « « p t ii» .

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Paa« 3. Ftetuencüu de oparuída dr nacriemei otaervailns (+ • + -) pan cada especie. Q hserrariétt: citaniicicl remirado de una pních i del (fescímneidn es pmieivn (IK D y V P en e-itt t-jcnijíSd), la i’fohalnüdud de Lj rt ¡Lícito] pftativa dt la pruebo, «unw ftdam 1* tvw oe dnífl \¿ ucilra P«raíl tátcuki. C iarán el resallado de la pw ha «k\ descrmnelíloes negativa (M R y OT>, k pnahabilidad de k neac¿ijúii negativa.£x I motas la ptttbabLliiiai de ccli:uimcs fm ibvib.

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h » 4 , C aciíhi de rm w nóni de upaidda dd perfil c.ifivJrvado (+ - + -) pan caita «poete. U fnxu<ít>;ki<£c «ptrtctfn m calcula. mulijpLh^itdojima). teda» las frecuencias de aparición ds las reacciones. Stm tfia tnaicesctra ta u ta b a a tr itfáiim eiiM X fü ch iltlk u n yiLra

= 0,1 X fl,&0 x X 0.02 t = 0 ,20 X v OvM K 0,10 x 0,50 -h « 0 &9 x 0,80 x 0,95 * CUB *

0.0U015W Ü,OJíOOOO 0,DÍ7«00

0,0727761 Piw t S. Purceniajcs da identificacifo. Caita frecupndí se divide per ia sajnta de leda* la* frm ieití in,, luepi «¡¡ m uJliplki p fl ]0ft pjr¡i i J jc cl precíntate de idenfilicadSn. La mir.a de los porcentajes de- i¿rn1iíi«aaén c* ip-ii a, IÜ0 S tr n iiü ttv tK tu v m

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P a » tf. Orden dé probabilidad 1. Kiebsieüa oxyloca

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2. Efít*n*fw)c1fr agjft<wtfra/ti

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J . S e rm ttu m ancnccns

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¿Cuál « la. pndMttiiEdiid áf n m JU tím tth m yivr* k» ta m|n»sb cumct* rala» Iw be* «qwaw aw I» bme de dalos? iUcrpiurtiT. %kl paso S, la respuesta e t iL ÍS ; aln ■embwjp, n isle una, pn.^Nü'itad del 4H .W de que el rnicrwaraniínw de^oBivída sea tufrnA m itr«R& ht»,r iiji.h. jwr lu lanlVi k «ktwnoUbtahíH pruebu» v.-..Lnjúnale.-, j:j ij ItlCDdJlCM'kl VUllWtilllKnle).

jL’ati que rracacmii KübiwUu miptant fia « lf perfil particular

mcrianuí

(Resputrto: áel paso A, el .1,8 % de las veces:«a olías palabras m muy a recaudo).

cíóti cQ inciviab cvoluciímé matunlmenle, casi como una nece&klad práetica, Los mlcroorgisiiisiira de los que se S4ibéque producen cnTcimadíidcs infecciosas tío sólo son muchos, sinu que a menudo Tienen 'también requerimientos nutridonaIcs espaciales y necesitan raímerosus pruebas bioquímicas para m jdeniificaóán. Marttener ta JivcrsiJad Je lew medios toovencionxles requeridos está más allá de la capacidail de mu­

chos laboratorios. La cofislnicción compacta (qu« requiere poco espado de almacenamiento), las reacciones químicas fácilmente visibles, un liempo de conservacién prolongado y un control de cálitLid esiandari/jdo provino por los fabricantes de estos eqsiii»s hacen muy conventenle sm uso en los labumitorifls de niicrohmlugfa. Son especialmente útiles en los labo­ ratorios de bajo volumen, donde es posible que no ajenien con

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276

CAPÍTULO 6 Enterobictoriiceae

el tiempo ni eon Ij experiencia técnica como parís hacer muchas de estas identificaciones y donde es mí» difícil mante­ ner cl control de calidad. Aspectos generales de los sistemas tom ¡aciales disponibles

Actualmente se ha vuello casi una práctica estándar de mu­ chos 1alsos atorn >s clínicos uúli/jr uno O mis sistemas comer* cíales de determinaciones múltiples disponibles para la identi­ ficación (te ciertos gnipos de TOicrwrganisnuis, Numerosas pruebas en laboratorios diagnósticos y de- investigación han demostrado un» concordancia del 95% o m a yo r entre la mayoría de estos ,'iiiienii’v de identificación y los nn5toctos convencio­ nales para ía identificación de microorganismos.. Por to tanto, estos sistema* tuvieron una amplia aceptación en íes laborato­ rios clínico* pnr las siguiente* rejones.

1. Su precisión ha probado ser comparable con. fia de los aisle­ mos de identificación convencionales. Sniilh y C-uls. realiza­ ron evaluaciones de vanos sistemas en los CDO\aM En tndns Jas evaluaciones, se utilizaron dos criterios pora medir el rendimiento de un producto: i] una comparación de cada prueba en cl producto con su análoga convencional y 2) la exactitud de la identificación que se hizo utilizando cl pro­ ducto, 2. Varios de los sistema* tienen un tiempo de conservación pro­ longado -6 ine*e* a I afio- ds modo que se reduce la cadu­ cidad de los medios. 3. Los sistemas ivqulcren sólo un mínimo de espacio para su almacenamiento c incubación. 4. Algunos de tos sistema* son fáciles de utilizar o más fáciles que los métodos convencionales. La inoculación es simple, las reacciones son casi siempre claras dentro de tas 24 horas y Ja disponibilidad de los registradores de archivos computarizados torna fácil y precisa la identificación Opiar por «no de los sistemas de identificación de determi­ naciones múltiples es en gran paite una cuestión de preferencia personal, La facilidad de la inoculación* la capacidad para seleccionar sólo las características por medir, la manipulación requerida para agregar reactivos después de Ja incubación y la disponibilidad de gráfkcft de interpretación o de bases de daicw computerizadas « n los ele mentos principales que deben con­ siderar Ion posibles usuarios antes de seleccionar un sistema. Si se prcsla una atención estricta a las instrucciones pTOVLS-tJS por el fabricante, se puede alcanzar el irrisín» gtSdo de precisión y contabilidad de nrndunicnuv sólo con diferencias menores en la sensibilidad de las pruebas individuales. Sistemas it itttntilicaciún ajpeciNcos m m . El sistema de identificación A PI (bioMérieux) se ha conver­ tido en el método de referencia con el cual se compara la pre­ cisión de los otnjs sistemas. Las 21 características que se pupdcn. determinar con él lo convierten en uno de los conjuntos de pruebas mis grandes de los equipos de determinaciones múlti­ ple*. El sistema identifica un alio porcentaje de especies bacte­ rianas! dentro de las 24 horas, sin necesidad de determinar otras características, fisiológicas (lámina, cti color 6-6A), Este siste ­ ma se encuentra entre los más uti libidos en los laboratorios clí­ nicos y tiene una base de datos grande que incluye cepas comu­ nes y atípicas. El índice de Perfil AlJL que puede utilizarse en forana manual o con ayuda computerizada, proporciona la pro­ babilidad en frecuencia de varias cepas que debe considerarse

para cada número biotípico. Por lo tanto, se aumenta al máxi­ mo la precisión de Icl identificación de los miembros de las enterobaeterias. Castillo y Bruckncrobservaron que cl sistema API 20E identificó correctamente el 97,75? de 339 aislados clí­ nicos y de stock. 4Et sistema es algo difícil de inocular; no obs­ tante, es un problema que se supera rápidamente con la prácti* ca. Después de la inoculación* las bandas deben manejarse con cuidado para que no se derramen las suspensiones bacterianas y contaminen el ambiente circundante. Se requiere práctica para interpretar las naciones limítrofes convencionales. pueden afectar el número biotípico y la identificación final. Ea ocasionesn es posible que los números biatípicos no aparezcan en el registro de perfiles: sin embargo, cl fabricante mantiene un número telefónico para consulta, El diseño del sistema,, los procedimientos operativos, los sustratos, incluidos y los estu­ dios de evaluación se muesiran en. el cuadro 6-29 (lámina en color ó-fiA ). SISTEMA ID B ü CRISTAL ENTERl&NQWFEHMftfTER El sistema de identificación B B L Crysial B/NF (Beeton Dickinson M ierobiology Systems, Sparícs. M D) es un método do identificación miniaLurizado que utiliza sustratos convencio­ nales y cromogCnicoi modificados. Está destinado a la i de-mi(teacidm de bacterias gramnegalivas aerobias clínicamente importantes qae pertenecen a 3a familia de las emerobacierias y algunos de le» bacilos gramnegativos fermentadores de la glucosa y no termentadores de origen humano aislado* con mayor frecuencia. El equipo B/NF comprende: 1) las lapas B B L Crystal E/Nl% 2) bases Ü BL Crystil y 3) tubos de líquido para Lrtóeub B B L L'ryslal Hnteric/Stool (véase lámina en color M )B ), La tapa B B L Q ysial contiene H) sustratos deshidrata­ dos sobre los extremos de pumas de plástico. I^a base B B L Crystal tiene 30 celdas pora reacción. E l inoculo de prueba está preparado con cl líquido de ittóculo UDL Crystal Entefic/Stool ID y se utiliza para llenar las JO celdas en la 'base B B L Crystal, Cuando se alinea ta ¡apa cotí la basé >se producé un resaflO por la ubicación corréela. cl Lnóculo de pmdta rehidrata los sustra­ tos desecados e inicia las reacciones de las pruebas. Las prue­ bas utilizadas en el sistema Crystal incluyen fermentación, oxi­ dación, degradación e hidrólisis de distintos sustratos, que comprenden sustratos ligados a eromágenos. Luego de la inoculación los paneles se incuban de arriba hacia abajo en una estufa de incubación sin CO? con una hume­ dad del 40*60% durante lU a lO horas a 35a 37“C. Después de la incubación, los paneles se leen de arriba hacia abajo utili­ zando la caja de luz B B L Crystnl. Se examinan las celdas para observar cambios de color y se genera un número de perfil de 10 dígitos, E l número de perfil y los resultados de la prueba fuera de línea para indol y oxidasa s¡e ingresan en un ordenador en cl que se ha instalado el libro de código* electrón icos para et sistema ID B B L Crystal para obtenerla identificación. En un estudio externo que comprendió ires laboratorios clí­ nicos. lu repmdueibilidad de Eos 30 sustratos individuales de E N F varió del al IÜQS-. El rendimiento del R/NF fue evaluado tanto en cepas de muestras clínicas frescas como en comprobaciones con cepas de prueba. De les 299 aislados fres­ cos evaluados por los métodos de identificación actuales de los laboratorios, el sistema ID B B L Crysiai comunicó comectamentc el incluidos 1fi casos en los cuales se comunica* pon dos o tres microorganismos y para resolverlo se requirieron pruebas complementarias. De 191 cepas de prueba previatnen* te identificadas confirmadas mediante los métodos de identifi­ cación actuales de tos laboratorios, el sistema ID B B L Crystal

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S a r n a s de iden|ifu:®i£i(5n en «quipos comerciales do determinaciones múlfcpics 277

Cu a [tro 6*29

Cunslm celóiu

um >v evaluar Ion

,

det sistema dr- idcalificactón A P I 20E

' DISEÑO FUNCIONAL

PRÍXTDLNQENTO Q UIRÚRGICO

El witm a cmiNMc en unn hudi de Se -agregan 5 mL de agwa reroRte a una ¡pHiueocíin 20cúpulai nunuiturizAbandeja de locutadéii para proporcionar une *diKwfejfl h.iinnli .Jnrjnii:- U ineuKi d it ijuc cijn(i?ntíij Hwtrjjtwdeiiudre' ticte y Lsrw cimsr» de incubnctáQ de cúSai^ Se coloca uin banda API M : en Ui fiJástic¥>«m uni iaf a que « flem bandeja de uinihacL™. Se pfepant uih His­ l-LMlLlCMC LVitKÜ lámina ce! «olor perutón h^ioian* del maowniaibmo ib pnsebfl sacudiendo tk urm ft-GA), Coda cúpula tiene im ¡jolíiai j bien uLtlnfe en S piL de solución pequeño pn 1* p.«c kiíjictííw • trapén del cual se puede ip ív u I jt ta wnpenühna al ertínl. Se cpnipara Oeí turáún knctcmra cui» uim pipeta. La hiiie¿ de la M»pens*dn oimi une>ttiniliic O J acción ímcIíiímm sofcre tos HtstrBíw de McFuliod. salvo para U$ kJeffltDc.ic¡aproduce cjmtiinsde color qyr wkd t» s deentarohacleniu rfel misrorodía, íiauiiuKrprtnidfis visualnaense

«lA m cnntf ara la &iu|Wfi»l
E s iu tu o s m E\;vLü\cr<jN

rispe, Argi niru «lihkkclH. U.«r» Hfcu^irtKií-ilaiu Ómrtina dp=e™ticnilrwi CiEratr Sulfura de hUtisniD U f«M Tdplflrwn aft»nitaa*a rn;7Ti'_r¡ir Ped 3al lOtt) Indo! Vo£ei-PtcBkaücr (ajre|ar KOII

Aldndse y Hod^rF. IntenKMMwal Clinical LakíoJOTi». Kiilivillq. TN: ac pstenlifid cl d? |íw isglatvcnt \ ci M.W-de Irntepas dlrtic»; ais­ ladas- E-s,a;iiciíd ^kitnij tfet 92S (f Clia Mift[L*wí iS B litJ; I2ÍKII5).

y«-rmfiüt) m

fieiau

InfriilLtt SírtfciKfl

comunicó ciunuclainente t i 96,9®, que incluyó ocho casos en lo® cuales se comunicaron dos o (res miciwnEamsmos y para resolverlo se requirieron pruebas complemenldiiM (prospecto del envase tfc B B L Crystal, mayo de 1994), En do* evaluadones independientes del sistema Crystal con p iic m jiin iw fermentativos. principal mentó de ta familia cnterohacterias, comunicó una identificación cwrwla sin pruebas complemen­ tarias en el 9 1 ,6 ^ y en el *22$ w respectivamente. En un estudio llevado a cabo por los CPC en el que se utilizó un stock de 626 cepas de prueba, el sistema Crystal identificó el 71.1% que mejoró hasta el 87,9íé (8S,8% para los entéricos. 84,3% para la i no entíticos) después de incluir Im pruebas adiciorales sugeridas por el programa del saftawareJ3^ SISTEMA RaptD onE E l sistema KapfD onE (Rcm el) es un miciomílodo cualitati­ vo que utiliza sustratos convencionales y eromogcniccM para lu identificación de enlcrnbactcrias de importancia clínica y otras bacterias seleccionadas gramnegatjvas oxjdasa negativas aisla­ das en muestras clínicas humanas. E l sistema comprende I > paneles RapID onE y 2) reactivo RapID onE, Cada panel RuplP i>nE tiene 18 cavidades de reacción formadas en la peri­ feria de una bandeja deseartable de plásüco. Las cavidades de reacción condenen reactivos deshidratados y la bandeja permi­ te la inoculación simultánea de cada cavidad con una cantidad predetemiiiada de inóculo (véase lámina en color 6-6C). Se utiliza una suspensión del microorganismo en líquido de ino­ culación RapID (2 m L) coma inóculo de prueba, cl cual se rehidrata e inicia las reacciones. Los paneles inoculados se colocan en lai bandejas de iitcubadón de 111+ufcra aglomerada provistas en el paquete c incubadas a 35 a 37 T " en una incu­ badora sin CO, durante 4 horas. Los paneles RapID onE contienen 18 cavidades cíe reacción que proporcionan Ia* puntuaciones de pruebas, l^as prueba*?

GreKcti y tiill. Uuívenily oí Ulahh-135 íuld^ra, idetnifK-acieifi det mismo día ■ :J Clw Msrnhkd I9*2;15.IÍHJ.II.TOIL

Mnfliint

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SUSTRATOS INCLUIDOS

virtn ha^Q^rÍJiU a IfaVév, d$l á^iljím de iínlS c Ttnibm i las ulfuljur úc Lis.

K “ > ■ '*

RjnUHHU Sx u n u ^||h|üt* AmipldijMi Aráíinosa

marcadas PRO. GOT y P Y R (cavidades 15. 16 y 17} requieren d reactivo RapID onE y son designadas con una caja dibujada alrededor de las pruebas. La prueba I H es bifuncional y contie­ ne dos pruebas separadas en lu misma cavidad. Esta pnwba es puntuada antes del agregado del reactivo y proporciona ?| resultado de la primera prueba, que es adonjtol: luego se agre* gan dos golas del reactivo INOVA Spot Indole a ta cavidad 1S y la misma cavidad se puntúa nuevamente después del agrega­ do del reactivo para proporcionar el resultado de la segunda prueba, que es indol. Los resulrados da las 19 pruebas, más oxi­ das* üon puntuados en las cajas apropiadas del formulario de informe y se genera un código de perfil de siete dígitos. E l mJcroofganismo se obtiene encontrando el código de perfiles en el Compendio de códigos RapID onE. En un estudio llevado a cabo en el University of Illinois Medical Center. 302 de 344 (S7.83&) fhróte gramnegativos oxida*u negativos evaluados fueron identificados correctamen­ te a nivel de las especies, con otras 24 (7% ) microorganismos identificados correctamente a nivel de género o grupo. Seis microorganismos dieron una identificación inaceptable o nin­ guna. ocho dieron idetii ificaciones cuestionables y cuatro f ] J % ) dieron identificaciones incíwrecia.H,**5 Kíieb y etils. comunicaron hallazgos similares con una lasa global de identi­ ficación a nivel de «pccte o de género det M jj'Jb, con una tasa de identificaciones equivocadas del | J ^ , JÍI EMTÉROlUgE El De textor ¡os sistemas. Ente retobe II (Becton Diclünson Mierohiolop Sy-aerm, Coekeysvüle, MDJ es el de inoculación más fácil. El sistema ocupa poco espacio y el riesgo de conta^ mutación es mínimo. Eií general* es fácil interpretar las reac­ ciones de color; existe un problema menor para diferenciar la elevación de! revestimiento de cera en el compartimento de glucosa (un indicador de producción de gas) de la retracción

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278 CAPÍTULO 6 ÉJTíffJnr¿>sf/flrwí03f afliÉECÍüJ de los medios durante el almacenamiento. Tjirbiün puede haber una interpretación faba ncgníiva si una pequeña pendida en cl plástico pemil te cl escupe de gas a añedida que se íunna. Se d¿bcn agregar TCartivcs de indol y de VngcsM a u c r con una aguja y una jeringa a través de 1 1delgado Ionio de plástico. Si iK> se bate huí cuidado. el reaclivo agre­ gado puede escapar a otros compartimentos y alterar las reac­ ciones. Por eso se recomienda interpretar las reacciones en los otnte compartimentos ames de agrega? Iús reactivos. Otra des­ ventaja del Enterotube 11, comparado con ¡os sistemas que uliLzan sustratos secos, es que la incorporación de medios de agar convencionales acorta cl tiempo de preservación. E] fabricante proporciona un sisteroa conveniente d i codificación compute­ rizada l identificación que enumera las posibles identificadtK mes bacterianas para tos números hioiípicos de cinco dígitos derivados de 3a interpelación de tos cambios de color. E» el cuadro 15-2de 3a segunda edición de este libro se enumeran Eos detalles de! diseño funcional, los procedimientos operativos y los sustratos utilizados.

Mlcro-ID Mi lio-ID (KemeE) es el sistema ideal para Idü laboratorios donde se desea la Identificación de bac terias en 4 a 6 horas. La inpculociión dd sistema es Tülalivamcnlc Fácil y San unidades ocupan poco espacio durante 3a incubación o el almacena­ miento. Sólo es necesario agregar un reactivo (bidróxido de potasio ul 2QÍR a una de las cámaras antes de interpretar tos resudados, Las reacciones son definida* y se pueden comparar con una guía de colores. Iil fabricante aporta un regi stro de perliles que enumera la identificación de los probable!; mjcroprga.mismos para la identificación de los números hioiípicos de cinco dígitos y .se pueden hacer comparaciones con el ordena­ dor para buscar el mejor ajuste. La precisión es igual a la de otros sistemas empaquetados o la excede. En el cuadro 15-2 de ] j i «egiinda cdicíAn de c-sitó Ithrci ¡su eitumntm los detalle* de construcción y los procedí míenlos operativos.

MlCfiüPUdDA Gíolog GN2 La mi«oplaea Biolog GN2 (BN og, % w á rd C A ) consiste ea una placa de microlítulos con 96 celdas que evalúa la capa­ cidad de sin micnxtfgunismo para utilizar (oxidar) una o más de 95 fuentes diferentes de carbono en présemeia de un indicador ródux (colorante de tclrazdb). Una celda no contiene curbono y sirve como control negativo o celda de referencia. Se prellenan y desecan en las % celdas de la placa todos los nutrientes v las sustancias bioquímicas necesarios. Se utiliza violeta de letrazolio para predetectar colorimÉtricamertie el aumento dt 1» respiración que ocurre en una celda cuando se está oxidando una fuente de carbono (véase lámina en color 6-fiD). Cual­ quiera que sea su estructura* casa lodo sustrato químico que sea oxidado por la celda conduce a la formación tic NADH. lo que lleva a un flujo de eleelronei a lo largo de una vía de transpon te de electrones. Los colorantes rídox, como el tetrazolio, gol­ pean con suavidad los electrones de este flujo y convierten el ictrazolio en formaxán altamente coloreado. Por lo tanto, cuan­ do se presenta a una célula una sustancia química que pueda oxidar, su respiración aumenta y el colorante incoloro se redu­ ce en forlfla irreversible a un forraaMn. lo que deriva en un color violeta» Si se ¡administra a la célula unn sustancia quíirriea que no puede oxidar, no ocurre ninguna explosión respirato­ ria y no se forma ningún color. La prueba arroja un patrón de celdas violetas que constituye una ^huella metabóüCiT de las

capacidades del microorganismo inoculado. Bodhner ha publi­ cado una descripción y los aspectos generales del sistema,® Mi 13er y RhodciL, en los CDC* han publicado una evaluación preliminar sobre el Biolog en Ea cual comunican que el sistema fue satisfactorio coa muchos géneros,, pero que at observaron problemas «un algunas cepas de Klcbsietla* Etuem hacftr y Serm tfj.KS Hnlmes y cois.336 estudiaron 7RL>trepas, incluidos 55 taxoDca gramnegativos encontrados en cí laboratorio clínico y comunicaron resultados mucho mejores cuando se leyeron tas placas en forma manual mfis que cuando se las leyó con un lector aulomálico. l,as placas leídas manualmente dieron ios siguientes rendimientos: fermentadores oxidasa positivos* cinto isxono. 64 cepas. 92% de resultados: correctos, 3% no ¡denliücdos y 5% de resultados incorrectos; no fcnncntodores bioquímicamente activos, ocho taxones* 122 cepas, 88% de resultados correctos, 6% no identificados y 6% incorrectos; enterobaeterias, 35 laxones. 511 cepas. 77% de resultados conccb». 8% no identificados y 15% incorrectas: no termen­ tadores no reactivos, siete tatones, 92 cepas, 38% de resultados correctos» 24% no identificados y 38% de resultados incorrec­ tos, Estos autores informaron problemas «tu la identificación de cepas encapulladas de albinos tabones de Eritewlwcfer y Kfebxiéttú, así como las cepas bioquímicamente menos activas de Moruxxttti y AW jtónü.^ En la actualidad. el sistema Bíolog se encuentra disponible en una plataforma completamente automática y se describe en la próxima sección sobre instru­ mentos automáticos, SISTEMA MicrvScan

El sistema MieroSear (Dade Behring. West Sacramento,. CA) consiste en bandejas de plástico de tamañoes\í.rutar para, midotítulos eon % celdas en las cuales se incluyen basta 32 sustratos reactivos para la identi Rondón de las eniembncterias y otras especies bacterianas (existen pañetes para gramposill\os. gramnegativos y de las vías urinarias). Algunas bandejas, denominadas bandejas Combo,. también incluyen nuerodiJi> clones de «tldo de vari» antibióticos en algunos de los microtúbulos para realizar pruebas de sensibilidad.” 1Los paneles de Micro Se un vienen en un estado congelado o contienen sustra­ tos deshidratados que vuelven más conveniente el transporte y permiten el almacenamiento a temperalura ambiente y un tiem­ po de conservación más prolongado, Schieven y cois,*11(^ser­ varon que las bandejas con paneles de núorodilucidn congela­ dos y deshidratados ptíipordoitiirort resultados comparables en la identificación de microorganismos y de la sensibilidad a tos antibióticos íla&as de discrepancia de solo 13% y 4,2%, res­ pectivamente >. Los míerotubos se inoculan con una suspensión importante del microorganismo por identificar y se incuban a 3 í *C duran­ te 15 o 18 horas. Los paneles pueden interpretarse visualmenle (véase lámina en color ó-óE), después de lo cual los resultado* bioquímico* son convenidos en un número binifpieo de siete u ocho dígiios que puede ser traducido en una identificación con un libro de códigos que proporciona el fabricante. Corno alter­ nativa, se puede utilizar un lector automático de bandejas para delectare! crecimiento bacteriano o cambios de color por dife­ rencias en la transmisión de la luz.. Las diferencias en los pul­ sos electrónicos son analizadas automáticamente mediante un microordenador que compara los patrones de reacción con un programa interno para determinarla probabilidad de identi­ ficaciones. Rhoden y cois-12* observaron que Auioíean-J, un lector automático en el sistema MicroScan, identificó comeciamente. et 95k4Sf de los miembros de las enterobaeleriaa (las lec-

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Sistemas de ¡denUficadón gemiautoniátie&s y automáticos 279

turas, tahas negativas; ocasionales para reacciones de sulfuro de hidrógeno y asinina dihidrolasa fueron los únicos problemas que condujeron j. una identificación errónea). Una desventaja citada por los autores es que el instrumento señalaa veces “ bio* tipo muy raro", lo cual hace que el usuario no tenga bien en cláttJ cuál era el biotipo indicado, SISTEMA E-ENSir.TRE

El sistema Sensítltre (T R EK Diagnostic Systems. Cleveland, OH) puede adquirirse como un sistema de identificación enté­ rico manual o en forma de un sistema de autoidentiñeaelón. La plata manual contiene metíaos para realizar 23 pruebas bioquí­ mica* estándares, mis un control. que están desecadas en las celdas de unu bandeja de microtítulos Je 96 Celdas y uunaílu estándar, Cada bandeja contiene cuatro conjuntos duplicados de celdas bioquímicas, que permiten la identificación simullá* nca de cuatro imerooriijmsmos por bandeja, E l sistema conde*

ne pntebas bioquímicas convencionales y es inoculado y leído en forma tnanuuL Slancck y eoh.437jnfurmarnn que la concor­ dancia entre Sensdtitre j API 20E para 1415 aislados de eníe* robacterias fue del 94,6% a nivel de especies. S i s t e m e s d e i t f e n t i f i w t m s e m w u t o m t i c Q s y a u to m á tic a s

MicroS^n Watawajr

El Walkaway (Dade MictoScan, West Sacramento C A )ñ un instrumento completamente automático que incuba cualquier combinación de hasta 96 paneles convencionales o Rapitl MicroScan en forma simultánea, agrega automáticamente reac­ tivos a paneles cun.venrionalcs+Ice e interpreta tas resultados de Jos pande* c imprime k)$ resultado*, todo sin intervención del operador (lámina en color 6-fiF). Existen panelea de fluo­ rescencia rápida además de Jos paneles MicroScan convcncionales para utiliíar eon el instrumento Walkaway, Los paneleé rápidos utilizan compuestos marcados fluorescentes > tvcetsLlan sólo una incubación de 2 Inoras para la identificación bacte­ riana. Cada SLtSlnüO fl uorcsctnlc consiste en un lluorófuro, ya s í a metilumbeliferona (M EU ) o 7-amino-4-mettlcumari.iu» (AM Cx) unida a un compuesto de fosfato, azúcar o aminoáci­ do. Se producen deis tipos de reaccione*: fluorojénicas y lluorométricas. En las reacciones fluorogénicus. si se presenta una enzima específica en la suspensión bacteriana. cj.Linde rl com­ puesto fluorescente, liberando el fluoróforo, el cual luego da fluorescencia. Por ejemplo: Álanina L-nlanina-AMC —---- — -----í {no fluorescente) aminopeptidasa

Alan ina ■ +AMC (fluorescente)

La» reacciones fluorornélricas delectan eamJbios en el pH como ocurre eon la fermentación de hidratos de carbono. La producción de ácido resultante produce una caída en el p ll y una disminución en la fluorescencia. Además, se utilizan ocho reacciones de velocidad flu o to g én icx Estas, reacciones miden la velocidad de liberación del fluoróforo y se uiilíauin para dife­ renciar especies fcnotípicamentc similares. Los resultados de las reneciones ID san convertidos en biíXHMÜgns, de 15 dígitos para su interpretación por el ordenador. EL sistema óptico colorim í trico Walkaway licsr^e 97 fonómetros iluminados con una fuente única de tungsteno-halógeno a través de 97 fibras ópti­ cas. Ij. Iiü. proveniente de la fucnic atraviesa los filtros de

interferencia sobre una rueda de colores y es enfocada sobre las fibra» óptica*, 96 de las cuales reflejan ía configuración de un pin el de 96 celdas. El fotómetro 97* proporciona una lectura hasal con la cual se determinan las proporciones de las señales del fotómetro. Durante cada cicla de lectura, la rueda de colores que rota proporciona lecturas en seis longitudes de onda dife­ rentes n iravíü dd espectp> visible, Pura las reacciones bioquí­ micos, el oftlenador selecciona la lectura en la longitud tle onda que mejor discrimina la reacción que ocurre en cada celda, Clayland y cois, han publicado una revisión de la tecnología del Walkaway."1* Varios estudios han mostrado que Walkaway pro­ porciona una identificación precisa de Ins micnxnsanismos per­ tenecientes a la familia £>?fentbfícr?r¿¡iceae,**1J ^ a E* El panel de identificación rápida en 2 horas fiuaroglnico de MicroScíW ha si«Ut actualizado para aumentar si *nif¡cmivymenfe la precisión de la identificación y ampliar la cantidad de taiones en la base de datos, El pane] actualizado (Panel rápido para idemi ficacidii de gramnegativos 3, RNID3 j consiste en .16 ■pruebas recientemente formuladas y una tose de dalos nueva compuesta por 119 taxones, que cubro un total de 150 cspccics, que incluyen 12 especies nw uts adicionales. Acbondo y cois, comunicaron que el sistema nuevo tiene una precisión del ^ .4 % (92,5% de resultados cfirrectos para las especies, l de resultados correctos para el género y 4,3% de resultados correctos para las especies m pruebas adicionales) y 99.3% de las cepas aisladas clínicamente significativas (97,4% de las especies conectas, 1,0% de los géneros correctos y 0.9% de las especies correctas mediante pruebas adicionales.* La preci­ sión y el rendimiento del panel RNID3 fueran examinados en una evaluación multieénlnea en la cual se evaluó un total de 405 aislados que comprendían 54 opee íes; 96.$% de estas, cspccics fueron idbttificiidos correctamcntcr En el mismo estudio, se examinaron 465 aislados paru la teproduclibilidad intóiluborotorío e inlcrlaboratorio y dieron una conccwdancia del 99,£%.11,14 Sistema Vitsk

E l sistema Víicli (Legacy) (bioMéricus) fue introducido inidiiliucnit: para realizar pruebas automáticas de sensibilidad a los antibióticos, eon modificaciones ulteriores para mejorar la precisión.1-7 hn 1982, se introdujo la Emerúhúi'teritíceaé-pltí* Bioctiemical Card (EM U +)„ que proporciona la identificación automática de las enlcrobacterias dentro de las 8 lloras de la incubación.^*16En 1996 se mcjoió la tarjeta de identificación para grainnegativos, La nueva versión, denominada Tarjeta GNI-k agregó 2C1especies a la base de datos, mejoró el rendi­ miento y aumernó la velocidad de identificación Moss y cote, comunicaron que G N If identifica hw microorganismos termentadores de ¡a glucosa en 2 a S horas y los microorganis­ mos no termentadores de glucosa en 4 a 12 horas y cl 40.1% de los microorganismos evaluadas, son ídem ideado^ en 3 bnra^,-1*1 11ausen y coLs, evaluaron la precisión de las tarjetas Vtick GNI+ ulilizando la inoculación directa desde frascos de hemocultivos positivos empleando una. suspensión elaborada mediante la centrifugación diferencial de caldo de hemcKutóvo positivo. El método directo condujo a un 75% de identificacio­ nes correctas» oca 9% (te identificaciones erróneas y un 17% de falta de identificación, Todos los aislados, mal idcntilicados fueron E . coli, de los. cuales se comunicó que el &0% eran SfUmonetb ser. Arizonac,iin El sistema Vitck Lcgacy tiene un amplio uso en los Laboratorios; de micfnbiologiti clínica y por lo general ha sido aceptado como un enfoque confiable para la rápida identificación de los bacilos giamnegativus hallados comúnmente.^ La construcción y los pruccdiniienliiü

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CAPÍTULO 6 Efltsrvbacttriacúae

operativos de las versiones anteriores dd sistema Vi ick, idea­ das ai principio pura ivali/^r pruebas automatizadas Je sensi­ bilidad a los antibióticos. se describieron con cierto detalle cu la segunda edición de este libro ('cuadro 10-5), V IT E K 2 (bíoMéiiciuxl es un sistrnu modular integrado que consiste en «na unklaü de I lenado-sel ladora. un lector-incuba­ dor, un módulo de control computerizado, una terminal de datos y una impresora de múltiples copias ívda&e lim iiuicn co­ lor 6 6 G ). A d em ás, in co rp o ra varias m ejo rías técnicas que automatizan muchos procedimientos que se realizan manualmente ton cl sistema V IT E K legacy- E l sistema deieda la prolifera­ ción bacteriana y fu* cambio* n i ü l M m en las anicroceldas de las tarjetas delgadas de plástico mil izando una tecnología basada en la fluorescencia (a fines de 2004 se introdujo un ins­ trumento de base coloriméiricn). La tarjéis! de identificación para los Iv :il'ilti;s gramnegaiivns itarjeta ID-GNB) para el V IT E K 2 es una tarjeta de plástico eon 64- celdas que contiene 41 pruebas bioquímicas fluorescentes que incluyen IB pruebas cn/imática* para «minopcpiidaw» y -twidjsas. Lus silhiruih utilizados para la detección de las aminopeptidasas suelen estar acoplados ton la 7-amino-metilcumarina (7 A M O ; ]ck sustra­ tos para la detecd
E l sistema de incubación y lectura automática Sensititre (A R IS ) {T R E K Diugnüstic Systems) es un sistema automático que utiliza la tecnología de fluorescencia para detectar la proli­ feración bacteriana y la actividad era unifica, E l -sistema con­ siste en 32 pruebas bioquímicas recién formulad», que inclu­ yen medios bioquímicos clásicos seleccionados refoimutados para que proporcionen ww señal de fluniíscectLiu, junto eon jiivchas de fluorescencia creadas tedenremente. Cada medio de prueba bioquímico junto con un indicador apropiado de fluorestentía e&tl desecado en las Celdas individuales de la placa Sensititre, Cada placa está diseñada para evaluar tres rrácroürgtuiistticis separados., Como son placas desecadas, pue­ den almacenarse a temperatura ambiente. Todas lias pruebas, ule autoidentifieaclón se leen en cl autolcctor Sensititre para detec­ tar la presencia o ausenda de fluorescencia. Los resaltados mí transmiten a un ordenador para .mi análisis e identificación, Los

resultados pueden leerse después de 5 horas de incubación. Si no se puede «Wener un nivel satisfactorio de idemificHción a las 5 horas, la placa puede ser simplemente rdncuhada y leída después de una incubación durante loda la noche. Debido al uso de la tecnología Je fluorescencia,, estas placas no pueden leerse manualmente y sólo se pueden leer en un autolcctor Sensititre corree u mente estandarizado. Los, datos internos de la compañía para l ¡184 aislados de enterobaeterias muestran una concordancia global a las S horas dd 92.4% y a las 18 horas dd 93,45* cuando se comparan con los métodos estánda­ res (inhumación técnica dd producto de Sensititre) Sistema Ptaanir

i l sistema microbiológico automático PhocniA (Bccton Dickinson Microtñolngy Systems. Sparfcs. MD.1 es un nuevo sistema de identificación \ prueba de scnsibilidi*d a l<« anti­ bióticos completamente automático. Está formado por paneles dcscartables que combinan tanto la identificación como las pruebas de sensibilidad a los antibióticos y un instrumento que realiza una lectura automática a intervalos de 20 minutos durante la incubación (lámina ert color Et segmento de identificación para gramnegativos utiliza 45 sustraías bioquí­ micos* que incluyen 16 fluorogenkos. M de fermentación. 8 de íacnles de carbono, 5 cmmnfsénkns y otros 2 sustratos (urca y omitiría i para identificar bacilos gramnegativos aerobios en 212 horas, con ia gran mayoría de los resultados provistos en 4 horas o menos. El instrumento controla tanto los cambios espectrales visibles como los niveles de intensidad de fluores­ cencia' según el tipo de sustrato, interpreta tos resultados y pro­ porciona una respuesta cuando el sistema tiene confianza en la identificación, En un estudio de Siefaniuk y cois.,, et Phoenijt mostró una tasa alia de cnneorclancia con les métodos de iden­ tificación convencionales, que varió del I001» para tos cOcos grampositivos hasta d W 1 * para los no fermentadores gjamnegativos y del 92,5% para las cnterobacierias.41'® Sistema ClmniL-cq ID

El sistema OmniLog ID (Biolog, tlayuard, CA) es una pla­ tafotma completamente automática para usar cm d método de prueba de utilización de fuente de carbono de Binlogf véase la descripción de Biolog GN2 Micnoplaca en la sección anterior). Rl sisicma OmniLng incuba, ice e interpreta simuiiárwamente las Mictoplacits Biolog. Este sistema procesa continuamente mue^tm> pero permite al usuario un accedo completo en cual­ quier momento durante una corrida de la muestra. Una caracte­ rística singular de este sistema es la temperatura de incubación definida por el usuario que permite que los microorganismos sean incubados a, su temperatura óptima para oNcner el crecímiento tnáíimo para una ideniifieaeióii pneeisa. El instrumento comienza la lectura de las ttiicloplacas 4 horas después de que han sido colocadas en el lector, Se compara et potrón con la base de datos de ¡demifíeatién y se dice que existe identificación cuando se han desarrollado suficientes reacciones positivas. Si no \e obtiene ningún rc^Lihíido después de fi Inoras, el instru­ mento coniintLa autnm^iieamentc incubando la microplaca y comienza la lectura nuevamente luego de 16 horas basta 24 horas. La base de datos de Biolog contiene más de 1400 micro­ organismos diferentes que incluyen 501 especies de gramnegativn-v que representan aquellos importantes tanto en microbtologia clínica como no clínica. Muchas de estas especies no pue­ den ser identificadas con otros sistemas de identificación.

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Referencias 231

En TSStirrwn. Jos fabricante* siguen ¡proporcionando nuevos sistemas. y inodificatcm s de los ya c a í Mentes pjifj la ¡ifcmiílcacídti Je itiinúü^m uuiM , Pana p.i^w lo* estindures de lu Ftxxi and Drug Adnini^traLinn. Lodbs psltus sistemas deben tener un rendimiento con una precisión igual o ¡mejor a ios método» de referencia. Por Io tanto, cada sistema puede .ser u«¡hiado en los laboratorios clínicos, pero la elección depende de div^rsis variables, como cl volunten de tas pruebas. Ia expe­ riencia dei pcnotul técnico, la necesidad de identLfurucioties definitivas y el costo de la operación Las enterobaclerias» co­ rnil grupo, estiia aunaentanJo can rapidez y en su mayoría %m muy iictivüs de^de el punto de vista bioquímico, por lo cual son muy apropiadas p an el procesamiento por medio Je siste­ mas aulomáiikQS y scmiauLomdiicos. Ln este libro sólo hay espacio para una reseca general de eslns sistemas, Para saber más remitimos al lector a la revisión ¡Je los sistemas auioindiicos escuta por Stager y Davis.JÍ* Pueden consultarse Has re Ferendas diadas para obtener dcscnpcioncs más detalladas j evaluaciones del rctidiimicnUJREFERENCIAS L, AWxm

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282

CAPÍTULO 6 E nterobsctarisarnff E n tin e ü in iftftin im íir to ih í fc iiu i

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v i Lh iboji hw d sj'nJraiic. i Clin Miciutnul 1^7:15:335>JL)S4 W . Calá^x"! M U Wjvrscíi TU S y lrtiiw ili"R m <£i1ílin rtfsltk'í J talTCCf U)S Cii. C j p r k 'liA . Tiifvi A l± H pK lrinkilafQ r c C íih ig a tuotiD- p m h ic i^ f ; i ir S í n 'f .i 'i k j l"iJ í iufci:-

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ehildim ü ilh furnii V i I V m n i j - l v a h i í i «h*l n-AUilafiun, Jijk 1. m M W k m m \famal w ü y Kep ’»7 C«nlrn fcrD áteii* i'anlrul and P rrvn tim fjurnitH icrtT Hifretirr« a«< í « í J I *7 -JÜ U . IW1 Cm tsn Pnr Di««sf- C o istiiL wvd Pra'VííBíiion. Oaibrert ■F rmuilidr.ij Efuiiatit .ftihuvirUu —U niial Suic^ l«iw w y—April 20QÍ M M W R. Mu»b 5 i'.iljJ m iy R ip M K A I :S4 V .J4 t T i I. frtw rt fíir Ou.’ S 'f Cc^(ifn|(*iji^vi,'rtiii,"i, ini(Kirt«i| fíjv-up— iyiw > \«kCiiv. jn«3»

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J 12. O niw t il. Scrrriia pdurifrra. bio^mip P « t iifn,^.u,¡r ha«iK)n ih Í k í i -'". I C|aq M iin í'W l 19 H ;:cr 12*4-1JJ3. I I 5 Chri :(n«'n ^ 'fl I 'wa demirfKKdicii ai j meafi* uf .liürrcnl'. 11; Pm im r .iniJ f n ~ í(í|h.t!. . ¿IlLi'iít Gnu i'Jiíh 72, cafwt íi.ni.1 ínmi '~i.'.'rí.'fr.r0i- jikl SkfgrUu ivpdi. I BaLliinLÍ IM 4:52:4ti^bA I |4 F , Hnrnvn IV, Unpn| J luiluAfril d ri fi^ 1 M U |U E d^UJI flrilí^pC alf|a| d e II

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7.M. IM C íia rT S f r r ( l i s r j a c C <*rlrul a n d f’KWKliiiifc L’ p íla lr K r m « i « r f f « - t 'i i t ó t J f b K K f f i ñ a an d e n d b lin in J iw f c l u m i a l r d » i i |» « < l híciA.1 f í l i m iw liw io w — l Q ncd S t a t n ,

i w í . MW W h Miifh Müfial W üv hen l'rtl.íu itT e - JlL

115. ClflA N C ISí’Ü BC. O '] Iv a CM, SitiH íniiiM » p . Cuukicj R f . Epslciniolufií iypinfi cl' r^ im ü iirtrr rdcamlii in I»tp iwrvláj'll riíKíí^iflii li fHHhTHÍi^. P ilIT l M u .- I * iij| EhlccE [ íis I 1 JWI.]1:4<17-I7Í

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288 CAPÍTULO 6 Cñtereb3tterítM¿e *47. S ííflfT RL, F^ldilfíturíJ SlUgl ií'iitt-raíifi«K l h «iutytic («srtíW BJíNlrnsy, JWMA M U J W .L J 7 f lL .l£ l.

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¡üicira-M oilnv J FValL K. Malí 0 5 . el .-I K tuvt'rm m eJiaxÉm tn fullim ¡rij o p e n -h s a l ftgr[íry- « f u f i í j v i í » IC lis M vfú í^ rf ¡ W£>,2i. S d t e i b l i t L F J , W í r n t r i r k . ÍjsretvhL¡tirfii¡i.ei¡*. 1 ■.. . M i t n d e l l Ü L , U u f t g j a i R f i J r. Bcm en ífc. « K Pnncijrtft and ('ru n c t o f io ich im * Di<«a
JS3-. V 'n A ít ir J. IV S m c l K Mtft liln M n i (3. il ti. Owtrsak i«f rs«Tflla«np fflk n x n lifa J.T.I-H.i jIl-i.L « ¡it fitti ¡tíétk'¡f i iw.U, jJ.:,- im prkrdHied lililí ¿intitula I CIJ ñ M ii- ri- l

Mí)l;Jk> 2H.1-2Í7. ■M4 Vpitflcjitar 1. IUniMM> ft tV Sufcf* I HíwiIhw nlwH4iirR«hi« 6w ,tJ Snimmm’nUl !.di I Clin M LidbiDl I 17:1&■ 167.

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B Est ignna del d r . VaFbr Eso

no Termentadores Parte I: Metabolismo de Parte II: Taxonomía, características los no termentadores bioquímicas Metabolismo fermentativo e importancia clínica V oxidativo de géneros de no Vía de Embden-Meyerficf-Ramas termentadores Vía de Errtner-Doudorcff relevantes en medicina Vía de las h&xosas monofosfato deW arburg^Dickens Señales iniciales de que ana cepa aislada desconocida es no fermenta dora Falta de pruebas de fermentación de la glucosa

Reacción de citocromo oxidasa positiva Falta de crecimiento en agar de MacCcnkey

Pruebas utilizadas en la identificación de los no termentadores Utilración de la glucosa Molifidad Producción de pigmentos Hidrólisis de la urna Reducción de nitratos Desnitrificación de nitratos y nitritos Producción de indol Descarboxilacrón Hidrólisis de esculca Tinciones para flagelos MétododeLeifeon MeladodBftyu Técnica de preparación húmeda Marfologa ds les flagelos

Microorganismos móviles con flagelos polares Pseudo monacales Familia Pseitdomonaddcsffi

Género

ANAI

Familia Buúhofderixede

Grupa rRNAII GéiaeroBürtíxtkÍBria^rupoPseutíomaifei Géneroflatetery graero Cüpriavklus Gérc<&Píñdaaea Génerotnquttms GénerotatMpia Familia Comamonadaceae GruporRNAII GrupoAtMmans GrupoFaat&Qeiiti&ti/í Familia Caufobacterswae Grupa rRNAIV Grupa ^mjntímms-Dsmimus Familia Xanthonmatiacsae Grupa rRNAV Género Stewirtiptmwnas Familia Sphingomnadaceas

GSnero Sptiingcrmnas Familia OceanuspMtaceae

B E sf^raclef^clr. VaFbrEso 289

290

C A P ÍT U L O ? Dadles gr^miiegaüvos no ¡«rmanEadores

Famplia Oxaiabacíeracsae

Género Massltia GéneroHaftsspMMi Familia Aftemmom&ceae Girera StewaMí!a-&w¡ produciddesulfurodefiídrógeno

GeneraAlistmoreHa -GaipoíialofilicD Familia Halomonaüaceae Género Hakmms Familia Mettytotectemc&e Génera Metttyfátacteriüm Génera fbs&xrmas Especies sin nombre

Laribactcr hongkongensis

Microorganismos móviles con flagelos peri tríeos Familia Aicaifg$mcm

GénmAkaügem GénerodflWMCfé/

GéneroBorfóslte GéneroKerstertia Gínwo Qligeiti Familia Rñimbisceas GéneroRtitiotiivnms Familia Bruceltaceae

Gsnera OdvQtwfím

Microorganismos inmóviles y oxidasa positivos Familia fíavobacteríac&ss Cttti'seoüacíetiuni. ünpedobac&y grtpu3 sin nDliitJte de I¿KCDC

Weefseiiay Befge^iia Génerohfymities Familia Sphingobacteñaceae SptinpobdüfriiiN'í Psóobacüf Familia Mormffaceae Género Mexaxeifa G é n e ro f f y t f t r í i& c f e r y gru po s f e M id a rre s íu g to iic c a ( K J ) ris les C D C

Familia Neissemuvae Género Wtáserttf G ru p a

1 (te

bacilos

m

G ¡ Lard'i

Microorganismos inmóviles y oxidasa negativos Género dft'rtÉíÜhítfflr

Grupo NO-1 Oe los CDC dotásfeflaflotofííirijpcNQ-2 delosCDC) GrupoEOS delosCDC

Parte III: Consideraciones para la recuperación y la identificación de los no termentadores Niveles de servicio en la identificación de los no termentadores Pautas para la recuperación de los no termentadores Identificación de las especies más frecuentes Pseudmom ¿eruginosa Arinetobacter baumanii Stenotmpliomonas maltophüta

Métodos para la identificación que utilizan pruebas convencionales Esquemas tte identificación de Weyant (CDC), Gilardi y Pickfitt Enfoque práctico de la identificación de los no termentadores Procesos computerizados

Equipos comerciales Tubo Oxi^erm Sistema API 2QE Sistema API 20NE

Sistema Rerral M/F Sistema Grystal Enteric/Nonfermenter

Sistema RapID NF Plus Sistema Biolog

Sistemas de Identificación automáticas Sistema Vitek Legacy Sistema Vitek 2 Sistemas MiCrOSCan Watkaway-96, Walkaway-40

y Autoscan-4 Sistema Sensititre APflO Sistema Phoenm

Selección de un sistema B Est igrra del d r . VaFbr Eso

Motólaofemo teririfl ntaiivo y axidativo 291

os hncilos gramnegativos no fermentadores como lu­ yen un grupo ds bacilos no esponjados. aerobios que no udlizan hidratos de carbono tomo fuente de ener­ gía. o los degradan a Invés de vías membólicüs «IL«-LítiIíbs de lu tcmientacídn. Dentro de este grupo existen varios géneros y especies de bacterias cotí requerimientos especiales de crecí* miento que no se explican en esle capítulo, t j h'nwi di vi son ¡i enue lo tjue es un "no fernientador" y lo i|ue puede ser desig­ nado de otro miwlo como bacilo gramnegalivo no l'erme mador “ can requerimientos nulrie¡«nales especiales’’, “ inusud" u ” üli*oh‘ |explicado en el capitulo 9) -se basa más sobre una con­ vencí i'm que en características geni ticas o fenmípicas definídas». En este capítulo, la expresitVi bacilos gramnegativos no fermentadores se utiliza pura indicar todos los burilo» graillnegsl ivas ^robios que muestran un crecimiento abundante dentro de las 24 horas sofee la superficie del agar hierro de Kiigler (K IA ) o agar triple antear-hierro (T SIJ, pero ninguno de ellos crece en el extremo de estos medios ni lo acidifican. Los géneros de no Ftnnentadorcs que se explicarán en este

L

Capítulo mui ÁL'hnjiiN ilH iíler, Awdtrvim tx. Acitietttbuctvr, Aj¡m-

bac irrita n , AScaUgewa. A U sh w m e lia , B a h ica tm , BergtycU a,

Banictelfa, Htvvuntt\m<musr Burkhuidrria, Chry&cwbQCfcriuin. Comámonos, Cuprim-mím, Oelfikh Em pedohiU'tfr. Flavoim a tritm , Lm b ai'ter. M eth yhtbtfi'ferium . M üm xeUa, M yrvi(te,% O rhnthoctTuiii, O H jftlta, Fw rditw cu, Püm cvfxvx, PedtthtietiT, Pscudtm iunaa. P.\vchnfifavlér, Ralxfariiu, Riiitifhitm l,

Rost'tHHonas, Sftfívatwiffít Sphmg&fafltwritmi, Spimgonwms. Stewnwphttnttwfvi. W rekxrtfa y ítlgum^ microorganismos que actual medite sólo llevan las de-i naciones alfanuméricLiN de U> Ccnters for Discase Control and Preven,[ion {CDC). En este capítulo también se incluyen algunas especies 4c N & w rio que se presentan corno bacilos gramnegatrius y deben ser diferen­ ciadas de los bacilos no termentadores que tienen un aspecto similor. Si bien los ¿eneros Eifaviella, fírticellñ y Fmtu m ito tienen las características generales de los no Fcmientadore-s, se los agrupa en esle libro con los bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionalcs «spcci^cs y se cxpiicsin cu et capítuloL) tn el cuadro 7-1se presenta 1a nomenclatura de los microorganismos aceptada en la actualidad y una lisia de las designaciones anteriores. En el cuadro 7*2 %e ofrecen los sinó­ nimos para vanos especies bacterianas que tenían antes o tie­ nen abura designaciones alfanuirttíricaj; de Ion CDC. A medida que se acumula más información, se debe aceptar como pude del progreso científico ln rcclasificudónde las faielerias entre género* y especie* y la crespón de nuevas desig­ naciones. Los estudio:; de homología del DNA a menudo desempeñan un papel más importante en I;l clítfifieaeinn final de lias bacterias que un esquema basado sólo sobre earaelerísíieas fenol [picas. Por ejemplo, dentro del género P/ieudomomut se reconocen actualmente varias biovariedailes y variedades patógenas. dispuestas según homologías de RNA recomhinann (rKN A ) v D N A ,*" A pesar de Ins. refinamientos, ios micro­ biólogos clínicos aún deben reconocer y clasificar las cepas aisladas en el laboratorio sobre la base de las caractenstieas m tifíuláiiciv y bioquímicas. También deben mantenerse al corriente de los cambios en la nomenclatura bacteriana para [KnJer utilizar los nombres actuales en la práctica diaria y no imer]jretar erróneamente los dato* experimentales recogidos de distintos investigadores ifuc ulili/iui di Furentes desigoaeiones.

PARTE I: METABOLISMO DE LOS NOFERMENTADORES Las baetcritts que obtienen su energía de compuestos orgáni­ cos se cutuxTcn eumis (|tümi(»i^Biió|roro$. La mayoría de las

bacterias halladas en medicina clínica obtienen energía de ta utilización de los hidratos de carbono por una de carias vías meiáWlttas, La de lección y la medición de distintos, producto* ntotabdlicra nt^estarias para identificar las cspccica bacte­ rianas que pueden ser causa de enfermedades infecciosas. Algunas bacterias, como los miembros del genero Momxeilo, nomeiaholizan los hidraios dé carbono, antes bien obtienen fe energía de la degradación de. otros compue^soN orgánicos, como andnoácidos, alcoholes y ácidos orgánicos. Algunas bac­ terias de v ida libre, ctimo [os gruptjs fijadores úe nitrógeno o aquellos capaces de oxidar azufre o hierro, pueden obtenerla de (timpiKskts Químicos inorgánicos ¿imple*, B i % se s no sdlo defi­ nen cl nicho laxonúnlíCode b bacterias; también dete/niinan las pruebas y kis procedimientos utilizados en la identificación de lew microorganismos en el labnratnrio, Se pueden consultar los libros de Dnelle192y ’l’himaniV-Tpara obtener una explicación más detallada ik l metabolismo y la fisiología bacterianos y el teMo de MacFaddin,*" que propoccirnta una revisión de U bioquímica de las prueban y reacciones utilizada* para rcali/Lix las diversas identificaciones.

Metabolismo fermentativo y oxidativo La degradación bacteriana de las hidratos de carbono prosi­ gue por varias vías merabólicas en las cuales tos hidrogeniones (electrones) son transferidos sucesivamente a compuestos de po­ tencial de oxidoncdueción mayor, con hi liberación final de energía en tortita de adertusirtlrifosfato (ATT).. Todos los hidra­ tos de carbono de seis, cinco y cuatro carbonos son degradados inicialmente a ácido pirúvico, un producto intermedio inicial, La glucosa es la principal fuente de hidratos de carbono pata his hacieriah y la degradación prosigue por tres vías principa­ les: de Embden-Mcyertof-Famas, de Entner-Doudoroff y *fc Wnrburg-Dicfcins idc las hexosas monofosfato). Como se mues­ tra en la figura 7-1. Ja glucosa es Convertida en ácido piruvito en cada una de estas tres vías por un conjunto diferente de pasifcs de degradación, Las bacterias utili/an una n rn:ls de estas ' fils para el metabolismo de ¡a gliMfó» ^egún su COpH|KVsílíc .ii i enziniática y Ea presencia o la ausencia de oxígeno. Via ríe Embden-Mcycrttoí-Parnas Com o ¡a glucosa se degrada sin oxígeno, la vía de EsnbdenMeyerhor-Pamas. también llamada vm Eliicnlítiea o unuernhin, es utilizada fundamentalmente por las bacterias anaero­ bias y, en cierta medida, también por laü bacteria* anaerobias facultalivas. Lm pasos inlermedios en la vta de EmbdenMeyerhof-Parnas comprenden la fosforilación inicial de atufO Sa. la Cüínerrión a fosfato de fructosa y ta segmentación para formar dos moléculas de gliceraldebído fosfato, las cualesi a través de una serie de pasos intermedios (que no se mues­ tran en la figura 7-1). fonium ácido ptruvico. Esta v í j se expli­ ca con mayor detalle en el capitulo 6. Ilislóricamenie. la \ ia de Elmbden-Meyerhof- Pamas también ha sido llamada lía fermentaliva. Fermentación \ metaboli'irno anaerobio fueron considerados sinónimos desde que Pasteui demos Lró que los ácidos y los alcoholes constituyen los principales productos finales de la degradación de los hidratos

B Est ¡gima del dr.V aF brE so

292

C A Fl T ULQ 7 Ba ciJu s t|ra muegati t q$ na tormentad oras

E f-jfa C ü id r & 7 ’ 1

íjM

.ji-,

l ' i a i u c n c L i l u n i j u r a b s u i ü K n n F i t i i u 11 L i í p 11W B B l& t if Z m -J r f' t v l n l

N O M B ft i; A C T U A L

U U S lü N A C IO N E S f l t f c V | A S

< O M I.M A R IO S

Aa’iF ffliS lw ftflrtffC rfiip n í B . K ) ' H A t 'h n m io b B e íe f tfe fú ü rip c ttn x

F h p h 'k 1 d f A k r i I r t i r t M .r y l r n * '¡ T Í ii é \ f \ í w iihf s p r ^ i i e n i t r i f l c u n >

t j T i i n h o it iíw

Vi» dh i s r ui l i / ü |..i d r a l p i í c i í i i i iír I s ' ¡ u h í ' f w t e

s o f e r '- f w ií t k w r í f f c m

/ U i i^ i^ íiir .'i CPC Ve ¿ í ‘t i rt m t 4 *í ¡ í ? í > ; •i^ 'A . i ui jVí

A k r i i t ■f.-h'.'S f>íi i'+mlfafir

í i p w i í %isl»d¡i fw fc L a m ftn iü Im e n tt d e m u ís ir a v clínica», hüll!JILa.«. p t r il üljiyísa:i « p j j . tliL LIk J Í'. u i Vi Li Lc í i Ií :. Nm s e ^ u ltik 'C ]j. Li^ipHM,U r t u ¿jlirc-LLi. LJnJ L'4iinLiilnün:n:i l de -u IÍLih iiil ^ U j . l s I p iir c s lif ssií:n ]i iC T iin ir ; '

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A i w \ f ¡<*<Mtfivr rtrftrhvi < r, l u .i ■■u rie iL h l u n íto M H e

N o ra T rif J e I j t^ p K k --d a d o ii ^ L r in r t o á n t 'r f r f e iK K ^ p t t ie 2

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( I a Jl' iii.n L i! ia c h ic t- j» liiu fu iu ra p t ! j : : r ¡ . ' . n .. L‘ »la ch p cc ie fo m e íc b u c ltr Iw v fiii

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N am K cv J e ía.-cspmijii’ d s il» a A e m e l i ' h n t ' t f r i’ 2 in(cs.pcL ni: ft. ( ’c |i;i il'.-i n M ib iil :■ -¡le f i k,'¡ '■.! 'i. Il.id;s en F IIIÍF J ra > -v 3 in jf# t hl:il!; in i'.

M i / r w i p c f y 'm o r p f x i

A ítv t fg e it c i f i t t t tt ¡h

's.l’ [ T i'p K i i /IJ'í í,. iV r'u / v i > , h ir t i n ,r E-n u r i lí'cli:-. p n ilc m ie pu ra im

CDC VI A k f i h g f w i ruJi iw n a

M lfc ttK M ftiiiin K i m i í «'í v n a w f j i ífc l mi»c

I s v f 1 ihkit»

hi f A k v S i g t m i .SííL'N-fí.i B t 'r j f t y v i l a z t 't ’fu rirH M

P ru fb .i Jp iirv ü pdpidiL p .i Lljvi|. A . ltqiiílI j con ín n r ik ’ durit'í «le

W V rtw F I'ü

PÍTFVM y Jllti-n

c m ' ir* f t t i ñ h ' w H t i b f t 't n h l & p i i c a

i l iV a /J jf f M í b m v h l c a n i s

P r u í b i d í ijrfiA rj-pd^j

, l i í tiiif fC iM S b n f f í t ' h t * t t j * i i i t í J?ijhi c t i i h t r'fn r.i ,T. •..•■, ■■. B m c f i i a b r tm r h if tp f if ii) I f c M i m p M m t e 'f k h is f p iu . a B r i l le Ir H t r fir n z ti

A k n í i g t f l t t f i w c ú í t i tip p Jl

pnv’fis, H n Iw in n rM ^

B a c te r ia T C i l - í i í . / j Jl- p iiv ^ j tt|x» 11

r e if k im u iia , s c t n s í í o ¿ ík 'ii > heve-'

E s p u te < k i^ lt v lif m iu i P í i f j i f l f l U t A/iAii»nrj

S 'u f r a C’ f w » ^ h U i b e n ?1 -M punto r a p r a l t e r w d e p j l i r r ; y

S i f l l i h f Ll B r ' h l c t t í U i rji'j'iírt-j

c^>m unicii el p u l t m e n f n en el n p a t il^

C ,T „

G n ijiu 2 i k ik» L iiid u if lf t J í las C D C i N G - 2 *

N iP C ri c ^ p e tic ilís Ij í m d e h c m c c u h t ^ . ( J i i r t u a r e f a t ñ ^ . in m ó ­ v il; p¡^" i k r i o ksI u N c p a fd c p r o d u c id a e n a p a r-i n l u ^ n d e « n id i-tin H iia N u r v í e v e e i e H Ís ln J a < k h e r i í h 1- v s p ra rc i^ n ^lí-cy,

B t t n i r í r í l a ¡n n it ilu m

fh k lM f f i- f i- t iF k f ir m m iZ f t i t m i n a i n

DESH iVD , rTAívll

í'.w s u ii.'f t i' r .c li t i t r í J i H S a C O C Eíi

,8 )t \n tn l\it \t H i( n i v i n f a r í i

P í . rrt¡ i ¡ t ) itji n íi i í i r sÍj ' iat a i í t í V ' r y t f P fr(T< ( e r i u r r i v e i k v i & r f

r e p a c ía c a n p lt j

/ >.v * tijr r ji:s iw j c i y o c ú i f * s i -arL íh*i «i..i ■ ‘"¿ii fir i a r f u i i

l'i.j ri. ni'. u E i-irillik '. j s l j i l i i dp n iík .l.j^ í u e j i Cc *. aeuuhds _V s i^ T d íll Lí s

h ú n ijrJ ji-. PaL-fhuemufi ic K p Ira liu rltn crt [kuc.nL-fl.li b llitj flbtuaL^

P a v u r f u iu n n a i t n A H f C D C É O -I

tJ i’ iiSi^lií ¿il Ii i l i i ■> crt íis¡c*- c ch|X £n:& j i c i l d L ^ dlllECÚCa ilc r fp ii-

P v i 1ft t HNO íhT ■. i íd lír f í i i

P rim ariain ciíE e p . i i - i

rur foi[iLfpjLai¡iLn££: B u t itA e k k r ia g la íio H

F v i í J / w b i v ^ ríiiirE fT iríii Ik r r fJ w h lr t h t fU t U & n m U r i

P iftw fr « w r w T p ^ m h . m » i f í * - ¡

C h r $ i t i ) b \ M w r jiM i t m i t i h w m ' i

r iVi i / ¿ M 11 f t fJíJtf (H. í ■t t o g v i t f r

it f 1 ■■ p L u i l j '

11 ■: silU i Cm 'i'niTiiLiilo d e

ís ]H H u ^le [ i ¡ i í i í ih ím v i'n 1'jhrivih <¡u1srn;j3 (."□Lisa J e irtcLUri Jijáis eA ve re i ■il íij íj í I k i ,

CbCUb C V ir ^ ín A iü 'n 'fM iM NlrMlJltjftí.ip^Ac m

f t u v r f i a i i t r i u n t m e n m . ^ u e p i k h ih

AH.íMoeitTr pgiu|s£: l i t u p u m I k b u lle s prtiltaS ufO s

CDC U*

B Est igma del d r . VaFbr Eso

Melaboli'&mo tormén tativo y raidalivo 293

Cuadra 7 * 1

s't . { '-i’. . '1 .-

Nm nnklatirii puní -

1*1

■ .. ...;

fcrtik'jilA d iirt'*

^riiiníírgaiiv<w (cu n t.) ■'

PESIUPTACIONLS PHKVlAS

NQMURIr, ACTUAL ( j'iWlíJITiíJITil ’■VJ'JT.C'CJlft

i )i J i nl.i'- eí^Wcies tk W rifí Jí. F ilia n Ií¡ lij'trij tpiriilruri atftiath'im

í.'-'iíniL'Tu.uiíH í^hiWjfriiííti

Í‘íí 'id/- /í.iffjr.v UsbUIi i«U¡■ SV'l/JfWtf'KdU ¡ÍlVUI, .J, ./ !’it:iiJminií¿i'¡ ifatimfu-if

UOMEXTARIOS

í'Tj'iííi'í^y.irr.i ríTWTiTírí idus ptmcwSití

DeSfíh/ at !¡Ii!vrtijn:i

UiíRTmto ptm^Sa H . / ! jii üíi \iSj¡ IVrr-í a c

Pftjík i ds Lírrua rlpiife

[“íurjiiiiTjA’Ju.', ¿Ji ii/i nvjrcifj i

F U a 'líi'ii iJí ¡th.IiiL ruirínj*í.«*>ij í>la piuAwt: ¡úii iK' jntrusLlinn j |unir lie üíi|"íi'li.i

[‘t i iidrtfm uhu cicitiaiFOrün.e irJvní-ülíK7ir.in,jri, tfrtur/ih lid >

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.li’feiuntí fcrrfpr^ríhiclfr btrt-ii K.^IHC.'ÍCmJC í Vil li l i l í .'4.-|TM11 > 11

MVr.v-.S.'ri'i"-';-jfíj ) ■t i r

lírtfcijiÍjt/LjiTmwflr ivir idpt/Gnflr

PintJtjm oíhtr tneiopUík uat m tíhanit . Vl&rk? mnrcjiiííJii IfV. . j . UMfhlftfrJ f-.ps1-jj-t-ilf P Viahjnwwfaje'r*'f

Vdnkis ofieüie^ uu 1lílLis .mits ea cl :'¿pj±n i U ta ufa, t-i. iw lun ■■■¡J'j JclIiliÍJIlíJ-Jí uMihi úÚLinhi»» lie Jíd-nefn rtli
Bjtlii.iy

L -j » i*í>d í ChfBíiMiHc i/rrúmt EZj]Vs ic!v .ii i¡ri}rrfn rkia \fi>nrrttía ¿rikmtftf

ít)C M- 1

\t>nurl!(i ¡aflántUti \f¡ifrn\'SS,¡ nffiiiíffii-fcti jsm Mt\mstíía fiiAPiuii

M vrtixriía li^tigfafienx

\fyjviiits tidontius .HfjJTíiiJTf\ etli¡Ti¡ir/itímM-f

fiüi l'Xi'jrí ifaftfr 1 Mi'míi ^vAi?iri?jjJir? variedad ux^Ajbt f-ríhvi/urj fj-nfiifj Ajnr¿j/if.m cncM -ir

<'n|fHniss grande^ crxi uiui lendoncdii ,i pnn^Miw: inJol «icgalmi

íiípwrie J lljWnjTii,p-fl*r M-5 CDC M-5

Cf[KL^ laadnúiGcnn inn>níeiJiiris dk1 prrrrK

F.vt'íil Íií líe Atpmiettn M ii CDC M-fíi

C atjlau ne-jp.liM.1. Cet.iv jsi.viaiüak t»xi m lm irdili^

Oi.í.iriJ-Ut-.rmrTj uulhnipi

CDC Vti-L YiL-1 Eipcei^dí .IcJr/i^jir^y.ii hT, tvknip» L y 1 At'Arafliothifwr, pn¿f»s A ,(!y iJ

ü.-k. >c a..iKi e:i mucstriui Eiumau.it

Oüftciin nrr(4}:i.tr

CDC IVc

fruchj. ik iucu t ipiii.t |.iub]tivj j (cnddlauiid 4leuniiiuuu ]xnili\j.

í

CDC M-J

Se aihJi■cu inlrL'ciuiw^ Uci «»iJp y de l:iv ^ s urinarias

AnfftWJft?

Nuou ¡idíieroiju í eosnpitihk i'tneoti^mcM

Se íu'k'i cl: ll;l:r'l.f J ' 1 .miui .i-. 4]!«J&.^‘utliiejiLi; tk ¡udrMes -l'lHí tll
P«1 I&I
^sfjr./ínti1vitlí 'HíkuWfrír' ¿i.k1cj ii'rt ele.11Í.ÍJfHJSa

pL rWfiteí ai guipo llinticcm^

VífMfrrá Hwwri N f I'-'i) TÍTd i W TMiJ tií J,LlKc^jh-’cLff

urrrímtüs

ftmfftmnPMf _flüfWfSCiM.í

PstM&mtnMtt UüfítUt

ítülX' h -MlT . tVpn 3Kbil:i t-on

iíU.^ bacuenda P íc il íil v í j I |tru|M flLnKítH.íúKL, fdaiiria

CDC Ve-1

Cun fiL|«5i.TiLi:) jman'lk), imJasa mqialjvo. L-wtilns.i fsimt.ni

Chr, itMWfcirijjj lurtcJii Chr, Mi-lil,-:P1HTpi1tylfiffriT Ü tm m k tl

B Est ¡gima del dr.V aF brE so

294 CAPÍTULO 7 Bacilos gramnpgatifos m lirmentailores

Cuadro 74 Nuweíifliiturii parn ¡indis» nu fermcnladurv» ^«nim'Sürtivii' ic-hu. í D ESIG N A CIO N ES PREVIA S

N OM BRE ACTUAL

f,'í'lrjííTJK>rW,i ítttílíl'iiLJríjJ

CDC V K -: Cepu KHiciad<Eu«n wei^K'^mia j in kK H Ü jlH d c válvula

P 111i ■■i v

Coa

itíwiti ,c /.i n ra ncyir*1f

PfllíBCíf uU

irJí ','i iraJI jrMNiYd

P i t r c j í j w fHí'JuíiifíiL/fj j j j i j í j í

p íu íé s b il

|iLyriKiüii airu-iil .' i-x dr.i n^.itjvii, rsculina n « i

f 'hi I íítWM iJi íH12lfc|,.'-VftflI

Aií uJíirítrirHJT sfirr'fí i

if t a

C O M EN T A R IO S

CDC Vb-2

I 'jí

■k* v : A i «

CiJiiijiii'. ni^n^j-.. Lrhicn-ín mCtVi'ijMi

CDC Vfcv¡

¡l^^ie Pik-j> \ l1^**■4imv¡;i tnii

l'cililulutci» üísAlllIShsa pcnitlvt’. ti l l j N j .CI llí1I illiL i !>'í

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1tiiifít. <.''.hvihíc riimhn" át Eir-L( ’DC

In c l^ y f rw:- ii.'iNKiviVitrttm's fi*it n o m litr (A itfliirdti. tí. c w v k n tis , ft. h, irr'du'i v - il'ís mih iiú in lirí. Cníi,i.n]j7¡ rosadas., ,i m eíiuJo iü u l' Lük.*--. Iw ílk ft cLifijiJí-'v tciíbcjitcla.ia L’]dnu»:cullit(i% J e lirx ’ii dctiil

Í Á i w V J í í r Jé1.» n . ' j f r r ' . T . J . / r - , ' ! :

J 3 w í iij'i i r a r v : i í j t i i" í t / í W j n n

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H .S |¡iOH.¡HVn.

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N a C l fiíi'j. tu c íL v Iin ltm ih

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í 'j if 1i ’ i i- : •S/1i'-'jVi ifk{rifríuí,i¡ mf, i ritYviun

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que né ¿n Iíi columna de l.i izquierda tle lu fi^nni 7-1. cl ácido [finívico jcUw como «ci:pujr inLcmicJíccdi; liiilróbieiiu. ptici lucijo se oxida d cntrc^iir >us hidro^cniones al fielato de tündtn pur« formar ácido Líciicu o u oteas viles o^gánicíw pitra jbnnjir ulgunos tJs? los íSenojninudm ácidos mixtos, h-cos ácij|us m-d Iísk productíis lsnales del ineiabolismo de l^nfiliiL-t^ii por La v iU ile Emlíden-Mcyflrtior-ñimíw y expli&an lu caída del pH

en l£ü piucbaü (le fcnncnlíKiíki ni iliradas para iiti:iuific;»r las bacterias» L*1'* baclerias (icuen lu-, stsicitía.% triijrtijUnm apropííbdns j-mtiien deerjdLii aún más estos íMcIik mixtos: cu alco­ holes, n oírjv; compuestos orgánicos. At»m|He e.s-ios ]U"irU-i|>¡os í'MMjLiiiiiíeO'. parveen Jl^o ¡ilejados Jet trLil*¡ijo eo| iili ana del Laboratorio, los miLTobiólügOs deben (etier im Hfonwimicnlo básico dcL i^cíllIx»!] ano batLeriaiKS c Liando idean o saiterpretmi procedimteiuo?* dt ppacba t[uc pom­ paran fcrmcntaenm Con íJ\idaei<'wi I .a Fertnervl JCtííll deho <ír delenninadii en los si^iema> tle prutfói tine exeluyen tufinein), Liis priuiueiLiN ¿!llll’üI[licos f(.trniados mediante fcrmefltucióii ltciien unaacidc¿ relalivamcntc fucile, ¡a cliu! ú.% dcleeliida eon

B Est ignna del d r . VaFbr Eso

Metabolismo fermentativo y oxidatira 295

Cuadro 7*2

G ru p o s b a e itriia u s a m le tras y n ú n irn b de It» C D C : slnúidnuu

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facilidad por Ion indicadores patu que ocurra i¡i glucóliiis. Ohsírvese en la columna centra] de b figura 7-1que la glueo ^£t no es convenida ¿n dtiH moléculas de ini.v-;s carbón» etnno en lu vía de Knihi,lt;n-Meycifi¡iif-Pn:masL irás hU?n, es oxidada a. frfmfogtueitjuin y 2-eeut-3-desglncoimlo anleu de formar ácido piruvico. Aipunas bacterios ulili^aji vías de coiIü ' drt-uii« □través de las euales Ja glucosa se OAÍdü directamente en Acido o luciinónico y eelojilueurómcQ sin yn paso dfc fo*lóriIación inicial, Ln cualquier caso, se forma cl ácido piruvico intermedio, "Oxidación" se refiere más ¡,i la manera en que el ¿eido piriivieo Inüisflcit mis hidru^taiiemc-s a la \fa jxir medio

de l;i cual se forma Al carecer de las en/imas dcsta<1n>,gena'ias necesaria* para oaidar d ácido pirúvico a ácido láctico u otros "ácidos mixtos". lis lueiena* otjdatlni-s transfieren Í0!> fiidrogeilíones disponibles tlel ácido piruvico al délo de Krebs. donde ln* iones finalmente se unen con oxígeno cfóincnial para fi'nn-ii aguiv Por lo tnn1uh cl nmuhaliiimo {ix íd u liv ii dr !o> hidratos de caribonu se define acluuJ lítenle como litó reaccio­ nes pmduciuiaa de eoci'gía upe requicneo m %cn» molecular (u otros elementos no oigánicua} cumn aceptar rtrmiua! de hidró­ geno (electrones J. Esta diferencia en el m etalxjlism oeii^ enfoques pntciico-s allemalivos para la identificación de bacterias oxidan ms y fer­ mentativas* Los ácidos que se forman en Ja vía de 3¿ntiu»rDüudocofí (ácido piiicLiííJrtieo y su* derivados} y los produci­ do* en el Ciclo de Kicbs tácido cítrico y sus derivados) stm extremadamente débiles comparados «tn los ácidos mistos resaltantes de la femienUciún. C¡m>i el producto final del metabolismo oxidaLivo es el agua* los microorganismosoxida-

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

Í9&

CAPÍTULO 7 Bacilos gramnegalim np f?intentad ates

Figure 7*1 Vías roeiahrtllcís para la Jcfradidón taeicnánu de filucosB.

[jvn'i no forman p * a panir de los liidraios de caitono, P
Via de Ira heiosas manofasralD de Wartiung-lJicleirS Las bacterias anaerobias facultativas llenen la capacidad de crecer ■snbnc: la H.Lipcrfit:iic- lLc uru placa de ajrar en presencia de oxígeno o en un niedioambience anaerobio, til hecho de que un microorganismo pueda crecer en un inedioambienie aerobio no significa necesariamente que utilice el oxígeno en su ntelabolismo. Es decir no lodos los aerobias sd ci nuidativos. EL lér* mim> aerololtrinlc es mis apropiado para las bacterias nn oxU

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

Pruebas utilizadas en la identificación de los no fermenta Sores 297 dativas que sai] capaces de crecer en presencia de oxígeno pero crecen mejor en un medioambiente anaerobio. Muchos; de los anaerobios facultativos pueden utilizar Ll vía de Embden-Meyerhof-Pamas o la vía de Enlner-DoudoroFt según fas oondiciones ambientales en las que están creciendo. La vía de las tiexosas monuTosfalOt como se muestra en la cotonía de la. rtmiHj derecha de lu figura 7-1, e* en realidad un híbrido di: la vía de Embóen-Meycihof-Panias y de la vía de EnüierOoudorofí, Obsérvese que los pasos, iniciales en la degradación de la glucosa en la vía tle las heus»* monofosfalo son paralelos a (os de la vía de Enlncr-Doudoroff;. sin embargo, más adelante en cl esquema de la vía de las. hcnosas monofusfatu, se furnia gticeraldeíiídO‘3'íbsfaiO'corno precursor del ácido pifth ico, similar a la vía de Embden-Meyerhof-Pimías. Estos microorganismos aparecen como fenneritadores en los sistemas de prueba, aun cumulo se utilice estrictamente esta última vía, Obsérvese en la figura 7-1que la «hulosa 5-fosfato es el pre­ cursor de la formación de glíeeraldehído 3’fosfato en ia vía de las botosas monofasfutu, Lu ribulosu es una pentosa y, por esta ratón, « la última \ia también ha sido denominada cielo de las pentosas. Proporciona el principa] camino por medio del cual algunas especies bacterianas mslíi balizan la prntosa.

Señales iniciales de que una cepa aíslate desconocida es no termentadora E l microbiólogo puede sospechar que un bacilo gramnegati* vo desconocido es miembro del grupo de ou lexmcntndort.s j] observar una o más de las siguientes características: 1. Falta de evidencias de fermentaeiritt de la glucosa (véase lámina en color 7-3A) 2. Reacción de cilocromo oxidasa positiva {véase lámina en co]or 7-IB ) 3. Palta de crecimiento en agar de MacConkey ivéase lámina en color 7-1C) En la lámina en color 7-1 se presentan oirás características utilizadas par# realizar una id entificación prelim inar de ¡os nn termentadores. Falta ds pruebas de fermentación ds la glucosa

Los ácidos producidos por los no femicniadofes son consi­ deralilemente más débiles que Sos ácidos tnntns derivado» de las bacterias fermeniadoras: por lo tanto, es posible que el pH de los medios de prueba de fermentación en et cual está cre­ ciendo un no termentador no caiga lo eficiente como para convertir el indicador de pH. La señal inicial de que un micro­ organismo desconocido es un no fcrmenlndor suele ser la falla de producción dé ácido en los medios KJA o TSI, que se mam 11esta en cada caso como una porción inclinada alcalina (roja) y una profundidad alcalina (véase lámina en color 7-1A), inicialmente, es importante que un microorganismo desconoci­ do sea clasificado por su modo de utilización de la glucosa para seleccionar el conjunto correcto de características bioquímicas como para hacer una identificación definitiva, Es posible que los microbiólogos que utilizan equipos comerciales de identifi­ cación y omiten la siembra del microorganismo desconocido en los tubos K IA o T SI no sepan si deben seleccionar un siste­ ma termentador o uno oxidativo. Por lo tanto, antes de estable­ cer diferentes sistemas, se recomienda evaluar la característica oxidativa-ferinentadora (O F} de toda cepa desconocida dé

bacilos gramnegativos medíanle la inoculación en agar inclina­ do (pico de llanta'} en medio K IA o TSL Reacción de eítocnjroo orídasa positiva

Se puede sospechar que cualquier colonia de un bacilo ¡sramnegativu que tríce ert agar sangre ü otíü medio de aislamiento primario que es ciiocxomo oxidase positivo pertenece al grupo de los no termentadores (véase lámina en color 7-IB ), Sin embargo, no iodos Ins bacilos gramnegativos ¿midasa positivos son no fennentadores, Por 3o tanto, es necesario medir aún el modo de utilización de la glucosa (lo que demuestra nuevninenie la importancia de establecer un tubo de K IA o T SI), Los cultivos de termentadores oxidas» positivos»como especies de Pm ifu vlla . especies tic Aewmwms* especies de PlesUmm
Aunque todos Ins miembros de las enlerobactcria* crecen en agar de MacConkey, algunos no termentadores no lo hacen. Por lo tanlo, se Jebe sospechar que un bueilogramnegaíivo que crece en agar sangre pero crece poco o no crece en agar de MacConkey pertenece aL grupo de los no íermcnLadures. Sin embargo, esta paula está lejos de ser absoluta, porque muchos de los bacilos gramnegalivD.s con requerimientos nutricionales especiales tampoco crecen en agar de MacCofllícy. La capaci­ dad de los bacterias para crecer en agar de MacCunkey se determina inspeccionando con lu/ reflejada la superficie de las placas que han sido inoculadas y luego incubadas durante 24 a 48 horas, Los microorganismos que crecen bien producen colo­ nias de 3 nun de diánsetro o más y fáciles de ver. Las ce|ias que crecen poco producen colonias punt iformes pequeñas amplia­ mente (lispenib o nu producen ningún crcciiniunio (véase lámina en color 7-ICj.

PrusbM utilizadas &nla identitieaeión de los no femmtadores (ililIzBcídn de la ijlucnsa La mayoría de los medios de cultivo convencionales ideados para detectar la producción de ácido por las bacterias fermentadisras, como las enterobacterias. no son apropiados para el esiudio de los bacilos no íermenlaiiorts. No apoyan el creci­ miento de muchas cepas y ios ácidos, producida a menudo son demasiado débiles para convertir el indicador de pH. Huglt y Leifson1^ fueron los primeros en idear un medio de OAÍdación-

B Est igma del d r . VaFbr Eso

238 GAFÍTU LO 7 Bacilos gramnegativas nn ferme utaj ores

Cerrado Abierto

Cerrade Aborto

Cerrado

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ca Lw inlcroor^nlfDH» aiscwolJtltfí*) que no otiJuan hidrum 4 tarttom» no protfu«n cim bioi « i ninguno Je Jos. íuIkh.

fermentación (O F) que se adaptara a las propiedades metabólicas fie fns bacilos no fcrmcEilarinres. como se señala en cl pro­ tocola 7-1, Obsérvese que el medio OF de Hua;¡i4.eifson contiene peptona ul 0,2% i- hidratos de carbono al L O 'í. de modo que la relación entre peptona e hidratos de carbono es de 1:5. a dife­ rencia de la relación 2:1 haU:uhi tu los medios utilizados jura la fermentación de los hadmlcts de carbono. La disminución en la pepttHid reduce la formación de producios oxiJaiivos a partir í Ll1ainirtnicidus,. que tienden u elevar cl pH del mediu \ pueden neutralizar los ácidos débiles producidos por los baci­ los no fermentadores. Por otra pane. ¿I aumento de la concen­ tración de hidratos de carbono incrementa la producción de ácido por el microorganismo, La consistencia semisótida tlel agarHcl uso de azul de bjomotimü] como indicador de pH y la inclusión de una pequeña calidad de huffer de di fosfato están ideados para aumentar la detección de ácido. Se necesitan do.s tubos de cadu medio de hidrato de carbono para la rmeba. E l medio en un tul.™ está expuesto ul ain;: el ouo eatí recubierto con vaselina estéril o parafarina fundida (ftg. 7-2)r Los microorganismos ojtidativns sólo producen ácido en cl tubo abierto eapuesto y] oxígeno atmosférico; los microorganismos termentadores pnodueen ácido en ambos lubus y las bacterias no saearulÍLíeus wft inertes en esie medio, el ciuil se mantiene a un pH alcalino después de la incubación, En la lámina en cnlor 7-1D se ilcistru la reacción O F de un no fennentador oxidaúvo y sólo el subo abierto muestra el color amarillo de producción de- ácido. La prueba OF tiene limitaciones. Es posible que los bacilos no fermentadores de crecimiento leatci un prtjduzcuj] cambios de culur durante varios días y las especies que producen ami­ das a partir de aminoácidos pueden hacer que las reacciones áeidas débiles reviertan con el tiempo, confundiendo así la interpretación final. Es impórtame seguir estrictamente las fór­ mulas de Hugh'Lcifson cuando se realiza la prueba O F (véase pro! nenio 7^1). MriNdad Es posible que un medio de agar semisólido para detectar la motilidad de los microorganismos fennentadores no sea apno-

pwdo para las especies no fermentadnras <|ue crecen sólo sobre lu superficie del agar. Si se utiliza un medio de agar sertii sólido para lu> bacilos no termentadores, Jebe inocularse cun un corle sólo ios 4 mm superiores del medio y realizar uita lectura ini­ cial en 4 a íi horas. Muchas, cepas móviles de bacilos no íermentadores muestran sólo una nebulosidad débil y temprana cerca de lu superficie del agar. que tiende a desparecer con una incubación prolongada. Nuevamente se deben realizar lecturas a las 24 y a las 48 horas para detectar la moulidad de las cepas de crecimiento lenlo.1.a incubación a 2 Í °C aumenta la motil idad de algunas cepas. Hemos observado que el medio de movi­ lidad B con letrazolio (Remel, Lenexa. K S) funciona muy bien pura demostrar la moEilidad con los bacilos rus fermenladcres £vóa,se lámina en color 7-! E), La preparaciín de la gota colgante puede ser mas precisa para detectar la molilidad de muchas espccics de bacilos no fermeniadores. En esta léenic^ se coioea una paite de un cul­ tivo de ciddu de crecí mienio aclivo de G a 24 hora* n|uc ha üMo incubado a 25 T en el ccntj'o de ua cubreobjetos I que es invertido y suspendido sobre la concavidad de un portaobjetos de depresión, Un enfoque más práctico <preferido por el autor) es extraer un petiuerto fragmento tlel cultivo desunollado en la superficie tic una placa de a|.rLir sanare después de Ifi a 24 horas y aplicarlo a ta superficie de un portaobjetos scco de vidrin í!e agrega una gnía de sn]ución salina al inneuln sobre el portaobjetos y se coloca un cubreobjetos sobre la gota. En cualquiera de lo» métodos Jo*; microorganismos se visualizan bajo un objetivo 40 X eon una lu¿ ¡educida para detectar la presencia de motilidad, Se debe diferenciar la verdadera moliiidad del movimiento hrowniano o el (lujo de líquido por debajo del cubrcobjelos. Las bacterias móviles muestran movjmiemo direccionaJ y cambios en su píssición unas en relación cern las utias; cuando el movimiento bmwniaíto es la causa de la motilidad, maniicnen las mismas posiciones relalivas. Et uso de tinciones para líatelos (véase protocolo 7-2y, que se ejtplicgn más adelante, lamban es útil parct diferenciar ciertas especies móviles (fifi. 7-3).l ',l' i'J PradüDciiin de pigmentos

Los no Termentadores producen denos piguaenios. algunos de los cuales son úiiles para realizar la ideniideación de una especie (víase lámina en color 7-1F). Los pigmenios hidrosoluhles incluyen camiennidéfi (amarillo-aniranjidn), vjnl&eeína ívioleia o púrpura) y fena?inas (rojo, marrón, amarillo), que imparten colores de l'i ni dos a las colonias. Los pigmentos hidmsuluMes y difu.sible.s iiicluyeil nuoresi-eítia (piuverdina), piocianina. piomibina. mclamna y oSros diversos subproductos de piementos. que carnbiaíi, de color el medio de cultivo. Los medie* H ech" y ‘< F3o''-14,1‘ íueion creados pura aumentar la for­ mación de los pigmentos htdrosolubles ptocianina y pioverdina (v¿ase lámina en color 7-IG). Eitos nialiE.™ tienen peptonas cspcciaíes y una niavor concentración de iones sulfato y majenesio para aumentar ta producción de pigmento. ICing y cutis. observaron que el tipo de peptona utdi/ada en el medio basal afedaha mucho la producción de pigmento. La peptona Baelo í Di feo Laboratories Detroit, M I) resultó superior para la pro­ ducción de ptocianina pero tuvo un efecto inhibidor sobre ¡a elaboración de fluorcsceína, mientras que la prnteosa pept<ma 3 (Difeo) aumentó la producción de fluoresceina e inhibió la formación de pioeianina» El aumento de la concentración de fosfato provoca mayor producción de fluoresceina peno dismi­ nuye la producción de piocianina. También se puede aumentar la producción de pigmentos haciendo cncocr los miemot^anis-

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

Pruebas utilizadas en la ¡donlLficación de tos no termjenlsífsres 299 F ig u ra 7-3

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mos en medios que contienen gelasina, patata o leche c inocu­ lándolos a 25 "C a 30 ^C. Se puede demostrar pioverdinu en agar Fio observando fluorescencia Nijo luz ultravioleta lulilizando urta lámpam Lie W oodlo por Li aparición de un pigmen­ to amarilla un ci medio Je cultivo cuando mj lu observa cují lu/ i ¡sable ívease lámina en color 7-IG y H),

utilizada pura utres microorganismos: e| parámetro es la apari­ ción de color rtjjü jl aere^ar ácido sullartilico V a-nat'ti]am¡na a un cultivo duran le loria la noehe en sin medio que contiene nitrato. Si no se observa color rojo, el nitrato no se ha reducido 0 la reducción ha proseguido más allá del estadio de nitrito hasta la formación de otros compuestos o hasta gas niírogeno 1d e í i T i i t r i E i e a d ^ n ) - 1. : l □ p a r i c i ó n t l e L O l O r i f l j f t C ñ n t l a g f l f g j h i ü

Hidriüütis líe la ucea La hidróliíii? Je la uiea se présenla con detalle en cl pix>nieolo 6-6, Como muchos de los no fenncnladoreis t|uc ludio! i7an urca requieren medios enriquecidos para el crecimiento, se utiliza ei agar inclinado-urea de Christensen* Se pueden lograr resultados positivos más rápidamente mediante cl empleo tle un inóculo importante. Las especies bacterianas, como Benietelki bnmFhistptiea, -que hidrolizan ávidamente b urea pueden provocar un cambio de color rojo dentro de Las 4 horas.:, loe¡ reactores débiles jiuciien requerir hasta ü í horas unten tte poder visualizar una reacción punitiva, La aparición de un tinle rosado, tarrifo débil en la porción inclinada superior de i medie] probablemente indica una depndación inespeCÍfiea de los aminoácidos y Jebe ser Leída como un resultado negativo de 9a prueba (véase lámina en color 7-2Ah. ñECuccien da nitialas Hn el protocolo 6-2 se presentan los principios y los proce­ dimientos básicos para realizar la prueba tle reducción de míra­ los. I .d reducción de nitratos a nitritos es sólo el primer paso en un proceso bioquímico utilizado por algunos microorganismos para liberur uií^cnu: un aeeplor final de hidrái’cn»en el puní» terminal riel metabolismo os idatrvo La prueba de reducción de nitrato* para no fermcniadnres renli/a en forma similar íl la

de una pequeña cantidad de polvo de cinc indica la presencia residual tle nitral»*. Eo que señal.1 ! un resultado negativo Je la prueba: la ausencia de Cultor indica que el nitral» lia sido redu­ cido a cocnpuc&toa distintos de los nitritos (habitualmcnle p¡> nitrógeno), lo que denota que h prueba original fue positiva, Dasnitrili camión de nitratos y nitrilos

Algunos no ¡Termentadores lienen la capacidad Je reducir eE nitrato o el nitrito (o ambos i a nitrógeno gaseoso (véase pro* tocoto 7-3) Se puede utilizar cl caldo de nitrato^ nitrito. eon un tubo de Durium invertido o un agar inclina Jo. Cbmo íos medios no contienen hidratos de caibono, cualquier gas que se forma deriva del nitrato i ule! nitrito, lu t|ue indica ena prueba de desnitrificación positiva. Es más fácil interpretar la prueba de caldo porque En recolección de burbujas de gas, habitualmente en las profundidades dei es tremo, indica un resultado positivo, La mayoría de Ioí medios desnitrificadorcs contienen tanto nitratos como nitritos. En raros easos íp. cj-. en tu iden­ tificación de ÁU-íiHgcncs Jm 'iüiis, que desnitrilica los nitritos pero no los nitratos), pueden eslai indicadas pruebas separadas de desnitrificación. Fruten medios combinados fluorescen­ cia -desu Ltrlfic aeión o Lluoreseenciadactosa-dcsnilrifícaciónl sin embariiu, las. reaecioncj pueden V a r ia r de las producidas en los medios recomendados por los CDC (véase liimina en culor 7-2 B>.

B Est igrma del d r . VaFbr Eso

300 C A PÍTULO 7 Bacilos grartinsgatlvas no le rmenia dores

Producción de indol En cl protocolo 1-4 se presemaii los principios básicos y cl pttKedi miento para Ij identificación de producción de indol. Pueden requerirse modificaciones menores cuando se detecta la producción de indol por ciertos. no fermentadores reactivos débiles, Puede Ser necesario un medio enriquecido que comiene triptófano. habitualmente caldo de infusión de corazón. Como algunos iun fermentadoref. forman sólo pequeñas canti­ dades de indol, puede ser útil lu extracción de los medios de cultivo formando capas con una pequeña cantidad de s lleno n cloroformo sohrc ta superficie. Se debe mct cuidadoso en agre­ gar sólo una pequeña cantidad de extractor porque incluso una dilución mínima puede disminuir la concentración de indo] p.+Vl Destaiboí ilación Ll método de M ullcr para dctcclar la dcscaiboxllación de un aminoácido (descrito en el capítulo 6i sC basa en Un Cambio Je! pl¡. Kl desarrollo íle un color violeta alcalino en cl medio de prueba. luego de la inoculación con el microorganismo de prue­ ba } la incubación a 35 DC Júrame 24 a 4Í5 horas, constituye un resultado positivo (víase protocolo 6-7). Muchos no fermenta­ dores muestran sólo una actividad débil de dt4CAirbc3*ilasa y pueden producir aminas insuficientes como para convertir el sistema indicador de pH. Este posible inconveniente del meto* do Je Mpller puede superarse utilizando sólo pequeña* canti­ dades de sustrato ¡1 a 2 mL) y un inóculo impon ante de micro­ organismos que ya han crecido y en el cual ya .se ha acumula­ do una alta concentración de enzimas. La sensibilidad de la i [elección lambién se aumenta si se cubre el medio de cultivo con 4 mm de vaselina. Es esencial m iliar controles Je sustra­ to sin imliiuáciduü, no inoculado^ para compara! las reaccio­ nes de color. La conversión inicial del medio a un color amari­ llo a medida que se acumulan ácidos a partir de la pequeña can­ tidad de glucosa en el medio no se observa con los tw lemienlaJotes; antes bien, las reaccione* de punto final se leen com­ parando las reacciones de color viólela alcalinas fuertes eon e! lime aíul verdoso más claro Je los controles (véase lámina en color 7‘2L>}. Los tubos deben incubarse a 35 °C hasta durante 5 días antes de inicipreiar la reacción como negativa. Otros sislemas que utili/an reactivo de Ninhyctrin como indicador pue­ den ¡ser mis sensibles para detectar actividad de desearboxil li­ sa porque el compuesto reacciona dircetamcnle con tai aminas para fomiar nn color violeta,

Hidrólisis de osenlina La hidrólisis de csculina .se utiliza principalmente como característica diferencial para distingair entre las tíos especies de Hn’wintiitnnna.‘¡ y algunas de las seudomonas de pigmento amarillo, 5e recomienda un medio de eseulina sin biEis para evaluar a le* no fermentadores. porque algunas especies de no fermentadores son inhibidas por la bilis. La cepa desconocida aislada se siembra eo agar inclinado-esculina y el cultivo se incuba a 35 “C durante 24 a JH horas tji eseulina en el medio

da fluorescencia cuando se observa con la lámpara de Yvood, Cuando la eseulina se bidnoliza, el medio vira a! nepo rojizo y la fluorescencia se pierde, lo que indica un remitido positivo de la prueba (véanse lámina en color 7-2É y protocolo 7-4). li aciones para llagelns Aunque no suele ser necesarias, las tinciones para flagelos en ocasiones *on útiles para identificar ciertos bacilos no Ter­ mentadores móviles, sobre todo cuando las reacciones bioquí­ micas son débiles o equívocas.

MÉTODO DE LEIFSDN Se pueden obtener resultados cotí Hables utilizando Ea técni­ ca de Unción de Leifson, descrita en cl protocolo 7-2, si se pres­ ta estríela atención a Jas consideraciones descritas en el retuadroT-l,1" MÉTODO OE RYU

También se recomienda el uso de ia tinción para flageEos de Eíyu, que es fácil de realizar y brinda buenos resultados..*ltLail El procedimiento pura este nraHcido se explica en et prutcvolo 1-2.

TÉCNICA DE PREPARACION HUMEDA

EHc-imbioolc y cois.-''" describieron et uso de la técnica Je la preparación húmeda de Mayfield e lnnis,MJ y la tinción de Ryu‘*+como uiicL forma rápida y simple de tinción de los fla­ gelos. En eme enfoque, las bacterios de pnjeba crecen en un medio no inhibidor Jurante 16 a 24 horas. Su prepara una sus­ pensión débilmente turbia toeando primero con un palillo api icadoro un alambre una colonia sobre la placa y luego tocando con una gota de agua un portaobjetos. Se coloca nn cubreobje­ tos sobre la gota y se examina el portaobjetos para delectar células móviles. Después de 5 a 10 minutos, o cuando alrede­ dor del 5Ü% Je las células están lijadas al portaobjetos o al cubreobjetos de * idrio. se aplican dos gotas de tincirtn de Ryu

Recuadro 7-1 Consideraciones cuando se prepara uno tinción do Loifscn I

ifcHrn Uaipiaf «C fU ftiliiíW W liC t 1^

fc .ta i dL-th;ii súi-

cint-vh'J"- en dicm iiialo ícmSo u-oleobul «LQku U ciJki cluriiM ncu c w 1 ccnfrudo 4l en aldvlwl al l?5'“ J dutaníf ? j J JhNI: itijílt 7n final hc ítíhc h x r r tnm cdiauiiKntc anlt^ del o «i entintawln k*tporlaotg d i» en Ui llama i/ u l de un m echan de Uun>«i 2. Las K ilut/Ljí deíicíi Jíet-er en lu cii.rJ¡,i.fc ü¡ji hidíju.^ Je t,ubüEn:i. Un p il Kajo [vrd e ¡nhi'Kir Ir fomuK«5ín de l«w FLqgeh» y cw iJípiBr ím n w in a tdda cu cl medie» piredr «er pCTjudK'FHl. íil pH de h solotiV i de line¿¿Wi ^ lÍcHc iniinLjrsc! tin ,“¡ l. m it allci*. I j I b j j i I r r L J S i L - l i i n s c r l c ñ i t l x v d u r in L c I;l í a n r ] | i j l i : I i : i i . ¡ i a i l i S ¡l i l c l

cpecimicnN». h^hijilirirDiv dtnWi de lat 24 n 4K linnn. l*ürtlí m?t suria Ij irxuhkiijn ¿ (empeíuíura sutlbiailc Jiin n u 2Aft4Hktura> |iaW p ri."i: i■■■'■ ■■r 4.'I d f ú i r i i l U i c i i f i i p k b ] J ¡! !

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B Est ignna del d r . VaFbr Eso

Microorgan ¡amns móviles con (lagelos polares 301

{descrita» en el protocolo 7*2) al borde del cubreobjetos y se deja fluir bajo et cubreobjetos por acción capilar. Se examinan las célula» pairo detectar la presencia de flagelos después
ese criterio, es posible agrupar a Im no termentadores, de importancia médica comu so muestra en cl recuadro 7-2,

Microvqjanismos móviles con flagelos polares PsEuíomonadalss

los fla b elo s

E l numero y la disposición de los flagelos sobre lu célula bacteriana pueden ser un auxiliar en la idenliJIcacitin de las especies. Se pueden observar les siguientes tipos de flageles según su disposición: » Polares. * Míonutríera: flagclu único en tul pulo nei) atllbúk * Multí tríeos: dos o más flagelos en uno o arabos polos, * Subpolares: flagelos cerca del polo eon base de los flagelos en ángulo necio con el eje mayor, * Laterales: flagelos que se proyectan desde el centro de la célula bacteriana. * Peritricos: (tácelos dispuestos al azar alrededor de Sa célula. Ert Ja ligara 7-3 se muestran bacterias representativas teñidas con tinciones para lisíelos,

P A R T Í Ií: TAXONOMÍA, CARACTERÍSTICAS BIOQUIM ICAS E IMPORTANCIA CLÍNICA D E GENEROS DE NO FERMENTADORES RELEVANTES EN MEDICINA

En el espacio disponible aquí es posible pmptiieinnar sólo un, resumen de Sos no termentadores de importancia médica. Se pueden consultar vana s referencias para obtener una explica­ ción mis exhaustiva <jc las caracierísiicas de identificación y 1m síndromes clínicos causados por este grupo de microorganismos.i44;y’,H1' liíJul-tl^ ^ 1^ Á diferencia de los enlerobaclerias, los bacilos gramnegativos nts termentadores no se ajustan convenientemente a una sola familia de géneros bien caracterizados y la ubicación taxo­ nómica correcta de muchos bacilos gramnegativos no fennentadores no se ira resuelto todavía. En consecuencia» el estudio de los no fermcnladorcs suele ser confuso para el microbiólo­ go que se inicia. Los principales géneros, de bacilos gramncau­ tivos no termentadores han sido clasificados por lo menos en 15 familias que abarcan Aiacaligenaceae (Alcaligenes. Achntmubacítr. Eurdeltlla, Ofigelict), Altemnio/tadacctie (Aiiihew aiittla, Shtnmneilú), Brut-cHticertr ^Ochrvbactrum^ Bu r kholdtriaccti? {Butkkoldrfia, Cupriavidus, Pandorata* Ralsto* «Kijl, Cavfabptriemcfw (Brevundimonat). C'tnmwmmfm'efie fCimümtmtM, ¿cídm oñit. D iljtiu i. Fiam baatm eeat iFtomImnerium, BwneytUii. Chrvm m haetm m i. Empedobaaer. MytiAdts, Weckaeilti), M eihylvOacKtiacea? (Mcihytobücíe~ ritiltl. RúSemnefttat:}, Mnruxeliaceac (hhimxeíla, Arhtelahacter, Psychmbacier), OceanosptríUaeeae (Batnealrix), Pseudomaumita Víic | Ps*iultMuMa.tJ. Rhizohiticrue fuum, AgrvhtíLteriitítt}, $ph("ni?obuctetiucea r (Sphim;t)¡.nuiirrsuiri Fedokaclrr), Sphingomonodaceae {Sphingomanas) y Ximíhümmmdaceae i$tenoímphnnwnm)}} ’ Además, enixteo algunos no termentadores de importancia clínica que no han sido asigna­ dos a¿n a ninguna fam ilia y cuya posición taxonómica es incierta. Un enfoque del estudio de los no termentadores es agruparlos sobre la base de la presencia o la ausencia de motilidad y el Upo de flagelo presente en las cepas que son inmóviles, Con

E l género Psctulmnomm y aljum » género* estrechamente relacionados, muchos de los cuales se ubicaban antes en cl género Pmtdom&nos, constituyen un grupo que a menudo se denomina pseudomonadales. Los miembros de este grupo comparlen las caracEcristicas de ser bacilos grartinegativos rec­ ios o ligeramente Cuinos que son aerobios estrictos; la mayoría de lu* cepas son móviles por medio de uno o más flagelos pola­ res; utilizan glucosa y oíros hidratos de carbono en forma oxídativa; y suelen ser ctlocromo oxidasa positivos, Las caraeterísiicas diferenciales claves del grupo d¡e pscudomonadales se describen ces el cuadro 7-3. Fallcroni'*'1separó los pseudomonadales en cinco pispos por homología de RNA ribosómieo sobre la base de los esludios de ¡homología de rRNA-DNA, Gxlaidi, por nim parte, los tsepstró en siete grupos principales de acuerdo con las características fenotípicas: fluorescentes, siuUeri, alcaligenes,pseudomaHei4acidovor«ins, íacilis-dclafiddii y dimi ñuta,15,11En el recuadro 7-3 se presenta un esquema actualizado que combina ulgujias de las características de la clasificación genotipica y fenotípica. Familia P$$vdinnQtwi3ctM GÉNERO FSEUDOMBNAS -GRUPO rftMA 1 Aunque Ea mayoría de los, pscudorronadalcs fueron cla&jtlcados al principio en el género Pxeudotnúnas* ahora te sabe que cada uno de los cinco grupos rRNA representa grupos genéticos taxonómicamente distintos y, en consecuencia, ^ 'han asignado diferentes nombres de género a cada uno, Sólo los miembros del grupo rRNA I retienen ia designación de genero de Pscudamoms, Grupo M onsanto Todas las especies dentro de este grupo se caracterizan por la producción de un pigmento píoverdiita hidrosuluble que da fluorescencia blanca a verde a/vlada bajti lu¿ ultravioleta de longitud de onda larga (400 run). La pro­ ducción de pipem os fluorescentes aumenta sobre todo en los medios con alia concentración de fosfate.™ Aunque los tres miembros de este grupo producen pioverdina, sólo una especie, H aeruginosa, produce cl pigmento hidrosolublc azul definido piocianjrc» I,véase lámina en color 7-10). Las características bioquímicas claves, que separan a los miembro* del grupo fluo­ rescente se presentan en el cuadro 7-4, PmHÍf*WiM£H fítm ginfl,w produce un aspeclo earactcríslico •cuando crece en una platea de agar sangre. Aparece como gran­ ates colonias grises con una periferia en expansión y muesBra IV hemólisis. Las colonias a menudo tienen aspecto de piel de cai­ mán y muestren un brillo metálico (lámina cu color 7-2F). Se puede baeer una identificación rápida de P. uerugirwm en cul­ tivo Mernpre que se observen las siguientes características; una morfología típica de las colonias (Minina cu color 7-2F}. pn> ducción de pigmentos difusibles í Idmi na en color 7-2G). olor a freía y positividad de oxidasa (recuadro 7-4).íS' En ocasiones» hemos observado cepas que producen un olor picante a “p la ­ tas podridas". Existe- al menos una comunicación de un brote hospitalario causado por cepas de P. üerugiftüSü maloliente,11" P. tie n ig in o m es el pseudomonadal que se aísla Con más fre­ cuencia en muestras clínicas. La infección por P. u c n ig im js a prevalece especialmente en los pacientes con quemaduras.

B Est igma del d r . VaFbr Eso

302 CAPÍTULO 7 Bacilos gramnegativos na fermafiadores

R C C D 3 d f3 7 - 2

Mu t e r m e n t a d o r e s d a i m p o r t a n c i a m ó d i c a

M óviles cara 1lat¡n!üs polares.

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Gíisírn CttptiüviJiu ílh-rwm/

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Íibrií'ii'i quÉü[¡C¡i. Icucania aguija, l^ispljntcs tfc ór^antus y wJicciún l1 JrtifeíLW intruviiniiíii^^' Las inrecciímcs suüEüji ixjuiTir en cualquier üth* donde licndc a acuinukirsc lm Kumcdatl: [r¿iqucústomía;,, cíttóEtíreíd pcrmjini;iiTes4 quemaduras,. el oído exfemo (“ oído de nad.idor” .) y heridas culáneas rezumsintcs. L.a exudación de pus. a?Lila(ld, enn olor ^innlur & \w& «vas pnr h de EntK'iailinii, es CariCItríStiOl, P. H etitR iitíuti Eüihtúá] piuvLJua iitLc-Lk:ii>iK.-s de iai vía.s urmüriL^ y la^ vías respira­ torio aüíasL cílas ultimas pueden ser graves c ineliLHO iwtcTictnl cncTili: [muíales en ten huespedes inmúnodiíprituidos. lil mieroorganjsino lanihien puede causar infecciones, devastadoras del tfjo. La queratitis», la infceciún de úlcera'* comcanus y Ea cruioflaliuitis por pseuJomonas dehen abordarse eomo íjnicrgcííeiuü inédÍLas que pueden ser fulminantes v pru^oeur la pérdida jX¡[m-inente de Ifl visión. Se presentan con írecnencia repulir en 3;l

literatura especial izada casos de endocarditis* meningitkH¿b^eseso enceídlicn e infecciones de hue?,os y ¡Litieulaciohes (Hif la propupaci™ lierrmiúgena.rtU La mayoría de los ejsoí de enikieandilis requieren un reemplazo valvular porque es diffcii e rra ­ dicar h inl'eceión.6" fc^tán hien deseritos los tvroteíi de demia* lilt^ y oEíiis externa pínr P a e n ig itiü s a asociados con el u-so de pisCiflító y bpfléíi¿¡> eylienies. I.ess C D C e que ucuniccun entre 1997 y 19911,p También .se han eí3munie.-idn infecciones esporádicas por P. a e n i$ m a s a iuegode la perforación de las orejas.111 P. íieruginma produce varias sustaticias que se cree que aumentan la colon i/avión y la infección del tejido del hués­ ped-'1 '' Esta*» sustancias, junto eon disiinto'- fac^iTes de viiuleneia. enire ellos, lipopolisaeárido (I.PS>Lexotoxi na A. Lueocádinu, fanpci exEraee IllIllt, prutcjisus. Rwfulipasa >' otrin diversas

B Est ignna del d r . VaFbr Eso

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B Est igma del d r . VaFbr Eso

304

CAPÍTULO 7 Bacilos gramrepüves na feerniniaflpies

R í cu adro 7-3

G&iasificación tonetiptea do p seu d o m o n a d a les (b a cilo s no faím -a n tad o re sco n Hagelos

polares) Grupa KfJAi

Onifun iluÉKv^T-ir í ' ^ Mrl' i.v i.x f if v Ul í ’B í J f i . i .fi-

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t jnifHi DiniliniMiP fírfvumi^nfviiu .íi -i i, u,) ibi'i wttíjffiuntti Miictdum Grupo rRNA V S í m H ftip fM ^ n itT l.1

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\hshewai\cHti ftuún liitii if.'ji i.-L/.h ■■i nui f j frnspí' 34Íc nn h-m m tiJivrK iulufílim n tic k»i CDC

enemas (recuadra 7-5), convienen a f* afniginaso en la bacte­ ria líl* mayor importancia clínica entre los bacilíw grainnegativos no fermenladores. Se recupera con frecuencia un rtiorfuti}.Ki mticciidc inusual d í 11 afnigifiosu de las scereeioncs respingo­ nas de pacientes con íibrosis quJ'stica que tienen infecciones trónicas por R aeruginasa (véase lámina en color 1-1H), Bl rnorfniipo mucoide se debe a la producción Je grande* canti­ dades de un poliiücirido idenominado al^ínaio) que rodea a Lj célula, el cual es responsable del mal pronóstico y de las alias tasa* de mortalidad en k>& pacientes enn fjbmsi'; quí^ika. Existfn fívií,¡onK e^íen^as de eme !ema.í1Mítfiili E l trotamíenio de la?* infecciune* pt>F P, a t ruginosa puede s»er difícil. Uri cspL-eln? relailvamentc eslnccho de antibiótico es eficaz e incluye tas carbo^j penicilinas (caj borne dina, tiearcili' naj, las tije irfopcniciJ irtos (meílocdina, piperjcilina), las cef«losporinaü anliseudomómcaü (celiaíidim a)r ios monobaciámitus íazlreunaiuK lOis taibapenáitiiUiM (imipencm. mcrtipenemK llS quiruilüiuí, (tipittFIuxacina, IcVEijloxaeinj) y los ominu^Tjcósidos (gentamicinaH tobramicina, amikacina). Casi íodas Jas cepas son resistentes a otras penicilinas y a ccfalosporinas. incluida ampicilina, cefuniauma J tcftHáXima,^ '^ 1 fl aemginirxu piiLvle pijrtür pUsntidos de niullinresialenda y csla CiiraCteríslica íu conducido a 9a LLparicidn de ulgunas cepasi re«islen> tes ,i todos los. antibiólieois cfieaccs,4'" P. flu a r rs c p n .’; y P. p u tid a aparecen en el ajina y el suelo y pueden existir en fuentes acuosas en el ambiente hospitalario, Ambos pueden existir como Mora laríngea normal y son paJiV genos oportuniHai raros en k«i stres humimos. Se ha comuni­ cado que P. p u f id a pmdycc sepsis rctacionada con eíJtélercs en pacientes con cánceria,wsy anriiis siíptica.44*^ 1Ambas especies Kan sido uSOCijidas Cftn h^'ieneniijL p úiiiea fuente de earbtjrltj para obtener ejiergfa. En el cuadro 7-5 se describen Jas carac' tcTÍRÜcas Ljue diferencian a lus miembros de este gntpflh P. \tittzeri (antes grupo Vb-] de Ioí C f)C ) es ubicuo en el vuelo y eJ agua y h¡a sido recuperado ds humus, estiércol, paja, aguas cloacales, agua estancada, fórmulas p^ra lactantes, equipumiento hospicalajio, cosm¿tico& para ojo.s y distintas tnue¿trasclínicas,^1-1^ 111Sólo pocas veces se ha asneiadn con infec­ ciones. como otiiis media/-1■conjutKiviiit,^ neumonía atiricia séptica.endocarditis.*” meningitis en un paciente H IV positivo,*11infecciones de injertos vapulares sintéticos+3íia infecciones de heridas traumáticas^1,1" y osteomielitis vertebrd.611' Es sensible a la mayoría de los amibióiicoí. Las colo­ nias rceicn aisladas ¡sou adhercntcs y tienen un aspecto rugoso Laraeierií,(iesí (véa-se lámina en color 7*3A l que se puede per­ der deipues del subcultivo repttidy en el Laboniforíor /í ,ífvtz?ft comprende un ci^njunCd heEerugencí} de cepas que incluye a) menos JO grupos genómicos sin una condición laxonómica denominados genomovarieílades.LWjíllM5At?fit7 Sin embargo, los genomovariedades xitítzerí se caracterizan por un alio nivel de heterogeneidad de las propiedades fcnolípicas, que no permite dividir Los üasones en diferentes cspccics/v l a Sólo

B Est igma del d r . VaFbr Eso

Microorganismos móviles con flagelos polares 305

Cuadro 7-4 Cam tcr£ilkB$ vím-cs dri PRUEBA

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una de lai genumovariedades descritas de fl JituTzeri ha sido recias¡ficMs. y publicada oon validen, cutiu» la nueva especie Pstudomoiias baíearica.™ No se ha comunicado aún cl aisla­ miento clínico de P. beltranea en huiíiunui. H mendocina (antes grupo Vl>2 de los CDC) y ta especie sin nombre 3 de los C tX ’ pocas veces se aíslan de mue^ras clínicas. Las colonia de h nieruiochui son lisas y lierifCrt cl aspcclo y Eli ctrnsislcmijai de ]j manteca. Se lia comuni­ cado un caso de cada una de endocarditis de válvula mitra! en iin pacicnle con reemplazo de válvula aoitica:i y endocarditis tfe váfvtil.:t mcúspide en un paeieme e«n un defecto cardiaco eongénlto,3*17Líls cepas del grupo Vb-3 de los CDC se a-seirieÍlui a P, siutzen salvo cu que son argintna positivos, Potvliege y co is.1" ' tiaji cumunicjJu un d j -h» de .septicemia por Vrb-J en un raíicntc con míe loma múltiple. Grupa Akallgcngs. Lus micimíTEanisTnris deí gTupo Alealigencs se caracterizan por ser asacanolfrieos, o srtlo débilmente saeamlítieos en el medio de glucosa O ft L q í miembros de este grupo son R alcalig etifí, P pseudotiL'tiligeTtes y especies de Psettdompiins del grupn I de los CDC. Las últimas especies sin nombre son iimilares a P. ¿ ír t U jín t íHsalvo en que las cepas lie especies de P.teudomonas del grupo I reducen lanío nilniEo cuino nitrito a £as,iS3 En el t o J ih 7-6 se detallan las earatle-

Hectiadrci 7-4

rfslicas; que dil'erencktn este grupt^ de tura^ pseiidumonas alealina\ similaresr Aunque Eljs miembros de este gnipü se recupe­ ran de jnuestras clínicas, sóto se ha comunicado pocas veces su L iip a c id n d p.Lru j c t u a r £ ú n iú patÓL[L,ni.5s llu m u n ú S . Hubti irtfO r-

FUcuaúro 7-5 "actores de vlrulonela ds Psmidomonw Boruglnosa Kartflr (Ir *|ruki>cla AIí i I'mC.i

Ai'IÍV ¡il.líl iiltuji^kTA PnligacjrultSuíapHLtüríiiit jvnjisrí .i ii^v hMLiítkáhjAÍlK'LuUúi ;ii Ihcritst! il Lu df l.i' LéliJBa cpilirliutcs ihilakiíiuj^i y ti-TrniU hiflfdtíulai que. j kiníí. pr<MC¿en ¡i tus hin:;¿rliLvík kn jMihhnúins} cl sislema imhuric ikrl LUrtpo.

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ApínJkc^ J l superficie l|Uí pcniuicji IdadJicccrdd lÍl'3 tlLiCtuur^aiúutiu j lu». nx'cptuffch Jet .'iii jl¡Nw,iilih f ¡\L EMibru Luí -i:p. tiÍlsl's dr U% rtlujíh dul hut^jwr.

S'L-i.:r,iqriinidj‘;ú

Elimini lo* miduM de tetto ^iilkfp de Im ttwífihxí^ Jl'I iJiiit'lii ' iJi' Ci-VI-!, tu l|ij? É;bCiL¡lu Li tUUibrL lIl h3b (Hit.

Ijpapoílniiandíp

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Ili^Clixih i A

EJí'-lnicn.ain fiMilnr, inti:hk'iíVi lu. sin1«iv pniiífe-n, ínii.-r^inipi' la adiviüml ttluhr >ln reífucstu dt V>\reucniEAgos-

tn1fTDlí>\LTia

tnlemnirí Ij jLliviiiad g-i^roinltMiaat nnmiat y pnjvftjj Jijiiej. rnhiSir i ,-i'nfi."i-it fknmi ye la nreaint>niíij ?iinpl»Mn tiicn; dcsuujc lu vu^tnReia irMiMikjmvj pulithwm. ánaciiva Lln0|i:-.LHUn.L..

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me* de P. alcatígencs que producen infccekmcs oculares, empiema y un caso de endocarditis mortal.1%'

Grupa m u ptgnjtnfo anwtlío Pjeudomoias lujóla. Esta especie ha sido conocida untes como CfimmtibüelcHum lyphiflüvutn, grupo Ve-1 de los CDC, Psi-udm w w u iutcofa, Psmthnuwas polytricha y Chryscomotuu tutéala.3*' La ubicación uxAnómica kít iüsoLviA en IW 7 cuan" do la especie fue ubícala nuevamente en el género Pseutitmanas.'* F. tuteóla es móvil por medio de flagelo* pola* res nwlblñcos. es uxidusa negativo, creoc tanto en medio de agar Je MacCcnkey como en agaí sanare; y prixluce colonias con pigmentación amarilla qué a menudo son rugosas y adberentes at agar {víase lámina en color 7-3B). La* «fcracterfMicas bioquímicas que diferencian P, tuteofa de otros pseudortwnadalcs con pigmento amarillo se describen en el euadru 7-1L Es una cepa clínica rara y ha sido aislada de distintas muestras clí* tucos. como muestras de heridas;, cuello uterina, urina y farin­ ge.250Las cepas recuperadas, de muestras clínicas en el University of Illinois. Hospital lian sido nieladas en cónica, esputo, miembros inferiores, cavidad endomelrial y ¡sangre. A menudo se aísla con otros, microorganismos y se juzga que no tiene importancia clínica. En un estudio, sólo se hallaron 14 cepas Je P. Uifeota entre 565 aislamientos clínicos cte no fermentadores en un período de dos años/" Las- comunicaciones de infcocio nes grave* producidas por P- lutraia incluyen bacicriemia cnJocarditisr^s m e n in g itis ,u lc e ra ­ ción de Lis piernas*™ osteomielitis™ y peritonÍt¡s.,4t,* B PHUtfomons or/illiabílans. Este microorganismo ha sitio des­ crito ¿1rites eOiitt? Cft*toiti4thai;trtiiim typhljlavum, Pstt-ti!ntnmuis or?$Íhabitam, pupo Ve-2 de los CDC y Fíavíinonns oiyzihuIritimsr,Ji La ubicación taxonómica se resolvM en 1997 cuando las especies fueron ubicadas nuevamente en el género Psettiiomoneis.u P otyzihabiians tiene características similares a Chryseofíwnta lulettla ya que estos microorganismos tam­ bién son móviles y m iikta nugaliitis y fonniin colonia cun pigmentación amarilla en agar sanpe. Al igual que P lateóla, las colonias de P. atysiltahitans son rugosas. Ene miemorganismo puede \cr diferenciado de R tutéala por las reacciones negativas para hidrólisis csculínay urtonitrofeoil-[J-lL>-gakclo-

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piranósido ÍO KPGl y la característica de tener un solo flagelo polar- En el cuadro 7.| | señalan otras características diferencíales. P úfyzihabitártí- también ha siJo aislado en distinto1 * sitios clínicos,, como heridas» esputo, oído, ojo, orina, líquido periluflcaJ. equipamiento para terapia inhalatona y sanM/b recientemente, h i infcocioucs por este microorganismo se han relacionado con la presencia de uu catéter intramuscular en pacientes inmuiKidtpriniidofl.^1 *1^ 1 En el Universiiy of Illinois Hospital, se to aisló en esputo, orina» secreción prosidilea, piel y sangre. También parece ser un pató­ geno emergente en 3aperitonitis relacionada con la diálisis peri loncid ambiil lU-nria zonlinua, con varios casos recién publica dos.*J,,lllJ12*,2: Otros factores predisponentes para las infeccio­ nes pítr P, nry'zihahitam Son los Catéteres intravascularcn per­ manentes, los injertos artificiales, cl abuso dé drogas intraveno­ sas. el traumatismo de cráneo grire que requiere einugía y cl trasplante de médula ósea’1b Familia Btiri¡ftn!i¡5müeae grupo ia n a i

E l grupo rRNA II cw fcie en tmcEOt»t¥anLsti»« ubicados en Jos géneros BurtJwfdc/iitJ1**1*2* Ratstortiti,*2* íh rtthm ia111y Cupria\idu$íi3a y denominadme en e! pasado grepo Pm idom alM . Todas las especies de este grupo se separan con facilidad de oíros pupos de pseudnmunadaJcs por la propiedad de mostrar re^is* tcncia al pupo de an'jbiétsesM de polünsxma (polimíxina B y cotislini). En los cuaditK 7-7,7-8 y 7-9 se desenlien las caracte­ rísticas bioquímicas utilizadas para disting uir a los miembros de este grupo* el cuati comprende muchas especies, algunas asocia­ da1' tOfl planta^. Oii este libro sólo se incluyen las asociadas con enfermedad humana. Du& de las especies patogénicas, #, pseutlvmallei y B. mulieü son mencionadas como agentes de amella­ ra tiimlógica categoría R por el Grupo de Trabajo de Planifica­ ción Estratégica de los CDC debido a su disponibilidad y poten­ cial para ocasionar enfermeitades con alta morb¡mortalidad.K 1 DÉNtftÜ BUMHÜLDERfA -GRUPO PSEUDOMALLEf R, mallei es un parásito estricto de los animales (fundamen­ talmente rabal los. molas y burros} que una infección del aparato respiratorio conocida cumn muermo. La forma aguda

B Est ignna del d r . VaFbr Eso

Micnooíganismos móviles con flagelos polares 307

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308- CAPITULO 7 Bacilos girampeganvos no Icrrosntadnres

Cuadro 7-7 Car»cltrblk»s eluvio de Burkhvktcrvi maSci. B. pscudormltei y ñ stítizrri PRUEBA ÜxidasíL

\1i.HfI ilIji J CtacirtLiciilu en ¡j^ jj de ninK-^u o f MíiUt^a OíLaclLH>4 OF MíniH)! OF Hrt!iiceióm é t MO NO ¿ ‘jj.-. Arijiiupa IjMJrta tlk W JjjiS l|« ál'FlUtfrl F*'..■ t; iLii ^íji .l Ij

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ilc Tía enfermedad puede mular a un caballo en un por de sema* ñas. En raros cdsoí, sc puede transmitir a íos seres humanos, habí malmente a través tic una uhruión de ln pie[.Tfti lin 2ÜUÜ ocurrió un caso de muermo adquirido en el laboratorio lig El muermo comparte eon el carbunco y con la pesie la “ dftiineiún" de su uso en 3a guerra. Existe documentación de que B. tw ltei fue Ml.iliftadu cothO agente para la guerra biológica ért ia Primera Guerra Mundial.1 ft mnilci es un pequeño cooobaciloftamnepiiiivo. En. agar sangre dé camero aparece como colo­ nia* translúcidas grísea y lisa* en 2 día^ sin ningún pigmento ■ti color característico. Es» la litiica especie inmóvil ene] g¿Mro. En eí cuadro 7-1 se preescnlan oirás características diferen­ ciales. Brpxeurfnmaflei eausa la melioidosis. una enfermedad simi­ lar al muermo en ios animales y los. seres humanos (recuadro 7-6). A partir de los resultados de rRNA y DNA-DNA obteni­ dos por Yatonichi y cois, es evidente que i?. m //rí y B. pxrudomaltei pertenecen a urna única genomoespocic, pero se ha propuesto mantener esias dos especies separadas por miones epidemiológicas y zoonóiiea.s.HJ:'i' B. p\finííHíiatle¿ c k c í bien en medios, üe laboratorio estándares y a menudo produce colonias rugosas, y, por lo tanto, ptiede ser morfológicamente semejante a ñ stutzeri* El microorganismo tiene un nicho ecológico y cxiüie en et sudo y en el agua estancada en un área de latitudes 20“ al norte y al sur det Ecuador, fundamentalmente en Tai taridia, Víetnam y partes del norte de Australia.15i,wt Algunos informes recientes confirman, que es endémico en China, Taiwán y Laos, pero se desconoce la verdadera inciden* cía en la mayoría de los países,’*1-^ Se han comunicado muy pocos casos de melioidosis en el smbconlinente de la India, a pesar de las similitudes en las condiciones ambientales con los países del sudeste asiático., aunque en 1999 sc comunico un caso de absceso encefálico y pulmonar par melinidosi.s despufis de un viaje a Sri Lanka.371 La mayoría de las infecciones mu asintomáticas o seprevenían como una enfermedad gripal autolimilíula y liruv^ que .sólo se puede diagnosticar mediante u ro ­ logía.’1Sc calcula que miles de miembros del personal militar de los Estados Unidos se infectaron por B, pseudamañii clksis-

dti cumplían servicio en cl sudeste asiático en las década* de IW ) y 1970. Algunos esludios scrológicos han puesto en evi­ dencia límlus positivos- para este luicioorgunismo en el! L-9% de los soldados de los Estados Unidos que regresaron de Vietnam.'11-*171® Por lo tanto, si sc estima en unos 3 millones el personal militar que sirvió en Vietnam desde 1965 hasta 1973. 250 000 pueden habema: infecundo con fl. pzrwiiiTwiB ti.m Una característica importante de esta enfermedad es su capacidad para producir una infección latente que se puede reactivar muchos añm después de la exposición pninana. Por esta razón, la melioidosls ha sido apodada la "Pamba de tiem­ po vietnamita" porque es posible que aun ía enfermedad se este incubando en ins veterana norteamericanos del connieto de Vtemam.^’ *1-1 Las infecciones sc adquieren por cl contacto con ci microor­ ganismo ya sea por inhalación de polvo o por contacto directo a través de lesiones en la piel. Se des^iibieron tres Jornias de melioidosis' I } enfermedad aguda, que se presenta como septi­ cemia con lesiones met&stás-icas; 2) enfermedad seiniaguda. i|Lte se presenta como una neumonía similar a la tuberculosis con edub» b y líufangitis y 3) enfermedad crónica, i[ue se pre­ senta como una celulitis crónica localizada (recuadro 7-6). Existe una eomunicaeión de linfadenitis y mediastinilis por B. pspudfmtíttei en un paciente con enfermedad franulomalosa c ró n ic a ,S c ha demostrado que la diabetes mdlitus es un fac­ tor de riesgo para d desarrollo de melioidosis bacteriémiea. lis impon ame iraiar los casos sospechosos con antibióticos anles de cualquier tTaCamienin de los paciente?;, «uno lesione^ que drenan, pata evitar la sepsis, i^a mortalidad es del 95% en los pacientes con enfermedad aguda i|ue no son tratados. B, putítdttmüíki es intrínsecamente re sisteme a muchos antibióti­ cos, entre dlosTpenicilinas, ecfalospoHniu de primera y según» da generación, macrólidos, «famicinas. colistina y aminoglucífeidía,1^1** En generJl, es sensible a doranfenicol, te|raeiclinas. iritiictoprim'SulfamctdKazül. ureidopenicilinas, cefalo^porinus de lencera generación, carbapenémicos e (inusual parta una {teeudomona) amoxic Llitua*clavulanato.11"1-*” Las tluoroquinalonas tienen sólo actividad débil y han resultado muy d e »

B Est igma del d r . VaFbr Eso

Micrcorganismos móviles con flagelos polares 309

Recua dio 7-6 Epidem iología, maq nóstico,

la m eN oittójis | Burk!\ofder\a paemtomiUtefk

m iento, p revtmtsnn e inform e

Epi d cfnialoq i-3

* Ui n~l iiMihi-. L-siiíii mÍCTrnct-L-KÍ fn.lc(3-'iN'j (r'flL'.nii ¡hn |a fah.kn.1 JJij.-^:>/.JVj ..; ■ Mr.',-v.*i,j/¡f: *

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* L u Hicirniit *|w cjipimi flMtbldihi't >f íflrtitiHtdín

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* /jifrjváiir f>i/JfiNitiáir‘. cíLi fijjfrtadc 3a ¡>u<x1é pffltfuíif un fu-idin ¿Urtieci de hrn>.|uili!> Je^e j neunwní» grave, En lus«»u» lípian-el takiu de 1: 1.!■.11-11 I-■ ¡iuI 1■■ ■ !•. ■*c a.- 1 |i .1' 1 jv t hohic jllu cvlakj, rv-. w >.!•' >i m i 1 I. - 'i ■ ■1 ■ ■ i I .1 ■ ! ¡’ 1 r_.i.M r ■-i-...r," pfrn unj ii,v, n-; ¡ im.1i. Ij'. _l 1f pftxJw.iHü kT.111 c^]!urii íh ■ >i ii. .! t!i f l v :' l'.i Je tílU ÍLiínia A ' tijcihiiJc^ !’ k fn jtc t úVt tig m ití iíc t U irrrw Sc c in u liiio ri& l llBpM.'icoLílf coa thlrrukrd.id Mjh>nrmEe i'ulru ElIV. ÍDMllirinncia rcnul y Jijb c lt i u n ofc<£Ladnk p T rktp tipa nk Ja eníemiedid. que m icIí produrii shcclt i¿[K¡n>. E n g enm l. I* t mni¡raiU!i diíkuliad rcüpiciMuna, Lvfaíca miubsí» íV¿ht’, d q m le^isxi^ cuiáiiiMs H ctik tk [m v Jc Jitc m cscuLiral tqrtn j- JcM trifntadfm . ELrv l-r^ tuso» ij'fKXH b u in fe ít'tó n tk curtí durrcirfn y Loa jh sccsra a «xusrm ijn su rudu r l ak rp a. ■In fg L iiá n tv ftiiiu iiii iviiurjnr: Li D»bui«kHLi «ránica es uiu ijiÍlv lil'h que alcLia Int i'irj^iMin Je l «ucq^K. quí en IfpictX IIKlu>vn arljcvIucUnke».

1WL-ras. jjAiielHU liíiÉali.-iis, 1‘IL‘I t-nrríalíX hi^JtdOi IMlmAn. |nift«#i y l-ki/M • LJ ^>clLudu de jaLii|,,iii.ji>¡i L!KDLfH.i cIJlíc Ij rji|^>Hi.iiiji \ la aFMi:mL'uh dr '.InCL'.miri i. tiiiLí.ii'-.i eili IiíhU tarikir^ nftirt

definid! i w n rla n Jjil, [W1S pUCÁ 1 i'Ol.iT tkí'Oe 1 dídN

P ru e iijs Cr lalKiolDrLD *

Sk‘ ¡lu c d R I «h I'h'H -H m ic iW f ii'f lit K ii.A y w iip m c kV ir %'íTiif' (*Cl|iirñ*'". h ¡ u ih 'i u r jm n e s a b v i^ en l.i Iiik h m i ifu C lram iE ík c U « le 'ü n c w tn f r ^ s p tra ti« rú i n n i.n j1

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* S í punle iiivlnr JhpAwj'A'riti p.w iaitw htlln j :111 u>.: pin■ . ru B tl» la.-, b arteru j en la landre uiu Eitn ■nncdii-> J j tTLa.|pj¿iL^ii.

T^umJenJo lecomcniradc • E b I ii» iníwriuiie». nguiLib « crónica. «■muuiMitiiíii la adinijiiH íJti^i putnlerál Je iii:i(H;trtiü o i-üiia/idiiim duuaLe 2-4 íciitdiUh sr^uidj -ikl I|U u»)ii.-i Mí > ■mil íw h jiqnxkíEiiu-chnilnqian o mn m nNnarióii dc^ m iñ ElliiJ y trinKHoprirri niKanh'iMuniil tkiaiHe J * lil traíanj|aiái.íik-l«tí jn U Li'u icir.prani■lu lI c u w iV l¡* tfíilmn.^Ul. ,\iíi|t¡m' l.i ialcdeídii Je l níicnle ciieul^dtH) t-w meliddoMSr,iftl'-u« r nwitaJ, h»

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* Se lian Jocm tKD tBja i rifo; rja 115 i adqui rijan rn d k(KTAt>«in. En am^kiHcs 4k jiM SIUKUKk Ib bjludLd uso de ptecjix'tcnej o.niiutiís ju j j Id ituiaijüsik« f ’ii dr '.in i'w \ tíquílos corpcmle'- pitmk rviLir U -ransmisitiii • Tim Iu Lb ttmeiLrjli de hb |xiLÍcnin. y Jin riilliu n licbcn eIuui¡|1 q[ji4Jcj^ uliu el um» ik y «41 i¿rt |BiibMlric J:' hii-kít^UJldad. L d i plix jn dílkfll w r ccrm ilK -Mfi riraa cuuuJn ícm iníiahüibk. ''¡ispiKKcAn" d i pLi^it Ljik- esfltfeHM tí. / írrv é n rm rlftr » F^ügrrma y d íh? e iiia n ; ■ Tinkh toh |VN.bl*'-. c jiíh í. de melf.nii.iMS Je lv u LiifuriEiaíse a Edh julurklaiks Miair^fLas

fin is lb d r t a i ( W

iJir/i-rfUoi-ta r*A- jynMritífliAtHmfr'titf.i i- in i.^ u h t* S iiv t.ji Ajwif v b«VMHlnnaii .W jr n / c i Afir n y u ií y ■

kntadom; ert Jos cns-ayos clínicos.’1" 11 L^lc perfil iuilibiólico aiíptCüíti JiíCir, rtíiiLcnrc :l ytn tumici na y coünEina. vscrmihle a amoiivilina-cEavulunalo) en un bacilo ^tamne^ativís osiitusa Emshílívíi ts üEil pau «mllmiEtr h ídcjitificacSón dc fí. p se u d a wj^HcL tn cl lübtjfalone? Je microbiologfa,1^ La ccñazidima hu sido el tralamictito di? elección pjja !¿ mcMmdúWi grave, peru [□ rcspucKia ;l| EnLtamienlc» parenle-ral en alln lenta,*0 Se 3i4L denimirado que los antibióticos carlwptiflírnico¡, son

« « un «iric-rvirM i.YwA-t

muy úctrt'ús tifnLrLi fi. p.\e¡idt»nal!?i Ln vitnci1" ' y cu un estu­ dio se mostró que el tmipcnein solo erj un iratamiento eric^í pjni l;i melimdoüiü y^Lvc aguda, y condtijn 3 menn^ fallas de tratam ¡finio que la cefti7idima En oiro estudio, t] w o de tej'apLi combinada con ccropdna^ona-^uIhacEani más trijtn[[jprim-.sulfomtlüiaztfl a gcítaiidima más trinjctopriin-iutra' metoxazol pareció w r igualmente eficaz pao el tn iL im v fin to Uc ki rncHniücftis gmvc,l3t

B Est ignna del d r . VaFbr Eso

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CAPÍTULO 7

Bacilos gramnepafivos nn fermentadores

E l diagnóstico definitivo de Ij mclioidosis, que lia sido de­ nominada lo pan imitadora4*, depende del aislamiento y la identificación de B. pstiídtmurilei de muestras clínicas. Et microorganismo crece fácilmente en la mayaría de tos medios habituales de laboralorio y se puede aislar de la sangre medían­ le técnicas de hemocuitivo ¿¡¡lindara.11*1Se recomiendan ugares selectivos, ya sea agar selectivo de Ashdown (A SA )2” o agar selectivo para Burkhotderia pseudomaüei lB P S A )},j o caldos selectivos 1(1para el aislamiento de B. pstudntnaltfi de sitios corporales no estériles, sobre todo de esputo en los casos clin icimente sospechosos de ovelioidosis y para el seguimiento durante el iraiamicnto de la enfermedad,U1 Un cl cuadro 7-7 se describen las propiedades bioquímicas (ililes para la identifica­ ción de este microorganismo. Dos biotipos de B pscw/amailer son categnriíados por su capacidad para asimilar i.-arabinosa,™ Los no asimiladores de i -arab¡n<»a { Ara - ) son viralenlos y pueden aislarte tanto de muestras clínicas como del enterno, mientras que los «similodoreH. de arabinosa (Ara +•) suelen ser avirulcnioi y con raías ticepcifiM i se encuentran sólo en el medioambiente,*31*” La identificación de B„ pseudamdfei nd suele ser difícil en los laboratorios en Areas donde el microor­ ganismo es endémico. Sin embarga eon el aumento Je los víajes- internacionales y la amenaza del h¡«terrorismo, kc ha vuello más probable que los laboratorios de áreas en donde ií. pitudomatlei no es endémico puedan encontrarlo, Como muchos laboratorios se basan sobte sistemas de identificación comer­ ciales» Lowe y cois, compararon la eaaelitad de c W ro siste­ mas, los A P E 20NE y 20E manual, y los sistemas Yitek L y 2 automáticos íbaoMérieux Inc. Hanclwogtt, M O ) por su capaci­ dad. para identificar correctamente 103 capan de B. pxendamaUci. Los sistemas A P I 2C3NE, A PI 2ÜE y Vkck 1dieron ta iden­ tificación conecta cía cl 98%* el 99% y el 99% de los casos, respectivamente. El VLlck 2 no pudo identificar muchas de las Cepas de tí, pseuJfjmaSiei debido en gran parte a diferencias en las reacciones bioquímicas logradas en comparación con lo*, val orea esperados en la b»se de dalos 4*° Koh y cois... mi]izando 47 cepas de fl. pstuderrnuilci^ eval Liaron un nuevo sis­ temo de identificación automático: el BD Pbocnk System, Aunque B pseudomaliei no está en Ja base de dalos Phntnix sólo se leyeron cuatro cepas come» carentes de identificación. Todas las recames fueron identificadas incorrectamente con resultados de alta confianza como ft cepac ia (34). cspccics de Burkholdfria/Kaijtnnia. (6) u otra especie de no fermenta.-* dores (3)-4|i Se han creado pruebas rápidas de aglutinación del látex para la delección ik arttígenn de fi, pMtidomeiiei en orina'S4'"JI ■ 'que ofrecen uti método simple* rápido y altamente específico para el diagnóstico de melioidosis y son muy útiles en áreas con instalaciones de laboratorio Eimitadas. Se aconseja a k» trabajadores dd labctraomo utiliiar capucIihü de seguridad biológica cuando trabajan con este microor­ ganismo ponqué se ba comunicado la infección por ft pseudom aiiei adquirida en ef toburatorio.1^ ™ ^ ^ 7Se puede hallar más. información sobre las características clínicas y de laboraron© de la ratUoidosfc en curas revisiones publicadas. BurkfudJeria cepacia es un fitopatógeno que produce putre­ facción en los bultos de cebolla > en los pies fputiefacciún de Sa ju n g la ) de los seres humanos/ü Desde comienzos de lu década de I9H0 ha surgido como- causa de infecciones humanas oportunistas, sobretodo en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica” 1*1* s“ y fibrosis quíMica.367,1'66*17™Los adelan­ tos taxonómicos rocíenles han demostrado que B. ¿¿pacía es en realidad un conjunto de como mínimo nueve especies, genómicas (o genomovariedades) estrechamente relacionadas denomi­

nado complejo f t cepacia que incluye í . cepacia (gcnomo*ariedaú I i, B. multivorms (genomo'variedud Ií), B, cenocepacia (gCnomov m ieJjd 1IÍ), ii. slabüis (gCnumovariedad IV ), B. vieína/niensix (genomovariedad V), tí. dolosa (genomovariedad V III) y ft pymtcima ijenomovanedad IX ). que pueden dife­ renciarse sobre la base de pruebas moleculares y bioquími­ cas 1ct,j^.uí.^fmiTM.^t.-í-.T1".:^ Aunque todas las genomovariedades del complejo de 8. capada han sido cultivadas a partir del esputo de paciente* eon Jihro-ás quísrica íí- Cffia('f,pflCÍG { genomovariedad ÍII) y ft muidvararts (ge nomovariedad II) representan la mayoría de las cepas aisladas en pacientes en los Estados Unidos11*-'1'^ 1 y E u r o p a / L o s enfermos con fibrosis quísiica t|ue están colonizíidos por estos gcnomOtipos tienen mayor mortalidad en el afta que sigue a la colonización j presentan un deterioro más acentuado en toda» las funcio­ nes pulmonares luego de la colonización/3" Estas bacterias también se asocian con mayor frecuencia con La propagación epidémica y con el “ síndrome de cepatiu1’, que se ¡naniJiesla por insuficiencia respiratoria progresiva grave y hocterieAdemás, varios estudios epulemiológicos lian indicado que algunas cepas del complejo 3, cepacia ¡ton transmisibles entre los pacientes y que la infección cruza' da posiblemenle ocurre1por propagación direclü de peisona a persona.1 Los marcadores de virulencia como el pilus cable (cblj codificado por el gen de la sufntrúdad tle piliou cable (cbiA) que media la adherencia a ¡as glucoprolefnas del tnocd y autrwíiia la adherencia a las células epiielia* les2M-*,-l!*?fíT?i y el marcador de cepa endémica tí* cepacia (BC ESM ),4' 1designado así por su asoeiaeiün con Uk lipo& de cepas de B. cepacia que infectan a mülliples pacientes con fibrosis quístiea. se hallan casi excEusivunveme en B, ceitocepackt. Se ha aislado el complejo B. cepacia en muchas fuentes de agua y superficies húmedas, en soluciones detergenles y líqui­ dos para infusiones intravenosas. En general, los brotes hospiialarios de infección por ti. t epaciti se deben a una única fuente caatajuinada, con» anestésicos,71desinfectantes/^ solucio­ nes intruv¡?nn¡iaí,lv3-íw sol uc iones para ncbulizadwres/..... lavado bucalllfJ' y dispositivos médicos, que incluyen equipa­ miento para terapia respiratoria.45*™ Los desinfectantes cu, ios cuales crece fi. cepacia son yodopovidona, compuestos de amonio cuaternario y clorhcíádina/1:L| :,í Se liun cummiieado acudobacleriemias (hemocultivos falsos positivos 1 luego del uso de soluciones desinfectantes contaminadas por ü. cepaTambién puede crecer en agua desrilada con una fuente de nitrógeno debido a su capacidad para fijar CO. a par­ tir del aire. Las infecciones clínicas incluyen neumonía'y neumoaitis en pacientes que reciben anestésicos contaminados, infección de las vías uTÍnaña-s en paeienies ijue njeiben líquidos de irrigación contaminados luego de un cateterismo o unacisloscopia, septicemia luego de cardíoeirugííu endocarditis cau­ sada por válvulas cardíacas contaminadas, conjuntivitis y artri­ tis sepiiea/^ La peritonitis que sigue a la diálisis pcnlonenl ba sido asociada con solución de yodopovidona contaminada per B, c e p a c ia Las infecciones que afecian el sistema nervioso central incluyen un c ü % o de baclericrnta secundaria a la conta­ minación de una válvula de Holter para derivación venlricuk»auriculúr en un niño con hidrocefalia con^lnita^'' y un caso de abscesos encefálicos secundarios a otitis media supurada Cró­ nica en un adulto,-'"’ Se describieron medios selectivos con colorantes bacteriostálleos, antibióticos o un pH bajo para cl aislamienm selectivo de B: cepacia, los cuales incluyen medio para f*tendámonos cepacia (PC M ). que contiene cristal viólela, polimixina B y

B Est igrma del d r . VaFbr Eso

Microorganismos móviles con flagelos polares 3 i 1

ticarcil¡íu;:s4 medio O F P B L que contiene poLimixinu B, towitrnetna y lactosai*" y agar selectivo para Burkítoíd¿ria í cpm ia (BC SA í, que contiene íñcloss, sncanosa, polimúina B, gentanlicifla y vancomicina.3'11 Las evaluaciones comparativas de estos n i6 d b han mostrado que el aislamiento de B, le/tada en nucientes con fihrcwis quística aumenta con su Se obuivó que BC5A (utilizado sobre lodo en los Estados Unidos) y cl medio para £í„ cepacia Masl {utilizado sobre iodo en Europa) son !•» ^ apropiados, para el crecimiento d i mdís las cepas problemáticas de B. cepada.™ *1* La identificación de B. cepacia en el laboratorio clínico es problemática poique no es un único fenotipo sino un complejo de por kt menos nueve especies genéticas separadas:*9* Los equipos de identi ficación comerciales han funcionado mal en la identificación de estos mieroot^anisnins. Kiska y cois, compa­ raran cuatro sistemas comerciales: RapSP NF Plus (Remel), A Pf Rd|)id NFT (renombrado A PI 30NE (bioMírieu*), Vliek GNI (bioMíricux) y Uni'N/F Tek {Rcm cl). La idemitleactán correcta para 8. arpada fue del (¡¿fe para Um-NIF Tek, del 11% para RaplD N FPIas, del ¡50% para Vilck GNI y del 43% para A PI Z0NE-'“ HVan Pelt y cois, comunicaron que de las cepas de fl. tapada fueron identificadas eoncclamento eon cl A P I 20NE y cl Vitek GNI, y un <5&%* con los paneles combo lipa l para orina de toda la noche MicroScan WalkAway, r'7 Shclfy y C*U, tvalMfún cl rendí mien to de nueve equipos comerciales diferentes utilizados en 108 laboratorios de micro* biología clínica de 91 « w k b de los Esiad » Unidm que remitían las cepas aisladas a un laboratorio de referencia en fibrosis quística para efectuar pruebas confirmatorias mil izan­ do un abordaje polifásico que incluyó ensayos de PCR basados sobre rRNA especifico de especie.1*1 Los valores pnediclivos positivos variaron del 71% al O T : los valores predicavos ne* gativos variaron del 50% al 82% y iodos los sistemas dieron identificaciones erróneas para e! complejo B. repacía, Las especies identificadas en furnia errónea miis a menudo eximo B. ccpacia fueron las de Burkhoídm a giadiolt, Brisse y cob,1'1 compararon los instrumentos automáticos BD Pboenin, y Viick 2 para la identificación de cepas del complejo tí, repacía, Las tasas de identificación correcta fueron del 50% para BD Phuenifc y del 53% pura V iic l 2 cuando se consideraron todas las cepas del complejo & cepaciut pero difirieron mucho para ti. ceno-cepacia (genomovariedad Jll) (71% para Phoenix y para Viick 1) y H mttilmunam (ecnumovaricdad II) ('58% para Hoenix y a?% para Vitek 2), Lí*í resultados de estos estu­ dios apoyan la recomendación de que cuando &e utilizan equi­ pos comerciales para la identificación de cepas del complejo B. cfpariar los resultados deben confirmarse con la realización ule pruebas bioquímicas complementarias (cuadro 7-H) o por métodos moleculares. A diferencia de otros pseudomonadalcs frecuentes, H. cepad a es resistente a los antibióticos njitmogiucósidos. pero suele ser sensible a trimctnprim'SulfameloxazoL que se lia convertí* do en el fármaco de elección para el tratamiento de las infec­ ciones Candidas por este germen, Daniel y Cois, realizaron estu­ dio» de sensibilidad in vitro en 36 aislamiento* de B, i epacitt en sangre y observaron que ia mayoría de cillas eran sensibles a minncieliiia (94,4%), cefW idim a (Sft, 1%), eip mil osari na (8¿U*S¡-) y trimetoprim-sulfametoiflTol (S3,3%J.lrti En los estu­ dios de sinergia de dos y tres fármacos realizados por Bormcoftj y cois., el agregado de cjproílo*acina aumentó sig­ nificativamente las actividades destructivas de pipcradLinn, imipenem y mempenem, mientras que la combinación de tres fármacos de ^-lactámicm-cjprotioxacifla-tohramicina tuvo el erecto más sinéisica71 Auron y «ds,, que también efectuaron

pruebas in vitro utilizando múltiples combinaciones de anti­ bióticos para ft cepucía1y comunicaron que la combinación de dos antibióticos mejoraba la actividad bactericida para las siguientes combinaciones: tneropenenHiiinoetclm&+ merope* iiem-amikacina y ttieropenem-ceftazidiina. Las combinaciones de tres antibióticos que contentan tobramietna* meropenem y otro antibiótico lueron mis eficaces y resultaron bactericidas contra el 81% y cl 93% cte las cepas aisladas. En otro estudio, N7-ula y cois, mostraron que las concentraciones inhibidoras mínimas de antibióticos (C IM ) varían ampliamente para las diferentes cepas del complejo fl, ctp acia™1Aunque todas las ce­ pas fueron residientes a la polimicina B. las CIM para clomnlénicol variaron desde 4 hasta 128 mg/L, aquellas para trimeloprim. desde 0.25 hasta 64 mg/L y la mayoría de lis cepas mostraron resistencia. Asimismo, los rangos de CIM para tnbraniirina. ciproflosacina y cefiazidjma variaron ampliamen­ te, lo que sugirió la necesidad de que los laboratorio* realizatan pruebas de sensibilidad en aislamientos individuales. Vermis y cola, observaran que las CIM de los microorganismos aislados en muestras de pacientes con fibrosis quísiica fueron mis alias que las: de pacientes que no tenían íibrosis quEstica y que, en general, las cepas del complejo fl. cepacia cían más sensibles a rifampicina, uimetopriin-sulfamctoKazol e Emipcncm y más resistentes a polimicina B, 1 Para obtener mayor infantuueián sobre bicjlújzíj, taxonomía, mecanismo^ de virulencia y epidemiología de B. cepacia. se pueden consultar varías revisiones eAC£lemes.LíLJí4liUÉí,-+,i<w,,,i B, gttidioti (antes F, m argim ía) es fuaidamentalmcnte un patógeno que causa "putrefacción de llures" en cl gladiolo y otras plañías. Es uno de los pocos pseudoraonadales negativos para la cilocmmo oxidasa y produce-colonias amarillas no fluo­ rescentes después de 4* a 72 horas de incubación. Se ha comu­ nicado que causa enfermedad pulmonar en el ser humano y a veces bacteriemia e infecciones de tejidos blandos en pacientes ton libtfusis i|uísücd,4l,lí,“ri4 enfermedad granulomatosa c tó n ita ^ 1 diabetes1^ y otras deficiencias inmunilnrias.-"1Existe ooa comunicación efe queratitis y endoftalmilis [mr ít. gladioii en un paciente anciano con diabetes mel]i(us.tív En general hcrece como colonias amarillas debido a la pro­ ducción de un pigmento amarillo difusible y no fluorescenie. Las pruebas bioquímicas que permiten la diferenciación del complejo B. cepacia incluyen reacciones negativas para lásina, maltosa y lados». La mayoría de las cepas son o\idasa negati­ vas y Catalasa positivas, En el cuadro 7-8 se presentan otras características de difetenckeióií. Los trabajadoras de laborato­ rio deben estar conscientes de que los métodos fenotípíeos para la diferenciación de R. gtadwü de los microorganismos son poco confiables y pueden conducir a una identificación erró­ nea.1’1Los sistemas de identificación comerciales a menudo no pueden discriminar fl. ghtdioít de especies relacionada».6*1™7 Por lo lanío, se deben utilizar métodos con ba&c molecular cuando se juzga necesario confirmar que una cepa aislada es B. filad ialiV ' El patrón de sensibilidad a los amibidticoü tam­ bién puede servir como indicio de que un microorganismo podría ser fl. gfadw ii dadu que tiende a ser sensible a aminoglucósidos. ímipenem, ciprofloxacina y trímetoprim-sulfameloxanol y resistente a azticonam y ccfalosporinas.*41 GÉNERO BALSTOm Y GÉNERO CUPfflW m S Falleroni1^ y mis tarde Lj y cois,48'1demostraran dos grupos de homología de DNA denuo del grupo II de homología de RNA para pxemhtnm&ar En 1992* Yabuuchi propuso cl nom­ bre genérico Burkhtffdtría [jara siele especies, pero sefialó que

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CAPITULO 7 Bacilo? gra runogativos nn forman! adores e je : tSwbB ;

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Microorganismos móviles con flagelo* polares 313

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ft. pickettii y b. sítíanaceanm eran sim ilar» entre ¡>t y dife­ rentes «le las ulniü dncu especies de Burklm ldriia CUíl nombre en esa ípoca.^ Un líW5hYabuuchi y cois. propusieron La transfereneia de ft. picketiii, ft soimaceamm y Afcaiigenes eutropbus al nuevo género Ratsionia y R- picketiii sirvió como espe­ cie ltp«,s:H: Cutí posterioridad, se agregaran vari ai esjieries nue­ vas u nuevos combinaciones uJ gdnero Rat&ioniti. El análisis comparativo de secuencias de rDÑA I6S indica ahora que Chis­ ten dos SLibliTuijcs distimo1 ; dentm de] géneru Rnlxtaniti. Iil pri­ mero, llamado linaje de Ralstonia eulmpha> está formado por R. basilensis, R, canrpinensb, R- eutrt)f)hc¡r R. gittmjfi. R. ttiewíidtinins-, R. uxahiticti, R. püiiL'iitti, R. itp iitictd i y R. luíwtificnsis, El segundo es cl Linaje de Ralstonia pickettii, formado por R, insidiosa, R mtmniíplytica, R. pickettü, R. síiianarearum y fi. ayzysii, F-sia separadlo está apoyada p+nt diferencias f<ími(ípica&. Los miembros del linyjc de R emmphit tienen flabelos pcrilrieus, ilu producen deidos li partir de La glucosa y son .sen' si bles a la culi si ina, a diferencia de los miembros de R. pickeítii. que tienen una o mas flagelas polares* producen ¡ÍcílIlí ih parur de varios hidratos de carbono y son resistentes a la eoLKtjna (véase recuadro 7-7)::]7í-™ VanccchoulEc y eots. propusie­ ron redasillcar las especies del linaje de R. eitintpu en el nucvii género 1i1írwftfrí/n.í4-) Más larde, algunos eaperimenlos de hibridadón de DNA-DNA y una evaluación de las caracicrísijeas ienotípieas, los cocientes con base en DNA y secuencias de genes rRNA 1óS demostraron que Waníersia ettfmplw, la espe­ cie tipo del género IfHHrmúi, es un sinónimo ulterior de Cttpnmidus necator, la especie lipn de) genero Cupriavidus, Pbr lo tanteu todos lus miembros del giínero Wamcrsia fueron reclnsiticados en el género Cupriavitíus.'^ Rahtttmíi pkLeitii fue establecida para un grupo de cepas clínicas*™ y también resultó que incluye cepas de lo*, grupas Va-1 y Va-2 de los CDC, consideradas dos bioviiriedades dife­ rentes de Rr pickeltii.^ Poco antes. King y cois,w comunica­ ran que R. i P i e i i d o n K i n a s " ) picketiii contenía Varia* biovariedadesh que incluían las cepas aisladas originariamente det Sí, Thomas Hospital. Londre^/"’1^ 1que habían sido designadas "Pseudomonas ihomasif, aunque cl nombre nunca fue publi* e«j^i eflii utlkhíi. En ]íflJ4, Fickttifl" jcilaliJ que cs> necesario ree[]n(]L-er tjne R. picketjU tiene (res biovanedadeí dcHiynadaü biovariedad Va-Ib biovaiiedad Va-Z y binvariedad WTfwmasfí. De Caere y cois.1"' confirmaron luego medíanle hibridación de DXA-DNA tjiie R. pifkcnü biovariedad 3rthomusii era itn;i especie separada y propusieíon el nombre Raisionia mtmnitfílyfiea, mí^s tarde corregida a ftahfonia tm riniiotihti('a.l*> ñ , picketiii pocas veces se asocia con infeccinn.es humanas, pero :,c lia ínrormudo conio causa de infeceiones hosp]t¡ilariasr que incluyen b^clericmij c infceeion.es urinarias. Hn IQ83. cin co líicuntcs en Ja sala de cuidados especiales de neonatolojsfci de un bospiial en Chicago ftternn coInniJiadós par ft. pieixttfi luego de la aspiración cndotraqueul con .solución salina a

partir de un preparado comercial en Irascos ampolla en dosis unitarias de 5 mL. PiKierionucnie. turas cuairo linspilales comunicaron hia)luni£uctún respiratoria de laclantes y adnlu>s pc.nr fl. pickfftii luego del usn de Ij tiiisanu rtsmea eomerclal de Irascos ampolla de salueitfn salina.111’ liste brote demuestra ta, capacidad de ft. pretierai jKira sobrevivir y crecer en solución salina Heslérir' comercial a pesar de la reglameniación peniiientcde la Food and Drug Administré! ion í t^DAí y píwgramas de la compacta paja identificar esla conlam inación. 3Jan ocu­ rrido hruics b(]ipiij]aricis miís reciente!, con soluciones de culdaLlns respiratorios eontami]iítrtasl'llt soluciones de hepariníu^7 solución salina “ estéritrf para inyección^1*1agua desliÍada','i,HS' y un sistema Je irrigación con agua contaminado.*1: También se lian informado scüdobíotes debidos a tapíts de frascoi de hetnocullivD contaminadas,71 y agua salpicada desde una pile­ ta.-"1Sólo existen algunas comunicaciones de infección prima’ ria causada porfl, pieketíii, que incluyen un chkei de nsteomieliiis veriebml y diwciiisen un padenleque recibió bernia!ialisis pmlongjula,™1b^tieñenisa eti un receptor de trasplante mtdu\a^14y meaingiiis caí uti lujiehero presumí btemenle Mno,í " en el cual no se pudo hallar una fuente conlam inanlc obvia de infección.. R, jñckeitii liene tin crecimiento lenm y produce sólü cnloniaii puní í í l í i mesen placas tle u^üí sangre de.spuísde 24 horas. Todas las ccpas son mensa posilivas y algunas cepas pueden ser caía!asa negativas. La motilidad es dcbil o tardía y es posible t[Lie nn sea cfclcciahle. Lu biovariedad Va-1 pucite ser separatta ik hi V.ü-2 pt>f la oxidación de lanosa y nuliosa. En el cuadro 7-9 se presenian características bioquímicas adicionales, R. matmUütiíyticti es d nombre dado a microorganismos eta’ siftciwios anles como fi, ptckellu biovariedad 3/ihofnasií (véase cxplieiiciún anterior).1^ Se ba aislúdo en espuios de placientes con iibrosi’L quísiieal4>J3Dy en un caso de meningitis recurren­ te y otro de liemoperitonco.?w Puede di^inguirse de todas las especies de Rnhltfnia desciitas jKir aeidi[icaeiúll de J>aiabi­ to! y manitol y su falta de reducción de míralo y de al cal ini zadún de tonralo. Se han aislado cepas de R. insidiosa del medioambieníe y de muestras clínicas humanas, que incluyen secreciones respirato­ nas de pacienles con fibn*¡is quí.slica.LM743 ¡So se han aislado cepas de R, sohmavftítwn ni de R. sy-ygii Je muestras clínicas humanas. Ln el cuadro 7-9 se detallan jas características para la identilicación de especies Je fialsrm ia de origen humano. El género Cuprímidux está compuesto ptir eípecieü anierioles de fíulMimia que son asacarolílicai, sensibles a la coli Mina y móviles, eon flagelos pcritricos (recuadro 7-7) c incluye: C Í/Bír'ícfffíj, C, cafífpinettsis, C. giianfíi, C, metatlidnrans. C. necatnr (especies lipo que ames erun Rahw nia cutrctpba)^ C, ríTíf/flííVdí.T. C. ixtNCtttutt C, tvspimcufi y C. ftiinntiensis,7*1* C. RtfanW (anles Rahumia .i; ¡hirdii) recibió ese iwmbte en

honor de ÍJ. L, Giturdu ttn microbiólogo norteamericana que contribuyó mucho a nuestro conocimiento de los bacilos gramnegalims nn Eermcnladores. Es fenol ipicamenlc similar a AkalljffwsfaecoHit \ fue denominado similar a A. f
B Estignnadel dr.V aF brE so

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Microorganismos móviles con flagelos polares 315 C. [M iit'iilw í ítüíes. ftaitím in pnnciüis y grupn IV c-2 de ios CDC) e> un lu d io gmirmceatno asHcnrolfíico oxídrivi positivo tiu€ es móvil por medio de flagelos peritricos y fuertemente ureasn positivo. Por la Lanío. si: iLvcmcja fenolípic ¡unerué a AU-uh'ví/irs, HtmieStfk y Otrgftta tirvotyliau ds los cuales debe ser diferenciado (véase cuadro 7-4J>. La mayoría de las comuni­ caciones. de infección humana tian síJo clisos de bacteriemia en pacientós LnnmnoüjcprLniiJos.11-“ -: w ' T;;hl; Tam­ bién existen dovcjsos de peritonitis luego de diálisis peiitoncnl ambulatoria conunua. uno asociado con septicemia1^' y uno ton uta irttcCCiún mixta pwsr I Ve-2 J AictiHfít'ní \ ' 1 j ütt caso de tenosinovitis de la mano luego de una mordedura Jl' ppSo.'‘,; En cl lillim o caso no está claro si Ta fueme del agenLe irfct’CiCiMí fue la mordedura Je l ¿41 1 0 o cj apia corriente uiili/uda para lavnr to lesión. C. respiren uU i anees Kat'Hr/nia respwacufi) se ha aislado del ajlarutn respiratorio de pncientes cal) fdm>Mv c|üL\1ica_ aunque la-' cepas no crecieron en B C SA .lfc Las características que dife­ rencian li C. ftfSfütiUuli tflrjs especies de Cupriui'kiitx sí presentan en el cuadro 1-9 C. kihvnm-ir-;\ ( lililí RnfstftfiUi itunxuwMf i latnbién l'i.1 sidu aislado del esputo de un paciento: con libros is quíMka.111 lis un bacilo gnurmegntivo no sacnroBtieo -que es oxidan, eatn lasa, nitrato y escalóla positri o. li 11 el LUddro 7-*) se proporeiono.ii otras earacterislicas bioquímicas. GÉNERO PAtíBOfíACA lin JíHN.Ír C u l'iijv y eols. describieron un ¡tréníró nuevo, Pnniitit\H'ít fqtie se rd¡ere íi la caja de Pandora cíe la milolnpia griega) h,Ic rto íenneiitadofes grainnegalivm aislados íuiidLinicuínUncJlte Jl' los esputos Je pacientes cutí fibt\>sis quJ'-’.lÍ-lll y del sise lo. 1 Originalmente, este genero eon tenía chico espe­ cies con nombre í P. apiiit rr tuiñtttbergert.iit> P. pttaffiettiiuí, P. paimtmicfllú y P. sputomttú y una especie grnómica sin nomine.: ' |í;ice poco, se agregaron tic-’ genatnaespedes de Ptítídotactí nuevas i.úu sin nombre), iinStís clasificadas como grupa 2 oxidante débil de los CDC íW O -2l.íw Las de Pi\ikJWi;ctr se han aislado jnineipdittjeilie de Iris seurccianen n^piraionasde pacientes con ribrosi&quí';tiesa pemi también %e huh etSLülllj'aiti) flj oirás mueSLus L‘líüic;is. que [i)l:luyen s;tn|irc > (ejido paE]]iH>nar.:,‘1Se ]ia coi 11u11iLado [u diseminaeidJi epídímka de P. Qphtti de un pacicnic índice ei otros cinco paeientes con i'ibrosis (jtirssíefi qim- paniciparon en campamei]íos inveníales <1 i|ue liabiaii sitio iiuspi[íili/.nli> . 1' 1 f;n la udUulidud. >e dcseoiioce la picvulenLÍd. Lu [jansiTLisibili Jul] Je -jn patríenle j oirn y la ncpcreuMÓll clínica de C^tos ihÍcilh^liIIÍ.SiTKU L'il pelLÍ(;flte% eon libro-sis naísticu porgue los méttjdoí Lie identdk'Lieión niamiLilesy Lnjtomati/udflsuliíij'Lidasen Ijintnnlía de las kiliomlnriLK no uhn ■üitisiaclorias pjira kkLnt¡lk\ir las « p w iíi ile ftíurffjmwi.'11t,s Hn jbeneivN eMl¡i> especien crcten ¡i]cn.fS6 uci niediiü sekeLi’. i) |xjíj H. ctjWC/ff y, pin lo tanlo. pue­ den ¡'ir confundidas como miembro^ del eomplcrju H ccpacm. I .as especies de Pumit/mm crecen bien en H A RJeipw ís de urn ineuhiciónde LihJsi la ntvhc si í.1! '“C. La.s voloniu*- ¡lisiadas a^íujeteii circulares, convc^ds, sentit’pytas, enteras y lisas v tienen 0,5 a i mm ule diimetro. L;t litntóiisis l-s variuble. Todas Lia especies son móviles. 1teñen, tíntelos poi^riLs y son posii¡v;is para crecimiento cu íi^ar Uc M jict’o:ikcy, píodiicción Je catLila-¡1 \ ¡dtakiLÍjfiu;ióii Je cilralo. E'oJjs las especies >on ims^íivn> pura icducL'ión de nitriiOL d .'sjiii:ííjcjlÍoh, pnoduc^ión de indok gelatina, e&culina e híilróNsjs de Twcen: lisina y ornilitia desc a r i n a d lns;i| V U i ^ i i l i n a Jilliili^Hjsi], [ l - ^ i i L i e t o s i J a ' í J y J L e l j v i d a d ile DNasa. Ni« se proJuce ácido a punir de manilo!, laelosii.

sacarasa* maltosa íí írucKwa base ü K [.as cepas prualuccn ácido dábil o aon negativas en glucosa OF,1 : ^ Para eoíMCCr las enraeterfslicas que diferencian iVírff/f»KJtj
GÉNERO m tffUNUS htqwfítms iintosw es ana bacíeria gramneguii^a inmóvil con forma Je bastón que mide 1*5 a 2 |im de ancho por 3-S pm de largo. Crece a y 42 T . pero poco n 25 *C. Pormsi coitinias no pij:3iienrrjd,iIi y rnny viscosa rnédioí no selectivos. Rl crecimicnio en ajiar de MaeConkey es muy leve después de .1 días. Es resistente a la poli minina B y ] ipasa positiva, lo que lo hdee parecer fenotípieamente similar al complejo H. cepacin (cuadro 7 ^ ).'^ ^ Todas, Ins cepas son positivas para oxidasa, catakisa. |ÍJ-j2lucos ülasa. tus la tasa, prolina jnmiopeplidavi. piiiol[Lluniliimitu^ptidasa y producción de aceioftu y negati­ vas paja lisina. ar?ininaHomitiría, desnhriJicaeiÓJi. indoL ci tra­ to v utilización de ükieosa.|if! Todas las trepsis han sido reenperadas de íteiítciones respiratorias de pacientes con (ibrosis íjUÍsliea. f ;i i^ita^dilicidad dcscoilfure.

GÉNERO LAUTROPtA ijsütrtspin m irabilif es un coco eramnecativo anaerobio 1'acuItálico y miYiil íjue fermenla glucosa, Iructosu. sacaron y niaoiiol: reduce nitrato y niiriioi y ]irodiicc reacciones pcisiilvas para oxidasa, uieasa y, 1 veces débilmente, calalmsii. ■' La earacleri/aeión filojjcnelicu wJitu el jiriilisiü ile secuencias del gen rRNA IfiS Líbica la esjiecie en el sül>L;rupo \\ de Pívíttib arifria. separada de los otros géneros, decenios, [wro nuís esLtetliaiuenle rclaciíMiaLla cíhi littrkiw iih'tiu.' 5E ' interésame señalar que Lu composición celular de ácidos grasos de L mirabais c.k ñus Miliikir q la comjnisicitin celular de áci­ dos grasos de A ciiUn'íKtiX tiviafifidii, Ctutuimimtii ’crrn.'frm y el gni|n> oxidante d i hit \ de los C lx : < W O - l U inutfolol!Ía ctK.^side j la capacidad para rcrutculur la glucosa sejuara inirabilis de C A iiéltijteidii y WO-I ¡y de los miembros del grupo IttniJujíderiu. L mimhiftt mucsira una morí o Ifijria celular exlremotamente politnoiíí). Se ohseivan al menos [jcn morfologías de colonia-; I) colonias planas, secas y cireulares cit cuHi^os jóvenes, 2) formas luís grandes, ju^tksas, onduladas s cialcrifoimch con Ea incubación pndot^’aJa y 3) colonias lisas, brilkulles, elevaLlas. reLlonJertas y ntucoides. lil diáiiLciro de las colon i¡ts ^■aria entre pimlilormes y 111¡ts Je 5 mm. \ las colonias suden ser ndlierentes al a g u r .L tiiimbih.% ha í'ido recuperado de sil ios bueaks j respiialuríus sujwriorcs.:j;i ítel espulff de un pacienle con fibmsi^ quistiea.v y de las cavidades bucales de niños injcelados por H IV 1''1" Su potencial palrraenico se desconoce,

Familia CamamonsdxceíB GBUFÍ rRNA IH Willeilis y cois. Iiart pntpueslo que los irticrooreamMiaii per1encelen tes al ^rupo rRNA III sean nrcontícidos como un» tules a fqmilia de baclerias: CrJNUJJJJrmudmCiíf lr' GRUPO ACIDGVCIJ1ANS Lste y rupo consiste en microotgatLiiinos jnles denominLjJos P s e íiJü fíto H ít'i

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í\ixi\{itfw>not tfrrigftki. En 1^87 Tamaoka 1propLKO ubkur n los microorganismos confuidos como pxfufiftmrfmta ncütovo*

B Est ignna del d r . VaFbr Eso

31$ CAPÍTULO 7 Bacías gramilegatwüs no fermentadares

mnx y P. tw o u w w i en el género Ctnntutum¡\, junto con la cspccic C. terrigc'm. Con posterioridad L C. acuh^vmns fue colocado en mi género nuevo D dpia coma la especie tipo D. addam ram Todos son móviles por medio de un penacho polar de hasui scU [tugclos. con L:l eiiraclcjfslLc.t definida de tener ufla longitud de onda larga (3.0 ¡Jm enire la (Kirie stipírior de [as ondas adyacentes). No w produce ácido en et medio OF glucosa yL por lo lanío, estos micruoiganisillos son agrupados entre las pseudomonas alcalinas (véase cuadro 7-éj, Como grupo, leu eornamonadalcs tienen una disirihidój» geográfica amplia y snn s.apróííu,« rpscuenies del Mielo y el agua. Se tos aislé en fuentes animales, producios alimenticios, etjuipamienlo hospital ario y muestras clínicas humanas. pero pocas. %eecs tienen importancia clínica. D, acidovorans c r- el que aísla con mayor frecuencia en las muestra* clínicas en éste grupo, ñiedc distinguirse con facilidad de k«¿ otros pseudomonadalesalcalinos debido a la producción de un icido débil: o una reac­ ción neutra en fmetosa O F y manilol OF. Es acetnmída positi­ vo y reduce el nitrato sin producción de gas, Es indol negativo,, pem Iw mayoría de las cepas producen ur. color anaranjado en el medio con «1 agregado del reíd ivo de Kovacs. (el denomina­ da Ludo] naranja) debida a la producción de ácido anlranflico a gwrLir de tripiona {véase lámina en color 7-2C)."Í! La reacción de tndoi naranja también se puede demostrar agregando una gotn de reactivo de Kovacs a colonias que crecen snhrc la superficie de placas de agar sanaré, Cuando la prueba de indol se réaliíit con extracción dé xileno y con el agregado dé reacti­ v o ^ Elirlieli. esias mismas cepas producen un color amarillo intenso en el medio de prueba. D. ui'idm'ümm lia sido aislado en distintas muestra* clínicas y suele ennsidenit^c nn patngenict». Ijis ccpíts halladas ert pariemcs internado* tle la llhiversiiy of Illinois se aislaron en empino, orina, uréteres derecho e izquierdo de rjfíones trasplantados, líquido de preservación renal, raspudos coméanos Je un pódente que se bahía sometido a numerosas cirugías oculares- precias y de san ere de o» pacien­ te con mbereulosis, Se han publ ieado casos Je D. aeidovúrtitis asociado con hacieriemia relacionada con canteres. otilís supurada,*1|:H infección de las vías urinarias,111 infecciones oculares4’1"l5 y peritonitis en un paciente sometido a nilidlisís pcriloivcíil ambulatoria continua ''L También se describió un caso de endocarditis por /). m-idtirrtntn* en un adicto a drogas intravenosas de 42 C, temmttntiii se aísla con poca frecuencia en cl laboratorio clínico, a pí"M4T de su amplia distribución ambiental. Barbarte y cois,,11 en una revisión de IR casos de infecciones por C ie«lo.ut-niru*' informaron que el microorganismo se encuentra mis a menudo en asociación con anomalías anatómicas del apáralo digestivo; la 3ii.as frecuente es ta pérfoiación apenüi calar. Oirás comunicaciones previas publicadas describen a C testostenmt como causa de sepsis,^ infección relacionada con catéter venoso eértiral'1'1y meningitis en un paciente con colevieatoma recurrente.11Queme recuperó C\ teslosts wm de la& secreciones respiratorias de dos parientes con fibrosis qiiística.5W En realidad, f , tfn ig fitti comprende tres grupos Separados génoiípicainente. C ¡errígena grupo DNA I tonserva cl nom­ bre C terrigenu. mientras que C, irrrigena gnipo DNA 2 (qilc contiene Aqm spinlliim mfiuaicum y algunas tepa% Je l grupo (O Je E. Falsen [EF]j rccibc cl nombré C. tiquatica y C. ferri fíijtiú grupo DNA 3 (que incluye algunas cepas que con anterioritlad kc clasificaban dentro d?l grupo 10 de EF> leeihe el rhífishre C ¿.rr.ittn ii.1*3 C rerrige-mi no se considera un palégenu Ituniano. aunque Sonncnwirlh informó cl aislamiento de C’. tefríjit'iut de Jos hcmocultivos de un pucicnlc con caducar

ditis' sin enil>arg
GRUPO FACIUSOELAFIELDH W j llenls y Mis. lian propuesto un nücVO ¿ í r t í n Acidovvríix. que con tiene las tres especie* sigiiienies; Acidam nix fa tifis ¡jantes Pseudotntmas faeitis}* Acidm'arax itdujictdii (antes Píatfíom onai ddafiddii) y /tríffrnwrm tempemus (para varias es eepító de Psvitdmwmws y A lraligirnrx),"'' Estas ircs especies forman un grupo sejíarado ileiuro del complejo rRNA grupo Eli. Dos de los especies. ,4. deidfieldü y A tempemm, han sido aisladas de muestras clínicas; sin embargo, no existe ninguna información referente 9 la importancia clínica de estos microorganismos,**11^ lEs pmbablé que A. ddafddii sea el mismo que el gmpo WCM de los CDC y que A. ttmpenms sea i^iual al irupo W O -IA Je Tos CDC.1 ®2 Lus e>.|>eciés de Addtft-omx son OAÍdasa positivas. moNtles y utilizan hidratos Je carbono cu forma osidativa. Para otras características diferenciales, con­ súltese él informe publicado por Wdlems y cOls.L;

Familia Cáotebncteraetae GRUPD rfiM IV Todas las especies Jel grupo rRN A TV han sido transferidas al nuevo género Hm-umlimmu;s (que significa bacteria con fla­ gelos de longitud de onda corla).6” GHliPQ B R EW m m O N A S*O tm W A El género Bm-untlimtmns incluye nueve esj^ecies de I » cua­ les sólo dos, ft ihtnñumi v ñ. n ut ítituis, se encuentran en muesiras clínicas humanas. Esuw especies eslán agrupadas con los pscudomnnudales alcalinus ponjue son no reactivas o sólo débihilcnte reactivas c.ti la mayoría dé los lúdratos de carbono [\éase cuadro 7-hy Esté gnipo se caraeleri/a por la presencia Je un único Híigekj jiolar apreiotUstuenie eiiroJlLido f Kitigiiud de on­ da de (1,6 a 1,0 pm|. B. resictiluris tiene crecimiento lento y suele requerir 48. horas de incubación para observar las colonias en agar sangre de canten», cjuc producen colonias de pigmento amarillo oscuro a anaranjado ívéase lámina en color 7-3CJ. La ina^on'j de las cepiih no crecen en aj*ai* de MacConkey. B . nv.ticidctrií puede ser ¡separado de todas lai otras especies de p$eudomonadulch ulcalinoa en virtud de una reacción hidrulitica fuerte de laesculina. En la University ot Illinois, hemos aislado fí í'fsicidiiris de líquido de diatiüado peritoneal, una máquina de diálisis i^naL nn absceso btia-sJ y una teridsi Jel cuero cabe­ lludo. Otroi autores han comunicado el aislamiento de esta especie de muestras del cuello uterino,^1, s a n g r e y en un caso Je botrirurrfcosis,, un trastorno grannlomatoso supu­ rado crónico y raro que afecta la pieP* H. veúcutam también ha sitki recuperadlo de muestra ambieUlalcs hospilalarias que incluyen lu manguera de una duclia^11y una pileta de hidiolciapia,J ' Existe una comunicación publicada de büctericmia por B. diminuía en un paciente con cirrosis.1- tí. dimimtui ha sido aislotlu en cultivo pairo de ln sangre de ¡res parientes en d University uf Illinois Ikrspilal, Un pudente em iliabéticso. otrn leni'a una ricemoiiía del lóbulo medio deiccbu y no se obluvieron antecedentes del tercero. Todas las cepas fueron no pig­ mentadas, crecieran bien en «gar de MaeConkey y fueron DNasa fhi^itivas eon el sistema UNI-Nff iRemeh Lenes a K,S) Moss y Kallenbaeli infonnaron t[iie el árido glutírtiico es pro­ ducido por B- diminuto pem po par JJ. iv.t¿t'f<¿iam cuamlts los micKjorgunismíHi crecen en agar triptieasa soja.51,6

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

Mí a w p n litio s móvites oon flagstos potaren 317 Familia XanitioirTanBdaceje

GRUPO rfiHAV géjieho smmopmMONAs E l genero Shmtítvpfumonas fue creado en IOT3 pam aoenunUr 3 X**WUMS matinpfritre? (ames. P.srttdtmuma% nuütftyrhiliui.*" Varios ¿siudio-, recientes han moslrado i|uc o isie una Jiversidad g c n c lb conshkmble dentro Je V. muUophilht y que esta especie coiisisle' al llicnus eai nueve gílipys peñón ii co.s l4!iJWl Además, se describieran «ras cuatro especies nuevas (Je SscnoUvpkoinami'i'- StcnaSmphnmsma'i africana, ' J Slenn¡mplNWtOñaS Itu rilirn iu rru t.~1 SlPitMmphmiimiX tít iifitm tnipiiifa3* y Sientnrvpiumiana.% riiizjtphilu.*'9 Si; propuso ü, afrit-aiM pitia una única cepa aislada en LCR, refltJífpkarnenic, dctcrmi.hu qUe era casi ideíLticí) a. S. úialtupSuliü, salvo etl Ij: propiedad de ser negativo para la Asimilación de cís-acomia' lo, "' Sin emburro, sumí1la baw de análisis moleculares P ie n ­ sos. Coenyc y eols. han determinado que S, africana o una cepa de la especie S. maílophifia'. p«sr lo lanío, no se permite el nombre de MpCíic S. africwrti.'^ De las- espccica restantes, scijn ,S, nttihaphiHa se asocia con 111Iece hmi en seres humanos. S t/udnrph¡fin e.s un bacilo móvil, tiene flagelos niultit riera polares y puede distinguirse con facilidad de om>s pseudomonadalcs en virtud de surlisinu positivo V PNasp positivo y midas.L ncgu(iv»(vt:us4; cuadra 7- IÜ). S. mtihopfiihu Sun sensibles a cutísima y polimi\ina I!, üita propiedad puede utilizarse para disiinguir matiaphilhi de IÜ. cc¡Tocia, que también c* lisina prnilho peni es resiste nte a eoliítina y jnilimixina B y DNusíi negativo. S. uiatlopfiííin alacu enérgicamente la OF maltona pena suele ser negativo O mjIu débilmente pn.'ssitivií en Ol' glü cosa en 24 horas. Las üotonias pueden aparecer Amarillo páli­ das o yris laumdu en medio de agar sangre l\írase lámina en color 70D ). Hcmtfcs observado pocas oepas. de A iitaUophiífa que son lentamente osidasa positivas- peru todas liertert ios otros rasgos bioquímicos característicos de S. mairophiíhi. Los estudiantes de microbiología tic ben saber que se pueden rceii' pefiw algunes eej»ii* nuas eon cantcteríslicas aberrantes de l«ts mtiestiELS elfnieas.

,V mtíliojtitifia es ubicua y pn «k «er aislada de casi cualquier sitio clínico. En ocasiones* produce infecciones oportunistas y está surgiendo como un pwiógeoo hospitalario Importan* lc : » m i ¡rj j-jiit, nij h frecuente de aislamiento de S. nmhvphilio es el aparalo respiratorio, aunque en la tnayorin de Eos pacientes estas cepas n» parecen lener impiírtauCií> ClíniCi. F,n ios u1hiikt?w jfiíj's ve fus ctiitilinteado una ¡[leidhíntia ereeienle de 5, ritaimpitilia en algunos centiosdc referencia en fíbrcisii -quístjea.JI‘ * y se ha nhservado una aaociuciún entre coldilizjeLón por S maiiúpiiitiei y daño pulmonar.4*^-7 Se demostró que et uso de medios selectivo^ aumenta las lasas tic aislamienLo de 5. muihtphitia de los esputos de pacientes es, edad supeiw a Iíks 40 añ. la toluni/acirtn puede ser favorecida por et uso de u:i üaLaJtiienLu antlpscudomdnieo

Cuadro 7-1I0 c .'raettrfelkliS de s nriilf&ptritiá y L^llipkjn IL repacía PRUEBA OimEasi MoütKtüí (tro ;riü C ü lL i cu j .l'4í de M . i j í

fllucnsa OR hilInrílOr L jc Kwii Ülr Muhfil OF RediKY-tfr ilo NOi 3 Anidru Liiína Hidrnl i-;i-ilc escutirüi ON?G I>Njs j Fi'l inu’vina H F^OeMu

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CO>IPLEJU B. CLI'ÁCÍA

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tic 'i Ü. &, lá/U t, -U1.

B Est igma del dr.V aF brE so

318 CAPÍTULO? Bacilos gramnegativoi no fermenta darat

de amplio espeeiro. Cabe señalar que 5. es intrín­ secamente sensible n tr i mcioprini -bul fo n m u o l. tro fánnacu que no tiene ninguna actividad contra P. uc ruginosa o la mayo­ ría de las oirás especies de F z citd o tn m 11ií , 1- -L■Además de! pro­ blema de la renuencia iMrinsee». existen problemas relaciona­ dos. con las prueba*, de sensibilidad de S. tm fivphílwr Algunos método* automatizados íp. ejH Vitek Lcgaey; bioMérieux, llazclwood. M O ) llenen un software programado que Impide la Curtí □mcación de los wsultiiütM tic sensibilidad ui se silbe que el micraoT^nnismo de prueba es S. ntaltapiiitifi, Se pueden observar iwñmclros limítrofes en las pruebas de dilución en agar y microdilueión, y Imn ocurrido lecluraü de falsa semibilidiid lw I los cnsayus de difusión con disco.'. de arminoglucósidus {deben w r uniformemente resistentes) y ciproflosacma/1*-^ Algunos estudios sobre e! uso de la prueba E (explicados en el capílulo m para pruebas de sensibilidad a ln*. aniibitfiicos üe S, twtlfapfiilitt biiP señalado 9u presencia t!c mieroeolonias diminuía.', o una nube de crecimiento translúcido dentro del í r u de inhibición que -i es omitida podría conducir a resulta«k* de f»ls» sensibilidad. *M l*QPara saber mas, el lector puede consultar la revistón ríe Rubio y Jan da/'1" Familia SpfswgomoKKfscvsc m GÉNERO SPHINGOMONAS 1:1 género Sphmgtmumas fue dií.HCíilo por Yabuüehi ji cois, en lOOtF1- y inecorregido poriakenehi y cok, en I^ .V ^ Los microorganismos de este género son bacilos no esporulad<w granuiegalhos que llenen un único tlugetu polar cuando son móviles. Son amarillos, aerubiits estricto* y producen eatalusj. Lai bacterias pertenecientes al género Sphiagitmtmttí son uhi* cuas en et suelo» el ag.ua y los sedimentos, y se sabe que las cepas ai^liutiis tle estos ambienles descomponen los compues­ tos aromál iet.fcs y, por Id lanío, se espera que ve la> utilice ftaiirt un remedio biológico para el mcdioambientc.^ Actualmente, se ¡¡abe t¡PC los. miembros del genero Spltin^omoiías pueden dividí r e en cnrun> smjw« filnpcnéticos cíkIii uno de los cu ¡síes representa un género diferente. Fn consecuencia, <e han crea­ do tres ¿íneroí nuevos: Spltingobiwtt, Novosphmftohmni y Sphiu/ntpvxis. además del genero Sphittgmnomis pata acomo­ dar los cuatro jniptw fitogenétieos, " Hl género con^gid» SphittgtmvftQX contiene al menos 23 especies, de las cuales m'iIíi \e cree que S, fmuí'imaNH.v, designada corno csqiecie ii|H» v S, ¡hintpam i'nvhiii.'i tienen importancia clínica. S. piiucimtjbilih, jiiles conocido como Pácudünwnas fhitwimobílis y como grupo ¡lk-l de Ins dXT, c* la especie más común hallada en muestras clínicas humanas. un bacilo móvil |»ramnc{¡alivtt eon un flagelo polar. Sin embargo, pocii*^ eélulas son activamente móviles en culllvu de caldo, lo que bate que ia mtHÍlidud sea urta. característica dilicil de demos­ trar La motilidad se presenta a 18 “C a 22 *C pero no a 37 ^C.-1^ 1 L i reacción de Oxidasa es positiva- aunque OUardi ha comuni­ cado que sólo el 9 l)f tle lav cepas son oxidasa positÍvia-s.-l? luis colonias que crecen en medio de agar sangre tienen pigmento am arilla sin emhargm, esra especie es de ciecimiento lento y sólo pueden observarse colonias pequeñas después de 24 htwan de incubación. Hl L-redmienm ocurre a Í7 l^C, peno no a -12 -= 'C’. y et crecimiento óptimo ocurre a 3C1 "C’.JA| Las cepas aisladus suti i’uertemenie ptísitivas para la hidrólisis de esculma y pro­ ducen una /tina de crecimiento inhibido alrededor de un disco de vancomicina (SO |lg) colocado en agar sangre (¡jchrcekcnbcrger P: nh^crvación pciMinal). En el cuwlro 7-11 se muesiran «Iras caracterfsiicas- bioquínneas. S- patiotiwbfiif! ha '.ido a is la d o de di Minias muestras clínicas, como sangre l LCR. orina: de heaidas. vagina y cuello uterino: y del medio-

ajubicntL". hospitalario . -,>l< También .se lia comunicado bactericniia y pcrimnilis adquirido.-» en ln eojnunidad en paeienlcs que reciben diálisis peritonc-ai ambulatoria pn»ltingada.* Existen algunas comunicaciones de infecciones hospitalarias por 5". pim rwfthitix por contaminación de líquidos d¿ heno* dialÍMs,'-" conlam inación de un sistema de agua hospitalario.5" contaiH inación durante cl pfoccsjhucnio in vilrti de («¿dula ósea para Irasptanlc1^ y sepsis relacionada eon ealetC’ res. También esis,tc una comunicación de hacientemía por Ü. ¡wítcimobifts acompañada por shock séptico en un paciente quemado.1” La mayoría de las cepas son sensibles a iciracieJina. cloranfeaicol, iriijrctoprim-sulfsimctusazol y auiinuglucósidt)->; su vcnsibilitLid u olrus agentes anlimicn.ibianos. incluidas las fluoroquinolonas. varía 1-'-,-í4i*|i Las caraererísticas eel nlaies y de laM colonias de S. panipuucimobiUv son similares y las de S, ptturitnobiti*. Se diferencia de esie último por el ennegrecí míenlo del papel de aceiulo de plumo suspendido sobre agar-hienro de Kligler, la capacidad para crecer y alcalini?,ar el medio de citrato de Sinimons y una reacción de desoíirribonudea^a estracelular negativa.íI-'r Se bín aislólo cepas en muestras clínicas de espino, orina y vayina.^7 Familia Oceanaspirittazcae

GÉNERO BALNEATHIX fínhtfíitrix e^ un género nuevo que consiste en una única especie: J?. uipti ti.'^ Esta bacteria fue aislada p«ir primera ve/ en l'JS ? durante un brote de neumonía y mcningilis c ji ptirso™ UaS qUc CuncUrrieron ll balnearios de liguas leimalcs (37 ^ C ) e n el sur de Francia.1'i r LUi Se produjeron 35 casos de neumonía y dos casos de meningilis. Las cepas, ulein ili cartas en ocho píicteutes fuercm aisladas en sangre. LC’K y espino, y una cepa fue aislada del a^ua. Lu bacteria s¿ describe como bacilos gramnegatavos. recios o curvos, móviles por un solo flagelo polar, acnihitffi est Helos, que crecen caí una amplia gama de icmperanints O í) T a Jf t T h l.as colonias itcnen 2 a 3 mm de diámetro, son convexas y loa>. Rl centro de las colonias es amarillo palillo desputS de 2 a 3 días y pardo pálido luego de -I d/as. E l LnicrLHJígoni smu CrcCc ert agar chuco late y ugar ttipti* casa soja pero no en agar de MacConkey, Bsosidasa p^nsitiv-ny no termentador pero mil iza tle forma oaidativa glucosa, manti­ sa. fnteiosa. maltosa, sor+sitol, maoiittl. glieetol e inositol. Se produce indol v e! nitrato es reducido a nitrito. La gelatina se liidroliza débilmente j la leeitinasa es positiva. No se utilizan los s-igLiiemcs sustratos: ar^inina. lisinq. omilina. ureasa. esculinü, acetíuuirta, almidón y {3NPC3 {ettadro 7-11 j."111'" Se comunica que B, uipica es sensible a la penicilina G y a todos los otros antibióticos p-laeiáinicos y los amínoglucósidos. eluranfeuicol, leü'adellitu, criitiHiiicida, sulÍLunidas, trlnietoprim, oOoxaeina y ácido rnilidíxico. Es resistente a clindamicina y vjncoiiúdnú, "K

OxjIotiaclerjcMe GÉNEROMASSIL1A Familia

El ¡jeneni Masxilut coosis-ie en una sola especie, M. tmmmit, que es un bacilo gramnegativn aerobio estricto y activamente m í vi | (con ll ágelos polares lateniles y únicos í, La Scola y cols.IJ' describieron lucepa tipocoimi oxidasa uegaLiva y aigtntna diliidrolasa positiva: sht embargo, Lmdquíst y cois, comu rucaron que la cepa tipo y taras cualr» aisladas en humanos daban reacciones tle oxidasa positivas y arginma negalLvas,4^1 Las colonias aparecen amarillas pálidast son deíiindamente tenaces en medios de agar y tienden a formar películas sobre la superficie del medio liquido.4' ’ Se produce rícido de forma oxs

B Est ¡gima del d r . VaFbr Eso

MicroorganifliriM móv'ilos con flagelos pelaros

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319

320

CAPlTU LO 7 Bacil os graranogalivw nuferme rttadores

d¿a(Kj lL |Mrln de ¡dimitís hidrato^ de LMrbnflO- l.iOiLqüist s «'I informaron que cuando crecían en inoím OF '.in agregado de hidratos de carbono, las. cepas producían una reacción definídamente alcalina. En consecuencia. una reacción neuim en un tubo cois hidraios de eaífrono era interpretada como débilmenB positiva para la producción de ácido.*1' tiñe! cundo» 1-11 s^flalan curas le-aCeiufiCít inuquftmcas. S e lia aislado mi una herida quirúrgica, LC R . cJ fémur de un pac icric d e 2l) años con osictnnlclUis y en la sangre en otros in s paeicmc>i;w-" N-,<|W' A/. finirmae es ¡.Cosible a la mayoría de Ins. untibitSlicOs y se comu­ nicó resistencia i ¿unpie ilina. evfuloliiia \ j¡f.[n;onam.;,il
GÉKEFID HERBASPm tüM

f-.sle género consiste en pequeñas tisetenas espi raladas de la*» plantas herhíkeiis que licúen semillas. I.as especies de Hrrhmpirütum mui bacilos grumneg¡ith <•*.generalmenteeur^i* y u \en:es helicoidales- U s células individuales tienen rt,6 |Uiti -i 0.7 Un» de ancho y 1,5 um a 5.0 fim de largo- > presentan uno a tres q mis íl ágelos sobre uno o ambos polos.* Mediante estudios de hibri­ dación molecular se ha demostrado que un grupo de cepas aísla* da1 » ci] muestras clínicas anles* desetilo como EF-1 pertenece: íi género ffirbm piiillum y es dcsipnmb como una nueva especie sin nombre* HerbaspiriHum especie l . 1' El micitlijm,an.iSTno es oxidasa positiva y ureasa positiva: [a eatalasa es débil o variable, Olras reacciones se muestran en el cuadro 7-12. Se lian aislad» m cl aparató re-ipifaCnrio, lleves, nrinü. nido, i'jo > sitios de heridiiv ■ ’ No exijiten tintas sre sensibilidad a his antibióticos. Familia Aiterom oaaifacM O GÉNERO SHEWANELLA -GRUPO PRODUCTOR OE SlILFUFlO DÉ HIDRÓGENO Eei I9R5 M ^ O m cll y Cohvid] piflpusieioii e! iiu m i jjéneru Sht:wuitelUi> compuesto por tres especies: S, pittnfitciem i antes PjhW oibojjíi.í pufne/tn?/tris, A/uwtmwtií puttvfaiitns y grupo

(h de los CDC), S. btmedai y S, berthkar4^ En la actualidad, existen al menos 22 especies incluidas en el pineroShnnvirlht. la mayoría de Las cuales se asocian con hábitats acuáticos y marinos; -sin embargo, ln especie tipo, S. puírefaciens, ha sido aislada en muestras clínicas humanas, Lo* CDC reconocen dos hioiipos de .V. putrrjiu ™ '¿obre la luse dei requerí míenlo de NaCl pora drLcíiniciitp, cttidjcifín Je sacjrtj^a y uulUiim, y Id capacidad de crcecr en agar para Salfítumlhi-ShigeHu íSS >.fli Owcn y eols,-“ Than mostrado que los microorganismos identificados como 'i c comprenden ni menos, cuatro gnipí« ptiivániicos bien sgpamdos (¡-IV). Sobre la h w *k: |j> pro­ puestas taxonómicas de No/ue ycols..'"u y Simidu y cok,,™ las cepas que pertenecen al grupo genómico IV de Oven (sinóni­ mo de biotipo 2 de Ins C P O deben identificarse como 5, algo {corregido a S. tilxtie).7* Khashe y Jandaw: fian co-munieaclo que A. ttigfíe es la cepa humana predomíname aislada en muestras clínicas (77**:), mientras que i pvtrrfiteiam (biolipo l de ttjs C P ) representa k mayoría de las eepas aisladas en no humanos {S9T:). ¿\ tiiijtií icqaiere NaCl para, sli ereíintiemo, rrrieuü-iLs que S. piltrefariem, no (coadnl 7-13). íjjs, cepas de 5. pií¡r?h\rím i y S. digne son oxidasa positivas y móviles por medio de f ágelos polares. Se dMinguen fácilmente porque son U>>únicos no fermcnladores que producen iulfuro de hidrógeno en rnedLos K IA y TSI. Todas las cepas ssin positivas para omitina desearboíídaüa, nitrato redtielasa y DNasa. Las colonias producen un pLgmcnln naranja tostado en medio de agar sangre. Aunque su aiMjmíenlo clínico es infrecuente. ,V, pnírefiicitfís y S. itlgtte han '■ido asociados CUU ükejxis Cutáneas.' 11' f ........ " iufcMiones ólieas/1 :u751infecciones oculares^- ajltitis \ oslcomiclitis.l’hW<>bactcriemia,!'LH<-,'1J^J'lM:5Krí'<1|MI endocarditis infeccio­ sa st y perinsEirns en paesemes que terihem diálisis penicmcul ambulatoria continua.1-TVarias cepas estudiadas en cE laborato­ rio de nueiuhitíUfgfa de Iw Uuiven.ily nf flliiwdt lun sido aisla­ das en lioces. dlccfiis saetas por decúbiu). úlcetiss de los miem­ bros inferiores, bilis, humor vitreo y sangre. Es probable que

Cuadra 7-12 FíaiSnnioiunialcs ™ ™ s L A JU B A C T E R H O N G K O X G E ftS íS '

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Microorganismos móviles con flagelos polares 321

Cuadro 7-13 Fxudm tiiH U k» tuLQfftfc»*, su IFuro de Uidrójttno-positivos o untos

5J/ElM .VÍiM í PRLÜD A O lid as MatUiJbd C i k ¡jiií £d1d mi ngbrde M k C obIüív Crft'Lmiettttf di KaCl t\ fivW HjS («tremo TSfJ Ciwi-micnU» a. 42 Gturan, OF M tlln a OF

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muchas Je Im iiifecdom» que se informaron eauüadau piir £ ptttnefiM-.icw huyw sidoprovw Kb por S. algo*:-' " r! En gene­ ral,, Im shewanelas- .son sensibles a la mayaría de tafc antibióticos eficaces contra bacilos gramnegaiivos,, salvo penicilina y cefalotina/1'^ Algunas investigaciones recientes han señalado que las CIM medida;* de S, aígae a peni d lina, ampkilina y tetradcltna eran nils alus que las CIM correspondientes de & puirvfüdtti5?Km

GÉNERO ¿UítffHKAeU-GAUPÜ KhlOFÉLICO Alúthvwanefla fmalLs es un bacilo gtathiiegitivtt halofflico que crece a temperaturas d e entre 25 “C y 42 "C. con un c jc c Ímicniú Óptimo a 37 °C.. Se requiere NaCI pura su ciocimirnto. Puede soportar concentraciones de NaCI de hasta un 8%, pero rt» trece en NaCI al 10%, lo que ayuda a diferenciar esta espe' de de S. algue, que puede crecer en NaCI sil I0% .TTFAdemás. l l diferencia Je S. atgae* es positivo para hidrólisis de esculinii. Es oxidasa positivo y cataln&a positivo y asacarolítico. No pro­ duce HyS en ei extremo de T Sl y K IA . En el cuadro 7-1J so proporcionan otras reaccionen, Ha sido aislado de un feto humano cu ¡a necropsia; sin embargo* su asociación con infec­ ción clínica es incierta m Fafniiía Hatomautlateao GÉNERO HALOMGNM

Hatomonas venusta fue descrito al principio como Afcaligwex vtiiustus.1'7pero más larde fue transferido ai géne­ ro nuevo Dekya, como Deieya vtmtxta, por Baumann y coEs.H En 1996,. Dwbücin y Franzmann propusieron combinar el géne­ ro Deteyu en un género más. ampliamente definido, Hahmanas.™ Vbn Graevenitz y cois, fueron ios primeros en

eumunÍL-jr una LnfeedAn. humana causada p o r ti. en una herida provocada por la mordedura de un pez.711 Estos autores informaron que cl microorganisí.n»n creció en los agares BAP y de MacCunkey y se presentó L'umo colonias mucoides & incoloras, Se produjeron reacciones, positivas eon nitrato, urca y csculina, En el cuadro 7' 13 se proporcionan oirás reac’ clones bioquímicas. Se notifica que H, venusta es sensible a la mayoría de los ajilEbidLkos.7tl E l grupo í do no fermentadores halofílkos de los CDC com­ prende seis cepas fcmHípicamcntc similares recibidas por los CDC entre 197II y I99H que son semejantes a H. wjrruffa salvo pOí la hidrólisis de csculina > ■la compusicidn celular de ácidos pasos. Cinco de cssas cepas se aislaron en hemocultivc» llama* nos, la sexta se identificó en cl cultivo de urja henda de cadera fCDC; dalos no publicadctíi Faitilika Me1tfyiat)3Glwí3£&>e

GÉNERO MmmOBACTEftm Las esjltícjes de Mclhytobatferíum síift hazte ria.L, prumne|íativas de color rosado que tienen la capacidad ¿le m ilitar meta­ no Cn forma facullaliva,177 Se reconocen 14 especies’ M. tm i* riarnruns. M. chkm nwthm km i. M. díchfamnethimkwn, M. extorquen** M. fujisatt/iuuse, M. lusiiuñitm. .V, írte-yophdivum. M. organophitmn, M. radioíolemns, Al. rímdesiamm, AJ. thadimtm, jW. suamiensv. M. ihiacyemcttom y A/, zatftmnii) y otras biovariedades no asignadas sobre la base del tipo de asimila­ ción. de carbono, e[ tipo eltclroforéiico y el dgrupamient» por homología de DNA'DNA..IV-3T7,ZT,,;w M. mempfdHcmnr antes cLisiiieado como P.fevdpwwuif ttwsophiliea y l'Um e exwtquenx, es la espede aislada mis a menudo de muestru* clínicas humanas Se comunica que los microorganismos, aislados son oxidasa positivos y móviles; sin embargo, la reacción de o k í -

B Estignnadel dr.V aF brE so

322

CAPITULO 7 Bacilosgrarn^egalivos na firmentedouss

Cuadro 7*14

O iffliíe rfo iio iw , i t uir s

PRU EBA

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ins im c iiiio iiiM M b ilo i «ro# pi^ntt'ou» itmadn E S P E C IE S OE M E T T iT LO B A C T E U lV Á t

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BítilO * CiKnWfr

ir mtnjn dr j év™ íííucíí.'j!.• 1 i f -09'T>d i', rpw{K>}iti*ál; OF. pjnd*:*fñi-ft:rmtnlu> tón.

dust puede set débil y puede- üer difícil demostrar la inutilidad. En nuestra experiencia* todas, las cepos esperadas han parecido inmóviles. Otras rcaccioncs claves son prueban posimms para catalasa, urcasa y amilasa (cuadm 7-141. Se pueden observar características diferenciales adicionales en el articulo de V'rakami y cols.T,T Las cepas aisladas tienen un crec imíenlo lento en los inedia urdiaari
ción débil, que aparecen en pares o cadenas cortas, principal­ mente con cocos y sólo algün bacilo ocasional (i’íttc lámina en color 7-3G). Crecen en agar sangre «fe camero al 5%, agar cha* eolaie, agar carbón con buífer y extracto de levadura (B C Y E), agar de Sabouraud y,, casi siempre Í9|ífc). en agar dé MaeConkey, El ciecimicnlo ocurre a 25 "C, 35 T I y habitutdmenle 42 ,-C y aparece comti colunias pu aliformes, rosadas pá­ lidas, brillantes,, elevadas, no ira ementadas y a menudo mucoi* des después de 2 li 3 dias de incubación a 35 "C (Lámina, en eoior 7-H l). Todas las cepas son débilmente oxidasa positivas ía menudo después de JO segundos) ti oxidasa negativas» catalasa posithas y uicíish positivas (véase cuadro 7-14). El géne­ ro Roscoriit/fiut fue descrito inici nlnlcmc en 1993 para incluir tres cspccics con nombre, R. xilardii, R, cervkaíis y R.fauriM . y (res genomucspecics sin nombre igenomoespecies 4, 5 y b),r“ Hace poco. Han y cois, propusieron una especie nueva,. Roseotnortut mucosa y una nueva subespecie^ R, gUtirdü subespccic vosea (en diferenciación de R, gilardii subespecie ¡¡¡iaríí«).a" Se han informado especies de ffasrwmmw en varias comunicaciones de casos únicos de infecciones de sangre o relacionadas con catíter& ai7wiwi!wrtv11* También sé publicó un caso de osteomielitis vertebral causado por especies de Roscaumnas** * y dos casos de peritonitis, uno debido a R. gHantii^'* y otro debido a N. jtm ria ^ en pacientes sometidos a diálisis peritoneal ambulatoria continua. En comunicaciones de casos múltiples alrededor del 60% de las cepas aisladas fueron de sangre con un 2Wb de lierúlib, exudados y abscesos, y alre«lotor det 10% de sitios genitourinarios.1 En el Uníversity of Illinois Hospital, hemos aislado 21 cepa* de bacterias con pigmento rosado en muestras clínicas, principalmente san­ gre; Ib de ésuis se ajustan a Ja descripción de Ro.mtmonas y 5 fueron identificadas como Mfdtyhihmtcrifmi. Hemos observa­ do que las Roseütavtitís! crecen muy bien en agar de Sabouraud y producen colonias nuicoides rosadas claras (a veces, líqui­ das}. Los microorganismos no aparecen negros citando se Los visualiza bajo lu* ultravioleta. fspsct es sin nombra

Se incluyen a continuación algunos microorganismos con características de pseudomonadales y que carecen de nombre oficial.

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Microorganismos móviles con fiígelo© polares 3 3 3

* Grupo 2 si mil ¡ir ti Pm id amonas. Es un ¡¡rujm no clasifi­ cado cte microorganismos similares a Psáiufomttna! que SúiWii %i¿ú incluido en el yrtipo PVd tic kis CDC, Lis Cepas son oxidasa positivas y móviles. Se comunica i|ue las coló* nías en agar sangre tienen ima consistencia pegajosa y es difícil elimituiH&s.^ Otras caracteris-tiens íctenlincadftra-s son crecimiento en agar de MacConkey1 . oxidación de gluCflsa, * i losa. manitol y lactosa; hidrólisis de urea; y reaccio­ nes negativas para indol, nitrato, hidrólisis de esculina y oxi­ dación de sacarasa y maltosa.1'*1Son similares a B. gladioU pero na o í ¡dan dulcitol ni inositol.™'1 La mayoría de ¡as cepas (66%) son resistentes a la colistina.24* En casos clíni­ cos se aislé en muestras del aparato respiratorio. sangre, líquido cefalorraquídeo. heces. orina y en líquido de diálisis. (“dialisado^1* ™ * * * ■ Grupo W O -I de los CDC, Se trata de la designación dada a un grupo de bacilos gramnegativos débilmente oxídativos aidadúüi primari ámeme de muestras clínicas. Esios bacilos oxidan maniEnl y glucosa, a menudo débilroenie y a veces en forma tardía {3 a 7 día*} y reducen el nitrato. La mayoría de las cepas son móviles, con uno o dos flagelos polares; sin embargo, IA motilidad suele ser (ardía en medio para motili­ dad o se detecta sólo medicóse un preparado húmedo. Las cepas suelen ser oxidasa y catalasa positivas. Algunas cepas producen pigmento soluble (amarillo. tostado. ámbar, verde oliva o p id o 1 ). Otras características diferenciales se pueden hallar cu el artículo de Hollis y cois.'1,1Es probable que Las cepas CDC WO-1 que oxidan xilosa y son citruto positivas sean Arufav&rm detajicidu, mientras qLte las cepas WQ. I A que son xilosa negativas y citrato negativas, sean Acietíh'ora.'t tempercuta.*0 La» cepas caracterizadas por los CDC se han aislado en sangre (33%), LCR (lOQfX orina, pulmón, herir das y algunas fuentes ambientales.114 ■ Grupo le de ios CDC* Los miembros del grupo le de tos CDC son bacilos gramnegativos delgados cortos a talgos y móviles con uno o dos flagelos polares. Los miemorganio­ nios. crecen bien en ios agares Je MacCnnkey. SS y habituaJmente celrimida; oxidan glucosa y maltosa; reducen, nitrato a nitrito sin gas; producen IE S eti papel de acetato de plomo (casi siempre tuerte); son aiginina dihidrolasa positivitó; son urcasu y citrato variables; sor negativos para la hidrólisis de eseulina y gelatina; y crecen bien u 25 *C, 3 5 T y hábil nal meme 42 X . La mayoría de Iws cepas aisladas provienen de fuentes humanas, que incluyen orina, esputo, sangre y otros sitios.1®1 No existen datos de sensibilidad a los antibióticos, * Grupos O-1»0-2 y 0-3 de tos CDC- Los gfupos O-1.0-2 y 0-3 de los CDC son fctciUM gramnegativos fenotípieamente similores, móviles y por lo general oxidasa positivos. Los grupos 0*1 y 0-2 tienen pigmento amarillo y se ase­ mejan muy estrechamente ai grupo aman lio de Agm* bacterítan y a las cmpecíes tle SftiiingoiiuNM ii tcuudru 7- i I

Estos microorganismos crecen poco o en absoluto en agar de MacCudkcy, suelen hidroli/.ar l.i csculinu. pero pofcua pane son inactivos. Todos &on móviles, aunque puede ser difícil demostrar la motilidad. Los microorganismos. 0-1 aparecen como bacilos gramnegativos uniformemente cor­ tos. los microorganismos 0-2 aparecen como bacilos ligera­ mente pleomurfos, algunas células aparecen delgadas en la porción central con extremos engrosados y Las células 0-3 aparecen como bacilos curvos delgados, intermedios a lige­ ramente largos Con extremos aguzados (en forma de ho2 ).1MIK Los microorganismos 0-3 constituyen el único grupo en cl cual no se produce pigmento tfce crecimiento

amarillo y es el único grupo de bacilos predominantemente curvos (cuadro 7-12). La tinción de Gram de las colunias después de 18-24 horas de cultivo en agar-infusión de cora­ zón muestra bacilos curvos delgados, intermediuss a ligera* mente largos con extremos aguzados (en forma de hoz) que a veces forníaO Tusctas.16* La mayoría de las cepas Je 0-3 crecen bien en placas de C A M PY CVA (agar para CampyUthat-fer con cefoperazona. vancomicina y anfoteriema B ) en condiciones micmacrófilas, lo que crea Ja posibilidad de una identificación errónea de los microorganismos 0-3 cocno Campylobacter.11* Las cepas de los tres grupos O han sido de distintas fuentes clínicas. Se informó un caso de neumonía asociada con el grupo O l complicada por una fís­ tula htoncQpiilmottfaii' y hacieriemia.^ S ó lo $e han comuni­ cado dalos de sensibilidad a los antibióticos para el grupo 0-3. Todas las cepas evaluadas fueron sensibles a tos arninoglucósidos» trimctoprim-sulfamctoxazol e imipenem. Se ohicrvíli resistencia a la mayoría dt Ifts ¡Í-l.tL'UÍcJTÍcnS y una sensibilidad variable para cloranfenicol. tetraciclina, eiprofloxacina y ainoxícilina-davulanato.1H * Grupo aniariílo de Agrobacterimn. Los microorganismos de este grupo están representados por bacilos gramnegativos delgados, intermedios a largos q«e producen un pigmento tic crecimiento insolublc amando y se asemejan mis estrecha­ mente a Sphmxtmmmn pauctmtdt¡lt.\ y microoiganisrtwa grupo 0-1 y 0-2 de los CDC. O crecimiento en agar de MaeConkey varia, la motilidad ocune a través de un único flagelo polar, y Ja oxidasa y ¡a catalasa son positivas; ox idan glucosa, xikisa, lactosa- sacarosa y maltosa, pero no manitol. la t reacciones a Jos hidratas de carbono pueden « r débiles, tardías o ambas."11 Una reacción de 3-celotaclona positiva y una renceiór de lipasa y DNasa negativas diferencian este microorganismo de £. paudmobiiis (cuadro 7-11). Las cepas se aislaron en sangre y liquido peri¡toneaLn"T:4jra * G FBA -L OFBA-I es un bacilo móvil gramnegativo inter­ medio a largo no da si fi eaiiu con uno o dos flagelos polares que tiene la propiedad inusual de producir ácido en medio de base O F sin hidratos de carbono; de ahí d nerón imo “01‘BA ” . que significa * tJI; Base Acid". El micitnarganisníO se asemeja más estrecha mente a P. aentgmma desde el punió de vísta bioquímico debido a la ¡3*hemolisis^ el creci­ miento a 42 "C. la presencia de arginimt dihidrolasa, la reduteiól’i de nitrato a Lias y la mili/ación de la rtuiyu-rfu de los hidratos de c a r b o n o . A diferencia de ñ üent#tnosa< es negativo para ln producción de pioeianina y pioverdina y la hidrólisis dé acctamida, Se ha aislado en sangre, úlceras de la* piernas, heridas abdominales, fajado bronquial e infección del túnel de un catéter en un paciente en diálisis peritoneo] ambulalorta aintinua."v' kl" Lsdhsctsr hanakanjensis

Sobre la base de la afiliación íiEogenética, esta bacteria per­ tenece a la familia Neissgriaceae y es un bmciln no csporolado anaerobio facultativo. L n la tinción de Gram los microorganisrnns apiírecen étimo han los gramnegativos enn Sorwia de gavio­ ta o espiralados. Crece en agar sangre de camero como ooloniíLS grises no hemolítícas de 1 mm de diámetro después de 24 horas de incubación a 37 *C en aire ambiente, E l crccLniicnto también neurre en agar de MacCnokcy y a 25 flC a 42 ®C. No se observa ningún refuerzo del crecimiento con CO , al 5%. La mayoría de las cepas son móviles eon flagelos polares. Todas tas cepas son oxidusa, caniflasa. ureasa y asinina dihidrolasa po­ sitiva* y reducen nitrato, pero no tennentan. oxidan ni asimilan

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CAPÍTULO ? Bacilosgramntgatlwrenalannenbdam ningún lúdraio de carbono (cuadro 7*12).1lllx L tuMgkthtgeitsis ha sido aislado en la sangre y cl Líquido pleural de. un paciente de 54 míos con cirrosis*1* y de ku deposiciones de pacientes con diarrea c.\crahmspi u Iaria.4’4-®1:MÍ W ™ y cois, han comunicado una asociación em e L hñttgkongensix y diarrea ¿strahospitalaria, la ingesta de pescado y l‘I i Laje;BJJ sin embar­ go. no se ha, dcmosliado un papel causal/1* L hmgkongemfs se hu noüJIcsido cu países de Asia (China y Japón), Europa (&UÍ7J), Africa (Túnez) y América Central (Cuba)* lo que sugiere que 9a bacteria se encuentra ea iodo cl imindft.111 Sin embargo,, en el momento en que se escribe este libro, no se lia comunicado su aislamiento cu America del Noric,

Microarpanisnios móviles con ftegefos peritricos Famiiia AtougemceM

Esta familia incluye tos generas de relevancia clínica Ahxdtgenes, Áchmmabaeter, Bonieieltfíh Kerstershi y OUgeilü.ití" ': Los miembros de la familia AlcaHgem ctve son bacilos granv negativos que suelen ser oxidasa positivos-, crecen en agar de MacConkey y son móviles por medio de íliigclw pcrilricos. Las características bioquímicas que diferencian a. los miembros (3c esia familia,. así coma otros ciertos fermentadores con carne* leréstieas bioquímicas similares, se detallan en Jos cuadra 7-1 í y 1-16,

GÉNERO ALCAUGEMS La taxonomía del género Airniigrne.í; esü estrechamente enueiejidii con la del género Achmmobacítr, y ahora varias especies de Aktiligenes han sido rcclasificadas cttmo especies de 4 ckmmobactcr.*7' A. fitecaft.\ ej¡ cl nuejubm de Ah'uligenaccae aislado con mayor frecuencia en el laboratorio clíni­ co. Los miembros de esia especie provocan reacciones alcali­ nas Hiedes en lodos los medios con hidratos de carbono. La mayoría de las cepas forman colonias característicos con un borde delgado de propagación irregular i véase Lámina ea color 7-4A). Algunas cepas (antes denominadas A, adamm) produ­ cen un olor frutal característico (a veces descrito como de «íar»Eiinds verdes) y un cambio de color verdoso en el medio de agar sangre. Una característica bioquímica clave de esta especie es ¡til capacidad para reducir nitrito pero no nitrato, A. faccuiis existe en el suelo y en el agua y ha sido aislado de muchos tipos de muestras clínicas, fis una causa rara de milis aguda, infbo cién de las vfas urinarias y taacterieiniu-1*6 La mayoría de las infecciones son oportunistas y w adquieren por elementos húmedos, como nebuliiodores, respiradores y líquidos para lavado. A menudo se encuentra en c u Eli vos mulos, sobre todo en muestras de ilLeeras diabéticas de Los pies y los miembros inferiores y su importancia clínica es difícil de determinar. GÉNERO ACMQMC8ACTÍR EL género AcfirpmohacteK descrito en t^fil porYabuuchi y Yano,R31contenía al principio una dnica especie: M írra ^ Ja r¡er xyfosoxidans, Sobre Ea base de estudios taxonómicos. Yabuuchi y cois, transfirieron las, especies AIcaligenex n th lw eiii v A ícalipenes picchtmdii al género AchrmmAmcter y propu­ sieron la transferencia de Afcuiigenex drmsrificmx al género Achnm útocttr como Achftmtihat'ter xyUmtxidimt subcspecíc denUrijicans.^ lo que creé así aulomálicamcntc una segunda subespecie, Avhwntabacler xvloxtaidans subespecie xvlmaxi-

dunn. Sin embaí pn. la recias itreaeidn d i Ate» f¡genes dvm trifi' cutis coino una subespecie de Acftrvmotmaer xyfa*ox¡daRs contradijo la investigación previa que mostraba que los dos taxones son especies distintas.™ En concordancia, Cocnye y cois, propusieron que Aathgenes drn¿tnficanj¡ fuera reclasiíV c«locomo'Ac^mtni?fc)cícrtíífííri't>!oÉm,fHU*Éi! este (esto, iraiamos estos microorganismos como especies separadas, refirién­ donos. a ellas como AcftrotnúbtíL'ter xylasoxidtiits y Adm.KhriíJ-bíictrr denilnficam . respcctivilmente. A los Unes, de Jü identifi­ cación. las especies de Arhtntnphacfer pueden ser divididas en tas especies asaearol fricas y sacarol fricas de acuerdii eon su capacidad para oxidar OF glucosa (cuadros 7 *lí y 7-16). Espesies isacitúíítícasdo ftchramabacter. A. piedm uiii fue des­ crito por primera t o en 1986.^ ruede distinguirse de otras especies de Afra/rtrínM por sus capacidades para reducir nitra­ to pero no m ilito y crecer en cloruro de sodio al 6.5^ (véase Cuadro 7-15). Aunque se informó que esta especie ha sido ais­ lada principalmente de material clínico húmalo, sólo existen raras comunicaciones de un posible papel patogénico para ella, Se informo un caso de secreción óticj crónica en un varón con diabetes*71 y un caso de baeteriemia recurrente en asociación con un catéter intravenoso en un anciano inmunLHleprimido.JTÍ Las cepas de A. demtrijicans se encuentran en cl suelo, pero en ocasiones se hallan en muestras clínicas humanas. Se han comunicado aislamientos en tubos de recolección de sangre, sangre, oído, LCR y orina TIUSe aisló un microorganismo bio­ químicamente similar a A. xyfaspxidans subespecie denitriftcan.t. conocido como pupo similar a A la d ¡genes 1, de sangre, absceso encefálico, orina, lavado bronquial, aírieulación de la rodil ta y agua, lo que sugiere que puede tener mayor potencial para, producir una infección humana, Puede ser diferenciado de A. demfHfitfmx por la composición celular de ácidos gra­ sos. 9a Salta de crecimiento en agar SS, la taita de alcalini/ación de lailrato y aectamidu. y una reacción de urcasa positiva (cuadro 7-t5).w': Hace poco. Cticnyc y c o k 11 describieron dos cspccics nue­ vas de Achtumobiicrtr a&aean)líLicj: A, insutitux y A. .\panius, las cuales pocas veces se encuenlran en muestras clínicas humanas. Ambas son oxidasa y caralasa positivas y reducen nitrato sin formación de gas, Ambas son asacarotíticas y desde el punto de visca bioquímico es difícil separar una de otra y tle otras especies de Achnmüfraci-er y de Atcirfigenes facra fis,1*' A. rhulandU es un comensal del suelo y no se sabe si es pato­ génico para los seres humanos.^ "Especies sacítúHffeas tíe Achromobacter. A .K%-hmmdam se dis* tingue fácilmente del género Atcaligenw y las especies asaca* ralílicas de A^m m aím ctef por la icidificKíón de glywjsa y xflvN&a O F (de ahí el nombre de la especie?. Ha sido aislado de muchos tipos de muestras, principalmente de fijiig « 4,,mi:iS*'Wf perca también de LCR, lavadas bronquiales, orina, pos y hen daR.M3Lm?4ffl Puede ser un patógeno oportunista del que ,se ha comunicado que produce 'infecciones hospitalarias, entre ellas neumonía, baeteriemia y meningitis, en pacientes con enfer­ medad subyacentes™21^1* Se informó que A. xylosaxidtms coloniza al apitrato respiratorio de niños ititubados y de pacien­ tes con librosis qu{$iicA y que 3a colonización de <sw« últimos se asocia con una exacerbación de Iík síntomas pulmonan a M ísr Holmes y cois, separurm Ins acrorraibacEervs en seis grupos (A—F) sobre la base de los pulnmes genéticos. I" Achmmohactrr grupos A. C y D construyen una ónica esf^cie y se obser­ vó que eran idénticos a Oiiintbdiwutti antltmpi.m Aehm * imrbíicter grupos B y E constituyen biotipos de un género nuevo único y cspccics que aún no han recibido nom-

B Est igma del d r . VaFbr Eso

Cuadro 7-15 Características claves de Alcaligenes, Achromobacter asacarolíticos, Kerstersia, Bordetella y especies relacionadas" ALCALIGENES

PRUEBA Oxidasa Motilidad Crecimiento en agar

ACHROMOBACTER

CDC

KERSTERSIA

BORDETELLA

OLIGEI.LA

CUPRIAVIDUS

A.

A.

A.

Grupo 1 similar

K.

B.

B.

B.

B.

O.

C.

C.

faecalis

denitrificans

piechaudii

a alcaligenes1"

gyiorum'1

trematum'

hinzii

avium

bronchiseptica

ureolytica

paítenlas

gilardii1

-

-

V

+ +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

-

+

-

V (66)

ND

+ + +

+ V (84) V (79)

+ + +

ND

-

-

V (1l)b

-

+ +

de MacConkey

N 0 3a N 0 2

+

+

NO, a N2

+

-

+

Glucosa OF Xilosa OF

-

-

-

+(92)b

-

+

-

-

V (58)

—

-

N 0 2 a N2

+

+

-

+

-

ND

-

-

V (63)

—

-

Urea

-

V (31)

-

V (75)

-

-

-

++

++

++

-

-

-

ND

ND

ND

V (15)

V (25)

+

V (7)

ND

-

V (ll)

PAD Acetamida

+

V (45)

V (42)

-

-

V (89)

+

-

-

NaCI al 6,5%

+

-

+

V (13)

V

ND

-

-

-

-

-

Malonato

+

+8

V (29y

ND

-

+

+

+

ND

ND

ND

Flagelos

pe

pe

pe

pe

ND

pe

pe

pe

pe

pe

1-2 p

+

pe

“A menos que se afirme otra cosa, los datos provienen de la referencia249. hPorcentaje positivo derivado de la referencia*02. cSimilar a A. denitrificans, puede ser diferenciado por la incapacidad para crecer en agar SS. ‘‘Datos tomados de la referencia140. eDatos tomados de la referencia755. fDatos tomados de la referencia'34. KDatos tomados de la referencia399. +: 90%o más de cepas positivas ; 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89%de cepas positivas; pe: flagelos peritricos; p: flagelos polares; ND: resultados no disponibles; OF: oxidación-fermentación. Los números entre paréntesis son los porcentajes de cepas que dan reacciones positivas.

Microorganismos móviles con flagelos peritricos

-

V (ll)

325

326

C a ra c te r ís tic a s claves d e las esp e cies d e O ch robactru m , R h izobiu m y A ch ro m o b a cter sa c a ro lític a s" RHIZOBIUM

AGROBACTERIUM

O. anthropi O. intermedium1’

R. radiobacter

“Agrobacterium grupo am arillo’*

G rupo B

+

+

+

+; pe

+; pe

Crecimiento en agar de MacConkey

+

Glucosa OF Xilosa OF

PRUEBA Oxidasa Motilidad

ACHROMOBACTER

O F B A -r' A. xylosoxidans

G rupo E

G rupo F

+

+

+

+

+

+; p, 1-2'

+; p, L

+; p, L

+

+; pe

+; p, 1-2

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactosa OF

-

+

+

-

-

-

Manitol OF

V (50)

+

-

+

-

+

-

+

Adonitol OF

+

+

-

-

-

+

-

ND

Dulcitol OF

+

+

-

-

-

+

-

ND

ONPG

-

+

V (4 0 /

+

+

-

-

-

N 03a N 02

+ (98)

V (84)

V (40/

+ (1 0 0 /

+ (1 0 0 /

¥

+ (99)

+ (100)*

NO, a N2

+ (91)

-(8 )

ND

+ (100)'

+ (100)*

ND

V (69)

+ (100)*

+ (100)**

+ (100)**''

V (5 1 /

ND

-

V (50)

+ (9 9 /

V (38)*

J

Urea

+

+

-

+

+

+

PAD

+

+

-

ND

ND

ND

-

+

Acetamida

-

-

ND

-

-

ND

V (66)

-

V (40)

+

+

+

+

+

-

-

-

Amarillo

-

-

-

-

-

N 0 2 a N2

Esculina Pigmento

-

"A menos que se afirme otra cosa; los datos provienen de la referencia249. bSe ha sugerido que la resistencia a la colistina diferencia O. intermedium (resistente a la colistina) de O. anthropi (sensible a la colistina).77' ‘Datos tomados de la referencia724. dDatos tomados de la referencia7X3. Móviles a temperatura ambiente, inmóviles a 37 °C.724 fDatos tomados de la referencia327. KDatos tomados de la referencia802. hCuando se evalúa a las 48 horas de incubación, es posible que la reducción de nitritos sólo se observe en medios que contienen <0,01% de nitritos. ‘Holmes comunica una reducción de nitritos negativa para Achromobacter grupo E.327 + : 90% o más de cepas positivas; 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; pe: flagelos peritricos; p: flagelos polares; L: flagelos laterales; ND: resultados no disponibles. Los números entre paréntesis son los porcentajes de cepas que dan reacciones positivas.

7 Bacilos gramnegativos no termentadores

OCHROBACTERUM

CAPÍTULO

C uadro 7 -1 6

M icroorganism os m óviles con flagelos peritricos

bre.-¡7-18,322 Achromobacter grupo F es genéticamente distinto ¿te los grupos B y E .317,318 Las pruebas bioquímicas útiles para _ -paración de Achromobacter grupos A -F de bacterias feno-r.camente similares han sido comunicadas por Holmes y : ais - Achromobacter grupos B y E pueden ser separados de 0 anthropi por las propiedades de ser O-nitrofenol-galactósi1 O N PG) positivo y esculina positivo y por no producir ácido . partir de adonitol y dulcitol.322 Los Achromobacter grupo F son similares a O. anthropi salvo en que no producen gas a par­ ir je nitrato y no crecen en agar de MacConkey (véase cuadro 16 . Achromobacter grupo B ha sido aislado en la sangre de 7-.:entes con septicemia317’321,363y en un paciente con endocari :: - Je válvula protésica.495 También se han aislado Achromox c r e r de los grupos grupos E y F en la sangre.317,318

327

causa. Se ha comunicado que origina neumonía en pacientes con SID A ,8,178,181,2°3,234,456,498'534,816 leucemia aguda,264 fibrosis quística787 y traumatismo torácico613 y luego del trasplante de médula ósea54,126 y del trasplante cardíaco.117 Existen dos co­ municaciones de bronquitis causada por B. bronchiseptica: una en una mujer anciana576 y otra en un paciente inmunodeprimido.497 La mayoría de las cepas de B. bronchiseptica son sensi­ bles a casi todos los antibióticos, con excepción de ampicilina, cefamandol y cefoxitina.266 B. avium es un patógeno de las aves que produce coriza o rinotraqueítis en aves de corral, sobre todo en pavos.387 Similar a las especies del complejo B. bronchiseptica, B. avium mues­ tra un fuerte tropismo por el epitelio ciliado de las vías aéreas superiores. Bordetella hinzii . denominada antes Acaligenes faecalis tipo II o similar a B. avium, ha sido aislada del aparato respiratorio aEXERO BORDETELLA de pollos y pavos en distintas partes del mundo. En los seres En la actualidad, el género Bordetella comprende ocho espehumanos se ha aislado en la sangre149-378 y el esputo,232,758 con . í - cuatro son móviles con flagelos peritricos (B. avium, B. reiterada recuperación de la bacteria en el esputo de un pacien­ rrnr.chiseptica, B. hinzii, B. trematum [cuadro 7-15] y cuatro te con fibrosis quística.231 B. hinzii también ha sido aislado de k o inmóviles (B. holmesii, B. pertussis, B. parapertussis, B. múltiples muestras biliares recogidas en 6 meses de un recep­ petri [cuadro 7-21]). Las tres especies humanas más frecuentor de un trasplante hepático con colangitis.27 B. hinzii son e B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica , no puemóviles y oxidasa positivos y deben distinguirse de los micro­ iec >er diferenciadas genotípicamente mediante estudios de organismos fenotípicamente similares, como se muestra en el indoiogía de DN A y es probable que sean subespecies o cepas cuadro 7-15. ce una sola especie con diferentes adaptaciones del huésped.569 Las cepas de B. holmesii han sido aisladas principalmente en 5 " embargo, desde el punto de vista fenotípico se comportan sangre humana.280,444,494,508'535,683,731,801 Shepard y cois, analiza­ Éc m xio muy diferente; B. bronchiseptica es móvil por medio ron en los CDC las historias clínicas de 30 pacientes con bac­ te flagelos peritricos y crece fácilmente en medios comunes, teriemia por B. holmesii cuyos cultivos fueron remitidos a estos ■Éentras que tanto B. pertussis como B. parapertussis son centros para su identificación. De los 26 pacientes de los que se mdó\ lies. B. pertussis requiere medios especiales para su cre­ dispuso de datos, 22 (85% ) estaban anatómica o funcional­ cimiento, en tanto B. parapertussis crece en agar sangre, agar mente asplénicos. B. holmesii fue el único microorganismo ais­ c k \ .ate y agar de MacConkey. B. pertussis y B. parapertuslado de las muestras de sangre en 25 (96%) de los 26 pacien­ m son los agentes etiológicos de la tos ferina (coqueluche) y tes.683 A pesar de las comunicaciones iniciales de que B. hol­ ’c explican en detalle en el capítulo 9, con los bacilos gramnemesii no causa enfermedad respiratoria, los pacientes pueden gtevos con requerimientos nutricionales especiales. estar infectados o colonizados por B. holmesii en la nasofarin_ colonias de B. bronchiseptica crecen bien en agar sangre ge. Un científico del Massachussets State Laboratory Institute y isar de MacConkey y en 24 horas aparecen como colonias comunicó el aislamiento de B. holmesii, pero no de B. pertus­ io s translúcidas e incoloras de alrededor de 1,5 mm de diásis, de 32 muestras nasofaríngeas recogidas en un período de 3 r e r En tinción de Gram, los microorganismos se presentan años de pacientes con síntomas similares a los de la tos feri­ • o : cocobacilos pequeños. Tienen la característica bioquímina.494,381 Loeffelholz y cois, demostraron que B. holmesii daba a definida de convertir rápidamente el agar urea de resultados positivos fuertes con su ensayo de PC R para B. per­ ~rr -Tensen (véase lámina en color 7-2A). Otras características tussis IS481, lo que confundía la confiabilidad diagnóstica de ^ r'r'.ciales se muestran en el cuadro 7-15. B. bronchiseptica estos ensayos.454 Russell y cois, comunicaron un caso de neu­ < encuentra en el aparato respiratorio de animales mamíferos monía intersticial y lobular con progresión a la fibrosis pulmo­ tenésticos y salvajes como perros, gatos, conejos, roedores, nar causada por B. holmesii.652 Se informa que B. holmesii es e r i l :■s y cerdos (“ bronchiseptica” deriva de la palabra griega sensible a amikacina. ampicilina, cefazolina, cefotaxima, ceftahus. que significa “ tráquea” ). Es una cepa aislada con zidima, cloranfenicol, gentamicina, mezlocilina, trimetoprimurca frecuencia en el laboratorio clínico y sólo se han publicasulfametoxazol, imipenem, ciprofloxacina y piperacilina-tazo, . cunos casos de infecciones humanas.241 Pedersen y cois.570 bactam.731 B. holmesii era clasificado antes como del grupo M w n icaro n el aislamiento de sólo 12 cepas de B. bronchisepNO-2 de los CDC, es inmóvil y oxidasa negativo, lo que lo ■ c ce un total de 565 no fermentadores, todos los cuales fuevuelve fenotípicamente similar a especies de Acinetobacter y al u r. de muestras respiratorias obtenidas de pacientes que no grupo NO-1 de los CDC (cuadro 7-21). Se amplían las carac­ infecciones. La mayoría de los casos asintomáticos han terísticas morfológicas y fenotípicas en el apartado “ Microor­ mcn en cuidadores de animales que presentaron síntomas simi­ ganismos inmóviles y oxidasa negativos” . a-es a los de la tos ferina leve. Ghosh241 comunicó un caso de B. petrii es inmóvil y oxidasa positivo. Sólo ha sido aislado tepbcemia y bronconeumonía mortal inducida por B. bronchidel medioambiente y es el único miembro del género capaz de m -- — en un paciente alcohólico desnutrido, lo que indica que crecimiento anaerobio.786 t i Microorganismo puede ser virulento en determinadas cirB. trematum es oxidasa negativo y móvil con flagelos peri­ ¡■wxancias. Woolfrey y Moody revisaron 25 casos de inféc­ tricos. E l crecimiento ocurre en agar de MacConkey y se utili­ tete -_mana por B. bronchiseptica asociada con sinusitis, tranza malonato. En el cuadro 7-15 se detallan otras reacciones ^ccfcronquitis, neumonía aguda, neumonía con septicemia, bioquímicas. Las cepas han sido aisladas de infecciones óticas Bfftoem ia y tos ferina.818 Para los casos de tos ferina, es pro­ y heridas de seres humanos, pero no de las muestras respirato­ te o e cue B. bronchiseptica actúe como colonizador y no como rias.755 Dorittke y cois, describieron el aislamiento de un “ mi­

328

CAPÍTULO 7 Bacilos gramnegativos no termentadores

croorganismo similar a B. avium” en un paciente con otitis me­ dia crónica, donde la cepa respectiva (L M G 13506) fue reclasificada más tarde como B. trematum , 1 9 7 -7 5 5 Daxboeck y cois, informaron el aislamiento de B. trematum de una úlcera de pie diabético; sin embargo, no hubo pruebas de un papel causal del microorganismo en la infección del pie.172

GÉNERO KERSTERSIA

Coenye y cois, describieron un género nuevo, Kerstersia gen. nov. que consiste en una única especie K. gyioritm (del griego gyion, que significa “ miembro” : se refiere al hecho de que la mayoría de las cepas fueron aisladas en heridas humanas de las piernas).140 Se presentan como pequeñas células cocoides gramnegativas (1-2 |im), células cocoides que se presentan aisladas, de a pares o en cadenas cortas. En agar nutriente, las colonias son planas o ligeramente convexas, con bordes lisos y un color que varía del blanco al pardo claro. E l crecimiento ocurre a 28 °C a 42 °C , la motilidad es dependiente de la cepa y todas las cepas son asacarolíticas. Todas las cepas son catalasa positivas, pero son negativas para oxidasa, arginina, lisina y ornitina descarboxilasa, |3-galactosidasa, gelatinasa, amilasa, ureasa, DNasa, reducción de nitrato y nitrito, e hidrólisis de esculina (cuadro 7-15). Las cepas se han aislado de distintas muestras humanas, que incluyen heces, esputo, y heridas de piernas y tobillos. La patogenicidad se desconoce.140

GÉNERO OLIGELLA

E l género Oligella consiste en dos especies: O. urethralis (antes Moraxella urethralis y grupo M-4 de los CDC) y O. ureolytica (antes grupo IVe de los CD C).644 Las colonias de O. urealytica se observan primero como de crecimiento lento en medio de agar sangre, y producen colo­ nias puntiformes después de 24 horas pero colonias grandes después de 3 días de incubación. Las colonias son blancas, opa­ cas, enteras y no hemolíticas. Las cepas de O. urealytica se ase­ mejan fenotípicamente a las especies de Achromobacter asaca­ rolíticas, B. bronchiseptica y Cupriavidus pauculus , en que son asacarolíticas, oxidasa positivas y móviles por medio de flage­ los peritricos. Difieren de las especies de Achromobacter por su capacidad para hidrolizar rápidamente la urea en agar urea de Christensen. En el cuadro 7-15 se muestran otras característi­ cas diferenciales. La mayoría de las cepas han sido aisladas en orina humana, a menudo de pacientes con catéteres permanen­ tes durante tiempos prolongados. Se comunicó un caso de bac­ teriemia en un paciente con uropatía obstructiva.632También se informó bacteriemia por O. urealytica en un paciente con SID A 477 y en un niño de 18 meses con neumonía.427 O. urealy­ tica fue aislado de un paciente en el University of Illinois Hospital que se presentó con una herida facial con impétigo y celulitis facial. Suele ser sensible a la mayoría de los antibióti­ cos, aunque existe una comunicación de una cepa altamente resistente que demostró resistencia in vitro a penicilinas, cefalosporinas, imipenem, meropenem, ciprofloxacina y trimetoprim-sulfametoxazol. pero que era sensible a los aminoglucósidos, tetraciclina y levofloxacina.427 O. urethralis es similar a las especies de Moraxella porque es una bacteria gramnegativa cocobacilar, oxidasa positiva e inmóvil. Las colonias son más pequeñas que las de M. osloensis y son opacas a blancuzcas. M. urethralis y M. osloensis comparten otras similitudes bioquímicas, como acumulación de ácido poli-p-hidroxibutírico y falta de hidrólisis de urea, pero pueden diferenciarse sobre la base de la reducción de

nitrito, el crecimiento a 42 °C y la alcalinización de formato, itaconato, prolina y treonina (todos positivos en O. urethralis. negativos en M. osloensis).591 También se puede utilizar la composición celular de ácidos grasos para diferenciar ambas especies.802 Las características bioquímicas que ayudan a dife­ renciar O. urethralis de las especies de Moraxella se muestran en el cuadro 7-19. Como su nombre lo indica, O. urethralis se aísla más a menudo de muestras uretrales y se lo considera un comensal del aparato genitourinario; sin embargo, en raros casos puede conducir a urosepsis.606 Hubo un caso de artritis infecciosa por O. urethralis que imitó clínicamente a una artri­ tis gonocócica.499 Familia Rhizobiaceae

E l único miembro de importancia médica de la familia

Rhizobiaceae es el género Rhizobium. Sin embargo, los miem­ bros de este género son fenotípicamente similares a las espe­ cies de Achromobacter sacarolíticas y a Ochrobactrum anthro­ pi, de los cuales deben ser diferenciados. Las características útiles para separar estos microorganismos se presentan en el cuadro 7-16.

GÉNERO RHIZOBIUM (ANTES AGROBACTERIUM)

E l ex género Agrobacterium contenía varias especies de patógenos de las plantas que aparecen en los suelos de todo el mundo.385 Como resultado de una gran cantidad de estudios comparativos, se reconocieron cuatro especies de Agrobac­ terium: Agrobacterium radiobacter (antes A. tumefaciens y grupo Vd-3 de los CDC), Agrobacterium rhizogenes (antes transferido al género Sphingom onas como S. rosa),72Sa Agrobacterium vitis552 y Agrobacterium rubi.666 La separación de las especies fenotípicamente indistinguibles A. tumefaciens y A. radiobacter se basó en la presencia de un plásmido induc­ tor de tumores de las plantas, presente en A. tumefasciens y ausente en A. radiobacter. Algunos estudios genéticos mostra­ ron que las dos especies eran las mismas, y se propuso recha­ zar el nombre A. tumefaciens y designar A. radiobacter como especie tipo para el género A grobacterium , 6 6 6 Young y cois.834-835 propusieron una descripción corregida del género Rhizobium para incluir a todas las especies de Agrobacterium. Según esta propuesta las nuevas combinaciones son Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes. R. rubi y R. vitisP 4 Farrand y cois, han presentado pruebas a partir de comparaciones clásicas y moleculares que apoyan la conclusión de que las agrobacterias biovariedades 1 y 3 son lo suficientemente diferentes de los miembros del género Rhizobium para justificar la retención del género Agrobacterium .216 Sin duda, no se ha escrito aún el capítulo final sobre la clasificación de Agrobacterium radio­ bacter y es probable que la controversia continúe durante algunos años; sin embargo, según los objetivos de este texto hemos decidido aceptar los argumentos establecidos por Young y cois.835 y referimos a esta bacteria como Rhizobium ra­

diobacter. Las pruebas bioquímicas claves utilizadas para diferenciar

R. radiobacter de las especies estrechamente relacionadas Ochrobactrum anthropi se muestran en el cuadro 7-16. Las características claves para este grupo de microorganismos son una reacción de ureasa rápida y una prueba positiva para fenilalanina desaminasa. Las colonias de R. radiobacter crecen en condiciones óptimas a 25 °C a 28 °C, pero también a 35 °C. Se presentan circulares, convexas, lisas y no pigmentadas a beige claras en agar sangre. Las colonias pueden tener aspecto húme­

M icroorganism os inm óviles y oxidasa positivos

do y se toman muy mucoides y rosadas en agar de MacConkey .:n una incubación prolongada (lámina en color 7-4B). En cisiones, R. radiobacter se aísla de muestras clínicas, pero >: 'o rara vez se lo relaciona con infección humana. En casos de erección humana comunicada, se ha aislado más a menudo Rhizobium en sangre 68,94,202,205,207,224,288,475,598,603,635,808 seguida :* : líquido de diálisis peritoneal,294,633,635 orina7,635 y líquido *scítico.610La mayoría de los casos ocurrieron en pacientes con . -iteres transcutáneos o prótesis biomédicas implantadas, y el -'-'-amiento eficaz a menudo requiere la extracción del disposi«.202,205,207,224,288.598,603,635,808 Lai y cois, examinaron los regismédicos de 13 pacientes con infecciones por R. radiobac3 ■curante el período 1996-2002. Diez (76%) tenían un proce> maligno hematológico o un cáncer de órgano sólido subya­ cente. Seis (46%) presentaron neutropenia febril durante el . d de la infección. E l 44% de las infecciones fueron bacteaam as relacionadas con catéteres y el 92% fueron intrahospi-^ar.as.420También se comunicaron dos casos de endoftalmitis por R radiobacter ulterior a la extracción de cataratas.503,526La e ¡ oibilidad a los antibióticos varía y requiere pruebas indivii — :- para cada aislamiento. Lai y cois, comunicaron que :torós las cepas evaluadas en su serie eran sensibles a cefepima, rreracilina-tazobactam, carbapenémicos y ciprofloxacina.420

-ar a Brucellaceae 9 B I0 OCHROBACTRUM

329

nantemente de sangre, heridas, aparato urogenital u orina, apa­ rato respiratorio, oídos, heces, un ojo y L C R .18,46,86,113,328,474,765 Las comunicaciones recientes de sepsis relacionada con catéte­ res venosos centrales causadas por O. Anthropi son muy preo­ cupantes.6,128,272,286,383,401,655,714E l aislamiento de este microorga­ nismo de la sangre debe plantear la sospecha de una infección relacionada con un catéter venoso central. Existe una comuni­ cación de shock séptico luego de una infusión venosa periféri­ ca de una solución contaminada con O. anthropi388y una comu­ nicación de bacteriemia hospitalaria en cinco receptores de trasplante de órganos luego de la infusión de globulina antitimocito contaminada.214 Se informaron dos casos de endocardi­ tis infecciosa debida a O. anthropi.473,637 Se comunica que O. anthropi es sensible a aminoglucósidos, carbenicilina, fluoroquinolonas, imipenem, tetraciclina y trimetoprim-sulfametoxazol, pero resistente a otros antimicrobianos.65,249,383,780

Microorganismos inmóviles y oxidasa positivos Familia Flavobacteriaceae

Vandamme y cois, notificaron que ninguna de las especies establecidas de flavobacterias se relaciona estrechamente con las especies tipo de F. aquatile: por lo tanto, propusieron incluir los microorganismos genéricamente mal clasificados F. balus-

tinum, F. gleum, F. indologenes, F. indoltheticum, F. meningosepticum y F. scophthalmum en un género nuevo: Chryseobacterium, con C. gleum como especie tipo.752Los mismos autores informaron que Flavobacterium breve representaba un taxón genético distinto y propusieron el nombre Empedobacter brevis para esta especie.752 Además, se observó que Flavobac­ terium odoratum comprendía dos especies diferentes, renom­ bradas Myroides odoratus y Myroides odoratimimus.751 Algu­

'Ochrobactrum anthropi es el nombre dado a especies de " Ae kvomobacter” ureasa positivas designadas antes como fn r*: Vd-1 y Vd-2 de los CDC y Achromobacter grupos A, C l I zz Holmes y cois.327,328 Sin embargo, los estudios ulterio*a ‘ _f- mostrado que el biogrupo C y algunas cepas que perte■Bgyn al biogiupo A constituyen un grupo de hibridación de B u \-DNA homogéneo separado de O. anthropi que ha recibinos investigadores franceses que trabajaban junto con el grupo JE ¡i lísignación de especie nueva de Ochrobactrum intermede Vandamme en Bélgica publicaron una descripción corregida jé l Ambas especies de Ochrobactrum están estrechamende la familia Flavobacteriaceae y una clasificación y descrip­ i.- seiadonadas con especies de Brucella y Ochrobactrum ción corregidas del género Flavobacterium.62 En el recuadro — zMum ocupa una posición filogenética intermedia entre 7-8 se presenta un esquema de la clasificación y la nomencla­ I . mmhropi y Brucella ,771Las dos especies comparten propie- tura actual de los miembros de importancia médica de la fami­ ■Btitr- linotípicas idénticas. Son oxidasa positivas, sacarolíticas lia Flavobacteriaceae ,237 0kn ¿es por medio de flagelos peritricos. Se observa un buen Cabe señalar que ninguna de las especies restantes de nto en medios de rutina en 24 horas. Las colonias tieFlavobacterium se encuentran en muestras clínicas humanas y írededor de 1 mm de diámetro y se presentan circulares, ninguna es indol-positiva, característica que ha sido sinónimo bajas, lisas, brillantes y enteras. Las cepas observadas del género Flavobacterium en el pasado. En el cuadro 7-17 se > autores crecen fácilmente en agar de MacConkey y tie-describen las características diferenciales claves de los miem­ mr -i- apariencia mucoide. Las pruebas clave útiles para disbros de importancia clínica de la familia Flavobacteriaceae y qhffjir O. anthropi de microorganismos relacionados incluyen bacterias relacionadas. La mayoría de las especies producen m laracidad para hidrolizar urea, la incapacidad para hidrolicolonias de pigmento amarillo en medio de agar sangre y todas a r ;s :Jin a y una prueba de O N PG negativa. Otras pruebas son oxidasa positivas. Todas las especies son inmóviles y nega­ iM prnucas útiles para diferenciar O. anthropi de especies de tivas para reducción de nitrato y la mayoría no crecen en agar ■ Pñ étMm y de las especies sacarolíticas de Achromobacter se de MacConkey. La mayoría de las especies (salvo Weeksella en el cuadro 7-16. No existe ninguna prueba bioquívirosa) son resistentes a la polimixina, una propiedad que com­ aue repare O. intermedium de O. anthropi; sin embargo, parten con el grupo pseudomallei en otra parte de este capítu­ H ü l sagerido que se puede utilizar la resistencia a la colistina lo. Sólo explicaremos mejor los miembros de importancia clí­ úna E ) y a la polimixina B para separar O. intermedium nica de las Flavobacteriaceae. Los dilemas taxonómicos de i i de O. anthropi (sensible).771 Se informó un casoFlavobacterium de y Sphingobacterium han sido revisados con d hepática piógena debido a O. intermedium;505 no obsdetalle en otros sitios.62,685,752,822 Wmt- i;r:d o a la estrecha similitud fenotípica entre O. anthropgr ü intermedium, es posible que ciertas infecciones que se CHRYSEOBACTERIUM. EMPEDOBACTER Y GRUPOS SIN NOMBRE | M K i ’- c rueron causadas por O. anthropi en realidad hayan DE LOS CDC -pb :^_'adas por O. intermedium. ahora todas las cepas de O. anthropi fueron aisladas en Estas ex especies de Flavobacterium se presentan natural­ ;línicas humanas (anthropi deriva del griego y signifimente en el suelo, el agua, las plantas y los productos alimen­ >er humano” ). Las cepas han sido aisladas predomi­ ticios. En el medioambiente hospitalario existen en los siste-

330

CAPÍTU LO 7 Bacilos gramnegativos no fermentadores

Recuadro 7-8

D escripción d e los m iem bros de im portancia m édica d e ta fam ilia Flavobacteriaceae

Género I. Flavobacterium Género tipo que consiste en 29 especies aisladas de ambientes acuáti­ cos. No se asocia con muestras clínicas humanas Género IV. Bergeyella B. zoohelcum Género V. Capnocytophaga C. ochracea C. canimorsus C. cynodegmi C. gingivalis C. granulosa C. haemolytica C. sputigena Género VII. Chryseobacterium C. gleum C. balustinum C. defluvii C. indologenes C. indoltheticum C. joostei C. meningosepticum0 C. miricola C. scophthalmum Género X. Empedobacter E. brevis Género XV. Myroides M. odoratus M. odoratimimus Género XXIII. Weeksella W. virosa

“Nota del autor en el momento de la impresión: Chryseobacterium meningosepticum ha sido trasladado recientemente a un género nuevo con el nombre Elizabethkingia meningoseptica.

mas de agua y sobre superficies húmedas. Se distinguen con facilidad de otros no fermentadores por su capacidad para pro­ ducir indol en caldo de triptófano (véase lámina en color 7-2C). A menudo, la reacción de indol es débil y difícil de demostrar; por lo tanto, se debe utilizar el método de Ehrlich más sensible (ya explicados en este capítulo). C. indologenes se reconoce con facilidad por la producción de colonias amarillo oscuras (lámina en color 7-4C). C. meningosepticum , por el contrario, produce colonias con un pigmento amarillo muy pálido que pueden no ser evidentes en el examen inicial a las 24 horas. Las colonias de Empedobacter brevis son amarillo pálido. La pro­ ducción de pigmento puede aumentar incubando el cultivo durante otras 24 horas a temperatura ambiente. En general, las especies de Chryseobacterium crecen poco, o en absoluto, en agar de MacConkey y se considera que oxidan la glucosa, aun­ que la mayoría de las cepas fermentan lentamente la glucosa después de la incubación prolongada. Desde el punto de vista microscópico, las células de C. meningosepticum, C. indologe­ nes y grupos lie, Ilh y Ili son más delgadas en su porción cen­ tral que en su porción periférica e incluyen formas filamento­ sas; las células Ilh son significativamente más pequeñas que las de otras especies. Cabe señalar que los resultados de las prue­ bas (p. ej., DNasa, indol, urea, hidrólisis de almidón) en este grupo dependen de la elección del medio, los reactivos y la duración de la incubación.582 Chryseobacterium indologenes,

C. gleum y el grupo Ilb de los CDC están tabulados en forrr.. individual en el cuadro 7-17. E l grupo Ilb es genéticamente heterogéneo e incluye cepas de C. indologenes, C. gleum y pro­ bablemente otras genomoespecies. Se necesitarán más estudios de hibridación de DNA-DNA para resolver este problema. L_ separación fenotípica entre C. indologenes y C. gleum ha sid difícil; sin embargo, la producción de ácido a partir de xilosa \ el crecimiento a 41 °C son regularmente positivos en los gru­ pos de D N A agrupados alrededor de la cepa tipo de C. gleum.14* En el cuadro 7-17 se pueden hallar otras característ cas que separan a los miembros de este grupo de microorga­ nismos. C. meningosepticum (antes Flavobacterium meningosepti­ cum y grupo lia de los C D C )a es la especie que más se asoci_ con enfermedad importante en los seres humanos. En lo' adultos se informó que causa neumonía, endocarditis, infec­ ciones de heridas, bacteriemia posoperatoria y meningitis casi siempre en pacientes con enfermedad subyacente grav e 32,67,124,150,228,293,305,440,476,550.628,684.735,798 A u n q u e S 5 J 0 r a r a y g z

encuentra meningitis neonatal es importante diagnosticar la en­ fermedad con exactitud porque las epidemias pueden ocurrir er salas de recién nacidos y se ha comunicado una mortalidad de hasta un 55%.780 C. indologenes (antes F. indologenes y grupo Ilb de lo CDC) es la cepa que con más frecuencia se aísla en humanov aunque pocas veces reviste importancia clínica.780 Se ha docu­ mentado que produce bacteriemia en pacientes hospitalizado' con una enfermedad subyacente grave, aunque la mortalidad relativamente baja incluso entre los pacientes que han recibid, antibióticos sin actividad contra C. indologenes ,341 Las infec­ ciones hospitalarias debidas a C. indologenes han sido relacio­ nadas con el uso de dispositivos permanentes durante la inter­ nación.343346-540 Se han comunicado raros casos de neumonía meningitis, piomiositis, queratitis y bacteriemia.276-341-343-461 Er el laboratorio de microbiología del University of IllinoiHospital C. indologenes fue aislado principalmente en herida' y en cultivos traqueales; en un neonato que nació por cesáre_ fue aislado en la sangre. E l lactante no tenía sepsis y más tarde fue dado de alta del hospital. Empedobacter brevis (antes Flavobacterium breve) y lo' grupos líe, Ilg, Ilh sin nombre de los CDC pocas veces se aís­ lan de material clínico y se sabe poco acerca de su participa­ ción en enfermedades clínicas. lanknecht y cois, comunicaron un brote de endoftalmitis por E. brevis en una serie de pacien­ tes en los que se realizó extracción de cataratas el mismo día por el mismo cirujano, lo que sugiere que la fuente de la infec­ ción pudo provenir de algo desde la lente hasta el proceso de esterilización.358 Se notificó un caso de meningitis causado por el grupo lie de los CD C790y también se comunicaron las carac­ terísticas fenotípicas de varias cepas de importancia clínica de los grupos lie y Ilg .311,313 Es difícil la elección apropiada de los antibióticos eficace' para el tratamiento de las infecciones por criseobacterias. Las especies de Chryseobacterium son intrínsecamente resistente' a muchos antibióticos utilizados a menudo para el tratamiento de las infecciones causadas por bacterias gramnegativas (aminoglucósidos, antibióticos (i-lactámicos, tetraciclinas, cloranfenicol), pero suelen ser sensibles a los agentes utilizados para el tratamiento de las infecciones causadas por bacterias grampositivas (rifampicina, clindamicina, eritromicina, esparfloxacina, trimetoprim-sulfametoxazol y vancomicina).217707 Aunque los primeros investigadores recomendaron la vancomicina para el tratamiento de una infección grave por C. menin­ gosepticum,296-599 algunos estudios recientes han mostrado una

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virosa1’

zoohelcum1’

brevis1’

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

V (26)

V (50)

-

V (54)

-

-

V (79)

-

-

Glucosa OF

+

+

+

+

+

De

+

-

+

V (80)

Manitol OF

+

-

V (10)

V (10)

-

-

-

-

-

-

Indol

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

V (67)

V (14)

V (22)

+ (90)

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

D'

-

-

-

+

P R U EBA

Oxidasa Motilidad Crecimiento en agar

+

de MacConkey

NO, a N 0 2

+

+

+

ND

+

-

V (20)

+ (90)

Gelatina

+

+

+

V (78)

V (20)

Almidón

V (8)

+

+

+

ND

+

ND

+

V (14)

-

-

V (40)

Esculina

+

+

+

V (70)

+

-

-

+

+

ND

ND

-

ONPG

+

+

V (41)

V (57)

ND

ND

ND

+

ND

ND

-

DNasa

+

V (17)

V (7)

ND

ND

-

V (13)

-

+

Urea

-

+

V (10)

V (14)

-

-

-

-

+

-

Penicilina

R

R

12% S

ND

ND

S

ND

67% S

57% S

S

S

R

Polimixina

R

R

3% S

ND

ND

S

ND

22% S

R

s

R

R

Amarillo

Amarillo-

Amarillo-

Amarillo-

Ocre a amarillo

-

Marrón claro

-

Amarillo pálido

pálido

naranja

naranja

naranja

Pigmento

+

ND

V (78)

o amarillo

claro

“Datos tomados de las referencias249802. bPorcentaje de positivos derivado de la referencia249. cPorcentaje de positivos derivado de la referencia802. ‘‘Datos tomados de la referencia3'3. eGilardi249 informa glucosa negativo; WeyantS02 informa glucosa positivo o positivo tardío: JGilardi249 informa gelatina positivo; Weyant802 informa gelatina negativo. + : 90% o más de cepas positivas; -: 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; pe: flagelos peritricos; p: flagelos polares, S: sensible; R: resistente, ND: resultados no disponibles; D: diferentes resultados comunicados; OF: oxidación-fermentación. Los números entre paréntesis son los porcentajes de cepas que dan reacciones positivas.

Microorganismos inmóviles y oxidasa positivos

NO, a N2

co

co

332

C A P ÍT U L O 7

Bacilos gramnegativos no fermentadores

mayor actividad in vitro de minociclina. rifampicina, trimetoprim-sulfametoxazol y quinolonas.67-223-707 Otro elemento que complica la elección del tratamiento antibiótico apropiado es el hecho de que los valores críticos de CIM para resistencia y sen­ sibilidad de las criseobacterias no han sido establecidos por el Clinical Laboratory Standards Institute (antes, National Committee for Clinical Laboratory Standards) y los resultados de las pruebas de difusión con discos han resultado poco fia­ bles para predecir la sensibilidad a los antibióticos de las espe­ cies de Chryseobacterium.2-U4-223J82 Se ha demostrado que el Etest es una alternativa posible al método de dilución estándar en agar para evaluar cefotaxima, ceftazidima, amikacina, mino­ ciclina, ofloxacina y ciprofloxacina, pero no piperacilina.340 El tratamiento definitivo para las cepas de importancia clínica debe estar guiado por los patrones de sensibilidad individual obtenidos mediante un método de determinación de la CIM tras una noche de incubación. WEEKSELLA Y BERGEYELLA

El género Weeksella originario contenía dos especies: W. virosa (antes grupo Uf de los CDC) y W. zoohelcum (antes grupo Ilj de los CDC).330'331 Vandamme y cois, mostraron que estas dos especies representan taxones genéticos separados y, por lo tanto, propusieron la reclasificación de una de estas especies, W. zoohelcum, como Bergeyella zoohelcum.152 Ambas especies son oxidasa positiva, no crecen en agar de MacConkey y son no pigmentadas, no sacarolíticas e indol positivas. Además, comparten la característica inusual de ser sensibles a la penicilina, lo que permite diferenciarlas con facilidad de los géneros relacionados (véase cuadro 7-17). W. virosa (derivada de la palabra latina “viscoso”) forma colonias mucoides y pegajosas difíciles de extraer del agar. Al principio se observa que las colonias son no pigmentadas, pero una mayor incuba­ ción puede conducir a una pigmentación marrón clara. W. viro­ sa es ureasa negativo y sensible a la polimixina B. Ha sido recuperado fundamentalmente del aparato urogenital en muje­ res, pero aún no existen pruebas de que pueda desempeñar algún papel patogénico.-330-480-616-617 Existe una comunicación de España de peritonitis espontánea causada por Weeksella virosa.70 Una característica diferencial clave de B. zoohelcum es la producción de una reacción de ureasa intensa en agar urea de Christensen. Forma colonias pegajosas que al principio son no pigmentadas pero puede formar colonias tostadas a amarillas con la incubación prolongada. Es sensible a la penicilina, pero resistente a la polimixina B. B. zoohelcum es parte de la flora bucal y nasal normal de perros y gatos.665 Por lo tanto, no es sorprendente que la mayoría de las cepas aisladas en seres humanos hayan sido el resultado de una mordedura de esos animales.331-506’615,689’802 Ha sido causa de septicemia por infeccio­ nes cutáneas graves en pacientes ancianos que permitieron que un gato durmiera arriba de sus piernas406536 y de neumonía en un paciente expuesto a un perro que era portador de este microor­ ganismo.282 Existe una comunicación de meningitis debida a B. zoohelcum luego de numerosas mordeduras de perro.83 GÉNERO MYROIDES

Vancanneyt y cois.751 determinaron que el microorganismo antes clasificado como Flavobacterium odoratum consistía en un grupo heterogéneo que comprendía dos especies distintas para las que propusieron los nombres Myroides odoratus y Myroides odoratimimus. Las células de ambas especies son

bacilos gramnegativos de 0,5 |im de diámetro y 1 a 2 j^m de longitud. Pueden aparecer varios tipos de colonias, pero la mayoría de ellas tienen pigmento amarillo y forman colonias difusas que se propagan y que pueden confundirse con la mor­ fología de colonias de una especie de Bacillus (lámina en color 7-4D). La mayoría de las cepas producen un olor frutal carac­ terístico (similar al de A. faecalis). Myroides crece en la mayo­ ría de los medios, incluido agar de MacConkey. El crecimien­ to ocurre a 18 °C a 37 °C pero no a 42 °C. Son asacarolíticas pero son oxidasa, catalasa, ureasa y gelatinasa positivas. No se produce indol y se reducen los nitritos (pero no los nitratos) (cuadro 7-18). No hay ninguna prueba fenotípica de rutina para diferenciar las dos especies de Myroides y sus diferencias están limitadas a las pruebas de asimilación y la composición celular de ácidos grasos.751 Los microorganismos identificados como M. odoratus fueron hallados principalmente en orina, pero tam­ bién se encontraron en muestras de heridas, esputo, sangre y oído.329,828 La infección clínica por especies de Myroides es excepcional; sin embargo, se han informado casos de fascitis necrosante rápidamente progresiva y baeteriemia347 y celulitis recurrente con baeteriemia.36275 La mayoría de las cepas son resistentes a penicilinas, cefalosporinas, aminoglucósidos, aztreonam y carbapenémicos.329 Familia Sphingobacteriaceae SPHINGOBACTERIUM Y PEDOBACTER

Las esfingobacterias tienen pigmento amarillo, son oxidasa positivas e inmóviles. Se diferencian de criseobacterias y weekselas por su falta de producción de indol a partir de triptófano y se separan de las especies de Myroides por su capaci­ dad para producir ácido en OF glucosa. Las especies actuales de Sphingobacterium son S. multivorum (antes Flavobac­ terium multivorum, grupo IIk-2 de los CDC), S. spiritivorum (incluye especies antes designadas Flavobacterium spiritovorum, F. yabuuchiae y grupo IIk-3 de los CDC), S. antarcticum, S. faecium, S. thalpophilum y especies sin nombre Sphingo­ bacterium genomoespecies 1 y 2.237-333,687-729-822 Las especies Sphingobacterium S. heparinum y S. piscium han sido ubica­ das en un nuevo género Pedobacter como P. heparinus y P. piscium.113 El género Pedobacter contiene varias especies de bacterias productoras de heparinasa halladas en el suelo, el limo activado o los peces, pero no en fuentes humanas. S. mul­ tivorum y S. spiritivorum son las dos especies aisladas más a menudo de muestras clínicas humanas. Puede distinguirse del microorganismo similar Sphingomonas paucimobilis (antes IIk-1) por la falta de motilidad y resistencia a la polimixina B. En el cuadro 7-18 se muestran otras características diferencia­ les de estas bacterias. S. multivorum ha sido aislado de distin­ tas muestras clínicas, pero sólo pocas veces se ha asociado con infecciones graves, como peritonitis y septicemia.25-190'226-326-601 Sangre y orina han sido las fuentes más frecuentes para el ais­ lamiento de S. spiritivorum,324483.743 S. thalpophilum se ha ais­ lado de heridas, sangre, ojo, abscesos e incisión abdominal.802 Una prueba de nitrato positiva y el crecimiento a 42 °C dife­ rencia S. thalpophilum de otras especies de Sphingobacterium. El microorganismo antes conocido como Sphingobacterium mizutaii ha sido transferido al género Flavobacterium,237333 pero está incluido en las esfingobacterias en el cuadro 7-18 porque es indol negativo y se asemeja fenotípicamente a las especies de Sphingobacterium. F. mizutaii ha sido aislado de muestras de sangre, LCR y heridas y puede diferenciarse de las especies de Sphingobacterium por su falta de crecimiento en agar de MacConkey y su falta habitual de actividad de ure­ asa.802 En general, las especies de Sphingobacterium son resis-

M ic ro o rg a n is m o s in m ó v ile s y o x id a s a p o s itiv o s

I jadfO 7-18

333

C aracterístic a s claves de Myroiders, Sphingobacterium y Flavobacterium mizutaiia M Y R O ID E S

PRUEBA Oxidasa Motilidad Crecimiento en agar j? MacConkey*' Gaseosa OF VLltiíqI OF l W O a NO,

a N2 Gesaona Miandón

Escalina CJNPG fia i Leca fte»cilina Mamixina ffearaito

SP H IN G O B A C T E R IU M

M . odoratus, M. odoratim im us

S. m ultivorum

S. spiritivorum

+ -

+ -

V (91)

+ +

V (46) + ND + + 19% S R Amarillo pálido

+ ND V (79) + + + R R Amarillo pálido

F L A V O B A C T E R IU M

5. thalpophilum

F. m izutaii + -

V (46)

+ +

+ + ND + + + + R R Amarillo pálido

+ + ND V (86) + + + + + R R Amarillo pálido

+ _c

-

+ + + R R Amarillo

i - W% o más de cepas positivas; -: 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; S: sensible; R: resistente; ND: resultados no disponibles; OF: oxidación-ferB jpaK ián. Los números entre paréntesis son los porcentajes de cepas que dan reacciones positivas. •fltatr? :ornados de las referencias249-802. [' W kKmñento en agar de MacConkey de la referencia802,

mjgjmede observar un color rosado muy débil en la capa de xileno.802

es a los aminoglucósidos y a la polimixina B, mientras que -ír.sibles in vitro a las quinolonas y a trimetoprim-sulfa-•¿zol. La sensibilidad a los antibióticos (J-lactámicos va? 'rauiere pruebas individuales para cada cepa aislada.707 = Moraxellaceae

L i familia Moraxellaceae, como se construye actualmente, ■ tn e tres géneros: Moraxella, Acinetobacter y Psychrof c a t r - 377 S C = : MORAXELLA

' to n as características claves nos hacen sospechar que un no k a o u a d o r desconocido puede pertenecer al género MoramsLl Después de 24 horas en agar sangre, las colonias tienden m m ' r-í-ieñas y puntiformes (habitualmente menos de 0,5 mm I k :-_~etro), con poco crecimiento o ninguno en agar de ■ k C nkev. Las células bacterianas aparecen como pequeños iú . o diplobacilos gramnegativos en los preparados con Gram con tendencia a resistir la descolonización.169 - reacciones de citocromo oxidasa como de catalasa positivas (la primera descarta las especies de Acine- la última descarta las especies de Kingella). La inca_J ie las especies de Moraxella para formar ácido a par¿ cé ‘ tratos de carbono también elimina a la mayoría de las ___ r- Je Neisseria de la consideración. La mayoría de las esp n c s de Moraxella son extremadamente sensibles a bajas • r e o racio n es de penicilina. Se puede utilizar el examen de T —¿d o s teñidos con Gram preparados desde la zona externa ~:ción alrededor del disco de sensibilidad a la penicilina

para distinguir las especies de Neisseria (que retienen su mor­ fología cócica) de las especies de Moraxella (que producen for­ mas pleomorfas alargadas; véase lámina en color 7-4E y F).106 Todas las especies de Moraxella son inmóviles. Las especies de Moraxella de importancia clínica son M. lacunata, M. nonliquefaciens, M. osloensis, M. atlantae (grupo M-3 de los CDC) y M. catarrhalis. Este último se analiza junto con las especies patogénicas de Neisseria en el capítulo 11. Los grupos M-2 y M-4 de los CDC han sido nombrados Psychrobacter phenylpyruvicus y Oligella urethralis, respecti­ vamente y se describen más adelante en esta sección. Los gru­ pos M-5 y M-6 de los CDC han sido colocados en el género Neisseria, aun cuando su aspecto microscópico es el de bacilos gramnegativos. El grupo M-5 ha sido designado Neisseria weaveri316 y el grupo M-6 se ha denominado Neisseria elongata subespecie nitroreducens.273 Es difícil distinguir estas especies, junto con otras especies de Moraxella descritas recientemente, como M. canis359 y M. lincolnii,753 de las especies establecidas de Moraxella. Las especies animales incluyen M. bovis, aisla­ do en ganado sano y en otros animales, entre ellos, caballos. M. boevrei y M. caprae (cabras), M. caviae (cobayos), M. cunicitli (conejos) y M. ovis (ovejas). En el cuadro 7-19 se proporcionan algunas pruebas diferen­ ciales útiles para la identificación de las especies de Moraxella de importancia clínica. M. atlantae, M. lacunata y M. nonli­ quefaciens son similares en muchas de sus características. El crecimiento de M. atlantae es estimulado por sales biliares y desoxicolato de sodio, mientras que M. lacunata y M. noliquefaciens no lo son. Sólo M. lacunata licúa la gelatina, mientras que M. lacunata y M. nonliquefaciens reducen nitrato a nitri-

334

C A P ÍT U L O 7

Bacilos gramnegativos no fermentadores

t0 8i,585 puecje ser difícil ia separación entre M. lacunata y M. nonliquefaciens que no se propaga, porque la hidrólisis de gelatina (con cualquier método) y la licuefacción de la porción inclinada de Loeffler puede llevar más de una semana. En algu­ nos casos, el análisis de ácidos grasos puede ayudar a determi­ nar la especie.802 Como muchas cepas de Moraxella tienen requerimientos nutricionales algo especiales y las reacciones bioquímicas suelen ser negativas o ambiguas, muchos labora­ torios deciden referirse a los miembros de este grupo como “especies de Moraxella". Las especies de Moraxella constituyen la flora normal sobre las superficies mucosas y se considera que tienen bajo poten­ cial patogénico. Se presentan más a menudo en el aparato res­ piratorio y menos en el aparato genital y, en ocasiones, produ­ cen infección sistémica. M. lacunata, que desde comienzos de siglo pasado se sabe que produce conjuntivitis, tiene requeri­ mientos nutricionales especiales y necesita medios enriqueci­ dos sin peptona o el agregado de ácido oleico o suero de cone­ jo para contrarrestar un efecto proteolítico tóxico. Además de la conjuntivitis, se informó que esta especie causa queratitis, sinusitis crónica y endocarditis.524'627741 M. nonliquefaciens también puede requerir suplementos de suero para un creci­ miento óptimo. Es parte de la flora normal de las vías aéreas altas en el ser humano y a menudo se lo aísla en la cavidad nasal. Ha sido aislado en sangre, ojo, LCR, vías aéreas bajas y otros sitios locales80,271 741 y se ha asociado con endoftalmitis204,425,453 y artr¡t¡s séptica.368 Se han aislado cepas mucoides atípicas de M. nonliquefaciens de muestras de esputo de tres pacientes con enfermedad pulmonar crónica.171 M. osloensis suele aislarse de muestras clínicas y no requiere suplementos para el crecimiento. En general, no es patogénico cuando se lo aísla de seres humanos; sin embargo, se han comunicado casos de sinusitis, conjuntivitis, bronquitis, artritis séptica, osteomie­ litis, peritonitis, meningitis, endocarditis, infección de catéter venoso central y septicemia.89,218,290,640,678,720 M. atlantae crece lentamente en medio de cultivo y produce colonias con ten­ dencia a formar una zona de propagación después de 48 horas de incubación.81 Constituyen una causa rara de baeteriemia en pacientes inmunodeprimidos.88,174 M. canis es una especie nueva que reside en las vías aéreas altas de perros y gatos. En humano han sido aislado en san­ gre,359 en ganglios linfáticos761 y en una herida por mordedura de perro.359 M. canis, M. catarrhalis, M. cuniculi, M. caviae y M. ovis pertenecen a las moraxelas cocoides, las cuales, a dife­ rencia de las moraxelas bacilares, muestran actividad de DNasa. Las capas de M. canis se asemejan a M. catarrhalis en la tinción de Gram; sin embargo, la morfología de sus colonias en agar sangre de carnero se asemeja más estrechamente a la de los miembros de las enterobacterias (colonias grandes y lisas).359 Algunas cepas también pueden producir colonias muy viscosas que semejan colonias de Klebsiella pneumoniae.359 La producción de un pigmento pardo en agar de Mueller-Hinton que contiene almidón también es típica de la mayoría de las cepas de M. canis.359 M. lincolnii ha sido aislado principalmen­ te del aparato respiratorio de seres humanos.753 La mayoría de las cepas de Moraxella son sensibles a peni­ cilina y sus derivados, cefalosporinas, tetraciclinas, quinolonas y aminoglucósidos.217,641,707 Sólo se ha comunicado rara vez la producción de |i-lactamasa en especies de Moraxella distintas de M. catarrhalis 36S-524M' Debido a la naturaleza de requeri­ mientos especiales de muchas especies de Moraxella y la previsibilidad del perfil antibiótico, las pruebas de sensibilidad a los antibióticos, salvo por las pruebas de (3-lactamasa, no sue­ len realizarse en casos clínicos.

GÉNERO PSYCHROBACTER Y GRUPOS DE OXIDANTES EUGÓNICOS (EO) DE LOS CDC

Las especies de Psychrobacter de importancia clínica son P. immobilis y P. phenylpyruvicus (antes Moraxella phenylpyruvica).82 Psychrobacter phenylpyruvicus. P. phenylpyruvicus es tanto urea positivo como fenilalanina desaminasa positivo, características que ayudan a distinguirlo de las especies de Moraxella y Oligella urethralis (cuadro 7-19). Los trabajadores de labora­ torio deben estar conscientes de que P. phenylpyruvicus puede asemejarse fenotípicamente a las especies de Brucella', han existido varias comunicaciones de especies de Brucella mal identificadas como P. phenylpyruvicus en los sistemas de iden­ tificación comerciales.42,50,573 La diferenciación entre P. phenylpyruvicus y especies de Brucella requiere microscopia (Brucella son cocobacilos diminutos) y pruebas para la acidifi­ cación de xilosa y glucosa.584,588 P. phenylpyruvicus es asacarolítico, mientras que las especies de Brucella utilizan xilosa y habitualmente glucosa cuando se utiliza un método suficiente­ mente sensible para detectar la acidificación de glucosa.584 P. phenylpyruvicus es una causa rara de infecciones en los seres humanos, pero se informó que produce endocarditis,284,742 peri­ tonitis111 y una lesión fulgurante del pie.393 Psychrobacter immobilis, Paracoccus yeei (EO-2) y grupos EO-3 y EO-4 de los CDC. La clasificación de este grupo de oxidantes eugónicos y cepas sacarolíticas de Psychrobacter immobilis es incompleta. Los miembros de este grupo son bacilos gramne­ gativos (que a veces parecen gram variables) aerobios, cocoides a cortos, gruesos o ligeramente gruesos que crecen, a veces poco, en agar de MacConkey. Todos son fuertemente oxidasa positivos, inmóviles e indol negativos y utilizan glucosa, xilo­ sa y lactosa517 (véase cuadro 7-20). Daneshvar y cois.167 propu­ sieron el nombre Paracoccus yeeii (más tarde cambiado a yeei de acuerdo con el código internacional para la nomenclatura bacteriana)213 para el ex grupo EO-2 de los CDC. Los grupos EO-3 y EO-4 aún no tienen nombre. P. yeei crece tanto en agar sangre como en agar de MacConkey y se presenta como colo­ nias no pigmentadas mucoides a muy mucoides después de 48 horas de incubación (lámina en color 7-4G). P. yeei también tiene una morfología celular definida con forma de O en el exa­ men con tinción de Gram debido a la presencia de células vacuoladas o teñidas periféricamente (lámina en color 7-4H).517 Esta morfología en O no se observa en P. immobilis o cepas EO-3 o EO-4. Las cepas EO-3 y EO-4 tienen un pigmento amarillo no difusible definido que no se observa en P. immobi­ lis o P. yeei.511 La mayoría de las cepas de P. immobilis crecen levemente o en absoluto a 35 °C y crecen mejor a 20 °C.349 P. immobilis está dividido en cepas sacarolíticas y asacarolíticas. Las cepas saca­ rolíticas tienen todas las características de las cepas asacarolí­ ticas (cuadro 7-20), salvo en que se oxida glucosa, xilosa y lac­ tosa, pero no sacarosa ni maltosa. Las cepas asacarolíticas son fenotípicamente similares a P. phenylpyruvicus. El diagnóstico de P. immobilis puede confirmarse mediante estudios de trans­ formación, perfil de ácidos grasos celulares y temperaturas de crecimiento óptimas < 35 °c.517,802 Muchas cepas tienen un olor semejante al agar alcohol feniletílico (PEA) (rosas)349 y son resistentes a la penicilina pero sensibles a la mayoría de los otros antibióticos.259,452 Los cuatro grupos han sido recuperados de muestras clíni­ cas. P. yeei se aisló de distintas infecciones de heridas humanas y sangre.167,229 Se comunicó que EO-3 causó peritonitis en un paciente en diálisis peritoneal continua.155 EO-4 fue aislado en sangre, orina y un seno paranasal, pero se desconoce la impor-

Cuadro 7-19

C aracte rístic a s claves de Moraxella, Oligella u re th ra lis y especies sim ilares a Moraxella PSYCHROBACTER

OLIGELLA

M.

P.

O.

N.

osloensis'1

phenylpyruvicus "

urethralis'1

weaveri •e

MO RAXELLA

N EISSE RIA

G R U PO DE BACILOS 1

M.

M.

M.

atlantae'1

canis“ht

catarrhalis

lacunata11

Oxidasa

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Catalasa

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Crecimiento en agar

+

+

-

l

< Q o

DE G IL A R D I

M.

V (86)

+

V (45)

V(54)

+

Motilidad

-

-

-

-

-

Glucosa OF

-

-

-

-

-

V(23)

-

-

-

+

-

-

-

-

V(68)

V( 17)

+

+

V (71)

-

+

-

V(42)

-

-

-

-

-

+

V(68)

-

-

+

-

-

+

+

+

-

-

-

-

-

-

M.

<

o

lincolnii'"1 nonliquefaciens"

l

PRUEBA

M.

"

Elongata subespecie nitroreducens"

de MacConkey

Urea

-

-

PAD Gelatina

ND

-

V(14)

-

-

+

N 0 2 reducido

-

V

V(86)

DNasa

-

+

+

-

Penicilina

S

S

R

S

S

S

92% S

73% S

S

S

S

s

CB

C

C

CB

CB

CB

CB

CB

CB

R

R

R

Forma celular

-

+

V(24)

V

“Datos tomados de la referencia802. hDatos tomados de la referencia359. CM. canis produce un pigmento pardo cuando crece en agar de Mueller-Hinton que contiene alm idón/59 dDatos tomados de la referencia753. 'Datos tomados de la referencia". 1Datos tomados de la referencia273. "N. elongata subespecie elongata es catalasa negativo, glucosa negativo y nitrato negativo y nitrito positivo. N. elongata subespecie glycolytica es catalasa positivo, débilmente glucosa positivo o glucosa negativo, nitrato negativo y nitrito positivo. N. elongata subespecie nitroreducens es catalasa negativo y débilmente glucosa positivo o glucosa negativo y reduce nitrato y nitrito." 316 '‘Datos tomados de la referencia5'5. +: 90% o más de cepas positivas; 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; S: sensible; R: resistente; ND: resultados no disponibles; C: coco; CB: cocobacilo; B: bacilo; OF: oxidación-fermentación. Los números entre paréntesis son porcentajes de cepas que dan reacciones positivas.

Microorganismos inmóviles y oxidasa positivos

N O , reducido

+(92)

335

336

C A P ÍT U L O 7

Cuadro 7-20

Bacilos gramnegativos no fermentadores

C aracterística s claves de Psychrobacter immobilis, Paracoccus yeei, EO-3, EO-4 y EF-4b'

Oxidasa Motilidad Crecimiento en agar de MacConkey Glucosa OF Xilosa OF NO, a NO, Crecimiento a 25 °C 35 °C 42 °C Células con forma de O Pigmento amarillo Olor

P SYC H R O B A C T E R

P ARACO CCU S

P. im m obilis

P. yeei (EO-2)

EO-3

E04

EF-4B

+

+

+

+

+

-

-

-

-

_

+

V(67)

V(65)

+

+

+

+

+ +

+

+

-

-

-

+ V(88)

V(40)

_b _b V(40)

V(64)

GRUPOS DE LOS CDC

+ V(40) V(20)

V(73)

+

+

+

+

+

V(36)

V(14)

-

+ -

-

Similar a la rosa

+ -

+

-

V(69)

-

-

V(83)

-

-

Palomita de maíz

“Datos de la referencia802. hLas cepas de P. im mobilis sacarolíticas comparten todas las características de las cepas asacarolíticas enumeradas aquí excepto en que oxidan glucosa, xilosa y lactosa, pero no sacarosa ni maltosa.802 + : 90% o más de cepas positivas; 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; ND: resultados no disponibles; OF: oxidación-fermentación. Los números entre paréntesis son porcentajes de cepas que dan reacciones positivas.

tancia clínica de estas cepas.800 Se comunicó que un caso de infección ocular y un caso de meningitis del lactante fueron causados por P. immobilis.259'452 Grupo EF-4b de los CDC. EF-4b junto con EF-4a fueron designa­ dos originariamente grupo de fermentadores eugónicos 4 (EF4); sin embargo, EF-4b no fermenta la glucosa, no hidroliza la arginina y no produce gas a partir de nitrato, lo que lo separa de las cepas fermentadoras de glucosa designadas como grupo EF-4a de los CDC (véase cap. 9). Las cepas EF-4b son bacilos cocoides a cortos inmóviles y oxidasa y catalasa positivos. Las colonias en las placas de cultivo son no pigmentadas y se comunica que huelen como las palomitas de maíz. La mayoría de los cultivos provienen de infecciones humanas luego de mordeduras de perros y gatos.802 La sensibilidad a los antibió­ ticos se asemeja a la de EF-4a.

42 °C. Las colonias son blanco grisáceas, con un borde entero, planas, algo brillantes y lisas. N. weaveri es inmóvil, fuerte­ mente positivo para oxidasa y catalasa, y negativo para utiliza­ ción de hidratos de carbono. Se reducen los nitritos, pero nr los nitratos, y es débilmente positivo para fenilalanina desaminasa (cuadro 7-19).11 Es sensible a penicilina, colistina \ vancomicina. Se considera que N. elongata subespecie elongata y N elongata subespecie glycolytica son colonizadores transitorio' de las vías aéreas altas humanas y del aparato urogenital; sin embargo, se informó que N. elongata subespecie elongata. produce endocarditis humana,15-528 y N. elongata subespecie glycolytica fue aislada de heridas humanas y hemocult: vos.12-336 La mayoría de las infecciones humanas se deben a A elongata subespecie nitroreducens, asociada con distintas in­ fecciones pero más a menudo con bacteriemia y endocardi­

Familia Nelsseriaceae GÉNERO NEISSERIA

o s 194,273,285,309.354,375,409.500,574,592,638,695,716,811 y p g c a S V eC eS COn OS-

Algunas especies de Neisseria tienen forma de bacilos en la tinción de Gram y es posible que no sean reconocidas inicial­ mente. Dos de estas especies son N. weaveri y N. elongata y ambas deben ser diferenciadas de otros bacilos no fermenta­ dores fenotípicamente similares (véase cuadro 7-19). Los miembros cocoides del género Neisseria se describen en el capítulo 11. Neisseria weaveri se encuentra como flora bucal normal en perros y se asocia con infecciones de heridas humanas resul­ tantes de mordeduras.ll 44-271-316 También se aisló en sangre,11" esputo y lavados bronquiales11-562 y en líquidos oculares, peritoneal y torácico.11 Existe una comunicación de la infección de una herida en un niño después de ser mordido por un tigre sibe­ riano blanco.98 N. weaveri aparecen como bacilos rectos aero­ bios, gramnegativos, anchos, pletóricos, intermedios a grandes de longitud variable, con una tendencia a crecer en cadenas o bacilos más grandes en caldos de cultivos.11 El crecimiento ocurre a 25 °C y 35 °C, y la mayoría de las cepas crecen a

teomielitis.236811 Conocido inicialmente como grupo M-6 de lo' CDC, fue reconocido como una subespecie singular de N. elongata llamada “nitroreducens” porque reduce los nitratos y lo* nitritos a aminas sin formación de gas.273 Otras característica' del microorganismo son reacciones de catalasa, ureasa e indoi negativas; reacción de oxidasa positiva y falta de producción de ácido a partir de hidratos de carbono (cuadro 7-19). N. elonga­ ta subespecie nitroreducens es típicamente sensible a aminopenicilinas, carbenicilina, cefalosporinas, aminoglucósidos, tnmetoprim-sulfametoxazol y polimixina, y es variadamente sen­ sible a la penicilina.194 GRUP01 DE BACILOS DE GILARDI

Este grupo consiste en bacilos sin requerimientos nutridonales especiales, no oxidativos, gramnegativos, ovales de lon­ gitud intermedia y a veces pleomorfos. Las características de cultivo y bioquímicas de este microorganismo son muy simila­ res a las del grupo M-5 de los CDC, ahora denominado

M ic ro o rg a n is m o s in m ó v ile s y o xid a s a n e g a tiv o s

Neisseria weaveri. Todas las cepas del grupo 1 de bacilos de Gilardi son fuertemente positivas en la reacción de fenilalanina desaminasa y producen un color verde profundo en agar incli­ nado, mientras que las cepas M-5, cuando son positivas, dan una reacción débil a moderada. Todas las cepas M-5 reducen el nitrito al 0,01%, mientras que todas las del grupo 1 de bacilos de Gilardi son negativas.249-515 En el cuadro 7-19 se presentan otras características diferenciales. Las cepas del grupo 1 de bacilos de Gilardi han sido aisladas en distintas muestras numanas, que incluyen heridas de piernas, brazos y pies; una lesión bucal; orina y sangre; sin embargo, no se ha determina­ do aún su potencial patogénico.515

W croorganismos inmóviles y oxidasa negativos SEÑERO ACINETOBACTER

El género Acinetobacter se clasifica actualmente en la fami­ lia Moraxellaceae y consiste en bacterias que son cocobacilos r -_Tinegativos inmóviles oxidasa negativos.237-645 En 1986, 5 -\et y Grimont proporcionaron una nueva clasificación que ^'.inguía 12 grupos (genoespecies o especies genómicas) denr : ¿el género Acinetobacter sobre la base de la hibridación de I '-A-DNA y las características nutricionales.76 En 1989, I r—berg y Ursing740 describieron otros tres grupos de DNA . «tricados 13 a 15; en forma simultánea, Bouvet y Jeanjean78 suscribieron cinco grupos DNA de especies proteolíticas de Mdr-robacter que numeraron del 13 al 17. Sin embargo, dos de £ grupos DNA descritos por Tjemberg y Ursing difieren Éacépicamente de los grupos DNA descritos por Bouvet y c r/e a n . Por lo tanto, diferentes grupos DNA tienen el mismo n-nero. lo que aumenta la confusión que rodea a la subdivisión ■anal del género. En la actualidad, existen al menos 25 genoo c e a e s descritas dentro del género Acinetobacter.352-530-531 La genoespecie 1 es la especie tipo y se la denomina A. cala . - - cus. Se aísla principalmente del suelo. La genoespecie 2 * ¿en mina A. baumanii-, incluye cepas antes denominadas A. ~n. mceticus variedad anitratus. La designación anitratus se <■ c - lera inválida y ya no debe utilizarse. La genoespecie 4 se

Idadro 7-21

337

denomina A. haemolyticus', la genoespecie 5 se denomina A. junii; la genoespecie 7 se denomina A. jolmsonii; la genoespe­ cie 8 se denomina A. lwoffii y la genoespecie 12 se denomina A. radioresistens. La mayoría de las genoespecies restantes no tienen nombre. Se describió un esquema de las pruebas fenotípicas para Acinetobacter genoespecie 1 a 12.76 Debido a los problemas para separar las cepas sacarolíticas pertenecientes a los grupos DNA 1, 2, 3 y 13 utilizando pruebas fenotípicas, algunos laboratorios decidieron referirse a los miembros de este grupo como “complejo Acinetobacter calcoaceticus-A. baumannii” o “Acinetobacter sacarolítico”. Asimismo, los laboratorios a veces nombran a los miembros no sacarolíticos de este género como “Acinetobacter no sacarolíticos” (véase cuadro 7-21). Un indicio inicial de que una cepa no fermentadora puede pertenecer al género Acinetobacter es la morfología en la tin­ ción de Gram; las células cocobacilares gramnegativas a menu­ do se presentan como diplococos (véase lámina en color 7-5 A). Esta similitud en el aspecto con Neisseria gonorrhoeae condu­ jo a la designación de género taxonómica arcaica “Mima ” (imi­ tar). Los estudiantes y los trabajadores del laboratorio también deben conocer el hecho de que las especies de Acinetobacter pueden aparecer inicialmente como cocos grampositivos en frotis directos de muestras clínicas y en frotis preparados a par­ tir de frascos de hemocultivos positivos.169-292 Después de 24 horas de crecimiento en agar sangre, las colonias tienen entre 0,5 y 2 mm de diámetro, son translúcidas a opacas (nunca pig­ mentadas) y convexas y enteras. La mayoría de las cepas cre­ cen bien en agar de MacConkey y producen un tinte rosado pálido (véase lámina en color 7-5B). Algunos acinetobacteres que oxidan glucosa pueden causar asimismo un cambio de color del agar infusión de corazón con tirosina o agar-sangre en el cual se incorpora glucosa.690-802 También hemos observado este fenómeno en los agares de MacConkey o de MuellerHinton con una cepa clínica de A. baumanii (lámina en color 75C). Se describieron medios diferenciales y selectivos para el aislamiento de especies de Acinetobacter de muestras contami­ nadas.335-360 La identificación presuntiva de especies de Acinetobacter se puede hacer sobre la base de la falta de acti­

C aracterísticas claves de Acinetobacter, Bordetella holmesii, Bordetella parapertussis y g ru p o s NO-1 y EO -5 'd e los CDC A C IN E T O B A C T E R B A U M A N N II

IH E B A

A C IN E T O B A C T E R L W O F F II

GRUPO NO-1 DE LOS CDC

BORDETELLA H O L M E S II (NO-2)

BORDETELLA P A R A P E R T U SSIS

GRUPO EO-5c DE LOS CDC

[ C e a m e n to en agar jc MacConkey 1 C c c i r ento a 42 °C t& rc s a O F 1 p Q xóocido

+

1

+ + V V -

+

V(20)

+

+

-

V(15)

-

V(18)

-

-

-

-

-

+

-

+

-

-

_

V V

-

-

-

_

-

-

+

+

-

-

Parda, soluble

Parda, soluble

Pigmento amarillo producido por algunas cepas

1 "z-l am riendo se señale, los datos son tomados de la referencia802. H hnriafiflm C Tz/i en agar sangre y produce colonias minúsculas, (3-hemolisis y un pigmento pardo hidrosoluble.802 H B h b v wm&ios de la referencia’65.

más de cepas positivas; V H b m dk ?

90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; OF: oxidación-fermentación. Los números entre paréntesis son porcentajes

; dan reacciones positivas.

338

C A P ÍT U L O 7

Bacilos gramnegativos no fermentadores

vidad de citocromo oxidasa, la falta de motilidad y la resisten­ cia a la penicilina. A. baumanii es sacarolítico y acidifica la mayoría de los hidratos de carbono OF; en particular, se hace una identifica­ ción definitiva demostrando la producción rápida de ácido a partir de lactosa (concentraciones al 1% y 10%). Por el contra­ rio, A. Iwolffii es asacarolítico. La genoespecie 7, A. johnsonnii, también es asacarolítica, pero puede separarse de todas las otras especies de Acinetobacter por su falta de crecimiento a 37 °C. Otras características diferenciales de las 12 genoespecies pueden hallarse en el artículo de Bouvet y Grimont.76 A. baumannii es la especie hallada con mayor frecuencia en muestras clínicas humanas, seguida de A. Iwoffii, A. haemolyticus, A. johnsonii, la genoespecie 3 y la genoespecie 6.79J73'675’740 A. johnsonii, A. Iwoffii y A. radioresistens son especies de Acinetobacter no sacarolíticas que se presentan como habitan­ tes naturales de la piel humana.79-675 Distintas infecciones humanas causadas por especies de Acinetobacter han sido revi­ sadas por Lyons463 e incluyen neumonía (más a menudo rela­ cionada con tubos endotraqueales o traqueostomías),93 endo­ carditis, meningitis, infecciones de la piel y las heridas, perito­ nitis (en pacientes que reciben diálisis peritoneal) e infecciones urinarias. También se han comunicado casos esporádicos de conjuntivitis, osteomielitis y sinovitis.261 Actualmente se reco­ noce que las especies de Acinetobacter desempeñan una fun­ ción importante en la colonización y la infección de los pacien­ tes hospitalizados. Fueron implicadas en distintas infecciones hospitalarias, que incluyen bacteriemia, infecciones urinarias y meningitis secundaria, pero su papel predominante es como agentes de neumonía hospitalaria, sobre todo neumonía asocia­ da con el respirador en los pacientes confinados a las unidades de cuidados intensivos.60-775 A. baumannii es la especie responsable más a menudo de las infecciones hospitalarias.55-457,775 Se ha establecido un sistema de biotipificación para diferenciar 17 biotipos de A. baumannii sobre la base de la utilización de seis sustratos que puede ser útil para los estudios epidemiológicos.77 Otras especies, como A. johnsonii, A. Iwoffii y A. radioresistens, parecen ser habitan­ tes naturales de la piel humana y también pueden ser comensa­ les en la orofaringe y la vagina.79A. Iwoffii ha sido más común­ mente asociado con meningitis que con otras especies de Acinetobacter,691 Se ha mostrado que A. ursingii produce infec­ ciones del torrente circulatorio en pacientes hospitaliza­ dos.458-530-532 A. junii es una causa rara de infección ocular604 y bacteriemia, sobre todo en pacientes pediátricos.63,376,442 También se ha comunicado un caso de bacteriemia extrahospitalaria por Acinetobacter radioresistens en un paciente HIV positivo.776A. Schindleri se aisló de distintas muestras humanas (vagina, cuello uterino, faringe, nariz, oído, conjuntivas y orina), pero en su mayor parte no se considera que tenga impor­ tancia clínica.530,532 Las especies de Acinetobacter tienden a ser resistentes a dis­ tintos antibióticos, aunque una especie, A. Iwoffii, tiende a ser más sensible que las otras. Existe una resistencia casi universal a penicilina, ampicilina y cefalotina, y la mayoría de las cepas son resistentes al cloranfenicol.463674 Se ha comunicado una sensibilidad variable a las cefalosporinas de segunda y tercera generación y a trimetoprim-sulfametoxazol. Hemos observado una mayor tendencia a la resistencia a los aminoglucósidos entre las especies de Acinetobacter en los últimos años y cepas multirresistentes, que incluyen especies de Acinetobacter resis­ tentes a los carbapenémicos en brotes hospitalarios.74-342,478,815 Las pruebas de sensibilidad a los antibióticos para las espe­ cies de Acinetobacter son problemáticas. Swenson y cois, han

mostrado en los CDC que los resultados obtenidos utilizando una dilución estandarizada en microcaldo no concuerdan con los obtenidos con el método estandarizado de difusión con dis­ cos para ciertos antibióticos. Los errores muy importantes eran frecuentes con la combinación de la (3-lactámicos e inhibidores de P-lactamasa y el método de dilución en microcaldo mostra­ ba típicamente mayor resistencia.725 En la actualidad, no existe ningún dato que indique cuál es el método que proporciona información de mayor relevancia clínica. El tratamiento combinado con un aminoglucósido y ticarcilina o piperacilina es sinérgico y puede ser eficaz en las infec­ ciones graves. Para las infecciones por Acinetobacter multirresistente, varios estudios han demostrado eficacia clínica del sulbactam combinado con ampicilina o cefoperazona 303,361,365,434,563 £| único antibacteriano cuya actividad contra Acinetobacter multirresistente se ha demostrado es la colistina 105,366,435 para una revjsión de las características clínicas, la epidemiología molecular y la sensibilidad a los antibióticos de las infecciones hospitalarias por Acinetobacter consúltense las revisiones de Bergogne-Berezin y Towner60 y Wisplinghoff y cois.809 GRUPO N0-1 DE LOS CDC

Una especie sin nombre de un bacilo gramnegativo no oxidativo con requerimientos nutricionales especiales, designado grupo NO-1 de los CDC (no oxidante-1) ha sido aislada de heridas humanas resultado fundamentalmente de mordeduras de perros o gatos.37,312,372 Este microorganismo es inmóvil, oxi­ dasa negativo y asacarolítico. Se presentan como bacilos gram­ negativos cocoides de tamaño intermedio que forman pequeñas colonias en agar sangre de camero. Se asemejan fenotípicamen­ te a las especies de Acinetobacter, pero se los puede separar fácilmente por una prueba positiva de reducción de nitrato. También es útil el análisis de los ácidos grasos celulares y ubiquinona para diferenciar NO-1 de las especies de Acinetobac­ ter.312 En el cuadro 7-21 se presentan otras características fenotípicas. Estos microorganismos son sensibles a distintos anti­ bióticos, como aminoglucósidos, (i-lactámicos, tetraciclinas, quinolonas y sulfamidas. Se comunicó que el 50% de las cepas son resistentes a la trimetoprim.312 BORDETELLA HOLMESII (GRUPO N0-2 DE LOS CDC)

B. holmesii era clasificado antes como grupo NO-2 de los CDC y se lo describe como un bacilo gramnegativo, cocoide pequeño y corto, y en ocasiones se observan bacilos más largos de ancho intermedio. Son asacarolíticos, oxidasa negativos, inmóviles, tienen requerimientos nutricionales especiales y pro­ ducen un pigmento soluble pardo (véase cuadro 7-21),801 La falta de actividad de oxidasa y la producción de un pigmento soluble pardo diferencian B. holmesii de B. pertussis, B. bronchiseptica y B. avium; la falta de actividad de ureasa diferencia este especie de B. parapertussis. Una reacción de nitrato negativa la diferen­ cia de las cepas NO-1 y la producción de un pigmento soluble pardo la diferencia de las especies de Acinetobacter. La infor­ mación de la importancia clínica de B. holmesii y su asociación con enfermedad en seres humanos fue presentada en otra parte de este capítulo con el título “Género Bordetella GRUPO EO-5 DE LOS CDC

Los microorganismos EO-5 de los CDC son bacilos gram­ negativos que oxidan glucosa y tienen un perfil bioquímico

P a u ta s p a ra la re c u p e ra c ió n d e no fe rm e n ta d o re s

'.milar a A. baumannii.165 Son inmóviles y oxidasa negativos, pero al contrario de las especies de Acinetobacter, no crecen en _;¿r de MacConkey. Algunas cepas producen un pigmento -: ¡uble amarillo. El análisis de ácidos grasos celulares también es útil para diferenciar las cepas EO-5 de Acinetobacter. Otras ; ^racterísticas se detallan en el cuadro 7-21. Se han aislado en sangre, líquido peritoneal, aspirado transtraqueal, vesícula v':ar y la herida de un brazo.165 No existen datos sobre sensi• :dad a los antibióticos.

-ARTE III: CONSIDERACIONES PARA LA RECUPERACIÓN ' LA IDENTIFICACIÓN DE LOS NO FERMENTADORES •» veles de servicio en la identificación

se los no fermentadores

El nivel en el cual se realiza la identificación de la especie de a Termentadores depende del tamaño y del objetivo de cada bi> ratorio. Los laboratorios de referencia o las universidades j i - ' centros clínicos donde entrenan los estudiantes y residenir- r ueden ser necesarios para identificar las especies de todos l > no fermentadores de importancia clínica. Los laboratorios proporcionan servicio fundamentalmente a la comunidad ■cdka pueden estar preparados para identificar sólo las espei más frecuentes y envían los microorganismos raros a un l¿o: ratorio de referencia. En el análisis de las muestras bacté­ ricas difundidas por los CDC para sus programas de evafcición de rendimiento en microbiología, Griffin y cois.281 aron que los laboratorios donde el volumen de muestras nadas es pequeño (menos de 80 muestras por semana) Ifta e n en promedio un tasa de errores de alrededor del doble I Ci.i- l : s laboratorios que analizan más de 1 200 muestras por M o a . Estos autores llegaron a la conclusión de que la difeI n d a en el rendimiento es constante y que un laboratorio no k s c o e corregir siempre ese rendimiento por muchas de las ■ r a e s que se mencionan en el recuadro 7-9. Recomiendan Iqoic ' laboratorios limiten el examen a los procedimientos r _eJen efectuar bien y que acuerden con un laboratorio de K fc e n c ia para que se haga cargo del examen de las muestras ! K : - habituales. Los factores que contribuyen a las dificultafc e~ la identificación de los no fermentadores se enumeran Hto ;i recuadro 7-9.

ro 7-9

Factores que contribuyen a las dificultad es en la identificación de los no fe rm entadores

v :ría de las especies sólo se encuentran rara vez. : a esta poca frecuencia, es posible que el personal de laboratorio é :amiliarizado con muchos de los no fermentadores. - - de los medios de cultivo convencionales no son apropiados ¿ i ¿entificación de los no fermentadores. i- e-pecies crecen lentamente, la reactividad bioquímica es débil y re ^na experiencia considerable para interpretar resultados ambi­ r e Je calidad de los medios de cultivo puede ser difícil y. debido se infrecuente, su vencimiento es un problema. ¡nipos comerciales a menudo tienen baja precisión para la identi- de las cepas de no fermentadores con mayores requerimientos iooales especiales y requieren el uso de medios adicionales.

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Existen actualmente varios sistemas comerciales para la identificación de los no fermentadores (se explican más adelante);315'405-546'556,631'711-791 sin embargo, como estos sistemas dependen del crecimiento bacteriano y de la formación de pro­ ductos bioquímicos en medios convencionales o en sustratos marginalmente nutritivos, sólo pueden identificarse las espe­ cies más activas con un grado aceptable de precisión. La exac­ titud del rendimiento también mejora con el uso de uno de los varios sistemas automáticos o semiautomáticos de identifica­ ción bacteriana, fundamentalmente porque confían en las lec­ turas automáticas con instrumentos y el registro de los resulta­ dos, lo que elimina el sesgo subjetivo intrínseco a la interpreta­ ción visual de los parámetros ambiguos. Estos instrumentos tienen la ventaja de hacer identificaciones varias horas antes que las requeridas con los métodos convencionales.

Pautas para la recuperación de los no fermentadores Teniendo en cuenta la explicación anterior, el director de cada laboratorio debe implementar un enfoque lógico para la identificación de los no fermentadores en su laboratorio. Las siguientes pautas son útiles para la recuperación e identifica­ ción de los bacilos gramnegativos no fermentadores: 1. Salvo por P. aeruginosa (y los pocas veces hallados B. mallei y B. pseudomallei), los no fermentadores tienen bajo grado de virulencia y más a menudo producen infecciones hospitalarias en pacientes debilitados o inmunodeprimidos. Este nicho estrecho de infecciosidad indica que las infec­ ciones serán infrecuentes (salvo por la incidencia relativa­ mente alta de P. aeruginosa y Acinetobacter baumannii, como se explicó antes). Sin embargo, como una proporción cada vez mayor de pacientes hospitalizados tiene una enfer­ medad subyacente grave, se están aislando no fermentadores con una frecuencia creciente en las muestras clínicas y se los debe considerar agentes importantes para muchas enfermedades infecciosas. Los trastornos o las enfermeda­ des específicos que predisponen a los pacientes a infeccio­ nes por no fermentadores son los siguientes: a. Procesos malignos (sobre todo del sistema reticuloendotelial) e instrumentación y cirugía: cateterismos (sobre todo del aparato urinario e intravascular permanente), traqueostomía, punción lumbar, diálisis, lavados y colo­ cación de derivaciones y prótesis. b. Tratamientos corticosteroideo, antibiótico, antimetabólico y antioncológico prolongados. c. Enfermedades metabólicas o infecciosas crónicas subya­ centes (p. ej., existe una relación evidente entre fibrosis quística e infecciones causadas por B. cepacia o P. aeru­ ginosa mucoide). d. Quemaduras, heridas abiertas y distintas lesiones exuda­ tivas. 2. La mayoría de los no fermentadores tienen su hábitat natu­ ral en varios medioambientes que sirven como posibles reservorios para las infecciones humanas: a. Distintos reservorios de agua prevalentes en los hospita­ les: humificadores y nebulizadores, baños de agua, solu­ ciones desinfectantes y de irrigación, vías de agua desti­ lada, cremas para manos, lociones corporales, etc. Estas soluciones a menudo entran en contacto directo con las mucosas y otras superficies corporales en el curso del tra­ tamiento del paciente.

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Bacilos gramnegativos no fermentadores

b. Implementos, como equipamiento anestésico, pinzas y termómetros, que pueden ser almacenados en soluciones desinfectantes; estropajos, esponjas y toallas. c. Partes intertriginosas húmedas de la piel, como los espa­ cios interdigitales del pie, la ingle, la axila y la fosa ante­ cubital. Las infecciones de estas fuentes tienden a preva­ lecer en el verano. d. Distintos animales domésticos que predisponen a los cui­ dadores a la infección. 3. Algunos no fermentadores tienden a causar infecciones específicas, que se explican en otra parte de este capítulo. Se puede hallar una septicemia casi con cualquier especie; la mayoría de las especies de no fermentadores pueden causar neumonitis o bronquitis, artritis séptica, infecciones urina­ rias, infecciones de heridas posoperatorias y postraumáticas y conjuntivitis. Algunas especies, sobre todo Pseudomonas, pueden producir toxinas citotóxicas y líticas que generan algunas de estas infecciones localmente graves y potencial­ mente mortales. 4. Se puede sospechar que las cepas clínicas que son bacilos gramnegativos en la tinción de Gram son no fermentadores si producen colonias pequeñas en agar sangre, crecen poco o no crecen en absoluto en agar de MacConkey. no convier­ ten la porción inclinada ni la profundidad de los medios KIA o TSI y son citocromo oxidasa positivos. 5. Muchas especies de no fermentadores también tienden a tener ciertos patrones de multirresistencia a los antibióticos. Estos patrones se aprenden a través de la experiencia y pueden pro­ porcionar un indicio inicial de que se está tratando con uno de los no fermentadores o puede señalar un género específico.

ficación cuando se sospecha P. aeruginosa (véase lámina en color 7-1G). Estos autores señalan que algunas cepas mucoides de P. aeruginosa de pacientes con fibrosis quística es posible que no produzcan pigmento y, por lo tanto, pueden ser malinterpretadas si la producción de pigmento es el único criterio utilizado para la identificación de estas cepas aberrantes. La detección de un olor similar al de las uvas también es un indi­ cio útil cuando se examina el crecimiento en placas de agar. Las colonias son grandes, pueden ser mucoides o secas, y a menudo se propagan (véase lámina en color 7-2F,G,H). Algunas cepas de P. aeruginosa pueden producir pigmentos con otros colores: piorrubina (rojo), piomelanina (pardo a negro) y pioverdina (amarillo). Se puede visualizar el pigmento de fluoresceína observando el crecimiento en ciertos medios que utilizan una fuente de luz ultravioleta de longitud de onda larga (p. ej., lámpara de Word: véase lámina en color 7-1H). Los medios que contienen proteosa peptona 3 (Difeo Laboratorios, Detroit MI) y cationes, como magnesio o manganeso, aumentan la síntesis de fluores­ ceína. El medio de King B, el medio de Sellers y el agar de Mueller-Hinton también son apropiados para demostrar fluo­ rescencia. El tubo estrangulado para fermentadores gramnega­ tivos (Remel, Lenexa. KS) permite una observación visual del pigmento amarillo y es posible que no sea necesaria la luz ultravioleta. En nuestra experiencia, los medios combinados de fluorescencia-lactosa-desnitrificación (FN o FNL) son menos sensibles para la detección ultravioleta de pigmento de fluores­ ceína. La fluorescencia puede aumentar si se incuban los culti­ vos a 20 a 30 °C en lugar de hacerlo a 35 a 37 °C.246 Las siguientes características adicionales son útiles para identificar cepas de P. aeruginosa que no producen pigmento:

Identificación de las especies más frecuentes

• • • •

Se trata primero la identificación de las tres especies más aisladas: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii y Stenotrophomonas maltophilia. La mayoría de las cepas pue­ den identificarse con facilidad sólo sobre la base de algunas observaciones y pruebas químicas. No sólo la identificación rápida de estos microorganismos comunes proporciona al médico información inmediata, sino que también evita al labo­ ratorio la realización de pruebas secundarias prolongadas y costosas. Pseudomonas aeruginosa

Más del 95% de las cepas de P. aeruginosa aisladas de mues­ tras clínicas pueden identificarse observando la presencia de las siguientes características primarias: • Colonias grandes, olor similar a uvas. • Se produce piocianina. • Las colonias son oxidasa positivas (dentro de los 10 segun­ dos). La mayoría de las cepas producen piocianina, un pigmento fenazínico verde hidrosoluble que imparte un color verdoso al medio de cultivo. De hecho, la presencia de piocianina puede ser la única característica necesaria para identificar a P. aerugi­ nosa, porque ningún otro no fermentador sintetiza este pig­ mento. Reyes y cois.621 mostraron que el 98% de las cepas de P. aeruginosa aisladas en su laboratorio producían piocianina en agar Tech398 en 48 horas y sugieren que este agar es una alternativa satisfactoria al uso de esquemas extensos de identi­

Crecimiento a 42 °C. Alcalinización de acetamida. Desnitrificación de nitratos y nitritos. Móviles con flagelo polar y monotrico.

También pueden hallarse variantes que producen colonias mucoides o enanas con reacciones bioquímicas atípicas, lo que a veces dificulta la identificación. Aunque no es necesaria una tinción para flagelos para identificar a la mayoría de las cepas, en estos casos puede ser útil evaluar la morfología flagelar. En resumen, la mayoría de las cepas de P. aeruginosa pue­ den identificarse con facilidad observando las colonias grandes típicas, con un cambio de color verde azulado en los medios de aislamiento primario, y confirmarse, además, detectando un olor típico similar a uvas. La demostración de pigmento de fluoresceína y actividad de citocromo oxidasa ayuda a la iden­ tificación final y no suelen ser necesarias otras pruebas. En el cuadro 7-4 se muestran las características típicas por medio de las cuales se identifica P. aeruginosa. Acinetobacter baumannii

A. baumannii es el segundo no fermentador más frecuente hallado en los laboratorios clínicos, pero sólo con alrededor de un 10% de la frecuencia de P. aeruginosa. Las siguientes son las características por medio de las cuales se puede hacer una identificación presuntiva: • Aparecen como cocos o cocobacilos en la tinción de Gram. • Crecen bien en agar de MacConkey (las colonias pueden tener una tinción ligeramente rosada, una característica útil cuando está presente).

M étodos para la identificación que utilizan pruebas convencionales

• No producen citocromo oxidasa. • Muestran una rápida utilización de la glucosa, con produc­ ción de ácido. • Muestran una rápida utilización de lactosa al 10%, con pro­ ducción de ácido. • Son inmóviles. • Son resistentes a la penicilina. El indicio inicial es la observación de diplococos pequeños 1 1.0 x 0.7 (im) en las tinciones de Gram preparadas directanente de materiales clínicos. Cuando las tinciones de Gram se i7"r?aran a partir de cultivos de agar o de caldo, las células pue­ den aparecer más grandes y ser más similares a cocobacilos (léase lámina en color 7-5A). Las especies de Acinetobacter m no pigmentadas cuando crecen en agar sangre, una carac«rística útil para diferenciarlas de algunos otros no fermentao: :e>. como cepas inmóviles oxidasa negativas ocasionales de iBmrkholderia cepacia. Sin embargo, las colonias que crecen en B ar ¿e MacConkey pueden producir un tinte rosado débil o un huI aciano más profundo cuando se observan en agar-eosi-^-ozjI de metileno (véase lámina en color 7-5B). La resistenIcb a la penicilina ayuda a distinguir A. baumannii de especies c e Moraxella altamente sensibles a la penicilina, que también i-oe^en aparecer como cocobacilos en la tinción de Gram. La ■ n o n a de las cepas de las especies de Moraxella son también a ü i s a positivas. A. Iwoffii es asacarolítica y puede diferende A. baumannii porque no produce ácido cuando crece en —edios que contienen hidratos de carbono.

Recuadro 7-10

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C onsideraciones para s eleccio n ar una prueba convencional

1. Los resultados de reacciones positivas y negativas delineados en el cua­ dro de identificación deben basarse sobre los procedimientos y las fór­ mulas mencionados en el manual de procedimientos del laboratorio. Es decir, los medios y los procedimientos deben ser los mismos que los utilizados para generar los resultados en un cuadro de las reacciones uti­ lizadas para la identificación. 2. Todas las reacciones mencionadas en el cuadro de identificación deben estar en un nivel de confianza del 90% o mayor y deben derivar de una base de datos con una cantidad suficientemente grande de microorga­ nismos para ser estadísticamente significativos. 3. Todas las pruebas deben realizarse bajo vigilancia estándar de control de calidad para asegurar que los reactivos, las reacciones y los paráme­ tros estén lo más próximo posible a aquellos sobre los que se basó ori­ ginariamente el cuadro.

vo requeridos para realizar las distintas pruebas, siempre que se cumplan los criterios enumerados en el recuadro 7-10. Esquemas de identificación de Weyant (CDC), Gilardi y Pickett

A excepción de los sistemas comerciales, los esquemas dise­ ñados por Pickett,581-587-589,590Gilardi244'248 y Weyant y cois.802(de acuerdo con los protocolos de identificación obtenidos origina­ riamente por Elizabeth King en los CDC397) tienen las bases de Ssr :yophomonas maltophilia datos más grandes. Los autores de cada uno de estos tres esque­ 5 maltophilia es «el tercer no fermentador en frecuencia mas de identificación publicaron en forma separada varias pun­ í p b d o en los laboratorios clínicos. Las siguientes son las tuaciones de cuadros de identificación individuales, procedi­ características por medio de las cuales se puede hacer una idenmientos y otra información relativa a los no fermentadores. La ifc^ción presuntiva: información se ha vuelto demasiado vasta para incluirla en este libro y es necesario simplificar el material para satisfacer las I <• 5_en crecimiento en agar sangre o agar de MacConkey. necesidades de los estudiantes y de los nuevos microbiólogos. • S : produce citocromo oxidasa. Por lo tanto, no comentaremos aquí los cuadros de identifica­ I • ouce ácido en OF maltosa pero puede ser negativo en OF ción utilizados en estos esquemas; sólo se explicarán los enfo­ | siseos a. ques singulares diseñados por estos investigadores. Se remite a • L sina descarboxilasa positivo. los lectores interesados a la segunda y tercera edición de este [ • DNasa positivo. libro o a las referencias citadas donde hallarán una lista com­ ■ • Algunas cepas tienen pigmento amarillo. pleta de los cuadros y protocolos de identificación utilizados en esos sistemas. E r ^trón de sensibilidad a los antibióticos también puede ser Esquema de los CDC-Weyant y cois En respuesta al problema de ■ u t re :c ió para la identificación de S. maltophilia, que es típicómo identificar a los no fermentadores en el laboratorio clíni­ 3 T ¿~ :; resistente a la mayoría de los antibióticos, incluidos co sin realizar todas las pruebas que se hacen en un laboratorio te :noglucósidos, pero es sensible a trimetoprim-sulfamede referencia. Weyant y cois.802 han publicado una guía de tres v colistina. partes que incluye: 1) una clave de identificación para los aero­ bios gramnegativos, 2) un conjunto de 12 cuadros de identifi­ cación y 3) un libro de códigos numéricos por medio del cual se pueden relacionar los números de los biotipos derivados con W>r::os para la identificación que utilizan pruebas los nombres de las especies. También incluyen procedimientos tra ic ió n a le s y fórmulas de medios para todas las pruebas bioquímicas cita­ das en el manual de identificación. Para interpretar correcta­ 5- un bacilo gramnegativo no fermentador desconocido no es mente los resultados de un cuadro de identificación dado, se monas aeruginosa, Acinetobacter baumannii o Stenodeben utilizar los mismos procedimientos sobre los cuales se ■■)- ■ monas maltophilia, deben determinarse otras caracterísbasan las reacciones. El manual se titula Identification o f para la identificación de una especie. En la actualidad, se Unusual Phatogenic Gram-Negative Aerobic and Facultatively varios esquemas en los laboratorios clínicos. En Anaerobic Bacteria (Identificación de bacterias aerobias y ane■ K á r s de ellos se utilizan híbridos de los procedimientos de robias facultativas gramnegativas patógenas inusuales) y está _sados en los esquemas publicados. El criterio de seleceditado por Lippincott Williams & Wilkins.802 «jftr crpende en gran parte de la preferencia personal, la expeEsquema de Gilardi. El enfoque de Gilardi de la identificación de Spfccia pasada y la disponibilidad local de los medios de cultilos bacilos gramnegativos no fermentadores evolucionó duran­

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Bacilos gramnegativos no fermentadores

te veinte años a un extenso sistema que se señala en varios pro­ tocolos y cuadros detallados incluidos en una serie de publica­ ciones.244'248 No obstante, el sistema no es más complejo que el de los no fermentadores propiamente dichos, y el último enfo­ que, dirigido a los laboratorios de tamaño pequeño e interme­ dio, refleja la tendencia progresiva hacia una mayor sencillez y practicidad.247 El enfoque de Gilardi se basa sobre dos principios funda­ mentales que han hecho práctico su uso en los laboratorios clí­ nicos: 1) los medios y las pruebas se pueden obtener fácilmen­ te en la mayoría de los laboratorios clínicos y a menudo son los mismos que los utilizados para la identificación de otros gru­ pos de bacterias, incluidas las enterobacterias y 2) la identifica­ ción de la mayoría de los aislamientos clínicos se puede hacer en dos etapas: la primera, mediante el uso de una serie primaria de medios y reacciones que son suficientes en la mayoría de los casos, y una serie secundaria, disponible cuando la primera es insuficiente.245 Remitimos al lector a las publicaciones citadas en las referencias anteriores para obtener una lista completa de los medios diferenciales y el alcance de las reacciones en las series primaria y secundaria de pruebas que conducen a la iden­ tificación de la mayoría de los no fermentadores de importan­ cia clínica. Esquema de Pickett. Hace más de tres décadas, Pickett fue uno de los primeros en poner algo de orden en la identificación de los no fermentadores.581587'589'590 Su sistema fue ideado para identificar rápidamente los dos no fermentadores aislados más a menudo: Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter bauman­ nii. Pickett recomendó el uso de un inóculo importante prepa­ rado en una suspensión acuosa a partir del cultivo bacteriano que desarrolló durante una noche (crecimiento en fase logarít­ mica) y sembrado en sustratos únicos con buffer para evaluar la acidificación de hidratos de carbono y la alcalinización de ami­ das y sales orgánicas. El fundamento subyacente al agregado del inóculo importante a los sustratos de prueba diferenciales fue introducir una alta concentración de enzimas preformadas u otros productos metabólicos que podrían ser detectados más rápidamente por el indicador parámetro, lo que permite leer la mayoría de las reacciones dentro de las 24 horas. Pickett diseñó cuadros de identificación para varios grupos de no fermentadores que son similares al esquema de WeyantCDC. Estos cuadros fueron publicados en su totalidad en la segunda edición de este libro y no los reproduciremos aquí. También se incluyen en la segunda edición las fórmulas para reactivos y sustratos y una descripción de todos los procedi­ mientos requeridos para realizar las pruebas diferenciales nece­ sarias para cada cuadro de identificación. Los sustratos necesa­ rios para realizar estas pruebas se encuentran disponibles en forma de tabletas deshidratadas de Key Scientific Products (Round Rock, TX) y en la forma reconstituida de Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA). Enfoque práctico de ia identificación de los no fermentadores

El enfoque utilizado en este libro fue diseñado por uno de nosotros (P. C. Schreckenberger)669 y requiere que se dividan los distintos bacilos no fermentadores de importancia clínica en cuatro grupos funcionales sobre la base de una evaluación inmediata de su motilidad y su capacidad para producir citocromo oxidasa (cuadro 7-22). Una vez logrado el subagrupamiento, se pueden realizar identificaciones definitivas remi­ tiéndose a los cuadros de identificación 7-23 a 7-35 y siguien­ do las instrucciones que se proporcionan en ellos. Las pruebas utilizadas en esta guía de identificación son fórmulas bioquí­

micas convencionales y se encuentran disponibles en el comer­ cio en la mayoría de los fabricantes de medios. Obsérvese que al utilizar estos cuadros, una especie dada de un bacilo no fer­ mentador puede aparecer en más de un cuadro porque es posi­ ble que el microorganismo particular no sea 100% positivo o negativo para una característica determinada; por lo tanto, se crea cierta redundancia en el esquema de modo que un bacilo desconocido será identificado cualquiera que sea el resultado obtenido con la prueba de cribado variable. Al seguir estos cua­ dros, el microbiólogo debe poder identificar en forma definiti­ va más del 95% de los bacilos no fermentadores que se aisla­ rán de las muestras clínicas. Procesos computarizados

BioBASE (BioBASE, Boston, MA) es un programa computarizado basado sobre DOS para la identificación computarizada de microorganismos.502 El sistema le permite al usuario crear y acceder a cientos de bases de datos de microbios y cam­ biar entre ellas, según las características primarias de los micro­ organismos aislados por estudiar. Con el software se incluye la base de datos, publicada por Holmes y cois.,327 que abarca los 66 taxones de no fermentadores identificados utilizando 83 pruebas fenotípicas. La identificación de las bacterias aisladas se puede basar en todas las pruebas seleccionadas o en algunas de ellas. Pibwin (Probabilistic Identification ot Bacteria for Windows, “Iden­ tificación probabilística de bacterias para Windows"). Este progra­

ma proporciona una identificación probabilística de las bacte­ rias desconocidas aisladas por comparación con matrices de identificación de cepas conocidas. El programa tiene tres fun­ ciones importantes: 1) la identificación de una cepa desconoci­ da, 2) la selección de pruebas adicionales para distinguir entre posibles cepas si no se logra la identificación y 3) el almacena­ miento y la recuperación de los resultados. Para hacerlo el pro­ grama utiliza los archivos Excel para almacenar matrices de identificación publicadas o creadas por el usuario. También tiene algunas funciones para evaluar la utilidad de las matrices de identificación y convertir las matrices en diferentes forma­ tos. PIBWIN fue creado por Trevor Bryant, University of Southampton Reino Unido y se puede consultar en http://www. som.soton.ac.uk/staff/tnb/pib.htm. Una matriz de identificación de bacilos gramnegativos no fermentadores que utiliza el pro­ grama PIBWIN ha sido ideada por P. C. Schreckenberger y A. P. Schrenckenberger. Se puede acceder a la matriz de identifi­ cación en www.pschreck.com.

Equipos comerciales Se han ideado equipos comerciales para la identificación de bacilos no fermentadores. Estos equipos comparten muchas características generales de los sistemas envasados; es decir, su uso es conveniente, tienen un tiempo de conservación muy largo y evitan la necesidad de suministros frescos de medios y reactivos. Los equipos comerciales también proporcionan téc­ nicas estandarizadas precisas y brindan resultados reproducibles iguales o mejores que los procedimientos convencionales, con las excepciones explicadas más adelante en este capítulo. Los problemas intrínsecos al uso de muchos de los equipos comerciales actualmente disponibles para la identificación de no fermentadores son: 1) la tendencia de los microorganismos que muestran actividad bioquímica débil o tardía a producir reacciones falsas negativas, 2) un diseño menos que óptimo de

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Motilidad

Preparación

Dextrosa OF Caldo de nitrato Urea (Christensen) Crecimiento a 44 °C Hemolisis Hidrólisis de gelatina Arginina (Moller) Malonato

Motilidad

Preparación

Lisina (M 0 ller) Maltosa OF Esculina Manitol OF Polimixina

Preparación: primera prueba

Cocohacilos

Bacilos

Preparación

Preparación

Dextrosa OF DNasa Urea (Christensen) Fenilalanina desaminasa Caldo de nitrato Caldo de nitrito Gelatina Agar de MacConkey Penicilina Opcional Catalasa

Indol (Ehrlich) Urea (Christensen) Caldo de nitrato Esculina A lm id ó n

Opción al

Gelatina DNasa Agar de MacConkey Manitol OF Penicilina Polimixina Dextrosa OF

Véase el cuadro 7-24 Vcase el cuadro 7-23

Véase el cuadro 7-25

Véase el cuadro 7-26

Seudo F Lactosa al 10% Acetamida Lisina (Moller) Caldo de nitrato Dextrosa al OF Pigmento en BAP

I

Véase el cuadro 7-27 P reparación : pruebas secundarias Fructosa OF Maltosa OF Manitol OF Xilosa OF KIA (para H2S) Arginina (M 0 ller) ONPG Urea (Christensen) Fenilalanina desaminasa Hidrólisis de esculina Hidrólisis de almidón Hidrólisis de gelatina NaCl al 6,5% DNasa Indol (Ehrlich) Polimixina Malonato Crecimiento a 42 °C Caldo de nitrito

INSTRUCCIONES PARA EL USO DE LOS CUADROS 7-22 A 7-35

PASOS POR SEGUIR 1. 2. 3. 4. 5. 6.

OF: oxidación-fermentación.

343

Determine la motilidad y las reacciones de oxidasa y siga el diagrama de flujo en el cuadro 7-22. Establezca las pruebas bioquímicas especificadas y diríjase al cuadro indicado para completar la identificación. Para utilizar los cuadros 7-23 a 7-35, com ience con la primera prueba mencionada del lado izquierdo del cuadro y ubique el recuadro o los recuadros sombreados en el ángulo superior izquierdo. Si sólo hay un recuadro sombreado y si la reacción dada se equipara con la reacción obtenida con su muestra, lo ha logrado. La identificación del microorganismo se menciona en la misma fila a la izquierda del recuadro. Si están sombreados múltiples recuadros y la reacción es compatible con la de su muestra, utilice las reacciones a la derecha de los recuadros sombreados para determinar la identificación correcta. Si la reacción obtenida con su muestra no es compatible con el recuadro o los recuadros sombreados, prosiga hasta la siguiente columna a la derecha y encuentre el recuadro o los recuadros sombreados en esta columna. Repita los pasos 4 y 5 hasta que alcance una identificación definitiva. 7. Se debe prestar consideración especial a los recuadros sombreados que contienen un signo de reacción variable (V). En estos casos raros, se debe tratar la reacción variable en el recuadro sombreado tanto com o compatible y com o incompatible.

Equipos comerciales

Este enfoque de la identificación de los no fermentadores está ideado para reducir la cantidad de pruebas bioquímicas necesarias para la identificación sobre la base de una evaluación preliminar de las reacciones de oxidasa y motili­ dad de los microorganismos por identificar. Una vez conocida esta información, se realiza una serie específica de pruebas para completar la identificación del microorganismo. Para los microorganismos que son tanto oxidasa positivos com o m óviles, se utiliza un enfoque en dos pasos, basado sobre las reacciones obtenidas en una serie de pruebas primarias seguidas por pruebas complementarias que se especifican en los cuadros designados. Según las necesidades y los recursos disponibles, el usuario de esta guía puede desear preparar todas las pruebas incluidas en las series primaria y secundaria siempre que se encuentre un no fermentador móvil y oxidasa positivo para obtener una identifica­ ción definitiva en el menor tiempo posible. Como regla general cuando se trabaja con bacilos no fermentadores, se debe utilizar un inóculo importante y las reacciones deben mantenerse 48 horas antes de realizar la lectura final.

344

No fermentadores oxidasa negativos e inmóviles"

A M A R IL L O

U REA SA

R EDU C ID O

PIG M E N TO SO L U B L E PARDO

CDC EO-5

+

+

-

Bordetella parapertussis

-

+

CDC NO-1

_

_

Bordetella holmesii (NO-2)

-

M IC RO O R G A N ISM O '

E SPE C IE S

Acinetobacter johnsonii

7

-

Acinetobacter baumannii

2

-

Acinetobacter haemolyticus

4

_

Especies de Acinetobacter

6

Especies de Acinetobacter

10

Acinetobacter calcoaceticus

1

-

Especies de Acinetobacter

3

-

Especies de Acinetobacter

12

Acinetobacter junii

5

-

C R E C IM IEN T O A H EM O L ISIS SA N G R E H ID R Ó LISIS D E GELA TINA D E C AR N ERO

I) EXTROSA

A RG IN IN A

M ALONATO

-

+

-

ND

+

ND

-

ND

ND

ND

-

-

-

-

ND

-

-

-

-

-

ND V (13)

37 °C

44 °C

-

+

-

ND

-

-

+

ND

+

-

+

+c'

+

-

-

-

-

-

-

V (35)

-

+

+d

-

-

+

+

+

+

-

+

+

V(52)

+

-

-

+

-

+

+

V(66)

+

-

-

+

-

+

-

-

+

+

-

+

-

+

-

+

-

-

-

-

+

-

-

+

+

V (87)

-

-

V(33)

+

+ -

-

+

-

-

-

-

+

Acinetobacter Iwoffii

8/9

-

+

-

-

-

-

-

-

Especies de Acinetobacter

11

-

+

-

-

-

-

-

-

-

“Datos tomados de las referencias763'2,80'. hTodos los microorganismos incluidos en este cuadro aparecen como cocobacilos gramnegativos en la tinción de Gram. Pigmento soluble pardo producido cuando crecen a 35 °C en agar tirosina infusión de corazón. dTambién debe ser dextrosa OF positivo. +: 90% o más de cepas positivas; 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas. Los números entre paréntesis son porcentajes de cepas que dan reacciones positivas.

CAPÍTULO 7 Bacilos gramnegativos no fermentadores

Cuadro 7 -23

E q u ip o s c o m e rc ia le s

345

I.a d ro 7-24 N o f e rm e n ta d o re s , o x id a sa n e g ativ o s e in m ó v iles

MICROORGANISMO I

iroph o m o n a s m a lto p h ilia

Cocriejo B u rk h o ld e ria cep a cia w m th o td e r ia g la d io li 3»:n¿:ella trem atum 1 5o*zr.¿om onas p a u c im o b ilis i

‘m ié m o n o s lu teo la

[ fa ta d o m o n a s o ryzih a b ita n s

LISINA DESCARBOXILASA

MALTOSA OF

MANITOL OF

ESCULINA

POLIM IXINA

+

+

-

+

S

Lavanda amarillento

+

+

+

V(67)

R

Amarillo

-

-

+

-

R

Amarillo

P IG M E N T O

-

-

-

-

ND

-

+

-

+

V(89)

-

+

+

+

S

Amarillo mate

-

+

+

-

S

Amarillo mate

Blanco grisáceo Amarillo profundo

1 tomados de la referencia249. I — <*-r o más de cepas positivas;

90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; + + : reacción positiva fuerte; ND: resultados no disponibles; R: resistente; wkjmaBÉtAe; OF: oxidación-fermentación. Los números entre paréntesis son porcentajes de cepas que dan reacciones positivas.

m eóos sistemas para el cultivo de ciertos no fermentadores y pruebas complementarias para obtener las identificaciones co­ rrectas 20,90,199,308,320,355,411,523,537.543.544,547,554,642,679 £ n g s f 0 s gS tU fi» L T-dusión de algunas pruebas diferenciales que es posible .ii— - a sean aplicables a la identificación de los no fermentadios, el mayor porcentaje de discrepancias ocurrió con las a re Aunque en general los miembros de las enterobacterias cepas de requerimientos nutricionales especiales o infrecuentes arcén rápidamente y muestran actividad enzimática activa y más a menudo fue el resultado de reacciones falsas negativas I ñ r s distintos sustratos que pueden detectarse con facilidad del tubo Oxi/Ferm para citrato, sulfuro de hidrógeno, argini­ a m - equipos, la mayoría de las especies de no fermentadona dihidrolasa, reducción de nitrato, glucosa OF y ureasa 308,355,523,537,547 También se observaron problemas en la detec­ ® r'.en un crecimiento lento y son relativamente inactivas el punto de vista enzimático. El microbiólogo necesita ción de gas N, bajo el revestimiento de cera en la cámara de experiencia considerable para interpretar algunas reaccio­ desnitrificación.20-355,679 ne incompletas o débiles que pueden hallarse en el uso de El diseño del tubo Oxi/Ferm parece limitar su rendimiento a c > sistemas. con los microorganismos de crecimiento lento o débilmente “ i'.endo en cuenta estas perspectivas se explican los siete reactivos. La aguja inoculadora puede mantener sólo una can­ siguientes. Fueron seleccionados debido a que la expetidad relativamente pequeña de inóculo y se ha demostrado que ■ k u ¿cumulada ha delineado sus aplicaciones y limitacioun inóculo importante es esencial para obtener productos bio­ ■es Los siete equipos son: químicos detectables de muchos de los no fermentadores. Gran parte de éstos son aerobios estrictos y el medioambiente dentro • Tirfx Oxi/Ferm® (Becton Dickinson Microbiology Systems, de las cámaras confinadas en el tubo Oxi/Ferm es posible que I xrkeysville MD). no favorezca un crecimiento óptimo. Los microorganismos de • 2ÓE® (BioMérieux, Hazelwood MO). prueba son colocados en profundidad en la parte central del • ; I XE® (BioMérieux). medio en cada cámara, donde están mínimamente expuestos al • Bemel Uni-N/F System® (Remel, Lenexa, KS). oxígeno atmosférico. Con la falta de crecimiento superficial, es • stal Enteric/Nonfermenter System® (Becton Dickinson difícil determinar si una reacción negativa refleja inactividad 11;:?biology Systems). bioquímica o la incapacidad del microorganismo para crecer en • ; _r.D XF Plus® (Remel). el medio. Algunos de los medios en el tubo Oxi/Ferm son inca­ • r ; System® (Biolog. Hayward C A ). paces de sostener el crecimiento de las cepas que tienen más requerimientos nutricionales especiales entre los no fermenta­ dores (p. ej., el agar-citrato no se encuentra en la mayoría de los ~ j m I i i Ferm sistemas de identificación para no fermentadores). En cierta E3 u :ercera edición de este libro se incluyen los detalles del medida, estos inconvenientes han obstaculizado la aceptación H o k funcional, los procedimientos operativos y los sustratos del tubo Oxi/Ferm en muchos laboratorios clínicos. en el tubo Oxi/Ferm. Los estudios diseñados para evab d rendimiento del tubo Oxi/Ferm en la identificación de Sistema API 20E ' no fermentadores de importancia clínica han mostrado ' especies halladas con mayor frecuencia -P. aeruginosa, El sistema API 20E, diseñado en su origen para la identifi­ £ wm • philia y especies de Acinetobacter- fueron identificadas cación de las enterobacterias, ha sido extendido para incluir m■ grado bastante alto de precisión cuando se compararon también la identificación de bacilos no fermentadores comu­ a ~ ' métodos convencionales. Sin embargo, la exactitud glones. Para aumentar al máximo el uso de API 20E para los no ta_ . ue en forma significativa cuando se consideran todos los no fermentadores, se agregaron otras seis pruebas para generar un * —en tadores. La exactitud global de la identificación de tubo número de perfil de nueve dígitos (recuadro 7-11). Algunos en estos estudios varió entre el 50% y el 95% según estudios realizados con no fermentadores han mostrado que 3É r reeie evaluada, ya sea que las lecturas fueran tomadas desaunque el sistema API 20E identifica a P. aeruginosa, S. malfm s oe 24 o de 48 horas de incubación y de que se utilizaran tophilia y especies de Acinetobacter con una exactitud de hasta

346 CAPÍTULO 7

Identificación de cocobacilos oxidasa positivos e inmóviles"

M IC R O O R G A N ISM O

O LO R O A SPECTO C A R A C TER ÍST IC O

DEXTR O SA OF

D NA SA

Psychrobacter immobilis

Olor de agar PEA (rosas)

+

-

+

U RE A SA

FE N IL A L A N IN A D E SA M IN A SA

H ID R Ó L ISIS D E GELATINA

N ITRATO R E D U C ID O

C R E C IM IE N T O EN AGAR DE M A C CO NK EY

N IT R IT O R ED U C ID O

CATALASA

C R E C IM IE N T O A 35 °C

+

+

-

V(86)

V

ND

+

-

+

ND

+

V (82)

ND

+

+

EO-2 de los CDC

Células con forma de Ob

EO-3 de los CDC

Colonias amarillas (100)

+

-

+

ND

-

+

ND

+

+

EO-4 de los CDC

Colonias amarillas (83)

+

ND

+

ND

-

+

ND

+

+

-

+

-

-

+

+

V

+

+

+

-

V

+

-

+

+

+

-

-

+

+

V (89)

+

-

Débil

+

-

V (83)

+

+

+

M. canis M. catarrhalis Psychrobacter phenylpyruvicus' O. urethralis

Células cocoides pequeñas

+

-

M. lacunata

-

M. nonliquefaciens

-

M. osloensis

-

+

M. atlantae

Colonias que se dispersan o se deprimen

-

M. lincolnii

Bacilos similares a cocos pletóricos

-

-

+

-

-

Débil

+

-

+

V(17)

-

+

+

-

V (26)

V(49)

-

Débil

+

-

-

+

V (20)

Débil o -

+

ND

-

-

V

+

+

“Datos tomados de las referencias249349,515,517'753. hLos extendidos con tinción de Gram muestran bacilos gruesos cocoides a cortos que a menudo están vacuolados. Las células tienen centros no teñidos pero están teñidas en la periferia y tienen aspecto de O. ‘Algunas especies de Brucella pueden ser confundidas con Psychrobacter pheylpyruvicus en algunos sistemas de identificación comerciales. +: 90% o más de cepas positivas; 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; + + : reacción positiva fuerte; ND: resultados no disponibles; OF: oxidación-fermentación. Los números entre paréntesis son porcentajes de cepas que dan reacciones positivas.

Bacilos gramnegativos no fermentadores

Cuadro 7 -25

Cuadro 7 -26

Identificación de bacilos con forma bacilar, oxidasa positivos e inmóviles"

M IC RO O RG A N ISM O

C O LO R , C A RA CTER ÍSTIC A , O L O R O A SPECTO

Sphingoba cterium multivorum

C R EC IM IE N TO EN AGAR DE M ACCON KEY

V(79)

-

V(17)

-

+

-

V(51)

V(10)

-

+

-

-

-

-

-

H ID RÓ L ISIS D E GELATINA

H ID RÓLISIS DE A LMIDÓN

-

+

+

-

-

+

+

-

Amarillo brillante

-

+

Myroides odoratus

Olor frutal verde amarillento

-

+

-

+

Neisseria weaveri

Colonias blancas grisáceas, catalasa fuertemente +

-

• *

-

Neisseria elongata subespecie nitroreducens

Catalasa -

-

Grupo 1 de bacilos de Gilardi

PAD

UREASA

Amarillo pálido

Sphingobacterium spirilivorum

Amarillo pálido

Sphingomonas paucimobilis

+ intensa

R EDUC CIÓN D E NITRATO

HID RÓ LISIS DE DNASE

H ID RÓ L ISIS DE ESCULINA

INDOL

+

M ANITOL OF

DEXTROSA OF

PEN IC ILIN A

-

+

R

R

+

+

R

R

-

+

S(33)

S(89)

V(78)

-

-

S(I9)

R

-

V(42)

-

-

S

S

ND

-

V(20)

-

S

S

ND

-

+

-

-

S

S

+

+

-

-

-

-

-

S

R

V

ND

ND

-

-

+

ND

ND

-

-

-

S

S

Tardío

R

R

Tardío

S

S

-

ND

S

Tardío

S(67)

S(22)

Tardío

S(57)

R R

R

Bergeyella zoohelcum

Sin pigmento

+

Grupo lie de los CDC

Sin pigmento

+

-

Weeksella virosa

Colonias pegadas al agar

+

-

-

+

-

V(13)

Empedobacter brevis

Amarillo pálido

+

-

-

+

V(40)

+

+b

-

Grupo lie de los CDC

Sin pigmento

+

-

-

-

+

-

Grupo Ilg de los CDC

Sin pigmento

+

-

-

ND

-

Sin pigmento

+

-6

+

(V78)

+ _b

-

Grupo Ilh de los CDC

+

Grupo Ili de los CDC

ND

+

-

+

-

V(14)

-

Chryseobacterium meningo­ septicum

Amarillo pálido

+

-

+

+

-

+

V(26)

Tardío

Tardío

R

Chryseobacterium indologenes

Amarillo intenso

+

-

+

+

+

-

-

-

Tardío

R

++ +

-

PO LIM IX IN A

"Datos tomados de las referencias'790-249-3'1.

Equipos comerciales

hDife rentes resultados comunicados, la reacción utilizada aquí es la informada por los CDC'79". +: 90% o más de cepas positivas; 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; ++: reacción positiva fuerte; ND: resultados no disponibles; R: resistente; S: sensible; PAD: fenilalanina desaminasa; OF: oxidación-fermentación. Los números entre paréntesis son porcentajes de cepas que dan reacciones positivas. Nota: Balneatrix alpica es amarillo pálida e indol positiva pero no se incluyó en este cuadro por su motilidad (véanse cuadros 7-32 y 7-34).

347

348

C A P ÍT U L O 7

Cuadro 7-27

Bacilos gramnegativos no fermentadores

Pruebas de cribado para la identificación de especies de no fermentadores oxidasa positivos y móviles -

Lactosa al 10%

+

-

Acetaraida Lisina (M 0 ller)

+

+

-

Pigmento en agar sangre

+

Gas a partir de nitrato o nitrato

+

Véase cuadro 7-35

Fluorescencia (agar seudo F bajo luz UV)

+

-

-

+

Véase cuadro 7-34

Cuadro 7 -28

Dextrosa OF Véase cuadro 7-33

Véase cuadro 7-32

Véase cuadro 7-31

Véase cuadro 7-30

Véase cuadro Véase cuadro 7-29 7-28

Identificación de no fermentadores fluorescentes

MICROORGANISMO

ACETAMIDA

CRECIMIENTO A 42 °C

GELATINA

P se u d o m o n a s a e ru g in o sa

+

+

+

P. flu o r e sc e n s

-

-

+

P. p u tid a

-

-

1

+ : 90% o más de cepas positivas; —: 90% o más de cepas negativas.

Cuadro 7 -2 9

Identificación de no fermentadores fuertemente lactosa positivos (oxidasa +, motilidad +, fluoresceina -) LISINA

MANITOL OF

UREASA

ONPG

POLIM IXINA B

C o m p le jo B u rk h o ld e ria cep a cia

+

+

V(45)

V(79)

R

B u rk h o ld e ria p s eu d o m a lle i

M ICROORGANISM O

-

+

V(43)

-

R

R h izo b iu m ra d io b a cter

-

+

+

+

S

R a lsto n ia m a n n ito lily tic a (Va-3)

-

+

+

-

R

R a lsto n ia p ic k ettii (Va-1)

-

-

-

-

R

S p h in g o m o n a s p a u c im o b ilis

-

-

+

S(89)

Datos tomados de la referencia249. +: 90% o más de cepas positivas; 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; R: resistente; S: sensible; OF: oxidación-fermentación. Los números entre paréntesis son porcentajes de cepas que dan reacciones positivas. Nota: Acinetobacter baumannii y las especies de Sphingobacterium son fuertemente lactosa positivas, pero están excluidas de este cuadro porque son inmóviles (véanse cuadros 7-23 y 7-26).

Cuadro 7 -30

Identificación de no ferm entadores acetamida positivos (oxidasa +, fluoresceina - lactosa al 10% - )

MICROORGANISMO

ARGININA

DEXTROSA OF

FRUCTOSA OF

MANITOL OF

NITRATO REDUCIDO

P se u d o m o n a s a eru g in o sa

*

NITRITO A GAS

MALONATO

NITRITO A GAS

INDOL NARANJA

V(60)

-

+

+

V(89)

V(68)

V(74)

ND

ND

C o m p le jo B u rk h o ld e ria cep a cia

-

+

+

+

V(37)

ND

ND

-

-

A c h ro m o b a cte r x ylo so x id a n s

-

+

V(9)

-

+

ND

ND

V(69)

-

D e lftia a c id o v o ra n s

-

-

+

+ (92)

+

ND

ND

-

+

+

+

+

-

A c h ro m o b a c te r d e n itrific a n s

-

-

-

-

+

A c h ro m o b a cte r p ie c h a u d ii

-

-

-

-

+

-

+

-

-

O lig ella u reo lytica

-

-

-

-

+

V(63)

-

V(58)

-

A lca lig e n e s fa e c a lis

-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

-

-

B o rd etella h in zii

-

-

-

-

-

-

+

B o rd etella a viu m

-

-

-

-

-

-

-

Datos tomados de las referencias24975*; datos para alcalinización tomados de la referencia400. + : 90% o más de cepas positivas; -: 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; ++: reacción positiva fuerte; ND: resultados no disponibles; R: resistente; S: sensible; OF: oxidación-fermentación. Los núme­ ros entre paréntesis son porcentajes de cepas que dan reacciones positivas.

Equipos comerciales

349

350

C A P ÍT U L O 7

Bacilos gramnegativos no fermentadores

Cuadro 7-31

Identificación de no fermentadores lisina positivos

MICROORGANISMO

POLIMIXINA B

DNASA

MANITOL OF

C o m p le jo B u rk h o ld e ria cep a cia

R

-

+

S ten o tro p h o m o n a s m a lto p h ilia

S

+

-

+: 90% o más de cepas positivas; 90% o menos de cepas negativas; R: resistente; S: sensible. Los números entre paréntesis son porcen­ tajes de cepas que dan reacciones positivas. Nota: algunas cepas de S. maltophilia pueden ser oxidas positivas.

un 99%, sobre todo después de 48 horas de incubación, el ren­ dimiento de otros no fermentadores poco frecuentes muchas veces fue menos que aceptable.20'90'199-308-509'537-543-544-554-680-789 Las identificaciones incorrectas ocurrieron menos a menudo debi­ do a reacciones falsas negativas para citrato, licuefacción de ge­ latina, motilidad, arginina dihidrolasa, ONPG, reducción de nitrato y pruebas de ureasa.20'199’308,537 En el estudio específico de Hofherr y cois.,308 el 12,2% de 836 reacciones bioquímicas individuales difirió entre el sistema API y los métodos conven­ cionales (53% involucró el uso de citrato y pruebas de licue­ facción de gelatina). En otros casos, no fue posible realizar las identificaciones porque el número de biotipo derivado de la banda 20E no estaba enumerado en el índice de perfiles API.680

2. Un tubo 42P no estrangulado que se utiliza para evaluar el crecimiento a 42 °C y la producción de pigmento de pio­ cianina. 3. Una placa Uni-N/F Tek circular que consiste en 11 pozos periféricos sellados en forma independiente, que contienen agar convencional, con la cual se pueden determinar las siguientes características: utilización de glucosa, xilosa, manitol, lactosa y maltosa; asimilación de acetamida; hidró­ lisis de esculina y urea; actividad de DNasa y de ONPG. Una de las celdas periféricas es un control de crecimiento de hidratos de carbono. Una celda del centro contiene un medio para detectar la producción de indol y sulfuro de hidrógeno.

Sistema API 20NE

La placa UNI-N/F está bien construida para evaluar a la mayoría de los no fermentadores; incluye medios que se ase­ mejan estrechamente a las fórmulas convencionales y apoyan el crecimiento de muchas de las cepas que tienen mayores requerimientos nutricionales especiales. La suspensión del mi­ croorganismo se inocula en la superficie de los bordes del agar. donde no sólo los microorganismos están expuestos a oxígeno atmosférico, sino que también se puede visualizar directamen­ te el crecimiento de las colonias. Por lo tanto, es posible dife­ renciar las reacciones negativas en las pruebas debidas a la falta de crecimiento de las debidas a la inactividad bioquímica y el usuario puede determinar directamente si otros microorganis­ mos pueden estar contaminando el inóculo. La capacidad del sistema Remel N/F para detectar P. aeru­ ginosa mediante el uso del tubo GNF estrangulado y el tubo 42P no estrangulado ahorra tiempo. Si el microorganismo de prueba es distinto de P. aeruginosa, se entrega una gota de una suspensión importante preparada de la porción inclinada del tubo GNF en cada una de las cámaras periféricas en la placa UNI-N/F Tek y se inocula con un corte la celda central. Se incuba la placa a 35 °C durante 24 horas y las distintas reac­ ciones se interpretan visualmente. Alrededor del 90% de P. aeruginosa fue identificado por los investigadores con los dos tubos de cribado después de 24 horas de incubación, lo que aumentó hasta un 98% después de 48 horas de incubación.20-45-90-411-681-789 La capacidad para detectar P. aeruginosa sin utilizar un conjunto completo de pruebas bioquí­ micas es considerada una ventaja definida por la mayoría de los usuarios. Algunos de los problemas mencionados con el sistema UNI-N/F fueron los siguientes: los tubos de cribado identifica­ ron sólo alrededor de un tercio de las cepas de P. fluorescens y P. putida, y fue necesario realizar otras pruebas.20-45'90'422681 Tam­ bién se hallaron problemas en la interpretación de la reacción del gas N, en el tubo GNF y la prueba de indol.20'789 Sólo fue posi­ ble realizar un bajo porcentaje de identificación con microorga-

El API 20NE es una modificación de la banda API 20E. La construcción de la banda de plástico es la misma que en el sis­ tema 20E; sin embargo, los sustratos han sido modificados para incluir 8 pruebas convencionales y 12 pruebas de asimilación que se basan sobre la observación del crecimiento microbiano en presencia de una fuente única de carbono (véase lámina en color 7-5D). En el recuadro 7-11 se describe el procedimiento quirúrgico y los sustratos incluidos. Las reacciones positivas y negativas son convertidas en un número de biotipo de 7 dígitos y las identificaciones de los microorganismos se hacen a partir de la base de datos computarizada o de una lista de perfiles pro­ vista por el fabricante. Los usuarios de este sistema deben observar que la base de datos está construida de acuerdo con las reacciones obtenidas a una temperatura de incubación de 30 °C (en lugar de los 35 °C a 37 °C convencionales) y se toman las lecturas finales después de 48 horas de incubación. Kiska y cois.404 evaluaron 150 no fermentadores aislados de pacientes con fibrosis quística y comunicaron una tasa global de identifi­ cación correcta del 57%, que incluyó un 43% de B. cepacia ais­ ladas. El rendimiento global del API 20NE ha demostrado que es uno de los equipos comerciales de mejor rendimiento para la identificación de no fermentadores.19-422'489'785'791 Sistema Remel N/F

El sistema Remel N/F (antes Unix-N/F), como se describe en el recuadro 7-12 y se muestra en la lámina en color 7-5E, consta de tres componentes: 1. Un tubo GNF estrangulado que detecta fermentación de glu­ cosa y N2(por debajo del estrangulamiento) y producción de fluoresceína en la porción inclinada (por encima del estran­ gulamiento).

Cuadro 7 -32 Identificación de no fermentadores pigmentados" (oxidasa +, motilidad +, fluoresceina

MICROORAGNISMO

COLOR

KIA/H,S

FRUCTOSA OF

GAS A PARTIR DE NITRATO

INDOL

lactosa al 10%

lisina - )

acetam ida

MANITOL OF

HIDRÓLISIS DE ESCULINA

CRECIMIENTO EN NACL AL 6,5%

V

-

-

Especies de R o se o m o n a sb

R o sa d o

-

+

Especies de M e th y lo b a c teriu m h

R o sa d o

-

V(50)

-

-

-

Sh e w a n e lla alga

Ocre

+

-

ND

-

+

Sh e w a n e lla p u trefa cie n s

Ocre

+

V

_

-

-

M a ssilia tim o n a e

Amarillo pálido

-

-

-

+

-

B re vu n d im o n a s v esicu la ris

Ocre/anaranjado

-

-

_

+

-

P se u d o m o n a s stu tze ri

Amarillo

-

+

+

-

V(70)

-

+

B a ln ea trix a lp ica

Amarillo pálido

-

+

-

+

+

-

ND

B u rk h o ld e ria cep a cia

Amarillo

-

+

-

-

+

V(67)

-

S p h in g o m o n a s p a u c im o b ilis

Amarillo

-

+

-

-

-

+

-

-

-

aDatos tomados de las referencias170249392-443'626. bLas especies de Methylobacterium aparecen como colonias oscuras bajo la luz UV de onda larga debido a la absorción de luz UV. Las especies de Roseomonas no absorben la luz UV y no aparecen oscuras. Nota: todos estos pigmentos se desarrollan sólo a medida que el cultivo envejece. Lti mayoría de las cepas de las especies de Chryseobacterium y Sphingobacterium también están pigmentadas (amarillo): sin embargo, estos microorganismos son excluidos de este cuadro porque son inmóviles (véase cuadro 7-26). +: 90% o más de cepas positivas; 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; ND: resultados no disponibles; OF: oxidación-fermentación. Los números entre paréntesis son porcentajes de cepas que dan reacciones positivas.

352 CAPÍTULO 7

MICROORGANISMO O lig e lla ureo lytica E s p e c ie s d e P se u d o m o n a s

A .d e n itrifica n s

CDC gru p o 1

lactosa al 10%

acetamida

lisina

pigmento -)

DEXTROSA OF

POLIMIXINA B

ONPG

NACL AL 6,5%

FENILALANINA DESAMINASA

ARGININA

HIDRÓLISIS DE ALMIDON

MALTOSA OF

UREASA

-

S

-

-

+

-

-

-

++

-

S

-

-

-

V(50)

-

-

-

-

S(83)

-

-

-

-

-

-

V(31)

R. p ic k e ttii

(Va-1)

+

R

-

-

-

-

V(48)

+

+

R. p ic k e ttii

(Va-2)

+

R

-

-

V(40)

-

V( 12)

-

+

+

S

+

-

+

-

V(16)

+

+

+

S

-

+

V(55)

-

+

+

V(17)

+

s

-

+

V(50)

+

-

-

V(50)

CDC Vb-3

+

s

-

+

V(56)

+

V(75)

V(88)

V(31)

O c hro b a ctru m a n th ro p i

+

s

-

-

+

V(36)

-

V(50)

+

P. a e ru g in o sa

+

s

-

-

-

+

-

V(12)

V(66)

A. x ylo so x id a n s

+

s

-

-

-

-

-

-

-

R h izo b iu m ra d io b a cter P. stu tze ri

(Vb-1)

P. m e n d o cin a

(Vb-2)

Datos tomados de la referenciam . + : 90% o más de cepas positivas; -: 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; R: resistente; S: sensible, OF: oxidación-fermentación. Los números entre paréntesis son porcentajes de cepas que dan reacciones positivas. Nota: A. denitrificans puede ser separado de las especies de Pseudomonas CDC grupo 1 sobre la base de la morfología de los flagelos. Achromobacter tiene flagelos peritricos; Pseudomonas grupo I tiene un único flagelo polar.

Bacilos gramnegativos no fermentadores

Cuadro 7-33 Identificación de no termentadores desnitrifkadores (oxidasa +,motilidad +, fluoresceina

Cuadro 7 -34

Identificación de no ferm entadores dextrosa positivos (oxidasa +, motilidad +, fluoresceína desnitrificación - )

M IC R O O R G A N ISM O

Methylobacterium

Balneatrix alpica

_

Brevundimonas diminuta

-

-

-

-

V

V

-

-

-

ND

+

+ débil

-

+

-

-

-

V (86)

-

-

-

V (12)

-

V (16)

V (19)

V (58)

-

-

V

-

+

+

+

ND

+

A xylosoxidans

-

• -

-

Amarillo pálido

-

-

-

Shewanella putrefaciens

-

V

Rosado

-

Rhizobium radiobacter

ONPG

-

pigm ento ->

H ID R Ó LISIS D E ESCU LINA

V

IND O L

FRU CTO SA OF

lisina

H ID R Ó LISIS DE GELATINA

DNASA

KIA H2S

acetainida

C R E C I­ M IEN TO A 42 "C

X ILO SA OF

PIG M EN TO DE LA S C O LO N IA S

lactosa al 10%

CRE C IM IEN T O EN N aCl 6,5%

FEN IL ALA N IN A DESA M IN A SA

A RG IN INA

+

+

+

+

-

-

+

V (13)

-

+

-

-

-

V (36)

V (75)

-

-

+

-

+

-

Grupo similar a Pseudomonas 2

-

-

+

+

+

-

-

+

P. pseudoalcaligenes

-

-

+

-

-

-

-

V (21)

+

+

+

-

+

+

-

+

V(56)

+

V (75)

-

-

+

+

-

-

+

V (36)

V (10)

-

V(40)

-

V (26)

V(77)

-

Acidovorax delafieldii

-

CDC Vb-3

O. anthropi R. pickettii (V A -1)

-

-

+

+6

-

-

P. aeruginosa

-

-

+

V(85)

-

-

+

+

V (46)

-

-

+

-

+

-

-

+

-

+

-

-

+

-

+

-

-

+

-

-

-

P. fluorescens P. putida

-

—

OF: oxidación-fermentación.

Los números entre paréntesis son porcentajes de cepas que dan reacciones positivas.

Equipos comerciales

Datos tomados de las referencias170-249. + : 90% o más de cepas positivas; 90% o menos de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas;

-

353

354

Identificación de no ferm entadores negativos dextrosa negativos" (oxidasa desnitrificación dextrosa - )

M IC R O O R G A N ISM O

C O L O N IA S CON PIG M EN TO A M A R IL L O

KIA H ,S

+,

motilidad

+,

fluoresceina

lactosa al 10%

FR U CTO SA OF

U R EA SA

NO A NO ,

N O , A GAS

H ID R Ó L ISIS DE A LM IDÓ N

FEN IL A LA N IN A D E SA M IN A SA

DNASA

acetamida

A RG IN INA

lisina

pigmento

FLA G ELO S SE G Ú N SU D ISPO SIC IÓ N

Methylobacteriumh

+

V

+

V

ND

+

-

-

Monotricos polares

Roseomonas1’

+

+

+

-

ND

+

V (17)

-

Variable

Shewanella putrefaciens/alga1

-

V

-

V

ND

-

-

Polar, 1-2

+

-

+

ND

-

V (21)

V (36)

Polar, 1-2

-

++

+

Vi 63}

-

+

-

Peritricos

-

++

+

-

-

V (25)

-

Peritricos

-

++

-

-

V(16)

-

-

Peritricos

-

-

-

ND

-

V (16)

-

Monotricos polares

-

-

-

-

-

V (15)

-

Peritricos

V(21)

V(61)

vno>

V(16)

V(20)

V(7)

Monotricos polares

-

-

+

V(ll)

-

V(30)

-

Multitricos polares

-

-

+

-

-

-

-

Peritricos

+

P. pseudoalcaligenes O. ureolytica

-

-

B. bronchiseptica Cupriavidus pauculus

—

Brevundimonas diminuta B. hinzii

-

-

P. alcaligenes

-

-

C. testosteroni

—

-

A. piechaudii

+

-

V (12)

"Datos tomados de la referencia249. bLas especies de Methylobacterium aparecen como colonias oscuras bajo la luz UV de onda larga debido a la absorción de luz UV. Las especies de Roseom onas no absorben luz UV y no aparecen oscuras. ‘Shewanella alga crecen en NaCI al 6,5%; Shewanella putrefaciens no crece en NaCI al 6,5%. +: 90% o más de cepas positivas; 90% o más de cepas negativas; V: 11-89% de cepas positivas; + + : reacción positiva fuerte; ND: resultados no disponibles; OF: oxidación-fermentación. Los números entre paréntesis son por­ centajes de cepas que dan reacciones positivas.

CAPÍTULO 7 Bacilos gramnegativos no fermentadores

Cuadro 7-35

E q u ip o s c o m e rc ia le s

^ rl^ a d ro 7-11

S istem as API 20E y A PI 20N E para iden tificar a los no ferm entadores

I S a ñ a funcional |

355

C ala sistema consiste en una banda de

rustico con 20 cúpulas miniaturizadas ; je contienen sustratos deshidratados y m a cámara de incubación de plástico con -na tapa que ajusta laxamente (véanse las laminas en color 6-6A y 7-5D). Cada cópula tiene un agujero pequeño en la parte superior a través del cual se puede ^ocular la suspensión bacteriana con una -p e ta . La acción bacteriana sobre los -ustratos produce turbidez o cambios de .olor que son interpretados visualmente.

Sustratos incluidos

Procedimiento operativo Para ambos sistemas: agregar 5 mL de agua corriente

a una bandeja de incubación para proveer una atmósfera húmeda durante la incubación. Colocar la banda en la bandeja de incubación. Preparar una suspensión bacteriana del microorganismo de prueba suspendiendo las células de una colonia bien aislada en 5 mL de solución salina al 0,85% estéril. La tur­ bidez debe ser equivalente a un estándar de McFarland al 0,5. A PI 2OE: con una pipeta de Pasteur, llenar cada cúpu­ la con la suspensión bacteriana a través del agujero de inoculación. Cubrir las tres cúpulas de descarboxilasa y las cúpulas de ureasa con vaselina estéril. La unidad se incuba a 35 °C durante 24 o 48 horas antes de leer los resultados de acuerdo con las siguientes reglas: después de 24 horas, si la glucosa es positiva, agregar reactivos, realizar una prueba de oxidasa y crear un número de perfil de 7 dígitos para buscarlo en la sección blanca del índice de perfiles; si la glucosa es negativa, pero tres o más de otras reacciones son positivas antes de agregar reactivos, proseguir como antes; si la glucosa es negativa y menos de otras tres pruebas son positivas, no agregar reactivos, recubrir las bandas durante otras 24 horas e inocular glucosa OF, medio para motilidad y agar de MacConkey. Después de 48 horas, agregar reacti­ vos, realizar la prueba de oxidasa y crear un número de perfil de 9 dígitos para buscarlo en la sección azul del índice de perfiles. A P I 20NE: con una pipeta de Pasteur. llenar la porción de tubo de las ocho primeras cúpulas (NO, a PNPG) con la suspensión bacteriana. Inocular una ampolla de medio AUX con cuatro gotas de la misma sus­ pensión salina. Mezclar bien. Con una nueva pipeta estéril inocular las pruebas de asimilación GLU a PAC (cúpulas con líneas coloreadas) llenando el tubo y la cúpula hasta obtener una superficie líquida plana sin un menisco. Agregar vaselina a las cúpulas GLU. ADH y URE. Incubar la banda durante 24 horas a 29-31 °C. Después de 24 horas, agregar reac­ tivos de nitrato a la cúpula de NO, y reactivo TRP a la cúpula TRP. Leer y registrar las reacciones. Las pruebas de asimilación se registran como positivas si existe un crecimiento visible en la porción de la cúpula del tubo. Se genera un número de perfil de 7 dígitos. Si no se obtiene una buena identificación o no se encuentra un número de perfil en el libro de códigos, se puede inocular la banda de prueba durante otras 24 horas. Para hacerlo, cubrir de inme­ diato las cúpulas de NO. y TRP con vaselina. Registrar los resultados de las pruebas de NOr TRP y GLU después de 24 horas; no leer estas pruebas después de 48 horas.

ásmos como B. cepacia y CDC grupo IV y con muchas de las cpas no oxidativas y no sacarolíticas.789 Fue necesario realizar -raebas complementarias, como morfología en la tinción de I-ram, motilidad de la gota colgante y tinciones para flagelos ora identificar estas cepas. No obstante, los investigadores

API 20E: ONPG Arginina dihidrolasa Lisina descarboxilasa Omitina descarboxilasa Citrato Sulfuro de hidrógeno Ureasa Triptófano desaminasa (agregar FeCl al 10%) Indol Voges-Proskauer (agregar KOH y a-naftol) Gelatina Glucosa Manitol Inositol Sorbitol Ramnosa Sacarosa Melibiosa Amigdalina Arabinosa Pruebas complementarias; Oxidasa NO, G asN , Motilidad Agar de MacConkey Glucosa-oxidativa OF Glucosa-fermentativa OF API 20NE: Pruebas bioquímicas: NO, Reducción de nitrato TRP Triptófano GLU Fermentación de glucosa ADH Arginia dihidrolasa URE Ureasa ESC Hidrólisis de esculina GEL Gelatinasa PNPG (3-galactosidasa Pruebas de asimilación: GLU D-glucosa ARA L-arabinosa MNE D-manosa MAN D-manitol NAG N-acetil-D-glucosamina MAL Maltosa GNT D-gluconato CAP Caprato ADI Adipato MLT L-malato CIT Citrato PAC Fenilacetato

comunican que es conveniente utilizar el sistema UNI-N/F, que tiene un porcentaje global elevado de identificaciones de bacilos no fermentadores en 24 horas y mejor rendimiento para la iden­ tificación de no fermentadores que los sistemas Oxi/Ferm o API 20E.20,45-90’411-422-681’789 Kiska y cois, informaron que el sistema

356

C A P ÍT U L O 7

Recuadro 7-12

Bacilos gramnegativos no fermentadores

Sistem a R em el N/F para la identificación de los no ferm entadores

Diseño funcional Este sistema consiste en dos tubos de medios ver­ tidos sobre una porción inclinada y una rueda, que incluye 13 compartimentos, 12 periféricos y 1 central, que contienen distintos sustratos de medios (lámina en color 7-5E). Los dos tubos se utilizan para evaluar P. aerugi­ nosa. El tubo no estrangulado se incuba a 42 °C para observar el crecimiento y la producción de pigmento piocianina; el tubo GNF estrangulado se utiliza para evaluar la presencia de fluores­ cencia, la fermentación de glucosa y el N,. La rueda se utiliza para determinar varias caracte­ rísticas bioquímicas. Cada uno de los comparti­ mentos de medios periféricos tiene un pequeño poro a través del cual se puede inocular una suspensión bacteriana. El medio del comparti­ mento central está abierto al aire y es inoculado directamente. Una tapa de plástico cubre la uni­ dad para evitar la evaporación durante la incu­ bación.

Procedimiento operativo

Sustratos incluidos

Inicialmente inocular con un corte los dos tubos, utilizando un alambre inoculador recto que ha sido tocado hasta la superficie de una colonia bien aislada de la bacteria de prueba que crece sobre una placa de agar. Incubar los tubos durante 18-24 horas a 35 °C. Si las reacciones en los tubos no son compatibles con P. aeruginosa, preparar una suspensión bacte­ riana importante para emulsificar todo el creci­ miento desde la porción inclinada del tubo GNF en 2 mL de agua destilada estéril. Agregar una gota a cada una de las 12 celdas periféricas a tra­ vés del poro inoculador e inocular con un corte profundamente el medio de agar en el centro de la rueda. Reemplazar la tapa de plástico sobre la rueda e incubar la unidad a 35 °C durante 18-24 horas. Las reacciones de color se interpretan visualmente y se hacen las identificaciones utili­ zando un esquema lógico o un programa computarizado suministrado por el fabricante.

UNI-N/F identificó correctamente el 72% de los bacilos no fer­ mentadores hallados en pacientes con fibrosis quística, que incluyó el 86% de las cepas de B. cepacia. El porcentaje de iden­ tificación de B. cepacia aisladas fue el más alto entre los cuatro equipos de prueba estudiados.404 Hemos observado que el siste­ ma Uni-N/F tiene un rendimiento comparable con los sistemas Crystal Enteric/Nonfermenter e IDS RapID NF Plus. (Schreckenberger PC, Anderson RP, Pierson C, Debusscher J, Brown W: datos no publicados). Sistema Crystal Enteric/Nonfermenter

El equipo de identificación Crystal Enteric/Nonfermenter se describió en el capítulo 6. La base de datos de no fermentadores incluye 24 taxones de no fermentadores que representan 10 géneros diferentes. Otros 20 taxones están incluidos en un grupo denominado “Otros bacilos gramnegativos”, que consis­ te en un grupo de especies oxidasa positivas que son relativa­ mente inactivas e indistinguibles unas de otras con el sistema Crystal E/NF. En este grupo se incluyen algunas especies de importancia clínica de Alcaligenes, Burkholderia, Comámo­ nos, Moraxella, Ochrobactrum, Oligella y Pseudomonas. En un estudio de Wauters y cois.791 la identificación correcta glo­ bal de 201 no fermentadores (que incluían 31 especies diferen­ tes) fue del 75,9% con Crystal E/NF, comparada con la identi­ ficación del 75,3% mediante API 20NE. Se destaca que sólo 36 de 45 cepas de P. aeruginosa fueron identificadas correcta­ mente con Crystal E/NF comparado con la identificación de 41 en 45 con API 20NE. El porcentaje global de identificaciones incorrectas de no fermentadores fue mayor en forma sustancial con API (13,8%) que con Crystal (6,3%). Los investigadores destacaron que la ventaja de Crystal con respecto al sistema

Agar inclinado en tubo no estrangulado: creci­ miento a 42 °C y producción de pigmento piocianina Tubo estrangulado Medio GNF Fermentación de glucosa

n2 Fluorescencia Rueda Compartimentos periféricos Control de crecimiento Glucosa Xilosa Manitol Lactosa Maltosa Acetamida Esculina Urea DNAsa ONPG Compartimento central Medios de agar: Sulfuro de hidrógeno Indol

API consiste en que tanto los microorganismos fermentadores como los no fermentadores pueden probarse con el mismo panel. Además, API 20NE puede requerir 48 horas de incuba­ ción, mientras que Crystal E/NF precisa sólo 18 horas de incu­ bación. Robinson y cois.631 estudiaron 131 bacilos no entéricos con Crystal E/NF, entre los cuales se incluyeron 11 especies de no fermentadores; sin embargo, tres especies (P. aeruginosa,~A. baumannii, S. maltophilia) representaron el 90% de los no fer­ mentadores evaluados. El sistema Crystal identificó correcta­ mente todas las especies de P. aeruginosa, A. baumannii y S. maltophilia evaluadas, pero sólo identificó correctamente 8 de 13 (61,5%) especies restantes de no fermentadores. Nuestra propia evaluación mostró una tasa de identificación global de especies del 62,5%. (Schreckenberg PC, Anderson RR, Pierson C, Debusscher J, Brown W: datos no publicados.) Sistema RapID NF Plus

El sistema RapID NF Plus (Remel) es un micrométodo que utiliza sustratos convencionales y cromogénicos para la identi­ ficación de bacterias gramnegativas no fermentadores de importancia clínica y otras bacterias gramnegativas fermentadoras de la glucosa seleccionadas no pertenecientes a la fami­ lia de enterobaeterias. Las pruebas utilizadas en este sistema se basan en la degradación microbiana de sustratos específicos detectados mediante distintos sistemas indicadores. Las reac­ ciones utilizadas son una combinación de pruebas convencio­ nales y pruebas cromogénicas de sustrato único. El sistema se describe en el recuadro 7-13 y se muestra en la lámina en color 7-5F. En el estudio de Kitch y cois.,405 la identificación de espe­ cies fue correcta en el 90,1% de todas las cepas sin otras prue­ bas. Kiska y cois 404 mostraron que el sistema RapID NF Plus

E q u ip o s c o m e rc ia le s

: : .adro 7-13

357

Sistem a R apID NF Plus para la iden tificación de los no ferm entadores

funcional tema consiste en 10 cavidades de reacción ¿eadas en la periferia de una bandeja des­ able de plástico (véase lámina en color F - Las cavidades de reacción contienen :ñvos deshidratados y la bandeja permite la .--lición simultánea de cada cavidad con cantidad predeterminada de inoculo, u'do se agrega el inoculo de prueba a la :¿ad de reacción, el sustrato de prueba se ¿rata y se inicia la reacción de la prueba, rués de la incubación durante 4 horas, se -¿na cada cavidad de prueba para detectar ¡dad anotando el desarrollo de un color, ¿igunos casos, se deben agregar reactivos a cavidades de prueba para proporcionar un ibio de color. El patrón resultante de las :ciones de prueba positivas y negativas se iza como base para la identificación de la a Je prueba por comparación de los resultade las pruebas con la reactividad de los roorganismos conocidos almacenados en base de datos generada computarizada.

Procedimiento operativo

Sustratos incluidos

Preparación de los inóculos: se deben hacer crecer los

microorganismos de prueba en cultivo puro y deben ser examinados mediante tinción de Gram y oxidasa antes de su uso en el Sistema RapID NF. Los micro­ organismos de prueba pueden extraerse de distintos medios de crecimiento en agar selectivos y no selec­ tivos. Las placas utilizadas para la preparación de los inóculos deben tener preferentemente de 18-24 horas de antigüedad. Utilizando un hisopo de algo­ dón o un ansa de inoculación, extraer microorganis­ mos de la placa de agar y suspender RapID Inoculation Fluid para lograr una turbidez visual de por lo menos un estándar de turbidez de McFarland pero no superior a tres estándares. Las suspensiones deben mezclarse con cuidado y utilizarse dentro de los 15 minutos de su preparación. Inoculación de paneles: retirar la tapa del panel sobre la puerta de inoculación. Con una pipeta de Pasteur. transferir con suavidad todo el contenido del líquido de inoculación en el ángulo superior derecho del panel. Volver a sellar la puerta de inoculación pre­ sionando la tapa en su lugar. Después de agregar la suspensión de prueba, inclinar el panel nuevamente lejos de las cavidades de prueba en un ángulo de 45°. Mientras está inclinado hacia atrás, mover con suavidad el panel de un lado a otro para distribuir en forma uniforme el inoculo a lo largo de los deflectores posteriores. Mientras se mantiene una posición horizontal a nivel, inclinar suavemente el panel hacia adelante hacia las cavidades de reacción hasta que el inoculo fluya a lo largo de los deflectores en las cavidades de reacción. Incubar los paneles a 35-37 °C en una estufa sin CO, durante 4 horas. Paneles de lectura : colocar el panel sobre la parte superior del banco y retirar la tapa marcada sobre las cavidades de reacción. Sin el agregado de ningún reactivo, leer y puntuar las cavidades 1 a 10, de izquierda a derecha y registrar en el formulario de informe. Registrar el color de la cavidad 10 (GLU) en el espacio provisto sobre el agujero de comunica­ ción. Luego agregar 2 gotas de reactivo NF Plus a las cavidades 4-8, 2 gotas de reactivo Innova Spot Indole a la cavidad 9 y 2 gotas de reactivo Innova Nitrato A a la cavidad 10. Dejar al menos 10 segun­ dos pero no más de 3 minutos para que aparezca el color. Registrar los resultados en recuadros apropia­ dos en el formulario de informe. Buscar en el com­ pendio de códigos o la base de datos del ordenador.

;ticaba correctamente el 80% de los bacilos no fermenta- aislados de pacientes con fibrosis quística, incluido el de los aislados de B. cepacia. Esta fue la tasa de identifi•n global más alta de los cuatro sistemas comerciales idos en este estudio.404 En el estudio de Schreckenberger y . la identificación correcta global de las especies fue del >. (Schreckenberger PC, Anderson RR, Pierson C, isscher J, Brown W: datos no publicados.) RapID NF Plus único sistema de prueba de 4 horas no automático dispopara la identificación de no fermentadores.

Arginina dihidrolasa Utilización de tiol alifático Hidrólisis de triglicéridos La hidrólisis enzimática de glucósido o fosfoéster ligado a sustratos nitrofenílicos libera o-nitrofenol o /j-nitrofenol amarillo: p-nitrofenil-fosfoéster p-nitrofen¡l-
Sistema Biolog

El sistema Biolog (Biolog, Hayward CA) se describió en el capítulo 6. La base de datos para gramnegativos versión 4.01 contiene cerca de 275 especies y biogrupos de bacilos gramne­ gativos no fermentadores. Holmes y cois.315 evaluaron el siste­ ma Biolog utilizando 214 cepas de no fermentadores que repre­ sentan 15 especies. Estos autores comunican que después de 4 horas de incubación identificaron correctamente las especies en el 20% de los no fermentadores utilizando el lector automáti­

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C A P ÍT U L O 7

Bacilos gramnegativos no fermentadores

co; sin embargo, después de 24 horas de incubación la identifi­ cación de especies fue correcta en el 54% y el 66% de los no fermentadores mediante las lecturas automática y manual, res­ pectivamente, utilizando software versión 3.01 A. Los autores señalan que ningún otro sistema de identificación bacteriano comercial tiene tantos taxones en una base de datos única como el proporcionado por Biolog, pero como existen tantos, incluso la gran cantidad de pruebas disponibles puede no ser suficien­ te, en la práctica, para discriminar todos los pares de taxones.315

Sistemas de identificación automáticos Sistema Vitek Legacy®

El sistema Vitek Legacy (bioMérieux), descrito en el capítu­ lo 6, ha sido utilizado con éxito en la identificación de los no fermentadores hallados con mayor frecuencia en el laboratorio clínico. Pfaller y cois.578 evaluaron 91 bacilos no fermentadores y el 90,1% fue identificado correctamente. El 15% fue identifi­ cado en 4 horas, otro 45%, en 5 a 8 horas y otro 40%, en 9 a 18 horas. Colonna y cois.147 evaluaron 142 no fermentadores y observaron un 79,6% de concordancia con el API NFT. Kiska y cois.404 evaluaron cuatro sistemas de identificación, que incluían la tarjeta Vitek GNI, para la identificación de bacilos no fermentadores de pacientes con fibrosis quística. Se evaluó un total de 150 cepas aisladas que incluyeron 58 B. cepacia, 30 S. maltophilia, 24 A. xylosoxidans, 14 P. aeruginosa y otros 24 bacilos no fermentadores. El Vitek identificó correctamente sólo el 50% de las cepas de B. cepacia y el 60% del total de microorganismos aislados. O'Hara y cois.548 evaluaron 23 no fermentadores (8 Acinetobacter, 10 P. aeruginosa, 5 S. maltop­ hilia) y comunicaron un 100% de identificaciones correctas con la tarjeta Vitek GNI y el software versión R07.1. Rhoads y cois.623 evaluaron 80 A. baumannii y 39 P. aeruginosa e infor­ maron una identificación correcta del 100% y del 84,6%, res­ pectivamente, con la tarjeta Vitek GNI y el software versión AMS-R08.2. Sung y cois, evaluaron el GNI+ para la identifi­ cación de 301 cepas de bacilos no fermentadores que represen­ taban 25 especies diferentes. La identificación correcta de especie en las pruebas iniciales fue del 71.8% y mejoró hasta el 92,3% después de las pruebas adicionales como lo recomen­ daba el protocolo del fabricante.722 Sistema Vitek 2®

El sistema Vitek 2 se describe en detalle en el capítulo 6. La tarjeta Vitek 2 original para la identificación de gramnegativos ha sido rediseñada para mejorar la identificación de los bacilos fermentadores y no fermentadores. La nueva tarjeta contiene 47 pruebas (26 que habían sido incluidas en la tarjeta previa y 21 pruebas nuevas), comparadas con las 41 en la tarjeta Vitek 2 IDx-GNB establecida. La base de datos para la nueva tarjeta ha sido ampliada hasta 159 taxones comparada con sólo 101 para la tarjeta Vitek 2 original. En un estudio realizado por Funke y cois., 133 de 144 (92,4%) bacilos no fermentadores fueron identificados correctamente con las nuevas tarjetas Vitek 2.230 Sistemas Microscan Walkaway-96®, Walkaway-40® y Autoscan-4®

Estos tres sistemas (fabricados por Dade Behring, West Sacramento CA), descritos en el capítulo 6, tienen una base de datos extensa que incluye muchas especies de bacilos no fer­

mentadores. Pfaller y cois.,578 utilizando el panel rápido para gramnegativos Walkaway-96, comunicaron que el 92,3% de los bacilos no entéricos eran identificados correctamente con una probabilidad mayor del 85%. Tenover y cois.734 evaluaron el Walkaway-96 (antes denominado autoSCAN-W/A) por su capacidad para identificar 310 bacilos gramnegativos no fer­ mentadores de la glucosa bien caracterizados. En su estudio, se evaluaron dos tipos de paneles de identificación: el panel tipo 2 de identificación Neg colorimétrico desecado (DCP) y el panel de identificación Neg fluorométrico rápido (RFP). Los resultados con DCP mostraron que el 41,3% de 286 microor­ ganismos fueron identificados correctamente, con una confian­ za mayor del 85%, mientras que el 22,4% fue mal identificado con el mismo grado de confianza (errores mayores). El 15% de los microorganismos fueron comunicados como no identifica­ dos. Se informaron problemas en la identificación de bacilos no fermentadores relativamente frecuentes, como P. fluorescens, P. putida y S. maltophilia con el panel DCP. Los investi­ gadores comunicaron mejores resultados con los paneles RFP. en los cuales el 77,1% de 239 cepas aisladas se identificaron correctamente, mientras que el 25% fue mal identificado. Los investigadores señalaron además que los resultados con los paneles RFP estaban disponibles en 2 horas; por lo tanto, cuan­ do no se puede identificar un microorganismo, se pueden ino­ cular otras pruebas bioquímicas el mismo día, y se pierde poco tiempo en la identificación. Colonna y cois, evaluaron en UCLA 142 bacilos no fermentadores utilizando el panel de identificación Neg rápido en 2 horas y comunicaron el 74,6% de concordancia con el API NFT.147 O'Hara y cois.548 evaluaron en los CDC 23 cepas de bacilos no fermentadores, incluidos 8 Acinetobacter, 10 P. aeruginosa y 5 S. maltophiliae e informa­ ron una precisión del 100% con el panel combo 3 Walkaway Neg y el software versión 17.02. Rhoads y cois.623 comunica­ ron una identificación correcta del 97,5% y el 82,1% de A. bau­ mannii y P. aeruginosa aislados, respectivamente, utilizando el sistema Walkaway-96 con combo 6 en orina y combo 16 nega­ tivo y software versión 20.20. Sung y cois, compararon el MicroScan Walkaway (W/A) utilizando paneles tipo 12 de Combo Neg convencional (toda la noche), con el Vitek GNI+ para la identificación de 301 bacilos no fermentadores aislados que mejoró hasta el 96,0% después de pruebas adicionales que fueron recomendadas por el protocolo del fabricante.722 Saiman y cois, evaluaron la capacidad del MicroScan Autoscan para identificar P. aeruginosa aisladas en pacientes con fibrosis quística.656 Utilizando los paneles Combo Negativos tipo 15 leídos después de 20 a 24 horas y nuevamente a las 48 horas de incubación pudieron identificar correctamente el 57% (108 o 189) de cepas no mucoides y 40% (24 de 60) de cepas mucoi­ des. La mala identificación más frecuente fue Pseudomonas fluorescens/putida.656 En 1997, MicroScan actualizó los paneles de identificación rápida de gramnegativos del panel tipo 2 al panel tipo 3 para mejorar la precisión de la identificación, eliminar la necesidad del revestimiento con vaselina para las pruebas de descarboxi­ lasa y aumentar el tiempo de conservación de 1 año a 2 años. La base de datos de identificación para el panel revisado fue actualizada para incluir 119 taxones. En una evaluación multicéntrica del nuevo panel tipo 3 la identificación de especies fue correcta en el 91,3% (63 de 69) de los bacilos no fermentadores.48 En un estudio realizado en la University of Illinois en Chicago, la identificación de especies con los paneles rápidos tipo 3 para gramnegativos fue correcta en el 92,2% (71 de 77) de los bacilos no fermentadores que representaban 10 espe­ cies.670

R e fe re n c ia s

Ssera Sensititre AP80® _ - paneles de identificación Sensititre AP80 (TREK D '^ * stic Systems, Cleveland, OH) pueden ser inoculados e ¡Brisados fuera de línea y luego leídos en el Autolector jfcisim re o pueden ser inoculados y colocados en el t e s r - “ rnto ARIS (Sistema de lectura e incubación automáti2 ¡te -rnto en el capítulo 6. El panel AP80 permite la identififMñóa de bacilos gramnegativos tan sólo en 5 horas, con la de una incubación adicional durante toda la noche si recesado o conveniente. Colonna y cois, evaluaron 142 hu-ák - gramnegativos utilizando los paneles Sensititre AP80 y a '---::a ro n un 71,1% de concordancia con el API NFT.147 Sameck y cois.711 evaluaron 144 cepas no entéricas que in135 no fermentadores que representaban ocho especies. H - • de los microorganismos aislados consistió sólo en tres b p m e s (68 P. aeruginosa, 33 Acinetobacter, 25 S. maltophiá . L Se obtuvo una identificación correcta para el 99,2% de tres especies y para el 95,1% de todos los no entéricos s __ jos. La pequeña cantidad de especies de no fermentadoíes : _._ados en este estudio hace difícil determinar el rendi■ éebk de este sistema para las pruebas de laboratorio clínico fcar mal de los no fermentadores. s e r a Phoenix® E_ Phoenix (Becton Dickinson Microbiology Systems) es un ■ t m a microbiológico automático de identificación y pruebas ác sensibilidad a los antibióticos creado recientemente. En el ttpE B l: 6 se presentan sus detalles. Hasta la fecha, sólo se han p ire .¿ d o algunos estudios que lo evalúan para la identificaa t ¿e bacilos no fermentadores. Stefaniuk y cois, evaluaron 5 - Bacilos no fermentadores (22 P. aeruginosa, 17 Acinetobacv . ' 5 5. maltophilia) y comunicaron un 96,3% (52 de 54) de ^ o. ra n cia con los métodos estándares.712 Donay y cois, evaa 56 bacilos no fermentadores que representaban siete ■ K a e s y comunicaron un 89,3% de identificaciones correctas a m eí sistema Phoenix en comparación con una identificación * referencia.196

Je eccióii de un sistema - - microbiólogos clínicos deben evaluar los parámetros precisión, costo-eficacia y efectos sobre el flujo de trai l . _ando deciden si van a utilizar un sistema comercial para ■identificación de los no fermentadores. Los sistemas comer; - rinden con niveles de precisión iguales o mejores que los k s :c ?s convencionales en la identificación de P. aeruginosa, ■ p edes de Acinetobacter y S. maltophilia', sin embargo, estos ai--organism os metabólicamente activos también pueden ser —*■ :':cados fácilmente utilizando algunas pruebas bioquími­ cas simples descritas antes. Muchos laboratorios han adoptado ■:> de los sistemas comerciales por conveniencia. No obstanm. debido a la baja sensibilidad y especificidad comunicadas a - identificación de muchos de los no fermentadores con :res requerimientos nutricionales especiales y más inacti■*» re>de el punto de vista bioquímico, se deben tener aún a s a n : medios diferenciales convencionales con suplementos. - r k tanto, la identificación definitiva de la mayoría de los no :~er.tadores requiere aún una experiencia técnica considera­ r e . el acceso a distintos medios de cultivo frescos bajo un pM rol estricto de calidad. Dado que relativamente pocos no Sarmentadores, sobre todo las cepas de especies distintas de las 3EEDBD

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tres mencionadas, se encuentran en la mayoría de los laborato­ rios intermedios o pequeños, se debe considerar seriamente los servicios de un laboratorio de referencia. No es difícil identifi­ car a los no fermentadores si el microbiólogo desea emplear el tiempo y la dedicación necesarios para lograr un nivel acepta­ ble de precisión. Se pueden recomendar los sistemas comercia­ les, siempre que se conozcan sus inconvenientes y se desee establecer pruebas complementarias para identificar las cepas débilmente reactivas o con requerimientos nutricionales espe­ ciales. REFERENCIAS 1. Aaron SD, Fems W, Henry DA, et al. Múltiple combination bactericidal antibiotic testing for patients with cystic fibrosis infected with Burkholderia cepacia. Am J Respir Crit Care Med 2000;161:1206-1212. 2. Aber RC, Wennerten C, Moellering RC Jr. Antimicrobial susceptibility o f flavobacteria. Antimicrob Agents Chemother 1978;14:483-487. 3. Agodi A, Mahenthiralingam E, Barchitta M, et al. 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Bacilos gramnegativos no fermentadores

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Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones Parte I: Bacilos curvos: Campylobacter, Wolinella, Arcobacter Helicobacter y bacterias relacionadas Reseña histórica

8

Pruebas diferentes del cultivo Métodos de detección directos

Cultivo y aislam iento de Helicobacter pylori Muestras para el aislamiento de H. pylori Procedimiento de aislamiento Identificación de H. pylori Prueba de ureasa en biopsia (prueba CLO)

Clasificación de Campylobacter y taxones relacionados Especies de Campylobacter Campylobacter jejuni subespecie jejuni Otras especies de Campylobacter Ex especies de Wolinella y Bacteroides incluidas en la familia

Campylobacteriaceae Género Arcobacter Género Helicobacter H. pylori Otras especies de Helicobacter de importancia clínica Especies de Helicobacter no humanas Otros bacilos gramnegativos microaerófilos

Identificación definitiva de campilobacteres y bacterias relacionadas Identificación rápida de cam pilobacteres a partir de colonias y m uestras de heces

Pruebas no invasivas para el diagnóstico de la infección por H. pylori Precisión de las pruebas invasivas y no invasivas para el diagnóstico de la infección por H. pylori Helicobacteres enterohepáticos

Parte II: Familias de Ifibrionaceae y “Aeromonadaceae” Filogenia de Vibrionaceae Género Vibrio Taxonomía Descripción y síndromes clínicos asociados de especies de Vibrio de importancia humana Métodos de aislamiento de Vibrios en el laboratorio Caracterización bioquímica e identificación de laboratorio de las especies de Vibrio

C la s ific a c ió n de C am pyloba cte r y ta x o n e s re la c io n a d o s

Géneros Listonella, Photobacteríum y Shewanella Aeromonasy Plesiomonas Señero Aeromonas

373

Especies de Aeromonas en sanguijuelas medicinales Aislamiento en el laboratorio de especies de Aeromonas a partir de muestras clínicas Identificación de laboratorio de especies de Aeromonas

Género Plesiomonas

'axonomía

Aislamiento e identificación de laboratorio

-portancia clínica

Género Chromobacterium

cois.,317-320 utilizando distintas técnicas moleculares, como hibri­ dación de DNA-rRNA, análisis de secuencia de RNA ribosómico (rRNA) 16S y análisis de inmunotipificación. determinaron que las especies de Campylobacter y los taxones relacionados - í seña histórica pertenecen al mismo grupo filogenético, al que denominaron superfamilia rRNA VI. Cinco géneros, entre ellos Campylo­ bacter, Arcobacter, Helicobacter, Wolinella y “Flexispira” E. microorganismo clasificado actualmente como Campylo(más tarde ubicada en el género Helicobacter) fueron incluidos macrerjejuni fue descubierto en 1931 por Jones y cois.157 como en la superfamilia rRNA VI. Las características que diferencian ■ente causal de la disentería invernal en el ganado. Transestos géneros relacionados se mencionan en el cuadro 8-1. r-n e ro n 36 años antes de que King describiera un grupo de Solnick y cois, también describieron dos microorganismos sacilos curvos móviles microaerófilos aislados de la sangre espiralados gástricos humanos no cultivables, “Gastrospirillum ie uños con disentería aguda, que designó como “vibriones hominis” 1 y 2, que han identificado como helicobacterias Kiad :>nados” porque eran similares en muchos aspectos a mediante análisis de rRNA 16S y que nombraron provisoria­ Wc^.c retus.114 King advirtió con suspicacia que los vibriones mente “Helicobacter heilmannii”,287 de la sangre de los niños podrían estar íntimamente Los estudios de Thompson y cois.311 mostraron que las espe­ je ... nados con el microorganismo descrito como V. jejuni cies bacterianas incluidas en la superfamilia rRNA VI podrían rrr _’:nes en 1931, el cual podría ser más importante como separarse en tres grupos rRNA distintos. Estos autores comu­ n i v de síndromes diarreicos infantiles de etiología descononicaron que sólo los microorganismos que comprendían el eica ie que lo se había creído. grupo rRNA I (C. fetus, C. coli, C. jejuni, C. lari, C. hyointesE era una afirmación hipotética; no obstante, transcurrietinalis, C. concisus, C. mucosalis, C. sputorum y C. upsalien■ i xros 15 años antes de que esta asociación tuviera sustento sis) eran verdaderas campilobacterias. Paster y Dewhirst252 si d laboratorio. En 1972, Dekeyser y cois.71 aislaron los observaron una estrecha relación entre Wolinella curva, i en :nes relacionados” de las heces de pacientes con enteriWolinella recta, Bacteroides gracilis. Bacteroides ureolyticus y ■: -x_da utilizando una técnica de filtración que permitía que las campilobacterias verdaderas que forman el grupo I de lis requeños bacilos curvos atravesaran la membrana pero homología de RNA y sugirieron colocar todos los miembros ¡Eenij los microorganismos fecales más grandes. Siguieron del grupo de las campilobacterias en el género Campylobacter. iMns distintas comunicaciones, que conectaron los vibriones Vandamme y cois.320 confirmaron los hallazgos de Thompson y lados (V. fetus subespecie jejuni; C. jejuni) con gastrocois.311 y Paster y Dewhirst252 y propusieron una descripción ■ nenns en seres humanos, con una distribución en todo el corregida del género Campylobacter para incluir todos los hbx3co.:?:’ 164 Desde entonces, esta incidencia relativa ha sido microorganismos ubicados en el grupo I de homología y trans­ _ ;5 Tenencia en la mayoría de los laboratorios clínicos, aunferir W. curva y W. recta al género Campilobacter como C. curTirante los últimos años las tasas de aislamiento han disvus y C. rectus, respectivamente. Hace poco, Vandamme y I T ' . ídO en cierto grado. cois.316 propusieron la reclasificación de B. gracilis como La nstoria del descubrimiento de Helicobacter pylori (antes Campylobacter gracilis. Sin embargo, aunque \B. ureolyticus] 3 Campylobacter pyloridis y luego C. pylori) es aun más es considerado miembro de la familia Campylobacteraceae, ■ ■ : sa. Se adjudica a Warren y Marshall su “descubrimiento” hasta ahora no ha sido renombrado y queda una especie incerm -. Australia, en 1982;328 sin embargo, han aparecido en tae sedis que espera el aislamiento y la caracterización de otras j l " ; ‘atura médica muchas descripciones anteriores de microbacterias similares a B. ureolyticus. ■^■nsm os espiralados en muestras de biopsia de mucosa gásEl grupo rRNA II contenía un conjunto homogéneo de r — humana que se remontan a comienzos de este siglo.105-180 microorganismos para los cuales Vandamme y cois.320 propu­ 5*:»: lespués del cultivo exitoso de esta bacteria utilizando la sieron la designación de género de Arcobacter. el cual incluye f ■" -r "atmósfera para Campylobacter" se le ha prestado ahora Arcobacter actualmente incluye Arcobacter ?utrofigilis m in mención, ya que puede ser la causa más frecuente de una (antes Campylobacter nitrofilis), Arcobacter cryaerophilus (an­ im r. -.: n. ya que puede ser la causa más frecuente de infección tes Campylobacter cryaerophila), Arcobacter (Campylobacter) ■ s t .ir.estinal humana y de gastritis.257 butzleri y Arcobacter skirrowii.172322 El grupo rRNA III contenía miembros de tres géneros dife­ I as f catión de Campylobacter y taxones relacionados rentes: Helicobacter, Wolinella, “Flexisipira" y una especie sin nombre, CLO-3. Vandamme y cois, corrigieron la descripción del género Helicobacter y propusieron la transferencia de _clasificación de los bacilos gramnegativos microaerófilos Campylobacter cianedi y C. fennelliae al género Helicobacter II ?iado mucho en las últimas décadas. Vandamme y I: BACILOS CURVOS: CAMPYLOBACTER, WOLINELLA, ■-:0BACTER, HELICOBACTER Y BACTERIAS RELACIONADAS

374

C A P ÍT U L O 8

Cuadro 8-1

Bacilos gramnegativos curvos y termentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

Características para diferenciar Arcobacter, Campylobacter, Wolinella, Helicobacter y “Flexispira” C R E C IM IEN T O A

GÉNERO

REDUCCIÓN D E N ITRATO S

C R EC IM IEN TO EN G LIC IN A A L 0,5%

H ID RÓ LISIS DE UREA

15 °C

30 °C

Arcobacter

+

ND

V

+

+

-

Bacilos curvos y espiralados

Ausentes

Campylobacter

+

V

-

+

V

Bacilos curvos y espiralados

Ausentes

D

Espiralados

Ausentes

V

Bacilos curvos y espiralados

Presentes

+

Bacilos fusiformes rectos

Presentes

Wolinella

+

-

-

Helicobacter

V

+

V

“Flexispira ”

-

+

+

V -

42 °C

CELULA R

VAINAS FLA G ELA R ES

+: 90% o más de las cepas son positivas; 90% o más de las cepas son negativas; V: variable, ll% -89% de las cepas son positivas; D: reacción débil; ND: no disponible. Modificado de Vandamme P, Falsen E, Rossau R et al. Revisión o f Campylobacter. Helicobacter and W olinella taxonomy: Emendation o f generic descriptions and proposal o f Arcobacter gen. nov. Int J Syst Bacteriol 41:88-103, 1991.

como H. cinaedi y H. fennelliae, respectivamente.320 “Fle­ xispira” está incluido ahora en el género Helicobacter. Wolinella succinogenes se mantiene como la única especie del género Wolinella. Especies de Campylobacter

Las especies de Campylobacter son bacterias espiraladas curvas microaerófilas (necesitan menos O,) y capnófilas (nece­ sitan más CO,), móviles por medio de un único flagelo polar sin vaina. Estos microorganismos tienen un metabolismo no fermentador y no oxidativo, y obtienen energía del uso de ami­ noácidos y los intermediarios de cuatro y seis carbonos del ciclo de Krebs. Se los solía clasificar con las especies de Vibrio, hasta que algunos estudios de homología del DNA mostraron que no estaban relacionados con los vibriones. Aun entre las especies de Campylobacter actualmente reconocidas, existe gran diversidad genotípica y fenotípica. Los microorganismos habitan una amplia variedad de nichos ecológicos y ambientes. La mayoría de las especies se encuentran en los animales (ganado vacuno y porcino) y causan esterilidad y aborto. CAMPYLOBACTER JEJUNI SUBESPECIE JEJUNI Importancia clínica. C. jejuni subespecie jejuni es el patógeno

humano más importante entre las campilobacterias. Tiene una distribución mundial y en los países industrializados se aísla en muestras de deposiciones diarreicas entre dos a siete veces más que Salmonella o Shigella.w También es ubicuo en ani­ males domésticos; las mascotas domésticas pueden portarlo y la gran mayoría de los pollos, pavos y aves acuáticas están colonizados.119 La leche cruda,56-324 aves parcialmente coci­ das119 o agua contaminada48 163 son las fuentes frecuentes de infecciones humanas.107 La enteritis con este microorganismo se caracteriza por dolor abdominal cólico, diarrea sanguino­ lenta, escalofríos y fiebre. En la mayoría de las personas, la infección es autolimitada y se resuelve en 3 a 7 días. El micro­ organismo puede seguir siendo excretado por los pacientes convalecientes durante 2 semanas a 1 mes. En casos de enfer­ medad grave, el paciente puede ser tratado con eritromicina por vía oral. Aunque la enteritis y los síndromes diarreicos siguen siendo las manifestaciones más frecuentes de las infecciones por Campylobacter, otras enfermedades han surgido durante los últimos años. Se han informado casos de artritis séptica, meningitis y proctocolitis secundarios a C. jejuni.263 Existen

varias comunicaciones que asocian la infección por C. jejuni con el síndrome de Guillain-Barré, una enfermedad desmielinizante aguda de los nervios periféricos.122182-270'290 Los datos de estudios serológicos y de cultivos muestran que entre el 20-40% de los pacientes con síndrome de Guillain-Barré están infectados por C. jejuni 1 a 3 semanas antes del inicio de los síntomas neurológicos.11 Sin embargo, el riesgo de aparición del síndrome después de la infección por C. jejuni es muy pequeño (< 1 caso de síndrome de Guillain-Barré/1 000 infec­ ciones por C. jejuni)}0 No hay ninguna relación entre la grave­ dad de los síntomas gastrointestinales y la probabilidad de desarrollar síndrome de Guillain-Barré después de la infección por C. jejuni; y de hecho, aun infecciones asintomáticas pueden desencadenarlo.11 En los Estados Unidos y Japón, el 30-80% de las cepas de C. jejuni de pacientes con síndrome de GuillainBarré pertenecen al serotipo Penner 0:19.11108 Recientemente, la infección por C. jejuni se ha asociado con enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado (también denominada enfermedad de las cadenas alfa).191 Una revisión de la epide­ miología, la patogenia y las características clínicas de la infec­ ción por C. jejuni ha sido escrita por Allos.10 Identificación presuntiva en las heces. Puede ser posible hacer un diagnóstico presuntivo de enteritis por Campylobacter obser­ vando formas curvas, con forma de S, en alas de gaviota o espiraladas largas gramnegativas características en los prepa­ rados teñidos con Gram de las deposiciones diarreicas (véase lámina en color 8-1A). Se podría considerar examinar prepa­ rados húmedos o frotis teñidos de todas las muestras de depo­ siciones diarreicas para leucocitos polimorfonudeares y la presencia de formas bacterianas sugestivas de especies de Campylobacter. Las muestras de heces para especies de Cam­ pylobacter no son sometidas a otros procesamientos en algu­ nos laboratorios a menos que se presenten leucocitos polimorfonucleares. El fundamento para esta práctica es que es poco probable que las especies de Campylobacter se aíslen en can­ tidades clínicamente importantes de las muestras de heces des­ provistas de leucocitos. El insumo de tiempo y el uso de medios de cultivo especiales para las muestras en las cuales existen pocas posibilidades de recuperar una cantidad impor­ tante de microbios no se considera un enfoque eficaz en rela­ ción con el costo. Métodos para el aislamiento de laboratorio. El aislamiento exito­ so de C. jejuni de las heces depende del uso de medios selecti­ vos (p. ej., Campy-Thio, Campy-BAP), la incubación a tempe­ ratura ambiente (42 °C) y la atmósfera apropiada de incubación (oxígeno al 5%, C 0 2 al 10%, nitrógeno al 85%). Se ha comu-

C la s ific a c ió n de C am pyloba cte r y ta x o n e s re la c io n a d o s

I .adro 8-2

P roced im ientos utilizados por d istin tos investigadores para crear un m edio m icroaerófilo ap rop iad o para el cu ltivo de especies de C a m p y lo b a c te r

INSTIGADORES

I

L a e c h tefeld y cois.201

E -.3cuación-reposición

I íí^t*eit y cois.* E •^uación-reposición

"Or rbt rr GA,

375

PROCEDIMIENTO Se extrajo el 75% del aire de una jarra de anaerobiosis y se rellenó a presión atmosférica con una mezcla de 10% de C 0 2y 90% de Nr Se incubaron seis placas de medios en una jarra Se extrajo el 75% de aire de una olla a presión modificada mediante una evacuación doble del recipiente hasta -38 cm de Hg y se rellenó con una mezcla de 10% de C 0 2 y 90% de N2 a presión atmosférica. Las placas ocuparon no más del 50% del volumen del recipiente

Hollis DG, Weaver RE et al.: 30 years o f campylobacters: Biochemical characteristics and a biotyping proposal fo r Campylobacters jejuni. J Clin Microbiol 15:1065-

MTJ. 1982.

hc.hío que una técnica de filtración de membrana que se utiliel CSM era el medio único mejor; sin embargo, se notaron las la coa placas de agar sangre no selectivas es tan eficaz como el tasas más altas de aislamiento cuando se utilizó CSM combi­ b c ie medios selectivos para el aislamiento de C. jejuni.195 nado con cualquier otro medio o con la técnica de filtro. Endtz E se método tiene la ventaja de permitir el aislamiento de camy cois, también informaron que prolongar el tiempo de incuba­ piabacterias sensibles a los antibióticos. En las últimas décación de 48 a 72 horas condujo a un aumento de la tasa de ais­ _■ se han utilizado medios de cultivo selectivos y condiciones lamiento cualquiera que fuera el medio utilizado.82 ESKciales de incubación necesarios para aislar especies de Se pueden inocular hisopados rectales o muestras de hisopos Zmmpylobacter en la mayoría de los laboratorios de microbiode heces directamente en un área pequeña sobre la superficie de ■ clínica. uno de los medios selectivos con agar recomendados. Las Se rueden utilizar varios procedimientos para proporcionar muestras de heces formadas también pueden procesarse emulb u atmósfera gaseosa apropiada para el cultivo de campilosificando una pequeña porción (del tamaño de un maní) en taderias microaerófilas. Éstos incluyen procedimientos de solución salina con buffer de fosfato o calcio antes de inocular ±’ ~-ición y rellenado de gases, uso de generadores descarta1 o 2 gotas en la superficie del agar con una pipeta de Pasteur; bies y del principio de Fortner. Dos de estos procedimientos, asimismo, se pueden inocular directamente 1 o 2 gotas de id iz jd o s con éxito por distintos investigadores, se señalan en muestras de heces líquidas. s ;_^dro 8-2. No se recomienda el uso de una estufa con C 0 2 En el recuadro 8-1 se muestra un bosquejo del procedimien­ pan incubar campilobacterias porque sólo crecen cepas que to que permitirá el aislamiento de campilobacteres entéricos de k c muy aerotolerantes en la atmósfera provista. Asimismo, no muestras de heces. Esta técnica es compatible con la informa­ * -e; r mienda la jarra de anaerobiosis por extinción con vela ción actual de la literatura especializada acerca de los requeri­ porque el nivel de oxígeno (12% a 17%) es demasiado alto para mientos para el cultivo de estas bacterias y su uso es apropiado «1 :-ec:miento óptimo de las campilobacterias.201-237 en la mayoría de los laboratorios clínicos. Se han creado varios medios selectivos para permitir el aisSe puede utilizar una técnica alternativa de filtro de mem­ .a~~rnto de C. jejuni en heces. Merino y cois.217 evaluaron la brana, como la descrita por Steele y McDermott,295 combinada riícacia de siete medios de aislamiento selectivos para con un medio selectivo para Campylobacter con resultados G smpylobacter. Los nombres de estos medios, su composición equivalentes (véanse lámina en color 8-1B y recuadro 8-2). y ir: resumen de la evaluación de cada uno de ellos se presenEn general, no se recomienda el uso sistemático del “caldo _■ en el cuadro 8-3. En la mayoría de los laboratorios clínicos Campy” de enriquecimiento. Los caldos de enriquecimiento -e ha utilizado el medio selectivo de Butzler, el medio de pueden ser beneficiosos si las muestras de heces se retardan en ■ teer (Campy-BAP) y agar sangre de Skirrow. Sin embargo, el tránsito o si se dejan a temperatura ambiente demasiado ■termo y cois.217 hallaron que con el medio sin sangre de tiempo. Cada director de laboratorio debe decidir si un caldo de fteston para Campylobacter con cefoparazona se lograba el enriquecimiento será beneficioso sobre la base de los patrones r número de aislamientos de C. jejuni. Karmali y cois, de enfermedades locales y en qué medida se podría controlar la aron que un medio selectivo sin sangre y basado sobre recolección y el transporte de muestras de calidad. Como las • n (CSM), que consiste en base de agar de Columbia, car- campilobacterias son microaerófilos, tienden a crecer mejor fc:c activado, hematina, piruvato de sodio, cefoperazona, vancerca de la parte superior del tubo. Si se utiliza un caldo para a n ñ c in a y cicloheximida, es más selectivo que el medio de Campylobacter, se debe seguir el siguiente procedimiento pa­ Sfcrrow y tiene una tasa de aislamiento mayor de C. jejuni ra el subcultivo: ú t cultivos mixtos. El carbón, la hematina, el sulfato ferroso y Utilizar una pipeta plástica de polietileno de marca Falcon d piruvato de sodio sirven como sustitutos de la sangre en los que se puede invertir. Colocar el extremo de la pipeta 2,5 cm ~ er. os de crecimiento para campilobacterias. Se agrega caseípor debajo de la superficie del medio y extraer continuamente ■s para ayudar a crecer a ciertas cepas de campilobacterias teruna muestra a medida que se retira la pipeta. Invertir la pipeta ■dfilas resistentes al ácido nalidíxico que son microorganispara facilitar la mezcla de la muestra, colocar 3 gotas en una -■< ambientales. placa Campy-BAP y sembrar en estría para el aislamiento. E ri:z y cois.82 compararon un medio para motilidad selecti­ Incubar como si se hiciera una placa de cultivo primario. va sin sangre semisólido117 con dos CSM sin sangre, dos Identificación para cultivo. La aparición de colonias en uno de los « e r : js con base de sangre (medio de Skirrow y Campy-BAP medios selectivos con agar para Campylobacter que ha sido :e 5.^>er) y la técnica de filtro de membrana. Observaron que incubado a 42 °C en la atmósfera descrita antes ya constituye

376

C A P ÍT U L O 8

Cuadro 8-3

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

Fórmulas para medios selectivos para el aislamiento de C am pylobacter je ju n i

MEDIO

BASE

ADITIVOS

Medio selectivo de Butzler

Medio de tioglicolato líquido (Difeo Laboratories, Detroit MI)

Agar (3%) Sangre de carnero (10%) Bacitracina (25 000 UI/L) Novobiocina (5 mg/L) Colistina (10 000 UI/L) Cefalotina (15 mg/L) Actidiona (50 mg/L)

Agar-sangre de Skirrow

Base de agar sangre 2 (Oxoid)

Sangre de caballo lisada (7%) Vancomicina (10 mg/L) Polimixina B (2 500 UI/L) Trimetoprim (5 mg/L)

Medio de Blaser (Campy-BAR)

Base de agar para brúcelas (Becton Dickinson, Microbiology Sistems, Cockeysville, MD)

Sangre de camero (10%) Vancomicina (10 mg/L) Trimetoprim (5 mg/L) Polimixina B (2 500 UI/L) Cefalotina (15 mg/L) Anfotericina B (2 mg/L)

Medio selectivo para Campylobacter de Preston

Caldo de nutrientes 2 (Oxoid CM67) Agar de Nueva Zelanda al 1,2%

Sangre de caballo lisada con saponina al 5% 1 Trimetoprima (10 ng/mL) Polimixina B (5 UI/mL) Rifampicina (10 (ig/mL) Cicloheximida (100 ng/mL)

Medio sin sangre para Campylobacter de Preston

Caldo de nutrientes 2 (Oxoid CM67) Agar de Nueva Zelanda al 1,2%

Carbón bacteriológico Desoxicolato de sodio Sulfato ferroso Piruvato de sodio Hidrolizado de caseína Cefoperazona (32 mg/L)

Medio para viriones de Butzler

Base de agar de Columbia (Oxoid CM331)

Sangre de carnero desfibrinada Cefoperazona (15 mg/L) Rifampicina (10 mg/L) Colistina (10 000 U/L) Anfotericina B (2 mg/L)

Medio de Preston modificado

Caldo de nutrientes 2 (Oxoid)

Sangre de caballo desfibrinada al 7% Cefoperazona (32 mg/L) Anfotericina B (2 mg/L) Suplemento de crecimiento para Cam pylobacter (Oxoid)

Medio selectivo sin sangre con base de carbón

Base de agar de Columbia (GIBCO)

Carbón activado (Oxoid) Hematina (0,032 g/L) Piruvato de sodio (0,1 g/L) Vancomicina (20 mg/L) Cefoperazona (32 mg/L) Cicloheximida (100 mg/L)

..................

Datos tomados de Karmali MA, SimerAE, Roscoe M et al.: Evaluation o f a blood-free, charcoal-based, selective médium fo r the isolation o f Campylobacter organisms from feces. J Clin Microbiol 23:456-459, 1986; y Merino FJ, Aguila A, Vlllasante PA et a l: Comparative efficacy o f seven selective media fo r isolating Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol 24:451-452, 1986.

una prueba presuntiva de que el microorganismo pertenece a una de las especies de Campylobacter termófilos (principal­ mente C. jejuni). La morfología de las especies de Campylobacter en agar selectivo varía desde colonias grises, planas y de forma irregular que pueden ser secas o húmedas

hasta colonias redondeadas, convexas y brillantes con bordes definidos (lámina en color 8-1C, D). Las colonias tienden a for­ mar un crecimiento confluente a lo largo de las líneas de siem­ bra sobre la superficie del agar. No se observan reacciones hemolíticas en agar sangre. La identificación puede confirmar-

C la s ific a c ió n de C am pyloba cte r y ta x o n e s re la c io n a d o s

-ecu adro 8-1

P rocedim iento para el aislam ien to de C. je ju n i y otras especies de C am p ylo b acter entéricas de las m uestras de heces

I- Utilizando una muestra de heces o una muestra de hisopo en un medio -r Cary-Blair, preparar una suspensión turbia de las heces en 10 mL de :^do-infusión de encéfalo-corazón. Inocular inmediatamente una o dos r.-;a s (es preferible dos placas) de un medio selectivo para Campylobacter (los mejores resultados se obtienen con CSM como se -.'".ila en el texto): sembrar en estría para obtener colonias aisladas y mantener una jarra con nitrógeno (véase cap. 14) hasta inocular los —edios restantes. 1 Centrifugar ligeramente la muestra (aproximadamente a 1 000 g) duran­ te 5 minutos. 5 Extraer aproximadamente 5 mL del sobrenadante con una jeringa y fil­ tre a través de un filtro Millipore de 0.65 |iL estéril, según lo describió B.tzler.41 Descartar los 3 mL primeros de líquido y utilizar 1 o 2 gotas del resto para inocular dos placas de agar chocolate sin agentes selecti• os o un medio de agar sangre como el agar sangre para anaerobios de i » Centers for Disease Control and Prevention (CDC) que sostendrá el ~ecimiento de Campylobacter. Sembrar en estrías para el aislamiento. - Incubar un conjunto de placas de agar selectivo para Cam pylobacter y agar chocolate a 42 °C en una atmósfera de O, al 5%, CO, al 10% y N, >5% y las placas restantes a 35 °C a 37 °C en la misma atmósfera gaseosa. 5 Lt>?eccionar las placas después de 24, 48 y 72 horas de incubación para colonias características de las especies de Cam pylobacter e identificar ¡as cepas con las técnicas descritas en el texto. Las placas que no muestren crecimiento después de 24 o 48 horas de incubación deben ser retomadas durante otras 24 a 48 horas en las mismas condiciones de estufa y atmosféricas gaseosas, como ya se describió.

-demás, realizando pruebas rápidas de catalasa y citocromo : ’^¿ji,a (C. jejuni, C. coli y C. lari dan pruebas positivas en caldo). En ocasiones, algunas especies bacterianas termófilas ±í^ntas de las especies de Campylobacter, especialmente Pseudomonas aeruginosa, aparecen y crecen en los medios selectivos. Sin embargo, es poco probable confundir P. aerugimna con C. jejuni. La morfología de las colonias de los dos organismos es diferente; si existiera alguna duda, una tin. : o de Gram diferenciaría rápidamente las especies de Camr lobacter de P. aeruginosa. L s preparados teñidos con Gram de colonias de C. jejuni irsrués de 24 a 48 horas de incubación en agar sangre muesn n formas espiraladas curvas, con forma de “S”, en alas de iota o alargadas gramnegativas características (véase lámien color 8-1 A). Las formas cocoides se observan más a me ~udo en los cultivos más viejos de C. jejuni, sobre todo despoés de la exposición de las colonias a temperatura ambiente. Es aportante el cumplimiento estricto del tiempo habitual que requiere la tinción de Gram porque las especies de Campy"... ter típicamente tienen una tinción débil. Por esta razón, se 7>:cna considerar extender el tiempo de tinción de la contratin3Ón de safranina al menos a los 10 minutos para permitir ■ayor intensidad de tinción. Una vez aisladas, ambas especies de C. jejuni pueden iden_f ; irse con facilidad dado que son las únicas campilobacterias , - r hidrolizan el hipurato (véanse lámina en color 8-1E y cua­ dro S-4). Además, esta especie es resistente a la cefalotina y •-¿le ser sensible al ácido nalidíxico, aunque en ocasiones se observan cepas resistentes (véase lámina en color 8-1F).

377

OTRAS ESPECIES DE CAMPYLOBACTER C. coli. C. coli está estrechamente relacionado con C. jejuni y también es un patógeno de relevancia que se transmite por vía alimentaria en los seres humanos.3® Comparte varias caracte­ rísticas de cultivo con C. jejuni, como la sensibilidad al ácido nalidíxico y la resistencia a la cefalotina. Puede ser diferencia­ do de C. jejuni por la prueba de hidrólisis de hipurato (C. jeju­ ni hidroliza hipurato; C. coli no lo hace). El informe cuando se aísla este microorganismo en los laboratorios en los cuales no se realiza la prueba de hipurato debe decir "C. jejuni/coli'. Se calcula que C. coli explica el 5-10% de los casos de enteritis por Campylobacter en los seres humanos.228 También se ha comunicado un caso de infección de las vías urinarias causado por C. coli resistente a las quinolonas.251 C. concisus. C. concisus es capaz de tener un crecimiento anae­ robio y requiere hidrógeno o formato para su crecimiento. El microorganismo se aísla principalmente de los surcos gingiva­ les humanos. Sin embargo, también puede causar enfermedad gastrointestinal, sobre todo en pacientes inmunodeprimidos.1,190-318 La recuperación de C. concisus de muestras de heces requiere el uso del método del filtro (explicado en otra parte de este capítulo). C. fetus subespecie fetus. C.fetus subespecie fetus se asocia fun­ damentalmente con aborto infeccioso en ganado vacuno y ove­ jas y es una causa poco frecuente de infecciones humanas. En general, las infecciones causan enfermedad sistémica y suelen afectar a las personas debilitadas por afecciones hepáticas, nefropatías crónicas, neoplasias o por inmunosupresión.49256 Se ha comunicado que C. fetus subespecie fetus produce proctitis y proctocolitis en varones homosexuales;74 trabajo de parto prematuro y sepsis neonatal en seres humanos;50 aborto sépti­ co;298 meningitis neonatal;185 infección de prótesis de articula­ ción de la cadera19-333 y endocarditis tanto en válvula nativa como protésica.88Antes no se creía que el microorganismo pro­ dujera gastroenteritis, pero debido a su sensibilidad a la cefalo­ tina y su falta de crecimiento a 42 °C, es posible que no se lo aísle en los laboratorios clínicos donde se utilizan medios selectivos y un aumento de las temperaturas de incubación como un cribado para C. jejuni; por lo tanto, no se conoce su papel etiológico en esta infección.127 C. fetus subespecie venerealis. C. fetus subespecie venerealis constituye parte de la flora normal del tracto genital de los toros, pero no ha sido asociado con infecciones en humanos.283 C. helveticus. C. helveticus es un Campylobacter catasala nega­ tivo y termóñlo que ha sido aislado en las heces de gatos y perros domésticos.292 Cabe destacar el hecho de que casi el

Recuadro 8-2

Técnica de filtro por m em brana de S teele y M cD erm ott

1. Mezclar 1 g de heces en 10 mL de solución salina estéril que contenga cuentas de vidrio. Utilizar mezclador eléctrico durante 30 segundos. 2. Colocar un filtro de membrana de triacetato de celulosa de Gelman 0.45 de 47 mm (Gelman 63069) centralmente sobre la superficie de una placa de agar para Brucella no selectivo que contenga agar sangre de camero al 5%. 3. Colocar 8 a 10 gotas de suspensión de heces sobre la superficie del fil­ tro con una pipeta de Pasteur. Tenga cuidado de que las gotas no se extiendan hasta el borde del filtro. 4. Retirar el filtro y esperar 30 minutos después de aplicar la suspensión. 5. Incubar la placa en medioambiente Campy como ya se describió.

378

Características diferenciales de campilobacterias y taxones relacionados de importancia clínica

M IC R O O R G A N ISM O

CATALASA NITRATO

SULFURO DE HIDRÓGENOACETATO TRIPLE AZÚCARDE HIERRO UREASA INDOXILO HIPURATC

CRECIMIENTO

SENSIBILIDAD*

Mac­ Conkey

TMAO al 0,1%

NaCl al 1,5%

+ + V + +

ND -

+ ND I V

25 °C

37 °C

42 °C

+ +

+ + + + +

+ C V -

V

+ + +

V + +

V +

ND +

ND ND

+

+

V

ND

ND

+ + + + + + +

+ D + + D V

+ + +

+

C

Glicina al 1%

Ácido nalidíxico

Cefalotina

G rupo RNA I

+ + V

+ + + + +

+ + -

-

V -

-

-

-

+

+ + +

+

-

V +

-

_

_

_

C. hyointestinalis subespe­ cie lawsonii

+

+

+

_

_

_

C. jejuni subespecie jejuni

+ V + +

+ + 4+ + +

+ + + +

+ +

-

+ V

+ + -

_

_

_

_

_

_

_

+

-

-

-

-

Campylobacter coli C. concisus C. curvus C. fetus subespecie fetus C. fetus subespecie venerealis C. gracilis C. helveticus C. hyointestinalis subespe­ cie hyointestinalis

C. jejuni subespecie doylei C. lar i C. mucosalis C. rectus C. showae

+ V

-

-

C. sputorum biovariedad bubulus

-

C. sputorum biovariedad fecalis

+

+

+

_

C. sputorum biovariedad sputorum

-

+

+

-

-(d )

+

-

-

C. upsaliensis

+

C

-

+

V

R

C

R

R

+ +

C V V

S S S

+ V +

V R

S s s

V

R

s

V S

R

+

+ + +

R

R

C

C

C

C

ND

ND

ND

ND

V S

_

+

+

+ V +

R

S S S S

+

+

+

+

+

R

s

+

+

+

C

+

+

V

s

+

+

-

-

-

C

S

s

_

_

-

_

-

\

s

s

CAPÍTULO 8 Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

Cuadro 8-4

Cuadro 8-4

Características diferenciales de campilobacterias y taxones relacionados de im portancia clínica (cont.)

M IC R O O R G A N ISM O

SU LFU R O DE H ID R Ó G EN O TR IPLE A ZÚ C A R H IER R O UREASA

C R E C IM IEN T O ACETATO DE IND O X ILO HIPU R ATO

SEN SIB IL ID A D *

25 °C

37 °C

42 °C

Mac­ Conkey

TMAO al 0,1%

NaCl al 1,5%

Glicina al 1%

Ácido nalidíxico

Cefalotina

+

+

V

+

ND

V

+

V

R

+

+

-

-

-

+

-

V

R

+

+

-

-

ND

+

-

S

S

+

+

V

-

ND

-

V

S

V

-

+

-

-

-

-

+

S

S

+

-

-

-

-

+

S

S

+

-

+

+

ND

ND

ND

+

S

R

-

+

+

ND

-

ND

ND

S

R

CATAI.ASA

N ITRATO

-(d )

+

-

-

+ +

+ +

+

A. nitrofigilis

+

V

-

A. skirrowii

+

+

-

-

+

+

+

-

-

C

-

-

-

G rupo RNA 11

Arcobacter butzleri A. cryaerophilus

+

G rupo RNA III

Helicobacter cinaedi

H. fennelliae (CLO-2)

+

CLO-3

+

H. pullorum

+

-

-

H. pylori

+

++

-

-

+

C

-

-

ND

V

R

S

Especies de Helicobacter cepa flexispira

C

++

-

-

+

+

ND

ND

ND

-(d )

R

R

+

+

*Sensibilidad a los antibióticos determinada con discos de 30 pg. 90% o más de las cepas son negativas; V: variable, 11-89% de las cepas son positivas; + + : reacción positiva fuerte; D: reacción débil; ND: resultados no disponibles; C: resultados contradictorios en la bibliografía; R: resistente; S: sensible; TMAO : óxido de trimetilamina. Datos tomados de las referencias * “>■'imm.v,,¡5.n 5.172.245.25t.26 i.275.292.29i.313.3 n.no.m_ +: 90% o más de las cepas son positivas;

Clasificación de Cam pylobacter y taxones relacionados

(CLO-1)

379

380

C A P ÍT U L O 8

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

50% de las cepas de Campylobacter halladas en gatos pertene­ cen a C. helveticus?9 Las colonias de C. helveticus son adherentes en agar sangre y pueden ser separadas de otras especies termófilas (C. jejuni, C. coli y C. lari) en virtud de una reac­ ción de catalasa negativa. La prueba de acetato de indoxilo es positiva y la bacteria es sensible al ácido nalidíxico y a la cefa­ lotina. C. hyoilei. C. hyoilei es el nombre para un grupo de bacterias similares aisladas en las lesiones intestinales de cerdos afecta­ dos por enteritis proliferativa.8 No se han comunicado cepas humanas. C. hyointestinalis. C. hyointestinalis, estrechamente relacionado con C. fetus subespecie fetus, fue hallado al principio sólo en animales, sobre todo como causa de ileítis en cerdos,110 pero hace poco se ha informado en muestras clínicas humanas. En una comunicación, se aisló C. hyointestinalis de muestras de heces de cuatro personas, con diarrea acuosa no sanguinolenta. La persona más joven (8 meses) y la más anciana (79 años) fue­ ron mujeres; los otros dos fueron varones homosexuales.80 Se ha comunicado en Francia el caso de una mujer de 52 años con leucemia mieloide crónica y diarrea acuosa no sanguinolenta asociada con este microorganismo,220 y el aislamiento del mis­ mo en un varón homosexual con proctitis en los Estados Unidos.90 C. hyointestinalis no se aísla en muchas fórmulas de medios para Campylobacter porque es sensible a las cefalosporinas, como cefalotina y cefoperaxona. Aunque crece a 42 °C, el crecimiento es más exuberante a 35 °C.90 El microor­ ganismo también es resistente al ácido nalidíxico, es hipurato negativo y produce sulfuro de hidrógeno en agar triple azúcar hierro. La producción de sulfuro de hidrógeno en agar triple azúcar hierro depende de la prueba que se incuba en un medioambiente microaerófilo que contiene hidrógeno.110 Se describió un grupo de microorganismos “similares a C. hyointestinalis’, obtenidos de estómagos porcinos. Estas cepas son suficientemente diferentes de C. hyointestinalis como para justificar la creación de una clasificación separada de las subespecies, C. hyointestinalis subespecie lawsonii.245 La creación de esta nueva subespecie requiere corregir la descripción de C. hyointestinalis a C. hyointestinalis subespecie hyointestinalis. C. hyointestinalis subespecie lawsonii puede ser separada de la subespecie hyointestinalis por su falta de crecimiento en bilis al 1,5%. C. hyointestinalis subespecie lawsonii ha sido aislado en el intestino y el estómago de cerdos; los intestinos de háms­ teres y las heces de vacas, ciervos y seres humanos; pero su patogenicidad no se conoce.245 C. jejuni subespecie doylei. Se ha aislado una nueva subespecie de C. jejuni de muestras clínicas humanas que incluyen biopsias de epitelio gástrico166 y heces de niños con diarrea.296 La patogenicidad del microorganismo sigue siendo desconocida. C. jejuni subespecie doylei puede distinguirse con facilidad de otras campilobacterias porque no reduce los nitratos ni hidroliza el hipurato.296 Es sensible a la cefalotina y, por lo tanto, no se aísla en medios que contienen antibióticos tipo cefalosporinas. C. lari. Antes llamado C. laridis, el microorganismo conocido ahora como C. lari es termófilo, halotolerante y resistente al ácido nalidíxico; por otra parte, comparte varias características con C. jejuni y C. coli.2*2 El crecimiento anaerobio en presen­ cia de óxido de trimetilamida (TMAO) al 0,1% y la falta de hidrólisis de acetato de indoxilo ayudan a identificar esta espe­ cie (reactivos disponibles en Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Muchos laboratorios se basan sobre la resistencia al ácido nalidíxico para separar C. lari de C. jejuni y C. coli; sin embargo, se está observando C. jejuni resistente al ácido nali­

díxico con mayor frecuencia. C. lari es endémico en gaviotas marinas, pero es un patógeno humano infrecuente. Sin embar­ go, en ocasiones, produce enteritis que simula las infecciones por C. jejuni y pocas veces, bacteriemia, sobre todo en perso­ nas inmunodeprimidas.21-58-209'230'306 C. mucosalis. C. mucosalis, antes clasificado como C. sputorum subespecie mucosalis, produce un pigmento amarillo y es catalasa negativo. Desde el punto de vista fenotípico, es muy similar a C. sputorum biovariedad sputorum y bubulus pero es capaz de crecer a 25 °C. A diferencia de la mayoría de las cam­ pilobacterias, esta especie necesita hidrógeno y formato como dador de electrones para su crecimiento, un requerimiento esencial de C. concisus, C. mucosalis, C. curvus y C. rectus.317 Figura y cois.92 comunicaron lo que se pensó que fue el primer aislamiento de C. mucosalis de niños con enteritis. No obstan­ te, este hallazgo ha sido discutido y se ha demostrado median­ te estudios de sonda molecular que las cepas eran C. conci.víí.y.1*6, 188,242 Es difícil separar estas dos especies sobre la base de pruebas bioquímicas solas y se ha sugerido que se deben utilizar métodos moleculares para su identificación precisa.188 On242 propuso el uso de varios medios que contienen distintos agentes inhibidores para separar C. concisus y C. mucosalis. Hasta ahora no existe ninguna comunicación confirmada que asocie C. mucosalis con infección humana. C. showae. C. showae es una especie recién descrita aislada de los surcos gingivales humanos.84 Es un bacilo recto con extre­ mos redondeados que contiene dos a cinco flagelos unipolares sin vaina, característica singular entre las campilobacterias. El microorganismo crece en una atmósfera microaerófila en pre­ sencia de fumarato con formato o H2, pero prefiere crecer en condiciones anaerobias. Debido a la cantidad limitada de ras­ gos bioquímicos confiables que se pueden utilizar para dife­ renciar las especies de Campylobacter estrechamente relacio­ nadas, pueden ser necesarias pruebas serológicas o molecula­ res o perfiles proteicos para identificar positivamente esta espe­ cie.84 No se ha demostrado una asociación con ninguna enfer­ medad humana. C. sputorum. C. sputorum es capaz de crecimiento anaerobio y puede ser aislado de la cavidad bucal y de los surcos gingiva­ les de los seres humanos. Si bien no se lo reconoce como agen­ te de enfermedad humana, se han informado algunas cepas clí­ nicas. Se describen tres biovariedades: C. sputorum biovarie­ dad bubulus, C. sputorum biovariedad sputorum y C. sputorum biovariedad fecalis.269 C. upsaliensls. C. upsaliensis es catalasa negativo o sólo débil­ mente positivo y por lo tanto se la ha denominado cepa CNW de Campylobacter. Sin embargo, como pueden ocurrir tam­ bién reacciones catalasa débiles para C. jejuni subespecie doy­ lei, ya no se mantiene la designación CNW. A excepción de la falta de producción de catalasa o por su producción débil, este microorganismo comparte varias características con campilo­ bacterias patógenas. Es termófilo (crece a 42 °C) y altamente sensible a los fármacos presentes en medios de aislamiento se­ lectivos, lo que los vuelve inapropiados para el aislamiento de C. upsaiensis.291 Goossens y cois.116 informaron el aislamien­ to de 99 cepas de C. upsaliensis mediante el método del filtro y sólo se recuperaron cuatro cepas simultáneamente de medios selectivos. Los animales domésticos pueden servir como reservorio de esta especie, aislada por primera vez de perros sanos, perros con diarrea y, más tarde, de gatos asintomáticos.102276 Los datos provenientes de algunos informes indican que puede ser un agente oportunista de infecciones en los niños. Lastovica y cois.187 comunicaron la recuperación de C. upsaliensis de

C la s ific a c ió n de C am pyloba cte r y ta x o n e s re la c io n a d o s

■ kw ruhivos de 16 pacientes, 10 de los cuales tenían 10 meses ae edad o menos. Walmsley y Karmali326 comunicaron su aisK á n t o de las deposiciones de seis niños. Otros informes asoel aislamiento de Campylobacter upsaliensis de la sanie pacientes con enfermedad subyacente grave.43,60 Existe B imi . ~ unicación de C. upsaliensis aislado en la sangre y el _i fetoplacentario de una mujer embarazada de 18 semal t ^ aae sufrió un aborto espontáneo.120 La paciente no tenía - p B n a enfermedad subyacente y su único embarazo previo no l'lta* . mplicaciones. El análisis numérico de los perfiles proElkLi- :s puso en evidencia que las cepas aisladas en la paciente y =i pato doméstico sano eran casi idénticas, lo que implicó ■nc ; pato podría haber sido la fuente de la infección.120 La :omunicación de C. upsaliensis en un sitio distinto de la I b e t ; o las heces fue la de un caso de un absceso mamario en H | r_al se aisló C. upsaliensis junto con una especie de W TM rrtptococcus en el exudado purulento obtenido por aspik á Ó D con aguja fina del sitio infectado.109 Sandstedt y ‘ s - describieron a C. upsaliensis, incluidas sus caractetfak as renotípicas y su importancia clínica. 3 ESPECIES DE WOLINELLA Y BACTEROIDES INCLUIDAS E* :LIA CAMPYLOBACTERIACEAE

__".er y cois., en sus estudios de la taxonomía de los baci­ l a tranmegativos anaerobios que deprimen el agar colocaron h i cepas inmóviles en el género Bacteroides y a las cepas ü é Oes en el grupo de “vibriones anaerobios” (que incluyen WÉ¿jr€¡la ecta, W. cun’a y Campylobacter concisus).304-305 Las l a p e inmóviles son separadas sobre la base de la producción a; _rr^sa en B. ureolyticus (ureasa positivo) y B. gracilis (ure­ as»! "rpativo; véase cuadro 8-5). Todas estas especies están ¡■Judas ahora en la familia Campylobacteriaceae y se las M ra d era verdaderas campilobacterias.317-320 I gracilis. El nombre Bacteroides gracilis fue propuesto por - i r r rr y cois.304 para un grupo de bacterias que corroen el : aear :riginariamente consideradas anaerobias. En 1995, ■■■iamme y cois, propusieron la transferencia de este micro■eam sm o al género Campylobacter como C. gracilis.316 Estas lanerías se encuentran en los surcos gingivales de seres f ?s y han sido aisladas primariamente de sitios de infecI c»:r usular profunda. Johnson y cois, informaron que el 83% fe Lis muestras en las cuales se aisló C. gracilis se obtuvieron pa^emes con infecciones viscerales graves o de cabeza y cue­ l a . - C. gracilis es microaerófilo y asacarolítico y se asemeja ■ I k ; ampilobacterias en casi todas las características fenotípKas Las células individuales se tiñen como gramnegativas y m i pequeñas y no ramificadas, y a menudo tienen extremos _ r :: aguzados como redondeados. El crecimiento es estimuU : en cultivos de caldo por el formato y el fumarato. Pueden diferenciados de otras campilobacterias por la ausencia de B á s e lo s y de actividad de oxidasa.304 Las cepas de C. gracilis rur;:en menos sensibles a los antibióticos que las especies fcrecham ente relacionadas [B. ureolyticus], y se ha comuniotic que sólo el 67% son sensibles a la penicilina.155 Se desun medio selectivo para el aislamiento de C. gracilis —r contiene base de agar tripticasa soja, formato, fumarato, ■Bato y dos agentes selectivos: ácido nalidíxico y teicoplaw

;j

-* *

ja rs ro id e s ureolyticus. El análisis de secuencia de RNA ribosó-

t^ ;: ubica claramente a [£. ureolyticus] como miembro de la dic^iia Campylobacteraceae', sin embargo, no está claro si se ::ica fuera del grupo Campylobacter (y debe ser colocado m on género nuevo) o dentro de él (y debe ser incluido en el

381

género Campylobacter).316 [ií. ureolyticus] difiere de las cam­ pilobacterias en su composición de ácidos grasos, su metabo­ lismo proteolítico y su capacidad para hidrolizar la urea.316 Se han aislado cepas de [B. ureolyticus] en pacientes con úlceras superficiales, infecciones de tejidos blandos, uretritis no gonocócica no producida por clamidias y enfermedad periodontal.76-77-95-96 En un estudio de Johnson y cois, se observó que las cepas de | ti. ureolyticus] eran uniformemente sensibles a peni­ cilinas, cefalosporinas, eritromicina, clindamicina, cloranfenicol, metronidazol y aminoglucósidos.155 C. curvus. C. curvus fue denominado originariamente Wolinella curva.305,320 Las células se tiñen como gramnegativas, son cor­ tas y ligeramente curvas. También pueden presentarse células helicoidales o rectas. Las cepas muestran una motilidad rápida en “saeta” y son asacarolíticas. El microorganismo crece en condiciones anaerobias y en atmósferas de 0 2 al 5% que con­ tienen H2. N o ocurre ningún crecimiento en aire enriquecido con CO, al 10%. Todos los cultivos necesitan formato y fumarato para el crecimiento en caldo. Algunas cepas muestran una morfología de corrosión en medios de agar. Las cepas fueron aisladas exclusivamente de fuentes humanas e incluyen con­ ductos radiculares dentales, absceso alveolar y sangre.305 En el cuadro 8-5 se presentan las características que permiten distin­ guir C. curvus de especies similares. C. rectus. C. rectus fue denominado originariamente Wolinella recta.304-320 Desde el punto de vista microscópico, las células aparecen pequeñas y rectas con extremos redondeados y se tiñen como gramnegativos. Las cepas muestran motilidad rápi­ da en saeta y son asacarolíticas. El crecimiento es anaerobio; sin embargo, algunas cepas pueden crecer en una atmósfera de O, al 5% pero no en aire enriquecido con CO, al 10%. El cre­ cimiento en caldo es estimulado por formato y fumarato. Los nitratos y nitritos se reducen, y tanto oxidasa como catalasa son negativas. En el cuadro 8-5 se detallan otras característi­ cas de identificación. C. rectus se encuentra en los surcos gin­ givales de los seres humanos.304Spiegel y Telford291 comunica­ ron el aislamiento de este microorganismo junto con Actinomyces viscosus de un masa actinomicótica de la pared torácica. Se ha aislado C. rectus en dos pacientes del University of Illinois Hospital, en uno de ellos, con anteceden­ tes de 18 años de alcoholismo y de 8 meses de dolor torácico derecho, se aisló en un nodulo pulmonar, y en el otro paciente, con una masa pulmonar, se aisló en un hemocuitivo. Género Arcobacter

Las especies de Arcobacter son aerotolerantes; crecen en presencia de niveles atmosféricos de oxígeno.244 Otras caracte­ rísticas útiles para distinguir las especies de “Campylobacter” aerotolerantes de otros campilobacteres son hidrólisis de aceta­ to de indoxilo, crecimiento a 15 °C, 25 °C y 36 °C pero no a 42 °C y la incapacidad para hidrolizar hipurato (véase cuadro 8-4). Vandamme y cois, han mostrado que los arcobacteres pueden ser separados en cinco grupos principales, que fueron identificados mediante datos de hibridación de DNA-DNA como A. cryaerophilus (dos subgrupos distintos), A. butzleri, A. nitrofigilis y A. skirrowii.322 A. cryaerophilus. A. cryaerophilus (antes C. cryaerophila) crece bien en condiciones aerobias, aunque puede requerir condicio­ nes microaerófilas para el aislamiento inicial. El crecimiento óptimo ocurre a 30 °C y el microorganismo no crece a 42 °C. Desde el punto de vista bioquímico, esta especie se asemeja a C. fetus subespecie fetus-, sin embargo, A. cryaerophilus es ace­ tato de indoxilo positivo, mientras que C. fetus subespecie/eíwí

382

C A P ÍT U L O 8

C uadro 8 -5

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

Características útiles para diferenciar Campylobacter curvus, C. Rectus, C. gracilis, [Bacteroides ureolyticus] y Wolinella succinogenes

CARACTERÍSTICA

C. C U R V U S

C. R E C T U S

C. G R A C IL IS

[B. U R E O L Y T IC U S]

W. SU C C IN O G E N E S

Clínica humana

Clínica humana

Clínica humana

Clínica humana

Rumen bovino

Predominan células curvas o helicoidales

+

-

-

Predominan células rectas

-

+

+

+

-

Células con extremos aguzados

+

-

-

-

+

Motilidad

+

+

-

Ureasa

-

-

-

+

Crecimiento en glicina al 1%

+

+

ND

ND

Hidrólisis de acetato de indoxilo

+

+

V

ND

Fuente Morfología

+

+ -

+ : 90% o más de las cepas son positivas; -: 90% o más de las cepas son negativas; V: variable, 11% a 89% de las cepas son positivas: ND: resultados no disponibles. Modificado de Tanner ACR, Listgarten MA. Ebersole JL: Wolinella curva sp. nov.: “Vibrio succinogenes" o f human origin. Int J Syst Bacteriol 34:275-282, 1984.

no lo es (véase cuadro 8-4). La mayoría de las cepas son sensi­ bles al ácido nalidíxico y resistentes a la cefalotina. En una comunicación de Borczyk y cois.30 que comparó el crecimien­ to de A. cryaerophilus en CMS, agar sangre de Skirrow y agar cefsulodina-irgasán-novobiocina (CIN), se observó que el cre­ cimiento más abundante se obtenía en agar CIN incubado durante 24 a 48 horas a 25 °C y 36 °C. Se han aislados micro­ organismos semejantes a A. cryaerophilus en las heces de un hombre infectado por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) con diarrea intermitente; sin embargo, luego se observó que esta cepa era A. butzleri.30im A. nitrofigilis. A. nitrofigilis (antes Campylobacter nitrofigilis) es una especie criófila que crece en condiciones óptimas a 25 °C. Es urea positivo y no patogénico para los seres hu­ manos. A. butzleri. Kiehlbauch y cois, en los CDC172 han comunicado que las cepas de campilobacterias aerotolerantes no confor­ man un grupo homogéneo. La mayoría de las cepas aisladas en humanos, tanto estadounidenses como de otros países, for­ man un grupo distinto por homología de DNA al que deno­ minaron Campylobacter butzleri (que se ha cambiado a Arcobacter butzleri luego de la aceptación de la designación del nuevo género para este grupo de microorganismos).322 Las cepas de A. butzleri pueden ser separadas de A. cryaerophilus demostrando aerotolerancia tanto a 30 °C como a 36 °C (A. cryaerophilus es aerotolerante a 30 °C pero no a 36 °C). Además, A. butzleri crece en agar de MacConkey y en medios que contienen glicina y nitrato (y reduce nitrato a nitrito) y en NaCI al 1,5% y al 3,5%. A. cryaerophilus da las reacciones opuestas.172 La mayoría de las cepas de A. butzleri aisladas en seres humanos se obtuvieron de deposiciones diarreicas;172’195-321 sin embargo, el microorganismo pocas veces fue aislado del contenido abdominal, líquido peritoneal y sang r e 172,332

A. skirrowii. A. skirrowii es la especie descrita más nueva de Arcobacter. Las cepas se han aislado principalmente de los líquidos prepuciales de toros y algunas de fetos abortados y heces diarreicas de vacas, cerdos y ovejas. No se ha estableci­ do la importancia clínica de esta nueva especie.

Género Helicobacter

(Los nombres propuestos que no han sido validados por el Comité Internacional sobre Bacteriología Sistemática están encerrados entre comillas). El género Helicobacter comprende 23 especies validadas for­ malmente. Las especies de Helicobacter son microaerófilas estrictas con una morfología espiralada o helicoidal. Muchas especies muestran una actividad de ureasa fuerte. La cepa “fle­ xispira” de las especies de Helicobacter (antes “Flexispira rappini”) es el nombre propuesto para un microorganismo relacio­ nado estrechamente con Helicobacter pero que tiene forma de cigarro más que curva y fusiforme. Las especies incluidas en los géneros Helicobacter tienen flagelos con vaina. Ninguna especie de Campylobacter o de Wolinella los tiene (véase cuadro 8-1). H. PYLORI

Esta especie fue denominada inicialmente Campylobacter pyloridis y luego Campylobacter pylori. El análisis molecular proporcionó pruebas que mostraron que este microorganismo no pertenece al género Campylobacter,115 Las características que lo distinguen de las campilobacterias son sus múltiples fla­ gelos con vaina, su fuerte hidrólisis de la urea y su perfil sin­ gular de ácidos grasos (un alto porcentaje del ácido 14:0, un bajo porcentaje del ácido 16:0 y la presencia del ácido 3-OH18:0). La secuenciación del rRNA 16S ha demostrado que está estrechamente relacionado con Wolinella succinogenes. Sin embargo, existen muchas diferencias bioquímicas y de creci­ miento entre H. pylori y W. succinogenes que indican que estas especies no deben ser del mismo género. W. succinogenes es catalasa negativo, ureasa negativo, no tiene actividad de y-glutammiltranspeptidasa ni de fostatasa alcalina, y no crece a 30 °C ni en glicina al 0,5%; H. pylori tiene las características opuestas. H. pylori se encuentra sólo en las células epiteliales mucosecretantes del estómago. Las pruebas sugieren que es el agen­ te causal de la gastritis antral crónica activa207 y un factor importante en la patogenia de la enfermedad ulcerosa pépti-

C la s ific a c ió n de C am pyloba cte r y ta x o n e s re la c io n a d o s

í l ^ Además, existen pruebas firmes de que está relacionado ■BK los adenocarcinomas gástricos y con el desarrollo del fin­ i r - . nc Hodgkin gástrico.250,288 La gastritis por H. pylori está fc iü i-d a en muchos países del mundo y puede ser una de las inscciones humanas crónicas más frecuentes. La definición ¡ei H pylori como agente causal de la úlcera duodenal sigue ñ l : :ontroversial. Para excelentes revisiones, véase el trabac je 3 i-ser,25 Buck36 y Dunn y cois.78 Lis .'epas de H. pylori son microaerófilas (CO, al 10%, O, _ f N; al 85%) y también crecen en el aire con mayor conE3D: de C 0 2 (10%). La temperatura óptima para el aisla■KBtc es de 35 °C a 37 °C, aunque algunas cepas crecen a -I T También se ha observado que la humedad elevada favo■ x el crecimiento. La mayoría de las cepas tardan 3 a 5 días a —ecer y algunas requieren 7 días de incubación antes de que c --en e el crecimiento. Pueden cultivarse en medios no ■¿ecnvos que contienen sangre y producen pequeñas colonias p s e s y translúcidas. La tinción de Gram característica (bacic s rícueños, curvos y ligeramente pletóricos) y reacciones p«mvas para catalasa, oxidasa y ureasa proporcionan una KKificación. ~ A 3 ESPECIES DE HELICOBACTER O í IMPORTANCIA CLÍNICA

>r han aislado varias especies de Helicobacter distintas de sL pylori de seres humanos y se asocian con enfermeOtL ~‘-'r 288 Estas especies son H. cinaedi, H. fennelliae, H. mmodensis, H. canis, H. winghamensis, H. pullorum, especies a; Helicobacter cepa “flexispira” (“Flexispira rappini"), H. u manni (“Gastrospirillum hominis”) y las especies de

1 .3 dTO 8-6

Helicobacter sin nombre CLO-3 (véase cuadro 8-6).97-215'288-293 H. cinaedi. H. cinaedi, originariamente designado como CLO-1. antes conocido como “Campylobacter cinaedi", ha sido aisla­ do de hisopados rectales tomados de varones homosexuales sintomáticos y asintomáticos.91,313 También se lo describió como causa de bacteriemia en dos varones homosexuales con tuberculosis concurrente,254 en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA)61,70,273 y en otro que era HIV seropositivo pero no tenía SIDA.236 Sin embargo, los informes sugieren que las infecciones por C. cinaedi no están limitadas a varones homosexuales o bisexuales. Por ejemplo, Vandamme y cois.319comunicaron el aislamiento de H. cinaedi en la sangre de dos mujeres sin ningún registro de contacto sexual con hombres homosexuales y en las deposiciones de tres menores, dos de ellos niñas. Orlicek y cois, informaron un caso de septicemia y meningi­ tis causado por H. cineadi en un recién nacido.246 Como H. cinaedi ha sido identificado como habitante intestinal normal de hámsteres111,299 y la madre del recién nacido tuvo hámsteres domésticos durante los dos primeros trimestres del embarazo, es probable que hayan servido como reservorio para la trans­ misión del microorganismo a la madre y que el recién nacido se colonizara durante el parto.246 Kielbauch y cois, comunica­ ron que el espectro clínico de enfermedad asociado con la infección por H. cinaedi incluye fiebre, bacteriemia y celulitis recurrente, y la mayoría de los pacientes tienen signos de infec­ ción sistémica, como leucocitosis y a menudo trombocitopenia.173 Estos mismos autores informan que el tratamiento con penicilina, tetraciclina o aminoglucósidos puede ser más eficaz que con cefalosporinas, eritromicina o ciprofloxacina.173

Especies de H e lic o b a c te r y microorganismos relacionados

ESPECIES

I

383

H ocm onychis

HUÉSPEDES

SITIO DE AISLAMIENTO

Guepardos

Mucosa gástrica

i 3 . bilis

Ratones

Bilis, hígado, intestino

1 H. bizzozeronii

Perros

Mucosa gástrica

1 3 . canis

Perros, seres humanos

Heces

1 H cinaedi

Seres humanos, hámsteres

Sangre, hisopados rectales (seres humanos), intestinos (hámsters)

1 H felis

Gatos, perros

Mucosa gástrica

I H fennelliae

Seres humanos

Sangre, hisopados rectales Hígado, intestino

I H. hepaticus

Ratones

I H muridarum

Ratas, ratones

Intestino

1 H. mustelae

Hurones

Mucosa gástrica

I H. nemestrinae

Monos macacos de cola de cerdo

Mucosa gástrica

I H pam etensis

Aves salvajes (golondrina, gaviota), cerdos

Heces

Pollos, seres humanos

Intestinos, hígado (pollos), heces (seres humanos)

i HL pylori

Seres humanos, monos, gatos

Mucosa gástrica

I Especie de H elicobacter cepa flexispira

Ovejas, perros, seres humanos

Hígado (ovejas), estómago (perros), heces (seres humanos)

Guepardos, seres humanos

Mucosa gástrica

Seres humanos

Hisopados rectales

H pullorum

’H. heilm annii”

1 CLO-3

384

C A P ÍT U L O 8

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

Burman y cois, también han comunicado la asociación de lesiones cutáneas y artritis debidas a baeteriemia por H. cinaedi.3* La mayoría de las veces el aislamiento en sangre se logró con instrumentos de hemocuitivo automático después de 5 o más días de incubación. En general, los microorganismos no se observan en la tinción inicial de Gram del material de hemocultivo, pero se pueden visualizar mediante campo oscuro o tinción con naranja de acridina. tí. cinaedi crece sólo a 37 °C, muestra una resistencia intermedia a la cefalotina (disco de 30 ¡J.g) y reduce el nitrato a nitrito. Se pueden encontrar otras caracterís­ ticas genotípicas y fenotípicas en la comunicación de Kiehlbauch y cois.171 El único reservorio natural hasta ahora conocido de H. cinaedi es el tracto intestinal de los hámsteres, que puede servir como reservorio de infecciones humanas.111,299 H. fennelliae. Designado originariamente CLO-2 y antes cono­ cido como ‘‘Campylobacter fennelliae”,313 este microorganis­ mo tiene el olor característico de los polvos de limpieza de hipoclorito.91 Es sensible a la cefalotina y no reduce los nitra­ tos a nitrito. Como sucede con H. cinaedi, H. fennelliae se ha aislado en hisopados rectales de varones homosexuales sinto­ máticos y asintomáticos.91 Existe una comunicación de este microorganismo aislado de la sangre de un hombre bisexual de 31 años con antecedentes de abuso de drogas intravenosas y serología positiva para HIV.236 CLO-3. Especie sin nombre descrita originariamente por Fennell y cois.,91 CLO-3 puede ser separado de los otros CLO por su capacidad para crecer a 42 °C, su resistencia a la cefalotina y su incapacidad para reducir el nitrato (véase cuadro 8-4). Se ha ais­ lado en el hisopado rectal de un varón homosexual sintomático.91 Especie de Helicobacter cepa ílexispira ( “Flexispira rappini ”). Es­ pecie de Helicobacter cepa “flexispira” (antes “Flexispira rap­ pini'') es el nombre propuesto35 para un microorganismo que es ureasa positivo y posiblemente muy relacionado desde el punto de vista genómico con H. pylori.320 Sin embargo, es un micro­ organismo recto no espiralado y fusiforme, con una superficie corrugada debido a la presencia de fibras periplasmáticas. Tiene múltiples flagelos bipolares. No tiene fosfatasa alcalina ni crece a 30 °C pero sí a 42 °C y es resistente al metronidazol (5 |Xg), mientras que H. pylori tiene las características opues­ tas.115 Se separa de las campilobacterias por las reacciones negativas para catalasa y nitrato y la incapacidad para crecer en glicina al 1%.14La especie de Helicobacter cepa “flexispira” ha sido aislada en muestras de heces de seres humanos con sínto­ mas de gastroenteritis y en hemocultivos, en deposiciones de perros14'268 y en fetos abortados de ovejas.175-176-268’289-309 “Helicobacter heilm annii” ( “Gastrospirillum hominis”). "Helico­ bacter hielmannii" es una bacteria espiralada no cultivada que se encuentra en la mucosa gástrica humana y es más grande y más apretadamente espiralada que H. pylori. El microorganis­ mo es helicoidal, tiene 3,5-7,5 fm de longitud y 0,9 |i m de diá­ metro con extremos truncados aplanados en las puntas, seis a ocho espirales y hasta 12 flagelos con vaina de 28 nm de diá­ metro en cada polo.212 McNulty y cois, propusieron el nombre “G. hominis”. Sin embargo, Solnick y cois.287 mostraron que “Gastrospirillum” es miembro del género Helicobacter y pro­ pusieron el nombre “H. heilmannii” en honor de Konrad Heilmann, histopatólogo alemán que describió la primera serie grande de pacientes infectados por el microorganismo.128 Heilmann y Borchard informaron que la prevalencia de infec­ ción por “Gastrospirillum" en pacientes que se presentaron para la endoscopia era inferior al 1%.128 “H. heilmannii" pare­ ce ser ubicuo en animales domésticos, lo que sugiere que la infección humana puede adquirirse como zoonosis.75 100129 La infección humana por esta bacteria puede acompañarse por una

gastritis crónica similar a la observada con la infección por H. p y lo r i 72.94,128,192,212,222,286

ESPECIES DE HELICOBACTER NO HUMANAS

Algunas especies de Helicobacter han sido aisladas de ani­ males. Entre éstas están H. acinonychis,19 H. bilis,104 H. bizzozeronii,123 H. canis 294 H. felis,253 H. hepaticus,99 H. muridarum,193 H. mustelae,9*’103'115 H. nemestrinae34 y H. pullorum.40’293 En general, estas bacterias se encuentran en el estómago y el tubo digestivo bajo.101 Cuando están presentes en el estómago, suelen asociarse con gastritis en el animal huésped. Algunas de estas cepas también han sido aisladas en seres humanos (véase cuadro 8-6). OTROS BACILOS GRAMNEGATIVOS MICROAERÓFILOS W olinella succinogenes. Es la especie tipo del género Wolinella.

definida en la actualidad como anaerobia, catalasa negativa y sulfuro de hidrógeno positiva.304 Sin embargo, se ha demostra­ do que W. succinogenes es oxidasa positiva y capaz de utilizar 0 2 como aceptor terminal de electrones en condiciones microaerófilas (O, al 2%), pero no bajo niveles atmosféricos de O,. Estos hallazgos, junto con otras pruebas sobre el sistema de transporte de electrones, indican que W. succinogenes no es un anaerobio, sino un microaerófilo que requiere Hr 311 No ha sido asociado con infecciones humanas. Sutterella wadsworthensis. Wexler y cois, propusieron el nombre S. wadsworthensis para un grupo de bacterias identificadas ori­ ginariamente como C. gracilis pero que diferían en ca­ racterísticas genéticas y bioquímicas de las cepas de C. gracilis típicas.331 Estos microorganismos son bacilos rectos gramnega­ tivos que crecen en una atmósfera microaerófila o en condicio­ nes anaerobias. Se diferencian de C. gracilis y de las especies de Campylobacter por ser oxidasa negativos, ureasa negativos y acetato de indoxilo negativos; resistentes a discos de bilis al 20% y por no reducir el tetracloruro de tetrazolio en condicio­ nes aerobias. Han sido aislados principalmente de infecciones humanas del aparato gastrointestinal.331

Identificación definitiva de campilobacteres y bacterias relacionadas La morfología de las colonias y las características en la tin­ ción de Gram de C. jejuni según se describieron antes también corresponden a la mayoría de las otras especies de Campy­ lobacter. Sin embargo, la identificación definitiva de las espe­ cies depende de la determinación de las características fenotí­ picas presentadas en el cuadro 8-4 o cuando estas pruebas no proporcionan la identificación de una especie, las técnicas moleculares. La sensibilidad diferencial al ácido nalidíxico y la cefalotina puede ser útil para distinguir las especies más frecuentemente halladas de Campylobacter según el esquema del recuadro 8-3 si la cepa es sensible al ácido nalidíxico. Como las cepas clíni­ cas de C. jejuni y C. coli resistentes al ácido nalidíxico se en­ cuentran cada vez con mayor frecuencia, estas pruebas se han tomado menos útiles. Luechtefeld y Wang202 también observaron que la resistencia de C. jejuni al cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) es útil para distinguir C. fetus. La prueba para la hidrólisis de hipurato es de valor para separar C. jejuni de la especie estrechamente rela­ cionada C. coli. La mayoría de las cepas de C. jejuni hidrolizan

Id e n tific a c ió n d e fin itiv a de c a m p ilo b a c te re s y b a c te ria s re la c io n a d a s

= ecuadro 8-3

385

Identificación definitiva de las c am pilobacterias halladas con m ayor frecuen cia ÁCIDO NALIDÍXICO

CEFALOTINA

TTC*

HIDRÓLISIS DE HIPURATO

HIDRÓLISIS DE ACETATO DE INDOXILO

V

R

R

+

S

R

R

-

+ +

jeju n i subespecie jeju n i

I C coli C fetus subespecie fetu s

R

S

S

-

-

C lari

R

R

S

-

-

* TTC: cloruro trifeniltetrazolio.

t. hipurato a ácido benzoico y glicina.126El procedimiento rápidc de Hwang y Ederer para la hidrólisis de hipurato, descrito a i el capítulo 12, es apropiado para evaluar las cepas clínicas je especies de Campylobacter. Morris y cois.223 describen un ■étodo más sensible para detectar ácido benzoico utilizando cromatografía gas-líquido (GLC). Esta aplicación es una exten­ sión del procedimiento comunicado antes por Kodaka y cois..1'9 que utilizaron un medio de hipurato-formato-fumarato pora detectar no sólo hidrólisis de hipurato mediante GLC sino ombíén la utilización de formato y fumarato. Mills y Gherna219 describieron el uso de una prueba rápida pora detectar la hidrólisis de acetato de indoxilo por especies de ' ^ipylobacter. Algunos estudios han mostrado que todas las cepas de C. jejuni, C. coli, C. curvus, C. helveticus, C. rectus, C showae, C. upsaliensis, Arcobacter butzleri, A. cryaerophi. Helicobacter fennelliae hidrolizan el acetato de indoxilo, —entras que la mayoría de los otros campilobacteres son negar-.os. 35-219'243’261 Otras varias características bioquímicas y físi­ cas pueden ser útiles para separar las distintas especies de Campylobacter y similares a Campylobacter (véase cuadro 84 Una revisión extensa de los métodos de identificación para campilobacterias, helicobacterias y microorganismos relacioos ha sido publicada por On.243 ratificación rápida de campilobacteres a partir de colonias i -uestras de heces

En la mayoría de los casos la aparición de colonias pequeías. tostadas a grises y acuosas que tienden a aplanarse en agar -electivo para Campylobacter, y que muestran una forma en ~5" y una morfología en alas de gaviota características en la m ción de Gram y que son oxidasa y catalasa positivas, será suficiente para establecer el diagnóstico de campilobacteriosis en los pacientes con síndrome diarreico. Hodge y cois.136 recomiendan el uso de técnicas de inmunofluorescencia directa en el cribado rápido de muestras de heces de pacientes con síndrome diarreico agudo. Este enfoque tiene b posibilidad de eliminar las conjeturas involucradas en la interpretación de los frotis teñidos con Gram. Sin embargo, no sí dispone de reactivos comerciales.

prueba de identificación de cultivos de Campylobacter AccuProbe (Gen-Probe, Inc., San Diego, CA) se basa en una sonda de DNA que proporciona una identificación rápida de C. jejuni, C. coli y C. lari directamente de las colonias bacteria­ nas.310 La sonda es no radiométrica y está marcada con un éster quimioluminescente de acridinio. Las reacciones se leen en un luminómetro. MÉTODOS DE DETECCIÓN DIRECTOS

Se han creado inmunoanálisis enzimáticos para evaluar las propiedades de virulencia de C. jejuni y para la detección directa de antígeno de Campylobacter en muestras de heces (ProSpecT Campylobacter, Alexon-Trend, Inc., Ramsey, MN).134177 La prueba para Campylobacter ProSpecT que se comercializa es menos sensible que el cultivo (sensibilidad, 80% a 96% en los estudios publicados), pero es altamente específica para C. jejuni/C. co/¡.81134'312 El ensayo no produce reacciones cruzadas con C. upsaliensis', sin embargo, esta espe­ cie se encuentra pocas veces en el laboratorio clínico. Varios investigadores han ideado pruebas de PCR para la detección directa de especies de Campylobacter en muestras de heces.181’199,204 No obstante, antes de que puedan ser transferi­ das al laboratorio clínico, se necesita un procedimiento técni­ camente sencillo y práctico para la extracción de DNA de las muestras de heces que elimine los inhibidores de la PCR. Cultivo y aislamiento de Helicobacter pylori MUESTRAS PARA EL AISLAMIENTO DE H. PYLORI

Para el diagnóstico de gastritis asociada con H. pylori, la tin­ ción histológica y el cultivo de muestras de biopsia han sido considerados las pruebas de referencia (gold standard).18 Las muestras apropiadas incluyen las biopsias gástricas y duodena­ les. Las muestras deben ser frescas y su transporte no se debe diferir por más de 3 horas. Las muestras pueden mantenerse hasta durante 5 horas si se las almacena a 4 °C. El tejido debe mantenerse húmedo mediante el agregado de 2 mL o menos de solución isotónica estéril. PROCEDIMIENTO DE AISLAMIENTO

-'RUEBAS DIFERENTES DEL CULTIVO

Se han utilizado las pruebas de aglutinación del látex para la ientificación de especies de Campylobacter. Estas pruebas -‘ilizan colonias aisladas para identificar C. jejuni y C. coli rero no distinguen entre ambos.138,229 Su capacidad para identi­ ficar correctamente C. lari es variable. También se pueden utilizar sondas de ácidos nucleicos para la confirmación de especies de Campylobacter en cultivo.262 La

Moler las muestras en un molinillo de vidrio esmerilado brin­ da un crecimiento mayor que picar o frotar la muestra en una superficie de agar. El material debe inocularse en un medio de agar sangre no selectivo, como placas de agar infusión de encé­ falo y corazón para brúcelas (BHI) o agar tripticasa soja con el agregado de sangre de camero o caballo al 5%. Se observa esca­ so crecimiento en las placas comerciales de agar chocolate; por lo tanto, no se recomienda este medio. Como estas bacterias son sensibles a la cefalotina, H. pylori no crece en ningún medio

386

C A P ÍT U L O 8

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

selectivo que contenga cefalosporinas. Muchos laboratorios han tenido buenos resultados utilizando agar de Thayer-Martin modificado como medio selectivo para el aislamiento de H. pylori en cultivos mixtos. Las placas se incuban a 37 °C en un medioambiente microaerófilo y húmedo. En general, el creci­ miento se observa en 3 a 5 días. Los datos no publicados de los experimentos llevados a cabo en el Laboratorio de Microbio­ logía del University of Illinois Hospital se muestran en el cua­ dro 8-7. Debido al peligro de utilizar un jarro para anaerobios sin un catalítico, recomendamos el uso de la jarra Campy GasPak (columna 2 en el cuadro 8-7). El crecimiento ocurrió en la jarra Campy GasPak pero no en la Poly Bag con una mezcla de gases Campy (columna 4 en el cuadro 8-7), presumiblemen­ te porque el agua agregada al sistema anterior proporciona la humedad necesaria para el crecimiento. IDENTIFICACIÓN DE H. PYLORI

Las colonias de H. pylori son pequeñas, grises, translúcidas y débilmente (3-hemolíticas. La tinción de Gram pone en evi­ dencia bacterias gramnegativas curvas y de tinción pálida con formas en alas de gaviota y “U” características. Se puede hacer una identificación presuntiva con reacciones positivas para oxi­ dasa y catalasa, y una reacción de ureasa extremadamente rápi­ da (en minutos). En el cuadro 8-4 se mencionan otras caracte­ rísticas de identificación. PRUEBA DE UREASA EN BIOPSIA (PRUEBA CLO)

Una técnica más rápida, pero algo menos sensible y especí­ fica que las pruebas mencionadas, es la técnica de ureasa en biopsia (prueba CLO). En esta prueba, se introduce la muestra de biopsia mucosa en un medio que contiene urea y un colo­

Cuadro 8-7

rante sensible al pH. Si la muestra contiene ureasa, la urea se desdobla y el amoníaco resultante produce una elevación del pH y un cambio ulterior en el color del indicador. Esta prueba puede dar resultados falsos negativos cuando la presencia del microorganismo es muy escasa, o resultados falsos positivos si aparecen en la muestra otros microorganismos que desdoblan la urea.213 PRUEBAS NO INVASIVAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR H. PYLORI

La infección por H. pylori se puede diagnosticar mediante ensayos invasivos que requieren endoscopia (cultivo, tinción. PCR, prueba CLO) o mediante ensayos no invasivos en los cuales no es necesaria la endoscopia. En la última categoría se incluyen el método de la ureasa, la detección de antígeno y la serología. Método de la ureasa. Se describieron dos métodos de la ureasa. El primero, denominado prueba de la urea y el aire espirado, requiere que el paciente ingiera urea marcada con 14C disuelta en agua, seguido por la recolección de muestras de aire espira­ do que son analizadas para detectar la presencia de l4CO, a los 60 minutos. Un segundo método utiliza urea radiomarcada que contiene 15N.154 Después de su ingestión, la urea radiomarcada es degradada en amoníaco y dióxido de carbono por la ureasa de H. pylori en el estómago. El amoníaco se absorbe en la san­ gre y se excreta con la orina. Se evalúa la cantidad de [15urea], que refleja la magnitud de la infección por H. pylori. midiendo la abundancia y la tasa de excreción de 15N en amoníaco en la orina. Se comunica que la sensibilidad de la prueba de excre­ ción de 15NH4 es del 96% con una especificidad del 100% cuando se compara con los pacientes que eran H. pylori positi­ vos mediante cultivo y tinción de Gram.154

Comparación de los medios de cultivo y las condiciones atmosféricas para el crecimiento de H e lic o b a c te r p y lo r i CONDICIONES DE INCUBACIÓN* Jarra Campy GasPak

Jarra de anaerobiosis con catalítico

Poly Bag (mezcla Campy Gas)’

Aire atmosférico con C 0 2 al 5%

Muy buen crecimiento P-hemolítico

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Tripticasa soja con sangre de camero al 5% Muy buen crecimiento

Buen crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Infusión de cerebro y corazón con sangre de caballo al 5%

Muy buen crecimiento

Buen crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Chocolate (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD)

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Chocolate (GIBCO)

Colonias pequeñas

Colonias pequeñas

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Chocolate (recién preparado)

Colonias muy pequeñas

Colonias muy pequeñas

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Campy-BAR (de Blaser)

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

Sin crecimiento

MEDIOS DE AGAR Brúcela con sangre de carnero al 5%

Jarra de anaerobiosis sin catalítico Mejor crecimiento (3-hemolítico

*Todos los cultivos fueron incubados a 37 °C y leídos después de 5 días. f0 2 al 5%; C 0 2al 10%; N2 al 85%. Datos de K. Ristow; University o f Illinois Hospital, Chicago IL.

F ilo g e n ia de V ibrionaceae

In s c c ió n de antígeno. Existe un preparado comercial de enzi~ mmunoanálisis (ELISA) para la detección directa de antíreno de H. pylori en muestras de heces para utilizarlo en el i -gnóstico y el seguimiento (Premier Platinum HpSA, '•'r-.dian Bioscience, Cincinnati, OH). Algunos estudios han -• -irado que la prueba de sensibilidad es aproximadamente x . 59% y la especificidad, 94% a 95%.205-221 y r'odos serológicos. Las pruebas serológicas para detectar anti. -rrpos contra H. pylori se han utilizado principalmente para es■dios epidemiológicos, pero también pueden utilizarse para ::c:rolar la eficacia del tratamiento. El formato principal es la ^raeba ELISA para la detección de IgG, aunque existen pruebas je aglutinación del látex. También se puede detectar IgA e IgM :t~: -on menos útiles desde el punto de vista del diagnóstico. Un arociema intrínseco es establecer un valor basal de positividad i c o que. en ciertas poblaciones, la prevalencia de títulos eleva¿ k de anticuerpos es relativamente alta. En un estudio extenso ic reclutas del ejército, Smoak y cois.285 observaron una tasa de pcsm :dad global del 26,3%. Esta tasa aumentó del 24,0% en el h ^ jo de 17 a 18 años al 43% en el grupo de 24 a 26 años. La kpcpositividad para los negros fue del 44%, para los hispanos, á d } ' :i y para los blancos, del 14%.

DECISIÓN DE LAS PRUEBAS INVASIVAS Y NO INVASIVAS EL DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR H. PYLORI

r_:ier y cois.68 evaluaron la precisión de varias pruebas para uñar la infección por H. pylori que incluyen la prueba de a ¡irsa y el aire espirado, la medición de las concentraciones de ■ e¡- jerpos de IgG e IgA en suero, y las muestras de biopsias es para la prueba CLO. histología y tinción de Warthinfcrry Estos autores observaron que la tinción de Warthin-Starry r a n la mejor sensibilidad y especificidad, aunque la prueba □ jO. la de la urea y el aire espirado y las concentraciones de IgG •» fueron estadísticamente diferentes para determinar el diag■taico correcto. Estos autores arribaron a la conclusión de que tai rr_eba de la urea y el aire espirado y la serología IgG no invaw *s s on tan precisas para predecir la condición de H. pylori en g r a n e s no tratados como las pruebas invasivas CLO y M tailnn-Starry. La ausencia de inflamación antral crónica exclu­ ye : :c precisión la infección por H. pylori.6* íe

. : jB a c te re s e n te ro h e p á tic o s

L¿ mayoría de los helicobacteres intestinales aislados de b e - numanos (p. ej., H. canadienses, H. cinaedi, H. fenneson ureasa negativos. La diferenciación entre estas heli•:n i::erias catalasa positivas y ureasa negativas de las campiH acterías entéricas similares a C. jejuni puede ser difícil. Los i r n :> de temperatura pueden ser útiles, ya que H. cinaedi y ^.fennelliae no crecen a 42 °C (C. jejuni y C. coli lo hacen). miejuni y C. coli también hidrolizan el acetato de indoxilo, ■ rnT ris que H. Cinaedi, no. H. pullorum puede distinguirse de Z L r sobre la base de su resistencia al ácido nalidíxico.

: - : ~E II: FAMILIAS O f VIBRIONACEAE • i-ROMONADACEAE” r xsn ia de Vibrionaceae El nombre Vibrionaceae fue propuesto originariamente por en 1965 con la intención de agrupar algunos bacilos

387

gramnegativos no entéricos fermentadores que eran oxidasa positivos y móviles por medio de flagelos polares. Este agrupamiento se hizo porque era conveniente al objetivo de dife­ renciar estos microorganismos de las enterobaeterias y no im­ plicaba siempre una relación taxonómica entre las especies incluidas. Los Vibrionaceae abarcaban en otra época cuatro gé­ neros: Vibrio, Aeromonas, Photobacterium y Plesiomonas. Sin embargo, en las últimas décadas distintos métodos para el aná­ lisis de ácidos nucleicos han revolucionado la taxonomía microbiana y han conducido a la reestructuración de esta fami­ lia a lo largo de líneas filogenéticas y el establecimiento de dos géneros nuevos: Listonella y Shewanella, y de una familia nueva: Aeromonadaceae,66-203.271 La ubicación filogenética correcta del género Plesiomonas sigue sin resolver. Género Vibrio

Las especies de Vibrio tienen tanto interés histórico como contemporáneo. V. cholerae es el agente etiológico del cólera asiático en los seres humanos, una enfermedad diarreica poten­ cialmente grave que ha sido un azote para la humanidad duran­ te siglos. Descrito por primera vez y nombrado por Pacini en 1854, fue aislado 32 años más tarde por Koch, que lo denomi­ nó “bacilo en coma” debido al aspecto curvo o en forma de coma característico de las células bacterianas individuales. Se han producido siete pandemias de cólera desde 18161817. La más reciente, causada por V. cholerae OL biotipo El Tor, comenzó en 1961 en Indonesia, se propagó rápidamente a Asia, Europa, Africa y el Pacífico Sur y alcanzó Sudamérica y América Central en 1991. Además, se han comunicado algunas epidemias menores de síndromes diarreicos e infec­ ciones extraintestinales causados por los serogrupos no 01 de V. cholerae y por varias especies halófilas descritas reciente­ mente en los Estados Unidos en varios estados de la costa del Golfo desde comienzos de la década de 1970.143162 La mayo­ ría de las infecciones ocurrieron después de la ingestión de mariscos contaminados y mal cocidos. También se informa­ ron infecciones de heridas luego de traumatismos al nadar o trabajar en aguas infectadas o por la exposición a animales marinos.143 El punto de este comentario es que los microbiólogos clíni­ cos deben tener presente la posibilidad de hallar especies de Vibrio en muestras de heces diarreicas y deben mantenerse informados sobre el modo de aislar e identificar las distintas especies. Quienes trabajan en laboratorios no costeros tienen menos posibilidades de encontrarlos que los que trabajan en hospitales de la costa del Golfo; no obstante, con los viajes por el mundo y el envío de mariscos a los mercados del interior, todos deben estar alertas. TAXONOMÍA

Las cepas de Vibrio cholerae aisladas en los casos clásicos de cólera pandémico se aglutinan en lo que se ha designado antisuero 01. Las cepas que no se aglutinan en este antisuero se denominan V. cholerae no 01 (si se determina esta especie bio­ químicamente) u otros distintos nombres de especies de vibrio­ nes, como V. parahemolyticus o V. mimicus. Dado que la espe­ cie no 01 no suele causar síndromes diarreicos tan graves ni potencialmente mortales como la especie 01 o puede asociarse más a menudo con infecciones extraintestinales, la diferencia­ ción temprana entre los dos grupos puede adquirir una impor­ tancia clínica considerable. Aunque se han identificado 35 o más especies de Vibrio, todos son microorganismos ambienta­

388

C A P ÍT U L O 8

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

les salvo 11, se denominan “especies marinas de vibriones” y no han sido asociados con infecciones humanas.152 DESCRIPCIÓN Y SÍNDROMES CLÍNICOS ASOCIADOS DE ESPECIES DE VIBRIO DE IMPORTANCIA HUMANA

Las especies que se aíslan en seres humanos y potencial­ mente producen enfermedad pueden dividirse en dos grupos: Vibrio cholerae y los vibriones no coléricos. Vibrio cholerae. Vibrio cholerae es el agente etiológico del cóle­ ra epidémico y endémico en los seres humanos. Dentro de la especie, existen muchas diferencias entre las cepas tanto en potencial patogénico como epidémico (cuadro 8-8). Las cepas pueden ser divididas según las diferencias en la composición de su pared celular (antígeno O somático) que forma la base del esquema de serotipificación que clasifica los microorganismos en 139 serogrupos diferentes. Todos comparten el antígeno fla­ gelar (H) común. A mediados de la década de 1930 se deter­ minó que todas las cepas pandémicas eran aglutinadas con un único antisuero designado 01. Las cepas de V. cholerae tipo 01 pueden separarse, además, en uno de tres serogrupos: Inaba, Ogawa e Hikojima. Estos serogrupos son importantes para estudios epidemiológicos. Por ejemplo, la pandemia actual de cólera que comenzó en 1961 es causada por el serogrupo Ogawa, mientras que un foco de cólera que es endémico en la región de la costa del golfo de los Estados Unidos se asocia con V. cholerae serotipo Inaba OI.168 En enero de 1991, apareció simultáneamente el cólera epidémico en varias ciudades coste­ ras del Perú y desde entonces ha sido comunicado en Ecuador, Chile, Colombia. Brasil y los Estados Unidos. Este brote apa­ rentemente se debe también a una cepa distinta de la cepa pan­ démica y ha sido identificado como serotipo Inaba 01, biotipo El Tor.51 Las cepas epidémicas de la serovariedad 01 pueden dividir­ se a su vez en las biovariedades clásica y El Tor. El Tor es un biotipo de V. cholerae activamente hemolítico que fue aislado en la estación El Tor Quarantine en Egipto. Se ha observado que la cepa El Tor es más resistente y más capaz de sobrevivir en el medioambiente; además, se han informado portadores crónicos de la cepa El Tor en la bibliografía.167Actualmente, se reconoce el vibrión El Tor como biotipo de V cholerae y es res­ ponsable de la mayoría de los brotes epidémicos actuales del cólera clásico. La pandemia actual de cólera que comenzó en 1961 es causada por la biovariedad El Tor, al igual que los bro­

Cuadro 8-8

tes de la costa del Golfo y Sudamérica. La biovariedad clásica casi ha desaparecido, salvo por raros aislamientos en la India. Algunos estudios de Bangladesh indican que el biotipo clásico ha resurgido.152 Cólera: reseña histórica mundial. Se han producido siete pandemias de cólera en la reseña histórica registrada; se sabe que las tres últimas se deben al Vibrio cholerae serogrupo 01. La séptima pandemia de cólera, originada en Clebes, Indone­ sia, en 1961, se propagó a todo el mundo y alcanzó el conti­ nente sudamericano en 1991. El surgimiento y la rápida propa­ gación del cólera causado por un nuevo serotipo designado 0139 Bengala en octubre de 1992 en nueve países (India. Bangladesh, Paquistán, Tailandia, Nepal, Malasia, Burma. Arabia Saudita y China) sugiere la posibilidad del inicio de la octava pandemia.73-89'206,300 Para una sinopsis de la pandemia de cólera de los siglos xix y xx, se remite al lector a la revisión publicada por Lacey.183 Vibrio cholerae 0139 Bengala toxigénico. En octubre de 1992, comenzó una epidemia de enfermedad similar al cólera en Madrás, India, y se propagó a Calcuta, Bangladesh y muchos otros lugares de la India y el sudeste de Asia.224 La cepa no pudo ser identificada como ninguno de los 138 tipos conocidos de V cholerae y por lo tanto representaba un nuevo serogrupo, 0139 (sinónimo Bengala para indicar su primer ais­ lamiento de las áreas costeras de la bahía de Bengala).73 La cepa produjo epidemias grandes de cólera en Bangladesh, India y países vecinos y, durante una época, reemplazó en gran pane a las cepas de V. cholerae 01 en las áreas afectadas. Desde 1996 hasta 2002. la mayoría de los casos de cólera en Bangladesh fueron causados por V. cholerae 01 biotipo El Tor, pero en marzo de 2002, volvió a surgir V. cholerae 0139 como el pató­ geno predominante.89 Existen tres puntos importantes para con­ siderar en relación con este nuevo serotipo: 1) los síntomas aso­ ciados con la infección por V. cholerae 0139 sugieren que e^ indistinguible del cólera causado por V. cholerae 01 y debe ser tratado con el mismo reemplazo rápido de líquidos, 2) la rápi­ da propagación de V. cholerae 0139 indica que la inmunidac preexistente contra V. cholerae 01 ofrece poco beneficio pro­ tector o ninguno, y los viajeros a las áreas afectadas no deber, asumir que la vacunación contra el cólera es protectora contr_ la cepa V. cholerae 0139, y 3) los métodos de identificación de laboratorio de V. cholerae 01 dependen de la detección del antí­ geno 01 sobre la superficie de la bacteria y, por lo tanto, no identifican la cepa nueva.53 Los rasgos fenotípicos, serológico'

Características de Vibrio cholerae

METODO DE CLASIFICACIÓN

ASOCIADOS CON EPIDEMIAS

NO ASOCIADOS CON EPIDEMIAS

Serogrupos

1

No 01 (serogrupos 02-0138)*

Biotipos

Clásico, El Tor

Biotipos no aplicables a cepas no 01

Serotipos

Inaba, Ogawa, Hikojima

Estos tres serotipos no son aplicables a cepas no 01

Toxina

Producen la toxina del cólera

Habitualmente no producen la toxina del cólera; a veces producen otras toxinas*

*Un serogrupo designado 0139 Bengala apareció en Calcuta, Bangladesh y otras partes de la India en 1992; produce la toxina del cólera en cantidades similares a las producidas por V. cholerae 01 y se ha propagado en proporciones epidémicas a través del subcontinente Indio.

F ilo g e n ia de V ibrionaceae

t xigénicos de V. cholerae 0 139 Bengala han sido comunicadc s por Nair y cois.231 Cólera: hemisferio occidental. En enero de 1991, el cólera i~: iémico, que no había sido comunicado en Sudamérica en el siglo xx, apareció simultáneamente en varias ciudades costeras Perú y se propagó con rapidez a toda Sudamérica y \.~.érica Central.121,249 En los Estados Unidos, existe un foco ambiental pequeño del • cholerae potencialmente epidémico a lo largo de la costa Jel Golfo.169 El cólera causado por esta cepa ha sido ligado en a mayoría de los casos con cangrejos mal cocidos u ostras cru­ das obtenidos de esta costa. En 1973, se comunicó en Texas el T^T.er caso de cólera en los Estados Unidos desde 1911.330 E a : fue seguido en 1978 por la comunicación de 11 casos en _ -:>iana y en 1981 con otros dos brotes en Texas que com­ pren dieron 18 casos.23 Se observó que los cangrejos obtenidos de r'tuarios cercanos eran el vehículo de la infección en los ■:s de Louisiana, mientras que el más grande de los dos broe ie Texas se rastreó hasta la contaminación de arroz cocido K£ del enjuague accidental con agua del medioambiente que anatema la cepa del brote.167 En la actualidad, se sabe que 44 Erecciones por V. cholerae 01 toxigénicas fueron adquiridas en h - Estados Unidos entre 1973 y 1987.152 Todas fueron resultair ie las exposiciones en Louisiana y Texas cerca de la costa ü Golfo. En 1991, se comunicaron 26 casos de cólera en los EsCjdos Unidos; 18 estuvieron vinculados con el brote de mérica.52 En 1992, se comunicaron 103 casos de cólera en las Estados Unidos; 75 fueron asociados con un brote a bordo ie uelo de Aerolíneas Argentinas entre la Argentina y Los -íceles en febrero de 1992. En 1993 y 1994, se comunicaron li casos de cólera en los Estados Unidos, respectivamene De éstos, 65 (94%) se asociaron con viajes al exterior. Tres dé estos fueron casos de V. cholerae 0139 confirmados por culv en viajeros al Asia.54 Desde 1995 a 2000, se comunicaron •♦casos de cólera; 6 se asociaron con un foco ambiental endétuc : \ 8. con mariscos importados.225 L s serotipos no 01 de V. cholerae han sido asociados con • - aislados de enfermedad diarreica, aunque la mayoría de i- ;rpas no 01 no producen la toxina del cólera, pero parecen pcducir una enterotoxina diferente. También se han aislado ie heridas e infecciones sistémicas. En una revisión de de baeteriemia por V. cholerae no 01, Safrin y cois.274 a m _":caron que la tasa de casos fatales para 13 pacientes en « s .--les se conoció el resultado fue del 61,5%. La mayoría a; : - casos conocidos han ocurrido en pacientes inmunodepnmdos. sobre todo con procesos malignos hematológicos o z — sis. Pitrak y Gindorf260 informaron un caso de celulitis «csenémica causado por V. cholerae no 01 que se adquirió en m - z : de agua dulce tierra adentro en el norte de Illinois. r : ::3tología de la gastroenteritis inducida por Vibrio cholerae. V. d h i ¿ r.:e es el prototipo de los síndromes diarreicos en los puúes la enfermedad no es causada por invasión tisular de los «xoorganism os sino a través de la producción de toxinas _:ectan el intercambio intraintestinal normal de agua y ■ectrolitos. Las cepas toxigénicas generan una toxina que se ■re - an receptor sobre la membrana de la célula epitelial, k t ¿ la adenilatociclasa y produce niveles elevados de adei«_-~onofosfato cíclico (cAMP) e hipersecreción de sal y lo que conduce a la diarrea característica en “agua de : ' del cólera. En el recuadro 8-4 se proporciona un relato f c r - i de la secuencia paso a paso de la gastroenteritis inducif c por V' cholerae. La figura 8-1 es una ilustración esquemáJel modo de acción de la toxina colérica. Para una reviÉ n ^nplia del cólera que incluye patogenia y factores de

Recuadro 8-4

389

Secuencia que co n d u c e a la gastroenteritis inducida por V. cholerae

1. Los microorganismos ingeridos en aguas contaminadas deben pasar pri­ mero las secreciones altamente ácidas del estómago. Se calcula que se necesitan 1010 microorganismos por mililitro para sobrevivir al pasaje gástrico en las personas sanas; se necesitan sólo unos 100 microorga­ nismos por mililitro en las personas hipoclorhídricas. ya sea debido a una gastrectomía previa o por la ingestión de antiácidos en el tratamien­ to de la enfermedad ulcerosa gástrica. 2. Para producir enfermedad, las células bacterianas de V. cholerae deben adherirse a las células epiteliales de la mucosa gástrica e intestinal. Estas bacterias son móviles y secretan mucina. dos propiedades que ayudan a la penetración de la capa protectora de mucina que reviste la superficie de la mucosa gastroentérica. La fijación de las bacterias es un mecanismo complejo que requiere el reconocimiento por parte de las células bacterianas de un marcador de superficie sobre las células epite­ liales al que se pueden unir. 3. V. cholerae produce una molécula de enterotoxina compuesta por dos subunidades: una subunidad A (activa) y una subunidad B (fijadora). La subunidad A está compuesta por dos péptidos: A! con actividad de toxi­ na y A,, que facilita la penetración de la subunidad A en la célula. La subunidad B une la molécula de toxina a los receptores gangliósidos GM1 específicos de la toxina del cólera sobre la membrana de la célula epitelial intestinal. Hay cinco subunidades B por molécula de toxina, dispuestas en un anillo alrededor de un centro que contiene la enzima A,. La unión inicial ocurre rápidamente, seguida de un cambio conformacional lento en la molécula de la toxina, que conduce a la internalización de la enzima A! en la célula huésped; por lo tanto, existe una fase de latencia corta (15 a 60 minutos) entre el momento en que se ingiere el agua infectada por cólera y el comienzo de los síntomas. A través de una serie de pasos, cataliza la ADP-ribosilación de la pro­ teína reguladora Gs (estimuladora), que la traba en el estado activo. La proteína Gs actúa para retornar la adelinato ciclasa de su forma inactiva a su forma activa, lo que a su vez produce una elevación intracelular en el AMP cíclico (AMPc; véase fig. 8-1).218 4. El AMP cíclico impide la reabsorción de iones sodio a través de la membrana del ribete en cepillo de la célula epitelial intestinal y la excreción de bicarbonato de sodio y potasio en la luz intestinal. El quilo intestinal tiene altas concentraciones de sodio y cloro (isotónico), bicar­ bonato (dos veces la concentración del plasma) y potasio (tres a cinco veces la concentración del plasma). Por lo tanto, el agua pasa pasiva­ mente desde las células epiteliales a la luz intestinal en respuesta a los altos gradientes de presión osmótica, siguiendo el viejo adagio, ‘‘donde va el sodio, va el agua” . 5. Por lo tanto, existe una secreción difusa de líquido desde las células epi­ teliales intestinales y la acumulación de grandes cantidades de agua en la luz intestinal. El ritmo de producción de líquido aumenta entre 3 y 10 horas después de la exposición. La pérdida de líquido persiste hasta durante 5 días en los pacientes que no reciben antibióticos, después de lo cual las células bacterianas del intestino se eliminan por un mecanis­ mo desconocido del huésped. El resultado son grados variados de deshidratación y desequilibrio electrolítico que pueden conducir a acidosis metabólica. hipopotasemia, shock y muerte en los casos extremos.

virulencia, se remite al lector a las publicaciones de Koper y cois., y Sack y cois.161-272 Tratamiento y prevención de las infecciones por Vibrio cholerae. La mayoría de V. cholerae son destruidos rápidamente por la tetraciclina; sin embargo, la secreción de líquido puede persistir durante varias horas después del tratamiento por el efecto de la toxina que ya está ligada a las células mucosas. La corrección de las pérdidas hidroelectrolíticas es esencial y se necesita hasta un litro o más de líquido por hora. La antibioticoterapia

390

C A P ÍT U L O 8

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

Toxina del cólera

Na*

Receptor de la glucoproteína GM1 Membrana celular

cAMP Activo

cAMP

cAMP

cAMP

Inhibidor Inactivo

% W

*l

ENTEROCITO ATP

ATP

ATP

Figura 8-1 Acción de la toxina del cólera (véanse los detalles en el recuadro 8-4).

(p. ej., trimetoprima-sulfametoxazol o tetraciclina) ayuda a acortar la duración de la diarrea y reducir el período de porta­ ción; sin embargo, los antibióticos deben considerarse auxilia­ res de la rehidratación enérgica. Además, durante las últimas décadas han surgido cepas de V. cholerae resistentes a los anti­ bióticos.225-272 Se puede reducir el riesgo de cólera y diarrea del viajero siguiendo la regla general “hiérvalo, cocínelo, pélelo u olvídelo”. En particular, los viajeros no deben consumir: 1) agua no hervida ni tratada, ni hielo fabricado con esta agua; 2) alimentos o bebidas de vendedores callejeros; 3) pescado y ma­ riscos crudos o parcialmente cocidos, incluido el ceviche y 4) verduras mal cocidas. Las ensaladas frías de mariscos pueden ser particularmente peligrosas. Se ha realizado un trabajo con­ siderable en relación con el desarrollo de vacunas orales contra el cólera.272 Dos vacunas orales están autorizadas en varios paí­ ses fuera de los Estados Unidos. Una consiste en V. cholerae destruidos más la subunidad cólera B, la otra es un mutante avirulento de V. cholerae. Actualmente no se comercializa ningu­ na vacuna contra el cólera en los Estados Unidos. Vibriones no coléricos. La mayoría de los casos de infecciones por vibriones en los Estados Unidos han sido causados por es­ pecies no endémicas distintas de V. cholerae. En el cuadro 8-9 se mencionan el hábitat natural y la distribución geográfica, los

medios de cultivo necesarios para la recuperación óptima, lareacciones bioquímicas claves y los síndromes clínicos asocia­ dos con las especies no coléricas de importancia médica. El tér­ mino no colérico probablemente sea un nombre erróneo por­ que muchas cepas pueden causar una enfermedad diarreica grave, además de las infecciones extraintestinales que pueden conducir a una septicemia mortal. En la mayoría de las infec­ ciones, los síntomas son menos graves y de menor duración que lo que se experimenta en el cólera epidémico clásico. Algunas especies de vibriones no coléricos producen enterotoxinas similares a las descritas para V. cholerae. Además, algunas especies producen enfermedad invasiva y simulan méestrechamente la disentería por Shigella; otras especies, V. vulnificus en particular, pueden invadir los linfáticos intestinales \ causar septicemia. Las afecciones extraintestinales producidapor Vibrio con más frecuencia son infecciones de heridas cutá­ neas u otitis externa, por contaminación de la piel al nadar o navegar en aguas marinas infectadas o después de manipular mariscos crudos contaminados.214281 El siguiente es un breve relato de la microbiología y los síndromes clínicos asociadocon cada una de las especies de Vibrio no coléricos. V. alginolyticus. V. alginolyticus fue clasificado originaria­ mente como biotipo 2 de V. parahaemolyticus. La mayoría de

F ilo g e n ia de Vibrionaceae

: . 2dro 8-9

Características de las especies de

1 ESPECIE 1 1 m rm olyticus

'W ¿ í r s e l a CDC

e r g » EF-5 Tangiendo al

señero Photobacierium i

X ^¡n ia le s

C fm m issii

[ £ kollisae

l 11 metschnikovii

V mimicus

V ib rio

de importancia clínica distintas de

V. c h o le r a e

HÁBITAT NATURAL, DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA; MODOS DE INFECCIÓ N HUMANOS

MEDIOS PARA EL CRECIM IENTO Ó PTIM O EN CULTIVOS DE LABORATORIO

REACCIONES BIOQUÍMICAS CLAVES

Hábitat: medioambiente marino Infección: exposición de la piel traumatiza­ da a agua salada o animales infectados

Suplemento de NaCI necesario para el crecimiento en medios no selectivos. Crece en agar sangre y medios enté­ ricos Colonias amarillas en agar tiosulfatocitrato-bilis-sacarosa (TCBS)

Lisina Arginina Voges-Proskauer NaCI al 8% NaCI al 10%

Hábitat: medioambiente marino Requiere NaCI al 1% en medios de Infección: exposición de la piel lesionada o cultivo no selectivos. Buen creci­ de heridas traumáticas a animales marinos miento en agar sangre. Colonias ver­ infectados o agua marina contaminada des en agar TCBS. Crecimiento ópti­ mo a 25 °C

Arginina Voges-Proskauer Fermentación: Glucosa Manitol Galactosa Trehalosa

Hábitat: todo el mundo; endémico en Bangladesh. En los Estados Unidos: costa del Golfo, Nueva York y estuarios de la costa noroccidental del Pacífico Infección: ingestión o contacto con agua contaminada

Suplemento de Na+ de los medios de cultivo menos críticos que otras especies de Vibrio halofílicas. Colonias amarillas en agar TCBS

Hábitat: endémico en las aguas marinas y los estuarios de Asia Infección: ingestión o contacto con agua contaminada

Suplemento de Na* para el crecimien­ to óptimo en medios de cultivo no selectivos Colonias amarillas en agar TCBS

Hábitat: medioambiente marino en la costa del Golfo y los estados de la bahía de Chesapeake Infección: consumo de mariscos crudos

391

Suplemento de NaCI al 1-2% necesa­ rio para el crecimiento. Escaso creci­ miento en agar TCBS o de MacConkey. Cribado para colonias oxidasa positivas en agar sangre

Arginina NaCI al 6% Glucosa (gas) Hidrólisis de esculina Aminovalerato Glutarato

Glucosa (gas) Hidrólisis de esculina Aminovalerato Glutarato Indol Lisina Arginina Ornitina Motilidad (des­ pués de 7 días) Urea

SÍNDROMES CLÍNICOS +

+ + V

+ +

Asociado con infeccio­ nes de tejidos blan­ dos; parece también tener un papel etiológico en las infec­ ciones de heridas y óticas Asociado con infeccio­ nes de heridas humanas

+

+ + + +

+ -

+

+ +

-

Hábitat: en todo el mundo en aguas dulces y marinas salobres, ríos, aguas de dese­ cho; también en camarones, cangrejos y langostas Infección: causa del cólera de las aves de corral; exposición o ingestión de agua o animales contaminados

Crece bien en la mayoría de los medios de aislamiento de laborato­ rio. El suplemento de sodio no es tan crítico como para otros vibriones halofílicos. Colonias amarillas en agar TCBS

Oxidasa Nitrato Voges-Proskauer

_

Hábitat: aguas costeras, y ostras y camarones Infección: ingestión de mariscos mal cocidos (sobre todo ostras)

Crece en medios de aislamiento entéri­ co. Colonias verdes en TCBS

Sacarosa Manitol Ornitina Lipasa Voges-Proskauer Polimixina

_

+

+ + V

S

Gastroenteritis y sín­ drome diarreico similares al cólera: diarrea acuosa, vómitos, deshidratación; probablemente inducidos por enterotoxina Aislado en pacientes con diarrea y gastro­ enteritis, sobre todo turistas que regresan de Asia Aislado en pacientes con diarrea y gastro­ enteritis. Se comuni­ ca la invasión del torrente circulatorio en pacientes con anomalías hepáticas Asociado con casos raros y aislados de infecciones huma­ nas: septicemia. infecciones urinarias. heridas, peritonitis

Síndrome diarreico relacionado con la producción de toxi­ nas termolábiles y termoestables; tam­ bién infecciones óti­ cas del nadador

(Continúa)

392

C A P ÍT U L O 8

Cuadro 8-9

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

C aracterístic as de las especies de Vibrio de im p o rta n c ia clínica d istin tas de V. ch olerae (coitt.)

ESPECIE V. parahaem olyticus

V. vulnificus ( Vibrio

lactosa positiva)

HÁBITAT NATURAL, DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA; MODOS DE INFECCIÓN HUMANOS Hábitat: distribución mundial en aguas dul­ ces y saladas. Endémico en Japón Infección: ingestión de mariscos contamina­ dos: peces y mariscos crudos

Hábitat: agua costera y estuarios Infección: ingestión de ostras crudas; expo­ sición de heridas traumáticas a animales marinos infectados o agua contaminada

MEDIOS PARA EL CRECIMIENTO ÓPTIMO EN CULTIVOS DE LABORATORIO

REACCIONES BIOQUÍMICAS CLAVES

Crecimiento lento en medios no Lisina selectivos. Cribado de colonias oxi­ Arginina dasa positivas en agar sangre. Voges-Proskauer Colonias verdes en agar TCBS Lactosa Salicina Ureasa Indol

NaCl al 1% necesario para el creci­ miento. Crecimiento bueno en agarsangre. Colonias verdes (85%) o amarillas (15%) en agar TCBS

Lactosa Lisina Arginina Salicina

SÍNDROMES CLÍNICOS + -

-

V +

+ + -

+

Gastroenteritis aguda: náuseas, vómitos, cólicos abdominales, fiebre, escalofríos Prueba de Kanagawa positiva Extraintestinales: heri­ das y septicemia Septicemia potencial­ mente mortal; morta­ lidad del 50%. Alta asociación con enfermedad hepática preexistente. Las heridas son dolorosas, con necrosis cutánea y muscular

S: sensible, 90% o mayor; V: variable, 11-89%; +: positivo, 90% o mayor; - negativo, 90% o mayor.

los cepas clínicas se aíslan de heridas superficiales83'210'258'279 o del oído externo.124 152 También se ha comunicado conjuntivi­ tis,197 gastroenteritis aguda,265 baeteriemia29-83 149 y fascitis necrosante114 causadas por V. alginolyticus. V. carchariae. V. carchariae es un patógeno de los tiburones, pero se ha informado un caso de infección de una herida en una niña de 11 años atacada por un tiburón mientras caminaba por el agua hasta el nivel de las rodillas en la costa de Carolina del Sur.255 V carchariae puede ser diferenciado de especies simila­ res desde el punto de vista bioquímico (V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. vulnificus) por hidrólisis negativa de gela­ tina a 22 °C, motilidad negativa a 36 °C y reacción de omitina descarboxilasa negativa. Las otras especies tienen las reaccio­ nes opuestas. V. cincinnatiensis. La infección humana causada por esta especie de Vibrio es rara. Ha sido aislado en sangre y líqui­ do cefalorraquídeo de un paciente de 70 años con bacteriemia y meningitis.31 El paciente fue tratado con ampicilina (día 1) y moxalactam durante 9 días, y se recuperó sin com­ plicaciones. V. damsela (Pliotobacterium damsela). V. Damsela, antes denominado grupo CDC EF-5, ha sido comunicado como cau­ sa de infecciones de heridas humanas, fundamentalmente des­ pués de la exposición a agua salada.64-139-226 La mayoría de las cepas son resistentes a la penicilina y sensibles a gentamicina, cloranfenicol y tetraciclina. MacDonell y Colwell203 propusie­ ron trasladar V. damsella al género Listonella. Con posteriori­ dad, Smith y cois, sugirieron que L. damsela debe ser reasig­ nado al género Photobacterium.284 V. fluvialis Antes designado como CDC grupo EF-6, V. fluvialis ha sido aislado de seres humanos con diarrea. Esta espe­ cie fue aislada en cultivos fecales de más de 500 pacientes con diarrea en el Cholera Research Laboratory en Bangladesh durante un período de 9 meses entre 1976-1977.144 En los

Estados Unidos, el microorganismo ha sido aislado en una herida de un paciente en Hawai, en agua y sedimento en la bahía de Nueva York, en mariscos de Louisiana, en agua y mariscos de los estuarios del Pacífico noreste, en un hombre de 81 años de Laredo, Texas, con diarrea,302 en las deposiciones de un lactante de un mes de vida131 y en las deposiciones de un hombre de 43 años con SIDA.137 V. furnissii. Antes designado como V. fluvialis biogrupo 2, V. furnissii ha sido aislado de pacientes con gastroenteritis aguda al menos en dos brotes de intoxicación alimentaria33 y de las heces de un lactante de un mes de vida.133 V. hollisae. Antes designado como grupo EF-13 de los CDC. V. hollisae ha sido aislado principalmente en muestras de heces de personas con diarrea y dolor abdominal y antecedente de ingesta de mariscos crudos ,4-130-226 Se describieron raros casos de infección sistémica causada por V. hollisae y más a menudo involucran una sepsis bacteriana en personas con deficiencias inmunes subyacentes.200-264 Las pruebas sugieren que V. holli­ sae puede compartir con V. vulnificus una predilección por la invasión del torrente circulatorio en personas con anomalías hepáticas.264 V. metschnikovii. V. metschnikovii, antes grupo entérico 16 de los CDC, se aísla a menudo del medioambiente, pero pocas veces de muestras clínicas humanas. El primer caso documen­ tado de infección humana fue de la sangre de un paciente con colecistitis en el Cook County Hospital en Chicago.153 Más recientemente, Hansen y cois, comunicaron dos casos de septi­ cemia por V. metschnikovii: un caso fatal en un paciente con cirrosis hepática, insuficiencia renal y diabetes; y otro de una mujer de 82 años con problemas respiratorios y una lesión infectada en la pierna, que fue tratada con éxito.125 Las cepas aisladas en humanos remitidas a los CDC para identificación incluyen dos provenientes de muestras de orina y cuatro, de fuentes desconocidas.86

F ilo g e n ia de V ibrionaceae

mimicus Antes clasificado como V. cholerae sacarosa ■ f h o. V. mimicus ha sido aislado en mariscos y agua y en deposiciones diarreicas humanas e infecciones óticas.69-281 I pjrahaemolyticus. V. parahaemolyticus produce gastro■ e ritis en seres humanos luego de la ingestión de mariscos ■notiininados,225 cuyo mecanismo no fue dilucidado. Desde se ha comunicado la propagación pandémica de infec■ ■ s por V. parahaemolyticus debidas a un único clon en ■hü - países asiáticos.315 Los síntomas son diarrea acuosa a « c f s >anguinolenta, cólicos abdominales, náuseas, vómitos, hipertermia leve y escalofríos. En general, la enferme¿fci e? leve a moderada y autolimitada, con una duración de 2 . : días. También se describieron infecciones extraintestinales per • parahaemolyticus. principalmente de heridas en contac­ to con agua salada, aunque pocas veces se comunicó una sepla primaria.225 Ha aparecido un biotipo urea positivo que e í sido la causa de varios brotes recientes, a menudo asociados . xi ii ingestión de ostras crudas contaminadas.5184-237-239 Janda y cois.52 ponen en evidencia que el 70% de los cultivos de V. 7‘s'jhaem olyticus remitidos para la identificación al ratono de Enfermedades Microbianas en el Laboratorio ie Departamento de Salud de Berkeley, California, fueron urepositivos. Se han informado hallazgos similares en la costa «■occidental del Pacífico.170 Más del 95% de las cepas de V. parahaemolyticus aisladas de pacientes con diarrea son Kanagawa positivas; es decir, hemo^cm los eritrocitos humanos en agar de Wagatsuma.160 La hemolisina es tanto citotóxica como cardiotóxica. Sólo alredei r del 1% de las cepas aisladas de medioambientes marinos > n Kanagawa positivas.152 La consecuencia es que la actividad je hemolisina de Kanagawa se asocia con la patogenia de la sastroenteritis por V. parahaemolyticus. Sin embargo, la asocueión de hemolisina de Kanagawa con la patogenia nunca fue probada y de hecho Honda y cois.142 informan que 11 de 12 leras de V. parahaemolyticus aisladas en pacientes durante un brote de gastroenteritis en 1985 en las Maldivas fueron Kanasawa negativos. En general, la rehidratación es el único tratamiento nece­ sario. vulnificus. Antes clasificado en el grupo EF-3 de los DC. V. vulnificus fue denominado al principio Vibrio lactosa positivo por Hollis y cois, en 1976.139 V vulnificus es una espe­ cie particularmente virulenta asociada con infecciones de heridas después de la exposición a agua salada contaminada y ?epticemias primarias y muerte luego del consumo de maris­ cos contaminados (habitualmente ostras crudas).55-57-225 Una alta tasa de mortalidad (40-60%) se asocia con las infecciones '¿pticas.152 Los microorganismos alcanzan el torrente circulat ?rio e invaden la mucosa intestinal. Los pacientes con enfer­ medad hepática son particularmente susceptibles a la septicemia.24-85-301 Las condiciones médicas que predisponen a la bacteriemia cor V. vulnificus incluyen disfunción hepática y síndromes que conducen a un aumento del depósito de hierro: cirrosis cróni­ ca. hepatitis, talasemia mayor, hemocromatosis y antecedentes de consumo importante de alcohol.152 Los síntomas principales asociados con la sepsis son fiebre, escalofríos y vómitos, que comienzan unas 38 horas después de ingerir ostras crudas. La diarrea no suele ser un componente del síndrome. MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE VIBRIOS Eli EL LABORATORIO

Existen cuatro posibles enfoques del abordaje de laboratorio del aislamiento de las especies de Vibrio de muestras clínicas:

393

1. Utilizar procedimientos normales y no realizar ningún es­ fuerzo específico por buscar especies de Vibrio. 2. Utilizar procedimientos y medios de siembra normales, y buscar colonias oxidasa positivas. 3. Incorporar agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS) como placa extra para los coprocultivos y también para otras muestras probables, como las de heridas, sangre, ojo y oído. 4. Utilizar otros procedimientos especiales para aumentar el aislamiento de V. cholerae, V. parahaemolyticus y otras especies de Vibrio. Para los laboratorios del medioeste de los Estados Unidos, donde los cultivos positivos para especies de Vibrio pueden ser pocos, parece más apropiado el primero o el segundo enfoque. En los laboratorios cercanos a los océanos, sobre todo los loca­ lizados en las áreas endémicas, puede estar indicado el tercero o el cuarto enfoque. Sin embargo, las desventajas del uso siste­ mático de agar TCBS son el mayor costo para una recuperación relativamente baja y que es posible que algunas especies o cepas de Vibrio no crezcan bien en agar TCBS. En estos casos, puede estar indicado todavía el uso de un medio selectivo o un enriquecimiento en caldo alcalino, que se explicará en una sec­ ción posterior. Recolección de muestras, procesamiento y selección de medios. Se debe notificar al personal de laboratorio si el médico sospecha un síndrome colérico o infecciones extraintestinales por espe­ cies de Vibrio. Las muestras deben ser recogidas tan pronto como se presente la enfermedad. En los estadios diarreicos agudos de la enfermedad, las muestras pueden recolectarse del recto con un catéter de goma blando o un hisopo o de una pequeña porción de las heces líquidas evacuadas. El cultivo del vómito también puede producir microorganismos, sobre todo en las primeras etapas de la enfermedad. Las muestras deben transportarse en recipientes cerrados para preservar la humedad y transferirse a medios de cultivo lo antes posible. En general, las especies de Vibrio son muy sen­ sibles al desecamiento, la exposición a la luz solar y el desa­ rrollo de un pH ácido. También son inhibidas fácilmente por la flora intestinal normal o por microorganismos contaminantes. Si no se pueden preparar cultivos de inmediato, las especies de Vibrio se mantienen viables en medio de transporte semisólido de Cary-Blair durante un período prolongado. Se debe evi­ tar el uso de un medio de transporte salino con glicerol y buffer. Si no se cuenta con un medio de transporte, se puede embeber en la muestra de heces una tira de 5 cm x 1.25 cm de papel secante grueso, colocarla en una bolsa de plástico sella­ da y luego enviarla hasta el laboratorio de referencia más cer­ cano.168 Las muestras sospechosas de albergar especies de Vibrio deben ser inoculadas en agar sangre de camero al 5% y agar de MacConkey. Cada supervisor de laboratorio debe determinar si se debe inocular también una placa de agar TCBS, un tubo de enriquecimiento alcalino con agua peptonada o ambos según la prevalencia de enfermedades relaciona­ das con Vibrio en cada localidad. Si no se utiliza agar TCBS, se deben evaluar las colonias hemolíticas que aparecen en agar sangre de camero después de una incubación durante toda la noche para detectar actividad de citocromo oxidasa. Se puede tocar en forma individual y evaluar de inmediato cada colonia representativa para la reacción de oxidasa utilizando reactivo de Kovac o se puede dejar caer una o dos gotas de este reacti­ vo en un área sobre la superficie de la placa donde se presen­ tan las colonias sospechosas. El rápido desarrollo de color azul indica una prueba positiva. Las colonias oxidasa positivas pueden ser transferidas a agar TCBS para la identificación de

394

CAPÍTULO 8

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

otras especies utilizando características bioquímicas y otras características. Los caldos de enriquecimiento con agua peptonada alcali­ na (APW) deben cultivarse en agar TCBS para una mejor eva­ luación de las colonias que crecen después de otras 24 a 48 horas de incubación. El APW que contiene peptona al 1% y NaCl al 1% a un pH de 8,6 es un caldo de enriquecimiento de uso simple que puede recomendarse en situaciones en que se anticipan bajas concentraciones de microorganismos en la muestra (p. ej., en estadios de convalecencia de la enferme­ dad). El pH alto del medio sirve para suprimir el crecimiento de muchas bacterias intestinales comensales mientras permi­ te la multiplicación desinhibida de V. cholerae. Se deben rea­ lizar subcultivos en agar TCBS o agar gelatina dentro de las 12 a 18 horas, dado que otros microorganismos pueden comenzar a crecer exageradamente en el caldo después de una incubación prolongada. APW también es un medio de trans­ porte excelente si las muestras no pueden entregarse de inm e­ diato al laboratorio para el procesamiento. Se recomienda colocar aproximadamente 1 mL de líquido o 1 gramo de heces formadas en 10 mL de APW en un tubo con tapa a rosca; como alternativa, se pueden colocar hisopados rectales en un tubo que contiene 1 a 2 mL de APW .168 Identificación presuntiva de especies de Vibrio sobre la base de la morfología de las colonias y microscópica. Los vibriones crecen

fácilmente en la mayoría de los medios de aislamiento; el cre­ cimiento de todas las especies aumenta con el agregado de NaCl al 1% al medio. En los casos típicos, las colonias son lisas, convexas, de consistencia cremosa, blanco grisáceas y tienen bordes continuos. En ocasiones, se encuentran colonias rugosas que se adhieren al agar. Algunos vibriones marinos pueden moverse en forma ascendente sobre la superficie de los medios de agar, asociados con la formación de células largas con flagelos laterales. Este fenómeno no se observa en la mayoría de las cepas aisladas en los seres humanos. Desde el punto de vista microscópico, se observan bacilos gramnegativos rectos o curvos (véase lámina en color 8-2D). La característica curva de las células se puede advertir mejor en la fase estacionaria temprana en los cultivos en caldo; en la fase de crecimiento logarítmico, se entremezclan formas cocoides rectas o redondeadas. Aunque se puede realizar un diagnóstico presuntivo de cólera observando gran cantidad de bacilos cur­ vos en las muestras de heces con tinción directa de Gram, se necesita la recuperación del microorganismo en cultivo para la identificación definitiva. Las reacciones diferenciales en agar TCBS son útiles para hacer una identificación presuntiva de V. cholerae, V. alginoly­ ticus, V. parahaemolyticus y V. vulnificus. Después de 18 a 24 horas de incubación en agar TCBS, V. cholerae crece como colonias amarillas lisas, de 2 a 4 mm de diámetro con un cen­ tro opaco y una periferia transparente (véase lámina en color 8-2A). Las colonias de V. alginolyticus. que también fermen­ tan la sacarosa, producen, además, colonias amarillas en agar. TCBS; V. parahaemolyticus y V. vulnificus, que no utilizan sacarosa, producen colonias verdes azuladas (véase lámina en color 8-2B). En agar gelatina V. cholerae crece como colonias transparentes rodeadas de un halo opaco que indica licuefac­ ción de la gelatina (véase lámina en color 8-2C). O ’Brien y Colwell describieron un agar taurocolato-telurito-gelatina modificado para la diferenciación entre V. cholerae ([i-galac­ tos a positivo) y V. parahaemolyticus) ((3-galactosa sobre la base de la hidrólisis de 4-metilumbeliferil-P-D-galactosa, ade­ más de la determinación de hidrólisis de gelatina y reducción de telurito.240

CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA E IDENTIFICACIÓN DE LABORATORIO DE LAS ESPECIES DE VIBRIO

Los miembros del género Vibrio son anaerobios facultati­ vos capaces tanto de metabolismo respiratorio como fermen­ tativo. Sin embargo, como crecen y reaccionan en medios de prueba para hidratos de carbono designados para el metabo­ lismo fermentativo, son clasificados con los fermentadores. El hábitat natural para las especies de Vibrio es acuático, tanto en agua dulce como salada. El crecimiento y la reactividad bio­ química de la mayoría de las especies aumentan en medios de prueba diferenciales complementados con cloruro de sodio al 1% y al 2%. La mayoría de las especies de Vibrio producen citocromo oxidasa, una característica que las separa de las enterobacte­ rias. Por lo tanto, están incluidas en el grupo de fermentadores oxidasa positivos -especies de Aeromonas, especies de Plesiomonas y especies de Chromobacterium- de los cuales deben ser diferenciadas (cuadro 8-10). Como V. cholerae fer­ menta la glucosa, se observa una reacción que combina pro­ fundidad ácida/agar inclinado (pico de flauta) alcalino en agar hierro de Kligler. Como también se fermenta la sacarosa, se observa una combinación profundidad ácida/porción inclinada ácida en agar triple azúcar hierro. V. cholerae produce tanto lisina como ornitina descarboxilasas. Los trabajadores de laboratorio que utilizan agar lisina hie­ rro para evaluar las cepas aisladas en heces observarán que V. cholerae, A. hydrophila y P. shigelloides producen una combi­ nación agar inclinado violeta/profundidad violeta debido a la descarboxilación de lisina. Se puede utilizar arginina para separar V. cholerae (negativo) de Aeromonas y Plesiomonas (positivo). La mayoría de las cepas de A. hydrophila hidrolizan la esculina, lo que las distingue de los otros microorganismos incluidos en el cuadro 8-10. Las diferencias en la utilización de lactosa, sacarosa, manitol e inositol también sirven para dife­ renciar estos géneros. V. cholerae, que incluye el biotipo El Tor, puede ser distin­ guido de otras especies de Vibrio por su capacidad para produ­ cir una prueba de la cuerda positiva (véase lámina en color 82E). Para realizar esta prueba, se mezclan colonias bacterianas con algunas gotas de desoxicolato de sodio al 0,5% en un por­ taobjetos de vidrio. Se introduce un ansa inoculadora en la mezcla y se la separa de la gota. V. cholerae produce una cuer­ da larga que se vuelve más tenaz después de 60 segundos o más (otros vibriones pueden dar una reacción de la cuerda inicial que disminuye o desaparece 45 a 60 segundos más tarde). Una aglutinación positiva en portaobjetos con antisuero O poliva­ lente también es útil para diferenciar V cholerae de otras cepas estrechamente relacionadas (véase lámina en color 8-2F). El biotipo El Tor se puede distinguir de las cepas clásicas de V. cholerae por varias características (cuadro 8-11). Las cepas El Tor son activamente (3-hemolíticas en agar sangre (véase lámi­ na en color 8-2G) y capaces de aglutinar eritrocitos de pollo (véase lámina en color 8-2H). La prueba de los eritrocitos de pollo se realiza mezclando un manojo de eritrocitos de pollo lavados (suspensión al 2,5% en solución salina) con células bacterianas de un cultivo puro por evaluar. El agrupamiento visible de los eritrocitos indica el biotipo El Tor, a diferencia de las cepas 01 clásicas de V. cholerae que carecen de esta pro­ piedad. Las cepas clásicas de V. cholerae son sensibles a 50 UI de polimixina B en la prueba de difusión en disco; las cepas El Tor son resistentes. Las cepas El Tor también son VogesProskauer positivas, mientras que las cepas clásicas de V cho­ lerae son Voges-Proskauer negativas. Lesmana y cois, descri­ bieron una prueba CAMP modificada para diferenciar el bioti-

Filogenia de V ibrionaceae

395

Cuadro 8-10 B acilos gram negativos ferm entadores oxidasa positivos: características diferen ciales de A e r o m o n a s h y d r o p h ila , P le is o m o n a s sh ig e llo id e s , C h r o m o b a c te riu m v io la c iu m y V ibrio c h o le r a e C A R A C T E R ÍS T IC A S Agar hierro de Kligler (agar inclinado/ profundidad/sulfuro de hidrógeno) Catalasa Esculina M otilidad ONPG Indol Voges-Proskauer I Lisina descarboxilasa I O m itina descarboxilasa Hidratos de carbono: Lactosa Sacarosa Manitol Inositol I Crecim iento en peptona, 1% con: NaCl al 0% NaCl al 7% NaCl al 11%

A. HYDROPHILA

P. SH IGELLOIDES

C. VIOLACEUM

V. CH OLERAE

K /A /-

K -A J A /-

YJA1-

YJPJ-

+ + + + + (+) + -

+

+ -

(-) + +

-

+ + +

-

-

-

+ +

-

+ + + (-) + +

(+) +

-

-

H -

+ + — + -

+ -

+

+

+

-

-

-

-

-

-

I 90% o más de las cepas son positivas; (+), 51-89% de las cepas son positivas, (-) 10-50% de las cepas son positivas; -: I LA: alcalino/ácido; K -A/A: alcalino a ácido/ácido; ONP: o-nitrofenil-fi-D-galactopiranósido.

ro clásico (CAMP negativo) del biotipo El Tor (CAMP positi• o fuerte).196 Las cepas V. cholerae 0139 también demuestran una reacción CAMP positiva fuerte, mientras que las cepas no y no 0139 dan una reacción CAMP positiva débil. La prueba >e realiza inoculando una cepa de S. aureus productora de Se:alisina (ATCC 25178) en una placa de agar sangre de car­ rero al 5% haciendo una única línea recta y luego inoculando ü especies de Vibrio por evaluar en una línea perpendicular a L¿ estría de S. aureus y a algunos milímetros de ella. Las placas -e incuban en una jarra de anaerobiosis por extinción con vela 1 37 °C durante 18 a 20 horas y se observan para detectar zonas re hemolisis sinérgica (véase protocolo 8-1). Para los laborato­ rios capaces de realizar pruebas de sensibilidad a fagos IV, las cepas El Tor son resistentes a este fago. Como primer paso en la identificación de especies de Vibrio, Nelly y cois.168 han diseñado un esquema dicotómico para ^er arar en seis grupos sobre la base de sus reacciones con siete rrrebas: requerimiento de NaCl al 1% para el crecimiento en . _ io con nutrientes; producción de oxidasa; reducción de ni­ trito a nitrito; fermentación de m/o-inositol y producción de ¿ranina dihidrolasa, lisina descarboxilasa y omitina descarbou lisa . Su esquema se reproduce en el cuadro 8-12. El agrupan:ento de las especies de esta forma proporciona una identifi­ cación presuntiva simple de la mayoría de las cepas clínicas. Se pueden obtener otras reacciones claves y una correlación clínica ; insultando el cuadro 8-9. Overnam y cois.248 recomendaron el ■so de la banda API 20E para realizar las pruebas bioquímicas recesarías para hacer identificaciones de los miembros más r u a d o s de los Vibrionaceae. Sin embargo, una evaluación más reciente de los sistemas de identificación comerciales mostró ere los seis métodos identificaban correctamente sólo el 63% ¿I >1% de las especies de Vibrio evaluadas.241 Para V. cholerae en particular la precisión varió del 50% al 97%. Por lo tanto, io s autores arribaron a la conclusión de que se deben tomar

+ -

menos del 10% de las cepas son positivas; V: variable;

precauciones extremas en la interpretación de los resultados de los sistemas comerciales de identificación de las especies de Vibrio. Métodos distintos del cultivo. Se ha creado una prueba de tirita reactiva inmunocromatográfica para la detección rápida de V. cholerae 01 y 0139 en las muestras de heces. En una evalua­ ción de la prueba en Madagascar y Bangladesh, donde el cóle­ ra es endémico, la sensibilidad varió del 94% al 100% y la especificidad, del 84% al 100%.235 Bhuiyan y cois, modificaron el procedimiento realizando un enriquecimiento durante 4 horas en agua peptonada alcalina antes del ensayo con tirita reactiva.22 Con este otro paso, la sensibilidad y la especificidad, respectivamente, fueron del 96% y del 92% para V. cholerae 01 y del 93% y el 98% para V cholerae 0139.

Cuadro 8-11

D iferenciación entre b iotip os de V ibrio c h o le r a e

PRUEBA

CLÁSICO

EL TOR

+

+

P-hemolítico en agar sangre de cam ero

-

Prueba de CAM P

-

+ + + +

Prueba de la cuerda

Prueba de Voges-Proskauer

-

Aglutinación de eritrocitos de pollo

-

Sensibilidad a 50 U de polim ixina B

s s

Sensibilidad a fago IV

+ : prueba positiva;

prueba negativa; S: sensible; R: resistente..

R R

396 CAPÍTULO 8

O ch o pru eb as diferen ciales claves para dividir las 12 esp ecies de V ibrio de im p ortan cia clín ica en seis grupos REACCIONES DE LAS ESPECIES EN: GRUPO 1

GRUPO 2

GRUPO 3

GRUPO 4

GRUPO 6

GRUPO 5

v:

V. cholerae

V. mim icus

V. metschnikovii

V. cincinnatiensis

V. hollisae

V. dam sela

V. flu vialis

furn issii

Sin agregado de NaCI

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

Con agregado de NaCI al 1%

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Oxidasa

+

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Nitrato nitrito

+

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Ferm entación de mm-inositol

-

-

V

+

-

-

-

-

-

-

-

Arginina dihidrolasa

-

-

V

-

-

+

+

+

-

-

-

Lisina descarboxilasa

+

+

V

V

-

V

-

-

+

+

+

+

Ornitina descarboxilasa

+

+

-

V

+

V

-

PRUEBA

V. paraV. algino­ haem olyticus lyticus

V. vulnificus

V. carchariae

Crecim iento en caldo de nutrientes

-

-

-

-

-

+

+

Todos los datos son para reacciones dentro de los 2 días de 35 °C a 37 °C; +: la mayoría de las cepas (en general 90-100%) son positivas; la mayoría de las cepas son negativas (en general 0-10% positivas); V: variable, entre 10-89% son positivas. Los resultados claves están recuadrados. Tomado de Kelly MT, Hickman-Brenner FW, Farmer JJ 111: Vibrio. En Ballows A (ed): Manual o f Clinical Microbiology, 5th ed, pp 384-395. @TFN: Washington DC, American Society fo r Microbiology, 1991.

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

Cuadro 8 -12

A erom onas y P lesiom onas 39 7

Asneros Listonella, Photobacterium /Shewanella MacDonell y Colwell203 propusieron restructurar los VibriomjL eae para incluir el establecimiento de dos géneros nuevos, Listonella y Shewanella, dentro de la familia. A través de estudios secuenciación de ribonucleótidos rRNA 5S algo complejos y ¿z.^l:>is de agrupamiento, estos autores arribaron a la conclusión ce que varias especies de Vibrio, en especial V. anguillarum, V. a sius y V damsela deben ser transferidas a un nuevo género ~ p jesto Listonella como L. anguillara, L. damsela y L. pelagia. También concluyeron, a partir de estos estudios, que Alteromonas P e iídomonas) putrefaciens y Alteromonas hanedai deben comrreodér el género nuevo Shewanella junto con una nueva especie r r ruesta: Shewanella benthica. Después del trabajo de '-'^cDonell y Colwell, Smith y cois, sugirieron que L. damsela ~_rra reasignado al género Photobacterium como P. damsela - ere la base de los datos fenotípicos.284 Los miembros de los ¿caeros Listonella, Photobacterium y Shewanella se asocian con an ~,edioambiente marino y son patógenos para los peces. Los miembros del género Shewanella (en especial S. putrem : tns) son bacilos gramnegativos rectos o curvos, móviles r«:: medio de un único flagelo polar. Las colonias característi. nenen forma de cúpula, son circulares, ligeramente viseó­ o s o mucoides y suelen ser pardo rojizas o color rosa salmón. —er.en actividad de citocromo oxidasa y producen abundante sururo de hidrógeno en agar hierro de Kligler. Los nitratos son -ícucidos a nitritos y las pruebas de gelatinasa, ornitina desc^rboxilasa y DNasa son positivas. Se ha aislado S. putrefa: ■:- de muestras clínicas humanas, lo cual se explica en detaSe en el capítulo 5 de este texto.

los Vibrionaceae.20 Sin embargo, a partir de pruebas genéticas moleculares, las especies de Aeromonas han sido ubicadas en una familia separada: Aeromonadaceae.66203 También se ha propuesto colocar Plesiomonas en el género Proteus. En el cuadro 8-10 se enumeran las diferencias fenotípicas entre las especies de Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas.'12 Género Aeromonas

Como lo indica la denominación de especie hidrófila (con afi­ nidad por el agua), el hábitat natural de las especies de Aeromonas es el agua dulce o el agua salada, donde suelen cau­ sar enfermedades infecciosas en animales acuáticos de sangre fría. Estas bacterias también residen en sifones de fregaderos y cañerías de desagües y pueden aislarse en grifos de agua corriente y suministros de agua destilada, que son fuentes potenciales de infecciones hospitalarias.

TAXONOMÍA

El género Aeromonas ha sufrido considerables revisiones taxonómicas y de nomenclatura durante los últimos años. Sólo se reconocieron cinco especies en 1988.151 Para el año 2000, la cantidad de genomoespecies publicadas válidas se había eleva­ do a 14.158 En el cuadro 8-13 se mencionan las especies actua­ les con nombre. A mediados de la década de 1970, el género Aeromonas fue dividido en dos grupos: psicrofílico y mesofílico. A. salmonicida, un patógeno de los peces, es la única espe­ cie en el grupo psicrofílico. Es inmóvil y no crece a 37 °C. El grupo mesofílico de las especies móviles son patógenos huma­ nos potenciales.

-eromonas / Plesiomonas

IMPORTANCIA CLÍNICA

Hace varios años, las especies de Aeromonas estaban inclui­ r á con las especies de Vibrio, y Plesiomonas shigelloides, en

Se describieron cuatro categorías de infecciones humanas: gastroenteritis, celulitis e infecciones de heridas, septicemia y otras infecciones. Sin embargo, a medida que se ha ampliado

Cuadro 8 -13 E sp ecies del gén ero A e r o m o n a s AISLA D O EN:

ESPECIES DE AEROM ONAS A . h yd ro p h ila A . caviae A. m ed ia A. e u cren o p h ila

ENFERMEDAD ASOCIADA

Seres hum anos/Patógeno

Gastrointestinal

Otras*

Sí/sí Sí/sí Sí/sí Sí/no

✓

/

/

/

/

A. veronii

biovariedad so b ria biobariedad veronii A. ja n d a e i A. trota A . sch u b ertii A. en ch eleia A . a llo sa cch a ro p h ila A . so b ria A. p o p o ffii A . b e stia ru m A . sa lm o n icid a

Sí/sí S í/sí

Sí/sí Sí/no Sí/sí Sí/no Sí/no No/no No/no Sí/no Sí/no

/ ✓ ?

/ /

*Predominantemente septicemia y heridas, que incluyen heridas asociadas con el uso de sanguijuelas medicinales. Pocas veces se han culti­ vado especies de Aeromonas de infecciones oculares, respiratorias, óseas y urinarias; meningitis; colecistitis; endocarditis y peritonitis.

398

CAPÍTULO 8

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

nuestro conocimiento sobre Aeromonas, ha aumentado la cate­ goría de otras enfermedades.147 Janda y otros autores146 148 han revisado el espectro de enfer­ medades infecciosas de las especies de Aeromonas y arribaron a la conclusión de que existen fundadas evidencias que apoyan que las especies de Aeromonas son agentes causales de diarrea, aunque los datos no son absolutos. Por una parte, estos auto­ res citan varias comunicaciones que indican que hay pocas diferencias importantes entre las personas sintomáticas y asintomáticas que albergan especies de Aeromonas en las he­ ces.93140-314 Por el contrario, otras comunicaciones relacionan las especies de Aeromonas con gastroenteritis.37-118 Watson y cois.329 propusieron que los factores de virulencia de las espe­ cies de Aeromonas que producen infecciones intestinales son similares a aquellos de otros patógenos entéricos, es decir, adherencia de las células bacterianas a la mucosa intestinal, producción de toxina e invasión mucosa. Alrededor del 20% de sus pacientes con infecciones intestinales por especies de Aeromonas tenían síntomas de disentería similares a los causados por las especies de Shigella y por cepas invasoras de Campy­ lobacter jejuni. La mayoría de las cepas invasoras incluidas en su estudio, según lo determina la invasividad en cultivo celular, fueron A. sobria', una minoría eran A. hydrophila. La mayoría de A. sobria y A. hydrophila producen una toxina extraíble similar a la del cólera (toxina Asao) que causa diarrea acuo­ sa.59-238 La idea previa de que A. caviae no produce una ente­ rotoxina, no es invasor y no se considera un patógeno huma­ no113 puede ser cuestionada a la luz de algunos informes en los cuales se observó que esta especie era una causa de gastroen­ teritis 12’106-233.234 Las infecciones de heridas, que varían en gravedad desde leves, fundamentalmente infecciones cutáneas (p. ej., celulitis), hasta infecciones graves que afectan músculo, articulaciones o hueso, constituyen la segunda afección más frecuente causada por especies de Aeromonas, después de la gastroenteritis. Las circunstancias clínicas asociadas con las infecciones de heridas por Aeromonas incluyen laceraciones/abrasiones asociadas con deportes acuáticos, heridas por punción u otra lesión penetran­ te, lesiones por aplastamiento (p. ej., accidente de vehículo de motor) y procedimientos médicos invasivos (p. ej., cirugía intraabdominal, cateterismo).147 En algunos casos, no se reco­ noce ningún traumatismo precedente ni acontecimiento preci­ pitante. Se propusieron cuatro categorías de personas que desarro­ llan septicemia por Aeromonas, sobre la base de la puerta de entrada, el estado patológico subyacente, el estado inmunitario y la exposición a agua dulce. Las dos categorías más fre­ cuentes son los adultos inmunodeprimidos y los lactantes de menos de 2 años que tienen trastornos clínicos subyacentes asociados (p. ej., neoplasias, enfermedad hepatobiliar, diabe­ tes) y Aeromonas en el tubo digestivo. La septicemia por Aeromonas en estos grupos de pacientes puede ser rápidamen­ te mortal, sobre todo en aquellos con cirrosis hepática o neoplasia subyacente.189 Una tercera categoría son las personas que desarrollan sepsis secundaria por Aeromonas a partir de una mionecrosis relacionada con un traumatismo. La cuarta y más pequeña categoría incluye a los adultos sin ningún defec­ to subyacente que están expuestos a fuentes de agua dulce. También se describió baeteriemia por Aeromonas en pacientes quem ados.16 La mayoría de los casos de septicemia por Aeromonas en seres humanos son causados por una de cuatro especies: A. hydrophila, A. veronii, A. caviae y A. jandaei.147,178 A. schubertii también ha sido responsable de algunos casos de baeteriemia.

Son infrecuentes otras infecciones por Aeromonas e inclu­ yen infecciones del aparato urinario, enfermedad hepatobiliar, meningitis, infecciones óticas, endocarditis, síndrome urémico hemolítico, peritonitis, enfermedad del aparato respiratorio e infecciones oculares.15-28-42-63’227 Las especies de Aeromonas de importancia clínica descritas recientemente incluyen A. schubertii132 (antes grupo entérico 501 de los CDC, manitol, sacarosa e indol negativo), que ha sido incriminado como causa de infecciones de heridas;47 A. veronii133 (antes grupo entérico 77 de los CDC, ornitina des­ carboxilasa positivo), del cual se ha comunicado que produce baeteriemia, infecciones de heridas y diarrea;6-133-159 y A. jandaei (antes A. sobria genoespecie DNA grupo 9, sacarosa, esculi­ na y celobiosa negativos) 46 A. trota tiene un perfil bioquímico singular, que incluye reacciones negativas para hidrólisis de esculina, fermentación de arabinosa y la prueba de VogesProskauer; reacciones positivas para fermentación de celobio­ sa, descarboxilación de lisina y utilización de citrato, y sensi­ bilidad a ampicilina.45-65 Este hallazgo puede invalidar el uso de medios selectivos que contienen ampicilina (se explica en la sección anterior) para el cribado de muestras de heces para especies de Aeromonas. A. trota se ha aislado casi exclusivamente de muestras fecales. A. allosaccharophila es otra especie de Aeromonas mesofílica nueva aislada de anguiluchos (anguilas jóvenes) enfermos y de las heces de un paciente con diarrea.208 Si bien se asemeja más estrechamente a A. sobria, puede distinguirse de éste porque utiliza L-arabinosa y L-histidina como única fuente de carbono. Además, esta especie es singular en su capa­ cidad para producir ácido a partir de D-melibiosa y D-rafinosa, o L-ramnosa o de utilizarlos.208

ESPECIES DE AEROMONAS EN SANGUIJUELAS MEDICINALES

La sanguijuela medicinal Hirudo medicinalis ha gozado de un resurgimiento como tratamiento para la congestión venosa luego de la cirugía microvascular o plástica. Lamentablemen­ te, las especies de Aeromonas están presentes en el intestino de la sanguijuela, donde ayudan en la degradación de los eri­ trocitos ingeridos. En consecuencia, un número creciente de infecciones por Aeromonas se ha asociado con la aplicación de sanguijuelas.156-247-278 Aunque algunos de los pacientes tuvieron episodios relativamente triviales de secreción de heridas, otros sufrieron episodios importantes de celulitis, absceso, pérdida tisular y sepsis.7-198-216 Se ha recomendado que la aplicación de sanguijuelas se restrinja a tejidos con perfusión arterial para reducir la contaminación de tejidos necróticos con Aeromonas. Además, se ha propuesto la adm i­ nistración profiláctica de antibióticos cuando se aplican san­ guijuelas.198

AISLAMIENTO EN EL LABORATORIO DE ESPECIES DE AEROMONAS A PARTIR DE MUESTRAS CLÍNICAS

Se deben utilizar agares diferenciales o selectivos cuando se sospecha Aeromonas como agente etiológico de gastroenteritis o cuando se remiten muestras de heces para la investigación en pacientes en los que el pico de los síntomas diarreicos ha cedi­ do (recuadro 8-5). La mayoría de las cepas crecen en medios entéricos selectivos como fermentadores de lactosa y, por lo tanto, pueden ser pasados por alto como microorganismos entéricos poco importantes o comensales.

A erom onas y P lesiom onas 39 9

Recuadro 8 -5

A gares selectivos utilizados para cultivar Aerom onas

A gar sangre (co n am p ic ilin a o sin ella): el a g ar sangre se p u e d e h acer selectivo in co rp o ran d o 10 |ig /m L de am p icilin a. Jan d a y c o is .150 re c o ­ m iendan e l uso de un a g ar sangre de c arn ero selectiv o q u e co n tien e a m picilin a (a g a r S B -A ) p a ra m e jo ra r la recu p erac ió n de e sp ecies de A e rom o n a s de las m u estras de h eces. I A gua p e p to n a d a alcalin a (A PW , pH 8,6): in ic ia lm e n te d esa rro lla d o para el a islam ie n to d e e sp ecies de Vibrio. A P W p u ed e u tiliz a rse p a ra aislar las a ero m o n as p re sen te s en b a ja can tid ad (1 0 U F C /m L ) en las h eces. D espués d el e n riq u e c im ie n to du ran te to d a la n o ch e, A P W es subcultivado e n el m ed io de a g ar d e elecció n . ? A g a r C IN : d esa rro lla d o o rig in ariam e n te p a ra el a islam ie n to de Yersinia enteroco litica . C IN a g a r tam b ién e s ap ro p iad o p a ra la re c u p erac ió n de A ero m o n a s de las heces. 4. A gares e n térico s: d eso x ico lato . M ac C o n k ey y x ilo sa-lisin a-d eso x ico lato pro p o rcio n a ro n las m ay o res eficacias de siem b ra g lo b a l de o c h o agares entérico s de ru tin a e v alu ad o s para la recu p erac ió n de esp e c ie s de A e rom o n a s de las h e ce s.73

DENTIFICACIÓN DE LABORATORIO DE ESPECIES DE AEROMONAS

Las especies de Aeromonas son citocromo oxidasa positivas > se las puede excluir rápidamente de las enterobaeterias mediante una prueba de oxidasa. Se puede colocar una gota o dos de tetrametil-p-fenilenediamina-dihidrocloruro (reactivo de oxidasa) sobre las colonias superficiales y se observa la evolución de un cambio de color negro característico de las colonias de las especies de Aeromonas. Las especies de Aeromonas mesofílicas son móviles con flagelos polares en lugar de peri­ n e o s similares a las especies de Pseudomonas; sin embargo, las especies de Aeromonas pueden ser diferenciadas de las últi­ mas porque utilizan glucosa de forma fermentativa en lugar de : xidativa y la mayoría de las especies de Aeromonas son indol positivas (las especies de Pseudomonas son negativas). Las características fenotípicas de las especies de Aeromonas , 4 4 revi­ radas por Altwegg y cois.13 y más recientemente por Abbott y cois..2 se resumen en el cuadro 8-14. Janda y Duffey151 señalan que un inconveniente en la identificación de las especies de Ae romonas es que algunos de los equipos de prueba semiautonáticos miniaturizados no pueden distinguir con eficacia entre las especies de Aeromonas y Vibrio fluvialis. No obstante, el último sólo pocas veces se encuentra en los laboratorios clíni­ cos y puede diferenciarse de las especies de Aeromonas por su .¿paridad de crecimiento en soluciones salinas al 6,5%, para producir colonias amarillas en agar TCBS (sacarosa positivo) y su sensibilidad al agente vibriostático 0/129.151 Xamdari y Bottone232 también describen el fenómeno suici­ da para la rápida diferenciación de las especies de Aeromonas. Este fenómeno se expresa cuando crecen cepas desconocidas en medios de caldo que contienen glucosa al 0,5%. La glucosa ^portada suprime el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, lo que conduce a la acumulación de ácido acético y a la muerte celu­ lar. A. hydrophila es no suicida, aerógena y esculina positiva; A. sobria es suicidia variable, aerógena y esculina negativa; y A. cavitae es suicida, anaerógena y esculina positiva. Otros estudios sobre las características bioquímicas y las propiedades serológicas del género Aeromonas han sido publicados por Janda y cois, y por Abbott y cois.2,148

Género Plesiomonas

El término plesiomonas deriva de la palabra griega “vecino”, lo que indica una estrecha asociación con Aeromonas. Sin embargo, como ya se mencionó, las especies de Aeromonas han sido reclasificadas dentro de su propia familia y se cree que Plesiomonas está más estrechamente relacionada con Proteus que con Aeromonas,203-21' y en la actualidad está incluido en la familia de las enterobaeterias. P. shigelloides es la única espe­ cie en el género. P. shigelloides es ubicuo en las aguas superficiales y en el suelo e infecta distintos animales de sangre fría (ranas, víboras, tortugas, lagartijas). Los seres humanos se infectan fundamen­ talmente por la ingestión de alimentos contaminados o no lava­ dos. Aunque se aísla menos a menudo en las heces humanas que las especies de Aeromonas, la gastroenteritis inducida por Plesiomonas ha sido comunicada en niños211 y en adultos.14®En el último estudio, 28 de 31 pacientes con gastroenteritis no tenían otros microorganismos que explicaran los síntomas agudos. En Tailandia se informó una tasa de portación de hasta un 5,5%.259 La gastroenteritis relacionada con plesiomonas en los seres humanos suele manifiestarse como una diarrea acuosa leve en la cual las deposiciones no tienen sangre y ni mucina. Se puede observar colitis grave o enfermedad similar al cólera en los pacientes inmunosuprimidos o con neoplasias gastrointestina­ les.267 La infección es más prevalente en las regiones subtropi­ cales y tropicales del mundo y durante los meses cálidos del verano. Es probable que la patogenicidad esté relacionada con la producción de una enterotoxina enteropatogénica; Sanyal y cois, demostraron que 13 cepas clínicas que estudiaron produ­ cían una acumulación importante de líquido en la prueba del asa ileal.277 La diarrea asociada con P. shigelloides ha ocurrido en epidemias pero también en casos aislados. Se describió luego del consumo de mariscos mal cocidos y como causa de diarrea de los viajeros.141 También se comunicaron algunos casos esporádicos de infecciones extraintestinales que incluyen septicemia, meningitis neonatal, celulitis, artritis séptica y colecistitis aguda.32,62,266 Hay informes de una infección abru­ madora posesplenectomía con P. shigelloides en un paciente curado de enfermedad de Hodgkin67 y disentería y colitis seudomembranosa persistentes asociadas con P. shigelloides en una mujer de 42 años de Bangladesh.323 El espectro de enfer­ medades clínicas y los factores patogénicos asociados con las infecciones por Plesiomonas han sido revisados por Brenden y cois.32

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LABORATORIO

P. shigelloides es un bacilo gramnegativo móvil, recto, redondeado y corto con flagelos polares y generalmente lofotricoso (las especies de Vibrio y las especies de Aeromonas son monotricosas). El microorganismo crece bien en agar sangre de carnero y en la mayoría de los medios entéricos. Los microor­ ganismos aislados son no hemolíticos en agar sangre de carne­ ro, y en 24 horas a 30 °C a 35 °C (el crecimiento es óptimo a 30 °C), las colonias miden en promedio 1,5 mm de diámetro y son grises, brillantes, lisas y opacas y pueden estar ligeramen­ te elevadas en el centro. P. shigelloides se aísla fácilmente en agares entéricos como agar de MacConkey, desoxicolato, Hektoen y xilosa-lisina-desoxicolato. Sin embargo, los medios selectivos que contienen ampicilina y se utilizan con frecuen­ cia para las especies de especies de Aeromonas no son apro­ piados para su aislamiento.325

400 CAPÍTULO 8

D iferen ciación de P le is o m o n a s s h ig e llo id e s y esp ecies de A e r o m o n a s de im p ortan cia clínica HEMOLISIS DE SANGRE DE CARNERO

OXIDASA

MOTILIDAD

+

+

+

+

A. caviae

ND

A. eucrenophila

ND

+ +

+ + + + +

+

A. media

+ + +

+ + + + +

+

+

+

A. trota

+ V +

P. shigelloides

-

+ + + +

+ + + +

MICROORGANISMO

VOGESPROS­ KAUER

Lisina

+

+

+

+

-

-

V ND

-

+ +

+ +

+ +

+

+

+

+

ND

+

+

+

+ +

V

+ + + +

DNASA INDOL

DESCARBOXILASA Ornitina

G ASA FERMENTACIÓN PARTIR D E ----------------GLUCOSA i.-arabinosa Sacarosa Manitol

Arginina

ESCULINA

+

+

+

+

+

+

+ + + + +

+ + +

+ +

+ +

+ -

ND

V

V

V

+ +

+ + +

+

+

-

+ +

Inositol

Complejo A. hydrophila A. hydrophila Complejo A. caviae

A. sobria A. veronii biotipo

-

V

+ ND

sobria A. veronii biotipo

+

+

+

-

-

+

-

+

-

veronii A. jandaei A. schubertii

+: 90% o más de las cepas son positivas; dos de las referencias39,3-32-45-,n-131151-280,

ND

■R

-

+ + +

-

+

-

-

+

90% o más de las cepas son negativas; V: variable, 11-89% de ¡as cepas son positivas; ND: resultados no disponibles. Las áreas sombreadas indican reacciones claves. Datos toma-

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

Cuadro 8 -14

Referencias

P shigelloides fermenta la glucosa; por lo tanto, la profundiú d oe los tubos de agar hierro de Kligler o agar triple azúcarínsm: se presenta amarilla. Aparece como un no fermentador .ictosa en agar de MacConkey y puede confundirse con r-re lie s de Shigella. La reacción de citocromo oxidasa es posi' - > se produce indol. P. shigelloides descarboxila arginina, fc m a y ornitina. No produce DNasa ni proteasas extracelulafermenta el inositol. pero no el manitol. Estas caracterís_ . ¡aves lo separan de las cuales es separado de las especies áe At romonas. Otras características identificadoras se enumeam en el cuadro 8-14. P ’úgelloides puede ser resistente a penicilina, ampicilina. . _“ -í-.:cilina y otras penicilinas sensibles a las (3-lactamasas. __ mayoría de las cepas son sensibles a los aminoglucósidos, áoranfenicol, tetraciclina, trimetoprima-sulfametoxazol y a ^m o lo n as, ciprofloxacina y norfloxacina.32-266

jí n e r o Chromobacterium Se hace aquí una breve mención del género Chromobacterman porque algunas cepas son fermentadores oxidasa positi■w-- y pueden confundirse con especies de Aeromonas y de | tb rio . Chromobacterium violaceum es la especie encontrada : - mayor frecuencia en los laboratorios clínicos, aunque rara ez se asocia con enfermedad humana. Crece bien en agar san£re > la mayoría de las cepas producen abundante pigmento ro le ta que facilita el reconocimiento. En el cuadro 8-10 se m .í'tra n sus principales características bioquímicas. Además, _ .opacidad del microorganismo para utilizar citrato, reducir s u a to s e hidrolizar fuertemente la caseína también es útil para - gemificación definitiva.

-£=ERENCIAS

1

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CAPÍTULO 8

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

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CAPÍTULO 8

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CAPÍTULO 8

Bacilos gramnegativos curvos y fermentadores oxidasa positivos: campilobacterias y vibriones

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CAPITULO

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales Especies de Haemophilus Taxonomía de Haemophilus y microorganismos relacionados Haemophilus influenzae Vacunas contra H. influenzae tipo b Infecciones causadas por especies de Haemophilus Meningitis Epiglotitis Otitis media Sinusitis Bronquitis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica

9

Diagnóstico de laboratorio de la infección por Haemophilus ducreyi Sensibilidad a los antibióticos de las especies de Haemophilus

Especies de Actinobacillus Actinobacillus actinomycetemcomitans Importancia clínica Características de los cultivos e identificación Sensibilidad a los antibióticos

Actinobaciullus ureae Actinobacillus hominis Especies animales en el género Actinobacillus

Neumonía Bacteriemia y sus complicaciones infecciosas Endocarditis

Especies de Pasteurella y Mannheimia

Infecciones urogenitales, maternas y perinatales

Taxonomía y características del género Pasteurella

Infecciones oculares

Pasteurella multocida

Fiebre purpúrica brasileña Otras infecciones por Haemophilus

influenzae

Haemophilus parainfluenzae Haemophilus aphrophilus y Haemophilus paraphrophilus Otras especies de Haemophilus Haemophilus ducreyi Diagnóstico de laboratorio de las infecciones por Haemophilus

Importancia clínica y virulencia Características de los cultivos e identificación Sensibilidad a los antibióticos

Otras especies de Pasteurella aisladas de infecciones humanas Pasteurella pneumotropica ( “Actinobacillus pneumotropica”) Pasteurella aerogenes ( “Actinobacillus aerogenes") Pasteurella dagmatis

Examen directo de muestras clínicas

Pasteurella canis y Pasteurella stomatis

Cultivo de especies de Haemophilus

Pasteurella bettyae

Identificación de especies de

Pasteurella cabalIi

Haemophilus

Pasteurella gallinarum 407

4 0 8 CAPÍTULO 9 Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

Especies de Mannheimia (antes complejo “ Pasteurella haemolytica/Pasteurella granulomatis ’)

Cardiobacterium hominis Taxonomía Importancia clínica Características de los cultivos e identificación Sensibilidad a los antibióticos

Eikenella corrodens Taxonomía y virulencia Importancia clínica Características de los cultivos e identificación Sensibilidad a los antibióticos

Especies de Kingella y Suttonella Taxonomía Importancia clínica Características de los cultivos e identificación Sensibilidad a los antibióticos

Espectro clínico de la brucelosis Diagnóstico serológico de la brucelosis Aislamiento y características de los cultivos Identificación de especies de Brucella Tratamiento de la brucelosis

Francisella tularensis Epidemiología de la tularemia Reseña histórica y taxonomía Virulencia de F. tularensis Espectro clínico de la tularemia Aislamiento y características de los cultivos Diagnóstico serológico de la tularemia Tratamiento de la tularemia

Especies de Bartonella Taxonomía y epidemiología de las especies de Bartonella Importancia clínica de las especies de Bartonella Fiebre de Oroya y verruga peruana Fiebre de las trincheras “clásica” y “urbana"

Especies humanas de Capnocytophaga Taxonomía Importancia clínica Características de los cultivos e identificación Sensibilidad a los antibióticos

Especies caninas de Capnocytophaga Taxonomía Importancia clínica Características de los cultivos e identificación Sensibilidad a los antibióticos

Especies de Dysgonomonas Grupos EF-4A y EF-4B de los CDC Especies de Simomsiella Streptobacillus moniliformis Taxonomía Importancia clínica Características de los cultivos e identificación Sensibilidad a los antibióticos

Especies de Brucella Epidemiología de la brucelosis Taxonomía de las especies de Brucella Virulencia de las especies de Brucella

Angiomatosis bacilar Peliosis Fiebre y bacteriemia Endocarditis Enfermedad por arañazo de gato Otras infecciones

Detección, aislamiento e identificación de especies de Bartonella Tipos de muestras Cultivo Tinción de Gram y morfología de las colonias Métodos de identificación

Diagnóstico serológico de las infecciones por Bartonella Sensibilidad a los antibióticos in vitro

Especies de Afipia Taxonomía e importancia clínica Aislamiento e identificación Sensibilidad a los antibióticos

Especies de Bordetella Antecedentes y taxonomía de las especies de Bordetella Epidemiología de latos ferina Importancia clínica de Bordetella pertussis Vacunas contra la tos ferina Importancia clínica de otras especies de Bordetella Bordetella parapertussis

Especies de H aem ophilus 4 0 9

Brúetella bronchiseptica EcóeteHa hinzii

Nuevas técnicas para la detección y la identificación de Bordetella pertussis

Sccóeteila holmesii

Pruebas serológicas para el diagnóstico de la tos ferina

Bordetella trematum

Tratamiento de la tos ferina

- .í amiento e identificación de las especies de Bordetella Vuestras y medios de cultivo

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos de las especies de Bordetella

: '.eoas de inmunofluorescencia directa la'acten'sticas de los cultivos e Identificación

zsjecies de Haemophilus Le - miembros del género Haemophilus son bacilos gramnesaers s pequeños e inmóviles que requieren factores presentes

= m -

la sangre para su crecimiento; el nombre del género signifii -, griego “que ama la sangre”. Algunas especies de Haep hilus necesitan factor X, que no es una sustancia única, sino ¿rapo de compuestos tetrapirrólicos termoestables provistos per arios pigmentos que contienen hierro (p. ej., hemina, :em_tina. protoporñrina IX). Estos compuestos se utilizan en la óate-sis de catalasas, peroxidasas y citocromos del sistema de ra isp o rte de electrones. La mayoría de las especies de Haemophilus necesitan también factor V, que es nicotinamida j c ; - ;na dinucleótido (NAD, coenzima I) o nicotinamida adenim ;:nucleótido fosfato (NADP, coenzima II). Tanto el factor V como el X se hallan dentro de los eritrocitos, incluidos los eriwxritos de camero que se encuentran en las fórmulas de agar sangre de uso habitual en los laboratorios clínicos. La sangre de :amero también contiene enzimas que hidrolizan lentamente el ac to r V.59 En consecuencia, los hemófilos dependientes del fac■m V no crecen en agar sangre de camero en el cual los eritro. ■> están intactos. Él calentamiento suave durante el agregado Je sangre a la base de agar molteno en la preparación de agar -"• colate conduce a la lisis de los eritrocitos, la liberación de ios rectores X y V, y la inactivación de las enzimas que hidrolizan el factor V. Aun cuando la mayoría de las especies de Haemophilus son incapaces de crecer en agar sangre de camepueden observar colonias pequeñas que crecen alrededor ae colonias de otros microorganismos hemolíticos en cultivos Mixtas (p. ej., Staphylococcus aureus); la lisis de los eritrocitos 5 rcra factor X, mientras que el factor V es sintetizado y provisa los hemófilos por los estafilococos propiamente dichos. Vanque la mayoría de los laboratorios utilizan agar chocolate : ara el cultivo de especies de Haemophilus a partir de muestras . fínicas, estos microorganismos también crecen en agar con 5% ¡Je sangre de caballo o de conejo. La hemolisis observada en est s medios es útil para la identificación de especies. ~i:onomía de Haemophilus y microorganismos ~!acionados

El género Haemophilus se clasifica en la familia Pasteurella. t ae. que también incluye los géneros Actinobacillus, PasteureMannheimia, Phocoenobacter y Lonepinella.3**25-455'6*6'915 Los estudios de secuenciación de RNA ribosómico (rRNA) -S de estos microorganismos han demostrado la diversidad 51 genética de las especies incluidas en Pasteurellaceae. En la -.vialidad, estos géneros son clasificados en el orden propues:: "Pasteurellales” en la división y de las Proteobacteria,455

Con excepción de Actinobacillus actinomycetemcomitans, Actinobacillus ureae y Actinobacillus hominis, los miembros del género Actinobacillus son fundamentalmente cepas anima­ les. Las especies de Pasteurella y Mannheimia también son cepas animales que en ocasiones se aíslan de seres humanos. Mannheimia es un género nuevo creado en 1999 para acomo­ dar al complejo “Pasteurella haemolytica” trehalosa negativa y Pasteurella granulomatis.}s Phocoenobacter y Lonepinella son géneros nuevos que incluyen aislados de marsopas y el medioambiente, respectivamente.425-975 En el cuadro 9-1 se presentan las características para la diferenciación de los distintos géne­ ros dentro de la familia Pasteurellaceae. Los miembros de los géneros Actinobacillus, Pasteurella y Mannheimia se explican más adelante en este capítulo. El género Haemophilus incluye nueve especies que se en­ cuentran en seres humanos y cinco en animales (recuadro 9-1). Las especies de los seres humanos se asocian con las vías res­ piratorias altas, salvo por Haemophilus ducreyi, que es la causa del chancroide, enfermedad de transmisión sexual. H. aphrophilus y H. paraphrophilus se encuentran fundamentalmente en los surcos gingivales y en la placa dental. H. aphrophilus es la única especie que no requiere los factores X o V; el H. paraph­ rophilus similar desde el punto de vista bioquímico necesita factor V para su crecimiento. Si bien los datos quimiotaxonómicos y el análisis por electroforesis enzimática multilocus sugieren que estos dos microorganismos son especies separa­ das, los estudios de homología del DNA, hibridación, transfor­ mación genética y ribotipificación indican que representan cepas fenotípicamente similares de la misma especie.969 1154 1280 La secuenciación del gen infB (factor de elongación 2) de las especies de Haemophilus indicó hace poco que todas las espe­ cies que necesitan factores X y V están íntimamente relaciona­ das, que H. parainfluenzae constituía un grupo heterogéneo dentro del género y que H. aphrophilus, H. paraphrophilus y Actinobacillus actinomycetemcomitans estaban relacionados en forma remota con la especie tipo, H. influenzae.550 H. ducre­ yi difiere en varios aspectos de otros miembros del género y en un principio se lo asignó al género Haemophilus por su reque­ rimiento del factor X. Algunos estudios de hibridación de DNA han mostrado que H. ducreyi está lejanamente relacionado con H. influenzae y los otros hemófilos; sin embargo la secuencia­ ción del rRNA 16S ha confirmado su membresía en la familia Pasteurellaceae.3131099 Haemophilus influenzae Las especies de Haemophilus forman parte de la flora bacte­ riana normal de la orofaringe y la nasofaringe en más del 85% de los adultos.901 La mayoría de los aislamientos orofaríngeos

410

CAPÍTULO 9

Cuadro 9-1

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

C aracterísticas para la diferenciación de m iem b ros de la fam ilia Pasteurellaceae

CARACTERÍSTICA Hem olisis

H AEM OPH ILUS

ACTINOBACILLUS

PASTEURELLA

MANNHEIM1A

V

V

-

V

I.O N IPIN F .U A

PHOCOENOBACTER

-

-

\

Catalasa

V

V

+

+

Oxidasa

V

V

V

+

-

+

Requerim iento de factor X

V

-

-

-

-

-

Requerim iento de factor V

+a

V

V

-

-

-

Indol

V

-

+b

-

-

-

Ureasa

V

+

V

-

-

-

Producción de acetoína

-

-

-

-

+

+

ODC

V

-

V

V

-

-

Producción de ácido a partir de: Glucosa

+

+

+

+

+

+

L-arabinosa

-

V

-

V

V

ND

M esoinositol

-

-

-

V

-

-

D-manitol

-

V

V

+

-

-

D-manosa

V

V

+

-

ND

-

D-melibiosa

-

V

-

-

V

-

D-sorbitol

-

-

V

V

ND

-

Trehalosa

-

V

V

-

ND

-

-

“ H. aphrophilus y H. ducreyi son negativos. b P. avium es indol negativo. + : reacción positiva; reacción negativa; V: reacción variable; ND: datos no disponibles.

son H. influenzae y H. parainfluenzae no encapsulados, aunque H. influenzae encapsulados (serotipos capsulares a, b, c, d, e y f) pueden encontrarse como parte de la flora normal de las vías respiratorias altas de niños y adultos. Antes de la disponibilidad de las vacunas conjugadas contra H. influenzae tipo b, el 2-6% de los niños eran portadores de cepas capsulares serotipo b y hasta en el 60% de los niños de las guarderías infantiles estaba coloniza la orofaringe.901 La recuperación de H. influenzae de muestras de esputo puede reflejar la presencia de estos micro­ organismos como flora normal. Sin embargo, en las enferme­ dades respiratorias crónicas (p. ej., bronquitis, enfermedad pul­ monar obstructiva crónica), tanto H. influenza encapsulado (tipificable) como no encapsulado (no tipificable) pueden cau­ sar infecciones graves.325’725’910J 134 Las infecciones causadas por hemóñlos, sus manifestaciones clínicas y las muestras apropia­ das para el cultivo se resumen en el recuadro 9-2. Entre los hemófilos, H. influenzae tipo b se considera el más patógeno de los seis tipos capsulares (es decir, tipos a, b, c, d, e y f). El polisacárido tipo b es el único tipo capsular que con­ tiene dos monosacáridos de pentosa en lugar de azúcares de hexosa como hidratos de carbono de las subunidades. La cáp­ sula tipo b nativa está compuesta por un ácido teicoico lineal que contiene ribosa, ribitol (un alcohol de azúcar de cinco car­ bonos) y fosfato conectados por enlaces fosfodiéster, y se

denomina PRP (polirribosil-ribitol-fosfato) (fig. 9-1). Aunque la virulencia de H. influenzae tipo b es multifactorial, la cápsu­ la de PRP tiene una importancia singular. Algunos estudios en animales con cepas isogénicas transformadas con codificación de DNA para la producción de cápsula confirmaron que las

Recuadro 9-1

M iem bros del género Haem ophilus

Especies humanas H. H. H. H. H. H. H. H. H.

influenzae* parainfluenzae haemolyticus parahaemolyticus aphrophilus paraphophilus paraphrophaemolyticus segnis ducreyi

Especies animales H. parasuis (cerdos) H. paragallinarum (aves) H. paracuniculus (conejos) H. haemoglobinophilus (perros) H. fe lis (gatos)

*Incluye las anteriores especies de H. aegyptius como H. influenzae biogrupo aegyptius.

Especies de H aem ophilus

: 5Cuadro 9 -2

411

Enferm edad es infecciosas asociadas con especies de H a e m o p h i l u s

Enfermedad

Especies

Muestras para cultivo

Manifestaciones clínicas Signos meníngeos (cefalea, rigidez de nuca), generalm en­ te de inicio insidioso; fiebre, convulsiones. Habitualmente se observa en niños de 1 m es a 2 años de edad Inicio rápido y progresión de odinofagia; disfagia y obs­ trucción de las vías aéreas superiores; epiglotis roja y tumefacta; puede requerir traqueostom ía para establecer una vía aérea Dolor y opresión en los oídos; habitualm ente bilateral; m embranas tim pánicas protruidas y opacas; se puede observar fiebre, irritabilidad y vóm itos; se debe sospe­ char una enfermedad sistém ica simultánea

Meningitis

H. influenzae tipo b (pocas veces otros tipos capsulares )

LCR; sangre

Eriglotitis

H. influenzae tipo b (pocas veces otros tipos capsulares)

Sangre; secreciones laríngeas

I

Otitis media

H. influenzae (habitualmente cepas no tipificables)

Hisopado de secreción en conduc­ to auditivo; aspiración con aguja o miringotomía; la sospecha de enfermedad sistém ica puede requerir la recolección de LCR o de hemocultivos

I

Sinusitis aguda

H. influenzae (habitualmente cepas no tipificables); a veces, H. parainfluenzae H. influenzae tipo b

Aspirados sinusales; muestras qui­ rúrgicas

Cefaleas frontales; dolor facial; tum efacción y rubor de tejidos suborbitarios y periorbitarios; em piem a sinusal

Hisopado faríngeo posterior; secreciones laríngeas

M ucosas inflamadas con tum efacción y exudados am ari­ llos; odinofagia con estridor y tos; sim ilar al crup si se afecta la m ucosa laríngea Tos persistente y no productiva; sibilancias y disnea; la enfermedad suele ser crónica con exacerbaciones puru­ lentas periódicas Tos, producción de esputo y dolor pleurítico; la distribu­ ción tiende a ser lobular o segm entaria y sim ula una neum onía neum ocócica; la neum onía bacteriém ica cau­ sada por cepas no tipificables se observa en los pacien­ tes ancianos Escalofríos, fiebres en picos, leucocitosis y com plicacio­ nes secundarias, com o anem ia, pérdida de peso, m ales­ tar general y anorexia; más com únm ente están afectadas las válvulas m itral y aórtica; alta incidencia de em boli­ zación arterial Uretritis causada por secreción mucoide fluida; pueden recuperarse m icroorganism os de cultivos cervicales y de sangre de m ujeres con fiebre posparto; tam bién pueden cultivarse de m últiples sitios genitales (p. ej., glándulas de Bartolino, endometrio); placenta, líquido am niótico y líquidos corporales neonatales Caracterizada por secreción conjuntival m ucopurulenta; conjuntivas hiperém icas y escleróticas difusam ente inyectadas; se propaga a otras personas por secreciones infecciosas de toallas y manos Fiebre, dolor abdom inal con vómitos; petequias y lesiones cutáneas hem orrágicas; los síntomas im itan la m eningi­ tis meningocócica, pero no se presenta una meningitis; habitualm ente se encuentra una infección conjuntival previa o sim ultánea con el clon de la FPB o H. influen­ zae biogrupo aegyptius Enferm edad de transmisión sexual caracterizada por lesio­ nes genitales dolorosas y ulcerativas y ganglios linfáti­ cos inguinales supurados y agrandados; puede progresar hasta la form ación de abscesos y fístulas si se deja sin tratamiento

I

t rm n g itis o laringotra-

I

queobronquitis aguda Bronquitis

|

I

H. influenzae (a menudo cepas no tipificables)

Esputo; aspirados transtraqueales; lavados bronquiales

Neumonía

H. influenzae tipo b; cepas no tipificables recuperadas de pacientes ancianos

Esputo; aspirados traqueales; lava­ dos bronquiales

Endocarditis

H. aphrophilus ; H. paraphrophilus; H. parainfluenzae; pocas veces, H. influenzae

Sangre

jiííc c ió n del tracto senital y bacterem ia posparto; sepsis neoaaial con meningitis

H. influenzae (no tipificable); H. parainfluenzae; H. influenzae genoespecies crípticas

M uestras uretrales y endocervicales; sangre; tejidos fetales; LCR

I

Conjuntivitis

H. influenzae biogrupo aegyptius

Hisopado conjuntival

I

Fiebre purpúrica brasilera

H. influenzae biogrupo aegyptius (clon de F P B )

Sangre; hisopados conjuntivales; lesiones cutáneas; orofaringe

I

C hineroide

H. ducreyi

Hisopados obtenidos de úlceras genitales; aspirados de bubones; muestras de hisopado endocervical

412

CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

j H HOC

, / ° \

C

V h/h c— c O

H

H O

H O

H O

H

H

H

H

H

H

-c-c-c-c-c

O -o -p -

O

■O —

OH

Ribosa

K

Ribitol

Fosfato

rn

Figura 9-1 Estructura de la unidad de repetición de polirribosa-ribitol-fosfato (PRP) de polisacárido capsular de H. influenzae tipo b. Esta molécula con­ siste en el m onosacárido de cinco carbonos ribosa. unido por un enlace éster a ribitol. un alcohol azúcar de cinco carbonos el cual, a su vez, está unido a un grupo fosfato.

cepas de tipo b eran más virulentas que los otros tipos capsula­ res.1436 La cápsula de PRP permite que el microorganismo resista la fagocitosis y la destrucción intracelular por los neutrófilos. Los anticuerpos antitipo b promueven la fagocitosis y la destrucción dependientes del complemento (opsonización) de estos microorganismos in vitro e in vivo.1294 Además de la cápsula tipo b, H. influenzae tiene varios factores de virulencia, la mayoría de los cuales se relacionan con adherencia, coloni­ zación e invasión. Algunos de estos factores se encuentran tanto en las cepas tipificables como no tipificables, mientras que otros se hallan sólo en H. influenzae no tipificables. Los factores de virulencia que se encuentran en H. influenzae tipo b y no tipificable se presentan en el recuadro 9-3. Vacunas contra H. influenzae tipo b

Antes de la introducción de vacunas eficaces contra H. influenzae tipo b, este microorganismo causaba cerca de 16 000 casos de enfermedad invasora por año en niños de 5 años y menores.666901 La mayoría de las infecciones sistémicas tipo b ocurrían en niños de 2 años y menores. Las concentraciones insuficientes de anticuerpos protectores bactericidas anti-PRP a esta edad desempeñan un papel importante en el desarrollo de la enfermedad. Durante el período neonatal inmediato, se adquiere inmunidad contra H. influenzae tipo b mediante los anticuerpos transplacentarios que se pierden dentro de los pri­ meros meses de vida. Estos anticuerpos vuelven a aparecer luego de la exposición a microorganismos de tipo b o a otros antígenos microbianos que generan anticuerpos reactivos cru­ zados. La mayoría de los individuos con una enfermedad sistémica por H. influenzae tipo b tienen concentraciones bajas o indetectables de anticuerpos anti-PRP capsular. Las capacida­ des antigénicas del PRP purificado nativo fueron explotadas en los primeros preparados de vacunas contra H. influenzae tipo b. El PRP purificado produjo anticuerpos en los niños mayores, pero no obtuvo una respuesta en los menores de 2 años, el grupo con mayor riesgo de sufrir enfermedad grave.547 Más aún, el PRP no produjo una respuesta previsible de “refuerzo” con una carga antigénica ulterior. Este fracaso se debió a la naturaleza independiente de las células T de la respuesta inmunitaria primaria contra los antígenos polisacáridos.782 Con poste­ rioridad se llevaron a cabo ensayos clínicos con cuatro vacunas conjugadas PRP/proteína.305-306'547" 9 Los conjugados consistie­ ron en PRP nativo conjugado en forma covalente con toxoide tetánico (PRP-T), toxoide diftérico (PRP-D), un complejo pro­ teico de la membrana externa (OMP) de Neisseria meningitidis (PRP-OMP) y con CRM197, una toxina diftérica “atóxica” ais­ lada de una cepa mutante de Corynebacterium diphtheriae

(PRP-HbOC). El uso de este enfoque presumiblemente aumen­ tará la toxicidad del material PRP, ya que la conjugación de las porciones de hidratos de carbono con proteínas como haptenos produce una respuesta inmunitaria dependiente de las células T con la generación de células de memoria.782 Después del desa­ rrollo de estos conjugados singulares, se instituyeron ensayos de eficacia clínica en gran escala. Los ensayos clínicos llevados a cabo con las distintas vacunas conjugadas en los Estados Unidos. Reino Unido, Finlandia y otros países en la última década han comunicado eficacias del 95-100%, según la dosi­ ficación y los esquemas de inmunización del estudio.138-547'999 En la actualidad, están autorizadas cuatro vacunas conjuga­ das básicas: PRP-HbOC, PRP-OMP y PRP-T. HbOC, PRPOMP y PRP-T están autorizadas para uso en niños menores de 12 meses y las cuatro están autorizadas para niños mayores de esa edad (recuadro 9-4). También existen tres vacunas com­ binadas: DTP-HbOC, DTP-PRP-T y DTaP-PRP-T. Las dos pri­ meras contienen los toxoides diftérico y tetánico y una vacuna contra la tos ferina de células enteras, mientras que la última contiene los toxoides diftérico y tetánico y una vacuna acelular contra la tos ferina. Estas vacunas combinadas se pueden utili­ zar para la serie de vacuna combinada primaria contra difteria, tétanos, tos ferina y H. influenzae tipo b, salvo por DTaP-PRPT, cuyo uso sólo está autorizado como cuarta dosis de la serie primaria debido a una menor inmunogenicidad en los niños más pequeños.207-210'212 El Comité de Enfermedades Infecciosas de la American Academy of Pediatrics y el Comité Asesor sobre Prácticas de Inmunización de los Centers for Disease Control and Prevention (CDC) han redactado recomendaciones relacionadas con la administración de la vacuna contra H. influenzae tipo b.209-212 Se está evaluando la inclusión de vacu­ nas contra H. influenzae tipo b mezcladas con otras vacunas (p. ej., vacuna acelular contra tos ferina, vacuna antipoliomielitis, vacuna contra hepatitis B), el uso de esquemas de administra­ ción alternativos y la persistencia de anticuerpos luego de la administración de diferentes vacunas.195'202'306'699 En el recuadro 9-5 se presentan las pautas generales para la administración de vacunas. Durante los ensayos de eficacia de las vacunas, los datos de vigilancia recogidos durante 1992, cuando alrededor del 67% de los niños incluidos de 12 a 24 meses de edad habían recibi­ do al menos una dosis de vacuna conjugada, ya sugerían reduc­ ciones espectaculares en la incidencia de enfermedad grave por H. influenzae tipo b. En efecto, se observaron grandes dismi­ nuciones en la incidencia entre los niños menores de 18 meses mucho antes de que las vacunas conjugadas tuvieran un uso amplio en los lactantes pequeños.913 Estos hallazgos sugirieron que las vacunas conjugadas no sólo prevenían la enfermedad al inducir inmunidad activa sino que también disminuían la por­ tación orofaríngea de //. influenzae tipo b. Esto fue demostra­ do en estudios en Europa y los Estados Unidos.913’914 1246 Las vacunas pueden proporcionar otra protección a los lactantes no vacunados al reducir su riesgo de exposición a H. influenzae tipo b por los contactos mayores vacunados. Será necesaria una vigilancia continua en las poblaciones de niños y adultos para evaluar si la inmunidad generada por las vacunas conjugadas es prolongada o si existe un aumento en la proporción de niños mayores y adultos que son susceptibles a las infecciones por H. influenzae tipo b a medida que pasa el tiempo. Aunque carecemos de experiencia a largo plazo con estas vacunas en niños prematuros o con enfermedades subyacentes, algunos estudios indican que es posible que no sean en ellos tan eficaces. En un estudio de 22 lactantes prematuros con una edad gestacional mediana de 28 semanas, la administración de

Especies de H aem ophilus

- e : Ladro 9 -3

413

F a c to re s d e v iru le n c ia d e H aem ophilus influenzae

'■-'O genética de la producción de la cápsula de PRP es com pleja y com prende tanto determ inantes genéticos capsulares como no capsulares. Los genes • j t B existen en el crom osom a com o una duplicación de dos segmentos idénticos de 17-18 kb unidos por una región corta de 1-1,3 kb.583-732 Esta región c .ontiene liexA, que codifica una protem a necesaria para la exportación del material capsular hacia la superficie celular.734 Esta disposición de genes .x c ^ a d o s se encuentra en más del 98% de las cepas de H. influenzae tipo b. Por el contrario, los genes cap en H. influenzae tipos a, c, d. e y f existen com o genes de copia única, aunque la evidencia reciente sugiere que las cepas de H. influenzae no tipo b invasivas tam bién pueden m ostrar una am plifica­ c ió n ie i gen cap.959 Las cepas de tipo b deficientes de cápsula carecen de la duplicación del locus de capB y tienen sólo una única copia de este gen.732 La KM aja evolutiva teórica im partida por el genotipo capB duplicado es la disponibilidad de un m olde listo para la am plificación rápida de secuencias del gen ;u r-_ lar de tipo b en condiciones am bientales en las cuales puede ser ventajoso producir más material capsular. Un examen de 36 cepas clínicas invasoras a : U influenzae tipo b de Finlandia y 14 cepas de W ashington, D.C., mostró que, en efecto, la amplificación de los genes capB ocurre principalm ente in »r- o '“ 2 Quince de las 36 cepas finlandesas y 5 de las 14 cepas estadounidenses contenían tres a cinco copias del gen capB. Las cepas con m últiples copias x ;er.es produjeron más polisacárido capsular tipo b; la cepa única que tenía cinco copias elaboró cuatro a cinco veces la cantidad de material capsular tipo fe ; ia cepa de tipo silvestre. Cabe destacar que la encapsulación de los microorganismos de tipo b se asocia con m enor adherencia a las células humanas y ■m or invasión de éstas.1228 Los m utantes deficientes en cápsulas de tipo b com o resultado de la pérdida de una copia de la duplicación en el locus capB m>:*iraron un aum ento de 50 veces en la adherencia a las células epiteliales hum anas y un aum ento de casi 300 veces en las capacidades invasoras. El restaHecim iento de la encapsulación por la transform ación condujo a una gran dism inución tanto en la adherencia como en la invasión,

i : ■esina de las fimbrias Lxs -.n b rias se encuentran en las cepas de tipo b encapsuladas y en alrededor de 30-40% de las cepas no tipificables.465-466 Algunas fimbrias m edian tanto la han aglutinación com o la adherencia a las células mucosas hum anas, pero en realidad inhiben la invasión de las células m ucosas.397 Las fimbrias de H. tm luenzae están com puestas por una proteína m ayor de 24 kDa (HifA) y dos proteínas m enores de peso m olecular 20,6 (HifD) y 45,5 kDa (HifE).466-845 1232 Lx proteína HifE se ubica en los extremos de las fimbrias; las mutaciones en el gen hifE conducen a la producción de fimbrias que tienen una capacidad seducida de hem aglutinar y adherirse a las células epiteliales.466-8451224 En conjunto, las fimbrias intactas median la adherencia al unirse a glucoproteínas y riocolípidos sobre la superficie de las células eucariontes y a las proteínas de la m ucina respiratoria.393-735 Los genes para estas proteínas (hifA, hifD e hifE) e u sie n com o un conjunto de copia única de dos genes (hifC e hifB) que codifican proteínas involucradas en la reunión de las fimbrias (HifC) y la protección ic las proteínas de las fimbrias nacientes de la degradación durante la exportación desde la célula (HifB).1232 Las fimbrias com puestas por otra proteína de i s im b rias, denom inada fim brina P5, tam bién han sido identificadas en cepas de H. influenzae no tipificables y en cepas de las genoespecies crípticas ■. adas en el tracto genital.491 Esta proteína de 36,4 kD a muestra una hom ología de secuencia con la proteína de la m em brana externa P5 (véase m ás adeb o te i y también se adhiere a las células orofaríngeas humanas, la m ucina y el m oco de las trompas de Eustaquio en el m odelo de otitis media de la chinchiAunque esta protem a muestra una heterogeneidad interespecie considerable entre las cepas no tipificables, se han identificado epítopos conservados de fsr.bnna P5 com o posibles antígenos para vacunas experim entales.947 Recientem ente, se describió todo el conjunto de genes de las fimbrias de la genoespectc Jel tracto genital críptico de H. influenzae y se observó que consistía en cinco genes (ghfA a ghfE) que son hom ólogos al conjunto de genes h if de otras cepas de H. influenzae.'*1

- Mesillas HMW1 y HMW2 HNrVVl (160 kDa) y HM W 2 (155 kDa) son adhesinas proteicas de alto peso m olecular que se encuentran en el 70-80% de H. influenzae no tipificable y - .r iia n la adherencia a las células epiteliales.1230 Estas proteínas están relacionadas estructural y funcionalm ente con la hem aglutinina filamentosa de 5- rdetella pertussis , 8 7 Los genes para estas proteínas están también dispuestos en grupos sobre el crom osom a junto con los genes que codifican las proteíque exportan, localizan y activan estas grandes proteínas de la m em brana externa (OM P).88 En un estudio con m icroorganism os aislados del oído medio i "isofaríngeos com patibles no tipificables de niños con otitis m edia, predominaron las cepas que tenían HM W1 y HM W 2; las cepas que no expresan estas adhesinas expresaron la adhesina hia (véase m ás adelante) o las fimbrias hem aglutinantes.727 Aunque estas proteínas son bastante heterogéneas de una cepa a tara. algunos estudios de inm unización en animales con HM W 1/HM W 2 purificado m ostraron cierta protección de la otitis media ante la exposición a la cepa hom ologa.86 Los aislamientos de diferentes sitios anatómicos o asociados con diferentes trastornos clínicos (p. ej., cepas asociadas con otitis media frente a cepas asociadas con EPOC) pueden diferir en el nivel de expresión de los genes de adhesina de HM W .1313 Estas proteínas tienen epítopos expuestos i la superficie que pueden ser útiles para el desarrollo de vacunas basadas en péptidos sintéticos recom binantes para H. influenzae no tipificable.89

Adhesina HAP HAP es una adhesina no perteneciente a las fimbrias de 155 kDa que se encuentra en todas las cepas de H. influenzae y media la adherencia y la invasión ie las células epiteliales.1227 La proteína hap tiene tanto actividad adhesiva com o de proteasa y está relacionada con la proteasa IgA de H. influenzae pero es -.itin ta de ella. Esta m olécula es sintetizada, secretada y sufre escisión autoproteolítica con la liberación del dominio adhesivo de la superficie celular.4® La interacción del dom inio adhesivo hap con fibronectina, lam inina o colágeno inhibe la escisión proteolítica de hap y prom ueve la adherencia bacteriana a estas proteínas. Debido a su actividad proteolítica, esta m olécula tam bién puede actuar después de la invasión celular. La inm unización intranasal de ratones ; :-n adhesina hap inhibe la colonización nasofaríngea.296

Adhesinas Hia y Hsf Algunas cepas no tipificables que carecen de las adhesinas HM W 1/HM W 2 tienen otra proteína no perteneciente a las fimbrias denom inada Hia.90 H ia es una ¿ihesina proteica de 115 kDa estructuralm ente similar a la proteína Hsf. una adhesina m enor hallada en las cepas tipo b.1225 1226 La protema hia es sintetizá­ i s y secretada intacta y se m antiene com pletamente asociada a la célula con la m em brana externa bacteriana.1225 Las proteínas H sf existen sobre las células ; omo apéndices de la superficie fibrilar cortos y delgados que son distintos de las fimbrias. El locus del gen hsf de las cepas tipo b muestra hom ología de secuencia con el locus hia de las cepas no tipificables. (Continúa)

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CAPÍTULO 9

R ecuadro 9 -3

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

F a c to re s d e v iru le n c ia d e H aem ophilus in flu en zae (cont.)

Proteína A asociada con la opacidad (OapA) OapA es una proteína adhesina de 47 kDa hallada en todas las cepas de H. influenzae. Se ha dem ostrado que esta proteína m edia la adherencia a las células epiteliales en cultivo y es necesaria para la colonización faríngea en modelos anim ales.1026'1355 En medio de crecim iento transparente, OapA es responsable de una m orfología opaca de las colonias.

Hemocina Más del 90% de las cepas de H. influenzae tipo b tam bién producen una bacteriocina denom inada “hem ocina'’.788-789 Las bacteriocinas son proteínas produci­ das por distintas especies bacterianas que pueden inhibir el crecim iento de las cepas de la misma especie o de cepas relacionadas. La hem ocina no es produ­ cida por cepas de H. influenzae encapsulados no tipo b o no tipificables, aunque la mayoría de estos m icroorganism os son sensibles a sus efectos letales.788 La producción de hem ocina puede contribuir a la capacidad de las cepas de H. influenzae tipo b para com petir eficazm ente con cepas no tipificables en la colonización nasofaríngea.

Proteasa IgA H. influenzae produce una proteasa Ig A l que inactiva la inm unoglobina hum ana A l, lo que explica más del 90 % de la IgA presente en la orofaringe.687 Esta m olécula es distinta de la adhesina Hap, la cual tiene cierta hom ología de secuencia con la proteasa IgA. Aunque el 97% o más de las cepas de H. influen­ zae no tipificables tienen el gen de proteasa IgA (iga), la actividad de proteasa es m ayor en las cepas aisladas clínicas de esputo, sangre y LCR que en las cepas aisladas de hisopados de fauces de portadores asintom áticos.1333

Lipooligosacáridos Las cepas de H. influenzae tienen un lipopolisacárido (LPS) asociado con la mem brana externa que consiste en Iípido A unido a través del ácido 2-ceto-3desoxioctulosónico (KCO) con un polímero polisacárido central que consiste en m onosacáridos neutros. Sin em bargo, difiere del LPS de los m icroorganis­ mos entéricos y de otro tipo en que carece de las cadenas laterales term inales repetidas (los antígenos “O ” o som áticos).85 Por lo tanto, el LPS de H. influen­ zae se denom ina con más precisión lipooligosacárido (LOS). El LOS Iípido A tiene todas las actividades endotóxicas del LPS Iípido A, incluida mitogenicidad, pirogenicidad en conejos, agregación plaquetaria y letalidad en el m odelo de endotoxem ia del ratón. En el LOS, los oligosacáridos centrales neutros -glucosa, galactosa, glucosam ina y heptosa- varían en su cantidad y en sus relaciones estructurales tanto entre las cepas como dentro de una cepa dada. La variación de fase de LOS a nivel genético ocurre por cam bios en la cantidad de secuencias de cuatro nucleótidos genóm icos (5’-CAAT-3') que conducen a desviaciones en el marco de lectura del codón/anticodón.569 Adem ás, el LOS de muchas cepas de H. influenzae está sialilado y, por lo tanto, es estructural y antigénicam ente sim ilar a los oligosacáridos sialilados de los esfmgolípidos glucolados humanos. Esta modificación de LOS ayuda a los microorganism os a evadir la opsonización y la fagocitosis al imitar las estructuras moleculares halladas normalmente en el huésped. El LOS de H. influenzae tam bién es inves­ tigado com o posible antígeno para el desarrollo de una vacuna contra H. influenzae no tipificable. El LOS destoxificado conjugado con proteínas de la m em brana externa de H. influenzae o con toxoide tetánico es inm unogénico y la inm unización activa con estos conjugados redujo la incidencia de otitis m edia debida a H. influenzae no tipificable en el m odelo de la chinchilla.506'1398 El análisis de loci genéticos responsables de la biosíntesis y la estructura del LOS ha puesto en evidencia que la expresión de ciertos loci (p. ej., el gen lic2B) puede asociarse con un aumento de la virulencia.1008

Proteínas de la membrana externa Las cepas de H. influenzae tienen seis a ocho OM P en la m em brana externa de la pared celular. La investigación sobre OM P de H. influenzae se ha centrado en aquellos que podrían ser útiles com o com ponentes de una vacuna contra H. influenzae no tipificable. Los OM P designados P2 y P6 han generado un m ayor interés com o antígenos potenciales de la vacuna. P2, el principal OM P de II. influenzae, com prende más del 50% del contenido de OMP. Esta proteí­ na tiene un peso m olecular de entre 38 y 40 kDa, existe en la mem brana externa com o un trímero y funciona com o una porina; por lo tanto, está parcial­ mente expuesta sobre la superficie de las cepas no tipificables.911'1176 En modelos anim ales, los anticuerpos dirigidos contra la proteína P2 son bactericidas y protectores contra la infección ante la exposición. Los epítopos de P2 también son im nunogénicos en los seres humanos y son dianas para los anticuerpos bactericidas que aparecen durante las infecciones por H. influenzae no tipificable.911 El análisis de secuencia de aminoácidos de la proteína P2 purificada indica que las porciones de la m olécula que están enterradas dentro de la m embrana externa están conservadas en sus secuencias de am inoácidos, mientras que los epítopos expuestos a la superficie son sum amente variables en su secuencia de una cepa a otra.1061176 Adem ás, los epítopos expuestos de P2 en cepas respiratorias individuales cam bian en el tiempo com o resultado de cambios únicos y secuenciales de bases en los genes estructurales de P2.358 Utilizando niveles anim ales y la técnica de anticuerpos monoclonales, se ha demostrado que la principal respuesta anti-P2 está dirigida contra una única "asa” expuesta de la superficie de la m olécula de P 2.1417 Los cam bios en la secuencia de am inoácidos dentro de esta región conducen a la elim inación inm unológica de los microorganism os que tienen el fenotipo P2 "reconocido’'. Este fenotipo es suplantado en el tiempo por microorganismos que expresan el fenotipo P2 ligera­ mente alterado. Este m ecanism o puede explicar en parte la naturaleza crónica de algunas infecciones asociadas con H. influenzae no tipificable (p. ej., sinu­ sitis, EPOC). Al considerar las proteínas P2 com o antígenos "candidatos” a la vacuna, el análisis de OM P de P2 de distintas cepas de H. influenzae será necesario para identificar epítopos que estén conservados desde el punto de vista estructural e inm unológico.911 P6 es una protem a que com prende 1 al 5% del contenido de OM P y está presente sobre la superficie tanto de las cepas tipificables como no tipificables.930 Tiene un peso m olecular de 16,6 kDa y es en realidad una lipoproteína asociada con peptidoglueano.912 En el m odelo de rata lactante y en el m odelo de oti­ tis m edia en la chinchilla los anticuerpos dirigidos contra P6 son bactericidas y protectores contra la exposición.317-912 En el m odelo de ratón de otitis media, la inm unización intranasal con P6 purificado condujo a la inducción tanto de IgA m ucoso específico de P6 como de respuestas inmunes mediadas por célu­ las.702 El análisis de secuencia de aminoácidos de la proteína P6 y la secuenciación de nucleótidos del gen P6 de las cepas tipo b y no tipificables mostró una hom ología mayor del 97%, lo que indicó que el gen P6 está altamente conservado a nivel genético.930 Los anticuerpos bactericidas dirigidos contra P6 están presentes en el suero humano normal. Debido a su naturaleza conservada y a su inm unogenecidad dem ostrada en animales y seres humanos, el OMP de P6 justifica otras investigaciones com o candidato potencial para la inclusión en una vacuna contra H. influenzae no tipificable. Otros estudios han dem os­ trado que los loci genéticos que codifican P2 no sufren tasas altas de variación genética en las secuencias de codificación, pero pueden m ostrar variación en las áreas donde se localizan las secuencias repetitivas.57,1

Especies de H aem ophilu s

41 5

Escuadro 9-4 Vacunas actu alm en te au to rizad as de conjugad os de H. influenzae tipo b Vacuna

Fabricante

Hidratos de carbono

Proteínas transportadoras

PRP-D PRP-HbOC PRP-T PRP-OMP

Pasteur M erieux Wyeth Lederle Pasteur Merieux M erck & Co.

PRP de tam año intermedio Oligosacárido PRP pequeño PRP de tam año grande PRP de tam año intermedio

Toxoide diftérico Toxina diftérica m utante no tóxica (CRM 0 - 1 Toxoide tetánico Com plejo de OM P de Neisseria meningiúdis serogrupo B

IRP-O M P a los 2 y 4 meses de edad cronológica condujo sólo

i un 27% y un 55% de lactantes que demostraron concentraa : nes anti-PRP mayores de 1 |ig/m L después de la primera y — xrgunda dosis de vacuna, respectivamente.1351 Esta respuesta Je anticuerpos fue significativamente menor que la observada a .ata n tes de término. En un estudio de seguimiento de lac■ k s extremadamente prematuros llevado a cabo 7 años des*b£s de recibir la vacuna se observó que los niños prematuros ¿ m n títulos más bajos de anticuerpos a varios antígenos de «acuna que los niños de término que habían recibido vacu: En un estudio de 19 niños infectados por HIV-1 que file­ t e inmunizados con una única dosis de PRP-T o HbOC a una icac media de 28 meses, sólo 7 presentaron concentraciones de ■ v . jerpos anti-PRP que indicaban inm unidad.1006 En otro i s ^ i i o realizado en niños africanos infectados por HIV tam­

bién se observó una disminución significativa de la respuesta a la vacuna.806 Se propone que la escasa respuesta a la vacuna en los individuos infectados por HIV se debe al estado de depleción de células T de los pacientes y a la naturaleza dependien­ te de las células T de la respuesta inmunitaria a las vacunas conjugadas. Las vacunas conjugadas contra H. influenzae tipo b son inmunógenas en los adultos HlV-seropositivos, pero la capacidad para desarrollar concentraciones protectoras de anti­ cuerpos se relaciona con los recuentos basales de linfocitos T CD4 y las concentraciones de IgG.338 1220 Infecciones causadas por especies de Haemophilus MENINGITIS

Con anterioridad a la utilización de las vacunas, H. influen­ zae era la causa más frecuente de meningitis bacteriana en los

-íru ad ro 9-5 Pautas para la adm in istración de vacunas de c o njugad o de H aem ophilus influenzae tipo b207209210212 I . Todos los niños deben recibir una de las vacunas conjugadas autorizadas para uso en lactantes (H bOC-PRP-OM P o PRP-T), com enzando a los 2 meses le ecad. Si se utiliza PRP-OM P para la prim era vacunación, se administra otra dosis a los 4 m eses, con una tercera dosis a los 12-15 meses de edad. Para -■ vacunas HbOC y PRP-T, se adm inistran tres dosis en intervalos de 2 meses (2, 4 y 6 meses) con una cuarta dosis a los 12-15 meses de edad. Para las ¿osís de los 12-15 meses, se puede utilizar cualquiera de las vacunas conjugadas. Estas vacunas pueden adm inistrarse durante las visitas cuando se están administrando otras vacunas (p. ej., saram pión, parotiditis, rubéola) y los lactantes program ados para recibir tanto HbOC com o D TP pueden recibir la « tij-n a de com binación, HbOC-DTP. En general, las vacunas conjugadas deben adm inistrarse en una jeringa separada y en un sitio separado de DTP u : r r ü vacunaciones. 1 En Los niños para los cuales no se inicia la inm unización hasta los 7 a 11 meses de edad, se debe adm inistrar HbOC, PRP-OM P o PRP-T en ese momenU- con una dosis de la m ism a vacuna adm inistrada 2 meses más tarde. Se adm inistra una tercera dosis de refuerzo de cualquiera de las vacunas conjuga­ bas a los 12-18 meses de edad. 5-.. P sra ios niños en los cuales se inicia la vacunación a los 12-14 meses de edad, se puede adm inistrar PRP-De, HbOC, PRP-OM P o PRP-T. Se deben jcn u n istrar dos dosis y la segunda dosis se debe adm inistrar al m enos dos meses después de la primera. 4 ios niños no vacunados de 15 meses a 5 años, se recom ienda una dosis única de cualquiera de las vacunas conjugadas autorizadas. 5 ?erie de inm unización para lactantes prem aturos se basa sobre la edad cronológica y se debe com enzar a los 2 meses de edad. m ios lactantes en los que la primera serie de inm unizaciones para difteria, tétanos o tos ferina se ha diferido hasta el año de edad (p. ej., niños con " ¿ r o s trastornos neurológicos), la vacuna PRP-OM P puede presentar una ventaja dado que es inm unogénica en ausencia de toxoides diftérico o tetánico. — ••acuna com bo DTP-HbOC no debe utilizarse para la inm unización de lactantes en los cuales está contraindicada la vacunación contra la tos ferina, f e o incluiría a los lactantes con antecedentes de reacciones inmediatas a DTP o el desarrollo de encefalopatía (alteraciones de conciencia, convulsiones), centro de los 7 días de recibir la vacuna DTP. los niños de 12 meses a 7 años de edad con deterioro inmunitario subyacente (p. ej.. los que tienen trasplante de m édula ósea, drepanocitosis, esplelectom ía, enfermedades neoplásicas que requieren quim ioterapia) que han recibido una serie prim aria de inyecciones y una dosis de refuerzo a los 12 —eses de edad o más, no se necesitan otras dosis de la vacuna, aunque algunos han recom endado la adm inistración de una dosis adicional antes de some­ terse a un ciclo de quim ioterapia o a una esplenectom ía. Para los niños de 12-59 meses de edad con estos trastornos subyacentes que no han sido vacunaé d s . se recom ienda 2 dosis de cualquier vacuna conjugada adm inistradas con dos meses de separación. S. I_.:-s niños no vacunados que tienen drepanocitosis o asplenia y tienen más de 5 años de edad pueden recibir una dosis de cualquier vacuna conjugada. Se >-iieren dos dosis de cualquier vacuna adm inistrada con 1-2 m eses de separación para los niños con infección por HIV, procesos m alignos, trasplante de ■ éd u la ósea y deficiencia de IgG2. Los datos de eficacia de la vacuna en niños de m enos de 12 meses de edad con deficiencia de subclases de inmunoglobulinas o infección por HIV actualm ente son limitados. 9 l Ez ios niños que han tenido una enfermedad invasora por H. influenzae tipo b antes de los 2 años de edad, la inm unización previa se debe descartar y se :e ? e volver a adm inistrar vacuna conjugada durante la convalecencia según los esquem as apropiados para la edad señalados antes. Los niños en los cua.e> se desarrolla una enfermedad por H. influenzae después de los 2 años de edad no necesitan reinmunización, dado que la propia infección induce una « p u e s t a inmune protectora en niños inm unológicam ente normales de esta edad.

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CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

niños de entre 1 mes y 2 años de edad, y la incidencia pico era entre los 6 y los 12 meses de edad.666 Entre los 2 y los 6 años, H. influenzae y Neissería meningitidis ocurrían con igual fre­ cuencia; la meningitis por H. influenzae era infrecuente en los niños mayores de 6 años. Más del 90% de las cepas aisladas en estos casos pertenecían al serotipo capsular b.901 Desde el punto de vista clínico, la meningitis por H. influenzae tipo b se ase­ meja estrechamente a la meningitis meningocócica. La coloni­ zación nasofaríngea previa en un huésped sensible conduce a la invasión del torrente circulatorio y la siembra ulterior de las meninges. Los síntomas de infección de las vías respiratorias altas de etiología viral y de otitis media a menudo preceden la aparición de la meningitis.1247 El inicio de los signos y los sín­ tomas puede ser brusco o insidioso, y el último es el patrón más frecuente. Los niños presentan ñebre, malestar general y, en ocasiones, vómitos; la rigidez de la nuca suele estar ausente. Algunos niños pueden sufrir parálisis de nervios periféricos, craneales o ambos, y crisis comiciales. Es necesario un alto índice de sospecha, abordajes diagnósticos agresivos (punción lumbar para recoger líquido cefalorraquídeo [LCR], recolec­ ción de hemocultivos y administración temprana de tratamien­ to antibiótico apropiado) y una comunicación estrecha con el laboratorio para establecer el diagnóstico correcto. Aunque relativamente infrecuentes, las complicaciones de la meningitis por H. influenzae tipo b son absceso encefálico, derrame subdural, pericarditis, artritis séptica e infecciones localizadas en otros sitios corporales debido a la diseminación hematógena 2i8,4oi La mayoría de los casos actuales de meningitis por H. influenzae tipo b ocurren en pacientes que no han sido inmuni­ zados.933 La meningitis por H. influenzae en adultos es infrecuente y suele complicar trastornos subyacentes, como la pérdida de LCR luego de un traumatismo de cráneo o procedimientos neuroquirúrgicos. También puede ser el resultado de una extensión directa desde un foco contiguo de infección en los senos paranasales o el oído medio.11341210 Las enfermedades subyacentes debilitantes, como diabetes, alcoholismo crónico, neumonía, infección por HIV y otros estados de inmunodeficiencia tam ­ bién predisponen a los adultos a la meningitis por H. influen­ zae.325'125 Alrededor del 50% de los casos se deben a cepas no tipificables de H. influenzae y el otro 50% son causados por cepas tipo b y otras cepas encapsuladas.9101210 H. influenzae se propaga a través de las secreciones respira­ torias y existe un riesgo elevado de enfermedad invasora secun­ daria para los contactos domésticos no vacunados o con vacu­ nación incompleta de 4 años de edad o menores. En este últi­ mo grupo, este riesgo puede ser mayor de 500 veces.998 La rifampicina, el fármaco de elección para la quimioprofilaxis, erradica la portación orofaríngea y, por lo tanto, la transmisión del microorganismo. Según la American Academy o f Pediatrics (AAP), se debe administrar profilaxis a todos los miembros de la casa (incluidos los adultos) cuando hay un contacto o con­ tactos menores de 48 meses cuyo estado de inmunización es incom pleto.1005 La AAP define el contacto como un niño que es miembro de la casa o que ha pasado 4 o más horas por día con el caso índice por lo menos durante 5 de los 7 días que pre­ cedieron al comienzo de la enfermedad. La dosificación de rifampicina para los niños es de 20 mg/kg una vez por día du­ rante 4 días y para los adultos, 600 mg dos veces por día durante 2 días.998 Para que sea eficaz se la debe administrar a los con­ tactos cercanos dentro de los 7 días desde el inicio de la enfer­ medad en el caso índice. Todos los miembros de una casa donde hay un niño inmunizado de menos de 12 meses de edad (los niños que aún no han recibido el “refuerzo” de los 12-15

meses) deben recibir rifampicina. La quimioprofilaxis no es necesaria cuando todos los contactos domésticos menores de 48 meses de edad han completado su serie de inmunización. Los niños que asisten a guarderías y son contactos de casos ín­ dices deben recibir profilaxis con rifampicina cuando no están vacunados o cuando tienen una vacunación incompleta y es­ tán expuestos al caso índice durante 25 o más horas en la sema­ na previa al inicio de la enfermedad en el caso índice. En los últimos años también se ha comunicado meningitis por H. influenzae como complicación de infecciones de deriva­ ciones del LCR.779’1390 Estas infecciones han ocurrido princi­ palmente en lactantes y niños y han involucrado derivaciones de tipo ventriculoperitoneal, ventriculoauricular y lumboperitoneal. Aunque las infecciones de las derivaciones causadas por Staphylococcus epidennidis o Staphylococcus aureus suelen desarrollarse por la contaminación intraoperatoria o perioperatoria de la derivación y el LCR ventricular, al parecer las infec­ ciones de las derivaciones por H. influenzae son el resultado de la siembra de la derivación y el LCR durante la baeteriemia. Los pacientes con signos y síntomas de meningitis a menudo tienen otras infecciones asociadas por H. influenzae, como oti­ tis media. Los microorganismos aislados en el líquido de la derivación han sido cepas capsulares tipo b o han sido no tipi­ ficables. Aunque las infecciones de las derivaciones causadas por bacterias grampositivas requieren la extracción/reemplaz-: del cuerpo extraño para lograr la curación, la antibioticoterapia sistémica sin extraer la derivación a menudo tiene éxito para eliminar las cepas tipo b, aunque el tratamiento farmacológica sólo ha tenido menos éxito en las infecciones de derivaciones causadas por cepas no tipificables.779,1390

EPIGL0TITIS

H. influenzae tipo b ha sido asociado históricamente con ep:glotitis, una celulitis de los tejidos supraglóticos que conduce a edema laríngeo obstructivo.901 La epiglotitis pocas veces ocurre en lactantes y se observa típicamente en niños de 2 a 7 años y en varones de 20-30 años. En general, la presentación es aguda, con odinofagia intensa, disfagia, fiebre y tumefacción de la epiglotis por encima de la laringe en la base de la lengua.1259 En los niños, este inicio brusco ayuda a diferenciar clínicamente la epiglotitis del crup causado por distintos agentes virales (p. ej.. virus sincitial respiratorio, virus parainfluenza) y de la tos fer.na causada por Bordetella pertussis. A medida que la enferme­ dad progresa, la deglución se torna cada vez más difícil y se asocia con sialorrea, estridor inspiratorio y dificultad respirato­ ria incipiente. La intubación endotraqueal y la administración enérgica de terapia antibiótica y de sostén puede salvar la vid_ en los casos de obstrucción de la vía aérea. Aunque los cultivos faríngeos posteriores no son útiles debido a la presencia de otra flora nasofaríngea, casi siempre se aísla H. influenzae tipo b de los hemocultivos. La epiglotitis también puede aparecer en adultos, en quienes la fiebre, la odinofagia, la disfagia y la difi­ cultad respiratoria son los signos y los síntomas de presenta­ ción.1389 La introducción de estrategias de vacunación eficace? también ha afectado la incidencia de epiglotitis.904 1248 En ur. estudio sueco, una comparación de la incidencia anual media de epiglotitis en el período prevacunación (1987-1991) con la incidencia en 1996 mostró disminuciones del 95% en los niño? de 0 a 4 años, del 83% en los niños de 5 a 9 años y del 30% er. los niños de 15 años y mayores.454 Sin embargo, a pesar de la? vacunas eficaces, se ha comunicado epiglotitis debida a H influenzae tipo b en niños que han recibido las series comple­ tas de vacunaciones.1341

Especies d e H aem ophilus

OTITIS MEDIA

La otitis media se refiere a la inflamación del oído medio y se divide quirúrgicamente en dos síndromes: otitis media aguda auido en el oído medio acompañado por signos y síntomas de infección aguda) y otitis media con derrame (líquido en el ido medio sin signos ni síntomas).1097 La otitis media aguda : uede ser clasificada a su vez como no complicada, persistenr 7ícurrente o crónica.1011 La otitis media ocurre principal¡nente en niños de 6 meses a 5 años, con la incidencia máxima r '.r e los niños menores de 3 años. La alta incidencia de esta afección en los niños pequeños refleja los mecanismos proKctores subdesarrollados de la trompa de Eustaquio. La otitis a»edia aguda suele ocurrir como complicación de infección ral ip. ej„ virus sincitial respiratorio [VSR], virus parain'_ínza). Los síntomas son dolor ótico, hipoacusia y, a veces, ■emeción desde el conducto auditivo externo. Los signos son :Te?re. irritabilidad, cefalea y, en ocasiones, náuseas y vómitos. En los pacientes con otitis media aguda, la otoscopía neumáti7>'ne en evidencia una membrana timpánica abombada roja pacificada relativamente inmóvil. En la otitis media con 7c7-ame. se observa abombamiento o disminución de la movi7^i de la membrana, pero ésta parece sólo ligeramente inflamada. El diagnóstico etiológico definitivo requiere la aspira..: n con aguja del líquido del oído medio (timpanocentesis), 77_e no se realiza de rutina. Sin embargo, cuando hay secreción, iebe recogerse para cultivo. Puede ser necesario el cultivo multáneo de LCR y sangre si aparecen signos y síntomas sisíémicos. Las causas bacterianas más frecuentes de otitis media aguda 500 Streptococcus pneumoniae, H. influenzae y Moraxella . -\.rrh a lis, y el 25% al 66% son causadas por H. influen--yo89 |viáS del 90% de las cepas de H. influenzae aisladas de -_e>tras apropiadamente recogidas son no tipificables y el restante son de tipo b.395 Hasta el 25% de los niños con mis media causada por microorganismos tipo b también tie­ nen una bacteriemia simultánea, meningitis o ambas.145 Las _ aplicaciones incluyen otitis media aguda recurrente, persis­ tencia de los derrames del oído medio que requiere la inserción tubos de drenaje, deterioro auditivo, mastoiditis, meningitis, antis media crónica, absceso encefálico y sepsis.775 Cabe des­ d a r que sólo el 20-30% de las muestras de líquido de oído medio recogidas de niños con otitis media con derrame tienen . -Livos bacterianos positivos, aunque sólo ahora se está apre_ _ndo el papel de los microorganismos de crecimiento lento y _ r. requerimientos nutricionales especiales (p. ej., Alloio. mtciis otitidis) como causas de esta infección.561 Se ha reco­ mendado amoxicilina/clavulanato combinados con amoxicilina ■ :a bucal), axetilo de cefuroxima (vía bucal) o ceftriaxona intramuscular) como antibióticos de elección para el trata­ miento de la otitis media recurrente y persistente.576’1011 SINUSITIS

La sinusitis aguda se caracteriza por síntomas de resfriado resistente, secreción nasal y nasal posterior purulenta, tos, fie­ rre. cefalea y, a menudo, dolor facial.1200 Esta presentación a;uda se mezcla con un trastorno denominado sinusitis cróni;a. caracterizado por la persistencia de los signos y los sínto­ mas anteriores más allá de una duración de 3 meses, con la tos > la secreción nasal purulenta como los síntomas principa­ les.1145 Una sensación de plenitud facial o la presencia de eiem a o cambio de color alrededor de los ojos puede indicar la extensión del proceso infeccioso desde los senos paranasales a ios tejidos blandos de la órbita. El diagnóstico de sinusitis se

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hace principalmente por la evaluación de los signos y los sín­ tomas; en ocasiones se utilizan técnicas por imágenes (radio­ grafía, tomografía computanzada, resonancia magnética) para visualizar los senos etmoidales y esfenoidales y determinar la afectación orbitaria. En los estudios en los cuales se obtuvieron muestras quirúrgicas o mediante aspiración con aguja de los es­ pacios de los senos maxilares, H. influenzae y S. pneumoniae fueron los microorganismos aislados más a menudo. Los estu­ dios bacteriológicos cuidadosos de pacientes con sinusitis agu­ da han demostrado con claridad que H. influenzae es el agente etiológico principal en el 20-25% de los adultos y en el 36-40% de los niños, respectivamente.1791200 Estos agentes suelen ser invasores secundarios luego de una infección sinusal viral (p. ej., rinovirus). La mayoría de las cepas de H. influenzae aisla­ das en pacientes con infecciones sinusales agudas son no tipi­ ficables.395’910 H. influenzae desempeña un papel menor en la patogenia de la sinusitis crónica. Un estudio reciente de aspira­ dos de senos frontales recogidos de 30 pacientes consecutivos observó que H. influenzae estaba presente sólo en el 9% de 35 cultivos.1145

BRONQUITIS Y ENFERMEDAD PULMONAR OBSTRUCTIVA CRÓNICA

La bronquitis crónica es una entidad clínica mal definida que comprende la inflamación de los bronquios sin afectación pul­ monar importante y que se caracteriza por una tos por lo gene­ ral no productiva y persistente, sibilancias y disnea.1256 1381 Este trastorno es extraordinariamente frecuente, sobre todo entre los varones de 40 años que fuman. Los factores ambientales (p. ej., contaminación del aire) y las infecciones virales concurrentes irritan e inflaman la mucosa respiratoria, la exponen más a la colonización bacteriana y conducen a la producción de esputo purulento.1381 En los pacientes con bronquitis crónica estable, las vías aéreas inferiores suelen estar colonizadas por numero­ sas cepas de H. influenzae no tipificable; durante las exacerba­ ciones agudas la cantidad de estos microorganismos aumen­ ta.80-887 La persistencia de tos crónica y producción de esputo por lo menos durante 3 meses consecutivos durante más de dos años en sucesión se denomina enfermedad pulmonar obstructi­ va crónica o EPOC.1159 1256 Los pacientes con exacerbaciones graves de bronquitis crónica y EPOC tienen disnea, hipoxia y habitualmente hipertermia leve. Durante las exacerbaciones, la producción de esputo está aumentada y la consistencia cambia de mucoide a mucopurulenta o purulenta.1159-1381 La tinción de Gram de muestras de esputo correctamente recogidas suelen mostrar muchos polimorfonucleares asociados con un morfotipo bacteriano particular (p. ej., los cocobacilos de H. influen­ zae de tinción pálida). Los agentes más frecuentes aislados del esputo purulento son cepas no tipificables de H. influenzae, seguidas de S. pneumoniae y M. ca ta rrhalis.«76,887,988 jan ]os pacientes con enfermedad asociada con H. influenzae, se pue­ den aislar cepas no tipificables de las vías aéreas inferiores aun entre las exacerbaciones de los síntomas.80-767 Durante las exa­ cerbaciones, se suele prescribir un tratamiento empírico con antibióticos orales que protegen contra H. influenzae y los otros microorganismos, junto con broncodilatadores y otras medidas de sostén. En los pacientes con obstrucción grave de las vías aéreas y abundante esputo purulento, el tratamiento antibiótico acorta significativamente la duración de los sínto­ mas.326 Los fármacos cuya eficacia se ha demostrado en esta circunstancia son cefalosporinas de amplio espectro, tetraciclinas, quinolonas (p. ej., ciprofloxacina, prulifloxacina) y los macrólidos más nuevos.326 La bronquitis crónica, las exacerba­ ciones agudas de la bronquitis purulenta, la EPOC y la neumo­

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CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

nía pueden representar estadios en una serie continua de pro­ cesos patológicos pulmonares en los cuales las cepas de H. influenzae no tipificables desempeñan un papel primario. Sin duda, distintos factores del huésped (estado inmunitario, otras afecciones pulmonares, infecciones virales previas o simultá­ neas) también contribuyen a la patogenia de este mal definido trastorno,1159

NEUMONÍA

La neumonía por H. influenzae puede ser otra manifestación de la infección sistémica por H. influenzae o una complicación de la EPOC. En los pacientes con enfermedad sistémica (meningitis, epiglotitis, baeteriemia, otitis media) esta neumo­ nía es lobular, segmentaria y purulenta, características simila­ res a la neumonía neumocócica. En estos casos, los microorga­ nismos de tipo b encapsulados constituyen los agentes etiológicos habituales. H. influenzae no tipificables son causas importantes de neumonía con baeteriemia o sin ella, sobre todo en pacientes ancianos con trastornos respiratorios subyacentes, como bronquitis crónica, EPOC y bronquiectasias o con enfer­ medades sistémicas, que incluyen inmunodeficiencia, diabetes, alcoholismo y enfermedad neoplásiea.325-725-1134Además, la neu­ monía bacteriémica debida a los tipos capsulares de H. influen­ zae distintos del tipo b también se ha comunicado en pacientes con trastornos subyacentes que deterioran los mecanismos de defensa locales o sistémicos del huésped.590 El diagnóstico definitivo de neumonía por H. influenzae se dificulta por la pre­ sencia del microorganismo en las vías respiratorias altas de los individuos sanos. Las muestras de esputo expectoradas y tosi­ das pueden proporcionar resultados insuficientes o engañosos; pueden ser necesarias muestras de lavado bronquial, broncoscopia o lavado broncoalveolar para obtener un diagnóstico definitivo del cultivo.

BACTERIEMIA Y SUS COMPLICACIONES INFECCIOSAS

La baeteriemia es una manifestación frecuente y temprana de la meningitis por H. influenzae tipo b, pero algunos lactan­ tes pueden tener baeteriemia sin evidencia de meningitis. La presentación aguda se observa sobre todo en niños con enfer­ medad subyacente (p. ej., drepanocitosis) e incluye fiebre, somnolencia y un aumento del recuento periférico de neutrófilos. La baeteriemia puede sembrar tejidos blandos, articulacio­ nes y hueso, y conducir a celulitis, artritis séptica y osteomie­ litis, respectivamente.901 La celulitis a menudo aparece en los niños como tumefacciones violáceas o azul rojizas sobre las mejillas y las áreas periorbitarias del rostro. La celulitis facial y periorbitaria asociada con H. influenzae casi ha desaparecido desde la introducción de las vacunas conjugadas de tipo b.25-414 También se describió la celulitis en los adultos en asociación con bacteriemias por H. influenzae tipo b y no tipificables.772 La artritis séptica se caracteriza por dolor, tumefacción y dis­ minución de la motilidad de la articulación infectada.770 La osteomielitis hematógena se presenta con síntomas constitu­ cionales, tumefacción y dolor óseo. Si bien H. influenzae tipo b aún es revindicado como la causa principal de artritis séptica en los niños más allá del período neonatal pero de menos de 2 años de edad, un estudio retrospectivo de 38 niños con artritis séptica documentada con cultivo entre 1991 y 1997 sólo puso en evidencia un caso debido a H. influenzae tipo b.803 Esta cepa P-lactamasa-negativa fue aislada en 1992 de un niño de 14 meses que no estaba inmunizado. Howard y cois, revisaron 851 casos de artritis séptica y osteomielitis desde 1977 hasta 1997

en Notario, y observaron que la artritis séptica y la osteomieli­ tis hematógenas por H. influenzae tipo b representaban el 30% y el 3% de estas infecciones respectivas antes de 1992, pero hubo sólo un caso de artritis séptica tipo b y no se observó nin­ gún caso de osteomielitis desde 1992 hasta 1997.607 Estos resultados indican que la vacunación amplia ha conducido a la casi desaparición de los microorganismos tipo b como agentes etiológicos de estas complicaciones de la baeteriemia. La baeteriemia por H. influenzae también puede ocurrir en recién nacidos y en ancianos. Se ha comunicado la sepsis neo­ natal aguda debida a H. influenzae como entidad clínica distin­ ta.440 En estos casos, se puede presentar meningitis o no. La mayoría de los casos de infección neonatal son el resultado de la transmisión matemofetal o matemoperinatal (véase más ade­ lante). Sólo el 20% de las cepas aisladas en las bacteriemias que ocurren durante el período neonatal son de tipo b; el resto son no tipificables.440 Aunque se ha comunicado la sepsis por H. influenzae tipo b en adultos ancianos, la mayoría de las cepas de estos pacientes son no tipificables y el aparato respiratorio es la fuente habitual.549-725 1134 La baeteriemia por H. influenzae no tipificable ocurre principalmente en pacientes ancianos con enfermedades subyacentes (p. ej., alcoholismo, lupus eritematoso sistémico [LES], artritis reumatoide, diabetes, procesos malignos) y se asocia con distintas complicaciones, como celu­ litis, artritis séptica, osteomielitis, empiema, infecciones intraabdominales, pielonefritis y endocarditis.126-,54-319-325-725-n34-1136

ENDOCARDITIS

H. parainfluenzae, H. aphrophilus y H. paraphrophilus son las especies de Haemophilus aisladas con mayor frecuencia de pacientes con endocarditis e infecciones intravasculares; H. influenzae tipificable y no tipificable son relativamente infre­ cuentes.20130'272'301-335'459-500-532 La incidencia de endocarditis es máxima en los adultos jóvenes y de edad mediana. Aunque la mortalidad asociada con la endocarditis correctamente tratada suele ser de alrededor del 10-15%, las tasas más altas (25-50%) publicadas en la bibliografía anterior probablemente reflejaban las dificultades para aislar estos microorganismos con requeri­ mientos nutricionales especiales de los hemocultivos, lo que llevaba a un tratamiento antibiótico inapropiado o insuficiente. En general, los pacientes tienen una evolución clínica subaguda con fiebre leve, malestar general, escalofríos y síntomas res­ piratorios. Se observa enfermedad valvular preexistente o sub­ yacente sólo en un 50% de los casos, y la presencia de un soplo cardíaco es el único hallazgo sugestivo en estos pacientes. Los estigmas periféricos de endocarditis, como manchas de Roth. estigmas de Janeway y hemorragias lineales subungulares sue­ len estar ausentes. Se ha comunicado coagulación intravascular diseminada y hemorragia pulmonar, y se puede observar hematuria y anemia con esta infección.1177 Los estudios ecocardiográficos han demostrado que la endocarditis por H. aphrophi­ lus se asocia con una alta incidencia de vegetaciones valvula­ res y complicaciones sépticas resultantes de la embolización a grandes arterias. Los factores de riesgo para endocarditis con las especies de Haemophilus son la presencia de lesiones den­ tales o bucales (periodontitis, traumatismo, heridas bucale' penetrantes), manipulaciones dentales o cirugía bucal prece­ dente, válvulas cardíacas enfermas o dañadas (p. ej., cardiopatía reumática, defectos congénitos, cirugía cardíaca previa) y la presencia de válvulas protésicas.130-272 H. parainfluenzae tam­ bién ha sido implicado en casos de endocarditis polimicrobiana en adictos a drogas intravenosas.1051 En los casos típicos, estos pacientes se presentan con endocarditis derecha, vegeta-

Especies de H aem ophilus

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a oes Je válvula tricúspide en la ecocardiografía, y evidencia ibiLCu \ radiológica de embolización pulmonar séptica. H. jm m nfluenzae también ha sido asociado con una bacteriemia ■ o s u d a resultante de la infección de implantes vasculares, ■ o : los cables de los marcapasos.1096

genoespecie críptica no puede ser diferenciada fenotípicamen­ te de otras cepas de H. influenzae biotipo IV. Este patógeno es caracterizado además para determinar las propiedades que con­ tribuyen a su virulencia en las infecciones del aparato genital y neonatales.1094

U FE IIIO N E S UROGENITALES, MATERNAS • HATALES

INFECCIONES OCULARES

especies de Haemophilus, sobre todo //. influenzae no TOcScübles y H. parainfluenzae, han sido reconocidas como infrecuentes de uretritis, infecciones del aparato genital fe -e -m o . vulvovaginitis prepuberal, infecciones obstétricas y r n e . : lógicas, bacteriemia posparto y sepsis neonatal con u c c :r.;itis o no.287-288-726-979’1038-1234 Sturm informó que H. m ^ e n z a e o H. parainfluenzae fueron los únicos microorgaB K - incluidas las clamidias y los ureaplasmas) aislados del W i a 242 episodios de uretritis no gonocócica en 234 varoíes; n se aislaron especies de Haemophilus en varones asinto■áncos. 34 En un estudio llevado a cabo en Houston entre T > > 1981, se aisló H. influenzae de hemocultivos de 16 ■ peres, con bacteriemia posparto y de 36 recién nacidos con ífcxeriemia o meningitis.1346 Otros 50 aislamientos de //. m¡-'~-.'-.:ae no asociados con bacteriemia ni meningitis provi■ s n c de los genitales (vagina, endometrio, cuello uterino, jiu.~-_.las de Bartolino, trompas de Falopio, uretra masculina y Bfrado prostático) y de tejidos fetales (líquido amniótico, tejijK rl-centarios). De estos aislamientos, el 94% fueron no tipiBctcnes desde el punto de vista serológico. Quentin y cois. -reraron especies de Haemophilus de cultivos genitales de *: mujeres en un período de 90 m eses.1038 De ellas, 42 tuvieron ■ ecciones bacterianas genitales importantes, como endomeK s . 'dlpingitis y abscesos de las glándulas de Bartolino. La ■sección del aparato genital se relacionó con la presencia de fcpositivos intrauterinos en el 62% de las pacientes con endo■ o n u s y en 4 de 6 pacientes con salpingitis, lo que sugirió que I k hemófilos genitales pueden comportarse como agentes :c>: monistas en sitios genitales. La adquisición prenatal y peris c i l ae especies de Haemophilus desde el aparato genital « ü í r n o también se asoció con prematuridad, rotura prematura je membranas, amnionitis y sepsis neonatal en éste y en otros dios.287,979 La biotipificación de cepas aisladas en los genitales (véase adelante) mostró que H. influenzae biotipos IV no tipifiotoie \ cepas de H. parainfluenzae biotipos I y II son habitane frecuentes del aparato genital y producen infecciones geni_ es localizadas e infecciones sistémicas maternas y neonatac - posparto.1038 Otros estudios de cepas de H. influenzae no ■píficables desde el punto de vista serológico recuperadas de e&as infecciones han sugerido la existencia de una genoespe.. r .ríptica nueva de H. influenzae.1036-1038 Esta genoespecie se ~ : l . a bioquímicamente como biotipo IV (indol negativa, urepositiva y ornitina descarboxilasa positiva) pero es caractensoca por otros criterios fenotípicos y genéticos. Estas cepas rec-en fimbrias peritricas, un perfil OMP característico en elecr : resis en gel de poliacrilamida, expresan un OMP variante véase recuadro 9-3) y exhiben un patrón enzimático singu­ lar en electroforesis enzimática multilocus.913,1037 Los estudios hibridación de DNA-DNA y de polimorfismo de longitud de —¿amentos de restricción del DNA ribosómico indican que estas cepas son clónales y genéticamente homogéneos, comn__ in menos del 70% de la similitud genómica global con H. ¡enzae estricto sensu y están relacionadas más estrecha­ mente con cepas de H. haemolyticus.xmi En la actualidad, esta

H. influenzae causa infecciones oculares que varían amplia­ mente en gravedad, entre ellas, conjuntivitis, escleritis y endoftalmitis. Produce una conjuntivitis aguda contagiosa denomi­ nada coloquialmente “ojo rosado”. Aparecen brotes localizados de conjuntivitis aguda entre personas que comparten toallas, pañuelos u otros objetos que entran en contacto directo con la piel del rostro o los ojos. El color rosado difuso de la escleró­ tica y la presencia de una secreción serosa o purulenta son prácticamente diagnósticos de conjuntivitis por Haemophilus. La conjuntivitis hemorrágica también puede ocurrir como parte de la presentación clínica de la enfermedad invasora por H. influenzae tipo b.994 La endoftalmitis por H. influenzae es infre­ cuente pero puede ocurrir como una complicación iatrogénica de la cirugía ocular (p. ej., luego de procedimientos de fistulización para el glaucoma).21,1146 Sykes y cois, informaron tres casos de escleritis por H. influenzae.1240 Estos pacientes ancia­ nos presentaron disminución grave de la agudeza visual, dolor y abscesos esclerales nodulares de los que se recuperó H. influenzae en cultivo. También se lo puede aislar de las úlceras corneales herpéticas sobreinfectadas y de muestras corneales de pacientes con queratoconjuntivitis atópica.1181 Desde el punto de vista histórico, las cepas aisladas en las infecciones conjuntivales fueron designadas como una especie separada denominada “H. aegyptius". Desde el punto de vista fenotípico, estas cepas son similares a H. influenzae biotipo III. La presentación clínica característica, los rasgos bioquímicos y los estudios serológicos se han utilizado para sostener la con­ dición de "H. aegyptius” como una especie separada dentro del género. Sin embargo, los estudios de nucleótidos genómicos han demostrado una homología importante de secuencias entre "H. aegyptius” y H. influenzae, de modo que este microorga­ nismo se denomina ahora H. influenzae biogrupo aegyptius. Apareció un clon singular y altamente virulento de II. influen­ zae biogrupo aegyptius a comienzos de la década de 1980 como agente causal de un síndrome clínico denominado fiebre purpúrica brasileña.

FIEBRE PURPÚRICA BRASILEÑA

Durante la década de 1980, se reconoció un subgrupo de cepas que eran fenotípicamente indistinguibles de H. influen­ zae biotipo III (“//. aegyptius”) en asociación con brotes de una enferm edad grave denom inada fiebre purpúrica brasileña.. 157,158,541 p ue comunicada por primera vez en 1984 en la ciu­ dad rural de Promissao, estado de San Pablo. Brasil, cuando 10 niños (de 3 meses a 8 años de edad) murieron por una enfer­ medad aguda caracterizada por fiebre alta, dolor abdominal con vómitos, erupción petequial/purpúrica, shock hipotensivo y colapso vascular. Un brote posterior entre 10 niños en la ciu­ dad cercana de Serrana condujo a otras cuatro muertes.159 Los hemocultivos de estos niños dieron H. aegyptus. Si bien la fie­ bre purpúrica brasileña se asemejaba a la enfermedad meningocócica, la meningitis no formaba parte de la presentación clí­ nica. Durante las investigaciones epidemiológicas, se observa­ ron casos que tuvieron una conjuntivitis purulenta reciente o simultánea.157 Desde los brotes iniciales, se han comunicado

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Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

casos esporádicos en otras áreas de Brasil, y en el centro y oeste de Australia.159-847-1375 Las cepas de H. aegyptius asociadas con brotes recuperados de hemocultivos, cultivos conjuntivales o ambos han sido estu­ diadas extensamente y tienen varias características no halladas en H. aegyptius aislado de casos de conjuntivitis purulenta sin fiebre purpúrica brasileña.167201-3841022-1367 Estas características son la falta de tipificación serológica, la presencia de un plásmido singular de 24 kDa, un OMP de 25 kDa característico, una proteasa A l de inmunoglobulina singular y resistencia a los efectos bactericidas del suero humano normal. El OMP de 25 kDa es una proteína de las fimbrias con homología de se­ cuencia del 71% con la principal proteína de las fimbrias de H. influenzae tipo b; la clonación y la secuenciación de los genes de las fimbrias de estas cepas han demostrado un 82% de homología de secuencia con genes de las fimbrias de las cepas de H. influenzae tipo b de referencia.1229 1367 1374 Los estudios de aglutinación e inhibición de la aglutinación de eritrocitos tam­ bién han mostrado que esta proteína de las fimbrias se une al mismo receptor de la superficie de los eritrocitos que la prote­ ína de las fimbrias de H. influenzae tipo b.1231 Las cepas de la fiebre purpúrica brasileña tienen un epítopo de la superficie celular altamente conservado y estable del OMP P1 de 48 kDa que no está presente en cepas no asociadas con esa enferme­ dad.771 Estos estudios arribaron a la conclusión de que los bro­ tes de fiebre purpúrica brasileña eran causados por un clon sin­ gular de H. aegyptius designado "H. influenzae biogrupo aegyptius”. Las cepas aisladas en brotes o casos esporádicos de fiebre purpúrica en Brasil aparentemente carecen del plásmido de 24 kDa y las cepas de la fiebre purpúrica brasileña austra­ liana tampoco tienen algunos de los marcadores inusuales.733 Al parecer, las cepas australianas representan un segundo clon de fiebre purpúrica brasileña.839 No se han comunicado casos ni brotes en otros sitios, aunque este diagnóstico se sospechó en un varón de 17 meses de Connecticut que presentó conjuntivi­ tis purulenta, fiebre, somnolencia y un hemocuitivo positivo con H. influenzae no tipificable biotipo III.1331 Los exámenes post mórtem de hígado, bazo y ganglios linfáticos establecie­ ron que la infección aplastante por virus de Epstein-Barr fue la causa de la enfermedad en ese niño. Algunos estudios con las bacterias que producen fiebre pur­ púrica brasileña también han sugerido que los microorganis­ mos tienen cápsula, aun cuando son no tipificables. Carlone y cois, comunicaron que el DNA de las cepas aisladas en pacien­ tes con fiebre purpúrica brasileña hibridizaba con una sonda que contenía secuencias de DNA relacionadas con la síntesis del polisacárido capsular de H. influenzae (secuencias del gen cap).201 Sin embargo, Dobson y cois, observaron que la sonda utilizada en los primeros estudios contenía secuencias que eran homologas no sólo de los genes cap de las cepas de H. influen­ zae tipificables, sino que también contenía secuencias de un elemento de inserción (\S1016) presente en las cepas de H. influenzae biogrupo aegyptius relacionadas con la fiebre pur­ púrica brasileña pero no en las cepas de H. influenzae que no producen fiebre purpúrica brasileña.337 La transposición de las secuencias 1S1016 de un plásmido en el genoma del clon vin­ culado con la fiebre purpúrica brasileña puede haber contribui­ do a la virulencia al alterar la transcripción y la expresión de los genes adyacentes al sitio de inserción.337 Algunos estudios in vivo que utilizaron un modelo de rata lactante y estudios in vitro con una línea de células endoteliales microvasculares humanas también han mostrado que las cepas de H. influenzae biogrupo aegyptius asociadas con fiebre purpúrica brasileña son más virulentas que las cepas no asociadas.1105-1370 Sobre la

base de los métodos de electroforesis enzimática multilocus, las cepas del biogrupo aegyptius forman tres linajes distintos dentro de la especie H. influenzae. Las cepas asociadas con la fiebre purpúrica brasileña no están estrechamente relacionadas desde el punto de vista genético con la cepa del biogrupo aegyptius que no produce fiebre purpúrica brasileña pero mues­ tran una relación genética estrecha con H. influenzae encapsu­ lado de serotipo capsular c.620-916 OTRAS INFECCIONES POR HAEMOPHILUS INFLUENZAE

H. influenzae tipo b puede causar otras infecciones infre­ cuentes; en algunos casos, el aislamiento de especies de Haemophilus fue inesperado. Se ha comunicado celulitis periorbitaria y facial, hallazgo frecuente en niños con bacteriemia tipo b y en adultos con baeteriemia e infecciones respira­ torias.356 Se ha aislado H. influenzae de infecciones abdomina­ les (p. ej., peritonitis, abscesos pancreáticos, apendicitis) y de infecciones del tracto hepatobiliar (colecistitis, absceso hepáti­ co piógeno).67-953-1034 En un paciente con enfermedad por HIV1 también se diagnosticó epididimitis y orquitis debidas a H. influenzae290 Aunque ocurrían infecciones esporádicas debidas a H. influenzae tipo no b encapsulado antes de la disponibilidad de la vacuna, en la era de la vacunación se están reconociendo cada vez más infecciones graves causadas tanto por los seroti­ pos capsulares tipo no b como por cepas no tipificables de H. influenzae 2Mi En 2001, se observaron cinco casos de enferme­ dad invasora causada por H. influenzae serotipo a en un perío­ do de 10 meses en Utah.2 Estos niños (edad mediana, 12 años) presentaron meningitis, baeteriemia y, en un caso, púrpura ful­ minante. El examen mediante técnicas moleculares mostró que tres de las cuatro cepas aisladas disponibles contenían una deleción en el gen \S1016-bex A, característica también halla­ da en las cepas virulentas de serotipo b. El examen de 48 H. influenzae tipo no b invasores mediante tipificación con endonucleasas de restricción mostró que las cepas tipo a se dividían en dos grupos clónales mayores, mientras que las cepas tipo e y tipo f, respectivamente, representaban clones únicos. Los investigadores propusieron que la mayor incidencia de H influenzae encapsulado tipo no b reflejaba la aparición de clo­ nes hipervirulentos o la diversidad genética limitada entre las cepas tipo no b.970 En un estudio llevado a cabo en Brasil antes de la introducción de la inmunización activa y durante su trans­ curso, la incidencia de meningitis por H. influenzae tipo a aumentó ocho veces durante la época en la cual la incidencia de meningitis tipo b había disminuido un 69% .1070 Como ya se mencionó, las infecciones bacteriémicas por H. influenzae que ocurren en la era de la vacuna se deben en gran parte a cepas no tipificables.325-395-910 En general, estas infecciones ocurren en individuos con una enfermedad subyacente importante (p. ej.. enfermedad de Hodgkin, leucemia linfocítica aguda) y en aquellos con defectos subyacentes en la producción de inmunoglobulinas. Haemophilus parainfluenzae

H. parainfluenzae es un agente infrecuente de infecciones hu­ manas. Además de endocarditis (véase sección sobre “Endo­ carditis”, antes), H. parainfluenzae ha sido aislado de casos de epiglotitis bacteriémica, bronquitis, sinusitis, otitis media. EPOC, neumonía, empiema, peritonitis, celulitis, abscesos, sep­ sis neonatal; infecciones de articulaciones naturales y protési­ cas, infecciones genitales y de las vías biliares, y abscesos ence-

Especies de H aem ophilus

f ü v - i-K 24.68,123,232,435,573,633,962,987,1013,1031,1349 Q |] ^ y CQJS

C O m U I lic a -

m un caso de osteomielitis vertebral por H. parainfluenzae - - í se evidenció clínicamente 3 meses después de que el pa­ centé se sometió a una septoplastia nasal; se presume que el 2fixredimiento quirúrgico produjo una baeteriemia que sembró enebras lumbosacras.967 Este microorganismo también ha a i : -islado en raras ocasiones como causa de infección urina­ ria en adultos.895 McClain y cois, informaron un caso de uretriá» rurulenta por H. parainfluenzae en un varón de 24 años que v: jmpañó por baeteriemia con el mismo microorganismo y ampien se ha comunicado prostatitis por H. parainfluenzae en m h :>mbre de 29 años con infección por HIV-1.258-843 Se han comunicado raras infecciones hepatobiliares por H. parainOmenzae, que incluyen abscesos hepáticos, tanto en niños como ea adultos.24-438-616 En estas últimas infecciones se propuso que H parainfluenzae ganaba acceso al árbol hepatobiliar desde el j a r a t o digestivo más que a través de una vía hematógena. Esto : ■¿poyado por la falta de una baeteriemia documentada por H. xra w flu en za e en los pacientes, y por el hecho de que se lo ha ü-ilado del tubo digestivo con mucha mayor frecuencia que «ros hemófilos.850 -vophilus aphrophilus y Haemophilus ~ohrophilus

H. aphrophilus y H. paraphrophilus son parte de la microflor-Jógena de la cavidad bucal, donde son componentes meno­ res de la flora periodontal sana.1268 Entre los hemófilos, H. aphwxmilus y H. paraphrophilus, junto con H. parainfluenzae, son bes especies asociadas con mayor frecuencia con endocarditis h e^'S sección sobre “Endocarditis”, antes). Además, estas bacm a s también producen infecciones de cabeza y cuello (sinusirtitis media, epiglotitis, absceso encefálico), infecciones resultantes de la diseminación hematógena (neumonía, empie- artritis séptica, osteomielitis vertebral, celulitis, endoftalmi- meningitis, fascitis necrosante), infecciones abdominales (in­ serciones del tracto hepatobiliar, colecistitis, abscesos abdomir^ e s i e infecciones de heridas.275-332’377650-663-880-1371 Neutropenia, rr:cesos malignos y quimioterapia oncológica son factores prei--ponentes para las infecciones por estos microorganismos.377 H aphrophilus y H. paraphrophilus se asemejan a otras bactem s gramnegativas con requerimientos nutricionales especiales Jesde el punto de vista del cultivo y forman parte del grupo HACEK”, que incluye Haemophilus (H), especies de Actinobacillus (A), Cardiobacterium (C), Eikenella (E) y Kingella (K). Estos microorganismos se describirán más adelante. 1 -2 s especies de Haemophilus

H. haemolyticus, H. parahaemolyticus y H. paraphrophae'.yticus forman parte de la flora normal del aparato respira­ torio y pocas veces se asocian con infecciones. H. segnis ha ?:do aislado de la placa dental y las vías respiratorias altas. En ¡981, Bullock y Devitt informaron sobre el aislamiento de H. - snis de sangre y pus de un absceso pancreático en un homrre alcóholico de 29 años.188 Con posterioridad, Welch y cois, rescribieron el aislamiento de H. segnis, tanto en cultivos raros como mixtos, de cinco pacientes con apendicitis -ru d a.1362 Este microorganismo también fue recuperado, junto . ?n microorganismos anaerobios, de un absceso umbilical -utáneo de una mujer de 70 años.252 Se necesita otra investir^eión de estos microorganismos con requerimientos nutriciorales especiales para una apreciación más completa de su r-ntencial patógeno.

421

Haemophilus ducreyi

H. ducreyi es el agente causal del chancroide. una infección de transmisión sexual altamente contagiosa caracterizada por úlceras genitales y perianales dolorosas y linfadenopatía ingui­ nal sensible a la palpación.1088 El chancroide es la causa princi­ pal de enfermedad ulcerosa genital en América Latina. Africa, este y sudeste asiático e India. Se han comunicado brotes de chancroide en algunas ciudades costeras en los Estados Unidos y Canadá. En estos brotes, las prostitutas han sido el reservorio habitual, y un factor de riesgo conductual importante es el intercambio de sexo por dinero o drogas (p. ej.. cocaína en crack). En estos brotes, se han observado relaciones de casos hombre:mujer de 3:1 a 25:1. Aunque se han identificado varios posibles factores de viru­ lencia en H. ducreyi, su función en la patogenia se conoce poco. Todas las cepas parecen tener fimbrias superficiales finas y enmarañadas, OMP de 40 kDa y 18 kDa, lipooligosacáridos y una citotoxina/hemolisina.12-13-169-1211-1284-1394 En la actualidad, no está claro el papel de estas moléculas en la patogenia de la enfermedad. H. ducreyi también tiene un requerimiento de cre­ cimiento específico para hierro, y aunque carece de sideróforos, el microorganismo tiene un receptor sobre su superficie que se une a la hemoglobina y es esencial para la captación de hierro.370 In vitro, es capaz de fijarse, invadir y producir efectos citopáticos en células de prepucio humano cultivadas, y se han desarrollado varios modelos animales para el chancroide con el fin de estudiar la virulencia y la patogenicidad, incluidos mode­ los de conejo, cerditos, primates y voluntarios humanos.14-23-1235 Las lesiones genitales causadas por este microorganismo también se denominan “chancros blandos" porque, al contrario de la lesión primaria (chancro) de la sífilis, los bordes de la lesión son irregulares y plegados y no están bien demarcados e indurados (véase lámina en color 9-2B).1088 Después de un pe­ ríodo de incubación de 4 a 7 días, las lesiones comienzan como pápulas eritematosas sensibles a la palpación que se vuelven pustulosas, erosionadas y ulceradas en las siguientes 48 a 72 horas. En los varones, las lesiones del chancroide suelen ser sensibles a la palpación, dolorosas y están cubiertas por un exu­ dado gris amarillento que cubre una base sangrante y dura. Suelen aparecer una a tres lesiones sobre los genitales externos; en los no circuncisos, estas lesiones a menudo se encuentran por debajo del prepucio. En las mujeres, se pueden presentar múltiples lesiones sobre los labios genitales, dentro de la vagi­ na y en la región perianal. Las lesiones pueden coalescer para formar grandes áreas ulcerativas que pueden sobreinfectarse. El chancroide extragenital es infrecuente, pero se describieron lesiones sobre la piel sin pelo, en la boca y sobre las conjunti­ vas. En alrededor del 50% de los pacientes infectados, se desa­ rrolla una linfadenopatía inguinal unilateral. Estas adenomegalias en realidad pueden supurar a través de la piel suprayacente para formar grandes abscesos inguinales y fístulas. En los países subdesarrollados, la infección por H. ducreyi se asocia con la transmisión del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-l) y tipo 2 (HIV-2). Algunos estudios en África han proporcionado evidencia de que el chancroide es un factor de riesgo para la transmisión heterosexual del HIV-l, el agente etiológico del SIDA.729-1178 Al parecer, las úlceras geni­ tales debidas a chancroide y otros agentes (p. ej., sífilis) vuel­ ven a las mujeres más sensibles a la infección por HIV-l luego del contacto heterosexual con hombres infectados y la presen­ cia de úlceras genitales en mujeres infectadas por HIV-l tam­ bién aumenta la probabilidad de que sus parejas de sexo mas­ culino se infecten. Las úlceras genitales debidas a chancroide y

422

CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

otras enfermedades, como linfogranuloma venéreo, al parecer facilitan la evacuación del virus en las secreciones vaginales. En Kenya, por ejemplo, un tercio de las infecciones por HIV en las prostitutas y al menos el 50% de las infecciones por HIV-1 en sus clientes varones parecen relacionarse significativamente con la infección simultánea por H. ducreyi.129 Diagnóstico de laboratorio de las infecciones por Haemophilus EXAMEN DIRECTO DE MUESTRAS CLÍNICAS

Tinción de Gram. Se puede hacer un diagnóstico presuntivo rápi­ do de meningitis por H. influenzae mediante el examen directo de LCR utilizando la tinción de Gram. Si se recibe LCR sufi­ ciente (más de 1-2 mL). se centrifuga la muestra para obtener un gránulo de material para examen y cultivo. La citocentrifugación de muestras de LCR aumenta la detección de pequeñas cantidades de microorganismos e incrementa considerable­ mente la sensibilidad de la tinción de Gram en comparación con las muestras centrifugadas de forma convencional o no centrifugadas.227 En los frotis con tinción de Gram, los micro­ organismos Haemophilus aparecen como pequeños cocobaci­ los gram negativos de tinción pálida (véase lám ina en color 9-1 A). En ocasiones, se observan células filamentosas delga­ das. Aunque H. influenzae puede ser el patógeno probable sobre la base del aspecto en la tinción de Gram y la presenta­ ción clínica del paciente, los microorganismos no pueden ser identificados sólo a partir del frotis teñido con Gram. Más aún, una tinción de Gram negativa no descarta la posibilidad de infección por Haemophilus porque se pueden presentar muy pocos microorganismos en la muestra. Los frotis teñidos con Gram de otros tipos de muestras también pueden ser útiles para el diagnóstico presuntivo. En un estudio del año 2000, la sen­ sibilidad y la especificidad de la tinción de Gram del esputo para el diagnóstico de la neumonía por H. influenzae adquirida en la comunidad fueron del 82% y del 99%, respectivamente, si se juzgaba que la muestra era suficiente según los criterios para el cribado del esputo.1098 Detección de antígeno capsular tipo b. Para el diagnóstico rápido de las infecciones por H. influenzae tipo b. existen técnicas inmunológicas para la detección del antígeno capsular PRP tipo b en LCR, suero y orina (cap. 3). Los métodos comercia­ les incluyen las técnicas de aglutinación de partículas de látex y coaglutinación de proteína A del estafilococo. Los equipos comerciales de aglutinación de partículas de látex son el Directigen Meningitis Combo Test Kit (BD Biosciences, Sparks, MD) y el Wellcogen Bacterial Antigen Kit (Murex Diagnostics, Dartford, Inglaterra). La prueba de coaglutinación de proteína A comercial es la prueba Phadebact para LCR (Boule Diagnostics, Huddinge, Suecia). Todos estos equipos contienen reactivos para detectar antígeno PRP de H. influen­ zae grupo b junto con reactivos para S. pneumoniae, N. meningitidis y detección de antígeno de estreptococos del grupo B en líquidos corporales. Varios estudios han comparado las sensibi­ lidades y especificidades relativas de aglutinación de partículas de látex y coaglutinación de proteína A para detectar antígeno PRP de H. influenzae tipo b en distintos líquidos corporales de pacientes con infecciones meníngeas y no meníngeas.271-820 1359 La mayoría de los estudios indican que la aglutinación de par­ tículas de látex y la coaglutinación de proteína A suelen ser más sensibles y detectan cantidades menores de antígeno que contra la inmunoelectroforesis (CIE), el método más antiguo para detectar antígenos bacterianos en los líquidos corporales. A pesar de la realización de estas pruebas en ensayos clíni­ cos que condujeron a la aprobación para su uso, muchos labo­ ratorios han dejado de ofrecer estas pruebas de rutina. Además

del alto costo de los reactivos de látex/coaglutinación de prote­ ína A propiamente dichos, su utilidad diagnóstica y pronostica no ha sido confirmada después de años de experiencia. Perkins y cois, revisaron todas las pruebas del látex realizadas en un período de 10 meses en dos hospitales y observaron 57 resulta­ dos positivos.1001 La revisión de estos casos puso en evidencia que 31 resultados eran falsos positivos, 22 eran verdaderos positivos y 4 eran indeterminados. Las pruebas falsas positivas se observaron principalmente con las muestras de orina. Los pacientes que tuvieron resultados falsos positivos en las prue­ bas recibieron un tratamiento innecesario que condujo a una hospitalización prolongada y otras complicaciones. Además, entre los 22 casos con resultados verdaderos positivos en la aglutinación de partículas de látex, no hubo ninguno en el cual el tratamiento antibiótico o clínico del paciente se alterara sobre la base del resultado de la prueba. Estas pruebas pueden ser muy útiles en casos de sospecha de meningitis para la cual la tinción de Gram inicial es negativa, los cultivos de LCR o ambos son negativos después de 48 horas.410 El método reco­ mendado para la detección directa óptima de H. influenzae en LCR depende de la inspección cuidadosa de un frotis teñido con Gram preparado a partir de una muestra citocentrifugada. Los métodos del látex también son mucho menos sensibles para la detección directa que los enfoques moleculares. Singhi y cois, examinaron el LCR de 107 niños con sospecha de meningitis; el 79% de ellos habían recibido también antibióti­ cos.1179 Se aisló H. influenzae tipo b en 14 casos, la prueba de aglutinación del látex fue positiva en 23 casos y la PCR para H. influenzae tipo b fue positiva en 37 casos, incluidos todos aque­ llos que fueron positivos en el cultivo o en la aglutinación del látex.

CULTIVO DE ESPECIES DE HAEMOPHILUS

La recuperación óptima de especies de Haemophilus de las muestras clínicas depende de la recolección y el transporte correctos de las muestras, y del uso de medios de cultivo y ambientes de incubación apropiados. Como estos microorga­ nismos tienen requerimientos nutricionales especiales, las muestras que los contienen no deben ser expuestas a la deseca­ ción ni a temperaturas extremas. Las muestras fundamentales, como el LCR, deben s,er transportadas a mano hasta el labora­ torio clínico lo antes posible después de la recolección. El agar sangre de carnero convencional no es apropiado para el cultivo de especies de Haemophilus que requieren factor V para el cre­ cimiento debido a que la sangre ovina contiene naturalmente enzimas que inactivan el factor V.59 La sangre de conejo o de caballo no contiene estas enzimas y los medios de agar que contienen algunos de estos productos hemáticos apoya el cre­ cimiento de la mayoría de las especies de Haemophilus. Cualquiera que sea el medio utilizado, el aislamiento de Haemophilus requiere la incubación a 35 a 37 °C en un medioambiente húmedo con mayor C 0 2 (3-5%). Esta atmósfera es provista por las incubadoras modernas de CO, o por jarras de anaerobiosis por extinción con vela. El aislamiento primario de especies de Haemophilus de muestras clínicas se logra uti­ lizando agar chocolate, agar para aislamiento de Haemophilus o la técnica de siembra en estría para estafilococos. Agar chocolate. El agar chocolate se prepara agregando sangre de camero a una base de agar enriquecido cuando la temperatura del medio es lo suficientemente alta como para lisar los eritro­ citos sin inactivar el NAD en el lisado de sangre (alrededor de 80 °C). La mayoría de los laboratorios clínicos compran agar chocolate y otros medios bacteriológicos a vendedores comer-

Especies de H aem ophilus

dales. En general, el “agar chocolate” preparado en el comercio ;: ntiene una mezcla sintética de hemina y un “cóctel” de facto­ res de crecimiento definidos químicamente que se agregan al medio de base de agar para gonococos. La base de agar para ; : r.ococos contiene proteosa peptona, almidón de maíz, buffers Je fosfato monobásico y dibásico, cloruro de sodio y agar. El suplemento definido químicamente contiene NAD, vitaminas IB clorhidrato de tiamina), minerales (hierro, magnesio), ami■oáridos que se necesitan para el tratamiento de las bacterias .: n requerimientos nutricionales especiales (cisterna, glutamii - y glucosa. Estos suplementos se comercializan con los nom­ bres IsoVitalex® (BD Biosciences) y GCHI Enrichment® Remel Laboratories, Lenexa, KS). La desventaja de utilizar agar chocolate para el aislamiento primario de especies de Haemophilus es que el medio no per■xite la determinación de las propiedades hemolíticas, lo que - uda a diferenciar H. haemolyticus y H. parahaemolyticus de H. influenzae y H. parainfluenzae, respectivamente. Sin embargo, es un medio excelente para la recuperación de otros microorganismos con requerimientos nutricionales especiales, como N. meningitidis y N. gonorrhoeae, de muestras que no i-elen estar contaminadas con otros microorganismos, como LCR o líquido articular. Como las especies de Haemophilus soti habitantes frecuentes de las vías respiratorias altas (que incluyen especies tanto hemolíticas como no hemolíticas), m .chos laboratorios han adoptado el agar para aislamiento de Haemophilus para la recuperación de estos microorganismos je maestras respiratorias. Se describieron medios selectivos :: r base de agar chocolate que contienen distintos antibióticos
42 3

cas (véase lámina en color 9-1C). Este método se puede utili­ zar para la identificación presuntiva de especies de Haemophilus cuando no se requiere ni es esencial la identifica­ ción de especie (p. ej., muestras del aparato respiratorio). IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE HAEMOPHILUS

Morfología de las colonias y características del cultivo. En agar chocolate, las colonias de H. influenzae son lisas y de color gris azulado; las cepas muy encapsuladas pueden parecer mucoides (véase lámina en color 9 -IB). La mayoría de las cepas produ­ cen colonias enteras, lisas y convexas de 1-2 mm después de un crecimiento de toda la noche. Algunas tienen olor a "E. c o ir debido a la producción de indol. En general, las colonias de H. parainfluenzae son más pequeñas, de color gris claro y presen­ tan un aspecto enmarañado en los medios de crecimiento. Las reacciones de oxidasa y de catalasa para estos microorganis­ mos suelen ser positivas, aunque la reacción de oxidasa puede ser tardía. Las colonias de H. aphrophilus y H. paraphrophilus son pequeñas después de 24 horas de incubación; se necesitan a menudo 48 a 72 horas antes de poder determinar la morfolo­ gía de las colonias y para que exista el crecimiento suficiente para las pruebas de identificación preliminares. En agar choco­ late, las colonias miden 0,5 a 1 mm de diámetro, son convexas, granulares y tienen un pigmento amarillento (véase lámina en color 9-1D, E y F). Se puede detectar un olor característico a “pasta de escuela primaria”. H. aphrophilus no necesita factor V y crece en agar sangre de carnero y en BHI o agar tripticasa de soja sin suplementos. H. paraphrophilus es bioquímicamen­ te similar a H. aphrophilus, salvo en que se necesita factor V para el crecimiento. Estos microorganismos son o x id ^ a nega­ tivos, aunque pueden observarse reacciones positivas débiles o tardías con algunas cepas. Tanto H. aphrophilus como H. paraphrophilus también son catalasa negativos, una caracterís­ tica que ayuda a diferenciarlos de Actinobacillus actinomycetemeomitans, que se asemeja a estos otros microorganismos con requerimientos nutricionales especiales (véase lámina en color 9-1C y D). Procedimientos de identificación. Las especies de Haemophilus comúnmente halladas son identificadas por sus reacciones hemolíticas en agar sangre de caballo y sus requerimientos de crecimiento para los factores X y V (cuadro 9-2). Se utilizan de rutina discos de papel de filtro o tiras impregnadas con fac­ tor X, factor V o ambos, para determinar estos requerimientos de factores. El microorganismo por identificar se siembra en estría en un medio deficiente en factores de crecimiento, como agar tripticasa de soja. Cuando se seleccionan colonias para las placas de cultivo primario para esta prueba es importante no transferir ninguno de los medios de agar chocolate u otros medios que contienen sangre a la placa para la determinación de los factores. La suspensión del microorganismo en un caldo deficiente en factores antes de la inoculación en la placa es una forma de reducir la transferencia de factores de creci­ miento y los consiguientes resultados positivos falsos. Se colocan los discos o las tiritas de factor X y de factor V sobre la superficie del agar separados por 1 o 2 cm. Si se utiliza tam ­ bién un disco/tirita que contiene ambos factores, los discos pueden estar más separados sobre la superficie del agar. Se incuban las placas en C 0 2 al 5-7% a 35 °C durante 18 a 24 horas y se observan los patrones de crecimiento alrededor de los discos/tiritas. Luego se hace la diferenciación de las espe­ cies de Haemophilus sobre la base de los factores de creci­ miento que se muestran en el protocolo 8-1 y en la lámina en color 9 -ID y E.

424

C aracterísticas para la id en tificación de esp ecies de H a e m o p h i l u s h u m a n a s

DE ALA

PRUEBA DE INDOL

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REQUERIMIENTO DE: BIOTIPO

X

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ORNITINA DESCARBOXILASA

Glucosa

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Lactosa

Fructosa

Ribosa

Xilosa

Mañosa

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PRODUCCIÓN DE ÁCIDO A PARTIR DE:

9

HEMOLISIS

V

PRUEBA DE UREASA

CAPÍTULO

C u a d ro 9 -2

H. influenzae

Biotipo II Biotipo III*

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Biotipo IV

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Biotipo V

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Biotipo VI

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Biotipo V il

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Biotipo VIII

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Biogrupo aegyptius

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Biotipo I

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Biotipo II

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Biotipo III

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Biotipo IV

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Biotipo VI

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+*'

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ND

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ND

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V

Biotipo VII

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ND

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ND

Biotipo VIII

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ND

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ND

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V

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V

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H. segnis

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+d

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H. aphrophilus

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H. paraphrophilus

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fi, parainfluenzaef

//. haemolyticus

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//. parahaemolyticus

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H■paraphrophaemolyticus

+

H. ducreyi

+d

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+ -

-

V

+ : positivo; negativo; +d: positivo débil; ND: no disponible. 'Las reacciones de biotipo son idénticas a las de H. influenzae biogrupo ; egyptius, pero las cepas del biogrupo aegyptius son xilosa negativas. ‘'Las cepas de H. parainfluenzae biotipo V son idénticas a H. segnis.

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

Biotipo I

Especies de H aem ophilus

Doren y Chapín evaluaron el rendimiento del agar tripticasa de soja, agar con infusión de encéfalo y corazón, agar con nutrientes y agar de Mueller-Hinton en la identificación de dis­ cos de factores de 187 aislamientos de H. influenzae.341 Observaron que 95,7%, 92,5%, 56,1% y 71,1% de los aisla­ mientos eran identificados correctamente en los cuatro medios, respectivamente. Las lecturas falsas positivas de crecimiento alrededor de los discos de factor V (que conducen a una iden­ tificación errónea de H. influenzae como H. parainfluenzae) en agar infusión de cerebro y corazón y la falta de crecimiento de as cepas en los agares de Mueller-Hinton y con nutrientes fue­ ron los principales hallazgos del estudio. Se recomendó el agar np ticasa soja como medio de elección para realizar el proce­ dimiento de determinación de factores de crecimiento. Si bien la interpretación de las pruebas de requerimiento de ractores suele estar clara, se han comunicado identificaciones erróneas causadas por confundir H. influenzae con H. parainñuenzae y viceversa debido a resultados discordantes en las ae:erminaciones del factor X. Se citaron las siguientes razones para estas imprecisiones: 1) la presencia de cantidades míni­ mas variables de hemina en el medio basal utilizado para la rm eba de determinación de factores; 2) la transferencia de facr X en los inóculos tomados de las colonias que crecen en el “ edio que contiene sangre y 3) la naturaleza de requerimientos ■utricionales especiales de algunas cepas de H. parainfluenzae ■ .i consiguiente dificultad para leer las pruebas de factores para estas cepas. La prueba de ácido 8-aminolevulínico (ALA)r»; tirin a evita muchos de los problemas descritos antes para la a,Terminación de requerimientos de factor X.684-909 Esta prueba es una evaluación directa de la capacidad de las cepas de Haemophilus para sintetizar intermediarios protoporfirínicos er ¡a vía biosintética hasta hemina a partir del compuesto prerars :>r ácido 5-aminolevulínico. Las cepas que necesitan factor X e ¿reno para su crecimiento (H. influenzae y H. haemolytiatlí son incapaces de sintetizar protoporfirinas a partir de ALA y en consecuencia, son negativas con esta prueba. Las cepas .xc no necesitan factor X exógeno para el crecimiento (H. pmnúnfluenzae y H. parahaemolyticus) tienen las enzimas que sm e iz a n compuestos protoporfirínicos a partir del sustrato IL A y, por lo tanto, son positivas en la prueba de ALA-porfiAdemás, tanto H. aphrophilus como H. paraphrophilus son posarnos en la prueba de ALA-porfirina. Los discos de papel de M r: impregnados con ALA (BD Biosciences; Remel La■ ra: ries) o los medios de crecimiento que contienen el reactivo Remel Laboratories) también se pueden utilizar para la p re b a de ALA-porfirina (véase lámina en color 9-1F y G). Con e - e: do del disco, se humedece el disco con agua y se inocula « s e microorganismos desde los medios de crecimiento. Después - - r ras de incubación, se observa el disco con luz ultraviole­ ta de Wood). La fluorescencia rojo ladrillo en el área de •qpésh del microorganismo indica un resultado positivo de la ranera. ia fluorescencia morada, un resultado negativo. Con el ■ b í de agar ALA, se inocula el microorganismo en el medio ; *: :ncuba durante toda la noche. Al día siguiente se exa~ :r_ e! crecimiento bajo una luz de Wood para detectar fluo¡fexxncia rojo ladrillo. rruebas para hemolisis en agar sangre de caballo, los ■ ^ o im ie n to s de factores y la prueba de ALA porfirina han ■ o r.^rporados en sistemas de placas sectorizadas comerrara la identificación de especies de Haemophilus. Estos ■ec r> en el Haemophilus ID II Triplate y la placa Haemophilus I - ^ -ad (Remel). La triplaca es una placa dividida en tres que a r ; - e agar sangre de caballo, agar con contenido de factor V ? iear con contenido de ALA. Luego de la inoculación y la

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incubación durante toda la noche, se lee la placa inspeccionan­ do el sector de agar sangre para detectar hemolisis, buscando crecimiento en el sector del factor V y crecimiento fluorescen­ te rojo ladrillo en el sector de ALA bajo iluminación con luz de Wood. La placa en cuadrantes contiene cuatro sectores que contienen medio de Mueller-Hinton con suplemento de facto­ res con sangre de caballo, medio enriquecido en factor X, medio enriquecido en factor V y medio que contiene tanto fac­ tor X como V, respectivamente. Sobre la base de la reacción hemolítica y del patrón de crecimiento en los cuadrantes res­ tantes, se puede identificar la cepa aislada. Serotipificación de Haem ophilus influenzae. La técnica más sim­ ple para la serotipificación es la aglutinación en portaobjetos. Se prepara una suspensión densa del microorganismo en solu­ ción salina. Se colocan gotas únicas de la suspensión en cada una de una serie de círculos sobre un portaobjetos de vidrio que corresponde a la cantidad de sueros por evaluar, más un control de solución salina. Se agregan antisueros específicos de tipo a cada uno de los círculos de prueba y se rota el portaobjetos. La aglutinación rápida (menos de 1 minuto) de los microorganis­ mos mediante un antisuero específico y la ausencia de agluti­ nación en el control salino identifican la cepa aislada como un serotipo específico. Existen antisueros comerciales polivalen­ tes y específicos de tipo para los seis serotipos de H. influenzae en BD Biosciences. La serotipificación de las cepas clínicas mediante aglutinación en portaobjetos debe realizarse en forma cuidadosa con agentes confiables cuya calidad esté controlada con microorganismos de serotipo conocido. En un estudio reciente, los CDC observaron discrepancias importantes entre los resultados de la tipificación serológica realizada en los departamentos de salud estatales y la detección de genes cap­ sulares mediante PCR (véase más adelante). En un examen de 141 aislamientos de H. influenzae de los departamentos de salud estatales, 56 (40%) de los identificados como un serotipo particular fueron no tipificables por PCR y se observó que dos, comunicados como tipos b y f eran tipos f y e, respectivamen­ te, por PCR.743 Más aun. de 40 cepas identificadas como H. influenzae tipo b mediante aglutinación en portaobjetos, 27 (68%) no contenían genes tipo b capsulares. La institución de pautas estrictas de control de calidad en tres laboratorios de ■‘prueba" del departamento de salud condujo a una mejoría importante, con una concordancia global del 94% entre los resultados de la aglutinación en portaobjetos y PCR para gen capsular. Existe una prueba de confirmación por cultivo de coagluti­ nación (Phadebact Haem ophilus, Boule Diagnostics) para la identificación y la serotipificación simultáneas de H. influen­ zae tipo b a partir de los medios de cultivo primarios. Este equipo contiene un frasco ampolla de células estafilocócicas sensibilizadas con anticuerpos tipo b (reactivo de prueba) y un segundo frasco ampolla de estafilococos sensibilizados con antisueros contra tipos a, c, d, e y f (reactivo control). Se mezclan colonias de medios de crecimiento con cada uno de los dos reactivos en un portaobjetos de cartón. Después de la mezcla, se hace oscilar el portaobjetos durante 30 a 60 segun­ dos. La aglutinación visible de la mezcla con reactivo de prue­ ba tipo b, pero no el reactivo control, identifica la cepa como H. influenzae tipo b. Una reacción positiva en el reactivo con­ trol indica que el microorganismo pertenece al tipo capsular a, c, d, e o f. Se ha demostrado que esta prueba es altamente sensible y específica para la identificación de H. influenzae tipo b.495 La serotipificación también se puede realizar mediante la incorporación de antisueros específicos de tipo en medio de

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CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

agar ópticamente claro que se complementa con factores X y V.84 En este formato, se detecta el tipo capsular mediante la for­ mación de una reacción de precipitación antígeno-anticuerpo (es decir, un “halo”) que rodea la colonia. Se puede utilizar este enfoque para la serotipificación simultánea de gran cantidad de cepas mediante la inoculación en el sitio de las cepas sobre la superficie de agar utilizando un replicador de Steers. También se puede utilizar el método de agar antisuero detectando la por­ tación orofanngea de H. influenzae tipo b. Cuando se utiliza con este objetivo, se agrega bacitracina para inhibir otros microorganismos orofaríngeos.84 Se pueden utilizar métodos moleculares para la tipificación capsular de H. influenzae. Falla y cois, crearon un método basado sobre PCR utilizando cebadores y sondas derivadas de secuencias de DNA específicas del tipo capsular clonadas a partir de grupos de genes capsulares (los loci cap) de los seis serotipos de H. influenzae ,394.487 Cuando se utilizan estas herra­ mientas junto con aquellas para el gen de exportación de la cápsula bexA, se podrían diferenciar entre ellos los mutantes tipo b capsulados, no capsulados y deficientes en cápsula. También se han identificado cebadores y sondas desarrollados a partir del DNA amplificado aleatoriamente para caracterizar a H. influenzae no tipificable mediante técnicas de PCR.651 Esta técnica se ha aplicado a investigaciones de brotes de enferme­ dades respiratorias asociadas con H. influenzae no tipificable y fue validada como un método epidemiológico aceptable cuan­ do se comparó tanto con el perfil de OMP como con los análi­ sis de restricción de genes rRNA.651 Biotipificación de H. influenzae y H. parainfluenzae. En su estudio taxonómico del género, Kilian introdujo pruebas bioquímicas para la identificación y la caracterización de los hemófilos.685 Los biotipos se determinan con tres pruebas: producción de indol, ureasa y ornitina descarboxilasa. Las cepas de H. influenzae podían ser divididas en siete biotipos que eran in­ dependientes del serotipo (tipo b, tipo no b o no tipificable).496'9521204 También se describieron siete biotipos de H. parainfluenzae utilizando estos métodos. Las reacciones de biotipificación para las especies de Haemophilus se incluyen

R ecuadro 9 -6

en el cuadro 9-2. En el recuadro 9-6 se describen los medios y los procedimientos utilizados para la biotipificación conven­ cional (véase lámina en color 9-1H). La biotipificación de las especies de Haemophilus ha mos­ trado que los biotipos específicos se asocian con diferentes infecciones, fuentes, propiedades antigénicas y patrones de resistencia a los antibióticos. Oberhofer y Back examinaron 464 H. influenzae y 83 H. parainfluenzae y observaron que H. influenzae biotipo I se recuperaba principalmente de LCR, san­ gre y secreciones respiratorias y que la mayoría era de lactan­ tes de menos de 1 año de vida.952 H. influenzae biotipos II y III también se recuperaron de cultivos conjuntivales y de esputo de niños de 1 a 5 años de edad y de adultos mayores de 20 años. Aunque la mayoría de las cepas serotipo b pertenecían al bioti­ po I, las cepas no tipificables eran principalmente biotipos II y III. En su estudio de 1979, Oberhofer y Back observaron una asociación entre H. influenzae biotipos II y III y las infecciones oculares; esta observación fue corroborada en un estudio del año 2002 en San Francisco.21952 Como ya se explicó, H. influenzae biotipo IV son patógenos emergentes en infecciones obstétricas, ginecológicas, perinatales y neonatales. Las genoespecies crípticas asociadas con infecciones matemofetales también se biotipifican como H. influenzae biotipo IV, lo que destaca los inconvenientes de los métodos fenotípicos para la tipificación de cepas. Las genoespecies crípticas pueden distin­ guirse de las cepas biotipo IV sólo mediante métodos de gené­ tica molecular que no se encuentran fácilmente en los labora­ torios de microbiología clínica. Estas cepas también pueden ser biotipificadas en forma menos confiable mediante sistemas de identificación comerciales. Quentin y cois, evaluaron cuatro sistemas por su capacidad para identificar/biotipificar 188 ais­ lamientos de genitales y neonatales.1035 De éstos, 167 (88%) fueron identificados y biotipificados correctamente, 8 fueron mal identificados y 13 fueron biotipificados incorrectamente al menos por un sistema. Los análisis de hibridación de DNADNA de los 21 aislamientos discrepantes pusieron en eviden­ cia que 15 de ellos eran las genoespecies crípticas del tracto genital.

M edios y pro cedim ientos para la biotipificación de H. influenzae y H. parainfluenzae

Prueba del indol Se prepara una suspensión importante del m icroorganism o en buffer de fosfato 0,05 M (pH 8,0) que contiene triptófano al 0.1% . Después de 4 horas de incubación a 35 °C, se agregan algunas gotas de reactivo de Kovac y se agita la suspensión. Un color rojo en la capa de alcohol superior es un resultado positivo de la prueba; un color amarillo es un resultado negativo. También se puede utilizar el caldo de indol-triptófano con una inoculación importante para los bacilos entéricos con el agregado del reactivo de Kovac después de una incubación de toda la noche.

Prueba de la ureasa Se prepara una solución balanceada de sales (KH:P 0 4 al 0,1% , K2H P 0 4 al 0,1% , NaCI al 0,5% , y 0,5 m L de una solución de rojo de fenol al 2%) (100 mL), ajustada a un pH de 7,0 y se la coloca en el autoclave. Se agrega urea acuosa y esterilizada con filtro (10 mL) y se coloca la solución en tubos estéri­ les en pequeñas cantidades. Para realizar la prueba, se prepara una suspensión importante del m icroorganism o en el medio. La aparición de un color rojo en el medio después de 4 horas de incubación es un resultado positivo de la prueba. También se pueden utilizar para esta prueba las porciones inclinadas del agar urea de Christensen con una inoculación importante.

Prueba de la ornitina descarboxilasa Se utiliza el caldo de ornitina descarboxilasa de M oeller estándar junto con un tubo de base de caldo de descarboxilasa de M oeller como control negativo. Se utiliza un inoculo im portante y cada tubo se cubre con vaselina estéril. Es m ejor leer los resultados'después de una incubación de toda la noche, aunque la m ayoría de las pruebas positivas se aprecian después de 4 a 6 horas y en general están disponibles después de 4 horas de incubación; las pruebas negati­ vas deben ser reincubadas durante toda la noche.

Especies de H aem ophilus

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Métodos bioquímicos y comerciales para la identificación de Hae■'"ophilus. También se pueden utilizar pruebas de fermentación de hidratos de carbono para la identificación de especies de Haemophilus (véase cuadro 9-2). Estos métodos evitan los problemas técnicos asociados con las determinaciones de requerimientos de factores que se explicaron antes. Se puede utilizar la producción de ácido a partir de varios hidratos de uarbono (sacarosa, fructosa, ribosa, xilosa y mañosa) para a p a ra r H. influenzae de H. parainfluenzae. Además de los requerimientos de factores de crecimiento, es necesaria una -ene limitada de pruebas para diferenciar e identificar H. aphrnphilus, H. paraphrophilus y H. segnis. La fermentación de lactosa o la hidrólisis de o-nitrofenil-[3-D-galactopiranósido ONPG) son útiles para la identificación de H. aphrophilus y H. paraphrophilus; ambos son positivos con estas pruebas, mientras que otras especies de Haemophilus (y Actinobacillus actinomycetemcomitans) son negativas (véase lámina en color --2G y H). H. segnis produjo una acidificación débil o tardía de sacarosa y fructosa, y es negativa en las tres reacciones de riotipificación. Se determina la utilización de hidratos de carbono en agar . .íteína-digerido trípico semisólido con inoculación importanle que contiene hidratos de carbono esterilizados con filtro al 1 En general, la producción de ácido se aprecia en 4 a 18 horas. Se pueden utilizar discos de ureasa y ornitina descarbo­ xilasa impregnados con reactivos (Remel Laboratories) y la rrueba de indol en el sitio para una biotipificación individual reñida (1 hora), si fuera necesario. También se pueden utilizar sistemas comerciales de identifi­ cación que utilizan pruebas convencionales modificadas y susrratos enzimáticos cromogénicos para identificar y biotipificar íimultáneamente especies de Haemophilus. El panel RapID NH (Remel Laboratories), la tarjeta de identificación para Seisseria-H aem ophilus Vitek (NHI) (bioM erieux-Vitek, Hazelwood, MO), el panel de identificación para Haemophilus-Neisseria (HNID) (Dade/MicroScan, West Sacramento, CAi y la tira API NH (bioMerieux, La Balme-les Grottes, Francia) identifican estos microorganismos dentro de las 4 horas de la inoculación (véase lámina en color 9-2A y C 141-628,629.909 s e incluyen ONPG, lactosa o ambos para la dife­ renciación de H. aphrophilus/paraphrophilus; las pruebas para un requerimiento de factor V separan estas dos especies. diagnóstico de laboratorio de la infección por Haemophilus ducreyi

Se pueden utilizar hisopos de algodón, rayón, dacrón o alginato de calcio para recoger muestras de úlceras chancroides. En ; ^adiciones ideales, las muestras se deben recoger de la base y 1os bordes socavados de la úlcera; el microorganismo no suele aislarse del pus de los bubones. No se ha evaluado la capacidad ue los medios de transporte para mantener cepas clínicas de H. ducreyi y las muestras pueden albergar sólo pequeñas cantidaues de microorganismos. Por lo tanto, los medios deben ser ino­ culados directamente. Los frotis teñidos con Gram del exudado >apurado de las lesiones genitales de chancroide pueden no ser útiles debido a la baja sensibilidad y especificidad de la tinción de Gram. Cuando se observa en extendidos directos, H. ducrei aparece como cocobacilos gramnegativos de tinción pálida, a menudo agrupados (“en cardúmenes”) o dispuestos en cade­ nas paralelas laxamente enrolladas (en “vías de ferrocarril”) ñg. 9-2). Se pueden encontrar en el interior y en el exterior de las células polimorfonucleares. Como las lesiones genitales y ': s ganglios supurados o los abscesos pueden sobreinfectarse

Figura 9-2 M orfología en la tinción de Gram de H aem ophilus ducreyi. En los frotis teñidos preparados a partir de lesiones de chancroide o del creci­ m iento de las colonias, los bacilos gramnegativos pueden aparecer en grupos laxos (“cardum en" [izquierda]) o dispuestos en líneas paralelas onduladas (“vías de ferrocarril” [derecha]).

con otras bacterias (sobre todo fusobacterias, estafilococos y estreptococos), el diagnóstico mediante un frotis teñido con Gram es difícil y se debe intentar el cultivo. El diagnóstico de chancroide a menudo se hace sobre bases clínicas y epidemio­ lógicas; sin embargo, en el diagnóstico diferencial se deben incluir la sífilis, la infección genital por virus del herpes simple y el linfogranuloma venéreo. Se describió un anticuerpo monoclonal dirigido contra H. ducreyi, que se utiliza en una prueba de inmunofluorescencia indirecta para detectar microorganis­ mos directamente en extendidos preparados de úlceras genita­ les.1141 También se han producido sondas de DNA para H. ducreyi que se utilizan en contextos de investigación para la identificación del microorganismo y para la detección directa en muestras de animales con infección experimental.986 Puede ser difícil que H. ducreyi se desarrolle en cultivo y se han evaluado varios medios para lograrlo.773 Estos medios inclu­ yen base de agar CG con suplemento de hemoglobina al 2%, suero fetal de ternero al 5% e IsoVitalex al 1% o enriqueci­ miento GCH1 (Remel) y agar de Mueller-Hinton con suple­ mento de sangre de caballo con chocolate al 5% más enriqueci­ miento de IsoVitalex al 1%.773-948 Totten y Stamm describieron una nueva placa clara y medios con caldo para H. ducreyi que contienen base de agar CG. enriquecimiento con factor XV al 1% (PML Microbiologicals, Tualatin, OR), suero fetal de ter­ nero al 10% y catalasa (Sigma Chemical, St. Louis, M O).1285 Se agrega catalasa como fuente de hemina. El caldo tiene una composición similar, pero se utiliza caldo CG en lugar de caldo como medio basal. Los medios comerciales de agar chocolate suelen sostener el crecimiento de H. ducreyi; se pueden colocar discos de vancomicina en distintos cuadrantes de una placa de chocolate para ayudar a la detección de los microorganismos en cultivos mixtos.536-773-1236 La mayoría de las cepas de H. ducreyi tienen concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) de vancomicina de 32 a 128 |ag/mL, pero algunas tienen una CIM de tan solo 4 ug/mL. Por lo tanto, puede ser ventajoso inocular medios con vancomicina y sin ella y recoger múltiples mues­ tras apropiadas. Los medios se incuban a 33 °C a 35 °C en C 0 2 al 5-7% o en una jarra de anaerobiosis por extensión con vela y elevada humedad. Se puede obtener un mejor crecimiento utilizando un ambiente microaerófilo, donde se colocan culti­ vos en una jarra Gas-Pak con dos envolturas que generan dió­ xido de carbono/gas hidrógeno y sin catalizador.1236 Se ins­

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CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

peccionan los cultivos diariamente durante 10 días. La mayo­ ría de las cepas clínicas producen un crecimiento visible en 2 a 4 días. Las colonias de H. ducreyi son pequeñas, no mucoides y de color gris, amarillo u ocre y pueden “acodarse” sobre la super­ ficie del agar cuando se aplica un ansa bacteriológica, son difí­ ciles de recoger y producen una suspensión heterogénea y “grande" en solución salina. En la tinción de Gram, los micro­ organismos aparecen como cocos gramnegativos, habitualmen­ te en estrecha asociación entre ellos. H. ducreyi es catalasa negativo y oxidasa positivo; la reacción de oxidasa suele ser tardía y se desarrolla sólo después de 15 a 20 segundos con el reactivo de dihidrocloruro de tetrametil-/?-fenilenediamina. Debido a los requerimientos nutricionales especiales de H. ducreyi, no se pueden demostrar requerimientos de factores de crecimiento con las técnicas de discos o tiras impregnadas en factores. La prueba de ALA-porfirina es negativa, lo que indi­ ca que se necesita hemina exógena para el crecimiento. El microorganismo es bioquímicamente inerte, salvo por las prue­ bas de reducción de nitrato y fosfatasa alcalina positivas. Hannah y Greenwood evaluaron 64 cepas de H. ducreyi con el sistema RapID NH; todas fueron identificadas correctamente por este sistema, y las pruebas de fosfatasa y de reducción de nitrato fueron las únicas reacciones positivas para todas las cepas evaluadas (véase lámina en color 9-2C).536 En una eva­ luación con 25 cepas de H. ducreyi, Shawar y cois, observaron que todas producían reacciones enzimáticas únicas y compati­ bles en el sistema RapID ANA (bioMerieux-Vitek), que es un sistema de 4 horas utilizado para la identificación de bacterias anaerobias de importancia clínica (véase cap. 14).1169 Estos investigadores también comunicaron que las cepas de H. du­ creyi son sensibles al polianetolsulfonato de sodio según lo determina un método de sensibilidad en disco. Estos autores sugirieron que las características de crecimiento simples, la sensibilidad al polianetolsulfonato de sodio y los perfiles de aminopeptidasa obtenidos con el sistema enzimático RapID ANA se podían utilizar para la identificación de H. ducreyi. Otros investigadores han mostrado que las cepas de H. ducreyi tienen perfiles uniformes aminopeptidasa que pueden ser útiles para la identificación de laboratorio.1310 También se han creado métodos no moleculares y técnicas no dependientes del crecimiento para la identificación o detec­ ción directa de H. ducreyi, 7 7 3 Roggen y cois, desarrollaron un inmunoanálisis enzimático (EIA) que utiliza anticuerpos policlonales contra un antígeno de membrana específico de especie de 29 kDa y un antígeno de membrana específico de inmunotipo de 30 a 34 kDa como anticuerpos de captura.1084 Este EIA reaccionó con todas las cepas de H. ducreyi evaluadas y tam­ bién pudo detectar los microorganismos directamente en mues­ tras clínicas. También se utilizó PCR para detectar H. ducreyi. Chui y cois, informaron del desarrollo de un conjunto de ceba­ dores y dos sondas de DNA específicas para H. ducreyi sobre la base de las secuencias de nucleótidos publicadas del rRNA de 16S del microorganismo.255 El conjunto de cebadores y las sondas tuvieron una sensibilidad del 100% para detectar 51 cepas de H. ducreyi que se aislaron en seis continentes en un período de 15 años. El procedimiento de detección directo basado sobre la PCR fue evaluado en 100 muestras clínicas y mostró una sensibilidad del 83% al 98% y una especificidad del 51% al 67%, según la cantidad de ciclos de amplifica­ ción.255 Otro grupo de investigadores también creó un ensayo basado sobre PCR para la detección directa de H. ducreyi, pero la sensibilidad y la especificidad de la prueba fueron desalen­ tadoras.648 Observaron que la falla de la PCR para detectar H.

ducreyi probablemente condujo a una inhibición inespecífica de la DNA polimerasa Taq por el material en la muestra. Gu y cois, produjeron, mediante ingeniería genética, una prueba de PCR para H. ducreyi que utilizó regiones separadoras intergénicas de rRNA de 16S y 23S como secuencias diana para la detección.505 Por último. Orle y cois, idearon un análisis de PCR múltiple para la detección directa de H. ducreyi, Treponema pallidum y virus del herpes simple tipos 1 y 2 directa­ mente de úlceras genitales.973 Sensibilidad a los antibióticos de las especies de Haemophilus

Hasta alrededor de 1973, las pruebas de sensibilidad a los antibióticos de H. influenzae eran innecesarias porque casi todas las cepas importantes eran sensibles a la ampicilina, el fármaco de elección para la meningitis y la baeteriemia causa­ das por este microorganismo. Para 1974. algunas cepas de H. influenzae se habían vuelto resistentes a la ampicilina debido a la producción de enzimas P-lactamasas mediadas por plásmidos que inactivan la ampicilina. Las P-lactamasas mediadas por plásmidos se han hallado en H. influenzae tipo b. no tipo b encapsulado y no tipificable, y en cepas de H. parainfluenzae. Estos microorganismos albergan un transposón de 3 MDA que transporta el gen para una enzima p-lactamasa tipo TEM-1. Algunas raras cepas de H. influenzae producen un segundo tipo de P-lactamasa, denominado ROB-1 .303 En los últimos 25 años, la prevalencia de cepas P-lactamasa positivas ha aumentado lentamente en todo el mundo.403 Un estudio de muestras respi­ ratorias de H. influenzae recogidas durante 1997 en los Estados Unidos y Canadá comunicó que el 34,2% de 837 aislamientos en 27 centros médicos de los Estados Unidos y el 31,3% de 240 aislamientos en 7 centros canadienses eran P-lactamasa positi­ vos.342 En un segundo estudio cooperativo reciente sobre sensi­ bilidad de los microorganismos aislados en los Estados Unidos, llevada a cabo como parte del SENTRY Surveillance Program. se observó que el 35% de 1 032 aislamientos de H. influenzae eran p-lactamasa positivas.1273 En el proyecto de vigilancia LIBRA 2002, H. influenzae P-lactamasa positivo representó el 32,2% de 2 791 cepas.649 En todos estos estudios, más del 99% de las cepas fueron sensibles a amoxicilina-clavulanato, inde­ pendientemente de la producción de p-lactamasa. El clavulanato inactiva la P-lactamasa y vuelve a los microorganismos sensibles a la amoxicilina incluida en esta combinación de anti­ bióticos. Se han aislado raras cepas de H. influenzae que son resisten­ tes a la ampicilina, pero no producen P-lactamasas.822-859 En es­ tas cepas, la resistencia se debe a alteraciones en las proteínas de la pared celular fijadoras de penicilina o en la permeabilidad de la membrana celular al agente.859 Estas cepas muestran menor sensibilidad a las cefalosporinas de tercera generación y a combinaciones de P-lactámico/inhibidor de P-lactamasa.857-859 Aunque los estudios iniciales sugirieron que es posible que los métodos de difusión con discos no detecten con precisión resis­ tencia a la ampicilina en estas cepas, cambios en el medio de prueba (Haemophilus Test Medisum [HTM]) y modificaciones de los criterios de interpretación han encarado estos proble­ mas.652-653-858 Por fortuna, estas cepas P-lactamasa negativas y resistentes a la ampicilina son muy infrecuentes. Un estudio de vigilancia de H. influenzae 2000-2001 sólo detectó 9 (0,6%) cepas P-lactamasas negativas y resistentes a la ampicilina entre 1 434 cepas.668 La CIM de la ampicilina para estas nueve cepas fue de 4 fig/mL; todas eran sensibles a amoxicilina-clavulana­ to, cefuroxima, cefprozilo, macrólidos y fluoroquinolonas.

Especies de A ctinobacillus

El cloranfenicol, utilizado antes como alternativa de la ampi­ cilina en el tratamiento de la meningitis, sigue siendo altamen­ te activo contra H. influenzae y el 99% de las cepas evaluadas en un estudio cooperativo entre los Estados Unidos y Canadá fueron sensibles.342 Las preocupaciones acerca de su toxicidad potencial y cuestiones relativas a interacciones farmacológicas han limitado su uso tanto en los Estados Unidos como en los países en vías de desarrollo.1119 También ha aparecido resisten­ cia al cloranfenicol en estos microorganismos.190831 La mayoría de H. influenzae resistentes al cloranfenicol producen cloranfe­ nicol acetiltransferasa (CAT), que cataliza la transferencia de dos grupos acilos desde la acetilcoenzima A a los sitios activos en la molécula de cloranfenicol, impidiendo así que el antibió­ tico realice su función normal de inhibir la síntesis de proteínas bacterianas.831 Aunque las cepas productoras de CAT de H. influenzae parecen producir la enzima en forma constitutiva ien todas las condiciones de crecimiento), la producción de CAT por otras especies de H. influenzae es inducible y requie­ re la exposición del fármaco para la producción de la enzima.831 Otras cepas resistentes al cloranfenicol demuestran una imper­ meabilidad relativa debido a la pérdida de un OMP importante que permite la entrada del fármaco en la célula.190 En la actualidad, las cefalosporinas de tercera generación : nstituyen la terapia recomendada para el tratamiento de las infecciones graves por Haemophilus debido a la actividad _ .relente de estos agentes tanto in vitro como in vivo.1119 En 1os estudios de los Estados Unidos y Canadá, las comunicacio­ nes de Surveillance Network Database y Alexander Project y los estudios de vigilancia SENTRY, todas las cepas de H. mfluenzae fueron sensibles a las cefalosporinas cefpodoxima, cefotaxima, ceftriaxona y cefixima.342-403-669 1273 Además de la u n \icilina, el cefaclor fue el único agente afectado adversan en :e por la producción de (3-lactamasa. Aunque 92,5-97,2% H. influenzae [3-lactamasa negativo fueron sensibles a cefaclor. sólo 54-76,9% de las cepas P-lactamasa positivas fueron sensibles.342’1273 Las infecciones asociadas con H. influenzae no tipificable, □tuno las exacerbaciones de bronquitis crónica, EPOC y otitis a menudo son tratadas con ampicilina y amoxicilina si se ha - '.umentado sensibilidad a estos agentes. De otro modo, se jrescnben macrólidos, sulfamidas o fluoroquinolonas por boca — ra estas infecciones. Entre los macrólidos, la azitromicina ¿s i mas, activo contra H. influenzae y el 99,8% de las cepas son •easibles a la azitromicina, en comparación con el 61,4-91,7% -ue 500 sensibles a la claritromicina.342’1273 Trimetoprim-sulfaaes \azol también se administra con frecuencia para estas i n r . : íes, pero sólo 77,3-87,5% de las cepas son sensibles a aae -¿ente. Sin embargo, las fluoroquinolonas tienen una actitririad excelente contra H. influenzae. Algunos estudios coopen n - grandes han comunicado que las cepas de H. influenzae •c e -entibies a ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, esparf c u e m a . gatifloxacina, grepafloxacina, gemifloxacina, moxi■ o n n a y trovofloxacina.107-323-451-6941273 Aunque la mayoría f e aes .epas de H. influenzae tienen una CIM de ciprofloxaciE i _ J.Ü6 ug/mL, recientemente se han comunicado cepas con CÜV je . iprofloxacina elevada (> 0,12 |ig/m L).l2fU29 ; r".eral, H. parainfluenzae, H. aphrophilus y H. paraphson sensibles a las cefalosporinas de tercera generamír__ as quinolonas, el cloranfenicol, las tetraciclinas y los -cosidos. Algunos agentes, como ceftriaxona, cefota■ÜM -iprofloxacina, han sido eficaces en pacientes con Ü ü - - nes graves del sistema nervioso central (SNC), absce■ ■ e rc e fílic o s y endocarditis.1332 Aunque la mayoría de las sensibles a penicilina y ampicilina, se han comuni­

42 9

cado cepas resistentes, incluidas algunas que producen [ü-lactamasa.650 Cuando se examinan cepas de distintas partes del mundo, las de H. ducreyi muestran una amplia gama de resistencia media­ da por plásmidos a los antibióticos, que incluyen ampicilina, tetraciclina, sulfamidas, cloranfenicol y los aminoglucósidos más antiguos. Las cefalosporinas de tercera generación (cefotaxima, ceftriaxona, ceftixima), las fluoroquinolonas (ciproflo­ xacina) y los macrólidos (eritromicina, azitromicina) muestran una actividad excelente contra H. ducreyi in vitro, mientras que muchas cepas son resistentes a tetraciclinas y trimetoprim-sulfametoxazol.698 824'1309 Muchos de estos agentes han sido utilizados como éxito para el tratamiento del chancroide.79,815,824,1295 s¡¡n embargo, debido a los fracasos terapéuticos en pacientes infectados por HIV, existe cierta preocupación acerca de la eficacia clínica de las terapias de dosis única o de serie corta (p. ej., ceftriaxona por vía intramuscular, azitromi­ cina por vía oral) en individuos con chancroide que también están inmunodeprimidos.1484296 Se puede determinar la sensibilidad a los antibióticos de las especies de Haemophilus mediante los procedimientos de difu­ sión con discos y dilución en caldo o agar. En el capítulo 15 se describen los métodos de evaluación de la sensibilidad.

Especies de Actinobacillus Los Actinobacillus son bacilos no esporulados, gramnegati­ vos pequeños e inmóviles que se encuentran predominante­ mente en los animales. Se hallan tres especies -A . actinomyce­ temcomitans, A. ureae y A. hom inis- en los seres humanos. Además de la asociación con los animales, estos microorganis­ mos son similares a los miembros del género Pasteurella en muchas de sus características de cultivo y fenotípicas. En 1986, una ex especie de Pasteurella, P. ureae, fue transferida formal­ mente al género Actinobacillus como Actinobacillus ureae; otras especies (p. ej., A. capsulatus, A. muris y A. seminis) per­ tenecen claramente a otros géneros sobre la base de la hibrida­ ción de DNA-rRNA y la secuenciación de rRNA 16S.331-9211009 A. actinomycetemcomitans, la principal cepa clínica humana, comparte muchas características de cultivo y bioquímicas con los hemófilos. Algunos estudios de transformación, hibridación de DNA e inmunodifusión han demostrado que está más estre­ chamente relacionado con H. aphrophilus, H. paraphrophilus y H. segnis que con las otras especies de Actinobacillus.'25* En 1985, se propuso transferir A. actinomycetemcomitans al géne­ ro Haemophilus como “Haemophilus actinomycetemcomi­ tans”.1024 Sin embargo, esta propuesta fue rechazada por la falta de similitud con la especie tipo del género Haemophilus (H. influenzae). Otros autores han argumentado que A. actinomy­ cetemcomitans y H. aphrophilus no deben ser incluidos en el género Haemophilus porque no requieren factores X o V. No obstante, las especies de los cerdos descritas recientemente -A. minor, A. porcinus y A. indolicus- son dependientes del factor V, como lo es A. pleuropneumoniae. En la actualidad, las espe­ cies de Actinobacillus, entre ellas, A. actinomycetemcomitans, se mantienen en la familia Pasteurella, ahora incluida en y-Proteobacteria.455 Actinobacillus actinomycetemcomitans

A. actinomycetemcomitans es parte de la flora normal de la cavidad bucal, sobre todo en los surcos gingivales y supragin-

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CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

givales. Sobre la base de las reacciones de anticuerpos monoclonales específicos con porciones expuestas de hidratos de car­ bono en la superficie celular del lipopolisacárido (LPS) de la pared celular, esta especie puede ser dividida en seis serotipos, designados a a f.471 Los serotipos a, b y c son los prevalentes y comprenden más del 80% de las cepas orales con frecuencias iguales.1117 Aunque se ha sugerido que ciertos serotipos (p. ej., serotipo b) pueden estar asociados con formas específicas de enfermedad periodontal. los estudios de biotipificación y de sondas genéticas rRNA demostraron una heterogeneidad fenotípica y genómica importante entre las cepas pertenecientes al mismo serotipo.65-344 1116 También se pueden detectar diferentes cepas dentro del mismo serotipo con PCR preparado arbitra­ riamente y análisis de polimorfismos de longitud de los frag­ mentos de restricción.344 Otros estudios que utilizaron análisis de secuencia de los genes rRNA de 16S y ensayos de PCR para leucotoxina, toxina distensora del citoesqueleto, antígeno de la subunidad principal de las fimbrias y genes de polisacárido O específicos de serotipos han mostrado que las cepas de A. actinomycetemcomitans pueden ser divididas en tres linajes que consisten en todas las cepas de serotipo b. todas las cepas de serotipo c y cepas pertenecientes a los serotipos a, d. e y f.665 Todos estos serotipos y linajes han sido aislados de pacientes con enfermedad periodontal, lo que sugiere que todos tienen potencial patogénico. IMPORTANCIA CLÍNICA

A. actinomycetemcomitans se asocia con infecciones actinomicóticas, endocarditis, baeteriemia, infecciones de heridas e infecciones dentales. El nombre del microorganismo deriva de su aislamiento “concomitante” reconocido con especies de Actinomyces de los abscesos y otras infecciones.28-738-897-1434 Junto con las otras bacterias HACEK, A. actinomycetemcomitans es una causa de endocarditis bacteriana subaguda.234-270-664-1221 En general, la endocarditis de válvula nativa ocurre en individuos con daño valvular previo causado por cardiopatías congénitas, que incluyen estenosis aórtica congénita, enfermedad de la vál­ vula aórtica, comunicación interauricular e insuficiencia de la válvula mitral debida a cardiopatía reumática. También se ha comunicado una endocarditis de la válvula mitral y aórtica pro­ tésica en individuos con válvulas porcinas y mecánicas y marcapasos; las complicaciones localizadas han incluido pericarditis y absceso paravalvular.1315-1379 Los factores predisponentes en el desarrollo de la endocarditis por A. actinomycetemcomitans incluyen una mala dentición y manipulaciones dentales recien­ tes,40-234 y suele tener un curso indolente. Es frecuente la fiebre, la pérdida de peso, los escalofríos, la tos y los sudores nocturnos, junto con un soplo cardíaco. La hepatoesplenomegalia y las hemorragias conjuntivales o lineales subungulares se presentan en forma variable. Las complicaciones sistémicas son embolias sépticas, arteritis coronaria, vasculitis, insuficiencia cardíaca congestiva, daño valvular que requiere colocación o reemplazo de válvula protésica, complicaciones infecciosas de la disemina­ ción hematógena (p. ej., endoftalmitis, slomerulonefritis. artritis séptica) y muerte.664-757-1163-1171-1221-1327 A. actinomycetemcomitans es un patógeno reconocido en el desarrollo de periodontitis. Este microorganismo está relacio­ nado causalmente con un tipo de periodontitis de inicio tem­ prano denominada p e r io d o n t it is j u v e n i l lo c a liz a d a .516 una enfermedad de los niños mayores y los adultos jóvenes (12-26 años) caracterizada por la rápida degeneración y destrucción del hueso alveolar que sostiene los primeros molares perma­ nentes e incisivos. La pérdida de hueso subgingival en estas

áreas provoca el desarrollo de bolsillos gingivales profundos y la acumulación de cálculos e inflamación gingival poco evi­ dente.516 La progresión de la pérdida ósea hasta afectar los dientes adyacentes conduce a la periodontitis juvenil generali­ zada o la periodontitis rápidamente progresiva. Algunos estudios epidemiológicos e inmunológicos sugieren que la periodontitis juvenil localizada y otras enfermedades periodontales graves tienen componentes raciales o genéticos que predisponen a estas infecciones endógenas graves. En una encuesta de más de 11 000 individuos de 14 a 17 años se obser­ vó que las personas de raza negra tenían una prevalencia mucho mayor de periodontitis juvenil localizada que las de raza blanca (2,64% frente a 0,17%).792 Los hombres de raza negra presenta­ ban una probabilidad casi tres veces mayor de sufrir periodon­ titis juvenil localizada que las mujeres de raza negra, mientras que la probabilidad era tres veces mayor en las mujeres de raza blanca que en los hombres de raza blanca. Los pacientes con periodontitis juvenil localizada también producen concentracio­ nes anormalmente altas de prostaglandina E2 y la citocina infla­ matoria factor de necrosis tumoral a (TNF-a) en los líquidos de los surcos que rodean los dientes.516 Estos factores son produci­ dos por monocitos y macrófagos locales en respuesta a los pro­ ductos bacterianos. Los monocitos y los macrófagos cultivados a estos pacientes producen tres a seis veces más cantidad de estas citocinas que las células similares de pacientes que no tie­ nen periodontitis juvenil localizada con exposición a lipopolisa­ cárido.1167 Estas citocinas inflamatorias inducen resorción ósea por los osteoclastos y conducen a pérdida ósea alveolar y regu­ lación negativa de la quimiotaxis de los neutrófilos. Los clones de A. actinomycetemcomitans que producen grandes cantida­ des de leucotoxina pueden asociarse con formas de inicio tem­ prano de periodontitis y pueden ser distintos entre las diferentes poblaciones raciales y geográficas.540-544 Sin duda, la periodon­ titis juvenil localizada y la periodontitis generalizada son enfer­ medades multifactoriales resultantes del interjuego de factores genéticos, ambientales y microbianos. La enfermedad periodontal asociada con A. actinomycetem­ comitans evoca respuestas inmunes sistémicas y localizadas. Los pacientes con periodontitis juvenil localizada producen títulos altos de IgG en suero contra los antígenos de serotipo de A. actinomycetemcomitans, que son oligosacáridos de cadena lateral O en el lipopolisacárido de la pared celular.504 El LPS del microorganismo también induce inflamación gingival loca­ lizada y permite que el microorganismo se establezca en la placa gingival. Además de una leucotoxina potente y un LPS, A. actinomycetemcomitans produce otras distintas propiedades que contribuyen a su virulencia como patógeno periodontal (recuadro 9-7). Algunos de estos factores también estimulan la producción de anticuerpos en el suero y el líquido de los sur­ cos.504 La respuesta inmunitaria a los antígenos microbianos puede ayudar a limitar el proceso periodontal y la falta de esti­ mulación de las respuestas humoral y celular contra el micro­ organismo o sus productos puede ser parcialmente responsable de la progresión hasta la enfermedad periodontal generalizada más grave.1120 Además del periodontitis juvenil localizada y de otras formas generalizadas de enfermedad periodontal, A. ac­ tinomycetemcomitans está implicado en la patogenia del sín­ drome de Papillon-Lefevre, una enfermedad hereditaria ca­ racterizada por hiperqueratosis de las palmas y las plantas, y destrucción periodontal extensa que conduce a la pérdida tan­ to de los dientes primarios como perm anentes.1321 Otras infecciones causadas por A. actinomycetemcomitans son el resultado de la propagación contigua del microorganis­ mo desde su hábitat en la cavidad bucal o por la diseminación

Especies de H aem ophilus

Recuadro 9-7

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Factores de virulencia de A ctin o b a cillu s actinom ycetem com itans

E z fresco, A. actinomycetem comitans tiene muchas fimbrias largas producidas en form a máxima bajo condiciones anaerobias y que se pierden en los subcainvos seriados.6181140 Estas fimbrias están com puestas por una subunidad proteica de 52 a 54 kDa. Las células con fimbrias se agregan espontáneam ente, je^iLiestran un aum ento de la adherencia a las cuentas de hidroxiapatita y promueven la adherencia a las superficies mucosas y a los tejidos bucales y su ■3?ioaización, respectivam ente.873

leucotoxina es una protem a de 116 kDa que se une a las m embranas celulares de neutrófilos, monocitos y linfocitos T .1245 La toxina induce la formación poros en las m em branas celulares, produce desgranulación del contenido lisosómico a la superficie celular de los polimorfonucleares, induce la escisión ¡ fragmentación del DNA crom osóm ico, posiblem ente por activación de nucleasas endógenas y protege al m icroorganismo de la fagocitosis.6*4-816-1245 La cuvción de leucotoxina en el área supragingival puede conducir a una desgranulación localizada de las células polim orfonucleares (PM N) y la liberación tenido lisosóm ico que puede aum entar la inflamación y producir la inmunosupresión localizada central para el desarrollo de las lesiones periodontales periodontitis juvenil localizada. Esta toxina es descodificada por un operón genético que consiste en cuatro genes (ItxC. ItxA, ItxB y ItxD), de los cuales 5 es el gen estructural.711 La protem a ItxC es necesaria para la activación de la proteína de leucotoxina, mientras que los productos genéticos ItxB y ItxD n involucrados en la secreción del polipéptido de la toxina.546 Esencialmente todas las cepas de A. actinomycetem comitans contienen el operón leucotol pero el nivel de leucotoxina producido por las diferentes cepas varía.610-710 Algunas cepas altam ente leucotóxicas de A. actinomycetem comitans produ10 a 20 veces más leucotoxina que las cepas m ínimam ente leucotóxicas debido a la presencia de una deleción de 530 pares de bases dentro de la región c o to r a de la toxina o por la presencia de un elemento de secuencia de inserción adyacente a la región prom otora de leucotoxina.178-546 Estos clones alta­ r a tóxicos se encuentran en los mismos grupos de edad que la periodontitis juvenil localizada y se asocian con una periodontitis grave.1426

distensora citoletal reteniente se identificó un locus genético del A. actinomycetem comitans que tenía una identidad de secuencia m ayor del 90% con el locus del gen disr de la citotoxina (cdt) de algunas cepas de E. coli patogénico y H. ducreyi.84° Las cepas que tienen los genes que producen toxina in vitro, aunque se atan naturalm ente com o cepas toxina negativas tenían deleciones grandes dentro del locus del gen cdt propiamente dicho. In vitro, la toxina distensora ta l produce distensión y m uerte del ovario del hám ster chino y otras líneas celulares y es capaz de causar detención del ciclo celular de los linfocif- Se está investigando el papel de esta toxina en la producción de enfermedad.

nomycetem com itans puede invadir activamente las células hum anas y las líneas celulares.863 Esta capacidad protege al microorganismo de los factores e-> hum orales y celulares y de los efectos de algunos antibióticos. La invasión celular por A. actinomycetem comitans com prende tanto vías dependien¿ctina com o independientes de ella.176 La capacidad de invasión no se relaciona con ningún tipo de cepa particular según lo define el análisis de ::f.>mo de longitud de los fragmentos de restricción, y se observa producción de leucotoxina más a m enudo en cepas no invasoras de A. actinomycemitans.m

i inductor de resorción ósea i demostrado que un antígeno polisacárido de superficie de A. actinomycetem comitans estim ula la resorción ósea en un sistema de cultivo de hueso de : r induce a células sim ilares a los osteoclastos en cultivos de m édula de ratón.1297 La pérdida de hueso alveolar durante la patogenia de la periodontitis focalizada puede reflejar parcialm ente la actividad de este antígeno in vivo.

inmunosupresora : > cois, aislaron y purificaron una fracción inm unosupresora (ISF) de A. actinomycetem comitans, inm unizaron a los animales con ISF y realizaron mentos de transferencia adoptiva para proporcionar células T sensibilizadas a ratones no inm unes.955 Estas células T inducidas por ISF ejercieron un mm unosupresor sobre la función de las células B y sobre la producción de anticuerpos contra A. actinomycetemcomitans. ISF puede actuar com o fac••’_-üiencia para suprim ir la producción localizada de anticuerpos, impidiendo así la opsonización y la elim inación de los microbios.

de lipopolisacáridos xoxina de A. actinom ycetem comitans tiene todas las propiedades de endotoxinas de las otras bacterias. En los surcos gingivales, el lipopolisacárido t estimula los osteoclastos a iniciar la resorción ósea, activa el com plem ento e induce la liberación lisosóm ica desde PMN.

que degradan inmunoglobulinas y componentes fijadores de Fe pft. J¡r^~->n\cetemcomitans tam bién produce enzim as que pueden degradar las inmunoglobulinas G, M y A. impidiendo así la opsonización por anticuer­ p o 5 Además, se producen com ponentes asociados con células y extracelulares que pueden unirse a la región Fe de las moléculas de inm unoglobulina.1279 ¡ p » lic e rá :ió n de estas moléculas desde los m icroorganismos puede contribuir a la periodontitis al interferir en la opsonización de las bacterias, la actividad de las células polim orfonucleares y la fijación del com plem ento. Este com ponente de unión aparentem ente es un OMP de 25 a 32 kDa relacioná­ i s e¡ OmpA de E. coli.™

y proteasas momycetemcomitans y otros microbios bucales producen colagenasas y proteasas que pueden actuar sobre el tejido conectivo y los colágenos de la rír.¿ basal.457 Estas enzim as pueden funcionar para facilitar la propagación del microorganism o en el tejido blando y para generar péptidos pequeños ¿eoen tener actividad biológica sobre mediadores de la inflamación.

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CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

hematógena durante la bacteriemia. Estas infecciones incluyen absceso encefálico; linfadenitis cervical; celulitis; artritis sépti­ ca; osteomielitis; discitis vertebral; abscesos subcutáneos, mediastínicos, de la pared torácica e intraabdominales, y oste­ omielitis vertebral.226-404-533-664-881'924-1434 Morris y Sewell comuni­ caron un caso de neumonía necrosante debida a A. actinomy­ cetemcomitans y A. actinomycetemcomitans israelii en un hombre de 46 años tres meses después de la extracción de varios dientes debido a una enfermedad periodontal avanza­ da.897 Kuijper y cois, informaron de un caso de actinomicosis diseminada en el cual se recuperaron tanto A. actinomycetem­ comitans como Actinomyces meyeri de lesiones subcutáneas y de abscesos cerebrales.738 El paciente había tenido lesiones pul­ monares lentamente progresivas durante los 6 años precedentes de las que se sospechó pero no se comprobó que eran la fuen­ te de ambos microorganismos. Las infecciones pulmonares por A. actinom ycetem com itans en ausencia de especies de Actinomyces son raras y sólo se comunicaron cuatro casos antes de 1990 en la bibliografía inglesa. En un caso informado por Yuan y cois., la infección afectó el pulmón, el tejido blan­ do de la pared torácica y las costillas y el esternón suprayacentes.1425 También puede ocurrir la embolización séptica del microorganismo desde un foco pulmonar prim ario.1332 Las puertas de entrada para estos distintos tipos de infecciones incluyeron lesiones bucales, infecciones pulmonares previas, abrasiones cutáneas, sitios de toracotomía e instrumentación de las vías urinarias.

CARACTERÍSTICAS DE LOS CULTIVOS E IDENTIFICACIÓN

A actinomycetemcomitans crece lentamente en agar chocola­ te y agar sangre, y aparecen colonias visibles después de 48 a 72 horas (véase lámina en color 9-3B). Las colonias son pequeñas, lisas, translúcidas, no hemolíticas y tienen bordes ligeramente irregulares. Las cepas clínicas frescas son adherentes al agar y es difícil emulsificarlas. Con una incubación prolongada (de 5 a 7 días), las colonias pueden desarrollar una densidad central que aparece como una estrella de cuatro o seis puntas. Esta caracte­ rística se pierde en el subcultivo repetido y las colonias se vuel­ ven menos adherentes. Como sucede con H. aphrophilus, el cre­ cimiento en caldo es escaso y adherente a los lados del tubo. En la tinción de Gram los microorganismos aparecen como cocobacilos gramnegativos de tinción pálida. Se pueden observar células más grandes con subcultivos repetidos. Las características para la identificación de A. actinomyce­ temcomitans incluyen falta de crecim iento en agar de MacConkey y otros agares entéricos, y reacciones positivas para la producción de catalasa y la reducción de nitrato. El microorganismo es oxidasa negativo (cepas ocasionales pueden ser débilmente positivas) y ureasa negativo, no produce indol y no requiere factores X ni V. Las reacciones de lisina y ornitina descarboxilasa y de arginina dihidrolasa son negativas. La mayoría de las cepas fermentan fuertemente la glucosa, la fruc­ tosa y la mañosa (véase lámina en color 9-3C); la producción de ácido a partir de maltosa, manitol y xilosa varía. A. acti­ nomycetemcomitans puede ser diferenciado de H. aphrophilus en que el primero es catalasa positivo y ONPG negativo y no se produce ácido a partir de lactosa, sacarosa o trehalosa (véase cuadro 9-3). También se describieron métodos moleculares para la detec­ ción e identificación de A. actinom ycetem com itans.343 1071 Algunos estudios genéticos han mostrado que el gen para rRNA 23S es dividido en dos formas más pequeñas en A. acti­ nomycetemcomitans, mientras que el transcrito es continuo en

H. aphrophilus, H. paraphrophilus, H. segnis y H. influen­ zae.102* El reconocimiento de este patrón atípico de RNA en la electroforesis en gel de poliacrilamida puede proporcionar una identificación/diferenciación de cepas precisas. También se han creado métodos basados sobre sondas directas y sondas ampli­ ficadas para la detección de A. actinomycetemcomitans y otros patógenos periodontales directamente en muestras de placas subgingivales.7121287 Se ha utilizado la amplificación del gen IktA, el gen estructural para la leucotoxina de A. actinomyce­ temcomitans, para la identificación y la detección directa del microorganismo en el líquido gingival y la placa subgingival.415-486 Aunque la tipificación y la caracterización de las cepas de A. actinomycetemcomitans pueden lograrse mediante serología, han utilizado otros métodos tradicionales y de base molecular, como tipificación del antibiograma; biotipificación basada sobre la fermentación de mañosa, manitol y xilosa; elec­ troforesis en gel de sulfato de dodecilo-poliacrilamida (SDSPAGE) de OMP, análisis de endonucleasas de restricción de la totalidad del DNA cromosómico, polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción y ribotipificación.65'534 1239 1314 Los ensayos de base molecular pueden tener un valor particular para diferenciar las cepas atípicas de A. actinomycetemcomi­ tans (p. ej., cepas catalasa negativas) de hemófilos y para estu­ dios epidemiológicos.1071

SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS

Las cepas de A. actinomycetemcomitans son sensibles a las ce­ falosporinas de tercera generación (p. ej., ceftriaxona, cefuroxima, cefixima, cefotaxima, ceftazidima, cefepima), fluroquinolonas (p. ej., ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, clinafloxacina), tetraciclina, doxiciclina, azitromicina, trimetoprim-sulfametoxazol, rifampicina y aminoglucósidos.736807-981-982’983 Aunque la amoxicilina muestra buena actividad contra A. actinomycetem­ comitans, entre el 30% y el 40% de las cepas son resistentes a la benzilpenicilina.70’736-807-980 Las cepas resistentes a la penicili­ na no producen enzimas (3-lactamasas, de modo que la resisten­ cia se debe presumiblemente a una alteración de las proteínas fijadoras de penicilina.980 La am oxicilina-clavulanato no demuestra ninguna actividad mayor que la amoxicilina sola, lo que apoya más la falta de actividad de las P-lactamasas.807 La sensibilidad in vitro a la amoxicilina no predice necesariamente un resultado clínico favorable y, en consecuencia, las cefalos­ porinas de tercera generación (ceftriaxona) se consideran los agentes de elección para el tratamiento empírico de las infec­ ciones graves como la endocarditis.1382Algunos estudios in vitro indican que las combinaciones de antibióticos para el trata­ miento de la endocarditis por A. actinomycetemcomitans puede ser sinérgica, aditiva o antagónica.993 Por ende, la eficacia de la terapia de combinación no puede ser predicha y debe ser deter­ minada para cepas individuales mediante una técnica de dilu­ ción en agar o Etest.982 El tratamiento de la enfermedad periodontal asociada con A. actinomycetemcomitans comprende desbridamiento subgingibal, descamación, cepillado de raíces y tratamiento antibiótico dirigido contra las bacterias asociadas con periodontitis. El tra­ tamiento exitoso depende en parte de la erradicación y la supre­ sión de A. actinomycetemcomitans y otras bacterias de los bol­ sillos periodontales profundos. El régimen actualmente reco­ mendado incluye tetraciclina, doxiciclina o un tratamiento combinado con amoxicilina y metronidazol.517 Aunque la mayoría de las cepas se han mantenido sensibles a las tetraci­ clinas -lo s agentes de elección durante muchos años- se ha comunicado una resistencia a las tetraciclinas asociada con

Cuadro 9-3

C aracterísticas bioq u ím icas para la id en tificación de Haemophilus aphrophilus, Haemophilus paraphrophilus, y esp ecies de Actinobacillus aislad as d e seres hu m anos

C A R A C T E R ÍS T IC A Hem olisis, SB A

A. H OM IN IS

H. APH RO PH ILU S

H. PARAPH ROPHILUS

A. ACTINOM YCETEM CO M ITAN S

A. UREAE

-

-

-

-

-

+

+

Oxidasa

—“

Catalasa

-

-

+

+

-

N O j reducido a N 0 2

+

+

+

+

+

Requiere factor X

-

-

-

-

-

Requiere factor V

-

+

—

-

-

Indol

-

-

-

-

-

U reasa

-

—

—

+

+

ODC

-

-

-

Hidrólisis de ON PG

+

+

-

-

+

Glucosa

+

+

+

+

+

M altosa

+

+

+'1

+“

+

Fructosa

+

+

+

ND

ND

Sacarosa

+

+

-

+

+

Lactosa

+

+

-

-

+

Xilosa

-

-

V

-

+

M anitol

-

-

Vc

+

+

M añosa

+

+

+

V

-

Galactosa

+

-

V

-

+

M elibiosa

-

+

-

-

+

Trehalosa

+

+

-

-

+

M elezitosa

-

+

ND

ND

ND

Rafinosa

+

-

-

-

+

Producción de ácido a partir de:

Especies de Actinobacillus

0Algunas cepas pueden producir reacciones positivas débiles o tardías. hRaras cepas son maltosa negativas. 'La mayoría de las cepas son manitol positivas. +: reacción positiva; -: reacción negativa; V: reacción variable; ND: datos no disponibles; ODC: orotidina-5’-fosfato descarboxilasa; SBA: agar sangre de carnero.

433

434

CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

plásmidos y mediada por tetb en A. actinomycetemcomitans,1081 La combinación am oxicilina-m etronidazol se asocia con menos fracasos terapéuticos y erradica y suprime eficazmente la proliferación subgingival del microorganismo.1316 Como la mayoría de las cepas de A. actinomycetemcomitans son resis­ tentes al metronidazol in vitro, el éxito del tratamiento combi­ nado puede deberse en parte a la actividad de la amoxicilina sobre A. actinomycetemcomitans y a la amplia actividad del metronidazol contra los microorganismos periodontales anae­ robios coinfectantes (especies de Prevotella y Porphyromonas). Las fluoroquinolonas (p. ej., ciprofloxacina, moxifloxacina) también pueden ser eficaces para el tratamiento de las infecciones periodontales asociadas con A. actinomycetemco­ mitans.691-907

enfermedad pulmonar crónica y en líquido de empiema.441 Wust y cois, comunicaron sobre dos pacientes con insuficien­ cia hepática, una debida a infección crónica por hepatitis B y la otra a cirrosis alcóholica, en los cuales ocurrió una septicemia por A. hominis como evento terminal de su enfermedad.1400 En un estudio llevado a cabo en Copenhague en 36 pacientes con infección de las vías respiratorias bajas, bacteriemia por A. hominis o ambos, el alcoholismo crónico, la enfermedad car­ diovascular, la drogadicción, los trastornos psiquiátricos cróni­ cos y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica fueron fac­ tores predisponentes frecuentes.442 En el cuadro 9-2 se incluyen las características para la identificación.

Actinobacillus ureae

Los miembros del género Actinobacillus y sus asociaciones con animales son A. lignieresii (caballos), A. equuli (subespe­ cie equuli y haemolyticus) (principalmente caballos), A. suis (cerdos), A. capsulatus (conejos), A. maris (ratones), A. seminis (ovejas, carneros), A. delphinicola (mamíferos marinos), A. scotiae (marsopas), A. succinogenes (rumen bovino) y A. arthritidis (caballos).38-250-251-424-426-508-1194 A. pleuropneumoniae, A. suis, A. rossii, A. minor, A. porcinus y A. indolicus se encuen­ tran en el aparato respiratorio de cerdos.884-1194 También se incluye en este grupo otros taxones sin nombres aislados rara vez (los taxones 5 y 8 de Bisgaard y Actinobacillus genomoespecie 2 [antes ciertas cepas del taxón 9 de Bisgaard]). A. lig­ nieresii causa infecciones granulomatosas en la cavidad bucal y el tubo digestivo del ganado vacuno e infecciones neumóni­ cas y cutáneas en ovejas y otros ungulados. A. equuli produce bacteriemia, peritonitis, nefritis, osteomielitis y artritis en caba­ llos y cerdos, y tanto infecciones localizadas como sistémicas en monos, temeros, perros y conejos. A. suis causa septicemia, neumonía y artritis en cerdos y caballos.997 A. capsulatus causa artritis en conejos y A. pleuropneumoniae es un agente impor­ tante que produce neumonía altamente contagiosa en cerdos. A. muris se encuentra en el aparato genital de los ratones. A. ros­ sii se halla en la vagina de puercas parturientas y en sus crías abortadas, y A. seminis es una causa de epididimitis y esterili­ dad en ovejas.1194 Las infecciones humanas por especies ani­ males de Actinobacillus suelen ocurrir como resultado de un traumatismo relacionado con animales. A. lignieresii, A. equu­ li y A. suis han sido recuperados de muestras clínicas humanas, que incluyen heridas por mordeduras de caballos y ovejas, líquido articular, sangre y esputo.64-109-385-997 Ashhurst-Smith y cois, comunicaron un caso de bacteriemia y sepsis por A. equulis en un carnicero después de que sufriera un corte con un cuchillo en el trabajo.64 Aunque este paciente tenía una válvula mitral protésica colocada, la endocarditis no fue una complica­ ción. Las especies restantes de Actinobacillus no han sido ais­ ladas de muestras clínicas humanas. En el cuadro 9-4 se pre­ sentan las características para la identificación de las especies de Actinobacillus.

Algunos estudios genéticos y fenotípicos han mostrado que varias especies de Pasteurella (“P. ureae”, “P. pneumotropica” y "P aerogenes”) están estrechamente relacionadas con espe­ cies animales del género Actinobacillus.m -3S6-920 Las similitu­ des fenotípicas incluyen reacciones similares de oxidasa y catalasa, reducción de nitrato a nitrito, crecimiento en agar de MacConkey, producción de ureasa y fermentación de varios hidratos de carbono. En la actualidad, P. ureae es la única espe­ cie que ha sido transferida formalmente al género Actinoba­ cillus como Actinobacillus ureae 921 A. ureae es un comensal infrecuente del aparato respiratorio humano y pocas veces aislado en varios tipos de infecciones humanas, como bacteriemia, endocarditis, meningitis, infec­ ción de médula la ósea, rinitis atrófica, bronquitis, neumonía, conjuntivitis, otitis media y peritonitis.71-131 149 156-691-943 En la mayoría de los casos se presenta un trastorno subyacente o pre­ disponente, como infección posquirúrgica, diabetes, enferme­ dad periodontal, enfisema y cirrosis alcóholica. Los casos de meningitis se han asociado con traumatismo de cráneo previo (ataque, cirugía craneal) y con una enfermedad subyacente, que incluye la infección por HIV.661-691 A. urea es un bacilo gramnegativo pleomorfo; en la tinción, algunas cepas forman filamentos característicos. Después de 24 horas de crecimiento en agar sangre en una atmósfera enri­ quecida con CO,, las colonias son lisas, tienen 1 mm de diá­ metro y son no hemolíticas. Algunas cepas pueden parecer mucoides. El microorganismo es oxidasa positivo y catalasa positivo, reduce nitrato a nitrito, no crece en agar de MacConkey e hidroliza rápidamente la urea. No se produce indol y las reacciones de descarboxilasa e hihidrolasa son nega­ tivas. Se produce ácido a partir de glucosa, maltosa, sacarosa y manitol; no se produce ácido a partir de lactosa y xilosa. Las otras especies de Actinobacillus bioquímicamente similares pueden ser diferenciadas de A. ureae por la producción de ácido a partir de otros hidratos de carbono (p. ej., lactosa y xilo­ sa) y por las capacidades de las primeras especies para crecer en agar de MacConkey (cuadros 9-3 y 9-4). Se han utilizado métodos moleculares para el diagnóstico de la meningitis por A. ureae , 1 3 7 3 Las cepas de A. ureae son sensibles a la mayoría de los antibióticos, como penicilina, ampicilina, cefalotina, cefoxitina, tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol y a los aminoglucósidos. Actinobacillus hominis

A. hominis es un microorganismo que con poca frecuencia se aísla en humanos en muestras de esputo de individuos con

Especies animales en el género Actinobacillus

Especies de Pasteurella / Mannheimia Taxonomía y características del género Pasteurella

Las especies de Pasteurella son miembros de la familia Pasteurellaceae (véase cuadro 9 - 1).205,33i,425,975 £ n [a actualidad, la estructura taxonómica de esa familia es complicada y poco clara, y los taxonomistas están intentando revelar las relaciones entre los miembros de los géneros descritos y la asignación correcta de distintas especies a estos géneros.38-254-313,331 La deli-

Cliadro 9 - 4

I ¡BnictcrÍNlIciis lilo<|iiiniints p u n í ln ¡ile n lillim io ii


especies tle Á c lin o b iic illm «le

iiiík c ii

¡iiiiiiuil

CRECIMIENTO, ESPECIE

H EM O LISIS, SBA

CATALASA

OXIDASA

AGAR DE MACCONKEY

REDUCCIÓN DE NITRATO

INDOL

UREASA

ODC

-

+

-

FOSFATASA

ONPG

-

v+

V

V

+

A. equuli subespecie equuli

-

\/+d

+/+■'

V

+

-

+

A. equuli subespecie haemolyticus

+

+

+

V

+

-

+

A. arthritidis

-

+

+

V

+

-

+

-

+

+

A. suis

+

v+

V

V

+

-

+

-

+

v+

A. capsulatus

-

+

+

+

+

-

+

-

+

+

A. maris

-

+

+

-

+

-

+

-

-

-

A. pleuropneumoniae

+

V

V

-

+

-

+

-

+

+

A. rossii

V

+

+

v+

+

-

+

-

+

v+

A. seminis

-

V

+

-

+

-

-

V

■ -

-

A. delphinicola

-

+

-

-

+

-

-

V

+

-

A. scotiae

-

+

-

-

+

-

+

V

ND

+

A. succinogenes

-

+

+

ND

+

-

-

ND

+

ND

A. minor

-

ND

-

ND

+

-

+

-

ND

+

A. porcinus

-

ND

-

ND

+

-

-

-

ND

+

A. indolicus

-

ND

+

ND

+

+

-

-

ND

+

A. lignieresii

'

+

V

ND

+

ND

ND

+

ND

+

+

+

RAF

MEL

SAL

+

-

V

-

-

V

-

+

+

-

-

+

+

-

ND

+

+

ND

ND

V+

-

+

+

+

+

+

-

+

+

+

-

-

Wd+

Vrf+

+

+d

+

-

-

+d

-

V

-

V

+

+

+

+

V

-

-

V

-

V

V

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

V

-

-

-

-

+

+

+

+

-

+

-

+

-

-

ND

-

+

ND

ND

V

V

ND

V

V

ND

ND

-

+

-

+

ND

ND

MAL

SAC

LAC

XIL

MNTL

TRE

MAN

ARAB

SORB

GAL

A. lignieresii

+

+

+

V

+

+

-

+

v-

V

A. equuli subespecie equuli

+

+

+

+

+

+

+

+

V

V

A. equuli subespecie haemolyticus

+

+

+

+

+

+

+

+

V

V

V

A. arthritidis

+

+

ND

ND

+

ND

+

ND

V

+

A. suis

+

+

+

+

+

-

+

+

v+

-

A. capsulatus

+

+

+

+

+

+

+

+

-

A. maris

+

+

+

-

-

+

+

+

A. pleuropneumoniae

+

+

+

V

+

+

-

+

A. rossii

+

V

-

V

+

+

-

A. seminis

+

V

-

-

-

V

-

A. delphinicola

+

-

-

-

-

-

-

A. scotiae

t

-

-

+

-

-

-

A. succinogenes

+

+

+

+

+

+

-

A. minor

+

+

+

+

ND

-

ND

+

A. porcinus

+

V

V

V

ND

V

ND

V

A. indolicus

+

+

+

V

ND

-

ND

+

-

-

435

+: reacción positiva; reacción negativa; V: reacción variable; V *: variable, pero la mayoría de las cepas son positivas; V : variable, pero la mayoría de las cepas son negativas. +d: reacción positiva débil; Vd+: variable, pero la mayoría de las cepas son débilmente positivas; Glu: glucosa; M al: maltosa; Sac; sacarosa; Lac: lactosa; X il: xilosa; Mntii. manitol; Tre: trehalosa; Man mañosa; Arab: arabinosa; Sorb: sorbitol; Gal: galactosa; ¡nos: inositol; RaJ: rafinosa; Mei. melibiosa; Sal: salicilina; SBA: agar sangre de carnero.

Especies de Pasteurella y Mannheimia

INOS

GLU

ESPECIE

R EQ U ERIM IENTO DE FACTOR V

436

CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

neación de estos géneros se basaba sobre estudios de hibrida­ ción de DNA y las especies que mostraban una homología mayor del 50% eran incluidas en el mismo género con poco res­ peto por su origen filogenético y la caracterización fenotípica 918,919,920,1197 [)esc[e 1985, nuevas especies dentro de la familia Pasteurellaceae han sido asignadas al género Actinobacillus o al género Pasteurella en forma más o menos arbitraria. El exa­ men de las secuencias de rRNA 16S ha mostrado que las espe­ cies “más viejas” de Pasteurella -P. pneumotropica, P. aeroge­ nes, P. ureae y “grupo P. haemolytica”- no están estrechamen­ te relacionadas con la especie tipo de Pasteurella (P. multocida sensu stricto) o entre sí y probablemente pertenecen al género Actinobacillus o a nuevos géneros.331-918 1194 La reestructuración formal de la familia comenzó en 1986, cuando P. ureae fue rea­ signado al género Actinobacillus como A. ureae.92' En 1999, los miembros del “grupo P. haemolytica” (incluidos P haemolytica sensu stricto y P. granulomatis) fueron colocados en el nuevo género Mannheimia o reclasificados como la especie previa­ mente descrita P. trehalosi.i%Estos estudios también condujeron a la transferencia de Haemophilus pleuropneumoniae al género Actinobacillus como A. pleuropneumoniae y a la transferencia de “Haemophilus avium” y otras cepas no clasificadas depen­ dientes del factor V al género Pasteurella (P. avium, P. volantium).919'0'9 Al igual que P. aerogenes y P. pneumotropica, “especies” como P. caballi y P. bettvae también tienen una con­ dición taxonómica indeterminada. Los miembros del género Pasteurella comparten algunas características fenotípicas.205-918'920 Las especies de Pasteurella son cocobacilos o bacilos anaerobios facultativos, gramnegati­ vos e inmóviles. La mayoría de las especies son oxidasa posi­ tivas, catalasa positivas y fosfatasa alcalina positivas y reducen el nitrato a nitrito. También producen ácido a partir de glucosa, fructosa, mañosa y sacarosa y ninguna de ellas hidroliza el almidón o la salicina. Todas tienen ácidos grasos similares en la pared celular, que son fundamentalmente C 16:lw7c, C l6;0 y C14:09. Por lo general, todas las especies son sensibles a penici­ linas, cefalosporinas y tetraciclinas. Es difícil distinguir fenotí­ picamente a los miembros del género Pasteurella y a especies de Actinobacillus asociados con animales.920 Al igual que las pasteurelas, las especies animales de Actinobacillus son carac­ terísticamente cocobacilos gramnegativos oxidasa positivos y catalasa positivos que reducen nitrato a nitrito. Varios miem­ bros de ambos géneros también producen ureasa. En el recua­ dro 9-8 se describen los hábitats y la importancia clínica de las especies de Pasteurella y Mannheimia y en el cuadro 9-5 y el cuadro 9-6, respectivamente, las características bioquímicas útiles para su identificación. Esta explicación se limitará a los microorganismos asociados con enfermedad humana. Pasteurella multocida IMPORTANCIA CLÍNICA Y VIRULENCIA

P. multocida es la especie de Pasteurella que más se aísla de muestras humanas; también se recupera de una amplia variedad de animales. El microorganismo puede cultivarse de las cavi­ dades bucales de gatos (70-90%) y perros (40-66%) domésti­ cos sanos, y también se encuentra en muchos otros animales, como ganado vacuno, caballos, cerdos, ovejas, aves de corral, roedores, conejos, monos, leones, panteras, linces, aves, renos y búfalos.1250 En algunos animales, causa infecciones graves, que incluyen fiebre de transporte y septicemia hemorrágica en ganado vacuno, cólera en aves de corral, rinitis atrófica en cer­ dos y pleuritis, neumonía, formación de abscesos, rinitis cróni­ ca, otitis media y septicemia en conejos de laboratorio. La mayoría de las infecciones humanas son de heridas y celulitis

asociadas con mordeduras y arañazos de gato. En ocasiones, se halla P. multocida en la nasofaringe de individuos sanos que tienen una exposición frecuente a los animales. Los pacientes inmunodeprimidos, sobre todo aquellos con enfermedades hepáticas (p. ej., cirrosis), tumores sólidos o procesos malignos hematológicos, pueden tener bacteriemia por este microorga­ nismo por infecciones localizadas (p. ej.. heridas por mordedu­ ras) y la bacteriemia puede sembrar otros sitios y conducir a neumonía, meningitis u otras complicaciones. En el recuadro 9-9 se ofrece más información sobre el espectro clínico de P. multocida. Se han investigado los factores de virulencia fundamental­ mente con cepas de P. multocida que se asocian con enferme­ dades de importancia económica en animales, como la rinitis atrófica en los cerdos. Algunas cepas son encapsuladas y se describieron cinco grupos capsulares, designados A, B, D, E y F. Estos grupos capsulares pueden ser divididos en los serotipos somáticos 1 a 16.1286 La mayoría de las cepas P. multocida aisladas en humanos pertenecen al grupo capsular A y, en menor grado, al grupo D. Las cepas de P. multocida que cau­ san rinitis atrófica producen una toxina dermonecrótica de 145 kDa que es un factor de virulencia esencial para el desarrollo de esta infección progresiva del aparato respiratorio.777 La pro­ ducción de toxina se asocia fundamentalmente con los tipos capsulares A y D, y el gen de la toxina, toxA, se localiza en una región conservada del cromosoma de P. multocida. El análisis fenotípico y genotípico de cepas toxigénicas ha mostrado que estas cepas no son clónales y no pudieron hallarse diferencias importantes entre las cepas toxigénicas de origen porcino o humano cuando se las investigó mediante métodos bioquími­ cos, serológicos o de tipificación genómica.347 Se han creado métodos moleculares para la detección directa del gen toxA en cepas de P. multocida aisladas en animales.777 No se cono­ ce el papel de la toxina dermonecrótica en la enfermedad humana. Las cepas clínicas de P. multocida también producen lipasas, que pueden ser factores de virulencia para este micro­ organism o.1027

CARACTERÍSTICAS DE LOS CULTIVOS E IDENTIFICACIÓN

No es difícil aislar ni identificar a P. multocida, aunque el conocimiento del tipo de muestra y el antecedente de exposi­ ción a animales aumentan el índice de sospecha acerca de su presencia. P. multocida crece bien en agar chocolate y agar san­ gre de carnero y forma colonias grises suaves que tienen 0,5 y 2 mm después de 24 horas de incubación en C 0 2 (véase lámi­ na en color 9-5A y B). El microorganismo es no hemolítico y no crece en agar de MacConkey, agar eosina azul de metileno (EMB) u otros tipos de medios entéricos selectivos o diferen­ ciales. Las cepas provenientes del aparato respiratorio pueden ser mucoides. Se observa a menudo un olor característico (similar a E. coli, pero más acre), tal vez por la formación de grandes cantidades de indol por el microorganismo. P. multoci­ da es oxidasa positivo, catalasa positivo, ornitina descarboxila­ sa positivo, indol positivo y ureasa negativo. La prueba de indol en el sitio utilizando el reactivo p-aminocinnamaldehído suele ser fuertemente positiva (véase lámina en color 9-5C). Produce ácido, pero no gas, a partir de glucosa, sacarosa y manitol, pero no de maltosa o lactosa. Para las cepas típicas aisladas en focos probables, como la mordedura o el arañazo de un gato, la demostración de bacilos gramnegativos oxidasa positivos fuer­ temente indol positivos y que no crecen en agar de MacConkey suele ser suficiente para identificar a P. multocida. Las cepas de P. multocida pueden dividirse a su vez en tres subespecies

Especies de Pasteurella y M annheim ia

R ecuadro 9 -8

437

E s p e c ie s d e P asteurella y M an n h eim ia re c o n o c id a s e n la a c tu a lid a d

Especie/subespecie E species d e Pasteurella P. multocida subespecie multocida P. multocida subespecie séptica P. multocida subespecie gallicida P. pneum otropica P. aerogenes P. bettyae P. dagmatis P. canis P. stomatis P. caballi P. gallinarum P. anatis P. langaaensis P. avium P. lymphangiditis P. m airi P. testudinis P. trehalosi Pasteurella sp. nueva especie 1 Especies d e M annheim ia Sí. haemolytica M. glucosida Sí. granulomatis Sí. ruminalis Sí. varigena

Hábitat e importancia clínica en los seres humanos

Aparato respiratorio de los m am íferos no humanos: cepas clínicas de infecciones en seres humanos Igual que el anterior Igual que el anterior; tam bién se asocia con cólera en aves de corral Aparato respiratorio de cobayos, ratas, hám sters, gatos y perros; pocas veces se aísla de seres humanos Flora normal en el tubo digestivo de los cerdos; infección hum ana luego de la m ordedura de un cerdo A bscesos humanos de glándula de Bartolino y de los dedos de las manos; puede asociarse con enfermedad ulcerosa genital; baeteriem ia posparto; neum onía y derrame pleural en pacientes con SIDA Aparato respiratorio de perros y gatos; heridas por m ordeduras de anim ales e infecciones sistém icas en seres humanos Aparato respiratorio de perros y corderos; heridas por mordeduras de perros en seres humanos Aparato respiratorio de perros; infecciones de heridas por m ordeduras de perros Cepa equina que produce neum onía, infección de herida; se ha comunicado una única infección de herida humana Aparato respiratorio de pollos y gallinas; dos casos com unicados de baeteriem ia en seres humanos Flora del tubo digestivo de patos Flora del aparato respiratorio de pollos y otras aves de corral Flora del aparato respiratorio de aves de corral sanas Linfangitis bovina Aborto espontáneo en marranas; sepsis en chanchitos Patógeno en algunas especies de tortugas del desierto Septicem ia en corderos adolescentes Flora de las vías respiratorias altas de perros y gatos; se asocia con heridas de m ordeduras de perros y gatos; tam bién se ha comunicado endocarditis hum ana Infecciones neum ónicas en el ganado vacuno; mastitis en las ovejas; septicem ia en las cabras y en las ovejas; flora de las vías respiratorias altas de los rumiantes; se han com unicado raras infecciones hum anas H ora de las vías respiratorias altas de ganado vacuno y ovejas Enferm edad granulom atosa progresiva (paniculitis) en el ganado; bronconeum onía y conjuntivitis en especies leprinas y ciervos Flora norm al en el rum en de ovejas y ganado N eum onía, mastitis y septicem ia en ganado vacuno; tam bién se encuentra com o parte del aparato respiratorio, el rum en y la flora intestinal del ganado vacuno; la flora del aparato respiratorio de los cerdos; sepsis, enteri­ tis y neum onía en cerdos

1

(subespecies multocida, séptica y callicida) sobre la base de la producción de ácido a partir de sorbitol y dulcitol (véase cua­ dro 9-5). Las cepas de P. multocida subespecie multocida tam­ bién son a-glucosidasa negativas, mientras las cepas de la subespecie séptica son a-glucosidasa positivas.613 En realidad, las cepas de la subespecie séptica asiladas en felinos pueden constituir una especie separada.737 La identificación de subes­ pecies es de interés en el estudio de las cepas aisladas veteri­ narias pero no es particularmente relevante o importante en las cepas aisladas en humanos. Como sucede con muchos otros microorganismos, se describieron técnicas moleculares para la identificación de especies y subespecies.737-865

SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS

Las pruebas de sensibilidad a los antibióticos indican que las cepas de P. multocida son ampliamente sensibles a distintos antibióticos in vitro. El microorganismo es sensible a penicili­ na. ampicilina, amoxicilina-clavulanato, penicilinas de amplio espectro (ticarcilina, piperacilina, mezlocilina), cefalosporinas de amplio espectro (es decir, cefotaxima, cefoperazona, cefuroxima, ceftazidima, ceftizoxima), tetraciclinas y cloranfeni-

col.476899’944 Se ha observado menos actividad con las cefalos­ porinas de primera generación, como cefalotina y cefazolina. y con las penicilinas semisintéticas.476944 Los aminoglucósidos tienen una actividad moderada a escasa contra las cepas de P. multocida in vitro y el microorganismo es resistente a vanco­ micina y clindamicina.477 Entre los macrólidos, azitromicina, claritromicina, roxitromicina y diritromicina tienen mayor acti­ vidad contra P. multocida que la eritromicina.477-480 Las cepas de P. multocida también son muy sensibles a las fluoroquino­ lonas y las oxazolidininonas, pero los datos clínicos que apo­ yan su eficacia como quimioterápicos son limitados.479-480 Las cepas animales de P. multocida a menudo son resistentes a tetraciclina debido a la presencia de un determinante de resis­ tencia a la tetraciclina tet(H) asociado con transposones.538 Aunque los resultados de las pruebas de sensibilidad por difusión con discos para las cepas de P. multocida suelen corre­ lacionarse con los obtenidos mediante técnicas de dilución en agar y caldo, se han observado discrepancias con aminoglucósidos y eritromicina. Con estos agentes, las pruebas de difusión con discos a menudo indican una mayor resistencia a estos fár­ macos que los procedimientos cuantitativos. A pesar de la sen­ sibilidad in vitro de P. multocida a numerosos agentes, la expe-

438

CAPÍTULO 9

C aracterísticas b ioq u ím icas para la id entificación de esp ecies de

ESPECIES

HEMOLISIS, SBA OXIDASA CATALASA

Pasteurella

CRECIMIENTO, AGAR DE MACCONKEY

REDUCCIÓN DE NITRATO INDOL UREASA

ODC

FOSFATASA

ONPG

REQUERIMIENTO DE FACTORV

P. multocida subespecie multocida

-

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P. multocida subespecie séptica

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P. multocida subespecie gallicida

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P (A .) pneumotropica

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P. canis P. stomatis P. caballi P. gallinarum P. anatis P. langaaensis P. avium P. lymphangiditis

-

-

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P. m airi

V

+

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V

P. testudinis

+

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V

-

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Pasteurella, nueva especie 1

-

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-

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+

Pasteurella, especie A

-

+

+

-

ND

-

Pasteurella, especie B

-

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+

-

ND

+

-

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

Cuadro 9-5

GLU

MAL

SAC

P. m u lto c id a subespecie m u lto c id a

+

-

ND

P. m u lto c id a subespecie sép tica

+

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ND

P. m u lto c id a subespecie g a llic id a

+

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P .(A .) p n e u m o tro p ic a

+

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KSI’KCIKS

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P asteurella nueva especie 1

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ND

P asteurella, especie A

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P asteurella, especie B

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ND

-

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ND

Especies de Pasteurella y Mannheimia

“Raras cepas pueden ser lactosa positivas. ''La mayoría de las reacciones son negativas para los microorganismos indicados. 1Raras cepas pueden ser xilosa negativas. dGas producido a partir de glucosa por la mayoría de las cepas. 'Algunas cepas form an pequeñas cantidades de gas a partir de hidratos de carbono. +: reacción positiva; reacción negativa; V: reacción variable; V+: reacción variable, la mayoría de las cepas son positivas; V~: reacción variable, la mayoría de las cepas son negativas; +d reacción positiva débil; ND: datos no disponibles; SBA: agar sangre de carnero; ODC: ornitina descarboxilasa; Glu: glucosa; Mal: maltosa; Sac: sacarosa; Lac: lactosa; Xil: xilosa; Mntl: manitol; Man: mañosa; Arab: arabinosa, Sorb: sorbitol; Gal: galactosa; Inos: inositol; R a f rafinosa; Dulc: dulcitol.

439

440

CAPÍTULO 9

Cuadro 9 -6

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

C aracterísticas bioq uím icas para la id entificación de esp ecies de M a n n h e im ia

C A R A C T E R ÍS T IC A Hemolisis, sangre bovina Oxidasa Reducción de nitrato Fosfatasa alcalina Citrato M otilidad Ureasa Indol Arginina dihidrolasa O m itina descarboxilasa Gas a partir de glucosa A cido a partir de: Adonitol Am igdalina A rabinosa Arbutina Celobiosa Dextrina Esculina Gentabiosa M esoinositol M altosa M anitol M añosa M elibiosa Salicina Sorbitol Trehalosa Xilosa P-glucosidasa (J-galactosidasa p-xilosidasa p-fucosidasa Fuente

M. H A EM O LYT1C A

M. G L U COSIDA"

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Ganado, ovejas

Ovejas

Ovejas, ciervos

G anado, ovejas0

V V V V G anado, cerdos

+

“Dividido en 9 biovariedades, A-I bDividido en 2 biovariedades, 1, 2. cDividido en 2 biovariedades, 1, 2. dBiovariedades A -E e I son positivas; biovariadades F, G y H son negativas. eBiovariedades A, C, D, G e I son positivas; biovariedades B, E, F y H son negativas. íBiovariedades A, B, D -H son positivas, biovariedades C e I son negativas. +: reacción positiva; reacción negativa; V: reacción variable; + : mayoría de cepas positivas, raras cepas negativas; - +: mayoría de cepas negativas, raras cepas positivas.

rienda clínica con muchos de ellos es limitada y, por lo tanto, impide su recomendación para el tratamiento empírico. En la actualidad, la penicilina y las cefalosporinas parenterales de amplio espectro siguen siendo los agentes de elección para el tra­ tamiento de las infecciones causadas por P. multocida. La resis­ tencia a la penicilina a través de la producción de P-lactamasas mediadas por plásmidos es bastante rara entre P. multocida y se comunicó por primera vez en cepas aisladas en animales.791 En 1991, se aisló la primera cepa de P. multocida productora de (i-lactamasa en un ser humano de una muestra respiratoria.1093 Esta cepa era resistente a penicilina, ticarcilina, cefalotina, sulfamidas y tetraciclinas; el clavulanato y el sulbactam redujeron 64 veces las CIM para los fármacos P-lactámicos. Esta P-lactamasa fue caracterizada como tipo RO B-1 según las especifici­ dades de sustrato y de inhibición y las determinaciones del punto isoeléctrico. En 2001, se aisló una cepa de P. multocida de origen humano que era resisten»? a la penicilina debido a la

producción de una P-lactamasa TEM-1 codificada por un plás­ mido de 4,3 Kb.922 Otras especies de Pasteurella aisladas de infecciones humanas

PASTEURELLA PNEUMOTROPICA ( “ACTINOBACILLUS PNEUMOTROPICA ”)

P. pneumotropica es parte de la flora del aparato respiratorio de perros, gatos, ratas y ratones. En roedores de laboratorio, el microorganismo produce infecciones de las vías respiratorias bajas. Los seres humanos adquieren el microorganismo a tra­ vés de la exposición traumática a animales, como mordeduras de perros y gatos. Las infecciones humanas atribuidas a P. pneumotropica incluyen meningitis, baeteriemia con shock, infecciones osteoarticulares, infección de heridas, celulitis e infección de las vías respiratorias altas.63436-444-872 1083 También se documentó una neumonía intersticial bilateral debida a P. pneumotropica en un paciente de 27 años con SIDA que vivía

Especies de Pasteurella y M annheim ia

Recuadro 9-9

441

Espectro clínico de las infecciones humanas por Pasteurella m ultocida

Infecciones de heridas y celulitis Las infecciones de heridas locales en los seres humanos se asocian con mordeduras de gatos, arañazos de gatos o mordeduras de perros. Estas infecciones se caracterizan por el rápido desarrollo de dolor, eritema, tumefacción, celulitis con form ación de abscesos o no y secreción purulenta o serosanguinolenta en el sitio de la herida.1366 Se presenta linfadenopatía regional en el 30-40% de los casos y pueden presentarse o no signos sistémicos de infección. Las com ­ plicaciones localizadas graves (p. ej.. artritis séptica, osteomielitis) siguen más a m enudo a las m ordeduras de gatos, en que la herida puede ser profunda, forzada y traum ática para los tejidos subyacentes. Com o la m ayoría de las heridas por m ordeduras están sobre las manos, se suelen observar com plicaciones :>eas y articulares en estos sitios. También pueden desarrollarse infecciones graves de las heridas que requieren desbridam iento escisional (p. ej.. fasciitis r.ecrosante) en pacientes con enferm edades subyacentes como diabetes.531 1424 En ocasiones, este m icroorganismo se encuentra en heridas que no se asocian . n mordeduras de animales o con una exposición obvia a ellos. También han ocurrido infecciones de heridas por P. multocida com o resultado de la lamida j e un perro o de un gato sobre heridas abiertas o parcialmente cicatrizadas.278 La bacteria ha sido aislada de úlceras por decúbito, de abscesos perioculares y j e infecciones de heridas abdom inales y ortopédicas posquirúrgicas.615

Mecciones de huesos y articulaciones Las infecciones de huesos y articulaciones son el resultado de la implantación de P. multocida en el hueso y los espacios articulares por una mordedura traum ática (habitualmente de un gato), por la siembra hem atógena de los espacios articulares o por la propagación continua desde una celulitis adyacente. L i artritis séptica por P. multocida a m enudo se asocia con enfermedad articular preexistente, artritis reum atoide y el uso de corticosteroides; las infecciones '•-elsn ser más graves en los pacientes con enfermedades subyacentes (p. ej., cáncer, gota).191'402 La propagación hem atógena de P. multocida puede también conducir a infección de las prótesis articulares.8171249 Puede ocurrir una osteomielitis por la extensión directa de la infección del tejido blando por la inocula­ ción traum ática de m icroorganismos en el periostio óseo en el m om ento de la m ordedura.

Infecciones del aparato respiratorio P- multocida puede ser recuperado también de las vías respiratorias altas y bajas, donde puede existir com o un comensal o como causa de epiglotitis, neu­ monía. em piema, absceso pulmonar, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, bronquitis, sinusitis, amigdalitis y otitis m edia.160-470-786'864-974-1383 Los individuos con colonización por P. multocida del aparato respiratorio a menudo tienen antecedentes de exposición ocupacional o recreativa a los animales. La m ayoría de los pacientes sintom áticos suelen tener cierto com prom iso preexistente de las vías respiratorias altas o los pulm ones (p. ej., enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis o sinusitis crónica, bronquiectasis, carcinom a pulmonar, SIDA). Los síntom as de la neum onía por P. multocida incluyen un inicio insidioso o brusco con fiebre, m alestar general, disnea y dolor torácico pleurítico. En la radiografía de tórax, la presentación más frecuente es la -: nsolidación lobular, con afectación principal del lóbulo inferior. Las com plicaciones incluyen el desarrollo de derrames pleurales y empiema. La infección ie ¡as vías respiratorias altas también puede tener presentaciones clínicas atípicas. Se comunicó un caso de amigdalitis por P. multocida en un paciente j-ego de la ingestión accidental de un cultivo de caldo de microorganismo y otro caso de am igdalitis en una m ujer cuyo gato habitualm ente lamía su cepillo i e dientes."»51433

Endocarditis

p

multocida puede ser una causa rara tanto de endocarditis de válvula natural com o de válvula protésica.458-932 1318 Los pacientes no suelen tener anteceden­

tes Je cardiopatía subyacente o preexistente, aunque com únm ente se encuentra com o antecedente la exposición a un gato o a un perro y una enfermedad '--y a c e n te (hepatitis, cirrosis). Con esta infección, se afecta la válvula aórtica más a m enudo que la válvula mitral. La endocarditis debida a P. multocida -_r.e ser subaguda en su presentación clínica, com o lo indica un retraso de 1 sem ana a 4 meses del inicio de los síntom as al diagnóstico etiológico. El único caso de endocarditis de válvula protésica ocurrió en una mujer de 72 años con un implante de una válvula de Carpentier-Edwards por una estenosis aórtica ? ¿ños antes del inicio de la enfermedad.932 La paciente respondió a penicilina y am plicina-sulbactam y no fue necesario el reemplazo valvular.

Mecciones del sistema nervioso central La< infecciones del sistema nervioso central causadas por P. multocida han incluido meningitis, em piema subdural y absceso encefálico.147-499-760-1338 La pre­ sentación clínica de la meningitis por P. multocida es sim ilar a la causada por otros agentes; el LCR es casi siempre purulento y se observan cocobacilos ¿rim negativos en las tinciones de Gram. Se han com unicado infecciones del SNC en individuos ancianos con enferm edades subyacentes y en lactantes. Los casos de meningitis en lactantes habitualm ente se han asociado con la exposición atraum ática a los animales. En un caso, un lactante de 7 meses con meninp a s no tuvo ninguna exposición directa a un gato dom éstico (p. ej., mordeduras, arañazos o lamidas), pero su herm ano de 2 años, cuyas m anos habían sido lamidas por e! perro dom éstico, a menudo reconfortaba al niño dejándolo que succionara sus dedos.1338

M ecciones oculares r,ulnicida ha sido aislado de raros casos de conjuntivitis, absceso peridural con celulitis. queratitis y endoftalmitis. Se diagnosticó una conjuntivitis puruaita en el propietario de un caballo que no recordaba haber recibido ninguna m ordedura o arañazo del anim al.1271 La queratitis por P. multocida y las úlcets corneales habitualm ente ocurren luego de laceraciones corneales por arañazos de gatos o perros.1241 La endoftalm itis por P. multocida ha ocurrido luego e heridas penetrantes por arañazos de gato como una com plicación posoperatoria inm ediata o tardía de la cirugía de cataratas o de implante del cristalio ' ' Esta infección puede conducir a la pérdida de la agudeza visual o a la necesidad de enucleación del ojo. (Continúa)

442

CAPÍTULO 9

R ecuadro 9 -9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

E s p e c tro c lín ic o d e la s in fe c c io n e s h u m a n a s p o r P asteurella m ultocida (cont.)

Sepsis y baeteriemia La sepsis y la baeteriem ia por P. multocida pueden ocurrir por propagación del m icroorganism o desde una herida por m ordedura localizada o pueden origi­ narse en un sitio infectado en cualquier otra parte.1043 En algunos casos, la herida inicial es tan inocua (p. ej., un rasguño m enor que un perro produce con sus patas) que es ignorada hasta que aparecen signos y síntomas de sepsis. La baeteriem ia ocurre predom inantem ente en casos de enfermedad hepática pre­ existente (p. ej.. cirrosis) u otros trastornos subyacentes, como neoplasias sólidas, procesos malignos hem atológicos, lupus eritem atoso sistém ico e infección por HIV.77-177-194'406-1043 Sin embargo, se ha observado una sepsis profunda debida a P. multocida luego de m ordedura de animales en individuos que no tenían ninguna enfermedad subyacente.1108 En los pacientes con baeteriemia, la diseminación hem atógena puede producir infección intraabdominal, meningitis, neumonía, artritis séptica, bursitis y osteomielitis vertebral.1041 También se describió una sepsis biliar m ortal por P. multocida en un paciente con cirrosis com plicada por el desarrollo del síndrome de W aterhouse-Friderichsen.619

Infecciones intraabdominales P. multocida es una causa infrecuente de infecciones intraabdom inales, com o infecciones de heridas posquirúrgicas, peritonitis bacteriana espontánea, apendicitis, abscesos intraabdom inales y abscesos esplénicos o hepáticos.485-59410431251 Los pacientes en los cuales se desarrollan estas infecciones siempre tienen enfermedades subyacentes com o cirrosis, tum ores de órganos sólidos o procesos hem atológicos malignos. Desde el punto de vista clínico, la peritonitis cau­ sada por P. m ultocida es sim ilar a la causada por bacterias entéricas, con dolor abdominal, fiebre, hem orragia gastrointestinal e hipotensión. P. multocida es recuperado de líquido de paracentesis en cultivo, aunque las tinciones de Gram directas del líquido a m enudo son negativas. Como la m ayoría de los pacien­ tes con peritonitis suelen tener baeteriem ia simultánea, se cree que la siembra de la cavidad peritoneal es a través de la vía hem atógena en la m ayoría de los casos, aunque se ha com unicado una infección peritoneal asociada con endoscopia alta.701 Aunque la m ayoría de los casos de peritonitis se asocian con el contacto con anim ales, algunos pacientes no recuerdan o no han tenido ninguna exposición importante a gatos o perros.103 La peritonitis asociada con diáli­ sis peritoneal am bulatoria continua causada por P. multocida es inusual pero ha sido com unicada.795915 En algunos casos, el microorganismo fue introducido en la cavidad peritoneal por mordeduras o arañazos de gato sobre la tubuladura de diálisis peritoneal.*2" 1

Infecciones obstétricas, ginecológicas y urinarias En ocasiones, P. m ultocida coloniza los genitales externos fem eninos, y produce infecciones ginecológicas o perinatales graves, que incluyen m eningitis, en el recién nacido. Las infecciones del aparato genital fem enino y neonatales han incluido infección difusa del aparato genital, absceso tuboovárico, absceso de la glándula de Bartolino, endom etritis relacionada con dispositivos intrauterinos, infección intrauterina seguida por aborto séptico, corioam nionitis con sepsis neonatal, neum onía o m eningitis.215'796 1073 1343 La m ayoría de los pacientes tienen algún tipo de enfermedad subyacente o com prom iso inm une, como traum atism o craneal previo, neurocirugía, cirrosis hepática, infección de heridas posoperatorias, carcinom a de cuello uterino y m alform aciones congénitas del aparato genitourinario. También se describió sepsis puerperal, con el aislamiento del m icroorganismo de la sangre y la secreción endocervical en una m ujer previam ente sana con exposición no traum ática al gato de la fam ilia.1336 En este caso, las "huellas digitales” m ediante PCR probaron la identificación genotípica de las cepas clínicas aisladas de la paciente y de la cavidad bucal de su gato. M uy pocas infecciones urinarias pueden ser causadas por P. multo­ cida. Estos casos se asocian más a menudo con gatos, y los pacientes suelen tener una anatom ía urológica anormal como resultado de una cirugía.790

con varios perros.292 Recientemente se informó una peritonitis por P. pneumotropica resultante de la contaminación de la tubuladura de diálisis por un hámster doméstico en un pacien­ te en diálisis ambulatoria continua.196 Las muestras que dieron cultivos positivos incluyeron secreción de heridas, fragmentos óseos, líquido articular, hisopados de fauces, orina, líquido pleural y sangre. Después de 24 horas de incubación, las colonias de P. pneu­ motropica en agar sangre tienen un tamaño variable (0,5-1 mm de diámetro), son lisas, convexas y no hemolíticas. Son ureasa positivas, indol positivas y ornitina descarboxilasa positivas (véase cuadro 9-5). Las dos últimas pruebas de identificación ayudan a diferenciar P. pneumotropica de A. ureae, que es negativo para estas dos reacciones (véase cuadro 9-3). Algunas cepas de P. pneumotropica crecen en agar de MacConkey. La prueba de ureasa positiva y las reacciones diferenciales para maltosa y manitol ayudan a diferenciar este microorganismo de P. multocida. Una “especie” que está estrechamente relacionada con P. pneumotropica recibió los nombres provisorios de especies de Pasteurella nueva especie 1, Pasteurella “gas” o grupo SP.205 Esta especie fue aislada de mordeduras de animales, otras

muestras de seres humanos y muestras orofaríngeas de perros y gatos. Este microorganismo se asemeja a P. pneumotropica en las características de cultivo y las reacciones bioquímicas. Las colonias tienden a ser ligeramente más grandes que las de P. pneumotropica después de 24 horas de incubación. Al igual que P. pneumotropica, es indol positiva, ureasa positiva y mal­ tosa positiva, pero puede diferenciarse por la falta de actividad de ornitina descarboxilasa y de producción de ácido a partir de xilosa. La ureasa, la ornitina descarboxilasa y la producción de ácido a partir de maltosa son útiles para diferenciar esta espe­ cie de P. multocida. Las cepas “similares a P. pneumotropica” ureasa negativas también han sido denominados especies de Pasteurella taxón 16.140Algunas cepas de Pasteurella “gas” pro­ ducen pequeñas cantidades de gas a partir de glucosa y otros hidratos de carbono. Algunos miembros de este taxón más algu­ nos otros microorganismos “similares a P. pneumotropica" han sido reclasificados como P. dagmatis (véase cuadro 9-5). Las cepas de P. pneumotropica habitualmente son sensibles a peni­ cilina; ampicilina; cefalosporinas de primera, segunda y terce­ ra generación; piperacilina; tetraciclina; eritromicina; cloranfenicol y ciprofloxacina. La mayoría de las cepas son sensibles a los aminoglucósidos y a trimetoprim-sulfametoxazol.292

Especies de P asteurella y M annheim ia

PASTEURELLA AEROGENES ( “ACTINOBACILLUS AEROGENES")

P. aerogenes es parte de la flora orofaríngea e intestinal de los cerdos.842 Algunas raras infecciones humanas han sido el resultado de mordeduras, heridas por ataques con los colmillos u otras exposiciones ocupacionales a cerdos y jabalíes.369 Este microorganismo también se asocia con abortos y mortinatos en animales, incluidos cerdos, perros y conejos. P. aerogenes fue aislado en los oídos y la faringe de un mortinato de 31 de ges­ tación.1274 También se lo aisló en los cultivos vaginales de la madre después del parto. En la investigación, los autores des­ cubrieron que la mujer trabajaba como asistente en una granja de cerdos en Dinamarca. No se supo si el microorganismo infectó al feto por vía hematógena o por una infección ascen­ dente del aparato genital. También se diagnosticó osteomielitis vertebral por P. aerogenes en un hombre inmunocompetente de 67 años que no tenía antecedentes de exposición a animales.1039 P. aerogenes produce colonias lisas, convexas, circulares y no hemolíticas en agar sangre y también crece en agar de MacConkey. Es indol negativo y ureasa positivo; la mayoría de las cepas también producen ornitina descarboxilasa (véase cuadro 9-5). Como su nombre lo indica, esta especie es “aeró­ gena". lo que sugiere que se produce gas a partir de glucosa durante la fermentación. Las cepas de P. aerogenes aisladas en heridas humanas han sido sensibles a ampicilina, cefalotina, cefotaxima, cefuroxima, aminoglucósidos, ciprofloxacina y tetraciclina.369 Las cepas aisladas en los animales pueden ser resistentes a ampicilina y cefalotina debido a la producción de (3-lactamasa y también son resistentes a menudo a las tetraci­ clinas.

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continua.1347 Las cepas de P. dagmatis aisladas en infecciones humanas han sido sensibles a penicilina, ampicilina, ticarcilina, cefalosporinas y cefamicinas, aminoglucósidos, tetraciclina, ciprofloxacina y trimetoprim-sulfametoxazol.392 1047 1202 PASTEURELLA CANIS Y PASTEURELLA STOMATIS

Tanto P. stomatis como P. canis también han sido aislados en infecciones de heridas resultantes de m ordeduras de perros.592-1025-1250 Las cepas de P. canis se dividen en dos bioti­ pos: el biotipo 1 se encuentra en la cavidad bucal de los perros, mientras que el biotipo 2 ha sido aislado en tem eros/ s En el estudio llevado a cabo por Holst y cois., 28 de 159 cepas exa­ minadas fueron identificadas como P. canis; todas eran de heri­ das por mordeduras de perro y pertenecían al biotipo 1.59: Diez de las 159 cepas fueron identificadas como P. stomatis: ocho eran de heridas por mordeduras de perro y dos fueron por abs­ cesos. En las ocho infecciones de heridas por P. stomatis. se aislaron simultáneamente P. multocida o P. canis con P. stoma­ tis. La formación de abscesos y la osteomielitis debidas a P. canis también pueden ser complicaciones de la infección de heridas por mordeduras.539 P. canis y P. stomatis son sensibles a ampicilina, amoxicilina-clavulanato, cefalotina, cefotaxima. linezolid y aminoglucósidos, tetraciclina, piperacilina y fluoroquinolonas.478-479-480-593-1025 Las pruebas taxonómicas recientes sugieren que el nombre de P. canis es incorrecto y debe ser reclasificado como P. m ultocida660 PASTEURELLA BETTYAE

PASTEURELLA DAGMATIS

P. dagmatis es parte de la flora bucal de perros y gatos y se asocia con mordeduras y arañazos de estos animales. En una serie de 32 aislamientos provenientes de heridas por mordedu­ ras de perro remitidas a un laboratorio de referencia de Australia, tres fueron identificados como P. dagmatis.996 De 159 cepas de Pasteurella remitidas a un laboratorio veterinario en Dinamarca, cinco fueron identificadas como P. dagmatis. Estas cepas fueron aisladas en un caso de celulitis (1), un abs­ ceso inguinal (1), un absceso faríngeo (1) y heridas por morde­ duras de perro (2).592 También se lo aisló en heridas producidas por mordedura de gato.1430 El microorganismo es una causa rara de endocarditis y se han comunicado tres casos en la bi­ bliografía.510-10951202 En una de estas comunicaciones, la endo­ carditis se complicó con osteomielitis vertebral.1202 Ésta era una paciente de 55 años que trabajaba en una agencia protectora de animales y había sufrido múltiples mordeduras y arañazos de ga­ tos extraviados. También se documentó neumonía por P. dag­ matis en una paciente de 54 años con carcinoma epidermoide de la faringe, en la que se aisló el microorganismo en cultivo puro de una muestra de esputo.1047 La paciente mantenía una compañía estrecha con un perro como parte de un sistema de apoyo que le ofrecía su asistente social. También se observó una bacteriemia por P. dagmatis en un hombre de 50 años con historia prolongada de diabetes,92 que había sufrido una celuli­ tis por P. multocida del dedo del pie con bacteriemia un año antes. En ese molmento, la infección fue rastreada hasta su perro salchicha, que había lamido una ampolla abierta en el pie del paciente. En su segunda hospitalización, desarrolló P. dag­ matis en los hemocultivos; nuevamente fue probable que la infección se debiera a las lamidas cariñosas de su terrier Yorkshire. Este microorganismo también produce peritonitis en pacientes que se encuentran en diálisis peritoneal ambulatoria

P. bettyae (antes conocida como grupo HB-5 de los CDC y luego como P. bettií) ha sido aislada fundamentalmente en el aparato genitourinario y muestras relacionadas (vagina, cuello uterino, uretra y líquido amniótico).75-1194 En 1989, se identifi­ có en Tennessee un conjunto de cinco pacientes con uretritis, enfermedad inflamatoria pelviana o abscesos de la glándula de Bartolino, en los cuales se aisló P. bettyae como agente etioló­ gico. Este brote sugirió que el microorganismo puede ser un patógeno de transmisión sexual,75 P. bettyae también puede ser asociado con enfermedad ulcerosa genital. En un estudio lleva­ do a cabo en Ruanda, se aisló el microorganismo en 25 (3,6%) de 675 pacientes (204 mujeres y 471 hombres) con enfermedad ulcerosa genital, pero sólo en uno de 983 pacientes sin esa enfermedad.150 De 145 hombres con secreción uretral pero sin úlceras genitales, fue aislado sólo de uno. En 1996, fue aislado en los hemocultivos de una mujer de 25 años con bacteriemia periparto y como causa de neumonía y derrame pleural fatales en un hombre de 40 años con infección por HIV.896-1168 P. bettyae es un cocobacilo gramnegativo que crece tanto en agar sangre como en agar chocolate; la capacidad para crecer en agar de MacConkey es variable. Después de 24 horas de incubación en un medio enriquecido con CO„ las colonias son puntiformes, no hemolíticas, lisas y blancas. El microorganis­ mo es oxidasa variable o tardía, aunque se suelen obtener resul­ tados positivos con el reactivo de tetrametilfenileno diamina. La reacción de catalasa es negativa. El nitrato es reducido a ni­ trito, pero no a gas y no se produce ureasa. Se forma ácido a partir de glucosa (junto con gas) y, en ocasiones, maltosa y mañosa, pero no a partir de maltosa, sacarosa, lactosa, manitol y xilosa (véase cuadro 9-5). El microorganismo produce indol después de una incubación de toda la noche en caldo de triptó­ fano; la cantidad de indol formada puede ser pequeña, de modo que a menudo se necesita la extracción de xileno del caldo y el uso del reactivo de indol de Ehrlich para su detección.

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CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

En general, las cepas de P. bettyae son sensibles a ampicili­ na, cefalosporinas, aztreonam, imipenem, fluoroquinolonas, aminoglucósidos, trimetoprim y trimetoprim-sulfametoxazol y son resistentes a eritromicina, clindamicina, vancomicina y tetraciclina. Los cinco aislamientos del grupo de Tennessee fueron sensibles a la ampicilina, mientras que 7 de los 24 ais­ lamientos evaluados en el estudio de Ruanda fueron resistentes a la ampicilina y produjeron p-lactamasa.75150 PASTEURELLA CABALLI

P. caballi es un habitante de las vías respiratorias altas de los caballos. También ha sido aislado en cultivo puro, mixto o ambos de infecciones equinas como endocarditis, neumonía, peritonitis, heridas, abscesos e infecciones del aparato geni­ tal.2561144 Los casos documentados de infección humana por P. caballi incluyen una lesión supurada similar a un panadizo de un dedo de la mano que ocurrió sin ninguna lesión traumática previa en un veterinario de 28 años que trabajaba con caballos y ponis y una infección cutánea de una herida por mordedura de caballo en un hombre de 56 años.139-387 Las cepas de P. caba­ lli son muy sensibles a los antibióticos; sin embargo, algunas son resistentes a lincomicina, estreptomicina y sulfamidas y tienen una sensibilidad intermedia a penicilina G .1144 La cepa aislada en el veterinario era sensible a todos los antibióticos excepto a la penicilina y las sulfamidas.139 PASTEURELLA GALLINARUM

P. gallinarum es un cocobabilo gramnegativo que habita en el aparato respiratorio de las aves de corral domésticas. La pri­ mera comunicación de una infección humana apareció en 1995, cuando el microorganismo fue aislado en los hemoculti­ vos de un varón de 12 años de Arabia Saudita que sufrió una endocarditis 10 años después de la reparación quirúrgica de una comunicación interventricular.15 La cepa era sensible a penicilina, ampicilina y cefotaxima. y el paciente respondió a 6 semanas de tratamiento con los dos últimos agentes. El pacien­ te no refirió ninguna mordedura, arañazo ni contacto con anima­ les. La segunda comunicación apareció en 1999 en Japón, cuan­ do se aisló P. gallinarum en los hemocultivos de un hombre de 34 años con gastroenteritis aguda.47 Esta cepa era sensible a ampicilina, cefazolina, cefotaxima. azitromicina, imipenem, norfloxacina y aminoglucósidos, y el paciente respondió al tra­ tamiento con cefazolina. La gastroenteritis se produjo 2 días después de que el paciente comiera pollo en un restorán y los autores sugirieron que esta comida puede haber sido la fuente. Sin embargo, esta cepa puede haber sido mal identificado.437 En 2002, se aisló P gallinarum en la sangre, orina y LCR de un recién nacido de 4 días como resultado de un parto séptico en el hogar.3 El microorganismo era sensible a penicilina, cefo­ taxima y aminoglucósidos. Las características bioquímicas de P. bettyae, P. dagmatis, P. canis, P. stomatis, P. caballi y P. gallinarum se presentan en el cuadro 9-4 junto con las de otras pasteurelas animales. Especies de Mannheimia (antes complejo “ Pasteurella

haemolytlca/Pasteurella gramilomatis”)

Las cepas de P. haemolytica son reconocidas como patógenos importantes en los animales domésticos, y causan enfermedades graves y pérdidas económicas considerables en el ganado vacu­ no, ovejas, cerdos e industrias avícolas. Históricamente, las cepas de P. haemolytica eran divididas en dos biotipos designa­

dos A (asociado con ganado vacuno) y T (asociado con ove­ jas).205 Las cepas biotipo A producían ácido a partir de arabinosa pero no de trehalosa, mientras que las cepas biotipo B produ­ cían ácido a partir de trehalosa pero no de arabinosa. Cada uno de estos biotipos fue dividido en 17 serotipos; y los serotipos I, 2, 5-9, 11-14, 16 y 17 pertenecían al biotipo A y los serotipos 3, 4, 10 y 15 pertenecían al biotipo T. En 1985, P. haemolytica sensu stricto fue excluida del género Pasteurella sobre la base de estudios de hibridación de DNA-DNA y la hibridación de DNArRNA confirmó su exclusión de los géneros Pasteurella, Haemophilus y Actinobacillus 918 Algunas investigaciones genotípicas de cepas de “P. haemolytica" trehalosa positivas (biotipo T) han conducido a su reclasificación como Pasteurella trehalosi, aun cuando muestran una afinidad genética marginal con el género Pasteurella."94 Los exámenes de muchas cepas diversas de “P. haemolytica" trehalosa negativas (biotipo A) por criterios fenotípicos, electroforesis enzimática multilocus, ribotipifícación y secuenciación de rRNA 16S condujeron a proponer un género nuevo, Mannheimia, para encuadrar a las cepas trehalosa negativas del complejo “P. haemolytica” y “P. granulomaíí's”.304'1069 Sobre la base de la secuenciación de rRNA 16S, se han establecido cuatro grupos relacionados distintos que corres­ ponden a cinco especies nuevas en el género nuevo Mannheimia: M. haemolytica y M. glucosida (grupo I), M. ruminalis (grupo II), M. granulomatis (grupo III) y M. varigena (grupo IV).38 Estas especies nuevas están más estrechamente relacionadas con el género Actinobacillus (sobre todo A. lignieresii) y “P. trehalosi”. Las especies de Mannheimia pueden ser separadas del géne­ ro Pasteurella porque las especies anteriores no producían ácido a partir de mañosa y porque la mayoría de las especies de Actinobacillus asociadas con animales eran ureasa negativas. Las especies de Mannheimia son manitol positivas, lo que las separa de las especies del género Haemophilus, que son manitol negativas. Las características bioquímicas del género Mannheimia y de las especies de Mannheimia se presentan en los cuadros 9-1 y 9-6, respectivamente. Las cepas de M. haemolytica son bien reconocidas como agente etiológico de la pasteurelosis neumónica bovina o “fie­ bre del transporte” y otras distintas infecciones del ganado vacuno, ovejas, cerdos y liebres.37 En el ganado vacuno, esta infección es desencadenada por el hacinamiento, el estrés, la inmunosupresión y la infección viral simultánea del aparato respiratorio. Las cepas de M. haemolytica aisladas del ganado vacuno con pasteurelosis neumónica producen una leucotoxina que es específica de especie y tiene actividad citolítica contra las células linfoides de los rumiantes.570-571 La leucotoxina es una proteína de 105 a 108 kDa que pertenece a la familia de las toxinas RTX, que también incluye la hemolisina de E. coli, la adenilato ciclasa/hemolisina de B. pertussis y la toxina Apx de A. pleuropneumoniae . 1 1 1 4 RTX (repeticiones en la toxina) se refiere a la presencia de unidades repetidas ricas en glicina características en el término C de la molécula peptídica. En bajas concentraciones, la leucotoxina de M. haemolytica activa los neutrófilos, induce la formación de citocinas inflamatorias y provoca cambios en el citoesqueleto que conducen a la apoptosis.1222 En concentraciones más altas, la toxina produce la for­ mación de poros en las membranas celulares que conducen a tumefacción celular y lisis. In vitro, la leucotoxina provoca cambios citopáticos en los alvéolos bovinos, donde se asocia con las membranas de los macrófagos y los neutrófilos en degeneración. Los mutantes de M. haemolytica leucotoxina negativos muestran una reducción importante de la virulencia en los modelos animales en comparación con las cepas pro­ ductoras de leucotoxina.1264

Cardiobacterium hominis

Los miembros del ex complejo “P. haemolytica” se aíslan pocas veces en seres humanos y las infecciones casi siempre son el resultado de la exposición ocupacional o recreativa a los animales. Rivera y cois, comunicaron un caso de infección de un injerto aórtico debida tanto a “P. haemolytica” biotipo A (M. haemolytica) como a estreptococos (3-hemolíticos del grupo C en un hombre de 50 años.1076 Yaneza y cois, informaron de un caso de endocarditis causada por este microorganismo.1415 El paciente no había tenido contacto con ganado vacuno ni otros animales de granja. Las cepas de M. haemolytica aisladas son sensibles a penicilina, ampicilina, amoxicilina-clavulanato, macrólidos (azitromicina, claritromicina, eritromicina), cloran­ fenicol, aminoglucósidos y fluoroquinolonas y resistentes al linezolid ,478'480

Cardiobacterium hominis Taxonomía

C. hominis es la única especie del género Cardiobacterium. Este microorganismo, originariamente descrito como grupo IID de los CDC, fue denominado Cardiobacterium hominis por Slotnick y Doughtery en 1964.1190 Estos investigadores demos­ traron sus características bioquímicas singulares y su falta de relación antigénica con otras bacterias gramnegativas y grampositivas con requerim ientos nutricionales especiales. El microorganismo tiene la pared celular típica de los gramnega­ tivos con una capa externa extraordinariamente densa y cas­ quetes terminal y polar en penacho adheridos a la membrana celular.1067 Estas características explican su aspecto atípico en la tinción de Gram (véase más adelante). En 1990, Dewhirst y cois, examinaron cepas de Cardiobacterium mediante análisis de secuencia de rRNA de 16S y observaron que este microor­ ganismo y Kingella indologenes estaban estrechamente rela­ cionados y diferían significativamente de las cepas de referen­ cia de otros microorganismos con requerimientos nutricionales especiales.330 Estos autores propusieron la familia Cardiobacteriaceae para incluir C. hominis, Kingella indologenes y el microorganismo relacionado del suelo Dichelobacter nodosus. Las similitudes fenotípicas también apoyaron la relación gené­ tica de C. hominis y K. indologenes.186 Este último fue elimi­ nado de la familia Neisseriaceae, su nombre se cambió por Suttonella indologenes y fue colocado en la fam ilia Cardiobacteriaceae junto con las especies de Cardiobacterium y de Dichelobacter , 3 3 0 Las cardiobacterias pertenecen al orden propuesto “Cardiobacteriales” en la subdivisión y de las proteobacterias455 (véase más adelante). Importancia clínica

C. hominis es un microorganismo de muy baja incidencia y tiene la característica singular de producir endocarditis casi exclusivamente; se han publicado alrededor de 50 casos de endocarditis.295-1397 El microorganismo es parte de la flora del aparato respiratorio normal, pero pocas veces se observa en muestras respiratorias debido a su baja tasa de crecimiento. Como sucede con otros microorganismos HACEK, C. hominis entra en el torrente circulatorio y suele infectar las válvulas car­ díacas que ya estaban enfermas o dañadas (p. ej., cardiopatía reumática, comunicaciones interventriculares). Sin embargo, la endocarditis por C. hominis también se puede desarrollar en individuos sin evidencia de cardiopatía previa. Alrededor del 20% de las infecciones por C. hominis comunicadas han afec­

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tado distintos tipos de válvulas cardíacas protésicas; entre ellas, válvulas de tejido de homoinjerto aórtico, válvulas aórtica y mitral de xenoinjertos porcinos, válvulas aórtica y mitral mecá­ nicas (válvulas de Starr-Edwards, Bjórk-Shiley y CarpentierEdwards) y electrodos de marcapasos.45-949-1030-1265 En general, los pacientes son de edad mediana a ancianos y tienen una den­ tadura en mal estado o el antecedente de procedimientos den­ tales recientes. En la comunicación de un caso, se desarrolló una endocarditis de válvula protésica luego de una endoscopia gastrointestinal alta.1030 La infección sigue una evolución muy subaguda, con inicio insidioso, fiebre leve y síntomas vagos que pueden persistir durante 7 a 9 meses antes de hacer un diagnóstico. En los que sufren una enfermedad de bajo grado y prolongada, se puede presentar esplenomegalia, hemorragias conjuntivales y lineales subungueales, hematuria y anemia. C. hominis tiende a formar vegetaciones grandes y friables sobre las válvulas cardíacas, de modo que las complicaciones más graves son embolia séptica, aneurismas micóticos e insuficien­ cia cardíaca congestiva.249-295-781-903 También puede ocurrir bac­ teriemia y sepsis por C. hominis sin endocarditis en pacientes inmunodeprimidos.1089 El aislamiento de C. hominis de mues­ tras distintas de los hemocultivos es raro. En 1983, Francioli y cois, diagnosticaron una meningitis por cardiobacterias en un paciente como complicación de la endocarditis y, en 1991, Rechtman y Nadler informaron sobre la recuperación de C. hominis junto con Clostridium bifermentans de un absceso abdominal y de la sangre de un hombre de 65 años con diabe­ tes y adenocarcinoma agresivo de riñón y ciego.432-1052 En 1998, Nurnberger y cois, informaron de un caso de infección por C. hominis asentada en el electrodo auricular de un marcapasos sin afectación valvular que se complicó por una presunta oste­ omielitis vertebral hematógena; el microorganismo fue aislado en los hemocultivos pero no en la biopsia de las vértebras afec­ tadas.949 Características de los cultivos e identificación

C. hominis puede crecer esencialmente en todos los medios de hemocultivo disponibles en el comercio. El microorganismo crece lentamente y no produce ningún cambio visible en el medio para hemocultivo (p. ej., hemolisis, formación de pelí­ cula, turbidez). Cuando la observación microscópica de los frascos de hemocultivo es negativa, se deben realizar subcultivos a ciegas en agar chocolate y agar sangre. En la comunica­ ción reciente de un caso, el microorganismo fue aislado sólo después del día 10 de incubación de un subcultivo a ciegas.801 Es posible que las tinciones de Gram de los frascos de hemo­ cultivo no pongan en evidencia el microorganismo; la centrifu­ gación a baja velocidad de una alícuota del medio para elimi­ nar los eritrocitos seguida por la centrifugación a alta velocidad para aglomerar pequeñas cantidades de microorganismos puede ayudar a su visualización. En las tinciones de Gram, los microorganismos pueden aparecer como gramvariables, con una tendencia de las células a retener el colorante de violeta de gerciana (cristal violeta) en los polos. Las células individuales pueden aparecer tumefactas en uno o ambos extremos, lo que conduce a microorganismos con forma de lágrima, pesa y “chupachús”. A menudo, las células adoptan agrupamientos similares a rosetas o se alinean en disposiciones de “cercas” en su orientación unas con otras (véase lámina en color 9-3D). La morfología de las células individuales depende del tipo de medio de cultivo utilizado; en los medios que contienen extrac­ to de levadura, aparecen como bacilos gramnegativos unifor­ mes con extremos redondeados.

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CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

En agar sangre y agar chocolate, C. hominis crece como colonias opacas, brillantes y muy pequeñas, generalmente des­ pués de 48 a 72 horas a 35 °C en C 0 2 al 5-7% (véase lámina en color 9-3E). Algunas cepas también pueden producir una depresión en el agar luego de su incubación. No se observa nin­ gún crecimiento en agar de MacConkey o en otros agares selectivos o diferenciales entéricos. C. hominis es oxidasa posi­ tivo y catalasa, nitrato y ureasa negativo. Las reacciones de reducción de oxidasa positiva y de catalasa negativa ayudan a diferenciarlo de H. aphrophilus/paraphrophilus y A. actinomy­ cetemcomitans, pero son similares a las reacciones observadas para Eikenella, Kingella y Suttonella. La característica más útil para identificar a este microorganismo es la producción de indol. El caldo de triptona debe tener un inóculo importante (con un hisopo) y debe incubarse durante 48 horas. La extrac­ ción con xileno o cloroformo y el uso del reactivo de Ehrlich más que del reactivo de Kovac permite la detección de peque­ ñas cantidades del indol producido por este microorganismo. Es posible que el reactivo de indol en el sitio (p- amino cinnamaldehído) no pueda detectar confiablemente la producción de indol por C. hominis. Se puede detectar la producción de sul­ furo de hidrógeno utilizando tiritas de acetato de plomo. C. hominis produce ácido a partir de glucosa, fructosa, sacarosa, mañosa y sorbitol; la producción de ácido a partir de maltosa y manitol es variable y la mayoría de las cepas producen reac­ ciones positivas. No se fermenta lactosa, xilosa, galactosa, tre­ halosa ni rafinosa. Desde el punto de vista fenotípico, C. homi­ nis es muy similar a S. indologenes (cuadro 9-7).186 También puede ser diferenciado de S. indologenes, E. corrodens y de las especies de Kingella mediante análisis de ácidos grasos celula­ res.1344 Como sucede con otros agentes de endocarditis bacte­ riana, se han utilizado con éxito los métodos moleculares para la detección directa de C. hominis de muestras clínicas.903-939 Sensibilidad a los antibióticos

Al igual que en otros miembros del grupo HACEK, las prue­ bas de sensibilidad a los antibióticos son difíciles debido a los requerimientos nutricionales especiales del microorganismo y su ritmo de crecimiento lento. No se han establecido niveles de corte, medios óptimos ni requerimientos de incubación para C. hominis ni para otros microorganismos con estos requerimien­ tos. En general, las cepas de C. hominis son sensibles a la ma­ yoría de los antibióticos, como penicilina, ampicilina, cefaloti­ na, cefalosporinas de tercera generación (cefixima, cefuroxima, cefotaxima, ceftriaxona. ceftazidima y cefepima), imipenem, meropenem, fluoroquinolonas (ciprofloxacina, clinafloxacina, levofloxacina, ofloxacina y trovafioxacina), aminoglucósidos, cloranfenicol, rifampicina y tetraciclina.736 En general, los pacientes con endocarditis por C. hominis han sido tratados con penicilina sola o penicilina combinada con un aminoglucósido. También se han logrado curaciones con monoterapia con cefa­ zolina y ciprofloxacina.249 1335 En la actualidad, el tratamiento recomendado incluye las cefalosporinas de tercera genera­ ción.1382 Las cepas resistentes a la penicilina y productoras de P-lactamasa son raras y han sido comunicadas dos veces. En 1994, se aisló una cepa productora de P-lactamasa de un caso de endocarditis en un hombre de 76 años.769 Esta cepa era sen­ sible a tetraciclina, rifampicina, vancomicina e imipenem y resistente a eritromicina, trimetoprim-sulfametoxazol, gentamicina, amoxicilina. ticarcilina, cefotaxima y piperacilina. El paciente respondió a vancomicina/rifampicina, seguida de amoxicilina-clavulanato. El segundo microorganismo produc­ tor de P-lactamasa fue aislado en una mujer de 66 años.801 Este

era resistente a penicilina y ampicilina y sensible a amoxicilina-clavulanato, cefotaxima, ceftriaxona, gentamicina, ciproflo­ xacina y trimetoprim-sulfametoxazol. Muchas cepas también son resistentes a vancomicina y eritromicina; este hecho es de cierta importancia, dado que estos agentes se utilizan a veces para la profilaxis dental de pacientes alérgicos a la penicili­ na.1029 La mayoría de los pacientes que tienen una endocarditis de válvula nativa debida a C. hominis son tratados con éxito con antibióticos solos, aunque algunos pueden requerir resec­ ción valvular parcial o reemplazo valvular debido al compro­ miso hemodinámico, fenómenos embólicos. insuficiencia car­ díaca progresiva o aneurismas micóticos.249-1265

Eikenella corrodens Taxonomía y virulencia

Originariamente, el género Eikenella (antes grupo HB-1 de los CDC) definía cepas consideras facultativas de la especie anaerobia Bacteroides corrodens. Con posterioridad, se demos­ tró que estos microorganismos eran fenotípica y genéticamen­ te distintos. La especie anaerobia estricta fue denominada Bacteroides ureolyticus y los anaerobios facultativos fueron colocados en el género inespecífico nuevo Eikenella como E. corrodens. Una característica clave que separa las especies anaerobias de las especies facultativas es la actividad de urea­ sa, en que B. urealyticus anaerobio es ureasa positivo y E. corrodens es ureasa negativo. B. ureolyticus también es sensi­ ble a clindamicina y metronidazol, mientras que E. corrodens es resistente a estos agentes. Sobre la base de la secuencia del RNA ribosómico 16S y de la hibridación de rRNA-DNA, se demostró que E. corrodens está relacionado con especies de Neisseria y está incluido ahora en la familia enmendada Neisseriaceae en el orden propuesto “Neiseriales” en el subgrupo p de las proteobacterias.329-1100 Se ha intentado definir los factores de virulencia de E. corro­ dens. En 1988, Yamazaki y cois, describieron una proteína similar a la lectina sobre la superficie de cepas de E. corrodens que funcionaba en la adherencia de las bacterias a las células epiteliales de los surcos humanos e interactuaba con un recep­ tor sobre la superficie de la célula epitelial que contiene galac­ tosa.1414 Esta molécula también aglutinaba eritrocitos. La inves­ tigación reciente ha mostrado que E. corrodens expresa pili tipo 4 y muestra variación de fase que comprende la transición irreversible de las variantes con pili o sin pili.1328 1329 En medios agar, las variantes con pili forman colonias pequeñas con de­ presiones, mientras que las variantes sin pili producen colonias más grandes sin depresiones. La formación de los pili es con­ trolada por el locus pilA, que incluye cuatro genes: pilA l, pilA2, pilB y hagA. Los loci p ilA l y pilA2 codifican las proteí­ nas estructurales de los pili tipo IV, pilB codifica una proteína de ensamblado de los pili y hagA codifica una hemaglutinina 1328.B29 Las células con pili sintetizan y exportan las proteí­ nas de los pili hacia la superficie celular, mientras que las variantes sin pili sintetizan pili pero no los exportan hacia la superficie celular. Además, las células con pili muestran “movimientos espasmódicos” y son capaces de sufrir transfor­ mación natural, mientras que las células sin pili carecen de estas características. E. corrodens también tiene un OMP prin­ cipal con un peso molecular aparente de 33 a 42 kDa.812 Esta proteína puede desencadenar la liberación de enzimas lisosómicas por los macrófagos y puede estimular o deprimir la acti­ vidad de los macrófagos en forma dependiente de la dosis. Al igual que otras bacterias gramnegativas, E. corrodens tiene un

Eikenella corrodens 4 4 7

/.popolisacárido (LPS) de la membrana externa que cumple actividades biológicas similares al LPS hallado en las bacterias entéricas.1032 Los antígenos de superficie de E. corrodens tie­ nen reacciones cruzadas amplias con otros microorganismos, entre ellos K. kingae, K. denitrificans y Moraxella bovis.230 nportancia clínica

E. corrodens es parte de la ñora normal de la boca y de las \ fas respiratorias altas. En la cavidad bucal puede desempeñar un papel en ciertos tipos de enfermedad periodontal. Suda y cois, observaron que la prevalencia más alta de E. corrodens en lai muestras de placas subgingivales ocurría en pacientes jóve­ nes con enfermedad periodontal, mientras que la prevalencia era más baja en los individuos sin esa enfermedad.1237 En las personas sanas, la prevalencia del microorganismo en las mues:ras gingivales profundas disminuyó con la edad del individuo. Entre los que tenían enfermedad periodontal, la prevalencia más alta se observó en los menores de 20 años con periodonti::s juvenil, seguida de aquellos con periodontitis posjuvenil, periodontitis prepuberal, periodontitis rápidamente progresiva \ periodontitis del adulto.1237 Además de la enfermedad pe­ riodontal, E. corrodens puede desempeñar un papel en otras infecciones bucales, como gingivitis, abscesos periapicales e in­ fecciones de los conductos radiculares. E. corrodens ha sido aislado en distintas infecciones huma­ n as." 1170 que incluyen infecciones oculares (p. ej., canaliculitis, celulitis periorbitaria, ulceraciones corneales, endoftalmitis, abs­ cesos lagrimales), infecciones de cabeza y cuello (p. ej., sinusitis. otitis media, mastoiditis, absceso encefálico, empiema subdural/extradural, osteomielitis craneal, absceso submandibular), infecciones pleuropulmonares (p. ej., neumonía aspirativa, abs­ cesos pulmonares bacterianos mixtos, empiema), infecciones intraabdominales (p. ej., absceso hepático) e infecciones esqueléticas (p. ej., osteomielitis vertebral J.46-62-66-560-566-609-654-655-695-1130 Lw infección pulmonar por E. corrodens se observa en indivi­ duos inmunodeprimidos, con tendencia a la aspiración pulmonar en presencia de una enfermedad pulmonar subyacente que conduce a compromiso de los mecanismos de defensa loca­ les. También se lo implicó junto con especies anaerobias estrictas (especies de Actinomyces o Arachnia) en la patogenia de un trastorno denominado osteomielitis esclerosante difusa crónica, una infección mixta de la mandíbula que tiene patrones radiológicos y tomográficos característicos y ocurre principal­ mente en mujeres jóvenes.827 Por extensión desde infecciones periodontales, de oído medio o sinusales, el microorganismo puede entrar en el SNC y provocar meningitis, abscesos encefá­ licos o paraespinales, y empiema subdural.174 E. corrodens es un microorganismo que se aísla en forma poco frecuente en otras varias infecciones graves. Se ha obser­ vado bacteriemia y endocarditis por E. corrodens en huéspedes r.munodeprimidos, adictos a drogas intravenosas e individuos e n daño valvular previo que habían recibido recientemente un "atam iento dental extenso.554-968 Sin embargo, también se : bservó endocarditis en individuos sanos sin factores de riesgo reconocidos.1353 Se ha comunicado endocarditis de válvulas rr: :esicas e infecciones de prótesis vasculares permanentes asociadas con E. corrodens.301 554 Asimismo, puede ocurrir una bacteriemia por E. corrodens con endocarditis o sin ella en los individuos con enfermedades subyacentes, como artritis reumatoide y procesos malignos hematológicos.391-886 También r_ede ser reconocido en abscesos subcutáneos y celulitis de tejidos blandos en adictos a drogas intravenosas. Estas infec­ ciones son resultado de la aplicación de saliva para limpiar la

piel antes de la inyección de las drogas.39488-968 E. corrodens también puede producir celulitis y osteomielitis de la mano como resultado de “lesiones con el puño cerrado” (por puñeta­ zos), mordeduras crónicas de las uñas y mordeduras huma­ nas.152-934 La implantación traumática del microorganismo en el tejido subcutáneo puede conducir a la extensión de la infección en los huesos y articulaciones con el desarrollo de osteomieli­ tis y artritis séptica. En estas circunstancias, a menudo el microorganismo desarrolla en cultivo mixto con otros microor­ ganismos facultativos (estreptococos a-hem olíticos y (3-hemolíticos, Staphylococcus aureus, estafilococos coagulasa negati­ vos, bacilos gramnegativos entéricos y anaerobios estrictos [especies de Peptostreptococcus, especies bucales de Bacte­ roides, Prevotella y Porphyromonas]). La discitis vertebral por E. corrodens también puede ocurrir como complicación de la cirugía espinal.36 En el año 2000, se comunicó un caso atípico de osteomielitis vertebral por E. corrodens en un hombre de 65 años en quien se inoculó el espacio paravertebral por un hueso de pescado que le había atravesado la faringe.764 También se informaron infecciones bacteriémicas por E. corrodens que conducen a celulitis hematógena, artritis séptica, ostemielitis vertebral, discitis intervertebral, absceso paraespinal y corioamnionitis.35-36-376-416-764-1040 E. corrodens sobrevive en el aparato gas­ trointestinal y puede aislarse en abscesos abdominales, esplénicos, hepáticos y pancreáticos e infecciones peritoneales junto con la flora facultativa y anaerobia del intestino.54-654-1046-1218 También ha sido aislado en infecciones ginecológicas, como corioamnionitis, endometritis y cervicitis resultante de la coloni­ zación de los dispositivos intrauterinos.35-638 Características de los cultivos e identificación

E. corrodens crece en agar sangre y agar chocolate pero no en el agar de MacConkey. Las colonias son pequeñas (0,5-1 mm) después de 48 horas. Alrededor del 50% de las cepas pue­ den “deprimir” el agar cuando crecen y se pueden observar tanto variantes con depresión como sin depresión en el mismo cultivo (véase lámina en color 9-3E y G). En general, se pro­ duce un pigmento amarillo pálido (observado mejor en un hiso­ po blanco que se desliza a través del crecimiento en una placa de agar chocolate) y la mayoría de las cepas tienen un olor semejante al del hipoclorito de sodio (lejía o lavandina). En la tinción de Gram los microorganismos aparecen como bacilos o cocobacilos gramnegativos delgados y regulares con extremos redondeados (véase lámina en color 9-3F). Las características bioquímicas de las cepas de E. corrodens que producen depresiones o de las que no la producen son bas­ tante uniformes. Los microorganismos son oxidasa positivos y catalasa negativos, aunque raras cepas pueden ser débilmente catalasa positivas. El microorganismo reduce el nitrato a nitri­ to y no requiere factores X o V. si bien la hemina es necesaria para el crecimiento aerobio. Las cepas que no producen depre­ sión pueden ser confundidas con especies de Haemophilus y cuando se evualúan con discos de factores X y V. muestran cre­ cimiento alrededor del disco con factor X pero no con factor V. No se produce indol ni ureasa, pero la mayoría de las cepas son lisina descarboxilasa y ornitina descarboxilasa positivas (véase lámina en color 9-3H). Al contrario de otros microorganismos del grupo HACEK, E. corrodens es asacarolítico. Sus caracte­ rísticas fenotípicas se presentan en el cuadro 9-7, junto con las otras bacterias HACEK con requerimientos nutricionales espe­ ciales oxidasa positivas y catalasa negativas. Como sucede con muchos de los microorganismos implica­ dos en la infección periodontal, se han explorado enfoques

44 8

CAPÍTULO 9

Cuadro 9 -7

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

C aracterísticas bioq u ím icas para la identificación de C a r d io b a c te riu m h o m in is , E ik e n e lla c o r r o d e n s , especies de K in g e lla y S u tto n e lla in d o lo g e n e s

CARACTERÍSTICA

C. H O M IN IS

K. K IN G A E

K. D E N IT R IF IC A N S

K. O R A L IS

S. IN D O L O G E N E S

+a

-

-

-

+

+

+

+

-

-

-

-

+

-

+

-

-

-

+

+

-

+

E. C O R R O D E N S

Hemolisis, SBA

-

O xidasa

+

+

Catalasa

_

__b

N 0 3 a NO , N 0 2 a gas N2

+

Indol

+

-

-

-

+

Ureasa

-

-

-

-

-

O rnitina descarboxilasa

-

-

-

-

-

H idrólisis de esculina

-

-

-

-

-

H idrólisis de ONPG

-

-

-

-

-

Gas a partir de glucosa

-

-

-

-

-

Glucosa

+

+

+

+

+

M altosa

+c

+

-

-

+

Fructosa

+

-

-

-

+

Sacarosa

+

-

-

-

+

-

-

-

-

+

Ácido producido a partir de:

-

-

Lactosa Xilosa

-

-

-

-

-

M anitol

+‘

-

-

-

-

M añosa

+

-

-

-

+

Galactosa

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Trehalosa Rafinosa

-

-

-

-

-

Sorbitol

+

-

-

-

-

“La mayoría de las cepas produc en una 13-hemolisis "suave’*en agar sangre de carnero. bRaras cepas pueden ser débilmente catalasa positivas. 'Raras cepas pueden ser maltosa negativas; manitol negativas o ambas.

moleculares para la detección, identificación y tipificación de E. corrodens. Se han diseñado sondas de DNA específicas, así como sondas para otros patógenos periodontales, mediante análisis de rRNA 16S. identificación de secuencias únicas de nucleótidos y síntesis química de las moléculas de las sondas que son complementarias de estas secuencias específicas de especie.787 Estas sondas han sido utilizadas para la detección directa del microorganismo en muestras de la placa subgingival de pacientes con gingivitis y periodontitis. También se han aplicado algunos métodos epidemiológicos, que incluyen SDSPAGE, electroforesis en gel de campo pulsado, análisis de endonucleasas de restricción y técnicas de PCR preparado arbi­ trariamente a E. corrodens para determinar su relación con otras bacterias y las diferencias entre las cepas de E. corrodens aisladas en pacientes.229'230’231,1217

Sensibilidad a los antibióticos

Las pruebas de sensibilidad a los antibióticos de rutina de E. corrodens son difíciles debido a los requerimientos nutriciona­ les especiales del microorganismo. En general, las pruebas se realizan mediante dilución en agar, que es poco práctica para los laboratorios clínicos. En 1998, Alcala y cois, comunicaron un procedimiento de microdilución en caldo para E. corrodens utilizando medio de prueba para Haemophilus* Según el anti­ biótico, se observó una concordancia entre el 75% y el 97% (± 1 log, de dilución) entre los procedimientos de microcaldo y dilución en agar. La mayoría de las cepas de E. corrodens son sensibles a ampicilina, amoxicilina y tetraciclinas y resistentes a las penicilinas resistentes a la penicilinasa, clindamicina, van­ comicina, eritromicina, metronidazol y aminoglucósidos.481-804

Especies de K ingella y S uttonella

La sensibilidad a la penicilina puede variar de una cepa a otra. La mayoría tiene una sensibilidad variable a las cefalosporinas de primera generación y la cefazolina es la más activa.481 E. corrodens también es sensible a cefoxitina, ceftriaxona, cefepima. ciprofloxacina y carbapenémicos (imipenem, meropenem).8'481-736-1170 Se han informado raras cepas j3-lactamasas positivas.481’744 La enzima (3-lactamasa de E. corrodens se aso­ cia altamente con las células, muestra poca actividad contra las cefalosporinas y es inhibida fuertemente por clavulanato y sulbactam.744

Especies de Kingella y Suttonella Taxonomía

La especie tipo del género Kingella, K. kingae, fue descrita originariamente en la década de 1960 y denominada en ese momento grupo M -l de los CDC. Las primeras descripciones sugirieron una relación con las moraxelas, salvo en que estas cepas eran catalasa negativas.1195 El grupo M -l de los CDC fue redenominado Moraxella kingii, nombre que luego se enmen­ dó taxonómicamente por Moraxella kingae.155 Debido a dife­ rencias genéticas, quimiotaxonómicas y fenotípicas importan­ tes. Henriksen y Bovre recomendaron eliminar a M. kingae del género Moraxella y lo redenominaron como género nuevo y especie Kingella kingae en la familia Neisseriaceae en 1976.562 Ese mismo año, Snell y LaPage propusieron la transferencia de tras dos especies sacarolíticas similares a moraxelas. oxidasa positivas y catalasa negativas al género Kingella , 1 1 9 6 Estas espe::es nuevas incluían el microorganismo denominado antes "TM -1” descrito por Hollis, Wiggins y Weaver (Kingella denirriñcans) y cepas indol positivas que habían sido aisladas ori;:nariamente en casos de conjuntivitis (Kingella indologe7!ubgrupo y de las proteobacterias.330455 K. kingae y K. denim ñcans se mantienen en la familia enmendada Neisseriaceae, que también está en el subgrupo y de las proteobacterias.1100 En - - ; . Dewhirst y cois, describieron una especie nueva de K:r. sella que fue recuperada de la placa dental humana de un r _;iente con periodontitis del adulto.328 Esta especie nueva fue denominada Kingella orales y m odificada luego como Kir. sella oralis. Este microorganismo constituye el 0,4% de la microbiota total de la placa dental de individuos periontónicamente sanos y alrededor del 4,6% de la microbiota en la placa dental de los pacientes adultos y juveniles con periodontitis.228 ~:ortancia clínica

Aunque forman parte de la flora de los aparatos respiratorio ;■ genitourinario normales de los seres humanos, las especies de Kingella y K. kingae en particular se reconocen en forma cre. ente como patógenos humanos importantes. Desde su des­

449

cripción inicial, K. kingae fue considerado una causa rara de infección en pacientes con endocarditis. Sin embargo, durante la última década ha surgido como un patógeno importante en pacientes pediátricos, causando principalmente baeteriemia e infecciones osteoarticulares.351 Este microorganismo puede aislarse en las vías respiratorias altas de lactantes y niños; se ob­ servó que casi el 75% de los niños mayores de 6 meses lo trans­ portan en la orofaringe en algún momento.1406 1407 La prevalencia del microorganismo en el aparato respiratorio es máxima entre los niños de 6 meses a 4 años, lo que corre paralelo a las edades que tienen las tasas más altas de ataque para una enfer­ medad invasiva.1407 Las tasas de portación son más bajas entre los niños menores de 6 meses y mayores de 4 años de edad. Algunos estudios en poblaciones de guarderías han mostrado que K. kingae puede ser transmitido de un niño a otro por la vía respiratoria en este contexto.1189 Es probable que la entrada para el microorganismo en el torrente circulatorio sea a través de lesiones en la mucosa orofaríngea. Las infecciones osteoarticulares son las manifestaciones clí­ nicas más frecuentes de infección por K. kingae en los niños; estas infecciones se presentan como baeteriemia, artritis sépti­ ca, osteomielitis, discitis, tenosinovitis y dactilitis.133’339-902’1403-1404 De hecho, con la disponibilidad de vacunas eficaces contra H. influenzae tipo b, K. kingae ha reemplazado esencialmente a H. influenzae como la bacteria gramnegativa más frecuente que produce infecciones osteoarticulares en los niños menores de 3 años.339 La mayoría de los lactantes con infecciones sistémicas por K. kingae presentan fiebre leve; también se observan a menudo infecciones virales de las vías respiratorias altas y estomatitis.27-133-339 En la mayoría de los casos, la artritis sépti­ ca por K. kingae es una infección aguda y los pacientes suelen presentarse dentro de los 3 días de la aparición de signos y sín­ tomas. Estos niños habitualmente se encuentran febriles y las articulaciones afectadas están tumefactas, sensibles a la palpa­ ción y muestran menor amplitud de movimiento. Los hemo­ cultivos suelen ser negativos.339 La artritis séptica por K. kingae suele ser una monoartritis, y la articulaciones más afectadas son la rodilla, la cadera y el tobillo. En general, la osteomieli­ tis debida a K. kingae es una infección indolente que sigue un curso subagudo y los pacientes suelen presentarse 7 a 10 días después de la aparición de los síntomas. Esta osteomielitis afecta el férmur y otros huesos largos y la tibia, el cúbito, el radio y el calcáneo. Los pacientes con osteomielitis de huesos largos suelen ser incapaces de apoyar peso sobre el miembro afectado y existe sensibilidad local a la palpación sobre el hueso comprometido.902 La siembra hematógena del disco intervertebral conduce a espondilitis y discitis interverte­ bral.339’751’1403 Las infecciones de los espacios discales pueden afectar el espacio lumbar, torácico, lumbosacro o toracolumbar.751 1404 Los niños con infecciones invasivas por K. kingae a menudo tienen trastornos subyacentes importantes, como leu­ cemia linfocítica aguda o cardiopatía congénita. Aunque raras, se han diagnosticado infecciones osteoarticulares debidas a K. kingae, que incluyen discitis intervertebral y artritis séptica en los adultos.389-852 Como sucede con otras bacterias HACEK. K. kingae y las otras especies de Kingella son causas raras de baeteriemia y endocarditis. La endocarditis por K. kingae ocurre primaria­ mente en personas con cardiopatía subyacente o prótesis cardí­ acas, al igual que las otras bacterias con requerimientos nutri­ cionales especiales explicadas hasta ahora, aunque se han com unicado casos en personas sin cardiopatía previa.214-405’1363’1387 A diferencia de las infecciones osteoarticula­ res, la endocarditis por K. kingae se observa más en adultos y

450

CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

niños en edad escolar, aunque ocurren casos en niños peque­ ños.1363'1404 Puede haber complicaciones, como pericarditis, absceso pericárdico, aneurisma micótico, infarto cerebral e insuficiencia cardíaca congestiva durante el curso clínico de la enfermedad. Se observa que los pacientes inmunodeprimidos tienen mala higiene dental, faringitis o ulceraciones mucosas debido al tratamiento para otros trastornos (p. ej., radioterapia). También se ha comunicado bacteriemia por K. kingae sin endo­ carditis en adultos inmunocompetentes luego de manipulacio­ nes dentales.1086 Otras complicaciones de la bacteriemia y las infecciones óseas por K. kingae son meningitis, endoftalmitis hematógena, infección de tejidos blandos y absceso comeal 200,883.1087,1312 $e comunicado endocarditis por K. kingae en una mujer con lupus eritematoso sistémico y bacteriemia por K. kingae como causa inmediata de muerte en un paciente con SIDA.1300-1387 Se ha aislado K. kingae en muestras de sangre y esputo de pacientes con neumonía, epiglotitis y traqueobronquitis.678 La septicemia por K. kingae también puede imitar las infecciones sistémicas por neiserias (meningococemia o infec­ ción gonocócica diseminada) en su presentación clínica. Redfield y cois, comunicaron un caso de bacteriemia por K. kingae en un varón de 4 años con leucemia linfocítica aguda que se presentó con lesiones cutáneas y afectación articular sugestivas de una infección gonocócica disem inada.1053 También se informó una meningitis aguda por K. kingae en un paciente con anemia drepanocítica, bacteriemia por K. kingae que se presenta como meningococemia en un hombre con cirrosis y un síndrome de artritis-dermatitis “similar a la infec­ ción gonocócica diseminada” debida a septicemia por K. kin­ gae en una mujer de 21 años antes sana.1164 1283 Pocas veces se ha aislado K. denitrificans y S. indologenes de infecciones de importancia clínica. K. denitrificans consti­ tuye parte de la flora de los aparatos respiratorio y genitourina­ rio normales y ha sido documentado como causa rara de septi­ cemia y endocarditis de válvulas nativas y protésicas.543 Las edades de los pacientes con endocarditis variaron de 22 a 66 años y todos salvo uno tenían una enfermedad valvular pre­ existente o una válvula protésica colocada. Los pacientes a menudo se habían sometido a procedimientos dentales sin pro­ filaxis o tenían infecciones respiratorias simultáneas. Se ha aislado K. denitrificans en el empiema de un paciente con car­ cinoma broncogénico, en la médula ósea de un paciente con SIDA y en el líquido amniótico de una mujer de 23 años con corioamnionitis.805'870'882 S. indologenes ha sido aislado de in­ fecciones oculares humanas y fue comunicado inicialmente en asociación con un caso de endocarditis de válvula protésica en 1987.634'1196 K. oralis no se ha asociado con ningún proceso infeccioso. Características de los cultivos e identificación

Las especies de Kingella son bacilos o cocobacilos gramne­ gativos pletóricos y cortos (2-3 por 0,3 |im) que a veces se pre­ sentan en pares o cadenas cortas. Son oxidasa positivos y, a diferencia de las especies de Neisseria y Moraxella, son catalasa negativos. Todas las especies crecen en agar chocolate y agar sangre y no crecen en agar de MacConkey u otros medios entéricos. Se describió un medio selectivo para la recuperación de K. kingae de muestras respiratorias; está compuesto por agar tripticasa de soja que contiene sangre de camero al 5-7% y van­ comicina (2 (ig/mL).1406 La vancomicina inhibe la flora bacte­ riana orofaríngea grampositiva y facilita la detección de la (3hemólisis producida por el microorganismo. Todas las especies de Kingella y Suttonella son oxidasa positivas y catalasa nega­

tivas y ninguna de ellas produce lisina u ornitina descarboxilasas, arginina dihidrolasa o ureasa. K. kingae es (3-hemolítico en agar sangre de camero; la reac­ ción hemolítica es “tenue” y se asemeja a la de los estreptococos del grupo B y puede observarse sólo en áreas de crecimiento confluente o después de extraer la colonia de la superficie del agar (véase lámina en color 9-4A). Con la incubación prolon­ gada, algunas cepas de K. kingae (y K. denitrificans) pueden “deprimir” el agar como E. corrodens. K. kingae produce ácido a partir de glucosa y maltosa solamente. K. denitrificans fue denominado “TM -1” y reconocido al principio por su capaci­ dad para crecer en medio de Thayer-Martin (véase lámina en color 9-4B).586 Produce ácido sólo a partir de glucosa en medios con complementos, pruebas rápidas de degradación de hidratos de carbono y distintos sistemas comerciales y también es prolil-aminopeptidasa positivo (véase lámina en color 9-4C). Debido a estas características, puede ser confundido con N. gonorrhoeae, sobre todo en muestras orofaríngeas y genitouri­ narias. Este microorganismo, al contrario de otras especies del género, reduce el nitrato a nitrito, y la mayoría de las cepas también reducen el nitrito a gas nitrógeno con una incubación prolongada. S. indologenes produce ácido a partir de glucosa, maltosa y sacarosa, pero no de lactosa y se distingue por su capacidad para producir indol. Al igual que C. hominis, esta característica debe determinarse en caldo de triptona con extracción de xileno y agregado de reactivo de indol de Ehrlich. S. indologenes puede diferenciarse de C. hominis, al que se ase­ meja estrechamente, por su aspecto en la tinción de Gram, acti­ vidad de fosfatasa alcalina positiva y falta de producción de ácido a partir de manitol y sorbitol.186330 K. oralis produce ácido sólo a partir de glucosa, pero puede ser diferenciado de K. denitrificans por su falta de reducción de nitrato y nitrito, y la ausencia de actividad de prolil-aminopeptidasa.328 E. corro­ dens puede ser diferenciado tanto de C. hominis como de espe­ cies de Kingella por su morfología en la tinción de Gram, la falta de fermentación de los hidratos de carbono y las reaccio­ nes de ornitina y lisina descarboxilasa positivas. En el cuadro 9-6 se presentan las reacciones bioquímicas para la identifica­ ción de especies de Kingella y S. indologenes. Aunque la identificación de estos microorganismos es fácil una vez que han sido aislados, algunos investigadores han encontrado dificultades para el crecimiento de K. kingae a par­ tir de muestras clínicas, sobre todo muestras de líquido articu­ lar, de pacientes con artritis y osteomielitis. Yagupsky y cois, observaron que la siembra directa del material aspirado fue mucho menos sensible para la recuperación de K. kingae que la inoculación de medios de cultivo en sangre BACTEC.1405 Entre 100 muestras cultivadas por ambos métodos, 34 dieron muchos microorganismos; 10 de los 11 aislamientos de K. kingae que fueron obtenidos crecieron sólo en el medio BACTEC y no fueron recuperados en la siembra directa. La discrepancia en la tasa de aislamiento de K. kingae no se observó para otros microorganismos que producen infecciones osteoarticulares. También se detectó K. kingae en sangre y líquidos sinoviales utilizando el sistema BacT/Alert® (Organon Tenia) y el tubo microbiano Isolator 1,5® pediátrico (Wampole Laboratories. Cranbury, NJ).765-1412 Utilizando líquido sinovial sembrado con inóculos pequeños de 24 aislamientos diferentes de K. kingae. Host y cois, detectaron el 100% de los 24 utilizando los frascos para aerobios BacT/Alert Aerobic y BacT/Alert Pedi-BacT, el 88% con el frasco para aerobios BacT/Alert FAN y el 63% con el frasco BACTEC Plus Aerobic F®.604 La mejor recuperación de K. kingae de muestras de líquido sinovial inoculadas en medios de hemocultivo puede deberse a la dilución de factores

Especies humanas de C apnocytophaga

inhibidores en líquido sinovial por el medio de cultivo (p. ej., -istemas de hemocultivo con base de caldo) o por la extracción de los microorganismos del medio para líquido sinovial (p. ej., cultivos Isolator). En cualquiera de los casos, la inoculación de líquidos osteoarticulares en frascos para hemocultivo debe ser el estándar para el procesamiento de estas muestras en el labo­ ratorio clínico.9021404 También se han utilizado métodos mole­ culares (p. ej., PCR) para la detección directa de K. kingae en líquido articular.1213 Sensibilidad a los antibióticos

Las cepas de K. kingae son sensibles a penicilina, ampicilina, xacilina, cefalosporinas de todas las generaciones, cloranfenic >1. aminoglucósidos, trimetoprim-sulfametoxazol y ciproflo­ xacina. Algunas pueden ser relativamente resistentes a eritromicina y la mayoría son resistentes a clindamicina, lincomicir.a y vancomicina.133’636-736 Las cepas de K. denitrificans tienen sensibilidades a los antibióticos similares a las de K. kingae; el crecimiento de K. denitrificans en agar de Thayer-Martin indi­ ca que son resistentes a vancomicina y colistina.586 Una cepa de Al indologenes aislada en una endocarditis fue sensible a ampicilina, cefazolina y tobramicina, según un informe de Jenny y cois.634 En 1993, Sordillo y cois, lograron el crecimiento de una cepa de K. kingae a partir de la sangre de un paciente de 29 años con SIDA. La cepa que produjo (3-lactamasa y era alta­ mente resistente a ampicilina, cefazolina y ticarcilina, pero era >cnsible a los agentes resistentes a la p-lactamasa y a fármacos combinados que contenían inhibidores de la p-lactamasa (cla• Ja n ato y sulbactam).1203 Entre cinco casos de infección por K. kingae comunicados en Islandia en 1997, tres de las cinco cepas produjeron enzimas p-lactamasa y eran resistentes a peni_lima y ampicilina.133

Especies humanas de Capnocytophaga

451

traban un requerimiento distinto de CO, para el crecimiento en medios de agar. Durante fines de la década de 1970. los investigadores de la University of Massachussets y en el Forsyth Dental Center en Boston publicaron estudios sobre un grupo de bacilos gramne­ gativos fusiformes que necesitaban CO; tanto para el creci­ miento aerobio como anaerobio y mostraban movilidad por deslizamiento.593’761'1199'1377 Estos microorganismos parecían tener un papel en la patogenia de la enfermedad periodontal humana y fueron denominados especies de Capnocytophaga. lo que refleja el “consumo” o requerimiento de CO, del micro­ organismo para su crecimiento. Algunos grupos de los labora­ torios en UCLA y en el Wadsworth VA Hospital compararon cepas y arribaron a la conclusión de que las especies de Cap­ nocytophaga de los investigadores de Boston, el grupo DF-1 de los CDC y “Bacteroides ochraceus” eran nombres diferentes para los mismos microorganismos.935’1378 La especie tipo de este grupo fue denominada Capnocytophaga ochracea. Las cepas relacionadas estudiadas al mismo tiempo fueron deno­ minadas Capnocytophaga sputigena y Capnocytophaga gingivalis. Los estudios de investigación ulteriores que utilizaron otros métodos (p. ej., análisis de ácidos grasos celulares; perfi­ les de aminopeptidasa) apoyaron la condición de especie de Capnocytophaga. la sinonimia de las distintas “especies” des­ critas por los científicos de Estados Unidos y Europa, y la inclusión de tres especies separadas dentro del género.308 En 1994, se identificaron dos nuevas especies humanas de Capno­ cytophaga -C . granulosa y C. haem olytica- en muestras de placa dental.571413 Sobre la base del análisis de rRNA 16S, las cinco especies de Capnocytophaga halladas en los seres huma­ nos se clasifican en la familia Flavobacteriaceae junto con especies de Flavobacterium, Chryseobacterium y Weeksella, en el orden propuesto “Flavobacteriales” en el filo Bacteroidetes.455-1305 Importancia clínica

Taxonomía

Las especies de Capnocytophaga fueron descritas originanam ente por Prévost en 1956 en el Pasteur Institute. Al prin­ cipio. se pensaba que estos microorganismos eran variantes fermentativas e indol negativas de Fusobacterium nucleatum; rieron denominados “fl nucleatum variedad ochraceus”. El análisis del contenido de G + C de cepas similares puso en evi­ dencia que estos microorganismos estaban más estrechamente -racionados con las bacterias denominadas “especies de Risella” que con las fusobacterias y se propuso reclasificar las ceras de F. nucleatum variedad ochraceus como Ristella ochracea.m Al mismo tiempo, Loesche estaba examinando cepas c; "Bacteroides oralis” de la cavidad bucal humana; algunas tenían morfologías “fusiformes” sugestivas de fusobacterias.761 Loesche sugirió el nombre “Bacteroides oralis variedad elonpara estas cepas. Aunque se habían perdido las cepas rcginales de Prevot, un mejor examen de “Ristella ochracea” Bacteroides oralis variedad elongatus" confirmó que estos n iinbres describían al mismo microorganismo y fue cambiado por "Bacteroides ochraceus”." 99 Durante los primeros años de la década de 1960, Elizabeth O. King también estaba estudiani : en los CDC varias cepas gramnegativas aisladas en muestras clínicas humanas, las cuales fueron designadas como grupo DF-1 de los CDC, en que "DF” significa “fermentador disgónico". Esto se refiere a las bajas capacidades fermentadoras de estos microorganismos en medio no complementado con suero. Estas cepas no eran anaerobias en su metabolismo, pero mos­

Las especies de Capnocytophaga son bacterias gramnegati­ vas con movilidad por deslizamiento que forman parte de la flora orofaríngea normal. Estos microorganismos pueden desempeñar un papel (junto con A. actinomycetemcomitans) en la patogenia de la periodontitis juvenil localizada y otras enfer­ medades periodontales. También pueden ser agentes de sepsis en pacientes con procesos malignos, granulocitopenia y otras enfermedades subyacentes graves (p. ej., leucemia mieloblástica, leucemia linfocítica aguda, adenocarcinoma, mieloma múl­ tiple, enfermedad de Hodgkin. carcinoma endometrial).132-484-731 Los episodios de bacteriemia a menudo coinciden con períodos de granulocitopenia profunda debida a procesos malignos hematológicos (sobre todo leucemia mieloide aguda o leuce­ mia linfocítica aguda) y a la administración de quimioterapia citotóxica. En los casos típicos, se encuentran mucositis y ulce­ raciones bucales en los pacientes profundamente inmunosuprimidos, lo que establece así una vía de entrada eficaz para el microorganismo en el torrente circulatorio.83-731 Las especies de Capnocytophaga se aíslan principalmente de fuentes respirato­ rias (surcos gingivales, bolsillos periodontales) y en ocasiones, de sangre y LCR.690 Pocas veces se pueden aislar en las vías respiratorias bajas, abscesos pulmonares, infecciones de heri­ das, líquidos pleural/peritoneal, líquido articular, muestras de hueso, conjuntiva y córnea y vitreo.374’551’985’11061269’1352’1384 Se han aislado especies de Capnocytophaga de infecciones del aparato genital femenino como causas de infecciones intraute­ rinas, intraamnióticas y perinatales graves (p. ej., endometritis,

452

CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

amnionitis, corioamnionitis), aborto prematuro, baeteriemia congénita y sepsis neonatal.7352'40a838-860 Se han comunicado endocarditis, linfadenitis cervical, empiema, absceso pulmo­ nar, sinusitis, osteomielitis vertebral, absceso subfrénico, pionefrosis, absceso hepático, osteomielitis y lesiones en los puños causadas por especies de Capnocytophaga tanto en pa­ cientes inmunodeprimidos como no.192-360374'985'1156 1266-1354 En 1995, se documentó el primer caso de especies de Capnocyto­ phaga (C. sputinega) como causa de peritonitis relacionada con diálisis peritoneal ambulatoria continua en un hombre de 73 años con enfermedad renal en estadio terminal.388 En el año 2000, se aisló la especie recién descrita -C . granulosa- en un absceso de un paciente inmunodeprimido.363 Los estudios de los factores de virulencia producidos por Capnocytophaga se han centrado en su papel reconocido en la enfermedad periodontal. Los microorganismos aislados en lesiones bucales producen distintas aminopeptidasas, protea­ sas, elastasas y enzimas similares a la quimiotripsina.457-1212 Estas enzimas pueden funcionar como factores de virulencia en forma directa produciendo la degradación del tejido periodon­ tal e indirecta, por su acción sobre las proteínas en la placa den­ tal que generan pequeñas moléculas que tienen el potencial inflamatorio conocido en la enfermedad periodontal (p. ej., bradicinina). Estas moléculas causan aumentos de la permeabi­ lidad vascular, acumulación de células polimorfonucleares y dolor. C. ochracea y C. sputigena producen neuraminidasa, una enzima producida por muchos otros microorganismos y que se considera que contribuye a la virulencia.885 En relación con la enfermedad periodontal y la sepsis, las especies de Capnocytophaga producen una sustancia dializable que altera el aspecto microscópico de neutrófilos e inhibe mucho la quimiotaxis in vitro.11741311 Esta sustancia puede actuar localmen­ te en el tejido orofaríngeo y bloquear la función de los neutrófilos en pacientes que ya están inmunodeprimidos. Los extrac­ tos de especies de Capnocytophaga preparados con células sometidas a ultrasonido contienen una sustancia proteica de 14 kDa que produce la inhibición dependiente de las dosis de la proliferación linfocítica en respuesta a mitógenos.954 Las espe­ cies de Capnocytophaga también secretan proteasas IgA, lo que permite la inutilización de la respuesta inmunitaria muco­ sa.433 La producción de polisacárido extracelular también puede contribuir a la virulencia al inhibir la respuesta de linfocitos T a mitógenos y antígenos.151 Por último, el LPS de las especies de Capnocytophaga puede volver algunas cepas resis­ tentes a los efectos bactericidas del suero humano normal.1380 Características de los cultivos e identificación

Las especies de Capnocytophaga tienen crecimiento lento, las colonias se vuelven visibles por lo general después de 48 horas de incubación y desarrollan una morfología característi­ ca después de este período. Todas las especies necesitan un medioambiente rico en C 0 2 para su crecimiento; esto puede ser provisto en una incubadora con CO, o una jarra de anaerobio­ sis con vela. Las colonias del microorganismo son amarillas, ocres o ligeramente rosadas y tienen proyecciones digitiformes marginales (movilidad por deslizamiento) que aparecen como una película que rodea el área central de la colonia (véase lámi­ na en color 9-4D). Las partes centrales de las colonias también tienen un aspecto moteado y húmedo. Las especies de Capnocytophaga crecen en agar sangre y agar chocolate, pero no en agar de MacConkey. También se puede observar un buen crecimiento en agar de Thayer-Martin modificado debido a la resistencia de los microorganismos a vancomicina, colistina y

trimetoprim. Los microorganismos son gramnegativos, largos (2,5-7,5 por 0,5 (im), fusiformes y que parecen rectos o ligera­ mente curvos (véase lámina en color 9-4E). El pleomorfismo, con células tumefactas o grandes en forma de cocos, es carac­ terístico en los cultivos más antiguos. Todas las especies son catalasa negativas y oxidasa negativas, y producen ácido a par­ tir de glucosa, maltosa, sacarosa y mañosa, pero no a partir de ribosa, xilosa, manitol o sorbitol.1199 No se produce indol ni ureasa, y tanto las reacciones de lisina descarboxilasa como de ornitina descarboxilasa y de arginina dihidrolasa son negativas. Las especies de Capnocytophaga producen perfiles uniformes característicos en el análisis de ácidos grasos celulares que per­ miten la identificación del género pero no de especies.308 Las especies son identificadas mediante una serie ampliada de pruebas (reducción de nitrato y nitrito, hidrólisis de almidón y dextrán, etc.). La especie recién descrita C. haemolytica es Phemolítica en sangre de camero y es la única especie hemolítica humana.1413 Las cepas de C. granulosa forman inclusiones granulosas intracelulares que se tiñen con carbol fucsina cuan­ do los microorganismos crecen en condiciones anaerobias en peptona-caldo de levadura glucosa en condiciones anaero­ bias.1413 Estas dos especies recién descritas pueden ser diferen­ ciadas también de las tres especies humanas de Capnocytophaga descritas antes mediante la determinación de las actividades de distintas aminopeptidasas. Las cepas de C. ochracea han mos­ trado reacciones cruzadas con algunos reactivos de aglutinación del látex (Serobact Legionella, Disposable Products, Adelaida, Australia) utilizados para la identificación de especies de Legionella.233 En el cuadro 9-8 se muestran las características bioquímicas de las cinco especies de Capnocytophaga asocia­ das con seres humanos. Sensibilidad a los antibióticos

Las especies de Capnocytophaga en general son sensibles a eritromicina, clindamicina, tetraciclina y fluoroquinolonas y son variablemente sensibles a penicilina, aztreonam, colistina y metronidazol.55'109-1109 Las cepas de Capnocytophaga resisten­ tes a la penicilina producen nuevas enzimas P-lactamasas que confieren resistencia a las cefalosporinas y penicilinas de amplio espectro.430 1092 Estas cepas productoras de P-lactamasa son muy resistentes a penicilina, amoxicilina y cefazolina; el agregado de clavulanato produce una disminución de 64 veces en la CIM de amoxicilina para más del 90% de las cepas pro­ ductoras de P-lactamasa.1091 Estas cepas también son menos sensibles a cefuroxima, cefotaxima y ceftazidima que las cepas P-lactamasa negativas.1091 El imipenem parece ser activo tanto contra las cepas de Capnocytophaga p-lactamasa positivas como P-lactamasa negativas. En general, las especies de Capnocytophaga son resistentes a los aminoglucósidos (gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina), trimetoprim. colistina y vancomicina, aunque algunas cepas pueden ser sen­ sibles.1091-1109 Gomez-Garces y cois, comunicaron un caso de baeteriemia mortal causado por una cepa de C. sputigena pro­ ductora de P-lactamasa resistente a la ciprofloxacina que era resistente a todos los P-lactámicos (salvo cefoxitina) y amino­ glucósidos, pero era sensible a tetraciclina, eritromicina, clin­ damicina, aztreonam e imipenem.484 En general, los pacientes inmunodeprimidos y aquellos con granulocitopenia son trata­ dos em píricam ente con una com binación de un antibiótico P-lactámico y un aminoglucósido, y suelen ser necesarios nive­ les bactericidas de los antibióticos para una respuesta terapéu­ tica óptima. Por lo tanto, es importante que el microbiólogo reconozca pronto las características sobresalientes de este

Especies caninas de C apnocytophaga

C uadro 9 -8

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C a r a c te rís tic a s b io q u ím ic a s d e C a p n o c y to p h a g a o c h r a c e a , C. g in g iv a lis , C. sp u tig e n a , C. h a e m o ly tic a y C. g r a n u lo s a

CARACTERÍSTICA Hemolisis, SBA Oxidasa Catalasa Motilidad deslizante Crecimiento en agar de MacConkey N 0 3a N 0 2 N 0 2a gas N2 Indol Ureasa Arginina dihidrolasa Lisina descarboxilasa Omitina descarboxilasa Hidrólisis de esculina Hidrólisis de glucógeno Hidrólisis de almidón Hidrólisis de dextrán Gas a partir de glucosa Producción de ácido a partir de: Glucosa Maltosa Fructosa Sacarosa Lactosa Xilosa Manitol Trehalosa Mañosa Rafmosa Galactosa Ribosa Arabinosa Salicina Sorbitol L-alanil-aminopeptidasa L-arginina-aminopeptidasa L-y-glutamilaminopeptidasa L-leucil -aminopeptidasa L-lisil-aminopeptidasa A-a-benzoil-DL-arginilaminopeptidasa

C. OCHRACEA

C. GINGIVALIS

C. SPUTIGENA

C. HAEMOLYTICA

C. GRANULOSA

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JMayoría de cepas positivas. 'Mayoría de cepas negativas. + : reacción positiva; reacción negativa; v: reacción variable; ND: no disponible; 1+ a 4+: intensidad de las reacciones de aminopeptidasas; SBA: agar sangre de camero.

microorganismo. Se debe comunicar al médico lo antes posible la resistencia intrínseca de las especies de Capnocytophaga a los aminoglucósidos y la producción de enzimas P-lactamasas por algunas cepas clínicas (detectada mediante la prueba de nitrofecina).

Especies caninas de Capnocytophaga Taxonomía

El grupo DF-2 de los CDC fue aislado originariamente en 1976 de los cultivos de sangre y líquido cefalorraquídeo de un paciente que se había vuelto sintomático después de sufrir la mordedura de un perro.146 Con ulterioridad se publicaron varias

comunicaciones que describen microorganismos similares y, durante 1987, más de 150 microorganismos aislados, denomi­ nados grupo DF-2 de los CDC (por fermentador disgónico) se enviaron a la Rama de Bacteriología Especial de los CDC.567 En 1989, DF-2 y un grupo de microorganismos ''similares a DF-2” fueron clasificados como especies de Capnocytophaga sobre la base de las características fenotípicas y los estudios de relación del DNA.165 El grupo DF-2 se denomina ahora Capnocytophaga canimorsus (latín para “m ordedura de perro”) y las cepas “similares a DF-2” se denominan Capnocytophaga cynodegmi (griego para "mordedura de perro”). De estas dos especies, C. canimorsus se aísla mucho más a menudo y parece ser más virulento. Los estudios en macrófagos de ratón cultivados han mostrado que C. canimor-

454

CAPÍTULO 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

sus es fagocitado, se multiplica dentro de la célula y produce muerte celular dentro de las 48 horas, mientras que C. cynodegmi no demuestra efectos citopáticos.413 Aunque estos micro­ organismos son genotípica y fenotípicamente diferentes de las especies de Capnocytophaga aisladas de seres humanos, son similares a ellas en relación con la morfología en la tinción de Gram, los ácidos grasos celulares, la motilidad por desliza­ miento y las condiciones de cultivo para el crecimiento. C. canimorsus y C. cynodegmi son clasificados con las especies humanas de Capnocytophaga en la familia Flavobacteriaceae en el filo Bacteroidetes,455 Importancia clínica

En general, las infecciones por C. canimorsus se asocian con m ordeduras de perros o contactos estrechos con ellos.606’785’1003'1113 Kullberg y cois, revisaron más de 60 casos de infección por C. canimorsus y observaron que el 47% de los pacientes tenían antecedentes de mordedura y el 27% refería contacto con perros sin mordeduras ni arañazos.739 Las mani­ festaciones clínicas más graves ocurren en individuos que pre­ sentan enfermedades subyacentes o trastornos que los predis­ ponen a una infección grave por este microorganismo, como enfermedad hepática secundaria a alcoholismo (p. ej., cirrosis), esplenectomía previa relacionada con otras circunstancias médicas, enfermedad de Hodgkin, tricoleucemia, fibrosis pul­ monar, síndrome de malabsorción, enfermedad renal, enferme­ dad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad ulcerosa pépti­ ca, macroglobulinemia de Waldenstrom y el uso de corticosteroides sistémicos o tópicos.542’567’739’825'1078'1107 La asociación observada con mayor frecuencia de infección sistémica por C. canimorsus con asplenia sugiere con firmeza que el sistema reticuloendotelial desempeña un papel importante para conte­ ner la propagación del microorganismo. Las principales carac­ terísticas clínicas de la infección por C. canimorsus incluyen infección de heridas con celulitis, meningitis, bacteriemia con shock séptico, insuficiencia renal, lesiones cutáneas hemorrágicas que recuerdan enfermedad meningocócica, neumonía con empiema y endocarditis tanto de válvulas nativas como proté­ sicas.31-142'217'714’766’938 La sepsis fulminante por C. canimorsus puede asemejarse clínicamente a la enfermedad meningocóci­ ca grave, con desarrollo de coagulación intravascular disemi­ nada, púrpura fulminante, lesiones cutáneas hemorrágicas rápi­ damente evolutivas, gangrena periférica simétrica y síndrome de Waterhouse-Friderichsen.542’739'877 Las presentaciones atípicas y las complicaciones de la sepsis por C. canimorsus inclu­ yeron hipotensión de rápida instalación complicada por síndro­ me de dificultad respiratoria del adulto, pleuritis, infarto de miocardio, mononeuropatía musculocutánea y púrpura trombocitopénica trombótica sin coagulación intravascular diseminada.82217-367-411-608-709 Las complicaciones gastrointestinales y renales incluyen cuadros de abdomen agudos, diarrea secreto­ ria profusa, síndrome urémico-hemolítico y peritonitis relacio­ nada con diálisis.213’322'905'995'1139'1278 Se ha aislado C. canimorsus en la orofaringe y la saliva de perros y, al menos en un caso de sepsis, la cepa aislada en sangre del paciente también se halló en muestras de hisopados gingivales del perro del paciente.825 Se han comunicado infecciones oculares, entre ellas, blefaritis angular, úlceras corneales crónicas, úlcera corneal con perfora­ ción y endoftalmitis causada por C. canimorsus.242’324-46*-10'01435 En un caso el paciente había sufrido un arañazo de su perro sobre la córnea y había sido tratado, entre otras medidas, con prednisona tópica. Cabe destacar que algunos casos de infec­ ción por C. canimorsus, incluidas queratitis e infección sisté­

mica, han ocurrido en individuos que sufrieron mordeduras o arañazos de gatos domésticos.204-242-810-989 1302 Características de los cultivos e identificación

En general, C. canimorsus se aísla en los hemocultivos, aun­ que puede hallarse en otras muestras (cultivos de heridas, aspi­ rados de celulitis, LCR). C. cynodegmi ha sido identificado en la boca de perros o en heridas por mordedura de perros.165 En casos de bacteriemia de alto grado, en realidad puede obser­ varse la bacteria en frotis de sangre periférica.877 El microorga­ nismo se desarrolla en varios tipos de medios para hemoculti­ vo y el crecimiento suele ser lento. También se ha utilizado el método de lisis-centrifugación (Isolator) con éxito para la recu­ peración de C. canimorsus.'21'' En la mayoría de las comunica­ ciones, los cultivos se tornan positivos 3 a 7 días después de la recolección. El microorganismo crece tanto en agar sangre como en agar chocolate incubado a 35 °C y en una estufa de CO, o en una jarra de anaerobiosis con vela y humedad aumen­ tada.559 El escaso crecimiento en agar sangre de carnero de ruti­ na ha sido atribuido al uso de una base de tripticasa de soja. Se observa mejor crecimiento cuando se utiliza una base de infu­ sión de corazón. Heltberg y cois, notaron que los medios com­ plementados con cisteína son propicios para un crecimiento óptimo.559 Los distintos tipos comerciales de agar chocolate con suplementos que contienen IsoVitalex (que contiene ciste­ ína) u otros enriquecimientos similares son satisfactorios. Aparecen colonias puntiformes luego de 3 o 4 días de incuba­ ción. Después de algunos días más las colonias se presentan circulares, lisas y convexas (véase lámina en color 9-4F). En la tinción de Gram, las bacterias aparecen como bacilos fusifor­ mes delgados de 2 a 4 ¡jg de longitud (véase lámina en color 9-4G). Algunas células pueden parecer ligeramente curvas. Al igual que las otras bacterias con requerimientos nutricionales especiales que explicamos hasta ahora, no se observa ningún crecimiento en agar de MacConkey. C. canimorsus y C. cyno­ degmi son catalasa y oxidasa positivos. Estas dos reacciones los diferencian de las otras especies de Capnocytophaga, que son tanto oxidasa como catalasa negativas. Ambas especies caninas también son arginina dihidrolasa positivas y ONPG positivas. Las pruebas de lisina y ornitina descarboxilasa son negativas. C. canimorsus y C. cynodegmi son diferenciados mediante las pruebas de utilización de hidratos de carbono, y el último microorganismo produce ácido a partir de una variedad más amplia de azúcares. En el cuadro 9-9 se muestran las reaccio­ nes bioquímicas de C. canimorsus y C. cynodegmi junto con las características bioquímicas generales de las otras especies de Capnocytophaga explicadas antes. El término “disgónico” significa que los medios de prueba bioquímicos para la identi­ ficación, incluido el medio basal para la fermentación de hidra­ tos de carbono, deben ser complementados con suero (tres a cinco gotas por 5 mL de caldo) para obtener reacciones confia­ bles y reproducibles. Sensibilidad a los antibióticos

El lento crecimiento de C. canimorsus en medios de agar y la falta de crecimiento de algunas cepas en ciertos tipos de me­ dios de caldo han impedido efectuar estudios adecuados de la sensibilidad a los antibióticos de este microorganismo. Algu­ nos estudios no estandarizados que utilizaron procedimientos de difusión con discos diseñados para bacterias de crecimiento más rápido habían comunicado que las cepas de C. canimorsus eran sensibles a la mayoría de los antibióticos, pero resistentes

Especies de D ysgonom onas

C uadro 9 -9

455

C a ra c te rís tic a s b io q u ím ic a s d e C a p nocytophaga c a n im o rsu s (D F -2), C. c yn o d e g m i (sim ila r a D F -2) y o tr a s e sp ecies d e C apno cyto p h a g a

CARACTERÍSTICA Hemolisis, SBA Oxidasa Catalasa Motilidad en vuelo Crecimiento en agar de MacConkey NO, a N 0 2 N 0 2a gas N2 Indol Ureasa Arginina dihidrolasa Lisina descarboxilasa Omitina descarboxilasa Hidrólisis de esculina Hidrólisis de ONPG Producción de ácido a partir de: Glucosa M altosa Fructosa Sacarosa Lactosa Xilosa Manitol M añosa Rafinosa Inulina Galactosa Melibiosa Hidrólisis de glucógeno Hidrólisis de alm idón

C. CANIM ORSUS

C. CYNODEGMI

ESPECIES D E CAPNOCYTOHPAGA*

_

_

-

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-

+ + + V V -

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+

V

V

+

+

V

“C. ochracea, C. gingivalis y C. sputigena. - : reacción positiva; - : reacción negativa; v: reacción variable; ND: no disponible; SBA: agar sangre de carnero.

a los aminoglucósidos. En 1988, Verghese y cois, informaron >obre una técnica de dilución en caldo que utilizaba el caldo de Schaedler como medio de crecim iento.1326 Las ocho cepas de C. canimorsus evaluadas fueron sensibles a todos los antibióti­ cos excepto a aztreonam. Estos antibióticos fueron penicilina, eritromicina, ticarcilina. piperacilina, cefazolina, cefoperazona. cefotaxima, ceftazidima, cloranfenicol, trimetoprim-sulfametoxazol y fluoroquinolonas. La sensibilidad de C. canimor­ sus a las sulfamidas y los aminoglucósidos es poco clara en la actualidad, dado que los resultados in vitro con estos agentes rirecen ser dependientes del método. Los antibióticos que por 13 general son más activos contra los microorganismos grampc 'itivos, como vancomicina, clindamicina, eritromicina y níampicina, también fueron activos contra C. canimorsus. E>ios datos apoyan la eficacia clínica observada con penicilina CIM promedio de la penicilina, 0,04 ± 0,01 ¡ig/mL para todas las cepas evaluadas).

Especies de Dysgonomonas La denominación de grupo DF-3 de los CDC se aplica a una cera clínica infrecuente clasificada hace poco en el género nuevo Dysgonomonas como D. capnocytophagoides , 5 8 1 Desde i', punto de vista bioquímico, este microorganismo se asemeja

a ciertas especies de Capnocytophaga (su epíteto de especie significa “similar a Capnocytophaga”), pero los estudios de secuenciación de rRNA 16S indican la relación genética con Bacteroides distasonis, Bacteroides uniformis, Bacteroides forsythus y Prevotella melaninogenica, que son bacilos gram­ negativos anerobios.581-1305 Las dos primeras comunicaciones de este microorganismo en asociación con una enfermedad humana fueron publicadas en 1988. En un caso, se aisló D. capnocytophagoides en cultivo puro de múltiples muestras de heces de una mujer anciana con hipogammaglobulinemia variable común de larga data.1342 En el segundo caso, se lo aisló en los hemocultivos de un varón de 24 años con leucemia linfocítica aguda en recaída y granulocitopenia profunda como resultado de la quimioterapia y la radioterapia intensivas.57 En 1991, Gilí y cois., en el National Cáncer Institute. evaluaron muestras de heces de 690 pacientes y observaron 11 con creci­ miento moderado a importante de D. capnocytophagoides:464 De estos 11 pacientes, 4 tenían antecedentes de diarrea prolon­ gada y fueron tratados; se había documentado diarrea en los otros 7 pacientes, pero los microorganismos desaparecieron en forma espontánea. Blum y cois, recuperaron D. capnocytopha­ goides de las heces de 8 pacientes durante un período de un año.144 Todos eran inmunodeprimidos o presentaban una enfer­ medad subyacente grave, incluidos tres pacientes con una infección por HIV y dos con enfermedad inflamatoria intesti­

456

C A P ÍT U L O 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

nal. Entre estos pacientes, el espectro clínico de D. capnocytoplmgoides varió desde una diarrea crónica con respuesta clí­ nica al tratamiento antibiótico hasta un estado de portador asintomático.144 Otros investigadores también observaron la asociación de una infección entérica por D. capnocytophagoides tanto con infección por HIV como con hipogammaglobulinemia variable común.552 Este microorganismo también ha sido aislado en abscesos de tejidos blandos, en úlceras por decúbito y en las vías urinarias de pacientes inmunodeprimidos.81-853-1149 D. capnocytophagoides se aísla más fácilmente si se siem­ bran muestras de heces en agar sangre con cefoperazona-vancomicina-anfotericina incubado a 35 °C en C 0 2 al 5-7%. El agar sangre no selectivo también debe ser incubado, ya que algunas cepas no crecen en este medio selectivo para Campylobacter ,464 También se logró su crecimiento en agar sangre con kanamicina y vancomicina luego de la incubación en condiciones anaerobias.853 D. capnocytophagoides crece con relativa lentitud y las colonias puntiformes son visibles después de 24 horas de incubación. Después de 48 a 72 horas, las colonias son blanco grisáceas, lisas y no hemolíticas, y algunas cepas producen un olor dulce durante el crecimiento en medios de agar (véase lámina en color 9-4H).57-121-144-464-1342 En la tinción de Gram, los microorganismos aparecen como pequeños cocobacilos gramnegativos. Tanto la reacción de oxi­ dasa como la de catalasa son negativas, no se reduce el nitrato y no se hidroliza la urea. Se produce indol en caldo de triptona y se hidroliza la esculina. No se produce lisina, ornitina des­ carboxilasa ni arginina dihidrolasa. Esta bacteria produce ácido de forma fermentativa a partir de glucosa, xilosa y maltosa; la mayoría de las cepas también producen ácido a partir de saca­ rosa y lactosa pero no de manitol (cuadro 9-10). Se describie­ ron algunas cepas “similares a DF-3” que son constantemente sacarosa negativas y ligeramente hemolíticas.300 La cromato­ grafía gas-líquido también es útil para la identificación, ya que todas las cepas demuestran constantemente 12 y 13-metiltetradecanoato, con cantidades menores de tetradecanoato y hexadecanoato en su pared celular.121'144-300 1345 Además de D. cap­ nocytophagoides, se describieron otras dos especies de Dysgonomonas. Un microorganismo que se denominó Dysgonomonas gadei se aisló por única vez en una vesícula humana. Dysgonomonas mossii fue aislado en muestras clínicas huma­ nas.581-759 Se ha determinado la sensibilidad a los antibióticos de las ce­ pas de D. capnocytophagoides mediante los métodos de difu­ sión en disco, dilución en caldo y Etest.57-144-552-853-1342 Las cepas de D. capnocytophagoides son resistentes a varios agentes, entre ellos penicilina, ampicilina. ampicilina-sulbactam, aztreonam, aminoglucósidos, cefalosporinas (incluidas cefalotina, cefoxitina, ceftriaxona, cefoperazona y ceftazidima), eritromicina, ciprofloxacina y vancomicina. La mayoría de las cepas son sensibles a trimetoprim-sulfametoxazol, rifampicina y cloranfenicol y tienen sensibilidad variable a piperacilina, clindamicina, tetraciclina e imipenem. En general, los pacientes responden al tratamiento con trimetoprim-sulfametoxazol, clindamicina o tetraciclina.144-464

Grupos EF-4A y EF-4B de ¡os CDC

normal de gatos y perros, y también puede causar infecciones cu­ táneas y pulmonares purulentas en estos animales.285-1368 EF-4 fue aislado en heridas humanas producidas por arañazos y mor­ deduras de gatos y perros y en la sangre de una mujer de 65 años con un tumor carcinoide hepático de células pequeñas metastásico.359-1250 La paciente era dueña de un perro, pero no recordaba haber sido mordida por él. EF-4 fue aislado simultáneamente con Pasteurella multocida de una laceración ocular y el líquido vitreo de una niña de 8 años después de que había sido arañada en el rostro por su gato y fue hallado en la secreción auricular purulenta de un hombre de 36 años que había sido lamido repe­ tidas veces en las orejas por su perro dálmata.1082-1317 La denominación de grupo EF-4 se refiere a un cocobacilo gramnegativo que crece tanto en agar sangre como en agar cho­ colate; algunas cepas pueden crecer también en agar de MacConkey. Después de 24 horas de incubación, las colonias miden alrededor de 1 mm de diámetro, son opacas, lisas y ama­ rillentas, tienen un borde entero y son débilmente a-hemolíticas o no hemolíticas. Algunas cepas tienen un olor característico similar a las “palomitas de maíz”. En el único caso bacteriémico, se detectó EF-4 radiométricamente por el sistema BACTEC después de 2 días de incubación. El microorganismo es inmó­ vil, oxidasa positivo y catalasa positivo, y reduce nitrato a nitri­ to. Algunas cepas también pueden reducir nitrito a gas nitróge­ no.186 El microorganismo no produce ureasa ni indol. Las cepas EF-4 se dividen en los subgrupos EF-4a y EF-4b sobre la base de la utilización de hidratos de carbono (véase cuadro 9-10). Las cepas EF-4a fermentan la glucosa, no producen ácidos a partir de otros hidratos de carbono y son arginina dihidrolasa positivas.537-1368 Asimismo, las cepas EF-4b producen ácido en condiciones oxidativas y no fermentativas a partir de glucosa solamente. Las cepas EF-4b tampoco reducen el nitrato en su totalidad hasta el gas y son arginina dihidrolasa negativas.537 La mayoría de las cepas EF-4 son sensibles a penicilina, ampicili­ na, cefazolina, cloranfenicol, tetraciclina, eritromicina, claritromicina, trimetoprim-sulfametoxazol, quinolonas y amino­ glucósidos.

Especies de Simonsiella Las especies de Simonsiella son bacilos gramnegativos aero­ bios con requerimientos nutricionales especiales que tienen la característica morfológica inusual de disponerse en configura­ ciones multicelulares que miden 20-50 por 4-8 |tm. Estas con­ figuraciones se forman con seis a ocho células, con el eje ma­ yor de los bacilos individuales en ángulos rectos con el eje del grupo celular. El grupo celular muestra movilidad por desliza­ miento y forma colonias amarillas pálidas en agar sangre des­ pués de 18 a 24 horas a 37 °C. El género Simonsiella contiene tres especies: S. muelleri se encuentra en la cavidad bucal humana, mientras que S. crassa y S. steedae se hallan en la cavidad bucal de ovejas, y de perros y gatos, respectivamente. S. muelleri fue aislado en el aspirado gástrico de un recién nacido, pero no ha sido implicado como patógeno humano.1372 El género se clasifica en la familia Neisseriaceae."00

Streptobacillus moniliformis Taxonomía

Estas bacterias, que antes formaban un grupo de afiliación taxonómica incierta, se clasifican ahora como miembros sin nombre de la familia Neisseriaceae .ll0° El grupo EF-4 de los CDC (fermentador eugónico 4) forma parte de la flora bucal

S. moniliformis es el único miembro del género Streptoba llus y su posición taxonómica actual es incierta. Sobre la base de

estudios de secuenciación de rRNA 16S, actualmente se clasifi­

S treptobacillus m oniliform is

C uadro 9 -1 0

457

C a r a c t e r ís t ic a s b io q u ím i c a s p a r a la i d e n t if ic a c ió n d e e s p e c ie s d e D y s g o n o m o n a s y g r u p o s E F - 4 A y E F - 4 B d e lo s C D C

C A R A C T E R ÍS T IC A

D . C A P N O C Y T O P H A G O ID E S

D. G Á D E l

D . R O S S II

G R U P O E F -4A

G R U P O E F -4 B ~ /a d

H em olisis, SBA

_

~ /a d

-

-/a -

_

O xidasa

-

+

+

Catalasa

-

+

V

M otilidad

-

-

-

+ -

+ -

-

-

V

V

C recim iento en agar de M acC onkey N 0 3a N O , N O z a gas N , Indol A cetoína

-

-

-

+

+

ND

ND

ND

V -

V -

+ -

V -

V -

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-

-

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ND

-

-

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-

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ND

ND

ND

+

+

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

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Eritritol

ND

+ -

ND

D ulcitol

ND -

ND

ND

ND

Fructosa

ND

G lucógeno Inositol

ND -

Lactosa

+

M altosa

+ -

ND -

Ureasa H idrólisis de gelatina Fosfatasa alcalina Arginina dihidrolasa Om itina descarboxilasa H idrólisis de esculina Gas a partir de glucosa

+

A cido producido a partir de: Glucosa A donitol L-arabinosa C elobiosa

M anitol

+ -

+

ND

ND

ND

ND

ND

-

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ND

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+

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-

-

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+

+

ND

ND

M elecitosa

ND

+

ND

ND

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+

+

ND

ND

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Rafinosa

+

+

ND

ND

ND

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M añosa

Ram osa

ND

+

V +w

Ribosa

ND

+d

ND

ND

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Salicina

ND

+

ND

ND

Sorbitol

-

+ -

ND

ND

ND

A lm idón

ND

+

ND

ND

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+

+

+

ND -

Trehalosa

-

+

+

ND

X ilosa

+

+

¡}-glucuronidasa

-

+

+ -

ND ND

ND

N -acetil-P -glucosam inidasa

-

+

+

ND

ND

a-fu cosid asa

-

+

+

ND

ND

-

-

reacción positiva; -: reacción negativa; +d: reacción positiva débil; v: reacción variable; ND: datos no disponibles; SAB: agar sangre de carnero. *Glucosa fermentada. Kilucosa oxidada.

ca a 5. moniliformis en la familia propuesta “Fusobacteriaceae ” ea la clase “Fusobacterias” del filo Fusobacteria ,445 ^portancia clínica

Streptobacillus moniliformis es un bacilo gramnegativo con requerimientos nutricionales especiales que normalmente se encuentra en la orofaringe de roedores y puede ser transmitido a los seres humanos por las mordeduras de estos animales. Los - edores son su reservorio natural y desempeñan un papel clave

en su transmisión. El microorganismo se encuentra en las vías respiratorias altas de ratas salvajes, ratas y ratones de laborato­ rio, y roedores domésticos (p. ej., cobayos, gerbos) y puede pro­ ducir enfermedad en estos animales.692713 También puede ser transportado por los animales que atrapan roedores o se alimen­ tan de ellos, como perros o gatos. En los seres humanos, S. moniliformis causa una enfermedad denominada “fiebre por mordedura de rata” o fiebre de Haverhill cuando es adquirida por la ingestión del microorga­ nismo. El último nombre proviene de Haverhill, Massachu-

458

C A P ÍT U L O 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

setts, donde se lo aisló en hemocultivos de varios pacientes durante un brote local de la enfermedad.745 1165 En la actualidad, la mayoría de los casos comprenden mordeduras de ratas o la exposición a roedores y muchas de estas infecciones ocurren en niños.497-963 Tras un período de incubación de 7 a 10 días des­ pués de la mordedura de una rata o de la ingestión de alimen­ tos o agua contaminados con excremento de ratas, existe un ini­ cio brusco de fiebre alta, escalofríos, cefalea, mialgas, vómitos y otros síntomas inespecíñcos.963 Algunos días después puede aparecer una erupción sobre las extremidades (que incluyen las palmas y las plantas) y dolor articular grave, poliartritis migra­ toria y asimétrica o artritis séptica franca en alrededor del 50% de los pacientes.294-523'577’591-1112 En los casos típicos, la erupción es rosada-roja y maculopapulosa, aunque puede ser petequial, purpúrica o pustulosa.113 También se describieron abscesos cutáneos y subcutáneos con edema depresible en asociación con esta infección.523'1282'1319 La enfermedad se puede resolver en forma espontánea sin síntomas residuales o puede desarro­ llarse en un trastorno crónico y periódicamente febril. Las complicaciones relacionadas con la diseminación sistémica a través del torrente circulatorio son endocarditis, neumonía con derrame pleural, septicemia, absceso encefálico, amnionitis, prostatitis, pancreatitis, abscesos cutáneos y del aparato geni­ tal, y muerte.199'333'399 1014'1090'11101158 Los síntomas artríticos pue­ den persistir durante años después de la resolución o del trata­ miento de la infección. Sin un indicio sobre el origen de la infección, la fiebre por mordedura de rata o fiebre de Haverhill puede asemejarse a una infección viral, meningococemia, fie­ bre tifoidea o fiebre manchada de las montañas Rocosas.1021 1399 El diagnóstico también puede ser problemático porque se han comunicado casos en pacientes sin antecedentes de mordedu­ ras de roedores o exposición directa a ellos.417 Por otra parte, la revisión de 45 casos que ocurrieron en California en los últi­ mos treinta años puso en evidencia que la fiebre por mordedu­ ra de rata se sospecha en el 75% de los casos en los cuales se dio un diagnóstico tentativo.497 Debido a los requerimientos nutricionales especiales del microorganismo y a las dificulta­ des involucradas con el cultivo, se han hecho diagnósticos retrospectivos de infección por S. moniliformis en ocasiones mediante técnicas serológicas, que incluyen la detección de aglutininas y anticuerpos fijadores del complemento contra la forma bacilar del microorganismo en suero. Sin embargo, no se dispone fácilmente de pruebas serológicas para esta infección y la mayoría de los enfoques serológicos se han utilizado para evaluar la presencia de este microorganismo en colonias de roedores de laboratorio. Características de los cultivos e identificación

S. moniliformis es un bacilo gramnegativo pleomorfo con requerimientos nutricionales especiales que tiende a formar células filamentosas únicas, delgadas y largas. Estas células delgadas (aproximadamente 1 |im) pueden tener más de 100 jim de longitud y plegarse en asas y espirales. En ocasiones, tienen una tinción variable con Gram. Con una incubación pro­ longada, puede aparecer una tumefacción bulbosa o con forma de salchicha a lo largo del filamento, que hace que el microor­ ganismo tenga un aspecto arrosariado. En medios enriquecidos que contienen suero, los microorganismos aparecen como bac­ terias fusiformes gramvariables, delgadas y regulares con extremos redondeados o puntiagudos. También pueden perder su pared celular y existir como una “forma en L (“deficiente en pared celular”)”. De hecho, existen pruebas genéticas, fenotípicas, serológicas y estructurales que sugieren su relación taxo­

nómica con los micoplasmas y los ureaplasmas, los cuales carecen de una pared celular bacteriana típica.1399 S. monilifor­ mis es microaerófilo y el crecimiento en medio líquido suele requerir un suplemento con suero (10-20%), sangre o líquido ascítico. El diagnóstico de fiebre por mordedura de rata o fiebre de Haverhill se hace por la demostración de S. moniliformis en hemocultivos, líquido sinovial, lesiones cutáneas y material de abscesos.366-1165-1166 Como el microorganismo es inhibido por el anticoagulante SPS, la sangre (10 mL) debe ser anticoagulada con citrato (10 mL de citrato de sodio al 2,5%) antes de su pro­ cesamiento.745'1166 También creció con éxito en medios de hemocultivo que contienen SPS con resinas (p. ej., BACTEC Peds-Plus, BD Biosciences).591 Las células sanguíneas citradas sedimentan mediante centrifugación y los eritrocitos centrifu­ gados se inoculan en medio de agar (agar infusión de corazón) que contiene suero de caballo sin complemento y estéril al 1020% y extracto de levadura al 0,5%. El inoculo se propaga sua­ vemente sobre la superficie de agar. También se inocula un medio de caldo de ingredientes similares (caldo de infusión de corazón con suero al 10-20% y extracto de levadura) con los eritrocitos centrifugados. El aislamiento de S. moniliformis también se ha logrado utilizando un medio bifásico con caldo de tripticasa de soja que contiene una porción inclinada (pico de flanta) de agar tripticasa de soja. Los medios se incuban a 35 °C en una jarra de anaerobiosis con vela o una estufa con C 0 2. Se pueden cultivar de la misma manera otras muestras (líquido articular citrado, aspirados, material de abscesos, etc.). En el medio de caldo el microorganismo crece como peque­ ñas “bolas” (puff balls) cerca de la parte inferior del tubo o el frasco y por encima de los eritrocitos y la estroma. La acumu­ lación de ácido en los medios de caldo puede destruir al micro­ organismo, de modo que es necesario un subcultivo frecuente para mantener la viabilidad. En el medio de agar enriquecido con suero, el crecimiento puede aparecer en 2 a 3 días o reque­ rir una semana o más. Las colonias son pequeñas (1-2 mm de diámetro), convexas, blanco grisáceas, lisas y de consistencia de mantequilla. Se forman variantes microscópicas en fase L en forma espontánea debajo de las colonias o alrededor de ellas; la morfología típica en “huevo frito” con un centro denso simi­ lar a la morfología de especies de Mycoplasma se puede obser­ var con un microscopio de disección. La identificación de S. moniliformis se logra observando la morfología filamentosa gramnegativa típica en la tinción de Gram y realizando pruebas de identificación bioquímica en medio con suplemento de suero.366’1399 Se pueden realizar pruebas de utilización de hidra­ tos de carbono en caldo con nutrientes que contiene hidratos de carbono esterilizados por filtro al 1% y suero de caballo estéril al 0,5%. Estas pruebas deben ser incubadas durante 3 semanas antes de la lectura, aunque se han obtenido resultados confia­ bles y reproducibles cuando los cultivos sólo fueron incubados durante una semana antes de la interpretación de las pruebas. También se puede lograr una rápida identificación del microor­ ganismo mediante los análisis de los perfiles de ácidos grasos utilizando cromatografía gas-líquido, por la detección de las actividades enzimáticas de distintas aminopeptidasas y glucosidasas utilizando la banda API-ZYM (BioMerieux, Inc.) y por los patrones proteicos obtenidos por PAGE.286’366-1104 Los ésteres metílicos de ácidos grasos detectados mediante cromato­ grafía gas-líquido incluyen ácido hexadecanoico (C16.0), ácido linoleico (Cl8:2) y ácidos octadecanoicos (C18.[ C 18.0).366’59U1W Las técnicas PAGE también pueden ser útiles para la tipifica­ ción de las cepas clínicas.286 Las reacciones de S. moniliformis a distintas pruebas de identificación bioquímica se muestran en

Especies de B rucella

el cuadro 9-11. Se ha desarrollado una amplificación de amplio :_ngo basada sobre PCR de una parte del gen de rRNA de 16S seguida por la secuenciación de amplicones para la detección de 5. moniliformis en colonias de roedores, bandadas de pavos ;• ^eres humanos.113-153 Este método se utilizó para diagnosticar fiebre por mordedura de rata en un varón de 11 años sintomá­ tico en el cual se desarrolló fiebre, vómitos, erupción y artritis después de haber sido mordido por su rata mascota. Los culti­ vos de sangre, LCR y orina fueron negativos, pero el líquido rroveniente de una ampolla cutánea fue positivo por el ensayo de amplificación/secuenciación.113

Cuadro 8-11

Características bioquímicas de Streptobacillu s m oniliform is

CARACTERÍSTICA

REACCIÓN

O xidasa

_

Catalasa

-

R educción de nitrato

-

Indol

-

Ureasa

-

H idrólisis de esculina

Sensibilidad a los antibióticos

Fosfatasa alcalina

+ + +

Producción de gas a partir de glucosa

-

Los datos de sensibilidad a los antibióticos in vitro indican que S. moniliformis es sensible a penicilina, ampicilina, penici­ linas de amplio espectro y resistente a penicilinasa (azlocilina, mezlocilina, piperacilina, oxacilina), cefalosporinas (cefazoli­ na. cefixima, cefotaxima, cefoxitina, cefpirona, ceftazidima), entromicina, clindamicina, tetraciclina, rifampicina, imipenem > vancomicina.366-1399 El microorganismo tiene una sensibilidad intermedia a aminoglucósidos, cloranfenicol y ciprofloxacina, y en general es resistente a nalidixato, norfloxacina, colistina y tnmetoprim-sulfametoxazol. El fármaco de elección para el tratamiento es la penicilina G procaína, aunque la cefalotina, la tetraciclina y otras cefalosporinas también han obtenido efica­ cia clínica.

A cid o producido a partir de:

Producción de H 2S (acetato de plom o)

Especies de Brucella Epidemiología de la brucelosis

La brucelosis (infección por especies de Brucella) tiene una distribución mundial y ha sido conocida históricamente como fiebre ondulante, enfermedad de Bang, fiebre de Gibraltar, fie­ bre mediterránea y fiebre de Malta. El microorganismo fue ais­ lado por primera vez en 1887 por sir David Bruce, que obtuvo un germen sospechoso en cultivos esplénicos de soldados bri­ tánicos que murieron por fiebre de Malta.1042 Más tarde se bservó que la leche, el queso y otros alimentos elaborados con leche de cabra eran la fuente de la infección de estos soldados. Se aislaron microorganismos similares en el ganado vacuno y porcino y en seres humanos expuestos a estos animales y sus productos. La brucelosis pasó a ser una zoonosis de gran importancia económica y una preocupación para la industria panadera en muchas partes del mundo. En los países desarro­ pados, algunas infecciones humanas se asocian con ocupacio­ nes relacionadas con el procesamiento de carnes y productos lácteos.1421 En los Estados Unidos, la mayoría de los casos comunicados en los últimos años han provenido de California, 1: va. Virginia y Texas, en relación con las actividades centra­ les de esos estados con respecto a la ganadería, la exportación ;e sus derivados y la industria láctea. La brucelosis se transmite entre los animales a través del -parato digestivo, la piel y las mucosas. Luego de la infección, 1os microorganismos alcanzan los ganglios linfáticos y ocurre la baeteriemia. En algunos animales (p. ej., infección por B. abortus en el ganado vacuno), los microorganismos proliferan en el útero y en la glándula mamaria. Su proliferación en las membranas coriónicas del animal preñado conduce al aborto. Muchos animales se recuperan de la infección espontáneamen­ te. pero siguen eliminando la bacteria durante tiempos varia­ bles en orina, secreciones vaginales y leche.

459

+

G lucosa M altosa

+

Fructosa

+

Sacarosa

V

Lactosa

V

X ilosa

-

M anitol

-

M añosa

+

+: reacción positiva;

reacción negativa; v: reacción variable.

Las especies de Brucella reciben el nombre según las espe­ cies de huéspedes primarios y se subdividen a su vez en biova­ riedades sobre la base de la aglutinación serológica con los antígenos M y A asociados con el “lipopolisacárido liso (SLPS)” (véase más adelante). B. melitensis se encuentra funda­ mentalmente en cabras y ovejas, pero también puede hallarse en el ganado vacuno por el contacto indirecto con rebaños de ovejas y cabras infectadas que han contaminado los pastos de donde se obtienen forrajes para las vacas que amamantan.1172 B. melitensis se divide en tres biovariedades (1-3). B. abortus es patógeno para el ganado vacuno; también puede infectar ove­ jas, cabras, cánidos, caballos y seres humanos. La especie está formada por siete biovariedades (1 -6 y 9 [las biovariedades 7 y 8 ya no son más válidas]). B. suis contiene cinco biovariedades; las biovariedades 1, 2 y 3 se encuentran en cerdos, mientras que la biovariedad 4 se encuentra en renos y caribú en las regiones árticas de América del Norte y Rusia, y la biovariedad 5 causa infecciones en los roedores. B. suis biovariedad 1 también se ha establecido en rebaños de ganado vacuno en Brasil y Columbia.1172 Las cepas de B. canis comprenden una única bio­ variedad y se presentan en perros (sobre todo beagles) en los Estados Unidos, México, Argentina, España, China. Japón y Túnez. B. ovis y B. neotomae contienen una única biovariedad y se encuentran en cameros y ratas del bosque, respectivamen­ te. Se ha demostrado variación antigénica entre las biovarieda­ des existentes para cada una de las especies de Brucella , lo que establece que las clasificaciones de las biovariedades requieren más estudio y expansión. B. melitensis, B. abortus y B. suis se asocian con enfermedad humana; B. melitensis se considera la especie más virulenta, seguida de B. suis y B. abortus. B. canis pocas veces provoca infecciones en seres humanos, y las infec­ ciones comunicadas a menudo se han asociado con el labora­ torio. Las complicaciones proteiformes asociadas con las in­ fecciones por Brucella por lo general no se observan en las infecciones humanas por B. canis.

460

C A P ÍT U L O 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

En 1994, se aisló una especie de Brucella que no había sido reconocida antes en mamíferos marinos y un delfín en Escocia y California, respectivamente.170-261-422 Con posterioridad, se aislaron otras cepas en focas, marsopas y nutrias,626 que corres­ pondían al menos a dos biovariedades primariamente halladas en focas y cetáceos, denominadas tentativamente “Brucella maris”.626 También se caracterizaron cepas obtenidas de fetos abortados de delfines nariz de botella y se propuso el nombre “Brucella delphini” para ellos.868 Algunos controles serológicos de especies de focas, marsopas, delfines y ballenas han mostrado que los anticuerpos contra las especies de Brucella se distribuyen ampliamente entre los mamíferos marinos.639'1291 El análisis molecular mostró que las cepas aisladas en ballenas, focas, marsopas y delfines son especies de Brucella pero difie­ ren entre ellas y de otras especies de Brucella en muchos aspectos, como la estructura del LPS y los OMP.100’170’635 El elemento de inserción IS777, que se encuentra en todas las especies de Brucella , también se halla en los aislamientos ma­ rinos, pero el elemento está en una localización cromosómica diferente.262 Mientras las especies de Brucella reconocidas con­ tienen dos genes omp2 comprendidos por una copa cada uno de omp2a y omp2b o dos genes omp2a , las brúcelas marinas trans­ portan dos copias de genes omp2b. La secuenciación de estos genes también puso en evidencia una heterogeneidad impor­ tante entre los aislamientos marinos, lo que indica que estos microorganismos comprenden más de una única especie ("B. maris”), como se había propuesto.261 263 Sobre la base de la pre­ ferencia del huésped y del polimorfismo en el locus omp2, Cloeckaert y cois, propusieron dos especies nuevas, “B. pinnipediae ” y ‘ B. cetaceae”, para incluir las cepas aisladas en focas y delfines, respectivamente.263 Ciertas pruebas también sugie­ ren que estas especies nuevas pueden tener un potencial pato­ génico ampliado. Rhyan y cois, inocularon a seis vacas con una cepa de Brucella de una foca que la albergaba y observaron que todos los animales sufrían una seroconversión en las pruebas utilizadas para la detección de anticuerpos contra B. abortus. Dos de las vacas tuvieron abortos y en los fetos mortinatos se aislaron las brúcelas, lo que indicó que estas cepas eran pató­ genas también para los mamíferos terrestres.1068 Se necesitan otras investigaciones para delinear las relaciones filogenéticas entre estas especies nuevas y determinar sus relaciones con las especies del género actualmente reconocidas.423 En los Estados Unidos, la incidencia de brucelosis humana ha disminuido constantemente como resultado de las medidas de control implementadas en la industria ganadera. Estas medi­ das incluyen la vacunación de los animales jóvenes y el sacri­ ficio de los animales enfermos o de los animales más viejos con pruebas serológicas de infección.1421 En el momento en que comenzó el Programa de erradicación de brucelosis cooperati­ vo del Estado Federal y de la pasteurización de rutina de los productos lácteos en 1945, se comunicaban más de 5 000 casos humanos a los CDC por año. En 1981, la incidencia doméstica anual de brucelosis humana había caído hasta 185 casos y desde ese momento, se habían informado menos de 200 casos por año. Sin embargo, es probable que la brucelosis humana sea subdiagnosticada y subcomunicada, y se estima que por lo menos 25 casos no son reconocidos por cada caso que sí lo es.1042 En las últimas dos décadas, se han diagnosticado muchas infec­ ciones por brúcela de adquisición doméstica entre individuos que viven en Texas y California que han ingerido queso mexi­ cano preparado con leche de cabra no pasteurizada.245-1267 Con la disponibilidad y la popularidad crecientes de los viajes inter­ nacionales, muchos casos de brucelosis diagnosticados en resi­ dentes de los Estados Unidos ocurren en personas que han visi­

tado países donde el microorganismo es endémico en los reba­ ños ovinos y bovinos y en los cuales los productos lácteos (sue­ ro, manteca, yogures, cremas) no son pasteurizados. La infec­ ción refleja en parte la participación en aspectos de una cultura extraña que son tan atractivos para los viajeros (“vivir como lo hacen los nativos”).1042 Los seres humanos también pueden infectarse por el contacto con animales infectados, productos de la concepción (sobre todo veterinarios, trabajadores del zoo­ lógico) o líquidos corporales de animales. La transmisión inter­ humana es rara. Las infecciones por Brucella han sido trans­ mitidas a través de transfusiones de sangre y trasplantes de médula ósea de donantes infectados.17383 La infección neonatal puede ser adquirida por vía transplacentaria, durante el parto o a través de la ingestión de leche materna contaminada.984 La brucelosis se distribuye en todas las áreas del hemisferio oriental y del occidental. Las infecciones de animales indíge­ nas y seres humanos ocurren en la región del Mediterráneo, el golfo arábigo, el subcontinente de la India, América Latina, Asia y partes de México. B. abortus se encuentra en todo el mundo y B. suis es endémico en el sur de los Estados Unidos, sudeste de Asia y América Latina. Se han diagnosticado infec­ ciones por B. canis en América Latina, Europa central y Japón. Se ha identificado brucelosis bovina y porcina causada por B. melitensis y B. suis, respectivamente, en todos los países de América Central, y la infección caprina y ovina por B. meliten­ sis está restringida a Guatemala.892 El norte de Europa, Dinamarca y Noruega no tienen infecciones animales debido a los programas exitosos de control y erradicación, pero los paí­ ses del sur de Europa siguen teniendo B. melitensis en las poblaciones ovina y caprina y, en consecuencia, comunican una alta cantidad de infecciones humanas.382-472 Estos países también han observado el resurgimiento de la infección por B. suis biovariedad 2 en cerdos debido a la extensión de la pobla­ ción de cerdos salvajes.472 La brucelosis en animales y seres humanos sigue siendo un problema en la región de los Balcanes del centro y sudeste de Europa. La infección por B. melitensis ocurre ampliamente entre ovejas, cabras y seres humanos y B. abortus se encuentra en rebaños de ganado vacu­ no en Grecia y Macedonia.1252 La infección por B. melitensis en rebaños de ovejas y cabras y la infección por B. suis biovarie­ dad 2 en cerdos se encuentran en Yugoslavia y Croacia, res­ pectivamente.1252 Rumania ha erradicado con éxito la infección por B. abortus en el ganado y la incidencia de infecciones en ovejas y cerdos se mantiene baja.336 Los países con incidencia más alta tanto de brucelosis ani­ mal como humana son Arabia Saudita, Irán, Siria, la Autoridad Palestina, Jordania y Omán. En la región del Cercano Oriente, la enfermedad ocurre en todos los animales domésticos, inclui­ dos ganado vacuno, ovejas, cabras, camellos, caballos, cerdos y búfalos. B. melitensis biovariedad 3 (Egipto, Israel, Túnez, Turquía, Jordania), B. melitensis biovariedad 2 (Arabia Saudita, Turquía) y B. melitensis biovariedad 1 (Libia, Omán, Israel) representan la mayor parte de la enfermedad, pero las infecciones por B. abortus biovariedades 1, 2, 3 y 6 han sido comunicadas en Egipto, Irán, Turquía y Sudán, respectivamen­ te.1055 Las biovariedades de B. abortus han surgido como la especie predominante en Yemen. En general, las infecciones humanas adquiridas en estas regiones se deben a B. melitensis, sobre todo biovariedad 3.1055 Las especies de Brucella también plantean un peligro ocupacional para los trabajadores del laboratorio debido a acci­ dentes, derrames o manipulaciones inapropiadas de muestras o cultivos que contienen Brucella.502 En 2000, Yagupsky y otros autores describieron siete casos adquiridos en el laboratorio de

Especies de B rucella

infección por B. melitensis en un centro médico del sur de Israel.1411 Este brote fue causado por tres biovariedades dife­ rentes de B. melitensis, lo que indicó múltiples exposiciones y las infecciones ocurrieron en un período de 3 meses cuando el 10% de 530 hemocultivos positivos dieron especies de Bru­ cella. Con la investigación, no se descubrieron fuentes ni vio­ laciones de la seguridad del laboratorio. También se diagnosti­ có brucelosis en siete empleados de un hospital (seis técnicos de laboratorio y un patólogo) en un período de 9 años en un hospital de Riyadh, Arabia Saudita.855 Las infecciones fueron diagnosticadas mediante pruebas serológicas, junto con signos y síntomas clínicos compatibles. La morbilidad resultante incluyó una recaída en dos pacientes y complicaciones (flebitis séptica, prótesis infectadas, epididimoorquitis y espondilitis lumbar) en otros cuatro. Las infecciones en los técnicos fueron rastreadas hasta la manipulación de cultivos de Brucella. En una comunicación de Italia, 12 trabajadores de laboratorio se infectaron después de la rotura accidental de un tubo de la cen­ trífuga.412 Estos individuos fueron tratados y controlados con pruebas serológicas. Aun cuando los laboratorios involucrados en estos experimentos utilizaran gabinetes de seguridad bioló­ gica clase II para las manipulaciones de muestras y cultivos, el riesgo para las infecciones adquiridas en el laboratorio es importante, sobre todo en los localizados en regiones endémi­ cas. La adherencia estricta a los protocolos de seguridad y los procedimientos en todos los laboratorios y la vigilancia y el cuidado cuando se manipulan muestras o cultivos es un reque­ rimiento absoluto para la prevención de las infecciones adqui­ ridas en el laboratorio de cualquier tipo. Luego de un brote en el hospital Riyadh, la respuesta del laboratorio fue la adquisi­ ción de una instalación de Bioseguridad nivel 3.855 Taxonomía de las especies de Brucella

Durante muchos años, la posición taxonómica de las espe­ cies de Brucella fue incierta. En 1985, Verger y cois, utilizaron las técnicas de hibridación de DNA-DNA para investigar 51 cepas de Brucella que representan todas las especies y obser­ varon que todas tenían una homología superior a 96 ± 4% entre sí.1325 Estos científicos propusieron que todas las brúcelas per­ tenecían a una sola especie (Brucella melitensis) y que las especies reconocidas deben considerarse biovariedades de B. melitensis (B. melitensis biovariedades Melitensis, Abortus, Suis y Canis). El análisis electroforético enzimático multilocus de cepas de Brucella también apoyó esta propuesta de género monoespecífica.448 Esta propuesta no ha sido aceptada debido a diferencias bioquímicas y serológicas entre las especies, los rangos divergentes de huéspedes mostrados por estas especies, las diferencias reconocidas en la virulencia y la presencia de OMP específicos de especies y genes que sustancian el estado de las especies existentes.893 Algunos estudios de genética molecular (mapeo de endonucleasas de restricción) pusieron luego en evidencia polimorfismos genéticos que podían dife­ renciar B. abortus, B. melitensis, B. suis y B. canis junto con líneas convencionales de especies, aunque estos métodos no podían delinear las biovariedades dentro de las especies.18 Uno de los genes polimorfos que ayudan a la diferenciación es el gen de porina omp2, que codifica un OMP de 36 kDa respon­ sable de determinar la sensibilidad a los colorantes utilizados para la identificación de especies convencionales.407 Algunos estudios sobre las relaciones genéticas de las brú­ celas revelaron otras características singulares del género. A diferencia de otras bacterias, algunas especies de Brucella tie­ nen dos cromosomas salvo B. suis biovariedad 3, que tiene un

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único cromosoma.656 Recientemente se secuenció el genona de B. melitensis cepa 16M y está compuesto por 3 294 935 pares de bases distribuidas en dos cromosomas circulares de 2 117 144 pares de bases y 1 177 787 pares de bases, respecti­ vamente.315316 Cada cromosoma codifica funciones que son esenciales para la replicación y la supervivencia del microor­ ganismo; de ahí su clasificación como cromosomas y no como plásmidos. No se describieron plásmidos endógenos, transfor­ mación ni conjugación en especies de Brucella. La hibridación de DNA-RNA y los estudios de secuenciación de rRNA 16S han determinado que algunas especies de Brucella están rela­ cionadas con Agrobacterium, especies de Rhizobium y Mesorhizobium endosimbióticas y especies de Bartonella. y están filogenéticamente más próximas a las especies de Ochrobactrum y Phyllobacterium, que los patógenos quimioautotróficos de vida libre de las plantas tropicales.589-992 Las especies de Brucella están más estrechamente relacionadas con O. anthro­ pi grupo de hibridación 2, para el cual se ha propuesto el nom­ bre de la nueva especie O. intermedium.1320 La relación genéti­ ca de estos microorganismos es tan próxima que O. anthropi es reactivo en un ensayo basado sobre PCR que es “específico" para especies de Brucella.191 En la actualidad, las especies de Brucella son clasificadas en el subgrupo a 2 de las Proteobacteria en la familia Brucellaceae en el orden propuesto “Rhizobiales”.455-894 Virulencia de las especies de Brucella

Las especies de Brucella sufren variación antigénica o “diso­ ciación” en subcultivo. Las colonias pasan de una morfología “lisa” a una “rugosa” que conduce a la pérdida de virulencia y a una menor reactividad con los anticuerpos específicos de Brucella. A nivel molecular, la variación antigénica es el resul­ tado de la menor expresión de los genes que codifican la glucosilación adicional de las porciones polisacáridas del lipopo­ lisacárido (LPS) de la pared celular.730 Los microorganismos que se encuentran en la fase lisa tienen un LPS de tipo liso (SLPS) y son resistentes a la destrucción intracelular por los leu­ cocitos polimorfonucleares (PMN), presumiblemente al inhibir la desgranulación de los lisosomas y el estallido respiratorio asociado con la activación de los PMN.191072 Fuera de la varia­ ción antigénica de los LPS y su relación con la virulencia, las especies de Brucella no producen exotoxinas y se sabe muy poco más en relación con otros mecanismos de virulencia en esas especies. El LPS de B. melitensis, B. abortus y B. suis contiene dos determinantes antigénicos importantes denominados A (por “Abortus”) y M (por "Melitensis”).189 Además de proporcionar marcadores para las determinaciones de las biovariedades, estas moléculas cumplen un papel en la virulencia del micro­ organismo, ya que los anticuerpos monoclonales dirigidos con­ tra el S-LPS son protectores en modelos de animales expuestos y las cepas lisas que han perdido el S-LPS por mutagénesis de transposones tienen una patogenicidad atenuada en los rato­ nes.888 Las cadenas O (antígeno somático) del S-LPS de cepas lisas de B. melitensis y B. abortus están compuestas por polí­ meros de 4,6-didesoxi-4-formamido-D-manosa (/V-formil-Dperosamina). En S-LPS de B. abortus, la cadena O contiene aproximadamente 100 residuos, casi todos los cuales tienen uniones a, 2 y un pequeño porcentaje tiene uniones a , 3 (deter­ minantes A). En las cadenas O de B. melitensis, las uniones a , 2 y a , 3 ocurren en una relación 4:1 (determinantes M). El antí­ geno A serodominante suele tener forma de bacilo, la cual está determinada por los cinco residuos consecutivos con uniones

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Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

a 12, mientras que el antígeno M serodominante tiene forma “retorcida" porque el cuarto residuo está unido al quinto por una unión a , 3. La expresión común de Aí-formil-D-perosamina no terminal con unión a , 2 es responsable de la reactividad cru­ zada observada entre S-LPS de las cepas lisas de B. abortus y las cepas lisas de B. melitensis y de la reactividad cruzada que se observa con otras especies (p. ej., Vibrio cholerae 0:1, Yersinia enterocolitica 0:9, Escherichia coli 0:157, Salmonella 0:30 y Stenotrophomonas maltophilia).189 Se utili­ za la aglutinación en portaobjetos o la EIA con anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para los epítopos A o M para determinar la preponderancia de antígeno A o M y las designaciones de las serovariedades de cepas de Brucella .1*9-453 Las cepas de B. abortus, B. melitensis y B. suis pueden ser antí­ geno A positivas, antígeno M positivas o tanto antígeno A como antígeno M positivas. Los determinantes antigénicos A y M no se encuentran en B. canis o B. ovis; estas especies son característicamente rugosas, no muestran variación de fase y tienen un número limitado de huéspedes. Las especies de Brucella son microorganismos intracelulares facultativos, y el espectro de sus enfermedades se explica en parte por su capacidad para evadir los mecanismos de defensa del huésped en virtud de la existencia intracelular. Las brúcelas son transmitidas a los seres humanos por tres vías principales: contacto directo con tejidos animales infectados, ingestión de carne o productos lácteos contaminados e inhalación de micropartículas en suspensión con microorganismos.283 1042 Una vez en el interior del huésped, los microorganismos son fagocitados pero no pueden sobrevivir dentro de las células, presumi­ blemente por la supresión o inactivación mediada por monofosfato de adenina y guanina de los mecanismos de defensa de mieloperoxidasa-peroxidasa intracelulares y por la producción de superóxido dismutasa, que bloquea la formación de radica­ les tóxicos del oxígeno.173-198 Los microorganismos son trans­ portados a través de los ganglios linfáticos y el torrente circu­ latorio y son retenidos en distintas partes del sistema reticuloendotelial: sinusoides hepáticos, bazo y médula ósea.856 En estos sitios, los PMN finalmente se degeneran y liberan los microorganismos intracelulares. Por su parte, los macrófagos y los monocitos incorporan las bacterias por endocitosis. La mul­ tiplicación continúa en el interior de estas células, las cuales finalmente son destruidas y liberan los microorganismos. El patrón “ondulante” de fiebre creciente y decreciente observado en la brucelosis se asocia con la liberación periódica de bacte­ rias y sus componentes desde las células fagocíticas. La libera­ ción de las bacterias en la circulación periférica conduce a la siembra hematógena de otros órganos y tejidos, lo que lleva así a las manifestaciones clínicas proteiformes de la brucelosis humana. Se mantienen controladas las recaídas y recurrencias de las enfermedades en cierta medida por un equilibrio entre la virulencia del microorganismo y la presencia de una respuesta inmunitaria celular funcional intacta. Como sucede con otros patógenos intracelulares, se producen anticuerpos humorales, pero se necesitan los mecanismos de defensa de inmunidad celular del huésped para contener las bacterias intracelulares. Se sabe que las citocinas producidas por los macrófagos acti­ vados, que incluyen factor de necrosis tumoral a (TNF-a), TNF-y, interleucina-1 (IL-1) e IL-2, influyen en la actividad antibrucelosa mediada por macrófagos durante la inducción de las respuestas inmunitarias mediadas por células.284 Carón y cois, han mostrado que las brúcelas sintetizan y liberan un fac­ tor proteico de alto peso molecular que inhibe específicamente la expresión de TNF-a en los macrófagos activados humanos. Es probable que esta inhibición contribuya a la capacidad de

las especies de Brucella para evadir las defensas del huésped humano y mantener una existencia intracelular.203 Cabe desta­ car que se ha observado que los antígenos proteicos ribosómicos intracelulares designados L7/L12 estimulan las respuestas inmunes celulares protectoras junto con una hipersensibilidad retardada.966 En consecuencia, estas proteínas se están investi­ gando por su potencial para utilizarse como antígenos para eventuales vacunas. El espectro clínico de la brucelosis depen­ de de muchos factores, como el estado inmunitario del hués­ ped, la presencia de otras enfermedades o trastornos subyacen­ tes y las especies del microorganismo infectante. La mayor virulencia de B. melitensis y B. suis ha sido apoyada por estu­ dios in vivo con animales infectados experimentalmente y por la investigación in vitro que examinó la fagocitosis, la supervi­ vencia intracelular y las respuestas linfocíticas a las diferentes especies. Las enfermedades causadas por B. abortus y B. canis son insidiosas en su inicio, pero tienden a producir síntomas inespecíficos más leves y complicaciones menos graves. Como estos microorganismos son infectantes a través de aerosoles, como lo demuestran las infecciones adquiridas en el laboratorio, las especies de Brucella constituyen una de varias bacterias que se consideran agentes potenciales para la guerra biológica y los atentados de bioterrorismo. Las brúcelas podrí­ an propagarse eficazmente mediante la dispersión de aerosoles y sobrevivir en el suelo y en el agua durante varias semanas, lo que proporciona así tanto un período inmediato como tardío de infecciosidad. Los Estados Unidos investigaron a B. suis como arma potencial durante las décadas de 1940 y 1950 y es proba­ ble que otras naciones hayan realizado intentos similiares.253 Los informes de presentaciones clínicas atípicas, junto con pruebas serológicas falsas para anticuerpos contra bucelas, han conducido a investigaciones que involucran a los CDC y al FBI en relación con actividades fehacientes de bioterrorismo con especies de Brucella.211 No existe ninguna vacunación contra brúcelas, ya que la vacuna contra B. abortus está autorizada sólo para uso veterinario. El tratamiento preventivo con doxici­ clina y rifampicina después de la exposición ha sido eficaz para evitar la enfermedad en los individuos en riesgo.434 Espectro clínico de la brucelosis

Puede ser difícil diagnosticar infecciones por brúcelas debi­ do al amplio espectro de manifestaciones clínicas asociadas con ellas.10421421 Luego de un período de incubación de unas 2 a 3 semanas (rango, 1 semana a 2-3 meses), el inicio de los sín­ tomas puede ser brusco o desarrollarse en un período de varios días a más de una semana. La fiebre, el sudor nocturno, los escalofríos y el malestar general, a menudo asociados con cefa­ lea intensa, mialgias y artralgias, son síntomas inespecíficos observados en la mayoría de los casos de brucelosis. La mayo­ ría de los individuos con la forma bacteriémica presentan enfermedad febril sola o con fiebre y artritis.856 También se pueden presentar linfadenopatía, esplenomegalia y hepatomegalia.10'923 Se pueden observar manifestaciones cutáneas y com­ plicaciones vasculares (p. ej., lesiones similares al eritema nudoso, erupciones maculopapulosas o papulonodulosas; trombosis venosa profunda) en algunos pacientes, y las lesio­ nes mucocutáneas ulcerativas y los abscesos subcutáneos son más infrecuentes.54'267'854'867'958 “Fiebre ondulante” es sinónimo de brucelosis (sobre todo la causada por B. melitensis) debido a las fiebres periódicas que pueden ocurrir en semanas, meses o incluso años.1421 La fiebre suele aparecer al atardecer y por la noche, y durante el día la temperatura es normal, en un perío­ do de 2 a 3 semanas. Después, puede haber varios días en que

Especies de B rucella

el paciente está afebril y se siente relativamente bien, sólo para experimentar otro ciclo de fiebre creciente y decreciente. Estos síntomas pueden ir y venir durante períodos prolongados debic a la retención de los microorganismos en granulomas en el tejido y su liberación ulterior (o de componentes de los micror.anismos, como el LPS) nuevamente en la circulación. Por lo tanto, la afección se presenta en forma inespecífica y adopta las características de una enfermedad crónica y debilitante. En general. la cronicidad se debe a los focos persistentes de infec­ ción. como lesiones supuradas en las articulaciones, los huesos, ei hígado o el bazo. A menudo en estos pacientes se toman pancultivos con el fin de determinar la etiología de la “fiebre de -gen desconocido”. La brucelosis aguda y la crónica pueden c nducir a complicaciones que afectan varios sistemas orgáni­ cos, como el sistema esquelético, el sistema nervioso central, el aparato respiratorio, el tracto hepatobiliar y el tubo digestivo, los aparatos cardiovasculares y genitourinario.274 En los hués­ pedes inmunodeprimidos que reciben inmunoterapia, la neutropenia febril prolongada que no responde a la cobertura antiriótica de amplio espectro es sugestiva de una infección por brúcela, sobre todo en las regiones donde la infección es endé­ mica.1135 En el recuadro 9-10 se ofrecen otros detalles sobre las presentaciones clínicas y la complicación de la brucelosis. También se pueden presentar distintos tipos de discrasias hematológicas debido a la permanencia del microorganismo en el sistema reticuloendotelial, que incluyen ganglios linfáticos, médula ósea y bazo. Éstas pueden ser la formación de granulo­ mas y abscesos directamente en estos tejidos o manifestaciones hematológicas periféricas.73-923 Se pueden observar pequeños granulomas no caseificados mal definidos en la médula ósea en alrededor del 70% de los casos, junto con histiocitos con una reactividad inespecífica.9 También se observó leucopenia, pancitopenia, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia grave en pacientes con brucelosis 9-334-1162-1422 En oca­ siones, predominan anomalías hematológicas en la infección incipiente, lo que enmascara la etiología infecciosa de la enfer­ medad e imita las enfermedades hematológicas primarias.334 Estas anomalías son transitorias y se normalizan luego del tra­ tamiento antibiótico exitoso para la infección bacteriana. Diagnóstico serológico de la brucelosis

Las pruebas serológicas también son útiles para el diagnós­ tico de brucelosis y la prueba de aglutinación sérica (SAT) es la más utilizada. Esta prueba utiliza un antígeno de B. abortus comercial estandarizado (BD Biosciences), se realiza como una prueba de dilución en tubo y detecta aglutinógenos de las clases IgG e IgM.1420 La incorporación de ditiotreitol o 2-mercaptoetanol en la prueba en tubo inactiva la IgM, y proporcio­ nan así un título de aglutininas específico de IgG. Algunos estudios han mostrado que, con la infección, se producen anti­ cuerpos IgM durante los 7 a 10 primeros días, seguido de una declinación en IgM y un cambio a la producción de IgG des­ pués de la segunda semana. La mayoría de los pacientes con brucelosis activa presentan títulos de aglutinación sérica > 160; estos títulos descienden con el tratamiento adecuado.672 Como sucede con otras muchas pruebas serológicas, se han explotado métodos menos laboriosos y subjetivos, como enzi­ moinmunoanálisis (EIA) para el diagnóstico serológico de infecciones por Brucella. Se describió EIA para la detección de anticuerpos IgM, IgG e IgA contra Brucella que utilizan célu­ las enteras de B. abortus, LPS liso de B. abortus, extractos pro­ teicos de B. abortus y LPS liso de B. melitensis como antígeno de fase sólida.52-977-1420 Ariza y cois, compararon la prueba de

463

aglutinación sérica con los métodos de EIA para la detección de IgG, IgM e IgA específicos de Brucella en 761 sueros obte­ nidos de 75 pacientes con brucelosis.52 El EIA en este estudio incorporó S-LPS de B. abortus como antígeno. Estos investi­ gadores observaron que los métodos de EIA eran tan sensibles y más específicos que las pruebas serológicas estandarizadas para la brucelosis. Los títulos iniciales de IgM fueron más altos en los pacientes que consultaron al médico antes en el curso clínico, mientras que los que habían estado enfermos durante cierto tiempo antes de buscar asistencia médica tendieron a tener títulos elevados de IgG y títulos más bajos de IgM. Con la recepción de un tratamiento antibiótico suficiente, los títulos de IgG en suero disminuyeron cuatro a ocho veces en los 3 a 6 meses posteriores. Se observaron aumentos ulteriores de IgG e IgA en EIA de pacientes con enfermedad recurrente. La per­ sistencia de concentraciones elevadas de IgG o una disminu­ ción más lenta de los títulos luego del tratamiento en los pacientes sin recaídas se asoció con la presencia de infección local.52 También se pueden presentar IgM e IgG antibrucelas durante los períodos bacteriémicos.977 En los programas de control y erradicación de la brucelosis se utiliza también la SAT y otros métodos serológicos, como fijación del comple­ mento y MAT (una adaptación de la SAT en microplacas).101 En 1993, Goldbaum y cois., en la Argentina, caracterizaron una proteína citoplasmática de 18 kDa que estaba presente en todas las especies de Brucella lisas y rugosas examinadas.473 Los sue­ ros de pacientes que tenían infecciones activas por brúcelas reaccionaron con este antígeno en un ensayo basado sobre EIA, mientras que los pacientes que no tenían brucelosis o que tení­ an una enfermedad inactiva fueron negativos con esta prueba. Este EIA también pudo diferenciar el ganado bovino sano vacunado del ganado vacunado infectado por una cepa de tipo silvestre, productora de enfermedad. Este antígeno ha sido purificado mediante cromatografía de afinidad y se ha clonado el gen para el antígeno en E. coli, con retención de la reactivi­ dad de la molécula recombinante con sueros animales y huma­ nos que contienen anticuerpos antibrucelosos.474 Esta molécula ha sido caracterizada como una lumazina sintasa, enzima invo­ lucrada en la biosíntesis de la riboflavina. Al-Shamahy y Wright comunicaron recientemente sobre un EIA para la detección de antígenos para brucelosis.22 La prueba utilizaba anticuerpos monoclonales contra el LPS de brúcelas y se realizó en muestras de suero. Se podrían detec­ tar tan sólo 100 microorganismos o 105 fg/mL de LPS. Este ensayo fue probado con 1 607 sueros de donantes de sangre al azar, 146 pacientes con brucelosis, 20 pacientes con riesgo de infección por Brucella y 264 sueros de pacientes con infecciones distintas de la brucelosis. La sensibilidad del ensayo fue del 100% comparada con los hemocultivos positi­ vos; la especificidad fue del 99,5% entre los donantes de san­ gre al azar y del 99,2% para los pacientes. Estos datos indi­ caron que la detección de antígeno utilizando este ensayo era una alternativa aceptable al hemocultivo para el diagnóstico de la infección. Aislamiento y características de los cultivos

Como las especies de Brucella infectan el sistema reticulo­ endotelial, las muestras de elección en los casos sospechosos incluyen muestras de sangre y médula ósea. En un estudio de 50 pacientes que finalmente tuvieron diagnóstico de brucelosis, los cultivos de sangre y médula ósea fueron positivos en el 70% y el 92% de los casos, respectivamente.490 La alta tasa de culti­ vos de médula ósea positivos es compatible con la retención de

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C A P ÍT U L O 9

R ecuadro 9 -1 0

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

E s p e c tro c lín ic o d e la b ru c e lo s is

Infecciones osteoarticulares La afectación del hueso y la articulación, que incluye artritis, bursitis. sacroileítis. espondilitis y osteom ielitis, es la com plicación más descrita de la brucelo­ sis y se observa más a m enudo luego de la baeteriem ia por B. m eliten sis.n -m 2 m ' La artritis y la sacroileítis se asocian con enferm edad aguda en pacientes pediátricos, mientras que espondilitis, osteom ielitis vertebral, osteítis y absceso paravertebral se observan más a m enudo en infecciones crónicas en indivi­ duos m ayores y en aquellos que tienen enferm edad subyacente (p. ej., infección por el virus de la inm unodeficiencia humana [H IV ]).11-94-446 1201 L os pacien­ tes con espondilitis suelen presentar fiebre, malestar general, dolor dorsal bajo y dificultad en la deam bulación. Los centellogram as óseos, la tom ografía com putarizada y la resonancia m agnética a menudo son útiles para detectar invasión ósea y com plicaciones com o absceso paraespinal.811-1201 La osteom ieli­ tis brucelósica tam bién puede afectar tanto im plantes protésicos articulares com o no articulares.813-927

Infecciones del sistema nervioso central La neurobrucelosis ocurre en m enos del 5% de los casos e inicialm ente se presenta com o encefalitis, m eningitis, m eningoencefalitis, m eningom ielitis o ata­ xia cerebelosa.4-519 L os pacientes en general tienen pleocitosis de LCR. hiperproteinorraquia y glu cosa baja a normal en e l LCR. L os pacientes con m eningi­ tis aguda presentan cefalea, vóm itos, fiebre y rigidez de nuca, y en algunos pacientes se puede desarrollar edem a de papila, síntom as visuales y parálisis de nervios craneales. La trom bosis de lo s vasos sanguíneos puede conducir a infarto y hemorragia cerebrales, encefalitis, m ielitis y neuropatía periférica.4 Los abscesos espinales epidurales, e l em piem a subdural, los abscesos paraespinales, los quistes derm oides intramedulares y los abscesos encefálicos son raros pero se observan en ocasion es.268-1000-1132-1173 La in fecció n del SN C conduce a colon ización de una derivación ventriculoperitoneal y e l desarrollo ulterior de peritonitis por B. m elitensis tam bién se ha docum entado.30 El cultivo de brúcelas del LCR es negativo en m ás del 75% de los casos, aunque los hem oculti­ vos pueden ser positivos.519 La enferm edad brucelósica del SN C tam bién puede diagnosticarse m ediante pruebas serológicas del LCR. En general el trata­ m iento com prende triple antibioticoterapia, que incluye un am in oglucósido y debe ser continuada durante 8 a 12 sem anas.4-519

Infecciones del aparato respiratorio Las infecciones pulmonares por B ru cella pueden ser resultado de disem inación hem atógena y la siem bra de los pulm ones o por inhalación directa de los m icroorganism os en aerosoles.1131 Las m anifestaciones clínicas de la brucelosis pulmonar pueden incluir bronquitis, bronconeum onía. absceso pulmonar, nodulos pulm onares, linfadenopatía hiliar, neum onitis intersticial, em piem a y derrames pleurales.1-679 En general los pacientes presentan cefalea, malestar general, m ialgias y tos no productiva.1131 S ó lo el 40% de los pacientes con tos tienen radiografías de tórax anormales.

Infecciones gastrointestinales y del tracto hepatobiliar La brucelosis gastrointestinal, hepatobiliar o hepatoesplénica ocurre com o m anifestación de la infección sistém ica aguda en m ás del 70% de los pacientes con brucelosis. Los síntom as son dolor abdom inal, náuseas, vóm itos, anorexia, diarrea o estreñim iento. Las in fecciones de larga data pueden conducir a una patología gastrointestinal m ás extensa, que incluye co litis, enterocolitis, peritonitis bacteriana espontánea, pancreatitis, colecistitis, abscesos hepatoesplénic o s e infartos esp lén ico s.273 274 320742-875-95711151121 La afectación hepática puede reflejarse sólo en elevacion es de las enzim as hepáticas, pero habitualm ente es más extensa, sobre todo en las infecciones por B. m eliten sis y B. suis. Las infecciones por estas dos esp ecies se asocian con la form ación de granulom as hepáticos caseificantes y m icroabscesos, mientras que B. a b o rtu s tiende a producir granulom as no caseificantes en el hígado. El manejo de las com p licacio­ nes supuradas de la brucelosis hepatoesplénica crónica requiere el abordaje quirúrgico y c lín ico com binado para obtener una respuesta clínica óptim a.53-1416 En el año 20 0 2 , se describió una peritonitis por B. m elitensis asociada con diálisis peritoneal ambulatoria crónica en un paciente en Turquía.1263 El paciente, que probablem ente se infectó por la ingestión de qu eso no pasteurizado un m es antes, sufrió una recaída luego del tratamiento con doxiciclina y rifam pici­ na; se obtuvo la curación con e l tratamiento antibiótico continuo y la extracción del catéter de Tenckhoff.

Infecciones del aparato genitourinario L as brúcelas pueden afectar el aparato genitourinario, habitualm ente co m o consecuencia de infección sistém ica, en la cual pueden producir epidim itis, prostatitis, orquitis y granulom as renales. Aunque la afectación renal es bastante infrecuente, se ha com unicado glom erulonefritis y pielonefritis. Las brú­ c elas producen aborto en anim ales infectados por la localización en las membranas corioam nióticas de la placenta, pero existen pocas pruebas que apoyen un papel para estos m icroorganism os en el aborto espontáneo en los seres hum anos.976 Sin embargo, rara vez los m icroorganism os pueden ser aislados del líquido am niótico y de tejidos placentarios de seres humanos con brucelosis.1421 M alone y cois, describieron la infección materna por brucelosis que condu­ jo a trabajo de parto prematuro, corioam nionitis, desprendim iento prematuro de placenta y parto de un lactante a la edad gestacional de 25 sem anas.814 Se aisló B. abortus de la sangre materna y del líquido am niótico. La com unicación de un caso en 1998 detalla el primer relato de la transmisión sexual de B. a bortu s.'m

Infecciones cardiovasculares La brucelosis cardiovascular es una com plicación rara, y se presenta en m enos del 2% de los pacientes infectados.219-1115 E s interesante destacar que la endo­ carditis por brúcelas es la causa principal de muerte relacionada con esta enferm edad.521 Puede presentarse endocarditis tanto en válvulas naturales com o protésicas; la afectación de la válvula aórtica es la más frecuente.5-58-1044 Las com plicaciones de la endocarditis por B ru cella son em bolia séptica, aneurismas m icóticos, miocarditis, pericarditis y la necesidad de la intervención quirúrgica para la colocación o el reem plazo de una válvula protésica.5-58-219-521 Se ha com unicado tam bién la infección por B. m elitensis de un m arcapasos y de los electrodos asociad os en un esquilador de ovejas de 45 años que se había som etido a 45 días de tratamiento para la brucelosis.310 En 1999. Ying y cois, describieron un caso de endocarditis por B. canis confirm ada serológicam ente que ocurrió en un hombre de 4 9 años después de que regresó de K uw ait.1419

Infecciones oculares Las infecciones oculares son co m plicaciones tardías y raras de la infección por brúcelas e incluyen neuritis óptica, uveítis, queratitis, endoftalm itis e infec­ ción de las glándulas lagrim ales.16-105-373 La neuritis óptica se asocia con pérdida de visión, fiebre, cefalea temporal y dolor retrobulbar. La endoftalm itis es el resultado de la disem inación hem atógena y se han obtenido cultivos positivos tanto del humor acuoso com o del humor vitreo.

Especies de Brucella

estas bacterias en el sistema reticuloendotelial. En ocasiones, se p _eden enviar otras muestras (p. ej., tejido, biopsias, LCR) rara cultivo de pacientes en los cuales se sospecha una enfer­ medad complicada. Dendo al riesgo documentado de infecciones por especies de Bmcella adquiridas en el laboratorio, todas las investigacio­ nes con muestras de las que se sospecha que las albergan y : :«da' las manipulaciones con cultivos de Brucella deben rea­ lizarse en un gabinete de seguridad biológica con las precau­ ciones recomendadas para microorganismos que requieren ::: >eguridad de nivel 3 (p. ej., micobacterias, Francisella tula' i.>5412'502 12991300 Los procedimientos que pueden generar aerosoles (aspiración de líquidos con jeringas, preparados con molinillos, sopleteado enérgico de pipetas, etc.) deben mante­ nerse en un mínimo. Sin duda, para cumplir con estas pautas, es necesaria una comunicación cuidadosa entre el director del laboratorio, los técnicos y los médicos que asisten a los pacien­ tes con presunta brucelosis. El médico debe advertir al perso­ na del laboratorio clínico cuando considera un diagnóstico de brucelosis para que adopte las precauciones de seguridad nece­ sarias.

Para el aislamiento de especies de Brucella, se inoculan muestras de sangre y médula ósea en frascos para aerobios y anaerobios. Debido al lento crecimiento de los microorganismos. los hemocultivos convencionales deben ser incubados a 3 5 3C durante 4 a 6 semanas realizando subcultivos a ciegas en _gar chocolate y agar sangre (véase lámina en color 9-5D). Los laboratorios que utilizan instrumentos para hemocultivo radiométricos o no radiométricos con monitorización continua sue­ len aislar las especies de Brucella de los hemocultivos después ce 5 a 7 días de incubación.361978 1402 Yagupsky evaluó la capa­ cidad del instrumento no radiométrico BACTEC 9240 para detectar el crecimiento de especies de Brucella y observó que se detectaban 21 (78,8%) de 27 cultivos positivos mediante el instrumento 9240 dentro de los 7 días; el resto se detectó mediante un subcultivo a ciegas después de 2 a 3 semanas de incubación.1409 El BACTEC 9240también detectó 14 de 15 cul­ tivos positivos para Brucella de líquidos sinoviales inoculados en frascos de cultivo Peds Plus; los 14 cultivos positivos fueron detectados en 3 a 7 días.1408 El microorganismo también ha cre­ cido con éxito después de 12 días de incubación utilizando el sistema Septi-Chek, en el cual se fija el frasco de hemocultivos rara aerobios con una “paleta” que contiene medios de agar chocolate y agar sangre y se realizan “subcultivos” inviniendo el frasco de modo que el medio se lava sobre la paleta de agar.492 Los frascos para aerobios estándares BacT/Alert, para aerobios reforzados BacT/Alert FAN y BacT/Alert sostienen el crecimiento rápido de brúcelas según lo demuestran los estu­ dios de hemocultivos simulados.1238 También se ha logrado un rápido crecimiento de especies de Brucella en los hemocultivos con el método de lisis-centrifugación Isolator.1410 Identificación de especies de Brucella

Se puede realizar el diagnóstico presuntivo de una posible especie de Brucella cuando se aísla un cocobacilo diminuto, que se tiñe poco y que crece lentamente en hemocultivos o cul­ tivos de médula ósea de un paciente “compatible”, es decir, aquel que tiene antecedentes de una posible exposición ocupacional. un viaje a un lugar “exótico” o ingestión de carnes poco cocidas o de productos lácteos no pasteurizados. Las especies de Brucella crecen lentamente en agar sangre y agar chocolate, pero no en los medios de agar de MacConkey, EMB u otros medios "entéricos”. También se obtiene buen crecimiento en

465

agar carbón-extracto de levadura con buffer utilizado para el aislamiento de especies de LegionelIa.mi Todas las especies de Brucella son aerobias y necesitan oxí­ geno para el crecimiento a partir de muestras clínicas. Aunque se puede demostrar la producción de ácidos por la degradación de hidratos de carbono en ciertas condiciones, su metabolismo en gran parte es oxidativo. Las cepas de Brucella son tanto oxi­ dasa como catalasa positivas; la mayoría de las brúcelas redu­ cen el nitrato a nitrito y algunas pueden reducir también el nitrito a gas. Todas las especies son indol negativas y VP nega­ tivas. La identificación de las especies de Brucella por métodos convencionales incluye el requerimiento de CO, para el creci­ miento. la producción de ureasa y H,S (utilizando tiritas de acetato de plomo) y la sensibilidad a los colorantes básicos fuc­ sina, tionina y azul de tionina (cuadro 9-12). La sensibilidad a los colorantes no sólo se utiliza para ayudar a la identificación de las especies, sino en el caso de B. abortus y B. suis, también es útil para determinar la biovariedad del microorganismo. B. abortus y B. suis son subdivididos en biovariedades sobre la base de diferencias bioquímicas y serológicas, mientras que las biovariedades (en realidad serovariedades) de B. melitensis están definidas sólo sobre la base de diferencias serológicas, dado que clásicamente son resistentes a fucsina básica, tionina y azul de tionina. El reconocimiento de cepas de B. melitensis confirmadas serológicamente que son sensibles a la tionina sugiere que el esquema de identificación convencional debe ser modificado y que se necesitan nuevos métodos de identifica­ ción menos problemáticos.282 B. melitensis, B. suis y B. abor­ tus producen ureasa; con un inoculo importante, las cepas de B. suis habitualmente son ureasa positivas en el medio de urea de Christensen dentro de los 5 minutos. La identificación de espe­ cies de Brucella también se ha logrado mediante coaglutina­ ción y manchado con puntos de las colonias utilizando un anti­ cuerpo monoclonal específico de género que detecta los antí­ genos A o M de B. melitensis, B. abortus y B. suis ,1334 En la actualidad, las especies de Brucella no están incluidas en las bases de datos de ninguno de los sistemas comerciales disponibles para la identificación de microorganismos gramne­ gativos y el uso inadvertido de estos sistemas puede retrasar el diagnóstico y el tratamiento. Los microorganismos Brucella han sido diagnosticados erróneamente como Moraxella phenylpyrivuca mediante el sistema de identificación no enté­ rico API 20NE, como especies de Moraxella por el sistema MicroScan Negative COMBO tipo 5 (Dade-MicroScan. West Sacramento, CA) y como Haemophilus influenzae tipo IV por el panel de identificación para Haemophilus-Neisseria (HNID) (Dade-MicroScan)91" En uno de los casos, el técnico que ino­ culó una tirita de API 20NE con una cepa de B. Melitensis se enfermó, posteriormente, de brucelosis.99 Algunos estudios preliminares de la identificación de especies de Brucella con el sistema de identificación mediante sustratos de carbono indica­ ron que todas las especies de Brucella oxidaban 3 de los 95 sustratos del panel y que B. melitensis, B. abortus y B. suis podían ser diferenciadas entre sí por la oxidación diferencial de otros siete sustratos.1391 Utilizando los resultados de siete prue­ bas sobre el Biotipo 100 (bioMerieux, Marcy-l’Etoile, Francia), una galería de identificación de sustratos de carbono inoculada en forma manual, Lopez-Merino y cois, pudieron identificar el 85,6% de 92 cepas de Brucella: la especificidad varió del 97,4% al 100%, según la especie.799 Estos investiga­ dores señalaron que el Biotipo 100 debe ser inoculado en un gabinete de seguridad biológica. En 1994, Bricker y Halling, del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, crearon una prueba de PCR

466

CAPÍTULO

Características bioquímicas para la identificación de especies de B ru cella CRECIMIENTO FUCSINA BÁSICA

TIONINA

AGLUTINACIÓN SEROLÓGICA* A

M

R

HUÉSPED COMÚN

ESPECIES

BIOTIPO

K|-.yiKKlVlltI\ 1US DE C 0 2

H,S

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TIONINA AZUL 2 ng/mL

B. m e lite n sis

1

-

-

Variable

+

+

+

+

-

+

-

Ovejas

2

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-

Variable

+

+

+

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+

-

-

Ovejas

3

-

-

Variable

+

+

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-

O vejas

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+

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+

-

-

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+

-

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Ganado vacuno

B. a b o rtu s

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2

+/V

+

1-2 h

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-

-

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+

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Ganado vacuno

3

+/v

+

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Ganado vacuno

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Ganado vacuno

+ /v

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6

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7

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Cerdos

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3

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Cerdos

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R enos

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ND

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R oedores Perros

4 5

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B. c a n is

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B. ovis

+

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+

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+

Ovejas

B. n eo to m a e

-

+

0 -3 0 m in

-

-

-

+

+

-

-

Rata de bosque

+: positivo; negativo; +/v: variable, pero la mayoría de las cepas son positivas; -/v: variable, pero la mayoría de las cepas son negativas; ND: no disponible. *A: antisuero específico para B. abortus; M: antisuero monoespecífico para B. melitensis; R: suero antibrucelas rugosas.

9 Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

Cuadro 9 -1 2

Francisella tularensis 4 6 7

que pudo identificar y diferenciar varias especies y biovarieda­ des de Brucella, incluida B. abortus biovariedades 1, 2 y 4, las tres biovariedades de B. melitensis, B. suis biovariedad 1 y todas las biovariedades de B. ovis.111 Este ensayo explotó la existencia de una secuencia de inserción IS777 (también deno­ minado IS6501 ) que es única de las especies de Brucella y se encuentra en las regiones específicas de especie y específicas de biovariedad del cromosoma. Las especies y las biovarieda­ des identificadas mediante este ensayo constituyen la mayoría de las observadas en los Estados Unidos, tanto en infecciones animales como humanas. Estos investigadores aumentaron más tarde su ensayo de PCR con otros cebadores para permitir la rá­ pida discriminación entre cepas patogénicas y las cepas de la vacuna para B. abortus (S19 y RB51) en ganado bovino ya va­ cunado.172390 El ensayo se denomina AMOS PCR porque detecta Brucella “Abortus, Melitensis, Ovis y Suis”, respecti­ vamente. También se han creado sondas genéticas específicas de proteínas citoplasmáticas para la diferenciación de ciertas biovariedades de B. melitensis, B. suis y B. abortus. Estos enfo­ ques moleculares son útiles para la identificación de especies y biovariedades en los laboratorios diagnósticos y para objetivos epidemiológicos, veterinarios y taxonómicos.26'1324 Además del AMOS PCR, se han desarrollado otros ensayos basados sobre PCR que utilizan la misma diana u otras dianas de amplificación para la identificación y la detección directa de especies de Brucella en muestras clínicas. Hermán y DeRidder describieron una prueba de hibridación en manchas (dot blot ) para la identificación de especies de Brucella utilizando ceba­ dores sintéticos y sondas para una secuencia de DNA específi­ ca de género e invariable.563 Fox y cois, analizaron los poli­ morfismos de amplicones luego de la amplificación con PCR de la región espaciadora de DNA ribosómico 16S-23S y obser­ varon que, aunque los productos eran singulares del género Brucella, los perfiles de interespacios de las cuatro especies principales eran idénticos.431 Casanas y otros autores desarro­ llaron en España un ensayo de PCR que utilizó cebadores espe­ cíficos para una región de 223 pares de bases de la secuencia de DNA que codifica una proteína de B. abortus inmunogénica de 31 kD.206 Este ensayo fue evaluado con sueros de 31 pacientes con brucelosis y 45 controles sanos; se detectó DNA de brúcelas en 30 de 31 pacientes y tuvo una especificidad del 100%.1432 También se han desarrollado ensayos de PCR que utlizaron el rRNA 16S de B. abortus y el gen para una proteí­ na de membrana externa de B. abortus (omp-2) como dianas de amplificación.926 Se describieron ensayos de PCR en tiempo real que utilizan cebadores derivados del sitio de inserción IS777 específico de género y secuencias características especí­ ficas de especie y de biovariedad.1054 Estos ensayos de 30 minu­ tos que utilizan el método de LightCycler fueron evaluados con cepas conocidas y microorganismos aislados en campo e iden­ tificaron a todas las biovariedades de B. abortus, B. melitensis y B. suis biovariedad 1. Tratamiento de la brucelosis

El tratamiento de la brucelosis humana es un área controversial debido al espectro de enfermedad, la posibilidad o probabilidad de una infección crónica y el desarrollo de com­ plicaciones.1042 A pesar de la sensibilidad in vitro a muchos antibióticos, estos resultados no se traducen en eficacia clínica m en resultados en los pacientes. El tratamiento exitoso requie­ re una antibioticoterapia prolongada, casi siempre con una combinación de agentes y, en algunos casos, la intervención quirúrgica también está indicada. La administración de agentes

que penetran y tienen actividad en las células fagocíticas es un prerrequisito para el tratamiento, dado que las brúcelas son patógenos intracelulares facultativos. Tradicionalmente, el tra­ tamiento recomendado era tetraciclina oral durante 6 semanas combinada con estreptomicina o gentamicina intramuscular diarios durante 2-3 semanas.1421 También se recomienda para el tratamiento doxiciclina (un derivado de la tetraciclina con mayor liposolubilidad y una vida media en suero más larga) y rifampicina administradas por vía oral por lo menos durante 6 semanas. El tratamiento de la brucelosis mediante monoterapia con alguna de las cefalosporinas más nuevas, como ceftriaxo­ na, ha conducido a fracasos y no puede recomendarse.746 En general, las fluoroquinolonas muestran buena actividad contra las especies de Brucella in vitro.700 Un estudio prospectivo y aleatorizado evaluó la eficacia de ciprofloxacina contra rifam­ picina más doxiciclina en el tratamiento de la brucelosis aguda. Después del tratamiento durante 45 días, cinco de los seis pacientes tratados con ciprofloxacina sufrieron una recaída, a pesar de la sensibilidad in vitro y las bajas CIM de B. Melitensis aisladas.747 En un estudio turco, se comparó la efi­ cacia clínica de una combinación de ofloxacina y rifampicina durante 6 semanas con la lograda con la combinación doxiciclina-rifampicina.6 Las fluoroquinolonas y las cefalosporinas más nuevas pueden mostrar mejor eficacia clínica cuando se utilizan combinadas con otros agentes.1290 El tratamiento de la neurobrucelosis y la endocarditis requie­ re una terapia combinada y a menudo intervenciones quirúrgi­ cas. En la neurobrucelosis, están contraindicados los regímenes con estreptomicina porque este fármaco no alcanza concentra­ ciones terapéuticas en el SNC. Se recomiendan las terapéuticas combinadas con dos o tres agentes (p. ej., doxiciclna, rifampi­ cina y trimetoprim-sulfametoxazol) que penetran el SNC y son activos contra la cepa infectante. El tratamiento adecuado de la endocarditis por brúcelas, al igual que la causada por otros agentes bacterianos, requiere la administración de concentra­ ciones bactericidas de antibióticos. Se ha utilizado con éxito la combinación de doxiciclina con rifampicina y trimetoprim-sulfametoxazol en el tratamiento de la endocarditis por brúcelas. Aunque algunos de estos pacientes se han curado con quimoterapia antibiótica aislada, el mejor enfoque es la intervención quirúrgica (el reemplazo valvular) combinada con antibióticoterapia.521-1421

Francisella tularensis Epidemiología de la tularemia

La tularemia, infección causada por el cocobacilo gramnegativo con requerimientos nutricionales especiales Francisella tularensis, es una enfermedad de los animales que los seres humanos adquieren por contacto con ellos.372 Los reservorios naturales de bacterias incluyen conejos, roedores, ardillas, ratas almizcleras, castores, ratones de campo, ciervos, lemmings (pequeños roedores del norte de Europa) y mapaches. y anima­ les domésticos como vacas, ovejas, cerdos y caballos. Los cer­ dos, caballos y las vacas son bastante resistentes a la infección, mientras que las ovejas son relativamente susceptibles. El microorganismo es transmitido entre los animales por garrapa­ tas y moscas mordedoras que pican, como los tábanos. La transmisión transovárica de F. tularensis también ocurre en la garrapata, lo que proporciona una fuente renovadora del micro­ organismo en el medioambiente. Las infecciones en los seres humanos se adquieren principalmente por las picaduras de

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Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

garrapatas, tábanos y mosquitos infectados, o por el contacto directo con sangre u órganos internos de animales infecta­ dos.1157 Entre las garrapatas, se sabe que por lo menos 13 espe­ cies diferentes tienen infecciones naturales por F. tularensis, y la garrapata del perro (Dermacentor variabilis) y la garrapata de la madera (Dermacentor andersoni) son las más frecuentes en América del Norte. Entre los cazadores, se han producido infecciones luego de quitar la piel, vestirse con sus pieles o ingerir animales infectados, que incluyen conejos, liebres, cas­ tores, ratas almizcleras y ardillas. El agua contaminada tam­ bién es una fuente importante del microorganismo en el medioambiente y han ocurrido infecciones en seres humanos luego de la ingestión de agua de pozos en los cuales se han hallado esqueletos de animales infectados.111 La pesquisa epidemioló­ gica de un brote grande de tularemia durante 1999-2000 en Kosovo condujo hasta los alimentos y el agua contaminados, y se identificó a los roedores como la fuente del microorganis­ mo.1061 Se han producido infecciones adquiridas por transmi­ sión aérea luego de la inhalación de polvo y heno que contenía heces y esqueletos de roedores. Las infecciones humanas tam­ bién se han adquirido por la exposición o las mordeduras de gatos domésticos. En estos casos, la contaminación de la boca o las garras del gato luego de matar y alimentarse de la presa es el modo probable de adquisición del microorganismo, aunque los gatos también pueden contraer infecciones sistémicas.8 Se describió un caso en el cual un cirujano veterinario contrajo tularemia ulceroganglionar después de cortarse un dedo mien­ tras realizaba una histerectomía a una gata.1143 F. tularensis es altamente contagioso: tan sólo 10 a 50 microorganismos admi­ nistrados por vía intradérmica o por partículas en suspensión son suficientes para producir infección y el microorganismo puede penetrar fácilmente a través de lesiones diminutas e inaparentes de la piel.372 La tularemia también se ha adquirido por accidentes de laboratorio ocurridos durante el procesamiento de muestras infectadas, el aislamiento y la identificación del microorganismo, y la manipulación de gran cantidad de micro­ organismos en circunstancias de investigación. Antes de la Segunda Guerra Mundial, la tularemia era bas­ tante frecuente, pero la incidencia declinó constantemente durante la década de 1950. Aunque la enfermedad se ha comu­ nicado en todos los Estados Unidos, la mayoría de los casos ocurren ahora en los estados del sur y centro-sur (Missouri, Arkansas, Oklahoma y Texas); durante los meses estivales o a mediados del invierno y corresponden a picos de enfermedad asociada con vectores y enfermedad asociada con caza, res­ pectivamente.624 Los varones se infectan más comúnmente que las mujeres, lo que está relacionado con la asociación de la infección con ciertas ocupaciones (p. ej., granjeros, veterina­ rios de grandes animales, cazadores, y esquiladores y pastores de ovejas).1157 Recientemente, se han planteado cuestiones vinculadas con el posible uso de F. tularensis como agente de guerra biológica y bioterrorismo.182'321'1077 En los Estados Unidos, fue investiga­ do como agente de la guerra biológica en las décadas de 1950 y 1960, antes de concluir el programa de bioterrorismo ofensi­ vo de ese país, y es probable que otros países también lo hayan investigado.253 En Fuerte Detrick, se expuso a animales y a voluntarios humanos tanto civiles como militares a aerosoles que contenían F. tularensis para determinar la infecciosidad del agente diseminado de esta forma y para evaluar la eficacia de las vacunas, los tratamientos profilácticos y los métodos tera­ péuticos.253 A causa de estas investigaciones, se consiguió una vacuna F. tularensis viva atenuada gracias al Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos y la Organización Mundial de la

Salud como nuevo agente experimental. La cepa viva de la vacuna brinda una buena protección contra la forma neumóni­ ca de la tularemia y modifica los signos y los síntomas de la forma ulceroganglionar.1183 Kaufmann y cois., de los CDC, publicaron hace poco una descripción del mejor y el peor esce­ nario que se plantearían si se liberaran microorganismos F. tularensis como una nube de aerosol como parte de un acto de bioterrorismo.674 Si la dosis infectante en aerosol de F. tularen­ sis es de 50 a 100 microorganismos y se acepta una tasa de ata­ que del 82,5%, la exposición de 100 000 personas conduciría a 82 500 casos de tularemia neumónica. Con una tasa de morta­ lidad del 6,2%, se esperarían 6 188 muertes, con un impacto económico de entre 465 y 562 millones de dólares. Reseña histórica y taxonomía

La tularemia fue descrita por primera vez en 1911 por McCoy como causa de una enfermedad similar a la peste en roedores durante sus investigaciones de la posible peste bubó­ nica en la población de roedores en el área de San Francisco luego del terremoto devastador de 1906. McCoy y Chapin ais­ laron luego el agente causal y lo denominaron Bacterium tularense, por el condado de Tulare, California, el sitio de su labo­ ratorio.372 Desde 1912 hasta 1925, Edward Francis estuvo estudiando la enfermedad humana denominada “fiebre por tábanos” e hizo una correlación entre esta enfermedad y la “enfermedad similar a la peste” descrita por McCoy en los roe­ dores. Este autor investigó los modos de transmisión, estudió el agente causal y acuñó el nombre “tularemia”. Este nombre refleja el del condado de Tulare, donde McCoy y Chapin aisla­ ron el microorganismo y la “bacteriemia” que ocurre como una manifestación de infección. Por su trabajo pionero sobre el cul­ tivo del microorganismo y los métodos para el diagnóstico serológico, los síndromes clínicos asociados y el reconoci­ miento de los reservorios y vectores principales, Francis reci­ bió el Premio Nobel de 1959 en ciencia, y el nombre del micro­ organismo se cambió de Bacterium tularense a Francisella tularensis en su honor. Al igual que otros microorganismos descritos en este capítu­ lo, la ubicación taxonómica de Francisella es incierta.368 Con el correr de los años, ha sido clasificado provisoriamente como género “Bacterium ” y se lo incluyó con las brúcelas y las pasteurelas. Sin embargo, los análisis genético, fenotípico y de la pared celular no han demostrado ninguna relación con especies de Brucella o de Pasteurella, o con los miembros transmitidos por garrapatas del género Yersinia (Y. pestis). En consecuencia, se aceptó a Francisella como un género nuevo a mediados de la década de 1960. El examen de las secuencias de rRNA 16S estableció que F. tularensis pertenece a la y-subdivisión de las proteobacterias y en la próxima edición del Bergey’s Manual está incluido como único género en la familia propuesta “Fancisellaceae" en el orden propuesto “Triotricales”.455 F. tularensis puede ser dividido en cuatro subespecies todas las cuales pueden producir tularemia, aunque difieren en su virulencia para seres humanos y conejos.450646 F. tularensis subespecie tularensis (también denominado F. tularensis sub­ especie nearctica o biovariedad tipo A) predomina en los Estados Unidos, pero no es tan frecuente en Europa (aunque recientemente se reconoció esta subespecie en Eslovaquia), se asocia con garrapatas y conejos, y es virulento tanto en conejos como en seres humanos.512'646 Este biogrupo se caracteriza fenotípicamente por la producción de ácido a partir de glicerol y porque tiene citrulina ureidasa.8191128 F. tularensis subespecie holarctica (antes denominado F. tularensis subespecie palae-

Francisella tularensis 4 6 9 circtica o biovariedad tipo b) ha sido aislado en Europa, Asia, Japón y los Estados Unidos, produce infecciones en roedores que se transmiten a través del agua y cuyos vectores son garra­ patas y mosquitos, tiene una virulencia intermedia en los seres humanos y es mínimamente virulento en los conejos.29624 La enfermedad debida a la subespecie holarctica puede ser más frecuente en los Estados Unidos de lo que se pensaba.1298 Las cepas subespecie holarctica son glicerol negativas y no suelen producir citrulina ureidasa. Se propusieron las denominaciones F. tularensis subespecie mediaasiatica para las cepas aisladas en el foco asiático central de la Unión Soviética y F. tularensis biogrupo palaearctica japónica para las cepas de Japón.1128 En un principio, los científicos soviéticos clasificaron a las cuatro como especies separadas, pero esta sugerencia no ha sido gene­ ralmente aceptada. Se demostró que las cepas de Asia Central y Japón tienen baja virulencia para los conejos (al igual que el biogrupo holarctica/palaearctica), pero indudablemente tienen una relación más estrecha con F. tularensis subespecie tularen­ sis sobre la base del análisis de rRNA 16S.1128 Algunos datos recientes que utilizaron dos elementos de secuencia de inser­ ción para tipear las cepas por los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción pusieron en evidencia que las cepas japonesas de F. tularensis subespecie holarctica (palae­ arctica ) en realidad pueden representar otra subespecie.1272 Una segunda especie de Francisella, aislada del agua en Utah en 1951 fue antes clasificada como una especie de Pasteurella y se le cambió el nombre por Francisella novicida en 1959.368749 Algunos estudios genéticos determinaron ulte­ riormente que F. novicida no era una especie separada, sino que constituía otra subespecie de F tularensis (subespecie novici­ da). dado que el grado de similitud de rRNA 16S era del 99.6% 418-585 F. tularensis subespecie novicida fue aislada de agua que contenía ratas almizcleras nuevas y de seres humanos en dos ocasiones. Una “tercera” (pero en realidad segunda) especie de Francisella denominada F. philomiragia incluye cepas bacte­ rianas antes llamadas “bacterias filomiragias” que fueron incluidas erróneamente con las yersinias como “Y. philomirasia".5i5 Estos microorganismos muestran una relación genética y antigénica con las subespecies de F. tularensis y tienen com­ ponentes similares de ácidos grasos y ubiquinona en la pared celular. El análisis de rRNA 16S de estos microorganismos ha corroborado la diferenciación actual del género en dos espe­ cies: F. tularensis y F. philomiragia .418,419 F. philomiragia es mucho menos virulenta que F. tularensis y ha sido aislada prin­ cipalmente en animales (p. ej., ratas almizcleras) y en el agua. Durante un período de 12 años, se remitieron 14 aislamientos numanos de F. philomiragia a la Rama de Bacteriología Especial de los CDC, cinco de los cuales provinieron de pacientes con enfermedad granulomatosa crónica, cinco de inii\ iduos que casi se habían ahogado en agua salada, dos de uentes humanas desconocidas y los casos únicos eran de un reciente con enfermedad de Hodgkin y de un paciente con metaplasia mieloide.585-1155-1364 En 1997, Sicherer y cois, infor­ maron sobre un decimoquinto paciente con baeteriemia por F. philomiragia que también tenía una enfermedad granulomato>a crónica.1175 Estos casos han definido el espectro clínico de F. philomiragia como agente raro de neumonía necrosante, bactenemia y meningitis.585’1155,1364 En 1997, se reconoció otra especie posible de Francisella . ’ino un endosimbionte en tejido ovárico de garrapatas hem­ bras Dermacentor andersoni, pero no ha sido detectada en can-apatas macho.929 La relación de este microorganismo, ií'ig n ad o el “simbionte de IX andersoni” (DAS) y las especies

de Francisella se basa sobre la presencia de un antígeno espe­ cífico de la membrana y las secuencias de rRNA 16S que son similares a las de F. tularensis. La investigación de las bacterias endosimbióticas estrictas que se encuentran en Paramecium tetraurelia observó que uno de estos endosimbiontes, Caedibacter taeniospiralis, forma un nuevo linaje evolutivo con las y-proteobacterias y comparte un 87% de similitud en sus secuencias de rRNA 16S con la familia Francisellaceae .l04 Se están caracterizando mejor estos endosimbiontes. Virulencia de F. tularensis

Los factores responsables de la virulencia de F. tularensis no se conocen. El microorganismo no produce ninguna exotoxina identificable, pero tiene una cápsula poco visible que contiene hidratos de carbono, proteínas y lípidos. La cápsula funciona protegiendo al microorganismo de la lisis mediada por com­ plemento y también puede ser antifagocítica. La extracción de la cápsula por mutación o métodos bioquímicos produce la abolición de la virulencia del microorganismo y lo torna sensi­ ble a la actividad bactericida del suero humano normal.1127 El LPS del microorganismo tiene una estructura singular, induce menor toxicidad celular y es menos activo en el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus para endotoxina que otras bacte­ rias gramnegativas.1129,1330 En infecciones experimentales pro­ ducidas en ratones, los microorganismos sólo pueden ser aisla­ das en tejidos del sistema reticuloendotelial y en los compo­ nentes celulares de la sangre periférica.421 Esto puede explicar el aislamiento infrecuente de este microorganismo en los hemocultivos obtenidos mediante venopunción. La infección natural o la inmunización con cepa viva de vacuna de F. tula­ rensis genera una resistencia celular y humoral duradera a la reinfección, y la respuesta inmunitaria celular es el principal mecanismo protector.1262 Se ha demostrado la persistencia de una inmunidad celular protectora con una declinación simultá­ nea en la inmunidad humoral en individuos que sufrieron una infección natural 25 años antes.381 Algunos estudios realizados con mutantes de la cepa viva de la vacuna sugieren que el principal factor de virulencia de F. tularensis es la capacidad para invadir y multiplicarse dentro de los macrófagos. hepatocitos y otras células del sistema reticu­ loendotelial.I27-421-498-1262 El microorganismo es fagocitado por estas células y vive dentro de vacuolas acidificadas y ricas en hierro. Otras células asociadas con el sistema reticuloendotelial (p. ej., células natural killer [NK]) son estimuladas para produ­ cir interferón y antes de la aparición de linfocitos T específicos de F. tularensis; el interferón y estimula la producción de óxido nítrico dentro de los macrófagos lo que, a su vez, inhibe el cre­ cimiento intracelular de F. tularensis y limita su propagación dentro del sistema reticuloendotelial.41 La capacidad para indu­ cir la producción de óxido nítrico en los macrófagos en el modelo del ratón es modulada por la expresión de la variación de fase del LPS. Esta variación incluye modificaciones estruc­ turales tanto de los antígenos somáticos (O) del LPS como de los antígenos A lipídicos centrales. Después de la infección cutánea de un huésped sensible, el microorganismo se multiplica localmente durante 3 a 7 días y produce una úlcera local. Las bacterias se propagan hasta los ganglios linfáticos regionales y se diseminan por vía linfohematógena para afectar múltiples órganos. Sigue una respuesta inflamatoria aguda inicial, con la acumulación de neutrófilos, fibrina y macrófagos. Las células mononucleares fagocitan los microorganismos sin anticuerpos opsonizantes, mientras que las células polimorfonucleares no pueden hacerlo. Los linfoci-

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Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

tos y los macrófagos migran en los tejidos infectados, fagocitan los microorganismos y forman granulomas en múltiples sitios (ganglios linfáticos, médula ósea, bazo, hígado y pulmo­ nes). Los microorganismos se mantienen viables dentro de estos macrófagos por la inhibición de la fusión fagosoma-lisosoma y la utilización de hierro de las células del huésped.420 La inmunidad mediada por células aparece 7-10 días después de la infección y los anticuerpos aglutinantes IgM, IgG e IgA apare­ cen durante las 2 semanas ulteriores.723 1262 La lisis de las célu­ las que albergan los microorganismos por parte de células inmunitarias efectoras en el hígado y otros órganos libera microorganismos de los compartimentos intracelulares, lo que les permite infectar otras células. Si no se trata, la supuración de los ganglios linfáticos que afecta a distintos tejidos conduce a otras manifestaciones de enfermedad sistémica. Espectro clínico de la tularemia

El espectro clínico de la tularemia depende del modo de adquisición del microorganismo, la virulencia innata de la cepa infectante y el estado inmunitario del huésped. Después de la infección, existe un período de incubación de 2 días a 3 sema­ nas, seguido por el inicio agudo de fiebre, escalofríos, malestar general, cefalea, odinofagia y a veces diarrea. La temperatura puede aumentar y disminuir pero habitualmente se mantiene elevada durante 4 a 5 semanas en ausencia de tratamiento. Durante este período, se desarrolla pérdida de peso, linfadenopatía y enfermedad crónica. Los pacientes que están infectados con cepas menos virulentas pueden tener una enfermedad leve que se resuelve espontáneamente, mientras aparecen otras infecciones multisistémicas debilitantes crónicas. La tularemia puede dividirse en seis síndromes principales delineados por el modo de adquisición del microorganismo y, por lo tanto, el grado de afectación sistémica.1085 La tu la rem ia u lc e r o g a n g lio n a r es la forma más frecuente (21-85% de los casos). El paciente presenta una lesión cutánea ulcerada, casi siempre en el sitio de la mordedura de una garrapata, junto con linfadenopatía regional dolorosa. En los adultos que presentan una infección asociada con la mordedura de garrapata, son más frecuentes la adenomegalias inguinales y cervicales, mientras que las adenomegalias cervicales y occipitales predominan en los niños. Las linfadenopatías asociadas con animales suelen ser cervicales, dado que a menudo la/s lesión/es inicial/es está/n en los miembros superiores. También se presentan otros síntomas (p. ej., cefalea, fiebre, escalofríos, sudoración, tos). La tu la rem ia g a n g lio n a r (3-20% de los casos) se caracteriza por adenomegalias y fiebre, pero no se aprecia fácilmente una lesión cutánea. En estos casos, la lesión puede haber cicatriza­ do o puede ser tan inocua que pasa inadvertida. Tanto en la tularemia ulceroganglionar como en la ganglionar, los ganglios linfáticos agrandados pueden supurar y necesitan drenaje qui­ rúrgico. La tu la r e m ia o c u lo g a n g lio n a r (2-5% de los casos) es el resultado de la inoculación del microorganismo en las con­ juntivas a través de la inoculación directa con las manos conta­ minadas o por salpicaduras o aerosoles. Esta forma clínica se caracteriza por conjuntivitis granulomatosa grave; pérdida de agudeza visual; adenomegalias preauriculares, submandibulares y cervicales; y manifestaciones sistémicas de fiebre y malestar general.1219 La tu la r e m ia o r o fa r ín g ea (2-12% de los casos) es la infección cuya lesión primaria está en la orofaringe. Esta forma de la enfermedad es resultado de la ingestión de alimentos o agua contaminados. El paciente presenta cefalea intensa, amigdalitis bilateral y faringitis exudativa sugestiva de una faringitis estreptocócica grave, difteria o enfermedad de

Vincent. Aparece una linfadenitis cervical profunda, casi siem­ pre en la forma de un ganglio linfático tumefacto persistente aislado una semana o dos después de la entrada del microorga­ nismo.579-945 La tu la r e m ia tifo id e a (5-30% de los casos) tiene un inicio súbito con fiebre, escalofríos, cefalea, odinofagia, vómitos y dolor y sensibilidad a la palpación abdominal. No se observa ninguna lesión cutánea ni linfadenopatía inicial, y es probable que la infección se adquiera por la ingestión de agua o alimentos contaminados.579 La tularemia tifoidea es la única forma en la cual la diarrea es una parte sobresaliente de la pre­ sentación clínica. La diarrea suele ser muy líquida o acuosa y sin sangre, aunque se puede observar necrosis intestinal focal con heces sanguinolentas, sobre todo en los niños. Se desarro­ lla una enfermedad pleuropulmonar secundaria, con infiltrados pulmonares y derrames pleurales, en casi el 50% de los pacien­ tes con tularemia tifoidea. En esta forma, los cultivos de sangre y esputo pueden ser positivos y la mortalidad suele ser alta. La tu la r e m ia n e u m ó n ic a (8-20% de los casos) puede ocurrir como complicación de todas las otras formas de la enfermedad debido a la siembra del aparato respiratorio durante la bacte­ riemia o como una entidad clínica resultante de la inhalación de los microorganismos en aerosoles en suspensión.108 Los exá­ menes radiológicos pueden mostrar la afectación de uno o más lóbulos, con derrames pleurales, infiltrados neumónicos, for­ mación de abscesos, nodulos pulmonares y adenomegalias hiliares 463925 Los síntomas son fiebre, tos con producción míni­ ma de esputo y dolor torácico pleurítico. Desde el punto de vista clínico, la tularemia neumónica se asemeja a la tubercu­ losis; a las neumonías atípicas debidas a Legionella, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Co.xiella hurnetii y a la neu­ monía micótica.463 La tularemia neumónica suele ser más grave en los pacientes con trastornos subyacentes, como desnutri­ ción, alcoholismo, enfermedad renal, enfermedad granulomatosa crónica e infección por HIV.818 En estos individuos ocurren más a menudo complicaciones como hepatoesplenomegalia, insuficiencia renal y rabdomiólisis. En general, la tularemia neumónica se observa en adultos y se asocia con ciertas ocu­ paciones (p. ej., esquiladores de ovejas, criadores de ganado, trabajadores de laboratorio), actividades de granja (p. ej., tri­ lla), siega del césped y corte de cerdas.1243 Es probable que esta asociación se deba a la presencia de heces de roedores o restos animales infectados en el heno.579 La supuración de las adeno­ megalias puede ser una complicación tardía hasta en el 50% de los pacientes con linfadenopatía.624 Las manifestaciones de múltiples tipos clínicos de tularemia pueden ocurrir en pacientes individuales, y se describieron otras complicaciones de la enfermedad. Plourde y cois, comu­ nicaron un caso de tularemia ganglionar con algunas caracte­ rísticas de enfermedad tifoidea en un niño que había sufrido la picadura de un insecto sobre el omóplato izquierdo.1018 Se observó linfadenopatía inguinal, en lugar de linfadenopatía cerca del sitio de picadura del insecto, y se desarrolló disten­ sión abdominal y diarrea acuosa grave, ambas características de la enfermedad tifoidea. Cooper y cois, comunicaron un caso atípico de infección crónica por F. tularensis de una prótesis de rodilla en un hombre de 68 años con enfermedad articular degenerativa 6 meses después de la picadura de una garrapa­ ta.281 La meningitis es una complicación rara de la infección por F. tularensis y sólo se han comunicado cinco casos pediá­ tricos y siete adultos en la literatura entre 1931 y 1998.1079 Estos pacientes pueden presentar o no enfermedad no menín­ gea (tularemia ganglionar o tularemia tifoidea). Los hallazgos del LCR son compatibles con meningitis bacteriana (hipoglucorraquia con hiperproteinorraquia) y muestran predominio de

Francisella tularensis 4 7 1

línfocitos en la tinción de Gram. En 1996, Pittman y cois, describieron el primer caso de infección de una derivación ventri. : peritoneal por F. tularensis en un varón de 5 años con miei memngocele.1016 Los signos y los síntomas estaban limitados . SNC y no hubo ninguna otra afectación sistémica. Dos semanas antes de la presentación, el niño había estado con unos ¿migos que estaban despellejando un conejo. El paciente res¡x n d i' satisfactoriamente a la gentamicina intratecal con reemp’azc ce la derivación. LeDoux informó de un caso de una presan.ta enfermedad del SNC por F. tularensis en un hombre de - años cuya presentación clínica predominante fue ataxia de _ marcha.763 En 2000, Tancik y Dillaha comunicaron el primer casc publicado de endocarditis de válvula nativa por F. tulansis en un hombre de 42 años proveniente de Arkansas.1255 El paciente respondió satisfactoriamente al tratamiento con gentamicína durante 4 semanas. La enfermedad grave también se asocia con compromiso del estado del huésped, como lo pone en evidencia una infección rápidamente mortal en un paciente con neutropenia que había recibido un trasplante de médula ósea.1137 - 1

amiento y características de los cultivos

Dado que este microorganismo puede penetrar a través de pequeñas lesiones en la piel, se considera peligroso manipular muestras o cultivos de F. tularensis en el laboratorio. Como sucede con la brucelosis, es posible que no se sospeche tularemia en el momento en que el paciente consulta al médico, de m do que puede pasar mucho tiempo en que se manipulan maestras y cultivos antes de considerar este diagnóstico. En los laboratorios que trabajan con materiales clínicos de origen ■.manoy animal, se recomiendan prácticas, equipo de contención e instalaciones de Bioseguridad de nivel 2, mientras que s-e necesitan prácticas de Bioseguridad de nivel 3 y 3: seguridad Animal de nivel 3 para los que trabajan con cul­ tivos vivos o realizan estudios experimentales en anima­ les 10 En el laboratorio de microbología clínica, todas las ~ _e'tras y los cultivos deben ser procesados en un gabinete de eguridad biológica de clase II de rutina, se deben utilizar ; -antes durante todos los procedimientos y evitar cualquiera que pueda generar partículas de aerosoles. Con la amenaza inminente del bioterrorismo, se deben incorporar pruebas de .rifado para F. tularensis y otros agentes de bioterrorismo en : s procedimientos de bancos de laboratorio para permitir la reñida identificación presuntiva de un microorganismo aislado ie modo que pueda remitirse a los laboratorios de nivel B para la identificación definitiva.1077 Las personas que sufren una exposición confirmada en el laboratorio deben ser tratadas en forma preventiva. F. tularensis puede aislarse de úlceras primarias, material de _'nración y biopsias ganglionares, esputo, médula ósea y biopsias titulares (p. ej., hígado, bazo). Las muestras deben mantenerse a 4-8 °C hasta su procesamiento y colocarse en un medio de transporte Amies con carbón o en medio de Stuart a :emperatura ambiente. También se han aislado microorganismos de muestras de sangre periférica, habitualmente en el caso ie una enfermedad subyacente preexistente. Se han observado hemocultivos positivos en pacientes con tularemia tifoidea, neumónica y orofaríngea, y en el único caso de endocarditis por F. tularensis.5'''>’945-m3A29S'ms En comunicaciones de casos que describieron la baeteriemia por F. tularensis, se observó -recimiento del microorganismo después de 3 a 7 días de incu­ bación utilizando el sistema radiométrico BACTEC. Sin embargo, en el único caso de endocarditis, F. tularensis creció

después de 9 días con el sistema BACTEC.1255 F. tularensis fue aislada después de 12 días de incubación en un frasco de hemocuitivo aerobio no radiométrico BACTEC (BACTEC NR6A) que fue inoculado con un volumen de 10-20 |*iL del material de aspiración percutánea con aguja fina de un ganglio linfático inguinal.175 Si hay sospecha clínica de tularemia, se deben incubar los hemocultivos en caldo antes de utilizar el período de incubación estándar de 5 a 7 días en muchos labo­ ratorios. F. tularensis es un cocobacilo gramnegativo pequeño y de tinción pálida (véase lámina en color 9-4E). Desde el punto de vista clásico, el crecimiento del microorganismo requiere cis­ terna, cistina u otros compuestos que contienen sulfhidrilo y el medio preferido para el aislamiento fue agar sangre glucosacisteína. Sin embargo, crece en agar chocolate disponible en el comercio y agar de Thayer-Martin modificado, dado que estos medios que contienen hemina son complementados con un enriquecedor del crecimiento (p. ej.. IsoVitalex; BD Biosciences) que contiene cisterna, cistina y otros nutrientes necesarios para las bacterias con requerimientos nutricionales especiales.1348 Al igual que las brúcelas, es capaz de crecer en agar carbón-extracto de levadura con buffer (BCYE), el medio utilizado para el aislamiento de especies de Legionella .1365 F. tularensis también ha sido aislado en una biopsia de una lesión cutánea por la téc­ nica de centrifugación de frasco ampolla con cultivo celular (shell vial), utilizando fibroblastos pulmonares embrionarios humanos.428 Aunque no crece en subcultivo en medios bacte­ riológicos, su identidad se determinó mediante análisis de PCR del microorganismo que creció en el frasco ampolla con culti­ vo celular. En 1994, Bemard y cois., del Laboratorio Nacional de Bacteriología de Ontario, Canadá, informaron sobre siete cepas remitidas al laboratorio de referencia canadiense como espe­ cies de Haemophilus o como bacterias gramnegativas con requerimientos nutricionales especiales no identificadas que fueron reconocidas como F. tularensis.'21 Estas cepas, que care­ cían del requerimiento de cisterna de las cepas clásicas de F. tularensis, fueron oxidasa y catalasa negativas, se aglutinaban firmemente en suero aglutinante para Francisella y no fueron reactivas en todas las otras pruebas fenotípicas, que incluyen las utlizadas para las determinaciones de biogrupos. El análisis de los ácidos grasos celulares de estas cepas puso en evidencia la presencia de ácidos grasos saturados e insaturados de cade­ na larga (Clg-C 26) y grandes cantidades de 3-hidroxi-octadecanoato (3OH-C18:0), un ácido graso que es singular de F. tula­ rensis. 368-631 Estos ácidos grasos hidroxi inusuales comprenden parte de la estructura del lípido A en el LPS del microorganis­ mo. En consecuencia, estos microorganismos pueden ser iden­ tificados fácilmente por análisis de ácidos grasos celulares uti­ lizando el software del Sistema de Identificación Microbiano (Microbial Identification System, MIDI) y el Sistema de Generación de Bibliotecas (Library Generation System. LGS) (MIDI, Newark, NJ). Clarridge y cois, también aislaron dos cepas de F. tularensis sin requerimientos nutricionales especia­ les del hemocuitivo de pacientes con neumonía.260 Estas cepas crecieron tanto en agar chocolate como en agar sangre y fueron identificadas como F. tularensis por las características fenotípi­ cas, secuenciación de genes rRNA 16S e hibridación de sondas de DNA. Estas cepas tampoco aglutinaron en antisueros comerciales contra F. tularensis. Las cepas de F. tularensis bio­ grupo novicida y F. philomiragia no demuestran un requeri­ miento de cisterna. F. tularensis es aerobio estricto; el crecimiento es estimula­ do por el aumento del C 0 2 y puede requerir 2 a 5 días de incu­

472

C A P ÍT U L O 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

bación a 35 °C a 37 °C antes de que las colonias sean visibles en medio de agar. Las colonias en agar chocolate son grises, lisas, mantecosas y tienen alrededor de 2 mm de diámetro después de 3 días de incubación. F. tularensis subespecie tularensis crece más lentamente que las otras subespecies. Las colonias de F. philomiragia son más grandes, más blancas y mucoides. En el cuadro 9-13 se muestran las características de la identificación presuntiva de las especies de Francisella. Los biogrupos de F. tularensis son oxidasa negativos, débilmente catalasa positivos, crecen poco (o nada) en agar de MacConkey y son inertes desde el punto de vista bioquímico. Las cepas de F. philomira­ gia son oxidasa positivas. En general, la identificación de las especies se confirma mediante pruebas de aglutinación utili­ zando antisueros policlonales de conejo específicos. Los culti­ vos deben ser examinados en un período de 10 a 14 días. Algunos estudios que utilizaron la inoculación en frascos de hemocultivo y ratones infectados de forma experimental ini­ cialmente sugirieron la utilidad del PCR como método para la detección y la identificación de F. tularensis en muestras clíni­ cas humanas.346-657-798 Estos ensayos pudieron detectar tanto la subespecie tularensis como holarctica con sensibilidades igua­ les a 1 UFC/uL de sangre. Con posterioridad, se desarrolló con éxito un ensayo de PCR múltiple dirigido tanto al gen de rRNA 16S como a un gen de lipoproteína de 17 kDa para la detección directa de F. tularensis en hisopados de lesiones de tularemia ulceroganglionar.642-1182 El gen de la lipoproteína se conserva entre las cepas de F. tularensis y no muestra similitudes de secuencias con otras secuencias procariontes conocidas publi­ cadas en los bancos genéticos actuales.642 La PCR realizada en muestras de heridas pudo proporcionar un diagnóstico rápido en pacientes en los que se sospechaba tularemia ulceroganglio­ nar y tenían cultivos negativos y aún no habían sufrido seroconversión.642-667 En respuesta a la necesidad de herramientas epidemiológicas para investigar brotes de tularemia, también se han desarrollado técnicas de PCR para detectar infección direc­ tamente en animales de experimentación y en vectores insectos y proporcionar métodos para la tipificación y la discriminación de las cepas.311-398-450-568-645-1272 Se han creado técnicas nuevas para la detección e identifica­ ción rápidas de F. tularensis como resultado directo de las pre­ ocupaciones acerca de su uso en bioterrorismo y guerra bioló­ gica. Grunow y cois, idearon un EIA estándar y un ensayo inmunocromatográfico manual que utiliza anticuerpos monoclonales contra el antígeno LPS como anticuerpo de captura para detectar F. tularensis subespecie tularensis y F. tularensis subespecie holarctica directamente de muestras veterinarias.503 También se han desarrollado EIA con captura de antígeno que utilizan fluorometría de resolución temporal para la detección de varios agentes asociados con bioterrorismo tanto en mues­ tras clínicas como ambientales.1004 Emanuel y cois, crearon un método basado en PCR fluorogénica para la detección de F. tularensis en ratones infectados. Este ensayo se podía realizar utilizando un termociclador manual diseñado para uso en el campo; los resultados estuvieron disponibles dentro de las 4 horas.375 Como las cepas que pertenecen a los diferentes biogrupos de F. tularensis son antigénicamente homogéneas, las subespecies se diferencian entre sí sobre la base de criterios fenotípicos o sondas específicas de subespecies para rRNA 16S.418 Las cepas de F. tularensis subespecie tularensis producen ácido en los medios que contienen glucosa, maltosa o glicerol como fuente de carbono e hibridan con una sonda de oligonucleótidos para las secuencias de rRNA 16S específicas de la subespecie tula­ rensis. Las cepas de la subespecie holarctica producen ácido a

partir de glucosa y maltosa, pero no de glicerol e hibridan con una sonda que es específica para las secuencias de rRNA 16S de la subespecie holarctica. Tanto las cepas de la subespecie mediaasiatica como las de la subespecie palaearctica japónica hibridan con la sonda específica del biogrupo tularensis; sin embargo, las cepas de la subespecie mediaasiatica producen ácido a partir de glicerol (y sacarosa), mientras que la subespe­ cie palaearctica japónica acidifica los medios que contienen glucosa o glicerol (véase cuadro 9-13). Los métodos serológicos pueden distinguir entre las cepas de las subespecies tula­ rensis y novicida, pero no entre las cepas de las subespecies tularensis y holarctica. La citrulina ureidasa, enzima que se correlaciona con la virulencia de F. tularensis, se encuentra en las cepas virulentas de las subespecies tularensis, algunas cepas de holarctica y cepas mediaasiatica.s m m La enzima no se encuentra en cepas tularensis atenuadas y en la mayoría de las cepas de la subespecie holarctica con baja virulencia. Las pruebas fenotípicas de estos microorganismos son problemáti­ cas, dado que las reacciones a menudo son tardías o variables. Se han desarrollado cebadores específicos, sondas y métodos de PCR que pueden distinguir F. tularensis subespecie tularen­ sis de otras subespecies, incluida F. tularensis subespecie tula­ rensis.450-646 Diagnóstico serológico de la tularemia

Como es posible que no se considere el diagnóstico de tula­ remia hasta avanzado el curso clínico y como el cultivo para el microorganismo a menudo fracasa, la prueba serológica es el método más frecuente para el diagnóstico de esta infección.124 La respuesta de anticuerpos a la infección por F. tularensis está influida en cierta medida por la forma clínica de la enfermedad y puede afectar los resultados serológicos según el método uti­ lizado.1242 La prueba serológica convencional es la de aglutina­ ción en tubo (TA), que utiliza células enteras destruidas con formalina como antígeno (BD Biosciences). En general, los anticuerpos de las clases IgM, IgG e IgA no aparecen hasta 2 semanas después de la infección. Se presentan simultáneamen­ te anticuerpos de todas las clases. Un único título de aglutina­ ción en tubo > 160 con una enfermedad compatible o una ele­ vación de cuatro veces en el título entre las muestras de suero de fase aguda y de convalecencia (separadas por 14 días) cons­ tituye un diagnóstico etiológico presuntivo. Una prueba de TA positiva no es útil si existen antecedentes de infección o de vacunación, ya que los anticuerpos de la clase IgM persisten durante años. La prueba de TA ha sido adaptada a un procedi­ miento de microaglutinación (MA) que utiliza como antígeno microorganismos F. tularensis formalinizados y teñidos con safranina. Sato y cois, demostraron que la prueba de MA era más sensible que la prueba TA estándar, que detectaba anti­ cuerpos anti-fl tularensis de clase IgM 9 días antes que la prue­ ba TA.1138 Se han desarrollado ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para la detección de anticuerpos específicos de tularemia que utilizan antígenos OMP purifica­ dos del microorganismo que parecen evocar respuestas inmu­ nes tempranas y fuertes que son influidas mínimamente por la presentación clínica.124-125 Tratamiento de la tularemia

El fármaco de elección para el tratamiento de la tularemia es el aminoglucósido estreptomicina y la gentamicina es un agen­ te alternativo.379-624 Sin embargo, se ha comunicado una recaída clínica después del tratamiento con gentamicina.379-1074 Se han

Francisella tularensis 4 7 3

Cuadro 9 -1 3

Características bioquímicas para la identificación de subespecies de F ran cisella tu laren sis y F ra n cisella p h ilo m ira g ia

CARACTERÍSTICA

F. T U L A R E N S IS

F. T U L A R E N S IS

F. T U L A R E N S IS

F. T U L A R E N S IS

SUBESPECIE

SUBESPECIE

SUBESPECIE

SUBESPECIE

SUBESPECIE

F. P H IL O -

T U L A R E N S IS

H O L A R T IC A

N O V IC ID A

M E D IA A S IA T IC A

P A L E A R T IC A -JA P O N IC A

M IR A G IA

-

-

+

+d

¥

¥

-

V

-

F. T U L A R E N S IS

CKidasa

-

Catalasa

+d

Motilidad

-

C recim iento en agar de

V

-

V

ND

ND

V

C recim iento, NaCI al 6.5%

-

—

V

ND

ND

V

H-S en agar TS1

-

+d

M acConkey

Ureasa

-

R educción d e nitrato

_

-

-

-

-

¥

-

-

-

-

-

-

A cido a partir de: G lucosa

+

+

+

-

+

+d

Maltosa

+

+

V

-

ND

■V1

Sacarosa

-

-

+

+

ND

¥

G licerol

+

-

+

+

+

ND

+

+

-

-

-

-

+-

-+

+

+

-

ND

Requerimiento de cisteína/cistina C itm lina ureidasa

—: reacción positiva; -: reacción negativa; v: reacción variable: +d: reacción positiva débil; nanu cepas positivas; ND: datos no disponibles; TS1: triple azúcar-hierro.

_:i.izado otros regímenes, como tetraciclina y cloranfenicol, re: >e asocian con tasas más altas de recaídas, específicamen­ te si >e administran al comienzo de la evolución clínica. La res­ puesta clínica inicial al tratamiento con tetraciclinas es espec­ tacular! los pacientes tienen una rápida y notable mejora), aun¡as tasas de recaída son superiores al 12%, dos veces la ada con gentamicina.379 1142 También se ha utilizado con r\i: el tratamiento intravenoso con eritromicina, aunque los i s in vitro sugieren que las cepas de F. tularensis no son pre.- -.emente sensibles.1365 Scheel y cois, observaron que 14 de 12 ^¿pas de Escandinavia eran resistentes a eritromicina, roxir , .na y claritromicina in vitro.1142 También se han utiliza­ re métodos Etest para demostrar resistencia a los macrólidos en F. tularensis.642 Muchas cepas son sensibles a la rifampicina r ttro. pero se han recuperado mutantes espontáneos estables . n CrSl de rifampicina > 32 (ig/mL dentro de las zonas de inhibición por la rifampicina de las cepas sensibles. A_nque algunos estudios in vitro que utilizaron métodos de dilución en caldo han comunicado CIM bajas para los (3-lactán __s cuando fueron evaluados contra F. tularensis, otros estudi s que utilizaron dilución en agar han llegado a la conclusión ¿e _ae el microorganismo es resistente a los esos antibióti- ; En un estudio de 22 cepas animales y humanas de F. ru^rensis que utilizó el método de dilución en agar con agar -_r rre-cisteína-glucosa, todas las cepas fueron resistentes no

mayoría de cepas positivas, raras cepas negativas; - +: mayoría de cepas negativas,

sólo a penicilina y cefalotina, sino también a cefuroxima, ceftazidima, aztreonam, imipenem y meropenem, con una CIM > 32 |ig/mL para todos los agentes.1142 Ikaheimo y cois, utlizaron tiritas de Etest en placas de agar cisteína-infusión de corazón para evaluar 20 cepas humanas y 18 de animales muertos.617 Todas fueron sensibles a los agentes utilizados para el trata­ miento (estreptomicinas, tetraciclina), pero resistentes a los P-lactámicos y los penémicos, incluidos ceftriaxona, ceftazidima, cefpiroma, imipenem, meropenem y piperacilina-tazobactam. La experiencia clínica con el uso de algunas cefalospori­ nas de tercera generación para la tularemia indica que no son eficaces. Cross y Jacobs informaron sobre ocho casos de fraca­ sos documentados con el uso ambulatorio de ceftriaxona en el tratamiento de la tularemia.291 Aun cuando las CIM de ceftazidima son más bajas para F. tularensis que las de ceftriaxona. no existe ninguna prueba como para sugerir que este fármaco seria igualmente útil.379 Las cepas de F. tularensis son sensibles a las fluoroquinolo­ nas in vitro y muchos datos clínicos apoyan la utilidad de estos agentes para el tratamiento.379647 1143 1244 Se ha demostrado in vitro sensibilidad a varias fluoroquinolonas utilizando dilución en agar y métodos Etest en medios suplementados con sangre y cisteína y enriquecidos.6171142 Syrjala y cois, informaron sobre tres pacientes con tularemia neumónica y uno con tula­ remia ulceroganglionar que fueron tratados con éxito con ci-

474

C A P ÍT U L O 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

profloxacina; otro paciente con tularemia ulceroganglionar res­ pondió al tratamiento con norfloxacina.1244 Scheel y cois, trata­ ron con éxito una recaída de tularemia ulceroganglionar con ciprofloxacina después de que el paciente había completado una serie de 10 días de amoxicilina y una serie de 3 semanas de doxiciclina.1143 Limaye y Hooper revisaron recientemente 10 casos de tularemia, que incluían las formas ulceroganglionar, neumónica y tifoidea, que fueron tratados con ciprofloxacina o levofloxacina y observaron resultados favorables sin recaídas en todos los casos.780 Se observó que una serie de 14 días de ciprofloxacina oral era eficaz para el tratamiento de 12 pacien­ tes pediátricos con infección ulceroganglionar; el cultivo de las lesiones fue exitoso en siete pacientes y todas las cepas tuvie­ ron una CIM de ciprofloxacina de 0,03 i^g/mL.643 En general, las cepas de F. philomiragia son sensibles a los aminoglucósidos. las fluoroquinolonas y la tetraciclina, y tie­ nen una sensibilidad variable a amoxicilina-clavulanato, rifam­ picina y eritromicina. La mayoría producen enzimas (i-lactamasas y son resistentes a la ampicilna y algunas pueden ser resistentes a cefazolina, cefotaxima y trimetoprim-sulfametoxazol.585 1155-1175

Especies de Bartonella Taxonomía y epidemiología de las especies de Bartonella

En la edición de 1984 del Manual de Bergey de Bacteriolo­ gía Sistemática, el orden Rickettsiales incluyó tres familias: Rickettsiaceae, Bartonellaceae y Anaplasm ataceae.'0'15 Las Rickettsiaceae incluyeron tres géneros: Rickettsia, Coxiella y Rochalimaea ,1357Aunque las rickettsias y las coxielas no pudie­ ron ser cultivadas fuera de células huéspedes específicas, los miembros del género Rochalimaeae tenían forma de bacilo que podían ser aislados en medios sin células. La familia Barto­ nellaceae incluía dos géneros: Bartonella y Grahamella .1357 Los miembros del género Bartonella podían infectar a los seres humanos y característicamente proliferaban en estrecha asocia­ ción con las superficies de los eritrocitos de los vertebrados, mientras que los del género Grahamella proliferaban dentro de los eritrocitos de vertebrados no humanos. Hasta 1984 se había descrito sólo una especie de Bartonella (B. bacilliformis), dos especies de Grahamella (G. talpae y G. peromysci) y dos espe­ cies de Rochalimaea (R. quintana y R. vinsonii). Histórica­ mente, R. quintana produce fiebre de las trincheras en seres humanos y R. vinsonii sólo ha sido aislado de ratones de campo que viven en Grosse Isle, Québec, Canadá.1356 A comienzos de la década de 1990, se describieron varias entidades clínicas inusuales -sobre todo angiomatosis bacilar y peliosis hepática- en pacientes con infección por HIV. Los microorganismos que se teñían con la tinción argéntica de Warthin-Starry podían observarse en biopsias recortadas de estas lesiones cutáneas y viscerales atípicas. pero era extrema­ damente difícil aislarlos en cultivo. Por último, fueron aislados en medios de agar recién preparados o en cultivos celulares después de una incubación prolongada y caracterizados mediante técnicas moleculares y genéticas. Se observó que estas bacterias con requerimientos nutricionales especiales eran miembros del género Rochalimaea e incluían a R. quinta­ na , el agente etiológico clásico de la fiebre de las trincheras, y una especie nueva que recibió el nombre R. henselae.m l'lm En 1993, algunos estudios taxonómicos de Brenner y cois, confir­ maron que las especies de Rochalimaeae estaban más estre­ chamente relacionadas con Bartonella bacilliformis y apoya­ ron la unificación de Rochalimaea y Bartonella.168 En conse­

cuencia, todos los miembros del género Rochalimaeae fueron transferidos al género Bartonella como Bartonella quintana, Bartonella vinsonii, Bartonella henselae y Bartonella elizabethae.

En 1995, se describieron tres especies nuevas de Grahamella junto con análisis de rRNA 16S y comparaciones con las espe­ cies de Grahamella y Bartonella existentes. Sobre la base de criterios genéticos y fenotípicos, Birtles y cois., del Laboratorio de Salud Pública Central, en Londres, propusieron unificar también el género Grahamella con el género Barto­ nella, y este último nombre asumió precedencia en la nomen­ clatura.136 Esta unificación condujo a otras cinco especies de Bartonella halladas en los roedores: B. talpae, B. peromysci, B. grahamii, B. taylorii y B. doshiae.'36 Los análisis genéticos mediante técnicas de secuenciación de rRNA 16S e hibridación de DNA confirmaron que Bartonella es el único género en la familia Bartonellaceae. Esta familia reside en el orden pro­ puesto “Rhizobiales”, que está en el subgrupo a 2 de la clase Proteobacteria ,455956 Los familiares cercanos son Afilia, Brucella y Agrobacterium tumefaciens. El descubrimiento de B. henselae y B. quintana como pató­ genos humanos oportunistas, la evidencia para B. henselae como agente causal de la enfermedad por arañazo de gato y la probabilidad de una transmisión a través de vectores de estas bacterias tanto entre animales como entre seres humanos han conducido a estudios extensos sobre la epidemiología de estos microorganismos y sus papeles como patógenos humanos y veterinarios emergentes. Utilizando los enfoques convenciona­ les de cultivo y serológicos, y técnicas moleculares y genéticas nuevas, se han descubierto y descrito varias especies de Bartonella nuevas durante los últimos años. En 1993, se recu­ peró una cepa única apodada B. elizabethae de un paciente con endocarditis.299 En 1996, Drancourt y cois, identificaron un segundo genotipo entre cepas de B. henselae involucradas en la enfermedad del arañazo de gato y la endocarditis, y se propuso dividir a B. henselae en dos genogrupos y serogrupos: B. hen­ selae Houston, 16 S tipo I y B. henselae Marsella, 16S tipo II -sobre la base de secuencias de rDNA 16S y exámenes quimiotaxonómicos de proteínas celulares mediante SDSPAGE.118353 En 1995, Clarridge y cois, publicaron en Houston una descripción de su enfoque de laboratorio para el diagnósti­ co de la enfermedad del arañazo de gato e incluyeron presenta­ ciones de casos de dos pacientes con esta afección.259 Aunque se aisló B. henselae en ambos pacientes, se halló una especie de Bartonella diferente en un gatito que pertenecía a uno de ellos. En 1996, esta cepa recibió el nombre de B. clarridgeiae en honor del doctor Jill Clarridge, y en 1997 Kordick y cois, describieron el primer caso de enfermedad del arañazo de gato causado por B. clarridgeiae ,717.758 Durante una encuesta para determinar la prevalencia de B. henselae en gatos en el área de la Bahía de San Francisco, se aisló otra especie nueva de Bartonella de dos gatos.357 Estas dos cepas tenían una relación entre sí del 97-100% mediante secuenciación de DNA, pero una relación de sólo 68-92% con la cepa tipo (Houston-1) y las otras cepas clínicas de B. henselae. Esta especie nueva fue denominada B. koehlerae. En el año 2000, se aisló una cuarta especie asociada con los gatos (“fi. weissii”) de felinos en Utah e Illinois; este microorganismo era idéntico a otras especies ~"B. bovis”- halladas en el ganado vacuno en Carolina del Norte.119'164 Algunos estudios llevados a cabo en los últimos 10 a 15 años han establecido que las especies de Bartonella constituyen un grupo singular de bacterias hallado en una amplia variedad de animales salvajes y domésticos. Estos animales pueden ser

Especies de Bartonella

¿sintomáticos o desarrollar una enfermedad importante, que incluye una bacteriemia crónica. Los animales infectados siren como reservorios y fuentes potenciales de otras infecciones animales o humanas.162 En 1995, los investigadores del College : Ví'erinary Medicine de la North Carolina State University describieron una especie nueva de Bartonella como causa de endocarditis canina. La caracterización fenotípica y genotípica de e>ie agente confirmó esta relación con el “agente del ratón de ;^mpo". B. vinsonii, y este microorganismo recibió el sombre de B. vinsonii subespecie berkoffii.'63-119 Al parecer, '-^especie representa una causa antes no reconocida de •arritmias cardíacas, endocarditis, miocarditis, síncope y muer­ te súbita en los perros.161 En el año 2000, B. vinsonii subespecie berkhoffii fue detectado mediante análisis de PCR de tejido _ ular como causa de endocarditis humana en un hombre de 35 años, que también tenía contacto con varios animales, incluido un perro.1102 En 1999, se aisló otra subespecie de B. :r.¿ nii. designada B. vinsonii subespecie arupensis, de hemo: s de un ranchero ganadero en Wyoming que presentaba ana enfermedad aguda con un componente neurológico impór­ tame ' Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con B. vinsonii subespecie berkhoffii y con tí. vinsubespecie vinsonii y con cepas de ratones con infección natural.*05 __ .llanda serológica y los estudios de hemocultivo entre mamíferos pequeños, rumiantes y otros miembros de la vida salvaje han conducido a descripciones de varias especies de Ban nella nuevas. Durante los controles epidemiológicos lle_u s a cabo para determinar los reservorios potenciales de íspecies de Bartonella en mamíferos salvajes, otra especie n ■a. denominada B. alsatica, fue aislada en hemocultivos de .: nejos -ah ajes ( Oryctolagus cuniculus) de la región de Alsade Francia cerca del río Rin.557 Las nuevas especies B. shov ii. B. bovis, B. capreoli y tí. birtlesii han sido aisladas en bem cultivos de corzas, de vacas lecheras, renos y mamíferos pequeños, respectivamente.119-120-309 El aislamiento de bartonea> de roedores y otros mamíferos salvajes ha conducido a bus­ car estas bacterias en las poblaciones de garrapatas. Entre los extractos de DNA de 109 garrapatas lxodes ricinos recogidas áe . rzas en Holanda, el 70% contenía secuencias del gen de rRNA 16S para Bartonella o especies estrechamente relacióna­ las con Bartonella."50 También se han detectado secuencias genéticas de Bartonella en extractos preparados de garrapa­ tas Lxodes y Dermacentor recogidas de seis condados de California.221-222 Lu infección por Bartonella es amplia y altamente prevalente en las poblaciones de roedores en diferentes localidades. La especie recientemente descrita tí. tribocorum fue aislada en la sangre de dos ratas salvajes (Rattus norvegicus) que también tueron atrapadas en la región de Alsacia de Francia.558 En un esrudio de campo de siete especies de roedores de 12 regiones r e : gráficas en el sudeste de los Estados Unidos se observaron especies de Bartonella en los hemocultivos del 42,2% de 279 roedores evaluados.724 Estas cepas representaban 14 variantes íenotípicas que se agrupaban en siete grupos filogenéticos, : uarro de los cuales contenían las especies de Bartonella des­ critas antes. Se aislaron especies de Bartonella de la sangre del 1v.5 de 325 Rattus norvegicus y del 11.8% de 92 Rattus rat■: de 13 áreas de los Estados Unidos y Portugal.371 Los análi- r .néticos de los microorganismos aislados en ratas de Perú • en ratas (R. norvegicus) de Louisiana y Maryland mostraron -r-uencias genéticas idénticas a las de B. elizabethae. que ha side aislado en cultivo en un solo caso de endocarditis humana ; Ellis y cois, sugirieron que las especies de Rattus, y tal

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vez otros roedores, constituyen el reservorio para B. elizabet­ hae y que la presencia de anticuerpos contra B. elizabethae entre adictos a drogas intravenosas de las ciudades del interior reflejaba la infección por esta especie de Bartonella y otras relacionadas.277-371 En un estudio de 200 sueros de "personas de la calle" que utilizaban un centro clínico gratuito en el centro de Los Angeles, la seroprevalencia de anticuerpos contra B. eli­ zabethae, B. quintana y B. henselae fue del 13.6%, el 12,5% y el 9,5%, respectivamente.1191 También se han aislado bartonelas en rumiantes salvajes y domésticos de vida libre y en especies de caninos salvajes y do­ mésticos en los Estados Unidos. Chang y cois, aislaron espe­ cies de Bartonella del 49% de 128 reces de ganado vacuno en California y Oklahoma, del 90% de 42 ciervos muía en California y del 15% de 100 alces de California y Oregón.220 Los estudios seroepidemiológicos de la infección por B. vinso­ nii subespecie berkhoffii en 869 coyotes que habitaban tanto en las regiones costeras como interiores de toda California duran­ te 1994 a 1998 encontraron prevalencias de anticuerpos que variaban entre el 51 % en las regiones centrales del estado hasta el 34% en las regiones del sur y el 7% en las regiones del norte.224 La distribución agrupada de seropositividad también sugirió que la infección por tí. vinsonii subespecie berkhoffii era transmitida por vectores entre estos animales. Un estudio epidemiológico reciente se llevó a cabo entre los coyotes del condado de Santa Clara, California, luego del desarrollo de una infección asociada con Bartonella en un niño después de haber sufrido la mordedura de un coyote. Entre 109 coyotes de la costa central de California, el 28% de los animales presentaba una bacteriemia por B. vinsonii subespecie berkhoffii y el 76% tenía anticuerpos específicos de especie.223 El análisis molecu­ lar de secuencias del gen de la citrato sintetasa, rRNA 16S y las regiones espadadoras intergénicas 16S-23S estableció que 6 de los 31 microorganismos aislados eran idénticos a la cepa tipo de B. vinsonii subespecie berkhoffii aislada en un perro con endocarditis, mientras que los 25 restantes eran similares a las cepas aisladas en perros sanos. Sobre la base de estos estudios, es probable que los coyotes sean el principal reservorio salvaje de B. vinsonii subespecie berkhoffii. Siete de los 31 coyotes bacteriémicos también eran seronegativos para los anticuerpos contra Bartonella.223 La participación de B. henselae y B. clarridgeiae en la enfer­ medad del arañazo de gato ha conducido a investigaciones sobre la prevalencia y la patogenicidad de estos microorganis­ mos en gatos domésticos, el reservorio para ambos microorga­ nismos. Algunos estudios han investigado el aislamiento y la detección de estos microorganismos en el torrente circulatorio de los felinos y la seroepidemiología. En un estudio llevado a cabo en San Francisco. Koehler y cois, observaron que el 41% de las muestras de sangre de 61 gatos vagabundos o domésti­ cos tuvieron cultivos positivos para B. henselae: los cachorros tuvieron mayor probabilidad de ser bacteriémicos.705 Chomel y cois, también estudiaron 205 gatos que vivían en el norte de California y observaron que el 39,5% de ellos había sufrido una bacteriemia por B. henselae; el 52% de estos gatos bacteriémi­ cos tenían más de 1 000 UFC de bacterias por mililitro de san­ gre cultivada.243 Entre estos animales, el 81% tuvo una prueba positiva para anticuerpos contra B. henselae y los gatos bacte­ riémicos tenían títulos de anticuerpos más altos que los no bac­ teriémicos. Heller y cois, efectuaron en Francia hemocultivos en 94 gatos extraviados de 10 colonias de gatos y observaron que el 53% de los animales estaban bacteriémicos con una especie de Bartonella.556 De las 50 cepas obtenidas, 35 eran B. henselae o una variante de B. henselae, y 15 eran B. clarrid-

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Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

geiae. Gurñeld y cois, realizaron un estudio epidemiológico en 436 gatos domésticos en Francia y observaron que 5 (1,1%) estaban infectados simultáneamente por B. henselae y B. cla­ rridgeiae , mientras que 2 (0,5%) lo estaban por dos cepas de B. henselae que mostraban variaciones en la secuencia del gen de rRNA 16S.511 En un estudio de 100 gatos de 89 casas en Freiburg, Alemania, el 13% presentaba baeteriemia por B. hen­ selae o una variante de B. henselae.1123 En un estudio de un perro sano y ocho gatos sanos (todos con pulgas) en una única casa, se aisló B. clarridgeiae en un gato dos veces y B. hense­ lae de un segundo gato cuatro veces en un período de 3 años.715 En un período de 16 meses, se aisló B. vinsonii subespecie berkhoffii en el perro en 8 de 10 intentos de cultivo. El propie­ tario de estos animales era seronegativo a pesar de su contacto frecuente con ellos. Los estudios de seroprevalencia también han documentado una tasa alta de infección por Bartonella entre los gatos en distintas partes del mundo. Un examen de sueros de banco pro­ venientes de 592 gatos en el área de Baltimore arrojó una seroprevalencia de B. henselae del 14,7% y un estudio de sero­ prevalencia en Suiza de 728 gatos observó que el 8,3% tenía anticuerpos contra B. henselae, sin ninguna diferencia impor­ tante en la seroprevalencia entre los animales enfermos y los sanos.240’469 En un estudio llevado a cabo en Dinamarca se observó que el 45,5% de 92 gatos de albergues o extraviados tenían anticuerpos contra B. henselae ,244 Es interesante desta­ car que en un estudio seroepidemiológico similar sobre prevalencia de anticuerpos contra Bartonella en gatos domésticos realizado en Suecia se observó que el 25% de 292 gatos tenía anticuerpos contra B. elizabethae, y la máxima prevalencia (46%) se halló en los que vivían en Estocolmo. Los autores señalaron que B. elizabethae fue el agente más frecuente halla­ do en los pacientes humanos de la misma región geográfica.575 También se han buscado especies de Bartonella, sobre todo B. henselae, en las pulgas de los gatos (Ctenocephalides felis), el presunto vector responsable de la transmisión de las bartonelas entre los gatos y posiblemente a los seres humanos. En una encuesta de 113 gatos de albergues en Holanda, el 50% era seropositivo para especies de Bartonella-, el 22% también tenía hemocultivos positivos.115 Siete de 27 extractos de DNA de pulgas extraídas de estos gatos contenían DNA de Bartonella. Chomel y cois, detectaron DNA de B. henselae en el 34% de 132 pulgas extraídas de 47 gatos de residencias para estos ani­ males, el 89% de los cuales eran bacteriémicos por B. hense­ la e 246 Estos investigadores también demostraron que las pulgas extraídas de gatos bacteriémicos podían transmitir B. henselae a gatos sin patógenos específicos. Sin embargo, los gatitos sin patógenos alojados juntos con gatos bacteriémicos que no tení­ an pulgas no se infectaron por B. henselae. Este microorganis­ mo puede multiplicarse hasta cantidades elevadas en la pulga del gato y mantenerse viable en las heces de las pulgas al menos durante 3 días.409 En los gatos, la baeteriemia por B. henselae o B. clarrid­ geiae suele ser asintomática y la presencia de enfermedad manifiesta parece depender de la cepa. Kordick y cois, inocu­ laron 18 gatos libres de patógenos específicos con B. henselae o B. clarridgeiae y observaron que, a pesar de la baeteriemia persistente, los signos y los síntomas clínicos eran mínimos.716 Mediante PCR se pudo detectar DNA de Bartonella en sangre, encéfalo, ganglios linfáticos, miocardio, hígado y riñones de los animales infectados. O'Reilly y cois, inocularon nueve gatos con una cepa de B. henselae virulenta y observaron que todos se volvían bacteriémicos dentro de los 14 días después de la infección; uno se mantuvo bacteriémico hasta 18 semanas

después de la infección.971 Se desarrollaron anticuerpos anti-fí. henselae en todos los animales. En otro estudio de 19 gatos pertenecientes a 14 pacientes con enfermedad del arañazo de gato, 17 tuvieron hemocultivos positivos y 13 mantuvieron positivos los cultivos para Bartonella durante los 12 meses siguientes.720 En un estudio de tres gatos con infección natural en un período de 2 años se observaron bacteriemias recurrentes en los tres con intervalos de 3 a 19 meses entre recaídas.658 Luego de episodios bacteriémicos, también se observaron aumentos en los títulos de anticuerpos específicos de B. hense­ lae. Se demostró que los aislamientos de B. Henselae en mues­ tras seriadas de sangre de los gatos bacteriémicos que se con­ trolaron tenían diferentes polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción con el tiempo. El surgimiento de mi­ croorganismos genéticamente distintos durante picos de bacteriemia recurrente puede contribuir al establecimiento de infec­ ciones persistentes en estos animales. Importancia clínica de las especies de Bartonella

Las especies de Bartonella se asocian con infecciones en el huésped inmunodeprimido, sobre todo en los pacientes con infección por HIV-1. Las infecciones por Bartonella incluyen ahora varios trastornos bien descritos, entre ellos fiebre de las trincheras clásica y urbana, angiomatosis bacilar con afecta­ ción cutánea o sistémica, peliosis hepática, fiebre recurrente con baeteriemia, endocarditis y enfermedad del arañazo de gato. La especie tipo del género Bartonella, B. bacilliformis produce la fiebre de Oroya, una enfermedad febril limitada geográficamente. Los progresos epidemiológicos en relación con estos microorganismos y el aumento de publicaciones sobre distintas especies y sus asociaciones con animales, vec­ tores insectos y enfermedades humanas se deben en gran parte a los excelentes métodos de laboratorio basados tanto en técni­ cas de cultivo “tradicionales” como en técnicas moleculares “de avanzada”.755 FIEBRE DE OROYA Y VERRUGA PERUANA

Estas dos entidades clínicas son manifestaciones de la infec­ ción por Bartonella bacilliformis ,808.809 Estas infecciones son geográficamente restringidas debido a los hábitats limitados del vector principal, la mosca Lutzomyia verrucarum. Se des­ conoce el reservorio del microorganismo, aunque los seres humanos con baeteriemia asintomática pueden serlo. Se obser­ van infecciones en los valles de los ríos de la Cordillera de los Andes occidental, en alturas de entre 600 y 2 400 m en Perú, Ecuador y Colombia. Esta infección también se conoce como enfermedad de Carrión en honor de Daniel Carrión, un estu­ diante de medicina peruano en el que se desarrolló la enferme­ dad después de haberse autoinoculado con material proveniente de una lesión infecciosa. Luego de la mordedura de un vector hembra infectado, los síntomas de la fiebre de Oroya aparecen en 3 semanas a 3 meses, aunque también puede ocurrir una infección asintomática. El inicio de la enfermedad puede ser brusco o insidioso. El paciente puede tener anorexia, cefalea, malestar general y fiebre leve que dura 2-7 días o más. Cuando el inicio es brusco, el paciente puede tener fiebre, cefalea grave, escalofríos y alteraciones del sensorio. Se presenta anemia grave causada por la destrucción de los eritrocitos por los microorganismos. También ictericia, hepatoesplenomegalia y adenopatías generalizadas, junto con dolor muscular y articular intenso.722 Se desarrollan infecciones oportunistas (p. ej., salmonelosis bacteriémica, sepsis por gramnegativos) o infeccio-

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oes latentes reactivadas (p. ej., toxoplasmosis, histoplasmosis) en un 30% de los pacientes causadas por el compromiso de la inmunidad celular. Puede haber disnea, angina de pecho y ne_mocistosis, así como delirio y coma. Durante esta fase, se r_ecen aislar los microorganismos en la sangre y en realidad -r : ' ouede observar en extendidos de sangre dentro de los enirocitos. La infección aguda durante el embarazo a menudo conduce al aborto o a la muerte materna, fetal o ambas. Sin :ento. la tasa de letalidad de la fiebre de Oroya puede ser de hasta un 90%, pero con tratamiento los casos fatales se reducen a menos del 10%. Este estadio “crítico” dura de 2 a 4 semanas, momento en el cual los microorganismos desapare­ cen de la circulación, la temperatura se normaliza y la anemia se corrige. Después de la resolución de la fiebre de Oroya, puede per­ sistir el dolor en los huesos, las articulaciones y los músculos hasta el estadio de desarrollo de la verruga. Esta etapa se caractenza por la aparición de lesiones nodulares sobre las partes expuestas del cuerpo, sobre las mucosas o en los órganos inter­ nos.' Estos nodulos se desarrollan en un período de 1-2 meses y pueden persistir durante meses a años. Las lesiones son de color rojo a púrpura, no son dolorosas a la palpación si no tie­ nen una infección secundaria y pueden presentarse agrupadas. Las "verrugas” pueden ser sésiles, similares a placas, miliares, nodulares, pedunculadas o confluentes.48 En general, el dolor articular y la fiebre ceden después de la aparición de las lesio­ nes cutáneas y la anemia suele faltar durante esta etapa de la enfermedad. En las muestras de tejidos de lesiones de verrugas, se puede observar B. bacilliformis con la tinción de WarthinStarry o de Giemsa y puede ser cultivado de las lesiones cutá­ neas y, en ocasiones, de la sangre y la médula ósea. La fiebre de Oroya ha sido tratada con distintos agentes, entre ellas peni­ cilina, tetraciclina y estreptomicina, y se considera el cloranfenicol como el de elección.809 También se han obtenido buenas respuestas con ciprofloxacina. La estreptomicina era el preferi­ do para el tratamiento de la enfermedad cutánea, pero la rifam­ picina y la ciprofloxacina producen buenas respuestas clínicas y se pueden administrar por boca en lugar de la inyección intra­ muscular. FIEBRE DE LAS TRINCHERAS “ CLÁSICA” Y “ URBANA”

B. quintana es el agente de la fiebre de las trincheras, una enfermedad febril y debilitante transmitida por piojos que afec­ tó a casi un millón de personas, incluido el personal militar ale­ mán y aliado durante la Primera Guerra Mundial. Después de la guerra, siguió apareciendo en España, Francia, Italia, partes de Europa del Este, norte de Africa y China. B. quintana tam­ bién ha sido detectada en piojos obtenidos de regiones de Perú y Sudamérica, donde no se había documentado antes la fiebre de las trincheras.1048 Las pruebas serológicas indican la presen­ cia del microorganismo en Bolivia y México.96 El microorga­ nismo es transmitido por el piojo del cuerpo humano, Pediculus humanis, que ha crecido en prevalencia en todo el mundo durante los últimos 10 a 15 años, sobre todo en los paí­ ses en vías de desarrollo y en áreas de gran desorden social, político y económico, como la ex Unión Soviética y algunas regiones de Europa del Este. La bacteria infecta al piojo, que luego elimina heces cargadas de microorganismos que conta­ minan la herida por mordedura. En los seres humanos, se desa­ rrolla fiebre, malestar general, escalofríos, sudoración profusa y dolor intenso cervical, dorsal y de las piernas después de un período de incubación de 5 a 20 días. Es característica la con­ juntivitis, el dolor retroorbitario y el dolor de las tibias; se ha

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observado esplenomegalia y erupción macular en algunos pacientes. La fiebre puede ceder rápidamente o puede durar 4 a 5 días. Las fiebres que duran hasta 5 días pueden aumentar y disminuir repetidas veces, o la fiebre puede persistir sin ceder durante varias semanas. En general, la enfermedad no es grave y es autolimitada. Los pacientes tienen una rápida respuesta al tratamiento con tetraciclinas, cloranfenicol o ambos. La fiebre de las trincheras “urbana” es una entidad clínica documentada entre personas sin hogar en áreas urbanas. Esta infección se asocia con fiebre, sudores nocturnos, baeteriemia prolongada o intermitente, infestación por piojos y títulos ele­ vados de anticuerpos contra B. quintana. La aparición de una infección por B. quintana entre individuos sin hogar en áreas urbanas ha conducido a investigaciones de fiebre de las trin­ cheras emergente y otras enfermedades transmitidas por piojos entre personas indigentes de varias ciudades.180'181-427 1103 1207 El papel de los piojos del cuerpo en la transmisión de la fiebre de las trincheras urbana ha sido confirmado por varias investiga­ ciones epidemiológicas y de laboratorio. En un estudio, se recogieron piojos de 268 personas en el Centro de Desinfección Municipal de Moscú y se sometieron a análisis por PCR para la detección de la secuencia del gen gltA (citrato sintasa) de B. quintana.1111 Se detectó DNA de B. quintana en el 12,3% de las muestras de piojos estudiadas. Este y otros estudios han confirmado el papel fundamental de P. humanus en la epidemiología de la fiebre reemergente del siglo xxi.961 ANGI0MAT0SIS BACILAR

La angiomatosis bacilar es una infección bacteriana causada por B. henselae y B. quintana que conduce a proliferación vas­ cular difusa inusual; se observa principalmente en pacientes con enfermedad por HIV avanzada.61'276'456,879'1017'1133 Esta infección también ha sido comunicada en pacientes con inmunosupresión sometidos a un trasplante, en los individuos que reciben qui­ mioterapia oncológica y en los pacientes con tratamiento pro­ longado con corticosteroides.11511281 También se la ha diagnos­ ticado en adultos y niños inmunocompetentes.11921260 Los pacientes con SIDA que tienen angiomatosis bacilar suelen tener recuentos de linfocitos CD4 de menos de 200 céluIas/jiL cuando aparecen las lesiones. La enfermedad se distingue del sarcoma de Kaposi y otras neoplasias vasculares en que las lesiones comienzan como pápulas pequeñas que crecen gra­ dualmente para formar nodulos rojos a púrpura violáceos redondeados que tienen un pequeño collar epitelial.264 Las lesiones de sarcoma de Kaposi suelen ser rosa claras a pardas o negras y son similares a placas más que nodulares, aunque sobre algunas superficies corporales, las lesiones de angioma­ tosis bacilar pueden desarrollarse inicialmente como placas induradas e hiperpigmentadas.264 La angiomatosis bacilar y el sarcoma de Kaposi pueden coexistir en el mismo paciente.1214 Las lesiones de la angiomatosis bacilar se desarrollan como lesiones separadas que crecen y coalescen para formar nodulos más grandes. Inicialmente lisas, luego pueden ulcerarse y cubrirse de costras. Algunas se localizan más profundamente en los tejidos subcutáneos (p. ej., hígado, bazo), pueden afectar hueso y médula ósea y formar grandes lesiones osteolíticas.707 La afectación del hueso por la angiomatosis bacilar es casi siempre dolorosa, suele afectar el radio, el peroné y la tibia, y se asocia fundamentalmente con infección por B. quintana.70* Se puede observar una lesión similar a una placa celulítica eritematosa en la piel que cubre y rodea a las lesiones óseas. La afectación visceral puede ocurrir como lesiones vasculares diseminadas o como una peliosis hepática bacilar cuando el

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Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

hígado está afectado. Se han documentado lesiones de angiomatosis bacilar extracutánea en las superficies mucosas de los aparatos respiratorio y gastrointestinal superior e inferior, las conjuntivas y la órbita, el corazón, el diafragma, las vías biliares, los músculos, el hígado, el bazo, los ganglios linfáticos, el apa­ rato genital y el sistema nervioso central.6"-614-704-908-1185 1209-1292 Las lesiones de la angiomatosis bacilar interna pueden volver­ se lo suficientemente grandes como para producir compresión u obstrucción de órganos internos, con signos y síntomas cons­ titucionales que incluyen fiebre, anorexia, vómitos y pérdida de peso. El diagnóstico histopatológico requiere la obtención de biopsias en sacabocados o escisionales para las lesiones cutá­ neas y subcutáneas, mientras se suele utilizar la escisión para las lesiones de asiento profundo. Además de la histopatología, también se pueden enviar biopsias para cultivo y análisis por microscopia electrónica y métodos moleculares. Desde el punto de vista histológico, las lesiones de la angio­ matosis bacilar están compuestas por células endoteliales cuboideas y grandes que revisten los vasos sanguíneos. Estas células se extienden en la luz vascular y se asocian con agrega­ dos de material granuloso purpúrico que representan agolpa­ mientos de bacterias.1208 También existe un infiltrado inflama­ torio denso de neutrófilos. Las lesiones de la angiomatosis bacilar pueden ser diferenciadas histológicamente del sarcoma de Kaposi en que no existe ningún vaso sanguíneo dentado extraño como se observa en este trastorno y el infiltrado infla­ matorio consiste en linfocitos, histiocitos y neutrófilos por opo­ sición a las células plasmáticas.1393 Cuando se tiñen cortes de tejido biopsiado con la tinción argéntica de Warthin-Starry, se observan grumos y masas enmarañadas de bacterias intersticia­ les. Se ha aislado B. henselae y, en algunos casos, B. quintana de la sangre, las lesiones cutáneas, el hueso, los órganos visce­ rales y el encéfalo de pacientes con angiomatosis baci­ lar.707-762-1065-1066-1188-1361 En un estudio de casos y controles de 1997 de 49 pacientes con angiomatosis bacilar en San Fran­ cisco, el 53% estaba infectado por B. henselae y el 47% por B. quintana.10* La infección por B. henselae se conectó desde el punto de vista epidemiológico con la exposición a gatos y pul­ gas de gatos, mientras que la infección por B. quintana se aso­ ció con bajos ingresos, falta de hogar y exposición a piojos. Algunos investigadores y médicos piensan que la angiomatosis bacilar puede ser una manifestación de la enfermedad del ara­ ñazo de gato peculiar del huésped inmunodeprimido.676-706-866 Algunos estudios in vitro de Bartonella han establecido que estos microorganismos pueden estimular la angiogénesis, el proceso fisiológico que conduce a la formación de nuevos vasos sanguíneos y afectar la migración y la proliferación de las células endoteliales.449-703 En general, la angiomatosis bacilar cutánea responde al tra­ tamiento con eritromicina, utilizando una dosis de 500 mg cua­ tro veces por día.1393 El tratamiento antibiótico se debe conti­ nuar por lo menos durante 6 semanas; pueden ser necesarias series más largas dado que las lesiones a menudo recurren des­ pués de suspendido el tratamiento. El tratamiento parenteral puede ser necesario para tratar las recaídas de la infección cutá­ nea y las infecciones diseminadas. Si las lesiones de angioma­ tosis bacilar están limitadas a la piel, pueden escindirse me­ diante cirugía. También se han comunicado buenas respuestas clínicas a otros antibióticos, como rifampicina, tetraciclinas (doxiciclina, minociclina, tetraciclina), otros macrólidos (azitromicina, claritromicina), cloranfenicol, trimetoprim-sul­ fametoxazol, vancomicina, norfloxacina y ciprofloxacina con gentamicina, pero la recaída es frecuente luego de suspendido el tratamiento. Los fármacos que inhiben la biosíntesis de la

pared celular (p. ej., penicilinas y cefalosporinas) no son útiles para el tratamiento de esta afección. PELIOSIS

Antes de la aparición de la epidemia de SIDA, la peliosis de los órganos viscerales internos era rara y sólo había sido des­ crita en pacientes con carcinoma o tuberculosis o en personas tratadas con esteroides anabólicos. La peliosis hepática se caracteriza por la presencia de lesiones quísticas llenas de san­ gre dispersas en la totalidad del parénquima del hígado.1393 Se ha comunicado una cantidad creciente de casos de peliosis que afectan el hígado y el bazo (peliosis esplénica) en asociación con la infección por HIV.708-1002La mayoría de los pacientes con peliosis hepática o esplénica también tienen angiomatosis baci­ lar y, dentro de los quistes hemáticos del hígado y el bazo, con­ tienen bacterias similares a las que se ven en las biopsias de angiomatosis bacilar con la tinción de Warthin-Starry. La mayoría de los pacientes con peliosis hepática bacilar presen­ tan pérdida de peso, dolor abdominal, náuseas intratables, ane­ mia, diarrea, fiebre, hepatoesplenomegalia y linfadenopatía. También se ha comunicado un sangrado intraperitoneal grave con shock hipovolémico como manifestación inusual de la peliosis parenquimatosa bacilar.800 En general, las enzimas hepáticas están elevadas, con concentraciones de fosfatasa alcalina de hasta 5 a 10 veces el valor normal.1002 Se ha comuni­ cado también peliosis baciliar parenquimatosa de otros órganos internos (corazón, laringe, pulmones, glándulas suprarrenales, cuello uterino, ovarios, glándula pineal y plexo coroideo). La peliosis hepática parece estar asociada exclusivamente con la infección por B. henselae y algunos autores piensan que es otra manifestación de la angiomatosis bacilar.826 FIEBRE Y BACTERIEMIA

Se describió bacteriemia por B. henselae en pacientes con HIV. pacientes con SIDA, receptores de trasplantes alogénicos inmunosuprimidos farmacológicamente y huéspedes inmunocompetentes sin factores de riesgo conocidos para enfermeda­ des inmunosupresoras.1057-1187-1361 En los pacientes con SIDA, se detectó bacteriemia por B. henselae en aquellos con angioma­ tosis bacilar focal o peliosis y en los que no las tienen. Los pacientes inmunodeprimidos presentan fiebres recurrentes, pérdida de peso, malestar general y fatiga; la recaída luego del tratamiento es frecuente. En los pacientes infectados por HIV, B. henselae también puede producir una enfermedad inflama­ toria generalizada del sistema reticuloendotelial; se pueden detectar microorganismos histopatológicamente o mediante técnicas moleculares en lesiones inflamatorias y necróticas del bazo, hígado, corazón, médula ósea y ganglios linfáticos.1186 En individuos inmunocompetentes y negativos para el HIV, la bac­ teriemia por B. henselae presenta un inicio brusco con fiebre y dolor articular y muscular asociado; algunos pacientes pueden manifestar signos y síntomas de afectación del SNC (cefalea, fotofobia y meningismo). Se ha documentado serológicamente a B. henselae como causa de “fiebre de origen desconocido” tanto en niños como en adultos.625-1293 Estos pacientes presen­ tan fiebre, anorexia, cefalea y otros síntomas inespecíficos. La bacteriemia persistente por B. quintana era un síntoma reconocido de la fiebre de las trincheras clásica y es una mani­ festación frecuente de “fiebre de las trincheras” reemergente entre los que no tienen hogar y los residentes alcóholicos de entornos urbanos. La fiebre y la bacteriemia producidas por B. quintana fueron documentadas por primera vez en 10 pacien­

Especies de B artonella

tes sin hogar que residían en Seattle y eran negativos para anti-_;rpos contra el HIV pero tenían alcoholismo crónico como enfermedad subyacente.1207 Todos estos individuos se presenta­ ron con fiebre, dos tenían esplenomegalia, dos comunicaron el arañazo reciente de un gato y se desarrolló una endocarditis en uno 'véase más adelante).1206 Brouqui y cois, documentaron baeteriemia por B. quintana en 10 (14%) de 71 pacientes sin n ;ar en Francia.181 Cinco de ellos tenían baeteriemia crónica, . orno lo demostraron los hemocultivos positivos durante varias ^emanas y 8 pacientes con baeteriemia estaban afebriles. Además, el 30% de los pacientes tenían títulos elevados de anticuerpos anti-fí. quintana y se detectaron infecciones recientes (baeteriemia o seroconversión) en 17 pacientes 2En este estudio, fue más probable que los pacientes que no teman hogar y presentaron una baeteriemia por B. quintana hubieran tenido exposición a piojos, y que presentaran cefale­ as. dolor de piernas y recuentos más bajos de plaquetas que aquellos que no tenían baeteriemia ni eran seronegativos para anticuerpos contra B. quintana.m -m Cabe señalar que se detectó DNA de B. quintana mediante PCR en piojos de 3 de 15 pacientes de los que se había recogido. De estos tres pacientes, d - eran bacteriémicos y uno era seropositivo pero no bacterremico. Los estudios serológicos también demostraron una alta prevalencia de infecciones por Bartonella entre adictos a drogas intravenosas que viven en la ciudad. Comer y cois, comunicaron que el 37,5% de las muestras de suero recogidas ne 630 adictos a drogas intravenosas en Baltimore reacciona­ ron al menos con un antígeno de Bartonella (B. henselae, B. quintana o B. elizabethae) mediante ensayo de inmunofluorescencia.277 Hn general, los pacientes inmunocompetentes tienen una res­ puesta rápida a una serie corta (10 días o menos) de tratamiento y no sufren recaídas; en algunos casos, las infecciones se resuelven sin antibioticoterapia.625 Sin embargo, Lucey y cois, informaron sobre dos pacientes inmunocompetentes que pre­ sentaron una enfermedad con recaídas y hemocultivos positi■os para B. henselae .802 Ambos habían sido picados por garrarr.a> antes de enfermarse. Estos dos casos fueron los primeros en los cuales se sugirió una transmisión epidemiológica de B. henselae por insectos. Drancourt, Raoult y otros autores comu­ na aron dos pacientes con baeteriemia y adenopatía mediastíruca crónica de los que se recuperó B. quintana de los cultivos de sangre y médula ósea.355-1049 Se trataba de mujeres de edad —eiia seronegativas para anticuerpos contra HIV, que tenían enrermedades subyacentes (tratamiento con corticosteroides, insuficiencia renal crónica que requería hemodiálisis), tuvieron exposición a gatos, gatitos y pulgas de gatos y fueron tratadas con éxito con aminoglucósidos parenterales.355 1049 Es intere­ sante que ninguna de las pacientes tuvo una respuesta serológiea detectable contra tí. quintana. ENDOCARDITIS

Las especies de Bartonella y B. quintana en particular, han s;do aisladas en varios casos de endocarditis con “cultivo nega: i y o " . 429-518-627' 1206 Se comunicó por primera vez una endocardi­ os por B. quintana en 1993 en un varón homosexual de 50 años infectado por HIV que tenía sudores nocturnos, pérdida de pe-~o y fatiga.1205 En el examen físico, se observó insuficiencia renal leve, esplenomegalia, anemia y un soplo cardíaco holo>:'tólico y el ecocardiograma puso en evidencia vegetaciones en las válvulas mitral y aórtica. Con posterioridad, se docu­ mentó B. quintana como causa de baeteriemia en 10 pacientes .ücóholicos febriles y sin hogar en Seattle; en uno de ellos se

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desarrolló una endocarditis de la válvula aórtica.1206 Aun des­ pués de 21 días de tratamiento, se siguió detectando B. quintana en los tejidos mediante PCR. También se aisló el microorga­ nismo como causa de endocarditis en tres hombres alcóholicos sin hogar de Francia.354 Todos estos pacientes necesitaron el reemplazo de la válvula aórtica mitral. También se ha comuni­ cado endocarditis por B. quintana en un adulto inmunodeprimido.184 En 1993, Hadfield y cois, describieron el primer caso de endocarditis causado por B. henselae en un hombre HIV negativo de 59 años con antecedentes de alcoholismo y otro caso fue comunicado en 1995 en un hombre de 41 años antes sano.520,588 Ambos pacientes requirieron cirugía de reemplazo valvular. Desde entonces, se ha identificado a B. henselae como causa tanto de endocarditis de válvula natural como de válvula protésica en varios pacientes inmunocompetentes.312378-696 B. elizabethae fue reconocido por primera vez como causa de endocarditis en un hombre de 31 años inmunocompetente.299 Esta infección se resolvió con el reemplazo val­ vular y el tratamiento con vancomicina e imipenem. En 1996. Raoult y cois, informaron acerca de 21 casos nuevos de endo­ carditis por Bartonella en pacientes franceses diagnosticados mediante técnicas serológicas, de cultivo y moleculares.1050 De los 22 pacientes, 11 eran alcóholicos, 9 no tenían hogar. 13 pre­ sentaban lesiones valvulares preexistentes y 4 tenían antece­ dentes de exposición a gatos. La mayoría de los pacientes pre­ sentaban vegetaciones en las válvulas aórticas y se desarrolla­ ron complicaciones embólicas en muchos de ellos y todos excepto un paciente requirieron cirugía valvular. Los microor­ ganismos implicados fueron B. quintana (5 pacientes), B. hen­ selae (4) y una especie de Bartonella indeterminada (13). Los últimos 13 pacientes fueron diagnosticados mediante pruebas serológicas que no pudieron distinguir entre B. quintana y B. henselae. En este estudio, la endocarditis por B. quintana se asoció con pacientes sin hogar con alcoholismo crónico, sin daño valvular previo, mientras que la endocarditis por B. hen­ selae ocurrió principalmente en pacientes con patología valvu­ lar preexistente y antecedentes de contacto con gatos. La endo­ carditis por Bartonella ha sido tratada con éxito con combina­ ciones de amoxicilina y gentamicina parenteral, vancomicina parenteral con ofloxacina y netilmicina seguidos de ofloxacina. rifampicina y pristinomicina oral, y con ceftriaxona parenteral seguida de una serie prolongada de eritromicina oral.354 10501207 Las especies de Bartonella también causan endocarditis y otras enfermedades cardíacas en perros. Breitschwerdt y cois, describieron en Carolina del Norte un caso de endocarditis que afectaba las válvulas aórtica y mitral en una perra Labrador retriever de 3 años a la que se le habían extirpado los ovarios.163 Se aisló un bacilo gramnegativo con requerimientos nutricio­ nales especiales de la sangre del perro utilizando el método de lisis-centrifugación, y el DNA extraído de las válvulas cardía­ cas afectadas fue amplificado mediante técnica de PCR y com­ parado con otras especies de Bartonella. La hibridación de DNA, la secuenciación de rRNA 16S, el análisis de ácidos gra­ sos celulares y las pruebas de fenotipificación del microorga­ nismo aislado lo caracterizaron como una nueva especie de Bartonella que se asemejaba más estrechamente a B. vinsonii. Se propuso el nombre tí. vinsonii subespecie berkhoffii para este nuevo microorganismo.719 Este agente representa un nuevo patógeno veterinario que produce arritmias cardíacas, miocar­ ditis y endocarditis en perros y recientemente ha sido comuni­ cado como agente de endocarditis asintomática en un ser humano.1611102 En la actualidad, B. henselae , B. elizabethae y B. clarridgeiae han sido detectados mediante técnicas molecu­ lares en muestras de sangre de perros y recientemente se ha

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Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

recuperado B. clarridgeiae como causa de endocarditis en un boxer macho castrado que tenía un soplo cardíaco sistólico y estenosis grave de la válvula aórtica.247-862 Los cánidos salvajes y domésticos pueden ser reservorios de todos estos agentes.862 ENFERMEDAD POR ARAÑAZO DE GATO

La enfermedad por arañazo de gato es una causa frecuente de linfadenopatía, sobre todo en niños y adolescentes. Se pre­ senta en todo el mundo; la mayoría de los casos ocurren entre septiembre y marzo; en los climas cálidos, las frecuencias pico pueden ocurrir en julio y agosto. Alrededor del 90% de los pacientes tienen antecedentes de exposición a gatos y habrá ocurrido el arañazo o la mordedura de un gato en alrededor del 75-80% de estas personas.97 Los gatos pequeños parecen estar implicados más a menudo que los gatos adultos y la transmi­ sión parece ser por contacto directo, dado que la enfermedad generalmente sigue a la mordedura, el arañazo o la lamida de un gato joven. Alrededor de 3 a 10 días después de que ocurre el arañazo o la mordedura, se forma una pápula eritematosa o pústula primaria. Estas lesiones persisten aproximadamente durante 2 a 3 semanas. Durante este período, se puede presen­ tar fiebre leve en un tercio de los pacientes y se observa males­ tar general y fiebre aproximadamente en el 25% de los casos.97 Alrededor del 25% presenta cefaleas y dolores musculares con odinofagia y se puede observar también una erupción débil que dura 1 a 2 semanas. Se desarrolla linfadenopatía regional en más del 90% de los pacientes cuya localización depende del sitio de la mordedura o el arañazo del gato. Como la mayoría de las lesiones se encuentran en los miembros superiores, la adenopatía suele aparecer en la región axilar, cervical o submandibular. En alrededor del 50% de los pacientes se afectan ganglios aislados. Es frecuente una linfadenopatía no contigua o generalizada y la hepatoesplenomegalia, pero puede confundirse con un proceso maligno (linfoma) cuando se presenta.461-677 Los ganglios linfáticos afectados suelen mostrar granulomas esta­ bles. microabscesos estrellados e hiperplasia folicular. A menu­ do se observan grupos de microorganismos bacilares en cortes de biopsias de ganglios linfáticos que se tiñen con la tinción de im­ pregnación argéntica de Warthin-Starry. En general, los ganglios linfáticos agrandados sufren una regresión espontánea en varios meses, aunque hasta el 20% de los pacientes pueden mostrar lin­ fadenopatía durante 12 a 24 meses. Si bien es infrecuente, la enfermedad por arañazo de gato puede tener presentaciones y complicaciones atípicas. Estas manifestaciones incluyen el síndrome oculoganglionar de Parinaud, que se presenta como un granuloma ocular o conjun­ tivitis con linfadenopatía preauricular, osteomielitis, una masa epitroclear que imita un rabdomiosarcoma. y microabscesos y granulomas hepáticos y esplénicos.51-494-612-1323 En general, el síndrome oculoganglionar es el resultado del arañazo, la lami­ da o la mordida de un gato sobre el párpado o en las conjunti­ vas, aunque también puede ocurrir la autoinoculación desde la lesión primaria en el ojo. La encefalopatía y la meningitis asép­ tica por enfermedad por arañazo de gato son complicaciones raras que pueden ocurrir 1 a 6 semanas después de que apare­ ce la linfadenopatía regional y se caracterizan por encefalitis, convulsiones, mielitis y neuropatía.460-941-1392 El paciente puede tener cefalea, alteraciones de su estado mental, convulsiones, conductas agresivas, entrar en coma. También se ha comunica­ do retinitis asociada con la enfermedad por arañazo de gato, incluido un caso de bacteriemia por B. henselae que condujo a una pérdida visual aguda.797-1392 La enfermedad también puede producir osteomielitis multifocal en sitios que están alejados

del arañazo o la mordedura inicial.728-878 Las manifestaciones pulmonares son excepcionales.821 En general, es una enfermedad autolimitada que no suele responder al tratamiento antibiótico dirigido. A pesar de la sen­ sibilidad in vitro de B. henselae a muchos agentes, su uso para el tratamiento de la enfermedad por arañazo de gato no ha con­ ducido a beneficios claros para el paciente. Sólo los aminoglu­ cósidos y la gentamicina en particular han resultado eficaces en el tratamiento de las complicaciones supuradas de esta enfer­ medad.97-917 Chia y cois, informaron sobre cuatro pacientes que fueron tratados con éxito con una serie de 5 a 10 días de azi­ tromicina, incluido un paciente en el cual el tratamiento con doxiciclina y cefazolina había fracasado.239 El tratamiento exi­ toso con azitromicina puede estar relacionado no sólo con la sensibilidad in vitro de las especies de Bartonella a este agen­ te, sino también con la penetración y la acumulación intracelu­ lar de azitromicina dentro de los neutrófilos y los macrófagos, que conduce a una relación de 40:1 entre la concentración intracelular y la extracelular del fármaco.239-846 La ciprofloxaci­ na también ha sido utilizada con éxito, otra vez presumible­ mente debido a su acumulación intracelular.584 Algunos estudios microbiológicos y serológicos llevados a cabo en los últimos años han establecido que B. henselae es el agente bacteriano responsable de la enfermedad por arañazo de gato. En 1988, English y cois., del Instituto de Anatomía Patológica de las Fuerzas Armadas (Armed Forces Institute of Pathology, AFIP) aislaron un microorganismo gramnegativo de los ganglios linfáticos de 10 pacientes con enfermedad del ara­ ñazo de gato.380 Una de estas cepas más otras tres aisladas en los ganglios linfáticos de niños con la enfermedad fueron caracterizadas mejor en los CDC y se propusieron como el género nuevo Afipia (nombre por AFIP), y el nombre de la especie felis reflejaba su asociación con esta enfermedad. Sobre la base de estos estudios, se postuló que A. felis era el agente causal de la afección. Al mismo tiempo, varios investi­ gadores estaban examinando la etiología de la angiomatosis bacilar, la peliosis y la bacteriemia en pacientes infectados por HIV con nuevos y poderosos métodos moleculares. Utilizando cebadores de oligonucleótidos altamente conservados de los genes 16 rRNA bacterianos, Relman y cois, pudieron demos­ trar y amplificar las secuencias de DNA bacteriano en tejidos de angiomatosis bacilar de pacientes con SIDA y mostraron que estas secuencias estaban genotípicamente relacionadas con especies de Rochalimaea, específicamente R (B.) quintana.'065 Slater y cois, también recuperaron un microorganismo similar a Rochalimaea de hemocultivos de adultos inmunodeprimidos febriles que tenían secuencias genéticas rRNA 16S que eran similares a las descritas por el grupo de Relman.1187 Esta inves­ tigación y otra establecieron que la especie de Rochalimaea recién descrita, R. (B.) henselae, y el antiguo agente de la fie­ bre de las trincheras, R. (B.) quintana, eran las causas de angio­ matosis bacilar, peliosis y bacteriemia en los pacientes con SIDA.1057-1188 En 1992, Regnery y cois, aislaron R. (B.) henselae en la san­ gre de un gato asintomático en dos ocasiones, y utilizando téc­ nicas de anticuerpos inmunofluorescentes, el mismo grupo de investigación demostró que el 88% de los pacientes con enfer­ medad por arañazo de gato tenía títulos elevados de anticuer­ pos contra los antígenos de R. (B.) henselae y no contra antí­ genos de A. felis ,1058-1059 Con posterioridad, varios grupos de investigación utilizaron PCR y técnicas similares para demos­ trar la presencia de DNA de B. henselae y la ausencia de DNA de B. quintana y A. felis en material purulento de los ganglios linfáticos supurados de pacientes con enfermedad por arañazo

Especies de B a rtonella

je gaio.'—U489 Utilizando las técnicas de inmunofluorescencia, ZsngM. ill y cois, observaron que el 84% de 45 pacientes tenían _erpos anti-/?. (B.) henselae, comparado con el 3% de 112 7— entes controles. Además, el 81% de los gatos pertenecien­ te- a pacientes con la enfermedad también eran seropositivos, ; tmparado con el 38% de 29 animales controles.1427 Este estu­ f e ac tnunicó asimismo que el riesgo era mayor para los indi_a_ t - que tenían gatos pequeños que para los propietarios de ga: - adultos, que los individuos que sufrían mordeduras o araü-z - ae gatos cachorros tenían mayor riesgo de la enfermedad jue aaaellos con heridas por gatos adultos y que el riesgo era ma;. t: -i el gato pequeño tenía pulgas.1427 También en 1993, 3 : lan ■cois. aislaron B. henselae de los ganglios linfáticos de a : s rae ¡entes inmunocompetentes con enfermedad por arañazo ir gatc Los bacilos observados en las biopsias de ganglios linfáticos supurados también fueron identificados como B. hen: mediante tinción inmunocitoquímica con anticuerpos anti 5 henselae. Otros estudios han confirmado los citados antes y, a_raae no se ha caracterizado totalmente el papel de A. felis en _ enfermedad, es muy probable que B. henselae sea la causa rrea t manante.116-462 En 1999, A. felis fue aislado en el sistema ae suministro de agua de un hospital francés en asociación con e>ree:es de amebas de vida libre, lo que llevó a los autores a sugerir que los aislamientos anteriores de A. felis en ganglios lunáticos de pacientes afectados por la enfermedad por araña: ae ¿ato en dos ocasiones podían haberse debido a contami­ na-. t n con agua y a procedimientos de esterilización inefica.r- ‘ El papel etiológico de B. henselae en la enfermedad por arañazo de gato ha sido reforzado también por la gran canti­ nea ie estudios epidemiológicos sobre infección con B. hena at en gatos domésticos (véase la sección sobre “Epidemio­ logía’, antes). En 1997, también se describió una segunda especie de Bü k - '.ella, B. clarridgeiae, en asociación con un caso de enfermedad del arañazo de gato.717 En este caso, la enfermedad r ae-arrolló en un veterinario después de que fuera mordido por un gato de 6 semanas de vida. Los hemocultivos recogidos ae. naciente y las pruebas serológicas (IFA) para anticuerpos .: ntra B. henselae, B. quintana y B. elizabethae fueron negatiSin embargo, el suero del paciente mostró reactividad en ana prueba de inmunofluorescencia con una cepa de 5 s r ".ella aislada en hemocultivos obtenidos del gato. También se obtuvo evidencia serológica de una infección por B clarridgeiae en un paciente con enfermedad por arañazo de gaic que tenía síntomas inespecíficos. antecedente de exposi. t n i gatos y arañazos de gatos, y un gran absceso de la pared tara-tea.'21 Aunque los cultivos del paciente se mantuvieron negativos. B. clarridgeiae fue aislado en la sangre de uno de los gat:s de su propiedad. Z~RAS INFECCIONES

Desde el descubrimiento de la asociación de especies de Bar: relia con enfermedad por arañazo de gato, angiomatosis

racüar y peliosis hepática, se han comunicado otras distintas manifestaciones de infección por B. henselae tanto en huéspeaes :nmunodeprimidos como inmunocompetentes. En la mayor.a áe estas infecciones, se documentó una asociación con g-io- pequeños, lo que condujo a una mayor creencia de la :■ sibilidad de que las manifestaciones clínicas infrecuentes de La infección por B. henselae representan parte de una serie continua en la presentación clínica de la enfermedad. Estas mani:e>taaiones incluyeron neurorretinitis sin el síndrome oculogan g ionar de Parinaud. linfadenitis unilateral y difusa aisladas.

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miocarditis grave y enfermedad neurológica asociada con demencia rápidamente progresiva.844 1153 1392 Meininger y cois, describieron el caso de un hombre sano en el cual se desarrolló miocarditis activa crónica debida a B. henselae que condujo a insuficiencia cardíaca y a la necesidad de un trasplante cardía­ co.851 La asociación de Bartonella con demencia por SIDA fue dilucidada por un estudio serológico llevado a cabo en Los Angeles por Schwartzman y cois, en el cual se halló que tanto poseer un gato como padecer deterioro neuropsicológico y demencia se asociaban significativamente con la presencia de anticuerpos IgM contra B. henselae.'152 Cañiza y cois, descri­ bieron un caso de una infección pulmonar oportunista debida a B. henselae en una mujer de 19 años receptora de un trasplan­ te renal.197 El tejido de los nodulos pulmonares de esta pacien­ te fue negativo en el cultivo pero contenía rRNA 16S específi­ co para R. henselae por PCR. Los ocho gatos domésticos que vivían con ella tenían hemocultivos positivos para B. henselae; el análisis de PCR estableció que las cepas aisladas en felinos eran idénticas a las halladas en el tejido pulmonar de la pacien­ te. La infección por B. henselae también ha sido responsable de inflamación intraocular y retiniana, y del edema de papila que conduce a pérdida sustancial de la agudeza visual.1337 Golnick y cois, informaron de cuatro pacientes que presentaron pérdida de visión como resultado de una inflamación intraocular, tume­ facción del nervio óptico y desprendimiento de retina.482 Los pacientes tenían títulos elevados contra B. henselae y respon­ dieron al tratamiento con mejorías resultantes en la visión. También se diagnosticó neurorretinitis en un paciente con prue­ bas serológicas de infección por B. elizabethae.960 En un caso inusual, se diagnosticó neurorretinitis bilateral acompañada por cefalea intensa y cambios conductuales en una mujer de 55 años con diabetes mellitus insulinodependiente e hipotiroidismo. El análisis mediante PCR del DNA extraído del líquido intraocular puso en evidencia la presencia de una secuencia genética de rRNA 16S que mostraba una homología del 100% con B. grahamii, una especie que se encuentra normalmente en roedores de Europa y América del Norte.680 La paciente, que era propietaria de un perro pero no tenía antecedentes de expo­ sición a gatos, roedores u otros animales, también tenía prue­ bas serológicas de infección por B. henselae por EIA, que pro­ bablemente se debió a una reactividad cruzada con B. graha­ mii. La paciente respondió al tratamiento con doxiciclina y rifampicina oral diarias durante 4 semanas. También se han diagnosticado infecciones infraorbitarias y retinianas por B. henselae mediante la detección de DNA en muestras introculares.482-1350 Detección, aislamiento e identificación de especies de Bartonella TIPOS DE MUESTRAS

Las muestras que pueden ser remitidas para el aislamiento de especies de Bartonella incluyen sangre, biopsias de lesio­ nes sospechosas de angiomatosis bacilar cutánea o sistémica, biopsias de ganglios linfáticos y material obtenido por aspi­ ración. Las muestras recogidas al comienzo del cuadro clíni­ co son preferibles, sobre todo las de biopsias de ganglios lin­ fáticos de pacientes con sospecha de enfermedad por arañazo de gato. Es posible que los ganglios linfáticos supurados en estadio tardío no arrojen microorganismos debido a la inten­ sa respuesta inmunitaria celular local.60 Las muestras titulares deben ser homogeneizadas y sembradas en medios de cultivo. Se ha comunicado que los métodos de lisis-centrifugación aumentan la recuperación de estas bacterias con requerimien­ tos nutricionales especiales de las muestras de sangre. Tam­ bién se puede remitir la sangre en tubos estériles con litio y

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Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

heparina. Con las muestras de sangre heparinizadas, el con­ gelamiento de la sangre y luego su descongelamiento a tem­ peratura ambiente antes de la siembra directa también puede aumentar el aislamiento. Como los microorganismos produ­ cen poco o ningún C 0 2 durante el crecimiento, la detección de especies de Bartonella en sistemas de hemocuitivo auto­ máticos (p. ej., BACTEC; Bacti/Alert) puede ser problemáti­ ca. Se ha aislado el microorganismo en frascos PLUS 26 de resina aerobia y alto volumen BACTEC, aunque los microor­ ganismos no registraron índices de crecimiento por encima del umbral positivo.802 Por lo tanto, se ha recomendado la tin­ ción de los extendidos preparados de los frascos inoculados con la tinción fluorescente de naranja de acridina después de 8 días de incubación.349-748 CULTIVO

Se pueden aislar especies de Bartonella sembrando en medios de agar apropiados o mediante el cocultivo en cultivo celular. Los métodos de cultivo celular se realizan con frascos para centrifugación que contienen una monocapa de células endoteliales humanas (p. ej., línea celular ECV 304) u otros tipos celulares (p. ej., células Vero, células HeLa, células L292).354’707-1049-1428 Las muestras procesadas con esta técnica han incluido biopsias de lesiones cutáneas y óseas de angio­ matosis bacilar y sangre heparinizada. Koehler y cois, utiliza­ ron una línea de células endoteliales bovinas (células CPA, línea celular ATTC #207) para aislar tanto B. henselae como B. quintana de biopsias de tejidos triturados de lesiones de angio­ matosis bacilar.707 Después de 9 a 36 días de incubación, los sobrenadantes turbios del cultivo fueron subcultivados en medios de agar para su crecimiento e identificación ulteriores. Drancourt y cois, utilizaron células ECV 304 (una línea de células endoteliales humanas continuas) para recuperar B. quintana de muestras de sangre de pacientes sin hogar que pre­ sentaban endocarditis.354 Con esta técnica, se pueden detectar los microorganismos en el frasco con cubierta mediante inmunofluorescencia y se los puede identificar por PCR u otras téc­ nicas moleculares. También se ha realizado una recuperación con enriquecimiento en caldo de especies de Bartonella con un medio definido que contiene RPMI 1640 (un medio líquido tipo cultivo tisular) suplementado con hemina, aminoácidos y piruvato.1388 Este medio fue utilizado para recuperar con éxito B. henselae de sangre humana y de gatos y de las biopsias de ganglios linfáticos de pacientes con enfermedad por arañazo de gato. Los métodos de cultivo basados sobre agar incluyen el culti­ vo en agar infusión de corazón que contiene sangre de caballo o de conejo al 5%. Los agares BH1 suplementados con sangre, tripticasa de soja y Columbia y el agar chocolate enriquecido también pueden favorecer el crecimiento. Los medios recién preparados son esenciales para un desarrollo óptimo. No exis­ ten medios selectivos y no se deben utilizar medios que contie­ nen antibióticos. Las placas inoculadas se incuban en una atmósfera húmeda a 35 °C a 37 °C como mínimo durante 21 días, aunque algunas cepas de Bartonella pueden requerir hasta 45 días antes de que se aprecie la proliferación.755 Los subcultivos obtenidos de cultivos primarios de crecimiento lento pue­ den requerir 15 a 20 días antes de obtener un buen aislamiento. La mayoría de las bartonelas no crecen en condiciones anaero­ bias, a temperaturas de 25 °C o 42 °C o en ausencia de hemina y C 0 2. B. bacilliformis es excepcional, ya que esta especie se desarroolla mejor con temperaturas más bajas (25-28 °C) y no requiere suplemento de C 0 2 para el aislamiento.

TINCIÓN DE GRAM Y MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS

En aislamiento primario, las especies de Bartonella aparecen inicialmente como pequeñas colonias adherentes blancas que varían en tamaño y forma. Algunas cepas de B. henselae , B. quintana y B. elizabethae pueden deprimir la superficie de agar durante su crecimiento. En forma característica, las colonias de B. henselae son blancas, secas, adherentes, “similares a una coliflor’-, están introducidas en el agar y son morfológicamen­ te heterogéneas. Con múltiples pasajes, las colonias se toman menos secas, menos adherentes, más grandes y tienden a proliferar más rápido. Las colonias de B. elizabethae se asemejan a B. henselae excepto en que se puede observar una hemolisis débil o parcial alrededor de las colonias que crecen en agar infusión de corazón con sangre de conejo al 5%.299 Las colo­ nias de B. bacilliformis difieren de las otras especies en que son inicialmente pequeñas, lisas y translúcidas y se mantienen así en un subcultivo seriado. En la tinción de Gram, los microor­ ganismos Bartonella aparecen como pequeños bacilos gram­ negativos pleomorfos y ligeramente curvos que miden aproxi­ madamente 1-2,5 por 0,5-0,6 Jim y muestran una motilidad con “contracciones” cuando se realiza un montaje en solución salina. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN

En general, las especies de Bartonella son bioquímicamente inertes y no reactivas en las pruebas de identificación de rutina, entre ellas, las pruebas de oxidasa, catalasa, indol, ureasa, des­ carboxilasa y reducción de nitrato. Existen varios métodos pre­ suntivos y definitivos para la identificación de especies de Bartonella, entre ellos, métodos fenotípicos, métodos quimiotaxonómicos que utilizan análisis de ácidos grasos y técnicas moleculares (p. ej., PCR, secuenciación de ácidos nucleicos). Se han evaluado anticuerpos monoclonales específicos de especies para la identificación rápida de B. quintana.1’’6 La identificación presuntiva de especies de Bartonella, como B. henselae, B. quintana y B. vinsonii, puede determinarse con sistemas de identificación comerciales que utilizan sustratos enzimáticos cromogénicos para detectar enzimas bacterianas preformadas (p. ej., Microscan Rapid Anaerobe Panel, tarjeta de identificación para Neisseria-Haemophilus Vitek, panel IDS RapID ANA II, panel API AnIDENT. panel Microscan HNID).1360 Estos sistemas produjeron patrones singulares de reacciones bioquímicas dentro de sus propias bases de datos, pero sólo las reacciones en el Microscan Rapid Anaerobe Panel pudieron diferenciar las especies B. henselae y B. quintana. Este panel distinguió todas las especies evaluadas y generó códigos de biotipos singulares para cada una (cuadro 9-14). Las especies de Bartonella pueden identificarse mediante análisis de cromatografía gas-líquido de los ácidos grasos celu­ lares (véase cuadro 9-14).1361 Todas las especies de Bartonella contienen más de 50% de isoácidos C18:1, 16-25% de C 180y 16-22% de C16:0, con cantidades menores de ácidos grasos C13., y C 17:0. Las cepas de B. henselae carecen de ácidos grasos C150 y C 12:0, que están presentes en cepas de B. vinsonii y B. baciíliformis, respectivamente. B. quintana pudo ser diferenciada de la mayoría de las cepas de B. henselae por la presencia de me­ nos del 20% de Cl8.0en B. quintana y más del 20% de C18.0en B. henselae. La composición de los ácidos grasos celulares de B. elizabethae es muy similar a la de B. vinsonii e incluye C150 (no hallado en B. henselae o B. quintana) y cantidades más grandes (21%) de C l70que B. henselae (3%), B. quintana (1%) y B. vinsonii (9%). B. elizabethae también contiene cantidades más pequeñas del ácido graso celular C160(13%) que la otra

Cuadro 9 -1 4

C aracterísticas bioq uím icas para l:i idciil ideación ele esp ecies
H. VINSONNII

li. VINSONNII

B. G RAH AM II

S U B E S P E C IE

S U B E S P E C IE

S U B E S P E C IE

Ii. E LIZA B ETH A E

B. CLARIOGEIAE

VINSONII

BERKHO FFII

ARU PENSIS

35-37 °C

35-37 °C

35-37 °C

35-37 °C

3 5-37 °C

3 5-37 °C

3 5-37 °C

-

-

+d

-

-

-

-

-

-

V

-

-

-

-

V

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+

V

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V

-

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-

-

-

-

-

-

-

B. BACILLIFORM IS

B. QUINTANA

B. HEN SE LA E

2 5 -3 0 °C

3 5 -37 °C

H em olisis

-

O xidasa Catalasa

C A R A C T E R ÍS T IC A Temperatura óptim a de crecim iento

R educción de nitrato U reasa

-

-

-

-

-

-

-

-

-

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-

-

-

-

-

-

-

-

-

A ceto ín a

-

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-

-

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-

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F lagelos

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-

-

M o tilid a d en c o n tra c cio n e s

-

+

+

-

-

-

-

-

-

c 18:1 >7C, c 16:0, c *“ 18:0

C 18:1 (o7C, C 18:0,

c 18:lco7C, c 16:0, c 18:0

ND

G lucosa 0 / F “

c 18:1 >7C, ^c1 6 :0 , c 16:l
P rin cip ales ácid o s g ra so s celu lares

g

g

r

c 18:1«)7C, c 17:0, c 16:0

c 18:lco7C, c 18:0,

c—17:0. c 16:0, c 15:0

16:0

C 18:I(1)7C, C 18:0, c c '-'1 5 :0

16:0,

C 18:lco7C, C 16:0,

c 17:0, c 18:0

+

V

+

+

ND

ND

+

+

+

L -argin in a-p -n aftiiam id asa

+

+

+

+

+

ND

+

+

+

G licina-(i-naftilam idasa

+

+

+

+

+

ND

+

+

+

G lic ilg lic in a -p -n a ftilam id asa

+

+

+

+

ND

ND

+

+

+

L-leucina-P-naftilam idasa

+

+

+

+

ND

+

+

+

+

L -lic in a-p -n a ftila m id a sa (ácida)

+

-

+

ND

ND

-

+

-

L -lic in a-p -n a ftila m id a sa (b ásica)

+

D L -m etio n in a-p -n aftilam id asa

+

L -p ro lin a-p -n altilam id asa

+

+

ND

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+

+

+

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ND

ND

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-

+

V

V

+

-

L-pirrolidonil-P-naftilamidasa

-

-

-

-

ND

-

-

-

-

L -trip tó fan o -p -n aftilam id asa

+

+

+

+

ND

ND

+

+

+

“Oxidación/fermentación de glucosa. + : reacción positiva; : reacción negativa;

r:

reacción variable;

Especies de Bartonella

/¡/v-/;-nitrofem l-fosfato

+'1: reacción positiva débil; ND: datos no disponibles.

483

484

C A P ÍT U L O 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

especie, que contiene desde 17% hasta 20% de ácidos grasos celulares C16:0.299 La identificación definitiva de las especies de Bartonella se logra mejor mediante los métodos moleculares de amplifica­ ción. Se ha utilizado con éxito para este objetivo la amplificación mediante PCR de distintos genes (p. ej., citrato sintasa, proteí­ nas de choque térmico, genes de síntesis de riboflavina, genes de la división celular) o el análisis de las regiones espaciadoras intergénicas de rRNA 16S-23S y el análisis de las endonucleasas de restricción de los amplicones.69-641-823-1431 Matar y cois, utilizaron PCR junto con cebadores en los genes de rRNA 16S y 23S para amplificar la región espaciadora entre el gen de rRNA 16S y una parte del gen de rRNA 23S, seguido por esci­ sión de las enzimas de restricción Alul y Hae III.830 Este enfo­ que condujo a perfiles de restricción característicos para B. bacilliformis, B. vinsonii y B. quintana, y dos perfiles para B. henselae, lo que sugiere que puede ser un método útil tanto para la identificación de especies de Bartonella como para la subtipificación de cepas de B. henselae. La amplificación de parte del gen de citrato sintasa (gltA ) seguida de la digestión y el análisis de enzimas de restricción se ha utilizado para iden­ tificar tanto especies de Bartonella como de Rickettsia perte­ necientes a los grupos del tifus y la fiebre manchada.641-946 1057 Utilizando este método, Joblet y cois, observaron que la ampli­ ficación del gen gltA seguida de la digestión con enzimas de restricción Taql y Acil permitía la diferenciación de las distin­ tas especies de Bartonella -641 Birtles y Raoult determinaron la secuencia de un fragmento de 940 pares de bases del gen que codifica la citrato sintasa (gtlA ) y observaron que estas secuen­ cias también eran útiles para construir árboles filogenéticos para determinar las relaciones entre especies de Bartonella descritas en forma válida y cepas de Bartonella no caracteriza­ das.37 Se han delineado análisis filogenéticos similares por aná­ lisis de secuencia del gen de la proteína de choque térmico de 60 kDa, groEL ,823 También se designaron oligonucleótidos cebadores sobre la base de diferencias localizadas en la secuen­ cia dentro de la región de DNA ribC (genes de síntesis de ribo­ flavina). Luego se utilizaron estas secuencias para desarrollar ensayos de PCR específicos de especies para la identificación de B. henselae, B. quintana, B. bacilliformis y B. clarrid­ geiae. 112 Jensen y cois, crearon un método de identificación que utilizaba PCR para amplificar la región espaciadora intergénica de rRNA 16S-23S.637 Este procedimiento condujo a produc­ tos de tamaño singular para cada especie de Bartonella, lo que permitió la diferenciación de las especies sin necesidad del análisis de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) o la secuenciación de amplicones. Rodríguez-Barradas y cois, idearon un método similar de iden­ tificación mediante PCR de “elementos repetitivos’" utilizando cebadores derivados de secuencias de consenso extragénicas o intergénicas repetitivas.1080 Como estas secuencias ya existen en múltiples copias discontinuas que conducían a múltiples amplicones discontinuos luego de la amplificación, el trata­ miento ulterior con endonucleasas de restricción antes de PAGE no fue necesario. Utilizando DNA extraído de microor­ ganismos cultivados, este método pudo identificar diferentes especies de Bartonella y también pudo utilizarse para la subti­ pificación de cepas de B. henselae .1080 Handley y Regnery, en los CDC, comunicaron un método de identificación depen­ diente de la PCR basado sobre la amplificación de segmentos escindidos con endonucleasas de restricción.535 Las enzimas utilizadas en este procedimiento condujeron a fragmentos grandes que pudieron ser templados con cebadores correspon­ dientes a secuencias de bases adyacentes a los sitios de restric­

ción de las endonucleasas para la PCR y la resolución posterior mediante PAGE. También se describieron varios métodos de identificación mediante PCR que explotan variaciones de las secuencias de base específicas de especie en el operón rDNA 135 , 30 2 , 83 7 , 9 5 6 , 1065,1124

Además de la confirmación mediante cultivo, se han desa­ rrollado enfoques moleculares para la detección directa de especies de Bartonella en muestras clínicas. Matar y cois, informaron de un método de PCR-RFLP para la detección e identificación simultáneas de bartonelas directamente de mues­ tras clínicas, que incluían biopsias y material de aspiración de ganglios linfáticos, piel, nodulos subcutáneos y otros tejidos.829 Este método involucró el uso de cebadores de PCR de regiones conservadas del gen de rDNA 16S, seguidas de la digestión con endonucleasas de restricción Ddel y Mse I y el análisis de los amplicones. Sander y Penno utilizaron PCR para generar amplicones biotinilados de la región del gen de rRNA 16S e inmovilizaron los amplicones en celdas de microtítulos reves­ tidas con estreptavidina. La hibridación de los amplicones con sondas de oligonucleótidos de rDNA 16S marcadas con digoxigenina específica de especie y el agregado ulterior de peroxidasa antidigoxigenina en un formato de EIA modificado pro­ porcionó la rápida identificación tanto de B. henselae como de B. quintana ,1124 Este método pudo detectar y cuantificar ambas especies directamente en muestras clínicas en concentraciones de tan solo 103 UFC/mL. Avidor y cois., evaluaron la amplifi­ cación de genes de rRNA 16S mediada por PCR seguida de la hibridación con sonda de B. henselae con la amplificación basada sobre PCR de gltA (citrato sintasa) o htrA (genes de las proteínas de choque térmico) y del análisis de RFLP de ampli­ cones para la detección directa de B. henselae en muestras clí­ nicas.69 Se detectó DNA de B. henselae en el 100% de 32 muestras de pus y ganglio linfático por el método de identifi­ cación de PCR de rRNA 16S/sonda y en el 94% y 69% por los métodos de g/M/RFLP y /;írA/RFLP, respectivamente. Estos investigadores sugirieron que las pruebas directas por g/fA/RFLP eran preferibles y más fáciles, ya que no era nece­ saria la hibridación especie-especie (a través de la sonda) con este método.69 Diagnóstico serológico de las infecciones por Bartonella

Como es difícil aislar las especies de Bartonella en cultivo, se han utilizado métodos serológicos para documentar infec­ ción por estos microorganismos. Regnery y cois, desarrollaron en los CDC un ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para B. henselae y observaron que el 88% de los pacientes con enfermedad por arañazo de gato tenían títulos de anticuerpos anti-fi. henselae de 64 o mayores.1059 En 1995, Dalton y cois., también en los CDC, cultivaron simultáneamente B. henselae, B. quintana y B. elizabethae en monocapas de células Vero y utilizaron estos microorganismos para preparar portaobjetos para las pruebas de inmunofluorescencia.298 De 91 pacientes cuya enfermedad cubría una definición clínica estricta de enfermedad por arañazo de gato, el 95% tenía títulos de inmu­ nofluorescencia de 64 o mayores contra B. henselae o B. quin­ tana. Como B. quintana no había sido asociado con la enfer­ medad por arañazo de gato, se creyó que los títulos positivos contra B. quintana representaban reacciones cruzadas serológi­ cas entre las dos especies. Sólo se observaron reacciones cru­ zadas entre B. elizabethae y las otras dos especies de Bartonella con muestras que tenían títulos extremadamente altos contra B. henselae o B. quintana. Los microorganismos B. bacilliformis cultivados simultáneamente con células Vero tam-

Especies de B artonella

r:e~ >e utilizaron para desarrollar una prueba de inmunofluorescencia para el diagnóstico de bartonelosis en regiones endé—. . . de Sudamérica. Se observó que la prueba tenía una sen■ :..::-d del 82% para detectar anticuerpos en sueros de fase de 106 pacientes con bartonelosis positiva en portaobje:: - microorganismos observados en eritrocitos en el extendido t'.r. teñido con Giemsa), positiva por PCR o confirmada por - - n - : ; ■Sobre la base de la prevalencia puntual elevada del 45 o observada antes del período de estudio y, durante su transla prueba de inmunofluorescencia tuvo un valor predict r . : positivo del 89%. Sergmans y otros autores en Holanda evaluaron la detección je IgM e IgG anti-fi. henselae utilizando IFI y EIA como te—amientas para el diagnóstico de enfermedad por arañazo de gút: \ observaron una variabilidad importante dependiente ie la fuente de los antígenos bacterianos para la preparación de ~ r rtaobjetos con inmunofluorescencia. 117 En este estudio, examinaron los sueros de 21 pacientes con "posible enferpor arañazo de gato” (pacientes que cumplían sólo uno óe cuatro criterios clínicos) y 22 con enfermedad "probable” entes que cumplían dos de cuatro criterios clínicos). : _undo se utilizaron como antígeno para la prueba de inmunocencía células de B. henselae cocultivadas en células Vero, a sensibilidad de la detección de IgG fue sólo del 31,8% los sueros de pacientes con "enfermedad probable” y del 35.3% para los pacientes con “enfermedad posible”. Cuando se snlízc B. henselae aislado en medios de agar como antígeno de inmunofluorescencia, las sensibilidades correspondientes del ensayo para los dos grupos de pacientes fueron del 40,9% y el 14.3%. respectivamente. También se observaron sensibilidades ir menos del 50% para las determinaciones de IgM que se reapor inmunofluorescencia en ambos grupos de pacientes, -eependientemente de que se utilicen como antígenos micro-gemsmos B. henselae aislados en agar o cocultivados. Se e _ .aron las especificidades de los ensayos de IgG e IgM uti:_nio sueros de donantes de sangre sanos y variaron entre el -r c< ;■ el 100%. Estos investigadores arribaron a la conclusión ir :_e se necesitan otros estudios antes de poder utilizar con¿úblemente inmunofluorescencia como método para el sero: -.r.óstico de enfermedad por arañazo de gato. En su comunin de endocarditis por B. quintana en tres hombres sin ■: gar. Drancourt y cois, observaron que los tres tuvieron títu. : ' titos de IgG contra B. quintana por una técnica de inmunof]. rescencia.354 Los títulos fueron más altos cuando las célute B. quintana utilizadas para el procedimiento eran cocult _zt< en la línea de células endoteliales ECV (títulos de 6 - • -. 2 800) que cuando provinieron de cultivos que crecieron r- _gar sangre de carnero al 5% (títulos de 400-800). Se dispone de diversos portaobjetos comerciales para inmun fluorescencia preparados con B. henselae derivados de agar vrr.gre o asociados con células. Zbinden y cois, estudiaron dos - 'temas comerciales de IFI que utilizan microorganismos deriados de agar sangre (MRL-BA, MRL Diagnostics, Cypress, I A. Yirion Institut, Virion, Suiza) y microorganismos asociaá > con células (portaobjetos MRL Vero/ Bartonella IgG S-t'strate. MRL Diagnostics; portaobjetos para B. henselae Bton. Bios, Alemania).1429 Estos portaobjetos comerciales fueron comparados con la inmunofluorescencia del laboratorio que utilizaba B. henselae cocultivada con células Vero como ¿r.tígeno. En general, los sistemas que utilizaron antígeno de B. henselae aislado en agar mostraron títulos más altos (menos r-recificidad) que los que utilizaron microorganismos asociaz > con células. Se comparó luego el sistema B. henselae '•'RL-Vero aislado con el sistema del laboratorio. Utilizando

485

un título de corte de 256 y sueros de 26 pacientes con enfer­ medad por arañazo de gato y 240 controles, el sistema MRLVero IFA mostró una sensibilidad del 84.5% y una especifici­ dad del 93,4%.1429 Se observaron resultados similares en una segunda evaluación de la prueba MRL IFA.836 También se ha evaluado EIA como método serológico para el diagnóstico de enfermedad por arañazo de gato. Barka y cois., en Speciality Laboratories (Santa Monica. CA). desarro­ llaron un EIA para la detección de IgG. IgM e IgA específicos utilizando células de B. henselae aisladas en agar como antíge­ no de fase sólida.92 De las muestras de suero de 40 casos con­ firmados de enfermedad del arañazo de gato (por historia clíni­ ca, cultivo o histopatología), 38 (95%) tenían concentraciones elevadas de anticuerpos contra B. henselae. Aunque ninguno de los 40 pacientes de este estudio tuvo IgM o IgA específicos contra B. henselae en ausencia de IgG, los autores afirmaron que habían observado IgM específica contra B. henselae como el único marcador en algunos pacientes y que ocurre seroconversión de IgG en presencia de IgM en un período de 2 a 3 semanas.92 No se observaron resultados positivos de EIA en ninguno de las 92 muestras de pacientes con títulos altos docu­ mentados de anticuerpos contra otros agentes, que incluyen Afipia felis, Rickettsia typhi, Rickettsia rickettsii, Borrelia burgdorferi, Yersinia pestis, Chlamydia trachomatis, virus de la

rubéola y citomegalovirus. Varios factores influyen sobre la capacidad de las pruebas serológicas para proporcionar un diagnóstico de infecciones por Bartonella y no todos están claros en la actualidad. En los pacientes con infección por HIV y manifestaciones de infec­ ciones por Bartonella, es posible que no se observe una res­ puesta importante de anticuerpos debido a la inmunosupresión relacionada con el HIV. La falta de una respuesta de anticuer­ pos también se ha observado en pacientes inmunocompetentes, como lo demuestra la ausencia de una respuesta de anticuerpos en un huésped con linfadenopatía crónica y hemocultivos posi­ tivos para B. quintana .1049 La falta de detección de anticuerpos también puede deberse a la heterogeneidad antigénica de los propios microorganismos. Se han aislado cepas antigénicamente diferentes de B. henselae en pacientes con endocarditis y en gatos; estas cepas no sólo eran serológicamente distintos, también eran diferentes por los perfiles proteicos y las secuen­ cias de rDNA 16S.118353 Sander y cois, investigaron hace poco la antigenicidad de la flagelina (FlaA) de B. clarridgeiae, la única especie de Bartonella que tiene flagelos.1126 Se detecta­ ron anticuerpos contra FlaA en el 3,9% de 724 muestras de suero de pcientes con enfermedad por arañazo de gato, linfa­ denopatía o ambas y en ninguna de 100 muestras de suero de controles sanos. Con el reconocimiento de B. clarridgeiae como posible agente de la enfermedad por arañazo de gato, la detección de anticuerpos contra FlaA puede ser útil para el diagnóstico de la enfermedad causada por esta especie. Utilizando la tecnología del DNA recombinante, se ha aislado una proteína de 17 kDa de B. henselae que es específicamente reactiva con sueros de pacientes con enfermedad por arañazo de gato y puede tener valor como reactivo serológico diagnós­ tico.33 También se puede demostrar una respuesta inmunitaria celular proliferativa específica de B. henselae de pacientes con enfermedad por arañazo de gato que tienen antígenos de B. henselae.60 Este ensayo puede ser útil para el diagnóstico de los casos en los cuales los resultados serológicos son ambiguos. También se han observado reacciones cruzadas serológicas entre las especies de Bartonella y otros microorganismos, que incluyen Coxiella burnetii (el agente causal de la fiebre Q) y especies de Chlamydia ,354.754.832 En los pacientes con endocar­

486

C A P ÍT U L O 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

ditis por B. quintana, se observaron títulos mayores de 256 contra C. pneumoniae y títulos de 64 contra C. psittaci y C. trachom atis354 Aunque la adsorción de muestras de suero con C. pneumoniae no redujo los títulos contra B. quintana, la adsor­ ción de esta última negativizó satisfactoriamente la reactividad contra C. pneumoniae. En otro estudio, más del 50% de los pacientes con fiebre Q crónica tenían títulos importantes de anticuerpos contra B. henselae. Los estudios de adsorción cru­ zada e inmunoprecipitación (immunohlot) establecieron que la reactividad con B. henselae era el resultado de reacciones cru­ zadas con anticuerpos contra C. burnetii: la adsorción de suero con C. burnetii eliminó la reactividad con antígenos de B. hen­ selae, mientras que la adsorción con B. henselae sólo eliminó la reactividad contra B. henselae.154 La adsorción de sueros con C. pneumoniae o B. quintana eliminó los anticuerpos contra C. pneumoniae, mientras que la adsorción con C. pneumoniae no cambió los títulos contra B. quintana.932 En el caso de la endo­ carditis por Bartonella, los títulos específicos pueden ser altos y los títulos contra otros agentes son significativamente más bajos, lo que sugiere que no ocurren diagnósticos erróneos siempre que se busquen simultáneamente anticuerpos contra todos estos agentes. Como ya se mencionó, el suero con títulos altos contra B. henselae también puede reaccionar en forma cruzada con otras especies de Bartonella. Se han realizado estudios de seroprevalencia para especies de Bartonella en varias poblaciones humanas. En un estudio llevado a cabo en Suecia, Holmberg y cois, examinaron 126 muestras de suero que habían sido remitidas para serología de Bartonella y 100 muestras de suero de donantes de sangre sanos (controles) utilizando un método de inmunofluorescencia (título positivo > 64).587 Entre estas muestras, el 4% de los 100 controles y el 8,3% de las 126 muestras de pacientes fue­ ron positivas. Entre las muestras de donantes, tres fueron posi­ tivas para anticuerpos contra B. elizabethae y una fue positiva tanto para B. henselae como para B. elizabethae. En el grupo de pacientes, 14 muestras provenientes de 9 pacientes fueron reactivas; tres pacientes mostraron aumentos de cuatro veces en el título en las muestras secuenciales. Estos tres pacientes te­ nían evidencia de enfermedad asociada con Bartonella (p. ej.. linfadenopatía recurrente y supurada; lesiones viscerales que muestran inflamación granulomatosa crónica) y antecedentes de exposición a gatos y roedores. Todos los sueros también mostraron reacciones positivas débiles a la prueba de inmunofluorescencia para Chlamydia pneumoniae, lo cual puede refle­ jar la reactividad cruzada descrita antes. Noah y cois, realiza­ ron pruebas de inmunofluorescencia para especies de Bartonella en sueros recogidos de 351 veterinarios que asistie­ ron a una conferencia en Ohio.942 Entre ellos, el 7,1% tenía un título positivo para B. henselae o B. quintana. Existen diversos sistemas comerciales para el serodiagnóstico de la infección por Bartonella (véase antes). Algunas prue­ bas serológicas también pueden distinguir los anticuerpos diri­ gidos contra diferentes especies de Bartonella (B. henselae y B. quintana).n25-US4 Las pruebas séricas de inmunofluorescencia para las especies de Bartonella se encuentran disponibles en laboratorios comerciales, como Associated Regional Uni­ versity Pathologists (ARUP, Salt Lake City UT). Speciality La­ boratories (Santa Monica, CA) y Microbiology Referent Laboratory (MRL Diagnostics). Sensibilidad a los antibióticos in vitro

Utilizando el método de dilución en agar, Maurin y Raoult evaluaron la sensibilidad in vitro de B. henselae, B. quintana y

B. vinsonii a distintos antibióticos.835 Estos microorganismos

eran sensibles a ampicilina, cefalosporinas de tercera genera­ ción (cefotaxima, ceftriaxona), tetraciclinas (doxiciclina, minociclina), macrólidos, rifampicina, trimetoprim-sulfametoxazol y aminoglucósidos (gentamicina, amikacina). Las CIM para oxacilina, cefalotina, clindamicina, cloranfenicol y fluoro­ quinolonas (ciprofloxacina, perfloxacina, ofloxacina) estaban cerca de las concentraciones máximas de fármaco disponible en el suero. Un estudio ulterior del mismo grupo de investiga­ ción utilizó un procedimiento de dilución con agar de Columbia y suplemento de sangre para determinar la sensibili­ dad in vitro de nueve cepas de B. quintana, tres de B. henselae y cepas únicas de B. elizabethae y B. bacilliformis ,833 Las pla­ cas se incubaron durante 5 días a 37 °C en una atmósfera de CO: al 5% antes de su interpretación. Todas las cepas eran sen­ sibles a los p-lactámicos (penicilina G, amoxicilina, ticarcilina, cefotetán, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona, imipenem), macrólidos (eritromicina. azitromicina. claritromicina, roxitromicina), doxiciclina, aminoglucósidos (gentamicina, tobramicina, amikacina) y rifampicina. Las cepas parecían menos sensibles a las penicilinas semisintéticas (oxacilina), a las ce­ falosporinas de primera generación (cefalotina) y a la clindami­ cina. La sensibilidad de estas 14 cepas a las fluoroquinolonas (perfloxacina, ciprofloxacina y esparfloxacina) fue variable. Sobraques y cois, evaluaron cuatro cepas de B. bacilliformis utilizando un procedimiento de dilución en agar y observaron que todas eran ampliamente sensibles a los antibióticos, que incluían p-lactámicos, aminoglucósidos, cloranfenicol, rifam­ picina, macrólidos, tetraciclinas y fluoroquinolonas.1198 Otros estudios de sensibilidad in vitro sobre especies de Bartonella se han centrado en la capacidad de los antibióticos para inhibir la proliferación de los microorganismos en medios con cultivos celulares. Ivés y cois, estudiaron la sensibilidad de las especies de Bartonella a varios antibióticos macrólidos uti­ lizando un método de cocultivo en monocapa de células Vero.621-622 La inhibición del crecimiento de los microorganis­ mos con diferentes concentraciones de antibióticos fue evalua­ da mediante el recuento visual de microorganismos según se determina por inmunofluorescencia específica en comparación con cultivos sin antibióticos después de 5 días de incubación. Utilizando este método, las cepas individuales de B. henselae, B. quintana y B. elizabethae eran sensibles a eritromicina, cla­ ritromicina, azitromicina, diritromicina y roxitromicina.621-622 Estos investigadores también señalaron que tanto la eritromici­ na como la doxiciclina se concentran en las células fagocíticas y alcanzan niveles intracelulares que exceden las concentracio­ nes séricas habituales. Aunque es probable que la proliferación de los microorganismos fagocitados por los neutrófilos y macrófagos se inhibiera debido a las altas concentraciones del fármaco en estas células, las distintas especies o cepas de Bar­ tonella pueden comportarse de modo diferente dentro de las células endoteliales u otros tipos de células. Kordick y cois, observaron que todas las cepas de B. henselae y B. clarridgeiae aisladas en gatos bacteriémicos con infección natural y experi­ mental eran sensibles a doxiciclina, enrofloxacina y ciprofloxa­ cina.718 Sin embargo, sólo un tratamiento fue exitoso (definido como tal por la falta de detección de baeteriemia por cultivo o por PCR) sólo en 9 de 14 gatos que recibieron enrofloxacina y en 2 de 8 gatos tratados con doxiciclina. Estos investigadores arribaron a la conclusión de que las pruebas convencionales de sensibilidad por dilución en agar de especies de Bartonella no proporcionan ninguna información clara sobre la eficacia tera­ péutica de los agentes, dado que existen muy pocos datos sobre los tropismos celulares de B. henselae y B. clarridgeiae en

E species de B ordetella

c_:: > Kordick y cois, propusieron que las células de los felinos infectadas por Bartonella pueden estar deterioradas funcionaltnenie hasta el grado en que los antibióticos no son captados o s o n acumulados lejos de los propios microorganismos.718 También se han examinado las actividades bactericidas de estos agentes contra B. henselae con medio de Schaedler con ?_r‘emento de sangre, hemina y vitamina K y con técnicas de . utivo simultáneo utilizando una línea de células endoteliales humanas o una línea de macrófagos murinos.917 Se demostró __r amoxicilina, cefotaxima, ceftriaxona, doxiciclina, eritromicina. rifampicina y ciprofloxacina eran bacteriostáticas para Lis especies de Bartonella, pero sólo los aminoglucósidos (gentamicina, tobramicina y amikacina) eran bactericidas.917

Esoecies de Afipia Taionomía e importancia clínica

Los microorganismos asignados ulteriormente al género Añpia fueron aislados por primera vez en muestras obtenidas

pe: punción y aspiración de ganglios linfáticos en pacientes con enfermedad por arañazo de gato utilizando un método de culti: celular.380 Más tarde, Brenner y cois, propusieron que eran el agente causal probable de esa enfermedad y denominaron a la cera tipo Afipia felis, por el Armed Forces Institute of Paihology, donde se aisló originariamente el microorganismo.166 5; obtuvo un segundo microorganismo similar en una biopsia ce ábia de un hombre de 69 años en la Cleveland Clinic y un lencero fue hallado en esputo, médula ósea y un absceso de la --.ñeca. Los dos últimos microorganismos aislados fueron dignados al género Afipia como A. clevalandensis y A. broomeae , respectivamente.166 También se describieron en ese momento tres genoespecies de Afipia sin nombre: Afipia genoespecies 1, 2 y 3, aisladas en una muestra de líquido pleural humano, una muestra de lavado bronquial y agua, respectiva—ente.166 Con el descubrimiento de B. henselae como agente 7': ni ario de la enfermedad por arañazo de gato y el aislamiento ce A. felis del suministro de agua de un hospital francés en 1999, en la actualidad se piensa que las especies de Afipia son bacterias con requerimientos nutricionales especiales asociadas con el agua capaces de tener existencia intracelular en amebas áe vida libre.750,756 En 2002, se aislaron otras cepas denomina­ das A. birgiae, A. massiliensis y Afipia felis genoespecie A en el sistema de suministro de agua del Timone Hospital Centre en Marsella, Francia.752 En este medio, estos microorganismos rueden desempeñar un papel en las infecciones hospitalarias, como lo indica su aislamiento en muestras de agua recogidas en las unidades de cuidados intensivos y la presencia de anticuer­ pos específicos en 11 de 85 pacientes internados en unidades de cuidados intensivos con neumonía hospitalaria.753 Las especies de Afipia se clasifican en el subgrupo a ; de las Proteobacterias dentro de la familia Bradyrhizobiaceae.455152 1316 Aislamiento e identificación

Las especies de Afipia son bacilos gramnegativos, oxidasa positivos y débilmente catalasa positivos que son móviles por­ que tienen un único flagelo polar, subpolar o lateral. Crecen en agar carbón extracto de levadura (BCYE), en agar chocolate y agar sangre y en caldo con nutrientes, pero no en presencia de NaCl al 6,5% en caldo y pocas veces crecen en agar de MacConkey. Se obtiene un buen crecimiento después de la incubación a 25 °C a 30 °C durante 3-4 días, un crecimiento

487

escaso después de la incubación a 35 °C y ningún crecimiento a 42 °C. Después de 72 horas de crecimiento en agar sangre, las colonias de las especies de Afipia son blanco grisáceas, bri­ llantes, no hemolíticas, convexas y opacas con un borde ente­ ro. Todas las especies y las genoespecies son oxidasa y ureasa positivas, y son negativas en las reacciones para hemolisis, pro­ ducción de gas a partir de nitrato, producción de indol, produc­ ción de H2S (método de agar triple azúcar-hierro [TSI]). hidró­ lisis de gelatina e hidrólisis de esculina. No se produce ácido de forma oxidativa ni fermentativa a partir de glucosa, lactosa, sacarosa o maltosa. En el cuadro 9-15 se muestran las caracte­ rísticas para la identificación de las especies de Afipia. También se las puede identificar mediante el análisis de áci­ dos grasos de la pared celular. Los miembros del género con­ tienen cw-octadeca-11 -enoico (C18:1(7c), ll-metiloctadeca-12enoico (CBrl9:1) y habitualmente 9,10-metilenehexadecanoato y 11,12-metileneoctadecanoato. La presencia de CBrl91 como principal ácido graso de la pared celular es una característica clave de las especies de Afipia, porque este ácido graso se encuentra sólo en cantidades mínimas en algunas especies de Pseudomonas y Brucella .'66152 Sensibilidad a los antibióticos

A felis es resistente a ampicilina, cefazolina, cefamandol, cefoperazona, cefalotina, clindamicina, eritromicina, penicili­ na, tetraciclina y ciprofloxacina.166-834 Se ha comunicado una sensibilidad intermedia a piperacilina, trimetoprim-sulfametoxazol, ticarcilina y vancomicina.166-834 A. felis es sensible a cefoxitina, cefotaxima, mezlocilina, aminoglucósidos, imipe­ nem y rifampicina. Aunque Afipia genoespecie 3 tiene las CIM más bajas entre las especies, todas las otras especies mostraron CIM a la mayoría de los agentes, como cefalosporinas (de todas las generaciones), ampicilina, penicilinas de amplio es­ pectro, combinaciones de (3-lactámicos/inhibidores de las P-lac­ tamasas, tetraciclinas y aminoglucósidos. El imipenem mostró las CIM más bajas para todas las especies evaluadas.166-834

Especies de Bordetella Antecedentes y taxonomía de las especies de Bordetella

El género Bordetella contiene siete especies: B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica, B. avium, B. hinzii, B. holme­ sii y B. /remtííMOT.681-1015-1303-1304-1369 Algunos estudios genéticos han mostrado que estos microorganismos están muy estrecha­ mente relacionados entre sí. De hecho, las técnicas de hibrida­ ción de DNA indican que pueden no ser lo suficientemente diferentes como para justificar la asignación de especies indi­ viduales, aunque existen entre ellos diferencias genéticas, feno­ típicas e inmunológicas.682 En el pasado, las bórdetelas fueron clasificadas con otras especies de bacterias, que incluyen Haemophilus, Brucella y Alcaligenes. En la edición de 1984 del Bergey ’s Manual o f Determinative Bacteriology. se inclu­ yeron tanto especies de Bordetella como de Brucella entre los géneros de afiliación incierta.1015 Después de una hibridación de DNA-rRNA extensa y análisis fenotípicos, De Ley y cois, propusieron que la familia Alcaligenaceae abarcara especies de Alcaligenes y Bordetella.314 La relación genética de las espe­ cies de Bordetella con el género Alcaligenes también es apo­ yada por el hallazgo de que B. pertussis y B. bronchiseptica producen un sideróforo denominado alcaligina que es casi idéntico al producido por Alcaligenes denitrificans?91 Los miembros del género Bordetella son cocobacilos gramnegati-

488

Características bioquímicas para la identificación de especies de AJipia

A. F E LIS

A. CLEVELAND EN SIS

A. BRO O M EAE

A. B IRG IA E

A. M A SS1U E N SIS

A F IP IA G EN O ESPEC IE

1

AFIPIA G EN O ESPEC IE 2

AFIPIA GENOESPEC IE 3

RELACIONADAS CON AF IP IA G EN O ESPEC IE 3

Hemólisis, SBA

-

-

-

-

-

-

Oxidasa

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Catalasa

+d

+./

+
+d

+d

¥

¥

¥

+d

+d

Motilidad

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Crecimiento en agar BCYE, 30 °C

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Crecimiento en agar BCYE, 35 °C

+

+

+d

+

-

-

+

+

+

-

Crecimiento en agar BCYE, 37 °C

+

+

-

+

+

+

-

Crecimiento en agar BCYE, 42 °C

-

-

-

-

-

Reducción de nitrato

+

-

+ -

+

+

■

+

-

-

-

+

-

+

-

-

-

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

Citrato

-

Ureasa

+

Hidrólisis de esculina

-

-

Arginina dihidrolasa

-

-

-

-

-

-

-

Hidrólisis de ONPG

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

Producción de H:S

+

+

+

Producción de ácido a partir de:

-

Glucosa Maltosa

_

-

-

-

-

-

-

Fructosa

_

-

-

-

-

-

-

Sacarosa

-

-

-

-

-

-

-

Manitol

-

-

-

+

+

-

-

Mañosa

-

-

-

+

+

-

-

Arabinosa

-

-

-

+

+

-

-

N-acetil-glucosamina

-

-

-

+

+

-

-

+: reacción positiva;

reacción negativa; +d: reacción positiva débil.

9 Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

CA RACTERÍSTICA

A. F E L IS G EN O ESPECIE A

CAPÍTULO

Cuadro 9 -1 5

Especies de B ordetella

w - pequeños en aislamiento primario. En subcultivo, tienden a wrfverse más pleomorfos. Son aerobios estrictos, crecen en condiciones óptimas a 35 °C a 37 °C, no utilizan hidratos de carbono y son inactivos en la mayoría de las pruebas bioquí­ micas B. pertussis , B. parapertussis y B. holmesii son inmóvi: — entras que B. bronchiseptica, B. avium y B. hinzii son — :le' y su desplazamiento se logra por medio de flagelos peritricos. Estos microorganismos no requieren hemina ni NAD. Sin embargo, el aislamiento primario de B. pertussis, en particular, requiere el agregado de carbón, resinas de intercamb*: iónico o sangre al 15-20% para neutralizar los efectos inhi­ bidores del crecimiento de sustancias como ácidos grasos insanrados. sulfuras, peróxidos y metales pesados.602 B. paraper23USÍ5 es algo menos exigente en sus requerimientos de creci­ miento. pero el aislamiento necesita aún el uso de los mismos medios especiales utilizados para B. pertussis. Las especies restantes tienen menos requerimientos nutricionales especiales .-ícen en los medios de agar habituales, como agar sangre, ágar chocolate y agar de MacConkey. Los análisis de secuen. _ ¿el rRNA 16S de las especies de Bordetella descritas han : : 'firmado la filogenia común con el género Alcaligenes y el ¿enero Bordetella reside ahora en la subdivisión (3, de las proir -ucterias en la familia Alcaligenaceae junto con los géneros Achromobacter, Pelistega, Sutterella y Taylorella,455 El género Bordetella incluye especies aisladas de seres humanos y otros animales. El hombre constituye el único huéspec reconocido de B. pertussis y también se creía que B. parar-ru ssis se encontraba sólo en los seres humanos. Sin embarc : . en 1994 se recuperó en Escocia y Nueva Zelanda una cepa similar a B. parapertussis del aparato respiratorio de corderos sanos y corderos con neumonía.1020B. parapertussis puede cau­ sar una enfermedad similar a la tos ferina en seres humanos. B. bronchiseptica se encuentra en distintos animales (p. ej., pri­ mates, perros, gatos, conejos, caballos, pavos, cerdos, zorros, icngüeyas) y, en ocasiones, en seres humanos, fundamental­ mente como agente oportunista. Como su nombre lo sugiere, B. :um se encuentra en aves y produce rinotraqueítis en pc\os.681 B. hinzii fue denominado antes “bacteria similar a B. ir. ium”, bacteria de la coriza del pavo tipo II, Alcaligenes faecalis tipo II y especie de Alcaligenes cepa C2T2; este microorpanismo fue asignado formalmente al género Bordetella en ;9 9 5 bm g holmesii era llamado antes grupo no oxidante 2 ce los CDC (NO-2). La caracterización de estas cepas mediante hibridación de DNA-DNA, secuenciación de rRNA ' 6S y análisis de ácidos grasos celulares/ubicuinona estable­ ció su relación con el género Bordetella.'369 Desde 1995, se describió a Bordetella grematum como una especie nueva que 'e encuentra en heridas e infecciones óticas humanas, y se han aislado las nuevas cepas “similares a Bordetella holmes i f de pacientes con bacteriemia, endocarditis e infecciones respiratorias.1257,1303'1418 Epidemiología de la tos ferina

La tos ferina sigue siendo una enfermedad endémica de importancia mundial a la cual se le atribuyen más de 350 000 muertes por año. Los seres humanos son el único huésped conocido de B. pertussis y la transmisión ocurre por contacto directo con microgotas en suspensión provenientes de indivi­ duos infectados que tosen. La tasa de ataque es muy alta y más del 90% de los individuos sensibles se infectan después de exposiciones importantes.141 Por razones desconocidas, la enfermedad entre los niños ocurre más a menudo en las muje­ res y tiende a seguir en ciclos epidémicos de 3 a 5 años. Antes

489

de la disponibilidad de vacuna de células enteras muertas, la mayoría de los casos de tos ferina ocurrían entre los niños de 1 a 5 años. Después de 1947, cuando se autorizó la vacuna con­ tra difteria-tos ferina-tétanos (DPT) que fue recomendada por la American Academy of Pediatrics. la incidencia más alta de la enfermedad se desplazó a los niños menores de 1 año. En los Estados Unidos a comienzos de la década de 1990. entre el 40% y el 50% de los casos de tos ferina comunicados ocurría en niños que tenían menos de 1 año de edad.- 7-20S Se han infor­ mado tasas de incidencia similares en otros países que han mantenido protocolos de vacunación. Por ejemplo, durante el período de 15 meses desde julio de 1993 hasta octubre de 1994, el 65% de los casos índices de tos ferina en un centro médico francés ocurrieron en niños menores de 1 año.93 Actualmente, aquellos con riesgo máximo de sufrir tos ferina son los lactan­ tes de 6 meses de edad y menores que no han recibido la serie completa de vacunación de tres dosis y los niños de edad preescolar que no han recibido todas las vacunaciones. La máxi­ ma cantidad de mortalidad relacionada con la tos ferina tam­ bién ocurre fundamentalmente entre los lactantes; los datos de vigilancia recogidos desde 1992 hasta 1993 mostraron que los lactantes de menos de 1 año representaban el 42% de los casos y el 87% de las muertes comunicadas.141,208 En los países donde la vacunación no es una práctica común, el grupo de 1 a 5 años de edad sigue estando en máximo riesgo. En 1993, se comunicaron más de 6 300 casos de tos ferina a los CDC, lo que representa un incremento del 82% sobre los casos del año anterior y la máxima incidencia de enfermedad desde 1967.98 El factor principal que contribuye al resurgi­ miento en la tos ferina es el crecimiento de una población gran­ de de adultos sensibles; este resurgimiento se refleja en la can­ tidad creciente de casos de tos ferina que ocurren en pacientes mayores de 10 años.98 Debido a la presentación atípica de la tos ferina en los individuos mayores, la enfermedad a menudo no es reconocida y el tratamiento no se administra, se retarda o es incompleto. Sin embargo, estos individuos infectados constitu­ yen una fuente importante para la transmisión de B. pertussis a otros, sobre todo a los lactantes y los niños pequeños que no están inmunizados en forma adecuada. Importancia clínica de Bordetella pertussis

B. pertussis produce el síndrome denominado tos quintosa o “tos ferina”. El microorganismo se transmite a través de microgotas infectantes y es sumamente contagioso, con una tasa de ataque mayor del 90% en las personas no inmunizadas. La inmunización parcial de los niños contra la tos ferina puede alterar la presentación clínica clásica. Además, la presentación y el diagnóstico de tos ferina en los niños pequeños (menores de 1 año) puede verse complicada por las infecciones virales simultáneas del aparato respiratorio, como virus influenza y sincitial respiratorio, en particular.900Clásicamente, la tos feri­ na clínica en los niños no vacunados puede dividirse en tres estadios. El esta d io p r o d r ó m ic o o c a ta r r a l comienza 5 a 10 días después de la adquisición del microorganismo y se carac­ teriza por síntomas inespecíficos de “resfriado” o “gripe". La enfermedad es altamente transmisible en este estadio, ya que hay gran cantidad de microorganismos en las vías respiratorias altas. Los cultivos recogidos en este momento tienen la máxi­ ma probabilidad de ser positivos. Una tos aparece más tarde en este estadio y aumenta en persistencia, gravedad y frecuencia. Esto evoluciona al e sta d io p a r o x ístie o o e sp a sm ó d ic o después de 7 a 14 días.236 Este estadio se caracteriza por la “tos en staccato” con el “silbido” inspiratorio prolongado que se escucha

490

C A P ÍT U L O 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

al final de la crisis de tos. Durante este estadio, no hay fiebre ni otros signos ni síntomas sistémicos. Los esfuerzos inspiratorios son inútiles durante el paroxismo de tos y el “silbido” es cau­ sado por la inspiración de aire a través de la glotis tumefacta y estrechada. La crisis de tos se asocia a menudo con cianosis y vómitos. Este estadio puede ser tan grave que es necesaria la asistencia ventilatoria intermitente. Las complicaciones que pueden ocurrir durante el curso de la enfermedad son infeccio­ nes bacterianas secundarias; otitis media; síntomas del SNC, como convulsiones y fiebre alta, sobre todo con la presencia de infecciones secundarias interpuestas; encefalopatía; ataxia cerebelosa, hernia inguinal y prolapso rectal asociados con la tos intensa.447 1160 La causa de la encefalopatía asociada con la tos ferina complicada no se conoce debido a la falta de un modelo animal apropiado, pero los mecanismos sugeridos incluyen la anoxia secundaria a los paroxismos de tos, hipoglucemia secundaria a los efectos tóxicos de la toxina pertussis (PT) y hemorragia intracerebral. El e sta d io d e co n v a le c e n c ia comienza por lo general dentro de las 4 semanas del inicio y, durante este período, existe una disminución de la frecuencia y la gravedad de las crisis de tos. (Véase recuadro 9-11.) La tos ferina atípica observada en los adultos se atribuye al hecho de que la mayoría fueron inmunizados cuando eran niños y que la memoria inmunitaria decreciente conduce a una enfermedad menos grave y modificada.1401 Como ya se men­ cionó, los adultos que tienen tos ferina sintomática pero no reconocida a menudo constituyen la fuente de contagio del microorganismo a los casos pediátricos.134236-972 Algunos estu­ dios de tos ferina en adultos se han focalizado en individuos con tos persistente y han utilizado métodos de cultivo, molecu­ lares o serológicos, para demostrar la presencia de los micro­ organismos o aumentos importantes en los títulos contra antí­ genos singulares de B. pertussis, respectivamente. En un estu­ dio de 130 estudiantes universitarios que se comunicaron al servicio de salud para estudiantes con una tos de 6 días de dura­ ción o mayor, el 26% tenía evidencia serológica de infección reciente por B. pertussis.*11 En un estudio posterior con esta población de estudiantes se observó que el 15% de 319 estu­ diantes con tos de una duración > 5 días tenía evidencia sero­ lógica de infección por B. pertussis ; 17 de estos estudiantes tenían también evidencia serológica de infecciones virales, por Chlamydia pneumoniae o Mycoplasma pneumoniae coexistentes.623 En un estudio llevado a cabo entre entrenados del Cuerpo de Marines de los Estados Unidos que comunicaron 7 días o más de tos, el 17% tenía infección aguda por B. pertussis.632 En otro estudio, se evaluó anualmente a 51 trabajadores de asis­ tencia de la salud durante un período de 5 años (1984-1989) para detectar elevaciones en los títulos de anticuerpos contra cuatro antígenos específicos de la tos ferina (PT, FHA, pertactina y fimbrias).327 De estos individuos, el 90% mostró una ele­ vación importante en el título de anticuerpos contra uno o más de los antígenos entre dos años consecutivos durante el perío­ do de cinco años del estudio. En un estudio realizado con 246 adultos alemanes con una enfermedad con tos de más de 14 días de duración, se observaron pruebas de infección por B. pertussis en 64 (26%); 5 tenían cultivos nasofaríngeos positi­ vos y 59 tuvieron un diagnóstico sobre la base de las pruebas serológicas, la PCR o ambas.1148 En un estudio danés efectua­ do en 201 pacientes con tos que persistió durante una media de 6.5 semanas se encontró que 4 (2%) tenían cultivos positivos para B. pertussis y 11 (5,5%) eran positivos por PCR (incluidos los 4 pacientes con cultivos positivos).134 También se demostró evidencia serológica de infección por tos ferina en 100 adultos > 65 años estudiados en un período de 3 años. Entre el 3,3% y

el 8% de esta población tuvieron infecciones por tos ferina y entre el 37,5% y el 50% estaban sintomáticos como resultado de la infección.578 Se describió el espectro clínico de la tos ferina en adultos en varios estudios. En un estudio llevado a cabo en UCLA, los dos diagnósticos clínicos principales que tuvieron los individuos en los que se descubrió tos ferina fueron infección inespecífica de las vías respiratorias altas (39%) y bronquitis (48%).871 En un estudio efectuado en Alemania en 64 adultos con infección documentada por B. pertussis , desde el punto de vista clínico sólo se pensó que el 39% tenía tos ferina y que el 14% no la tenía; otros diagnósticos fueron infecciones de las vías respira­ torias altas, nasofaringitis, faringitis, adenoitidis y sinusitis. Sin embargo, de los 64 pacientes, el 70% tenía tos paroxística; el 38%, silbido inspiratorio y en el 17% la tos era seguida por vómitos.1148 En otro estudio alemán de 84 adultos con tos feri­ na se observó tos persistente (> 21 días) en el 81%, tos espasmódica en el 65% y ahogos en el 56%.1023 Dieciocho pacientes tuvieron complicaciones que incluyeron otitis media, neumo­ nía, incontinencia urinaria, linfadenopatía cervical, pérdida auditiva aguda, fracturas costales y hernia inguinal. También se documentó una encefalopatía asociada con tos ferina en adul­ tos con esta enfermedad.530 Si bien son infrecuentes, se descri­ bieron infecciones agudas por B. pertussis en adultos; en un caso, se diagnosticó tos ferina aguda en un hombre de 53 años que adquirió el microorganismo de su hijo, que había sido inmunizado y tenía tos ferina leve.1193 También se ha aislado B. pertussis de adultos con enferme­ dad subyacente como infección por HIV. Ng y cois, aislaron B. pertussis de las muestras de lavado broncoalveolar y biopsia transbronquial de tres pacientes con SIDA.936-937 Estos microor­ ganismos crecieron en medios para aislamiento de Legionella. Doebbeling y cois, informaron el aislamiento de B. pertussis de las vías respiratorias altas de un paciente HIV positivo de 25 años con una historia de 4 meses de tos paroxística; también se comunicó un caso similar en un paciente de 60 años con SIDA en Bélgica.269-340 A pesar de estas comunicaciones, se cree que la tos ferina es relativamente rara en los pacientes infectados por el HIV y se estima una prevalencia de portación nasofarín­ gea de menos de 6,5 casos por 10 000 pacientes.266 En un caso muy atípico, se aisló B. pertussis en un hemocuitivo de un hombre de 31 años con granulomatosis de Wegener, un trastor­ no asociado con neumonía crónica y el desarrollo de nodulos pulmonares y lesiones pulmonares cavitarias.630 También se lo halló en muestras respiratorias de lactantes con otros proble­ mas subyacentes, como enterocolitis necrosante, enfermedad pulmonar crónica y neumonía por adenovirus.493-1161 Vacunas contra la tos ferina

La vacuna original de células enteras contra la tos ferina fue administrada junto con los toxoides diftérico y tetánico y adyu­ vantes con aluminio (DwPT). Después de su autorización, el uso difundido de la vacuna de células enteras condujo a la declinación de la enfermedad en los países con inmunización obligatoria y otras pruebas de eficacia se acumularon como resultado de la atenuación de los programas de inmunización en algunos países. Por ejemplo, algunos años después de la introducción de preparados para la vacuna que utilizaban can­ tidades más pequeñas de antígeno se informó un aumento de la cantidad de casos de tos ferina en Dinamarca. Debido a que la aceptación popular de la inmunización en Gran Bretaña se redujo a partir de mediados de la década de 1970 la tos ferina alcanzó proporciones epidémicas entre los niños menores de 5

Especies de B ordetella

Recuadro 9-11

491

Factores de virulencia de Bordetella pertussis

Toxina pertussis La toxina pertusis (PT) es un factor de virulencia importante de B. pertu ssis. PT es una protema única de peso m olecular 105-117 kD a que tiene un am plio e l e c t r o de productividad b io ló g ica y es producida só lo por B. p ertu ssis. PT es sintetizada con una secuencia señal N-term inal que media la secreción de toxina en el esp acio periplasm ático. En el periplasma, el péptido señal es extraído y las subunidades se pliegan y reúnen en la toxina com pleta.1' PT es un hexám ero que consiste en una porción tóxica enzim ática (protómero A ) y una porción heteropentam érica atóxica (oligóm ero B ). El oligóm ero B e s responsable de unir la toxina a las células sen sib les y de transportar el protóm ero A a través de la membrana de las células eucariontes.289 La subunidad B está - im puesta por dos dím eros - lo s polipéptidos S2 y S 4 y lo s polipéptidos S3 y S 4 - reunidos por otro polipéptido denom inado S5. PT tam bién funciona com o adhesina en su capacidad para unirse a las células ciliadas y a lo s m acrófagos. La subunidad A contiene un único polipéptido, designado S I , que tiene acti• : -¿d de adenosindifosfato ribosiltransferasa.670 Esta enzim a transfiere grupos A D P ribosa del N A D a las proteínas reguladoras Gi (inhibidoras) que normal-.er.te funcionan en la transducción de señales celulares. Se cree que la actividad de PT es responsable de m uchos de lo s signos y los síntom as clín icos de s ferina, aunque no ha sido demostrado inequívocam ente, y no existen datos relativos a la diana o dianas afectadas por PT en el tejido. Los efectos b io ­ lógicos de PT incluyen la sen sib ilización de ratones a la histam ina, la producción de lin focitosis, la activación de células de lo s islotes pancreáticos y la estim ulación de las respuestas inm unitarias.564-565 L os anticuerpos dirigidos contra PT son protectores para los ratones cuando son som etidos a inoculación intracerebral o del aparato respiratorio. L os genes para los péptidos de PT están dispuestos com o un operón. Este operón está presente en B. pertu ssis, B. p a ra p ertu ssis y B. bronchiseptica, pero lo s genes no son transcritos ni traducidos en las últim as dos esp ec ie s.501216 L os anticuerpos dirigidos contra PT también son protectores en m od elos anim ales de tos ferina. PT es la única m olécula que está representada en todas las vacunas acelulares contra la tos ferina formuladas hasta ahora.

Hemaglutinina filamentosa La hem aglutinina filam entosa (FH A ) es una adhesina de la superficie celular de p eso m olecular 2 20 kD a que tiene actividad hem aglutinante y, junto con PT. media la adhesión de B. p e rtu ssis a las células eucariontes in vitro y a las células ciliadas de las vías respiratorias altas.1064-1306 F H A tiene m últiples acti■:¿jdes fijadoras que permiten a B. p e rtu ssis adherirse a diferentes tipos celulares y en algunos casos a invadirlos, incluidos los m acrófagos, en diferentes ev a d io s de infección y junto con otras adhesinas.889 La fijación de FH A a los m acrófagos conduce a fagocitosis de los m icroorganism os sin el estallido oxidarivo asociado con la fagocitosis de otros m icroorganism os. Esta circunstancia inusual puede ser fundamental para la supervivencia intracelular de B. p e rtussis. L os anticuerpos contra FH A proporcionan cierta inm unidad contra la exp osición respiratoria pero no intracerebral en anim ales, presum iblem ente al :r_".:?ir la fijación de lo s m icroorganism os.

Pertactina Lu ^enactina describe varias proteínas de la membrana celular asociadas con la superficie halladas en tres esp ecies de B ordetella. La pertactina P.69 de B. p e rtu ssis tiene un peso m olecular de 6 9 kD a, y proteínas hom ologas de pesos m oleculares ligeram ente diferentes se encuentran en B. p a ra p ertu ssis (pertacP.70) y en B. bron ch iseptica (pertactina P.68). Las pertactinas son m odificadas y producidas com o proteínas ligeram ente m ás grandes que son escindi¿üí proteolíticam ente para arrojar las m oléculas maduras. La pertactina de B. pertu ssis fue denom inada originariamente P69 o proteína 69K . Se ha determinado que e l verdadero p eso m olecular es de alrededor de 60.5 kD a después de que se encontró que la pertactina derivaba del procesam iento postraduccional de una proteína precursora más grande. La pertactina de B. p e rtu ssis funciona junto con FH A para mediar la fijación de la bacteria a las células de culti■: nsular ayudando a la m olécula de FH A a lograr una conform ación que aum enta al m áxim o la fijación de la célula bacteriana.49 L os anticuerpos contra 7e~dctina P.69 protegen a los ratones contra la infección por B. p e rtu ssis administrada por la vía del aerosol, pero la protección contra la carga intracerebral requiere anticuerpos tanto contra P.69 co m o contra FH A.

M e n ila to ciclasa-hemolisina | 5 p e rtu ssis produce un adenilato ciclasa-hem olisina (A C -H ), una proteína bifuncional de 177 kD a que es secretada en el m edio y tiene tanto actividad de I ^Lenilato ciclasa com o hem olítica.683 La proteína es capaz de unirse a las células sensibles y es translocada en la célula intacta. En e l interior de la célula I ¿ a n a , la m o lécu la se escind e proteolíticam ente. La activación de la actividad de adenilato ciclasa por la proteína eucarionte calm odulina condu ce a la acuI m ulación intracelular de cAM P. Esta acum ulación puede suprimir la expresión de la respuesta inmunitaria local al inhibir la quim iotaxis y la fagocitosis de I los neutrófilos.565

Citotoxina traqueal L-i citotoxina traqueal (TCT) es una m olécula pequeña de alrededor de 921 D a com puesta por un tetrapéptido disacárido derivado del peptidoglucano de la r ir ed celular. La m olécula contiene glucosam ina, ácido murámico. alanina, ácido glutám ico y ácido diam inopim élico en una relación 1: 1:2 1:1 y es libera7i

en el sobrenadante del cultivo durante la fase de crecim iento logarítm ico.279 La TCT daña y destruye específicam ente las células epiteliales ciliadas que

re ■:sten las vías aéreas donde e l m icroorganism o se fija y puede contribuir a la tos característica de la tos ferina clínica. Se ha demostrado que la TC T afecadversamente las fu nciones de las células polim orfonucleares en bajas concentraciones y e s tóxica para estas células en concentraciones más altas.293 Ti.—bién conduce a la producción de interleucina-1 e induce óxid o nítrico sintasa, que se cree que m edia el daño del epitelio del aparato respiratorio.555 La TCT y otros péptidos m uram ílicos sim ilares tienen otras varias actividades biológicas, que incluyen pirogenicidad y adyuvancia.

( C ontinúa)

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C A P ÍT U L O 9

R ecuadro 9-11

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

F a c to re s d e v iru le n c ia d e Bordetella pertussis (cont.)

Toxina term olábil (toxina dermonecrosante) B. pe rtu ssis tam bién produce una toxina term olábil (HLT o toxina derm onecrosante) que es un polipéptido único de unos 140 kDa. Las HLT producidas por B. pertu ssis, B. p a ra p ertu ssis y B. bron ch iseptica son sim ilares en sus propiedades b iológicas y son indistinguibles desde el punto de vista fisicoquím ico y serológico, mientras que la HLT producida por B. avium es ligeram ente diferente en e so s aspectos. HLT induce la contracción de los vasos sanguíneos debido a efectos constrictores esp ecífico s sobre el tejido del m ú sculo liso vascular y produce necrosis hem orrágica en ratones y en cobayos. A unque su papel en la patogenia de la tos ferina, si existe alguno, se descon oce, lo s efectos constrictores de la HLT sobre los tejidos altam ente vascularizados del apa­ rato respiratorio podrían conducir a inflam ación local y pueden explicar algo de la patología respiratoria asociada con la tos ferina.

Lipooligosacárido A l igual que otras bacterias gramnegativas, B. p e rtu ssis tiene lipopolisacárido (LPS, o endotoxina) en la membrana externa de su pared celular. C om o suce­ de con algunos otros patógenos bacterianos, la endotoxina de B. p ertu ssis es en realidad un lipooligosacárido (LO S). Este LOS contiene Iípido A y un cen ­ tro de oligosacáridos con ácido 2 -ceto-3-d esoxioctu losón ico, pero carece de los antígenos “O ” de polisacáridos de cadena larga hallados en las m oléculas de LPS. El papel de LOS en la patogenia de la tos ferina se descon oce, aunque tiene las propiedades habituales asociadas con e l LOS de m uchos m icroorganis­ m os, que incluyen pirogenicidad, adyuvancia, inducción de producción de interferón y m itogenicidad y activación policlonal de las células B. La LOS de B. p e rtu ssis puede ser al m enos parcialmente responsable de la reactividad asociada con la vacuna de las células enteras contra la tos ferina.

Aglutinógenos “0 ” termolábiles Las esp ecies de B ord etella tam bién tienen antígenos denom inados aglutinógenos "O” sobre la superficie de la célula bacteriana. Se describieron catorce aglutinógenos (A G G ) term olábiles para estas esp ecies, lo s cuales se asocian con fim brias y al parecer tam bién participan en la m ediación de la fijación a las células diana. L os AGG 1 a 6 se encuentran en B. p e rtu ssis ; AG G 1 es com ún a todas las cepas de B. pertu ssis, y los AG G 2 a 6 están presentes en estas com binaciones en las diferentes cepas.

años al finalizar esa década. Aunque la experiencia ha sugerido una eficacia clínica del 80% o mayor, las amplias variaciones en el rendimiento de diferentes preparados de vacunas de célu­ las enteras sólo se evidenciaron durante los estudios de eficacia clínica prospectiva llevados a cabo con vacunas acelulares potenciales contra la tos ferina. Además, la publicidad que rodea los informes de encefalopatía y secuelas neurológicas permanentes que se relacionaron temporalmente con la recep­ ción de una vacuna DwPT aceleraron los intentos de crear vacunas acelulares o de “subunidades”. La caracterización de los componentes subcelulares de B. pertussis permitió la ela­ boración de varias vacunas acelulares consistentes en uno o más antígenos y, comenzando a principios de la década de 1990, se llevaron a cabo al menos siete ensayos sobre eficacia de diferentes vacunas acelulares, entre ellas PT destoxificada junto con uno o más de los otros componentes inmunógenos, como FHA, fimbrias o pertactina P.69. Se logró una eficacia variable entre el 71% y el 97% tanto con las vacunas acelula­ res como de células enteras. En general, la vacuna acelular de uno y dos componentes tuvo menos éxito que las vacunas con tres a cinco antígenos, y las vacunas de células enteras tuvieron el mismo rendimiento o mayor que los productos acelulares, aunque las vacunas acelulares se asociaron con tasas mucho más bajas de reactividad.365'515'778’965 1012a147-12611288 En 1999 se autorizó en los Estados Unidos el uso de cuatro vacunas acelu­ lares contra B. pertussis: 1. ACEL-IMMUNE® (Wyeth-Lederle Vaccines and Pediatrics): vacuna tetravalente que contiene PT, FHA, fimbrias y per­ tactina. 2. TriPedia® (Connaught Laboratories, Inc.): contiene PT y FHA. 3. Infanrix® (SmithKline Beecham Biologicals): contenía PT, FHA y pertactina. 4. Certiva® (North American Vaccines): contiene sólo PT.

En la actualidad, se administran tanto vacunas de células enteras como acelulares junto con los toxoides diftérico y tetá­ nico como DwPT (con la vacuna de células enteras) o como DaPT (con las vacunas acelulares contra tos ferina). El esque­ ma de inmunización consiste en tres dosis de DwPT o DaPT mediante inyección intramuscular a intervalos de 4 a 8 sema­ nas, típicamente a los 2 meses, 4 meses y 6 meses de edad, con una cuarta dosis 6 a 12 meses más tarde.209 Se recomienda una quinta dosis a los 4 a 6 años de edad. La respuesta inmunitaria del huésped luego de recibir vacunas acelulares contra la tos ferina está dirigida contra los antígenos definidos contenidos en la vacuna individual, mientras que la respuesta que sigue a la recepción de la vacuna de células enteras está dirigida pre­ dominantemente contra antígenos de la membrana externa y las fimbrias. En general, algunos estudios han mostrado que las va­ cunas de múltiples componentes que contienen pertactina y antígenos de las fimbrias además de PT y FHA producen una respuesta inmunitaria más viva que las que contienen sólo PT y FHA.209965 Estas vacunas también parecen ser altamente inmunogénicas cuando se administran junto con otras inmuni­ zaciones infantiles. Halperin y cois, investigaron las respuestas inmunitarias de 180 lactantes inmunizados con una vacuna ace­ lular de tres componentes contra tos ferina, toxoides diftérico y tetánico, vacuna contra poliovirus inactivados y vacuna conju­ gada contra H. influenzae tipo b-toxoide tetánico. La vacuna contra H. influenzae tipo b se administró en la misma jeringa que las otras vacunas o en otra separada. En este estudio se observó que todas las vacunas, incluida la vacuna contra B. pertussis, eran inocuas, bien toleradas e inmunogénicas inde­ pendientemente de la cantidad de vacunas incluidas en la inyección.529 Otras cuestiones relacionadas con el uso de vacunas de subu­ nidades de pertussis incluyen su eficacia en adultos y lactantes pequeños con riesgo de tos ferina. Aunque B. pertussis no es una causa importante de enfermedad respiratoria en la mayoría

Especies de Bordetella

ás los adultos, algunos estudios epidemiológicos han implicaa renetidas veces a los adultos infectados como fuente y trans­ ir:' res del microorganismo a los niños.235236237 Además, han •__rndo brotes en cuidadores adultos expuestos a niños con tos tern a en guarderías. Como la reactividad contra la vacuna de ¿¿lulas enteras puede ser más grave en los adultos, también se realizan investigaciones sobre vacunas de componentes aceluiares acerca de su inmunogenicidad en adultos que ya fueron — uñados o que están mal vacunados. Varios estudios en raciones adultas han mostrado que las vacunas acelulares . ntra la tos ferina, cuando se administran solas o cuando se : mbinan con toxoide diftérico y tetánico, producen efectos .adversos mínimos y generan respuestas vivas de anticuerpos . 'ira PT. FHA, pertactina y antígenos de las fimbrias presenr- en la vacuna sin ninguna interferencia en las respuestas _'~unitarias a los toxoides tetánico o diftérico.364-675-972-1101 Se e-stán confeccionando pautas para la inmunización de los adul:: s con riesgo de tos ferina. También se puede observar tos feri­ na en lactantes pequeños debido a concentraciones subóptimas ae anticuerpos transplacentarios de madres sensibles a la enfer­ me dad. Un estudio de una vacuna acelular en lactantes peque­ ños mostró que la vacuna no prevenía la infección en estos niños, pero mejoró sustancialmente la aparición de los sínto­ mas graves.42 Debido a la autorización relativamente reciente de las vacu­ nas acelulares contra la tos ferina, existen pocos datos sobre la a-ración de la protección que brindan. Sin embargo, los datos publicados indican que los niveles de anticuerpos luego de la inmunización con vacunas acelulares se mantienen altos d_rante varios años. Okada y cois, examinaron las concentra.: nes de anticuerpos contra la tos ferina en tres grupos de niños de 5 a 7 años después de la última inoculación.964 Los niños de estos cuatro grupos incluyeron a aquellos que habían recibido cuatro dosis de DwPT (75 niños), tres dosis de DwPT y un refuerzo con DaPT (90) o cuatro dosis de DaPT (131). En este estudio se observó que los títulos de anticuerpos después de la vacunación con DaPT eran equivalentes a los que recibieron DwPT o mejores.964 En un estudio de seguimiento de 10 años de duración de 207 niños japoneses que habían recibido una vacuna acelular de dos componentes contra la tos terina (FHA y PT) o la vacuna de células enteras contra la tos ferina se observó que el 77% de los vacunados tenían aún anticuerpos medibles, independientemente del tipo de vacuna que habían recibido.1276 Antes de pasar a una explicación sobre las técnicas de aisla­ miento y los métodos de identificación para B. pertussis y otras especies de Bordetella, trataremos las capacidades patogénicas ae B. parapertussis, B. bronchiseptica, B. hinzii, B. holmesii y B. trematum.

-iportancia clínica de otras especies de Bordetella BORDETELLA PARAPERTUSSIS B. parapertussis también se asocia con una enfermedad si­

milar a la tos ferina en los seres humanos, pero su presentación clínica suele ser menos grave.114595-828 Los niños con infección por B. parapertussis tuvieron una duración más breve de la tos, ei broncoespasmo, los silbidos, los vómitos, la apnea y la cia­ nosis.595-828 Sin embargo, se han comunicado brotes de B. para­ pertussis en los cuales la enfermedad ha sido muy grave y con­ dujo a la muerte, sobre todo en niños muy pequeños. Wirsing von Konig y Finger compararon la gravedad de la enfermedad en 33 niños con infección por P. parapertussis con 331 pacien­ tes con infección por B. pertussis y observaron que la frecuen­

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cia de la tos paroxística, silbidos y vómitos era casi idéntica en los dos grupos.1385 Heininger y cois, también compararon la infección por B. pertussis en 76 pacientes con la infección por B. parapertussis en 38 pacientes apareados por edad y sexo.553 Estos autores observaron que la enfermedad causada por B. parapertussis era como la típica de tos ferina pero mucho menos grave y que, al contrario de la tos ferina, la linfocitosis no era una característica de la infección, presumiblemente debido a la ausencia de actividad promotora de la linfocitosis de PT. La menor patogenicidad en B. parapertussis puede deberse en efecto a la falta de expresión de PT y otros factores de virulencia. Es interesante señalar que cuando se transfieren genes que codifican ciertos factores de virulencia de pertussis (p. ej., PT y FHA) en B. parapertussis mediante técnicas gené­ ticas, el microorganismo se toma capaz de producir caracterís­ ticas similares a B. pertussis in vitro (p. ej., anafilaxia. sensibi­ lidad a la histamina y leucocitosis), lo que sugiere que la pre­ sencia de genes de virulencia y su regulación pueden constituir la diferencia primaria entre estas especies genéticamente “idénticas”. BORDETELLA BRONCHISEPTICA B. bronchiseptica causa infecciones del aparato respiratorio

en distintas especies animales (p. ej., traqueobronquitis infec­ ciosa o “tos de las perreras” en canes, neumonía en gatos, rini­ tis atrófica y bronconeumonía en cerdos y lechones, neumonía, otitis media en conejos y cobayos) y puede ser aislado como comensal de las vías respiratorias altas de los seres humanos. Estos a menudo adquieren el microorganismo de animales domesticados y también puede ocurrir la transmisión hospita­ laria de un paciente a otro.507-1223 B. bronchiseptica es una causa inusual de infecciones fundamentalmente en huéspedes inmunodeprimidos.1395 Se ha comunicado sepsis, meningitis que sigue a un traumatismo de cráneo, peritonitis, bronquitis y neu­ monía causadas por B. bronchiseptica en pacientes con enfer­ medad hepática subyacente, alcoholismo, asplenia, enfermeda­ des hematológicas malignas, insuficiencia renal crónica, asma crónica, lupus eritematoso sistémico e hipertensión grave.193-225-483-1007-1395 Bauwens y cois, describieron un caso de bacteriemia y neumonía en una mujer de 20 años luego del trasplante de médula ósea por leucemia mieloide aguda.102 Choy y cois, también describieron un caso de neumonía por B. bronchiseptica en un varón de 7 años 28 días después del tras­ plante de médula ósea por un síndrome de hipergammaglobulinemia IgM ligada al cromosoma X.248 Reina y cois, informa­ ron de un caso de neumonía debida a B. bronchiseptica en un paciente de 37 años que había sufrido un traumatismo de tórax grave en un accidente automovilístico y requirió intubación.1060 Dentro de las 72 horas aparecieron infiltrados en la radiografía de tórax y el cultivo del material de aspiración endotraqueal dio el microorganismo en cultivo puro. En ocasiones. B. bronchi­ septica causa infecciones graves, como neumonía con shock, en pacientes inmunocompetentes.1253 Desde 1991. se han comunicado varios casos de neumonía por B. bronchiseptica en pacientes con SIDA.362-452-861 También se han publicado casos raros de endocarditis causada por B. bronchiseptica. En uno de estos casos, el paciente presentó fiebre y una dermatitis alrede­ dor de una incisión quirúrgica reciente. Se supo después que el perro del paciente a menudo mordisqueaba y lamía el área de dermatitis que rodeaba la incisión, lo que sugirió un origen canino para el microorganismo.1180 De hecho, se lo solía llamar B. bronchicanis debido a su presencia en las vías respiratorias altas de los perros.

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C A P ÍT U L O 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

BORDETELLA HINZII Se propuso B. hinzii como especie nueva en 1995, aunque el

microorganismo había sido descrito informalmente cuando fue aislado en el esputo y en múltiples hemocultivos de un pacien­ te de 42 años con SIDA que no tenía síntomas respirato­ rios.2801304 Este microorganismo similar a B. avium ha sido ais­ lado del aparato respiratorio de pollos y pavos, además en muestras respiratorias de seres humanos.1304 Se aislaron cepas de B. hinzii en ocho ocasiones en un período de 3 años de un paciente adulto con fibrosis quística en asociación con exacer­ baciones agudas de su enfermedad pulmonar crónica; el micro­ organismo no pudo ser erradicado del aparato respiratorio del paciente a pesar del tratamiento antibiótico adecuado.443 En el año 2000, se comunicó una baeteriemia mortal por B. hinzii en un hombre de 69 años con colestasis y se aisló B. hinzii junto con microorganismos del complejo Nocardia asteroides del líquido de lavado broncoalveolar de un paciente con SIDA.445-671 Aunque la exposición aviaria del aparato respirato­ rio se puede descartar en el paciente con SIDA, la posible adquisición de la exposición aviar o la colonización gastroin­ testinal seguida de colangitis ascendente fueron sugeridos como posibles modos de patogenia en el paciente bacteriémico. Otro microorganismo “similar a B. avium" hasta ahora sin nombre fue aislado en un cultivo mixto de un paciente con oti­ tis media crónica. Esta bacteria era distinta de B. avium en su patrón de resistencia a los antibióticos, la composición de pro­ teínas y ácidos grasos y las hibridaciones de DNA-DNA y DNA-rRNA.348 B. avium no ha sido aislado de muestras huma­ nas o infecciones. BORDETELLA HOLMESII B. holmesii, descrito originariamente como un microoganis-

mo no oxidante del grupo 2 de los CDC (NO-2), ha sido aisla­ do en hemocultivos de pacientes con enfermedades febriles agudas, endocarditis, anemia drepanocítica complicada por artritis, diabetes, esplenectomías previas, enfermedad de Hodgkin e insuficiencia respiratoria.1369 De los 15 casos descri­ tos en esta comunicación, se presentó una enfermedad subya­ cente en siete, tres ocurrieron en pacientes asplénicos y un paciente había sido mordido por un perro. Las cepas descritas habían sido aisladas en Suiza, Arabia Saudita y los Estados Unidos. En 1996, Lindquist y cois, aislaron B. holmesii en múl­ tiples hemocultivos en un varón de 12 años con fiebre, cefalea y un antecedente importante de esplenectomía 4 años antes.784 Aunque se desconoce el hábitat normal de B. holmesii, el paciente tenía contacto frecuente y prolongado con perros de caza y había sufrido recientemente una lesión en el dedo pul­ gar con un anzuelo. Tang y otros autores en la Mayo Clinic comunicaron el aislamiento de un microorganismo similar a B. holmesii de tres pacientes con septicemia, endocarditis e insu­ ficiencia respiratoria.1257 Los factores de riesgo fueron asplenia subyacente, enfermedad de Hodgkin y miocardiopatía grave, respectivamente. B. holmesii también fue aislado en un lactan­ te de 10 meses que llegó a la sala de emergencias con fiebre e irritabilidad.898 Con un diagnóstico original de síndrome viral, creció B. holmesii en el único hemocuitivo para aerobios den­ tro de las 36 horas. Durante el seguimiento, el lactante estuvo afebril y asintomático. También se ha aislado B. holmesii en múltiples hemocultivos en un varón de 24 años con tos seca y fiebre y una anamnesis compatible con anemia drepanocítica manifiesta desde el período neonatal, hepatitis C, osteomielitis tibial a los 6 años de edad y crisis abdominales frecuentes que requirieron múltiples transfusiones hasta los 8 años de edad.940

Recientemente, se han aislado cepas de B. holmesii en mues­ tras respiratorias de pacientes con sospecha de padecer tos ferina.8411418 De 10 996 muestras remitidas desde enero de 1995 hasta diciembre de 1998 al Massachussets State Laboratory Institute en Boston para el cultivo de especies de Bordetella, 32 dieron B. holmesii, mientras que 740 y 96 muestras fueron positivas para B. pertussis y B. parapertussis, respectivamente.841 BORDETELLA TREMATUM B. trematum, otra especie recién descrita, ha sido asilada en

muestras de heridas humanas y en casos de otitis media cróni­ ca.1303 Se observó que esta especie estaba más estrechamente relacionada desde el punto de vista genético y quimiotaxonómico con la cepa tipo del género Bordetella (B. pertussis ) que con la cepa tipo del género Alcaligenes (A. faecalis). Aislamiento e identificación de las especies de Bordetella MUESTRAS Y MEDIOS DE CULTIVO

Como B. pertussis se fija preferencialmente al epitelio cilia­ do en las vías respiratorias altas, la muestra de elección se obtiene por aspiración nasofaríngea con un tubo de alimenta­ ción para lactantes conectado a un frasco de aspiración de moco. Se introduce la punta del tubo en una narina a lo largo del piso de la nasofaringe hasta que alcance la faringe posterior. Una vez que el tubo está colocado, se aplica aspiración suave. Luego de la aspiración, se introduce solución salina (1 mL) a través de la tubuladura en el frasco.525 Para obtener las mues­ tras de hisopadas, se pasa un hisopo nasofaríngeo pequeño a través de cada narina hasta que la punta del hisopo alcance la nasofaringe posterior. Se dejan colocados los hisopos y se los rota suavemente durante 30 segundos a 1 minuto de modo que absorban los microorganismos. Los hisopos para cultivo o diagnóstico molecular deben estar compuestos de Dacrón con vainas de plástico. No se deben utilizar hisopos con punta de algodón porque algunas fibras ese material inhiben el cultivo. El alginato de calcio y el aluminio lixiviado para vainas de hisopo metálicas también son inhibidores para los ensayos basados sobre PCR para la detección de B. pertussis ,1339 El máximo rendimiento de cultivos positivos se logra con los hisopos nasofaríngeos recogidos junto con el material de aspi­ ración. Los cultivos habituales de fauces no son apropiados para el aislamiento de B. pertussis. Las muestras para bórdete­ las también requieren medios de transporte especiales para el crecimiento óptimo del microorganismo. Se puede utilizar el medio de transporte de Regan-Lowe para el material de aspira­ ción las muestras de hisopados, que tienen la ventaja de servir como transporte y como medio de enriquecimiento (véase más adelante). Se necesitan medios especiales para el aislamiento de B. per­ tussis. El medio clásico es agar de Bordet-Gengou (BG), el cual se prepara con patatas para incorporarle un alto contenido de almidón. El almidón neutraliza los materiales tóxicos que puede haber en el agar o en la muestra propiamente dicha. Se omiten las peptonas en el medio, dado que estas proteínas tam­ bién son inhibidoras. El agar BG también contiene glicerol como agente estabilizador. Aunque la base de agar BG “case­ ra” es superior, existe un medio basal deshidratado comercial (Remel Laboratories; BD Biosciences). La base se prepara con anticipación y se almacena refrigerada. Si se sospecha B. per­ tussis, se debe notificar al laboratorio antes de que reciba la muestra, dado que el medio final debe prepararse en fresco. Para preparar el medio para el uso, se funde la base de agar con

Especies de Bordetella

patatas glicerol y se agregan 30 mL de sangre desfibrinada de camero por 100 mL de medio base de agar (aproximadamente 25 -> de sangre peso/volumen). En las fórmulas más antiguas, -e pregaba cefalexina (concentración final, 40 |ig/mL) a los ~e¿:cs para inhibir los microorganismos grampositivos conta­ minantes. Se puede sustituir por meticilina (2,5 |ig/mL) u oxacílina (0.625 ng/mL). Se inoculan tanto medios no selectivos c : mo ^electivos, ya que algunas cepas de B. pertussis pueden >e: ligeramente inhibidas por la cefalexina. En 1977, Regan y Lowe describieron un medio que contenía carbón y sangre de caballo que resultó superior al agar BG en varios estudios.1056 Aunque se lo describió originariamente . m medio de transporte/enriquecimiento, las fórmulas de agar Regan-Lowe se encuentran disponibles como medio de transporte/enriquecimiento semisólido y como medio sólido para el aislamiento del microorganismo. Las fórmulas para el medí ? de Regan-Lowe (RL) se muestran en el recuadro 9-12. El medio de transporte/enriquecimiento semisólido es idénnc :• en fórmula al medio de aislamiento que mostramos antes, salvo en que se presenta agar carbón con la mitad de concentración (es decir, 25,5 g/L) y se expende en tubos con tapa a :: sea estériles y no en placas de Petri de 100 mm. También se recomienda preparar algo del medio sin cefalexina de modo de . ntar con el medio selectivo y con el no selectivo para el crecimiento de los microorganismos. Et. condiciones óptimas, los medios deben ser inoculados ¿.rectamente en el momento de la recolección de muestras tanto en medios selectivos (con cefalexina, meticilina u oxaciima. véase antes) como en medios no selectivos (véase lámina er. color 9-5G). Si se utiliza un medio de transporte, el medio >emisólido de Regan-Lowe (RL) es óptimo, dado que las fór­ mulas de los medios de transporte de Stuart y de Amies no son adecuadas para mantener la viabilidad de B. pertussis. Las muestras transportadas en medio semisólido RL pueden ser >_:s:ultivadas al recibirlas en el medio RL para aislamiento o en medio BG con cefalexina y sin ella (u oxacilina/meticilina). El medio de transporte se incuba luego junto con las placas pri­ marias y se subcultiva en agar RL después de 48 horas de enriquecimiento a 35 °C en aire humidificado ambiente.601 Al contrario de las ideas y las prácticas sostenidas ampliamente, el _ire ambiente es superior al medio de incubación enriquecido con C 0 2. Las placas deben incubarse por lo menos du­ rante 7-10 días. Sin embargo, en un estudio llevado a cabo en Canadá, crecieron 7 (16%) de 44 aislamientos de B. pertussis y 1 i f 0%) de 4 aislamientos de B. parapertussis después de sólo 12 días de incubación.673 Se han publicado otras fórmulas de medios para el aisla­ miento de B. pertussis.44’601'602'1*1 Muchas de ellas fueron modific aciones de la fórmula de Regan-Lowe, es decir, una base de e. j carbón con suplemento de sangre desfibrinada más anti­

R ecuadro 9 -1 2

M e d io d e R e g a n -L o w e p a ra e l a is la m ie n to d e Bordetella pertussis (p o r litro de a g u a d e s tila d a )

I

A gar c arbón (O xoide CM 119)

1

Sangre de caballo, desfibrinada

51 g 100 mL

1 C efalexina (om itir para agar no selectivo)

0 .0 4 g

I

0,05 g

A nfotericina B (op cion al)

495

bióticos como lincomicina. Hoppe y Schlagenhauf observaron que la sangre de caballo estimulaba una proliferación abundan­ te y más rápida de B. pertussis que la sangre de camero, y que ambas eran claramente superiores a la sangre humana.601 El microorganismo también crece en agar carbón-extracto de leva­ dura (BCYE), el medio utilizado para el aislamiento de especies de Legionella. Ng y cois, aislaron inesperadamente B. pertussis de muestras de lavado broncoalveolar y biopsia transbronquial de tres pacientes con SIDA en agar BCYE en su búsqueda de microorganismos Legionella en estos pacientes. También se describió un medio sin sangre denominado medio sólido de ciclodextrina (CSM),44 que contiene un compuesto llamado heptaquis (2,6-0)-dimetil-P-ciclodextrina en una base de caldo sintética compuesta por glutamato, prolina, sales balanceadas, buffer TRIS, ácidos de Casamino y L-cisteína. Se observó que heptaquis-ciclodextrina estimulaba el crecimiento de B. pertus­ sis y suprimía el crecimiento de la flora orofaríngea normal. Este medio también se puede volver selectivo mediante la inclusión de cefalexina (concentración final, 5 (xg/mL). En un estudio de 40 muestras de 29 pacientes con tos ferina clínica, desarrolló B. pertussis en el 100% de las muestras cultivadas en medio CSM selectivo, pero sólo en el 65% de las muestras cul­ tivadas en agar BG selectivo.44 También se demostró que el medio CSM tenía un período de validez refrigerado más pro­ longado que el agar BG. PRUEBAS DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

Además del cultivo, las pruebas de inmunofluorescencia directa (IFD) también se utilizan para detectar B. pertussis directamente en extendidos preparados de muestras nasofarín­ geas. Aunque estas pruebas proporcionan resultados rápidos, es bien aceptado que el cultivo en medios apropiados es más sen­ sible la prueba de IFD.528 1233 1423 Según cuándo se recogen las muestras en el curso clínico, es posible que la prueba de IFD no detecte pequeñas cantidades de microorganismos que serán recogidos en el cultivo. Algunos investigadores observaron que esta prueba es inaceptablemente poco sensible e inespecífica, sobre todo cuando se utilizan antisueros policlonales comer­ ciales. Halperin y cois, notaron que sólo 6 de 20 casos positi­ vos por cultivo tenían IFD positivas, y que en sólo 4 de los 12 casos de IFD positiva se confirmaron cultivos negativos me­ diante pruebas serológicas de muestras de suero de fase aguda y de convalecencia.528 A esto se agregan las dificultades intrín­ secas con la interpretación y la subjetividad de las técnicas de fluorescencia. Además, se demostró que los anticuerpos poli­ clonales contra Legionella también reaccionan con algunas cepas de B. pertussis y B. Bronchiseptica en las pruebas de IFD contra los primeros, lo que conduce a resultados falsos positi­ vos de inmunofluorescencia para especies de Legionella.1'0-640-936 La prueba de IFD para la detección de B. pertussis debe utilizarse junto con el cultivo, no en sustitución de él. Las pruebas de IFD pueden realizarse utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos monoclonales (Accu-Mab, Alta-Chem Pharma, Edmonton, Alberta, Canadá) están dirigidas contra un epítopo de lipooligosacárido y es un reactivo fluorocromo doble para la detección de B. pertussis y B. parapertussis en la misma muestra. Para realizar la prueba IFD, se colocan muestras de hisopados nasofaríngeos o mate­ rial de aspiración nasofaríngea en un tubo estéril que contiene una pequeña cantidad (0,5 mL) de caldo de ácidos Casamino. Después de una mezcla enérgica, se preparan cuatro a seis extendidos. La formación de capas con las gotas de material y la posterior desecación antes de las aplicaciones de gotas pro­

496

C A P ÍT U L O 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

duce un frotis con una película visible de material sobre él. Después de la desecación y la fijación con calor, se pueden teñir los portaobjetos. Se deben utilizar conjugados de B. per­ tussis y B. parapertussis correctamente titulados; debido a la alta especificidad de los conjugados, uno se puede utilizar como control negativo de tinción inespecífica del otro en el procedimiento de tinción. Los conjugados policlonales provie­ nen de BD Biosciences. Los frotis de control positivos y nega­ tivos se preparan con suspensiones PBS/solución salina (igual a un McFarland #1) de cultivos de referencia en medio BG o RL sin antibióticos. Con estas suspensiones se logran frotis con 10 a 100 microorganismos por campo de inmersión en aceite. En la prueba de IFD, los microorganismos se presentan como cocobacilos pequeños con una fluorescencia periférica de color verde manzana brillante (véase lámina en color 9-5E). Pueden aparecer aislados, de a pares o en grupos. En los frotis prepara­ dos con muestras altamente viscosas, los microorganismos pue­ den mostrar adherencia a las bandas mucosas. Los extendidos de muestras se examinan con 400 x; las áreas sospechosas se examinan con objetivo de inmersión en aceite para su confir­ mación. Las tinciones de Gram de extendidos preparados simul­ táneamente también pueden ayudar a confirmar la morfología de los microorganismos que fluorescen con los anticuerpos. CARACTERÍSTICAS DE LOS CULTIVOS E IDENTIFICACIÓN

En cultivo, las colonias de B. pertussis pueden observarse después de 2 a 4 días. El crecimiento suele ser evidente antes en medios sin antibióticos, pero no siempre es así. Las placas se examinan en el microscopio con un objetivo de campo (10 x) y una luz incidente oblicua para determinar las características de las colonias. Las cepas clínicas frescas de B. pertussis en agar BG aparecen como pequeñas colonias brillantes y muy acumi­ nadas en el perfil. Clásicamente, se describe que se asemejan a pequeñas gotitas de mercurio (véase lámina en color 9-4G). Las colonias en BG pueden ser ligeramente (3-hemolíticas,

Cuadro 9 -1 6

sobre todo en las áreas más confluentes de crecimiento o des­ pués de una incubación prolongada. En medio de agar RL, las colonias son pequeñas, con cúpula y brillantes, con una opa­ lescencia en madreperla blanca (véase lámina en color 9-5G y H). Las colonias de B. parapertussis crecen más rápidamente, son más (i-hemolíticas en agar BG y tienen un color gris o lige­ ramente pardo. Las colonias de B. bronchiseptica se observan dentro de las 24 horas, son grandes, más planas y tienen aspec­ to mate más que brillante. Las últimas especies se asemejan a un bacilo gramnegativo no fermentativo (al igual que una espe­ cie de Alcaligenes) en el aspecto de sus colonias y la produc­ ción de un olor característico a “no fermentadores”. También difiere la morfología de la tinción de Gram de estos microor­ ganismos. B. pertussis aparece como cocobacilos pequeños y de tinción pálida, mientras que B. parapertussis y B. bronchi­ septica tienen definitivamente más forma de bacilos. Debido a la tinción pálida de los microorganismos, se debe dejar sobre el portaobjetos una contratinción de safranina al menos durante 2 minutos (véase lámina en color 9-5F). Una vez aislado, B. pertussis suele identificarse por la prue­ ba de inmunofluorescencia, dado que es muy inerte en las prue­ bas de identificación bioquímica (cuadro 9-16).524 Los métodos serológicos también pueden utilizarse para identificar B. para-, pertussis, pero los métodos bioquímicos pueden proporcionar una identificación presuntiva. B. pertussis, B. bronchiseptica, B. hinzii y B. avium son oxidasa positivos con el reactivo de oxidasa de Kovac, mientras que B. parapertussis, B. holmesii y B. trematum son oxidasa negativos. B. parapertussis, B. bron­ chiseptica, B. hinzii y B. holmesii son catalasa positivos, mien­ tras que B. pertussis es variable para la producción de catalasa. Tanto B. parapertussis como B. bronchiseptica son ureasa positivos, y las últimas especies producen una prueba positiva en 4 horas o menos. B. hinzii es variable para la producción de ureasa, mientras que B. pertussis, B. holmesii, B. avium y B. trematum son ureasa negativos. Tanto B. parapertussis como B. holmesii producen un pigmento pardo soluble en medios de

Características bioquímicas para la identificación de especies de B ordetella B. PERTUSSIS

B. PARAPERTUSSIS

B. BRONCHISEPTICA

B. AVIUM

B. HINZII

B. HOLMESII

B. TREMATUM

O xidasa

+

-

+

+

+

_

_

Catalasa

+

+

+

+

+

+“

+

M otilidad

-

-

+

+

+

-

+

R educción de nitrato

-

-

+

-

-

-

V

Ureasa

-

V

-

-

Citrato

-

Pigm ento marrón en agar infusión de

-

CARACTERISTICA

+

(24 horas)

+

(4 horas)

+

+

+

+

ND

+

-

-

-

+

ND ND

corazón con L-tirosina (1 g/L ) C recim iento en: A gar de Bordet-G engou

2 - 6 días

1 -3 días

1 -2 días

2 días

2 días

2 días

2 días

A gar de R egan-L ow e

3 - 6 días

2 - 3 días

1 -2 días

1—2 días

2 días

2 días

2 días

A gar sangre

Sin crecim iento

1 -3 días

1 -2 días

2 días

2 días

2 días

2 días

A gar chocolate

Sin crecim iento

1 -3 días

+

2 días

2 días

2 días

2 días

Agar de M acC onkey

Sin crecim iento

V

+

+

+

3 - 7 días

2 días

+ : reacción positiva; reacción negativa v: reacción variable. aReacción débil/retardada.

E species de B ordetella

mientras que B. pertussis, B. bronchiseptica, B. hinzii, B. :r¿”'.L¡tum y B. avium no lo hacen. En el cuadro 9-16 se mues­ tran otras características para la identificación de las especies de Bordetella. v e v a s técnicas para la detección y la identificación de Bordetella pertussis

También se han aplicado varias técnicas más nuevas a la mentificación y la detección directa de B. pertussis en muestras clínicas.906 Se han utilizado anticuerpos monoclonales desarro_dos contra LPS y FHA de B. pertussis en formatos de ensa;• :■> "de manchas” (dot blot) e inmunosorbente enzimático para la identificación de B. pertussis a partir de las colonias aisla¿¿ 5 5 3.514.1122 También se describieron varios métodos rápidos pira la detección directa de antígenos y factores de virulencia de B. pertussis en muestras nasofaríngeas. Se han desarrollado anticuerpos monoclonales preparados contra PT, FHA y LPS n B. pertussis que han sido evaluados en formatos de inmunoanálisis enzimáticos como pruebas de “captura de antígeno” pira la detección directa de estos factores de virulencia específicos de B. pertussis en muestras clínicas.439'513’514 Las pruebas de cultivo tisular in vitro, como la prueba de citotoxicidad de células ováricas de hámster chino realizada directamente en muestras de las vías respiratorias altas, también se describieron c» :no rápidas, sensibles y específicas para el diagnóstico de tos ferina.527 Se ha explotado PT purificada. FHA y otras proteínas . mo antígenos para uso en las pruebas de detección de anti­ cuerpos como herramientas diagnósticas y para vigilancias del í'tado inmunitario (véase sección en “Pruebas serológicas para el diagnóstico de tos ferina”, más adelante). Con la caracterización genética de B. pertussis y sus factores de virulencia y la clonación de los genes para estas proteínas, se han desarrollado genes, cebadores de PCR específicos de c-pecie o ambos y sondas tanto para la detección directa de mi­ croorganismos en muestras nasofaríngeas como para la identiticación de microorganismos aislados en cultivo. De hecho, las pruebas basadas sobre PCR se convierten en las de elección para el diagnóstico de tos ferina debido a su exquisita sensibi­ lidad y especificidad. Se han identificado las secuencias diana ae ácidos nucleicos específicas de B. pertussis y se han desarrollado cebadores y sondas para su detección mediante PCR. Las. secuencias diana de PCR incluyen la secuencia de inser­ ción repetida IS481 específica de B. pertussis, la región pro­ motora del gen de la toxina de B. pertussis, el gen de la adenilatociclasa y los genes estructurales para las proteínas porinas de B. pertMií/í.187.350,467,783,849,931,1063,1275,1307,1340 E] USQ dg una combinación de cebadores y enzimas de restricción puede per­ mitir la detección simultánea de B. pertussis y B. parapertussis ■ ia discriminación entre ellos. Algunas secuencias diana utili­ zadas para PCR, como la secuencia de inserción IS481 de B. pertussis, también se han detectado en otras especies de Bordetella, como B. holmesii.194 La técnica de PCR anidada nested) utiliza una secuencia de 239 pares de bases de la región promotora PT como diana.1063 Esta secuencia se encuen­ da en B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica y es amplificada durante el ciclado térmico. La identificación de las especies se completa mediante la escisión de amplicones con endonucleasas de restricción y el análisis en electroforesis en cel de agarosa con tinción de bromuro de etidio.951 Cada espe­ cie produce un patrón de fragmentos de restricción caracterís­ tico. También se ha modificado la detección de amplicones luego de la amplificación con PCR con el uso de técnicas de . uptura de productos específicos de sondas.187-931 En un forma­

497

to, los amplicones son desnaturalizados y colocados en mocroceldas que contienen una sonda de captura monocatenaria. Después del lavado, se agrega una sonda detectora conjugada con fosfatasa alcalina en fase de solución que reacciona con una porción del amplieón desnaturalizado y capturado.931 También se pueden utilizar los métodos que se valen de la PCR para identificar microorganismos en casos en los cuales las pruebas bioquímicas, serológicas o ambas dan resultados no concluyentes.1215 Las recomendaciones para un enfoque estan­ darizado de la tipificación epidemiológica de cepas de B. per­ tussis han incluido una combinación de técnicas serológicas y moleculares, como LPS y serotipificación de fimbrias, huellas digitales (fingerprinting) de DNA mediante electroforesis en gel de campo pulsado y la secuenciación de los genes para per­ tactina (PRN) y la subunidad SI de PT.890 También se ha utili­ zado análisis de enzimas de restricción y ribotipificación para la diferenciación de B. hinzii y B. avium."'* Se han comparado los métodos que utilizan la PCR con la IFD y los cultivos convencionales en varios estudios. En un estudio canadiense reciente, Tilley y cois, observaron que la PCR tenía una sensibilidad del 95% comparada con el cultivo (36%) y la prueba de IFD que utilizaba reactivos policlonales (11,4%) y monoclonales (8,3%).1275 En un estudio de valida­ ción de PCR llevado a cabo durante un ensayo de vacuna con­ tra la tos ferina en Suecia, el análisis por PCR de 2 421 mues­ tras de aspiración nasofaríngea en el que se utilizó la región promotora PT como diana tuvo una sensibilidad del 94,3% y una especificidad diagnóstica del 99%.1063 Nelson y cois, comunicaron que la PCR y el cultivo tenían sensibilidades de sólo 86% y 58%, respectivamente; el intervalo entre el inicio de la enfermedad y la recolección de muestras y el estado inmunitario del paciente por evaluar fueron los factores que más afectaron la sensibilidad de ambos ensayos.931 Loeffelhoz y cois, compararon cultivo, IFD y PCR para la secuencia IS481 en 319 muestras consecutivas, lo que llevó a que 59 muestras fueran positivas para una o más pruebas. Sobre la base de las revisiones de protocolos y las evaluaciones de los pacientes según una definición de caso de tos ferina de los CDC, la sensiblidades del cultivo, la IFD y la PCR fueron del 15,2%, 52,2% y 93,5%, con especificidades correspondientes del 100%, 98,2% y 97,1%, respectivamente.793 Este estudio señaló que varios resultados positivos de la PCR se obtuvieron sobre muestras de individuos que no cumplían con la defini­ ción de caso, pero tenían síntomas compatibles con tos ferina típica y atípica. Los métodos moleculares también han identificado secuen­ cias de inserción y, por lo tanto, métodos de identificación molecular, para B. parapertussis y B. bronchiseptica.'30* IS 1002 es una secuencia de inserción que se encuentra junto con 1S481 en B. pertussis y tiene una identidad de secuencia del 61,5% con IS481. \S1002 también se encuentra en cepas de B. parapertussis humanas, pero está ausente en cepas ovinas. Otra secuencia de inserción, IS7007, se encuentra en todas las cepas de B. parapertussis humanas y ovinas y en cepas de B. bronchiseptica que se aíslan en mamíferos pero no se encuen­ tran en B. pertussis. La detección directa de IS1001, una secuencia de inserción que se encuentra en B. parapertussis, ha sido utilizada para desarrollar una técnica de detección/identi­ ficación basada sobre PCR para este microorganismo.783 El análisis filogenético de estas secuencias de inserción sugiere que es probable que las cepas humanas y ovinas de B. para­ pertussis evolucionan en forma independiente de las cepas de B. bronchiseptica y que B. parapertussis haya adquirido IS 1002 de B. pertussis.

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Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

Pruebas serológicas para el diagnóstico de la tos ferina

Con la disponibilidad de antígenos separados de B. pertus­ sis, como PT y FHA, se han investigado y desarrollado méto­ dos serológicos para determinar las respuestas inmunes a antí­ genos específicos luego de la infección clínica o la inmuniza­ ción. Varios componentes de B. pertussis son inmunogénicos y generan respuestas intensas de anticuerpos. Guiso y cois, utili­ zaron análisis de Western blot para examinar la respuesta del huésped a varios antígenos de B. pertussis, entre ellos PT, FHA, adenilato ciclasa-hemolisina y pertactina, en 27 niños con sospecha de tos ferina.509 De estos niños, 19 tuvieron diag­ nóstico de tos ferina mediante pruebas serológicas y 10 tenían cultivos positivos. En la convalecencia, los sueros de los 19 pacientes fueron positivos para anticueipos anti-PT, anti-FHA y anti-H-AC mediante Western inmunoblot, mientras que sólo una muestra de suero de la etapa de convalecencia mostró anti­ cuerpos antipertactina. He y cois, examinaron antígenos acumu­ lados y purificados de B. pertussis en un formato de inmunoanálisis enzimático para determinar el antígeno o los antígenos que proporcionarían la prueba más sensible que tuviera una especificidad por lo menos del 99%.545 Observaron que las sen­ sibilidades del EIA utilizando PT solo, FHA solo o pertactina sola fueron del 92%, 85% y 62%, respectivamente; la sensibi­ lidad del EIA con un conjunto de estos antígenos fue del 85%. También se purificó la adenilato ciclasa de B. pertussis y se uti­ lizó como antígeno en una prueba serológica basada sobre EIA, que mostró que se producen títulos elevados de anticuerpos antiadenilatociclasa después de la infección y después de la inmunización con vacunas de células enteras.396 También se han creado pruebas funcionales para la inhibición de los efec­ tos biológicos de los factores de virulencia del microorganismo mediada por anticuerpos. Por ejemplo, Kaslow y cois, descri­ bieron métodos directos e indirectos para medir la inhibición de la actividad de la ADP-ribosiltransferasa mediada por PT luego de la inmunización y de la infección por B. pertussis.6'10 Las pruebas serológicas para B. pertussis han atraído mucho interés científico en los últimos años debido al desarrollo y la evaluación de vacunas acelulares contra la tos ferina que utili­ zan antígenos purificados más que células enteras.238524-526 Antes de la iniciación de grandes ensayos sobre la eficacia de las vacunas, se realizaron pruebas de detección de anticuerpos para tos ferina con células enteras inactivadas, células enteras sonicadas o extractos acelulares crudos de B. pertussis como antígenos; la interpretación de las pruebas serológicas utilizan­ do estos antígenos a menudo fue difícil. Como parte de varios ensayos de vacunas llevados a cabo bajo los auspicios de la Organización Mundial de la Salud (OMS), se desarrolló mejor la serología de la tos ferina como un procedimiento de inrnunoanálisis enzimático semiestandarizado que fue incluido en la definición de caso de tos ferina adoptada por la OMS.1396 En la actualidad, la mayoría de los ensayos de anticuerpos para el diagnóstico de tos ferina utilizan antígenos purificados, como PT, FHA. pertactina y antígenos de las fimbrias, en un formato de EIA. Los anticuerpos dirigidos contra PT son específicos de B. pertussis, mientras que los anticuerpos anti-FHA también son producidos luego de la infección por B. parapertussis. Además, otros microorganismos pueden generar anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con FHA de B. pertussis (p. ej., H. influenzae no tipificables). Luego de la infección natu­ ral, los anticuerpos suelen aparecer 10 días a 2 semanas des­ pués del inicio de los síntomas y se detectan anticuerpos IgG anti-PT y anti-FHA en más del 90% y anticuerpos IgA en el 20-40% de los individuos infectados. Las respuestas inmunita-

rias a otros antígenos (p. ej., pertactina, antígenos de las fim­ brias) tienden a ser más variables y pueden hallarse en el 2060% de las personas infectadas. Las respuestas inmunes a B. pertussis están influidas por el estado de vacunación y la edad del huésped.906 En la definición de caso de tos ferina desarrollada por la OMS, la confirmación serológica requiere sueros apareados (que muestran seroconversión de negativo a positivo o una elevación de cuatro veces en el título), junto con criterios clínicos (tos espasmódica durante más de 21 días).1396 Trollfors y cois, realizaron pruebas seroló­ gicas para tos ferina en un grupo de niños suecos no vacunados, con signos clínicos (tos >21 días y tos < 21 días) y evidencia no serológica de infección por B. pertussis (cultivo positivo, PCR). Entre los que tenían tos > 21 días, las concentraciones de anti­ cuerpos anti-PT y anti-FHA aumentaron 400 veces y 68 veces, respectivamente. Más del 90% de los niños tuvieron un aumen­ to importante del título a ambos antígenos si la muestra de fase aguda se obtenía dentro de los 14 días del inicio de la enferme­ dad.1289 Sin embargo, es posible que las pruebas serológicas no sean útiles en el tratamiento de un paciente con enfermedad aguda porque la producción de anticuerpos específicos se puede retardar, sobre todo en los lactantes. En un estudio reciente de un grupo de pacientes pediátricos no vacunados que se ajusta­ ban a la definición de caso de tos ferina de la OMS, sólo el 714% de todos los niños tenían concentraciones elevadas de IgG anti-PT en la muestra de fase aguda.1386 Las muestras recogidas 5 a 10 semanas después del inicio de la tos tuvieron una sensi­ bilidad diagnóstica del 81 -89% cuando se aplicaron los valores de referencia relacionados con prevalencia de tos ferina en los lactantes (< 1 año), los niños pequeños (1-4 años) y los escola­ res (5-10 años). En los niños vacunados, la respuesta inmunitaria secundaria conduce a incrementos rápidos del título de anti­ cuerpos, de modo que es posible que no se observen cambios importantes en los anticuerpos entre las muestras secuenciales. Sin embargo, las pruebas serológicas en las poblaciones vacu­ nadas pueden ser útiles para el diagnóstico, dado que un título elevado de la respuesta inmunitaria secundaria en una única muestra de suero puede indicar infección en “tiempo real”. Este enfoque puede ser útil para diagnosticar tos ferina en adoles­ centes y adultos, ya que la tos ferina a menudo no se incluye en el diagnóstico diferencial inicial de las infecciones respiratorias pediátricas; en consecuencia los intentos de cultivo o de PCR se hacen tarde en el curso clínico. Después del análisis de datos de un estudio poblacional grande llevado a cabo en Holanda, De Melker y cois, observaron que los niveles de IgG anti-PT de al menos 100 U/mL en un ensayo de EIA son diagnósticos de infección reciente o activa por B. pertussis; en la mayoría de los casos, esta concentración de anticuerpos se logró dentro de las 4 semanas del comienzo de la enfermedad.318 Las unidades de PT por mililitro de suero se determinan mediante calibración de ensayos de EIA con antígeno preparado por la FDA (Labo­ ratorio para Tos ferina de la Food and Drug Administration, Rockville, MD). Además de la EIA, también se describieron pruebas de aglu­ tinación de partículas para detección de anticuerpos. Aoyama y cois, desarrollaron un ensayo de aglutinación de partículas con poli(y-metil-L-glutamato) sensibilizado para PT como partícu­ la sólida para la detección de anticuerpos anti-PT.43 Se detecta­ ron anticuerpos anti-PT en los 21 receptores de la vacuna des­ pués de cada vacunación. Además, se detectó un aumento importante (más de cuatro veces) en los anticuerpos anti-PT en el 76% de 51 pacientes con tos ferina confirmada dentro de las 4 semanas del inicio de la enfermedad, comparado con el 67% de los 51 que fueron detectados con E IA 43

Especies de B ordetella

Tratamiento de la tos ferina

En general, la tos ferina se trata con eritromicina (forma de estolato, 40 mg/kg/día; forma de etilsuccinato, 50-60 mg/kg/día) durante un período por lo menos de 2 semanas para evitar las recaídas. Es posible que las series más cortas (p. ej., ~-10 días) no eliminen el microorganismo de las vías respira­ torias altas. La administración de este antibiótico incluso durante la etapa paroxística disminuye la gravedad y la dura­ ción de la enfermedad. Las cepas de B. pertussis son sensibles a la eritromicina in vitro y tienen CIM que varían entre 0,02 y 0.12 |ig/mL. No se observó resistencia a la eritromicina hasta 1995, cuando se comunicó el primer caso de tos ferina causada por una cepa de B. pertussis resistente a la eritromicina en un niño de 2 meses en Yuma, Arizona.774 Cuando no hubo mejoría clínica después de una serie de 12 días de eritromicina, las pruebas con disco de las cepas no mostraron zonas de inhibi­ ción alrededor de los discos de eritromicina, claritromicina y clindamicina. Las pruebas de dilución en agar pusieron en evi­ dencia una CIM de eritromicina > 64 pg/mL. Sin embargo, las cepas resistentes a la eritromicina siguen siendo relativamente infrecuentes. En una vigilancia de 47 cepas de niños recogidas en la región occidental intermontañosa de los Estados Unidos desde enero de 1985 hasta junio de 1997, sólo una fue resis­ tente a la eritromicina (CIM, 32 pg/mL) en las pruebas de dilu­ ción en agar.721 Se han utilizado otros fármacos como azitromi­ cina en estudios no comparativos abiertos y eliminan con éxito el microorganismo del aparato respiratorio, pero el equilibrio de la experiencia clínica indica que la eritromicina es supe­ rior.74 El trimetoprim-sulfametoxazol también puede erradicar B. pertussis de la nasofaringe y fue utilizado con éxito para tra­ tar al niño con la cepa resistente a la eritromicina. Aunque tri­ metoprim-sulfametoxazol puede ser una alternativa útil a la eri­ tromicina, no se ha determinado la dosificación ni la duración del tratamiento.598’774 Las fluoroquinolonas también suele tener buena actividad contra B. pertussis, pero no se han realizado ensayos clínicos, ya que su uso está contraindicado en los niños; estos agentes pueden ser útiles para el tratamiento de adultos con infección por B. pertussis.603 Además de la quimioterapia antibiótica, se han investigado otros métodos terapéuticos para B. pertussis. Recientemente, se llevó a cabo un ensayo en fase I sobre la seguridad, la farmaco­ logía y la respuesta al tratamiento de B. pertussis con inmunoglobulina anti-fi. pertussis intravenosa (P-IGIV). Este producto plasmático acumulado contiene una concentración siete veces mayor de inmunoglobulina anti-PT que la globulina sérica inmu­ ne convencional. En 26 niños con tos ferina confirmada, el trata­ miento con P-IGIV condujo a declinaciones de la linfocitosis y la tos paroxística para el tercer día después de la transfusión de P-IGIV en todos los tratados sin provocar efectos adversos.185 Pruebas de sensibilidad a los antibióticos de las especies de Bordetella

Aunque no existen procedimientos estandarizados, se han eva­ luado varios métodos para las pruebas de sensibilidad in vitro de las especies de Bordetella. Se han realizado pruebas de sensibi­ lidad por dilución en agar con algunos medios, entre ellos agar de Mueller-Hinton con sangre de caballo al 5%, agar de BordetGengou con sangre de caballo al 5% o al 20% y agar de Re­ gan-Lowe.572'599 Hoppe y Paulus evaluaron el agar de BordetGenou con sangre de caballo al 5%, agar oxoide-carbón con sangre de caballo al 5% y agar de Mueller-Hinton con sangre de caballo al 5% para las pruebas de dilución en agar in vitro y

499

observaron que el agar de Mueller-Hinton con sangre de caba­ llo proporcionaba los resultados más constantes.599 Las CIM determinadas en medios que contienen carbón fueron una a cinco veces más altas para las cepas clínicas, las cepas control y S. aureus ATCC 29213, debido a la inactivación de algunos antibióticos por el carbón. Utilizando el método de dilución en agar, B. pertussis es sensible a una amplia variedad de antibió­ ticos in vitro, incluidos P-lactámicos (ampicilina/amoxicilina), macrólidos (azitromicina, claritromicina. eritromicina. roxitromicina), sulfamidas (trimetoprim-sulfametoxazol). rifampicina y fluoroquinolonas (ciprofloxacina, ofloxacina, temafloxacina, trovafloxacina).596'597'600'603'721'740 Entre las fluoroquinolonas, la levofloxacina es más activa contra B. pertussis (CIM. 1 Ug/mL) que contra cepas de B. parapertussis (CIM, > 2 pg/mL i.' ' La mayoría de las cepas de B. pertussis son resistentes a la tetra­ ciclina. Las tiritas Etest (AB Biodisk, Piscataway, NJ) y los métodos modificados de difusión con discos también fueron evaluados para pruebas de sensibilidad a los antibióticos de B. pertussis. Korgenski y Daly observaron un acuerdo esencial entre las CIM por dilución en agar y las CIM de Etest para el 89,1% de 46 aislamientos (la CIM de Etest estaba dentro + 1 dilución doble de la CIM del agar, mientras que el 10,9% tenía CIM que eran > 1 dilución doble de la CIM por dilución en agar.721 Hill y cois, también evaluaron el Etest utilizando tanto agar de Bordet-Gengou con sangre de caballo al 20% como agar de Regan-Lowe y observaron que el método Etest producía resulta­ dos similares a los de su procedimiento de dilución en agar de referencia (utilizando agar de Bordet-Gengou con sangre de ca­ ballo al 20%) para eritromicina, rifampicina y cloranfenicol; las CIM de trimetoprim-sulfametoxazol utilizando Etest fueron más bajas que las obtenidas con dilución en agar.572 Estos investigadores evaluaron también un procedimiento de difusión con disco utilizando agar de Regan-Lowe con un inóculo estan­ darizado (estándar de McFarland 0,5) y observaron que este método detectaba con precisión la resistencia a la eritromici­ na.572 Las cepas resistentes (CIM, > 256 pg/mL) no produjeron zonas alrededor del disco de eritromicina estándar, mientras que las sensibles (CIM, < 0,06 pg/mL) produjeron zonas de por lo menos 42 mm. La estandarización de las pruebas de sensiblidad para estos microorganismos es necesaria para la investi­ gación de nuevos antibióticos contra las bórdetelas y puede ganar relevancia clínica si la resistencia a la eritromicina se extiende. Las cepas de B. parapertussis son más resistentes a los anti­ bióticos que B. pertussis. Como parte del Multicenter Pertussis Surveillance Project, se recogieron datos sobre sensibilidad a los antibióticos por dilución en agar de 46 cepas de B. para­ pertussis y 11 de B. bronchiseptica.140 Aunque las cepas de B. parapertussis fueron sensibles a eritromicina, trimetoprim-sulfametoxazol y ciprofloxacina, la mayoría fueron resistentes a rifampicina y tetraciclina. La levofloxacina, la ciprofloxacina y la cefpirona, una cefalosporina de amplio espectro, son más activas contra B. pertussis que contra B. parapertussis , 6 o n Entre los macrólidos, tanto la eritromicina como la azitromicina son activas contra B. parapertussis y el 90% de las cepas tienen CIM para eritromicina y azitromicina de 0,5 ug/mL y < 0,06 pg/mL, respectivamente.596'828 Las otras especies de Bordetella tienden a ser más resisten­ tes a los antibióticos que B. pertussis o B. parapertussis. En el estudio multicéntrico, el 82% de las cepas de B. bronchisepti­ ca fueron sensibles a trimetoprim-sulfametoxazol y 27%, a ciprofloxacina; todas las cepas de B. bronchiseptica fueron resistentes a amoxicilina, eritromicina, rifampicina y tetracicli-

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C A P ÍT U L O 9

Otros bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales

na.740 Las cepas de B. hinzii fueron resistentes a ampicilina, ampicilina-sulbactam, cefazolina, ceftriaxona, cefotaxima, cefuroxima, cefotetán, aztreonam, ciprofloxacina y tobramicina, y sensibles a cefalotina, cefatizidima, cefepima, imipenem, tetraci­ clina, trimetoprim-sulfametoxazol. levofloxacina, gentamicina y amikacina.443'671 Las cepas de B. holmesii fueron sensibles a amoxicilina, amoxicilina-clavulanato, cefazolina, cefotaxima, ceftazidima, gentamicina, tobramicina, amikacina, imipenem, tetraciclina. eritromicina, rifampicina, ciprofloxacina y trimetoprim-sulfametoxazol, y resistentes a la penicilina.784940 1257

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Legionella I

Taxonomía y características del género Legionella Espectro clínico y anatomopatológico de la legionelosis Factores predisponentes Anatomía patológica y patogenia

Aspectos epidemiológicos y ecológicos de la legionelosis Incidencia Legionellaceae en el medioambiente Hábitats naturales Hábitats acuáticos creados por el hombre (artificiales)

Legionelosis en viajeros Brotes intrahospitalarios de legionelosis

Diagnóstico de laboratorio Selección, recolección y transporte de muestras clínicas Examen directo de muestras clínicas

Inmunofluorescencia directa (IFD) Detección de antígeno en orina y líquidos corporales

Detección de Legionella en muestras clínicas Aislamiento de especies de Legionella en muestras clínicas Biopsia, extirpación quirúrgica y tejido de necropsia Líquido pleural y aspirados transtraqueales Procedimiento de descontaminación por lavado ácido para esputo y otras muestras contaminadas Hemocultivos

Identificación de especies de Legionella Sensibilidad a los antibióticos y tratamiento Inmunofluorescencia indirecta Diagnóstico molecular

Estudios de microbiología ambiental

Exámenes macroscópico y microscópico de materiales teñidos

Aislamiento de Legionella de muestras ambientales

Examen microscópico de materiales teñidos

Tipificación de cepas de Legionella

523

524

C A PÍTU LO 10 Legionella

urante el verano de 1976, ocurrió un brote explosivo de neumonía de etiología desconocida entre las per­ sonas que asistieron a una convención de la American Legión en Filadelña.63 Se dijo que los individuos que sufrieron una enfermedad multisistémica (que incluía neumo­ nía) tenían la enfermedad de los legionarios.23 Se documentó un total de 182 casos; 29 de estos pacientes fallecieron. Para enero de 1977, el doctor Joseph McDade, de los Centers for Disease Control (CDC), había aislado del agente etiológico.104 Por lo tanto, en 6 meses se resolvió un misterio clínico impor­ tante y se descubrió una nueva fam ilia de bacterias: Legionellaceae. La historia de la enfermedad de los legionarios fue revisada en 1988160 y existen varias evaluaciones más recientes.58,107 139 También se ha detallado la disponibilidad de sitios web.10

D

Taxonomía y características del género Legionella En 1979, Brenner, Steigerwalt y McDade clasificaron la bac­ teria que produjo el brote de enfermedad de los legionarios en F iladelña com o Legionella pneum ophila, en la fam ilia Legionellaceae.20 En la actualidad, se han aislado 50 especies y subespecies y un total de 71 tipos serológicos de Legionella publicados en forma válida de muestras humanas o de muestras am bientales (cuadro 10-1).78-162 Varias especies descritas recientemente son parásitos intracelulares estrictos de amebas de vida libre y pueden aislarse sólo mediante cocultivo con amebas.2,34 Estos patógenos de las amebas fueron reconocidos por primera vez por Rowbotham,125que los denominó patóge­ nos de las amebas similares a Legionella. La más frecuente de estas especies parece ser L. lytica (antes Sarcobium lyticum). Las especies de Legionella son bacilos gramnegativos no esporulados, estrechos, de 0,3 pm a 0,9 pm de ancho. Su lon­ gitud varía desde formas cortas, de 1,5 a 2 pm, hasta formas filamentosas más largas. En general, son cortos y delgados o cocobacilos cuando se los observa en extendidos directos de muestras clínicas, pero tienen una longitud más variable des­ pués del crecimiento en medios de cultivo, cuando las formas más largas de 20 pm no son infrecuentes. Las legionelas se tiñen mucho más fácilmente con las tinciones de Diff-Quik, Giemsa o Gram-Weigert que con la tinción de Gram tradicio­ nal en los preparados de improntas de tejido fresco, frotis de líquido de lavado broncoalveolar o esputo. Sin embargo, el agregado de fucsina básica al 0,05% a la contratinción con safranina en el procedimiento de Gram tiñe mejor las especies de Legionella y de otros numerosos bacilos gramnegativos que se tiñen poco. Salvo por tres especies que son inmóviles, L. oakridgensis, L. nautarum y L. londinensis, el resto de las especies de Legionella se mueven por medio de uno o más flagelos polares o subpolares.162 Las legionelas son aerobias y tienen requeri­ mientos nutricionales especiales. Necesitan L-cisteína y sales de hierro para su crecimiento. R. E. Weaver cultivó por prime­ ra vez L. pneumophila en agar de Mueller-Hinton con suple­ mento de IsoVitalex al 1% y hemoglobina al 1%. Las cepas pueden crecer muy lentamente en agar chocolate utilizado tam­ bién para el aislamiento de gonococos.35 El medio óptimo para el crecimiento es una variación en agar carbón-extracto de levadura desarrollado por James Feeley.55 El extracto de leva­ dura aporta los nutrientes necesarios. El carbón activado elimi­ na los radicales tóxicos de oxígeno producidos por la exposi­ ción de muchos medios a la luz.77 El buffer ACES tiene un pK

Cuadro 10-1

E s p e c ie s d e l g é n e r o Legionella (c a n tid a d d e se r o g r u p o s)

ESPECIES AISLADAS DE SERES H UM ANO S Y DEL M EDIOAM BIENTE

ESPECIES AISLADAS ÚNICAM EN TE DEL M EDIOAM BIENTE

L. anisa L. bozemanii (2) L. birm inghamensis L. cincinnatiensis L. dumoffii L. erythra (2) L. fe e le i (2) L. gorm anii L. hackeliae (2) L. jordanis L. lansingensis L. longbeacheae (2) L. lytica L. m aceachernii L. micdadei L. oakridgensis L. parisiensis L. pneum ophila pneum ophila (15) L. pneum ophila fraseri L. pneum ophila pascullei L. sainthelensi (2) L. tucsonensis L. wadsworthii

L. adelaidensis L. beliardensis L. brunensis L. cherrii L. drozanskii L. fairfieldensis L. fallonii L. geestiana L. gratiana L. gresilensis L. israelensis L. jam estowneiensis L. londiniensis L. moravica L. nautarum L. quateirensis L. quinlivanii (2) L. rowbothamii L. rubrilucens L. santicrucis L. shakespearei L. spiritensis L. steigerwaltii L. taurinensis L. waltersii L. worsleiensis Genom oespecies

de 6,9, el óptimo para el crecimiento de especies de Legionella. El agregado de buffer ACES y a-cetoglutarato arroja el agar B C Y E a.38 El crecimiento en agar B C Y Ea sin ningún crecimiento en agar sangre es uno de los i n d i c i o s p r e s u n t i v o s más útiles de que una cepa podría ser una especie de Legionella. Otro micro­ organismo gramnegativo que también crece en BCY Ea, pero no en agar sangre común es Francisella tularensis. A diferen­ cia de las especies de Francisella, que producen ácido a partir de hidratos de carbono, las especies de Legionella no fermen­ tan ni oxidan hidratos de carbono. Algunos bacilos esporulados termofílicos y Bordetella pertussis también pueden crecer en agar BCYEa; las diferencias en morfología, características serológicas y ácidos grasos celulares ayudan a distinguirlos. Las especies de Legionella producen ácidos grasos de cadena ramificada característicos en sus paredes celulares.162 La mayo­ ría de las especies son débilmente catalasa positivas y peroxidasa positivas. La prueba de hidrólisis de hipurato de sodio, que es positiva para L. pneumophila y negativa para la mayoría de otras especies de Legionella aisladas en muestras clínicas, proporciona un procedimiento presuntivo útil para la diferen­ ciación entre L. pneumophila y las otras especies de Legio­ nella. La caracterización fenotípica de las cepas de Legionella utilizando pruebas bioquímicas tiene sólo un valor limitado para la identificación presuntiva de especies. Sin embargo, la serotipificación mediante pruebas de anticuerpos inmunofluorescentes es una forma práctica de diferenciar presuntivamente

E spectro clínico y anatom op atológico de la legionelosis las especies de Legionella. La identificación definitiva puede requerir estudios de ácidos nucleicos y otros procedimientos de referencia quimiotaxonómicos.46

Espectro clínico y anatomopatológico de la legionelosis La enfermedad de los legionarios puede presentarse de manera esporádica, como una neumonía adquirida en la comu­ nidad o en epidemias.22-54-53 Además de la enfermedad de los legionarios, hay una form a leve denom inada fiebre de Pontiac.69 La enfermedad también puede afectar regiones ana­ tómicas extratorácicas. Por lo tanto, en este capítulo se utiliza el término legionelosis, que incluye la enfermedad de los legio­ narios, la fiebre de Pontiac y la afectación extrapulmonar por especies de Legionella, para referirse a cualquier infección cau­ sada por bacterias de la familia Legionellaceae. Cerca del 85% de los casos documentados de legionelosis fueron causados por L. pneumophila. Los serogrupos 1 a 6 de L. pneumophila por sí mismos han representado hasta el 75% de las legionelas de las que se comunica que causan enfermedad.118 Además de L. pneumophila, se han aislado muchas otras especies de muestras clínicas recogidas de seres humanos (véase cuadro 10-1). En una vigilancia internacional reciente de casos confirmados con cultivo, las especies más frecuentes no pneumophila fueron L. longbeachae y L. bozemanii.163 L. m icdadei8993 y L. dumof/ ; / 145,82 también han sido responsables de enfermedad esporádi­ ca y epidémica en algunos lugares. Se pueden presentar múlti­ ples especies o serogrupos en sistemas de agua, ambientales o potables, y el mismo paciente puede estar infectado por más de un serogrupo o especie al mismo tiempo.96 La legionelosis ha sido reconocida principalmente como forma de neumonía. En los casos típicos, los primeros síntomas son sensación de agotamiento, mialgias y cefalea leve. Suele haber un comienzo rápido con tos seca, temperatura alta (p. ej., no es infrecuente 38,5 °C a 40 °C o más) y escalofríos. Muchos pacientes presentan dolor abdominal y síntomas gastrointesti­ nales (p. ej., náuseas, vómitos y diarrea). En el cuadro 10-2 se resumen las manifestaciones clínicas. Para los investigadores es difícil distinguir entre las distintas etiologías de la neumonía

C uadro 1 0 -2

sobre la base de la anamnesis, el examen físico o las pruebas de laboratorio.122 Al comienzo, las radiografías de tórax muestran infiltrados focales, que pueden progresar hasta una consolidación de los cinco lóbulos.51 106 142 Los infiltrados son bilaterales en dos ter­ cios de los pacientes y pueden observarse cavidades abscedadas, sobre todo en los pacientes inmunodeprimidos. Los hallaz­ gos del laboratorio suelen incluir, en distintas combinaciones, leucocitosis moderada con desviación a la izquierda, proteinuria, hiponatremia, uremia, transaminasa glutámico oxalacética (también llamada aspartato aminotransferasa o AST i en suero elevada y eritrosedimentación alta. Como ya se dijo, la legio­ nelosis también puede adoptar una forma leve y autolimitada de breve duración, conocida como fiebre de Pontiac. con fiebre alta, mialgias, malestar general y cefalea, pero con poc os o nin­ gún hallazgo respiratorio y sin neumonía.57 En el cuadro 10-2 se comparan los aspectos clínicos de la enfermedad de los legionarios y la fiebre de Pontiac. Tanto la enfermedac neumó­ nica como la no neumónica pueden ser el resulta - de la expo­ sición a la misma fuente ambiental.68 En los últimos años, se ha ampliado el espectro clínico de la legionelosis. La enfermedad puede afectar cualquier _parato o sistema orgánico, con neumonía o sin ella. A continuación, damos ejemplos de algunas manifestaciones de afectación extrapulmonar. Se ha comunicado bacteriemia. per faltan datos sobre su frecuencia.40121 Casi el 50% de los pácteme:? con enfermedad de los legionarios muestra m anifestad ne> de! sis­ tema nervioso central, como cefalea, somnolencia, confusión, estupor y otras menos frecuentes, que incluyen ataxia, coma y convulsiones.81 Se ha comunicado una erupción macular, dolorosa y no pruriginosa, limitada a las superficies preubiaies de las piernas; sin embargo, las manifestaciones dérmicas son infrecuentes.75 Se ha demostrado L. pneumophiL: serogrupo 1 en ganglios linfáticos, bazo, riñón y médula ósea. \ ha sido documentada en miocarditis aguda,155161 endocarditis de %álvula protésica,103 pericarditis102 e infecciones de fístulas de nemodiálisis.86 Amow y cois.7 comunicaron el aislamiento de L pneumophila serogrupo 3, mezclado con múltiples e?pe.:es de bacterias anaerobias, de un absceso perirrectal. Se demostró L pneumophila serogrupo 4 mediante inmunofluorescencia indi­

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s e n d o s tip o s d e le g io n e lo s is

M ortalidad Período de incubación Síntomas

Pulmón Riñón Hígado Aparato digestivo Sistem a nervioso central

ENFERM EDAD DE LOS LEG IONARIOS

FIEBRE DE PONTIAC

15%-30% 2-10 días Fiebre, escalofríos, tos, mialgias, cefalea, dolor torácico, esputo y diarrea (y confusión u otros estados m entales en algunos casos) N eum onía y derrame pleural (absceso pulm onar en algunos casos) Insuficiencia renal (proteinuria, urem ia y hematuria en algunos casos) Anom alías leves de la función pulm onar Diarrea acuosa, dolor abdominal, y náuseas y vómitos Somonolencia, delirio, desorientación, confusión y obnubilación (pocas veces se documentan convulsiones)

0% 1-2 días Sim ilar a la gripe: fiebre, escalofríos y mialgias (y tos, dolor torácico y confu­ sión en algunos casos) D olor pleurítico; sin neumonía, sin abs­ ceso pulm onar Sin m anifestaciones renales

Modificado de las referencias146-88.

525

Sin anomalías de la función hepática Sin anomalías Sin m anifestaciones del sistema nervioso central

526

C APÍTULO 10 Legionella

recta en lesiones de pielonefritis aguda en un paciente que tenía tanto neumonía como pielonefritis asociadas con el microorga­ nismo.32 L. micdadei fue el único microorganismo aislado de un absceso cutáneo de la pierna de una mujer de 62 años que había recibido prednisona y ciclofosfamida por una glomerulonefritis rápidamente progresiva.4 Sin embargo, las comunica­ ciones de manifestaciones extrapulmonares se han asociado más a menudo con L. pneumophila que con otras especies. Fang53-54 y M uder106' 108 y cois, han publicado revisiones de las manifestaciones de enfermedad producidas por especies de Legionella distintas de L. pneumophila. La prevalencia elevada de anticuerpos contra legionelas en algunas poblaciones sugiere que puede ser frecuente la infec­ ción asintomática o subclínica. Esta presunción es reforzada por la documentación de infecciones no reconocidas (definidas por seroconversión) que ocurrieron incluso en un grupo de pacientes que habían sido sometidos a un trasplante renal. Factores predisponentes

Tres factores son necesarios o aumentan la probabilidad de infección sintomática: 1. La presencia de legionelas virulentas en una fuente am­ biental. 2. Un mecanismo eficiente para la diseminación de bacterias desde el medioambiente hacia los seres humanos. 3. La disminución de los mecanismos de defensa del huésped que son eficaces contra este microorganismo. En general, las personas que tienen enfermedad de los legio­ narios son de edad mediana o mayores (edad media, unos 55 años); sin embargo, puede ocurrir a cualquier edad, aun en los niños. La legionelosis debe incluirse en el diagnóstico diferencial de los pacientes inmunosuprimidos que presentan fiebre e infil­ trados pulmonares; se desarrolla en los pacientes en los cuales la neumonía no responde a penicilinas, cefalosporinas o ami­ noglucósidos; o en cualquier paciente con neumonía grave, sobre todo cuando no existe ningún otro diagnóstico alternati­ vo muy evidente. En los individuos que reciben hemodiálisis, receptores de trasplantes de órganos y otros pacientes quirúrgi­ cos, por ejemplo, la enfermedad de los legionarios ha sido una causa importante de morbimortalidad.116,93 Otros posibles trastornos predisponentes son diabetes mellitus, etilismo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y enfermedad cardiovascular. También se sugirió el tabaquismo en el brote de Filadelfia y en algunos brotes ulteriores. Un prerrequisito es la exposición a altas concentraciones de microor­ ganismos virulentos del género Legionella en el medioam­ biente. Por lo tanto, ha ocurrido legionelosis con frecuencias más altas en las personas que viajaron a un sitio con hiperendemia progresiva (a menudo no reconocida).11 En los últimos años, ése ha sido en ocasiones el vehículo del viaje, ya que han ocurrido epidemias repetidas veces en barcos cruceros, casi siempre asociadas con el uso de hidromasajes o baños de agua caliente.80 Como resultado de los prerrequisitos señalados, los proble­ mas relacionados con esta bacteria se presentan en los sitios donde se congregan personas ancianas o debilitadas. Aunque se carece de estudios que correlacionen el “giro cama” de los albergues turísticos con la frecuencia de legionelosis, no sería sorprendente que existiera esa correlación, dada la frecuencia con la cual los hidromasajes y los baños de inmersión han sido

señalados como fuentes de infección. Por cierto, las instalacio­ nes de los centros asistenciales han constituido un problema importante, en parte gracias a la contribución involuntaria de los ingenieros que ubican las torres de refrigeración en las pro­ ximidades de las tomas de aire de respiraderos, un diseño indu­ dablemente fortuito que es preocupante por su reiteración.31 Anatomía patológica y patogenia

Las características anatomopatológicas de la infección humana por varias especies de Legionella distintas de L. pneu­ mophila son similares a las halladas en las infecciones por L. pneumophila. Una neumonía lobular multifocal muchas veces se vuelve confluente y puede adoptar un aspecto lobular. Son frecuentes los abscesos pequeños; menos a menudo, se presen­ tan abscesos grandes que pueden verse en la radiografía. Desde el punto de vista histológico, se han observado neu­ trófilos, macrófagos y gran cantidad de espacios aéreos llenos de fibrilla y vasculitis séptica de pequeños vasos sanguíneos. Puede haber fibrosis pulmonar y función pulmonar disminuida como secuelas a largo plazo.26 Las legionelas no se tiñen bien con hematoxilina y eosina en cortes con parafina fijados con formalina, pero pueden observarse si se presentan en cantidad. Los métodos de impregnación argéntica, como los de Dieterle, Steiner o Warthin-Starry, tiñen confiablemente los microorga­ nism os.148 Las técnicas de impregnación argéntica son inespecíficas y tiñen a casi todos los microorganismos, además de Legionella. La tinción de Gram tisular de Brown-Hopps tam­ bién demuestra las bacterias, pero es esencial una atención cui­ dadosa a los detalles, además de controles apropiados. Siempre que sea posible, se deben preparar improntas fres­ cas de material de biopsia pulmonar, porque la visualización y el análisis de todas las bacterias son más fáciles en los frotis que en los cortes histológicos. Las legionelas se pueden demos­ trar con los procedimientos de Giemsa, Gram-Weigert y Gram, sobre todo si se agrega fucsina básica al 0,05% a la contratin­ ción tradicional con safranina en el procedimiento de Gram (véase lámina en color 10-1). Los microorganismos son pató­ genos intracelulares facultativos y pueden hallarse dentro de los macrófagos y los neutrófilos o fuera de la célula. Una característica definida de L. micdadei es la ácido-al­ cohol resistencia del material clínico, propiedad que se pierde después del cultivo en agar. Puede ser necesaria una decolora­ ción modificada, como se utiliza para especies de Nocardia. Se han registrado algunos casos en los cuales se aisló L. pneu­ mophila de una muestra en la cual se habían demostrado baci­ los ácido-alcohol resistentes.12 Sin embargo, es difícil asegurar que no se presentaba una infección simultánea por L. micda­ dei, ya que es más complicado aislar esta especie que L. pneu­ mophila. El conocimiento de la patogenia de la legionelosis ha pro­ gresado considerablemente.6414149,57-79 Las bacterias son pató­ genos intracelulares facultativos y se reproducen en forma pre­ dominante dentro de las células del sistema monocitos-macrófagos, que incluye sobre todo macrófagos pulmonares. En el medioambiente natural distintas amebas de vida libre son los macrófagos de la naturaleza. Las legionelas a menudo son fagocitadas por neutrófilos polimorfonucleares, pero no pare­ cen reproducirse en estas células. Dentro de los macrófagos, las lesiones inhiben la fusión de fagolisosomas y la acidificación del fagosoma; se siguen multiplicando hasta que la célula del huésped se rompe y libera los microorganismos, que luego pue­ den infectar otras células fagocíticas. La patogenia detallada es tema de una investigación progresiva e intensa. La inmunidad

A spectos epidem iológicos y ecológicos de la legionelosis celular y no la humoral parece desempeñar un papel central en la defensa del huésped contra las legionelas.

Aspectos epidemiológicos y ecológicos de la legionelosis Las especies de Legionella están difundidas tanto en el medioambiente natural como en el diseñado por el hombre. La enfermedad de los legionarios y la fiebre de Pontiac se pueden contraer por la exposición a una amplia variedad de fuentes ambientales, pero no hay ninguna evidencia convincente de un estado de portador en seres humanos o de transmisión persona a persona. Por lo tanto, no existe ninguna prueba de que los pacientes que tienen o han tenido una enfermedad de los legio­ narios sean “contagiosos” . Más aún, no se ha probado que las especies de Legionella sean más peligrosas para el personal que las bacterias aisladas de rutina en el laboratorio de micro­ biología clínica. Las fuentes más probables de propagación son la inhalación de microorganismos aerosolizados desde fuentes ambientales o posiblemente la aspiración de microorganismos presentes en agua o en contenido orofaríngeo. Sigue siendo de interés la revisión temprana efectuada por Broome.22 Incidencia

Si bien la legionelosis ha sido documentada en todo el mundo, la morbimortalidad asociada tanto con casos epidémi­ cos como esporádicos está subcomunicada en las estadísticas de salud pública. No sólo la mayoría de los países carecen de un sistema de vigilancia orientado a rastrear la enfermedad, sino que los médicos y los laboratorios de microbiología pue­ den pasar por alto la infección debido a la falta de conciencia por parte de los primeros o porque los laboratorios no utilizan métodos diagnósticos correctos.70 En general, se ha calculado que menos del 1-5% de los casos de neumonía son causados por especies de Legionella, pero es probable que esto sea una simplificación exagerada.36 En los brotes de la enfermedad de los legionarios (por oposición a la fiebre de Pontiac), las tasas de ataque para la población de alto riesgo expuesta suelen ser bajas, pero se han comunicado hasta del 30%.6 Las especies de Legionella (6,7% de los agentes cau­ sales) se ubicaron como tercer agente etiológico (luego de Streptococcus pneumoniae, 15,3% y Haemophilus influenzae, 10,9%) de la neumonía adquirida en la comunidad en 359 pacientes internados en hospitales universitarios, comunitarios y de los Veterans Affaire examinados en un estudio multicéntrico de los Estados Unidos.53 En otros países, la frecuencia de casos esporádicos de neumonía adquirida en la comunidad cau­ sados por especies de Legionella variaron del 2% en el Reino Unido al 3-4% en Alemania y el 10% en Francia.126 La inci­ dencia de fiebre de Pontiac en la población general se desco­ noce. Fuera de una circunstancia de brote, es probable que los casi esporádicos casos de fiebre de Pontiac no sean reconoci­ dos. De todos modos, la definición de fiebre de Pontiac es par­ cialmente epidemiológica; la diferenciación de los casos no neumónicos esporádicos de “enfermedad de los legionarios” y fiebre de Pontiac es clínicamente imposible. Se han comunica­ do casos de las formas neumónica y no neumónica (fiebre de Pontiac) de la misma exposición a las bacterias ambientales, que reflejan sobre todo diferencias en las defensas del huésped en la cantidad de las bacterias inhaladas. Cuando se evalúan estudios de incidencia, es importante reconocer el sesgo intrínseco introducido por los métodos ele­

5 27

gidos por los investigadores, por la factibilidad de diagnosticar algunas causas de neumonía y probablemente también por los intereses intrínsecos de quienes recogen los datos. En un estu­ dio extenso reciente de neumonía adquirida en forma ambula­ toria, las especies de Legionella estaban muy abajo en la lista de agentes etiológicos.16 En todos los estudios el agente causal más frecuente fue “desconocido”. Legionellaceae en el medioambiente

Como ya se mencionó, las especies del género Legionella están presentes en diversos hábitats naturales y creados por el hombre. Numerosos estudios se han centrado en la ecología de las especies que habitan en los espacios creados por el hombre, como las torres de enfriamiento que utilizan evaporación de agua y los sistemas de agua potable (de bebida) dentro de los edificios, los cuales probablemente sirven como "amplificado­ res” o diseminadores de legionelas originadas en ambientes naturales.

HÁBITATS NATURALES

Se han hallado especies de Legionella en fuentes naturales de agua en todo el mundo, incluida el agua subterránea.12 Estas especies están distribuidas en lagos, charcas, arroyos y en manantiales tanto de aguas frías como tibias. Se las ha ais­ lado de hábitats acuáticos con temperaturas que varían desde 5,7 °C hasta 63 °C61 y en aguas calientes de manantial utiliza­ das para hidroterapia.17 Parece existir una mayor concentra­ ción de especies de Legionella en aguas más calientes (30 °C a 45 °C) que en agua con temperaturas más frías.151 En Puerto Rico, se recuperaron legionelas de aguas marinas y de epífitos en los árboles.115 Aunque se afirmó que el suelo (p. ej., el polvo esparcido por el viento desde una excavación) tuvo una participación epide­ miológica (pero que no fue estudiado desde el punto de vista microbiológico) como fuente de Legionella en uno de los pri­ meros brotes de enfermedad de los legionarios, existen pocas comunicaciones de intentos de aislar especies de Legionella del suelo. L. pneumophila y L. bozemanii fueron aislados en mues­ tras de suelos húmedos poco después del reconocimiento de los microorganismos.105 Más recientemente, Steele y cois, aislaron L. pneumophila, L. longbeachae serogrupo 1 y L. micdadei en tierra de macetas en Australia.137 L. longbeachae serogrupo 1 también fue aislado en suelos naturales y en aserrín de pino. Algunos estudios epidemiológicos y microbiológicos del sur de Australia relacionados con un brote de legionelosis debida a L. longbeachae serogrupo 1 sugirieron que el suelo, y no el agua, podría ser el hábitat natural de L. longbeachae serogrupo 1 y que el suelo podría ser la fuente de este microorganismo en la enfermedad humana. En este estudio, los trabajos de jardi­ nería en el suelo, antes que la exposición a agua contaminada con L. longbeachae, parecieron ser el principal factor de riesgo ambiental.136 Se necesitan muchas más investigaciones sobre la ecología de las especies de Legionella en los hábitats acuáticos y terrestres.

HÁBITATS ACUÁTICOS CREADOS POR EL HOMBRE (ARTIFICIALES)

Numerosos informes asociaron la presencia de L. pneumop­ hila en el agua potable caliente de edificaciones con la apari­ ción de legionelosis. Las legionelas parecen sobrevivir a los procedimientos habituales de cloración de las instalaciones de tratamiento de aguas municipales y, por lo tanto, no es inespe­

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C APÍTULO 10 Legionella

rada su presencia en el agua potable provista a hogares, edifi­ cios de departamentos, hoteles, hospitales y otros edificios.3140 En algunos casos se han hallado grandes concentraciones de Le­ gionella en el agua potable caliente, sobre todo cuando no exce­ día de 55 °C. Además de la temperatura del agua, la construc­ ción de los sistemas de plomería parece desempeñar un papel importante; por ejemplo, ciertos tipos de resinas en las juntas; extremos muertos o fondos de saco, donde existe estasis, obs­ trucción o estancamiento del flujo de agua; y las biopelículas o capas de limo sobre la superficie de caños que contienen otras bacterias comensales, protozoos y algas pueden favorecer la presencia de legionelas.94-135 Muchos de estos estudios fueron realizados antes de reconocerse la importancia de los protozoos ambientales y no está claro si alguna de las asociaciones puede haber sido fortuita en lugar de causal. Se han definido algunos de los factores asociados con una mayor replicación de las bac­ terias en los hogares,28 pero abordar el problema a nivel resi­ dencial es prácticamente imposible. Cabe señalar que la infec­ ción adquirida al parecer intrahospitalariamente, en realidad puede haber sido adquirida en el hogar del paciente.129 En la sociedad moderna los mecanismos por los cuales las bacterias del agua pueden dispersarse por aerosoles y transmi­ tirse al aparato respiratorio son muchos. En 1990, los CDC comunicaron un brote de enfermedad de los legionarios adqui­ rida en la comunidad que afectó a 33 personas, que se relacio­ nó con un atomizador ubicado en el depósito de un almacén.97 La máquina generaba un aerosol de agua corriente (que presu­ miblemente contenía L. pneumophila) en gotitas inhalables (25 |J,m) sobre el mostrador de los productos. El sistema utiliza­ ba transductores ultrasónicos ubicados en el reservorio de agua corriente del humidificador para crear la niebla. Otras fuentes públicas de infección son las fuentes ornamen­ tales.76 Los baños con hidromasajes se han asociado con fre­ cuencia con casos de legionelosis.52,71 La popularidad de estos baños, tan eficientes para diseminar bacterias a través del agua, se extiende al alta mar, de modo que los marineros de aguas flu­ viales no son los únicos en riesgo. Espectacularmente, la pes­ quisa de un brote grande vinculado con una exposición de flo­ res en Holanda condujo a las piscinas de hidromasajes que se utilizaron en las exhibiciones.30 También se recuperó una cepa de L. pneumophila de un rociador utilizado en las exhibiciones, pero el genotipo de esta cepa era diferente de aquel de las dos piscinas de hidromasajes y del de los pacientes infectados. Estas experiencias destacan la importancia del cultivo bacteriano y del análisis molecular de cepas clínicas y ambientales durante la investigación de una epidemia. Aunque en varias ocasiones se han aislado legionelas en cabezales de ducha y en el agua de las duchas, la evidencia epi­ demiológica de que las duchas o el uso del agua de las duchas conducen a la legionelosis ha sido algo débil.62,108 Las pruebas de apoyo informadas por Breiman y cois, a partir de una inves­ tigación de un brote de enfermedad de los legionarios en un hospital en Dakota de Sur fortaleció la hipótesis de que el agua de ducha vaporizada puede servir como vehículo para la pro­ pagación de Legionella pneumophila a los pacientes.9 Tal vez el caso más extraño de enfermedad de los legionarios asociada con agua fue una infección neonatal que se adquirió durante un nacimiento ocurrido en la tina de hidromasaje de una casa.112 Los factores que promueven el crecimiento de legionelas en los sistemas y equipos de plomería son poco conocidos a pesar de las numerosas publicaciones al respecto. Las legionelas son microorganismos con requerimientos nutricionales especiales que necesitan medios enriquecidos para crecer en el laborato­ rio y es poco probable que el agua potable aporte todos sus

requerimientos para el crecimiento y energéticos. Rowbotham fue el primero en comunicar que las especies de Legionella se multiplican en íntima asociación con amebas acuáticas y te­ rrestres de vida libre de los géneros Acanthamoeba y Naegleria (véase cap. 22).124 Otros autores han confirmado y ampliado estas observaciones, no sólo con Acanthamoeba y Naegleria, sino también con otras amebas, como Hartmannella y los cilia­ dos Tetrahymena.59-113-150 Por lo tanto, las amebas o los ciliados fagocitan a las legionelas, como lo hacen otras bacterias en la naturaleza y luego las legionelas sobreviven y se multiplican en hábitats nutricionalmente deficientes mediante una vida parasi­ taria dentro de los protozoos. Además, se ha sugerido que las amebas, que forman quistes, podrían ofrecer una nueva protec­ ción a las legionelas dentro de los quistes contra los efectos del cloro.87,134 Los científicos han aprovechado esta asociación para aumentar la recuperación de legionelas del medioambiente y las cepas de una especie, L. lytica, sólo crecen intracelularmente en amebas. Legionelosis en viajeros

Desde el brote de la enfermedad de los legionarios de 1976, que ocurrió en viajeros que iban a Filadelfia, se reconocieron casos epidémicos y esporádicos asociados con viajes en muchos países de todos los continentes.85,123 No está clara la verdadera incidencia de la enfermedad asociada con los viajes. Es probable que los casos sean subcomunicados no sólo debi­ do al subdiagnóstico y a la falta de conocimiento de su impor­ tancia epidemiológica; también es concebible que se trate de las preocupaciones por el efecto adverso de la publicidad sobre el turismo. No obstante, todos los años ocurren casos agrupa­ dos y casos esporádicos relacionados sobre todo con los siste­ mas de agua de los hoteles contaminados con legionelas. No es sorprendente que los brotes puedan ser recurrentes y persisten­ tes hasta que se detecte y se corrija la naturaleza del problema. También se han observado casos agrupados en los viajeros que han estado a bordo de cruceros. Los casos aislados o agrupados de infección por Legionella asociados con viajes deben comunicarse a las oficinas de salud pública estatales y federales y conducir a investigaciones sobre la fuente y la magnitud del brote para evitar una mayor propa­ gación entre los viajeros. Como se demostró por primera vez en la epidemia de Filadelfia de 1976 y se confirmó en repetidas oportunidades, es posible que la recolección de múltiples noti­ ficaciones individuales de enfermedad en un sitio común, como una institución de salud pública, lleve al reconocimiento del problema. Al parecer, la enfermedad esporádica no ligada a viajes puede estar relacionada también con un foco epidémico no reconocido.14 Bhopal ha sugerido estrategias que pueden ser útiles para que las autoridades de salud pública detecten pro­ blemas en sus áreas de influencia.13 Un cambio reciente sobre el tema de la infección asociada con los viajes ha sido el reconocimiento de que quienes viajan en cruceros de vacaciones están expuestos al riesgo de contraer esta y otras infecciones.25 Como ha sucedido con los complejos turísticos en “tierra firme”, estas infecciones han sido origina­ das en los sistemas de agua contaminados, como las piscinas de hidromasajes. Brotes intrahospitalarios de legionelosis

En las poblaciones hospitalizadas hay pacientes que pueden estar inmunodeprimidos y son muy vulnerables a las infeccio­

D iagnóstico de laboratorio ne> er. general. Estos pacientes tienen el riesgo de adquirir legionelosis si están expuestos a microorganismos virulentos. rúente habitual de Legionella en los pacientes hospitali­ z a : s es el agua131 (principalmente el sistema de agua calienr . ' bre todo de duchas o de baños.50 Además, los pacientes r - íc e n infectarse de las torres de refrigeración que forman r-arte del complejo sanitario o que están adyacentes a él.1-67 Dtras fuentes documentadas son las sondas nasogástricas (con nucroaspiración de legionelas en agua contaminada), los humi¿ificadores, el equipo de terapia respiratoria (p. ej., máscaras y nebulizadores manuales lavados con agua corriente contaminá­ is . los hidromasajes y otras fuentes menos frecuentes. El diag'tico temprano de legionelosis y la vigilancia epidemiológi­ ca de casos dentro del hospital son necesarios no sólo para un tratamiento rápido y eficaz sino para ayudar a instituir medidas de control para evitar los casos ulteriores. Debido a la alta mor­ alid ad de la enfermedad de los legionarios intrahospitalaria r^ngo. 30-50%) sería prudente esforzarse por evitar la propa­ gación de las especies de Legionella del medioambiente hospi­ talario a los pacientes que estén más predispuestos a adquirir la infección. La enfermedad de los legionarios intrahospitalaria ha sido :gada también específicamente al uso de agua corriente para limpiar nebulizadores utilizados para la administración de medicación y a otro equipamiento de terapia respiratoria. En un informe de Mastro y cois., el agua corriente contaminada con L. pneumophila usada para lavar nebulizadores fue una fuente de contaminación importante que condujo a un brote intrahospitalario de enfermedad de los legionarios en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica.101 En un número de casos agrupados particularmente ilustrativos, se observó que la enfermedad fue más frecuente en los pacientes que recibían corticosteroides y a su vez estaban expuestos a nebulizadores o humidificadores ambientales que utilizaban agua corriente.8 Es preocupante el hecho reciente de que algunos casos de enfermedad intrahospitalaria de los legionarios se hayan pro­ ducido por microaspiración de agua contaminada con especies de Legionella en pacientes con sondas nasogástricas. 15'4U00'99 Un problema diferente se constató en el Stanford University Medical Center cuando algunos pacientes posquirúrgicos que habían sido bañados con agua corriente desarrollaron infeccio­ nes por legionelas en las heridas. Las bacterias ingresaron directamente a través de las heridas,95 mientras que en los otros casos se constató que la diseminación fue posterior a la intro­ ducción a través del aparato respiratorio. Debido a estos sucesos y a la relativa facilidad con la cual se puede utilizar agua estéril en individuos de alto riesgo, es difí­ cil justificar o defender el uso de agua corriente en estos casos.5

Diagnóstico de laboratorio La base para el diagnóstico sigue siendo el cultivo, que es absolutamente específico y permite el aislamiento para el estu­ dio epidemiológico y la tipificación molecular. La detección de antígeno urinario es una técnica auxiliar útil, sobre todo en los pacientes que no producen esputo suficiente para el cultivo. La detección de ácidos nucleicos todavía no ha alcanzado una comercialización amplia ni características prácticas, pero es probable que se convierta en un recurso diagnóstico importan­ te en el futuro.110 El diagnóstico serológico requiere seroconversión y, por lo tanto, es retrospectivo; es útil para la investi­ gación de epidemias, pero no tiene un papel primario en el diagnóstico de infecciones en pacientes individuales. Las limi­

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taciones de las pruebas diagnósticas actuales han sido explica­ das por Waterer y cois;153 sin embargo, Marrie ha expuesto las razones para continuar intentando la confirmación de laborato­ rio ante la sospecha clínica.98 Selección, recolección y transporte de muestras clínicas

El amplio espectro clínico y la morbimortalidad grave de la enfermedad de los legionarios destacan la necesidad de un diagnóstico de laboratorio rápido y preciso. Cuando hay sospe­ cha clínica de legionelosis, se deben recoger muestras de las vías respiratorias bajas, tanto para cultivo como para pruebas de inmunofluorescencia directa (IFD). Las muestras apropia­ das son esputo obtenido por expectoración, materiales recogi­ dos mediante broncoscopio (p. ej., cepillado bronquial, biopsia. lavado o lavados), aspirado transtraqueal, material de biopsia a cielo cerrado y a cielo abierto, aspirados con aguja fina de pul­ món y líquido pleural. En la mayoría de las situaciones es apro­ piado tomar cultivos para especies de Legionella sólo ante una solicitud específica. Sin embargo, sería conveniente incluir las legionelas en el espectro de patógenos que se investigan cuan­ do se cultiva tejido pulmonar, tanto si se obtiene ante mórtem como post mórtem. Este cultivo de rutina puede servir como parte del sistema de advertencia de que estos patógenos aso­ ciados con el agua constituyen un problema en una institución particular. El aislamiento primario de legionelas en medios sólidos ha sido exitoso a partir de biopsias pulmonares a tórax cerrado y a tórax abierto, líquido pleural y aspirados transtraqueales, muestras de lavado broncoalveolar y esputo. Se cuenta con un medio selectivo razonablemente semieficaz para el aislamiento primario de L. pneumophila en esputo y muestras bronquiales contaminadas.37'39-156 Las muestras deben recogerse con cuidado para evitar los aerosoles y transportarse al laboratorio a temperatura ambiente en recipientes estériles a prueba de pérdidas, preferiblemente dentro de las 2 horas de la recolección. Las muestras que deben enviarse al laboratorio de referencia deben ser refrigeradas o conservadas en hielo húmedo si se prevé una demora de menos de 2 días. Las que van a almacenarse durante días o semanas pueden enviarse en hielo seco. Las muestras que van a ser remi­ tidas a un laboratorio de referencia deben empaquetarse y enviarse de acuerdo con las reglamentaciones federales (véase cap. 1). Si se las va a remitir sólo para estudio anatomopatoló­ gico y se las fija en formalina neutra con buffer antes de su envío, no es necesario refrigerarlas o congelarlas durante el transporte. Se ha aislado L. pneumophila de hemocultivos en algunas ocasiones utilizando medios convencionales con suplemento de L-cisteína y pirofosfato férrico, o utilizando m edios aerobios y anaerobios radiométricos BACTEC (Becton Dickinson Instrument Systems, Sparks, MD) sin suplementos especia­ les.45 El subcultivo a ciegas de los frascos para aerobios y ana­ erobios de BACTEC en B C Y Ea parece ser necesario para el aislamiento de legionelas. Como ya se dijo, también se pueden hallar legionelas (pocas veces) en localizaciones extrapulmonares. Sin embargo, no se ha establecido el valor práctico (o la relevancia clínica) de buscar especies de Legionella en hemo­ cultivos o sitios extrapulmonares. Además de las muestras anteriores, se debe recoger orina (de preferencia una muestra matinal temprana) para la detección del antígeno de Legionella. Se debe recoger una muestra sérica inicial de fase aguda como auxiliar de otras pruebas que hagan posible un diagnós­ tico más rápido. Se recoge una muestra sérica de seguimiento

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C A P ÍT U L 0 10 Legionella

dentro de las 2 a 6 semanas después de la recolección de la muestra de fase aguda, para poder demostrar una elevación de cuatro veces en el título de anticuerpos contra Legionella. Por necesidad, el diagnóstico será retrospectivo, pero puede ser el único medio para diagnosticar la infección en algunos pacien­ tes, sobre todo en aquellos con mínima secreción de esputo.156 Lamentablemente, la elevación diagnóstica de cuatro veces en el título de anticuerpos puede ser lenta y ocurrir en no más del 75-80% de los pacientes en los que finalmente se comprueba que tienen enfermedad de los legionarios.156 Además, algunas personas que presentan seroconversión se mantienen asintomáticas (probablemente debido a la infección subclínica). Examen directo de muestras clínicas EXÁMENES MACROSCÓPICO Y MICROSCÓPICO DE MATERIALES TEÑIDOS

El examen macroscópico de muestras de pulmón puede ayu­ dar al patólogo a seleccionar las mejores áreas para el cultivo o el examen histológico. Se deben preparar frotis directos de exu­ dados o preparados de improntas (frotis por contacto sobre un portaobjetos) de material fresco de biopsia pulmonar. Los cor­ tes por congelación de las muestras pulmonares también son útiles para el diagnóstico. Los cortes por congelación y los pre­ parados de improntas deben colocarse en metanol para su fija­ ción si se desea emplear tinción de Gram. hematoxilina y eosina, tinción de Giemsa, “Diff-Quik” o tinción ácido-alcohol resistente modificada de Kinyoun. La tinción de Giemsa es útil para observar legionelas y otras bacterias en preparados de improntas de material pulmonar o broncoscópico frescos. Sin embargo, también debe realizarse una tinción de Gram por su utilidad para el diagnóstico diferencial.

EXAMEN MICROSCÓPICO DE MATERIALES TEÑIDOS

La tinción de Gram puede utilizarse con distintas muestras (p. ej., aspirados transtraqueales, líquido pleural, aspirados de empiema torácico, punción pulmonar con aguja fina y prepara­ dos por improntas de material pulmonar). Es mejor la fijación con metanol que la fijación con calor; asimismo, se puede mejorar la intensidad de la tinción aumentando el tiempo de tinción con safranina a 10 minutos o más. Como alternativa, algunos investigadores han agregado carbolfucsina al 0,05% a la safranina para mejorar la intensidad de la tinción con la con­ tratinción. La tinción de Gram-Weigert. “Diff-Quik” o Giemsa puede poner de manifiesto más microorganismos de los que se pueden ver con la tinción de Gram habitual. En los cortes his­ tológicos embebidos en parafina y fijados con formalina, no es posible ver fácilmente Legionella en los preparados teñidos con hematoxilina y eosina, Gram, Brown-Brenn, Brown y Hopps o MacCallum-Goodpasture. La tinción de metenamina plata de Gomori (GMS) y la tinción del ácido peryódico de Schiff no son útiles para demostrar legionelas. Una tinción ácido-alcohol resistente modificada, como la realizada para las especies de Nocardia, es útil para demostrar L. m icdadei111 y posiblemente algunas cepas de L. pneumophila. Todas estas tinciones pueden realizarse en extendidos por impresión o cor­ tes titulares, pero son más satisfactorias en frotis de gota fina. Un método histoquímico muy sensible para demostrar bacte­ rias de todos los tipos es una de las tinciones de impregnación argéntica, creada originariamente para las espiroquetas. Al principio se utilizó una tinción de Dieterle modificada; los microorganismos se tiñen de negro a pardo oscuro. También funcionan otras técnicas de impregnación argéntica, como los métodos de Steinert y de Warthin-Starry. Estas tinciones argén­

ticas suelen realizarse en cortes histológicos y son cambiantes; la elección óptima es la tinción que mejor realiza el laboratorio local. Aunque son sensibles, los granos de plata depositados en estas tinciones oscurecen la morfología bacteriana y, por supuesto, no se puede determinar la reacción de Gram. En la lámina en color 10-1 A, B y D se muestra la morfología de L. pneumophila.

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFD)

Los ensayos de inmunofluorescencia directa, creados por Cherry y cois, en los CDC,27 se han utilizado con éxito para la detección rápida de especies de Legionella en muestras clínicas del aparato respiratorio. Comparados con los cultivos, la IFD tiene baja sensibilidad (25-70%).162 La especificidad ha sido alta, pero cuando existe baja prevalencia de infección por Legionella, los resultados falsos positivos son inaceptablemente frecuentes. Además de las reacciones cruzadas inmunológicas potenciales, la contaminación con bacterias ambientales parece haber causado algunos resultados falsos positivos, aun cuando se ejerza un cuidado escrupuloso al realizar la prueba. Por lo tanto, no se puede recomendar el uso de inmunofluorescencia para el diagnóstico directamente en muestras del paciente. Sin embargo, la inmunofluorescencia es un método útil para la identificación de bacterias aisladas se comercializan antisue­ ros polivalentes conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC), así como sueros de control y otros reactivos para prue­ bas de IFD de Legionella. Genetic Systems (Seattle. WA) ofre­ ce un conjugado de anticuerpos monoclonales que tiene la ven­ taja de disminuir la cantidad de resultados falsos positivos mientras retiene la capacidad de reaccionar con la mayoría de los serotipos de L. pneumophila .43 Como nota de precaución, cabe señalar que el conjugado monoclonal de Genetic Systems para IFD no pudo detectar L. pneumophila en los tanques de almacenamiento de agua caliente y fría ni en muestras de hiso­ pados de duchas y de un grifo de agua;149 por lo tanto, no se puede recomendar para los estudios de IFD de agua potable u otras muestras de sistemas de agua artificiales y su realización en estudios de agua de hábitats naturales es incierta. Al realizar la prueba de IFD, los anticuerpos específicos en forma de antisuero polivalente marcado con FITC (conjugado) dirigido contra el/os antígeno/s por detectar se adquieren en el comercio. Se deben seguir exactamente las instrucciones del fabricante del equipo. El antígeno (presente en la superficie de Legionella o dentro de estos microorganismos) se fija sobre un portaobjetos y luego se recubre con anticuerpos marcados con FITC. El antígeno se une a la globulina en el anticuerpo mar­ cado con FITC y forma un complejo antígeno-anticuerpo (que no se elimina cuando se lo enjuaga suavemente con buffer) que es visible por la excitación del FITC con luz ultravioleta. Cuando el/os antígeno/s de una especie de Legionella ha reac­ cionado con anticuerpos conjugados con FITC, la exposición a la luz ultravioleta hace que el FITC emita longitudes de onda de luz más largas en la región amarillo-verde del espectro de colores, y se pueden ver las bacterias (utilizando un microsco­ pio de fluorescencia) como bacilos amarillo verdosos de fluo­ rescencia brillante.

DETECCIÓN DE ANTÍGENO EN ORINA Y LÍQUIDOS CORPORALES

Los procedimientos para detectar antígenos Legionella en orina, creados por Kohler y cois, en el Indiana University Medical Center, son radioinmunoanálisis, ensayo inmunosorbente enzimático y aglutinación del látex.92 Los inmunoanálisis

D etección de Legionella en m uestras clínicas

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comerciales para la detección de antigenuria causada por L. pneumophila serogrupo 1 tienen una sensibilidad de alrededor del $0-90% y una especificidad que se aproxima al 100%. En ei pasado, se utilizaron radioinmunoanálisis, inmunoanálisis enzim áticos y ensayos de aglutinación de partículas. Actualmente, también existe un ensayo en bandas inmunocromcgráficas (Binax NOW, Portland, Maine), que es muy útil, sobre todo en los pacientes que no producen un esputo sufi­ ciente para el cultivo. Las limitaciones incluyen la restricción a un único serogrupo, si bien es el patógeno humano más fre­ cuente en el género, y la excreción prolongada de antígeno en ¿igunos pacientes. En particular, es probable que los pacientes nmunosuprimidos que tienen una resolución tardía de la fiebre excreten antígeno durante más de 60 días.133 Por lo tanto, la letección de antígeno urinario debe correlacionarse en forma cuidadosa con la historia clínica antes de adjudicar la infección actual a Legionella,9' También se describieron reacciones cru­ zadas ocasionales entre los serogrupos de L. pneumophila .90

homogeneización, se inocula el medio de siembra aproximada­ mente con 0,1 mL del homogeneizado y se lo siembra en estría para su aislamiento. Además, se deben preparar portaobjetos pa­ ra tinción de Gram de la misma muestra.

Detección de Legionella en muestras clínicas

PROCEDIMIENTO DE DESCONTAMINACIÓN POR LAVADO ÁCIDO PARA ESPUTO Y OTRAS MUESTRAS CONTAMINADAS

Aislamiento de especies de Legionella en muestras clínicas

El cultivo bacteriológico de Legionella es la forma preferida i y por lo tanto el patrón de referencia) para el diagnóstico de la legionelosis.165 Según Bridge y Edelstein, el cultivo es 1,5-3 veces más sensible que la prueba de IFD. No se aíslan de ruti­ na especies de Legionella de la flora normal de las vías respi­ ratorias altas, aunque la prueba de DFA para L. pneumophila fue positiva en algunos individuos sanos,21 si bien no se esta­ bleció la especificidad de la reacción de DFA. El medio sólido no selectivo recomendado para el aislamien­ to de legionelas es el agar cabón-extracto de levadura con buffer (BCY Ea), que contiene L-cisteína, pirofosfato férrico, buffer ACES (ácido A,-[2-acetamidol-2-aminoetanosulfónico), ácido a-cetoglutárico y carbón activado (BCY Ea) y se comer­ cializa con diferentes marcas de diversos fabricantes. Además de BCYEa, se recomienda utilizar uno o más medios selecti­ vos para evitar el sobrecrecimiento exagerado de la flora nor­ mal y la posibilidad de que otros microorganismos inhiban el crecimiento de Legionella. Se han agregado antibióticos a la base BCYEa, lo que conduce a medios selectivos razonable­ mente eficaces. Un medio selectivo útil contiene base (BCY Ea) con suplemento de cefamandol. polimixina B y anisomicina (BMPAa); un segundo medio contiene glicina, van­ comicina, polimixina B y anisomicina (denominado medio "de Wadowsky-Yee modificado” o medio de MWY). El cefaman­ dol en BM PAa puede inhibir las especies de Legionella que no producen P-lactamasa, mientras que el medio MWY no es tan selectivo como BM PAa. Los medios selectivos con base de BCY Ea se encuentran ampliamente disponibles en el comer­ cio. Como los medios selectivos pueden inhibir a algunas legionelas, se los debe utilizar junto con B C Y Ea no selectivo.

BIOPSIA, EXTIRPACIÓN QUIRÚRGICA Y TEJIDO DE NECROPSIA

Para inocular los medios B C Y E a o B M Pa, se debe tocar suavemente con la superficie fresca de corte del pulmón en el primer cuadrante y se utiliza un ansa de inoculación estéril para transferir este inoculo a los otros cuadrantes para su aislamien­ to primario. Como alternativa, se puede utilizar un molinillo tisular estéril para homogeneizar trozos de 1 a 2 mm de tejido picado en 0,5 a 1 mL de un caldo estéril (como caldo triptica­ sa soja o medio de tioglicolato enriquecido). Después de la

LÍQUIDO PLEURAL Y ASPIRADOS TRANSTRAQUEALES

El líquido pleural y los aspirados transtraqueales se siem­ bran directamente en los medios selectivos y no selectivos como se hace para los homogeneizados tisulares. Se incuban las placas de B C Y Ea o B M Pa en una incubadora con CO, al 5-10% a 35 °C y se las examina diariamente durante 5 días; se las puede examinar mejor cada 2 a 3 días hasta durante 2 sema­ nas. Se inoculan otros medios para las muestras de las vías res­ piratorias bajas (p. ej., agar sangre de carnero, agar chocolate y agar de MacConkey) y se los incuba de la forma habitual. Se procesa mejor la misma muestra utilizada para el cultivo haciendo frotis para la tinción de Gram.

Los medios selectivos disponibles para el aislamiento pri­ mario de legionelas no son completamente selectivos y, por lo tanto, permiten el crecimiento intercurrente de algunos micro­ organismos no deseados (p. ej., especies de Bacillus o especies de Pseudomonas). Además, el crecimiento de legionelas en B C Y E a puede ser inhibido por otras bacterias en las muestras clínicas, aun cuando se incorporen antibióticos en los medios selectivos. Se ha comunicado que el tratamiento de las muestras respiratorias contaminadas como esputo, lavados bronquiales y aspirados traqueales con una solución ácida de lavado antes de la inoculación de placas de B C Y Ea y B M Pa mejora el aisla­ miento de Legionella .24 Se puede utilizar el protocolo explica­ do en el recuadro 10-1 para el procesamiento de las muestras que contienen flora normal. Sin embargo, cabe señalar que no existe ninguna otra comunicación que confirme ni refute la efi­ cacia del tratamiento con ácido, de modo que se debe evaluar el trabajo extra involucrado en cada laboratorio. El tratamiento

Recuadro 10-1

P rotocolo para la d e scontam inación por lavado ácido de esputo y o tras m uestras contam in adas

1. Antes de realizar el tratam iento con ácido de la m uestra, preparar seis frotis para la prueba de IFD. 2. Inocular una placa de B C Y E a y una placa de B M PA a con tres a cinco gotas de la muestra respiratoria no tratada y sem brar en estría para el aislamiento. 3. Agregar 0,5 mL de muestra respiratoria a 4,5 mL de solución ácida (KC1-HC1 0,2 M) en un tubo con tapa a rosca. a. Sellar apretadamente el tubo y mezclar con cuidado agitando bajo una capucha de seguridad. b. Dejar reposar la suspensión a temperatura am biente durante 5 minutos. 4. Inocular un segundo conjunto de placas de B C Y E a y B M PA a con tres a cinco gotas de la mezcla ácido-m uestra preparada en el paso 3 y sem ­ brar en estría para aislamiento. M arcar las placas con una “A ” para identificar las placas inoculadas después del tratam iento con ácido. 5. Colocar las cuatro placas inoculadas en bolsas de plástico perm eables al C O , (dos por bolsa) e incubar en C O , a 35 °C durante 2 semanas. Exam inar cada 2 a 3 días para detectar crecimiento.

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C A P ÍT U L 0 10 Legionella

de las muestras con calor sólo mejoró en forma marginal el ais­ lamiento de Legionella y no fue recomendado para su uso sis­ temático.48

HEMOCULTIVOS

En ocasiones, la recolección de sangre para el cultivo de Le­ gionella es útil en ciertas circunstancias clínicas. Se han utili­ zado tanto métodos de cultivo en caldo como de lisis-centrifugación. Se debe realizar un subcultivo a ciegas de los cultivos en caldo o la tinción con un método sensible como naranja de acridina, porque las legionelas no desencadenan regularmente indicadores de crecimiento en los sistemas comerciales. Los pacientes con hemocultivos positivos tuvieron concentraciones mucho más altas de legionelas en las muestras respiratorias que aquellos con hemocultivos negativos. No está clara la utilidad de realizar hemocultivos de rutina en los pacientes que no están tan gravemente enfermos. Identificación de especies de Legionella

En los casos típicos, las colonias de Legionella aparecen en B C Y Ea después de 2 a 3 días de incubación en las áreas que han recibido un inóculo importante. Sin embargo, si sólo se presentan algunos microorganismos y si las placas han sido inoculadas ligeramente, pueden requerir varios días más para desarrollarse. Las colonias tienen un tamaño variable (puntiformes hasta 3 a 4 mm), son brillantes, convexas, circulares, ligeramente irregulares y tienen un margen entero (véase lámi­ na en color 10-1C). Cuando se las examina a través de un microscopio de disección (7x a 15x) parecen tener estructuras internas cristalinas o un aspecto moteado opalescente similar al de Fusobacterium nucleatum (véanse cap. 16 y lámina en color 10-1C y D). Algunas especies muestran una fluorescencia blan­ co azulada bajo luz ultravioleta de onda larga (366 nm) (véase lámina en color 10-IE); otras muestran una fluorescencia roja (cuadro 10-3). Las presentes colonias de Legionella deben subcultivarse en una placa de agar sangre de camero al 5% común sin suplementos o B C Y E a sin L-cisteína y en medio B C Y Ea que contiene L-cisteína. Los microorganismos que crecen en agar sangre de camero al 5%, en B C Y E a sin L-cisteína o en otros medios habituales (como agar de MacConkey) es proba­ ble que no sean Legionella. Se pueden aislar cepas ocasionales de especies de Legionella en agar chocolate enriquecido. Se deben caracterizar las cepas de bacilos gramnegativos con características típicas de las colonias de Legionella que crecen en medio B C Y E a o B M P a después de 48 horas de incubación o más, pero no crecen en B C Y E a que carece de L-cisteína o en agar sangre de carnero. La mayoría de estas cepas pertenecen a L. pneumophila serogrupo 1, pero existe variación geográfica en las especies y los serogrupos recuperados. La prueba de laboratorio más conveniente para confirmar Legionella ante un microorganismo sospechoso es la prueba IFD. Las colonias pueden ser evaluadas con los conjugados de anticuerpos fluo­ rescentes mencionados antes para realizar el seroagrupamiento de la cepa aislada. En ocasiones, se encuentran microorganismos que se ase­ mejan a Legionella, pero que no reaccionan con los reactivos serológicos utilizados en la prueba de IFD. Todas las pruebas bioquímicas tienen un uso limitado (cuadro 10-3); la caracteri­ zación de los ácidos grasos celulares es útil si el laboratorio está preparado para realizar este análisis (cuadro 10-4). Sin embargo, para la mayoría de los laboratorios la conducta ade­ cuada será remitir la cepa a un laboratorio de referencia para

determinar si representa un serogrupo para el cual no se dispo­ ne de reactivos o incluso una especie o un serogrupo que antes no fue reconocido. Cabe señalar que existen especies distintas de Legionella que requieren L-cisteína, no crecen en agar san­ gre y pueden asemejarse a Legionella en la morfología de las colonias y microscópica.162 Las pruebas utilizadas para la caracterización definitiva de las especies de Legionella en algu­ nos laboratorios de referencia o de investigación comprenden pruebas serológicas, cromatografía gas-líquido de ácidos gra­ sos celulares y estudios genéticos de ácidos nucleicos. Como ya se dijo, se demostró que la sonda de eDNA marcada con 152I que se comercializa, diseñada para detectar rRNA de legione­ las, diferencia entre los microorganismos de género Legionella y no Legionella que crecen en cultivo.144 En la lámina en color 10-1 se muestran las características seleccionadas para el reco­ nocimiento de laboratorio de las especies de Legionella. Sensibilidad a los antibióticos y tratamiento

La mortalidad de los pacientes con legionelosis causada por L. pneumophila varía del 0% al 30%, según la circunstancia clínica y la población de pacientes. La eritromicina ha sido efi­ caz para reducir la tasa de letalidad e históricamente ha sido el fármaco de elección para la legionelosis. La mortalidad de la infección por Legionella se correlacionó tanto con la demora en la iniciación del tratamiento con eritromicina después de la hospitalización como con la demora total para administrar el antibiótico.74 Como las especies de Legionella son patógenos intracelula­ res facultativos, que se reproducen dentro de los monocitos y los macrófagos, es muy probable que los antibióticos que son concentrados dentro de las células sean satisfactorios en el tra­ tamiento. Los macrólidos más nuevos (p. ej., azitromicina y cla­ ritromicina) y las fluoroquinolonas (p. ej., ciprofloxacina y pefloxacina) son más activos in vitro y en modelos experimen­ tales que la eritromicina, aunque la experiencia clínica con estos agentes sigue siendo limitada. Se sabe que la rifampicina es muy activa in vitro144 y se podría administrar además de la eritromicina a algunos pacientes gravemente enfermos o que no responden a la eritromicina sola, pero no se debe adminis­ trar rifampicina aislada. Como alternativa, se ha recomendado doxiciclina combinada con rifampicina para pacientes modera­ da o gravemente enfermos. Otra posible opción es trimetoprima-sulfametoxazol con rifampicina o sin ella. Las penicilinas (p. ej., penicilina, carbenicilina. oxacilina); las cefalosporinas de primera generación (p. ej., cefalotina, cefazolina), de segun­ da generación (p. ej., cefamandol. cefoxitina) y presumible­ mente las de tercera generación; los aminoglucósidos (p. ej., gentamicina, tobramicina, amikacina) y la vancomicina no son eficaces para el tratamiento. La prueba de sensibilidad a los antibióticos in vitro de las cepas aisladas de Legionella no ha sido estandarizada y no se correlaciona con la respuesta clíni­ ca a la antibioticoterapia en los pacientes. Por lo tanto, no se recomienda realizar pruebas de sensibilidad a los antibióticos in vitro cuando se isla Legionella en el laboratorio del diag­ nóstico del hospital porque los resultados no son interpretados fácilmente por el microbiólogo o el médico. Inmunofluorescencia indirecta

La prueba de inmunofluorescenia indirecta (IFI) se reco­ mienda como auxiliar para el diagnóstico de legionelosis, sobre todo para pacientes que no pueden proporcionar muestras res­ piratorias suficientes (como esputo) para cultivo. La sensibili-

Cuadro 10-3

C a r a c te r ís tic a s s e le c c io n a d a s d e e s p e c ie s d e

Legionella

im p lic a d a s e n e n f e r m e d a d e s h u m a n a s *

Á C IDO -ALCO H O L R ESISTEN CIA M O DIFICADA EN EL TEJIDO

COLORACIÓ N PARDA DE LOS M EDIOS QUE CO NTIENEN TIROSINA

HIDRÓLISIS DE HIPURATO

LIQUEFACCIÓN DE GELATINA

PRO DUCCIÓ N DE P-LACTAMASA

OXIDASA

M OTILIDAD

L. amisa

-

+

-

-

+ + +“

-

+ +

+ ±

±

±

+ +

-

+
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+ + + +

+ + + + + + + + + + +

AB

L. birmingham ensis

+ + + + + +

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ND

ND

ND

ND

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ND

+

+

-

+

_b

-

+ +

+ +

+(d)

±

+ +

+ +/±

+ +

-

ESPECIES DE L E G IO N E L L A

L. bozemannii L. cincinnatiensis L. dumoffii L. feelei L. gorm anii L. hackelii L. jordanis L. lansingensis L. longbeachae L. lytica L. m aceachernii

-

AUTOFLUO RESCENCIA

AB

AB

AB

-

+d

+ + +

L. pneum ophila subespecie fra seri

-

+

±

+

+

+/±

+

L. pneum ophila subespecie. pascullei

-

+

+

+

+

+/±

+

L. sainthelensi

-

+

-

+ + +

+ + +

+

+ +

AB

-

-

L. parisiensis

L. tuconsensis L. wadsworthii

-

-

AB

"

-

-

(

-

*Todas las especies son gramnegativas. muestran falta de crecimiento en agar sangre sin suplemento y requieren L-cisteína (presente en agar BCYEa) para el aislamiento primario excepto para cepas adaptadas en laboratorio de / cisteína). Son catalasa positivas o peroxidasa positivas. Ninguna reduce nitrato a nitrito, produce ácido a partir de D-glucosa ni produce ureasa. +: positivo; negativo; reacción débil; NI): datos no disponibles; a: cepa negativa; d: débil; b: negativo en el aislamiento inicial; puede ser positivo luego de transferencia a agar BCYEa; c: raras cepas han sido aisladas de casos con bacilos ácido ideo hol resistentes modificados en muestras clínicas; estas cepas no fueron divididas en subespecies; d: algunas cepas negativas; AB: autofluorescencia azulmblancuzca. Adaptado de referencia 162.

L. oakridgensis. que pierden el requerimiento de

+(
Detección de Legionella en muestras clínicas

L. pneum ophila subespecie pneum ophila

_c

+ + +

L. micdadei L. oakridgensis

533

534

C A P ÍT U L 0 10 Legionella

Cuadro 1 0 -4

Principales ácidos grasos celulares de las espe­ cies de Legionella aisladas en seres humanos*)

ESPECIE L. anisa L. birminghamensis L. bozemannii L. cincinnatiensis L. dumoffii L. feelei L. gorm anii L. hackelii L. jordanis L. lansingensis L. longbeachae L. maceachernii L. micdadei L. oakridgensis L. pneum ophila L. sainthelensi L. tucsonensis L. wadsworthii

ÁCIDOS GRASO S CELULAR ES1

a " ^ 1 5 :0 a " ^ 1 5 : 0 ’ *“^ 1 4 h a - ^ 1 5 :0 Í " ^ 1 6 : 0 ’ 1_^ 1 6 h a " ^ 1 5 :0 a " ^ 1 5 :0 ’ n " ^ 1 6 :l a “ ^ 1 5 :0 a " ^ 1 5 :0 a _ ^ 1 5 :0 a " ^ 1 7 :0 ’ a _ ^ 1 5 h 16:0

den eliminar algunas reacciones cruzadas mediante absorción de antisueros con E. coli, aunque con cierta disminución en el título anti-Legionella.15* Es posible eliminar las reacciones cru­ zadas con Campylobacter mediante la absorción de sueros con esa bacteria.18 El serodiagnóstico de una infección reciente por Legionella requiere seroconversión (aumento de cuatro veces en el título de anticuerpos) hasta títulos recíprocos de 1:128 o mayores. Los títulos recíprocos elevados únicos de 256 o mayores pue­ den ser sugestivos durante un brote. Sin embargo, en casos esporádicos, un título de 1:256 o mayor no siempre indica una infección reciente porque estos títulos altos pueden persistir en personas sanas sin ninguna evidencia clínica simultánea de legionelosis. Como cuestión práctica es poco probable que el seguimiento necesario para demostrar seroconversión ocurra en la mayoría de los casos esporádicos.

a " ^ 1 5 :0 a _ C 15:0

Diagnóstico molecular

Í-C16:0 ‘ “^ 1 6 :0 * ~ ^ 1 6 :0 a _ C 15:0’ n " C 14h a '^ 1 5 : 0

*Se enumeran los principales ácidos grasos celulares (determinados mediante croma­ tografía gas-líquido) de las especies de Legionella aisladas de seres humanas. Estas bacterias son inusuales comparadas con las otras bacterias gramnegativas debido a sus cantidades relativamente grandes de ácidos celulares de cadena ramificada. El ácido más abundante de L. pneumophila y algunas cepas de L. longbeachae es i-C]6 ff Sin embargo, las cepas de L. longbeachae pueden tener i-C¡6;0 o C¡6 ¡ como ácido principal o los dos ácidos pueden estar presentes en cantidades aproximadamente iguales como los dos ácidos más abundantes. Por otra parte, el principal ácido graso de L. bonzemanii, L. micdadei, L. dumoffii, L. gormanii, L. jordanis y algunos otros es un ácido saturado de 15 carbonos y cadena ramificada (a-C/5.0). fLos números antes de los dos puntos representan la cantidad de átomos de carbono contenidos en cada uno de los diferentes ácidos grasos; los números después de los dos puntos es la cantidad de enlaces dobles; i_indica una rama metilo (-C H J en el átomo de carbono iso (próximo al último); a indica una rama metilo en el átomo de carbono anteiso (segundo desde el último). Adaptado de la referencia162.

dad de la prueba IFI es del 75-80% y la especificidad es del 106%.143,157,159 Sin embargo, los médicos deben esperar 2 a 6 semanas para que se produzca una elevación de cuatro veces en el título de anticuerpos en los pacientes. Los reactivos para las pruebas de serodiagnóstico para Legionella deben detectar anticuerpos de las clases IgG, IgM e IgA. En algunos pacien­ tes, puede ocurrir una elevación en el título de IgM sin una ele­ vación detectable en los títulos de IgG o IgA o puede ocurrir antes en el curso de la enfermedad que una elevación en el títu­ lo de IgG .164 Los anticuerpos IgM pueden persistir hasta duran­ te un año, de modo que su presencia no puede utilizarse para el diagnóstico de infección reciente. Como lo documentaron Wilkinson y cois., la prueba de IFI en suero utilizando antígenos contra Legionella puede dar reac­ ciones cruzadas con el suero de pacientes que tienen otras determinadas infecciones.157,159 Los sueros de pacientes que tu­ vieron infecciones por Mycoplasma pneumoniae asociadas con brotes y pacientes con fiebre Q dan reacciones cruzadas con L. longbeachae serogrupo 2 y L. jordanis. También, se observaron reacciones cruzadas entre sueros de pacientes que tenían tula­ remia asociada con brotes (Francisella tularensis) y antígeno de L. jordanis. Además, se han observado reacciones falsas positivas en pacientes con Bacteroides fragilis, Proteus vulgaris, especies de Rickettsia y especies de Citrobacter.12 Se pue­

Dada la necesidad de una confirmación de laboratorio del diagnóstico de enfermedad de los legionarios y lo inadecuado de los métodos tradicionales, no es sorprendente que se inves­ tigue mucho para lograr un diagnóstico molecular. Plasta este momento ese potencial no se ha cumplido, pero los estudios continúan. Un primer intento por utilizar sondas de DNA para el diagnóstico clínico fue suspendido por problemas con la sen­ sibilidad y la especificidad. Se han utilizado con éxito métodos de amplificación para detectar legionelas en muestras ambien­ tales y el método comercial ha sido satisfactorio en muestras clínicas,154 pero no ha sido aceptado por la Food and Drug Administration para muestras humanas. Más recientemente, la atención se ha centrado en los ensayos de amplificación en tiempo real (RT-PCR) para su uso en muestras clínicas.117119,73 Estos ensayos aún están en desarrollo, pero parecen promiso­ rios como herramientas para el diagnóstico rápido. Un indicio de que estas pruebas se encuentran en desarrollo es la notifica­ ción de que un ensayo comercial de amplificación de uso fre­ cuente para la extracción de DNA no es apropiado para la detección de especies de Legionella en muestras clínicas.147

Estudios de microbiología ambiental Aislamiento de Legionella en muestras ambientales

Se ha observado repetidas veces la presencia creciente de especies de Legionella tanto en aguas naturales como artificia­ les, en ausencia de pacientes con enfermedad clínica, lo que argumenta en contra del cultivo microbiológico sistemático del agua. Por otra parte, se han acumulado muchas pruebas que citan el agua potable como fuente del microorganismo en numerosos pacientes que han tenido una infección por L. pneu­ mophila. La provisión de agua caliente de los edificios ha sido implicada a menudo en la legionelosis; sin embargo, se necesi­ tan más estudios sobre la magnitud de la contaminación por Legionella en los sistemas de agua potable doméstica y de agua caliente y la frecuencia de la asociación con la infección.42 Por ejemplo, se definieron los factores que aumentan la probabili­ dad de que las especies de Legionella colonicen los sistemas de agua domésticos de provisión de agua, pero estos factores no parecían aumentar la incidencia de legionelosis adquirida en la comunidad. La probabilidad de que gran cantidad de personas sanas estén expuestas a menudo a estos microorganismos en la naturaleza, en el hogar, en el lugar de trabajo y en edificios pri­ vados y públicos de todo tipo es alta, por lo que es posible que

Estudios de m icrobiología am biental muchas legionelas aisladas en fuentes naturales de agua y en el agua com ente no sean altamente virulentas, que la exposición al microorganismo sea de poca magnitud o que la mayoría de las personas no sean huéspedes susceptibles; o tal vez todas las alteraciones sean ciertas. Por lo tanto, la enumeración microbiológica de las especies de Legionella en el agua potable o de otro tipo (como la de las torres de refrigeración) no tiene nin­ guna relevancia clínica ni epidemiológica para la enfermedad en los seres humanos a menos que se documenten casos clíni­ cos. Lamentablemente, no existen marcadores de virulencia adecuados para distinguir las cepas ambientales que son "pató­ genas” de aquellas que es poco probable que lo sean, ni hay pruebas apropiadas que predigan en qué huéspedes humanos se desarrollará la legionelosis o quiénes serán resistentes cuando estén expuestos a Legionella en el medioambiente. Más aún, no se puede medir con exactitud el grado ni la extensión de la exposición al microorganismo. Por lo tanto, la vigilancia microbiológica de las aguas ambientales es especialmente difícil de interpretar en ausencia de casos de la enfermedad (e incluso en presencia también de casos documentados). Asimismo, se recomienda la vigilancia clínica y epidemiológica de los pacientes (p. ej., por parte de enfermeras de control de infec­ ciones hospitalarias) como parte de un programa para evitar la legionelosis hospitalaria. En los brotes de legionelosis intrahospitalaria, la hipercloración del agua hospitalaria hasta un nivel de entre 2 y 6 mg/L de cloro residual libre y la elevación de la temperatura del agua caliente hasta más de 70 °C o una combinación de hipercloración y lavado con calor son métodos cuya eficacia para supri­ mir el crecimiento de Legionella ha sido probada.109,132,134 Para lograr el lavado por calor o la erradicación por medios térmi­ cos, se hace circular el agua caliente en todo el sistema de agua del edificio a una temperatura de 70-75 °C. Se lavan con agua caliente todas las cabezas de duchas y los grifos con el objeti­ vo de destruir las Legionella en estos sitios. Se han publicado en otros sitios protocolos de hipercloración y erradicación por medios térmicos.109,132’134 Lamentablemente, existe el riesgo de sufrir escaldaduras por el agua caliente y se deben tomar las precauciones necesarias para reducir esta posibilidad (p. ej., colocar señales de advertencia, calentar el agua durante perío­ dos relativamente cortos cuando la mayoría de los pacientes están dormidos). (Las reglamentaciones de algunos estados exigen que la temperatura del agua en los hospitales sea infe­ rior a 48,9 °C para evitar la escaldadura de los pacientes). La cloración continua (hasta lograr concentraciones de cloro de 1,5 partes por millón de cloro residual libre) puede ser excesi­ vamente corrosiva y destructiva para algunos sistemas y equi­ pos de plomería; también existe el riesgo de exposición tóxica al triahalometano. Si no se realiza de forma continua trata­ miento con calor, cloración o ambos, el tratamiento debe ser recurrente porque la recolonización del agua es altamente pro­ bable y tiende a recurrir luego de suspendido el calor o la clo­ ración. Se están investigando otros métodos, como esteriliza­ ción con luz ultravioleta, ozonización, agregado de agentes amebicidas y de iones metálicos en pequeñas cantidades (p. ej., plata, cobre) como tratamientos alternativos de los sistemas de agua. Si se documentan casos hospitalarios de infección por Legionella, se puede llevar a cabo una investigación microbiológica centrada especialmente en el muestreo ambiental para ayudar a determinar la fuente más probable. Se pueden implementar medidas de control por calor o cloración para eliminar o suprimir el microorganismo y los cultivos ambientales de seguimiento pueden ayudar a determinar la eficacia de estas

535

medidas. En los hospitales que presentan un brote o un proble­ ma hiperendémico de Legionella, se debe considerar la vigi­ lancia microbiológica periódica del ambiente, combinada con medidas de control continuas o repetidas, a menos que se pueda mostrar que no han ocurrido casos de legionelosis. Se recomiendan los métodos señalados en el protocolo de Barbaree y cois.9 para las personas que desean aislar e identifi­ car especies de Legionella en el agua ambiental. En este proto­ colo, se recogen muestras de agua (1 a 2 L) y se concentran uti­ lizando filtros de policarbonato de 0,2 ¡im (tamaño de los poros). Se realizan recuentos viables con tratamiento ácido pre­ vio en B C Y Ea o sin él y el medio que contiene base de B C Y E a con suplemento de glicina, polimixina B. vancomici­ na y anisomicina. Tipificación de cepas de Legionella

Debido a la amplia distribución de L. pneumophila serogru­ po 1 en el medioambiente. el seroagrupamiento con los reacti­ vos de IFD descritos antes ha tenido sólo utilidad epidemioló­ gica limitada en la investigación de la fuente de diferentes cepas. Algunos investigadores han creado métodos para tipifi­ car o subagrupar cepas de L. pneumophila serogrupo 1. Se han investigado los análisis de subtipos dentro de L. pneumophila serogrupo 1 utilizando paneles de anticuerpos monoclona­ les,84'83 análisis estructural genético de L. pneumophila utili­ zando técnica de electroforesis enzimática multilocus47 130 y determinación del contenido de plásmidos114 de diferentes ce­ pas de distintas fuentes. Las técnicas más recientes incluyen electroforesis de proteínas de la membrana externa de L. pneumophilam y un método de tipificación basado en el uso de son­ das de DNA biotiniladas clonadas para el análisis de polimor­ fismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP).128 Uno de los métodos de tipificación más promisorios es la deter­ minación de perfiles de DNA polimorfo amplificado aleatorio de Legionella pneumophila mediante PCR; este método parece ser más rápido y menos costoso que la tipificación mediante RFLP. Se ha comunicado que la determinación de perfiles de DNA polimorfo amplificado aleatorio es más discriminatoria que la tipificación mediante RFLP de algunas cepas de Legionella y puede detectar diferencias entre ellas con diferen­ tes tipos de RFLP.127 La investigación de una epidemia o el aná­ lisis de casos aparentemente no relacionados puede reforzarse mediante la comparación del patrón molecular de las cepas ais­ ladas de pacientes y del medioambiente. Aunque la secuencia­ ción directa del ácido nucleico de las muestras puede ser facti­ ble para estudios epidemiológicos, se necesitan cepas aisladas, lo que destaca nuevamente la importancia del cultivo para el diagnóstico de estas infecciones. Es importante recordar que la demostración de cepas "idénticas” de los pacientes y de un sitio ambiental significa que el sitio ambiental está “en discusión” como fuente de la infección, pero no prueba la asociación. Es esencial un análisis epidemiológico cuidadoso y la considera­ ción de todas las posibilidades. Lamentablemente, es posible que nadie aprecie algunas de estas posibles fuentes. Un ejem­ plo clásico de este fenómeno fue el reconocimiento de que el agua potable era la fuente de infecciones en el Veterans Affairs Hospital después de que se probó la falacia de las presunciones iniciales de que lo eran las torres de refrigeración. En general, la caracterización de los ácidos nucleicos es más discriminatoria que el análisis de la estructura antigénica utili­ zando anticuerpos monoclonales. Es interesante señalar que los tipos antigénicos y las variantes genómicas no siempre concuerdan.29 La prueba final para cualquier técnica de tipificación

536

C A P ÍT U L 0 10 Legionella

Cuadro 1 0 -5

C o r r e la c ió n d e lo s p a tr o n e s d e a n tic u e r p o s m o n o c lo n a le s c o n e l a n á lisis e p id e m io ló g ic o

PATRÓN DE A NTICUERPO S M O NO CLON ALES

CEPAS CLÍNICAS

CEPAS AMBIENTALES

A

Casos epidém icos

Torres de refrigeración

B

Casos intrahospitalarios esporádicos

Agua potable del hospital

C

Caso com unitario espo­ rádico

—

Adaptado de la referencia82.

es discriminar las cepas en grupo con sentido epidemiológico. Los patrones deben mostrar suficientes diferencias como para separar las cepas en grupos relacionados, pero no tantas como para discriminar grupos absurdos de cepas. Por una parte, cepas aparentemente similares podrían parecer diferentes si se utilizara otra herramienta de tipificación. Por otra, puede ser necesario un acuerdo de consenso para decidir cuántas y qué tipo de diferencias definen realmente las diferencias del mundo real con una técnica particular. Siempre que sea posible es ópti­ mo analizar las cepas con más de una técnica. En el mejor de los casos, el análisis molecular o antigénico puede racionalizar un problema epidémico o endémico. El aná­ lisis de un grupo de cepas clínicas y ambientales de un lugar en un período de años produjo tres agrupamientos de cepas, como se resume en el cuadro 10-5. Estas cepas fueron caracterizadas con un panel de anticuerpos monoclonales, reactivos relativa­ mente no discriminatorios. Un grupo de investigadores euro­ peos ha utilizado con éxito el análisis de polimorfismos de lon­ gitud de fragmentos amplificados.66 Se han definido y validado los tipos de polimorfisniQ de L. pneumophila serogrupo I mediante pruebas de eficacia.65 Los autores de un estudio reciente de ribotipificación automatizada, utilizando cepas de referencia, arribaron a la conclusión de que el procedimiento era útil para el análisis genómico. pero no lo suficientemente discriminatorio para utilizarlo para el análisis epidémico. Sin duda se requieren más investigaciones en esta tan importante área. REFERENCIAS 1. Addiss DG, et al. Community-acquired Legionnaires’ disease associated with a cooling tower: evidence for longer-disance transport of Legionella pneumophila. Am J Epidemiol 1989;130:557-568. 2. Adeleke AA, et al. Legionella drozanskii sp. nov. Legionella rowbothamii sp. nov. and Legionella fallonii sp. nov.: three unusual new Legionella species. Int J Syst Evol Microbiol 2001;51:1151-1160. 3. Alary M, Joly JR. Factor comtributing to the contamination of hospital water distribution systems by legionellae. J Infect Dis 1992;165:565-569. 4. Ampel NM, et al. Cutaneous abscess caused by Legionella micdadei in an immunosuppressed patient. Ann Intem Med 1985;102:630-632. 5. Anaissie EJ, et al. The hospital water supply as a source of nosocomial infections: a plea for action. Arch Intem Med 2002;162:1483-1492. 6. Anonymous. Epidemiology, prevention and control of legionellosis: memorándum from a WHO meeting. Bull WHO 1990;68:155-164. 7. Amow PM, et al. Perirectal abscess caused by Legionella pneumophila and mixed anaerobic bacteria. Ann Intem Med 1983;98:184-185. 8. Amow PM, et al. Nosocomial Legionnaires’ disease caused by aerosolized tap water from respiratory devices. J Infec Dis 1982;146:460-467. 9. Barharee JM, et al. Protocol for sampling environmental sites for legionellae. Appl Environ Microbiol 1987;53:1454-1458.

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Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis Taxonomía de la familia Neisseriaceae y de la familia

Moraxellaceae Características generales del género Neisseria Importancia clínica de las especies de Neisseria Neisseria gonorrhoeae Epidemiología Infecciones causadas por N. gonorrhoeae

Neisseria meningitidis Epidemiología infecciones causadas por N. meningitidis Profilaxis meningocócica y vacunas meningocócicas

Otras especies de Neissería

Importancia clínica de

Moraxella catarrhalis Aislamiento de especies de Neisseria Neisseria gonorrhoeae

Identificación de especies de Neisseria Morfología de las colonias Tinción de Gram y prueba de la oxidasa Prueba de Superoxol® Diferenciación de otros microorganismos en medios selectivos Criterios presuntivos para la identificación de N. gonorrhoeae Pruebas de identificación para especies de Neisseria Pruebas para la utilización de hidratos de carbono Medio CTA convencional con hidratos de carbono Prueba rápida de utilización de hidratos de carbono Prueba RIM-/Ve/sse/7áf®(método rápido de identificación de Neisseria) Otros métodos de utilización de hidratos de carbono

Pruebas cromogénicas de enzima sustrato

Frotis directos teñido con Gram

Gonochek II®

Recolección de la muestra

BactiCard Neisseria®

Transporte de la muestra Medios de cultivo selectivos: inoculación e incubación

Neisseria meningitidis Seguridad en el laboratorio Frotis directos teñidos con Gram y pruebas directas para antígenos capsulares Recolección y transporte de la muestra Aislamiento e incubación

Métodos inmunológicos para la confirmación del cultivo de N. gonorrhoeae Inmunofluorescencia directa con anticuerpos monoclonales Pruebas de coaglutinación Prueba GonoGen II15'

Sistemas de identificación multipruebas

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C A PÍTU LO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

Prueba de sondas de DNA para la confirmación del cultivo de N. gonorrhoeae Pruebas de amplificación e hibridación de ácidos nucleicos para N. gonorrhoeae Métodos moleculares para la detección de N. meningitidis

Características del cultivo de las especies de Neisseria Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Otras especies de Neisseria Neisseria lactamica Neisseria cinerea Neisseria flavescens

a gonorrea fue reconocida ya en tiempos de Galeno (siglo II a.C.), quien la denominó con las palabras griegas gonor (“semen”) y rhoia (“flujo”), para suge­ rir que la enfermedad estaba relacionada con el flujo de semen. También se encontraron referencias a esta infección en el Antiguo Testamento y en historias escritas de varias culturas. Aunque bien reconocida como una enfermedad de transmisión sexual en el siglo xm, la gonorrea no se distinguió de la sífilis hasta mediados del siglo xix. En 1897, Albert Neisser, de la Universidad de Breslau, Alemania, observó por primera vez Neisseria gonorrhoeae, el agente etiológico de la gonorrea, en exudados purulentos del aparato genital y de la conjuntiva. El aislamiento posterior del microorganismo, la inoculación en voluntarios humanos y su reaislamiento por Bumm en 1885 permitieron establecer la relación causal entre el microorganis­ mo y la enfermedad (véanse los postulados de Koch, cap. 5). La meningitis cefalorraquídea epidémica fue conocida a principios del siglo xix, pero el agente causal no se describió hasta 1884, cuando Marchiofava y Celli lo observaron en exu­ dados meníngeos. En 1887, Weichselbaum aisló el microorga­ nismo, ahora llamado Neisseria meningitidis, en un cultivo puro y describió por primera vez sus características y su papel etiológico en seis pacientes con meningitis aguda. Otros traba­ jos realizados por Kiefer en 1896 y por Albretch en 1901 esta­ blecieron la existencia del estado portador meningocócico en individuos sanos.97 Durante el período transcurrido desde 1929 hasta fines de 1943, grandes brotes de enfermedad meningocócica en Chile y ciudades de los Estados Unidos (p. ej., Detroit y Milwaukee) concentraron la atención científica en este microorganismo. Con los brotes ulteriores entre los reclutas militares en los Estados Unidos y otros países se comenzó a adquirir un mejor conocimiento de la epidemiología, la patogenia, la quimioprofilaxis, y las perspectivas para el desarrollo de vacunas.680 A finales de 1930, se encontró que las sulfonamidas servían para erradicar el estado de portador meningocócico, lo que propor­ cionó una forma de evitar la diseminación de la enfermedad.

L

Neisseria subflava biovariedades, Neisseria mucosa y Neisseria sicca Neisseria polysaccharea Subespecies de Neisseria elongata

Neisseria gonorrhoeae subespecie kochii ( “Neisseria kochii”) Especies de Neisseria no humanas y atípicas

Características del cultivo e identificación de Moraxella catarrhalis Sensibilidad de las especies de Neisseria a los antibióticos Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis

Sensibilidad a los antibióticos de Moraxella catarrhalis

Durante principios de la década de 1960, comenzó a aparecer resistencia de los meningococos a las sulfonamidas, junto con la enfermedad epidémica en dos instalaciones militares en California. Estos brotes estimularon la creación de vacunas de polisacáridos eficaces contra meningococos de los serogrupos A y C. En la actualidad, la meningitis epidémica de N. menin­ gitidis serogrupo A se presenta como un problema serio en regiones de Africa y la enfermedad meningocócica todavía se observa en poblaciones militares semicerradas.27’427611 Recien­ temente, han ocurrido epidemias de enfermedad meningocóci­ ca en Norway, Canadá, y en los países de la ex Unión Sovié­ tica, y han surgido en Arabia Saudita enfermedades asociadas con el serogrupo W-135 de N. meningitidis.2'5-513-606 Tanto en los Estados Unidos como en Europa, la enfermedad meningo­ cócica por el serogrupo C ha aumentado en la comunidad y en las universidades y colegios, lo que se tradujo en un incre­ mento importante de su incidencia en adolescentes y adultos jóvenes.22Z287-290-535 Las técnicas moleculares han permitido a los investigadores analizar los factores de virulencia meningocócicos y entender la “epidemiología molecular” de los sero­ grupos, serotipos y subserotipos, meningocócicos y la virulen­ cia clonal.427-513'535'611 N. gonorrhoeae y N. meningitidis continúan siendo patóge­ nos temibles y versátiles que constituyen una preocupación tanto para los médicos como para los profesionales del labora­ torio clínico. Aunque los métodos para el aislamiento y la iden­ tificación de las especies de Neisseria a partir de muestras clí­ nicas no han cambiado demasiado, las técnicas nuevas para la detección directa de N. gonorrhoeae basadas en la amplifica­ ción de ácidos nucleicos y en sondas de ácidos nucleicos han modificado bastante el acceso del laboratorio al diagnóstico de enfermedad gonocócica. La resistencia a los agentes antimi­ crobianos continúa siendo una preocupación importante en el nuevo milenio, en particular con la aparición de gonococos resistentes a las fluoroquinolonas en todo el mundo.354 N. meningitidis ha cobrado mayor importancia en estos años con la autorización de vacunas contra otros agentes causantes de

Taxonom ía de la fam ilia N eisseriaceae y de la fam ilia M oraxeiiaceae

meningitis (p. ej., Haemophilus influenzae tipo b). El recono. jniento. el tratamiento y el manejo de la enfermedad menin; : , ocica en una comunidad requieren la cooperación de médi­ cos. profesionales de laboratorio clínico y epidemiólogos para c : -cen ar las intervenciones más convenientes. Al igual que los gonococos, las cepas raras de N. meningitidis han adquirido información genética para producir P-lactamasa, mientras que ::ras han desarrollado “sensibilidad dism inuida” a algunos p-lactámicos debido a la adquisición de proteínas de unión a la penicilina alteradas.189,482 A veces, la recuperación de especies de Neisseria recién reconocidas y “no patógenas” de pacientes inmunodeprimidos también debe ser considerada por los m crobiólogos para acceder a la detección e identificación de especies de Neisseria y bacterias “tipo neisseria” en muestras clínicas.

Taxonomía de la familia Neisseriaceae y de la familia M oraxeiiaceae En la edición de 1984 del M anual de Bacteriología Siste­ mática de Bergey, la familia Neisseriaceae incluía cuatro géne­ ros: Neisseria, Moraxella, Kingella y Acinetobacter ,87 En ese momento, el género Neisseria consistía en 11 especies consi­ deradas “neisseriae verdaderas” y tres especies animales, lla­ madas en grupo “neisseriae falsas” (N. caviae, N. ovis y N. cuniculi), consideradas species incertae sedis.m El género Moraxella fue subdividido en dos subgéneros: el subgénero M oraxella y el subgénero Branham ella .86 En el género Moraxella subgénero Moraxella se ubicaron seis especies: M. M. i lacunata, M. (M.) bovis, M. (M.) nonliquefaciens, M. (M.) atlantae, M. (M.) phenylpyruvica y M. (M.) osloensis, y en el subgénero Branhamella se colocaron cuatro especies: M.(B.) catharralis, M. (B.) caviae, M. (B.) ovis y M. (B.) cuniculi.86,87 " Moraxella urethralis ” fue considerado un m icroorganismo de filiación incierta. La familia también incluyó tres especies de Kingella (K. kingae, K. denitrificans y K. indologenes) y gru­ pos fenotípicos Acinetobacter ,87 Psychrobacter immobilis fue agregado a la familia Neisseriaceae en 1986.334 En 1988, usando varias técnicas moleculares nuevas para la taxonom ía bacteriana, Stackebrandt y cois, describieron Proteobacteria y sus subgrupos RNA filogenéticos.617 La apli­ cación de técnicas moleculares (p. ej., hibridación de [rRNA] RNA DNA-ribosómico, hibridación de DNA-DNA, análisis de secuencia 16S rRNA) condujo a varios cambios en la taxono­

Recuadro 11-1

541

mía de la familia Neisseriaceae . 186,554 Las “neisseriae verdade­ ras”, especies de Kingella y “Moraxella urethralis” fueron asignadas al (3-subgrupo de Proteobacteria y se recomendó la eliminación de Acinetobacter, Moraxella, Branhamella y las falsas neisserias de la familia Neisseriaceae. A continuación, “M. urethralis” fue reclasificada como Oligella urethralis, la variedad tipo del género Oligella.551 Otro trabajo genético tam­ bién estableció que los géneros Eikenella. Simonsiella y Alysiella y los grupos EF-4A, EF-4B. M-5 y M-6 de los Centers for Disease Control and Prevention (CDC) pertenecen asimismo a la enmendada familia N e i s s e r i a c e a e Los grupos M-5 y M-6 de los CDC, considerados en principio especies “de tipo moraxella” han sido reclasificados como N. weaveri y N. elongata subespecie nitroreducens, r e s p e c t i v a m e n t e . E l género Kingella permanece en la familia Neisseriaceae e K. indologenes pertenece ahora al género Suttonella en la familia Cardiobacteriaceae como Suttonella indologenes (véase cap. 9). Psychrobacter immobilis también fue excluida de la familia Neisseriaceae por el trabajo de Rossau y cois.554 En la próxima edición del Manual de Bergey, la Neisseriaceae es la única familia en el orden propuesto “Neisseriales” dentro del p-subgrupo de Probacteria, junto con Eikenella, Kingella y varios otros géneros de origen animal y ambientales.248 El estado taxonómico de M. (B.) catarrhalis, la otra especie Moraxella y la neisseria falsa han sido objeto de debate y desa­ cuerdo entre los microbiólogos y los taxonomistas durante años.88 En 1991, Rossau y cois, delinearon un grupo rRNA familiar nuevo dentro del y-subgrupo de Proteobacteria.555 Este grupo contenía el grupo Moraxella-Psychrobacter y el género Acinetobacter. El primer grupo fue dividido en el “subgrupo Moraxella lacunata” (que contiene las moraxelas clásicas: M. lacunata subespecies lacunata, M. lacunata subespecies liquefaciens, M. boris, M. liquefaciens, las neisserias falsas y M. catarrhalis), el “subgrupo Moraxella osloensis”, el “subgrupo Moraxella atlantae” y el “subgrupo Psychrobacter-Moraxella phenylpyruvica”. Estos investigadores propusieron una familia Moraxeiiaceae- nueva para este grupo rRNA.555 El mismo año, Catlin propuso la familia Branhamaceae para incluir el género Branhamella y el género Moraxella.125 Este género Branhamella propuesto abarcaba fi. catarrhalis y las neisserias falsas, mientras que el género Moraxella incluía todas las espe­ cies de Moraxella (M. boris, M. lacunata y M. nonliquefaciens) y especies tipo moraxella (M. osloensis, M. phenylpyruvica y M. atlantae). El género Acinetobacter no fue incorporado en la propuesta de Catlin. (Véase recuadro 11-1).

C lasificación de especies dentro de la fam ilia N eiss eria c ea e y la fam ilia M o raxeiiaceae en el dom inio B acteria236 487

Clase

Orden

Familia

Género

Especies

¡5-proteobacteria

"N eisseriales”

Neisseriaceae

Neisseria

N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. lactamica, N. sicca. N. subflava biova­ riedades, N. mucosa, N. flavescens, N. cinerea, N. polysaccharea, N. elongata subespecies, N. weaveri, N. canis, N. macacae, N. denitrificans, N. iguanae, N. dentium

v-proteobacterla

"Pseudom onadales”

M oraxeiiaceae

M oraxella

Grupo I - Cuatro grupos: “Grupo M. l a c u n a t a subespecies M. lacunata; “Grupo M. nonliquefaciens”: M. nonliquefaciens; “Grupo M. b o vis”: M. bovis, M. ovis; “Grupo M. catarrhalis": M. catarrhalis, M. cuniculi, M. caviae Grupo I I- M. osloensis, M. atlantae Grupo III- M. phenylpyruvica

J

542

C APÍTULO 11 Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

La propuesta de la familia M om xellaceae ha sido respalda­ da con la aplicación del análisis de secuencias del rDNA 16S.503 Estos datos indican que los miembros de la familia M omxellaceae constituyen un taxón monofilético que forma una línea distinta de descendencia dentro del y-subgrupo del Proteobacteria. El género Moraxella se compone de cuatro grupos designados de I hasta IV. Los grupos de II hasta IV incluyen M. osloensis y M. atlantae (grupo II), M. phenylpyruvica y el género Psychrobacter (grupo III) y el género Acinetobacter (grupo IV). El grupo I se compone de cuatro “grupos”, que incluyen el “grupo M. lacunata” (subespecies M. lacunata), el “grupo M. nonliquefaciens ” (M. nonliquefaciens), el “grupo M. bovis” (M. bovis y M. ovis) y el “grupo M. catarr­ halis’'. El último grupo incluye el diplococo M. catarrhalis y el primero, las falsas neisserias M. cuniculi y M. caviae. A pesar de la familiaridad del nombre “Branhamella catarrhalis” para los microbiólogos clínicos, Moraxella catarrhalis ha sido aceptada como la nueva designación para este microorganismo. M. catarrhalis y las “moraxella cócicas” se tratan en este capí­ tulo junto con las especies de Neisseria debido a sus similitu­ des bioquím icas y m orfológicas. Las otras especies de Moraxella se consideran con los bacilos gramnegativos no fer­ mentadores en el capítulo 5.

Características generales del género Neisseria Los miembros del género Neisseria son microorganismos gramnegativos baciliformes o con forma de cocos que por lo general se encuentran en pares o cadenas cortas. Las especies de diplococos tienen caras adyacentes aplanadas, que les dan una apariencia de “grano de café”. Todas las especies del géne­ ro Neisseria habitan en la superficie de las mucosas de huéspe­ des de sangre caliente. Estos microorganismos son inmóviles, no forman esporos y la mayoría de las especies crecen de modo óptimo a una temperatura de 35 °C a 37 °C. Son capnófilos y se desarrollan mejor en ambientes húmedos. Las especies de Neisseria producen ácido a partir de hidratos de carbono en forma oxidativa y esta característica constituye parte de la iden­ tificación de referencia de estas especies. Por lo general, las especies de Neisseria (excepto las tres subespecies N. elonga­ ta y N. weaveri) son los cocos verdaderos de la familia Neisseriaceae. Las subespecies N. elongata y N. weaveri son bacilos gruesos medianos a grandes, que a veces se encuentran en pares o en cadenas cortas.25-89-299 Todas las especies del género son oxidasa positivas y (excep­ to N. elongata subespecie elongata y N. elongata subespecie nitroreducens) son catalasa positivas.89-268 Los miembros del género que se encuentran en los seres humanos son N. gonorr­ hoeae, N. meningitidis, N. lactamica, N. sicca, N. subflava (que incluye las biovariedades subflava, flava y perflava), N. muco­ sa, N. flavescens, N. cinerea, N. polysaccharea y subespecies de N. elongata. “N. kochii”, una cepa rara que algunos autores consideran una subespecie de N. gonorrhoeae, está fenotípica y genéticamente relacionada con N. gonorrhoeae.426 Entre las especies animales, se encontraron N. canis y N. weaveri como parte de la flora normal del aparato respiratorio de perros, N. denitrificans está presente en las vías respiratorias altas de cobayos y N. macacae, N. dentiae y N. iguanae se encontraron en la boca de macacos de la India (Macaca mulattá) vacas y lagartos iguánidos, respectivamente.25'51-86,88'299,691 La importan­ cia clínica, las características de los cultivos y los procedi­ mientos para la diferenciación de estos microorganismos se tra­ tan más adelante en este capítulo.

La mayoría de las especies de Neisseria humanas son habi­ tantes normales de las vis respiratorias altas y no se consideran patógenos, aunque a veces se los puede aislar en procesos infecciosos, en particular durante el curso de una enfermedad subyacente y de inmunosupresión. N. gonorrhoeae siempre se considera un patógeno, sin tener en cuenta el lugar del aisla­ miento. N. meningitidis causa enfermedad importante y a me­ nudo grave, pero también puede colonizar la nasofaringe humana sin producir enfermedad. Aunque la mayoría de las especies de Neisseria no tienen requerimientos nutricionales especiales de crecimiento, las especies patógenas y N. gonorr­ hoeae en particular, son más exigentes desde el punto de vista nutricional. N. gonorrhoeae no crecerá en ausencia del amino­ ácido cisteína y de una fuente de energía utilizable (glucosa, piruvato o lactato). Algunas cepas muestran requerimientos de aminoácidos, pirimidinas y purinas como resultado de vías biosintéticas alteradas o defectuosas.599 La demostración de estos requerimientos de crecimiento constituye la base de un método de tipificación de cepas de aislamientos gonocócicos llamado auxotipificación (tratado más adelante en este capítulo).124 Las neisserias son aerobias, pero crecen en condiciones ana­ erobias si está presente un aceptor de electrones alternativo (p. ej., nitritos) en bajas concentraciones.352-353 Aunque las especies saprofitas de Neisseria pueden usar aminoácidos para el creci­ miento, Neisseria patógena requiere glucosa u otra fuente de energía para el metabolismo mediante el ciclo de Krebs (véase cap. 5). El desarrollo de especies de Neisseria también se esti­ mula con C 0 2 y humedad. El CO., atmosférico acorta la fase de retraso porque se asimila rápidamente para la biosíntesis inicial de proteínas y ácidos nucleicos. En el laboratorio clínico el uso de medios enriquecidos e incubación de los cultivos en una atmósfera con C 0 2 al 5-7% cumple con los requerimientos necesarios para que estos microorganismos presentes en las muestras clínicas se desarrollen en cultivo. N. gonorrhoeae y N. meningitidis pueden intercambiar infor­ mación genética mediante transformación y conjugación (véase cap. 5). Las neisserias tienen la capacidad de transformarse por acción del DNA plasmídico o cromosómico durante todo su ciclo de crecimiento y tomar el DNA aislado para incorporarlo posteriormente al cromosoma en las regiones con secuencias homologas de nucleótidos. Para que esta transformación ocurra, son necesarias la expresión funcional de PilE (la proteína pilus mayor) y PilC (la proteína pilus menor) y la presencia de un fac­ tor habilitante (factor de “competencia”), lo que sugiere que ambos están involucrados en el reconocimiento o la captación del DNA transformador (véase recuadro H -2).216-557-558 Las es­ pecies de Neisseria probablemente intercambien DNA in vivo por transformación a partir del ácido nucleico de las células, liberado por mecanismos autolíticos. La transformación puede derivar en características fenotípicas alteradas. Por ejemplo, se ha sugerido la adquisición transformacional de un gen dihidropteroato sintasa mutado como el mecanismo para la resis­ tencia de los meningococos a las sulfonamidas.520 También sucede la transferencia de DNA plásmido pero no de DNA cro­ mosómico por conjugación. La conjugación en los gonococos y los meningococos requiere la presencia de plásmidos conjugativos grandes de 24,5 a 25,2 MDa para que suceda la moviliza­ ción de DNA (véanse recuadros 11-2 y 11-3). Estos plásmidos conjugativos existen sólo en cepas de N. meningitidis, N. gonorrhoeae y N. cinerea y pueden ser transferidos a células receptoras junto con genes que codifican la resistencia a los antimicrobianos. No se identificaron bacteriófagos gonocócicos o meningocócicos, de modo que la transferencia de elementos genéticos por transducción no ocurre.

C aracterísticas generales del género N eisseria

R ecuadro 1 1 -2

543

F actores de virulencia y an tíg en o s aso c ia d o s con virulencia d e N eisseria gon o rrh o eae

Factores de virulencia

Comentarios

L ip o oligosacáridos

Como otras bacterias gramnegativas, las especies de Neisseria tienen una m em brana interna citoplasmática. una capa delgada de peptidoglueano y una m em brana externa que contiene lipopolisacáridos (LPS), proteínas y fosfolípidos (fig. 11-1). A diferencia de muchas otras bacterias gramnegativas (p. ej., las Enterobacteriaceae), los LPS gonocócicos y m eningocócicos carecen de las cadenas laterales repetidas del antígeno som ático “O”, por fuera del núcleo de polisacárido; por lo tanto, esas estructuras se lla­ m an más exactam ente lipooligopolisacáridos (LOS).272 Los polisacáridos nucleares del LOS gonocócico sufren variación antigénica en la estructura m olecular con una frecuencia bastante elevada (10~2 a 10~3), lo que deriva en la exposición en la superficie celular de diferentes epítopos de LOS nucleares distintos todo el tiempo.34-582 Las estructuras term inales en el LOS gonocócico se vuelven sialiladas in vivo por el agregado de ácido neuram ínico del ácido citidina-5 '-monofosfato-W -acetil-neuramínico (CMPNANA).493 L a variación estructural de LOS influye en la adherencia bacteriana y en la resistencia a los efectos bactericidas del suero hum ano norm al581 El LOS gonocócico tam bién estim ula una respuesta inflam atoria rápida, activa el com plem ento, esti­ m ula la producción de citocinas e induce la lisis de los neutrófilos polim orfonucleares (PM N) y de las células epiteliales.'" La inducción del factor de necrosis tum oral a (T N F a) por el LOS gonocócico puede causar algunos de los daños en el tejido obser­ vados en la enfermedad inflam atoria pelviana.271 Los gonococos tam bién liberan fragm entos de peptidoglueano por autóhsis in vivo e in vitro; estos fragm entos son tóxicos para la m ucosa del aparato genital y otros tejidos e intensifican la respuesta inflama­ toria observada en las infecciones gonocócicas.235

F im b ria s (pili)

Los pili y otras superficies de N. gonorrhoeae han sido investigados durante años en el intento de identificar estructuras inm unogé­ nicas para el desarrollo de vacunas gonocócicas.661 N. gonorrhoeae y N. meningitidis poseen pili o fiambriae, que m edian de modo parcial en la fijación de los m icroorganism os a las superficies mucosas (véase cap. 5).292 Los pili gonocócicos están com ­ puestos por subunidades de la proteína pilina que tienen un peso m olecular de 16,5 a 21,5 kD a.586 Los pili gonocócicos tienen tres regiones distintas: una región de 53 residuos aminoácidos, conservada, adyacente a la m em brana externa que funciona en conjunto, una región semivariable central y una región carboxiterm inal variable. Los gonococos con pili se adhieren a las células sensibles para iniciar la infección; anticuerpos dirigidos contra los pili gonocócicos pueden inhibir la adherencia.695 Los pili gonocócicos funcionan durante parte de un proceso de fijación en dos etapas ayudando a superar la repulsión electrostática entre la superficie de la m ucosa cargada negativamente y las células bacterianas con carga similar.292 La form ación del pili y la unión de N. gonorrhoeae m ediada por pili son prerrequisitos para la infección gonocócica in vivo. Los pili gonocócicos sufren v ariació n de fase y v ariació n antigénica. In vitro, la variación de fase entre el estado con pili (P+ y P++) y sin pili (P~) sucede con una frecuencia elevada; en esta situación, los genes pilE (genes estructurales para proteínas de pilus) pueden no estar expresados (las proteínas de pilus no se producen) o las proteínas de pilus no pueden ensam blarse en pili funcionales y se excretan en el medio. La variación de fase reversible resulta de fabricar desvíos en la región que codifica el pép­ tido señal de pilC l y pilC2, genes que codifican las proteínas que reúnen los pili.330 Los pili gonocócicos también sufren varia­ ción genética. La m ayoría de las variedades de N. gonorrhoeae contienen una única copia de pilE, que contiene el gen de la subunidad principal de pilina expresado y asociado con prom otores y al m enos 20 copias de piIS, transcripcionalm ente silente, genes pilina incompletos que contienen secuencias que varían y que carecen de la región prom otor y secuencias 5 ’ codificantes. La recom binación entre los genes pili expresados y silentes se traduce en nuevos tipos antigénicos de pili. En una sola variedad en un tiempo dado, sólo un único gen pilus es funcional y se expresa sólo en un tipo de pilus. El número total de tipos de pilus que puede resultar de la recom binación entre los 20 o m ás genes piIS sugiere que la colección de tipos de pilus es teóricamente grande. La expresión del gen p il cuantitativa en gonococos tam bién responde a la regulación transcripcional por proteínas transductoras de señal que están codificadas por pilA y pilB y que se form an en respuestas a estím ulos del medioam biente, com o los niveles de nitrógeno. Otras proteínas asociadas con pilus (p. ej., PilV) se expresan en niveles bajos con respecto a la proteína estructural principal de pilus (PilE) e interactúan con proteínas que reúnen pilus PilC.719 Los estudios en voluntarios humanos han probado que la variación antigénica en los pili suceden durante la infección clínica, con distintas variantes pilina aisladas durante el curso de la infección.596 Los pili intervienen en la fijación gonocócica a varios tipos de células, com o las células epite­ liales vaginales y bucales, eritrocitos, células amnióticas, neutrófilos y células esperm áticas. Los pili tam bién impiden la fagoci­ tosis gonocócica por los NPM.

P ro te ín a s de la m em ­ b r a n a ex tern a Porl-PorA /PorB

Las paredes celulares de N. gonorrhoeae contienen proteínas que se ubican en la superficie de la m em brana externa o que abarcan la m em brana externa (proteínas integrales) (fig. 11-1). Las proteínas de la m em brana externa gonocócica (OMP) dem uestran o imparten muchas actividades biológicas, entre ellas la producción de respuestas inm unitarias hum oral y m ediada por células. la disminución de asociación leucocitaria y la resistencia a los efectos bactericidas del suero hum ano normal.613 Algunas ds estas proteínas son específicas de tipo, de variedad y de especie y han sido explotadas com o posibles antígenos para el desarrollo de vacunas.661 L a proteína porina, o p ro teín a I, ahora llam ada P o r, es una proteína de 34 a 36 kDa, terrooestable, asociada con LOS. Los gonococos expresan una de las dos form as de proteínas relacionadas desde el punto de vista estructural, pero inmunológica y quím icam ente distintas, llamadas P orA (PIA ) y P orB (PIB ). Existe una única copia del gen estructural p_ra esta proteí­ na en el crom osom a, lo que sugiere que los genes para PorA y PorB son alelo s."5U na cepa de N. gonorrhoeae tiene PorA o PorB pero nunca ambas. Las proteínas Por son proteínas integrales y funcionan com o canales específicos para aniones a través de la mem brana externa gonocócica 613 La proteína Por puede funcionar en la interacción célula-célula por colapso del potencial de m em brana en contacto con las células epiteliales y puede influir en la m uerte intracelular de microorganism os en los PMN mediante el im pedimento de la fusión fagosom a-lisosom a y la dism inución del estallido oxidativo. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopos de Por son la base de los esquemas de tipificación gonocócica serológica.36 571 Los anticuerpos anti-Por tam bién se usan en pruebas de coaglutinación com erciales (GonoGen I® y Phadebact GC® ) para identificación de N. gonorrhoe­ ae. Se ha desarrollado un sistem a para la tipificación de regiones variables del gen porB que usa sondas de oligonucleótidos que pueden detectar diferencias en porB entre los aislamientos pertenecientes a la m isma serovariedad. (Continúa)

544

C A PÍTU LO 11

R ecuadro 11-2

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

F actores de virulencia y an tíg en o s a so c ia d o s con virulencia d e N eisseria g o n o rrh o e a e (cont.)

Factores de virulencia

Comentarios

Proteínas Opa (Proteína II, P II)

N. gonorrhoeae expresa las proteínas (Opa) de opacidad de la m em brana externa que aum enta la adherencia mediada por pilus a las superficies m ucosas.289 Ciertas proteínas Opa tam bién facilitan la invasión celular a la mucosa por N. gonorrhoeae P xm M o m Estas proteínas son termolábiles y tienen pesos moleculares de 24 a 28 kDa.’’33 Las cepas de N. gonorrhoeae tienen 11 a 12 genes Opa com pletos en el cromosom a; cada uno tiene su región prom otor propia y se transcribe en mRNA de manera continua.63 Una variedad gonocócica puede expresar cuatro o cinco genes Opa diferentes en form a simultánea o no expresar nin­ guno. La regulación del gen Opa depende de la presencia de una secuencia de cinco nucleótidos (CTCTT) que se encuentren en triplicado (o múltiplos de tres) en el extremo 3' del gen estructural inm ediatamente adyacente al codón “inicio” ATG.626 En una célula gonocócica pueden estar presentes 7 a 28 repeticiones de esta secuencia pentamérica. Cuando estas repeticiones se encuentran en triplicado (o m últiplos de tres), los genes Opa se transcriben y traducen en bloque, lo que conduce a la expresión sim ultánea de varios genes Opa diferentes. Otros múltiplos de la repetición pentam érica derivan en la transcripción que está fuera del bloque cuando se traduce, así las proteínas O pa no se producen. La variabilidad del número de copias de esta secuencia de cinco nucleótidos se genera durante la replicación del D N A .160,161 Adem ás, los dominios hipervariables dentro de cada gen Opa pueden recom binar con dom inios hom ólogos en otros loci Opa, lo que conduce a la evolución de genes Opa y proteínas nuevos. Las colonias gonocócicas que expresan proteínas Opa son opacas en ciertos medios de cultivo transparentes, mientras que las variedades Opa negativas producen colonias claras. Las proteínas O pa también pueden variar durante una infección ure­ tral no com plicada y están influidas por el ciclo m enstrual.326 Los aislamientos endocervicales de mujeres que estén menstruando o de lugares normalmente estériles (p. ej., sangre, líquidos articulares) a menudo carecen de proteínas Opa. La variación antigé­ nica de las proteínas Opa durante las infecciones naturales perm ite que los gonococos evadan a los efectores de la respuesta inmunitaria.

Proteína Rmp (Proteína UI, P.III)

Una tercera proteína gonocócica, llam ada proteína III o Rm p (proteína m odificable por reducción) tiene un peso m olecular de 30 a 31 kDa, está muy asociada con LOS y Por, muestra una pequeña variación intravariedad y es hom ologa a una proteína de la m embrana externa de Escherichia coli, llam ada Om pA.263-526 Los anticuerpos dirigidos contra Rmp en la superficie celular blo­ quean la unión de los anticuerpos anti-LOS y anti-Por. La unión de estos anticuerpos dism inuye en gran m edida los efectos bac­ tericidas del suero hum ano normal sobre los gonococos.526

Proteína H.8

Las cepas de N. gonorrhoeae tam bién tienen dos proteínas H.8, llamadas así porque tienen epítopos que reaccionan con el anti­ cuerpo monoclonal H .8 ."2 Aunque la función de estas proteínas que contienen cobre se desconoce, proteínas similares en otros m icroorganism os están involucradas en el transporte electrónico.343 Las proteínas H.8 están presentes en todos los gonococos y m eningococos y en las cepas de N. lactamica y N. cinerea ,112Los pacientes con IGD y con infecciones m eningocócicas tienen anticuerpos contra esos antígenos de m em brana extem a H.8.68

Otras Proteínas de la m em brana externa

Se desecribieron muchas otras proteínas de membrana externa en N. gonorrhoeae. A diferencia de las ya tratadas, estas otras se producen sólo en condiciones de carencia de hierro o anaerobiosis.™ Se describieron varias proteínas reguladas por hierro (FRP), incluida una proteína de unión férrica de 37 kDa (Fbp), más otras cuyo peso m olecular oscila de 60 a más de 100 kD a.442 Se observaron Fbp de 37 kDa similares tanto en gonococos como en m eningococos.441 También se ha encontrado en gonococos y m eningococos otra proteína que transporta hierro, FrpB.61-69 Estas pequeñas proteínas de mem brana externa reguladas por hierro son receptores para la transferrina, lactoferrina o hem oglobina que unen sus respectivos ligandos y, durante la infección con las proteínas integrales de la m em brana externa, transportan hierro hacia el interior de la célula.709

Ig A l P ro te a sa

Todos los gonococos producen una IgA l proteasa, que hidroliza las m oléculas de IgA l (pero no IgA2) en la región bisagra (véase cap. 3). Esta enzim a actúa com o un factor de virulencia por inactivación de la IgA l en las superficies de las m ucosas, con lo que se perm ite la fijación inicial y la posterior invasión.457 Ig A l también promueve la supervivencia intracelular de los gonococos por modificación enzim ática de una proteína intracelular llamada LAMP1 que está involucrada en la fusión fagosom a/lisosom a.43 Otra investigación ha documentado que esta exoenzim a puede desencadenar la liberación de citocinas proinflam atorias de los m onocitos humanos y puede activar los Iinfocitos T CD4(+) y CD8(+), lo que conduce a la producción de interferón gamma (IFN-y) y TNF.666 La proteasa se sintetiza com o una proteína precursora de 169 kDa que se escinde enzim áticam ente para form ar la IgA l proteasa m adura de 106 kD a y una proteína exportable asociada con la m em brana de 45 kDa.

P lásm id o s

Los determ inantes de virulencia llevados por plásmidos en N. gonorrhoeae están asociados con la resistencia a los antibióticos. Aunque se describieron varios otros, los dos plásmidos principales que transportan los genes estructurales para las p-lactam asas TEM-1 tienen pesos m oleculares de 3,2 M Da y 4,4 M Da.29 El plásmido de 3,2 M Da fue im portado de Africa alrededor de 1976 y se encontró en principio en África, Europa y el este de los Estados Unidos, mientras que el plásm ido de 4,4 m Da probable­ mente se originó en A sia y se transportó a grandes ciudades en el oeste de los Estados Unidos a fines de la década de 1970. Las regiones del gen son homologas a TnA, un transposón de resistencia a la am picilina encontrado en la familia Entem bacteriaceae. Sin embargo, más del 60% de las secuencias de transposón encontradas en los plásmidos gonocócicos son hom ologas a las secuencias de nucleótidos encontradas en los plásm idos de especies de Haemophilus. Los plásmidos de p-lactamasa gonocócicos pueden ser transferidos por conjugación si la célula donante tam bién tiene el plásm ido conjugativo de 24,5 MDa o de 25,2 MDa. Los últimos plásmidos tam bién transportan tetM, que desde el punto de vista fenotípico produce un eleva­ do nivel de resistencia a las tetraciclinas (las concentraciones inhibitorias minimas [CIM] > 16 pg/mL). Estos plásmidos automovilizadores pueden transferirse por conjugación a otro gonococo, m eningococo, neisseria saprofita y a algunas especies de Haemophilus. La mayoría de las cepas gonocócicas también llevan un plásm ido "críptico” de 2.6 M D a de función desconocida.

C aracterísticas generales del género N eisseria

R ecuadro 1 1 -3

545

Factores de viru lencia y antígenos asociados con la v iru len cia de N eisseria m en in gitidis

Factores de virulencia y antígenos Polisacáridos capsulares

j Lipooligosacáridos

Fim brias (pili)

Proteínas de la m em brana externa PorA y PorB

Comentarios Las cepas de N. meningitidis con frecuencia son capsuladas y se describieron 13 serogrupos capsulares diferentes, designados serogrupos A, B. C, D, H, I. K, L, W 125, X, Y, Z y 29E. Con la excepción del polisacárido del serogrupo A. estas moléculas están com puestas por derivados del ácido A'-acetil-neuramínico (ácido siálico). El polisacárido capsular del grupo A está com ­ puesto por unidades repetidas de tx-A'-acetil-manosamina-l-fosfato. En los otros serogrupos importantes, se sintetiza un precur­ sor del polisacárido capsular, ácido citosina-monofosfato-/V-acetil-neuramínico (CMP-NANA). por el operón sia de tres genes. Un cuarto gen del operón de la biosíntesis de la cápsula es responsable de las polisialiltransferasas que son únicas para cada serogrupo capsular m eningocócico.635,636 Otro operón conservado entre los serogrupos m eningocócicos - e l operón crr de cuatro g enes- codifica proteínas necesarias para exportar el polisacárido capsular de la célula.634 Los aislamientos sistém icos de .V. meningitidis por lo general son densam ente capsulados, mientras que las cepas transportadas en la nasofaringe tienen m enos m aterial capsular o son no capsuladas (no agrupables). Los m eningococos no agrupables se originan por subregulación de la pro­ ducción de la cápsula. Esto sucede por el agregado de una secuencia de inserción (p. ej.. IS /Í 0 7 ) en el prim er gen del operón sia o por recom binación/inactivación genéticas de los loci de polisialiltransferasa específica de serogrupo entre especies meningocócicas.282-636 El desvío capsular (el cam bio de un serogrupo por otro) tam bién se ha dem ostrado in vivo e in vitro y sucede por mal apaream iento de hebras deslizadas en el gen polisialiltransferasa (siaD).2a Los polisacáridos capsulares m eningocócicos impiden la muerte del m icroorganism o por la acción de células fagocíticas y mejora su supervivencia durante la invasión al SNC y al torrente circulatorio. Los polisacáridos capsulares m eningocócicos no intervienen en la adherencia a las células epiteliales y las células capsuladas se adhieren a las células de las mucosas m enos fácilm ente que las células no capsuladas.625 Com o el LOS gonocócico. el LOS de N. m eningitidis carece de antígenos O repetidos y consiste en una región nuclear interna conservada com puesta por ácido 3-desoxi-D-mano-2-octulosónico (KDO) y heptosa unidos al Iípido A .272 Los residuos de hidra­ tos de carbono nucleares externos (glucosa, galactosa. A'-acetilglucosamina y ácido ¿V-acetilneuramínico) están unidos a las heptosas del núcleo interno. En N. meningitidis, algunos de los residuos heptosas están unidos a cadenas de oligosacáridos de com ­ posición variable: estos residuos form an la base para la inmunotipificación de las cepas m eningocócicas. Se describieron al m enos 12 inm unotipos LOS, designados L l hasta L12.412 La presencia del hidrato de carbono lacto-JV-neotetrosa en el LOS se estableció como un determ inante de virulencia m eningocócica. Las mitades de lacto-JV-neotetrosa en posiciones term inales en los LOS se asemejan a los com ponentes estructurales de los glucoesfingoh'pidos presentes en muchos tipos de células humanas, incluido el antígeno del eritrocito I hum ano.411 Ocho de los 12 inmunotipos LOS de N. meningitidis contienen la estructura de lacto-iV-neotetrosa.665 En m odelos anim ales, las cepas recuperadas de infecciones sistémicas expresan este determ inante incluso cuando la capa usada originalm ente para establecer la infección no lo hacía. Los aislamientos m eningocócicos sistémicos hum a­ nos también expresan este determ inante, mientras que puede no hacerlo la m ism a cepa aislada de la nasofaringe del paciente.328 Las mitades de lacto-iV-neotetrosa term inales en los LOS también son sustratos para las 2,3-sialiltransferasas endógenas.255 La sialilación de estos residuos enmascara su presencia y deriva en la subregulación de la activación del com plem ento y la inhibi­ ción de la actividad bactericida del suero. El LOS m eningocócico tam bién estim ula la liberación de T N F -a, que causa daño pos­ terior en la célula huésped. Los aislamientos frescos de m eningococos tienen pili; los pili intervienen en la fijación de los microorganism os a las células m ucosas de la nasofaringe.507 In vivo, los m icroorganismos en el LCR tienen pili, pero no se sabe si éstos cum plen un papel en la capacidad del m eningococo para atravesar la barrera hematoencefálica o para interactuar con tejidos m eníngeos.292 Los pili de N. meningitidis se dividen en pili clase 1 y pili clase 2; los pili clase 1 se asem ejan mucho a los de N. gonorrhoeae, m ientras que los pili clase 2 están compuestos por proteínas subunitarias más pequeñas que com parten determ inantes conform acionales con los pili clase 1 y los gonocócicos.696 Los pili están com puestos por subunidades de la proteína pilina de 15 a 20 kDa codificadas por el locus pilE. El dom inio C-terminal de las proteínas pilE contiene regiones variables que son responsables de la variación antigénica de la pilina.467 La form ación estable de pili en los m eningococos requiere la participación de dos proteínas de 110 kDa, llamadas P ilC l y PilC2, que se encuentran en los extremos de los pili funcionales y en la superficie de la m embrana exter­ n a ->66,558 La expresión de la proteína P ilC l es necesaria para la adherencia, porque las cepas que carecen de locus p ilC l y expre­ san sólo PÍ1C2 no se adhieren a las células epiteliales a pesar de tener los pili intactos.521 En contacto con las células epiteliales, la expresión del gen p ilC l se sobrerregula, lo que conduce a la síntesis de pilus adicionales.639 Una vez que sucede la adherencia m ediada por pilus, otra proteína (PilT) inicia un contacto más íntim o bacteria-superficie celular.518 Otros loci (p. ej., pilG. pilQi codifican proteínas involucradas en la exportación de la proteína pilina y en la form ación del p ilu s659-660 La proteína cofactor de m em brana (CD46), una glucoproteína que participa en la regulación del com plem ento y que se encuentra en muchos tipos celu­ lares, ha sido identificada com o un receptor del pilus m eningocócico.336

Las proteínas de la m embrana externa (OMP, por sus siglas del inglés) de N. meningitidis se dividen en cinco clases sobre la base del peso molecular: clase 1 (44 a 47 kDa), clase 2 (40 a 42 kDa), clase 3 (37 a 39 kDa), clase 4 (33 a 34 kD ai y clase 5 (26 a 30 kDa).242Estas proteínas difieren en su sensibilidad a la hidrólisis enzim ática y desnaturalización térmica. Todas las cepas de N. meningitidis tienen OM P de clase 2 o de clase 3 que constituye la proteína predom inante de la m em brana extem a. Las proteínas de clase 1 y de clase 2 son porinas y tam bién son responsables de la especificidad de serotipo. Las proteínas de clase 1 y de clase 5 se encuentran en la m ayoría de los meningococos, aunque se han señalado diferencias cualitativas y cuantitativas en su expre­ sión. El sistem a de tipificación serológica que se usa para estudios epidem iológicos de m eningococos se basa en el antígeno polisacárido de grupo junto con diferencias antigénicas entre las proteínas de clase 2 o 3 y los determ inantes LOS presentes.33-242 Los determ inantes antigénicos encontrados en las proteínas 1 y 5, si están presentes, se usan para designar subserotipos. Por ejem plo, un m eningococo del serotipo C:2b:P1.3;P5.2;L3,7 es un m eningococo del serogrupo C que expresa una proteína de clase 2 serotipo “b’\ una proteína de clase 1 serotipo 3, una proteína de clase 5 serotipo 2 y LOS tipos 3 y 7.242 (Continúa)

546

C A PÍTU LO 11

Recuadro 11-3

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

Factores de viru lencia y an tíg en o s a so c iad o s con la viru lencia de N eisseria m en in g itid is (cont.)

Factores de virulencia y antígenos

Comentarios Las proteínas porina m eningocócicas son el resultado de la expresión de dos genes llamados porA y porB. La proteína PorA se produce en todos los m eningococos y es una porina de clase 1 (catión-selectiva); aislamientos individuales pueden variar en las cantidades de proteína PorA presentes en la m em brana externa. PorB codifica proteínas PorB clase 2 o clase 3. Estas son porinas anión-selectivas que constituyen el com ponente porina principal en la m em brana externa meningocócica. Las proteínas clase 2/clase 3 de N. meningitidis son análogas a las proteínas PorA(PIA)/PorB(PIB) de N. gonorrhoeae. Las proteínas Por B pueden insertarse por sí mismas en las m em branas de las células diana y de los fagolisosomas e inducen apoptosis, con lo que facilitan la infección e invasión del huésped.458

Proteínas O pa y Opc

Las proteínas Opa de clase 5 también se encuentran en la mem brana externa de N. meningitidis. Sin embargo, en vez del repertorio de 12 genes Opa com o en los gonococos, se han identificado sólo tres a cuatro genes Opa en los diferentes aislamientos de m eningococos.440 Las proteínas Opa m eningocócicas tam bién facilitan la adherencia bacteriana a las células epiteliales y a los neutrófilos. A islam ientos de distintos lugares anatóm icos (p. ej., sangre, LCR, nasofaringe) también pueden expresar proteínas Opa diferentes.656 Las moléculas de adhesión CD66 humanas son receptores para las proteínas Opa m eningocócicas.697 Opc es otra proteína de clase 5 de unión a heparina y vitronectina. Opc funciona en la adherencia a las mucosas y en la invasión de célu­ las endoteliales y tam bién es una diana para los anticuerpos bactericidas.185

P ro te ín a s de a d q u isi­ ción/unión al h ierro

Com o los gonococos, N. meningitidis ha desarrollado m ecanismos particulares para la adquisición de hierro. Los tres sistemas de transporte de dos componentes, llamados TbpA/TbpB, LbpA/LbpB y HpuA/HpuB están involucrados en la adquisición de hierro de la transferrina, lactoferrina y hemoglobina/haptoglobina hum anas, respectivam ente.387-388-502546'627 Los sistem as TbpA/TbpB funcionan de modo óptimo durante la infección inicial y la invasión, porque la lactoferrina es la principal fuente de hierro en las superficies mucosas, mientras que el sistema HpuA/HpuB se expresa de m anera máxima durante la baeteriem ia, cuando los com ­ plejos haptoglobina/hem oglobina representan la form a de hierro más abundante. Los m eningococos tam bién tienen una proteína de superficie llamada HmbR que puede extraer hemo de la hem oglobina unida a la superficie y transportarlo al interior de la célula.382 Todas estas proteínas son OM P integrales.

Ig A l P ro te a sa

Todos los meningococos producen una IgA 1 proteasa sim ilar a la encontrada en N. gonorrhoeae. Se postula que sirve com o un factor de virulencia mediante la anulación de la inm unidad de las mucosas. Los anticuerpos contra IgA 1 proteasa se producen y son detectables durante la enfermedad meningocócica y aparecen también durante la portación nasofaríngea asintom ática.96

P lásm idos

Los plásmidos no son com unes en N. meningitidis. Sin em bargo, las cepas de N. meningitidis resistentes a la tetraciclina contienen el mismo plám ido que lleva tetM de 25,2 M Da que el encontrado en N. gonorrhoeae resistente a la tetraciclina. Los plásmidos que codifican P-lactam asa de N. gonorrhoeae también pueden ser transferidos a N. meningitidis in vitro por el plásmido de 24,5 o de 25,2 kDa encontrado en algunos gonococos.542 La adquisición m eningocócica del gen P-lactamasa también es posible que ocurra in vivo, en especial cuando ambos m icroorganism os están presentes en el m ism o lugar o m uestra.189 Backm an y cois, secuenciaron los plásmidos de dos cepas de N. m eningitidis p-lactam asa positivas aisladas en pacientes en España.44 El plásmido de 5 597 pares de bases fue el mismo en ambos aislamientos y fue virtualmente idéntico al plásmido P-lactamasa de 5 597 pares de bases encontrado en N. gonorrhoeae.

Las especies patógenas de Neisseria tienen varios factores y características que contribuyen a la virulencia. Las cepas de N. meningitidis aisladas en infecciones graves suelen tener cápsu­ las de polisacáridos por fuera de la membrana externa de la superficie celular bacteriana; se describieron 13 serogrupos capsulares diferentes (véase más adelante). Las cápsulas vuel­ ven a los miroorganismos resistentes a la fagocitosis, en parti­ cular en ausencia de anticuerpos opsonizantes.33 Varios antíge­ nos proteicos de la membrana externa encontrados tanto en N. gonorrhoeae como en N. meningitidis también tienen funcio­ nes asociadas con la virulencia (fig. 11-1; véanse recuadros 112 y 11-3). Los gonococos y los meningococos producen, ade­ más, una proteasa de inmunoglobulina A (Ig A l) capaz de hidrolizar la IgA 1 secretoria y humoral en los fragmentos Fab y Fe, que neutralizan los efectos de IgA secretoria y anulan la resistencia de la mucosa a la infección.457 Las condiciones atmosféricas y nutricionales también contribuyen a la virulen­ cia de los gonococos y los meningococos. La colonización y la infección ulterior de las superficies mucosas por estos micro­ organismos requieren hierro y ambos tienen métodos enzimáticos regulados genéticamente para liberarlo a partir de transfe­ rrina y lactoferrina, haciendo accesible el hierro libre para el metabolismo bacteriano (véanse recuadros 11-2 y 11-3). Los

requerimientos de las diferentes cepas gonocócicas y meningo­ cócicas de ciertos aminoácidos específicos u otros nutrientes también pueden limitar su capacidad de causar determinados síndromes clínicos. Las cepas de N. gonorrhoeae también pue­ den crecer en anaerobiosis en presencia de nitrito como aceptor de electrones.352353 En estas condiciones, también se expre­ san proteínas de la membrana externa nuevas y diferentes regu­ ladas genéticamente.156 Esta propiedad puede contribuir a la virulencia gonocócica porque permite la proliferación del microorganismo en ambientes anaerobios, como el endocérvix, el recto, el aparato genital y la faringe, y también explicaría su papel fundamental en la enfermedad inflamatoria pelviana, caso en el cual se lo puede recuperar en cultivos junto con bac­ terias anaerobias estrictas.

Importancia clínica de las especies de Neisseria Neisseria gonorrhoeae EPIDEMIOLOGÍA

N. gonorrhoeae es el agente causal de la gonorrea, una infec­ ción bacteriana de gran importancia para la salud pública. En los Estados Unidos, la incidencia de gonorrea aumentó de

Im portancia clínica de las especies de N eisseria

- g u r a 11-1 Esquem a de la estructura de la 9p ex d cie de N. gonorrhoeae, que muestra los ;•:<=>:-ner.tes principales que contribuyen a la {■Deenicidad y a la resistencia a los antibióticos. Opa. Por \ Rmp son las designaciones de las prinr r s l e s proteínas de la m em brana externa (véase a k x k >>: LOS significa lipooligosacárido.

5 47

Membrana externa Espacio periplasmático Peptidoglueano

Membrana citoplasmática

I ] Oligosacárido

LOS K Fosfolípido

manera constante durante la década de 1960 y principios de los años 1970, con la incidencia más elevada -m ás de 460 casos por 100 000 habitantes- que ocurrió en 1975.614 La “gonorrea endém ica" que sucedió durante esos años se atribuyó a varios :¿ctores, entre ellos, el incremento de la población de adultos '■enes en riesgo, la importación de variedades gonocócicas menos sensibles que acompañó el retomo de los soldados que rrestaron el servicio militar en la guerra de Vietnam, el aumento del uso de métodos anticonceptivos sin barrera (la pildora anticonceptiva y los dispositivos intrauterinos), el m ejora­ miento de los métodos de detección y seguimiento de contactov- 3614 En las décadas de 1980 y 1990, la incidencia de gono­ rrea declinó de modo sostenido. Esta declinación se debió en gran parte a los cambios en las conductas sexuales, en particu­ lar entre varones homosexuales o bisexuales, en respuesta al SIDA y a la detección más eficaz de casos y contactos. En 1994. se informó por primera vez que los casos de infección por Chlamydia trachomatis excedían los de infección gonocó­ cica.191 Sin embargo, la tendencia decreciente de la incidencia de infecciones gonocócicas entre varones homosexuales y bise­ xuales se ha revertido en los últimos años. Los datos del Pro­ yecto de vigilancia de aislamientos gonocócicos (Gonococcal Isolate Surveillance Project) de los CDC muestran que la pro­ porción de infecciones en varones homo/bisexuales aumentó de 4,5% en 1992 a 13,2% en 1999.238 La incidencia de gono­ rrea todavía es alta en los adolescentes sexualmente activos 'con edades desde 10 hasta 19 años) y los adultos jóvenes (con edades desde 20 hasta 24 años) de todas las razas, y los índices más altos están entre los varones y las mujeres de 15 a 24 años.614 Indices desproporcionadamente altos de infección gonocócica también se encuentran en la población afroameri­ cana urbana, en particular en las mujeres de 15 a 19 años. La transmisión de la gonorrea está relacionada con un grupo social o "núcleo" de “transmisores de alta frecuencia”, que sirven como reservorio de la infección.101-612 Los factores de riesgo social (el nivel socioeconómico bajo, la residencia urbana, la falta de educación y de acceso a la atención sanitaria, el estado civil soltero, la raza/etnia, la homosexualidad masculina, la prostitución, los antecedentes de otras enfermedades de trans­ misión sexual [ E T S ] ) y de conductas de riesgo (relaciones sexuales sin protección, parejas múltiples, parejas de alto ries­ go. consumo de drogas) han sido identificados como dianas

] L'Pido A

0

Proteína

para la intervención y los programas de control de las ETS. En los Estados Unidos, la infección gonocócica se ha convertido cada vez más en una enfermedad del pobre y del desprotegido y, como con la infección por HIV, las asociaciones epidemio­ lógicas han advertido una relación entre gonorrea, el uso de crack de cocaína y drogas intravenosas, y el intercambio de sexo por dinero o drogas.589 Desde el punto de vista global, la mayor incidencia de gonorrea y sus complicaciones se encuen­ tra en los países en vías de desarrollo, como los de África y América latina. El riesgo de adquirir gonorrea es multifactorial y se relacio­ na con la frecuencia y los sitios de exposición. Para los varones heterosexuales, el riesgo de adquirir infección uretral de una mujer infectada es casi del 20% con una única exposición y de más del 80% con cuatro exposiciones.300 Debido a considera­ ciones anatómicas, el riesgo de infección del aparato genital femenino con una única exposición a un varón infectado es mucho mayor. La transmisión de la infección rectal también es bastante eficaz y estudios recientes entre varones homose­ xuales y bisexuales han demostrado que la infección uretral luego del sexo oral con una pareja infectada puede representar hasta el 26% de las infecciones uretrales diagnosticadas en esta población.372 En las mujeres, el uso de métodos anticonceptivos hormonales está asociado con un mayor riesgo de infección gonocócica, mientras que los métodos de barrera, como con­ dones o diafragmas usados con geles y espumas espermicidas. (p. ej., nonoxinol 9), ejercen un efecto protector contra la infec­ ción.403-404

INFECCIONES CAUSADAS POR N. GONORRHOEAE

En los varones, N. gonorrhoeae causa uretritis aguda con disuria y secreción uretral (fig. 1 1-2).303-614 El período de incu­ bación entre la adquisición del microorganismo y la aparición de los síntomas oscila entre 1 y 14 días o más. con un prome­ dio de 2 a 7 días. Estas infecciones son asintomáticas durante el estadio prodrómico y, a la inversa. 95-99% de los hombres con infección gonocócica uretral experimentarán una secreción alguna vez. La secreción es purulenta en el 75% de los casos, turbia en el 20% y mucosa en alrededor del 5%; la consisten­ cia de la secreción en la presentación está afectada por el tiem­ po de incubación y si el paciente ha orinado recientemente.

548

C A PÍTU LO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

Figura 11-2 Secreción uretral purulenta característica de infección por Neisseria gonorrhoeae.

Casi el 2,5% de los hombres que consultan a centros de enfer­ medades de transmisión sexual están completamente asintomáticos, y se estima que la prevalencia de gonorrea urogenital asintomática en la población masculina general puede ser de hasta el 5%. Este patrón de enfermedad a menudo está asocia­ do con infecciones por ciertas serovariedades gonocócicas Por IA y auxotipos de N. gonorrhoeae con arginina, hipoxantina y uracilo (AHU) y otros (véase más adelante).102,356,360,453 Si no se tratan, la mayoría de los casos de gonorrea se resuelven espon­ táneamente, pero en menos del 10% de los pacientes la infec­ ción ascendente puede derivar en epididimitis gonocócica, epididimoorquitis, prostatitis, abscesos periuretrales y constric­ ción uretral. Estas complicaciones se observan rara vez en la práctica clínica en los Estados Unidos. En las mujeres, la infección gonocócica primaria está pre­ sente en el endocérvix y la infección uretral simultánea ocurre en el 70-90% de los casos. Después de un período de incuba­ ción de 8-10 días, las pacientes pueden presentar con secreción cervicovaginal anormal o sangrado intermenstrual y dolor ab­ dominal o pelviano; esto último sugiere la presencia de enfer­ medad de los genitales internos.637 La presencia de disuria indi­ ca compromiso uretral importante. La infección gonocócica del epitelio pavimentoso vaginal de mujeres pospuberales no es común y en las que han tenido histerectomías, la uretra es el sitio primario más frecuente de infección. Aunque a menudo se ha establecido que la mayoría de las mujeres con infección gonocócica son asintomáticas, esto no es verdad. Esta asevera­ ción se basaba en que muchas mujeres infectadas fueron detec­ tadas durante exámenes de cribado masivo en lugares como clí­ nicas de planificación familiar, y no se tenía en cuenta que muchas mujeres consultaban a los médicos o a los servicios de emergencia por diversos síntomas del aparato genital (p. ej., secreción vaginal, dispareunia, menorragia) o pelvianos.614 Los síntomas de infección endocervical no complicada a veces se asemejan a los de otras afecciones, como cistitis o infecciones vaginales, y la sintomatología de endocervicitis gonocócica

suele estar enmascarada por la coinfección con Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis o Candida albicans. Aunque el aparato genital puede parecer normal, un examen endocervi­ cal cuidadoso revela áreas de mucosa cervical friables que san­ gran al limpiarlas. Sin embargo, sólo 10-20% de las mujeres infectadas tienen secreción endocervical mucopurulenta. La infección de las glándulas de Bertolino y de Skene puede observarse en casi un tercio de las mujeres con infección geni­ tal. La manipulación cuidadosa de estas áreas puede a veces permitir la obtención de material purulento para examen direc­ to y cultivo. La gonorrea endocervical también puede compli­ car el embarazo y es un cofactor reconocido para aborto espon­ táneo, corioamnionitis, rotura prematura de membranas y parto prematuro.303’637 Los recién nacidos de madres con infecciones genitales están expuestos a padecer conjuntivitis gonocócica (“oftalmía neonatal) o infección gonocócica faríngea. La infección gonocócica ascendente puede suceder en el 1020% de las mujeres infectadas y derivar en enfermedad infla­ matoria pelviana (EIP) aguda que se manifiesta con salpingitis (infección de las trompas de Falopio), endometritis y abscesos tuboováricos, que pueden causar cicatrices en las trompas de Falopio, embarazos ectópicos, esterilidad y dolor pelviano cró­ nico.303,614 Los síntomas de EIP gonocócica son dolor pelviano bilateral, secreción cervical anormal y sangrado, dolor durante el movimiento, fiebre y leucocitosis periférica. La EIP causada por N. gonorrhoeae por lo general sucede temprana, más que tardíamente, en la infección y a menudo poco después del co lienzo o durante la menstruación. Se observa fiebre, leucocii jsís, eritrosedimentación elevada y proteína C reactiva en alrededor de dos tercios de las pacientes, mientras que los esca­ lofríos, las náuseas y los vómitos son variables en la EIP. En las mujeres con salpingitis, también puede producir una perihepatitis llamada síndrome de Fitz-Hugh-Curtis, caracterizado por la propagación directa de los microorganismos desde las trom­ pas de Falopio hasta el hígado y el peritoneo, que provoca dolor en el hipocondrio derecho y el hallazgo laparoscópico de adherencias entre el hígado y la pared abdominal anterior.614,637 La aparición de EIP está influida por diversos factores, entre ellos el diagnóstico y tratamiento de otras infecciones genitales (p. ej., infección por C. trachomatis, vaginosis bacteriana), EIP anterior; el uso de anticonceptivos orales, dispositivos intraute­ rinos, duchas vaginales; las características de las cepas infec­ tantes y el estado inmunitario del huésped. La obstrucción de las trompas de Falopio, que conduce a la esterilidad, sucede en el 10-20% de las mujeres después de un episodio único de EIP gonocócica aguda y en el 50-80% de aquellas con tres episo­ dios o más. Entre las mujeres con embarazos ectópicos, más del 80% tiene antecedentes de EIP.202 En las mujeres embara­ zadas, la infección gonocócica está asociada con un aumento del riesgo de complicaciones, como parto prematuro, rotura prematura de membranas fetales, aborto espontáneo y mortali­ dad infantil. Las complicaciones debidas a las infecciones gonocócicas son menos comunes después del primer trimestre de embarazo. N. gonorrhoeae también puede causar infecciones anorrectales y faríngeas. La infección gonocócica orofaríngea se observa en varones homosexuales y bisexuales y en mujeres heterosexuales, que adquieren la infección por contacto sexual orogenital con una pareja infectada. La gonorrea faríngea tam­ bién se observa en ocasiones en varones heterosexuales, como resultado de la práctica de sexo oral con una pareja infectada. Más del 90% de las infecciones gonocócicas orofaríngeas son asintomáticas y se diagnostican mediante el cultivo del micro­ organismo de la garganta.48 Las infecciones anorrectales suce-

Im portancia clínica de las especies de N eisseria aen en varones homosexuales y bisexuales que practican rela­ jo n e s sexuales anales receptivas sin protección. Las mujeres t_mbién adquieren infecciones rectales por coito anal recepti. pero la mayoría de las infecciones rectales en las mujeres deben a contaminación perianal con secreciones cervicova_nnales infectadas. Las infecciones gonocócicas rectales son a ~er¡udo asintomáticas, pero algunos individuos pueden experi­ mentar proctitis aguda con dolor anorrectal moderado y prurito, 'e.reción mucopurulenta, sangrado, tenesmo y estreñimiento 5 _ " días después de la infección.547 El examen anoscópico del canal anal por lo general revela una mucosa rectal edematosa y entematosa y secreción purulenta en las criptas anales.715 La infección por Chlamydia, la infección por el virus del herpes 'im ple y otras infecciones de transmisión sexual están inclui­ das en el diagnóstico diferencial de la infección gonocócica anorrectal. En un pequeño porcentaje (un 0,5-3%) de individuos infectados, los gonococos pueden invadir el torrente circulatorio y provocar una infección gonocócica diseminada (IGD).433,552 E '.a infección se caracteriza por fiebre poco elevada (rara vez por encima de 39 °C), lesiones cutáneas hemorrágicas, tenosin ■itis. poliartralgias migratorias y artritis franca. Las mujeres r crecen tener un riesgo mayor para la 1GD, en particular durante la menstruación y durante el segundo y el tercer trimestre del embarazo. Las lesiones cutáneas suelen ser dolorosas y apare­ cen como una pápula que evoluciona hacia una pústula necrótica sobre una base eritematosa (fig. 11-3). Por lo común, se precentan unas pocas como 5 o más de 30 lesiones y la mayoría de ellas están en las extremidades (dedos de los pies y de las manos) 433 (Véase lámina en color 11-1B). Los cultivos de las le­ gones cutáneas y de los líquidos sinoviales de los pacientes . n IGD pueden ser negativos, lo que sugiere que los procesos inmunes (p. ej., el depósito de complejos antígeno-anticuerpo) , ntribuyen a la patogenia de la IGD. A veces aparecen erup­ ciones petequiales, papulares o maculares extendidas. Mastrolonardo y cois, informaron una IGD en una mujer de 24 años que consultó por lesiones vesiculares, hemorrágicas y r.ecróticas extensas en las nalgas y los miembros inferiores.422 En el 30-40% de los casos, los microorganismos del torrente circulatorio pueden localizarse en una articulación o más y cau­ sar una artritis gonocócica destructiva y purulenta.170 El com­ promiso de la articulación es casi siempre asimétrico e involu­ cra las articulaciones de la rodilla, el codo, la muñeca, los dedos de la mano y el tobillo.720 Rara vez están comprometidas tras articulaciones.381 El líquido sinovial infectado contiene entre 50.000 y 200.000 células/mm3, el 90% de ellas, neutrófilos polim orfonucleares.170-235 La tinción de Gram y el cultivo de los aspirados de la articulación son positivos sólo en el 10-30% de los casos. La reacción en cadena de la polimerasa ‘PCR) también se aplicó para la detección de gonococos en el líquido sinovial.392-459 Las complicaciones de la IGD son daño articular permanen­ te. endocarditis y rara vez, meningitis.530-706 La endocarditis gonocócica es una entidad clínica rara, con menos de 60 casos informados en la literatura desde 1938. Puede desarrollarse en alrededor del 1-2% de los pacientes con infección diseminada, suele comprometer la válvula aórtica y sigue un curso destruc­ tivo y rápido.706 En 1996, Thompson y Brantley informaron un caso de endocarditis gonocócica en un varón de 23 años que necesitó el empleo de prótesis valvular como resultado de una insuficiencia aórtica grave y prolapso de las valvas aórticas.652 En 1997, se diagnosticó el primer caso de endocarditis gono­ cócica asociada con lupus eritematoso sistémico en una mujer de 24 años con síntomas inespecíficos de tos, dolor de pecho,

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Figura 11-3 L esión cutánea característica de infección gonocócica disem i­ nada en un dedo de la m ano. Estas lesiones suelen ubicarse en las extrem i­ dades.

fiebre y malestar sin signos ni síntomas de IGD.655 Los electro­ cardiogramas transesofágicos y transtorácicos mostraron una gran vegetación en la válvula pulmonar y los hemocultivos fue­ ron positivos para N. gonorrhoeae. La pericarditis y los derra­ mes pericárdicos también son complicaciones de la IGD y el síndrome de dificultad respiratoria del adulto se informó en asociación con baeteriemia gonocócica.56-159,717 La meningitis gonocócica es una complicación rara de la infección disemina­ da que tiene los rasgos típicos de la meningitis causada por otros microorganismos.530 Dentro de las entidades clínicas que se asemejan a la IGD están el síndrome de Reiter, la artritis inducida por cristales y piógena, la artritis sifilítica y tubercu­ losa, la artritis reumatoide, la enfermedad de Lyme y la fiebre reumática.552 Se han observado ataques repetidos de IGD en individuos con ciertas deficiencias del complemento.211 552 La enfermedad diseminada puede aparecer después de la infección en sitios genitales o extragenitales. Los estudios de cepas recu­ peradas de casos de IGD han mostrado que esas cepas más invasivas tienen características atípicas, como requerimientos nutricionales especiales (p. ej., requerimientos de arginina. hipoxantina y uracilo para crecer [variedades A HU]). categorización definida de serovariedad Por IA. resistencia a la acción bactericida del suero humano normal y sensibilidad extrema a la penicilina.207,356-453'585 Con la declinación en la prevalencia de la serovariedad Por IA/AHLJ en los últimos años, el incre­ mento del número de IGD se ha asociado con otras clases de au xotipo/sero variedad.102645 En los últimos años han aparecido en la literatura médica informes de presentaciones o infecciones gonocócicas inusua­ les. Las infecciones gonocócicas oculares, vistas por primera vez en recién nacidos que adquirían el microorganismo duran­ te el pasaje por el canal de parto infectado (oftalmía neonatal), se han informado en adultos que se infectan mediante secre­ ciones genitales.704 El personal de laboratorio que trabaja con cultivos también puede infectarse accidentalmente si no toma

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C A PÍTU LO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

los recaudos para protegerse los ojos.410 La infección ocular causa celulitis periorbital, secreción purulenta profusa, inyec­ ción conjuntival, edema y eritema de los párpados, y queratitis de la estroma y epitelial. Los tratamientos inadecuados de las infecciones oculares pueden conducir a queratitis ulcerativa, perforación de la córnea y ceguera.704 Se han publicado infor­ mes de infección gonocócica cutánea primaria, resultante de la inoculación de una lesión preexistente, que incluye un caso de mastitis gonocócica en un varón.74-592 Se han comunicado abs­ cesos gonocócicos en el cuero cabelludo de recién nacidos como una complicación de la monitorización fetal intrauteri­ na.40 Se pueden observar presentaciones atípicas y cursos clíni­ cos en pacientes con enfermedades subyacentes, como la infec­ ción por HIV. Jacoby y Mady describieron un caso de sepsis gonocócica aguda en una mujer de 35 años HlV-positiva que incluyó acidosis e hipotensión profundas, hallazgos que no suelen observarse en pacientes con IGD.316 Risher y McFadden comunicaron un caso de un aneurisma micótico de la aorta ascendente por N. gonorrhoeae en una mujer de 38 años con lupus eritematoso sistémico que necesitó terapia antimicrobia­ na prolongada con resección quirúrgica de las válvulas afecta­ das.540 Strongin y cois, informaron sobre un varón homosexual de 27 años HlV-positivo con artritis gonocócica de la cadera y de una sola articulación esternoclavicular.630 Brook y cois, des­ cribieron un “minibrote” de N. gonorrhoeae invasor de tejidos entre dos contactos sexuales masculinos y tres femeninos que derivó en infección asintomática en uno de los hombres. EIP en una de las mujeres, IGD en otra mujer y linfadenopatía ingui­ nal en dos de los pacientes.95 En 1994, Bodsworth y cois, comunicaron el primer caso de infección gonocócica de la '"neovagina" de un transexual masculino a femenino.-' Por últi­ mo, Burnett y cois, informaron un caso muy poco común de infección gonocócica de una derivación ventriculoperitoneal en una mujer de 17 años.103 Los autores propusieron que el extre­ mo peritoneal de la derivación, que producía el mayor creci­ miento del microorganismo, pudo haberse contaminado con gonococos durante la menstruación, cuando la sangre podía refluir a través de las trompas de Falopio y entrar en la cavidad peritoneal. Históricamente, las infecciones gonocócicas en los niños sólo incluían la oftalmía neonatal, que es la gonorrea ocular transmitida al recién nacido durante el pasaje a través del cue­ llo uterino.389 Casi todos los casos de gonorrea en niños duran­ te el período neonatal son el resultado de la contaminación ocu­ lar, aunque se han informado infecciones más graves por gono­ cocos en recién nacidos.214 La transmisión de la gonorrea desde los adultos hacia los niños por fómites (p. ej.. toallas comparti­ das) se propuso como un modelo de transmisión en los niños mayores. Sin embargo, ahora se reconoce que las infecciones gonocócicas, incluidas la conjuntivitis y otras enfermedades de transmisión sexual en los niños más allá del período neonatal inmediato, son indicadores de abuso sexual.30-54 153-544 Con un acercamiento multidisciplinario cuidadoso es posible obtener historias de contactos sexuales de los niños mayores. Cuando se identifica a un niño con gonorrea, la investigación de ambos adultos tutores y de otros hermanos suele revelar la infección en adultos y otros niños.18 Las infecciones gonocócicas infan­ tiles se asemejan a las de los adultos, pero con algunas dife­ rencias notables. N. gonorrhoeae causa vaginitis, más que cer­ vicitis, en las niñas prepúberes. El epitelio de la vagina prepuberal está compuesto por células epiteliales cilindricas, el tipo de células que N. gonorrhoeae infecta de preferencia. Con la aparición de la pubertad, estas células se reemplazan por un epitelio pavimentoso estratificado que no es vulnerable a la

infección gonocócica. Las niñas con infección gonocócica genital suelen tener secreción vaginal. La infección uretral en los niños varones, si se presenta, se asemeja a la observada en los adultos. Las infecciones gonocócicas faríngeas y rectales, como en los adultos, son por lo común asintomáticas en los niños. Neisseria meningitidis EPIDEMIOLOGÍA

N. meningitidis es un patógeno primario que causa un con­ junto de procesos infecciosos, que van desde la sepsis oculta con rápida recuperación hasta la enfermedad mortal fulminan­ te.33 En ciertos pacientes sólo se manifiestan algunos aspectos de este espectro clínico, mientras que en otros puede progresar a través del espectro con alarmante rapidez. Un factor de viru­ lencia importante de todos los aislamientos de N. meningitidis asociados con enfermedad es la cápsula de polisacáridos. Se han reconocido 13 serogrupos de polisacáridos capsulares meningocócicos (A, B, C, D, H, I, K, L, X, Y, Z, W135 y 29E); la mayoría de las infecciones son causadas por microorganis­ mos pertenecientes a los serogrupos A, B, C, Y y W135. Un porcentaje variable de cepas aisla. vs en portadores nasofarín­ geos no pueden expresar un antígeno polisacárido capsular detectable (no agrupable). Por ejemplo, en un estudio reciente de transmisión meningocócica entre estudiantes universitarios en el Reino Unido, 43,9% de las 904 cepas aisladas en porta­ dores fueron serológicamente no agrupables.16 Las cepas meningocócicas pueden estar subdivididas en 20 serotipos adi­ cionales basados en los antígenos de clase 2 y 3 OMP (PorB), 10 serotipos basados en los antígenos de clase I OMP (PorA) y 13 inmunotipos basados en la estructura del lipooligosacári­ do (LOS) (véase recuadro 11-3). Aunque estos métodos serológicos son útiles para determinar el parentesco de las cepas en forma local y para definir el entorno clínico, ninguno de ellos permite discriminar y definir el parentesco genético de variedades meningocócicas para propósitos epidemiológicos globales. A causa de la elevada frecuencia de variación anti­ génica en las proteínas de la membrana externa y al fenómeno de “cambio capsular”, se han creado otros métodos para defi­ nir, identificar y rastrear genéticamente las cepas de N. m enin­ gitidis patógenas en forma global.636 Técnicas como la tipifi­ cación multilocular por electroforesis de isoenzimas (tipifica­ ción ET) y la tipificación multilocular de secuencias han ayu­ dado a científicos y epidemiólogos a identificar un número de grupos clónales definidos desde el punto de vista genético que causan tanto la enfermedad endémica y esporádica, como la epidém ica.129-597 Estos g ru p o s E T pueden, además, dividirse en s u b g ru p o s clónales. Por ejemplo, entre más de 500 cepas del serogrupo A epidémicas coleccionadas en Africa desde la década de 1960, se han reconocido 84 tipos electroforéticos (ET) que son divisibles en nueve subgrupos. Tres de esos sub­ grupos han sido responsables de todas las epidemias impor­ tantes ocurridas en la región.278,427 Complejos ET individuales incluirán cepas que llevan antígenos de serogrupos diferentes. Por ejemplo, mientras el complejo ET-37 incluye la mayoría de las cepas del serogrupo C y el complejo ET-5 contiene la mayoría de las cepas del serogrupo B, ambos complejos tam ­ bién abarcan otros serogrupos. Se describieron, además, méto­ dos moleculares para la tipificación epidemiológica meningo­ cócica. Por ejemplo, la secuenciación del gen del antígeno de serogrupo meningocócico por PCR del gen sialiltransferasa puede usarse para confirmar los métodos de agrupamiento serológico y determinar el agrupamiento genético de cepas “no agrupables” desde el punto de vista serológico que con­

Im portancia clínica de las especies de N eisseria tienen genes capsulares “inactivos”.81222 Otros métodos de genética molecular (p. ej., huellas de DNA, análisis del polim rñsm o de longitud de los fragmentos de restricción, electroíoresis en gel de campo pulsado, ribotipificación, análisis Je PCR basados en elementos repetitivos, PCR amplificada al _c_r. -ecuenciación del gen porA, y análisis de la endonucleasu del amplieón por PCR) también se han creado para contro­ lar la epidemiología de las cepas patogénicas de N. m eningiti­ dis en el mundo 52-276’277.347,368,495,535,629,658,723,726 El análisis clonal de N. meningitidis reveló muchas caracter.sticas interesantes relacionadas con la virulencia y la enfermedad. Los clones virulentos se distinguen por sus velocidades ce Transmisión elevadas y por causar altas tasas de enfermedad pe r -.ntroducción en una población predispuesta. Se encuentran clones avirulentos en portadores asintomáticos y rara vez cau­ san enfermedad, incluso cuando se transmiten con una velociCuá 'im ilar a la de los clones virulentos.671 La presencia de clo­ nes \irulentos acoplados con altas tasas de transmisión, una población sensible, ciertos factores del huésped (p. ej., taba­ quismo. inmunidad de las mucosas, coinfecciones virales, defi­ ciencias del complemento adquiridas o congénitas) y factores ce la conducta y del medioambiente (hacinamiento, contactos cercanos, exposición al humo del cigarrillo) conducen a tasas elevadas de transmisión y a menudo a la aparición explosiva de la enfermedad.126,227’733 Finalmente, los grupos clónales virulen­ tos circulantes sufren diversificación genética mediante trans: rmación y varias presiones medioambientales selectivas; e>:os clones pueden desaparecer o resurgir más tarde.126 Varios clones patogénicos mundiales de N. meningitidis com­ puestos por diferentes serogrupos, serotipos, subserotipos e inmunotipos causan tanto la enfermedad endémica como la epidémica.126 La enfermedad meningocócica endémica sucede en tasas de 1 a 3 casos por 100 000 personas en los Estados Unidos \ de 10 a 25 casos por 100 000 personas en los países en vías de ce'arrollo.680 En los últimos años, la incidencia anual de enfer­ medad meningocócica en los Estados Unidos ha sido de 0,8 a 1 por 100 000 habitantes; los recién nacidos, los ancianos y los mmunodeprimidos tienen el mayor riesgo.315 Las tasas de ata­ que son las más altas entre los niños de 3 meses a 1 año de edad > entre adolescentes mayores y adultos jóvenes. En ciertas regiones de Africa subsahariana denominadas el “cinturón de la meningitis”, la enfermedad meningocócica causada en principio por las cepas del serogrupo A ocurre todo el año, con inciden­ c ia de hasta 1 000 casos por 100 000 habitantes.278,534 Desde fines de la década de 1960, se diseminaron varios clones de N. meningitidis del serogrupo A por China, India y Medio Oriente, que culminaron en un gran brote de enfermedad debido a una cepa del serogrupo A subgrupo III-1 entre musulmanes que hacían la peregrinación anual a la Meca (Hajj) en 1987.451,478,534 Durante el año siguiente y hasta fines de 1996, este mismo clon se diseminó y causó epidemias en Sudán, Uganda, Kenya, Etiopía. Arabia Saudita, Chad, Nigeria, Nepal y Sudáfric a . - .449.451.506 Las cepas del serogrupo B pertenecientes al complejo ET-5 han causado brotes esporádicos en Inglaterra, Dinamarca, Noruega y los Países Bajos desde mediados de 1970 y se han documentado cepas similares en todo el Lejano Oriente (p. ej., China, Japón, Tailandia), Sudamérica (p. ej., Brasil, Chile), el Caribe (p. ej., Cuba), Canadá y los Estados Lnidos (p. ej., Oregón).38,39,127,133,571,572,583,584,606 Las cepas de N. meningitidis del serogrupo B pertenecientes a otros tipos cló­ nales (ET-24 y ET-25) también surgieron en Europa durante la década de 1980 y se diseminaron a Finlandia, Noruega e I'iandia durante la década siguiente, con brotes en el Reino L nido y Bélgica.690

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Ciertos clones, como el complejo ET-37. han sido la causa de brotes esporádicos en Brasil. China. Sudáfrica y los Estados Unidos.126 El complejo ET-37 incluye cepas que expresan los serogrupos B, C, Y y W-135. Durante la década de 1980, las cepas del serogrupo B perteneciente a este complejo fueron reconocidas en China y en Sudáfrica. mientras que las del sero­ grupo C se aislaron en otras regiones de Africa y Europa.126 A fines de la década de 1980 y durante la de 1990. las cepas del serogrupo C dentro del complejo ET-37 se establecieron en los Estados Unidos, Canadá y otros países. Estas cepas causaron un grupo de enfermedades esporádicas en Iowa. Illinois. Los Angeles, Ontario y Saskatchewan, Canadá, y también se han aislado en el Reino Unido, Italia, D inam arca y Bra­ s i l , 39,205,313,421,536,548,559,629 mjsm0 tiempo, apareció un com­ plejo variante de ET-37, llamado complejo ET-15. y a princi­ pios de 1990 emergieron las cepas del grupo C dentro de este complejo variante como la causa principal de las enfermedades esporádicas en los Estados Unidos, Canadá, Inglaterra. Australia y Europa Oriental.39,290,313,536 En los Estados Unidos, estas cepas estaban asociadas con brotes en escuelas e institu­ tos correccionales.98,642,735 También durante la primera mitad de la década de 1990, aparecieron cepas de N. meningitidis del serogrupo Y en los Estados Unidos y ciertos clones complejos (p. ej., ET-508 y otros) que llevan este antígeno de serogrupo ahora son la causa de casi el 30% de las enfermedades menin­ gocócicas endémicas en ese país. En Chicago, la prevalencia de cepas del serogrupo Y aumentó de 6% en 1991 a 71% en 1995.519 El equilibrio de la enferm edad en los Estados U ni­ dos está causado por las cepas ET-37 y ET-15 del serogrupo C, las del complejo ET-5 del serogrupo B y las del serogrupo W -135.126,519,657 En el nuevo milenio, los brotes meningocócicos continúan afectando los países en vías de desarrollo y los patrones de enfermedad en los Estados Unidos reflejan cambios significa­ tivos en la epidemiología meningocócica doméstica. Por pri­ mera vez, se aislaron las cepas del serogrupo W-135 patógenas de más de 300 musulmanes que concurrieron al Hajj del año 2000, que concluyó en marzo de 2000.137,572 Un examen de cua­ tro aislamientos en peregrinos que volvían a los Estados Unidos encontró que esos meningococos pertenecían a ET-927, un grupo muy relacionado desde el punto de vista genético con el complejo ET-37.513 Estas cepas se demostraron, además, en cuatro pacientes franceses con vínculos epidemiológicos con el Hajj del año 2000.572 Estas cepas también mostraron patrones similares en la electroforesis en gel de campo pulsado y distin­ tos de otras cepas del serogrupo W-135.513 En los Estados Unidos, los cambios en la epidemiología meningocócica durante la década de 1990 incluyeron un aumento de la inci­ dencia de infecciones con serogrupos C adquiridas en la comu­ nidad, y un aumento de la enfermedad entre adolescentes y adultos jóvenes tanto durante la escuela secundaria como en la universidad.135,288,550,735 Algunos brotes han ocurrido en ciuda­ des universitarias y se han asociado con la concurrencia a bares y discos, el consumo de alcohol y cigarrillos y la residencia en albergues estudiantiles.165,310,311 Un estudio reciente en colabora­ ción documentó que los estudiantes estadounidenses de primer año de la universidad que residían en albergues universitarios tenían una tasa de incidencia anual de enfermedad meningocó­ cica de 5,4 por 100 000. que es cinco veces la tasa nacional y sólo la supera en incidencia la del grupo etario de niños meno­ res de 2 años.99 Se han observado numerosos casos en estudian­ tes que no eran del primer año y en los que vivían fuera de las instalaciones universitarias.287,288 Las razones para el aumento de la incidencia de enfermedad grupo C entre adolescentes y

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C APÍTULO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

residentes de albergues estudiantiles universitarios en particular, no se conocen. En respuesta a estos cambios en los patrones de incidencia y a la capacidad de evitar la enfermedad grave del serogrupo C con vacunas disponibles en la actualidad, el Advisory Committee on Immunization Practices (Comité Consultivo en Prácticas de Inmunización) de los Estados Unidos ha recomendado que se brinden inmunizaciones menin­ gocócicas en el ingreso a la universidad a los estudiantes que viven en residencias universitarias, mientras que otros aconse­ jan hacer accesible la vacunación meningocócica a todos los estudiantes universitarios aún no graduados.134 136'243'287-288 INFECCIONES CAUSADAS POR N. MENINGITIDIS

N. meningitidis puede ser portada de modo asintomático en la orofaringe y la nasofaringe por un porcentaje variable de individuos y la tasa de portación está relacionada con varios factores, como edad, clase socioeconómica y presencia de enfermedad real en la comunidad.121 La portación de meningo­ cocos en la nasofaringe puede ser transitoria, intermitente o persistente.16 En general, las tasas de portación tienden a ser casi del 8-20%; los niños mayores y los adultos jóvenes tienen tasas más altas (20-40%) que los niños pequeños.128'481 La dura­ ción del estado de portador también puede variar con el indivi­ duo y con el serogrupo de la cepa colonizante. Durante los períodos en que la enfermedad está presente en la comunidad, las tasas de portación pueden no ser diferentes de las observa­ das cuando se están informando enfermedades no clínicas, pero se ha notado que la proporción de individuos que portan las variedades más virulentas aumenta.33 Al contrario de lo que se ha afirmado durante años, la tasa de portación meningocócica no parece ser estacional, aunque la mayor parte de las enfer­ medades meningocócicas en los países en vías de desarrollo tiende a ocurrir durante el invierno tardío o principios de la primavera. Las condiciones de vida en hacinamiento facilitan la diseminación respiratoria de los meningococos y afecta tanto la transmisión del microorganismo como la ocurrencia de la enfermedad evidente, lo cual ha sido ampliamente demostrado por los grandes brotes ocurridos en las bases militares durante años, donde gran cantidad de adultos jóvenes susceptibles viven juntos en cuarteles cerrados por períodos prolongados. Entre tales poblaciones cerradas, las tasas de portación se pue­ den aproximar al 100%. Las cepas portadas pueden ser encapsuladas (agrupables) o no encapsuladas (no agrupables) y deri­ van en la formación de anticuerpos específicos de serogrupo y anticuerpos de amplia reacción cruzada contra varios antígenos de la membrana externa. Incluso individuos que están coloni­ zados con cepas no agrupables desarrollan altos títulos de anti­ cuerpos contra cepas agrupables, debido tal vez a la presencia de determinantes antigénicos compartidos. En un estudio de 38 individuos que portaban cepas no agrupables en la nasofaringe, 2-52% de los varones desarrollaron anticuerpos específicos de grupo, según el serogrupo analizado.525 En la mayoría de los huéspedes, la colonización meningocócica de las vías respira­ torias altas deriva en la formación de anticuerpos bactericidas del suero específicos de serogrupo dentro de los 7 a 10 días.33 Esta respuesta no elimina el estado de portador, pero puede proteger al huésped de la enfermedad sintomática. En algunos individuos, la variedad meningocócica que se establece en las vías respiratorias altas progresa para entrar en el torrente circulatorio e iniciar una enfermedad sistémica. Parece que la enfermedad invasiva de N. meningitidis sucede en personas que están recién infectadas con una cepa contra la cual el individuo carece de anticuerpos específicos de serogru­

po meningocócicos bactericidas. En un estudio entre personal militar, Edwards y cois, encontraron que el 86% de los 31 pacientes tenían cultivos negativos de nasofaringe durante las dos semanas anteriores al comienzo de la enfermedad y que cuatro pacientes tuvieron cultivos negativos el día anterior al inicio de la enfermedad.206 Sin embargo, en un informe recien­ te, se documentó un intervalo de 7 semanas ocurrido entre el contagio nasofaríngeo del microorganismo y el inicio de la enfermedad meníngea.471 La infección viral o micoplásmica simultánea de las vías respiratorias altas también puede facili­ tar la invasión sistémica por el microorganismo porque tanto los brotes esporádicos como los epidémicos de enfermedad meningocócica han sido asociados con brotes de infecciones respiratorias por virus y micoplasmas.450 El riesgo de enferme­ dad meningocócica también es mayor en los portadores con deficiencias de los componentes finales del complemento (p. ej., C5, C6. C7, C8 y C9) o en el sistema de la properdina 228.229,605 otras afecciones subyacentes, como falla hepática, lupus eritematoso sistémico, mieloma múltiple y asplenia pue­ den predisponer también a enfermedad meningocócica grave.33 La patogenia de la enfermedad meningocócica no se conoce bien y, aunque se ha informado mucho acerca de la epidemio­ logía descriptiva del microorganismo y sus estados de enfer­ medad. se sabe muy poco acerca de la dinámica de la produc­ ción de la enfermedad.439-671 Los seres humanos son el único huésped natural para N. meningitidis y el microorganismo se disemina por las gotitas del aparato respiratorio. Los meningo­ cocos colonizan la mucosa respiratoria superior y pueden luego invadir el torrente circulatorio. La fijación inicial a la mucosa nasofaríngea está mediada aparentemente por la interacción de los pili con la proteína cofactor de membrana (CD46).336 La variación antigénica a nivel del pilus regula la elusión de fac­ tores del huésped no específicos durante la adherencia inicial a la mucosa epitelial.467 Los factores medioambientales, como el hábito de fumar, y las infecciones virales concurrentes de las vías respiratorias altas aumentan el riesgo de colonización debido a alteraciones en la mucosa o a la anulación de la inmu­ nidad local.450-619 Luego, las proteínas de la membrana externa (OMP) de clase 5 se unen al receptor C46 y las proteínas Opa se unen a los receptores de proteoglucano heparansulfato sobre las células endoteliales y fagocíticas. respectivamente.439 Esto estimula la liberación de citocinas por estas células, con la endocitosis ulterior de los microorganismos por las células epi­ teliales.624,671 Más tarde, las proteínas PorB se insertan en la membrana del fagosoma e impiden la fusión con los lisosomas.439 Así, los meningococos pueden evitar los mecanismos inmunitarios humorales y sobrevivir en los leucocitos mononucleares en el subepitelio.522 El principal factor de virulencia meningocócica asociado con la invasión del torrente circulato­ rio es la cápsula de polisacáridos. En ausencia de anticuerpos opsonizantes, la cápsula impide la fagocitosis de los microor­ ganismos y protege también contra la bacteriólisis mediada por complemento. Además, ciertas clases de OMP de clase 1 de N. meningitidis pueden reducir la expresión de varios receptores de complemento en los neutrófilos, con lo cual se inhibe la ingestión de los microorganismos.66 La invasión del torrente circulatorio por los meningococos también se correlaciona con la liberación sistémica de diversas citocinas inflamatorias (p. ej.. interleucina-1, interleucina-6, factor de necrosis tumoral a ) que contribuyen a la patogenia de la meningococemia y del shock séptico meningocócico.93,94-680'699 Algunas de estas citoci­ nas pueden aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y permitir la entrada de los meningococos en el líqui­ do cefalorraquídeo (LCR). Además, la invasión meningocócica

Im portancia clínica de las especies de N eisseria Je las células endoteliales con edema resultante e inducción de apoptosis puede liberar mircroorganismos hacia el interior del LCR y de otros espacios cerrados. Los meningococos pueden causar meningitis endémica y epidémica, y los serogrupos A, B y C provocan el 90% de los casos mundiales. En la actualidad, N. meningitidis es la segun­ da causa importante de meningitis adquirida en la comunidad en 1: > Estados Unidos.120,2(14 La manifestación clínica más gra■¿ ie la enfermedad meningocócica es la meningitis acompa­ ñada por sepsis meningocócica aguda. Las presentaciones clí­ nicas de la enfermedad pueden ser bastante variadas e incluyen —eningoencefalitis, meningitis con meningococemia o sin ella, meningococemia sin meningitis y baeteriemia sin complicaciones sépticas.33,120,340,570El inicio de la meningitis meningocócica aguda es repentino, con fiebre y escalofríos, mialgias y ^rtralgias.120 Los signos clásicos de meningitis, como confu­ sión. cefalea, fiebre y rigidez de la nuca, se pueden observar en casi la mitad de los pacientes.33 Los vómitos también pueden -er una parte de la presentación clínica, en particular en los niños. La meningococemia y la diseminación de los microor­ ganismos se anuncian por la aparición rápida de exantema que observa en alrededor del 50-60% de los pacientes, y que co­ mienza como una erupción macopapular rosada que luego se uelve petequial. Al principio, las petequias aparecen en las mucosas (p. ej., la conjuntiva) y luego se extienden hacia el '.ronco y los miembros inferiores. Estas lesiones son indicado­ res de complicaciones hemorrágicas y coagulopatías causadas por el microorganismo. La enfermedad rápidamente progresiva fulminante puede derivar en la formación de máculas y pápulas que progresan para formar áreas purpúreas o equimóticas con hemorragia y necrosis cutánea.570 La p ú r p u r a f u l m i n a n t e se desarrolla en cerca del 10% de los pacientes con meningo­ cocemia y causa áreas extensas de destrucción tisular secunda­ ria a la coagulopatía; el control intensivo de los parámetros de la coagulación y el reemplazo de los factores de la coagulación pueden beneficiar a algunos pacientes.516 El compromiso neurológico difuso, más que los signos y los síntomas focales, y el compromiso miocárdico se observan con más frecuencia en la meningitis meningocócica que en otros tipos de meningitis bacterianas. Las anormalidades cardíacas, incluida la pericar­ ditis purulenta con taponamiento, son complicaciones de la enfermedad meningocócica que suelen aparecer durante la con­ valecencia.306 El informe de un caso de sepsis por un meningococo del grupo B desencadenó un infarto agudo de miocardio en un hombre de 42 años con arterias coronarias sanas.230 El shock meningocócico fulminante a menudo domina el cuadro clínico de meningitis meningocócica y sepsis meningo­ cócica aguda.33 El paciente se vuelve insensible, con ausencia ¿«-reflejos tendinosos superficiales y profundos y sensorio deprimido. Debido a la vasoconstricción periférica, se pueden notar cambios gangrenosos en las extremidades. La presencia de shock, bajo recuento de leucocitos, exantema y estado men­ tal alterado se asocian con mala evolución.649 La mortalidad del shock séptico meningocócico también está asociada con nive­ les bajos de sodio sérico y un exceso de bases negativo, lo que refleja anormalidades metabólicas generalizadas, y los niveles bajos de plaquetas y de proteína C reactiva están asociados con la duración de las petequias y la púrpura y pronostican coagu­ lación intravascular diseminada (CID) inminente.366 La muerte puede sobrevenir como resultado de la CID. En estos casos, la necropsia revela miocarditis terminal o lesiones de la CID. con microtrombos y trombosis en muchos órganos. Se ha docu­ mentado una necrosis avascular del hueso debida a trombosis en los vasos sanguíneos intraóseos secundaria a la CID en

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casos de enfermedad meningocócica grave.108 El hallazgo clá­ sico de necrosis hemorrágica aguda de las glándulas suprarre­ nales representa el rasgo característico del síndrome de Waterhouse-Friederichsen.9 A pesar de contar con excelentes agentes terapéuticos, la meningitis con sepsis causada por N. meningitidis todavía puede tener una mortalidad superior al 30%. Casi el 10% de los sobrevivientes de la infección tendrán sordera sensorioneural.425 N. meningitidis también puede causar infección en el torren­ te circulatorio (meningococemia) sin meningitis.33 Los pacien­ tes con baeteriemia meningocócica sin sepsis, por lo común presentan fiebre, cefalea, malestar general y leucocitosis peri­ férica. También puede haber síntomas de infección respiratoria, pero no síntomas y signos meníngeos. Se aíslan meningococos en los hemocultivos, pero el paciente está clínicamente bien en ese momento, y no se administra ningún tipo de terapia. En los casos de meningococemia crónica el paciente está casi siempre sintomático, con fiebre escasa, exantema y, a veces, artritis. Es­ ta presentación clínica es muy similar al síndrome de dermati­ tis-artritis gonocócica. También se describieron manifestaciones cutáneas menos comunes, como eritema nudoso, en asociación con meningococemia crónica.713 Esta forma de enfermedad meningocócica, con meningitis o sin ella, se repite en algunos pacientes, quienes con frecuencia han heredado deficiencias subyacentes de C3, properdina, C5, C8 y otros componentes tardíos del complemento.146,228,229 Los individuos con afeccio­ nes subyacentes asociadas con estados hipocomplementémicos, como lupus eritematoso sistémico, están expuestos a enfermedad meningocócica grave y se ha documentado menin­ gococemia crónica en pacientes infectados por HIV.10,41,223 En un caso informado, la meningococemia sucedió como compli­ cación de una endoscopia digestiva alta. El microorganismo probablemente fue introducido en el torrente circulatorio desde las vías respiratorias altas mediante una lesión provocada en la mucosa por el pasaje del endoscopio a través de la boca hacia el tubo digestivo.19 La sepsis por N. meningitidis también se ha comunicado como una complicación del parto prematuro en una mujer de 19 años, aunque no se realizaron los estudios complementario s 474 N. meningitidis también puede causar otras infecciones, algunas de las cuales resultan por diseminación hemática. Esta diseminación puede infectar otros órganos y llevar a complica­ ciones como osteomielitis, artritis, celulitis, pericarditis, endof­ talmitis y peritonitis bacteriana espontánea.32,252,306,383,409 En ocasiones, N. meningitidis se aísla en sitios distantes del cuer­ po sin evidencia clínica de meningitis, meningococemia u otro foco de infección meningocócica. Por ejemplo, Baevsky infor­ mó un caso de pericarditis meningocócica primaria con tapo­ namiento en un varón de 18 años que se complicó por el desa­ rrollo de CID y daño renal y hepático debido a hipotensión inducida por taponamiento cardíaco.45 En otro caso informado, se aisló N. meningitidis del serogrupo B en el líquido articular aspirado de la rodilla de un niño de 13 años sano sin evidencia de infección meningocócica.171 Por último. N. meningitidis es uno de los microorganismos de una larga lista que han sido recuperados de pacientes con peritonitis y baeteriemia compli­ cada por diálisis peritoneal ambulatoria continua.162 La neumonía meningocócica es infrecuente, pero se presen­ ta en principio como una neumonía adquirida en la comunidad indistinguible clínicamente de otras neumonías bacterianas agudas.33,718 La patogenia de la neumonía puede involucrar la diseminación hematógena o la aspiración seguida de invasión directa del parénquima pulmonar. Esta infección sucede en per­ sonas de mediana edad a mayores con enfermedades preexis­

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tentes, entre ellas, infecciones virales del aparato respiratorio, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad arterial coronaria, diabetes, infección por HIV y lupus eritematoso sistémico.524718 En un estudio de 68 reclutas militares con neumo­ nía meningocócica probada por cultivos de aspirados transtra­ queales, fueron hallazgos comunes fiebre, estertores e infiltra­ dos lobulares.365 Los pacientes tuvieron una enfermedad mode­ rada, pero no hubo casos mortales. En una revisión de más de 25 años de 58 casos de neumonía meningocócica adquirida en la comunidad se encontraron hemocultivos positivos en el 79,3% de los pacientes, aunque los síntomas y las secuelas aso­ ciadas con meningococemia no se desarrollaron en estos casos.718 Los cultivos de esputo fueron positivos en 15 (83,3%) de los 18 casos en los que se recolectaron muestras de esputo, y 5 de los 58 pacientes murieron a causa de la infección. El diagnóstico de neumonía meningocócica se distorsiona por la presencia del microorganismo en la nasofaringe, que provoca la contaminación orofaríngea de las muestras de esputo. Además de la neumonía, se informó supraglotitis bacteriémica fulminante en asociación con infecciones meningocócicas de los serogrupos B, C e Y.424’472-588'604 Estas infecciones se carac­ terizan por angina, disfagia. tejidos supraglóticos inflamados y celulitis cervical. Cinco de seis pacientes descritos con esta afección requirieron intubación o traqueotomía de urgencia, lo que indica que la supraglotitis meningocócica es una infección fulminante potencialmente mortal. La conjuntivitis meningocócica primaria se ha reconocido como una entidad clínica distinta.28-510 La mayoría de los casos suceden como parte de la infección sistémica con N. meningi­ tidis y la enfermedad meningocócica sistémica asociada con infección conjuntival se presenta en el 10-18% de los pacien­ tes.50-210 La conjuntivitis primaria causada por N. meningitidis se informó en recién nacidos, niños mayores y adultos. En dos tercios de los casos, la infección se limita a un solo ojo. En una revisión de 84 casos de conjuntivitis menigocócica primaria, 17,8% de ellos tuvieron enfermedad meningocócica sistémica (meningitis o meningococemia); entre estos pacientes, la mor­ talidad fue del 13,3%.50 La infección sistémica sucede con más frecuencia en los enfermos que recibieron terapia antimicro­ biana tópica en vez de sistémica; en efecto, el riesgo de enfer­ medad sistémica fue casi 20 veces mayor en los pacientes que recibieron terapia tópica que en los que recibieron terapia sis­ témica. Las complicaciones de la infección que estuvieron limitadas al ojo fueron úlceras de córnea, queratitis, hemorra­ gia subconjuntival e iritis. En un informe de tres casos de con­ juntivitis meningocócica primaria en el Reino Unido, se men­ cionó que un hermano menor del caso inicial sufrió meningitis meningocócica, por lo que los autores de esta comunicación recomendaron que siempre se encare la proteción profiláctica de los contactos cercanos de casos de conjuntivitis meningocó­ cica primaria.618 Saperstein y cois, también informaron un caso de endoftalmitis meningocócica exógena. en el cual el micro­ organismo entró en el ojo a través de una fístula posterior a una cirugía de cataratas y no por diseminación hemática.575 Además de la infección del ojo, ya sea en forma primaria o secundaria, se ha informado el desarrollo de cataratas transitorias junto con la aparición de exantema y fiebre en asociación con enferme­ dad meningocócica.286 En 1998, García-Lechuz y cois, dieron a conocer el primer caso de conjuntivitis meningocócica prima­ ria en un paciente infectado por HIV-1.247 N. meningitidis puede en ocasiones aislarse en la uretra mas­ culina, el aparato genital femenino y el conducto anal. En esos sitios, puede causar infecciones clínicamente indistinguibles de las gonocócicas, como uretritis purulenta aguda, cervicitis, sal-

pingitis y proctitis.149-172-317-348-714Se cree que las prácticas sexua­ les oroanales, anogenitales y orogenitales son responsables de la presencia de meningococos en esos sitios.291-317-716

PROFILAXIS MENINGOCÓCICA Y VACUNAS MENINGOCÓCICAS

El riesgo de enfermedad meningocócica secundaria en los contactos cercanos de la casa de un caso primario de meningi­ tis o meningococemia es 500-800 veces mayor que el de la población general.436 Por lo tanto, la norma de la práctica médi­ ca es proveer terapia antimicrobiana quimioprofiláctica para esos contactos lo antes posible después de la exposición. Los casos secundarios de enfermedad meningocócica entre los con­ tactos cercanos de un caso inicial suelen suceder dentro de los 10 días de la exposición. La profilaxis administrada dos sema­ nas o más después de la exposición no es eficaz para evitar los casos secundarios. Durante las décadas de 1940 y 1950, las sul­ fonamidas fueron eficaces para erradicar el estado de portador meningocócico y evitar la enfermedad. Sin embargo, durante los años sesenta se desarrolló la resistencia a las sulfonamidas en las cepas de N. meningitidis. De modo transitorio, altas dosis de penicilina eliminaron los meningococos de la nasofa­ ringe. pero los microorganismos se restablecieron con rapidez al suspender el tratamiento. En la actualidad, se administran dosis orales de rifampicina (adultos, 600 mg cada 12 horas durante 2 días; niños de menos de un mes, 5 mg/kg durante dos días; niños mayores de un mes, 10 mg/kg durante dos días) para erradicar la portación, aunque este fármaco puede fracasar en la erradicación del microorganismo en el 10-20% de los por­ tadores.496 Se ha notado un surgimiento rápido de resistencia a la rifampicina entre los meningococos, incluso durante el tiem­ po en que se administra. Se informó un caso de meningitis meningocócica causada por una cepa resistente a la rifampici­ na en un niño que la había recibido en forma profiláctica en el comienzo de la enfermedad.166 La ciprofloxacina (adultos, 500 mg en una dosis única) y la ofloxacina (400 mg en una sola dosis) también se utilizaron con éxito para erradicar la portación meningocócica nasofaríngea, lo que se confirmó en todos los casos entre las 2 y las 5 semanas.249-256-517 La ceftriaxona, admi­ nistrada como una única dosis intramuscular (niños, 125 mg; adultos, 250 mg) erradicará la portación meningocócica por casi dos semanas.590-600 La azitromicina (500 mg en dosis única) también se ha probado para erradicar el estado de portador meningocócico en adultos.232 La profilaxis debería administrar­ se a los contactos convivientes de la casa y de los centros de atención y a cualquier persona expuesta de modo íntimo a las secreciones orales del paciente. Esto también puede incluir a los individuos que duermen o comen con frecuencia en la misma vivienda con el paciente del caso inicial. Lo último tam­ bién incluye a los miembros del equipo médico que puedan haber realizado reanimación cardiopulmonar o intubación endotraqueal en ese paciente. Los contactos íntimos dentro de poblaciones cerradas, como dormitorios de estudiantes univer­ sitarios, barracas militares, salas de cuidados especiales pro­ longados, también deberían recibir profilaxis. Dado que la virulencia de N. menigitidis está asociada con los polisacáridos capsulares específicos de grupo del microor­ ganismo, ha sido posible la creación de vacunas contra la enfer­ medad meningocócica. Las vacunas de polisacáridos de los grupos A y C univalentes se han desarrollado como una vacu­ na cuatrivalente que incorpora material capsular de los grupos A, C, Y y W135. Estas vacunas pueden producir una respuesta inmunitaria en niños mayores y adultos. Sin embargo, las vacu­ nas por lo general son poco inmunogénicas en los niños meno-

Im portancia clínica de las especies de N eisseria re> de 2 a 3 años e inducen respuestas inmunitarias de corta duración en los niños mayores.262-344-384-498 Además, los títulos ie anticuerpos producidos decaen con bastante rapidez con el ^em po.344 En los niños menores de 12 meses de edad que fue­ ron •acunados con el polisacárido del grupo A, se mantuvo una re-r _esta detectable de anticuerpos sólo durante 12 meses, y en !■:*> niños inmunizados en edades de 12 a 17 meses, los títulos fueron detectables durante dos años. En un estudio reciente realizado en Montana, sólo el 18% de los niños de un año de edad, el 32% de los niños de 2 años y el 50-60% de los niños de 4 y 5 años producían títulos de anticuerpos bactericidas en -eo u esta a la vacuna de polisacárido del serogrupo C.420 Además, las vacunas de polisacárido del grupo C nativo pueien inducir hiposensibilidad (tolerancia) inmunitaria cuando se aplican dos dosis durante los primeros seis meses de vida.262 En La actualidad, se recomienda la vacuna cuatrivalente para indi•:duos de alto riesgo, como los que tienen deficiencias del im p le m e n to o asplenia, los que viajan hacia zonas que son altamente endémicas para enfermedad meningocócica, los reclutas militares y los que viven en áreas que padecen brotes. La vacuna también puede administrarse para controlar los bro:es y para profilaxis de los contactos de la enfermedad y ahora -e utiliza cada vez más en los estudiantes de primer año que viven en los albergues universitarios.136 Los CDC también recomiendan la vacunación para el personal de laboratorio clí­ nico. industrial y de investigación expuestos habitualmente a os meningococos que pueden diseminarse por aerosoles. Con los recientes informes de infecciones por N. meningitidis mortales en trabajadores del laboratorio clínico de un hospital que habí­ an manipulado cultivos de meningococos de pacientes hospita­ lizados, los CDC están considerando recomendar la vacuna­ ción para los trabajadores de laboratorio con exposición ocupacional a N. meningitidis.2114' En algunas instituciones, la vacuna cuatrivalente se ofrece a los empleados de laboratorio en forma voluntaria. A causa del bajo riesgo total para la infec­ ción en los Estados Unidos y del fracaso en proveer inmunidad duradera, no se recomienda su uso en los niños. Con la disponibilidad de vacunas relativamente eficaz contra los serogrupos meningocócicos A, C, Y y W135, y la vacuna conjugada contra H. influenzae tipo b, el serogrupo B de N. meningitidis se ha convertido en la causa principal de meningi­ tis bacteriana en el mundo. Las vacunas de polisacáridos pre­ paradas de las cepas del grupo B son muy poco inmunogénicas, tanto para los niños como para los adultos. Esta falta de antigenicidad es el resultado de la semejanza del material capsular del grupo B con los antígenos encontrados en tejidos cerebra­ les humanos; la cápsula es reconocida como "propia” por el sistema inmunitario, de modo que no hay respuesta inmunita­ ria contra el material capsular del microorganismo del grupo B.231 La respuesta inmunitaria que se produce es transitoria y está compuesta predominantemente por IgM .15 Los esfuerzos para crear vacunas del grupo B se han centrado en los antíge­ nos OMP del microorganismo. Las OMP de los meningococos del grupo B son inmunogénicas tanto en los niños como en los adultos, pero en un estudio doble ciego controlado con placebo se demostró que esta inmunidad es subóptima.241 Para compli­ car los problemas, la inmunidad hacia las OMP del grupo B es específica de tipo más que específica de grupo, por lo tanto, cualquier posible vacuna tendría que incluir las OMP de varios serotipos y subserotipos del grupo B que producen la enferme­ dad. Otra propuesta es modificar la estructura del polisacárido capsular del serogrupo B mediante el reemplazo de los grupos ¿V-acetilo del material de ácido siálico con grupos N- propionilos antes de la conjugación con la proteína. En ese sentido, se

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ha creado una vacuna meningocócica del serogrupo B (NprGBMP-rPorB) que contiene un polisacárido modificado (poli­ sacárido meningocócico del grupo B-ácido siálico N-propionilado [NPr-GMBP]) con a una proteína transportadora de clase 3 recombinante (rPorB) altamente inmunogénica y segura para uso humano.244 Se han desarrollado pocas vacunas contra meningococos del serogrupo B y se han probado en partes del mundo con tasas elevadas de enfermedad endémica y epidémica.6" 443452 En un intento por controlar un brote epidémico del grupo B en gran parte de San Pablo, estado del Brasil, se administró una vacu­ na producida en Cuba a más de 2 millones de niños de 3 meses a 6 años de edad durante 1989 y 1990. Esta vacuna, llamada vacuna cubana BC, está compuesta por OMP del serogrupo purificadas, de peso molecular 65 a 95 kDa, carentes de LOS. El polisacárido del grupo C purificado también fue incluido para proporcionar protección contra los meningococos del grupo C y para ayudar a solubilizar las proteínas del grupo B . Como se informó con las primeras vacunas, la eficacia variaba según la edad a la que se las aplicaba. Entre los niños de 48 meses y mayores, el 74% tenía una respuesta inmunitaria pro­ tectora, mientras que sólo el 37% de los menores de 24 meses tenían una respuesta inmunitaria eficaz con la vacuna. En Noruega, se llevó a cabo un ensayo de eficacia de la vacuna del grupo B usando una vacuna que contenía el polisacárido del grupo B, antígenos proteicos de subserotipo (clase 1) y seroti­ po (clase 3), y antígenos de inmunotipo LOS.67 Los receptores de la vacuna fueron 171 800 personas de 13 a 21 años de edad. La vacuna tuvo sólo el 57,2% de eficacia para evitar la enfer­ medad meningocócica. Para aumentar la inmunogenicidad de los antígenos capsula­ res tipo B y las OMP y los polisacáridos de otros serogrupos meningocócicos, se están investigando y desarrollando vacunas conjugadas.11'15509 Algunas vacunas conjugadas del grupo B no logran inducir una respuesta inmunitaria o inducen anticuerpos bactericidas que no reaccionan con el polisacárido nativo.324-325 Sin embargo, cuando el polisacárido se conjuga con una pro­ teína transportadora mediante un enlace dihidrazida adípico (ADH), se puede detectar una respuesta inmunitaria contra el poliscárido de grupo B, la proteína transportadora, y el epítopo que se crea por el enlace ADH.53 También se han creado y probado vacunas conjugadas contra meningococos de los serogrupos A y C. Estas vacunas contienen el polisacárido conjugado con una proteína, como el toxoide del tétanos o CRM I97.219'532'669 Las vacunas conjugadas contra meningococos del serogrupo C indujeron niveles de anticuerpos bactericidas con títulos dos veces más altos que los obtenidos con el polisa­ cárido nativo, mientras que no se observaron diferencias entre los generados por la vacuna conjugada del grupo A y el polisa­ cárido nativo del grupo A.391 Además, cuando los niños que ya habían sido vacunados con la vacuna conjugada del serogrupo C o con la vacuna de polisacárido nativo del serogrupo C fue­ ron revacunados con la vacuna conjugada del serogrupo C, desarrollaron respuestas de anticuerpo antiserogrupo C signifi­ cativamente más altas los que antes habían recibido la vacuna conjugada.380 Por otra parte, no se observó diferencia en la res­ puesta anamnésica en la revacunación con una vacuna conju­ gada del serogrupo A en niños que habían recibido la vacuna de poliscacárido del grupo A o la vacuna conjugada de polisacári­ do del serogrupo A.497 Un ensayo reciente de una vacuna con­ jugada del grupo C-CRM I97 (mutante de la toxina diftérica) capsular meningocócico en 182 lactantes sanos encontró que la vacuna fue segura, inmunogénica y generadora de memoria inmunitaria cuando se daba junto con otras vacunas para lac­

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C APÍTULO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

tantes de 2, 3 y 4 meses de edad.408 Otra propuesta para el desa­ rrollo de vacunas involucra el uso de otros antígenos que no son parte del complejo de la membrana externa. Por ejemplo, las proteínas de unión a la transferrina meningocócicas T bp-1 y Tbp-2, que se expresan por los meningococos durante el cre­ cimiento in vivo, son inmunogénicas en ratones y los sueros de ocho pacientes convalecientes de enfermedad meningocócica causada por N. meningitidis grupos A, B y C reaccionan inmunitariamente con la proteína purificada Tbp-2 de las dos cepas homologas y con cepas heterólogas representativas.17 Otras especies de Neisseria

Neisseria lactamica es un microorganismo de interés espe­ cial porque puede crecer en un medio selectivo para gonococos y meningococos y debe diferenciarse de ellos. N. lactamica se encuentra con mayor frecuencia en la orofaringe de los niños que en la de los adultos. En un estudio de 2 969 lactantes y niños, Gold y cois, encontraron que la tasa de portadores de N. lactamica aumentaba de 3,8% a los 3 meses de edad hasta una tasa pico del 21% a los 18 meses de edad, seguida de una dis­ minución a 1,8% para las edades de 14 a 17 años.261 Los mis­ mos investigadores también mostraron que la portación de N. lactamica puede estimular la producción de anticuerpos bacte­ ricidas contra N. meningitidis de los grupos A, B y C a causa de la reactividad cruzada antigénica entre ambos microorganis­ mos.261 N. lactamica fue aislada como causa rara de meningitis y sepsis tanto en adultos como en niños; el caso adulto se aso­ ció con una fractura de la lámina cribosa.181,376 Este microorga­ nismo fue asociado con otitis media recurrente y septicemia en un niño de 7 años sometido a terapia inmunosupresora por una leucemia linfocítica aguda.483-580 También se lo ha recuperado del aparato genital femenino en asociación con secreción vagi­ nal persistente.647 Las cepas de N. lactamica resistentes a la penicilina contienen una proteína de unión a la penicilina (PBP 2) alterada que es similar a la PBP 2 encontrada en las cepas de N. meningitidis relativamente resistentes a la penicilina, lo que sugiere que las especies comensales, como N. lactamica (y N. polysaccharea), son las fuentes de los determinantes de resis­ tencia genética que por lo común se encuentran en los menin­ gococos.405-565 Neisseria subflava (biovariedades flava, subflava y perflava), N. mucosa, N. sicca y N. flavescens se han informado con mucha frecuencia como causas poco frecuentes de endocardi­ tis de válvulas nativas y protésicas.22-31,176-293-393-400-602-676 En los casos de endocarditis de válvula nativa, las anormalidades estructurales cardíacas causadas por infecciones pasadas (p. ej., fiebre reumática) o cirugía previa están presentes con frecuen­ cia. En algunos informes, el uso de drogas intravenosas fue un factor de riesgo significativo para endocarditis, porque pueden usarse las secreciones orales para disolver las drogas o limpiar la piel antes de la inyección.176-676 En un caso reciente, se desa­ rrolló endocarditis por N. mucosa en una mujer de 20 años sin historia de enfermedad cardíaca un mes después de haberse perforado la lengua para colocarse un arete.664 Se documentó la formación de abscesos miocárdicos como una complicación de endocarditis por N. mucosa.226 Además de la endocarditis, estos microorganismos normalmente saprofíticos fueron aislados de otras infecciones importantes. N. subflava fue aislada del líqui­ do articular de un niño con artritis séptica, de abscesos de la glándula de Bartolino y como causa de bacteriemia y meningi­ tis primaria en huéspedes inmunodeprimidos.46-180,199,479 En la Illinois University, una cepa de N. subflava subvariedad perflava fue recuperada varias veces de cultivos de orina de un niño

de 10 años con anormalidades estructurales congénitas de la vejiga urinaria.321 Se ha informado peritonitis por N. subflava subvariedad perflava como complicación de la diálisis perito­ neal ambulatoria crónica.692 N. mucosa se ha aislado como causa inusual de meningitis, abscesos pulmonares, infecciones oculares, artritis, bursitis, celulitis crepitante, bacteriemia rela­ cionada con diálisis y peritonitis asociadas con diálisis perito­ neal ambulatoria.4,118,259,307,395,407,628 N. sicca ha sido aislada como causa rara de neumonía, bronquiectasia, meningitis en huéspedes inmunodeprimidos, infección de derivaciones de líquido cefalorraquídeo (LCR), sinusitis, osteomielitis, artritis/bursitis séptica, absceso de la glándula de Bartolino y peri­ tonitis en pacientes mantenidos en diálisis peritoneal prolongacj a _59,i93,25i,2 58,273,281,304,448.473,576^ subflava biovariedad perflava y N. sicca también han sido aisladas de hemocultivos de pacien­ tes con SIDA en estadios terminales.455 Estos microorganismos pueden presentar dilemas terapéuticos porque algunas cepas pueden ser resistentes a la penicilina a causa de la elaboración de enzimas de P-lactamasa o de proteínas de unión a la penici­ lina alteradas. En esos casos, deben identificarse las especies de las cepas aisladas y realizarse pruebas de sensibilidad a los antibióticos. Neisseria cinerea es una especie saprofita de las vías respi­ ratorias altas, de particular interés a causa de su semejanza en las características de cultivo con N. gonorrhoeae, su recupera­ ción ocasional de los sitios genitales y su asociación con los síndromes similares a los causados por gonococos, como oftal­ mía neonatal y proctitis.42,85,91,201,357,361 N. cinerea también ha sido identificada como causa de neumonía hospitalaria en un paciente con SIDA y como causa de linfadenitis.92,157 Se ha documentado bacteriemia por N. cinerea en un niño con neu­ monía y otitis media, en un hombre alcohólico con enfermedad intraabdominal, en un paciente que recibía hemodiálisis y en un varón de 17 años después de una pelea a puñetazos en la que sufrió un trauma facial importante.327,349,610 En este último caso, el microorganismo también se halló en el LCR. N. cinerea tam­ bién ha sido aislada en casos de conjuntivitis purulenta, oftal­ mía neonatal y peritonitis asociada con diálisis peritoneal ambulatoria crónica.40,85,198,253 La “especie” N. gonorrhoeae subespecie kochii (o N. kocchii) ha sido aislada en pacientes con conjuntivitis en zonas rurales de Egipto; no se describieron aislamientos de los Estados Unidos.426 N. polysaccharea se encontró en las vías respiratorias altas de casi el 0,5% de los individuos y no se des­ cribió como parte de un proceso patológico.84,111,538M canis, N. denitrificans, N. iguanae y N. dentiae son cepas animales ais­ ladas de la cavidad bucal y de las vías respiratorias altas de gatos, cobayos, iguanas y vacas, respectivamente.51,608 N. canis se ha aislado en heridas humanas producidas por mordeduras de gatos.279,566 Los miembros baciliformes del género Neissera incluyen tres subespecies de N. elongata (subesp. Elongata, subesp. gly­ colytica y subesp. nitroreducens) y N. vveav’er;,25-26-89,268,299 Hasta 1990, N. elongata sólo incluía dos subespecies: N. elon­ gata subesp. elongata y N. elongata subesp. glycolytica. Estos microorganismos se encuentran normalmente en las vías respi­ ratorias altas humanas. Ninguna de estas subespecies ha estado implicada en infecciones humanas hasta 1995, cuando se aisló N. elongata subesp. glycolytica de muestras de herida de tres pacientes y de hemocultivos de un hombre de 57 años con endocarditis bacteriana subaguda e insuficiencia aórtica.26 En 1996, Nawaz y cois, informaron otro caso de endocarditis cau­ sado por N. elongata subesp. elongata que se complicó por un aneurisma micótico roto de la arterial braquial derecha.470 N.

Im portancia clínica de M oraxella catarrhalis 5 5 7 c-Ion gata subesp. nitroreducens, fue llamada en principio grupo M-6 de los CDC.268 Se demostró que esta bacteria “tipo mora­ xella" está relacionada con las especies de Neisseria en gene­ ral y con las subespecies N. elongata en particular sobre la base de estudios genéticos, composición de ácidos grasos celulares y propiedades fenotípicas. N. elongata subesp. nitroreducens se encuentra normalmente en la orofaringe de los seres huma­ nos y ha sido m encionada como un agente oportunista de baeteriem ia y endocarditis, y como causa de osteomielitis posterior a una cirugía bucal.200,268,295,437,631,721 También se la ha aislado en orina y tejido apendicular.268 N. weaveri, un micro­ organismo baciliforme llamado en un principio grupo M-5 de los CDC, es parte de la flora de las vías respiratorias altas de perros y gatos y puede ser aislado en heridas humanas y hemo­ cultivos asociados con mordeduras de animales.25,116,299 En 2002, N. weaveri fue aislado en lavados bronquiales y esputo de un hom bre de 60 años con bronquiectasias y en una infec­ ción de herida en una niña de 7 años posterior a una mordedu­ ra de tigre.113,492

Importancia clínica de M oraxella catarrhalis Durante los últimos 10 años, el microorganismo en principio llamado “Neisseria catarrhalis”, luego Branhamella catarr­ halis” y ahora M. catarrhalis ha sido objeto de mucha atención como un patógeno humano emergente.213,341 Antes de 1990, se pensaba que M. catarrhalis era parte de la flora normal de las vías respiratorias altas; durante años se mantuvo esta idea en muchos libros de texto y en informes de casos sin ninguna evi­ dencia que la avalara. Estudios realizados por Vaneechoutte y cois, y por Knapp y Hook han mostrado que el microorganis­ mo se encuentra en las vías respiratorias altas en alrededor del 1,5-5,4% de los adultos sanos y que es más común en el apara­ to respiratorio de niños sanos (50,8%) y de adultos de edad avanzada (26.5%).357,686 En un estudio realizado luego en Dinamarca también se encontró que M. catarrhalis no era un miembro importante de la flora nasofaríngea de los adultos y que rara vez estaba presente en los niños menores de un mes de vida.209 Sin embargo, el 36% de los niños de 1 a 48 meses de edad tenían M. catarrhalis como parte de la flora del aparato respiratorio y, en este mismo grupo etario, la prevalencia del microorganismo en niños con infecciones respiratorias era del 68%. Un estudio sobre colonización nasofaríngea con M. catarrhalis durante los primeros dos años de vida mostró que el 66% de 120 niños cultivados en forma seriada se coloniza­ ron durante el primer año de vida y que el 77,5% fueron colo­ nizados cerca del final del segundo año de vida.217 En este estudio también se encontró que, en niños individuales, se adquirían de tres a cuatro cepas diferentes de M. catarrhalis y después se depuraban durante los dos primeros años de vida. Las mayores tasas de colonización se observaron en los niños en edad preescolar con asma (70%) en comparación con los niños sanos (33%).594 En los adultos sanos, la colonización de M. catarrhalis cercana al 4% es indicativa de las bajas tasas de infección observadas en los adultos respecto de los niños.332 Cuando se aísla en adultos con enfermedad respiratoria, es más frecuente encontrar el microorganismo en muestras representa­ tivas de las secreciones de las vías respiratorias bajas que en las muestras con abundante contaminación orofaríngea. Las tasas crecientes de colonización del aparato respiratorio en los adul­ tos están asociadas con bronquitis crónica, bronquiectasias y enfermedad pulmonar obstructiva crónica.461,734 En un grupo de

adultos con enfermedad crónica de las vías aéreas que fueron seguidos por un período mayor de 27 meses, Klingman y cois, hallaron que el 42,9% estaba colonizado con M. catarrhalis y que cada paciente fue colonizado con una a cuatro cepas dife­ rentes, cada una de las cuales persistió alrededor de 2,3 meses.351 Entre los pacientes con bronquitis crónica analizados en Buffalo, Nueva York, las tasas de colonización con M. catarrhalis excedían el 10%.461 El hecho de que el aislamiento de este microorganismo sea más frecuente en el aparato respi­ ratorio de niños y ancianos con enfermedad respiratoria cróni­ ca señala su papel en ciertas infecciones de la infancia y en las infecciones de las vías respiratorias bajas observadas en las personas mayores. Las infecciones de las vías respiratorias y de las áreas anató­ micas adyacentes dan cuenta de la mayoría de las afecciones clínicas que señalan a M. catarrhalis como el agente etiológico. Estas infecciones son otitis media, sinusitis, bronquitis y neumonía.213,341,367,414,688Aunque la otitis media causada por este microorganismo puede contraerse a cualquier edad, la mayoría de los estudios se han centrado en su papel en las infecciones pediátricas. En un estudio realizado por Van Haré y cois.. M. catarrhalis fue el único patógeno bacteriano aislado en el líqui­ do del oído medio de 40 (11%) de 355 niños con otitis media aguda y fue aislado junto a H. influenzae o Streptococcus pneu­ moniae en 21 (6%) de los pacientes.688 Estudios in vitro han mostrado que las cepas de M. catarrhalis presentan mayor adherencia a las células epiteliales nasofaríngeas de los niños propensos a las otitis que a las células de los niños sin esa pro­ pensión.623 Estudios de cultivos seriados de niños propensos a la otitis durante los primeros 2 años de vida demostraron que esos niños tienen tasas de colonización con M. catarrhalis con­ siderablemente mayores que otros niños.217 Además, estudios serológicos indicaron que los niños con otitis media debida a M. catarrhalis producen anticuerpos contra una variedad de antígenos proteicos de M. catarrhalis (p. ej., UspA, TpbB y CopB) y LOS (recuadro 1 1-4) 423 Estos antígenos están siendo investigados para el desarrollo de vacunas, en particular para el grupo etario pediátrico. Los hallazgos bacteriológicos de la oti­ tis media aguda se reflejan en los estudios de sinusitis aguda en los mismos grupos etarios. M. catarrhalis puede ser aislado en los aspirados de senos maxilares recolectados con cuidado en niños con sinusitis aguda en cultivos puros o mixtos en el 216% de los pacientes.414 En los adultos, las sinusitis agudas se asocian con este microorganismo pero con menos frecuencia que en los niños. A pesar de su participación en la otitis media y la sinusitis en los niños, M. catarrhalis es una causa poco común de infecciones de las vías respiratorias bajas adquiridas en la comunidad en este grupo etario.155 En los niños con neu­ monía, M. catarrhalis puede comportarse como un patógeno primario o secundario superpuesto en una infección viral pre­ cedente (p. ej., virus sincitial respiratorio).225 En raras ocasio­ nes, causa traqueítis fulminante y enfermedad de las vías res­ piratorias bajas en niños aparentemente sanos.601,603 Las infecciones respiratorias bajas debidas a M. catarrhalis en adultos ocurren por lo general en ancianos y en paciente inmunodeprimidos, en particular en aquellos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquiectasias, insuficiencia cardíaca congestiva y predisposición a la aspiración.151,428,461 También son factores contribuyentes importantes las anormali­ dades inmunitarias a causa de enfermedades subyacentes (p. ej., diabetes, alcoholismo, infección por HIV, trasplantes).413,595 En los adultos, M. catarrhalis suele asociarse con hallazgos clí­ nicos de bronquitis aguda y la neumonía es menos frecuente.331 Los pacientes con bronquitis tienen mayor producción de espu-

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C A PÍTU LO 11

Recuadro 11-4

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

Factores de v iru len cia y an tíg en o s a so ciad o s con ia viru lencia d e M o raxella catarrh alis

Factores de virulencia y antígenos

Comentarios

Lipooligosacárido

Estudios con anticuerpos m onoclonales han m ostrado que la estructura del LOS de M. catarrhalis está relativamente conservada. Vaneechoutte y cois, analizaron 302 cepas de M. catarrhalis e identificaron tres serotipos LOS, designados A. B, y C, con los anticuerpos m onoclonales dirigidos al LOS.685 Los serotipos A, B y C del LOS dan cuenta del 61,3% , el 28,8% y el 5,3%, res­ pectivamente, de las 302 cepas examinadas. Gu y cois, prepararon una vacuna de LOS conjugado por unión de un LOS de seroti­ po A al toxoide del tétanos o a las OM P de elevado peso m olecular de H. influenzae no tipificable y la probaron en ratones.274 En form a sorprendente, desarrollaron en los ratones anticuerpos que tenían actividad bactericida dependiente del complemento. En teoría, las vacunas conjugadas de LOS preparadas con los tres serotipos LOS deberían provocar respuestas de anticuerpos que podrían tener eficacia en la prevención de infecciones con al menos el 90% de las cepas. Los posibles problem as con las vacunas que contienen com ponentes de LOS son la necesidad de la destoxificación previa del LOS y el desarrollo de un m étodo conjugativo que no altere la antigenicidad del LOS necesaria.

Fim brias (pili)

Se han dem ostrado fimbrias en algunas cepas de M. catarrhalis. Las microfotografías electrónicas de cepas piliadas muestran fibri­ llas superficiales de 20 a 146 nm de longitud.12 Una sonda génica dirigida contra el pili de tipo 4 de M oraxella bovis hibridó con DNA genómico de cuatro cepas de M. catarrhalis, con lo que se refuerza la estrecha relación genética de M. catarrhalis con las otras M oraxellas415 Los pili de clase 4 tam bién se encuentran en Neisseria, Pseudomonas aeruginosa y Vibrio cholerae patóge­ nos. Com o las fimbrias de otros microorganismos, las de M. catarrhalis aparentem ente funcionan com o adhesinas y se ha identi­ ficado un receptor específico de fimbrias glucoesfingolípido en células epiteliales respiratorias.13

Hem oaglutininas

Se cree que las hemoaglutininas producidas por M. catarrhalis contribuyen a la adherencia. La hem oaglutinina m ejor definida es una proteína de 200 kD a que se une al glucolípido globotriaosilceram ida.234 Esta hem oaglutinina es serológicam ente variable y se conoce poco acerca de su antigenicidad o su potencial para producir anticuerpos bactericidas u opsonizantes. Las hem oagluti­ ninas no se encuentran en todas las cepas. Los aislamientos que expresan hem oaglutinina a menudo son de pacientes infectados más que de pacientes colonizados, y existe una relación entre la expresión de la hemoaglutinina y la resistencia a la actividad bactericida del suero humano norm al.460

Proteínas de la m em brana externa Proteínas UspA

Proteína CD

Dos proteínas bacterianas de superficie. U spA l y UspA2, han sido identificadas en M. catarrhalis. En un principio se pensó que estas proteínas eran una proteína sola debido a la presencia de un dom inio conservado en cada una que reaccionaba con el mismo anticuerpo monoclonal y por la com igración en la electroforesis en gel de poliacrilam ida -dodecil sulfato de sodio (SDA-PAGE).432 Los loci U spA l y UspA2 com parten un alto grado de hom ología en la secuencia y codifican proteínas que tie­ nen dom inios conservados o sem iconservados.167 Los dominios N-term inales conservados se reconocen con el m ism o anticuerpo monoclonal, mientras que los dom inios C-term inales diferencian a las dos proteínas y contienen sus regiones funcionales parti­ culares. Las proteínas UspA se encuentran en todas las cepas, aunque sus pesos m oleculares pueden variar de una cepa a otra. U spA l tiene un peso m olecular de casi 88 kDa y es una adhesina, porque los m utantes U psA l no pueden adherirse a las células epiteliales y los anticuerpos anti-U spA l bloquean la adherencia celular.7-432U spA l tam bién se une a la proteína m atriz extracelular del huésped, la fibronectina. La proteína UspA2 influye en la resistencia al suero no inmune, desem peña un papel en la mediación de la adherencia a las mucosas y se une a la proteína vitronectina del huésped, un regulador del sistem a del com ple­ mento. 3 La inm unización de ratones o cobayos con cualquier proteína deriva en la form ación de anticuerpos que son bacterici­ das tanto para las cepas de M. catarrhalis hom ologas como para las heterólogas.432 El suero de hum anos adultos sanos contiene títulos altos de anticuerpos anti-UspA bactericidas, mientras que el de los niños de 6 a 36 meses de edad tienen títulos bajos.147 Estos datos, adem ás de los estudios realizados en anim ales, brindan respaldo para continuar las investigaciones de las proteínas UspA com o antígenos para vacunas de M. catarrhalis.430-431 La proteína CD de M. catarrhalis es una OM P integral de 45 kDa, conservada que funciona com o una proteína p o rin a .^ C D puede actuar como un factor de virulencia por unión específica a las m ucinas óticas y nasales, pero no a las m ucinas salivales.523 Las m ucinas son glucoproteínas com plejas y la unión de esas moléculas a la proteína CD puede facilitar la fijación y el transpor­ te de los m icroorganism os hacia el interior del oído medio m ediante la trom pa de Eustaquio, donde pueden causar otitis media. La inm unización de ratones con proteínas CD recom binantes o purificadas engendra una respuesta fuerte de anticuerpo que deri­ va en la depuración de microorganism os M. catarrhalis hom ólogos y heterólogos del aparato respiratorio en estudio.463 Los mecanismos inm unitarios involucrados en la depuración de microorganism os del aparato respiratorio no se conocen bien porque los anticuerpos anti-CD carecen de actividad bactericida dependiente de com plem ento y no son opsoninas. La depuración de los microorganismos puede ser el resultado de la inhibición de la unión a la m ucina por la proteína CD asociada con la superficie.

Proteínas LpbA y LpbB

LpbA y LpbB son proteínas que se unen a la lactoferrina de pesos moleculares 111 kDa y 99 kDa, respectivamente, que extraen hierro de la lactoferrina cuando los m icroorganism os se desarrollan en condiciones lim itantes en hierro.76 Estas proteínas están relacionadas con las proteínas que unen lactoferrina de especies de Neisseria y están altamente conservadas entre cepas de M. catarrhalis diferentes. A continuación de la infección hum ana, se detectan los anticuerpos contra LpbB, pero no LpbA, lo que sugiere que la LpbA no está expuesta sobre la superficie del m icroorganism o.732 LpbB está siendo caracterizada com o un antíge­ no posible para vacuna.

Proteínas TbpA y TbpB

TbpA y TbpB son proteínas que se unen a la transferrina con pesos moleculares de 105 kDa y 74 kDa, respectivam ente.107-148-732 Com o las proteínas que se unen a la lactoferrina, estas proteínas tienen hom ología con proteínas sim ilares encontradas en neisserias, Haemophilus y otras bacterias. TbpA recom binante o purificada produce anticuerpos bactericidas en animales, pero (Continúa)

A islam iento de especies de N eisseria

Recuadro 11-4

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F actores de virulencia y a n tíg en o s a so c ia d o s co n la virulencia d e M oraxella catarrh alis (cont.)

Factores de virulencia y antígenos

Comentarios sólo contra cepas homologas. Los anticuerpos contra TbpA no se producen a continuación de la infección natural en seres hum a­ nos.732 En los ratones, TbpB ("también llam ada B 1 y protem a 74 K) estim ula la producción de anticuerpos que reaccionan con cepas hom ologas y, con alguna extensión, con cepas heterólogas, como se evidenció por análisis de inm unoprecipitación Western blot.107,148 L a secuenciación de la proteína de TbpB de diferentes cepas se docum entó en secuencias identificatorias que van del 50 al 70%. Las variaciones en la respuesta inm unitaria a las proteínas TbpB de diferentes cepas de M . c a ta rrh a lis :am bién se eviden­ ciaron por diferencias en la actividad bactericida dependiente del com plem ento y en la eficacia de la depuración pulm onar en estudios respiratorios con M . ca ta rrh a lis en ratones.148-464 E n los seres humanos, los anticuerpos contra TbpB reaccionan con cepas hom ologas y heterólogas, pero carecen de actividad bactericida dependiente del com plem ento.

Proteína CopB

La proteína CopB es una OM P integral expuesta a la superficie de 81 kDa que está conservada entre las variedades de M catarrhalis y que está codificada por el gen c o p B J Esta proteína es hom ologa con la proteína FrpB encontrada en las neisserias \ funciona en la adquisición de hierro para el crecim iento y el metabolism o. Estudios con anticuerpos m onoclonales contra diferentes epíto­ pos CopB de distintas cepas de M . c a ta rrh a lis indican que existen al m enos dos serotipos CopB.6 También existen diferencias en las respuestas bactericidas de ratones inmunizados con anticuerpos m onoclonales contra la proteína CopB de diferentes cepas de M. ca ta rrh a lis: 598 Esto es sorprendente dado que los antígenos CopB de diferentes cepas tienen el 97% de hom ología en sus secuencias de aminoácidos. Las diferencias en las respuestas de anticuerpos pueden deberse a la exposición lim itada de epítopos antigénicos claves en la superficie celular.6

Proteína E

La proteína E es una proteína de la m em brana externa de 47 a 50 kD a de función incierta, aunque podría ayudar en el transporte de ácidos grasos hacia el interior de la célula.64 U sando un anticuerpo monoclonal anti-E específico llam ado 1 B3, se han identifica­ do al m enos dos serotipos de proteína E. com o quedó evidenciado por la reactividad de 82% de las cepas con este reactivo. Las proteínas E de cepas de M . c a ta rrh a lis que fallan al reaccionar con 1 B3 todavía tienen el 97% de hom ología en la secuencia con las cepas 1 B3 reactivas, lo que indica que los serotipos de la proteína E están altamente conservados. L a infección con M . c a ta rr­ h a lis conduce a la form ación de anticuerpos anti-E, pero su actividad biológica y su funcionalidad no han sido investigadas.

to purulento y dificultad respiratoria moderada sin fiebre. El compromiso neumónico está anunciado por la aparición de fie­ bre de bajo grado, disnea y producción de cantidades crecien­ tes de esputo purulento. En algunos pacientes se ha observado la progresión hacia la falla respiratoria. Desde el punto de vista radiológico, la enfermedad aparece como infiltrados “en par­ ches” en ambos pulmones, aunque también se ha documentado el compromiso lobular con formación de absceso subpleural o no.208 La epiglotitis causada por M. catarrhalis se ha informa­ do como una complicación de la leucemia mieloide aguda en un hombre diabético de 65 años.693 Se comunicó la baeteriemia por M. catarrhalis como complicación de infecciones respira­ torias. La mayoría de los casos pediátricos de baeteriemia por M. catarrhalis ocurren en forma secundaria a otitis media, si­ nusitis o neumonía en pacientes inmunodeprimidos debido a leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, linfoma, SIDA, hipogammaglobulinemia, anemia drepanocítica, prematuridad y anormalidades neurológicas congénitas.5,312,438,485 En una revisión de 53 casos de bacteriemias por M. catarrha­ lis, la neutropenia o el cáncer estuvieron presentes en el 30,2% de los pacientes y el 24,5% tenía enfermedad respiratoria sub­ yacente.312 Sin embargo, el 28,3% de los casos ocurrieron en individuos inmunocompetentes. La baeteriemia en adultos puede provenir de un foco primario, como sinusitis o neumo­ nía, pero en pacientes inmunodeprimidos, la puerta de entrada puede ser poco clara.485 M. catarrhalis también ha sido aislado en pacientes con endocarditis, meningitis, infecciones oculares, infecciones uro­ genitales, infecciones de heridas, artritis séptica, infecciones respiratorias hospitalarias y peritonitis asociadas con diálisis peritoneal ambulatoria continua.105,163,194,269,406,434,475,531 Se ha informado endocarditis en individuos sanos sin enfermedad valvular anterior, en pacientes inmunodeprimidos con afeccio­ nes subyacentes (p. ej., leucemia, linfoma, estados de deficien­

cia de inmunoglobulinas, SIDA) y posteriores a varios tipos de procedimientos invasivos (p. ej., angioplastia).569,574,620,722 Han ocurrido casos raros de meningitis y ventriculitis por M. cata­ rrhalis luego de procedimientos quirúrgicos que involucran la cabeza y el cuello o de derivaciones ventriculoperitoneales o drenajes ventriculares externos.164,465,556 Viagappan y cois, co­ municaron un caso atípico de absceso cerebral por M. cata­ rrhalis en un varón de 36 años posterior a una lesión orbitaria penetrante con un taco de billar y se describió una meningitis neonatal mortal en un recién nacido de 26 días dos semanas después de sufrir una cirugía abdominal.173,694 Las infecciones conjuntivales causadas por M. catarrhalis se han documentado tanto en el período neonatal como en la infancia tardía. Se han documentado infecciones de explantes esclerales por M. catarrhalis, endoftalmitis secundaria a la cirugía filtrante de glaucoma y celulitis periorbitaria con sepsis.105,396,663 La oftal­ mía neonatal causada por M. catarrhalis proviene de la trans­ misión del microorganismo durante el nacimiento por el tracto genital colonizado de la madre o por las secreciones del apara­ to respiratorio de los cuidadores del niño. El aislamiento de este microorganismo en el aparato genital masculino o femeni­ no es raro, pero en algunos casos se informó como causa de una uretritis similar a la gonorrea.194 La neumonía intrahospitalaria debida a M. catarrhalis puede ocurrir en unidades respiratorias y en unidades pediátricas de cuidados intensivos.163,531

Aislamiento de especies de Neisseria Neisseria gonorrhoeae FROTIS DIRECTOS TEÑIDOS CON GRAM

El diagnóstico de uretritis goncócica en varones adultos suele efectuarse por la observación de diplococos gramnegati-

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C A PÍTU LO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

vos dentro de leucocitos polimorfonucleares o estrechamente asociados con ellos en un frotis de la secreción uretral (véase lámina en color 11-1 A). Cuando se realiza en forma adecuada, la tinción de Gram tiene una sensibilidad del 90-95% y una especificidad del 95-100% para diagnosticar gonorrea genital en varones sintomáticos.350 En las mujeres, la tinción de Gram de muestras endocervicales recolectadas bajo visualización directa del cuello uterino (con un espéculo) también puede ser muy útil para el diagnóstico (véase apartado sobre recolección de la muestra). Los frotis teñidos con Gram de esas muestras tienen una sensibilidad del 50-70%, según la adecuación de la muestra y la población de pacientes. Un frotis endocervical que muestra diplococos intracelulares gramnegativos, en particular de una mujer con otros signos y síntomas de infección gono­ cócica, es muy predictivo.401 Sin embargo, en una mujer asintomática, el valor predictivo de la tinción de Gram es mucho menor. En pacientes con proctitis sintomática, los frotis de muestras recolectadas bajo visualización directa mediante un anoscopio pueden proporcionar un diagnóstico en el 70-80% de las pacientes, al contrario de lo que sucede con los frotis de muestras obtenidas a ciegas, que teñidos con Gram tienen una sensibilidad de sólo el 40-60%.715 Los frotis teñidos con la coloración de Gram no tienen valor en el diagnóstico de infec­ ción gonocócica faríngea. No se debería confiar el diagnóstico de gonorrea en estos frotis y se deben usar junto con pruebas más específicas. Los frotis directos para la tinción de Gram se deben preparar de sitios endocervicales y uretrales y recolectarse con distintos hisopos. Para la preparación del frotis, el hisopo se hace rodar con cuidado sobre la superficie de un portaobjetos en una sola dirección. Esta técnica reduce la deformación y la rotura de los leucocitos polimorfonucleares (PMN) y preserva el aspecto de los microorganismos (lámina en color 11-1A). Los frotis pre­ parados con muestras sometidas a medios de transporte pueden ser más difíciles de interpretar a causa de la deformación de los PMN o a la presencia de sustancias que provocan interferencias (p. ej., carbón). También deben obtenerse frotis de lugares nor­ malmente estériles o muy poco contaminados (p. ej.. líquido articular, lesiones cutáneas).

RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

Del mismo modo que para otros microorganismos patóge­ nos, el éxito del aislamiento depende de la recolección de las muestras apropiadas, lo cual es particularmente importante para la detección de N. gonorrhoeae. Debido a que este micro­ organismo puede causar infección en diversos sitios del cuer­ po, la recolección de las muestras apropiadas para el cultivo y el diagnóstico depende del sexo, de las prácticas sexuales del paciente y del cuadro de presentación clínica. En todos los casos, deben recolectarse muestras de sitios genitales (uretra masculina, endocérvix femenino). Si el paciente tiene antece­ dentes de contactos sexuales anogenitales u urogenitales, tam ­ bién es adecuada la recolección de muestras del conducto anal u orofaríngeas. En los casos sospechosos de infección gonocó­ cica diseminada, se deben obtener muestras de sangre para hemocultivos y muestras de sitios genitales y extragenitales. Los lugares del cuerpo que son apropiados para tomar cultivos se resumen en el cuadro 11-1. Las muestras deben recolectarse con hisopos de dacrón o rayón. El alginato cálcico usado para preparar algunos lotes de hisopos puede ser tóxico para los gonococos.377 Se pueden usar hisopos de algodón; sin embargo, algunas marcas de este mate­ rial contienen ácidos grasos que pueden ser inhibitorios para el

Cuadro 1 1 -1

O b te n c ió n d e m u e s tr a s p a r a c u ltiv o d e N e is s e r ia g o n o rrh o ea e SITIO(S) PRIMA RIO(S)

PACIENTE

SITIO! S) SECUNDARIO! S)

M ujer Varón, heterosexual Varón, heterosexual o bisexual M ujer con infección diseminada

Endocérvix Uretra Uretra, recto, faringe

Recto, uretra, faringe Faringe

Sangre, endocérvix, recto

Varón con infección diseminada

Sangre, uretra

Faringe, lesiones cutáneas*, líquido articular** Faringe, recto, lesio­ nes cutáneas, líqui­ do articular**

* Si está presente. ** Cultivar si hay presencia de artritis.

desarrollo de los gonococos. Por lo tanto, los hisopos de algi­ nato cálcico y algodón deberían utilizarse sólo si las muestras se inoculan directamente en el medio de cultivo o se transpor­ tan en un medio no nutritivo. Algunas formulaciones de medios de transporte contienen carbón para inactivar los materiales tóxicos presentes en el hisopo o en la misma muestra. Los ins­ trumentos usados para ayudar en la recolección apropiada de las muestras (p. ej., espéculo vaginal) deben estar lubricados con agua caliente o solución fisiológica porque varios lubri­ cantes a base de agua y aceite también pueden inhibir el creci­ miento del microorganismo. En el recuadro 11-5 se describen los procedimientos de recolección para el aislamiento de N. gonorrhoeae en diferentes lugares anatómicos. La función que cumple el laboratorio de microbiología clí­ nica en el diagnóstico de las infecciones gonocócicas en niños es crucial e involucra la manipulación adecuada de las muestras recolectadas en forma apropiada y la identificación exacta de los microorganismos aislados.30 153-712 En el caso de mujeres prepúberes, las muestras deben obtenerse de la vagina o la ure­ tra, la orofaringe y el recto e inocularse en medios de cultivo como se describe más adelante. En los niños varones, se deben recolectar muestras con hisopo de la uretra, la orofaringe y el recto e inocularlas en medios de cultivo.

TRANSPORTE DE LA MUESTRA

Aunque la recuperación máxima de los gonococos se obtie­ ne cuando las muestras se cultivan directamente en el medio después de la recolección, esta técnica no siempre es posible o práctica, en particular en clínicas muy ocupadas o salas de emergencia hospitalarias.398 Para estas situaciones, se cuenta con varios sistemas de transporte: S iste m a s d e tr a n sp o r te d e h iso p o s n o n u tr itiv o s. Los medios de transporte semisólidos bufferados de Stuart o de Amies se usan para el transporte de las muestras con hisopos de N. gonorrhoeae. Estos medios están disponibles en la mayo­ ría de las clínicas y los hospitales y no requieren equipamiento ni condiciones de almacenamiento especiales.218 Sin embargo, las muestras enviadas al laboratorio en sistemas de transporte con hisopo deben permanecer a temperatura ambiente y proce­ sarse lo antes posible después de la recolección. En 1997. Perry y cois, realizaron un estudio sobre el aislamiento cuantitativo

A islam iento de especies de N eisseria

Recuadro 1 1-5

561

P roced im ientos de recolección de m uestra para el diag nóstico de infecciones gono cócicas

Muestra

Procedimiento de recolección

Uretra m asculina

La secreción purulenta se puede extraer presionando la parte anterior del pene y recolectando el material con un hisopo. Las muestras de varones asintom áticos se obtienen por inserción de un hisopo nasofaríngeo de alginato cálcico en el interior de la uretra. El hisopo se rota con cuidado para retirarlo.

Endocérvix

Después de que el espéculo está colocado, elim inar algún moco cervical con algodón o gasa. Insertar el hisopo y recoger la m uestra con un movimiento suave. Dar tiempo para que los m icroorganism os se absorban en el hisopo. Tomar cualquier secreción cervical presente.

Recto

Insertar el hisopo 4-5 cm er el conducto anal y m overlo con suavidad de un lado a otro para tom ar la muestra de las criptas anales. Dar algunos segundos para que los m icroorganismos se absorban en el hisopo y rotar despacio mientras se retira. Si se observa una densa contam inación fecal en el hisopo, recoger otra muestra con un hisopo nuevo.

Orofaringe

Con la ayuda de un bajalenguas, hisopar con firm eza las áreas de las amígdalas y la faringe posterior.

Sangre

Después de la punción venosa, inocular la sangre en el medio de cultivo adecuado (caldo tripticasa soja, caldo de Columbia que contenga polianetosulfonato de sodio (SPS). Si se usan los tubos Vacutainer SPS® para la recolección de la m uestra, transtenr la muestra de sangre del tubo al medio de cultivo lo más rápido posible, porque la exposición a altas concentraciones de SPS puede inhibir a los gonococos.

Líquido articular

El líquido articular se puede aspirar con una aguja y jeringa e inocular en un frasco de hemocultivo aerobio.

Lesiones cutáneas

Las muestras de punción biopsia se recogen y se colocan en un recipiente estéril con una pequeña cantidad de caldo o solución fisiológica estéril y se rem iten al laboratorio.

Conjuntiva

La secreción conjuntival se recoge de la cara interna del párpado inferior con un pequeño hisopo nasofaríngeo. Preparar frotis para tinciones de Gram com o se describe en el texto.

de N. gonorrhoeae usando dos sistemas de transporte con hiso­ pos -hisopos Copan® (Copan Diagnostics, Inc., Corona, CA; ahora con la marca BBL CultureSwabs Plus®, BD Biosciences, Sparks, MD) e hisopos Starswab® (Starplex Scientific, Etobicoke, Ontario, C anadá)- que contenían medio de trans­ porte líquido de Stuart.501 En estos sistemas el hisopo está en contacto con una esponja de poliuretano (Copan®) o de celulo­ sa (Starplex®) que se embebe en el medio de Stuart. Estos investigadores hallaron que el aislamiento cuantitativo de N. gonorrhoeae disminuía cerca de un 30% en el sistema Copan® y de un 100% en el sistema Starswab® después de cuatro horas de incubación a temperatura ambiente. Los autores señalaron que los materiales de las esponjas en algunos sistemas de trans­ porte con hisopos pueden contener sustancias (p. ej., azufre, compuestos de amonio cuaternario) que pueden inhibir o dañar a los microorganismos con requerimientos nutricionales espe­ ciales. Aunque estos problemas fueron derivados a los fabri­ cantes de sistemas de transporte a partir de la publicación de estos estudios, la importancia de los dispositivos de recolección confiables para el mantenimiento de la viabilidad del microor­ ganismo tiene implicancias para otros microorganismos y muestras más allá de los recolectados para el aislamiento de N. gonorrhoeae. La naturaleza del medio de transporte también es central para el aislamiento de N. gonorrhoeae y otros microorganis­ mos. Thompson y French evaluaron varios medios de transpor­ te comerciales para el aislamiento de 30 cepas clínicas frescas de N. gonorrhoeae y encontraron que la formulación Amies sin carbón usada en los dispositivos Copan Transystem® (incluidos CultureSwab®, fabricado por Copan para Difeo) fueron supe­ riores y preservaron la viabilidad de 29 de las 30 cepas duran­ te más de 48 horas.651 Los hisopos de transporte BBL Culturette® (BD Biosciences) y Starswab® fueron de calidad

inferior, con declinaciones mayores en la viabilidad del micro­ organismo entre 24 y 48 horas. En otro estudio, tanto los medios de transporte de gel Copan® y Amies® con y sin carbón detectaron el 95% de las cepas de N. gonorrhoeae que se detec­ taron por cultivo directo de la muestra; el medio Copan® con carbón detectó el 98% de las cepas obtenidas por cultivo direc­ to después de haber sido mantenidas en el medio de transporte durante 6 horas.480 Los sistemas de transporte inoculados con muestras que pueden contener N. gonorrhoeae deben mante­ nerse a temperatura ambiente, porque la exposición a tempera­ turas extremas (p. ej., refrigeración) comprometerá el éxito del aislamiento del microorganismo. S iste m a s d e tra n sp o r te en m e d io s d e c u ltiv o . El transpor­ te de muestras en medios de cultivo presenta ciertas ventajas y se comercializan varios sistemas para este propósito. Entre ellos están las placas JEMBEC® (Cámara de ambiente biológi­ co de James E. Martin) que contienen varias fórmulas de medios selectivos, el sistema Gono-Pak® (BD Biosciences) y el sistema Intray GC® (BioMed Diagnostics, Inc.. San José, CA).62 184,417 Mientras JEMBEC y Gono-Pak requieren almace­ namiento refrigerado antes de usarlos, el sistema InTray® per­ mite el almacenamiento del medio a temperatura ambiente durante más de un año. Con estos sistemas, los medios se ino­ culan con la muestra y se colocan en una bolsa plástica imper­ meable con un gránulo de bicarbonato-ácido cítrico. El contac­ to del gránulo con la humedad (mediante la evaporación del medio [JEMBEC] o por la rotura de una ampolla de agua adya­ cente al gránulo [Gono-Pak]) genera un ambiente enriquecido en C 0 2 dentro de la bolsa. La incubación de al menos 18 a 24 horas a 35 °C antes de transportarlo a un laboratorio de refe­ rencia permite el crecimiento inicial de los microorganismos y reducir la pérdida de viabilidad que puede ocurrir con la utili­ zación de hisopos de transporte.

562

CAPÍTULO 11 Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS: INOCULACIÓN E INCUBACIÓN

Se dispone de diversos medios selectivos enriquecidos para el cultivo de N. gonorrhoeae, entre los que se incluyen el medio de Thayer-Martin modificado (MTM), el medio de Martin-Lewis (ML), el medio GC-Lect® (BD Biosciences) y el medio New York City® (NYC). MTM, ML y GC-Lect son medios en base a agar chocolate suplementados con factores de crecimiento para microorganismos con requerimientos nutri­ cionales especiales, mientras que el medio NYC® es una base de agar almidón de maíz-peptona purificado que contiene leva­ dura dializada, plasma equino citratado y eritrocitos de caballo Usados.221Estos medios contienen antibióticos que inhiben el desarrollo de otros microorganismos y permiten el aislamiento selectivo de N. gonorrhoeae, N. meningitidis y N. lactamica (cuadro 11-2). La vancomicina y la colistina, antibióticos pre­ sentes en las cuatro formulaciones, inhiben el desarrollo de bacterias grampositivas y gramnegativas (incluidas las especies saprofitas de Neisseria), respectivamente. El agar GC-Lect (BD Biosciences) también contiene lincomicina. La trimetoprim se agrega para inhibir las especies Proteus presentes en las mues­ tras rectales y, en ocasiones, cervicovaginales. Nistatina, anfotericina B o anisomicina se agregan para inhibir levaduras y hongos filamentosos. Estos medios permiten el aislamiento selectivo de N. gonorrhoeae de sitios del cuerpo que hospedan una gran flora bacteriana endógena. El medio NYC también sustentará el crecimiento de micoplasmas y ureaplasmas geni­ tales. Estos medios se comercializan ya sea en placas de Petri o en placas de JEMBEC. Sus fórmulas están disponibles en las referencias generales de medios de cultivo. Los medios selectivos comerciales varían en su capacidad para sustentar el crecimiento de especies de Neisseria patóge­ nas y para inhibir el crecimiento de neisserias no patógenas y otros contaminantes.730 El fracaso de algunos medios selectivos para sustentar el desarrollo gonocócico también puede deberse a la sensibilidad de algunas cepas de N. gonorrhoeae a la van­ comicina. Estas cepas explican el porcentaje variable de aisla­ mientos que depende del área geográfica.730 Por ese motivo, es prudente inocular muestras genitales femeninas y masculinas tanto en medios selectivos (p. ej., MTM) como no selectivos (agar chocolate). La inoculación en medios no selectivos per­ mite el aislamiento de otros posibles patógenos del aparato genital, como las especies de Haemophilus o Pasteurella bettyae (cap. 9). Los medios de cultivo para el aislamiento de Neisseria deben estar a temperatura ambiente antes de la inoculación y

Cuadro 1 1 -2

A n tib ió tic o s e n lo s m e d io s se le c tiv o s p a r a N e is s e r ia FÓRM ULA DEL M EDIO ((ig/mL)

ANTIBIÓ TICO Vancomicina Lincom icina Colistin Nistatina Anfotericina B A nisom icina Trim etoprim

MTM

mL

NYC

G C-LECT

3

4

2

-

-

-

7,5 12,5

7,5

5,5

2 1 7,5

-

-

-

-

20

-

-

-

5

5

1,2 5

-

1,5 5

no deben estar húmedos o secos en exceso. Si la humedad es excesiva en la tapa de las placas, se coloca la parte de arriba de éstas hacia abajo y se entreabren levemente en una estufa de incubación aireada a 35 °C durante 20 a 30 minutos. El “apilador de placas” (BD Biosciences) tiende a cerrarse si la hume­ dad es excesiva y el crecimiento de los microorganismos se retarda. Las muestras recolectadas en los hisopos se hacen rodar firmemente en forma de “Z ” sobre el medio selectivo y se siembra en estría con un ansa bacteriológica. Si también se inocula en medios no selectivos, estas placas se siembran en estría para el aislamiento. Las placas se incuban en una estufa de C 0 2 o en una jarra de anaerobiosis por extinción con vela a una temperatura de 35 °C a 37 °C. El nivel de CO, de la estufa debe ser 3-7%; concentraciones más altas de C 0 2 pueden inhi­ bir el crecimiento de algunas cepas. Las jarras de anaerobiosis por extinción con vela proveen un nivel de C 0 2 de 3-4%. La atmósfera debe ser húmeda y, para las jarras de anaerobiosis, la humedad de evaporación del medio de cultivo durante la incu­ bación es suficiente para el desarrollo del microorganismo. Las estufas de C 0 2 que no están equipadas con humidificadores pueden mantener la humedad mediante la colocación de un recipiente con agua sobre el estante inferior. Si se usan jarras de anaerobiosis con vela, las velas deben estar fabricadas con cera blanca o cera de abejas; mientras están encendidas y durante la extinción, las velas coloreadas o con esencias libe­ ran productos volátiles que pueden inhibir el desarrollo de microorganismos. Las placas se inspeccionan a las 24, 48 y 72 horas antes de la emisión del informe final “no desarrolla” . Las colonias sospechosas se subcultivan en agar chocolate, se incu­ ban y se usan como inóculo para los procedimientos de identi­ ficación.

Neisseria meningitidis SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

N. meningitidis se clasifica como un microorganismo de nivel 2 de bioseguridad, lo que significa que se debe usar un gabinete de seguridad biológica para la manipulación de las muestras que tienen un riesgo sustancial por la generación de aerosoles (p. ej., pulverización, centrifugación, mezclado con agitadora vorticial). Los informes de infecciones meningocóci­ cas adquiridas en el laboratorio sugieren que la manipulación de los cultivos, más que la de las muestras, aumenta el riesgo de infección para los técnicos y profesionales del laboratorio microbiológico.21141'674 Tales manipulaciones incluyen la pre­ paración de las suspensiones concentradas de microorganismos para la inoculación de los sistemas de identificación y para el seroagrupamiento de los aislamientos meningocócicos median­ te aglutinación en portaobjetos. El uso de un gabinete de segu­ ridad biológica cuando se manipulan cultivos podría garantizar la protección del personal del laboratorio con respecto a los microorganismos aerosolizados. Se están implementando otras medidas de protección alternativa (p. ej., protectores de salpi­ caduras, máscaras). La educación y el cumplimiento de las medidas de seguridad impartidas por el laboratorio deberían reducir al mínimo el riesgo de infecciones meningocócicas pa­ ra el personal del laboratorio de microbiología clínica. También se deben establecer pautas de laboratorio para situaciones que puedan requerir la implementación de medidas de profilaxis para empleados expuestos a meningococos. Los directores de laboratorio también pueden considerar el ofrecimiento de la vacuna meningocócica cuatrivalente al equipo de trabajo, medida que disminuiría pero no eliminaría el riesgo de infec­ ciones meningocócicas.

A islam iento de especies de N eisseria

FROTIS DIRECTOS TEÑIDOS CON GRAM Y PRUEBAS DIRECTAS PARA ANTÍGENOS CAPSULARES

Sobre los frotis teñidos con Gram preparados a partir de muestras clínicas, en particular de LCR, los meningococos aparecen como diplococos gramnegativos tanto fuera como dentro de los leucocitos PMN. Los microorganismos pueden exhibir una considerable variación de tamaño y tienden a resis­ tir la decoloración. Las cepas encapsuladas pueden tener un halo rosado claro alrededor de las células. Como la presencia de células inflamatorias tiene valor pronóstico (p. ej., en el ca­ so de una enfermedad fulminante rápidamente mortal, están presentes muchos microorganismos y unas pocas células infla­ matorias), el informe al médico de la tinción de Gram debe incluir la cuantificación de microorganismos y de PMN. Además de la tinción de Gram y el cultivo de LCR, el labo­ ratorio puede realizar pruebas directas de detección de antíge­ no para los polisacáridos capsulares meningocócicos.371 Las pruebas de antígeno directas usan aglutinación de látex sensi­ bilizado con anticuerpo o coaglutinación para detectar antíge­ nos capsulares de los grupos A, B, C, Y y W135. Estos reacti­ vos se pueden obtener de distintos proveedores (pruebas de látex: Hynson®, Westcott® y Dunning®, Baltimore MD; Murex Diagnostics®, Dartford, Reino Unido; pruebas de coaglutina­ ción: Boule Diagnostics® AB, Huddinge, Suecia). Si bien los resultados positivos de las pruebas con estos reactivos son úti­ les para el diagnóstico temprano, una prueba negativa no des­ carta la meningitis causada por cualquiera de los microorganis­ mos que se encuentran comúnmente. Estas pruebas siempre se deben realizar junto con la tinción de Gram y cultivos en medios de agar enriquecidos. Una modificación reciente de la prueba de aglutinación manual modifica el rendimiento de este ensayo por la presen­ cia de una onda sostenida de ultrasonido. Las partículas de

R e c u a d ro 1 1 -6

563

látex recubiertas de anticuerpos inmersas en la onda se some­ ten a fuerzas físicas cue aumentan el contacto entre partículas y se produce una mejoría de la aglutinación en presencia del antígeno, lo que lleva a un aumento de la sensibilidad de la prueba. La aglutinación de látex mejorada con ultrasonido para la detección de serogrupos meningocócicos A. B. C, Y y W135 ha mostrado una mayor sensibilidad con muestras clínicas sin ninguna pérdida de especificidad.49-270 Este ensayo se ha usado para mejorar la detección de polisacáridos meningocócicos en suero y para cuantificar la concentración de antígeno en sangre. En un estudio realizado por Sobanski y cois, se detectó una concentración de tan solo 0,05 ug/mL de antígeno con el ensa­ yo mejorado con ultrasonido en comparación con 1.98 |ig/mL con el ensayo de aglutinación de látex convencional, lo que representa unas 30 veces de mejoría en la sensibilidad de la prueba.609

RECOLECCIÓN Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA

Las muestras útiles para el diagnóstico de enfermedad meningocócica son LCR, sangre, muestras de biopsia y mate­ rial de aspiración, e hisopados nasofaríngeos y orofaríngeos. A veces se solicita la detección de meningococos en esputo y aspirados transtraqueales. Los procedimientos de recolección y procesamiento de las muestras a los que puede someterse N. meningitidis se presentan en el recuadro 11-6. Los aislamien­ tos genital, rectal y orofaríngeo de N. meningitidis se pueden obtener usando los procedimientos de recolección e inocula­ ción descritos para N. gonorrhoeae en el recuadro 11-5. Las condiciones de incubación para el medio inoculado con las muestras son las mismas que las ya detalladas para N. gonorr­ hoeae. Los meningococos crecen bien en todos los medios selectivos para las neisserias patógenas, y no se describieron

P roced im ientos de recolección d e m uestra para el aislam ien to de Neisseria meningitidis

Muestra

Procedimiento de recolección

LCR

En los casos de m eningitis m eningocócica sospechosa, se debe enviar al laboratorio tanto LCR com o sea posible (como m ínim o 1 mL I para cultivar, porque pueden estar presente escasos microorganism os. La muestra de LCR se debe transportar m anualmente al labora­ torio después de su recolección y no debe refrigerarse. Una alícuota del LCR debe centrifugarse para la tinción de Gram. Si hay canti­ dad suficiente de LCR, la muestra debe centrifugarse y el “botón” aglutinado debe ser inoculado en agar sangre y agar chocolate.

Sangre

La sangre debe cultivarse com o se describió en el recuadro 11-5. Se prefiere la inoculación directa de la sangre en los frascos de hem o­ cultivo más que en los tubos SPS Vacutainer® debido a los reconocidos efectos inhibitorios del SPS sobre los meningococos. Esta inhibición puede superarse por el agregado de gelatina estéril al 1% (volumen final) al m edio del hemocultivo. El uso del sistema Isolator® para hemocultivos evita el problem a de la inhibición del SPS.

Petequias

Las m uestras de lesiones cutáneas petequiales pueden recolectarse por inyección y aspiración de pequeñas cantidades de solución salina estéril en el borde de la lesión, usando una jeringa de tuberculina. Los aspirados se cultivan directamente en agar sangre y agar choco­ late. Debido a que algunas lesiones son el resultado del fenóm eno inmunitario, el cultivo de lesiones cutáneas puede no contribuir para el diagnóstico.

Hisopados nasofaríngeos

Los hisopados nasofaríngeos son importantes, en particular, para detectar colonización de individuos que son contactos cercanos a los casos de infección m eningocócica y para el reconocim iento de portadores. Para estas muestras, se pasa un hisopo fino en un hilo de m etal flexible (p. ej., un hisopo nasofaríngeo de alginato de calcio) a través de la orofaringe y detrás de la úvula. Por lo general, los hisopados de fauces recolectados con cuidado proveerán la m ism a información. Estas m uestras se inoculan en un m edio selectivo, com o MTM.

Biopsias

Las m uestras de biopsia deben enviarse al laboratorio en recipientes estériles. Deben hum edecerse con solución salina o caldo estériles y no se deben refrigerar. En el laboratorio, las m uestras deben ser sem bradas aparte y cultivadas en agar sangre y agar chocolate.

A spirados

Los aspirados de espacios cerrados se recolectan con aguja y jeringa. En el laboratorio, estas muestras se inoculan en agar sangre y agar chocolate.

564

C A PÍTU LO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

cepas sensibles a la vancomicina. Contrariamente a las creen­ cias sostenidas durante mucho tiempo, la mayoría de las cepas de N. gonorrhoeae crecerán en agar sangre de carnero comer­ cial, aunque no tan bien como en agar chocolate. El aislamien­ to de gonococos y meningococos en los hemocultivos puede estar afectado de modo adverso por el anticoagulante poliane­ tolsulfonato de sodio (SPS) presente en los medios de hemocultivo. Este efecto se puede neutralizar por el agregado de gelatina estéril (1% de concentración final) al medio o por el procesamiento de la muestra de sangre mediante lisis por cen­ trifugación (Isolator®).212’487,593

AISLAMIENTO E INCUBACIÓN

Para el aislamiento de N. meningitidis, las muestras de LCR deben cultivarse en agar chocolate no selectivo y en agar san­ gre de camero como se describe en el recuadro 11-6, mientras que las muestras que pueden contener otros microorganismos (p. ej., muestras de hisopados orofaríngeo y nasofaríngeo) deben inocularse en medios selectivos (p. ej.. agar MTM, Martin-Lewis, NYC o GC Lect) y en medios no selectivos. Las placas se incuban en 5-7% de CO, a 35 °C (estufa de C 0 2 o jarra de anaerobiosis por extinción con vela) y se inspeccionan después de 24, 48 y 72 horas antes de emitir un informe final que indique “no desarrolla”. Las colonias sospechosas se subcultivan en agar sangre y agar chocolate para la identificación posterior.

Identificación de especies de Neisseria Morfología de las colonias

Los gonococos producen varios tipos de colonias en los cul­ tivos. En el esquema de Kellogg, estos tipos se denominan des­ de T l hasta T5 y se describen en función del tamaño de la co­ lonia y de otras características (coloración, topografía de las colonias, reflexión de la luz, etc.).345 A nivel celular individual, los microorganismos que constan de colonias tipo P+ y P++ (antes T l y T2. respectivamente) tienen pili sobre la superficie celular, mientras que las células de las colonias tipo P+ (T3, T4 y T5) carecen ellos. Los aislamientos obtenidos de cultivos pri­ marios son en su mayoría colonias del tipo P+ y P++. Estas colo­ nias tienden a ser pequeñas, brillantes y elevadas (lámina en color 11-1C). Se puede mantener el cultivo con este tipo colo­ nial subcultivando colonias con pili. Las suspensiones de microorganismos preparadas a partir de cultivos de 18-24 horas que contienen en principio colonias del tipo P+ y P++ tienden a ser uniformes y homogéneas. Con subcultivos en medios no selectivos (un “barrido” de desarrollo), los otros tipos de colo­ nias se harán más evidentes, con todas las colonias por último convertidas en variedades sin pili. Estos tipos de colonias son más grandes, más aplanadas y no tienen el brillo característico de las colonias con pili. Los cultivos en los que predominan los tipos de colonias grandes con frecuencia no forman suspensio­ nes uniformes, porque las colonias se vuelven gomosas debido a la autólisis y la liberación de DNA celular. La presencia de todos los tipos de colonias en un subcultivo de una placa pri­ maria a menudo puede dar la apariencia de un cultivo mixto. La observación cuidadosa y el subcultivo con el uso de un micros­ copio de disección (lOx) permiten familiarizarse con este tipo de colonias (lámina en color 11 -ID). La variación en el tipo de colonia se observa con aislamientos frescos de N. gonorrhoeae. Los gonococos atípicos (aquellos con requerimientos nutricio­

nales múltiples, como las cepas que requieren AHU) también producen varios tipos de colonias, pero éstas crecen más lenta­ mente y requieren la observación con un microscopio de disec­ ción para la detección y caracterización del tipo de colonia.453 Otro sistema descriptivo considera las características de opa­ cidad de las colonias de los gonococos determinadas por exa­ men del desarrollo en un medio transparente mediante amplifi­ cación e iluminación desde la parte inferior del microscopio. Las colonias opacas, sin tener en cuenta la forma, se denomi­ nan 0 + y 0 + + , mientras que las transparentes se llaman 0 +. Los tipos T de colonias descritos por Kellogg y cois.345 pueden reconocerse en cultivos habituales en agar chocolate o MTM; sin embargo, el medio transparente apropiado para determinar la opacidad característica de las colonias no siempre es acce­ sible. Los meningococos crecen bien tanto en agar sangre como en agar chocolate, así como en medios selectivos para las Neisserias patógenas (lámina en color 11-1F). Las cepas cap­ suladas de N. meningitidis pueden aparecer mucosas en agar. La mayoría de los aislamientos meningocócicos son grisáceos y pueden mostrar una reacción verdosa difusa en áreas de cre­ cimiento confluente. Algunos pueden tener una pigmentación levemente amarillenta. La variación en los tipos de colonias puede observarse con algunos aislamientos frescos. Tinción de Gram y prueba de la oxidasa

Las placas primarias para el aislamiento de N. gonorrhoeae debe examinarse después de 24, 48 y 72 horas de incubación usando una lupa o. de preferencia, un microscopio de disec­ ción. Los frotis de colonias sospechosas deben examinarse con la tinción de Gram y debe realizarse la prueba de la oxidasa. En la tinción de Gram de la colonia deben verse diplococos gramnegativos característicos, uniformes. Algunos de los microorganismos pueden aparecer como tétradas, en particular en los frotis de colonias jóvenes. Los microorganismos en los frotis de cultivos viejos pueden parecer hinchados y mostrar una amplia variación en la intensidad de la contratinción. Los frotis de colonias parcialmente autolisadas pueden presentar dificultades de interpretación. El examen de la tinción de Gram es esencial para la identificación presuntiva porque en los medios selectivos también pueden crecer otros microorga­ nismos, en particular de las muestras orofaríngeas (tratadas más adelante). Los resultados de las pruebas de la oxidasa se obtienen con el derivado tetrametilo del reactivo de oxidasa (N,N,N,N-tetrametil-1,4-fenilendiamina al 1% en solución acuosa). Esta solu­ ción se coloca sobre un trozo de papel de filtro y una porción del desarrollo de la colonia se frota en el reactivo con un ansa de platino, un hisopo de algodón o un palillo aplicador de madera. En cultivos jóvenes aparecerá un color violeta oscuro dentro de los 10 segundos. Se obtienen excelentes resultados con los reactivos de oxidasa envasados en ampollas de vidrio rompibles (p. ej.. BACTIDROP® Oxidase, Remel Laboratories). Prueba de Superoxol®

El Superoxol®, otra prueba útil para la identificación presun­ tiva rápida de N. gonorrhoeae,561 es peróxido de hidrógeno al 30% (no la solución al 3% usada para la prueba de la catalasa). Las cepas de N. gonorrhoeae producen de inmediato un burbu­ jeo efervescente cuando algo del material de la colonia se emulsiona con el reactivo sobre un portaobjetos de vidrio. Tanto N. meningitidis como N. lactamica, la otra especie que

Identificación de especies de N eisseria

565

crece en medios selectivos, producen burbujeo demorado y débil. En un estudio que usa esta prueba en microorganismos aislados en medios selectivos, 201 gonococos probados produ­ cían de inmediato un burbujeo vigoroso en Superoxol, mientras que 241 de 242 meningococos y una de dos cepas de N. lacta­ mica producían reacciones positivas débiles, demoradas o negativas.567

dades enzimáticas específicas) o la prueba de confirmación del cultivo con sondas de DNA (véase más adelante). Ésta es extre­ madamente importante debido a ciertas consecuencias medicolegales y sociales que ocurren tras la publicación de los resul­ tados.

Diferenciación de otros microorganismos en medios selectivos

Las pruebas confirmatorias para gonococos, meningococos y otras especies de Neisseria incluyen las pruebas de utiliza­ ción de hidratos de carbono, las pruebas cromogénicas de enzi­ ma sustrato, las pruebas inmunológicas (p. ej.. anticuerpos fluorescentes, coaglutinación estafilocócica y otras), sistemas de identificación multiprueba y pruebas con sondas de DNA. Las pruebas de utilización de hidratos de carbono y los siste­ mas de identificación multiprueba se pueden usar para identifi­ car N. gonorrhoeae, N. meningitidis y otras especies de Neisseria. Los procedimientos de identificación con sustratos cromogénicos se limitan a identificar aislamientos que crecen en medios selectivos (N. gonorrhoeae, N. meningitidis. N. lac­ tamica y algunas cepas de M. catarrhalis). Los anticuerpos fluorescentes, la coaglutinación, otras pruebas inmunológicas y la prueba de confirmación de cultivo con sondas de DNA son accesibles sólo para la identificación de N. gonorrhoeae. Los procedimientos más nuevos de amplificación de ácidos nuclei­ cos e hibridación de ácidos nucleicos están aprobados sólo para la detección directa de N. gonorrhoeae del aparato genital y de muestras de orina.

Tanto la identificación presuntiva como la confirmatoria de las especies de Neisseria dependen de la capacidad de diferen­ ciar estos microorganismos de otros que también pueden crecer en medios selectivos. Estos son Kingella denitrificans, especies de M oraxella (además de M. catarrhalis), especies de Acinetobacter y especies de Capnocytophaga. K. denitrificans crece bien en el medio MTM y produce tipos de colonias que se asemejan a las de N. gonorrhoeae.298 Una prueba útil para identificar en forma presuntiva los gonococos y diferenciarlos de K. denitrificans es la p ru e b a de la catalasa. Los gonococos producen un burbujeo vigoroso cuando el desarrollo de la placa se sumerge en una solución de peróxido de hidrógeno al 3% (H ,0 2): K. denitrificans produce una reacción catalasa negati­ va. M. catarrhalis y otras especies de Moraxella, como los gonococos, son oxidasa positivas y catalasa positivas. Estos microorganismos pueden diferenciarse de Neisseria por la p ru eb a del disco de penicilina.123 El microorganismo se subcultiva en una placa de agar sangre tripticasa soja y se siembra para obtener un desarrollo confluente. Luego se coloca un disco de sensibilidad de penicilina (10 unidades) sobre el ino­ culo. Después de una incubación de toda la noche en CO„ se prepara una tinción de Gram a partir del desarrollo en el borde de la zona de inhibición. Las especies de Neisseria y M. catarr­ halis retendrán su morfología de diplococos, aunque las célu­ las pueden aparecer hinchadas. Las especies de Moraxella cocobacilares formarán filamentos largos o células en forma de huso bajo la influencia de las concentraciones subinhibitorias de la penicilina. Las especies de Acinetobacter pueden diferen­ ciarse por su reacción oxidasa negativa. Las especies de Capnocytophaga aparecen como bacterias fusiformes, leve­ mente curvadas, gramnegativas, con tinción pálida, y tanto la reacción de la oxidasa como la de la catalasa son negativas. Durante la incubación prolongada (mayor de 48 horas) estos microorganismos tienden a diseminarse debido a su movilidad deslizante y pueden impedir la recuperación de los gonococos de muestras orofaríngeas. Criterios presuntivos para la identificación de N. gonorrhoeae

Todos los diplococos gramnegativos y oxidasa positivos que se aíslan en sitios urogenitales y que crecen en medios selecti­ vos pueden ser identificados como N. gonorrhoeae. El Superoxol, descrito antes, proporciona una prueba presuntiva adicional para identificar estos microorganismos. Sin embargo, las pruebas de identificación confirmatoria se recomiendan para todas las cepas y son necesarias para la identificación de los aislamientos de sitios extragenitales (faringe, recto, sangre, líquido articular, LCR). Además, los gonococos sospechosos aislados en niños deben confirmarse por al menos dos métodos diferentes que involucren principios distintos.20-712 Éstos pue­ den incluir las pruebas de utilización de hidratos de carbono, métodos inmunológicos (p. ej., pruebas de fluorescencia con anticuerpos monoclonales; pruebas de coaglutinación), proce­ dimientos enzimáticos (p. ej„ detección cromogénica de activi­

Pruebas de identificación para especies de Neisseria

Pruebas de utilización de hidratos de carbono MEDIO CTA CONVENCIONAL CON HIDRATOS DE CARBONO

La técnica convencional para la identificación de especies de Neisseria usa un medio semisólido de agar base cisti na-tripticasa (CTA) que contiene 1% de hidratos de carbono y un indi­ cador de pH rojo de fenol (lámina en color 11-1E). La serie de pruebas más común incluye CTA-glucosa, -maltosa-sacarosa y -lactosa, más un control CTA sin hidratos de carbono. El aná­ logo estructural de la lactosa, o-nitrofenil-|3-D-galactopiranósido (ONPG), puede ser sustituido por el tubo de lactosa y el agregado de fructosa a la serie de pruebas es útil para la iden­ tificación de varias biovariedades de N. subflava. Algunas for­ mulaciones comerciales de CTA pueden ser suplementadas con líquido ascítico para sustentar el desarrollo de microorganis­ mos con requerimientos nutricionales especiales. Los medios CTA se inoculan con una suspensión densa de los microorga­ nismos para ser identificados a partir de un cultivo puro de 18 a 24 horas en agar chocolate. El inoculo se prepara en 0.5 mL de solución fisiológica y se divide entre los tubos o cada tubo se inocula en forma individual con una ansa del microorganis­ mo. El inoculo está limitado a los 1,25 cm superiores de los tubos profundos de agar. Los tubos se colocan en una estufa sin CO, a 35 °C con las tapas bien apretadas. Con un inoculo car­ gado, la mayoría de los aislamientos producen un cambio de color detectable en el indicador rojo de fenol dentro de las 24 horas. Si el inoculo está suficientemente cargado, muchas cepas cambiarán el indicador dentro de las 4 horas. Sin embar­ go, algunas cepas gonocócicas con requerimientos nutriciona­ les especiales pueden necesitar 24 a 72 horas para producir ácido suficiente para cambiar el indicador. Como el medio CTA que contiene 1% de hidratos de carbono se usa en princi­ pio para la detección de ácido producido por microorganismos fermentadores, la escasa cantidad de ácido producido en forma oxidativa por algunas cepas de especies de Neisseria no puede detectarse.

566

C A PÍTU LO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

PRUEBA RÁPIDA DE UTILIZACIÓN DE HIDRATOS DE CARBONO

Esta prueba es un método dependiente de la falta de creci­ miento para detectar la producción de ácido a partir de los hidratos de carbono. En este método, se fraccionan pequeños volúmenes de una solución salina equilibrada (BSS; pH 7,0) con indicador rojo de fenol en tubos no estériles a los cuales se les agrega unas gotas de una solución de hidratos de carbono al 20% esterilizada y filtrada (lámina en color 11-1G). Se prepa­ ra una suspensión densa del microorganismo en BSS con un ansa bacteriológica; esta suspensión puede mezclarse en un agi­ tador vorticial para dispersar las aglutinaciones. Se agrega una gota de suspensión a cada tubo que contiene hidratos de carbo­ no. Los tubos se incuban durante 4 horas a 35 °C en una estufa sin C 0 2 o en un baño de agua. Este método es muy económi­ co, los reactivos son fáciles de preparar e inocular, y los resul­ tados son bien definidos. Los detalles de este método se pre­ sentan en el protocolo 11 -1. La clave de esta técnica es el uso de hidratos de carbono de “grado reactivo”. La maltosa produ­ ce resultados positivos o ambiguos para N. gonorrhoeae en la prueba de degradación rápida de hidratos de carbono, debido tal vez a la presencia de glucosa contaminante. Los inóculos para este procedimiento pueden obtenerse del cultivo primario si hay suficientes colonias y si el desarrollo tiene un tiempo menor de 24 horas. Como el crecimiento bacteriano no sucede en el medioambiente de prueba, los escasos contaminantes que pueden estar presentes no interfieren en los resultados. Sin embargo, la incubación no puede continuarse durante toda la noche.

PRUEBA RM-NEISSERIA® (MÉTODO RÁPIDO DE IDENTIFICACIÓN DE NEISSERIA)

En el sistema de este equipo (Remel Laboratories), se agre­ gan pequeñas cantidades (dos a tres gotas) de soluciones de hidratos de carbono (glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa) y rojo fenol al 2% bufferadas y un buffer control sin hidratos de car­ bono a cinco microtubos bufferados no estériles incluidos en el equipo. Los inóculos de un cultivo puro de 18 a 24 horas de diplococos gramnegativos, oxidasa positivos, que se desarro­ llaron en un medio selectivo o de un subcultivo en agar choco­ late, se disponen en cada uno de los tubos con pequeñas ansas plásticas provistas en el equipo. Después de la inoculación, los tubos se colocan en un agitador vorticial durante 10 segundos y se incuban al aire a 35 °C durante una hora. La producción de ácido se indica por un cambio en el indicador rojo de fenol de rojo rosado a amarillo o amarillo naranja. En las reacciones negativas de los hidratos de carbono permanece el color rojo rosado o se vuelve levemente rosa anaranjado. En una evalua­ ción de este sistema realizada en la University of Illinois, el sis­ tema RIM-Neisseria identificaba el 98% de 176 N. gonorrhoe­ ae, el 99% de 173 N. meningitidis, el 94% de 48 N. lactamica, y el 100% de 12 M. catarrhalis dentro de los 60 minutos.322 De los microorganismos identificados correctamente después de una hora, 94% de los gonococos, 99% de los meningococos y 84% de las cepas de N. lactamica fueron identificados dentro de los primeros 30 minutos. Otros investigadores también in­ formaron una buena concordancia de la prueba R\M -Neisseria con los métodos convencionales.188 197-254374-543 También se co­ mercializa una prueba similar de DNasa inoculada para la con­ firmación de M. catarrhalis. OTROS MÉTODOS DE UTILIZACIÓN DE HIDRATOS DE CARBONO

El equipo de la prueba Neisseria-Kwik® (Micro-Biologics, St Cloud MN) y el Gonobio-Test® (I.A.F. Production. Inc.,

Laval, Québec, Canadá) también son modificaciones comer­ ciales del procedimiento de la prueba rápida de hidratos de car­ bono. El Neisseria-Kwik® usa una cubeta que contiene hidra­ tos de carbono deshidratados en pocilios separados. Se inocula cada pocilio con una suspensión cargada del microorganismo preparada en buffer y los resultados se leen después de 3 a 4 horas registrando cambios en el color de los indicadores. El Gonobio-Test es un método de 2 horas que requiere una inocu­ lación cargada en los microtubos que contienen como sustratos los hidratos de carbono. Estos dos sistemas fueron evaluados y comparados con los métodos convencionales.188 Pruebas cromogánicas de enzima sustrato

Los sistemas de identificación enzimáticos usan sustratos bioquímicos específicos que, después de la hidrólisis por enzi­ mas bacterianas, producen un producto final coloreado que se detecta directamente (p. ej., amarillo de nitrofenol o producto de nitroanilina) o después de la adición de un diazorreactivo acoplador de color (reactivo cinamaldehído para la detección de (3-naftilamida). El uso de estos sistemas está limitado a especies capaces de crecer en medios selectivos: N. gonorrho­ eae, N. meningitidis y N. lactamica. Como algunas cepas de N. catarrhalis se desarrollan en medios selectivos, estos sistemas también proveerán una identificación presuntiva de este microorganismo. Las pruebas de identificación con sustratos cromogénicos no deben usarse para identificar meningococos sospechosos que crecen en agar sangre o agar chocolate sin antes subcultivarlos en medios selectivos. Las actividades enzimáticas que se detectan en estos sistemas son [3-galactosidasa, y-glutamil aminopeptidasa y prolil-hidroxiprolil aminopeptida­ sa (cuadro 11-3). P-galactosidasa y y-glutamil aminopeptidasa son específicas para N. lactamica y N. meningitidis, respecti­ vamente. En ocasiones, las cepas de N. meningitidis carecen de actividad y-glutamil aminopeptidasa; en 2002, se encontró una cepa meningocócica aislada de un portador que carece de esta enzima a causa de la presencia de una mutación de inserción en el gen ggt.m La ausencia de estas actividades y la presencia de prolil-hidroxiprolil aminopeptidasa identifican un microorga­ nismo como N. gonorrhoeae. M. catarrhalis carece de las tres actividades enzimáticas. Los sistemas comerciales que usan este enfoque son el Gonochek II®, el BactiCard Neisseria® y el Neisstrip®.

GONOCHEK II®

El Gonochek II (EY Laboratorios, San Mateo, CA) es un único tubo que contiene tres sustratos cromogénicos deshidra­ tados (lámina en color 11-1H). Después de la rehidratación con gotas de solución salina buffer-fosfato (pH 7,4), se emulsionan en el tubo con un palillo aplicador de madera 5 a 10 colonias de diplococos gramnegativos, oxidasa positivos de un cultivo puro que se desarrolla en un medio selectivo o de un subculti­ vo disponible. Se tapa el tubo y se incuba a 35 °C durante 30 minutos. Las reacciones de color específicas en la suspensión bacteriana confirman el aislamiento como N. meningitidis (hidrólisis de y-glutamil-p-nitroanilida; amarillo) o N. lactami­ ca (hidrólisis de 5-bromo-4-cloro-3-indoil-(3-D-galactopiranósido; azul). Si la suspensión es incolora al final del período de incubación, el tapón se separa y su parte superior se inserta en el tubo. El tubo se invierte de modo que la suspensión bacte­ riana se ponga en contacto con el diazorreactivo acoplador de color (sal de o-aminoazotolueno diazonio [Fast Gamet®] pre­ sente en el tapón. La detección de (3-naftilamina liberada por la

Identificación de especies de N eisseria

C uadro 1 1 -3

A c tiv id a d e s e n z im á tic a s u sa d a s p a r a la id e n tific a c ió n d e e s p e c ie s d e

Neisseria

p a tó g e n a s

P-GALACTOSIDASAS

(y-GLUTAMIL AM INO PEPTIDASA

N. lactamica

+

_

+

N. meningitidis

-

+

V

-

N. gonorrhoeae

-

-

+

M. catarrhalis

-

-

-

+

ESPECIES

+: reacción positiva;

5 67

HIDROXIPROLIL AM INOPEPTIDASA

BUTIRATO ESTEARASA

reacción negativa; V: reacción variable.

actividad hidroxipropil aminopeptidasa bacteriana (rojo) iden­ tifica el microorganismo aislado como N. gonorrhoeae. La ausencia de un producto de color cuando se completa la prue­ ba y los pasos de lectura provee una identificación presuntiva de M. catarrhalis. En una gran evaluación de este sistema, el Gonochek II identificó el 99% de 176 gonococos, el 97% de 173 meningococos y el 100% de 48 N. lactamica y 10 M. catarrhalis, respectivamente.322 Otros investigadores han eva­ luado también el Gonochek II y lo han encontrado confiable para la identificación de estos microorganismos.188-707

tamica y el 98,4% de 125 cepas de M. catarrhalis.'- Un tercer producto, Neisstrip® (Lab M Ltd., Bury, Reino Unido i es muy similar a BactiCard Neisseria, pero no tiene el reactivo indoxil butirato para identificar M. catarrhalis. Dealler y cois, infor­ maron que el Neisstrip identificó 93 de 95 cepas gonocócicas y 2 de 400 cepas no gonocócicas fueron mal identificadas con esta tira.178

BACTICARD NEISSERIA1'

Métodos ¡nmunológicos para la confirmación del cultivo de N. gonorrhoeae INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES

El BactiCard Neisseria® (Remel Laboratorios, Lenexa KA) usa cuatro sustratos cromogénicos que están impregnados en cuatro círculos de pruebas individuales dentro de una tarjeta de cartón (lámina en color 11-2A). Después de humectar cada uno de los cuatro círculos con una única gota de líquido de rehidratación, se frotan varias colonias de los microorganismos toma­ das de medios selectivos (o de un subcultivo de medios selec­ tivos) en cada una de las cuatro áreas de la prueba. Luego de 2 minutos de incubación sobre la mesada, se inspecciona el cír­ culo del sustrato de indoxil butirato estearasa (IB; 5-bromo-4cloro-3-indolil butirato) para observar la aparición de un color azul a azul verdoso. Si la prueba es positiva, el microorganis­ mo puede ser identificado como M. catarrhalis y no es necesa­ ria otra prueba. Si la prueba IB es negativa, la tarjeta se incuba en la mesada durante unos 13 minutos más (tiempo total de la prueba, 15 minutos). Pasado ese tiempo, se inspecciona el cír­ culo del sustrato de (3-galactosidasa (BGAL; 5-bromo-4-cloro3 - i n(Io 1i1- p-1)-ga 1ac topi ranós ido ) para observar la presencia de color azul verdoso. Si la prueba es positiva, el microorganismo puede identificarse como N. lactamica y no se necesitan prue­ bas adicionales. Si la prueba BGAL es negativa, se coloca una sola gota del reactivo que desarrolla color sobre los círculos de las pruebas del prolilaminopeptidasa (PRO; L-prolina-P-naftilamida) y de y-glutamil aminopeptidasa (GLUT; y-glutamil-Pnaftilamida). Estas dos pruebas son rojas cuando son positivas si aparece un color rosa o rojo definido dentro de los 30 segun­ dos del agregado del reactivo. Una reacción PRO positiva iden­ tifica al microorganismo aislado como N. gonorrhoeae. mien­ tras que una reacción GLUT positiva la identifica como N. meningitidis. La reacción PRO también puede ser positiva para algunas cepas de N. meningitidis. En la University of Illinois, la prueba BactiCard Neisseria se comparó con los procedi­ mientos de identificación convencionales para 558 aislamien­ tos. BactiCard Neisseria identificó el 100% de 254 N. gonorr­ hoeae. el 100% de 125 N. meningitidis, el 98,2% de 54 N. lac­

Por lo general, el procedimiento de confirmación de cultivos con inmunofluorescencia directa (IFD) usa anticuerpos mono­ clonales que reconocen epítopos en la proteína de la membra­ na externa PorA (la antigua proteína I), la principal proteína de la membrana externa de N. gonorrhoeae.™ La prueba de IFD (Neisseria gonorrhoeae Culture Confiramation Test®; Wampole Laboratorios, Cranberry, NJ) se realiza mediante la prepa­ ración de una tenue suspensión de microorganismos en 5 |iL de agua en un portaobjetos para IFD; se permite secar la suspen­ sión. se fija la muestra al calor, se cubre el frotis con el reacti­ vo para IFD y se incuba durante 15 minutos. El frotis se lava, se seca al aire, se cubre con un cubreobjetos y se observa con un microscopio de fluorescencia. Los gonococos aparecen como diplococos fluorescentes color verde manzana (lámina en color 11-2B). Cuando esta prueba fue comercializada por Syva en 1986, se informaron sensibilidades y especificidades del 100%.197-378-708 En 1989, Walton informó el aislamiento de dos cepas de N. gonorrhoeae P-lactamasa positivas, IFD negativas de dos pare­ jas sexuales.703 Boehm y cois, comunicaron el 100% de sensi­ bilidad y de especificidad para la prueba, pero mencionaron que se había aislado una cepa P-lactamasa positiva. IFD nega­ tiva luego de completar sus estudios.75 En 1993. Janda y cois, hallaron que la prueba IFD identificaba en forma correcta el 95,4% de 151 cepas P-lactamasa negativas, pero sólo el 74,4% de 43 cepas p-lactamasa positivas.323 En otro estudio de 1993, Beebe y su equipo de trabajo encontraron que 18 (4,6%) de 395 cepas de gonococos aisladas durante 1991 y 1992 eran IFD negativas; 6 de 18 cepas eran P-lactamasa positivas.55 Los datos de serotipificación y electroforesis en gel de campo pulsado indican que las variedades productoras y no productoras de Plactamasa que eran negativas con el reactivo para IFD pertene­ cen a diversas serovariedades.55-65-323-607 El “cóctel” de anticuer­ pos monoclonales anti-Por común usados en el producto Syva original es fabricado por Trinity Biotech (Wicklow, Irlanda) y

568

C A PÍTU LO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

no ha sido cambiado desde que el producto fue vendido a Wampole Laboratories. A la luz de los estudios citados con anterioridad, los anuncios del 99,6% de sensibilidad y de 100% de especificidad ya no eran válidos. Por ese motivo, los aisla­ mientos que fracasan en la tinción con el reactivo de IFD deben ser identificados por otros métodos. Esta advertencia limita las ventajas reales del procedimiento de IFD, que incluyen su rapi­ dez, la capacidad para probar colonias directamente de cultivos primarios y el escaso crecimiento requerido para realizar la prueba. La prueba de IFD no está destinada a la detección e identificación directa de los microorganismos en frotis de muestras de pacientes.

PRUEBAS DE COAGLUTINACIÓN

Las pruebas de coaglutinación hacen uso de la capacidad de la proteína A en las células de Staphylococcus aureus para unirse a moléculas de IgG por su región Fe. La unión del anti­ cuerpo antigonocócico a las células muertas de S. aureus y la mezcla posterior con una suspensión de gonococos causa una aglutinación visible de la suspensión. En la actualidad se ven­ den dos pruebas de coaglutinación para la identificación de N. gonorrhoeae, el Phadebact Monoclonal GC® y la prueba GonoGen I®. El Phadebact Monoclonal GC® (Boule Diagnostics AB. Huddinge, Suecia) usa anticuerpos monoclonales para Por gonocócica (proteína I). A diferencia de la prueba GC OMNI® comercializada antes por Boule Diagnostics, la prueba mono­ clonal GC contiene un reactivo que reacciona con el serogrupo WI de las cepas de N. gonorrhoeae y un segundo reactivo que reacciona con las cepas del serogrupo WII/WIII. Como no está incluido un reactivo de control negativo, los aislamientos gono­ cócicos reaccionarán con el reactivo W I o con el reactivo WII/WIII, según la composición del antígeno Por del aisla­ miento individual. La falta de aglutinación en cualquiera de los reactivos constituye una prueba negativa. Para realizar la prue­ ba, se prepara una suspensión (0,5 del estándar de McFarland) en un buffer salino (pH 7,2 a 7,4) y se hierve durante 5 minu­ tos. Después que se enfría, la suspensión se mezcla con reacti­ vos control y prueba sobre un portaobjetos con la tarjeta de car­ tón. La aglutinación dentro de un minuto es un resultado posi­ tivo de la prueba. Se incorpora un colorante azul en los reacti­ vos para ayudar a visualizar la aglutinación contra el fondo blanco de la tarjeta. Es necesario prestar atención a los detalles del procedimiento para evitar resultados falsos negativos y fal­ sos positivos. Las evaluaciones de la prueba GC ÓMNI dispo­ nible con anterioridad informaron una sensibilidad del 98100% y una especificidad del 99-100% .188J97,323 Las suspensio­ nes de microorganismos más concentradas que la densidad M cFarland especificada pueden dar resultados falsos positi­ vos. Además, se ha informado que el uso de solución salina con pH menor o mayor de 7,4 produce resultados falsos posi­ tivos con algunas cepas de N. lactamica, N. cinerea y M. ca­ tarrhalis.1**-323 La prueba GonoGen I (New Horizons Diagnostics, Columbia MD) también usa células estafilocócicas recubiertas con anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína de la membrana externa Por de varias serovariedades gonocócicas.444 Se realiza usando una suspensión hervida (McFarland 3) del microorganismo. Los resultados por lo general son bien defini­ dos y aparecen dentro de los 15 a 30 segundos de la mezcla de los reactivos de la prueba y la suspensión. El equipo contiene reactivos de coaglutinación de control y de prueba, además de suspensiones de control positivas y negativas para la prueba gonocócica. Las evaluaciones de esta prueba han informado

una sensibilidad del 86-100% y una especificidad del 99100% 24,323,346,379,444

PRUEBA GONOGEN II®

El GonoGen II® (New Horizons Diagnostics, Columbia MD) usa anticuerpos monoclonales anti-Por conjugados con oro coloidal como reactivo de detección. Se prepara una sus­ pensión (McFarland 1) en 0,5 mL de una solución de microor­ ganismos lisados y se agrega una gota del reactivo anticuerpo. Después de 5 minutos, se pasan dos gotas de la suspensión a través de una membrana filtrante que retiene los complejos antígeno-anticuerpo. La retención y la concentración del com­ plejo en el filtro vuelven el filtro de color rojo, identificador del microorganismo como N. gonorrhoeae. En los aislamientos no gonocócicos el filtro permanece blanco o rosa pálido. Janda y cois, observaron que el GonoGen II identificaba el 91,8% de 194 cepas de N. gonorrhoeae', cinco fueron negativas y 11 pro­ dujeron reacciones de color dudosas en la membrana. Además, una variedad menigocócica y dos cepas de N. lactamica pro­ dujeron en forma repetida resultados falsos positivos.323 Kellogg y Orwing hallaron que el GonoGen II identificaba 99,6% de 248 cepas gonocócicas, pero 7 de 22 cepas de N. meningitidis producían resultados falsos positivos. Estos inves­ tigadores sugirieron que los resultados positivos de la prueba GonoGen II necesitan la confirmación con otro método.346 Sistemas de identificación multipruebas

Se comercializan cuatro sistemas de equipos que pueden usarse no sólo para identificar especies de Neisseria sino tam­ bién para otros gramnegativos con requerimientos nutriciona­ les especiales. Estos son: el sistema rapID NH® (NeisseriaHaemophilus) (Remel Laboratories: lámina en color 11-2C), la tarjeta Vitek NHI® (Neisseria-H em philus Identification) (bioMerieux, Inc., Hazelwood MO), el panel de identificación Haemophilus-Neisseria (HNID®) (Dade/American Microscan, Sacramento CA; lámina en color 11-2D) y el sistema API NH® (bioMerieux, Inc., La Balme-les-Grottes, Francia).47 197’318,319 Véase la lámina en color 11-2E y F. Todos estos sistemas usan pruebas convencionales modificadas (p. ej., producción de ácido a partir de hidratos de carbono, ureasa, indol, ornitina descarboxilasa) y sustratos cromogénicas para proporcionar identificaciones de 2 o de 4 horas de Neisseria, Haemophilus y otras bacterias gramnegativas con requerimientos nutricionales especiales encontradas en muestras clínicas. La tarjeta NHI de bioMerieux, brinda por lo general excelentes resultados para las especies de Neisseria patógenas y también identifica N. cinerea.3'9 Sin embargo, las cepas de M. catarrhalis no pueden diferenciarse de otras especies de Moraxella con las pruebas actuales de la tarjeta. El panel MicroScan HNID no incluye N. cinerea en su base de datos y estos microorganismos se identi­ fican mal como N. gonorrhoeae o M. catarrhalis cuando se probaron con este sistema.318 Además, algunas cepas de N. meningitidis no producen reacciones definidas con pruebas cla­ ves de identificación en el panel (producción de ácido de mal­ tosa o actividad de y-glutamil aminopeptidasa), lo que da lugar a identificaciones erróneas. El RapID NH contiene pruebas (p. ej., reducción de nitrito y un sustrato de estearasa) que se pre­ sume permitirán la identificación confiable tanto de N. cinerea como de M. catarrhalis. Una sola evaluación de este sistema indicó que RapID NH fue confiable para la identificación de las especies de Neisseria, pero que algunas reacciones fueron difíciles de interpretar.188 En el estudio de Barbe y cois., el sis­

Identificación de especies de N eisseria tema API NH identificó gonococos, meningococos, N. lacta­ mica y M. catarrhalis dentro de las 2 horas, mientras que otras especies de Neisseria requerían pruebas adicionales para la identificación correcta de las especies.47 Pruebas de sondas de DNA para la confirmación del cultivo de N. gonorrhoeae

La prueba de confirmación de cultivos de N. gonorrhoeae Accuprobe® (GenProbe®) identifica N. gonorrhoeae por la detección de secuencias rRNA específicas de especie. En la prueba, se lisan los microorganismos que crecieron en un medio con agar y se mezclan con una sonda de DNA monocatenario marcada con quimioluminiscencia complementaria al rRNA gonocócico. Después que sucede la hibridación, el com­ plejo sondas DNA/rRNA bicatenario se selecciona por un pro­ ceso químico, y la presencia de la sonda en el material bicate­ nario se detecta por el agregado de reactivos de detección que hidrolizan la marca quimioluminiscente en la sonda, con lo que se libera energía lumínica. Esta energía se detecta en un instru­ mento llamado quimioluminómetro y el resultado se informa como negativo o positivo. En una evaluación llevada a cabo en la University of Illinois que examinó los procedimientos de coaglutinación con anticuerpos monoclonales, la inmunofluo­ rescencia directa y el AccuProbe® para la identificación de N. gonorrhoeae, la última prueba fue el único procedimiento que tuvo el 100% de exactitud en la identificación N. gonorrhoe­ ae.323 Otros investigadores han informado resultados similares para la prueba AccuProbe.386-731 Esta prueba puede ser muy útil para determinar cepas que no se identifican con facilidad por otros procedimientos confirmatorios. Pruebas de amplificación e hibridación de ácidos nucleicos para N. gonorrhoeae

La técnica de hibridación con sondas también se usa en las pruebas de detección de N. gonorrhoeae en muestras urogeni­ tales. El sistema PACE 2 (del inglés, ensayo quimioluminis­ cente con sonda mejorado) (GenProbe®, San Diego, CA) es una sonda quimioluminiscente no isotópica de DNA que híbrida en forma específica con rRNA gonocócico multicopia. Las mues­ tras se recolectan como para cultivo y se colocan en una solu­ ción lisante de transporte. Una porción de la muestra se mezcla con la sonda unida mediante unión éster a la acridina. Después de la incubación, el ácido nucleico hibridado se separa del material no hibridado. El complejo rRNA-sonda marcada con éster de acridina se procesa en un quimioluminómetro semiautomatizado con el agregado de una solución alcalina de peróxi­ do de hidrógeno. Esta hidroliza el enlace éster de la sonda mar­ cada y libera luz. que se detecta en el quimioluminómetro y se informa como unidades relativas de luz (RLU). La cantidad de luz liberada es directamente proporcional a la cantidad de rRNA gonocócico presente en la muestra. El ensayo requiere casi 2 horas para su realización. La evaluación del sistema PACE 2 de hibridación de ácidos nucleicos indican que esta sonda puede ser más sensible que el cultivo, debido a las características de los microorganismos con requerimientos nutricionales especiales.I45,28a394'698 Este proble­ ma es más crítico para los laboratorios que reciben cultivos de gonococos de lugares distantes, como centros municipales de en­ fermedades de transmisión sexual. En todos los estudios, los ensayos de comparación con sonda (probe competition) se usa­ ron para confirmar si las muestras con cultivo negativo/sonda positiva se debían a cultivos falsos negativos o a resultados fal­

5 69

sos positivos de la sonda. Chapin-Robinson y cois, compararon el PACE 2 con el cultivo en 795 muestras endocervicales y encontraron que la sensibilidad y la especificidad determinadas eran del 100% y del 99,5%, respectivamente.145 Un estudio similar fue llevado a cabo por Hale y cois, en 271 muestras endocervicales y 165 muestras uretrales masculinas.2' Veinte de las 27 muestras con sonda positiva/cultivo negativo se defi­ nieron como cultivos falsos negativos mediante la comparación con la sonda; la sensibilidad y la especificidad determinadas de PACE 2 fueron 99,4% y 99,6%, respectivamente. Por último, un gran estudio del sistema de detección PACE 2. que tuvo lugar en los Países Bajos en 1 750 muestras, informó una sen­ sibilidad del 97,1% y una especificidad del 99.1% '" En gene­ ral, la sensibilidad del sistema PACE 2 ha aumentado desde 85,5% hasta 100% para muestras endocervicales femeninas y desde 91,5% hasta 100% para muestras uretrales masculinas.;
570

C APÍTULO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

expectativas analíticas anticipadas por los fabricantes.143 Otro método, la prueba de captura Digene® (Digene, Silver Spring, MD), es un ensayo basado en una sonda quimioluminiscente que usa hibridación y captura del híbrido, seguida de la ampli­ ficación de la señal.445 Estas pruebas están aprobadas para la evaluación de muestras de hisopados genitales y muestras de orina, tanto en hombres como en mujeres. El ensayo AMPLICOR Neisseria gonorrhoeae PCR y los sistemas autom atizados COBAS AM PLICOR utilizan la amplificación basada en la PCR convencional. El ensayo origi­ nal no automatizado usa el termociclador PerkinElmer 9600 con la detección ulterior por enzimoinmunoanálisis que utiliza placas de micropocillos recubiertas con un oligonucleótido pa­ ra capturar los productos del amplicón biotinilados. El COBAS AMPLICOR es un sistema automatizado en el cual el DNA diana se amplifica por una reacción de PCR convencional que usa termocicladores construidos dentro del instrumento. Para ambos ensayos AMPLICOR, la secuencia diana de amplifica­ ción en N. gonorrhoeae es un fragmento de 201 pares de bases del gen citosina DNA metiltransferasa. Los productos de amplificación biotinilados son captados por partículas magné­ ticas recubiertas con sondas de oligonucleótidos con secuen­ cias específicas de amplicón y se detectan colorimétricamente con peroxidasa de rábano conjugado con avidina.333 Varios estudios han analizado el desempeño del ensayo AMPLICOR para gonorrea. Crotchfeldt y cois, evaluaron el ensayo de micropocillos AMPLICOR de Roche con 344 mues­ tras de hisopado uretral y orina de varones y 192 muestras de hisopado endocervical y de orina de mujeres. La sensibilidad del ensayo fue del 94,4% para muestras de orina y del 97,3% para muestras de hisopado uretral masculino. La sensibilidad del ensayo para las muestras de orina y de hisopado endocervi­ cal de mujeres fue del 90% y del 100%, respectivamente. La especificidad del ensayo se extendió del 95,9% hasta el 98,5% para muestras de orina y del 97,0% hasta el 99.4% para mues­ tras de hisopados.169 Paladino y cois, evaluaron el ensayo de PCR con muestras de orina de 73 varones y encontraron que el ensayo tuvo 100% de sensibilidad y de especificidad en com­ paración con el cultivo.488 En una gran evaluación multicéntrica del ensayo de micropocillos AMPLICOR semiautomatizado y del ensayo COBAS AMPLICOR automatizado se analizaron 2 192 muestras pareadas de hisopado endocervical y de orina de mujeres y muestras pareadas de orina y de hisopados ure­ trales de 1 981 varones.416 El ensayo de micropocillos AMPLICOR y el COBAS AMPLICOR produjeron resultados concor­ dantes en el 98% de las muestras y exhibieron sensibilidades idénticas del 99,5% y del 99,8% para hisopado endocervical y muestras de orina de mujeres, respectivamente, y del 98.9% y el 99,9% para hisopados uretrales y muestras de orina de hom­ bres, respectivamente. Livengood y Wrenn observaron, en un estudio de 618 muestras de hisopado endocervical, que el sis­ tema COBAS AMPLICOR tenía una sensibilidad y especifici­ dad analíticas del 96,3% y el 100%, respectivamente.399 En un estudio que analizó la especificidad del ensayo de micropocillos AMPLICOR, Farrel encontró que 6 de 15 cepas de N. subflava producían resultados positivos, incluida una que fue aislada de una muestra vaginal.220 Otros estudios, así como el fabricante, también han reconocido que las neisserias saprofitas (p. ej., N. cinerea, N. subflava, N. sicca y N. flavescens) pueden producir resultados de reacción cruzada en el ensayo de micropocillos AMPLICOR Neisseria gonorrhoeae PCR.491'545,678 El sistema BD ProbeTec ET® usa amplificación de desplaza­ miento de hebra más que PCR por amplificación, de modo que toda la prueba se realiza en forma isotérmica sin necesidad de

un termociclador.397 El sistema tiene una operatividad mayor que otros métodos de amplificación, con una capacidad de realizar 300 ensayos en un turno de 8 horas. También tiene opciones para la realización y la interpretación de la prueba con control de amplificación o no, y usa reactivos que pueden almacenarse a temperatura ambiente. En este ensayo, la diana de amplificación está en el homólogo de la proteína de inver­ sión del cromosómico de la pilina, que está presente en copias múltiples en la célula gonocócica.117 Van der Pol y cois, eva­ luaron el sistema ProbeTec ET con muestras de hisopado y de orina de hombres y mujeres.677 Para las muestras de mujeres, la sensibilidad del sistema fue del 96,6% y el 84,9%, respectiva­ mente. Para las muestras de hombres, la sensibilidad fue del 98,5% y el 97,9%, respectivamente. La especificidad aumentó desde el 94,4% hasta el 100% para las muestras de orina y del 94,8% hasta el 99,6% para las muestras de hisopado. En otra evaluación del ProbeTec ET con 733 muestras de hisopado endocervical de prostitutas en Bélgica, el procedimiento SDA se realizó con una sensibilidad del 90% y una especificidad del 100% comparadas con el cultivo.681 En un estudio de 3 544 muestras de orina en las que se hicieron pruebas para N. gonorrhoeae, Akduman y cois, encontraron que la sensibilidad y la especificidad del ProbeTec ET fueron del 99,2% y el 99,3%, respectivamente, en una población con una prevalencia del 3,6% por cultivo.14 Otra evaluación realizada en Canadá con muestras de orina de 825 hombres y 399 mujeres comparó ProbeTec ET con COBAS AMPLICOR PCR y halló que el procedimiento SDA fue 100% sensible y 99,7%, específico.144 Como los ensayos AMPLICOR para N. gonorrhoeae, el BD ProbeTec ET también puede producir reacciones falsas positvas con varias especies de Neisseria no gonocócicas.491 El APTIMA Combo 2 es un ensayo más nuevo que usa la amplificación mediada con transcripción para la detección de gonococos y clamidias en muestras de hisopado y de orina. Gaydos y cois, lo evaluaron con ambas muestras, hisopado endocervical y orina, sometidas a la detección de N. gonorrho­ eae ,2S0 La sensibilidad y la especificidad del sistema APTIMA fueron del 99,2% y del 98,7%, respectivamente, para muestras de hisopado endocervical, y del 91,3% y el 99,3%, para la pri­ mera muestra de orina. Este ensayo se está sometiendo a otras evaluaciones, incluido el uso de hisopados vaginales para la detección de microorganismos autorrecolectados o recolecta­ dos por el médico. Las pruebas APTIMA también parecen menos sensibles a los inhibidores de la amplificación, que a menudo se encuentran en las muestras de orina, que otros ensa­ yos de amplificación.150 El ensayo de captura del híbrido Digene®, como ya se men­ cionó, usa amplificación de señal en lugar de amplificación de la diana para aumentar su sensibilidad de detección. En este ensayo, el DNA diana se hibrida a las sondas RNA específicas de secuencia, provistas con el ensayo. Los productos híbridos se transfieren a los pocilios de una cubeta de microtitulación, donde se inmovilizan por los anticuerpos en un pocilio microtitulador. Luego, se agrega a cada micropocillo un reactivo de detección, que consiste en un anticuerpo conjugado específico para híbridos RNA/DNA. Las enzimas múltiples se conjugan con cada una de estas moléculas de anticuerpo y muchas molé­ culas de anticuerpo se unen a cada híbrido RNA/DNA, lo que deriva en una amplificación de la señal marcada además de la del sustrato enzimático quimioluminiscente. En un estudio rea­ lizado con muestras de hisopado endocervical de 1 370 muje­ res, el ensayo Digene demostró una sensibilidad del 92,6% y una especificidad del 98,5% comparado con el cultivo.579 En un análisis de 669 muestras endocervicales, la prueba Digene tuvo

C aracterísticas del cultivo de especies de N eisseria

un 92.2% de sensibilidad y más del 99% de especificidad para la detección de N. gonorrhoeae cuando se comparó con el cul­ tivo.174 Van der Pol y cois, encontraron que el ensayo Digene se realizaba con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 99% para la detección de N. gonorrhoeae en muestras de hisopado endocervical.679 Además de las pruebas comerciales de amplificación mole­ cular para N. gonorrhoeae, se han creado los ensayos de PCR en "tiempo real" que usan la plataforma de LightCycler®. En un estudio de 152 muestras de orina, se comparó la prueba LightCycler con una prueba PCR casera para N. gonorrhoe­ a e .'1'' El método del LightCycler tuvo una sensibilidad del 94% y su especialidad fue comparable con la de las pruebas de autoaplicación. Li y cois, tam bién inventaron una prueba LightCycler que detectó tanto el microorganismo como las mu­ taciones en el gen gyrA responsables de la resistencia a las quinolonas.190 El uso de métodos basados en ácidos nucleicos para la detec­ ción de N. gonorrhoeae en muestras clínicas tiene ventajas y desventajas. Las ventajas son la capacidad de evaluar muestras de fácil recolección (orina), la velocidad del procedimiento, cada vez más rápido, y el aumento demostrado en la sensibili­ dad de estos métodos comparados con los cultivos. Las des­ ventajas son el costo de las pruebas (equipamiento e insumos), la necesidad de un lugar especial dedicado al procesamiento de la muestra y a la realización de la prueba, y los cambios en las rutinas de trabajo del laboratorio para impedir la contamina­ ción con amplieón del instrumental y del medioambiente. Un lado oscuro del uso generalizado de estos ensayos basados en el no cultivo es el desaprovechamiento de los aislamientos gonocócicos para la vigilancia de la resistencia emergente a los antibióticos. A pesar de la alta especificidad de estas pruebas, su desempeño en poblaciones con baja prevalencia requiere otro estudio; algunos especialistas han recomendado pruebas confirmatorias con métodos moleculares más específicos (p. ej., 16S rRNA PCR) para los resultados positivos de las prue­ bas amplificadas obtenidos en poblaciones con baja prevalen­ cia de gonorrea.187 Todavía se requiere el cultivo para el diag­ nóstico de infecciones gonocócicas extragenitales y para el registro y la documentación de infecciones gonocócicas geni­ tales, rectales u orofaríngeas en los niños. Métodos moleculares para la detección de N. meningitidis

También se describieron métodos moleculares para la detec­ ción directa de N. meningitidis en muestras clínicas, pero nin­ guno se comercializa. Lansac y cois, describieron pruebas identificación con PCR específicas de especie y de género usando pares de cebadores derivados del gen aspartato (i-semialdheído (asd) de especies de Neisseria y del gen de una pro­ teína de la membrana externa conservada (ctrA) de N. meningi­ tidis, respectivamente.375 El primer ensayo fue 100% específico para la identificación de 321 de 322 cepas que representaban 13 especies de Neisseria, mientras que el segundo ensayo amplifi­ có el DNA de 256 aislamientos de N. meningitidis pertenecien­ tes a nueve serogrupos diferentes. También se describieron varios ensayos de PCR para la detección directa de meningo­ cocos en muestras clínicas. Durante una epidemia de enferme­ dad causada por el serogrupo B que comenzó en Chile en 1987, Saunders y su equipo de investigación desarrollaron un ensayo de PCR anidada que amplificó el gen porA que codifica la pro­ teína específica de subserotipo.578 El uso de este ensayo en muestras de LCR durante la epidemia tuvo una sensibilidad de prueba del 96,7% y una especificidad del 100%.577 También se

571

describieron métodos de PCR que amplifican los genes de los polisacáridos capsulares múltiples (ensayo PCR ctrA) o que amplifican los genes específicos de serogrupo (ensayo PCR s/aD).81-82-335-514 Taha describió un ensayo de PCR realizado di­ rectamente sobre LCR para la detección meningocócica y el seroagrupamiento simultáneos. El ensayo de detección ampli­ ficó un gen conservado involucrado en la regulación de la adhe­ rencia meningocócica a las células diana (crgA). mientras se realizaba un ensayo de PCR múltiple simultáneo con oligonu­ cleótidos en los genes siaD para la detección de los serogrupos B, C, Y y W135 y en el casete del gen orf-2 requerido para la detección del serogrupo A por biosíntesis del serogrupo capsu­ lar A.638 Orvelid y cois, describieron un método basado en PCR para la detección de meningococos del serogrupo A en LCR.486 Este ensayo usó cebadores y sondas específicos para el gen casete que codifica la (a 1-6) 7V-acetil-D-manosamina que com­ pone el polisacárido capsular del serogrupo A. También se han desarrollado ensayos LightCycler basados en PCR que pueden detectar, identificar y realizar la subserotipificación del gen porA de N. meningitidis directamente de muestras clínicas.446

Características del cultivo de especies de Neisseria Las secciones siguientes presentan aspectos útiles para la caracterización e identificación en el laboratorio de los cocos gramnegativos. Se reseñan las sugerencias para la realización de pruebas confirmatorias y diferenciales descritas en detalle en la sección anterior y los procedimientos de pruebas adicio­ nales. En el cuadro 11-4 se muestran las características para la identificación de especies de Neissera y M. catarrhalis. Neisseria gonorrhoeae

Aunque los sistemas de identificación tratados en la sección anterior de este capítulo y las características bioquímicas del cuadro 11-4 son confiables para la identificación habitual de N. gonorrhoeae en el laboratorio clínico, otras técnicas han con­ tribuido mucho al conocimiento de la biología y la epidemio­ logía de los gonococos. Técnicas como la auxotipificación y la serotipificación han sido útiles para determinar la virulencia potencial, la invasividad, la sensibilidad a los antibióticos y la constitución genética de diferentes cepas de gonococos. Las cepas de gonococos con requerimientos nutricionales específi­ cos por ciertos factores del crecimiento se conocen como a u x o t i p o s . 124 Aun cuando en estudios de auxotipificación se pueden determinar hasta 15 factores del crecimiento diferentes (como requerimientos por valina, leucina, lisina. arginina. prolina, hipoxantina, citrulina u otros), las cepas que requieren la tríada de arginina, hipoxantina y uracilo (cepas AHU) han sido las más estudiadas. Estas cepas son de particular interés porque, por lo general, se aíslan en pacientes con infección gonocócica diseminada y son muy sensibles a la penicilina.356-453 Las cepas AHU halladas en infecciones sistémicas a menudo son resis­ tentes a la acción bactericida normal del suero humano, lo que puede explicar en parte su capacidad para entrar en el torrente circulatorio.585 Las cepas AHU también están asociadas con infecciones uretrales asintomáticas en los varones; en un estu­ dio, 96% de los varones asintomáticos estaban infectados con este auxotipo.168 Las capas que requieren AHU crecen como colonias atípicas en agar; algunas pueden requerir 72 horas más de incubación antes de que se observe un crecimiento visi­ ble.453 Además de las cepas AHU, los auxótrofos que requieren

572

C A PÍTU LO 11

Cuadro 1 1 - 4

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

C a r a c te r ís tic a s p a r a la id e n tifíc a c ió n d e e s p e c ie s d e Neissería , M oraxella catarrhalis y la “ f a ls a Neisseria ” CRECIM IENTO EN

PRO DUCCIÓN DE GAS DE

OXIDASA

CATALASA

Medio selectivo, 35 °C

Agar chocolate, 22 °C

Agar nutritivo, 35 "C

Glucosa

M altosa

Fructosa

N. gonorrhoeae

+

+

+

-

-

+

-

-

N. m eningitidis

+

+

+

-

-

+

+

-

N. lactamica

+

+

+

-

-

+

+

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N. cinerea

+

+

- t

-

-

-

-

-

N. polysaccharea

+

+

V

-

+

+

+

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N. sicca

+

+

-

+

+

+

+

+

bv. subflava

+

+

-

+

+

+

+

-

bv. fla va

+

+

-

+

+

+

+

+

bv. perflava

+

+

+

+

+

+

+

N. mucosa

+

+

-

+

+

+

+

+

N. flavescens

+

+

-

-

+

-

-

-

“N. ko ch ii "

+

+

+

-

-

+

-

-

subesp. elongata

+

-

-

+

+

-

-

-

subesp. glycolytica

+

+

-

+

+

+d

-

-

subesp. nitroreducens

+

-

-

+

+

-

-

N. weaveri

+

+

-

+

+

-

-

-

N. canis

+

+

ND

ND

ND

-

-

-

N. denitrificans

+

+

-

ND

ND

+

-

+

N. m acacae

+

+

-

ND

ND

+

+

+

N. caviae

+

+

ND

ND

ND

-

-

-

N. ovis

+

+

ND

ND

ND

-

-

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N. cuniculi

+

+

ND

ND

ND

-

-

-

N. iguanae

+

+

ND

ND

ND

V

-

ND

M oraxella catarrhalis

+

+

V

+

+

-

-

-

ESPECIES

N. subflava

N. elongata

+, reacción positiva; reacción negativa; V: reacción variable; +d: reacción positiva débil; —/+d: negativa a reacción positiva débil; ND: datos no disponibles. *Las reacciones mostradas están en medios con 0,1% nitrito, N. gonorrhoeae reducirá 0,01% de nitrito. +Algunas cepas recuperadas en medios selectivos. *Algunas cepas desarrolladas en medios selectivos.

prolina, citrulina y uracilo han sido asociados con infecciones asintomáticas en varones en los Estados Unidos, Canadá y Suecia.102 Los estudios de las características inmunológicas del gono­ coco incluyen la caracterización de las proteínas de la mem­ brana externa del microorganismo y el desarrollo de anticuer­ pos monoclonales contra epítopos de la proteína Por (proteína I), la principal proteína de la membrana externa de N. gonorr­ hoeae.251’360 Estos anticuerpos se pueden adsorber sobre células estafilocócicas para usarlos como reactivos de coaglutinación.

Las diferencias en Por dividen las cepas en tres grupos: el sero­ grupo WI contiene Por AI, mientras que los serogrupos WII y WIII contienen Por IB. Los serotipos WI se asocian con infec­ ciones diseminadas, infecciones asintomáticas en los varones y resistencia mediada por complemento a la actividad bacterici­ da del suero humano normal. La exploración de varios epítopos de Por IA y IB ha llevado a la subdivisión de Por IA (serotipo WI) en más de 18 serovariedades y de Por IB (serotipos WII/WIII) en más de 28 serovariedades.360 Las determinacio­ nes de serovariedades a menudo se logran mediante técnicas de

C aracterísticas del cultivo de especies de N eisseria

573

PRODUCCIÓ N DE GAS DE Sacarosa

Lactosa

POLISACÁRIDO DE SACAROSA

REDUCCIÓN DE NO, N 0 2*

N.gonorrhoeae

-

-

-

-

N. meningitidis

-

-

-

N.lactamica

-

+

N. cinerea

-

N. polysaccharea N. sicca

DNASA

HIDRÓLISIS DE TRIBU'TIRINA

-

-

-

Seres humanos

-

V

-

-

Seres humanos

-

-

V

-

-

Seres humanos

-

-

-

V

-

-

Seres humanos

-

-

+

-

V

-

-

Seres humanos

+

-

+

-

+

-

-

Seres humanos

bv. su bflava

-

-

-

-

+

-

-

Seres humanos

bv. fla v a

-

-

-

-

+

-

-

Seres humanos

bv. p e rfla va

+

-

+

-

+

-

-

Seres humanos

N. mucosa

+

-

+

+

+

-

-

Seres hum anos

N. flavescens

-

-

+

-

+

-

-

Seres hum anos

“N. kochii"

-

-

-

-

-

-

-

Seres hum anos (raro)

subesp. elongata

-

-

-

-

+

-

-

Seres humanos

subesp. glycolytica

-

-

-

-

+

-

-

Seres hum anos

subesp. nitroreducens

-

-

-

+

+

-

-

Seres humanos

N. weaveri

-

-

-

-

+

-

-

Perros

N. canis

-

-

-

+

-

ND

-

Perros

N. denitrificans

+

-

+

-

+

ND

-

Cobayos

N. m acacae

+

ND

+

-

+

ND

ND

Primates

N. caviae

-

-

-

+

+

ND

+

Cobayos

N. ovis

-

-

-

+

-

ND

+

Ovejas/vacas

N. cuniculi

-

-

-

-

-

NA

+

Conejos

N. iguanae

V

ND

+

+

V

ND

ND

Iguanas

M oraxella catarrhalis

-

-

-

+

+

+

+

ESPECIES

.

HABITATS

N . subfla va

N. elongata

coaglutinación, aunque los reactivos de tipificación monoclo­ nal también han sido adaptados a un formato de enzimoinmu­ noanálisis con resultados menos subjetivos y más reproducibles.114Las aplicaciones de estos esquemas de tipificación han incluido 1) el estudio de las diferencias regionales y los cam­ bios temporales en los gonococos de todo el país y dentro de comunidades, 2) el análisis de las relaciones serovariedadauxotipo, 3) el estudio de serovariedades gonocócicas como indicadores o predictores de virulencia, 4) el uso de la deter­ minación de serovariedades para definir una recidiva o una

Seres humanos

reinfección en pacientes individuales, y 5) el uso de la deter­ minación de serovariedades como una herramienta de la pato­ logía forense relacionada con asaltos y abusos sexuales.257 Los métodos moleculares más nuevos han sido desarrollados para aumentar y extender la capacidad de discriminación de la auxotipificación y la serotipificación. Estas técnicas incluyen perfiles de antibiograma, análisis de plásmidos, tipificación de Opa, secuenciación del gen PorB. ribotipificación, análisis de isoenzimas, análisis de endonucleasas de restricción, electrofo­ resis en gel de campo pulsado, PCR cebada arbitrariamente,

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C APÍTULO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

análisis de restricción de RNA ribosómico amplificado, huellas dactilares (fingerprinting) del polimorfismo de longitud de los fragmentos amplificados.106'476-477,484'489-490'508-650'673 Estos métodos nuevos de tipificación han demostrado la existencia de “grupos” dentro de auxotipo(s)/serovariedad(es) existentes.672,689 Otro sistema de tipificación involucra la amplificación y la secuenciación de los genes lip, que codifican una lipoproteína de la membrana externa de 18 a 30 kDa de peso molecular y que se encuentra en todos los meningococos.662 Los tres genes lip han sido identificados y secuenciados. Las secuencias de nucleótidos de esos genes predicen los péptidos que están com­ puestos por un aminoácido pentamérico que se repite de 13 a 19 veces. Las variaciones en el número de repeticiones de lip en una secuencia y la naturaleza de la secuencia por sí misma pueden usarse junto con el auxotipo, la serovariedad. la sensi­ bilidad a los antibióticos y otras características para construir un sistema altamente discriminativo para la tipificación de ais­ lamientos individuales. Debido a las consecuencias medicolegales que se originan después de aislar N. gonorrhoeae en un niño y de hallar gono­ cocos tanto en los genitales como en otras partes del cuerpo, la identificación apropiada del microorganismo aislado es impe­ rativa. W hittington y cois, informaron 40 aislamientos bacte­ rianos en menores de 15 años identificados como N. gonorrho­ eae y remitidos a los CDC para su confirmación.712 Catorce (35%) de esas cepas habían sido mal identificadas por el labo­ ratorio de origen, entre ellas cuatro N. cinerea, tres N. lactami­ ca, dos N. meningitidis, tres M. catarrhalis, una K. denitrifi­ cans y una especie de Neisseria nogonocócica no identificada. En 10 de los 14 casos, los microorganismos se aislaron en niños en quienes no hubo evidencia de abuso sexual. En muchos casos, los laboratorios que informaron estas cepas estaban usando los equipos comerciales descritos con anterio­ ridad para la identificación de N. gonorrhoeae. Como ya se mencionó, algunos sistemas de pruebas de utilización de hidra­ tos de carbono comerciales pueden producir reacciones a la glucosa falsas positivas para N. cinerea, que pueden conducir a la identificación equivocada de estas especies como N. gonorr­ hoeae.91'92 Las pruebas de coaglutinación, si bien suelen ser bastante confiables, pueden producir resultados falsos negati­ vos con algunas cepas gonocócicas y también pueden mostrar resultados falsos positivos con algunas otras cepas de Neisseria o especies relacionadas, como N. lactamica, N. cinerea y M. catarrhalis. Los detalles del procedimiento para estas pruebas (p. ej., densidad de la suspensión de la prueba, tipo y pH del líquido en el que se hace la suspensión) difieren entre los fabri­ cantes y deben seguirse estrictamente las instrucciones inclui­ das en el embalaje. Las pruebas enzimáticas para la detección de prolilaminopeptidasa gonocócica deben usarse sólo para neisserias que sean capaces de crecer bien en medios selecti­ vos. Algunas cepas de N. cinerea y ciertas cepas de N. subfla­ va biovariedad perflava pueden crecer en medios selectivos y también pueden ser positivas para prolilaminopeptidasa en sis­ temas comerciales.320 Las cepas aisladas en la orofaringe pue­ den ser problemáticas. N. lactamica, una especie que crece bien en medios selectivos y puede ser mal identificada como N. gonorrhoeae, coloniza la orofaringe de casi el 60% de los niños de entre 1 y 4 años.261 El Comité de abandono y abuso infantil de la American Academy of Pediatrics recomienda que el aislamiento presun­ tivo de N. gonorrhoeae en un niño, sin tener en cuenta el sitio del aislamiento, se confirme con al menos dos métodos.20 Las técnicas sin cultivo, como la hibridación de ácidos nucleicos y los métodos de amplificación, son pruebas de investigación uti­

lizadas en niños, de modo que sus resultados positivos deben confirmarse con un cultivo. Si un laboratorio no puede estable­ cer la identificación definitiva, la cepa debería enviarse a un laboratorio de referencia para efectuar otras pruebas y, si es posible, también debería guardarse. Esto se puede lograr si se extraen los cultivos obtenidos en unas pocas placas de agar chocolate, se los prepara en suspensión en 1 mL de caldo de infusión de cerebro y corazón más suero equino sin comple­ mento (en proporción 1:1) y se lo almacena a -7 0 °C. Neisseria meningitidis

Los procedimientos de identificación para meningococos (y gonococos) producen los mejores resultados cuando se inocu­ lan a partir de subcultivos de 18 a 24 horas en agar sangre o agar chocolate. En las pruebas confirmatorias de utilización de hidratos de carbono, la reacción ácida en el tubo de maltosa suele ser más fuerte que la del tubo de glucosa porque el micro­ organismo degrada la maltosa en dos moléculas de glucosa, que luego se metabolizan. De tanto en tanto, pueden hallarse cepas de N. meningitidis asacarolíticas glucosa negativas y maltosa negativas,266-505'562’705 Si se aíslan esas cepas aberrantes desde el punto de vista bioquímico, se deben realizar pruebas confirmatorias con sustratos cromogénicos o seroagrupamiento de los aislamientos. La aglutinación en portaobjetos es la técnica usada con mayor frecuencia para el seroagrupamiento de meningococos. Se prepara una suspensión densa del microorganismo en 0,5 a 1,0 m í de solución salina de buffer fosfato (PBS), pH 7,2 de un subcultivo de 12 a 18 horas en agar sangre tripticasa soja. Se mezcla una gota de esta suspensión con una gota de antisuero meningocócico en un portaobjetos sectorizado y se lo rota durante 2 a 4 minutos. Las cepas agrupables por lo general aglutinarán firmemente en ese lapso. Aunque las cepas de infecciones sistémicas aglutinan enseguida, las de portadores pueden no hacerlo (cepas no agrupables) o pueden autoaglutinarse en PBS. El uso de cultivos jóvenes de agar sangre (6 a 8 horas) o de medios enriquecidos con suero, como agar triptica­ sa soja que contiene 10% de suero equino descomplementado, puede resolver esos problemas. Se dispone de antisueros para los principales serogrupos meningocócicos de BD Bioscien­ ces®. Algunas de estas cepas no agrupables pueden ser N. poly­ saccharea; la prueba para la producción de polisacáridos a par­ tir de sacarosa ayuda en la identificación de estas especies (véase la explicación más adelante).84 Además de la aglutina­ ción en portaobjetos, el seroagrupamiento de meningococos puede realizarse con células enteras, enzimoinmunoanálisis indirecto y por inmunotransferencia en manchas (dot blot) con anticuerpos monoclonales contra los serogrupos A, B, C, Y y W135. Según Rosenqvist y cois., las dos últimas técnicas son más sensibles, más específicas y más fáciles de interpretar que las pruebas de aglutinación en portaobjetos, pero su aplicabilidad está limitada a la disponibilidad de reactivos monoclonales específicos de serogrupo.549 Además de las determinaciones de serogrupos, los aisla­ mientos de N. meningitidis pueden ser serotipificados y subserotipificados basándose en sus proteínas de membrana externa y antígenos LOS (véase recuadro 11 -3). Estas técnicas se usan principalmente para investigaciones de epidemias y brotes esporádicos de la enfermedad y no están al alcance de los labo­ ratorios microbiológicos clínicos de rutina. Además de las téc­ nicas serológicas, se han aplicado varias técnicas moleculares a investigaciones de enfermedad meningocócica y a la epide­ miología de las cepas de N. meningitidis. Estas técnicas son

C aracterísticas del cultivo de especies de N eisseria

i.ectroforesis de enzimas multilocus, análisis de polimorfismos ie longitud de los fragmentos de restricción, técnicas con son­ das de rRNA (ribotipificación), análisis de los genes cromosómicos porA y dhps (dihidropteroato sintasa) de N. meningitidis per endonucleasas de restricción-amplicón de PCR y electroforesis en gel de campo pulsado.276-277-347-369-495-629-658 Otras especies de Neisseria

NEISSERIA LACTAMICA

X. lactamica se asemeja a N. meningitidis en la morfología de las colonias y en un principio se pensó que era una variante .¿ctosa positiva de aquella.297 Esta especie reside en la faringe y 'e encuentra más a menudo en los niños.261 Crece en medios '¿lectivos y produce ácido de glucosa, maltosa y lactosa. También hidroliza ONPG, que puede usarse como sustituto de la lactosa en la serie de pruebas bioquímicas. Se ha informado ¿ue algunas cepas causan reacciones falsas positivas con algu­ nas pruebas de coaglutinación comerciales.322-323 Las cepas de V lactamica tienen sensibilidad intermedia a la penicilina y a la ampicilina. pero son sensibles a la cefotaxima y la ceftriaxona.36 NEISSERIA CINEREA

Las colonias de N. cinerea se asemejan a los tipos de colo­ nias grandes de N. gonorrhoeae y pueden producir resultados compatibles con N. gonorrhoea en algunos sistemas de identi­ ficación comerciales.91 Aunque es parte de la flora comensal de las vías respiratorias altas, ha sido aislado en otros sitios, incluidos cuello uterino, recto, celulitis orbital, conjuntiva, san­ gre y LCR.42-85-198-201-361 N. cinerea crece tanto en agar sangre como en agar chocolate. En agar chocolate después de 24 horas de incubación, las colonias son de casi 1 mm de diámetro, lisas y con bordes continuos. El microorganismo no genera ácido con los hidratos de carbono ni en los medios con CTA ni en las pruebas rápidas de degradación de hidratos de carbono. Se han infomado reacciones positivas débiles con glucosa después de incubación de toda la noche para algunos sistemas de identifi­ cación y su reacción hidroxiprolil aminopeptidasa positiva también puede llevar a una identificación errónea de N. cinerea como N. gonorrhoeae. Sin embargo, la mayoría de las cepas de N. cinerea no crecen bien en MTM u otros medios selectivos, lo que excluye a estos microorganismos de las pruebas con sus­ tratos cromogénicos, como Gonochek y BactiCard Neisseria. N. cinerea puede diferenciarse de las especies asacarolíticas N. flavescens por su incapacidad para producir polisacáridos de sacarosa (véase más adelante) y por la falta de un pigmento amarillo perceptible. Esta especie también puede ser separada de M. catarrhalis, otra especie asacarolítica, por su reducción de nitratos negativa (véase cuadro 11-4). Para diferenciar N. cinerea de N. gonorrhoeae es útil la prueba de sensibilidad a la colistina. Se prepara una suspensión del microorganismo (0,5 del estándar de turbidez de McFarland) en caldo y se siembra con hisopo en placas de agar sangre o agar chocolate como para una prueba de sensibilidad por difusión con discos. Se coloca un disco de 10 mg de colistina sobre el inóculo y se incuba la placa en C 0 2 entre 18 a 24 horas. N. cinerea es sen­ sible a la colistina y tendrá una zona >10 mm sin crecimien­ to alrededor del disco. Por lo general, N. gonorrhoeae crece hasta el borde del disco. NEISSERIA FLAVESCENS

N. flavescens se encuentra en el aparato respiratorio y rara vez se asocia con procesos infecciosos. Este microorganismo

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crece como colonias amarillentas lisas, tanto en agar sangre como en agar chocolate. Además de crecer en un agar nutriti­ vo a 35 °C, la mayoría de las variedades crecen a temperatura ambiente en agar sangre o agar chocolate. Es un microorga­ nismo incapaz de sintetizar polisacáridos yodopositivos a par­ tir de la sacarosa (véase descripción) y puede diferenciarse de M. catarrhalis por su incapacidad para reducir nitrato y por sus reacciones de la DNasa y de hidrólisis de la tributirina negativas. NEISSERIA SUBFLAVA BIOVARIEDADES, NEISSERIA MUCOSA NEISSERIA SICCA

Y

La identificación de especies de Neisseria "no patógenas" no suele ser necesaria a menos que se determine que el microor­ ganismo es importante desde el punto de vista clínico o si se lo aísla de un sitio sistémico (p. ej., sangre, LCR) o de un cultivo puro. La identificación se basa en la morfología de la colonia, el crecimiento en un medio nutritivo simple, la incapacidad para desarrollarse en medios selectivos, la producción de ácido a partir de hidratos de carbono, la reducción de nitrato y nitri­ to y la síntesis de un polisacárido que se tiñe con yodo, similar al almidón, a partir de sacarosa. L a r e d u c c ió n d e n it r a t o y d e n i t r i t o se determinan en un medio (caldo con infusión de cora­ zón o tripticasa soja) que contiene 0,1% (p/v) de KNO, y 0,01% (p/v) de KNÓ2, respectivamente. La s ín te s is d e l p o lis a ­ c á r id o se determina por inoculación del microorganismo en un agar infusión de cerebro y corazón que contiene 5% de sacaro­ sa. Se inocula un medio sin sacarosa como control negativo. Después de la incubación a 35 °C durante 48 horas, las placas se cubren con solución de yodo de Lugol o de Gram (dilución 1:4). Una prueba positiva está indicada por la aparición de un color azul intenso en y alrededor de las colonias sintetizadoras del polisacárido. Se han obtenido excelentes resultados por el agregado regular de yodo de Gram (una a dos gotas) al tubo que contiene sacarosa en la técnica rápida de degradación de hidratos de carbono, después de 4 horas de incubación. Si es positiva, aparece un color azul intenso en el tubo. Este se com­ para con el color observado en los otros tubos de hidratos de carbono (p. ej., el tubo de maltosa) después del agregado del yodo de Gram. Las cepas de N. subflava pueden subdividirse en tres biova­ riedades (biovariedades subflava, flava y perflava) sobre la base de la producción de ácido a partir de fructosa y sacarosa y la síntesis de polisacárido yodopositivo a partir de sacarosa (véase cuadro 11-4). Las tres biovariedades reducen nitrito, pero no nitrato. N. mucosa tiene un patrón de utilización de hidratos de carbono similar a N. subflava bv. pe/flava y tam­ bién produce polisacárido yodopositivo, pero N. mucosa puede reducir tanto nitrato como nitrito a N2 gas (lámina en color 112D). Todos estos microorganismos exhiben grados variables de pigmentación amarilla. Las cepas de N. sicca son idénticas desde el punto de vista bioquímico a N. subflava bv. perflava, pero forman colonias coriáceas, adherentes y secas (disecadas) características en agar que no pueden ser emulsionadas fácil­ mente. NEISSERIA POLYSACCHAREA

N. polysaccharea se encuentra en la orofaringe humana. Este microorganismo es un diplococo gramnegativo, catalasa positi­ vo, oxidasa positivo que forma colonias amarillas lisas.538 En la descripción original, la capacidad para crecer en medios selec­ tivos (p. ej., agar MTM) fue una característica clave. Sin em­

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C A PITU LO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

bargo, estudios posteriores indicaron que el desarrollo en me­ dios selectivos para las especies de Neisseria patógenas es una característica variable en N. polysaccharea debido a la sensibi­ lidad a la colistina de algunas cepas.23 Las cepas capaces de crecer en medios selectivos tienen concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) para la colistina de 64 |*ig/mL o mayores, mien­ tras que las que son inhibidas tienen CIM para la colistina de 1 |ig/mL o menores. Los microorganismos son resistentes a la vancomicina. Después de 24 horas de crecimiento, N. polysac­ charea forma colonias de casi 2 mm de diámetro en agar san­ gre o en agar chocolate. Produce ácido de glucosa y maltosa pero no de fructosa o lactosa. La producción de ácido a partir de sacarosa varía y parece depender de los tipos de medios usa­ dos para determinar esta característica. N. polysaccharea tam­ bién tiene una amilosacarosa que sintetiza un polisacárido extracelular ácido a partir de sacarosa.104515 El polímero se compone principalmente de residuos D-glucopiranosilo unidos por enlaces a 1,4 y alrededor de un 6% de elementos de rami­ ficación O -a 4,6-D-glucopiranosilo.539 La producción de dife­ rentes cantidades del material por distintas cepas puede explicar la naturaleza variable de la reacción de la sacarosa.538-539 No reduce nitrato, mientras que el nitrito es reducido con frecuen­ cia. N. polysaccharea puede diferenciarse de N. meningitidis por la síntesis de polisacárido y las pruebas de y-glutamil ami­ nopeptidasa. N. polysaccharea produce polisacárido yodopositivo de sacarosa y es y-glutamil aminopeptidasa negativa, mien­ tras que N. meningitidis no produce polisacárido yodopositivo de sacarosa y es y-glutamil aminopeptidasa positiva.23-84 Como N. gonorrhoeae, N. lactamica, y algunas cepas de N. meningiti­ dis, N. polysaccharea son prolil aminopeptidasa positivas. El microorganismo requiere cisteína para desarrollarse y no crece en agar nutritivo o en agar chocolate a 22 °C. Aunque sus carac­ terísticas de cultivo se parecen a las de N. meningitidis, el perfil proteico de su membrana externa se asemeja al de N. lactamica más que al de las especies patógenas.111 SUBESPECIES DE NEISSERIA ELONGATA

N. elongata subespecies elongata, glycolytica y nitroredu­ cens son miembros baciliformes del género Neisseria. Las pri­ meras dos subespecies se reconocieron en la edición más reciente del Manual de Bacteriología Sistemática de Bergey como especies de Neisseria, mientras que la última subespecie, en principio conocida como grupo M-6 de los CDC, fue reclasificada recientemente en el género.89-268-721 Todas las subespe­ cies son miembros de la flora de las vías respiratorias altas humanas y han sido aisladas en pacientes con procesos infec­ ciosos.295-470-721 Estas subespecies pueden diferenciarse sobre la base de la reactividad a la catalasa, la producción de ácido de la glucosa y la reducción de nitrato (véase cuadro 11-4). NEISSERIA GONORRHOEAE SUBESPECIE KOCHII ( “NEISSERIA KOCHII”)

En 1986, se aislaron siete cepas de una Neisseria atípica de cultivos conjuntivales de niños en dos villas rurales de Egip­ t o 426 Estos aislamientos crecieron en agar chocolate y en el m e­ dio de Thayer-Martin modificado y produjeron colonias lisas y grandes que asemejaban meningococos. De modo similar a los gonococos, estos microorganismos requieren el aminoácido cisteína para crecer. Las cepas fueron oxidasa positivas, produ­ jeron ácido sólo de glucosa y fueron y-glutamil aminopeptidasa negativas. No reaccionaron con los anticuerpos monoclonales go­ nocócicos fluorescentes ni con los reactivos monoclonales para

la coaglutinación usados para las determinaciones de serova­ riedades de N. gonorrhoeae. En análisis posteriores estas cepas tenían proteínas de superficie diferentes de las variedades gonocócicas con las cuales se las comparó. Sin embargo, el análisis de plásmidos mostró homología significativa con los plásmidos encontrados por lo común en cepas gonocócicas. Los experimentos de homología de DNA mostraron similitud suficiente tanto a N. gonorrhoeae como a N. meningitidis', sobre esta base, los investigadores percibieron que esos aisla­ mientos no representaban una especie nueva sino más bien una subespecie de N. gonorrhoeae. Dado que estas cepas podrían ser identificadas como N. gonorrhoeae en un laboratorio clíni­ co y que su sitio de aislamiento y el patrón de utilización de hidratos de carbono eran similares a los observados en los gonococos, se los ha llamado N. gonorrhoeae subespecie kocchii o “N. kocchi ”.426 Esta especie todavía no ha sido adoptada formalmente. ESPECIES DE NEISSERIA NO HUM ANAS Y ATÍPICAS

Las especies de Neisseria con perfiles serológicos o bioquí­ micos inusuales o atípicos están siendo reconocidas de manera creciente. Hodge y cois, aislaron un microorganismo que fue bioquímicamente un meningococo, incluso reaccionó con los reactivos de inmunofluorescencia de anticuerpos monoclonales y con los de coaglutinación para N. gonorrhoeae ,294 Janda y cois, aislaron cepas de N. subflava bv. perflava de cultivos orofaríngeos de varones homosexuales que crecieron en forma abundante en un medio selectivo (agar de Thayer-Martin modi­ ficado).320-322 En las pruebas de sustratos cromogénicos, estos microorganismos fueron identificados como N. gonorrhoeae basándose en la reacción hidroxiprolil aminopeptidasa positiva y en las reacciones (¡S-galactosidasa y y-glutamil aminopeptida­ sa negativas. Una caracterización más completa de las cepas de neiserias aisladas, en particular las halladas en pacientes inmu­ nodeprimidos, puede detectar formas inusuales o anómalas en el futuro. En ocasiones, en el laboratorio microbiológico clínico se aís­ lan especies de Neisseria de origen animal a partir de infeccio­ nes humanas, como heridas por mordedura de animales. Estas especies pueden incluir N. weaveri, N. canis, N. denitrificans y miembros de la falsa neisseria. Todos estos microorganismos muestran una morfología diplocócica gramnegativa típica excepto N. weaveri, que es un bacilo gramnegativo. Las reac­ ciones bioquímicas para estos microorganismos también se presentan en el cuadro 11-4.

Características del cultivo e identificación de Moraxella catarrhalis M. catarrhalis crece bien tanto en agar sangre como en agar chocolate y algunas cepas también crecerán bien en MTM y en otros medios selectivos. Las colonias por lo general son blanco grisáceas, opacas y lisas. También se describió un medio selec­ tivo que incorpora acetazolamida como inhibidor de otra flora del aparato respiratorio.684 El microorganismo es asacarolítico en las pruebas de degradación de hidratos de carbono y por lo común puede volver alcalino el medio de identificación a base de peptona. La mayoría de las cepas reducen nitrato y nitrito y producen D Nasa.192 La actividad DNasa se detecta a través de la inoculación concentrada en un área del tamaño de una mone­ da sobre la placa del medio para la prueba de DNasa que con­ tiene azul de toluidina 0 (lámina en color 11-2F). Después de

S ensibilidad de las especies de N eisseria a los antibióticos La incubación durante toda la noche, la hidrólisis del DNA se detecta por un cambio en el color del medio alrededor y debael inóculo de azul a rosa. También se inoculan las cepas de 5 aureus y S. epidermidis en la placa como controles positivos > negativos de la prueba, respectivamente. .V/. catarrhalis también puede distinguirse de las especies de Neisseria por su capacidad para hidrolizar el enlace éster de los grupos butirato (butirato estearasa).615 Véase lámina en color 9-2H. Esta actividad enzimática se detecta con un sustrato lla­ mado tributirina. Una prueba rápida de hidrólisis de tributirina fluorescente que usa 4-metilumbeliferil butirato como sustra­ to fue informada por Vaneechoutte y cois.683 En este estudio, las 62 cepas de M. catarrhalis fueron positivas con esta prue­ ba dentro de los 5 minutos, mientras que todas las otras espe­ cies de Neisseria probadas fueron negativas. Se describió una prueba muy rápida (2,5 minutos) y confiable de hidrólisis de índoxil-butirato que se comercializa (Remel®Laboratories; Carr-Scarbourough. Stone Mountain, GA; lámina en color 112G 402 Esta misma prueba también se incluyó en el BactiCsrá-Neisseria junto con los otros tres sustratos cromogénicos para la identificación de Neisseria (véase lámina en color 112A . - El sistema Rapad NH también contiene una prueba de "idrólisis del éster del ácido graso para ayudar en la identifica­ ción de M. catarrhalis. El indoxil acetato, que se usa para la : Jentificación de especies de Campylobacter, también puede „sarse como sustrato para la enzima estearasa de M. catarrhaHs ¡20.615 Además, la mayoría de las cepas de M. catarrhalis clí­ nicamente significativas producen una P-lactamasa asociada con la célula, inducible (véase más adelante).196 Debido a su naturaleza inducible, las pruebas rápidas de P-lactamasa acidométricas (que se basan en la conversión de la hidrólisis de la penicilina en ácido peniciloico) pueden producir resultados fal­ sos negativos. Los mejores resutados se obtienen con el método yodométrico con la prueba de la cefalosporina cromogénica.447 Con el reconocimiento de M. catarrhalis como un patógeno primario en ciertos medios clínicos y ante la sospecha de que puedan ocurrir infecciones hospitalarias por este microorganis­ mo. se han investigado métodos para la tipificación de las cepas.309-454 como biotipificación enzimática, electroforesis en gel de poliacrilamida de proteínas de células completas, análi­ sis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restric­ ción obtenidos con endonucleasas.418-429-454 Estas técnicas han sido aplicadas a investigaciones de brotes de enfermedad del aparato respiratorio en unidades de cuidados intensivos en los Estados Unidos y en otros países.494-531 Dos de los métodos de ti­ pificación de DNA, el análisis de polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción obtenidos con endoncleasas ge­ nerados por sondas y el análisis de fragmentos polimorfos modificados por simple adaptador, se usaron recientemente para demostrar la existencia de dos subgrupos dentro de M. catarrhalis que pueden representar subespecies separadas.78

Sensibilidad de las especies de Neisseria a los antibióticos Neisseria gonorrhoeae

A poco de su descubrimiento durante la década de 1940, la penicilina se convirtió rápidamente en el tratamiento de elec­ ción para la gonorrea. Desde la década de 1950 hasta mediados de los años setenta, los programas de tratamiento con penicili­ na fueron actualizados en forma regular para conservar la resis­

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tencia creciente al fármaco y se usaron otros antibióticos (p. ej., tetraciclinas y macrólidos) para el tratamiento. El aumento de la resistencia obedeció a mutaciones en varios genes cromosómicos, como mtr y env, que codifican proteínas que participan en el flujo de sustratos y en la permeabilidad de la membrana, y penA, que codifica la proteína 2 de unión a la penicilina. En 1976, las cepas de N. gonorrhoeae con elevado nivel de resis­ tencia a la penicilina fueron llevadas a los Estados Unidos desde Africa Occidental y el Lejano Oriente. Estas cepas con­ tenían plásmidos que transportaban genes para una enzima P-lactamasa y se les dio el nombre de "PPNG" por ser X. gono­ rrhoeae productora de penicilinasa.301 Entre 1976 y 1979. las cepas PPNG fueron asociadas con brotes esporádicos en los Estados Unidos y, entre 1979 y 1982, el número de casos de gonorrea causados por cepas PPNG aumentó 15 veces, con grandes brotes en Nueva York, Los Ángeles y Miami. Desde mediados de la década de 1980, las cepas PPNG se volvieron endémicas en varias áreas metropolitanas de los Estados Unidos.711 En la actualidad, se recomienda el uso de espectinomicina para el tratamiento de estas infecciones. Sin embargo, hacia 1981 se había informado sobre cuatro cepas de N. gonorrhoeae resistentes a la espectinomicina y más tarde tam­ bién aparecieron cepas de PPNG resistentes a ese agente 37,5ii,736 £ sa resistencia se debe a una mutación en un solo paso en el RNA 16S ribosómico (rRNA) que produce una ele­ vada resistencia (CIM de 256 Ug/mL o mayores).245 En 1983, se produjo un brote causado por gonococos P-lac­ tamasa negativos, resistentes a la penicilina en Carolina del N orte.130 Estas cepas carecían del plásmido P-lactamasa y fue­ ron negativas en las pruebas para la detección de P-lactamasa. Su elevado nivel de resistencia a la penicilina se debió a muta­ ciones cromosómicas en el loci que contribuye a la resistencia a los antibióticos y se las designó N. gonorrhoeae resistentes mediadas cromosómicamente (CMRNG). En octubre de 1984, se informaron a los CDC 446 casos de infecciones por CMRNG de 23 estados que se habían sometido a un cribado para este tipo de resistencia.527 Las cepas CMRNG tienen CIM de penicilina mayores de 1 jig/mL, y el 75% de ellos, CIM ma­ yores de 2 pg/mL. Las CMRNG también son moderadamente resistentes a la tetraciclina (CIM > 2 pg/mL), muestran sensi­ bilidad disminuida a eritromicina, cefoxitina y trimetoprimsulfametoxazol, y a menudo son sensibles a espectinomicina y ceftriaxona. En 1985, los CDC informaron sobre 12 cepas de N. gonorr­ hoeae aisladas en Georgia, Pensilvania y New Hampshire de pacientes en quienes la terapia con tetraciclina había fracasado (N. gonorrhoeae resistente a la tetracilina [TRNG]).1’ La prue­ ba de sensibilidad por dilución en agar mostró un nivel eleva­ do de resistencia a la tetraciclina (CIM de 16 a 32 pg/mL i y a la doxiciclina (CIM de 8-32 pg/mL), pero con sensibilidad a la penicilina (CIM de 0.008 a 0,25 pg/mL), la espectinomicina y la cefotaxima. Estas cepas también son moderadamente resis­ tentes a cefoxitina. Estudios actuales han determinado que N. gonorrhoeae resistente a la tetraciclina (TRNG) hospeda un plásmido de 25,2 mDa construido por la inserción de un deter­ minante de resistencia a la tetraciclina (tetM ) en el plásmido conjugativo de 24,5 mDa encontrado en algunas cepas gonocó­ cicas.364-456 Este gen asociado con el transposón también se halló en estreptococos, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Gardenerella vaginalis, Kingella denitrificans, Eikenella corrodens y algunas N. meningitidis.358-541-667 El plás­ mido conjugativo que transporta el determinante tetM puede ser transferido a cepas de N. gonorrhoeae receptoras por trans­ formación o conjugación.541-542 Se cree que el determinante

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C APÍTULO 11

Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis

tetM codifica una proteína o proteínas que interactúan con el ribosoma gonocócico para impedir la inhibición de la síntesis proteica por tetraciclina. Con la caracterización de estas cepas resistentes, los investi­ gadores de los CDC han delineado cinco fenotipos de resisten­ cia en cepas de N. gonorrhoeae.528 Estos fenotipos son 1) cepas sensibles a la penicilina (CIM < 2 p.g/mL), 2) cepas producto­ ras de penicilinasa (PPNG, P-lactamasa positiva), 3) cepas con nivel elevado de resistencia a la tetraciclina mediada por plás­ midos (TRNG, CIM > 2 |ig/mL) que tienen el determinante tetM. 4) cepas con resistencia a la penicilina mediada cromosómicamente (CMRNG. CIM > 2 (ig/mL) y 5) cepas con nivel elevado de resistencia a la penicilina y a la tetraciclina media­ da por plásmido (P-lactamasa positiva con el determinante tetM). La aparición y la diseminación de otros determinantes de resistencia entre estos cinco fenotipos forman las bases de la implementación de la vigilancia gonocócica conducida por todos los Estados Unidos por los CDC.139-140-264 A causa de la resistencia creciente de N. gonorrhoeae a los antibióticos ya comentada y sobre la base de varios estudios clínicos de eficacia controlados, el Servicio de Salud Pública de los Estados Unidos recomienda que todos los pacientes con infecciones gonocócicas no complicadas reciban uno de los cinco regímenes de tratamiento de dosis única.142 Estos son cef­ triaxona (125 mg por vía intramuscular), y cefixima (400 mg), ciprofloxacina (500 mg), ofloxacina (400 mg) y levofloxacina (250 mg) todos por vía oral. Cada una de estas terapias incluye también azitromicina (1 g por vía oral) o doxiciclina (100 mg, dos veces por día durante 7 días por vía oral) para el trata­ miento de la coinfección por Chlamydia trachomatis. Las mujeres embarazadas deben ser tratadas con ceftriaxona (250 mg por vía intramuscular) seguida de 7 a 10 días de eritromici­ na, porque las cefalosporinas orales no han sido estudiadas en esta población, y las quinolonas y las tetracicilinas están con­ traindicadas en las embarazadas. En las PHS Treatment Guidelines también se han incluido regímenes adicionales para pacientes internadas y ambulatorias con salpingitis e infeccio­ nes gonocócicas diseminadas, ya sea hospitalizados o ambula­ torios. 142 En la actualidad, no se ha identificado resistencia sig­ nificativa a las cefalosporinas para los tratamientos recomen­ dados de infecciones gonocócicas.239-342 Aun cuando no se haya observado resistencia a las nuevas cefalosporinas, el surgimiento de cepas de N. gonorrhoeae con sensibilidad disminuida a las fluoroquinolonas es problemáti­ co.240 En Europa, las fluoroquinolonas como la ciprofloxacina se usaron para el tratamiento de infecciones gonocócicas a finales de la década de 1980 y a principios de 1990, se obser­ vó en el Reino Unido el fracaso de ese tratamiento.267 Más tarde, se documentaron fracasos similares en pacientes tratados con fluoroquinolonas en el Lejano Oriente, Canadá. Australia y los Estados Unidos.132-138-338-643,644 La prueba de sensibilidad antimicrobiana de cepas gonocócicas de pacientes en quienes la terapia oral con 250 mg de ciprofloxacina no obtuvo buenos resultados tenían una CIM para ciprofloxacina de 0,06 a 0,25 pg/mL, mientras que las cepas de infecciones tratadas con 500 mg orales de ciprofloxacina o 400 mg de ofloxacina tenían una CIM > 1 |J.g/mL y 2 |ig/mL, respectivamente.267-337-338-643-644 Sobre la base de los niveles séricos pico alcanzados después de la administración oral, los CDC propusieron criterios para la interpretación de sensibilidades in vitro a ciprofloxacina, oflo­ xacina y otras fluoroquinolonas. Las cepas con resistencia intermedia a ciprofloxacina y ofloxacina tienen CIM de 0,125 a 0,5 Ug/mL y de 0,5 a 1 |ig/mL, respectivamente. Las cepas resistentes a ciprofloxacina y ofloxacina tienen CIM > 1 pg/mL

y > 2 pg/mL, respectivamente.355Las cepas de A7, gonorrhoeae que han disminuido la sensibilidad o que son resistentes a ciprofloxacina y ofloxacina se han documentado en diversas regiones geográficas, entre ellas Canadá, Australia, Hong Kong, Japón, Tailandia, las Filipinas, España, el Reino Unido y los Estados Unidos.132158-354,359,362-363'537-641-644 Algunas de estas cepas tienen CIM para ciprofoxacina de hasta 2 pg/m L.354,359 Las cepas altamente resistentes a las fluoroquinolonas se recu­ peraron de pacientes que habían viajado al sudeste asiático o eran contactos sexuales de individuos que habían estado allí. Estas cepas también eran resistentes a la penicilina y muchas lo eran, además, a la tetraciclina, pero todas eran sensibles a cef­ triaxona y cefixima. En la mayoría de estas regiones, la preva­ lencia de cepas con sensibilidad disminuida o resistencia a las fluoroquinolonas está en aumento. Las cepas resistentes a la fluoroquinolona tienen mutaciones de genes que derivan en sustituciones de aminoácidos en las subunidades A y B (GyrA y GyrB, respectivamente) de la DNA girasa, y en la subunidad que codifica parC de la topoisomerasa IV.57-179-621 La disminución de la sensibilidad y la resistencia a las fluo­ roquinolonas de N. gonorrhoeae pronostican que la utilidad de esos agentes para el tratamiento de la gonorrea necesitará revisión en un futuro cercano.240 La vigilancia adicional de la sensibilidad antimicrobiana gonocócica en determinados gru­ pos de pacientes (p. ej.. mujeres con enfermedad inflamatoria pelviana u otras complicaciones) que puedan recibir otros anti­ bióticos (p. ej., cefoxitina. clindamicina, metronidazol, y gen­ tamicina) también es necesaria para evitar la emergencia de resistencias clínicamente importantes.529 Aunque la azitromici­ na no es un tratamiento recomendado para la gonorrea, puede ser útil en regiones donde la resistencia a la quinolona es prevalente. Para la terapia con azitromicina, se recomienda un régimen oral de 2 g más que el régimen de 1 g usado para el tratamiento de infecciones por clamidia. Los fracasos clínicos siguientes al tratamiento con regímenes de 1 g y 2 g de azitro­ micina se han asociado con cepas que tienen CIM para azitro­ micina de 0,125-0,25 Ug/mL y < 0,5 pg/mL, respectivamen­ te.284-646 En algunas regiones de los Estados Unidos se comunicó el aislam iento de gonococos poco sensibles a la azitromicina (CIM > 1 pg/mL).138-139 Los CDC también han efectuado recomendaciones sobre indicaciones y métodos para probar la sensibilidad a los anti­ bióticos de N. gonorrhoeae, los cuales se refieren más a una mayor vigilancia de los patrones de resistencia gonocócica que al manejo de pacientes individuales. En 1989, se publicó un estudio multicéntrico en el que se determinaron los criterios interpretativos para la dilución en agar y la difusión con discos para penicilina, tetraciclina, espectinomicina y ceftriaxona.329 Las guías para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos de N. gonorrhoeae han sido publicadas y son actualizadas conti­ nuamente por el National Committee on Clinical Laboratory Standards (NCCLS) 469 En la actualidad, los puntos de corte de la dilución en agar y la difusión con discos de N. gonorrhoeae están disponibles para penicilina, cefalosporinas parenterales, cefalosporinas orales (p. ej., cefixima), tetraciclina, fluoroqui­ nolonas y espectinomicina.469 Además de la dilución en agar y la difusión con discos, la prueba E (AB Biodsk®, Solna, Noruega) ha sido usada para determinar la sensibilidad a los antibióticos de N. gonorrhoeae.682-728 Neisseria meningitidis

A pesar de la recuperación ocasional de cepas de N. menin­ gitidis con sensibilidad disminuida a la penicilina, la penicilina

S ensibilidad de las especies de N eisseria a los antibióticos G - cue siendo el fármaco de elección en los Estados Unidos para el tratamiento de la meningitis meningocócica, porque la eran mayoría de las cepas son sensibles a la penicilina y a la ampicilina.134 Para el tratamiento de infecciones meningocóci­ cas graves, se administra penicilina G parenteral (300 000 l'k g /d ía ) durante 10 a 14 días. El cloranfenicol (100 mg • g dial hasta 4 g/día es una alternativa para los pacientes - ; . eos a la penicilina. Las cefalosporinas de tercera genera­ ción (cefotaxima, ceftriaxona, ceftizoxima y ceftazidima) alcanzan niveles en LCR que son varios miles de veces la CIM ie la cepa infectante, y estos antibióticos se han usado con ¿xit en el tratamiento de la enfermedad meningocócica; la ceftnaxona (niños, 50 mg/kg/día hasta 4 g; adultos, 2 g/día) es un -rg.men parenteral generalmente recomendado. Además de la terapia con antibióticos, los pacientes con enfermedad mening.cocica grave requieren cuidados intensivos, incluido el -a n e jo del estado de shock y el control cuidadoso de los sig- - \itales para la detección de complicaciones (p. ej., síndro­ me ie dificultad respiratoria aguda, secuela neurológica, peri­ carditis) y progresión de la enfermedad (p. ej., estudios para cetectar coagulación intravascular diseminada).119-680 Las nueas terapias complementarias, como la proteína recombinante b -mana que aumenta la permeabilidad y de acción bactericida. >e muestran promisorias en la prevención de la falla multiorgánica debido a la endotoxemia.260 Otros agentes biológicos, . mo los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la endotoxina o contra citocinas involucradas en el shock séptico meningocócico (p. ej., IL-1. IL-6, T N F-a) también pueden ^ e m p e ñ a r un papel como intervenciones terapéuticas complementarias.93-182-680-699 No obstante el hecho de que la gran mayoría de las cepas, en particular en los Estados Unidos, continúan siendo sensibles a la penicilina, se ha acumulado evidencia que muestra que los perfiles de sensibilidad a los antibióticos de las cepas de N. meningitidis también están evolucionando. Históricamente, las -ípas de N. meningitidis sensibles a la penicilina tienen una CIM para penicilina < 0,06 pg/mL. En 1983, Dillon y cois, ais­ laron en Canadá la primera cepa meningocócica productora de o-lactamasa de una muestra urogenital.189 Esta cepa albergaba el plásmido p-lactamasa de 4,5 Mda gonocócico y el plásmido conjugativo de 24,5 Mda. Posterior a este caso, sólo se han publicado tres aislamientos de N. meningitidis productora de 3-lactamasa: dos cepas se aislaron en 1988 de dos pacientes con meningitis en Sudáfrica y la cuarta fue recuperada en 1989 ie una paciente en España.83-237-561 Las cepas P-lactamasa positivas tienen CIM para penicilina mayores de 256 pg/mL. En 1987. se aisló una cepa de N. meningitidis que había disminuido su sensibilidad a la penicilina (CIM > 0,06 pg/mL), pero cue era P-lactamasa negativa.563 Estas cepas se mencionan como relativamente resistentes, moderadamente sensibles o con sensibilidad disminuida a la penicilina. Desde aquel momento, se han informado otros aislamientos con caracterís­ ticas similares en el Reino Unido, Europa, Grecia, Sudáfrica y los Estados Unidos.71-100-314-632-670-675-687-724 En España, la frecuen­ cia de aislamiento de estas cepas ha aumentado del 0,4% en 1985 al 67% en 1994, mientras que la frecuencia de estas cepas en el Reino Unido permanece estable en alrededor del 9%.35236 En 1997, la vigilancia activa realizada por los CDC acumuló 90 aislamientos de 121 casos de enfermedad meningocócica infor­ mada. De ellos, tres (< 3%) fueron moderadamente sensibles a la penicilina con una CIM de 0,12 pg/m L.551 De las 87 cepas sensibles a la penicilina restantes, 49 tenían una CIM de 0,06 ug/mL; las variedades con sensibilidad disminuida tenían CIM que iban de 0,10 pg/mL a 1 pg/m L.551-564 Las variedades resis­

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tentes se definen como las que tienen una CIM para penicilina > 2 pg/mL. La mayoría de los meningococos relativamente resistentes que se han informado pertenecen a los serogrupos B o c .35-60-71-236 La resistencia a penicilina/ampicilina también puede surgir durante la terapia con estos antibióticos. En el informe de un caso interesante, se aisló una cepa de iV. menin­ gitidis del serogrupo W-135 resistente a la ampicilina en los hemocultivos de una mujer de 82 años con shock séptico mor­ tal.263 Los aislamientos iniciales de sangre y esputo eran sensi­ bles a la penicilina (CIM = 0,05 pg/mL) y ía ampicilina (0.016 pg/mL). A pesar de los 7 días de terapia con ampicilina en altas dosis, la paciente murió. La cepa aislada en la sangre 7 días después de la internación se había vuelto moderadamente resis­ tente tanto a penicilina (CIM = 1 pg/mL) como a la ampicilina (CIM = 1,2 pg/mL). La sensibilidad disminuida a la penicilina en las cepas de N. meningitidis moderadamente resistentes se debe a una re­ ducción de la unión del antibiótico causada por alteración de las proteínas de unión a la penicilina (PBP 2 y PBP 3) de la pared celular m eningocócica.435 En el caso de las proteínas PBP 2, la unión disminuida de la penicilina resulta de una secuencia de nucleótidos alterada del gen de PBP 2, penA. " Las formas de baja afinidad similares de PBP 2 se encuentran en cepas resistentes a la penicilina de otras especies de Neisseria, entre ellas N. lactamica, N. flavescens, N. polysac­ charea y N. gonorrhoeae. Las formas de PBP 2 de baja afini­ dad alteradas en las cepas de N. meningitidis surgen de eventos de recombinación que derivan en el reemplazo de secuencias en el gen penA meningocócico nativo con material genético correspondiente de especies de Neisseria comensales.90-564-565-616 La importancia clínica de la sensibilidad a la penicilina dis­ minuida en N. meningitidis no está clara hasta ahora. Aunque se han observado fracasos en el tratamiento y altas tasas de complicaciones en pacientes infectados con cepas relativamen­ te resistentes, la administración de dosis mayores de penicilina ha sido clínicamente eficaz.560-668 Ciertas cefalosporinas de ter­ cera generación, como ceftriaxona y cefotaxima, son activas contra las cepas de N. meningitidis sensibles y moderadamen­ te sensibles, pero las CIM de algunos antibióticos para estas últimas -e n particular, cefuroxima, aztreonam e imipenem pueden ser más elevadas que las de las cepas sensibles.41'9 Meropenem es muy activo contra los meningococos, con más del 90% de las cepas inhibidas por < 1 pg/m L.3-504 Las cepas de N. meningitidis también han mostrado resisten­ cia a otros antibióticos. Se informó un nivel elevado de resis­ tencia a cloranfenicol en aislamientos en Francia y Vietnam.246 El temor a la diseminación de la resistencia al cloranfenicol está justificado porque el fármaco es el pilar del tratamiento de la meningitis en el Africa subsahariana.611 Ahora está disemi­ nado el elevado nivel de resistencia a las sulfonamidas. el fár­ maco usado antes para la profilaxis y es común encontrarlo entre ciertos clones epidémicos del serogrupo A de N. menin­ gitidis.6" En un estudio llevado a cabo en España, el 43.6% de las 55 cepas tanto de casos como de portadores eran resistentes a trimetoprim-sulfametoxazol.236 El surgimiento de la resisten­ cia a la rifampicina se observó incluso durante la administra­ ción de profilaxis con rifampicina.166La resistencia a la rifampicina surge debido a alteraciones en la permeabilidad de la membrana celular o a mutaciones en el gen rpoB que codifica la subunidad P de la RNA polimerasa meningocócica.2 En 2000, se aisló en Australia una cepa de N. meningitidis con sen­ sibilidad disminuida a la ciprofloxacina (CIM de 0,25 pg/mL) de una mujer de 19 años que tenía una enfermedad meningo­ cócica invasora.587 Las cepas sensibles tienen una CIM para

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ciprofloxacina < 0,03 |ig/mL. La amplificación por PCR y la secuenciación del gen gyrA de este aislamiento revelaron una diferencia de tres nucleótidos con las cepas sensibles a la ciprofloxacina tipo silvestre. Se ha mencionado la adquisición por N. meningitidis del determinante a la resistencia a tetraci­ clina, tetM.661 La prueba de sensibilidad a los antibióticos de N. meningiti­ dis es dificultosa y las determinaciones de CIM son los méto­ dos de elección.648 No están disponibles los estándares acepta­ dos y los puntos de corte para N. meningitidis, y las evaluacio­ nes de los métodos de difusión con discos usando discos de penicilina, oxacilina, ampicilina y rifampicina han dado resul­ tados decepcionantes.70'109 110-305'500 El NCCLS recomienda la microdilución en caldo o la dilución en agar para la determina­ ción de la CIM de N. meningitidis usando caldo de MuellerHinton suplementado con cationes con 2-5% de sangre de caballo lacada o agar de Mueller-Hinton con 5% (v/v) de san­ gre de carnero, respectivamente.469 La prueba E también puede resultar valiosa para determinar la sensibilidad a los antibióti­ cos de aislamientos meningocócicos individuales.305-500 En algunos informes publicados sobre sensibilidad meningocócica a otros antibióticos, a menudo se usan los puntos de corte de las CIM de N. gonorrhoeae para la interpretación.35 Como la mayoría de los laboratorios microbiológicos clínicos no están equipados para realizar las pruebas de dilución en agar, los meningococos aislados en pacientes que no responden a la qui­ mioterapia antibiótica apropiada y algunos que se presumen resistentes a la penicilina deben probarse para la producción de p-lactamasa con la prueba de cefalosporina cromogénica (Nitrocefin®, BD Biosciences) y remitirse a un laboratorio de referencia para la prueba de sensibilidad por dilución en agar. Puesto que no se han establecido los criterios del tamaño de la zona para otras especies de Neisseria, el método de dilución en agar es el de elección para la determinación de la sensibili­ dad a los antibióticos. Hay informes anecdóticos de que el pro­ cedimiento de difusión con discos, el procedimiento de dilu­ ción en agar y los criterios de interpretación publicados por el NCCLS para gonococos también pueden utilizarse para otras especies de Neisseria.469 Aunque estos microorganismos suelen crecer bien en el agar de Muller-Hinton suplementado con san­ gre recomendado por el NCCLS, algunas cepas pueden reque­ rir una suplem entación del medio con aditivos como IsoVitalex®.

Sensibilidad a los antibióticos de Moraxella catarrhalis La aparición y la diseminación de la resistencia a los anti­ bióticos entre Neisseria patógenas también están reflejadas en la sensibilidad a los antibióticos de los aislamientos de M. catarrhalis. Antes de mediados de la década de 1970, este microorganismo era muy sensible a los antibióticos. M. catarr­ halis p-lactamasa positiva fue aislada por primera vez en 1976; hacia finales de esa década, cerca del 75% de las cepas produ­ cían enzimas P-lactamasa. Un estudio de Doern y Tubert mos­ tró que las pruebas en tubo y con disco de cefalosporina cro­ mogénica (Nitrocefin®) tenían una sensibilidad superior para la detección de p-lactamasa cuando se las comparaba con las pruebas que usan cefalosporina piridin-2-azo-p-dimetilanilina (PADAC), los procedimientos acidométricos y yodométricos en tubo y con disco.196 En el laboratorio clínico, las cepas de M. catarrhalis deben ser probadas para la producción de p-lac­ tamasa, de preferencia con la prueba de cefalosporina cromo­ génica.447

Las pruebas de sensibilidad a la ampicilina de dilución en caldo para aislamientos de M. catarrhalis pueden dar resulta­ dos confusos. Algunas cepas productoras de P-lactamasa ten­ drán CIM elevadas para ampicilina (12,5 a 25 |ig/mL), mien­ tras que otras tendrán CIM bajas (0,10 a 0,40 p,g/mL). Las pruebas de dilución en caldo para ampicilina para las últimas cepas son dependientes del inoculo.727 Con inóculos más pequeños (104 UFC/mL), estas cepas se muestran sensibles a la ampicilina y a otros P-lactámicos. Con inóculos mayores (107 UFC/mL), tienen CIM más elevadas y son resistentes. El efec­ to inoculo se observó para ampicilina, penicilina G, cefalotina, cefamandol, cefuroxima y cefaclor. Estudios de las enzimas P-lactamasa de M. catarrhalis han mostrado la existencia de dos tipos de enzimas en las cepas de estos microorganismos.701702 BRO-1 (o tipo Ravisio) y BRO-2 (o tipo 1908).308,702 Una tercera enzima p-lactamasa, BRO-3, fue descrita por Christensen y cois, en 1991, pero ahora se sabe que es un precursor unido a la membrana de las otras enzimas BRO .152,622 El nombre “BRO” es una contracción de “BRanhamella y mOraxella”, debido a que se han encontrado P-lactamasas similares en moraxellas baciliformes.701 Las cepas de M. catarrhalis producen BRO-1 o BRO-2 y estas enzimas pueden diferenciarse por isoelectroenfoque. Las cepas que producen enzimas PRO-1 dan cuenta de casi el 90% de los aislamientos de M. catarrhalis productores de P-lactamasa de muestras clínicas, mientras que las productoras de BRO-2 constituyen el 10% restante.203-701 El análisis molecular de la producción de P-lactamasa indica que la enzima BRO-1 está codificada por un gen cromosómico único (bla) que codifica un polipéptido de 314 aminoácidos.80 El análisis de la secuencia de los genes bla de las cepas productoras de BRO-1 y BRO-2 difiere en cinco bases de nucleótidos que deriva en un solo resi­ duo aminoácido de diferencia en las secuencias de aminoáci­ dos de las enzimas BRO-1 y BRO-2. Sin embargo, se encontró una deleción en el par de bases 21 en la región del promotor del gen BRO-2. Las diferencias en las CIM de las cepas de M. catarrhalis productoras de B R O -1 y BRO-2 pueden explicarse por los niveles más bajos de producción de BRO-2 debidos a la deleción en la región del promotor, mientras que la estructura y las actividades enzimáticas de las dos enzimas son simila­ res.80 Los pacientes que han estado infectados con cepas de M. catarrhalis productoras de P-lactamasa BRO-2 también han respondido clínicamente a la penicilina y la ampicilina. La BRO-1 tiene un peso molecular de casi 32,5 kDa. Las varia­ ciones en el peso molecular informado de esta enzima, que oscilan desde 28 kDA hasta 41 kDa, se explican por la presen­ cia de formas de BRO-1 libres y asociadas con lípidos.77La prevalencia de cepas que producen enzimas BRO-1 o BRO-2 también difiere. Entre los aislamientos clínicos de M. catarr­ halis recolectados en estudios de vigilancia multicéntricos durante 1994-1995 y durante 1997-1998, la prevalencia de cepas productoras de BRO-1 y BRO-2 fueron del 97,5% y el 2,5%, respectivamente.533 El gen bla puede estar asociado con transposón y ser transferible por mecanismos conjugativos o transformacionales.79-339-702 Los estudios in vitro indican que las P-lactamasas de M. catarrhalis pueden intervenir indirecta­ mente en la virulencia al inactivar la penicilina o la ampicilina administradas por otras infecciones respiratorias, como la neu­ monía neumocócica.296 Varios estudios llevados a cabo en los Estados Unidos y en el exterior señalan que las cepas de M. catarrhalis son casi siempre sensibles a amoxicilina-clavulanato, cefalosporinas de segunda y tercera generación (cefuroxima, cefotaxima, ceftrianona, cefpodoxima, ceftibuteno y los antibióticos orales cefixi-

R eferencias \ cefaclor). macrólidos (azitromicina, claritromicina, eriiromicina), tetraciclinas y rifampicina.72'99-195,224,568-653'654'700'737 Mientras que la mayoría de las cepas son sensibles a las fluo­ roquinolonas (incluidas ciprofloxacina, levofloxacina, esparfloxacina. grepafloxacina, trovafloxacina y gemifloxacina), la resistencia a las fluoroquinolonas ha surgido en aislamientos obtenidos de pacientes que recibían esos fármacos durante períodos prolongados. 122.175.>83,i9o,4i9,5i2 Q )n excepción de las variaciones de producción de p-lactamasas, no se han señalado diferencias notorias en las sensibilidades a los antibióticos de las cepas de M. catarrhalis aisladas en distintos países (entre ellos Japón, el Reino Unido, Alemania, España, Francia, Italia y los Estados Unidos).568 Algunas cepas raras de M. catarrha­ lis pueden ser resistentes a tetracicilinas, macrólidos o trimetroprim-sulfametoxazol.653,737 En el capítulo 17 se presenta una información más detallada acerca de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos para estos microorganismos.

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Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

Taxonomía de los estafilococos y de los cocos grampositivos relacionados Importancia clínica de los estafilococos y de los cocos grampositivos relacionados Staphylococcus aureus subesp. aureus Estafilococos coagulasa negativos Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophytlcus subesp. saprophyticus Otros estafilococos coagulasa negativos

Especies de Micrococcus y géneros relacionados Rothia mucilaginosa

Aislamiento y diferenciación preliminar de los estafilococos y de los cocos grampositivos relacionados Frotis directos con tinción de Gram Aislamientos en muestras clínicas Morfología de la colonia La prueba de la catalasa Métodos para la diferenciación de micrococos y estafilococos

Identificación de Staphylococcus aureus Prueba de la coagulasa en portaobjetos Prueba de la coagulasa en tubo Procedimientos alternativos para la prueba de la coagulasa Aglutinación del látex Hemaglutinación pasiva

Pruebas confirmatorias adicionales Prueba de la desoxirribonucleasa (DNasa) Prueba de la endonucleasa termoestable Fermentación del manitol

Otros métodos para la identificación de Staphylococcus aureus Pruebas rápidas de detección de resistencia a la meticilina Diferenciación de estafilococos coagulasa positivos de origen veterinario

Identificación de estafilococos coagulasa negativos Métodos de identificación convencionales Producción de fosfatasa para la identificación de Staphylococcus epidermidis Actividad pirrolidonil arilamidasa Sensibilidad a la polimixina B

Fermentación de la glucosa

Prueba de ornitina descarboxilasa (ODC)

Sensibilidad a la lisostafina

Producción de ureasa

Producción de ácido a partir del glicerol en presencia de eritromicina

Producción de acetoína

Sensibilidad a la turazolidona Prueba de la oxidasa modificada Sensibilidad a la bacitracina

Sensibilidad a la deferoxamina

Sensibilidad a la novobiocina para la identificación de Staphylococcus saprophyticus 593

594

C A P ÍT U L O 12

Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

Sistemas de identificación comerciales

Staph-Zym®

RapiDEC Staph®

Microbact Staphylococcal 12S®

API Staph-IDENT®

Microbial Identification System®

API Staph® API ID32 Staph® Tarjeta para la identificación parade grampositivos Vitek (GPI)® Panel MicroScan Rapid Pos Combo® Panel MicroScan Pos ID® Sistema BBL Cristal para la identificación de grampositivos (GP)® Sistema staf 18-R®

on la excepción de Enterobacteriaceae, las bacterias grampositivas, en particular los cocos, son los microorganismos aislados con mayor frecuencia en muestras clínicas. Estas bacterias están diseminadas en la naturaleza y pueden hallarse en el medioambiente o como comensales de la piel, las mucosas y otros lugares del cuerpo en seres humanos y animales. La ubicuidad de estas bacterias grampositivas en la naturaleza hace difícil la interpretación de su aislamiento en muestras ocasionales de pacientes aun cuan­ do que se presenten manifestaciones clínicas de un proceso infeccioso. La recuperación de estos microorganismos en muestras siempre debe correlacionarse con la condición clíni­ ca del paciente antes de que se pueda establecer su papel en un proceso infeccioso. Aunque las bacterias grampositivas pueden causar infección por multiplicación tanto local como sistémica, algunas pueden multiplicarse en un sitio localizado y ejercer sus efectos pató­ genos mediante la producción de exotoxinas o enzimas que actúan a distancia. Las toxinas estafilocócicas son responsables de la intoxicación alimentaria, el síndrome de la piel escaldada y el síndrome de shock séptico. El síndrome de shock tóxico estreptocócico (cap. 13) es una entidad clínica en la cual los signos y los síntomas de infección y los rasgos patológicos de la enfermedad se deben en gran parte a los efectos de las exo­ toxinas. Por otro lado, las bacterias gramnegativas tienen endotoxina, que es la porción lipídica del lipopolisacárido de la membrana externa. Las infecciones sistémicas por las bacterias gramnegativas pueden conducir al shock endotóxico, caracteri­ zado por hipotensión, colapso vascular y, a veces, muerte. Esto sucede con mayor frecuencia cuando los microorganismos gramnegativos ingresan en el torrente circulatorio. Debido al número creciente de especies estafilocócicas reco­ nocidas en infecciones humanas y el hallazgo de resistencia a múltiples antibióticos en aislamientos comunes y no comunes, es imperativo que los microbiólogos clínicos estén familiariza­ dos con los métodos actuales para la caracterización de estos microorganismos. En este capítulo se presentan los procedi­ mientos de laboratorio y la importancia clínica del aislamiento y la identificación de los estafilococos y microorganismos rela­ cionados. En el capítulo 13, se tratarán los estreptococos y las

C

Sistema de identificación Biolog Microplate®

Métodos moleculares para identificación y tipificación de estafilococos Identificación de Micrococcus y especies relacionadas Identificación de Rothia mucilaginosa

Enfoque para la identificación de estafilococos en el laboratorio

bacterias similares a ellos. Las pruebas de sensibilidad a los antibióticos de estos grupos bacterianos se consignan en el capítulo 16.

Taxonomía de los estafilococos y de los cocos grampositivos relacionados En la edición de 1986 del M anual de Bacteriología Siste­ mática de Bergey, la familia Micrococcaceae incluía cuatro géneros: Planococcus, Micrococcus, Stomatococcus y Staphy­ lococcus.29'30225232’231 Los estudios genéticos ulteriores (p. ej., hibridación de RNA DNA-ribosómico, secuenciación de rRNA 16S) y los análisis quimiotaxonómicos (p. ej., composición de la pared celular, ácidos grasos celulares) documentaron la diversidad de estos microorganismos y establecieron que estos cuatro géneros no se deben englobar en una única familia. Los planococos y los estafilococos pertenecen a la línea filática Bacillus/Lactobacillus/Streptococcus, mientras que los micrococos y los estomatococos están relacionados con una clasifi­ cación de actinomicetos amicélicos. De acuerdo con la “hoja de ruta” de la nueva edición del M anual de Bacteriología Siste­ mática de Bergey, los estafilococos están en el filo Firmicutes y comprenden el género I en la familia V (“Staphylococcaceae”), orden I (BacillalesAL) en clase III “Bacilos”. La familia V también incluye Gemella (véase cap. 13), Macrococcus y Salinicoccus.125 Las especies de Planococcus son cocos mari­ nos capaces de crecer en medios que contengan 15% de NaCl. Este género suele abarcar nueve especies: P. citreus, P. kocuri, P. antarcticus, P. psychrophilus, P. alkanoclasticus, P. lilacinus, P. rifietensis, P. maritimus y P. rtmitriensis.5 '03233’363311’503 Dos de las primeras especies, Planococcus, P. okeanokoites y P. mcmeekinii, fueron reclasificadas recientemente en el nuevo género Planomicrobium.m ’3'3’502 Los planococos están ahora clasifica­ dos como género I en la familia Planococcaceae en el orden I Bacillales. El género Micrococcus estaba compuesto originalmente por nueve especies: M. luteus, M. lylae, M. varians, M. roseus, M. agilis, M. kristinae, M. nishinomiyaensis, M. sedentarius y

Im p o rta n c ia c lín ic a d e los e s ta filo c o c o s y de los c o c o s g ra m p o s itiv o s re la c io n a d o s

M halobius.232 En 1995, Stackebrandt, Koch y cois, realizaron un análisis de la secuencia del DNA ribosómico 16S en estas especies reconocidas que derivó en la separación taxonómica y en la reorganización del género.231-423 M. roseas, M. varians y M. kristinae pertenecen ahora al género Kocuria como K. roseus, K. varians y K. kristinae.400 M. halobius, M. nishinomiyaensis y M. sedentarius ahora se ubican en tres géneros sepa­ rados como Nesterenkonia halobia, Kytococcus sedentarius y Dermacoccus nishinomiyaensis. M. agilis ha sido reclasificado en el género Arthrobacter como A. agilis.23' En este nuevo esquema taxonómico, Micrococcus luteus y Micrococcus lylae permanecen como especies únicas en el género Micrococcus.''96 En 2000, se describió una tercera especie Micrococcus, M. antarcticus, una especie psicrófila aislada en la Antártida.269 A partir de 1995, se han aislado en fuentes medioambientales otras tres especies Kocuria (K. palustris, K. Rhizophila y K. polaris) y una especie nueva de Nesterenkonia (N. lacusekhoensis), y se aisló una segunda especie Kytococcus (K. schroeteri) en sangre humana.25-80-237,364 Estas ex especies Micrococcus ahora están en un filo y una clase separados de los estafiloco­ cos (filo Actinobacteria, clase Actinobacteria) y están en el mismo orden que los actinomicetos (orden Actinomycetales). Dentro de este orden las anteriores especies Micrococcus se ubican en la familia Micrococcaceae (M icrococcus, Arthrobac­ ter, Kocuria, Nesterenkonia) y en la familia Dermatophilaceae (Dermacoccus y Kytococcus)}25 Los micrococos y especies relacionadas son cocos grampositivos un poco más grandes que las células estafilocócicas. Los micrococos tienen un diámetro de 1 a 1,8 |im , mientras que los estafilococos miden 0,5 a 1,5 |tm. Las células se acomodan en su mayoría de a pares, en tétradas y en grupos irregulares. En el resto del capítulo, estos microorganismos se mencionan como micrococos y especies relacionadas. El nuevo género Macrococcus incluye microorganismos ais­ lados en animales que parecen cocos más grandes (1,1 -2,5 |im de diámetro), de ahí el nombre “macro”-coccus.217 El género difiere del estafilococo en que tiene menos similitudes de secuencia en el rRNA 16S, mayor contenido de G + C en el DNA, carece de ácidos teicoicos en la pared celular y tiene patrones de ribotipificación y restricción de DNA particulares. Los miembros del género Macrococcus son claramente distin­ tos que los del género Staphylococcus, pero están muy relacio­ nados con el “grupo S. sciuri”, los únicos miembros de los esta­ filococos oxidasa positivos.244 Se describieron siete especies Macrococcus: M. equipercicus y M. carouselicus (ambas halla­ das en caballos), M. bovicus (aisladas en el ganado vacuno), M. caseolyticus (ex Staphylococcus caseolyticus), aislados en pro­ ductos lácteos, en ballenas piloto (calderón), y carnes y M. brunensis, M. hajekii y M. lamae, aislados en piel de llamas.217-280 Los miembros del género Macrococcus no están comprometi­ dos en infecciones humanas. Stomatococcus mucilaginosus, el único miembro del ante­ rior género Stomatococcus, es un coco grampositivo encapsulado que es parte de la flora normal del aparato respiratorio humano.2930 Sobre la base de la secuenciación de rDNA 16S y de los datos taxonómicos, los estomatococos son los más relacionados con los microorganismos del género Rothia. S. mucilaginosus ha sido transferido al género Rothia como Rothia mucilaginosa junto con R. dentocariosa y una especie nueva, Rothia nasim urium , un microorganismo encontrado en la nariz de los ratones.79 Aunque R. mucilaginosa y R. nasi­ murium son cocos grampositivos, R. dentocariosa es un baci­ lo corineforme grampositivo que muestra ramificación rudi­ mentaria. A causa de su m orfología cocal. R. mucilaginosa se

595

describirá en este capítulo; R. dentocariosa se tratará en el capítulo 14.

Importancia clínica de los estafilococos y de los cocos grampositivos relacionados El género Staphylococcus por lo general está compuesto por varias especies, muchas de las cuales se pueden encontrar en muestras clínicas humanas (recuadro 12-1). Los estafilococos son cocos grampositivos, no móviles, que no forman esporas, catalasa positivos. Estos microorganismos se acomodan como células simples, en pares, en tétradas y en cadenas cortas, pero aparecen en forma predominante en grupos como racimos. La mayoría de las especies son anaerobios facultativos, excepto 5. aureus subespecie anaerobius y S. saccharolyticus. Estas dos especies crecen de forma anaerobia y, a diferencia de las espe­ cies facultativas, a menudo son catalasa negativas. Los estafi­ lococos se encuentran por lo general en la piel y las mucosas de seres humanos y otros animales. En algunos casos, esta aso­ ciación es muy específica. Por ejemplo, S. capitis subespecie capitis forma parte de la flora humana normal de la piel y las glándulas sebáceas del cuero cabelludo, la frente y el cuello, mientras que S. auricularis se encuentra en el canal auditivo externo.222-224 Algunas especies se encuentran sólo en animales y se reconocen como patógenos de animales. Por ejemplo, 5. hvicus causa dermatitis infecciosa en los cerdos y S. intermedius ha sido aislado en varios tipos de infecciones en perros, incluidas infecciones cutáneas, mastitis, infecciones de heridas e infecciones del aparato reproductor.96 156 157 Las especies ante­ riores han sido aisladas en heridas de mordedura de perro en seres humanos 436,437 S. delphini, S. felis, S. schleiferi subespe­ cie coagulans y S. lutrae causan procesos infecciosos en delfi­ nes, gatos domésticos, perros y nutrias de mar, respectivamente iu.190.191.469 l os seres humanos pueden colonizarse o infectar­ se por contacto cercano o frecuente con animales (p. ej., vete­ rinarios, trabajadores de zoológicos, granjeros). Algunos de los estafilococos patógenos tanto para seres humanos como para animales producen una enzima llamada c o a g u la sa . cuya detec­ ción se usa en el laboratorio para identificar a estos microorga­ nismos (recuadro 12-2).156,469 Entre los estafilococos, la especie S. aureus coagulasa positiva y las dos especies coagulasa nega­ tivas, S. epidermidis y S. saprophyticus, se observan con fre­ cuencia en infecciones humanas.

Staphylococcus aureus subespecie aureus S. aureus es por mucho el patógeno humano más importan­ te entre los estafilococos. Se encuentra en el medioambiente externo y coloniza las narinas en el 20-40% de los adultos. Otros sitios son los pliegues cutáneos intertriginosos, el peri­ neo, las axilas y la vagina. Aunque forma parte de la microflora humana normal, puede causar infecciones oportunistas importantes en condiciones apropiadas.478 Los factores que pueden predisponer a infecciones graves por 5. aureus son: • Defectos congénitos en la quimiotaxis de los leucocitos (p. ej., síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de Down, sín­ drome de Job y síndrome de Chediak-Higashi) o adquiridos (p. ej., diabetes mellitus, artritis reumatoide). • Defectos en la oposonización por anticuerpos secundarios a hipogammaglobulinemias adquiridas o congénitas o defectos o deficiencias en componentes del complemento (en especial C3 y C5).

596

C A P ÍT U L O 12

Recuadro 12-1 Especie

Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

E sp e c ie s d e

Staphylococcus

hum anas, a n im ales y m ed ioam b ien tales

Comentarios

ESTAFILOCOCOS ENCONTRADOS EN SERES HUMANOS Y EN PRIMATES S. S. S. S.

aureus epidermidis saprophyticus haemolyticus391

Véase el texto Véase el texto Véase el texto S. haemolyticus es parte de la flora normal de la piel humana y también se encuentra en los primates. Este microorganismo ha sido informado como causa de bacteriemias primaria y hospitalaria, infecciones de tejidos blandos y heridas, infecciones urinarias e infecciones neonatales y pediátricas hospitalarias.93'152-240'271-340341-432 Varios investigadores han informado cepas de S. haemolyticus que tienen CIM relativamente altas (2 a > 8 |ig/mL) para vancomicina en contextos clínicos de adminis­ tración prolongada de vancomicina, lo que sugiere que la selección de clones resistentes se origina de poblaciones de microorganismos previamente sensibles.16-174-401-402-470 Al respecto, se describieron cepas resistentes a los dos glucopéptidos (vancomicina y teicoplanina ) o sensibles a la vancomicina y resistentes a la teicoplanina.35-50-240La resistencia a glucopépti­ dos en S. haemolyticus y en otros estafilococos coagulasa negativos, por lo general, está expresada de modo heterogéneo y existen dentro del mismo cultivo subpoblaciones sensibles y resistentes,35-36 El surgimiento de resistencia a los glucopépti­ dos en S. haemolyticus ha subrayado la importancia de la identificación correcta y de las pruebas de sensibilidad de estos aislamientos y el control de su diseminación en el ambiente hospitalario. Aunque la identificación fenotípica de S. haemoly­ ticus es bastante directa, se han creado sondas de ácido nucleico para su identificación específica.3 Estudios acerca del mecanismo de resistencia a los glucopéptidos sugieren que las causas son multifactoriales y que pueden relacionarse con la estructura de la pared celular, donde las alteraciones en los entrecruzamientos dentro del peptidoglucano interfieren en la unión de los dímeros de glucopéptido y, por lo tanto, en la interacción apropiada del antibiótico con su objetivo.37 Además de la resistencia a los glucopéptidos, también se han informado aislamientos de S. haemolyticus resistentes a meticilina y quinolona.340-432-501 La presencia de S. haemolyticus con resistencia múltiple a los antibióticos en el medio hospitalario y la transmisión de clones resistentes mediante las manos de los trabajadores sanitarios han sido documentadas por varios inves­ tigadores usando diversos métodos moleculares (p. ej., inmunoanálisis de polipéptidos estafilocócicos, análisis de plásmi­ dos, polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción del DNA cromosómico, electroforesis en gel de campo pul­ sado del DNA total).93-340-432 S. haemolyticus, de modo similar a S. epidermidis, S. warneri, S. xvlosus y S. hyicus, también produce una lipasa extracelular que puede cumplir una función en la virulencia.322-372

S. warneri222

Esta especie representa cerca del 1% de los estafilococos encontrados normalmente en la piel humana. S. warneri es ahora una causa bien reconocida de baeteriemia relacionada con el catéter, endocarditis de válvula nativa, osteomielitis vertebral hematógena y meningitis asociada con derivación ventriculoperitoneal.51-54'87'452'498 Las cepas aisladas en seres humanos ahora se llaman 5. warneri subespecie 1, mientras que las cepas de primates se llaman S. warneri subespecie 2. Las cepas de S. warneri producen una enzima extracelular que tiene actividad de lipasa y fosfolipasa.372-438-467

S. hominis220-122

S. hominis se encuentra en la piel humana; en ocasiones ha sido aislado de infecciones como un patógeno de bajo grado, que causa sepsis relacionadas con catéteres en huéspedes inmunodeprimidos.45 S. hominis también ha sido informado como causa de endocarditis en un paciente como complicación de una vasectomía.214 En 1998, la especie se dividió en dos subes­ pecies: S. hominis subesp. hominis, y S. hominis subesp. Novobiosepticus.220 S. hominis subespecie hominis se encuentra en la piel y es un microorganismo infrecuente en procesos infecciosos, mientras que S. hominis subespecie novobiosepticus se aísla con más frecuencia en hemocultivos e infecciones confirmadas. La subespecie novobiosepticus es resistente a la novobiocina y no produce ácido a partir de D-trehalosa o A'-acetil-D-glucosamina, mientras que la subespecie hominis es sensible a la novobiocina y produce ácido en forma aeróbica de D-trehalosa y de TV-acetil-D-glucosamina.220 La subespecie novobio­ septicus también tiende a ser más resistente a los antibióticos que la subespecie hominis.

S. simulans222

S. simulans se encuentra sobre la piel y en la uretra de mujeres sanas. El microorganismo ha sido aislado como causa de sep­ ticemia, osteomielitis, endocarditis de válvula nativa, artritis séptica siguiente a una fractura expuesta de peroné, osteomie­ litis vertebral e infección de prótesis articular.193-278-289-36,-430S. simulans tiene una cápsula que inhibe ia fagocitosis in vitro y contribuye a la virulencia in vivo.323 Junto con ciertos estafilococos coagulasa negativos (S. epidermidis, S. haemolyticus y S. hominis), las cepas de S. simulans resistentes a la meticilina tienen una proteína de unión a la penicilina adicional que muestra baja afinidad por meticilina, cefalotina y cefamandol y tiene una secuencia de aminoácidos análoga a la PBP2" encontrada en las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina.346

S. lugdunensis'1'

Esta especie, descrita por primera vez en 1988, se ha establecido rápidamente como un patógeno humano significativo. S. lugdunensis coloniza el área inguinal humana como se estableció por cultivo de muestras del pliegue inguinal y el predomi­ nio de cepas obtenidas en abscesos en la región de la cintura pelviana.27'326-465 S. lugdunensis se ha asociado con una amplia variedad de infecciones, como endocarditis asociada con válvula nativa y con válvula protésica y con marcapasos; meningi­ tis; abscesos en la piel y los tejidos blandos; celulitis; peritonitis; prótesis de cadera infectadas; osteomielitis; discitis verte­ bral; infecciones de las vías vasculares; infecciones bucales; artritis séptica después de cirugía artroscópica; infecciones uri­ narias, e infecciones de la derivación ventriculoperitoneal.42'53-57'64'101'107'155'197-200-203-238-264-312-329-332'383-399-421-461-485-504 La presenta­ ción de un shock séptico similar al observado por bacterias gramnegativas también se asoció con baeteriemia por S. lugdu­ nensis.62 Se han caracterizado las cepas de S. lugdunensis resistentes a la oxacilina que transportan el gen mecA.*42 El análi­ sis de los aislamientos clínicos demostró que S. lugdunensis produce una variedad de factores de virulencia, incluidas a-y 8-hemolisinas, lipasas y estearasas.162-2*

Im p o rta n c ia c lín ic a d e los e s ta filo c o c o s y de los c o c o s g ra m p o s itiv o s re la c io n a d o s

Recuadro 12-1 Especie

597

Especies de S taphylococcu s hum anas, an im ales y m ed io am bien tales (cont.) Comentarios

I 5. schleiferi121

S. schleiferi fue descrito por primera vez en 1988 y se ha aislado de varias infecciones humanas, entre ellas empiema cerebral, infecciones de heridas, bacteriemia complicada con osteítis vertebral, infección de un¿ prótesi> de cadera, infección del catéter, infecciones urinarias hospitalarias, endocarditis de válvula protésica, osteomielitis e infecciones de marcapasos.5665 172-229-261-328 En 1990, la especie fue dividida en dos subespecies; las cepas h u m a ra y caninos i asocia­ das con pioderma) se han designado S. schleiferi subespecie schleiferi y las cepas que causan otit> extema en perros se han designado S. schleiferi subespecie coagulans."919' La especie produce una variedad de factores a los que se los vincula con la virulencia (p. ej., glucocáliz, lipasas, estearasas y hemolisinas) y que pueden contribuir a la p¿:.>genicidad,162'246'336 Cuando se describieron por primera vez las subespecies, se pensó que las cepas de la subespecie schleiferi daban factor de aglutinación positivo y pruebas de coagulasa en tubo negativas, mientras que las cepas de la subespecie coagulans mostraban factor de aglutinación negativo y pruebas de coagulasa en tubo positivas.191 Vandenes^h y cois, aislaron luego tres cepas de S. schleiferi subespecie schleiferi con factor de aglutinación y prueba de coagu.asa en tubo positivos (lámina en color 12-3E y H).463

S. capitis222

S. capitis es parte de la flora humana normal y rodea las glándulas sebáceas en el cuero cabelludo y la frente. En 1991. esta especie fue dividida en dos subespecies, S. capitis subespecie capitis y S. capitis subespecie ureolyticus -- 5. capitis subespecie ureolyticus puede diferenciarse de la subespecie capitis por su actividad ureasa positiva, por la capacidad para producir ácido de maltosa en condiciones anaerobias, y por los perfiles de ácidos grasos celulares. Desde 1992. esta especie ha sido informada como causa de endocarditis de válvula nativa y de válvula protésica (incluida endocardi­ tis de válvula aórtica), endocarditis asociada con endoscopia superior e implantación de marcapasos.8-202'253-382'475 Se documentó S. capitis como la causa de 17 casos de sepsis en recién nacidos prematuros en estado crítico, incluido un caso de meningitis.483 En estos casos, todos los aislamientos fueron resistentes a oxacilina, eritromicina y clindamicina. Las cepas de S. capitis aisladas en unidades de cuidados intensivos neonatales también han mostrado heterorresistencia a la vancomicina.466

S. auricularis224

Esta especie se encuentra en el conducto auditivo externo humano y rara vez está implicado en infecciones.

S. pasteuri75

S. pasteuri es una especie recién descrita que se encuentra en muestras clínicas animales y humanas y en alimentos. Todavía no ha sido asociada con procesos infecciosos y es similar desde el punto de vista fenotípico a S. wameri. Se han diseñado sondas de oligonucleótidos derivadas de DNA amplificado al azar para su identificación y diferencia­ ción.464

5. caprae97-210

S. caprae se pensó en un principio que era una especie animal aislada en cabras y en la leche de esos animales. En 1991. fue cultivada de un exudado de un paciente con dermatitis y de la orina de un segundo paciente.2®* Luego, se la aisló en un paciente con endocarditis, dos pacientes con bacteriemia relacionada con el catéter, dos casos de infección urinaria y en hemocultivos de un recién nacido con enfermedad cardíaca congénita.422-462 S. caprae ha sido informado en asocia­ ción con infecciones articulares y óseas, incluido un caso de empiema intraarticular posterior a una cirugía artroscópica de rodilla, y como causa de osteomielitis iatrogénica posterior a implantación quirúrgica de materiales ortopédi­ cos.7'02-408 En un estudio de la distribución de las especies Staphylococcus entre las muestras clínicas humanas. S. caprae comprendió el 10,7% de las 1 230 cepas analizadas.210 Se han identificado ribotipos similares en cepas de S. caprae aisladas en leche de cabra y en muestras clínicas, aun cuando las características fenotípicas pueden variar entre los diferentes aislamientos.26 S. caprae es el más relacionado con S. epidermidis y con las subespecies de S. capitis.131 Las cepas de S. caprae de seres humanos contienen un operón ica de cinco genes que codifica los productos génicos implicados en la formación de la biopelícula.6-7 Los polipéptidos derivados de las secuencias del gen ica muestran 67% a 88% de identidad de aminoácidos con los productos del operón del gen ica similar al encontrado en S. aureus y S. epidermidis.

5. colmii228-191

S. cohnii fue descrito por primera vez en 1975 y en 1991 se dividió en dos subespecies designadas S. cohnii subesp. cohnii y S. cohnii subespecie urealyticum.m La subespecie cohnii sólo ha sido aislada en seres humanos, mientras que la anterior subespecie urealylicum ureasa positiva ha sido aislada en seres humanos y en primates. Ambas son flora nor­ mal de la piel. S. cohnii es un agente oportunista emergente, que ha sido informado como causa de neumonía adquirida en la comunidad, artritis séptica primaria y sepsis relacionada con el catéter en pacientes inmunodeprimidos.~ " ;s6-287 También se han informado corioamnionitis y sepsis neonatal con meningitis debidas a S. cohnii.2" 1

S. xylosus*9'

S. xylosus se encuentra en humanos y en primates y ha sido informado como causa de infecciones urinarias altas y bajas y de endocarditis asociada con el uso de drogas intravenosas.83454 Este microorganismo fue aislado en sangre y bilis de un paciente de 11 años sometido a un trasplante hepático y cardíaco y en un seudoquiste pancreático en un paciente infectado por HIV.284-285 También se lo aisló en queso y leche de cabra.297 Las cepas de S. .xylosus producen además una lipasa extracelular.372

S. saccharolyticus'■

Esta especie anaerobia fue en principio llamada Peptococcus saccharolyticus y fue transferida al género Staphylococcus sobre la base del análisis de oligonucleótidos del RNA 16S ribosómico. Se encuentra en las mucosas humanas. Se han informado dos casos de endocarditis (uno que comprometió una válvula cardíaca nativa y el otro, una válvula cardíaca protésica) causados) causados por este microorganismo.241-494

(Continúa)

598

C A P ÍT U L O 12

Recuadro 12-1 Especie

Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

E sp ecies de Stap h ylo co ccu s hum anas, an im a les y m ed io am bien tales (cont.) Comentarios

ESTAFILOCOCOS ENCONTRADOS EN OTROS ANIMALES S. intermedius156

Esta especie se encuentra como parte de la flora de perros, monos, caballos y gatos y puede causar infecciones cutáneas, urinarias, óseas y del sistema nervioso central en varias especies animales. S. intermedius es el estafilococo coagulasa positivo predominante recuperado de la piel canina normal e infectada y de infecciones caninas graves.136 El portador humano de S. intermedias es raro incluso entre individuos con exposición frecuente a los animales.277-437 Ha sido aisla­ do en personas con heridas por mordedura de perros infectadas y también en individuos con lesiones no infligidas por perros, como infecciones de úlcera de vena varicosa e incisiones de sutura.435-436 Infecciones menores ( p. ej., otitis externa) con este microorganismo pueden ocurrir como consecuencia del contacto estrecho no traumático con cáni­ dos.441 También se ha informado el caso de sepsis por S. intermedius relacionada con el catéter en un paciente de 63 años con cáncer y neumonía por S. intermedius posterior a una Cirugía de bypass de arteria coronaria.134-460 S. interme­ dius se caracteriza por las pruebas de coagulasa en tubo positivas y factor de aglutinación variable. La coagulasa de S. intermedius es una proteína de 64.6 kDa que induce la formación de coágulo en plasma humano y de conejo, pero no en el de rata o de cobayo.234

S. hyicus96

S. hyicus se encuentra en el ganado y en la leche de vaca y se asocia con epidermitis exudativa (síndrome de “cerdo gra­ sicnto”), una enfermedad aguda de las crías de cerdos lactantes y destetados. Las cepas de S. hyicus que causan esta infección de la piel producen tres tipos de toxinas exfoiiativas y una enzima lipasa/fosfolipasa extracelular dependiente de calcio que contribuye a la patología de este síndrome.10372 Aunque no se considera un patógeno para los seres huma­ nos, en 1997 se informó un caso de infección de herida humana causada por S. hyicus después de una mordedura de burro.327

S. sciuri226

S. sciuri está ampliamente distribuido en la naturaleza y ha sido aislado en alimentos, animales de granja, roedores, mar­ supiales, mamíferos marinos y, en ocasiones, seres humanos y pequeñas mascotas. Actualmente se reconocen tres subespecies.218-283 S. sciuri subespecie sciuri se encuentra en la naturaleza y como parte de la flora cutánea transitoria en varios mamíferos y especies de aves; rara vez se encuentra en seres humanos y en primates. S. sciuri subespecie carnaticus se encuentra principalmente en huéspedes bovinos y productos derivados de su carne. S. sciuri subespecie rodentium se encuentra sobre todo en los roedores. Las cepas humanas han sido aisladas en heridas, piel, e infecciones de tejidos blandos, y, en 1998 se informó un caso de endocarditis debida a S. sciuri.m -2t3A25 También fue causa de peri­ tonitis en un paciente en diálisis 480 Un análisis de 30 aislamientos clínicos humanos de S. sciuri encontró que el 70% eran subespecies sciuri, el 23%, subespecie rodentium y el 7%, subespecie carnaticus. Se observó que todas las subes­ pecies de S. sciuri albergan un homólogo del gen mecA de S. aureus de resistencia a la meticilina y el 46% de las cepas que habían sido examinadas también transportaban el gen mecA que se encuentra en las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina.*4-500 Estos dos mecA homólogos tienen casi 80% de pares de bases similares. Las cepas de S. sciuri que llevan su homólogo mecA natural expresan la resistencia límite a la meticilina, mientras que las cepas que llevan el gen mecA MRSA expresan resistencia heterogénea. S. sciuri produce una variedad de factores sospechosos (p. ej., forma­ ción de biopelículas, factor de aglutinación, exotoxinas, DNasa y actividades proteolíticas) pero su contribución a la patogenicidad de este organismo no se ha determinado.426

S. gallinarum97 S. lentusm S. equorum390

Esta especie, antes una subespecie de S. hyicus, causa infecciones cutáneas en ganado bovino, cerdos y cabras.11 Se la encuentra en aves de corral y no es patógena. S. lentus, antes una subespecie de S. sciuri (S. sciuri subespecie lentus) es parte de la flora cutánea normal de ovejas y de cabras. S. equorum es una especie rara de importancia patógena no determinada. Ha sido aislada en caballos, así como en queso y leche de cabra.297

S. delphinim

Esta especie coagulasa positiva causa lesiones cutáneas purulentas en delfines.

S. felis1*9'™

S. felis es la especie de Staphylococcus más comúnmente aislada en gatos, y causa otitis, cistitis, abscesos, heridas y otras infecciones cutáneas.

S. lutrae'"

Esta especie, descrita en 1997, fue aislada durante los análisis post mórtem de tres nutrias marinas (Lutra lutra) de las islas Inner Hebrides al oeste del continente de Escocia. Los aislamientos se obtuvieron a partir de los tejidos hepáticos y esplénicos y en una glándula mamaria y un nodulo linfático supramamario. S. lutrae es coagulasa libre positiva y fac­ tor de aglutinación negativa y la mayoría está muy relacionada con S. delphini, S. felis, S. intermedius, S. schleiferi y S. muscae.iu

S. vitulinusiS1

Esta especie, descrita en 1994, se encontró como parte de la flora de caballos, ratones silvestres y ballenas piloto (calde­ rón). Ha sido aislada en productos cárnicos, entre ellos, de cordero, de pollo, de vaca y de ternera. Estudios de hibrida­ ción de DNA muestran que está muy relacionada con S. lentus y S. sciuri.487

S. muscae158

Esta especie recién descrita forma parte de una flora transitoria de la superficie corporal de moscas que habitan los esta­ blos de vacas, pero no se encuentra en las moscas que habitan las viviendas humanas.

Im p o rta n c ia c lín ic a de los e s ta filo c o c o s y d e los c o c o s g ra m p o s itiv o s re la c io n a d o s

Recuadro 12-1

599

Especies de S taphylococcu s hum anas, anim ales y m ed io am bien tales (cont.)

Especie

Comentarios

OTROS ESTAFILOCOCOS (EN SU MAYOR PARTE MEDIOAMBIENTALES) S. camosus388

Esta especie se usa como cultivo iniciador en el procesamiento de carnes como la de salames y salchichas. En la actuali­ dad, se reconocen dos subespecies: S. camosus subespecie camosus y S. camosus subespecie utilis.K1

S. kloosii390

Esta especie se encuentra en mamíferos y su importancia clínica y estado taxonómico son inciertos.

S. arlettaem

Esta especie se encuentra en mamíferos y pájaros y su importancia clínica y estado taxonómico son indeterm:nados.

S. piscifermentans*40

Esta especie se encuentra en peces, productos de pescados fermentados y pasta de soja y está muy relacionada con 5. carnosus y S. condomenti.m

S. condimentP57

Esta especie se encuentra en la salsa de soja (como S. piscifermentans) y está muy relacionada con las subespecies de S. camosus.

S. succinis247

Esta especie, descrita por primera vez en 1998, fue aislada en un fragmento de ámbar dominicano de hace 25 a 35 millo­ nes de años. Se asemeja fenotípicamente a S. xylosus y está muy relacionada con S. xylosus, S. saprophyticum. 5. equorum y otros estafilococos resistentes a la novobiocina. Una subespecie de S. succinis, S. succinis subespecie casei. ha sido propuesta para cepas aisladas en la superfice de quesos gruyere maduros.351

S. fleurettii41'

Esta especie ha sido aislada de quesos preparados de leche de cabra.

• Defectos en la muerte intracelular de bacterias seguida de fagocitosis debido a la capacidad para inactivar el sistema oxidasa unido a la membrana, lo que deriva en la ausencia de peróxidos y superóxidos de las vacuolas fagocíticas (p. ej., enfermedad granulomatosa crónica, leucemia linfoblástica y leucemia mieloide crónica y aguda). • Lesiones cutáneas (p. ej., quemaduras, incisiones quirúrgi­ cas, eccema). • Presencia de cuerpos extraños (p. ej., suturas, guías intrave­ nosas, dispositivos de prótesis). • Infección por otros agentes, en particular virus (p. ej., in­ fluenza). • Enfermedad crónica subyacente, como cáncer, alcoholismo y enfermedad cardíaca. • Administración profiláctica o terapéutica de antibióticos. En estas circunstancias, S. aureus puede causar diversos pro­ cesos infecciosos que van desde infecciones cutáneas relativa­ mente benignas hasta enfermedades sistémicas potencialmente mortales (recuadro 12-3). Las infecciones cutáneas incluyen foliculitis simple e impétigo (véase lámina en color 12-1A), así como forúnculos y carbunclos que afectan los tejidos subcutá­ neos y causan síntomas sistémicos, como fiebre. S. aureus se aísla con frecuencia en infecciones de heridas posquirúrgicas, que pueden servir como nido para el desarrollo de infecciones sistémicas. La neumonía estafilocócica adquirida en la comu­ nidad suele observarse en individuos ancianos y está asociada con neumonía viral como factor predisponente. La neumonía hospitalaria debida a S. aureus se produce en un contexto clí­ nico de pacientes con enfermedad obstructiva crónica e indivi­ duos sometidos a intubación y aspiración de secreciones. Las enfermedades malignas subyacentes se reconocen como facto­ res importantes de riesgo para el desarrollo de bacteriemia por S. aureus.60 La bacteriemia también puede diseminarse en sitios distantes por todo el cuerpo y conducir a endocarditis, osteomielitis, pioartritis, y formación de absceso metastásico, en particular en la piel, el tejido subcutáneo, los pulmones, el hígado, los riñones y el cerebro. La meningitis por S. aureus

sucede en pacientes con anormalidades en el sistema nervioso central relacionadas con traumatismos, cirugía, neoplasias malignas e hidrocefalia. S. aureus es también uno de los muchos microorganismos asociados con peritonitis en pacien­ tes que reciben diálisis peritoneal ambulatoria continua.347 Sus toxinas son responsables de la necrólisis epidérmica tóxica (síndrome estafilocócico de la piel escaldada) y el síndrome de shock tóxico (véanse recuadros 12-2,12-3,12-4). Las cepas de S. aureus también pueden causar intoxicación alimentaria debi­ do a la producción de exotoxinas durante su proliferación en alimentos contaminados. S. aureus tiene varias propiedades que se cree que contribuyen a su capacidad de enfermar (véase recuadro 12-2). A pesar de que estos factores de virulencia no se encuentran en todas las cepas, este microorganismo continúa siendo una fuente constante de sorpresas porque se descubren nuevas y diferentes propiedades patogénicas. Los factores de virulencia producidos por S. aureus se presentan en el recuadro 12-2 y los detalles referentes a los procesos infecciosos asocia­ dos con S. aureus se enumeran en el recuadro 12-3. La defini­ ción de caso de síndrome de shock tóxico se encuentra en el recuadro 12-4. En un principio, la penicilina fue el fármaco de elección para el tratamiento de las infecciones graves por S. aureus. El surgi­ miento de la resistencia a la penicilina en S. aureus se debió a la adquisición de elementos genéticos llevados por plásmidos que codifican la producción de P-lactamasa. Las cepas de S. aureus producen hasta cuatro enzimas p-lactamasa diferentes, como se evidenció por los pesos moleculares y la especificidad por el sustrato. En la actualidad, más del 80 9c de las cepas de S. aureus son resistentes a la penicilina a causa de la acción de esas enzimas P-lactamasas hidrolíticas o penicilinasas. Las penicilinas resistentes a la penicilinasa, semisintéticas (oxacilina y meticilina) son los fármacos de elección para el trata­ miento de las infecciones debidas a S. aureus resistente a la penicilina. Durante la década de 1980, surgieron las penicilinas resistentes a la penicilinasa. Este tipo de resistencia obedece a la presencia de una protema de unión a la penicilina alterada llamada PBP2a (o PBP2') que resulta de la adquisición de un

600

C A P ÍT U L O 12

Recuadro 12-2

Cocos grampositivos: Parte i: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

Factores de viru lencia de S taphylococcu s aureus

Factor de virulencia

Comentarios

Polisacáridos capsulares

Algunas cepas de S. aureus producen un exopolisacárido que puede impedir la ingestión del microorganismo por las células polimorfonucleares. Estos exopolisacáridos se sido observaron al examen con microscopio electrónico de cables de marcapaso. catéteres peritoneales y vías intravenosas infectados por S. aureus y han sido demostra­ dos en forma inmunológica in vitro. 178 Este material puede promover la adherencia de los microorganismos a las células huésped y a los dispositivos protésicos. Las cepas clínicas de S. aureus han sido clasificadas en 11 tipos sobre la base de la inmunotipificación del polisacárido capsular y 70-80% de las cepas de importancia clínica pertenecen al serotipo capsular 5 u 8.13-178 La producción de material capsular por 5. aureus está influida por diversos factores tanto in vivo como in vitro. En los sistemas de cultivo, la producción de cápsulas está influida por la composición del medio y las condiciones de desarrollo (p. ej., medio líquido o sólido, complejidad del medio).89-429 In vivo, se ha demostrado la síntesis de elevados niveles de polisacárido tipo 8 para S. aureus sem­ brados a partir de lesiones endocárdicas en un modelo murino de endocarditis.257 Mientras que estudios anterio­ res sugirieron que la cápsula no potenciaba la virulencia, estudios posteriores han indicado que las cápsulas de S. aureus por cierto contribuyen a la patogenicidad y la virulencia estafilocócicas. Karakawa y cois, informaron que las cápsulas elaboradas por las cepas de S. aureus de tipo 5 y tipo 8 eran antifagocíticas.205 En un modelo murino de baeteriemia. la expresión óptima del polisacárido capsular tipo 5 en S. aureus potenciaba la virulencia bacte­ riana y volvía a los microorganismos resistentes a la muerte opsonofagocítica mediada por los leucocitos.446 El tipo capsular 5 también ha mostrado ser un factor de virulencia que contribuye al desarrollo de baeteriemia estafilocócica y artritis en un modelo de ratón, y los anticuerpos adquiridos por inmunización con una "vacuna con­ jugada” de proteína-polisacárido del tipo 5 eran capaces de proteger contra la infección por S. aureus que expresa ese serotipo capsular en un modelo de endocarditis de rata.255-319 Estos dos tipos capsulares, en particular el tipo 8, también están asociados con otros factores de virulencia de S. aureus, como la producción de toxina del sín­ drome del shock tóxico.256 Además, un número importante de cepas de S. aureus resistentes a oxacilina, la peni­ cilina antiestafilocócica más usada, expresaron el polisacárido capsular de serotipo S.11-1 Los polisacáridos capsu­ lares de los serotipos capsulares 1, 2, 5 y 8 de S. aureus han sido purificados y caracterizados, y los genes que codifican los polisacáridos capsulares tipos 1, 2, 5 y 8 han sido clonados y secuenciados.115-263-308-387

Peptidoglucano y ácidos teicoicos

Las paredes celulares de S. aureus contienen peptidoglucanos (entrecruzamiento de polímeros de TV-acetil glucosomina y ácido W-acetil murámico). que son similares a los encontrados en otras bacterias grampositivas, y ácidos teicoicos, que son polímeros de fosfato de ribitol (monosacárido de 5 carbonos) (véase cap. 5). Los ácidos teicoi­ cos actúan en la adherencia específica de las bacterias grampositivas a las superficies mucosas. Además de prove­ er rigidez y elasticidad a la membrana celular estafilocócica, los peptidoglucanos y los ácidos teicoicos tienen varias actividades biológicas que se piensa que contribuyen a la virulencia.478 Estas propiedades incluyen la capa­ cidad de activar el complemento, mejorar la quimiotaxis de los leucocitos polimorfonucleares, activar la produc­ ción de interleucina 1 por los monocitos humanos y estimular la producción de anticuerpos opsonizantes. Las pruebas serológicas para la detección de anticuerpos hacia esas moléculas han sido investigadas por su posible valor diagnóstico o pronóstico; los resultados han sido desalentadores debido al considerable solapamiento de los títulos de anticuerpos entre individuos infectados y no infectados, el amplio espectro de infección y enfermedad causadas por S. aureus y la variabilidad de la respuesta inmunitaria dependiente del huésped debida a la edad, a otras infecciones y a la inmunocompetencia general.492 Otras varias proteínas, incluidas adhesinas, proteínas de unión a fibrinonectina, proteínas de unión a colágeno, y factor de aglutinación, se incorporan de modo covalente a la estructura del peptidoglucano de S. aureus.

Proteína A

La pared celular de S. aureus también contiene una proteína llamada proteína A. La proteína A purificada tiene un peso molecular de 42 kDa y se encuentra en la superficie celular y en el medio de cultivo. Esta proteína particu­ lar tiene la capacidad de unirse a la región Fe de todas las subclases de IgG humanas excepto IgGr 110 La proteína A funciona como un factor de virulencia porque interfiere en la opsonización e ingestión de los microorganismos llevada a cabo por los leucocitos polimorfonucleares, activa el complemento y provoca reacciones de hipersensibilidad del tipo inmediatas y tardías.478 La proteína A es inmunogénica, y los anticuerpos contra ella se encuen­ tran en individuos con infecciones graves por S. aureus. La presencia de proteína A en S. aureus provee la base para los procedimientos de las pruebas de coaglutinación que se usan en muchos laboratorios clínicos para la identificación de los microorganismos (p. ej., gonococos, agrupamiento estreptocócico) y para la detección de antígenos bacterianos en líquidos corporales.

Im p o rta n c ia c lín ic a d e los e s ta filo c o c o s y de los c o c o s g ra m p o s itiv o s re la c io n a d o s

Recuadro 12-2

601

Factores de viru lencia de S tap h ylo co ccu s aureu s (cont.)

Factor de virulencia

Comentarios

Enzimas

S. aureus produce varias enzimas que contribuyen a su virulencia. La producción de catalasa por estos microorganismos puede funcionar para inactivar el peróxido de hidrógeno y los radicales libres tóxicos formados por el sistema de la mieloperoxidasa dentro de las células fagocíticas después de la ingestión de los microorganismos.219 El factor de aglutinación, un material unido a la célula que puede unirse al fibrinógeno, es responsable de la unión de S. aureus a fibrina y fibrinógeno. La coagula­ sa. que puede existir en forma libre en el medio o unida a la célula, se une a la protrombina y la vuelve enzimáticamente acti­ va. con lo que cataliza la conversión de fibrinógeno en fibrina.209 Esta actividad enzimática puede actuar para cubrir las células bacterianas con fibrina, haciéndolas más resistentes a la opsonización y la fagocitosis. Las fibrinolisinas rompen los coágulos de fibrina y facilitan la diseminación de la infección a tejidos contiguos. De modo similar, la hialuronidasa hidroliza la matriz intracelular de mucopolisacáridos ácidos en el tejido y, puede actuar así para diseminar los microorgan:?mos a áreas adyacentes en los tejidos. Se ha encontrado que las cepas de S. aureus que causan forunculosis crónica son productoras de lipasas potentes que pueden ayudar a diseminar los microorganismos en los tejidos cutáneo y subcutáneo.1 - Se describió una fosfolipasa C específica para fosfatidilinositol que está asociada con cepas recuperadas en pacientes adultos con síndrome de dificultad respiratoria y coagulación intravascular diseminada.281 Los tejidos afectados por esta enzima se vuelven más sen­ sibles al daño y la destrucción mediante la acción de componentes del complemento bioactivos y productos generados durante la activación del complemento. S. aureus también produce una nucleasa o fosfodiesterasa que tiene actividad de endonucleasa y exonucleasa. Estudios inmunológicos y de especificidad de sustrato indican que S. aureus produce al menos tres tipo> diferentes de enzimas p-lactamasa. La producción de estas enzimas puede ser inducible (se producen sólo en presencia de antibióticos (3-lactámicos) o constitutiva (se producen en forma continua) y vuelve a estos microorganismos resistentes a la penicilina y a la ampicilina. Los genes que codifican estas enzimas, por lo general, residen en plásmidos (DNA extracromosómico) que también transportan genes para la resistencia a varios antibióticos, como eritromicina y tetraciclina.478 Estos genes de resistencia pueden ser transferidos a otras bacterias por transformación y transducción.

Hemolisina,s

Las hemolisinas de S. aureus cumplen varias actividades biológicas. La a-hemolisina tiene efectos letales sobre una gran varie­ dad de tipos celulares, incluidos los leucocitos polimorfonucleares y lisan eritrocitos de varias especies animales. Los eritroci­ tos de conejo son extremadamente sensibles a la lisis por oc-hemolisina, y son 100 veces más sensibles que otros eritrocitos de mamíferos y más de 1 000 veces más sensibles que los eritrocitos humanos.34 La toxina es una proteína con un peso molecular de 33 kDa y es segregada en el medio de cultivo durante el crecimiento logarítmico tardío.146 Los monómeros individuales interactúan en la membrana de la célula diana para formar heptámeros cilindricos con un poro central.458 Los poros abiertos por estos agregados heptaméricos de a-hemolisina permiten la salida rápida de iones de potasio y de otras moléculas peque­ ñas y el ingreso de iones de sodio y calcio, lo que conduce a la tumefacción osmótica y a la rotura de la célula. La a-hemoli­ sina también es dermonecrótica en inyección subcutánea y letal para animales cuando se administra en forma intravenosa. Estas propiedades contribuyen a la creencia de que esta toxina cumple un papel importante en la patogenia de las infecciones por S. aureus.9* La neurotoxicidad también es una propiedad de la a-hemolisina. que causa la desmielinización de las vainas de mielina en modelos de infección en ratones y conejos. Esta toxina es responsable de la zona de hematíes hemolizados observada alrededor de las colonias de algunas cepas de S. aureus que crecen en agar sangre de camero. La (3-heniolisina es una esfingomielinasa (actúa en el complejo esfingomielina lipocarbohidrato) que es activa en una variedad de células. Sin embargo, no es dermonecrótica en los cobayos y no es letal para los ratones.98 La (3-hemolisina es una exotoxina proteica con un peso molecular de 35 kDa y se segrega en el medio hacia el final de la fase de crecimiento logarítmico.358 La actividad hemolítica requiere iones magnesio y la especificidad de sustrato está restringida a esfingomielina y lisofosfatidilcolina. Es probable que las sensibilidades variables de los eritrocitos de diferentes especies animales a la lisis mediada por |3-hemo]isina se deba a diferencias en el contenido de esfingomielina de la membrana. La |3-hemolisina es una hemolisina “calor-frío”; es decir, sus propiedades hemolíticas se potencian por la exposición ulterior de los hematíes a temperaturas frías. Esta propiedad puede estar causada por la rotura inicial de las fuerzas cohesivas dentro de la membrana por la toxina y la tase posterior de separación dentro de la misma membrana porque la temperatura es más baja. La fS-hemolisina, junto con el factor CAMP producido por estreptococos B, es responsable de la hemolisis sinérgica observada en una prueba CAMP positiva para la identificación presuntiva de estreptococos del grupo B. Las 8-hemolisina y y-hemolisina se encuentran en algunas cepas de S. aureus y también causan la lisis de diversos tipos celula­ res. La 8-hemolisina es una proteína con un peso molecular de 3 kDa y se segrega en el medio hacia el final de la fase de cre­ cimiento exponencial. Esta hemolisina es producida por más del 97% de las cepas de S. aureus y también se encuentra en el 50-70% de los estafilococos coagulasa negativos.98 La 8-hemolisina actúa en principio como un agente tensoactivo que rompe la membrana celular, y puede interactuar con la membrana para formar canales que con el tiempo aumentan de tamaño, lo que provoca el escape del contenido celular. El término 'y-hemolisina describe en la actualidad tres proteínas que. junto con las dos proteínas que componen la leucocidina de Panton-Valentine (PV-leucocidina), constituyen seis toxinas de "dos componentes”.265-356-431 Las tres proteínas “y-hemolisina”, cada una de las cuales tiene un peso molecular en el rango de 32-35 kDa, interactúan con una de las dos proteínas PV-leucocidina (con pesos moleculares de 32 y 34 kDa) para formar seis combinacio­ nes posibles, todas ellas con actividad biológica. Ninguna de estas cinco proteínas tiene actividad hemolítica o leucotóxica por sí misma. Mientras estas toxinas de dos componentes muestran grados variables de actividad hemolítica, las seis pueden lisar leucocitos en forma eficiente.235 La actividad leucocítica se ejerce en forma directa en las membranas de los leucocitos poli­ morfonucleares humanos y causa desgranulación del citoplasma, tumefacción celular y lisis. Estas toxinas actúan mediante la formación de poros, con lo que alteran la permeabilidad celular al potasio y a otros cationes. (Continúa)

602

C A P ÍT U L O 12

Recuadro 12-2

Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

Factores de viru lencia de Staphylococcu s aureu s (cont.)

Factor de virulencia

Comentarios

Toxinas

Las toxinas exfoliatinas o toxinas epidermolíticas son producidas por algunas cepas estafilocócicas y se componen de dos proteínas, designadas ET-A y ET-B, cada una con un peso molecular de 24 kDa.478 Las dos moléculas son bioquímica e inmunológicamente distintas, pero tienen actividades biológicas similares. ET-A es una proteína termoestable cuyo gen estructural es cromosómico, mientras que ET-B es termolábil y de origen plásmido. Estas proteínas tienen actividad proteo­ lítica y disuelven la matriz de mucopolisacáridos de la epidermis, lo que conduce a la rotura intraepitelial de conexiones celulares en el estrato granuloso.433 Las cepas que producen una o ambas toxinas son responsables del "‘estafilocócico de la piel escaldada” (véase lámina en color 12-1B). Se han publicado estudios de PCR para la detección de los genes de las toxi­ nas exfoliatinas.294 Las enterotoxinas A hasta E, H e I son moléculas termoestables responsables de las características clínicas de la intoxica­ ción alimentaria estafilocócica. probablemente la causa más común de intoxicación por alimentos en los Estados Unidos. El modo exacto de acción de estas enterotoxinas se desconoce, pero se ha demostrado un aumento del pedstaltismo intestinal. La ingestión de enterotoxinas preformadas en alimentos contaminados con desarrollo estafilocócico (p. ej., artículos de panadería, flanes, ensalada de patatas, carnes procesadas, helados) provoca vómitos con diarrea o sin ella dentro de las 2 a 8 horas. Estas afecciones tóxicas se autolimitan (24-48 horas) y sólo requieren terapia de mantenimiento. Los cambios infla­ matorios (hiperemia mucosa, infiltrantes por neutrófilos, exudados mucopurulentos duodenales, lesión del ribete en cepillo) se observan en todo el tubo digestivo; las lesiones más graves y extendidas se encuentran en el estómago y en los segmentos altos del intestino delgado.2 3 Se han creado métodos inmunológicos y sondas de ácido nucleico para la detección de las exfoliatinas y las enterotoxinas.181-317 Los métodos inmunológicos detectan directamente la toxina, mientras que las sondas detectan los genes estructurales dentro de la célula bacteriana que codifican las toxinas. Se describieron métodos de PCR múltiple para la detección de enterotoxinas estafilocócicas.396

Superantígenos

Las enterotoxinas estafilocócicas pertenecen a un grupo de toxinas conocidas como superantígenos de toxinas pirógenas, que también incluyen la toxina-1 del síndrome del shock tóxico (TSST-1, véase más adelante), las exotoxinas pirogénicas estreptocócicas (SPE A, B, C, F, G. H y J) y el superantígeno estreptocócico.44 Todas estas toxinas comparten tres caracterís­ ticas biológicas: pirogenicidad, superantigenicidad y la capacidad de potenciar los efectos letales de pequeñas cantidades de la endotoxina en conejos más de 100 000 veces. La superantigenicidad se refiere a la capacidad de estas toxinas para esti­ mular la proliferación de linfocitos T sin tener en cuenta sus especificidades antigénicas. Todas estas toxinas inducen la pro­ liferación policlonal de células T mediante la coligación entre las moléculas clase II del complejo mayor de histocompatibilidad en las células presentadoras de antígeno y la porción variable de la cadena P del receptor del antígeno de la célula T.282 El papel de estas enterotoxinas en otras afecciones que no sea la intoxicación alimentaria estafilocócica ha sido confirmado por la complicación documentada de las enterotoxinas A hasta D. H e I con casos de síndrome del shock tóxico (SST) no asociados con menstruación y otros dos síndromes similares al SST llamados escarlatina estafilocócica y descamación eritematosa recalcitrante, respectivamente. 195.a9-393 Tan pronto como se describió la enfermedad, se postuló que el SST estaba causado por una toxina. En 1981, dos grupos infor­ maron el aislamiento y la caracterización de toxinas singulares producidas por cepas de 5. aureus de pacientes con SST.31-32-394 Estas dos proteínas se designaron exotoxina pirogénica tipo C y enterotoxina F estafilocócica. Estudios posterio­ res indicaron que ambas eran idénticas y la toxina ahora se denomina toxina 1 del síndrome del shock tóxico (TSST-1). La toxina madura es una proteína pequeña con un peso molecular de 22 kDa que es resistente a la inactivación por calor y enzi­ mas proteolíticas (p. ej.. tripsina). Se describió en algunos aislamientos una forma de la toxina con una pequeña diferencia del punto isoeléctrico, pero está codificada por el mismo gen y tiene los mismos efectos biológicos 40 Aunque esta toxina tiene un amplio espectro de actividad biológica, su papel en la patogenia del SST no está claro. Como las enterotoxinas. TSST-1 es un superantígeno que puede potenciar la respuesta letal en pequeñas cantidades de endotoxina gramnegativa en modelos animales por desvío de los pasos usuales de procesamiento del antígeno celular mononuclear y la unión directa a monocitos y linfocitos, que deriva en la liberación de linfocinas y monocinas. La liberación sistémica de estas citocinas puede explicar la rápida aparición del compromiso multisistémico observado en el SST. Otros estudios también sugirieron que algunos estafilococos coagulasa negativos pueden producir TSST-1 y se han informado casos de SST debidos a esos microorganismos.85-201 Se ha identificado una toxina similar a TSST-1 en cepas de S. aureus aisladas en ovejas, cabras y vacas.177 Se describió una prueba de aglutinación del látex pasiva inversa que usa partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos anti-TSST-1 para la detección de la producción de toxina in vitro.188 Esta prueba se realiza sobre diluciones seriadas de cul­ tivos filtrados de aislamientos estafilocócicos. Miwa y cois, crearon un enzimoinmunoanálisis para la detección de TSST-1 en suero de pacientes con SST probado o sospechado.3" Aunque la concentración media de TSST-1 en suero de individuos sanos fue menor de 30 pg/mL, las cantidades medias y máximas detectadas en pacientes SST fueron 440 pg/mL y 5 450 pg/mL. respectivamente. Neill y cois, describieron la síntesis y la aplicación de una sonda oligonucleótida radiactiva de TSST-1,317 Esta sonda hibrida con los genes estructurales bacterianos que codifican TSST-1. Aunque los métodos para la detección de la toxina (p. ej., aglutinación del látex, técnicas de inmunoblot de colonias, inmunoanálisis) dependen de la presencia de TSST-1 en o por encima del nivel de detección del ensayo y de las condiciones apropiadas de desarrollo bacte­ riano para la producción de la toxina, la sonda detectó la capacidad genética de cepas individuales para producir TSST-1, más allá de la capacidad de esas cepas para producir toxina in vitro.188-317 También se describieron métodos basados en PCR para la detección de TSST-1,2!M'305'396

Im p o rta n c ia c lín ic a d e los e s ta filo c o c o s y d e los c o c o s g ra m p o s itiv o s re la c io n a d o s

Recuadro 12-3

603

Infecciones asociadas con S taphylococcu s aureu s

Infección

Comentarios

Foliculitis

La foliculitis es una infección benigna restringida a los orificios de los folículos pilosos y se caracteriza por la presencia de lesiones dolorosas. rojizas y pequeñas y la ausencia de síntomas sistémicos.

Fórunculos y ántrax

Los forúnculos son piodermas profundos que se presentan como lesiones elevadas, firmes, dolorosas. con centros necróticos que contienen material purulento. El ántrax son lesiones aún más profundas que comprometen los tejidos subcutá­ neos. Varias lesiones pueden estar presentes y coalescer mediante la formación de senos subcutáneo'- El ántrax a menu­ do está asociado con signos sistémicos de fiebre intermitente.

Impétigo

El impétigo es una infección estafilocócica que se observa mayormente en los niños y por lo general se presenta en áreas expuestas, en especial la cara (lámina en color 12-1B). Las lesiones comienzan como máculas rojas que evolucionan a vesículas que contienen líquido serosanguinolento. Con el tiempo, estas lesiones se secan y forman costras, con una escara color miel sobre un borde eritrematoso. S. aureus da cuenta del 80-90% de los casos de impétigo. con el porcen­ taje restante asociado con estreptococos p-hemolíticos del grupo A. El impétigo causado por estos dos microorganismos es indistinguible desde el punto de vista clínico.

Hidradenitis supurada

Esta afección se caracteriza por la presencia de múltiples lesiones similares a forúnculos asociadas con las glándula' sudoríparas apocrinas infectadas y bloqueadas. Esta infección cutánea sucede en las áreas intertriginosas (axilas, ingle y áreas perineales). Aunque están presentes el dolor local, edema y eritema, por lo general están ausentes los síntomas sistémicos como fiebre.

Mastitis

La mastitis se refiere a la infección de la mama asociada con el parto y la lactancia y se caracteriza por edema, tumefac­ ción, dureza y en ocasiones eritema de los tejidos mamarios. Los abscesos superficiales se pueden drenar por aspiración con aguja, mientras que las lesiones persistentes, más profundas, requieren incisión y drenaje, a menudo junto con tera­ pia antibiótica.

Infecciones de herida

La mayoría de las infecciones estafilocócicas de heridas suceden en las salas posquirúrgicas y se reconocen por enrojeci­ miento. tumefacción, dolor y presencia de drenaje serosanguinolento turbio. La indicación para el cuidado de una heri­ da en pacientes con infección estafilocócica depende de la profundidad de la infección, el estado del huésped, la presen­ cia o gravedad de los signos y los síntomas clínicos, y la presencia de cuerpos extraños dentro de la herida. Estos facto­ res determinan la extensión del desbridamiento y la necesidad de quimioterapia antibiótica parenteral.

Bacteriemia y endocarditis

La bacteriemia por S. aureus por lo general sucede en forma secundaria a una infección localizada en otra parte (p. ej., abscesos, úlceras, quemaduras, neumonía) o por acceso directo de los microorganismos en el torrente circulatorio a tra­ vés de catéteres, otros dispositivos o jeringas usadas para inyección de drogas.60143-424 Los pacientes con bacteriemia estafilocócica por lo general presentan temblor, escalofríos y fiebre. Puede haber lesiones cutáneas hemorrágicas y evo­ lucionar para formar úlceras necróticas más grandes. Puede estar presente la endocarditis en una forma sutil, o con múl­ tiples signos y síntomas.116117 Con infección de las válvulas cardíacas pueden estar presentes más manifestaciones hemorrágicas (p. ej., lesiones de Janeway, manchas de Rot y hemorragias en astillas). Pueden observarse soplos cardía­ cos, roces de fricción pericárdica y derrames pericárdicos y, según el tipo de soplo, a menudo se puede sugerir la ubica­ ción probable del compromiso bacteriano y de la insuficiencia valvular. La ecocardiografía transtorácica y la transesofágica ayudan a delinear la extensión del compromiso cardíaco y a determinar la necesidad y la urgencia de intervencio­ nes quirúrgicas.196 La trombocitopenia a menudo está presente y la coagulación intravascular diseminada representa una complicación rafa pero mortal que sucede en forma temprana en el curso clínico de la enfermedad. La diseminación hematógena del riñón puede causar insuficiencia renal, abscesos renales y pielonefritis.

Meningitis

La meningitis debida a S. aureus puede suceder como complicación de bacteriemia, debida a trauma local, cirugía o lesión, o colonización de implantes de bombas intratecales.28 Aunque los signos y los síntomas son similares a los de otras infecciones meníngeas, están presentes con más frecuencia otros cofactores (p. ej., inmunodeficiencia, enfermedad subyacente).260

Pericarditis

La pericarditis (infección de las membranas que recubren el corazón) debida a S. aureus puede originarse por vía hemató­ gena o en forma secundaria a una infección local de un trauma penetrante de tórax.376 También puede suceder como complicación de la endocarditis estafilocócica. Los pacientes presentan dolor en el pecho, frote, insuficiencia cardíaca global o mediastinitis.

Infecciones pulmonares

Las infecciones pulmonares causadas por S. aureus pueden originarse por aspiración o diseminación hematógena desde otro sitio. La neumonía por aspiración adquirida en la comunidad suele observarse en ancianos como complicación de la neumonía por influenza, mientras que la intrahospitalaria por lo común es secundaria a la intubación con asistencia ventilatoria. Las radiografías de tórax de estos pacientes pueden mostrar abscesos definidos, infliltrados diseminados o nodulos, consolidación franca o cavitación. En los niños pequeños, se pueden observar neumatoceles de paredes delga­ das con niveles de líquido-aire. La infección pulmonar hematógena sucede como complicación de endocarditis del lado derecho y es secundaria a la embolización de lesiones valvulares, con el resultado de infartos pulmonares. En estos pacientes, la radiografía de tórax suele mostrar infiltrados aislados junto con embolia. Las complicaciones de los dos tipos de infección pulmonar son bacteriemia, abscesos pulmonares y empiemas pleurales/- 43

(Continúa)

604

C A P ÍT U L O 12

Recuadro 12-3

Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

Infecciones asociadas con Staphylococcus aureus (cont.)

Infección

Comentarios

Osteomielitis/artritis séptica

La osteomieltis por S. aureus en la mayoría de los casos sucede como complicación de una infección local por extensión directa, aunque también puede ocurrir la osteomielitis hematógena. Esta última a menudo compromete los huesos largos en los niños; sin embargo la osteomielitis de la columna vertebral da cuen­ ta de más del 60% de dichas infecciones en adultos.59 Varios tipos de estudios por imágenes, como la resonancia magnética y la tomografía computarizada, son útiles para delinear la extensión del compromi­ so vertebral y la presencia de abscesos paravertebrales. Los abscesos y las lesiones óseas líticas deben aspirarse y cultivarse para proveer de un diagnóstico definitivo. La osteomielitis asociada con infección contigua suele ser evidente porque la infección ósea es adyacente a una herida traumática o quirúrgica y es más grave cuando se infectan las prótesis de la cadera o de la rodilla.395 Con los últimos tipos de infec­ ción, los materiales implantados a menudo tienen que ser extraídos y reemplazados con la extirpación posterior de los tejidos circundantes infectados o comprometidos. La artritis séptica debida a S. aureus sucede en principio en niños prepúberes y como complicación de baeteriemia en adultos. Por lo general los pacientes presentan una articulación caliente y tumefacta (las más comunes son la rodilla, la cadera, el codo, el hombro y las articulaciones interfalángicas) dolorosa al movimiento. Se require la aspiración de la articulación, y la coloración de Gram y el cultivo del exudado purulento para el manejo de la infección.

Piomiositis

La piomiositis es una infección de los músculos esqueléticos que por lo general sucede en forma secundaria a un trauma, a menudo en la vecindad de un foco de infección existente (p. ej., un forúnculo).333 Los pacientes presentan fiebre y dolor muscular; las muestras obtenidas por aspiración y los cultivos detectan S. aureus. La incisión y el drenaje bajo la cobertura de un antibiótico apropiado son determinantes para lograr la curación.

Intoxicación alimenticia estafilocócica

La intoxicación estafilocócica por alimentos es el resultado de la ingestión de alimentos contaminados con cepas de S. aureus que producen enterotoxinas termoestables. Los productos implicados por lo general se contaminan a través de un operario que los procesa, con el subsiguiente desarrollo del microorganismo y la producción de la toxina. Los alimentos implicados incluyen ensalada de patatas, helados, natillas, pro­ ductos de panadería, alimentos enlatados y carnes procesadas. Los síntomas, como náuseas, vómitos, espasmos abdominales y diarrea, suelen comenzar a las 2 a 6 horas de la ingestión y disminuyen después de 8 a 10 horas. Es característica la falta de fiebre y de signos neurológicos. El tratamiento incluye la reposición del líquido perdido debido a los vómitos y la diarrea y la recuperación es completa.

Síndrome de la piel escaldada estafilocócico

En el síndrome estafilocócico de la piel escaldada se forman lesiones ampollares en áreas extensas del cuer­ po con descamación ulterior de las capas superficiales de piel (lámina en color 12-1C). Esto deriva en amplias áreas de piel desprotegida y denudada. Esta enfermedad a menudo se observa en recién nacidos y lactantes. Las toxinas responsables son antigénicas y los anticuerpos contra ellas son protectores (recua­ dro 12-2).

Síndrome del shock tóxico estafilocócico

El síndrome del shock tóxico (SST), describe por primera vez por Todd y cois, en 1978, es una enfermedad multisistémica caracterizada por un síndrome clínico que incluye fiebre, hipotensión, vértigo ortostático, eritrodermia (erupción blanquecina) y grados variables de vómitos, diarrea, falla renal, cefaleas, escalofrí­ os. úlceras faríngeas y conjuntivitis.160-449-478 Al principio, la enfermedad se notó con más frecuencia en las mujeres, con el inicio durante la menstruación. Los investigadores de los primeros casos notaron una aso­ ciación entre el comienzo de la enfermedad y el uso de tampones hiperabsorbibles. Más tarde se informa­ ron casos de SST no asociados con la menstruación tanto en varones como en mujeres, y como complica­ ción de abscesos estafilocócicos, osteomieltis, infecciones de heridas posquirúrgicas y neumonía posin­ fluenza.32 El papel de TSST-1 y otros superantígenos en la enfermedad también está avalado por la aparición aguda de los síntomas, con congestión vascular que se desarrolla en un período de 1 a 2 días. Con el incremento de las fugas a través de los capilares y la disminución generalizada de la resistencia vascular, hay una pérdi­ da de líquidos intravasculares en los espacios intersticiales. La pérdida de líquidos también se exacerba por la presencia de diarrea en algunos pacientes. La pérdida de volumen intravascular conduce a hipoten­ sión e hipoxia tisular. El síndrome de dificultad respiratoria aguda y la coagulación intravascular disemi­ nada son complicaciones comunes de TSS potencialmente mortales.251 La TSST-1 parece tener algunos efectos tóxicos directos en los tejidos del miocardio, el músculo esquelético, el hígado y el riñón.478 Las afecciones que pueden estar incluidas en el diagnóstico diferencial son otras infecciones mediadas por toxinas (p. ej., síndrome de la piel escaldada, gastroenteritis, escarlatina), infecciones locales con shock y/o dolor abdominal agudo (p. ej., gastroenteritis, salpingitis, aborto séptico e infecciones urinarias agu­ das), y enfermedades multisistémicas de infecciones (p. ej., shock séptico asociado con neumococos, meningococos o Haemophilus influenzae tipo b; rubéola, fiebre manchada de las Montañas Rocosas, tifus por garrapatas, leptospirosis, infección por Legionella'. toxoplasmosis; y síndromes adenovirales y enterovirales), y etiologías no infecciosas (p. ej., enfermedad de Kawasaki. lupus eritematoso sistémico, fiebre reumática aguda, artritis reumatoide, reacciones a fármacos). El diagnóstico se basa en los signos y los síntomas clínicos de acuerdo con la definición del caso (recuadro 12-4).

Im p o rta n c ia c lín ic a de los e s ta filo c o c o s y de los c o c o s g ra m p o s itiv o s re la c io n a d o s

Recuadro 12-4

605

D efinición de caso de sínd rom e de shock séptico estafilo có cico 331

Manifestación

Comentarios

F:ebre Erupción Decantación

Temperatura > 38,9 °C Eritrodermia macular difusa 1-2 semanas (por lo general 10-14 días) después de la aparición de la enfermedad; en particular en las palmas de las manos, las plantas de los pies, los dedos de manos y pies Presión sistólica < 90 mm Hg para adultos o menos del percentilo 5 correspondiente a la edad en menores de 16 año- Caída ortostática de la presión diastólica > 15 mm Hg de cuando un individuo acostado se sienta; síncope ortostático o '.énsgo <>rt—Utico

Hipotensión

Compromiso de tres o más sistemas de órganos Gastrointestinal Vómitos o diarreas al inicio de la enfermedad Muscular Mialgia grave o creatinincinasa mayor del doble del límite superior normal Mucosas Vaginal, orofaríngea o hiperemia conjuntival Renal Nitrógeno ureico en sangre (BUN) o creatinina sérica mayores de dos veces el límite superior normal para el laboratorio o sedimen­ to urinario con piuría (> 5 leucocitos por campo de gran aumento) en ausencia de infección urinaria Hepático Niveles de bilirrubina total, alanina aminotransferasa o aspartato aminotransferasa al menos el doble del límite superior normal para el laboratorio Hematológico Recuento de plaquetas (< 100 000/mm’) SNC Desorientación o alteraciones en la conciencia sin signos neurológicos focales cuando no hay fiebre e hipotensión

Criterios de laboratorio Resultados negativos en las siguientes pruebas Cultivos de sangre, faringe y líquido cefalorraquídeo (los hemocultivos pueden ser positivos para S. aureus) Pruebas serológicas para fiebre manchada de las Montañas Rocosas, leptospirosis y sarampión

CLASIFICACION DEL CASO Confirmado Probable

Caso en el que los seis hallazgos clínicos mencionados antes se encuentran presentes Caso en que hay cinco de los seis hallazgos clínicos mencionados antes

Hallazgos adicionales de laboratorio patognomónicos para SST, pero no incluidos en la definción del caso .Aislamiento de S. aureus en una mucosa o un sitio del cuerpo normalmente estéril Producción de TSST-1 por un aislamiento estafilocócico incriminado o en una toxina alternativa conocida que cause SST Sensibilidad serológica a la toxina pertinente en el momento de la enfermedad aguda Desarrollo de anticuerpos para la toxina pertinente durante la convalecencia

gen cromosómico llamado mecA. PBP2a tiene baja afinidad por todos los antibióticos P-lactámicos, incluidas las cefalos­ porinas. Una vez que las PBP presentes normalmente han sido inactivadas por un antibiótico p-lactámico, la PBP2a continúa actuando y permite la síntesis de una estructura peptidogluca­ no estable, lo que le posibilita proliferar y dividirse. Las cepas de S. aureus que expresan el determinante mecA se llaman SARM (S. aureus resistente a la meticilina). El gen mecA puede expresarse por algunas o por todas las células en una población dada, de modo que la resistencia mediada por las PBP alteradas se denomina heterorresistencia. El determinan­ te mecA de S. aureus heterorresistente también se encuentra en los estafilicocos coagulasa negativos resistentes a la meticilina y contiene varios elementos genéticos involucrados en la expresión y la regulación de la resistencia a los P-lactámicos y a otras clases de antibióticos. Por esta causa, los estafilococos resistentes a la oxacilina también tienden a serlo a otros anti­ bióticos, como clindamicina y eritromicina. La resistencia a la oxacilina y a otras penicilinas resistentes a la penicilinasa tam­ bién se puede observar en cepas de S. aureus que carecen del determinante mecA. En esos casos, la resistencia se debe a "hiperproducción” de enzimas P-lactamasa, cuyo resultado es

una hidrólisis lenta de las penicilinas semisintéticas y resisten­ cia meticilina/oxacilina en el límite. Los SARM representa un desafío para todas las instituciones sanitarias y se han elaborado pautas con respecto a cómo mane­ jar y controlar su diseminación dentro de ellas.46-490491 Algunos hospitales han instituido cultivos nasales sistemáticos para el personal a fin de detectar y tratar a los portadores de SARM con el objeto de reducir el número de pacientes expuestos y, como consecuencia, las infecciones institucionales. Aunque SARM fue en sus orígenes un patógeno hospitalario, ahora queda claro que los individuos dentro de la comunidad y fuera de los establecimientos sanitarios también están en riesgo de adquirirlo. Los informes iniciales de infecciones por SARM adquiridas en la comunidad reflejaron ciertas circunstancias y conductas de riesgo responsables, como el consumo de drogas intravenosas, los tratamientos antibióticos en pacientes ambu­ latorios, las hospitalizaciones previas y las enfermedades sub­ yacentes graves.385 Sin embargo, ahora se están observando infecciones por SARM en comunidades y poblaciones que no reflejan esas conductas o factores de riesgo. En un estudio lle­ vado a cabo en la Yale University School of Medicine, el 41% de 87 pacientes con SARM habían adquirido la infección en la

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Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

comunidad.254 La adquisición del microorganismo se asoció con los factores de riesgo mencionados con anterioridad; la residencia en un sanatorio fue un factor de riesgo adicional; ocho pacientes (22%) no tuvieron factores de riesgo identificables para las infecciones. Con el surgimiento de la resistencia a las penicilinas resis­ tentes a la penicilinasa, el glucopéptido vancomicina se volvió el tratamiento de elección para las infecciones debidas al SARM. Sin embargo, en mayo de 1996 se informó desde Japón la primera infección causada por una cepa de S. aureus con resistencia intermedia a la vancomicina.66 175 Más tarde, se ais­ laron cepas de S. aureus con sensibilidad disminuida a la van­ comicina en pacientes vistos en Michigan, estado de Nueva York, Nueva Jersey e Illinois.67'68-374-417 A estas cepas se les asig­ nó la mnemotecnia “GISA” (glycopeptide-intermediate S. aureus) porque tienen sensibilidad disminuida a los antibióti­ cos glucopéptidos, vancomicina y teicoplanina; en los Estados Unidos, el nombre más usado para estas cepas es “VISA” (vancomycin-intermediate S. aureus).444 Estas cepas tienen concen­ traciones inhibitorias mínimas (CIM) para vancomicina de 8 |jg/mL. El Clinical Laboratories Standards Institutes, CLSI (Instituto de estándares para los laboratorios clínicos, antes lla­ mado NCCLS) define “sensibles” a los estafilococos que requieren concentraciones de vancomicina < 4 Ug/mL para la inhibición del desarrollo; intermedios, a los que requieren de 8 a 16 Ug/mL y resistentes, a los que requieren > 32 |ig/m L.316 En 2002, se informaron dos cepas de S. aureus resistentes a la van­ comicina (CIM, > 32 ng/mL) desde Michigan y Pensilvania, y, en 2004, se informó el tercer aislamiento clínico documentado desde Nueva York.69'71 La sensibilidad reducida a la vancomici­ na encontrada en estas cepas no se detecta de modo confiable por métodos de sensibilidad rápidos, automatizados o de difu­ sión en disco (paneles rápidos Microscan®, Vitek®).445 El méto­ do de prueba de sensibilidad más exacto para la detección de estas cepas es un método CIM no automatizado, como la microdilución en caldo o la dilución en agar con 24 horas com­ pletas de incubación. La recomendación actual para los labora­ torios que usan métodos de sensibilidad automatizados es ino­ cular el microorganismo en una placa de cribado para sensibi­ lidad de vancomicina, que contenga agar infusión de cerebro y corazón (BHI) y 6 |ig/m L de vancomicina, e inspeccionar la placa para observar el crecimiento después de 24 horas com­ pletas de incubación. Todas las cepas con CIM para vancomi­ cina de 8 (jg/mL crecerán en esas placas de cribado. Los que crecen en las placas deben probarse luego mediante un proce­ dimiento de microdilución en caldo. Sobre la base de un estu­ dio comparativo, un Etest® (AB Biodisk, Piscataway, NJ) rea­ lizado en agar de Mueller-Hinton con un inoculo preparado a partir de una suspensión equivalente a la número 2 de McFarland e incubada por un período de 24 horas completas también es un método específico y sensible para la detección de esas cepas; con Etest, las cepas VISA tienen una CIM para vancomicina > de 6 |ig/m L.4ííl De acuerdo con los Centers for Disease Control and Prevention (CDC), se deben reunir tres criterios para verificar que una cepa dada es una VISA; CIM de 8 a 16 |!g/mL para vancomicina en microdilución en caldo; de 6 |ig/mL para vancomicina con Etest y desarrollo dentro de las 24 horas en una placa de agar BHI que contiene 6 (Jg/mL de vancomicina.444-445 La detección exacta y apropiada y la confir­ mación de estas cepas es necesaria y crítica para el tratamiento óptimo de los pacientes individuales y para evitar la transm i-' sión de estas cepas a otros enfermos.490 El aislamiento de S. aureus con sensibilidad reducida confir­ mada o resistencia franca a la vancomicina se debe informar al

personal del control de infecciones dentro de la institución, a los departamentos de salud locales y del estado, y a los CDC. La determinación de enfoques terapéuticos óptimos para pacientes individuales puede requerir otras pruebas de labora­ torio (p. ej., estudios de sinergismo, estudios con placas de microdilución, curvas de muerte-tiempo, etc.) porque existe evidencia de que las cepas S. epidermidis resistentes a la meticilina, VISA, SARM y S. haemolyticus resistente a la vanco­ micina pueden responder de modo sinérgico a las combinacio­ nes de vancomicina con otros (i-lactámicos.78 En el capítulo 16 se presenta más información respecto de otros mecanismos de resistencia (p. ej., resistencia a eritromicina y clindamicina) y pruebas de sensibilidad de los estafilococos a los antibióticos. S. aureus subespecie anaerobius provoca la formación de abscesos en ovejas y no ha sido aislado en infecciones huma­ nas o de muestras clínicas 94 Estafilococos coagulasa negativos

En el pasado, los estafilococos coagulasa negativos eran considerados por lo general contaminantes con escasa impor­ tancia clínica. Sin embargo, durante las últimas cuatro décadas se los reconoció como agentes importantes de enfermedades humanas. Aunque se describieron varias especies diferentes de estafilococos coagulasa negativos (véase recuadro 12-1), muy pocas de ellas causan infecciones en los seres humanos. No obstante, como muchos laboratorios intentan identificar los estafilococos coagulasa negativos, las infecciones causadas por otras especies se están reconociendo cada vez con mayor fre­ cuencia. Los tipos de infecciones asociadas con los estafiloco­ cos coagulasa negativos se enumeran y se describen en el recuadro 12-5. STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS Cuando los hallazgos clínicos se correlacionan con el hallaz­ go de estafilococos coagulasa negativos, S. epidermidis es por mucho el microorganismo aislado con más frecuencia y da cuenta del 50% hasta más del 80% de los aislamientos.14 Casi todas las infecciones causadas por S. epidermidis son adquiri­ das en hospitales, excepto la endocarditis de válvula nativa y las infecciones de dispositivos de acceso venoso semipermanentes. Además de la endocarditis de válvula nativa y de próte­ sis valvular. S. epidermidis ha sido aislado y documentado como patógeno en infecciones urinarias, infecciones de heridas quirúrgicas, infecciones de varios dispositivos de prótesis, infecciones de derivación de líquido cefalorraquídeo (LCR), infecciones relacionadas con diálisis peritoneal e infecciones oftálmicas (véase recuadro 12-5). Durante los últimos años, se han progresado en la identificación de varios factores de viru­ lencia en S. epidermidis. Los estudios de microscopía electró­ nica de transmisión y de barrido y los análisis inmunológicos de cepas de S. epidermidis de infecciones de dispositivos médi­ cos colonizados han mostrado que esas bacterias producen macromoléculas de superficie y extracelulares que inician y luego mejoran la adhesión bacteriana a las superficies plásticas de cuerpos extraños para formar una biopelícula. En un princi­ pio, la adherencia específica de la mayoría de las cepas de S. epidermidis a superficies plásticas parece ser mediada en gran parte por un polisacárido-adhesina llamado P S /A .310-450 PS/A es una molécula de poliglucosamina con enlaces (3-1,6, N-succinilada de forma variada, de elevado peso molecular, codificada por el locus ica del genoma de S. epidermidis.29' PS/A purifi­ cada puede bloquear la adherencia de S. epidermidis productor

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Recuadro 12-5

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Infecciones asociadas con S taphylococcu s ep id erm id is y otros estafilococos coagu lasa negativos

Infección

Comentarios

Infecciones urinarias

Entre los estafilococos coagulasa negativos, S. saprophyticus es un patógeno real de las vías urinarias, que causa infecciones urinarias altas y bajas, principalmente en mujeres jóvenes. Varios estudios han encontrado que es la segunda causa más común de infecciones urinarias después de Escherichia coli y representan el 11-32% de esas infecciones en mujeres de consulta externa.182-252-378 Otros estafilococos coagulasa negativos son causas raras de infecciones urinarias, y casi el 80-90% de esas infecciones son causadas por S. epidermidis.262 Las infecciones urinarias debidas a S. epidermidis y a otros estafilococos coagulasa negativos están por lo general asociadas con catéteres y se producen en pacientes ancianos, con anterior instrumentación del tracto urinario, o cirugías, trasplante renal, urolitiasis u otras anormalidades urológicas.262 La piuría y las afecciones urinarias altas significativas se observan por lo general en sólo el 10% del último grupo de pacientes. Las cepas coagu­ lasa negativas de estos pacientes a menudo son adquiridos en el hospital y son multirresistentes.

Osteomielitis

La osteomielitis debida a estafilococos coagulasa negativos puede ocurrir como una complicación de la cirugía cardiotorácica y por la implantación de materiales protésicos, como prótesis de rodilla y de cadera. La cirugía cardiotorácica puede conducir a una herida esternal y a infecciones óseas que pueden requerir desbridamiento quirúrgico.148-208 Las infecciones asociadas con prótesis se diagnostican por examen directo y cultivo de aspi­ rados con agujas del sitio afectado, por biopsia ósea o por retiro y cultivo del material implantado. La osteo­ mielitis hematógena puede resultar de baeteriemia con estafilococos coagulasa negativos que se originan en infecciones de derivaciones de otros dispositivos protésicos.

Endocarditis de válvula nativa

Los estafilococos coagulasa negativos rara vez son la causa de endocarditis relacionadas con marcapasos o con válvula nativa y dar cuenta del 5% de todos los casos.58 La patogenia compromete la colonización de las vál­ vulas cardíacas dañadas con anterioridad o del endocardio durante la baeteriemia transitoria. Más de la mitad de los pacientes con esta infección tienen complicaciones, como insuficiencia cardíaca congestiva o fenómeno embólico. Casi la mitad de estas infecciones involucran a estafilococos coagulasa negativos además de S. epi­ dermidis. Otras especies, como S. lugdunensis, han sido informadas como causa poco común de endocarditis grave, con destrucción valvular masiva.461

Endocarditis de válvula protésica

La diferencia de lo que sucede en las endocarditis de válvula nativa, los estafilococos coagulasa negativos son los agentes etiológicos más comunes de la endocarditis de válvula protésica, y S. epidermidis es la especie aislada con mayor frecuencia, casi con exclusión de todas las otras.14-206 En esta infección, los microorganis­ mos infectan el anillo de las suturas que sostienen la válvula en su lugar, causando la formación de microabscesos que están relativamente protegidos de los antibióticos.55 El paciente por lo general presenta fiebre y evi­ dencia de disfunción valvular. Las complicaciones son dehiscencia de la válvula, obstrucción de la válvula debida a la formación de vegetaciones protuberantes y, en ocasiones, disritmia cardíaca. Como la mayoría de estas infecciones se deben a la inoculación de un pequeño número de microorganismos en el sitio y en el momento de la colocación de la válvula, los síntomas de endocarditis aparecen lentamente después de varios meses.55-206 Además de las válvulas protésicas, los estafilococos también pueden infectar hilos de marcapasos e injertos vasculares.17

Infecciones de catéteres intravenosos

S. epidermidis es el aislamiento más común que infecta catéteres intravenosos.362 Los tipos de catéteres implica­ dos incluyen las vías intravenosas periféricas y centrales, catéteres de hiperalimentación central, catéteres de hemodiálisis subclavia, vías centrales de Hickman y Broviac, y catéteres de Swan-Ganz.266-355 Los catéteres infectados pueden ser el origen de las bacteriemias, que pueden colonizar sitios distantes para crear otras complicaciones infecciosas.77 Los catéteres infectados y los sitios de inserción del catéter a menudo no pare­ cen infectados (p. ej„ puede no haber eritema o purulencia) y la baeteriemia relacionada con catéteres puede ser muy poco sintomática. Aunque los cuidados asiduos de los catéteres pueden disminuir la incidencia de estos episodios bacteriémicos, otras innovaciones, como los catéteres impregnados en antibióticos (rifampici­ na o minociclina) parecen disminuir de manera significativa la incidencia de estas infecciones.88 El tratamien­ to incluye la extracción del catéter, si es posible, junto con terapia antibiótica sistémica. Los estudios de las infecciones relacionadas con catéter y las bacteriemias incluyen hemocultivos de sangre periférica, sangre extraída del catéter y, a menudo, cultivo del catéter.81-266

Infecciones de derivación de LCR

S. epidermidis es la causa más común de infección asociada con derivación de LCR, catéteres de LCR, bombas intratecales y sitios de ventriculostomía.288-478 Estas infecciones por lo general suceden a pocas semanas de la colocación de la derivación, pero también pueden ocurrir durante otras manipulaciones.24'’ Los pacientes con infecciones de la derivación de LCR pueden estar asintomáticos, aunque algunos pueden presentar síntomas de meningitis. El análisis del LCR aspirado puede mostrar pleiocitosis moderada y los niveles de glucosa pue­ den ser normales o estar un poco disminuidos. A menudo es necesaria la extracción de la derivación para el efecto curativo, aunque algunas infecciones estafilocócicas han sido tratadas con eficacia con antibióticos solos.118-482 Los antibióticos usados son vancomicina, rifampicina y una aminoglucósido administrado intraventricularmente. debido a que estas infecciones adquiridas en los hospitales son causadas por estafilococos resistentes a las penicilinas semisintéticas (p. ej., oxacilina, meticilina).142

(Continúa)

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Recuadro 12-5

Cocos grampositivos: Parte I: Estatilococos y cocos grampositivos relacionados

Infecciones asociadas con S taphylococcu s ep id erm id is y otros estafilo co co s coagu lasa negativos (co n t.)

Infección

Comentarios

Infecciones asociadas con catéteres de diálisis peritoneal

S. epidermidis es el microorganismo aislado con mayor frecuencia de pacientes con peritonitis asociada con diá­ lisis peritoneal ambulatoria continua (DPAC).'8-409'493 La peritonitis se caracteriza por dolor abdominal, náu­ seas, vómitos, fiebre y un efluente turbio después de la diálisis, aunque muchos pacientes pueden tener sínto­ mas escasos o moderados. El líquido peritoneal puede aparecer turbio y contener > 100 leucocitos por milili­ tro. Las tinciones de Gram del líquido no concentrado pueden ser negativas y se requiere centrifugación o fil­ tración para recuperar el escaso número de microorganismos.92 La terapia con antibióticos de las peritonitis estafílocócicas asociadas con DPAC puede administrarse de forma parenteral, oral o intraperitoneal y por lo genera] incluye oxacilina o meticilina, cefalosporinas, aminoglucósidos, vancomicina o trimetoprim-sulfametoxazol.242

Infecciones de injerto vascular

Las infecciones de injertos vasculares muy a menudo son causadas por S. epidermidis. Muchos de estos injertos se colonizan con un pequeño número de microorganismos en el momento de la colocación del injerto y las infecciones pueden no aparecer clínicamente hasta meses o incluso años más tarde.321-499 Las cepas estafilocócicas aisladas en estas infecciones son multirresistentes, lo que sugiere que las infecciones se deben a la pre­ sencia de microorganismos contaminantes en los propios injertos.

Bacteriemia

En la actualidad en la mayoría de los centros médicos S. epidermidis es el agente causal más común de bacte­ riemia en pacientes inmunodeprimidos.77 109'353 Estos microorganismos alcanzan el torrente circulatorio mediante los dispositivos de acceso vasculares infectados.362 Los pacientes en los que desarrolla bacteriemia estafilocócica relacionada con catéteres suelen tener dispositivos de acceso múltiples ubicados para el trata­ miento de cáncer o para la administración de agentes quimioterapéuticos para el trasplante de médula ósea.477 Otras especies de estafilococos coagulasa negativos también han sido asociadas con bacteriemia en huéspedes inmunodeprimidos.

Infecciones pediátricas

La mayoría de las infecciones pediátricas son bacteriemias estafílocócicas hospitalarias que suceden en las uni­ dades de cuidados intensivos neonatales.9 Estas infecciones están asociadas con prematuridad, presencia de vías centrales o periféricas colonizadas, asistencia ventilatoria y administración de nutrición parenteral total.120 Aunque la mayoría de los microorganismos estafilocócicos en tales infecciones son S. epidermidis. también han estado involucradas otras especies (p. ej., S. haemolyticus).211

Infecciones oculares

S. epidermidis es el patógeno implicado con más frecuencia que causa endoftalmitis posquirúrgica. Los procedi­ mientos quirúrgicos asociados con estas infecciones incluyen el implante de cristalino y las cirugías de catara­ tas.486 El diagnóstico se hace por aspiración y cultivo del humor vitreo. El tratamiento de la endoftalmitis por S. epidermidis requiere la administración parenteral e intraorbital de antibióticos (penicilinas, cefalosporinas, aminoglucósidos, rifampicina o vancomicina). Se han informado otras infecciones oculares de importancia clínica, como blefaritis, conjuntivitis purulenta y queratitis supurada que involucran a S. epidermidis y a otras especies coagulasa negativas (S. warneri, S. capitis, S. hominis, S. simulans, S. lugdunensis y S. xylosus).m

Infecciones cutáneas

Los estafilococos coagulasa negativos pueden ser aislados en diversas lesiones cutáneas (quistes, carbunclos, forúnculos), ya sea solos o junto con otras bacterias piógenas, incluidos S. aureus y estreptococos P-hemolíticos. Las especies más comúnmente implicadas son S. epidermidis, S. haemolyticus. S. lugdunensis y S. homi­ nis,4 Entre las infecciones cutáneas inusuales que involucran a S. epidermidis se incluye la otitis externa maligna.418

de PS/A a los catéteres plásticos in vitro y los anticuerpos diri­ gidos contra PS/A parecen bloquear, además, la adherencia a los biomateriales. También protege a los microorganismos de la muerte fagocítica mediada por complemento.310'406,407 Se descri­ bieron otros polisacáridos de la superficie celular que pueden contribuir con este proceso.21 Además, ciertas proteínas pueden actuar para promover la adherencia a los plásticos en algunas cepas de S. epidermidis.168-184,448 Por ejemplo, Heilmann y cois, identificaron una adhesina-autolisina codificada por un gen lla­ mado atlE que funciona en conjunto con PS/A en la adherencia inicial de S. epidermidis a los biomateriales.168 Después de la adhesión inicial a los biomateriales. la pato­ genia de la infección por S. epidermidis parece involucrar la adhesión entre células fijadas a la superficie plástica y forman la base de la matriz de la biopelícula de polisacárido/célula bacteriana.15 La adhesión intercelular está mediada por un poli­ sacárido llamado P I A (adhesina intracelular polisacárido) jun­

to con algunas otras proteínas asociadas con la célula.274 PIA es un polisacárido lineal compuesto por residuos de (3-1,6 2-desoxi-2-amino-D-glucopiranosilo, de los cuales 80-85% están Nacetilados y cargados positivamente o modificados con resi­ duos fosfato o succinato y cargados negativamente.273 Como los de PS/A, los genes estructurales de PIA también residen dentro del operón cromosómico para cuatro genes llamado /ca; los cuatro genes son icaA, icaB, icaC e ¡ca D . 133,169,291 PIA tam­ bién parece funcionar como una hemoaglutinina, ya que los anticuerpos anti PIA y PIA purificada pueden inhibir la hemaglutinación. Por lo tanto, los mutantes deteriorados en la sínte­ sis de PIA por manipulaciones genéticas también pierden la capacidad para aglutinar hematíes de varias especies.108,275 El papel de PS/A, PIA y otros posibles factores de virulencia de S. epidermidis en la iniciación y síntesis de biopelículas en bio­ materiales está sustentado en estudios con modelos animales con cepas mutantes que carecen de la capacidad de sintetizar

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esas moléculas y por inhibición de esas interacciones por anti­ cuerpos específicos.275,379,506 Usando un modelo de cuerpo extraño murino y un modelo de infección asociada con un caté­ ter venoso central de rata, Rupp y cois, mostraron que la cepa de S. epidermidis tipo silvestre era mucho más capaz de causar formación de abscesos, más difícil de ser erradicada por las defensas del huésped y más adherente a los plásticos implanta­ dos que una cepa mutante PIA negativa isogénica.379 380 Estudios genéticos también avalan la indicación de que el locus ¡ca de S. epidermidis codifica proteínas que pueden sintetizar PS/A. que está relacionada desde el punto de vista químico con PIA. pero que se distingue de ésta por el tamaño molecular, las propiedades biofísicas y la presencia de grupos succinato en la mayoría de los grupos amino de los residuos glucosalina que constituyen el polímero. Sin embargo, es improbable que PS/A y PIA sean los únicos factores que participan en la coloniza­ ción y la formación de biopelículas en biomateriales como los catéteres plásticos. En efecto, se ha identificado una proteína extracelular de 140 kDa que cumple un papel en la acumula­ ción de la biopelícula, aunque este papel todavía no se ha defi­ nido.184 Otro mecanismo de adhesión utilizado por S. epidermidis involucra interacciones específicas con varios componentes del plasma, suero y tejidos del huésped, entre ellas las proteínas del tejido conectivo, como colágeno y laminina, y las proteínas derivadas del suero, como fibronectina y vitronectina. ' ^07.335,505 rj'a]es interacciones pueden constituir los pasos iniciales de la colonización del tejido y del establecimiento de las infecciones en ausencia de cuerpos extraños, como catéte­ res o derivaciones. También se ha detectado una proteína de unión al fibrinógeno, llamada fbe, en la superficie de las cepas de S. epidermidis?20 La proteína de unión al fibrinógeno puri­ ficada inhibió por completo la adherencia de S. epidermidis al fibrinógeno inmovilizado, también se encontró que los anti­ cuerpos contra la proteína bloquean en forma eficiente la adhe­ rencia.338 El gen que codifica esta proteína (el gen fb e) ha sido clonado y secuenciado; esta proteína muestra homología par­ cial con dos de los tres tipos de factores de aglutinación produ­ cidos por S. aureus.43’100-33* Se han identificado otros posibles factores de virulencia para otras capacidades patogénicas atribuidas a S. epidermidis. Algu­ nas cepas producen una enzima modificadora del ácido graso que inactiva los ácidos grasos bactericidas esterificándolos con colesterol, inactivan los ácidos grasos y permiten a S. epidermidis vivir en la piel durante períodos prolongados.72,73 Algunas cepas de S. epidermidis también producen lipasas, que pueden cumplir un papel en la colonización de la piel, la formación de rMopelículas y la iniciación de infecciones cutáneas.411 Aunque por lo general no se considera un factor que contri­ buya a la virulencia, el reconocimiento de la creciente resisten­ cia a los antibióticos de las cepas de S. epidermidis es una característica emergente preocupante.360416 Durante los últimos años ha surgido la resistencia de los estafilococos coagulasa -.egativos a muchas clases de antibióticos, incluida la resisten­ cia a las penicilinas resistentes a la penicilinasa (oxacilina, meticilina). El uso cada vez mayor de vancomicina ha llevado al surgimiento de estafilococos coagulasa negativos con sensi­ bilidad disminuida a la vancomicina.410 Esto se observó prime­ ro en S. haemolyticus, pero también ocurrió en menor medida en cepas clínicas de S. epidermidis 409 Aunque los informes de cepas de S. epidermidis resistentes a la vancomicina aparecen entre mediados y fines de la década de 1980, no se proveyó la información clínica de esas cepas.402 Sin embargo, en 1991, se aisló en Inglaterra una cepa de S. epidermidis resistente a la

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vancomicina en un paciente con peritonitis.384 Cinco años des­ pués, se informó S. epidermidis resistente a la vancomicina en varios pacientes de la República Soviética.239 En 1999, se infor­ mó el primer caso de baeteriemia debida a S. epidermidis con sensibilidad disminuida a la vancomicina en los Estados Unidos.124 La paciente era una mujer de 49 años con carcinoma de vesícula biliar que había recibido vancomicina y varios otros antibióticos a causa del curso clínico complicado de la enfer­ medad. Se aislaron dos cepas de S. epidermidis algo diferentes en sangre periférica y en sangre extraída del catéter venoso central. Una fue sensible a la vancomicina (CIM, 4 pg/mL), mientras que la otra tuvo sensibilidad intermedia (CIM, 8 pg/mL). Aunque ambos aislamientos resultaron sensibles en las pruebas de difusión en disco (tamaño de las zonas. 16-17 mm), las pruebas para CIM con el panel MicroScan Pos Combo®, E test® y dilución en caldo confirmaron la CIM ele­ vada para la segunda cepa. El escaso rendimiento del método de difusión en disco llevó a estos investigadores a recomendar las determinaciones de CIM cuando se pruebe la sensibilidad de los estafilococos a la vancomicina, en particular cuando la bacteria se haya aislado en muestras corporales como sangre y otros líquidos corporales normalmente estériles.124 STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTICUS SUBESPECIE SAPROPHYTICUS

La especie de S. saprophyticus coagulasa negativa merece una mención especial, porque se ha comprobado que este pató­ geno causa infecciones urinarias en mujeres jóvenes sanas sexualmente activas.182-252,398En 1996, se caracterizó una subes­ pecie nueva entre cepas resistentes a la novobiocina, coagulasa negativas recuperadas del 7% en cultivos nasales de vacas sanas.159 Las características fenotípicas, los análisis de ácidos grasos y de la pared celular, y los estudios de parentesco gené­ tico mostraron que esas cepas eran similares pero distintas de las de S. saprophyticus aisladas en seres humanos. Estas cepas bovinas fueron llamadas S. saprophyticus subespcie bovis, mientras que las cepas humanas ahora se llaman S. saprophyti­ cus subespecie saprophyticus (de aquí en adelante mencionado como S. saprophyticus). En las mujeres jóvenes y en las adolescentes, S. saprophyti­ cus es la segunda causa más común de cistitis no complicada después de Escherichia co/¿.153,293,398 En muestras de orina de esas pacientes, el microorganismo suele estar presente en can­ tidades menores de 100 000 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL, pero en muestras seriadas de pacientes infectadas de microorganismo se confirma. Las pacientes a menudo pre­ sentan disuria, piuria y hematuria. Las infecciones urinarias altas (pielonefritis) pueden observarse en el 41-86% de los pacientes y, a veces, puede haber baeteriemia por S. saprophy­ ticus como complicación urinaria alta.137,258 Este microorganis­ mo ha sido implicado como causa de infecciones urinarias y de uretritis en hombres y mujeres (síndrome uretral agudo), infec­ ciones urinarias asociadas con catéteres vesicales, prostatitis en varones mayores y rara vez baeteriemia. sepsis y endocardi­ tis.33,137,207,315-412 Se demostró que S. saprophyticus causa infec­ ciones urinarias sintomáticas agudas en niños, niñas y adoles­ centes en ausencia de anormalidades estructurales del aparato urinario.2,451 En 1999, Hell y cois, informaron el aislamiento de S. saprophyticus como causa de neumonía de origen hospi­ talario.170 También se ha investigado la fuente de S. saprophyticus en la patogenia de las infecciones urinarias. Rupp y cois, estudia­ ron la prevalencia de la colonización urogenital en 276 mujeres y encontraron que el recto fue el sitio de colonización por S.

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Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

saprophyticus más frecuente (40%), seguido de la uretra (30%), la orina (20%) y el cuello uterino (10%).378 En este estu­ dio, el seguimiento durante casi 7 meses de las mujeres coloni­ zadas no reveló ninguna progresión a infección urinaria sinto­ mática por S. saprophyticus. En otro estudio de 14 mujeres con infección urinaria por S. saprophyticus, se encontró el mismo aislamiento en las heces de 6 mujeres, lo que sugiere que el conducto rectal puede ser un reservorio importante para este microorganismo.167 5. saprophyticus también fue aislado en otros animales (p. ej., cerdos), en la pastura y el forraje; hay evidencia que indica que el alimento puede ser la fuente pri­ maria del microorganismo.165J66Hedman y cois, encontraron S. saprophyticus en 16,4% de 1 331 muestras de alimentos, con una prevalencia del 34% en carne de vaca y de cerdo.165 Estos investigadores concluyeron que el microorganismo proviene de las reses del matadero, contamina la materia prima del alimen­ to y luego coloniza el aparato digestivo humano. En los últimos años se han estudiado varios posibles factores de virulencia de S. saprophyticus. Estudios in vitro sobre la adherencia de esta especie a varios tipos de células mostraron que S. saprophyticus se adhiere a las células periuretrales, ure­ trales y uroepiteliales más que otros estafilococos y no se adhiere a otros tipos de células, como las de la mucosa bucal y las de la piel.293 Este tropismo por el tejido uroepitelial puede explicar en forma parcial la elevada frecuencia de infecciones urinarias causadas por este microorganismo. La ureasa, un reconocido factor de virulencia para otros patógenos urogeni­ tales (p. ej., especies de Proteus, Corynebacterium ureolyticum), también se produce por S. saprophyticus y contribuye a la invasión del tejido vesical en modelos animales de infección urinaria.176 La producción de moco no ha sido un atributo cons­ tante de cepas de S. saprophyticus.369 Hjelm y LundellEtherden encontraron que, aunque sólo 9 de 30 cepas de S. saprophyticus producían moco en caldo tripticasa soja, las 30 lo producían en la orina.176 Estos investigadores propusieron que tanto la presencia de orina como la de ureasa eran esencia­ les para la producción de moco por este microorganismo. Se ha identificado una proteína fibrilar de 95 kDa asociada con la superficie de las cepas de S. saprophyticus como posible factor de virulencia.126 Esta proteína, designada Ssp (por protema de S. saprophyticus asociada con la superficie) puede participar en las interacciones iniciales y la adherencia a las células uroepi­ teliales. También se demostró una hemaglutinina de 160 kDa sobre la superficie de las células de S. saprophyticus ,128 Esta hemaglutinina se une a una proteína de membrana o proteínas presentes en la superficie de eritrocitos de carnero; se demos­ tró que es la principal adhesina para la unión de microorganis­ mos a las células epiteliales299'300 y que también es capaz de unirse a la fibronectina.127 Además de Ssp y la hemaglutinina, se ha identificado recientemente sobre la superficie de las célu­ las de S. saprophyticus otra proteína de superficie celular que se une a la fibronectina y a los eritrocitos.171 Esta proteína tiene tanto propiedades adhesivas como autolíticas y el gen para esta proteína (llamado gen aas) ha sido clonado y secuenciado. Las secuencias de aminoácidos para los dominios funcionales de la autolisina codifican las enzimas N-acetil-muramil-L-alanina amidasa y endo-p-A'-acetil-D-glucosaminidasa y son similares a las de las autolisinas identificadas tanto en S. aureus como en S. epidermidis. Las secuencias restantes funcionan como la adhesina y representan una clase nueva de factores de virulen­ cia estafilocócicos.171 Por último, Schneider y Riley informaron que el 79% de 100 aislamientos urinarios de S. saprophyticus mostraban una superficie celular intensamente hidrófoba en un ensayo de dos fases, acuosa e hidrocarbonada.397 Luego se

demostró que la hidrofobicidad es independiente de Ssp y de la hemoaglutinina.298 Como las interacciones hidrófobas de la superficie celular entre las bacterias y las células mamíferas promueven la adherencia, las estructuras hidrófobas de super­ ficie de S. saprophyticus podrían funcionar en la interacción inicial de estos microorganismos con las células uroepiteliales. OTROS ESTAFILOCOCOS COAGULASA NEGATIVOS

Otras especies estafílocócicas se encuentran en seres huma­ nos y en animales como parte de la flora normal y son causa de varios tipos de infecciones (véase recuadro 12-1). Algunas especies habitan en el medioambiente y se usan en varias industrias, incluido el procesamiento de alimentos. Aunque especies coagulasa negativas de S. epidermidis y S. saprophy­ ticus se encuentran con frecuencia como contaminantes en muestras clínicas, el progreso médico les asignó un papel importante en enfermedades e infecciones humanas a otros numerosos estafilococos coagulasa negativos. Muchas especies ahora han sido informadas como causa de infecciones, princi­ palmente de heridas, infecciones urinarias, bacteriemia, osteo­ mielitis, sepsis relacionada con el catéter, infecciones de la derivación ventriculoperitoneal y endocarditis de prótesis val­ vular o de válvula nativa (recuadros 12-1 y 12-5). Estos agen­ tes están siendo reconocidos como patógenos oportunistas en pacientes inmunodeprimidos, incluidos recién nacidos prema­ turos, pacientes neutropénicos por cáncer, personas ancianas con enfermedades subyacentes graves y enfermos hospitaliza­ dos por procedimientos invasivos y portadores de dispositivos plásticos. Las infecciones con muchas de estas otras especies se adquieren en las salas del hospital. Las especies implicadas con mayor asiduidad son S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. schleiferi, S. wameri, S. hominis, S. simulans y S. saccharoly­ ticus. Algunos de estos agentes, como S. schleiferi y S. warneri, producen diversos productos extracelulares (glucocáliz, DNasa, lipasa, estearasa, proteasa y ex- y P-hemolisinas) que contribuyen a la virulencia.162 S. haemolyticus ha concitado un interés creciente a causa del surgimiento de su resistencia a los glucopéptidos.271,401'403'470 Los nichos ecológicos y la importan­ cia clínica de los estafilococos además de S. aureus, S. epider­ midis y S. saprophyticus se describen en el recuadro 12-1, mientras que los procesos infecciosos asociados con S. epider­ midis y otros estafilococos coagulasa negativos se detallan en el recuadro 12-5. Especies de Micrococcus y géneros relacionados

Los miembros del anterior género Micrococcus están mucho más relacionados con el género Arthrobacter corineforme grampositivo que con los estafilococos. Estos microorganismos se encuentran en el medioambiente y como flora transitoria en la piel humana y de otros mamíferos. Algunas especies produ­ cen pigmentos carotenoides, lo que da lugar al desarrollo de colonias am arillas o rosadas en agar. Las especies de Micrococcus tienen usos industriales como microorganismos en bioensayos para la detección de antibióticos en los alimen­ tos para animales, cosméticos y líquidos corporales. Sólo en ocasiones se aíslan en muestras clínicas humanas, en las que por lo común representan contaminantes de la piel, de las superficies mucosas o del medioambiente. Estos microorganis­ mos pueden comportarse como patógenos oportunistas en pacientes inmunodeprimidos y se han informado como causa de neumonía, meningitis, artritis séptica, bacteriemia, sepsis relacionada con cateterismo y peritonitis vinculada con diálisis

A is la m ie n to y d ife re n c ia c ió n p re lim in a r de los e s ta filo c o c o s y d e los c o c o s g ra m p o s itiv o s re la c io n a d o s

rem oneal ambulatoria continua.61-276'337,381-474,495 Kytococcus sedentarius (antes Micrococcus sedentarius) produce dos enzi­ mas capaces de hidrolizar la queratina y es responsable de la erosión de la epidermis humana en la afección dermatológica ..amada queratólisis punteada.270

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dos cocos grampositivos”) Si la apariencia de la coloración de Gram es más típica, se puede informar “cocos grampositivos semejantes a estafilococos”, con confirmación con cultivos posteriores. No se puede usar la morfología de la tinción de Gram para diferenciar estafilococos de micrococos y géneros relacionados o de planococos.

Rothia mucilaginosa La primera infección humana por R. mucilaginosa fue infor­ mada en 1978 en un paciente que había desarrollado endocar­ ditis luego de la cateterización cardíaca.377 Desde entonces, han aparecido en la bibliografía varios casos de endocarditis de vál­ vula protésica y de válvula nativa causadas por R. mucilagino­ sa. En algunos de esos casos, la infección cardíaca estuvo aso­ ciada con el uso de drogas intravenosas.82,349-365 La sepsis por R. mucilaginosa ha sido informada en asociación con trauma de cuello y cabeza, dispositivos de acceso periféricos y centrales, quimioterapia contra cáncer, cateterización cardíaca seguida de infarto de miocardio, diálisis peritoneal ambulatoria continua y prematuridad extrema.303-352,377 R. mucilaginosa también ha sur­ gido como un patógeno importante tanto en adultos como en niños con procesos malignos (p. ej., leucemia, linfoma, cáncer de mama, enfermedad de Hodgkin, carcinoma espinocelular, osteosarcoma, rabdomiosarcoma y SIDA) y en receptores de trasplantes de médula ósea.1-12-86-140-149-334-453-488 Entre las infec­ ciones están incluidas bacteriemias sostenidas o transitorias, sepsis asociadas con una vía central o periférica, neumonía, meningitis, osteomielitis vertebral y colangitis.1,12-86-140-161-318 La recuperación de R. mucilaginosa de esos pacientes se asoció con neutropenia acentuada como resultado de una enfermedad subyacente, inmunosupresión o quimoterapia citotóxica. Los dispositivos de acceso colonizados (p. ej., guías intraarteriales o intravenosas, catéteres de Brouviac y de Hickman) fueron la procedencia del microorganismo en algunos pacientes, mien­ tras que las ulceraciones esofágicas o mucosas secundarias a quimioterapia quimiotóxica, enfermedad periodontal o infec­ ciones odontológicas o procedimientos se creyeron el origen en otros. Se ha informado endoftalmitis grave seguida a la implan­ tación de lentes intraoculares que requirió la evisceración del ojo.439

Aislamiento y diferenciación preliminar de los estafilococos y de los cocos grampositivos relacionados Frotis directos con tinción de Gram

En frotis directos teñidos con Gram a partir de muestras clí­ nicas, los estafilococos aparecen como cocos grampositivos o gramvariables con diámetros que van desde 0,5 hasta casi 1,5 (im. Las células más grandes se observan entre los miembros del género Macrococcus, pero estas especies no causan infec­ ciones humanas.217 Los microorganismos pueden aparecer solos, en pares, en cadenas cortas o en grupos, tanto dentro como fuera de los leucocitos polimorfonucleares (PMN) (lámi­ na en color 12-ID y F). Las variaciones en el tamaño celular y en la tinción de Gram se deben probablemente a la acción de las células inflamatorias y a sus enzimas hidrolíticas en las células bacterianas. En los frotis directos, los pares o cadenas cortas de microorganismos no pueden diferenciarse de estrep­ tococos, micrococos o peptoestreptococos, aunque los estrep­ tococos suelen aparecer como cadenas o diplococos más que como cadenas de células individuales aisladas. Los informes de los extendidos directos deben incluir la cuantificación de tipos de células y microorganismos (p. ej., “muchos PMN, modera­

Aislamientos en muestras clínicas

Para la recuperación de estafilococos y microorganismos relacionados, las muestras clínicas se deben inocular en agar sangre de camero (SBA) y otros medios bacteriológicos. Para el aislamiento de microorganismos de muestras densamente contaminadas, las muestran deben ser inoculadas en agar Columbia adicionado con colistín y ácido nalidíxico (CNA) o en agar alcohol feniletílico (PEA), que inhiben el desarrollo de bacterias gramnegativas y permiten el desarrollo de microorga­ nismos grampositivos. El agar manitol sal es un medio selecti­ vo bueno para determinar la presencia de S. aureus en muestras como los cultivos nasales. En SBA, la mayoría de los estafilo­ cocos crecen bien dentro de las 24 horas, aunque los microco­ cos pueden requerir 48 horas para formar colonias de tamaño adecuado. Algunas especies de estafilococos pueden requerir más de 24 a 48 horas de incubación para poder discernir si una muestra contiene un cultivo puro o mixto. Una incubación más prolongada -m ayor de 72 horas- puede ser necesaria para ase­ gurar que la identificación y las pruebas de sensibilidad se están realizando sobre un cultivo puro, en especial si se han tomado colonias múltiples para obtener un inóculo representa­ tivo. Morfología de la colonia

Las especies de Micrococcus y Staphylococcus forman colo­ nias distintas en SBA. Las colonias de la mayoría de las espe­ cies estafilocócicas crecen más rápido que los micrococos y tienen un diámetro de 1 a 3 mm después de 24 horas de incu­ bación, aunque algunas (S. warneri, S. simulans, S. auricularis, S. vitulinus, S. lentus) pueden formar colonias más pequeñas durante ese lapso. Las cepas de algunas especies estafilocóci­ cas mostrarán una variación considerable en el tamaño de las colonias en la misma placa de cultivo y dar la apariencia de un cultivo mixto. Las colonias estafilocócicas suelen ser lisas, cre­ mosas y tienen un perfil convexo poco sobreelevado y bordes netos. Las colonias de algunas cepas de S. aureus son por lo general grandes (4-6 mm de diámetro), lisas, enteras y de con­ sistencia cremosa, aunque ciertas cepas pueden ser de aparien­ cia húmeda o “viscosas”. Algunas cepas pueden estar pigmen­ tadas de amarillo o de amarillo naranja (de ahí el nombre “aureus” que significa “color oro”), mientras que otras pueden producir colonias blanquecinas o grises. Las últimas cepas se pueden asemejar a los estreptococos del grupo D y a los enterococos (catalasa negativos). La producción de pigmento en S. aureus y entre los estafilococos coagulasa negativos por lo general se vuelve más pronunciada después de la incubación a temperatura ambiente durante 2 a 3 días. Algunas de las espe­ cies de S. aureus y de las especies coagulasa negativas pueden tener una zona difusa de p-hemólisis alrededor de las colonias; esta propiedad hemolítica puede evidenciarse sólo después de una incubación prolongada (lámina en color 12-1E). Las cepas de S. aureus aisladas en pacientes que han sido tratados con antibióticos durante períodos prolongados o en aquellos con afecciones permanentes, como la fibrosis quística, pueden crecer como colonias atípicas conocidas como varían-

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Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

tes de colonias pequeñas. Estas colonias suelen ser muy

pequeñas, no pigmentadas y crecen mejor en presencia de CO,. Estos aislamientos también pueden ser dificultosos para probar sensibilidad a los antibióticos debido a su escaso desarrollo. El caldo usado en las pruebas de sensibilidad por microdilución de estos aislamientos puede necesitar suplementación, y la dilución en agar, la difusión en disco y los métodos de sensibi­ lidad Etest deben realizarse en agar de Mueller-Hinton que contenga 5% de sangre camero. Los micrococos y las especies relacionadas crecen casi siempre más lentamente; a menudo requieren 48 horas de incu­ bación antes de que se pueda distinguir la morfología típica de la colonia. Después de ese tiempo las colonias de los microco­ cos miden 1 a 2 mm de diámetro, son opacas o mate, con per­ fil convexo bien sobreelevado y bordes netos. La especie recientemente descrita M. antarctica produce colonias muco­ sas, pigmentadas amarillas en agar.269 Las colonias de especies de Micrococcus, Nesterenkonia, Dermacoccus y Kocuria, y A. agilis pueden ser lisas o mate. Algunas especies son no pig­ mentadas (M. lylae, N. halobia) o pueden producir colonias amarillas (M. luteus, K. sedentarius, K. varians, K. palustris, K rhizophila), naranjas (D. nishinomiyaensis, K. kristinae) o rosadas a rojas (K. rosea, A. agilis) en agar lámina en color 121H). La pigmentación a veces se vuelve más clara o intensa si las placas se incuban a temperatura ambiente durante varios días. Las colonias de R. mucilaginosa son de grises a blancas y pue­ den tener aspecto mucoide. Tienden a adherirse al agar y cuando se las extrae del medio, son difíciles de emulsionar. Se cuenta con medios de cultivo que contienen sustratos cromogénicos para el aislamiento y la identificación presuntiva de S. aureus. Las formulaciones disponibles son CHROMagar Staph aureus® (CHROMagar Microbiology, París, Francia) y S. aureus ID agar® (bioMerieux, La Balme Les Grottes, Francia).123,343 En CHROMagar Staph aureus, las colonias de S. aureus son de color malva, mientras que en S. aureus ID agar son verdes. Las colonias coloreadas crecen en esos medios a causa de la producción de a-glucosidasa por los microorganis­ mos durante el desarrollo. Los estafilococos coagulasa negati­ vos producen colonias azules, blancas o beige en esos medios. En una evaluación comparativa de CHROMagar Staph aureus y S. aureus ID agar, el 96,8% de las cepas de S. aureus produ­ cían colonias verdes en el S. aureus ID agar después de 18-20 horas de incubación, mientras que el 91,1% de las cepas for­ maban colonias de color malva en CHROMagar Staph aureus dentro del mismo lapso.343 Se recuperaron un total de 94,3% de las cepas dentro de las 18-20 horas en agar sangre convencio­ nal. Los rendimientos del desarrollo en todos los medios aumentaron después de una incubación adicional de 20-24 horas. Cuando fueron confirmadas las identidades de las colo­ nias coloreadas, el 94,7% de las colonias verdes en S. aureus ID agar y el 94,4% de las colonias malva en CHROMagar Staph aureus eran S. aureus. Se observó que CHROMagar Staph au­ reus es más sensible que los medios agar sangre de rutina para detectar S. aureus cuando se lo usó como parte del protocolo primario de la muestra.123 Los medios de agar cromogénico se han utilizado como métodos rápidos para la identificación simultánea de S. aureus y la determinación de resistencia a la meticilina por incorporación de oxacilina o meticilina en el medio.230-296 La prueba de la catalasa

Los estafilococos y los micrococos se diferencian de los estreptococos, los enterococos y las bacterias “tipo-estreptoco­

cos” por la prueba de la catalasa. Esta prueba detecta la pre­ sencia de enzimas citocromo oxidasas (protocolo 12-1). La prueba de la catalasa se realiza con 3% de peróxido de hidró­ geno (H ,O 0) sobre un portaobjetos de vidrio. Un burbujeo vigo­ roso e inmediato indica la conversión del H20 2 en agua y oxí­ geno gaseoso (lámina en color 12-1G). En forma ideal, la prue­ ba de la catalasa debe realizarse a partir de un medio que no contenga sangre, porque los hematíes por sí mismos pueden causar una reacción de catalasa positiva débil. Sin embargo, como la mayoría de los laboratorios clínicos recuperan estafi­ lococos de medios no selectivos o de medios selectivos que contienen sangre (p. ej., SBA y agar CNA, respectivamente) se debe tener el cuidado de tomar la muestra sólo de la parte supe­ rior de las colonias para la prueba de la catalasa a fin de evitar el traslado de sangre y las posibles reacciones falsas positivas. Esto se puede hacer de modo más expeditivo con un palillo aplicador de madera. Las cepas raras de estafilococos pueden ser catalasa negativas y algunos enterococos producen una “seudocatalasa” y son débilmente reactivos con H^O,.455 R. mucilaginosa es por lo general catalasa negativa o positiva débil. Métodos para la diferenciación de micrococos y estafilococos

Se dispone de varios métodos para la diferenciación entre las especies de Micrococcus y Staphylococcus, los dos géneros catalasa positivos observados con mayor frecuencia en el labo­ ratorio clínico, y otros cocos grampositivos, catalasa positivos. Algunos requieren medios especiales e incubación prolongada, mientras que otros se encuentran en el comercio y proporcio­ nan resultados dentro de las 18-24 horas o menos. En el cuadro 12-1 se enumeran los métodos de prueba y los resultados para las especies Micrococcus, Macrococcus y Staphylococcus. Aunque las especies de Macrococcus son en principio cepas equinas, sus reacciones se incluyen para el reconocimiento pri­ mario de aislamientos de macrococos recuperados en laborato­ rios que proveen servicios a prácticas veterinarias. FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA

Esta prueba se realiza de modo similar a las pruebas de oxidación-fermentación (OF) para bacilos gramnegativos. El medio OF para estafilococos contiene nutrientes adicionales, como extracto de levadura para colmar los requerimientos necesarios para el desarrollo de estafilococos. Este método, considerado el procedimiento de referencia para la diferencia­ ción de Micrococcaceae, requiere una incubación prolongada y no es fácilmente adaptable para el uso en el laboratorio de rutina.223 SENSIBILIDAD A LA LISOSTAFINA

La lisostafina es una endopeptidasa que escinde los puentes de entrecruzamiento del pentapéptido rico en glicina en el peptidoglucano de la pared celular estafilocócica.129 Esta actividad vuelve las células sensibles a la lisis osmótica. Ciertas especies estafílocócicas (S. aureus, S. simulans, S. cohnii y S. xylosus) son más sensibles a la lisostafina que otras (p. ej., S. hominis, S. saprophyticus y S. haemoliticus)', de allí que la estandariza­ ción e interpretación de esta prueba es a veces dificultosa. Se comercializa una prueba en tubo para sensibilidad a la lisosta­ fina de Remel® (Lenexa, KA). Se prepara una suspensión car­ gada del microorganismo en 0,2 mL de solución salina estéril, después de lo cual se agregan 0,2 ml de solución de lisostafina

A is la m ie n to y d ife re n c ia c ió n p re lim in a r de los e s ta filo c o c o s y de los c o c o s g ra m p o s itiv o s re la c io n a d o s

Cuadro 12-1

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Características fenotípicas para la diferenciación de M icrococcus, m a cro co ccu s y S ta p h ylo co ccu s DESCRIPCIÓN/REACCIÓN PARA:

CARACTERÍSTICAS Tamaño de la colonia Forma de la colonia Velocidad de crecimiento Pr xiucción de ácido a partir de glucosa en condiciones anaerobias Lisostafina Producción de ácido a partir de glicerol en aerobiosis en presencia de 0,4 Ug/mL de eritromicina terribilidad a la furazolidona (disco de 100 |ig/mL de furazolidona) Sensibilidad a la bacitracina (disco Taxo A de 0,04 uni­ dades) Prueba de oxidasa modificada

Micrococcus y especies relacionadas"

Macrococcus

Staphylococcus 0.6-1,5 |im Elevada, poco convexa Lento a rápido

-

1,3-2,5 (im Poco convexa, abovedada Lento -

R -

S ND

S

R

S

S

S

R

R

+

+

_b

1-1,8 |im Convexa Muy lento

+

+

- Incluye los géneros Micrococcus, Kytococcus, Dermacoccus, Nesterenkonia y Kocuria. 'Todas las especies de Staphylococcus son oxidasa modificada negativas excepto las cepas de S. sciuri, S. lentus y S. vitulinus. reacción positiva; -: reacción negativa; S: sensible; R: resistente; ND: datos no disponibles.

Remel. La suspensión se incuba a 35 °C durante 2 horas. El aclaramiento de la suspensión indica sensibilidad a la lisostafina. Esta sensibilidad también puede determinarse usando un método de difusión en papel de filtro.354 Se inocula una placa de agar de Mueller-Hinton con el microorganismo por probar ■0.5 de la escala de turbidez estándar de McFarland) y se colo­ ca en la placa un disco impregnado con 10 pg de lisostafina >olución esterilizada con filtro, 287 unidades/mL). La placa se incuba durante 24 horas a 35 °C. Las especies de Staphylol o c c i / s por lo general mostrarán zonas de inhibición de 10-16 mm de diámetro. Micrococcus y las especies relacionadas no mostrarán esas zonas. Para obtener resultados óptimos con la prueba de sensibili­ dad a la lisostafina, el microorganismo debe desarrollarse en un medio con base de peptona de carne más que en un medio con base de peptona de caseína. El factor crucial es el contenido en glicina del medio, porque la glicina es una parte importante de la pared celular estafilocócica y es esencial para la acción de la lisostafina.

PRODUCCIÓN DE ÁCIDO A PARTIR DE GLICEROL EN PRESENCIA DE ERITROMICINA

En esta prueba, se prepara un medio que contenga glicerol 1 1%) y eritromicina (0,4 pg/mL) con un agar base enriquecido

que contiene púrpura de bromocresol como indicador y se coloca en placas de Petri.392 Se siembran varias colonias del aislamiento como una única línea en el medio y la placa se incuba durante más de 3 días a 35 °C. Los estafilococos produ­ cirán ácido en ese medio, mientras que los micrococos, no. SENSIBILIDAD A LA FURAZOLIDONA19306476

Esta prueba se realiza como un procedimiento de sensibili­ dad en disco que puede compararse en el comercio (discos FX®, 100 pg; BD Biosciences®, Sparks, MD®). El procedi­ miento para esta prueba se describe en detalle en el protocolo

12-1 y en la lámina en color 12-1A y B. Los estafilococos se inhiben por la acción de la furazolidona y muestran zonas de inhibición de 15 mm o más, mientras que los micrococos y las especies relacionadas son resistentes y muestran zonas de 6 mm (sin zona) a 9 mm.19 Sin embargo, en ocasiones pueden observarse estafilococos coagulasa negativos resistentes a la furazolidona. PRUEBA DE LA OXIDASA MODIFICADA19105

Esta prueba de Remel (Microdase Test Disks) también está disponible en el mercado. Se usan discos de papel de filtro impregnados con dihidrocloro tetram etil-p-fenilendiam ina (reactivo oxidasa) en dimetil sulfóxido (DMSO). Este último vuelve a las células permeables a los reactivos. Se extrae una colonia del medio de desarrollo con un palillo aplicador y se frota en el disco. La aparición de color violeta azulado dentro de los 30 segundos es una prueba positiva (lámina en color 122C). La prueba es negativa cuando no hay color en ese lapso. Las especies de Micrococcus, N. halobia, D. nishinotniyaensis, A. agilis, K. kristinae y las especies de Macrococcus son oxi­ dasa positivas, mientras que las cepas de K. sedentarius, K. rosea, K. varians, K. palustris y K. rhizophila son oxidasa negativas.217’231-423 Todas las especies de Staphylococcus son oxidasa negativas excepto las cepas de S. sciuri, S. lentus y S. vitulinus.218 SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA19104

Para este procedimiento se emplean los mismos discos de bacitracina usados para la identificación presuntiva de los estreptococos P-hemolíticos del grupo A. Se prepara una super­ ficie de cultivo en una placa de agar de Mueller-Hinton o de agar sangre como se describió para la prueba en disco FX® y se coloca un disco diferencial de bacitracina (Taxo A, 0,04 unida­ des de bacitracina; BD Biosciences®) en el inóculo. Después de una incubación de toda la noche, se miden los tamaños de las

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Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

zonas de inhibición. Los estafilococos son resistentes y creecen en el borde del disco, mientras que los micrococos y las espe­ cies relacionadas son sensibles y producen zonas de inhibición de 10 mm o mayores.19 El método de elección usado en un laboratorio dado depen­ de del tipo de trabajo realizado (p. ej.. laboratorio de referen­ cia, microbiología medioambiental, laboratorio clínico). En la mayoría de los laboratorios microbiológicos clínicos, la prueba de oxidasa modificada, la prueba en disco de furazolidona y la prueba en disco de bacitracina Taxo A son las opciones más lógicas porque son rápidas, confiables, de bajo costo y se encuentran en el comercio.

Identificación de Staphylococcus aureus La única característica más confiable para la identificación de S. aureus es la prueba de la coagulasa. La prueba de la coa­ gulasa convencional se puede realizar mediante los siguientes procedimientos en portaobjetos o en tubo. Prueba de la coagulasa en portaobjetos

La mayoría de las cepas de S. aureus tienen un término coa­ gulasa o “factor de aglutinación” en la superficie de la pared celular. Este factor reacciona en forma directa con fibrinógeno en plasma y causa una aglutinación celular rápida (lámina en color 12-2D). El rendimiento de esta prueba se describe en de­ talle en el protocolo 1-3. La prueba se puede realizar con un cultivo en agar sangre, agar CNA u otro medio nutritivo no selectivo, pero no debe efectuarse en medios con alto conteni­ do salino (p. ej., agar manitol sal) porque éste provoca la autoaglutinación de algunas cepas de S. aureus. Las cepas que son negativas en la prueba de la coagulasa en portaobjetos deben confirmarse con una prueba de la coagulasa en tubo, porque las cepas deficientes en factor de aglutinación por lo general pro­ ducirán coagulasa libre. Algunas cepas de las especies de S. lugdunensis y S. schleiferi subespecie schleiferi también pro­ ducen factor de aglutinación y pueden ser positivas con la prue­ ba en portaobjetos.121-162’463 Prueba de la coagulasa en tubo

La coagulasa detectada por este método se segrega de forma extracelular y reacciona con una sustancia en el plasma llama­ da factor de la reacción coagulasa (CRF) para formar un com­ plejo que, a su vez, reacciona con el fibrinógeno para formar fibrina (formación del coágulo) (véanse protocolo 1-3 y lámi­ na en color 12-2E). Las pruebas que son negativas después de 4 horas de incubación a 35 °C deben mantenerse a temperatura ambiente y lerse nuevamente después de 18 a 24 horas porque algunas cepas producirán fibrinolisina en la incubación prolon­ gada a 35 °C, causando la disolución del coágulo durante el período de incubación.248 Ciertas cepas poco frecuentes de S. aureus pueden ser coagulasa negativas, y algunos aislamientos animales (S. intermedias, S. hyicus, S. delphini y S. schleiferi subespecie coagulans) pueden ser coagulasa positivos para la prueba en tubo.96-156-157-463'469 Recientemente se han recuperado cepas de S. schleiferi subespecie schleiferi coagulasa positivas tanto en tubo como para el factor de aglutinación de infecciones humanas.463 Estos aislam ientos tam bién producen una DNasa term oestable (véase más adelante) y, por lo tanto, podrían ser mal identifi­

cados como S. aureus. Estas cepas pueden diferenciarse de S. aureus por la falta de producción de ácido de maltosa, lactosa, manitol, sacarosa y turanosa. Además, S. schleiferi subespecie coagulans, un microorganismo que causa otitis externa cani­ na, se ha encontrado en infecciones humanas y también puede ser mal identificado como cepas de S. aureus con factor de aglutinación negativo. Estas subespecies pueden diferenciar­ se de S. aureus por las pruebas de utilización de hidratos de carbono.463 Como ya se mencionó, el medio recomendado para las prue­ bas de coagulasa tanto en portaobjetos como en tubo es el plas­ ma de conejo con EDTA. El plasma citratado no se debe usar porque los microorganismos que pueden usar citrato (p. ej., especies de Enterococcus) producirán resultados positivos si se los confunde de modo inadvertido con estafilococos. Este error puede evitarse haciendo siempre primero una prueba de catala­ sa. El plasma humano (p. ej., material vencido de bancos de sangre) contiene cantidades variables de CRF y anticuerpos antiestafilocócicos y no debe usarse para realizar pruebas de coagulasa. La prueba de la coagulasa en tubo todavía es el procedi­ miento de referencia para la identificación de S. aureus. Aunque suele realizarse con aislamientos tomados de medios de agar, también puede ser inoculada con caldos de hemoculti­ vos positivos o centrifugado de microorganismos a partir de caldos de hemocultivos. McDonald y Chapin revaluaron un procedimiento de coagulasa en tubo de 2 horas para la identifi­ cación de S. aureus en hemocultivos positivos.290 La inocula­ ción de la prueba de coagulasa en forma directa con los medios de cultivos positivos fue comparada con un inoculo obtenido por centrifugación y resuspensión de los microorganismos del medio del hemocultivo. Además, tanto el caldo de cultivo como el pellet bacteriano fueron probados con dos pruebas de agluti­ nación del látex comercial (véase más adelante). Usando 180 hemocultivos sembrados y clínicos, la prueba de la coagulasa en tubo de 2 horas mostró sensibilidad del 86,2% y el 84,4%, y del 100% de especificidad cuando se inoculaba directamente con caldo de hemocultivos positivos y con centrifugados bac­ terianos, respectivamente. Las pruebas de aglutinación del látex fueron 6,8-8,6% sensibles y sólo 95,9% específicas cuan­ do se inocularon con caldo de hemocultivos positivos o centri­ fugados bacterianos, respectivamente.290 Procedimientos alternativos para la prueba de la coagulasa AGLUTINACIÓN DEL LÁTEX

Este procedimiento usa partículas de látex recubiertas con plasma. El fibrinógeno adherido al látex detecta el factor de aglutinación. Además, las moléculas de inmunoglobulinas tam­ bién presentes en las partículas detectan la proteína A, proteína de la pared celular estafilocócica que puede unirse a las molé­ culas de inmunoglobulina G por la región Fe. Mezclar los reac­ tivos de la prueba con material de las colonias de una placa de agar da por resultado una aglutinación rápida de la suspensión microorganismo-látex (lámina en color 12-2F). Se comerciali­ zan varios productos que usan esta aproximación: StaphAurex® (Murex, Norcross, CA), Slidex Staph® (bioMerieux, Hazelwood, MO), Staphylatex® (Dade/MicroScan, West Sacramen­ to, CA), Fastaph® (Carr-Scarborough, Stone Mountain GA), Staph Rapid® (Roche, Nutley, NJ), Staphylase® (Oxoid Ltd., Basingstoke, Inglaterra), Staphytect® (Oxoid Unipath, Dardillo, Francia) y Veri-Staph® (Zeus Technologies, Raritan, NJ). Además, algunas cepas de S. lugdunensis y S. schleiferi subespecie schkeiferi producen factor de aglutinación y pueden ser positivas con estos procedimientos rápidos.

Id e n tific a c ió n de S taphylococcus aureus

HEMAGLUTINACIÓN PASIVA

Estos procedimientos de prueba usan hematíes de oveja sen­ sibilizados con fibrinógeno para detectar el factor de aglutina­ ción en la superficie de las células de S. aureus (lámina en color 12-2E). Se venden tres equipos comerciales: Staphyloslide® (BD Biosciences), Hemastaph® (Remel Laboratories) y Staphyslide® (bioMerieux, Marcy l'Etoile, Francia). Algunos operadores prefieren estas pruebas a las de aglutinación del látex porque se incluye una suspensión de hematíes no sensibi­ lizados como control negativo para cada prueba. Algunas cepas de S. saprophyticus también pueden producir resultados falsos positivos con pruebas de coagulasa de látex rápidas o de hemaglutinación.147 Esto puede explicarse por la presencia de una hemaglutinina que se encuentra en la superficie de las cepas de S. saprophyticus.128 Se han publicado varias evaluaciones que comparan los equipos de látex y de hemaglutinación pasiva con las pruebas de coagulasa en tubo de 4 horas y de 24 horas. Estos equipos tienen sensibilidades y especificidades del 94-100% y del 93100%, respectivamente.20 199-339-373 Se han observado sensibili­ dades que van desde valores tan bajos como el 6% hasta el 62% cuando se las usó directamente en hemocultivos que mostraban cocos grampositivos en grupos en el frotis teñido con Gram.290-414 Varios investigadores informaron que se pueden encontrar resultados falsos negativos de aglutinación del látex y hemaglutinación pasiva cuando se prueban cepas de S. aureus resistentes a meticilina/oxacilina. Por ejemplo. Piper y cois, hallaron que, cuando se realizaron dos pruebas de aglutinación y un procedimiento de hemaglutinación, sólo 82-86% de estas cepas fueron identificadas.350 En otro estudio que comparó la reactividad con pruebas rápidas de coagulasa para serotipo cap­ sular y sensibilidad a la oxacilina, todas las cepas que dieron pruebas de aglutinación negativas fueron del serotipo capsular 5 y todas, excepto una cepa, fueron resistentes a la oxacilina.113 Se postuló que la falta de reacción de las cepas de S. aureus con los procedimientos rápidos de coagulasa está relacionada con la presencia del serotipo capsular 5 en la superficie de la célu­ la. De modo sorprendente, el serotipo capsular 5 es predomi­ nante entre las cepas resistentes a la meticilina.113 La presencia de esta cápsula puede interferir en la accesibilidad de los reac­ tivos de la prueba al factor de aglutinación y a la proteína A presentes en la pared celular bacteriana. En 1993, Fournier y sus cois, informaron sobre una nueva prueba de aglutinación del látex denominada “Pastorex StaphPlus®” (Sanofi-Diagnostics Pasteur, Marnes la Coquette, Francia).114 Este reactivo consiste en una mezcla 2:1 de partí­ culas de látex recubiertas con fibrinógeno para la detección del factor de aglutinación y con IgG para la detección de proteína A y partículas de látex recubiertas con anticuerpos monoclo­ nales dirigidos contra los polisacáridos capsulares de los sero­ tipos 5 y 8. Los últimos componentes de este reactivo identifi­ carían las cepas no identificadas por los reactivos de aglutina­ ción del látex comunes. En el estudio de Fournier y cois., este reactivo nuevo se comparó con el Staphyslide® (un reactivo de hem aglutinación francés), el StaphAurex® (M urex) y el Pastorex-Staph® (un equivalente francés del StaphAurex®).114 De las 220 cepas de S. aureus (61 de las cuales eran resisten­ tes a la oxacilina) y 128 estafilococos coagulasa negativos pro­ bados. Pastorex Staph-Plus identificó el 98,6% de las cepas de S. aureus, en comparación con 91,8%, 91,4% y 84,5% para las pruebas Pastorex-Staph, Staphyslide y StaphAurex. Ninguno de los estafilococos coagulasa negativos reaccionó con los reactivos nuevos. Cuando las 61 cepas oxacilina resistentes se analizaron por separado, Pastorex Staph-Plus identificó

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95,1%, en comparación con 73,8%, 72,1% y 49,2% obtenidos con Pastorex-Staph. Staphyslide y StaphAurex. Como se sabe que los tipos capsulares 5 y 8 predominan entre los aislamien­ tos clínicos, que las cepas capsulares tipo 5 predominan entre las cepas resistentes a la oxacilina y que estas últimas no se identifican bien mediante las pruebas del látex y hemaglutina­ ción pasiva, la incorporación de anticuerpos monoclonales contra estos tipos capsulares en una preparación de látex ofre­ ce una ventaja real y teórica en la identificación de S. aureus resistente a la meticilina. Además de Pastorex Staph-Plus, se fabrican el Slidex Staph-Kit® (bioMerieux) y el StaphAurexPlus® (Murex Biotech, Chatillon, Francia) para incluir anti­ cuerpos específicos para los polisacáridos capsulares tipos 5 y 8. El Slidex Staph-Kit es un producto combinado de látex y he­ maglutinación, mientras que el StaphAurex-Plus es una prue­ ba de aglutinación del látex.272,497 El Dryspot Staphylotec Plus® (Oxoid, Hampshire, Inglaterra) usa látex azul sensibili­ zado con fibrinógeno porcino, IgG de conejo y anticuerpos anticapsulares policlonales. El reactivo desecado se rehidrata con solución salina, se mezcla con el material extraído de las colonias y se lee dentro de los 20 segundos para la aglutina­ ción. En un estudio de 202 aislamientos, Sariya y cois, encon­ traron que la prueba Dryspot tenía una sensibilidad del 99,1% y una especificidad del 93,1% para la identificación de S. aureus ,386 Otra prueba de látex, Monostaph-Plus® (Bionor, Skin, Noruega) usa partículas de látex recubiertas de fibrinó­ geno, inmunoglobulina G y anticuerpos policlonales contra el polisacárido capsular tipo 5 solamente.456 En un estudio que com para el látex M onostaph con el reactivo de látex Monostaph-Plus® Tveten encontró que Monostaph identifica­ ba sólo el 79,5% de los 78 S. aureus resistentes a la oxacilina, mientras que M onostaph-Plus identificaba el 98,7%; ambos reactivos identificaron de modo correcto 50 cepas de S. aureus sensibles a la oxacilina456 Otros estudios han sugerido que las cepas de S. aureus que no se aglutinan con los reactivos de látex son “deficientes” desde el punto de vista genético con respecto al factor de aglu­ tinación y a la proteína A. En Alemania, Schwarzkopf y cois, analizaron 50 cepas con factor de aglutinación y proteína A negativas y resistentes a la oxacilina, y encontraron que todas tenían antibiogramas similares, eran no tipificables con un grupo internacional de bacteriófagos y tenían un plásmido de 30 kb que fue similar para todas las cepas en un análisis de en­ zima de restricción.404 Estos datos sugirieron que esas cepas de S. aureus deficientes pertenecían a un único clon. Los análisis con enzimas de restricción y amplificación de los genes coagu­ lasa de esas cepas revelaron un solo producto de 650 pb en las cepas deficientes, mientras que análisis similares de cepas resistentes a la oxacilina, coagulasa positivas mostraron dife­ rentes patrones de restricción, lo que muestra diferencias sus­ tanciales en los loci del gen coagulasa.404 La amplificación por PCR de los genes de la proteína A indicó que las cepas proteí­ na A negativas tenían genes que codificaban cuatro dominios de unión a IgG, mientras que las cepas de tipo silvestre tenían genes que codificaban cinco dominios, lo que sugiere que es necesaria la falta de la secuencia del gen de la proteína A para la reactividad de la aglutinación del látex.404 En el sistema de identificación RapiDEC Staph® (bioMe­ rieux) está incluida un prueba de coagulasa fluorogénica como prueba para S. aureus (véase más adelante). Esta prueba, que se realiza por inoculación de una pequeña cúpula que contiene el sustrato, detecta lo que los fabricantes llaman “aureasa” (coa­ gulasa). La aureasa es una enzima proteolítica de coagulación que reacciona con protrombina para formar un complejo lia-

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C A P ÍT U L O 12

Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

mado estafilotrombina. Luego la estafilotrombina escinde en forma enzimática un péptido fluorogénico presente en la cúpu­ la de la prueba, con lo que libera un péptido y un radical que es fluorescente bajo la luz ultravioleta. Una fluorescencia en la cúpula de la prueba mayor que la de la cúpula control sin el sustrato proporciona la identificación de S. aureus. La prueba de la “aureasa” en el RapiDEC Staph® resultó altamente sensi­ ble y específica.131,192,302 Mitchell y cois, evaluaron la prueba aureasa RapiDEC para la identificación de S. aureus directa­ mente en hemocultivos; 27 de 28 S. aureus fueron identificados en forma correcta dentro de las 2 horas que requiere esta prue­ ba; ninguno de los estafilococos coagulasa negativos producía resultados falsos positivos cuando la prueba de aureasa se ino­ culaba con suspensiones bacterianas de hemocultivos positi-

Pruebas confirmatorias adicionales PRUEBA DE LA DESOXIRRIBONUCLEASA (DNasa)

Algunas cepas de S. aureus pueden producir reacciones de coagulasa en tubo equívocas o débiles y los aislamientos raros pueden ser en efecto coagulasa negativos. En esos casos, puede ser útil realizar otras pruebas que se correlacionen bastante con la producción de coagulasa. S. aureus produce DNasa y una nucleasa termoestable que tienen actividades endonucleolíticas y exonucleolíticas.151,250 Ambas enzimas hidrolizan ácido nucleico (ácido desoxirribonucleico, DNA). La DNasa puede ser detectada por la inoculación en motas grandes de varias colonias del microorganismo en un medio de prueba DNasa que contenga el colorante metacromático azul de toluidina O (disponible en el comercio). Después de 24 horas de incuba­ ción a 35 °C, el medio debajo y alrededor del inóculo se vuel­ ve de azul claro a rosado, lo que indica hidrólisis de DNA (lámina en color 12-2G). El contenido de azul de toluidina O en el medio no debe exceder el 0,005% porque el color azul impartido en el medio por altas concentraciones puede enmas­ carar la detección de la actividad DNasa.479 La inoculación en motas es necesaria porque algunas cepas de S. aureus no cre­ cen bien en el medio y no se requiere el desarrollo para la detección de la actividad DNasa. Aunque esta prueba es útil como una prueba adjunta para la identificación de S. aureus, otros estafilococos también pueden producir reacciones de DNasa positivas.

PRUEBA DE LA ENDONUCLEASA TERMOESTABLE

Para esta prueba, se usa el mismo medio de la prueba DNasa, sólo que se cortan orificios de 3 mm en el agar con un sacabo­ cados estéril y los pozos se llenan con un caldo de cultivo de 24 horas del microorganismo de prueba que se ha hervido en un baño de agua durante 15 minutos. La placa se incuba toda la noche a 35 °C. Las cepas de S. aureus mostrarán una zona rosada alrededor del pocilio que contiene la suspensión hervi­ da. Ciertos aislamientos animales (p. ej., S. caprae, S. schleiferi, S. intermedius y S. hyicus) también producen una termonucleasa termoestable y algunos estafilococos coagulasa negati­ vos (S. epidermidis, S. simulans, S. capitis y S. carnosus) pue­ den producir reacciones positivas débiles. La especificidad de este ensayo para endonucleasa termoestable de S. aureus puede confirmarse por seroinhibición de la reacción por anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra la enzima de S. aureus o mediante amplificación de PCR y secuenciación del gen nuc que codifica la endonucleasa termoestable de S. aureus (véase más adelante).48

FERMENTACIÓN DEL MANITOL

Además de las pruebas anteriores, S. aureus, a diferencia de S. epidermidis y otras especies coagulasa negativas, puede fermen­ tar el manitol. Esta propiedad se utiliza en estudios epidemioló­ gicos para detectar S. aureus en el suelo y las heces y en la selec­ ción de portadores nasales del microorganismo. El medio usado es agar m anitol sal. Este medio contiene manitol (1%), NaCl 7,5%, rojo de fenol y peptonas. La elevada concentración salina inhibe el desarrollo de otros microorganismos (excepto el de enterococos) y permite el crecimiento selectivo de los estafilo­ cocos. S. aureus puede ser detectado por la presencia de una zona amarilla alrededor de las colonias, lo que indica la produc­ ción de ácido a partir del manitol. Sin embargo, otras especies estafilocócicas aisladas con poca frecuencia también pueden producir ácido del manitol, de modo que los microorganismos manitol positivos que crecen en este medio se deben subcultivar en agar sangre y controlar para la producción de coagulasa. Otros métodos para la identificación de Staphylococcus aureus

La detección de la presencia de enzimas particulares de S. aureus se utilizó como una forma de identificar a este microor­ ganismo. Guzman y cois, crearon un enzimoinmunoanálisis para la identificación de S. aureus que usa la detección simultá­ nea de la proteína A y la endo p-A'-acetiIglucosaminidasa de S. aureus (SaG), una enzima producida por todas las cepas de esta especie.154 Mediante el uso de un anticuerpo monoclonal dirigi­ do contra SaG, este enzimoinmunoanálisis podría identificar cepas de S. aureus por detección simultánea de SaG (mediante unión de la enzima bacteriana a los sitio Fab del anticuerpo) y de la proteína A (mediante la unión a la región Fe). Este ensayo se desempeñó mejor que la aglutinación del látex y la hemaglutinación pasiva cuando se lo comparó con esos productos comerciales.150 La prueba mostró 100% de sensibilidad y de especificidad y fue muy útil para identificar cepas que carecían del factor de aglutinación o de proteína A detectables. Las téc­ nicas de biología molecular, como los métodos de sondas de DNA y la PCR, también se utilizaron para la identificación de S. aureus. Davis y Fuller encontraron que el Accu-Probe® para la confirmación del cultivo de S. aureus (Gen-Probe. San Diego, CA) se desempeñó bien para la identificación directa de S. aureus en hemocultivos que mostraron cocos grampositivos agrupados en la tinción de Gram.91 En un estudio similar, Skulnick informó una sensibilidad del 95% y una especificidad del 98,5% cuando la prueba AccuProbe de S. aureus se realiza­ ba directamente en caldos de hemocultivos.414 También se sinte­ tizaron cebadores y sondas de amplificación y detección del gen nuc de S. aureus y se analizó para su utilidad en la confirmación y en la detección directa de cultivos.47 El gen nuc codifica la endonucleasa termoestable de S. aureus. Para la identificación, el límite más bajo de sensibilidad del ensayo PCR fue 5-20 UFC del microorganismo. Usando muestras clínicas sin estafi­ lococos que se sembraron con diluciones seriadas de S. aureus, el límite inferior para la detección directa de S. aureus por el ensayo de PCR iba de 10-20 UFC hasta más de 1 000 UFC, según el tipo de muestra clínica. El ensayo basado en PCR fue 100% específico para S. aureus.41 Pruebas rápidas de detección de resistencia a la meticilina

Si bien no es un método de identificación, la detección rápi­ da de resistencia a la meticilina en S. aureus es en verdad tan crítica como la identificación de la especie. El gen mecA es el gen estructural para una proteína de unión a la penicilina de

Id e n tific a c ió n de e s ta filo c o c o s c o a g u la s a n e g a tiv o s

baja afinidad (PBP 2 ’ o PBP 2a) que se encuentra en las cepas de S. aureus resistentes a meticilina/oxacilina (SARM).405-457 Los métodos de detección comerciales que usan la técnica de amplificación de la sonda cíclica (ensayo de identificación SARM Velogene Rapid®, Alexon-Trend, Minneapolis), la téc­ nica de fluorescencia (Crystal SARM ID System®, BD Bio­ sciences) y la aglutinación del látex (SARM-Screen®, Denka Seiken, Niigata, Japón; prueba de aglutinación del látex Oxoid Penicillin Binding Protein®, Oxoid) para la detección de PBP 2a (PBP 2 ’) de las cepas de S. aureus resistentes a la meticili­ na ahora están disponibles para su uso en los laboratorios microbiológicos clínicos.63'186-314359 Estas pruebas son exactas y sus resultados se obtienen más rápidamente que los de las prue­ bas de sensibilidad a los antibióticos automatizadas o conven­ cionales. Las pruebas de látex involucran la extracción/lisis, centrifugación aglutinante de los desechos celulares y la mez­ cla del sobrenadante con los reactivos de la prueba y del con­ trol del látex. En una evaluación del SARM-Screen, Van Leeuwen y cois, encontraron que la prueba detectó el 97% de 90 S. aureus resistentes a la meticilina y no detectó ninguna de las 106 cepas de S. aureus sensibles a la meticilina 468 Estas pruebas no son sustitutos de las pruebas de identificación espe­ cíficas para S. aureus porque las cepas de S. aureus sensibles a la meticilina serán negativas para la prueba SARM-Screen y los estafilococos coagulasa negativos resistentes a la meticilina también llevan el gen mecA y serán positivos.311-468 En el capí­ tulo 15 se amplía la información sobre la resistencia a la meti­ cilina de los estafilococos y los métodos para su detección. Diferenciación de estafilococos coagulasa positivos de origen veterinario

En medicina veterinaria, tres cocos coagulasa positivos -S. aureus (ambas subespecies aureus y anaerobius), algunas cepas de S. hyicus y S. intermedius- han sido la causa de mas­ titis bovina. Estos microorganismos producen coagulasa libre, como lo indican las pruebas en tubo positivas después de 4 a 24 horas de incubación. Roberson y cois, analizaron 80 cepas de cada una de esas especies para investigar pruebas simples que puedan diferenciarlas.370 Las cepas de S. aureus crecieron en agar P y en agar P con acriflavina (7 |ig/mL). fueron VP posi­ tivas y producían ácido de manitol en condiciones anaerobias. S. hyicus y S. intermedius no crecían en agar P o en agar P con acriflavina y no producían acetoína ni fermentaban manitol. Las cepas de S. intermedius eran (3-galactosidasa positivas, mientras que las cepas S. hyicus eran P-galactosidasa negativas. S. schleiferi subespecie coagulans causa infecciones tanto en sres humanos como en perros; estas cepas por lo general son coagulasa positivas en tubo y factor de aglutinación negativas i las reacciones opuestas para estas dos pruebas se observan en las cepas de las subespecies schleiferi). S. schleiferi subespecie schleiferi y subespecie coagulans pueden diferenciarse de S. aureus por la falta de producción de ácido de maltosa y trehalosa (véase cuadro 12-3). S. delphini y S. lutrae también son coagulasa positivos, pero estas especies están asociadas sólo con medioambientes marinos e infecciones cutáneas en delfi­ nes y nutrias marinas, respectivamente.111-469 Otras especies recuperadas de animales son coagulasa negativas.

Identificación de estafilococos coagulasa negativos Como ya se describió, S. epidermidis y S. saprophyticus son los estafilococos coagulasa negativos aislados con más fre­

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cuencia y de mayor importancia clínica en los laboratorios c lí-' nicos que trabajan con muestras de origen humano. Debido a la significación clínica reconocida de S. saprophyticus en las infecciones urinarias y a la importancia de S. epidermidis como agente causal de infecciones, es ventajoso para los laboratorios el uso de métodos para la identificación confirmatoria de ambas especies. Además, los equipos comerciales le permiten al laboratorio identificar no sólo S. epidermidis y S. saprophy­ ticus, sino también varios de los otros estafilococos humanos, animales y medioambientales. Aunque se describieron varias especies estafílocócicas coagulasa negativas y muchas de ellas han sido recuperadas de muestras clínicas, se observan relati­ vamente pocas con alguna regularidad en la práctica real. En 1993, Kleeman y cois, publicaron los resultados de la identifi­ cación de especie en 500 aislamientos coagulasa negativos recuperados de muestras remitidas al laboratorio de microbio­ logía de un hospital de la comunidad de 400 camas en Raleigh, NC.216 S. epidermidis dio cuenta del 64,5% de los aislamientos, seguido en frecuencia decreciente por S. haemolyticus (13,4%), S. hominis (7,4%), S. warneri (4%), S. lugdunensis (2,8%), S. simulans (2,4%), S. capitis subespecie capitis (2%) y S. capitis subespecie ureolyticus (1,6%). S. saprophyticus, S. cohnii (subespecie urealyticum y subespecie cohnii) y S. auricularis cada uno dio cuenta por menos del 1% de los aislamientos que crecieron en el laboratorio (lámina en color 12-3A). En 1996, un análisis de 415 estafilococos coagulasa negativos significa­ tivos aislados en hemocultivos en Dinamarca encontró que el 68,7% eran S. epidermidis, seguidos en frecuencia de S. homi­ nis (14,7%), S. haemolyticus (10,4%), S. warneri (2,9%) y S. cohnii (1,7%), con S. saprophyticus, S. capitis y S. lugdunensis cada uno dando cuenta del 1% o menos del total.194 La distri­ bución de las especies importantes informadas en estos estu­ dios por lo general refleja lo que la literatura especializada ha acumulado con respecto a la significación clínica de las espe­ cies individuales. Métodos de identificación convencionales

En 1975, Kloos y Schleifer publicaron un esquema para la identificación bioquímica de los estafilococos coagulasa nega­ tivos.223 Este esquema usó la prueba de la coagulasa para iden­ tificar S. aureus y usó una serie de pruebas fisiológicas y bio­ químicas para diferenciar las especies coagulasa negativas. Este esquema fue actualizado y difundido por Kloos y Lambe en 1991. pero desde entonces se describieron varias especies nuevas.221 En 1999, Freney y los miembros del subcomité de taxonomía de estafilococos y estreptococos del International Committe on Systematic Bacteriology (Comité Internacional de Bacteriología Sistemática) publicó un documento que esta­ blece los estándares mínimos para el género Staphylococcus y para la descripción de nuevas especies de estafilococos.122 En este documento, los estándares mínimos recomendados para las designaciones de especies nuevas se basan en los resultados de estudios fenotípicos y genotípicos en al menos cinco cepas aisladas en forma independiente. Los criterios fenotípicos y ge­ notípicos para la identificación en las categorías de género y especie se enumeran en el recuadro 12-6.122 Los procedimien­ tos convencionales para la identificación de estafilococos requieren numerosas pruebas bioquímicas laboriosas, que de­ mandan tiempo y que no son fáciles de implementar como pro­ cedimiento habitual en un laboratorio clínico. Por fortuna, sólo se recuperan un escaso número de especies estafílocócicas de infecciones humanas importantes, y la mayoría de los equipos comerciales descritos más adelante servirán para este propósi-

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C A P ÍT U L O 12

Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

Recuadro 12-6 Pruebas fe n o típ ic as y gen o típ icas recom en­ dadas para la iden tificación de e sta filo c o ­ cos en las categorías de g én ero y especie Categoría de género

Categoría de especie

Criterios fenotípicos: Reacción de Gram y morfología general Catalasa Oxidasa Movilidad Metabolismo aerobio/fermentativo Estructura de la pared celular Tipo de peptidoglucano Presencia de ácidos teicoicos Pruebas adicionales: Acidificación de glicerol Sensibilidad a la lisostafina Sensibilidad a la lisozima Sensibilidad a furazolidona y baci­ tracina Patrón de menaquinona Acidos grasos celulares Fructosa-1,6-bifosfato Clase idolasa C riterios genotípicos: Contenido G+C Secuenciación de oligonucleótidos de rRNA

C riterios fenotípicos: Características y requerimientos de desarrollo Morfología de las colonias Pigmentación Sensibilidad a la novobiocina Actividad oxidativa/fermentativa sobre hidratos de carbono Actividades enzimáticas (nitrato reductasa, ADH. ODC. ureasa) Factor de aglutinación Coagulasa Pruebas adicionales: Hidratos de carbono adicionales Perfil del producto final de fermen­ tación Producción de acetoína Sensibilidad a la fosfomicina Actividades enzimáticas (p. ej.. ¡3-GAL, p-GUR, lecitinasa, etc.) Sensibilidad a otros antibióticos, antisépticos, etc. Hemolisinas Actividades estafilolíticas Análisis de membrana (ácidos tei­ coicos, ácidos grasos, citocromos, etc.) Análisis de proteína A C riterios genotípicos: Hibridación de DNA-DNA Temperaturas de fusión/templado de DNA

to en gran parte de los laboratorios.194,216 Los laboratorios que deseen usar estos procedimientos pueden consultar las referen­ cias al final del capítulo sobre formulaciones de medios y pro­ cedimientos de inoculación. En el cuadro 12-2 se presentan las características fenotípicas para la identificación de los estafilo­ cocos que se aíslan más a menudo en muestras clínicas huma­ nas y la figura 12-1 es un algoritmo dicotómico que facilita la identificación de la mayoría de los aislamientos clínicos por métodos convencionales, aunque a veces pueden ser necesarias otras pruebas. En el cuadro 12-3 se incluyen los criterios fenotípicos para la identificación de especies humanas, animales y medioambientales del género Staphylococcus. En el método de identificación convencional, se realizan ciertas pruebas bioquímicas usando medios entéricos, como caldo nitrato, cultivos inclinados (“pico de flauta”) con agar urea y medios de caldo ornitina descarboxilasa y arginina dihi­ drolasa de Moeller. Las pruebas de utilización de hidratos de carbono se realizan en agar caldo violeta que contiene 1% de hidratos de carbono estériles, con incubación en aire ambiental a 35-37 °C. La suplementación con extracto de levadura (1-2%) puede ser necesaria para el desarrollo de cepas con requeri­ mientos nutricionales especiales. Además de las pruebas bio­ químicas y de la producción de ácido a partir de hidratos de carbono, Hebert y cois, mostraron que la sensibilidad a la poli­

mixina B (disco de 300 unidades) y la prueba de la pirrolidonil arilamidasa (PYR) (para la identificación de enterococos, cap. 13), también son útiles para la identificación de estafilococos coagulasa negativos.163 Rhoden y cois, formularon en los CDC una aproximación convencional modificada para la identificación de los cocos grampositivos, catalasa positivos usando hidratos de carbono y pruebas bioquímicas junto con pruebas cromogénicas de enzi­ ma sustrato del sistema API Staph-Ident® (véase más adelan­ te).367 Esta aproximación difirió de los métodos de identifica­ ción de referencia previos en que se asignó un sistema de códi­ go numérico para la serie de pruebas convencionales a fin de generar una base de datos similar a la de los sistemas comer­ ciales, en vez de usar un análisis del “mejor acceso” basado en las reacciones incluidas en los cuadros de identificación. Se usaron las pruebas de selección para identificar morfología (tinción de Gram), designación de familia (prueba de la catala­ sa), agrupación de género (fermentación de la glucosa) y pre­ sencia de coagulasa libre y unida (prueba de aglutinación del látex StaphAurex® en tubo y en portaobjetos). Luego, se ino­ culó una serie de 18 pruebas primarias convencionales para la identificación. Se usó una serie de 11 pruebas adicionales con­ firmatorias para resolver la identidad de cepas problemáticas y biotipos raros o inusuales que se generaron a partir de la serie de pruebas iniciales. Usando 147 cepas de referencia, 388 ce­ pas control bien caracterizadas y 289 aislamientos clínicos, este método identificó más del 95% de las especies Staphylo­ coccus, Micrococcus y Stomatococcus probadas.367 Otros in­ vestigadores informaron esquemas de identificación conven­ cional modificados para estafilococos que cuentan con combi­ naciones de números limitados de pruebas discriminatorias para la identificación de las especies estafilocócicas aisladas más comúnmente.187,306 PRODUCCIÓN DE FOSFATASA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS

En los esquemas tradicionales para la identificación de esta­ filococos coagulasa negativos, se informó que la actividad fos­ fatasa es positiva para las cepas de S. epidermidis y S. xylosus y negativa para otros estafilococos coagulasa negativos.250,420 Sin embargo, estudios posteriores demostraron que otras espe­ cies de estafilococos también puede producir enzimas fosfata­ sa. Usando cuatro métodos diferentes, Langlois y cois, encon­ traron actividad fosfatasa en todas las cepas de S. aureus, S. intermedius y S. hyicus coagulasa positivas y en la mayoría de las cepas de S. epidermidis, S. chromogenes, S. hyicus coagu­ lasa negativas, S. sciuri, S. simulans, S. xylosus y S. wameri/hominis después de 24 y 48 horas de incubación.250 La pro­ ducción de actividad fosfatasa fue afectada por el pH y por la presencia de fosfato inorgánico (Pi) en el medio de cultivo. Soro y cois, hallaron que todas las cepas de las distintas especies estafilocócicas fueron fosfatasa positivas cuando la prueba se realizó con un pH de 8 y cuando los microorganismos crecían en ausencia de Pi 420 Cuando crecieron en un medio suplementado con 0,3% de Pi, sólo las cepas de S. aureus, S. epidermi­ dis y S. xylosus eran fosfatasa positivas. Estos investigadores concluyeron que la actividad de fosfatasa era una propiedad más común entre las cepas humanas de lo que se pensaba antes y que esta actividad puede ser constitutiva en algunas especies y reprimida por fosfatos en otras.420 En la actualidad, no existen pruebas comerciales únicas para la detección de actividad fosfatasa en estafilococos, aunque varios sistemas de equipos comerciales (p. ej., API Staph-

Cuadro 1 2-2 C a r a c te r ís tic a s fe n o típ ic a s p a r a la d ife re n c ia c ió n d e e sp ecies d e Staphylococcus c o m ú n m e n te a is la d a s S. SCHLEIFERI SCHLEIFERI

S. SAPROPHYTICUS SUBESP. SAPROPHYTICUS

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Polimixina B Novobiocina

PRUEBA

s. EPIDERMIDIS

S. HAEMOLYTICUS

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+

-

Factor de aglutinación

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s. HOMINIS

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Trehalosa

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Acido producido en aerobiosis de:

ODC: ornitina descarboxilasa: PAL:fosfatasa alcalina; +: reacción positiva; tente ; ND: datos no disponibles.

V

reacción negativa: +': reacción positiva lenta; V: reacción variable; V- : reacción variable, la mayoría de las cepas negativas; S: sensible; R: resis-

Identificación de estafilococos coagulasa negativos

S WARNERI

s. LUGDUNENSIS

s. AUREUS

619

620

C A P ÍT U L O 12

Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

OD C

I + X ilosa

S. lugdunensis

r ' + S acarosa

X. xylosus

+

+

Trehalosa

Trehalosa

+ S. c o h n ii

S. capitis

M altosa

Fructosa

+

+

Fosfatasa

Lactosa

S. ca p itis S. epiderm idis

U reasa

r

R educción de nitrato

i S. hom inis

S. h aem olyticus

S. sim ulans

M altosa

+

U reasa

U reasa

i S. capitis

S. capitis

S. sim ulans

S. saprophyticus

+

M añosa

Nitrato

N ovobiocina

R M añosa

S. co h n ii

+

S. h aem olyticus

S. coh nii

S. hom inis

S S. w arneri

S. saprophyticus

Figura 12-1 Claves dicotómicas para la identificación de los estafilococos coagulasa negativos humanos más comunes. ODC: omitina descarboxilasa.

IDENT, API Staph, ID32Staph y RapiDEC Staph) incluyen una prueba de fosfatasa en la serie de pruebas bioquímicas. En estos sistemas, S. aureus, S. schleiferi, S. intermedius, S. hyicus y la mayoría de las cepas de S. epidermidis son fosfatasa posi­ tivas. Geary y Stevens informaron un método simple en agar (agar PNP) que usaba agar de Mueller-Hinton bufferado a pH 5,6-5,8 y que contenía p-nitrofenil-fosfato (0,495 mg/mL).130 El medio con el microorganismo se inocula en motas y se lee después de 18-24 horas de incubación. La presencia de color amarillo brillante debajo y alrededor del inóculo es un resulta­ do positivo de la prueba. Geary y Stevens identificaron 305 cepas coagulasa negativas para especie y las probaron con agar PNP.130 Encontraron que 83% de las 170 cepas de S. epidermi­ dis, 17% de las siete cepas de S. cohnii y 75% de las cuatro cepas de S. xylosus eran PNP positivas, mientras que 124 ais­ lamientos que representan otras seis especies (que incluyen 38 cepas de S. saprophyticus) eran PNP negativas. ACTIVIDAD PIRROLIDONIL ARILAMIDASA

La prueba PYR también es útil como prueba fenotípica para la identificación de estafilococos coagulasa negativos. Como sucede con los enterococos, L-pirrolidonil-P-naftilamida se escinde por acción de la arilamidasa en L-pirrolidona y P-naftilamida libre, que se combina con el reactivo de PYR (p-dimetilaminocinamaldehído) para producir un color rojo. La prueba

se realiza con caldo PYR inoculado hasta aproximarse a la turbidez estándar n° 2 de McFarland. Después de 2 horas de incu­ bación a 35 °C se agrega el reactivo PYR. La aparición de color rojo dentro de los 2 minutos constituye una prueba posi­ tiva, y es negativa si aparece amarillo, naranja o rosa. De modo alternativo, se puede usar cualquiera de los discos de prueba rápida PYR comerciales. La hidrólisis de PYR también se encuentra en algunos de los sistemas de equipos comerciales para la identificación de estafilococos. S. aureus y S. epider­ midis son PYR negativos, mientras que S. haemolyticus, S. intermedius, S. lugdunensis y 5. schleiferi subespecie schleife­ ri son PYR positivos. SENSIBILIDAD A LA POLIMIXINA B

La prueba de difusión en disco para sensibilidad a la polimi­ xina B también es útil para identificar estafilococos coagulasa negativos. Puede realizarse en SBA junto con la de sensibilidad a la novobiocina (véase más adelante). Se prepara una suspen­ sión del microorganismo en solución salina hasta alcanzar el equivalente a 0,5 del estándar de turbidez de la escala de McFarland y se siembra con hisopo en una placa para pruebas de difusión en disco de Bauer-Kirby. Se aplica un disco de poli­ mixina B (300 unidades; BD Biosciences®) al inóculo y la pla­ ca se incuba toda la noche. La resistencia se indica por la pre­ sencia de una zona de menos de 10 mm. Las cepas sensibles

Cuadro 1 2 -3

Características fenotípicas para la identificación de especies Staphylococcus

ESPECIE

COAGUIA S A

FACTOR DE AGLUTINACIÓN

DESARROLLO ANAEROBIO EN TIIIO

ENDONUCLEASA TERMOESTABLE

PAL

ADH

ODC

PYR

ACETOÍNA

REDUCCIÓN DE N 0 3

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OXIDASA B-GUR MODIFICADA

UREASA

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S. saprophyticus subesp. saprophyticus S. saprophyticus subesp. bovis

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S. haemolyticus

-

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-

S. hominis subesp.hominis

-

S. hominis subesp. novobiosepticus

-

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S. schleiferi subesp. schleiferi

V-

S. schleiferi subesp. coagulans

+

S. aitricularis S. pasteuri S. caprae S. cohnii subesp. cohnii S. cohnii subesp. urealyticus S. xylosus

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-

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S. chromogenes

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S. gallinarum

-

S. 1entus S. equorum

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S. delphini

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S. felis

-

S. lutrae

+

S. vitulinus

-

S. muscae S. klosii S. arlettae

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S. piscifermentans

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-

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7

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-

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-

-

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-

(Continúa)

621

+

-

+

Identificación de estafilococos coagulasa negativos

-

+

-

C a r a c t e r í s ti c a s f e n o típ ic a s p a r a la id e n tif ic a c ió n d e e s p e c ie s S ta p h y lo c o c c u s

S.aureus subesp. aureus

POLIMIXINA B

NOVOBIOCINA

GLUCOSA

MALTOSA

SACAROSA

LACTOSA

( c o n t.)

MANITOL

MAÑOSA

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TREHALOSA XILOSA

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S. epiermidis

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S. saprophyticus subesp. saprophyticus

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S. schleiferi subesp. schleiferi

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S. schleiferi subesp. coagulans

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S. saprophyticus subesp. bovis S. haemolyticus

S. hominis subesp. novobiosepticus S. simulans S. lugdunensis

S. capitis subesp. capitis S. capitis subesp. ureolyticus

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S. gallinarum

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+ : reacción positiva; reacción negativa; V: reacción variable; +': reacción p o sitiva lenta; V—: reacción variable, la m ayoría de las cepas son negativas; V: reacción variable pero con reacciones po sitiva s lentas; ND: datos no dispo­ nibles; THIO: caldo tioglicolato; PAL: fo sfa ta sa alcalina; ADH: arginina dihidrolasa; ODC: o m itin a descarboxilasa; /3-glu: beta-glucosidasa; (5-gal: beta-gatactosidasa; fi-GUR: beta-glucuronidasa; S: sensible; R: resistente.

Cocos grampositivos: Parte i: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

S

12

R ND

S. aureus subesp. anaerobius

N-ACETILRAFINOSA CELOBIOSA GLUCOSAMINA

CAPÍTULO

ESPECIE

622

C u a d ro 1 2 -3

Id e n tific a c ió n de e s ta filo c o c o s c o a g u la s a n e g a tiv o s

tienen zonas > 1 0 mm. S. aureus, S. epidermidis, S. hyicus y algunas cepas de S. lugdunensis son resistentes a la polimixina. PRUEBA DE ORNITINA DESCARBOXILASA (ODC)

La prueba de ODC es la más útil para confirmar la identidad de S. lugdunensis, porque esta especie es la única ornitina des­ carboxilasa positiva. En un tubo con base de descarboxilasa y uno con base y agregado de ornitina (Remel®) se introducen inóculos abundantes y se cubren con aceite mineral estéril. En la incubación a 35 °C ambos tubos se tornarán de gris pálido a amarillo a medida que se fermenta la glucosa, tras lo cual la ornitina en el tubo de prueba se descarboxila; como resultado, el caldo ornitina se vuelve violeta. El tubo con base sola per­ manecerá amarillo y el tubo con ornitina permanecerá amarillo si no se produce ODC. Aunque las pruebas más positivas se pueden detectar dentro de las 6 a 8 horas, la prueba se lee des­ pués de las 24 horas de incubación. Esta prueba no está inclui­ da en la mayoría de los equipos comerciales para la identifica­ ción de estafilococos y debe considerarse una prueba adicional. PRODUCCIÓN DE UREASA

Algunos estafilococos son ureasa positivos, incluidos S. epi­ dermidis, S. intermedius y la mayoría de las cepas de S. sapro­ phyticus. Para esta prueba se puede usar el caldo ureasa común o el cultivo inclinado de agar urea. Cualquiera de ellos se ino­ cula y se incuba a 35 °C durante 18-24 horas. Un cambio en el indicador rojo de fenol de amarillo a rosa/rojo es una prueba positiva. PRODUCCIÓN DE ACETOÍNA

La producción de acetoína (la prueba de Voges-Proskauer) es útil para distinguir especies de S. aureus, que son acetoína positivas, de otras especies coagulasa positivas (S. intermedius y S. hyicus), que son acetoína negativas. La prueba de produc­ ción de acetoína entérica convencional (caldo MR-VP) o el método rápido en disco pueden usarse con iguales resultados.90 SENSIBILIDAD A LA DEFEROXAMINA

En 1991 y 1993, Lindsay y cois, informaron una prueba nueva para la identificación específica de S. epidermidis y S. hominis,267-268 La prueba determina la sensibilidad a la deferoxamina, que es un sideróforo producido por Stretptomyces pilosus y se usa para el tratamiento clínico de la sobrecarga de hie­ rro crónica y aguda. Se realiza como una prueba de difusión en disco de modo similar a las pruebas de sensibilidad a furazolidona y bacitracina. Después de preparar una suspensión del microorganismo correspondiente a 0,5 de la escala de turbidez estándar de McFarland, se inocula una placa de agar BHI con la suspensión y se coloca un disco de 1 mg de deferoxamina (Desferal®; Ciba-Geigy, Suiza) en el inoculo. Después de toda la noche de incubación a 35 °C, se inspecciona la placa para observar una zona de inhibición del desarrollo alrededor del disco. En su estudio original, Lindsay y Riley encontraron que, entre 95 estafilococos coagulasa negativos, 57 cepas de S. epi­ dermidis y 4 de S. hominis fueron sensibles a la deferoxamina, mientras que otras 34 fueron resistentes.268 En un estudio pos­ terior de 161 estafilococos coagulasa negativos, todas las cepas de S. epidermidis y S. hominis fueron sensibles a la deferoxa­ mina mientras que todos los estafilococos restantes fueron resistentes.267 Mulder probó 670 S. epidermidis, 37 S. hominis

623

y otros 151 estafilococos coagulasa negativos para la sensibili­ dad a la deferoxamina usando una prueba de disco (50 |iL por disco de una solución de deferoxamina al 2%) y encontró que todas las cepas de S. epidermidis y S. hominis eran sensibles a la deferoxamina, mientras que sólo 5 (3,3%) de los 151 aisla­ mientos identificados como otras especies estafílocócicas lo eran.309 Monsen y cois, también evaluaron esta prueba y encon­ traron que las 139 cepas de S. epidermidis y las 18 de S. homi­ nis eran sensibles a la deferoxamina, y mostraron zonas de inhibición de 28-31 mm y 15-41 mm, respectivamente.306 Todos los otros estafilococos coagulasa negativos probados en este estudio eran altamente resistentes a la deferoxamina. Mientras la deferoxamina puede comprarse en el comercio, hasta el momento los discos de prueba de sensibilidad estanda­ rizados deben prepararse en el laboratorio. Sensibilidad a la novobiocina para la identificación de Staphylococcus saprophyticus

Cuatro especies estafílocócicas humanas (S. saprophyticus, subespecies de S. cohnii, S. hominis subespecie novobiosepticus, y S. xylosus), siete especies animales (S. sciuri, S. lentus, S. gallinarum, S. kloosii, S. equorum, S. arlettae y S. vitulinus) y una especie medioambiental (5. succinus) son resistentes a la novobiocina, con concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) > 1,6 jjg/mL.220’226-228,247'389'391'487 Como las especies resistentes a la novobiocina que no sean S. saprophyticus no se encuentran con frecuencia en muestras clínicas humanas, la prueba de sen­ sibilidad a la novobiocina provee un método útil para la identi­ ficación de S. saporpliyticus. La prueba de la novobiocina se realiza como una prueba de sensibilidad en disco usando un disco de novobiocina (5 |ig) y se describe en detalle en el pro­ tocolo 12-2 (lámina en color 12-3B, C y D). Las cepas resis­ tentes a la novobiocina mostrarán zonas de inhibición que miden de 6 mm (no zona) a 12 mm; las cepas sensibles mostra­ rán zonas de 16 mm a 27 mm. Esta prueba se describió en prin­ cipio usando un medio llamado agar P, que no se comercializa. Sin embargo, estudios con medios de rutina antes mencionados han mostrado que se obtienen resultados comparables.141 En un intento por determinar la confiabilidad y la exactitud de la prueba de sensibilidad a la novobiocina, McTaggart y Elliott analizaron 36 cepas que presuntivamente eran S. saprophyticus (microorganismos resistentes a la novobiocina en muestras de orina de pacientes con infecciones urinarias) con un sistema de identificación comercial (API Staph-Ident®, véase más adelante) y con series ampliadas de sustratos adi­ cionales, que incluyen pruebas de utilización de hidratos de carbono, derivados de 7-amino-4-metilumbeliferona de ésteres y glucósidos orgánicos e inorgánicos, y derivados de 7-amino4-metilcumarina de aminoácidos.292 De las 36 cepas, 21 (58%) fueron identificadas como S. saprophyticus, 3 cepas no pudie­ ron ser identificadas, 9 cepas tenían características atribuibles a más de una especie resistente a la novobiocina y 3 cepas fue­ ron identificadas como S. epidermidis, S. hominis y S. simulans, respectivamente. Incluso cepas que fueron identificadas como S. saprophyticus por el Staph-Ident producían un espec­ tro de reactividades con los otros sustratos cromogénicos, lo que ilustra la heterogeneidad de los microorganismos llamados “S. saprophyticus” y sugiere que en realidad pueden represen­ tar un grupo heterogéneo de cepas resistentes a la novobiocina relacionadas desde el punto de vista genotípico y fenotípico. Estos investigadores concluyeron que se necesitan más pruebas para la identificación presuntiva confiable de S. saprophyticus además de la prueba de sensibilidad a la novobiocina. Cepas

624

C A P ÍT U L O 12

Cocos gram positivos: Parte I: Estafilococos y cocos gram positivos relacionados

humanas ocasionales que no son S. saprophyticus, subespecies de S. cohnii, S. hominis subespecie novobiosepticus, o S. xylo­ sus también pueden ser resistentes a la novobiocina. En una evaluación del RapiDEC-Staph, Janda y cois, encontraron que, mientras todos los aislamientos de S. saprophyticus eran resis­ tentes a la novobiocina, 5 (7%) de las 74 cepas de S. epidermi­ dis también lo eran.192 Sistemas de Identificación comerciales

En la actualidad se comercializan varios equipos para la identificación de estafilococos coagulasa negativos. Todos ellos usan pruebas de fermentación de hidratos de carbono modificadas, adaptaciones de las pruebas estándares de identi­ ficación bacteriológica (p. ej., reducción de nitrato, ureasa, Voges-Proskauer) y las pruebas cromogénicas de enzima sus­ trato para la identificación de microorganismos. Estos sistemas se adaptan al formato particular usado por el fabricante (p. ej., tiras con pequeñas cúpulas, bandejas microtituladoras, tarjetas plásticas). RAPIDEC STAPH®

RapiDEC Staph® (bioMerieux) es un equipo comercial que identifica S. aureus, S. epidermidis y S. saprophyticus dentro de las 2 horas. El aislamiento para ser identificado se emulsio­ na en agua y la suspensión se distribuye en cuatro cúpulas. La primera cúpula es un control, mientras las otras contienen un sustrato coagulasa fluorescente (véase la prueba “Aureasa” ya mencionada), un sustrato fosfatasa alcalina (PAL) y un sustra­ to P-galactosidasa (|3GAL), respectivamente. Después de 2 ho­ ras de incubación, las cúpulas se observan bajo luz ultravioleta (longitud de onda 365 nm). Si la fluorescencia es mayor en la segunda cúpula que en la primera cúpula control, el aislamien­ to se identifica como S. aureus. Si la prueba es negativa, las otras dos cúpulas se leen ya sea en forma directa (cúpula 3) o después del agregado de un reactivo de detección (cúpula 4). Una reacción positiva en la cúpula 3 o 4 identifica la cepa como S. epidermidis (fosfatasa alcalina positiva) o S. saprophyticus (P-galactosidasa positiva), respectivamente. Los resultados positivos en las pruebas PAL y PGAL proveen una identifica­ ción presuntiva de S. xylosus/S. intermedius. En una evalua­ ción, RapiDEC Staph identificó de modo correcto el 100% de las 130 cepas de S. aureus, mientras que lo hizo sólo en el 70% de las 74 cepas de S. epidermidis y en el 81% de las 32 cepas de S. saprophyticus,192 Entre otros 62 aislamientos coagulasa negativos probados, 4 cepas de S. sciuri fueron mal identifica­ das como S. epidermidis y 8 aislamientos (uno S. hominis, tres S. cohnii subespecie urealyticum, tres S. simulans y uno S. kloosii) fueron mal identificados como S. saprophyticus. Mientras la prueba PAL en el RapiDEC Staph parece ser relativamente específica para la detección de la fosfatasa de S. epidermidis, cepas de esta especie fosfatasa negativas o que producen bajos niveles de la enzima no serán identificadas como S. epidermi­ dis por este equipo. Como consecuencia, la sensibilidad y el desempeño de RapiDEC Staph para identificar S. epidermidis depende de la prevalencia relativa de cepas PAL negativas y positivas en la población.192 API STAPH-IDENT®

El producto API Staph-Ident® (bioMerieux) usa una serie de 10 pruebas bioquímicas en miniatura que se inoculan con una suspensión densa del microorganismo por identificar. La iden­

tificación de especie se determina por la generación de un códi­ go octal de cuatro dígitos derivado de las pruebas positivas de tira y de la base de datos. Se pueden requerir otras pruebas (p. ej., ácido de xilosa, sensibilidad a la novobiocina) para identi­ ficar algunas cepas. La base de datos de este sistema incluye varias especies o subespecies de estafilococos, micrococos y R. mucilaginosa. Los microorganismos que se denominan R. mucilaginosa en Staph-Ident requieren confirmación; las reco­ mendaciones incluyen sensibilidad a la lisostafina para separar el microorganismo de los estafilococos, y catalasa y desarrollo en caldo salado para separar el microorganismo de K. kristinae. Staph-Ident ha sido evaluado en forma extensa, y el acuerdo con los procedimientos convencionales se extiende del 43% al 95%, según la especie probada.99-135 145,185-227 Rhoden y Miller publicaron un estudio prospectivo de 4 años que comparó el API Staph-Ident con los métodos de referencia en 1 106 aisla­ mientos y encontraron un acuerdo total del 81,1%.368 El acuer­ do para los cinco aislamientos más comunes fue 97,1% para S. epidermidis', 82,5% para S. hominis; 77,2% para S. aureus; 75,8% para S. haemolyticus y 64,1% para S. warneri. Estos investigadores concluyeron que la base de datos del sistema Staph-Ident actual es inadecuada para la identificación de las especies estafilocócicas comunes y poco comunes.368 API STAPH®

API Staph® (antes API Staph-Trac; bioMerieux) es un sistema de identificación de 18 a 24 horas para micrococos y estafiloco­ cos. Contiene 19 pruebas distribuidas en un formato de tira y se inocula con una suspensión de microorganismos preparada en un medio de caldo con extracto de levadura y peptona provisto con el equipo. Después de leer las reacciones bioquímicas, se genera un código octal de siete dígitos y se obtiene la identificación del microorganismo con la ayuda de la base de datos del ordenador (lámina en color 12-3B y H). La base de datos consiste en 25 taxones e incluye estafilococos de origen humano y veterinario, especies de Micrococcus, y R. mucilaginosa. Aunque la base de datos de este sistema es grande, no ha sido evaluada extensa­ mente.135 Un estudio de Perl y cois, encontró que el sistema API Staph identificó de modo correcto el 73% de 277 estafilococos coagulasa negativos.342 Mientras el 94% de 94 cepas de S. epidermidis fueron identificadas en forma correcta, el sistema tuvo un mal desempeño en el caso de cepas menos comunes, como S. haemolyticus (correcto, 85%), S. hominis (correcto, 75%), S. simulans (correcto, 67%) y S. warneri (correcto, 22%). API ID32 STAPH®

ID32 Staph® (bioMerieux) es un sistema de tira que requie­ re 24 horas para la identificación de estafilococos y especies relacionadas. El panel contiene 32 cúpulas y en la actualidad tiene 26 pruebas bioquímicas. El sistema puede ser leído en forma manual para generar un número de perfil que se inter­ preta con una base de datos asistida por ordenador (lámina en color 12-2H), o bien, la tira puede usarse con el sistema ATB bioMerieux automatizado, que incluye un densitómetro, un inoculador, un lector, un microordenador y una impresora. El ID32 Staph tiene la base de datos más extensa de todos los sis­ temas, con todas las especies estafilocócicas humanas (excepto S. saccharolyticus) e incluye varias especies animales y medio­ ambientales. También identifica seis especies de micrococos y R. mucilaginosa. Una evaluación internacional con 792 cepas llevada a cabo en ocho laboratorios encontró que ID32 Staph identificó de modo correcto 95,5% de los aislamientos proba­

Id e n tific a c ió n d e e s ta filo c o c o s c o a g u la s a n e g a tiv o s

dos; 83,5% fueron identificados sin pruebas posteriores, mien­ tras que para un 12% de cepas adicionales, la identificación correcta fue entre las elecciones propuestas.49 Sólo el 1,2% de las cepas fueron mal identificadas, y el 3,3% no fueron identi­ ficadas por ID32 Staph. En otro estudio de 440 aislamientos estafilocócicos coagulasa negativos consecutivos, leven y cois, informaron que el panel ID32 Staph identificó el 95,2%.187 S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. schleiferi y S. capitis fueron identificados con una exactitud del 98-100%.187 Renneberg y cois, encontraron que el panel ID32 Staph® iden­ tificó el 79,5% de 200 aislamientos estafilocócicos clínicos y de referencia.366 Otros investigadores europeos pusieron a prue­ ba el sistema con una recolección de 42 cepas que no podían ser clasificadas mediante otros procedimientos fenotípicos dis­ ponibles y hallaron que sólo 22 (52%) fueron identificadas por el ID32 Staph.74 TARJETA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE GRAMPOSITIVOS VITEK (GPI)®

Vitek GPI® (bioMerieux) es una tarjeta para la identificación de microorganismos grampositivos diseñada para usar con el sistema de prueba identificación/sensibilidad bacteriana Vitek automatizado. Las tarjetas contienen 30 pocilios (28 de prueba y 2 controles) que contienen sustratos para la identificación de especies de Staphylococcus (11 especies humanas y 4 veterina­ rias), especies de Streptococcus y varias especies bacilares grampositivas (p. ej., especies Corynebacterium, Erysipelothrix rhusiopathiae y Listeria monocytogenes). Se prepara una suspensión del microorganismo en solución salina, se fija la tarjeta a la suspensión bacteriana mediante un tubo transporta­ dor y se coloca en el módulo de llenado del instrumento. La tar­ jeta se inocula por un método de vacío/descarga. Luego se co­ loca en el módulo incubador/lector del instrumento Vitek, se rastrea por un mecanismo óptico y se lee en forma periódica. La identificación de estafilococos coagulasa negativos por lo general requiere 10 a 13 horas. Bannerman y cois, evaluaron la base de datos GPI actualizada con 500 cepas clínicas.22 La con­ cordancia total entre la tarjeta GPI y los métodos convenciona­ les fue del 89%. La tarjeta identificó el 92% de las cepas de S. epidermidis, el 95% de las de S. haemolyticus, el 88% de las de S. capitis subespecie capitis y el 100% de las cepas de S. saprophyticus probadas. Los microorganismos que no están en la base de datos, como S. lugdunensis, eran mal identificados o no identificados por la tarjeta GPI. En la evaluación realizada por Perl y cois, en 1994, la tarjeta identificó correctamente sólo el 67% de 185 aislamientos.342 Estos investigadores señalaron que el escaso desempeño de la tarjeta GPI en su estudio pudo haberse debido a la preponderancia de estafilococos “no epi­ dermidis” entre los 277 aislamientos probados. En 1996, Kellog y cois, pusieron a prueba la tarjeta GPI con 616 cepas clínicas de estafilococos coagulasa negativos.212La tarjeta iden­ tificó el 100% de 12 cepas de S. capitis y de 79 cepas de S. saprophyticus, el 98,4% de 250 cepas de S. epidermidis y el 96% de 126 cepas de S. haemolyticus. Sólo el 64,5% de los 107 aislamientos restantes fue identificado correctamente.212 Todos estos estudios han concluido que la tarjeta GPI no es confiable para identificar las especies estafílocócicas menos comunes y la base de datos para este producto necesita mejoras. La tarjeta GPI para el instrumento Vitek 2 aguarda una evaluación clínica. PANEL MICROSCAN RAPID POS COMBO®

El panel MicroScan Rapid Pos Combo® (Dade/MicroScan) es un sistema en formato de placa de microtitulación que usa

625

sustratos fluorogénicos y un indicador de pH fluorescente para detectar varias actividades enzimáticas bacterianas.219 Contiene 42 pruebas para la identificación de estafilococos, estreptoco­ cos y listerias. Las pruebas están basadas en la hidrólisis de los sustratos fluorogénicos, cambios de pH seguidos a la utiliza­ ción de sustratos y la producción de productos metabólicos específicos. El sistema se inocula con una suspensión del microorganismo y se incuba y lee en el instrumento Microscan Walk/Away. Las identificaciones están disponibles 2 horas des­ pués de la incubación del panel. En una evaluación canadiense de este sistema, el panel MicroScan Rapid Pos Combo identi­ ficó correctamente el 91,6% de 239 aislamientos estafilocóci­ cos.428 Para un 3,8% adicional de los aislamientos, la identifi­ cación correcta se hallaba en la lista de elección de especies provista por la base de datos. Otra evaluación de Portland. Oregon, encontró que el panel identificó sólo el 50,5% de 233 aislamientos, con un 24,9% adicional que tienen la identifica­ ción correcta entre las posibilidades generadas por la base de datos.144Weinstein y cois, encontraron que, mientras el sistema identificaba de modo exacto S. epidermidis y varios otros esta­ filococos coagulasa negativos, más de la mitad de las cepas de S. haemolyticus y S. hominis fueron mal identificadas.489 PANEL MICROSCAN POS ID®

El sistema del panel MicroScan Pos ID® (Dade/MicroScan) ofrece la combinación de las capacidades de identificación y pruebas de sensibilidad para microorganismos grampositivos, incluidos micrococos, estafilococos, estreptococos, enteroco­ cos y listerias. El panel contiene 27 pruebas bioquímicas de identificación convencionales en miniatura, 18 de las cuales se usan para la identificación de estafilococos y especies relacio­ nadas. Los paneles liofilizados se reconstituyen, inoculan e incuban durante 24 a 48 horas y se leen en forma manual o con el sistema MicroScan Walk/Away automatizado. Los resulta­ dos de las pruebas se computan en un código de seis dígitos y la base de datos del sistema provee una identificación. En una evaluación, el panel proporciona la identificación exacta de S. epidermidis y S. saprophyticus, pero sólo después de 48 horas de incubación.185 Se identificaron otras especies de Staphylo­ coccus con menos confiabilidad dentro del mismo período. Skulnick y cois, analizaron 163 aislamientos estafilocócicos y encontraron que el panel Microscan identificó el 96% de ellos; los microorganismos que estaban mal identificados fueron dos cepas de S. haemolyticus y una sola cepa de S. epidermidis, S. hominis, S. xylosus y S. sciuri,413 Kloos y George también encontraron que este sistema identificaba correctamente la mayoría de los aislamientos estafilocócicos humanos con una exactitud mayor del 80%.219 Una evaluación más reciente infor­ mó que el sistema identificaba sólo el 53,6% de 233 aisla­ mientos estafilocócicos, con un 24,9% adicional de aislamien­ tos cuya identificación correcta se hallaba en la lista de elec­ ciones posibles de la base de datos del ordenador.144 SISTEMA BBL CRISTAL PARA LA IDENTIFICACIÓN DE GRAMPOSITIVOS (GP)®

El sistema BBL Cristal GP® (BD Biosciences) es un panel de identificación en miniatura que consiste en 29 pruebas con­ vencionales fluorogénicas, cromogénicas y modificadas para la identificación de cepas grampositivas que pertenecen a varios géneros, como Staphylococcus, Micrococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Enterococcus, Aerococcus y Lactococcus. El sistema se inocula con una suspensión de microorganismos

626

C A P ÍT U L O 1 2

Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos gram positivos relacionados

(0,5 del estándar de turbidez de McFarland), se incuba durante 18-24 horas a 35-37 °C en atmósfera ambiental y se lee con visor especial del panel del sistema Cristal. Von Baum y cois, evaluaron el sistema usando 77 cepas de especies de Staphy­ lococcus, 5 de especies de Micrococcus y una única cepa de R. mucilaginosa,m El BBL Cristal identificó correctamente el 100% de 22 cepas de S. aureus y 24 de S. epidermidis. Entre 31 cepas que representan otras 10 especies coagulasa negativas, 29 fueron bien identificadas. Todos los aislamientos de micrococos y el aislamiento de R. mucilaginosa se identificaron en forma correcta. Mientras el sistema Cristal parece ser útil para la identificación de estafilococos importantes desde el punto de vista clínico, se necesitan otros estudios debido al escaso número de cepas analizadas en la evaluación anterior y la omi­ sión de incluir otras especies importantes, como S. saprophyti­ cus, S. schleiferi y S. caprae. SISTEMA STAF18-R®

El sistema Staf 18-R® (Liofilchem s.r.l. Roseto degli Abruzzi, Teramo, Italia) consiste en una cubeta plástica que contiene 18 sustratos convencionales modificados. Los pocilios se inoculan con una suspensión del microorganismo que usa una pipeta multicanal y el panel se incuba y se lee después de 18 a 24 horas. Piccolomini y cois, evaluaron este sistema con 523 cepas pertenecientes a 18 especies humanas de Staphylo­ coccus y encontraron que 491 cepas (93,9%) fueron identifica­ das correctamente, y otras 28 cepas (5,4%) requirieron pruebas suplementarias para la identificación completa.344 Como en el caso de muchos de estos equipos, los autores señalaron la nece­ sidad de ajustar la base de datos y de seleccionar pruebas más discriminatorias para identificar en forma correcta cepas importantes, como S. lugdunensis y S. schleiferi. STAPH-ZYM®

El Staph-Zym® (ROSCO, Taastrup, Dinamarca) es un siste­ ma escandinavo nuevo de identificación compuesto por una tira plástica de 10 minitubos que contiene sustratos convencionales modificados y cromogénicos deshidratados. Los microtubos individuales se inoculan con una alícuota de una suspensión bacteriana preparada en solución salina y los resultados se leen después de la incubación de toda la noche. Renneberg y cois, lo probaron con 111 cepas estafílocócicas de referencia y 89 aislamientos clínicos y encontraron que identificaba de modo correcto el 90-100% de las cepas de referencia y el 82,1% de los aislamientos clínicos, con una exactitud del 91,5% en com­ paración con los métodos de identificación convencionales.366 En otra evaluación, el Staph-Zym identificó correctamente el 97,5% de 440 aislamientos cuando se los comparó con las identificaciones de referencia.187 El Staph-Zym parece ser un sistema exacto para la identificación estafilocócica. MICR0BACT STAPHYL0C0CCAL12S®

El Microbact Staphylococcal 12S® (Oxoid) es un sistema de 12 pruebas basado en la acidificación de hidratos de carbono y en la detección de enzimas usando sustratos cromogénicos. Los pocilios de la tira se inoculan con una suspensión del microor­ ganismo y la tira se incuba toda la noche a 35 °C. Después del agregado de los reactivos que desarrollan color para las prue­ bas enzimáticas, las pruebas se leen e interpretan de acuerdo con la base de datos incluida en el inserto del envase. No están disponibles evaluaciones de este nuevo sistema.

SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN MICROBIANA

El Microbial Identification System (Sistema de identifica­ ción microbiana, MIS® o MIDI®; Microbial ID, Newark, DE) utiliza la cromatografía gas líquido (GLC) de alta resolución de derivados de ácidos grasos celulares para la identificación de bacterias.39 La base de datos del sistema está compuesta de colecciones de perfiles de ácidos grasos celulares de varias bacterias y compara la composición de los aislamientos indivi­ duales con la de las cepas de la base de datos mediante un pro­ grama de reconocimiento del patrón/matriz de covariancia. Se usa un índice similar para expresar el parentesco de un perfil de un microorganismo desconocido con los perfiles representati­ vos de microorganismos conocidos. En una evaluación compa­ rativa con los procedimientos convencionales para identificar estafilococos, el sistema MIS mostró concordancia completa con estos métodos para el 87,8% de 470 aislamientos proba­ dos.427 El sistema identificó todas las cepas de S. epidermidis, S. intermedius, S. cohnii, S. lugdunensis, S. schleiferi, S. simulans, S. sciuri y S. xylosus. Las cepas de S. hominis y S. saprophyticus dan cuenta de más de la mitad de las identifica­ ciones erróneas obtenidas con el sistema. La propuesta GLC usada en MIS se muestra promisoria como método alternativo para la identificación de especies de estafilococos. SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN BIOLOG MICR0PLATE®

El sistema de identificación Biolog MicroPlate® (Biolog, Hayward, CA) identifica microorganismos sobre la base de la oxidación de diversos sustratos. El sistema usa una bandeja de microtitulación de 96 pocilios con 95 sustratos más un pocilio control sin sustrato. La placa se inocula con una suspensión del microorganismo y se incuba durante 4 o 24 horas. Si el micro­ organismo oxida un sustrato en un pozo individual, la respira­ ción del microorganismo durante la asimilación oxidativa del sustrato causa la reducción de un colorante indicador tetrazolio, que torna el pozo de incoloro a violeta. En la actualidad, el sistema Biolog MicroPlate incluye la GN MicroPlate para la identificación de 569 especies gramnegativas y la GP Biolog MicroPlate, el que incluye 225 microorganismos grampositivos en su base de datos. Miller y Biddle, en los CDC, y Quenzer y McLaughlin en la University of New México realizaron un eva­ luación conjunta de la GP Biolog MicroPlate para la identifi­ cación de 113 aislamientos catalasa positivos, incluidos 33 tipos de cepas de estafilococos, 5 cepas de especies de Micro­ coccus y 1 cepa de R. mucilaginosa .301 Estos investigadores encontraron que la exactitud total del sistema fue 69% y 73% en los CDC y en los laboratorios de New México, respectiva­ mente. Estos resultados indican que el sistema Biolog no es todavía lo suficientemente exacto para ser usado como método de rutina para la identificación de estafilococos coagulasa negativos y los microorganismos relacionados. Métodos moleculares para identificación y tipificación de estafilococos

Diversas pruebas que emplean métodos moleculares recién desarrollados y métodos tradicionales se han usado para iden­ tificar estafilococos y caracterizar cepas en estudios epidemio­ lógicos y en brotes de cepas multirresistentes o inusuales. Antes, los estudios epidemiológicos estaban basados en marca­ dores fenotípicos tales como reacciones bioquímicas o utiliza­ ción de hidratos de carbono poco comunes, patrones de sensi­ bilidad a los antibióticos, serotipificación, biotipificación y sensibilidad ante series de bacteriófagos.415443 Otros estudios,

Cuadro 12-4

C aracterístic a s fenotípicas p a ra la identificación de M icrococcus y especies relacio n ad as DISPOSICIÓN CELULAR

ESPECIES

ADH

REDUCCIÓN DE NITRATO

Rojo-rosada

-

-

Naranja

-

V

Naranja-rosada a roja

-

+

-

Am arillo intenso

-

+

+

Crem a pálido a naranja pálido

-

-

Am arillo pálido

-

+

-

Amarillo

-

-

+

Naranja

Pares

Tétradas

Cubos

Grupos

CATALASA

OXIDASA

A rthrobacter agilis

+

+

-

+

+

+

D erm acoccus nishinom iyaensis

+

+

-

+

+

+

Kocuria rosea

+

+

-

+

+

V-

Kocuria varians

-

+

-

+

+

Kocuria kristinae

-

+

-

+

+

Kocuria palustris

+

+

+

-

+

Kocuria rhizophila

+

+

+

-

+

Kocuria polaris

PIGMENTACIÓN

+

-

+

+

-

+

-

Blanco a am arillo manteca

+

V

Kytococcus schroeteri

+

+

-

-

+

-

Am arillo turbio

+

-

M icrococcus luteus

+

+

+

+

+

+

Am arillo a am arillo verdoso

-

-

M icrococcus lylae

+

+

+

+

+

+

Blanco

-

-

M icrococcus antarcticus

+

-

+

+

+

+

Amarillo, mucoide

-

+

Nesterenkonia halobia

+

+

-

+

+

+

No pigmentada

-

-

ND

ND

ND

ND

+

-

A m arillo brillante

ND

-

Nesterenkonia lacusekhoensis

(Continúa )

Identificación de estafilococos coagulasa negativos

Kytococcus sedentarius

627

628 CAPÍTULO 12

M ic r o c o c c u s y especies relacio n ad as (c o n t.)

HIDRÓLISIS DE: ESPECIES Arthrobacter agilis

MOVILIDAD

UREASA

+

ÁCIDO EN AEROBIOSIS DE: Glucosa

Glicerol

Lactosa

+

+

+

-

-

-

-

V

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+"

+

ND

ND

-

+

-

+

ND

ND

+

-

-

+

ND

ND

-

-

+

+

ND

ND

+

-

+

-

+

ND

ND

-

+

-

+

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

+

+

ND

-

+

Kocuria rosea

-

-

+

-

Kocuria varians

+

Kocuria kristinae

V

Dermacoccus nishinomiyaensis

i

>

Gelatina

i

Almidón

+ >

Esculina

+

Kocuria palustris

-

Kocuria rhizophila

_

Kocuria polaris Kytococcus sedentarius

-

Kytococcus schroeteri

_

M icrococcus luteus

-

M icrococcus lylae

_

M icrococcus antarcticus

-

-

Nesterenkonia halobia Nesterenkonia lacusekhoensis

ND

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

ND

+

ND

+

+

+

-

ND

-

ND

ND

Manitol

+

+

Mañosa

Xilosa

“Bastones cortos con ramificaciones, predominan los cocos en cultivos viejos. +: reacción positiva; reacción negativa; V: reacción variable; V + : reacción variable pero la mayoría de las cepas son positivas; V -: reacción variable pero la mayoría de las cepas son negativas; +d: reacción positiva débil.

Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos grampositivos relacionados

Cuadro 12-4 C aracte rístic a s fenotípicas p a ra la identificación d e

E n fo q u e p a ra la id e n tific a c ió n de e s ta filo c o c o s en el la b o ra to rio

como el análisis proteico de la célula completa usando electro­ foresis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDSPAGE), cromatografía gas-líquido, cromatografía líquida de alta presión, espectrometría de masa y electroforesis de enzi­ mas multilocus, son más discriminatorios para reconocer simi­ litudes y diferencias entre cepas, pero son costosos e insumen mucho tiempo.39,345,447 La SDS-PAGE de las proteínas celulares totales y de las proteínas de unión a la penicilina y la cromato­ grafía gas-líquido de los ácidos grasos celulares han mostrado el 92% a más del 95% de concordancia con procedimientos fenotípicos para la identificación y tipificación de estafilococos coagulasa negativos.236-345 Las técnicas genéticas y moleculares más nuevas han ganado popularidad como métodos altamente discriminato­ rios y de relativo bajo costo para la identificación, tipifica­ ción epidemiológica y caracterización de cepas de S. aureus y para la identificación y caracterización de estafilococos coagulasa negativos. Estos métodos incluyen análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción de ácidos nucleicos de plásmidos, ribosómicos y cromosómicos, electroforesis en gel de campo pulsado del DNA total, ribotipificación, reacción en cadena de la polimerasa/procedimientos de hibridación de sondas de ácidos nucleicos, aná­ lisis de inserción de elementos y regiones espaciadoras inter­ génicas de 16S-23S rRNA por PCR, clonación/secuenciación de los genes de proteínas de choque térmico, análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción de la coagulasa de S. aureus y de los genes de la proteína A, hibridación in situ dirigida por 16S rRNA y secuenciación de 16S S R N A

38.41,76,95,138,139,179,180,243,245.295,324,325,416,434.459,472

Estos procedimientos se han usado para investigar los bro­ tes de S. aureus resistentes a la oxacilina en recién nacidos y adultos en unidades de cuidados intensivos, la diseminación de S. haemolyticus resistente a la vancomicina en pacientes y cuidadores, y la variación fenotípica e identificación de otros estafilococos coagulasa negativos (p. ej., S. schleiferi) aisla­ dos en infecciones graves. Tales técnicas también han sido útiles en estudios diseñados para identificar a individuos colonizados y para rastrear las fuentes de microorganismos causantes de infecciones, como la relación entre la portación de una cepa particular de S. aureus en la nariz de los pacien­ tes y de sus cuidadores y el desarrollo posterior de peritonitis relacionada con diálisis peritoneal ambulatoria continua.347 Estos métodos también se están aplicando al análisis taxonó­ mico de microorganismos y, al respecto, han revolucionado

Cuadro 1 2 -5

los conceptos de parentesco de microorganismos, clasifica­ ción e identificación. Identificación de Micrococcus y especies relacionadas

En los laboratorios, los micrococos y las especies relaciona­ das no suelen identificarse en la jerarquía de especies porque son pocos importantes desde el punto de vista clínico. Usando las pruebas descritas con anterioridad y en el cuadro 12-1, los laboratorios pueden emitir informes de “especie Micrococcus” sin otras pruebas. Sin embargo, con el reconocimiento de estos agentes como patógenos oportunistas a veces es necesario iden­ tificarlos como especie. Los criterios de identificación para los miembros recién reclasificados del antiguo género Micrococcus se presentan en el cuadro 12-4. Como ya se mencionó, estos microorganismos también se incluyen en la base de datos de algunos de los equipos comerciales usados en los laboratorios. Identificación de Rothia mucilaginosa

Las colonias de R. mucilaginosa son viscosas o mucosas, claras a blancas y adherentes a la superficie del agar. Aparecen en los extendidos teñidos con Gram como grandes cocos gram­ positivos dispuestos en pares o en grupos. Son catalasa positi­ vos débiles, aunque algunas cepas son catalasa negativas. R. mucilaginosa puede diferenciarse de especies de Micrococcus y Staphylococcus por su falta de crecimiento en medio agar nutritivo que contiene 5% de NaCI y por la presencia de una cápsula.29-30 Estos microorganismos también se incluyen en la base de datos de los sistemas API Staph-Ident®, API Staph® e ID32 Staph®. Otras características bioquímicas se observan en el cuadro 12-5. El medio usado para la identificación entérica puede ser inoculado para determinar las reacciones bioquími­ cas para este microorganismo y las pruebas de utilización de hi­ dratos de carbono pueden realizarse con medios a base de agar cisteína tripticasa o caldo violeta que contengan 1% de hidratos de carbono esterilizados por filtración.

Enfoque para la identificación de estafilococos en el laboratorio Como los estafilococos están entre los microorganismos ais­ lados con mayor frecuencia en el laboratorio clínico, las deci­ siones se deben tomar con respecto a “cuán lejos ir” en su iden­

Características fenotípicas para la identificación de R othia m ucilaginosa

CARACTERÍSTICA

REACCIÓN

CARACTERÍSTICA

REACCIÓN

Catalasa

V

Glucosa

+

Acetoína (VP)

+

Sacarosa

+

Hidrólisis de gelatina

+

Fructosa

+

D esarrollo en condiciones anaerobias

+

Salicina

+

D esarrollo en agar nutritivo con 5% de NaCI

-

M añosa

V

C oagulasa

-

Trehalosa

V

Fosfatasa alcalina

-

M anitol

-

Sorbitol

-

+: reacción positiva;

reacción negativa; V: reacción variable.

629

630

C A P ÍT U L O 12

Cocos gram positivos: Parte I: Estafilococos y cocos gram positivos relacionados

tificación. Esto es válido en especial en referencia a los micro­ organismos coagulasa negativos. Muchos laboratorios han adoptado procedimientos rápidos para coagulasa (pruebas del látex o hemaglutinación), de manera que pruebas pueden reali­ zarse de modo rápido en las colonias que “parezcan” estafilo­ cocos y sean catalasa positivas. Si las colonias son coagulasa positivas, el microorganismo se identifica como 5. aureus. Para aislamientos que son coagulasa negativos, se puede realizar una prueba de disco de bacitracina o furazolidona, o la prueba de oxidasa modificada para diferenciar estafilococos coagulasa negativos de Micrococcus y especies relacionadas. Los aisla­ mientos estafilocócicos significativos de cultivos urinarios también deben probarse para la sensibilidad a la novobiocina para la identificación presuntiva de S. saprophyticus. La iden­ tificación completa de especie que utilice un método comercial o el procedimiento de referencia debe estar reservada para ais­ lamientos significativos desde el punto de vista clínico. Éstos pueden incluir cepas que han sido aisladas en múltiples hemo­ cultivos, en catéteres intravenosos infectados (donde el paciente puede tener el mismo aislamiento en múltiples hemocultivos), o en otros sitios normalmente estériles donde se ha aislado en for­ ma repetida el mismo estafilococo coagulasa negativo. Las decisiones que implican identificaciones adicionales de estos microorganismos deben ser tomadas en cada caso con el apor­ te tanto del laboratorio como de los médicos a cargo del cuida­ do del paciente.

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638

C A P ÍT U L O 12

Cocos grampositivos: Parte I: Estafilococos y cocos gram positivos relacionados

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Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus” Características generales de los estreptococos Estreptococos (3-hemolíticos del grupo A (Streptococcus pyogenes) Factores de virulencia Importancia clínica

Estreptococos (3-hemolíticos del grupo B (Streptococcus agalactiae) Factores de virulencia Importancia clínica

Estreptococos del grupo D: el “complejo Streptococcus bovis/Streptococcus equinus” y especies relacionadas

Streptococcus suis Otros estreptococos viridans aislados en animales Otros estreptococos Especies de Enterococcus

Estreptococos B-hemolíticos de los grupos C y G

Taxonomía Factores de virulencia Importancia clínica Género Melissococcus

Estreptococos (3-hemolíticos del grupo F

Bacterias “similares a Streptococcus”

Otros estreptococos del grupo de “cocos piógenos” Streptococcus pneumoniae Factores de virulencia Vacunas antineumocócicas Importancia clínica

Estreptococos viridans Grupo anginoso: Streptococcus angmosus, Streptococcus constellatus y Streptococcus intermedius

Especies de Abiotrophia y de Granulicatella Especies de Aerococcus y de Helcococcus Especies de Leuconostoc Especies de Pediococcus y de Tetragenococcus Especies de Gemella Especies de Vagococcus Especies de Alloiococcus Especies de Globicatella Especies de Facklamia Especies de Dolosigranulum, Ignavigranum y Dolosicoccus 639

640

C A P ÍT U L O 13

Cocos gram positivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “sim ilares a Streptococcus"

Especies de Eremococcus Género Lactococcus

Aislamiento e identificación de estreptococos y bacterias “similares a Streptococcus” Frotis directos con tinción de Gram Medios de cultivo Hemolisis en agar sangre Técnicas de detección directa diferentes del cultivo para estreptococos (3-hemolíticos del grupo A en muestras faríngeas Técnicas de detección directa diferentes del cultivo para estreptococos (3-hemolíticos del grupo B y Streptococcus pneumoniae Morfología de las colonias y prueba de la catalasa Reconocimiento y caracterización preliminar de ios estreptococos y las bacterias “similares a Streptococcus Identificación presuntiva de estreptococos Sensibilidad a la bacitracina Sensibilidad a trimetoprim-sulfametoxazol Prueba CAMP y producción de pigmento Hidrólisis de hipurato de sodio Prueba de bilis esculina Prueba de tolerancia a la sal (caldo de NaCl al 6,5%) Prueba de la leucina aminopeptidasa (LAP) Prueba de la pirrolidonil arilamidasa (PYR)

Aglutinación del látex

Identificación serológica de Streptococcus pneumoniae Características bioquímicas para la identificación de estreptococos agrupables Identificación de estreptococos viridans Grupo Sanguis Grupo Mitis Grupo Mutans Grupo Salivarius Grupo Anginosus Grupo Bovis

Identificación de Streptococcus suis y otros estreptococos aislados en animales Identificación de especies de Enterococcus Identificación de especies de Abiotrophiay Granulicatella Identificación de especies de Aerococcusy Helcococcus Identificación de especies de Leuconostoc, Pediococcus y Tetragenococcus Identificación de especies de Gemella Identificación de especies de Vagococcus Identificación de especies de Alloiococcus, Globicatella, Facklamia, Dolosigranulum, Ignavigranum y Dolosicoccus Identificación de especies de Lactococcus Sistemas comerciales para la identificación de estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus seleccionadas

Sensibilidad a la optoquina

API Rapid Strep

Prueba de solubilidad en bilis

Sistema de identificación para grampositivos BBL Crystal

Pruebas comerciales de identificación presuntiva Identificación serológica de estreptococos (3-hemolíticos

Rapid ID 32 Strep RapID STR

Prueba de la precipitina capilar

Tarjeta de identificación para grampositivos Vitek (GPI)

Coaglutinación

Panel combinado de valor crítico para grampositivos de Microscan

os estreptococos, los enterococos y las bacterias simi­ lares a Streptococcus son bacterias grampositivas, catalasa negativas que tienden a crecer en pares y en cadenas. La detección de las enzimas citocromo con la prueba de catalasa distingue a los miembros de distintos grupos de es­ pecies de micrococos y estafilococos (catalasa positivos) de los estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Strepto­ c o c c u s que son catalasa negativos. Como sucede con otros grupos de microbios, la clasificación y la taxonomía de los estreptococos y las bacterias similares a Streptococcus han cambiado radicalmente con las descripciones de varios géneros nuevos de cocos catalasa negativos. Estos cambios tienen una importancia que excede lo académico para los microbiólogos clínicos ya que, a medida que se avanza en el siglo xxi, se aís­ lan cada vez con más frecuencia microorganismos pertenecien­ tes a estos grupos en infecciones humanas que antes eran infre­ cuentes y, aunque se investiga activamente, aún se desconoce el

L

potencial patogénico de las especies viejas y de las recién des­ critas. La aplicación de métodos taxonómicos moleculares y la des­ cripción de varios géneros nuevos de cocos grampositivos catalasa negativos han conducido a una reorganización compleja de la taxonomía de los estreptococos en comparación con la publi­ cada en la edición de 1984 del Manual de Bacteriología Siste­ mática de Bergey. En un principio se utilizaban los métodos moleculares como hibridación de DNA-DNA, hibridación de DNA-RNA ribosómico (rRNA) y secuenciación de rRNA de subunidades pequeñas (16S) para validar la división de la fami­ lia Streptococcaceae en los géneros Streptococcus, Entero­ coccus y Lactococcus, y no se los ha aplicado a los estreptoco­ cos viridans recientemente descritos, enterococos y otras cepas catalasa negativas para determinar sus relaciones con estos tres géneros.79-80’558 En la nueva edición del Manual de Bergey, los cocos grampositivos catalasa negativos de origen humano se

E s tre p to c o c o s p -h e m o lític o s del g ru p o A (Streptococcus pyogenes)

clasifican en seis familias en el orden propuesto “Lactoba. ízales" y una familia en el orden Bacillales; ambos están en la dase "Bacilos” en el filo Firmicutes (recuadro 13-1). El género Streptococcus, que contiene los patógenos humanos más importantes. puede ser dividido operacionalmente en siete grupos, como se muestra en el recuadro 13-2. Con la descripción de varios géneros y especies nuevas de :ocos grampositivos, catalasa negativos en la última década, se _:ebe agregar una nota en relación con los nombres bacterianos utilizados en este capítulo. En general, los taxonomistas Bacte­ rianos siguen las reglas para nombrar las bacterias como se describen en el Código Internacional de Nomenclatura bacte­ riana (International Code of Nomenclature of Bacteria), pero con el paso de los años algunos nombres de bacterias que apa­ recen en la bibliografía son gramaticalmente incorrectos en relación con el Código Internacional, como sucede con los nombres de las especies de uso común para cuatro estreptoco­ cos viridans -S. sanguis, S. crista, S. parasanguis y S. rattusque deben modificarse a S. sanguinis, S. cristatus, S. parasanguinis y S. ratti. Sin embargo, otra regla del Código Internacional establece que la libertad para “corregir” un nom­ bre bacteriano se debe utilizar con precaución y se debe reser­ var para evitar la confusión. Si bien se han propuesto estos cambios en la nomenclatura gramatical, otros autores reco­ mendaron la conservación de los nombres “gramaticalmente incorrectos” familiares más antiguos, conducta que se ha adop­ tado-'67'968 en este capítulo en gran parte para evitar confusiones.

Características generales de los estreptococos Los estreptococos son anaerobios facultativos, aunque algu­ nas cepas crecen mejor en condiciones anaerobias. Si bien casi todas las especies crecen en el aire, el crecimiento de la mayo­ ría de ellas es estimulado por un aumento del COr Los estrep­ tococos, los enterococos y los aerococos de importancia clínica son hom oferm entadores, lo que significa que el único pro­ ducto de la fermentación de la glucosa es el ácido láctico sin producción de gas. Los estreptococos también son catalasa negativos y oxidasa negativos, propiedad que, junto con la tin­ ción de Gram, diferencia los estreptococos de las especies de Neisseria. Los miembros del género Streptococcus crecen característicamente en cadenas (o cadenas de diplococos) cuando lo hacen en medios de caldo. Esta característica es compartida con los enterococos, los lactococos y algunos géne­ ros recién reconocidos o propuestos (especies de Leuconostoc, especies de Vagococcus y especies de Globicatella). Otras bac­ terias similares a Streptococcus (aerococos, especies de Alloiococcus, especies de Gemella, especies de Pediococcus,

R ecuadro 13-1

641

especies de Tetragenococcus y especies de Helcoccus) crecen como pares o tétradas en caldo. La disposición celular se eva­ lúa mejor mediante la tinción de Gram de un cultivo del micro­ organismo que crece en caldo de tioglicolato. Cuando se utili­ za este caldo se debe fijar el preparado del frotis en metanol después de la desecación por aire, en lugar de fijarse con calor, para evitr que las bacterias “desaparezcan” del portaobjetos durante el proceso de tinción. La composición de la pared celular de los estreptococos es similar a la de otras bacterias grampositivas, que están com­ puestas principalmente por peptidoglueano, en el cual están introducidos distintos hidratos de carbono, ácidos teicoicos, lipoproteínas y antígenos proteicos de superficie (véase cap. 5). Algunas especies de estreptococos pueden ser clasificadas desde el punto de vista serológico sobre la base de los antígenos de la superficie celular constituidos por hidratos de carbono. El trabajo pionero de Rebecca Lancefield estableció el sistema de grupos que lleva su nombre para los estreptococos P-hemolíticos.596 Los antígenos detectados en el sistema de grupos de Lancefield son polisacáridos de la pared celular (como en los estreptococos humanos grupos A, B, C, F y G) o son ácidos lipoteicoicos de la pared celular (estreptococos del grupo D y especies de Enterococcus). Al principio, estos antígenos de la pared celular eran extraídos con ácido hidroclórico o nitroso diluido, formamida o mediante tratamiento con autoclave, y se determinaron los grupos por las reacciones de las precipitinas capilares. Los sistemas comerciales para la determinación de grupos de estreptococos utilizan técnicas de extracción enzi­ mática y coaglutinación o aglutinación de partículas del látex para detectar antígenos. Otros estreptococos, sobre todo los miembros de los grupos de los estreptococos viridans no tienen ninguno de los antígenos de la pared celular que determinan los grupos de Lancefield, aunque algunas cepas pueden tener antí­ genos similares que darán reacciones cruzadas con anticuerpos específicos de grupos de estreptococos P-hemolíticos. Los estreptococos viridans bien estudiados, como el microorganis­ mo cariogénico S. mutans, han sido divididos en serotipos según los carbohidratos antigénicos de su propia pared celular. Más tarde, los distintos serotipos de S. mutans fueron elevados al estado de especie y comprenden ahora el “grupo mutans” de los estreptococos bucales.

Estreptococos ¡i-hemol¡ticos del grupo A (Streptococcus pyogenes) Factores de virulencia

Los estreptococos patógenos tienen varias características que contribuyen a su virulencia. Los mecanismos de virulencia

C la s ific a c ió n d e lo s e s tre p to c o c o s . E n te ro c o c o s y b a c te ria s “ s im ila re s a S tre p to c o c c u s ” d e l D o m in io B a c te ria , filo F irm ic u te s , c la s e “ B a c illi”

Orden

F am ilia

Género

Bacillales "Lactobacillales”

“Staphylococcaceae” "Lactobacillaceae” “Aerococcaceae” “Cam obacteriaceae” “Enterococcaceae" ■‘Leuconostocaceae” Streptococcaceae

Gemella Pediococcus Aerococcus. Abiotrophia, Dolosicoccus, Eremococcus. Facklamia. Globicatella, Ignavigranum Alloiococcus, Dolosigranulum Enterococcus, Melissococcus, Tetragenococcus, Vagococcus Leuconostoc, Oenococcus, Weissella Streptococcus, Lactococcus

642

C A P ÍT U L O 13

R ecuadro 1 3 -2

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “ sim ilares a Streptococcus"

G rupos de especies de estreptoco cos sobre la base del análisis de secuencia de rR NA de subunidades pequeñas

Grupo

Nombre del grupo

Miembros del grupo (grupols] de Lancefield)

Hábitats

I

Grupo piógeno

S. S. S. S. S.

pyogenes (estreptococos P-hemolíticos del grupo A) agalactiae (estreptococos P-hemolíticos del grupo B) equi subespecie equi (estreptococos P-hemolíticos del grupo C) equi subespecie zooepidemicus (estreptococos P-hemolíticos del grupo C) dvsgalactiae subespecie dystalactiae (estreptococos P-hemolíticos de los grupos C y L) S. dysgalactiae subespecie equisimilis (estreptococos P-hemolíticos de los grupos C y G) S. canis (estreptococos de los grupos G. L y M) S. iniae (designación de grupos distintos de Lancefield) S. porcinus (estreptococos grupos E, P, U y V) S. phocae (estreptococos grupos C, F o no agrupables) S. didelphis (sin grupo) S. urinalis (sin grupo)

Seres humanos Seres humanos Caballos, burros M uchos animales Cerdos, ganado bovino Seres humanos M uchos animales Delfines de agua dulce Cerdos, seres humanos Focas Zarigüeyas Seres humanos

II

Grupo Sanguis

S. S. S. S.

sanguis (S. sanguinis) (3 biotipos) parasanguis (S. parasanguinis) gordonii sinensis

Seres Seres Seres Seres

humanos humanos humanos humanos

III

Grupo Mitis

S. S. S. S. S. S. S.

mitis oralis crista (S. cri status) peroris infantis australis oligofermentans

Seres Seres Seres Seres Seres Seres Seres

humanos humanos humanos humanos humanos humanos humanos

IV

Grupo Mutans

S. mutans S. sobrinus S. cricetus S. downei S. rattus (S. ratti i S. macacae S. feru s

Seres humanos Seres humanos Hám sters, ratas (seres hum anos) Monos Ratas, seres humanos Monos Ratas

V

Grupo Salivarius

S. S. S. S. S.

Seres humanos Seres humanos Seres humanos Productos lácteos Hembras porcinas

VI

Grupo Anginosus

S. constellatus, subespecies S. anginosus S. intermedius

Seres humanos Seres humanos Seres humanos

VII

Grupo Bovis

S. S. S. S. S. S. S. S.

bovis/S. equinus gallolyticus subespecie gallolyticus (5. bovis I) gallolyticus subespecie pasteurianus (S. bovis II.2) ("S. pasteurianus") gallolyticus subespecie macedonicus (S. macedonicus. S. waius) infantarius subespecie infantarius (S. bovis II. 1) infantarius subespecie coli (“S. lutetiensis") alactolyticus suis (grupos R. S, T)

Ganado bovino, caballos Seres hum anos, ganado bovino, koalas, osos Seres humanos Am biental (quesos) Seres hum anos, ganado bovino Seres humanos Cerdos, perros, pollos Cerdos, ganado bovino, seres humanos

Otros

S. S. S. S. S. S. S. S. S. S.

uberis/parauberis (Grupo E o no agrupable) hyointestinalis hyovaginalis thoraltensis pluranim alium uberis/parauberis (Grupo E o no agrupable) enrericus ovis gallinaceus m inor

Ganado bovino Cerdos Cerdos Cerdos Ganado bovino, ovejas, gatos, canarios Ganado bovino Ganado bovino Ovejas Pollos Perros, gatos, ganado bovino

salivarius vestibularis infantarius thermophilus hyointestinalis

E s tre p to c o c o s (3-hem olíticos del g ru p o A (Streptococcus pyogenes)

de los estreptococos (3-hemolíticos del grupo A (S. pyogenes), en particular, han sido estudiados en forma extensa. Este microorganismo sigue siendo un patógeno humano extremada­ mente importante cuyos únicos reservorios conocidos en la naturaleza son la piel y las mucosas de los seres humanos. En los Estados Unidos, las infecciones por estreptococos del grupo A ocurren con una tasa anual de unos 3,5 casos por 100 000 habitantes, lo que conduce a más de 9 600 casos y 1 100 a 1 300 muertes por año.734 Además de las infecciones agudas, los estreptococos del grupo A se han asociado con dos secuelas no supuradas -fiebre reumática aguda y glomerulonefritis posestreptocócica aguda- que siguen ocurriendo, sobre todo en los países en vías de desarrollo. La pared celular de los estreptococos p-hemolíticos del grupo A consiste en un peptidoglueano grueso junto con ácidos lipoteicoicos integrales y otras moléculas asociadas con la superficie, como se describe en el capítulo 5. Se cree que los ácidos lipoteicoicos integrales desempeñan un papel central en la promoción de la adherencia inicial de estos estreptococos a las células epiteliales faríngeas.66,737 Además de los ácidos lipo­ teicoicos integrales, se describieron otras varias adhesinas de los estreptococos del grupo A, diversas proteínas que fijan fibronectina, como la proteína F l (Sfbl, proteína fijadora de fi­ bronectina de los estreptococos), y las proteínas F2 (SbflI), FPB54 y pFBP.239-459-529’588-817 Estas últimas promueven la adhe­ rencia tanto al tipo celular faríngeo como cutáneo. También se cree que las proteínas M desempeñan un papel en la adheren­ cia. sobre todo a los queratinocitos en la piel a través de la inte­ racción con el cofactor de la membrana de los queratinocitos CD46.739 El principal antígeno de la pared celular del grupo A es un polisacárido complejo que consiste en L-ramnosa y Nacetil- D-glucosamina en una relación 2:l .100 El antígeno está unido de forma covalente al peptidoglueano. El papel del antí­ geno de grupo de la pared celular como factor de virulencia se desconoce, aunque el material peptidoglueano propiamente dicho tiene actividad biológica, que incluye la inducción de fie­ bre. necrosis dérmica y cardíaca en animales, lisis de eritroci­ tos y plaquetas, y aumento de la resistencia inespecífica. Algunas cepas del grupo A tienen una cápsula de ácido hialurónico, un polímero lineal de alto peso molecular compuesto por unidades repetidas de disacáridos con uniones p( 1-4) de ácido D-glucurónico y (l-3)-P- D-A^-acetilglucosamina.1038 Este material es el producto de enzimas codificadas por un grupo de tres genes que consiste en hasA, hasB y hasC.ul Estos tres genes codifican una ácido hialurónico sintasa, una UDP-glucosa deshidrogenasa y una glucosa pirofosforilasa, respectiva­ mente,17 y se encuentran altamente conservados entre las cepas de estreptococos del grupo A. Es probable que las variaciones en el grado de expresión de los genes capsulares reflejen dife­ rencias en la regulación de la transcripción genética. Las cepas que tienen una expresión máxima de estos genes parecen mucoides cuando crecen en agar sangre de carnero.1041 Dos productos genéticos, CrsS y C rsR , parecen funcionar como un sistema regulador de dos componentes que es capaz de aumen­ tar o de disminuir el grado de encapsulación mediante una regulación positiva o negativa de la expresión del gen has.621 Desde el punto de vista químico, este material capsular es indistinguible de la sustancia fundamental del tejido conectivo, lo que puede explicar la falta de inmunogenicidad de esta sus­ tancia en el huésped infectado. In vitro, la producción de la cápsula es máxima durante el crecimiento logarítmico y los microorganismos eliminan sus cápsulas a medida que entran en la fase estacionaria de crecimiento; es probable que esta pérdi­ da se deba a la elaboración de hialuronidasa durante las últi­

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mas etapas de la fase de crecimiento logarítmico. La cápsula de ácido hialurónico funciona para ayudar a los microorganismos a resistir la destrucción de las células fagocíticas dependiente del complemento. En modelos animales, se ha demostrado que la cápsula de ácido hialurónico contribuye a la capacidad de los estreptococos del grupo A para causar infecciones invasoras de los tejidos blandos,40 así como para adherirse a las células epi­ teliales al modular la interacción de la proteína M y otras molé­ culas de superficie y servir como ligando al unirse al receptor CD44 sobre las superficies de las células epiteliales.8M1038 El principal factor de virulencia de Streptococcus del grupo A es un antígeno de la superficie celular designado proteína M .100 Las proteínas M, proteínas fibrilares estables al ácido, termoestables y lábiles a la tripsina asociadas con la superficie externa de la pared celular, están compuestas por dos cadenas polipeptídicas que forman un complejo entre ellas en una con­ figuración de hélices a enrolladas entre sí.363 La proteína M está unida a la membrana celular, se extiende a través de la ca­ pa de peptidoglueano y se proyecta desde la superficie de la célula bacteriana (fig. 13-1).774 La secuencia de aminoácidos y la estructura del extremo carboxilo terminal de la molécula se disponen dentro de la membrana celular y la pared celular del microorganismo y casi no presentan variaciones entre las cepas del grupo A. El extremo N se extiende más allá de la superficie celular y termina con una secuencia de unos 11 resi­ duos aminoácidos. Esta secuencia terminal varía entre las cepas clínicas y constituye la base para la clasificación seroló­ gica de Lancefield de los estreptococos del grupo A. Las cepas que son ricas en proteína M son resistentes a la fagocitosis y la destrucción intracelular por los leucocitos polimorfonuclea­ res; las células que carecen de proteína M demostrable son fácilmente fagocitadas y destruidas.597 Al parecer la proteína M ejerce sus efectos antifagocíticos interfiriendo en la opsonización de las células bacterianas a través de la vía alternativa del complemento.95 Las proteínas M también pueden formar complejos con fibrinógeno que luego se unen a integrinas (L de los neutrófilos. Esta unión produce la liberación de media­ dores inflamatorios que inducen pérdida vascular, un compo­ nente patológico del shock tóxico estreptocócico.481 La tipifi­ cación serológica de M suele realizarse en extractos ácidos calientes de estreptococos del grupo A que utilizan técnicas de inmunodifusión en precipitinas capilares o gel de agarosa. Las cepas del grupo A expresan sólo un único antígeno tipo M y se han identificado 93 serotipos M diferentes utilizando estos métodos.334,543 Lamentablemente, muchas de estas cepas no son tipificables desde el punto de vista serológico; no existe el antisuero M apropiado o es posible que la proteína M de una cepa dada no se exprese en forma óptima en las condiciones de cultivo.809 También se han identificado los genes que codi­ fican distintas proteínas utilizando sondas de oligonucleótidos que corresponden a las secuencias NH^-terminales de tipos M específicos.555 Estas sondas pudieron hibridarse con DNA genómico de cepas de estreptococos del grupo A obtenido por inmunotransferencia en puntos (dot blot) e identificar varios tipos M con mayor facilidad que los procedimientos de tipifi­ cación M serológicos convencionales. Además de la proteína M, algunos estreptococos tienen otras proteínas “similares a M” (p. ej., la proteína Spa de los estreptococos del grupo A tipo M 18) que se ha demostrado que contribuyen a la viru­ lencia y la aumentan.678 La clonación del gen de la proteína M, denominado gen emm, ha conducido a la expansión y la estandarización de la tipificación emm para reemplazar el método serológico con­ vencional. El sistema de tipificación emm se realiza median­

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C A P ÍT U L O 13

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “sim ilares a Streptococcus"

Fim brias M em brana celular Peptidoglucano m uram íllco

P olisacárido grupo A A cido lipoteicolco M olécula am pliada de la proteína M específica de tipo

A ntígenos M, T, R Á cido hialurónlco

Figura 13-1 Principales determ inantes antigénicos conocidos sobre la superficie de los estreptococos del grupo A encapsulados virulentos.

te el análisis de las secuencias de los residuos de nucleótidos NH^-terminales y ha conducido a la identificación de más de 124 genotipos emm reconocidos.340,848 La definición de una nueva secuencia de tipo emm se basa sobre la identificación de más de 160 bases de nucleótidos en el término 5 ’ de la región hipervariable. Los diferentes tipos emm tendrán una homología de secuencia inferior al 80% con otros tipos emm.67334 El análisis de la secuencia de aminoácidos de las proteínas M de muchos tipos también ha identificado porcio­ nes de la molécula de la proteína M que son comunes entre varios tipos de proteína M; es decir, esta secuencia de amino­ ácidos está altamente conservada.791 Los sueros de individuos que viven en diferentes regiones geográficas con tasas eleva­ das de infección estreptocócica reaccionaron con este péptido M conservado en un inmunoanálisis de adsorción enzimática (ELISA). Además, los anticuerpos dirigidos contra este pép­ tido pudieron opsonizar los estreptococos pertenecientes a distintos tipos M. Esta porción altamente conservada de la molécula de la proteína M es investigada mejor como posible antígeno para la vacuna contra la infección por estreptococos del grupo A y la fiebre reumática. Otras diversas proteínas de la superficie celular relacionadas con la proteína M han sido identificadas en los estreptococos del grupo A y los genes que codifican estas moléculas (p. ej., enn, mrp, arp, fcrA, protH) han sido agrupados como miembros de la superfamilia de genes emm.539 Al parecer, estas moléculas funcionan junto con las proteínas M para ayudar a los microorganismos a resistir la fagocitosis. Estas moléculas similares a las proteí­ nas M también pueden unirse a varias proteínas del huésped como plasminógeno y fibrinógeno y, a través de esta interac­ ción, ejercen además efectos antiopsónicos. Las secuencias de los tipos emm reconocidos pueden hallarse en línea en http://www.cdc.gov/nci-dod/biotech/infotech_hp.html. El factor de opacidad (O F) describe otro antígeno de la superficie celular asociado con la proteína M de los estrepto­ cocos del grupo A que es un factor de virulencia posible.806 OF es una a-lipoproteinasa capaz de opacificar (volver opaco) los medios que contienen suero de mamífero.543 Los anticuerpos dirigidos contra OF son específicos al inhibir la reacción de

opacidad del tipo M que la produce, de modo que se puede uti­ lizar la opacificación OF como reacción de tipificación suple­ mentaria o complementaria. OF es producida por cepas que pertenecen a 29 tipos M diferentes y puede detectarse en aque­ llos tipos M incluso cuando la reactividad específica del tipo M se pierde o es indetectable (la presencia de OF sólo se asocia con tipos M específicos). Por lo tanto, las reacciones OF posi­ tivas y OF negativas se asocian en forma constante con los tipos M específicos. OF se asocia principalmente con cepas de estreptococos del grupo A aisladas en infecciones de la piel.91 Los estreptococos del grupo A también pueden tener antígenos T y R. Los antígenos T son antígenos estables al ácido y termoestables que pueden estar limitados a un único tipo M o pue­ den ser compartidos por varios tipos M diferentes.100 Ni el antí­ geno T ni el antígeno R se asocian con virulencia y pocas veces se los utiliza en los sistemas de tipificación actuales desde la descripción de la tipificación emm y OF. Además de estos métodos serológicos, los estreptococos del grupo A pueden ser tipificados mediante biotipificación fenotípica con sistemas de identificación comerciales, electroforesis de enzimas multilocus, polimorfismos de longitud de los fragmentos de restric­ ción (RFLP), RFLP de genes rRNA (ribotipificación) y análi­ sis de DNA polimorfo amplificado aleatorio.124J33-440-713'877 Los estreptococos del grupo A producen dos hemolisinas: estreptolisina A y estreptolisina S. La estreptolisina O (SLO) es lábil al oxígeno, es antigénica, es inhibida por el colesterol y es tóxica para distintos tipos celulares, entre ellos leucocitos, monocitos y células en cultivo. Debido a su labilidad al oxíge­ no, SLO es principalmente responsable de la (^-hemolisis que se observa alrededor de las colonias de la subsuperficie de los estreptococos del grupo A en las placas donde se vierten o en las regiones de corte de las placas de agar sangre de carnero con inoculación en superficie. También es producida por algu­ nos estreptococos de los grupos C y G. Parece existir en dos formas activas, con pesos moleculares entre 50 y 70 kDA; la escisión de estas moléculas durante la secreción produce la forma completamente activa de SLO que tiene un peso mole­ cular de unos 57 kDa.93 SLO produce la formación de poros en la membrana de las células sensibles mediante la fijación ini­

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cial de los monómeros de SLO al colesterol de la membrana celular. Esta unión conduce a un cambio en la conformación de la molécula que produce la congregación de otros monómeros de SLO sobre la membrana.876 Estos agregados forman al prin­ cipio estructuras con aspecto de arco sobre la membrana que por último se convierten en poros completamente formados, lo que conduce a la lisis osmótica de la célula afectada. La SLO también induce la desgranulación y la lisis de leucocitos poli­ morfonucleares, inhibe la fagocitosis por los macrófagos y deteriora la respuesta de los linfocitos a los mitógenos; además puede estimular la producción de citocinas.447 La medición de los anticuerpos contra estreptolisina O (títulos antiestreptolisina O [ASO]) en suero es útil para el diagnóstico retrospectivo de infecciones estreptocócicas faríngeas recientes. La respues­ ta de ASO luego de las infecciones cutáneas es mala, debido tal vez a la inactivación del antígeno por el colesterol presente en la piel. En estos casos, los títulos anti-DNasaB son más confia­ bles (véase la explicación más adelante). La estreptolisina S (SLS) es estable al oxígeno, no antigé­ nica y, al igual que SLO, es tóxica para distintos tipos celula­ res. Existe en la forma extracelular ligada a la superficie celu­ lar y en la forma intracelular, y suele estar asociada con algún tipo de molécula transportadora, como albúmina en suero, RNA o a-lipoproteína. SLS. una molécula pequeña que tiene un peso molecular de unos 1 800 daltons, es producida en can­ tidades máximas durante las fases logarítmica tardía y esta­ cionaria temprana de crecimiento, y requiere hierro para una producción máxima.19'439 Se piensa que interactúa con los fosfolípidos de la membrana para ejercer sus efectos tóxicos. Los eritrocitos expuestos a SLS sufren edema, seguido de lisis debi­ da a la interrupción de la barrera osmótica y la pérdida de iones desde la célula.19 Al contrario de SLO, no se observan hendi­ duras ni poros sobre las membranas de las células eritrocíticas afectadas mediante microscopía electrónica. SLS es activa tanto en la hemolisis de superficie como de subsuperficie cuan­ do los microorganismos crecen en agar sangre de camero. La actividad hemolítica de SLS es inhibida por las lipoproteínas en suero y otros fosfolípidos simples. Al igual que SLO, SLS puede dañar las membranas de las células PMN, las plaquetas y los orgánulos subcelulares internos. Los estreptococos del grupo A también producen varios pro­ ductos extracelulares; muchos de éstos desempeñan un papel real o teórico en su virulencia. Las exotoxinas pirógenas estreptocócicas (SPE) (sobre todo SPE A y SPE B) son res­ ponsables de la erupción de la escarlatina y también de los principales factores de virulencia en la patogenia del síndrome similar al shock tóxico estreptocócico. Se describieron tres SPE inmunológicamente distintas, designadas SPE tipos A, B y C. y se han identificado y caracterizado los genes que las codifican.417-418'468'729,1033 Los genes para las exotoxinas piróge­ nas estreptocócicas A y C (speA y speC) son codificados sobre un bacteriófago lisogénico estreptocócico, mientras que el gen para la exotoxina tipo B (speB) es cromosómico. El gen speB se encuentra en todos los estreptococos del grupo A, mientras que los otros dos genes pueden estar presentes o no. SPE B, el producto del gen speB, es en realidad una enzima cisteína pro­ teasa capaz de escindir la inmunoglobulina humana, la fibro­ nectina. la vitronectina y otras proteínas de las células huéspe­ des. lo que conduce a la formación de péptidos pequeños y bio­ lógicamente activos, que incluyen interleucina-1, histamina y cininas.480 1026 Las exotoxinas pirógenas como SPE A y SPE C no sólo inducen fiebre, como su nombre lo indica, sino que también funcionan como superantígenos. Los superantígenos son moléculas capaces de inducir proliferación de los linfoci­

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tos T del huésped, independientemente de su especificidad antigénica, al unirse a las moléculas de clase II del complejo de histocompatibilidad mayor (CMH).630-790 La activación de las células T por superantígenos conduce a la liberación masiva de distintas citocinas por los monocitos y los linfocitos humanos, que incluyen factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), interleuqcina 1(3 y mediadores de las células T, como interleucina-2 e interferón-y.447,448 Estas citocinas activan las cascadas del com­ plemento, de la coagulación y fibrinolítica y producen pérdida desde los capilares con el resultado de hipotensión y shock, las manifestaciones más graves del síndrome del shock tóxico estreptocócico. Estos superantígenos también potencian la res­ puesta del huésped a pequeñas cantidades de endotoxina de gramnegativos por un factor mayor de 100 000 veces y tienen efectos tóxicos directos sobre las células endoteliales que revis­ ten los capilares. Las exotoxinas pirógenas estreptocócicas tie­ nen pesos moleculares de 25 a 28 kDa y contienen sitios de unión a los receptores de las células T y de unión a las molé­ culas de clase II del CMH, más un sitio de unión al cinc que funciona mediando la unión de las moléculas de clase II a la exotoxina. Además de SPE A, B y C, se han identificado a par­ tir de estudios de secuenciación de distintas cepas de estrepto­ cocos del grupo A otras exotoxinas pirógenas (p. ej., SSA [superantígeno estreptocócico], SPE D, SPE F MF [factor mitogénico], SMEZ-1, SMEZ-2, SpeG-SpeL) y sus loci gené­ ticos (p. ej., speG, speH, speJ).mj30-1S9-S02-m -9S2 La producción de estos superantígenos varía entre las cepas de estreptococos que pertenecen a diferentes tipos M o emm. Además de los estreptococos del grupo A, distintos genes de los superantíge­ nos estreptocócicos (p. ej., ssa, speM, smeZ) se encuentran en algunos estreptococos p-hemolíticos de los grupos C y G (S. dysgalactiae subespecie equisimilis y S. canis).509 Los estreptococos p-hemolíticos del grupo A también pro­ ducen otros distintos productos que contribuyen a la virulencia. Como se mencionó, SPE B es en realidad una C5a peptidasa que está unida a la superficie celular. Se piensa que esta molé­ cula contribuye a la enfermedad debido en gran parte a su acti­ vidad de peptidasa más que como superantígeno funcionante. La C5a peptidasa escinde e inactiva C5a, el componente quimiotáctico del complemento, lo que conduce a la limitación del reclutamiento y la quimiotaxis de los leucocitos polimorfonu­ cleares.736 Estos microorganismos también producen cuatro desoxirribonucleasas inmunológica y electroforéticamente diferentes, designadas DNasa A, B, C y D. Los anticuerpos contra la DNasa B (anti-DNasa B) son útiles, junto con los títu­ los de ASO, para la documentación serológica de infecciones faríngeas o cutáneas previas por estreptococos del grupo A. La hialuronidasa producida por estreptococos del grupo A despolimeriza la sustancia fundamental del tejido conectivo, lo que conduce a la propagación por contigüidad del microorganis­ mo. Las estreptocinasas producidas por estos estreptococos hidrolizan los coágulos de fibrina y pueden funcionar en la virulencia al evitar la formación de las barreras de fibrina en la periferia de las lesiones estreptocócicas que se propagan. La contribución de estas enzimas y toxinas a la infección es incierta. Muchos de estos factores son producidos también por otros estreptococos P-hemolíticos. Las cepas de Streptococcus grupo A M -1 y algunos otros tipos M producen una proteína denominada SIC que inhibe al complemento al quedar incor­ porada en el complejo de ataque de membrana del comple­ mento (C5b-C9), inhibiendo así la lisis de la célula diana.14 Se puede utilizar el polimorfismo en el gen sic para caracterizar las cepas M-l que pueden estar ligadas desde el punto del vista epidemiológico.486

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Importancia clínica

Los seres humanos constituyen el reservorio natural de los estreptococos p-hemolíticos del grupo A, y el microorganismo es transmitido de una persona a otra por la vía respiratoria. La infección más frecuente causada por estos estreptococos es la faringitis estreptocócica. La mayoría de los casos de faringitis se observan en niños de edad escolar (5 a 15 años) durante el invierno o la primavera. Luego de un período de incubación ini­ cial de 2 a 4 días, el inicio suele ser súbito, con fiebre, odinofa­ gia, cefalea, malestar general y dolor abdominal. La porción posterior de la faringe suele estar inflamada y tumefacta, y se puede presentar un exudado blanco grisáceo sobre las amígda­ las. Los ganglios linfáticos cervicales anteriores habitualmente son dolorosos a la palpación y están tumefactos. La presencia de rinorrea, disfonía, tos o diarrea habla en contra de una infección por estreptococos del grupo A: en cambio sugiere una etiología viral o por micoplasmas.98-890 La infección por cepas que elabo­ ran las exotoxinas pirógenas A, B o C también puede producir una erupción escarlatiniforme (escarlatina clásica). Las compli­ caciones de la faringitis por estreptococos del grupo A pueden ser supuradas (absceso periamigdalino, absceso retrofaríngeo, adenitis cervical supurada, otitis media, sinusitis, mastoiditis, baeteriemia), no supuradas (fiebre reumática aguda y crónica, glomerulonefritis) o mediadas por toxinas (síndrome similar al shock tóxico estreptocócico).889-890 En ausencia de complicacio­ nes, la faringitis estreptocócica es autolimitada. Sin embargo, casi siempre se la trata (en condiciones ideales, cultivo seguido de tratamiento antibiótico). Alrededor del 15% de los individuos con faringitis estreptocócica pueden convertirse en portadores asintomáticos de los microorganismos luego del tratamiento.100 En la actualidad, las recomendaciones para el tratamiento de la faringitis estreptocócica son penicilina V por vía oral (niños, 250 mg dos o tres veces por día; adolescentes y adultos, 250 mg tres o cuatro veces por día; adolescentes y adultos, 500 mg dos veces por día) durante 10 días, o penicilina G benzatínica intra­ muscular (600 000 a 1,2 millones de unidades).98 La eritromici­ na (dosificación dependiente de la fórmula utilizada) es una alternativa apropiada para los pacientes alérgicos a la penicilina. Aunque se ha comunicado una resistencia importante a los macrólidos entre los estreptococos del grupo A en varios países (p. ej., Australia, Finlandia, Canadá, Hawai, Japón, Italia, Finlandia, Grecia, Filipinas, Suecia), se ha demostrado que menos del 5% de las cepas son resistentes a la eritromicin a _231,235.531,549,552.878,879,1035,1089

Los

e S tre p tO C O C O S

p -h e iT lO lítiC O S

del grupo A siguen siendo altamente sensibles a la penicilina G. En los pacientes que están infectados por estreptococos del grupo A resistentes a la eritromicina y que no pueden tolerar los agentes p-lactámicos, también se puede utilizar clindamicina.98 Además de la faringitis, los estreptococos P-hemolíticos del grupo A causan distintas infecciones cutáneas superficiales, entre ellas impétigo, erisipela, celulitis, sepsis puerperal e infecciones posparto. El im pétigo suele ocurrir en niños de 5 a 15 años y se caracteriza por la aparición de lesiones vesicula­ res que evolucionan a pústulas,132 las cuales se abren en los 5 a 7 días siguientes para formar costras gruesas. En general, las lesiones de impétigo están sobre los miembros inferiores y también pueden involucrar otros patógenos, como Staphylo­ coccus aureus. Como mencionamos, la infección cutánea por cepas de estreptococos del grupo A nefritogénicas puede dar origen a una glomerulonefritis posestreptocócica (véase más adelante). La erisipela es una infección aguda asociada con la afectación de los tejidos blandos y los linfáticos cutáneos y conduce a evidencia sistémica de infección, que incluye fiebre.

Las lesiones se presentan como áreas de edema y eritema que se propagan con rapidez, tienen un margen elevado y bien demarcado, se localizan casi siempre sobre el rostro y los pacientes suelen tener faringitis estreptocócica asociada (véase lámina en color 13-1 A).113 La celulitis es muchas veces el resultado de una infección estreptocócica de lesiones previas, como heridas, quemaduras o incisiones quirúrgicas. Esta infec­ ción se presenta como un proceso inflamatorio que se propaga y puede afectar grandes áreas de la piel y los tejidos subcutá­ neos, junto con fiebre, escalofríos, linfangitis y, en ocasiones, baeteriemia, y suele observarse en los consumidores de drogas intravenosas.313 La sepsis puerperal se observa en las mujeres luego de un parto o un aborto. Los microorganismos que colo­ nizan el aparato genital o que provienen del personal obstétri­ co invaden los genitales internos y causan endometritis, linfan­ gitis, baeteriemia, fascitis necrosante y síndrome del shock tóxico estreptocócico.56,406 La infección genital puede compli­ carse con celulitis pelviana, peritonitis y formación de absce­ sos. También se observó la transmisión intraparto de estrepto­ cocos del grupo A, lo que conduce a una enfermedad grave y a menudo mortal en el neonato.753 La afectación perinatal produ­ ce mortinatos, septicemia, ictericia y celulitis. En el tratamiento de la faringitis por estreptococos del grupo A es importante considerar las complicaciones “no supurati­ vas” y bien estudiadas de las infecciones por estreptococos del grupo A, es decir, la fiebre reumática aguda y la glomerulonefritis.96-655-932 La fiebre reum ática aguda se asocia con una faringitis previa por estreptococos del grupo A, mientras que la glomerulonefritis se relaciona con una infección faríngea o cutánea previa por el microorganismo. La fiebre reumática aguda es una colagenopatía multisistémica tardía caracterizada por las manifestaciones mayores de carditis, poliartritis, nodu­ los subcutáneos, eritema marginado y corea, que comienza 2 a 5 semanas después de la faringitis estreptocócica.96 Las infec­ ciones cutáneas por estreptococos del grupo A no desencade­ nan fiebre reumática aguda. En general, la patología cardíaca afecta el endocardio, el miocardio, el pericardio y, más a menu­ do, la válvula mitral; se manifiesta clínicamente como soplos cardíacos característicos, cardiomegalia, insuficiencia cardíaca congestiva o, pocas veces, paro cardíaco intratable y muerte. En general, la artritis es migratoria, afecta múltiples articula­ ciones (sobre todo rodillas, codos, tobillos y muñecas) y se resuelve en forma espontánea. Aparecen nodulos subcutáneos firmes e indoloros al mismo tiempo que la carditis y suelen hallarse sobre las extremidades cerca de áreas óseas de los pies y las manos. Las lesiones del eritema marginado son erupcio­ nes eritematosas con bordes rojos, elevados y serpinginosos y áreas centrales de resolución que suelen aparecer sobre el tron­ co, los brazos y las piernas. La corea es una manifestación neurológica caracterizada por espasmos musculares, incoordina­ ción y debilidad muscular que aparecen durante la fiebre reu­ mática aguda o después de varios meses. En general, las mani­ festaciones agudas de la fiebre reumática duran 3 a 6 meses. El diagnóstico diferencial es amplio debido a las manifestaciones proteiformes del síndrome e incluye artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, drepanocitosis, rubéola, artritis séptica, infección gonocócica diseminada, enfermedad de Lyme, endo­ carditis bacteriana y miocarditis. Los hallazgos de laboratorio son eritrosedimentación elevada, proteína C reactiva elevada y detección de una infección estreptocócica previa, demostrada por un cultivo de fauces positivo o una prueba directa de antí­ genos positiva para estreptococos del grupo A o por los títulos elevados o crecientes de anticuerpos antiestreptocócicos (p. ej., ASO, anti-DNasaB, antihialuronidasa).248 Una única prueba de

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anticuerpos antiestreptocócicos positiva no es diagnóstica de fiebre reumática aguda, de modo que se recomienda realizar las tres pruebas de anticuerpos específicos si hay alta sospecha de enfermedad. El tratamiento consiste en analgésicos, salicilatos y corticosteroides para la fiebre y la inflamación y las medidas correspondientes para evitar la insuficiencia cardíaca.96 La glom erulonefritis aguda es una enfermedad inflamato­ ria del glomérulo renal que se asocia con lesiones glomerulares difusas, hipertensión, hematuria y proteinuria.96 Las técnicas de inmunofluorescencia permiten comprobar que las lesiones glo­ merulares contienen depósitos de componentes del comple­ mento (sobre todo C3), properdina e inmunoglobulinas.599,683 Si bien la aparición de la fiebre reumática puede darse 1 a 5 sema­ nas después de la faringitis estreptocócica, la instalación de una glomerulonefritis puede ocurrir tan sólo 10 días después de la faringitis o después de 3 a 6 semanas de las infecciones cutá­ neas.31 Clínicamente, la enfermedad se caracteriza por malestar general, debilidad, anorexia, cefalea, edema y congestión cir­ culatoria, según lo demuestran la hipertensión y la encefalopa­ tía. Los hallazgos de laboratorio son anemia, eritrosedimentación elevada, disminución de C3 y del complemento total, hematuria y proteinuria. El análisis de orina muestra eritroci­ tos, leucocitos y cilindros. En general, se puede demostrar el antecedente de una infección por estreptococos del grupo A por el aislamiento de los microorganismos de las fauces o las lesio­ nes de la piel o por la elevación de los anticuerpos antiestrep­ tocócicos. Las respuestas de ASO luego de las infecciones cutáneas estreptocócicas no están fiablemente elevadas, y se deben realizar títulos para anticuerpos anti-DNasaB y anti-hialuronidasa.96 Se han propuesto varias teorías vinculadas con el mecanis­ mo por el cual los estreptococos del grupo A inducen fiebre reumática aguda y glomerulonefritis.44,491 La más sostenible es la de que los estreptococos inducen la formación de anticuer­ pos antiestreptocócicos contra los antígenos capsular (ácido hialurónico), de la pared celular (antihidratos de carbono de grupo, anti-M y otras proteínas asociadas) y de la membrana celular que dan reacciones cruzadas con distintas porciones antigénicas en el tejido cardíaco miocárdico, endocárdico y valvular, el sarcolema miocárdico, el músculo esquelético y las articulaciones. Estos estreptococos vanan en sus capacidades de desencadenar fiebre reumática aguda o glomerulonefritis aguda, y se han identificado ahora ciertos tipos estreptocócicos M como “reumatógenos” o “nefritógenos”. Las cepas de estreptococos P-hemolíticos del grupo A responsables de la fie­ bre reumática aguda suelen ser ricas en proteína M, muestran una morfología mucoide de las colonias debido a una encapsulación importante, suelen ser OF negativas y se asocian funda­ mentalmente con infecciones faríngeas. Estas cepas también evocan una fuerte respuesta inmunitaria específica de tipo. Se ha mostrado que los tipos M de estreptococos del grupo A, que abarcan los tipos M l, M3, M5, M16. M18, M19, M24 y algu­ nos otros son “reumatógenos”.931,932 Se ha demostrado que los epítopos antigénicos de algunos de estos tipos M comparten determinantes de antigenicidad con el músculo cardíaco, las proteínas de la membrana del sarcolema y las membranas sinoviales 46,249,250,267 Otros investigadores han demostrado reaccio­ nes inmunitarias similares entre el antígeno polisacárido de los estreptococos del grupo A y ciertas glucoproteínas de las vál­ vulas cardíacas, entre el ácido hialurónico de los estreptococos (el material capsular) y el ácido hialurónico humano, y entre las membranas de las células estreptocócicas y los núcleos neuronales caudado y subtalámico en el sistema nervioso central humano.360,409,503,870 Lo último puede explicar el papel de la

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infección estreptocócica precedente en el compromiso neurológico de la fiebre reumática aguda. Asimismo, se han identifi­ cado cepas “nefritógenas” de estreptococos del grupo A que pertenecen a ciertos tipos M. Los tipos M M2, M49, M55, M57, M59. M60 y M 61 se han asociado con glomerulonefritis luego de infecciones cutáneas, mientras que los tipos M l, M4, M12 y M25 están implicados más a menudo luego de infeccio­ nes faríngeas. Aunque se han demostrado reacciones cruzadas entre cepas estreptocócicas nefritógenas y tejidos renales, en realidad las anomalías anatomopatológicas pueden deberse al depósito de inmunocomplejos preformados que contienen antí­ genos estreptocócicos y anticuerpos del huésped en los tejidos glomerulares o a la unión renal de productos estreptocócicos seguida del depósito de anticuerpos para crear inmunocomplej o s 101,416,491,972,996

Desde finales de la Segunda Guerra Mundial, la incidencia de faringitis estreptocócica en los Estados Unidos y Europa Occidental se ha mantenido bastante estable, mientras que la de fiebre reumática aguda y glomerulonefritis aguda posestreptocócica ha disminuido en forma espectacular.794 Sin embargo, a mediados de la década de 1980 se comunicaron "brotes” de fiebre reumática en Salt Lake City, Colorado, California, Pensilvania, Carolina del Norte, Tennessee, Missouri, West Virginia, Texas, Ohio y Nueva York.141,164,165,438,616,666,1004,1023,1044,1045 En estos brotes, muchos individuos no recordaban haber tenido una infección estrepto­ cócica. En tales casos y para el diagnóstico de secuelas no supuradas, se deben realizar estudios serológicos (anticuerpos séricos contra la estreptolisina O, anticuerpos séricos contra la DNasa B. anticuerpos séricos antihialuronidasa) para la docu­ mentación retrospectiva de las infecciones previas por estrep­ tococos del grupo A. Entre las cepas aisladas en los pacientes que tenían cultivos faríngeos positivos durante estos distintos brotes, se observó que muchas eran cepas mucoides pertene­ cientes a los tipos M 1, 3, 5, 6 y 18; estas cepas habían sido aisladas con escasa frecuencia desde antes de 1985. Poco después de la publicación de estos informes de fiebre reumática resurgente causada por los serotipos M reumatóge­ nos reconocidos, se comunicaron varias infecciones invasoras graves por estreptococos del grupo A asociadas con un síndro­ me similar al shock tóxico en centros médicos de Europa y los Estados Unidos.62,136,176,183,230,369 En una de las comunicaciones iniciales, Stevens y cois, informaron sobre 20 pacientes de la región de las Montañas Rocosas que presentaron distintos tipos de infecciones de tejidos blandos por estos estreptococos (faringitis, celulitis, tromboflebitis supurada, peritonitis, fascitis necrosante, miometritis posparto, infección localizada de heridas) y que siguieron desarrollando otros síntomas similares a los hallados en pacientes con síndrome del shock tóxico estafilocócico clásico.924,928 Estas características clínicas incluían hipotensión, disfunción renal, hipoalbuminuria, trombocitopenia, hipocalcemia e insuficiencia respiratoria. Todos los pacientes tenían cultivos positivos para estreptococos del grupo A, incluidos 12 enfermos con hemocultivos positivos. De los 20 pacientes, 19 desarrollaron shock y 6 murieron como resul­ tado de las infecciones. Es interesante señalar que 8 de las 10 cepas de estreptococos del grupo A que estuvieron disponibles para el estudio ulterior produjeron exotoxina pirógena estrep­ tocócica A (SPE A), la toxina asociada con la escarlatina. Esto fue particularmente interesante porque se habían aislado pocas veces en los Estados Unidos desde 1976 cepas que produjeran SPE A. La vigilancia activa con base en el laboratorio y poblacional desde julio de 1995 a diciembre de 1999 en cinco esta­ dos de los Estados Unidos permitió detectar que los tipos M 1.

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C A P ÍT U L O 13

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “ sim ilares a Streptococcus"

3, 11, 12 y 28 representaban el 49,2% de las cepas en infeccio­ nes invasoras y los tipos emm recientemente caracterizados representaban el 8,9% de las cepas.734 En la actualidad el síndrome similar al shock tóxico por estreptococos del grupo A es una entidad clínica bien recono­ cida.927 En los Estados Unidos, los CDC han estimado que la tasa de ataque es de aproximadamente 1 caso por 100 000 habi­ tantes, aunque pueden observarse tasas regionales altas y entre los muy pequeños o los muy ancianos.924-925 Los pacientes que sufren infecciones invasoras por estreptococos del grupo A sue­ len tener enfermedades comórbidas, como diabetes mellitus. insuficiencia cardíaca congestiva, neoplasias e inmunosupresión.76Alrededor del 20% de los pacientes con síndrome similar al shock tóxico presentan pródromos de tipo viral con fiebre, escalofríos y mialgias. Se pueden apreciar signos de infección de los tejidos blandos, como tumefacción, molestias a la palpa­ ción, eritema o dolor si la infección primaria es cutánea. En los pacientes con fascitis necrosante o miositis se presenta un sín­ drome tóxico y pueden aparecer rápidamente lesiones ampo­ llares violáceas. Los pacientes pueden sufrir una amplia varie­ dad de manifestaciones clínicas como miocarditis, hepatitis, peritonitis, miocarditis, artritis séptica, endoftalmitis, sepsis puerperal, meningitis y toxemia fulminante.538 El compromiso pulmonar asociado con la infección produce cianosis, taquipnea e insuficiencia respiratoria. La afectación renal ocurre al comienzo del curso clínico en más del 80% de los pacientes, como lo muestran las altas concentraciones de creatinina y la hemoglobinuria en suero. El deterioro renal suele persistir a pesar del tratamiento intensivo con antibióticos y líquidos intravenosos, y puede requerirse diálisis. Los pacientes pueden presentar rápidamente hipotensión y en la mayoría no respon­ den a la administrción de albúmina y líquidos con electrolitos. Aparece un síndrome de dificultad respiratoria aguda en más del 50% de los enfermos, que requiere intubación y ventilación mecánica. En las infecciones fulminantes y finalmente morta­ les, se puede observar el síndrome de Waterhouse-Friderichsen y coagulación intravascular diseminada.371-550 Se presenta bacteriemia por estreptococos del grupo A en alrededor del 70% de los pacientes. Si se observa infección de los tejidos blandos, pueden ser necesarios procedimientos quirúrgicos para elimi­ nar los tejidos infectados, desvitalizados y necróticos. Este sín­ drome produce característicamente shock y falla multiorgánica poco después del inicio de los síntomas y su tasa de mortalidad puede alcanzar entre el 30% y hasta más del 80% de los casos.65 El tratamiento requiere antibioticoterapia, administra­ ción de líquidos y medidas intensivas de sostén. La clindamicina tiene mayor eficacia que la penicilina y se la utiliza a menu­ do para el tratamiento junto con aquélla.53 Se ha demostrado que la clindamicina inhibe la expresión de proteínas M y la sín­ tesis y exportación de toxinas (incluidas las exotoxinas piróge­ nas SPE A y SPE B), enzimas (p. ej., DNasa, SLO y SLS) y material capsular.131-665-916 Ciertas pruebas indican que la infu­ sión de inmunoglobulina intravenosa también puede ser bene­ ficiosa.731 Se ha demostrado que las exotoxinas pirógenas estreptocócicas (SPE) desempeñan un papel importante en la patogenia del síndrome similar al shock tóxico. Hauser y cois, examinaron 34 cepas de estreptococos del grupo A del síndrome similar al shock tóxico y observaron que el 54% eran tipo MI o M3. Si bien el 53% produjo SPE A, el 85% contenía el gen sepA que codifica SPE A.469 Todas las cepas contenían el gen que codifi­ ca SPE B (speB) y el 21% contenía el gen que codifica SPE C (,speC). Estos investigadores llegaron a la conclusión de que SpE A se asociaba firmemente con estreptococos del grupo A

capaces de provocar síndrome similar al shock tóxico, aunque propusieron que otros factores también pueden estar involucra­ dos, dado que no todas las cepas aisladas en los pacientes con ese síndrome contenían el gen speA. Musser y cois, examina­ ron los tipos M y la presencia de genes que codifican SPE A (genotipo speA) y SPE C (genotipo speC) en un conjunto de cepas de estreptococos del grupo A de casos de faringitis ocu­ rridos en nueve estados.714 Más del 50% de las cepas que expre­ saban el serotipo MI o M3 hibridaron específicamente con una sonda para speA, lo que indicó que aquellos con capacidad de producir enfermedad estreptocócica grave estaban bien repre­ sentadas entre las que causaban faringitis extrahospitalaria. Otros autores no hallaron que SPE A ni otras exotoxinas piró­ genas sean similares a las exotoxinas estafilocócicas ni supe­ rantígenos capaces de inducir la liberación de distintas citoci­ nas y linfocinas.97-353-448 Por su parte, estas moléculas median los efectos sistémicos profundos que promueven la invasión sistémica rápida por los microorganismos y precipitan la afec­ tación sistémica multiorgánica que caracteriza al síndrome 63o,79o Como ya se mencionó, se recomienda el tratamiento con clindamicina y penicilina, dado que la clindamicina es mucho más potente para inhibir la síntesis de exotoxinas piró­ genas (en especial SPE A y SPE B) que la penicilina.665 En forma simultánea con el reconocimiento del síndrome similar al shock tóxico, se observaron aumentos en la inciden­ cia de otras infecciones por estreptococos del grupo A, sobre todo bacteriemias, fascitis necrosante y miositis, tanto en poblaciones adultas como pediátricas de los Estados Unidos y otros países.247-926 Al principio, estas infecciones estreptocócicas graves se comunicaron entre los adictos a drogas intrave­ nosas en Filadelfia, los adultos en las áreas de Denver y Los Angeles y los niños en Winston-Salem, Carolina del Norte y Denver, Colorado.166-619-1045 También se informaron casos agru­ pados en familiares y brotes focalizados en hospitales y asi­ los.872 Además de la baeteriemia, muchos pacientes sufrieron fascitis necrosante estreptocócica. Esta es una infección de los tejidos subcutáneos profundos que conduce a la desvitalización y la destrucción progresivas de las aponeurosis.874 La infección se inicia con eritema en el sitio de un traumatismo aparente o trivial, aunque también ocurre la siembra hematógena de músculo y tejido blando subcutáneos. En los niños, suele aso­ ciarse con una infección estreptocócica de lesiones de varicela en individuos antes sanos.517 La infección se desarrolla y se pro­ paga con rapidez de modo que en las siguientes 24 a 72 horas los tejidos cambian de color desde un tinte rojo eritematoso hasta un azul profundo o violáceo, con la formación de lesio­ nes ampollares que contienen líquido serosanguinolento. En este punto, los tejidos se vuelven gangrenosos y el tejido des­ vitalizado se esfacela para poner en evidencia la necrosis extensa del tejido subcutáneo.371 La infección se propaga con rapidez a lo largo de los planos aponeuróticos para afectar los tejidos blandos y los músculos, y conduce a miositis y mioneerosis.721-936-1031 Algunos estudios de resonancia magnética son útiles para identificar la extensión de la fascitis y el edema de los tejidos blandos que infiltran los planos aponeuróticos antes de que se manifieste la necrosis. El paciente se torna cada vez más obnubilado y estuporoso debido a un cuadro tóxico fulmi­ nante, e incluso con una cobertura antibiótica apropiada y el desbridamiento quirúrgico extenso de los tejidos desvitaliza­ dos, la mortalidad puede ser del 30% al 60%; algunas muertes ocurren ya a las 48 horas del inicio de los signos y los sínto­ mas. La afectación muscular extensa predice un pronóstico incluso más ominoso, con tasas de letalidad de entre el 80% y el 100%. Debido a la gravedad de las infecciones y a la alta

E s tre p to c o c o s p -h e m o lític o s del g ru p o B (Streptococcus agalactiae)

mortalidad asociada con ellas, se requieren intervenciones médicas y quirúrgicas intensivas que pueden salvar la vida de muchos pacientes.371,1076 Con el reconocimiento de la gravedad de estas infecciones estreptocócicas y la aparición del síndro­ me similar al shock tóxico, Streptococcus del grupo A se ha vuelto a establecer como un microorganismo que debe tenerse en cuenta en el siglo xxi. Los estreptococos (3-hemolíticos del grupo A también pue­ den causar otras infecciones, como neumonía, meningitis, oste­ omielitis, endocarditis, peritonitis e infecciones hospitalarias. En general, la neumonía debida a estos estreptococos ocurre en huéspedes debilitados por otros trastornos, entre ellos gripe u otras infecciones intercurrentes por virus respiratorios, enfer­ medad pulmonar obstructiva crónica, alcoholismo y enferme­ dad neoplásica.57 La neumonía también puede formar parte de la presentación clínica de las enfermedades invasoras por estreptococos del grupo A, como el síndrome del shock tóxico estreptocócico. La neumonía estreptocócica a menudo tiene un inicio brusco con fiebre, escalofríos, malestar general, disnea y dolor torácico. Las radiografías de tórax suelen mostrar infil­ trados basales con derrame pleural. En general, el diagnóstico se hace mediante cultivos de esputo, líquido pleural, líquido de empiema o sangre.702,826 El esputo suele ser purulento y tener estrías sanguinolentas. Las complicaciones de las infecciones pulmonares son sepsis, derrame pleural, empiema, neumoto­ rax, pericarditis, mediastinitis, shock, abscesos pulmonares y metastásicos, bronquiectasias y osteomielitis.57,718 La osteomie­ litis se observa a menudo como una complicación de infeccio­ nes por varicela en los niños; en los adultos, suele ocurrir como complicación de la bacteriemia.13 La meningitis debida a estreptococos del grupo A ocurre en alrededor del 2% de todos los pacientes con infección sistémica por estos estreptococos y representa del 0,2% al 1% de todos los casos de meningitis.187 Esta infección es similar en su presentación a otras meningitis bacterianas agudas, con cefalea, fiebre, rigidez de la nuca y déficits neurológicos focales.538,709 Los pacientes pueden tener un foco de infección que conduce a bacteriemia, con la inva­ sión ulterior de las meninges.912 En una revisión de 41 pacien­ tes adultos con esta infección, el 60% tenía antecedentes de oti­ tis media, sinusitis, neumonía, traumatismo de cráneo reciente, neurocirugía reciente o presencia de un dispositivo neuroquirúrgico.994 La endocarditis por estreptococos del grupo A es una infección rara que ocurre en lactantes, niños y adultos. La endocarditis pediátrica puede asociarse con bacteriemia e infección por varicela.691,1065 En general, en los adultos ocurre en pacientes sin antecedentes de anomalías cardíacas y se aso­ cia con tasa alta de complicaciones, como embolias cerebrales u otras embolias sistémicas, artritis, discitis y osteomielitis.45 También se han comunicado infecciones intrahospitalarias por estreptococos del grupo A, habitualmente en asociación con la presencia de catéteres y otros dispositivos médicos permanen­ tes.660 Estos estreptococos se han unido a la lista creciente de otros microorganismos implicados en la peritonitis asociada con diálisis peritoneal ambulatoria continua.163

Estreptococos fi-hemolíticos del grupo B (Streptococcus agalactiae) Factores de virulencia

Streptococcus (3-hemolítico del grupo B (5. agalactiae) con­ tiene un antígeno del grupo de Lancefield, un polisacárido de la superficie celular específico de tipo y antígenos proteicos. El antígeno del grupo B está compuesto por un polímero de ram-

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nosa-glucosamina fijado a la capa de peptidoglueano. La espe­ cificidad de tipo es proporcionada tanto por el polisacárido capsular como por los antígenos proteicos. Los estreptococos del grupo B son siempre encapsulados y pertenecen a uno de nueve serotipos capsulares reconocidos, los cuales están com­ puestos por glucosa, galactosa, N-acetilglucosamina y ácido Nacetil-neuramínico (ácido siálico); la especificidad de serotipo está determinada por las distintas disposiciones de estos cuatro componentes en cada uno de los nueve tipos capsulares. Los antígenos polisacáridos capsulares se designan la. Ib, II, III, IV, V, VII y v n i .333,582,1018,1019,1039 El antígeno proteico es desig­ nado sólo con la letra c, que existe en dos formas: c a y c(3. Este antígeno c se encuentra en todas las cepas Ib (las cepas tipo la carecen de la proteína c), en el 60% de las cepas tipo II y pocas veces se encuentra en las cepas tipo III (no se han examinado suficientes cepas serotipos IV-VIII para detectar su presencia). Por lo tanto, las designaciones de los serotipos para las cepas que contienen antígeno c se expresan como Ib/c y II/c. La importancia de estos componentes capsulares como factores de virulencia está demostrada tanto por datos in vitro como in vivo. Los anticuerpos opsonizantes contra estreptococos del grupo B son específicos de serotipo, como lo demuestran los estudios que utilizan leucocitos polimorfonucleares y macrófa­ gos, y la falta de anticuerpos maternos contra estos antígenos es un factor de riesgo reconocido para el desarrollo de la enfer­ medad por estreptococos del grupo B en el recién nacido.358 Aunque las técnicas serológicas son los métodos de referen­ cia para los determinantes de serotipos, también se han creeado métodos con base molecular tanto para la serotipificación como para la subserotipificación de las cepas. Kong y cois, crearon cebadores y ensayos de secuenciación con base en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para los genes cps capsulares de todos los serotipos que se correlacionaban en un 100% con los métodos serológicos.583 Se logró una mayor subserotipificación mediante la amplificación y la secuenciación de los genes para las proteínas de superficie c a (gen bea), simi­ lar a c a (genes alp2, alp3 y alp4), Rib (gen rib) y c(3 (gen ¿ac).583,584 Bohnsack y cois, utilizaron patrones de digestión de restricción de DNA del gen de la hialuronato liasa de los estreptococos del grupo B (hylB) para subdividir las cepas de serotipo III, una de las cuales (III-3) se correlacionó con clones que tienen mayor virulencia.111 También se describieron méto­ dos moleculares de serotipificación para uso en laboratorios clínicos. Borchardt y cois, designaron cebadores para amplifi­ car las secuencias de los genes capsulares y luego aplicaron sondas específicas de tipo cps en un formato de transferencia en puntos (dot blot) para determinar el serotipo.114 Utilizando este procedimiento, el 99% de 306 aislamientos fueron asigna­ dos a un serotipo, en comparación con el 89% que eran tipificables mediante el método de referencia de las precipitinas capi­ lares. También se han utilizado otros métodos moleculares para caracterizar mejor las cepas de estreptococos del grupo B.1093 La prevalencia de los distintos serotipos capsulares del grupo B varía en el tiempo y puede diferir de un lugar a otro. Antes de la década de 1990, la mayoría de las enfermedades por estreptococos del grupo B eran causadas por los serotipos la, Ib, II, III y V; los serotipos IV y VI a VII eran relativamen­ te infrecuentes. Durante la primera mitad de la década de 1990, comenzaron a aparecer las cepas de serotipo V y el porcentaje de aislamientos de este grupo aumentó del 2,6% en 1992 al 20% en 1994.324,436 Los estudios llevados a cabo en los Estados Unidos y en otros países indican que los serotipos la, Ib, II, III y V predominan ahora entre los aislamientos vaginales y los aislamientos clínicos en los pacientes.82,106,628 Han aparecido

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Cocos gram positivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias "sim ilares a Streptococcus"

hace poco serotipos VI y VIII como serotipos predominantes en Japón.591 En un estudio de 73 aislamientos vaginales en mujeres embarazadas que asistieron a un centro clínico obsté­ trico urbano en Kawasaki, Japón, el 35,6% era serotipo VIII y el 24,7% era serotipo VI. También se ha comunicado en Japón enfermedad neonatal de inicio temprano debida al serotipo VIII.669 Las cepas de tipo III de estreptococos del grupo B representan el 60% de los aislamientos en sepsis neonatal y más del 80% de los aislamientos en lactantes con meningitis, lo que indica la mayor virulencia de este serotipo.286,628 El polisa­ cárido capsular de tipo III está formado por un esqueleto estructural repetitivo que consiste en galactosa, glucosa y Nacetil-glucosamina con cadenas laterales compuestas por galactosa y una porción de ácido A'-acetilneuramínico terminal. El componente estructural de la cápsula de tipo III que parece estar asociado con la mayor virulencia es el ácido /V-acetilneuramínico (ácido siálico). La presencia de esta molécula sobre la superficie del microorganismo inhibe la activación de la casca­ da alternativa del complemento y evita la fagocitosis. La elimi­ nación de residuos de ácido siálico con neuraminidasa condu­ ce a activación del complemento, fagocitosis y destrucción intracelular de los microorganismos y menor virulencia en pruebas de exposición intravenosa en modelos murinos.311,312,1040 Se han obtenido resultados similares con mutantes de estreptococos del grupo B serotipo II isogénicos con una deficiencia capsular que carecen de los residuos de ácido siáli­ co terminal. Cuando se los compara con las cepas madre, los mutantes son opsonizados y destruidos en presencia de com­ plemento y células PMN.827,1042 Estos mutantes también se unen al factor del complemento C3b activo en forma más efi­ caz que en el tipo silvestre. En este último tipo, los residuos de ácido siálico bloquean la unión de C3 y promueven la inactiva­ ción de C3b.656 Estos mutantes capsulares de tipo III también fueron menos virulentos en modelos experimentales en ratas recién nacidas con baeteriemia y neumonía por estreptococos del grupo B que las cepas madre de tipo III isogénicas.661,1042 Mediante el análisis molecular de subtipos virulentos de cepas serotipo III (serotipo III-3) se identificaron regiones de DNA genómico que codificaban una proteína de superficie (Spb 1) que media la intemalización y la invasión de células epiteliales por los microorganismos serotipo III.3 Los estreptococos del grupo B también producen otros dis­ tintos determinantes potenciales de virulencia. Al igual que los del grupo A, los del grupo B producen C5a peptidasa. C5a es un producto de la escisión de los componentes del comple­ mento producido por las células epiteliales alveolares, atrae a las células inflamatorias y participa en el proceso de inflama­ ción pulmonar.933 La C5a peptidasa producida por los estrep­ tococos escinde C5a en el término C, interfiriendo así en la quimiotaxis de los neutrófilos mediada por C5a.110 La nueva información indica que esta peptidasa también se une a la fibronectina y sirve como adhesina e invasina bacterianas.69,182 Esta enzima existe en una forma asociada con las células y también requiere la presencia de la cápsula del grupo B para lograr una actividad máxima. La opsonización de los estrepto­ cocos del grupo B pertenecientes a los serotipos la. Ib, II, III y V con anticuerpos antipeptidasa C5a conduce a una mayor des­ trucción tanto por parte de los macrófagos como de los leuco­ citos polimorfonucleares.180 La inmunización de ratones con C5a peptidasa estreptocócica purificada produce una respuesta de anticuerpos que los protege de la infección por microorga­ nismos del grupo B independiente del serotipo, lo que sugiere que la C5a peptidasa podría ser un antígeno con firmes posibi­ lidades de utilizarse para vacunas.181 La C5a peptidasa también

es producida por estreptococos (3-hemolíticos de los grupos A y G, y los genes que codifican la C5a peptidasa en las cepas grupo B (scpB) y grupo A (scpA) demuestran un 98% de homo­ logía de secuencia entre ellos. La (3-hem olisina/citolisina de los estreptococos del grupo B puede actuar como factor de vi­ rulencia, sobre todo en las infecciones pulmonares.397,723 Esta (3-hemolisina formadora de poros puede lisar las células epite­ liales y endoteliales de los alvéolos humanos in vitro, lo que sugiere un papel para la hemolisina como factor de virulencia en las infecciones pulmonares neonatales.724 También puede aumentar la capacidad de los microorganismos para invadir las células endoteliales en el sistema nervioso central (SNC).725 Algunos estudios in vivo e in vitro indican que contribuye a la baeteriemia y la invasión bacteriana del hígado y activa las vías apoptóticas en los hepatocitos, lo que conduce a necrosis hepá­ tica.814 El ácido lipoteicoico también se encuentra en los estreptococos del grupo B y puede participar facilitando la adherencia como primer paso de la infección.720 El ácido lipo­ teicoico purificado de los estreptococos del grupo B es citotóxico para las células encefálicas embrionarias y amni óticas humanas que crecen en cultivo tisular.407 Varias proteínas de la superficie celular (p. ej., antígenos c, R, BPS y Rib) se encuentran en distintas combinaciones en los diferentes seroti­ pos de estos estreptococos.328 En particular, el antígeno c, puede actuar mediando la intemalización de microorganismos dentro de las células epiteliales cervicales humanas luego de su fijación y los protege de la destrucción intracelular después de la fagocitosis.112,763 Estas moléculas son antigénicas y los anti­ cuerpos dirigidos contra ellas son protectores contra la carga microbiana en modelos animales. Hace poco. Jones y cois, identificaron una proteína de unión a penicilina de la su per­ ficie celular (PBP1 a) que permitía a las células estreptocócicas resistir la destrucción intracelular de las células fagocíticas.544 Los estreptococos del grupo B producen además una ácido hialurónico liasa, que puede actuar tanto para propagar la infección por la degradación del ácido hialurónico en la matriz extracelular como sobre el ácido hialurónico presente en altas concentraciones en tejidos placentarios y fetales, y en el líquido amniótico.788 Se ha identificado la presencia del factor CAMP, enzimas proteasas y distintas nucleasas en algunos estreptococos del grupo B, pero el papel de estas moléculas en la patogenia de las enfermedades es incierto. Importancia clínica

Los estreptococos (3-hemolíticos del grupo B constituyen una causa importante de enfermedad en los períodos neonatal y perinatal. Las mujeres son colonizadas por el microorganis­ mo en la vagina y el recto, y se observa colonización vaginal en el 10-35% de las embarazadas; hasta el 60% de las mujeres colonizadas portan el microorganismo en forma intermitente 458,805 £ n reaixda.d, la colonización de la vagina puede reflejar la contaminación del recto y el tubo digestivo es el principal reservorio de los microorganismos. La colonización vaginal suele ser asintomática, aunque algunos informes documentan vaginitis asociada con una colonización importante y la resolu­ ción de los síntomas vaginales con el tratamiento.493,494 Esta colonización genera una respuesta inmunitaria específica de serotipo, con incrementos acumulativos de anticuerpos con el aumento de la edad: las concentraciones más bajas de anti­ cuerpos en niñas adolescentes pueden traducirse en un mayor riesgo de enfermedad por estreptococos del grupo B en los hijos de estas mujeres más jóvenes.149 La transmisión sexual es controversial. Algunos estudios han documentado tasas más

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altas de colonización entre los que asisten a centros de atención de enfermedades de transmisión sexual y en pacientes con gonorrea.824 También se han observado tasas más altas de colo­ nización en mujeres que tienen mayor actividad sexual y mayor cantidad de parejas sexuales.515 Sin embargo, otros estudios no han comprobado ninguna correlación entre la colonización por estreptococos del grupo B. la experiencia sexual o la presencia de otras enfermedades de transmisión sexual.494 También se han aislado estreptococos del grupo B en cultivos de fauces y en los genitales masculinos. Su presencia en el aparato genital femenino en el momento del nacimiento puede conducir a la infección del recién naci­ do. Uno de cada dos lactantes hijos de mujeres colonizadas es colonizado en la piel o las superficies mucosas por la transmi­ sión vertical desde la madre, ya sea in útero o durante el parto. Además, el recién nacido puede ser colonizado por la exposi­ ción hospitalaria al microorganismo después del parto. Entre los lactantes colonizados, la enfermedad puede ocurrir en 1 a 4 niños por 1 000 nacidos vivos.311-915 La enfermedad neonatal por estreptococos del grupo B sigue dos patrones, denomina­ dos enfermedad de inicio temprano y enfermedad de inicio tardío. La enferm edad de inicio tem prano ocurre con una inci­ dencia de 0,7 en 1 000 a 3,7 en 1 000 nacidos vivos y se asocia con la adquisición in útero o perinatal del microorganismo.311 Es probable que esta incidencia sea una subestimación; un estudio de la enfermedad de inicio temprano llevado a cabo en el Reino Unido comunicó una incidencia de 3 a 6 infecciones por cada 1 000 nacidos vivos sobre la base de la cantidad de neonatos que requirieron la detección de una posible sepsis durante las primeras 72 horas de vida.639 El microorganismo se adquiere por una infección ascendente in útero antes del parto, a través de la rotura de membranas o durante el pasaje a través del canal de parto colonizado por los estreptococos. Aunque una proporción sustancial de estos lactantes (aproximadamen­ te el 50%) estarán colonizados, sólo el 1-2% de ellos se infec­ ta.311-359 El inicio de la enfermedad ocurre durante los 5 prime­ ros días de vida; en más del 50% de los casos, los lactantes se enferman dentro de las primeras 12 a 20 horas después del nacimiento.374 El espectro de la enfermedad incluye bacterie­ mia, neumonía, meningitis, shock séptico y neutropenia. Aunque más del 50% de los casos ocurren en lactantes de tér­ mino. los lactantes prematuros se asociaron con tasas de ataque más altas y mayor morbilidad.359 La mortalidad debida a enfer­ medad de inicio temprano en los lactantes de término varía del 2% al 8%; se observan tasas de mortalidad más altas en los lac­ tantes prematuros y son inversamente proporcionales al peso de nacimiento.866-1081 Los factores matemos que aumentan el riesgo de infección de inicio temprano del recién nacido son trabajo de parto prematuro, rotura prolongada de membranas, bacteriemia posparto, amnionitis materna, colonización vagi­ nal importante y bacteriuria por estreptococos del grupo g :-t.286.33i,374 [)urante |a década de 1970, alrededor del 50% de los lactantes en los que se desarrolló una enfermedad de inicio temprano murieron por la infección, y muchos pacientes que sobrevivieron a la meningitis por estreptococos del grupo B quedaron con secuelas neurológicas permanentes. La enferm edad de inicio tardío ocurre con una incidencia de 0.5 en 1 000 a 1,8 en 1 000 nacidos vivos311 y se vuelve clí­ nicamente evidente 7 días a 3 meses (promedio, 3 a 4 semanas) después del nacimiento. Aunque alrededor del 50% de las infecciones de inicio tardío se adquieren a partir del canal de parto de las madres colonizadas, los casos restantes son el resultado de la adquisición posnatal del microorganismo desde

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la madre u otros cuidadores o dentro del hospital.755 La bac­ teriemia por meningitis asociada es la presentación clínica pre­ dominante.574 La mortalidad asociada con la enfermedad de inicio tardío es del 10-15%. Hasta el 50% de los niños con meningitis de inicio tardío tienen complicaciones y secuelas neurológicas permanentes.1022 La distribución de los serotipos de estreptococos del grupo B también varía según que la enfer­ medad sea de inicio temprano o tardío.311 Entre los recién naci­ dos con enfermedad de inicio temprano y sin meningitis, la dis­ tribución de los serotipos se divide por igual entre los serotipos Ic, II y III. Entre los que tienen una infección similar por meningitis, predominan las cepas del serotipo III. En la enfer­ medad de inicio tardío, en la cual la meningitis es la presenta­ ción clínica frecuente, las cepas del serotipo III representan más del 90% de los aislamientos. Por otra parte, la meningitis por estreptococos del grupo B en los adultos se asocia princi­ palmente con microorganismos serotipo II. Hacia mediados de la década de 1980, el mayor conoci­ miento de las infecciones por estreptococos del grupo B y el reconocimiento de los síntomas en los pacientes en riesgo lle­ varon a adelantos en la asistencia neonatal que condujeron a una reducción de la tasa de mortalidad hasta alrededor del 15%. Como es más probable que los lactantes hijos de madres muy colonizadas tengan enfermedad de inicio temprano y dado que los que adquieren un inoculo bacteriano grande durante el parto tienen una probabilidad significativamente mayor de sufrir tanto la enfermedad de inicio temprano como la de inicio tardío, la identificación de las madres colonizadas se convirtió en el centro de atención de las estrategias de prevención. Los investigadores examinaron las posibles intervenciones para evitar la enfermedad por estreptococos del grupo B, y varios ensayos clínicos demostraron que la administración intraparto de antibióticos interrumpía la transmisión del microorganismo de la madre al hijo y reducía la incidencia de infecciones de ini­ cio temprano.128-387-624-697-976 Este enfoque quimioprofiláctico previno alrededor del 70-75% de la enfermedad de inicio tem­ prano, pero no tuvo ningún efecto sobre la de inicio tardío. En ese momento, varios fabricantes de productos microbiológicos comenzaron a desarrollar métodos de detección directa para estreptococos del grupo B en muestras de hisopados vaginales similares a los utilizados para la detección directa de estrepto­ cocos del grupo A en muestras de hisopados de fauces. Estas pruebas utilizaban anticuerpos antiestreptococos grupo B para detectar microorganismos directamente mediante los formatos de aglutinación del látex o inmunoanálisis visual o colorimétrico rápido. En teoría, estas pruebas rápidas podían realizarse en el período preparto inmediato para determinar el estado de la colonización, y se podía administrar una quimioprofilaxis anti­ biótica antes del parto y durante su transcurso si los ensayos preparto eran positivos. Las pruebas comerciales rápidas para la detección directa de estreptococos del grupo B en las mues­ tras de hisopados vaginales variaban significativamente en sen­ sibilidad (11-88%) cuando se comparaban con técnicas de cul­ tivo en caldo durante toda la noche y, en general, identificaban sólo a las mujeres que tenían una colonización importan­ t e , 297,625,913,1084 La validez de la premisa de que el riesgo de infección neonatal es mayor para los lactantes nacidos de muje­ res muy colonizadas fue puesta en duda por algunos informes clínicos. En una evaluación de un sistema de inmunoanálisis enzimático (EIA) rápido para la detección directa de estreptoco­ cos del grupo B en muestras vaginales, Towers y cois, comuni­ caron que la enfermedad de inicio temprano mortal se desarro­ lló en dos de nueve lactantes hijos de madres con colonización leve y resultados negativos en el EIA rápido.959 En otro estudio

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de un método de detección rápido para la colonización por estreptococos del grupo B. Morales y Lim comunicaron que, en 37 mujeres con colonización leve y pruebas de cuidado rápido negativas, 6 dieron a luz niños con sepsis de inicio temprano.697 Además, también se discute la oportunidad de la prueba prena­ tal para la colonización por estreptococos del grupo B. Alrededor del 60-70% de las mujeres con cultivos vaginales positivos en el segundo trimestre estarán colonizados al térmi­ no, pero hasta el 30% de las mujeres con cultivos negativos durante el segundo trimestre tendrán cultivos positivos en el momento del parto. Por lo tanto, el desarrollo de métodos pre­ cisos para la detección rápida, sensible y específica de la colo­ nización por estreptococos del grupo B en las mujeres en el momento del parto o cerca de él se convirtió en el eje de la investigación microbiológica clínica. En 1996, los Centers for Disease Control and Prevention (CDC), junto con la American Academy of Pediatrics (AAP) y el American College of Obstetrics and Gynecology (ACOG) acordaron por consenso recomendaciones sobre estrategias de prevención para la enfermedad por estreptoco­ cos del grupo B.21,22,167 Estas pautas consejaban los encargados del cuidado obstétrico que adoptan una estrategia basada sobre el cultivo o sobre los riesgos para la prevención de la enferme­ dad de inicio temprano. La implementación ulterior de estas pautas y su cumplimiento han conducido a una disminución importante de la incidencia de la enfermedad neonatal de ini­ cio temprano.863 Un componente crítico de estas pautas es el uso de profilaxis antibiótica materna durante el trabajo de parto y el parto. Esto planteó preocupaciones en relación con los efectos adversos de un mayor uso de antibióticos y el riesgo aumentado de reacciones anafilácticas contra la penicilina, el fármaco de elección para la quimioprofilaxis. Otra preocupa­ ción ha sido el surgimiento potencial de resistencia a los anti­ bióticos en los estreptococos del grupo B. Hasta la fecha, no se han aislado cepas resistentes a la penicilina, aunque se ha vuel­ to relativamente frecuente la resistencia a la clindamicina y a la eritromicina. Una tercera preocupación fue que la mayor admi­ nistración de penicilina en el período neonatal puede propor­ cionar suficiente presión selectiva como para que conduzca a infecciones neonatales debido a microorganismos resistentes a la penicilina como Escherichia coli, el segundo agente en fre­ cuencia de sepsis en el período neonatal. Esta posibilidad no se ha concretado hasta la fecha y se requiere una vigilancia conti­ nua para su detección y contención eventual. En 2002, el Commmittee on Obstetrical Practice (Comité sobre Prácticas Obstétricas) de los Estados Unidos emitió una declaración de apoyo al uso de estrategias de prevención con base en cultivos de acuerdo con los datos de la red del Active Bacterial Core Surveillance/ Emerging Infections Program que sugiere que el enfoque basado sobre cultivos es superior al basado sobre ries­ gos.23 Los CDC emitieron nuevas pautas en 2002, que reem­ plazaron a las de 1996 y recomendaban la detección sistemáti­ ca universal basada sobre el cultivo para la colonización vagi­ nal y rectal de todas las mujeres embarazadas a las 35-37 sema­ nas de gestación (recuadro 13-3).170 El protocolo de cultivos recomendado por los CDC, la ACOG y la FDA comprende la recolección de muestras de hi­ sopados vaginales y rectales durante las semanas 35 a 37 de gestación.167 170,367'865 Las muestras de hisopados vaginales se recogen del tercio inferior de la vagina y del conducto anal (un único hisopado de la vagina y luego del conducto anal o un hi­ sopado recogido de cada sitio). Los hisopados se colocan en Trans-Vag® o caldo LIM (caldo de Todd-Hewith con 10 ug/mL de ácido nalidíxico, 15 ug/mL de colistina y 10 mg/mL

de extracto de levadura) y se incuban durante 18 a 24 horas.625 Después de la incubación, se subcultiva el caldo en agar sangre de carnero y se incuba durante 18-24 horas. Las placas son reincubadas por un día adicional si no se encuentran estrepto­ cocos del grupo B. Entonces se los identifica mediante méto­ dos bioquímicos (p. ej., prueba CAMP, hidrólisis de hipurato, API Rapid Strep), serológicos (seroagrupamiento mediante coaglutinación o aglutinación del látex) o hibridación quimioluminescente (Gen-Probe®, AccuProbe®). Todo el procedi­ miento de cribado puede llevar 2 a 3 días. La detección directa de estreptococos del grupo B en el caldo LIM luego de la incu­ bación también puede tener valor para acortar el tiempo de detección, pero este método necesita otra evaluación. Guerrero y cois, examinaron 551 cultivos rectovaginales para estrepto­ cocos del grupo B y 101 fueron positivos por el método de sub­ cultivo.442 De estas 101 muestras, 99 (98%) de los cultivos en caldo dieron pruebas de aglutinación positivas con el reactivo de látex para grupo B. La prueba de AccuProbe Group B Streptococcus Culture Identification® (Gen-Probe, San Diego, CA), un ensayo de confirmación de cultivos con sonda de áci­ dos nucleicos quimioluminescente, también fue evaluada para la detección de estreptococos del grupo B en muestras de caldo LIM que contienen hisopados vaginoanorrectales después de la incubación durante 18 a 24 horas. Se obtuvieron sensibilidades del 94,7-95.6% y especificidades del 98,4-99,5% cuando se comparó la prueba AccuProbe con incubación en caldo LIM con el subcultivo e identificación.122,1063 También se puede uti­ lizar la sonda DNA quimioluminescente AccuProbe para iden­ tificar cepas en medios de cultivo o en gránulos originales obte­ nidos mediante centrifugación de caldos de hemocuitivo posi­ tivos.251,257 En ocasiones, los cultivos de cribado darán otros agentes de infección. Stefonek y cois, comunicaron el aisla­ miento de estreptococos [3-hemolíticos del grupo A de cultivos de cribado rectovaginales de dos pacientes en los que se desa­ rrolló sepsis puerperal por estreptococos del grupo A.919 En 2002, la Food and Drug Administration aprobó un nuevo producto denominado ensayo IDI-Strep B (Infection Diagnostic, Sainte Foy, Quebec, Canadá) como una nueva prueba para la detección de estreptococos del grupo B en hisopados rectovaginales recogidos de mujeres embarazadas. Este es un ensayo de PCR en tiempo real que utiliza el instrumento Cepheid Smart Cycler para detectar DNA de estreptococos del grupo B. La prueba puede proporcionar resultados dentro de la hora y es la primera prueba sin cultivos que reúne los criterios de rendimiento recomendados por las pautas de los CDC en el recuadro 13-3. Este método tiene una sensibilidad de como mínimo un 85% en comparación con el método de amplifica­ ción-cultivo en caldo. Al igual que el método estándar, se reco­ ge la muestra de una paciente con 35 a 37 semanas de gesta­ ción o cuando comienza el trabajo de parto. Esta prueba debe realizarse de modo de obtener los resultados con tiempo sufi­ ciente para que la mujer reciba 4 horas de antibioticoterapia antes del parto. Aun cuando puede realizarse como prueba estándar sola, sigue siendo necesario el cultivo de la muestra para efectuar las pruebas de sensibilidad a los antibióticos para clindamicina y eritromicina si el paciente es alérgico a la peni­ cilina. Debido a la ventana de tratamiento de 4 horas, la prue­ ba es útil sólo si los resultados se obtienen al menos 4 horas antes del parto. En las pacientes que acuden durante el trabajo de parto o que no han tenido cuidados prenatales, se puede rea­ lizar el ensayo IDI-Strep B si se dispone de 5 a 6 horas para las pruebas y la administración de tratamiento antibiótico. Aunque los estreptococos del grupo B se asocian con un 20% de endometrids posparto, 25% de bacteriemias luego de la

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R ecuadro 1 3 -3

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P ro c e d im ie n to s p a ra re c o g e r y p ro c e s a r m u e s tra s c lín ic a s p a ra c u ltiv o de e s tre p to c o c o s d e l g ru p o B y p a ra re a liz a r p ru e b a s d e s e n s ib ilid a d p a ra c lin d a m ic in a y e ritro m ic in a 170

Procedim iento para la recolección de m uestras clínicas para cultivo de estreptococos del grupo B a las 3 5 -3 7 sem anas de gestación • Pase el hisopo por la porción más externa de la vagina (introito vaginal) y luego por el recto (inserte el hisopo a través del esfínter anal) utilizando el mismo hisopo o dos hisopos diferentes. El cultivo debe ser recolectado en la paciente ambulatoria por el personal sanitario de la salud o la propia paciente, con instrucciones apropiadas. N o se recomiendan los cultivos del cuello uterino y no se debe utilizar un espéculo para recoger el cultivo. • Coloque el/los hisopo/s en un m edio de transporte de rutina. Existen en el com ercio sistem as de transporte apropiados (p. ej.. de Amie o de Stuart sin car­ bón). Si se recogen por separado hisopados vaginales y rectales, ambos hisopos pueden ser colocados en el mismo recipiente del medio. Los m edios de transporte m antienen la viabilidad de los estreptococos del grupo B hasta durante 4 días a tem peratura am biente o bajo refrigeración. • Los rótulos deben identificar claram ente que las muestras son para cultivo de estreptococos del grupo B. Si se ordenan pruebas de sensibilidad para m uje­ res alérgicas a la penicilna, los rótulos de las m uestras tam bién deben identificar a la paciente com o alérgica a la penicilina y deben especificar que se deben realizar pruebas de sensibilidad para clindam icina y eritrom icina si se aíslan estreptococos del grupo B. Procedim iento para el procesam iento de m uestras clínicas para cultivo de estreptococos del grupo B • Extraiga el/los hisopo/s del medio de transporte11. Inocule el/los hisopo/s en un medio de caldo selectivo recomendado, com o caldo de Todd-Hewitt suplementado con gentam icina (8 ng/m L) y ácido nalidíxico (15 |ig/m L) o con colistina (10 )ig/mL) y ácido nalidíxico (15 |ig/m L). Los ejemplos de opciones com erciales disponibles incluyen caldo de Trans-Vag suplementado con sangre de cam ero desfibrinada o caldo LIM .b • Incube el caldo selectivo inoculado durante 18-24 horas a 35-37 °C en aire ambiente o CO, al 5%. Subcultive el caldo en una placa de agar sangre de car­ nero (p. ej., agar tripticasa soja con sangre de carnero desfibrinada). • Inspeccione e identifique los m icroorganismos sugestivos de estreptococos del grupo B (zona estrecha de p-hemólisis, cocos grampositivos, catalasa nega­ tivos). Tenga en cuenta que puede ser difícil observar la hem olisis, de m odo que las colonias típicas sin hemolisis deben ser evaluadas m ejor Si no se iden­ tifican estreptococos del grupo B después de la incubación durante 18-24 horas, reincube e inspeccione a las 48 horas para identificar los m icroorganismos sospechosos. • Se pueden utilizar distintas pruebas de látex para el agrupam iento de Streptococcus u otras pruebas para detección de antígeno de estreptococos del grupo B (p. ej., sonda genética) para la identificación específica o se puede utilizar la prueba de CAM P para una identificación presuntiva. Procedim iento para las pruebas de sensibilidad en disco para clindam icina y eritrom icina en las cepas aislad as, cuando se indican en pacientes alérgicos1 • Utilice un hisopo de algodón para fabricar una suspensión a partir de un crecim iento de 18-24 horas del m icroorganism o en solución salina fisiológica o caldo de Mueller-Hinton para equiparar el estándar de turbidez de M cFarland 0,5. • Dentro de los 15 minutos de ajustar la turbidez. sumerja un hisopo de algodón estéril en la suspensión ajustada. El hisopo debe rotarse varias veces y pre­ sionarse con firm eza en la pared lateral del tubo por encim a del nivel del líquido. Utilice el hisopo para inocular toda la superficie de una placa de agar sangre de carnero. U na vez que la placa está seca, utilice una pinza estéril para colocar un disco de clindam icina (2 (ig) en el 50% de la placa y un disco de eritrom icina (15 |ig ) en la otra mitad. • Incube a 35 °C en C 0 2 al 5% durante 20-24 horas. • M ida el diám etro de la zona de inhibición utilizando una regla o calibradores. Interprete según las pautas de NCCLS para especies de Streptococcus distin­ tas de S. pneum oniae (valores críticos 2 0 0 2 c: clindamicina: > 19 mm = sensible, 16-18 mm = intermedio, < 15 m m = resistente; eritromicina: > 21 mm = sensible; 16-20 mm = intermedio, < 1 5 mm = resistente.

aAntes del paso de inoculación, algunos laboratorios pueden decidir hacer rodar el/os/ hisopo/s sobre una sola placa de agar sangre de camero o una placa de agar sangre de camero con colistina-ácido nalidíxico (CAN). Esto sólo se debe hacer además de la inoculación en caldo selectivo y no en su lugar. La placa debe ser sembrada en estría para el aislamiento, debe ser incubada a 35-37 °C en aire ambiente o en C 0 2 al 5% durante 28-24 horas y debe ser inspeccionada para detectar microorganismos sugestivos de estreptococos grupo B como se describió antes. Si las colonias sospechosas son confirmadas como estreptococos del grupo B, el caldo puede ser descartado, lo que acorta el tiempo para obtener los resulta­ dos de los cultivos. bFenton U , Harper M. H. Evaluation o f colistin and nalidix acid in Todd-Hewitt brothfor selective recovery o f group B streptococci. J Clin Microbiol 1979;9:167-169. Aunque existe a menudo el medio Trans-Vag sin sangre de camero, la comparación directa del medio con sangre de carnero y sin ella ha mostrado un rendimiento más alto cuando se agrega sangre. El caldo LIM también puede beneficiarse con el agregado de sangre de camero, aunque la mejoría en el rendimiento es más pequeña y no existen aún datos suficientes para sostener una recomendación. ‘National Committee fo r Clinical Laboratory Standards. Estándar de rendimiento para pruebas de sensibilidad a los antibióticos. M100-S12, cuadro 2H, Wayne, PA. . NCCLS, 2002. NCCLS recomienda las pruebas de difusión con discos (M-2) o de microdilución en caldo (M-7) para evaluar la sensibilidad de estreptococos del grupo B. También se pueden utilizar sistemas comerciales que han sido aceptados o aprobados para el examen de estreptococos distintos de S. pneumoniae. No se recomiendan de rutina las pruebas de sensibilidad a la penicilina para estreptococos del grupo B porque hasta la fecha no se han confirmado cepas resistentes.

cesárea y 25-30% de casos de bacteriuria asintomática durante el parto y después de él, también se asocian con distintas infecciones en adultos sin embarazo.344 Con la declinación de la enfermedad neonatal por estreptococos del grupo B, más de dos tercios de las infecciones ocurren ahora en adultos y no se vinculan con embarazo. En general, los adultos infectados tienen una enfermedad subyacente importante, como diabetes, cirrosis hepática, accidente cerebrovascular, neoplasia o dis-

función de las vías urinarias.516 Las infecciones de la piel y los tejidos blandos son las entidades clínicas más frecuentes asociadas con estreptococos del grupo B invasores e incluyen celulitis, abscesos, úlceras por decúbito infectadas e infecciones invasoras de heridas luego de procedimientos quirúrgicos.99146 La osteomielitis puede ocurrir como complicación de la celulitis por la propagación contigua, sobre todo en asociación con úlceras por decúbito o como resultado de la siembra hematóge-

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Cocos gram positivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “ sim ilares a Streptococcus"

na desde otro sitio de infección.385-414 Es necesario el tratamien­ to antibiótico con aspiración o drenaje abierto de las articula­ ciones infectadas y la extracción de los dispositivos protésicos, si están presentes, para lograr la curación. Los estreptococos del grupo B también constituyen la principal causa de osteo­ mielitis en los lactantes y la siembra hematógena del hueso es la fuente del microorganismo.940 La osteomielitis vertebral cau­ sada por estos estreptococos es rara y suele ser el resultado de la siembra hematógena desde otro foco o desde el tubo diges­ tivo.320-352 También se ha comunicado osteomielitis vertebral como complicación rara de la baeteriemia posparto e infeccio­ nes urinarias.64-629 En general, la artritis séptica por estos estrep­ tococos del grupo B se presenta con fiebre y dolor articular que sigue a la baeteriemia o es simultáneo con ella.384 Los pacien­ tes con artritis suelen ser ancianos, tienen diabetes o una neoplasia como factores de riesgo y presentan hemocultivos o cul­ tivos sinoviales positivos.851 También se han comunicado raros casos de fascitis necrosante debida a estreptococos del grupo g 812,937 g n general, la neumonía por estos estreptococos ocurre en huéspedes debilitados más ancianos, a menudo es el resul­ tado de la aspiración del contenido orofaríngeo y se puede complicar con el desarrollo de empiema.392-1007 La conjuntivitis, la queratitis y la endoftalmitis hematógena por estreptococos del grupo B son infecciones graves, aunque raras, que ocurren en ojos con daño previo y conducen a una patología importan­ te, que lleva a disminución de la agudeza visual o incluso a la ceguera.747 La baeteriemia por estreptococos del grupo B desde un foco distante de infección puede conducir a meningitis y endocardi­ tis. La meningitis es rara, representa un 4% de la meningitis bacteriana en los adultos y ocurre principalmente en mujeres posparto y adultos de edad avanzada con enfermedades subya­ centes crónicas, como diabetes, cirrosis, deterioro neurológico, neoplasias, insuficiencia renal, enfermedad cardiovascular/pul­ monar e infección por HIV.295-441-635 También se ha comunicado meningitis por estreptococos del grupo B luego de un trauma­ tismo de cráneo grave o asociada con rinorrea de líquido cefa­ lorraquídeo.1002 La endocarditis ocurre tanto en varones como en mujeres, se puede presentar de forma aguda o subaguda y representa el 2-18% de las enfermedades invasoras por estrep­ tococos del grupo B en los adultos.45-345 Las anomalías cardía­ cas preexistentes suelen estar presentes antes del inicio de la enfermedad y, una vez establecidas, habitualmente se desarro­ llan grandes vegetaciones y la válvula mitral es la más afecta­ da. Las complicaciones causadas por fenómenos embólicos o por la rápida destrucción del tejido valvular puede requerir el reemplazo valvular.382,873 La endocarditis en recién nacidos y lactantes ocurre pocas veces pero se asemeja a los casos en los adultos, con destrucción valvular extensa y aparición de fenó­ menos embólicos.20,901 La baeteriemia, la endocarditis y la meningitis por estreptococos del grupo B en los pacientes con cáncer gastrointestinal, colónico o pancreático han sugerido una asociación similar a la que existe entre S. bovis, y enfer­ medades colónicas y cáncer de colon.390-1066 La bacteriuria por estreptococos del grupo B se ha asociado con una evolución desfavorable del embarazo, mayor tasa de trabajo de parto prematuro y rotura prematura de membra­ nas.692,1074 Además de ser una causa bien reconocida de infec­ ción urinaria en las mujeres embarazadas, este microorganismo es una causa de cistitis y pielonefritis en hombres, mujeres no embarazadas y niños.704 Entre el 5% y el 20% de los adultos sin embarazo con baeteriemia tienen infección urinaria por estrep­ tococos del grupo B.516,705 Los factores de riesgo para la infec­ ción urinaria causada por este microorganismo son edad avan­

zada, enfermedad subyacente (sobre todo diabetes), presencia de un catéter urinario permanente, infecciones urinarias pre­ vias, anomalías estructurales del aparato urinario y otros tras­ tornos comórbidos (p. ej., enfermedad prostática).345-704 La pie­ lonefritis y el absceso renal son posibles complicaciones de la infección ascendente y la diseminación hematógena de los estreptococos del grupo B.1079 Estos estreptococos pueden producir el síndrome similar al shock tóxico que se asocia con estreptococos del grupo A.386-860 Schlievert y cois, comunicaron el caso de una mujer de 27 años que presentó una enfermedad similar al shock tóxico que con­ sistía en fiebre, hipotensión y erupción eritematosa, descama­ ción y falla multiorgánica.860 Aunque sus hemocultivos fueron negativos, se aislaron estreptococos p-hemolíticos grupo B en los cultivos de orina y vaginales. Otros estudios de estos culti­ vos demostraron que producían una sustancia tóxica que tenía las propiedades asociadas con las exotoxinas pirógenas; la sus­ tancia producía fiebre, mayor sensibilidad a la endotoxina en animales de experimentación y actuaba como un mitógeno linfocítico potente. Al igual que los estreptococos del grupo A, los del grupo B siguen siendo sensibles a la penicilina G, el fármaco de elec­ ción para el tratamiento de las infecciones y para la quimio­ profilaxis perinatal de mujeres que eran portadoras vaginales de estreptococos del grupo B.708 También son altamente acti­ vas ampicilina, cefotaxima, ceftriaxona, cefazolina, quinupristina-dalfopristina y meropenem, y la mayoría de las cepas tienen concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) < 0,06 (ig/mL.27,551-668,708 Algunos estreptococos del grupo B demues­ tran resistencia a la eritromicina y la clindamicina, y la propor­ ción de cepas resistentes varía con la localización geográfica. En una encuesta de 119 cepas invasoras y 227 cepas coloniza­ doras de estreptococos P-hemolíticos del grupo B aisladas en recién nacidos de seis centros académicos de los Estados Unidos, el 20,2% y el 6,9% eran resistentes a la eritromicina y la clindamicina, respectivamente.627 Entre las cepas aisladas en California, el 32% y el 12% fueron resistentes a la eritromici­ na y la clindamicina, respectivamente, mientras que las cifras correspondientes para las cepas aisladas en Florida fueron del 8,5% y del 2,1%. Los datos nacionales estadounidenses de sensibilidad de los microorganismos aislados en el torrente circulatorio de centros que participan en el programa de vigi­ lancia SENTRY mostraron que el 25,4% de las cepas de los Estados Unidos y el 14,3% de las de Canadá eran resistentes a la eritromicina y el 7% de los aislamientos provenientes tanto de los Estados Unidos como de Canadá eran resistentes a la clindamicina.27 Los genotipos de resistencia a macrólidosgentamicina que se han detectado en estreptococos del grupo B incluyen ermA (resistentes a la eritromicina, sensibles a la clindamicina), ermB (resistentes a la eritromicina, resistentes a la clindamicina) y m ef (resistentes a la eritromicina, sensi­ bles la clindamicina).285 Todas las cepas de estreptococos del grupo B evaluadas hasta la fecha han sido sensibles a la van­ comicina.

Estreptococos fi-hemolíticos de los grupos CyG Los estreptococos P-hemolíticos del grupo C actualmente incluyen S. dysgalactiae subespecie equisimilis, S. dysgalactiae subespecie dysgalactiae, S. equi subespecie equi y S. equi subespecie zooepidemicus. Se ha demostrado que las cepas anteriores de S. equisimilis aisladas en seres humanos portan

E s tre p to c o c o s (3-hem olíticos del g ru p o F

los antígenos del grupo C o del grupo G de Lancefield y son desde el punto de vista genético lo suficientemente similares a las cepas del grupo C de los animales (subespecie dysgalactiae) como para ser ubicadas en la misma especie, pero corres­ ponden a diferentes subespecies.89,992,1011 S. dysgalactiae subes­ pecie equisimilis crece como colonias grandes en agar sangre de carnero (SBA) y suele ser P-hemolítico. Las cepas relacio­ nadas que portan el antígeno del grupo C o L y son aisladas pri­ mariamente en animales se denominan ahora S. dysgalactiae subespecie dysgalactiae.992 Las cepas de esta subespecie pue­ den ser a-hem olíticas, [3-hemolíticas o no hemolíticas. Además, algunos estudios genéticos moleculares han hallado grandes semejanzas entre las especies anteriores S. equi y S. zooepidemicus; estas especies han sido reclasificadas ahora como S. equi subespecie equi y S. equi subespecie zooepidemi­ cus.341 Estas subespecies son portadoras del carbohidrato antigénico del grupo C de Lancefield en su pared celular y produ­ cen hemolisinas que son similares a las de los estreptococos del grupo C. Las subespecies de S. equi y S. dysgalactiae for­ man colonias grandes en SBA, lo que las diferencia de los estreptococos a-hemolíticos, p-hemolíticos o no hemolíticos "diminutos” o de “colonias pequeñas” del grupo anginoso de estreptococos viridans, que también pueden portar el antígeno polisacárido del grupo C.987 Los microorganismos del grupo anginoso también difieren de los microorganismos del grupo C de “colonias grandes” desde el punto de vista genético y fenotípico.332,604 Algunos estudios de casos y controles indican que los microorganismos del grupo C de colonias grandes pueden producir faringitis, mientras que los del grupo anginoso que portan el antígeno del grupo C (o A, G o F) no lo hacen.198 Sin embargo, algunos estudios recientes han realizado una asocia­ ción entre faringitis y una subespecie recién descrita de S. constellatus, S. constellatus subespecie pharyngis.1051 S. dysgalactiae subespecie equisimilis, la cepa humana más frecuente, ha sido aislada en la faringe de portadores y en perso­ nas con faringitis y amigdalitis exudativa.236,370,681,977,978,1090 Este microorganismo también ha sido aislado en otras infecciones, tanto en niños como en adultos, que incluyen sepsis en huéspe­ des neutropénicos, sepsis puerperal, celulitis, fascitis necrosante, neumonía, epiglotitis, empiema, bacteriemia. meningitis, absce­ so encefálico, osteomielitis, artritis séptica, endocarditis, endof­ talmitis, absceso intraabdominal, sepsis relacionada con catéte­ res y meningitis.35,39,81,157,732,757,796,840,892,895,911,1062 La mayoría de los pacientes con estas infecciones tienen enfermedades subyacen­ tes, como enfermedad cardiopulmonar crónica, diabetes, inmunosupresión, trastornos dermatológicos, neoplasias, infección por HIV y alcoholismo.840,892,922Los estreptococos p-hemolíticos que tienen antígenos de los grupos C y G también han sido aso­ ciados con síndrome del shock tóxico estreptocócico, fascitis necrosante y fiebre reumática aguda.466,562,1062 El cribado de ais­ lamientos de estreptococos de los grupos C y G para exotoxinas pirogénicas estreptocócicas ha identificado sólo el gen para SPE G (speG) y los otros SPE y sus respectivos genes naturales están ausentes.466,836 Sin embargo, Igwe y cois, examinaron 21 cepas de estreptococos P-hemolíticos de los grupos C y G y observa­ ron que 11 eran PCR positivas al menos para uno de los genes speM, ssa o smeZ, que son miembros de la familia de los supe­ rantígenos de los estreptococos del grupo A.509 5. equi subespecie zooepidemicus causa distintos tipos de enfermedades en animales, entre ellas mastitis bovina, infec­ ciones respiratorias en caballos, artritis purulenta en corderos y cabras, e infecciones genitales en aves de corral. S. equis subes­ pecie zooepidemicus también ha sido implicado en infecciones humanas, como neumonía, bacteriemia, endocarditis, meningi­

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tis, artritis séptica, aneurisma de la aorta abdominal, trombosis venosa profunda, nefritis y linfadenitis cervical.54,55,204,601,1088 Los brotes de faringitis humana causados por S. equis subespe­ cie zooepidemicus han sido rastreados al consumo de leche de vaca no pasteurizada y queso casero que contenía los microor­ ganismos.310,375 En algunos de los individuos afectados, tam­ bién se observó glomerulonefritis posestreptocócica.375 S. equi subespecie equi es la causa de una infección respiratoria de los caballos llamada “gurma” o “papera equina”, caracterizada por fiebre alta, secreción nasal mucopurulenta y abscesos en los ganglios linfáticos submandibulares y retrofaríngeos que finalmente se rompen y drenan en el aparato respiratorio del animal infectado.957 Este microorganismo es excepcional en seres humanos y ha sido aislado en casos de bacteriemia y meningitis.81,326 Los estreptococos p-hemolíticos del grupo G constituyen una parte de la flora gastrointestinal, vaginal, orofaríngea y cutánea humana normal. Las cepas con antígeno del grupo G aisladas en humanos también se denominan S. dysgalactiae subespecie equisimilis y las cepas con este antígeno aisladas en animales corresponden a S. canis,277,1010 Las infecciones causa­ das por cepas del grupo G asociadas con seres humanos son faringitis, otitis media, infecciones pleuropulmonares, celulitis, tromboflebitis séptica, bacteriemia, endocarditis y meningi­ tis.519,644,1001,1032,1069,1072 También se han comunicado infecciones graves de las prótesis óseas y articulares causadas por estos microorganismos.139 Se ha informado celulitis y artritis séptica por estreptococos del grupo G en el sitio de una inyección parenteral o cerca de él, con bacteriemia y complicaciones hematógenas ulteriores, en adictos a drogas intravenosas.243,408 La bacteriemia por este microorganismo también se observa en las circunstancias clínicas de neoplasias subyacentes, sepsis puerperal, aborto séptico, enfermedad pulmonar crónica e insu­ ficiencia cardíaca congestiva. Se ha comunicado meningitis y sepsis por estreptococos del grupo G en un paciente con SIDA.800 Se identificó S. canis, el estreptococo del grupo G ais­ lado en perros, en un ser humano con sepsis en 1997.90 En general, los estreptococos p-hemolíticos de los grupos C y G son sensibles a penicilina, ampicilina y cefalosporinas de tercera generación, como ceftriaxona.52,159,961 Algunas cepas pueden mostrar una sensibilidad intermedia a la penicilina G, pero son sensibles a las cefalosporinas de tercera y de cuarta generación. Algunas cepas pueden ser resistentes a la eritromi­ cina y a otros macrólidos (p. ej., clindamicina, claritromicina y azitromicina). Todas las cepas evaluadas hasta la fecha han sido sensibles a la vancomicina.

Estreptococos $-hemolíticos del grupo F Los microorganismos de este grupo han sido llamados S. milleri en el esquema taxonómico británico y el grupo angi­ noso (S. anginoso, S. constellatus y S. intermedius) en los esquemas taxonómicos estadounidenses. Estos microorganis­ mos pueden ser a-hemolíticos, P-hemolíticos o no hemolíticos y pueden tener el antígeno grupo F, C o G o pueden ser no agrupables. Estos estreptococos característicamente crecen en colonias diminutas en medios de agar. Las colonias son puntiformes después de 24 horas y, si son P-hemolíticas tienen una zona grande de hemolisis que se extiende mucho más allá del margen de la colonia. Los estreptococos P-hemolíticos del gru­ po F son causas reconocidas de infecciones supuradas graves, como celulitis, abscesos de tejidos profundos, bacteriemia,

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osteomielitis y endocarditis (véase luego la sección sobre “El grupo anginoso”). El grupo anginoso se explicará con los estreptococos viridans.

Otros estreptococos del grupo de “cocos pi ágenos” Se describieron otros estreptococos P-hemolíticos piógenos que portan otros antígenos de la pared celular de Lan­ cefield y que producen infecciones en animales. Estos estrep­ tococos son S. porcinus, S. iniae (S. shiloi), S. phocae y S. didelphys. Las cepas de S. porcinus pertenecen al grupo E, P, U o V de Lancefield y causan infecciones en cerdos. En 1995, Facklam y cois, comunicaron sobre 13 cepas de S. porcinus que se habían descubierto en seres humanos y fueron enviadas a los CDC en los 10 años anteriores.337 De estas 13 cepas, 5 prove­ nían del aparato genital femenino (vagina, cuello uterino), 3 eran de tejidos placentarios, 2 fueron aislados en sangre y se aisló una en piel, una en orina y otra en una herida infectada. Nueve reaccionaron con el nuevo y provisorio antígeno Cl de grupo, 3 reaccionaron con el antisuero contra grupo P de Lan­ cefield y 1 no fue agrupable. S. iniae es un patógeno de algu­ nos peces, como la tilapia, pero puede causar baeteriemia, meningitis y endocarditis en personas que manipulan peces contaminados.1034 S. shiloi, una especie de estreptococos P-he­ molíticos que causa meningoencefalitis en las truchas, es idén­ tico desde el punto de vista bioquímico y genético a S. iniae?'1 S. phocae es un Streptococcus P-hemolítico que provoca infec­ ciones pleuropulmonares en focas de puerto y focas grises. En la descripción original de esta especie, se caracterizaron 22 cepas.898 Cinco de las 22 cepas reaccionaron con los antisueros para el grupo C de Lancefield. pero las 17 restantes no fueron agrupables. Las mismas 5 cepas reaccionaron con el reactivo de látex grupo C Streptex, 13 reaccionaron con el reactivo de látex grupo F Streptex y 4 no reaccionaron con ningún reacti­ vo Streptex. S. didelphys es un Streptococcus P-hemolítico que ha sido aislado en lesiones cutáneas, hígado, bazo y pulmones de zarigüeyas.835 Esta especie es inusual en cuanto que la prue­ ba de catalasa es fuertemente positiva hasta que el microorga­ nismo ha sido subcultivado varias veces. S. urinalis es un Streptococcus antes no descrito que fue ais­ lado en una muestra de orina de un paciente con cistitis.212 La secuenciación comparativa de genes RNA (rRNA) ribosómico 16S muestra que este microorganismo pertenece al subgrupo de cocos piógenos de los estreptococos y tiene afinidad filogenéticas estrecha con los estreptococos P-hemolíticos del grupo A y S. canis (grupo G). Al contrario de la mayoría de los miem­ bros del subgrupo piógeno, esta especie es a-hemolítica en SBA.

Streptococcus pneumoniae Factores de virulencia

La virulencia de S. pneumoniae es atribuible fundamental­ mente a su capacidad para resistir la opsonización. la fagocito­ sis y la destrucción intracelular de las células fagocíticas.711 Esta resistencia se relaciona fundamentalmente con la cápsula de polisacárido del microorganismo. En modelos animales, la inhibición de la producción de la cápsula mediante técnicas genéticas (mutagénesis de transposones) vuelve a estos micro­ organismos avirulentos. Existen al menos 90 tipos capsulares de S. pneumoniae', 23 de estos tipos representan más del 88% de las bacteriemias y meningitis por neumococos.711 Los poli­

sacáridos capsulares en S. pneumoniae están compuestos por polímeros largos de unidades repetidas formadas por dos a siete monosacáridos, algunos de los cuales pueden estar en cadenas largas o ramificadas.988 Estos polímeros se sintetizan por el agregado de porciones de hidratos de carbono al extremo proximal de la cadena y la mayoría de los tipos están fijados al peptidoglucano y el polisacárido C de la pared celular. Algunos tipos de la cápsula neumocócica (p. ej., tipo 3) tienen propie­ dades biológicas que tornan a estos microorganismos más virulentos que otros y los neumococos que pertenecen a los diferentes serotipos capsulares varían en su capacidad para pro­ ducir respuestas de anticuerpos humorales.988 Estas caracterís­ ticas pueden explicar la mayor virulencia asociada con algunos tipos capsulares sobre otros. Al parecer, la adherencia inicial de los neumococos a la mucosa nasofaríngea no está mediada por material capsular sino que está relacionada con adhesinas bac­ terianas que interactúan con receptores sobre las superficies de las células epiteliales faríngeas. La interacción puede ocurrir con el ácido siálico mucoso a través de la neuraminidasa neu­ mocócica o a través de ligandos de la superficie celular del neumococo que se unen a residuos disacáridos de A?-acetil-Dgalactosamina-galactosa sobre las superficies de las células del aparato respiratorio.26 Los neumococos también tienen tanto ácidos teicoicos como ácidos lipoteicoicos. Los ácidos teicoi­ cos están ligados de forma covalente al peptidoglucano de la pared celular por enlaces fosfodiéster, mientras que los ácidos lipoteicoicos están ligados a la membrana celular. Estas molé­ culas son estructuralmente similares y están compuestas por unidades repetidas que contienen glucosa, 2-acetamido-4amino-2,4,6-tridesoxi-D-galactosa, A^-acetil-glucosamina, fosfocolina y ribitol-5-fosfato. Las unidades repetidas están liga­ das entre sí por enlaces fosfodiéster. Los ácidos teicoicos y los ácidos lipoteicoicos de S. pneumoniae también se denominan polisacárido C y antígeno F, respectivamente, y todos los sero­ tipos neumocócicos tienen ambos antígenos. Otros productos celulares de S. pneumoniae, como neumolisina, autolisina y moléculas de la superficie celular, pueden desempeñar un papel en la virulencia de los neumococos. Los mutantes defectuosos en la producción de estos distintos com­ ponentes tienen una virulencia menor en modelos animales, y la inmunización con productos purificados conduce a la pro­ ducción de anticuerpos específicos que confieren una resisten­ cia parcial ante la exposición a infecciones.120 La neum olisina es una proteína citotoxina activada por tiol de 53 kDa que se acumula dentro de las células durante el crecimiento y es libe­ rada con la lisis celular por la autolisina.121 La neumolisina interactúa con el colesterol en las membranas celulares de dis­ tintas células huéspedes, forma oligómeros sobre la membrana y dentro de ella que evolucionan a poros, y finalmente lisa las células. Además, inhibe la actividad bactericida de las células fagocíticas, detiene la motilidad ciliar, estimula la producción de citocinas por los macrófagos (sobre todo interleucina [IL]1, IL-8 y factor de necrosis tumoral [TNF]) y activa la vía clá­ sica del complemento.202,203’828 Los mutantes que carecen de capacidad para producir neumolisina tienen menor virulencia en modelos animales y la inmunización con neumolisina puri­ ficada proporciona una protección parcial a una carga de cepas virulentas, productoras de neumolisina.87,761 La autolisina es una Af-acetil-muramoil-L-alanina amidasa que, junto con una enzima glucosidasa, funciona durante la división celular para separar las células hijas, y al final del crecimiento exponencial para dividir los microorganismos, produciendo dispersión lítica de neumolisina y a-hemolisina.85 La virulencia está dismi­ nuida en los mutantes negativos para autolisina en comparación

Streptococcus pneumoniae

con las cepas de tipo silvestre.151 Es probable que la menor virulencia se deba a la falta de liberación de componentes tóxi­ cos de la pared celular y neumolisina y, por ende, a la genera­ ción de una respuesta inflamatoria muy reducida. Las cepas de S. pneumoniae también producen dos enzim as neuram inidasa diferentes (NanA y N anB ), que escinden el ácido siálico terminal de las superficies celulares para exponer las porcio­ nes N-acetil-glucosamina-galactosa que median la adherencia de las células bacterianas.148 Se ha propuesto que las neuraminidasas liberadas en el sistema nervioso central (SNC) por neumococos in vivo pueden producir la desialilación de la gpl20 sialilada del HIV y de los receptores de quimiocinas/CD4 de las células de la microglía/linfocitos diana del HIV, lo que conduce a la progresión de la infección viral y al desarrollo manifiesto de encefalitis por HIV.822 Algunas cepas neumocócicas también producen h ialu ron idasa y IgAj proteasas. La primera enzima facilita la propagación de los micro­ organismos en el tejido, mientras que la última inactiva la IgA secretoria para facilitar la colonización neumocócica y la inva­ sión ulterior de las superficies mucosas.86 También se descri­ bió una proteína de superficie denominada P spA (proteína de superficie A del neumococo) que es importante para la viru­ lencia neumocócica, aunque su función se desconoce.241-674 PspA es la proteína antigénica inmunodominante sobre la superficie de las células neumocócicas, y los anticuerpos diri­ gidos contra PspA de una cepa neumocócica dada protegen a los animales de experimentación contra la carga de la cepa homologa y de las cepas heterólogas. Los mutantes defectuo­ sos en la producción de PspA son avirulentos. La inoculación intranasal de ratones con PspA evita tanto la colonización del aparato respiratorio como el desarrollo de enfermedad invasi­ va.1080 Por esta razón. PspA es un antígeno que podría utilizar­ se para la elaboración de vacunas.130 Vacunas antineumocócicas

Actualmente, existen dos vacunas para la prevención de la enfermedad debida a S. pneumoniae: vacunas de polisacáridos puros y vacunas conjugadas de polisacáridos y proteínas. Las vacunas de polisacáridos neum ocócicos -Pneumovax23® (Merck and Company, Whitehouse Station, NJ) y PneuImune23® (Lederle, Wyeth-Lderle, Inc., Pearl River, NY)están compuestas por una mezcla de 23 polisacáridos capsula­ res neumocócicos.712 Los 23 serotipos capsulares incluidos en estas vacunas son 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F. Estos tipos capsulares representan por lo menos un 85-90% de los serotipos que causan infecciones neumocócicas invasivas en adultos y niños, y los seis serotipos que originan más a menu­ do infecciones neumocócicas resistentes a los fármacos en los Estados Unidos (serotipos 6B, 9V, 14, 19A, 19F y 23F).733 El Immunization Practices Advisory Committee (Comité Asesor sobre Prácticas de Inmunización) de los CDC recomienda la vacunación de: 1) personas de 65 años o mayores; 2) personas de 2-64 años que tienen una enfermedad crónica (p. ej., enfer­ medad cardiovascular crónica, miocardiopatías), enfermedad pulmonar crónica (p. ej., enfermedad pulmonar obstructiva cró­ nica [EPOC], enfisema, pero no asma), diabetes mellitus, alco­ holismo, hepatopatía (p. ej., cirrosis) o pérdidas de líquido cefalorraquídeo (LCR); 3) aquellos que presentan asplenia fun­ cional o anatómica (p. ej., drepanocitosis, esplenectomía): 4) personas de 2-64 años que viven en ambientes o circunstancias que los colocan en riesgo de enfermedad neumocócica invasora (nativos de Alaska, algunas poblaciones de indígenas norte­

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americanos, residentes de asilos y otras instituciones de cuida­ dos crónicos) y 5) personas de 2 años o mayores que están inmunodeprimidas, incluidas aquellas con infección por HIV, leucemia, linfoma, enfermedad de Hodgkin. mieloma múltiple, neoplasias, insuficiencia renal crónica, síndrome nefrítico y otros trastornos asociados con inmunosupresión (p. ej., tras­ plante de médula ósea) y personas que reciben inmunoterapia supresora.143-168 Se ha demostrado que son vacunas seguras, efi­ caces y relativamente poco costosas. Estas vacunas de polisa­ cáridos puros provocan una respuesta de anticuerpos en las células B, pero los antígenos son independientes de las células T, de modo que no se observa una respuesta inmunitaria pro­ tectora en los niños menores de 2 años.772 Otros inconvenientes de las vacunas de polisacárido neumocócico son su incapaci­ dad para afectar la portación nasofaríngea y, por lo tanto, la propagación de los microorganismos de una persona a otra, y su eficacia limitada en pacientes con neoplasias hematológicas o estados de inmunodeficiencia subyacente. En febrero de 2000, se autorizó el uso de PCV7 (Pneumoccocal Conjúgate Vaccine 7), una nueva vacuna de conjugado neumocócico heptavalente (Prevnar; Wyeth Lederle Vaccines, Peral River, NY) en lactantes y niños.169 PCV7 está compuesta por una proteína transportadora de toxina diftérica inerte (CRM197) ligada de forma covalente con los antígenos polisa­ cáridos capsulares de siete serotipos de S. pneumoniae. Los siete serotipos incluidos en la vacuna son los serotipos 4, 6B. 9V, 14, 18C, 19F y 23F, asociados con un 80% de enfermedad neumocócica que ocurre en niños menores de 6 años.169-772 Esta nueva vacuna se aplica en inyección intramuscular y se puede administrar simultáneamente con otras inmunizaciones infanti­ les. Se recomienda PCV7 para los niños de 2 años y menores, y se administra a los 2, 4 y 6 meses de edad, con una inmuni­ zación de refuerzo a los 12 y 15 meses de edad. La inmuniza­ ción inicial con PCV7 ya se puede iniciar a las 6 semanas de vida. Para los niños de 2 a 5 años de edad, el Advisory Committee on Immunization Practices (Comité Asesor sobre Prácticas de Inmunización) de los Estados Unidos ha recomen­ dado que los niños en alto riesgo de enfermedad neumocócica (niños con hemoglobinopatías por células falciformes, asplenia congénita/adquirida/funcional, inmunodeficiencias congénitas o adquiridas, tratamientos inmunosupresores, enfermedades crónicas) reciban tanto PCV7 como la vacuna de polisacáridos para aumentar la respuesta inmunitaria por la administración de un antígeno dependiente de las células T y ampliar la cober­ tura de anticuerpos más allá de los siete serotipos incluidos en la PCV7. La vacuna conjugada PCV7 provoca una respuesta viva de anticuerpos dependientes de las células T, necesaria para la producción óptima de anticuerpos y la capacidad para montar una respuesta ainnésica a través de la memoria inmuni­ taria.169-733-886 Algunos estudios grandes han mostrado que la nueva vacuna de conjugado heptavalente neumocócico es efi­ caz para evitar la enfermedad invasora en niños pequeños debi­ da a los serotipos de S. pneumoniae de la vacuna.547-810 Estos estudios indican que se previno más del 90% de la enfermedad neumocócica invasora debida a los serotipos de la vacuna en los niños inmunizados. Es interesante señalar que no se obser­ varon aumentos en las infecciones debidas a serotipos distintos de la vacuna durante los ensayos de eficacia clínica, y se obser­ vó que las tasas de portación nasofaríngea de S. pneumoniae estaban disminuidas en los niños vacunados, fenómeno no observado en los que recibieron la vacuna de polisacárido. En un pequeño estudio sobre eficacia se observó que la PCV7 pro­ vocaba también respuestas protectoras de anticuerpos en los niños con drepanocitosis.735

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Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “sim ilares a Streptococcus ”

Importancia clínica

S. pneumoniae es la causa principal de neumonía bacteriana extrahospitalaria. El microorganismo puede estar alojado en las vías respiratorias altas del 5-10% de los adultos, aunque se han comunicado tasas de portación mayores del 60% en poblacio­ nes cerradas.711 En general, los lactantes son colonizados alre­ dedor de los 3 a 4 meses de edad y se mantienen así durante unos 4 meses con un serotipo dado; la incidencia máxima de colonización neumocócica ocurre a los 2 a 3 años cuando la tasa puede ser de hasta 40-60%.109-430 En los adultos, la coloni­ zación y la portación persisten desde 2 a 4 semanas, pero pue­ den mantenerse mucho más tiempo, y las tasas de portación entre los adultos suelen variar del 5% al 10%.316 La duración de la portación disminuye con la edad y, por lo tanto, tiende a ser más prolongada en los niños que en los adultos. La coloniza­ ción de los lactantes con neumococos se relaciona con la ausencia de anticuerpos anticapsulares específicos y los seroti­ pos poco antigénicos que son frecuentes en este grupo etario.432 La sensibilidad de las personas ancianas a la enfermedad neu­ mocócica refleja el envejecimiento del sistema inmunitario y la producción disminuida ulterior de anticuerpos, junto con cam­ bios generales en los niveles de actividad, los mecanismos de depuración mucociliar comprometidos, la desnutrición o el debilitamiento debido a otras enfermedades crónicas subya­ centes, como diabetes y alcoholismo.140 La mayoría de las infecciones graves por S. pneumoniae ocurren en lactantes menores de 3 años y en mayores de 65 años.686-711 Las tasas de ataque son cuatro a cinco veces mayo­ res en los individuos de raza negra que en los de raza blanca.78 Esta diferencia parece ser real, aunque otros factores (p. ej., acceso a la asistencia de salud, otras condiciones biológicas o ambientales subyacentes) pueden influir en estas tasas. Las tasas de ataque también son más altas entre las poblaciones de nativos de Alaska, las poblaciones de indígenas nativos de los Estados Unidos y los aborígenes australianos.256-964 Los pacien­ tes con afecciones subyacentes que suprimen distintos meca­ nismos de defensa del huésped como hipogammaglobulinemia, deficiencias de los componentes del complemento y drepanocitosis, corren un riesgo mayor de enfermedad neumocócica invasiva.5431-1068 Las personas que tienen asplenia funcional o aquellas que han sufrido esplenectomías quirúrgicas están expuestas a un riesgo particularmente alto de desarrollar una baeteriemia neumocócica invasora y a menudo mortal.934 Entre los niños, las infecciones suelen asociarse con los serotipos 6, 14, 18, 19 y 23. En un estudio pediátrico de 15 años de dura­ ción llevado a cabo en Birmingham, Alabama, estos serotipos fueron responsables del 70% de los casos de meningitis y bacteriemia.432-745 Entre los adultos, predominan los serotipos 1, 3, 4, 7, 8 y 12. En el huésped apropiado, S. pneumoniae gana acceso a los espacios alveolares por la aspiración o inhalación y finalmen­ te puede producir neumonía lobular, con consolidación y bacteriemia.711 Los trastornos que se reconocen por predisponer a los adultos a la enfermedad neumocócica son enfermedad broncopulmonar subyacente y compromiso de la inmunidad humoral.140 Los trastornos que deterioran la respuesta inmuni­ taria humoral (p. ej., mieloma, linfoma, leucemia linfocítica crónica, cirrosis hepática, deficiencias de los componentes del complemento) probablemente tengan la influencia máxima sobre la sensibilidad individual a la infección neumocócica. La incidencia y la gravedad de la enfermedad neumocócica también están aumentadas en los individuos con defectos en los mecanismos de depuración de las vías respiratorias altas,

como los fumadores y los individuos con asma, bronquitis crónica, EPOC o carcinoma broncógeno y epidermoide del pulmón. Las infecciones respiratorias virales también predis­ ponen a la infección neumocócica del aparato respiratorio porque estos agentes dañan los mecanismos de depuración bronquial. El inicio de la neumonía neumocócica es casi siem­ pre brusco, aun en los pacientes en los que una infección viral respiratoria previa es el principal factor predisponente. En los niños mayores y los adultos jóvenes, los síntomas incluyen escalofríos, seguidos de fiebre sostenida, tos y producción de esputo purulento y a menudo hemoptoico. En los pacientes ancianos, la infección puede presentarse en forma insidiosa en varios días.631 Los síntomas pueden variar desde una tos míni­ ma, con disminución real de la temperatura, hasta una presen­ tación fulminante, que conduce rápidamente al shock y la muerte. Los hemocultivos son positivos en el 20-30% de los pacientes con neumonía neumocócica. En general, los adultos mayores tienen otros trastornos que los colocan en mayor ries­ go de enfermedad grave, como neoplasias, alcoholismo, car­ diopatía, EPOC y diabetes.658-711 Las radiografías de tórax de los pacientes con neumonía neumocócica demuestran consoli­ dación lobular en un 40-50% y el resto muestra un patrón bronconeumónico focal. Los infiltrados debidos a enfermedad neumocócica tienden a ser unilaterales y afectan los alvéolos, más que los bronquíolos y los tejidos intersticiales. Las com­ plicaciones de la neumonía neumocócica son absceso pulmo­ nar, infecciones pericárdicas, empiema, derrames pleurales y endocarditis.134 1086 Los derrames y los empiemas pleurales se pueden visualizar en las radiografías de tórax, pero se delinean mejor mediante tomografía computarizada (TC) y ecogra­ fía.134 Si las colecciones líquidas son lo suficientemente gran­ des, puede ser necesario un drenaje a través de la colocación de un tubo de toracostomía para lograr la curación, junto con la antibioticoterapia. Las TC y la ecografía son útiles para el diagnóstico de las neumonías necrosantes y los abscesos pul­ monares profundos debidos a S. pneumoniae. La tasa de mor­ talidad de la neumonía neumocócica es de un 5%, pero puede aproximarse al 20-30% cuando se acompaña por baeteriemia. La baeteriemia neumocócica sin afectación pulmonar es una entidad que ocurre en huéspedes inmunológicamente deprimi­ dos. Las enfermedades o los trastornos subyacentes que pre­ disponen a los pacientes a la baeteriemia neumocócica recu­ rrente o recidivante son esplenectomía. leucemia mieloide aguda, trasplante de médula ósea, drepanocitosis, infección por HIV y síndrome de intestino corto.395-404-589-743-803-808-1068 S. pneumoniae también es una causa importante de bacteriemia y sepsis tanto en niños como en adultos. En niños por otra parte sanos que tienen baeteriemia, alrededor del 25% se aso­ cian con una otitis media neumocócica coexistente, el 30-40% están ligados a neumonía o infecciones neumocócicas focales y el resto no tiene ningún foco identificable.246-431-745 Por otra parte, más del 90% de las bacteriemias en los adultos son el resultado de una neumonía.5 Como ya se mencionó, otros tras­ tornos comórbidos -asplenia, neoplasias, drepanocitosis e infección por HIV- contribuyen al desarrollo de baeteriemia y también afectan la respuesta final a los antibióticos y al trata­ miento de sostén. Aunque la mortalidad para la baeteriemia neumocócica y la sepsis es bastante baja en los niños, en los adultos se aproximan al 35-40%. S. pneumoniae también ha surgido como causa importante de enfermedad en pacientes infectados por HIV.803 Estas infecciones tienden a ocurrir al comienzo de la evolución de la infección por HIV (a menudo antes de que se haya considerado incluso un diagnóstico de ésta), son extraordinariamente graves, y pueden tener presenta­

Streptococcus pneumoniae

ciones clínicas inusuales junto con la bacteriemia.770 Rodriguez-Barradas informó cinco casos de infecciones neumocóci­ cas graves en pacientes infectados por HIV; las presentaciones incluyeron neumonía con derrames pleurales recurrentes, pioneumotórax complicado por una fístula broncopleural, púrpura fulminante con gangrena periférica de las extremidades, mediastinitis neumocócica con infección adyacente de los teji­ dos blandos de la pared torácica y absceso encefálico neumo­ cócico.819 S. pneumoniae también es la causa más frecuente de menin­ gitis bacteriana en adultos; con el uso creciente de las vacunas conjugadas de H. influenzae tipo b, el neumococo es el agente actual más frecuente en lactantes y niños pequeños.711 En los adultos, el neumococo representa alrededor de un tercio de las meningitis extrahospitalarias en los Estados Unidos y tiene una mortalidad asociada del 20-25%.304 En general, la meningitis por S. pneumoniae ocurre como resultado de la siembra de las meninges durante la bacteriemia, y los microorganismos pro­ bablemente entran a través del plexo coroideo. Los síntomas de presentación en alrededor del 60-70% de los adultos son fiebre, rigidez de la nuca y cambios del sensorio.973 En los lactantes, llanto, irritabilidad, malestar general, alimentación insuficien­ te, vómitos y convulsiones pueden dominar el cuadro clínico; se desarrolla un abombamiento de la fontanela sólo en un ter­ cio de estos niños. En ancianos, en inmunocomprimidos o en ambos, la presentación puede ser insidiosa y la norma es la somnolencia, la obnubilación y poca fiebre o ninguna. Sin embargo, puede ocurrir una meningitis, junto con el shock séptico mortal en pacientes que están profundamente inmunosuprimidos (p. ej., pacientes que han sufrido trasplante de médula ósea).449 S. pneumoniae también es la causa principal de meningitis luego de las fracturas de cráneo. El traumatismo de cráneo que produce una fractura de la base con pérdida de LCR interrumpe la integridad de la duramadre y puede permi­ tir la entrada directa de microorganismos en el SNC desde un sitio adyacente de infección (p. ej., sinusitis, mastoiditis, otitis media).711 En la población pediátrica, S. pneumoniae representa el 4050% de los casos de otitis media aguda y se ha asociado con sinusitis y mastoiditis.105-577 En los pacientes con otitis media, la membrana timpánica aparece inflamada, inmóvil y abomba­ da en el examen con un otoscopio. Las complicaciones de la otitis media neumocócica aguda son perforación de la mem­ brana timpánica, mastoiditis, parálisis del nervio facial, bacte­ riemia y artritis séptica.586 Es mejor obtener muestras para el diagnóstico a través de una miringotomía o timpanocentesis. Los neumococos, junto con H. influenzae, también son respon­ sables de un 70% de las infecciones sinusales agudas y subagudas. S. pneumoniae es una causa infrecuente de endocarditis, pericarditis, osteomielitis, artritis séptica, peritonitis, infeccio­ nes pelvianas agudas, infecciones neonatales e infecciones de piel/tejidos blandos. La mayoría de los pacientes tienen enfer­ medad subyacente, como diabetes, neoplasias, alcoholismo, lupus eritematoso sistémico o infección por HIV y otros focos de enfermedad neumocócica, como meningitis o neumonía. Las neumonías representan menos del 3% de los casos de endocarditis bacteriana y el 3-7% de todos los casos de endo­ carditis pediátrica.403 La endocarditis neumocócica sigue un curso agudo, se asocia con destrucción valvular y formación de abscesos perivalvulares aórticos y tiene una tasa de mortalidad de alrededor del 24% hasta más del 50%.391-615-783-893 El trata­ miento de la endocarditis neumocócica con terapia farmacoló­ gicamente sola se asocia con malos resultados. En general, los

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pacientes tienen cardiopatía preexistente y, en un estudio de endocarditis neumocócica en niños, la cardiopatía congénita fue el único factor de riesgo identificable.186 La peritonitis pri­ maria causada por los neumococos se observaba en otra época con frecuencia en los niños en asociación con síndrome nefrótico, pero en la actualidad ocurre sobre todo en adultos con cirrosis y otras hepatopatías junto con bacilos gramnegativos entéricos. La osteomielitis y la artritis séptica causadas por S. pneumoniae ocurren a menudo en niños con drepanocitosis.942 En los adultos, la artritis séptica neumocócica suele ocurrir en pacientes con bacteriemia y afecta más de una articulación en alrededor de un tercio de los pacientes.825 La mayoría de los casos pueden ser manejados con cobertura antibiótica apropia­ da y artrocentesis. En algunas mujeres, S. pneumoniae puede formar parte transitoria de la flora vaginal, y pueden ocurrir infecciones pelvianas, obstétricas y ginecológicas, sobre todo con trastornos subyacentes como la presencia de un dispositivo intrauterino o la cirugía ginecológica reciente.303-1043 Los absce­ sos tuboováricos debidos a S. pneumoniae también pueden ser una fuente de infecciones peritoneales neumocócicas.897 Se han comunicado infecciones neumocócicas neonatales que repre­ sentan el 1-11% de los casos de sepsis neonatal.488 Estos niños presentan meningitis, bacteriemia, neumonía, artritis/osteomie­ litis séptica u otitis media, casi siempre han nacido a término, y tienen 2 a 3 semanas de vida en el momento de la presenta­ ción. La fuente probable de infección es el aparato genital de la madre. S. pneumoniae también ha sido reconocido como causa importante de infecciones de los tejidos blandos, que incluyen celulitis facial y periorbitaria, fascitis, rabdomiólisis y abscesos.104-428-603-758-765-771-786-914-920 Estas infecciones ocurren en hués­ pedes con trastornos subyacentes, como lupus eritematoso sistémico, enfermedad renal en estadio terminal, artritis reumatoide, diabetes tipo 2 o infección por HIV. Algunos investi­ gadores también han observado una asociación con las colagenopatías.287 Una preocupación importante con respecto a S. pneumoniae es la aparición de resistencia a los antibióticos, sobre todo a la penicilina.33-153-579 Los neumococos con resistencia disminuida a la penicilina fueron comunicados inicialmente en la década de 1960. Durante las décadas de 1970 y 1980, la resistencia a la penicilina entre las cepas de S. pneumoniae era rara en los Estados Unidos y sólo el 0,2% eran resistentes. Sin embargo, a mediados de la década de 1990, el 35% de la totalidad de los aislamientos neumocócicos de los Estados Unidos mostraron una menor sensibilidad a la penicilina.9-867 Algunos estudios más recientes entre poblaciones del sistema de vigilancia nacional de los CDC indican que la menor sensibilidad a la penicilina de las cepas de S. pneumoniae varía del 15% al 35%, según la región geográfica.1056 Entre 10 103 cepas extrahospi­ talarias de S. pneumoniae aisladas en muestras respiratorias durante 2000-2001 en 206 centros de 154 regiones de los Estados Unidos, el 38,9% mostraron menor sensibilidad a la penicilina.291 Esto también se documentó en cepas foráneas de S. pneumoniae. En un estudio de 2003, el porcentaje de cepas con menor sensibilidad a la penicilina fue del 6,5% en el Reino Unido, el 9,1% en Alemania, el 12,4% en Italia, el 36,4% en Grecia, el 54,5% en España y el 56,7% en Francia.545 La resis­ tencia a la penicilina de S. pneumoniae se asocia con una alte­ ración de las proteínas de unión a penicilina (PBP) que tienen menor afinidad para fijar la penicilina a la pared de la célula bacteriana.527 Las PBP son en realidad enzimas transpeptidasa que participan en la síntesis de peptidoglucanos y se han iden­ tificado seis PBP -designadas IA, IB. 2A, 2B, 2X y 3 - en S. pneumoniae. Las mutaciones en los genes que codifican PBP

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2B explican la resistencia de bajo nivel a la penicilina, mientras que las mutaciones en el gen para PBP 2X se asocian con resis­ tencia de alto nivel a la penicilina.903904 Se considera que las cepas con CIM de penicilina de 0,06 |ig/mL o menor son sen­ sibles, las que tienen una CIM de 0,1 a I pg/mL tienen resis­ tencia intermedia (y tienen una sensibilidad disminuida a la penicilina) y aquellas con CIM mayores de 1 (ig/mL son resis­ tentes.526 Las cepas que tienen una resistencia a la penicilina de alto nivel presentan una CIM de penicilina > 2 |ig/mL. Las cepas de S. pneumoniae que muestran menor sensibilidad o resistencia franca a la penicilina G también son menos sensi­ bles a otras penicilinas y cefalosporinas de todas las generacio­ nes, y se han comunicado fracasos terapéuticos para las infec­ ciones neumocócicas graves con agentes que antes eran útiles como cefotaxima, cefuroxima y ceftriaxona.153-162-526-542 Además de las penicilinas y las cefalosporinas, se informó una resisten­ cia simultánea de los neumococos a otros antibióticos, como macrólidos, sulfamidas y tetraciclinas.293'294-5461056 En un estu­ dio internacional publicado en 2004, la resistencia a los macró­ lidos fue máxima entre las cepas de S. pneumoniae en Asia (51,7% de resistencia), seguida de Europa (26% de resistencia), Estados Unidos (21,6% de resistencia). Medio Oriente (13,7% de resistencia), Pacífico Sur (10,6% de resistencia) y África (10% de resistencia).119 Se ha desarrollado una tendencia parti­ cularmente alarmante de resistencia neumocócica a los agentes antibióticos fluoroquinolonas.415 1056 En el capítulo 15 se presen­ ta más información relacionada con la sensibilidad a los anti­ bióticos de S. pneumoniae y los métodos para evaluarla.

Estreptococos viridans El grupo viridans incluye varias especies de estreptococos a-hemolíticos y no hemolíticos, la mayoría de los cuales cons­ tituyen parte de la flora normal de las vías respiratorias altas y del aparato urogenital.376 Los estreptococos viridans causan el 30-40% de los casos de endocarditis bacteriana subaguda, lo que conduce a su aislamiento de múltiples conjuntos de hemo­ cultivos.1027 La endocarditis por estreptococos viridans ocurre principalmente en individuos con enfermedad preexistente de las válvulas nativas; también puede asociarse con infección de válvulas protésicas. Esta endocarditis se presenta de forma insidiosa, y la fiebre, la fatiga y la pérdida de peso son los hallazgos más frecuentes. También se presentan a menudo soplos cardíacos, estigmas periféricos de endocarditis (p. ej., hemorragias lineales subungueales y conjuntivales, petequias) y vegetaciones en los ecocardiogramas. Las complicaciones incluyen enfermedad multivalvular, aneurismas de la válvula mitral, abscesos paravalvulvares y glomerulonefritis asociadas con inmunocomplejos circulantes.746-799 En un estudio reciente de 77 pacientes con endocarditis, el 18% tenía afectación de múltiples válvulas y el 36% de estas infecciones se debieron a estreptococos viridans.573 La identificación sistemática de las especies de estreptococos viridans asociadas con endocarditis bacteriana subaguda indican que S. mitis, S. sanguis, S. oralis, S. gordonii, S. mutans, S. salivarius, S. vestibularis y S. sinensis, una nueva especie a-hemolítica, son los estreptococos viridans que con más frecuencia producen endocarditis . 3oi,302,523,622,1027,1071 orofaringe es la fuente probable de bac­ terias en la mayoría de estas infecciones; a menudo se observa mala higiene bucal y enfermedad periodontal en estos pacien­ tes. Otros procedimientos, como sigmoidoscopia de fibra ópti­ ca y endoscopia gastrointestinal superior, también pueden pro­

vocar baeteriemia transitoria que puede infectar válvulas car­ díacas ya dañadas.695-727 Algunas comunicaciones recientes de endocarditis debidas a estreptococos viridans resistentes a la penicilina han ocurrido en pacientes que recibieron profilaxis con penicilina para procedimientos dentales.450-500 Aunque las bacteriemias transitorias por estos microorganis­ mos suelen resolverse en el huésped normal sin ninguna secue­ la adversa, se ha reconocido como entidad clínica distinta la baeteriemia prolongada por estreptococos viridans, sobre todo en pacientes pediátricos y adultos neutropénicos que se some­ ten a quimioterapia oncológica.I2'107-108-253-752-974'1096 En estos enfermos, la baeteriemia se asocia con la quimioterapia citotóxica agresiva administrada para el tratamiento de leucemias, linfomas o tumores sólidos y para el trasplante de médula ósea.12-43-138-921 Los factores de riesgo para el desarrollo de bacteriemia por estreptococos viridans en estos pacientes inmunode­ primidos son la administración de dosis altas de agentes citotóxicos (p. ej., citarabina), la presencia de ulceraciones mucosas bucales secundarias a la quimioterapia citotóxica o radiación, la ausencia de antibioticoterapia previa y la neutropenia grave.12-108-752 La mucositis bucal probablemente sirve como puerta de entrada para estos microorganismos en el torrente cir­ culatorio.253 Al respecto, la mala salud dental subyacente y la enfermedad periodontal son factores de riesgo para el desarro­ llo de baeteriemia por estreptococos viridans en los huéspedes neutropénicos 426 Algunos antibióticos utilizados para profila­ xis en estos enfermos también se asocian con baeteriemia por estreptococos viridans. En un estudio de 38 niños con neutro­ penia, el 60% estaba recibiendo trimetoprim-sulfametoxazol profiláctico en el momento de que el primer hemocuitivo se volvió positivo.12 También se ha identificado el uso profilácti­ co de fluoroquinolonas como factor de riesgo de baeteriemia en pacientes con leucemia mieloide aguda.769 En estos pacientes, la baeteriemia por estreptococos viridans puede complicarse por el desarrollo de síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA), hipotensión, shock y endocarditis bacteria­ n a , 107,108,741 Las especies de estreptococos viridans asociadas con baeteriemia neutropénica son S. mitis, S. oralis, S. saliva­ rius y S. s a n g u i s También se han comunicado infecciones bacteriémicas por estreptococos viridans en recién nacidos de término y de pretérmino de bajo peso al nacer.2 Las madres de estos recién nacidos suelen tener varios factores de riesgo que afectan adversamente el pronóstico del embarazo, como corioamnionitis, rotura prematura de membranas, inicio prematuro del trabajo de parto e infección urinaria en el mo­ mento del parto. Los estreptococos viridans también pueden ser aislados en raras ocasiones en otras infecciones graves, como meningitis y neumonía, sobre todo en huéspedes inmunodeprimidos. La meningitis causada por estreptococos viridans puede ocurrir tanto en adultos como en niños, y la presentación clínica difie­ re poco de la de otras meningitis piógenas (rigidez de la nuca, convulsiones, inflamación meníngea y alteración del senso­ rio).244-636 En general, el origen del microorganismo es endóge­ no; las anomalías estructurales congénitas de cabeza y cuello, las infecciones de cabeza y cuello, la endocarditis, las infec­ ciones extracraneales y el traumatismo de cráneo o los proce­ dimientos neuroquirúrgicos previos (p. ej., craneotomía) se han asociado con el desarrollo de meningitis, pero es posible que los orígenes definidos de la infección no estén señalados hasta en un tercio de los pacientes.585 Se ha documentado meningitis recurrente por estreptococos viridans en niños con anomalías estructurales del oído interno y los senos mastoideos.684 Las complicaciones de la meningitis incluyen supuración intracra­

E s tre p to c o c o s v irid a n s

neal y vasculitis cerebral.636 También se ha comunicado menin­ gitis y bacteriemia causadas por S. mitis y S. salivarías luego de punción lumbar, endoscopia digestiva alta y cauterización por hemorragia gástrica.1561085 Asimismo, se informó una meningitis recurrente por S. sanguinis en un varón de 15 años con una derivación ventriculoperitoneal.16 Colville y cois, informaron el primer caso de meningitis causado por S. oralis en una niña saludable de 12 años luego de la extracción de un diente canino deciduo como parte de su tratamiento ortodóntico.229 Se aisló S. salivarius como causa de meningitis en una mujer de 73 años antes sana en la que luego se descubrió que tenía un adenocarcinoma colónico asintomático, lo que sugirió una asociación de esta especie “similar a S. bovis” con una enfermedad neoplásica oculta.617 Otras infecciones del SNC, como absceso encefálico pueden ocurrir luego de un traumatis­ mo o cirugía de cráneo, o pueden ser secundarias a un foco pri­ mario de infección en otro sitio a través de la extensión directa desde un sitio contiguo o a través de la vía hematógena.237,637 Puede ocurrir una extensión directa desde infecciones odonto­ lógicas (p. ej., abscesos radiculares, periodontitis), infecciones de los senos paranasales o fuentes óticas.637 En general, los abs­ cesos óticos son únicos, se localizan en los lóbulos frontales o temporales, y pueden ser polimicrobianos. Los trastornos pre­ disponentes para el absceso encefálico por estreptococos viri­ dans son insuficiencia cardíaca congestiva, otitis media cróni­ ca, traumatismos de cráneo con rinorrea de LCR, sinusectomía y craneotomía seguida de la colocación de una derivación ven­ triculoperitoneal.935 También se ha comunicado una neumonía bacteriémica por estreptococos viridans. pero es rara. Marrie informó sobre siete pacientes con neumonía extrahospitalaria por estreptococos viridans 657 Todos los pacientes eran de edad más avanzada (49 a 80 años), tenían varios trastornos predisponentes (incluidos alcoholismo, carcinoma de pulmón resecado, hipotiroidismo y diabetes mellitus) y estaban bacteriémicos. Las cepas de estreptococos viridans de tres pacientes fueron S. mitis, S. sanguis y S. intermedius. Sarker y cois, comunicaron tres casos de neumonía extrahospitalaria por estreptococos viridans con hemocultivos positivos simultáneos en adultos antes sanos.843 Se presenta neumonía por estreptococos viridans en pacientes de edad avanzada en el caso de una aspiración orofaríngea954 Las complicaciones de la neumonía, como empiema y absce­ sos pulmonares asociados con neumonía por estreptococos viridans, son entidades clínicas relativamente raras.158,535 Diversas infecciones provocadas por distintas especies de estreptococos viridans han incluido epiglotitis, artritis séptica, osteomielitis vertebral secundaria a bacteriemia/endocarditis, pericarditis, síndrome de Lemierre y queratitis cristalina infec­ ciosa.117,309,512,611,676,969,980 En 2003, se comunicó un brote de un síndrome de shock tóxico en pacientes inmunocompetentes que residían en el delta del río YangZi en la provincia de Jiangsu. China.638 Este brote, que ocurrió durante 1990-1991, se debió a un clon de S. mitis. Con posterioridad se encontró este mismo clon, según los resultados de los patrones de elec­ troforesis en gel de campo pulsado, en otros pacientes con el síndrome desde 1991 a 1995. Esta cepa producía una proteína de 34 kDa que era pirógena en ratones, mitógena en esplenocitos cultivados y aumentaba la sensibilidad de los conejos a una carga de endotoxina. La secuenciación de esta proteína mostró que no estaba relacionada con exotoxinas pirógenas conocidas producidas por estreptococos (3-hemolíticos del grupo A y de otro tipo. Algunos estreptococos viridans que habitan en la cavidad bucal han surgido como patógenos importantes asociados pre­

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dominantemente con la iniciación y la patogenia de las caries dentales. S. mutans, S. sobrinus y otros miembros del “grupo mutans” de estreptococos bucales son capaces de producir enzimas denominadas glucosiltransferasas. que hidrolizan la sacarosa de la dieta (un disacárido de glucosa y fructosa) y conectan las porciones de glucosa entre sí en uniones a l . 6 y a l , 4 glucosídicas para formar glucanos insolubles.1083 Estos glucanos permiten a los microorganismos adherirse a las super­ ficies lisas de los dientes y forman la matriz de la placa dental. La fijación específica e inespecífica de 5. mutans y otros microorganismos a los glucanos adherentes e insolubles y la formación ulterior de ácidos conduce a la desmineralización del esmalte dental y a la iniciación de lesiones de caries.50 Otros estreptococos bucales, como S. sanguis, S. salivarius y tal vez S. gordonii, también pueden sintetizar estos polisacári­ dos. pero sólo el “estreptococo mutans" muestra un aumento de la colonización bucal inducido por sacarosa.632,983,1009 Además, los estreptococos mutans parecen producir mayor cantidad de ácido a partir de hidratos de carbono que otras bacterias buca­ les orales porque pueden fermentar una amplia variedad de azúcares y toleran más el ácido que otros estreptococos buca­ les.465,632 Estos microorganismos sintetizan polisacáridos intra­ celulares que pueden ser metabolizados a ácido en ausencia de hidratos de carbono fermentables exógenos, lo que les permite producir cantidades importantes de ácido incluso “entre las comidas”.632 Los estreptococos mutans integraban al principio una única especie -S. mutans- que estaba dividida en ocho serotipos designados “a" a “h” sobre la base de la especificidad serológica de los antígenos de hidratos de carbono de la pared celular. Luego, estos distintos serotipos fueron asignados a un estado de especies separadas.240 S. mutans (serotipos c, e y f) y S. sobrinus (serotipos d y g) son las especies que predominan en los seres humanos; la otra especie se encuentra en distintos animales.240 Los investigadores que se ocupan de la microbio­ logía dental han implementado métodos moleculares de detec­ ción directa de S. mutans en muestras de placa y gingivales, y anticuerpos monoclonales contra S. mutans que utilizan junto con técnicas de inmunotransferencia de colonias para la identi­ ficación y el recuento de estos microorganismos en muestras de saliva y de placa dental.271 Antes de la década de 1980, las especies de estreptococos viridans se describían por completo en función de sus caracte­ rísticas fenotípicas. El análisis mediante técnicas moleculares y genéticas y con series extensas de pruebas fenotípicas ha modi­ ficado considerablemente la taxonomía de estos microorganis­ mos. Los principales cambios ocurridos como resultado de estos análisis incluyen descripciones enmendadas de especies bien reconocidas como S. mitis y S. sanguis, el descubrimiento y la descripción de varias especies bucales nuevas (p. ej., S. vestibularis, S. gordonii, S, parasanguis, S. oralis, S. crista, S. sinensis y S. oligofermentans), la división de los serotipos del grupo S. mutans en distintas especies y la reasignación taxonó­ mica de “Streptococcus” viridans S. morbillorum como segun­ da especie en el género Ge,He//fl.24°.456-568.57i.958.iw9.io52,io7i fre_ cuencia de algunas de las especies recién descritas en muestras clínicas no se conoce y se esperan otras investigaciones a medi­ da que se disponga de métodos más fiables para su identifica­ ción en los laboratorios de microbiología clínica. Aunque se han comunicado en muestras humanas, S. uberis y S. parauberis se aíslan principalmente en animales; producen mastitis bovina.484,532,1059 En el pasado, los estreptococos viridans eran sensibles a penicilina, ampicilina y a la mayoría de los otros antibióticos. Sin embargo, en las dos últimas décadas los estudios de sensi­

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Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “sim ilares a Streptococcus"

bilidad a los antibióticos han mostrado con claridad que está aumentando la resistencia a penicilinas, cefalosporinas, amino­ glucósidos y otras clases de antibióticos, sobre todo entre las cepas de S. mitis. En 1992, Potgieter y cois, informaron la sen­ sibilidad a los antibióticos de 211 estreptococos viridans aisla­ dos en hemocultivos.782 Aunque todas las cepas fueron sensi­ bles a cefotaxima, ceftriaxona, imipenem y vancomicina, el 38% era resistente a la penicilina (CIM, > 0,25 ng/mL). el 41% era resistente a eritromicina y el 7% era resistente tanto a la eri­ tromicina como a la tetraciclina. Cinco cepas de S. mitis eran resistentes a la penicilina (CIM. 16 a 32 (ig/mL) y también mostraban mayor resistencia (CIM, 64 a 128 ng/mL) o alto grado de resistencia (CIM > 500 |ig/mL) a la gentamicina y la tobramicina. Kaufhold y Potgieter comunicaron sobre cuatro cepas de S. mitis aisladas en hemocultivos que eran resistentes a la penicilina (CIM, 16 a 32 |0.g/mL); dos de éstas eran resis­ tentes a la gentamicina (CIM, 128 (J.g/mL) y las otras dos mos­ traron alto grado de resistencia a la gentamicina (CIM, > 1 000 |j.g/mL).556 En un estudio de 352 aislamientos de estreptococos viridans de 43 centros médicos de los Estados Unidos, el 13% mostró alto grado de resistencia a la penicilina (CIM, > 4 |ig/mL) y 43% tuvo una resistencia intermedia (CIM. 0,25-2,0 |ig/mL) a la penicilina y S. mitis y S. salivarius comprendían las cepas altamente resistentes a la penicilina.292 Asimismo, el 44% de 50 aislamientos hemáticos del Memorial SloanKettering Cáncer Center era resistente a la penicilina.974 En 2001, Levy y cois, informaron sobre dos pacientes con endo­ carditis causada por cepas resistentes a la penicilina de S. mitis y S. sanguinis, respectivamente.622 Ambas cepas también fue­ ron resistentes a la ceftriaxona y sensibles a la clindamicina y la vancomicina. Un estudio publicado en 2004 de Finlandia observó que S. mitis constituía el 82% de los estreptococos viridans aislados en pacientes con neutropenia y que el 5% y el 4% de estas cepas mostraban resistencia a la penicilina (CIM, > 4 |ig/mL) y la cefotaxima (CIM, > 4 |ig/mL), respectivamen­ te.645 Hasta la fecha, no se han descrito estreptococos viridans resistentes a la vancomicina.

Grupo anginoso: Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus y Streptococcus intermedius Entre los estreptococos viridans, un grupo de microorganis­ mos que ha tenido revisiones taxonómicas repetidas es el “grupo anginoso”, también conocido como “grupo Streptococcus milleri” en la literatura taxonómica británica. El grupo anginoso de estreptococos viridans corresponde a tres especies -S. intermedius, S. constellatus y S. anginosus- que forman colonias diminutas en medios de agar. Estos microor­ ganismos pueden portar o no antígenos de grupo de Lancefield (grupo A, C, F o G) y pueden ser o no hemolíticos en agar san­ gre de carnero.1046 La mayoría de las cepas de S. anginosus son no hemolíticas, mientras que más del 50% de las de S. conste­ llatus pueden ser (3-hemolíticas; las cepas de S. intermedius pocas veces son (3-hemolíticas.521 10461050 Estos microorganis­ mos forman parte de la flora orofaríngea humana y pueden ser cultivados en las fauces, la nasofaringe y las crestas gingivales. También se encuentran normalmente en el tubo digestivo y en la vagina. La virulencia de este grupo puede estar relacionada con la presencia de una cápsula en algunas cepas, la producción de una proteína inmunosupresora parcialmente caracterizada y la producción de distintas enzimas que degradan glucosaminoglucanos (p. ej., neuraminidasa, DNasa, condroitinsulfato polimerasa y hialuronidasa).34-74-492-524-834 Algunas cepas que perte­

necen al grupo anginoso también pueden fijar fibronectina y producir una actividad similar a la trombina.1057 Además, algu­ nos estudios in vitro han mostrado que los estreptococos del grupo anginoso inhiben la quimiotaxis de los leucocitos poli­ morfonucleares y son ingeridos por las células PMN más rápi­ damente que S. aureus\ sin embargo, una vez ingeridos son destruidos más lentamente que éste.1025 Las cepas de S. inter­ medius también producen una toxina similar a la leucocidina, denominada interm ediolisina. que puede estar asociada con virulencia, aunque ni la toxina ni sus genes se encuentran en S. constellatus o S. anginosus.641 El estudio de cepas del grupo anginoso provenientes de la faringe humana ha conducido a la descripción de una nueva subespecie de S. constellatus -S. constellatus subespecie pharingys- que expresa el hidrato de carbono del grupo C y se asocia con faringitis.1051 Además, recientemente se delinearon cinco “ribogrupos” rRNA 16S entre las cepas de S. anginosus que difieren algo en sus carac­ terísticas fenotípicas y su potencial patogénico.522 S. intennedius, S. constellatus y S. anginosus se reconocen por su tendencia a producir abscesos purulentos en tejidos pro­ fundos, bacteriemia, endocarditis e infecciones intraabdominales, pulmonares, del SNC y bucales.88-365-520 La bacteriemia por estos microorganismos suele ser atribuible a un foco de infec­ ción en otro sitio, y el tubo digestivo y las vías respiratorias altas son las fuentes más frecuentes. Los abscesos metastásicos supurados constituyen una complicación importante de la bac­ teriemia. Las cepas de S. intermedius y S. constellatus se aso­ cian más a menudo con formación de abscesos que S. angino­ sus.'99 S. constellatus se aísla en infecciones odontógenas, pleuropulmonares e intraabdominales. S. intennedius también se aísla en infecciones pulmonares, pero se asocia más a menu­ do con abscesos de los tejidos blandos profundos, abscesos hepáticos e infecciones del SNC (p. ej., abscesos encefáli­ cos).1991048 S. anginosus a menudo participa en infecciones mixtas de origen gastrointestinal o genitourinario.4111048 Además, estas bacterias son los agentes causales en el 8% a más del 30% de todas las infecciones cutáneas y subcutáneas, y pueden ocasionar infecciones graves de los tejidos blandos, sobre todo en pacientes con trastornos subyacentes, como dia­ betes mal controlada y consumo de drogas intravenosas.885-930 Al igual que otros estreptococos viridans, los del grupo angi­ noso causan bacteriemia en pacientes con neutropenia y enfer­ medades subyacentes que son tratados con regímenes citotóxicos, aunque también puede ocurrir una bacteriemia fulminante en individuos antes sanos.365-521 Los estreptococos del grupo anginoso se aíslan con poca frecuencia en pacientes con endo­ carditis.614 Woo y cois, comunicaron seis casos de endocarditis del grupo anginoso entre 377 casos de endocarditis que ocu­ rrieron en Hong Kong en un período de 5 años.1073 Cinco pacientes tenían enfermedades subyacentes (cardiopatía reu­ mática, cardiopatía isquémica, enfermedad pulmonar obstruc­ tiva crónica, taquicardia supraventricular) y uno era adicto a drogas intravenosas. Todas las cepas de estos pacientes fueron identificadas como S. anginosus. En general, las infecciones pleuropulmonares y las infeccio­ nes de cabeza y cuello producidas por estreptococos del grupo anginoso ocurren como abscesos de flora mixta, que también sirven como fuentes para la diseminación hematógena. Las infecciones pulmonares a menudo son el resultado de la aspi­ ración del contenido orofaríngeo, que conduce a neumonía. La neumonía puede complicarse por empiema y la formación de abscesos pulmonares.780-788 Los microorganismos del grupo anginoso residentes de la cavidad bucal pueden producir abs­ cesos periodontales y periapicales y otras infecciones maxilo-

E s tre p to c o c o s del g ru p o D: el “c o m p le jo Streptococcus bovis/Streptococcus equinug' y e s p e c ie s re la c io n a d a s

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faciales supuradas.51 Fisher y Russell aislaron estreptococos del grupo anginoso en el 37% de 45 pacientes con abscesos periapicales dentoalveolares; todos salvo uno fueron S. angi­ nosus.364 Los microorganismos de sitios dentales infectados, senos paranasales, tejidos blandos y regiones periamigdalinas pueden propagarse por extensión directa para afectar el cráneo, la órbita y los espacios de los tejidos profundos en el cuello y el SNC.455 1030 En consecuencia, se pueden aislar microorganis­ mos del grupo anginoso en cultivo puro o mixto en casos de sinusitis crónica, abscesos encefálicos, abscesos submandibulares, líquido del oído medio o el oído interno, abscesos cervi­ cales, abscesos epidurales y líquido de empiema subdu-

micina y resistencia mediadas por la salida de macrólidos, res­ pectivamente. Aun cuando la mayoría de las cepas del grupo anginoso son relativamente resistentes a los aminoglucósidos (es decir, gentamicina), habitualmente se puede demostrar sinergia con los (3-lactámicos. Los microorganismos del grupo anginoso son sensibles a la vancomicina.626

r a J 282,478,504,1082

Los estreptococos del grupo D. que son comunes en la flora intestinal de los vertebrados, fueron identificados en un princi­ pio por sus características bioquímicas y antigénicas. Estos estreptococos tienen el antígeno ácido lipoteicoico del grupo D en sus paredes celulares. Algunas ex especies del grupo D son habitantes normales predominantes del tubo digestivo humano y fueron denominadas “enterococos”, mientras que otras espe­ cies que tienen el antígeno D y forman sólo una pequeña parte de la flora entérica normal fueron denominadas “no enteroco­ cos”. La consideración práctica que subyace en la división de estos microorganismos en dos grupos era que los enterococos suelen ser más resistentes a penicilinas, cefalosporinas y ami­ noglucósidos que los estreptococos del grupo D no enteroco­ cos. La aplicación de técnicas de genética molecular durante mediados de la década de 1980 condujo a la división de los estreptococos del grupo D en dos grupos. Las especies de ente­ rococos fueron colocadas en el género Enterococcus, mientras que las especies de no estreptococos se mantuvieron en el género Streptococcus. Los estreptococos del grupo D no enterococos fueron desig­ nados S. bovis o S. equinus sobre la base de sus características fenotípicas y su origen. Las cepas de S. bovis fueron divididas en dos biotipos sobre la base de la fermentación del manitol: las cepas de S. bovis biotipo I siguieron siendo manitol positi­ vas, mientras que las cepas biotipo II (o la variante S. bovis) eran manitol negativas. Las cepas biotipo II fueron divididas fenotípicamente sobre la base de la actividad de p-glucuronidasa (P-GUR): S. bovis biotipo II. 1 eran p-GUR negativas, mientras que S. bovis biotipo II.2 eran P-GUR positivas. En 1984, Farrow y cois, delinearon seis grupos diferentes por homología de DNA entre los estreptococos del grupo D.351 La cepa tipo S. equinus y las cepas S. bovis biotipo II. 1 (manitol negativas, P-GUR negativas) del ganado pertenecían al grupo genómico 1. El grupo genómico 2 incluyó las cepas identifica­ das como S. bovis biotipo 1 (manitol positivas) y las aisladas en la sangre humana y en casos de endocarditis; estas cepas fue­ ron reclasificadas luego como la nueva especie S. gallolyticus, porque también hidrolizaban el galato.750 El grupo 3 estaba for­ mado por cepas manitol variable atípicas de S. bovis y S. equi­ nus, mientras que el grupo 4 estaba formado por un conjunto heterogéneo de cepas con pruebas de hidrólisis de esculina positivas y negativas. Las cepas con DNA del grupo 4 fueron clasificadas como la nueva especie Streptococcus infantañus.125 Con posterioridad, el análisis de S. infantarius definió dos subespecies dentro de este grupo: S. infantarius subespecie infantarius y S. infantarius subespecie co//.853 Los grupos 5 y 6 estaban formados por microorganismos clasificados actual­ mente como Enterococcus saccharolyticus y Streptococcus alactolyticus, respectivamente. Al mismo tiempo, se describie­ ron otras dos cepas estreptocócicas nuevas relacionadas con el grupo de S. bovis: S. macedonicus, una especie a-hemolítica aislada originariamente en el queso griego y S. waius, una

Hasta el 40% de las infecciones asociadas con el grupo angi­ noso son intraabdominales que se desarrollan luego de una apendicectomía u otra cirugía o como resultado de la perfora­ ción colónica causada por un traumatismo u otras lesiones gas­ trointestinales (p. ej., carcinoma de colon). Las infecciones intraabdominales por estreptococos del grupo anginoso se aso­ cian con peritonitis y formación de abscesos apendiculares, hepáticos, subfrénicos y pancreáticos.299463 Al parecer, el trau­ matismo y la enfermedad de la mucosa intestinal facilitan la invasión del torrente circulatorio por los microorganismos. En general, en los abscesos intraabdominales se aíslan aerobios y anaerobios mixtos en cultivo y la evidencia proveniente de modelos animales sugiere que el potencial patogénico de estos estreptococos aumenta por el crecimiento sinérgico de bacterias anaerobias.887 Tresadern y cois, comunicaron sobre infecciones del grupo anginoso en 23 pacientes de cirugía general, muchos de los cuales se sometieron a procedimientos colorrectales, y arribaron a la conclusión de que el uso de antibióticos preope­ ratorios, como gentamicina y metronidazol, puede promover en realidad el surgimiento de estos microorganismos como pató­ genos en esta localización anatómica.962 En ocasiones, se aíslan estreptococos del grupo anginoso en infecciones ginecológicas, obstétricas, urogenitales y neonatales, que incluyen abscesos pelvianos, carcinoma colorrectal, abscesos tuboováricos, infec­ ciones intrauterinas y lesiones de los genitales externos.675-801 En general, los miembros del grupo anginoso han sido con­ siderados sensibles a distintos antibióticos, pero existen indica­ ciones de que su resistencia puede estar aumentando. En un examen realizado en 1999 de 180 cepas del grupo anginoso, 94,4%, 92,8%, 87,1%, 97,3% y 97,3% fueron sensibles a peni­ cilina, ampicilina, cefuroxima, cefazolina y cefotaxima, res­ pectivamente.626 En un examen más reciente de 44 cepas caracterizadas genotípicamente no se observó ningún caso de resistencia a la penicilina en 12 cepas de S. intermedius, 16 de S. constellatus y 16 de S. anginosus, aunque 4 mostraron menor sensibilidad a la penicilina y 4 tenían una sensibilidad intermedia a la ampicilina; todas fueron sensibles a la ceftria­ xona.960También está surgiendo resistencia a macrólidos-lincosamida-estreptogramina entre estos microorganismos. En el estudio de Limia y cois., el 17,7% al 18,3% de las 180 cepas evaluadas fueron resistentes a la eritromicina y la clindamicina, respectivamente.626 Algunos estudios de vigilancia de la sensi­ bilidad a los antibióticos indican que puede hallarse resistencia a la eritromicina en el 3,2-17,7% de las cepas, según la locali­ zación geográfica y sólo se han observado ligeras diferencias en la resistencia a macrólidos-lincosamida-estreptogramina entre estas tres especies del grupo anginoso.525-960 El análisis genético de algunas cepas resistentes a macrólidos-lincosamida-estreptogramina ha documentado la presencia de los genes erm(B), erm(TK) y mef[A)-meflE) que conducen a resistencia constitutiva a la eritromicina, resistencia inducible a la eritro­

Estreptococos del grupo D: el “complejo Streptococcus bovis/Streptococcus equiñus” y especies relacionadas

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Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “sim ilares a Streptococcus"

especie a-hemolítica aislada en biopelículas de leche desnatada 366,970 [vJás tarde se observó que S. waius era idéntico a S. macedonius, de modo que se mantuvo el nombre de la especie como S. macedonius.651 Asimismo, se halló que S. caprinus era una denominación tardía subjetiva equivalente de S. gallolyti­ cus, por lo que se conservó el nombre S. gallolyticus.902 En 2001, Clarridge y cois, examinaron 22 cepas clínicas de S. bovis y las especies relacionadas descritas antes mediante métodos fenotípicos y genotípicos y sugirieron que las cepas S. bovis biotipo II.2 constituían una genoespecie separada distin­ ta de S. bovis, S. gallolyticus y S. infantarius.200 Como las secuencias de rRNA 16S de estas especies muestran una iden­ tidad del 97,1-99,8% entre ellas, se buscaron secuencias gené­ ticas alternativas para discriminar genotípicamente entre estas especies estrechamente relacionadas. Para este fin, Poyart y cois, amplificaron y secuenciaron una porción interna del gen sodA, que codifica una superóxido dismutasa dependiente del manganeso, para crear una base de datos de acuerdo con las secuencias de sodA a fin de examinar estos microorganis­ mos.784 A partir de estas secuencias, se delinearon cinco grupos correspondientes a cinco especies distintas. Tres de los cinco grupos correspondían a S. equinus, S. gallolyticus y S. infanta­ rius. El cuarto grupo estaba formado por cepas identificadas fenotípicamente como S. bovis biotipo II.2 y el quinto grupo correspondía a cepas identificadas como S. infantarius subes­ pecie coli. Estos investigadores propusieron que las cepas S. bovis biotipo II.2 fueran asignadas a la nueva especie, S. pas­ teurianus y que las cepas S. infantarius subespecie coli fueran renombradas Streptococcus lutetiensis. En 2003, se realizó una reevaluación de la taxonomía del grupo S. bovis/S. equinus en un esfuerzo por mejorar la dife­ renciación fisiológica entre estas especies y aclarar su ubica­ ción filogenética.852 Utilizando hibridación de DNA-DNA y análisis de secuencia de rRNA 16S, estos investigadores con­ cluyeron que muchas de estas nuevas “especies” (p. ej.. “5. pasteurianus”, “5. lutetiensis”) no mostraron suficiente diver­ gencia entre las secuencias como para asignarlas a una especie separada. Como el nombre “Streptococcus gallolyticus” tenía un precedente taxonómico, Schlegel y cois, propusieron adop­ tar los nombres S. gallolyticus subespecie gallolyticus, S. gallolyticus subespecie pasteurianus y S. gallolyticus subespe­ cie macedonicus para S. bovis biotipo I, S. bovis biotipo II.2 (“5. pasteurianus") y S. macedonicus, respectivamente. Además, algunos estudios de hibridación no apoyaron esta asignación de cepas de S. infantarius subespecie coli a la espe­ cie propuesta “S. lutetiensis", de modo que se propuso retener las dos subespecies S. infantarius. Si se aceptan las dos nomen­ claturas propuestas, S. bovis I, S. bovis II.l y S. bovis II.2 corresponden a S. gallolyticus subespecie gallolyticus, S. infan­ tarius subespecie coli (S. lutetiensis) y S. gallolyticus subespe­ cie pasteurianus (“S. pasteurianus"), respectivamente.854 Estos estudios taxonómicos también establecieron que S. bovis y S. equinus constituyen la misma especie, lo que sugiere que las cepas de “S. equinus” aisladas en muestras clínicas humanas probablemente fueran mal interpretadas.325-401-854 Estos estudios confirmaron que S. alactolyticus y S. intestinalis también son idénticos. S. bovis causa baeteriemia. meningitis y endocarditis de vál­ vula nativa y de válvula protésica; el aislamiento de este micro­ organismo en la sangre también se asocia con carcinoma del colon.307'464487 1021 En un estudio de 16 pacientes evaluables con endocarditis por S. bovis, 11 (69%) tenían tumores colónicos.307 Se observó S. bovis significativamente más en las heces de pacientes con cáncer colorrectal que en las de controles

sanos o en aquellos con pólipos intestinales benignos. Una investigación bacteriológica de pacientes con cáncer de colon y otras enfermedades intestinales mostró que el 56% de los pacientes con cáncer de colon tenían 5. bovis en sus heces, en comparación con el 10% de los pacientes controles sin trastor­ nos intestinales.578 Zarkin y cois, observaron que la baeteriemia por S. bovis también se asociaba con enfermedad y disfunción hepáticas.1091 En este estudio, el 58% de los pacientes con endocarditis por S. bovis y el 46% de aquellos con baeteriemia tenían enfermedad colónica; se observó enfermedad hepática en el 52% de los pacientes con endocarditis y en el 57% de aquellos con baeteriemia. Se observó tanto enfermedad colóni­ ca como hepática en el 27% de los pacientes en los que se desa­ rrolló endocarditis. Gonzalez-Quintela y cois, también obser­ varon que el 55% de 22 pacientes con baeteriemia por S. bovis tenían una hepatopatía subyacente, que incluía cirrosis e infec­ ción por hepatitis C.412 Wilson y otros también han comunica­ do una asociación entre endocarditis por S. bovis y enfermeda­ des del colon distintas del carcinoma.464 1064 Entre 21 pacientes con endocarditis por S. bovis, el 62% tenía enfermedad colóni­ ca que no estaba limitada al carcinoma; el 24% tenía una enfer­ medad intestinal inflamatoria, el 14% tenía diverticulitis, el 10% tenía pólipos colónicos, el 10% tenía adenomas vellosos colónicos y el 5% tenía carcinoma colónico.1064 También se ha observado una asociación entre infecciones diseminadas por S. bovis y colitis ulcerativa idiopática y enterocolitis crónica por radiación.528700 Osada y cois, comunicaron un caso en el cual se aisló S. bovis en el empiema torácico de un paciente que se sometió a un tratamiento por cáncer de colon recurrente.749 Se ha postulado un mecanismo de que la enfermedad colónica subyacente o los cambios en la secreción hepática de bilis o inmunoglobulinas en la luz intestinal pueden promover el sobrecrecimiento de S. bovis y el movimiento de los microor­ ganismos desde el intestino a la circulación venosa portal. La falla del sistema reticuloendotelial hepático afectado para con­ tener a los microorganismos conduce a baeteriemia y endocar­ ditis. Los pacientes con baeteriemia, endocarditis o meningitis por S. bovis se deben realizar una colonoscopia completa para detectar lesiones gastrointestinales ocultas.653 La baeteriemia y la diseminación hematógena de S. bovis pueden conducir a otras distintas presentaciones clínicas. A pesar de la asociación frecuente con el carcinoma de colon, se ha comunicado meningitis y baeteriemia por S. bovis en pacientes sin neoplasias subyacentes.356'389-792 Jain y cois, infor­ maron de un caso habitual de meningitis por S. bovis en un paciente infectado por HIV, que también tenía colitis y hemo­ rragia gastrointestinal graves secundarias a infección por Strongyloides stercolaris.530 Es posible que las ulceraciones mucosas producidas por la migración de estrongiloides haya permitido el acceso de S. bovis al torrente circulatorio. Algunos informes también han establecido S. bovis como causa ocasio­ nal de peritonitis bacteriana espontánea.319-1012 White y cois, comunicaron un caso de infección intraamniótica mortal de un feto de 24 semanas en el cual se aisló S. bovis en sangre y teji­ dos fetales maternos.1054 En 2002, se comunicó el primer caso de baeteriemia por S. bovis debida a la colonización de la luz de un catéter venoso permanente en un paciente con enfermedad avanzada por HIV y hepatitis B; el paciente no tenía enferme­ dad gastrointestinal ni hepática y la baeteriemia se resolvió con la extracción del catéter.28 Otras infecciones asociadas con S. bovis son neumonía, espondilodiscitis aguda, artritis séptica, absceso encefálico, peritonitis asociada con diálisis peritoneal ambulatoria continua, osteomielitis ileal y vertebral e infección de artroplastia secundaria a baeteriemia en asociación con car­

Streptococcus suis

cinoma del colon.327,471-6I8-659-71f' m -1014-1067 La penicilina sigue siendo altamente activa contra la mayoría de las cepas de S. bovis. aunque se han comunicado cepas ocasionales relativa­ mente resistentes a ella. Asimismo, la clindamicina también es activa contra la mayoría de las cepas, pero parece estar sur­ giendo resistencia a este agente.894 S. bovis también se encuentra en varias especies animales, en las cuales se lo suele considerar un habitante inofensivo del aparato digestivo. De hecho, la cepa tipo de S. bovis fue aisla­ da originariamente en excrementos de vacas y difiere de las cepas clínicas humanas en varias pruebas fisiológicas.580 Algunas cepas parecen ser causas importantes de septicemia en las palomas.264 También se han aislado cepas similares a S. bovis en el tubo digestivo de cerdos y pollos identificadas como S. alactolyticus.35' Algunos estudios quimiotaxonómicos con cepas de animales y de seres humanos también apo­ yan la literatura taxonómica más nueva, lo que indica que es más probable que S. gallolyticus subespecie gallolyticus esté más involucrado en infecciones humanas que S. bovis sensu stricto,281

Streptococcus suis Streptococcus suis merece especial atención debido a su valor taxonómico como patógeno importante de los cerdos y ocasional de los seres humanos. Las infecciones causadas por S. suis representan problemas sanitarios y económicos serios en países con industrias porcinas intensivas, como España, Australia, Alemania, Bélgica, Holanda y el Reino Unido. S. suis causa un amplio espectro de enfermedades graves en cer­ dos, como neumonía, meningitis, septicemia y artritis purulen­ ta.483 En los lechones, las amígdalas y las vías nasales se colo­ nizan entre las 5 y las 10 semanas de vida; las tasas de porta­ ción entre animales sanos pueden ser de hasta un 80%.37 Algu­ nos estudios realizados en Australia mostraron que más del 70% de los cerdos sacrificados para consumo humano en ese país eran portadores de S. suis}16 En los animales infectados, S. suis produce inicialmente fiebre, anorexia y otros síntomas generales, y la afectación meníngea se manifiesta por el rápido inicio de convulsiones, parálisis y muerte.642 Los microorganis­ mos pueden aislarse fácilmente en los ventrículos cerebrales y en los ganglios linfáticos regionales de las vías respiratorias altas, aunque el aislamiento en tejido esplénico o hepático es infrecuente.468 Aunque la enfermedad de los cerdos en los Estados Unidos no es frecuente, se ha aislado S. suis en gana­ do porcino de Minnesota y Nebraska.329 Los primeros casos humanos de infección por S. suis fueron comunicados en 1968 en Dinamarca y. para 1989, se habían publicado 108 casos humanos. Las infecciones humanas apare­ cieron en Hong Kong, Holanda, Dinamarca, Gran Bretaña, Francia, Bélgica, Alemania y Suecia.917,947 El primer informe de infección humana en América del Norte fue de un caso de en­ docarditis por S. suis en un paciente de Canadá.965 Las infec­ ciones humanas ocurren principalmente en personas que traba­ jan directamente con cerdos (p. ej., trabajadores de mataderos, granjeros de cerdos, inspectores de carnes, veterinarios) o en el procesamiento industrial y la elaboración de productos porci­ nos.137,1029 De hecho, algunos casos humanos comunicados en Hong Kong se han atribuido a la popularidad y el consumo de gran cantidad de cerdo en China.179 Se cree que S. suis ingresa en el huésped por vía percutánea a través de cortes y abrasio­ nes en la piel. También se ha propuesto el ingreso a través de la

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nasofaringe y el tubo digestivo y la gastroenteritis aguda puede ser una manifestación destacada de la presentación séptica.649 Después de la infección, el inicio de la enfermedad es anuncia­ do por un prodrómo “similar a la gripe", seguido del rápido desarrollo de baeteriemia y meningitis.38,298,643 También puede ocurrir una baeteriemia fulminante sin meningitis.137 La secue­ la más frecuente de la infección meníngea es el compromiso vestibulococlear que conduce a ataxia y mareos.298 A menudo se observa afectación del octavo nervio craneal, con hipoacusia unilateral o bilateral.862 Las complicaciones son el resultado de la siembra de sitios distantes durante la baeteriemia y pueden incluir artritis, espondilodiscitis, endoftalmitis, peritonitis y neumonía.36,679,1013 También se han comunicado varios casos de endocarditis por S. suis.4S5;766,965 Se han realizado en varios países algunos estudios sobre la sensibilidad a los antibióticos de las cepas de S. suis tipo 2 y otros serotipos obtenidos de animales y seres humanos. En un estudio de 110 cepas de cerdos y 25 cepas de seres humanos llevado a cabo en Francia, casi todas fueron sensibles a penici­ lina, amoxicilina y gentamicina: los agentes menos activos fue­ ron macrólidos, lincosamidas y doxiciclina.654 En una encuesta de 689 cepas porcinas realizada en Japón desde 1987 hasta 1996 se observó que las cepas de S. suis tipo 2 eran altamente sensibles a penicilinas, cefazolina, ofloxacina y trimetoprimsulfametoxazol.553 Casi el 87% de las cepas fueron resistentes a las tetraciclinas y el 71,4% y el 29,5% lo fueron a kanamicina y estreptomicina, respectivamente. Algunos estudios efec­ tuados en cepas aisladas en Suecia y Dinamarca desde 1967 hasta 1981 y desde 1992 hasta 1997 comunicaron que todas eran sensibles a penicilina, ampicilina, vancomicina y trimeto­ prim. Entre las aisladas en Dinamarca desde 1992 hasta 1997, el 20,4% de las cepas de serotipo 2 y el 44,8% de las cepas de serotipo 7 fueron resistentes a los macrólidos (eritromicina, clindamicina).1 También se observó resistencia a las tetracicli­ nas en el 43,9% de las cepas serotipo 2 y el 15,5% de las cepas serotipo 7 aisladas durante el mismo período. Menos del 5% de las cepas recogidas desde 1967 hasta 1981 fueron resistentes a estos agentes. De las muestras contemporáneas, el 15,4% de las cepas de serotipo 2 provenientes de Suecia, el 57.1% de las ce­ pas de serotipo 2 provenientes de Dinamarca y el 91,4% de las cepas de serotipo 7 de Suecia fueron resistentes al sulfametoxazol. Se considera que la penicilina es el fármaco de elección para el tratamiento de la infección sistémica por S. suis. Sin embargo, se ha informado resistencia a la penicilina no mediada por p-lactamasas entre las cepas de S. suis de cerdos en España y en una cepa aislada en un caso de meningitis humana.787,862 S. suis fue reconocido oficialmente como una especie de Streptococcus existente en 1987.569 Las cepas son agrupables con los antisueros de Lancefield en los grupos R, S. RS y T o son no agrupables.270 Algunas también reaccionan con antisue­ ro contra estreptococos del grupo D, lo que sugiere que tienen el antígeno lipoteicoico de ese grupo D. Por esta razón, al prin­ cipio se creyó que era un Streptococcus del grupo D o una especie de Enterococcus. Esta observación no fue sustentada con técnicas moleculares y la reactividad con antisueros del grupo D se debe a reacciones cruzadas falsas entre los grupos D y R. Las cepas de S. suis también están encapsuladas y se describieron 35 serotipos capsulares diferentes, designados 1 a 35 421’423,482,767 S. suis de serotipo 1 produce meningitis en lecho­ nes menores de 6 semanas de vida. Este serotipo incluye cepas pertenecientes al grupo S de Lancefield. S. suis de serotipo cap­ sular 2 también se asocia con enfermedad sistémica en cerdos de 3 a 20 semanas de vida y es el único serotipo del que se ha comunicado que produce enfermedad sistémica en los seres

666

C A P ÍT U L O 1 3

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “sim ilares a Streptococcus"

humanos. En la serie de casos humanos comunicados en 1988 por Arends y Zanen en Holanda, 28 de las 30 cepas aisladas en infecciones humanas eran de serotipo capsular 2, una era de serotipo 4 y una era no tipificable.38 Este serotipo comprende los estreptococos grupo R de Lancefield. Se pueden hallar otros serotipos que tienen los grupos RS de Lancefield (reac­ cionan con el antisuero R y con el antisuero S) y reactividad T tanto en cerdos asintomáticos como enfermos. Los serotipos pueden determinarse mediante aglutinación en portaobjetos, inmunodifusión o coaglutinación.420 A pesar de que la mayor parte de los casos de la enfermedad es causada por una peque­ ña cantidad de serotipos diferentes, el serotipo capsular no es predictor de virulencia. Varios métodos para determinar huellas digitales genómicas que incluyen electroforesis en gel de campo pulsado, ribotipificación, análisis de DNA polimorfo con amplificación aleatoria y tipificación de secuencias multi­ locus han demostrado una heterogeneidad genética considera­ ble entre las cepas de S. suis pertenecientes al mismo serotipo capsular o a serotipos capsulares diferentes.177,178’576'798'1006 Los métodos de ribotipificación han podido identificar dos grupos principales entre las cepas de S. suis tipo 2 porcinas en Dinamarca.797 Las cepas de un grupo se asociaron con menin­ gitis, mientras que las del segundo agrupamiento se asociaron con neumonía, sepsis y endocarditis. Las cepas de meningitis en el primer grupo fueron resistentes al sulfametoxazol, mien­ tras que las del segundo fueron resistentes a la tetraciclina. S. suis de serotipo 2 produce distintos factores que se aso­ cian con virulencia, aunque la patogenia de la infección en los seres humanos y los animales es aún poco clara 425 La cápsula de las cepas serotipo 2 es un factor de virulencia compuesto por glucosa, galactosa, ramnosa, A'-acetil-glucosamina y ácido siá­ lico.906 El locus del gen cps de S. suis tipo 2 ha sido clonado, caracterizado y manipulado mediante mutagénesis insercional para producir mutantes carentes de cápsula.905 Estas cepas no encapsuladas fueron muy sensibles a la ingestión y la destruc­ ción por los macrófagos alveolares del pulmón porcino in vitro y fueron avirulentas en cerdos sin gérmenes luego de una carga intranasal. S. suis también produce una citolisina/hemolisina que activa el tiol, forma poros y fija el colesterol denominada suilisina.518 El gen para suilisina (sly) ha sido secuenciado y es estructuralmente similar a la neumolisina producida por S. pneumoniae,875 Esta hemolisina/citolisina es responsable de los efectos tóxicos directos sobre las células epiteliales.595 Los mutantes que carecían de suilisina fueron no hemolíticos, no citotóxicos para macrófagos cultivados y avirulentos en ratones cuando fueron inoculados a través de la vía intraperitoneal. pero sólo estaban ligeramente atenuados en un modelo porcino de infección sistémica.18 Utilizando técnicas de PCR, se obser­ vó el gen sly en más del 80% de las cepas asociadas con casos de meningitis, septicemia y artritis, y en más del 90% de las cepas provenientes de las amígdalas de cerdos sanos, pero sólo en el 44% de las cepas asociadas con neumonía porcina.575 Las cepas de tipo 2 encapsuladas también producen dos proteínas -proteína liberada por la muramidasa (MRP) y factor proteico extracelular (EF)- que se asocian con virulencia, pero su papel en la patogenia de la enfermedad no está claro, ya que los mutantes isogénicos que carecen de estas proteínas no se com­ portan en forma diferente de las cepas de tipo silvestre en modelos de infección en el ratón.425-918 Se describieron cuatro proteasas asociadas con células y extracelulares distintas en cepas de S. suis de tipo 2 virulentas.541 Estas proteasas pueden funcionar para obtener nutrientres, para neutralizar los meca­ nismos de defensa del huésped y para ayudar a la invasión y la destrucción tisulares. Las cepas S. suis tipo 2 producen una

hemaglutinina adhesina de 18 kDa que se une a las porciones de galactosa y galactosa-A^-acetilglucosamina. una proteína fijadora de albúmina de 39 kDa y también se ha descrito una proteína fijadora de IgG de 60 kDa. Como se ha observado esta adhesina tanto en cepas virulentas como avirulentas, su papel en la patogenia de esta enfermedad, si es que existe alguno, no está claro.77’424’793

Otros estreptococos viridans aislados en animales Se describieron otras varias “especies” de estreptococos ahemolíticos y no hemolíticos en la literatura médica, veterina­ ria y taxonómica. Estas especies son S. thoraltensis, S. hyovaginalis, S. hyointestinalis, S. pluranimalium, S. uberis, S. parauberis, S. entericus, S. ovis, S. gallinaceus y S. minor. S. tho­ raltensis y S. hyovaginalis son especies de estreptocos ahemolíticos que se han aislado en el aparato genital de hembras porcinas, mientras que S. hyointestinalis se encuentra en el tubo digestivo porcino.278-279 S. pluranimalium, una nueva espe­ cie que se asemeja a las cepas de la ex especie S. acidominimus (véase más adelante), es una especie a-hemolítica que se encuentra en el aparato genital y las amígdalas del ganado vacuno, los tejidos amigdalinos de ovejas y felinos, y en el buche y el aparato respiratorio de los canarios.280 Esta especie también ha sido aislada en mastitis subclínica en el ganado vacuno. S. uberis y S. parauberis son causas de mastitis bovi­ na y no han sido aisladas en seres humanos. Estas dos especies son indistinguibles entre sí utilizando criterios fenotípicos, y se han creado sondas moleculares específicas de especie para ambas. Cepas humanas identificadas fenotípicamente como S. uberis se han vuelto a identificar como Globicatella sanguinis.so S. entericus es un nuevo Streptococcus a-hemolítico que habita en el intestino bovino.1005 S. ovis y S. gallinaceus son especies oc-hemolíticas que han sido aisladas en infecciones (incluida la bacteriemia) en ovejas y pollos, respectivamente.2i6a.2n £ minor se describió en 2004 y ha sido aislado en las amígdalas, los hisopados anales y las heces de perros, y en las amígdalas de temeros y gatos.985 Emerococcus coleocola es un microorganismo similar a Streptococcus a-hemolítico que se aísla en el aparato repro­ ductor de caballos.222 Esta especie se encuentra más estrecha­ mente relacionada con microorganismos similares a Strep­ tococcus en los géneros Abiotrophia, Ignavigranum, Facklamia y Globicatella, que han sido aislados en muestras clínicas humanas.

Otros estreptococos Las cepas de S. acidominimus han sido mal caracterizadas desde que se describiera la especie original en 1922.80 El nuevo examen de las cepas aisladas en seres humanos estableció su verdadera identidad como Facklamia sourekii.213 S. thermophilus y S. macedonicus se encuentran en quesos y otros produc­ tos lácteos. S. thermophilus está relacionado con S. salivarius y puede ser incorporado como subespecie de S. salivarius o ser una especie distinta.347-856 S. macedonicus ha sido reclasificado como S. gallolyticus subespecie macedonicus, que forma parte del complejo S. bovis/S. equinus. S. caprinus es un sinónimo subjetivo ulterior de S. gallolyticus y S. intestinalis es un sinóni­ mo reciente de S. alactolyticus.902-9*9 Se observó que S. difficile

E s p e cie s de Enterococcus

correspondía a cepas no hemolíticas de estreptococos del grupo B (5. agalactiae).990

Especies de Enterococcus Taxonomía

El género Enterococcus incluye a los miembros enterococos ya clasificados con los estreptococos del grupo D.857858 Estos microorganismos son residentes normales del tubo digestivo y las vías biliares y, en menor cantidad, de la vagina y la uretra masculina. Su importancia como causantes de enfermedades humanas es cada vez mayor, en gran parte debido a su resis­ tencia a los antibióticos a los cuales otros estreptococos suelen ser sensibles. In vitro, los enterococos tienen CIM de penicili­ na que son 10 a 100 veces más altas que para otros estreptoco­ cos. Los enterococos constituyen la segunda causa en frecuen­ cia de infecciones intrahospitalarias urinarias y de heridas y la tercera causa de baeteriemia intrahospitalaria.354,690 Debido a su resistencia a las penicilinas y a cefalosporinas de varias gene­ raciones, la adquisición de resistencia de alto nivel a los ami­ noglucósidos, y ahora el surgimiento de resistencia a la vanco­ micina, estas bacterias a menudo producen sobreinfecciones graves entre los pacientes que reciben tratamientos con anti­ bióticos de amplio espectro. La taxonomía de las especies de Enterococcus ha sufrido un cambio considerable desde mediados de la década de 1980. Antes del advenimiento y el uso amplio de las técnicas genéti­ cas para el análisis taxonómico, los enterococos se distinguían de los estreptococos y de especies relacionadas por su capaci­ dad para crecer a 10 °C y 45 °C, por su crecimiento en presen­ cia de NaCl al 6,5%, por su crecimiento a un pH de 9,6, su capacidad para hidrolizar esculina en presencia de bilis al 40% y la producción de pirrolidonil arilamidasa (PYR). Más del 90% de las cepas también tenían el antígeno lipoteicoico del grupo D de Lancefield en las paredes celulares. Algunos estudios taxonómicos actuales han puesto en evidencia varias especies que son miembros del género Enterococcus por criterios gené­ ticos, pero que carecen de muchas de las características fenotí­ picas típicas del género.1061 Por fortuna, la mayoría de estas especies no son comunes en muestras clínicas humanas. E. fa e­ calis es la cepa más frecuente y está asociado con el 80-90% de las infecciones por enterococos humanos. E. faecium se ubica segundo y se aísla en 10-15% de las infecciones.833 Otras espe­ cies de enterococos, que incluyen E. avium, E. casseliflavus, E. cecorum, E. durans, E. gallinarum, E. hirae, E. raffinosus, E. malodoratus, E. dispar, E. raffinosus y E. mundtii se aíslan pocas veces en infecciones humanas (véase recuadro 13-4). Las especies restantes se encuentran fundamentalmente en el tubo digestivo de distintos animales y pocas veces, o nunca, se aíslan en infecciones humanas importantes (véase recuadro 134). En los últimos años, se han descrito varias especies nuevas de enterococos en fuentes clínicas humanas (E. gilvus, E. pallens, CDC PNS [por probable new species, probable espe­ cie nueva]-El, CDC PNS-E2, CDC PNS-E3), animales (E. canis, E. villorum [igual que E. porcinus], E. ratti, E. asini, E. phoeniculicola) y el medioambiente (E. haemoperoxidus, E. moraviensis) (recuadro 13-4). Con ayuda de las técnicas de taxonomía molecular, se han vuelto a clasificar algunas ex especies de Enterococcus o se notó que son iguales a las ya reconocidas. Por ejemplo, se observó que E. seriolicida era idéntica a Lactococcus garvieae, E. flavescens era igual a E. casseliflavus y E. solitarius era idéntica a Tetragenococcus

667

halophilus.m -590-95l952''m Se verán de vez en cuando en la bi­ bliografía informes de especies inusuales o infrecuentes de Enterococcus aisladas en infecciones humanas. En la era del huésped inmunodeprimido, el microbiólogo clínico debe cono­ cer estas otras especies y los métodos para su identificación. En el recuadro 13-4 se describen los miembros del género Enterococcus,. Factores de virulencia

A diferencia de varias especies de estreptococos explicadas hasta ahora, no se conocen bien los factores que determinan la virulencia de los enterococos.536,703 Algunas cepas de E. faeca­ lis producen una citolisina/hem olisina que actúa sobre los eri­ trocitos humanos, de conejos, equinos y bovinos (pero no sobre los eritrocitos de ovejas) y tiene una importante toxicidad demostrada en los modelos de endoftalmitis y endocarditis en el conejo.188,537 La sustancia de agregación es una proteína de unión de superficie por plásmidos que promueve el agrupamiento de los microorganismos para facilitar el intercambio de los plásmidos.188,201 Esta sustancia también funciona facilitando la adherencia de los enterococos a células intestinales y epite­ liales renales cultivadas y promueve el crecimiento de vegeta­ ciones cardíacas en el modelo de endocarditis en el conej 0 188,383,587 otros estudios sugieren que la sustancia de agrega­ ción puede participar en la fijación de E. faecalis a los neutró­ filos y las células epiteliales intestinales cultivadas y en la intemalización ulterior y la supervivencia intracelular de estos microorganismos.742,795,998Alrededor del 40% de las cepas de E. faecalis aisladas en sangre y en endocarditis producen una pro­ teína de superficie singular denominada Esp (“extracelular surface protein", proteína de la superficie celular) que ayuda al microorganismo a evadir los anticuerpos por su capacidad para alejarse de la superficie celular.880 La mayoría de las cepas de E. faecalis y algunas de E. faecium en bacteriemias produ­ cen gran cantidad de superóxido extracelular que puede aumentar la virulencia de los enterococos en abscesos de flora mixta.505 Los ácidos lipoteicoicos constituyen el antígeno del grupo D de los enterococos y también puede funcionar en la virulencia al inducir la producción de factor de necrosis tumoral (TNF) e interferón, lo que conduce a la modulación de la respuesta inmunitaria.971 Por último, el 50-65% de las cepas de E. faecalis producen cocolisina, una metaloendopeptidasa extracelular. que puede desempeñar un papel en la virulencia al inactivar a la endotelina, un péptido vasoactivo.650 Importancia clínica

Las especies de Enterococcus causan infecciones urinarias complicadas, baeteriemia, endocarditis, infecciones intraabdo­ minales y pelvianas, infecciones de heridas y tejidos blandos, sepsis neonatal y, pocas veces, meningitis.690 Las infecciones urinarias constituyen la infección enterocócica más frecuente e incluyen cistitis, pielonefritis, prostatitis, absceso perinéfrico e in­ fecciones complicadas con baeteriemia. La mayoría de éstas son de origen intrahospitalario o se asocian con anomalías estructurales e instrumentación de las vías urinarias.699,850 En general, las bacteriemias enterocócicas son el resultado de la infección en otros sitios (p. ej., infecciones urinarias, de las vías biliares, gastrointestinales/genitourinarias) y más a menu­ do son intrahospitalarias. Los factores de riesgo para el desa­ rrollo de baeteriemia son edad avanzada, inmunosupresión, enfermedades y trastornos subyacentes (p. ej., prematuridad, diabetes, neoplasias, insuficiencia cardíaca congestiva, insufi-

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C A P ÍT U L O 13

R ecuadro 1 3 -4

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “ sim ilares a Streptococcus”

M ie m b ro s d e l g é n e ro E n te ro c o c c u s

GRUPO/Especle

C om entarios

GRUPO 1 E. avium 218

Aislado en el tubo digestivo de aves, perros y seres hum anos; las cepas pueden portar tanto los antígenos hidratos de carbono grupo D com o grupo Q de Lancefield; esta especie (y E. malodoratus) son las dos especies de enterococos que producen H,S. E. avium ha sido aislado en casos de bacteriemia y osteomieli-

E. gilvus979

Nueva especie descrita en 2002; fue aislada originariam ente en una muestra de bilis de un paciente con cole­ cistitis. Aislada de queso G ouda y productos lácteos no pasteurizados; el nom bre significa "de mal olor” ; también produce H,S. Nueva especie descrita en 2002; aislada en una muestra de líquido de diálisis peritoneal de un paciente en el cual se desarrolló peritonitis a partir del intestino perforado. Los estudios de relación genética y algunas características fenotípicas diferencian esta especie de E. avium : cepa tipo aislada en un caso de mastitis bovina. Originariam ente se lo consideró relacionado con E. avium (junto con E. solitarius y E. pseudoavium)-, se lo denom ina así por su capacidad para producir ácido a partir de rafinosa; se aísla en infecciones humanas, que incluyen hem ocultivos, orina, abscesos y osteomielitis vertebral.i85-842 O riginariam ente se denom inó S. saccharolyticus: describía un grupo de cepas sim ilares a S. bovis aisladas en vacas; el análisis genético m ostró que este m icroorganism o está más estrecham ente relacionado con los enterococos que con los estreptococos; tiene ciertas características fenotípicas sim ilares a las especies de Enterococcus (p. ej., crecim iento a 10 °C y 45 °C, crecim iento en NaCI al 6,5%), pero no reacciona con antisueros de grupo D; se propuso pasar esta especie del grupo de Streptococcus viridans al género Enterococcus com o E. saccharolyticus. “Nueva especie propuesta” de los CDC, aislada en tejido encefálico obtenido de un paciente de 11 meses en Honolulu. Hawai, en 2001.

j j s 238.258.435,682,759

E. m alodoratus218 E. pallens919 E. pseudoavium 207 E. raffinosus207

E. saccharolyticusm

Enterococcus, especie CD C PNS-E-3161

GRUPO 2 E. faecalis E. faecium E. casseliflavus218

E. gallinarum218

E. mundtii211

E. haemoperoxidus938 Enterococcus, especie CDC PN S-E2161

Se aísla más frecuentem ente en muestras clínicas hum anas y en el tubo digestivo humano; tam bién se encuentra en el tubo digestivo de aves de corral, ganado bovino, cerdos, perros, caballos, ovejas y cabras. Se encuentra en muestras clínicas humanas; suele ser más resistente a los antibióticos que E. faecalis: tam ­ bién se encuentra en el tubo digestivo de distintas especies de animales. Se aísla en plantas, suelo y, pocas veces, en las heces de pollos; originariam ente fue clasificado com o una subespecie de E. faecium : produce un pigm ento am arillo y también es móvil. Este m icroorganism o es un agente oportunista en infecciones humanas y ha sido aislado en pacientes con bacteriem ia.754-779807'832" 9 Aislado en heces de pollos; originariam ente fue clasificado como Streptococcus galinarum "grupo D de pollos”; una de las dos especies móviles de Enterococcus: tam bién se ha aislado en una infección de un paciente en hemodiálisis, com o causa de endocarditis de válvula nativa, y en hem ocultivos.254-807 M icroorganismo inmóvil de pigm ento amarillo; aislado en plantas, suelo y tubo digestivo de ganado bovino, cerdos y caballos; llam ado así por J. O. M undt, m icrobiólogo norteamericano. Esta especie ha sido aislada en un absceso hum ano en un muslo y en una muestra de m ucosa sinusal obtenida quirúrgicam ente.554 Nueva especie am biental de enterococos descrita en 2001; aislada en aguas superficiales, piscinas y agua potable en la región del norte de M oravia en la República Checa. “Nueva especie propuesta" de los CDC. aislada en hemocultivos de un paciente en Los Angeles en 1997.

GRUPO 3 £ . dispar126

£.

durans *

E. hirae349

£. rattp*9 E. villorum163949-9**

Especie de la que se creyó originariam ente que era una variante bioquím ica de E. hirae, pero el análisis de 16S rRNA indicó que es en realidad una especie antes no descrita; aislada en muestras hum anas, incluidas heces y líquido sinovial.226 Esta especie se encuentra principalmente en la leche y en otros productos lácteos y es una cepa clínica rara. En 2004, E. durans fue aislado como causa de endocarditis de válvula nativa.923 Produce detención del crecim iento en pollos; aislado en el buche y las heces de los pollos, y el tubo digestivo de ganado bovino, cerdos, perros, caballos, ovejas, cabras y conejos; la cepa tipo (E. hirae ATCC 8043) tiene requerim ientos nutricionales com plejos y es utilizada en la industria alim entaria com o m icroorganis­ mo de bioensayos para am inoácidos y vitaminas. E. hirae fue aislado en la sangre de una paciente de 49 años con enfermedad renal en estadio term inal que se había sometido a hem odiálisis.399 Descrita en 2001. esta especie fue aislada originariam ente en los intestinos y las heces de ratas con diarrea. Aislada en el tubo digestivo de perros; fenotípicam ente idéntica a E. porcinus, que se considera un sinónimo m enor de E. villorum y fue aislada originariamente en los intestinos y las heces de cerdos con diarrea.

ciencia renal, infecciones profundas), instrumentación gastrointestinal, genitourinaria o del aparato respiratorio previa, hospitalización prolongada y el uso de antibióticos de amplio

espectro que tienen poca o ninguna actividad antienterocócica (p. ej., cefalosporinas).427-443 1028 En general, los microorganismos acceden al torrente circulatorio a través de las vías urina-

E s p e cie s de Enterococcus

Recuadro 1 3 -4

669

M ie m b ro s del g é n e ro E n te ro c o c c u s (c o n t.)

GRUPO/Especie

GRUPO 4 asinf72

£

E. cecorum2

E. sulfureus663 E. phoeniculicolaa Enterococcus especie CDC PNS-E1

Com entarios

Descrita en 1998, esta especie se encuentra en el ciego de burros; m ás estrechamente relacionada con E. avium, E. pseudoavium y E. faecium . Especie de estreptococo recientem ente reclasificada hallada en los intestinos de pollos; carece del antígeno grupo D, es PYR-negativa y es incapaz de crecer en caldo de NaCl al 6,5% ; sim ilar a E. columbae. puede ser confundido con E. avium y con S. bovis.m -276-im E. cecorum ha sido aislado com o causa de peritonitis asociada con la diálisis peritoneal, peritonitis bacteriém ica recurrente y peritonitis bacteriana espontánea con empiema, y ha sido aislado en hem ocultivos de un paciente con desnutrición grave.260■4:'7■499'"’7', Especie de pigm ento amarillo recién descrita; aislada en plantas; no ha sido aislada aún en seres humanos. Descrita en 2003, esta especie se encuentra en las glándulas del plumaje de la abubilla arbórea silvestre de pico rojo; no crece en agar BE ni en caldo de NaCl al 6,5%. “N ueva especie propuesta" de los CDC aislada en la sangre de un paciente en Evanston, Illinois, en 1991.

GRUPO 5 E. colum bae275

E. canis263 E. moraviensisnn

Especie de estreptococos recién clasificada aislada en tubo digestivo de palomas; estrechamente relacionada con E. cecorum y E. avium', caracterizada por ser PYR negativa e incapaz de crecer en caldo de NaCl al 6.5% A islada originariamente de un perro con otitis externa crónica; probablem ente residente del intestino canino; crece en agar BE, crece en caldo de NaCl al 6,5% y es PYR positiva. Nueva especie enterocócica ambiental descrita en 2001; aislada en aguas superficiales y fuentes de agua pota­ ble del norte de M oravia en la República Checa.

rias. abscesos intraabdominales o pelvianos, heridas, úlceras por decúbito o dispositivos de acceso intravenoso. Los enterococos también causan el 5-20% de los casos de endocarditis y constituyen una causa frecuente de endocarditis de válvula pro­ tésica.680 En general, la endocarditis afecta a pacientes de edad avanzada que tienen una valvulopatía subyacente o válvulas protésicas y tiene casi siempre una presentación subaguda.25-811 En las infecciones intraabdominales y pelvianas, los enterococos suelen hallarse mezclados con otros microorganismos aerobios y anaerobios endógenos; también se ha comunicado una peritonitis espontánea pura por enterococos y la peritonitis enterocócica asociada con diálisis peritoneal ambulatoria con­ tinua.300-722 Aunque muchas infecciones invasoras por enteroco­ cos se originan en sitios intraabdominales, existe una contro­ versia relacionada con el papel de los microorganismos en la patogenia de las infecciones intraabdominales y la peritoni­ tis.722 Algunos estudios han mostrado que la cobertura antibiótica antienterocócica empírica es beneficiosa para los pacientes inmunodeprimidos que tienen una peritonitis posoperatoria intrahospitalaria, los enfermos con sepsis intraabdominal que han recibido antibióticos que no cubren al enterococo, y los pacientes con peritonitis y cardiopatía coexistente o prótesis que se encuentran en riesgo de sufrir una endocarditis por ente­ rococos.460A menudo se encuentran enterococos en infecciones de heridas y tejidos blandos (p. ej., quemaduras, úlceras por decúbito) por otras bacterias facultativas y anaerobias, y las complicaciones asociadas con estas infecciones (p. ej., osteo­ mielitis enterocócica) pocas veces se deben a enterococos a menos que se presenten como agentes sobreinfectantes. La sep­ sis neonatal por enterococos tiene una presentación aguda de inicio temprano, caracterizada por fiebre, somnolencia y difi­ cultad respiratoria acompañada por baeteriemia y meningi­ tis.290 Los recién nacidos prematuros corren mayor riesgo de sufrir infecciones intrahospitalarias por enterococos, sobre todo cuando tienen dispositivos de acceso periféricos o sondas

de alimentación.641 La meningitis por enterococos es una infec­ ción enterocócica rara que puede observarse tanto en adultos como en niños.634-777,929 Esta meningitis se puede desarrollar en forma espontánea o como una complicación posoperatoria. Los individuos con meningitis espontánea por enterococos suelen tener una infección enterocócica en otros sitios, presentan una enfermedad subyacente grave y tienen una baeteriemia entero­ cócica simultánea más a menudo que aquellos que tienen infec­ ciones posoperatorias. La enfermedad subyacente en los pacientes con meningitis espontánea incluye neoplasias, diabe­ tes, insuficiencia renal y tratamiento con agentes inmunosupresores. Los pacientes con meningitis posquirúrgica por enterococos suelen tener un antecedente de traumatismo del SNC (p. ej., accidentes, colocación de una derivación).634 En una revi­ sión reciente de meningitis por enterococos, E. faecalis repre­ sentó el 76% de las cepas y 15 de los 25 casos que se debieron a E. faecium fueron causados por cepas resistentes a la vanco­ micina.777 Las infecciones respiratorias causadas por enteroco­ cos son raras y sólo se observan en pacientes muy debilitados.84 La resistencia de los enterococos a distintos antibióticos contribuye realmente a su patogenicidad. Estos microorganis­ mos muestran poca resistencia intrínseca a los aminoglucósi­ dos y las lincosamidas, tienen CIM relativamente altas para penicilinas y cefalosporinas, y son resistentes a la acción de las sulfamidas in vitro. Las CIM más altas para los P-lactámicos se deben a la menor afinidad de las proteínas de unión a penicili­ na (PBP) de la pared celular por estos agentes. La baja resis­ tencia a los aminoglucósidos se debe a la menor penetrabilidad de la pared celular del enterococo.321 Aunque los enterococos parecen sensibles a las sulfamidas in vitro, pueden superar el bloqueo de la síntesis de folato in vitro. En general, las infec­ ciones graves asociadas con enterococos se tratan con una combinación de penicilina o ampicilina y un aminoglucósido. El surgimiento de resistencia elevada a los aminoglucósidos (CIM de estreptomicina > 2 000 (ig/mL); CIM de pentamicina

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C A P ÍT U L O 13

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “sim ilares a Streptococcus"

> 500 pg/mL en los enterococos, sobre todo E. faecalis y E. faecium, afectó gravemente el enfoque terapéutico y la res­ puesta clínica de los pacientes con bacteriemia, endocarditis y otras infecciones graves.30 142 La resistencia elevada a los ami­ noglucósidos se ha diseminado entre varias especies de enterococos y ha sido documentada en cepas de E. avium, E. casseliflavus, E. gallinarum, E. raffinosus y E. mundtii,837 Las cepas que muestran resistencia elevada a los aminoglucósidos no son destruidas por la actividad sinérgica del agente (3-lactámico junto con un aminoglucósido. Esta gran resistencia está media­ da por transposones y puede ser transferida a otros microorga­ nismos.321 El sinergismo bactericida entre penicilina y amino­ glucósidos requiere que el microorganismo no sólo tenga CIM para los aminoglucósidos por debajo de los valores citados antes, sino que la concentración en suero de penicilina esté cerca de la CIM o la exceda, la resistencia creciente a los P-lactámicos junto con CIM elevadas de aminoglucósidos anula también el sinergismo. A causa de la falta de sinergismo con­ fiable entre penicilina y aminoglucósidos contra los enteroco­ cos, resistencia alta de éstos a los aminoglucósidos y surgi­ miento de 5. aureus resistente a la meticilina, la vancomicina se convirtió en un agente de primera línea eficaz tanto contra estafilococos como contra enterococos. Hasta comienzos de la década de 1980, la sensibilidad de los enterococos a la ampicilina y la vancomicina seguía siendo bastante previsible. Desde ese momento, se han comunicado especies de Enterococcus resistentes a la ampicilina y la van­ comicina con una frecuencia creciente. Se demostró que la resistencia a la ampicilina en algunas cepas de E. faecalis se debía a la producción de enzimas P-lactamasas.762 Con poste­ rioridad, se informó resistencia a la penicilina en cepas de E. faecium, E. gallinarum y E. raffinosus; con estos microorga­ nismos, la resistencia se debió a la menor afinidad de las pro­ teínas de unión a penicilina de la pared celular.I85-321-673 La apa­ rición de cepas de E. faecalis y E. faecium resistentes a la van­ comicina anunció un cambio importante en los enterococos. La resistencia adquirida a los glucopéptidos (vancomicina y teicoplanina) en las especies de Enterococcus corresponde a cinco fenotipos diferentes, designados VanA, VanB, VanD, VanE y Vanó, donde VanA y VanB son los fenotipos prevalentes y de mayor importancia clínica.396405-1077 Estos fenotipos corresponden a genotipos designados vanA, vanB, vanD, vanE y vanG, respectivamente. En general, estos fenotipos describen grupos de genes que codifican enzimas que crean los compo­ nentes estructurales que conducen a la resistencia fenotípica. Esta resistencia a los glucopéptidos es el resultado de la sínte­ sis de diferentes precursores de peptidoglucanos que quedan incorporados en la pared celular y tienen menor afinidad de unión a vancomicina, teicoplanina o ambas. Normalmente, las cepas sensibles a la vancomicina tienen cadenas laterales de peptidoglucanos que terminan con el depsipéptido “D-alanil-Dalanina” y el antibiótico glucopéptido se une a este depsipépti­ do. En las cepas resistentes a los glucopéptidos, el depsipéptido es reemplazado por “D-alanil-D-lactato” (fenotipos VanA, VanB y VanD) o por “D-alanil-D-serina” (fenotipos VanE y VanG). Las cepas de E. faecium y E. faecalis que tienen el genotipo vanA muestran una resistencia inducible característica alta, mediada por transposones, tanto a la vancomicina (CIM, 64-1 000 |ig/mL) como a la teicoplanina (CIM, 16-512 jig/mL), ambos antibióticos de la clase de los glucopéptidos.1077 Las cepas con el genotipo vanB tienen una resistencia inducible adquirida a distintas concentraciones de vancomicina (CIM, 41 000 (ig/mL), pero siguen siendo sensibles a la teicoplanina (CIM, 0,5-1 |ig/mL), aunque raras cepas vanB también pueden

ser resistentes a este último antibiótico.396-1077 Las cepas que expresan el genotipo vanB también incluyen las de E. faecalis y E. faecium. Algunas cepas de E. faecium expresan el genoti­ po vanD\ estas cepas son constitutivamente resistentes tanto a la vancomicina (CIM, 64-28 ¡ig/mL) como a la teicoplanina (CIM, 4-64 Ug/mL) y la resistencia no es transferible a otros enterococos.768 Raras cepas de E. faecalis que expresan el genotipo vanE expresan una resistencia inducible baja a la van­ comicina (CIM. 16 |ig/mL), aunque siguen siendo sensibles a la teicoplanina (CIM, 0,5 (J.g/mL).361 El fenotipo VanG se aso­ cia con resistencia baja a la vancomicina (CIM, 16 |ig/mL), pero con sensibilidad a la teicoplanina (CIM, 0,5 (ig/mL) e ini­ cialmente se observó en cepas de E. faecalis provenientes de Australia.677 Las cepas que tienen el genotipo vanC muestran una resistencia constitutiva e intrínseca baja a la vancomicina (CIM. 2-32 |jg/mL) y son sensibles a la teicoplanina (CIM, 0,51 |ig/mL). El genotipo vanC corresponde a la resistencia intrín­ seca a los glucopéptidos observada en E. gallinarum, E. casseliflavus y E. flavescens. Este grupo del gen vanC no es transfe­ rido mediante conjugación a otros microorganismos, suele expresarse en forma constitutiva y tiene origen cromosómico 6io,7i9 £i genotipo vanF se refiere al grupo de genes de resis­ tencia a glucopéptido hallado en la ex especie Bacillus, Paenibacillus popillae.760 Los enterococos del fenotipo VanA son los más problemáticos porque estas cepas pueden transfe­ rir marcadores de resistencia vanA por un mecanismo conjugativo a otros enterococos y otros microorganismos grampositi­ vos, que incluyen Staphylococcus aureus.726 Sin embargo, en 1994, se mostró que las cepas con el genotipo de clase vanB podían transferir también sus genes de resistencia a la vanco­ micina.127 El desarrollo de sondas de DNA para la detección directa de locus de resistencia ayudó en algunas investigacio­ nes epidemiológicas de brotes hospitalarios causados por ente­ rococos resistentes a la vancomicina.1078 Otro fenóm eno de los enterococos es el de la dependencia de la vancomicina. Esto se refiere a las cepas de enterococos que crecen sólo en presencia de este agente. Los enterococos de­ pendientes de la vancomicina fueron descritos por primera vez en 1994, cuando estos microorganismos fueron cultivados en la orina de un paciente que recibía un tratamiento prolongado con vancom icina.372-373 Desde ese momento, se han com unica­ do otros aislamientos de enterococos dependientes de la van­ com icina.273 Los pacientes expuestos a la vancom icina y a otros agentes (p. ej., cefalosporinas de espectro ampliado) corren riesgo de colonización por enterococos resistentes a la vancomicina y esta exposición también los coloca en riesgo de ser colonizados por enterococos dependientes de la vancom i­ cina. Los enterococos resistentes y dependientes de la vanco­ micina pueden utilizar las ligasas de la pared celular para ela­ borar un depsipéptido alternativo de la pared celular (D-alanina-D-lactato), que reemplaza a la D-alanina-D-alanina hallada normalmente. En la ausencia de vancomicina, los enterococos resistentes a la vancom icina conservan su capacidad para ela­ borar el depsipéptido D-alanina-D-alanina y siguen creciendo en forma normal. D ebido a mutaciones en los genes de la ligasa que conducen a deleciones/sustituciones de am inoáci­ dos en la enzima ligasa, las cepas de enterococos dependien­ tes de vancomicina no pueden elaborar el depsipéptido D-alanina-D-alanina original com o com ponente de la pared celular, de m odo que en realidad el crecim iento es dependiente de la vancomicina. Estas cepas de enterococos son relativamente poco frecuentes. Se describieron cepas dependientes de la vancom icina derivadas tanto de E. faecalis com o de E. fa e ­

cium.273'373

B a c te ria s “s im ila re s a Streptococcus” 6 7 1

Se explica más adelante en este capítulo la identificación de las especies de Enterococcus. En el capítulo 17 se proporciona más información sobre la resistencia a los antibióticos y los métodos para evaluar las pruebas de sensibilidad. Género Melissococcus

El género Melisosococcus contiene una única especie, M. pintón. Este microorganismo causa una enfermedad de las abé­ is denominada “loque europea”. En 1994, utilizando datos de '¿.'uencia de rRNA 16S, Cai y Collins demostraron que M. plu: m estaba más estrechamente relacionado con el género Enterococcus,145 Como la denominación de este microorganis­ mo en el género Melissococcus precedió a la descripción del género Enterococcus. la incorporación de M. pluton entre los enterococos, según las reglas de la nomenclatura, hubiera requerido transferir todas las especies de enterococos al géne­ ro Melissococcus. Debido a la familiaridad de los enterococos tanto para los médicos como para los microbiólogos, esos auto­ res recomendaron mantener a M. pluton como la única especie del género Melissococcus.145

Bacterias “similares a Streptococcus ” Especies de Abiotrophia y de Granulicatella

En un principio se pensaba que los “estreptococos con variante nutricional” eran estreptococos viridans que requerían compuestos del tiol (p. ej., cisterna) o la forma activa de vita­ mina B (piridoxal o piridoxamina) para el crecimiento en medios bacteriológicos.155 Estos microorganismos también han sido denominados estreptococos con deficiencias nutricionales, estreptococos que requieren tiol, estreptococos que requieren piridoxal y estreptococos “satélites”. Los estudios de relación de DNA que compararon las variantes nutricionales de estrep­ tococos y otros estreptococos viridans identificaron dos grupos de hibridación de DNA que correspondían a dos especies, denominadas Streptococcus defectivus y Streptococcus adjacens.n6 En 1995, Kawamura y cois, en Japón realizaron análi­ sis de secuencia de rRNA 16S de estas dos especies y observa­ ron que no estaban relacionadas con ninguna especie pertene­ ciente al género Streptococcus. Se propuso el nuevo género Abiotrophia para acomodar estos “estreptococos”, y los nom­ bres de las nuevas especies fueron Abiotrophia adiacens y Abiotrophia defectiva.55'' En 1998 y 1999, se caracterizaron otros dos miembros del género: Abiotrophia elegans, de un paciente con endocarditis y Abiotrophia balaenopterae, aislado en un rocual aliblanco (ballena minke, Balaenoptera acutorostrata i.609-820 En 2000, Kanamoto y cois, utilizando criterios genéticos y fenotípicos identificaron y caracterizaron otra nueva especie de Abiotrophia estrechamente relacionada con .4. adiacens y propusieron el nombre Abiotrophia para-adiacens para esta nueva especie.548 Más tarde, se demostró que estas nuevas especies tienen una afinidad filogenética más estrecha con A. adiacens que con A. defectiva. La última espe­ cie se encuentra más relacionada desde el punto de vista filogenético con varias especies “similares a Streptococcus" no Abiotrophia, que incluyen Globicatella sanguinis, especies de Facklamia, especies de Eremococcus y especies de Ignavigranum. En la actualidad, varios estudios han demostrado la naturaleza polifilética del género Abiotrophia y la estrecha afi­ nidad entre A. adiacens, A. elegans, A. para-adiacens y A. balaenopterae. Sobre la base de estos estudios, estos tres microorganismos han sido reclasificados en el nuevo género

Granulicatella como Granulicatella adiacens, Granulicatella paraadiancens, Granulicatella elegans y Granulicatella bala­ enopterae.223 A. defectiva se conserva como la única especie del género Abiotrophia. A. defectiva, G. adiacens y G. elegans forman parte de la flora normal de las vías respiratorias altas, el aparato urogeni­ tal y el tubo digestivo.687845 Las especies de Abiotrophia y Granulicatella causan sepsis y baeteriemia, y constituyen la causa del 5-6% de los casos de endocarditis infecciosa y com­ plicaciones bacteriémicas asociadas con endocarditiS'i23,i73,i89.i9o.7io,82o,823 £>esde 19 9 9 se ha documentado que A. defectiva y G. adiacens producen infecciones del SNC, como meningitis y abscesos encefálicos y epidurales.94 171-685-855 En casi todos los casos, la infección se asoció con procedimientos neuroquirúrgicos previos, que incluyen craneotomía, coloca­ ción de una derivación ventriculoperitoneal. mielografía guia­ da por tomografía computarizada y resección tumoral. Estos microorganismos también han sido aislados en infecciones oculares importantes, entre ellas conjuntivitis, endoftalmitis luego de cirugía de cataratas y queratitis asociada con lentes de contacto de hidrogel de uso prolongado.58,561,715'748 Otras infec­ ciones que las especies de Abiotrophia y Granulicatella produ­ cen neumonía, absceso escrotal, sinusitis, artritis séptica, oste­ omielitis vertebral, infección de artroplastia e infección de médula ósea.189'470,479'510'823 Estos microorganismos producen distintos factores extracelulares in vitro, que incluyen neuraminidasa y varias aminopeptidasas, que pueden contribuir a su virulencia; también pueden unirse a fibronectina y otras pro­ teínas de la matriz extracelular.72,740 Por su importancia clínica y sus requerimientos exigentes en el cultivo, es esencial que el microbiólogo clínico esté familiarizado con las circunstancias clínicas en las cuales ocurren y con los métodos de laborato­ rio que son necesarios para su aislamiento en muestras de pacientes. Las especies de Abiotrophia y Granulicatella son más resis­ tentes a los antibióticos que los estreptococos viridans. Aunque la mayoría de las cepas son sensibles a clindamicina, eritromi­ cina, rifampicina y vancomicina, algunos estudios han demos­ trado menor sensibilidad a la penicilina y sensibilidad variable a cefalosporinas y aminoglucósidos.710 En un estudio de Tuhoy y cois., el 41% de 27 cepas de G. adiacens y 12 de A. defecti­ va fueron sensibles a la penicilina (CIM, < 0 ,1 2 ug/mL), el 51% tenía una sensibilidad intermedia (CIM, 0,25-2 |ig/mL) y el 8% eran resistentes a la penicilina (CIM, > 4 |ig/mL).975 Las cepas de G. adiacens fueron más sensibles a la penicilina y la cefazolina (55% de sensibilidad a la penicilina, 52% de sensi­ bilidad a la cefazolina) que las cepas de A. defectiva (8% de sensibilidad a la penicilina, 0% de sensibilidad a la cefazolina). Para ceftriaxona, el 83% de las cepas de A. defectiva y el 63% de G. adiacens eran sensibles en el punto de corte del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). En este estudio, todas las cepas fueron sensibles a clindamicina, rifampicina, ofloxa­ cina, levofloxacina, quinupristina-dalfopristina y vancomicina y no se detectó resistencia elevada a los aminoglucósidos. Como estos microorganismos necesitan piridoxal para su cre­ cimiento, los medios de prueba de sensibilidad a los antibióti­ cos deben ser complementados con clorhidrato de piridoxal (concentración final del 0,001%) para su realización.956 Especies de Aerococcus y de Helcococcus

Los aerococos son microorganismos similares a Strepto­ coccus que se encuentran en el medioambiente, casi siempre en asociación con agua y pueden aislarse en aire, polvo, suelo,

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Cocos grampositivos: Parte il: Estreptococos, enterococos y bacterias “ sim ilares a Streptococcus"

vegetación, productos cárneos y el medioambiente hospitala­ rio.564 Aerococcus viridans, la especie más vieja del género, causa una enfermedad mortal de las langostas denominada gafkemia, pero en los seres humanos son fundamentalmente opor­ tunistas.63,756 Los aerococos han sido aislados en pacientes con algunos trastornos clínicos, como endocarditis, bacteriemia, meningitis, artritis séptica, osteomielitis e infecciones de heri­ das.565,717,775,939,948 En ocasiones, los aerococos son incluidos en estudios de eficiencia y pueden confundirse fácilmente con estreptococos viridans y enterococos. Los aerococos tienen una tendencia característica a formar tétradas cuando crecen en cal­ dos de cultivo. Los microorganismos son microaerófilos y se observa escaso o ningún crecimiento en condiciones anaero­ bias. Se ha demostrado que las cepas antes asignadas al género Pediococcus como P. urinae-equi están estrechamente relacio­ nadas desde el punto de vista fenotípico con A. viridans.22* En general, las cepas de A. viridans son sensibles a penicilina, macrólidos, sulfamidas y trimetoprim. En 1989, Christensen y cois, en Copenhague comunicaron sobre un grupo de 29 pacientes con sospecha de infecciones urinarias en los cuales se aislaron “microorganismos similares a Aerococcus” en muestras de orina.193,194 En 11 de estos pacientes, el microorganismo fue aislado en cultivo puro (> 106 unidades formadoras de colonias [UFC]/mL). Los pacientes (20 mujeres y 9 hombres) variaron en edad de 49 a 88 años y el 50% de ellos tenían trastornos locales o sistémicos (p. ej., diabetes, neoplasias del aparato urinario o de otros sitios, urolitiasis) que también los pueden haber predispuesto a una infec­ ción por microorganismos oportunistas. Los pacientes con sep­ ticemia y endocarditis causadas por estos microorganismos eran ancianos, tenían algún tipo de enfermedad subyacente (p. ej., infarto de miocardio, cáncer de próstata, diabetes) y en ellos se habían aislado microorganismos similares a Aerococcus en muestras de sangre u orina.191,192 La caracteriza­ ción fenotípica de estas cepas de microorganismos similares a Aerococcus demostró que diferían de las cepas de A. viridans en varios aspectos.8,194 Sobre la base de los criterios fenotípicos de diferenciación y el análisis filogenético de los datos de secuencia de rRNA 16S de cepas de referencia de A. viridans, Aguirre y Collins propusieron clasificar a estos microorganis­ mos como la nueva especie Aerococcus urinae? La inclusión de A. urinae en el género Aerococcus se sustenta en los resul­ tados de secuenciación del rRNA 16S, y estos datos también son el sustento de la inclusión tanto de los biotipos esculina positivos como los esculina negativos dentro de la misma espe­ cie.195 Desde la denominación de esta nueva especie, se ha comunicado A. urinae como causa de infecciones urinarias, septicemia, endocarditis, infecciones de tejidos blandos, espondilodiscitis y linfadenitis.308,473,868,869,900,1092,1094 Las cepas de A. urinae suelen ser sensibles a penicilina, amoxicilina, piperacilina, cefepima, rifampicina y vancomicina.193,899 Las quinolonas, las tetraciclinas y la eritromicina muestran una actividad moderada a buena, y la mayoría de las cepas tienen CIM ele­ vadas para algunas cefalosporinas y una menor sensibilidad a los aminoglucósidos. Algunos estudios de muerte bacteriana en función del tiempo sugieren que el tratamiento combinado es el de elección para la endocarditis causada por este micro­ organismo.899 Desde la identificación de A. urinae se describieron otras tres especies de Aerococcus: Aerococcus christensenii, Aerococcus urinaehominis y Aerococcus sanguinicola.221-606,601 A. christensenii fue aislado en muestras vaginales en la University of Washington en Seattle y había sido identificado tentativamente como Streptococcus acidominimus,221 La des­

cripción de A. sanguinocola se basa sobre un único aislamien­ to en hemocultivos humanos, pero esta especie ha sido aislada tanto en urocultivos como en hemocultivos (incluida la endo­ carditis) desde su descripción inicial en 2001.339,607 Las cepas de A. sanguinocola son sensibles a penicilina, amoxicilina, cefotaxima, cefuroxima, eritromicina, vancomicina, quinupristina-dalfopristina, rifampicina, linezolida y tetraciclinas, y tie­ nen una sensibilidad variable a las quinolonas; algunas cepas son resistentes a clindamicina. meropenem y trimetoprim-sul­ fametoxazol.339 Asimismo, la descripción de A. urinaehominis se basa sobre un único aislamiento en una muestra de orina humana.606 No existe información sobre la sensibilidad a los antibióticos de A. urinaehominis. Durante un examen de varios aislamientos similares a Strep­ tococcus provenientes de fuentes clínicas humanas, Collins y cois, encontraron nueve cepas de cocos facultativos, gramposi­ tivos y catalasa negativos semejantes a los aerococos pero que producían un crecimiento variable en caldo de NaCI al 6,5%.208 Siete de las nueve cepas fueron aisladas en heridas de los pies o las piernas y dos provenían de cultivos de masas mamarias. La otra característica inusual de estos microorganismos era que fueron lipofílicos; el crecimiento en medios de agar y en caldo fue aumentando por la presencia de suero o Tween 80. Se demostró que estos microorganismos pertenecían a un nuevo género y especie de cocos grampositivos mediante análisis genético y criterios fenotípicos y han sido asignados al nuevo género Helcoccocus como Helcococcus kunzii. Otros estudios sobre la nueva ecología de este nuevo microorganismo sugie­ ren una asociación con la flora bacteriana de las extremida­ des inferiores y una tendencia a ser aislados en las infeccio­ nes de heridas y celulitis junto con microorganismos más virulentos, como Staphylococcus aureus.141’445 Desde su des­ cripción, H. kunzii ha sido aislado en cultivo puro en un quis­ te sebáceo infectado, un absceso mamario y un absceso posquirúrgico del pie.172,764,813 En 1999, se describió una segunda especie de Helcococcus, Helcococcus ovis,209 que se encuentra en las ovejas. Especies de Leuconostoc

Las especies de Leuconostoc son cocos facultativos, heterofermentativos, no esporulados, inmóviles y grampositivos que se encuentran en el medioambiente (sobre plantas y en el suelo). Estos microorganismos tienen importancia económica debido a su uso en las industrias láctea y de conservas y en la elaboración de vinos. Han sido aislados en infecciones huma­ nas, la mayoría de las cuales ocurren en huéspedes inmunode­ primidos.434,457,513,694 Se han aislado especies de Leuconostoc en hemocultivos de pacientes con neoplasias subyacentes y caté­ teres intravenosos permanentes y también en abscesos hepáti­ cos e intraabdominales, sitios de gastrostomía y traqueostomía, abscesos odontógenos, abscesos mamarios, osteomielitis, empiema pleural, peritonitis bacteriana relacionada con diálisis y espontánea, y fístulas secretantes.59,116,400,462,696,701,953,984,1037 Se han aislado especies de Leuconostoc como agentes oportunis­ tas que producen bacteriemia e infecciones pulmonares en receptores de trasplantes de médula ósea, de trasplantes de órganos sólidos, pacientes con afecciones gastrointestinales, pacientes quemados y pacientes con SIDA.330,357,402,433,540,694 También se aisló una especie de Leuconostoc en el LCR de una niña de 16 años que antes estaba sana, en la cual el microorga­ nismo produjo una meningitis purulenta.233 Friedland y cois, comunicaron un caso de meningitis purulenta debida a L. mesenteroides en una niña de un mes.380 Carapetis y cois, des-

B a c te ria s “s im ila re s a Streptococcus”

cnbieron dos casos de baeteriemia causada por especies de Leuconostoc (específicamente, L. lactis y L. pseudomesente■ idt i en niños con enterocolitis necrosante que estaban reci­ biendo nutrición parenteral prolongada.154 En uno de estos casos, se aisló la misma cepa de L. lactis en el sitio del tubo de gastrostomía del paciente. Se comunicó baeteriemia causada por L. mesenteroides y Enterobacter sakazakii en asociación con fórmulas para lactantes contaminadas.728 También se infor­ maron especies de Leuconostoc como causas de infecciones intrahospitalarias.152'849 Las especies de Leuconostoc pueden ser identificadas erróne­ amente como neumococos, estreptococos viridans o lactobacilos. En forma similar a los pediococos y a ciertos lactobacilos, pero a diferencia de la mayoría de las otras bacterias grampositivas. las especies de Leuconostoc son intrínsecamente resis­ tentes a la vancomicina.646 En algunas comunicaciones de casos, los pacientes fueron tratados con vancomicina cuando las infecciones por estos microorganismos se evidenciaron clí­ nicamente. Las características de las especies de Leucononstoc que ayudan a diferenciarlas de otras bacterias similares a Streptococcus son su resistencia a la vancomicina y la forma­ ción de gas a partir de glucosa durante el crecimiento en caldo MRS (se explica más adelante). El tratamiento para las infec­ ciones graves por Leuconostoc incluye penicilina y aminoglu­ cósidos; la mayoría de las cepas son sensibles a tetraciclinas, imipenem, clindamicina y gentamicina. Especies de Pediococcus y de Tetragenococcus

Las especies de Pediococcus son cocos grampositivos que al igual que los estreptococos, producen ácido láctico como único producto de fermentación de la glucosa. Estos microorganis­ mos se encuentran naturalmente en las plantas y son importan­ tes en las industrias cervecera y alimentaria. Se los puede hallar en las cervezas común y de bajas calorías y también se los uti­ liza en los alimentos para el procesamiento y la preservación. Se agregan a las verduras procesadas y a los productos de soja como reforzadores de sabor y se utilizan en biotecnología como cepas indicadoras para los bioensayos vitamínicos. El género Pediococcus incluye siete especies: P acidilactici, P. damnosus, P. dextrinicus, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus y P. claussenii,289 Las cepas de P. urinae-equi, ex espe­ cie de Pediococcus, se asemejan fenotípicamente a A. viridans, y una sonda de DNA específica para A. viridans también reac­ ciona con P urinae-equi, lo que indica que son el mismo microorganismo.228-429 Además, algunos estudios genéticos que utilizaron rRNA 16S y hibridación de DNA-DNA señalan que la ex especie Pediococcus halophilus representa una línea de descendencia que está separada tanto de pediococos como de aerococos y está más estrechamente relacionada con los ente­ rococos. Debido a estos datos genéticos, las cepas antes deno­ minadas P. halophilus han sido ubicadas en el nuevo género Tetragenococcus y la especie tipo es Tetragenococcus halophilus.22s También se halló que T. halophilus es idéntico a Enterococcus solitarius. En 1997, Satomi y cois, describieron otra especie de Tetragenococcus, T. muriaticus, que fue aislada en la salsa de hígado de calamar, un alimento fermentado japo­ nés tradicional.847 Esta especie puede crecer en concentraciones de NaCl de hasta un 25%. El Bacterial Reference Laboratory of the Respiratory Diseases Brandi (Laboratorio Bacteriano de Referencia de la División de Enfermedades Respiratorias) de los CDC ha reci­ bido cepas de pediococos provenientes de distintas muestras clínicas humanas, que incluyen saliva, heces, orina, heridas,

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abscesos y sangre.667 En general, los pediococos han sido ais­ lados en pacientes con distintos trastornos subyacentes, como neoplasias hematológicas, enfermedad cardiovascular, enfer­ medad pulmonar crónica, gastrosquisis, pancreatitis y diabet e s . 4 2 ' 6 1 2 3 4 ' 4 7 4 ' 8 4 4 ' 8 9 6 Muchos pacientes con estas infecciones ha­ bían tenido una operación abdominal previa o tenían colocados tubos nasogástricos o catéteres venosos centrales para nutrición parenteral total durante períodos prolongados. Los pediococos aislados en hemocultivos suelen ser cultivos positivos únicos entre varios cultivos positivos con otros microorganismos. En un estudio de 26 pacientes que se sometieron a una desconta­ minación intestinal total con gentamicina-vancomicina-colimicina preparatoria para la terapia de inducción de remisión o el trasplante de médula ósea, Maugein y cois, observaron espe­ cies de Pediococcus en el 89% de muestras de heces recogidas en estos enfermos.670Al igual que las especies de Leuconostoc, estos microorganismos son resistentes a la vancomicina; muchos pacientes manifiestan primero síntomas de infección mientras son tratados con este antibiótico.667’941 En una comu­ nicación, P. acidilactici fue identificado en múltiples hemocul­ tivos en un hombre de 53 años con leucemia mieloblástica aguda.410 En el momento del primer hemocuitivo positivo, este paciente había estado recibiendo vancomicina durante 14 días, junto con ceftazidima, metronidazol y quimioterapia oncológi­ ca. Los pediococos aislados en muestras clínicas se identifica­ ron como P. acidilactici o P. pentosaceus. En general, los pediococos son sensibles a penicilina G, eritromicina, clinda­ micina, gentamicina e imipenem.941,944 Especies de Gemella

En la actualidad, el género Gemella incluye seis especies: G. haemolysans, G. morbillorum, G. bergeriae, G. sanguinis, G. palaticanis y G. cuniculi.2'5'2'6-219’496'510 G. haemolysans, la especie tipo del género, es un coco grampositivo de fácil deco­ loración que aparece característicamente como diplococos con las caras adyacentes aplanadas. Debido a estas propiedades, fue incluido con los cocos gramnegativos en el género Neisseria. El análisis de la pared celular demostró que el microorganismo tenía una pared celular de tipo grampositivo, aunque es mucho más delgada que la de otros microorganis­ mos grampositivos. Algunos estudios de hibridación de ácidos nucleicos no mostraron ninguna relación con los miembros de la familia Neisseriaceae. Estos datos, junto con la reacción de catalasa negativa, relegaron a esta especie a la familia Streptococcaceae. Sin embargo, al contrario de lo que sucede con los estreptococos, el crecimiento es malo en condiciones anaerobias. G. morbillorum fue clasificado antes con los estreptococos como Streptococcus morbillorum e incluido en un principio en los estreptococos viridans. El análisis genético de cepas de S. morbillorum indicó que el microorganismo estaba más estrechamente relacionado con G. haemolysans que con los estreptococos y los peptoestreptococos.570-640-1055 Algunos estudios de cromatografía gas-líquido mostraron que, además del ácido láctico, algunas cepas también producían ácidos acético, fórmico, succínico y pirúvico, más cantidades pequeñas de etanol, lo que apoyó la transferencia de S. morbi­ llorum al género Gemella como Gemella morbillorum. En 1998, se caracterizaron y describieron dos especies nuevas de Gemella: Gemella bergeriae y Gemella sanguinis.215-2'6 Estas cepas (seis de cada especie) fueron aisladas en sangre y eran distintas de las especies de Gemella descritas mediante carac­ terización bioquímica y molecular. Con posterioridad, se des­ cribieron otras dos especies: Gemella palaticanis y Gemella

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C A P ÍT U L O 13

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “sim ilares a Streptococcus"

cuniculi,219'496 G. palaticanis fue aislado en una vesícula de la cavidad bucal de un perro Labrador retriever y G. cuniculi, en un absceso submandibular de un conejo de orejas caídas. En la actualidad, no se conoce el hábitat de G. bergeriae y G. sanguinis en los seres humanos y, fuera del aislamiento en los hemocultivos, no se ha asociado ninguna infección específica con esta nueva especie. Los miembros del género Gemella se aíslan pocas veces en muestras clínicas. Sin embargo, su similitud con los estrepto­ cocos viridans probablemente ha conducido a que no fuera reconocido y a que fuera mal interpretado. G. haemolysans forma parte de la flora de las vías respiratorias altas, mientras que G. morbillorum puede hallarse en los aparatos respiratorio y digestivo humanos. Se ha aislado tanto G. haemolysans como G. morbillorum como causas ocasionales de bacteriemia y endocarditis que afectan válvulas cardíacas nativas y protési­ cas.75’346’379’490'600’698'744 También se han comunicado casos de meningitis, meningoencefalitis, artritis séptica, osteomielitis, espondilodiscitis, queratitis con endoftalmitis, absceso retrofaríngeo, empiema torácico con absceso pulmonar, shock séptico y una artroplastia de rodilla infectada asociada con especies de Gemella 41>245.261.3i4,3i5,671,689,744,785,815,997,1003,1008,1017 igual que las infecciones por S. bovis, también se ha realizado una aso­ ciación entre endocarditis debida a especies de Gemella y la presencia de pólipos adenomatosos y carcinoma de colon.477633 En general, las especies de Gemella son sensibles a una amplia variedad de agentes antibióticos, que incluyen penicilina, ampicilina, rifampicina y vancomicina, pero se puede observar resistencia de bajo nivel a aminoglucósidos y trimetroprim en algunas cepas.144 En 1993, se observó que una cepa de G. hae­ molysans que fue aislada en un hemocultivo tenía menor sensi­ bilidad a la penicilina y resistencia franca a vancomicina, tei­ coplanina, eritromicina y tetraciclina.804 Especies de Vagococcus

El género Vagococcus fue propuesto en 1989 para categorizar un grupo de cocos grampositivos móviles y catalasa nega­ tivos que se asemejaban a lactococos.206 Estos microorganis­ mos móviles habían sido aislados en heces de pollos y agua de río. Utilizando datos de secuenciación del rRNA 16S, se mos­ tró que estas cepas “similares a Lactococcus" móviles forma­ ban una línea de descendencia distinta dentro de las bacterias productoras de ácido láctico y estaban claramente separadas de los estreptococos, enterococos y especies de Lactococcus sensu stricto. Más aún, también se observó que eran fenotípicamente distintas. Collins y cois, colocaron a estos microorganismos en el nuevo género Vagococcus (“coco errante”).206 Las cepas similares a Lactococcus móviles del grupo N en el género Vagococcus se denominan ahora Vagococcus fluvialis (“pro­ pias de un río”). También se han aislado cepas de V. fluvialis en lesiones cutáneas y amígdalas en cerdos, vacas, caballos y gatos domésticos.781 Los CDC han comunicado la recepción de dos cepas de V. fluvialis, una de un hemocultivo y la otra del líquido peritoneal de un paciente en diálisis renal.336 Se han ais­ lado otras cepas de V. fluvialis en muestras clínicas humanas (hemocultivos, líquido peritoneal, heridas), en animales (cer­ dos) y en el medioambiente (agua de pozo).950 Durante un estudio genético de lactobacilos atípicos aislados en distintos productos cárneos (miembros del género Carnobacterium), se describieron dos cepas en truchas arco iris adultas, distintas de las aisladas en las aves de corral.1024 Estas dos cepas mostraron el máximo grado de homología de secuen­ cia del rRNA 16S con cepas de V. fluvialis, con las que forman

un grupo genético cercano filogenéticamente a carnobacterias, estreptococos, lactococos y enterococos, pero distinto de ellos. Los dos aislamientos provenientes de salmónidos han sido asignados al género Vagococcus como Vagococcus salmoninarum. Más tarde, se demostró que este microorganismo produ­ cía infecciones peritoneales en el salmón y en la trucha marrón.861 En 1999, se describió una tercera especie de Vagococcus aislada en muestras de sangre, hígado, pulmón y bazo de una nutria común (Lutra lutra). Esta cepa fue caracte­ rizada genéticamente y denominada Vagococcus lutrae,608 En 2000, se aisló una cuarta especie de Vagococcus durante exá­ menes post mórtem en una foca y una marsopa de puerto. Esta cepa se halló en cultivo puro en los tejidos hepáticos y renales de la foca, y se observó un crecimiento importante en los teji­ dos peritoneal. esplénico, renal, hepático, pulmonar, encefáli­ co, placentario e intestinal de la marsopa del puerto. Sobre la base de los datos filogenéticos y fenotípicos, la cepa fue deno­ minada Vagococcus fessus.49* No se ha aislado V. salmoninarum, V. lutrae y V. fessus en muestras clínicas obtenidas de seres humanos. Especies de Alloiococcus

En 1989, Faden y Dryja informaron sobre el aislamiento de un coco grampositivo grande y de lento crecimiento en 10 niños con otitis media crónica con derrame.343 Los niños tenían 10 meses a casi 3 años de edad, y cada niño tenía antecedentes de dos a cinco episodios de otitis media. Mediante la aspiración del oído medio se extrajeron secreciones serosas, mucoides o francamente purulentas; se observaron células inflamatorias en todas las muestras. En la mayoría de los casos, también se pudieron observar grandes cocos grampositivos en los frotis teñidos con Gram de estos líquidos. Se aisló un nuevo micro­ organismo en cultivo puro en 11 aspirados óticos y en cultivo mixto con Haemophilus influenzae no tipificable, difteroides, micrococos o estafilococos coagulasa negativos en cinco mues­ tras. En uno de los niños examinados en el estudio se aisló el mismo microorganismo en tres muestras separadas de oído medio recogidas en un período de 8 meses. En cultivo, los microorganismos crecieron con extremada lentitud y conduje­ ron a los autores a sugerir que tal vez habían sido omitidos en el pasado porque las placas de cultivo no habían sido incuba­ das el tiempo suficiente. Debido a la asociación de este gram­ positivo de lento crecimiento con la otitis media crónica, Faden y Dryjia recomendaron que las muestras para cultivo obtenidas por aspiración del oído medio debían ser incubadas por lo menos durante 5 días para facilitar la detección de estas bacte­ rias.343 Aguirre y Collins caracterizaron luego este coco inusual y lo llamaron Alloiococcus otitis.6 Una revisión del nombre de este microorganismo de A. otitis a A. otitidis fue sugerida y aprobada luego de acuerdo con las reglas de la nomenclatura binomial. Además de las cepas aisladas en secreciones del oído medio, los CDC han recibido cepas de A. otitidis provenientes de hemocultivos y esputo.336 Las cepas de A. otitidis son sensi­ bles o tienen una resistencia intermedia a penicilina, ampicili­ na y cefalosporinas de espectro ampliado (cefixima, ceftriaxo­ na) y son resistentes a eritromicina y trimetoprim-sulfametoxa­ zol.118 Debido a su lento crecimiento, varios investigadores han ideado métodos de amplificación molecular para la detección de este microorganismo en derrames del oído medio.7’92620 Estas técnicas altamente sensibles también han permitido la detección del microorganismo en la nasofaringe y el conducto auditivo externo, lo que sugiere que estos sitios constituyen su hábitat natural.305

B a c te ria s “s im ila re s a Streptococcus”

Em e: es de Globicatella

Er 1992. Collins y cois, describieron nueve aislamientos clí­ nicos rumanos únicos (cinco provenientes de hemocultivos, urocultivos y uno de LCR).205 Los rasgos fenotípicos indicaron que estas cepas no eran miembros de los grupos Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus o Aerococcus. Además, los investigadores genéticos mostraron claramente una rea de descendencia distinta para estas cepas dentro del “grupo de bacterias productoras de ácido láctico”. Estas cepas han -ido asignadas al nuevo género Globicatella (que significa .na .adena corta compuesta por células esféricas). Todas eran :er. úricamente similares y han recibido el nombre de especie Globicatella sanguinis (antes G. sanguis). Las cepas de G. sanptinis 'emitidas a los CDC provenían de hemocultivos, urocul: ' \ cultivos de heridas y de una muestra de LCR obtenida durante una necropsia.336 En 2001, Shewmaker y cois, comur. sobre 28 cepas de G. sanguinis que habían sido aísla­ l a en urocultivos y hemocultivos de pacientes con diagnósticc de endocarditis, sepsis y baeteriemia.884 Vandamme y cois, er. Bélgica caracterizaron una segunda especie de Globicatella que :ue aislada en infecciones del aparato respiratorio y arti­ culares en temeros, ovejas y cerdos.991 Esta cepa fue denomi­ nada Globicatella sulfidifaciens por su capacidad para produ­ cir H.S. Esoecies de Facklamia

En 1997, Collins y cois, caracterizaron cinco cepas humanas ¿e cocos grampositivos catalasa negativos en muestras de urina, vagina, sangre y abscesos.210 Algunos estudios compara:: ■> de secuenciación de genes rRNA 16S demostraron que estas cepas desconocidas eran genealógicamente homogéneas • constituían una nueva línea filogenética estrechamente rela,: :r.jda con el género Globicatella pero distinta de él. También diferían de G. sanguinis en su estructura del peptidoglucano mureína. Aun cuando estaban muy estrechamente relacionadas con G. sanguinis desde el punto de vista filogenético, fenotípi_bínente eran muy diferentes. G. sanguinis producía ácido a partir de varios hidratos de carbono, mientras que las nuevas ;eras eran totalmente asacarolíticas. Estas cepas también tení­ an algunas características que se asemejaban a microorganis­ mos similares a Gemella con tolerancia a la sal, como D. r.irum (véase más adelante) y fueron colocadas en el nuevo ¿enero Facklamia como Facklamia hominis.210 Se describieron otras varias especies de Facklamia en la literatura taxonómica y microbiológica de años ulteriores. Collins y cois, caracterizaron dos cepas en sangre humana como segunda ^pecie asacarolítica, Facklamia ignava.224 El año siguiente, el mismo grupo describió a Facklamia sourekii en su caracterización de otras dos cepas aisladas en hemocultivos humanos.213 Esta nueva especie difería de F. hominis y F. ignava por ser un fermentador activo. Facklamia languida fue propuesto como nueva especie de Facklamia para describir tres cepas humanas en muestras de sangre y LCR.605 Esta especie es asacarolítica, pero difiere fenotípicamente de la otra especie en varias reacciones enzimáticas. Fackalamia tabacinalis también se describió en 1999 y fue denominado para describir una cepa aislada como un contaminante del rapé.214 Su secuencia genética de rRNA 16S se asemejó muy estrechamente a F. ignava. Facklamia miroungae fue descrito en 2001 y fue aislado en un hisopado nasal de un elefante marino joven (Mirounga leonina).497 Las distintas especies de Facklamia parecen tener perfiles de sensibilidad a los antibióticos ligeramente diferentes. LaClaire

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y Facklam determinaron la sensibilidad de F. hominis (cuatro cepas), F. ignava (cinco cepas), F. languida (seis cepas), F. sou­ rekii (tres cepas) y F. tabacinalis (una cepa) y observaron que una cepa de F. hominis y dos cepas de F. ignata tenían CIM de penicilina que caían en el rango intermedio, mientras que todas las otras cepas eran sensibles a la penicilina.593 Una cepa de F. ignava, una de F. sourekii y las seis cepas de F. languida fue­ ron resistentes a la cefotaxima; cinco de las seis últimas cepas también eran resistentes a la cefuroxima. Aunque la mayoría fueron sensibles a la eritromicina, tres cepas de F. ignava y dos de F. languida eran resistentes. Cinco de las seis cepas de F. languida y una de las cinco de F. ignava eran resistentes a la clindamicina. Todas tenían una sensibilidad intermedia o eran resistentes a trimetoprim-sulfametoxazol y ninguna fue resis­ tente a la levofloxacina o la vancomicina. Especies de Dolosigranulum, Ignavigranum y Dolosicoccus

Los géneros Dolosigranulum e Ignavigranum describen bac­ terias similares a Gemella que pueden crecer en NaCl al 6,5%. Dolosigranulum pigrum, la única especie del género, fue des­ crita en 1993, y el Laboratorio de Estreptococos de los CDC ha caracterizado varias cepas en hemocultivos, muestras oculares, hisopados nasofaríngeos, esputo, orina, aspirados gástricos y de senos paranasales, y muestras medulares de necropsia.11 D. pigrum también ha sido aislado en los hemocultivos de un hombre de 64 años con sinovitis.451 LaClaire y Facklam reali­ zaron pruebas de sensibilidad en 27 cepas clínicas de D. pigrum y observaron que todas eran sensibles a penicilina, amoxicilina, cefalosporinas (cefotaxima, cefuroxima), clinda­ micina, levofloxacina, meropenem, rifampicina, tetraciclina y vancomicina; 15 eran resistentes a la eritromicina.592 Ignavigranum ruoffiae es el nombre dado a dos cepas de cocos grampositivos catalasa negativos que fueron aislados en una herida y un absceso ótico.225 Estas cepas tolerantes a la sal estaban relacionadas filogenéticamente con especies de Globicatella y Facklamia y fenotípicamente se asemejan a las especies de Facklamia asacarolíticas. No existen datos de su sensibilidad a los antibióticos. El género Dolosicoccus fue creado para clasificar a otro coco grampositivo catalasa negativo único que fue aislado en un hemocuitivo.220 Esta cepa estaba filogenéticamente relacio­ nada con G. sanguinis y el grupo de especies de Facklamia y fenotípicamente se asemeja a F. hominis y F. ignava. La única especie en el género es Dolosicoccus paucivorans. Especies de Eremococcus

El género Eremococcus fue creado para clasificar cocos filogenética y fenotípicamente iguales aislados en el aparato geni­ tal de yeguas de pura sangre.222 La secuenciación comparativa del rRNA 16S demostró que estaban relacionados con A. defec­ tiva y G. sanguinis y más lejanamente relacionados con espe­ cies de Facklamia e I. ruoffiae. La única especie en el género es Eremococcus coleocola. Género Lactococcus

El género Lactococcus consiste en “estreptococos producto­ res de ácido láctico” o “estreptococos lácteos”. Desde el punto de vista histórico, estos microorganismos portan el antígeno de grupo N de Lancefield, aunque sólo alrededor del 80% de las cepas de lactococos portan el antígeno extraíble en sus paredes celulares. Los lactococos son microorganismos infrecuentes en

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Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “sim ilares a Streptococcus”

muestras clínicas que han sido aislados en sangre, orina y heri­ das.322-652-859-1075 Los lactococos deben ser considerados patóge­ nos oportunistas de baja virulencia.10 Los miembros del género Lactococcus son L. lactis subespecie lactis, L. lactis subespe­ cie cremoris, L. lactis subespecie hordniae, L. garx’eiae, L. plantarían, L. raffinolactis y L. xylosus. L. lactis subespecie lactis y L. garveiae son las especies de lactococos aisladas más a menudo en muestras clínicas humanas.

Aislamiento e identificación de estreptococos y bacterias “similares a Streptococcus” Frotis directos con tinción de Gram

Por lo general, en las muestras clínicas la tinción de Gram de los frotis pondrá en evidencia cocos grampositivos o gramvariables dispuestos en pares o cadenas cuando en los cultivos crecen estreptococos (véase lámina en color 13-1B). Tanto en las muestras como en los cultivos en caldo, las cadenas de célu­ las tienden a aparecer como cadenas de pares de células más que como cadenas de células individuales. Las formas de las células individuales varían desde las que se asemejan a diplo­ cocos hasta las que parecen cocobacilares o corineformes. Esta morfología a menudo se observa en frotis de cultivos en caldo y también de medios sólidos. Los estreptococos viridans, en particular, tienden a tener células que parecen más alargadas. S. pneumoniae suele presentarse como pares de células lanceola­ das (véase lámina en color 13-1C). En frotis de muestras que dan cepas mucoides y muy encapsuladas, la cápsula puede apa­ recer como un halo rosado o como un área sin tinción que rodea a las células en relieve contra un fondo rosado que rodea al microorganismo. Se puede hacer un diagnóstico rápido de meningitis por estreptococos del grupo B y por neumococos por el examen de un frotis de LCR teñido con Gram. Si se remite el LCR sufi­ ciente (más de 1-2 mL), debe centrifugarse la muestra para obtener un gránulo para examen y cultivo. La citocentrifugación de muestras de LCR aumenta la detección de pequeñas cantidades de microorganismos e incrementa la sensibilidad de la tinción de Gram en comparación con las muestras con centri­ fugación convencional o sin centrifrugar.175 El uso de citocentrifugación evita la realización de pruebas del látex o coaglutina­ ción para la detección de antígenos capsulares de estreptococos del grupo B o de neumococos (véase sección sobre “Detección directa”, más adelante). Medios de cultivo

Cuando se sospechan estreptococos, las muestras para culti­ vo deben sembrarse en un medio apropiado que contenga san­ gre con una base de peptona lo suficientemente rica como para favorecer el desarrollo de estos microorganismos con requeri­ mientos nutricionales especiales. El medio base de agar debe ser un medio de infusión en peptona (p. ej., tripticasa soja, proteosa peptona, Todd-Hewitt) sin hidratos de carbono agrega­ dos. Aunque las colonias serán más grandes en medios que contengan glucosa (p. ej., medio base de Columbia) después de 24 horas, el ácido producido a partir de glucosa inactiva la estreptolisina S de los estreptococos (3-hemolíticos del grupo A y puede interferir en la interpretación de las cualidades hemo­ líticas del microorganismo. Se agrega sangre de carnero al medio basal en una concentración del 5% como células indica­ doras de hemolisis. Las concentraciones más bajas de sangre en los medios hacen más dificultoso el reconocimiento de la

reacción hemolítica, mientras que las concentraciones más altas pueden ocultar por completo la hemolisis. En agar sangre de carnero, los estreptococos pertenecientes a los grupos A, B, C, F y G son (3-hemolíticos (se describirán más adelante), mientras que la mayoría de las especies de Enterococcus y los estreptococos del grupo D son a-hemolíticos o no hemolíticos. Excepto para las cepas del grupo D y algunas cepas del grupo B, los estreptococos agrupables no hemolíticos son raros. El agar sangre de carnero no favorece el crecimiento de Haemophilus haemolyticus o Haemophilus parahaemolyticus; de ahí que pequeñas colonias (3-hemolíticas aisladas en mues­ tras en agar sangre de carnero suelen ser estreptococos. La bibliografía creciente sobre Arcanobacterium haemolyticum como causa de faringitis puede requerir cambios en los méto­ dos de laboratorio utilizados para los cultivos de faringe, por­ que este microorganismo es (3-hemolítico y catalasa negativo pero es un bacilo grampositivo (cap. 14). El agar selectivo también puede aumentar el aislamiento de estreptococos del grupo A de cultivos de faringe. Las fórmulas que más se utilizan y que se comercializan utilizan una base de agar tripticasa soja que contiene sangre de carnero al 5% y sulfametoxazol (23,75 |ig/mL)-trimetoprim (1,25 |ig/mL).1036 Gran parte de la flora orofaríngea normal (p. ej., estreptococos viridans, micrococos, estafilococos y neisserias) será inhibida en este medio. El empleo de este medio selectivo aumenta el aislamiento de estreptococos de los grupos A y B y permite la visualización de (3-hemólisis sin el “trasfondo” del crecimien­ to de otros microorganismos. Los medios selectivos comercia­ les incluyen Group A Selective Strep A® con sangre de carne­ ro al 5% (ssA; BD Diagnostics Systems, Sparks, MD) y Strep A Isolation Agar® (Remel Laboratories, Lenexa KS). En una evaluación comparativa. Pacifico y cois, cotejaron la recupera­ ción de estreptococos del grupo A en medios selectivos para estreptococos (ssA) y en agar sangre de carnero regular incu­ bado en diferentes condiciones (en aire, en CO, y en atmósfe­ ra anaerobia).751 El máximo rendimiento de cultivo positivo en este estudio se obtuvo utilizando el medio selectivo para Streptococcus incubado en condiciones anaerobias durante 48 horas. La mayoría de los laboratorios incuban medios para el aislamiento de estreptococos (3-hemolíticos del grupo A duran­ te 48 horas en un medioambiente enriquecido con CO,, presu­ poniendo que sólo los cultivos de pacientes con pequeñas can­ tidades de microorganismos o de aquellos que son portadores de estreptococos del grupo A crecen en condiciones anaero­ bias.29 Sin embargo, aun los pacientes con pequeñas cantidades de microorganismos pueden tener una respuesta inmunitaria, lo que sugiere que están infectados y no son simplemente porta­ dores del microorganismo.751 Las pequeñas cantidades de microorganismos en una placa de cultivo en un paciente con faringitis estreptocócica clínica también pueden reflejar la recolección insuficiente de las muestras. Los estreptococos aislados en muestras clínicas humanas se identifican sobre la base de sus cualidades hemolíticas, las pruebas serológicas para la detección de antígenos de la pared celular o capsulares, y pruebas fisiológicas y bioquímicas. Algunas de las pruebas realizadas en el laboratorio para la identificación de estos microorganismos proporcionan resulta­ dos presuntivos, mientras que otras brindan resultados definiti­ vos. Sin embargo, antes de proseguir con las pruebas de iden­ tificación, es necesario verificar que los cocos grampositivos en consideración son catalasa negativos utilizando H ,0, al 3%, lo que los ubica en Streptococcus y grupos bacterianos simila­ res a Streptococcus. La prueba de la catalasa se explica en deta­ lle en el capítulo 12.

A is la m ie n to e id e n tific a c ió n de e s tre p to c o c o s y b a c te ria s “s im ila re s a S treptococcus

Becuadro 1 3 -5

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Id e n tific a c ió n d e h e m o lis is

l i p a de hem olisis

Com entarios

a-hem olisis

Lisis parcial de los eritrocitos que rodea a una colonia, que produce un cambio de color gris verdoso o pardusco en el medio (lám ina en color 13-1£). Lisis com pleta de eritrocitos, que produce una eliminación de la sangre del medio debajo de las colonias y a su alrededor (lám ina en color 13-ID y F). Sin hemolisis y, en consecuencia, sin cam bio en el medio debajo de las colonias y a su alrededor. Se dice que los microorga­ nismos que no m uestran hem olisis son y-hemolíticos o no hemolíticos. Una zona pequeña de eritrocitos intactos inmediatam ente adyacente a la colonia, con una zona de hemolisis com pleta de los eritrocitos que rodea a la zona de eritrocitos intactos. Este tipo de hem olisis puede ser confundida con P-hemólisis.

^-hem olisis ‘.-hem olisis Cebado a o “zona ancha" a-hem ólisis

-em ólisis en agar sangre

Los estreptococos en agar sangre de camero pueden produ­ cir cuatro tipos de hemolisis (recuadro 13-5). La observación y la interpretación correcta de las propiedades hemolíticas de los estreptococos son muy importantes porque la realización de pruebas ulteriores se basa sobre esta evaluación inicial. Es mejor observar la hemolisis examinando las colonias que cre­ cer. en condiciones anaerobias o inspeccionando las subsuperficies en cuatro placas o en placas con siembra en estría y punción porque, para los estreptococos del grupo A, la máxima actividad de las hemolisinas lábiles al oxígeno (OLS) y esta­ bles al oxígeno (SLS) se observa sólo en condiciones anaero­ bias. Las hemolisinas lábiles al oxígeno también son produci­ das por las cepas del grupo C y algunas cepas del gmpo G, de modo que la detección de hemolisinas por estos microorganis­ mos también aumenta por incubación anaerobia. Aunque no se recomienda la incubación anaerobia sistemática de muestras en las que se sospechan estreptococos, se pueden adoptar pasos para aumentar al máximo la detección de hemolisinas bajo incubación aerobia o capnofílica. Ésta es la finalidad de la téc­ nica de “estría y punción” que se utiliza para sembrar muestras de hisopados de faringe en agar sangre para el diagnóstico de faringitis estreptocócica (fig. 13-2; véase lámina en color 131D y F). Esta técnica introduce parte del inoculo debajo del agar. creando así un medioambiente relativamente anaerobio. También se deben punzar las áreas de la placa no inoculadas con la muestra. Las placas deben ser incubadas a 35 °C en aire o en CO, al 5-7%. Aunque algunos laboratorios recomiendan un medioambiente de incubación sobre los otros para los culti­ vos faríngeos, en general el aislamiento de estreptococos (3hemolíticos de pacientes con faringitis estreptocócica no se compromete en ninguna condición ambiental.1036

del grupo A variaba entre el 62% y el 96%; la especificidad en la mayoría de los casos excedía el 97%. 150,288,333,393,489,871,1087 También se introdujeron las técnicas de inmunoanálisis liposómico como el sistema de Q Test Strep (BD Diagnostic Systems) en las cuales, en lugar de utilizar anticuerpos antiestreptococos del grupo A conjugados a una enzima, los anticuerpos eran con­ jugados a un liposoma (una “esfera” artificial de fosfolípidos) que contenía el colorante sulfato de rodamina. La reacción del antígeno con los anticuerpos lisaba el liposoma y liberaba el colorante sulfato de rodamina. Se ha evaluado el método del liposoma; la sensibilidad y la especificidad fueron del 91% y del 83%, respectivamente.394,501 El “Strep A OIA” (para inmunoanálisis óptico) (Biostar, Boulder CO) es una prueba que se realiza sobre un portaobje­ tos. El resultado se determina por un cambio físico en el espe­ sor de delgadas películas formadas por las reacciones de unión entre el antígeno del grupo A y los anticuerpos antigrupo A (véase lámina en color 13-1H). El antígeno se extrae del hiso­ po con ácido acético (0,3 M) y se agregan anticuerpos de cone­ jos contra estreptococos del gmpo A marcados con peroxidasa de rábano picante. Esta mezcla se deposita sobre el portaobje­ tos OIA, donde el antígeno se une a los anticuerpos antiestrep­ tococos del grupo A fijados sobre el portaobjetos. Se lava el

S iem bra prim aria con hisopo P rim era estría con ansa de alam bre

Técnicas de detección directa diferentes del cultivo para estreptococos p-hemolíticos del grupo A en muestras faríngeas

Las técnicas sin cultivo para la detección directa de estrepto­ cocos del grupo A en muestras de hisopados faríngeos han teni­ do un uso amplio en los laboratorios clínicos desde comienzos de la década de 1980. En estos sistemas, el antígeno estreptocó­ cico de grupo se extrae del material hisopado utilizando óxido nitroso o mediante un paso de extracción enzimática, seguido de la detección del antígeno extraído. En los primeros equipos comerciales, los formatos de aglutinación del látex o de enzi­ moinmunoanálisis (EIA) eran los métodos utilizados para la detección de antígenos (véase lámina en color 13-1G). La sensi­ bilidad de estos ensayos para detectar antígenos de estreptococos

Punción en el agar con a nsa de alam bre

E strías adicionales con el ansa de alam bre para dispersar los m icroorganism os en colonias aisladas F igu ra 13-2 Técnica de estría y punción para el aislamiento de estreptoco­ cos P-hemolíticos.

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C A P ÍT U L O 13

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “ sim ilares a Streptococcus"

portaobjetos y se aplica un sustrato enzimático (tetrametil benzidina que contiene peróxido de hidrógeno) que se deja reac­ cionar durante 4 minutos. Después del lavado, la reacción se lee examinando el matiz de luz reflejado desde el punto de reacción sobre el portaobjetos; si se presenta antígeno de es­ treptococos del grupo A en la muestra del hisopado original, el área de reacción sobre el portaobjetos aparece como una man­ cha violácea. Si el antígeno no está presente, la superficie del portaobjetos retiene su color oro. La sensibilidad y la especifi­ cidad de Strep OIA varía del 81% al 98,9% y del 95% al 100%, respectivamente.174'252’268-461-476 También se han utilizado técnicas de sondas y de sondas amplificadas de DNA para la detección directa de estreptoco­ cos del grupo A en muestras de hisopado faríngeo. La prueba Gen-Probe Group A Strep Direct (Prueba Directa para Estreptococos del grupo A, Gen-Probe, San Diego, CA) es un método quimioluminescente no isotópico que utiliza una sonda de DNA para detectar las secuencias complementarias de rRNA de los estreptococos del grupo A directamente en un extracto de un hisopado faríngeo. Esta prueba ha sido evaluada por varios grupos; se han comunicado sensibilidades del 88,6% al 94,8% y especificidades del 98% al 99,7%.174-472.475.778 Un inconveniente de la prueba Gen-Probe Group A Strep Direct es que el hisopo utilizado para recoger la muestra debe estar com­ puesto por rayón o fibras de dacrón que son esterilizadas con óxido de etileno o hisopos de dacrón esterilizados mediante rayos gamma. Los hisopos compuestos por fibras de rayón que se esterilizan mediante rayos gamma producen una quimioluminiscencia de fondo elevada. Por esta razón, no se deben uti­ lizar hisopos CulturettePlus® (rayón irradiado) (BD Bio­ sciences) con esta prueba. Hace poco, se ha comercializado el ensayo LightCycler Strep-A® (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), una prueba de sonda amplificada que utiliza PCR en tiempo real, para su uso en laboratorios clínicos. Este método utiliza el equipo LightCycler y puede evaluar hasta 32 muestras en un tiempo de ejecución de 1,5 horas. Uhl y cois., en la Mayo Clinic, evaluaron este ensayo y observaron una sen­ sibilidad y una especificidad del 93% y el 98%, respectiva­ mente.981 Es probable que la sensibilidad de este ensayo sea mayor del 93%, dado que las siete muestras evaluadas eran positivas con el ensayo LightCycler y los cultivos negativos. Es probable que otro estudio de este nuevo ensayo aclare las características de realización de este enfoque para el diagnósti­ co de la faringitis estreptocócica. En los Estados Unidos, muchas de las pruebas basadas en inmunoanálisis para la detección directa de estreptococos del grupo A y utilizadas en los laboratorios de los consultorios médicos han obtenido, por su complejidad, la eximición de la FDA de los alcances de la Clinical Laboratory Improvement Act (Ley de Mejoramiento de Laboratorios Clínicos). Algunas de estas pruebas eximidas son el BD Link2 Strep A® (BD Diagnostic Systems), la prueba QuickVue Dipstick Strep A® (Quidel, San Diego, CA) y la prueba ImmunoCard STAT Strep A® (Meridian Bioscience, Cincinnati, OH). Aunque la especi­ ficidad de los sistemas de aglutinación del látex y EIA es muy alta (habitualmente mayor del 97%), la sensibilidad de los dis­ tintos sistemas para la detección de estreptococos del grupo A varía ampliamente (entre el 62% y el 95%). Aunque el American College of Physicians y la American Society of Internal Medicine propusieron pautas de práctica para el trata­ miento de adultos con faringitis que se basaban sólo sobre cri­ terios clínicos (incluso sin utilizar las pruebas de antígenos rápidos) para el diagnóstico, este enfoque es considerado con­ troversia! por otras sociedades médicas, como la Infectious

Diseases Society of America, la American Heart Association y la American Academy of Pediatrics.98’232-398,910 La American Heart Association, los prospectos de los envases de muchos de los sistemas de prueba rápida para antígeno y la mayoría de los microbiólogos clínicos recomiendan que todas las muestras que dan resultados negativos de antígenos rápidos sean confir­ madas por cultivo. Independientemente del método de ensayo de los sistemas de prueba o de las afirmaciones del fabricante para un sistema de prueba o una técnica dados, se recomienda obtener dos hisopados faríngeos. Se debe realizar un cultivo faríngeo estándar con el segundo hisopo para las muestras que dan resultados negativos en la detección rápida de antígeno con el primer hisopo. Algunos laboratorios han sustituido el cultivo por la prueba Gen-Probe Group A Strep Direct para la confir­ mación de los resultados negativos del antígeno directo.475 Técnicas de detección directa diferentes del cultivo para estreptococos p-hemolíticos del grupo B y Streptococcus pneumoniae

El diagnóstico de la enfermedad sistémica por estreptococos del grupo B se logra mejor cultivando el microorganismo de muestras correctamente recogidas. También existen métodos para la detección directa de antígeno capsular de estreptococos del grupo B en LCR, suero y orina. Las pruebas de aglutina­ ción del látex (LA) y coaglutinación (COA) han sido utilizadas en muchos laboratorios para el diagnóstico rápido de las infec­ ciones sistémicas por estreptococos del grupo B, sobre todo meningitis durante el período neonatal. Las pruebas LA actual­ mente disponibles incluyen el sistema Directogen Meningitis Combo Test® (BD Biosciences Microbiology Products, Sparks, MD) y el sistema Wellcogen Bacterial Antigen® (Murex Diagnostics, Dartford, Reino Unido). El sistema de prueba comercial COA es la prueba de LCR Phadebact (Boule Diagnostics, Huddinge, Suecia). La sensibilidad de los produc­ tos de aglutinación del látex para la detección de antígenos de estreptococos del grupo B varía entre alrededor del 85% al 100%, aunque algunos estudios han comunicado sensibilidades de tan sólo 27% a 54%.4S'6ÍU81'446-454’511 Las especificidades correspondientes de las pruebas de aglutinación del látex va­ rían entre el 80% y el 100%.48381-446511 A pesar de la realización de estas pruebas en ensayos clínicos que condujeron a la apro­ bación para su uso, muchos laboratorios han dejado de ofre­ cerlas de rutina. Además del costo relativamente alto, no se ha confirmado su utilidad diagnóstica y pronostica después de años de experiencia. Pueden ser muy útiles en casos de sospe­ cha de meningitis en los cuales la tinción de Gram es negativa, cuando los cultivos de LCR son negativos después de 48 horas o ambos.362 En la actualidad, el método recomendado para la detección directa óptima de estreptococos del grupo B en LCR depende de la inspección cuidadosa de un frotis teñido con Gram de una muestra citocentrifugada.175 Los métodos de detección directa para estreptococos del grupo B en muestras rectovaginales son relativamente poco sensibles en comparación con el método de amplificación en caldo recomendado por los CDC (recuadro 13-3). Los ensayos rápidos en formato de aglutinación del látex o EIA no deben utilizarse para el cribado de muestras de hisopados rectovagi­ nales para estreptococos P-hemolíticos del grupo B (véase la sección sobre “Importancia clínica” en “Estreptococos Phemolíticos del grupo B”, para una explicación de los métodos de cribado).367 Como adyuvante del diagnóstico, por cultivos en infecciones respiratorias por S. pneumoniae, existen métodos para la detec­ ción de antígeno neumocócico en orina en pacientes con neu­

A is la m ie n to e id e n tific a c ió n de e s tre p to c o c o s y b a c te ria s “s im ila re s a Streptococcus?' 6 7 9

monía neumocócica. La prueba de antígeno urinario de Streptococcus pneumoniae Binax NOW® (Binax, Portland, ME» e- un ensayo inmunocromatográfico rápido que permite realizar un diagnóstico presuntivo de neumonía neumocócica mediante la detección de antígenos capsulares solubles especírk >s en muestras de orina. Los antígenos neumocócicos deteclados por esta prueba representan más del 90% de la enferme­ dad invasora que se presenta en los Estados Unidos y en todo el mundo. En un estudio llevado a cabo en el Reino Unido, el ensayo NOW fue positivo en el 82% de 107 muestras de orina ie pacientes con neumonía neumocócica bacteriémica; 3 de 1 ' pacientes con neumonía y bacteriemia debida a otros microorganismos también eran prueba NOW positivos, lo que dio una especificidad del 97%.908 En un estudio poblacional rr 'pectivo de adultos con neumonía en España, la prueba fue positiva en el 70,4% de 27 pacientes con neumonía neumocócica documentada por cultivo; la especificidad correspondiente Je la prueba en este estudio fue del 89,7%.444 En otro estudio, se detectó antígeno urinario en el 80% de 20 pacientes con bac:e~.emia neumocócica y en el 52% de 54 pacientes con S. pneu­ moniae aislado en el esputo.707 Samra y cois, evaluaron la prue­ ba NOW tanto con muestras de LCR como de orina de 22 re le n te s con meningitis neumocócica documentada por cultivo '' Para las muestras de LCR, 21 de 22 fueron positivas sensibilidad del 95,4%) con la prueba rápida; sólo 12 de 21 muestras de orina fueron positivas (sensibilidad del 57,1%). El examen de todas las muestras de LCR que eran negativas por cultivo para S. pneumoniae o positivas para otros microorga­ nismos fueron negativas, para una especificidad del 100% para muestras de LCR. Sin embargo, 5 (18,5%) de 27 muestras de nna de pacientes con cultivo de LCR positivos para otras bac­ terias y 63 (13,4%) de 470 muestras de orina de pacientes con cultivo de LCR negativos fueron positivas con la prueba NOW. L n inconveniente potencial de la prueba NOW de orina es que los portadores nasofaríngeos sanos de S. pneumoniae también pueden tener pruebas positivas. Un estudio llevado a cabo en Gambia. donde la tasa de portación entre los niños evaluados fue del 87%, comunicó que el 55% de las muestras de orina de niños sanos que eran portadores neumocócicos eran prueba Binax NOW positiva.4 En otro estudio realizado en Ecuador se observó que el 21,7% de los niños que eran portadores nasofa­ ríngeos de S. pneumoniae eran prueba NOW positivos y el 4.2% de los no portadores tenían pruebas falsas positivas de antígeno urinario.452 Estos investigadores postularon que el ensayo Binax NOW en orina puede ser más útil para el diag­ nóstico de neumonía neumocócica y bacteriemia en poblacio­ nes con bajas tasas de portación nasofaríngea de neumococos. Además de la detección de antígeno en orina, se han creado varios métodos moleculares basados en la PCR para la detec­ ción directa, identificación y tipificación de S. pneumo/i/ae.467'613-8311015 También se describieron técnicas de PCR en tiempo real que utilizan LighCycler y que comprenden la am­ plificación de genes de neumolisina o autolisina para la detec­ ción directa de neumococos de muestras clínicas, como sangre v LCR 672-883.|00° Morfología de las colonias y prueba de la catalasa

Después de 18 a 24 horas de incubación en agar sangre, las colonias de estreptococos (3-hemolíticos del grupo A tienen aproximadamente 0,5 mm de diámetro, son translúcidas o transparentes y tienen una superficie lisa o mate. En general, la zona de P-hemólisis tiene dos a tres veces el diámetro de la co­ lonia. Las colonias tienen cúpula y presentan un borde conti­

nuo. Algunas cepas de estreptococos del grupo A serán mucoides debido a la presencia de gran cantidad de material capsu­ lar. Los grupos C y G también tienen un aspecto similar, aun­ que las colonias de algunas cepas del grupo G pueden tener un tinte dorado a la inspección cuidadosa y las zonas hemolíticas suelen ser muy grandes. Los estreptococos P-hemolíticos del grupo B forman colonias más grandes en agar. el margen de hemolisis alrededor de la colonia es comparativamente más pequeño para los estreptococos del grupo B que para los otros estreptococos P-hemolíticos y en general la hemolisis es "más tenue” y menos evidente. Una proporción importante de estrep­ tococos del grupo B (hasta el 11%) puede ser no hemolítica. Las colonias de estreptococos del grupo D tienden a ser más grandes que aquellas del grupo A, de 0,5 a 1 mm después de la incubación durante toda la noche. Las cepas del grupo D son a-hemolíticas o no hemolíticas en agar sangre de camero (véase lámina en color 13-4C). En general, las colonias son gri­ ses, lisas y tienen un borde liso o continuo. Los estreptococos del grupo F forman colonias muy pequeñas y puntiformes con una zona grande de p-hemólisis. Estas colonias extremada­ mente pequeñas se denominan “colonias diminutas” y son características del grupo anginoso de estreptococos; S. angino­ sus, S. constellatus y S. intermedius. En general, las colonias P~ hemolíticas diminutas son puntiformes luego de 24 horas de incubación, aunque tienen una zona algo grande y manifiesta de P-hemólisis. Los microorganismos del grupo anginoso que crecen en medios sólidos también tienen un olor característico dulce, acaramelado o a madreselva debido a la producción de diacetilo.184 Esta característica se puede observar con los miembros a-hemolíticos, p-hemolíticos y no hemolíticos de este grupo. S. pneumoniae muestra un espectro de tipos de colonias, cuyo aspecto depende del grado de encapsulación. En general, estas colonias están rodeadas por una amplia zona verde inten­ sa de a-hemólisis. Las colonias de las cepas muy encapsuladas pueden tener varios milímetros de diámetro, son muy mucoides, parecen grises y pueden asemejarse a gotas de aceite en la superficie del agar. Las colonias de cepas menos encapsuladas son más pequeñas (véase lámina en color 13-2H). Con la incu­ bación prolongada, la porción central de la colonia puede colapsar y toma un aspecto característico en “pieza de damas”. Algunas colonias pueden colapsar todas juntas, lo que da el aspecto de la cabeza plana de un clavo sobre la superficie del agar. Otras especies de estreptococos viridans forman colonias de diversos tamaños y texturas (véase lámina en color 13-IE). Algunas pueden ser lisas y tienen un borde continuo, mientras que otras pueden parecer rugosas, con la formación de bordes festoneados con la incubación prolongada. Las colonias de Aerococcus, Pediococcus, Gemella, Leuconostoc, Tetrageno­ coccus, Vagococcus, Globicatella, Helcococcus, Facklamia, Dolosicoccus, Dolosigranulum, Ignavigranum y las especies facultativas de Lactobacillus se asemejan estrechamente a estreptococos viridans o estreptococos del grupo D en su aspecto y son a-hemolíticas o no hemolíticas. Los miembros de los estreptococos y de grupos de bacterias similares a Streptococcus son catalasa negativos, excepto por A. otitidis. Este microorganismo es similar a Streptococcus en la morfología de sus colonias pero es catalasa positivo. Algunas cepas de enterococos (sobre todo las de E. faecalis) producen una “seudocatalasa” que es responsable de la reacción de catalasa positiva débil que se observa con algunas cepas, sobre todo en los aislamientos primarios. La fuerza de esta reacción puede disminuir después de algunos subcultivos seriados.

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C A P IT U L O 13

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “sim ilares a Streptococcus"

Reconocimiento y caracterización preliminar de los estreptococos y las bacterias “similares a Streptococcus"

La determinación de hemolisis y la realización de una prue­ ba de catalasa eran en otra época los únicos requerimientos para caracterizar preliminarmente a los estreptococos. Sin embargo, con el reconocimiento de varios grupos de bacterias similares a Streptococcus en infecciones humanas, también son necesarias otras pruebas, sobre todo para cepas aisladas en líquidos corpo­ rales estériles. Algunos de estos microorganismos (especies de Leuconostoc y Pediococcus) son intrínsecamente resistentes a la vancomicina y a los antibióticos glucopéptidos cíclicos relacio­ nados (p. ej., ristocetina, aricidina y teicoplanina). El aumento aparente en el reconocimiento y el aislamiento de estos micro­ organismos puede estar parcialmente relacionado con el surgi­ miento de S. aureus resistente a la meticilina y el uso consi­ guiente de vancomicina como un antibiótico de primera línea, sobre todo en huéspedes muy debilitados. Estos microorganis­ mos y otros "‘de aspecto similar” pueden ser diferenciados pre­ liminarmente de especies de Streptococcus y Enterococcus y entre ellos con las pruebas que se muestran en el cuadro 13-1. En agar sangre de carnero, estos microorganismos se aseme­ jan a estreptococos viridans o enterococos; todos ellos son ahemolíticos o no hemolíticos. Se observa una morfología estreptocócica característica -cadenas de cocos- con los estrep­ tococos, enterococos, lactococos, especies de LeuconostocAVeissella, especies de Vagococcus, especies de Abiotrophia/Granulicatella, especies de Dolosicoccus, especies de Ignavigranum, especies de Globicatella y especies de Lactoco­ ccus en los frotis teñidos con Gram de cultivos de caldo de tioglicolato. Los cocos grampositivos dispuestos predominante­ mente en pares, tétradas o en cúmulos son más característicos de los aerococos, especies de Alloiococcus, especies de Gemella, especies de Pediococcus, especies de Helococcus y especies de Tetragenococcus. Algunas de las bacterias similares a Streptococcus descritas hace poco (p. ej., especies de Fackla­ mia, especies de Tetragenococcus) a menudo forman pares o cadenas cortas. En general, los lactobacilos facultativos mues­ tran la morfología bacilar típica, mientras que otras especies se asemejan a cocos. La observación de cocos grampositivos en cadenas cortas en medios de cultivos de sangre y el crecimien­ to de microorganismos en subcultivo de agar chocolate sin cre­ cimiento en el subcultivo de SBA correspondiente sugieren especies de Abiotrophia/Granulicatella. En medios que contie­ nen sangre, algunas cepas pueden producir una reacción de catalasa débil con H20 , al 3%; por lo tanto, las cepas que mues­ tran esta reacción deben ser subcultivadas en medio sin sangre y revaluadas para actividad de catalasa. Cabe señalar que la única especie entre las bacterias similares a Streptococcus que es verdaderamente catalasa positiva es Alloiococcus otitidis. La investigación de la sensibilidad a la vancomicina de los estreptococos viridans o no hemolíticos aislados en líquidos corporales mediante procedimientos asépticos pueden evaluar­ se utilizando el disco común de 30 ¡ag en una placa de agar san­ gre de camero incubada a 35 °C durante 18 a 24 horas. Algunas cepas pueden requerir una incubación prolongada (hasta 72 horas) para interpretar la prueba. Los microorganismos resis­ tentes a la vancomicina (especies de Pediococcus, especies de Leuconostoc) suelen tener CIM mayores de 250 (ig/mL y cre­ cen hasta el borde del disco. La presencia de cualquier zona alrededor del disco indica sensibilidad a la vancomicina. La producción de gas a partir de glucosa, una prueba útil para la diferenciación de las especies de Leuconostoc de los otros microorganismos, se determina mejor en caldo de Mann,

Rogosa y Sharpe (MRS) para Lactobacillus (Difeo Labora­ tories, Detroit MI) cubierto con vaselina.269 La formación de burbujas bajo el sello de vaselina indica producción de gas y la naturaleza heterofermentativa de su metabolismo. El caldo MRS se incuba hasta durante 7 días. Otras pruebas útiles para la caracterización preliminar de los microorganismos similares a Streptococcus son pirrolidonil arilamidasa (PYR), leucina aminopeptidasa (LAP) y pruebas de tolerancia a la sal. Esta última se realiza en caldo con infusión de corazón que contie­ ne NaCl al 6,5% y se incuba hasta 14 días antes de llamarla negativa. El parámetro es la presencia de crecimiento, como en la prueba de tolerancia a la sal para la identificación de enterococos. Las pruebas PYR y LAP están disponibles como prue­ bas rápidas en disco de varios fabricantes (p. ej., Remel; CarrScarborough, Decatur, GA) y también en algunos de los siste­ mas comerciales (p. ej., API Rapid STREP). La prueba para Streptococcus BactiCard (Remel) incluye PYR, LAP y una prueba de hidrólisis de esculina. Esta tarjeta, cuando se utiliza con resultados de sensibilidad a la vancomicina, puede propor­ cionar una caracterización preliminar de especies de Entero­ coccus, Lactococcus, Aerococcus, Gemella, Leuconostoc, Pe­ diococcus y Globicatella. En ocasiones, pruebas menos frecuentes son útiles para aumentar las pruebas tradicionales o confirmar las identifica­ ciones obtenidas con sistemas comerciales. Para las pruebas de temperatura de crecimiento, se recomienda utilizar un baño de agua regulado a 45 °C y un refrigerador a 10 °C. Si existe algún crecimiento, se observa después de 24 a 48 horas de incu­ bación. La motilidad se determina en un medio de agar semisó­ lido común para motilidad, con el agregado de tetrazolio o sin él. Esta prueba debe ser incubada hasta 48 horas a temperatura ambiente. La prueba de Voges-Proskauer (VP) para acetilmetilcarbinol que se utiliza para los estreptococos se realiza en caldo VP con un inóculo importante incubado durante toda la noche. Después del agregado de a-naftol y reactivos de hidróxido de sodio, se agita o se sacude el tubo y se lo incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. En este momento, las reacciones rojas, rosadas e incoloras corresponden a reacciones positivas, débilmente positivas y negativas, respectivamente. Identificación presuntiva de estreptococos

Los estreptococos (3-hemolíticos, los neumococos, los estreptococos del grupo D y los enterococos son identificados definitivamente utilizando procedimientos serológicos (que se explican más adelante) que detectan los antígenos de grupos de Lancefield (grupos A, B. C, D, F y G) o los antígenos de poli­ sacáridos capsulares (5'. pneumoniae) de los microorganismos. La identificación de especie de los estreptococos del grupo D, especies de Enterococcus y los estreptococos viridans se logra fundamentalmente mediante pruebas bioquímicas, fisiológicas y enzimáticas. Sin embargo, muchos laboratorios utilizan algu­ nas pruebas presuntivas que se correlacionan altamente con los métodos serológicos, aunque son menos costosas. En el cuadro 13-2 se resumen los resultados de las pruebas presuntivas para los principales gmpos de estreptococos. En los protocolos 1-2, 1-6, 8-1 y 13-1 a 13-4 se describen los procedimientos detalla­ dos para la realización y la interpretación de las pruebas pre­ suntivas más frecuentes. SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA

La prueba de sensibilidad a la bacitracina se utiliza para la identificación presuntiva de los estreptococos (3-hemolíticos

Cuadro 13-1

Características fenotípicas para la identificación presuntiva de cocos grampositivos catalasa negativos MORFOLOGÍA DE LA TINCIÓN HEMOLISIS, DE GRAM SBA

CRECI­ MIENTO, 35-37 °C, CA

CRECIMIENTO, 35-37 °C, SBA

Streptococcus

+

+

Cadenas

a , p ,y

Enterococcus

+

+

Cadenas

Abiotrophia

+

-

Granulicatella

+

-

GÉNERO

CAT

LAP

PYR

SENSIBILIDAD A LA VANCOMICINA

-

+

-

S

-

-

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-

V

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+

+

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-

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Cadenas

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Cadenas

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-

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CRECIMIENTO, CALDO DE NaCI AL 6,5%

CRECIMIENTO, CRECIMIENTO, 10 °C 45 °C

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-

-

+

-

+

Tétradas, grupos, cadenas

a, y

V

+

S

-

-

-

-

-

0 0

+

Cadenas

a, y

+

+

S

-

+

+

+

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+

+

Grupos, tétradas

a

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+

S

-

-

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-

"O O O

Globicatella

+

+

Cadenas

a

-

+

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-

-

+

-

-

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Facklamia

+

+

Grupos, cadenas

a

+

+

s

-

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+

-

-

CT

Dolosigranulum

+

+

Grupos, tétradas

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+

+

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-

-

+

-

-

0

Ignavigranum

+

+

Grupos, cadenas

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-

-

Dolosicoccus

+

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Cadenas

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-

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+

+

Cadenas

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-

-

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-

+

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+

+

Cadenas

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+

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-

-

V

+

V

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+

+

Tétradas, grupos

a

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+

+

Tétradas, grupos

y

-

Leuconostoc

+

+

Cadenas

a, y

Weisella

+

+

Cadenas

a, y

Pediococcus

+

+

Tétradas, grupos

a

Tetragenococcus

+

+

Tétradas, grupos

Gemella

+

+

Vagococcus

+

A lloiococcus

3

0

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o

o ci 0 3 O 0) o O' 3 Q_

CO

+

0

o o o

ÍD

0

+: reacción positiva; reacción negativa; V: reacción variable; ND: datos no disponibles; +d: reacción positiva débil; CA: agar chocolate; Hemolisis SBO: hemolisis en agar sangre de camero, CAT: catalasa; LAP: leucina am inopeptidasa; PYR: pirrolidonil arilamidasa; MOT: motilidad.

0) —t 0 CO 0) CO

1 O o o

8 §L O) 00

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Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “sim ilares a Streptococcus”

del grupo A. La prueba se realiza en un medio de agar sangre con un disco diferencial de bacitracina (p. ej., disco de bacitra­ cina TAXO A, 0,04 unidades, BD Microbiology Systems, Cockeysville, MD; discos Bacitracin Diferenciation, 0,04 uni­ dades, Remel). El procedimiento se describe en detalle en el protocolo 13-1. Cualquier zona de inhibición alrededor del disco se considera una prueba positiva (véase lámina en color 13-2B y C). Aunque es una prueba simple, económica y bas­ tante precisa para la identificación presuntiva de estreptococos del grupo A, no es altamente específica. Más del 10% de las cepas de estreptococos de los grupos C y G también son sensi­ bles a la bacitracina, como lo son alrededor del 5% de las cepas del grupo B. En consecuencia, esta prueba se realiza a menudo junto con la prueba de sensibilidad a trimetoprim-sulfametoxazol porque los estreptococos de los grupos C y G suelen ser sensibles a este antibiótico, mientras que los estreptococos de los grupos A y B son resistentes. Algunos investigadores han recomendado el uso de discos de bacitracina directamente sobre el agar sangre primario no selectivo para la rápida detec­ ción e identificación de estreptococos del grupo A en cultivos faríngeos. Sin embargo, este método sólo identifica el 50-60% de las cepas. La colocación de discos de bacitracina en placas primarias que contienen medios selectivos es mucho más sen­ sible. El informe de laboratorio debe reflejar el uso de un méto­ do presuntivo: “estreptococos (3-hemolíticos, presuntivamente no grupo A por bacitracina”. SENSIBILIDAD A TRIMET0PRIM-SULFAIVIET0XAZ0L

La prueba de sensibilidad a trimetoprim-sulfametoxazol pre­ suntivamente distingue los estreptococos de los grupos A y B de otros estreptococos [3-hemolíticos. Cuando se la utiliza junto con la prueba de la bacitracina, ayuda a separar los estreptoco­ cos no A, no B que pueden ser sensibles a la bacitracina, por­ que tanto las cepas A como B son resistentes a trimetoprim-sulfametoxazol, mientras que los grupos C, F y G son sensibles (véase lámina en color 13-2C). La prueba se efectúa de la misma forma que la de la bacitracina, salvo en que se utiliza un disco comercial que contiene 1,25 \ig de trimetoprim y 23,75 |ig de sulfametoxazol. Cualquier zona de inhibición indica sen­ sibilidad a trimetoprim-sulfametoxazol (véase protocolo 13-1). PRUEBA DE CAMP Y PRODUCCIÓN DE PIGMENTO

La prueba de CAMP (denominada así por Christie, Atkins y Munch-Petersen) se utiliza para identificar presuntivamente estreptococos del grupo B (véase protocolo 8-1) y se realiza uti­ lizando una cepa de S. aureus productora de P-hemolisina (ATCC [American Type Culture Collection] 25923).196 Los estreptococos del grupo B secretan una proteína llamada “factor CAMP” que interactúa con la P-hemolisina producida y secre­ tada por S. aureus para producir una hemolisis mayor o sinérgica. Esta aparece como un área con forma de punta de flecha de mayor hemolisis en el lugar donde las dos líneas de crecimien­ to están más próximas (véase lámina en color 13-2D).255 Esta prueba es altamente sensible, e incluso cepas del grupo B no hemolíticas serán CAMP positivas. Un pequeño porcentaje de estreptococos del grupo A también serán CAMP positivos, al igual que algunas cepas de Listeria monocytogenes. Esta prue­ ba se utiliza a menudo junto con las pruebas de bacitracina y trimetoprim-sulfametoxazol en la misma placa de agar sangre para la identificación presuntiva de estos microorganismos (cua­ dro 13-2). Los informes deben declarar “estreptococos P-hemolíticos del grupo B presuntivos por prueba de CAMP”.

La prueba de CAMP sigue siendo ampliamente utilizada pa­ ra la identificación presuntiva de estreptococos del grupo B, pero se han explotado otras características fisiológicas del microorganismo como posibles métodos de identificación. Los estreptococos del grupo B producen un pigmento carotenoide naranja rojizo en ciertos tipos de medios de cultivo. Esta pro­ piedad ha sido explotada para su identificación presuntiva y varios investigadores han publicado fórmulas en los medios para este objetivo.266,945 De la Rosa y cois, comunicaron en España sobre un medio denominado NGM (nuevo medio Granada).265 Este medio contiene peptona proteosa, almidón soluble, glucosa, piruvato y agar como medio basal, con metotrexato de sodio como reforzador de pigmento y colistina como agente selectivo. Cuando se sembraron muestras del aparato genital femenino en NGM y se las incubó en condiciones ana­ erobias, se detectaron el 95% de los estreptococos del grupo B por el crecimiento de colonias naranja-rojizas después de 18 horas de incubación. La colocación de NGM en tubos profun­ dos de agar detectó el 98% de los estreptococos del grupo B dentro de las 12 horas. La pigmentación fue menos evidente o intensa cuando las placas fueron incubadas en condiciones aerobias, pero esta diferencia no se observó con NGM en tubo. Se han utilizado medios de agar y de Granada en caldo para la búsqueda de estreptococos del grupo B en la vagina en muje­ res preparto y se han obtenido resultados similares a los logra­ dos con el caldo LIM selectivo.103,1020 Los medios de Granada se utilizan principalmente en centros europeos y no se comer­ cializan en los Estados Unidos. Recientemente se ha comercializado una adaptación del medio de Granada para la detección de estreptococos del grupo B en muestras rectovaginales. El sistema Strep B Carrot Broth (Hardy Diagnostics, Santa Maria. CA) consiste en un tubo de medio líquido que contiene proteosa peptona, almidón y siste­ mas amortiguadores (buffers). Los enriquecimientos suple­ mentarios para el crecimiento de estreptococos del grupo B son proporcionados en un disco de papel de filtro que se deja go­ tear en forma aséptica en el medio de caldo antes de la inocu­ lación. Se coloca un hisopado rectovaginal de la paciente en el medio después de la recolección y se sella bien el tubo con la tapa a rosca. Se incuba luego el caldo durante 6 a 24 horas a 35 °C. Los estreptococos P-hemolíticos del grupo B viran el naranja del caldo Strept B Carrot a rojo en 6 a 24 horas, con­ firmando así su presencia en la muestra. Las pruebas de caldo que viran el rojo a naranja no necesitan ser subcultivadas para confirmar la presencia de estreptococos del grupo B; los tubos que no viran el naranja a rojo luego de la incubación deben ser subcultivados en agar sangre. Sólo los estreptococos del grupo B P-hemolíticos viran el naranja del caldo de Carrot a rojo; un cambio de color no ocurre fiablemente con las cepas no hemo­ líticas. En la actualidad, se evalúa esta prueba nueva para determinar si el sistema Strep B Carrot Broth es equivalente al método que utiliza caldo LIM con subcultivos en placas de agar sangre. HIDRÓLISIS DE HIPURAT0 DE SODIO

Los estreptococos del grupo B también pueden hidrolizar el hipurato en sus componentes glicina y ácido benzoico. Para la prueba se inocula el microorganismo en caldo con hipurato de sodio y se incuba durante la noche a 35 °C. Las células se cen­ trifugan y se extrae el sobrenadante. Se agrega un reactivo con cloruro férrico (0,2 mL; FeCl3 ■g H20 , 12 g en 100 mL de solu­ ción acuosa de HC1 al 2%) en el sobrenadante (0,8 mL), con formación de un precipitado pesado. Si el precipitado se man-

Criterios fenotípicos para la identificación presuntiva de estreptococos y enterococos de importancia clínica

MICROORGANISMO

HEMOLISIS

BACITRACINA

SXT

PRUEBA DE CAMP

Estreptococos del grupo A

P

S

R

-

Estreptococos del grupo B

P, ninguna

R

R

+

Estreptococos de los grupos

P

V

S

-

Enterococos del grupo D

a , p, ninguna

R

R

Estreptococos del grupo D, no enterococos

a, ninguna

R

S

Estreptococos viridans

a , ninguna

V

S

Neum ococos

a

V

s

CRECIMIENTO, CALDO CON NaCI AL 6,5%

OPTOQUINA

SOLUBILIDAD DE BILIS

LAP

PYR

ESCULINA DE BILIS

+

+

-

-

R

-

+

-

-

V

R

-

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—

—

—

R

—

Y

+

+

+

+

R

-

-

+

—

+

—

R

V

+

-

V

-

R

+

-

-

-

S

HIDRÓLISIS DE HIPURATO

+

C, F y G

+ : reacción positiva;

-

-

reacción negativa; S: sensible; R: resistente; SXT: trimeloprim-sulfametoxasol; LAP: leucina aminopeptidasa; PYR: pirrolidonil arilumidasa.

■

.

Aislam iento e identificación de estreptococos y bacterias “similares a Streptococcus•'

Cuadro 13-2

683

684

C A P ÍT U L O 13

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus"

tiene luego de 1 0 minutos, hay ácido benzoico y la prueba de hidrólisis del hipurato es positiva. Como alternativa, puede agregarse reactivo de ninhidrina al sobrenadante para detectar glicina libre .506 Con este método, la aparición de un color azul intenso es positiva. Los estreptococos (3-hemolíticos hipuratopositivos se informan como “presuntos estreptococos del grupo B por hidrólisis del hipurato” . PRUEBA DE BILIS ESCULINA

Esta prueba se utiliza para la identificación presuntiva de especies de Enterococcus y estreptococos del grupo D. En general, se realiza en agar inclinado o en una placa (protocolo 13-2). Los microorganismos que son bilis esculina positivos pueden crecer en presencia de bilis al 40% e hidrolizar la escu­ lina. La mayoría de las especies de Enterococcus y los estrep­ tococos del grupo D ennegrecen el medio de bilis-esculina den­ tro de las 24 horas (véase lámina en color 13-2F); algunas raras cepas pueden requerir una incubación de 48 horas antes de que se aprecie hidrólisis . 197 Se deben tomar precauciones en utilizar fórmulas de agar bilis esculina que contengan el requisito de bilis al 40%; los productos de algunos fabricantes contienen menos bilis que esta cantidad, lo que conduce a la identifica­ ción equivocada de algunos estreptococos viridans como estreptococos del grupo D o enterococos. PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL (CALDO DE NaCl AL 6,5%)

La prueba de tolerancia a la sal (caldo de NaCl al 6,5%) sepa­ ra las especies de Enterococcus de los estreptococos no enterococos grupo D S. bovis y S. equinus (véase protocolo 13-4). Se inocula el microorganismo por identificar en un agar o caldo con base de infusión que contiene NaCl al 6,5%. Después de una incubación durante toda la noche, se observa el medio para detectar la presencia de crecimiento, lo que indica tolerancia a la sal al 6,5%. Las especies de Enterococcus serán tolerantes a la sal (véase lámina en color 13-2D); S. bovis no crece. PRUEBA DE LA LEUCINA AMINOPEPTIDASA (LAP)

La producción de leucina aminopeptidasa (LAP), junto con PYR, es útil para identificar estreptococos, enterococos y algu­ nos microorganismos similares a Streptococcus. Esta prueba se encuentra disponible como un ensayo de manchas en disco (Remel; Carr-Scarbourough), como parte de un sistema de identificación presuntivo de tres pruebas (Remel BactiCard Strep) o en paneles de 4 horas o de toda la noche para la iden­ tificación de estreptococos (API Rapid Strep ) . 341 Se humedecen los discos y se coloca un inóculo importante del material de las colonias de una placa de agar (esto puede requerir que las pla­ cas con aislamientos de crecimiento muy lento se incuben 2 a 3 días antes de contar con un inóculo suficiente para la prueba). Después de 10 minutos, se agrega al disco una gota de reactivo para la detección. La aparición de color rojo en el disco des­ pués de 3 minutos señala una reacción LAP positiva; un color amarillo indica una prueba negativa y un color rosado se codi­ fica como una prueba débilmente positiva. La prueba LAP es positiva para todos los estreptococos y enterococos, y estos últimos son PYR positivos. PRUEBA DE LA PIRROLIDONIL ARILAMIDASA (PYR)

La prueba de hidrólisis de PYR (protocolo 1- 6 ) es una prue­ ba presuntiva tanto para estreptococos del grupo A como del

grupo D .342 Reemplaza a la prueba de la bacitracina y a la prueba de tolerancia a la sal para estreptococos del grupo A y especies de Enterococcus, respectivamente. La enzima detec­ tada se denomina pirrolidonil arilamidasa. Se inocula caldo que contiene PYR L-pirrolidonil-(3-naftilamida) con el micro­ organismo y se incuba a 35 °C durante 4 horas. Durante este tiempo se hidroliza PYR. Luego se detecta (3-naftilamida libre mediante el agregado del acoplador de colorante diazo, N,Ndimetilaminocinnamaldehído. Se desarrolla color rojo si PYR ha sido hidrolizado (véase lámina en color 13-2G). Esta prue­ ba es altamente sensible y específica para los estreptococos del grupo A y la mayoría de las especies de Enterococcus. Existen varias adaptaciones de la prueba de hidrólisis de PYR en el comercio y proporcionan resultados rápidos (15 minutos o menos). Otros microorganismos (p. ej., la mayoría de los lactococos, A. viridans, G. haemolysans, los estreptococos con variantes nutricionales y algunos estafilococos) también son PYR positivos. Esta prueba está incluida con la hidrólisis de esculina y la leucina aminopeptidasa en el sitema BactiCard Strep® (Remel). SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA

Se utiliza la sensibilidad a la optoquina (clorhidrato de etilhidrocupreína) para diferenciar S. pneumoniae de los otros estreptococos viridans (véase protocolo 13-3). Como sucede con las pruebas de bacitracina y trimetoprim-sulfametoxazol, la prueba de sensibilidad a la optoquina se realiza en medios de agar sangre. Sin embargo, a diferencia de las otras dos pruebas, se deben medir las zonas de inhibición antes de la interpretación. Una zona de 14 mm o más ancha alrededor del disco de 6 mm indica sensibilidad a la optoquina e identifica al microorganismo como neumococo (véase lámina en color 13-2E). Si la zona es menor de 14 mm, se debe realizar una prueba de identificación alternativa (p. ej., serología o solubili­ dad en bilis) porque algunos estreptococos viridans no neumo­ cocos y aerococos pueden mostrar pequeñas zonas de inhibi­ ción. En general, los estreptococos viridans y los estreptococos del grupo D son resistentes a la optoquina. Una evaluación reciente de la prueba con 99 cepas clínicas de S. pneumoniae y 1 0 1 estreptococos viridans comunicó una sensibilidad y una especificidad del 99% y el 98%, respectivamente .563 Se han informado cepas de S. pneumoniae resistentes a la optoquina, pero pocas veces se encuentran . 355,706 Borek y cois, también comunicaron aislamiento de Streptococcus viridans con una zona de 18 mm de inhibición alrededor del disco de optoqui­ na . 115 La caracterización de cepas de S. mitis sensibles a la optoquina puso en evidencia la adquisición de genes de S. pneumoniae que codifican subunidades de H + ATPasa, que es la diana de la optoquina . 664 Las cepas de S. pneumoniae que son resistentes a la optoquina tienen mutaciones puntuales en la subunidad a o c de la H + ATPasa y presentan CIM de optoquina que son 4 a 30 veces más altas que las de las cepas sen­ sibles . 776

PRUEBA DE SOLUBILIDAD EN BILIS

La prueba de solubilidad en bilis es otra prueba para la iden­ tificación de S. pneumoniae. Puede realizarse en una suspen­ sión del microorganismo en caldo o en solución fisiológica o directamente en una placa. Ambos procedimientos se describen en el protocolo 1-2. El desoxicolato, el reactivo de “bilis” uti­ lizado en estos procedimientos, activa las enzimas autolíticas del microorganismo.

A is la m ie n to e id e n tific a c ió n d e e s tre p to c o c o s y b a c te ria s “s im ila re s a StreptococcuS

Pruebas comerciales de identificación presuntiva

Existen placas comerciales triples para la identificación pre­ suntiva de estreptococos P-hemolíticos de los grupos A y B, estreptococos del grupo D y especies de Enterococcus. La Strep-ID Tri-Plate® (Remel) contiene tres compartimentos: un sector con agar sangre de camero para la evaluación de hemo­ lisis y la realización de las pruebas CAMP y de trimetoprimsulfametoxazol, un sector con agar bilis esculina y un sector con medio PYR. Después de la inoculación y la incubación durante toda la noche, las pruebas se interpretan como se mues­ tra en el cuadro 13-2 y en la lámina en color 13-2H. Identificación serológica de estreptococos p-hemolíticos

El trabajo pionero de Rebecca Lancefield estableció las bases de la clasificación serológica de los estreptococos aisla­ dos en humanos. Esta clasificación se basa sobre la detección de antígenos de hidratos de carbono específicos de grupo de la pared celular del microorganismo. Los estreptococos agrupables que producen enfermedad en los seres humanos pertene­ cen a los grupos de Lancefield A, B, C, D, F y G. Con este esquema sólo se pueden clasificar los estreptococos P-hemolí­ ticos y los microorganismos a-hem olíticos y no hemolíticos grupo D. Para detectar los antígenos de la pared celular de estos microorganismos, el antígeno de la pared celular debe ser extraído primero y luego solubilizado. Esto se puede lograr mediante la extracción con ácido (p. ej., ácido nitroso), la extracción en autoclave (método de Rantz-Randall) o por ex­ tracción enzimática. Una vez extraído, el antígeno puede detec­ tarse mediante distintos métodos. PRUEBA DE LA PRECIPITINA CAPILAR

En este método utilizado por Lancefield, se deposita en capas el antígeno extraído sobre los antisueros específicos de grupo en un tubo capilar.596 La formación de una reacción de precipitina en la interfaz extracto-antisuero proporciona la desig­ nación de gmpo del microorganismo.

COAGLUTINACIÓN

En esta técnica, se hace reaccionar el extracto de antígeno con S. aureus sensibilizados con anticuerpos específicos de gmpo. La aglutinación visible de los estafilococos cubiertos por el antisuero específico identifica el grupo de los microor­ ganismos. Existen sistemas comerciales de coaglutinación (Phadebact Streptococcus®, Boule Diagnostics, Huddinge, Suecia; Meritec Strep®, Meridian Diagnostics, Cincinnati OH). AGLUTINACIÓN DEL LÁTEX

Las pruebas de aglutinación del látex utilizan cuentas de látex de poliestireno como transportadores de antisueros espe­ cíficos de gmpo que se hacen reaccionar con el extracto del microorganismo. Se utilizan también ampliamente sistemas comerciales para este método (Patho-Dx Strep Grouping Kit®, Diagnostics Products, Los Angeles CA; Slidex Strep®, BioM érieux, Hazelwood MO; Meritec-Strep®, M eridian Diagnostics, Cincinnati, OH ) . 453 Los procedimientos de agluti­ nación del látex han reemplazado esencialmente a la técnica de extracción-precipitina capilar como método de referencia para el seroagrupamiento de los estreptococos P-hemolíticos (véase

685

lámina en color 13-3A). La evaluación correcta de la hemolisis es esencial para la fiabilidad de la prueba y se han comunicado reacciones cruzadas con otros microorganismos. Por ejemplo, Lee y Wetherall demostraron que algunas cepas de S. pneumo­ niae pueden dar reacciones cruzadas con el reactivo de látex de los estreptococos C .612 Este error puede ocurrir cuando los microorganismos se evalúan directamente en los frascos de he­ mocultivo sin determinar primero el carácter hemolítico de la cepa. Algunos de los reactivos comerciales también pueden tener dificultad para detectar el antígeno gmpo D en especies de Enterococcus.966 Thompson y Facklam también comunica­ ron que el reactivo grupo B en los sistemas de reactivos de aglutinación del látex de varios fabricantes daban reacciones cruzadas con cepas de S. porcinus, que pueden aislarse en seres humanos y cerdos .337’955 En la University of Illinois, hemos ais­ lado S. porcinus en varias muestras de hisopado rectovaginal remitidas para cribado de estreptococos del grupo B. Aunque estas cepas reaccionan con los reactivos de látex del gmpo B. los microorganismos forman colonias pequeñas con zonas cla­ ras muy grandes de p-hemólisis, lo cual es muy diferente de la P-hemólisis marginal blanda asociada con los estreptococos del grupo B. Identificación serológica de Streptococcus pneumoniae

La identificación definitiva de S. pneumoniae comprende la detección serológica de polisacáridos capsulares neumocócicos utilizando antisueros específicos. Esto es complicado porque existen más de 83 serotipos capsulares diferentes. El omnisuero, un producto escandinavo, es capaz de detectar todos los serotipos neumocócicos. Este conjunto de antisueros se ha uti­ lizado para crear pruebas comerciales de coaglutinación (Phadebact Pneumococcus®, Boule Diagnostics) y de aglutina­ ción del látex (Pneumoslide®, BD Microbiology Systems; Slidex Pneumo®, BioMérieux) para una rápida identificación serológica de S. pneumoniae (véase lámina en color 13-3C). En una revaluación reciente de ambos sistemas de prueba, la sen­ sibilidad y la especificidad fueron del 99-100% y del 85,198%, respectivamente .563 La identificación específica y la asig­ nación a un serotipo capsular individual se logra con la prueba de hinchazón capsular de Neufeld (Quellung). La prueba de hinchazón capsular puede utilizar un conjunto de sueros y antisueros específicos de tipo (Pneumotest®, Statens Serum Institut, Copenhague, Dinamarca). Se prepara una suspensión diluida del microorganismo en solución salina fisiológica y se mezcla un ansa de la suspensión con un ansa de azul de metileno sobre un portaobjetos de vidrio. Se aplica un cubreobjetos de vidrio y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se examina el portaobjetos con el objetivo seco de gran aumento y con el de inmersión en aceite, con luz reducida. Debido a una reacción de microprecipitinas que ocu­ rre sobre la superficie del microorganismo, cambia el índice refractario de la cápsula y adopta un aspecto "tumefacto” más visible, como un halo alrededor de las células bacterianas teñi­ das de azul (véase lámina en color 13-3B). También se puede observar una aglutinación microscópica de microorganismos, sobre todo con cepas muy encapsuladas. Se deben comparar los resultados de la prueba de hinchazón capsular microscópi­ camente con un preparado similar elaborado con solución sali­ na fisiológica en lugar de antisueros. También se puede utilizar Denka Seiken (Tokyo, Japón) una prueba comercial de aglutinación en portaobjetos para serotipi­ ficación neumocócica. Esta prueba cuenta con ocho reactivos polivalentes, cada uno de los cuales contiene antisueros para

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C A P ÍT U L O 13

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus"

cuatro a siete serotipos diferentes y se realiza sobre una sus­ pensión de microorganismos preparada en una solución salina con buffer de fosfato. Si se observa aglutinación con uno de los reactivos polivalentes, se evalúan los serotipos de los indivi­ duos dentro del grupo para determinar el serotipo del microor­ ganismo aislado. En una comparación reciente de la prueba Denka Seiken con la técnica Pneumotest Quellung, hubo una concordancia del 95,7% entre los dos métodos; los autores también observaron que esta prueba de aglutinación en porta­ objetos era más fácil de realizar e interpretar . 891 Características bioquímicas para la identificación de estreptococos agrupables

La identificación de especies de estreptococos agrupables puede establecerse sobre la base de las características fisiológi­ cas. Se utilizan varias de estas reacciones en los distintos siste­ mas comerciales para la identificación de estreptococos [3-he­ molíticos. Los métodos de identificación bioquímica también pueden permitir la detección de cepas aberrantes. Por ejemplo, Brand y cois, aislaron tres cepas de estreptococos (3-hemolíti­ cos en hemocultivos que tenían el antígeno grupo A, pero fue­ ron identificadas como S. dysgalactiae subespecie equisimilis mediante pruebas de fenotipificación y secuenciación de rDNA 16S.129 Estas cepas eran acetoína negativas y PYR negativas, al contrario de los estreptococos del grupo A. Aunque la mayoría de los laboratorios clínicos que manejan muestras provenien­ tes de seres humanos utilizan métodos serológicos para la identificación de estos microorganismos, los microbiólogos veterinarios pueden hallar útiles estas pruebas porque no se consiguen fácilmente antisueros de Lancefield para grupos distintos de A, B, C, F y G. En el cuadro 13-3 se presentan las características fenotípicas para la identificación de estreptoco­ cos agrupables. Identificación de estreptococos viridans

Los estreptococos viridans distintos de S. pneumoniae com­ prenden varias especies de microorganismos a-hem olíticos y no hemolíticos (véanse cuadro 13-4 y lámina en color 13-4F). Al contrario de los estreptococos (3-hemolíticos humanos, estos microorganismos, con excepción de los miembros del grupo bovis, carecen de antígenos de gmpo serológico de Lancefield específicos, aunque algunos pueden transportar antígenos que reaccionan en forma cmzada con estos antisueros. A diferencia de los neumococos, son resistentes a la optoquina e insolubles en bilis. En ciertas circunstancias, como en los casos de endo­ carditis y bacteriemia en pacientes con neutropenia, puede ser clínicamente útil identificar a estos microorganismos. Los individuos con daño valvular previo pueden tener episodios recurrentes de endocarditis y sufrir recaídas después de un tra­ tamiento insuficiente. El conocimiento del microorganismo aislado y de su sensibilidad a los antibióticos puede ayudar a evitar problemas como fracasos terapéuticos, reinfecciones y tolerancia a los antibióticos. La aplicación de técnicas moleculares y quimiotaxonómicas ha conducido a modificaciones importantes en la taxonomía de los estreptococos viridans y los enfoques de la identificación. Debido a la gran cantidad de estreptococos viridans reconoci­ dos, los métodos de identificación fenotípica comprenden la realización de algunas pruebas bioquímicas y enzimáticas . 1047 La mayoría de los laboratorios que intentan identificar a este microorganismo utilizan uno o más sistemas comerciales para este objetivo (véase lámina en color 13-4F, G y H). Lamen­

tablemente, las bases de datos de los distintos sistemas comer­ ciales no se actualizan con la suficiente frecuencia como para identificar en forma fiable especies más nuevas y a menudo se requieren otras pruebas. Estos sistemas utilizan pruebas con­ vencionales modificadas y sustratos cromogénicos y fluorogé­ nicos novedosos para la detección de actividades enzimáticas preformadas, y estos enfoques se han convertido en una parte estándar de las series de pruebas utilizadas para la identifica­ ción de estas bacterias .378-566 1047 Los métodos no fenotípicos de caracterización de estos microorganismos, como la pirrólisiscromatografía de gases y la espectroscopia infrarroja por trans­ formación de Fourrier, se han mostrado promisorios como métodos auxiliares de la identificación . 377" 5 Otros métodos moleculares y quimiotaxonómicos son la amplificación por PCR y la detección de secuencias de ácidos nucleicos especí­ ficas de especie, el análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción de genes rRNA 16S, el análisis de patrones electroforéticos de proteínas de células enteras y la espectrometría de m asas . 15-60-262-508-560-623-829-830-846-967-993 Sin embargo, ninguno de estos métodos se presta para su uso habi­ tual en los laboratorios hospitalarios que tienen mucho traba­ jo. Por lo tanto, la identificación de estos microorganismos en laboratorios clínicos se basa aún sobre el uso de característi­ cas fenotípicas claves. Por conveniencia, los estreptococos viridans pueden ser ubi­ cados en grupos sobre la base de características bioquímicas comunes. Estos grupos incluyen el grupo sanguis, el grupo mitis, el grupo mutans, el grupo salivarius, el grupo angi­ nosus y el grupo bovis. Los microorganismos pueden ser asig­ nados a estos grupos sobre la base de arginina dihidrolasa, hidrólisis de esculina, producción de acetoína (prueba VP), producción de ácido a partir de manitol y sorbitol, y presencia de ureasa (cuadro 13-4). En 1991 y 1998, Beighton y cois., del Departamento de Microbiología Bucal del London Hospital Medical College publicaron esquemas amplios para la identificación fenotípica de los miembros reconocidos de estreptococos viridans .711047 Este esquema emplea pruebas convencionales de utilización de hidratos de carbono de 24 horas más una serie de sustratos liga­ dos a 4-metilumbeliferilo para la determinación rápida (3 horas) de enzimas glucosídicas. El cuadro 13-5 se basa sobre las descripciones taxonómicas de especies viridans presentadas por Beighton y otros . 71-376 1047 La clave dicotómica de la figura 13-3 incorpora las pruebas de “agrupamiento” del cuadro 13-4 y otras pmebas del cuadro 13-5 para la identificación de espe­ cies individuales “típicas” dentro de un gmpo. Hasta que se actualicen las bases de datos de los sistemas comerciales indi­ viduales para incluir las especies y las pruebas más nuevas, los microbiólogos deberán utilizar un enfoque de “el que mejor se ajusta” para la identificación de especie de los estreptococos viridans.

GRUPO SANGUIS

El grupo de los estreptococos viridans incluye tres especies que se encuentran en la cavidad bucal humana: S. sanguis, S. parasanguis, S. gordonii y S. sinensis. Aunque algunos inves­ tigadores consideran que estas especies forman parte del grupo mitis sobre la base de los estudios de secuencia rRNA 16S, pueden diferenciarse fácilmente desde el punto de vista fenotípico de ese grupo por sus reacciones positivas para argi­ nina dihidrolasa e hidrólisis de esculina .558 S. parasanguis se describió en 1990 y ha sido aislado en muestras de cultivos faríngeos humanos, sangre y orina . 1049 S. sanguis puede ser

Cuadro 13-3

ESPECIES

C aracterísticas fen otíp icas p ara la id en tificación de los estrep tococos p-h em olíticos

GRUPO DE LANCEFIELD

5AC

PRUEBA SXT DE CAMP LAP PYR ADH ESC

A

S

R

S. agalactiae

B

R

R/S

S. dysgalactiae

C

R

A, C, G, L

S. equi subesp. equi

-

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R

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C

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+

V

-

S. equi subesp. zooepidemicus

C

R

S

+

+

V

-

S. canis

G

R

S

+

+

S. phocae

C, F

S

S

S. porcinus

E, P, U, V,

R

S

+

+

+

+

+

subesp.

dysgalactiae S. dysgalactiae

+

subesp.

equisimilis

+

-

+ +

-

+

+

+

+

+

+

-

-

-

+

V

+

+

-

-

+

_

+

_

+

V

+

+

V

-

V

+

-

+

+

-

+

+

-

-

+

+

ND

ND

+

ND

+

-

ninguno

S. iniae

Ninguno

R

s

S. didelphis

Ninguno

R

s

+

S. urinalis

Ninguno

R

s

+

+

+

+ -

+

+: reacción positiva; -: reacción negativa; ND: datos no disponibles; V: reacción variable; BAC: bacitracina, disco de 0,04 unidades; SXT: sulfametoxasol-trimetoprim; LAP: leucina aminopeptidasa; PYR: pirrolidonil arilamidasa; ADH: arginina dihidrolasa; ESC: hidrólisis de esculina; PAL: fosfatasa alcalina; a-GAL: a-galactosidasa; {5-GUR: (3-glucuronidasa; Glu: glucosa; Lac: lactosa; Mntl: manitol; Raf: rafinosa; Rib: ribosa; Sal: salicina; Sorb: sorbitol; Tre: trehalosa; R: resistente; S: sensible.

Aislamiento e identificación de estreptococos y bacterias “similares a S tre p to c o cc u s

S. pyogenes

ÁCIDO PRODUCIDO A PARTIR DE HIDRÓLISIS HIDRÓLISIS DE DE HIPURATO ACETOÍNA ALMIDÓN PAL a-GAL p-GUR GLU LAC MNTL RAF RIB SAL SORB TRE

687

688

C A P ÍT U L O 13

Cuadro 13-4 GRUPO VIRIDANS Grupo Sanguis

Diferenciación fenotípica de los grupos de estreptococos viridans hallados en seres humanos

ADH +

Grupo Mitis

Grupo Mutans

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus”

~

Grupo Salivarius

HIDRÓLISIS ACETOÍNA DE ESCULINA (VP) MANITOL SORBITOL UREASA +

_

-

-

-

■ +

+

V

MIEMBROS DEL GRUPO

-

S. sanguis (S . sanguinis), S. parasanguis (S. parasanguinis), S. gordonii, S. sinensis (VP+)

-

-

S. mitis, S. oralis, S. crista (S. cristatus), S. peroris, S. infantis, S. australis, S. oligofermentans

+

+

-

S. mutans, S. sobrinus, S. cricetus, S. ratti, S. macacae, S. downei, S. ferus y S. hyovaginalis

V

-

-

V

S. salivarius, S. vestibularis, S. infantarius, S. alactolyticus, S. hyointestinalis y S. thermophilus

-

-

S. intermedius, subespecies de S. constellatus, S. anginosus

—

S. bovis/S. equinus, subespecies de S. gallolyticus, subespecies de S. infantarius, S. alactolyticus

Grupo Anginosus

+

+

+

-

Grupo Bovis

~

+

+

V

+. reacción positiva; -, reacción negativa; V, reacción variable.

dividido en tres biotipos sobre la base de las pruebas fenotípi­ cas (cuadro 13-5). S. sinensis es un nuevo Streptococcus ahemolítico que fue aislado en la sangre de un paciente con endocarditis en 2002 . 1071 Este microorganismo está más estre­ chamente relacionado con S. gordonii.

GRUPO MITIS

Estos estreptococos a-hemolíticos se encuentran en la cavi­ dad bucal. S. mitis es una de las especies aisladas con mayor frecuencia en los hemocultivos y tiene cierta importancia debi­ do a su resistencia emergente a la penicilina y a otros p-laetámicos. El análisis de varios investigadores de cepas similiares a S. sanguis condujo a la descripción de S. gordonii y S. oralis.56* Aunque relacionado genotípicamente con otros microorganis­ mos del grupo mitis, S. gordonii se asemeja fenotípicamente a los microorganismos del grupo sanguis (arginina dihidrolasa positivos y a menudo hidrólisis de esculina positivos). S. cris­ ta, una especie bastante nueva que ha sido aislada en la cavidad bucal humana ,456 es inusual porque tiene penachos laterales de fibrillas cortas sobre la superficie celular que ayudan al micro­ organismo a congregarse con otros en la placa dental. S. peroris, S. australis, S. infantis y S. oligofermentans son miembros nuevos del grupo mitis y se encuentran en los dientes y en la nasofaringe . 559 1058 S. orisratti se encuentra en la cavidad bucal de ratas Sprague-Dawley debido a su similitud bioquímica con otros miembros del grupo mitis. Esta especie es atípica porque tiene el antígeno carbohidrato del grupo A de Lancefield . 1095

GRUPO MUTANS

El grupo mutans incluye estreptococos bucales que se encuentran en seres humanos y en distintas especies animales (recuadro 13-2). Como ya se mencionó, las especies del grupo mutans eran originariamente serotipos de S. mutans que luego fueron elevados a la condición de especie. S. mutans y S. sobri­ nus son las especies aisladas con mayor frecuencia en seres humanos .73 S. hyovaginalis también está incluido en el grupo mutans debido a su senejanza bioquímica con otros estreptoco­

cos del grupo mutans, pero esta especie forma parte de la flora normal del aparato genital de los cerdos .279

GRUPO SALIVARIUS

Entre las especies en el grupo salivarius, sólo S. salivarius, S. vestibularis y S. infantarius han sido aislados en muestras clínicas humanas. S. salivarius y S. vestibularis se encuentran en la cavidad bucal humana, mientras que S. infantarius ha sido aislado en seres humanos y productos alimenticios .853 1052 Las cepas de S. infantarius también están incluidas en el grupo bovis porque algunas son bilis esculina positivas e hidrólisis de esculina positivas. S. alactolyticus también está estrechamente relacionada con microorganismos del grupo bovis y se encuen­ tra en distintas especies de aves y en cerdos. S. hyointestinalis es una especie del grupo salvarius que se encuentra en el intes­ tino de cerdos y S. thermophilus se aísla en productos lác­ teos .278 En el grupo salivarius, todas las cepas de S. vestibularis y algunas cepas de S. salivarius producen ureasa.

GRUPO ANGINOSUS

Las tres especies que componen el grupo anginoso de estrep­ tococos -S. anginosus, subespecies de S. constellatus y S. interm edius- producen colonias “puntiformes” en agar sangre y pue­ den ser p-hemolíticas, a-hemolíticas o no hemolíticas. Una pro­ porción mayor de cepas de S. intermedius son no hemolíticas, y las cepas de S. constellatus a menudo son p-hemolíticas. En las cepas P-hemolíticas, el tamaño de la zona hemolítica es varias veces el diámetro de la colonia. Además del tamaño de la colo­ nia, otro indicio de que una cepa puede ser miembro de este grupo es la presencia de un olor dulce que ha sido descrito como “acaramelado” o a “madreselvas”. Este olor se debe a la pro­ ducción del metabolito diacetilo . 184 Las cepas pueden portar los antígenos A, C, F o G o pueden ser no agrupables. El creci­ miento de estos microorganismos aumenta por la incubación en un medio enriquecido con C 0 2 y algunas cepas pueden requerir incubación en condiciones anaerobias para un crecimiento ópti­ mo. Como sucede con todos los estreptococos, estos microor-

Cuadro 13-5

Características fenotípicas para la identificación de las especies de grupo Mitis, grupo Mutans y grupo Salivarius de los estreptococos viridans aislados en seres humanos ÁCIDO PRODUCIDO A PARTIR DE:

HEM SBO

ESC

ADH

S. sanguis biotipo 1

a

+

+

+

+

ND

+

-

ND

V-

ND

V-

+

+

-

+

+

ND

-

ND

S. sanguis biotipo 2

a

+

+

+

+

ND

+

-

ND

v+

ND

-

V+

+

-

+

+

ND

-

ND

S. sanguis biotipo 3

a

-

+

+

+

ND

+

-

ND

-

ND

+

-

V-

-

+

+

ND

-

ND

S. parasanguis

a

V-

+

+•

+

ND

+

-

ND

V-

ND

v+

v+

ND

V+

V+

ND

ND

ND

V-

S. gordonii

a

+

+

+

+

ND

+

-

ND

-

ND

V-

V-

-

+

+

-

-

ND

+

S. sinensis

a

+

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

ND

S. mitis

a

-

-

+

+

ND

V+

-

ND

V-

ND

V-

v+

v+

V-

V-

V-

ND

ND

S. oralis

a

V-

-

+

+

ND

+

-

ND

-

ND

-

v+

v+

v+

-

V-

ND

-

ND

S. crista

a

-

V+

+

+

ND

v+

-

ND

-

-

-

-

-

-

ND

+

ND

ND

ND

S. peroris

a

-

-

+

+

+

+

-

ND

-

-

-

-

-

-

ND

-

ND

ND

-

S. infantis

a

-

-

+

+

+

v+

-

ND

-

-

V-

-

-

-

ND

-

ND

ND

-

S. australis

a

ND

+

+

+

+

+

-

ND

-

-

ND

-

-

-

ND

-

ND

ND

S. oligofermentans

a

-

-

+

+

+

V

-

+

-

-

-

-

V

-

-

V

-

ND

5. mutans

a, y

+

+

+

+

+

+

+

ND

+

ND

+

v+

+

-

+

+

-

-

S. sobrinus

y, a

-

+

+

+

+

v+

V+

ND

V-

ND

+

-

-

-

-

+

-

-

-

y, a

+

v+

V+

+

ND

ND

+

-

ND

-

-

V+

V-

v+

ND

+

V

ND

-

ND

V

a

V+

+

+

+

+

ND

v+

-

ND

-

ND

-

-

-

-

+

V

ND

ND

ND

V+

GRUPO/ESPECIES

VP

URE

GLU MAL

suc

LAC MNTL MANN SORB ARAB INU MEL RAF RIB SAL TRE STA GLYC GLYG AMGD

Grupo Sanguis

+

+

+

ND

Grupo Mitis

-

-

-

+

-

ND

-

Grupo Mutans

' -

+

Grupo Salivarius

S. salivarius S. vestibularis

(Continúa)

Aislamiento e identificación de estreptococos y bacterias “similares a S tre p to c o c c u s "

-

689

690

Características fenotípicas para la identificación de las especies de grupo M itis, grupo M utans y grupo Salivarius de los estreptococos viridans aislados en seres humanos (cont.)

a-GAL

p-GAL

a-GLU

P-GLU

P-GUR

-

V

_

NAGA

a-ARAB

a-FUC

p-FUC

NAGALA

PAL

Grupo Sanguis _

_

-

S. sanguis biotipo 2

+

V-

-

+

V-

-

-

+

-

S. sanguis biotipo 3

-

+

-

V

+

-

-

V+

-

S. parasanguis

+

+

+

V-

+

V-

V-

V-

+

+

S. gordonii

1 >

_

V+

1 >

_

S. sanguis biotipo 1

V-

+

+

-

+

-

V+

+

S. sinensis

-

ND

+

ND

ND

ND

ND

ND

v+

_

_

-

V+

-

+

V-

-

-

ND

-

ND

-

-

ND

-

V-

ND

ND

+

+

-

+

-

_

-

Grupo Mitis S. mitis

+ >

1 >

V+

S. oralis

V-

+

+

S. crista S. peroris

+

S. infantis S. australis S. oligofermentans

+

ND

-

+

ND V+

ND

ND

V+ +

+

+

-

ND

V

ND

V

V

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

+

Grupo Mutans S. mutans S. sobrinus

+

-

-

-

-

-

-

-

-

Grupo Salivarius S. salivarius S. vestibularis

V-

+

V+

V+

ND

-

+

V+

-

ND

+ -

+

V+

V+

V+

-

+: reacción positiva; reacción negativa; V: reacción variable; V+: reacción variable, la mayoría de cepas positivas; V-: reacción variable, mayoría de cepas negativas; ND: datos no disponibles; Hem SBA: hemolisis en agar sangre de carnero; ESC: hidrólisis de esculina; ADH: arginina dihidrolasa; VP: producción de acetoína; URE, ureasa; GLU: glucosa; MAL: maltosa; SUC: sacarosa; LAC: lactosa; MNTL: manitol; MANN: mannosa; SORB: sorbitol; ARAB: arabinosa; INU: inulina; MEL, melibiosa ; RAF, rafinosa; RIB, ribOsa; SAL: salicina; TRE: trehalosa; STA: almidón; GLY: glicerol; GLYC: glucógeno; AMGD: amigdalina; a-GAL: a-galactosidasa; fi-GAL: p-galactosidasa; a-GLU: a-glucosidasa; (5-GLU: p-glucosidasa; p-GUR: (5-glucuronidasa; NAGA: N-acetil-fi-D-glucosaminidasa; a-ARAB: a-arabinosidasa; a-FUC: a-fucosidasa; (3-FUC: [5-fucosidasa; NAGALA: N-acetil-p-D-galactosaminidasa; PAL: fo s ­ fatasa alcalina.

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus’

GRUPO/ESPECIES

13

PRODUCCIÓN DE:

CAPÍTULO

Cuadro 1 3-5

A is la m ie n to e id e n tific a c ió n d e e s tre p to c o c o s y b a c te ria s “s im ila re s a S tr e p to c o c c u S

691

Manitol/sorbitol + /+

+ /-

S. m utans S. u beris/paruberis

S. sobrinus

Hidrólisis de esculina

h

-

1

i Arginina dihidrolasa

PYR

S. m utans

Arginina dihidrolasa

S. ub e rís/ pa raub eris

p-N-acetilglucosaminidasa P-N-acetilgalactosaminidasa Sialidasa Rafinosa

Inulina

S. salivarius

Amigdalina/ P-D-fucosidasa

S. sanguis bio 1

S. oralis S. m itis + — + + -

S. vestibularis

Inulina/ Rafinosa

S. g o rd o n ii + /+

+ /-

-/+

S. sanguis bio 2

S. sanguis bio 3

S. p arasanguis

r

S. crista

Figura 13-3 Organigrama para la identificación de estreptococos viridans.

ganismos son LAP positivos. Todas las especies en el grupo anginoso dan pruebas positivas de hidrólisis de esculina, argini­ na dihidrolasa y producción de acetoína y fosfatasa alcalina y son negativas las pruebas de hidrólisis de hipurato, ureasa y PYR. La especie individual puede ser diferenciada por las prue­ bas bioquímicas y enzimáticas que se muestran en el cuadro 13 -6 , 1046 1050 1053 muchas de las cuales se encuentran en sistemas comerciales. Estos microorganismos están incluidos en las bases de datos de los sistemas comerciales (p. ej., API Rapid Strep, RapID STR y los sistemas API ID32), aunque puede ser necesario realizar otras pruebas junto con el seroagrupamiento de cepas P-hemolíticas. Hace poco, S. constellatus ha sido divi­ dido en dos subespecies: S. constellatus subespecie constellatus y 5. constellatus subespecie pharyngis .1051 Además de la identi­ ficación fenotípica, se han desarrollado ensayos con base mole­ cular para la identificación de estos microorganismos .419,943

Se demostró que las cepas de S. anginosus se encuadran en cinco ribogrupos estrechamente relacionados por su rRNA 16S y tienen una similitud mayor del 97% entre ellos . 522 Estos cinco grupos han sido designados cepas “similares a ATCC”, cepas móviles y ribogrupos I, II y III. Las cepas similares a ATCC hibridaron con sondas de oligonucleótidos preparados a partir de S. anginosus ATCC 33397. El grupo móvil representó el 37,8% de las cepas de S. anginosus examinadas y el 83% de éstas fueron aisladas en el aparato urogenital como parte de la flora normal. Estas cepas de S. anginosus móviles fermentaron el manitol y la rafinosa, mientras que las de los otros grupos no lo hicieron. A menudo, S. anginosus ribogrupo I portaba el antígeno grupo C de Lancefield. Las cepas ribogrupo II se aso­ ciaron con infecciones abdominales y las ribogrupo III fueron aisladas en infecciones abdominalesm de tejidos blandos, de cabeza y cuello e infecciones urinarias. En la actualidad, no

692 CAPÍTULO 13

Características fenotípicas para la identificación del grupo anginoso: Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus y Streptococcus intermedius PRODUCCIÓN DE:

PRODUCCIÓN DE ÁCIDO A PARTIR DE: ESPECIE S. anginosus

S. constellatus

subespecie constellatus S. constellatus

subespecie

GRUPOS DE LANCEFIELD

HEMOLISIS

Glucosa

Lactosa

Manitol

Rafinosa

Amigdalina

P-GAL

a-GLU

P-GLU

NAGA

P

A,C,F,G, ninguno

+

+

-

-

+

+

-

+

V

no (3

C,F,G, ninguno3

+

+

-

-

+

-

V

+

-

P

F, ninguno

+

V

-

-

V

-

+

-

no p

F, ninguno

+

V

-

-

V

-

+

-

P

C

+

+

-

-

+

+

+

+

+

P

Ninguno

+

+

-

-

+

+

+

V

+

no p

Ninguno

+

+

-

-

+

+

+

V

+

pharyngis S. intermedius

“ Una variante móvil no hemolítica de S. anginosus que fermentaba lactosa, manitol, rafinosa y amigdalina y producía tanto a- como fí-glucosidasa fue descrita en 1995.83 +: reacción positiva, reacción negativa; V: reacción variable; fí-GAL: ¡3-galactosidasa; a-GLU: a-glucosidasa; fi-GLU: (3-glucosidasa; NAGA: N-acetil-fi-D-glucosaminidasa.

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus'

Cuadro 13-6

A is la m ie n to e id e n tific a c ió n de e s tre p to c o c o s y b a c te ria s “s im ila re s a Streptococcus

existe ningún criterio fenotípico fácilmente determinado dispo­ nible para separar estos cinco ribogrupos entre sí.

693

cola. Las especies del “grupo mutans” de los animales no están incluidas en este cuadro porque forman parte de la flora bucal normal de los animales y no es probable observarlas en infec­ ciones humanas ni animales.

GRUPO BOVIS

Como ya se explicó, el grupo 5. bovis ha sufrido una revisión taxonómica importante. Al igual que los enterococos, los estreptococos del grupo D tienen el antígeno grupo D. hidrolizan esculina en presencia de bilis al 40% y crecen a 45 °C. No crecen en caldo de NaCl al 6,5%, no hidrolizan PYR y no cre­ cen a 10 °C. La mayoría de las cepas son LAP positivas, pro­ ducen acetoína, no producen arginina dihidrolasa ni ureasa y acidifican lactosa pero no sorbitol. Sobre la base de los crite­ rios fenotípicos, el sistema de identificación API Rapid Strep divide las cepas de S. bovis en S. bovis I, S. bovis II. 1 y S. bovis II.2. Las cepas S. bovis I (S. gallolyticus subespecie gallolyti­ cus) son manitol positivas, rafinosa positivas, glucógeno posi­ tivas, amigdalina positivas y a-G A L positivas y son (i-GUR negativas (véase lámina en color 13-4D y E). S. bovis II. 1 (S. infantarius subespecie infantarius) y S. bovis II.2 (S. gallolyti­ cus subespecie pasteurianus) son manitol negativas, con las cepas de S. bovis II. 1 (3-GUR negativas y las cepas de S. bovis II.2 (3-GUR positivas. Estas características se presentan en el cuadro 13-7. Las cepas de S. bovis I (S. gallolyticus subespecie gallolyticus) también producen dextranos extracelulares a par­ tir de sacarosa y pueden hidrolizar el almidón. La hidrólisis del almidón se puede detectar con placas de agar de MuellerHinton que son sembradas con el microorganismo e incubadas durante 48 horas. Luego se irrigan las placas con yodo de Gram. Las áreas incoloras que están debajo del crecimiento del microorganismo y lo rodean indican hidrólisis de almidón, mientras que el mantenimiento del color azul o violáceo alre­ dedor de las colonias no señala ninguna hidrólisis de almidón. Como alternativa, se pueden utilizar placas de almidón (varios fabricantes). Identificación de Streptococcus suis y otros estreptococos aislados en animales

Se debe sospechar S. suis en pacientes con signos sistémicos de sepsis y meningitis que han tenido contacto con cerdos o pro­ ductos porcinos. El microorganismo es un coco grampositivo, de aspecto típico, catalasa negativo e inmóvil que aparece solo, de a pares o en cadenas cortas. S. suis es a-hemolítico en agar sangre de camero (p-hemolítico en agar sangre de caballo), re­ sistente a la optoquina y no crece en caldo de NaCl al 6,5%. Algunas cepas crecen en presencia de bilis al 40% y todas pue­ den hidrolizar la esculina. S. suis se asemeja fenotípicamente a ciertos estreptococos viridans, sobre todo a S. gordonii, S. san­ guinis y S. parasanguinis. Las cepas humanas suelen ser del serotipo capsular 2 que reaccionan con anticuerpos contra el grupo R de Lancefield (Statens Serum Institute, Copenhague, Dinamarca). También se puede lograr la tipificación capsular utilizando métodos moleculares mediante análisis de secuencia de genes cps capsulares .907 Otras características útiles para la identificación de S. suis se presentan en el cuadro 13-8.946 Este importante patógeno animal está incluido en la base de datos del sistema API Rapid Strep (véase explicación más adelante). En el cuadro 13-8 también se presentan las características fenotípicas de los estreptococos a-hem olíticos y no hemolíti­ cos y cepas relacionadas de distintas especies halladas en ani­ males. Estas especies son S. entericus, S. pluranimalium, S. uberis/parauberis, S. thoraltensis, S. hyovaginalis, S. hyointes­ tinalis, S. ovis, S. minor, S. gallinaceus y Eremococcus coleo-

Identificación de especies de Enterococcus

Las especies de Enterococcus crecen bien en la mayoría de los medios bacteriológicos, incluido agar sangre de camero al 5% colistina ácido nalidíxico (CNA) y agar chocolate (véase lámina en color 13-3E). En SBA, la mayoría de las cepas son no hemolíticas o a-hemolíticas. La mayoría de las cepas pueden crecer a 35-37 °C en aire ambiente, aunque la incubación en un medio enriquecido con C 0 2 estimula el crecimiento de la mayo­ ría de ellas. Las muestras que contienen enterococos que están muy contaminados con bacilos gramnegativos pueden aislarse con facilidad en medios que contienen azida de sodio (p. ej., agar selectivo para enterococos de Pfizer, agar bilis esculina azida). Ford y cois, describieron un medio denominado agar cefalexina-aztreonam-arabinosa que puede utilizarse para estu­ dios epidemiológicos para detectar la presencia de E. faecium en heces de pacientes hospitalizados expuestos a infecciones enterocócicas graves . 368 Este medio contiene arabinosa (10 g/L), aztreonam (75 mg/L), cefalexina (50 mg/L) e indicador de rojo fenol (2%) en una base de agar de Columbia (40 g/L). E. fa e ­ cium crece en este medio como colonias blancas con halos ama­ rillos, lo que indica la producción de ácido a partir de arabino­ sa, mientras que E. faecalis crece como colonias claras sin halos, lo que señala la falta de utilización de arabinosa. La identificación de las especies de enterococos a menudo es útil y a veces es fundamental para un tratamiento correcto del paciente y para fines epidemiológicos y de control de infeccio­ nes. Las cepas de E. faecium tienden a ser más resistentes a la penicilina y la ampicilina que las de E. faecalis y la gran mayo­ ría de los enterococos resistentes a la vancomicina son cepas de E. faecium. La detección temprana de enterococos resistentes a la vancomicina en los pacientes en riesgo permite la institución oportuna de prácticas de control de infecciones que se sabe que limitan la propagación de estos agentes oportunistas .495 Para este fin, se han utilizado varias fórmulas de medios de agar y caldo para la rápida detección de enterococos resistentes a la vancomicina en sitios anatómicos que albergan enterococos (muestras de heces, hisopados rectales) (véase lámina en color 13-3H).507'598-838 El caldo para enriquecer el crecimiento de enterococos resistentes a la vancomicina se tom a semiselectivo mediante el agregado de vancomicina a los medios, por lo general en una concentración de 6 |J.g/mL; también se pueden agregar otros agentes selectivos (p. ej., clindamicina, aztreo­ nam). Como algunas cepas de enterococos resistentes a la van­ comicina pueden ser inhibidas por estas combinaciones de antibióticos, se sugiere el subcultivo del medio de caldo selec­ tivo en medios de agar selectivo y no selectivo para optimizar el aislamiento de los resistentes. La identificación de especies de Enterococcus se logra mediante pruebas bioquímicas y fisiológicas (cuadro 13-9). La mayoría (80%) de las especies de Enterococcus reaccionan con antisuero contra el grupo D de Lancefield por precipitina capi­ lar o aglutinación del látex; no se puede demostrar el antígeno grupo D en cepas de E. pseudoavium, E. dispar, E. cecorum, E. sulfureus, E. columbae y E. saccharolyticus. La mayoría de las especies de enterococos pueden crecer dentro de las 48 horas en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI), tanto a 10 °C como 45 °C; sin embargo, E. cecorum y E. columbae no crecen a 10 °C y E. sulfureus, E. malodoratus y E. dispar no crecen a

694 CAPÍTULO

Características fenotípicas para la identificación de los miembros del grupo “ Streptococcus bovis/Streptococcus equinus”

13

Cuadro 1 3-7

S. GALLOLYTICUS

S. GALLOLYTICUS

S. INFANTARIUS

S. INFANTARIUS

SUBESPECIE

SUBESPECIE

SUBESPECIE

SUBESPECIE

SUBESPECIE

GALLOLYTICUS

PASTEURIANUS

MACEDONICUS

INFANTARIUS

COLI

S. ALACTOLYTICUS

+

+

+

V

+

+

-

+

-

-

-

-

Glucosa

+/+

+

+

+

+

+

+

Lactosa

-/+

+

+

+

+

+

-

M anitol

-

+

-

-

-

-

Rafinosa

-/+

+

V

-

-

-

Trehalosa

V

+

+

-

-

-

Inulina

-/+

+

-

-

-

-

Almidón

-/+

+

-

+

+

V

-

Glucógeno

-/+

+

-

+

+

V

-

a-G A L

- /+

+

V

V

+

+

+

P-GAL

-

-

V

v+

-

-

P-GLU

+

+

+

+

+

P-GUR

-

-

+

-

-

Hidrólisis de esculina H idrólisis de galato

PRUEBA

Producción de ácido a partir de:

+

Producción de:

Com entarios (nuevos nom bres propuestos, etc.)

+: reacción positiva;

Cepas de tipo S. feovií/aislados en S. equinus (homología de secuencia del 91/100% ). Las cepas representadas son principalmente de origen bovino y equino

S. bovis I; incluye cepas aisladas en seres humanos, gana do bovino y koalas

S. bovis Í1.2; incluye cepas humanas

V

S. macedonicus, S. waius

S. bovis II. 1; incluye

“S. lutetiensis"

S. intestinalis

cepas hum anas y bovinas

reacción negativa; V: reacción variable; V+: reacción variable, pero mayoría de cepas positivas; a-GAL: a-galactosidasa; P-GAL: p-galactosidasa; P-GLU: Pglucosidasa; p-GUR: P-glucumnidasa.

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus'

S. GALLOLYTICUS S. BOVIS/S. EQUINUS

Cuadro 13-8

Características bioquímicas para la identificación de Streptococcus suis, Eremococcus coleocola en animales

otros estreptococos a-hemolíticos y no hemolíticos aislados

y

S. ENTERICUS

S. PLURANIMALIUM

S. UBERIS/ PARAVBERIS

S. THORALENSIS

S. HYOVAGINALIS

S. HYOINTESTINALIS

S. OVIS

S. MINOR

S. GALLINACEUS

E. COLEOCOLA

Hemolisis, SBA

a

a

a

a , ninguno

a

a

a

a

a

a

a

Crecim iento a 10 °C

-

-

-

ND

-

-

ND

ND

ND

ND

-

Crecim iento a 45 °C

-

-

+

ND

-

-

ND

ND

ND

ND

+

LAP

+

+

+

+

+

+d

+

+

+

ND

-

PYR

ND

ND

-

+

-

-

-

ND

-

ND

ND

Crecim iento en agar BE

V

-

+

- /+ d

+

-

-

ND

+

ND

-

Crecim iento con NaCl al 6,5%

-

-

V

+

+

-

-

ND

ND

ND

+d

Hidrólisis de esculina

+

+

+

+

+

ND

+

+

+

+

-

ADH

+

-

-

+

+

-

-

V+

+

+

+

Hidrólisis de hipurato

-

-

+

+

V

+

-

-

-

-

+

Ureasa

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

V

A cetoína

-

-

-

V

+

+

+

-

ND

-

-

M otilidad

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Glucosa

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

M altosa

+

+

ND

+

+

+

+

+

+

+

-

Sacarosa

+

+

ND

+

+

+

+

+

+

+

-

Lactosa

+

+

ND

+

+

+

+

+

+

+

-

M anitol

-

-

V+

+

+

+

-

+

+d

+

-

M elibiosa

V

-

ND

ND

V

-

ND

-

-

+

ND

Inulina

+

-

-

V

+

-

-

ND

V

ND

ND

A rabinosa

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

Sorbitol

-

-

-

+

V

+

-

+

V

-

-

Almidón

ND

+

-

ND

+

-

+

ND

V

ND

ND

Rafinosa

V

-

ND

-

V

-

ND

+

V

+

ND

Ribosa

-

-

V

+

+

V

-

-

-

+

ND

Trehalosa

ND

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

Glucógeno

ND

+

-

ND

-

-

-

+

+

-

Producción de ácido a partir de:

-

695

(Continúa)

Aislam iento e identificación de estreptococos y bacterias “similares a S tre p to c o c c u s f

S. SUIS

CARACTERÍSTICA

696 CAPÍTULO 13

en animales (cont.) S. SUIS

S. ENTERICUS

S. PLURANIMALIVM

S. UBERIS/ PARAUBERIS

S. THORALENSIS

S. HYOVAGINALIS

S. HYOINTESTINAUS

S. OVIS

S. MINOR

NACEUS

E. COLEOCOLA

a-G A L

+

-

ND

ND

V

-

V

V

V+d

+

-

P-GAL

V

+

ND

ND

-

+

-

-

+

-

a-G L U

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

+

ND

+

ND

P-GLU

ND

+

V

ND

+

V

+

+

ND

+

-

P-GUR

+

-

V+

+

+

+

-

-

-

-

NAGA

ND

-

ND

ND

-

+

ND

ND

-l+d

ND

-

-

V+

ND

+d

+

+

-

-

ND

Pollos

Caballos

C A R A C T E R ÍS T IC A

S. GALLI-

Producción de:

PAL Hábitat

Infecciones en crías Tubo diges­ tivo del de cerdos; el sero­ tipo 2 causa ganado bovino m eningitis en seres hum anos

Ganado bovino (mastitis), apara­ to genital (am íg­ dalas), cabras (amígdalas), gatos (am ígda­ las), canarios (buche, aparato respiratorio)

Ganado bovino (mastitis)

Aparatos genital y digestivo porcino

-

Aparato geni­ Tubo digestivo M uestras A m ígdalas y tal porcino porcino clínicas heces de de ovejas perros, amígdalas de bovinos y felinos

+ : reacción positiva; -: reacción negativa; V: reacción variable; +d: reacción positiva débil o tardía ; V+d: reacción variable, pero tardía o débil cuando es positiva; -/+d: reacción negativa o positiva tardía o débil; ND: datos no dis­ ponibles; a-GAL: a-galactosidasa; p-GAL: p-galactosidasa; a-GLU: a-glucosidasa; P-GLU: P-glucosidasa; P-GUR: P-glucuronidasa; NAGA: N-acetil-P-D-glucosaminidasa; AL: fosfatasa alcalina.

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus’

Cuadro 13-8 Características bioquímicas para la identificación de Streptococcus suis, Eremococcus coleocola y otros estreptococos a-hemolíticos y no hemolíticos aislados

A is la m ie n to e id e n tific a c ió n de e s tre p to c o c o s y b a c te ria s “s im ila re s a Streptococcusi'

45 °C. La mayoría de las especies de Enterococcus hidrolizan la esculina en presencia de bilis al 40% (prueba BE), crecen en caldo que contiene NaCI al 6,5% y son PYR positivas, aunque algunas especies también son negativas en estas pruebas (cua­ dro 13-9). Aunque E. faecalis y E. faecium son las especies ais­ ladas más comúnmente en muestras clínicas, la incidencia de las otras especies y su participación en procesos patológicos específicos se desconocen. Facklam y Collins han propuesto un método escalonado para la identificación de especies de Enterococcus.335 Las cepas que se ajustan a los criterios men­ cionados antes son inoculadas en varios medios de prueba y divididos en cinco grupos sobre la base de esas reacciones. Las especies individuales dentro de cada grupo se diferencian a su vez en especies separadas sobre la base de otras pruebas o características. En 1992, Knudtson y Hartman, de la Iowa State University, exam inaron 59 cepas de 13 especies de Enterococcus con métodos convencionales y dos sistemas comerciales (el sistema API Rapid Strep y el panel MicroScan Pos ID) (véase lámina en color 13-3F y G ) . 581 Estos investiga­ dores encontraron varias discrepancias entre las reacciones publicadas para las pruebas individuales, las reacciones en sus propias pruebas convencionales y los resultados de las pruebas individuales obtenidos con los dos sistemas comerciales. Utilizando combinaciones de distintas pruebas convencionales y de sistemas, estos investigadores también publicaron claves dicotómicas multifásicas para la identificación de los microor­ ganismos. En la figura 13-4 se presenta un organigrama para identificar las especies de Enterococcus de importancia clínica. Para la identificación de enterococos mediante procedimien­ tos convencionales, se determinan las pruebas de fermentación de hidratos de carbono y de utilización de piruvato en medios con base de caldo de infusión de corazón que contienen viole­ ta de bromcresol e hidratos de carbono esterilizados con filtro al 1% o piruvato al 1%. La desaminación de arginina se deter­ mina utilizando caldo con descarboxilasa de Moeller y la moti­ lidad se determina en medios semisólidos para motilidad (véase lámina en color I3-4B). La detección del pigmento amarillo producido por E. casseliflavus, E. gallinarum y E. mundtii se logra recogiendo algo del crecimiento en un hisopo de Dacrón blanco y observando el material de las colonias en el hisopo para detectar un color amarillo o naranja-amarillo (véase lámina en color 13-4B). Cartwright y cois, observaron que el uso tanto de la prueba de motilidad como de detección de pigmento junto con un sistema de prueba comercial mejora­ ba mucho la fiabilidad y la exactitud de la identificación de los enterococos en el laboratorio clínico . 160 Muchos laboratorios se basan sobre los sistemas comercia­ les para la identificación de los enterococos. La mayoría de los sistemas comerciales descritos más adelante en este capítulo tienen muy buen rendimiento para la identificación de las espe­ cies más frecuentes. También se puede identificar con precisión el género de los enterococos mediante la prueba para Entero­ coccus AccuProbe (Gen-Probe), que utiliza una sonda de DNA oligomérica quimioluminescente marcada con éster de acridinio para detectar el rRNA del microorganismo diana .251257 Esta prueba se puede realizar en cepas que crecen en agar o en el sedimento celular obtenido por centrifugación de un caldo de hemocultivo . 257 También se han creado métodos genéticos y moleculares para la identificación de especies de Enterococcus y para la caracterización genotípica de sensibilidades de anti­ bióticos derivados fenotípicamente e incluyen métodos de hibridación del DNA, electroforesis de campo eléctrico homo­ géneo de contorno limitado, ribotipificación, electroforesis en gel de campo pulsado y PCR . 296306'413

697

Identificación de especies de Abiotrophia y de Granulicatella

Se debe sospechar A. defectiva y las especies de Granulicatella cuando las tinciones directas de Gram de mues­ tras o los hemocultivos positivos evidencian microorganismos estreptocócicos que no crecen en cultivo o subcultivo posterior. Los medios de hemocultivo comerciales contienen piridoxal y favorecen el crecimiento de estos microorganismos. El subcul­ tivo en agar sangre y la colocación de una estría de estafiloco­ cos como se hace en la prueba satélite para especies de Haemophilus asegura el crecimiento de las variantes nutricio­ nales de estreptococos en las adyacencias de la estría de estafi­ lococos (véase lámina en color 13-3D). Como alternativa, se pueden colocar discos impregnados con piridoxal en la placa de subcultivo, con crecimiento ulterior de los microorganismos que aparecen como colonias satélites que rodean el disco. El agar chocolate comercial contiene piridoxal, de modo que estos microorganismos crecen en agar chocolate. Cuando crecen en medios con suplemento de piridoxal (clor­ hidrato de piridoxal 10 mg por litro) o cisteína (100 mg de L cisteína por litro), estos microorganismos pueden ser identifi­ cados con las pruebas bioquímicas que se muestran en el cua­ dro 13-10. Muchas de estas pruebas se encuentran en sistemas comerciales (p. ej., API Rapid Strep). Al igual que los estrep­ tococos, estas dos especies son LAP positivas, pero al contra­ rio de ellos, A. defectiva y las especies de Granulicatella son PYR positivas. Estos microorganismos son homofermentativos, con ácido láctico como único producto terminal de la fer­ mentación de la glucosa. También son resistentes a la optoquina y sensibles a la vancomicina. Es necesario tener en cuenta que algunas cepas de estreptococos viridans (p. ej., S. mitis) también pueden mostrar variantes nutricionales . 882 Se descri­ bieron métodos moleculares de la identificación de estas espe­ cies con variantes nutricionales . 738821 Identificación de especies de Aerococcus y de Helcococcus

El género Aerococcus contiene cinco especies: A. viridans, A. urinae, A. sanguinicola, A. christensenii y A. urinaehominis, todas son a-hem olíticas en SBA y en cultivos en caldo crecen en pares, tétradas y en cúmulos pequeños. En los casos carac­ terísticos. las cepas de A. viridans aparecen principalmente co­ mo tétradas en los frotis teñidos con Gram, mientras que las de A. urinae se presentan principalmente en cúmulos. En agar, las cepas de A. viridans forman grandes colonias semejantes a las de los enterococos. Todas las especies excepto A. christensenii crecen en NaCI al 6,5%; A. sanguinicola y algunos A. viridans crecen como colonias negras en agar BE. Las cepas de A. viri­ dans son PYR positivas y LAP negativas, pero las de A. uri­ nae y A. christensenii son PYR negativas y LAP positivas. A. sanguinicola es positiva para LAP y PYR, mientras que A. urinaehominis es negativa para ambas pruebas. En el cuadro 13-11 se proporcionan otras características fenotípicas de estas especies. Se han desarrollado ensayos basados sobre PCR y sonda de DNA para la identificación de A. viridans y A. urinae . 9,429 Otra especie similar a Aerococcus descrita recientemente es Helcococcus kunzii. A diferencia de la mayoría de los aeroco­ cos, el crecimiento de esta especie es variable en NaCI al 6,5% mientras que el suero o el Tween 80 lo estimulan. En el sistema API Rapid Strep, H. kunzii produce un perfil que se correspon­ de a una identificación “dudosa” de A. viridans (API perfil 4100413). Las cepas de H. kunzii son no hemolíticas y no cre­ cen a 10 °C ni a 45 °C. El microorganismo es esculina positivo

698

C aracterísticas fen otíp icas para la identificación de

Grupo II E. facealis E. faecium E. casseliflavus E. gallinarum E. mundtii E. haemoperoxidus Enterococcus, especie CDC PNS-E2 Especies de Lactococcus Grupo III E. dispar E. durans E. hirae E. ratti E. villorum

+ + + + + -

+ + + + + + ND

+ + + + + + +

ND + ND + + + ND +

+ + -

+ + + ND

PRODUCCIÓN DE ÁCIDO A PARTIR DE: LAP

PYR

MOT

PIGMENTO AMARILLO

+ + + + + + + +d

+ + + + + -

-

+ + -

+ + + + + + +

+ + + + + + +

+ + ND + + + +

V

+

+ + + + + +

+ + + + + + +

+ + + + + + +

+ + -

V

V

—

RAF

SAC

PYRV

MGP

+ + + + + + + +

+ + + -

+ + + + + + + +

+ + + + +

+ + + + + + +

+ + + + + + +

V

+ + + + + +

-

+ + + + -

+ V V V -

V + + + -

+ + + + + +

+

+

-

—

-

+

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+

+

—

—

V

—

—

+

-

-

-

-

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

+

+

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

+ + -

+ + + +

+ + +

V + + +

+ V

+ +

+ +

+

HIP

GLU

MNTL

-

V V + + -

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

"

"

+ + +d

+ + + + + +

+ + +

+ + + + + +

—

+

-

V

V+

V

" + + + + + + +

SORB ARAB SBTL

ADH

-

—

-

+

+

+

-

+

+

-

-

+

+

+

+

ND

+

+

+

-

-

+

V V

+

+

+

+

+

+

+

-

-

+

-

+ d

+

+

+

+

+

+

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

+

V -

Grupo IV E. asini E. cecorum E. sulfurous E. phoeniculicula Enterococcus especie CDC PNS-E1

+ ND +

+ ND + +

+ +

V + +

V + +

+ + + ND +

+ + ND +

-

+ -

-

+ -

+ + + + +

-

-

-

+ -

Grupo V E. columbae E. canis E. moraviensis Especies de Vagococcus

-

+ + + ND

+ +

ND ND +

ND ND -

+ + +

+ V

-

-

_

+ +

+

-

+ +

+

-

-

-

-

-

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-

-

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+ + +

_

ND +

+

+

+

+

-

-

-

+

-

V-

+

+ +

~

-

V + V +

+ + + -

+

+ +

'

Agar BE: agar bilis esculina; LAP: leucina aminopeptidasa; PYR: pirrolidonil arilamidasa; MOT: motilidad; ADH: arginina dihidrolasa; HIP: hidrólisis de hipurato; GLU: glucosa; MNTL: manitol; SORB: sorbosa; ARAB: arabinosa; SBTL: sorbitol; RAF: rafinosa; SAC: sacarosa; P1RV: piruvato; MGP: metil-a-D-glucopiranosida.

1

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus'

Grupo I E. avium E. gilvus E. malodoratus E. pallens E. pseudoavium E. raffinosus E. saccharolyticus Enterococcus, especie CDC PNS-E3

CRECICRECIMIENTO CRECI­ CRECI­ ANTÍGENO MIENTO, CON NACL MIENTO MIENTO GRUPO D AGAR BE al 6,5% A 10 °C A 45 °C

13

GRUPO/ESPECIES

Enterococcus y esp ecies relacion adas

CAPÍTULO

Cuadro 1 3 -9

A is la m ie n to e id e n tific a c ió n de e s tre p to c o c o s y b a c te ria s “s im ila re s a StreptococcuS

699

Especies de E nterococcus (Esculina bilis +, NaCI al 6,5% +, PYR+)

1 Manitol +

-/+

-

+ /-

Arginina dihidrolasa/sorbasa

Grupo I

Grupo I

Grupo II

Sacarosa/rafinosa + /+

Arabinosa/rafinosa +/+ + /-/+ -/-

= = = =

Pigmento amarillo

Arabinosa

+ E. casseliflavus

Crecimiento en piruvato

Crecimiento en piruvato

Moti idad

E. raffinosus E. avium (H2S+) E. m alodoratus (H2S+) E. pseudoavium

E. d isp a r

E. hirae

E. faecalis

(variantes asacarolíticas)

E. durans

-

E. ga llin a ru m

Pigmento amarillo

E. m u n d tii

Lactosa

E. faecium

Sacarosa/ melezitosa

E, faecalis + /+

E. solitarius

E. seriolicida

Figura 13-4 Organigrama para la identificación de especies de Enterococcus (adaptado de referencia335).

y PYR positivo, y LAP negativo, produce ácido a partir de glu­ cosa, maltosa, lactosa, trehalosa y glucógeno, y no produce p-galactosidasa o (3-glucuronidasa. Estos microorganismos sue­ len ser sensibles a penicilina, ampicilina y vancomicina. La especie humana H. kunzii se diferencia fácilmente de la especie ovina H. ovis mediante pruebas bioquímicas (cuadro 13-11).

Identificación de especies de Leuconostoc, Pediococcus y Tetragenococcus

El género Leuconostoc contiene varias especies: L. mesenteroides subespecie mesenteroides, L. mesenteroides subespecie cremoris, L. mesenteroides subespecie dextranicum, L. pseudo-

700

C A P ÍT U L O 13

C u a d ro 1 3 - 1 0

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus"

C a r a c t e r í s t i c a s f e n o típ ic a s p a r a la id e n tif ic a c ió n d e e s p e c ie s d e A b io tro p h ia defectiva y G ranulicatella

C A R A C T E R ÍS T IC A Requerim ientos de piridoxal Crecim iento a 10 °C Crecim iento a 45 °C Gas, caldo MRS Crecim iento en agar BE Crecim iento en caldo con NaCI 6,5% Arginina dihidrolasa Hidrólisis de hipurato Producción de ácido a partir de: Glucosa Sacarosa Trehalosa Producción de: a-G A L p-GAL P-GLU Hábitat

A. DEFECTIVA

G. AD1ACENS

G. PARA-ADIACENS

G. ELEGANS

G. BALAENOPTERAE

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

_

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+ +

-

+ + +

+ +

+ +

+ +

-

-

-

+

+ +

-

-

-

-

-

-

-

+ Seres humanos

-

Seres humanos

Seres hum anos

-

+

+

-

Seres humanos

Cetáceos

+: reacción positiva; reacción negativa a-GAL: a-galactosidasa; p-GAL: f5-galactosidasa; fi-GLU: fi-glucosidasa; MRS: caldo para Lactobacillus de Mann-Rugosa-Sharpe; agar BE: agar bilis esculina.

mesenteroides, L. lactis, L. citreum, L. gelidum, L. carnosum, L. fallax, L. argentinum, L. gasicomitatum, L. kimchii, L. ficulneuum y L. fructosum .32A02-m350-512'662m Los microorganismos antes designados L. cremoris y L. dextranicum se incluyen ahora como subespecies de L. mesenteroides. Los microorga­ nismos pertenecientes a la ex especie L. paramesenteroides han sido reclasificados en el nuevo género Weissella como Weissella paramesenteroides?21 Asimismo, los estudios de secuenciación genética e hibridación y el análisis electroforético de actividades enzimáticas de la ex especie de Leuconostoc L. oenos han demostrado que este microorganismo forma una rama distinta alejada de las otras especies de Leuconostoc, de modo que ha sido colocado en el género Oenococcus como Oenococcus oeni.2*3,388 Las subespecies de L. mesenteroides y L. lactis se encuentran principalmente en la leche y los pro­ ductos lácteos, mientras que O. oenos se aísla sólo en vino y hábitats relacionados. L. pseudomesenteroides, L. citreum y L. kimchii se hallan en plantas y verduras, y en productos lácteos. L. gelidum, L. carnosum y L. gasicomitatum se encuentran en carnes (vaca, cerdo, tocino, jamón). L. fallax se encuentra en el chucrut (repollo fermentado) y L. argentinum ha sido aislado en leche argentina cruda .284 Las especies de Leuconostoc son cocos grampositivos, catalasa negativos y productores de ácido láctico resistentes a la vancomicina y producen gas CO, a partir de glucosa .338 Estas bacterias pueden ser diferenciadas de los lactobacilos produc­ tores de gas mediante un escrutinio cuidadoso de los frotis teñi­ dos con Gram de caldo de tioglicolato (véase lámina en color 13-3E y F). Las especies de Leuconostoc no crecen a 45 °C y son arginina dihidrolasa negativas, PYR negativas y LAP nega­ tivas. Es mejor determinar la producción de gas a partir de glu­ cosa en caldo para Lactobacillus MRS (Mann-Rogosa-Sharpe) (Difeo Laboratories, Detroit, MI) recubierto con vaselina esté­ ril. La formación de burbujas debajo del sello de vaselina indi­ ca producción de gas y confirma su metabolismo heterofermentativo. Las especies de Leuconostoc son identificadas a su vez por diversas pruebas bioquímicas (cuadro 13-12). También

se han identificado algunas especies de Leuconostoc mediante análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) de proteínas solubles de la célula entera .323 En el cuadro 13-12 se muestran las caracterís­ ticas fenotípicas de L. mesenteroides subespecie mesenteroi­ des, L. mesenteroides subespecie dextranicum, L. mesenteroides subespecie cremoris, L. pseudomesenteroides, L. citreum, L. lactis y Weissella paramesenteroides (antes L. paramesenteroi­ des), que son las especies de LeuconostocAVeissella aisladas en muestras clínicas humanas. Las especies de Pediococcus también son intrínsecamente cocos grampositivos resistentes a la vancomicina. Sin embargo, son no fermentativos, similar a los estreptococos y, a diferencia de las especies de Leuconostoc, no producen gas a partir de glucosa en caldo M RS .338 Los microorganismos aparecen como cocos grampositivos en pares, grupos y tétradas y son catalasa negativos. El crecimiento ocurre sobre un rango de temperatu­ ra de 25 a 50 °C. En placas, se asemejan a estreptococos viri­ dans en la morfología de sus colonias. Pueden confundirse con estreptococos del grupo D o enterococos porque son bilis escu­ lina positivos, tienen el antígeno grupo D de Lancefield y algu­ nas cepas crecen en presencia de NaCI al 6,5%. Los pediococos son PYR negativos y LAP positivos. Las especies que se han aislado en infecciones humanas incluyen P. acidilactici y P. pentosaceus. Puede ser difícil diferenciar estos microorga­ nismos entre sí y la fermentación de la maltosa -positiva para P. pentosaceus y negativa para P. acidilactici- constituye la prueba más fiable para la separación de los dos. Sin embargo, Tankovic y cois, señalaron que las dos especies podían ser separadas por la sensibilidad a la novobiocina .944 Las 25 cepas de P. acidilactici fueron sensibles a la novobiocina (diámetros de las zonas en discos de 5 mg, > 16 mm), mientras que las nueve cepas de P. pentosaceus fueron resistentes (diámetros de la zona, < 10 mm). Ambas especies son sensibles a p-lactámicos, clindamicina, rifampicina, eritromicina, gentamicina e imipenem y son resistentes a vancomicina, teicoplanina y fluo­ roquinolonas .944

Cuadro 13-11

Características bioquímicas para la identificación de especies de Aerococcus y Hetcococcus

C A R A C T E R ÍS T IC A D isposición celular Hem olisis

A VIRIDANS

A. URINAE

A. SANGUINICOLA

A. C H R ISTE N SE N II

A. URINAEHOM INIS

II. KUNZII

ll. OVIS

Pares, tétradas, grupos

Pares, tétradas, grupos

Pares, tétradas, grupos

Pares, tétradas, grupos

Pares, tétradas, grupos

Pares, grupos

Pares, grupos

a

a

a

a

a

N inguna, a

Ninguna ND

Crecim iento a 10 °C

ND

ND

ND

ND

ND

Crecim iento a 45 °C

ND

ND

ND

ND

ND

PYR

+

-

LAP

-

+

+ +

+ -

-

-

-

-

+

-

ND

M otilidad

-

-

Crecim iento en agar BE

V

+ +

ND

-

+

-

-

+

ND

+

ND

+

V

+

-

V

H idrólisis de esculina

+

+

-

H idrólisis de almidón

ND

ND

ND

ND

ND

V

-

H idrólisis de hipurato

V

+

+

+

+

-

-

Arginina dihidrolasa

-

-

-

-

-

-

-

Ureasa

-

-

-

-

-

ND

ND

-

-

+

-

-

+d -

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

V

Fosfatasa alcalina Acetoína Acido a partir de: Glucosa M altosa

V+

-

+

-

Sacarosa

+

+

+

-

+

-

-

Lactosa

v+

-

V-

-

-

+

-

Manitol

V

+

-

-

-

-

-

Ribosa

V

+

+

-

+

-

-

Trehalosa

+

-

+

-

-

+

-

Arabinosa

ND

-

-

-

-

-

-

Rafinosa

ND

ND

-

-

-

-

-

Sorbitol

-

+

-

-

-

-

-

Glucógeno

+

-

-

-

-

V

V

a-G A L

ND

-

-

-

-

-

ND

p-GAL

+

-

-

-

-

-

V

p-GUR

-

+

+

-

+

-

a-G L U

ND

ND

-

ND

-

ND

ND

P-GLU

ND

-

-

-

V

+

-

NAGA

ND

ND

-

-

-

+

-

701

+ : reacción positiva; -: reacción negativa; V: reacción variable; V+: variable, pero mayoría de cepas positivas; V : variable, pero mayoría de cepas negativas; +'/: reacción positiva débil; ND: datos no disponibles; PYR : pirrolidonil arilamidasa; LAP: leucina aminopeptidasa; a-GAL: a-galactosidasa; ¡3-GAL: p-galactosidasa fi-GUR: fí-glucuronidasa; a-GLU: a-glucosidasa: ¡i-GLU: fi-glucosidasa; NAGA: N-acetil-fi-D-glucosaminidasa.

Aislamiento e identificación de estreptococos y bacterias “similares a S tre p to c o c c u s f

Crecim iento con NaCl 65%

+

702

Cuadro 13-12 Características fenotípicas para la identiñcación de especies de Leuconostoc aisladas en muestras clínicas humanas

L. CITREUM

L. LACTIS

W EISELLA PARAMESENTEROIDES

-

-

-

-

+

-

-

ND

+

13

+

ND

ND

+

+

+

+

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus"

L. M ESENTEROID ES

SUBESPECIE

SUBESPECIE

L. M ESENTEROID ES

M ESENTEROID ES

DEXTRANICU M

SUBESPECIE CREM ORIS

H em olisis en SBO

-

-

-

Pigm ento amarillo

-

-

-

Crecim iento a 10 °C

ND

ND

Crecim iento a 37 °C

V+

+

CARACTERÍSTICA

L. PSEUDOMESENTERO IDES

Crecim iento a 45 °C

-

-

-

-

-

-

-

LAP

-

-

-

-

-

-

-

PYR

-

-

-

-

-

-

-

H idrólisis de esculina

+

V+

-

+

+

V-

V+

Dextrán a partir de sacarosa

+

+

-

ND

ND

-

-

V

V

-

V-

V+

-

-

+

-

+

+

Acido producido a partir de: A m igdalina

v+ v+

-

-

V

-

v+ v+

-

V

Fructosa

+

+

V

+

+

+

+

Galactosa

A rabinosa Celobiosa

v+

V

+

v+

V-

+

+

Glucosa

+

+

+

+

+

+

+

Lactosa

V

+

V

V

-

+

-

M altosa

+

+

V-

+

+

+

+

Manitol

+

V

-

V-

V

-

+

M añosa

+

V

V

+

+

+

+

M elibiosa

+

V

V-

v+ v+

-

v+

+

-

v+

V-

Rafinosa

v+

V

V-

Ribosa

v+

ND

V-

+

-

-

+

Salicina

+

V

-

V

+

-

V-

Alm idón

-

-

-

+

-

-

-

v+

+

+

+

Sacarosa

+

+

V

Trehalosa

+

+

V

+

+

V

+

Xilosa

+

V

V-

+

V-

-

-

Productos lácteos, vegetación

Productos lácteos

Productos lácteos

Plantas, productos lácteos

Plantas

Productos lácteos

Productos lácteos

Hábitat + : reacción positiva;

reacción negativa; V+: mayoría de cepas positivas, raras cepas negativas; V : mayoría de cepas negativas, raras cepas positivas; V: reacción variable: ND: datos no disponibles; LAP: leucina aminopeptidasa;

PYR: pirrolidonil arilamidasa.

CAPÍTULO

L. M ESENTEROID ES

A is la m ie n to e id e n tific a c ió n de e s tre p to c o c o s y b a c te ria s “s im ila re s a StreptococcuS

Como ya se mencionó, P halophilus es filogenéticamente más cercano a los enterococos y ha sido reelasificado en el género Tetragenococcus como T. halophilus. Según los datos que se mencionan en la descripción original de esta especie, T. halophilus característicamente crece como pares o tétradas (de ahí el nombre) y, en ocasiones, como grupos, no crece a 10 °C o a 45 °C, es inmóvil, crece en NaCI al 6,5% (en realidad crece hasta en NaCI al 10%) y en agar BE y es arginina dihidrolasa negativo. La mayoría de las cepas producen ácido a partir de arabinosa, glucosa, glicerol, maltosa, ribosa, sacarosa y trehalosa y no lo producen a partir de lactosa, mañosa, manitol y sorbitol (véase cuadro 13-13). Al contrario de otros pediococos, T. halophilus es sensible a la vancomicina. T. muriaticus no se asocia con infecciones humanas.

cadenas cortas. El crecimiento de algunas cepas se ve aumen­ tado por la presencia de hidratos de carbono fermentables y por el agregado de Tween 80 a los medios de crecimiento. Debido a la cantidad limitada de aislamientos clínicos, el rendimiento de los sistemas para la identificación de estas bacterias no puede ser evaluado en forma crítica. Sólo se incluyen G. hae­ molysans y G. morbillorum en las bases de datos de los distin­ tos sistemas comerciales en este momento. En el cuadro 13-14 se señalan las características fenotípicas para la identificación de especies de Gemella. Identificación de especies de Vagococcus

El género Vagococcus incluye a V. fluvialis, aislada en huma­ nos y animales, y a V. salmoninarum, V. lutre y V. fessus, aisla­ das en animales. El género Vagococcus fue descrito inicial­ mente como lactococos del grupo N móviles, y la cepa tipo es V. fluvialis. V. fluvialis es similar a Streptococcus en la morfo­ logía de sus colonias y es a-hem olítico o no hemolítico, facul­ tativo y homofermentativo en su metabolismo, y catalasa nega­ tivo. En las tinciones de Gram, los microorganismos aparecen como células esféricas u ovoides, están dispuestos en pares o en cadenas. Según la descripción original de Collins y cois., V. fluvialis son cocos móviles que producen flagelos peritricosos. La motilidad puede demostrarse incubando el microorganismo en un medio para movilidad a temperatura ambiente. V. flu via ­ lis es PYR positivo, LAP positivo e hidroliza esculina en pre­ sencia de bilis al 40% (cuadro 13-15).950 La mayoría de las cepas crecen a 10 °C, pero el crecimiento a 45 °C es variable. La mayoría de las cepas también crecen en NaCI al 6,5% y algunas producen acetoína . 336-950 V. fluvialis produce ácido a partir de glucosa, maltosa, manitol, sorbitol, ribosa y trehalosa, pero no de arabinosa, inulina, melibiosa o rafinosa (cuadro 13I5 ) . 950 Se han aislado cepas de V. fluvialis en cerdos, gatos y caballos; estas cepas fueron VP positivas, fosfatasa alcalina positivas y LAP positivas, y algunas fueron inmóviles . 781 Las cepas de V. fluvialis aisladas en muestras clínicas humanas son sensibles a ampicilina, cefotaxina, trimetoprim-sulfametoxazol y vancomicina, y son resistentes a clindamicina y ofloxacina .950 V. salmoninarum se encuentra en peces enfermos, V. lutre en nutrias y focas y V. fessus en marsopas de modo que su aisla­ miento en muestras clínicas humanas es improbable. Las tres

Identificación de especies de Gemella

De las seis especies de Gemella que se describieron, cuatro -G . haemolysans, G. morbillorum, G. hergeriae y G. sanguin is- han sido aisladas en muestras clínicas humanas. Las dos especies restantes -G . palaticanis y G. cuniculi- se encuentran en perros y conejos, respectivamente. Las especies de Gemella son cocos grampositivos, catalasa negativos que crecen carac­ terísticamente como colonias puntiformes en SBA, que a menudo requieren 48 horas o más para el crecimiento de dis­ tintas colonias. La incubación en una atmósfera enriquecida con CO, estimula el crecimiento. Son a-hem olíticos o no hem olíticos, salvo por la especie animal G. cuniculi, que es ¡3-hemolítico. En los frotis teñidos con Gram de cultivos en caldo, los microorganismos aparecen como células únicas, pares o cadenas cortas. Todas las especies de Gemella son PYR positivas, LAP positivas, inmóviles y no crecen a 10 °C ni a 45 °C. No crecen en agar BE, no hidrolizan la esculina, la urea, el almidón ni la gelatina y no crecen en caldo con NaCI al 6,5%. Las especies de Gemella pueden ser diferenciadas sobre la base de la formación de ácido a partir de maltosa, sacarosa, lactosa, manitol, sorbitol y trehalosa. G. haemolysans y G. morbillo­ rum. los aislamientos clínicos más frecuentes, también pueden ser diferenciados por reducción de nitrito. Debido a sus pare­ des celulares delgadas, G. haemolysans y G. morbillorum cam­ bian fácilmente de color en la tinción de Gram y pueden apa­ recer como cocos gramnegativos en pares, en cúmulos y en

Cuadro 13-13

703

Características para la identificación de especies de P ediococcus y T etragenococcus haloph ilus

CARACTERISTICA Crecimiento a 45 °C Acido producido a partir de: Glucosa Maltosa Arabinosa Almidón Glicerol Melezitosa Dextrina Xilosa Novobiocina

P. ACIDILACTICI

P. PENTOSACEUS

P. DEXTRIN1CUS

P. DAMNOSUS

P. PARVULUS

+

V

-

-

-

+ V — + S

+ + +

+ +

+ V

+ +

+ +

-

-

-

_

-

+

-

-

_

_

-

-

-

-

_

-

-

V

_

_

+ +

-

V R

+

-

-

-

ND

ND

-

ND

P. INOPINATUS

T. HALOPHILUS -

+ + +

V

—

-

-

ND

.

ND

+: reacción positiva; -: reacción negativa; V: reacción variable; ND: datos no disponibles; S: sensible a novobiocina (zona de disco de 5 mg, > 16 mm); R: resistente a novobiocina (zona de disco de 5 mg, " 1 0 mm).

704

C A P ÍT U L O 13

Cuadro 1 3-14

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus”

Características fenotípicas para la identificación de especies de G em ella

C A R A C T E R ÍS T IC A Hemolisis

G. HAEM OLYSANS

G. M ORBILLORUM

G. BERG ERIAE

G. SANGUINIS

G. PALATICANIS

Ninguna, a

Ninguna, a

Ninguna, a

Ninguna, p

Ninguna

P

G. CUNICULI

Crecim iento a 10 °C

_

ND

ND

Crecim iento a 45 °C

_

ND

ND

PYR

+

+

+

+

ND

ND

LAP

+

+

+

+

ND

ND

Motilidad

_

-

-

Bilis esculina

_

ND

ND

Crecim iento con NaCl al 6,5%

_

ND

ND

Hidrólisis de esculina

-

-

-

-

-

-

Hidrólisis de hipurato

-

-

-

-

-

ND

ND

ND

-

-

-

-

+

-

+

V

-

-

-

-

Hidrólisis de almidón Arginina dihidrolasa

-

Ureasa

-

Fosfatasa alcalina

V+

-

-

-

-

Acetoína (VP)

-

Producción de: a-G A L p-GAL a-G L U

ND

ND

ND

ND

ND

-

ND

ND

ND

-

_

ND

-

ND

ND

-

Reducción de N O a

-

-

-

Reducción de NO ,

+

-

ND

ND

ND

ND

Glucosa

+

+

+

+

+

+

M altosa

+

+

~/+d

+

+

-

Sacarosa

V

+

-

+

+w

-

V-

+

-

¡5-GLU P-GUR NAGA

Producción de ácido a partir de:

Lactosa M anitol Sorbitol

-

Trehalosa

_

Hábitat

Seres humanos

V+

V-

+

-

+

v+

-

+

-

+

+

-

Caninos

Conejos

Seres humanos

Seres humanos

Seres humanos

+: reacción positiva; -: reacción negativa; V: reacción variable; V+: reacción variable, pero mayoría de cepas positivas; ~/+d: mayoría de cepas negativas, cepas positivas producen reacciones débiles; ND: datos no disponibles; PYR: pirrolidonil arilamidasa; LAP: leucina aminopeptidasa; a-GAL: a-galactosidasa; p-GAL: P-galactosidasa; a-GLU: a-glucosidasa; P-GLU: fi-glucosidasa; ¡5-GUR: a-glucuronidasa; NAGA: N-acetil-P-D-glucosaminidasa.

A is la m ie n to e id e n tific a c ió n d e e s tre p to c o c o s y b a c te ria s “s im ila re s a Streptococcusf

Cuadro 13-15

705

Características bioquímicas para la identificación de especies de Vagococcus V. FLU VIALIS

V. SALM ONINARUM

V. LUTRE

V. FESSU S

D isposición celular

Solo, pares, cadenas cortas

Solo, pares, cadenas cortas

Solo, pares, cadenas cortas

Solo, pares, cadenas cortas

H em olisis en SBO

a, y

a, y

ND

a

-. miento a 10 °C

V+

+

ND

ND

Crec-.miento a 45 °C

V-

-

ND

ND

C \R

a

C T E R ÍS T IC A

M otilidad

+

-

+

-

Catalasa

-

-

-

-

LAP

+

ND

ND

+

PYR

+

ND

ND

ND

Hidrólisis de esculina

+

+

+

ND

Crecim iento con NaCI al 6,5%

+

+

ND

ND

Arginina dihidrolasa

V

-

-

-

Hidrólisis de hipurato

-

-

-

-

Ureasa

-

-

-

-

Crecim iento en agar BE

+

ND

ND

ND

H.S en KIA

-

+

ND

ND

Acetoína

V

-

-

-

ND

ND

ND

V

S

S

S

S

+ /-

+ /-

+

+

M altosa

+

+

+

-

Sacarosa

V

+

+

-

Lactosa

-

—

-

-

M anitol

+

-

-

-

Fosfatasa alcalina Vancomicina Producción de ácido a partir de: Glucosa/gas

Sorbitol

+

-

+

-

A rabinosa

-

-

-

-

Melibiosa

-

-

-

-

Rafinosa

-

-

-

-

Ribosa

+

+

+

-

Trehalosa

+

+

+

-

Glucógeno

ND

-

-

-

a-G A L

-

ND

+

P-GAL

V

ND

a-G L U

ND

ND

+

-

P-GLU

ND

ND

+

V

Hidrólisis de:

p-GUR NAGA Hábitat

V

-

ND

-

-

ND

ND

+

-

Agua, muestras clínicas humanas

Peces salmónidos

Otros

Focas, m arsopas del puerto

+ : reacción positiva; reacción negativa; +d: reacción positiva débil; ND: datos no disponibles; LAP: leucina aminopeptidasa; PYR: pirrolidonil arilamidasa; a-GAL: a-galactosidasa; fi-GAL: fi-galactosidasa; a-GLU: a-glucosidasa; fí-GLU: fi~glucosidasa; p-GUR: a-glucuronidasa; NAGA: N-acetil-fi-D-glucosaminidasa.

706

C A P ÍT U L O 13

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus"

especies son cocos a-hem olíticos que aparecen como células aisladas, en pares o en cadenas en los frotis teñidos con Gram de cultivos en caldo. Al contrario de V. fluvialis y V. lutre, V. salmoninarum es inmóvil y produce H 2S. V. fluvialis también produce ácido a partir de glicerol y sorbitol, mientras que V. salmoninarum no lo hace. V. lutre es inmóvil, pero puede ser diferenciado de V. fluvialis por sus reacciones positivas para a-galatosidasa y P-galactosidasa .608 Aunque la motilidad de V. fessus no se describió, esta especie puede ser diferenciada de V. fluvialis, V. lutre y V. salmoninarum por su incapacidad para producir ácido a partir de maltosa, ribosa, sacarosa o trehalosa. Tanto V. salmoninarum como V. fluvialis producen reacciones positivas con la prueba AccuProbe para Enterococcus (GenProbe). Los miembros del género Vagococcus no están inclui­ dos en la base de datos de ninguno de los sistemas de identifi­ cación comerciales. Identificación de especies de Alloiococcus, Globicatella, Facklamia, Dolosigranulum, Ignavigranum y Dolosicoccus

Los microorganismos incluidos en el género Alloiococcus y los géneros Globicatella, Facklamia, D olosigranulum e Ignavigranum son especies similares a Gemella que pueden crecer en NaCl al 6,5% (cuadro 13-16). A. otitidis, el único miembro del género Alloiococcus, se aísla en muestras de timpanocentesis obtenidas del oído medio de niños con otitis media crónica, en hemocultivos y en esputo . 6620 El microorga­ nismo crece lentamente en medios de agar, las colonias son visibles luego de 2 a 3 días y no crece en caldo de tioglicolato. Los frotis teñidos con Gram de medios de agar muestran cocos dispuestos en pares, tétradas y a veces en cúmulos. El creci­ miento óptimo ocurre a 35 a 37 °C y requiere C 0 2, y no ocurre ningún crecimiento a 10 °C o 45 °C . 688 Las colonias aparecen de color hueso, puntiformes y no hemolíticas, aunque se puede observar a-hem ólisis y una pigmentación ligeramente amarilla después de varios días de incubación . 118 Las cepas clínicas fres­ cas de A. otitidis crecen en agar sangre, pero es posible que no crezcan en agar chocolate. El crecimiento exuberante en caldo que contiene Tween al 0,5% o lecitina al 0,07% sugiere que el microorganismo puede requerir lípidos para el crecimiento óptimo. Al contrario de los otros microorganisms considerados en este capítulo, A. otitidis es catalasa positivo; esta reacción puede ser muy débil o tardía. El microorganismo es aerobio más que facultativo y no produce ácido a partir de ningún hidrato de carbono. A. otitidis crece en agar bilis esculina pero no hidroliza la esculina y crece lentamente en caldo de NaCl al 6,5%. Se produce PYR, LAP y p-galactosidasa y algunas cepas hidrolizan el hipurato. Bosley y cois, realizaron estudios de sensibilidad a los antibióticos en 19 cepas de A. otitidis y observaron que todas eran resistentes a trimetoprim-sulfametoxazol y 18 eran resistentes a la eritromicina . 118 Las CIM para penicilina y ampicilina fueron variables, con cepas sensibles y otras con resistencia intermedia (rango de CIM para penicilina, 0,06 a 0,12 |ig/mL: rango de CIM para ampicilina, 0,12 a 0,5 ug/mL) y se observa el mismo grado de resistencia relativa para ceftriaxona y cefixima. Ninguna de las cepas que exami­ naron produjo enzimas P-lactamasas . 118 G. sanguinis ha sido aislado en muestras humanas, incluidos sangre, LCR y orina. En los frotis teñidos con Gram de culti­ vos en caldo, estos microorganismos aparecen como cocos grampositivos en pares y cadenas cortas. Las colonias en agar sangre de camero son similares a Streptococcus y son a-hem olíticas. Al igual que los enterococos, G. sanguinis es bilis escu­ lina positivo, crece en NaCl al 6,5% y produce PYR; al contra­

rio de enterococos y estreptococos, no se produce LAP. G. san­ guinis crece a 45 °C pero no a 10 °C . 884 Estas reacciones tam ­ bién diferencian a G. sanguinis de otros estreptococos viridans en que las últimas especies son PYR negativas y LAP positivas y no crecen en caldo de NaCl al 6,5%. Se puede utilizar para estas determinaciones BactiCard STREP (Remel), que incluye las pruebas Rapid PYR, LAP e hidrólisis de esculina en for­ mato de tarjeta. A diferencia de los aerococos, G. sanguinis produce cadenas características en medios de caldo en lugar de tétradas. Se debe determinar esta característica de crecimiento para diferenciar G. sanguinis de A. viridans, que como G. san­ guinis, es LAP negativo, PYR positivo e hidrólisis de hipurato positivo. G. sanguinis produce ácido a partir de varios hidratos de carbono, incluidos glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa, manitol, rafinosa y trehalosa; la producción de ácido a partir de arabinosa, ribosa y sorbitol es variable (cuadro 13-16). G. san­ guinis se encuentra en la base de datos del sistema BBL Crystal Gram-Positive ID, pero no en la base de datos del API Rapid Strep, el RapID STR o los sistemas de identificación ID32.884 Utilizando los puntos de corte de CLSI para especies de Streptococcus distintas de S. pneumoniae, Shewmaker y cois, determinaron la sensibilidad a los antibióticos de 28 cepas de G. sanguinis y observaron que todas eran sensibles a la amoxi­ cilina y la vancomicina y algunas tenían CIM de penicilina que caían en el rango intermedio . 884 Se observó una sensibilidad variable a otros agentes, incluida cefotaxima (sensibilidad del 52%), cefuroxima (sensibilidad del 26%), meropenem (sensi­ bilidad del 63%), eritromicina (sensibilidad del 52%), trimeto­ prim-sulfametoxazol (sensibilidad del 48%), clindamicina (sensibilidad del 70%) y tetraciclina (sensibilidad del 48%). El patógeno bovino/ovino, G. sulfidifaciens, puede ser dife­ renciado fácilmente de G. s a n g u i n i s G . sulfidifaciens produ­ ce H2S y P-glucuronidasa, mientras que G. sanguinis no lo hace. G. sanguinis también produce P-galactosidasa, fermenta el manitol e hidroliza el hipurato; G. sulfidifaciens produce reacciones negativas en estas tres pruebas. Los miembros del género Facklamia son cocos grampositi­ vos y catalasa negativos relacionados con las especies de Globicatella pero que son filogenéticamente distintos. Las especies aisladas en muestras clínicas humanas son F. hominis, F. sourekii, F. ignava y F. languida. F. miroungae y F. tabaci­ nalis han sido aislados en elefantes marinos y en tabaco en polvo, respectivamente. En los frotis de caldo de tioglicolato teñidos con Gram, las especies de Facklamia aparecen como cocos grampositivos dispuestos en pares o cadenas cortas, excepto por F. hominus, que suele formar grupos. En SBA, las colonias suelen ser a-hemolíticas y similares a estreptococos viridans. Las especies de Facklamia no crecen en medios de bi­ lis esculina, pero crecen en NaCl al 6,5%. Las especies de Facklamia no crecen a 10 °C ni a 45 °C y son LAP y PYR posi­ tivas (cuadro 13-16). El género Ignavigranum, con su única especie, 1. ruoffiae, fue descrito por primera vez en 1999. Esta especie crece prin­ cipalmente como cadenas en caldo de tioglicolato y está estre­ chamente relacionada desde el punto de vista filogenético tanto con F. hominis como con G. sanguinis. I. ruoffiae es PYR y LAP positivo, crece en caldo de NaCl al 6,5% y no hidroliza la esculina. Algunas cepas son argina dihidrolasa positivas. Aunque la mayoría de las cepas de F. hominis también son argi­ nina dihidrolasa positivas, esta especie es hidrólisis de hipura­ to positiva, mientras que I. ruoffiae es hipurato negativa (cua­ dro 13-16). Un rasgo característico de I. ruoffiae es el olor a “chucrut” producido por el microorganismo cuando crece en SBA.

C u ad ro 1 3 -1 6

C a r a c t e r í s t i c a s f e n o t í p i c a s p a r a l a i d e n t i f i c a c i ó n d e e s p e c i e s d e G lo b i c a t e l l a , A l l o i o c o c c u s , F a c k l a m i a , I g n a v i g r a n u m , D o l o s i g r a n u l u m y D o l o s i c o c c u s G. SAN G U IN IS

G. SULFIDIFACIENS

Disposición celular

Cadenas cortas, pares

Solo, pares, Pares, tétradas, cadenas cortas grupos

CARACTERÍSTICA

A. OTITID IS

F. H O M IN IS Grupos, pares

F IGNAVA

F. SO U REKII

F. LANGUIDA

Pares, cadenas Pares, cadenas Pares, cadenas cortas cortas cortas

a

a

y

a

-

ND

-

-

Crecimiento a 45 °C

+

ND

-

-

Motilidad

-

Catalasa

-

-

+

-

-

-

-

LAP

-

ND

+

+

+

+

PYR

V+

-

+

V+

+

+

ND

-

-

Crecimiento en caldo con NaCI al 6,5%

+

+

+

+

Arginina dihidrolasa

-

-

-

+

Hidrólisis de hipurato

+

-

V

+

Ureasa

-

-

-

ND

Crecimiento en agar BE

+

-

+

ND

H2S en KIA

-

+

ND

Hidrólisis de esculina

Acetoína (VP)

•-

]

y

-

a

-

-

D. PIGRUM

D. PAUCIVORANS

Pares, células únicas, cadenas cortas

Pares, cadenas cortas

Células únicas, pares, grupos

Grupos, tétradas

Pares, cadenas cortas

a

y

a

a

-

-

ND

• -

-

-

-

-

-

-

+

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

+

-

+

+

+

+

+

-

-

+

-

+

+

+

-

+

+

-

ND

+

+

-

-

-

-

ND

ND

ND

ND

ND

ND

-

-

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

-

-

-

-

V

+

V

-

-

S

S

S

S

S

s

S

s

+

+

+

+

+

+

+

+d

-

ND

-

ND

S

S

S

Glucosa

+

+

-

+d

+

Maltosa

+

+

-

-

_

+

Sacarosa

+

+

-

-

-

+

Lactosa

V+

-

-

_

S

a

ND

-

-

Vancomicina

I. RU O FFIAE

-

ND

Fosfatasa alcalina

y

F. MIRO U NG AE

Producción de ácido a partir de:

-

Manitol

+

-

-

-

-

+

-

Sorbitol

V

-

-

-

-

+

-

Arabinosa

V

-

-

Melibiosa

+

+

Rafinosa

+ v+

Ribosa

+

-

-

1 +

-

-

! +d

V

+d

-

-

-

_

-

V

-

-

_

-

ND

-

+

-

-

-

+

-

-

_

-

ND

+

-

-

V +

-

Trehalosa

+

+

-

-

-

+

+

+

Glucógeno

+

ND

-

-

-

-

-

-

a-G A L

ND

+

+

+

p-GAL

+

-

+

+

a-GLU

ND

ND

ND

ND

-

' -

-

p-GLU

V

ND

ND

_

-

-

-

P-GUR

ND

ND

ND

_

-

-

-

NAGA

ND

ND

ND

ND

v+

V

-

-

ND

-

ND

-

-

-

-

-

V

Hidrólisis de: +

-

707

+: reacción positiva; reacción negativa; V: reacción variable; +d: reacción positiva débil; V+: variable, pero mayoría de cepas positivas; V variable pero mayoría de cepas negativas; ND: datos no disponibles; LAP: leucina ami­ nopeptidasa; PYR: pirrolidonil arilamidasa; a-GAL: a-galactosidasa; P-GAL: fi—galactosidasa; a-GLU: a —glucosidasa; P-GLU: f}-glucosidasa; P-GUR: a —glucuronidasa; NAGA: N-acetil-p-D-glucosaminidasa.

Aislam iento e identificación de estreptococos y bacterias “similares a S tre pto coccuS

Hemolisis en SBO Crecimiento a 10 °C

F. TABAC IN ALIS

708

C A P ÍT U L O 13

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus”

El género Dolosigranulum contiene una única especie, D. pigrum. En SBA, este microorganismo crece como pequeñas colonias a-hem olíticas blanco grisáceas. En las tinciones de Gram de caldo (tanto tioglicolato y, en el informe de un caso, medio para hemocuitivo Organon-Teknika BacT/Alert FAN), este microorganismo aparece en pares, tétradas similares a Gemella y cúmulos .451 Como las especies de Facklamia, D. pigrum es PYR y LAP positivo y crece en sal al 6,5%. Este microorganismo es hidrólisis de esculina positivo, pero esta reacción puede tardar varios días para desarrollarse. No se observa ningún crecimiento a 10 °C o a 45 °C o en agar BE (cuadro 13-16). El género Dolosicoccus, con su único miembro, Dolosi­ coccus paucivorans, es un grupo nuevo que se basa sobre dos cepas aisladas en hemocultivos humanos. Este microorganismo es distinto de los géneros Facklamia y Globicatella, pero está relacionado filogenéticamente con ellos. Como el microorga­ nismo explicado antes, D. paucivorans es PYR positivo, pero 'al contrario de estos otros, es LAP negativo, no crece en caldo de NaCl al 6,5% y aparece sobre los frotis de caldo teñidos con Gram como células únicas, en pares y en cadenas cortas. Al igual que D. pigrum, D. paucivorans no crece en medio BE ni tampoco a 10 °C o a 45 °C (cuadro 13-16).

que una cepa sea una especie de Lactococcus es la generación de una lista de características que no se ajustan a los estrepto­ cocos ni a los enterococos . 336 La mayoría de las cepas clínicas de lactococos remitidas a los CDC han sido L. lactis subespe­ cie lactis o L. garveiae. Estas dos especies pueden ser diferen­ ciadas de las especies comunes de Enterococcus en que ambas producen ácido a partir de manitol pero no a partir de rafinosa, sorbitol o arabinosa. L. garveiae, L. lactis subespecie cremoris, L. lactis subespecie lactis y L. raffinolactis están incluidos en la base de datos de los sistemas de identificación ID32 Strep, API Rapid Strep y BBL Crystal, respectivamente (véase la sec­ ción siguiente). También se describieron métodos de sondas de oligonucleótidos y las técnicas de PCR específicas de género para separar los enterococos y lactobacilos .259839 En el cuadro 13-17 se presentan las características bioquímicas para identi­ ficar las especies de Lactococcus. Sistemas comerciales para la identificación de estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus” seleccionadas

El desarrollo de sistemas comerciales que incorporan tipos similares de pruebas fisiológicas y enzimáticas para la identifi­ cación de estreptococos ha sido de gran ayuda para la identifi­ cación de las especies de estreptococos viridans, las especies de Enterococcus y los estreptococos del grupo D. Se utilizan las reacciones bioquímicas incluidas en los sistemas para generar un número biotipo que corresponde a la identidad del microorganismo. Aunque estos sistemas incluyen los estrep­ tococos P-hemolíticos en sus bases de datos, es mejor m ane­ jar estos microorganismos utilizando otros métodos, como las pruebas presuntivas ya descritas o los sistemas comerciales de identificación rápida de grupo estreptocócico. Sin embar­ go, también hay que tener precaución con los sistemas de identificación comerciales. Por ejemplo, el API Rapid Strep®

Identificación de especies de Lactococcus

Debido a la semejanza superficial con los enterococos o los estreptococos viridans, estos microorganismos han sido mal identificados como estreptococos o enterococos atípicos en el laboratorio clínico. Los lactococos muestran muchas de las características de los estreptococos y los enterococos; muchas cepas son PYR, LAP, BE y NaCl al 6,5% positivas, y pueden crecer a 10 °C. Los lactococos, al contrario de los enterococos, no crecen a 45 °C. Una información sobre la posibilidad de

Cuadro 1 3 - 1 7

Características fenotípicas para la identificación de especies de Lactococcus L. LACTIS

L. LACTIS

L. LACTIS

S U B E S P E C IE

S U B E S P E C IE

SU B E S P E C IE

LACTIS

CREM ORIS

HORDNIAE

L. GARVEIAE

Arginina dihidrolasa

+

-

+

+

-

-

+

Hidrólisis de hipurato

-

+

-

-

-

-

-

PYR

V

-

-

+

-

-

-

Acetoína (VP)

+

+

+

+

+

+

+

Glucosa

+

+

+

+

+

+

+

M altosa

+

-

-

+

+

+

+

Sacarosa

+

-

+

V

+

-

+

Lactosa

+

+

-

V

-

+

-

M anitol

+

-

-

+

+

V

+

PRUEBA

L. L. PLANTARUM RAFFINOLACTIS

L. XYLOSUS

Producción de ácido a partir de:

Sorbitol

-

-

-

-

+

-

-

Rafinosa

-

-

-

-

-

+

-

Trehalosa

+

-

+

+

+

-

+

+: reacción positiva;

reacción negativa; V: reacción variable; PYR: pirrolidonil arilamidasa.

A is la m ie n to e id e n tific a c ió n de e s tre p to c o c o s y b a c te ria s “s im ila re s a Streptococcus? 7 0 9

identifica erróneamente a los microorganismos Leuconostoc como especies de estreptococos viridans, de modo que se debe considerar la resistencia a la vancomicina y otros resul­ tados de pruebas preliminares junto con las reacciones bio­ químicas que se observan sobre la tirita. Los sistemas comer­ ciales para la identificación de estreptococos incluyen los siguientes. API RAPID STREP8

Este sistema con formato en tira (BioMérieux) consta de 20 pruebas, que incluyen pruebas fisiológicas, pruebas de sustra­ tos enzimáticos cromogénicos y pruebas de utilización de hidratos de carbono. Lo que puede destacarse acerca de este sistema es que la tira se puede leer dos veces. Si no se obtiene una identificación luego de 4 horas de incubación utilizando los sustratos fisiológicos y cromogénicos, se puede volver a incubar la tira y leerla luego de la incubación durante toda la noche para incluir la producción de ácido de 1 0 hidratos de car­ bono (véase lámina en color 13-3C). La base de datos incluye estreptococos P-hemolíticos, especies de Enterococcus (E. fa e ­ calis, E. faecium, E. gallinarum, E. avium y E. durans), estrep­ tococos viridans, lactococos, aerococos, especies de Gemella, cepas de S. bovis y Listeria monocytogenes. El API Rapid Strep® es en la actualidad el sistema comercial más amplia­ mente disponible para la identificación de los estreptococos y las bacterias similares a Streptococcus. La identificación de las cepas que han sido completamente caracterizadas mediante pruebas bioquímicas convencionales y análisis genético (p. ej., relación de DNA, secuenciación de rRNA 16S) indica que el sistema API Rapid Strep® es reproducible y complementa los estudios genéticos existentes. En algunos casos, las pruebas sobre las tiras en realidad pusieron en evidencia diferencias fenotípicas no observadas con los métodos convencionales. En otros casos, la presencia de diferencias fenotípicas entre las cepas del sistema Rapid Strep podría demostrar que es genotípicamente distinto cuando se realizaron estudios de ácidos nucleicos. Las reacciones bioquímicas para muchos microor­ ganismos que se muestran en los cuadros de este capítulo refle­ jan los estudios recientes durante los cuales se realizó análisis genético y la descripción de nuevas especies junto con la carac­ terización por API Rapid Strep®. Sin embargo, la base de datos para este sistema no ha sido actualizada ni ampliada para incluir especies estreptocócicas más nuevas (p. ej.. S. vestibularis, S. gordonii, S. crista).

SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN PARA GRAMPOSITIVOS BBL CRYSTAL

El sistema de identificación para grampositivos Crystal con­ tiene 29 sustratos bioquímicos y enzimáticos desecados más un control negativo a la fluorescencia. Se prepara el inóculo sus­ pendiendo colonias de una cepa aislada pura en el líquido pro­ visto con el equipo hasta una turbidez equivalente a un están­ dar de McFarland de 0,5. Luego se vierte la suspensión en un área específica de la base del panel, el cual se manipula hasta distribuir el inóculo. Se golpea luego la tapa del panel, que con­ tiene los sustratos de prueba, en la base, con la hidratación ulte­ rior de los sustratos con el inóculo. Después de la incubación, se leen las pruebas para detectar fluorescencia o cambios en los colores de los indicadores de pH utilizando un visualizador especial del panel. El patrón resultante de las 29 reacciones es convertido en un número de perfil de 1 0 dígitos que se correla­ ciona con una identificación provista por el libro de Códigos electrónicos Crystal. El panel puede ser interpretado utilizando

una base de datos de 4 horas de incubación o de 18-24 horas de incubación. En una evaluación de este sistema, el Crystal Gram-Positive® identificó a todas las cepas de estreptococos P-hemolíticos agru­ pables y S. pneumoniae, pero sólo identificó 25 de 37 cepas de estreptococos viridans en la categoría de especie. El sistema identificó correctamente a los 23 E. faecalis, 2 de 2 E. avium y a todos los 14 E. faecium .1016 Hudson y cois, probaron el siste­ ma con cepas veterinarias de enterococos definidas por genoti­ po y observaron que las pruebas repetidas de las mismas cepas conducían a identificaciones diferentes .502 De hecho, 19 de las 50 cepas evaluadas fueron identificadas en diferentes momentos tanto como E. faecalis y como E. faecium. Cuando este sistema fue probado con 55 aislamientos que pertenecen a los géneros similares a Streptococcus (Alloiococcus otitidis, especies de Facklamia, D. pigrum y I. ruoffiae) que no se encuentran en la base de datos actual, el sistema produjo resultados “de identifi­ cación inaceptables” para 14 aislamientos e identificó errónea­ mente a los otros como especies de Micrococcus.594

RAPID ID 32 STREP®

Este sistema (BioMérieux) es un sistema de identificación en formato de tira de 32 pruebas para los estreptococos y bacterias similares a Streptococcus. Su base de datos es extensa e inclu­ ye los estreptococos agrupables, varias especies de Enterococcus y los estreptococos viridans (que incluyen las especies recién descritas como los estreptococos bucales del “grupo mutans”, S. oralis, S. gordonii y S. vestibularis). Se pre­ para una suspensión del microorganismo en agua estéril hasta una turbidez equivalente de un estándar de MacFarland de 4 y 55 |jL de la suspensión en cada una de las 32 cúpulas. Se incu­ ba la tirita a 35 a 37 °C durante 4 horas y se lee manualmente utilizando un libro de códigos o con el lector automático (ATB 1520 Reader conectado a un ordenador ATB 1545, BioMérieux; véase lámina en color 13-3G). En una evaluación del sistema Rapid ID 32 Strep con 433 cepas pertenecientes a los géneros Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Aerococcus, Gemella, Leuconostoc, Erysipelothrix, Gardnerella y Listeria, el 95,3% de las cepas fueron identificadas correctamente . 378 Se necesitaron pruebas adicionales para la identificación del 25,1% de las cepas. Sólo no se identificaron 16 cepas (3,7%) y sólo cuatro (1%) fueron mal identificadas. Otra evaluación de Kikuchi y cois, comunicó que el sistema ID32 Strep identificó el 87% de 156 cepas de estreptococos viridans y que la mayor parte de las identificaciones incorrec­ tas comprendió cepas de S. oralis, S. mitis y S. gordonii.566 Jensen y cois, evaluaron 122 cepas de estreptococos y enterococos en el sistema ID 32 Strep y observaron que, indepen­ dientemente de que las interpretaciones de las reacciones se obtuvieran por lectura automática o manual, el 75-77% de las cepas fueron identificadas correctamente, el 7% fueron mal identificadas y el 16-18% no fueron identificadas. Se identifi­ caron correctamente la mayoría de los enterococos y cocos piógenos y sólo dos tercios de los estreptococos viridans . 534 Cuando se evaluó con 55 cepas aisladas de microorganismos “similares a Streptococcus" no incluidos en la base de datos actual, el ID 32 Strep® determinó correctamente la falta de identificación para todos los aislamientos de 27 D. pigrum, 6 de 18 especies de Facklamia y 2 de 3 /. ruoffiae como “identi­ ficaciones inaceptables ” .594 Las identificaciones incorrectas más frecuentes de especies de Facklamia proporcionadas por el ID 32 fueron como distintas especies de Streptococcus y Gemella.

710

C A P ÍT U L O 13

Cocos grampositivos: Parte il: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus"

RAPID STR®

El sistema RapID STR® (Remel) utiliza una cubeta pequeña que contiene 10 celdas, 4 de las cuales son bifuncionales y con­ ducen a un total de 14 pruebas bioquímicas (utilizadas junto con la reacción hemolítica del microorganismo aislado). Las pruebas incluyen determinaciones fisiológicas (arginina dihi­ drolasa, hidrólisis de esculina), pruebas de utilización de hidra­ tos de carbono e hidrólisis de sustratos enzimáticos cromogé­ nicos (véase lámina en color 13-3H). El sistema es inoculado con una suspensión del microorganismo (estándar de turbidez de MaeFarland de 1) preparada en un líquido adquirido con el sistema y las pruebas se leen después de una incubación de 4 horas a 35 °C en una incubadora sin CO,. La base de datos de este sistema incluye los estreptococos p-hemolíticos grupos A, B y C/G, estreptococos del grupo D (S. bovis, variante de 5. bovis, S. equinus), el grupo de S. milleri (S. anginosus, S. cons­ tellatus, S. intermedius), especies de Enterococcus (E. faecalis, E. faecium, E. avium, E. cassiliflavus/mundtii, E. durans/hirae, E. gallinarum, E. raffinosus y E. malodoratus), especies de estreptococos viridans (S. mitis, S. mutans, S. salivarius/vestibularis, S. sanguinis/gordonii), S. pneumoniae, especies de Aerococcus, Gemella morbillorum, especies de Leuconostoc, especies de Lactococcus (L. lactis, grupo de L. mesenteroides) y especies de Pediococcus (P. acidilactici, P. pentosaceus). Los estreptococos viridans descritos recientemente, enterococos y bacterias similares a Streptococcus no están incluidos en la base de datos en este momento. En un estudio reciente de Shewmaker y cois, sobre caracterización fenotípica de 28 cepas de G. sanguinis, el RaplD STR identificó incorrectamente siete cepas: cinco como S. mutans, una como E. casseliflavus y una como E. malodoratus, mientras que las cepas restantes dieron perfiles inadecuados para la identificación . 884 En la actualidad, los géneros similares a Streptococcus recién descritos no for­ man parte de la base de datos RaplD Strep. LaClaire y Facklam evaluaron 27 cepas de D. pigrum en el RaplD Strep: sólo una proporcionó una identificación “ninguna elección”, dos produ­ jeron un “biocódigo cuestionable” y el resto fueron identifica­ das como “ID inadecuado, 90% E. faecalis”. Dos de las 18 especies de Facklamia y las tres cepas de I. ruojfiae evaluadas fueron identificadas correctam ente como “ninguna elec­ ción ” . 594 Las cepas de A. otitidis fueron mal identificados como G. morbillorum, A. viridans, S. mitis o S. acidominimus. TARJETA DE IDENTIFICACIÓN PARA GRAMPOSITIVOS VITEK (GPI)

La tarjeta GPI® (BioMérieux) es la misma utilizada para la identificación de estafilococos coagulasa negativos y algunos bacilos grampositivos facultativos no esporulados. La tarjeta consta de 30 celdas, 29 de las cuales contienen sustratos de identificación bioquímicos; la celda restante es un control negativo. La tarjeta proporciona identificaciones automáticas en 2 a 15 horas. La tarjeta ha sido modificada ligeramente desde su liberación inicial y se ha actualizado la base de datos, la cual incluye estreptococos (3-hemolíticos (grupos A, B. C y G), estreptococos del grupo D (S. bovis, variante de S. bovis y S. equinus), S. pneumoniae, siete especies de Enterococcus (E. faecalis, E. faecium, E. avium, E. durans, E. casseliflavus, E. gallinarum y E. hirae), algunas especies de estreptococos viridans (S. mitis, S. mutans, S. oralis, S. salivarius, S. sangui­ nis/gordonii y S. uberis), el grupo anginoso (S. anginosus, S. constellatus y S. intermedius), especies de Aerococcus y Gemella morbillorum. Como sucede con otros sistemas, las especies de estreptococos viridans descritas más recientemente no se han incluido todavía. La base de datos de la tarjeta GPI

incluye tam bién algunas especies de Staphylococcus, Corynebacterium, Arcanobacterium, Listeria y Erysipelothrix. No se ha evaluado recientemente la tarjeta modificada con la base de datos ampliada en cuanto a su capacidad para identifi­ car correctamente los estreptococos viridans. La tarjeta GPI puede identificar correctamente E. faecalis y E. faecium , pero no rinde tan bien para la identificación de otras especies de Enterococcus . 135

PANEL COMBINADO DE VALOR CRÍTICO PARA GRAMPOSITIVOS DE MICROSCAN

Los paneles de identificación M icroScan® (Dade MicroScan, West Sacramento, CA) proporcionan resultados simultáneos de identificación y sensibilidad a los antibióticos en un formato de microtítulo. Tritz y cois, evaluaron la capaci­ dad de este sistema para identificar enterococos y observaron que tanto E. faecalis como E. faecium eran identificados fia­ blemente, pero las especies de enterococos menos frecuentes eran mal identificadas .963 Iwen y cois, evaluaron el panel de identificación para grampositivos MicroScan Dried Overnight GramPositive Identification por su capacidad para identificar ocho especies diferentes de Enterococcus y observaron que el sistema identificaba el 98,5% de las cepas evaluadas; la resolu­ ción de las identificaciones de baja probabilidad con otras pruebas (es decir, motilidad y pigmentación) sólo fue necesaria para cepas de E. gallinarum/casseliflavus.514 American MicroScan (Sacramento, CA) y MicroMedia (San José, CA) comercializan otros sistemas de microtitulación para identificación de estreptococos pero aún no han sido evaluados.

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C A P ÍT U L O 13

Cocos grampositivos: Parte II: Estreptococos, enterococos y bacterias “similares a Streptococcus”

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Bacilos grampositivos aerobios y facultativos Especies de Listeria y Listeria monocytogenes Taxonomía del género Listeria Factores de virulencia de L. monocytogenes Epidemiología de L. monocytogenes Importancia clínica de L. monocytogenes Aislamiento de L. monocytogenes en muestras clínicas Identificación de especies de Listeria Sensibilidad a los antibióticos y tratamiento de las infecciones por Listeria Patogenicidad de otras especies de Listeria

Especies de Erysipelothrix:

Erysipelothrix rhusiopathiae y Erysipelothrix tonsiliarum Taxonomía del género Erysipelothrix Factores de virulencia de £ rhusiopathiae Importancia clínica de £ rhusiopathiae Aislamiento e identificación de £ rhusiopathiae Sensibilidad de £ rhusiopathiae a los antibióticos

Especies de Bacillus y géneros relacionados Taxonomía y disección taxonómica del género Bacillus Bacillus anthracis Epidemiología del carbunco

Factores de virulencia de B. anthracis Presentaciones clínicas del carbunco Tratamiento del carbunco Prevención del carbunco

Bacillus cereus Factores de virulencia de B. cereus Gastroenteritis por B. cereus

Infecciones oportunistas por especies de Bacillus Bacteriemia y endocarditis Infecciones en huéspedes inmunodeprimidos Infecciones oculares Infecciones musculoesqueléticas Infecciones hospitalarias

Seguridad en el laboratorio, recolección de muestras y procesamiento Aislamiento e identificación de espe­ cies de Bacillus. El “grupo Bacillus cereus” ( B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis y B. mycoides) Sensibilidad de las especies de Bacillus a los antibióticos

Especies de Corynebacterium Introducción y taxonomía Identificación de especies de Corynebacterium y bacterias corineformes Pruebas de sensibilidad a los antibióticos de las especies de Corynebacterium y bacterias corineformes Miembros del género Corynebacterium aislados en seres humanos

E s p e cie s de Listeria y Listeria monocytogenes . ; ! } -lebacterium amycolatum

Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium jeikeium Corynebacterium pseudodiphtheriticum Corynebacterium striatum Corynebacterium urealyticum

Especies de Corynebacterium asociadas con animales Especies de Corynebacterium aisladas en los alimentos y el medioambiente

Otras bacterias corineformes Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies

de Actinobaculum de Actinomyces aisladas en seres humanos de Actinomyces aisladas en animales de Arcanobacterium de Arthrobacter de Brevibacterium de Cellulomonas, Cellulosimicrobium y Oerskovia de Dermabacter

os bacilos grampositivos aerobios/facultativos inclu­ yen una amplia variedad de microorganismos que causan enfermedades “clásicas” como listeriosis, car­ bunco y difteria, y también de síndromes patológicos más nue­ vos, sobre todo en huéspedes inmunodeprimidos. También abarcan varios géneros recién reconocidos que son microorga­ nismos ambientales o veterinarios no asociados antes con per­ sonas o infecciones humanas. El uso de técnicas moleculares para la caracterización de muchas especies nuevas ha requeri­ do además una revisión de los patógenos clásicos. Por ejemplo, el reconocimiento de varias especies facultativas del género Actinomyces ha permitido reconocer la naturaleza facultativa de patógenos clásicos, como A. israelii, antes considerados microorganismos anaerobios estrictos. Estas técnicas nuevas han permitido la clasificación de bacterias sin nombre, como los grupos corineformes de los CDC (Centers for Disease Control and Prevention), en géneros nuevos o existentes, y han conducido a la disección taxonómica de los géneros conocidos para contener muchas especies no relacionadas (p. ej., el géne­ ro Bacillus). El esquema de clasificación presentado en la pró­ xima edición del M anual de Bacteriología Sistemática de Bergey refleja ahora relaciones genotípicas más que similitudes fenotípicas entre estos microorganismos. En el recuadro 14-1 se presenta la clasificación de los microorganismos que se explicarán en este capítulo.

L

Especies de Listeria / Listeria monocytogenes Taxonomía del género Listeria

El género Listeria consiste en bacterias con forma de bacilos regulares, grampositivas, no esporuladas, anaerobias facultati­

729

Especies de Exiguobacterium Especies de Leifsonia Especies de Microbacterium (Aureobacterium) Especies de Rothia y “similares a Rothia" (grupo 4 de los CDC) Especies de Turiceiia

Gardnerella vaginalis Taxonomía y morfología celular Factores de virulencia de G. vaginalis Importancia clínica de G. vaginalis Aislamiento e identificación Sensibilidad a los antibióticos

Especies de Lactobacillus Taxonomía y epidemiología Importancia clínica Aislamiento e identificación Sensibilidad a los antibióticos

vas (véase lámina en color 14-1 A). El género está definido por un contenido de DNA G + C del 36-38%, una pared celular típica de grampositivos con una capa de mureína de peptido­ glucanos que contiene ácido meso-diaminopimélico (mesoDAP) fijada a la membrana celular por ácido lipoteicoico y áci­ dos teicoicos polirribitol asociados con la m em brana . 272 Algunos estudios genéticos indican que los microorganismos Listeria muestran la relación filogenética más estrecha con el género Brochothñx (un microorganismo ambiental) y presen­ tan una relación más distante con microorganismos del género Bacillus, géneros esporulados relacionados y el género Lactobacillus, más que con los microorganismos de los géne­ ros Streptococcus, Enterococcus y Lactococcus.460,738 La rela­ ción entre las especies de Listeria y Brochothñx también es apoyada por datos quimiotaxonómicos . 176 Aunque algunos taxonomistas han recomendado la inclusión de especies de Listeria en la familia Lactobacillaceae, Collins 176 y otros investigadores creen que las especies de Listeria merecen la inclusión en una nueva familia. En la próxima edición del Manual de Bacterio­ logía Sistemática de Bergey, las especies de Listeria y Brochothrix se incluyen en la familia propuesta “Listeriaceae” en el orden Bacillales, clase “Bacilli" en el filo Firmicutes,329 El géne­ ro Erysipelothrix está incluido en el filo Firmicutes junto con especies de Listeria, pero se encuentra en una clase, un orden y una familia diferentes (recuadro 14-1). En el cuadro 14-1 se pre­ sentan las principales características que diferencian a Listeria, Erysipelothrix, Lactobacillus y Brochothrix entre sí. Durante muchos años, el género Listeria consistió en ocho especies -L . monocytogenes, L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L. murrayi, L. seeligeri, L. welshimeri y L. denitrificans ,787 Sobre la base de la secuenciación de rRNA 16S de L. denitrifi­ cans, este microorganismo ha sido excluido del género Listeria

730

C A P ÍT U L O 14

Recuadro 14-1

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

C lasificación de los bacilos gram positivos aerob io s/facultativos en el d o m in o B acterias329

Filo

Clase/subclase

Orden/suborden

Fam ilia

Géneros

Firmicutes

Molicutes "B acilos”

Incertae sedis Bacillales

“Eiysipelotrichaeeae ” Bacillaceae

Erysipelothrix Bacillus, Amphibacillus, Exiguobacterium, Gracilibacillus, Halobacillus, Salibacillus, Virgibacillus Listeria, Brochothrix Sporolactobacillus Paenibacillus, Aneurinibacillus, Brevibacillus, Thermobacillus Alicyclobacillus, Sulfobacillus Lactobacillus Actinomyces, Actinobaculum, Arcanobacterium, Mobiluncus Rhotia Brevibacterium Cellulomonas, CeUulosimicrobium, Oerskovia Dermabacter Sanguibacter Jonesia Microbacterium (Aureobacterium), Leifsonia Corynebacterium

“Listeriaceae " “Sporolactobacillaceae ” “ Paenibacillaceae ”

Actinobacterias

A ctinobacterias/ Actinobacteridae

"Lactobacillales” Actinomicetales/ Actinomycineae Actinomicetales/ Micrococcineae

“Alicyclobacillaceae ” Lactobacillaceae Actinomycetaceae Micrococcaceae Brevibacteriaceae Cellulomonadaceae Dermabacteriaceae Intrasporangiaceae Jonesiaceae Microbacteriaceae Corynebacteriaceae

Actinomicetales/ Corynebacterineae Bifidobacteriales

Bifidogacteriaceae “Afiliación desconocida”

y colocado en el género Jonesia como Jonesia denitrificans, que está ahora en su propia familia (Jonesiaceae) en el orden Actinomycetales, clase Actinobacteria, filo Actinobacteria (recuadro 14-1).329-703.740 A l g u n o s datos de secuenciación adi­ cionales sobre los otros miembros del género Listeria han iden­ tificado dos líneas de descendencia estrechamente relacionadas pero distintas: el “grupo L. monocytogenes” (que consiste en L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri y L. welshimeri) y el “grupo L. grayi/L. murrayi”. Desde entonces L. grayi y L. murrayi se han combinado en una especie única: L. g rayiP 9 Además, algunos estudios electroforéticos enzimáti­ cos multilocus de cepas de L. ivanovii sugirieron que esta espe­ cie también podía ser dividida en dos grupos genómicos .95 Con posterioridad, algunos estudios de homología de DNA mostra­ ron que estos dos grupos representaban dos subespecies: L. iva­ novii subespecie ivanovii y L. ivanovii subespecie londonien-

Cuadro 14-1

sis.94 Por lo tanto, el género Listeria incluye ahora seis especies L. monocytogenes, L. ivanovii subespecie ivanovii, L. ivanovii subespecie londoniensis, L. seeligeri, L. innocua, L. grayi y L. welshimeri. L. monocytogenes puede ser dividida en 13 seroti­ pos sobre la base de los antígenos somáticos (S) y flagelares (H). Entre los 13 serotipos (1 /2a, l/2b, l/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4c, 4d, 4e y 7), la mayor parte de las enfermedades se debe a los tipos 4 b,l/2a y l/2b .553 Factores de virulencia de L. monocytogenes

L. monocytogenes es un patógeno intracelular facultativo capaz de invadir y sobrevivir dentro de las células de los mamí­ feros, incluidos los macrófagos y varias líneas celulares de cul­ tivo tisular humano. Estos microorganismos tienen una proteí­ na de superficie de 80 kDa denominada in te rn a lin a .320 525 659 La

Características para la diferenciación de Listeria, Erysipelothrix, Lactobacillus y Brochotrix PRODUC­ CIÓN DE H,S MOTI- ÁCIDO A PARTIR EN KIA/TSI LIDAD DE GLUCOSA

RELACIÓN CON 0 2

CRECIMIENTO, 35 °C

CATALASA

+

+

.

+

-

+

+“ -

L a c to b a c illu s

Facultativa Facultativa Facultativa

+

-

-

_b

B rochothrix

Facultativa

-

+

-

-

GÉNERO L iste ria E r y sip e lo th rix

Gardnerella Turicella

a Todas las cepas móviles a 20-25 °C. Poco móviles o inmóviles a 35-37 °C. bMayoría de especies inmóviles, pero se han descrito algunas especies móviles. KIA: agar hierro de Kliger; +: reacción positiva; -: reacción negativa.

PEPTIDOGLUCANO DIAMINOÁCIDO

+

meso- D A P

+ +

L-lisina L-lisina, o meso-D A P o L-omitina

+

meso- D A P

MOL% G + C 36-38 36-40 34-53 35,6-36,1

E s p e cie s de Listeria y Listeria monocytogenes

mtemalina interactúa con un receptor de adhesión de la célula ñamado E-cadherina sobre las células epiteliales humanas y .onduce a la inducción de fagocitosis .602 Las cadherinas son glucoproteínas transmembrana de 110 kDa que están estructu­ ralmente relacionadas y son específicas de los tejidos. Algunos experimentos que utilizaron varias líneas celulares diferentes han establecido que la interacción intemalina/E-cadherina pro­ mueve tanto la fijación específica como la entrada de L. monocytogenes en las células epiteliales .602 La presencia de intemalina sola es suficiente para la entrada del microorganis­ mo en las células epiteliales si éstas tienen el receptor apropia­ do. Se describieron otras proteínas de superficie en la familia de las intemalinas (p. ej., inlB, inlC) y parecen mediar la inva­ sión de otros tipos celulares, como las células endoteliales y los hepatocitos . 231'321'659 Una vez secuestrados dentro de los fagosomas. los microorganismos producen listeriolisina O y varias fosfolipasas que les permiten escapar del fagosoma antes de la fusión lisosómica, evitando así la destrucción intracelular. La .isteriolisina O es codificada por el gen hly y es una hemolisi­ na formadora de poros similar a la estreptolisina O de los estreptococos del grupo A .689 Actúa al unirse al colesterol de la membrana y luego insertarse en la membrana diana, lo que conduce a la formación de los poros transmembrana. Los mutantes que carecen del gen hly son avirulentos e incapaces de escapar de la vacuola internalizada .689 Además, la expresión de este gen en las bacterias avirulentas (p. ej., B. subtilis) pro­ mueve el escape de estos microorganismos al citoplasma .690 Asimismo, los mutantes que carecen de fosfolipasa de amplio espectro (PlcB) y fosfolipasa específica de fosfatidilinositol i Pie A) muestran alrededor del 50% de la eficiencia en el esca­ pe de los fagosomas de los macrófagos como cepas de tipo silvestre .818 Una vez dentro del citosol, otra proteína de la superficie de la listeria, ActA, produce la polimerización intra­ celular de la actina .497 Esto conduce a la translocación de las bacterias hacia la superficie de la membrana de la célula diana para formar proyecciones similares a seudópodos que brotan y son ingeridas por los macrófagos y otras células, como hepatocitos y enterocitos. Tanto las fosfolipasas bacterianas como una enzima metaloproteasa adicional funcionan también facilitan­ do la propagación intercelular de las bacterias luego de la trans­ locación mediada por la actina hacia la superficie celular.694-818 Estos mecanismos le permiten al microorganismo moverse directamente de una célula a otra sin exposición a factores inmunitarios solubles, como anticuerpos y complemento. Epidemiología de L. monocytogenes

Aunque todas las especies de Listeria pueden ser aisladas en el medioambiente y en diversos animales como patógenos y como comensales, sólo L. monocytogenes es un patógeno ani­ mal y humano bien reconocido. Este microorganismo puede ser aislado en suelo, agua fresca, aguas residuales y vegetación y como parte de la flora fecal de una amplia variedad de ani­ males. 83 L. monocytogenes puede infectar numerosos animales domésticos, como roedores, conejos, ovejas y rumiantes, los cuales se infectan del medioambiente, donde el microorganis­ mo contamina la vegetación y el suelo. Las infecciones en estos animales son sepsis, romboencefalitis, prematuridad y abor­ to.' ' L. monocytogenes también es un contaminante frecuente de los productos alimenticios. Puede crecer en biopelículas sobre la superficie de distintos alimentos y en realidad la refri­ geración aumenta aún más su crecimiento debido a la capaci­ dad de los microorganismos para crecer a 4 °C. Dada su ubicui­ dad en los alimentos, es probable que los seres humanos tengan

731

contacto diario con estos microorganismos y, en consecuencia, algunas personas se convierten en sus portadores fecales . 587 El microorganismo es un componente transitorio de la flora intes­ tinal humana y puede ser excretado en las heces en un 1 - 1 0 % de las personas sanas .780 783 La listeriosis humana ocurre principal­ mente en los meses de primavera y verano, y hay casos esporá­ dicos (fuera de los brotes de transmisión alimentaria) en tasas anualizadas de menos de 1 caso por 1 0 0 0 0 0 habitantes, aunque la infección es más frecuente en los lactantes ( 1 0 casos / 1 0 0 0 0 0 habitantes) y los ancianos (1,4 casos/100 000 habitantes ) . 334 Aunque la infección asintomática es bastante rara, siempre se debe sospechar en el caso de huéspedes inmunodeprimidos. Importancia clínica de L. monocytogenes

L. monocytogenes se asocia con diversos síndromes clínicos .553-599-600-621-669 El resultado más frecuente de la adquisición del microorganismo casi siempre como consecuencia de la ingestión de alimentos contaminados, es la aparición de un estado de portación gastrointestinal en individuos asintomáticos. Durante este estado el microorganismo puede ser excretado en las heces. La infección sintomática aguda ocurre a m enu­ do durante el embarazo, habitualmente durante la última mitad de la gestación (segundo o tercer trimestre) y la enfermedad se presenta con síntomas similares a la gripe, con fiebre, odinofa­ gia, mialgias, malestar general, dolor en hipogastrio y dorsalgia .856 En ocasiones, se observa secreción vaginal, diarrea y síntomas urinarios. Se puede presentar leucocitosis periférica y los hemocultivos recogidos durante la fase aguda de esta enfermedad transitoria pueden ser positivos. Durante la infec­ ción materna, puede ocurrir bacteriemia oculta y la transmisión transplacentaria del microorganismo, que conducen a la infec­ ción intrauterina del feto . 856 La infección in útero puede indu­ cir trabajo de parto y el nacimiento prematuro de un feto infec­ tado o mortinato. En general, los síntomas en la madre ceden luego del parto y el alumbramiento. La supervivencia fetal está determinada en parte por la duración de la gestación: el aborto espontáneo ocurre cuando ésta se adquiere al comienzo del embarazo y se presenta una infección neonatal cuando la infec­ ción se adquiere más tarde .281564 La enfermedad en los neonatos puede ser categorizada como de “inicio temprano” o de “inicio tardío”. En general, los recién nacidos infectados in útero presentan sepsis aguda, tienen una enfermedad diseminada y se observan lesiones cutáneas pustu­ losas y granulomas que contienen L. monocytogenes en el encéfalo, el hígado, los riñones, el pulmón y el bazo (enferme­ dad de inicio temprano). Los tejidos placentarios suelen mos­ trar pruebas de corioamnionitis aguda. La mortalidad de la lis­ teriosis de inicio agudo es alta, pero las infecciones neonatales mortales son más frecuentes en los niños inmunodeprimidos .588 La listeriosis en los lactantes también puede presentarse como infecciones de inicio tardío, en las cuales el neonato se infecta a través de la portación gastrointestinal materna del microorga­ nismo. El lactante es expuesto a los microorganismos durante el parto vaginal a través del canal de parto; la deglución o la aspiración de los microorganismos en este medio es el modo probable de adquisición del microorganismo y de la infección. Los lactantes con este cuadro tienen más de 3 a 5 días de vida, y la enfermedad aparece 7 a 14 días después del nacimient 0 553,599 g n genej-a^ [a listeriosis de inicio tardío se presenta como una meningitis neonatal, con signos y síntomas de fiebre, irritabilidad y fontanelas hipertensas. En estos recién nacidos, la tinción de Gram del líquido cefalorraquídeo (LCR) muestra leucocitos polimorfonucleares junto con hiperproteinorraquia e

732

C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

hipoglucorraquia; se observan los bacilos grampositivos de L. monocytogenes en más del 50% de los casos. En los casos de enfermedad de inicio tardío, el embarazo casi siempre transcu­ rre sin complicaciones, signos de infección (p. ej., fiebre) ni sepsis (p. ej., hemocultivos positivos). Las personas adultas también pueden infectarse con L. mo­ nocytogenes; estos pacientes presentan sepsis aguda, meningi­ tis subaguda, meningoencefalitis o romboencefalitis . 600 Los adultos que sufren una sepsis aguda por listeria suelen tener procesos malignos subyacentes o están inmunodeprimidos (p. ej., linfoma, trasplante de órganos, diabetes, enfermedad hepá­ tica/renal crónica, colagenopatías). En general, se observan hemocultivos positivos y un cuadro clínico similar a la sepsis asociada con la baeteriemia por gramnegativos. En algunos pacientes, los microorganismos atraviesan la barrera hematoencefálica e infectan las meninges y el encéfalo .857 La menin­ gitis subaguda se desarrolla en varios días y se caracteriza por fiebre de bajo grado, cefaleas y rigidez de la nuca. En la pre­ sentación subaguda, los recuentos de células en LCR suelen ser más bajos y los microorganismos a menudo no se observan en las tinciones de Gram del LCR. La meningoencefalitis causada por L. monocytogenes se asocia con varias características sin­ gulares. La rigidez de nuca es menos frecuente y se observa en el 80-85% de los adultos. Los trastornos motores, como ataxia, temblores, parálisis de nervios craneales y actividad comicial, son más frecuentes con la infección por listeria que por otros agentes etiológicos de meningoencefalitis . 35-790 Otra caracte­ rística clínica de estos pacientes es la fluctuación del estado mental. En algunos casos, la infección del sistema nervioso central por listerias puede progresar y afectar el tronco ence­ fálico (rombencefalitis), y los estudios por imágenes por lo general muestran microabscesos en el diencéfalo y en el cere­ belo . 790 Los abscesos encefálicos, tanto únicos como múltiples, pue­ den producirse como complicación de la meningoencefalitis por listerias . 210920 El diagnóstico de meningoencefalitis y de romboencefalitis se establece por el cultivo de las muestras de LCR y sangre. Las infecciones focales causadas por L. monocytogenes abarcan infecciones cutáneas, abscesos, artritis, peritonitis (que incluye peritonitis bacteriana espontánea), abscesos hepáticos y esplénicos, colecistitis, endoftalmitis, infecciones de articula­ ciones protésicas y de injertos vasculares, osteomielitis, mio­ carditis y endocarditis . I08-149-217'241'332’351’452-453-472-544-812-837-844-915 La mayoría de estas complicaciones se asocian con la diseminación hematógena y suelen ocurrir en huéspedes inmunodeprimidos. Se han comunicado casos en pacientes inmunodeprimidos debi­ do a enfermedades agudas o crónicas de fondo caracterizadas por inmunodeficiencia celular o humoral (p. ej., neoplasias, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, trasplante de órganos, colitis ulcerosa, diabetes, nefropatía, cirrosis alcohóli­ ca e infección por HIV) y en los que son tratados con agentes quimioterápicos citotóxicos o esferoides por sus trastornos sub­ yacentes . 24’73’147'343'393'540'551,594 Se observaron infecciones cutáne­ as en individuos antes sanos que tuvieron contacto directo con animales infectados o tejidos animales (tejidos placentarios, líquido amniótico). Estas infecciones ocurren en veterinarios, individuos con ocupaciones asociadas con animales y, en oca­ siones, en el personal de laboratorio. Las infecciones cutáneas se caracterizan por lesiones papulares o pustulosas y han ocu­ rrido infecciones diseminadas luego de la inoculación cutánea primaria . 125-819 La endocarditis por L. monocytogenes es resul­ tado de la baeteriemia y suele afectar las válvulas aórtica o mitral nativas dañadas o las válvulas protésicas. Es frecuente la

embolización séptica y la formación ulterior de abscesos en sitios distantes. Se observan abscesos hepáticos y esplénicos, hepatitis, granulomas hepáticos y peritonitis espontánea cau­ sados por L. monocytogenes diseminada en pacientes con trasplantes, en diabéticos y en aquellos con cirrosis u otras hepatopatías . 102 Se han documentado infecciones de líquido pleural por L. monocytogenes en pacientes con cáncer, en los cuales la infección pleural ocurrió por siembra hematógena de derrames pleurales malignos más que en forma secundaria a un proceso paraneum ónico . 591 L. monocytogenes también puede causar infecciones en pacientes que se encuentran en diálisis peritoneal ambulatoria continua y en aquellos que tie­ nen derivaciones ventriculoperitoneales .228'558 812956 Algunos estudios mostraron que los individuos con infección por HIV tienen un riesgo 500 a 1 000 veces mayor de sufrir una infec­ ción por HIV que la población general 470 En los casos típicos, las infecciones por listerias en individuos infectados por HIV se presentan como meningitis o como baeteriemia sin una fuen­ te identificable .73'209'252-475 L. monocytogenes está presente como contaminante en muchos tipos de productos alimenticios, como leche y verduras crudas, peces, aves de corral y carnes frescas y procesa­ das .683-775-781 En los alimentos contaminados, los recuentos de colonias del microorganismo pueden exceder 1 0 9 unidades formadoras de colonias (UFC)/g de alimento. En los últimos años, se han reconocido con frecuencia creciente brotes de gastroen­ teritis febril por alim entos debidos a L. monocytogenes .44' 120' 141-142-198,724'759 En las vacas lecheras puede producir encefalitis, meningitis, septicemia y mastitis. La siembra del microorganismo desde la ubre o la contaminación del medioambiente puede conducir a su presencia en la leche cruda . 198 Algunas encuestas han indicado que L. monocytogenes puede estar presente en alrededor del 4% de las muestras de leche cruda examinadas en los Estados Unidos .781 El microorganismo ha sido aislado en leche y quesos no pasteurizados preparados con productos lácteos también sin pasteurizar. El rastreo de otro brote logró que se estableciera que la contaminación pro­ venía de repollos y ensaladas de repollos, zanahorias, cebolla y mayonesa contaminados .775 En estos casos, el repollo creció en suelo contaminado con excrementos de ovejas infectadas. En 1985, un brote grande en el condado de Los Angeles, California, afectó a más de 181 personas, incluidos 93 casos perinatales, y condujo a una tasa de mortalidad del 33 % . 141 El alimento implicado fue un queso blando de estilo mexicano que había sido preparado con leche no pasteurizada. También se ha implicado en algunos brotes el helado contaminado; las carnes crudas y los productos procesados preparados con car­ nes y pescado pueden también alojar a los microorganismos . 142 En 1994, ocurrió un brote transmitido por alimentos en 10 de 36 personas (incluidas dos mujeres embarazadas) que asistie­ ron a una fiesta en la ciudad de Nueva York .724 En este brote, los camarones fueron los alimentos contaminados. La investi­ gación de otro brote entre 45 concurrentes de un picnic en Illinois indicó que la leche de chocolate estaba contamina­ da . 198774 Como corolario del reconocimiento de los brotes de transmisión alimentaria de listeriosis, se describió un síndrome de gastroenteritis febril causado por L. monocytogenes. Este síndrome incluye diarrea no sanguinolenta, náuseas y vómitos acompañados por fiebre, fatiga, escalofríos y mialgias .724'759'774 El análisis serológico retrospectivo de pacientes con gastroen­ teritis febril ha podido demostrar respuestas inmunitarias a la listeriolisina, un presunto factor de virulencia de L. monocyto­ genes. 198 La gastroenteritis febril suele ser autolimitada, pero puede ocurrir enfermedad invasora en pacientes inmunodepri-

E s p e c ie s de Listeria y Listeria monocytogenes

midos y en aquellos con otras infecciones gastrointestinales racterianas o virales subyacentes .552 Junto con el reconocimiento y la documentación de brotes de ’.ransmisión alimentaria debidos a L. monocytogenes, los CDC han establecido pautas para su prevención . 143 Las pautas, que se aplican a todos los individuos, son cocinar con cuidado los ali­ mentos crudos de origen animal; lavar en forma minuciosa las verduras crudas antes de comerlas; mantener las carnes crudas reparadas de las verduras, los alimentos cocidos y los “alimen­ tos listos para comer" y evitar el consumo de leche cruda (no pasteurizada) o de alimentos elaborados con ella. Se deben lavar con cuidado las manos, los cuchillos y las planchas para cortar después de la manipulación de alimentos crudos. En las personas con alto riesgo de listeriosis (personas inmunodeprimidas. embarazadas, ancianos), se deben evitar los quesos blan­ dos (p. ej., queso de estilo mexicano, queso fresco, queso cremoso, Camembert y Roquefort), aunque no hay ninguna necesidad de evitar los quesos duros (p. ej., queso gruyer, queso Colby), el queso crema, el requesón o el yogur .339 Los alimentos sobrantes o “listos para comer” (p. ej., “perritos ca­ lientes”) deben ser recalentados con vapor hasta que estén calientes antes de ingerirlos. Los alimentos "del mostrador de chacinería” (p. ej., fiambres, salames) deben evitarse o calen­ tarse con cuidado. A mediados de la década de 1990, la indus­ tria alimentaria introdujo una iniciativa denominada Análisis de riesgos en puntos de control críticos (Hazard Analysis at Critical Control Points, HACCP) para mejorar la vigilancia y el control de L. monocytogenes y otros patógenos transmitidos por alimentos en el medioambiente de la planta procesadora de alimentos. La Food and Drug Administration (FDA) ha exigi­ do un enfoque de “cero tolerancia” para el control de la liste­ riosis, con incrementos tanto en la cantidad de inspecciones en los centros de procesamiento de alimentos como el retiro del mercado de los alimentos sospechosos de albergar pató­ genos . 873 También se han documentado infecciones intrahospitalarias por listerias. En junio de 1989, ocurrió un brote de listeriosis hospitalaria en Costa Rica en recién nacidos de 4 a 8 días de vida luego del parto de un lactante con infección por listeria de inicio temprano .782 La investigación de posibles fuentes del microorganismo para los nueve casos mostró que todos los lac­ tantes habían sido bañados con vaselina de un recipiente de múltiples dosis. Se aisló una cepa de L. monocytogenes que era idéntica a la de los lactantes mediante electroforesis enzimáti­ ca multilocus del frasco de vaselina mediante enriquecimiento en frío. El rastreo de otro brote de listeriosis hospitalaria en recién nacidos detectó como frente de infección el uso fre­ cuente de un termómetro rectal limpiado en forma incorrec­ ta .674 También han ocurrido casos agrupados de infecciones hospitalarias por L. monocytogenes en adultos inmunosuprimidos en varios hospitales. Muchas veces no pudo determinarse la fuente de microorganismos de estos brotes. Aislamiento de L. monocytogenes en muestras clínicas

L. monocytogenes puede ser aislado en sangre, LCR, mues­ tras genitales, líquido amniótico y muestras de biopsia de teji­ dos maternofetales. La inoculación directa tanto en medios de agar como en caldo con una incubación durante toda la noche suele dar como resultado el desarrollo del microorganismo. En las tinciones de Gram de muestras clínicas y de hemocultivos, el microorganismo puede aparecer como bacilos grampositivos comunes o como cocobacilos pletóricos y cortos. Si se presen­ tan células polimorfonucleares o mononucleares, los microor­

733

ganismos se encuentran tanto en forma intracelular como extracelular. Debido a las variaciones en la morfología de la colora­ ción de Gram que se observan con este microorganismo, los morfotipos de L. monocytogenes pueden ser confundidos con difteroides o con ciertos estreptococos, sobre todo S. pneumo­ niae, enterococos y algunos estreptococos viridans. Los métodos para el aislamiento de L. monocytogenes en los alimentos difieren significativamente de los utilizados para el de muestras clínicas humanas. Estos métodos comprenden el en­ riquecimiento en caldo y el subcultivo en distintos tipos de medios selectivos, entre ellos Chromogar (París, Francia). El reconocimiento de L. monocytogenes se logra por la presencia de sustancias químicas en los medios que producen colonias coloreadas. Estos métodos se mencionan en publicaciones del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y del Ser­ vicio de Inspección de Alimentos de Holanda .401,914 Identificación de especies de Listeria

L. monocytogenes crece bien en agar sangre de camero (SBA) y produce colonias blanco grisáceas que se asemejan estrecha­ mente a las de los estreptococos P-hemolíticos del grupo B. Después de 18-24 horas de incubación, las colonias pueden mostrar una zona estrecha de P-hemólisis que no se extiende mucho más allá del borde de la colonia (véase lámina en color 14-IB y C). Antes de ese momento, la P-hemólisis sólo se puede observar directamente debajo de la colonia luego de eli­ minar el crecimiento de ésta de la superficie de agar con un hisopo. En la incubación más prolongada o en zonas de la placa que han sido inoculadas con cortes, la p-hemólisis del micro­ organismo se tom a más obvia. Entre las otras especies, las subespecies de L. ivanovii producen zonas anchas o incluso múltiples zonas de p-hemólisis en medios que contienen san­ gre o sangre de caballo, mientras que L. seeligeri produce zonas hemolíticas que son más estrechas que las de L. monocy­ togenes. Fujisawa y Morí evaluaron varios medios basales y sangre de diferentes especies animales para la detección de P-hemólisis producida por L. monocytogenes y observaron que la base de agar sangre n° 2 (Oxoide, Basingstoke, Inglaterra) con suplemento de sangre desfibrinada de caballo al 5% proporcio­ naba la detección más definida de la actividad de hemolisina . 287 Debido a la semejanza de las colonias de L. monocytogenes con las de los enterococos y los estreptococos P-hemolíticos del grupo B, no se recomienda la utilización de procedimientos abreviados de identificación en el laboratorio. Siempre se de­ ben realizar tinciones de Gram y pruebas de catalasa. L. monocytogenes es un bacilo grampositivo catalasa positi­ vo, facultativo (cuadro 14-2). El microorganismo es móvil y muestra unos movimientos “tambaleantes” sobre todo en frotis de “gota gruesa” preparados con cultivos de caldo después de la incubación durante una noche a 25 °C. Esta mayor motilidad luego de la incubación a temperatura ambiente también es evi­ dente en un medio semisólido para motilidad, donde el micro­ organismo muestra un "paraguas” característico de motilidad cerca de la superficie del medio que contiene agar al 0 ,2 -0 ,4% después de la incubación a 25 °C (véase lámina en color 141E) . 17 El microorganismo también crece en presencia de bilis al 40% e hidroliza la esculina; por lo tanto, se pueden usar medios de agar inclinado (pico de flauta) con bilis esculina, como los que se utilizan para el diagnóstico presuntivo de estreptococos del grupo D (Streptococcus bovis) y enterococos para demos­ trar hidrólisis de esculina. El microorganismo es fermentativo, produce ácido a partir de glucosa y produce acetoína, lo que conduce a una reacción de Voges-Proskauer positiva. Todas las

734 CAPÍTULO 14

Características fenotípicas para la identificación de especies de L isteria PRODUCCIÓN DE ÁCIDO A PARTIR DE:

ESPECIES

H E M O L IS IS , SBA

PRUEBA DE CAMP,

REDUCCIÓN HIDRÓLISIS DE NO, DE HIPURATO S. AUREUS

PRUEBA DE CAMP, R. EQUI

Manitol

a-metilD-manósido

,Y-acetil-p-

Almidón

L-ramnosa

D-xilosa

Ribosa

»-manosamina

soluble

L. monocytogenes

p

-

+

+

V

-

+

+

-

-

ND

-

L. ivanovii su b esp ecie ivanovii

p“

-

+

-

+

-

-

-

+

+

V

-

L. ivanovii su b esp ecie londoniensis

p"

-

+

-

+

-

-

-

+

-

+

-

+

-

-

-

+

V

-

-

ND

-

V

L. innocua

Ninguna

-

L. gray i

Ninguna

V

-

-

-

+

+

-

V

ND

+

P

ND

ND

+

-

-

-

-

+

-

ND

ND

Ninguna

ND

ND

-

-

-

+

V

+

-

ND

ND

L. seeligeri L. welshimeri

aZonas amplias o múltiples de ¡i-hemolisis. +, reacción positiva; reacción negativa; V, reacción variable; ND, datos no disponibles.

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

Cuadro 14-2

E s p e c ie s d e Listeria y Listeria monocytogenes

.e ra s de L. monocytogenes fermentan el a-metil-D-manósido y no fermentan la D-xilosa. La reacción P-hemolítica, la prueba de catalasa positiva, la falta de producción de H 2S en agar tri­ ple azúcar hierro (TSI), la motilidad a temperatura ambiente y la hidrólisis de esculina diferencian L. monocytogenes de Erisipelothrix rhusiopathiae. Este microorganismo se diferen­ cia de todas las especies de Corynebacterium por la motilidad. Leisfonia aquatica, el ex “Corynebacterium aquaticum”, tam­ bién es un bacilo grampositivo, catalasa positivo y móvil, pero este microorganismo es no hemolítico, crece como colonias con pigmentación amarilla y muestra una reacción de VogesProskauer negativa (véase la sección sobre especies de Leifsonia). Aunque las características de L. monocytogenes suelen ser uniformes y poco ambiguas, se han aislado cepas aberrantes que carecen en actividad de catalasa en pacientes con sepsis y meningitis por listeria típicas . 119-242-857 En el cuadro 14-2 se pre­ sentan las características bioquímicas para la identificación de las especies de Listeria. La prueba de CAMP también se ha utilizado para identificar L. monocytogenes . 117 Con las especies de Listeria, la prueba CAMP se realiza con una cepa de S. aureus productora de P-lisina y con una cepa de Rhodococcus equi. Se observa hemolisis sinérgica entre S. aureus y cepas presuntas de L. monocytogenes y L. seeligeri, mientras que se observa hemoli­ sis aumentada entre R. equi y cepas presuntas de L. ivanovii. Con L. monocytogenes, está indicada una prueba de CAMP positiva con S. aureus por una mayor hemolisis en la región que se encuentra entre las dos estrías de crecimiento que están en ángulo recto entre sí y no se intersecan, mientras que la observada entre R. equi y L. ivanovii aparece como un área de hemolisis aumentada con forma de pala. Puede ser difícil inter­ pretar esta prueba, ya que algunos investigadores han comuni­ cado reacciones hemolíticas sinérgicas entre L. monocytogenes y R. equi.11 También existen sistemas comerciales para la identificación de especies de Listeria. Los sistemas API Coryne® (BioMé­ rieux. Marcy l'Etoile, Francia) y RaplD CB-Plus® (Remel, Lenexa, KS) contienen especies de Listeria en sus bases de datos y al menos identifican en forma confiable el género de estos microorganismos. En una evaluación de este sistema para la identificación de especies de Listeria, el API Coryne identificó las 72 cepas de L. monocytogenes que fueron evaluadas como L. monocytogenes/innocua y la identificación de la especie fue dependiente de la presencia de P-hemólisis y de una reacción de CAMP positiva (véase lámina en color 14-1F).485 Otros investigadores han comunicado resultados similares tanto para API Coryne como para RaplD CB-Plus .283-305-310-333-438,833 API Listeria (BioMérieux) y Micro-ID Listeria (Remel, Lenexa, KS) están diseñados específicamente para la identificación de especies de Listeria. El primero es un sistema de sustratos enzimáticos cromogénicos de 1 0 pruebas que identifica de modo fiable varias especies en el género, entre ellas L. monocytoge­ nes, dentro de las 24 horas .84’287,671 Este panel incluye una prue­ ba para glicil arilamidasa (prueba DIM) que diferencia L. monocytogenes (prueba DIM negativa) de L. innocua (prueba DIM positiva) sin necesidad de evaluar la actividad hemolítica en SBA. También se pueden utilizar las pruebas autónomas para la detección de alanil arilamidasa que utilizan D ,L-alaninaP-naftilamida o D ,L -a la n in a -p -n itro a n ilid a para id e n tific a r especies de Listeria.160 L. monocytogenes no hidroliza estos compuestos debido a la ausencia de arilamidasas específicas, mientras que todas las otras especies, que incluyen L. innocua, son alanil o glicil a rila m id a sa positivas. Esta prueba es muy útil para identificar cepas de L. monocytogenes que son poco

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hemolíticas o no hemolíticas. El Micro-ID Listeria de 15 prue­ bas también identifica correctamente a estos microorganismos, pero al igual que API Coryne, requiere una evaluación de hemolisis para la diferenciación de L. monocytogenes y L. innocua.54 También se han utilizado ciertos sustratos en el panel de asimilación de hidratos de carbono API 50CH (BioMérieux) para la identificación de especies de Listeria ,486 Se han desarrollado además métodos moleculares para la identificación de especies de Listeria. También existe un ensa­ yo con sonda quimioluminiscente de DNA altamente sensible y específico -AccuProbe® Listeria (Gen-Probe, San Diego, CA) y un ensayo con sonda espectrofotométrica de DNA -G eneTrak Listeria® (GeneTrak Systems, Framingham M A )para la identificación rápida de L. monocytogenes de colonias que crecen en medios de aislamiento primario . 638651 La última prueba se creó y utilizó fundamentalmente para la detección de L. monocytogenes en los alimentos. Volohov y cois., en la Food and Drug Administration, idearon un ensayo de micromatrices moleculares para la identificación de las seis especies de Listeria.924 Este ensayo involucraba la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple de seis genes diana y la hibridación de sondas de DNA monocatenario marcadas con fluorescencia específicas para cada una de las seis especies. Se han utilizado varios métodos para la caracterización molecular de las cepas de L. monocytogenes del medioambien­ te y tanto de infecciones humanas como animales. Los méto­ dos electroforéticos enzimáticos multilocus han sido útiles en los estudios taxonómicos de listerias, pero no son suficiente­ mente discriminatorios para fines epidem iológicos . 93-95-358 La ribotipificación, la determinación de huellas dactilares del DNA (ftngerprinting) sobre base de PCR, el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción, la electroforesis en gel de campo pulsado y PCR con cebado aleatorio han sido muy útiles para la identificación de especies de Listeria, en inves­ tigaciones de brotes de listeriosis por transm isión alim enta­ ria, en la diferenciación entre la recaída y la reinfección, y en la determinación de la diferencia de cepas entre las cepas ambientales y aquellas provenientes de animales con listerio­ sis . 195-338-518-534-554-640-655-901-909 Se han utilizado métodos similares para la vigilancia de Listeria en mataderos y para la caracteri­ zación de cepas aisladas en distintos productos alimenti­ cios . 342-692 La electroforesis en gel de campo pulsado parece ser el método más sólido de subtipificación de algunos serotipos de listerias como los serotipos 4b, que no son subtipificados fiablemente mediante otros métodos moleculares, como la ribotipificación y el polimorfismo de longitud de los fragmen­ tos de restricción. El sistem a autom ático RiboPrinter® (Qualicon, Wilmington, DE) facilita el rápido reconocimiento ( 8 horas) de cepas relacionadas y puede ser útil como primer paso para caracterizar cepas aisladas durante los brotes, utili­ zándose otros métodos (electroforesis en gel de campo pulsa­ do) para una mayor caracterización. Cai y cois, describieron un método de tipificación que involucraba la secuenciación multi­ locus de genes específicos (genes de mantenimiento -housekeeping genes-, genes asociados con la virulencia) y regiones espaciadoras intergénicas de los que se observó que son reproducibles y altamente discriminatorios para diferenciar las cepas de L. monocytogenes humanas, animales y transmitidas por ali­ mentos . 124 La serotipificación, método clásico de caracteriza­ ción de especies, no ha sido muy útil, dado que sólo una peque­ ña cantidad de serotipos (específicamente los serotipos l/ 2 a, l/2b y 4b) ha sido vinculada con brotes y con la aparición de enfermedad. Más aún, algunos antígenos de L. monocytogenes

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C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

utilizados en el esquema de tipificación son compartidos con L. innocua, L. seeligeri y L. welshimeri. También existen grupos de bacteriófagos para la tipificación de fagos de L. monocyto­ genes utilizados por muchas plantas procesadoras de alimentos en Europa. La tipificación de fagos no es muy eficiente porque algunas cepas son no tipificables con los conjuntos de fagos existentes. Algunos estudios han mostrado que las cepas del mismo serotipo provenientes de diferentes áreas geográficas pueden no ser igualmente sensibles a la lisis por el mismo con­ junto de bacteriófagos . 128 Sensibilidad a los antibióticos y tratamiento de las infecciones por Listeria

Excepto en el caso de las mujeres que dan a luz a lactantes con enfermedad de inicio temprano, la infección por L. monocytogenes suele ser mortal si no se trata. L. monocytoge­ nes es en general sensible a penicilina, ampicilina, aminoglu­ cósidos, eritromicina, tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol e imipenem .582 Las cefalosporinas (de primera, segunda y ter­ cera generación) y las fluoroquinolonas no son activas contra L. monocytogenes 2>4A2> La ampicilina con un aminoglucósido (p. ej., gentamina) o sin él se considera el tratamiento de elec­ ción para las infecciones sistémicas .421,463'553 En los pacientes alérgicos a la penicilina, se cree que trimetoprim-sulfametoxazol con rifampicina o sin ella es la mejor alternativa .603-835-955 En un estudio retrospectivo también se observó que amoxicilina con trimetoprim-sulfametoxazol era un régimen terapéutico eficaz .603 Los pacientes deben ser tratados por lo menos duran­ te 3 semanas, según su estado inmunitario. Los que tienen una enfermedad avanzada por HIV pueden requerir tratamiento durante toda la vida para evitar las recaídas. Es interesante señalar que el uso de trimetoprim-sulfametoxazol como agente profiláctico para las infecciones por Pneumocystis jiroveci en pacientes HIV positivos puede ser parcialmente responsable de proteger a estos individuos de las infecciones por Listeria, aun­ que las pautas alimentarias ampliamente aceptadas también pueden tener cierta repercusión sobre la incidencia de enfer­ medad en esta población .252 La vancomicina es un agente tera­ péutico apropiado contra la baeteriemia primaria por L. monocytogenes, pero no atraviesa bien la barrera hematoencefálica como para ser útil en el tratamiento de la meningitis. Nunca se ha comunicado una resistencia natural alta a la van­ comicina entre las listerias, pero se han transferido genes vanA que codifican la resistencia a la vancomicina en Enterococcus faecium a L. monocytogenes y otras cuatro especies de Listeria en laboratorios de investigación . 82 Para evaluar la sensibilidad a los antibióticos de las especies de Listeria, el Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) de los Estados Unidos recomienda utilizar un método de microdilución en caldo de Mueller-Hinton con suplemento de cationes y sangre de caba­ llo lisada al 2-5% sólo para las pruebas con penicilina y ampi­ cilina .626 Patogenicidad de otras especies de Listeria

En modelos de cultivo de ratón y tisulares, sólo L. monocyto­ genes y L. ivanovii muestran propiedades patógenas, mientras que las otras especies del género se consideran no patógenas .420 Gouin y cois, observaron que el conjunto de genes asociados con la virulencia de L. monocytogenes también se encuentra en L. ivanovii y L. seeligeri.153 Aunque tanto L. monocytogenes como L. ivanovii pueden invadir las células de mamíferos en cultivo tisular y propagarse de una célula a otra, la última espe­

cie carece de la citotoxina asociada con L. monocytogenes, lo que sugiere que la falta de citotoxina puede explicar la menor virulencia de L. ivanovii,481 Esta última es una causa contagio­ sa de aborto tanto en ovejas como en ganado bovino . 15-788 Cummins y cois, aislaron L. ivanovii en hemocultivos de un paciente con SIDA complicado con un linfoma no Hodgkin . 193 Lessing y cois, también lo aislaron en un hemocuitivo de un alcóholico de 26 años consumidor de drogas intravenosas . 533 En 2003, L. innocua fue comunicado por primera vez como causa de baeteriemia mortal en un paciente de 62 años no inmunodeprimido con colangitis y shock séptico .678 El micro­ organismo fue identificado mediante métodos convencionales y confirmado por API Listeria y secuenciación de rDNA 16S.

Especies de Erysipelothrix; Erysipelothrix rhusiopathiae y Erysipelothrix tonsillarum Taxonomía del género Erysipelothrix

En la edición de 1984 del M anual de Bergey, se incluye el género Erysipelothrix con los bacilos grampositivos, no espo­ rulados habituales de condición familiar incierta .459 Algunos estudios de secuenciación de rRNA 16S indican que este géne­ ro está estrechamente relacionado con el micoplasma, mientras que el análisis de la pared celular sugiere una afiliación con los clostridios y los actinomicetos. En la siguiente edición del Manual de Bergey, el género Erysipelothrix es clasificado en el nuevo filo Firmicutes en la clase Molicutos (recuadro 14-1). Dentro de esta clase, los órdenes I a IV incluyen a los micoplasmas y microorganismos relacionados, mientras que el orden V (incertae sedis) incluye los géneros Erysipelothrix y Holdemania en la familia propuesta “Erysipelotrichaceae ” .329 Desde el punto de vista serológico. las cepas de Erysipelothrix pueden ser subidividas en serotipos, y el más recientemente des­ crito es el serotipo 26. Existen también algunas cepas, denomi­ nadas “cepas N”. que no producen ningún anticuerpo precipi­ tante contra extractos termoestables homólogos o heterólogos en conejos. Los estudios de hibridación de DNA-DNA realiza­ dos con estos distintos serotipos indican que el género Erysipelothrix contiene dos especies: E. rhusiopathiae (com­ puesta por los serotipos la. Ib, 2a, 2b, 4-6, 8 , 9, 11, 12, 15-17, 19, 21 y tipo N) y E. tonsillarum (compuesta por los serotipos 3, 7, 10, 14, 20, 22 y 23):864,870 Las cepas que representan el pri­ mer grupo de serotipos mostraron una hibridación mayor del 73% con la cepa tipo de E. rhusiopathiae, pero una hibridación inferior al 24% con la cepa tipo de E. tonsillarum ,861 Por el con­ trario. las cepas pertenecientes al segundo grupo de serotipos mostraron una hibridación mayor del 6 6 % con la cepa tipo E. tonsillarum y menor del 27% con la cepa tipo E. rhusiopat­ hiae ,861 Estos datos genéticos también han sido apoyados por exámenes de patrones proteicos de células enteras en SDSPAGE . 152870 Las cepas de E. tonsillarum son fenotípicamente idénticas a E. rhusiopathiae, salvo en que la primera especie puede fermentar sacarosa (cuadro 14-3). Algunos estudios de genes rRNA 16S de E. rhusiopathiae y E. tonsillarum han mostrado que las secuencias de nucleótidos tienen una concor­ dancia del 99,8% y sólo se presenta una diferencia de tres nucleótidos entre las dos secuencias .490 Dos serotipos (13 y 18) se distinguen de los otros mediante hibridación de DNA y pue­ den representar especies genómicas separadas sin nombre. Se ha aislado E. tonsillarum en tejido de amígdalas porcinas y en la sangre de perros con endocarditis; pero no en infecciones humanas .860-862 Las cepas pertenecientes al mismo serotipo

E species de E ry s ip e lo th rix : E ry s ip e lo th rix rh u s io p a th ia e y E ry s ip e lo th rix to n s illa ru m

Cuadro 14-3

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Características fenotípicas para la identificación de especies de Erysipelothrix

C A R A C T E R ÍS T IC A I Hemolisis. SBA I Catalasa I Reducción de nitrato H.S en agar hierro de Kligler (KIA) 1 Acetoína Producción de ácido a partir de glucosa Producción de ácido a partir de sacarosa Serotipos incluidos47

E. RHUSIOPATHIAE

E. TONSILLARUM

Ninguna, a -

Ninguna, a -

-

-

+

+

+

+ + + 3, 7, 10, 14, 20, 22, 23

+

la, Ib, 2a, 2b, 4 -6 , 8, 9, 11, 12, 15-17, 19, 21, tipo N

Los serotipos 13 y 18 son distintos de los otros por hibridación de DNA y pueden representar otras especies genómicas separadas.

representan cepas diversas, como lo demostró la ribotipificación y la secuenciación de rDNA 16S.11 Se han desarrollado métodos basados sobre PCR para la detección directa del microorganis­ mo en tejidos de cerdos provenientes de mataderos .572,798 865 Factores de virulencia de E. rhusiopathiae

E. rhusiopathiae produce varios factores que pueden aumen­ tar la virulencia de estos microorganismos . 796 La neuraminidasa. enzima que libera residuos de ácido siálico terminal de glucolípidos y glucoproteínas. al parecer funciona promoviendo la fijación de las bacterias y la ulterior invasión celular de E. rhu­ siopathiae.624 Su mayor propagación en los tejidos puede de­ berse a la producción de hialuronidasa por el microorganismo, aunque el papel de esta enzima en la patogenia de la enferme­ dad no es todavía muy claro .796 E. rhusiopathiae también pro­ duce una cápsula de polisacárido, la cual tiene un peso mole­ cular de 14 a 22 kDa y funciona ayudando al microorganismo a resistir la fagocitosis por los leucocitos polimorfonuclea­ res .800 En presencia de suero normal, los macrófagos pueden fagocitar a estos microorganismos, pero la cápsula les permite sobrevivir y reproducirse intracelularmente por la inhibición de la explosión oxidativa dentro de los macrófagos y una produc­ ción reducida de metabolitos oxidativos reactivos .799 La opsonización con anticuerpos anticapsulares y com plem ento promueve la fagocitosis y la destrucción intracelular de los microorganismos. También se demostró que algunas estructu­ ras de la superficie celular distintas de la cápsula influyen en la reducción de la inmunidad protectora contra la infección por E. rhusiopathiae. Los antisueros dirigidos contra SpaA purifica­ da, una proteína de superficie de 69 kDa que se extiende desde la superficie celular a través de la cápsula, pueden proteger a los ratones de la exposición a una cepa virulenta de E. rhusio­ pathiae, y la administración de SpaA purificada a cobayos induce la formación de anticuerpos opsónicos protectores .442-797 También se sugirió un papel similar para una proteína de super­ ficie de 64-66 kDa, aunque esta proteína, y tal vez otras, pue­ den ser causa de la inducción de inmunidad celular más que de inmunidad humoral . 368 Importancia clínica de E. rhusiopathiae

E. rhusiopathiae se distribuye ampliamente en la naturaleza, donde se encuentra en distintas especies de animales, princi­ palmente cerdos y vacas. Como también en peces, aves y otros mamíferos salvajes y domésticos . 737 En cerdos y vacas, causa

una enfermedad de importancia económica conocida como e ri­ sipela, pero puede provocar una enfermedad importante en otras especies de animales salvajes y domésticos. La erisipela del cerdo es el resultado de la ingestión de alimentos y agua con­ taminados. Los microorganismos se multiplican en las amígda­ las y los tejidos linfoides en el intestino y ganan acceso al torren­ te circulatorio. En estos animales, E. rhusiopathiae causa una septicemia aguda o una enfermedad crónica con el desarrollo de poliartritis y endocarditis. También se lo encuentra en materia orgánica en descomposición y puede ser aislado en el suelo. En general, los seres humanos adquieren el microorganismo a través del contacto con los tejidos de animales y sus productos infecta­ dos. De ahí que la infección habitualmente, pero no siempre, está limitada a individuos de ciertas ocupaciones, como carniceros, veterinarios, granjeros y pescadores . 182-413-709 En los seres humanos, E. rhusiopathiae puede causar una infección cutánea localizada y leve o, pocas veces, una infec­ ción sistémica con septicemia . 115-709 La primera forma, denomi­ nada erisipeloide, aparece luego de la inoculación cutánea del microorganismo y suele encontrarse sobre los dedos o la m ano . 708 En los casos típicos, hay dolor localizado, tumefac­ ción y un eritema violáceo que puede propagarse hasta la muñeca y el antebrazo. Las lesiones aparecen 2 a 7 días des­ pués de la infección y se caracterizan por un borde elevado y eritematoso que avanza y un área central que ha perdido color. Una manifestación cutánea más grave incluye la formación de ampollas hemorrágicas junto con linfadenitis o linfangitis regional. Como el microorganismo se ubica en las regiones perivasculares de la dermis, se necesitan muestras de biopsia del borde de la lesión que avanza para aislarlo en las infeccio­ nes localizadas. Esta forma de infección suele ser autolimitada y cicatrizar en 2 a 4 semanas. Las infecciones sistémicas ocurren pocas veces y se caracte­ rizan por sepsis y bacteriemia . U 5-324-464785 En estos pacientes, es frecuente la endocarditis por E. rhusiopathiae (sobre todo del lado izquierdo) que causa un daño extenso de las válvulas y los tejidos cardíacos sanos, y tiene una m ortalidad eleva115,413,565,899,916 t¡e p,a comunicado tanto endocarditis de válvu­ la nativa como de válvula protésica (que incluye las válvulas protésicas de Starr-Edwards y las válvulas de xenoinjertos por­ cinos) causadas por E. rhusiopathiae.400 A menudo, los indivi­ duos con infección sistémica no tienen antecedentes de infec­ ción cutánea primaria . 899 Estos pacientes están casi siempre debilitados por el tratamiento inmunosupresor (p. ej., adminis­ tración de corticosteroides) o trastornos subyacentes que con­ ducen a estados de inmunosupresión, como cáncer, diabetes,

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C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

alcoholismo o lupus eritematoso sistémico . 324-793-890 También se ha comunicado una enfermedad multisistémica que se manifesta por shock e insuficiencia renal, sobre todo en los pacientes con endocarditis .264-340'916 Las manifestaciones y las complica­ ciones inusuales de la sepsis y la baeteriemia por este microor­ ganismo incluyen abscesos paravalvulares y miocárdicos, artri­ tis séptica, fascitis necrosante e infartos intracraneales .38-496-750-808 Aislamiento e identificación de E. rhusiopathiae

E. rhusiopathiae puede aislarse en muestras de biopsia de lesiones de erisipeloide y ocasionalmente en hemocultivos. Las muestras de elección para el aislamiento son las obtenidas de los bordes en progresión de lesiones cutáneas con celulitis mediante la inyección de solución salina fisiológica estéril seguida de aspiración o mediante la obtención de biopsias en sacabocados de las mismas zonas. El microorganismo crece bien en los medios de hemocuitivo comercialmente disponi­ bles. E. rhusiopathiae se desarrolla en forma adecuada en agar sangre de carnero y forma colonias pequeñas (0,1 a 0,5 mm de diámetro), circulares, convexas, lisas (véase lámina en color 14-IH). Puede notarse una débil reacción de a-hem ólisis en el medio, en particular donde el crecimiento presenta más zonas confluentes. En la tinción de Gram el microorganismo aparece en forma de bacilos delgados; también pueden observarse cadenas no ramificadas de bacilos (cuadro 14-3). La propiedad más útil para identificar a este microorganismo es la produc­ ción de HnS en la profundidad del agar triple azúcar hierro o del agar hierro de Kliger (KIA) en pico de flauta (agar inclinado). Cuando en cepas sospechosas no se investiga la producción de H2S se puede concluir erróneamente que estos microorganis­ mos son especies de Lactobacillus ,235 La inoculación apropia­ da por estría y punción en el pico de flauta del medio KIA pon­ drá en evidencia un agar inclinado ácido y una zona profunda ácida debido a la producción de ácido a partir de glucosa y lac­ tosa; el H,S puede notarse en toda la profundidad o sólo a lo largo de la línea de estriación en profundidad (véase lámina en color 12-2A). Esta reacción es útil para diferenciar E. rhusio­ pathiae de otros bacilos gramnegativos como Arcanobacterium haemolyticum; esta especie presenta también |3-hemólisis en agar sangre de carnero. Una reacción de catalasa negativa, la falta de hemolisis o una a-hem ólisis débil en el agar sangre de carnero y la producción de H2S en el medio KIA o en agar tri­ ple azúcar hierro también ayudan a diferenciar E. rhusiopat­ hiae de L. monocytogenes. La inoculación por punción en un tubo de agar gelatina y la incubación a 22 °C lleva al creci­ miento en forma de “cepillo limpiatubos”, en el cual los micro­ organismos se propagan en líneas perpendiculares a la inocula­ ción por punción.* lo que da una apariencia “vellosa” (véase lámina en color 14-1G). Se ha comunicado que E. rhusiopat­ hiae produce una enzima coagulasa que puede coagular el plas­ ma bovino o de conejos .881 No obstante, se estableció que esta característica se debía al uso de citrato, hallado en el plasma; no se observó actividad de coagulasa cuando se utilizaron pre­ parados con oxalato, EDTA o heparina . 863 E. rhusiopathiae es débilmente fermentador, produce ácido a partir de glucosa, galactosa, fructosa, lactosa, maltosa y Nacetilglucosamina. No produce ácido a partir de glicerol. ara­ binosa, xilosa, adonitol, inositol, manitol, sorbitol, amigdalina, melibiosa, trehalosa, celobiosa, inulina, melezitosa, rafinosa ni glucógeno .459 No produce acetoína ni indol y no reduce los nitratos a nitritos. Las bases de datos de los sistemas de identi­ ficación API Coryne® y RapID CB-Plus® incluyen a E. rhu­ siopathiae. Las cepas de E tonsillarum son fenotípicamente

idénticas a E. rhusiopathiae, excepto en que la primera espe­ cie también produce ácido a partir de la sacarosa. Las caracte­ rísticas bioquímicas de identificación de especies de Erysipelo­ thrix se muestran en el cuadro 14-3. Sensibilidad de E. rhusiopathiae a los antibióticos

En general, las cepas de E. rhusiopathiae son sensibles a penicilina, cefotaxima, imipenem. piperacilina, clindamicina y ciprofloxacina .271-565-917 Se han comunicado sensibilidades varia­ bles para eritromicina, tetraciclinas y cloranfenicol. Trimeto­ prim-sulfametoxazol, gentamicina y netilmicina tienen escasa actividad contra E. rhusiopathiae. Es de importancia terapéuti­ ca considerable el hecho de que las cepas de E. rhusiopathiae sean intrínsecamente resistentes a vancomicina, teicoplanina y otros glucopéptidos .271-666 Se observó que penicilina, imipenem y fluoroquinolonas son los agentes más activos contra este microorganismo. Aun con un tratamiento antibiótico apropiado, la mortalidad asociada con la enfermedad diseminada puede ser de hasta un 35-40%. Esta alta mortalidad es atribuible en gran parte a las complicaciones de la endocarditis.

Especies de Bacillus y géneros relacionados Taxonomía y disección taxonómica del género Bacillus

El género Bacillus está formado por un grupo grande de bacilos grampositivos, catalasa positivos y facultativos caracte­ rizados por la capacidad para formar esporas en condiciones aerobias (véase lámina en color 14-2B). También se describió un segundo género esporulado, Sporolactobacillus. en la edi­ ción de 1986 del M anual de Bacteriología Sistemática de Ber­ gey.163 Este género contiene una sola especie -S. inulinus- ba­ cilo grampositivo esporulado que es catalasa negativo, carece de citocromos y tiene menaquinonas. En 1990, Nimura y cois, describieron un tercer género formador de endosporas, Amphibacillus, que contiene la especie A. xyla n u s631 El género Amphibacillus incluye bacilos facultativos que forman endos­ poras en condiciones aerobias o anaerobias y carecen de citocromos, menaquinonas y actividad de catalasa. Dado que la descripción del género Bacillus pone un énfasis especial en la formación de endosporas como criterio taxonó­ mico, se ha asignado al género durante varias décadas un con­ junto extremadamente diverso de especies. Aun dentro de este criterio, también se utilizan como descriptores taxonómicos la forma de las endosporas (esféricas, ovaladas, elipsoides, cilin­ dricas), su localización dentro de la célula (central, subterminal, terminal) y los cambios inducidos por ellas en la forma celular (células tumefactas o no tumefactas por la espora intracelular). Hasta hace poco, los miembros del género Bacillus abarcaban microorganismos aerobios y facultativos que también eran acidófilos, alcalífilos, psicrófilos, mesófilos y termófilos, lo que reflejaba el crecimiento y el metabolismo en un amplio espec­ tro de temperaturas y pH. Algunas especies pueden metabolizar una gran colección de fuentes de carbono, que incluyen meta­ nol, celulosa y quitina. También se observa una variación importante en los aminoácidos que comprenden las uniones cru­ zadas dentro del peptidoglucano de la pared celular. A nivel genético, la diversidad dentro del género está ejemplificada por el contenido de G + C, que varía de 33 a 69 mol%. Esta hetero­ geneidad genética es incompatible con la inclusión en un único género según lo definen los métodos taxonómicos bacterianos actuales. No es sorprendente que algunos estudios de secuen-

E s p e c ie s de Bacillus y g é n e ro s re la c io n a d o s

ciArión de rRNA 16S demuestren que el "género Bacillus” sea ñ l : genéticamente heterogéneo, representado al menos con ocho 'meas ñléticas altamente divergentes .41,42-632’702’745 La disección taxonómica polifásica del género Bacillus ha cc r.ducido a la descripción de muchos géneros nuevos desde 1990. En 1992. las especies que eran termófilas y acidófilas y _je contenían ácidos grasos cicloheptanos/ciclohexanos únicos rr. la membrana celular (B. acidoterrestris, B. cyclohepatnicus y 3. acidocaldarius) fueron colocadas en el nuevo género Alicxclobacilus (como A. acidoterrestris, A. cyclohepatnicus y A. acidocaldarius) en la familia Bacillaceae; se describieron otras especies de Alicyclobacillus en 2000 y 2002 . 14-352-590-895-957 En 1993-1994, se propuso el género Paenibacillus para incluir certas especies de Bacillus facultativos, con la transferencia Jterior de otras distintas especies de Bacillus y especies "pre- jntivas de Bacillus” al género Paenibacillus desde ese momento -:.409-iii,795 g n 1 996, Shida y cois, demostraron que dos grupos relacionados dentro del género Bacillus -el “grupo Bacillus bre■is" (10 especies de Bacillus existentes) y el “grupo Bacillus aneurolyticus” (dos especies de Bacillus)- representaban taxones filogenéticamente distintos entre sí y de otros géneros, que incluyen Bacillus, Sporolactobacillus, Paenibacillus, Amphibacillus y Alicyclobacillus ,794 Estos dos “grupos de Bacillus” se conv irtieron en el género Brevibacillus (que contiene 10 espe­ cies) y el género Aneurinibacillus (que contiene tres especies), respectivamente. Desde 1996, el examen genético y la revalua­ ción de otras cepas esporuladas aerobias han conducido a la crea­ ción de otros géneros, que incluyen Virgibacillus, Ureibacillus, Thennobacillus, Halobacillus, Gracilibacillus, Filobacillus, Geobacillus, Sulfobacillus, Paraliobacillus, Salibacillus y Lentibacillus 33-234-279.280.3 18,349,408,412,445,627,642,688,777,836,854,892,932,981 | ^ a caracterización fenotípica de estos géneros nuevos es metodoló­ gicamente compleja y no es pasible de las técnicas de identifica­ ción de rutina. Varias especies familiares se mantienen en el género Bacillus, como B. anthracis, B. cereus, B. subtilis, B. thuringiensis, B. licheniformis, B. pumilus, B. sphaericus y B. circulans. Con toda probabilidad, el género Bacillus seguirá sufriendo una disección sistemática, lo que conduce a nuevos géneros y especies de bacterias esporuladas (véase lámina en color 14-11). El género Bacillus sensu stricto está compuesto por bacilos grampositivos aerobios que produjeron endosporas en condi­ ciones aerobias. Todas las especies son aerobias o facultativas salvo B. infernos, que es estrictamente anaerobia y que fue ha­ llada en el suelo .97 Con raras excepciones, las especies de Baci­ llus son mesófilas. El patógeno primario en este grupo es Bacillus anthracis, el agente causal del carbunco. Estos micro­ organismos son catalasa positivos y, con excepción de B. anth­ racis y B. mycoides, casi todas las otras especies son móviles a través de flagelos peritricos (antígenos H). La mayoría de las especies distintas de Bacillus anthracis son ubicuas en el medioambiente (polvo, suelo, agua, materiales de origen vege­ tal y animal). Algunas son patógenos reconocidos de animales e insectos. Algunas especies de Bacillus se utilizan en la elabo­ ración y producción de antibióticos y vitaminas, en bioensayos y como microorganismos indicadores para la monitorización de la eficacia de desinfectantes y procedimientos de esteriliza­ ción (p. ej., tratamiento en autoclave, esterilización mediante calor y radiación). Cada vez más especies dentro de este grupo, particularmente B. cereus, se reconocen sobre todo en los hués­ pedes inmunodeprimidos por su potencial para producir impor­ tantes infecciones humanas, sobre todo entre los huéspedes inm unodeprim idos. B. anthracis pertenece al “grupo B. cereus", que incluye B. cereus, B. thuringiensis y B. mycoides,

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pero está más estrechamente relacionado con B. cereus sobre la base de la hibridación de DNA, el análisis de secuencias de rRNA 16S y 23S y la presencia de algunas secuencias intergé­ nicas de DNA .40-394 Bacillus anthracis EPIDEMIOLOGÍA DEL CARBUNCO

El carbunco, la enfermedad clásica causada por B. anthracis, es fundamentalmente una afección de los animales herbívoros; los seres humanos se infectan por contacto con animales y pro­ ductos animales infectados .877 En los Estados Unidos, se la erradicó por el uso amplio de vacunas humanas y animales efi­ caces desde fines de la década de 1930, los adelantos de los procedimientos higiénicos utilizados en las fábricas que proce­ san productos animales, y el mayor uso de fibras sintéticas como alternativas a los cueros, pieles y pelos animales. Sin embargo, como las esporas de B. anthracis son altamente resis­ tentes a las condiciones ambientales adversas y como es muy difícil asegurarse de que el microorganismo ha sido verdadera­ mente erradicado de regiones que antes eran endémicas, se debe mantener un alto índice de sospecha ante la aparición súbita de una enfermedad clínicamente compatible. El agente causal, B. anthracis, se mantiene en el suelo como endosporas resistentes y, así, puede seguir siendo infeccioso durante años. Tradicionalmente, el carbunco suele definirse en términos de su modo de adquisición. El carbunco industrial se refiere a la adquisición del microorganismo por los individuos empleados en el procesamiento de cueros, lana, pelo o hueso de animales. El carbunco no industrial alude a la adquisición de los micro­ organismos por el contacto estrecho con animales infectados o sus esqueletos. La adquisición industrial se asocia con las for­ mas cutánea y pulmonar de la enfermedad, mientras que la no industrial se vincula a carbunco orofaríngeo y gastrointestinal y a carbunco cutáneo. Varios países, como Japón, la ex Unión Soviética, el Reino Unido, Irak y los Estados Unidos también han explotado y desarrollado el uso de B. anthracis como agente de guerra bio­ lógica . 156-514 En 1992, los soviéticos admitieron sus esfuerzos continuos para transformar el carbunco en un arma en las déca­ das anteriores y divulgaron que en 1979 la liberación acciden­ tal de esporas de un laboratorio militar en Sverdlovsk produjo más de 77 casos de carbunco inhalatorio, con más de 6 6 muer­ tes . 146 La utilización potencial de B. anthracis para bioterroris­ mo fue constatada en los Estados Unidos durante los últimos cuatro meses de 2001, cuando se entregaron esporas de B. anthracis en cartas y paquetes despachados a localidades del interior de ese país. Estos incidentes condujeron a 11 casos de carbunco inhalatorio y 1 1 casos de carbuno cutáneo. Los incidentes llevaron a la promulgación de la legislación antiterrorista en los Estados Unidos y al desarrollo de la Iniciativa de Preparación para el Bioterrorismo. A través de esta iniciativa, los CDC, junto con la Association of Public Health Laboratories (APHL), varias agencias federales (el Federal Bureau of Investigation [FBI] y el Departamento de Defensa) y los laboratorios de salud pública de varios estados, establecieron la Laboratory Response Network (LRN). En la LRN están integrados los laboratorios de microbiología clínica de todo el país en una red de cuatro niveles -desde el nivel A hasta el nivel D - de acuerdo con la capacidad de exámenes diagnósticos e instalaciones de seguridad de los laboratorios. La mayoría de los laboratorios clínicos hospitalarios que tienen capacidad de microbiología son miembros de nivel A de la LRN . 145 En este nivel, los laboratorios participan en la detec­ ción temprana de los agentes microbianos de bioterrorismo y

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C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

pueden realizar e interpretar las pruebas bioquímicas observacionales y simples para descartar agentes potenciales de biote­ rrorismo. Si las pruebas de detección sistemática sugieren que una cepa dada es un posible patógeno de bioterrorismo, se la remite a un laboratorio de nivel B o más alto. En el cuadro 14-5 se detallan las pruebas de detección sistemática de nivel A para B. anthracis que se tratan en la sección “Aislamiento e identificación” más adelante.

FACTORES DE VIRULENCIA DE B. ANTHRACIS

B. anthracis produce toxinas compuestas por tres proteínas distintas: antígeno protector (PA), factor de edema (EF) y fac­ tor letal (LF). Las cepas virulentas también están encapsuladas. Los genes estructurales de PA, EF y LF -pagA, cya y le f res­ pectivamente- residen en un plásmido denominado pX O l. Estos genes son no contiguos dentro de un área de 30 kb sobre el plásmido pX O l. Otro gen pX O l denominado atxA codifica una proteína reguladora de acción trans que activa la transcrip­ ción de pagA, cya y /e/ ' . 196 6,2 PA es sintetizada y secretada por el microorganismo y se une a receptores no identificados sobre células diana, donde sufre escisión proteolítica. Se libera un fragmento aminoterminal de 20 kDa y el fragmento de 63 kDa restante se polimeriza con otros fragmentos similares para for­ mar un heptámero de forma anular, que forma un poro a través de la membrana celular . 257-948 Cada monómero en el heptámero se une a EF o LF, lo que les permite entrar en la célula diana. Estas tres proteínas actúan luego en combinaciones binarias; ninguna tiene actividad tóxica por sí misma. Cada monómero de PA de 63 kDa puede unirse a una molécula de EF o LF. 391 EF y PA forman un complejo denominado toxina de edema (ET), que tiene actividad de adenilato ciclasa. LF y PA forman un complejo llamado toxina letal (LT), que es el principal fac­ tor de virulencia de B. anthracis. En conjunto, ET y LT aumen­ tan las concentraciones intracelulares de adenosinmonofosfato cíclico (cAMP), inhiben la fagocitosis bacteriana y bloquean la explosión oxidativa de los leucocitos polimorfonucleares. En los macrófagos, LT inhibe la síntesis macromolecular, promue­ ve la apoptosis y actúa como una proteasa al hidrolizar proteincinasas involucradas en la transducción de señales intrace­ lulares. La interrupción de esta vía de señalización conduce a la inactivación de factores de transcripción en el núcleo celular. La expresión de los genes de las toxinas y la producción de toxinas son aumentados específicamente a nivel genético por CO, y el crecimiento a 35-37 °C .498 El crecimiento del micro­ organismo en estas condiciones provoca aumentos de cuatro a seis veces en la transcripción de genes de toxina y en la sínte­ sis de toxinas . 612-811 Las cepas virulentas de B. anthracis también están encapsu­ ladas. Los genes para la producción de la cápsula residen en un segundo plásmido denominado pX 02 y consiste en tres genes que codifican tres proteínas vinculadas con la síntesis capsular (capB, capC, capA) y un cuarto gen regulador (acpA). Las pro­ teínas tienen pesos moleculares de 44, 16 y 46 kDa, respecti­ vamente, y están asociadas con la membrana. Un quinto gen pX 02, dep, codifica otra proteína de 51 kDa que hidroliza el material capsular y genera péptidos de menor peso molecu­ lar.898 La cápsula propiamente dicha es un polímero de cadenas de a-péptido con uniones y de 50-100 residuos de ácido D-glutámico y contribuye a la virulencia al inhibir la fagocitosis de los microorganismos .573-612 Al igual que la producción de toxi­ na, la síntesis de material capsular en B. anthracis aumenta por las concentraciones elevadas de CO, y bicarbonato atmosféri­ cas tanto in vivo como in vitro .612

PRESENTACIONES CLÍNICAS DEL CARBUNCO

El carbunco humano puede ser dividido en cuatro formas clínicas, según el modo de adquisición del microorganis­ m o .510-612 El carbunco cutáneo representa el 95-99% de casos en todo el mundo y es el resultado del contacto mucoso direc­ to con animales infectados o sus productos (p. ej., pelo o cue­ ros), suelo que contiene el microorganismo o exposición a esporas. En general, las lesiones ocurren en áreas expuestas de la piel (p. ej., manos, brazos, cuello y rostro). Después de un período de incubación de 2 a 5 días, aparece una pápula inicial en el sitio de inoculación. Esta lesión está rodeada por un área de edema y eritema debido al crecimiento del microorganismo y a la elaboración local de toxina de edema . 575 La lesión evo­ luciona con rapidez a una vesícula o ampolla que tiene 1 a 3 cm de diámetro y el líquido dentro de la vesícula se torna negro por la hemorragia dentro del área. Finalmente la lesión se ulcera y aparece una escara central de fondo negro con edema circundante. A menudo, pueden aparecer pequeñas lesiones satélites similares a perlas que rodean la escara cen­ tral. Las escaras características del carbunco cutáneo son indo­ loras, aunque la reacción edematosa circundante puede ser dolorosa. Se puede observar una linfadenopatía dolorosa loca­ lizada o generalizada, según la extensión y la gravedad de la infección inicial y también pueden presentarse síntomas gene­ rales (p. ej., fiebre, malestar general, cefalea). La mortalidad asociada con el carbunco cutáneo no tratado es de alrededor del 1 0 - 2 0 %. El carbunco pulmonar o inhalatorio es el resultado de la inhalación de endosporas. Las esporas alcanzan los pulmones, donde son eliminadas por los macrófagos del sistema reticulo­ endotelial que se encuentran en los ganglios linfáticos hiliares y mediastínicos. La infección activa ocurre en los ganglios lin­ fáticos que drenan los pulmones más que en los pulmones pro­ piamente dichos .676 Las esporas germinan para formar células bacterianas vegetativas dentro de los macrófagos. Esto condu­ ce a edema y necrosis hemorrágica del mediastino, que se apre­ cia en las radiografías de tórax como un ensanchamiento mediastínico pronunciado. Desde el área subestemal, los microorganismos invaden el espacio pleural y provocan derra­ me pleural hemorrágico. Los macrófagos que albergan los microorganismos son destruidos y las bacterias vegetativas salen a la circulación general, donde siguen multiplicándose. La diseminación hematógena siembra los sitios distantes del cuerpo, entre ellos el tubo digestivo y el sistema nervioso cen­ tral. La mayoría de los pacientes no sobreviven el tiempo sufi­ ciente como para manifestar signos y síntomas de meningitis; los pacientes suelen estar lúcidos hasta que ocurre el shock sis­ témico, lo que conduce a coma y muerte .508-859 El período de incubación del carbunco inhalatorio es de 1 a 3 días, seguido del inicio súbito de síntomas. Estos son fiebre y escalofríos, tos seca no productiva, dolor subestemal, disnea y náuseas con vómitos. En las radiografías de tórax se pueden observar infil­ trados, derrames pleurales y ensanchamiento mediastínico. La afectación gastrointestinal produce dolor abdominal, hematemesis y melena. La mortalidad asociada con esta forma de la enfermedad excede el 80-90% si se deja sin tratamiento. El carbunco orofaríngeo y el carbunco gastrointestinal se adquieren por la ingestión de alimentos mal cocidos que con­ tienen esporas o bacilos vegetativos. Ambas formas de infec­ ción pueden volverse sistémicas y, al igual que la forma pul­ monar, tienen una mortalidad elevada si no son tratadas. El período de incubación del carbunco gastrointestinal es de 2 a 7 días. Los síntomas comienzan con fiebre y náuseas con vómi­ tos sanguinolentos. Luego aparece dolor abdominal y diarrea

E s p e cie s de Bacillus y g é n e ro s re la c io n a d o s

sanguinolenta, seguidos de toxemia fulminante, cianosis, shock ~ _r"e i véase lámina en color 14-2C). En los casos mortales, - ~ suele producirse dentro de los 2 a 5 días del inicio. La aie-itación orofaríngea es sugerida por dolor y edema cervi­ cal • bucal. Se pueden observar escaras en la faringe posterior, kas áreas amigdalinas o el paladar duro. La progresión de la níección conduce a disfagia, dolor faríngeo intenso y linfadea paría cervical. La muerte es el resultado de una sepsis fulmi-

TF ¿"AMIENTO DEL CARBUNCO

Se pueden utilizar distintos agentes para el tratamiento del . _ " - _;o. La penicilina en altas dosis (4 millones de unidades - - 6 horas) es el fármaco de elección. En los pacientes té rric o s a la penicilina, se puede utilizar ciprofloxacina (400 ~ c por vía intravenosa cada 8 - 1 2 horas) o doxiciclina ( 2 0 0 mg por vía intravenosa cada 8-12 horas). Ante brotes y durante los : "lecimientos recientes de 2 0 0 1 . relacionados con bioterror.smo. se administró profilaxis con ciprofloxacina (500 mg por ía ral. dos veces por día) o doxiciclina ( 1 0 0 mg por vía oral. ; : s veces por día) a individuos potencialmente expuestos :_:ante 6 semanas. Aunque la mayoría de los casos de carbun-: inhalatorio son mortales, el tratamiento de las infecciones c_:aneas casi siempre es eficaz.

=REVENCIÓN DEL CARBUNCO

Existen vacunas para el carbunco animal y humano .260’388 La •acuna animal es en realidad un preparado de esporas de una cepa atenuada de B. anthracis que produce las tres proteínas de la toxina, pero carece de la cápsula debido a la ausencia del p’ism ido pX 02. La vacuna humana autorizada para uso en los Estados U nidos es BioThrax® (antes Vacuna contra el Carbunco Adsorbida [Anthrax Vaccine A dsorbed. AVA], B iport. Lansing, MI), una fórmula acelular preparada del Ai­ ra d o de un cultivo de una cepa toxigénica, no encapsulada y avirulenta de B. anthracis (cepa V770-NP-1-R). Este filtrado -e cultivo contiene PA. LF y EF, y PA es el componente prin­ cipal. La protección de los seres humanos contra el carbunco por esta vacuna requiere múltiples dosis iniciales (tres inocula. iones subcutáneas a intervalos de 2 semanas seguidas de inyecciones adicionales a los 6 , 1 2 y 18 meses), e inmuniza­ ciones anuales de refuerzo para mantener un nivel de anticuer­ pos protector. En general, la vacuna para animales produce títu­ los más altos y más duraderos de anticuerpos protectores que la vacuna humana. Esto puede deberse al aumento de la respues­ ta inmunitaria por la producción continua de PA y otros antí­ genos protectores por la cepa atenuada o por la participación de la inmunidad celular en respuesta a los microorganismos ate­ nuados pero no al PA purificado hallado en la vacuna huma­ na .'" '2 La vacuna AVA se recomienda para quienes trabajan directamente con B. anthracis en el laboratorio, los que traba­ jan con productos animales (p. ej., cueros y pieles) importados de áreas de endemicidad del carbunco, los que trabajan con ani­ males y sus productos dentro de las regiones endémicas y el personal militar desplegado a regiones de alto riesgo del mundo. Además, la vacuna puede utilizarse como profilaxis preexposición para las personas con riesgos cuantificables de exposición como el personal de laboratorio que maneja mues­ tras ambientales, por ejemplo, polvos, los que realizan pruebas confirmatorias para B. anthracis en laboratorios LRN de nivel B y superiores y los que trabajan en áreas contaminadas luego de un ataque terrorista . 146

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Bacillus cereus FACTORES DE VIRULENCIA DE B. CEREUS

Al igual que otras especies de Bacillus, B. cereus se encuen­ tra en el suelo y también puede aislarse en la paja y el arroz. Esta especie es fenotípica y genotípicamente similar a las espe­ cies de Bacillus relacionadas, que incluyen B. anthracis, B. mycoides y B. thuringiensis. Algunos estudios genéticos y quimiotaxonómicos han sugerido que B. cereus. B. thuringiensis y B. anthracis pertenecen a la misma especie, con las caracterís­ ticas diferenciadoras que las separa funcionalmente de ellas de ser transmitidas por plásmidos y transmisibles .39-40 402 Por ejem­ plo, la única diferencia entre B. cereus y B. thuringiensis es la presencia de plásmidos que codifican las toxinas insecticidas en la última. B. cereus produce varios factores de virulencia potenciales, además de las toxinas asociadas con infecciones gastrointestinales (véase más adelante) y se cree que estos fac­ tores desempeñan un papel en las infecciones no gastrointesti­ nales. Estos factores de virulencia incluyen tres hemolisinas y tres fosfolipasas .48,356,801 Las hemolisinas son cereolisina, hemolisina II y hemolisina III, respectivamente. La cere o lis in a es similar a la estreptolisina O por ser una proteína termolábil que es activada por tioles e inhibida por colesterol. La h e m o li­ sina O es una toxina hemolítica que también es una toxina letal en ratones y la h e m o lis in a I I I produce lisis osmótica de eri­ trocitos por la formación de poros transmembrana. Las fosfolipasas incluyen fosfatidilinositol hidrolasa, fosfatidilcolina hidrolasa y una esfingomielinasa. Las fosfolipasas escinden las porciones lipídicas que sirven para fijar las proteínas de la superficie celular, comprometen la integridad de la membrana celular y defienden las capacidades regenerativas de las células lesionadas. Las cepas de B. cereus también producen tres (3lactamasas, colagenasas extracelulares y proteasas ligadas a la me m brana .569,571 ’653'806 GASTROENTERITIS POR B. CEREUS

B. cereus es responsable de la enfermedad transmitida por ali­ mentos debido a la formación de exotoxinas. Como esta enfer­ medad no es comunicable, no se cuenta con cifras exactas sobre incidencia y prevalencia para la mayor parte del mundo. Entre 1973 y 1985, los porcentajes de enfermedad transmitida por ali­ mentos asociada con B. cereus variaron del 0,7% en Inglaterra y Gales hasta el 17,8% en Finlandia .500 La incidencia en los Es­ tados Unidos parece ser mucho más baja, y sólo el 1.3% de los casos de intoxicación alimentaria bacteriana fueron atribuibles a B. cereus entre 1972 y 1982. Los productos alimenticios se con­ taminan desde el medioambiente y las esporas altamente resis­ tentes pueden superar la pasteurización y la exposición a radia­ ción y. La capacidad de algunas cepas de B. cereus para crecer a bajas temperaturas (4-7 °C) explica parcialmente su presencia en productos lácteos pasteurizados y refrigerados. Diversos produc­ tos alimenticios pueden ser contaminados con células vegetati­ vas o esporas de B. cereus, como pastas, arroz, lácteos, granos, especies, verduras, carne, pollo y mariscos. Los alimentos, los productos lácteos y los suplementos y fórmulas para lactantes preparados en el hospital o la farmacia contaminados represen­ tan un riesgo para los pacientes hospitalizados, sobre todo los niños y los enfermos inmunosuprimidos. Se sabe que las cepas de B. cereus productoras de enteroto­ xina causan gastroenteritis aguda autolimitada en los seres humanos, casi siempre luego de la ingestión de alimentos con­ taminados .500 Este síndrome sigue dos formas clínicas, según el tipo de toxina producida por los microorganismos presentes en el alimento sospechoso. La enfermedad de corta incubación (o

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C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

la enfermedad emética) se caracteriza por el inicio de los sín­ tomas 1 a 6 horas después de la ingestión del alimento conta­ minado, con vómitos y cólicos abdominales. En general, los síntomas ceden 10-24 horas después del comienzo. La exoto­ xina termoestable responsable de estas cepas de B. cereus es un dodecadepsipéptido denominado cereulida, que tiene un peso molecular de alrededor de 5 kD a .4-6 7 Esta molécula es estable en presencia de ácidos, álcalis, proteasas y calor; es no antigé­ nica y requiere el uso de bioensayos o espectrometría de masa para la detección de la toxina .27-380 La cereulida, que se produ­ ce durante la fase estacionaria de crecimiento y se asocia prin­ cipalmente con el serotipo flagelar H -1, 6 provoca hinchazón de las mitocondrias y desacople de la fosforilación oxidativa . 607 Los alimentos incriminados asociados con el tipo emético de enfermedad incluyen platos de arroz oriental frito, crema y pro­ ductos lácteos, pastas y fórmulas para lactantes reconstituidas. La intoxicación alimentaria por B. cereus de incubación pro­ longada ocurre 8 a 16 horas luego de la ingestión y se caracteri­ za predominantemente por el inicio de diarrea acuosa profusa, náuseas, tenesmo y cólicos abdominales hipogástricos. En gene­ ral, los síntomas ceden después de 12 a 36 horas. Cuatro enterotoxinas termolábiles diferentes se asocian con esta presentación clínica, que incluyen dos complejos proteicos (hemosilina BL [HBL] y enterotoxina no hemolítica [NHE]) y dos proteínas enterotóxicas (enterotoxina T y citotoxina K ) . 5-70-357-560-752 HBL y NHE están compuestas por tres proteínas cada una, y los loci genéticos que codifican HBL o NHE se organizan en operones individuales y separados. HBL es una exotoxina que tiene acti­ vidad hemolítica y está compuesta por tres proteínas: un compo­ nente de fijación de 35 kDa y dos proteínas (Ll, 36 kDa y L 2 ,45 kDa) que tienen propiedades citolíticas y dermonecróticas .69 El principal componente de NHE es una proteína antigénica de 45 kDa que se asocia con proteínas de 39 y 105 kDa. Esta toxina tri­ partita es dermonecrótica y citotóxica, y altera la permeabilidad de la membrana .561 Otros investigadores han caracterizado y comunicado sobre otras enterotoxinas de distintas cepas de B. cereus, pero HBL y NHE se consideran las toxinas responsables de la enfermedad diarreica por B. cereus resultante de intoxica­ ción alimentaria .802 Los alimentos asociados con este tipo de enfermedad incluyen carne y platos de verduras, tortas, salsas y productos lácteos. Algunas cepas de B. cereus pueden producir tanto la toxina emética como los complejos de enterotoxinas. La intoxicación asociada con B. cereus y sus toxinas puede evitarse mediante la cocción suficiente de los alimentos, sobre todo las carnes y el almacenamiento refrigerado correcto. B. thuringiensis también ha sido aislado en asociación con brotes de gastro­ enteritis y su citotoxicidad es similar a la causada por B. cereus enterotoxigénico .448 En raras ocasiones, otras especies de Bacillus (p. ej., B. subtilis. B. licheniformis) también causan gas­ troenteritis e intoxicación alimentaria .559 Infecciones oportunistas por especies de Bacillus

Debido a su ubicuidad en el medioambiente, el aislamiento de especies de Bacillus en muestras clínicas se ha considerado muy a menudo una contaminación importante. Sin embargo, la frecuencia creciente de comunicaciones en la bibliografía de especies de Bacillus como agentes de enfermedad en huéspe­ des inmunodeprimidos sugiere que estos microorganismos no deben ser descartados como contaminantes en todos los casos. Las infecciones graves por especies de Bacillus se han asocia­ do con procedimientos quirúrgicos, inmunosupresión, heridas traumáticas, quemaduras, hemodiálisis y abuso de drogas parenterales. Las cepas aisladas en infecciones no gastrointes­

tinales producen distintos factores presuntivos de virulencia, como hemolisinas, exotoxinas necrosantes y fosfolipasas. Los análisis de grandes series de casos que involucran infecciones importantes por Bacillus indican su participación en los sín­ dromes clínicos explicados antes. BACTERIEMIA Y ENDOCARDITIS

Muchos de los pacientes en estos estudios eran consumido­ res de drogas intravenosas, tenían colocados catéteres vasculares centrales o periféricos permanentes o estaban inmunosuprimidos por cáncer o quimioterapia . 52-330-620 La endocarditis causada por especies de Bacillus es una afección rara, pero en casos de abuso de drogas parenterales (habitualmente heroína) es una complicación bien reconocida . l34-815-845 En estos casos, es nota­ ble que los microorganismos provengan de agujas y jeringas contaminadas o de la heroína propiamente dicha. En estos pacientes, la infección suele comprometer la válvula tricúspi­ de, y se observan embolias pulmonares sépticas en las radio­ grafías de tórax. Los consumidores de drogas que tienen una endocarditis por Bacillus presentarán hallazgos clínicos com­ patibles y múltiples hemocultivos positivos por especies de Bacillus poco tiempo después de la administración de drogas parenterales. También se puede presentar esta endocarditis en pacientes con válvulas cardíacas protésicas o marcapasos . 134 La bacteriemia por Bacillus también puede reflejar contaminación hospitalaria de catéteres intravasculares implantados .91-406 En estos casos, la extracción del material duro del catéter suele eli­ minar los microorganismos del torrente circulatorio. La bacte­ riemia por especies de Bacillus también puede ocurrir en pacientes con neutropenia grave.

INFECCIONES EN HUÉSPEDES INMUNODEPRIMIDOS

Se observaron infecciones graves por Bacillus en pacientes inmunodeprimidos, entre ellas infecciones del sistema ner­ vioso central (meningitis, meningoencefalitis, absceso ence­ fálico), infecciones de las vías respiratorias bajas con em pie­ ma, bacteriemia primaria, infecciones de heridas penetrantes, infecciones posquirúrgicas, sepsis refractaria y quemadu­ ras. 13-36-155-331-414-579-617-695-757-888m Las infecciones del sistema ner­ vioso central pueden ocurrir como resultado de anestesia espi­ nal, reparación de fístulas, propagación desde un foco contiguo de infección (p. ej., otitis media, mastoiditis) o por derivaciones ventriculoperitoneales contaminadas .580 Las infecciones pulmo­ nares. que incluyen neumonitis necrosante. traqueobronquitis seudomembranosa, neumonía e insuficiencia respiratoria aguda con sepsis ocurrieron sobre todo en pacientes con leucemia y cáncer hepático, y en recién nacidos prematuros .7 I-186-454-847 Tam­ bién se han comunicado infecciones cutáneas no producidas por Bacillus anthracis en pacientes inmunodeprimidos .566 Las razo­ nes para la inmunosupresión en estos pacientes fueron alcoholis­ mo importante, leucemia, linfoma, quimioterapia de inducción, meningioma. artritis reumatoide. lupus eritematoso sistémico, quemaduras graves, diabetes, enfermedad grave por inmunodeficiencia y SIDA . 132-341-654,847 En general, la evolución de los pacientes que presentan infecciones sistémicas por Bacillus es mala y refleja una inmunosupresión generalizada a causa de la enfermedad subyacente y la quimioterapia citotóxica utilizada para el tratamiento. Las infecciones por Bacillus en los indivi­ duos inmunocompetentes son raras. Por ejemplo, Latsios y cois, describieron un caso de peritonitis debido a Bacillus cereus como resultado de la rotura de un absceso hepático en una mujer de 72 años antes sana .519

E s p e cie s de Bacillus y g é n e ro s re la c io n a d o s

743

WFECC ONES OCULARES

INFECCIONES HOSPITALARIAS

- er.doñalmitis (una infección del humor acuoso y el vitreo del ojo) por especies de Bacillus ocurre luego de heri±jc> mulares penetrantes o como consecuencia de la siembra ixactenana durante episodios bacteriémicos . 16,90,205,404,772,885 En Aquellos que tienen heridas penetrantes o cuerpos extraños retenidos dentro de la órbita, el edema periorbitario y la inflarrjción corneal conducen a una infección del vitreo que se r - r__a hasta la retina, lo que provoca pérdida de la agudeza tsual 12 a 24 horas después de la lesión. En general, se pre-:r:_ fiebre y leucocitosis. La endoftalmitis debida a especies de Bacillus puede complicarse por la propagación de los ~:~r organismos hasta sitios anatómicos contiguos, como el encéralo y el sistema nervioso central .80 Los pacientes con er.dc rtalmitis de origen hematógeno a menudo tienen antece­ dentes de uso de drogas parenterales. También se han comunir^ros casos luego de la cirugía de cataratas . 747 Este sín¿r me sigue una evolución clínica rápida que conduce a la r t r i i da de la visión y la enucleación del ojo. Como estas infecciones son rápidamente destructivas, se requiere un alto índice de sospecha y una terapia intensiva (p. ej., clindamicina \ gentamicina administradas por vía sistémica e intraocu. En el laboratorio clínico, las tinciones de Gram de mate­ rial aspirado de muestras de humor acuoso y vitreo deben r.:erpretarse con cuidado, y el aislamiento de una especie de Búcillus en estas muestras debe comunicarse al médico y no cere ser descartado como contaminante. Además de la endof■Jm itis, se han comunicado otras infecciones oculares (p. ej., - jeratitis) asociadas con especies de Bacillus vinculadas al uso de lentes de contacto .230,682 La evolución rápidamente des­ a c t i v a de las infecciones intraoculares por Bacillus ha sido -tribuida a la producción de toxinas y enzimas destructivas por los microorganismos causales . 126

Se han comunicado brotes de gastroenteritis por Bacillus en instituciones sanitarias y en otras circunstancias instituciona­ les. En estos casos, los alimentos implicados han sido estofa­ dos de vaca, arroz frito, pollo y pavo procesado. Otros brotes hospitalarios de infecciones por Bacillus han involucrado una propagación de fuente común desde reservorios contaminados en el medioambiente . 884 Estas fuentes han incluido hemodializadores contaminados, broncoscopios, reservorios de Omaya. balones de ventilación manual, inyectables de múltiples unida­ des, y pañales, guantes y vendajes quirúrgicos contamina­ dos . 194,323,346,723,908,983 En 2001. la pesquisa epidemiológica de una seudobacteriana en una unidad de cuidados intensivos neo­ natales causada por Paenibacillus macerans condujo al hallaz­ go de frascos de hemocultivo contaminados .643 También se han aislado especies de Bacillus en líquidos peritoneales en casos de peritonitis asociada con diálisis peritoneal intrahospitala­ ria .681 La investigación de seudobacteriemias causadas por es­ pecies de Bacillus también estableció que la contaminación provenía de agujas de instrumentos radiométricos para hemo­ cultivos y su secuencia temporal ha sido relacionada con modi­ ficaciones ambientales, como la construcción de un hospital .548

1

INFECCIONES MUSCULOESQUELÉTICAS

Algunas especies de Bacillus también pueden causar distin­ tas infecciones musculoesqueléticas, como osteomielitis aguda y crónica, fascitis necrosante y celulitis crepitante .201,617,779 Nuevamente, los individuos infectados a menudo han sido con­ sumidores de drogas intravenosas, presentaron neoplasias hematológicas subyacentes o recibieron tratamientos inmunosupresores. En los adictos a drogas intravenosas, se informó una osteomielitis vertebral aguda como resultado de la propa­ gación hematógena: las drogas o las jeringas contaminadas son las fuentes probables de los microorganismos. Se ha comuni­ cado fascitis necrosante en los pacientes con leucemia, drepa­ nocitosis y síndrome mielodisplásico .617,815 Esta infección pue­ de ser bastante destructiva para los tejidos, se asemeja a la gan­ grena gaseosa por clostridios y a menudo requiere la amputación de las extremidades afectadas. Se han informado infecciones graves (infección de heridas postraumáticas y posoperatorias, infección de tejidos blandos, fascitis necrosante, osteomielitis) causadas por especies de Bacillus en individuos que habían sufrido un traumatismo grave por accidentes automovilísticos y de motocicleta o heridas por armas de fuego .502,960 Las especies de Bacillus también pueden producir infecciones importantes en los pacientes quemados. La destrucción tisular que se observa con las infecciones graves de heridas causadas por especies de Bacillus puede estar relacionada en parte con la producción de distintas enzimas extracelulares nocivas que tienen propie­ dades histológicas e histotóxicas (p. ej., hemolisinas, fosfolipa­ sas, proteasas).

Seguridad en el laboratorio, recolección de muestras y procesamiento

Si se sospecha carbunco, se debe notificar de inmediato al laboratorio de salud pública y a los CDC. Las muestras que pueden ser recogidas son material de lesiones cutáneas, hemo­ cultivos y cualquier otro tejido potencialmente infectado. La seguridad del laboratorio es de suma importancia cuando se trabaja con cualquier material que se considera que contiene B. anthracis. Todas las muestras y los cultivos deben ser exami­ nados y procesados con cuidado en un gabinete de seguridad biológica (cuadro 14-5). Se deben tomar todas las precauciones para reducir al mínimo la formación de aerosoles desde el material potencialmente infectante. El personal debe utilizar sacos o batas protectores, máscaras y guantes cuando manipu­ la las muestras. Este material debe ser descartado o esteriliza­ do en autoclave antes de su reutilización. Después de comple­ tar el procesamiento de las muestras y la inoculación de los medios en placa y tubo, se deben desinfectar todas las superfi­ cies del gabinete de seguridad biológica y de las áreas expuestas con hipociorito de sodio al 5% y todos los instrumentos utiliza­ dos para el procesamiento de las muestras deben ser esterili­ zados en la autoclave. Además, el personal que trabaja con suspensiones de esporas o esqueletos y tejidos animales conta­ minados debe estar inmunizado apropiadamente. Las muestras para el aislamiento de B. anthracis deben refle­ jar el modo de adquisición y la anatomía patológica consiguien­ te de la infección. Para el diagnóstico de carbunco cutáneo, se deben recoger muestras con hisopo de los líquidos serosos obte­ nidos de la parte inferior de la superficie de la escara junto con los hemocultivos. Cuando se sospecha carbunco inhalatorio se requiere la recolección de muestras de esputo y hemocultivos para el diagnóstico. Las muestras de aspiración gástricos y de heces deben remitirse como auxiliares para el diagnóstico del carbunco gastrointestinal, junto con los hemocultivos. Ante la sospecha de gastroenteritis por B. anthracis. se deben recoger alimentos que estén vinculados epidemiológica­ mente con la enfermedad. Como el microorganismo puede estar presente en las deposiciones de los individuos sanos y no existe ningún sistema fácil de tipificación en los laboratorios clínicos, el aislamiento de B. cereus de las deposiciones de pacientes enfermos no proporciona las pruebas suficientes para

744

C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

adjudicarles un papel etiológico. Sin embargo ante brotes puede ser útil aislar el microorganismo en las heces de los indi­ viduos siempre que se demuestre que las muestras similares de controles adecuados apareados no contienen el microorganis­ mo. Se pueden enviar muestras de los alimentos implicados y de las heces de los pacientes a un laboratorio de referencia (p. ej., el laboratorio del departamento de salud pública o a los CDC) para la confirmación de la identidad y la tipificación de la cepa. Se debe recoger una muestra de heces de volumen sufi­ ciente (25-50 g) en un recipiente estéril con tapa hermética. Se deben enviar los alimentos, las muestras de heces o las cepas aisladas al departamento de salud estatal o a los CDC después de la notificación previa de los casos de brotes y de las aclara­ ciones correspondientes a las mismas oficinas. Aislamiento e identificación de especies de Bacillus. el “grupo Bacillus cereus" (B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis y B. mycoides)

Los miembros del género Bacillus aislados en muestras clí­ nicas suelen crecer bien y esporular en agar sangre de carnero y agar chocolate incubados a 37 °C en condiciones aerobias. La esporulación puede ser estimulada mediante el subcultivo en agar nutrientes con suplemento de M n S 0 4 (concentración final de 5 |ig/mL) e incubación ulterior. En las tinciones de Gram de los hemocultivos, otros medios de caldo y en ocasiones medios sólidos, las especies de Bacillus y otras especies relacionadas pueden aparecer como bacilos gramnegativos, lo que conduce a la impresión errónea de que el microorganismo es un bacilo gramnegativo no fermentador . 89 La inoculación de medios de caldo y la preparación de un frotis teñido con Gram después de algunas horas de crecimiento pueden poner en evidencia su naturaleza grampositiva. Las esporas intracelulares y libres de células no se tiñen con la técnica de Gram, pero pueden visua­ lizarse con la tinción de verde de malaquita. Se hace un frotis del microorganismo en un portaobjetos, se lo fija con calor y se lo tiñe con verde de malaquita al 10% durante 45 minutos. Se lo lava, se lo contratiñe con safranina durante 30 segundos y se lo observa al microscopio con objetivo de inmersión en aceite. Las esporas aparecen verdes, mientras que las células vegetati­ vas se tiñen de rosa a rojo (véase lámina en color 14-2D). En SBA, las colonias de B. cereus y B. thuringiensis suelen ser grandes, con una textura mate o granular, y la mayoría de las cepas son P-hemolíticas (véase lámina en color 14-2H). Estas colonias tienen una consistencia untuosa con bordes lisos, festoneados o fimbriados. Por el contrario, las colonias de B. anthracis suelen ser más pequeñas, blanco grisáceas, de superficie rugosa, no hemolíticas y tienen una consistencia vis­ cosa, de modo que cuando las colonias son tocadas con un ansa de inoculación, forman picos permanentes semejantes a claras de huevo batidas (véase lámina en color 14-2E. F y G). Bajo el microscopio de disección, muchas excrecencias que consisten en cadenas filamentosas de bacilos rodean a la colonia de B. anthracis, lo que le da el aspecto de una “cabeza de M edusa” de la mitología griega. Las colonias de B. mycoides son planas, no hemolíticas y tienen un aspecto sinuoso o rizoide que se ase­ meja a algunos clostridios. En los frotis teñidos con Gram, las células del grupo de B. cereus (incluido B. anthracis) son baci­ los grampositivos de 1,2 a 1,4 [im de ancho que se presentan solos o en cadenas. Las células individuales tienen extremos cuadrados o cóncavos. Se pueden observar esporas ovaladas central o subterminalmente, y las células no están tumefactas en las áreas donde se localiza la espora. Con el microscopio de contraste de fase de los frotis de B. thuringiensis pueden obser­ varse cristales adyacentes a la espora (cristales paraespora).

Estos cristales, que consisten en la toxina insecticida de pro­ ducción natural, también pueden observarse mediante la tin­ ción de un frotis del microorganismo con verde de malaquita. Todos los miembros del grupo de B. cereus producen lecitinasa en agar yema de huevo e hidrolizan la caseína, el almidón y la gelatina. B. thuringiensis y algunas cepas de B. cereus y B. mycoides son arginina dihidrolasa positivas; B. anthracis es arginina dihidrolasa negativa. No se produce indol y la mayo­ ría de las cepas reducen nitrato a nitrito. B. anthracis también es inmóvil en los preparados de gota gruesa o en medios semisólidos para evaluar motilidad. mientras que B. cereus, B. thuringiensis 'y B. mycoides son móviles. Además, las cepas de B. anthracis a menudo son encapsuladas en los tejidos infectados, como se demuestra con un preparado húmedo en tinta china o con la tinción de la cápsula de M'Fadyean. La formación del material capsular puede ser estimulada mediante el subcultivo del microorganismo en agar nutrientes que contiene NaHCO, al 0,7% e incubación a 37 °C durante toda la noche. B. anthra­ cis también puede ser identificado y diferenciado en forma definitiva de otras especies de Bacillus mediante análisis de ácidos grasos cromatográficos de células enteras o mediante la detección de susceptibilidad al y-bacteriófago .521 En el cuadro 14-4 se presentan las características bioquímicas para la iden­ tificación de B. anthracis, B. cereus y B. thuringiensis. Como se mencionó, B. anthracis es uno de varios posibles agentes de bioterrorismo. Los CDC y los miembros de la LRN han determinado que todas las especies de Bacillus aisladas en el laboratorio clínico deben ser evaluadas para la detección del posible B. anthracis. Los agentes que se ajustan a los criterios de detección sistemática son remitidos a los laboratorios de salud pública para la identificación definitiva. En general, estas características incluyen la tinción de Gram y la morfología de las colonias, la presencia o ausencia de hemolisis, la produc­ ción de catalasa y la determinación de motilidad. En los labo­ ratorios de derivación, la identidad de las cepas presuntivas de B. anthracis se confirma mediante análisis de ácidos grasos de cé­ lulas enteras, sensibilidad a y-bacteriófagos o métodos de PCR en tiempo real. En el cuadro 14-5 se presentan las característi­ cas de laboratorio de nivel A para la detección sistemática de cepas de Bacillus para posible B. anthracis. Otras característi­ cas que pueden ser útiles son la tinción de la cápsula (realizada directamente en el material clínico) y una prueba de P-lactama­ sa. La mayoría de las especies de Bacillus que no producen car­ bunco son no encapsuladas y son resistentes a la penicilina debido a la producción de P-lactamasas. Se puede utilizar la prueba cromogénica con disco de cefalosporinas (Nitrocefin®; BD Microbiology Systems, Franklin Lakes, NJ) como última prueba. La identificación de especies de Bacillus en grupos distintos de B. cereus y especies relacionadas en los géneros recién des­ critos se puede lograr por la observación de la morfología celu­ lar; la forma, la posición y la aparición de endosporas, y la determinación de las características bioquímicas utilizando pruebas convencionales (cuadro 14-6) (véase lámina en color 14-1J).719 En general, las formas y las localizaciones de las esporas son determinadas por la tinción de Gram o una tinción de las esporas, y la motilidad celular se establece mediante ino­ culación por punción del medio semisólido para motilidad. Se puede evaluar la acidificación de hidratos de carbono con medio semisólido CTA (agar cistina tripticasa digerida) que contiene hidratos de carbono al 1%. Se detecta reducción de nitratos y producción de indol mediante la inoculación de caldo de nitra­ to de indol y el desarrollo con los reactivos apropiados, respec­ tivamente. Se determina la hidrólisis de gelatina, caseína y almi­

Especies de B acillus y géneros relacionados 7 4 5

Cuadro 1 4-4

Identificación del “Grupo B a c illu s

CARACTERÍSTICA

c e r e u s ” - B . a n th ra c is , B . c e r e u s, B . th u r in g ie n s is y B . m y c o id e s

II. ANTH RACIS

B. CEREUS

B. TH URINGIENSIS

B. MYCOIDES

1,3 |am

1,4 |jm

1,4 nm

1,3 |im

+

+

+

+

Ovalada

Ovaladas, cilindricas

Ovaladas, cilindricas

Ovaladas

Subterminal

Subterminal, central

Subterminal

Subterminal

Células con tum efacciones de esporas

-

-

-

-

Crecim iento anaerobio

+

+

+

+

M otilidad

-

+

+

-

L ecitinasa (agar yem a de huevo)

+

+

+

+

Arginina dihidrolasa”

-

V

+

V

Reducción de nitrato”

+

v+

+

V+

Hidrólisis de gelatina”

V+

+

+

+

Hidrólisis de almidón

+

+

+

+

Hidrólisis de caseína

+

+

+

+

M anitol

-

-

-

-

Salicilina

-

+

V+

v+

Trehalosa

+

+

+

+

Inulina

-

-

-

-

Glicerol

-

+

+

+

Glucógeno

+

+

+

+

-

+

+

ND

D iám etro celular Células en cadenas Form a de las esporas Localización de las esporas

Producción de ácido a partir de:4 Arabinosa

Producción de P-lactamasa

Reacción determinada con A P I 20E. 'Reacción determinada con API 50CHB. +. reacción positiva; reacción negativa; V+, reacción variable, mayoría de cepas positivas; ND, datos no disponibles.

dón por la inoculación de medios convencionales en tubo o en placa. Los sistemas comerciales miniaturizados como API 20E® i incluye cúpulas para arginina dihidrolasa [ADH], indol, reduc­ ción de nitrato e hidrólisis de gelatina) y el API 50CHB® tam­ bién pueden ser útiles para la diferenciación de B. anthracis de otros microorganismos del grupo de B. cereus y para la identi­ ficación de otras especies de Bacillus y especies relacionadas (cuadros 14-5 y 14-6).549 El sistema Vitek® (BioMérieux, Marcy 1‘Etoile. Francia) tiene una tarjeta de identificación de Bacillus autónoma y el sistema Biolog® (Biolog, Hayward, CA) tiene una completa base de datos de especies de Bacillus.49 Existe un análisis de metilésteres de ácidos grasos que utiliza el sistema de identificación microbiano (MIDI) (Microbial ID, Newark, DE) para la identificación de estos microorganismos. Se han identificado especies de Bacillus utilizando distintos métodos quimiotaxonómicos, entre ellos espectrometría de masa por pirólisis, espectroscopia infrarroja por transform ación de

Fourier y electroforesis en gel de poliacril amida. También se han utilizado métodos moleculares para la identificación y la tipificación de cepas de B. cereus asociados con brotes de trans­ misión alimentaria y casos agrupados de infecciones de aparen­ te transmisión hospitalaria.546'589-878 Sensibilidad de las especies de Bacillus a los antibióticos

Aunque la mayoría de las especies de Bacillus son resisten­ tes a la penicilina a causa de la producción de una enzima P-lactamasa de amplio espectro, B. anthracis casi siempre es sensi­ ble a la penicilina.720 Además, la mayoría de las cepas de B. anthracis también son sensibles a fluoroquinolonas, tetracicli­ nas, eritromicina, gentamicina y cloranfenicol.227-943 Es intere­ sante señalar que la mayoría de las cepas de B. anthracis son resistentes a las cefalosporinas. B. cereus y B. thuringiensis producen una enzima p-lactamasa que hidroliza penicilina,

746

C A P ÍT U L O 14

Cuadro 14-5

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

Guía de laboratorio de nivel A para la identificación de B a c illu s

CATEGORÍA Seguridad

a n th r a c is

CARACTERÍSTICAS Bioseguridad de nivel 2 para el procesam iento de m uestras clínicas Prácticas de laboratorio de bioseguridad de nivel 3 para las m anipulaciones de todos los cultivos que podrían pro­ ducir aerosoles (corte, picado, torbellinos, etc.) Realice todo el trabajo en un gabinete de seguridad biológica

C aracterísticas de las colonias

Colonias de rápido crecim iento, de 2-5 mm de diám etro después de una incubación toda la noche a 35-37 °C Superficie “en vidrio esm erilado”, seca, no pigm entada, plana o ligeram ente convexa Bordes irregulares con proyecciones en “form a de com a” (colonia en cabeza de M edusa) Consistencia pegajosa y viscosa; cuando se tocan las colonias con un ansa, el crecim iento de las colonias se eleva com o clara de huevo batida No hem olíticas en SBA

Características microscópicas

Bacilos gram positivos grandes, únicos o en cadenas. Pueden volverse gram variables después de 72 horas Puede estar encapsulado en el m aterial clínico y en los m edios para hemocultivos Las esporas term inales/subterm inales no edem atizan la célula vegetativa (se pueden observar las esporas en la tin­ ción de Gram, la tinción de verde de m alaquita o mediante microscopio de contraste de fase) No se presentan esporas en material clínico a m enos que estén expuestos a concentraciones bajas de CO ,, com o las halladas en la atmósfera Las concentraciones más altas de C 0 2 inhiben la esporulación

Características claves

Bacilos grampositivos No hemolíticos Inmóviles Catalasa positivos Se presentan esporas cuando se cultiva en condiciones aerobias sin C O ,

ampicilina y cefalosporinas, pero la mayoría de las cepas de estas especies son sensibles a clindamicina, eritromicina, clo­ ranfenicol, aminoglucósidos y vancomicina.

Especies de Corynebacterium Introducción y taxonomía

El género Corynebacterium está compuesto por muchas espe­ cies, que incluyen el patógeno clásico C. diphtheriae, el agente causal de la difteria. Aunque la difteria es bastante infrecuente en los países desarrollados debido a la amplia vacunación de los individuos susceptibles, es una causa de morbimortalidad im­ portante, y, en ocasiones, se comunican brotes esporádicos en los Estados Unidos. Muchos de los microorganismos del géne­ ro Corynebacterium constituyen parte de la flora normal de la piel y las vías respiratorias altas.928 Estas mismas especies, así como otras especies de Corynebacterium y bacterias corinefor­ mes relacionadas, han comenzado a ser reconocidas como agentes importantes de enfermedad humana, sobre todo en huéspedes inm unodeprim idos.315925 La aplicación de técnicas moleculares a la caracterización de los bacilos grampositivos ha conducido a la descripción de varias especies nuevas de C orynebacterium aisladas en muestras clínicas humanas. Estos métodos incluyen análisis genéticos (secuenciación de rRNA y rDNA 16S, hibridación de ácidos nucleicos, etc.),

métodos quimiotaxonómicos (detección de ácidos micólicos, análisis de peptidoglucanos, estudios de ácidos grasos celula­ res, caracterización de menaquinona, espectroscopia infrarro­ ja por transformación de Fourier) y técnicas fenotípicas (pruebas fenotípicas convencionales, sistemas de identifica­ ción. pruebas de asim ilación de compuestos orgánicos, de­ tección de las enzimas preformadas glucosidasa o aminopepti­ dasa).75'207-646'665-706,749'872’911’926,927-973 El análisis de varias cepas corineformes sin nombre ha llevado a la asignación a géneros ya descritos (p. ej.. Corynebacterium, Arcanobacterium y A c ti­ nomyces) y a géneros nuevos (p. ej., Turicella, Cellulosimicrobium y D erm abacter). Se ha observado que cepas de grupos corineformes nuevos y de grupos de los CDC antes reco­ nocidas pertenecen a géneros de los que se pensaba que no incluían patógenos humanos (p. ej., Arthrobacter, B reviba c­ terium, Cellulomonas, M icrobacterium ). Los géneros que están relacionados con las especies de Corynebacterium comprenden los microorganismos nocardiformes (N ocardia , Streptomyces, Oerskovia, Rhodococcus, Rothia, Gordona, D ietzia, Tsukamurella), los actinomicetos facultativos y anaerobios (Actinom y­ ces, Arachnia), los “difteroides” anaerobios (Propionibacterium, Propioniferax) y los bacilos ácido-alcohol resistentes (M yco bacterium). En el cuadro 14-7 se encuentran descripciones quimiotaxonómicas y fenotípicas del género Corynebacterium y

de géneros corineformes relacionados en muestras clínicas humanas. Algunos de estos géneros serán explicados en este

Cuadro 14-6 C aracterísticas bioquímicas de las especies de A n eu rin ib a cillu s , grupo B acillus no B acillu s cereuSy B revibacillus , G eobacillu s y P aen ibacillu s aisladas en muestras clínicas humanas P R O D U C C IÓ N D E Á C ID O A P A R T IR D E LO CALIZA CIÓN DE LAS ESPORA S

CÉLULA CON TUM EFACCIÓN DE ESPORAS

Aneurinibacillus aneurinilyticus

Ovaladas

C/ST

+

+

Bacillus amyloliquefaciens

Ovaladas

C/T

-

+

Bacillus badius

Ovaladas

C/ST/T

Bacillus circulans

Ovaladas

ST/T

+

+

V-

Bacillus coagulans

Ovaladas

ST/T

+

+

V

Bacillus firm us

Ovaladas

ST

V

+

-

Bacillus lentus

Ovaladas

ST/C

V

+

-

ESPEC IE

flS illill!:

+

ND

ND

Ovaladas

ST/C

Bacillus megaterium

Ovaladas/esféricas

ST/C

Bacillus pumilis

Esféricas/ovaladas

ST/C

-

Bacillus sphericus

Esféricas/ovaladas

ST/T

+

+

ND -

l l l I I I iil;

HID R Ó ­ LISIS DE ALM IDÓN

G A SA PARTIR DE GLUCOSA

ARABINOSA

G L ICER O L

GLUCÓ­ GEN O

INULINA

MANI TO L

SALICINA

TREHA­ LOSA

ND

ND

¡ l l l l i ¡¡

ND

ND

ND

+

ND

ND

1131

ND

-

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-

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V

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+

V+

v-

V

+

-

+

+ ND

ND

-

HIDRÓLISIS DE GELATINA

+

+

Bacillus licheniformis

-

H ID R Ó ­ LISIS DE CASEÍNA

REDUCLEC IC IÓ N D E M OTI- TINASA, LIDAD EYA ADH INDOL NITRATO

FORM A DE LAS ESPORAS

V+

V

+

+

V+

V

V

+

ND V +

-

V

V—

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1

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V

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-

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+

+

ND

ND

ND

Brevibacillus brevis

Ovaladas

ST/C

+

+

ND

ND

ND

+

+

+

ND

ND

ND

Brebivacillus laterosporus

Ovaladas

ST/C

+

+

ND

ND

ND

+

+

+

ND

ND

ND

Geobacillus stearothermophilus

Ovaladas

ST/T

+

+

V

+

v+

+

Geohacillus thermodenitrificans

Ovaladas

ST

-

-

V

+

V-

Paenibacillus alvei

Ovaladas

ST/C

+

+

-

—

+

-

+

Paenihacillus mace mus

Ovaladas

ST/T

+

+

—

—

—

V

Paenibacillus polymyxa

Ovaladas

ST/C

+

+

Paenihacillus validus

Ovaladas

ST/T

+

+

Ovaladas/esféricas

ST/T

+

+

+

+

C, es p o ra d e lo c a liza c ió n ce n tra l; ST, e s p o ra d e lo c a liza c ió n su b term in a l; T, e s p o ra d e lo c a liza c ió n term in a l; +, p o s itiv a ; - , n e g a tiv a ; V, re a cc ió n v a ria b le ; V + , va riable, m a y o r ía d e c e p a s p o s itiv a s ; V -, va ria b le , m a y o r ía d e c e p a s n e g a tiv a s; N D , n o d isp o n ib le s; EYA , a g a r y e m a d e huevo; A D H , a rg in in a d ih id ro la sa .

Especies de Corynebacteríum

-

+

+

+

v+

ND

-

V

V

-

ST/C

-

-

+

ST/C

V

V

V+

Ovaladas

-

+

ND

Brevibacillus agri

+

+

+

+

Bacillus subtilis

V

+

ND

+

V-

V

V

Ovaladas

Virgibacillus pantothenticus

-

+ V

747

748

CAPÍTULO 14

G ÉN ER O

Características del género Corynebacterium y otros bacilos grampositivos corineformes

M O R FO LO G ÍA CELU LA R

CATALASA

M OTILIDAD

PIGM ENTACIÓN

CR EC IM IE N TO

M ETA BOLISM O DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

ÁCIDOS M IC Ó LIC O S

PEPTID O G LU CANO DIAM INOÁCIDO

M ENAQUINONAS

ÁCIDOS GRASOS CE LULA RES

CO M ENTA RIOS

Ninguna

Facultativo/Anaerobio

Fermentativo

Ausentes

L-lisina, L-omitina

MK-10(H4)

C16:0, C18:1(9C, ciclo), C 18:0

Cuatro especies, que incluyen el ex Actinomyces suis

Ninguna; ocasional­ mente rosa/roja

Facultativo/Anaerobio

Fermentativo

Ausentes

L-lisina, L-omitina

MK-10(H4)

C16:0, C18:1(9C, ciclo), 0 8 : 0

Cepas grupo 1, grupo 2, “similar grupo 1” y grupo E de los CDA, más otras especies de Actinomyces descritas antes

-

Ninguna

Facultativo

Fermentativo

Ausentes

L-lisina

MK-9(H4)

0 6 : 0 , 0 8 : 1 (9C, ciclo), 0 8 : 0

Cinco especies, que incluyen el ex Actinomyces bernardiae

+

V

Variable

Aerobio

Oxidativo

Ausentes

L-lisina

MK-8, MK-9, C15:0ai, C17:0ai, MK-9(H2) C15:0i

Algunas cepas grupos B-l y B-3 de los CDC

Ciclo bacilo-coco

+

~

Blanca levemente gri­ sácea, amarilla, ana­ ranjada, violeta

Aerobio

Oxidativo (inerte)

Ausentes

meso-DAP

MK-8(H2), MK-7(H2)

C15:0ai, C17:0ai, C16:0i

Algunas cepas grupos B-l y B-3 de los CDC

Cellulomonas

Bacilos irregulares; formas cócicas

+

V

Amarilla

Facultativo

Fermentativo/ oxidativo

Ausentes

L-om itina

MK-9(H4)

C15:0ai, 0 6 : 0

Grupo A-3 de los CDC (C. hominis); en la actualidad es poco clara la clasificación de 0. turbata como C. cellulans

Cellulosimicrobium

Bacilos irregulares; ciclo bacilo-coco

+

Blanco amarillenta

Facultativo

Fermentativo

Ausentes

L-lisina

MK-9(H4)

C15:0ai, C16:0i, 0 6 : 0 , C16:0i

Incluye Cellulosimicrobium cellu­ lans, antes Oerskovia xanthineolytica

Corynebacterium

Bacilos, bacilos con forma de palos

+

-

Ninguna, gris/blanca

Facultativo

Fermentativo/inerte

V (C22-C38)

meso-DAP

MK-9(H2), MK-8(H2)

0 8 :1 ,0 6 :0 , 0 8 :0

Especies de Corynebacterium

Dermabacter

Bacilos cortos o cocobacilos

+

-

Ninguna

Facultativo

Fermentativo

Ausentes

meso- DAP

MK-9, MK-8, C17:0ai, C15:0ai, MK-7 C16:0i

Grupos 3 y 5 de los CDC

Exiguobacterium

Bacilos irregulares y cortos con ciclo bacilo-coco

+

+

Anaranjada pálida, amarilla

Facultativo

Fermentativo

Ausentes

L-lisina

MK-7

Incluye E. acetylicum\ se asemeja a las cepas grupo A-4 de los CDC

Actinobaculum

Bacilos delgados rectos a ligeramente curvos; pue­ den mostrar cierta ramifi­ cación

Actinomyces

Bacilos, filamentosos, rami­ ficación

V

Arcanobacterium

Bacilos irregulares y cortos

V

Arthrobacter

Ciclo bacilo-coco

Brevibacterium

C17:0i, C15:0i, 0 6 :0

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

Cuadro 1 4 -7

G ÉNERO

M O R FO LO G ÍA CELULA R

CATALASA

M OTILIDAD

PIGM ENTACIÓN

C R EC IM IE N TO

M ETA BOLISM O DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

ÁCID OS M IC Ó LIC O S

p e p t id o g l u CANO DI AM INO ÁCID O

MENAQUINONAS

ÁCIDOS GRASOS CELU LA RES

COM ENTARIOS

Leifsonia

Bacilos pleomorfos que se fragmentan en bacilos y cocos más cortos; móviles a través de flagelos peri­ tricos

+

+

Amarillenta a amarilla intensa con el enve­ jecimiento

Aerobio

Oxidativo, fermenta­ tivo (de hidratos de carbono)

Ausentes

DL-ácido diaminobutírico

MK-11, MK-10

C15:0ai, C17:0ai, C16:0i

Incluye L. aquatica (antes “Corynebacterium aquaticum") y otras bacterias ambientales

Microbacterium

Bacilos irregulares y delga­ dos; algunas formas cócicas

+

V

Entre incolora y amarilla

Aerobio

Oxidativo/débilmente fermentativo

Ausentes

L-lisina

MK-12, MK-11, MK-10

C15:0ai, C17:0ai, C16:0i

Algunas cepas grupos A-4 y A-5 de los CDC; incluye las ex especies Aureobacterium

Oerskovia

Filamentos cocoides a rudi­ mentarios; vegetativos pero sin “hifas” aéreas

+

V

Amarillo

Facultativo/aerobio

Fermentativo

Ausentes

L-lisina

MK-9(H4)

C15:0, 16:0, Incluye Oerskovia turbata (Cellulomonas cellulans); 0 . C15:0i, C17:0ai jenensis (de los insectos) y 0. pauromeabola (del suelo)

Propionibacterium

Bacilos irregulares con rami­ ficación o extremos “bífidos”; algunas formas cócicas

V

Blanca/blanco grisácea

Anaerobio/facultativo

Fermentativo

Ausentes

LL-DAP

MK-9(H4)

0 5 : 0 , C15:0ai, C17:0ai

Suelen crecer mejor en condiciones anaerobias, sobre todo en aisla­ miento primario; producen una cantidad importante de ácido láctico a partir de glucosa

Propioniferax

Bacilos irregulares

+

Ninguna

Aerobio

Fermentativo

Ausentes

LL-A2pm

MK-9(H4)

C15:0ai, C16:0i

Incluye las especies únicas Propioniferax innocua (antes Propionibacterium innocuum)

Rothia

Bacilos irregulares con rami­ ficación rudimentaria

+

Blanca, blanco grisácea

Facultativo

Fermentativo

Ausentes

L-lisina

MK-7

C15:0ai, C17:0ai, C16.0

Incluye variantes de colonias blan­ cas y negras y grupo 4 de los CDC de corineformes fermenta­ tivos; otra cepa humana del género es R. mucilaginosa

Turicella

Bacilos irregulares

+

Ninguna

Aerobio

Inerte

Ausentes

meso-DAP

MK-10(H2), 0 8 :1 ,0 6 :0 , MK-11(H2) 0 8 :0

-

-

Especies únicas (71 otitidis) fenotí­ picamente similares a C. auris y C. afermentans

Especies de Corynebacterium

749

750

C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

capítulo, mientras que otros (p. ej., especies de Propionibacterium) se describen en capítulos ulteriores. El género Corynebacterium está compuesto por bacilos gram­ positivos pleomorfos con forma de porra o maza que son catalasa positivos, inmóviles, no esporulados y no ácido-alcohol resistentes. La mayoría de las especies de Corynebacterium con­ tienen ácidos micólicos, arabinosa y galactosa en sus paredes celulares.973 El peptidoglueano de las especies de Corynebac­ terium contiene ácido m eso-diam inopim élico (meso- DAP) como el diaminoácido componente. También se encuentran dis­ tintos ácidos grasos celulares y menaquinonas en sus membranas celulares (cuadro 14-5). Las descripciones clásicas de este géne­ ro incluyen su tendencia a formar disposiciones en “cerca” y en “letras chinas” sobre los extendidos teñidos con Gram (lámina en color 14-3A). La mayoría de las especies son facultativas y son fermentativas en su metabolismo de hidratos de carbono, aunque algunas son no fermentativas o utilizan los hidratos de carbono en forma oxidativa. Algunas especies también requie­ ren lípidos para un crecimiento óptimo (lipoñlia). Esta necesidad es sugerida por el crecimiento en medios que contienen lípidos (p. ej., SBA) y por un crecimiento escaso o nulo en agar choco­ late disponible en el comercio, que contiene polvo de hemina en lugar de eritrocitos lisados. El lipofilismo se demuestra mejor por el mayor crecimiento de estas especies en el medio que con­ tiene Tween 80 al 0,1-1% en comparación con el mismo medio que carece de ese compuesto. La aplicación de técnicas de “investigación” a la caracteriza­ ción de los microorganismos corineformes también ha creado problemas para el laboratorio clínico, donde los recursos de métodos de identificación genéticos y quimiotaxonómicos son limitados y la identificación fenotípica es la norma. Dos cepas clínicas pueden producir resultados idénticos en las pruebas fenotípicas (p. ej., un API Coryne), pero cuando se aplican métodos genéticos y quimiotaxonómicos pueden ser diferentes (p. ej., diferentes ácidos grasos celulares, diferentes diaminoá­ cidos en el peptidoglueano, etc.). Debido a la caracterización fenotípica limitada de muchos géneros ambientales (p. ej., especies de M ycobacterium ), la asignación de las cepas clíni­ cas a estos géneros es más difícil y, lamentablemente, menos precisa. Como resultado del progreso científico, la interpreta­ ción de las comunicaciones de los casos clínicos en relación con Corynebacterium o especies corineformes individuales se ha vuelto problemática porque las cepas descritas en estas comunicaciones no han sido rigurosamente caracterizadas. Identificación de especies de Corynebacterium y bacterias corineformes

La identificación de especies de Corynebacterium y otras bacterias corineformes se realizaba originariamente con pruebas fenotípicas de la misma forma que para otras bacterias faculta­ tivas. Con la aplicación de los métodos moleculares, ha aumen­ tado mucho la cantidad de especies en el género Corynebacte­ rium y géneros relacionados. Por lo tanto, el número de pruebas fenotípicas necesarias para la identificación aumentó también. Se realizan pruebas convencionales como para otros microorga­ nismos (p. ej., bacilos gramnegativos entéricos), con ciertas modificaciones. Los requerimientos de lípidos se determinan por la inoculación en superficie del microorganismo en un medio que no contiene lípidos (p. ej., agar de Mueller-Hinton, agar BHI, agar tripticasa soja) y colocando una gota de Tween 80 al 0,1% en el inoculo. Después de la incubación, las cepas lipofílicas muestran mayor crecimiento en el área de depósito de Tween y crecimiento escaso o nulo en las áreas alejadas del

Iípido. Las cepas no lipofílicas crecen en toda la superficie de agar (véase lámina en color 14-3B). Los medios de identifica­ ción convencionales (pruebas de utilización de hidratos de car­ bono) también pueden requerir el suplemento con tres a cuatro gotas de Tween 80 al 0,1-1% (por 5 mL de medios de caldo) para la identificación de las cepas lipofílicas. La cromatografía gas-líquido para la detección de productos volátiles y no volátiles de la fermentación de la glucosa tam­ bién es útil para identificar especies de Corynebacterium. Todos los taxones producen cantidades pequeñas a moderadas de ácidos acético, láctico y succínico a partir de la glucosa, pero algunas especies también producen una cantidad impor­ tante de ácido propiónico a partir de glucosa. Esta característi­ ca a menudo es útil para separar cepas que tienen perfiles bio­ químicos muy similares (p. ej., separación de C. amycolatum [propionato positivas] de C. striatum Lpropionato negativas]). En el recuadro 14-2 se enumeran las especies que producen ácido propiónico a partir de glucosa según se determine por cromatografía gas-líquido. Dos sistemas que tratan la identificación de bacilos grampo­ sitivos corineformes son el A PI Coryne® (BioMérieux, LaBalme-les-Grottes, Francia) y el R ap lD CB Plus® (Remel Laboratories, Lenexa, KS). El API Coryne® es un sistema de identificación que consta de un panel o galería de microcúpulas con once pruebas enzimáticas, ocho pruebas de fermentación de hidratos de carbono y una cúpula de control de fermenta­ ción. Se prepara una suspensión concentrada de microorganis­ mos (estándar de McFarland #6 o mayor) en agua y se la colo­ ca en las cúpulas de prueba de enzima (nitrato [NIT] a través de gelatina [GEL]). Se coloca luego una alícuota de 0,5 mL de esta suspensión en el medio GP (medio enriquecido con indi­ cador de rojo fenol) provisto; esto se utiliza para llenar el con­ trol de hidratos de carbono y las cúpulas de prueba (O a GLYG). Se cubre cada una de las últimas cúpulas con vaselina estéril. Se incuba la tira durante 24-48 horas en una incubado­ ra sin CO,. Se agregan los reactivos A y B a la cúpula de nitra­ to y los reactivos ZYM A y ZYM B a las cúpulas de enzimas (pirazinamidasa [PYZ] a [3-N-acetilglucosaminidasa [P-NAG]); estas reacciones se leen después de 10 minutos. Las pruebas de esculina (ESC), ureasa (URE), GEL e hidratos de carbono se leen directamente sin el agregado de reactivos. A partir del patrón de reacciones en la tirita, se genera un biocódigo que se interpreta consultando el API Coryne Analytical Profile Index o haciendo entrar el biocódigo en el API Computer Service por teléfono. Las evaluaciones del API Coryne versión 1 en 1991 obser­ varon que desde el 65% al 86,5% de las especies de Corynebacterium eran identificadas correctamente sólo con el sistema. Desde el 21,8% hasta el 31,8% de las cepas eran iden­ tificadas con pruebas adicionales (p. ej., producción de pig­ mento, motilidad, crecimiento en NaCI al 6,5%, prueba CAMP, hemolisis, crecimiento a 42 °C).282’833 Esta versión identificó sólo el 36,4% de 22 bacterias corineformes de los CDC carac­ terizadas sin pruebas adicionales.333 La base de datos API Coryne fue actualizada en 1997 para incluir algunos taxones recién descritos y para reflejar los cambios en la taxonomía. Funke y cois, evaluaron el API Coryne versión 2,0 con 390 cepas que representaban los 49 taxones incluidos en la nueva base de datos más 17 cepas pertenecientes a taxones no inclui­ dos.310 El sistema identificó el 90,5% de las cepas pertenecien­ tes a los taxones incluidos, y se requieren pruebas adicionales para la identificación correcta del 55,1% de todas las cepas eva­ luadas. Sólo 5,6% de las cepas no fueron identificadas y 3,8% fueron mal interpretadas. El API Coryne requiere un inoculo

Especies de C orynebacteríum

R ecuadro 1 4 -2

751

M ie m b ro s d e l g é n e ro C orynebacteríum

Especie

Importancia clínica e identificación

C orynebacterium accolens

C. accolens, descrito por Neubauer y cois, en 1991, ha sido aislado en muestras clínicas humanas, que incluyen secreción de heridas, muestras endocervicales, esputo e hisopados de fauces.29 Las cepas similares remitidas a los CDC de muestras clínicas fueron denominadas antes corineformes grupo 4 de los CDC. Este microorganismo fue observado inicialmente por su crecimiento satélite alrededor de una estría de Staphylococcus aureus en agar sangre, pero el subcultivo repetido del microorganismo condujo a la adaptación al crecimiento lejos de la estria del estafilococo. No se observó ningún creci­ miento alrededor de los discos impregnados con factor X o factor V o entre ellos. El crecimiento satélite probablemente se debió al cumplimiento del requerimiento líquido por la acción de los estafilococos sobre los eritrocitos en el agar sangre de cam ero (SBA). Se ha comunicado un solo caso de endocarditis de válvula mitral y aórtica nativas causado por C. acco­ lens.'59 C. accolens es una especie lipoíílica que forma colonias pequeñas (< 0.5 mm de diámetro), grises, üsas, transpa­ rentes, no hemolíticas en SBA después de 48 horas de incubación. Reduce el nitrato pero no hidroliza la esculina ni pro­ duce ureasa. Al igual que la mayoría de las otras corinebacterias, la m ayoría de las cepas de C. accolens dan positiva la reacción de pirazinamidasa; sin embargo, no se produce fosfatasa alcalina. Fermentan glucosa y ribosa, y algunas cepas también producen ácido a partir de sacarosa o manitol. Las cepas de esta especie son sensibles a penicilina, cefalospori­ nas, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y aminoglucósidos, y son resistentes al sulfametoxazol.159-629 Los m icroorganism os pertenecientes al grupo ANF-1 de los CDC fueron descritos por prim era vez en 1981. Estos microorganism os son bacilos gram positivos pleom orfos que no producen ácido a partir de ningún hidrato de carbono, de ahí el nombre ANF, que significa “no ferm entador absoluto” . Han sido aislados en hem ocultivos y muestras del oído; sin embargo, su im portancia clínica no es clara. Riegel y cois, exam inaron las características genéticas y bioquím icas de 11 cepas de ANF-1 y propusieron una nueva especie, Coiynebacterium afermentans. que contiene dos subespecies. C. afermentans subespecie afermentans y C. afermentans subespecie lipophilum.™ L a prim era subespecie crece igual­ mente bien tanto en ausencia com o en presencia de Tween 80 al 1%, aunque las colonias adquieren una pigm entación m arrón clara en m edios que contienen Tween. Las últim as subespecies forman colonias muy pequeñas en SBA después de 24 horas, pero producen grandes colonias de color m arrón claro en SBA con suplemento de Tween 80. Fuera de los requerim ientos de líquido, estos m icroorganism os son bioquím icam ente inertes excepto por las reacciones de pirazina­ m idasa (PYZ) y de fosfatasa alcalina (PAL) positivas. Desde el punto de vista fenotípico, C. afermentans subespecie afermentans se asem eja a las otras dos especies de corineform es -Corynebacteríum auris y Turicella o titid is- ambas asociadas con otitis media. Todas producen el m ism o biocódigo en el A PI Coryne (biocódigo 2100004). Estos tres m icroorganismos pueden ser diferenciados sobre la base de la m orfología de las colonias, la prueba de CAMP, las acti­ vidades de DNAsa y leucina arilam idasa (LAP). C. afermentans subespecie lipophilum tam bién produce el m ism o bio­ código A PI y es la única especie lipofílica que puede ser prueba de CA M P positiva. Sewell y cois, com unicaron el pri­ m er caso de endocarditis de válvula protésica por C. afermentans subespecie lipophilum en un hom bre de 76 años.789 El m icroorganism o fue aislado en 5 de 15 hem ocultivos BACTEC y de un absceso perivalvular. L a cepa era sensible a penicilina, ampicilina, vancom icina, cefazolina, ceftriaxona, gentamicina, eritrom icina, ciprofloxacina e im ipenem , y era resistente a clindam icina y trim etoprim -sulfam etoxazol. C. afeimentans subespecie lipophilum tam bién ha sido des­ crito com o causa de un absceso encefálico y otro hepático en un hombre de 39 años antes sano.237 C. afermentans subespecie afermentans también ha sido docum entado com o causa de sepsis luego de neurocirugía.505 Véase el texto.

Corynebacteríum afermentans subespecie afermentans. Corynebacteríum afermentans subespecie lipophilum

Corynebacteríum amycolatum Corynebacteríum appendicis

Corynebacteríum argentoratense

Corynebacteríum atypicum

C. appendicis es una especie recién descrita que fue aislada en una herida posquirúrgica en un paciente con apendicitis.977 Desde el punto de vista genotípico, esta nueva especie está m ás estrechamente relacionada con C. afermentans, C. covleae y C. lipophiloflavum. Esta especie lipofílica da reacciones positivas de pirazinam idasa, fosfatasa alcalina y ureasa y produce ácido a partir de glucosa y m altosa sólo dentro de los 7 días (reacciones API Coryne). El lactato es el principal producto de la ferm entación de la glucosa. C. argentoratense fue denom inado así por Argentoratum, nombre latino de Strasbourg. Francia, donde se lo aisló.732 Las cuatro cepas originales fueron aisladas en cultivos faríngeos'hum anos en pacientes con amigdalitis, pero no se conoce el papel de estas bacterias en la enfermedad. Esta especie está estrecham ente relacionada con m iembros del “grupo de C. diphtheriae” (C. diphtheriae, C. pseudotuberculosis y C. ulcerans) y con C. kutscheri. Debido a la similitud genéti­ ca con el "grupo de C. diphtheriae”, estas cepas fueron exam inadas para detectar la presencia del gen del P-corinefago, pero no se lo detectó en ninguna de las cepas. C. argentoratense es no lipofílico, form a colonias no hem olíticas, blanco grisáceas crem osas en SBA y produce rápidam ente ácido a partir de glucosa, fructosa y, ocasionalm ente, ribosa.732 No reduce el nitrato y no hidroliza la urea, la esculina ni la gelatina. Da positiva la reacción de pirazinam idasa, pero la m ayoría de las cepas dan pruebas de fosfatasa alcalina negativas. Este m icroorganism o se asem eja a C. coyleae salvo que este últim o es fuertemente prueba de CAM P positiva y acidifica ribosa, m ientras que C. argentoratense es prueba de CA M P negativa y es variable en la ferm entación de ribosa. Al igual que C. amycolatum, C. argentoratense produce ácido propiónico a partir de la ferm entación de la glucosa. La descripción de C. atypicum corresponde a una única cepa obtenida de una fuente hum ana no descubierta.385 La cepa era no lipofílica, no hem olítica y no hidrolizaba esculina. gelatina ni almidón, y era leucina am inopeptidasa positiva. A diferencia de la m ayoría de las especies de Corynebacteríum. las pruebas de pirazinam idasa y de fosfatasa alcalina fue­ ron negativas. Se produce ácido a partir de glucosa, maltosa, sacarosa y ribosa. Esta nueva especie, al igual que C. amycolatum y C. kroppenstedtii, carece de los ácidos m icólicos de la pared celular. Al igual que C. glucuronolyticum, esta especie produce (3-glucuronidasa ((3-GUR), y otras pruebas enzim áticas en el A PI Coryne son negativas. El código API singular para esta especie atípica es 0200365. (Continúa)

752

C A P ÍT U L O 14

R ecuadro 1 4 -2

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

M ie m b ro s d e l g é n e ro C o ryn eb acteriu m (co n t.)

Especie

Importancia clínica e identificación

Corynebacterium aurimucosum

Esta especie ha sido aislada en m uestras clínicas humanas, que incluyen hemocultivos de un paciente con bronquitis.976 El m icroorganism o crece com o colonias pegajosas y ligeram ente am arillas en SBA. En el API Coryne, las pruebas de pirazinam idasa y fosfatasa alcalina son positivas y se produce ácido a partir de glucosa, maltosa y sacarosa, lo que con­ duce al biocódigo API Coryne 2100125. El ácido láctico es el principal producto de la ferm entación de la glucosa. Desde el punto de vista genotípico y fenotípico, C. aurimucosum se asem eja estrechamente a C. minutissimum. El per­ fil API Coryne. 2100125 es el mismo para ambas especies, excepto que C. aurimucosum produce colonias amarillas y es hidrólisis de hipurato positivo, mientras que C. minutissimum crece com o colonias blanco grisáceas y es hipurato negativo. En 2004, D aneshvar y cois, com unicaron sobre cepas con pigm ento negro carbón de m uestras del aparato genital que fueron designadas provisoriam ente com o grupo corineform e ferm entativo 4 de los CD C .202 Estas cepas fue­ ron relacionadas a nivel de especie con C. aurimucosum y C. nigricans, las cuales fueron aisladas originariam ente en muestras del aparato genital femenino. Debido a estas cepas y su estrecha relación con C. aurimucosum, la descripción de este m icroorganism o ha sido enm endada para incluir no sólo los tipos originales de colonias (“pegajosas, ligeram en­ te am arillentas” ) sino tam bién estas variantes con pigm ento negro carbón. C. nigricans se considera actualm ente un “pro sinónim o” de C. nigricans. Algunas bacterias del grupo A N F -1 de los CDC aisladas en pacientes pediátricos con infecciones óticas han sido caracte­ rizadas y asignadas al género Corynebacterium com o subespecies de C. afermentans (véase antes).726 Otras cepas cori­ neform es aisladas en muestras óticas que se asem ejan fenotípicam ente a los m icroorganism os del grupo AFN-1 de los CDC. pero que son genética y quim iotaxonóm icam ente distintos (bacterias “similares a AFN-1”), han recibido el nom ­ bre Turicella otitidis.m m Funke y cois, también informaron sobre el aislamiento de 10 cepas identificadas como grupo “sim ilar a A FN -1” de los CDC, pero que eran distintas tanto de las subespecies de C. afermentans com o de T. otitidis por la m orfología celular y el aspecto de las colonias.298 Las colonias eran secas, débilm ente adherentes al agar y se volvieron ligeram ente am arillas con el tiempo, m ientras que las colonias de C. afermentans y de T. otitidis eran crem o­ sas, lisas y blanco grisáceas. Estas cepas eran fenotípicam ente similares tanto a C. afermentans subespecie afermentans com o a T. otitidis utilizando pruebas bioquím icas comunes. Sin embargo, pudieron ser diferenciadas por distintos sus­ tratos en el sistem a de identificación BIOLOG. El análisis genético confirmó que las 10 cepas eran una nueva especie de Corynebacterium y se propuso el nombre Corynebacterium auris (“auris” se refiere al oído). C. auris crece como colonias no lipofílicas, no hem olíticas, secas, adherentes y am arillentas en SBA y, com o m encionam os, produce reac­ ciones en pruebas fenotípicas com unes que son idénticas a C. afermentans subespecie afermentans y T. otitidis. Sin embargo, tanto C. auris com o T. otitidis son fuertem ente prueba de CAM P positivos, m ientras que C. afermentans es prueba de CA M P variable.298 Adem ás, las especies de C. afermentans y C. auris son D N asa negativas, mientras que T. otitidis es DNasa positivo. Se puede detectar actividad de leucina arilam idasa (LAP) en T. otitidis y C. auris, mientras que C. afermentans subespecie afermentans es LAP negativo.718 En el API Coryne, el biocódigo num érico para C. auris es 2100004. Un estudio de 48 cepas de C. auris m ostró que todas eran resistentes a la penicilina y la CIM 50% era de 1 |ig/m L .306 Estas cepas tam bién fueron más sensibles a cefalotina que a ceftriaxona. Todas las cepas de C. auris eran sensibles a cloranfenicol, ciprofloxacina. gentam icina. rifam picina y tetraciclina. Se observó resistencia sim ultánea a la clindam icina y la tetraciclina en el 30% de las cepas. Esta especie lipofílica se asocia principalmente con ganado bovino, aunque se han docum entado raras infecciones hum a­ nas.77-315 C. bovis es una especie lipofílica que es pirazinam idasa negativa, fosfatasa alcalina y ureasa positiva, y produ­ ce ácido sólo a partir de glucosa. Algunas cepas raras son tam bién débilm ente m altosa positivas, aunque esta reacción es negativa en API Coryne. El perfil API Coryne para C. bovis es 0 1 0 1 104.77 C. confusum es una especie nueva que ha sido aislada en un absceso plantar, osteom ielitis del calcáneo y sangre.302 La cepa de los hem ocultivos fue aislada en un hombre no inmunodeprim ido de 20 años durante un episodio febril luego de una cirugía del dorso. Este m icroorganism o es no lipofílico y produce una reacción ácida retardada a partir de glu­ cosa (la cúpula GLU en el API Coryne fue positiva sólo después de 48-72 horas de incubación). La falta de prolonga­ ción de la incubación de la banda API Coryne luego de 24 horas condujo a la identificación de estas cepas como C. propinquum (véase m ás adelante), pero estas cepas no hidrolizaban tirosina (C. propinquum es hidrólisis de tirosina positivo). C. confusum reduce nitrato a nitrito, produce pirazinam idasa y fosfatasa alcalina, no hidroliza esculina ni urea y es prueba de CAM P negativo. Todas las pruebas enzimáticas API son negativas. En el API Coryne, los códigos generados por este m icroorganism o son 3100304 o 3100104, lo que indica que algunas cepas son tam bién ribosa posi­ tivas. En la com unicación original, las cepas de C. confusum fueron sensibles a penicilinas, cefalosporinas, am inoglu­ cósidos, tetraciclinas, quinolonas y glucopéptidos, y tenían una sensibilidad variable a rifam picina y macrólidos.302 Todas las cepas eran resistentes al aztreonam. C. coyleae ha sido aislado en m uestras de líquido pleural, abscesos m amarios, muestras del aparato genitourinario y hemocultivos de pacientes con fiebres de origen desconocido secundarias a trastornos subyacentes (p. ej„ SIDA, ciru­ gía).308 Las colonias de C. coyleae son no lipofñicas. no hem olíticas en SBA. de consistencia crem osa a pegajosa y tie­ nen aproxim adam ente 1 mm de diám etro después de 24 horas de incubación. El microorganismo es pirazinam idasa. fosfatasa alcalina y prueba de CAM P positivo, y produce ácido a partir de glucosa, ribosa, fructosa y mañosa. La m ayoría de las cepas producen números de biocódigos 2100304 o 6100304. El último biocódigo es el m ism o que para C. jeikeium. pero C. coyleae es no lipofílico y no muestra resistencia múltiple a los antibióticos. Las seis cepas de C. coyleae descritas en la comunicación original eran sensibles a ampicilina, am oxicilina clavulanato. cefalotina.

Corynebacterium auris

Corynebacterium bovis

Corynebacterium confusum

Corynebacterium coyleae

Especies de C orynebacteríum

R ecuadro 1 4 -2

7 53

M ie m b ro s d e l g é n e ro C oryn eb acteríu m (cont.)

Especie

Corynebacterium diphtheriae Corynebacteríum durum

Corynebacterium falsenii

Corynebacterium freneyi

Corynebacterium glucuronolyticum ( “Corynebacterium semin ale”)

Corynebacterium imitans

Importancia clínica e identificación ceftriaxona, cefuroxima, ciprofloxacina. eritromicina, gentam icina, imipenem. penicilina G. rifampicina, tetraciclina, vancomicina y teicoplanina. Cuatro de las seis cepas fueron sensibles a la clindamicina. Véase el texto. C. durum es una especie recién descrita que ha sido aislada en cultivos faríngeos de individuos sanos y en esputo y muestras de lavado de huéspedes inmunodeprim idos (neoplasias, leucemia, insuficiencia renal).728-928 En cultivo, este m icroorganism o no lipofílico produce pequeñas colonias de color marrón claro que son adherentes al agar, aunque no todas tienen este aspecto. En las tinciones de Gram. las células son largas, pleom orfas y a veces filamentosas, y se ase­ mejan algo a la m orfología celular de C. matruchotii, pero carecen del aspecto de “látigo” característico de las últimas especies. La m ayoría de las cepas de C. durum son fosfatasa alcalina y PYR negativas. La esculina es hidrolizada débilm ente y la hidrólisis de urea es lentam ente positiva o negativa. C. durum también es una de las pocas especies de Corynebacterium que fermenta fuertem ente tanto m anitol como galactosa, lo que ayuda a diferenciarlo de C. matru­ chotii, que no fermenta a estos hidratos de carbono. En la tira de A PI Coryne, C. durum produce perfiles num éricos singulares (3000135, 3001135, 3040135, 3400115, 3400135, 3400305, 3400325, 3400335, 3040325, 3040335, 3440335, 3441335) aun cuando este m icroorganism o no está incluido en la base de datos de ese sistema.61 Los datos sobre la sensibilidad a los antibióticos de esta nueva especie no se encuentran disponibles. C. falsenii fue descrito en 1998 por Sjoden y cois, en la Universidad de Goteborg, Suecia.813 Las cepas fueron obtenidas de hemocultivos (tres) y cultivos de líquido cefalorraquídeo (una). Dos de las m uestras de hemocultivos provinieron de pacientes con linfom a maligno y leucemia linfática, respectivamente. Estas cepas eran no lipofílicas y desarrollaron una pigm entación amarilla definida después de 72 horas; la incubación prolongada más allá de este tiempo condujo a una pigm entación más intensa. No reducían el nitrato y no hidrolizaban la esculina. Las cuatro cepas ferm entaban len­ tam ente la glucosa, mientras que una cepa única tam bién produjo una reacción ácida lenta con maltosa. La urea con­ vencional fue hidrolizada después de una incubación de toda la noche y la cúpula de ureasa del API Coryne se volvió positiva sólo después de 48 horas de incubación. Estas cepas fermentativas no lipofílicas eran genética y quimiotaxonóm icam ente distintas, y se propuso el nombre C. falsenii. Desde la descripción de C. falsenii en m uestras clínicas hum anas, también se han aislado cepas similares en las bocas de águilas, junto con una segunda cepa no lipofílica (C. aquilae).267 En el API Coryne, los biocódigos para C. falsenii incluyen 2101104 y 2101304. Algunos biocódigos API Coryne para este microorganismo son idénticos a aquellos para C. jeikeium (2100304, 2100324), pero las cepas de C. falsenii serán am arillentas y no lipofílicas. Las cepas de C. falsenii son sensibles a cefalotina. ciprofloxacina, eritrom i­ cina, gentam icina, imipenem, rifampicina, tetraciclina, cefetam et y ceftibuteno y resistentes al aztreonam. Las CIM para penicilina variaron desde 0,25 hasta 0,50 ng/mL. Esta nueva especie comprende cinco muestras clínicas de sangre, heridas, abscesos y una m uestra de semen.46-716 Las cepas de C. freneyi están relacionadas genéticam ente con C. xerosis y C. amycolatum y pueden ser diferenciadas desde el punto de vista fenotípico de ellos por asimilaciones de fuentes de carbono y algunas características bioquím icas. Las colonias son blancas, secas, tienen 0,5 a 1 mm de diám etro después de 24 horas de crecimiento, son no hem olíticas y no lipofílicas. Al igual que C. xerosis, las cepas de C. freneyi son a-glucosidasa positivas. C. freneyi puede crecer a 20 °C, ferm enta la glucosa a 42 °C y no acidifica el etilenglicol, m ientras que las cepas de C. xerosis no crecen a 20 °C y no ferm entan glucosa a 42 °C; algunas acidifican el etilenglicol. La capacidad de C. freneyi para crecer a 20 °C tam ­ bién ayuda a diferenciarlo de C. amycolatum, que no es capaz de crecer a 20 °C. C. striatum y C. minutissimum tam ­ bién pueden asem ejarse a C. freneyi, pero C. striatum crece a 20 °C, ferm enta la glucosa a 42 °C y acidifica el etilen­ glicol. C. minutissimum fermenta la glucosa a 42 °C, pero no crece a 20 °C y no acidifica el etilenglicol. En el API Coryne, C. freneyi proporciona un biocódigo de 3110325, que corresponde a una identificación cruzada C. striatum/C. amycolatunr, estas especies pueden ser separadas mediante las pruebas descritas antes. Esta especie es un corineform e no lipofílico que ha sido aislado en pacientes varones con infecciones genitourinarias y de m uestras de sem en de pacientes con prostatitis.289-733 También se halló en el semen de cerdos y en secreciones uteri­ nas y vaginales de cerdas.218 El análisis filogenético de estas cepas definió un taxón distinto estrechamente relacionado con T. otitidis. Este microorganismo produce colonias blanco grisáceas a ligeramente amarillas y no hem olíticas en SBA (véase lám ina en color 14-4G y H). Aunque algunos resultados de las pruebas fenotípicas son variables (reduc­ ción de nitrato, hidrólisis de esculina, ureasa), la mayoría de las cepas son fuertem ente prueba de CAM P positivas y 0glucuronidasa (p-GLU) positivas (véase lám ina en color 14-5A y B). En crom atografía gas-líquido de los m edios de cultivo enviados, esta especie tam bién produce ácidos propiónico, láctico y succínico a partir de glucosa. En general, las cepas suelen ser sensibles a P-lactámicos, am inoglucósidos, rifam picina y vancomicina; algunas cepas son resisten­ tes a tetraciclina, doxiciclina, eritrom icina, clindam icina y algunas quinolonas (p. ej., ciprofloxacina, norfloxacina) 289.396,733 Qtro grupo de investigadores también describió este microorganismo y lo denom inó “Corynebacterium seminóle", pero se ha dado precedencia al nombre C. glucuronolyticum,733 C. imitans ha sido aislado en cultivos faríngeos de pacientes con sospecha de difteria en Polonia.291 Además del caso ini­ cial, un varón de 5 m eses de edad, se com unicaron luego otros siete casos, todos los cuales tuvieron contacto con el caso inicial. Se aisló un m icroorganismo “sim ilar a C. diptheriae” del caso inicial y de tres de los otros casos. Todas las cepas fueron negativas para la toxina diftérica tanto por pruebas con animales com o por el método de Elek. Dos m étodos de PCR independientes no pudieron dem ostrar la presencia de ninguna porción del gen tox en ninguna de las cepas. Como éstas no producían toxina diftérica, los autores creyeron que no eran la causa de la enfermedad y que

(Continúa)

754

C A P ÍT U L O 14

R ecuadro 1 4 -2

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

M ie m b ro s d e l g é n e ro C oryn eb acteriu m (cont.)

Especie

Corynebacterium jeikeium Corynebacterium kroppenstedtii

Corynebacterium lipophiloflavum

Corynebacterium macginleyi

Corynebacterium matruchotii

Importancia clínica e identificación habían equivocado el diagnóstico, aunque había ocurrido probablem ente la transm isión persona a persona. C. imi­ tans no es una especie lipofílica que pueda ser distinguida fácilm ente de C. diphtheriae. A diferencia de esta últi­ ma, C. imitans da pruebas débilm ente positivas de pirazinam ida, negativa de a-glucuronidasa y prueba de CAM P positiva, mientras que C. diphtheriae da pirazinam idasa negativa, a-glucuronidasa positiva y prueba de CAM P negativa. Las cuatro cepas de la com unicación inicial produjeron núm eros de perfil idénticos en el API Coryne (2100324).291 C. imitans pudo ser diferenciado de C. striatum y de C. minutissimum/C. amycolatum por la ferm en­ tación de la m altosa y la prueba de CAMP, respectivamente. Lactato y succinato son los únicos productos de la ferm entación de la glucosa por C. imitans. mientras que tanto C. amycolatum com o C. diphtheriae producen prin­ cipalm ente ácido propiónico. Las cuatro cepas descritas en la comunicación inicial fueron sensibles a los antibióti­ cos, salvo aztreonam. clindamicina, eritrom icina y azitromicina.291 Véase el texto. La descripción de C. kroppenstedtii se basa sobre una sola cepa hum ana que aislada en el esputo de una m ujer de 82 años con enfermedad pulm onar.167 El análisis de la pared celular puso de manifiesto la presencia de meso-DAP y arabinogalactano, y el análisis de secuencia de rRNA 16S apoyó la inclusión de este m icroorganism o en ei género Corynebacterium. Sin embargo, esta especie carece de los ácidos m icólicos de la pared celular, lo que la convierte junto con C. amycolatum en los únicos dos m iem bros del género que carecen de los ácidos micólicos de la pared celular. Los estudios recientes sugieren que este m icroorganism o tiene vinculación con la patogenia de la mastitis granulom atosa femenina.670'678 C. kroppenstedtii es una especie lipofílica que produce colonias grises, no pigm en­ tadas, ligeramente secas o lisas en agar sangre. Las colonias suelen tener m enos de 0,5 mm de diám etro después de 24 horas de incubación. Este microorganism o da una prueba de esculina positiva, de ureasa y nitrato reductasa negativas, y la prueba de CAM P negativa. Se produce ácido a partir de glucosa, sacarosa y m altosa (reacción débil). Los biocódigos A PI Coryne para esta cepa son 2040105 o 2040125, según la interpretación de la reacción de maltosa. C. kroppenstedtii no crece a 42 °C. Las pruebas in vitro de la única cepa mostraron sensibilidad a penicilina, cefuroxima, clindam icina, eritrom icina y vancom icina.167 Durante una investigación de microorganism os involucrados en la patogenia de la vaginosis bacteriana, Funke y cois, aislaron un m icroorganism o corineform e antes no descrito en la vagina de una m ujer de 32 años con este diagnóstico clínico.296 Esta cepa cum plía los criterios iniciales de ser m iem bro del género Coiynebacterium, tenía una pigm entación am arilla intensa y mostró requerimientos de lípidos para su crecimiento. El m etabolism o del m icroorganism o era oxidativo. no producía ácido a partir de hidratos de carbono y era ureasa positivo después de 24 horas en caldo de ureasa. El API Coryne produjo el m ism o número de perfil que C. urealyticum (perfil #2101004). Sin embargo. C. urealyticum da rápidamente una reacción de ureasa positiva (el agar urea, las porcio­ nes en pico de flauta de Christianson se vuelven notablemente positivos en minutos) y no es pigm entado. Además, esta nueva cepa era am pliam ente sensible a P-lactámicos, macrólidos, clindam icina y am inoglucósidos, mientras que C. urealyticum suele ser m ultirresistente a estos antibióticos. El papel de esta cepa, si es que existe alguno, en la patogenia de la vaginosis bacteriana es poco claro. Se ha propuesto el nom bre C. lipophiloflavum para esta corinebacteria atípica. Esta especie fue propuesta luego del examen genético de 51 cepas corineform es lipofílicas (13 cepas de referencia y 38 cepas clínicas) que mostraban patrones bioquím icos heterogéneos.731 Se han aislado cepas de C. macginleyi principalmente en muestras oculares de pacientes con conjuntivitis y úlceras corneales.303-335'468 También se lo aisló en la orina de un paciente con un catéter perm anente y en hemocultivos obtenidos de un paciente con sepsis rela­ cionada con el catéter.226-918 Las cepas de C. macginleyi son similares a algunas cepas lipofílicas corineform es del grupo G -l de los CDC. En SBA. el m icroorganism o forma colonias puntiform es después de 48 horas; en SBA con suplemento de Tween 80 al 0,1% , se producen grandes colonias m arrón rojizas. Las concentraciones más altas de Tween 80 (1% frente a 0,1% ) pueden ser algo inhibidoras del crecim iento de algunas cepas. C. macginleyi es fos­ fatasa alcalina positivo, pero es pirazinam idasa negativo (al igual que C. diphtheriae, C. pseudotuberculosis y C. ulcerans). Se produce ácido a partir de glucosa, sacarosa y manitol, y no se produce ácido propiónico a partir de la ferm entación de la glucosa. En general, las cepas son susceptibles a una am plia gama de antibióticos. Este m icroorganismo fue denom inado antes Bacterionema matruchotii y trasladado al género Corynebacterium en 1983.164 C. matruchotii es parte de la flora normal de los seres humanos y de los anim ales y ha sido aislado en raras ocasiones en casos de endoftalm itis y úlceras corneales en pacientes inmunodeprim idos.950 Aunque pueden aparecer en la tinción de Gram com o bacterias corineform es típicas, tam bién pueden aparecer con form a de “láti­ go” en la tinción y m ostrar una ram ificación rudim entaria.188 Las colonias de C. matruchotii tam bién son atípicas en com paración con otros corineform es, pequeñas y planas. C. matruchotii es no lipofílico, produce pirazinam ida­ sa pero no fosfatasa alcalina, reduce nitrato a nitrito y suele ser esculina positivo. Se produce ácido a partir de glu­ cosa, maltosa, sacarosa y ribosa. El análisis reciente de varias cepas ATCC de C. matruchotii puso en evidencia que algunas eran en realidad miem bros de la especie recién descrita C. durum.61 Aunque no están incluidas en la base de datos API Coryne, se ha observado que las cepas de C. matruchotii genuinas producen biocódigos API Coryne 7000325, 7010325 o 7050325. La cepa ATCC original de C. matruchotii (ATCC #43833) es distinta de las cepas de C. matruchotii verdaderas por análisis de secuencia de rDNA 16S. Esta cepa se denom ina ahora “cepa sim ilar a C. matruchotii” y arroja el biocódigo 2140325 en el A PI Coryne.61

Especies de C orynebacterium

R ecuadro 1 4 -2

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M ie m b ro s d e l g é n e ro C oryn eb acteriu m (cont.)

Especie

Importancia clínica e identificación

Corynebacterium minutissimum

C. minutissimum es una especie no lipofílica de im portancia clínica incierta porque la m ayoría de los casos com uni­ cados no contienen suficientes datos fenotípicos com o para descartar otras especies, sobre todo C. amycolatum?*0 Desde el punto de vista histórico, C. minutissimum se asocia con eritrasma, una infección cutánea superficial caracterizada por pequeños parches maculares rojo parduscos, por lo general en las zonas intertriginosas. Las lesiones pueden ser pruriginosas y escamosas o la infección puede ser asintomática. Las com unicaciones de casos que implican a “C. minutissimum" com o agente etiológico incluyen abscesos profundos recurrentes del tejido mam ario, baeteriem ia asociada con mielom a múltiple, infección de heridas quirúrgicas posdiscectom ía/posfusión vertebral, pielonefritis pediátrica, absceso costocondral, sepsis polim icrobiana relacionada con catéter venoso cen­ tral y peritonitis asociada con diálisis peritoneal ambulatoria continua.5374140189'268'348-751 Van Bosterhaut y cois, com unicaron el aislamiento de cepas m ultirresistentes de “C. minutissimum” de hemocultivos en un hom bre de 60 años sometido a tratam iento por una leucemia linfocítica, un paciente en hem odiálisis de 50 años y una m ujer de 77 años en diálisis peritoneal por insuficiencia renal crónica.904 Era muy probable que estas cepas fueran C. amy­ colatum, dado que se produjo ácido propiónico a partir de la ferm entación de la glucosa y el m icroorganism o era m ultirresistente a los antibióticos. Las verdaderas cepas de C. minutissimum crecen como colonias lisas, húmedas, blanco grisáceas y no hem olíticas en SBA, al contrario de las colonias cerosas de C. amycolatum ,988Desde el punto de vista fenotípico, este m icroorganism o se asem eja estrechamente a C. aitrimucosum 9,6 Se produce ácido a partir de glucosa y maltosa; la m ayoría de las cepas acidifican tam bién la sacarosa. No se produce ácido a partir de glucógeno, inulina, lactosa, mañosa, ribosa, sorbitol, trehalosa o xilosa. Las pruebas de pirazinamidasa, fosfatasa alcalina y leucina arilam idasa son positivas. Las cepas de C. minutissimum tam bién producen acetoína, son PYR negativas y pocas veces son prueba de CAM P positivas. También son DNasa positivas y producen ácido láctico y succínico a partir de glucosa, mientras que las cepas de C. amycolatum son DN asa negativas y producen ácido lác­ tico y propiónico a partir de glucosa.940,988 C. mucifaciens ha sido aislada en m uestras de sangre, heridas y líquido articular hum anos.299 Las colonias de esta especie son inusuales ya que son no lipofílicas, brillantes, ligeram ente am arillentas y muy mucoides, una caracte­ rística infrecuente entre las corinebacterias, pero que se observa en los m iem bros del género Rhodococcus. En el API Coryne, estos microorganism os producen núm eros de perfil que corresponden a varias especies lipofílicas (C. jeikeium, C. bovis, grupo G de los CDC) o a la especie fermentativa no lipofílica C. striatum (cuadro 14-10). C. mucifaciens produce pirazinam idasa y fosfatasa alcalina y no hidroliza esculina. urea ni gelatina. Es probable que el m etabolism o oxidativo que m uestra esta especie sea responsable de la falta de acidificación rápida de los hidra­ tos de carbono presente en el panel (“galería” ) API Coryne. C. mucifaciens produce ácido en form a oxidativa a partir de glucosa y en ocasiones de sacarosa; la producción de ácido a partir de fructosa, m añosa y glicerol ayuda a diferenciarla de R. equi. El análisis de la pared celular confirmó la relación con el género Rhodococcus. También se exam inaron las ocho cepas de C. mucifaciens descritas en la com unicación original para sensibilidad a los anti­ bióticos.299 Siete de las ocho eran sensibles a los p-lactám icos (cefazolina, penicilina) y todas eran sensibles a los glucopéptidos (teicoplanina y vancomicina) y los aminoglucósidos. Las sensibilidades de estas cepas a las tetraci­ clinas, los macrólidos (eritrom icina, azitromicina. claritrom icina), la clindam icina y las quinolonas fueron varia­ bles. Las ocho cepas fueron resistentes a aztreonam. cefetam et, ceftibuteno y fosfomicina. C. nigricans es una especie de Corynebacterium inusual con pigm ento negro que ha sido aislado en el aparato geni­ tal fem enino humano. Estas cepas se han asociado con com plicaciones del em barazo, com o aborto espontáneo y trabajo de parto prem aturo.803-80* Desde el punto de vista morfológico, las colonias de C. nigricans son negras, adherentes y tienden a “cavar en" el agar. Este m icroorganismo debe ser diferenciado de las cepas con pigm ento negro grisáceo del grupo 4 de los CDC. que se asem ejan a especies de Rothia más estrechamente que las corine­ bacterias. Las colonias de C. nigricans miden unos 2-3 mm de diámetro después de 48 horas de incubación y son no lipofílicas. Esta especie ferm enta glucosa, m altosa y sacarosa; algunas cepas ferm entan glucógeno o ribosa. Aunque las reacciones de pirazinam idasa y fosfatasa alcalina son variables, la reducción de nitrato y la hidrólisis de esculina, urea y gelatina son negativas. En el API Coryne, C. nigricans produce los biocódigos 0000125, 2000125 y 2100327. Estos códigos se corresponden con identificaciones de baja coincidencia para C. striatum. C. amycolatum, C. minutissimum y grupos G y F - l de los CDC, pero la m orfología de las colonias de C. nigricans es suficientemente diferente com o para que la identificación no constituya un problema. Las cepas de bacterias del grupo 4 de los CDC reducen el nitrato e hidrolizan esculina y gelatina.803 C. nigricans tam bién está relacionado a nivel de especie con variantes de pigm entación negra de C. aurimucosum,202 Esta especie nueva incluye cepas que antes pertenecían al grupo ANF-3 de los CD C .725 Todas estas cepas no lipofíli­ cas han sido aisladas en m uestras respiratorias o en sangre hum ana, que incluyen un caso de endocarditis de válvu­ la aórtica nativa.679 El m icroorganismo está relacionado filogenéticamente con C. pseudodiphtheriticum. Las colo­ nias en SBA tienen 1-2 mm de diám etro después de 24 horas de incubación, son de color hueso y secas, con bor­ des enteros. No se hidroliza esculina ni urea, y las cepas producen de form a variable pirazinam idasa y fosfatasa alcalina. Al igual que C. pseudodiphtheriticum, C. propinquum es asacarolítica, pero las dos pueden ser diferencia­ das por la producción de ureasa por parte de C. pseudodiphtheriticum. Además, C. propinquum puede ser diferen­ ciado de C. afermentans subespecie fermentans por la capacidad del primero para reducir nitrato y de C. afermen­ tans subespecie lipophilum tanto por la reducción de nitrato com o por la falta de requerim ientos de lípidos. No existen datos disponibles acerca de la sensibilidad a los antibióticos de esta especie.

Corynebacterium mucifaciens

Corynebacterium nigricans

Corynebacterium propinquum

(Continúa)

756

C A P ÍT U L O 14

R ecuadro 1 4 -2

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

M ie m b ro s d e l g é n e ro C oryn eb acteriu m (cont.)

Corynebacterium pseudodiphthericum Corynebacterium pseudotuberculosis

Corynebacterium riegelii

Corynebacterium sanguinis

Corynebacterium simulans

Véase el texto. C. pseudotuberculosis (antes denom inado Corynebacterium avis) produce linfadenitis caseosa en ovejas, vacas y otros rum iantes pequeños.951 También se ha demostrado que este m icroorganismo causa aborto o m ortinatos en ovejas con infección experimental y foliculitis en caballos. La mayoría de las infecciones hum anas asociadas con C. pseudotuberculosis se han comunicado entre pastores de ovejas en Australia o en carniceros y, com o en las infecciones animales, se han presentado como linfadenitis aguda o crónica.110-608672 Se describió un único caso de linfadenopatía cervical granulomatosa supurada debida a C. pseudotuberculosis en un habitante de la ciudad (Seattle) que tenía antecedentes de ingerir leche de vaca y de cabra cruda.345 En estas infecciones humanas, fue necesario el drenaje y la escisión del/os ganglio/s linfático/s afectado/s y la mayoría de los pacientes tenían secre­ ción persistente o recurrente desde el sitio de la herida durante períodos prolongados. Debido al lento proceso de cicatrización, la m ayoría de los pacientes fueron tratados con varios antibióticos, com o penicilina G, tetraciclina, eritromicina, sulfisoxazol y penicilinas antiestafilocócicas. En 1978 se com unicó un caso inusual de neum onía en un estudiante de medicina veterinaria de 28 años causado por C. pseudotuberculosis 487 Este paciente había trabaja­ do con el microorganism o en su clase de m icrobiología veterinaria durante las 4 sem anas antes del inicio de los síntom as pulm onares y también había estado expuesto a caballos “enferm os” en la práctica. C. pseudotuberculosis es m iem bro del “grupo de C. diphtheriae”, que tam bién incluye C. diphtheriae y C. ulcerans. C. pseudotuberculo­ sis tam bién ha sido transform ado en una especie productora de toxina diftérica por una infección experim ental y lisogenización con el (3-corinéfago. pero no se han aislado cepas lisogenizadas naturales. Todos estos m icroorga­ nism os son pirazinam idasa negativos (al contrario de la gran mayoría de las especies de Corynebacterium) y pro­ ducen actividad de cistinasa, com o lo dem uestra la producción de halos pardos alrededor de las colonias en medio de Tinsdale modificado.616-853 C. pseudotuberculosis es ureasa positivo y nitrato reductasa y fosfatasa alcalina variable y difiere de C. ulcerans en que no produce ácido a partir de glucógeno ni trehalosa y no hidroliza la gela­ tina. A diferencia de C. ulcerans y A. haemolyticum, C. pseudotuberculosis es prueba de CAM P inversa positivo. En la comunicación sobre 10 casos de linfadenitis hum ana debida a C. pseudotuberculosis publicada por Peel y cois., todas las cepas produjeron un perfil en el API Coryne #0111324, lo que indicó una reacción positiva para fosfatasa alcalina, a-glucosidasa, ureasa, glucosa, m altosa y ribosa.672 Gran parte de la investigación relacionada con C. pseudotuberculosis en los últimos años se ha concentrado sobre el desarrollo de pruebas diagnósticas para linfadenitis caseosa y una vacuna para prevenirla en los criadores de ovejas y cabras.215-684 Estos microorganism os suelen ser sensibles a penicilinas, macrólidos, tetraciclinas. cefalosporinas, quinolonas y rifampicinas; la m ayoría son resistentes a am inoglucósidos, nitrofuranos y polim ixina.469 Esta especie recién descrita ha sido aislada en muestras de orina de m ujeres con síntomas de infección urinaria y en hemocultivos.300 Se aislaron cepas en orina de mujeres de 21 a 62 años sin enferm edades subyacentes. Los m icro­ organismos estaban presentes en cantidades im portantes (> 100 000 UFC/mL). Las cepas de C. riegelii son no lipofílicas y producen colonias pegajosas brillantes y blancas en SBA (véase lám ina en color 14-5E). Son fuerte­ mente ureasa positivas (como C. urealyticum) y se observan reacciones positivas en las porciones inclinadas de urea de Christensen dentro de los 5 minutos después de la inoculación (véase lám ina en color 14-5F). Una caracte­ rística inusual de esta especie es que las cepas producen ácido lentamente a partir de maltosa, pero no se forma ácido a partir de glucosa. Estas reacciones atípicas ocurren con m edios convencionales (p. ej., hidratos de carbono sobre base de CTA) y con la tira de API Coryne. Los núm eros de perfil de API Coryne para C. riegelii son 0101224, 2001224 y 2101224 (véase lámina en color 14-5G y H). Las cepas son sensibles a penicilina, cefalotina, cloranfenicol, ciprofloxacina, gentam icina, rifampicina, tetraciclina y vancom icina, y son resistentes a cefetamet, ceftibuteno y fosfom icina.300 Hasta la fecha, esta nueva especie no lipofílica sólo ha sido aislada en hemocultivos.294 Las colonias de este microorganism o en SBA tienen 1-2 mm de diámetro después de 48 horas de incubación, son lisas, secas y amarillentas. Las pruebas de pirazinamidasa, fosfatasa alcalina y PYR son positivas, y la prueba de CAM P es negativa. El microorganismo ferm enta lentamente glucosa y ribosa (en el API Coryne) pero ningún otro hidrato de carbono. C. sanguinis es nitrato, ureasa, esculina y prueba de CAM P negativo. En el API Coryne, todas las cepas producen el número de biocódigo 6100304. C. simulans es una nueva especie que ha sido aislada en un absceso en el pie. una biopsia de ganglio linfático y un forúnculo.936 Este microorganism o es una especie ferm entadora no lipofílica fenotípicam ente sim ilar a C. minutis­ simum y C. striatum, pero filogenéticamente distinta sobre la base de secuencias de rRNA 16S. Las cepas de C. simulans crecen com o colonias crem osas, brillantes, blanco grisáceas y no lipofílicas que tienen 1-2 mm de diá­ metro después de 48 horas. C. simulans es nitrato positivo y m altosa negativo (C. minutissimum es nitrato negativo y m altosa positivo) y no ferm enta el etilenglicol ni crece a 20 °C (C. striatum ferm enta el etilenglicol y crece a 20 °C). Esta es la única especie de Corynebacterium que puede reducir nitrato a nitrito y luego reducir además nitrito a gas nitrógeno, de m odo que una prueba de nitrito negativa debe ser evaluada con cinc para confirm ar esta reacción. Además, algunas cepas pueden ser catalasa negativas. En el API Coryne, C. simulans produce varios bio­ códigos (cuadro 14-10). No existen datos sobre sensibilidad a los antibióticos de C. simulans.

Especies de C orynebacterium

R ecuadro 1 4 -2

7 57

M ie m b ro s d e l g é n e ro C o ryn eb acteriu m (cont.)

Especie

Importancia clínica e identificación

Corynebacteríum singulare

La descripción de C. singulare se basa sobre dos cepas hum anas (una del semen, otra de la sangre).734 Am bas tenían todas las características quim iotaxonóm icas claves del género Corynebacterium y se asem ejaban a C. minutissimum por características morfológicas y bioquím icas. Las colonias de C. singulare son convexas, de bordes lisos, crem osas y de color gris blancuzco. Sin embargo, a diferencia de C. minutissimum, las dos cepas son ureasa positivas. El exam en de otros taxones ureasa positivos dentro del género confirm ó que las dos cepas eran en efecto distintas de ellos por varias características, com o una mayor capacidad fermentativa, la falta de reducción de nitrato y la ausencia de P-glucuronidasa. El microorganism o puede ser diferenciado de C. amycolatum por su falta de producción de ácido propió­ nico a partir de glucosa. En el API Coryne, el microorganismo genera un código octal único (biocódigo 6101125). Sobre la base de estos criterios, se ha propuesto el nom bre C. singulare.™ No existen datos de sensibilidad a los anti­ bióticos para este especie. Véase el texto. C. sundsvallense ha sido aislado en hemocultivos. una muestra vaginal y el cultivo de una herida en la ingle.165 El aspec­ to en la tinción de Gram de este microorganismo es singular, ya que se pueden observar botones o “protrusiones” en los extremos de algunos de los bacilos. El microorganism o es no lipofílico y produce colonias de color amarillo, pega­ josas y adherentes en SBA. El m icroorganism o ferm enta lentam ente glucosa, m altosa y sacarosa, pero no lactosa, m anitol. ribosa, xilosa o amigdalina. No se reduce el nitrato y no se hidroliza la esculina. pero se produce ureasa y la reacción de a-glucosidasa es positiva (cuadros 14-9 y 14-10). Los ácidos láctico y succínico son los productos princi­ pales de la fermentación de la glucosa. No existen datos de sensibilidad a los antibióticos sobre este microorganismo. La descripción de la especie de este m icroorganismo se basa sobre dos cepas similares aisladas en muestras de líquido pleural de un hom bre de 56 años con insuficiencia renal crónica, accidente cerebrovascular y neum onía.987 C. thomsse­ nii es un m icroorganism o no lipofílico de crecim iento lento que produce colonias pegajosas y adherentes de m enos de 0,5 mm de diám etro incluso después de 48 horas de incubación. El m icroorganism o es ureasa positivo. DN asa positi­ vo. e hidrólisis de nitrato y de esculina negativo. Se produce lentamente ácido a partir de glucosa, m altosa y sacarosa. Al contrario de todas las otras especies de Corynebacterium, las cepas de esta especie son fuertem ente A'-acetil-P-glucosam inidasa positivas, y producen el núm ero de perfil 2121125 en el API Coryne. Las cepas de C. thomssenii son sensibles a penicilina, am picilina, cefazolina, gentamicina, eritrom icina. clindam icina. tetraciclina, ciprofloxacina, rifam picina y vancom icina y resistentes a aztreonam, cefetamet, ceftibuteno y fosfom icina.987 C. ulcerans es un m iem bro no lipofílico del “grupo de C. diphtheriae", junto con C. diphtheriae y C. pseudotuberculosis. En años anteriores, la validez de C. ulcerans com o una especie de Corynebacterium separada fue controversial. Sin embargo, en 1995, el estado de especie de este m icroorganismo fue reafirm ado por Riegel y cois.,730 quienes observaron que los tres m icroorganismos que com prendían el "grupo de C. diphtheriae" eran taxones separados y que los biotipos y las biovariedades dentro de cada especie estaban estrechamente relacionados desde el punto de vista genómico. Los análisis de las secuencias de rRNA 16S mostraron que C. ulcerans tiene un conjunto de semejanzas estrechas con C. pseudotuberculosis y en efecto es una especie separada. Adem ás, se ha dem ostrado que la m ayoría de las cepas de C. ulcerans (y algunas de C. pseudotuberculosis) producen toxina diftérica. En un estudio, 25 de 37 cepas de C. ulcerans y 1 de 14 cepas de C. pseudotuberculosis produjeron pruebas de Elek positivas para toxina diftérica.367 Además, todas las cepas con prueba de Elek positiva y dos cepas con prueba negativa produjeron resultados positivos en la hibridación con una sonda de DNA para el gen estructural tox de la toxina diftérica. Los análisis de los fragm en­ tos obtenidos por endonucleasas de restricción m ostraron que las cepas de C. diphtheriae y C. ulcerans com parten una hom ología considerable en las pruebas de Southern blot; estos fragmentos hom ólogos incluyen el sitio de integración de la fam ilia p de corinefagos. Wong y Grom an tam bién dem ostraron que las toxinas diftéricas producidas por cepas de C. ulcerans y C. pseudotuberculosis eran similares en peso m olecular y estructura inm unológica, en actividad ribosiladora de ADP enzim ática y en la regulación de su síntesis por el hierro.961 Las cepas de C. ulcerans tam bién pueden producir una segunda toxina -fosfolipasa D - que es idéntica a la producida por C. pseudotuberculosis.5'' Esta toxina afecta la esfingomielina y altera la perm eabilidad de la mem brana de las células diana. C. ulcerans es una causa rara de infecciones tanto en animales como en el hombre. Causa mastitis en ganado vacuno, primates y otros anim ales, y se ha aislado en leche de vaca no pasteurizada y otros productos lácteos.100 También ha sido aislado en ardillas de tie­ rra salvajes, en las cuales provoca derm atitis gangrenosa, toxemia y sepsis.652 Las infecciones humanas ocurrieron casi siempre en áreas rurales en individuos con antecedentes de exposición a animales o ingestión de productos lácteos crudos.1110 C. ulcerans ha sido aislada en pacientes con enfermedades indistinguibles de la difteria clásica, con presen­ cia tanto de secuelas cardíacas com o neurológicas o sin ella.208'396-482 En 1985, se comunicó un caso de neum onía por C. ulcerans finalmente m ortal en un hom bre de Baltim ore de 78 años que un año antes había recibido terapia radiante en el tórax superior derecho para el tratam iento de un carcinom a pulm onar de células escam osas con m etástasis en las costillas.805 En este caso, el m icroorganism o era sensible a penicilina, am picilina, cefalotina, eritrom icina, clindam ici­ na, tetraciclina y gentam icina. Se com unicó otro caso de infección pulm onar por C. ulcerans en un hom bre de 53 años que presentó múltiples nodulos pulm onares bilaterales sugestivos de carcinom a m etastásico.216 El examen histopatológico de estos nodulos puso en evidencia una inflamación necrosante granulom atosa y el cultivo dio una cepa no pro­ ductora de toxina diftérica de C. ulcerans. En 1996, se com unicó un caso de difteria respiratoria debida a C. ulcerans toxigénico en una m ujer de 54 años de Terre Haute, Indiana.144 La paciente, que nunca había sido inm unizada contra la difteria, fue tratada con ceftriaxona, eritrom icina y 40 000 unidades internacionales (UI) de antitoxina

Corynebacterium striatum Corynebacterium sundsvallense

Corynebacterium thomssenii

Corynebacterium ulcerans

(Continúa)

758

C A P ÍT U L O 14

R ecuadro 1 4 -2

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

M ie m b ro s d e l g é n e ro C oryn eb acteriu m (cont.)

Especie

Importancia clínica e identificación

Corynebacterium urealyticum

diftérica equina, y tuvo una rápida respuesta clínica. El cultivo de muestras clínicas (hisopados faríngeos y fragm entos de seudom em brana diftérica) confirm ó la presencia de C. ulcerans y la toxigenicidad de esta cepa fue dem ostrada tanto m ediante un ensayo de inm unoprecipitación de Elek como por un ensayo de PCR para toxina diftérica. Las cepas de C. ulcerans productoras de toxina tam bién han causado casos de “difteria” cutánea.931 En 2002, W ellinghausen y cois, describieron un caso mortal de sinusitis necrosante en un anciano debido a C. ulcerans toxigénico.947 Las colonias de C. ulcerans son blanco grisáceas, secas y de aspecto ceroso, con un área leve difusamente p-hem olítica debajo de las colonias individuales y a su alrededor. El m icroorganism o es no lipofílico y las colonias tienen 1-2 mm de diám etro después de 24 horas de incubación. C. ulcerans es pirazinam idasa negativo y fosfatasa alcalina y ureasa positivo. Se produce ácido a partir de glucosa, maltosa, m añosa, arabinosa, ribosa y glucógeno. Al igual que C. pseudotuberculosis. C. ulcerans es prueba de CA M P inversa positivo y produce ácido propiónico como producto de fermentación de la glucosa. Véase el texto.

Corynebacterium xerosis

Corynebacterium grupo F -l

Corynebacterium grupo G

Corynebacterium grupos F2 e I

Hasta hace poco se crecía que C. xerosis era el corineform e m ás frecuente sobre la piel y, en consecuencia, la cepa clíni­ ca más frecuente perteneciente al género Corynebacterium. Datos sustanciales indican ahora que la m ayoría de las cepas clínicas de “C. xerosis" son en realidad C. amycolatum (véase explicación anterior sobre este m icroorganis­ m o).297 El verdadero C. xerosis produce colonias amarillas granulosas que contienen ácidos m icólicos en sus paredes celulares, son LAP y a-glucosidasa positivas y producen ácido láctico a partir de la fermentación de la glucosa, m ien­ tras que las cepas de C. amycolatum producen colonias gris blanquecinas, secas y cerosas; carecen de ácidos m icóli­ cos; son negativas o débilm ente positivas para LAP; son a-glucosidasa negativas y producen ácido propiónico a partir de la ferm entación de la glucosa.297'315-940 A diferencia de C. striatum. las verdaderas cepas de C. xerosis no hidrolizan tirosina ni ferm entan azúcares lentam ente (72-96 horas). La bibliografía contiene varias com unicaciones de casos refe­ rentes a C. xerosis com o agente etiológico en distintos tipos de infecciones humanas. En estas comunicaciones, a m enudo se observó que las cepas eran m ultirresistentes a los antibióticos. Estas cepas m ultirresistentes eran en reali­ dad C. amycolatum y no C. xerosis. dado que las cepas verdaderas de la últim a especie son bastante raras y se sabe que tienen una sensibilidad amplia. Debido a su aislamiento frecuente en el laboratorio clínico, C. xerosis fue elim ina­ do de la versión 2 de la base de datos API Coryne. Sin embargo, ciertos biocódigos -2110325 y 3110325- correspon­ den a las verdaderas cepas de C. xerosis. La bacteria corineform e del grupo F l de los CDC es un corineform e ferm entador lipofílico que puede ser separado en dos grupos de hom ología de DNA fenotípicam ente indistinguibles. Como corineforme ureasa positivo que requiere lípidos. el grupo F l de los CDC se asem eja estrechamente a la especie con requerim ientos de Iípido que recientem ente ha recibido el nombre C. macginleyi.13' Sin embargo, las cepas del grupo F l de los CDC son pirazinam idasa positivas, fosfatasa alcalina negativas y ferm entan glucosa, maltosa y sacarosa, mientras que las cepas C. macginleyi son pirazi­ nam idasa negativas, fosfatasa alcalina positivas y ferm entan glucosa y sacarosa, pero no maltosa. El grupo F l corine­ forme de los CDC ha sido aislado principalmente en el aparato urogenital. En 1992, se inform ó un caso de formación de cálculos de estruvita en un paciente de 40 años asociado con el grupo F l de los CDC.224 El microorganism o estaba presente en la orina en cantidades im portantes (> 10s UFC/m L) y era sensible a las tetraciclinas. El tratam iento del paciente con doxiciclina condujo a la resolución de la infección y el cese de la form ación de cálculos. La bacteria corineform e del grupo F de los CDC ha sido aislada en m uestras del humor vitreo, la sangre, el líquido cefa­ lorraquídeo y el aparato genitourinario (véase lám ina en color 14-6C y D ).700-731 Las cepas pertenecientes al grupo F son lipofílicas y el crecim iento es estim ulado por Tween-80. En 1983, A ustin y Hill com unicaron un caso de endocar­ ditis m ortal de válvula protésica asociado con el grupo F de los CDC en un hombre de 40 años.45 La cepa era sensible a am picilina, cefalotina, cefam andol, cefoxitina, gentam icina y vancomicina. También se aislaron corineform es del grupo G en hemocultivos de un paciente de 74 años que se som etió a hem odiálisis de m antenim iento debido a insufi­ ciencia renal crónica.484 Esta cepa tam bién era uniform em ente sensible a los antibióticos. Se ha dem ostrado que los grupos F2 e I de los CDC corresponden a cepas de C. amvco/aíwm.261-574'940

importante para evitar las reacciones falsas negativas, y puede ser necesaria una incubación más prolongada para detectar reacciones de fermentación de hidratos de carbono de algunas especies (p. ej., especies de A rthrobacter).304 En varias de las comunicaciones sobre nuevas especies de Corynebacterium, el API Coryne se utilizó para caracterizar fe­ notípicamente las nuevas cepas y se generaron biocódigos a partir de los patrones de reacciones positivas y negativas. Algunos biocódigos para nuevas especies dan identificaciones para especies ya incluidas en la base de datos. En estos casos, se deben realizar pruebas adicionales para llegar a la identifi­ cación correcta. Sin embargo, algunas nuevas especies generan biocódigos que son únicos.

El RaplD CB-Plus utiliza el formato de cubeta similar a otros sistemas de identificación Remel e incluye 18 celdas de pruebas únicas. Para inocular el sistema, se prepara una sus­ pensión del microorganismo que crece en SBA al 5% (triptica­ sa soja, Columbia o base BHI) equivalente a un estándar de tur­ bidez de McFarland #4 en 2 mL de líquido de inoculación RaplD. Se vierte o pipetea la suspensión en la cubeta y se ino­ culan simultáneamente las 18 celdas mediante manipulaciones manuales de la cubeta. El sistema se incuba durante 4-6 horas a 35-37 °C en una incubadora sin CO,. Se agregan los reactivos de nitrato A y B a la celda NIT y un segundo reactivo (Reactivo RapIDx CB Plus) a las celdas de prueba de arilamidasa. Treinta segundos a un minuto después de agregar el reactivo, se leen

Especies de C orynebacterium

¡as reacciones de color en las celdas y se genera un microcódigo numérico. Se consulta el Compendio de Códigos RapID CB Plus para la identificación. Las evaluaciones de RaplD CB-Plus han comunicado que el sistema identifica correctamente el 88.5-95% de las especies de Corynebacterium , sobre todo las halladas comúnmente en el laboratorio clínico (C. amycolatum, C. jeikeium , C. striatum, C. urealyticum, C. minutissimum, C. pseudodiphtheriticum y grupo G de los CDC).305,438 También se

identificaron correctamente las cepas de algunos taxones recién descritos (p. ej.. D erm abacter hominis, especies de Microbacterium, Turicella otitidis, especies de Cellulomonas, Brevibacterium casei y A rthrobacter cumminsii). Las dificultades con este sistema estaban relacionadas con la interpretación de algunas de las reacciones de acidificación de hidratos de car­ bono y aminopeptidasa. Pruebas de sensibilidad a los antibióticos de las especies de Corynebacterium y bacterias corineformes

En varias publicaciones se informó la sensibilidad a los anti­ bióticos de muchos de los corineformes recién descritos. En estos informes, se han utilizado procedimientos de dilución en agar y de dilución en microcaldo.306-347-583-584,832 Tanto Soriano y cois., como Funke y cois, utilizaron un procedimiento de dilu­ ción en agar con agar de Mueller-Hinton con suplemento de sangre de camero al 5% y un inóculo de 104 UFC por microor­ ganismo.306-832 Martinez-Martinez y cois, emplearon un proce­ dimiento de microdilución en caldo de Mueller-Hinton con suplemento de cationes que contenía Tween 80 al 0,5% y un inóculo de 5 x 104 UFC por celda de microtítulo.583,584 Las pla­ cas o bandejas se incubaron a 35 °C durante 18-24 horas en condiciones aerobias. Como no existe ningún valor crítico

Cuadro 1 4 -8

determinado por CLSI para las pruebas de sensibilidad de las especies de Corynebacteríum u otros corineformes, los “valo­ res críticos” para la interpretación de las CIM obtenidas mediante los métodos anteriores fueron definidos por los inves­ tigadores en estos estudios. En el caso de penicilina, ampicili­ na, amoxicilina-clavulanato y oxacilina, se utilizaron los valo­ res críticos determinados por CLSI para los estafilococos. En el cuadro 14-8 se mencionan los valores críticos utilizados para la determinación de la sensibilidad a los antibióticos de las corinebacterias y otros corineformes de la literatura.306-832 Algunos investigadores también han utilizado los métodos Etest para determinar la sensibilidad a los antibióticos de las especies de Corynebacteríum y los corineformes similares a Arcanobacterium haem olyticum . 129,583 Utilizando Etest, la concordancia con la CIM por dilución en caldo varió con el agente por eva­ luar. El acuerdo entre los métodos varió del 88,2% para cefalo­ tina y rifampicina hasta el 65,4% para amikacina y el 31,1% para vancomicina.583 En la actualidad, el CLSI ha convocado a un nuevo subcomité para preparar recomendaciones para los laboratorios clínicos que evalúan bacilos grampositivos corine­ formes y bacterias gramnegativas con requerimientos nutricio­ nales especiales. Estas recomendaciones tratarán los métodos más apropiados para uso, los medios y las condiciones de incu­ bación, y los valores críticos para determinar la sensibilidad a los antibióticos de estos microorganismos. Miembros del género Corynebacterium aislados en seres humanos

El género Corynebacteríum contiene gran cantidad de espe­ cies que han sido aisladas en muestras clínicas humanas, ani­ males y el medioambiente. C. diphtheriae, un patógeno clási­ co, es la causa de la difteria. Otras especies, como C. jeikeium,

Valores críticos para la determinación de sensibilidad a los antibióticos de las especies de Corynebacterium y otras bacterias corineformes'06-832

A N T IB IÓ T IC O

759

S E N S IB L E , Ug/mL

R E S IS T E N T E , Ug/mL

Penicilina

< 0,12

> 0 ,1 2

Am picilina

< 0,25

> 0 ,2 5

Amoxicilina/clavulanato

< 4/2

> 4 /2

Oxacilina

< 2

>2

Cefalotina

< 8

>8

Ceftriaxona

< 8

>8

Cefuroxim a

< 8

>8

Cloranfenicol

< 8

>8

Clindam icina

< 0,5

> 0 ,5

Eritromicina

< 0,5

> 0 ,5

Ciprofloxacina

< 1

> 1

Gentamicina

< 4

>4

Rifam picina

< 1

> 1

Imipenem

< 4

>4

Tetraciclina

< 4

>4

Vancomicina

< 4

>4

Teicoplanina

< 8

>8

Nitrofurantoína

< 1

> 1

760

C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

C. striatum , C. pseudodiphteriticum y C. urealyticum, se aíslan más a menudo que las otras especies de Corynebacterium y se comportan principalm ente como agentes oportunistas en pacientes inmunodeprimidos o debilitados. C. amycolatum es la especie aislada con mayor frecuencia en el laboratorio clíni­ co y puede representar un contaminante cutáneo o un agente importante de infección. También es difícil diferenciar esta especie de otras con características bioquímicas similares. C. am ycolatum , C. diphtheriae, C. jeikeium, C. pseudodiphtheriticum, C. striatum y C. urealyticum se explican más ade­ lante. En el recuadro 14-2 se enumeran las otras especies de C o­ rynebacterium, se describe su importancia clínica y se incluye información útil sobre la identificación de estos microorganis­ mos. En el cuadro 14-9 se exponen las características bioquí­ micas fenotípicas de las especies de Corynebacterium aisladas en muestras clínicas humanas. El cuadro 14-10 es un compen­ dio de los biocódigos de API Coryne para las especies de Corynebacterium no incluidas aún en la base de datos API Coryne. Estos biocódigos se han obtenido de las descripciones originales de las distintas especies si el API Coryne fue inclui­ do como parte de la caracterización de los microorganismos.

CORYNEBACTERIUM AMYCOLATUM

En 1988, Collins y cois, informaron sobre una nueva especie de Corynebacterium aislada en la piel hum ana.166 Aunque meso-DAP, arabinosa y galactosa estaban presentes en la pared celular, este nuevo microorganismo carecía de los ácidos corinemicólicos que se encuentran en todas las otras especies de Corynebacterium. A pesar de esta separación de un criterio importante utilizado para asignar a los bacilos grampositivos al género Corynebacterium , el análisis de secuencia de rRNA 16S apoyó la inclusión de este microorganismo. Este fue denomi­ nado Corynebacterium amycolatum (“sin ácidos micólicos”) y aceptado como especie válida de Corynebacterium en 1988. Varios estudios indican que es probable que C. amicolatum haya sido mal identificado por los laboratorios clínicos durante muchos años como C. striatum, C. xerosis, C. minutissimum y grupo 1-1 de los CDC.60-297-940-988 En los casos típicos, C. am yco­ latum produce colonias planas, secas, gris blanquecinas, mate o cerosas en SBA (véase lámina en color 14-3C). Las áreas de crecimiento confluentes en medios de agar pueden adquirir un aspecto rugoso con una incubación prolongada. Esta morfología de las colonias se diferencia con facilidad de aquellas de C. minutissimum o C. striatum, que siempre producen colonias húmedas blanco grisáceas. C. amycolatum da pruebas positivas de pirazinamidasa y fosfatasa alcalina, y la mayoría de las cepas reducen también el nitrato a nitrito. C. amycolatum produce ácido a partir de glucosa y ribosa, y la mayoría de las cepas tam­ bién fermentan la maltosa y la sacarosa. Algunas pueden ser ureasa positivas y PYR positivas. Todas producen ácido propió­ nico como principal producto final del metabolismo de la glu­ cosa. En el cuadro 14-9 se muestran las pruebas adicionales que se pueden utilizar para diferenciar C. amycolatum, C. striatum, C. minutissimum y C. xero m .60-717-940-942,988 Los números fre­ cuentes del perfil API Coryne son 3100325, 3100125, 7100125, 3100365, 4100325 y 3040121 (véase lámina en color 14-3D y E); estos números suelen identificar a los microorganismos como C. amycolatum/C. striatum, lo que requiere estas pruebas adicionales para la identificación definitiva. También se pueden utilizar métodos quimiotaxonómicos para resolver la identifica­ ción de estas especies.923 C. amycolatum ha sido aislado en infecciones humanas importantes. Se ha comunicado una cepa confirmada con qui-

miotaxonomía como causa de sepsis mortal en un lactante pre­ maturo.79 Desde entonces C. amycolatum ha sido aislado en infecciones relacionadas con catéteres, infecciones de heridas quirúrgicas, quistes pilonidales, mastitis, endocarditis de vál­ vulas nativas y hospitalarias, infección de electrodos de cardioversores y artritis séptica luego de sepsis de injertos vascular e s i 6 i ,202,250,494,670.910 L a s cepas son a menudo multirresistentes a los antibióticos, como (3-lactámicos, macrólidos, clindamicina, aminoglucósidos, quinolonas y rifampicina.729-826-832 Alrededor del 40% de 101 cepas de C. amycolatum evaluadas en un estu­ dio reciente fueron resistentes a los P-lactámicos (CIM > 64 pg/mL).306 Además, las CIM de ciprofloxacina, cloranfenicol, clindamicina y eritromicina en las cuales se inhibía el 50% de las cepas eran mayores que los valores críticos de sensibilidad para los estafilococos. También se observó en algunas resisten­ cia a la gentamicina. Todas fueron sensibles a la tetraciclina y la vancomicina.306 CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE C. diphtheriae es la causa de la enfermedad clásica difteria,

infección relativamente infrecuente en los Estados Unidos, aunque se sigue viendo en los países en vías de desarrollo.31-921 La infección se previene mediante la inmunización amplia de las poblaciones en riesgo con toxoide diftérico; el uso de este material en otros países ha conducido a disminuciones espec­ taculares en la incidencia de difteria también en esas localida­ des. Si bien la inmunización amplia en muchos países fue exitosa, la difteria sigue siendo un agente infeccioso letal y resurgente, sobre todo dentro de ciertas partes del mundo, que incluyen Europa Oriental, sudeste de Asia, Sudamérica y el subcontinente de la India.473 La importación de C. diphtheriae toxigénico de los países en vías de desarrollo donde la difteria sigue siendo endémica plantea una amenaza constante y ha explicado la mayoría de los casos de difteria de los últimos en los países industrializados. Por ejemplo, en un estudio de casos y controles de 1993 del primer caso de difteria mortal ocurrido en el Condado de Dade, Florida, en más de veinte años, el viaje reciente a Haití entre los contactos del caso ini­ cial sugirió que el microorganismo podría haber sido importa­ do.259 Además, varias comunicaciones han documentado ahora la importancia clínica de las cepas no toxigénicas de C. diphí/zenae.370-374-426-952-990 Estos microorganismos han sido aislados en cultivos faríngeos y lesiones cutáneas de personas sin hogar, adictos a drogas intravenosas y se ha informado también bac­ teriemia y endocarditis debidas a cepas no toxigénicas de C. diphtheriae en estos pacientes. En la actualidad, el Im munization Practices Advisory Committee (Comité Asesor sobre Prácticas de Inmunización) del sistema de Salud Pública de los Estados Unidos recomien­ da administrar tres dosis intramusculares de DPT (toxoide dif­ térico, vacuna acelular contra la tos ferina y toxoide tetánico) a intervalos de 4 a 8 semanas a todos los niños comenzando a las 6-8 semanas de edad, con una cuarta dosis administrada 6-12 meses después de la tercera dosis. Los niños que han comple­ tado la serie primaria de inmunizaciones deben recibir una dosis de refuerzo en el momento del ingreso escolar. Para los niños de 7 años y mayores, se debe administrar toxoide diftéri­ co sólo dos veces con un intervalo de 4 a 8 semanas, y se admi­ nistra una tercera dosis 6 a 12 meses más tarde. Los individuos mayores deben recibir un refuerzo de toxoide diftérico a inter­ valos de 10 años. Las personas que viajan a regiones endémi­ cas para la difteria también deben recibir inoculaciones de refuerzo. Además, las personas que están convaleciendo de la

Cuadro 1 4 -9

Características bioquímicas para la identificación de especies de C o ryn eb a cteriu m aisladas en seres humanos REQ L IP

HEM ÓL SBA

RED N O ,

PYZ

AP

E SC

URE

GEL

PRUEBA DE C A M P

GLU

MAL

SAC

M N TL

XY L

C. accolens

+

-

+

v+

-

-

-

-

-

+

-

V

-

-

C. afermentans su b esp ecie afermentans

_

+

+

_

-

-

V

_

_

_

_

_

C. afermentans su b esp ecie lipophilum

+

+

+

-

-

-

V

-

-

_

_

-

-

-

E S P E C IE

+

+

-

V-

-

-

+

V+

v+

C. appendices

+

+

+

-

+

-

ND

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-

-

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C. argentoratense

-

+

V-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

C. atypicum

_

-

-

-

-

-

ND

+

+

+

-

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C. aurimucosum

-

+

+

V

V-

V-

ND

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+

-

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C. auris

_

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+

-

-

ND

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-

-

-

-

C. confusum

-

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-

-

-

C. coyleae

-

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-

-

ND

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V-

-

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-

-

-

-

V-

-

+

+

-

-

-

-

V-

-

+

+

-

-

-

V+

C. amycolatum

-

C. diphtheriae gravis C. diphtheriae intermedius

+

-

C. diphtheriae mitis C. diphtheriae belfanti

+

-

-

-

+

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

V-

-

+

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-

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-

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v+

-

ND

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+d

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v+

-

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-

-

_

C. durum C. falsenii

+

.

-

-

V

+

+

-

-

-

ND

+

+

C. glucuronolyticum

-

-

V

+

V-

V

v+

-

+

+

V

+

-

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C. imitans

-

-

-

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-

-

-

+

+

+

+d

-

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C. jeikeium

+

+

+

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-

-

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V

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-

-

C. kroppenstedtii

-

-

-

+

-

+

-

-

ND

+

+“

+

-

-

C. lipophiloflavum

+

-

-

+

+

-

+ 24h

ND

ND

-

-

-

-

-

C. macginleyi

+

-

+

-

+

-

-

-

ND

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V

V

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+

ND

-

V

V

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-

-

-

-

-

-

_

C. freneyi

C. matruchotii C. m in u tissim u m

-

C. mucifaciens

-

C. nigricans

_

C. propinquum

-

V

■

761

(Continúa)

Especies de Corynebacterium

-

762

C u a d ro 1 4 - 9

C a r a c t e r í s t i c a s b i o q u ím i c a s p a r a la i d e n tif ic a c ió n d e e s p e c ie s d e C o r y n e b a c te r iu m a i s la d a s e n s e r e s h u m a n o s (c o n t.) MNE

ARA

C. accolens

-

+

-

C. afermentans subespecie afermentans

-

-

C. afermentans subespecie lipophilum

-

C. amycolatum C. appendices

SO R

RIB

GLY G

AM YG

a -G A L

-

+

-

ND

ND

ND

-

-

-

ND

-

-

ND

-

-

-

ND

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ND

ND

ND

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-

ND

P-G AL

a -G L U

P-G LU

P-G U R

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-

-

-

-

-

V

ND

-

_

_

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_

-

—

-

-

_

-

-

-

-

-

-

V

ND

14

LA C

ND

-

-

-

ND

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

ND

ND

ND

V

-

ND

ND

-

-

-

-

-

-

V

C. atypicum

-

ND

ND

ND

+

-

ND

-

-

-

-

+

-

-

+

C. aurimucosum

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

C. auris

ND

ND

-

-

ND

ND

-

-

-

-

-

-

ND

-

-

-

-

-

-

-

-

-

V

-

ND

C. confusum

-

ND

-

-

+

C. coyleae

-

+

-

ND

+

-

-

-

-

-

-

-

-

V

+

C. diphtheriae gravis

-

ND

ND

ND

+

+

ND

-

-

+

-

-

-

-

ND

C. diphtheriae intermedius

-

ND

ND

ND

+

-

ND

-

-

+

-

-

-

-

ND

C. diphtheriae mitis

-

ND

ND

ND

+

-

ND

-

-

+

-

-

-

-

ND

C. diphtheriae belfanti

-

ND

ND

ND

+

-

ND

-

-

+

-

-

-

-

ND

ND

ND

+

-

-

ND

V

-

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-

-

-

V

C. durum

-

ND

C. falsenii

V

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-

-

C. freneyi

-

ND

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-

C. imitans

-

+

+

-

+

C. jeikeium

-

ND

ND

ND

V-

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-

-

-

-

-

-

-

ND

C. kroppenstedtii

-

ND

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-

-

-

+

C. lipophiloflavum

-

ND

ND

ND

-

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-

-

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-

-

+

C. macginleyi

-

ND

-

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ND

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-

-

-

-

-

C. matruchotii

-

ND

ND

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+

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ND

ND

-

V

-

-

-

+

ND

C. minutissimum

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

C. mucifaciens

-

+

-

-

V

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-

-

-

-

-

V

-

C. nigricans

-

+

ND

ND

V

V

ND

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-

-

-

-

-

ND

-

ND

ND

ND

-

ND

ND

-

V

ND

C. propinquum

-

-

-

-

-

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

-

C. argentoratense

C. glucuronolyticum

CAPÍTULO

E S P E C IE

Cuadro 14-9 Características bioquímicas para la identificación de especies de REQ

C o r y n e b a c te r iu m

aisladas en seres humanos

(c o n t.)

H E M O L IS IS SBA

RED NO,

PYZ

AP

E SC

U RE

GEL

PRUEBA DE C A M P

GLU

MAL

SAC

M NTL

XYL

C. p s eu d o d ip h th eric u m

-

-

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V

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-

-

C. p seu d o tu b e rcu lo sis

-

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-

-

C. riegelii

-

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C. san g u in is

-

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-

+

+

-

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-

-

-

-

C. sim u la n s

-

-

+

V

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-

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+

-

+

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-

C. sing u la re

-

-

-

+

+

-

ND

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-

-

C. stria tu m

-

-

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-

V

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v+

-

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C. su n d sv a lle n se

-

-

-

V

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-

+

+

+

-

-

C. tho m ssen ii

-

-

-

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+

-

-

+'

+'

+'

-

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C. ulcera n s

-

p

-

-

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+

+

-

-

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C. u rea lyticu m

+

-

-

+

V

C. xero sis

-

-

V

+

+

+

-

v+

+

-

+

-

V

+

+

C o ryn eb a cteriu m g ru p o

Fl

C o ryn eb a cteriu m g ru p o G

R ápida

+

+ -

R áp id a

+ -

+

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+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

-

-

-

-

+

+

+

-

-

-

-

+

V

V

-

(Continúa)

Especies de Corynebacterium

LÍP

E S P E C IE

763

764 CAPÍTULO 14

Características bioquímicas para la identificación de especies de Corynebacterium aisladas en seres humanos (cont.) LAC

MNE

ARA

SOR

C. pseudodiphthericum

-

ND

ND

ND

C. pseudotuberculosis

-

+

ND

ND

+

C. riegelii

-

-

-

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C. sanguinis

-

ND

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C. simulans

-

+

C. singulare

-

C. striatum

ESPECIE

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ND

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C. sundsvallense

-

ND

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-

C. thomssenii

-

+

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-

-

-

-

-

C. ulcerans

—

+

+

ND

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+

ND

ND

ND

ND

ND

ND

_

ND

ND

ND

+

-

ND

ND

C o ry n e b a cteriu m g ru p o F l

ND

ND

ND

V-

-

ND

ND

C o ry n e b a cteriu m g ru p o G

ND

ND

ND

+

-

ND

ND

C. urealyticum C. xerosis

-

RIB

GLYG

P-GAL

-

-

a-GLU

P-GLU

V

-

-

P-GUR

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-

-

V

ND

-

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ND

V

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-

ND

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-

-

ND ND

-

-

-

ND

V

ND

+, reacción positiva; -, reacción negativa; V, reacción variable; +', reacción positiva tardía; +d, reacción débil; V+, reacción variable, mayoría de cepas positivas; V-, reacción variable, mayoría de cepas negativas; R+, reacción positiva rápida; Inv+, prueba de CAMP inversa positiva; ND, datos no disponibles. Leyenda: REQ. LIP. requerimientos de lípidos; Hem SBA, hemolisis en agar sangre de carnero; Red N O {P reducción de nitrato; PYZ, pirazinamidasa; AP, fosfatasa alcalina; ESC, hidrólisis de esculina; URE. prueba de ureasa; GEL, hidrólisis de gelatina; P. CAMP, prueba de CAMP; Glu, ácido a partir de glucosa; Mal, ácido a partir de maltosa; SAC, ácido a partir de sacarosa; Mntl, ácido a partir de manitol; Xyl, ácido a partir de xilosa; Mne, ácido a partir de mañosa; Ara, ácido a partir de arabinosa; Sor, ácido a partir de sorbitol; Rib, ácido a partir de ribosa; Glyg, ácido a partir de glucógeno; Amyg, ácido a partir de amigdalina; a-GAL, a-galactosidasa; (i-GAl., p-galactosidasa; a-GLU, a-glucosidasa; p-GLU, p-glucosúlasa; P-GUR, P-glucuronidasa; NAGA, N-acetil-p-D-glucosaminidasa; PYR, pirrolidonil arilamidasa; LAP, leucina aminopeptidasa.

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

C uadro 1 4 -9

Especies de C orynebacterium 7 6 5

Cuadro 1 4 -1 0 E S P E C IE I C appendicis C. argemoratense I C. atypicum C. aurimusocum

Biocódigos API Coryne para especies de C o r y n e b a c te r iu m no incluidas en la base de datos actual B IO C Ó D IG O S D E L A P I C O R Y N E

E S P E C IE

B IO C Ó D IG O S D E L A P I C O R Y N E

2101124

C. matruchotii

7000325, 7010325, 7050325

2000104

“Sim ilar a C. m atruchotii'

2140325

0200365

C. mucifaciens

2000004. 2000104, 2000105, 2100104, 2100105, 2100004, 6000004, 6100104, 6100105, 0000004, 6100125

C. nigricans

0000125, 2000125, 2100327

C. riegelii

0101224. 2001224, 2101224

C. sanguinis

6100304

C. simulans

0100305. 2100105, 2100301, 2100305, 3000125

C. singulare

6101125

C. sundsvallense

0011125, 0111125, 2011125, 2111125, 2001004, 2101125

C. thomssenii

2121125,0101004

C. xerosis

2110325, 31100325

2100125

I C. auris

2100004

C. bovis

0101104

C. confusum

3100304, 3100104

C. coyleae

2100104, 6100304, 2100304, 4100304, 6100004

C. durum

3000135, 3001135, 3040135, 3400115, 3400135, 3400305, 3400325, 3400335, 3040325, 3040335, 3440335, 3441335, 3440125, 3441125

C. falsenii

2101104, 2101304, 2100304, 2100324

C. freneyi

3110325

C. imitans

2100324

C. kroppenstedtii

2040105. 2040125

C. lipophiloflavum

2101004

difteria clínica también deben recibir inmunización con toxoi­ de. dado que la infección clínica no induce necesariamente niveles protectores de antitoxina. Con la comunicación de nue­ vos casos de difteria respiratoria en los Estados Unidos, es imperativo que la respuesta de salud pública incluya tanto el manejo del caso como la identificación de los contactos cerca­ nos. Debido a la falta de recepción de inyecciones de refuerzo en la mayoría de los adultos, existe actualmente una población de adultos susceptibles; el 10-60% de los individuos mayores de 30 años tienen niveles insuficientes de anticuerpos circulantes contra la toxina diftérica. En consecuencia, se siguen comuni­ cando brotes de difteria. C. diphtheriae es el prototipo clásico del microorganismo toxigénico. Su virulencia está relacionada casi por completo con la producción de toxina diftérica.424 La toxina diftérica es un polipéptido de 58 342 Da que contiene 535 residuos amino­ ácidos. La toxina está compuesta por dos fragmentos: el frag­ mento A tiene 21 500 Da y el fragmento B tiene 37 200 Da. El fragmento B, que contiene los dominios de fijación/transloca­ ción del receptor, permite el pasaje de la molécula de toxina a través de la membrana celular de las células diana. El frag­ mento A, la porción biológicamente activa de la molécula, cataliza la transferencia de la porción de adenosindifosfato ribosa (ADPR) desde dicotinam ida adenina dinucleótido (NAD) al factor de elongación 2 (EF-2), una proteína soluble que es necesaria para la translocación de peptidilo-RNA de transferencia desde el sitio aceptor al sitio donante sobre el ribosoma eucarionte. Esta adenorribosilación inactiva EF-2 y se inhibe la síntesis proteica en la célula afectada. El gen estructural (gen tox) que codifica la toxina diftérica reside sobre el DNA de un corinéfago (bacteriófago) denominado [3corinéfago.424 Con la infección por una cepa de C. diphtheriae con el corinéfago tox +, el ácido nucleico que contiene el gen tox queda integrado en el cromosoma bacteriano (lisogenia) y se reproduce junto con él. La mayoría de las cepas no toxigénicas

de C. diphtheriae y la mayoría de los corinéfagos tox no con­ tienen ninguna secuencia de DNA relacionada con tox detectable. Sólo las cepas de C. diphtheriae que son lisogenizadas por un (i-fago que contiene el gen tox son capaces de producir toxi­ na diftérica. C. ulcerans y C. pseudotuberculosis (los microor­ ganismos del “grupo C. diphtheriae ”) también pueden portar el ¡3-corinéfago y producir toxina diftérica. La difteria del aparato respiratorio se transmite entre los seres humanos sobre todo por contacto directo, el estornudo o la tos.379 La portación del microorganismo sobre la piel y la portación asintomática en las vías respiratorias altas son fuen­ tes frecuentes de transmisión a otros individuos susceptibles.78 Durante un período de incubación de 2-7 días, el microorga­ nismo se multiplica localmente en la nasofaringe posterior y la orofaringe. Durante este período, existe una acumulación de microorganismos, fibrina y células inflamatorias para producir la s e u d o m e m b r a n a ca r a c te r ístic a , que finalmente puede cubrir las amígdalas, la faringe, la laringe y las vías nasales posteriores (véase lámina en color 14-3F). La extensión de la seudomembrana hacia adelante puede conducir a la afectación del paladar blando y la úvula. En los casos graves, la seudo­ membrana puede extenderse a la tráquea y los bronquios y obstruir las vías aéreas. También suele presentarse una linfade­ nopatía cervical y submandibular. Una mayor extensión de la seudomembrana en la nasofaringe posterior y las vías nasales se asocia con una secreción serosanguinolenta o purulenta desde la nariz que es altamente infecciosa. La afectación del oído medio puede ser el resultado de la propagación del pro­ ceso infeccioso por contigüidad. La extensión de la infección respiratoria hasta la piel del rostro (nariz, oídos, mejillas) y el cuello también ocurre en ocasiones. La inoculación de los microorganismos en los ojos puede provocar conjuntivitis con afectación de la córnea o sin ella. También pueden aparecer lesiones satélites en el esófago, el estómago o las vías respira­ torias bajas.

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C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

C. diphtheriae también puede causar una infección cutánea primaria, en la cual la toxina es absorbida por vía sistémica. Las lesiones de la piel pueden ser semejantes a otras lesiones cutáneas, que incluyen foliculitis, impétigo, piodermia o der­ matitis seborreica. Otros microorganismos piógenos, como Streptococcus pyogenes , pueden ser aislados simultáneamente con C. diphtheriae. También se ha comunicado difteria cutánea luego de picaduras de insectos, como arañas, y también se ha documentado infección de heridas preexistentes (p. ej.. heridas quirúrgicas, piodermia, eccema, impétigo, dermatitis).31,379 La lesión inicial es una lesión ulcerosa denominada ectim a d ifté ­ rico. Esta lesión comienza como una vesícula o una pústula que contiene un líquido de color pajizo o serosanguinolento. Una vez que este material drena, la lesión se convierte en una úlcera en sacabocados de algunos milímetros hasta algunos centímetros de diámetro. Los márgenes de la lesión están ele­ vados y socavados. En general, las lesiones cutáneas diftéricas son dolorosas y luego se cubren por una escara o costra seudomembranosa oscura y adherente. Por último, la seudomembrana se desprende y deja una base hemorrágica y fuerte que rezu­ ma líquido serosanguinolento. A medida que se desarrolla la lesión inicial, la piel circundante se torna roja y edematosa, con la formación de ampollas satélites que rodean a la lesión de ectima diftérico. La mayoría de las lesiones cutáneas están sobre los brazos, las manos, los pies o las piernas. Aunque es mucho menos probable que las lesiones cutáneas produzcan una toxicidad sistémica grave, plantean un riesgo importante de propagación hacia el medioambiente y a otros individuos. Las bacterias que se multiplican localmente sintetizan y libe­ ran toxina diftérica, que es absorbida por vía sistémica. La toxi­ na tiene efectos tóxicos directos sobre el corazón, el sistema nervioso central y el periférico, el hígado y los riñones.379 Una miocardiopatía difusa puede aparecer en el 20-70% de los pa­ cientes. Estos síntomas pueden aparecer de forma insidiosa o cataclísmica, y conducir a colapso circulatorio e insuficiencia cardíaca congestiva aguda. Se pueden presentar complicaciones neurológicas y neuropatías en el 20-75% de los pacientes que suelen relacionarse con la gravedad de la enfermedad. Ini­ cialmente, las complicaciones pueden incluir parálisis del pala­ dar blando y la pared faríngea posterior, seguida de parálisis oculomotora y ciliar. Esta última contribuye al riesgo de aspiración orofaríngea y neumonía. Los cambios degenerativos grasos y la necrosis focal en los riñones, el hígado y las glándulas suprarre­ nales también pueden complicar las infecciones graves. En gene­ ral, la miocardiopatía y la neuropatía ocurren más adelante y son menos graves luego de las infecciones diftéricas cutáneas que aquellas que siguen a la infección respiratoria. La muerte puede ocurrir por insuficiencia cardíaca o parálisis del diafragma. Infecciones distintas de la difteria clásica también se han asociado con C. diphtheriae ; algunas de estas infecciones gra­ ves se debieron a cepas no toxigénicas.668 En los últimos años se han publicado varias comunicaciones de endocarditis infec­ ciosa debida tanto a cepas toxigénicas como no toxigénicas que afectan a válvulas cardíacas nativas y protésicas. En 1993, Tiley y cois, informaron sobre siete casos de endocarditis debi­ da a cepas no toxigénicas que ocurrieron en Nueva Gales del Sur. Australia, en un período de 12 meses.886 La edad de los pacientes varió entre 12 y 49 años. Tres de los siete tenían ano­ malías cardíacas preexistentes y sólo uno era adicto a drogas intravenosas. Los pacientes presentaron una enfermedad prodrómica (cefalea, malestar general, fiebre, mialgias) de 4 a 10 días de duración; cinco tenían también faringitis no exudativa. La ecocardiografía demostró vegetaciones valvulares grandes en el momento de la presentación. La ecocardiografía mostró

grandes vegetaciones valvulares en cinco pacientes. Se desa­ rrollaron embolias sépticas difusas en los pequeños vasos san­ guíneos en cuatro pacientes, mientras que se presentaron embolias en el encéfalo, el bazo y los riñones en el quinto, lo que condujo a su muerte. Los aneurismas micóticos complica­ ron dos casos y se desarrolló artritis séptica en cuatro de los siete pacientes. No se conoce en la actualidad la patogenia de las infecciones graves debidas a C. diphtheriae no toxigénica. El microorganismo puede invadir activamente el tejido y cau­ sar una enfermedad fulminante que afecta los tejidos cardíacos, endoteliales y sinoviales. También se informó endocarditis por una cepa no toxigénica de C. diphtheriae en un estudiante varón de 20 años en el cual se desarrollaron embolias cerebra­ les y rabdomiólisis grave, que requirió el reemplazo de las vál­ vulas mitral y aórtica.98 La capacidad de C. diphtheriae para infectar una amplia variedad de tipos celulares puede ser la causa de algunas de las presentaciones inusuales de la difteria. Havaldar y Shanthala comunicaron un caso en una niña de 11 años que presentó dolor abdominal de dos semanas de duración.398 Con posterio­ ridad, aparecieron seudomembranas conjuntivales bilaterales que eran positivas en cultivo para C. diphtheriae. La afectación intestinal se volvió evidente con la evacuación de heces san­ guinolentas y membranas de tejido intestinal desprendido. Se han comunicado otras infecciones asociadas con C. diphtheriae (p. ej., artritis séptica, osteomielitis), pero son raras.56,687 A pesar de las prácticas de inmunización y un riesgo apa­ rentemente bajo de difteria de adquisición endógena en los Estados Unidos, existen grandes subgrupos de individuos sus­ ceptibles. Las encuestas indican que sólo el 40-60% de los niños estadounidenses que tienen como mínimo 2 años de edad han recibido todas las vacunaciones recomendadas. Estudios similares también han mostrado que hasta el 20% de los niños preescolares carecen de inmunidad protectora contra la toxina diftérica. Además, algunas investigaciones serológicas en ado­ lescentes y adultos en los Estados Unidos han mostrado que el 20% hasta más del 50% de estos individuos carecían de inmu­ nidad contra la toxina diftérica. Los niveles de inmunidad en los individuos ancianos fueron muy bajos, tal vez como resul­ tado de la falta de exposición natural durante la primera era de la vacunación, las tasas bajas de vacunación y la inmunidad inducida por la vacuna decreciente o ausente. El tratamiento de la difteria comprende la administración de antitoxina equina para neutralizar la toxina que ya no está unida a las células diana. No existe ningún tratamiento eficaz para revertir la afectación cardíaca o neurológica que podría haber ocurrido antes del diagnóstico específico. Se necesitan medidas de sostén (traqueostomía o intubación, depuración de la vía aérea, monitorización de la función cardíaca) que son de extrema importancia. También se puede administrar penicili­ na o eritromicina para acelerar la erradicación de los microor­ ganismos del aparato respiratorio.493 Se ha utilizado rifampici­ na y eritromicina para erradicar la portación de C. diphtheriae en los individuos expuestos. Las pruebas de sensibilidad a los antibióticos in vitro han mostrado que las cepas de C. diphthe­ riae generalmente son sensibles a penicilina, ampicilina, cefu­ roxima, eritromicina, tetraciclina, ciprofloxacina, gentamicina, trimetoprim y rifampicina.578 Para el aislamiento de C. diphtheriae, se obtienen muestras de hisopados orofaríngeos, nasofaríngeos o de lesiones cutáne­ as. Los hisopos deben elaborarse de dacrón y se utilizan para tomar muestras de múltiples áreas inflamadas de la nasofarin­ ge. Si se hallan seudomembranas, se deben recoger muestras con hisopos por debajo de las membranas. Las muestras deben

Especies de Corynebacterium

env iarse al laboratorio en un medio de transporte semisólido de rutina, como Amies. Estos hisopos son inoculados en una placa de agar sangre de carnero o una placa de agar colistina ácido nalidíxico (CNA) Columbia y un medio de agar que contiene cistina y telurito de potasio. Para el medio de cistina telurito, los laboratorios deben utilizar agar sangre con cistina telurito o agar de Tinsdale modificado para el aislamiento de C. diphthe­ riae. Aunque no se realiza de rutina, algunos laboratorios tam­ bién inoculan el agar inclinado (“pico de flauta”) de medio de Loeffler, que contiene sangre de vaca coagulada y huevo. La tinción de frotis de preparados con azul de metileno luego de 8 a 18 horas de crecimiento en medio de Loeffler puede estable­ cer un diagnóstico preliminar de difteria, dado que estos micro­ organismos crecen rápidamente en este medio y producen célu­ las difteroides características con forma de porra o maza que contienen gránulos metacromáticos (véase lámina en color 14-3H). Sin embargo, dado que otros corineformes también pueden tener este aspecto en el medio de Loeffler. los resulta­ dos sólo deben informarse como presuntivos y deben relacio­ narse con la presentación clínica del paciente. SBA y CNA se utilizan para evaluar estreptococos P-hemolíticos, Staphylo­ coccus aureus y Arcanobacterium haemolyticum. S. aureus puede ser aislado simultáneamente con C. diphtheriae y tam­ bién crece como colonias negras en el medio de Tinsdale, de modo que la placa de agar sangre o la placa de CNA ayudan a evaluar la extensión del crecimiento de los estafilococos en el medio que contiene telurito. Dado que es posible que algunos laboratorios no almacenen medios que contienen telurito debi­ do a que su utilización es infrecuente, la inoculación de sangre o agar CNA permite aún el aislamiento de C. diphtheriae y de otros microorganismos patógenos, lo que posibilita que las

cepas corineformes sospechosas sean subcultivadas y examina­ das mejor si la presentación clínica y los antecedentes del paciente (p. ej., presencia de una lesión orofaríngea seudomembranosa característica, falta de inmunizaciones, circuns­ tancias de brote) sugieren con fuerza una infección por C. diphtheriae. (Véanse los protocolos 14-1 y 14-2 para las des­ cripciones de la preparación de la tinción de azul de metileno de Loeffler y el medio de suero). C. diphtheriae, C. ulcerans y C. pseudotuberculosis produ­ cen colonias negras que están rodeadas por halos pardos en un medio de Tinsdale modificado (véase lámina en color 143G).616 La coloración negra de las colonias es el resultado de la actividad de la telurito reductasa, lo que conduce a la reducción de telurio, mientras que los halos pardos indican actividad de cistinasa.853 Otros difteroides, estafilococos y algunos estrepto­ cocos también pueden reducir el telurito (aunque no suelen pre­ sentarse halos alrededor de las colonias), de modo que las tin­ ciones de Gram y las pruebas de catalasa deben realizarse en todas las colonias sospechosas. Como C. diphtheriae no pro­ duce ureasa, esta prueba puede utilizarse para distinguir este microorganismo de C. ulcerans y C. pseudotuberculosis (ambos ureasa positivos). Los dos últimos microorganismos pueden diferenciarse entre sí por la producción de ácido a par­ tir de almidón o glucógeno. La desaminación de la pirazinamida en ácido pirazinoico por acción de la pirazinamidasa, una prueba utilizada en micobacteriología, también es útil para dis­ tinguir los microorganismos “C. diphtheriae ” (pirazinamidasa negativos) de otras especies de Corynebacterium (principal­ mente pirazinamidasa positivas). En la figura 14-1 se presenta un algoritmo para la detección e identificación presuntiva de cepas aisladas en medio de Tinsdale.

H isopado de orofaringe, nasofaringe o lesión cutánea

i

A gar C N A

í

A gar sangre de carnero (SBA)

A gar Tinsdale m odificado

A gar inclinado (pico de flauta) de Loeffler (opcional)

T 24 horas

I

24 horas

/

B uscar estreptococos p-hem olíticos, A. haem olyticum , S. aureus, crecim iento

767

244 horas ho

I

C olonias negras con halos pardos

8-18 horas

Teñir el cultivo con azul de m etileno

F ig u r a 1 4 -1 Algoritm o para la identificación de Corynebacterium diphtheriae.

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C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

C olonias negras con halos pardos en m edio de Tinsdale m odificado

I

La tinción de G ram m uestra bacilos gram positivos corineform es

l

U reasa Positiva

N egativa

Y P roducción de ácido a partir de alm idón o glucógeno

Positiva

1

C. ulcerans (PY Z negativa)

Y C. diphtheriae PYZ negativa

N egativa

1

C. pse u d otu b e rcu lo sis (PYZ negativa)

F ig u r a 1 4 -2 Algoritm o para el aislamiento de C. diphtheriae.

C. diphtheriae puede aparecer como cuatro tipos (biotipos) de colonias distintas designadas gravis, mitis, intermedius y belfanti. Estos biotipos también difieren significativamente en la morfología de la coloración de Gram, algunas reacciones bioquímicas y, desde del punto de vista histórico, en la grave­ dad de los procesos patológicos que producen. Las cepas de C. diphtheriae biotipo gravis y las cepas biotipo mitis producen colonias convexas bastante grandes (1-2 mm de diámetro a las 24 horas), colonias convexas con bordes lisos, mientras que las cepas biotipo intermedius producen colonias pequeñas (< 1 mm a las 24 horas), más negras y más densas en agar que con­ tiene telurito. La mayoría de las cepas mitis y algunas cepas gravis son débilmente (3-hemolíticas en SBA (véase lámina en color 14-4A). Los cuatro biotipos crecen como colonias negras rodeadas por halos pardos en medio de Tinsdale modificado y todos forman colonias blanco grisáceas, lisas y no hemolíticas en SBA. Todos los biotipos carecen de actividad de pirazina­ midasa, no producen fosfatasa alcalina y no hidrolizan esculi­ na ni urea. Se produce ácido a partir de glucosa y maltosa, pero no de sacarosa, manitol o xilosa; se han comunicado raras cepas que fermentan la sacarosa (véase lámina en color 14-4B y C).211 (En el protocolo 14-3 se presenta la preparación y el uso del medio de Tinsdale y en el protocolo 14-4, la prepara­ ción y el uso de agar sangre cistina telurito). Una vez identificado un microorganismo desde el punto de vista bioquímico como posible C. diphtheriae, debe ser eva­ luado por su capacidad para producir toxina diftérica. Muchos laboratorios que realizan pruebas de toxigenicidad utilizan el procedimiento de inmunoprecipitación de Elek modificado, un método de inmunodifusión similar a la prueba de Ouchterlony clásica. La prueba utiliza agar KL Virulence (Difeo, Franklin Lakes, NJ), un agar con base de proteosa peptona, con suple­ mento de suero estéril de conejo o con enriquecimiento con KL Virulence (un enriquecimiento no seroso ideado para uso con agar KL Virulence por Difeo) y con telurito de potasio al 0,03% (con suplemento de solución de telurito de BactoChapman, 1%; Difeo) como medio base. Este medio se vierte

en una placa de Petri estéril de 150 mm. Antes de que el medio se solidifique, se sumerge una tira de 1 cm x 8 cm de papel de filtro saturado con antitoxina diftérica (tiritas de antitoxina Bacto-KL; Difeo) en el medio y se lo orienta cruzando el diá­ metro de la placa. Después del enfriamiento, se realiza una estría perpendicular con la cepa por evaluar para la producción de toxina en la tirita de antitoxina sumergida. Equidistante de uno de los lados de esta estría, también se siembra otra estría con una cepa toxigénica conocida de C. diphtheriae como con­ trol de la prueba. Luego se incuba la placa a 35 °C y se la exa­ mina cada 24 horas durante 3 días. Si la cepa desconocida es toxigénica, se forman líneas de precipitina en ángulos de 45° entre el inóculo y la tira de antitoxina. Esta líneas serán idénti­ cas a la cepa toxigénica de C. diphtheriae de control. En un procedimiento de inmunodifusión de Elek modificado se utili­ za un disco central con antitoxina y los microorganismos de prueba se inoculan a 7-9 mm del disco central.246 Estas modifi­ caciones permiten la evaluación simultánea de múltiples cepas y son adaptables a situaciones de brotes de casos. Se puede obtener una antitoxina de alta calidad de varias fuentes (Pasteur-Mérieux, Lyon, Francia; CNG, Peyrm. Rusia; Wyeth Laboratories, Marietta, PA; Connaught Laboratories, Swiftwater, PA). También se han creado otros métodos, que incluyen inmunoanálisis enzimáticos y pruebas de aglutinación del látex pasi­ vas inversas para la detección de producción de toxina por C. diphtheriae ,244-245.633’889 El EIA rápido desarrollado por Engler y Efstratiou utilizó antitoxina policlonal equina como anticuerpo de captura, y un anticuerpo monoclonal marcado con fosfatasa alcalina dirigido contra el fragmento A de la toxina diftérica como anticuerpo de detección. Este método detectó 87 cepas toxigénicas entre 245 cepas de C. diphtheriae y fue totalmente concordante con los resultados del método de Elek modifica­ do.244 En 2002, se creó un ensayo de tira inmunocromatográfica (ICS) que fue comercializado por la Organización Mundial de la Salud y el Programa para una Tecnología Apropiada en Salud (Seattle, WA).245 Para esta prueba, se preparó una sus­ pensión del microorganismo en un caldo de enriquecimiento que se incubó durante 3 horas. Se colocó una tira ICS en el tubo. Después de 10 minutos, se examinó la presencia de una banda paralela a un control interno positivo que contiene la tira. Este ensayo puede detectar tan sólo 0,5 ng/mL de toxina difté­ rica y es 10 veces más sensible que los métodos EIA y 20 veces más sensible que los ensayos de aglutinación.245 También se han implementado métodos moleculares para la detección de producción de toxina por C. diphtheriae. La mayoría de los métodos de PCR han sido dirigidos al gen tox, que utilizó cebadores que flanquean secuencias correspondien­ tes al fragmento A de la toxina biológicamente activa.34'606'622'656 Estos ensayos fueron utilizados para la detección de toxina en cultivos puros de C. diphtheriae y directamente en muestras clínicas. Algunos estudios han observado una correlación del 100% entre las técnicas de base molecular y los métodos feno­ típicos para la detección de producción de toxina (p. ej., la prueba de Elek).606 Sin embargo, los métodos de PCR también pueden detectar secuencias de genes de toxinas en cepas que no producen toxina biológicamente activa.619-656 En un estudio, 6 de 55 cepas de C. diphtheriae no produjeron toxina pero tenían el gen tox, en todo o en parte.238 Por lo tanto, en cepas sospe­ chosas, las pruebas de PCR negativas son útiles para excluir el diagnóstico de difteria, pero es posible que no predigan la expresión fenotípica de producción de toxina. También se han utilizado métodos moleculares para tipificar tanto las cepas toxigénicas como no toxigénicas de C. diphtheriae a partir de

Especies de C orynebacterium

1:s brotes. Estos métodos han incluido ribotipificación, análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados, electroforesis en gel de campo pulsado y análisis de DNA polim "Ico amplificado aleatorio.219'221-581-623-887-929 CORYNEBACTERIUM JEIKEIUM C. jeikeium es una de las especies de Corynebacterium aisla-

das con mayor frecuencia en las infecciones humanas.315 Esta especie lipofílica coloniza la piel de los pacientes hospitalizados ;• :¿mbién puede ser aislada en objetos inanimados en el medioambiente hospitalario.199-831-879 Las infecciones por C. jeikeium se en predominantemente en huéspedes inmunodeprimidos con neoplasias y otras enfermedades subyacentes (que incluyen SIDA), dispositivos médicos permanentes, roturas de la barrera ircumentaria, neutropenia y terapia con antibióticos de amplio r-rectro.828-834-907,934 Este microorganismo es una causa bien documentada de muchas infecciones graves, como bacteriemia exirahospitalaria y hospitalaria y sepsis, endocarditis de válvulas nativas y válvulas protésicas, meningitis, ventriculitis, neumo­ n í a . pielonefritis, osteomielitis, peritonitis, otitis media e infec­ ciones cutáneas y de tejidos blandos.92-188'212'360-447-456-495-744-905-946-978 Después de 24 horas de incubación, las colonias de C. je i­ keium en SBA son pequeñas (0,5-1 mm de diámetro), no hemolincas y blanco grisáceas (véase lámina en color 14-4D). El crecimiento en agar chocolate disponible en el comercio suele -er escaso debido a la ausencia de lípidos en las fórmulas actuales de ese medio. A diferencia de otras especies, este microorganismo es estrictamente aerobio. En ausencia de suplemento para los medios de crecimiento con Tween 80, la ¿.idificación de la glucosa y de las cúpulas de prueba de ribo­ sa en el API Coryne a menudo es débil después de 24 horas ■ease lámina en color 14-2F). El microorganismo da pruebas ne pirazinamidasa y fosfatasa alcalina positivas y acidifica la -cosa, la ribosa y la galactosa, y algunas cepas también aci­ difican la maltosa. Todas las pruebas enzimáticas en API Corvne son negativas para C. jeikeium (véase lámina en color 14-4E y F). C. jeikeium fue la primera especie de Corynebacterium docu­ mentada como multirresistente a los antibióticos.447 Las cepas de esta especie a menudo muestran resistencia a los (3-lactámicos penicilinas, cefalosporinas, imipenem) y los aminoglucósidos gentamicina, tobramicina), sensibilidad variable a los macróli­ dos. tetraciclinas, rifampicina y quinolonas (ciprofloxacina) y sensibilidad a los glucopéptidos (p. ej., vancomicina y teicoplanina) y quinupristina-dalfopristina.51-457-511-584'615-677-680-764-832’893 C. jeikeium también es resistente a muchas de las fluoroquinolonas más nuevas (gemifloxacina, trovafloxacina) y a los macrólidos i azitromicina).285 Se cree que la resistencia múltiple a los anti­ bióticos es cromosómica más que asociada con plásmidos. Sin embargo, en C. jeikeium se ha demostrado resistencia a macrólidos. lincosamida y estreptogramina, inducible y asociada con transposones.742

CORYNEBACTERIUM PSEUDODIPHTHERITICUM

Si bien no es una especie recién descrita, la cantidad cre­ ciente de comunicaciones de casos sugiere que C. pseudodiph th eriticu m puede constituir un patógeno emergente importante, sobre todo en los huéspedes inmunodeprimidos. Aunque se lo considera miembro de la flora orofaríngea nor­ mal, las infecciones respiratorias asociadas con él incluyen faringitis exudativa, bronquitis, bronquiolitis, traqueítis necrosante, traqueobronquitis, neumonía y absceso pulmo­

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nar.10-25'121'148,178'190-282-378,577 En los huéspedes inmunodeprimidos con estas infecciones, las enfermedades subyacentes o los fac­ tores predisponentes han incluido traqueostomía permanente secundaria a carcinoma laríngeo, enfermedad pulmonar obs­ tructiva crónica, diabetes mellitus, cardiopatía isquémica e intubación y ventilación mecánica como consecuencia de acci­ dentes de tránsito e infección por HIV. En algunos casos, la infección respiratoria por C. pseudodiphtheriticum puede imi­ tar la difteria respiratoria.446 También se han informado casos de endocarditis de válvula nativa y de válvula protésica. La mayoría de los casos de endocarditis en válvula nativa ocurrie­ ron en pacientes con daño valvular preexistente.139-618-954 En una comunicación, una vegetación grande en el área que rodeaba a la válvula mitral ocluía por completo la entrada en la aurícula izquierda y se extendía hacia abajo en el ventrículo izquier­ do.618 También se informó una linfadenitis cervical supurada por C. pseudodiphtheriticum en un niño de tres años y medio y un caso de discitis vertebral.516-966 En este último caso, la infec­ ción se debió a una infección de los cornetes nasales; se sugi­ rió que este procedimiento podía haber causado una bacterie­ mia que sembró el disco vertebral. Además, se ha comunicado tanto una herida cutánea como infecciones oculares (queratitis y conjuntivitis) causadas por el microorganismo.405-536 C. pseudodiphtheriticum es no lipofílico y crece como colo­ nias blancas y lisas en SBA (véase lámina en color 14-5C). La pirazinamidasa y las reacciones de nitrato reductasa son posi­ tivas, y la reacción de fosfatasa alcalina es variable. Este microorganismo es ureasa positivo después de 24 horas y no fermenta ni oxida los hidratos de carbono. Las cepas de C. pseudodiphtheriticum suelen ser sensibles a P-lactámicos, van­ comicina y aminoglucósidos, pero se han hallado algunos resistentes a clindamicina, eritromicina, tetraciclina y quinolo­ nas. Al igual que las subespecies de C. afermentans y C. auris, C. pseudodiphtheriticum no produce ácido a partir de hidratos de carbono, pero es diferenciado fácilmente de estas especies por sus reacciones positivas de ureasa y de reducción de nitra­ tos (véase lámina en color 14-5D). CORYNEBACTERIUM STRIATUM C. striatum ha sido hallado en el ganado bovino, como parte

de la flora normal de las vías nasales humanas y sobre la piel humana. En 1980, se comunicó el primer caso de infección pleuropulmonar humana por C. striatum en un hombre de 79 años con leucemia linfocítica crónica.104 El microorganismo fue aislado en el esputo, dos series de hemocultivos y un culti­ vo de líquido pleural. También se lo aisló, junto con estrepto­ cocos del grupo B y peptoestreptococos, en el esputo y las secreciones traqueales de un varón de 22 años que había sufri­ do una fractura de cráneo grave en un accidente automovilísti­ co y en los hemocultivos tomados en una mujer de 64 años con carcinoma endometrial metastásico.59-197 Desde 1993, han aparecido varias comunicaciones de otros casos relacionados con C. striatum que apoyan más el papel de este microorganismo como patógeno emergente en los indivi­ duos inmunodeprimidos.187 Watkins y cois., en la Case Western Reserve University, informó sobre el aislamiento de C. striatum en seis pacientes.935 Las edades de estos pacientes variaban entre 19 y 78 años y tenían distintas enfermedades subyacentes, como linfoma linfoblástico con trasplante de médula autóloga, mielodisplasia con trasplante de médula ósea alogénica, esclerosis lateral amiotrófica, cáncer colorrectal, diabetes, conjuntivitis purulenta y rotura prematura de membranas amnióticas. Las fuentes de las cepas fueron sangre, puntas de catéteres, líquido

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C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

peritoneal, granuloma de heridas de dedos, conjuntivas, tejidos uterinos y placentarios y orina. Peiris y cois., en el Reino Unido, aislaron cultivos puros de C. striatum en esputo, membranas amnióticas y una herida profunda del codo en tres pacientes.673 En 1994, Wolde Rufael y Cohn comunicaron el primer caso de endocarditis de válvula nativa causado por C. striatum y Tumbarello y cois, informaron el primer caso de baeteriemia por C. striatum en un paciente con infección por HIV.897959 La evi­ dencia proveniente de estudios llevados a cabo en unidades de cuidados intensivos sugiere que en ocasiones C. striatum se transmite intrahospitalariamente.107,529 Desde mediados de 1990, se han aislado cepas importantes de C. striatum en pacientes con osteomielitis vertebral, artritis séptica y sinovitis, abscesos pul­ monares, abscesos mamarios, meningitis, infecciones de deriva­ ciones de LCR y peritonitis asociada con diálisis peritoneal ambulatoria continua.64,81,179,263,585,846,945 Desde 1994 se han comu­ nicado otros varios casos de endocarditis por C. striatum, que incluyen endocarditis asociada con marcapasos y el primer caso de endocarditis de válvula protésica.206,471,601,748,875 Las cepas de C. striatum son no lipofílicas y crecen como colonias blanco grisáceas no hemolíticas, lisas y húmedas con bordes lisos en SBA (véase lámina en color 14-6A). Las colo­ nias miden 1-2 mm de diámetro luego de 24 horas de incuba­ ción. Se produce pirazinamidasa y fosfatasa alcalina y no se hidrolizan urea, esculina ni gelatina. La mayoría de las cepas reducen el nitrato y producen ácido a partir de glucosa, sacaro­ sa, fructosa y galactosa solamente (véase lámina en color 146B).586 Las cepas de C. striatum producen ácidos láctico y succínico a partir de glucosa, lo cual es útil para diferenciarlas de C. amycolatum. En un examen de 1995 de 31 cepas clínicas se observó que todas eran sensibles a imipenem y a vancomicina; la mayoría fueron sensibles a ampicilina, cefalosporinas y ami­ noglucósidos, y la mayoría fueron resistentes a clindamicina, eritromicina y tetraciclina.586 En el informe de Tumbarello y cois., la cepa de C. striatum era sensible a vancomicina, teicoplanina, rifampicina y tetraciclina, pero resistente a todos los P-lactámicos (incluido imipenem), todos los aminoglucósidos, las fluoroquinolonas, la eritromicina y la clindamicina.897

CORYNEBACTERIUM UREALYTICUM C. urealyticum era denominado antes grupo corineforme D-

2 de los CDC; en 1992 se propuso formalmente y se adoptó el nombre Corynebacterium urealyticum.w s 6 Las pruebas de res­ tricción del DNA de cepas clínicas y de referencia y algunos estudios con sondas génicas de rRNA han demostrado que esta especie representa un taxón singular entre los corineformes.727 Normalmente microorganismo saprofito hallado en la piel, esta especie ha sido asociada con infecciones urinarias agudas y crónicas, urolitiasis, quistes renales y estenosis ureteral.229,628,649,810,824,825,830 También causa infecciones similares en perros.239,851 Se asocia altamente con la cistitis incrustante alcalina, un trastorno crónico observado en huéspedes inmu­ nodeprimidos con lesiones vesicales preexistentes, en quienes la inflamación ulcerosa conduce al depósito de cristales de fos­ fato de amonio-magnesio (estruvita; MgNH4P 0 4*6H20 ) y cris­ tales de apatita (C A [0 H ][P 0 4]3) sobre la pared vesical.336 Este trastorno es causado por microorganismos capaces de desdo­ blar rápidamente la urea, como las especies de Proteus. La pie­ lonefritis causada por C. urealyticum se observa sobre todo en pacientes inmunodeprimidos y en quienes han recibido un tras­ plante renal y tuvieron complicaciones posquirúrgicas.8,229 Además de su papel como patógeno de las vías urinarias, C. urealyticum ha sido aislado en ocasiones en hemocultivos y

como causa de baeteriemia, endocarditis, pericarditis, osteo­ mielitis e infecciones de heridas y de los tejidos blan150,243,269,650,753,829,964

C. urealyticum es un corineforme lipofílico que crece lenta­ mente en SBA y produce pequeñas (< 0,5 mm de diámetro des­ pués de 24 horas de incubación) colonias grises, no hemolíti­ cas. Es pirazinamidasa positivo y fosfatasa alcalina positivo, asacarolítico y rápidamente ureasa positivo. Los medios de agar urea en “pico de flauta” comienzan a hacerse positivos inmediatamente con la inoculación. Las cepas de C. urealyti­ cum suelen ser multirresistentes a P-lactámicos, aminoglucósi­ dos y macrólidos; algunas pueden ser sensibles a los P-lactá­ micos.325,634,986 Las fluoroquinolonas muestran una actividad irregular y la ofloxacina es el agente más activo.827 Doxiciclina, rifampicina y los antibióticos glucopéptidos vancomicina y teicoplanina son los agentes más activos contra esta especie bac­ teriana. Se pueden seleccionar cepas resistentes a las quinolo­ nas y la rifampicina durante el tratamiento con estos fármacos. También se describieron métodos de PCR para la identificación de C. urealyticum .81° La ribotipificación parece ser la herra­ mienta más útil para la caracterización de las cepas.634 Especies de Corynebacterium asociadas con animales

Algunas especies de Corynebacterium se han aislado en ani­ males, en los cuales pueden constituir parte de la flora normal o ser una causa de un proceso infeccioso. Como ya se dijo, C. pseudotuberculosis es principalmente una cepa animal que en ocasiones produce enfermedad en los seres humanos que tie­ nen contacto con animales o con productos animales infectados (p. ej., leche no pasteurizada).608,672 C. bovis forma parte de la flora normal de la ubre bovina y también ha sido implicado como causa de mastitis en estos animales. Este microorganis­ mo es una causa rara de infecciones humanas (véase antes). C. kutscheri es un patógeno desconocido de ratas y ratones de experimentación, en los cuales puede causar enfermedades rápidamente progresivas y mortales.117 En estos animales, el microorganismo puede ser aislado en la cavidad bucal y en los ganglios linfáticos regionales. Para determinar su presencia en las colonias de roedores de experimentación, se han creado sondas de ácidos nucleicos a fin de detectarlo en improntas de biopsias de ganglios linfáticos de los animales.763 Aunque han aparecido dos comunicaciones de infecciones por C. kutscheri en seres humanos en la bibliografía (corioamnionitis y artritis séptica), los microorganismos fueron caracterizados en forma incompleta, de modo que existen dudas sobre la validez de las identificaciones.276,604 C. vitaruman fue aislado originariamen­ te en el rumen de una vaca y denominado al principio Flavobacterium vitaruman. Se cree que participa en la síntesis del complejo vitamínico B, sobre todo en la producción de riboflavina, en el rumen. No ha sido aislado en seres humanos. El “grupo C. retíale", que incluye C. retíale, C. cystiditis y C. pilosum , causa afecciones genitourinarias en el ganado bovi­ no y en otros animales.506,974 No se han informado casos de infecciones humanas debidas a C. retíale o C. cystiditis. Se des­ cribió C. pilosum en un absceso perirrectal humano y como causa de endocarditis de válvula protésica en una mujer de 79 años, ocho años después del reemplazo de una válvula aórtica por una bioprótesis pericárdica bovina.315,822 Sin embargo, en estas comunicaciones de casos, las descripciones de la morfo­ logía de las colonias de las cepas aisladas no coincidieron con las de la cepa tipo de C. pilosum y las características bioquími­ cas que se utilizaron para las identificaciones fueron incomple­ tas. La morfología de las colonias descritas en estas comunica­

Especies de C orynebacterium 7 7 1 ciones, y el hecho de que las cepas a menudo fueran multirresi sientes, sugieren que C. amycolatum fue en realidad la cepa aislada en estos pacientes. En los últimos años, se han descrito varias especies de Corynebacterium nuevas halladas en animales. C. auriscanis ha sido aislado en otitis externa, piodermia y heridas interdigi­ tales de perros.171 Esta especie está más estrechamente relacio­ nada con C. falsen ii, C. jeikeium y C. urealyticum, y es tanto filogenética como fenotípicamente distinta. C. m astiditis y C. amporealensis fueron descritas por primera vez como causas de mastitis subclínica en ovejas.265-266 Ambos microorganismos han sido aislados en muestras de leche en España. C. m astidis es una especie lipofílica similar desde el punto de vista bioquí­ mico a C. urealyticum y C. afermentans subespecie lipophilum, pero es distinta de ellas sobre la base de las características quimiotaxonómicas y los estudios de secuencia de genes rRNA. C. cam porealensis es no lipofílico y está más estrechamente rela­ cionado desde el punto de vista ñlogenético con C. striatum. C. capitovis es una especie no lipofílica aislada en lesiones cutá­ neas sobre la cabeza de una oveja.168 C. testudinoris y C. felinum son nuevas especies no lipofílicas aisladas en lesiones necróticas de la boca de una tortuga y en el tejido pulmonar de un gato salvaje escocés, respectivamente.169 C. phoace es una especie no lipofílica aislada en Phoca vitulina, la foca común.663 Desde el punto de vista ñlogenético, esta especie está más estrechamente relacionada con C. striatum, C. vitarumen y C. flavescens. C. spheniscorum y C. sphenisci son espe­ cies no lipofílicas recién descritas que fueron aisladas en las cloacas de pingüinos salvajes.354-355 Por último, C. aquilae es una nueva especie aislada en la boca de las águilas imperiales españolas (Aquila adalberti) jóvenes junto con cepas de C. f a l­ senii.267 Las propiedades fenotípicas para la identificación de las especies de C orynebacterium más recientemente identifi­ cadas y caracterizadas de los animales se encuentran en el cua­ dro 14-11. Especies de Corynebacterium aisladas en los alimentos y el medioambiente

Varias especies de Corynebacterium nuevas y descritas recientemente se encuentran en distintos productos alimenticios y en el medioambiente, pero no han sido aisladas en muestras clínicas humanas. C. flavescens fue denominado al principio Microbacterium flavu s cuando se describió en 1919 y transferi­ do formalmente al género Corynebacterium en 1979. Este microorganismo ha sido aislado en el queso y otros productos lácteos. C. mooreparkense y C. casei son especies nuevas que se encuentran en la superficie de los quesos muy fermentados como el Limburger y el Tilsit.111 C. ammoniagenes también se encuentra en los alimentos, sobre todo como parte de la microflora de las piezas de queso.900 C. terpenotabidum es una espe­ cie ambiental capaz de degradar el titerpeno lineal (CJ0) escualeno.867 C. glutamicum (también denominado C. lillium ), C. calhmae y C. efficiens son corinebacterias ambientales que se utilizan en la industria por su capacidad para producir gran can­ tidad de ácido L-glutámico en el medio de cultivo durante el cre­ cimiento en condiciones aerobias.286 La nueva especie C. glaucum fue aislada en una muestra de colorante cosmético.975

Otras bacterias corineformes Otras bacterias corineformes que han sido aisladas en mues­ tras clínicas humanas incluyen bacilos grampositivos fenotípi­

cos que forman letras chinas características, formas en V y for­ mas cocoides ocasionales en la tinción de Gram. Estas especies difieren de las especies de Corynebacterium reconocidas en varios aspectos. La mayoría de ellas carecen de m eso- DAP como diaminoácido que comprende los enlaces cruzados en la estructura del peptidoglueano y tienen en cambio otros amino­ ácidos (p. ej., L-lisina, L-omitina) (cuadro 14-7).315 Otros com­ ponentes hallados normalmente en la pared celular de las cori­ nebacterias, como arabinosa, galactosa y ácidos micólicos de cadena corta también pueden estar ausentes. Las metaquinonas presentes como parte del sistema de transporte de electrones también varían de un grupo a otro. Además, algunos de los microorganismos son oxidativos más que fermentativos en relación con el metabolismo de los hidratos de carbono. Estas bacterias han sido aisladas en varios tipos de muestras clínicas humanas, como sangre, líquido cefalorraquídeo, orina y otros sitios y líquidos corporales normalmente estériles.315 Aunque algunos de los ex grupos corineformes de los CDC han sido reclasificados formalmente en el género Coryne­ bacterium, se ha observado que otros pertenecen a géneros que antes no estaban asociados con patología humana. Varios gru­ pos de investigación en los Estados Unidos y Europa están tra­ bajando para descubrir las relaciones taxonómicas complejas entre estos microorganismos dispares utilizando tanto enfoques genéticos (p. ej., hibridación de DNA-DNA, secuenciación de RNA ribosómico [rRNA] 16S y 5S) como quimiotaxonómicos (p. ej., análisis de pared celular, ácidos grasos celulares y menaquinona celular).60-75-207-706 Estos métodos han establecido que basarse sólo sobre las características fenotípicas puede no ser suficiente para la identificación de estos microorganismos, y que pueden ser necesarios los análisis moleculares y quimio­ taxonómicos de los componentes subcelulares para diferenciar entre los microorganismos que tienen características fenotípi­ cas idénticas o similares. Aunque estos microorganismos son cepas relativamente infrecuentes en el laboratorio clínico, cada vez se están aislando más como colonizadores hospitalarios y patógenos ocasionales, sobre todo en pacientes inmunodepri­ midos. Especies de Actinobaculum

El examen intenso de otras cepas “similares a A ctinom yces ” provenientes de muestras clínicas humanas también ha condu­ cido a la descripción de géneros totalmente nuevos y a la reclasificación de las especies existentes de Actinom yces. Lawson y cois, examinaron cinco cepas de un microorganismo descono­ cido similar a Actinom yces que fueron aisladas en especies humanas (incluida la sangre) y observaron que eran distintas de las especies de Actinom yces descritas antes.522 El microorganis­ mo más estrechamente relacionado con estas cepas desconoci­ das fue Actinomyces suis, e incluso éste era filogenéticamente divergente de otras especies de Actinom yces examinadas.536 Sobre la base de sus datos genéticos, quimiotaxonómicos y bioquímicos, estos investigadores propusieron un género nuevo, Actinobaculum, y el nombre de una especie, Actino­ baculum schaalii, para las cinco cepas humanas antes no des­ critas y propusieron reclasificar a Actinom yces suis como Actinobaculum suis.522 Las especies de Actinobaculum eran bacilos grampositivos catalasa negativos, anaerobios o anaero­ bios facultativos. Las células individuales pueden ser ligera­ mente curvas o mostrar ramificaciones. Los productos princi­ pales de la fermentación de la glucosa o la maltosa son los ácidos láctico y acético; A. schaalii produce también succinato y A. suis produce los ácidos acético y fórmico más algo de eta-

772

C A P ÍT U L O 14

Cuadro 14-11

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

Características bioquímicas de especies de C orynebacterium aisladas en los animales

ESPECIE

REQ LIP

C. aquilae

RED no3

PYZ

AP

ESC

URE

GEL

PRUEBA DE CAMP

GLU

MAL

SAC

MNTL

XYL

-

-

+

+

-

-

-

-

+

-

-

-

-

C. auriscanis

-

-

-

+

V

-

-

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+

-

-

-

-

C. bovis

+

-

V

+

-

-

-

-

+

-

-

-

-

C. camporealensis

-

-

+

+

-

-

-

+

+

-

-

-

-

C. capitovis

-

-

-

+

-

-

-

ND

+

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

ND

+

+

-

-

-

C. felinum

HEMÓL SBA

-

C. mastiditis

+

-

+

+

-

V

-

ND

-

-

-

-

-

C. phocae

-

-

+

+

-

V

-

ND

+

+

V

-

-

C. sphensci

-

+

+

-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

C. spheniscorum

-

-

+

-

-

-

-

+

+

+

-

-

-

C. testudinoris

-

+

-

-

+

-

-

ND

+

+

+

-

-

Véase leyenda del cuadro 14-9.

nol a partir de la fermentación de la maltosa (no se fermenta la glucosa). Los miembros del género no reducen nitrato a nitrito, y no se hidroliza esculina ni gelatina. Desde la descripción de A. schaalii y la reclasificación de A. suis, se han aislado otras dos especies de Actinobaculum - “A. m assiliae ” y A. urinaleen muestras de orina de pacientes con infecciones urinarias crónicas.365'382 En el cuadro 14-12 se incluyen las característi­ cas fenotípicas para la identificación de especies de A ctino­ baculum. Especies de Actinomyces aisladas en seres humanos

El género Actinom yces está compuesto por un grupo hetero­ géneo de bacilos grampositivos, anaerobios facultativos o microaerófilos, no esporulados, inmóviles y no ácido-alcohol resistentes. Algunas cepas muestran una ramificación rudimen­ taria. Muchas especies de Actinom yces forman parte de la microflora bucal de seres humanos y distintos animales. Algunas especies, como A. israelii, A. gerencseriae, A. georgiae, A. odontolyticus y A. naeslundii son altamente prevalentes tanto en muestras de placa supragingival como subgingiva! de pacientes con periodontitis y gingivitis del adulto. Estos mismos m icroorganism os también desem peñan un papel importante en el desarrollo de las caries de las superficies radi­ culares.106 Las especies de Actinom yces pueden producir actinomicosis clásica, infecciones de heridas, abscesos, infeccio­ nes genitales e infecciones urinarias. Las infecciones genitales, en particular por A. israelii, se asocian a menudo con la pre­ sencia de dispositivos intrauterinos.274-982 En el nuevo M anual de Bergey, el género Actinom yces está incluido en el nuevo filo Actinobacterias, clase Actinobacterias, orden Actinomycetales, familia Actinomycetaceae junto con los géneros Actinoba­ culum, Arcanobacterium y Mobiluncus (recuadro 14-1 ).329 El género Actinom yces ha sufrido una rápida expansión en los últimos años, con la descripción de varias especies nuevas en seres humanos y animales. En el pasado, algunos laborato­

rios clínicos se basaban en técnicas de identificación aerobias convencionales y métodos bacteriológicos anaerobios para la identificación, como los que se presentan en el VPI Anaerobe Manual, Bergey's M anual o f System atic B acteriology y el W adsworth

A naerobic

B a cterio lo g y

M anual.422'461-161-111

Muchos laboratorios utilizan sistemas de identificación de ana­ erobios enzimáticos rápidos (p. ej., RapID ANA) para la iden­ tificación de las especies de Actinom yces, pero estos sistemas no tienen buen rendimiento en la identificación de estos micro­ organismos.609 Santala y cois, evaluaron recientemente los sis­ temas RaplD ANA II® (Remel), RapilD CB-Plus® (Remel), BBL Crystal ANR ID® (BD M icrobiology Systems, Cockeysville, MD) y RaplD 32A® (BioMérieux, Inc.) por su capacidad para identificar a las especies “clásica” y recién des­ critas de Actinom yces.165 Estos sistemas identificaron correcta­ mente sólo del 26% al 65% de las cepas de Actinom yces “clá­ sicas” hasta la categoría de especie y sólo el 13% al 49% de las especies recién descritas hasta la categoría de género, lo que indica que se deben actualizar sus bases de datos. La naturale­ za facultativa de la mayoría de las especies de Actinom yces ha conducido a la inclusión de algunas especies en las bases de datos de los sistemas de identificación para bacterias facultati­ vas y anaerobias, como API Coryne. API Rapid ID32A y API Rapid ID32 Strep (todas de BioMérieux). Algunas de las des­ cripciones de las especies nuevas de Actinom yces se basan en reacciones bioquímicas obtenidas con estos sistemas y los bio­ códigos resultantes son incluidos como parte de las descripcio­ nes fenotípicas en las publicaciones. La cromatografía gaslíquido para la detección de productos volátiles y no volátiles de la fermentación de la glucosa es extremadamente útil para la identificación, dado que los bacilos grampositivos no esporula­ dos que producen grandes cantidades de ácido succínico pue­ den ser colocados en el género Actinom yces sin otras pruebas. Como las especies nuevas son validadas actualmente mediante métodos moleculares fenotípicos, no existen datos de cromato­ grafía gas-líquido disponibles para las especies descritas más

Especies de Corynebacterium

773

LAC

MNE

ARAB

SORB

RIB

GLYG

AMYG

a-GAL

P-GAL

a-GLU

P-GLU

P-GUR

NAGA

PYR

LAP

-

ND

ND

ND

-

-

ND

-

-

-

-

-

-

+

+

-

ND

ND

ND

-

-

ND

-

V

-

-

-

-

ND

ND

-

ND

ND

ND

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-

ND

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-

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+

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ND

ND

ND

-

ND

ND

-

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-

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+

-

ND

ND

ND

+

ND

ND

-

-

+

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-

ND

+

+

-

ND

ND

ND

-

-

ND

-

-

-

-

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-

-

+

v

+

-

-

nd

-

-

-

nd

v

-

+

ND

ND

+

-

ND

-

-

-

-

-

ND

-

+d

-

ND

ND

ND

+

-

ND

-

-

V

-

-

-

-

+

recientes. Debido a las dificultades con la identificación feno­ típica, muchos investigadores han desarrollado sondas de DNA específicas de género y de especie, sobre todo para investigar el papel de estas bacterias en la enfermedad periodontal.871'972 Las especies de Actinom yces también pueden ser identificadas mediante métodos moleculares, como PCR de rDNA 16S y análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restric­ ción.387-768 Sin embargo, ninguna de estas técnicas moleculares se encuentra disponible en el laboratorio clínico de rutina. En el recuadro 14-3 se describen las especies de Actinom yces que han sido aisladas en seres humanos, mientras que las aisladas en animales se describen brevemente más adelante. Los datos fenotípicos presentados en el cuadro 14-13 incluyen tanto cepas humanas como animales y representan una síntesis de las características fenotípicas y las descripciones de varias fuen­ te s 422-467-771 Sarconeme y cois, también publicaron un diagrama de flujo dicotómico para ayudar en la identificación de especies de Actinomyces, Arccinobacterium y Actinobaculum utilizando reactivos fácilmente disponibles (p. ej., tabletas de reactivo Rosco, Rosco, Taastrup. Dinamarca).767 Estos diagramas de flujo se presentan en la figura 14-3. A israelii es la causa más frecuente de actinomicosis en los seres humanos, aunque otras especies (es decir, A. meyeri, A. naeslundii, A. odontolyticus, A. gerencseriae y A. viscosus ) también pueden producir en ocasiones esta infección.697 La actinomicosis es una infección crónica caracterizada por la for­ mación de abscesos, trayectos fistulosos que drenan y fibrosis tisular. Debido a su naturaleza crónica, las infecciones actinomicóticas a menudo imitan a los carcinomas.223-436 Las formas clínicas de actinomicosis incluyen actinomicosis cervicofacial, actinomicosis torácica, actinom icosis abdominal y pelviana y actinomicosis del sistema nervioso central (SNC).816 La actinomicosis cervicofacial se asocia con mala dentición, mani­ pulaciones dentales y otras infecciones de la cabeza y el cuello (p. ej., otitis, mastoiditis).12Al menos nueve especies diferentes de Actinom yces pueden producir esta infección, aunque predo­

-

+

minan A. israelii y A gerencseriae ,697 En la mayoría de los casos, se introducen Actinom yces orales endógenos con algún tipo de traumatismo y comienzan a crecer en los tejidos de la cabeza y el cuello para formar un absceso piógeno agudo que puede evolucionar a una masa submandibular indurada con un trayecto fistuloso secretante o más de uno. Se secretan microcolonias de los microorganismos denominadas gránulos de azufre desde estos trayectos fistulosos. La actinomicosis torá­ cica ocurre como extensión de la infección cervicofacial en la región de tórax y el mediastino, como resultado de la aspira­ ción del contenido orofaríngeo o como extensión de una infec­ ción abdominal o pelviana propagada al retroperitoneo o por vía transdiafragmática.874 La infección se inicia como una neu­ monía aspirativa, con el desarrollo final de cavitaciones o masas pulmonares. Los síntomas son tos, dolor torácico e hipertermia leve, y las radiografías de tórax pueden poner en evidencia lesiones fibronodulares o cavitarias con derrame pleural o empiema acompañantes.489 La infección pulmonar también puede extenderse para afectar los huesos (costillas, esternón, cintura escapular), los músculos de la pared torácica y los tejidos blandos.62 La actinomicosis abdominal es el resultado de un traumatismo penetrante, una perforación colónica o una cirugía del tubo digestivo. En general, está afectada la región ileocecal del colon y la infección puede mantenerse localizada o propagarse por vía hematógena o por extensión directa.158 La actinomicosis anorrectal puede originarse en una cripta, una fisura o un absceso anal infectados o por extensión directa desde una localización intraabdominal. La infección del riñón, el hígado y el bazo pocas veces puede ocurrir por exten­ sión directa desde un foco abdominal o a través del torrente cir­ culatorio. La actinomicosis pelviana puede provenir de la pro­ pagación continua de la actinomicosis abdominal u originarse en la pelvis propiamente dicha. Esta infección se asocia con dispositivos intrauterinos que son colonizados por actinomices.274-962 Esto conduce a la infección endometrial con exten­ sión hasta los ovarios. La actinomicosis del SNC ocurre como

774

C A P ÍT U L O 14

Cuadro 1 4 - 1 2

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

Características bioquímicas para la identificación de especies de A c tin o b a c u lu m

CARACTERÍSTICA

A. SCH AALII

A. SUIS

A. M ASSILIAE

A. URINALE

Pequeñas, blanco grisáceas

Blancas, granulosas, de bordes lisos o irregulares, centro elevado

Pequeñas, grises, de bordes lisos

Pequeñas, blanco grisáceas, convexas. lisas, de bordes continuos (lisos)

Hemolisis, SBA

-

-

-

P

Pirazinam idasa

-

M orfología/pigm ento de las colonias

V

ND

+

Fosfatasa alcalina

-

+

-

-

Ureasa

-

+

-

V+

Arginina dihidrolasa

-

ND

-

-

Hidrólisis de hipurato

+

ND

+

+ -

Acetoína (VP)

-

-

ND

ND

ND

-

-

Prueba CAM P

+d

ND

ND

ND

PYR

V

ND

-

ND

a-G A L

-

ND

-

-

P-GAL

-

+

-

-

a-G L U

+

+

+

-

p-GLU

LAP

-

ND

ND

-

P-GUR

-

+

-

+

NAGA

-

ND

-

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Glucosa

+

.

+

+

M altosa

+

V

+

V

Sacarosa

V

-

ND

V

Manitol

-

-

-

-

Xilosa

+

-

+

-

Lactosa

-

-

ND

-

Mañosa

V

-

-

-

Arabinosa

V

-

ND

-

Sorbitol

-

-

-

-

Rafinosa

-

-

+d

-

Ribosa

+

ND

+

+

Trehalosa

V

-

+

-

Glucógeno

-

+

+

-

Acido producido a partir de:

Melibiosa

-

-

ND

M elezitosa

-

-

ND

-

A, S

A, f, EtOH (a partir de maltosa)

ND

L, a

Productos, ferm entación de la glucosa

consecuencia de la diseminación hematógena o por extensión directa desde infecciones actinomicóticas en las áreas de cabe­ za y cuello.816 En general, los pacientes presentan meningitis o meningoencefalitis crónica complicada por el desarrollo de empiema subdural, abscesos epidurales y subdurales, y osteo­ mielitis craneal. En el 75% de los casos, en la actinomicosis del SNC se observan abscesos encefálicos únicos o múltiples,

habitualmente en los lóbulos temporales o frontales.816,817 Los pacientes pueden tener un cuadro de meningitis crónica que se asemeja a la meningitis tuberculosa. En general, el LCR mues­ tra pleocitosis mononuclear, hiperproteinorraquia y concentra­ ciones de glucosa normales o bajas. Es interesante señalar que se suele presentar fiebre sólo en alrededor del 50% de los pacientes con actinomicosis del SNC.

E species de C orynebacterium

R ecuadro 1 4 -3

7 75

M ie m b ro s d e l g é n e ro A ctino m yces

Especie

Importancia clínica e identificación

Actinomyces bovis

A. bovis produce actinom icosis en ganado bovino y otros anim ales. Este m icroorganism o no ha sido aislado en infecciones hum anas; sin embargo, un caso reciente de baeteriem ia por A. bovis en un ser hum ano fue com unicado por Bernard y cois, (en prensa). Fue confirm ado con enfoques fenotípico, quim iotaxonóm ico y genotípico. En el API Coryne. esta cepa produjo el núm ero de biocódigo 0101104, lo que indicó reacciones positivas para fosfatasa alcalina, ureasa, glucosa y catalasa. Esta especie nueva ha sido aislada en líquido pleural hum ano, un absceso paracolónico, un absceso mandibular, un absceso ótico posm astoidectom ía, un lavado sinusal y dispositivos intrauterinos.381 En las tinciones de Gram, los m icroorganism os aparecen como bacilos delgados y ligeram ente curvos con filamentos arrosariados ramificados. D espués de 48 horas de incubación, las colonias son pequeñas, convexas, de bordes lisos y pueden ser crem osas a rosadas. A. cardiffensis es un anaerobio facultativo catalasa negativo y produce cantidades im portantes de ácidos succínico y láctico y pequeñas cantidades de ácido acético a partir de la ferm entación de la glucosa. No hidroliza esculina, urea ni gelatina. Esta nueva especie fue descrita en 1997, cuando fue aislada com o el único m icroorganism o o com o el único m icro­ organism o aerobio en m uestras obtenidas de un absceso hum ano.288 También se lo aisló en infecciones relaciona­ das con la piel (p. ej., infección de seno pilonidal, abscesos perianales, úlceras por decúbito) e infecciones urina­ rias.754 En los extendidos teñidos con Gram, aparece com o bacilos gram positivos cortos dispuestos en grupos pequeños sin ram ificaciones evidentes. Las colonias en SBA son pequeñas (< 0,5 mm después de 48 horas de incubación en CO,), grises y translúcidas. Este m icroorganism o da una prueba de catalasa negativa, es inm óvil y ferm enta la glucosa y la maltosa, pero no el manitol ni la xilosa. Algunas cepas hidrolizan esculina y gelatina, pero estas reacciones son tardías. N o se reduce nitrato a nitrito ni se produce ureasa. Com o sucede con otras especies de Actinomyces, se produce ácido succínico com o principal producto de la ferm entación de la glucosa. Esta especie recién descrita fue aislada originariam ente en hemocultivos, el cultivo de una herida esternal y una inci­ sión abdominal hum ana y recientem ente com unicada como causa de endocarditis de válvula tricúspide nativa.524949 Estas cepas fueron identificadas en un principio com o de A. turicensis, pero algunos rasgos fenotípicos y la secuenciación de rRNA 16S mostraron que este m icroorganism o estaba estrechamente relacionado con A. turicen­ sis, pero no era idéntico a él. Las células de A. funkei son grampositivas, delgadas, ligeram ente curvas y muestran cierta ram ificación. El crecim iento ocurre en condiciones aerobias y anaerobias. En agar sangre de cam ero (SBA), las colonias son pequeñas, no hem olíticas y grises después de 24 horas de incubación. Se produce ácido a partir de glucosa, sacarosa y xilosa, pero no de arabinosa, m anitol, glucógeno, rafinosa, sorbitol o trehalosa. Se hidroliza hipurato, pero no esculina ni gelatina. En el sistema API Coryne, la cepa original produjo los núm eros de biocódi­ go 0130761 o 3530761, lo que indicó la variabilidad de las reacciones de pirazinam idasa, nitrato reductasa y P-galactosidasa sobre la tira. A. georgia fue descrito en 1990 y se encuentra como parte de la flora normal de los surcos gingivales de adultos y niños. Las cepas de esta especie son anaerobias facultativas. En las tinciones de Gram, esta especie aparece como bacilos que se presentan de a pares o cadenas cortas; a lo largo de ellas las células pueden tener tum efacciones y rara vez se observan ram ificaciones.458 En los cultivos de caldo m ás antiguos, las células pueden tener un aspecto cocoide. D espués de 48 horas de incubación en condiciones anaerobias, las colonias tienen 1 mm de diám etro, son circulares, brillantes, lisas y con bordes continuos (lisos). Las colonias pueden ser blancas, ocres o m arrones cla­ ras. El m icroorganism o es catalasa negativo y se producen ácidos succínico, acético, fórm ico y pequeñas cantida­ des de ácido láctico a partir de la ferm entación de la glucosa. Se produce ácido a partir de distintos hidratos de carbono, que incluyen glucosa, maltosa, sacarosa, xilosa, trehalosa y glucógeno. La m ayoría de las cepas hidroli­ zan esculina y no reducen nitrato a nitrito. Esta especie fue descrita en 1990 y antes denom inada A. israelii serotipo II 458 Sin embargo, no está relacionada genéticam ente con la cepa tipo de A. israelii. A. gereneseriae se encuentra en la cavidad bucal hum ana y en los surcos gingivales. Alrededor del 12% de las cepas son anaerobias estrictas, m ientras que el resto producen un cre­ cim iento escaso a moderado en agar sangre incubado en CO, al 5-7%. En las tinciones de Gram, los m icroorganis­ m os aparecen com o células filam entosas con tum efacciones ocasionales y ram ificación. D espués de 48 horas de incubación en condiciones anaerobias, las colonias miden unos 0,2 mm de diámetro, son blancas, opacas, no hem olíticas y pueden tener una topografía "desigual”. Esta especie da pruebas de catalasa negativa, hidrólisis de esculina positiva, hidrólisis de gelatina negativa y produce ácido a partir de distintos hidratos de carbono, que incluyen glucosa, maltosa, mañosa, sacarosa y trehalosa. Se producen los ácidos láctico, succínico, fórm ico y acé­ tico por la ferm entación de la glucosa. La com unicación original de esta nueva especie describió cuatro cepas humanas, tres de las cuales provenían de m uestras respiratorias, mientras que la cuarta se aisló en la m andíbula de un paciente con osteítis.™ Estas cepas eran bacilos ligeram ente curvos, grampositivos e inm óviles con cierta ram ificación y extremos tum efactos ocasio­ nales. Las colonias en SBA son pequeñas (0,2 mm de diám etro después de 24 horas de incubación) y son adhe­ rentes al agar, sobre todo en aislamiento primario. Esta especie da una prueba de catalasa negativa, no hidroliza esculina, urea ni hipurato y no reduce nitrato a nitrito. Esta especie tam bién es fuertem ente A'-acetil-p-D-glucosam inidasa positiva en la banda API Coryne. lo cual ayuda a diferenciarla de las otras especies de Actinomyces estre­ cham ente relacionadas. Los ácidos succínico y láctico constituyen los productos term inales de la fermentación de la glucosa.

Actinomyces cardiffensis

Actinomyces europaeus

Actinomyces funkei

Actinomyces georgiae

Actinomyces gereneseriae

Actinomyces graevenitzii

(Continúa)

776

C A P ÍT U L O 14

R ecuadro 1 4 -3

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

M ie m b ro s d e l g é n e ro A ctin o m yces (co n t.)

Especie

Importancia clínica e identificación

Actinomyces hongkongensis

Esta especie nueva, descrita en 2003, fue aislada de material purulento de un paciente con actinom icosis pelviana.962 Esta especie es estrictam ente anaerobia, crece en SBA com o colonias no hem olíticas puntiform es y es catalasa negativa. Mediante secuenciación de genes rRNA 16S, esta especie está m ás estrechamente relacionada con A. maramammaliuin, el cual ha sido aislado en focas y marsopas. Esta especie hum ana se originó con tres cepas de abscesos subcutáneos graves que requirieron drenaje.162/!, housto­ nensis es un anaerobio facultativo, que produce colonias grises a-hem olíticas que miden unos 0,2 mm de diám etro después de 48 horas de incubación a 35-37 °C. Las células son bacilos grampositivos pleomorfos que tienden a form ar semicírculos. El m icroorganism o da una prueba de catalasa negativa y no hidroliza esculina. urea o gelati­ na. Reduce el nitrato a nitrito y produce ácido a partir de glucosa y sacarosa, pero no de xilosa. A. israelii es el agente actinom icótico asociado con m ayor frecuencia con actinom icosis cervicofacial clásica. Este m icroorganism o tam bién puede causar infecciones m usculoesqueléticas asociadas con infecciones de tejidos blan­ dos adyacentes, traum atism o y diseminación hem atógena.5’5 También se han comunicado infecciones de articula­ ciones protésicas luego de una bacteriem ia por A. israelii ,985Este m icroorganism o es prim ariam ente anaerobio, y el crecim iento facultativo en una atmósfera rica en C 0 2 sólo ocurre después de subcultivos repetidos. Las colonias pueden asem ejarse a un diente molar, son no hem olíticas en SBA y reducen el nitrato a nitrito. Se produce ácido a partir de glucosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, xilosa, lactosa y trehalosa. A. meyeri es una especie anaerobia estricta asociada con distintas infecciones hum anas, como actinom icosis torácica y diseminada; neum onía; abscesos encefálicos, cutáneos y esplénicos; endocarditis; funisitis; corioam nionitis y osteom ielitis.32-177-327-437-537'657'913-967 Las colonias en agar sangre son blancas y no pigmentadas. Las cepas de A. meyeri son catalasa negativas, no hidrolizan esculina y no reducen nitrato. La prueba de CAM P es positiva y algu­ nas cepas también producen ureasa. Se produce ácido a partir de glucosa, maltosa, sacarosa y xilosa, y algunas cepas también ferm entan glicerol y glucógeno. N o se ferm enta m anitol, trehalosa, rafinosa ni mañosa. A. naeslundii se encuentra en la orofaringe hum ana y es una causa rara de actinomicosis cervicofacial. actinom icosis endocervical asociada con dispositivos intrauterinos ÍDIU). artritis séptica, enfermedad periodontal y otras infec­ ciones.387-532'971 Las cepas de A. naeslundii son divididas en las genoespecies I y II. am bas anaerobias facultativas. En general, las cepas del grupo I son catalasa negativas, pueden reducir o no nitrato a nitrito, y son prueba de CAM P negativas, m ientras que las cepas del grupo II suelen ser catalasa positivas, reducen nitrato a nitrito y son prueba de CAM P positivas. Am bos grupos hidrolizan esculina, ferm entan distintos hidratos de carbono y son urea­ sa positivos. Las colonias en agar sangre son no pigm entadas. Esta especie fue aislada originariamente en pus que fue aspirado del antro de un paciente que se som etió a una polipectom ía nasal de rutina.386 En las tinciones de Gram. aparece com o bacilos grampositivos corineformes, y se observa tam bién con cierta ram ificación y formas cocoides. El microorganismo es anaerobio facultativo y catalasa negativo; se producen ácido acético, láctico y succínico com o productos de ferm entación de la glucosa. No hidroli­ za esculina, gelatina ni almidón y la prueba de ureasa es negativa. Se produce ácido a partir de fructosa y celobiosa, pero no de glucosa, maltosa, sacarosa, ribosa, xilosa, lactosa, m anitol o amigdalina. Estas especies de Actinomyces fueron descritas en 1994 y com prenden los ex m iem bros de las cepas corineform e del grupo I de los CDC y “sim ilares al grupo I" que fueron aisladas en distintas muestras clínicas, como de deri­ vaciones de líquido cefalorraquídeo, cultivos óticos, líquidos vitreos, abscesos de glándulas m am arias, forúnculos y sangre.301 Las cepas del grupo I eran a-hem olíticas en agar sangre hum ana, reducían nitrato a nitrito, eran inca­ paces de ferm entar adonitol y eran fosfatasa alcalina negativas, m ientras que las cepas similares al grupo 1 eran no hem olíticas, no reducían nitrato a nitrito, ferm entaban adonitol y eran fosfatasa alcalina positivas. Am bos gru­ pos de microorganism os crecieron en condiciones aerobias y estrictam ente anaerobias. El análisis de la pared celular m ostró que carecían de ácidos meso-DAP y m icólicos. El análisis de ácidos grasos volátiles y no volátiles m ostró que el ácido succínico era el principal producto term inal de la ferm entación de la glucosa para ambos grupos de m icroorganism os y el examen de los ésteres m etílicos de ácidos grasos puso en evidencia que las pare­ des celulares contenían los ésteres m etílicos de los ácidos grasos C16:0, C 18:1c/í-9 y C18:0 com o sus principales com ponentes. Estos datos sugirieron una relación filogenética entre cepas del grupo 1 y sim ilares al grupo 1 de los CDC y especies de Actinom yces ,301-771 Luego, se hallaron las secuencias de genes rRNA 16S de estos m icroor­ ganismos que apoyaron la inclusión de las cepas del grupo 1 y sim ilares al grupo 1 de los CDC en el género Actinomyces. En 1994, las cepas del grupo 1 y sim ilares al grupo 1 de los CDC fueron propuestas form alm ente com o Actinomyces neuii subespecie neuii y Actinomyces neuii subespecie anitratus. respectivam ente.313 Desde el depósito de este corineform e en el género Actinomyces, esta especie ha sido asociada con corioam nionitis y sep­ sis neonatal, bacteriem ia m ortal en un huésped no inm unodeprim ido, endoftalm itis posoperatoria e infección de una prótesis m am aria.118'314328-576 Tanto A. neuii subespecie neuii com o A. neuii subespecie nitratus son bacilos gram positivos no hem olíticos catalasa positivos. Las colonias son circulares, lisas, convexas y blancas con bordes lisos; la subespecie neuii es a-hem olítica en SBA, m ientras que la subespecie anitratus es no hem olítica. Estos m icroorganism os son ferm entadores muy activos y producen ácido a partir de glucosa, m altosa, sacarosa, m ani­ tol, lactosa, m añosa, trehalosa y xilosa. Am bas especies producen leucina arilam idasa, a-galactosidasa, P-galactosidasa y a-glucosidasa, y son prueba de CA M P positivas. A. neuii subespecie neuii reduce nitrato a nitrito, m ientras que la subespecie anitratus es negativa para esta característica. Algunas raras cepas de A. neuii pueden ser catalasa negativas.118

Actinomyces houstonensis

Actinomyces ism elii

Actinomyces meveri

Actinomyces naeslundii

Actinomyces nasicola

Actinomyces neuii subespecie neuii y Actinomyces neuii subespecie anitratus

Especies de C orynebacterium

R ecuadro 1 4 -3

777

M ie m b ro s d e l g é n e ro Actinom yces (cont.)

Especie tinomyces odontolyticus

Actinomyces oricola

Actinomyces radicidentis

Actinomyces radingae

Actinomyces turicensis

Actinomyces urogenitalis

Actinomyces viscosus

Importancia clínica e identificación Esta especie se encuentra en la orofaringe hum ana en asociación con los surcos gingivales y lesiones cariadas pro­ fundas. También es una causa rara de baeteriemia, infecciones toracopulm onares, abscesos pulm onares, infeccio­ nes de tejidos blandos y actinom icosis pelviana asociadas con D H j.62-180-345-823-869962 Esta especie es catalasa negati­ va, produce colonias rosadas en SBA y form a colonias rojas en agar infusión de cerebro y corazón. El nitrato se reduce a nitrito y no se produce ureasa. Se produce ácido a partir de glucosa, m altosa y sacarosa, y algunas cepas ferm entan tam bién glicerol, glucógeno y xilosa. E sta especie nueva, al igual que A. radicidentis (véase más adelante), fue aislada originariam ente en un absceso den­ tal.384 Esta especie incluye bacilos grampositivos que m uestran tanto ramificación com o form ación de filamentos. El m icroorganismo es anaerobio facultativo, catalasa negativo y produce colonias puntiform es en SBA después de 48 horas de incubación. El análisis por crom atografía gas-líquido de cultivos en caldo de glucosa pasada muestra la form ación de ácidos acético, láctico y succínico. En la banda del API Coryne. se produce ácido a partir de glu­ cosa, m altosa y sacarosa solamente y produjo un núm ero de biocódigo de 2550121, que indica reacciones positivas para pirazinam idasa, fosfatasa alcalina e hidrólisis de esculina, a-glucosidasa y p-galactosidasa. A. radicidentis es una especie nueva que ha sido aislada en cultivos puros de conductos radiculares infectados en seres hum anos.170-476 Estas cepas eran grampositivas, catalasa positivas, de m orfología cocoide a cocobacilar y cre­ cieron en condiciones aerobias y anaerobias. Las colonias en SBA pueden producir un pigm ento rosado. Esta espe­ cie es activa desde el punto de vista ferm entativo, produce ácido a partir de glucosa, m altosa, m anitol, lactosa, ribosa y sacarosa en el API Coryne. hidroliza esculina y la reducción de nitrato y la producción de ureasa son características variables. La secuenciación del rRNA 16S de este m icroorganism o confirmó una relación estrecha con A. slackii. A. bovis, A. bowdenii, A. naeslundii y A. viscosus.™ Este m icroorganism o probablem ente es un m iem bro antes no reconocido de la m icroflora bucal norm al de los seres humanos. Los m icroorganismos del grupo E de los CDC fueron descritos originariam ente com o bacterias “similares a A. p yo ­ genes’’ que han sido aisladas en distintas fuentes clínicas hum anas que incluyen muestras de oído medio, líquido de em piema, quistes pilonidales, abscesos perianales, hem ocultivos, urocultivos y úlceras por decúbito.9*19Al prin­ cipio se pensaba que estos m icroorganism os eran cepas aerotolerantes del m icroorganism o anaerobio Bifidobacterium adolescentes que diferían en su crecim iento aerobio y en los productos term inales volátiles y no volátiles producidos a partir de la ferm entación de la glucosa.375 U tilizando enfoques genéticos y quimiotaxonóm icos, W ust y cois, observaron que estas cepas estaban estrecham ente relacionadas con especies de Actinomyces y propusieron dos especies nuevas en el género Actinomyces: Actinomyces radingae y Actinomyces turiscensis,970 Vandamme y cois, utilizaron luego electroforesis proteica de células enteras, análisis de ácidos grasos, pruebas fenotípicas bioquím icas (API Coryne y el panel 1DS Rapid ANA) y sondas de oligonucleótidos específicos de especie para caracterizar un grupo de bacterias corineform es catalasa negativas no identificadas.906 Estos investiga­ dores observaron que los m icroorganism os form aban dos grupos que correspondían a A. turicensis y A. radingae, respectivamente. Estos análisis perm itieron la publicación de descripciones corregidas de estas cepas similares a A. pyogenes de m uestras clínicas hum anas.906 U tilizando sondas de oligonucleótidos específicas de especie para A. turicensis y A. radingae, Sabbe y cois, exam inaron 294 cepas “similares a actinom ices" de m uestras clínicas hum anas recogidas en un período de 7 años y observaron que A. randigae se asocia fundam entalm ente con infec­ ciones relacionadas con la piel (p. ej., abscesos cutáneos, quistes pilonidales, abscesos perianales).734 A. radingae son bacilos gram positivos facultativos y catalasa negativos. D espués de 48 horas de incubación, las colonias en SBA son pequeñas, grises, convexas y circulares con una consistencia m antecosa. La mayoría de las cepas son a-hem olíticas. Se hidroliza esculina, pero no gelatina ni urea. N o se reduce el nitrato a nitrito y la prueba de CA M P es negativa. Se produce ácido a partir de glucosa, m altosa, sacarosa, lactosa, xilosa y ribosa, pero no de m anitol o glucógeno. Con las pruebas enzim áticas en el API Coryne, A. randigae produce a-glucosidasa. P-glucosidasa, a-galactosidasa, p-galactosidasa y N-acetil-P-D-glucosaminidasa, pero no produce leucina arilamidasa, pirrolidonil arilamidasa, fosfatasa alcalina o P-glucuronidasa. Las cepas de A. radingae son sensibles a penicilina, cefalosporinas, eritrom icina y tetraciclinas.*16 A. turicensis se encuentra principalmente en infecciones genitales, infecciones relacionadas con la piel e infecciones urinarias y algunas cepas han sido aisladas en tejido apendicular, absceso hepático, infecciones de cabeza y cuello y sangre.735-754 En la tinción de Gram, las células de A. turicensis son rectas, ligeramente curvas o con form a de palo. Las colonias en SBA son pequeñas, grises, convexas y enteras después de 48 horas de incubación en una atm ósfera de CO,. El m icroorganismo es catalasa negativo, no hidroliza esculina, urea ni gelatina, no reduce nitra­ to a nitrito y es prueba de CAM P negativo. Se produce ácido a partir de glucosa, maltosa, sacarosa, xilosa, ribosa y trehalosa, pero no se ferm enta lactosa ni manitol. En el API Coryne. se detecta a-galactosidasa, pero las otras pruebas enzim áticas son negativas. A. turicensis es am pliamente sensible a distintos agentes, com o penicilina, cefalosporinas, eritrom icina y doxiciclina.906 Las cepas de esta nueva especie fueron aisladas originariam ente en orina, secreción vaginal y cultivos uretrales.636 Estos microorganism os son bacilos catalasa negativos, grampositivos regulares y facultativos. Esta especie produce ácido a partir de glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y xilosa, y algunas cepas tam bién ferm entan manitol y ribosa. Se reduce nitrato a nitrito y se hidroliza la esculina, pero no se hidroliza gelatina, urea ni hipurato. Se cree que esta especie es un comensal de la vagina hum ana y aún no ha sido reconocido com o causa de enfermedad del aparato urogenital. A. viscosus se encuentra en la cavidad bucal del hom bre y los animales. Esta especie es un bacilo grampositivo y catalasa positivo. Las colonias en SBA son pequeñas y no hemolíticas después de crecim iento durante 48 horas. Se hidroliza esculina y urea, y el nitrato se reduce a nitrito. Se produce ácido a partir de glucosa y sacarosa, y algunas cepas producen tam bién ácido a partir de xilosa.

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C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

a. E species de A ctino m yce s

C atalasa

pigm ento

Pigm ento, células cocoides

A. radicidentis

+ i

P rueba de C A M P

U reasa

N AGA ____I___

I

___________ _______,

A rabinosa A. viscosus A. ne u ii

I R educción de nitrato

A. odontolyticus H idrólisis ___ de esculina

E sculina crecim iento aerobio

4 + + A. n e u ii subespecie n e u ii

____ I____

A. urogenitalis A. n e u ii colonias subespecie anitratus adherentes

_____ I_____ „ + , A. n a eslundii

H idrólisis de esculina

a-fu co sid a sa

I A. funkei

A. isra e lii

A. m eyeri

+ I NAGA ONPG

N AG A ____ L _

A. graevenitizii

+ A. europaeus A. georgiae A. gevencseriae

A. radingae

+ A. m eyeri

b. A rcan obacte rium y A ctino b a cu lu m sch a lii

A. turicensis

C atalasa

P rueba de C AM P

+ débil

I

Inversa

+

O N PG N AG A

I

O N PG p-xilosidasa A. h aem olyticum

A. s ch a lii A. pyogenes

A. bernardiae

F ig u r a 1 4 -3 Algoritm o para la identificación de especies de Actinomyces, Actinobaculum y Arcanobacterium en muestras clínicas humanas.

Especies de Actinomyces aisladas en animales

Muchas especies de Actinom yces, que incluyen varios géne­ ros descritos originariamente, son patógenos animales. Como ya se mencionó, A. bovis es una causa de actinomicosis bovi­ na. A. hordeovulneris, A. canis, A. catuli y A. coleocanis se encuentran en la vagina de perros y A. bowdenii ha sido aisla­ do en infecciones cutáneas de perros y gatos.429-430-433-644 A. hor­ deovulneris y A. denticolens también se encuentran en los sur­ cos gingivales de gatos.555 A. hordeovulneris ha sido asociado con actinomicosis canina, pleuritis piogranulomatosa, peritoni­

tis, pericarditis y artritis séptica.675 A. hyovaginalis se encuen­ tra en el aparato genital de cerdos y ha sido aislado en lesiones purulentas del aparato genital y en el pulmón de estos anima­ les. 1,175 La nueva especie A. suim astiditis fue aislada originaria­ mente en un cerdo con mastitis 432 A. howellii, A. denticolens, A. slackii y A. vaccim axillae se encuentran en las orofaringes de vacas; la última especie fue aislada originariamente en la lesión mandibular de una vaca.214-383-698 A. marimammalium ha sido aislado en mamíferos marinos, como focas y marsopas.434 El cuadro 14-13 contiene las características fenotípicas de todas las especies de Actinomyces.

Especies de C orynebacterium

Especies de Arcanobacterium

Las especies de Arcanobacterium son bacilos grampositivos facultativos que pueden ser ligeramente curvos y pueden mos­ trar una ramificación rudimentaria junto con formas en letras chinas y V. A diferencia de las especies de Corynebacterium , estos microorganismos son catalasa negativos, no tienen ácidos micólicos de la pared celular y contienen L-lisina y L-omitina más que m eso- DAP como el peptidoglueano diaminoácido. El género Arcanobacterium incluye actualmente seis especies: A. haemolyticum, A. pyogenes, A. bernardiae, A. phocae, A. p lu ­ ranimalium y A. h ippocoleae,m ,m ’523,105 A. haemolyticum, A. pyogenes y A. bernardiae eran antes miembros del género Corynebacterium y ulteriormente del género Actinom yces

antes de que el análisis de secuencias de rRNA 16S estable­ ciera que era miembro del género Arcanobacterium Se ha aislado A. phocae en focas y otros animales marinos, mientras que A. pluranim alium ha sido aislado en marsopas y ciervos.523,705 El miembro más nuevo del género, A. hippocoleae, ha sido aislado sólo en las secreciones vaginales de un caballo.431 A. haemolyticum se asocia con faringitis aguda en los seres humanos.480,930 A menudo, las adenopatías cervicales, la amig­ dalitis y la erupción pueden acompañar a la infección.567 Debido a la erupción, se puede considerar que los pacientes tie­ nen escarlatina. También se han observado “seudomembranas” faríngeas extensas semejantes a las observadas con la difteria en algunos pacientes.359 En general, la faringitis por A. hae­ molyticum ocurre en niños y adultos jóvenes (el grupo de 10 a 30 años). También se lo ha aislado en úlceras cutáneas crónicas, infecciones de tejidos blandos, abscesos de tejidos profundos (que incluyen abscesos encefálicos, periamigdalinos, paravertebrales e intraabdominales) e infección de espacios articula­ res, y ha sido asociado con sinusitis, celulitis orbitarias, neu­ monía, osteomielitis, endocarditis y meningitis.21'225-278'541-814 También se lo involucró en un caso de enfermedad de Lemierre asociado con Fusobacterium necrophorum.9M En general, A. haemolyticum es sensible a todas las clases de antibióticos, que incluyen penicilinas, cefalosporinas, macrólidos y vancomici­ na, y la resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol se considera un hallazgo constante.19'219' 131 Algunas cepas pueden ser resis­ tentes a las tetraciclinas. los macrólidos, la clindamicina y la ciprofloxacina.131 Arcanobacterium bernardiae es una especie recién descrita que incluye cepas antes denominadas corineformes del grupo 2 de los CDC.309 Se lo aisló en distintas fuentes clínicas huma­ nas, entre ellos sangre, heridas y orina. En 1995, Funke y cois, propusieron la inclusión de los microorganismos grupo 2 de los CDC en el género Actinom yces como Actinom yces bernar­ diae? 09 El análisis de secuencia de rRNA 16S de estas cepas condujo a la propuesta ulterior de transferirla al género Arcanobacterium como Arcanobacterium bern a rd ia e105 Se han comunicado dos casos de infecciones urinarias complica­ das y un caso de artritis séptica debidas a A. bernardiae .3-441-530 En uno de estos casos, el paciente tenía una disfunción vesical de larga data y desarrolló hidroureteronefrosis, cálculos rena­ les, abscesos perirrenales y septicemia.441 A. pyogenes es reconocido como patógeno veterinario, que produce infecciones en cerdos, ganado bovino, ovejas, cabras y animales domésticos de compañía (perros y gatos).85 Al res­ pecto, el microorganismo y sus infecciones tienen gran impor­ tancia económica. También se puede aislar en la leche y otros productos lácteos producidos de animales infectados. Aunque se han comunicado infecciones humanas causadas por este

779

microorganismo desde 1940, la validez de estas comunicacio­ nes es cuestionable debido a la ausencia de datos microbiológicos que aseguren una distinción definida entre este agente y bacterias estrechamente relacionadas como A. haemolyticum (véase lámina en color 14-2G). Las infecciones porA . p yo g e­ nes confirmadas bacteriológicamente han incluido bacteriemia en un paciente con cáncer de colon, cinco pacientes con infec­ ciones intraabdominales (incluida una con cáncer del cuello uterino), dos con otitis media, uno con mastoiditis, dos con cis­ titis (incluido uno con carcinoma prostático), dos con abscesos cutáneos y un paciente con diabetes y una infección mixta de una herida y hemocultivos positivos que contenían pyogenes ^ 58,232,319,563 £¡ microorganismo ha sido aislado como causa de úlceras en las piernas entre un grupo de niños de la zona rural de Tailandia.501 A. haemolyticum, A. bernardiae y A. pyogenes son las espe­ cies que pueden hallarse en muestras clínicas de seres huma­ nos. En SBA, A. haemolyticum crece como pequeñas colonias mate P-hemolíticas (véase lámina en color 14-6E). Se puede observar hemolisis inicialmente en áreas de crecimiento con­ fluente luego de 24 horas de incubación; las colonias aisladas serán p-hemolíticas luego de 48 horas de incubación. A. hae­ molyticum también es catalasa negativo y no hidroliza esculina ni urea. La mayoría de las cepas son pirazinamidasa, fosfatasa alcalina, P-galactosidasa, a-glucosidasa y /V-acetil-P-glucosaminidasa positivas y hidrólisis de gelatina y P-glucuronidasa negativas. La mayoría de las cepas fermentan glucosa, maltosa, lactosa y ribosa, y no fermentan manitol, xilosa o glucógeno (véase lámina en color 14-6F). A. haemolyticum es la única especie de Arcanobacterium que es prueba de CAMP inversa positiva (o inhibición de la prueba de CAMP positiva). En esta prueba, el efecto de la P-hemolisina de S. aureus sobre los eri­ trocitos de carnero es inhibido por la fosfolipasa de A. hae­ molyticum. Esto aparece sobre la placa de SBA como un área no hemolizada con forma de punta de flecha entre S. aureus y A. haemolyticum sembrado en estría en ángulos rectos con la estría de estafilococo. A. bernardiae forma pequeñas colonias lisas y espejadas en SBA que pueden ser o no P-hemolíticas. Este microorganismo es catalasa negativo y produce ácido a partir de glucosa y maltosa, pero no de sacarosa, manitol, xilo­ sa y lactosa. A diferencia de A. haemolyticum, se fermenta más fácilmente la glucosa que la maltosa, y se fermenta fácilmente el glucógeno. A. pyogenes, la especie aislada más a menudo en los seres humanos, también es P-hemolítica y catalasa negati­ va. Esta especie se diferencia fácilmente de A. haemolyticum y de A. bernardiae porque es obviamente P-hemolítica a las 24 horas, es hidrólisis de gelatina positiva, fermenta la xilosa y es P-glucuronidasa (p-GUR) positiva. Las tres especies se identi­ fican con facilidad con API Coryne. En el cuadro 14-14 se encuentran las características fenotípicas de las especies de Arcanobacterium. Especies de Arthrobacter

Durante su examen de distintas cepas de los grupos B-l y B-3 de los CDC, Funke y cois, encontraron 11 muestras clíni­ cas humanas (de orina, infección cutánea, hemocultivos y endoftalmitis) que mostraron un ciclo bacilo-coco pronuncia­ do. El análisis de la pared celular mostró que la lisina era el principal diaminoácido y la presencia de diferentes ácidos gra­ sos celulares.295 Estos datos fueron compatibles con miembros del género Arthrobacter. Los miembros de este género se encuentran en el medioambiente y también son aislados en los animales; pocas veces se aíslan en muestras clínicas huma-

780

C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

Cuadro 14-13A Características bioquímicas para la identiñcación de especies de A c tin o m y c e s aisladas en seres humanos y animales

ESPECIE

CAT

MORFOLOGÍA PIGMENTACION DE LAS COLONIAS

HEMOL SBA

RED N 0 3 PYZ

AP

ESC

URE

ADH

-/P

-

ND

-

v+

-

ND

Pequeñas, blanco grisáceas

-

+

+

V

+

-

-

+

No descritas

-

-

+d

-

-

-

-

-

V

-

-

-

-

-

A. catuli

V

Pequeñas, convexas, de color crem a a rosado, y de bordes lisos Pequeñas, convexas, blancas, adherentes

-

+

+

-

+

-

V

A. coleocanis

-

No inform ada

-

-

+d

-

-

-

-

A. denticolens

-

De bordes continuos (lisos), convexas o umbilicadas, lisas, pigm entación rosada clara

-

+

ND

-

+

ND

ND

A. europaeus

-

Pequeñas, grisáceas, translúcidas

- /p d

-

-

-

V

-

ND

A. funkei

A. bovis

-

Lisas o granulosas con centros oscuros, blancas, de bordes continuos (lisos)

A. bowdenii

+

A. canis A. cardiffensis

-

Pequeñas, grises

-

V

V

+

-

-

-

A. georg ia e

-

Pequeñas, circulares, de bordes lisos, convexas

-

V-

ND

ND

+“

-

ND

A. geren eseria e

-

Pequeñas, circulares, convexas

V

V-

ND

ND

+

-

ND

A. gra even itzii

-

Pequeñas, adherentes, ligeram ente rosadas en SBA

-

-

ND

ND

-

-

ND

-

-

ND

+

-

-

+

-

V

-

+

-

ND

-

+

A. hong ko n g en sis

-

Pequeñas, puntiformes

A. hordeovulneris

+d

Blancas, adherentes, con forma de cúpula, consistencia m antecosa

A. ho w ellii

-

+

Blancas, lisas, convexas, de bordes continuos (lisos)

ND

-

+

+

+

A. h y ova g in a lis

-

Planas con bordes hacia afuera

-

V

-

+

+

-

-

A. hou sto n ien sis

-

Pequeñas, grises, convexas

-

+

ND

-

-

-

ND

A. israelii

-

Rugosas, apiladas, "en diente molar”, blancas a blanco grisáceas

-

v+

ND

ND

+

-

ND

A. marimammalium

-

Pequeñas, grises, convexas, de bordes lisos

-

-

-

V

-

-

-

A. meyer i

-

Pequeñas, planas a convexas, blancas, brillantes, lisas

-

V-

ND

-

-

V

ND

A. na e slu n d ii genoespecie 1

V-

Lisas, circulares, convexas, umbilicadas

-

v+

+

-

+

+

-

A. na e slu n d ii genoespecie 2

v+

Lisas, circulares, convexas, um bilicadas

-

+

+

+d

+

+

-

A. nasico la

-

Puntiformes, blanco grisáceas, opacas, de bordes lisos

-

-

ND

-

V

-

V

A. n e u ii subespecie n eu ii

+

Circulares, pequeñas, convexas, opacas

a

+

+

-

-

-

ND

A. n e u ii subespecie a n itra tu s

ND

+

Circulares, pequeñas, convexas, opacas

-

-

+

V

-

-

A. odo n to lyticu s

-

Pequeñas, pigm entación rosada en SBA. rojas en BHI

-

+

ND

-

V

-

-

A. oricola

-

Puntiform es. “en miga de pan”, blancas

-

-

+

V

+

-

-

A. radicidentis

+

Pigm entación rosada, pequeñas, de bordes lisos

-

V

+

-

+d

V

-

A. radin g a e

-

Pequeñas, grises, convexas, circulares, opacas

ot/pd

-

V

-

+

-

ND

A. slackii

+

Pequeñas, grises, opacas

-

+

V

-

+

v-

-

A. suimastitidis

-

N o descritas

-

-

+d

V

+

-

-

A. turicensis

-

Pequeñas, grises, opacas, enteras

-

ND

N o descritas

V

-

-

A. vaccimaxillae

-

Pequeñas, blancas, opacas, de bordes lisos

-

-

+

+

-

-

+

-

A. urog en ita lis

Pd -

+

+

-

-

A. viscosus serotipo 1

+

Pequeñas, lisas, circulares de bordes continuos (lisos)

-

V

-

-

+

+

-

A. viscosus serotipo 2

+

Pequeñas, lisas, circulares de bordes continuos (lisos)

-

V

+

-

V

V

V

+, reacción positiva; - reacción negativa; +d, reacción positiva débil o retardada; V, reacción variable; V+, variable, mayoría de cepas positivas; V-, variable, mayoría de cepas negativas; ND, datos no disponibles; Cat, catalasa; Fac, facultativo; Ana, anaerobio; Cat, catalasa; Hemol SBA, hemolisis en agar sangre de camero; BH1, agar con infusión de cerebro y corazón; Red N 0 3, reducción de nitrato a nitrito; PYZ, pirazinamidasa; AP, fosfatasa alcalina; ESC, hidrólisis de esculina; URE, hidrólisis de urea; ADH, dihidrolasa que produce arginina; MOT, motilidad; GEl, hidrólisis de gelatina; LAP, leucina arilamidasa; PYR, pirrolidonil arilamidasa; Prueba CAMP, prueba de CAMP con S. aureus que produce

Especies de C orynebacterium

781

GEL

LAP

PY R

PRUEBA CAM P

a -G A L

P-G AL

a -G L U

P-GLU

P-G UR

NAGA

H IP

A C E T O ÍN A

-

+

ND

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V

V

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-

+

ND

ND

-

V

V

+

-

-

-

-

^-hemolisina; a-GAL, a-galactosidasa; ¡5-GAL, fi-galactosidasa; a-GLU, a-glucosidasa; [5-GLU, (5-glucosidasa; P-GUR, fi-glucuronidasa; NAGA, N-acetil-fí-D-glucosaminidasa; Hip, hidrólisis de hipurato; Glu, glucosa; Mal, maltosa; SAC, sacarosa; Mntl, manitol; Xil, xilosa; Lac, lactosa; Mne, mañosa; Arab, arabinosa; Sorb, sorbitol; Raf, rafinosa; Tre, trehalosa; Glycg, glucógeno; Amyg, amigdalina; Meli, melibosa; Melez, melezitosa; S, cantidades importantes de ácido succínico a partir de glucosa; l, cantidades menores de ácido láctico a partir de glucosa; f, cantidades menores de ácido fórmico a partir de glucosa.

(Continúa)

782

C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

Cuadro 14-13B Características bioquímicas para la identificación de especies de A ctin om yces aisladas en seres humanos y animales

E S P E C IE A. bovis

R E L A C IÓ N CON O ,

G LU

MAL

SAC

M NTL

XYL

LAC

MNE

ARA B

SORB

RAF

Ana/Fac

+

+

+

-

-

+

V

-

-

-

A. bowdenii

Fac

+

+

+

-

-

+

ND

-

-

+

A. canis

Fac

+

+

V

-

+

+

ND

+

-

V

A. cardiffensis

Fac

+

V

V

-

-

-

V

-

-

V

A. catuli

Fac

+

+

+

-

+

+

ND

V

-

+

A. coleocanis

Fac

+

+

-

-

-

+

ND

-

-

-

A. denticolens

Fac

+

+

+

V

-

+

V

-

-

+

A. europaeus

Fac

+

+

V

-

-

-

V

-

-

-

A. funkei

Fac

+

V

+

-

+

V

ND

-

-

-

Fac

+

+

+

V-

+

v+

v-

V-

V-

V-

A. gerencseriae

Ana/Fac

+

+

+

V

+

+

+

-

V

+

A. graevenitzii

Fac

+

+

+

-

-

+

ND

-

-

-

A. hongkongensis

Ana

-

ND

ND

ND

-

ND

-

-

ND

-

A. hordeovulneris

Ana/Fac

+

+

+

-

+

+

+d

V

ND

+“

A. howellii

Ana/Fac

+

+

+

-

+

V

V

-

ND

+J

A. hyovaginalis

Fac

+

+

+

-

+

V

+

+

-

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A. houstoniensis

Fac

+

ND

+

ND

-

ND

ND

ND

ND

ND

Ana/Fac

+

+

+

V+

+

+

+

V+

V-

+

Fac

+

+

-

-

-

+

ND

-

-

-

Ana/Fac

+

+

+

-

+

V+

-

V-

-

-

A. naeslundii genoespecie 1

Fac

+

+

V+

-

V-

V

+

-

-

+

A. naeslundii genoespecie 2

Fac

+

+

v+

+

v+

V

+

-

V

+

A. nasicola

Fac

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

A. neuii subespecie neuii

Fac

+

+

+

V

+

+

+

v+

ND

+

A. neuii subespecie anitratus

Fac

+

+

+

v+

+

+

+

-

ND

+

A. georgiae

A. israelii A. marimammalium A. meyeri

A. odontolyticus

Ana/Fac

+

V+

+

-

V

V

-

V

-

-

A. oricola

Fac

+

V+

+

-

-

-

ND

-

-

+

A. radicidentis

Fac

+

+

+

+

-

+

ND

-

-

+

A. radingae

Fac

+

+

+

-

+

v+

ND

VD

ND

V

A. slackii

Fac

+

ND

V

-

+

ND

ND

-

ND

ND

A. suimastitidis

Fac

+

V

+

-

+

-

ND

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-

+

A. turicensis

Fac

+

+

+

-

+

-

ND

ND

ND

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A. urogenitalis

Fac

+

+

+

V

+

+

ND

V

-

+

A. vaccimaxillae

Fac

+

-

V

V

+

+

ND

+

-

-

A. viscosus serotipo 1

Fac

+

V

+

-

V-

v+

V

-

-

+

A. viscosus serotipo 2

Fac

+

V

+

-

-

v+

V

-

-

+

+, reacción positiva; -, reacción negativa; +d, reacción positiva débil o retardada; V, reacción variable; V+, variable, mayoría de cepas positivas; V-, variable, mayoría de cepas negativas; ND, datos no disponibles; Cat, catalasa; Fac, facultativo; Ana, anaerobio; Cat, catalasa; Hemol SBA, hemolisis en agar sangre de carnero; Reducción de NOy reducción de nitrato a nitrito; PYZ, pirazinamidasa; AP, fosfatasa alcalina; ESC, hidrólisis de esculina; URE, hidrólisis de urea; ADH, dihidrolasa que produce arginina; MOT, motilidad; GEl, hidrólisis de gelatina; LAP, leucina arilamidasa; PYR, pirrolidonil arilamidasa; Prueba CAMP, prueba de CAMP con S. aureus productor de (5-hemolisina; a-GAL,

Especies de C orynebacterium

RIB

TRE

GLY

G LY CG

AM YG

M ELI

M ELEZ

F E R M E N T A C IÓ N (G L C )

-

-

-

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-

V

-

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+

+

ND

ND

ND

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+

S, L, A

+

+

ND

-

-

ND

783

PRO D U CTO S DE GLUCOSA B IO C Ó D IG O S A P I F R E C U E N T E S 0101104 3410365, 3400365, 3510365, 3500365

-

ND

V

-

ND

-

-

-

-

L, S, a

0010121,0010321, 1010121, 1010321

+

+

ND

-

ND

V

-

S, L, a

7650761, 7650765, 7670761, 7670765

-

-

ND

+

ND

-

-

S, L S, A, L

2430766, 2430767

2410162

V

-

-

ND

-

ND

-

V

V

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V

-

V

V

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V

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-

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ND

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V

V

S, L, a, f

ND (0,2)(0,4)2036!

ND 04 (1/5) 0 (1/3) 2 (0/1/2/3); G EL + después de 5 días 0130761, 3530761

+

-

+

-

+

-

-

-

-

L, S

-

-

ND

ND

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ND

ND

ND

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V

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V

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ND

-

V

V

ND

ND

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-

-

-

V

-

V

-

+

-

-

ND

0570721, 0170721

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

V+

+

-

-

V+

V+

V

S, A, L, f

ND

-

S, A, L

0520162, 0420160, 0520160

-

ND

V

ND

-

-

+

-

V

V

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-

-

S, a, 1, f

ND

V

V+

V

-

V

V

-

L, s, a, f

ND

V

v+

V

V

V

V

V

L, s, a, f

ND

-

-

-

-

-

-

-

S, a, 1

ND

+

+

+

v+

ND

v+

+

S, L

Incluido en la base de datos de API Coryne

+

+

+

V

ND

+

+

S, L

Incluido en la base de datos de API Coryne

V

V

V

V

-

-

-

S, A, f

ND

V

+

ND

ND

+d

-

-

S, A, L

ND

+

+

ND

-

ND

+

+

ND

ND

+

ND

ND

-

ND

ND

ND

ND

Incluido en la base de datos de API Coryne

-

+

ND

-

ND

+

ND

ND

ND

+d

-

ND

ND

ND

+

-

ND

ND

+

+

+

-

ND

ND

ND

ND

00170721. 0010701, 0010723, 1010701; incluido en la base de datos de API Coryne

V

+

ND

-

ND

+

+

ND

ND

+

+

ND

+

-

-

-

S, L, a

ND

-

V-

-

V

-

-

-

S, A, L, f

ND

+

V

V

V

-

V

-

S, A, L, f

ND

a-galactosidasa; p-GAL, p-galactosidasa; a-GLU, a-glucosidasa; P-GLU, P-glucosidasa; P-GUR, P-glucuronidasa; NAGA, N-acetil-P-D-glucosaminidasa; Hip, hidrólisis de hipura­ to; Glu, glucosa; Mal, maltosa; SAC, sacarosa; Mntl, manitol; Xil, xilosa; Lac, lactosa; Mne, mañosa; Arab, arabinosa; Sorb, sorbitol; Raf, rafinosa; Tre, trehalosa; Glycg, glucóge­ no; Amyg, amigdalina; Meli, melibosa; Melez, melezitosa; S, cantidades importantes de ácido succínico a partir de glucosa; l, cantidades menores de ácido láctico a partir de gluco­ sa; f, cantidades menores de ácido fórm ico a partir de glucosa.

784

C A P ÍT U L O 14

Cuadro 1 4 -1 4

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

Características bioquímicas para la identificación de especies de Arcanobacterium

PRU EBA

A. BERNARDIAE

A. HAEM OLYTICUM

A. H IPPO COLEAE

A. PH O CAE

A. PLURANIM ALIUM

A. PYOGENES

-

-

V

+

-

Catalasa

-

Hemólisis, SBA

V

P

P

P

a

P

Reducción de N 0 3

-

-

-

-

-

V

Pirazinam idasa

+

+

-

+

V

V-

Fosfatasa alcalina

-

V+

V+

+

-

V

-

Hidrólisis de esculina

-

-

+J

Arginina dihidrolasa

ND

ND

-

ND

-

ND

Hidrólisis de hipurato

ND

ND

+

ND

+

ND

Producción de acetoína

ND

ND

-

ND

-

ND

-

ND

-

-

+

+

Glucosa

+

+

+

+

+

+

M altosa

Hidrólisis de gelatina

-

Acido producido a partir de:

+

+

V

+

V

+

Sacarosa

-

V

-

+

-

V

Manitol

-

-

-

V-

-

V

Xilosa

-

-

-

-

-

+

Lactosa

-

+

+

+

-

+

M añosa

ND

ND

ND

v+

ND

+

Arabinosa

ND

ND

-

-

-

V

Sorbitol

ND

ND

-

-

-

V

Rafinosa

ND

ND

-

-

-

-

Ribosa

V+

V+

-

+

+

ND

Trehalosa

ND

ND

-

v+

-

+

+

-

ND

+

ND

ND

V+

ND

-

+

-

+

ND

ND

ND

-

Glicerol Glucógeno Amigdalina

-

ND

M elibiosa

ND

ND

-

-

-

-

M elezitosa

ND

ND

-

V+

-

+

LAP

+

ND

+

+

ND

ND

PYR

V

V

-

-

ND

+

a-G A L

-

ND

-

+

-

-

P-GAL

-

V+

+

+

-

+

a-G L U

+

+

+

+

-

+

P-GLU

-

-

-

-

-

-

P-GUR

-

V

+

-

+

+

NAGA

-

v+

V

-

-

V

+, reacción positiva; -, reacción negativa; V, reacción variable; V+, reacción variable, mayoría de cepas positivas; V-, reacción variable, mayoría de cepas negativas; +d, reac­ ción positiva débil.

ñas.249,435 Algunas comparaciones quimiotaxonómicas y genéti­ cas de estas cepas con las especies de Arthrobacter ambienta­ les existentes condujeron a proponer dos especies de A rthrobacter nuevas -A . cumminsii y A. w oluw en sis- para

algunos las cepas grupos B -l y B-3 de los CDC.295 Un análisis realizado en 1998 de 15 muestras clínicas de A. cumminsii del aparato urinario, oído medio, líquido amniótico, vagina, osteo­ mielitis calcánea, celulitis de tejidos profundos, cuello uterino,

Especies de C orynebacterium

sangre y heridas puso en evidencia patrones singulares de los ácidos grasos celulares, con la presencia constante de C14:0i y C14:0, y cantidades extraordinariamente altas de ácidos grasos C 16:0 y C16:0i, que no se encuentran en otras especies de A rthrobacter ,304 Cuando se evaluaron estas cepas en API Coryne, se observaron muchos biotipos después de 24 horas y 7 días de incubación. (Véase cuadro 14-13). A. cumminsii es la especie de A rthrobacter aislada más a menudo en muestras clínicas humanas. Este microorganismo es catalasa positivo, LAP positivo, inmóvil y tanto nitrato reductasa como hidrólisis de esculina negativo. Algunas cepas producen ureasa y la mayoría tienen tanto actividad de DNasa como de gelatinasa. Aunque la mayoría producen ácido a par­ tir de ribosa, la producción de ácido a partir de glucosa es variable, y no se produce ácido a partir de maltosa, sacarosa, manitol, xilosa, lactosa o glucógeno.304 A. woluwensis hidroli­ za esculina, urea, gelatina y DNA y, al contrario de A. cum­ minsii, produce varias actividades enzimáticas, que incluyen (3-galactosidasa (P-GAL), a-glucosidasa (a-G LU ), p-glucosidasa (P-GLU) y A'-acetil-P-D-glucosaminidasa (NAGA). En la mayoría de las comunicaciones sobre estos microorganismos, se utilizó API CHO® (BioMérieux), un panel de asimilación de hidratos de carbono (sin fermentación) para la caracterización, pero este sistema no suele emplearse en los laboratorios clíni­ cos. Desde que se describieron A. cumminsii y A. woluwensis, se han aislado otras especies de Arthrobacter descritas antes (A. oxydans) y tres especies nuevas de A rthrobacter (A. creatinolyticus, A. luteolus y A. albus) en muestras clínicas humanas, que incluyen sangre, heridas quirúrgicas y orina.428-938 A. creatinolyticus hidroliza creatina, xantina y gelatina, pero no almi­ dón. Esta especie también produce ácido a partir de glicerol, pero la descripción original no describió la acidificación de hidratos de carbono. Las especies de A rthrobacter están inclui­ das en la base de datos API Coryne; no obstante, las cúpulas para la fermentación de hidratos de carbono suelen ser negati­ vas después de 24 horas. La incubación prolongada de los paneles de identificación (hasta 5 a 7 días) puede conducir a la utilización oxidativa lenta de algunos hidratos de carbono. En el cuadro 14-15 se presentan algunas características fenotípicas y bioquímicas de las especies de Arthrobacter aisladas en las especies clínicas. Especies de Brevibaclerium

Las especies de Brevibacterium son bacterias irregulares, delgadas, con forma de bacilos que muestran un ciclo bacilococo pronunciado. Los subcultivos frescos (< 3 días) se tiñen como bacilos, pero a medida que el cultivo envejece (4-7 días), las células pueden tener morfología de cocos. Ambas formas del microorganismo son grampositivas, pero fácilmente pueden cambiar de color. Las células con forma de bacilo muestran una morfología difteroide y son no ácido-alcohol resistentes. Las especies de Brevibacterium son aerobias estrictas y tienen metabolismo oxidativo. Son inmóviles y tolerantes a la sal (NaCI > 6,5%), producen catalasa y proteinasas, no tienen ure­ asa y no producen ácido a partir de glucosa ni otros hidratos de carbono en medios con peptona. Las brevibacterias también producen característicamente metanetiol (CH3SH) a partir de L metionina. El peptidoglueano contiene m eso- DAP como dia­ minoácido principal, pero no contiene arabinosa, lisina ni áci­ dos micólicos (se puede presentar o no galactosa).123-462 En la actualidad, el género Brevibacterium está compuesto por nueve especies: B. linens, B. iodinum, B. casei, B. epid er­ m i d i s B . mcbrellneri, B. otitidis, B. paucivorans, B. lutescens

785

y B. avium. En la edición de 1986 del B ergey’s M anual se des­ cribieron cuatro especies: B. linens. B. iodinum, B. casei y B. epiderm idis.462 B. casei y B. epiderm idis crecen en condiciones óptimas a 30-37 °C, mientras que B. linens y B. iodinum pre­ fieren hacerlo a 20-30 °C. Las colonias de estos microorganis­ mos son blanco grisáceas, blanco amarillentas, amarillas u ocres y tienen un olor intenso “a queso’" (véase lámina en color 14-6G). El hábitat de las brevibacterias es fundamentalmente los productos lácteos, en los cuales las bacterias contribuyen al aroma y el color (p. ej.. B. linens con pigmento anaranjado) de los quesos que maduran superficialmente (p. ej., queso Limburger). También se encuentran sobre las superficies cutá­ neas humanas. Cuando residen sobre la piel humana en condi­ ciones de maceración y humedad (p. ej., entre los dedos del pie y otras zonas intertriginosas), se cree que contribuyen al olor corporal. B. m cbrellneri , descrito en 1993, fue aislado en los pelos de los genitales humanos que estaban infectados simultá­ neamente por Trichosporon beigelii.597’ Brevibacterium otitidis, una especie aislada en seres humanos con otorrea bilateral, fue descrito en 1996.662 B. paucivorans, descrito en 2001, ha sido aislado de LCR. abscesos, heridas, sangre, secreción ótica y catéteres intravasculares.939 B. lutescens es una especie similar a B. otitidis aislada en líquido de diálisis peritoneal humana y en una secreción ótica infectada en 2003 937 B. avium ha sido aislado en lesiones granulomatosas en aves de corral.661 Las brevibacterias son causas raras de infecciones humanas y el examen de las cepas clasificadas antes como grupos B-l y B-3 de los CDC estableció que algunas eran, de hecho, espe­ cies de Brevibacterium. En 1991. McCaughey comunicó el pri­ mer caso documentado de infección de una vía venosa central causado por B. epiderm idis en un hombre de 40 años.595 En 1993, Gruner y cois, aislaron nueve cepas de Brevibacterium, en el líquido de diálisis de pacientes que se encontraban en diá­ lisis peritoneal ambulatoria continua, hemocultivos, esputo, LCR, líquido pleural y otro líquido corporal.371 La compara­ ción de sus características bioquímicas con las cepas de Brevibacterium de referencia indicó que estos microorganis­ mos eran B. casei o B. epiderm idis. Estos investigadores sugi­ rieron que los bacilos aerobios, grampositivos y catalasa posi­ tivos que son inmóviles y no fermentan azúcares pueden ser identificados como especies presuntivas de Bacteroides sobre la base de la pigmentación y la morfología de las colonias (blancas grisáceas a amarillas, opacas, convexas y lisas) y un olor intenso a “queso” o “pies hediondos” . Estos mismos inves­ tigadores examinaron luego 41 cepas clínicas grupos B -l y B3 de los CDC y observaron que 22 eran idénticas a B. casei y otras 5 formaban otro gurpo fenotípico dentro del género Brevibacterium ,372 Funke y Carlotti también examinaron 43 cepas de Brevibacterium aisladas en muestras clínicas en los últimos 20 años y las compararon con cepas de referencia.290 Utilizando análisis quimiotaxonómico y pruebas de asimila­ ción de hidratos de carbono con el panel de asimilación de hidratos de carbono API 50CH, 41 fueron identificadas como B. casei y 2 como B. epiderm idis. Las colonias de B. casei sue­ len ser gris blancuzcas, mientras que las cepas de B. epiderm i­ dis desarrollan colonias amarillentas con el tiempo. Se puede utilizar la detección de metanetiol y el análisis de ácidos grasos celulares para confirmar la asignación de la cepa al género Brevibacterium, y se pueden utilizar asimilaciones de hidratos de carbono para identificarla con la especie. Las brevibacterias también están incluidas en las bases de datos del API Coryne y el RaplD CB-Plus (véase lámina en color 14-6H). En el cuadro 14-16 se muestran las características bioquímicas de las espe­ cies de Brevibacterium.

786

C A P ÍT U L O 14

Cuadro 1 4 -1 5

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

C aracterísticas bioquímicas para ia identificación de especies de Arthrobacter A.

C A R A C T E R IS T IC A

ALBUS

A. CITREUS

A. CREATINOLYTICUS

A. CUM M INSII

A. LUTEOLUS

A. OXYDANS

A. WOLUWENSIS

+

+

+

+

+

Catalasa

+

+

Hemolisis, SBA

-

ND

-

-

-

-

-

Crecim iento, 20 °C

-

+

ND

V

+

+

+

Crecim iento, 42 °C

+

-

ND

+

+

V

+

Reducción de N 0 3

-

+

+

-

+

+

-

Pirazinam idasa

+

ND

ND

V

+

ND

ND

Fosfatasa alcalina

+

ND

ND

V

ND

ND

+

Hidrólisis de esculina

-

ND

ND

-

-

-

+ 3 días

Ureasa

-

ND

ND

V

-

-

+ 3 días

Motilidad

-

+sl

-

-

+

-

-

Hidrólisis de gelatina

+'

+

+

+ 10 días

+

+

+ 24 horas

DNasa

-

+

ND

+ 10 días

+

+

+ 24 horas

LAP

+

ND

ND

+

+

ND

+

PYR

+

-

ND

+

-

-

+

a-G A L

-

ND

ND

-

-

ND

-

p-GAL

-

+

ND

-

-

+

+

a-G L U

-

+

ND

-

+

+

+

P-GLU

-

ND

ND

-

-

ND

+

a-G U R

-

ND

ND

-

-

ND

-

NAGA

-

+

ND

-

-

-

+

V

+

+

+

Acido de form a oxidativa a partir de:

+

Glucosa M alto sa

-

ND

ND

-

+

-

ND

Sacarosa

-

ND

ND

-

+

+

ND

M anitol

-

+

ND

-

-

+

+

Xilosa

-

ND

-

-

+

-

ND

L acto sa

ND

ND

ND

-

-

ND

ND

6102004, 6100004

ND

ND

Varía (depende de la duración de la incubación)

3110004

3750004

ND

Biocódigos API Coryne frecuentes

+, reacción positiva;

reacción negativa; V, reacción variable;

+', reacción positiva tardía; ND, datos no disponibles.

En la actualidad se han publicado varias comunicaciones de casos que documentan las especies de Brevibacterium como agentes oportunistas. Se han informado las brevibacterias como causa de baeteriemia persistente en pacientes con enfer­ medades subyacentes, como leucemia linfoblástica, linfoma no Hodgkin y cáncer testicular.483-543'648-714 Una especie de Brevibacterium también fue aislada como causa de osteomieli­ tis esternal en un varón de 4 semanas.630 Se ha informado B. iodinum y B. otitidis como causas de peritonitis en pacientes que se someten a diálisis peritoneal ambulatoria continua.29941 En 2000, Brazzola y cois, aislaron B. casei tanto en sangre periférica como en sangre recogida a través de un Porto-Cath

de una mujer de 18 años con SIDA y, en 2002, Janda y cois, aislaron B. casei en la sangre de un hombre de 34 años con SIDA y sepsis a partir de una vía.109451 Se describió endocardi­ tis de válvula protésica debida a B. otitidis en un paciente en los National Institutes of Health.204 Especies de Cellulomonas, Cellulosimicrobium y Oerskovia

Las especies de Cellulomonas son microorganismos princi­ palmente ambientales que aparecen como bacilos corineformes irregulares y delgados que pueden parecer más cocoides en los cultivos más antiguos. Son grampositivos (aunque cambian

C u a d ro 1 4 - 1 6

Características bioquímicas para la identificación de especies de Brevibacterium B. AVIUM

B. CASEI

B. EPIDERM IDIS

B. IO D IN U M

B. LINENS

B. LUTESCENS

B. M CBRELLNERI

II. OTITIDIS

B. PAUCIVORANS

Catalasa

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Hem olisis, SBA

-

-

-

-

-

-

-

-

Reducción de N O ,

+

V-

V+

+

ND

-

-

-

ND

+

+

+

+

+

-

+

Fosfatasa alcalina

+

+

ND

ND

ND

V

ND

+

H idrólisis de esculina

-

-

ND

ND

ND

-

ND

-

Ureasa

-

-

ND

ND

ND

-

ND

-

ND

+

+

ND

ND

+

ND

ND

ND

+

+

ND

ND

ND

ND

ND

+

ND

Gelatina

+

+

+

+

+

+

+'

+

+'

Caseína

+

+

+

+

+

+

+

+

-

Xantina

+

+

+

+

+

-

V

-

Acido a partir de hidratos de carbono

-

-

-

-

-

-

-

-

LAP

+

+

ND

ND

ND

+

ND

+

PYR

ND

v+

-

-

-

+

-

+

a-G A L

-

-

ND

ND

ND

-

ND

-

P-GAL

-

-

ND

ND

ND

-

ND

-

a-G L U

-

v+

-

-

-

-

-

-

P-GLU

-

-

ND

ND

ND

-

ND

-

p-GUR

—

-

ND

ND

ND

-

ND

-

NAGA

-

-

+

-

-

+

+

ND

6112004,4112004

ND

ND

ND

6002004, 6102004

ND

C A R A C T E R ÍS T IC A

Pirazinam idasa

Crecim iento, NaCl al 6,5% DNasa

-

Hidrólisis de:

+, reacción positiva;

reacción negativa;

V6002004

0000004

Especies de Corynebacterium

Biocódigos API Coryne frecuentes

+

reacción positiva tardía : V. reacción variable ; V+, reacción variable, mayoría de cepas positivas; V—, reacción variable, mayoría de cepas negativas; ND, datos no disponibles.

787

788

C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

fácilmente de color), no ácido-alcohol resistentes y pueden ser inmóviles o móviles debido a flagelos polares únicos o latera­ les escasos. Las colonias de estos microorganismos suelen ser opacas, convexas y de pigmento amarillo. El peptidoglueano de la pared celular contiene L-ornitina y no contiene m eso- DAP, glicina, lisina u homoserina.841 Estos microorganismos tienen metabolismo oxidativo o fermentativo; la mayoría de las cepas producen ácido a partir de glucosa tanto en condiciones aero­ bias como anaerobias. Las especies de Cellulomonas son catalasa positivas, hidrolizan celulosa, almidón y gelatina (reacción débil), reducen nitrato a nitrito y producen DNasa. El género Cellulomonas incluye más de ocho especies válidas que se aís­ lan en distintos medioambientes.307 Algunas cepas corineformes de los grupos A-3 y A-4 de los CDC se reconocen ahora como especies de Cellulomonas que han sido aisladas en muestras clínicas humanas.307-311397 Funke y cois, examinaron muestras clínicas de LCR (dos muestras) y sangre (dos muestras); ambas cepas de LCR habían sido iden­ tificadas desde el punto de vista fenotípico como grupo A-3 de los CDC. mientras que las de hemocultivos fueron identifica­ das como grupo A-4 de los CDC.307 Estas cepas se compararon con cepas tipo de las especies de Cellulomonas ambientales caracterizadas mediante análisis de peptidoglueano y ácidos grasos celulares además de las pruebas fenotípicas utilizadas para la caracterización de los corineformes. Los resultados de las pruebas fenotípicas para estos aislados no se correspondie­ ron con ninguna de las especies de Cellulomonas existentes. Las cuatro cepas clínicas aisladas contenían L-omitina como diaminoácido peptidoglueano, reforzando así la afinidad con las especies de Cellulomonas. La secuenciación parcial de los rRNA 16S de estos microorganismos validaron más las simili­ tudes con las especies de Cellulomonas, y Funke y cois, propu­ sieron formalmente asignar las cepas del grupo A-3 y algunas cepas del grupo A-4 de los CDC a un género nuevo, Cellulo­ monas hominis. Estos microorganismos han sido aislados en muestras de humor vitreo luego de lesiones penetrantes o tras­ plantes infraoculares de cristalino, hemoculitivos asociados con sepsis relacionada con catéteres, endocarditis de válvula nativa y líquido cefalorraquídeo.88-185-392-539 Las cepas de C. hominis son bacilos grampositivos cortos, delgados e inmóviles. Las colonias en SBA son lisas, circula­ res, convexas y blancas; se desarrolla una pigmentación amari­ llenta después de unos 3 días. Se hidroliza esculina, gelatina y DNA y se reduce nitrato a nitrito, pero no se produce ureasa. Este microorganismo es fermentativo, y produce ácido a partir de glucosa, maltosa, sacarosa, xilosa y lactosa, pero no de manitol. A diferencia de las especies de Cellulomonas ambien­ tales, C. hominis no hidroliza la celulosa. Las especies de Cellulomonas están incluidas en la base de datos API Coryne, pero estos microorganismos suelen dar una prueba cruzada con las especies de M icrobacterium . Cellulomonas turbata es el mismo microorganismo que Oerskovia turbata (véase más ade­ lante). Los bacilos corineformes asignados al género Oerskovia -O . turbata y O. xanthineolytica- fueron designados originaria­ mente como corineformes grupos A -l y A-2 de los CDC, res­ pectivamente, y estaban relacionados con los grupos A-3, A-4 y A-5. Sin embargo, las primeras pruebas genéticas y quimiotaxonómicas sugirieron que las dos especies de O erskovia no estaban estrechamente relacionadas. En 1982, Stackbrandt y cois, propusieron la unión de los géneros O erskovia y Cellulomonas sobre la base de las pruebas filogenéticas, con el epíteto de género Cellulomonas que tiene precedencia.840-942 El nombre Cellulomonas cellulans fue propuesto para O. xanthi­

neolytica, y O. turbata se convirtió en Cellulomonas turbata.

Sin embargo, el cambio de nombre no tuvo en cuenta la apa­ rente falta de relación de “C. cellulans ” con “C. turbata’'. El análisis de los dendrogramas de rDNA 16S proporcionó prue­ bas de que “C. cellulans" se ramificaba fuera de los límites filogenéticos del género Cellulomonas y era un “vecino filogenético más cercano” del género Promicromonospora. Además, el análisis quimiotaxonómico de la pared celular de “C. cellu­ lans" ha mostrado que la cepa tipo y otras cepas de esta espe­ cie tienen un peptidoglueano “tipo A 4 a”. una característica que no se ha hallado entre los miembros del género Cellulomonas, que incluyen “C. turbata". Se observó que L-lisina es el princi­ pal diaminoácido de la pared celular de “C. cellulans ”, mien­ tras que otras especies de Cellulomonas contienen L-ornitina. La concordancia entre la posición filogenéticamente distinta de este microorganismo en el dendrograma rDNA 16S y sus dife­ rentes propiedades quimiotaxonómicas justificó la asignación de “C. cellulans" al nuevo género Cellulosimicrobium, siendo la especie tipo Cellulosimicrobium cellulans (“Oerskovia xant­ hineolytica")™ 4 En 2002, se aisló una segunda especie de Cellulosimicrobium (C. variabile) en el intestino posterior de la termita.50 Los taxonomistas tampoco están de acuerdo sobre el estado de O erskovia turbata como especie de Cellulomonas. Algunos estudios recientes que utilizaron secuenciación de DNA 16S y análisis de la estructura de la pared celular también sugieren que es posible que no sea válida la transferencia de O. turbata al género Cellulom onas ,839 Los miembros del enmendado género Oerskovia demuestran hitas vegetativas ramificadas que penentran en el agar y se frag­ mentan en elementos bacilares móviles.839 En los frotis, los mi­ croorganismos aparecen como bacilos corineformes. Los micro­ organismos pueden ser móviles o no. Son catalasa positivos y oxidasa positivos y facultativos en relación con el oxígeno, aunque algunas cepas pueden ser estrictamente aerobias. Los principales ácidos grasos, la composición de quinonas isoprenoides y otras características del género se muestran en el cua­ dro 14-7. Además de la cepa tipo. O. turbata, se describieron o otras tres especies. O enterophila se aísla en insectos y antes era una especie de Promicromonospora, mientras que O .jenensis y O. paurom etabola se aíslan en el suelo.839 En el cuadro 14-17 se muestran las características bioquímicas que son úti­ les para la identificación de especies de Cellulomonas, C. ho­ minis, C. (O.) turbata y C. cellulans. Cellulosimicrobium cellulans produce colonias lisas y bri­ llantes que tienen un fuerte pigmento amarillo (véase lámina en color 14-7C). Las afinidades por los actinomicetos del micro­ organismo se manifiestan por la producción de un “micelio" sustrato que se fragmenta en bacilos irregulares, curvos y con forma de palos dispuestos en formas de V y “letras chinas”. Después del agotamiento de los hidratos de carbono fermentables de los medios de caldo, estos microorganismos con forma de bacilos son transformados incluso en bacilos más cortos o formas de cocos. Son bioquímicamente activos y están inclui­ dos en las bases de datos tanto del sistema API Coryne como del IDS RaplD CB plus para la identificación de bacterias cori­ neformes. Los biocódigos comunes API Coryne para C. cellu­ lans son 3552727, 7552727, 3572727 o 7572727 (véase lámi­ na en color 14-7D). Tanto O. turbata como Cellulosimicrobium cellulans hidrolizan caseína, pero sólo las últimas especies hidrolizan xantina. Además, Cellulosim icrobium cellulans crece a 42 °C, mientras que O. turbata no lo hace. Cellulosimicrobium cellulans y O. turbata son causas raras de infecciones oportunistas en huéspedes inmunodeprimidos. O. turbata ha sido aislado como causa de bacteriemia relacio-

Cuadro 1 4 -1 7

Características bioquímicas para la identificación de especies de Cellulomonas, Cellulomonas hominis, Cellulomonas turbata, Cellulosimicrobium cellulans y üerm abacter hominis E S P E C IE S D E CELLULOM ONAS

C. HOM INIS

C. (O.) TURBATA

Catalasa

+

+

+

+

+

Hemolisis, SBA

-

-

-

-

-

C A R A C T E R ÍS T IC A

M otilidad Reducción de N 0 3 Pirazinam idasa

CELLU LO SIM ICROBIUM CE LLULANS

DERM ABACTER H OM IN IS

V+

+

+

+

-

+

+

+

+

-

ND

ND

-

ND

-

Fosfatasa alcalina

V

-

ND

ND

+

Hidrólisis de esculina

+

+

+

+

+

Ureasa

-

-

-

-

-

DNasa

V

+

+

+

+

Hidrólisis de: Gelatina

+

+

+

+“

V+

Almidón

ND

ND

ND

+

+

Caseína

ND

ND

+

+

ND

Xantina

ND

ND

-

+

ND

Tirosina

ND

ND

-

-

ND

Acido producido en condiciones fermentativas a partir de: +

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Sacarosa

+

+

+

+

+

M anitol

V

-

-

-

-

Xilosa

+

+

+

+

V

Lactosa

ND

+

ND

+

+

Arabinosa

ND

+

ND

ND

ND

ND

LAP

+

+

ND

+

PYR

ND

ND

-

ND

+

a-G A L

ND

ND

ND

ND

V+

p-GAL

ND

ND

+

ND

+

a-G L U

+

+

+

ND

+

P-GLU

ND

ND

+

ND

+

P-GUR

ND

-

-

ND

-

NAGA

ND

ND

+

ND

+

+, reacción positiva; -, reacción negativa; +'1, reacción positiva débil o retardada; V, reacción variable; V+, variable, mayoría de cepas positivas; V-, variable, mayoría de cepas negativas; ND, datos no disponibles; Cat, catalasa; Fac, facultativo; Ana, anaerobio; Cat, catalasa; Hemol SBA, hemolisis en agar sangre de carnero; Reducción de NO» reducción de nitrato a nitrito; LAP, leucina arilamidasa; PYR, pirrolidonil arilamidasa; a-GAL, a-galactosidasa; p-GAL, p-galactosidasa; a-GLU, a-glucosidasa; P-GLU, p-glucosidasa; p-GUR, p-glucuronidasa; NAGA, N-acetil-p-D-glucosaminidasa.

Especies de Corynebacterium

Glucosa M altosa

789

790

C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

nada con catéteres Broviac en un varón de 3 años y como causa de endocarditis en un hombre de 68 años cuya válvula aórtica había sido reemplazada por un homoinjerto de válvula cardía­ ca debido a insuficiencia aórtica grave relacionada con espon­ dilitis anquilosante.531-715 En 1996, se comunicó a este microor­ ganismo como causa de baeteriemia (junto con Comomonas acidovorans) en un paciente con SIDA.512 C. cellulans ha sido informado como causa rara de queratitis, endoftalmitis, neu­ monía, infección relacionada con válvula protésica, bacteriemia relacionada con catéter, meningitis asociada con deriva­ ción ventriculoperitoneal y peritonitis en pacientes que reciben diálisis peritoneal ambulatoria crónica.99-395'440-474-557'596-631-736'791 También se ha documentado baeteriemia por C. cellulans en receptores de trasplantes de médula ósea, en pacientes con SIDA y en enfermos con hepatopatía subyacente.240-570 Se los aisló como contaminantes en soluciones de nutrición parente­ ral total; esto fue descubierto sólo después de que se desarro­ llaran signos y síntomas de baeteriemia en un paciente inme­ diatamente luego de la infusión parenteral, con aislamiento de los microorganismos en hemocultivos, en el catéter venoso central del paciente y en el suplemento nutricional propiamen­ te dicho.377 O. turbata y C. cellulans varían en su sensibilidad a los anti­ bióticos. Aunque se ha comunicado que muchas cepas son sen­ sibles a penicilina, ampicilina, cefalotina, tetraciclina, clindami­ cina, eritromicina, gentamicina, trimetoprim-sulfametoxazol. ciprofloxacina y vancomicina, también se han informado cepas resistentes a estos agentes.377-440-596-736-894 Se ha comunicado resistencia de alto nivel a la vancomicina y la teicoplanina en una cepa clínica de O. turbata .693 Se demostró que esta resis­ tencia a los glucopéptidos se debía a la estructura de peptido­ glucanos modificada de la pared celular relacionada con la pre­ sencia de secuencias genéticas vanA similares a las halladas en cepas de Enterococcus faecium resistentes a la vancomicina.

microorganismos aparecen cocobacilares o cocoides. En gene­ ral, las colonias son blancas, convexas y tienen una consisten­ cia cremosa o ligeramente pegajosa. Después de 24 horas de incubación, las colonias miden alrededor de 1,5 mm de diáme­ tro. No reducen nitrato ni producen pirazinamidasa, pero hidrolizan esculina y fosfatasa alcalina, pirrolidonil arilamidasa, leu­ cina aminopeptidasa y DNasa. También producen tanto lisina como ornitina descarboxilasa. Se produce ácido a partir de glu­ cosa, maltosa, sacarosa y lactosa; las ex cepas del grupo 3 D. hominis de los CDC también fermentan xilosa, mientras que las ex cepas del grupo 5 de los CDC no lo hacen. Este micro­ organismo está incluido en la base de datos API Coryne.76 En el cuadro 14-17 se detallan otras características fenotípicas.

Especies de Dermabacter

Durante una investigación taxonómica de microbios aislados en nudos de raíces vegetales inducidos por un nematodo de vida libre. Evtushenko y cois, reconocieron un grupo de bacte­ rias corineformes que eran fenotípicamente similares al corine­ forme móvil denominado históricamente “C. aquaticum" ,251 Si bien durante mucho tiempo ha sido considerada una especie de C orynebacterium , ciertas propiedades (p. ej., movilidad y metabolismo oxidativo de los hidratos de carbono) sirven para excluirlas de ese género. Las cepas antes denominadas “C. aquaticum ” también contenían ácido DL-2,4-diaminobutírico en la pared celular, al igual que las aisladas en los nudos de raí­ ces. Este diaminoácido inusual se encuentra en la pared celular de las especies de Clavibacter. Un mejor análisis de las cepas aisladas en los nudos de raíces, las cepas de referencia de “C. aquaticum ” y las cepas de las especies existentes de C lavi­ bacter estableció que estos microorganismos estaban relacio­ nados desde el punto de vista taxonómico y filogenético. Se creó el género Leifsonia para incluir a la especie de C lavibacter descrita, la cepa de los nudos vegetales y “C. aqu aticu m '. Por lo tanto, el género Leifsonia está formado por L. xyli subespe­ cie xyli y L. xyli subespecie cynodontis (antes especies de Clavibacter), L. p oae (la cepa de Poa annua inducida por el nematodo Subanguina radicóla aislado en los nudos de raíces) y L. aquatica (“C. aquaticum ").855 L. aquatica es una causa rara de infecciones en los seres humanos, entre ellas baeteriemia, endocarditis, infección de dispositivos de accesos, meningitis, peritonitis asociada con diálisis peritoneal ambulatoria crónica, infecciones de heridas e infecciones de las vías urinarias.168'133’275-479-507'517-614-880 Las

En 1988, Jones y Collins describieron cuatro cepas de bac­ terias corineformes que fueron aisladas exclusivamente en la piel humana.461 Las paredes celulares de estas cepas contenían meso-DAP, alanina y ácido glutámico, pero carecían de ácidos micólicos.123 Estas bacterias también contenían predominante­ mente ácidos grasos celulares de carbonos ramificados, una característica hallada sólo en especies de Brevibacterium y el microorganismo ambiental Brachybacterium faeciu m .123 Los microorganismos eran fermentadores (no oxidativos como las especies de Brevibacterium y de Brachybacterium) y producían ácido a partir de varios hidratos de carbono. Se propuso para estas cepas el nombre D erm abacter hominis. El examen ulte­ rior de cepas de los grupos 3 y 5 de los CDC aisladas en dis­ tintas muestras clínicas humanas por Gruner y cois., Bernard y cois, y Funke y cois, estableció que estos dos grupos de los CDC eran idénticos a la cepa tipo de D erm abacter hominis descrita por Jones y Collins.76'312'373-461 D. hominis ha sido aisla­ do en distintas muestras clínicas, que incluyen sangre, tejido pulmonar, abscesos, LCR. líquido peritoneal, conjuntivas, oste­ omielitis calcánea e injertos vasculares infectados.350-903 En 1998, Bavbek y cois, describieron un caso de absceso cerebral por D. hominis en el receptor de un trasplante renal que se pre­ sentó como una base encefálica con refuerzo por contraste.65 D. hominis también fue causa de peritonitis en un paciente en diá­ lisis peritoneal ambulatoria continua.701 Las cepas de D. hominis son corineformes catalasa positivas, no hemolíticas e inmóviles. En frotis teñidos con Gram, los

Especies de Exiguobacterium

Las especies de Exiguobacterium son bacterias corineformes irregulares y cortas que demuestran un ciclo bacilo-coco pro­ nunciado en su crecimiento. Característicamente producen colonias amarillas o anaranjado pálidas en medios de agar y tienen un metabolismo facultativo o fermentador. Los ácidos micólicos están ausentes y L-lisina es el diaminoácido peptido­ glucano. Son catalasa positivas, móviles y se asemejan a las especies de M icrobacterium y O erskovia , aunque difieren en los ácidos grasos de su pared celular. E. acetylicum, una ex especie de Brevibacterium. ha sido aislado en heridas y líquido cefalorraquídeo. Produce colonias amarillo claras, amarillo intensas o anaranjadas en SBA. Este microorganismo catalasa positivo es rápidamente fermentador y produce ácido a partir de glucosa, maltosa, sacarosa y manitol, pero no de xilosa. Hidroliza la esculina, pero no produce ureasa. Algunas cepas reducen nitrato a nitrito. (Véase cuadro 14-18). Especies de Leifsonia

C uadro 1 4 -1 8

Características bioquímicas para la identificación de Exiguobacterium acetylicum, Leifsonia aquatica y especies de Microbacterium

CARACTERISTICA Pigmentación

ESPECIES DE

EXIGUO BACTERIU M A C E T YIJC U M

LEIFSONIA AQUATICA

M ICROBACTERIUM

MICROBACTERIUM AR BO RESCENS

MICROBACTERIUM IM PERIALE

M ICROBACTERIUM PARAOXYDANS

Amarilla, anaranjada pálida

Amarilla, lisa

Blanco amarillenta, amarilla

Catalasa

+

+

+

+

+

+

Hemolisis, SBA

-

-

-

-

-

-

Reducción de NO ,

Anaranjada, am arilla oscura Anaranjada, am arilla oscura

Am arilla brillante, pegajosa, lisa

V

V

V

-

-

-

Pirazinam idasa

ND

+

v+

ND

ND

ND

Fosfatasa alcalina

ND

V

ND

ND

ND

ND

+ + +

V

V

+

+

+'

-

V

-

-

-

+ -

V+

+

+

ND

ND

ND

+ + +

Hidrólisis de esculina Ureasa M otilidad DNasa Hidrólisis de: Gelatina

+

+

ND

ND

Caseína

+

-

V

ND

ND

+

Xantina

ND

-

ND

ND

ND

ND

Tirosina

ND

-

ND

ND

ND

-

Almidón

+

+

ND

ND

ND

ND

Ferm/Oxid

Ferm

Oxid

Oxid

Ferm

Ferm

Oxid

Acido producido a partir de: Glucosa

+

+

+

+

+

+

M altosa

+

V

+

+

+

+

Sacarosa

+

V

V

+

+

+

Manitol

+

+

v+

+

+

+

Xilosa

-

ND

V

+

+

ND

Lactosa

-

+

V

ND

ND

ND

Arabinosa

-

+

-

+

+

ND

+

ND

Rafinosa

ND

-

ND

ND

ND

ND

ND

+

PYR

ND

V-

ND

ND

ND

ND

-

P-GAL

ND

ND

V+

+

+

V

a-G L U

ND

+

v+

ND

ND

+

P-GLU

ND

ND

V

+

+

-

P-GUR

ND

ND

ND

ND

-

NAGA

ND

N úm eros de biocódigos API frecuentes

ND

-

V+

V

Utilización de los Las cepas que no fermentan hidratos de carbo­ hidratos de carbono pueden no habitualmente representar ex especies de negativa debido al Aureobacterium, que tienen m etabolism o oxim etabolismo oxidativo de dativo hidratos de carbono

+

+

V

ND

ND

ND

791

+, reacción positiva; -, reacción negativa; V, reacción variable; V+, reacción variable, mayoría de cepas positivas; V-, reacción variable, mayoría de cepas negativas; +', reacción positiva tardía o débil; ND, datos no disponibles; Oxid, utilización oxidativa de los hidratos de carbono; Ferm, utilización fermentativa de los hidratos de carbono.

Especies de Corynebacterium

-

LAP

792

C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

colonias de L. aquatica son opacas, untuosas y de pigmenta­ ción amarilla. Esta pigmentación aumenta con la antigüedad del cultivo. Las células son móviles a 35-37 °C y a temperatu­ ra ambiente por medio de flagelos peritricos largos. El micro­ organismo demuestra un ciclo bacilo-coco, de modo que en los cultivos más viejos predominan las células cocoides. Es aero­ bio y catalasa y oxidasa positivo (véase cuadro 14-18). Se pro­ duce ácido en forma oxidativa a partir de glucosa, sacarosa, fructosa, arabinosa, galactosa y mañosa. El microorganismo es ureasa negativo y no hidroliza la esculina, pero se produce H,S. En el pasado, se han identificado erróneamente como “C. aquaticum ” algunas especies de M icrobacterium aisladas en muestras clínicas humanas.316369 La hidrólisis de caseína y gelatina es útil para separar las posibles especies de M icrobacterium (hidrólisis de gelatina e hidrólisis de caseína negativas). L. aquaticum también produce fuerte actividad de DNasa. Otras especies de Leifsonia (L. cynodontis, L. rubra, L. aurea, L. shinshuensis, C. naganoensis) son cepas ambientales y no han sido aisladas en muestras clínicas humanas.711-855 Especies de Microbacterium (Auereobacterium)

Las especies de M icrobacterium son bacilos pequeños, de forma irregular, grampositivos y catalasa positivos que crecen con una morfología “difteroide” típica. Pueden ser inmóviles o móviles, con uno a tres flagelos y son oxidativos y aerobios en su metabolismo, aunque algunas especies pueden ser fermentadoras. En lugar de weso-DAP, estos microorganismos contie­ nen lisina como diaminoácido en sus paredes celulares y tienen “glicina-glicina-lisina” o “glicina-lisina” como puentes trans­ versales interpeptídicos del peptidoglueano de la pared celu­ lar.292-866-979 A diferencia de las especies de Corynebacterium, arabinosa, galactosa y ácidos micólicos no son componentes de la pared celular. Antes de 1998, el género M icrobacterium con­ tenía seis especies válidas aisladas en suelo, aguas cloacales y productos lácteos.868 En 1998, Takeuchi e Hitano analizaron las especies de M icrobacterium y A ureobacterium utilizando secuenciación de rRNA 16S y observaron que la especie en estos dos géneros formaba una asociación intermezclada monofilética. Esta y otras características fisiológicas y quimiotaxonómicas condujeron a la unificación de estos géneros en un género redefinido de M icrobacterium que contenía 13 ex espe­ cies de Aureobacterium .m -979-980 Los miembros del género M icrobacterium están compuestos por bacilos grampositivos irregulares, cortos, catalasa positivos y aerobios estrictos. La producción de ácido a partir de hidra­ tos de carbono es el resultado de procesos de oxidación y no de fermentación. Al contrario de las especies de Cellulomonas, las especies de M icrobacterium no hidrolizan celulosa. Los miem­ bros de este género contienen ornitina en el peptidoglueano de la pared celular junto con residuos de glicina dentro de los puentes interpeptídicos.173 También contienen altas concentra­ ciones de glucolato en el peptidoglueano, lo que sugiere que el ácido murámico en la pared celular aparece en la forma A'-glucolilo en lugar de la forma Af-acetilo habitual. Además de D-ornitina y glicina, la pared celular contiene alanina, ácido glutámico y homoserina. Desde 1998, se han aislado más de 15 otras especies de M icrobacterium en alimentos, plantas, suelo, aguas cloacales e insectos. Se han aislado especies de M icrobacterium en muestras clí­ nicas humanas y algunas ex cepas de los grupos corineformes A-4 y A-5 de los CDC han sido asignadas al género M icro­ bacterium sobre la base de los análisis fenotípicos, quimiota­ xonómicos y genotípicos. Funke y cois, examinaron 22 cepas

de bacilos grampositivos con pigmento amarillo y anaranjado mediante distintas técnicas quimiotaxonómicas y fenotípi­ cas.292 Estas incluyeron cepas de tipo M icrobacterium, cepas ambientales y 13 cepas clínicas, 10 de las cuales fueron aisla­ das en hemocultivos. Todas eran especies de M icrobacterium por el análisis de la pared celular; tres de las muestras clínicas eran fenotípicamente idénticas a M. im periale y otras dos eran idénticas a la cepa tipo de M. arborescens. Las cepas clínicas restantes no se asem ejaban a ninguna otra especie de M icrobacterium reconocida desde el punto de vista fenotípico, aunque eran especies de M icrobacterium de acuerdo con el análisis quimiotaxonómico. Las especies de M icrobacterium se han asociado con infec­ ciones humanas graves, que incluyen una infección disem ina­ da mortal en un hombre de 75 años y bacteriemia persistente por celulitis en un hombre de 39 años con leucemia mieloide aguda y porfiria cutánea tardía.641-769 En el último caso, la cepa era resistente a la vancomicina. Estos microorganismos también han sido asociados con bacteriemias hospitalarias y relacionadas con catéteres en pacientes con leucemia, y con la contaminación de productos de células madre en sangre perifé­ rica infundidos en receptores de trasplantes de células madre 20,127,418,520 g n una comunicación de un caso reciente, se aisló una cepa corineforme con pigmento amarillo en los hemoculti­ vos de un niño con leucemia. Las comparaciones genéticas y quimiotaxonómicas con las especies de M icrobacterium exis­ tentes condujeron a la caracterización de M. paraoxydans, otra especie de M icrobacterium nueva.509 Funke y cois, en Suiza y Alemania comunicaron un caso de endoftalmitis debido a una especie de Microbacterium luego de una lesión ocular pene­ trante.293 Desde el punto de vista filogenético, el microorganis­ mo se agrupaba con especies de Microbacterium reconocidas, lo que sugiere que la cepa puede representar en realidad otra especie nueva de M icrobacterium.293 La cepa era sensible a cefazolina, cefotetán, ciprofloxacina, clindamicina, imipenem, piperacilina, teicoplanina y vancomicina y era resistente a gen­ tamicina y tobramicina. Las especies de M icrobacterium forman colonias de pig­ mentación amarilla blancuzca, amarilla o anaranjada en SBA (véase lámina en color 14-6E). Todas las especies son catalasa positivas y algunas especies (M. arborescens, M. imperiale, M. paraoxydans) son móviles. La mayoría hidrolizan la esculina y no la urea. Se produce ácido de forma oxidativa a partir de dis­ tintos hidratos de carbono. Los miembros originales del géne­ ro M icrobacterium tienden a ser fermentadores, mientras que las primeras especies de Aureobacterium que fueron transferi­ das al género M icrobacterium son oxidativas en su utilización de hidratos de carbono. Las especies de Microbacterium están incluidas en la base de datos API Coryne, pero se necesitan otras pruebas para separarlas de las especies de Cellulomonas y “C. aquaticum ” (véase lámina en color 14-6F). Como algu­ nas microbacterias producen ácido a partir de los hidratos de carbono en forma oxidativa y no fermentativa, es posible que la acidificación de los hidratos de carbono no sea evidente des­ pués de 24 horas de incubación. Los biocódigos API Coryne (0470004. 0452004. 0472004, 0570004,0572004) incluidos en la base de datos suelen dar resultados cruzados con “C. aqua­ ticum” y la incubación de las galerías de API Coryne más allá de las 24 horas puede ser necesaria para determinar la acidifi­ cación de los hidratos de carbono. Las especies fermentadoras pueden producir algunas reacciones de acidificación positivas en API Coryne, pero puede ser necesaria una incubación mayor de 24 horas. En el cuadro 14-18 se encuentran otros datos feno­ típicos.

Especies de C orynebacterium

Especies de Rothia y “similares a Rothia” (grupo 4 de los CDC)

Las especies de Rothia son miembros del filo recién descrito Actinobacteria, subclase Actinobacteridae, orden Actinomice­ tales. En la próxima edición del Manual Bacteriológico Sis■t ¡mítico de Bergey , el género Rothia está incluido en la familia M icrococcaceae, que también incluye los géneros Micrococcus, Arthrobacter, Kocuria, N esterenkonia y Stom atococcus.329 Desde el punto de vista histórico, el género Rothia incluía una especie única, Rothia dentocariosa. Sobre la base de datos de secuenciación de rDNA 16S y quimiotaxonómicos, se ha ampliado Stomatococcus mucilaginosus, el coco grampositivo catalasa variable hallado en la orofaringe humana, está estre­ chamente relacionado con los microorganismos en el género Rothia y ha sido transferido como Rothia m ucilaginosa ,m Se describió una tercera especie en el género, Rothia nasimurium\ esta especie se encuentra en la parte posterior de las fosas nasa­ les de los ratones. Mientras que R. mucilaginosa y R. nasimurium son cocos grampositivos, R. dentocariosa es un bacilo corineforme grampositivo que muestra ramificación rudimen­ taria. aunque en los cultivos de caldo más viejos pueden pre­ dominar las células cocoides. R. dentocariosa no produce can­ tidades importantes de ácido succínico a partir de glucosa, característica que distingue este microorganismo de especies facultativas de Actinom yces. Al igual que las corinebacterias y los actinomicetos aerobios, estos microorganismos son catala­ sa positivos y tienden a crecer mejor en condiciones aerobias. Sin embargo, a diferencia de las especies de N ocardia, estos microorganismos son fermentadores y se prestan a la identifi­ cación por las pruebas fenotípicas utilizadas de rutina para las especies de Corynebacterium y los grupos corineformes des­ critos antes. Rothia dentocariosa es parte de la flora orofaríngea y gin­ gival humana normal y puede ser aislado en la saliva y la placa supragingival. Durante las décadas de 1950 y 1960. la Rama de Bacteriología Especial en los CDC recogieron varias cepas, la mayoría de las cuales provenían de abscesos, muestras del aparato respiratorio, quistes pilonidales, líquido cefalorraquí­ deo, orina y sangre.562-610'773’933 Desde 1972, han aparecido varias comunicaciones de endocarditis por R. dentocariosa que afectaba tanto válvulas nativas como válvulas protési­ cas.2687101105'499'944 En varios casos, la infección se asoció con complicaciones graves y potencialmente mortales, entre ellas la afectación de múltiples válvulas cardíacas y abscesos paravalvulares de la raíz aórtica.270-852 Las infecciones valvulares a menudo conducen a la formación de grandes vegetaciones, que pueden causar infartos pulmonares, hemorragias intracraneales y abscesos encefálicos.444-722 También se ha informado bacteriemia sin endocarditis.758 R. dentocariosa ha sido aislado en la secreción de una fístula arteriovenosa en un hombre diabético de 46 años con insuficiencia renal.639 Las comunicaciones recientes de casos han documentado a R. dentocariosa como causa de endoftalmitis, osteomielitis vertebral con absceso paraespinal y peritonitis asociada con diálisis peritoneal ambu­ latoria crónica.83-547-568 Aunque raro, también se lo ha reconoci­ do como causa de neumonía en pacientes con enfermedades subyacentes graves, como leucemia mielocítica aguda y adenocarcinoma del pulmón. Las afinidades de R. dentocariosa con otros actinomicetos aerobios son evidentes en el examen de la morfología de las colonias. Después de 72 horas de incubación a 35-37 °C en C 0 2, las colonias suelen ser secas, rugosas y de color blanco hueso. A menudo aparecen apiladas y cerebriformes, sobre todo en las áreas de crecimiento confluente (véase lámina en

793

color 14-7A). La inspección de los bordes de las colonias pone en evidencia que tienden a "hundirse” en la superficie del agar como las de las especies de N ocardia. Las cepas de R. dento­ cariosa también tienen características fenotípicas relativamen­ te uniformes y son muy activas desde el punto de vista bioquí­ mico. R. dentocariosa es catalasa positivo, reduce nitrato a nitrito y produce pirazinamidasa y pirrolidonil arilamidasa (véase cuadro 14-19). El microorganismo hidroliza esculina pero no urea ni gelatina, y se produce ácido de forma fermen­ tativa a partir de glucosa, maltosa y sacarosa. Los ácidos acéti­ co y láctico con cantidades pequeñas de ácido pirúvico y R. dentocariosa están incluidos en la base de datos tanto de API Coryne como de RaplD CB-Plus. En API Coryne, la mayoría de las cepas producen los biocódigos 7050125, 7052125, 7050165 o 7052165 (véase lámina en color 14-7B). Aunque estos microorganismos suelen ser uniformemente sensibles a todas las clases de antibióticos, se han aislado cepas resistentes a los P-lactámicos a causa de la producción de P-lactamasa.610 Las últimas cepas contienen plásmidos que sostienen los genes estructurales de las p-lactamasas. Los microorganismos pertenecientes al grupo 4 de corine­ formes fermentadores de los CDC están estrechamente relacio­ nados con R. dentocariosa. Estos microorganismos han sido aislados principalmente en muestras del aparato genital feme­ nino, aunque no se han comunicado infecciones humanas espe­ cíficas por cepas del grupo 4 de los CDC. Desde el punto de vista morfológico, algunas forman colonias de color negro car­ bón en medios de agar, semejantes a las de C. nigricans (véase recuadro 14-2). Recientemente, Daaneshvar y cois, en los CDC investigaron varias cepas formadoras de colonias negras categorizadas transitoriamente como bacterias del grupo 4.202 Estos microorganismos fueron separados en dos grupos por análisis genético molecular. Un grupo (que sólo incluía una muestra del aparato genital) estaba más estrechamente relacionado con R. dentocariosa, mientras que el otro grupo, que incluía cepas ais­ ladas principalmente en muestras del aparato genital femeni­ no, estaban más estrechamente relacionados con C. aurimucosum, una especie de Corynebacteríum recién descrita aislada predominantemente en el aparato genital femenino (véase recuadro 14-2). Esta investigación condujo a enmiendas de las descripciones de las especies tanto de R. dentocariosa como de C. aurimucosum para incluir variantes que formaban colonias de color negro carbón en medios de agar. En el cuadro 14-19 se presentan las características fenotípicas de R. dentocariosa y el grupo 4 de corineformes fermentadores de los CDC. Las carac­ terísticas fenotípicas de C. aurimucosum y C. nigricans tam­ bién están incluidas en el cuadro 14-19 como comparación para ayudar en la identificación de los corineformes que producen colonias de pigmentación negro carbón. Especies de Turicella

En 1993, Simonet y cois., en Francia, comunicaron el aisla­ miento de una cepa corineforme en cultivo puro de los líquidos del oído medio recogidos mediante timpanocentesis de niños con otitis media aguda.809 Estas cepas contenían m eso- DAP, arabinosa y galactosa en sus paredes celulares, pero estaban ausentes los ácidos corinemicólicos. La cepa creció como colo­ nias convexas, blancuzcas, cremosas y no hemolíticas en agar sangre que se volvían amarillentas con el tiempo. Esta morfo­ logía de las colonias era definidamente diferente de las colo­ nias planas, blanco grisáceas y no hemolíticas producidas por subespecies de C. afermentans o de las colonias secas conve­ xas, adherentes y ligeramente amarillentas de C. auris, corine-

794

C A P ÍT U L O 14

C uadro 1 4 - 1 9

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

C a r a c t e r í s t i c a s b io q u ím ic a s p a r a la id e n tif ic a c ió n d e Rothia dentocariosa, b a c t e r i a s c o r in e f o r m e s t e r m e n t a d o r a s d e l g r u p o 4 d e lo s C D C “ s im i la r e s a R o th ia ” , Corynebacterium aurimucosum y Corynebacterium nigricans

C A R A C T E R ÍS T IC A Lipofílico M orfología de las colonias

ROTHIA DENTOCARIOSA

BA C TE R IA S C O R IN E F O R M E S FERM ENTAD ORAS D E L G R U PO 4 D E L O S C D C “ S IM IL A R E S A R O T H IA ”

-

-

Color negro carbón, circulares, con­ Blanco hueso, color hueso, secas, rugosas, adherentes o vexas, lisas o rugosas y adherentes, convexas, lisas o negro car­ de bordes continuos (lisos) bón, enteras y de consistencii blanda

C. AURIMUCOSUM Pegajosas, amarillentas a blancas o color negro carbón

C. NIGRICANS Negro carbón, adherentes

Hemolisis, SBA Catalasa

V

V

+

+

Pirazinamidasa

+

ND

+

+

Fosfatasa alcalina

V

ND

+

+

M otilidad

-

-

-

-

Reducción de N 0 3

+

+

-

-

Hidrólisis de esculina

+

+

V

-

Ureasa

-

-

V-

-

Hidrólisis de hipurato

ND

ND

+

ND

A cetoína

+

ND

+

ND

H,S (papel de acetato de plomo)

+

+

ND

ND

V-

Hidrólisis de: Gelatina

V

+

Almidón

-

ND

-

-

Caseína

-

ND

ND

-

Glucosa

+

+

+

+

M altosa

+

+

+

+

Sacarosa

+

+

+

+

M anitol

-

-

V

-

Lactosa

-

-

-

-

X ilosa

-

-

-

-

LAP

ND

ND

+

ND

PYR

+

ND

-

-

a-G A L

-

ND

-

ND

P-GAL

-

ND

-

-

a-G L U

+

ND

-

-

p-GLU

+

ND

-

-

a-G U R

-

ND

-

-

NAGA

-

ND

-

ND

Acido producido a partir de:

+, reacción positiva; ■reacción negativa V, reacción variable; V-, reacción variable, mayoría de cepas negativas; ND, datos no disponibles.

formes asociadas con otitis media aguda y crónica.298726 En el análisis quimiotaxonómico, los patrones de menaquinona celu­ lares de esta cepa del oído medio también eran diferentes de las dos especies de Corynebacterium. Aun cuando estos microor­ ganismos mostraban morfologías de colonias muy diferentes, las dos especies de Corynebacterium y la tercera cepa tenían características fenotípicas idénticas. Estas cepas han sido asig­ nadas al género nuevo Turicella (que hace referencia a

Turicum , el nombre latino para Zurich, Suiza, donde se aisla­ ron las primeras cepas) como Turicella otitidis.311 Desde su descripción, T. otitidis ha sido aislado en otras infecciones de cabeza y cuello (p. ej., absceso auricular posterior) y en hemo­ cultivos.200,550,721 En las tinciones de Gram, T. otitidis aparece como bacilos largos y, en cultivo, las colonias del microorganismo son gris blancuzcas, convexas y tienen bordes enteros. En SBA miden

G ardnerella vaginalis 7 9 5

1.5 a 2 mm de diámetro después de 48 horas de incubación. Todas las cepas de T. otitidis producen el número de biocódigo 2100004 en el sistema API Coryne, lo que indica resultados positivos de las pruebas para pirazinamidasa, fosfatasa alcalina y catalasa, y pruebas negativas para glucosa, ribosa, xilosa, manitol. maltosa, lactosa, sacarosa y fermentación de glucóge­ no. nitrato reductasa, ureasa, hidrólisis de esculina. (3-glucuronidasa, P-galactosidasa, a-glucosidasa, hidrólisis de esculina, ureasa e hidrólisis de gelatina. Estas características fenotípicas son similares tanto a C. afermentans subespecie afermentans como a C. auris. T. o titid is , las subespecies de C. aferm en­ tans y C. auris pueden ser diferenciadas más eficientemente mediante análisis genéticos y quimiotaxonómicos. Sin embar­ go. Renaud y cois, han mostrado que la morfología de las colo­ nias. la prueba de CAMP, ciertas actividades enzimáticas (p. ej.. LAP, DNasa) y las asimilaciones de sustratos de carbono son útiles para separar estas especies, como se muestra en el cuadro 14-20.718 Las cepas de T. otitidis son sensibles a ampi­ cilina, cefalosporinas, ciprofloxacina, gentamicina, rifampici­ na. tetraciclinas y cloranfenicol; algunas son resistentes a clin­ damicina y eritromicina.306-729

peso de la pared celular.192 En consecuencia, diferentes cepas de G. vaginalis pueden parecer predominantemente gramposi­ tivas, gramnegativas o gramvariables.755 Los extractos de la pared celular de G. vaginalis no contienen compuestos nor­ malmente presentes en los lipopolisacáridos de la pared celular de los gramnegativos (p. ej., meso-DAP, ácido 2-ceto-3-desoxiD-mano-2-octonoico, ácidos grasos hidroxi). La ausencia de »?e?
Gardnerella vaginalis Taxonomía y morfología celular

Gardnerella vaginalis fue descrito por primera vez en 1953 por Leopold y luego denominado Haemophilus vaginalis por Gardner y Dukes en 1955.326362 En 1963, Zinnemann y Turner propusieron el nombre Corynebacterium vaginale para este microorganismo debido a su tendencia a ser grampositivo y la falta de requerimientos de factor X o factor V.989 En 1980, fue colocado formalmente en el nuevo género, Gardnerella, por Greenwold, Pickett y otros sobre la base de los datos de microscopía electrónica, bioquímicos y quimiotaxonómicos, y los estudios de hibridación de DNA-DNA.361,362 Los estudios ultraestructurales de G. vaginalis indican que este microorga­ nismo tiene un tipo grampositivo de pared celular, pero la capa de peptidoglucanos es mucho más delgada que la hallada en las paredes celulares de las especies de C oryn ebacterium , Lactobacillus o Staphylococcus. El contenido de peptidogluca­ no de la pared celular de G. vaginalis constituye aproximada­ mente el 20% del peso de la pared celular total, que es similar al hallado en los entéricos gramnegativos, como Escherichia coli, en el cual el peptidoglucano constituye cerca del 23% del

Cuadro 1 4 -2 0

Diferenciación de Turicella otitidis, Corynebacterium afermentans subespecie afermentans y Corynebacterium auris

CARACTERÍSTICA

C. AFERMENTANS SUBESPECIE AFERMENTANS

T. OTITIDIS

C. AURIS

M orfología de las colonias

Cremosas, convexas, circulares

Planas, lisas

Pigm entación de las colonias

Am arillo pálida con la incubación prolongada

Blanco grisácea

Circulares, convexas, secas, ligera­ mente adherentes Ligeram ente am arillenta

+

V

+

Prueba de CAM P DNasa Leucina arilam idasa

+ +

+, reacción positiva; -, reacción negativa; V, reacción variable.

+

796

C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

cas, el análisis de restricción del DNA ribosómico amplificado ha mostrado que las cepas de G. vaginalis son bastante hetero­ géneas y pueden ser divididas al menos en tres o cuatro geno­ tipos según las enzimas de restricción utilizadas.443 En cultivo, puede ser difícil diferenciar algunas cepas de G. vaginalis de los microorganismos “de aspecto similar”, que se denominan bacterias “corineformes catalasa negativas no clasificadas”. Factores de virulencia de G. vaginalis

Además de la estructura singular de la pared celular, G. vaginalis tiene otras propiedades que pueden contribuir a su capa­ cidad para causar procesos infecciosos. Estos microorganismos tienen un exopolisacárido fibrilar que ha sido observado mediante microscopía electrónica y que funciona en la adhe­ rencia del microorganismo a las células epiteliales vagina­ les.755-786 También se han demostrado pili sobre la superficie de la célula de G. vaginalis y se cree que contribuyen a la adhe­ rencia mucosa.103 En 1990, Rottini y cois, describieron una citolisina (hemolisina) extracelular producida por G. vaginalis.746 Esta citolisina es una proteína con un peso molecular de 59 a 63 kDa que tiene especificidad por los eritrocitos huma­ nos; se necesitan concentraciones de esta citolisina 100 veces mayores para la lisis de otros eritrocitos animales. Esta citoli­ sina también puede lisar otras células humanas, incluidas las células epiteliales y los leucocitos polimorfonucleares.746 La citolisina produce la formación de pequeños poros en la mem­ brana del eritrocito; la formación de estos poros es inhibida competitivamente por el colesterol que forma complejos con los fosfolípidos con carga negativa.137 Las pruebas de que esta citolisina puede desempeñar un papel en la patogenicidad del microorganismo son sostenidas por el hallazgo de IgA especí­ fica de citolisina en el líquido vaginal de mujeres con vagino­ sis bacteriana, una infección en la cual G. vaginalis desempe­ ña un papel importante pero hasta ahora indefinido.135 136 138 Algunas cepas de G. vaginalis también pueden producir fosfo­ lipasa C, una enzima que hidroliza lecitina en fosforilcolina y 1,2-diglicérido.598 Se sabe que la fosfolipasa C daña los tejidos del aparato reproductor tanto por mecanismos directos como indirectos. Al parecer, las cepas de G. vaginalis no producen sialidasas (neuraminidasas). que son factores de virulencia reconocidos en otros microorganismos.114 Importancia clínica de G. vaginalis

G. vaginalis se asocia con el síndrome clínico denominado v a g in o sis b a c te r ia n a .821 Este trastorno se denomina así porque

no hay ningún microorganismo como el único responsable y no se observan células inflamatorias (observadas con las infeccio­ nes por Candida y Tricomonas) en los frotis teñidos con Gram de la secreción vaginal (véase lámina en color 14-8C). La vagi­ nosis bacteriana se caracteriza clínicamente por secreción maloliente asociada con un aumento importante de la cantidad de G. vaginalis y distintos anaerobios estrictos (p. ej., que incluyen Prevotella bivia, Prevotella disiens, especies de M ycoplasm a , peptoestreptococos y especies de M obiluncus) con una disminución simultánea de la cantidad de lactobacilos vaginales normales.403-415-821 La vaginosis bacteriana es un fac­ tor de riesgo para las infecciones obstétricas, distintos tipos de resultados adversos del embarazo y enfermedad inflamatoria pelviana.248-415 Cuando este trastorno fue descrito originaria­ mente por Gardner y Dukes, se propuso que G. vaginalis era el agente etiológico.326 Algunos estudios ulteriores determinaron que también podían participar otros microorganismos y que,

aunque G. vaginalis siempre estaba presente en la vagina de las mujeres con vaginosis bacteriana, también lo estaba en más del 50% de las mujeres sanas.605 Utilizando medios semiselectivos, G. vaginalis puede hallarse en el 14-70% de las mujeres sin vaginosis bacteriana.191-891 Sin embargo, parece que la presen­ cia de gran cantidad de estos microorganismos en la vagina es indicativa de la enfermedad. Utilizando una sonda de oligonu­ cleótidos radiomarcada específica para rRNA 16S de G. vagi­ nalis, Sienes y cois., en Seattle, mostraron que la presencia de estas bacterias en concentraciones > 2 x 107 UFC/mL de líqui­ do vaginal, junto con un pH vaginal superior a 4,5, tenía una sensibilidad y una especificidad del 95% y el 99%, respectiva­ mente, para clasificar a las mujeres con vaginosis bacteriana y sin ella cuando se compararon con criterios diagnósticos estric­ tamente clínicos.792 Las técnicas de inmunofluorescencia han demostrado que los microorganismos predominantes adhe­ rentes a las “células clave” clásicas sugestivas de vaginosis bacteriana son en realidad G. va gin alis.m Entre el 93% y el 100% de las mujeres infectadas tienen una colonización importante por G. vaginalis y la cantidad de UFC por m ilili­ tro de líquido vaginal es mucho mayor en las muestras prove­ nientes de mujeres infectadas que en muestras similares de mu­ jeres sanas.23-248-415-425-891 El diagnóstico se logra mejor con criterios clínicos junto con una tinción de Gram de la secreción vaginal.415-644 No se reco­ mienda el cultivo de rutina de las muestras vaginales para G. vaginalis para el diagnóstico dado que no proporciona pruebas decisivas de infección debido a la presencia de G. vaginalis como parte de la microflora vaginal residente. G. vaginalis ha sido aislado en muestras rectales del 56% de 148 mujeres con vaginosis bacteriana, el 12% de 69 mujeres sanas, el 9% de 83 compañeros sexuales masculinos de mujeres con vaginosis bacteriana y el 6% de 49 parejas sexuales masculinas de muje­ res sanas.425-919 Estos últimos datos sugieren que G. vaginalis no se transmite sexualmente. sino que es probable que coloni­ ce la vagina por vía endógena desde el tubo digestivo.425 Por otra parte, Villegas y cois, realizaron hace poco un estudio ultraestructural de las secreciones vaginales de 10 mujeres con vaginosis bacteriana y muestras de semen de sus compañeros sexuales asintomáticos utilizando microscopia óptica y microscopia electrónica.919 G. vaginalis fue aislado en muestras de semen del 50% de los hombres. Con el microscopio electróni­ co se observó que los microorganismos se adherían a las mem­ branas celulares y penetraban en el citoplasma de las células epiteliales de la vagina y de la uretra masculina. Estos investiga­ dores sugirieron que la colonización asintomática del aparato genital masculino inferior por G. vaginalis puede tener cierta relevancia en relación con el papel del compañero masculino en la “recolonización" (“reinfección”) de la vagina. Además de su papel en la vaginosis bacteriana. G. vaginalis también ha sido aislado en infecciones del aparato genital femenino asociadas con complicaciones del embarazo y de lac­ tantes hijos de madres con estas complicaciones, sobre todo durante el parto y después de él. Estas complicaciones incluyen infecciones intrauterinas, infecciones intraamnióticas, corio­ amnionitis, enfermedad inflamatoria pelviana posaborto y endometritis posparto después de cesárea.337-417-504-526-743 En estas infecciones, los tejidos obtenidos por procedimientos qui­ rúrgicos pueden permitir el aislamiento de G. vaginalis en cul­ tivos puros o mixtos con otros microorganismos anaerobios facultativos o estrictos. En estos contextos clínicos pueden pro­ ducirse bacteriemias posparto o posaborto por G. vaginalis y otros microorganismos del aparato genital.96-277-712 La bacterie­ mia por microflora del aparato genital ocurre cuando estos

G ardnerella vaginalis 7 9 7

microorganismos ganan acceso a canales venosos del lecho placentario. que son interrumpidos antes de los partos por vía vaginal y cesárea y durante su transcurso. También se han comunicado infecciones sistémicas y localizadas con G. vagi­ nalis en recién nacidos hijos de madres con estas complicacio­ nes. Estas infecciones han incluido amnionitis, infección de herida de episiotomía, bacteriemias neonatales, meningitis, celulitis, conjuntivitis y osteomielitis por hematomas infecta­ dos causados por la aplicación de monitores sobre el cuero cabelludo fetal .22-72-153-154-528-635-850 Los cultivos orofaríngeos, de muestras de aspiración gástrica y traqueal de recién nacidos también han aislado G. vaginalis, adquirida tal vez durante el pasaje a través de un canal de parto muy colonizado.317 Tanto en mujeres embarazadas como en no embarazadas, se ha aisla­ do G vaginalis, en cultivo puro o mixto, en abscesos de la glándula de Bartolino y en infecciones de heridas quirúrgicas /aego de cesáreas, cirugías abdominales, histerectomías y episiotomías.153-503-850 G. vaginalis también ha sido causa de infecciones en hom­ bres. Se ha comunicado baeteriemia por G. vaginalis luego de una prostatectomía transuretral y corrección quirúrgica de estre­ checes uretrales.63-953 También fue aislado en hemocultivos de un hombre de 65 años con retención urinaria debida a un ade­ noma de la próstata.213 Las infecciones extragenitales inusua­ les por G. vaginalis han incluido un absceso hepático piógeno en una mujer de 23 años luego de una cesárea, baeteriemia con absceso pulmonar y empiema en un hombre alcóholico con neu­ monía aspirativa, infección de espacios intervertebrales en una mujer posmenopáusica de 50 años e infecciones de los espacios articulares.253-419-527 G. vaginalis también puede desempeñar un papel en las infecciones urinarias tanto en hombres como en mujeres.66 Dado su ecosistema como parte de la flora vaginal, no es sor­ prendente que haya sido aislado en muestras urinarias de muje­ res más a menudo que de varones.466,513 G. vaginalis ha sido aislado tanto de las vías urinarias altas (uréteres, pelvis renal y cálices) como bajas (vejiga) de pacientes sintomáticas y asin­ tomáticas.255-597 Las tasas de aislamiento de las muestras de orina son mayores en las mujeres embarazadas que en las no embarazadas y muchas de estas pacientes están asintomáti­ cas.597 La piuria parece rara vez asociada con infecciones uri­ narias por G. vaginalis y puede estar ausente aun en presencia de una enfermedad grave de las vías urinarias altas.255-256-466 En un estudio del papel de G. vaginalis en las infecciones urina­ rias en hombres, dos tercios de 15 pacientes con cantidades importantes de G. vaginalis en la orina tenían signos y sínto­ mas atribuibles al aparato urinario (micción imperiosa, polaquiuria, hematuria).820 La mayoría de estos pacientes también tenían enfermedades subyacentes, como diabetes, hipertensión, lesiones medulares, infecciones previas de las vías urinarias y accidentes cardiovasculares. Como en los estudios anteriores de G. vaginalis y del aparato urinario, se presentó piuria sólo en 7 de los 15 hombres evaluados. Es difícil evaluar una canti­ dad importante (es decir. > 104 UFC/mL) de G. vaginalis en muestras de orina porque estas cantidades pueden observarse en cultivos de hombres asintomáticos y de pacientes con enfer­ medades renales subyacentes, como obstrucción uretral, prostatitis crónica y enfermedad renal en estadio terminal.466-849 Pocas veces, G. vaginalis puede causar una infección urinaria ascendente complicada en hombres sanos, aunque estos esce­ narios son más probables en huéspedes inmunodeprimidos, como los receptores de trasplantes renales.273-953 El consenso es que G. vaginalis puede desempeñar un papel importante en las infecciones urinarias complicadas y no complicadas tanto en

hombres como en mujeres y, si se presenta en cantidades sus­ tanciales, debe ser identificado y comunicado. G. vaginalis y otros microorganismos que están estrechamente relacionados también pueden ser aislados en los animales (p. ej., yeguas).762 Todavía se desconoce si pueden causar patología en estos ani­ males, o si las bacterias forman parte de la flora residente del aparato genital equino. Aislamiento e identificación

El aislamiento de G. vaginalis en muestras clínicas se logra mejor utilizando medios semiselectivos, aunque el microorga­ nismo crece en los medios habituales de agar SBA, agar CNA y agar chocolate (véase lámina en color 14-8D). Los medios semiselectivos incluyen agar sangre humana con bicapa-Tween (agar HBT) o agar V.891 El agar HBT contiene una capa inferior de agar colistina-ácido nalidíxico de Columbia con suplemen­ to de peptona proteosa n° 3 (BD Microbiology Systems, Sparks, MD), anfotericina B (2 |ig/mL) y Tween 80 al 0,0075%, recu­ bierto con una capa superior de la misma composición, salvo en que se agrega sangre humana al 5%. El Tween 80 en el medio mejora el crecimiento y aumenta la (3-hemólisis producida por cepas de G. vaginalis. El agar V contiene base de agar de Columbia con peptona proteosa al 1% y sangre humana al 5%. En lo concerniente a los medios de rutina, G. vaginalis crece mejor en agar CNA que contiene sangre de camero que en agar sangre preparada con una base de tripticasa soja.344 G. vaginalis es un P-hemolítico en medios que contienen sangre huma­ na, pero no en medios que contienen sangre de camero. Los cultivos que crecen en agar CNA con sangre de carnero pueden mostrar una hemolisis “difusa” sutil que rodea a las colonias, sobre todo después de una incubación prolongada (> 72 ho­ ras). El microorganismo crece mejor a 35-37 °C en una atmós­ fera de C 0 2 al 5-7% (una incubadora con C 0 2 o una jarra de anaerobiosis por extinción con vela). En general, los cultivos tardan más de 24 horas en crecer y la mayoría de las cepas se aíslan luego de 48 a 72 horas de incubación. El microorganis­ mo también crece en la mayoría de los medios de cultivo con sangre; sin embargo, el aditivo anticoagulante polianetol sulfonato de sodio (SPS) es inhibidor de G. vaginalis y puede com ­ prometer su aislamiento en estos hemocultivos.712-713 Como sucede con N eisseria patógenas, esta inhibición del crecimien­ to por SPS puede superarse agregando gelatina (1% v/v) a los frascos de hemocuitivo.713 La identificación presuntiva de G. vaginalis se basa sobre la morfología celular típica en los frotis teñidos con Gram (pequeños cocobacilos grampositivos, gramnegativos o gramvariables), el crecimiento característico y la hemolisis en agar HBT (pequeñas zonas claras de colonias P-hemolíticas que rodean a colonias con bordes difusos, colonias de 0,3-0,5 mm de diámetro después de 48 horas de incubación) y las pruebas de oxidasa y catalasa negativas (véase lámina en color 14-8E). La identificación definitiva puede hacerse de acuerdo con las reacciones que se muestran en el cuadro 14x£T. Otras caracte­ rísticas que confirman la identificación de G. vaginalis y ayu­ dan a separarlo de otros microorganismos corineformes catala­ sa negativos denominados no clasificados son la presencia de a-glucosidasa, la ausencia de P-glucosidasa y las reacciones positivas de hidrólisis de almidón e hipurato.361 Es mejor reali­ zar las pruebas de utilización de hidratos de carbono en un medio que contenga peptona proteosa N° 3, indicador rojo fenol e hidratos de carbono esterilizado con filtro al 1%. Este medio puede tener un suplemento de agar al 0,5% o suero de caballo al 5%. Estos medios deben tener un inóculo importan-

798

C A P ÍT U L O 14

Cuadro 14 -2 1

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

Características bioquímicas para la identifica­ ción de Gardnerella vaginalis

CARACTERÍSTICA

REACCIÓN

H em olisis en agar-bicapa de sangre humana-Tween (HBT)

P

Oxidasa

-

Catalasa

-

Hidrólisis de hipurato

+

Producción de ácido a partir de: Glucosa

+

M altosa

+

Sacarosa

+

Manitol

-

Almidón

+

Zona de inhibición de crecim iento con: M etronidazol (disco de 50 (lg)

+

Trim etoprim

+

Sulfonamida

+

+, reacción positiva;

reacción negativa.

te de microorganismos que crecen durante 18-24 horas y son incubados durante 5 días. Se produce ácido a partir de glucosa, maltosa y almidón, pero no de manitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa o salicina (véase lámina en color 14-8F).236362 El microor­ ganismo no tiene lisina ni ornitina descarboxilasas ni arginina dihidrolasa, no reduce el nitrato y no produce indol, ureasa ni acetoína. Las cepas de G. vaginalis muestran zonas de inhibi­ ción alrededor de los discos que contienen metronidazol (50 jig) y trimetoprim (5 Ltg). Se pueden utilizar otros métodos convencionales modificados rápidos y sistemas para identificar G. vaginalis. Greenwood y cois, describieron un método de identificación que utiliza una solución de sales con buffer-rojo fenol, hidratos de carbono esterilizados con filtro y un inoculo importante.363 En la University of Illinois hemos utilizado este método para la iden­ tificación de G. vaginalis mediante una serie de pruebas que consisten en glucosa (reacción positiva), maltosa (reacción positiva), manitol (reacción negativa) y almidón soluble (reac­ ción positiva) junto con una prueba de hidrólisis de hipurato de 4 horas desarrollada con Ninhydrin® (reacción positiva). El sis­ tema de intensificación RIM (rapid identification method, método de identificación rápido) (Austin Biologicals, Austin, TX) es un método comercial que utiliza la fermentación de almidón y rafinosa e hidrólisis de hipurato para identificar G. vaginalis. En un estudio, este método identificó correctamente el 91,4% de 105 cepas de G. vaginalis. 538 Este microorganismo también está incluido en la base de datos del sistema API Coryne (BioMérieux, Hazelwood, MO) para la identificación de bacilos grampositivos y en las bases de datos de dos siste­ mas -e l Panel de identificación para H aem ophilus-N eisseña (HNIA) (American MicroScan, West Sacramento, CA) y la tar­ jeta de identificación para Neisseria-H aem ophilus Vitek (NHI) (BioMérieux, Hazelwood, M O )- para la identificación de los bacilos gramnegativos con requerimientos nutricionales especiales.310-449'450

Las cepas de G. vaginalis también pueden ser divididas en biotipos sobre la base de reacciones para lipasa, hidrólisis de hipurato y producción de P-galactosidasa.685 Utilizando estas tres reacciones, se describieron ocho biotipos (todas las combi­ naciones de reacciones positivas y negativas). En ese estudio, los biotipos más frecuentes fueron aquellos en los cuales la reacción de hipurato era positiva y las otras dos reacciones eran positivas o negativas. Piot y cois, no observaron ninguna rela­ ción entre los biotipos vaginales y la presencia o la ausencia de vaginosis bacteriana.685 Se aislaron biotipos idénticos antes y después del tratamiento cuando el intervalo entre las recolec­ ciones de muestras vaginales fue menor de una semana. Además, se aislaron biotipos similares de las vaginas de muje­ res con vaginosis bacteriana y las uretras de sus compañeros sexuales. Por otra parte, Briselden y Hillier observaron que la distribución de biotipos de G. vaginalis de las mujeres con vaginosis bacteriana y sin ella era diferente: los biotipos lipasa positivos (p. ej., biotipos 1. 2, 3 y 4) eran más predominantes en las mujeres infectadas.112 Wu y cois, examinaron 20 cepas biotipo 1 (que son positivos para hidrólisis de hipurato, lipasa y (3-galactosidada [ONPG]) y observaron que estas cepas eran genéticamente heterogéneas; no se pudo discriminar entre las cepas biotipo 1 aisladas en mujeres con vaginosis bacteriana y en mujeres sanas.968 Estos investigadores no investigaron otros biotipos lipasa positivos o lipasa negativos en este estudio. Los resultados del último estudio sugieren que las huellas digitales genómicas de otros biotipos de G. vaginalis probablemente no ofrecen ninguna idea adicional sobre el reconocimiento de cepas que son más “virulentas” que otras. También se han utilizado técnica de sondas y amplificación de ácidos nucleicos para detectar e identificar G. vaginalis en muestras clínicas, incluidas las muestras vaginales y los líqui­ dos amnióticos.122’542'645,902 Van Belkum y cois, secuenciaron la región entre los genes de rRNA 16S y 23S de G. vaginalis y crearon un ensayo basado sobre PCR confirmado con sonda y específico para este microorganismo.902 Utilizando este méto­ do de PCR, se detectó G. vaginalis en el 40% de las muestras vaginales de las mujeres sin tener en cuenta su estado clínico. De las 11 pacientes con diagnóstico clínico de vaginosis bacteriana, 10 fueron positivas para G. vaginalis con el ensayo basado sobre PCR y sonda. Pao y cois, utilizaron DNA de G. vaginalis clo­ nado, marcado y digerido con endonucleasas de restricción como sonda en un ensayo de transferencia por ranuras (d o tblot) para la detección de G. vaginalis en muestras vaginales y observaron que la sonda podía detectar hasta 104 microorganis­ mos.658 La Prueba de Identificación Affirm VP Microbial® (Becton-Dickson, Sparks, MD), un sistema comercial, utiliza sondas sintéticas de oligonucleótidos para la detección simul­ tánea de G. vaginalis, Trichomonas vaginalis y especies de Candida de un único hisopado vaginal.113 Cuando se comparó con preparados húmedos de rutina para la detección de células clave, la prueba Affirm VP mostró una sensibilidad y una espe­ cificidad del 90% y el 97%, respectivamente, lo que sugiere que podría utilizarse en reemplazo del microscopio de montaje húmedo para la detección de células clave. Como la sonda fue más sensible que el cultivo de G. vaginalis en medio HBT, se pensó que la prueba se podía hacer más específica utilizándola junto con otros criterios diagnósticos (pH vaginal, presencia de olor a aminas con KOH [“prueba del olor”]) para la vaginosis bacteriana. Globalmente. Briselden y Hillier observaron que la prueba Affirm VP para G. vaginalis era positiva para el 97% de las mujeres que tenían vaginosis bacteriana sobre la base de criterios clínicos y tenía una especificidad del 71% .113 Witt y cois, observaron que la prueba Affirm VP III tenía una especi-

E species de Lactobacillus

..dad mayor del 97% cuando se comparó con los frotis teñi­ dos con Gram.958 La sensibilidad del ensayo varió de acuerdo con la puntuación dada al frotis teñido con Gram por los criten o s de puntuación establecidos y varió del 73,2% al S9.5%.644-958 Sensibilidad a los antibióticos

Las cepas de G. vaginalis por lo general son sensibles a penicilina. ampicilina, eritromicina, clindamicina, trimetoprim y ancomicina.488 Ciprofloxacina e imipenem muestran actividad \ ariable. Algunas cepas son resistentes a tetraciclina y minociclina. y se observa una resistencia pronunciada a amikacina, aztreonam y sulfametoxazol en la mayoría de las cepas. Debido a la resistencia al sulfametoxazol, no se observa ninguna acti­ vidad sinérgica contra G. vaginalis con cotrimoxazol (sulfame­ toxazol y trimetoprim en una relación 19:1). Como se mencionó, G. vaginalis se asocia con vaginosis bacteriana, que se sabe tiene una etiología polimocrobiana, pero también se puede aislar en las vaginas de mujeres sanas. En consecuencia, no se recomienda el cultivo de muestras vagi­ nales para ese microorganismo. El uso sistemático de medios semiselectivos como los agares HBT y V para cultivo de mues­ tras vaginales representa un costo innecesario que contribuye con poca información útil, dado que el diagnóstico de labora­ torio reside en el examen clínico cuidadoso y la interpretación de un frotis teñido con Gram recogido correctamente de las secreciones vaginales.415-644-821 Se puede aislar G. vaginalis en un medio convencional de agar CNA después de una incubación prolongada y la identificación presuntiva suele bastar en estas circunstancias.344 Sin embargo, los aislamientos en sitios corpo­ rales sistémicos (p. ej., sangre, líquido articular) deben confir­ marse con otras pruebas bioquímicas, como ya se describió.

Especies de Lactobacillus Taxonomía y epidemiología

Los lactobacilos son bacilos grampositivos que forman parte de la flora normal de la vagina, el tubo digestivo y la orofaringe humanos. Están ampliamente distribuidos en diversos ámbitos (agua de fuentes naturales, aguas servidas, silos) y comprenden parte de la flora normal de muchas otras especies animales. También se encuentran en distintos alimentos (p. ej., productos lácteos, granos, comidas, peces, chucrut) en gran parte debido a su amplia gama de capacidades fermentativas. Algunas espe­ cies de Lactobacillus se agregan ahora a alimentos como prebióticos, tal vez por sus efectos beneficiosos para la salud. Las células individuales de especies de Lactobacillus a menudo son largas y delgadas, aunque pueden observarse bacilos “corineformes” o “cocobacilos” más pequeños. Algunas especies pue­ den formar cadenas largas de bacilos (véase lámina en color 14-2H e I). La mayoría de las especies son inmóviles; las raras especies móviles tienen flagelos peritricos 478 La mayoría de las especies son aerobias facultativas, aunque algunas crecen mejor en condiciones anaerobias o microaerófilas, sobre todo en el aislamiento primario. Los lactobacilos se denominan así porque más del 50% de los productos terminales de la fermen­ tación de la glucosa es ácido láctico; algunas especies pueden producir también ácidos acético, fórmico y succínico, junto con CO,. Los lactobacilos son uniformemente catalasa negati­ vos y oxidasa negativos, no reducen nitrato, no producen indol ni H,S. no licúan la gelatina y no forman esporas. Las paredes

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celulares de las especies de Lactobacillus contienen un pepti­ doglucano grueso y ácidos teicoicos ligados a la membrana. Lisina, m eso- DAP y ornitina son los diaminoácidos que com­ prenden los enlaces cruzados de peptidoglucanos. Las mena­ quinonas de transporte de electrones están ausentes. Algunas especies (p. ej„ L. confusus ) producen “limo” extracelular a partir de sacarosa. En la edición de 1986 de B ergey’s Manual o f System atic Bacteriology se mencionan más de 45 especies de Lactobacillus o similares a Lactobacillus y se describieron varias más desde entonces. En la próxima edición, los lactoba­ cilos son clasificados en el filo Firmicutes en la clase Bacilos, orden propuesto Lactobacillales. En este orden, se incluyen el género Lactobacillus y el género Pediococcus en la familia L actobacillaceae.329 Importancia clínica

Aunque los lactobacilos son intrínsecamente de baja viru­ lencia, causan raras infecciones oportunistas sobre todo en huéspedes inmunodeprimidos. Se informó que las especies de Lactobacillus causan endocarditis en pacientes con malforma­ ciones congénitas (p. ej., comunicación interventricular, defec­ tos de válvula aórtica bicúspide), defectos adquiridos de válvu­ las nativas (p. ej., endocarditis previa, cardiopatía reumática), injertos vasculares y válvulas protésicas.43-322-366-439-696-778-882-922 La baeteriemia transitoria originada en abscesos localizados (p. ej.. abscesos dentales periapicales), manipulaciones dentales (p. ej., extracciones, tratamiento de conducto radicular), endometritis posparto, perionfalitis neonatal y endoscopia gastroin­ testinal puede sembrar las válvulas anormales e iniciar lesiones endocárdicas. En los que tienen enfermedad de válvulas nati­ vas, se pueden observar mediante ecocadiogramas grandes vegetaciones que contienen los lactobacilos en las válvulas aór­ tica, mitral, tricúspide y pulmonar.696 Estas vegetaciones cardí­ acas tienen una tendencia pronunciada a embolizar hacia el encéfalo. En la serie de pacientes revisada por Gallemore y cois., se desarrollaron embolias sépticas en 14 de 35 pacientes; 5 de ellos fallecieron y 9 requirieron cirugía.322 Para los pacien­ tes con endocarditis debida a especies de Lactobacillus, la tera­ pia sinérgica con un P-lactámico más un aminoglucósido por lo menos durante 4 a 6 semanas parece ser el tratamiento óptimo. Sin embargo, a menudo es difícil la curación médica sin recaí­ da o sin necesidad de reemplazo valvular. En una serie, sólo se logró la curación con antibióticos únicamente en el 39% de los pacientes.366 La baeteriemia por Lactobacillus sin endocarditis simultá­ nea es relativamente infrecuente y ocurre sobre todo en pacien­ tes con trastornos subyacentes, como cáncer tratado con qui­ mioterapia, trasplante de médula ósea y órganos (en especial hígado), diabetes, enfermedad renal y cirugía ginecológic a 28,30.37.667,770,776 [ as puertas de entrada de los cuadros de sep­ sis por lactobacilos reflejan los hábitos normales de estos microorganismos dentro de la orofaringe. el aparato genitouri­ nario y el tubo digestivo. Estos microorganismos no forman parte de la flora cutánea residente y no se ha demostrado que produzcan infecciones relacionadas con catéteres intraveno­ sos.30 Los factores de riesgo para el desarrollo de baeteriemia por Lactobacillus son neutropenia persistente, uso de antibióti­ cos de amplio espectro, trasplante de aloinjertos con terapia inmunosupresora, quimioterapia para cáncer e instrumentación y procedimientos invasivos sobre los aparatos digestivo y res­ piratorio.151-184-284-477-770 La baeteriemia por Lactobacillus tam­ bién se ha asociado con infección por HIV y SIDA.2-427,741 En los pacientes con inmunosupresión profunda, puede ocurrir una

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C A P ÍT U L O 14

Bacilos grampositivos aerobios y facultativos

bacteriemia por cepas de Lactobacillus resistentes a la vanco­ micina durante la administración de este antibiótico (y otros agentes de amplio espectro) o poco después de ella. La bacteriemia por Lactobacillus también se asocia con infecciones ginecológicas o pleuropulmonares. En general, las mujeres con lactobacilemia tienen enfermedad o anomalías subyacentes o han sufrido procedimientos ginecológicos u obs­ tétricos invasivos, que han incluido endometritis luego de pro­ cedimientos de dilatación y curetaje, abscesos pelvianos y neo­ plasias del aparato genitourinario (p. ej., cáncer de ovario con invasión de intestino grueso, coriocarcinoma).28-66-181 En estos casos, la fuente del microorganismo suele ser la propia microflora vaginal de las pacientes. También se han comunicado infecciones pleuropulmonares y abscesos pulmonares debidos a especies de Lactobacillus en pacientes inmunodeprimidos. Estas infecciones han incluido neumonía necrosante secunda­ ria a una fístula traqueobronquial en un paciente con carcino­ ma pavimentoso del esófago, empiema pleural debido a várices esofágicas sangrantes, absceso pulmonar extrahospitalario y neumonías aspirativas en pacientes con SIDA.625-699'741 Sriskanden y cois, también documentaron una neumonía debi­ da a especies de Lactobacillus en tres pacientes con neutrope­ nia profunda secundaria a inmunosupresión por SIDA y por quimioterapia citotóxica para vasculitis y trasplante medular ulterior.838 Un único informe de caso describió la neumonía por Lactobacillus en un hombre de 52 aftos en el cual al parecer el microorganismo se transmitió al paciente por el propio pulmón trasplantado.465 En 2002, Wood y cois, informaron sobre el pri­ mer caso de neumonía asociada con el respirador en un pacien­ te inmunocompetente en estado crítico.965 También se han comunicado infecciones por Lactobacillus en recién nacidos. Broughton y cois, informaron un caso de meningitis debida a lactobacilos que ocurrió en un lactante recién nacido inmunitariamente norm al.116 En este caso, se creyó que la transmisión vertical del microorganismo de la madre al lactante durante el pasaje a través del canal de parto era la fuente del microorganismo aislado en el líquido cefalo­ rraquídeo del neonato. Thompson y cois, comunicaron un caso de sepsis por L. acidophilus en un lactante de 2 meses de vida en el cual la fuente del microorganismo fue un catéter venoso central infectado.883 Varias comunicaciones de casos han documentado lactoba­ cilos como agentes etiológicos en otros distintos tipos de infec­ ciones. Las presentaciones clínicas infrecuentes han incluido abscesos asociados con cuerpos extraños retenidos (p. ej., asti­ llas), endoftalmitis secundaria a lesiones oculares penetrantes, condritis secundaria a perforación de orejas, empiema de la vesícula biliar, absceso esplénico con empiema, colecistitis bacteriémica, infección intravascular luego de rotura intraesplénica de un aneurism a m icótico y peritonitis prim a­ ria.18-55-222-364-707-756-848'963 También se documentó una sepsis por iM ctobacillus en un paciente con colitis ulcerosa, en la cual se había dañado la microestructura fisiológica de la mucosa intes­ tinal mediante procedimientos endoscópicos y quirúrgicos.258 Al igual que muchos otros agentes oportunistas, también se han aislado lactobacilos en infecciones peritoneales en pacientes en diálisis peritoneal ambulatoria continua.492-766 A pesar del uso creciente y amplio de los lactobacilos en distintos productos como prebióticos (p. ej., L. acidophilus, L. rhamnosus GC), no ha aumentado la incidencia de infecciones o la proporción de infecciones bacteriémicas por lactobacilos.760-761 En su nicho ecológico normal en la vagina humana, los lac­ tobacilos pueden desempeñar un papel clave en la defensa con­ tra el desarrollo de vaginitis por C andida , vaginosis bacteriana,

infecciones urinarias e infecciones de transmisión sexual como gonorrea (véase lámina en color 14-8B).247-376-416-843 Los lacto­ bacilos facultativos constituyen la flora normal predominante de la vagina sana, mientras que las especies anaerobias de lac­ tobacilos son más a menudo aisladas en mujeres con diagnós­ tico clínico de vaginosis. Las especies facultativas producen gran cantidad de peróxido de hidrógeno, mientras que las espe­ cies anaerobias no lo hacen. Se postula que la colonización de la vagina por microorganismos facultativos, productores de peró­ xido de hidrógeno, puede representar un mecanismo de defen­ sa antimicrobiano inespecífico para la vagina normal y puede impedir el desarrollo de vaginosis bacteriana y vaginitis por Candida por el efecto tóxico directo de los radicales libres de peróxido sobre los microorganismos facultativos y anaerobios estrictos asociados con las infecciones vaginales.399-416-491 Aislamiento e identificación

Después del crecimiento durante 24 horas en SBA, las colonias de las especies de L actobacillus suelen ser pequeñas (2-5 mm), convexas y lisas con bordes enteros; también puede observarse cierta a-hemólisis o “descoloración gris” de los medios (véase lámina en color 14-6G y H). Debido a la gran cantidad de especies de Lactobacillus que se decribieron, en general no se identifica la categoría de especie de las cepas ais­ ladas478 En comunicaciones en las cuales se realizaron identifi­ caciones específicas, la mayoría de los investigadores han utili­ zado los métodos fenotípicos descritos por Holdeman y Moore en el Virginia Polytechnic Institute (VPI) Anaerobe M anual , con referencias cruzadas a descripciones de especies en el Bergey ’s Manual o f Systematic Bacteriology; 422-478 Además de los méto­ dos fenotípicos convencionales, los patrones proteicos de célu­ las enteras altamente estandarizados obtenidos por electrofore­ sis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) han probado ser útiles para la identificación de especies de Lactobacillus. 613691 También se han desarrollado métodos taxo­ nómicos por hibridación de oligonucleótidos y moleculares (PCR, secuenciación de rRNA 16S) para la identificación tanto de género como de especie de lactobacilos 47-233-660-807-963 El reconocimiento y la confirmación de lactobacilos en el laboratorio de microbiología clínica se pueden obtener con pre­ cisión con algunas pruebas fenotípicas. Algunas especies de Lactobacillus son intrínsecamente resistentes a la vancomicina, y esta característica es útil para su identificación 423 En general, las cepas resistentes crecen hasta el borde de una prueba de vancomicina por difusión en disco (véase lámina en color 147A). Las cepas resistentes a la vancomicina deben ser diferen­ ciadas de las especies de Leuconostoc y Pediococcus, ambas resistentes a la vancomicina y que pueden parecer cocobacilares en las tinciones de Gram. Las especies de Leuconostoc pro­ ducen gas a partir de glucosa en caldo de Mann-Rugosa-Sharp (M RS), m ientras que la m ayoría de las especies de Lactobacillus aisladas en el laboratorio clínico no producen gas. Los lactobacilos son PYR positivos, en tanto las especies de Leuconostoc como de Pediococcus son PYR negativas. Los lactobacilos también son LAP negativos, en tanto las especies de Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus y Lactococcus son LAP positivas. Por supuesto, se puede utilizar cromatogra­ fía gas-líquido a partir de cultivos de caldo de glucosa para obtener una identificación precisa de la categoría de género de las cepas aisladas, debido a la formación de gran cantidad de ácido láctico por estos microorganismos. Las especies de L ac­ tobacillus que se han identificado en asociación con infeccio­ nes humanas son L. rhamnosus, L. plantarían, L. leishmanii, L.

Referencias 801 fermentum, L. casei subespecie casei, L. paracasei, L. confusus > el grupo de L. acidophilus. En particular, las cepas de L. rhamnosus, L. casei y L. plantarum pueden ser intrínsecamen­

te resistentes a la vancomicina y la teicoplanina.858 Sensibilidad a los antibióticos

En general, los lactobacilos son sensibles a penicilina G, ampicilina, cefalosporinas y clindamicina.389,407 Sin embargo, se observó que varias especies de Lactobacillus son tolerantes a las penicilinas y las cefalosporinas. Se han demostrado rela­ ciones de concentración bactericida mínima con concentración inhibidora mínima (CBM:CIM) desde 30:1 para cefalotina hasta 266:1 para ampicilina en varias cepas de importancia clí­ nica.66,67 Estos datos in vitro se correlacionan con el dilema del tratamiento antibiótico para los pacientes con endocarditis por Lactobacillus causada por cepas tolerantes a penicilina/ampicilina. En un estudio de nueve pacientes con endocarditis, las nueve cepas de lactobacilos tenían CIM para penicilina y cefa­ lotina que estaban en el rango de sensibilidad, pero sólo el 52% tenía CBM para estos agentes que se pudieron lograr en suero mediante regímenes de dosificación estándares.43,66 Se observó una situación similar para clindamicina en estas cepas. Ocho de las nueve cepas tuvieron CIM para clindamicina que estaban en el intervalo de sensibilidad, aunque las nueve tenían CBM que excedían en mucho las concentraciones séricas alcanzables para clindamicina. Como ya se mencionó, el tratamiento combinado con peni­ cilina y un aminoglucósido parece ser el enfoque terapéutico de elección para el tratamiento de las infecciones graves por Lactobacillus como endocarditis e infecciones profundas (p. ej.. infección intrauterina). Bayer y cois, demostraron actividad sinérgica con penicilina/ampicilina y gentamicina o estrepto­ micina.66 Además, no se puede considerar que las cefalospori­ nas ni la vancomicina sean alternativas justificadas en lugar de penicilina/ampicilina.366 Las cepas de Lactobacillus que son resistentes a la penicilina y la ampicilina también tienden a serlo a las cefalosporinas (p. ej., cefalotina, ceftazidima, cefu­ roxima, cefotaxima) y a las cefamicinas (cefoxitina) o a tener CIM elevadas de estos antibióticos.55 Los lactobacilos son casi uniformemente resistentes a fluoroquinolonas y trimetoprimsulfametoxazol. mientras que la mayoría de las cepas son sen­ sibles a gentamicina, tobramicina y cloranfenicol.30,66,67,203 Las CIM de los lactobacilos para imipenem y antibióticos macróli­ dos suelen caer dentro del intervalo de sensibilidad y parecen ser eficaces en los pacientes con alergia a las penicilinas.30,151,858 Además de las penicilinas y las cefalosporinas, algunas espe­ cies de lactobacilos son resistentes a los antibióticos glucopép­ tidos vancomicina y teicoplanina (véase antes). La sensibilidad de las distintas especies de lactobacilos a estos agentes está rela­ cionada con la estructura de su pared celular. El análisis de las paredes celulares de las cepas resistentes a la vancomicina (p. ej.. L. rhamnosus ) pone de manifiesto que los precursores pep­ tidoglucanos de estas especies tienen un depsipéptido terminal "D-alanina-D-lactato”, mientras que las especies que son sensi­ bles a la vancomicina (p. ej., el grupo de L. acidophilus) tienen una estructura final “D-alanina-D-alanina”.86,390 Esta diferencia en un solo aminoácido de la estructura de peptidoglucanos alte­ ra eficazmente el sitio diana para la vancomicina, lo que per­ mite que ocurra la síntesis de peptidoglucanos en presencia de vancomicina. Es interesante señalar que se ha demostrado que la sensibilidad a los glucopéptidos está relacionada con la espe­ cie.262 Por ejemplo, L. rhamnosus (ex L. casei subespecie rhamnosus), especie que se ha asociado con infecciones graves

en huéspedes inmunodeprimidos, y L. p aracasei subespecie paracasei, son intrínsecamente resistentes a los glucopéptidos, y las CIM de vancomicina exceden los 256 fig/mL.151,262 Otras especies aisladas en infecciones graves han sido sensibles a la vancomicina por las pruebas de CIM pero, como sucede con las CBM para las penicilinas y la clindamicina, las CBM de van­ comicina pueden ser diluciones varias veces mayores que la CIM.366

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C A P ÍT U L O 14

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Actinomicetos aerobios

3

Introducción, clasificación y taxonomía Grupo nocardioforme Nocardia Epidemiología, anatomía patológica y taxonomía Enfermedad clínica

Rhodococcus Epidemiología, anatomía patológica y patogenia Enfermedad clínica

Otras bacterias nocardioformes

Maduromicetos y termomonosporas Actinomadura Epidemiología Enfermedad clínica y anatomía patológica

Nocardiopsis

Estreptomicetos Streptomyces

Otros actinomicetos Oerskovia Dermatophilus Tropheryma whlpplei Historia y taxonomía Ecología Enfermedad clínica y anatomía patológica

Diagnóstico de laboratorio de las infecciones causadas por actinomicetos aerobios Aislamiento primario Diferenciación de Nocardia de otros géneros de acínomicetos aerobios Identificación de los actinomicetos termófilos Identificación de Tropheryma whipplei Sensibilidad in vitro de Nocardia y bacterias relacionadas a los antibióticos y tratamiento de las infecciones

Actinomicetos termófilos

Introducción, clasificación y taxonomía Los actinomicetos aerobios son bacterias grampositivas que suelen ser más fila­ mentosas y ramificadas que las bacterias explicadas en capítulos anteriores, y produ­ cen comúnmente un micelio similar a un hongo que se fragmenta o divide en formas de bacilos o cocoides cortos. Estos microorganismos, cuando son aislados en muchos laboratorios, se derivan para su identificación a la “sección de micología” o a la “sec­ ción de micobacteriología'’, más que al laboratorio de bacteriología general. Las razo­ nes son que la mayoría crecen más lentamente que otras bacterias aerobias y anaero­ bias facultativas y pueden ser aisladas en medios comunes para hongos (p. ej., agar dextrosa de Sabouraud) o en medios para el aislamiento de micobacterias (p. ej., 817

818

C A P ÍT U L O 15 Actinomicetos aerobios

agares sintéticos de Middlebrook y medio de LowensteinJensen). No obstante, estos bacilos grampositivos filamentosos, ramificados y aerobios son bacterias, no hongos. Los hongos verdaderos tienen una organización celular eucarionte. A dife­ rencia de los hongos, los actinomicetos aerobios procariontes no tienen un núcleo rodeado por una membrana; carecen de los orgánulos intracelulares que tienen los microorganismos euca­ riontes (p. ej., no tienen mitocondrias); sus paredes celulares contienen ácido murámico, ácido diaminopimélico o lisina (de la cual carecen los hongos); son inhibidos por los antibióticos antibacterianos, pero no por los antimicóticos, y difieren en otras características fundamentales. Las hifas ramificadas de los actinomicetos aerobios son más estrechas que las hifas micóticas y miden 0,5 a 1,2 (im de diámetro. Las técnicas químicas y genéticas modernas han establecido la gran diversidad de este grupo, pero las características fenotí­ picas descritas antes siguen constituyendo una parte importan­ te de la definición microbiológica (cuadro 15-1).10 Los actino­ micetos aerobios como un todo se ubican taxonómicamente en la clase Actinobacteria, orden Actinom ycetales, suborden Corynebacterianeae. El algoritmo de la figura 15-1 muestra las relaciones entre estas bacterias. Aunque la taxonomía y la nomenclatura de estas bacterias cambian continuamente, sigue siendo útil una caracterización fenotípica ad hoc provisoria del grupo (cuadro 15-1).I0-30-58 El esquema de la figura 15-1 se basa en pruebas que se rea­ lizan comúnmente en los laboratorios de microbiología clínica siempre que sea posible. Los géneros no ácido-alcohol resis­ tentes presentan el máximo problema, porque los análisis de la pared celular necesarios para su identificación se encuentran más allá de la capacidad de la mayoría de los laboratorios clí­ nicos. Los saprofitos más frecuentes aislados en la práctica cotidiana son las especies de Streptomyces. Si la bacteria pro­

Cuadro 15-1

G ru pos fenotípicos de los actin om icetos aerobios

GRUPO FENOTÍPICO

GÉNEROS Y ESPECIES REPRESENTATIVOS

M adurom icetos

Grupo de Actinomadura pusilla

Nocardioform es 0

Especies Especies Especies Especies Especies Especies

N ocardioides

Especies de Nocardioides

Estreptomicetos

Especies de Streptomyces

M ícropolisporas

Especies de Faenia (especies de

de de de de de de

Nocardia Rhodococcus Gordonia Tsukamurella Dietzia Mycobacterium

Micropolyspora)b Especies de Saccharomonosporab Especies de Saccharopolysporab Termomonosporas

Grupo de Actinomadura madurae Nocardiopsis

Otros actinom icetos

Especies de Thermoactinomycesb

Tropheryma whipplei Especies de Oerskovia Especies de Dermatophilus

“El grupo nocardioforme contiene ácidos micólicos en las paredes celulares, como las especies de Corynebacteríum. bEspecies termofílicas que crecen a temperaturas superiores a 50 °C.

viene de un paciente con una enfermedad clínicamente compa­ tible, debe ser derivado a un laboratorio de referencia para una identificación completa. Aun dentro del grupo ácido-alcohol resistente la complejidad creciente de las pruebas necesarias estimulará la derivación de muchos aislamientos de importan­ cia clínica. Por lo general, la presencia de una especie de Mycobacterium se determina por la ácido-alcohol resistencia completa, la ausencia de bacilos filamentosos y la afección clí­ nica asociada (véase cap. 19). Brown y McNeil proporcionan un algoritmo diagnóstico diferente, sobre la base del crecimiento en lisozima,10 mientras que Kiska y cois, han presentado una serie simplificada de pruebas para la identificación de especies de Nocardia , 4 3 Los términos definidos en el recuadro 15-1 se utilizan para diferen­ ciar estas bacterias. Los actinomicetos aerobios se distribuyen en forma amplia en la naturaleza, donde participan en la descomposición de la mate­ ria orgánica de origen vegetal.33-80 Las cepas aisladas de distintas especies en general provienen del suelo, de los sedimentos mari­ nos y de las heces de diversos animales. Se los debe considerar patógenos oportunistas, que producen infección sobre todo en los individuos cuyos mecanismos de defensa están deprimidos. Sin embargo, estas bacterias han proporcionado algunos de los antibióticos más importantes; estreptomicina (especies de Streptomyces), vancomicina (Amycolatopsis orientalis), macró­ lidos (especies de Micromonospora) y aminoglucósidos (espe­ cies de Micromonospora). Con mucho, los patógenos más importantes están en el género Nocardia, que será estudiado en detalle. Otros géneros se explicarán más brevemente. Desde un punto de vista práctico, estos microorganismos pueden ser reconocidos en el laboratorio porque forman colo­ nias lisas, firmes, adherentes, cerosas o calcáreas que crecen después de 3 días a 2 semanas de incubación. Pueden tener una pigmentación ocre, rosada, anaranjada o gris. El olor a sótano húmedo o a suelo recién removido es un indicio importante por el cual se los puede reconocer. La temperatura óptima de cre­ cimiento es de 30 a 36 °C, tanto en la incubadora de CO, (como para el cultivo de micobacterias) como en el aire ambiente (como en las incubadoras utilizadas para el cultivo de hongos). Crecen bien en medios con base de huevo de LowensteinJensen o en agar sintético de Middlebrook y en la mayoría de los medios de aislamiento de hongos que carecen de cicloheximida. La mayoría de los cultivos bacterianos de rutina se man­ tienen sólo durante 48 horas, de modo que los aislamientos a menudo se hacen en el laboratorio de micobacteriología o de micología. Todas las especies son grampositivas, aunque las especies de Nocardia, en particular, tienden a teñirse con un patrón arrosariado y gramvariable. Por lo tanto, el hallazgo de microorganis­ mos ramificados grampositivos o gramvariables, arrosariados y frágiles (1 (im de diámetro) debe alertar acerca de la posibili­ dad de un actinomiceto aerobio; las placas de aislamiento deben mantenerse durante 2 a 4 semanas para asegurar el creci­ miento. Las características prácticas por las cuales las especies de Nocardia son separadas más comúnmente de las especies de Mycobacterium en los laboratorios clínicos son la ramificación de las células bacterianas, la ácido-alcohol resistencia “parcial” (reacción ácido-alcohol resistente sólo cuando se utiliza como decolorante un ácido inorgánico en baja concentración en lugar de alcohol ácido) y la detección de un olor a humedad produ­ cido por las colonias maduras. Sin embargo, estas propiedades son variables y no siempre fiables. En los casos difíciles, se requiere el análisis de la pared celular o del genoma, pero lamentablemente estas técnicas sólo se encuentran en laborato-

G ru p o n o c a rd io fo rm e

819

Géneros de los actínomicetos aerobios* Ácido-alcohol resistencia** Positiva

Débilm ente positiva

Mycobacterium

Negativa

Micelio aéreo

Ácido diam inopim éllco (DAP) de la pared celular

Presente

Ausente

I

I

Nocardia

Tipo L

Mesotipo

Streptomyces

Rhodococcus Gordonia Tsukamurella Dietzia

Azúcares de la pared celular

Arabinosa Galactosa

Ninguna

M adurosa

I Nocardiopsis

Crecimiento a 50 °C Positivo

Saccharomonospora Saccharopolyspora Thermoactinomyces

Utilización de glucosa

Negativo

Amycolatopsis Micromonospora

Oxidativa

Actinomadura

Fermentativa

Dermatophilus

*No se ha cultivado Tropheryma whipplei en medios artificiales y no ha sido analizado para estas características. "T odos los microorganismos ácido-alcohol resistentes y débilmente ácido-alcohol resistentes contienen ácido micólico; adem ás, las especies de Corynebacterium contienen este componente de la pared celular.

Figura 15-1 Clasificación de los actínomicetos aerobios asociados con enfermedades humanas.

rios de referencia en este punto.I7,67’80 La composición de la pared celular de los acinomicetos aerobios, útil tanto desde el punto de vista taxonómico como diagnóstico, se detalla en el cuadro 15-2.

Grupo nocardioforme Nocardia

La taxonomía de Nocardia, el género más importante entre los actínomicetos aerobios, es tan confusa (y confundidora) como la del grupo en su totalidad. El aislamiento original de animales infectados con enfermedad granulomatosa (muermo bovino o farcinosis) fue realizado por Nocard en 1888 en la isla de Guadalupe. Más tarde se lo denominó Nocardia farcinica y este microorganismo se convirtió en la especie tipo del género. Es instructivo señalar que el aislamiento original consistió en dos cepas que se creyó que eran idénticas. En la actualidad una de las cepas tiene ácidos micólicos característicos de las nocardias, mientras que los ácidos micólicos de los otros son más típicos de las micobacterias.51 El miembro más importante del género es Nocardia asteroi­ des, que fue aislado en una infección humana poco después del aislamiento original de Nocard. N. asteroides es también taxo­ nómicamente variable y se lo suele describir como el comple­ jo de N. asteroides , 7 8 Varios miembros con nombre del com­ plejo, N. farcinica, N. nova y N. abscessus, han sido separados del grupo; a veces se los describe como subgrupos de N. aste­ roides.5^ 0 La separación de N. farcinica y N. nova, originaria­ mente controversial, fue validada por el reconocimiento de que tienen un perfil muy diferente de sensibilidad a los antibióticos del de N. asteroides , 5 8 Estas diferencias en la sensibilidad a los antibióticos tienen importancia clínica práctica, así como importancia taxonómica. Algunos especialistas sugieren que

los pacientes no deben ser tratados con cefalosporinas, a la cual N. farcinica es resistente, hasta que se hayan realizado las prue­ bas de sensibilidad. En un principio, Steingrube y cois, definieron cuatro grupos separados sin nombre, designados tipo I, tipo II, tipo IV y tipo VI.88 Utilizaron amplificación de DNA y polimorfismo de lon­ gitud de los fragmentos de restricción (RLFP) para caracterizar los productos derivados del gen de la proteína de choque tér­ mico de 65 kDa presente en las cepas. Los distintos grupos muestran diferencias en los perfiles de sensibilidad a los anti-

Recuadro 15-1

T érm in o s utilizados para d iferen ciar los a ctin o m ic eto s aerobios

Micelio sustrato: se refiere a las células que crecen sobre la superficie del medio y luego dentro de él. Estos m icroorganism os característicam ente form an células ram ificadas ("lufas”) que crecen juntas para form ar colo­ nias resistentes y correosas. Este crecim iento puede denom inarse tam ­ bién micelio vegetativo.

Fragmentación: en general, los m icelios sustrato de estos m icroorganis­ mos están compuestos por cadenas de bacilos largos que, con el crecim iento y el envejecimiento, com ienzan a “dividirse” en células con form a de bacilos (bacilares) y con forma de cocos (cocoides) individuales.

Hifas aéreas: En realidad, algunas especies producen células que crecen erectas y lejos de la superficie del agar. Se encontrarán hifas aéreas más maduras en el centro de la colonia, y las hifas aéreas más rudimentarias en la periferia. Con el envejecimiento, las hifas aéreas se fragm entan en "esporas” cocoides que dan a las colonias más viejas un aspecto atercio­ pelado o polvoriento. En una especie (Dermatophilus congoliensis), las esporas que son producidas en el m icelio aéreo son móviles.

820

C A P ÍT U L O 15

Cuadro 15-2

Actinomicetos aerobios

C om p osición de la pared celu lar de los actin o­ m icetos aerobios

QUIMIOTIPO DE LA PARED CELULAR'

COMPOSICIÓN

GÉNEROS

I

/-DAP y sin azúcares diagnósticos

Streptomyces

II

m eso-DAP y sin azúca­ res diagnósticos

Thermoactinomyces, Nocardiopsis

III

meso-DAP y m adurosa

Dermatophilus, Actinomadura

IV

meso-DAP, arabinosa y

Faenia (Micropolyspora), Nocardiab Rhodococcus,b Gordonia,b Tsukamurella,b Dietzia,b Saccaromonospora, Saccaropolyspora, Mycobacterium

galactosa

VI

Sin DAP, ácido aspártico Oerskovia y galactosa (variable)

NA

Sin DAP y m adurosa

Actinomadura

NA

Información no disponible

Tropheryma

" Las paredes celulares de todos los géneros contienen cantidades importantes de alanina, ácido glutámico, glucosalina y ácido murámico. Ningún patógeno huma­ no importante tiene las características de las paredes celulares tipo I, V, VII u VIII. Para más detalles véanse las referencias10,30,50,58. hÁcido nocardomicólico presente. NA, no aplicable.

bióticos. El tipo IV y los aislamientos de N. translensis estu­ diados fueron resistentes a los aminoglucósidos. Todos, salvo los tipos II y IV, han recibido nombres. Las cepas que se ajus­ tan a la descripción clásica pueden ser designadas Nocardia asteroides sensu stricto tipo VI (denominadas de ahí en ade­ lante N. asteroides). Cabe señalar que el “tipo VI” en este con­ texto se refiere al perfil de sensibilidad a los antibióticos, no a los componentes de la pared celular. Se ha propuesto que los aislamientos con un patrón de sensibilidad de tipo VI deben ser denominados N. cyriacigeorgica , 7 8 Los perfiles de sensibilidad a los antibióticos de los miembros del complejo de Nocardia asteroides se detallan en el cuadro 15-3, que incluye la nomen­ clatura actual. Muchas de las primeras comunicaciones no dis­ tinguieron a estos patógenos. Muchos casos de infecciones invasivas atribuidas a N. brasiliensis se adjudican ahora a una especie relacionada, N. pseudobrasiliensis.19,98 Otras especies que son patógenas para los seres humanos o que han sido aisladas en ellos son N. otitidiscaviarum,1'416-69 N. transvalensis,28'59 N. africana,37 N. vetera­ na:,18,71 N. paucivorans,23,109 N. brevicatena,78 N. arthritidis,41 N. cyriacigeorgici,"2 N. abscessus,ni N. punism y posiblemente otras especies con nombre y sin él.43 EPIDEMIOLOGÍA, ANATOMÍA PATOLÓGICA Y PATOGENIA

N. asteroides, el patógeno aislado más a menudo, está distri­ buido ampliamente en todos los Estados Unidos,80 al igual que N. farcinica, que es menos prevalente. ¿V. nova parece ser menos frecuente en los estados del sudoeste.

N. brasiliensis es una causa común de infecciones subcutá­ neas y micetoma en Sudamérica, gran parte de América latina y México. En la década de 1960, el 85-95% de los micetomas comunicados en México eran causados por N. brasiliensis.29 Castro y cois, observaron que N. brasiliensis era, con mucho, el actinomiceto más frecuente aislado en 41 pacientes observa­ dos en San Pablo, Brasil, entre 1978 y 1989.13 La mayoría de los pacientes provenían de áreas rurales en las regiones del noreste del país y eran peones de campo. También se observó una infección importante de la piel y los tejidos blandos por N. brasiliensis en pacientes de Queensland, Australia, que tenían nocardiosis.28 Aunque se lo halló sobre todo en los países tro­ picales, N. brasiliensis es la segunda cepa aislada con mayor frecuencia en los Estados Unidos, donde es más prevalente en los estados del sudoeste y el sudeste.84 N. otitidiscaviarum (antes N. caviae) ha sido aislado en el suelo en todo el mundo. La distribución de otras especies ais­ ladas pocas veces es menos clara. Se ha calculado que ocurren 500 a 1 000 casos de nocardiosis en los Estados Unidos por año,5 pero es probable que esa cifra sea una subestimación.4 Las nocardias son patógenos oportunistas que causan infec­ ciones en pacientes inmunodeprimidos o que presentan enfer­ medades debilitantes. La combinación de tratamiento corticosteroide prolongado y enfermedad pulmonar crónica se ha sugerido como una combinación particularmente importante de riesgo.80 Alrededor del 10% de los pacientes con nocardiosis no tienen ningún defecto subyacente demostrable. Significativamente, las nocardias pueden colonizar la piel y las vías respiratorias. En un estudio australiano, el 20% de las cepas no fueron aso­ ciadas con enfermedad clínica.28 Aun el aislamiento de espe­ cies de Nocardia en los hemocultivos puede no ser importante. De ocho pacientes con baeteriemia por Nocardia informados por Esteban y cois., se creyó que N. asteroides tenía relevancia clínica sólo en dos; los aislamientos restantes se consideraron insignificantes o de importancia incierta.24 Todos los pacientes se curaron. Estos autores arribaron a la conclusión de que las especies de Nocardia pueden constituir un contaminante y la importancia de cualquier aislamiento dado sigue siendo cues­ tión de juicio clínico. La forma más grave de nocardiosis es la infección pulmonar crónica, con diseminación a otros órganos o sin ella. La pato­ genia de la infección con el complejo de Nocardia asteroides es tal vez la inhalación de bacterias de transmisión aérea, lo que quizás explique la frecuencia de infección en los estados secos del sudoeste, análogo a Coccidioides immitis . 8 0 Es probable que la enfermedad cutánea, que incluye el micetoma actinomicótico, sea el resultado de la introducción directa de bacterias después del traumatismo, como el que sucede al caminar des­ calzo.80 Aunque la mayoría de las infecciones se adquieren del medioambiente, se describió la adquisición hospitalaria.103 Las especies de Nocardia son patógenos intracelulares facul­ tativos. No cabe duda de que su capacidad para crecer en los macrófagos y tal vez también en los neutrófilos polimorfonu­ cleares es importante por su capacidad para provocar infección. Los microorganismos pueden vivir en el interior de los macró­ fagos al inhibir la fusión fagosoma-lisosoma y por su capacidad para producir catalasa y superóxido disminutasa, que inactivan el sistema de la mieloperoxidasa de estas células fagocíticas. Los pacientes con enfermedad granulomatosa crónica corren el riesgo de una infección grave por nocardias, al igual que lo tie­ nen para otras bacterias que producen catalasa.20 La respuesta inmunitaria celular es fundamental para el control de la infec­ ción, como lo sugieren los estudios experimentales y la apari­ ción de la enfermedad en pacientes con compromiso de la

G ru p o n o c a rd io fo rm e

Cuadro 15-3

TIPO I

821

Sen sib ilid ad a los an tib ióticos de 78 a islam ien tos del com p lejo de N o ca rd ia asteroides

% DE AISLAMIENTOS 2 0

SENSIBLE

RESISTENTE

CORRELACIÓN ENTRE LAS ESPECIES

Im ipenem (50%)

Nocardia abscessus

Am picilina, eritrom icina

Carbenicilina

Nocardia nova

Ciprofloxacina

Todos los am inoglucósidos, incluida la am ikacina

Ampicilina. carbenicilina. cefalosporinas de am plio espectro, im ipenem (50%)

II

0

Igual que el tipo I, pero sensible a kanamicina y ciprofloxacina

ni

18

rv

5

V

17

Ciprofloxacina, imipenem

Todas las penicilinas y las cefalospo­ rinas de am plio espectro, todos los am inoglucósidos excepto kanamicina

Nocardia farcinica

VI

35

Cefalosporinas de am plio espectro

Penicilinas

Nocardia asteroides sensu stricto, Nocardia cyriacigeorgica

inmunidad celular.4 Algunos médicos opinan que la infección por nocardias está subrepresentada en los pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Sin embar­ go, Beaman señala la cantidad acumulada de informes de casos e infecciones subcomunicadas, y que las variaciones geográfi­ cas en las nocardias ambientales, que no se ajustan a los cen­ tros de infección por HIV, pueden explicar en parte la discre­ pancia.4 Se obtiene una situación similar probablemente con Legionella pneumophila, otro patógeno para el cual la inmuni­ dad celular es fundamental. En ambos casos una población pre­ dispuesta de pacientes debe estar en la proximidad de sitios ambientales que albergan las bacterias (véase cap. 10). Las células bacterianas de las especies de Nocardia no sue­ len observarse en los cortes teñidos con hematoxilina y eosina, y es posible que no se observen en las tinciones del ácido peryódico de Schiff. Se observan con bastante facilidad en las tin­ ciones de metenam ina plata de Gomori, Gram-W eigert, Giemsa o tisulares de Gram (p. ej., tinciones de Brown y Brenn o Brown-Hopps). En una tinción de Gram para tejidos, los microorganismos suelen ser bacilos filamentosos ramificados, arrosariados y delgados. La tinción ácido-alcohol resistente de Kinyoun modificada (en la cual la eliminación de la tinción se realiza con H 2S 0 4 acuosa al 1% en lugar del ácido-alcohol habitual que se utiliza en el método de Ziehl-Neelsen) es útil para los frotis directos y los cortes congelados, mientras que se recomienda la tinción ácido-alcohol resistente de Fite-Ferraco para los cortes con parafina.45 106 107 Con estas cepas, las espe­ cies de Nocardia son ácido-alcohol resistentes (o “parcialmen­ te ácido-alcohol resistentes”), las especies de Mycobacterium son fuertem ente ácido-alcohol resistentes, m ientras que Actinomyces israelii y los otros actínomicetos anaerobios no son ácido-alcohol resistentes. ENFERMEDAD CLÍNICA

La enfermedad clínica causada por todas las especies del género, denominada nocardiosis, es similar. La infección vis­ ceral es una enfermedad aguda, subaguda o crónica, que suele

comenzar en las vías respiratorias.58 Las manifestaciones inclu­ yen fiebre, tos productiva con esputo mucopurulento e infiltra­ dos de aspecto variado en las radiografías de tórax que no se resuelven. Puede haber bronconeumonía progresiva, infiltrados localizados o difusos, consolidación extensa, abscesos únicos o múltiples, derrames pleurales, empiema y trayectos fistulosos con afectación de la pared torácica. Se describió la formación de granulomas y la presencia de células gigantes con especies de Nocardia, pero en nuestra experiencia los granulomas no son típicos de la afectación pulmonar por estas bacterias. En general, la infección diseminada se origina en un foco pulmonar, pero también puede ocurrir después de una infección cutánea primaria. La propagación bacteriémica conduce a infección multiorgánica, sobre todo en el encéfalo y la piel.19 Alrededor del 45% de los pacientes con nocardiosis disemina­ da tienen infecciones del sistema nervioso central.54 El pronós­ tico es malo, con una tasa de mortalidad del 7-44% global y de hasta un 85% en los pacientes con inmunosupresión grave.58 Se ha documentado una infección grave por especies de Nocardia en pacientes que tienen enfermedad neoplásica94 o síndrome de inmunodeficiencia adquirida40 y en receptores de trasplantes renales,104 entre otros. Los abscesos encefálicos metastásicos, que se desarrollan en alrededor de un tercio de los pacientes, producen cefaleas, alteraciones del sensorio, convulsiones, déficits neurológicos focales u otras anomalías neurológicas. Los hemocultivos (a pesar de la propagación hematógena del microorganismo) y los cultivos de LCR casi nunca pueden demostrar las bacterias. Es probable que las infecciones cutáneas sean subdiagnosticadas porque a menudo son autolimitadas y es posible que no se hagan estudios microbiológicos adecuados sobre las infec­ ciones superficiales.54 Las pústulas, los abscesos, la celulitis y la paroniquia pueden ser el resultado de la introducción trau­ mática de nocardias en la piel. La inflamación se asemeja a la observada en otras infecciones bacterianas, salvo en que tiende a ser menos manifiesta. Cuando el proceso se extiende hasta los ganglios linfáticos regionales, puede asemejarse a la esporotricosis, y se lo llama nocardiosis esporotricoide.83 Si las bacterias

822

C A P ÍT U L O 15 Actínomicetos aerobios

se introducen en el ojo debido a un traumatismo penetrante, puede ocurrir queratitis o endoftalmitis. Una lesión cutánea clásica, el micetoma, puede ser causada por hongos verdaderos (micetoma eumicótico) o por actinomicetos aerobios (micetoma actinomicótico). (Véase la explica­ ción en la sección sobre “Actinomadura” más adelante). Aunque la enfermedad producida por varias especies es similar, existen características que las diferencian. Los miem­ bros del complejo de N. asteroides causan enfermedad pulmo­ nar y diseminada, pero N. farcinica es muy probable que se disemine y N. nova lo hace muy pocas veces.58 N. brasiliensis provoca infecciones cutáneas más a menudo, mientras que N. pseudobrasiliensis, más recientemente delineado, tiende a pro­ ducir una enfermedad diseminada. La información clínica sobre otras especies de nocardias es menos abundante. Rhodococcus

Rhodococcus equi es el patógeno humano más importante del género. Los otros patógenos humanos, R. erytliropolis, R. rhodnii y R. rhodochrous pocas veces se aíslan en muestras clí­ nicas. R. equi era conocido como Corynebacterium equi. También ha sido llamado “Mycobacterium rhodochrous” y ha sido denominado complejo “rhodochrous”.32

bazo y otros órganos.58 Otras formas de infección son endof­ talmitis, osteomielitis, pleuresía con derrame e infección de heridas. Otras bacterias nocardioformes

Las especies de Gordonia (originariamente especies de Gordona) fueron clasificadas antes en el género Rhodococcus. Es difícil identificar y separar a los miembros de este género entre sí y de géneros relacionados, lo que dificulta la evaluación de la literatura clínica.10 Se ha aislado Gordonia aurantiaca (antes R. aurantiacus) en el esputo de pacientes con enfermedad pulmonar crónica,96 en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente con leucemia de células pilosas y en una lesión grave de tenosinovitis gangrenosa con múltiples abscesos subcutáneos en una mujer con enfermedad de De Quervain.95 Las especies de Tsukamurella fueron descritas inicialmente en Japón como agentes de enfermedad pulmonar crónica que se asemejaba a la tuberculosis.10 Se han informado infecciones pocas veces como enfermedad oportunista en pacientes inmu­ nodeprimidos o que tienen cuerpos extraños. Se definieron más a menudo las especies de Dietzia. La especie tipo, D. maris (antes Rhodococcus maris) ha sido ais­ lada en el torrente circulatorio de un paciente inmunosuprimido que tenía colocado un catéter intravascular permanente.7

EPIDEMIOLOGÍA, ANATOMÍA PATOLÓGICA Y PATOGENIA

R. equi es causa de enfermedad pulmonar en potrillos y otros animales de granja.72 Entre 1967 y comienzos de la década de 1980, se informó sólo sobre unas pocas infecciones humanas. Se cree que éstas son resultado del contacto con animales por­ tadores (p. ej., ganado bovino, cerdos, caballos o estiércol de ganado bovino), presumiblemente por la vía respiratoria.97 Los rodococos están muy difundidos en el suelo, lo que tal vez explica la infección en personas que no recuerdan el contacto con animales. Takai y cois, señalaron la asociación de rodoco­ cos virulentos en el suelo de una estancia en la que se criaban caballos con potrillos enfermos, a diferencia de otra estancia sin casos de enfermedad equina y con menos aislamientos del suelo.92 Las infecciones humanas suelen ocurrir en personas inmunodeprimidas, sobre todo en aquellas con defectos en la inmuni­ dad celular, por ejemplo, pacientes con linfoma, enfermedad de Hodgkin, leucemia o síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y luego de trasplantes.955-97 McNeil y Brown citan más de 100 casos de infecciones por R. equi en pacientes con SIDA.58 La histopatología de la infección por Rhodococcus se ase­ meja a la de especies de Nocardia. Existe inflamación crónica (fundamentalmente de macrófagos) y fibrosis, con interposi­ ción de microabscesos.58 No se presentan típicamente granulo­ mas caseificados bien formados, como se observan en la tuber­ culosis. La malacoplaquia, una reacción histológica definida en la cual se encuentran concreciones basófilas laminadas (cuer­ pos de Michaelis-Gutmann) entre los macrófagos, se describió en casos de infección pulmonar por Rhodococcus equi.35 ENFERMEDAD CLÍNICA

Las infecciones clínicas pueden imitar a la tuberculosis, se tornan lentamente progresivas y se cavitan.48-81-97 La neumonía invasora con formación de cavitaciones se observa sobre todo en pacientes con SIDA, en los cuales existe una alta propensión a que la infección se disemine hasta el encéfalo, el hígado, el

Maduromicetos y termomonosporas Actinomadura

El género Actinomadura es genéticamente diverso y abarca dos grupos supragenéricos.30,58 Una vez más la terminología es confusa y está en transición. Goodfellow sugiere que las espe­ cies de Actinomadura deben reservarse para A. madurae y especies relacionadas (que incluyen A. pelletieri), que desde el punto de vista genético se encuentran más estrechamente rela­ cionadas con el grupo Thermomonospora . 3 1 Por el contrario, “maduromicetos” se reserva para un grupo natural de bacterias que incluye A. pusilla y microorganismos relacionados.31 Desde el punto de vista práctico, los principales patógenos humanos, A. madurae y A. pelletieri forman parte del primer grupo. Los miembros del género Actinomadura contienen meso-DAP en sus paredes celulares (pared celular de tipo IIIB; madurosa es un componente hidrocarbonado importante).31 EPIDEMIOLOGÍA

Las especies de Actinomadura son microorganismos del suelo que se introducen a través de la piel por un traumatismo, que puede ser menor. Las infecciones se observan fundamen­ talmente en países tropicales y subtropicales, lo que puede reflejar en parte la mayor tendencia de las personas que viven en climas más cálidos a caminar descalzas.58 ENFERMEDAD CLÍNICA Y ANATOMÍA PATOLÓGICA

Los micetomas son lesiones crónicas, penetrantes y progresi­ vamente destructivas que afectan la piel, el tejido subcutáneo y las estructuras subyacentes, como el hueso, el músculo y la fascia. No es sorprendente en las infecciones causadas por micro­ organismos del suelo, que tiendan a ocurrir sobre los miembros; el pie es un sitio muy frecuente. La inflamación granulomatosa crónica suele conducir a múltiples fístulas secretantes, de las cuales se eliminan gránulos (o granos). El hueso casi siempre

A ctinom icetos term ófilos está afectado. Estos gránulos, que miden menos de 1 mm de diámetro, representan colonias del agente infeccioso, y varían ¿e color según la naturaleza del agente infectante, por ejemplo, ma de granos blancos.54 Microscópicamente, los granu­ los consisten en masas de bacterias filamentosas o hifas introen una matriz similar al cemento, que imparte el color __e 'e observa a simple vista. Se puede presentar una reacción inm unitaria, conocida como el fenóm eno de SplendoreH erpli. La fibrosis suele ser el resultado final del micetoma, ue no en la medida en que se observa en la actimicosis caupor Actinomyces israelii (véanse caps. 14 y 16). Los micetomas son causados por hongos verdaderos (micet m a eumicótico) y por actinomicetos aerobios (micetoma actin rv.icótico). En la jerga coloquial, el micetoma actinomicótico >e denomina a veces “pie de M adura”. Los agentes etiológicos más 'recuentes y sus gránulos asociados se resumen en el cuadr '5-4. En un estudio de 366 aislamientos de actinomicetos aerobios en micetomas remitidos a los Centers for Disease C ntrol (ahora, Centers for Disease Control and Prevention CDCji a finales de la década de 1980, A. madúrete tuvo la 'í;u n d a incidencia más frecuente luego de N. asteroides '..5 ^ frente a 26%).60 La mayoría de las infecciones ocurren en países tropicales, sobre todo en India y Túnez (A. madurae) en Senegal, Chad y Somalia (A. pelletieri). Como señalamos, Socardia asteroides causa infecciones en todo el mundo, mien:ras que N. brasiliensis se limita a Sudamérica, América Central y México. Veintitrés de 28 casos probados por cultivo ae micetoma actinomicótico en los Estados Unidos ocurrieron er, ios estados del sur y el oeste, incluidos 11 de Texas y 3 cada uno de California y Florida.93 Aunque casi todas las infecciones porA. madurae son super­ ficiales, se han comunicado infecciones sistémicas en pacientes con inmunodeficiencia. Se informó de un caso de peritonitis por A. madurae en un paciente sometido a diálisis peritoneal conti­ nua. s La infección diseminada ocurrió en un paciente con SIDA que también era un consumidor habitual de heroína.62

823

blecer una categoría para los microorganismos relacionados que carecen del hidrato de carbono madurosa de la pared celu­ lar. N. dassonvillei, comúnmente un saprofito del suelo, ha sido aislado en animales y pocas veces en infecciones humanas, sobre todo en micetomas.10 En 1997 Yassin y cois, comunica­ ron el aislamiento de una especie nueva, N. synnemataformans en el esputo de un receptor de trasplante renal;110 el papel de esta especie nueva en la enfermedad humana es poco claro.

Estreptomicetos Streptomyces

Las especies de Streptomyces son microorganismos del suelo que tienen una importancia considerable en la industria y el campo farmacéutico. Algunas especies que causan infecciones humanas han sido aisladas en esputo y otras secreciones respi­ ratorias, en heridas superficiales, piel y otras muestras. En un estudio de 366 aislamientos de actinomicetos aerobios en mice­ tomas clínicos remitidos para su estudio a los CDC a finales de la década de 1980, sólo N. asteroides y A. madurae fueron ais­ lados más a menudo que las especies de Streptomyces.60 S. somaliensis, que causa micetoma actinomicótico, tiene una dis­ tribución casi mundial y ha sido aislado en casos de micetoma en Arabia Saudita, Nigeria, Níger, Sudán, Somalia, Sudáfrica, Venezuela, India y México.58 En una alta proporción de estos casos se afectaron la cabeza y el cuello, produciendo lo que se conoce como “cráneo de Madura”. Hasta 1981, los estrep­ tomicetos no habían sido aislados en micetomas en los Estados Unidos.93 Los granos de los micetomas por estreptomicetos son grandes (2 a 4 mm) y pardo amarillentos. Streptomyces anulatus (antes S. griseus), un microorganismo que causa micetomas subcutáneos en felinos y delfines, también ha sido aislado en micetomas humanos.

Actinomicetos termófilos

Nocardiopsis

Nocardiopsis dassonvillei, la especie más importante del género, forma cadenas en zigzag de esporas dentro de una estructura similar a una vaina y tiene una pared celular de tipo III (meso-DAP) sin azúcares diagnósticos. El género Nocardiopsis fue separado del género Actinomadura para esta­

Cuadro 15-4

Los actinomicetos termófilos provocan enfermedad humana, pero pocas veces se encuentran en el laboratorio de microbio­ logía clínica, porque causan reacciones alérgicas en lugar de infecciones productivas. En 1963 Pepys y cois, denominaron a la fuente antigénica del heno mohoso como Saccharopolyspora rectivirgula , 6 8 Con posterioridad, se reconoció a Thermoac-

A gentes etiológicos de los m icetom as

MICETOMA DE GRANOS BLANCOS (EUMICÓTICOS)

MICETOMA DE GRANOS NEGROS (EUMICÓTICOS)

MICETOMA DE GRANOS BLANCOS/AMARILLOS (ACTINOMICÓTICOS)

MICETOMAS DE GRANOS PARDO/ROJIZOS (ACTINOMICÓTICOS)

Especies de Acremonium

Especies de Curvularia

Actinomadura madurae

Actinomadura pelletieri

Especies de Aspergillus

Exophiala jeanselmei

Nocardia asteroides

Streptomyces somaliensis

Corynespora cassicola

Especies de Leptosphaeris

Nocardia brasiliensis

Especies de Fusarium

Especies de Madurella

Neotestudina rosatii

Phialophora cyanescens

Pseudodallescheria boydii

Plenodomas arramii

Pseudochaetoapheronema tárense

Especies de Pyrenochaeta

Adaptado de referencia'5.

824

C A P ÍT U L O 15

Actínomicetos aerobios

tinomyces vuigaris como una fuente adicional de alergenos. La enfermedad clínica, el pulmón del granjero, es un ejemplo de neumonitis por hipersensibilidad o neumonitis alérgica extrín­ seca. La enfermedad puede ser crónica y discapacitante, con deterioro de la función pulmonar hasta que se evita o elimina el agente desencadenante. Otros cuadros similares se producen luego de la exposición a mohos contenidos en compost, caña de azúcar (bagasosis), acondicionadores de aire o conductos de ven­ tilación.10 Son responsables varios miembros de los géneros Saccharopolyspora, Micropolyspora (Faenia) y Thermoactinomyces. La taxonomía de estos microorganismos ha sufrido múltiples cambios a través de los años.

Otros actínomicetos Oerskovia

Las dos especies más importantes de Oerskovia son O. turbata y O. xanthineolytica. Después de cierta controversia taxo­ nómica referente a la relación de estos microorganismos con el género Cellulomonas, el género Oerskovia ha sido reconstitui­ do con O. turbata como especie tipo.87 Estas bacterias eran cla­ sificadas como grupos corineformes A-3 y A-4 {O. turbata) y A -l y A-2 (O. xanthineolytica) de los CDC.86 Son bacilos grampositivos aerobios que se encuentran en el suelo. Sottnek y cois, describieron las características de 57 aislamientos clíni­ cos, que pertenecían al género Oerskovia, que habían sido deri­ vados a los CDC desde los laboratorios del hospital y salud pública de todo el país.86 Cinco de ellos provenían de válvulas cardíacas o de otras localizaciones cardíacas, nueve provenían de la sangre, uno era de LCR y los restantes provenían de sitios como orina, heridas traumáticas y quirúrgicas, secreción ocu­ lar, líquidos pleurales y quistes pilonidales. Las especies de Oerskovia han causado infección intrahospitalaria luego de la contaminación de líquidos para nutrición parenteral domésti­ ca36 y han sido responsables de endocarditis bacteriana,76 bac­ teriemia asociada con catéteres,53 infección de articulaciones protésicas38 e infección de diálisis peritoneal.77 Dermatophilus

Dermatophilus congolensis es un actinomiceto interesante que produce una dermatitis exudativa pustulosa conocida como dermatofilosis (también denominada gomosis o putrefacción del pie, queratólisis con depresiones o estreptotricosis) en muchas especies de animales (entre ellas, ganado bovino, ove­ jas, caballos, cabras, ciervos, cerdos, ardillas y gatos domésti­ cos). Pocas veces causa enfermedad en los seres humanos. Se desconoce el modo exacto de transmisión, aunque la mayoría de las infecciones ocurren luego del contacto directo con mate­ riales infectados y posiblemente por las picaduras de ectoparásitos e insectos voladores. Las ocupaciones y las diversiones que aparecen con riesgo particular son fundamentalmente aquellas que involucran un contacto estrecho con animales, como veterinarios, trabajadores de mataderos y cazadores.10 Los patólogos pueden encontrar estos microorganismos dentro de los folículos pilosos o las capas de queratina de las plantas de los pies en formas de masas de filamentos tabicados, ramifica­ dos, no ácido-alcohol resistentes. Tropheryma whipplei HISTORIA Y TAXONOMÍA

Esta bacteria es el último agregado a los actínomicetos aero­ bios, pero la enfermedad asociada, la lipodistrofia intestinal

(enfermedad de Whipple), fue descrita por primera vez en 1907 por George Whipple. Se habían identificado bacterias en los tejidos afectados mediante microscopía óptica y electrónica, pero la naturaleza del agente etiológico siguió siendo un mis­ terio hasta 1991, cuando Wilson y cois, utilizaron amplifica­ ción de ácidos nucleicos y secuenciación de RNA 16S en una biopsia duodenal de un paciente con enfermedad de Whipple para dilucidarla.57 El aspecto morfológico de las bacterias en el tejido no se consideró típico de los bacilos grampositivos o gramnegativos, tal vez debido a la localización intracelular de los microorganismos.57 Sin embargo, mediante análisis molecu­ lar, el microorganismo se ajusta a la familia de los grampositivos, más estrechamente relacionado con R othia51 Rhodococcus, Arthrobacter y Streptomyces, menos estrechamente relaciona­ do con las micobacterias.105 Casi una década más tarde, la bac­ teria fue cultivada en fibroblastos humanos74 y denominada Tropheryma whipplei (designación enmendada de T. whippelii original).46 En la actualidad, se ha secuenciado por completo el genoma de T. whipplei, lo que proporciona nociones útiles sobre su naturaleza.8 La bacteria tiene un genoma sorprenden­ temente pequeño, que demuestra las características de otras bac­ terias intracelulares que requieren aminoácidos externos y son deficientes en metabolismo energético. No obstante, la cantidad de material genético dedicado a codificar estructuras de super­ ficie es bastante grande, lo que sugiere que las interacciones entre el exterior de las bacterias y el huésped son fundamenta­ les para su supervivencia. Por último, existe considerable varia­ bilidad genética (que incluye la variación de fase), que puede ser ventajosa para la adaptación a los medioambientes intrace­ lulares cambiantes.8 ECOLOGÍA

El lugar de T. whipplei en la naturaleza se desconoce. Se lo ha detectado en heces humanas y en aguas servidas, pero no está claro si el ácido nucleico era una fuente de infección para el hombre o si era el resultado de la excreción por los indivi­ duos infectados.57 Se ha comunicado la detección de ácidos nucleicos mediante técnicas de amplificación en la saliva humana91 y en secreciones gástricas.22 Ha sido hallado en muestras de biopsia duodenal de pacientes que no tienen enfer­ medad de Whipple,22 aunque otros investigadores observaron DNA sólo rara vez en ausencia de pruebas clínicas de la enfer­ medad.56 Por lo tanto, es posible que los seres humanos sean reservorios de las bacterias, pero no hay otra opinión clara sobre eso. Los problemas potenciales con la especificidad de los procedimientos de amplificación y la presencia de enfer­ medad de Whipple extraintestinal sin afectación manifiesta del intestino34 complican el análisis. ENFERMEDAD CLÍNICA Y ANATOMÍA PATOLÓGICA

La enfermedad de Whipple es una enfermedad multi sistémi­ ca crónica rara.21-57 La tríada clásica de diarrea, pérdida de peso y malabsorción refleja la frecuencia con la cual se afecta el tubo digestivo. También se afectan otros sistemas orgánicos, sobre todo articulaciones y sistema nervioso (recuadro 15-2). El corazón también puede estar afectado y T. whipplei es una causa de endocarditis bacteriana con cultivos negativos.2534 La patogenia de la enfermedad de Whipple se conoce poco. Es probable que sean importantes los defectos en la inmunidad celular o la función de los macrófagos, pero parecen ser espe­ cíficos para este agente, ya que los pacientes no suelen estar infectados por otros patógenos oportunistas.

D ia g n ó s tic o de la b o ra to rio d e las in fe c c io n e s c a u s a d a s p o r a c tin o m ic e to s a e ro b io s

Recuadro 15-2

S itios extraintestinales de la enferm edad de W hipple: análisis de 52 cas o s a

Sitio extraintestínal

Ns (%) de casos

Articulaciones Sistema nervioso Piel y mucosas Corazón y vasos sanguíneos Pulmón y pleura Ojo

43 (83) 1 1 (2 1 ) 9 (1 7 ) 9 (1 7 ) 7 (1 3 ) 5 (1 0 )

ü Múltiples sitios afectados en algunos pacientes. Adaptado de la referencia21.

T. whipplei es un patógeno intracelular facultativo. Como es cierto para otras bacterias de esta categoría, el sello patológico de la infección es el macrófago. Los macrófagos espumosos, que contienen muchas bacterias dentro de vacuolas, eran res­ ponsables de los quilíferos amarillos que George Whipple observó en el intestino delgado. Las bacterias en estas células pueden ser teñidas por el método de ácido peryódico de Schiff, pero esta técnica no es específica. Otras bacterias, sobre todo el complejo Mycobacterium avium y Rhodococcus equi, pueden causar un cuadro similar. Las tinciones ácido-alcohol resisten­ tes pueden ayudar con la diferenciación, ya que T. whipplei no es ácido-alcohol resistente. Por último, se necesita la tinción inmunológica de tejidos, cultivo o amplificación de ácidos nucleicos para los casos difíciles. En los tejidos extraintestinales pueden observarse granulomas similares al sarcoide y no caseificados.57

Diagnóstico de laboratorio de las infecciones causadas por actinomicetos aerobios Aislamiento primario

N. asteroides y otros actinomicetos aerobios son microorga­ nismos aerobios que crecen en distintos medios bacteriológicos, que incluyen agar sangre, agar infusión de encéfalo y corazón o agar dextrosa de Sabouraud sin antibióticos (son inhibidos por cloranfenicol, penicilina y estreptomicina) y en medios desig­ nados para el aislamiento de micobacterias. N. asteroides crece bien a 25 °C, a 35 a 37 °C y a 42 a 45 °C. La incubación a una temperatura más alta permite su crecimiento, mientras que muchas otras bacterias serán inhibidas. El crecimiento puede llevar de 4 días a 6 semanas de incubación y es aumentado por la incubación en C 0 2 al 10%. Los aislamientos a menudo se hacen en los laboratorios de microbiología o micobacteriología, porque los cultivos han sido incubados durante un período suficientemente prolongado. Las especies de Nocardia pueden ser aisladas en muestras contaminadas utilizando el medio de Thayer-Martin (MTM) modificado.65 Shawar y cois, aprovecharon la capacidad pecu­ liar de crecimiento con parafina como única fuente de carbono para crear un medio selectivo y químicamente definido que contenía parafina (técnica de cebado con parafina).82 Mediante esta técnica, se inserta una varilla de vidrio recubierta con para­ fina en un caldo libre de carbono mezclado con la muestra de esputo. En los cultivos positivos, el crecimiento aparece sobre la varilla inmediatamente por encima de la superficie del caldo.

825

Asimismo, Ayyar y cois, observaron que el agar parafina era un medio selectivo poco costoso para las especies de Nocardia y era superior a MTM o a la técnica de cebado con parafina.2 El medio selectivo de agar extracto de levadura-carbón amortiguado (BCYE, utilizado comúnmente para el aislamien­ to de especies de Legionella en muestras respiratorias) también facilita el aislamiento de especies de Nocardia en el esputo y otras muestras que pueden estar contaminadas con bacterias mixtas.27,42 El uso del agar selectivo BYCE, al cual se ha agrega­ do polimixina B, anisomicina y vancomicina, y el pretratamiento de la muestra con un lavado ácido mejoró el aislamiento de las especies de Nocardia desde el 8% al 33% para el primero y al 67% para el últim o42 N. asteroides sobrevive al procedimiento de digestión habi­ tual con Af-acetil-L-cisteína (sin NaOH) que se utiliza para ais­ lar micobacterias en el esputo o los lavados bronquiales.64 Se ha recomendado realizar los cultivos de estas muestras para el aislamiento de especies de Nocardia tanto antes como después del procedimiento de digestión, aunque este enfoque duplica el trabajo. Las colonias en los medios de Lówenstein-Jensen (LJ) a menudo se desarrollan en 1 a 2 semanas. Pueden tener un aspecto similar a las micobacterias atípicas (véase cap. 19). Sin embargo, las especies de Mycobacterium no producen hifas aéreas y difieren bioquímicamente de las nocardias. Las hifas ramificadas de Nocardia, las cuales no siempre pueden verse en los extendidos preparados a partir del crecimiento en medios sólidos, a veces se demuestran por el crecimiento en cultivos en caldo, mientras que las micobacterias no suelen ramificarse (aun cuando los bacilos pueden ser alargados). Una excepción que vale la pena mencionar es Mycobacterium fortuitum, del cual se ha observado que produce filamentos ramificados en frotis de pus y puede producir colonias filamentosas. Diferenciación de Nocardia de otros géneros de actinomicetos aerobios

Las infecciones de los seres humanos por los géneros Strep­ tomyces, Nocardiopsis, Rhodococcus, Actinomadura, Gordonia, Tsukamurella, Oerskovia y Dermatophilus parecen ser raras en los Estados Unidos, aunque faltan buenos datos sobre su incidencia. En los cuadros 15-5 y 15-6 se presentan algunas características que pueden ayudar a diferenciar entre los géne­ ros de los actinomicetos aerobios y otras bacterias relacionadas y dentro de ellos. En el recuadro 15-1 se proporciona un breve glosario de los términos utilizados en la diferenciación de los actinomicetos. Se puede sospechar la presencia de especies de Nocardia y Streptomyces sobre la base de algunas características simples. Las colonias típicas de ambas especies son de consistencia seca a cretácea, habitualmente apiladas o plegadas y su color varía de amarillo a blanco grisáceo (véase lámina en color 15-1 A). Las especies de Nocardia suelen tener cierto sombreado ama­ rillo, mientras que las de Streptomyces son más a menudo blan­ co grisáceas. Ambos grupos producen colonias con un olor intenso a sótano húmedo (probablemente porque los sótanos son “fábricas” de Streptomyces). Las colonias de Rhodococcus equi carecen del olor húmedo y a menudo tienen un color rosa­ do o salmón en medios de agar (lámina en color 15-IB). En condiciones típicas, la tinción de Gram del material de una colonia muestra filamentos ramificados y delicados de no más de I um de diámetro (véase lámina en color 15-1C). Las especies de Nocardia son parcialmente ácido-alcohol resisten­ tes (no pierden el color cuando son tratadas con H2S 0 4 al 1% o HC1 al 3%, pero sí cuando se aplica el decolorante de alcohol ácido más activo en las tinciones de Ziehl-Neelsen o de

826

Cuadro 15-5

P ru e b a s b ioquím icas y fisiológicas p a ra la identificación de actínom icetos aero b io s seleccionados de im p o rtan cia clínica OPACIFICRECI­ CACIÓN DE MIENTO EN LISOZIMA MIDDLEBROOK

DESCOMPOSICIÓN DE

CRECIMIENTO A 45 “C EN 3 DÍAS

Caseína

Tirosina

Xantina

HIDRÓLISIS DE Hipoxantina UREASA GELATINA

CAPÍTULO

MICROORGANISMO

ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE MODIFICADO +

+

-

V

-

-

-

+

-

15

Nocardia brasiliensis

+

+

-

_

+

+

+

+

+

Nocardia otitidiscaviarum (N. caviae)

+

+

-

V

-

+

+

-

Nocardia transvalensis

+

+

-

-

-

+

+

-

Nocardia farcinica

+

+

+

+

-

+

-

m

V

-

Actínomicetos aerobios

Nocardia asteroides

-

+ -

H H H H |H H | m

HHHHHHH H H H H H

Nocardia nova

+

+

Nocardia pseudobrasiliensis

+

+

-

-

Rhodococcus equi

+

-

ND

ND

ND

-

Rhodococcus erythropolis

+

+

ND

ND

ND

-

+

+

+

+

ND

ND

-

ND

ND

Rhodococcus rhodnii

+

+

ND

ND

ND

+

-

ND

ND

Rhodococcus rhodochrous

+

-

ND

ND

ND

-

-

ND

ND

Gordonia bronchialis

+

HHH|

ND

ND

ND

ND

Gordonia rubropertincta

+

-

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

Gordonia sputi

+

-

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

Gordonia terrae

+

-

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

m m n H H H H

m

Tsukamurella inchonensis

+

+

ND

ND

+

-

+

ND

ND

Tsukamurella paurometabola (Rhodococcus aurantiacus)

+

+

ND

ND

-

-

-

+

ND

Tsukamurella pulmonis

+

+

ND

ND

-

-

-

ND

ND

-

ND

ND

Tsukamurella strandjordae

+

+

ND

ND

Tsukamurella tyrosinosolvens

+

+

ND

-

-

ND

+

+

+

ND

ND

ND

+

+

+

ND

ND

+

ND

+

+

ND

ND

Tsukamurella wratislaviensis

+

+

ND

ND

Dietzia (Rhodococcus) maris

-

-

ND

ND

Dermatophilus, especies

-

Oerskovia turbata

H H H H HHHHHHHH H H H H

ND

ND

ND

+

HHH|

ND

-

+ +

ND

-

HHHHHHHH ■ H H +

+

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Oerskovia xanthineolytica

-

-

ND

V

Actinomadura madurae

-

-

ND

ND

+

+

+

-

ND

ND

+

+

+

ND

ND

+

+

HHHH

-

+

ND

+

+

+

+

V

+

ND

+

+

+

+

+

+

Actinomadura pelletieri Streptomyces somaliensis

-

HHHHHHH HHHH

Streptomyces griseus

-

-

ND

Nocardiopsis dassonvillei

-

-

ND

+ -

+

Cuadro 15-5 P ru e b a s bioquím icas y fisiológicas p a ra la identificación de actinom icetos aerobios seleccionados de im p o rtan cia clínica (conl.) UTILIZACIÓN COMO ÚNICA FUENTE DE CARBONO DE

i.-arabinosa

Citrato

i-eritritol

D-galactosa

D-glucosa

i-mioinositol

D-manitol

L-ramnosa

D-sorbitol

i)-trehalosa

Nocardia asteroides

-

-

V

-

V

+

-

-

V

-

V

Nocardia brasiliensis

-

-

+

-

+

+

+

+

-

-

+

Nocardia otitidiscaviarum (N. caviae)

-

V

-

-

-

+

+

V

-

-

V

Nocardia transvalensis

V

-

+

V

V

V

V

V

-

V

+

Nocardia farciitica

-

-

-

+

-

+

-

-

+

-

-

-

-

m

+

-

+

+

+

ND

Nocardia nova

-

-

+

Rhodococcus equi

ND

ND

-

ND

Rhodococcus erythropolis

ND

ND

+

ND

V

ND

Rhodococcus rhodnii

ND

ND

V

ND

+

ND

V

ND

-

+

-

ND

+

-

-

+

-

+

Nocardia pseudobrasiliensis

m

m

m

+ +

+

-

V

-

-

+

-

V

-

ND

+

-

+

ND

H

ND

+

ND

H

ND

+

m

u

H

H

H

Rhodococcus rhodochrous

ND

ND

V

ND

Gordonia bronchialis

ND

ND

-

ND

Gordonia rubropertincta

ND

ND

+

ND

+

ND

Gordonia sputi

ND

ND

-

ND

+

ND

Gordonia terrae

ND

ND

+

ND

+

ND

-

+

+

+

ND

Tsukamurella inchonensis

ND

ND

+

ND

ND

ND

+

+

ND

+

ND

Tsukamurella paurometabola (Rhodococcus aurantiacus)

ND

ND

+

ND

ND

ND

-

-

ND

-

ND

-

|H

H

-

H

|H

+

ND

+

ND

Tsukamurella pulmonis

ND

ND

-

ND

ND

ND

-

+

ND

+

ND

Tsukamurella slrandjordae

ND

ND

+

ND

ND

ND

+

+

ND

+

ND

Tsukamurella tyrosinosolvens

ND

ND

V

ND

ND

ND

+

+

ND

+

ND

Tsukamurella wratislaviensis

ND

ND

-

ND

ND

ND

+

+

ND

+

ND

Dietzia (Rhodococcus) maris

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

Dermatophilus, especies

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

Oerskovia turbata

ND

ND

-

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

Oerskovia xanthineolytica

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

ND

+

+

+

+

+

ND

ND

ND

ND

ND

ND

+

-

-

-

+

Streptomyces somaliensis

ND

ND

ND

ND

ND

ND

+

-

-

-

-

Streptomyces griseus

ND

ND

ND

ND

ND

ND

+

-

-

-

-

Nocardiopsis dassonvillei

ND

ND

ND

ND

ND

ND

+

-

+

+

+

+, positiva;

negativa; V, variable; ND. no disponible.

827

Actinomadura madurae Actinomadura pelletieri

Diagnóstico de laboratorio de las infecciones causadas por actinomicetos aerobios

Adonitol (Ribitol)

MICROORGANISMO

828

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

+

-

+ -

_

Bacterionema

A, F

+

-

B ifidobacteríum

AE

+c

-

Corynebacterium

A, F

Dermatophilus

A, M

Mycobacterium

A

+

Nocardia

A

+

+

+

+

+

-

-

Nocardiopsis

A

+

+

+

D

+

-

-

A, F

-

-

+

+

D

-

+

D

-

-

+

+

+

+

-

-

-

+

1

+

1

A

1

-

+

A, M

-

+

A

+

+

Streptomyces

+

+c

1

Rothia

-

AE, F, M

1

Rhodococcus

_

+

Propionibacterium

+

Oerskovia

-

1

A, F

0

Arcanobacterium

i

AE, F, M

+

i

-

+

+

+

i

+

+

+

i

A

MOTILIDAD'

CATALASA

FUERTEMENTE ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTE'

i

CONIDIAS

FILAMENTOS RAMIFICADOS (MICROSCÓPICOS)

i

Actinomyces

MICELIO AÉREO*

PARCIALMENTE ACIDO-ALCOHOL RESISTENTE/Y ARILSULFATASA* POSITIVO

-

-

“Relación con oxígeno: A, aerobio; F, anaerobio facultativo; M, microaerófilo; AE, aerobio estricto. bMicelio aéreo : +, producido de form a persistente o transitoria; -, no producido. Filamentos ramificados (microscópicos): las células bifurcadas que comúnmente producen Bifidobacterium no se consideran verdaderas ramas. La mayoría de las cepas de Propionibacterium aisladas clínicamente no se rami­ fican; las cepas ocasionales que se ramifican podrían ser confundidas con Actinomyces o Arachnia. La mayoría de las cepas de Mycobacterium halladas clínicamente no se ramifican. Sin embargo, M. fortuitum, un microor­ ganismo de rápido crecimiento, puede form ar hifas ramificadas y asemejarse a Nocardia. d.Fragmentación del micelio en cultivos más antiguos; los filamentos tienden a dividirse en elementos bacilares o cocoides cortos. Dermatophilus congolensis, parásito de la piel y agente de la dermatitis exudativa en los anima­ les (pocas veces en los seres humanos), forma filamentos miceliales que se dividen tanto transversal como longitudinalmente para form ar grupos de hasta ocho células cocoides móviles. eLas especies de Mycobacterium son fuertemente ácido-alcohol resistentes cuando son teñidas con Ziehl-Neelsen, auramina-rodamina o tinciones de Kinyoun modificadas. Por el contrario, las especies de Nocardia y las espe­ cies de Rhodococcus son sólo débil o parcialmente ácido-alcohol resistentes y sólo se tiñen con una tinción ácido-alcohol resistente modificada (véase el texto). 'Parcialmente ácido-alcohol resistente: positiva sólo cuando se utiliza una baja concentración de ácido inorgánico (p. ej., ácido sulfúrico al 1%) en lugar de alcohol ácido; la tinción de las bacterias a menudo es irregular con segmentos no teñidos. HPrueba de la arilsulfatasa (3 días). Véase capítulo 19. hD, Actinomyces viscosus y dos especies de importancia no médica, A. howelii y A. hordeovulneris, constituyen las únicas especies de Actinomyces que son catalasa positivas. 90% o más de cepas negativas; +, 90% o más de cepas positivas; D, 11-89% de cepas positivas. Datos tomados de Sneath PHA, Mair NS, Sharpe ME, Holt G. Bergey’s Manual o f Systematic Bacteriology. Vol. 2. Baltimore: Williams & Williams, 1986; Buchanan RE, Gibbons NE: Bergey’s Manual o f Determinative Bacteriology. Ed. 8. Baltimore: Williams & Wilkins, 1974 y Rippon JW. Medical Mycology. Ed. 2. Filadelfia: Saunders, 1982.

Actínomicetos aerobios

Actinomadura

RELACION CON EL OXIGENO

FRAGMENTACION DE LOS MICELIOS EN LOS CULTIVOS MÁS ANTIGUOS '

15

GENERO

C a ra c terístic a s diferenciales adicionales: N o c a rd ia , o tro s actínom icetos y géneros relacio n ad o s que pueden en c o n tra rse en el la b o rato rio clínico

CAPÍTULO

Cuadro 15-6

D ia g n ó s tic o de la b o ra to rio de las in fe c cio n e s c a u s a d a s p o r a c tin o m ic e to s a e ro b io s

i------------------------------------------------------------------------------------

829

Recuadro 15-3 Tinció n ácido-alco hol resisten te m odificada para especies de N ocardia ----------------------------------------------------------------------------- --------------------------

Recuadro 15-4 Prueba de la lisozim a para la identificación de las especies de N ocardia

1 Realizar un frotis del m icroorganismo de los medios de crecimiento y fijar con calor.

1. Preparar caldo de glicerol agregando 5 g de peptona y 70 mL de glice­ rol a 1 000 mL de agua destilada (reducir proporcionalmente las canti­ dades si se desean cantidades más pequeñas). Esterilizar con autoclave a 15 psi durante 15 minutos. 2. Preparar una solución de lisozima disolviendo 100 mg de polvo de liso­ zima en 100 mL de HCI 0,01 N. 3. Com binar 95 mL de caldo de glicerol con 5 mL de solución de lisozima y dividir en alícuotas de 5 mL en tubos con tapa a rosca. Utilizar alí­ cuotas de 5 mL de caldo de glicerol sin lisozoma para el control del crecimiento. 4. Preparar una suspensión diluida del microorganismo desconocido en solución salina estéril. Utilizando una pipeta Pasteur, inocular 1 o 2 gotas en el tubo con lisozima y el tubo de control (mantener el inoculo diluido). 5. Incubar a 25 °C. Examinar cada tubo para detectar crecimiento en 7 a 14 días. El crecimiento aparece como una película sobre la superficie, como un sedimento o como ambos. Los tubos pueden ser sacudidos suavemente para observar partículas similares a migas de pan en los tubos que muestran un crecimiento positivo. 6 . Un microorganismo resistente a la lisozima crece tanto en el tubo con lisozima como en el tubo control: un microorganismo que es sensible crece sólo en el tubo control.

2. Irrigar el portaobjetos con carbolfucsina de Kinyoun durante 5 minutos. | 3 Verter el exceso de tinción. - Realizar la decoloración con una solución acuosa al 1% de ácido sulfú­ rico. 5 Lavar con agua corriente. - Realizar la contratinción con azul de metileno durante un minuto. '. Enjuagar con agua y secar. Exam inar con microscopio de inmersión en aceite.

Kinyoun) (recuadro 15-3). Por el contrario, las especies de Streptomyces no son parcialmente ácido-alcohol resistentes. Se puede aumentar la tinción ácido-alcohol resistente haciendo crecer el microorganismo en ciertos medios, como agar de Middlebrook 7H11 o agar caseína (véase luego la explicación de las técnicas de identificación). Si el microorganismo desco­ nocido no es ácido-alcohol resistente, se puede hacer un infor­ me de “actinomiceto aerobio no ácido-alcohol resistente”, pero ese informe debe ser diferido hasta que se realicen intentos adecuados para reforzar la ácido-alcohol resistencia. Las especies de Rhodococcus no forman los filamentos lar­ gos observados en los aislamientos de Nocardia y Strepto­ myces. Son bacilos grampositivos que pueden agruparse como caracteres chinos, lo que refleja su hogar taxonómico anterior en el género Corynebacterium (lámina en color 15-1D). Los aislamientos a menudo son parcialmente ácido-alcohol resis­ tentes (lámina en color 1-E). El crecimiento en presencia de lisozima es útil para identifi­ car las especies de Nocardia (véase cuadro 15-5), sobre todo las cepas que no son ácido-alcohol resistentes. Todas las espe­ cies de Nocardia son resistentes a lisozima y crecen en su pre­ sencia en 5 a 20 días. Se debe realizar un tubo de control de caldo de glicerol sin lisozima y tanto controles positivos como negativos con cada prueba. La prueba se efectúa como se expli­ ca en el recuadro 15-4. La capacidad diferencial de las distintas nocardias y los acti­ nomicetos aerobios relacionados para hidrolizar caseína, tirosi­ na, xantina e hipoxantina es uno de los puntos fundamentales

Cuadro 15-7

de los protocolos de identificación en la mayoría de los labora­ torios clínicos. El procedimiento se describe en el protocolo 15-1 y los patrones de reacción se muestran en el cuadro 15-5. Las placas diferenciales se inocularon con el microorganismo desconocido hasta durante 3 semanas a 30 °C y se observó la presencia de hidrólisis (aclaración del medio que rodeaba a las colonias). En la figura 15-2 se muestra un ejemplo de la hidró­ lisis de caseína por una colonia de especies de Streptomyces. La diferenciación de ciertas especies no se puede lograr sólo con el análisis de la hidrólisis. Puede ser necesaria la caracteri­ zación de la capacidad para descomponer hidratos de carbono o utilizarlos como única fuente de carbono.10-63 La diferencia­ ción entre Nocardia farcinica y N. asteroides se ve facilitada por el análisis de la temperatura del crecimiento,12 por la capa­ cidad para opacificar los medios de Middlebrook 7H10 o 7H 11 (cuadro 15-5)12-26-43 y por el perfil de sensibilidad a los antibió­ ticos (véase cuadro 15-10).85 Se describió una reacción en cadena de la polimerasa, en la cual se amplifica una secuencia de DNA específica de especie para N. farcinica,n

P ruebas claves para la diferenciación entre las especies de N ocardia

MICROORGANISMO

PRUEBA O CARACTERÍSTICA

Nocardia nova

Positiva para arilsulfatasa

Nocardia farcinica

Opacificación de agar de Middlebrook

Nocardia brasiliensis y Nocardia pseudobrasiliensis

Licuefacción de gelatina

Nocardia transvalensis, Nocardia asteroides tipo IV, Nocardia brevicatena

Patrón de asimilación de azúcar de levadura en API 20C

Nocardia nova, Nocardia farcinica, Nocardia brevicatena

Patrón de sensibilidad a gentamicina, tobramicina, am ikacina y eritromicina

Tomado de la referencia43.

830

C A P ÍT U L O 15 Actinomicetos aerobios

Si los resultados de estas pruebas son ambiguos, puede ser útil la cromatografía en capa fina. En algunos laboratorios de investigación o laboratorios de referencia se utilizan las dife­ rencias en la composición de la pared celular con fines taxonó­ micos. En el cuadro 15-2 (véase también fig. 15-1) se resumen los componentes primarios de las paredes celulares. La mayo­ ría de los microorganismos nocardioformes, que incluyen Nocardia y Rhodococcus, tienen una composición de la pared celular tipo IV (los componentes importantes son ácido mesodiaminopimélico [DAP], arabinosa y galactosa, con ácidos micólicos presentes). Las especies de Streptomyces tienen paredes celulares tipo I (sin l-D A P y sin hidratos de carbono diagnósticos). Las especies de Oerskovia tienen paredes celu­ lares de tipo VI (sin DAP ni hidratos de carbono de utilidad diagnóstica). Otras pruebas quimiotaxonómicas, además de determinar el tipo de pared celular, incluyen análisis de mena­ quinonas, ácidos grasos de cadena larga, fosfolípidos y ácidos micólicos. Estos estudios no son prácticos ni necesarios para la diferenciación de la mayoría de las cepas de Nocardia y Rhodococcus en el laboratorio de microbiología clínica. Si es necesaria una diferenciación definitiva, los microbiólogos pue­ den desear enviar los microorganismos aislados a un laborato­ rio de referencia. Cada vez más los procedimientos de amplificación y secuen­ ciación moleculares son útiles tanto para la detección directa de los actinomicetos aerobios en muestras clínicas como para la identificación de las bacterias aisladas.6-47'49,67'70,90 Cloud y cois, han sugerido que la secuenciación del RNA ribosómico 16S es más precisa que una combinación de pruebas bioquímicas con­ vencionales y perfiles de sensibilidad a los antibióticos para la identificación de las especies de Nocardia.'1 En el caso de Tropheryma whipplei, los enfoques moleculares constituyen el método diagnóstico primario. En la actualidad, estas técnicas se utilizan sobre todo en laboratorios de investigación o gran­ des laboratorios de referencia; los microbiólogos deben mante­ nerse alerta acerca de la disponibilidad futura de los productos comerciales. Las cuestiones son suficientemente complejas como para que incluso algunos análisis moleculares no puedan diferenciar entre ciertas especies.18

F igu ra 15-2 Placa de agar caseína que muestra ia acción hidrolítica de dos especies de Streptomyces.

Mishra y cois, han diseñado un esquema para la diferencia­ ción más detallada de las nocardias y los estreptomicetos que se presenta en el cuadro 15-5.63 Su cuadro diferencial es parti­ cularmente útil, ya que enumera los porcentajes de cepas posi­ tivas para una gran serie de pruebas bioquímicas, las caracte­ rísticas morfológicas y las características fisiológicas. Más recientemente, Kiska y cois, han sugerido pruebas que tienen un uso particular para la diferenciación de las especies de Nocardia (cuadro 15-7).43 Estos autores idearon un algoritmo eficaz que utiliza patrones de sensibilidad a los antibióticos, utilización de citrato, utilización de acetamida y asimilación de dos azúcares (inositol y adonitol). Para m uchos laboratorios las tiras API 20C AUX (BioMérieux, Hazelwood, MO) proporcionarán una herra­ m ienta expeditiva para la identificación de especies de Nocardia (cuadro 15-8).43 En algunos casos pueden ser necesa­ rias pruebas complementarias para resolver los patrones dupli­ cados de asimilación de hidratos de carbono (cuadro 15-9).

Cuadro 15-8

Uso de bandas de API 20C AUX para la identificación de especies de Nocardia“ N -A C E T IL

ESPECIE (N° DE CEPAS)

GLUCOSA

GLICINA

GALACTOSA

GLUCOSAMINA

INOSITOL

ADONITOL

N. asteroides tipo I ( 8 )

+

+

-

+ (63)

-

-

-

N. asteroides tipo IV (1)

+

+

+

-

-

-

+

N. asteroides tipo VI (10)

+

+(90)

-

-(9 0 )

-

-

-(8 0 )

N. farcinica (16)

+

+d (63)

-

-

-

-(9 4 )

N. nova (19)

+

+d -

-

-

-

-

-

N. brasiliensis (6 )

+

+

+

+

+

-

+

N. pseudobrasiliensis (5)

+

+

+

+

+

-

+

N. otitidiscaviarum ( 8 )

+

+

-(7 5 )

+

+

-

+ (50)

N. transvalensis

+

+

+

+

-

+

+ (90 y

aPruebas de asimilación incubadas durante 4 a 7 días a 35 °C. Los números entre paréntesis indican el porcentaje de cepas con la reacción indicada, d, pueden observarse reacciones débiles; c, resultado basado sobre las cepas clínicas comunicadas. Adaptado de la referencia43.

TREHALC

Cuadro 1 5-9

Pruebas complementarias necesarias para resolver los patrones de utilización de hidratos de carbono por las especies de N ocardia utilizando API 20C AUX"

ESPECIE 1

PATRÓN DE SENSIBILIDAD'

ESPECIE 2

GELATINA (7 DÍAS)

+ (89)

ACETAMIDA (3 DÍAS)

OPACIFICACIÓN DE7H11

-

-

N. a stero id es tipo VI

SSSR

-

N. fa r c in ic a

RRSS o RRSR

-

+

+

RRSS o RRSR

-

+

+

-

-

N. fa r c in ic a N. a stero id e s tipo IV

RRSR, SRSR, RRRR o SRRR

N. a stero id es tipo I

SSSR o SRSR

-

N. a stero id es tipo VI

SSSR

-

N. o titid isc a v ia ru m N. b ra silien sis N. p s eu d o b ra silie n sis

COLONIAS AMARILLAS EN AGAR DE MUELLER-HINTON

-

-

+ (83)

+

+

+

“Se puede utilizar una o más de las características diferenciadoras. Los números entre paréntesis indican el porcentaje de cepas con la reacción indicada. bPruebas de difusión en disco (Kirbv-Bauer) realizadas a 35 °C; los antibióticos en orden son gentamicina. tobramicina, amikacina y eritromicina. Adaptado de la referencia41.

Diagnóstico de laboratorio de las infecciones causadas por actinomicetos aerobios

SSSS, SRSS o RRSS

N . n o va

ARILSULFATASA (7 DÍAS)

00

co

832 CAPÍTULO 15

Sensibilidad a los antibióticos in vitro de los actinomicetos aerobios (% de sensibles)

M IC R O O R G A N IS M O

SU LFA M E- E R IT R O T O X A Z O L M IC IN A

M IN O C IC LIN A

D O X IC I- C IP R O F L O - G EN TA C L IN A XACINA M IC IN A

KANAM IC IN A

A M IK A CINA

A M O X IC IA M P IC I- L IN A -C L A - CE FO TA - C E F T R IA ­ LIN A V U LA NATO X IM A X ON A

IM IP E NEM

C om plejo Nocardia asteroides (todos los tipos)

91-100“

22-35“

94-100“

ND

29-50“

67*

55b

95b

18-40“

41-58"

79-82"

79-82"

71-100“

Nocardia asteroides sensu stricto

96-99“

23-93“

78-94“

48-88“

38-98"

ND

ND

1 0 0

a

40-93“

53-67"

94-100“

94-100"

77-98"

Nocardia farcinica

89-100“

0-3“

20-96“

0-14"

ad

0-5“

47-71“

0-7“

0-73“

Nocardia nova

89-97“

"

89-100“

19-94“

3-6“

87-100“

N. transvalensis

90“

50“

54“

30“

50“

50“

90“

N. otitidiscaviarum

V"

ND

R"

ND

R“

Rhodococcus equi

ND

'

ND

ND

Actinomadura madurae

W

Streptomyces anulatus (griseus)

5 7

tipo VI

bTomado de la referencia101. ' Tomado de la referencia58. d Tomado de la referencia61. ■Tomado de la referencia™. V, variable; S, sensible; R. resistente.

-8 8 “

0

"*

V

1 0 0

"

ND

ND

36"

60"

ND

ND

28a

10

S“

ND

R“

ND

ND

5a

ND

R"

9T

ND

ND

CN OO

" Tomado de la referencia85.

i

6 8

ND

ND

32"

1 0 0

93d

90*

93d

91d

ND

ND

ND

3 7

i

81d

90“'

1 0 0

rf

90^

81rf

ND

ND

ND

2 0

'

51d

48^

80d

1 0 0

8 6

0

1 0 0

"

1 0 0

a

“

1 0 0

“

“

1 0 0

''

64-87“ 1 0 0

1 0 0

“

"

IOO'' 81^

Actinomicetos aerobios

Cuadro 1 5-10

R e fe re n c ia s

Identificación de los actinomicetos termófilos

Los actinomicetos termófilos pocas veces se encuentran en el laboratorio clínico porque son microorganismos ambientales que causan enfermedad en los seres humanos por una reacción alérgica, más que una infección productiva.68 Su capacidad para crecer a temperaturas elevadas proporciona un medio útil por el cual se evalúa su presencia en las muestras ambientales, si se desea. Se han sugerido protocolos para la identificación de estas bacterias.39-44 Identificación de Tropheryma whipplei

Este actinomiceto puede ser cultivado, pero sólo con dificul­ tad.75 En la mayoría de los casos el diagnóstico se hará con cri­ terios clínicos e histológicos. Se ha registrado la identificación inmunohistoquímica del microorganismo en el tejido secciona­ do.1í2-75 Como alternativa, se lo puede reconocer por las técni­ cas de amplificación de ácidos nucleicos.73 Aunque la experien­ cia es limitada, se ha sugerido que la amplificación molecular puede ser más útil que la histología para el control de la evolu­ ción de los pacientes con enfermedad de W hipple.73 Es impor­ tante reconocer que el DNA de T. whipplei puede ser detectado en ausencia de enfermedad clínica manifiesta.22,91 La importan­ cia de estos resultados es poco clara, pero el diagnóstico de la enfermedad de Whipple no debe basarse sólo en la detección molecular del DNA bacteriano. Sensibilidad in vitro de Nocardia y bacterias relacionadas a los antibióticos y tratamiento de las infecciones

Los patrones de sensibilidad a los antibióticos de los actino­ micetos aerobios son útiles para los taxonomistas, los micro­ biólogos clínicos (como indicio de la identificación de un ais­ lamiento) y los médicos, para el tratamiento de los pacientes infectados. En el cuadro 15-10 se resume el patrón de sensibi­ lidad. La estandarización de las pruebas de sensibilidad para uso clínico es un fenómeno reciente.66 Es prudente que los laboratorios que realizan estas pruebas con poca frecuencia envíen los aislamientos a un laboratorio de referencia con expe­ riencia suficiente en actinomicetos aerobios. Parte de la resistencia de las especies de Nocardia puede estar mediada por P-lactamasas. Las que han sido caracteriza­ das son principalmente penicilinasas con mucha menos activi­ dad contra las cefalosporinas. Las enzimas halladas en N. farcinica son bastante homogéneas y distintas de las encontradas en otras especies.89 Por el contrario, existe una diversidad con­ siderable en las enzimas de N. brasiliensis, aunque el perfil de sustratos es uniforme.99 Las P-lactamasas son inhibidas por ácido clavulánico, lo que sugiere que podrían ser útiles las combinaciones de penicilinas e inhibidores de las p-lactamasas (algunos de los cuales pueden ser administrados por vía oral).99 En un estudio (realizado antes de la delineación de los compo­ nentes del grupo de N. asteroides) casi todas las cepas conte­ nían P-lactamasas.102 La mejor correlación entre la presencia de una p-lactamasa y la resistencia a las penicilinasas in vitro fue la presencia de enzima extracelular además de la P-lactamasa asociada con la célula o críptica. No está clara la inactivación enzimática de las penicilinas. Los fármacos de elección para el tratamiento de la nocardio­ sis, aun en los pacientes inmunosuprimidos, siguen siendo las sulfamidas (p. ej., sulfadiazina, sulfisoxazol y combinaciones de tres sulfamidas). La mayoría de los médicos prefieren la combinación de trimetoprim y sulfametoxazol,85 pero sigue

833

abierta la cuestión de si la combinación es más eficaz que una sulfamida sola.85,100 Pueden ser necesarios algunos estudios in vitro para ayudar en la selección de los antibióticos para los pacientes que son hipersensibles a las sulfamidas o que están infectados por N. otitidiscaviarum, lo que demuestra una sen­ sibilidad inconstante a las sulfamidas. El imipenem, la minociclina y la amikacina son posibles elecciones, sobre la base de algunos estudios in vitro y ensayos clínicos limitados. Como alternativa, puede considerarse la desensibilización a las sulfa­ midas.85 Para los micetomas, está indicada una combinación de los enfoques quirúrgico y farmacológico. El tiempo de tratamiento recomendado para la enfermedad de Whipple es prolongado (por lo menos un año) con trimetoprim-sulfametoxazol.57 El tratamiento con tetraciclina, antes de uso frecuente, se asocia con una frecuencia muy alta de recaí­ das. En especial en los pacientes con enfermedad grave, se administra una serie inicial de tratamiento parenteral con cef­ triaxona o una combinación de penicilina y estreptomicina antes de iniciar el tratamiento oral prolongado con trimeto­ prim-sulfametoxazol.57 Rhodococcus equi es sensible a la vancomicina, la cual se considera el tratamiento de elección, y la mayoría de las cepas son sensibles a eritromicina, aminoglucósidos, rifampicina y cloranfenicol.85 Sin embargo, la experiencia con el tratamiento es muy limitada. Aun existe menos información para otros acti­ nomicetos aerobios.

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C A P ÍT U L O 15

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Bacterias anaerobias

Formas de interacción de las bacterias y el oxígeno Tolerancia al oxígeno Potencial de oxidorreducción

Hábitats Clasificación taxonómica y nomenclatura Infecciones humanas Aislamiento de bacterias anaerobias Selección de las muestras para cultivo Recolección y transporte de las muestras Hemocultivos anaerobios (resumen de las pautas para el caldo tradicional y los sistemas instrumentados) Examen directo de los materiales clínicos Selección y uso de los medios

Sistemas anaerobios para el cultivo de bacterias anaerobias Técnicas de jarras anaerobias Uso de la cámara de anaerobiosis Sistema de capa extendida por rodamiento ( roll-streafy Bolsas plásticas anaerobias Uso de la jarra contenedora anaerobia

Incubación de los cultivos

Inspección de los subcultivos de colonias Pruebas de aerotolerancia Informes preliminares de los resultados Determinación de las características bioquímicas y de cultivo para la diferenciación de aislamientos anaerobios Identificación presuntiva Usos de medios de agar diferenciales Placas Presumpto Placas de sensibilidad a los antibióticos

Caracterización de anaerobios usando pruebas bioquímicas convencionales en tubos grandes Procedimientos alternativos La prueba de Nagler y la prueba de CAMP para C. perfringens

Microsistemas comerciales Equipos comerciales para la identificación de anaerobios después de 4 horas de incubación aerobia

Determinación de productos metabólicos por cromatografía de gas-líquido Identificación de ácidos grasos volátiles Análisis de ácidos no volátiles

F o rm a s de in te ra cc ió n de las b a c te ria s y el o x íg e n o

Controles de la cromatografía de gas-líquido

Identificación de bacterias anaerobias Bacilos gramnegativos anaerobios no tom adores de esporas

Especies de Eubacterium

Mobiiuncus y vaginosis bacteriana Otros géneros y especies de bacilos grampositivos anaerobios no formadores de esporas

Identificación de especies de Clostridium

Clasificación y nomenclatura

Clostridios histotóxicos implicados en mionecrosis clostridiana o gangrena gaseosa

Identificación preliminar o presuntiva del Grupo de Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas y Fusobacterium

Otros clostridios en diversos cuadros clínicos

Identificación de cocos anaerobios Identificación de bacilos grampositivos anaerobios no formadores de esporas Especies de Propionibacterium Especies de Bifidobacterium Especies de Lactobacillus Especies de Actinomyces

Formas de interacción de las bacterias y el oxígeno Aunque definidas de varias formas por distintos autores, una definición práctica de trabajo es que las bacterias anaerobias obligadas son aquellas que crecen en ausencia de oxígeno libre pero que no se multiplican en presencia de oxígeno en la super­ ficie de los medios sólidos nutricionalmente adecuados incuba­ dos en la atmósfera ambiente o en una estufa de incubación con C 0 2 (que contiene 5-10% de C 0 2 en aire). La cantidad de 0 2 en una estufa con CO, o en una jarra de anaerobiosis por extin­ ción con vela, es considerable (alrededor del 18-19%). En la práctica, las bacterias anaerobias se reconocen en los laborato­ rios clínicos siguiendo las pruebas de aerotolerancia de las colonias que se desarrollan en las placas de aislamiento primano incubadas en anaerobiosis (véase más adelante). Así, la mayoría de los anaerobios identificados en el laboratorio clí­ nico crecen en principio en agar sangre en anaerobiosis en alguno de los medios selectivos anaerobios o en un caldo enri­ quecido incubado en anaerobiosis, pero no en placas de agar 'jn g re o agar chocolate incubadas en aerobiosis o en una estu­ fa de C 0 2. Referirse a los anaerobios como si correspondieran de mane­ ra uniforme a un gran grupo es una simplificación excesiva. También lo es (y no es correcto) referirse a todas las bacterias que se desarrollan en el ambiente como aerobias. Así, se han usado varios términos, como aerobios obligados, anaerobios facultativos, microaerófilos, anaerobios aerotolerantes y anae­ robios obligados (estrictos y moderados) para subdividir las bacterias sobre la base de su vinculación con el oxígeno. Estos términos reflejan un espectro continuo de bacterias que se extiende desde las que no pueden tolerar el oxígeno hasta aque­ llas que lo necesitan para crecer. Los microorganismos aerobios obligados, incluidas las espe­ cies de Micrococcus y Pseudomonas, requieren oxígeno mole­ cular como un aceptor final de electrones, que derivan en la

837

Clostridium difficile asociado con enfermedad intestinal Botulismo Tétanos

Pruebas de sensibilidad de las bacterias anaerobias a los antibióticos Métodos de evaluación de la sensibilidad de los anaerobios a los antibióticos

formación de agua y no obtienen energía por vías fermentati­ vas. Sin embargo, no es infrecuente encontrar P. aeruginosa con desarrollo escaso en medios incubados en anaerobiosis en el laboratorio clínico, porque estas bacterias pueden usar nitra­ to del medio como aceptor final de electrones (mediante la res­ piración anaerobia) en lugar del O,. Por el contrario, el oxíge­ no molecular tiene un efecto tóxico variable en diferentes especies de bacterias anaerobias y no es un aceptor final de electrones en las bacterias anaerobias. En general, los microor­ ganismos anaerobios clínicamente importantes obtienen su energía mediante vías fermentativas, en las cuales los com­ puestos orgánicos, como los ácidos orgánicos, los alcoholes y otros productos sirven como aceptores finales de electrones. Por otro lado, los anaerobios se dividen en dos grupos prin­ cipales: los anaerobios obligados (definidos con anterioridad) y los anaerobios aerotolerantes. Los anaerobios obligados ade­ más han sido subdivididos en dos grupos sobre la base de su capacidad para desarrollarse en presencia de oxígeno o de to­ lerarlo. Los anaerobios obligados estrictos no crecen en la superficie del agar ante niveles de 0 2 que exceden el 0,5%. El oxígeno atmosférico es altamente tóxico para estos microorga­ nismos por razones que no se conocen por completo. Ejemplos de estas bacterias son Clostridium haemolyticum, C. novyi tipo B, Selenomonas ruminatium y Treponema denticola. El segun­ do grupo de anaerobios obligados, los anaerobios obligados moderados, son bacterias que pueden desarrollarse cuando se exponen a niveles de oxígeno que oscilan desde casi 2% hasta 8% (promedio, 3%). Ejemplos de estas bacterias son los miem­ bros de Bacteroides fragilis y de los grupos Prevotella-Porphy­ romonas pigmentados (antes llamados grupo Bacteroides pig­ mentados), Fusibacterium nucleatum y C. perfringens.151 El término anaerobio aerotolerante es usado por varios microbiólogos para describir las bacterias anaerobias que muestran limitado o escaso desarrollo en agar en aire ambien­ te o en una estufa con 5-10% de C 0 2, pero que tienen buen desarrollo en condiciones anaerobias. Ejemplos de estas bacte-

838

C A P ÍT U L O 16

Bacterias anaerobias

rías son Clostridium carnis, C. histolyticum y C. tertium. La mayoría de los aislamientos anaerobios de muestras seleccio­ nadas y recolectadas en forma adecuada en el laboratorio clíni­ co corresponden a la categoría de anaerobios obligados mode­ rados. Estos microorganismos son más tolerantes a los efectos tóxicos del oxígeno que los anaerobios obligados estrictos; sin embargo, el oxígeno los mata a pesar de que las condiciones anaerobias se mantengan de modo apropiado durante la reco­ lección y el transporte de la muestra hacia el laboratorio y durante los pasos requeridos para el procesamiento de muestras y el aislamiento e identificación, como se verá en las secciones posteriores del capítulo. Si bien los anaerobios obligados estrictos son raros en las infecciones humanas, tanto los anae­ robios obligados moderados como los anaerobios estrictos se encuentran en diversos hábitats no patógenos (p. ej., heces y orofaringe), como parte de la flora normal. Los anaerobios facultativos (p. ej., Escherichia coli y Staphylococcus aureus) se desarrollan en condiciones aerobias o anaerobias. Usan oxígeno como aceptor final de electrones o, con menos eficacia, pueden obtener su energía a través de reac­ ciones de fermentación en condiciones anaerobias. Desa­ rrollados en aerobiosis, los anaerobios facultativos obtienen mucha más energía (38 ATP) cuando catabolizan por comple­ to una molécula de glucosa a C 0 2 y H20 , que cuando se desa­ rrollan en anaerobiosis. En condiciones anaerobias, el meta­ bolismo fermentativo de la molécula de glucosa produce sólo 2-3 ATP.163 Los microorganismos microaerófilos requieren oxígeno como aceptor final de electrones, pero estas bacterias no crecen en la superficie de los medios sólidos en una estufa de incuba­ ción aerobia (21% de O,) y casi nada en condiciones anaero­ bias. Un ejemplo de un microaerófilo es Campylobacter jejuni, que se desarrolla en forma óptima en 5% de 0 2 (la mezcla ga­ seosa del medioambiente de incubación más usada para aislar este microorganismo en el laboratorio clínico es 5% de 0 2, 10% de C 0 2 y 85% de N,). A través de los años, los bacteriólogos que trabajan en la creación de medios mejorados y sistemas de cultivo de anaero­ bios se han centrado en dos factores limitantes fundamentales que pueden afectar el crecimiento de los anaerobios. El prime­ ro y más importante es el efecto inhibitorio del oxígeno atmos­ férico y de sus derivados tóxicos. El segundo es el potencial de oxidorreducción (Eh) del medio de cultivo. Tolerancia al oxígeno

Algunos de los anaerobios obligados más estrictos (p. ej., Clostridium haemolyticum y C. novyi tipo B) se mueren cuan­ do se exponen al oxígeno atmosférico en la mesada de labora­ torio durante 10 minutos o más. Por otro lado, la mayoría de los anaerobios obligados moderados encontrados en infecciones humanas toleran la exposición al oxígeno por períodos más prolongados. Las razones por las que los anaerobios varían en su tolerancia al oxígeno son múltiples, pero una idea es que la tolerancia al oxígeno de muchos anaerobios obligados mode­ rados depende de su producción de superóxido dismutasa, catalasas y, posiblemente, enzimas peroxidasas, que son pro­ tectoras contra los productos tóxicos de la reducción del oxí­ geno 23,87,101,163,235 Una opinión popular es que la exposición al 0 2 atmosférico provoca diversas reacciones dentro de las células bacterianas, posibles reacciones mediadas por flavoproteínas, que derivan en la producción del radical superóxido (O,-) con carga negati­ va, el peróxido de hidrógeno (H20 2) y otros productos tóxicos

de la reducción del oxígeno.23 172 El anión superóxido y el H20 2 pueden reaccionar juntos para producir radicales hidroxilo libres (O H), los oxidantes biológicos más poderosos conoci­ dos, y también puede ser la producción de oxígeno singulete tóxico C 0 2) mediante la reacción de los aniones superóxido con los radicales hidroxilo libres. La superóxido dismutasa cataliza la conversión de los radicales superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno molecular menos tóxicos. La catalasa cataliza la conversión de peróxido de hidrógeno para formar agua y oxígeno. Se demostró que varias especies de anaerobios obligados moderados tolerantes al oxígeno producen superóxi­ do dismutasa (SOD) y el nivel de SOD producido se relaciona con el nivel de tolerancia al oxígeno y la virulencia del micro­ organism o.235 En otro estudio, varias cepas del género Bacteroides, varios cocos anaerobios, bacilos grampositivos anaerobios no formadores de esporas y clostridios producían SOD, pero no se encontró relación con el origen del microor­ ganismo, el presunto nivel de patogenicidad y el nivel de SOD producido.87 Varias especies de anaerobios producen catalasa (p. ej., miembros del grupo Bacteroides fragilis, Propionibacterium acnés y otros), así como SOD, pero algunos anaerobios que son relativamente tolerantes al oxígeno o aerotolerantes (p. ej., Clostridium tertium) no producen SOD ni catalasa. Rolfe y cois, observaron que el grado de tolerancia al oxígeno en las bacterias anaerobias se relaciona con la proporción de células bacterianas en la población que sobrevive después de la expo­ sición al oxígeno.200 En la práctica, a menudo es esencial usar grandes inóculos cuando se inoculan o subcultivan medios de cultivo anaerobios, lo que probablemente sirva para reducir los efectos dañinos de los múltiples factores tóxicos del oxígeno limitantes del desarrollo. Queda claro que se necesita trabajar mucho más sobre los mecanismos de tolerancia e intolerancia al oxígeno de las bacterias anaerobias. Potencial de oxidorreducción

El potencial de oxidorreducción (abreviado potencial “redox” o Eh) de un medio de cultivo, expresado en voltios o milivoltios, puede ser medido mediante un electrodo de plati­ no, junto con un electrodo de referencia conectado a un pHímetro. El Eh está afectado por el pH (o concentración de iones hidrógeno); así, el potencial redox se expresa común­ mente a pH neutro (pH 7) como Eh. Los agentes reductores, como tioglicolato y L-cisteína se pueden agregar al medio de transporte anaerobio y a ciertos medios de cultivo para ayudar a mantener condiciones reductoras (o de bajo Eh) en el medio. Un potencial de oxidorreducción positivo (p. ej., como el que se reconoce en algunos medios por el color rosado del indica­ dor resazurina o en otros medios por el color azul del indicador azul de metileno) significa que el medio está oxidado. En la naturaleza, el límite superior de Eh es +820 mV, que puede encontrarse en algunos ambientes que tienen una oxigenación considerable. Las condiciones oxidantes prevalecen en el teji­ do humano sano que está bien oxigenado y tiene un suministro de sangre continuo (p. ej., el Eh es casi + 150 mV). Por el con­ trario, el límite inferior de Eh en la naturaleza es cerca de - 420 mV. Un medioambiente anaerobio (p. ej., un absceso, un tejido necròtico) o un medio de cultivo rico en hidrógeno puede tener un Eh bajo. El intestino grueso humano, que contiene gran número de anaerobios obligados estrictos, tiene un Eh de alre­ dedor de -2 5 0 mV.163 ¿Cuál es la importancia relativa del potencial de oxidorreducción frente al oxígeno atmosférico en relación con la supervivencia y el desarrollo de las bacterias anaerobias? Como lo advirtieron hace varios años Hentges y

C la s ific a c ió n ta x o n ó m ic a y n o m e n c la tu ra

Maier.,01existen antiguos informes que indican que ciertos ana­ erobios no podrían proliferar por encima de un cierto nivel de Eh bajo y que algunos anaerobios obligados podían desarro­ llarse en el aire ambiente si el Eh del medio se mantenía sufi­ cientemente bajo. En un estudio excelente realizado por Walden y Hentges,248 fueron disipados algunos conceptos erró­ neos acerca de los efectos del Eh en las bacterias anaerobias. Estos investigadores estudiaron los efectos diferenciales del O, y el potencial de oxidorreducción en el desarrollo de C. perfringens, B. fragilis y P. magnus. El oxígeno inhibía la multi­ plicación de estos tres anaerobios si el medio estaba en un potencial de oxidorreducción negativo (Eh = -5 0 mV), equili­ brado por el agregado de ditiotreitol ([DTT] un agente reduc­ tor), o en un potencial de oxidorreducción positivo (Eh cerca­ no a +500 mV) en un medio aireado sin DTT. En ausencia de oxígeno, estos microorganismos eran capaces de m ultiplicar­ se incluso cuando el Eh se m antenía a +325 mV, por el agre­ gado de ferricianuro de potasio (un agente oxidante). De su trabajo se extrajo una conclusión práctica: que la eliminación total del oxígeno en el ambiente en el que se halla el cultivo, para evitar la toxicidad del oxígeno, es más im portante que el establecimiento de un Eh bajo.248 Así, la obtención rápida y el m antenim iento de una tensión de oxígeno baja, o la ausencia de oxígeno, son requisitos esenciales para el cultivo exitoso de anaerobios en los sistemas modernos para anaerobios (p. ej., jarras y cámaras de anaerobiosis usadas para la incubación de anaerobios en el laboratorio clínico).

Hábitats Las bacterias anaerobias están diseminadas en el suelo, los pantanos, los sedimentos de lagos y ríos, los océanos, las aguas cloacales, los alimentos y los animales. En los seres humanos, son prevalentes en la cavidad bucal alrededor de los dientes, en el aparato digestivo, en especial en el colon, donde exceden en número a los coliformes por al menos 1 000:1; en los orificios del aparato genitourinario y en la piel.69 100 La mayoría de estos hábitats anaerobios tienen baja tensión de oxígeno y reducido potencial de oxidorreducción resultantes de la actividad metabólica de los microorganismos que consumen oxígeno a través de la respiración.163 Si el oxígeno no es reemplazado, las con­ diciones anaerobias se mantienen en el ambiente. En el recuadro 16-1 se ofrece un resumen de los microorga­ nismos anaerobios encontrados en la flora normal del cuerpo humano.

Clasificación taxonómica y nomenclatura Entre los microorganismos anaerobios se incluyen todas las variedades morfológicas de bacterias; bacilos gramnegativos, curvados, en forma de espiral, y formas espiroquetas, cocos grampositivos y gramnegativos, bacilos grampositivos no for­ madores de esporas y formadores de esporas.8 Sobre la base de sus características morfológicas observadas en las preparacio­ nes teñidas con Gram y la presencia o ausencia de esporas, las bacterias anaerobias se clasifican de manera general como se muestra en el cuadro 16-1. Varios de los géneros en esta lista se han encontrado sólo en hábitats no patógenos (p. ej., sitios en los que reside la flora normal humana o de muchos anima­ les, como la cavidad bucal, el intestino grueso, el aparato geni-

Recuadro 16-1

839

A naerobios e n co n trad o s en la flora hum ana norm al

Cavidad bucal y vías respiratorias altas Especies de Prevotella pigm entadas; especies de Porphyromonas Especies de Prevotella no pigm entadas (p. ej., P. oralis) Especies de Bacteroides (p. ej.. B. ureolyticus) Especies de Fusobacterium (p. ej., F. nucleatumi) Cocos anaerobios Especies de Veillonella Especies de Actinomyces y especies de Propionibacterium

Estómago (durante el ayuno) L actobacilos

Intestino delgado (porción proximal) Estreptococos Lactobacilos

Intestino grueso (e íleon terminal) Grupo Bacteroides fragilis Especies de Porphyromonas Especies de Fusobacterium M uchas especies de cocos anaerobios Especies de Clostridium Especies de Eubacteriwn Especies de Bifidobacterium Especies de Propionibacterium

Aparato genitourinario; vagina y cuello uterino Especies de Prevotella pigm entadas; especies de Porphyromonas Prevotella no pigmentada Especies de Bacteroides Cocos anaerobios Especies de Clostridium Especies de Veillonella Especies de Lactobacillus Especies de Eubacteriwn Especies de Propionibacterium

Uretra (masculina y femenina) Especies de Propionibacterium Cocos anaerobios Especies de Bacteroides (Prevotella ) Especies de Fusobacterium

Piel Especies de Propionibacterium Cocos anaerobios

tourinario y la piel) y no se ha informado que produzcan enfer­ medades en los seres humanos. La mayoría de estos géneros no se tratarán más adelante. Han ocurrido muchos cambios recientes en la clasificación taxonómica y la nomenclatura de anaerobios desde que se publicó la quinta edición de este libro. Estudios genéticos que

840

C A P ÍT U L O 16

Cuadro 16-1

Bacterias anaerobias

Clasificación de los géneros de las b acte rias an aero b ias

Bacilos gramnegativos (se incluyen las formas curvas, espiraladas

Megamonas

Gemmiger

Cryptobacterium

Mitsuokella

Micromonasa

Collinsella

Pectinatus

Peptococcus

Eggerthellaa

y espiroquetas)

Porphyromonasa

Pepto streptococcus0

Eubacterium0

Alistipes

Prevotellaa

Ruminococcus

Holdemania

Anaerobacter

Propionigenium

Sarcina

Lachnospira

Anaerobio spirillum

Propionispira

Peptoniphilusa

Lactobacillusa

Anaerorhabdus

Rikenella

Staphylococcusa

Methanobacterium

Bacteroidesa

Ruminobacter

Streptococcusa

MobiluncusM

Bilophilaa

Sebaldella

Gemellaa

Mogibacterium

Borrelia

Selenomonas

Butyrivibrioc

Serpula

Cocos gramnegativos

Roseburia

Capnocytophaga

Spirochaeta

Acidaminococcus

Shuttleworthia

Capsularis

Succinimonas

Anaeroglobus

Slackiaa

Campylobactera

Succinivibrio

Anaerosphaera

Varibaculum

Catonellaa

Sutterellaa

Megasphaera Veillonellaa

Propionibacteriuma

Centipeda

Tannerella“

Cetobacterium

Tissierella

Desulfuromonas

Treponema

Desulfovibrio

Wolinella

Bacilos grampositivos no formadores de esporas

Desulfotomaculum

Actinobaculum

Desulfosporosinus

Dichelobacter

Cocos grampositivos

Actinomycesa

Caloramatorb

Faecalibacterium

Anaerococcusa

Aracnobacterium“

Filifactor1’

Fibrobacter

Atopobiuma

Atopobiuma

Moorellab

Fusobacteriuma

Coprococcus

Bifidobacteriuma

Oxobacter0

Johnsonellaa

Finegoldiaa

Bulleidia

Oxolophagusb

Leptotrichia

Gallicola

Catenibacterium

Dialister0

Bacilos grampositivos formadores de esporas Clostridiumab

a En la mayoría de las m uestra^ clínicas, sólo esos géneros necesitarán ser considerados por el microbiólogo clínico. Sin embargo, en raras ocasiones enfermedades graves pueden involucrar a Anaerobiospirillum,191 Leptotrichia,144 Selenomonas,256 Desulfovibrio*5 y algún otro género que no está listado arriba. h El género Clostridium está bajo revisión taxonómica. Así, en 1994 fueron propuestos por Collins y cois, cinco nuevos géneros de anaerobios formado res de esporas.44 Con una sola excepción, ninguno de ellos se conoce que sea patógeno para los seres humanos. Filifactor alocis ha sido aislado en pacientes con infecciones endodónticas.2'8 ! Butyrivibrio se trata con los bacilos gramnegativos en el Vol. 1 y con los bacilos anaerobios grampositivos no formadores de esporas irregulares en el Vol. 2 del Manual de Bergey.141223 Aunque son gramnegativos con la tinción de Gram, algunas cepas tienen rasgos de la pared celular grampositiva atípicos mediante microscopía electrónica. Adaptado y modificado del Manual de Bacteriología Sistemática de Bergey141-223 y de varios volúmenes recientes del Internacional Journal o f Systematic and Evolutionary Microbiology que contiene numerosas publicaciones relacionadas con cambios recientes en la taxonomía anaerobia.

utilizan PCR y secuenciación de RNA 16S ribosómico, 16S rDNA, PCR de región espaciadora de 16S-23S rRNA y otros métodos moleculares han colocado la clasificación de anaero­ bios en un terreno mucho más sólido científicamente que el que fue posible usando la caracterización fenotípica y los métodos genéticos más antiguos y menos sofisticados disponibles en el pasado.226,227 Estos estudios han brindado descripciones de muchas especies nuevas y otras taxas. Por fortuna, algunas actualizaciones taxonómicas excelentes han simplificado la tarea de mantener los cambios constantes de la nomenclatu­ ra .67,71.121-123 g n ei cuacjro ]6-2 se provee un compendio de cam­ bios, compilados en las dos décadas pasadas, en las designa­ ciones taxonómicas de las bacterias anaerobias clínicamente significativas. En el cuadro 16-3 se enumeran los anaerobios más im portantes clínicam ente y/o los anaerobios encontra­ dos más a menudo en muestras hum anas seleccionadas y re­ colectadas en forma apropiada. Hasta ahora, las identificacio­ nes de especie correctas pueden tener importantes implicancias respecto del pronóstico, el tratamiento y los resultados clínicos

de los pacientes con enfermedades infecciosas causadas por anaerobios.15-69

Infecciones humanas Las bacterias anaerobias han sido encontradas en infeccio­ nes que comprometen todos los órganos y regiones anatómicas del cuerpo.19-69 Algunos de los sitios afectados más a menudo se ilustran en la figura 16-1. Sobre la base de otros informes de la literatura, la incidencia relativa de anaerobios en infecciones se resume en el cuadro 16-4.19-69-70 Los abscesos asentados más profundos y las lesiones necrosantes que involucran anaerobios son polimicrobianos y pue­ den incluir aerobios obligados, anaerobios facultativos o microaerófilos como microorganismos acompañantes.69-70 Es­ tos microorganismos, actuando en forma conjunta con el trau­ ma, la estasis vascular o la necrosis tisular, reducen la tensión

In fe cc io n e s h u m a n a s

Cuadro 16-2

841

Nombres actuales y antiguos de las bacterias anaerobias

NOMBRE ACTUAL

NOMBRE ANTIGUO/COMENTARIOS

Bacilos gramnegativos anaerobios Género Bacteroides Bacteroides caccae B. distasonis

NOMBRE ACTUAL NOMBRE ANTIGUO/COMENTARIO P. disiens

Bacteroides disiens, infecciones genitourinarias

Grupo Bacteroides fragilis “3452 A” , flora fecal hum ana Infecciones hum anas infrecuentes relacionadas con Tannerelia forsythensis (antes

P. enoeca

Cavidad bucal hum ana; no pigm entada

P. heparinolytica

Bacteroides heparinolyticus

P. intermedia

Bacteroides intermedius, com ún en seres humanos;

B. forsythus) B. eggerthii

Flora fecal, no com ún en infecciones

B. fragilis

El anaerobio más com ún en infecciones humanas

B. merdae

“T4-1”, flora fecal hum ana, relacionado con T. forsythensis (antes B. forsythus)

cabeza y cuello, sitios pelvianos, abdom inales; pig­ mentado

P. loescheii

Bacteroides loescheii, seres humanos; pigm entado

P. melaninogenica

Bacteroides melaninogenicus, infecciones

P. nigrescens

Antes genotipo II de P. intermedia, seres humanos; pigm entado

P. oralis

Bacteroides oralis

La segunda especie de Bacteroides más com ún en infecciones humanas

P.oris

Bacteroides oris

P. oulorum

B. oulorum; Prevotella oulora

B. unifomiis

Aislamiento ocasional en infecciones humanas

P. pallens

Especie nueva

B. vulgatus

Com ún en flora fecal humana, aislamiento ocasional en infecciones

P. salivae

Especie nueva, saliva hum ana

P. shahii

Especie nueva, saliva hum ana

P. tannerae

Especie nueva, seres hum anos; -40% de cepas pig­ m entadas

P. uenoni

Fusobacterium uenonas (especie nueva; Finegold SM:

B. ovatus

Flora fecal humana, en ocasiones produce infecciones

B. stercoris

“Subespecie A ”, flora fecal hum ana

B. thetaiotaomicron

Otras especies que faltan en el género Bacteroides, pero no del Grupo Bacteroides fragilis B. capillosus

Raro en m uestras clínicas

B. coagulans

Raro en muestras clínicas

B. forsythus

Género nuevo, Tannereliaforsythensis, cavidad bucal humana

B.galacturonicus

Flora fecal hum ana

B. heparinolyticus

P. heparinolytica, pero se inhibe por bilis, flora fecal hum ana

B. pectinophilus

Flora fecal hum ana

B. splanchnicus

Se asem eja al grupo B. fragilis pero probable­ mente representa un género nuevo

B. tectus

B. tectum, gatos y perros

B. ureolyticus B. zoogleoformans

humanas en varios sitios; pigm entado

com unicación personal)

P. veroralis

Bacteroides veroralis

P. zoogleoformans

Bacteroides zoogleoformis

Género Porphyromonas P. asaccharolytica

Bacteroides asaccharolyticus, varias infecciones clíni­ cas hum anas; pigm entado

P. cangingivalis

Perros

P. canoris

Perros

P.cansulci

Perros

Bacteroides corrodens, relacionado con el género Campylobacter

P.catoniae

Oribaculum catoniae, cavidad bucal humana; la única no pigm entada Porphyromonas

P. zoogleoformans, relacionado con el grupo B. fragilis, se inhibe por bilis

P. circumdentaria

Gatos

P. crevioricanis

Perros

P. endodontalis

Bacteroides endodontalis, seres hum anos; pigm entado

P. gingivalis

Bacteroides gingivalis, infecciones del conducto radi­

Género Prevotella P. bivia

Bacteroides bivius, infecciones genitourinarias

P. buccae

Bacteroides buccae, infecciones de cabeza,

cular hum ano y otras infecciones bucales dentales; pigm entado

cuello, tórax

P. buccalis

Bacteroides buccalis

P. corporis

Bacteroides corporis, seres humanos; pigm entado

P. dentalis

Mistuokella dentalis y Hallela seregens

P. denticola

Bacteroides denticola, seres humanos; pigm entado

P. gingivicanis

Perros

P. gulae

Surcos gingivales, varios animales

P. levii

Bacteroides levii, ganado

P. macacae

Bacteroides macacae, monos; Porphyromonas salivo­ sa, gatos; Bacteroides salivosus, gatos

(Continúa)

842

C A P ÍT U L O 16

Cuadro 16-2

Bacterias anaerobias

N om bres actu ales y antig u o s de las b ac te ria s an aero b ia s (cont.)

NOMBRE ACTUAL

NOMBRE ANTIGUO/COMENTARIOS

Género Fusobacterium

NOMBRE ACTUAL

NOMBRE ANTIGUO/COMENTARIO

C. rectus

Wolinella recta

F. gonidiaformans

Infecciones humanas

C. showae

Cavidad bucal humana

F. mortiferum

Infecciones hum anas; se asem eja a F. varium y F. ulcerans

C. sputorum

F. naviforme

Infecciones humanas

F. necrogenes

Heces humanas, animales

F. necrophorum subesp. funduliforme

F. necrophorum biovariedad B. lipasa

F. necrophorum subesp. necrophorum

F. necrophorum biovariedad A-Lipasa

F. nucleatum, actualm ente

animalis

con las siguientes cinco subespecies:

negativa; m enos virulento que la subespecie necrophorum

positiva; la subespecie m ás virulenta

fusiforme nucleatum polymorphum

Género Capnocytophaga C. canimorsus

Grupo DF-2 de los CDC; infecciones hum anas después de m ordedura de perro

C. cynodegmi

Infecciones humanas después de m ordedu­ ra de perro

C. gingivalis C. granulosa

Placa dental

C. haemolytica

Placa dental

C. ochracea

Bacteroides ocharaceus

C. sputigena

vincentii F. periodonticum

Relacionado con F. nucleatum

F. rusii

Heces humanas

F. ulcerans

Especie nueva, úlceras cutáneas

F. varium

Varias infecciones humanas

Otras especies de Fusobacterium encontradas en animales F. equinum

Cavidad bucal de caballos

F. perfoetans

Heces de cerdos

F. russii

Flora bucal de caninos y felinos

F. simiae

B oca de macacos

Más géneros de bacilos gramnegativos Catonella morbi

Relacionado con el subfilo Clostridium de bacterias gram positvas, grupo XlVa

Centipeda periodontii

Relacionado con el subfilo Clostridium de bacterias gram positivas, grupo XlVa.

Cetobacterium somerae

Especies nuevas, heces humanas

Desulfovibrio piger

Desulfomonas pigra

Dialister pneumosintes

Bacteroides pneumosintes; relacionado con la ram a Sporomusa del subfilo Clostridium, grupo IX

Dichelobacter nodosus

Bacteroides nodosus, necrosis de patas de oveja y ganado vacuno

Faecalibacterium prausnitzii

Otros géneros de bacilo(s) gramnegativos anaerobios Alistipes finegoldii

Especie nueva, apendicitis hum ana

A. putredinis

Bacteroides putredinis, género nuevo; raro, infecciones intraabdom inales humanas

Fusobacterium prausnitzii, heces humanas; relacionado con el subfilo Clostridium, grupo IV

Fibrobacter intestinalis

Especies nuevas

F. succinogenes

Bacteroides succinogenes

Filifactor alocis

Fusobacterium alocis, gingivitis hum ana

Johnsonella ignava

Relacionado con el subfilo Clostridium de bacterias grampositivas. grupo XlVa

Anaerobiospirillum succiniciproducens

Baeteriem ia en seres humanos; heces hum anas, de gatos y de perros

Anerobiospirillum thomasii

Especie nueva; heces humanas, de gatos y de perros

Anaerostipes caccae

Especie nueva; heces humanas

Anaerorhabdus furcosa

Bacteroides furcosus; Anaerohabdus furcosus

L. amnionii

Especies nuevas, líquido amniótico; rela­ cionado con especies de Sneathia

Bilophila wadsworthia

Infecciones humanas

L. buccalis

“Leptothrix buccalis ”

L. goodfellowii

Especie nueva, sangre

L. hofstadii

Especie nueva, saliva

Género Campylobacter C. concisus

Género Leptotrichia

En el filo Fusobacterium

C. curvus

Wolinella curva

L. shahii

Especie nueva, gingivitis

C. gracilis

Bacteroides gracilis

L. trevisanii

Especie nueva, baeteriem ia

C. hominis

Especie nueva, tubo digestivo hum ano

L. wadeii

Especie nueva, saliva

In fe cc io n e s h u m a n a s

Cuadro 16-2

843

Nombres actuales y antiguos de las bacterias anaerobias (cont.)

NOMBRE ACTUAL Mitsuokella multiacida

NOMBRE ANTIGUO/COMENTARIOS

NOMBRE ACTUAL

Bacteroides multiacidus; relacionado con la ram a Sporomusa del subfilo Clostridium

Peptoniphilus asaccharolyticus

Peptostreptococcus asaccharolyticus,

P. harei

Peptostreptococcus harei, pus de úlcera

grupo IX

Oxalobacter formigenes

Colon humano, degrada oxalato de calcio

Rikenella microfusus

Bacteroides microfusus

Ruminobacter amylophilus

Bacteroides amylophilus

Sebaldella termitidis

Bacteroides termitidis

P. indolicus

5. flueggei

Flora bucal hum ana

S. infelix

Surco gingival hum ano

S. noxia

Surco gingival humano

Sneathia sanguinegens

Leptotrichia sanguinegens, bacteriem ia en seres humanos

P. lacrimalis

Tannerella forsythensis

Bacteroides forsythus

Tissierella praeacuta

Bacteroides praeacutus, relacionado con el subfilo Clostridium de bacterias grampositivas, grupo XII

Cocos anaerobios Cocos grampositivos Peptococcus niger

Sólo especie faltante en este género

Peptostreptococcus anaerobius

Sólo especie faltante en este género

Cocos anaerobios reclasificados Anaerococcus prevotii

Peptostreptococcus prevotii, secreciones

A. tetradius

Peptostreptococcus tetradius, secreciones

Otros cocos grampositivos anaerobios Atopobium minutum

Lactobacillus minutus, heridas abdom ina­

Atopobium parvulum

Streptococcus parvulus, abscesos dentales;

les humanas, abscesos pelvianos

flora del surco gingival

Atopobium rimae

Peptostreptococcus hydrogenalis, secreciones vaginales, abscesos ováricos

Peptostreptococcus vaginalis, secreciones vaginales, abscesos ováricos

A. lactolyticus

Peptostreptococcus lactolyticus, secreciones vaginales, abscesos ováricos

A. octavius

Peptostreptococcus octavius, cavidad nasal hum ana, piel, vagina

Finegoldia magna

Peptostreptococcus magnus, infecciones arti­ culares y óseas, de tejidos blandos hum a­ nos; flora vaginal y fecal

Gallicola barnesae

Peptostreptococcus barnesae, aislado en heces de pollos

Micromonas micros

Peptostreptococcus micros, m uestras hum a­ nas que incluyen boca; flora de la boca, heces y vagina

Lactobacillus rimae, abscesos dentales; flora del surco gingival

Atopobium vaginae

Especie nueva, flora vaginal hum ana

Coprococcus catus

Heces humanas

Coprococcus comes

Heces humanas

Coprococcus eutactus

Heces humanas

Gemella morbillorum

Streptococcus morbillorum

Ruminococcus hansenii

Streptococcus hansenii

Ruminococcus productus

Streptococcus productus

Sarcina ventriculi

Enferm edad estomacal y de colon en seres humanos

vaginales, abscesos peritoneales y ováricos

vaginales, abscesos ováricos

Peptostreptococcus lacrimalis, abscesos de glándulas lagrimales humanas

Campylobacter (Bacteroides) gracilis, en parte

A. vaginalis

Peptostreptococcus ivorii, úlceras en pier­ nas humanas

Surco gingival hum ano

A. hydrogenalis

Peptostreptococcus indolicus, ganado (mastitis); indol positivo, coagulasa posi­ tiva

P. ivorii

S. dianae

Sutterella wadsworthensis

secreciones vaginales, abscesos ováricos, peritoneales y otros; no produce ácido de hidratos de carbono

sacra hum ana

Género Selenomonas S. artemidis

NOMBRE ANTIGUO/COMENTARIO

Los cocos grampositivos no considerados anaerobios verdade­ ros pueden aparecer al principio como anaerobios en aisla­ mientos primarios, pero en subcultivos crecen en atmósfera con 10% de C 0 2 Staphylococcus saccharolyticus

Peptococcus saccharolyticus

Streptococcus anginosus

Grupo "5. milleri"

S. constellatus

Grupo “S. milleri”

S. intermedius

“S. MG-intemedius”, “S. MG"

Cocos gramnegativos Acidaminococcus fermentans

M uestras clínicas humanas; también heces humanas y de perros

Anaeroglobus geminatus

E specie nueva, boca humana, tubo digesti­ vo; materiales clínicos

Megasphaera elsdenii

Heces humanas y muestras clínicas; rumen de ganado vacuno y ovino, intestino de cerdos ( Continúa)

844

C A P ÍT U L O 16

Cuadro 16-2

Bacterias anaerobias

N om bres actu ales y antiguos de las b acte rias an aero b ias (cont.)

NOMBRE ACTUAL

NOMBRE ANTIGUO/COMENTARIOS

NOMBRE ACTUAL

NOMBRE ANTIGUO/COMENTARIO

Megasphaera micronuciformis

Especie nueva, muestras clínicas humanas

Megasphaera cerevisiae

Especie nueva, deteriora la cerveza

Arcanobacterium bemardiae

Actinomyces (grupo 2 corineform e de los CDC) bemardiae , orígenes humanos

Veillonella atypica

Flora hum ana o de m uestras clínicas durante procesos infecciosos

Arcanobacterium pyogenes

Actinomyces (Corynebacterium) pyogenes,

V. dispar

Flora hum ana o de muestras clínicas durante procesos infecciosos

V. parvula

Flora hum ana o de m uestras clínicas durante procesos infecciosos

B. denticolens

V. ratti

Semen humano

B. dentium

Bifidobacterium ericksonii

V. montpellierensis

Especie nueva, muestras clínicas humanas

B. gallicum

Heces humanas

Bacilos grampositivos anaerobios no formadores de esporas

B. inopinatum

No más Bifidobacterium, ahora Scardovia inopinata, heces humanas

Género Actinomyces

B. longum

Caries dentales humanas; ahora con tres biotipos: B. longum, B. infantis y B. suis

orígenes humanos

Género Bifidobacterium B. breve No más Bifidobacterium, ahora

Parascardovia denticolens

A. cardiffensis

Especie nueva, fuentes clínicas hum anas que incluyen abscesos de varios sitios

A. europaeus

Especie nueva, muestras clínicas humanas

A. funkei

Especie nueva, muestras clínicas humanas

A. georgiae

Surco gingival humano

A. gereneseriae

Flora periodontal humana

A. graevenitzii

Especie nueva, muestras clínicas humanas

A. hongkongensis

Especie nueva, m uestras clínicas hum anas

E. saphenum

Dentadura hum ana

A. israelii

Principal causa de actinom icosis hum ana

E. sulci

Fusobacterium sulci '

A. meyeri

Surcos periodontales hum anos, absceso de cerebro; infecciones de cabeza y cuello

E. yurii 9 ubesp. margaretiae

Placa dental humana

A. naeslundii

Causa de actinomicosis

E. yurii subesp. schtitka

Placa dental humana

A. nasicola

Especie nueva, nariz hum ana

E. yurii subesp. yurii

Placa dental humana

A. neuii subesp. neuii

Grupo 1 corineform e de los CDC; de fuentes humanas

A. neuii subesp. anitratus

“Similar” al grupo 1 corineforme de los CDC; de fuentes hum anas

A. odontolyticus

Cavidad bucal humana, causa rara de actino­ micosis

A. oricola

Especie nueva, abscesos dentales hum anos

A. radicidentis

Especie nueva, conductos radiculares de dien­ tes infectados

A. radingae

Especie nueva, m uestras clínicas humanas

A. turicensis

Especie nueva, m uestras clínicas humanas

A. urogenitalis

Especie nueva, aparato urogenital humano

A. viscosus

Cavidad bucal hum ana y origen cervicovaginal; en ocasiones actinomicosis

Otros géneros muy relacionados con Actinomyces Actinobaculum schaalii Actinobaculum urinale

Especie nueva, sangre hum ana; hábitat desconocido Especie nueva, orina humana

Género Eubacterium E. biforme

Flora fecal humana

E. brachy

Periodontitis hum ana

E. infirmum

Especie nueva bucal, asacarolítica

E. minutum

Eubacterium tardum, un sinónimo (no tiene prioridad)

Género Lactobacillus L. coleohominis

Especie nueva, m uestras clínicas hum anas

L. oris

Saliva hum ana

L. paraplantarum

Especie nueva, heces hum anas

L. rimae

Surcos gingivales humanos

L. uli

Surcos gingivales humanos

Otros recientes cambios en los bacilos grampositivos no formadores de esporas Anaerofustis stercorihominis

Género y especie nuevos, heces hum a­ nas: relacionada con el rRNA del grupo XV del subfilo Clostridium de bacterias grampositivas

Anaerotruncus colihominis

Género y especie nuevos, heces humanas: relacionada con el grupo leptum rRNA Clostridium de bacterias

Especies de

Género nuevo; bacterias cocoides; listadas en otro sitio con los cocos grampositivos anaerobios

Atopobium

In fe cc io n e s h u m a n a s

Cuadro 16-2

845

N om bres actuales y antiguos de las b acte rias an aero b ias (cont.) NOMBRE ANTIGUO/COMENTARIO

NOMBRE ANTIGUO/COMENTARIOS

NOMBRE ACTUAL

Bulleidia extructa

Género y especie nuevos, cavidad bucal hum ana

Bacilos grampositivos formadores de esporas

Catenibacterium mitsuokai

Género y especie nuevos, heces humanas

Collinsella aerofaciens

Género nuevo, Eubacterium aerofaciens, flora fecal hum ana

NOMBRE ACTUAL

Collinsella stercolis

Especie nueva, flora fecal humana

Collinsella intestinalis

Especie nueva, flora fecal humana

Cryptobacterium curtum

Género y especie nuevos, cavidad bucal humana

Dorea formicigenerans

Género nuevo, Eubacterium formicigenerans, heces humanas

Dorea longicatena

Especie nueva, heces humanas

Eggerthella lenta

Género nuevo, Eubacterium lentum, heces humanas

Holdemania filiformis

Género y especie nuevos, heces humanas

Mobiluncus curtisii

Propuesto para enm endar M. curtisii (para incluir aquellos antes llam ados Falcivibrio vaginalis', tam bién se incluyen las subespe­ cies de Mobiluncus curtisii)

Mogibacterium pumilum Mogibacterium vescum

Género y especie nuevos, cavidad bucal hum ana Género y especie nuevos, cavidad bucal hum ana

Clostridium: ser humano C. argentinense

C. botulinum tipo G y algunos C. hastiforme y C. subterminale no toxigénicos

C. baratii

C. baratii, C. paraperfringens, C. perenne

Clostridium bartlettii

Especie nueva, aislada en heces humanas

Clostridium bolteae

Especie nueva, aislada en heces humanas, en especial de niños con autismo

Clostridium botulinum

Conservación de Clostridium botulinum (toxigénico) y C. sporogenes (no toxigénico) que están genéticam ente relaciona­ dos con el nivel de especie; exclusión de C. putrificum (un sinónimo anterior)

C. butyricum

C. pseudotetanicum

Clostridium clostidioforme

Cepas humanas identificadas fenotípica­ m ente como C. clostridioforme se encon­ tró que eran C. bolteae, C. clostridiofor­ me o Clostridium hathewayi

Clostridium hathewayi

Especie nueva, aislada en heces humanas

Clostridium hiranonis

E specie nueva, aislada en heces humanas

Clostridium hylemonae

E specie nueva, aislada en heces humanas

C. methylpentosum

Flora fecal hum ana

C. orbiscindens

Flora fecal hum ana

Clostridium neonatale

Especie nueva, aislada en heces y sangre de lactantes con enterocolitis necrosante neonatal

C. orbiscindens

Flora fecal hum ana

C. perfringens

C. welchii

C. ramosum

Eubacterium filamentosum, Ramibacterium ramosum, Actinomyces ramosum, Eubacterium ramosus

Mogibacterium timidum

Género nuevo, Eubacterium timidum

Mogibacterium diversum

Especie nueva, cavidad bucal hum ana

Mogibacterium neglectum

E specie nueva, cavidad bucal hum ana

Olsenella profusa

E specie nueva, cavidad bucal hum ana

Propionibacterium propionicum

Arachnia propionica

Pseudoramibacter alactolyticus

Género nuevo, Eubacterium alactolyticum

Roseburia intestinalis

E specie nueva, heces humanas

Shuttleworthia satelles

Género y especie nuevos, cavidad bucal hum ana

Slackia exigua

Género nuevo, Eubacterium exiguum

Slackia heliontrinireducens

Peptostreptococcus heliontrinireducens

C. scindens

Especie nueva, flora fecal hum ana

Varibaculum cambriensis

Género y especie nuevos, bacterias similares a Actinomyces de muestras clínicas humanas

C. symbiosum

Fusobacterium symbiosum

C. tetanomorphorum

Nombre en revisión, infecciones humanas

Ésta no intenta ser una lista completa. No se han incluido numerosas especies sin relevancia clínica o en duda de tenerla, en especial de los géneros Bacteroides, Eubacterium, Lactobacillus y Clostridium. Basado en la información compilada de 1) referencias771122,125,177y 2) numerosas publicaciones en el International Journal o f Systematic and Evolutionary Microbiology, Volúmenes 47-54; 1997-2004.

de oxígeno y el potencial de oxidorreducción en los tejidos y proveen las condiciones favorables para la multiplicación de los anaerobios obligados. Las infecciones y enfermedades en las que intervienen anaerobios de fuentes exógenas son las mejor conocidas (recuadro 16-2).

Sin embargo, en las últimas décadas, las infecciones anaero­ bias endógenas se han vuelto mucho más comunes. Existen dos probables explicaciones. Una es que el aislamiento por parte del laboratorio de las bacterias anaerobias ha mejorado de modo que las infecciones endógenas no son más mal diagnos-

846

C A P ÍT U L O 16

Bacterias anaerobias

Cuadro 16-3

A naerobios clínicam ente m ás im p o rta n tes o en co n trad o s con m ás frecuencia en m u e stra s clínicas

Bacilos gramnegativos Grupo Bacteroides fragilis (en especial B. fragilis, B. thetaiotaomicron, B. vulgatus, B. distasonis y B. ovatus) Otros Bacteroides (B. ureolyticus)

Porphyromonas (en especial P. asaccharolytica, P. gingivalis y P. endodontalis) Prevotella pigmentada (P. melaninogenica, P. loescheii, P. denticola, P. tanne rae, P. intermedia, P. nigrescens y P. corporis) Prevotella no pigmentada (grupo P. oralis, P. oris/buccae, P. bivia, P. disiens) Fusobacterium (en especial F. nucleatum, F. necrophorum, F. mortiferum y F. varium) Bilophila wadsworthia

Cocos anaerobios Cocos gram positivos (en especial Peptostreptococcus anaerobius, Finegoldia magna, Micromonas micros, Peptoniphilus asaccharolyticus, Anaerococcus prevotii y los estreptococos m icroaerófilos, incluido Streptococcus intermedius) Cocos gram negativos (especies de Veillonella)

Bacilos grampositivos anaerobios no formadores de esporas Actinomyces (en especial A. israelii, A. meyeri, A. naeslundii, A. odontolyticus y A. viscosus) Propionibacterium (P. acnés y P. propionicum) Bifidobacterium dentium Eubacterium (E. limosum y Eggerhella lenta [Eubacterium lentum])

Bacilos grampositivos formadores de esporas Clostridium C. perfringens Grupo C. clostridioforme (en especial C. clostridioforme, C. hathewayi y C. bolteaé)

C. innocuum C. ramosum C. difficile C. bifermentans C. sporogenes C. septicum C. sordellii C. novyi C. histolyticum C. botulinum C. tetani

ticadas o pasan inadvertidas como antes. La otra es que una proporción mucho mayor de pacientes están recibiendo fárma­ cos inmunosupresores por neoplasias u otras afecciones, lo que deriva en la resistencia del huésped inmunodeprimido.9,69,70Las infecciones anaerobias primarias se establecen fácilmente en áreas de tejido dañado y la baeteriemia, diseminación metastásica de las bacterias con formación de abscesos distantes y una cadena progresiva de eventos, puede suceder algunas veces con un desenlace mortal. Las infecciones anerobias endógenas más comunes se enumeran en el recuadro 16-3. Es esencial aislar e identificar las bacterias anaerobias por­ que 1) estas infecciones están asociadas con elevada morbimortalidad y 2) el tratamiento de la infección varía con la especie bacteriana implicada. La terapia con antibióticos para ciertas infecciones con anaerobios es diferente de la usada para muchas infecciones causadas por bacterias aerobias o anaero­ bias facultativas.19,69 La indicación de intervención quirúrgica, que incluye el desbridamiento de tejido necrótico o la amputa­

ción de un miembro, puede ser de importancia extrema, en par­ ticular en los casos de gangrena gaseosa por clostridios o en abscesos loculados en los cuales los antibióticos pueden ser ineficaces hasta que se drene el exudado. Antes de mediados de la década de 1960, predominaban las infecciones clostridianas. Sin embargo, en los últimos años, 15% de todos los aislamientos anaerobios en tales muestras fueron especies de Clostridium . l 3 5 En la actualidad, más de tres cuartas partes de los anaerobios aislados en muestras clínicas seleccionadas en forma adecuada pertenecen al grupo de Bacteroides fragilis, Prevotella, Porphyromonas, Fusobacte­ rium, cocos anaerobios y bacilos grampositivos anaerobios no formadores de esporas (véase cuadro 16-3). Los bacilos gramnegativos anaerobios no formadores de esporas aislados en muestras clínicas que causan enfermedad con mayor frecuencia son Bacteroides fragilis y los grupos Prevotella-Porphyromonas pigmentados (antes Bacteroides pigmentados) y Fusobacterium nucleatum. B. fragilis, B. the-

In fe cc io n e s h u m a n a s

Absceso cerebral

847

-£ ? K m Sinusitis crónica

Infecciones periodontales ■

Absceso pulm onar - neum onía necrosante - empiem a

Baeteriemia, septicemia, endocarditis Absceso subdiafragmático, hepático y subhepático

Infecciones abdom inales - postraum áticas o posquirúrgicas - luego de ruptura de visceras - cáncer

■ r3B¿

• v - ,<

Absceso pelviano en mujeres, endom etritis, infecciones posaborto, abscesos tuboováricos Absceso perirrectal -

Celulitis necrosante

Infección vascular o gangrena gaseosa

H J Figura 16-1 Localizaciones com unes de infecciones que involucran bacterias anaerobias.

taiotaomicron y otras especies del grupo B. fragilis son bas­ tante comunes. Son importantes no sólo porque pueden aislar­ se en diversas infecciones potencialmente mortales, sino tam ­ bién debido a su resistencia a la acción de la penicilina y sus análogos; su resistencia a muchas cefalosporinas, incluidas las cefalosporinas de tercera generación; las tetraciclinas; los am i­ noglucósidos; el surgimiento de resistencia a varias de las qui­ nolonas más nuevas, y el incremento de la resistencia a la clin­ damicina 48-58-64-84,186. 188,224 La penicilina G fue históricamente el antibiótico de elección para las infecciones clínicas causadas por la mayoría de las bacterias anaerobias. Ahora, además del grupo B. fragilis,

Fusobacterium mortiferum, F. varium, miembros del grupo Prevotella-Porphyromonas pigmentado, Prevotella bivia, P. disiens y algunas especies de Clostridium son resistentes a la penicilina G, a algunos de sus análogos y a algunas de las cefa­ losporinas. Aunque los clostridios se aíslan en infecciones anae­ robias con menos frecuencia que las especies de Bacteroides, las especies de Fusobacterium y los cocos anaerobios pueden ser responsables de enfermedades potencialmente mortales. Las especies de Clostridium más comunes aisladas de origen clínico son C. perfringens, el grupo C. clostridioforme, C. ramosum, C. difftcile, C. innocuum, C. septicum, C. sordellii y C. bifermentans (véase cuadro 16-3).7 Se desconoce la relevan-

848

C A P ÍT U L O 16

Cuadro 16-4

Bacterias anaerobias

Incidencia de an aero b io s en las infecciones

T IP O D E IN F E C C IÓ N Neum onía por aspiración, absceso pulmonar, neum onía necrosante Bacteriem ia A bsceso cerebral Sinusitis crónica Dental/bucal Em piem a (torácico) Sepsis intraabdom inal/pelviana Otras infecciones de tejidos blandos: A bsceso mamario Heridas posapendicectom ía y poscirugía electiva de colon Osteom ielitis A bsceso perirrectal Abscesos cutáneos y de tejidos blandos Celulitis crepitantes no clostridianas Gangrena gaseosa (m ionecrosis clostridiana) Absceso pilonidal G angrena diabética infectada, úlceras de pie diabético Infección urinaria

62-93 6 -1 0

60-89 52 90-100 76 60-100 53-83 79-95 40 77 60-62 75 100 88

<

1

Infecciones anaerobias de origen exógeno

Diarrea hospitalaria por Clostridium difficile Botulismo de origen alimentario Botulismo infantil Botulismo por heridas G astroenteritis por Clostridium perfringens M ionecrosis (gangrena gaseosa) Tétanos Celulitis crepitante Infecciones superficiales benignas Infecciones posteriores a m ordedura de animales o humanas Aborto séptico

Absceso de algún órgano A ctinom icosis Artritis séptica Celulitis crepitante o no crepitante Com plicaciones de apendicitis o colecistitis Diarrea y colitis asociadas con antibióticos Em piem a subdural Em piem a torácico Endocarditis Infecciones dentales o peridontales M eningitis, por lo general posterior a absceso cerebral M ionecrosis clostridiana Neum onía necrosante Neum onía por aspiración Osteom ielitis Otitis media Peritonitis Sinusitis Tétanos

85-95

cia clínica de muchas especies de Clostridium: en la mayoría de los casos, su significación varía según el contexto clínico. El aislamiento de una especie de Clostridium en una herida, un hemocultivo u otro líquido corporal no siempre tiene signi­ ficado clínico. C. peifringens, la especie de Clostridium aisla­ da con mayor frecuencia, es un residente común del intestino grueso; éste y otros clostridios contaminan en forma transitoria la piel del área perianal y otras superficies cutáneas. C. per­ fringens no siempre es patógena. Sin embargo, junto con C. difficile, C. septicum, C. botulinum, C. tetani y algunos otros clos­ tridios están asociados con las enfermedades más importantes y se tratan más adelante en este capítulo. Actinomyces israelii es la principal causa de actinomicosis. Otras especies que se han establecido como causa de esta

Infecciones por abuso de drogas intravenosas

Infecciones anaerobias de origen endógeno

IN C ID E N C IA (% )

Modificado de las referencias1969,70.

Recuadro 16-2

Recuadro 16-3

enfermedad, aunque con menos frecuencia, son A. naeslundii, A. odontolyticus, A. meyeri, A. viscosus, A. gerencseriae y Propionibacterium propionicum (antes Arachnia propionica). Si bien se las encuentra con relativa baja frecuencia en mues­ tras habituales, estas especies son patógenos bien documenta­ dos. La actinomicosis es una enfermedad infecciosa aguda y crónica caracterizada por lesiones supuradas, abscesos y fístu­ las. La enfermedad se presenta como actinomicosis cervicofa­ cial, torácica, abdominal o pelviana, pero puede afectar otras regiones del cuerpo.6-202 Bifidobacterium eriksonii (antes Actinomyces eriksonii, ahora se denomina Bifidobacterium dentium), una posible causa de infecciones genitales y pulmonares, es la única espe­ cie documentada como patógena de este género.34,70,72 Otras bifidobacterias (p. ej., B. longum y B. breve) se aíslan rara vez en muestras clínicas;177 sin embargo, no se conoce que tengan significación clínica. Propionibacterium acnés, por lo general un contaminante en muestras clínicas, ha sido aislado en casos de endocarditis y otras enfermedades, a menudo asociadas con prótesis implantadas. Entre los cocos anaerobios encontrados con mayor freuencia en muestras clínicas se incluyen Finegoldia magna (antes Pep­ tostreptococcus magnus), Peptostreptococcus anaerobius, Peptoniphilus asaccharolyticus (antes Peptostreptococcus asa­ ccharolyticus), Anaerococcus prevotii (antes Peptostreptococ­ cus prevotii), Micromonas micros (antes Peptostreptococcus micros) y Streptococcus intermedius.135 Los cambios de la no­ menclatura actual para los cocos anaerobios se presentan en el cuadro 16-2 Existe una pequeña duda de que algunos cocos anaerobios son patógenos para los seres humanos en ciertos cuadros clínicos. En la Mayo Clinic se aisló F. magna en el 10% de los cultivos anaerobios recogidos de pacientes con in­ fecciones sospechosas y fue el coco grampositivo aislado con mayor frecuencia.31 Estuvo involucrado en infecciones óseas, articulares, de tejidos blandos, úlceras de pie e infecciones abdominales. Los cocos anaerobios y microaerófilos también son impor­ tantes en abscesos cerebrales, sinusitis maxilar crónica e infec­

A is la m ie n to de b a c te ria s a n a e ro b ia s

ciones pelvianas y pleuropulmonares. Mientras que la mayoría i í los antibióticos de primera línea usados en tratamientos empíricos de infecciones anaerobias (en general) son activos contra la mayoría de esas bacterias, se ha informado resistencia a clindamicina, metronidazol, ciprofloxacina, penicilina G, otras penicilinas y ciertas cefalosporinas entre cepas ocasiona­ les de cocos anaerobios.2-181

Aislamiento de bacterias anaerobias Los pasos por seguir para el diagnóstico de laboratorio de las infecciones bacterianas por anaerobios son similares a los de las infecciones bacterianas no producidas por anaerobios que se describen en los capítulos 1 y 2 de este libro. En particular, es importante que se ponga atención en la selección, recolec­ ción y transporte adecuados de las muestras clínicas para el ais­ lamiento de bacterias anaerobias. El procesamiento de las muestras, la elección de los medios de cultivo, los métodos de inoculación e incubación, y la inspección de los cultivos posi­ tivos son procedimientos de laboratorio que requieren contro­ les de calidad. La realización de algunos de los pasos en forma incorrecta puede conducir a resultados erróneos y proporcionar así una información equivocada al médico. En los capítulos 1 y 2 se explica cada uno de estos pasos en detalle, con la excepción de los hemocultivos anaerobios; aquí se ofrecen sólo algunos comentarios atinentes a las bacterias anaerobias. Selección de las muestras para cultivo

Con escasas excepciones, todos los materiales recogidos de lugares que carecen de flora natural, como líquidos corporales que no sea orina, exudados de abscesos profundos, aspirados con aguja fina y biopsias de tejidos, pueden ser cultivados para bacterias anaerobias. Sin embargo, como los anaerobios suelen habitar la piel y las mucosas como parte de la flora normal, las muestras mencionadas en la lista del cuadro 12-5 son casi siempre inaceptables para el cultivo anaerobio porque es impo­ sible interpretar los resultados.

Cuadro 16-5

M u estras que no deben cu ltivarse en medios p a ra anaerobios

H ISO PA D O S F A R ÍN G E O S O N A SO FA R ÍN G E O S Hisopados gingivales M uestras broncoscópicas o esputo Contenido gástrico, contenido de intestino delgado, heces, hisopados rec­ tales, fístulas colonocutáneas, estomas de colonostomía" Superficies de úlceras por decúbito, hisopados de muestras de costras de abscesos, revestimientos m ucosos y escaras M ateriales adyacentes a la piel o las mucosas adem ás de los no han sido descontam inados en form a adecuada Orina de micción espontánea Hisopados cervicales o vaginales " Cuando se indican clínicamente, las muestras de estos orígenes pueden ayudar al diagnóstico de botulismo y para enfermedades intestinales causadas por Clostridium difficile o C. perfringens.

849

Recolección y transporte de las muestras

Cuando se recolectan las muestras a través de la piel o muco­ sas, se deben tomar estrictas precauciones para descontaminar en forma adecuada la superficie. Se debe usar un jabón quirúr­ gico para la limpieza, seguido de la aplicación de alcohol etíli­ co o isopropílico al 70%, luego tintura de yodo durante 1 minu­ to (en círculos concéntricos comenzando desde el centro). Dado que algunos pacientes son sensibles o alérgicos a la tin­ tura de yodo, es importante sacar el yodo con alcohol después de recolectar la muestra. Otra alternativa satisfactoria es la limpieza de la piel con alcohol seguida de la aplicación de yodopovidona al 10% (Betadine®), luego de lo cual se espera al menos 2 minutos antes de la extracción de la muestra. Cuando sea posible se debe usar aguja y jeringa para reco­ lectar muestras para cultivos anaerobios. La recolección de muestras con hisopos debe rechazarse porque expone a los anaerobios, si están presentes, a ambientes oxigenados. Una vez recogidas las muestras, se deben tomar precauciones parti­ culares para protegerlas de la exposición al oxígeno y remitir­ las al laboratorio lo antes posible. Hemocultivos anaerobios (resumen de las pautas para el caldo tradicional y los sistemas instrumentados)

Las técnicas de hemocuitivo deberían permitir el aislamien­ to óptimo de anaerobios obligados tanto como de aerobios y anaerobios facultativos. Durante muchos años, los anaerobios se encontraron en casi 9-20% de todos los grupos de hemocul­ tivos positivos en un gran número de centros médicos.68 En el período que se extiende desde los últimos años de la década de 1980 hasta principios de 1990, el porcentaje de cocos grampo­ sitivos (p. ej., estafilococos, enterococos, estreptococos) y Enterobacteriacecie aumentó en el Indiana University Medical Center y en todos lados, probablemente como resultado de los cambios en el tratamiento antibiótico y en las proporciones mayores de pacientes inmunodeprimidos en cuidados tercia­ rios. Durante las dos décadas pasadas, se informó que los ana­ erobios representaban sólo el 2-5% de las bacterie­ mias.47-51-140'153-184 Recientemente se ha documentado en el Indiana University Medical Center un incremento relativo del número de pacientes con baeteriemia que comprende especies del grupo Bacteroides fragilis que eran menos comunes duran­ te las décadas de 1970 y 1980, y ahora son más resistentes a los antibióticos.5 Además, se está encontrando mayor número de Fusobacterium mortiferum, especies de Clostridium, Leptotrichia buccalis, especies de Lactobacillus y especies de Acti­ nomyces, que reflejan el surgimiento de anaerobios ahora resis­ tentes a una amplia variedad de antibióticos. Un informe reciente comunicó que las infecciones de pacientes con bacteriemia por Bacteroides resistentes a los antibióticos tienen mal pronóstico,186 lo que renueva el interés en el diagnóstico de laboratorio de baeteriemia anaerobia y en la necesidad de prue­ bas de sensibilidad a los antibióticos para estas bacterias.98 De modo similar a la recolección de otras muestras, es muy importante la descontaminación de la piel en el sitio de la venopunción. Durante mucho tiempo se recomendó preparar la piel antes de la venopunción, con alcohol y yodopovidona.197 Como alternativa, la clorhexidina parece ser comparable con el alco­ hol y la yodopovidona o con el alcohol y la tintura de yodo14-175 y se la utiliza para la antisepsia de la piel en algunos centros médicos. Se ha recomendado que la contaminación de los hemocultivos con flora cutánea (en especial por Propionibacte-

850

C A P ÍT U L O 16

Bacterias anaerobias

rium acnés y estafilococos coagulasa negativos) sea menor del 3% de todas las muestras de hemocultivos, aunque existe una amplia variabilidad entre las instituciones.207 Además, la sangre para cultivo no debe ser extraída a través de catéteres venosos arteriales permanentes, a menos que no pueda obtenerse por venopunción.197 Para optimizar el aislamiento de microorganis­ mos en pacientes con infecciones en el torrente circulatorio, el volumen de la muestra de sangre extraída por venopunción en pacientes adultos debe ser de 20 a 30 mL.252 Si se usa el siste­ ma Bactec® (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD), una muestra de 20 mL de sangre puede ser fraccionada en tres frascos estándares para anaerobios y aerobios (-7 mL/frasco). Uno o dos de esos frascos pueden ser para cultivos anaerobios y el restante para incubación aerobia. De modo alternativo, 8-10 mL de sangre se pueden inocular en cada Bactec Plus® (Anaerobic/F y Aerobic/F) u 8-10 mL de sangre en un frasco Bactec Lytic/10 Anaerobic/F®. Para recién nacidos y niños mayores, se pueden extraer volúmenes más pequeños (p. ej., < 0,5 mL para un lactante; 2-5 mL para un niño mayor). La recolección de más de dos a tres muestras de sangre por un período de 24 horas para diagnosticar un episodio sospechoso de bacteriemia no es necesaria y no se recomienda.197'255 Varias formulaciones de medios de caldo tradicional, dispo­ nibles en frascos bajo vacío con C 0 2, parecen satisfactorias para el aislamiento de anaerobios (p. ej.. medio de tioglicolato enriquecido, caldo tripticasa soja, caldo suplementado con pep­ tona. caldo con infusión de cerebro y corazón, caldo Brucella, caldo Columbia y otros).197'250-251 Estos medios a menudo se expenden en volúmenes de 40-100 mL por frasco. Entre los sistemas de hemocultivo más perfeccionados, los frascos disponibles en la actualidad que se utilizan en forma indistinta para el desarrollo de bacterias anaerobias obligadas y para el de bacterias anaerobias facultativas se enumeran más adelante. Bactec Plus Anaerobic/F® (resina, anaerobia; 3-10 mL de san­ gre) Bactec Lytic/10 Anaerobic F® (agente lítico; 3-10 mL de san­ gre) Bactec Anaerobic F® (anaerobio estándar; 3-7 mL de sangre) BacT/Alert FN® (FAN, anaerobio con carbón activado; más de 10 mL de sangre) BacT/Alert® (anaerobio estándar; más de 10 mL) ESP 80N® Caldo anaerobio (anaerobio estándar; más de 10 mL de sangre) ESP 40N® Caldo anaerobio (caldo anaerobio inoculado con sólo 5 mL de sangre) La relación recomendada entre el volumen de caldo y de sangre para los frascos de hemocultivos tradicionales es 1:5 a 1:10.197 Sin embargo, el volumen del medio fue disminuido en los frascos que contienen resina Bactec® para incluir un volu­ men mayor de sangre. Así, la inoculación de 10 mL en un fras­ co de Bactec Plus Anaerobic/F® genera un factor de dilución de sólo 1:3,5; las resinas en el medio neutralizan el problema de la actividad microbiana residual que puede estar presente en la sangre de los pacientes.137 Aunque el agregado de polianetolsulfonato de sodio (SPS) al medio del hemocultivo mejora el aislamiento de la mayoría de las bacterias, incluidas las anaerobias, puede ser inhibitorio para otras, como las especies patógenas de Neisseria. Peptostreptococcus anaerobius es el único anaerobio conocido que se inhibe por SPS en el medio del hemocultivo. Es poco común en hemocultivos, así que los intentos especiales para

aislarlo usando medios especiales suplementados (p. ej., por agregado de gelatina al 1,2% para superar el efecto de SPS) pueden no ser muy eficaces. La incubación de hemocultivos en caldo debe incluir al menos un frasco para anaerobios incuba­ do sin introducción de aire y un frasco para aerobios aireado transitoriamente (si se usa un sistema de caldo tradicional) por serie de hemocultivos, Los sistemas de hemocultivo más per­ feccionados tienen lugares especiales de atmósferas anaerobias que contienen nitrógeno y dióxido de carbono sin oxígeno. Los frascos para aerobios y anaerobios deben ser agitados durante la incubación e incubados a 35 °C durante 5 a 7 días. Los fras­ cos de caldo tradicional deben inspeccionarse en forma visual para detectar el desarrollo de microorganismos (p. ej., observar turbidez, producción de gas, hemolisis o colonias en el sedi­ mento) dos veces por día durante las primeras 72 horas y luego una vez por día. Se deben realizar tinciones de Gram y subcul­ tivos ciegos de los hemocultivos tradicionales en aerobiosis durante las primeras 6-12 horas de incubación, sin importar si se observa evidencia macroscópica de crecimiento.197 Los sub­ cultivos ciegos aerobios no se recomiendan en la actualidad para los hemocultivos tradicionales macroscópicamente nega­ tivos. Los cultivos negativos deben ser mantenidos por 5 a 7 días antes de ser informados como negativos. Los frascos de hemocultivos para aerobios y anaerobios de los sistemas perfeccionados Bactec®, BacT/Alert® o ESP no requieren subcultivos a ciegas. Cuando los frascos de aerobios o anaerobios muestran evidencia macroscópica de desarrollo, deben ser subcultivados en agar chocolate (incubados en una estufa con C 0 2 al 5-10%) y en agar sangre para anaerobios (incubado en anaerobiosis). También se recomienda el uso de medios selectivos en placa para subcultivo de anaerobios (como agar sangre para anaerobios con feniletil alcohol o agar sangre kanamicina-vancomicina), junto con agar sangre no selectivo para anaerobios para ayudar al aislamiento de anae­ robios en el cuadro de bacteriemia polimicrobiana. Los anaero­ bios se aíslan a veces en frascos para aerobios (tanto como en frascos para anaerobios). La falta de subcultivos para anaero­ bios a partir de frascos para aerobios macroscópicamente posi­ tivos es una práctica inaceptable. Con respecto al aislamiento de bacterias anaerobias, hasta ahora, el sistema de lisis/centrifugación (Isolator®; Wampole. Cranbury, NJ)250 y el sistema de hemocultivo Septichek® (Roche, Indianápolis, IN)264 (tratados en los caps. 1 y 2) se han desempeñado sólo en forma subóptima en comparación con los sistemas tradicionales de caldo Bactec® para hemocultivos anaerobios. Se recomienda que los laboratorios que usan cualquiera de estos sistemas también uti­ licen un sistema de cultivo en caldo tradicional o instrumenta­ do para hemocultivos anaerobios.129'254 Examen directo de los materiales clínicos

El análisis macroscópico de las muestras es valioso para establecer la presencia de anaerobios. Un olor fétido, el aspec­ to purulento de las muestras líquidas y el hallazgo de tejido necrótico y gas o gránulos de azufre son datos orientadores claves. Varios autores han enfatizado la importancia del examen microscópico de las muestras clínicas y la información deriva­ da que puede dar datos presuntivos inmediatos de la presencia de anaerobios.125'166 En los portaobjetos preparados para la tin­ ción de Gram, la fijación con metanol es mucho mejor que la fijación por calor tradicional. Deben observarse las caracterís­ ticas celulares y el fondo del frotis, y en la reacción de Gram, la forma, el tamaño y la disposición de las bacterias, y debe

A is la m ie n to de b a c te ria s a n a e ro b ia s

registrarse el número relativo de microorganismos presentes. Se debe reparar en la presencia de esporas, su forma y posición en la célula bacteriana, y otras características morfológicas ji>tintivas, como ramificaciones, filamentos con corpúsculos esféricos, extremos aguzados y formas granulares. Aunque la tinción de Gram es satisfactoria para determinar las caractensticas celulares, las tinciones de Wright y de Giemsa a veces pueden revelar información valiosa adicional. Las tinciones de naranja de acridina son las más útiles para detectar bacterias en hemocultivos, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido pleural, líquido articular y exudados.142 La morfología de varios anae­ robios en frotis examinados con el microscopio se ilustran en las microfotografías incluidas en las láminas en color 16-1, 162 y 16-3 y en las láminas en color del capítulo 1. La presencia de numerosas células epiteliales pavimentosas sin células inflamatorias en heridas de la piel y en muestras res­ piratorias y urogenitales a menudo indica que el material se ha recolectado de modo superficial, es de mala calidad y que pro­ bablemente producirá mezclas de microorganismos insignifi­ cantes de la flora normal o bien microorganismos contaminan­ tes. Vale la pena limitar la extensión de las identificaciones cuando los exámenes directos con el microscopio revelan muestras de baja calidad. Por supuesto que los médicos deben ser notificados de manera oportuna sobre los resultados de los exámenes directos y el problema de la calidad de la muestra antes de descartar las placas del cultivo primario. Los micro­ biólogos deben trabajar estrechamente con los médicos para tratar de mejorar la calidad y la importancia clínica de las muestras procesadas y de los resultados informados. Las pruebas inmunológicas para la detección directa de antí­ genos anaerobios han tenido aplicaciones muy limitadas. Los productos de anticuerpos fluorescentes para detectar Clos­ tridium chauvoei, C. novyi, C. septicum y C. sordellii están dis­ ponibles para uso en medicina veterinaria (VMRD®, Pullman, WA; www.vmrd.com). Los anticuerpos fluorescentes en equi­ pos comerciales creados hace algunos años para especies de Bacteroides en general no fueron útiles por la no especificidad y las reacciones cruzadas, con una sensibilidad insuficiente para ayudar a la identificación directa de microorganismos en muestras frescas. Además de los cultivos (tratados más adelante en este capí­ tulo), ciertos procedimientos pueden ayudar al diagnóstico de la enfermedad asociada con Clostridium difficile (EACD).7'8 Entre ellos se incluyen una prueba de aglutinación del látex, un inmunoanálisis para el antígeno común glutamato deshidrogenasa232 y la cromatografía de gas-líquido para detectar ácido isocaproico.119 La especificidad ha sido un logro para estos métodos. Los procedimientos de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) parecen promisorios,24'88'148 pero no están disponibles en el mercado. La prueba de neutra­ lización de la citotoxina B de Clostridium difficile, basada en el uso de antisueros específicos para toxina B, acoplada con hallazgos clínicos se considera el procedimiento de referencia con el que se deben comparar otras pruebas diagnósticas para C. difficile. Sin embargo, existen problemas con el ensayo de citotoxina B, entre ellos su escasa sensibilidad, un tiempo de re­ cambio de 1 a 4 días, los requerimientos para los medios de cultivos tisulares y la falta de estandarización entre los labora­ torios.8'239 Los procedimientos inmunológicos alternativos para la detección directa de toxina(s) de C. difficile en muestras feca­ les incluyen varios enzimoinmunoanálisis (EIA) disponibles en el mercado, que han sido revisados en detalle en otra parte.8 Los productos comerciales recién evaluados en un estudio

851

importante realizado por Turgeon y cois.239 incluyen el Sistema Prima Tox A de Clostridium difficile (Trinity Biotech®, Bray, Irlanda) y Tox A II de Clostridium difficile VIDAS® (BioMérieux-Vitek, Hazelwood, MO), ambos detectan toxina A de C. difficile. El Premier Cytoclone A/B (Meridian Diagnostics®, Cincinnati, OH) y el Clostridium difficile Tox A/B (Techlab®, Blacksburg, VA) detectan ambas toxinas, A y B. Los paneles de ImmunoCard® Clostridium difficile (ICard; Meridian Diagnostics, Cincinnati, OH) y Triage Micro® C. dif­ ficile (Triage; Biosite Diagnostics, San Diego, CA) detectan el antígeno común glutamato deshidrogenasa y la toxina A. Todos estos EIA y otros revisados por Alien y cois.8 son rápidos (p. ej., 1 a 3 horas de tiempo de recambio), fáciles de usar y se pre­ sentan como alternativas promisorias a los ensayos de neutrali­ zación de citotoxinas tradicionales. En teoría, la sensibilidad y la especificidad de las pruebas directas de toxina de C. difficile en heces se deben mejorar en gran medida usando EIA para detectar la enterotoxina (toxina A) o la citotoxina (toxina B), o ambas, producidas por el microorganismo en las heces. Aunque algunos de estos EIA parecen ser muy específicos (p. ej., 98% a > 99% de especificidad), la mayoría son menos sensibles que los ensayos de citotoxina B con los cuales han sido compara­ dos (p. ej., 56-82% de sensibilidad).8,239 En otro tiempo se creyó que se necesitaban ambas toxinas, A y B, para que se produzca EACD. Ahora es claro que la enfer­ medad grave puede ser causada por cepas de C. difficile toxina A-negativas/toxina B-positivas, que pueden perderse si el EIA se diseña para detectar sólo toxina a . 1'120-149-260 Se están infor­ mando nuevos casos y brotes de EACD con toxina A-negati­ va/toxina B-positiva con una frecuencia creciente en todo el mundo. Así, además de, o en vez de un EIA para toxina A, se puede recomendar un ensayo de citotoxina para toxina B y/o cultivos para C. difficile toxigénico.7 Si bien se describió el uso de la cromatografía de gas-líquido para detectar anaerobios en exudados y líquidos corporales no ha sido muy popular.86 El valor de este procedimiento está creciendo mediante el examen microscópico cuidadoso del material de la misma muestra. Una gran cantidad de ácido butí­ rico en una muestra que contenga sólo bacilos gramnegativos delgados aguzados podría sugerir especies de Fusobacterium. Un pico principal de succinato y la presencia de sólo bacilos gramnegativos podrían indicar especies de Bacteroides, espe­ cies de Prevotella o especies de Porphyromonas. Un pico prin­ cipal de propionato en un hemocultivo positivo que contiene bacilos grampositivos, no formadores de esporas, pleomorfos (llamados difteroides) podría ser muy compatible con especies de Propionibacterium. Sin embargo, la cromatografía de gaslíquido directa provee sólo claves presuntivas y debe interpre­ tarse con cautela en infecciones polimicrobianas. Selección y uso de los medios

Los medios usados para aislar anaerobios a partir de mues­ tras deben incluir tipos no selectivos, selectivos y enriquecidos, como se ilustra en el cuadro 16-6. Otros medios también pueden ser incluidos o sustituidos por los listados en el cuadro 16-6. Por ejemplo, el medio de carne picada y glucosa se usa a menudo en vez del medio de tioglicolato enriquecido; el agar ácido nalidí­ xico colistín (CNA) puede usarse en lugar del agar feniletil alcohol (PEA). Tanto el agar sangre vancomicina-paromomicina como el agar sangre vancomicina-kanamicina pueden usarse para el ais­ lamiento selectivo de anaerobios gramnegativos no formadores de esporas. El agar bilis esculina para Bacteroides se reco-

852

CAPÍTULO 16

Cuadro 16-6

Bacterias anaerobias

Medios representativos para el aislamiento primario de anaerobios en muestras clínicas"

M E D IO

P R IN C IP A L E S C O M P O N E N T E S Y C O M E N T A R IO S

O B JE T IV O

Agar sangre para anaerobios de los CDC (AnBAP)

A gar base tripticasa soja con 5% de sangre de cam ero; suplementado con extracto de levadura, hemina, vitamina K, y L-cistina para los anaerobios que requieren factores de crecimiento adicionales (p. ej., Prevotella melaninogenica, Fusobacterium necrophorum y otros). Otros m edios base, incluidos Brucella, infusión de cerebro y corazón, Schaedler y agar sangre Colum bia son excelentes para el desarrollo de muchos anaerobios, pero la morfología y otras características tienden a diferir en esos medios

M edio en placa de agar sangre no selectivo para el aislamiento primario de todos los tipos de anaerobios encontrados en materiales clínicos (véanse texto y láminas en color de 16-1 a 16-4)

Agar sangre feniletilalcohol para anaerobios (PEA)

Además de contener los mismos componentes que la formulación anterior de agar sangre para anaerobios de los CDC. este medio tiene feniletilalcohol (2,5 g/L). PEA inhibe el desarrollo de espe­ cies de Proteus y el de muchas otras bacterias anaerobias facultati­ vas gramnegativas, incluidas la m ayoría de las Enterobacteriaceae. PEA es volátil. Las placas deben ser selladas en bolsas plásticas o de celofán y almacenadas a 4 °C. La tanda de placas que no inhi­ ben el desarrollo de Proteus deben descartarse, sin im portar la fecha de vencimiento

El medio PEA ayuda al aislamiento selectivo de anaerobios a partir de materiales infectados que contengan una m ezcla de bacterias. Debe proveer un buen desarrollo para la m ayoría de bacterias anaerobias obligadas gramnegativas y gram posi­ tivas. Las bacterias grampositivas anaerobias facultativas, com o estafilococos, estreptococos, especies de Bacillus y las bacterias corineform es tam bién crecen bien en este medio

Agar sangre kanamicina-vancom icina para anaerobio (KV)

Contiene la m ism a formulación que el agar sangre para anaerobios de los CDC com o el antedicho AnBAP. pero además, contiene 100 mg/L de kanam icina y 7,5 mg/L de vancomicina. La kanam icina inhibe el desarrollo de muchos (pero no todos) bacilos gram negati­ vos anaerobios facultativos y la vancom icina inhibe el de las bac­ terias grampositivas en general (incluidas la m ayoría de anaerobios y no anaerobios grampositivos). La vancomicina en esta concen­ tración tam bién puede inhibir el desarrollo de especies de

El medio KV es útil para el aislamiento selectivo de la m ayoría de las especies de Bacteroides, de Prevotella, de Fusobacterium y de Veillonella de m uestras clínicas que con­ tienen bacterias aerobias y anaerobias mezcladas

Porphyromonas. Agar sangre lacada parom om icinavancom icina para anaerobios (PV)

El medio PV lacado es sim ilar a la formulación antes citada, excepto en que los 100 mg/L de parom om icina son sustituidos por kanamiciña. También en PV, la sangre es lacada antes de agregarla (por congelación y descongelación de la sangre). El desem peño es similar a KV, excepto que la parom om icina puede inhibir algunos otros anaerobios facultativos resistentes a la kanam icina, como algunas cepas de Klebsiella. De m odo sim ilar al agar KV, el PV lacado puede inhibir el desarrollo de los microorganismos gram po­ sitivos en general. La sangre lacada puede ayudar al reconocim ien­ to tem prano de Prevotella pigm entada

PV lacado es un medio excelente para el aislamiento primario de microorganismos pertenecientes al grupo Bacteroides fra ­ gilis, especies de Prevotella pigm entada y no pigmentada,

Agar fructosa cicloserina-cefoxitina (CCFA)

Base peptona proteosa o tripticasa soja que contiene fructosa e indicador rojo neutro. Además, se agregan cicloserina (500 mg/L) y cefoxitina (16 mg/L) para inhibir la flora intestinal. C.difficile, a 48 horas de incubación, form a colonias rizoides am arillentas de 4 mm o más grandes que tienen estructuras internas cristalinas birrefringentes (“opalescencia jaspeada” ). Las colonias de C. difficile muestran una fluorescencia verde am arillenta bajo luz de longitud de onda UV (su olor recuerda al estiércol de caballo). C. difficile es negativo para las actividades de lipasa y lecitinasa

CCFA se utiliza para el aislamiento selectivo de C. difficile en muestras de heces u otros m ateriales intestinales. Sin em bar­ go, el desarrollo en CCFA no es específico sólo para C. diffi­ cile', por lo tanto, se requiere la identificación de un cultivo puro (es común encontrar colonias que se desarrollan en m edios para Enterobacteriaceae no deseados, especies de Bacillus, estafilococos y otros clostridios)

M edio de tioglicolato enriquecido (THIO)

THIO es un m edio líquido enriquecido preparado por suplementación del medio de tioglicolato fórm ula BBL-0135C (sin indicador) con hem ina y vitam ina K,

Éste es un caldo no inhibitorio que es útil en especial para el aislamiento primario de actinomicetos. THIO también es un excelente suplemento para m edios sólidos en placa para el aislamiento de microorganism os con requerimientos nutricio­ nales especiales. Debe proveer un buen desarrollo para todos los anaerobios encontrados en materiales clínicos.

Fusobacterium nucleatum, F. necrophorum, F. mortiferum, Veillonella y otros anaerobios obligados no form adores de esporas gramnegativos. No es necesario el uso de KV y PV; es razonable seleccionar uno de ellos, según las preferencias del microbiólogo

" Todos los medios en este cuadro están disponibles preparados por varios fabricantes (véase el texto). Todos excepto CCFA fueron decritos originalmente por Dowell, Lombard y cois, en un manual de los CDC.56 Para más información acerca de CCFA, se recomiendan las publicaciones de George et al.,77 Bartley y Dowell22 y Marler et al.167

S is te m a s a n a e ro b io s p a ra el c u ltiv o de b a c te ria s a n a e ro b ia s

“íienda en el manual Wadsworth Anaerobio Bacteriology para la selección e identificación presuntiva del grupo Bacteroides fragilis125 y también se ha encontrado útil como un medio '¿lectivo para Bilophila wadsworthia.16 Los resultados obteni­ dos con formulaciones de medios en placa, como Schaedler, Columbia, Brucella u otros pueden no ser enteramente compa­ rables con las características de desarrollo y morfología de anaerobios observadas en las formulaciones de medios en base a agar sangre de los Centers for Disease Control and Prevention CDC) (véanse láminas en color 16-1 a 16-4). El agar sangre anaerobio usado en los CDC y en la Indiana University se recom ienda como un medio no selectivo. Contiene 5% de sangre de camero o conejo desfibrinada agre­ gada al agar tripticasa soja (Becton Dickinson Microbiology Systems®; BDMS, Cockeysville, MD), adicionado con L-cistina, extracto de levadura (Difeo, Detroit, MI), vitamina K2 y hemina.56 La fórmula se encuentra en el recuadro 16-4. Se dispone de placas con este medio fabricadas por Becton Dickinson Microbiology Systems y Remel (Lenexa, KS). Las placas comerciales de agar sangre para anaerobios pueden ser almacenadas en el refrigerador en bolsas de celofán por al menos 6 semanas. Antes de usarlos, las placas se mantienen 4 a 6 horas en una jarra anaerobia o en una cámara de anaerobiosis (glove-box) en una atmósfera de 85% de N2, 10% de H2 y 5% de C 0 2. Un beneficio adicional del agar sangre para anaerobios de los CDC descrito con anterioridad es que la adición de L-cistina en el medio permite el desarrollo de ciertas bacterias que requieren aminoácidos que contienen azufre, como Fusobacterium ne­ crophorum y estreptococos con requerimientos nutricionales especiales dependientes del azufre que han sido aislados en pacientes con endocarditis.9 En este medio también crecen muy bien los anaerobios estrictos Clostridium novyi tipo B y Clostridium haemolyticum. El agar sangre con feniletilalcohol se prepara mediante la suplementación del agar sangre para anaerobios descrito antes con 0,25% de feniletil alcohol. De modo similar, el agar sangre vancomicina-kanamicina o el agar sangre vancomicina-paromomicina se preparan por el agregado de 100 |ig de kanamici­ na o paromomicina y 7,5 |ig de vancomicina por mililitro de medio de agar sangre. El medio de tioglicolato enriquecido (BBL-135C con suple­ mento de hemina y vitamina K,) se recomienda como reem­ plazo del medio en placa.56 Este medio es útil en particular para cultivar especies de Actinomyces de crecimiento lento. El caldo con glucosa y carne picada, una buena alternativa para enri­

Recuadro 1 6-4

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quecer el medio de tioglicolato, es útil para el aislamiento de especies de Clostridium por la técnica de selección de esporas y para cultivos anaerobios en general. Otros medios selectivos con fines especiales para el aisla­ miento primario de anaerobios en la flora normal se describen en detalle en el M anual Wadsworth.125 Además, Smith y Moore describieron los medios selectivos y una técnica de enriqueci­ miento en frío para ayudar al aislamiento de especies de Mobiluncus en muestras vaginales.220 Eley y cois, informaron un medio diferencial y selectivo para el aislamiento de Bac­ teroides ureolyticus59 Lee y cois, desarrollaron un nuevo medio selectivo para Bacteroides gracilis.141 Malnick y cois, formularon un nuevo medio selectivo para el aislamiento de especies de Anaerobiospirillum de heces.164 Se han desarrolla­ do medios selectivos adicionales con fines especiales y proce­ dimientos para el aislamiento y la cuantificación de Clos­ tridium difficile, C. perfringens y C. botulinum de heces (y/o de muestras de alimentos).7'22125

Sistemas anaerobios para el cultivo de bacterias anaerobias Según se determinó por estudios comparativos, el uso apro­ piado de los siguientes sistemas es satisfactorio para el cultivo de bacterias anaerobias asociadas con enfermedades huma­ nas:130201 jarras de evacuación-reemplazo; jarras anaerobias con generadores de gas desechables; técnicas para cámaras anaerobias; medios esterilizados en forma aerobia prerreducidos (PRAS) para la siembra en un tubo con capa extendida por rodamiento (roll-streak). Deben seguirse los principios genera­ les enumerados en el recuadro 16-5 para asegurar resultados óptimos. Técnicas de jarras anaerobias

Las jarras suelen usarse para el cultivo anaerobio de bacte­ rias en medios en placa primarios o en placas de subcultivos. La jarra GasPak® (Becton Dickinson), ilustrada en la figura 16-2, se ha usado durante mucho tiempo en laboratorios clíni­ cos de los Estados Unidos. La jarra anaerobia Oxoid® (fig. 16-3) consta de una tapa de metal, válvulas Schrader y un manómetro. Al igual que la jarra GasPak, la jarra Oxoid puede usarse como jarra de evacuaciónreemplazo o con un generador de gas. Otras fuentes comercia­ les de jarras anaerobias son Almoore® (Ardy Diagnostics, Santa María, CA), Key® (Scientific Products, Rockville, MD), Mitsubishi Gas Chemical America® (Nueva York, NY) y EM Science® (Darmstadt, Alemania).

A gar s angre para anaerobios de los C D C

INGREDIENTES

CANTIDADES

A gar tripticasa soja (BDMS) Fitona (BDMS) Cloruro de sodio Agar Extracto de levadura (Difeo) Hem ina Vitamina K, (3-fitilmenadiona) L-cistina Agua desm ineralizada Sangre (de carnero o conejo) desfibrinada

15 g 5g 5g 2 0 g

Recuadro 16-5

5g 5 mg 1 0 mg 400 mg 1L 50 mL

P rincipios para el aislam ien to óptim o de a naerobios

1. Recolección y transporte adecuados de las m uestras clínicas. 2. Procesam iento de las muestras con la mínima exposición al oxígeno atmosférico. 3. Uso de m edios frescos o prerreducidos. 4. Uso apropiado de un sistem a anaerobio, con la inclusión de un cataliza­ dor activo que perm ita la elim inación del oxígeno (de sistem a jarra o cám ara de anaerobiosis).

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C A P ÍT U L O 16

Bacterias anaerobias

rápidamente. Se puede usar algún contenedor hermético, incluida una jarra GasPak con una tapa de ventilación, una jarra Brewer, una jarra Oxoid o incluso una olla de presión modifi­ cada. Whaley y Gorman describieron un dispositivo económico para vaciar y llenar de gas las jarras y otros sistemas.258 Estos dispositivos pueden usarse con un aspirador casero, con lo que se elimina la necesidad de una bomba de aspiración cuando se utiliza el procedimiento de evacuación/reemplazo. Se evacúa el aire de la jarra por extracción mediante una presión negativa de -5 0 a -6 0 cm de mercurio. El procedimiento se repite tres veces. Luego la jarra se llena con N, después de las dos prime­ ras evacuaciones y el reemplazo final se hace con la mezcla gaseosa compuesta por 85% de N2, 10% de H, y 5% de C 0 2. El Anoxomat® (Mart Microbiology, Lichtenvoorde, Países Bajos) es un sistema de evacuación/reemplazo automatizado. Aunque es similar en principio al procedimiento descrito antes, los estudios han mostrado un desarrollo un poco mayor usando Axonomat® en lugar de otros sistemas anaerobios con los que se comparó.32-215 Los generadores de C 0 2 e H, del GasPak se usan abriendo el sobre con generador y colocándolo en la jarra. Se agregan cerca de 10 mL de agua para permitir la generación de hidrógeno y dióxido de carbono y la tapa se sella de manera apretada. Si la F ig u ra 16-2 Sistem a anaerobio GasPak® (Becton Dickinson M icrobiology System s, Cockeysville, MD): la jarra contiene placas inoculadas, tubos de caldo, un envase generador de dióxido de carbono e hidrógeno, una tira con indicador azul de m etileno y un catalizador en la tapa.

El principio básico de las jarras que requieren catalizador (p. ej., GasPak) es la eliminación del oxígeno de la cámara mediante la reacción con el hidrógeno agregado al sistema en presencia del catalizador. El oxígeno se reduce a agua como sigue: (catalizador) 2H, + 0 2 <----------------->2 H ,0 La técnica más antigua de la jarra Brewer usaba un cataliza­ dor de paladio en la tapa de la jarra (una jarra Mclntosh-Fildes modificada), que requería ser calentado con una corriente eléc­ trica para estar activo por completo. La jarra GasPak usa un catalizador “frío”, compuesto por partículas de aluminio recu­ biertas de paladio, que no necesitan calentamiento. El cataliza­ dor frío es más conveniente y no tiene peligro de explosión. El catalizador de paladio frío puede inactivarse en la jarra por la producción de sulfuro de hidrógeno u otros productos metabólicos volátiles de las bacterias. Se recomienda reemplazar las partículas de catalizador con partículas nuevas o reacondicionadas cada vez que se use la jarra. Las partículas pueden ser reacondicionadas o restituidas a su actividad completa calen­ tándolas en un homo de calor seco de 160 °C a 170 °C durante 2 horas. Después del calentamiento, las partículas se almace­ nan a temperatura ambiente en un contenedor seco y limpio o en un desecador hasta el momento de su uso. Las condiciones anaerobias pueden ser producidas en siste­ mas de jarras con un generador de dióxido de carbono-hidrógeno (GasPak, Oxoid) o por el procedimiento de evacuación y reemplazo. En este procedimiento el aire en la jarra es elimi­ nado y reemplazado con una mezcla de 85% de N 2, 10% de H, y 5% de C 0 0; es más económico que los generadores de gas y permite que las condiciones anaerobias se establezcan más

F igu ra 16-3 La jarra anaerobia Oxoid® (Oxoid USA, Columbia, MD) contie­ ne una jarra de policarbonato de 3,5 L cerrada por una tapa metálica pesada y una abrazadera de metal. El centro de la tapa tiene dos válvulas de Schrader y un manómetro de presión máxima o mínima, con dos válvulas para facilitar la técnica de evacuación/reemplazo (E/R). En la tapa también hay una válvula de seguridad para impedir la presión gaseosa extra causada por el uso incorrec­ to de la técnica de E/R. Un saché con un catalizador que actúa a baja tempera­ tura se abre hacia la superficie interior de la tapa. En lugar de la técnica E/R, la jarra se puede usar con el equipo comercial generador Oxoid® del fabricante.

S is te m a s a n a e ro b io s p a ra el c u ltiv o de b a c te ria s a n a e ro b ia s

:apa no está caliente al tacto dentro de los 40 minutos después de sellada o si la condensación no aparece en la superficie interna del vidrio dentro de los 25 minutos, se debe abrir la jarra, descartar el sobre con generador y reemplazarlo por un generador nuevo. Las dos causas más comunes de fracaso del sistema son un cierre defectuoso de la tapa que permita el esca­ pe de gas o que se inactiven las partículas de catalizador. Las condiciones anaerobias siempre deben controlarse cuan­ do se usa cualquiera de las dos técnicas de jarras mediante la inclusión de un indicador de oxidorreducción. Para este objeti­ vo se venden tiras de azul de metileno (BD Microbiology Systems). De otra forma se puede colocar en la jarra un tubo de ensayo de 13 mm x 100 mm que contenga unos pocos milili­ tros de una mezcla de glucosa-N aCH 03-azul de metileno.53 El azul de metileno es azul cuando está oxidado y se decolora cuando está reducido. El color cambia a casi +11,0 mV. Así, si se alcanzan las condiciones anaerobias, la solución del indica­ dor azul de metileno se tom ará incolora y permanecerá de esa forma si no existen escapes que permitan el ingreso de oxíge­ no adicional en el sistema. Si la solución se vuelve azul des­ pués de haber sido incolora, indica que no se han mantenido las condiciones y que los resultados del cultivo pueden no ser válidos. El sistema GasPak 100 Anaerobic® ha sido analizado con res­ pecto a las concentraciones de 0 2 y CO:, tiempo de aparición de agua condensada, temperatura del catalizador y Eh de los medios en placas preparados en el comercio a distintos interva­ los a 20 hasta 25 °C.208 La concentración de O, fue 0,2-0,6% dentro de los 60 minutos después de la activación del generador y menor de 0,2% a los 100 minutos. La concentración de CO: fue 4.6-6,2% a los 60 minutos después de la activación. El Eh de los tres medios probados varió de +60 mV (agar Colum ­ bia con 5% de sangre de carnero) hasta +500 mV (agar Schaedler con 5% de sangre de carnero) a tiempo cero. El Eh se exten­ dió desde -3 0 mV hasta -229 mV después de 60 minutos y osciló de -115 mV hasta -3 0 0 mV después de 100 minutos. Esto indica la reducción rápida del medio; aun así el indicador azul de metileno no se decolora en menos de 6 horas a 25 °C. A 35 °C, el azul de metileno por lo general se reduce en casi 5 horas, y es probable que el medio se reduzca más rápidamente

F ig u ra 16-4 C ám ara de anaerobiosis (Coy Laboratory Products. Ann Arbor, MI). Los materiales se pasan hacia dentro y afuera de la cám ara plástica, flexible, grande mediante una entrada autom ática. Las condiciones anaerobias se mantienen por recirculación constante de la atm ósfera dentro de la cám ara plástica (85% de N 2, 10% de H2, y 5% de C 0 2) m ediante un catalizador de paladio. Los cultivos se incuban dentro de una estufa separada en el interior de la cám ara de anaerobiosis o por m antenim iento de la caja íntegra a 35 °C mediante el uso de cajas calentadas con catalizador.

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a 35 °C que a 25 °C. Sin embargo, si el aire ambiente entra en el sistema, el indicador cambia hacia el azul en pocos minutos. Hace relativamente poco se han introducido sistemas anae­ robios por generación de gas que no requieren catalizador ni adición de agua para su activación. El AnaeroPack® (Mitsu­ bishi Gas Chemical America, Nueva York, NY), por ejemplo, absorbe oxígeno y genera dióxido de carbono, pero no genera hidrógeno. Parece una excelente alternativa al GasPak® y a otros sistemas de incubación anaerobia establecidos.49 Otro tipo de sistema comercial libre de catalizador hace uso de lima­ duras de hierro en un saché al que se le agrega agua (Anerocult®, Merck, Darmstadt, Alemania), produciendo una atmós­ fera rica en dióxido de carbono, libre de oxígeno. Uso de la cámara de anerobiosis

Una cámara de anaerobiosis (“caja con guantes” o glovebox) es un sistema anaerobio completo que permite al micro­ biólogo procesar muestras y realizar la mayoría de las técnicas bacteriológicas para el aislamiento e identificación de bacterias anaerobias sin exposición al aire. Pueden estar construidas de varios materiales, como acero, plástico acrílico o fibra de vi­ drio (fig. 16-4). La cámara anaerobia de plástico vinílico flexi­ ble desarrollada en la University of Michigan ha gozado de una amplia popularidad" y se dispone de una modificación de este diseño en varios tamaños de la marca Coy Manufacturing® (Ann Arbor, MI). Una cámara anaerobia de diseño diferente se muestra en la figura 16-5. Entre otros fabricantes de cámaras anaerobias se encuentran Forma Scientific (Marietta, OH) y Toucan Technologies (Cincinnati, OH). Las cámaras rígidas son comercializadas por Anaerobe Systems® (Bactron Anae­ robe Chamber; Sheldon Manufacturing, Comelius, OR) y por Russkinn Technology y Don Whitley (Shipley, West Yorkshire, Inglaterra). Una cámara de anaerobiosis, si está construida de forma apropiada, es económica para operar porque permite el uso del medio en placas convencionales y el costo de los gases para la operación del sistema es mínimo. Una vez armada, el principal gasto es la mezcla gaseosa de 85% de nitrógeno-10% de hidrógeno-5% de dióxido de carbono para reemplazar el aire en el

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Bacterias anaerobias

■Hv

orificio de entrada cuando los materiales se pasan hacia el inte­ rior de la cámara de anaerobiosis. Sistema de capa extendida por rodamiento (roll-streak)

El sistema de capa extendida por rodamiento (roll-streak) creado por WEC Moore y asociados del Laboratorio VPI Anaerobe107 es una modificación de la técnica en tubo desarro­ llada por Hungate y asociados para el cultivo de bacterias anae­ robias del rumen de vacas y otros animales herbívoros. El equi­ pamiento para el sistema de cultivo anaerobio VIP (incluidos los tubos Hungate) es com ercializado por Bélico Glass (Vineland, NJ). El sistema de capa extendida por rodamiento usa medios PRAS preparados en tubos con tapones de goma. Después de la esterilización en autoclave los tubos de medios de agar se enfrían en una máquina rodante, lo que produce el depósito de una capa delgada del medio solidificado en las superficies internas de los tubos. Los tubos y los medios líquidos PRAS requieren la adición de un agente reductor, como clorhidrato de L-cisteína, que se agrega justo antes de la esterilización en autoclave para ayudar a mantener un bajo potencial de oxido­ rreducción dentro del sistema. Todas las inoculaciones y sub­ cultivos de los medios líquidos y sólidos PRAS se realizan bajo una corriente de dióxido de carbono libre de oxígeno, que redu­ ce la exposición al aire y ayuda a mantener un potencial de oxi­ dorreducción en el medio antes y después del desarrollo de los anaerobios obligados. La técnica de Hungate requiere menos equipamiento que la técnica de la capa extendida por roda­ miento para inocular el medio líquido. La inoculación en los medios PRAS de los tubos Hungate se realiza con una jeringa y aguja a través del tapón de goma de la tapa de rosca. Bolsas plásticas anaerobias

Se dispone del sistema de bolsa plástica anaerobia fabricado por BD Microbiology Systems (Sparks, MD). Un segundo sis­ tema, el AnaeroPouch®, es comercializado por Mitsubishi (Nueva York, NY). Un tercer sistema de bolsa anaerobia, Anaerocult P®, se fabrica en Alemania (Merck, Darmstadt,

F ig u ra 16-5 Cám ara de anaerobiosis Forma Modelo 1024® (Form a Scientific. M arietta. OH). Este sistem a tiene una boca de entrada automática. Durante la operación diaria de rutina, el aire atm osférico burbujea a través de una solución buffer HEPES-glucosa-azul de metileno, que ayuda al control de las pérdidas de 0 2 o para determ inar si el catalizador no funciona en form a adecuada.

Alemania). Otros sistemas de bolsas son el Anaerogen® (Oxoid) y el Anabag® (Hardy Diagnostics). La bolsa anaerobia (BD) consiste en una bolsa de plástico transparente (de varios tamaños con capacidad para una a tres placas de Petri de 100 mm de diámetro), un generador de gas H:-C 0 2 que produce una atmósfera cuando se le agrega agua (análogo al generador usado en una jarra GasPak), partículas de catalizador de paladio frío y resazurina como indicador. La bolsa se sella con calor luego de la activación del generador para permitir el mantenimiento de las condiciones anaerobias de acuerdo con el mismo principio descrito para el sistema de la jarra GasPak. Por otro lado, el AnaeroPouch y el Anaerocult logran las condiciones anaerobias en forma diferente, sin catalizador, para eliminar el oxígeno de la atmósfera y generar CO,. El oxí­ geno se elimina desde dentro de la bolsa Anaerocult sellada por combinación con el polvo del hierro para producir óxidos de hierro. Estos sistemas de bolsas anaerobias parecen ser alterna­ tivas prácticas a las jarras o a los sistemas de cámaras de anae­ robiosis para la incubación de anaerobios cuando sólo se incu­ ban unas pocas placas. Uso de la jarra contenedora anaerobia

Una modificación del procedimiento de la jarra contenedora de Martin es un aditamento económico y conveniente ante los sistemas de la jarra y la cámara anaerobias que permite la siem­ bra en placa primaria, la inspección de los cultivos y el subcul­ tivo de colonias en la mesada del laboratorio con una mínima exposición de las bacterias anaerobias al oxígeno atmosféri­ co.9'168 El armado de la jarra contenedora se ilustra en la figura 16-6 y su uso se describe brevemente en el recuadro 16-6. En el sistema de jarra contenedora se puede usar N, grado comercial, que es muy económico. Se abre la pequeña válvula de aguja pequeña del tubo múltiple (fig. 16-7) y se coloca el regulador del tanque de gas en 0,28 kg/cm2 durante 20 a 30 segundos para purgar en forma rápida la jarra de aire. Luego se baja el regulador de presión hasta casi 0,04 a 0,07 kg/cm2 y se ajusta el flujo de cada jarra en 50 a 100 mL/min, usando la vál-

In c u b a ció n de los c u ltiv o s

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NITROG ENO

F ig u ra 16-7 Esquem a del sistem a de jarra de anaerobiosis. L a velocidad de flujo de nitrógeno para cada jarra se regula por las válvulas agujas en el m úl­ tiple juego de tres válvulas (disponible donde se venden artículos para acua­ rios). Las jarras A, B y C contienen placas sin inocular, placas con colonias para ser subcultivadas y placas recién inoculadas, respectivamente.

la exposición al oxígeno. En situaciones de emergencia, se pue­ den incubar dos grupos de medios en placas en jarras diferen­ tes: un grupo durante 18-24 horas y el otro durante 3 a 5 días. Este procedimiento permite el pronto aislamiento de anaero­ bios de crecimiento rápido en la jarra de 18-24 horas de incu­ bación y el aislamiento tardío de los que se desarrollan en forma lenta en las jarras dejadas para la incubación demorada. Si se sospecha una mionecrosis causada por clostridios, las pla­ cas deben inspeccionarse tan rápido como 6 a 12 horas después de la inoculación. F igu ra 16-6 Equipo de cultivo en bolsa anaerobia (Becton Dickinson M icrobiology Systems, Sparks, MD). Este equipo de cultivo incluye una placa de agar sangre para anaerobios de los CDC contenida en una bolsa im permea­ ble al oxígeno. El sistem a tiene su propio equipo generador de gas y cataliza­ dor en frío.

vula de la aguja pequeña en el tubo múltiple. Esto es equiva­ lente a una relación de flujo de una a dos burbujas por segundo cuando el tubo de goma de la jarra apenas se sumerge en el agua de un vaso. Como alternativa, en las jarras contenedoras se puede usar C 0 2 pasado a través de un tubo de catalizador de cobre caliente (homo Sargent) en lugar de N2.

Incubación de los cultivos En la mayoría de los casos, 35 °C a 37 °C es la temperatura más adecuada para el aislamiento primario de bacterias anae­ robias a partir de muestras clínicas. Las placas inoculadas en la mesada de laboratorio y colocadas en jarras de anaerobiosis deben incubarse al menos durante 48 horas y reincubarse por otros 2-4 días para permitir que los microorganismos de creci­ miento lento formen colonias; algunos anaerobios, como cier­ tas especies de Actinomyces y Eubacterium, crecen más lenta­ mente y las colonias no pueden detectarse si las jarras se abren antes. Además, si la jarra se abre muy pronto, algunos de los microorganismos de crecimiento lento pueden morir debido a

Recuadro 16-6

P roced im iento de utilizació n de la jarra de anaerobiosis

1. Se usan tres jarras de anaerobiosis. la primera para colocar m edios sin inocular, la segunda para placas en las que se desarrollan colonias sub­ cultivadas y la tercera para recibir placas de medios recién inoculados. 2. Se pueden usar placas de agar com erciales o m edios de agar recién pre­ parados en el laboratorio. Se pueden mantener en refrigerador por más de 6 semanas si están em bolsadas en celofán. 3. Las placas para ser usadas en un día dado se deben colocar prim ero en una cám ara de anaerobiosis o en una jarra de anaerobiosis durante 4 a 15 horas antes de usar para reducir el medio. 4. A m edida que se necesiten, los medios reducidos se colocan en la pri­ mera jarra de m antenimiento y se hace pasar en form a continua una corriente suave de N2. 5. Las placas con los m edios reducidos se inoculan en superficie, de una por vez. en el aire am biente e inm ediatamente se colocan en la tercera jarra, que también se ha llenado con N2. La segunda jarra se usa para guardar algunas placas sacadas de la jarra GasPak que requieran sub­ cultivos. 6 . D espués que la jarra que contiene las placas recién inoculadas se lle­ nan, las placas se pueden transferir a un sistema anaerobio convencio­ nal, com o una jarra GasPak o en una cám ara de anaerobiosis para incu­ bación a 35 °C.

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C A P ÍT U L O 16

Bacterias anaerobias

Debe evitarse la exposición prolongada de las placas recién inoculadas al aire ambiente. Ciertos anaerobios por lo general encontrados en muestras clínicas, como Peptostreptococcus anaerobius, pueden no crecer o mostrar un retraso prolongado en el desarrollo cuando las placas recién inoculadas se mantie­ nen en el aire ambiente por lapsos de tan sólo 2 horas. Así, si no se usa un procedimiento de jarra contenedora, las placas inoculadas deben colocarse de inmediato en un sistema anae­ robio (jarra o cámara de anaerobiosis) para permitir el cultivo eficaz de estos anaerobios. Los medios de tioglicolato enriquecido y de carne picada y glucosa también deben inocularse con muestras clínicas incu­ badas en un sistema anaerobio para permitir el máximo aisla­ miento de anaerobios. También se pueden usar los medios PRAS en tubos con tapones de goma. No es necesario hervir los tubos de tioglicolato enriquecido o caldo de carne picada y glucosa si están preparados en tubos con tapa de rosca bien ajustados y con gas en una cámara después de la esterilización en autoclave. A pesar de que el desarrollo se observa a simple vista, los cultivos en caldo deben mantenerse un mínimo de 5 a 7 días antes de descartarlos como negativos.

Inspección de los subcullivos de colonias Después de la incubación, las placas incubadas en atmósfe­ ras con 5-10% de C 0 2 se deben examinar con lentes de aumen­ to o, de preferencia, con un microscopio de disección. Si se usan jarras anaerobias, se debe usar un sistema de jarra conte­ nedora en el momento de examinar las colonias y subcultivar para reducir la exposición al aire de los aislamientos sensibles al oxígeno. La cámara de anaerobiosis y los sistemas de bolsas (fig. 16-6) permiten la inspección de las colonias en ausencia de aire. El uso de microscopio estereoscópico de disección durante el examen de las colonias es muy útil porque los anaerobios tie­ nen colonias con características distintivas. El microscopio de disección también es una valiosa ayuda durante el subcultivo de colonias para obtener aislamientos puros. Durante la inspección de las colonias se debe registrar cual­ quier acción en el medio, como la hemolisis del agar sangre o la decoloración del agar yema de huevo, así como el tamaño y las características distintivas de las colonias. Las características de las colonias de los anaerobios se ilustran en las láminas en

Agar sangre anaerobio incubado en anaerobiosis

color 16-1, 16-2 y 16-3. Cuando se registran las características, se debe observar lo siguiente: el tiempo transcurrido del culti­ vo y el nombre del medio, el diámetro en milímetros de cada colonia además de su color, características de la superficie (bri­ llantes, opacas), la densidad (mate, translúcida), la consistencia (cremosa, viscosa, membranosa, friable) y otras particularida­ des (véanse caps. 1 y 2). Se deben examinar los frotis teñidos con Gram de las colo­ nias de las placas incubadas en C 0 2 y en anaerobiosis. No hay que presuponer sobre la base del tipo de colonia y de las carac­ terísticas microscópicas solas que las colonias en las placas que han sido incubadas en un sistema anaerobio son anaerobios obligados. Aunque la morfología y las características de las colonias de ciertos anaerobios son distintivas, a menudo es imposible distinguir algunos anaerobios facultativos de los anaerobios obligados sin pruebas de aerotolerancia, incluso cuando las placas incubadas con C 0 2 no muestran crecimiento. Se debe determinar el número de tipos diferentes de colonias en las placas anaerobias y registrar una estimación semicuantitativa del número de cada tipo (escaso, moderado o abundante desarrollo). Con una aguja o una pipeta capilar de Pasteur, se transfiere cada colonia diferente a otra placa de agar sangre para anaerobios para obtener un cultivo puro y a una placa de agar sangre para aerobios para probar la aerotolerancia (descri­ ta más adelante). Si las colonias están bien separadas en la placa de aislamiento primario, se deben inocular en un tubo de caldo enriquecido, como medio de tioglicolato enriquecido o de carne picada y glucosa, para proveer una fuente de inóculo para las pruebas diferenciales. Después de la incubación, los subcultivos en medios de carne picada y glucosa y de tioglicolato enriquecido se tiñen con Gram. Si los microorganismos parecen estar en un cultivo puro, se pueden usar para inocular medios diferenciales apro­ piados para su identificación. Se examinan los cultivos en carne picada y glucosa y en tio­ glicolato enriquecido que fueron inoculados con la muestra ori­ ginal junto con todas las placas de aislamiento primario. Si no existe desarrollo evidente en las placas anaerobias primarias o si las colonias aisladas no corresponden a los tipos morfológi­ cos encontrados en los frotis directos teñidos con Gram de la muestra, cada medio de caldo debe ser subcultivado en dos pla­ cas de agar sangre anaerobio: una para incubación anaerobia y la otra incubada en una estufa con C 0 2al 5-10%. Como alter­ nativa para el subcultivo puede utilizarse una placa con agar chocolate que se incuba en estufa con C 0 2al 5-10%. Estas pla-

Agar sangre aerobio incubado en jarra de anaerobiosis por extinción con vela

F ig u ra 16-8 Técnica de placas en cuadrantes usadas para las pruebas de aerotolerancia de cuatro aislamientos anaerobios. La placa de la izquierda ha sido incubada en una jarra de anae­ robiosis durante 18 a 24 horas, mientras que la placa de la dere­ cha se incubó en una jarra de anaerobiosis por extinción con vela. Los aislamientos A y C son anaerobios obligados. El ais­ lamiento B es anaerobio facultativo. El aislamiento C es un m icroaerófilo o un anaerobio obligado y debe ser probado luego por su capacidad de crecimiento en aire ambiente y comparado con el medioam biente que contiene C 0 2 aumentado. La jarra de anaerobiosis por extinción con vela no es adecuada para probar a Campylobacter jejuni; esta especie crece de m anera óptim a en 5-10% de C O ,, 10% de C O , y 85% de N,.

D e te rm in a c ió n d e las c a ra c te rís tic a s b io q u ím ic a s y d e c u ltiv o p ara la d ife re n c ia c ió n de a is la m ie n to s a n a e ro b io s

as de subcultivo deben examinarse más tarde como ya se desribió.

Pruebas de aerotolerancia Cada tipo de colonia de la placa de aislamiento anaerobio se subcultiva en una placa de agar sangre aerobia (5-10% de C 0 2 o una jarra de anaerobiosis por extinción con vela) y anaerobia para una incubación de toda la noche. Hemophilus influenzae, que se desarrolla en agar sangre anae­ robio en anaerobiosis pero no en agar sangre ordinario en aerobiosis. puede ser confundido con un anaerobio. Esto se puede ev itar mediante la inoculación en una placa de agar chocolate (en lugar de la placa agar sangre aerobia) e incubación en estufa con CO. al 5-10%. Puede ser conveniente inocular los cuadrantes o sextantes de la placa de agar chocolate para probar la aerotole­ rancia de cuatro a seis colonias en una placa de aislamiento pri­ mario (fig. 16-8). Sin embargo, sólo debe hacerse si las colonias están bien separadas o si se seleccionan de una placa pura. O bien, se deben sembrar en estría placas únicas con cada aisla­ miento para transferir un cultivo puro y evitar la contaminación.

Informes preliminares de los resultados Se debe informar al médico de inmediato si se comprobó que los microorganismos son anaerobios obligados, junto con los resultados de la observación de un frotis teñido con Gram y de las características de las colonias. Sin embargo, no se justifica el informe de la presencia de un anaerobio obligado hasta que se hayan completado los estudios de aerotolerancia. Lamentablemente, a menudo se requiere un período de 3 días o más para completar estos estudios. Los médicos deben conocer que ese tiempo prolongado no se puede evitar con algunos anaerobios de crecimiento lento (p. ej., algunas espe­ cies de Actinomycetes y Propionibacterium). Por fortuna, la morfología de las colonias de ciertas bacterias anaerobias a menudo es distintiva, de modo que los informes preliminares o presuntivos de esos aislamientos se pueden hacer antes de los estudios de aerotolerancia. Son ejemplos de ellas, Clostridium perfringens, miembros del grupo Bacteroides fragilis, del grupo Prevotella pigmentada y Porphyromonas, y otras.

con práctica no son difíciles de aislar e identificar. Los micro­ organism os del grupo Bacteroides fragilis, del grupo Prevotella-Porphyromonas pigmentado, F. nucleatum y los cocos anaerobios se aíslan con bastante frecuencia; no obstan­ te, otros anaerobios menos comunes tienen un potencial pato­ génico mayor. Por lo tanto, es importante estar familiarizado y ser capaz de reconocer a: Actinomyces israelii, A. naeslundii, A. meyeri, Propionibacterium propionicum y Bifidobacterium dentium (antes B. eriksonii), que pueden ser causa de enferme­ dades inflamatorias crónicas y agudas graves; Prevotella bivia y P. disiens, por lo común resistentes a varias penicilinas y cefalosporinas; Fusobacterium necrophorum (que puede ser altamente virulento); F. mortiferum y F. varium, que varían en su sensibilidad a ciertas penicilinas, cefalosporinas y clindami­ cina; C. septicum, microorganismo asociado con frecuencia con carcinoma de colon o neoplasia hematopoyética cuando se aísla en la sangre de esos pacientes; los clostridios “histotóxicos”, además de C. perfringens, que pueden causar gangrena gaseosa y varias infecciones de heridas; C. difficile, la causa principal de diarrea y colitis asociada con antibióticos, y C. tetani y C. botulinum debido a las enfermedades que provoc a n _7,10,69.125

Los laboratorios de referencia suelen usar numerosas series de pruebas en la caracterización de aislamientos anaerobios mencionados para la identificación o confirmación, las cuales se enumeran en el recuadro 16-7. Además, se están recono­ ciendo nuevas especies mediante métodos quimiotaxonómicos y estudios de genética molecular. Los datos derivados de la caracterización de cultivos con un gran número de pruebas han proporcionado bases de datos valiosas para recopilar cuadros de características diferenciales, como los publicados por los CDC, el Virginia Polytechnic Institute (VPI), la State University y los Wadsworth Anaerobe Laboratories.53-107 125-259 Sin embargo, en la mayoría de los laboratorios diagnósticos no es práctico o factible desde el punto de vista económico usar un gran número de medios diferenciales y determinaciones bio­ químicas para identificar aislamientos en muestras clínicas. Por fortuna, ciertas características (recuadro 16-8) son muy útiles en la identificación de anaerobios. Estas características forman la base de una aproximación práctica para identificar aislamientos anaerobios que se encuentran con mayor frecuen­ cia en el laboratorio clínico y de otras especies menos comunes o patógenos potenciales importantes, incluso raros.

Determinación de las características bioquímicas y de cultivo para la diferenciación de aislamientos anaerobios Una vez confirmada la presencia de anaerobios por las prue­ bas de aerotolerancia y que se ha informado una descripción de las características morfológicas, la próxima prioridad es identi­ ficar el cultivo puro aislado del modo más rápido y exacto posi­ ble e informar los resultados al médico dentro de un tiempo apropiado. Aunque en la actualidad los taxonomistas recono­ cen más de varios cientos de especies de anaerobios, la tarea de identificar anaerobios para el microbiólogo clínico no es tan compleja como podría parecer porque sólo un pequeño núme­ ro de especies participan en infecciones anaerobias con alguna frecuencia.69125 Identificación presuntiva

Casi todos los aislamientos clínicamente significativos son anaerobios obligados moderados o anaerobios aerotolerantes, y

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Recuadro 16-7

C aracterización de bacterias anaerobias

Relación con el oxígeno M orfología de las colonias Reacción de tinción de Gram Rasgos m icroscópicos M ovilidad Desarrollo en medio líquido Pruebas bioquímicas Productos metabólicos (CGL) Sensibilidad a los antibióticos Pruebas serológicas Toxicidad, neutralización de toxinas, patogenicidad en animales Electroforesis en gel de poliacrilam ida de proteínas solubles Acidos grasos de cadena larga de la pared celular; menaquinonas

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C A P ÍT U L O 16

Recuadro 16-8

Bacterias anaerobias

A lg unas características principales de los anaerobios

Relación con el oxígeno C aracterísticas de las colonias Pigmentos Hemolisis Hoyuelos en el medio Reacción con la tinción de Gram M orfología Esporas M ovilidad Flagelos Otras Desarrollo en caldo tioglicolato, catalasa, lecitinasa, lipasa; reacciones en medio lácteo; producción de indol; hidrólisis de almidón, esculina y gelatina; reducción de nitrato; ferm entación de hidratos de carbono cla­ ves (p. ej., glucosa, manitol, lactosa, ramnosa); desarrollo en presencia de bilis, penicilina, rifam picina y kanamicina; inhibición por polianetol­ sulfonato de sodio; producción de toxinas; productos metabólicos.

Usos de medios de agar diferenciales

Se pueden obtener varias características valiosas para la identificación de bacterias anaerobias a partir de cultivos puros en agar sangre para anaerobios de los CDC y en medio de tio­ glicolato enriquecido. Estas características, señaladas en el cuadro 16-7, proveen datos importantes para la diferenciación de anaerobios en general. Se determinan características adicio­ nales mediante el uso de discos diferenciales, que se agregan a placas de agar sangre para anaerobios recién inoculadas. Los discos de 2-U de penicilina, de 1 000 ug de kanamicina y de 15 pg de rifam picina (Becton Dickinson M icrobiology Systems) ayudan a la diferenciación de bacilos gramnegativos, no formadores de esporas, anaerobios. Los discos de colistina y vancomicina también pueden ser muy útiles.125 La prueba con disco de polianetolsulfonato de sodio es una forma práctica de separar Peptostreptococcus anaerobius de otros cocos anaero­ bios. Para demostrar la reducción de nitrato conviene incluir una prueba con disco de nitrato durante el procesamiento de las bacterias anaerobias (en general). PLACAS PRESUMPTO

Dowell, Lombard y cois, crearon tres tipos de placas en cua­ drantes (Presumpto 1, 2 y 3) que contienen 12 medios agar diferenciales en un sistema que permite la determinación de 20 características diferentes (cuadro 16-7) de aislamientos anaero­ bios a un mínimo costo.55 La información derivada de usar las placas de tres cuadrantes, junto con las otras características obtenidas de agar sangre anaerobio y medio de tioglicolato enriquecido más el análisis del producto metabólico usando GLC permite la identificación definitiva de muchas bacterias anaerobias significativas que se encuentran en el laboratorio. Además, las placas en cuadrantes, en especial las placas Presumpto 1 y 2, se pueden usar para suplementar a varios de los equipos comerciales, tanto como a los sistemas de identifi­ cación en caldo tradicional, con pruebas o características importantes de los que esos sistemas sin agar carecen.

El medio básico en el sistema de placa en cuadrantes Pre­ sumpto es el medio de Lombard-Dowell (LD). El agar LD es un medio especialmente diseñado para el desarrollo de una amplia variedad de anaerobios, incluidos algunos con requerimientos nutricionales especiales. Es notable que el caldo LD (el mismo medio sin agar o con sólo una pequeña cantidad) es el caldo de inoculación para el Minitek® (Becton Dickinson Microbiology Systems) y los sistemas API® (BioMérieux-Vitek).8 La placa Presumpto 1 es una placa de Petri de cuatro cua­ drantes que contiene los siguientes medios: agar LD, agar escu­ lina LD, agar yema de huevo LD y agar bilis LD. Dowell y Lombard de los CDC publicaron por primera vez los detalles del uso de esa placa.54 En principio, se usó para la identifica­ ción presuntiva de Bacteroides y Fusobacterium (sin placas de Presumpto 2 y 3), pero desde entonces ha sido útil para la iden­ tificación de otras bacterias anaerobias. La placa Presumpto 2 contiene agar glucosa LD, agar DNA LD agar leche LD y agar almidón LD. Es útil para la caracteri­ zación de clostridios, bacilos grampositivos y gramnegativos no formadores de esporas anaerobios y cocos anaerobios. Como la placa Presumpto 1, puede usarse junto con micrométodos envasados comerciales que carecen de las pruebas que contiene o junto con pruebas convencionales en tubo. La placa Presumpto 3 contiene agar gelatina LD, agar mani­ tol LD agar lactosa LD y agar ramnosa LD. El uso del agar gelatina LD y de hidratos de carbono en esta placa en cuadran­ tes ya se describió.55 Las características que se pueden determinar con cada una de las tres placas en cuadrantes se muestran en el cuadro 16-7. Las formulaciones y la preparación de los medios y reactivos usados en el sistema de placa en cuadrantes se brindan en deta­ lle en otra parte.8,259 Inoculación y lectura de las placas Presumpto. Los procedimientos para la inoculación de los medios en las placas en cuadrantes Presumpto, el método de incubación y el uso de pruebas con discos de antibióticos e inhibitorias diferenciales se reseñan en el recuadro 16-9. Observación e interpretación de los resultados Después de la incubación, se examinan las placas en cuadrantes y las placas de agar sangre para anaerobios que contienen los discos anti­ bióticos y los discos de diferenciación de SPS y nitrato. Placa en cuadrantes Presumpto I (lám ina en color 16-5) A gar L D Se observa y registra el grado de desarrollo en agar

LD (escaso, moderado, abundante). Se prueba para indol con el agregado de dos gotas de reactivo para-dimetilaminocinamaldehído a un disco de papel sobre el medio. Se observa el desa­ rrollo de color azul o verde-azulado en el disco dentro de los 30 segundos, que es una reacción positiva para indol. El desarro­ llo de otro color (rosa, rojo, violeta) o sin color es una reacción negativa para indol. Un color lavanda a violeta indica una reac­ ción positiva para los derivados del indol. A gar yem a de huevo L D La formación de una zona de pre­ cipitado insoluble en el medio alrededor de las colonias bacte­ rianas indica una reacción positiva para la producción de leci­ tinasa. Esto se observa mejor con luz transmitida. La presencia de un brillo iridiscente (una capa nacarada sobre la superficie de las colonias y en el medio alrededor de las colonias bacterianas, más evidente con luz reflejada) indica producción de lipasa. Si la reacción es dudosa, se agregan unas gotas de agua y se busca una película que flota en la parte supe­ rior del agua. La decoloracion del medio en la vecindad del desarrollo bac­ teriano indica proteólisis, como lo demuestran ciertos clostri­ dios proteolíticos.

D e te rm in a c ió n de las c a ra c te rís tic a s b io q u ím ic a s y de c u ltiv o p a ra la d ife re n c ia c ió n de a is la m ie n to s a n a e ro b io s

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Cuadro 16-7 M edios y característica s de los cultivos que pued en d e te rm in arse con la utilización de m edios d iferen ­ ciales de a g a r p a ra la identificación de anaerobios M E D IO S

C A R A C T E R IS T IC A S

A gar sangre

Relación con el O / , características de la colonia, hemolisis, pigm ento, fluorescencia con luz UV (lám para de Wood), hoyuelos en el agar, m orfología celular, reacción de tinción de Gram, espo­ ras, m ovilidad (m ontaje húm edo); inhibición por penicilina, rifam picina y kanam icina

M edio de tioglicolato enriquecido

A parición del desarrollo, rapidez de crecimiento, producción de gas, olor, m orfología celular

Placa Presumpto 1 A gar LD A gar esculina LD A gar yem a de huevo LD A gar bilis LD

Indol, desarrollo en medio LD, catalasa 6 Hidrólisis de esculina, H 2S, catalasa Lipasa, lecitinasa, proteolisis Desarrollo en presencia de 20% de bilis (2% de bilis bovina), precipitado insoluble debajo y alre­ dedor del desarrollo

Placa Presum pto 2 A gar glucosa LD A gar almidón LD A gar leche LD A gar DNA LD

Ferm entación de glucosa; estim ulación del desarrollo por hidratos de carbono ferm entables Hidrólisis de almidón Hidrólisis de caseína Actividad de desoxirribonucleasa

Placa Presum pto 3 A gar manitol LD A gar lactosa LD A gar ram nosa LD Gelatina LD

Ferm entación de manitol Ferm entación de lactosa Ferm entación de ram nosa Hidrólisis de gelatina

" Por comparación de desarrollos en placa anaerobia con agar sangre (o agar chocolate) incubada en incubador de 5-10% de C 02 (o jarra de anaerobiosis por extinción con vela) o en aire ambiente. bLa prueba de catalasa puede realizarse por agregado de peróxido de hidrógeno al 3% al desarrollo en agar LD, pero las reacciones de cultivos catalasa positiva son más vigorosas en agar esculina LD.

Agar esculina LD Una prueba positiva para la hidrólisis de esculina se indica por la aparición de un tono marrón rojizo a marrón oscuro en el agar esculina alrededor de las colonias bacterianas después de exponer al aire el cultivo en placa en cuadrantes durante al menos 15 minutos. El examen del cua­ drante de agar esculina bajo la lámpara de Wood puede dar información adicional de la hidrólisis de esculina. El agar escu­ lina exhibe un brillo azul fluorescente bajo la luz ultravioleta que no aparece después que la esculina se hidroliza. El ennegrecimiento de las colonias bacterianas en el agar esculina indica la producción de H2S. El ennegrecimiento se disipa muy rápido después de la exposición al aire. Por lo tanto, el desarrollo bacteriano debe observarse por el ennegrecimiento en condiciones anaerobias (cámara anaerobia) o inmediata­ mente después de abrir las jarras anaerobias al aire. Para probar la degradación de peróxido de hidrógeno como una indicación de catalasa se exponen las placas al aire al menos 30 minutos y luego se inunda el cuadrante de agar esculina con unas gotas de H20 2 al 3% fresca. Un burbujeo persistente después de la adi­ ción de H 20 2 es una reacción positiva para catalasa. En algunos casos, el burbujeo rápido puede no ser evidente hasta después de 30 segundos a un minuto. Agar bilis LD Se compara el grado de crecimiento bacte­ riano en el agar bilis LD con el del agar LD común y se regis­ tra como I (crecimiento menor que en el control agar LD) o E (crecimiento igual o mayor que en el agar control LD). Usando luz trasmitida, se observa la presencia o la falta de un precipi­ tado blanco insoluble debajo o alrededor del desarrollo bacte­

riano. En caso de duda, se inspecciona bajo un estereomicroscopio usando luz transmitida.

Placa en cuadrantes Presumpto 2 (lám ina en color 16-5) Agar glucosa LD La fermentación de la glucosa se indica por la producción de ácido o por un color amarillo donde hay desarrollo en el medio de cultivo y alrededor de esas zonas. Un color azul alrededor del desarrollo es una reacción negativa. Algunas bacterias reducen el indicador, por lo tanto, a veces es necesario irrigar el cuadrante con reactivo azul de bromotimol diluido para observar si se ha producido ácido. La estimulación con glucosa puede observarse por compara­ ción de la cantidad de desarrollo en agar glucosa LD con el del agar LD común. Agar almidón LD Para detectar la hidrólisis de almidón, se irriga el cuadrante con solución yodada de Gram; la decolora­ ción alrededor del desarrollo indica una reacción positiva. Un color pardusco indica almidón no hidrolizado y una reacción negativa. Agar leche LD Una zona clara alrededor del desarrollo en el cuadrante indica la hidrólisis de la caseína (la digestión de las proteínas de la leche) y una reacción positiva. Si la caseína no se hidroliza, el medio permanece turbio (reacción negativa). Agar DNA LD Una zona rosada a rojiza alrededor del desa­ rrollo en el cuadrante indica una reacción positiva para la degradación de DNA (actividad de desoxirribonucleasa). Si el medio permanece azul alrededor del desarrollo, el DNA no se degradó y la reacción es negativa.

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C A P ÍT U L O 16

Recuadro 16-9

Bacterias anaerobias

U so de las placas en cuadrante Presum pto

1. Preparar el inoculo a partir del desarrollo de un cultivo puro del aisla­ miento anaerobio. Usar una suspensión celular túrbida (M cFarland 3) en caldo LD preparada a partir de colonias aisladas o un subcultivo en m edio de tioglicolato enriquecido de 24 a 48 horas de una colonia ais­ lada (tam bién se puede usar un subcultivo en caldo de glucosa y carne picada de 24 a 48 horas). 2. Inocular las placas cuadrantes com o sigue: a. Saturar un hisopo estéril (para cada placa cuadrante que se inocule) en la suspensión celular o en el cultivo en caldo. b. Sem brar en estría la porción m edia de cada cuadrante con el hisopo que contiene bacterias. 3. Colocar un disco de papel de 1.25 cm de diámetro, blanco y estéril sobre el agar LD cerca de la periferia externa del cuadrante. Este disco se usa para la prueba de indol después de la incubación de las placas. Además de montar las placas Presumpto, también: 1. Inocular la superficie de una placa de agar sangre con un hisopo estéril em bebido en la suspensión celular o en el cultivo en caldo. 2. Colocar los discos de antibióticos (penicilina. 2 U; rifampicina. 15 Jig; kanam icina, 1 000 ¡ig) en el agar sangre con pinzas estériles. Espaciar los discos de tal modo que la superposición de las zonas de inhibición no sea un problema. 3. Colocar los discos de polianetosulfonato de sodio (SPS) y nitrato en una segunda placa de agar sangre anaerobio, si se usan adem ás de los discos de antibióticos. Para preparar el disco de SPS, pipetear 20 ¡iL de SPS al 5% (disponible en Anaerobe Systems [Morgan Hill, CA] y Remel [Lenexa, KS] en discos blancos estériles de 0,635 cm (Becton D ickinson [BD], Sparks, MD) y secar. Los discos de SPS son estables a tem peratura ambiente por 6 meses. Para preparar el disco de nitrato, disolver 30 g de KNO , y 0.1 g de m olibdato de sodio (N a,M o 0 4 ■ 2 H ,0 ) en 100 mL de agua destilada y esterilizada por filtración usando un filtro de m em brana de 0,45 (im. Luego, agregar 20 )iL de este reac­ tivo a los discos blancos, estériles de 0,635 cm y secar a temperatura ambiente por lo m enos 72 horas.

Placa en cuadrantes Presumpto 3 Agar gelatina L D Para detectar la hidrólisis de la gelatina, se irriga el cuadrante con reactivo cloruro de mercurio acidifi­ cado. Este reactivo se une a la gelatina no hidrolizada. Una zona de aclaramiento completo alrededor del desarrollo en el cuadrante indica que la gelatina ha sido hidrolizada y se regis­ tra como una prueba positiva. Agar manitol L D , agar lactosa L D y agar ramnosa L D Se examinan e interpretan estos cuadrantes como se describió para el agar glucosa LD.

PLACAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS

Inhibición del desarrollo en agar sangre para anaerobios con antibióticos PRUEBAS con discos. Las zonas de inhibición alrededor de los discos de antibióticos se observan y registran como sigue: Penicilina, disco de 2 U: sensible (S) si la zona de inhibición de desarrollo es > 12 mm de diámetro; resistente (R) si la zona es < 12 mm. Rifampicina, disco de 15 |ig: sensible (S) si la zona de inhi­ bición del desarrollo es > 15 mm; resistente (R) si la zona es < 12 mm.

Kanamicina, disco de 1 000 g: sensible (S) si la zona de inhi­ bición de desarrollo es > 12 mm; resistente (R) si la zona es < 1 2 mm.

Uso de pruebas de SPS y de nitrato con discos Prueba de SPS con disco Medir la zona de inhibición alre­ dedor del disco de 6 mm. Una zona de inhibición > 1 2 mm se registra como sensible. Prueba de nitrato con disco Prueba para la reducción de nitrato mediante el agregado de una gota de reactivo A para nitrato (ácido sulfanflico) y una gota de reactivo B (ácido 1,6 de Cleave) al disco.125 Un color rosa o rojo indica que el nitrato ha sido reducido a nitrito. Si el disco estaba incoloro después del agregado de los reactivos A y B, se esparce polvo de cinc en el disco para confirmar una reacción negativa. El desarrollo de color rojo después que se agrega el polvo de cinc confirma que el nitrato todavía está presente en el disco (reacción negativa). En los cuadros 16-14 al 16-16 y 16-18 al 16-25 se resumen las características para la identificación de varias especies de anaerobios usando pruebas diferenciales en los medios de agar. El agar sangre para anaerobios, las placas en cuadrantes Presumpto y otros medios descritos en esta sección se venden en el comercio (Remel) o se pueden preparar en el laboratorio. Los detalles para la preparación de los medios y los reactivos se pueden encontrar en ediciones previas de este libro y en otros sitios.53,55-56 Si se preparan en el propio laboratorio, exis­ te la opción de poner un único medio diferencial en una placa y no usar placas de Petri de cuatro cuadrantes. Esta modalidad de mayor flexibilidad es apropiada para los microbiólogos que prefieran usar otras combinaciones de pruebas. Caracterización de anaerobios usando pruebas bioquímicas convencionales en tubos grandes

No es posible tratar en este libro todos los procedimientos disponibles para la caracterización bioquímica de anaerobios. Los procedimientos convencionales de cultivo en tubo se des­ criben en forma breve más adelante. Para más detalles, recurrir a los manuales de laboratorio en bacteriología de anaero­ bios.53’107-125’179 En lugar de utilizar las pruebas diferenciales descritas para medios con agar, se puede usar el medio PRAS en tubos gran­ des para determinar las características bioquímicas. Éstos se inoculan mediante un diafragma de goma en tubos Hungate o mediante un dispositivo especial que emite de gas de acuerdo con los procedimientos del manual VPI.107179 Los medios PRAS se pueden preparar en el laboratorio u obtener en el comercio. Si se los usa para la caracterización de los aisla­ mientos, también se pueden usar las tablas de Holdeman, Moore y cols.107'109’112’179 El pH de las pruebas de fermentación de hidratos de carbo­ no basadas en medios con peptona y extracto de levadura (PY), prerreducido antes de esterilizar (PRAS) se determina directa­ mente usando un pHímetro; se inserta un electrodo de combi­ nación delgado y largo en cada tubo de cultivo. De acuerdo con el manual VIP, el pH 5,5 a 6 se registra como ácido débil, mien­ tras que el pH por debajo de 5,5 es ácido fuerte. Nótese que el pH de los cultivos de hidratos de carbono en PY se deben com ­ parar con los cultivos en medios PY comunes (sin hidratos de carbono). El pH del caldo PY oscila entre 6,2 y 6,4 cuando se inocula bajo CO,. También, algunos microorganismos pueden producir ácido de peptonas en un medio PY com ún.107Además, el pH de PRAS PY- arabinosa, PY-ribosa o PY-xilosa sin ino­ cular puede ser tan bajo como 5,9 después que el medio se ha

D e te rm in a c ió n de las c a ra c te rís tic a s b io q u ím ic a s y d e c u ltiv o p a ra la d ife re n c ia c ió n de a is la m ie n to s a n a e ro b io s

—^atenido durante 1 a 2 días bajo una atmósfera de C 0 2; así, el pH de los cultivos en esos medios no se interpreta como ácido a menos que sea inferior a 5,7.107 Los medios convencionales de Dowell y cois, se comerciali­ zan en tubos con tapa de rosca de 15 mm x 90 mm (Remel, Lenexa, KS). Los detalles de la preparación y el uso de esos —¿dios se publican en otra parte.53 Cuando se usan estos me­ dios diferenciales, deben consultarse los cuadros de identifica­ ción de Dowell y Hawkins.53 Con cualquiera de los sistemas convencionales VPI o CDC, las reacciones bioquímicas pueden leerse después de la incubación de toda la noche en ciertos cul­ tivos anaerobios de crecimiento rápido (p. ej., algunos B.fragis y clostridios) o se observa un buen desarrollo más tarde (por 1:>general 48 horas y más para especies de crecimiento lento). Las pruebas de fermentación se leen mediante el uso de azul de bromotimol (amarillo a pH 6) o usando un pHímetro (un pH por debajo de 6 se considera ácido). En nuestra experiencia, ¿Igunos de los llamados sistemas de micrométodos rápidos no son en verdad más rápidos. Procedimientos alternativos

El uso de medios convencionales en tubos de Hungate o en otros tubos grandes insume un tiempo considerable y los medios son costosos para preparar o comprar. Como alternati­ va a los medios y métodos convencionales, así como al sistema de placas en cuadrantes Presumpto, se describieron diversos procedimientos para la caracterización e identificación de ais­ lam ientos y esquem as de identificación alternativos.810 Algunos contienen volúmenes más pequeños de medios en envases que pueden ser manipulados con razonable velocidad en la mesada del laboratorio. Una de las propuestas alternativas más populares ha sido la prueba para ciertas características cla­ ves de aislamientos en medios de agar diferencial (p. ej., agar esculina bilis Bacteroides; Anaerobe Systems®, Morgan Hill, CA). Otra ha sido el uso de discos impregnados con antibióti­ cos o varios otros químicos para probar la inhibición del desa­ rrollo o su estimulación. Otra propuesta excelente ha sido el uso de pequeños comprimidos (p. ej., WEE-TABS®, Key Scientific Products, Round Rock, TX) para determinar ciertas reacciones enzimáticas de sustrato cromogénico. WEE-TABS se han usado como pruebas suplementarias o solas para dife­ renciar varios anaerobios. Los detalles de su uso y las descrip­ ciones de varias otras pruebas para la caracterización de aisla­ mientos anaerobios se encuentran en el Wadsworth Anaerobic Bacteriology M anual125 y han sido revisados en otros sitios.8 LA PRUEBA DE NAGLER Y LA PRUEBA DE CAMP PARA C. PERFRINGENS

Históricamente, la prueba de Nagler se usó para la identifi­ cación presuntiva de Clostridium perfringens. Aunque la mayoría de los clostridios aislados en el laboratorio clínico que dan una reacción positiva son C. perfringens, la antitoxi­ na usada en la prueba no es específica. C. bifermentans, C. sordellii, y C. barattii (antes C. paraperfringens) también se sabe que son Nagler positivos y son necesarias otras pruebas para separarlos. Durante los últimos años, la popularidad de la prueba de Nagler ha disminuido porque no se dispone de la an­ titoxina. Los detalles que describen la prueba de Nagler se hallan en las ediciones previas de este libro. Una alternativa a la prueba de Nagler, usada en algunos la­ boratorios, es la llamada prueba de CAM P inversa.35 Para rea­ lizar la prueba, se inocula una placa de agar sangre para anae­

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robios con una sola estría de un microorganismo desconocido que posiblemente sea una cepa de C. perfringens. Luego, se efectúa una única estría a un ángulo de 90° a la distancia de 12 mm de la prim era estría, usando un inóculo de un Streptococcus p-hemolítico del grupo B. Una punta de flecha de hemolisis sinérgica, con el extremo de la flecha señalando desde Streptococcus hacia C. perfringens, es una prueba posi­ tiva. Pueden ocurrir resultados falsos negativos y falsos positi­ vos. Se necesitan más datos sobre la especificidad de esta prueba para los aislamientos clínicos de C. perfringens. Según nuestro punto de vista, la mayoría de los laboratorios experi­ mentados en bacteriología de anaerobios y en las característi­ cas de los cultivos y morfológicas adicionales de C. perfrin­ gens pueden recobrar el uso de la prueba de Nagler y la prue­ ba de CAMP inversa, por lo que quizá sea innecesaria una prueba “nueva”. Microsistemas comerciales

Dos equipos de micrométodos comerciales creados en la dé­ cada de 1970 se continúan usando a través de los años en los laboratorios de microbiología clínica para la identificación de anaerobios: el API-20A® (BioMérieux-Vitek) y el Minitek® (Becton Dickinson Microbiology Systems). La construcción y el uso de estos sistemas han sido repasados por Stargel y cois.233 Equipos comerciales para la identificación de anaerobios después de 4 horas de incubación aerobia

Varios fabricantes han comercializado equipos completos que prueban enzimas preformadas. La mayoría de estos siste­ mas utilizan una serie de sustratos cromogénicos para probar en forma rápida diversas aminopeptidasas y glucosidasas. Cada sistema requiere la preparación de una suspensión celular car­ gada a partir de la superficie de un cultivo puro en placa. Estos equipos permiten a los microbiólogos determinar múltiples características enzimáticas de un cultivo puro aislado después de 4 horas o menos de incubación aerobia. Excepto el equipo API-ZYM®,8,233 todos estos sistemas comerciales proveen códi­ gos numéricos, bases de datos en el ordenador y cuadros de identificación para ayudar a la identificación una vez que ha sido caracterizado usando el sistema. La lista de productos incluye los siguientes: API An-Ident® (BioMérieux-Vitek) API-ZYM® (BioMérieux-Vitek) Crystal Anaerobe Identification System® (Becton Dickinson Microbiology Systems) MicroScan Rapid Anaerobe Panel® (Dade Behring Microscan) RaplD-ANA II® (Remel) Rapid ID 32A® (BioMérieux-Vitek) Vitek Anaerobe Identification (ANI) Card® (BioMérieuxVitek) Estos equipos son populares entre los microbiólogos y se están utilizando ampliamente en los laboratorios de microbio­ logía diagnóstica. En general, son de uso simple e insumen menos tiempo que los métodos convencionales. En otro sitio se describe con detalles cada uno de los sistemas, incluidos los sustratos, los procedimientos de uso, la interpretación de los re­ sultados de la prueba y un tratamiento de las evaluaciones del desempeño.8 Todos los microsistemas comerciales menciona­ dos con anterioridad deben suplementarse con otras pruebas para la identificación definitiva y exacta de los grupos de ana­

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C A P ÍT U L O 16

Bacterias anaerobias

erobios seleccionados (p. ej., el uso de agar yema de huevo y cromatografía gas-líquido [CGL] para clostridios además de para C. perfringens', el uso tanto de medios sólidos como líqui­ dos para desarrollos rápidos, varias pruebas suplementarias adicionales, más CGL para los bacilos grampositivos anaero­ bios no formadores de esporas; el uso de 20% de bilis, esculi­ na, de pruebas de hidratos de carbono seleccionados para espe­ cies de Bacteroides, el uso de CGL y reacciones en yema de huevo para la diferenciación de especies de Fusobacterium, así como pruebas adicionales para otros anaerobios). Por supues­ to, es necesario observar e interpretar correctamente las reac­ ciones de Gram, la morfología de las colonias y los resultados de las pruebas de aerotolerancia y usar siempre cultivos puros cuando se intenta diferenciar anaerobios con sistemas comer­ ciales. Cuando un equipo produce una identificación de una especie rara, no se la debe aceptar sin repetir las pruebas con procedi­ mientos alternativos o quizá con la confirmación de un labora­ torio de referencia cuando sea clínicamente importante.

Determinación de productos metabólicos por cromatografía de gas-liquido El análisis de los productos metabólicos por CGL es un pro­ cedimiento práctico y poco costoso que es realizado con facili­ dad por el personal de laboratorio.217 Los productos metabólicos, liberados en el medio de cultivo en caldo durante el desarrollo anaerobio, son características claves de las bacterias anaerobias y de muchas bacterias anaerobias facultativas. Junto con la determinación de la relación con el oxígeno, la mayoría de los anaerobios se pueden identificar hasta la categoría de género sobre la base de la presencia o ausencia de esporas, la reac­ ción de Gram, la m orfología celular y los resultados del aná­ lisis por CGL. Esta técnica mejora la velocidad y precisión de la identificación y disminuye los costos a causa del ahorro de tiem po.180 Como ya se mencionó, los anaerobios facultativos usan res­ piración aerobia en su producción de energía a partir de la glu­ cosa, pero además pueden obtener energía por reacciones de fermentación. Los anaerobios obligados son similares a los anaerobios facultativos con respecto a las vías usadas para las reacciones de fermentación. Como los aerobios obligados y los anaerobios facultativos, algunos anaerobios obligados también usan respiración anaerobia como manera de obtener energía; sin embargo, los anaerobios obligados no usan respiración aerobia y para ellos el oxígeno no es el aceptor final de elec­ trones. Muchos anaerobios obligados aislados en el laboratorio clínico, cuando se desarrollan en un medio líquido que contie­ ne glucosa, producen piruvato de la glucosa por la vía de Embden-M eyerhof y por otras vías. Sin embargo, muchas bac­ terias anaerobias obtienen energía en medios deficientes en glucosa u otros hidratos de carbono mediante la fermentación de uno o más aminoácidos. Por ejemplo, Clostridium sporogenes fermenta alanina y glicina (reacción de Strickland) para producir acetato, C 0 2 y NH3.163 Existe una relación directa entre las cantidades de peptona y glucosa en un medio y la pro­ ducción de ácidos grasos de cadena corta ramificados (p. ej., isobutirato, isovalerato, isocaproato) por ciertos anaerobios.152 Los productos de fermentación producidos por las bacterias a partir de compuestos orgánicos, como el ácido pirúvico, varían entre los diferentes géneros y especies de anaerobios obligados y entre microorganismos anaerobios facultativos

Los patrones de fermentación de microorganismos se han usado durante mucho tiempo para determinar grupos taxonó­ micos.163 Ciertas levaduras, como Saccharomyces, llevan a cabo una fermentación alcohólica en la que los productos meta­ bólicos se componen principalmente de etanol y C 0 2. Las bac­ terias ácido lácticas, que incluyen el género Lactobacillus y Streptococcus, son bien conocidas por sus patrones caracterís­ ticos de fermentación en los que acumulan ácido láctico como producto principal. Escherichia coli y ciertas Enterobacte­ riaceae se caracterizan por su fermentación ácida mixta en la cual se forman en cantidades significativas acetato, lactato y succinato junto con etanol, C 0 2 e H 2. Otros miembros de Ente­ robacteriaceae, por ejemplo, Enterobacter aerogenes, produ­ cen un tipo de fermentación con producción de butanodiol; los principales son 2,3-butanodiol, etanol, C 0 2 e H2, y se forman pequeñas cantidades de acetato, lactato y succinato. La presen­ cia de este tipo de fermentación se determina en forma ordina­ ria en el laboratorio clínico por la prueba de Voges-Proskauer (véase cap. 6). La fermentación ácido butírica, en la cual se producen ácido butírico, cantidades limitadas de ácido acético, COz e H2, se lleva a cabo por ciertas especies de Clostridium (p. ej., C. butyricum). El patrón de fermentación ácido butíri­ co permite establecer uno de los casi 14 grupos o subdivisio­ nes de este género sólo sobre la base del análisis del producto metabólico. Por otro lado, muchos de los otros géneros de ana­ erobios han sido definidos de acuerdo con un patrón metabó­ lico único (p. ej., ácido propiónico para el género Propioni­ bacterium). Las definiciones de géneros basadas en vías metabólicas tie­ nen un sustento científico porque las vías metabólicas repre­ sentan rasgos conservados o genéticamente estables de las bac­ terias.180 Los esquemas de los cuadros 16-8 y 16-9 ilustran el valor del análisis de los productos metabólicos ácidos para la diferenciación de los géneros de bacterias anaerobias. Aunque el análisis por CGL no es obligatorio para la identi­ ficación presuntiva del grupo B. fragilis, de los bacilos gram­ negativos anaerobios pigmentados, F. nucleatum, C. perfrin­ gens, P. anaerobius y unos pocos anaerobios aislados por lo común de muestras clínicas, es necesario para la identificación definitiva de muchas especies de Bacteroides y Fusobacterium, para la mayoría de Actinomyces, Bifidobacterium, Clostridium, Eubacterium, Lactobacillus, Propionibacterium y para casi todos los cocos anaerobios.217 Los cromatógrafos gaseosos son relativamente económicos, seguros, simples de operar y confiables y los fabrican varias com­ pañías de instrumentos científicos. El equipamiento y los proce­ dimientos para la determinación de productos metabólicos por CGL se describen con más detalle en otra parte.53 107 125’152-180-217 Identificación de ácidos grasos volátiles

La CGL se usa para identificar ácidos grasos de cadena corta que son solubles en éter. Los ácidos detectados con este proce­ dimiento son: el acético, propiónico, isobutírico, butírico isovalérico, valérico, isocaproico y caproico. El procedimiento se explica en el recuadro 16-10. Los ácidos grasos volátiles se pueden identificar por compa­ ración de los tiempos de elusión de los productos en los extrac­ tos con los de una m ezcla de ácidos conocidos (estándar de ácidos grasos volátiles) cromatografiados en las mismas condi­ ciones el mismo día. En la figura 16-9 se muestra un trazado estándar representativo y en las figuras 16-10, 16-11 y 16-12 se presentan ejemplos de los resultados de la CGL en tres aisla­ mientos anaerobios.

D eterm inación de productos m etabólicos por crom atografía de gas-líquido

Cuadro 1 6-8

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Diferenciación de géneros de bacilos bacilo(s) gramnegativos anaerobios no formadores de esporas

I. No móviles o móviles con flagelos peritricosos; bacilos cocobacilares o rectos A. Propuesta por Shah y Collins 2 1 0 para incluir sólo las especies resistentes a bilis y altam ente fermentativas que se asemejan a B. fragilis (B. distasonis, B. caccae, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. merdae, B. vulgatus, B. uniformis, B. eggerthii y B. stercoris). Otras especies continúan en este género; son necesarios más estudios para determ inar su ubicación correcta (p. ej., B. capillosus, B. coagulans, B. cellulosolvens, B. pectinophilus, B. tectum, B. ureolyticus y otras) Hasta que no se traslade el últim o grupo este género continuará siendo heterogéneo B. A m enudo colonias pigmentadas de negro; produce ácidos acético, butírico y succínico, con cantidades m enores de ácidos propiónico, isobutírico e isovalérico. Todas son asacarolíticas e indol positivas C. Colonias no pigm entadas a pigm entadas; inhibidas por bilis y sacarolíticas; por lo general m icroflora bucal D. Resistente a bilis, catalasa positiva, reduce nitrato y ureasa positiva E. Encontradas com o parte de la flora hum ana normal, pero rara vez en m uestras clínicas seleccionadas en form a adecuada

Bacteroides0

Porphyromonasb Prevotella“ Bilophilab Alistipesc Anaerostipesc Anaerorhabdus‘ Catonellac CetobacteriumL Dialiste f Faecalibactef Fihrohactef Johnsonella Megamonasc Mitsuokellac Oxalobacter1 Sneathiac Sutterellac Tannerellac Tissierellac

F. Encontradas en anim ales y en la naturaleza

Dichelobactef Pectinatusc Rikenella1 Roseburiac Ruminobactef Sebaldella0

G. Produce grandes cantidades de ácido butírico (pero muy poco o nada de isoácido) com o el principal producto metabólico; no se produce ácido succínico; todas las especies son no móviles H. El ácido láctico es el principal y único producto; L. buccalis, la única especie, es no móvil I. El ácido acético es el principal producto metabólico ácido; produce sulfuro de hidrógeno; reduce sulfato; D. pigra, la única especie, es no móvil Móvil, no producido por flagelos peritricosos A. Bacilos curvados con flagelos polares lofotricosos o m onotricosos o flagelos subsolares; el ácido butírico es el principal producto de ferm entación B Los ácidos acético y succínico son los principales productos de ferm entación 1. Bacilos rectos cortos a cocobacilos; un flagelo polar único; encontrado sólo en rum en bovino 2. Bacilos helicoidales, curvos con extremos aguzados; movilidad tipo vibración por un único flagelo polar 3. Bacilos curvos, helicoidales; penachos bipolares de flagelos C. Bacilos espiralados y curvos, oxidasa postivos, m icroaerófilos. con ausencia de una envoltura flagelar; no ferm enta hidra­ tos de carbono; produce ácido succínico de ácido fum árico D. Los ácidos acético y propiónico son los principales productos de ferm entación 1. Penachos de flagelos en lado cóncavo de las células en form a de m edia luna 2. Flagelo polar único; bacilos curvos; lipolíticos 3. Los flagelos están insertados en una espiral a lo largo de la célula

Fusobacterium“ Leptotrichiab Desulfomonas'

Butyrivibriob Succinimonasc Succinivibriob Anaerobiospirillumb CampylobacterJ Wollinella‘

Selenomonasb Anaerovibriob Centipedac

J Comúnmente encontrados en muestras clínicas. ' Rara vez encontrados en muestras clínicas. c Flora normal humana o de otros animales. ' Campylobacter gracilis es oxidasa negativo y carece de flagelos, pero tiene “movilidad espasmódica’’; difiere de otras especies de Campylobacter por estos dos aspectos. * Wolinella succinogenes, aislada en el rumen bovino y ahora la única especie que permanece en el género Wolinella, es difícil de diferenciar de las especies del género Campylobacter. Modificado de Koneman et al.135 y otras referencias citadas en el texto.

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Cuadro 16-9

Bacterias anaerobias

Diferenciación de géneros de bacilos grampositivos anaerobios encontrados en muestras humanas

I. No producen endoesporas bacterianas A. Producen grandes cantidades de ácidos acético y propiónico; a m enudo producen catalasa; bacilos de form a regular o irre­ gular, células cocoides; en ocasiones ram ificados B. Producen ácidos acético y láctico (relación >1:1); bacilos muy irregulares con formas bífidas y ramificaciones C. Producen ácido láctico com o único producto 1. Bacilos cortos a largos delgados; es com ún la form ación de cadenas; no es com ún la presencia de bacilos irregulares; a menudo se desarrollan en agar jugo de tom ate a pH < 4,5 (véase cap. 14) 2. Cocos alargados pequeños que se encuentran solos, en pares, o en cadenas cortas D. Producen grandes cantidades de ácidos láctico y succínico y moderadas de ácido acético; predominan las formas de bacilos irregulares; form as filam entosas con ram ificaciones E. Producen m ezclas de ácidos acético, butírico, láctico y a veces fórm ico; bacilos difteroides pleom orfos; sacarolíticos F. Producen cantidades pequeñas de ácido acético y vestigios de ácidos láctico y succínico; asacarolíticos G. Producen grandes cantidades de ácido acético y pequeñas cantidades de succinato; bacilos rectos a curvos con algunas ram ificaciones (“sim ilar a Actinomyces") H. A cetato y butirato son los únicos productos metabólicos; sacarolíticos; bacilos delgados I. Produce una cantidad im portante de lactato con cantidades variables de ácidos fórmico, acético y succínico; cocobacilos, pleom orfos, bacilos difteroides cortos; anaerobios facultativos; sacarolíticos; A. pyogenes es P-hem olítico en agar sangre de cam ero J. Producen cantidades m oderadas de acetato y lactato y vestigios de ácido succínico; sacarolíticos; bacilos cortos K. Se encuentran com o bacilos cortos en cadenas entrecruzadas; sacarolíticos; producen ácidos acético, butírico, isobutírico y láctico L. Bacilos muy cortos; asacarolíticos; no se detectan productos m etabólicos en caldo peptona y extracto de levadura y glucosa M. Producen ácidos acético, fórm ico y láctico, a veces con vestigios de ácido succínico; abundante etanol; sacarolíticos; a menudo en form a de cocos pleom orfos a bacilos cortos; pueden ser confundidos con estreptococos o lactobacilos pero se distinguen por producir abundante H 2 N. A cetato y lactato son los principales productos con una pequeña cantidad de succinato; sacarolíticos (débil); bacilos cortos a largos que se encuentran en pares y cadenas cortas 0. El ácido fenilacético producido com o único producto metabólico en caldo de peptona. extracto de levadura y glucosa; asa­ carolíticos; bacilos cortos que se encuentran solos, en cadenas cortas o en racim os P. Los ácidos succínico y acético son los principales productos de fermentación, con ácido láctico o sin él; oxidasa negativos, bacilos curvos, móviles con m últiples flagelos subterm inales; ferm entadores en caldo de peptona, extracto de levadura y glucógeno, suplementado con suero de conejo Q- Producen form ato, acetato, butirato, caproato e H2; bacilos pleom orfos que se encuentran en pares asem ejándose a pájaros en vuelo, racim os o letras chinas (antes Eubacterium alactolyticum) R. Producen sólo ácido acético o productos metabólicos no ácidos; se encuentran en forma de bacilos, cocos o cocobacilos en cadenas y racimos II. Producen endoesporas bacterianas

Propionibacterium Bifidobacterium Lactobacillus Atopobium Actinomyces Eubacterium Eggerthella Actinobaculum Anaerotruncus Arcanobacterium

Bulleidia Catenibacterium Cryptobacterium Collinsella

Holdemania Mogibacterium Mobiluncus

Pseudoramibacter Slackia Clostridium

Adaptado de Koneman et al.'35y de otras referencias citadas en el texto.

Análisis de ácidos no volátiles

Los ácidos pirúvico, láctico, fumárico, succínico, hidrocinámico y fenilacético no se detectan con el procedimiento de extracción con éter para ácidos grasos volátiles. Estos ácidos no volátiles se identifican después de la preparación de derivados metilados. El procedimiento se reseña en el recuadro 16-11. Se realiza el análisis de los extractos clorofórmicos usando las mismas condiciones cromatográficas que para los ácidos volátiles. Se identifican los ácidos metilados o no volátiles por comparación de los tiempos de elusión en los extractos con los de los ácidos grasos conocidos cromatografiados el mismo día. Después de probar aproximadamente 20 muestras metiladas, se inyectan 14 )aL de metanol en el cromatógrafo de gas. Controles de la cromatografía de gas-líquido

Las soluciones estándares que contienen 1 mEq/100 mL de cada ácido volátil y no volátil deben ser analizadas al mismo tiempo que se prueban las soluciones desconocidas. El están­

dar de ácidos volátiles debe contener al menos los siguientes ácidos: acético, propiónico, isobutírico, butírico, isovalérico, valérico, isocaproico y caproico. El estándar de ácidos no volá­ tiles debe contener al menos los ácidos pirúvico, láctico, fumá­ rico, succínico, hidrocinámico y fenilacético. Se debe analizar un tubo con medio sin inocular de la misma forma, porque varios lotes de caldo PYG pueden contener cantidades signifi­ cativas de estos ácidos. Lombard y cois, encontraron que varios medios líquidos tanto como el caldo PYG pueden usarse para el análisis de pro­ ductos metabólicos ácidos.152 Estos medios son: caldo de tioglicolato enriquecido, glucosa y carne picada, caldo con glucosa de Lombard-Dowell y caldo de Schaedler (BD Microbiology Systems). Sin embargo, cuando crecen en esos medios de caldo, los resultados de un microorganismo dado pueden diferir de los logrados en PYG. Así, se debe tener cuidado en la interpreta­ ción de los productos de diferentes medios cuando los cuadros de identificación han sido preparados a partir de una base de datos PYG. Se garantiza una nota adicional de cuidado; la can­ tidad de ácido acético, láctico y otros ácidos presentes en cier-

Id e n tific a c ió n d e b a c te ria s a n a e ro b ia s

Recuadro 1 6-10

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Iden tificación de ácidos grasos volátiles

n 1. Inocular tubos que contienen 7 a 8 mL de caldo glucosa-extracto de levadua-peptona (PYG) prerreducido con unas gotas (0,05 a 0,1 mL) de un cultivo en desarrollo activo. 2. Incubar en condiciones anaerobias durante 48 horas o hasta obtener un desarrollo adecuado. 3. Transferir 2 mL del cultivo a un tubo con tapa de rosca de 13 por 1 0 0 mm. 4. Acidificar el cultivo hasta un pH de 2 o m enor por el agregado de 0,2 mL de solución acuosa al 50% (v/v) de H ,S 0 4. 5. A gregar 1 mL de éter etílico, apretar la tapa y m ezclar por inversión suave del tubo cerca de 2 0 veces. 6 . Centrifugar en una centrifuga clínica (1 500 a 2 000 rpm) para rom per la emulsión éter-cultivo. 7. Colocar la m ezcla éter-cultivo en el congelador a - 2 0 °C o m enos o en un baño de hielo seco-alcohol hasta que la porción acuosa (de abajo) se congele. 8 . Vaciar en form a rápida la capa de éter en un tubo de tapa de rosca lim ­ pio. Si se desea, agregar una o dos partículas de CaCl 2 al extracto de éter para elim inar el agua residual. 9. Inyectar 14 j^L del extracto en la colum na de un cromatógrafo gaseoso cargada con SP-1220.

tos medios líquidos, como caldo con glucosa y carne picada pueden hacer difícil o a veces imposible determinar si el pico de ácido acético o láctico fue producido por el aislamiento desco­ nocido o simplemente por el medio sin inocular.152 En las figuras 16-9 hasta 16-13 se muestran los trazados cromatográficos de un estándar de ácidos volátiles; cultivos en caldo PYG de Fusobacterium mortiferum, Clostridium diffici­ le y Peptostreptococcus anaerobius, y un estándar de ácidos no volátiles. Los productos metabólicos de especies comunes de bacilos gramnegativos anaerobios se enumeran en el cuadro 16-11.

Identificación de bacterias anaerobias En el cuadro 16-2 se proporciona una actualización extensa de la nomenclatura (nombres actuales y antiguos) de las bacte­ rias anaerobias. Por fortuna, los anaerobios clínicamente más importantes o los aislados con mayor frecuencia en muestras clínicas recolectadas y seleccionadas de manera apropiada comprenden una lista bastante más pequeña (cuadro 16-3). Sólo 12-15 grupos o especies dan cuenta del 75% o más de los aislamientos de especies aisladas en forma adecuada. Estas incluyen el grupo de Bacteroides fragilis, el grupo PrevotellaPorphyromonas pigm entado, Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus anaerobius, Finegoldia magna (y algunas otras especies de cocos anaerobios), Propionibacterium acnés, Clostridium perfringens, C. ramosum y especies de Veillonella. El personal de laboratorio debe estar familiarizado con estas especies porque no son muy comunes y a menudo son clínica­ mente significativas. También es importante que los microbió­ logos clínicos conozcan y puedan reconocer a: Fusobacterium necrophorum, Actinomyces israelii, Propionibacterium propionicum, el grupo C. clostridioforme, C. septicum, C. difficile, C. botulinum, C. tetani y algunas otras especies (tratadas más ade-

F igura 16-9 Crom atogram a estándar de ácidos volátiles típicos. El tiempo transcurrido entre la inyección de un extracto etéreo de la solución estándar y el pico para cada ácido (tiempo de retención) se usa para identificar los ácidos. Nótese, por ejemplo, que el tiempo de retención para el ácido acético es de 1,8 minutos y para el ácido valérico es de 6 m inutos (instrumento usado: Dohrmann Anabac, Clinical Analysis Products, Sunnyvale CA; Detector: con­ ductividad térmica; carga de la columna: 15%, SP-1220/1% de H 3P 0 4 en 100/120 Chrom asorb W/AW® de Supelco, Bellefonte, PA).

lante) porque estos microorganismos pueden ser altamente patógenos para los pacientes (incluso si no son comunes). Más allá de considerar la necesidad de estar familiarizado con los anaerobios comunes o clínicamente importantes se ha propuesto que los microbiólogos podrían desear limitar la extensión de la identificación anaerobia, basada en niveles de capacidad.810 Como ya se propuso, los laboratorios con capa­ cidad limitada (nivel 1 o extensión 1) deben poder aislar anae­ robios en cultivos puros y evaluar la morfología de la colonia y las características microscópicas. Junto con los resultados de las pruebas de aerotolerancia, esta información debe transmi­ tirse a los médicos (como informe preliminar). Si es clínica­ mente relevante sobre la base de 1) la situación clínica vista por el médico; 2) un frotis directo teñido con Gram de una herida o un absceso, líquido peritoneal u otras muestras, que revelen

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Bacterias anaerobias

B

__________ 2________ 4________ 6 ________ 8 _______ 10_______ 12______ 14 4

Tiem po (minutos)

Inyección F igu ra 16-10 Crom atogram a de ácidos volátiles de un cultivo de 48 horas en caldo de peptona, extracto de levadura y glucosa de Fusobacterium mortiferum. Los tiem pos de retención de los productos en el cultivo en caldo se com ­ paran con los del trazado estándar (véase fig. 16-9) para identificar los ácidos desconocidos. Los picos indican las cantidades mayores de ácido butírico y acético, pero sólo una cantidad menor de propionato para este cultivo. Se usa­ ron las m ism as condiciones y el mismo instrum ento que en el trazado de la figura 16-9.

evidencia de inflamación aguda (como numerosos leucocitos polimorfonucleares, pero ausencia de células epiteliales pavimentosas) o necrosis; 3) evidencia microscópica de mionecro­ sis de clostridios (lámina en color 16-3D); 4) gránulos de azu­ fre sugestivos de actinomicetos (lámina en color 16-2C y D), 5) hemocultivos positivos o cultivos positivos de líquidos corpo­ rales (p. ej., líquido pleural, líquido cefalorraquídeo, líquido articular), los aislamientos junto con los extendidos directos deben ser transportados a un laboratorio de referencia y proce­ sados con más detalle. A su vez, los laboratorios incluso con la capacidad de identificación definitiva (nivel 4) de aislamientos anaerobios podrían querer limitar la extensión del proceso al nivel 1 cuando no existe razón clínica para realizar la identifi­ cación adicional. Un ejemplo podría ser una muestra de hiso­ pado peritoneal obtenida en la operación de un paciente a pocas horas de una herida penetrante de cuchillo o de un disparo de arma de fuego en el abdomen. La perforación del intestino

F igu ra 16-11 Ejem plo de un crom atogram a de ácidos volátiles de un cultivo de 48 horas en caldo de peptona, extracto de levadura y glucosa de Clostridium difficile. A, ácido acético; P, ácido propiónico; IB, ácido isobutírico; B, ácido butírico; IV, ácido isovalérico; V, ácido valérico; IC, ácido isocaproico.

grueso y del intestino delgado distal provoca un derramamien­ to fecal en el abdomen. Las muestras obtenidas en ese momen­ to probablemente mostrarán formas morfológicas bacterianas mixtas y algunos leucocitos polimorfonucleares en los frotis teñidos con Gram y desarrollarán una mezcla de flora intesti­ nal normal. La identificación de estos microorganismos no ten­ dría utilidad clínica y sería desmedidamente costosa. El segundo nivel de capacidad propuesto requeriría, además del nivel L alguna capacidad de identificación.810 Debe reali­ zarse la diferenciación del grupo B. fragilis de los anaerobios gramnegativos y la identificación de C. perfringens. De modo similar al primer nivel de identificación, los aislamientos y los frotis directos de los casos relevantes deberán ser transportados a un laboratorio de referencia para identificaciones adicionales de los aislamientos.

Identificación de bacterias anaerobias

F igu ra 16-12 Ejemplo de un trazado crom atográfico de ácidos volátiles de un cultivo de 48 horas en caldo de peptona, extracto de levadura y glucosa de Peptostreptococcus anaerobius: A, ácido acético; P. ácido propiónico; IB, ¿cido isobutírico; B, ácido butírico; IV, ácido isovalérico; IC, ácido isocaproico.

Recuadro 16-11

Identificación de ácidos grasos no volátiles

1. Transferir 1 mL del cultivo en PYG original a un tubo con tapa de rosca de 13 por 100 mm limpio. 2. A gregar 0,4 mL de H;S 0 4 y 2 mL de metanol. 3. Colocar el tubo en un baño de agua a 55 °C por 1 hora o durante toda la noche. 4. Agregar 1 m L de agua destilada y 0,5 mL de cloroformo, y centrifugar poco tiempo para rom per la emulsión en la capa de cloroform o (el clo­ roform o estará en la parte inferior del tubo). 5. Llenar una jeringa con el extracto clorofórmico después de colocar el extrem o de la aguja por debajo de la capa acuosa. 6. Lim piar la parte exterior de la aguja con un tisú limpio e inyectar 14 u L en una colum na CGL cargada con SP-1000.

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F igu ra 16-13 Crom atogram a estándar de ácidos no volátiles típicos. La colum na está cargada con 10% de SP. 1000/1% de H ,P 0 4 en 100/120 de Chrom asorb W/AW® (Supelco, Bellefonte, PA). P, ácido pirúvico; L, ácido láctico; F, ácido fumárico; S, ácido succínico; PA, ácido fenilacético.

El tercer nivel de capacidad propuesto requeriría la identifi­ cación presuntiva de la mayoría de los doce grupos anaerobios más comunes y de especies mencionadas antes. Esta tercera categoría o extensión de identificación puede ser cumplimen­ tada sin el uso de cromatografía gaseosa. Como se dijo en la explicación de los procedimientos de CGL, los anaerobios comunes y clínicamente importantes que pueden ser identifi­ cados de forma presuntiva, usando unas pocas pruebas rápidas simples, son el grupo B. fragilis, los grupos PrevotellaPorphyromonas pigmentados (cuando se forma pigmento), F. nucleatum, P. anaerobius, F. magna, P. acnés, C. perfringens, C. ramosum, A. israelii y varias especies no tan comunes. Los detalles de la morfología, las características del desarrollo, la aerotolerancia, algunas pruebas rápidas de manchas, el siste­ ma de placa Presumpto y otros métodos prácticos que permi­ ten el reconocimiento y la diferenciación de esos grupos y especies se dan a continuaión. Ya se señaló que entre los ais­

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C A P ÍT U L O 16

Bacterias anaerobias

lamientos que requieren CGL y caracterización adicional para permitir una identificación precisa se incluyen la mayoría de las especies de Clostridium además de C. perfringens o C. ramosum, la mayoría de las especies de Fusobacterium, la mayoría de los géneros y especies de bacilos gramnegativos anaerobios no formadores de esporas además del grupo B. fr a ­ gilis, algunos de los cocos anaerobios, y la mayoría de los bacilos grampositivos anaerobios no formadores de esporas. Esto se menciona de nuevo porque el cuarto nivel de identifi­ cación (o identificación definitiva), que abarca las pruebas hechas en los niveles previos, también incluye CGL para los microorganismos que lo requieran. Además de determinar la morfología, las características del desarrollo, las relaciones con el oxígeno, las pruebas preliminares de manchas, el uso del sistema Presumpto y CGL, la identificación definitiva (nivel 4) incluye determinar qué otras características se nece­ sitan para arribar a una identificación exacta de especie (incluidas las especies que no se aíslan con frecuencia). Así, las características adicionales pueden obtenerse mediante pruebas bioquímicas tradicionales en caldo, ciertas pruebas enzimáticas rápidas (p. ej., API-ZYM® [BioMérieux-Vitek, Inc., Hazelwood, MO[, RaplD-ANA II® [Remel, Leneka, KS] o en uno de los otros equipos comerciales), pruebas de toxici­ dad, electroforesis en gel de poliacrilamida de las proteínas solubles de la célula entera, análisis de ácidos grasos de cade­ na larga, secuenciación de 16S rRNA-DNA u otros procedi­ mientos que se consideren necesarios (p. ej., remitiendo el aislamiento a un laboratorio de investigación para pruebas mo­ leculares más extensas). Los laboratorios capaces de la identi­ ficación definitiva tienen la alternativa de limitar las identifi­ caciones a los niveles presuntivos o preliminares descritos con anterioridad. Entre los laboratorios que realizan la identifica­ ción definitiva o de nivel 4 se pueden incluir aquellos de los centros médicos universitarios grandes, muchos de los hospi­ tales privados y comunitarios más importantes y los laborato­ rios de salud pública federales y de cada estado. Se requiere la identificación definitiva para definir mejor el papel de las bacterias anaerobias en las enfermedades, para proveer un diagnóstico microbiológico exacto que pueda ayu­ dar a la elección óptima de los antibióticos y al tratamiento clí­ nico del paciente, para objetivos de la salud pública (p. ej., dia­ rrea causada por C. difficile) y para contribuir a la educación de médicos y microbiólogos clínicos. Cuán lejos se debe ir en la identificación de anaerobios depende de varias consideraciones que diferirán entre los distintos laboratorios. No se puede espe­ rar que todos los laboratorios realicen los mismos niveles de estudios bacteriológicos anaerobios. Los factores que influyen en la toma de decisiones en la extensión de la identificación son la competencia técnica y la experiencia de las personas que tra­ bajan en el laboratorio, el número de personal disponible, la provisión y el presupuesto para equipamiento, la población de pacientes a la que se presta el servicio y las necesidades de los médicos que tienen la responsabilidad de sus pacientes.810 Los microbiólogos clínicos deben ser competentes en su trabajo y no vacilar en usar los servicios de los laboratorios de referen­ cia como ayuda para la identificación definitiva o para la con­ firmación de referencia de los aislamientos, así como las pruebas de sensibilidad a los antibióticos, las pruebas de toxigenicidad, los estudios de ácidos nucleicos u otros procedi­ mientos cuando sean de importancia clínica, si el laboratorio mencionado carece de esta capacidad. En otra parte se brindan aproximaciones adicionales e información actualizada de la identificación de anaerobios basadas en varias combinaciones de pruebas en diferentes niveles.60,125

Bacilos gramnegativos anaerobios no formadores de esporas CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA

Las bacterias gramnegativas anaerobias no formadoras de esporas se clasifican ahora en los géneros presentados en el cuadro 16-1. Las características claves para la diferenciación se dan en el cuadro 16-8. Los bacilos gramnegativos anaerobios están entre la flora normal de la orofaringe, el intestino grueso, la vagina, el cuello uterino, la uretra y los genitales externos. Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium, y Biophila son los géneros que por lo común se aíslan en mues­ tras recolectadas y seleccionadas en forma adecuada (muestras sin contaminación con flora normal) de seres humanos con infecciones significativas. Los nombres de los bacilos gramnegativos continúan cam­ biando (cuadro 16-2), en gran parte como resultado de estudios taxonómicos en los que se usan los procedimientos molecula­ res, como la secuenciación de 16S rDNA.67,123,124 Las bacterias anaerobias están siendo clasificadas y reclasificadas sobre la base del parentesco filogenético y los resultados de esas inves­ tigaciones taxonómicas pueden no relacionarse con la reacción de Gram, la morfología de coco o bacilo, la capacidad para for­ mar esporas, las relaciones con el oxígeno u otras característi­ cas fenotípicas tradicionales para clasificar anaerobios. De acuerdo con los estudios filogenéticos actuales, muchas espe­ cies de bacilos gramnegativos se agrupan dentro del subfilo Clostridium de bacterias grampositivas; éste incluye un gran número de bacterias que están entre la microflora natural humana y de varios animales, y son raras en muestras clínicas o todavía no han sido aisladas en ellas (p. ej., especies de Leptotrichia, Butyrivibrio fibrisolvens, Catonella morbi, Centipeda periodontii, Dialister pneumosintes, Johnsonella ignava, Mitsuokella multiacida, especies de Selenomonas, especies de Tissierella y otras).44,67,123,124 A pesar de Jos numerosos avances taxonómicos nuevos basa­ dos en métodos de investigación de genética molecular, las pruebas fenotípicas todavía son importantes para los objetivos de diagnóstico clínico y pueden confiarse a los laboratorios hospitalarios para identificar anaerobios hasta que los procedi­ mientos de identificación molecular de bajo costo, simples y fáciles de usar se vuelvan accesibles para esas bacterias.67 Así, para la identificación de aislamientos en los laboratorios diag­ nósticos, los microbiólogos clínicos continúan dependiendo de las características morfológicas claves, las características bio­ químicas y fisiológicas, y, en muchas oportunidades, de la sen­ sibilidad o resistencia a ciertos antibióticos. IDENTIFICACIÓN PRELIMINAR 0 PRESUNTIVA DEL GRUPO DE BACTEROIDES, PREVOTELLA, PORPHYROMONAS Y FUSOBACTERIUM

Como ya se indicó, el objetivo primero y principal de la identificación debe ser determinar si las bacterias anaerobias están presentes y aislarlas en cultivos puros.10 La presencia de bacilos gramnegativos anaerobios sugestivos de Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas o especies de Fusobacterium (basándose en las relaciones con el oxígeno), junto con los resultados de la tinción de Gram y de la observación de las colonias, debe informarse enseguida al médico. La identifica­ ción presuntiva o preliminar del grupo B. fragilis y el grupo Prevotella-Porphyromonas, junto con otros bacilos gramnegati­ vos, anaerobios obligados, puede realizarse fácilmente usando características diferenciales obtenidas con la placa Presumpto 1 y agar sangre para anaerobios (cuadros 16-10 y 16-11). En los cuadros 16-12 a 16-16 se encuentran otros datos para la identi­ ficación de grupo junto con las características claves de varias

Identificación de bacterias anaerobias

especies. Nótese que todos los bacilos gramnegativos anaero­ bios no formadores de esporas encontrados en la clínica (cua­ dros 16-10 y 16-11) son no móviles. En la práctica no es nece-ario determinar la movilidad y realizar tinciones de flagelos rara diferenciar los otros géneros de bacilos gramnegativos anaerobios (cuadro 16-8), a menos que las características dife­ renciales de un aislamiento (en cultivo puro) no se ajusten a las de las especies enumeradas en los cuadros 16-10 a 16-16. dentilicación de Bacteroides: el grupo de Bacteroides fragilis. Co­ rzo ya se mencionó, los microorganismos del grupo B. fragilis son las bacterias anaerobias aisladas con más frecuencia en infecciones humanas y son importantes desde el punto de vista clínico (cuadro 16-10). Son parte de la microflora natural del rabo digestivo de la mayoría de las personas, pero rara vez se encuentran en la boca. A través de los años, se han usado numerosos nombres de especies para este grupo (p. ej., conve­ nís. convexa, pseudoinsolita, inequalis, incommunis, uncata) y :ambién varios nombres de género, pero ahora el grupo inclu­ ye sólo los referidos en el cuadro 16-2. El grupo VPI “3542A” de DNA homólogo, antes sin nom­ bre. que se asemeja mucho fenotípicamente a B. distasonis, ha ?ido nombrado B. caccae.m La mayoría de las cepas de B. cacae fueron aisladas en las heces; no son comunes en muestras clínicas humanas recolectadas de modo apropiado. Otros dos grupos de DNA homólogo, VPI “T4-1” y "B5-21”, fueron nombrados B. merdae y B. stercoralis, respectivamente. Estas especies también tienen similitud fenotípica con B. fragilis y con todas las otras especies del grupo B. fragilis. B. merdae y B. stercoralis fueron aisladas en muestras fecales y rara vez en muestras clínicas contaminadas con heces o contenidos intesti­ nales (Alien SD y Siders JA, datos no publicados). B. fragilis es la especie más común del grupo encontrada en muestras clínicas, pero no se aísla a menudo en las heces durante los estudios de flora intestinal. Por otro lado, B. ovatus no se aísla con tanta frecuencia en muestras bien recolectadas, pero es común en la materia fecal. Sin embargo, B. ovatus se aísla en ocasiones en la sangre de pacientes inmunodeprimidos con bacteriemia polimicrobiana secundaria a un traumatismo masivo o a necrosis del intestino. Las probabilidades de aisla­ miento de B. ovatus, B. caccae, B. merdae o B. stercoralis en muestras no intestinales recolectadas en forma apropiada son tan bajas que los aislamientos que muestren características diferenciales de esas especies deben ser comunicados al super­ visor o director del laboratorio. B. thetaiotaomicron es la segunda especie más común del grupo B. fragilis en infeccio­ nes clínicas (cuadro 16-2). Para más información sobre las pro­ piedades patógenas y las infecciones causadas por el grupo B. fragilis, el lector puede remitirse a otro sitio.6,70 155'222 Los microorganismos del grupo B. fragilis son bacilos gramnegativos, no móviles, con extremos redondeados, de 0,5-0,8 jj.m de diámetro x 1,5-9 ¡im de largo.222 Las células del cultivo en caldo tienden a ser pleomorfas, a menudo con vacuolas. M uchas cepas son capsuladas; la importancia pato­ génica de sus cápsulas no está clara. Las colonias de B. fra g i­ lis en agar sangre para anaerobios de los CDC tienen un diá­ metro de 1 a 4 mm, son no hemolíticas, grises, de bordes lisos, semiopacas y con espirales concéntricas o estructuras en forma de anillo en el interior de las colonias (lámina en color 16-1). Las colonias de otras especies del grupo son similares en forma y tamaño, pero difieren con respecto a sus estructu­ ras internas. Una característica clave de las especies del grupo B. fragilis es que su crecimiento se m ejora con bilis (cuadros 16-10 y 16-12). Todas son resistentes a penicilina, kanamici­ na, colistina y vancomicina, pero sensibles a la rifampicina por

871

la técnica con disco (cuadro 16-10). Todas son sacarolíticas y sus patrones de fermentación de hidratos de carbono (junto con el indol) ayudan a diferenciar entre las especies (cuadro 16-12). Las características detalladas de las especies se dan en los cuadros 16-10 al 16-15. Hay dos especies de Bacteroides en el cuadro 16-12 que no fermentan sacarosa: B. eggerthii y B. splanchnicus y comparten varias características fenotípicas. En su objetivo por restringir el género Bacteroides a Bacte­ roides fragilis y especies muy relacionadas, Shah y Collins incluyeron B. eggerthii, pero no B. splanchnicus en el grupo B. fragilis.210 En la práctica, ambas especies se aíslan con poca frecuencia en muestras clínicas recolectadas y seleccionadas apropiadamente. Así, la diferenciación entre B. eggerthii y B. splanchnicus es un informe raro en el laboratorio clínico. Para más detalles sobre las características de B. splanchnicus, véase el cuadro 16-14. Para más información acerca de B. splanch­ nicus y B. eggerthii, se recomienda el capítulo de Holdeman y cois, del Manual de Bergey.110 Bacilos gramnegativos anaerobios pigmentados. Como ya se men­ cionó, Shah y Collins propusieron que el género Bacteroides esté restringido al grupo Bacteroides fragilis y especies rela­ cionadas, que fermentan la glucosa (pH < 5,4) (altamente saca­ rolíticas), se desarrollan en presencia de 20% de bilis e hidro­ lizan esculina.210 Sus productos metabólicos ácidos más impor­ tantes a partir del metabolismo de la glucosa son los ácidos acético y succínico, y se pueden producir cantidades menores de otros ácidos grasos de cadena corta.210 Por lo tanto, los baci­ los gramnegativos anerobios pigmentados no se clasifican más en el género Bacteroides. Las especies pigmentadas, modera­ damente sacarolíticas, se colocaron en el género Prevotella. En 1988, los Bacteroides pigmentados, asacarolíticos, todos aisla­ dos en seres humanos, se reclasificaron en el género Porphyromonas como P. asaccharolytica, P. gingivalis y P. endodontalis.209 Las especies de Porphyromonas adicionales de origen humano ahora incluyen P. catoniae (no pigmentada) y aquellas consideradas similares a P. levii.124 Las siguientes especies sacarolíticas pigmentadas se encuen­ tran en muestras clínicas humanas: Prevotella melaninogenica, P. corporis, P. denticola, P. intermedia, P. nigrescens, P. loescheii, P. tannerae y P. pallens, P. shahii y P. .sa/ívae.136,178,204,211,213,214,261 Muchas especies de Prevotella se aíslan a menudo en la cavidad bucal, en infecciones que comprometen la cabeza, el cuello y las vías respiratorias bajas, y en el aparato urogenital. Una gran proporción, si no la mayoría, de las cepas de Porphyromonas aisladas en la cavidad bucal son Porphyromo­ nas gingivalis;244 la mayoría de los aislamientos clínicos no bucales de Porpyromonas aislados en otras regiones anatómi­ cas humanas son Porphyromonas asaccharolytica, mientras que las cepas de Porphyromonas endodontalis han sido aisla­ das en infecciones de conductos radiculares infectados.209 Desde 1992, el género Porphyromonas ha cambiado mucho, ahora con un total de 13 especies (cuadro 16-2). Cinco de esas especies sólo se aislaron en la cavidad bucal de perros (P. cangingivalis, P. canoris, P. cansulci, P. crevioricanis y P. gingivicanis),45'105-159 una se ha aislado sólo en la cavidad bucal de gatos (P. circumdentaria),151 y otra, en monos y gatos (P. macacae, que incluye los llamados con anterioridad P. salivosa),156-158 otra es del ganado (P. levii),212 una especie fue aislada en la cavidad bucal humana (PI catoniae)262 y P. gulae, descrita en 2001, fue aislada en varios animales (osos, gatos, coyotes, perros, lobos y monos). Aunque su importancia clínica en los seres humanos se desconoce, las especies aisladas en la boca de animales pueden encontrarse en infecciones de heridas por mordeduras.

872 CAPÍTULO 16 Bacterias anaerobias

C uadro 16-10

Identificación p resu n tiv a o p re lim in a r de bacilos g ram negativos an aero b io s obligados AGAR SANGRE PARA ANAEROBIOS

GRUPOS O ESPECIES Grupo B. fragilis

Fluorescencia Colonias Colonias roja marrón- < 1 mm de Agar con (luz UV) negras diámetro hoyuelos

PLACA CUADRANTE PRESUMPTO 1

Penicilina Rifampicina (disco (discos de 2 U) de 15 ng)

Kanamicina (disco de 1 ng)

Indol

Lipasa

Esculina

H2S

+/-

Catalasa (agar esculina LD)

Crecimiento en agar bilis

V

E

-

-

-

-

R

S

R

V

Porphyromonas-Prevotella

+

+

—

-

SoR

s

R

+

-/+

-

IoE

B. ureolyticus

-

-

+

+

S

s

S

-

-

-

I

Fusobacterium mortiferum

-

—

-

-

R oS

R

S

-

-

+

E

F. necrophorum

—

—

—

-

S

S

S

+

+

+

I

F. nucleatum

-

-

-

-

S

s

S

+

-

-

1

F. varium

—

-

—

-

R oS

R

S

+

-

+

E

Pigmentados

R, crecimiento no inhibido; S, crecimiento inhibido; LD, Lombard-Dowell; V reacción variable; +, reacción positiva del 90-100% de las cepas probadas; en agar LD; I, crecimiento inhibido fen comparación con agar LD).

+

reacción negativa en las cepas probadas; E. crecimiento > crecimiento

Cuadro 16-11

E S P E C IE

A lgunas de las caracte rístic as claves diferenciales de especies de Hacteroides y Fusobacterium aisladas ro n frecuencia en a g a r sangre p a ra anaerobios de los CDC

R E L A C IÓ N CON ()2

C A R A C T E R ÍS T IC A S D E L A S C O L O N IA S

FLU O RESH E M Ó L IS IS C E N C IA DE SANGRE R O JO D E C A R N E R O L A D R IL L O

P IG M E N ­ TO NEGRO

HOYU ELO S EN EL AGAR -

B. distasonis

AO

Pequeñas a m edianas, convexas, sem iopacas, de bordes lisos

-

B. fragilis

AO

Pequeñas a m edianas, convexas, de superficie m oteada, anillos con ­ céntricos, bordes lisos

-

B. ovatus

AO

Pequeñas a m edianas, convexas, opacas, de bordes lisos

-

B. thetaiotaomicron

AO

Pequeñas a m edianas, convexas, opacas, de bordes lisos

-

B. uniformis

AO

B. ureolyticus

P E N IC I­ LIN A (D ISC O D E 2 U)

R IF A M P IC IN A (D IS C O D E 15 Mg)

K AN A M IC IN A (D IS C O D E 1 ng)

REDUC­ C IÓ N D E N IT R A T O

Bacilos pequeños de longitud variable

R

S

R

-

Bacilos pequeños de longitud variable

R

S

R

—

M O R F O L O G ÍA CELULAR

GRAM N E G A T IV O , ESPORA S, M O V IL ID A D

-

Bacilos pequeños de longitud variable

R

s

R

-

-

-

Bacilos pequeños de longitud variable

R

s

R

-

Pequeñas a m edianas, convexas, opacas, de bordes lisos

-

-

Bacilos pequeños de longitud variable

R

s

R

-

AO

D im inutas, convexas, de bordes irregulares

-

+

Bacilos pequeños, delgados, de longitud variable

S

s

S

+

B. vulgatus

AO

Pequeñas a m edianas, convexas, sem iopacas, de bordes lisos

-

-

Bacilos pequeños de longitud variable

R

s

R

-

Porphyromonas com o un grupo P. gingivalis asacarolítico

AO

Pequeñas a m edianas, convexas, de bordes lisos

+

-

Bacilos cocoides dim inutos

S

s

R

-

Prevotella bivia

AO

Pequeñas a m edianas, convexas, de bordes lisos

-

B acilos cocoides dim inutos, varían en longitud

R

s

R

-

P. disiens

AO

Pequeñas a m edianas, convexas, de bordes lisos

-

Bacilos cocoides dim inutos, varían en longitud

R

s

R

-

P. intermedia

AO

Pequeñas a m edianas, convexas, de bordes lisos

Bacilos cocoides dim inutos

SoR

s

R

-

Fusobacterium F. mortiferum

AO

Pequeñas a m edianas, con form a de huevo frito"

-

Bacilos altam ente pleom orfos, filam entosos, cor­ púsculos redondos grandes

R oS

R

S

-

F. naviforme

AO

Pequeñas, poco convexas, m otea­ das, bordes lisos

-

Bacilos delgados pleom orfos, algunos con extrem os agu­ zados

S

S

S

—

F. necrophorum

AO

Pequeñas a m edianas, elevadas con centros opacos

-

M uy variables en anchura y longitud

S

s

S

-

F. nucleatum

AO

Pequeñas a m edianas, de opalescencia ja s p e a d a / A veces las colonias se asem ejan a migas de pan

-

Bacilos filam entosos delga­ dos, p o r lo general con extrem os aguzados

S

s

S

F. varium

AO

Pequeñas a m edianas, con form a de huevo frito"

-

B acilos pequeños, de longi­ tud variable, con extrem os redondeados

RoS

R

S

+

+

+

+

+

Verde

-

-

“Forma de huevo frito: centro opaco elevado con borde entero translúcido.

873

b F. necrophorum hidroliza hematíes de conejo, pero no de carnero. ' Opalescencia moteada: las colonias de F. nucleatum muestran motas (en las colonias) cuando se observan con un microscopio de disección con luz reflejada; por lo común no son hemolíticas, pero pueden causar decoloración grisácea del agar sangre en exposición al oxígeno. AO, anaerobio obligado; +, reacción positiva en el 90% de las cepas probadas; -, reacción negativa en el 90% de las cepas probadas; R, resistente; S, sensible. Según Dowell VR, Alien SD. Anaerobic bacterial infections. En: Balows A, Hausler WJ Jr. eds. Diagnostic Procedures fo r Bacterial, Mycotic, and Parasitic Infections. 6a ed. Washington, DC: 174-219.

—

Identificación de bacterias anaerobias

-

-

874

Algunas características de los bacilos gram negativos que se aíslan con frecuencia en medios diferenciales de agar de los CDC PLACA PR ESU M PTO 1

PLA CA P R E S U M P T O 2

CAPÍTULO

Cuadro 16-12

PLA CA P R E S U M P T O 3

16

N° D E C E P A S EX A M IN A D A S

E 0> U .

iu.

-/+

-

-

-

+

+

+ ;

l

+

l

-1+

-/+

-

-

-

+

-

B. ovatus

5

+

l

<

i

C pp

+

V

V

V

-

+/-

+

+

c c c c

+

-/+

-1+

+/-

-

-

+

+

+

-

V

V

-

-

+

-/+

-

-

-

-

+

+

+

-

-

-

V

-

+

-

V

-

-

-/+

-

-/+

-

-

-

~ /+

-

-

-

+/-

-/+

V

_

i

i

i i

l

i

+

l l

+ i

5

+

B. ureolyticus

1

-

10

-

V

-

-

6

J +

i

+ l

se

-

- _

P. gingivalis

13

se

-

-/+

+

-

+

-

-

-

Prevotella bivia

14

-

se

+

- /+

+/-

+/-

V

- /+

+

-1+

P. disiens

3

-

V

+ +/+

V

5

+/+ +/+

+

P. denticola

+

+/+ +/-

+ -/+ +

+

-

V

V

+ + -/+

+ +

-

_

+

-

- /+

-

-

V

-

+

V

-

-

-

-

i

<

i

l

i

-

-

-

-/+

+

-

-

V

F. nucleatum

31

+

-

-

V

6

V

-

-

V

l

+ i

F. necrophorum

6 18

i

5

F. naviforme

i

F. mortiferum

+

V

6

1

2

Fusobacterium gonidiaform ans

1

P. veroralis

l

+

l

l

+ +

l

9

i

2

P. oris/buccae

+ 1

-

P oralis

F. varium

l

-

i

-

i

l

10

-

i

16

P. melaninogenica

+

P. intermedia/nigrescens

i

Campylobacter gracilis Porphyromonas asac­ charolytica

i

2

>

B. splanchnicus

i

+

1

23

+

B. vulgatus

+

B. uniformis

71

+

B. thetaiotaomicron

l

-

+

+

+

+ i

c Cpp

l

+/-

l

+

135

B. distasionis

l

21

B. fragilis

i

r4* ti»

l

a

+ -

-

+

se se se se se se se c se se se c

+/-

V

-

_

_

V

+

-

-

V

_

+ V + +

V

-/+ V _

-

-

-

V

-

-

-

-

-

-

1+

- /+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+, reacción positiva en < 90% de las cepas; reacción negativa en < 90% de las cepas; +/-, la mayoría de las cepas positivas con ocasionales cepas negativas -/+, la mayoría de las cepas negativas, con ocasionales cepas positivas; V, variable; I, crecimiento inhibido; E, crecimiento igual al control sin bilis; Cpp, crecimiento igual con un precipitado adyacente o debajo de las colonias, SC, sin crecimiento. Adaptado de Whaley DN, Wiggs LS, Miller PH, Srivastava PU, Miller JM. Use o f Presunto plates to identify anaerobic bacteria. J Clin Microbiol 33: 1196-1202, 1995, y ediciones previas de este libro.

Bacterias anaerobias

E S P E C IE

Cuadro 16-13

Características útiles en la diferenciación del grupo Bacteroides fragilis y especies muy relacionadas que crecen bien en 20% de bilis PRODUCCIÓN DE

ESPECIES

Indol

Catalasa

FERMENTACIÓN DE Arabinosa

Celobiosa

Glucosa

Melecitosa

Ramnosa

Ribosa

Salicina

Sacarosa

Trealosa

+

+

+

+

+ /-

+

+

+

+

Xilano

Grupo Ii. fragilis A. Subgrupo indol negativo B. caccae B. distasonis

-

+

-

+

+

+

+/-

+/-

+

+

+

-

B. fragilis

-

+

-

-Id

+

-

-

-

-

+

-

-

B. merdae

-

-

-/+

-

+

+

-/+

-

d

+

+

-

B. vulgatus

-

V

+

-

+

-

+

-/+

-

+

-

-/+

B. ovatus

+

+

+

+

+

+/-

+

+

+

+

+

+

B. stercoris

+

-

-/+

-

+

-

+

-Id

-

+

-

-

B. thetaiotaomicron

+

+

+

+

+

V

+

+

-/+

+

+

-

B. uniformis

+

-

+

+

+

-

-/+

-/+

+/-

+

-

ND

B. eggerthii

+

V

+

-/d

+

-

d/-

-

-

-

-

+

B. Subgrupo indol positivo

B. splanchnicus

+

+

+

ND

+, Reacción positiva para el 90% o más de las cepas (incluye reacciones fuertes y débiles); +/-, 51-89% de cepas positivas; -/+, 10-50% de cepas positivas; - menos del 10% de cepas positivas; V, reacción variable; d, reacción débil; ND, datos no disponibles. De Holdeman et al.;'05 Johnson et al."6y Alien y Siders, datos no publicados.

Identificación de bacterias anaerobias

Otros Bacteroides y especies relacionadas

875

876

Cuadro 16-14

FERMENTACIÓN DE Arabinosa

Celobiosa

Lactosa

Melibiosa

Rafinosa

Salicina

Xilosa

HIDRÓLISIS DE ESCULINA

INDOL

-

-

-

-

Pueden ser pigmentadas P. corporis

-

-

-

-

-

P. denticola

-

V

+

-

+

P. intermedia

-

-

-

-

V

P. loescheii

-

+

+

V

+

P. melaninogenica

-

V

+

-/+

P. nigrescens

-

-

-

P. tannerae

-

-

-

V

+ +

+ -

+

+

+

-/+

+

+

V

-

NP

+

V

-

V

V

-

+

-

-

-

_

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

d

+

d

-

V

-

+ V

No pigmentadas P. bivia

NP

P. dentalis

NP

P. disiens

-

-

-

-

-

-

P. enoeca

-

-

+

-

-

+

+

NP

+

+

+

+

+

P. oralis

NP

+

+

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

V

+

+

+

-

+

-

+/-

P. oulora

NP

-

+

á/+

+

-

V

+

d

+

V

+

1

-

>

-

>

+

P. oris

V

V

V

V

V

+

V

V

+/-

P. veroralis P. zoogleoformansb

- /d

+

-

1

P. buccalis

+

+

>

+/-

P. heparinolyticab

+

>

P. buccae

V

+

+

" Características bioquímicas modificadas de Holdeman, Nelly y Moore (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 1984), Shah y Collins (Int J System Bacteriol 1990; 40: 205-208), Shah y Gharbia (Int J Syst Bacteriol 1992; 42: 542-546), Moore y Moore (Int J System Bacteriol 1994; 44: 599-602), y Williams y Collins (Int J System Bacteriol 1995; 45: 832-836). hLos cultivos en caldo tienen un sedimento cohesivo o pegajoso. reacción negativa; +, reacción positiva; V, reacción variable; +/-, la mayoría de las cepas positivas; -/+, la mayoría de las cepas negativas; NP, no probadas; +/d, la mayoría de las cepas positivas, algunas positivas débiles; d/+, la mayoría de las cepas positivas débiles; d, reacción débil.

Bacterias anaerobias

Sacarosa

16

Amigdalina

CAPÍTULO

C a rac te rística s de ferm en tació n de la glucosa, sensibilidad a la bilis, pigm entación y no pigm entación de especies de Prevotella aisladas en m u estras clínicas"

Identificación de bacterias anaerobias

Cuadro 16-15

877

Productos metabólicos de especies de Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella y Fusobacterium en cultivos en caldo de peptona, extracto de levadura y glucosa después de 48 horas a 35 °C“

ESPECIE O GRUPO

A

P

IB

B

IV

V

IC

C

L

s

PAS

B. capillosus

+

V

-

-

-

-

-

-

-

+

B. distasonis

+

+/-

-

-

V

-

-

-

+/-

+

+

B. fragilis

+

+/-

V

-

V

-

-

-

+

+

+

-

-

-

V

+

+

s

PROPIONATO DE TREONINA

Bacteroides

B. ovatus

+

+

V

-

V

B. splanchnicus

+

+

+

+

V

-

-

-

V

B. thetaiotaomicron

+

+ /-

V

-

V

-

-

-

V

+

B. uniformis

+

+ /-

V

-

V

-

-

-

+

+

B. ureolyticus

+

-

-

-

-

-

-

-

-

+

B. vulgatus

+

+

V

-

-

V

-

-

+

+

-

P. asaccharolyticab

+

+

+

+

+

-

-

-

-

+

-

P. gingivalis

+

+

+

+

+

-

-

-

-

+

+

P. bivia

+

-

V

-

+ /-

-

-

-

-

+

P. disiens

+

V

V

-

V

-

-

-

P. intermedia

+

V

V

-

+

-

-

-

-

+

F. gonidiaformans

+

+

-

+

-

-

-

-

-

-

+

F. mortiferum

+

+ /-

-

+

-

-/+

-

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

+

P o rp h y ro m o n as

P revotella

+ -

F u so b acteriu m

F. naviforme

+

V

-

+

F. necrophorum

+

+

-

+

-

-

-

-

-

-

+

F. nucleatum

+

+

-

+

-

-

-

-

-

- /+

+

F. varium

+

+

-

+

-

-

-

-

+

- /+

+

a Las especies enumeradas en este cuadro son las que pueden distinguirse usando el sistema de medios de agar diferenciales (véanse cuadros 16-10, 16-11 y 16-12). Porphyro­ monas pigmentadas negras, asacarolíticas, P. asaccharolyticus y P. gingivalis se pueden diferenciar en forma presuntiva por la presencia o ausencia de ácido fenilacético (PA) y otras pruebas descritas en el texto. h Los datos para la diferenciación de ciertos microorganismos del grupo B acteroides fragilis y especies pigmentadas negras usando ácido PA son de Mayrand y Shah y Collins, como se citan en la 5o edición de este libro. A, ácido acético; P, ácido propiónico; IB, ácido isobutírico; B, ácido butírico; IV, ácido isovalérico; 1C, ácido isocaproico; C, ácido caproico; L, ácido láctico; PA, ácido fenilacéti­ co; S, ácido succínico; +, pico principal; pico no principal; +/-, po r lo general un pico principal, pero puede ser negativo; -/+ , por lo general negativo, pero puede estar pre­ sente; V, variable. De Doxvell VR, Lombard GL. Presumptive identification o f anaerobic non-spore-forming gram-negative bacilli. Atlan ta: CDC, 1977:13.

En 1995, Willems y Collins no sólo reclasificaron Oribaculum catoniae como Porphyromonas catoniae, sino que tam­ bién enmendaron el género Porphyromonas. De acuerdo con su nueva descripción, algunas especies ahora se incluyen como sacarolíticas (P. levii, P. macacae y P. catoniae) y P. catoniae no forma pigmento.262 Las características presuntivas para el reconocimiento de bacilos gramnegativos anaerobios que corresponden al género Porphyromonas son la formación de colonias de color bronce que emiten fluorescencia rojo ladrillo cuando se exponen a la luz ultravioleta de onda larga o la presencia de colonias marro­ nes a negras (la mayoría de las especies), la inhibición del desa­ rrollo en presencia de vancomicina (falta de desarrollo en agar

sangre kanamicina-vancomicina), inhibición por bilis, inhibi­ ción por penicilina y rifampicina, pero resistencia a kanamici­ na, formación de indol. y falta de fermentación de glucosa u otros hidratos de carbono de la mayoría de las especies. La identificación definitiva de las especies de Porphyromonas sobre la base de características fenotípicas es dificultosa. Algunas características diferenciales claves de las especies asa­ carolíticas, pigmentadas y catalasa negativas encontradas en enfermedades humanas se enumeran en el recuadro 16-12. Por lo tanto, la determinación de actividades enzimáticas mediante el uso de un sistema de pruebas rápidas en 4 horas (el sistema Rapid ID 32 A o RaplD ANAII) es una ayuda práctica para identificar las especies de Porphyromonas encontradas en

878

C A P ÍT U L O 16

Recuadro 16-12

Bacterias anaerobias

C aracterísticas para la identificación de especies de P orp hyro m onas

1. P. gingivalis: produce ácido fenilacético (véase cuadro 16-11) y agluti­ na hem atíes de carnero;'73 produce p-galactosa-6-fosfatasa y iV-acetil-pglucosam inidasa, pero no a-fucosidasa; puede ser probada en el sistema R apid ID 32A (BioM érieux-Vitek).204’06 2. P. asaccharolytica: no com o la especie anterior; produce a-fucosidasa; probada en el sistema Rapid ID 32A.204-206 3. P endodontalis: com o ninguna de las dos especies anteriores.

seres humanos.50,243'244 Otras características de las especies de Porphyromonas se indican en el cuadro 16-16. A diferencia de Porphyromonas, todas las especies pigmen­ tadas de Prevotella fermentan la glucosa y otros hidratos de carbono (cuadros 16-14 y 16-16). Se enfatiza que el grupo Prevotella “pigmentado” descrito en el cuadro 16-16 puede tomar de 2 días a 3 semanas para formar pigmento en agar san­ gre para anaerobios de los CDC o incluso puede faltar la pro­ ducción de colonias pigmentadas. Prevotella intermedia es dis­ tintiva en que forma colonias negras, produce indol, es lipasa positiva en agar yema de huevo y fermenta la sacarosa. Prevotella nigrescens es una especie derivada de un grupo dis­ tinto genéticamente de cepas antes incluidas en Prevotella intermedia.2'7. Algunas de estas cepas eran de pacientes con periodontitis; otras eran de individuos sanos. Mientras P. nigrescens y P. intermedia forman colonias de marrón a negras en agar sangre, producen indol y fermentan la sacarosa, sólo P. intermedia produce lipasa. Prevotella corporis, antes clasifica­ da como Bacteroides melaningenicus subespecie intermedius, difiere de P. intermedia en que no produce indol, es lipasa negativa y no fermenta la sacarosa (cuadro 16-16). Prevotella bivia y Prevotella disiens son muy similares desde el punto de

Cuadro 1 6-16

vista fenotípico a P. intermedius y P. corporis. Prevotella bivia se encuentra en el aparato urogenital y en la boca, y P. disiens se aísla por lo común en el aparato urogenital. Son sacarolíti­ cas y se pueden confundir con facilidad cuando P. intermedia y P. corporis no producen pigmentos. Además, Ueno informó (comunicación personal) que P. bivia puede producir pigmento en ciertas condiciones. Otras cuatro especies de Prevotella sacarolíticas pigmentadas que se pueden aislar en seres huma­ nos (Prevotella melaninogenica, P. loescheii, P. denticola y P. tannerae) a menudo fermentan lactosa, a diferencia de P. inter­ media, P. nigrescens y P. corporis, que son lactosa negativas. P. denticola es lenta para producir pigmento; algunas cepas no pueden producir pigmento incluso después de 3 semanas de incubación. P. denticola fermenta esculina y ribosa, caracterís­ tica que ayuda a separarla de P. melaninogenica (que es negati­ va para estas características).109 P. loescheii tampoco fermenta esculina, a diferencia de P. denticola y P. melaninogenica y es celobiosa positiva. La mayoría de las cepas de P. tannerae no hidrolizan esculina (86% de las cepas negativas para esculina) y la mayoría (69%) no fermentan la sacarosa. Otro microorga­ nismo pigmentado, Porphyromonas levii, se ha aislado en rumiantes y no se tratará más adelante.212 El principal problema en identificar las especies del grupo pigmentado es que a menudo son microorganismos con reque­ rimientos nutricionales especiales y de crecimiento lento, y pueden requerir de 2 días hasta 3 semanas completas para for­ mar el pigmento (en agar sangre de carnero o en agar sangre hemolizada de conejo lacada). Los grupos Prevotella-Porphyromonas son parte de la flora normal de la orofaringe, la nariz y los aparatos genitourinario y gastrointestinal. Son los segundos grupos más comunes de bacterias anaerobias encon­ tradas en infecciones humanas (cuadro 16-3). En algunas situa­ ciones clínicas, por ejemplo, en lesiones orofaciales e infeccio­ nes pleuropulmonares anaerobias, son más comunes que el grupo B. fragilis. Ciertas especies, en particular Prevotella intermedia (y posiblemente P. nigrescens), son de especial in­ terés clínico porque por lo común producen P-lactamasa y pue­

C aracte rístic a s útiles p a ra id en tificar especies de B acteroides, P orphyrom onas, P revotella y F u so b a c te riu m en co n tra d a s con frecuencia

CARACTERÍSTICAS Fluorescencia rojo-ladrillo (con luz de longitud de onda UV) o pigm ento marrón-negro Buen crecim iento en bilis al 20%; resistente a penicilina (disco de 2 U), kanam icina (disco de 1 (Xg); e inhibido por rifam picina (disco de 15 (ig) Produce catalasa en agar esculina LD Produce lipasa en agar yem a de huevo LD Asacarolítico (no ferm enta glucosa ni otros hidratos de carbono)

A gar con hoyuelos; ureasa positiva H idroliza gelatina; digiere leche DN asa positiva; desarrollo potenciado en bilis al 20% Resistente a rifampicina; hidroliza esculina Resistente a rifampicina; no hidroliza esculina Bacilos filamentosos, delgados, largos; manchas internas en las colonias; produce propionato a partir de treonina

a Para el listado de especies incluidas véase el texto.

ESPECIE Grupo Prevotella melaninogenica", especies de Porphyromonas Grupo Bacteroides fragilis"

B. fragilis, B. thetaiotaomicron, B. distasonis, B. ovatus Prevotella intermedia, F. necrophorum Bacteroides del grupo F2 de los CDC, Porphyromonas asaccharolytica, P. gingivalis, B. capillosis (esta especie es rara), B. ureolyticus, F. gonidiaformans (rara), F. naviforme, F. nucleatum B. ureolyticus Prevotella bivia, P. disiens, P. intermedia B. thetaiotaomicron, B. uniformis, B. ovatus F. mortiferum F. varium F. nucleatum

Identificación de bacterias anaerobias

den 'e r resistentes in vitro a la penicilina G y a otros antibióti.: > Antes de la pigmentación, las colonias jóvenes a menudo emiten una fluorescencia rojo ladrillo cuando se exponen a la luz ultravioleta de onda larga (365 nm). En las preparaciones :emdas con Gram, las células son bacilos gramnegativos, cocoides, cortos, por lo general de 0,3-0,4 |im de diámetro x 3.6-1 de largo (lámina en color 16-1). En el sistema de placa Presumpto, estas especies se inhiben por bilis, a menudo pero no siempre) son sensibles a la prueba con disco de 2 U de icilina, sensibles a la rifampicina y resistentes a la kanamicina. En el cuadro 16-16 se incluyen otras características para la diferenciación o pueden determinarse usando pruebas para 1¿> actividades enzimáticas.50,178’214,242-244 Otras especies de Prevotella. Como se mencionó, Prevotella bi. ia y P. disiens son especies que se asemejan fenotípicamente ^ P. intermedia, P. nigrescins y P. corporis. Se inhiben por bilis, a menudo son resistentes a la penicilina, sensibles a la rifampicina y resistentes a la kanamicina. El acetato y el succinato son los principales productos metabólicos. Además de su usual falta de pigmento en agar sangre para anaerobios de los CDC mantenidos por 5 a 7 días, P. bivia y P. disiens difieren de P. intermedia-nigrescens en que son indol negativas y lipasa negativas. Además, P. bivia fermenta la lactosa, mientras que P. disiens y P. intermedia-nigrescens no lo hacen.108 Un P. corporis no pigmentado parecería idéntico a P. disiens (cuadro 1616 1. Como los grupos B. fragilis y Prevotella-Porphyromonas pigmentados, las cepas de P. bivia y P. disiens producen (3-lactamasa y pueden ser resistentes a varios antibióticos (3-lactámicos.69 Se han aislado en sangre, infecciones de cuello y cabeza, infecciones genitourinarias en hombres y mujeres, y otros sitios de infección. Las características útiles para la separación de P. bivia y P. disiens de P. oralis y especies relacionadas simi­ lares se presentan en el cuadro 16-16. Además de Prevotella tannerae, descrita antes, Moore y cois, describieron otra espe­ cie que habita el surco gingival humano, Prevotella enoeca, y enmendaron la descripción de Prevotella-zoogleoformans.™ Ambas especies han sido aisladas en pacientes con periodonti­ tis, ninguna produce pigmentos en agar sangre y ambas fer­ mentan una variedad de hidratos de carbono. Los rasgos claves que ayudan a distinguir P. enoeca de otras especies de Pre­ votella son su incapacidad para digerir gelatina, su falta de fer­ mentación a la sacarosa y su perfil de ácidos grasos celulares. La fermentación de celobiosa y lactosa, la falta de pigmento y el perfil de ácidos grasos celulares son características claves que ayudan a diferenciar P. zoogleoformans de otras especies de Prevotella indol positivas, en especial P. intermedia y P. nigrescens, con las cuales comparte características fenotípi­ cas.178 Un cambio taxonómico adicional en 1995 fue la reclasificación de Hallella seregens y Mitsuokella dentalis como Prevotella dentalis.26' Aisladas en conductos de raíces dentales, las colonias de P. dentalis no son pigmentadas; difieren de las otras especies Prevotella por su aspecto característico de “gota de agua”. Prevotella oralis y especies relacionadas. Los principales cambios en la clasificación taxonómica de los microorganismos antes llamados Bacteroides oralis y B. ruminicola (cepas humanas) se realizaron sobre la base de estudios de homología de DNA.106 Algunas de las cepas aisladas como "B . oralis” en el pasado fueron miembros del grupo B. melaninogenicus no formador de pigmentos, en especial Prevotella denticola (tratada con anterioridad). Prevotella buccalis, P. veroralis y B. oralis eran llamadas B. oralis. Todas se inhiben en el medio con 20% de bilis, son indol negativas, positivas para la hidrólisis de esculina y fermentan varios hidratos de carbono.109 Las pruebas

879

diferenciales que ayudan a separar estas especies son la fer­ mentación de salicina, amigdalina y xilano y la hidrólisis de almidón (cuadro 16-16). Si no producen pigmentos, P. dentico­ la y P. melaninogenicus pueden ser fácilmente confundidas con P. buccalis, P. veroralis y P. oralis. Sin embargo, las tres espe­ cies anteriores fermentan celobiosa; P. denticola y P. melani­ nogenicus son celobiosa negativas. P. oris y P. buccae han sido aisladas en infecciones periodontales y varios otros sitios de infecciones humanas.113 Muchas cepas de estas especies antes se llamaban B. ruminicola (cepas humanas). Como P. buccalis, P veroralis y P. oralis, P. oris y P. buccae se inhiben por bilis, son indol negativas y positivas para la hidrólisis de esculina, y fermentan glucosa más hidratos de carbono adicionales. La producción de ácido de arabinosa o xilosa separa P. oris y P. buccae de P. oralis ,113 La fermentación de salicina ayuda a separar P. buccae y P. oris de P. buccalis y P. veroralis, que son salicina negativas. Una prueba que es positiva para la actividad p-glucosidasa por P. buccae pero negativa para P. oris ayuda a separar estas especies.109 Las reacciones obtenidas usando el sis­ tema RapID-ANA II® también pueden ser útiles como un suplemento a las pruebas presentadas en el cuadro 16-16, para ayudar a diferenciar estas especies.50 Bacteroides ureolyticus y otras especies asacarolíticas nitrato posi­ tivas. Bacteroides ureolyticus (antes B. corrodens) es un bacilo

gramnegativo relativamente pequeño (casi 0,5 |ltn de diámetro por 1,5 a 2 |iin de longitud), microaerófilo (sin embargo, antes se había pensado que era anaerobio), con requerimientos nutri­ cionales especiales, que produce hoyuelos en el agar sangre para anaerobios. Esta especie debe reclasificarse. Las células no producen flagelos y no son móviles. Como característica, las colonias pueden ser de dos tipos: 1) de 0,5-1 mm de diá­ metro después de 2 días o más de incubación, circular, conve­ xa y translúcida con bordes lisos o recortados, o 2) delgada, chata, extendida, colonias translúcidas irregulares hacia el exterior de un área central algo elevada. Este último tipo de colonia produce depresiones u "hoyuelos"' dentro de la superfi­ cie del agar, que quizás se asemejan a la “corrosión” de las planchas de metal. B. ureolyticus se inhibe por penicilina (disco de 2 U), rifampicina (disco de 15 |ig) y kanamicina (dis­ co de 1 |ig) y no se desarrolla en presencia de bilis al 20% ni ferm enta ningún hidrato de carbono (es asacarolítico). Campylobacter gracilis, antes llamado Bacteroides gracilis,245 también es microaerófilo y desarrolla características similares a las de B. ureolyticus. Una prueba positiva para la actividad ureasa separa B. ureolyticus de C. gracilis y de especies simi­ lares de Campylobacter y Wollinella succinogenes (la única especie restante después que W. curva y W. rectus fueron reclasificadas como Campylobacter curvus y C. rectus), que son todos ureasa negativos. C. gracilis (.B. gracilis) no forma flage­ los y no es móvil, a diferencia de C. cu n ’us, C. rectus y W. suc­ cinogenes. C. rectus, por ejemplo, es muy móvil (por medio de un único flagelo polar).125 De acuerdo con un informe,116 B. ureolyticus fue el aislamiento más frecuente en infecciones leves de tejidos blandos superficiales o huesos. C. gracilis (B. gracilis), por el contrario, por lo común fue aislado en infec­ ciones profundas “graves”, incluidas infecciones de cuello y cabeza, infecciones pleuropulmonares y lugares infectados dentro del abdomen y la pelvis. B. ureolyticus fue sensible en forma uniforme a varias penicilinas, cefalosporinas y otros antibióticos (entre ellos clindamicina, cloranfenicol, metroni­ dazol e incluso aminoglucósidos), mientras que los aislamien­ tos de C. gracilis por lo común fueron resistentes a penicilinas, cefalosporinas y clindamicina.116 Por lo tanto, es probable que C. gracilis sea un microorganismo más virulento para los seres

880

C A P ÍT U L O 16

Bacterias anaerobias

humanos que B. ureolyticus y su frecuente resistencia a los antibióticos puede contribuir a su importancia clínica. La importancia clínica de C. concisus y C. recta, que comparten algunas características con B. ureolyticus y C. gracilis, todavía no ha sido establecida. Ejemplos de otras especies de Bacteroides o antiguas especies de Bacteroides cuya importancia clínica no sea bien conocida o establecida son B. amylophilus, B. coagulans, B. eggerthii, B. hypermegas (ahora Megamonas hypermegas), B. multiacidus (ahora Mitsuokella multiacidus), B. nodosus, B. pneumosintes, B. praeacutus (ahora Tissierella praeacuta), B. putredinis, B. splanchnicus y otras. La mayoría de estas especies se encuentran sólo rara vez en muestras clínicas humanas. Las características detalladas de estas y otras especies de Bacteroides poco cono­ cidas pueden consultarse en el Manual VIP107 y en el Manual de Bacteriología Determinativa de Bergey.109 Para una revisión excelente de su papel en las infecciones y de su sensibilidad a los antibióticos, véase Kirby y cois.133 Especies de Bilophila. Barón y cois., durante un estudio de aisla­ miento bacteriano de muestras de apendicitis y heces humanas, aislaron un bacilo gramnegativo anerobio nuevo particular en agar bilis esculina para BacteroidesP Se informó que esta nueva especie mostraba las características enumeradas en el recuadro 16-13. Aunque Bilophila wadsworthia es similar a la especie del grupo B. fragilis y a ciertas especies de Fusobacterium que se desarrollan en presencia de 20% de bilis, varias de las propie­ dades fenotípicas de Biophila wadsworthia son diferentes de las del grupo Bacteroides fragilis y de las especies de Fuso­ bacterium. Biophila wadsworthia difiere del grupo B. fragilis por su falta de fermentación de hidratos de carbono, su pro­ ducción de ureasa y su falta de producción de una cantidad importante de ácido succínico. La producción de una conside­ rable actividad de catalasa y su falta de producción de ácido butírico son características claves que separan B. wadsworthia de las especies de Fusobacterium.

Recuadro 16-13

C aracterísticas las especies de B ilo p h il

Bacilo(s) gramnegativos, pleom orfos, no móviles, no form adores de espo­ ras; 0.7-1.1 (jm de ancho por 1-10 ¡jm de longitud. Desarrollo potenciado por 20% de bilis y por 1% de piruvato; crecim iento lento en bacteroides bilis esculina (BBE); las colonias en BBE después de 4 días de incubación se describieron com o de 1 a 2 mm de diámetro, circulares, irregulares, um bilicales y translúcidas con centros oscuros, o com o colonias negras opacas, poco convexas, irregulares. Las colonias en agar Brucella form adas lentamente (4 a 7 días) eran pun­ teadas, de m enos de 1 mm de diámetro, circulares, irregulares, translúci­ das y grises. Catalasa fuertem ente positiva (usando H:0 , al 15%). Asacarolítica. U reasa positiva. H 2S positiva, desulfoviridina positiva. Nitrato positiva. Negativa para la hidrólisis de esculina o almidón. Indol negativa: no licúa gelatina, no produce reacciones agar yem a de huevo o leche; oxidasa negativa. (3-lactamasa negativa (prueba de la nitrocefina) pero, no obstante, resisten­ te a los antibióticos P-lactámicos. El acetato es el producto metabólico principal; no se detecta lactato; se producen cantidades menores o restos de succinato en glucosa-levadurapeptona (suplem entado por piruvato).

Fusobacterium. El género Fusobacterium incluye varias espe­ cies de bacilos gramnegativos anaerobios no formadores de esporas que pueden diferenciarse de las especies de Bacteroi­ des, Prevotella, Porphyromonas y Leptotrichia por su produc­ ción de cantidades mayores de ácido butírico pero no de ácido isobutírico e isovalérico (fig. 16-10 y cuadro 16-15). Las espe­ cies de Bacteroides y Porphyromonas que producen ácido butí­ rico tam bién producen ácidos isobutírico e isovalérico. Históricamente, las especies de Fusobacterium tenían muchos otros nombres de género, como Sphaerophorus, Fusiformis, Pseudobacterium, Ristella, Necrobacterium y Zuberella.222 Aunque su nombre parecería sugerir que las fusobacterias son “fusiformes”, sólo algunas de ellas lo son, la mayoría no; más bien son bacilos con lados paralelos y extremos redondea­ dos (no aguzados). Crecen bien en agar sangre anaerobio en condiciones anerobias y mueren con facilidad por exposición al aire ambiente. La mayoría de las especies son o no fermentati­ vas o fermentativas débiles.222 Las especies de Fusobacterium se encuentran normalmente en las vías respiratorias altas, el tracto digestivo y el aparato genitourinario humanos. Están involucradas en infecciones graves en distintos sitios del cuerpo.6155 Se asocian con infec­ ciones de la boca, heridas por mordedura y del aparato respira­ torio, lo que no sorprende porque la boca es un hábitat impor­ tante. En algunos casos hospitalarios, las fusobacterias son comunes en los hemocultivos.5 Felner y Dowell66 describieron 55 pacientes con baeteriemia por Fusobacterium (comparados con 196 casos de baeteriemia por Bacteroides). Henry y cois, publicaron una serie adicional de 26 casos de baeteriemia por Fusobacterium." Bourgault y cois, informaron tasas de morta­ lidad significativas en las bacteriemias por Fusobacterium; 13 de 40 pacientes (32,5%) con hemocultivos positivos murie­ ron.30 En un estudio posterior, se identificaron 36 aislamientos de especies que incluyeron F. nucleatum (17 aislamientos), F. necrophorum (8 aislamientos), F. mortiferum (5), F. varium (3) y F. gonidiaformans (3). Los siguientes antibióticos fueron activos contra las 36 cepas: penicilina, piperacilina, cefoxitina, clindamicina, metronidazol e imipenem.30 F. nucleatum y los miembros del grupo Prevotella-Porphyromonas son los microorganismos que con más frecuencia pro­ ducen infecciones pleuropulmonares anaerobias (p. ej., neumo­ nía por aspiración, absceso pulmonar, neumonía necrosante, empiema torácico). Las fusobacterias también son patógenos bastante comunes en abscesos cerebrales, sinusitis crónica, osteomielitis metastásica, artritis séptica, absceso hepático y otras infecciones intraabdominales.6 F. nucleatum es la especie encontrada con mayor frecuencia en materiales clínicos. Han llamado la atención en forma reciente las infecciones sistémicas causadas por F. nucleatum en pacientes con neutropenia y mucositis posteriores a la qui­ mioterapia.36-65143 El reconocimiento temprano de F. nucleatum en muestras clínicas, en particular durante el examen micros­ cópico directo de líquidos corporales o exudados, puede ser importante. Las células en forma de huso son largas, con fila­ mentos delgados y extremos afilados (lámina en color 16-1).166 A veces hay protuberancias esféricas. Las células miden 5 |im a 10 (im de largo, pero a menudo se observan formas más cor­ tas. Las colonias que se desarrollan en agar sangre para anaero­ bios tienen un diámetro de 1 a 2 mm, son levemente convexas con bordes algo irregulares y tienen una mancha característica denominada “estructura cristalina interna” por J. A. Siders y “mancha opalescente”, por G. L. Lombard (lámina en color 16-1). F. nucleatum es relativamente inactivo desde el punto de vista bioquímico (cuadro 16-12). Sobre la base de patrones

Identificación de bacterias anaerobias

íiectroforéticos de proteínas de la célula íntegra y estudios de nomología de DNA, en 1990 se sugirió que F. nucleatum se subdividiera en tres subespecies: F. nucleatum subespecie nucleatum, F. nucleatum subespecie polymorphum y F. nucleatum subespecie vincentii.57 En 1992, Gharbia y Shah propusie­ ron que se debían reconocer otras dos subespecies: F. nuclea­ tum subespecie fusiform e y F. nucleatum subespecie animalis.82 En la actualidad, los métodos fenotípicos tradicionales no dife­ rencian entre estas subespecies y tampoco es clínicamente importante su distinción. F. necrophorum puede causar infecciones graves (p. ej., abs­ ceso hepático) y no es inusual que se aísle solo (en cultivo puro) en lesiones de los tejidos blandos.6'222 Varios informes recientes han atraído la atención hacia el síndrome de Lemierre potencialmente mortal o la septicemia posangina, una enfer­ medad supurativa grave causada por este microorganismo 25.194,198,237 g] síndrome de Lemierre, también llamado "necrobacilosis”, sucede en su mayoría en personas de entre 12 y 25 años. Casi todos los pacientes carecen de factores predis­ ponentes y antes eran sanos. La afección se caracteriza por infección orofaríngea (p. ej., amigdalitis, absceso periamigdalino o absceso faríngeo) seguido de septicemia anaerobia y complicaciones metastásicas, que con frecuencia involucran los pulmones o las grandes articulaciones y, con menor fre­ cuencia, las meninges.89 Los hallazgos comunes con disemina­ ción metastásica hacia los pulmones son abscesos pulmonares y empiema torácico. Este síndrome debe ser sospechado en especial en pacientes jóvenes en los que se desarrolla trombo­ flebitis séptica de la vena yugular interna. Desde 1980, la mor­ talidad en los pacientes tratados ha sido cercana al 18%, pero sin antibióticos es > 50%. Por fortuna, F. necrophorum es sen­ sible in vitro a metronidazol, clindamicina, cloranfenicol, imi­ penem y a casi todos los P-lactámicos, incluida la penicilina G y las penicilinas más nuevas, así como las cefalosporinas de tercera generación. Sin embargo, la eritromicina sólo es activa en forma moderada, muchas cepas del microorganismo son resistentes a las tetraciclinas, y es resistente a aztreonam, trimetoprim-sulfametoxazol y aminoglucósidos.40-89 Las células de F. necrophorum miden cerca de 0,6 (im x 5 (im y son pleomorfas, a menudo con formas curvadas y áreas esféricas en su interior (lámina en color 16-1). Como F. mortiferum (tratado más adelante), también producen corpúsculos cocoides libres que, en el examen directo, a veces se asemejan a leucocitos degradados. La mayoría de las cepas producen lipasa en agar yema de huevo LD. F. necrophorum ha sido divi­ dido en tres variedades (o “biovariedades” A, B y C). En 1990, se propuso una especie nueva, Fusobacterium pseudonecrophorum para F. necrophorum biovariedad C.216 F. necrophorum es patógeno, productor de abscesos hepáticos en ratones y es sensible a la penicilina (500 U/mL), mientras que la especie nueva no produce abscesos en ratones y es muy resistente a la penicilina (500 U/mL). Las cepas de F. mortiferum y F. varium a menudo son resis­ tentes a la clindamicina,6135 y pueden producir P-lactamasa.70 Las células miden 0,5-2 |im de ancho por 2-10 |im de largo, son muy pleomorfas, cocoides a filamentosas, con espirales esféricas cerca del centro o un extremo de los bacilos teñidos en forma desigual. Las colonias en agar sangre son de 1 a 2 mm de diámetro y tienen una apariencia característica en forma de huevo frito, con centros elevados, opacos, y bordes chatos y translúcidos. F. mortiferum y F. varium son resistentes a la rifampicina (disco de 15 |ig), lo que ayuda a separarlas de otras especies de Fusobacterium, Bacteroides, Porphyromonas y Prevotella. Estas dos especies Fusobacterium se pueden dife­

881

renciar con pruebas para la hidrólisis de esculina y fermenta­ ción de lactosa (cuadro 16-12). Rara vez se pueden encontrar otras especies de Fusobacte­ rium en infecciones. Las características de F. gonidiaformans y F. naviforme obtenidas usando el sistema de placa Presumpto se observan en el cuadro 16-12. Se recomiendan las siguientes referencias para conocer características complementarias de estas y de otras especies.6-41,124’125-155 Identificación de cocos anaerobios

Los cocos anerobios son el segundo grupo más común de anaerobios encontrados en infecciones humanas; los primeros son los bacilos gramnegativos (cuadro 16-3). Del mismo modo que los bacilos gramnegativos anaerobios, se encuentran con frecuencia en el laboratorio clínico en hemocultivos, en otros líquidos corporales y en una amplia variedad de muestras de abscesos y heridas. En la octava edición del Manual de Bac­ teriología Determinativa de Bergey, los cocos grampositivos anerobios fueron clasificados en la familia Peptococcaceae en los siguientes géneros: Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus y Sarcina.134 Los cocos anaerobios gramnegati­ vos fueron enum erados en tres géneros en la fam ilia Veillonellaceae como sigue: Veillonella, Acidaminococcus y Megasphaera. Más tarde, en 1974, Holdeman y Moore propu­ sieron agregar un género nuevo, Coprococcus, a la familia Peptococcaceae,m También sugirieron dos especies nuevas de Rum inococcus y una especie nueva de Streptococcus. Recomendaron la transferencia de Peptostreptococcus interme­ dius, Peptostreptococcus morbillorum y Peptococcus conste­ llatus al género Streptococcus, porque estas especies producen ácido láctico como el principal y único producto metabólico. En 1981. Peptococcus saccharolyticus fue transferido al géne­ ro Staphylococcus.13' Por lo tanto, S. saccharolyticus se consi­ dera una especie anaerobia del género Staphylococcus. En 1983, se hicieron grandes cambios en la clasificación taxonó­ mica de los cocos anaerobios, basados en los datos del porcen­ taje de guanina más citosina (G + C) y en los estudios de homo­ logía del DNA de Ezaki y cois.63 Excepto Peptococcus niger, todas las antiguas especies del género Peptococcus fueron transferidas al género Peptostreptococcus. Luego, en 1994, Ezaki y cois, determinaron las secuencias 16S rDNA de todas las especies de Peptostreptococcus e informaron que los miem­ bros del género debían ser divididos en cinco grupos filogené­ ticos diferentes; en 1994 transfirieron las especies antes llama­ das Peptostreptococcus productus y Streptococcus hansenii al género Ruminococcus.62 Ambas son miembros de la microflo­ ra fecal humana, pero son raras en muestras clínicas. Desde 1999, se han hecho muchos cambios en el género Peptostreptococcus, incluida la transferencia de todas menos una especie a cinco géneros nuevos (cuadro 16-2).61-182 La única especie remanente de Peptostreptococcus es P. anaero­ bius.'93 Los antes llamados P. magnus y P. micros6' ahora son Finegoldia magna y Micromonas micros, respectivamente.182 Los llamados Peptostreptococcus hydrogenalis, P. lactolyticus, P. octavius, P. prevotii, P. tetradius y P. vaginalis todavía tienen los mismos nombres de especies, pero ahora son miembros del género Anaerococcus.6' Otras especies denominadas Pepto­ streptococcus asaccharolyticus, P. harei, P. indolicus, P. ivorii y P. lacramaris retuvieron sus nombres de especie, pero fueron movidas al nuevo género Peptoniphilus.6' Se propuso un género nuevo con una especie única: Gallicola barnesae; ha sido aislada en heces de pollos, pero no se tratará más adelante porque no se han informado fuentes

882

C A P ÍT U L O 16

Bacterias anaerobias

humanas.61 Tampoco se tratará una especie aislada en el rumen de oveja: Slackia heliotriniredcens (antes Peptostreptococcus heliotrinreducens).241 Además, el ex Peptostreptococcus parvulus es ahora Atopobium parvulum.46 Esta especie ha sido aislada en el surco gin­ gival humano. Se conoce poco acerca del significado clínico de ésta y de otras especies de Atopobium (cuadro 16-2). Otros estreptococcuss anaerobios o microaerófilos son Streptococos intermedius y S. pleomorphus. Los antes llamados Strepto­ coccus morbillorum ahora son Gemella morbillorum. 132 Los cocos gramnegativos anaerobios se clasifican en la fami­ lia Veillonellaceae.199 Durante un largo período tres géneros -Veillonella, Acidaminococcus y Megasphaera- han sido miembros de la familia, pero en 2002 se describió un cuarto género (Anaeroglobus germinatus).37 Antes de 1982, V. parvula era la única especie reconocida de Veillonella. En ese año se propusieron otras seis especies: V. dispar, V. atypica, V. roden­ tium, V. ratti, V. criceti y V. caviaei}11 En 2004, se aisló una nueva especie de Veillonella en muestras humanas: V. montpellierensis.'26 Se carece de información sobre su importancia clínica. Las especies de Veillonella son parte de la microflora de la boca, vías respiratorias altas, intestino y aparato genitourinario. Acidaminococcus habita en el intestino grueso de los seres humanos. Los hábitats principales de las especies de Megasphaera son el intestino grueso y el aparato genitourina­ rio humanos, así como el rumen del ganado.222 La única cepa de Anaeroglobus germinatus descrita fue aislada con una mez­ cla de otras bacterias en el líquido posoperatorio recogido 27 días después de una gastrectomía y anastomosis esofagoyeyunal en una mujer de 70 años.37 No se conoce su hábitat ni su significado clínico. Veillonella parvula permanece como la especie más común de todos los cocos gramnegativos anaerobios en muestras humanas recolectadas de modo apropiado. Se ha encontrado como agente causal en endocarditis potencialmente morta­ les,26192 baeteriemia73 150 y en infecciones polimicrobianas en las que el papel patógeno es incierto.6 Los géneros mencionados de cocos gramnegativos y gram­ positivos anaerobios pueden ser parte de la flora normal de varios sitios en seres humanos y en animales; sólo las especies enumeradas en el cuadro 16-3 se encuentran con alguna fre­ cuencia significativa en muestras clínicas procesadas y reco­ lectadas en forma adecuada. Las características identificatorias de las especies encontradas con mayor frecuencia se presentan en los cuadros 16-17 y 16-18. Se recomiendan las siguientes referencias para más información.37'61 107,125 199t222 En la figura 16-12 se muestra un trazado cromatográfico típico de ácido volátil de Peptostreptococcus anaerobius. La sensibilidad a los antibióticos in vitro de los cocos anae­ robios se describió en otro sitio.135181 De acuerdo con las pau­ tas recientes, los antibióticos de elección para el tratamiento empírico de los pacientes con infecciones por cocos anaerobios son penicilina (p. ej., penicilina G, ampicilina, amoxicilina) y clindamicina.18169 Varias cepas de P. anaerobius son resistentes a la penicilina G. El metronidazol es activo contra más del 90% de los cocos anaerobios obligados, pero no contra la mayoría de las cepas de estreptococos microaerófilos (p. ej., Streptococcus intermedius).'35 Otros compuestos activos in vitro contra la mayoría de los cocos anaerobios son cloranfenicol, imipenem, ampicilina/su 1bactam, piperacilina/tazobactam y cefoxitina, pero no cefoperazona, cefotaxima o cefotetán.135 Entre los compuestos que se muestran promisorios contra los cocos ana­ erobios grampositivos se incluyen algunas de las fluoroquino­

lonas más nuevas (p. ej., moxifloxacino, gatifloxacino), quinupristina/dalfopristina y linezolid.18169 Las especies de Veillo­ nella son resistentes a la vancomicina y a algunas de las qui­ nolonas. Los antibióticos que no son activos contra los cocos anaerobios son los aminoglucósidos, aztreonam y trimetoprimsulfametoxazol.18169 Identificación de bacilos grampositivos anaerobios no formadores de esporas

En este grupo de anaerobios se incluyen las especies del género Actinomyces, Arcanobacterium, Bifidobacterium, Eggerthella, Eubacterium, Lactobacillus, Propionibacterium, Pseudoramibacter y muchas otras.6,67'125 177 En el cuadro 16-2 se pro­ vee una lista extensa de los cambios recientes en la taxonomía de estas bacterias. Algunas características diferenciales claves de las especies de bacilos grampositivos, no formadores de espo­ ras se presentan en los cuadros 16-19 y 16-20. La morfología m icroscópica y las características de las colonias de Actinomycetes israelii y Eggerthella lenta (antes Eubacterium lentum) se muestran en la lámina en color 16-2. La identificación de los bacilos grampositivos anaerobios no formadores de esporas requiere el uso de CGL para el análisis de productos metabólicos. La morfología celular de muchos de esos m icroorganism os tiende a variar con el tipo de medio de cultivo y las condiciones de desarrollo. A veces pueden ser confundidos con otros géneros, como Clostridium, Corynebac­ terium, Lactobacillus, Leptotrichia, Listeria, Nocardia, Pep­ tostreptococcus y Streptococcus. Así, los resultados de CGL y las características morfológicas, consideradas juntas, ayudan a la diferenciación práctica (cuadros 16-9 y 16-19). A veces algunas cepas de bacilos anaerobios se asemejan a cocos, en particular en preparaciones teñidas con Gram en colonias jóvenes de agar sangre. Además, algunos estreptoco­ cos, como S. mutans, S. intermedius, S. constellatus y Gemella morbillorum y ciertos peptoestreptococos, pueden aparecer en forma de bacilos cuando se observan con el microscopio célu­ las de colonias en agar sangre. Por otro lado, estas bacterias suelen formar cadenas largas de células en caldo tioglicolato enriquecido y en otros medios líquidos. Cabe recordar que muchas bacterias grampositivas tienden a volverse gramnegati­ vas con la edad. También algunos clostridios (p. ej., C. perfrin­ gens, C. ramosum y C. clostridioforme) no producen esporas en los medios habituales usados en el laboratorio clínico, mien­ tras que otros lo hacen a medida que envejecen. Por lo tanto, las preparaciones teñidas con Gram de cultivos muy jóvenes pue­ den ser una ayuda para la demostración de la variabilidad de Gram y la observación de frotis de cultivos viejos puede ayu­ dar en la demostración de esporas de los clostridios. ESPECIES DE PROPIONIBACTERIUM

Propionibacterium acnés es con mucho el bacilo anaerobio formador de esporas grampositivo encontrado con mayor fre­ cuencia en muestras clínicas. Es parte de la flora normal de la piel, la nasofaringe, la cavidad bucal, y los aparatos gastroin­ testinal y genitourinario. Como miembro predominante de la microflora cutánea y habitante del aparato glandular de los fo­ lículos pilosos/sebáceos, P. acnés es un contaminante frecuen­ te de los hemocultivos. Sin embargo, en ocasiones causa endo­ carditis, infecciones de derivaciones de líquido cefalorraquídeo del sistema nervioso central y otras infecciones. P. avidum y P. granulosum rara vez se encuentran en el laboratorio clínico y por lo general no son clínicamente significativos. Las células

Cuadro 1 6-17

Algunas característica claves de los cocos anaerobios aislados con frecuencia en muestras clínicas

I

I

I

I

í I

I

+ I

I

Glucosa

Lactosa

Maltosa

+

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+

A, B

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-

A

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A, L

-

-

A

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-

A, (P), B

+

-

-

A, (P), B

NP

-

-

A, (P), IB, B, IV, (V), C

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A. tetradius

Peptococcus niger

+

+

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I

I

I

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Staphylococcus saccharolyticus

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i I

I

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I

Especies de Veillonella

+

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i

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i

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A, (IB), (B), (IV), IC

+

A

-

A

+

A, L

-

A, P

“ Las cepas de A. tetradius pierden su capacidad de ferm entar azúcares en form a rápida después de subcultivarlos de modo que no es infrecuente que estas reacciones sean negativas. b La mayoría de las cepas de M. m icros producen una muy leve P-hemólisis en agar sangre para anaerobios de los CDC (Remel, Lenexa, KS), que ayuda a distinguirlas de F. m agna (Alien y Siders: datos no publicados). SPS, polianetol sulfonato de sodio; +, reacción positiva: - reacción negativa; d, fermentador débil; -/+, cepas positivas ocasionales; d/ -, la mayoría de las cepas fermentadoras débiles con cepas negativas ocasionales; A. ácido acético; P, ácido propiónico; IB, ácido isobutírico; B, ácido butírico; IV, ácido isovalérico; V, ácido valérico; IC, ácido isocaproico; C, ácido caproico L, ácido láctico; ( ), ácido variable: NP. no probado.

Identificación de bacterias anaerobias

+

Oh

Ruminococcus productus

I


I

Peptostreptococcus anaerobius

i

+

I

+

-

I

I

+

_

i

P. indolicus

_

+

Peptoniphilus asaccharolyticus

_

I

_

I

_

+

Micromonas microsb

_

I

+

I

Gemella morbillorum

I

+

+

Finegoldia magna

PRODUCTOS METABÓLI­ COS ÁCIDOS EN PYG, 48 HORAS A 35 °C

FOSFATASA ALCALINA

+

INHIBICIÓN UREASA POR SPS

+

NITRATO

+

+

I

+

A. prevotii

I

Anaerococcus hydrogenalis

INDOL

COAGULASA

+

ESPECIE

PIGMENTO NEGRO

I

FERMENTACIÓN DE REACCIÓN DE GRAM

883

884

CAPÍTULO 16 Bacterias anaerobias

Cuadro 16-18

Reacciones de cocos anaerobios en medios diferenciales de agar de los CDC PLA C A P R E S U M P T O 1

PLA C A P R E S U M P T O 2

PLA CA PR E SU M PT O 3

s “O s 'O N» D E C EPA S EX A M IN A D A S

o =

A n a e ro c o c c u s p rev o tii

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21

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1

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P e p to strep to c o c cu s a n a ero b iu s

21

V

S ta p h y lo c o cc u s sa cch a ro lyticu s

2

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S trep to co c c u s in term ed iu s

9

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Especies de Veillonella

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-

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-

-

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-

+, reacción positiva en > 90% de las cepas; reacción negativa > 90% de las cepas; - /+ , la mayoría de las cepas negativas, cepa positiva ocasional; 1, crecimiento inhibido; V, variable; SC, sin crecimiento. Adaptado de Whaley DN, Wiggs LS, Miller PH, Srivastava PU. Miller JM. Use o f Presumpto plates to identify anaerobic bacteria. J Clin Microbiol 1995; 33; 1196-1202, y ediciones previas de este libro.

Identificación de bacterias anaerobias

de P. acnés miden de 0,3-1,3 ¡im de diámetro x 1-10 |im de .argo.222 Su morfología se describió como de apariencia difteroide. Las células son marcadamente pleomorfas y se encuen­ tran en formas y tamaños variados, que van desde cocoides hasta bacilos definidos. Las células a menudo se tiñen en forma desigual por el procedimiento de Gram. Del mismo modo que las corinebacterias, las células tienen una morfología de letras chinas, de “pájaros en vuelo” y de estacas aguzadas, se presu­ me que debido a un movimiento súbito después de su división. P. acnés se desarrolla como un anaerobio obligado; sin embar­ go. algunas cepas muestran un desarrollo escaso en una jarra de anaerobiosis por extinción con vela (pero su crecimiento es mejor en anaerobiosis) y se las describió como aerotolerantes o microaerófilas. Las colonias de P ,acnés en agar sangre para anaerobios son de 1 a 2 mm de diámetro, circulares, de bordes Usos, convexas, brillantes y opalescentes. Algunas cepas pro­ ducen una zona estrecha de hemolisis. El análisis de productos metabólicos ácidos de cadena corta por CGL revela la produc­ ción de una importante cantidad de ácido propiónico, una can­ tidad menor de ácido acético y sólo una pequeña cantidad de ácido isovalérico [aP(iv)]. P. acnés puede ser reconocido sin el uso de CGL cuando produce indol y catalasa. Sin embargo, no todas las cepas producen indol ni todas producen catalasa. Además, Actinomyces viscosus, que tiene una morfología simi­ lar en algunos medios, produce catalasa. Propionibacterium propionicum. En 1988, Arachnia propionica fue reclasificada como Propionibacterium propionicum ,39 Con anterioridad, el nombre Arachnia propionica había sido creado para acomodar las bacterias una vez llamadas Actinomyces propionicus. Esta especie, mientras su patogenicidad y sus carac­ terísticas morfológicas se asemejan a las de ciertas especies de Actinomyces, difiere de las especies de Actinomyces por la pro­ ducción de ácido propiónico como producto metabólico princi­ pal y por su contenido de mureína y composición de menaquinona de la pared celular que se asemeja a los de las especies de Propionibacterium. Propionibacterium propionicum todavía debe considerarse un posible agente etiológico de actinomico­ sis. Los microorganismos han sido incriminados en casos de actinomicosis cervicofacial, formación de absceso pulmonar con empiema torácico o no, un absceso de cuello, una infección de herida de dedo seguida a una mordedura humana, un absceso renal y unos pocos casos de canaliculitis lagrimal.33 Este micro­ organismo es morfológicamente indistinguible, en tejidos y en cultivos, de Actinomyces israelii. P. propionicum y A. israelii for­ man bacilos “difteroides” pleomorfos y filamentos ramificados, largos (descritos con más detalle en la sección de especies de Actinomyces). Ambas especies son microaerófilas a anaerobias y crecen en forma óptima en condiciones anaerobias. ESPECIES DE BIFIDOBACTERIUM

En la actualidad, se reconocen más de 30 especies del géne­ ro Bifidobacterium y la mayoría habita los intestinos humanos y de algunos animales.114 Algunos cambios recientes en este grupo incluyen la transferencia de B. inopinatum al género Scardovia como Scardovia inopinata y la de B. denticolens a Parascardovia como Parascardovia denticolens.115 Con la excepción de Bifidobacterium dentium, ninguna bacteria del género Bifidobacterium parece patógena para los seres huma­ nos.6 Bifidobacterium dentium ahora incluye los antes llamados Actinomyces eriksonii y más tarde Bifidobacterium eriksonii. Es parte de la microflora normal de la boca y del tubo digesti­ vo y se ha encontrado en infecciones polimicrobianas de las vías respiratorias bajas. La morfología de B. dentium es a veces

885

similar a la de Actinomyces, pero difiere en que no produce filamentos ramificados en medio de tioglicolato. Los frotis teñidos de Gram preparados a partir de medios sólidos o culti­ vos en caldo muestran formas difteroides grampositivas que son mucho más variables en forma y tamaño que P. acnés. Las células varían de formas cocoides a alargadas, a menudo cur­ vadas, con extremos engrosados característicos o formas bífidas que habitualmente se observan en B. dentium. En el análi­ sis de los productos metabólicos ácidos de cadena corta por GLC, las bifidobacterias producen cantidades importantes de ácidos acético y láctico. ESPECIES DE LACTOBACILLUS

Las especies de Lactobacillus son parte de la microflora de la cavidad bucal, la faringe, el tubo digestivo y el aparato genitourinario (en especial, la vagina) humanos; a veces se encuentran en muestras clínicas. A menudo es difícil asignar importancia patógena a la mayoría de las cepas aisladas en el laboratorio; sin embargo, las especies de Lactobacillus han sido informadas en varios casos de endocarditis bacteriana, meningitis, bacteriemia clínicamente significativa, peritonitis, abscesos y otras infecciones potencialmente mortales. Aunque la mayoría de las cepas de Lactobacillus no son anaerobias estrictas, muchas crecen mejor en anaerobiosis. Las caracterís­ ticas que ayudan al reconocimiento de los lactobacilos son su desarrollo en un medio selectivo de agar jugo de tomate de Rogosa a pH relativamente bajo (Becton Dickinson M i­ crobiology Systems), su reacción catalasa negativa, su tenden­ cia a formar cadenas de bacilos grampositivos bastante unifor­ mes y su producción de ácido láctico como producto principal con sólo una pequeña cantidad de acetato (detectada usando GLC). La identificación de los lactobacilos más allá de un nivel presuntivo es dificultosa y escapa al alcance de este libro. Es notable que los lactobacilos sean resistentes a la vancomicina. Para más información sobre la identificación y la sensibilidad a los antibióticos de las especies de Lactobacillus, véase el capítulo 14. ESPECIES DE ACTINOMYCES

En los últimos años, se han efectuado numerosas revisiones taxonómicas dentro del género Actinomyces (cuadro 16-2). Entre estos cambios están la designación de varias especies nuevas y adicionales que incluyen A. cardijfensis,90 A. europaeus,14-2mA. funke i,146 A. georgiae,111 A. gerencseriae,"1 A. graevenitzii,195 A. hongkongensis,265 A. nasicola 93 A. neuii,15'16'165 A. oricola,92A. radicidentis,43'12*-219 A. radingae,266 A. turicensis203'246 y A. urogenitalis.ni Otros géneros relacionados con el género Actinomyces son Actinobaculum (p. ej., Actinobaculum schaalii y A. urinale)91-145 y Arcanobacterium (p. ej., Arcano­ bacterium bernardiae y A. pyogenes).'96 El informe de Clarridge y cois, ayuda a comprender la importancia de varias espe­ cies recién descritas42 Aunque las especies nuevas listadas en el cuadro 16-2 han sido aisladas en varias fuentes clínicas humanas, todavía falta información sobre muchas de ellas, así como respecto de su importancia clínica.170 Las bacterias que se han informado como agentes causales de actinomicosis humana son Actinomyces israelii, A. naeslun­ dii, A. odontolyticus, A. gerencseriae, A. viscosus, A. meyeri, A. georgiae, A. neuii subespecie neuii, P. propionicum y B. den­ tium (incluye, en parte, los antes llamados B. eriksonii).193'206'222 Estas bacterias son parte de la flora normal de la boca y muchas de ellas se pueden encontrar en el aparato genitourinario. A. is-

886

C A P ÍT U L O 16

Bacterias anaerobias

rae Iii es la especie más común en infecciones clínicas. Sin em­ bargo, la actinomicosis (con lesiones en los tejidos) es rara en la actualidad. En frotis con tinción de Gram preparados a par­ tir de lesiones, se pueden observar gránulos de azufre caracte­ rísticos, que son microcolonias granulares del microorganismo rodeadas por exudado purulento. Las células de A. israelii son bacilos grampositivos, por lo general de 1 ¡am de diámetro, pero muy variables en longitud. Las células pueden ser bacilos difteroides cortos, en forma de clava, filamentos ramificados o no ramificados (lámina en color 16-2). En agar sangre a menu­ do desarrollan colonias rugosas compuestas por bacilos ramifi­ cados o filamentos. Las colonias jóvenes (de 2 a 3 días), cuan­ do se observan con microscopio de disección, aparecen como filamentos radiados delgados conocidos como “colonias de arañas” . Cuando las colonias alcanzan los 7 a 14 días de incu­ bación, a menudo son elevadas, apiladas, blancas, opalescentes y brillantes; tienen bordes irregulares o lobulares, y se llaman colonias en forma de “molar” (lámina en color 16-2). Sin embargo, las cepas lisas (cerca de un tercio de A. israelii) pro­ ducen colonias en forma más rápida que las cepas rugosas. Las cepas lisas pueden producir colonias de 1 a 2 mm de diámetro, circulares, algo elevadas, blancas, opalescentes, lisas, brillantes después de sólo 2 a 3 días de incubación. A. naeslundii también puede producir colonias lisas o rugosas. Las colonias de A. vis­ cosus son en su mayoría de 0,5 a 2 mm de diámetro, enteras, convexas, grisáceas y translúcidas. En las colonias de A. odontolyticus puede aparecer un color rojo en agar sangre después de 7 a 14 días de incubación anaerobia o después de que las placas se han dejado al aire y a la temperatura ambiente duran­ te varios días. Como ya se mencionó, las características celula­ res y de las colonias de Propionibacterium propionicum son similares a las de los otros Actinomyces. Además de la morfología, las características de la colonia y los productos metabólicos, las características útiles para la identificación de los actinomicetos incluyen la relación con el oxígeno, la aparición y rapidez de desarrollo en medio de tio­ glicolato enriquecido, la producción de indol, la hidrólisis de gelatina y esculina, la fermentación de ciertos hidratos de car­ bono, los resultados de la evaluación con varias pruebas enzi­ máticas rápidas, la secuenciación de 16S rRNA y otros méto­ dos moleculares. Se recomiendan las siguientes referencias para más información respecto de la caracterización e identifi­ cación de las cepas más allá de las indicadas en los cuadros 1619 y 16-20.42’125’177,205

ESPECIES DE EUBACTERIUM

Las especies de Eubacterium son bastante comunes en heri­ das y abscesos, en los que por lo general están mezcladas con otras bacterias. Su importancia patogénica en muestras clínicas suele ser incierta.222 Sin embargo, como lo sugirieron Mascini y Verhoef,170 las especies de Eubacteriwn han sido informadas, aunque rara vez, como causa de baeteriemia, endocarditis y otras infecciones potencialmente mortales. Las especies aisla­ das con mayor frecuencia en muestras clínicas durante mucho tiempo fueron E. lentum (ahora Eggerthella lenta) y E. limosum. En los cuadros 16-19 y 16-20 se brinda información para la identificación presuntiva de las especies de Eubacterium más comunes. Como lo informaron Wade y cois., durante muchos años ignorados, el género Eubacterium fue considerado heterogéneo y contenía muchas especies no relacionadas.247 Sobre la base de los resultados de las determinaciones de la secuencia génica de 16S rRNA y otros datos, el género en la actualidad está

sufriendo una revisión taxonómica importante. Así, E. lentum fue transferida al género Eggerthella como Eggerthella lenta, mientras E. limosum continuó el tipo de especie del género Eubacterium.241 En el cuadro 16-2 se enumeran otros numero­ sos cambios, como la transferencia de Eubacterium aerofaciens al género Collinsella como Collinsella aerofaciens}21 Además, el microorganismo llamado Eubacterium fonnicigenerans es ahora Doria formicigenerans,236 la especie antes llama­ da E. timidum ahora es Mogibacterium timidum94 y la especie conocida como E. alactolyticum es Pseudoramibacter alactolyticus,263 Se describieron otros géneros de bacilos grampositivos no formadores de esporas, entre ellos, Cryptobacterium, Bulleidia, Atopobium, Slackia, Holdemania y Catenibacterium, pero su importancia clínica aún se desconoce.170,176

MOBILUNCUS Y VAGINOSIS BACTERIANA

Mobiluncus, junto con otros anaerobios, está presente en muestras vaginales de mujeres con vaginitis inespecífica (vagi­ nosis bacteriana).104,177,230 En 1984, Spiegel y Roberts propusie­ ron el nombre Mobiluncus para un género nuevo de bacilos anerobios no formadores de esporas, curvados, móviles, gram­ negativos o gramvariables, que se encuentran solos o en pares con una apariencia de “alas de gaviota”.231 Mediante la microfotografía electrónica se observaron paredes celulares con ca­ pas múltiples sin membrana externa, probablemente más típi­ cas de paredes celulares grampositivas que de gramnegativas; no obstante, los microorganismos tienden a ser gramvariables en los cultivos jóvenes y gramnegativos en los cultivos viejos. El nombre Mobiluncus derivó de las palabras latinas mobilis (que significa capaz de movimiento) y uncus (gancho).231 El potencial patogénico de las especies de Mobiluncus, si existe alguno, todavía no está claro. Se aisló en pacientes con infec­ ciones extragenitales en pocas ocasiones y existe un caso infor­ mado de su aislamiento en un paciente con sepsis grave.83,102 El microorganismo es uno de los muchos géneros de anaerobios que colonizan la vagina tanto sana como enferma.177 La vaginosis bacteriana implica un sobrecrecimiento de bac­ terias múltiples, incluidas Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, especies de Mobiluncus, Prevotella bivia, Prevotella disiens, otras especies de Prevotella, Peptostreptococcus anae­ robius, P. asaccharolyticus, P. magnus y otros cocos anaero­ bios, más bacilos grampositivos anaerobios como las especies de Propionibacterium .l03104230 Por lo tanto, es probable que la vaginosis sea una infección sinérgica en la que participan muchos microorganismos. Como se repasó en otro lugar,225 el diagnóstico de vaginosis bacteriana se basa en la demostración de tres de los siguientes cuatro criterios: 1) secreción vaginal “fluida” (pero profusa), 2) pH mayor de 4,5, 3) olor que por lo común se describe como “a pescado” (en especial después de agregar hidróxido de potasio al 10%), y 4) detección de “célu­ las clave” en el examen microscópico. Las “células clave” son células epiteliales pavimentosas de la vagina con un gran número de bacilos pequeños adheridos a su superficie. Se las puede observar en preparados húmedos o en frotis con tinción de Gram (o en preparaciones teñidas con Papanicolaou). Las especies de Mobiluncus crecen en varios tipos de medios no selectivos en placa, incluidos agar sangre para anaerobios (p. ej., infusión de cerebro y corazón, Brucella y medio base de agar sangre para anaerobios de los CDC) y agar chocolate. Des­ pués de 3 a 5 días de incubación, las colonias son de 2 a 4 mm de diámetro, incoloras, translúcidas, lisas y chatas, a veces con

Cuadro 1 6-19

C ara c terístic a s diferenciales de bacilos gram positivos an aero b io s no fo rm ad o res de esporas

ESPECIE

RELACIÓN CON EL OXÍGENO

RAPIDEZ DE CRECI­ MIENTO

COLONIAS EN AGAR SANGRE

PIGMENTO ROJO EN AGAR SANGRE

APARIENCIA EN CALDO TIOGLICOLATO ENRIQUECIDO

MORFOLOGÍA CELULAR EN CALDO TIOGLICOLATO ENRIQUECIDO

Actinomyces israelii

M o AO

Lento

Rugosas

-

G ranular o difusa

Filamentos ram ificados o difteroides

A. naeslundi

F

M oderado

Lisas

-

Difusa

A. odontolyticus

M o AO

M oderado

Lisas

+

A. viscosus

F

Rápido

Lisas

A. meyeri

AO, F

Arcanobacterium pyogenes

F

Bifidobacterium dentium

AO

Eggerthella lenta

REDUC­ CIÓN DE NITRATO

PRODUCTOS METABÓLICOS EN CALDO PYG, 48 HORAS A 35 °C

V

A, L, S

D ifteroide, ramificada

+ /-

A, L, S

Difusa

Difteroide. ram ificada

+

A, L, S

-

Difusa

Difteroide, ramificada

+

A, L, S

Lisas

-

Difusa

Difteroide, ramificada

-

A, L, S

Lisas

-

Difusa

Difteroide, cocoide

-

A, L, S

Rápido

Lisas

-

Difusa

Bacilos delgados, extremos bífidos, extrem os bulbosos

-

A, L

AO

Moderado

Lisas

-

Difusa

Bacilos cocoides cortos, difteroides

V

A

Eubacterium limosum

AO

Rápido

Lisas

Difusa

Bacilos pletóricos, bífidos y bulbosos

V

Lactobacillus catenaformis

AO

Rápido

Lisas

-

Difusa (granular)

Bacilos cortos en cadenas o solos

-

A, L

Propionibacterium avidum

F

Rápido

Lisas

-

Difusa

Difteroides

V

A, P

P. acnés

AO FF

Moderado

Lisas

-

Difusa (granular)

Difteroides

+

A, P

P. granulosum

F

Rápido

Lisas

-

Difusa

Difteroides

-

A, P

P. propionicum

MoAO

Lento

Rugosas

-

G ranular o difusa

Filam entos ram ificados o difteroides

+

A, P

Pseudoramibacter alactolyticum

AO

Lento

Lisas

-

Difusa

Bacilos delgados, en form a de V, entre cruzados

A, B (los que producen ácido a partir de un caldo que no contiene glucosa son A, IB, B, IV)

+, reacción positiva para el 90-100% de las cepas probadas; -, reacción negativa para el 90-100% de las cepas probadas, superíndice, reacción observada en el 11-25% de las cepas probadas; V, reacción variable; paréntesis,

variable; F, anaerobio facultativo; M, microaerófilo; AO, anaerobio obligado; A, ácido acético; B, ácido butírico; C, ácido caproico; L, ácido láctico; P, ácido propiónico; S, ácido succínico; IB, ácido isobutírico; IC, ácido isocaproico. Modificado de Dowell VR. Clinical veret9inary anaerobic bacteriology. Atlanta : Centres fo r Disease Control, 1977; 1-25, y adaptado de las siguientes referencias: Alien SD. Gram-positive, non-spore-forming anaerobic bacilli. ln: Lennette EH, Ballows A, Hausler WJ Jr, Shadomy EJ, eds. Manual o f Clinical Microbiology. Ed. 4. Washington, DC: American Society fo r Microbiology, 1985: 461-472; Jones D, Collins MD. Irregular, nonsporing gram-positive rods. ln: Sneath PHA, Mair NS, Sharpe MG, Holt JG. eds. Bergey’s Manual o f Systematic Bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins, 1986: 1261-1434.

Identificación de bacterias anaerobias

A, B, C

887

888

Cuadro 1 6-20

Reacciones de bacilos grampositivos no formadores de esporas en medios diferenciales de agar CDC PLA C A P R E S U M P T O 2

PLA CA P R E S U M P T O 3 O '5 a £

E

t0> Q

£

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z

Q

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1 CS u 4» •O

s

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2

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—

s E La u<

E Iw

Actinomyces A. israelii

12

V

+

-/+

-1+

V

- /+

-/+

A. meyeri

39

-

-

-

-

-

-

-

TNC

+ /-

-

-

-1+

-

-

V

-

A. naeslundii

31

-

-

+ /-

-

-

-

-

V

+

-

-

-

-

-/+

+ /-

-

A. odontolyticus

56

-

-

V

-

-

-

-

V

+

-

-

-

-

-

V

-/+

A. viscosus

25

-

-

V

-

+ /-

-

-

SC1

+

-

-

-

-

-

V

-

12

-

-

-

-

-

-

-

JNC

+

-

+

- /+

+ /-

-

- /+

-

B. adolescentis

8

-

-

V

-

-

-

-

E

+

-1+

-

-

-

-/+

+

-

B. bifidum

4

-

-

-

-

-

-

-

E

+

-

-

-

-

-

+

-

B. breve

4

-

-

+ /-

-

-

-

-

E

+

-/+

-

-

-

V

+

-

B. dentiuma

3

-

-

-

-1+

-

-

-

E

+

-

-

-

-

+

+ /-

-

B. infantis/longum

3

-

-

-

-

-

-

-

E

+

V

-

-

-

-

+

-

3

-

-

- /+

-

-

-

-

E

+

-

+ /-

-

-

-

+

-

33

-

-

-

-/+

V

-

-

E1

-

-

-

-

-

-

-

-

E. brachy

2

-

-

-

-

-

-

-

SC

-

-

-

-

-

-

-

-

E. limosum

8

-

-

-

+

-

-

-

E

+

V

-

-

-

+

-

-

E. nodatum

3

-

-

-

-

-

-

-

SC

-

-

-

-

-

-

-

-

E. saburreum

2

V

-

V

-

-

-

-

SC

-

-

-

-

-

-

-

E. timidum

3

-

-

-

-

-

-

-

SC

-

-

-

-

-

-

-

_

_

+

_

-1+

V

+

_

+ /-

.

V

-

+ /-

-

+

-

+ /-

E

+

-

V

-

+ /-

+

A racnobacterium A. pyogenes Bifidobacterium

Collinsella C. aerofaciens Eggerthella E. lenta Eubacterium

-

Propionibacterium P. acnés

144

+ /-

P. avidum

5

-

-

-

P. granulosum

7

-

-

-

-

+

-

-1+

V

+

-

V

-/+

- /+

-/+

-/+

-

P. propionicum

10

-

-

-

-

-

-

-

I

V

-

-

-

-

V

V

-

4

-

-

-

-

-

-

-

1

V

-

-

-

-

-

-

-

Pseudoramibacter P. alactolyticum

“Antes llamado B. eriksonii. +, reacción positiva en más del 90% de las cepas; - reacción negativa en más del 90% de las cepas; +/-, la mayoría de las cepas positivas, cepa negativa ocasional; - /+ , la mayoría de las cepas negativas, cepa positiva ocasio­ nal; I, crecimiento inhibido; V, variable; E, crecimiento igual (equivalente) al control sin bilis; E', crecimiento igual al control con cepa inhibida ocasional; INC, crecimiento inhibido con cepas ocasionales que no crecen; SC, sin crecimiento; SC1, sin crecimiento con cepa inhibida ocasional. Adaptado de Whaley DN, Wiggs LS, Miller PH, Srivastava PU, M iller JM. Use o f Presumpto plates to identify anaerobic bacterie. J Clin Microbiol 1995,33:1196-1202 y ediciones previas de este libro.

Bacterias anaerobias

E S P E C IE

N ” D E C EPA S E X A M IN A D A S

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3

16

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CAPÍTULO

PLA CA PR E SU M PT O 1

Identificación de bacterias anaerobias

¿specto expansivo. Las células miden menos de 0,5 (im de ancho por casi 1,5 a 3 (im de longitud. El succinato y el acetato son los productos más importantes (con pequeñas cantidades de lactato o no) después del desarrollo en caldo con peptona y extracto de levadura suplementado con glucógeno al 2% en suero de conejo. La diferenciación entre las dos especies ahora reconocidas, M. curtisii y M. mulieris ,238 basada en diferencias de morfología, reacciones negativas para indol y catalasa, desarrollo en presencia de arginina, hidrólisis de hipurato, reducción del nitrato variable y otras características, es difi­ cultosa.125177-231 OTROS GÉNEROS Y ESPECIES DE BACILOS GRAMPOSITIVOS ANAEROBIOS NO FORMADORES DE ESPORAS

Finegold actualizó los cambios taxonómicos de los anaero­ bios asociados con los seres humanos, incluida la información de géneros y especies no mencionadas en este libro.67 A los interesados en la identificación definitiva de los bacilos gram­ positivos anaerobios no formadores de esporas que necesiten recursos no disponibles en muchos (si no en la mayoría) de los laboratorios de microbiología clínica se recomienda la lectura de las referencias que siguen.42-125-177 Identificación de especies de Clostridium

Los bacilos grampositivos anaerobios formadores de esporas encontrados en muestras clínicas humanas son miembros del género Clostridium. En 1994, Collins y cois.,44 sobre la base de secuencias génicas de 16S rRNA determinadas por secuencia­ ción directa m ediante PCR, encontraron que el género Clostridium era muy heterogéneo. Por lo tanto, les dieron nom­ bre a cinco géneros nuevos de bacilos formadores de esporas.44 Se incluyeron las siguientes especies: Caloramator, Filifactor, Moorella, Oxobacter y Oxalophagus. Además, se propusieron 11 combinaciones nuevas de especies. Ninguna de estas desig­ naciones nuevas de género y especie fueron relevantes para enfermedades infecciosas humanas. Las especies recién crea­ das en el momento que se escribe este texto son Clostridium bartlettii,229 C. bolteae,228 C. hathewayi234 y C. n eo n a ta les Se deben consultar los documentos originales para obtener infor­ mación acerca de su importancia clínica. En la actualidad, las especies de Clostridium encontradas en la clínica varían en sus relaciones con el oxígeno y en sus acti­ vidades fisiológicas catabólicas y anabólicas. Ciertos clostridios, por ejemplo C. haemolyticum y C. novyi tipo B. están entre los anaerobios obligados más estrictos. En el otro extre­ mo del espectro, C. histolyticum, C. tertium y C. carnis son aerotolerantes y forman colonias en placas de agar sangre para anaerobios incubadas en una jarra de anaerobiosis por extin­ ción con vela o en una estufa con 5-10% de C 0 2. En el labora­ torio clínico a veces el problema se origina en determinar si una cepa es un clostridio aerotolerante o un bacilo anaerobio facultativo. Los clostridios aerotolerantes rara vez forman esporas cuando crecen en aerobiosis y son catalasa negativos, mientras que las especies del género Bacillus rara vez forman esporas cuando crecen en condiciones anaerobias y producen catalasa.222 Aunque los clostridios se consideran grampositivos, muchos son gramnegativos cuando se preparan los frotis de las colonias en desarrollo. Por ejemplo, Clostridium ramosum y C. clostridioforme son por lo común gramnegativos. La demostración de esporas suele ser difícil con algunas especies, por ejemplo, C. perfringens, C. ramosum y C. clos-

889

tridioforme. La demostración de producción de esporas no es necesaria para la identificación de estas tres especies. Para demostrar esporas, por lo general son suficientes las prepara­ ciones teñidas con Gram; las tinciones especiales para esporas no suelen tener ventajas particulares. Sin embargo, el examen de preparados húmedos con un microscopio con contraste de fase es útil cuando las esporas son maduras y refringentes. En nuestra experiencia, la mejor forma para demostrar la produc­ ción de esporas es inocular un agar inclinado (en pico de flau­ ta) con carne cocida e incubar en anaerobiosis durante 5 a 7 días a 30 °C. Las células del crecimiento en el agar inclinado se observan luego en una preparación teñida con Gram o en una preparación húmeda con microscopio de contraste de fase. Además, se pueden usar técnicas de selección de esporas mediante la aplicación de alcohol o choque térm ico.138 En los cuadros 16-21, 16-22 y 16-23 se muestran las características identificatorias para la mayoría de los clostridios encontrados en infecciones humanas. Algunas de las reacciones claves para la identificación de C. perfringens se ilustran en la lámina en color 16-3. La doble zona de hemolisis en agar sangre, la producción de lecitinasa en agar yema de huevo y la fermentación abrupta de leche tornasolada (o proteólisis en agar leche) son características de esta especie. Las células de C. perfringens son de 0,8-1,5 (im de diámetro x 2-4 |im de longitud con extremos romos. A menudo se descri­ ben como en forma de furgón de carga. No obstante, las células examinadas durante el desarrollo temprano en cultivo en caldo tienden a ser cortas y cocoides, mientras que los cultivos más viejos contienen células más largas que pueden ser casi fila­ mentosas. Después de toda una noche de incubación en agar sangre, las colonias por lo común son de 1 a 3 mm de diámetro, pero pueden alcanzar 4 a 15 mm después de una incubación prolongada. Las colonias suelen ser chatas, a veces rizoides y elevadas en el centro. Algunas tienden a extenderse, pero no coalescen. C. perfringens es no móvil. C. perfringens es con mucho la especie de Clostridium de origen humano aislada con mayor frecuencia. Sin embargo, los clostridios dan cuenta de tan sólo el 10-12% de los aislamien­ tos de bacterias anaerobias en muestras clínicas recolectadas y seleccionadas en forma apropiada. C. perfringens y otros clos­ tridios se encuentran entre la flora normal del tubo digestivo. También habitan de manera transitoria en la piel. Muchos clos­ tridios aislados en muestras clínicas, incluso de hemocultivos, son contaminantes accidentales y pueden no revestir importan­ cia clínica. En otras circunstancias, la presencia de ciertos clos­ tridios en una lesión puede tener consecuencias lamentables para el huésped. Así, las propiedades patogénicas de los clos­ tridios pueden ser manifestadas sólo en circunstancias especia­ les y la comunicación entre el microbiólogo y el médico que atiende al paciente es casi siempre necesaria para determinar la importancia de una cepa dada. C. perfringens también se encuentra en la mionecrosis (gangrena gaseosa), la colecistitis gangrenosa, la septicemia y la hemolisis intravascular posterior a un aborto e infecciones pleuropulmonares anaerobias; es la causa principal de intoxicación alimentaria en los Estados Unidos; también es causa de diarrea asociada con antibióticos y la causa más diseminada de enterocolitis necrosante que afec­ ta a niños y adultos.4-7-28-81-189-222-253 CLOSTRIDIOS HIST0TÓXIC0S IMPLICADOS EN MIONECROSIS CLOSTRIDIANA 0 GANGRENA GASEOSA

Los clostridios implicados más a menudo en la gangrena gaseosa son C. perfringens (80%), C. novyi (40%) y C. septi-

890 CAPÍTULO 16

E SPE C IE »

A lgunas caracte rístic as claves de especies de C lo strid iu m asociadas con en ferm ed ad h u m a n a

AEROTOLERA N TE

C. bifermentans

_

C. botulinumb

-

C. butyricum

ZONA D O B LE D E H E M O L IS IS

E SP O R A S T E R M IN A L E S

M O V IL ID A D

P R O D U C T O S M E T A B Ó L IC O S V O L Á T IL E S (C G L ) EN P Y G , 48 H O R A S A 35 °C

OTRAS

+

A, IC, (P), (IB), (B), (IV)

U reasa negativas; indol positivas

+

A, (P), (IB), B, IV, (V), (IC)

Lipasa positivas

-

+

A, B

M uy sacarolíticas

C. difficile

_

+

A, IB, B, IV, IC

C. innocuum

-

-

+

-

A, B

Lactosa y m altosa negativas

C. limosum

-

-

-

+

A

A sacarolíticas; gelatina positivas

C. novyi tipo A

-

-

-

+

A, P, B

Es raro encontrarlas en m uestras clínicas

C. perfringens

-

+

-

-

A, B, (P)

Rara vez se observan esporas

C. ramosum

-

-

+

-

A

Rara vez se observan esporas; con frecuencia gramnegativas

C. septicum

-

-

-

+

A, B

Sacarolítica, pero sacarosa negativas

C. sordellii

_

+

A, IC, (P), (IB), (IV)

Ureasa positivas; indol positivas

C. sporogenesh

-

+

A, P, IB, B. IB, V, IC

Lipasa positivas

C. subterminale

_

+

A, IB. B, IV, (P)

A sacarolíticas; gelatina positivas

C. tetani

-

-

+

+

A, (P), B

Pueden aparecer gramnegativas

C. tertium

+

-

+

+

A, B

Sin esporas en condiciones anaerobias

-

-

-

-

“Para más información sobre la identificación definitiva de estas especies y otros clostridios que pueden encontrarse en muestras clínicas.7'51107'22-125 b Prueba de neutralización de toxina requerida para la identificación definitiva. +, reacción positiva para el 90-100% de las cepas probadas; -, reacción negativa para el 90-100% de las cepas probadas, V, reacción variable; paréntesis, variable; A, ácido acético; P, ácido propiónico; IB, ácido isobutírico; IV, ácido isovalérico; V, ácido valérico; IC, ácido isocaproico.

Bacterias anaerobias

Cuadro 16-21

Cuadro 16-22

Reacciones de especies de Clostridium en medios diferenciales de agar de los ( ’IH

E S P E C IE

C. baratii C. bifermentans C. butyricum C. cadaveris C. clostridioforme C. difficile

8 16 31

E 3 E

•E

N" D E C EPA S E X A M IN A D A S

O + -

6

+ /-

18

-/+

-

-

+

-

-

+

-

+

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V

V

-

E

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-

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+

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V

-

V

-

-

-

-

E

-

-

-

-

£u

z

V

+

PLA C A P R E S U M P T O 3

PLA C A P R E S U M P T O 2

PLA CA PR E SU M PT O 1

-

-

-

+ /-

-

-

+

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

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-

-

-

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-

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-

-

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5

-

-

-

-

-

-

-

V

-

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-

-

-

18

-

-

+

-

-

-

-

E

+

-

-

-

-

+ /-

-

-

C. limosum

2

-

-

-

-

-

-

-

SC

V

V

V

V

-

-

-

-

C. malenominatum

7

+

-

-

V

-

-

-

IE

-

-

-

- /+

-

-

-

-

C. paraputrificum

13

-

-

+

-

-

-

-

E

+

- /+

-

-

-

-

+

-

C. perfringens

79

-

-

V

-1+

-

+

-

E

+

+ /-

V

+

+

-

+

-

C. ramosum

16

-

-

+

-

-

-

-

E

+

-

-

-

-

V

+

V

C. septicum

56

-

-

+ /-

-

-

-

-

E

+

-

-

+

+ /-

-

+ /-

-

C. sordellii

32

+

-

-

V

-

+ /-

-

E

+

-

+

-

+

-

-

-

+ /-

-

V

-

-

-

-

V

+

-

-

V

-

V

V

V

C. histolyticum C. innocuum

C. sphenoides

8

C. sporogenes

52

-

+

+

-

-

- /+

+

E

+

-

+

-/+

+

-

-

-

C. subterminale

7

-

-

-

V

-

-

-

V

-

- /+

V

-/+

+ /-

-

-

-

C. symbosium

2

-

-

-

-

-

-

-

V

V

-

-

-

-

V

-

-

C. tertium

44

-

-

+

-

-

-

-

E

+

V

-

+ /-

-

+

+

-

C. tetani

27

+ /-

-

-

V

-

-

- /+

E'

-

-

-

V

+

-

-

-

+, reacción positiva en más del 90% de las cepas; - reacción negativa en más del 90% de las cepas; +/-, la mayoría de las cepas positivas, cepa negativa ocasional; -/+ , la mayoría de las cepas negativas, cepa positiva ocasio­ nal; V, variable; I, crecimiento inhibido; E, crecimiento igual (equivalente) al control sin bilis; E‘, crecimiento igual al control con cepa inhibida ocasional; ENC, crecimiento igual con cepas ocasionales que no crecen; SC, sin cre­ cimiento; IE, la mayoría de las cepas inhibidas con cepas ocasionales que crecen igual. Adaptado de la referencia 259 de Whaley DN, Wiggs LS.Wiggs LS, Miller PH, Srivastava PU, Miller JM. Use o f Presumpto plates to identify anaerobic bacteria. J Clin Microbiol 1995;33:1196-1202 y ediciones previas de este libro.

Identificación de bacterias anaerobias

490

+

00 CD

892

C A P ÍT U L O 16

Cuadro 16-23

Bacterias anaerobias

C aracterístic a s útiles p a ra la identificación de algunas especies de Clostridium

C A R A C T E R ÍS T IC A A erotolerante No móvil Esporas terminales Produce lecitinasa en agar yem a de huevo Produce lipasa en agar yem a de huevo Asacarolítico y proteolítico (es decir, gelatina positivo) U reasa positivo N o hidroliza gelatina Ferm enta manitol Ferm enta ram nosa Sacarolítico y proteolítico Sacarolítico y no proteolítico

E S P E C IE S C. camis, C. histolyticum, C. tertium C. innocuum, C. perfringens, C. ramosum C. baratti, C. cadaveris, C. innocuum, C. ramosum, C. tertium, C. telani C. bifermentans, C. limosum, C. novyi, C. perfringens, C. sordellii, C. subterminale, C. baratii, C. haemolyticum C. botulinum, C. novyi tipo A, C. sporogenes C. histolyticum, C. limosum, C. subterminale, C. tetani, C. malenominatum (débil a gelatina negativo) C. sordellii (C. bifermentans, al que se asem eja, es ureasa negativo) C. butyricum, C. clostridioforme, C. malenominatum, C. paraputrificum, C. baratii, C. ramosum

C. difficile, C. innocuum, C. ramosum, C. sphenoides, C. symbiosum, C. tertium C. clostridioforme, C. ramosum, C. sporogenes C. bifermentans, C. botulinum, C. cadaveris, C. difficile, C. haemolyticum, C. novyi, C. perfringens, C. putrificum, C. septicum, C. sordellii, C. sporogenes C. baratii, C. beijerinckii, C. butyricum, C clostridioforme, C. glycolicum, C. innocuum, C. paraputrificum, C. ramosum, C. tertium

cum (20%), seguidos en ocasiones de C. histolyticum y C. sordellii.222 La mionecrosis por clostridios (gangrena gaseosa) es una entidad clínica invasiva de instalación rápida con necrosis por licuefacción de los músculos y formación de gas, con sig­ nos clínicos de toxicidad. No obstante, la cooperación entre el laboratorio microbiológico y el equipo médico es una necesi­ dad urgente para la confirmación del diagnóstico clínico. Los frotis teñidos con Gram del material aspirado de la mionecro­ sis revelan un fondo necrótico con falta de células inflamato­ rias y presencia de formas morfológicas que se asemejan a C. perfringens o a otro clostridio. En otras condiciones, como la infección de una herida simple o la celulitis anaerobia (en la que también puede haber gas en el tejido), la presencia de con­ tornos de células musculares o de granulocitos y bacterias con morfología mixta en frotis teñidos con Gram de tejidos afecta­ dos serían una evidencia en contra de la mionecrosis por clos­ tridios. Las referencias que siguen dan más detalles sobre los clos­ tridios histotóxicos.7-70-154,222 Enfermedad intestinal desencadenada por C. perfringens. C. per­ fringens, posicionado detrás de las especies de Salmonella y Staphylococcus aureus, ha sido el tercer agente etiológico más común de enfermedad transmitida por alimentos en los Estados Unidos durante muchos años.38 La mayoría de los brotes de intoxicación alimenticia por C. perfringens en ese país han sido producidos por las cepas de toxina tipo A.738 La intoxicación se produce por la ingesta de carne de vaca, pollo, cerdo, pavo, extractos de carne y otros alimentos contaminados con gran cantidad de microorganismos. Por lo general, dentro de las 7 a 15 horas después de ingerir los alimentos sospechosos se pre­ senta con dolor abdominal de tipo cólico. En la mayoría de los casos, hay diarrea, heces espumosas con olor fétido y pocos vómitos o fiebre. La enfermedad aparece después de que casi 108 células de C. perfringens vegetativas viables llegan al intes­ tino delgado y sufren esporulación. La diarrea es consecuencia de una potente enterotoxina (una proteína de cerca de 34 kDa) que se produce en el intestino mientras forma las esporas. La enfermedad tiende a ser leve y a autolimitarse, y los pacientes suelen recuperarse a los 2 a 3 días de su aparición. Para confir­ mar el diagnóstico durante la investigación de un brote se han

hecho cultivos anaerobios cuantitativos en medios selectivos en placa, que demostraron al menos 105 microorganismos en los alimentos implicados en la epidemiología, y recuentos que mostraron 106 o más esporas de C. perfringens por gramo de heces recolectadas dentro de las 24 horas del comienzo de los síntomas. Además, se realizó la serotipificación de los aisla­ mientos para demostrar que el mismo serotipo de C. perfrin­ gens estaba presente en los alimentos implicados y en las heces de las personas enfermas, pero no en los controles. La tipifica­ ción serológica debe efectuarse en laboratorios establecidos muy bien equipados para este servicio (como el de los CDC).7-53 Oxoid® (Basingstoke, Inglaterra) comercializa un equipo para la detección de enterotoxina de C. perfringens. El sobre­ nadante de un homogenato salino de heces se prueba para la endotoxina usando un procedimiento de aglutinación del látex pasiva inversa, de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Faltan datos con respecto a la sensibilidad, la especificidad y la exactitud de la prueba. La enfermedad intestinal necrosante causada por Clostri­ dium perfringens es bastante más grave que la enfermedad transmitida por alimentos descrita con anterioridad. Se caracte­ riza por la rápida aparición de dolores cólicos y distensión abdominales, vómitos, diarrea sanguinolenta y shock relacio­ nado con problemas con los líquidos y los electrólitos, e infla­ mación aguda y necrosis local o diseminada de la mucosa intestinal. Conocida en la posguerra alemana como “Darmbrand" (“intestinos de fuego”) fue una forma grave de entero­ colitis necrosante con una mortalidad aproximada del 40%. Una forma de enteritis necrosante observada principalmente en los niños de la zona montañosa de Papua-Nueva Guinea deno­ minada pig bel (vientre de cerdo) se asocia con una mortalidad del 30-60%.174249Los casos esporádicos de enfermedad intesti­ nal necrosante por C. perfringens han sido informados en muchas partes del mundo, incluidos Europa y los Estados Unidos.4 Entre los factores que se creen importantes como con­ diciones predisponentes para la enfermedad intestinal necro­ sante está el consumo de cantidades excesivas de alimentos ricos en inhibidores de la tripsina (p. ej., boniato, cacahuete) por individuos desnutridos. C. perfringens tipo C ha sido invo­

Identificación de bacterias anaerobias

lucrado en los síndromes de Darmbrand, de pig bel y de enfer­ medad intestinal necrosante en los países de Occidente duran­ te los últimos años.4 Se ha sugerido que C. perfringens tipo A también desempeña un papel en algunos casos de enfermedad intestinal necrosante, en particular en los países occidentales.241 En los nativos de las montañas de Papua-Nueva Guinea, la enfermedad típica se desarrolla después del consumo de gran­ des cantidades de carne mal cocida en la fiesta del cerdo. Un inoculo cargado de C. peifringens tipo C se ingiere con la comida y el microorganismo prolifera en el intestino delgado donde produce (3-toxina. Los niveles bajos de enzimas proteolíticas pancreáticas, asociados con la dieta usual baja en pro­ teínas de los montañeses y con el consumo abundante de bonia­ to. pueden permitir que la (3-toxina de C. perfringens actúe en el intestino delgado sin que sea destruida por la tripsina pan­ creática u otras proteasas. Existe un espectro clínico y patoló­ gico en cuanto a la gravedad de la enfermedad intestinal necro­ sante. Algunos pacientes pueden sobrevivir con cuidados de mantenimiento y descompresión del intestino; otros pueden requerir la resección del segmento intestinal afectado; otros son inoperables y mueren con necrosis gangrenosa extensa de los intestinos delgado y grueso. El diagnóstico diferencial incluye colitis seudomembranosa (de un modo u otro asociada con Clostridium difficile), shigelosis aguda, enfermedad transmiti­ da por alimentos por varios agentes causales (como Escherichia coli y Campylobacter jejuni entre otros), colitis ulcerosa aguda y obstrucción intestinal (debida a adherencias, vólvulo, etc.). En los casos sospechosos, se debe procurar el cultivo de C. perfringens tipo A y tipo C (p. ej., hemocultivos, cultivos peritoneales si existe peritonitis y del contenido intestinal de muestras de necropsia o quirúrgicas). Se debe consultar a un laboratorio de referencia (como el de los CDC), donde se pueda cumplimentar la tipificación de las cepas. Se deben obtener muestras pareadas de suero para los estudios de sero­ tipificación (p. ej., para determinar un aumento en el título de anticuerpos séricos para (i-toxina). Una elevación del título de anticuerpos sería compatible con enfermedad por C. per­ fringens tipo B o tipo C.249

OTROS CLOSTRIDIOS EN DIVERSOS CUADROS CLÍNICOS

Clostridium ramosum. Clostridium ramosum fue llamado en el pasado Eubacterium füamentosus, Catenabacterium filamentosum, Actinomyces ramosus, Fusiformis ramosus, Ramibacterium ramosus y con otros nombres.222 En 1971, como ya se mencionó, se encontró que producía esporas terminales y fue colocado en el género Clostridium.'35 Es un miembro destaca­ do de la flora del intestino grueso y es el segundo Clostridium aislado con más frecuencia en muestras clínicas recolectadas en forma apropiada. Es común, en particular, en infecciones abdominales posteriores a traumatismos. Clostridium ramosum es importante desde el punto de vista clínico a causa de su resistencia a la penicilina G, a la clindamicina y a otros anti­ bióticos. Aunque se ha encontrado en infecciones graves de todos los sitios corporales, puede ser mal identificado o pasado por alto, porque por lo general se tiñe como bacilo gramnega­ tivo y sus esporas terminales son difíciles de demostrar. Las células de C. ramosum suelen ser menores de 0,6 |im de diámetro x 2-5 (im de largo, pero son muy pleomorfas y a veces producen cadenas cortas o filamentos largos. En agar sangre, las colonias a menudo son de 1 a 2 mm de diámetro, no hemolíticas, circulares o levemente irregulares, de bordes lisos, poco convexas y translúcidas. Las cepas de C. ramosum son resistentes a la rifampicina por el método de disco de 15 j_tg tra­

893

tado con anterioridad, pero inhibidas por el disco de penicilina de 2 U y el de kanamicina de 1 mg (de modo similar a F. mor­ tiferum y F. varium). C. ramosum es indol negativa (F. mortife­ rum y F. varium son indol positivas); muestra un desarrollo potenciado en agar bilis; hidroliza la esculina, y es negativo para catalasa. lipasa y lecitinasa. Está entre los pocos clostri­ dios que fermentan el manitol (cuadro 16-23). Los ácidos acé­ tico, láctico y succínico son los principales productos metabó­ licos. Clostridium septicum. Aunque Clostridium septicum no es tan común como C. perfringens y C. ramosum. es importante reco­ nocerlo en el laboratorio clínico. Se lo suele aislar en infeccio­ nes graves, a menudo mortales. La bacteriemia por C. septi­ cum, por razones desconocidas, se asocia con cáncer subya­ cente, en particular carcinoma de colon, carcinoma de mama y neoplasias hematológicas (p. ej., leucemia-linfoma).139 Las células son de 0,6 |im de ancho y 3 a 6 |im de longitud. Tiende a ser pleomorfo, a veces produce filamentos delgados y largos. La formación en cadena es común, como unidades en forma de limón intensamente coloreadas. Las esporas son ovales y subterminales y distienden el microorganismo. Después de 48 horas de incubación en agar sangre, las colonias tienen 2 a 5 mm de diámetro, están rodeadas por una zona de I a 4 mm de hemolisis completa; son chatas, levemente elevadas, grises, brillosas y semitranslúcidas, y los bordes de irregulares a rizoi­ des, a menudo rodeados por una zona de aglomeración. Las cepas muy móviles pueden aglomerarse en una área amplia de la placa. A veces, para evitar la aglomeración en la placa se usa agar sangre condensado, que contiene 4-6% de agar en lugar del usual de 1,5%. Algunas características claves de C. septi­ cum son que hidroliza gelatina; no produce indol, lipasa o leci­ tinasa, y fermenta lactosa pero no manitol, ramnosa o sacarosa. Los ácidos acético y butírico son los principales productos metabólicos. CLOSTRIDIUM DIFFICILE ASOCIADO CON ENFERMEDAD INTESTINAL Se creyó que S. difficile, aislado por primera vez en 1935, no era patógeno para los seres humanos hasta los últimos años de la década de 1970, cuando estuvo implicado como agente cau­ sal en diarrea asociada con antibióticos (DAA) y colitis seudo­ membranosa (CSM).7,21 La diarrea benigna, autolimitante, con frecuencia aparece en pacientes hospitalizados que están sien­ do tratados con antibióticos. La diarrea leve suele apaciguarse al interrumpir el tratamiento y su causa no está determinada. En otros pacientes, los síntomas intestinales pueden ser más graves, y la diarrea puede persistir. Estos enfermos pueden tener colitis asociada con antibióticos (CAA) o colitis seudo­ membranosa potencialmente mortal.7-20-21 Es probable que C. difficile cause la mayoría de los casos de CSM; sin embargo, es infrecuente que sea causada por Staphylococcus aureus o por C. perfringens.1 Como se verá en otra parte, Borriello y cois, observaron una relación entre C. perfringens enterotoxigénico y diarrea asociada con antibióticos en el Reino Unido.2829 Además de CSM, se ha estimado que C. difficile causa el 6075% de los casos de colitis asociadas con los antibióticos y el 11-33% de los casos de DAA.173 Todavía no ha sido estableci­ do si C. perfringes causa o no DAA, con alguna frecuencia, en los Estados Unidos. La gravedad de la enfermedad, así como los hallazgos patológicos, son muy variables y dependen de si el paciente tiene CSM, CAA, DAA sin evidencia anató­ mica de colitis o está simplemente colonizado por C. difficile (o si es un portador asintomático). Los hallazgos patológicos en la CSM y la CAA se han detallado en otro sitio.27

894

C A P ÍT U L O 16

Bacterias anaerobias

Los factores involucrados en la enfermedad asociada con C. difficile son: 1) toxina A, una enterotoxina que puede producir acumulación de líquido en el intestino, según se observó en experimentos realizados en segmentos de asas ileales de cone­ jos, 2) toxina B. una citotoxina potente capaz de producir efec­ tos citopatogénicos en varias líneas celulares en cultivos de tejidos, y 3) “un factor alterador de la movilidad”, que estimu­ la las contracciones del músculo liso del intestino y es distinto de las toxinas A y B.7 La toxina A también es citotóxica en cier­ tas líneas celulares, pero no lo es tanto como la toxina B en las líneas celulares que se han usado durante largo tiempo para la investigación de la toxina B.160'162 Las siguientes referencias se recomiendan para más información sobre C. difficile y sus toxin a s 3,7,20.21,81,161

C. difficile es ubicuo en la naturaleza y ha sido aislado en el suelo, el agua, los contenidos intestinales de varios animales, la vagina y la uretra humanas y las heces de muchos lactantes sa­ nos, pero sólo en las heces del 3% de voluntarios adultos sanos. Sin embargo, el microorganismo es más prevalente en las heces de algunos adultos hospitalizados que no tienen diarrea ni coli­ tis. Se lo encontró en las heces del 13-30% de los adultos hos­ pitalizados que estaban colonizados pero no tenían evidencia de enfermedad causada por C. difficile o antecedentes de trata­ miento antibiótico. Sin embargo, también está implicado con frecuencia como agente causal de diarrea o colitis adquiridas en el hospital.81173 Aunque se lo suele encontrar en las heces de muchos lactantes sanos, algunos lactantes con diarrea prolon­ gada y grave, asociada con antecedente de terapia antibiótica, habían tenido colitis seudomembranosa y al mismo tiempo, la citotoxina de C. difficile estaba presente en sus heces sin otro agente etiológico presuntivo. Estos pacientes respondieron clí­ nicamente bien al tratamiento oral con vancomicina (Schaeffer J: comunicación personal, 1986). Entre los antibióticos implicados en la enfermedad gastroin­ testinal asociada con C. difficile están numerosos aminoglucó­ sidos, penicilinas, cefalosporinas, compuestos P-lactámicos de segunda y tercera generación, clindamicina, eritromicina, lin­ comicina, metronidazol, rifampicina, trimetoprim-sulfametoxazol, anfotericina B y fluoroquinolonas.8081 Además, C. difficile ha sido involucrado en los siguientes cuadros clínicos sin asociación con tratamientos antibióticos: 1) colitis seudomembranosa; 2) diarrea asociada con trata­ miento con metotrexato y otros agentes quimioterapéuticos anticancerosos; 3) recidivas de enfermedad intestinal inflama­ toria no específica (p. ej., enfermedad de Crohn, colitis ulcero­ sa); 4) obstrucción o estrangulación intestinal y en 5) algunos pocos casos de síndrome de muerte súbita del lactante.70 Sin embargo, el papel de C. difficile en esas afecciones, si existe, no ha sido aclarado. Para más información acerca de los hallaz­ gos y el diagnóstico clínico de DAA, CAA, y CSM, el lector debe remitirse a las referencias que se indican.20,21'78'7981 Recolección y transporte de muestras que contienen C. difticile. Por lo común, para el diagnóstico de laboratorio se prefieren mues­ tras fecales amorfas, semisólidas o líquidas (alrededor de 5-50 g o 5-50 mL). Son inadecuadas las muestras tomadas con hiso­ pos a causa del pequeño volumen obtenido. Las muestras de heces sólidas son inapropiadas a menos que se esté llevando a cabo un estudio epidemiológico de portación fecal. Otras muestras convenientes son material de biopsia o contenido de la luz intestinal obtenidos por colonoscopia o del intestino afectado (obtenidos por resección quirúrgica o autopsia). Sin embargo, los procedimientos colonoscópicos pueden diluir en exceso la muestra, o la cantidad obtenida por biopsia puede ser insuficiente para el trabajo del laboratorio. Para el transporte de

la muestra se deben usar envases plásticos herméticos. Si las muestras son procesadas en el mismo día por el laboratorio, el transporte a temperatura ambiente será suficiente. Si la mues­ tra llega tarde y no puede ser procesada hasta el día siguiente, se puede mantener en el refrigerador sin pérdida demostrable de actividad citotóxica. Las muestras no deben permanecer a temperatura ambiente más de 2 horas antes de ser procesadas o refrigeradas. Sin embargo, para remitir las muestras a laborato­ rios de referencia para un ensayo de toxina, es recomendable enviarlas en hielo seco. Por otro lado, se debe usar un envase anaerobio (transportado a 25 °C) para muestras que se procesen para aislamiento e identificación de C. difficile. Las muestras que se procesan para la prueba de aglutinación del látex para C. difficile (prueba Culturette Brand CDT® C. difficile', Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD) no se deben congelar porque el antígeno detectado es inestable en la con­ gelación. Diagnóstico de laboratorio de C. difficile. Como se trató en la sec­ ción “Examen directo” de este capítulo, las pruebas diagnósti­ cas en los casos de sospecha de enfermedad asociada con C. difficile deben realizarse en el laboratorio mediante la demos­ tración de la citotoxina, por el aislamiento y la identificación de toxinas producidas por C. difficile a partir de heces, por reali­ zación de una prueba de aglutinación del látex o un enzimoin­ munoanálisis (EIA) para la glutamato deshidrogenasa de C. difficile, por una prueba EIA para la enterotoxina o citotoxina producidas por el microorganismo en las heces o por una com­ binación de métodos. En el recuadro 16-14 se describe en forma breve un procedimiento práctico para la detección de la citotoxina de C. difficile. C. difficile puede ser aislado mediante una técnica de selec­ ción de esporas (procedimientos de selección de esporas

Recuadro 1 6 -1 4 Ensayo para toxina en heces m ed iante el pro cedim iento de c itotoxicidad en cultivo de tejido*' 1. Centrifugar heces líquidas o extractos de heces form adas (2 000 g por 20 minutos o 10 000 g por 10 minutos). 2. Filtrar a través de una membrana filtrante de 0,45 nm. 3. Agregar 0,1 mL de sobrenadante libre de células más 0,1 mmL de dilu­ yem e gelatina tam ponada (con buffer) (pH 7 a 7,2) o de solución salina tam ponada con fosfato (PBS) a un tubo de cultivo de tejido. Es conve­ niente usar fibroblastos pulm onares diploides humanos (células W I-38) disponibles en el comercio. 4. Observar las células del cultivo de tejido para citotoxicidad a las 4, 24 y 48 horas (la m ayoría son positivas a las 24 horas). 5. Para la prueba de neutralización de antitoxina, agregar 0,1 mL de anti­ toxina de C. difficile (TechLab, Blacksburg, VA) a 0,1 mL de sobrena­ dante libre de células y llevar a cabo los pasos del 1 al 4. La curvatura de las células W I-38 (llamada cam bio actinom órfico) u otros efectos citopáticos no deben verse si la toxina que está presente en las heces está neutralizada. 6. El título de la toxina se determ ina usando diluciones seriadas de la muestra fecal filtrada en diluyem e de gelatina buferada (pH 7 a 7,2) o en PBS. La correlación entre los títulos de toxina y la gravedad de la enfermedad es muy escasa.

“Los equipos comerciales para la realización de los ensayos de neutralización de citotoxina de C. difficile son fabricados por Bartels Diagnostics y Bio-Whittaker/Wampole. Se pueden adquirir completos con fibroblastos de prepucio humanos en cubetas de dilu­ ción en microcaldo y proveen la antitoxina necesaria y otros reactivos para realizar el ensayo de neutralización de citotoxina.

Identificación de bacterias anaerobias

mediante la aplicación de alcohol o choque térmico) y por medios selectivos en placa, como agar sangre feniletil alcohol PEA) (Remel®, Lenexa, KS, o BD Microbiology Systems®) o agar fructosa, yema de huevo, cicloserina-cefoxitina (CCFA) más un medio no selectivo de agar sangre para anaerobios de los CDC.7167 Las descripciones detalladas de los procedimien­ tos se selección de esporas con alcohol y tratamiento térmico se presentan en otro sitio.7 Si se usa cualquiera de estos proce­ dimientos, el tratamiento térmico o el alcohol, la muestra se inocula en agar sangre para anaerobios de los CDC (o en agar yema de huevo) después del tratamiento. Pasadas 48 horas de incubación anaerobia, las colonias de C. difficile en agar sangre anaerobio son no hemolíticas, de 2 a 4 mm de diámetro, grisá­ ceas translúcidas, levemente elevadas, planas y extendidas, con bordes rizoides. Como se observa en el microscopio de disec­ ción. las colonias muestran un aspecto iridiscente, “opalescente-jaspeado”. C. difficile es negativo para lipasa y lecitinasa en agar yema de huevo. Además del procedimiento de selección de esporas, se puede inocular una placa del medio PEA y una placa de CCFA con heces sin ser tratadas (o una suspensión de heces preparada en diluyente de gelatina amortiguada). Después de 48 horas de incubación, las colonias de C. difficile en medio PEA serán idénticas a las desarrolladas en agar sangre para anaerobios (descritas antes). La apariencia de las colonias de C. difficile en el medio CCFA se describe en el cuadro 16-6. M arler y cois, hallaron diferencias importantes en el rendimiento del medio CCFA preparado por tres fabricantes diferentes.167 Bartley y Dowell evaluaron las formulaciones de los medios selectivos adicionales para el aislamiento primario de C. difficile,22 Varios autores describen la identificación de C. diffici7.125.189.190 Además de las características de las colonias recién descritas, tienen un olor distintivo. Los bacilos grampositivos a gramvariables tienen esporas subterminales y, en cultivos jóve­ nes en caldo, son móviles. El análisis de los productos meta­ bólicos revela la producción de los ácidos acético, propiónico, isobutírico, butírico, isovalérico, valérico e isocaproico (cuadro 16-21). Hidrolizan esculina y gelatina. Son indol, nitrato y ureasa negativos. La mayoría de las cepas fermentan glucosa, manitol y mañosa. Salicina y xilosa son variables (cuadros 1622 y 16-23). BOTULISMO

El botulismo es una enfermedad neuroparalítica potencial­ mente mortal causada por toxinas proteicas, termolábiles, antigénicamente distintas de C. botulinum.52221 Aunque se produ­ cen siete tipos de toxinas (A, B, C, D, E, F, G) por diferentes cepas de C. botulinum, la mayoría de los casos de botulismo humano son causados por los tipos A, B, E y F. Entre ellas, el tipo F es el menos común. Los tipos C y D se asocian con botu­ lismo en aves y mamíferos, pero no en seres humanos. El tipo C puede ser subdividido en dos tipos: Cj y C2.95 Aunque los microorganismos del tipo G, ahora llamados Clostridium argentinense, como lo menciona Hatheway,96 han sido aislados en muestras de autopsia de unos pocos individuos que murie­ ron súbitamente, no está claro si causan botulismo en los seres humanos. Sin hacer caso del tipo antigénico (A, B, C o E), la toxina botulínica actúa en principio uniéndose a las vesículas sinápticas de los nervios colinérgicos, con lo que impide la liberación de acetilcolina a las terminaciones nerviosas perifé­ ricas (incluidas las conexiones neuromusculares) y desarrolla parálisis descendente, flácida y aguda.52 La parálisis comienza con el deterioro bilateral de los nervios craneales y deriva en

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parálisis de los músculos de la cara (incluidos los de los párpa­ dos), la cabeza y la faringe. Luego desciende en forma simétri­ ca para comprometer los músculos del tórax, el diafragma y los miembros. Los pacientes pueden morir de parálisis respiratoria a menos que reciban cuidado intensivo respiratorio adecuado, como ventilación mecánica; la muerte también puede resultar de neumonía secundaria (causada por microorganismos no botulínicos).68-221 Los CDC reconocen cuatro categorías diferentes de botulis­ mo. La primera es el botulismo clásico de origen alimentario, típico en los adultos, que resulta de la ingestión de toxina preformada en alimentos contaminados. La segunda categoría, botulismo de herida, es la forma más rara; resulta de la pro­ ducción de toxina botulínica in vivo después que C. botulinum se ha multiplicado en una herida infectada. La tercera catego­ ría, el botulismo infantil, es la más común y proviene de la mul­ tiplicación in vivo de C. botulinum con producción de la neurotoxina dentro del intestino del lactante. La cuarta categoría, “clasificación indeterminada”, es para los casos de botulismo en individuos mayores de 12 meses en los que no se puede reconocer un origen alimentario o de herida de C. botulinum,52 Los brotes de botulismo de origen alimentario se han debido a alimentos de procesamiento casero más que a los comerciales. Los alimentos más implicados han sido vegetales (p. ej.. toma­ tes enlatados caseros, jugo de tomates, guisantes, pimientos verdes, maíz, remolachas, espinaca), pescado (p. ej., atún pro­ cesado casero, salmón ahumado, huevos de pescado, atún procesado comercialmente, etc.), frutas (puré de manzanas enla­ tado casero, moras, etc.) y otros alimentos (p. ej., carne estofada, pimientos, salsa de espárragos, conservas de carnes, etc.). El botulismo del lactante fue reconocido como una entidad clínica distinta en 1976.1213 Desde entonces hasta 1988, se diagnosticaron 760 casos en los Estados U nidos135 y ha sido informado en muchos estados diferentes, con el mayor número de casos en California.95 La mayoría de los casos provenientes del oeste del río Misisipi han sido del tipo A; la mayoría de los casos al este del río han sido del tipo B. Los lactantes afectados tenían de 6 días a 11,7 meses de edad y estuvieron afecta­ dos ambos sexos por igual.95 Casi todos los grupos raciales y étnicos han sido afectados. Los lactantes ingieren esporas, pero no toxina preformada (la toxina preformada se ingiere en el botulismo de origen alimentario), del suelo, polvo ambiental, miel y otras fuentes. Dentro del intestino, C. botulinum se mul­ tiplica y elabora la toxina. Las características clínicas incluyen estreñimiento (por lo general el primer signo), desgano, difi­ cultad para succionar y deglutir, llanto alterado, hipotonía y debilidad muscular. Por último el bebé se ve hipotónico, pier­ de el control de la cabeza y pueden aparecer ptosis, oftalmoplejía, expresión facial flácida. disfagia y otros signos neurológicos. Ocurren paro o insuficiencia respiratorios que requieren asistencia respiratoria. En un escaso número de lactantes muer­ tos el botulismo fue confirmado por el laboratorio. El botulis­ mo infantil da cuenta de un pequeño número de casos de sín­ drome de muerte súbita del lactante.12 El diagnóstico de botulismo clásico de origen alimentario se confirma en laboratorios de referencia, como el de los CDC por demostración de la toxina botulínica en suero, heces, conteni­ do gástrico, o vómito. También, el microorganismo puede ser aislado en las heces del paciente.52 La detección de toxina botu­ línica en los alimentos con compromiso epidemiológico, con aislamiento del microorganismo o no, es útil para averiguar el alimento involucrado en el brote. Se deben recolectar alrededor de 15 a 20 mL de suero y 25-50 g de heces para el envío al laboratorio de referencia apropiado (cuando se envía al estado

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Bacterias anaerobias

adecuado o al oficial de salud pública federal capaz de proveer ayuda de laboratorio y epidemiológica en la investigación). En el caso de botulismo sospechoso de herida, se debe recolectar suero, exudado o muestras de hisopado de la herida, junto con tejidos (p. ej., en la autopsia) y heces. Cuando se sospecha botulismo del lactante, se debe recolec­ tar suero (2 a 3 mL) y tantas heces como sea posible (lo ideal, 25-50 g) en un envase plástico hermético y refrigerado o colo­ cado en hielo seco para el transporte. Sin embargo, todos, si no la mayoría de estos lactantes están estreñidos en la primera etapa de la enfermedad y las heces no están disponibles. Por lo tanto, el médico debe decidir si el riesgo de obtener una mues­ tra de hisopado anorrectal está clínicamente justificado para que el laboratorio aísle C. botulinum a partir de esa fuente. Algunos laboratorios del Departamento de Salud Pública de los Estados Unidos proveen servicios de diagnóstico para botu­ lismo. Con la aprobación previa de los CDC (Tel. 770-4887100 o 770-488-4819; sitio web www.cdc.gov/ncidod/hip o www.bt.cdc.gov) y del laboratorio del Departamento de Salud del estado local, se pueden remitir las muestras a los CDC para el diagnóstico de laboratorio. La confirmación del diagnóstico clínico de botulismo requiere la demostración de la toxina botulínica (prueba de neutralización en ratón) en suero o heces o C. botulinum en heces.7-52'97 El aislamiento y la identificación del microorganismo se realizan mediante procedimientos bio­ químicos en cultivos convencionales y prueba de neutraliza­ ción de la toxina. Rara vez se ha detectado la toxina en suero de lactantes afectados. Se recomienda que el cultivo y la prue­ ba de la toxina para C. botulinum sean efectuados por labora­ torios de referencia bien equipados para estas pruebas especia­ lizadas. Para más detalles, el lector interesado puede remitirse a las siguientes referencias.7-52-97 TÉTANOS

El tétanos es una enfermedad infecciosa causada por C. tetani que afecta en gran parte a personas no inmunizadas en los Estados Unidos, sobre todo en las zonas rurales del sur del país.7-52 Es una enfermedad alarmante caracterizada por con­ tracciones espásticas de los músculos voluntarios e hiperreflexia, causada por una toxina (tetanospasmina) proteica, termolábil, protoplasmática elaborada por C. tetani,7'52-68 El tétanos comparte algunas similitudes con la difteria, en que la infec­ ción (y el microorganismo) permanecen localizados (por lo general en una herida penetrante menor) y la toxina se absorbe y causa los principales efectos sistémicos. Las esporas de C. tetani, como las de C. botulinum, se distribuyen ampliamente en el suelo, así como en los medios acuáticos. El tétanos suele ser el resultado de la contaminación con esporas de heridas punzantes, laceraciones o incluso lesiones por aplastamien­ t o ^ , 68 La contaminación fecal del cordón umbilical ha sido el origen de C. tetani en algunos casos de tétanos neonatal. Después de una lesión penetrante localizada, puede haber una infección mixta de ubicación profunda que involucra tanto a anaerobios como aerobios en tejidos sin vitalidad, lo cual deri­ va en una baja tensión de oxígeno y en un bajo potencial de oxidorreducción. Se producen así las condiciones favorables para que germinen las esporas de C. tetani y para que las célu­ las vegetativas se multipliquen y liberen la tetanospasmina en la autólisis de las células bacterianas.52 La tetanospasmina se adhiere a las terminaciones de los nervios motores periféricos y viaja a lo largo de los nervios hacia el sistema nervioso cen­ tral (SNC). La toxina se une a los gangliósidos en el SNC y bloquea los impulsos inhibitorios hacia las neuronas motoras.

Los pacientes tienen espasmos musculares prolongados de los músculos flexores y extensores. La tetanospasmina se adhiere a los sitios de unión en las conexiones mioneurales, e inhibe la liberación de acetilcolina. Esto es similar a la adhesión de la to­ xina botulínica a las conexiones mioneurales, excepto en que los sitios de unión para tetanospasmina y para toxina botulíni­ ca son diferentes.52 Como ya se indicó, los pacientes con téta­ nos tienen contracciones musculares espásticas, dificultad para abrir la mandíbula (llamada tétanos, “trismo”), una sonrisa característica llamada “risa sardónica” y contracciones de los músculos de la espalda que provocan una curvatura hacia atrás. Los pacientes son muy irritables y sufren accesos tetánicos, que consisten en contracciones musculares dolorosas y violen­ tas posteriores a algunos estímulos menores, como un ruido. El diagnóstico de tétanos se basa en gran parte en los hallazgos clínicos, no en los estudios de laboratorio. A menudo el ante­ cedente de lesión herida es menor o trivial. Los frotis directos teñidos con Gram y los cultivos anaerobios del sitio de la heri­ da suelen ser negativos. C. tetani forma esporas terminales redondas, produce desarrollo extenso en agar sangre para ana­ erobios y cantidades importantes de acetato y butirato, con sólo una cantidad menor de propionato, es lipasa y lecitinasa nega­ tivo en agar yema de huevo y es asacarolítico. Para más infor­ mación acerca de C. tetani, se recomiendan los libros de Finegold y George70 y de Smith y Williams222 y los artículos de revisión de Dowell52 y de Hatheway.96

Pruebas de sensibilidad de las bacterias anaerobias a los antibióticos El manejo exitoso de enfermedades producidas por bacterias anaerobias requiere la selección y el tratamiento con antibió­ ticos apropiados, a menudo junto con la eliminación de las bacterias por drenajes de abscesos, eliminación de cuerpos ex­ traños y desbridamiento del tejido necrótico y otras medidas qui­ rúrgicas. Alguna vez se creyó que la mayoría de los anaerobios tenían patrones predecibles de sensibilidad a los antibióticos y que la identificación exacta de las cepas era todo lo necesario para predecir la sensibilidad de los aislamientos individuales pa­ ra varios antibióticos. Sin duda, esto es una sobresimplificación. Mientras algunos antibióticos son activos contra casi todas (> 95%) las bacterias anaerobias (p. ej., imipenem, meropenem, piperacilina-tazobactam y cloranfenicol), otros antibió­ ticos que se pueden seleccionar para usar en el tratamiento no son tan predecibles en sus actividades contra los géneros y especies seleccionados de anaerobios. Por ejemplo, el metronidazol es muy activo contra la mayoría de las bacterias anerobias gramnegativas probadas en los Estados Unidos, pero ha surgido resistencia al metronidazol en cepas de B. fragilis en otros países.98 Además, la resistencia al metronidazol suele encontrarse en especies de Actinomyces, de Propionibacterium y de Lactobacillus, en cocos anaerobios y en otros anaerobios grampositivos.6 Aunque algunas de las fluoroquinolonas mos­ traron buena actividad contra anaerobios en un principio, la resistencia a esos antibióticos se ha desarrollado con rapidez'.98 Las penicilinas y las ureidopenicilinas, las cefalosporinas de segunda y tercera generación y la clindamicina pueden o no ser activas contra ciertas especies de bacilos gramnegativos anae­ robios y clostridios.2 La resistencia a estos antibióticos es variable.98-240-257 No obstante, a menudo el médico se encuentra ante la necesidad de iniciar el tratamiento antibiótico en forma empírica antes de que estén disponibles los resultados de la iden­ tificación y de las pruebas de sensibilidad. Por lo tanto, la sen­

Referencias

sibilidad tabulada y los resultados del tratamiento informados en la literatura o en el hospital local, y la experiencia clínica de I : - médicos pueden ser la base para la elección inicial de los Antibióticos. Se ha publicado hace poco una información excelente respecto de la selección de antibióticos con objetivos de r--.amiento.98 155’240 Sin embargo, la variabilidad en los patrones de '¿nsibilidad de los anaerobios de importancia clínica es suficiente para que a veces se soliciten pruebas de sensibilidad in Miro de aislamientos individuales con el objetivo de ayudar a : ' médicos en el manejo de infecciones graves y de aquellas que requieren tratamientos prolongados, como abscesos cerebrales, endocarditis, abscesos pulmonares, infecciones articularey. osteomielitis, infecciones relacionadas con dispositivos protésicos. injertos vasculares, bacteriemia refractaria o recurrente, : . uando la infección no responde al tratamiento empírico.185 Otra indicación para las pruebas de sensibilidad es la situa­ ción en la cual no se cuenta con datos clínicos evidentes sobre los cuales basar las decisiones de tratamiento. Además, los —jcrobiólogos clínicos experimentados en el trabajo con anae­ robios están autorizados a investigar la actividad de los nuevos antibióticos comercializados o en etapa de investigación sobre los aislamientos anaerobios en sus laboratorios hospitalarios. También existe una necesidad de controlar los patrones de sen­ sibilidad de anaerobios en la comunidad local y en niveles hos­ p ician o s y en múltiples centros médicos en los Estados Unidos > en otros diversos países.135 Entre los microorganismos considerados para las pruebas de >ensibilidad a los antibióticos, debido a su virulencia o a que 'uelen ser resistentes a ciertos antibióticos se incluyen especies del grupo Bacteroides fragilis, especies del grupo PrevotellaPorphyromonas pigmentado, otras Prevotella, Fusobacterium mortiferum, F. varium y F. necrophorum, Bilophila, Sutterrella '■ algunas especies de Clostridium. Métodos de evaluación de la sensibilidad de los anaerobios a los antibióticos

En la actualidad, se recomiendan los procedimientos no automatizados para probar la sensibilidad de los anaerobios a los antibióticos. Se pueden obtener resultados reproducibles por uno de tres métodos.98 185 El método de dilución en agar es útil, sobre todo para probar 30 o más cepas de algún anaerobio. El medio usado es agar sangre Brucella suplementado con hemina, vitamina y sangre hemolizada de carnero. El uso de paneles de microdilución en caldo es una alternativa menos laboriosa que el procedimiento de dilución en agar y se consi­ dera equivalente al procedimiento de dilución en agar para las cepas pruebas de sensibilidad para cepas del grupo Bacteroides fragilis.98,185 El medio recomendado para el procedimiento de microdilución en caldo es el caldo Brucella suplementado con hemina, vitamina K, y sangre de caballo lisada. En él crecen la mayoría de los anerobios. Sin embargo, el Clinical Laborato­ ry' Standards Institute (antes el National Committee for Clinical Standards) en la actualidad no recomienda el procedimiento de dilución en caldo para la investigación en anaerobios no bacte­ roides. La tercera forma recomendada para probar anaerobios (que también es fácil de usar) es la prueba de la tira con gra­ diente Etest® (AB Biodisk North America, Piscataway, NJ). Tanto el procedimiento Etest como el de microdilución en caldo son formas prácticas para probar aislamientos individua­ les contra un número limitado de antibióticos.98,185 Las técnicas de difusión con disco en agar y las de elusión con disco en caldo se usaron en el pasado, pero no deben utilizarse para probar anaerobios a pesar de su conveniencia. La mayoría

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de los anaerobios además de las especies de Bacteroides cre­ cen de modo muy lento para trabajar con el procedimiento de difusión con disco; los protocolos de interpretación de BauerKirby no fueron diseñados para anaerobios y están faltando protocolos de interpretación basados en medios estandarizados y métodos para examinar a los anaerobios con pruebas de difu­ sión con discos; también hubo muy poca relación entre las medidas del tamaño de la zona y los resultados de las pruebas de dilución de la concentración inhibitoria mínima. Para los detalles de los procedimientos recomendados, el lector se debe remitir al documento más reciente del Clinical Laboratory Standards Institute.98185

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Pruebas de sensibilidad a los antibióticos Reseña histórica Resistencia bacteriana a los antibióticos Variables que intervienen Mecanismos de resistencia Transporte de antibióticos a través de la pared y las membranas celulares

Garantía de calidad Interpretación de los resultados Selección de los antibióticos para el informe Antibiograma por macrodilución en caldo Antibiograma por dilución en agar Antibiograma por difusión con discos

Antibióticos que interfieren en la formación de las paredes de las células bacterianas: p-lactámicos y glucopéptidos

Desarrollo de un procedimiento estandarizado para pruebas de difusión con discos

Antibióticos que no actúan sobre la pared celular

Control de calidad

Interacciones entre los mecanismos de resistencia

El laboratorio como guía del tratamiento antibiótico Pruebas para determinar la actividad inhibitoria de los antibióticos Indicaciones Elección de la prueba Selección de antibióticos Estandarización

Interpretación de los resultados

Limitaciones

Antibiograma por microdilución en caldo Sistemas comerciales Vitek y MicroScan Prueba del epsilómetro

Problemas especiales con las pruebas de sensibilidad p-lactamasas Especies de Staphylococcus Especies de Haemophilus

Neisseria gonorrhoeae

Medio de cultivo

Moraxella (Branhamella) catarrhalis

PH

Especies de Enterococcus

Suero

p-lactamasas de espectro ampliado

Concentración de cationes Atmósfera

Especies de Staphylococcus

Temperatura

Antibióticos p-lactámicos (especies de Staphylococcus resistentes a la oxacilina)

Inoculo

Vancomicina

Antibióticos

Macrólidos, lincosamidas y estreptograminas

Control de calidad

Fluoroqulnolonas

Resistencia bacteriana a los antibióticos

Especies de Haemophilus Penicilinas

Listeria monocytogenes Streptococcus pyogenes (Streptococcus (3-hemolítico

Cloranfenicol

grupo A)

Cefalosporinas

Penicilina

Trimetoprim-sulfametoxazol

Eritromicina

Streptococcus pneumoniae Penicilina y otros antibióticos p-lactámicos Resistencia múltiple Macrólidos y lincosamidas

Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Especies de Enterococcus Antibióticos aminoglucósidos

903

Fluoroquinolonas

Streptococcus agalactiae (Streptococcus (3-hemolítico grupo B) Estreptococos viridans Otras bacterias grampositivas

Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia y Stenotrophomonas maltophilia en pacientes con fibrosis quística Pruebas de sensibilidad directa

Antibióticos fHactámicos Vancomicina

Reseña histórica La función básica de quienes trabajan en el laboratorio de microbiología clínica es proporcionar información con la cual los médicos puedan diagnosticar y tratar enfermedades infec­ ciosas. Ante una enfermedad transmisible, la identificación de un patógeno específico es de suma importancia para el epide­ miólogo de un hospital o el trabajador de salud pública. La identificación de un microorganismo que ha sido aislado en una muestra clínica a menudo beneficia al paciente al identifi­ car en forma precisa una enfermedad hasta entonces incierta y ayudar a la elección inicial de la antibioticoterapia. Sin embar­ go, los dos elementos de información más importantes para un médico son: 1) si se presenta un agente infeccioso y 2) cuál es el antibiótico que proporcionaría un tratamiento adecuado. Estas prioridades se establecieron en estrecha vinculación con uno de los grandes adelantos médicos del siglo xx: el des­ cubrimiento de la penicilina.88 En 1928, Alexander Fleming observó el crecimiento de un hongo contaminante en una placa de cultivo que había quedado abierta al aire por descuido. Además, las colonias de bacterias que crecían en las adyacen­ cias del hongo estaban sufriendo lisis (fig. 17-1). Fleming arri­ bó a la conclusión correcta de que el hongo, identificado más tarde como una cepa de Penicillium notatum, estaba produ­ ciendo una sustancia bacteriolítica difusible capaz de destruir bacterias. El antibiótico desconocido de Fleming, más tarde denominado penicilina, fue el precursor del advenimiento de la era antibiótica moderna. La aplicación práctica del descubri­ miento de Fleming no comenzó hasta 1939, cuando Florey y Chain crearon una técnica práctica por medio de la cual se podía obtener el extracto antibiótico de Penicillium con la pure­ za y en la cantidad suficiente para usarlo en los seres humanos. La necesidad de las pruebas de sensibilidad a los antibióti­ cos se hizo evidente poco después de la comercialización de los antibióticos. Antes de la Segunda Guerra Mundial, la produc­ ción de penicilina era limitada y extremadamente costosa. Durante ese conflicto armado, se descubrieron otros antibióti­ cos y se establecieron patrones de sensibilidad contra distintos

microorganismos. En relación con un arraigado interés por los microbios del suelo, Waksman descubrió la estreptomicina en 1943 y Dubos, la gramicidina y la tirocidina poco después. La investigación de Duggar condujo al descubrimiento de la clortetraciclina (aureomicina) por los laboratorios Lederle (Pearl River, NY) en 1944. Si bien estos nuevos antibióticos eran real­ mente “fármacos maravillosos” en el momento de su introduc­ ción, no pasó mucho tiempo antes de que aparecieran cepas bacterianas resistentes. Las pruebas de sensibilidad (antibiogramas) se convirtieron en una necesidad práctica. El optimismo inicial acerca de que los antibióticos puedan poner fin a la infección bacteriana ha dado lugar a una acepta­ ción reticente de que los recursos farmacológicos deben ser manejados con prudencia para controlar la enfermedad.221 Algunas bacterias, como Streptococcus pyogenes (estreptoco­ cos (3-hemolíticos del grupo A), han mantenido su sensibilidad predecible a la penicilina. Lamentablemente, esta sensibilidad persistente es la excepción en lugar de la regla. Las bacterias han sido tan inventivas que se han aislado cepas que necesitan la presencia de un antibiótico terapéutico para su crecimien­ to.92166 La ingenuidad de los químicos de la industria farma­ céutica ha sido grande y se refleja en la gran cantidad de anti­ bióticos con que cuentan los médicos (cuadro 17-1).

Resistencia bacteriana a los antibióticos Los mecanismos de resistencia bacteriana son complejos, variados y no se conocen por completo. Los lectores interesa­ dos pueden consultar una explicación excelente en Enferme­ dades Infecciosas, Principio y Práctica de Mandell235 y varias revisiones amplias de los principales mecanismos de resisten­ cia hallados en los patógenos humanos más importantes.89 104248 Las herramientas de la biología molecular han mejorado mucho nuestro conocimiento sobre los mecanismos de resis­ tencia. Para el microbiólogo clínico, el resultado a veces puede ser intimidante: terminología poco amigable e ideas extrema­ damente complejas. Sin embargo, vale la pena tomarse tiempo para comprender al menos los principios básicos debido a la

904

C A P ÍT U L O 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

F ig u ra 17-1 Reconstrucción del descubrim iento de Flem ing de la acción antibiótica de Penicillium. En el laboratorio de Flem ing, las colonias de Bacillus (Haemophilus) influenzae fueron inhibidas por el hongo “contam i­ nante” . En esta reconstrucción, se observan colonias de estafilococos que cre­ cen en A; una colonia contam inante de Penicillium está creciendo en C. Las colonias de Staphylococcus que rodean a la colonia del hongo en el área B están poco desarrolladas y sufren lisis causada por una sustancia antibiótica producida por el hongo. Esta sustancia desconocida fue denom inada m ás tarde penicilina.

singularidad de los sistemas biológicos y también por la mayor sofisticación con la cual se pueden tomar las decisiones clíni­ cas cotidianas. Explicaremos a continuación los mecanismos y los microorganismos individuales. Variables que intervienen

Para comprender los mecanismos de resistencia bacteriana es necesario conocer la fisiología bacteriana, la farmacología de los antibióticos y la biología molecular de los agentes infec­ ciosos. Algunas de las variables importantes necesarias para comprender los mecanismos de resistencia se mencionan en el cuadro 17-2. Los genes para el mecanismo de resistencia pueden estar localizados sobre el cromosoma o sobre un elemento extracromosómico denominado plásmido. Los plásmidos son piezas circulares de DNA que actúan en forma independiente del cro­ mosoma. La importancia práctica de la diferencia es que el DNA cromosómico es relativamente estable, mientras que el DNA del plásmido se moviliza con facilidad de una cepa a otra, una especie a otra o incluso un género a otro. Además, la cone­ xión de los genes de resistencia para múltiples antibióticos sobre un plásmido permite la transferencia masiva de resisten­ cia que caracteriza a muchos microorganismos con resistencia reciente.274 El mecanismo más frecuente por medio del cual se transfie­ ren los genes de resistencia es la conjugación. Es necesario otro factor de transferencia genética antes de que un plásmido que transporta un gen de resistencia pueda pasar de un microorga­ nismo a otro. El mecanismo de transferencia delineado más

recientemente es el transposón (elemento genético transponible).283 Los transposones pueden transportar porciones de plás­ midos. Lo más importante es que también pueden transportar un trozo del cromosoma de una bacteria a otra por transferen­ cia de conjugación (transposón conjugativo o “gen saltador”). El resultado puede ser un mosaico de material genético de las bacterias donante y receptora.189 Se ha documentado la transfe­ rencia de resistencia a los antibióticos a través de las barreras existentes entre bacterias grampositivas y gramnegativas.51 No debe desestimarse la importancia que la transferencia horizon­ tal de resistencia a los antibióticos tiene y tendrá en las enfer­ medades infecciosas. Un mecanismo de resistencia puede ser expresado en forma permanente ya sea que se presente o no una exposición desen­ cadenante. Este estado se denomina expresión constitutiva. Por el contrario, algunos genes deben ser “inducidos” por la expo­ sición a una sustancia incitadora antes de que se produzca el producto genético inducido. La P-lactamasa estafilocócica (penicilinasa) es un ejemplo de una enzima inducible. Está pre­ sente sobre un plásmido y no es producida a menos que las bac­ terias estén expuestas a un antibiótico P-lactámico, como la penicilina, después de lo cual se activa la producción de la en­ zima. Muchas P-lactamasas de las bacterias gramnegativas están presentes en el cromosoma y son producidas constituti­ vamente, pero pueden ser inducidas a producir incluso concen­ traciones mayores de la enzima. Algunas enzimas son secretadas activamente en el medioambiente extracelular, donde pueden ejercer su acción anti­ bacteriana. Las P-lactamasas estafilocócicas son secretadas. Por el contrario, la mayoría de las enzimas de las bacterias gramnegativas están unidas a la célula de modo que ejercen sus efectos sólo si el antibiótico entra en la pared de la célula bacteriana. Por último, algunos mecanismos de resistencia se expresan en forma homogénea, mientras que otros lo hacen en forma heterogénea. La expresión homogénea o uniforme de un factor facilita la detección de dicho factor en el laboratorio. Si sólo una pequeña fracción de las bacterias expresa el mecanismo de resistencia (expresión heterogénea o heterorresistencia), el error de muestreo puede comprometer la detección de la resis­ tencia en el laboratorio. Un hallazgo fascinante pero perturbador es la documentación de que algunos antibióticos producen un aumento transitorio de las mutaciones de las bacterias.20 Por lo tanto, es posible que los antibióticos no sólo sirvan como selectores de clones resistentes a los antibióticos, sino también como promotores primarios de resistencia. Mecanismos de resistencia

Los mecanismos por medio de los cuales se expresa la resis­ tencia en las bacterias se resumen en el cuadro 17-3 y la figura 17-2. Se considerará primero el transporte de los antibióticos hasta el sitio de acción en la célula bacteriana, porque es importante para todos los compuestos y todas las bacterias. Otros meca­ nismos de resistencia se considerarán en forma separada para los antibióticos que son activos contra las paredes celulares (los antibióticos p-lactámicos, el grupo único más importante de an­ tibióticos, y los glucopéptidos) y para los que actúan mediante otros mecanismos. Se debe señalar desde el principio que se puede hallar en la mayoría de las bacterias casi cualquier meca­ nismo de resistencia y que a menudo se encuentran diversos mecanismos en un solo microorganismo (cuadro 17-4).

Resistencia bacteriana a los antibióticos

Cuadro 17-1

905

C la s ific a c ió n d e lo s a n tib ió tic o s

P-lactámicos

E JE M P L O S

G R U PO

C L A SE

Penicilinas naturales

Penicilina G, penicilina V

Penicilinas resistentes a la penicilinasa

Meticilina, nafcilina

Penicilinas resistentes a la penicilinasa: penicilinas isoxazolílicas

Cloxacilina, dicloxacilina, ofloxacina

Am inopenicilinas

Amoxicilina, ampicilina

Carboxipenicilinas

Carbenicilina, ticarcilina

Ureidopenicilinas

Azlocilina, mezlocilina, piperacilina

Cefalosporinas de prim era generación

Cefazolina, cefalotina, cefapirina, cefradina

Cefalosporinas de segunda generación

Cefam andol, cefonicida. cefuroxima

Cefam icinas

Cefm etazol, cefotetán, cefoxitina

Cefalosporinas de tercera generación

Cefoperaxona, cefotaxim a, ceftazidim a, ceftizoxima, ceftriaxona

Cefalosporinas de cuarta generación

Cefipima

Cefalosporinas disponibles para uso oral

Cefaclor, cefadroxilo. cefdinir. cefditorén, ceftamet, cefixima, cefpodoxima, cefprozilo, ceftibuteno, cefuroxim a (axetilo), cefalexina, cefradina

Carbacefem

Loracarbef

M onobactámicos

Aztreonam

Carbapenémicos

Ertapenem , im ipenem, meropenem

Com binaciones p-lactamasa-inhibidor de la P-lactamasa

Am oxicilina-ácido clavulánico, ampicilina-sulbactam , piperacilina-tazobactam, ticarcilina-ácido clavulánico

Am inociclitoles

Espectinom icina, trospectinom icina

Aminoglucósidos

Amikacina, gentamicina, kanamicina, netilm icina, estreptom icina, tobra­ micina

Ansamicinas

Rifampicina

Macrólidos

Azitrom icina, claritrom icina, diritrom icina, eritrom icina

Lincosamidas Glucopéptidos

Quinolonas

Clindam icina Glucopéptidos

Vancomicina, teicoplanina

Lipopéptidos

D aptom icina

Quinolonas

Cinoxacina, garenoxacina, ácido nalidíxico

Fluoroquinolonas

Ciprofloxacina, clinafloxacina, enoxacina, fleroxacina, gatifloxacina, gem ifloxacina. grepafloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, moxifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina, trovafloxacina

Oxazolidinonas

Linezolida

Estreptograminas

Q uinupristina-dalfopristina

Inhibidores de las vías del folato

Sulfamidas, trim etoprim, trimetoprim -sulfametoxazol

Fosfomicinas

Fosfom icina

Cetólidos

Telitromicina

Lipopéptidos

Daptomicina

Nitrofuranos

Nitrofurantoína

Nitroimidazoles

M etronidazol

Fenicoles

Cloranfenicol

Tetraciclinas

Doxiciclina, m inociclina, tetraciclina

Adaptado de Glossary I, MIC testing, Supplementary Tables, NCCLS.2'8

906

C A P ÍT U L O 17

Cuadro 17-2

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

V ariables en la expresión y la tran sferen cia de la resistencia b a c te ria n a

CARACTERÍSTICA Localización

Transferencia

Expresión

VARIABLE

COMENTARIOS

Crom osóm ica

Estabilidad genética; expresión a menudo constitutiva

Extracrom osóm ica

Plásm idos fácilm ente m ovilizados para la transferencia entre células bacterianas

Transposón

Puede transferir material genético entre el crom osom a y el plásmido o entre células bacterianas

Conjugación

Plásm idos (factor R) o transposones

Transducción

Transferencia por bacteriófagos

Transformación

Transferencia directa de DNA entre especies compatibles

Constitutiva

Producida con la exposición a un estím ulo o sin ella

Inducible

Producida sólo después de la exposición al estím ulo

Constitutiva-inducible

Producida a bajo nivel sin estímulo; producción muy aumentada después de la estimulación

No debe desestimarse la importancia de múltiples m eca­ nismos de resistencia, a menudo complementarios, en las especies bacterianas. Cuando un representante farmacéutico se jacta de que debe utilizarse el antibiótico de su compañía debido a su eficacia contra las cepas resistentes prevalentes, debe asegurársele que sólo es cuestión de tiempo antes de que las bacterias desarrollen resistencia también a ese producto. TRANSPORTE DE ANTIBIÓTICOS A TRAVÉS DE LA PARED Y LAS MEMBRANAS CELULARES

La acumulación de antibióticos en su sitio de acción en la célula bacteriana es la suma del transporte en la célula, la inac­ tivación durante el proceso de transporte y la depuración del antibiótico desde la célula. Consideraremos primero el proceso de movimiento anterógrado a través de la/s membrana/s. Para comprender el transporte de moléculas hacia el sitio activo es necesario considerar las diferencias estructurales entre las bac­ terias grampositivas y gramnegativas. Las bacterias son micro­ organismos procariontes y tanto las especies grampositivas como gramnegativas contienen una mezcla de ácidos nuclei­ cos, ribosomas y otra maquinaria celular en su citoplasma (fig.

Cuadro 17-3

17-3). Las bacterias grampositivas tienen una única membrana celular con una capa externa generosa de peptidoglueano (figs. 17-3A y 17-4). Para los antibióticos glucopéptidos y (3-lactámicos que probablemente no tienen que atravesar la membrana plasmática para ejercer su actividad antibiótica, el transporte a través de las membranas de las bacterias grampositivas no constituye un problema. Las bacterias gramnegativas tienen una membrana plasmáti­ ca interna y una membrana celular externa, entre la cual hay una capa delgada de peptidoglueano (figs. 17-3B y 17-5). La permeabilidad de las membranas a los antibióticos y el trans­ porte de las moléculas a través de las barreras son muy impor­ tantes para las bacterias gramnegativas, que tienen dos mem­ branas que obstaculizan la llegada de los antibióticos a sus dia­ nas intracelulares. Se considerará primero la membrana celular externa, que es una barrera fundamental para todos los antibióticos. Se han publicado varias revisiones excelentes sobre el tem a.180'226229 El método más sencillo para el ingreso de los fármacos en la célu­ la es la difusión directa a través de la membrana lipídica, pero incluso las sustancias muy hidrófobas no atraviesan la bicapa lipídica con eficacia. La razón para este bloqueo de la difusión

M ecanism os de resistencia b a c te ria n a a los antibióticos

MECANISMO Inactivación enzim ática

Alteración de los receptores

Alteración del transporte de antibióticos

GRUPO DE ANTIBIÓTICOS

EJEMPLOS

p-lactám icos

P-lactamasas: penicilinasas; cefalosporinasas; carbapenemasas

Am inoglucósidos

Enzimas modificadoras de los am inoglucósidos de las bacterias gramnegativas y grampositivas

P-lactámicos

Proteínas de unión a penicilina alteradas de las bacterias gramnegativas y grampositivas

A lteraciones ribosómicas

Tetraciclina; eritromicina; aminoglucósidos

A lteraciones de la DNA girasa

Quinolonas

Enzimas bacterianas alteradas

Sulfametoxazol; trimetroprim

A lteraciones en las proteínas de la membrana externa (porinas)

Bacterias gramnegativas; ingreso reducido

Reducción de la fuerza impulsora proteica

Am inoglucósidos y bacterias gramnegativas; ingreso reducido

Transporte activo desde las células bacterianas

Tetraciclina; eritromicina; salida activa

Resistencia bacteriana a los antibióticos

907

B A lteración de los receptores (proteínas de unión)

D egradación enzim ática

E jem plos: betalactam asas, enzim as m odificadoras de los am inoglucósidos

E jem plos: resistencia de neum ococo a penicilina, resistencia de estafilococo a m eticilina

S ortear inhibiciones

A lteración de la perm eabilidad

íA

^ I------- '" N

C ___ _ D

'Velocidad máxima 150 kph

V

c=C>

E jem plos: seudom onas y am inoglucósidos (ingreso), tetra cilin a y m últiples antibióticos (salida)

A ___ ^

|

^ C

D

Ejem plo: enterococos y trim etoprim -sulfam etoxazol (auxótrofo)

Figura 17-2 Se muestran las cuatro clases más im portantes de resistencia m icrobiana a los antibióticos. (A ) La inactivación enzim ática de los antibióticos por las p-lactam asas (5) producidas por las células estafilocócicas está representada por las caricaturas de tiburones. Otras clases de antibióticos son degradados por otras enzim as, com o las enzimas m odificadores de los am inoglucósidos o la cloranfenicol acetiltransferasa. (B) El segundo m ecanism o en im portancia es el cam bio en los receptores para la fijación del antibiótico a estructuras críticas, representadas aquí por la alteración de las proteínas de unión normales ( círculos) sobre las m em ­ branas celulares de las bacterias gram positivas a las proteínas de unión con una afinidad reducida por los antibióticos ( triángulos). También son im portantes los cam bios en la afinidad de los receptores por otros antibióticos, com o la DNA girasa y las quinolonas o los ribosom as y los am inoglucósidos. (C) Una tercera clase de m ecanismo está representada por el efecto de la perm eabilidad de la m embrana sobre la resistencia a varias clases de antibióticos en las bacterias gram negati­ vas. El bacilo gramnegativo de la izquierda limita la entrada de los antibióticos m ediante cam bios en las proteínas transportadoras, como las porinas. El bacilo de la derecha bom bea antibióticos hacia el exterior de la célula tan rápidamente que no pueden acumularse en el citoplasma. (D ) Por últim o, un m icroorganism o puede sortear un bloqueo m etabólico impuesto por un antibiótico, com o el que se ilustra entre trim etoprim -sulfam etoxazol y los enterococos. El bloqueo m etabólico pro­ ducido por los antibióticos entre los pasos B y C es obviado cuando las bacterias obtienen el compuesto C preform ado in vivo.

es en parte la naturaleza polarizada y asimétrica de la membra­ na celular externa bacteriana, que tiene lipopolisacáridos con el lípido A y un oligosacárido unido a la cara externa de la mem­ brana solamente. Proteínas porinas y difusión a través de la membrana externa. Para muchos antibióticos, incluido el grupo (í-lactámico, el medio primario de transporte a través de la membrana externa de las bacterias entéricas es un grupo notable de proteínas de mem­ brana, denominadas porinas (fig. 17-5).228’229'346 Se han identifi­ cado dos proteínas porinas mayores en E. coli, la especie más estudiada: un gran canal de porina designado Omp F (outermembrane-protein F, proteína F de la membrana externa) y una pequeña porina de canal denominada Omp C.346 Se produce un tercer canal denominado PhoE en los mutantes que carecen tanto de Omp F como de Omp C, pero este canal no parece ser sustancial para el movimiento de los antibióticos.228 Factores como la carga sobre la molécula y la hidrofobicidad del com­ puesto desempeñan un papel importante (fig. 17-6). Las molé­ culas con carga negativa se mueven más lentamente a través de la membrana que las moléculas con carga más positiva o que los iones dipolares (zwiteriones, compuestos con cargas positi­ vas y negativas equilibradas). Se presume que las cargas nega­ tivas hacen que el antibiótico “se cuelgue” cuando atraviesa el canal porina de carga negativa. La exclusión de los compuestos

hidrófobos del medioambiente acuoso de la porina puede expli­ car la falta de eficacia del compuesto hidrófobo meticilina con­ tra las bacterias gramnegativas. Asimismo, los p-lactámicos con cadenas laterales grandes y voluminosas, como mezlocilina, piperacilina y cefoperazona, también atraviesan poco la mem­ brana. En un estudio, el “mejor rendimiento” entre los P-lac­ támicos fue el del imipenem. un compuesto hidrófilo dipolar con una estructura muy compacta.346 Se ha propuesto que la expli­ cación de la sensibilidad de Enterobacter cloacae al imipenem en presencia de resistencia a las cefalosporinas de tercera gene­ ración es la mayor accesibilidad del imipenem a las moléculas diana, mediada por el rápido tránsito probablemente a través de varios canales de porina.246 La influencia de la porina sobre la sensibilidad está bien ilus­ trada por un interesante caso comunicado por Medeiros y cois, (fig. 17-7).201 Estos investigadores aislaron una cepa de Salmonella typhimurium que contenía dos proteínas porinas, OmpF y OmpC (aislamiento 1). Una cepa variante aislada en el mismo paciente produjo sólo la proteína OmpF (aislamiento 2). Las dos cepas produjeron una P-lactamasa similar. En medios de baja osmolalidad, la cepa 1 produjo las proteínas F y C, mientras que la cepa 2 produjo sólo la proteína F, la porina de canal grande. En condiciones de alta osmolalidad, como las que podrían ocurrir en los tejidos del paciente, la síntesis de la

908

C A P ÍT U L O 17

Cuadro 17-4

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

M ecanism os de resistencia a los antibióticos en las b acte rias de m ás relevancia clínica

TIPO DE BACTERIA Especies de Staphylococcus

Streptococcus pneumoniae

Especies de Enterococcus

GRUPO DE ANTIBIÓTICOS

MECANISMO/S FRECUENTE/S

OTRO/S MECANISMO/S

Penicilinas

p-lactam asa (penicilinasa)

Alteración de las proteínas de unión a penicilina

Penicilinas resistentes a la penicilinasa

Proteínas de unión a penicilina alteradas

Límite: alteración de las proteínas de unión a penicilina; meticilinasa; hiperproducción de p-lactam asa

Quinolonas

Salida activa; alteración de la DNA girasa

E scaso transporte a través de la m em brana

Eritromicina

A lteración de los sitios diana ribosómicos

Salida activa de antibióticos

p-lactámicos

A lteración de las proteínas de unión a penicilina

Salida activa de antibióticos

Eritrom icina

A lteración de los sitios diana ribosómicos

p-lactámicos

Proteínas de unión a penicilina de baja afi­ nidad

P-lactamasa

Am inoglucósidos

Baja concentración: escaso transporte a tra­ vés de la m embrana

Alteración de los sitios de unión ribosóm icos

A lta concentración: enzim as modificadoras de los aminoglucósidos Glucopéptidos

A lteración de las proteínas de unión

Penicilinas

p-lactam asa (penicilinasa)

Alteración de las proteínas de unión a penicilina

Cloranfenicol

Cloranfenicol acetiltransferasa

Alteración del transporte de la m em brana

Neisseria gonorrhoeae

Penicilinas

p-lactam asa (penicilinasa)

A lteración de las proteínas de unión a penicilina

Neisseria meningiditis

Penicilinas

Haemophilus influenzae

Pseudomonadales

P-lactamasa (penicilinasa); alteración de las proteínas de unión a penicilina

P-lactámicos

Escasa difusión o alteración de las porinas; P-lactamasas

Am inoglucósidos

Escasa difusión o alteración de las porinas; enzim as modificadoras de los am inoglu­ cósidos

Quinolonas

A lteración de la DNA girasa

Tetraciclinas

Salida activa

Trim etoprim -sulfam etoxasol

Alteración de los sitios diana enzimáticos

P-lactámicos

Escasa difusión o alteración de las porinas; p-lactamasas

Am inoglucósidos

Escasa difusión o alteración de las porinas; enzim as modificadoras de los aminoglu­ cósidos

Quinolonas

Alteración de la DNA girasa

Alteración de las proteínas de unión a penicilina; baja fuerza im pulsora protei­ ca; P-lactam asas de espectro ampliado

Alteración del transporte a través de la m em brana externa

Alteración de las proteínas de unión a penicilina; baja fuerza im pulsora protei­ ca; p-lactam asas de espectro ampliado

Alteración del transporte a través de la m em brana externa

Resistencia bacteriana a los antibióticos

proteína OmpF estaba reprimida en ambas cepas. Con el cie­ rre de la porina OmpF, continuó la expresión de OmpC en la cepa 1, mientras que en la cepa 2 no hubo ningún canal de transporte (porinas) restante, de modo que el transporte del antibiótico a través de la membrana cesó y se presentó resis­ tencia bacteriana. Las proteínas porinas de otras bacterias gramnegativas enté­ ricas parecen comportarse en forma similar a las de E. coli. Sin embargo, las porinas de Pseudomonas aeruginosa no se comportan de la misma m anera.184 El único antibiótico para el cual se explica claramente la resistencia en P. aeruginosa por medio de una alteración del transporte de membrana es imipe­ nem. En algunas situaciones, este antibiótico ingresa no a tra­ vés de la proteína porina principal sino a través de una proteí­ na de transporte específica, designada D2.261 Sin embargo, al parecer se requiere la presencia de una p-lactamasa de clase C cromosómica para la resistencia, además de la proteína porina alterada.181 Los antibióticos distintos de los p-lactámicos también pue­ den depender de los canales de porina para el acceso a la célu­ la. La resistencia al cloranfenicol, que suele estar causada por degradación enzimática, también puede estar mediada por pro­ teínas porinas alteradas en las bacterias entéricas324 y Haemophilus influenzae .30 Asimismo, la resistencia a los ami­ noglucósidos puede estar mediada por alteraciones en las pro­ teínas porinas, aunque el mecanismo primario para la resisten­ cia es la degradación enzimática.106 La resistencia a las quinolonas. que está mediada principalmente por los cambios en la estructura de la enzima diana, también puede ser causada por alteraciones en las proteínas de membrana.278 En las bacterias se han desarrollado proteínas de transporte específicas para el transporte de grandes moléculas, como vita­ minas, a través de la membrana celular. Si se pudieran diseñar antibióticos que aprovecharan esta “autopista” que existe en la célula bacteriana, tendrían una ventaja competitiva importante. Lamentablemente, ha sido difícil desarrollar este tipo de com­ puestos que también tengan utilidad clínica. Para algunas bacterias que deben entrar en el citoplasma bacteriano, puede existir una segunda barrera en la membrana plasmática interna. El cruce de la segunda membrana se logra por medio de un proceso que requiere gasto de energía y una carga negativa mínima en el citoplasma, la fuerza motora de protones, para “llevar” los antibióticos aminoglucósidos hacia el citoplasma. Este mecanismo de transporte ha sido demostra­ do tanto en bacterias grampositivas196 como en bacterias gram­ negativas.29 Se describieron Enterobacteriaceae mutantes que son resistentes a los antibióticos in vitro debido a deficiencias en este mecanismo de transporte, pero su importancia clínica no está clara.275 Estas variantes aparecen como colonias peque­ ñas en medios de agar, pero pueden revertir a una morfología normal de las colonias. Transporte activo de los antibióticos fuera de la célula bacteriana.

En algunas bacterias, un importante mecanismo de resistencia es la extracción activa de los antibióticos desde la célula bacte­ riana, de modo que las concentraciones intracelulares de éstos nunca alcanzan un nivel suficientemente alto como para ejercer una actividad antibiótica eficaz. Los mecanismos de transporte activo son teleológicamente útiles para eliminar distintas sustancias potencialmente tóxicas, de las cuales es posible que los antibióticos incluso no sean los principales. El mecanismo de salida dependiente de energía es una defensa importante para las bacterias contra las tetracicli­ nas199 y los macrólidos,105 dos grupos de antibióticos que inter­ fieren en la síntesis proteica a nivel ribosómico. Asimismo, la

909

F igu ra 17-3 Estructura de las bacterias vista con el m icroscopio electrónico. (A) Staphylococcus aureus. Dos cocos grampositivos se encuentran en las eta­ pas finales de la división. La m em brana celular (flechas) está rodeada por una gruesa capa de peptidoglucanos que es libremente accesible a los antibióticos (30 OOOx). (B) Pseudomonas aeruginosa. Estos bacilos gramnegativos tienen una m em brana citoplasm ática interna (flechas) y una m em brana celular exter­ na (puntas de flecha). Entre ambas membranas se ubica el espacio periplasmático que contiene el peptidoglueano. Los antibióticos P-lactámicos deben atravesar la m em brana celular antes de alcanzar el peptidoglueano (35 OOOx).

extracción del antibiótico es un mecanismo de resistencia de los estafilococos contra las quinolonas, que interfieren en la DNA girasa.223 El transportador puede extraer con eficacia diversos tipos de antibióticos, como en el caso de una proteína de la membrana externa (OprK) que participa en la secreción de sideróforos en Pseudomonas aeruginosa.251 Las cepas mutan­ tes con hiperproducción de la proteína demostraron resistencia a múltiples antibióticos, entre ellos ciprofloxacin, ácido nalidí­ xico, tetraciclina y cloranfenicol. Las cepas que habían perdi­ do la capacidad para producir la proteína transportadora mos­ traron una mayor sensibilidad a los antibióticos.227 Entre las bacterias grampositivas existen dos clases de bom­ bas de salida para múltiples fármacos dentro del grupo facilita­ dor mayor de transportadores, que dependen de la fuerza moto­ ra proteica para energía: 1) el transportador Bmr/NorA, que bombea hacia afuera colorantes catiónicos, cationes permeables

C ápsula

Á cido lipoteicoico C apa de peptidoglucanos P roteína M U nidad /-— estructural

p _

P roteína de unión a penicilina con actividad transpeptidasa P roteína — de m em brana

P roteína de unión a penicilina

Fosfolípido F igu ra 17-4 La pared celular de las bacterias grampositivas se compone, desde dentro hacia afuera, de (A) una membrana celular lipoproteica, (B) una pared celu­ lar de peptidoglucano, (C) una cápsula de polisacárido (en algunas cepas de ciertas especies, como Streptococcus pneumoniae ) y (D) el medioambiente extracelular. La m embrana celular A contiene fosfolípido. proteínas de membrana (que incluyen la proteína M en Streptococcus pyogenes), ácido lipoteicoico en los estafilococos y distintas proteínas de unión a penicilina, entre ellas p-lactamasa, ilustrada por las caricaturas de tiburones (S). En las bacterias grampositivas las p-lactamasas son secretadas en el medioam biente extracelular (D), donde pueden activar a los antibióticos P-lactámicos. Los bloques de construcción del peptidoglucano (PJ en la pared celular (B) son integrados en el peptidoglucano por una transpeptidasa de unión a penicilina en la m em brana (A). Los antibióticos P-lactámicos (L) tam bién interactúan con estas proteínas en la m em brana (A) e interfieren en el proceso.

a la membrana y quinolonas y 2) el grupo de compuestos de amonio cuaternario, que eliminan de las células los desinfec­ tantes y los colorantes catiónicos. A diferencia del transportador mef hallado en muchas bacterias grampositivas (incluidos los estafilococos), el transportador msr hallado sólo en los estafilo­ cocos también confiere resistencia a las estreptograminas B.271 Existen también dos clases de bombas para múltiples fárma­ cos entre las bacterias gramnegativas. La primera, que está relacionada con la familia Smr, puede conferir un ligero au­ mento de la resistencia a algunos antibióticos, pero no se la considera clínicamente importante; al parecer, los compuestos son exportados al espacio periplasmático. El segundo grupo, que es más complicado, es muy importante desde el punto de vista clínico y tiene un amplio espectro de especificidad; con­ tiene transportadores de la familia MF o de la familia de resistencia-nodulación-división (RND). En este grupo el transporta­ dor está compuesto por tres componentes: 1) una proteína transportadora en la membrana citoplasmática, 2) un poro de membrana y 3) una proteína “conectora” periplasmática que conecta a los otros dos componentes. La resistencia de los bacilos gramnegativos a muchos anti­ bióticos se atribuyó en un principio a una escasa entrada de éstos en la célula bacteriana debido a tamaño, hidrofobicidad o carga. Ahora se piensa que la salida activa de estos antibióticos

de la célula bacteriana es al menos igualmente importante, por­ que las bombas pueden excretar compuestos químicos, inclui­ dos los antibióticos, en forma directa en el medio extracelular, donde su reentrada está restringida.227 ANTIBIÓTICOS QUE INTERFIEREN EN LA FORMACIÓN DE LAS PAREDES DE LAS CÉLULAS BACTERIANAS: p-LACTÁMICOS Y GLUCOPÉPTIDOS La superfamilia de las enzimas que reconocen penicilina y antibió­ ticos activos en las membranas celulares. Antes de intentar com­

prender los mecanismos individuales de resistencia es impor­ tante considerar el concepto en evolución de una superfamilia de enzimas que reconocen a la penicilina y su relación con la estructura de las células bacterianas. Estas consideraciones son necesarias para comprender el grupo más importante de anti­ bióticos: la familia de los P-lactámicos. Como sucede a menu­ do en biología, la complejidad de los procesos y las interaccio­ nes se vuelven más evidentes a medida que más se aprende sobre ellos. Lo que a primera vista parece ser un proceso aisla­ do finalmente puede verse como parte de un sistema biológico mucho más grande y complejo, de manera muy similar a como un único punto en una pintura de Seurat puede apreciarse como parte de una obra de arte al retroceder y observar la totalidad del lienzo.

Resistencia bacteriana a los antibióticos

911

Canal de proteína porina abierto Beta# ) lactám ico

Lipopolisacárido

Lipoproteína

P roteína porina cerrada

Pared celular

Betaí 1 ■ lactam asa

í 1.

Espacio periplasm ático P eptidoglucano Unidad estruc­ tural

M em brana celular

P roteína de unión a penicilina

P roteína de m em brana

Figura 17-5 Las bacterias gram positivas consisten en una mem brana plasmática interna (A), un espacio periplasm ático con una disposición laxa de peptidoglu­ cano (B) y una m em brana celular externa (C). Las dos m em branas celulares consisten en bicapas lipoproteicas asimétricas con fosfolípidos y porciones proteicas. La m em brana plasmática (A) contiene distintas proteínas de unión a penicilina, que participan en el proceso de form ación de los peptidoglucanos y son inhibidas por los antibióticos P-lactámicos. La m em brana celular externa (C) incluye lipopolisacárido, que consiste en lípido A (endotoxina). un centro con uniones covalentes y una cadena polisacárida que determ ina el antígeno somático O utilizado en muchos esquemas de tipificación serológica. La m em brana externa también incluye importantes proteínas de transporte, que incluyen transportadores específicos y las im portantes proteínas porinas de varios tam años y tipos. La p-lactamasa en las bacterias gramnegativas está lim itada al espacio periplasm ático, donde puede inactivar a los antibióticos a m edida que atraviesan; la p-lactam asa no es excretada en el m edioam biente externo.

La penicilina y las proteínas de unión a vancom icina. El peptidoglucano, que proporciona rigidez y estabilidad funcio­ nal a la célula bacteriana, consiste en bandas intercaladas de aminoazúcares, A'-acetilglucosamina y ácido iV-acetilmurámico entrelazadas mediante péptidos. Como ya se explicó, la capa de peptidoglucanos de las bacterias grampositivas es una ca­ pa gruesa externa a la membrana de la célula única (figs. 17-3A y 17-4), mientras que la capa de peptidoglucanos de las bacte­ rias gramnegativas, que está adelgazada, se localiza entre la membrana plasmática y la membrana celular externa (figs. 173B y 17-5). La biosíntesis de peptidoglucano consiste en

muchos pasos que comienzan en el citoplasma y terminan fuera de la membrana celular. La etapa final en este proceso es la transpeptidación de la molécula de peptidoglucano en desarro­ llo, en la cual un residuo de glicina terminal sobre la cadena lateral de pentaglicina está ligado a D-alanina sobre una banda adyacente, lo que libera una segunda molécula de D-alanina en el proceso en el cual también parecen participar una glucosilasa y una carboxilasa, pero cuyos papeles son menos claros.191 La transpeptidasa, que está unida a la membrana celular, es una de una familia de enzimas conocidas como proteínas de unión a penicilina, que a su vez forman parte de la superfamilia de

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C A P ÍT U L O 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

F igu ra 17-6 Factores que influyen en el movimiento de antibióticos a través de las proteínas porinas de las bacterias gramnegativas: se m uestra la mem brana celu­ lar externa (véase fig. 17-5C) y dos antibióticos con diferentes características. El antibiótico A. que es grande, hidrófobo y tiene numerosas cargas negativas, es excluido por el canal de porina (C). El antibiótico (B). que es com pacto, tiene cargas equilibradas (ión dipolar o zwiterión) y es hidrófilo, atraviesa el canal de pori­ na D sin ninguna dificultad.

enzimas que reconocen a la penicilina.200 Además de las transpeptidasas, otras proteínas de unión a penicilina participan en la formación de la pared de la célula bacteriana. Estas proteí­ nas de unión se fijan a la membrana celular de las bacterias grampositivas y a la membrana plasmática interna en las espe­ cies gramnegativas. Las funciones características de diferentes proteínas de unión a penicilina se ha ilustrado espectacular­ mente en Escherichia coli, en la cual la interferencia en dife­ rentes proteínas produce efectos morfológicos distintos a medi­ da que se altera la síntesis de las paredes celulares (fig. 17-8).291 En los microorganismos bacilares, diferentes proteínas de unión parecen funcionar en la formación de las paredes cruza­ das en la división celular (proteína 2 en E. coli) y en la elonga­ ción celular después de la división (proteína 3 en E. coli).29' Las proteínas de unión a penicilina se numeran según su peso molecular y la proteína 1 tiene el peso molecular más alto. El sistema de numeración es específico para cada especie, de modo que la proteína de unión a penicilina 1 en Escherichia coli no es la misma proteína que la proteína 1 en Klebsiella pneumoniae o Streptococcus pneumoniae. Los compuestos de alto peso molecular funcionan como las transpeptidasas que son esenciales para la formación de peptidoglueano.96-293 Los compuestos de bajo peso molecular parecen funcionar como D-alanina carboxipeptidasas y su importancia biológica no está clara. Los P-lactámicos ejercen sus efectos al interferir en la for­ mación de peptidoglueano, un mecanismo que es compartido con los glucopéptidos, como la vancomicina.321'335 Hace muchos años se reconoció que una similitud estructural entre la molécu­ la de penicilina y el término D-alanina-D-alanina de la cadena de peptidoglueano era fundamental para la acción antibacteriana del compuesto.320 Kelly y cois, han dilucidado la estructura tri­ dimensional de la proteína de unión a penicilina con actividad transpeptidasa y observaron directamente su interacción con penicilinas y cefalosporinas, lo que estableció en forma defini­ tiva la identidad del sitio fijador de penicilina y la enzima trans­

peptidasa.162 En esencia, la penicilina “engaña” a la proteína de unión a penicilina, y ésta la toma como la siguiente unidad estructural que debe agregarse a la cadena de peptidoglueano. Una vez insertada, la molécula de penicilina impide una mayor elongación del peptidoglueano. Los distintos miembros del grupo grande de P-lactámicos tienen afinidades diferentes por las proteínas de unión a penicilina individuales. La eficacia de los compuestos contra las bacterias está determinada, en parte, por el grado en el cual se unen. El aztreonam, que es un anti­ biótico p-lactámico, no interactúa con las proteínas de unión de las bacterias grampositivas y es el único miembro del grupo que no es eficaz contra estos microorganismos. La actividad bactericida puede requerir la interacción de un antibiótico P-lactámico con más de una proteína de unión a penicilina.112 Satta y cois, observaron que la resistencia de E. coli aumenta­ ba a medida que se saturaban más proteínas de unión no esen­ ciales. La saturación de proteínas de unión no esenciales no tuvo ningún efecto sobre la sensibilidad a los antibióticos.279 La acción de las enzimas autolíticas también puede ser importan­ te para la actividad bactericida de los p-lactámicos.90 La otra clase de antibióticos que interfiere activamente en la síntesis de las paredes de las células bacterianas es el grupo de glucopéptidos, representado por vancomicina y teicoplanina. A diferencia de los P-lactámicos, que bloquean la actividad de las peptidasas unidas a la membrana celular, los glucopéptidos se unen en forma no covalente al término D-alanil-D-alanil de un precursor peptidoglueano pentapéptido.215 El antibiótico tiene similitudes estructurales y funcionales con una D-alanil-D-ala­ nil peptidasa que participa en la elongación de la cadena de peptidoglueano.169 La unión del antibiótico con la proteína pre­ cursora puede impedir el acceso de la unidad estructural esen­ cial a la peptidasa por interferencia estérica. M odificación de las enzim as diana: proteínas de unión y resistencia a los antibióticos. Un mecanismo importante de re­ sistencia de las bacterias a los p-lactámicos es la alteración de las proteínas de unión a penicilina de modo que el antibiótico ya

Resistencia bacteriana a los antibióticos

C epa de tipo silvestre ln vitro, m edio hipoosm olar

913

Cepa de tipo silvestre ln vitro, m edio hiperosm olar ln vivo, tejido

C efalosporina

P roteína porina O M P C (abierta)

Sensible

C epa m utante ln vitro, m edio h ipoosm olar

S ensible

B

C epa m utante ln vitro, m edio hiperosm olar ln vivo, tejido

S ensible

R esistente

Figura 17-7 Im portancia crítica de las proteínas porinas en la resistencia a los antibióticos según lo dem uestra una cepa mutante de Salmonella lyphimurium.101 se m uestra la m em brana celular externa para cuatro com binaciones de bacteria y m edioambiente. (A) La cepa de tipo silvestre que crece en un medio hipoosm olar en el laboratorio tiene una porina de canal pequeño (OmpC) y una porina de canal grande (OmpF). La cefalosporina tiene libre acceso a sus sitios de unión sobre la m em brana plasm ática interna (no se muestra) y la cepa es sensible. (B) La cepa de tipo silvestre ha crecido en el medio hiperosm olar en el laboratorio, lo que imita las condiciones in vivo. La porina de canal grande (Om pF) se ha cerrado, pero la porina de canal pequeño sigue aún disponible para la cefalosporina y la cepa sigue siendo sensible. (C) U na cepa mutante ha perdido su porina de canal pequeño (OmpC). pero aún tiene la porina Om pF cuando crece en un medio hipoosm o­ lar en el laboratorio. La cefalosporina puede atravesar la m embrana a través de Om pF y la cepa mutante es sensible in vitro. (D) La cepa mutante en medios hiperosm olares o in vivo. La proteína OmpF se cierra, com o lo hizo en la cepa de tipo silvestre en condiciones similares, pero ahora no existe ninguna porina OmpC dis­ ponible para el antibiótico. Sin ningún medio para entrar en la célula la cefalosporina es ineficaz y la cepa mutante ahora es resistente.

no tiene acceso a la cadena de peptidoglucanos en crecimiento. Las proteínas alteradas se indican mediante el agregado de un sufijo, que puede ser una letra o una designación principal, al esquema de numeración. Por ejemplo, el mecanismo de resis­ tencia de alto nivel de Staphylococcus aureus a las penicilinas resistentes a la penicilinasa es la producción de una variante de protema de unión a penicilina 2 (PBP 2), designada PBP 2a. Como alternativa, puede haber una pérdida de proteínas de unión que tienen la máxima afinidad por el antibiótico.

La evidencia que apoya el papel de las proteínas de unión alteradas proviene de dos fuentes. Primero, la presencia de pro­ teínas alteradas se asocia con la aparición de resistencia. La exposición de los estafilococos a la meticilina indujo una alte­ ración en la proteína de unión a penicilina 2 (PBP2) que la transformó en una forma variante (PBP 2a)119,236 Las variantes que perdieron la resistencia no contenían la proteína de unión variante.119-326 Asimismo, los aislamientos de Streptococcus pneumoniae que eran resistentes a la penicilina mostraron

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C A P ÍT U L O 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

<§> E. coli

B etalactám ico

P roteína de unión a penicilina Proteínas de unión a penicilina

P roteína de m em brana

F igu ra 17-8 Efectos de tres proteínas de unión a penicilina sobre la estructura de Escherichia coli : se m uestra la m em brana plasm ática interna de E. coli (corres­ pondiente a la capa A en la fig. 17-5). Tres proteínas de unión a penicilina diferentes se num eran 1 a 3, en el orden del peso m olecular decreciente. También se pre­ senta una variante de la proteína 1 (la ). Los antibióticos P-lactám icos que interactúan con la proteína 1 hacen que el bacilo se lise rápidamente. La interacción con la proteína 2 produce la form ación de células cócicas (C), que finalmente progresan hasta la lisis. Los antibióticos que interactúan con la proteína 3 no producen lisis, pero causan un defecto en la información de las paredes cruzadas de modo que las células bacterianas se alargan y adoptan formas extrañas (E). Las proteí­ nas de unión a penicilina 4 a 6 (no se muestran) no son esenciales y no producen cam bios obvios cuando los antibióticos interactúan con ellas.291

menor afinidad de la penicilina por las células bacterianas ente­ ras, los preparados de membrana y dos proteínas de unión a penicilina importantes.115 Se han comunicado resultados simi­ lares para estreptococos viridans en Sudáfrica.80 Por el contra­ rio, la transición de resistencia a hipersensibilidad fue asociada con la pérdida de una proteína de unión de baja afinidad. La proteína de unión de alta afinidad resultante se asoció entonces con sensibilidad al antibiótico unido. Las alteraciones en las proteínas de unión pueden constituir un proceso de un solo paso, controlado por un gen único, como el gen MecA, que codifica una PBP 2a variante en Staphylococcus aureus.326 Sin embargo, en el caso de Streptococcus pneumoniae, las alteraciones de múltiples proteínas de unión conducen a un proceso de resistencia creciente en múltiples pasos.137 Las alteraciones en las proteínas de unión son más impor­ tantes para la resistencia de las bacterias grampositivas a los P-lactámicos que para las bacterias gramnegativas entéricas y las especies de Pseudomonas. Sin embargo, los cambios en las proteínas de unión tienen efectos considerables sobre algunas bacterias gramnegativas y algunos P-lactámicos. El mecanismo por medio del cual Haemophilus influenzae y Neisseria gonorrohoeae que no producen p-lactamasa son resistentes a los P-lactámicos es la alteración de las proteínas de unión.72-239 Incluso N. meningitidis, que durante tantos años siguió siendo uniformemente sensible a la penicilina, ha desarrollado proteí­ nas de unión alteradas que han producido resistencia a ese anti­ biótico.349 La importancia clínica de estas proteínas de unión está bien ilustrada por el caso de un paciente en el cual H. influenzae no tipificable produjo meningitis. El paciente fue tratado con éxito con cefuroxima. La cepa aislada no producía

P-lactamasa y no contenía barreras para la permeabilidad, pero contenía proteínas que se unían poco a la cefuroxima.202 Incluso entre las enterobacterias pueden ser importantes los cambios en las proteínas de unión. Los cambios en PBP 3 de Escherichia coli se asociaron con resistencia a la cefalexina y a algunas otras cefalosporinas.123 Asimismo, la resistencia al imipenem puede estar mediada por cambios en las proteínas de unión, tanto entre las bacterias entéricas, como Enterobacter aerogenes, como Acinetobacter baumanii:45'100 En el caso de la cepa de Enterobacter, la proteína de unión estaba en la mem­ brana externa, más que en la membrana citoplasmática y puede haber sido importante en el transporte de antibióticos a través de la membrana. La segunda línea de evidencia que apoya el papel de las pro­ teínas de unión proviene de la observación de que la pérdida de la proteína variante conduce al restablecimiento de la sensibili­ dad o incluso a un estado de hipersensibilidad.80-91119'326 Se producen acontecimientos similares durante el desarrollo de resistencia a la vancomicina. El gen vanA de los enteroco­ cos codifica las proteínas precursoras depsipeptídicas para pep­ tidoglucano que saltean la interacción de vancomicina con el término D-alanil-D-alanil de los péptidos.169 174 La resistencia de Staphylococcus aureus a los glucopéptidos fue anticipada por el desarrollo de mutantes con menor sensibilidad en el labora­ torio. La disminución de la sensibilidad se asoció con la apari­ ción de una nueva proteína de 39 kDa en el citoplasma y en algunas fracciones de la membrana junto con una desorganiza­ ción considerable de la capa de peptidoglucanos.53 Existen varias revisiones útiles de las proteínas de unión a penicilina como mecanismos de resistencia.42 190-292

Resistencia bacteriana a los antibióticos

Enzim as que m odifican a los antibióticos: las p-lactam asas. Otro grupo importante de proteínas que reconocen a la

penicilina es la clase de enzimas conocidas como P-lactamasas. E?. la actualidad está claro que las p-lactamasas y las proteínas de unión a penicilina tienen un origen evolutivo común aunque distante.293 Ambas clases de compuestos deben interactuar con los P-lactámicos para realizar su función. Se han demostrado secuencias similares de aminoácidos en proteínas de unión a penicilina de alto y de bajo peso molecular y algunos tipos de P-lactamasa. Además, se han documentado similitudes en la conformación y la estructura tridimensional. Cabe señalar que algunas proteínas de unión a penicilina pueden funcionar como una P-lactamasa, aunque no en forma tan eficiente o con tanta im portancia clínica como las p-lactam asas “profesiona­ les’’.200:225 Además, el mecanismo de acción tanto de las p-lactamasas como de la proteína de unión a penicilina con activi­ dad transpeptidasa es la escisión de un enlace amino por un mecanismo acil-enzimático.19 Las P-lactamasas constituyen una familia de enzimas cuya importancia varía desde el mecanismo casi exclusivo de resis­ tencia estafilocócica a la penicilina en un extremo hasta com­ ponentes de la pared celular sin importancia clínica en algunas bacterias entéricas. Cualquier antibiótico o grupo de antibióti­ cos P-lactámicos puede ser inactivado por estas enzimas. La cantidad de enzimas diferentes excede ahora las 340, y el inten­ so incremento no muestra ningún signo de aminorarse.25-35'200 Al igual que la especificidad de las proteínas de unión a peni­ cilina por los antibióticos P-lactámicos es un factor para deter­ minar la sensibilidad de la bacteria al antibiótico; la especifici­ dad de una P-lactamasa por un P-lactámico es un determinante importante de la eficiencia con la cual la enzima hidroliza el antibiótico. Una mutación puntual en uno o más aminoácidos puede modificar la especificidad de la molécula si se presenta en un área estructuralmente crítica de la enzima,21,36 lo que lleva la lamantable situación de que las bacterias puedan inuti­ lizar en un instante inversiones millonarias en investigación y desarrollo farmacéuticos. Existen pruebas de que las fuentes microbianas de antibióti­ cos (como las especies de Streptomyces) producen el antibiótico y tam b ién las e n zim as modificadoras que protegen ai produc­ tor contra la autodestrucción. Es interesante recordar que Abraham y Chain, dos de los científicos fundamentales para el desarrollo de la penicilina, comunicaron la presencia de peni­ cilinasa en una cepa de Bacillus (Escherichia) coli antes de la introducción del uso clínico del antibiótico.3 Existen ejemplos de enzimas P-lactamasas documentadas antes de la introduc­ ción local del sustrato antibiótico relevante.25 Sin duda, la natu­ raleza no creó las p-lactamasas sólo para ocasionar problemas a los médicos infectólogos y a las compañías farmacéuticas. Dos grupos de investigadores han presentado pruebas que apo­ yan el concepto de que el papel fisiológico de las P-lactamasas es reestructurar el peptidoglueano durante el crecimiento de las células bacterianas.19325 Observaron que la síntesis de P-lactamasas era inducida tanto por la presencia de antibióticos P-lac­ támicos como por los precursores del medioambiente extracelular, lo que recuerda la similitud estructural de la penicilina y el término dipeptídico de la D -alanina-D -alanina de las c a d en as de peptidoglueano. Se han diseñado distintos esquemas de clasificación, lo que conduce a cierta confusión en la nomenclatura. Un primer esquema de clasificación útil fue provisto por Richmond y Sykes,268 pero ha proliferado la cantidad y la variedad de enzi­ mas más allá de los límites de ese esquema. Un esquema más moderno, sobre la base de la estructura molecular propuesta

915

por Ambler6 incluye, por necesidad, sólo enzimas que han sido caracterizadas. Más tarde, se estableció una clasificación de las p-lactamasas, el esquema de Bush-Jacoby-Medeiros, para inte­ grar las características funcionales y moleculares.36 Esta clasi­ ficación se resume en el cuadro 17-5, que también incluye la clase de Ambler correspondiente para cada uno de los grupos. El grupo más importante consiste en las serina proteasas que tienen preferencia por las penicilinas o una actividad de amplio espectro (Ambler A; Grupo 2 de Bush-Jacoby-Medeiros) y que se encuentran en los cromosomas o sobre los plásmidos; por lo tanto, pueden transferirse con facilidad de una bacteria a otra. También pueden localizarse sobre transposones que contienen genes para resistencia a otras clases de antibióticos, lo que con­ duce a cepas bacterianas multirresistentes.35 Estas P-lactamasas clase A/grupo 2 pueden ser producidas en forma constitutiva o pueden requerir inducción. En este grupo se encuentran las enzimas estafílocócicas y muchas de las P-lactamasas más importantes de las bacterias gramnegativas. Las enzimas Ambler clase C/grupo 1 de Bush-Jacoby-Me­ deiros son primariamente cefalosporinasas, constitutivas o inducibles, que se hallan sobre los cromosomas de las bacterias gramnegativas. En el cuadro 17-6 se resumen las características de estas “P-lactamasas de amplio espectro” . En forma más reciente y ominosa, las enzimas de clase C han hallado su camino hacia los plásmidos, por medio de los cuales se han diseminado entre las cepas bacterianas.233'262,316 Las enzimas A m bler clase B/grupo 3 de Bush-JacobyM edeiros (m etaloenzim as) y las enzim as A m bler clase D/grupo 2d de Bush-Jacoby-Medeiros (oxacilinasas) han sido consideradas de menor importancia clínica, pero cada vez se destaca más el papel de las metaloenzimas.34,183 Algunas p-lactamasas, como las producidas por Staphylo­ coccus aureus, han sido estables durante varias décadas. Estas enzimas tienen un espectro de actividad algo restringido dirigi­ do a las moléculas de penicilina. Las P-lactamasas mediadas por plásmidos de espectro más amplio de las bacterias gram­ negativas, como TEM-1 y SHV-1, también fueron estables durante muchos años. Sin embargo, a comienzos de la década de 1980, aparecieron diversas variantes enzimáticas que tenían un espectro de actividad ampliado contra muchos de los anti­ bióticos P-lactámicos recién descubiertos. Estas P-lactamasas de espectro ampliado se hallaron primero en Europa, principal­ mente en aislamientos de especies de Klebsiella, menos a menudo en Escherichia coli.252 Estas enzimas han sido ahora demostradas en muchas especies dentro de las enterobaeterias (que incluyen especies de Enterobacter, especies de Serratia y Proteus mirabilis) y más recientemente en otros géneros, como Pseudomonas aeruginosa.340 Las nuevas enzimas y sus precur­ sores, como TEM-1 y SHV-1, están localizados sobre plásmi­ dos, pero pueden haber sido derivados originariamente de una enzima cromosómica. Muchas de las nuevas P-lactamasas difieren entre sí sólo en la sustitución de un único aminoácido, pero los cambios tienen profundas implicaciones para el mane­ jo clínico de las enfermedades infecciosas.46,200 En el cuadro 17-6 se resumen las características de las enzimas de espectro ampliado. Estas enzimas han cobrado una importancia especial por varias razones: 1) se han vuelto prevalentes en algunos cen­ tros médicos de Europa y los Estados Unidos,345-259 2) confieren resistencia contra casi todos los antibióticos p-lactámicos con la principal excepción de los carbapenémicos, como imipenem. 3) la resistencia a muchos antibióticos no es detectada fácil­ mente por muchas técnicas de laboratorio de uso frecuente160 (véase luego la explicación sobre detección) y 4) en algunos casos la falla clínica ha sido el resultado del tratamiento con

916 CAPÍTULO

Cuadro 1 7-5

Esquema de clasificación funcional de Bush-Jacobi-Medeiros para p-lactamasas (con relación con el esquema de clasificación molecular de Ambler) 17

1

2a

TIPO ENZIMÁTICO

CLASE CANTIDAD MOLECULAR DE ENZIMAS (AMBLER) (MÍNIMA)

LOCALIZACIÓN PREDOMINANTE DE LA ENZIMA

EXPRESIÓN PREDOMINANTE

EJEMPLOS

Cefalosporinasa

No

C

53

Crom osóm ica o plásmido

Las enzim as crom osóm icas suelen ser inducibles; las enzimas de los plásmidos suelen ser constitutivas

Resistencia a todos los P-lactámicos excepto carbapeném icos (a m enos que se com bine con cam bios en las porinas)

Penicilinasa

Sí

A

23

Plásm ido o transposón

Inducible en S. aureus

Staphylococcus aureus; S. epidermis', espe­ cies de Enterococcus', predom inantem en­ te penicilinas

2b

De amplio espectro

Sí

A

16

2be

De espectro ampliado

Sí

A

119

2br

Resistente a los inhibidores

Dism inuida

A

24

Fundam entalm ente derivado del tipo TEM

2c

Cerbenicilinasa

Sí

A

19

PSE-1, CARB-3; BRO-1; carbenicilina

2d

Cloxacilinasa

Sí

D oA

31

OXA-1; PSE-2; Streptomyces cacaoi', clozacilina/oxacilina

2e

Cefalosporinasa

Sí

20

Proteus vulgaris; bacteroides fragilis

Crom osóm ica o plásmido

Inducible o constitutiva

TEM -1, SHV-1; penicilinas y cefalospori­ nas

Plásm ido

Constitutiva

TEM -3; SHV-2; Klebsiella oxytoca K -l; penicilinas y cefalosporinas

CepA; cefalosporinas 2f

Carbapenemasa

Sí

A

4

Enterobacter cloacae IM I-1; NM C-A; car­ bapeném icos

3

M etaloenzim a

No

B

24

Stenotrophomonas maltophilia L l ; todas las clases de p-lactám icos excepto los m onobactám icos

4

Penicilinasa

No

9

Burkholderia cepacia: otras enzim as no secuenciadas que no se ajustan a otros grupos

Adaptado de las referencias25352002'11'231'316.

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

GRUPO

INHIBICIÓN POR CI.AVULANATO

Resistencia bacteriana a los antibióticos

Cuadra 17-6

917

C aracterísticas de las P-lactam asas “de am plio esp ectro ” m ediadas p o r plásm idos m ás frecuentes

PARÁMETRO

P-LACTAMASAS DE ESPECTRO AMPLIADO

P-LACTAMASAS AMPC

Prim er año de comunicación

1983

1988

Especies bacterianas afectadas

Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae ; especies de Enterobacter; especies de Salmonella; especies de Proteus: especies de Citrobacter, Morganetta morganii; Serratia marcescens; Shigella dysenteriae; Pseudomonas aeruginosa: Burkholderia cepacia; Capnocytophaga ochracea y otras

Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae-, especies de Salmonella; Citrobacter freundii; Enterobacter aerogenes; Proteus mirabilis

Inhibición por inhibidores de la P-lactamasa (p. ej„ clavulanato)

Sí

No

Localización de la enzima

Plásmido

Plásmido (derivado de enzim a crom osóm ica inducible)

Expresión

Constitutiva

Constitutivo (una excepción)

Antibióticos indicadores

Aztreonam, ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima, cefpodoxima

Posiblemente cefoxitina o cefotetán

Mecanismo de detección (examen de detección)

Antibiótico indicador con inhibidor de la p-lactam asa o sin él

Problemático; utiliza K. pneumoniae (ninguna enzim a AmpC cromosómica) com o “pantalla institucional"

Problemas asociados

La presencia de una p-lactam asa de espectro ampliado puede estar enm ascarada por la coexistencia de la enzima AmpC

Difícil de diferenciar el plásmido de las enzimas cromosómicas

Efecto del inóculo

Sí

Sí

Eficacia de P-lactámicos aparente­ mente sensibles a la presencia de la enzim a

No

Probablem ente no

Tratamiento con com binaciones de p-lactám ico/inhibidor de la P-lactamasa

Controversial

No

Adaptado de las referencias25-35'200-218-231-316

antibióticos P-lactámicos que parecían ser eficaces in vitro.241 El reconocimiento de una epidemia de infección causada por una P-lactamasa de espectro ampliado se difirió porque las pruebas de sensibilidad por difusión con discos produjeron in­ formes falsos de sensibilidad.204 Inhibidores de las p-lactam asas. La última pieza del rom­ pecabezas de las proteínas que reconocen a la penicilina es la introducción de los inhibidores de las P-lactamasas.33 182 Estos compuestos se asemejan a los antibióticos P-lactámicos lo suficientemente bien como para que puedan unirse a las p-lac­ tamasas, ya sea en forma reversible o irreversible, lo que pro­ tege al antibiótico de la destrucción. Cuando son más eficces sirven como bombarderos suicidas y absorben toda la enzima disponible.182 No sorprende que estos compuestos, que deben imitar a los P-lactámicos para funcionar, también tengan una actividad antibacteriana limitada propia. De hecho, después de que el aztreonam fuera desarrollado como un antibiótico P-lactámico, se descubrió que tenía actividad adicional como inhi­ bidor de la p-lactamasa.33 Los tres inhibidores de la actividad de P-lactamasas que han hallado un lugar en la medicina clí­ nica son el ácido clavulánico, el sulbactam y el tazobactam. Los tres son eficaces contra la penicilinasa estafilocócica y tie­ nen una eficacia variable contra las enzimas cromosómicas de las bacterias gramnegativas. El clavulanato y el tazobactam son superiores al sulbactam en la actividad contra las P-lactamasas mediadas por plásmidos de los microorganismos gramnegati­ vos, que incluyen las P-lactamasas de espectro ampliado.244 No

existe ninguna diferencia importante entre las actividades inhi­ bidoras del clavulanato y el tazobactam, aunque el espectro de su actividad es diferente. Algunas enzimas de espectro amplia­ do son resistentes a la actividad de los tres compuestos. El cla­ vulanato es un inductor más eficiente de las P-lactamasas clase C/grupo 1 AmpC que el tazobactam o el sulbactam. P-lactam asas y resistencia a los antibióticos. Las P-lacta­ masas de las bacterias grampositivas, representadas predominan­ temente por los estafilococos, son en su mayor parte enzimas de clase C inducibles que se forman en la membrana celular, pero también son excretadas de manera extracelular (fig. 17-4). Las implicaciones prácticas de estas características son dobles. En primer lugar, las bacterias deben estar expuestas al antibiótico p-lactámico antes de que la enzima se produzca en grandes cantidades. En el laboratorio es posible destruir las bacterias con grandes cantidades de antibiótico antes de que ocurra la inducción enzimática, lo que produce la falsa impresión de sen­ sibilidad. En teoría, también se podrían matar pequeñas canti­ dades de estafilococos in vivo antes de la inducción de P-lactamasa, pero no se ha documentado esta eventualidad. Segundo, la producción extracelular de P-lactamasa podría proteger las bacterias coinfectantes que no producen la enzima. Se ha pos­ tulado la hipótesis de que las recaídas de la faringitis estrepto­ cócica después del tratamiento con penicilina podrían ser cau­ sadas por este mecanismo,27 pero otros investigadores no han podido documentar una relación entre la presencia de bacterias que producen P-lactamasa y el resultado del tratamiento.306

918

C A P IT U L O 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Las P-lactamasas de las bacterias gramnegativas son más complicadas y el nivel creciente de complejidad no muestra nin­ gún signo de disminuir (cuadro 17-5). Las enzimas cromosómicas que eran expresadas constitutivamente en bajo nivel en muchas especies entéricas (clase C/grupo 1) fueron aumentadas primero por enzimas de amplio espectro inducibles codificadas por plásmidos o transposones (clase A/grupo 2), más tarde por mutaciones en las enzimas de espectro ampliado mediadas por plásmidos (también clase A/grupo 2) y más recientemente por la aparición de las enzimas clase C/grupo 1 sobre plásmi­ dos. La complejidad está acentuada por varios factores, que se resumen en el recuadro 17-1.

Recuadro 17-1

C aracterísticas seleccio n ad as d e las p-lactam asas

1. M últiples p-lactam asas de diferentes tipos pueden ser expresadas en la m isma cepa de bacterias. Las diferentes enzimas pueden tener diferen­ tes im plicaciones clínicas y cada vez es más difícil identificar los perfi­ les enzim áticos en todos los laboratorios clínicos a excepción de los más sofisticados. Por ejemplo, la presencia de una p-lactam asa de espectro ampliado clase A/grupo 2 puede estar enm ascarada por la pre­ sencia de una P-lactam asa clase C/grupo l 25-316 (véase explicación de la detección más adelante). 2. Los efectos del inoculo pueden dificultar la detección de una resistencia importante de relevancia clínica.316 Los microorganismos que producen

ANTIBIÓTICOS QUE NO ACTÚAN SOBRE LA PARED CELULAR

Producción de enzimas modificadoras. Las enzimas modificado­ ras también son importantes para algunos antibióticos que ejer­ cen sus efectos dentro del citoplasma de las células bacterianas. El mecanismo primario para el desarrollo de resistencia a los aminoglucósidos se realiza a través de enzimas modificadoras. Existen tres tipos generales de procesos: 1) fosforilación, 2) acetilación y 3) adenilación. Todos los antibióticos aminoglu­ cósidos corren riesgo de inactivación por una de estas enzi­ m as.197,253 Aunque los tres tipos de enzimas se encuentran en todos los tipos de bacterias, las de los microorganismos gram­ positivos y gramnegativos son diferentes. Las enzimas de las bacterias gramnegativas que inactivan la estreptomicina y la kanamicina se han difundido tanto que estos antibióticos han caído fuera del uso clínico frecuente. La amikacina es menos vulnerable a estas enzimas inactivadoras, pero puede volverse ineficaz por otros mecanismos, sobre todo en Pseudomonas aeruginosa. La resistencia a los aminoglucósidos ha aparecido en proporciones epidémicas en los hospitales de todo el mundo.197 M iller y cois., que resumieron los resultados de numerosos estudios, observaron variaciones en el tiempo y entre las regiones geográficas.206 Parecía existir una relación entre la resistencia y los patrones de uso de antibióticos. Especialmente se observó la presencia de una enzima que acetila a la amikacina pero no a la gentamicina, o ejemplo de la inventiva de las bacterias. La eritromicina y el cloranfenicol también pueden ser inactivados por vía enzimática. En el caso del cloranfenicol, la en­ zima acetiltransferasa es responsable de la mayor parte de la resistencia clínica.97 Un mecanismo menor para la resistencia a las tetraciclinas es la inactivación enzimática.307 En las bacterias grampositivas, la resistencia a los macróli­ dos y las lincosamidas puede ser producida por varios métodos aislados o en combinación: inactivación enzimática, alteración de los puntos diana cromosómicos o expulsión activa.172 Se han identificado muchos genes (erm) de metilasa rRNA,271 los cua­ les son muy importantes porque producen el fenotipo MLSB, que confiere resistencia a todos los macrólidos (entre ellos claritromicina y azitromicina), lincosamidas (clindamicina) y estreptograminas (quinupristina-dalfopristina). Alteración de los sitios diana. Los cambios en la afinidad de los puntos diana ribosómicos por las enzimas son importantes para la resistencia a algunos antibióticos, sobre todo tetraciclina, eritromicina, quinolonas, aminoglucósidos, trimetoprim y sulfametoxazol. Aunque el mecanismo de resistencia primario para las tetraciclinas es el mecanismo de expulsión, también se describió la protección de los ribosomas por una proteína solu­ ble como un mecanismo secundario importante.307 Las altera­ ciones en el sitio ribosómico de acción de los macrólidos y las

P-lactam asas de espectro am pliado demuestran una resistencia creciente a las cefalosporinas de tercera generación con un inoculo bacteriano creciente (efecto del inoculo),139 fenómeno que probablem ente sea cau­ sado por la incapacidad de los antibióticos para destruir a las bacterias e inhibirlas.204 Las cefam icinas, que a menudo parecen ser sensibles in vitro. tam poco pueden ejercer actividad bactericida204 y el lugar de estos antibióticos en el tratamiento es poco claro. El imipinem. que tiene acti­ vidad bacteriostática y bactericida, parece eficaz in vitro y es terapéuti­ cam ente activo contra las cepas que no tienen otros mecanism os para la resistencia. Aunque los inhibidores de la P-lactamasa inhiben a las P-lactam asas de espectro ampliado, el papel de estos agentes en el trata­ miento de las infecciones humanas tam bién es controversial. En un estudio, el uso de inhibidores de la P-lactamasa pareció dism inuir la propagación de enzimas productoras de p-lactam asas de espectro ampliado, pero el uso de estos agentes generalm ente no se recomienda y el lavado de las manos sigue siendo la piedra fundam ental de las medidas para controlar la propagación de las infecciones intrahospitalarias.255 Cuando se infectaron en forma experimental ratas con una cepa de Klebsiella pneumoniae que producía una P-lactamasa TEM -26, las com binaciones de am picilina-sulbactam y piperacilina-tazobactam fue­ ron eficaces para reducir los recuentos de colonias bacterianas en los abscesos intrabdominales. pero el imipenem proporcionó el tratamiento más eficaz.266 3. Cada enzima tiene diferentes afinidades para distintos antibióticos P-lactámicos, pero la hiperproducción de una enzim a puede volver inactivo a un antibiótico que normalmente es eficaz.122-249 4. Se han caracterizado enzim as que son activas contra casi todos los anti­ bióticos P-lactámicos, aun aquellos (como los carbapeném icos) que no suelen ser afectados por las enzimas com unes.232334 5. No es raro que la misma cepa bacteriana presente m ecanismos de resis­ tencia redundantes. Por ejem plo, una p-lactam asa clase A/grupo 2 que es inhibida por ácido clavulánico (y podría ser tratada teóricam ente con una com binación P-lactámico-inhibidor de la P-lactamasa) también puede contener una m utación de la porina que vuelve resistente a la bacteria a m últiples antibióticos con la presencia de inhibidores de la p-lactam asa o sin ella.25 La resistencia a ceftazidim a y piperacilinatazobactam (habitualmente no inactivados in vitro por las P-lactamasas de espectro ampliado) en una cepa de Klebsiella pneumoniae fue adju­ dicada a la combinación de una P-lactamasa SHV-1 (clase A; grupo 2) y una alteración en las proteínas de la m em brana externa.265 Asimismo, el imipenem (no afectado por las P-lactamasas de espectro ampliado) fue inactivado por una com binación de una P-lactam asa AmpC mediada por plásmidos (clase C; grupo 1) y la pérdida de una proteína de la mem brana externa.26 6. Por último, los transposones pueden transportar genes para la resisten­ cia de múltiples antibióticos fuera de los P-lactámicos, como fluoroqui­ nolonas, trim etoprim -sulfametoxazol o am inoglucósidos.111-231

El laboratorio como guía del tratamiento antibiótico

lincosamidas, como eritromicina y clindamicina, son mecanis­ mos importantes para la resistencia contra este grupo de anti­ bióticos.172-238 La mutación en el sitio diana de la DNA girasa de las quinolonas es el mecanismo principal para la resistencia a este importante grupo de antibióticos, tanto en bacterias grampositivas como gramnegativas,126-127 aunque la resistencia también puede estar mediada por barreras en la difusión a tra­ vés de la pared celular. En algunos géneros (p. ej., Staphylococcus aureus o Pseudomonas aeruginosa) una única mutación es suficiente para conferir resistencia; en otros (p. ej„ Campylobacter jejuni, Escherichia coli o Neisseria gonorrho­ eae) se necesitan múltiples mutaciones.127 La resistencia a los aminoglucósidos puede estar mediada por alteraciones en los si­ tios diana ribosómicos y por inactivación enzimática. Cuando este mecanismo está operando, puede existir en realidad una acumulación (ineficaz) de antibiótico dentro de la célula bacte­ riana.4 Un mecanismo importante de resistencia a sulfametoxa­ zol y a trimetoprim es la alteración de las enzimas diana secuenciales en la vía bioquímica para la formación de ácidos nucleicos, dihidropteroato sintetasa para sulfamidas y dihidrofolato reductasa para trimetoprim.132 Desviación como mecanismo de resistencia. Los mutantes autotróficos que necesitan timina para su crecimiento pueden ser capaces de evitar la actividad de trimetoprim y sulfametoxazol in vitro con el uso de sustratos disponibles y vías alternati­ vas.245 El ejemplo de mayor importancia clínica de un meca­ nismo de desviación es la capacidad de las cepas naturales de las especies de Enterococcus para utilizar compuestos como ácido polínico para el crecimiento in vivo en presencia de trimetoprim-sulfametoxazol.108,348 Las cepas pueden parecer sen­ sibles in vitro, aunque no responden a la antibioticoterapia in vivo. El resultado in vitro puede ser transformado de sensible a resistente mediante el agregado de ácido polínico al medio de prueba. Por lo tanto, los enterococos no deben ser evaluados contra trimetoprim-sulfametoxazol. INTERACCIONES ENTRE LOS MECANISMOS DE RESISTENCIA

Muchas bacterias han desarrollado diversos mecanismos de resistencia que a menudo son complementarios. Ya se ha men­ cionado la presencia de numerosas enzimas P-lactamasas dife­ rentes en la misma bacteria. Un caso clásico para el estudio de los problemas de resistencia es el de Pseudomonas aeruginosa, que combina una lista numerosa de mecanismos de resistencia con la capacidad de causar infecciones serias en pacientes con enfermedades graves.183 El mejor ejemplo de las defensas sinérgicas es la combina­ ción de barreras contra la difusión de los antibióticos P-lactámicos a través de la membrana celular externa de las bacterias gramnegativas y la producción de P-lactamasas en el espacio limitado de la capa de peptidoglucano entre las dos membranas (fig. 17-5). En consecuencia, aumenta mucho la eficacia con la cual las enzimas pueden degradar el antibiótico. Se puede uti­ lizar una analogía militar para ilustrar la utilidad de la estrate­ gia bacteriana. Las bacterias grampositivas que permiten el acceso relativamente libre a la membrana celular interna, pero pueden secretar enzimas en el medioambiente extracelular (fig. 17-4) son análogas a los combatientes que cuentan con una artillería pesada de largo alcance, pero se enfrentan a un ejér­ cito enemigo desplegado en una planicie abierta. Por el contra­ rio, las bacterias gramnegativas tienen sólo rifles de un solo tiro, pero han ubicado a sus tiradores de primera para eliminar a los soldados enemigos a medida que marchan en una sola hilera a través del paso de montaña de los canales de porina y

919

la capa de peptidoglucano. El ejemplo de la estrategia combi­ nada es bien ilustrado por Serratia marcescens, que suele ser sensible a las cefalosporinas de tercera generación y a los carbapenémicos.122 Una cepa que produjo grandes cantidades de una P-lactamasa cromosómica tenía resistencia de bajo nivel a estos antibióticos. Sin embargo, cuando se agregaron a la plactamasa barreras al pasaje del antibiótico a través de la mem­ brana externa, el microorganismo aislado se volvió altamente resistente a los antibióticos. El fenómeno de complementación también se puede ilustrar observando los efectos de un inóculo en la interacción entre distintas bacterias gramnegativas y antibióticos P-lactámicos (fig. 17-9). Una cepa de Haemophilus influenzae productora de p-lactamasa, que tiene barreras mínimas contra el transporte de ampicilina a través de la membrana, es destruida en forma eficaz si la relación de la bacteria con las moléculas de anti­ biótico es pequeña. Sin embargo, si la relación aumenta, las moléculas de antibiótico ya no pueden alcanzar a todas las bac­ terias. de modo que algunos microorganismos escapan al daño y son capaces de multiplicarse. Este fenómeno, conocido como efecto del inóculo, tiene importantes implicaciones potenciales para las pruebas en el laboratorio. Por el contrario, las bacterias entéricas que tienen barreras importantes contra el pasaje del antibiótico a través de la membrana son resistentes a la activi­ dad bactericida aun cuando se presenten pocas bacterias. No existe ningún efecto de inóculo. Por otra parte, los científicos han utilizado su conocimiento de los mecanismos de acción de los antibióticos para construir combinaciones sinergistas que pueden derrotar los mecanismos de defensa bacterianos. La combinación de sulfametoxazol y trimetoprim es un buen ejemplo de la eficacia del uso de dos fármacos que actúan en diferentes puntos en una importante vía bioquímica bacteriana. Asimismo, la combinación de antibióti­ cos P-lactámicos e inhibidores de la p-lactamasa tiene una lógica obvia como estrategia terapéutica. Por último, la combi­ nación de aminoglucósidos y P-lactámicos para la infección enterocócica grave, utilizada al inicio en forma empírica,131 tiene una base racional una vez que se comprenden los meca­ nismos de acción de los antibióticos y la resistencia bacteria­ na (fig. 17-10). Los enterococos son intrínsecamente resisten­ tes a los aminoglucósidos. que no atraviesan la pared celular bacteriana de modo eficaz. Sin embargo, el agregado de P-lactámicos desorganiza lo suficiente el peptidoglucano de la pared celular de modo que los aminoglucósidos pueden pene­ trar en el citoplasma y ganar acceso a sus sitios diana ribosó­ micos. Por su parte, los enterococos han respondido desarro­ llando varios mecanismos para la resistencia a la combinación sinérgica: alteraciones de las proteínas de unión y p-lactama­ sa para las penicilinas y resistencia de alto nivel a los amino­ glucósidos por degradación enzimática o alteraciones ribosómicas.

El laboratorio como guía del tratamiento antibiótico Un fármaco quimioterápico es un compuesto químico que se utiliza en el tratamiento de una enfermedad. El compuesto puede tener un origen celular o puede haber sido sintetizado por un químico en el laboratorio. La enfermedad puede ser de cual­ quier tipo, incluidos los procesos infecciosos y neoplásicos. Un antibiótico es un agente antimicrobiano que es derivado de un microorganismo; un antibiótico es un fármaco que actúa funda­ mentalmente contra los microorganismos infecciosos.

920

C A P ÍT U L O 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

c

*

B B etalactam asa positiva, alta perm eabilidad; p. ej., H aem ophilus y am picilina

B etalactam asa positiva, baja perm eabilidad; p. ej., E nte ro b a cte r y am picilina

X X


=3) =5)(C ==5)

c® c« B etalactam asa positiva, alta perm eabilidad; efecto del inoculo

(C== > )(C Z= }> B etalactam asa positiva, baja perm eabilidad; sin efecto del inoculo

F igu ra 17-9 Actividad com plem entaria de P-lactamasa y barreras contra la difusión a través de las m em branas externas, com o se dem uestra por.los efectos del inoculo en las bacterias gramnegativas (A). Una cepa de Haemophilus influenzae productora de P-lactam asa perm ite la libre difusión de ampicilina (A) a través de la pared celular. A pesar de la presencia de la enzima, el antibiótico es capaz de destruir una pequeña cantidad de bacterias (X). (C) La presencia de gran cantidad de bacterias supera el efecto del antibiótico; una porción de la población bacteriana escapa a la lesión y es capaz de reproducirse. (B y D) Por el contrario, una cepa de Enterobacter cloacae también produce P-lactamasa, pero además lim ita la entrada del antibiótico en su sitio de acción sobre la mem brana plasmática interna. En consecuencia, una porción de la población bacteriana puede escapar a la destrucción antibiótica y reproducirse, ya sea que el inoculo sea grande o pequeño. Existe un efecto de inoculo con H. influenzae y ampicilina, pero no con Enterobacter y ampicilina. La im portancia de com binar dos m ecanism os de resistencia: producción de enzim as inactivadoras y restricción del transporte de antibióticos a través de la m em brana celular externa, es fundam ental para el resultado dicotómico. En el texto, se explican otras causas de los efectos del inoculo.

Los microbiólogos pueden ser de gran ayuda para los médi­ cos. Pueden evaluar las interacciones in vitro entre un microbio aislado y los antibióticos que serían apropiados para el trata­ miento de una infección in vivo. Su investigación en el labora­ torio puede proporcionar datos para ayudar al médico a decidir si las dosis seleccionadas de un antibiótico son suficientes. Varios de los sistemas comerciales para medir la sensibilidad ofrecen resultados rápidos, lo cual permite a los microbiólogos comunicar los resultados de la identificación y la sensibilidad el mismo día que se ha aislado la cepa en el cultivo. Doren y cois, evaluaron cuidadosamente el impacto clínico de los infor­ mes “rápidos”.70 Durante un año se evaluaron las bacterias ais­ ladas utilizando un método comercial rápido (grupo rápido) o los métodos convencionales durante toda la noche (grupo con­ vencional). El tiempo medio hasta el informe de los resultados

fue de 11,3 horas y de 19,6 horas en los grupos rápido y con­ vencional, respectivamente. La duración de la hospitalización fue comparable en los dos grupos, pero ocurrieron mejorías significativas en el grupo rápido para los factores mencionados en el recuadro 17-2. Un estudio ulterior de los aislamientos de hemocultivos demostró una correlación estadística entre el mayor tiempo desde la recolección de los hemocultivos hasta el informe ini­ cial de los resultados con una mayor duración de la estadía hospitalaria.16 En este caso la detección más rápida de aisla­ mientos bacteriémicos con instrumentos que evalúan continua­ mente el crecimiento en los frascos de hemocultivos fue res­ ponsable del efecto. Presumiblemente, la detección y el informe más rápidos de los resultados de la sensibilidad pudieron pro­ ducir resultados aditivos, si no sinérgicos.

El laboratorio como guía del tratamiento antibiótico

921

V ancom icina G entam icina

Peptidoglucano

Proteína de unión a penicilina

Receptor de vancomicina

Proteina de membrana

Proteína de unión a penicilina

Fosfolípido W

.

Ribosomas

A

R esistencia in trínseca a los am in o g lu có sid o s de bajo nivel

B

irj

.

'—

f

\

^

Sinergia p-lactám ico-am inoglucósido

B etalactam asa

/

V ancom icina

Proteína de membrana Enzima modificadora de amino­ glucósidos

Fosfolípido

•

• •

• •

* ▲

4 R esistencia a p enicilina y vancom icina

Receptor ribosómico alterado

R esistencia de alto nivel a los am inog lucósidos

Figura 17-10 Respuesta m icrobiana de los enterococos a la actividad sinérgica de los antibióticos am inoglucósidos y P-lactámicos. En cada panel la m em brana de una célula aislada y la pared celular de peptidoglucanos circundante (compárese con la fig. 17-4) de un enterococo rodean el citoplasm a que contiene ribosom as. (A) Resistencia intrínseca de los enterococos a la gentam icina, que no atraviesa la m em brana celular eficientemente y, por lo tanto, nunca alcanza el sitio diana, el ribosom a bacteriano. (B) Un antibiótico p-lactám ico ha desorganizado la m em brana celular al hacer “perforaciones” en la m embrana, de m odo que el aminoglucósido puede atravesar para alcanzar su sitio diana ribosóm ico. La com binación de p-lactám ico y am inoglucósido, ninguno de cuales es totalm ente eficaz solo, produce una acción antibiótica sinérgica. (C) El enterococo resistente ha producido P-lactam asa, lo que anula el efecto del antibiótico p-lactám ico y reproduce la situación que se encuentra en A. O tra vez el am inoglucósido es incapaz de alcanzar el sitio diana ribosóm ico. (D ) Otra estrategia microbiana: en este caso el P-lactám ico sigue siendo eficaz y el am inoglucósido puede alcanzar su sitio diana ribosóm ico. Sin embargo, los ribosom as alterados bloquean la actividad antibacteria­ na del am inoglucósido (T) una vez que alcanza el sitio ribosómico. Ya no se presenta actividad sinérgica. Como alternativa, las enzimas modificadoras de los am ino­ glucósidos (M) inactivan el antibiótico antes de que alcance el ribosoma. Se pierde nuevamente la actividad sinérgica, porque las bacterias han adquirido resistencia de alto nivel al aminoglucósido. Obviamente, am bos m ecanism os de resistencia bacterianos que se muestran en C y D podrían estar operando en la m ism a cepa, lo que produce una doble sombra.

922

C A P ÍT U L O 17

Recuadro 17-2

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Factores afectados p ositivam ente por la determ inación rápida de la sensibilidad a los antibióticos en las b acterias patógenas

1. Tasa de m ortalidad. 2. Cantidad de estudios de laboratorio realizados. 3. Cantidad de procedim ientos por imágenes. 4. Días de intubación. 5. Días transcurridos en un área de cuidados intensivos o intermedios. 6. Tiempo hasta la alteración del tratamiento antibiótico. 7. Costos totales de la hospitalización.

En este capítulo se explica la evaluación de los antibióticos que son activos contra bacterias aerobias y anaerobias faculta­ tivas. La evaluación de las bacterias anaerobias, las micobacterias y los hongos se explica en los capítulos 16, 19 y 21, res­ pectivamente. Los procedimientos para evaluar los antibióticos se resumen en el cuadro 17-7, que incluye una breve descripción de cada una de las pruebas y una lista de muestras que el laboratorio debe tener a mano. Las pruebas pueden ser divididas conve­ nientemente en dos grupos: 1) pruebas que predicen la eficacia del tratamiento y 2) pruebas que controlan la eficacia del trata­ miento.

Cuadro 17-7

Se han diseñado varios tipos de pruebas de sensibilidad a los antibióticos (antibiogramas). Las dos pruebas de referencia son los procedimientos por dilución macroscópica en caldo y por dilución en agar. Ambos están ideados para cuantificar la con­ centración mínima de un antibiótico que inhibe el crecimiento visible in vitro del microbio: la concentración inhibitoria míni­ ma (CIM). La prueba más utilizada para guiar el tratamiento con antibióticos es el antibiograma por difusión con discos (prueba de Bauer-Kirby), en el cual las interpretaciones clíni­ cas se derivan de las correlaciones con la prueba de referencia. En los últimos años, una cantidad creciente de laboratorios han utilizado de rutina una prueba en caldo miniaturizada (prueba por microdilución en caldo) o un sistema comercial automati­ zado. La prueba por microdilución en caldo se ha difundido tanto y ha sido tan bien estudiada que se convirtió en el patrón de referencia para muchos investigadores. Existen ahora en el comercio distintas opciones para los estudios de sensibilidad a los antibióticos, que incluyen las pla­ cas de CIM (tanto congeladas como deshidratadas), el análisis computarizado del crecimiento y la difusión de gradientes. A los fines de la explicación de este capítulo estos métodos serán incluidos en la designación “pruebas de dilución” o “pruebas de CIM” . Los procedimientos restantes para evaluar los antibióticos pocas veces se utilizan o suelen realizarse en laboratorios de química clínica. Estos procedimientos de prueba complemen­ tarios se mencionan en el recuadro 17-3. El lector interesado puede consultar la edición anterior de este libro.

Guía del tratamiento antibiótico

P R O C E D IM IE N T O

D E F IN IC IÓ N

M U ESTR A S

IN D IC A C IO N E S

Concentración inhibitoria m ínim a (CIM , caldo o agar)

L a concentración m ínim a del antibiótico que inhibe el crecimiento visible

Microorganism o aislado

Sensibilidad a los antibióticos de los aislamientos si se esta­ blece papel etiológico y la sensibilidad (o resistencia) no es predecible

Difusión con discos

D iám etro de inhibición del crecimiento alrededor del disco de papel impregnado con el antibiótico

M icroorganismo aislado

Método sim plificado para aproxim ar la CIM con correlacio­ nes interpretativas

Cálculo de la curva de crecim iento

CIM calculada sobre la base del efecto del antibiótico en las especies particulares

M icroorganism o aislado

Cálculo de CIM com putarizado integrado con identificación (p. ej., Vitek)

D ifusión por gradiente

CIM determ inada por la intersección del crecim iento bacteriano con las concen­ traciones graduadas de un antibiótico en una tira de papel

M icroorganism o aislado

M étodo com ercial (Etest®) útil en determ inadas situaciones

Detección m olecular

Dem ostración m olecular de gen/es o producto/s genético/s responsable/s de la resistencia

M icroorganism o aislado

M ás útil cuando se presenta un único gen de resistencia, p. ej., alteraciones en PBP 2 en estafilococos; tam bién se utili­ za para la caracterización de P-lactamasas

Concentraciones bacteri­ cidas mínimas

Concentración m ínim a del antibiótico que destruye el 99,9% del inoculo

M icroorganismo aislado

Pocas veces está indicado; posiblem ente endocarditis estrep­ tocócica; potencialm ente para osteomielitis; potencialm ente aislamientos tolerantes si no responde al tratam iento

Concentraciones de los antibióticos

Concentración ()ig/mL) del antibiótico en suero

Pico en suero, m ínim a en suero

Impredicibilidad de las concentraciones pico o potencial para la toxicidad; puede ser incorporado en algoritm o de manejo

Títulos bactericidas en suero

Dilución del suero que destruye el 99,9% del inoculo

Pico en suero, m ínima en suero, m icrobio aislado

Pocas veces está indicado; posiblem ente endocarditis bacte­ riana, osteomielitis, sepsis por gramnegativos en pacientes inmunodeprimidos

Pruebas sinérgicas

A ctividad sinérgica de múltiples antibióticos

M icroorganismo aislado

Procedim iento de investigación para el desarrollo de regím e­ nes terapéuticos; pocas veces, confirm ación de sinergia contra aislamientos individuales, más com únm ente en m icroorganismos aislados en las vías respiratorias de pacientes con fibrosis quística

El laboratorio como guía del tratamiento antibiótico

Recuadro 17-3

O tros pro cedim ientos para evalu ar los antibióticos

1. Determ inación de la actividad bactericida y de la actividad inhibitoria de los antibióticos contra las bacterias aisladas 2. M edición de la actividad antibacteriana de los fárm acos en com bina­ ción, también conocida com o prueba de sinergia 3. Cuantificación de las concentraciones del antibiótico en líquidos corpo­ rales, sobre todo suero 4. D eterm inación de la actividad bactericida en suero, a veces denom inada prueba de Schlichter

El medio más útil para evaluar si el tratamiento antibiótico es adecuado en muchas infecciones es la respuesta clínica del paciente al tratamiento y, si fuera necesario, la demostración mediante cultivos repetidos de que el microorganismo infec­ tante ha sido eliminado (curación bacteriana) o persiste (fraca­ so bacteriano). Lamentablemente, una curación bacteriana no siempre asegura un resultado clínico satisfactorio. Es importante señalar que las pruebas de sensibilidad a los antibióticos están destinadas a ser una guía para el médico, no una garantía de que un antibiótico será eficaz en el tratamien­ to. Un objetivo de los microbiólogos ha sido, y debe seguir siendo, la provisión de pruebas in vitro estandarizadas que pue­ dan ser reproducidas día a día y de un laboratorio a otro. Sin reproducibilidad no existe ninguna base científica para el trata­ miento. Sin embargo, en la lucha por la estandarización, es posible que no se tenga en cuenta la variabilidad de cada infec­ ción y de cada paciente. Los factores que determinan el pro­ nóstico de un proceso infeccioso son complejos y, en muchos casos, son evaluados en forma incompleta por las pruebas in vitro.332 Los ejemplos que siguen pueden aclarar el carácter esquivo de una correlación absoluta entre las interrelaciones del laboratorio y el resultado clínico. pH: las pruebas de sensibilidad microbiana están estandariza­

das a pH fisiológico (7,2 a 7,4), aunque a menudo se desarro­ llan niveles no fisiológicos de pH en los sitios de infecciones purulentas (como meningitis bacteriémica298 o abscesos121). Algunos antibióticos, como las penicilinas y las cefalospori­ nas, funcionan bien en un amplio intervalo de valores de pH. Las tetraciclinas funcionan mejor en medioambientes más ácidos y podrían en realidad resultar más eficaces en un exu­ dado inflamatorio ácido que en medios de cultivo del labora­ torio. Por el contrario, los aminoglucósidos y los macrólidos, como la eritromicina, son menos eficaces en medioambien­ tes ácidos que a pH neutro. Aunque se pueden lograr con­ centraciones elevadas de aminoglucósidos en las vías urina­ rias, los fármacos no funcionarán en condiciones óptimas si el pH de la orina es bajo. Cationes: en ciertas combinaciones de bacterias y agentes anti­ microbianos, más notablemente entre Pseudomonas aerugi­ nosa y aminoglucósidos, la concentración de cationes divalentes, en especial calcio (Ca2+) y magnesio (Mg2+), tiene un efecto drástico en la sensibilidad in vitro. Las variaciones en la concentración de cationes264 pueden desencadenar una diversidad de resultados entre la sensibilidad y la resistencia como consecuencia de cambios en el transporte de los agen­ tes antimicrobianos a través de la membrana. Los medios de agar y de caldo varían mucho en su concentración de catio­

923

nes divalentes. Por convención, las determinaciones se reali­ zan bajo condiciones fisiológicas. Inóculo: con ciertas combinaciones de bacterias y antibiótico, el inóculo es de gran importancia para determinar la sensibi­ lidad in vitro.79 La inactivación enzimática de los P-lactámi­ cos, como las penicilinas y las cefalosporinas, es un meca­ nismo importante de resistencia bacteriana. Estas enzimas siempre son expresadas en algunas bacterias, pero deben ser inducidas por la presencia del antibiótico en otras bacterias. Si se incuban in vitro con penicilina pequeñas cantidades de Staphylococcus aureus, que contiene una P-lactamasa indu­ cible, las bacterias pueden ser destruidas antes de que se pro­ duzcan cantidades eficaces de la enzima. Por el contrario, grandes cantidades de bacterias en una infección clínica acti­ va pueden sobrevivir para producir la enzima inactivadora y destruir al antibiótico. En este caso, con la prueba de labora­ torio se podría producir una falsa impresión de sensibilidad a los antibióticos y un falso sentido de seguridad. Cuando interactúan estafilococos y penicilinas resistentes a las P-lactamasas, como meticilina, sólo una pequeña fracción de bacterias expresan resistencia (heterorresistencia). Por lo tanto, si el inóculo es pequeño, es posible que no se incluyan las células bacterianas resistentes. La cantidad de bacterias en los pacientes infectados varía mucho, de modo que los inóculos estandarizados utilizados en el laboratorio repre­ sentan un compromiso razonable más que una reproducción de condiciones in vivo. Por último, la interacción entre las P-lactamasas y las membra­ nas de las bacterias gramnegativas puede conducir a los efec­ tos del inóculo, como se muestra en la figura 17-9. Farm acología clínica: la penetración de los antibióticos en sitios de infección es otra variable importante que no se puede evaluar in vitro. Se pueden lograr altas concentracio­ nes de los antibióticos en sitios donde son excretados del cuerpo, por lo habitual en la orina o la bilis. Por el contrario, pueden hallarse bajas concentraciones en relación con el suero en tejidos como líquido prostático, hueso o líquido cefalorraquídeo. En el caso del cloranfenicol, la excreción se realiza a través de las vías biliares y el fármaco no aparece en la orina. Sucede lo inverso con ciertos antibióticos, como la nitrofurantoína y la norfloxacina, que no logran concen­ traciones eficaces en sitios distintos de las vías urinarias. La ineficacia de muchos antibióticos, como los aminoglucó­ sidos, en el tratamiento de las infecciones por Legionella, a pesar de su excelente actividad in vitro, es causada probable­ mente por la mala concentración de los antibióticos en los macrófagos donde las bacterias están creciendo.205 En otras situaciones, la fisiología bacteriana es un determinante impor­ tante (p. ej., desviación de los efectos de la trimetoprim y las sulfamidas por los enterococos; véase más adelante la sección sobre enterococos). Algunas interacciones favorecen la resolución de la infec­ ción, aun cuando el tratamiento antibiótico sea subóptimo. Las defensas inflamatorias e inmunitarias del paciente son esencia­ les para el éxito del resultado clínico. Está claro que las bajas concentraciones de los antibióticos, por debajo de la concen­ tración necesaria para destruir la bacteria, pueden aumentar la capacidad de las células fagocíticas para ingerir y destruir un microorganismo infectante.128 Muchas infecciones, sobre todo las causadas por las bacte­ rias anaerobias estrictas, son sinérgicas; es decir, las bacterias dependen unas de otras para la supervivencia. Esta infección puede curarse con fármacos que son ineficaces contra algunas

924

C A P ÍT U L O 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

de las bacterias infectantes si se eliminan los participantes esenciales.273 Al considerar todos los factores que inñuyen en el resultado de una infección, es imperativo que el laboratorio proporcione a los médicos el “registro de rastreo” del antibió­ tico para guiarlos en la selección del tratamiento antibiótico apropiado. Algunos estudios clínicos bien diseñados han demostrado una relación entre el pronóstico y lo apropiado del tratamiento.337 Por lo tanto, los médicos deben relacionar los resultados de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos y la experiencia clínica con la selección de los regímenes terapéuti­ cos en los pacientes con infecciones similares.

Pruebas para determinar la actividad inhibitoria de los antibióticos Indicaciones

Las pruebas de actividad inhibitoria de los antibióticos están ideadas para bacterias que crecen bien después de una incuba­ ción de una noche en aire y tienen pruebas de sensibilidad imprevisibles. Las bacterias con requerimientos nutricionales especiales, que crecen más lentamente o necesitan suplementos nutricionales o atmosféricos, deben ser evaluadas con antibiogramas por dilución sólo cuando el uso cuidadoso de las cepas bacterianas de control demuestra la ausencia de efectos inhibi­ torios sobre las interacciones. La prueba por difusión con dis­ cos puede ser modificada para estos microorganismos cuando el procedimiento ha sido validado mediante la comparación con pruebas de referencia y con la experiencia clínica.222 Los microbiólogos deben resistir la presión de los médicos para aplicar los procedimientos más allá de sus límites esta­ blecidos. Los participantes en los estudios de pruebas de efi­ ciencia del College of American Pathologists cometieron muchos errores en la determinación de la sensibilidad de Listeria monocytogenes a la penicilina y la ampicilina porque las pautas publicadas no fueron diseñadas para esta bacteria.144 Otros estudios hicieron posible establecer pautas válidas para las especies de Listeria y los resultados de los estudios han mejorado. Lamentablemente, la lista de bacterias que tienen sensibili­ dades siempre predecibles se está volviendo más breve. La pre­ valencia de cepas de Haemophilus influenzae y Neisseria go­ norrhoeae productoras de P-lactamasas es suficientemente alta como para que no se considere que estos microorganismos son sensibles a los análogos de la penicilina.66 Los neumococos que son relativamente resistentes a la penicilina (CIM, 0,12-1 jag/ mL) o que tienen resistencia de alto grado (CIM, > 1 pg/mL) son cada vez más frecuentes en los Estados Unidos y se deben evaluar para resistencia las cepas neumocócicas aisladas en las infecciones graves.63 Aun la vancomicina, el bastión de la antibioticoterapia para las infecciones causadas por bacterias grampositivas, ha mostrado fisuras en su eficacia contra los enterococos103 y los estafilococos.94 Casi solo, Streptococcus pyogenes sigue sensible a la penicilina, aunque la resistencia a los antibióticos macrólidos se ha convertido en un hecho de la vida en varios géneros importantes de cocos grampositi­ vos.39'63-172 En ciertas situaciones, que se resumen en el cuadro 17-8, no se deben realizar las pruebas de sensibilidad ni se deben comu­ nicar los resultados a los médicos. Algunos de estos problemas se consideran en forma más completa en las secciones corres­ pondiente de este capítulo.

En algunos casos la sensibilidad o la resistencia siguen sien­ do predecibles y no están indicadas las pruebas de rutina. Estas pruebas pueden estar indicadas cuando la respuesta clínica no es la esperada. Sin embargo, cabe recordar que puede haber explicaciones alternativas a la falta de respuesta clínica. Los pacientes con faringitis por Streptococcus pyogenes suelen sufrir recaídas clínicas o bacteriológicas, después de las cuales los médicos sospechan resistencia a la penicilina. Como men­ cionamos, no se ha detectado aún resistencia de S. pyogenes a la penicilina; de las posibles explicaciones alternativas para las recaídas la más probable es la penetración insuficiente del anti­ biótico administrado por boca en las criptas de las amígdalas y las adenoides donde las bacterias merodean. Por supuesto, los microbiólogos deben estar listos para revisar la lista cuando sea pertinente. Sólo deben evaluarse los microorganismos aislados que pro­ ducen una infección. Las bacterias aisladas en un líquido cor­ poral normalmente estéril suelen ser patógenas. Si se aísla la bacteria potencialmente patógena en un sitio que contiene flora colonizadora, como las vías respiratorias altas o la piel, se debe escrutar más estrechamente el cultivo antes de realizar una prueba de sensibilidad, sobre todo si se presentan diversas especies de microorganismos. El examen de un frotis con tin­ ción de Gram puede documentar la inclusión de células epite­ liales pavimentosas y sugiere la contaminación por secreciones colonizadas, o la ausencia de neutrófilos segmentados, lo que indica la falta de una respuesta inflamatoria. En situaciones en las cuales el microbiólogo no puede determinar si una prueba de sensibilidad es procedente, es adecuado realizar una consul­ ta con el médico. Elección de la prueba

En la mayoría de las situaciones es suficiente realizar un antibiograma por difusión con discos (protocolo 17-1) o un antibiograma por microdilución en caldo (protocolo 17-2) para guiar el tratamiento clínico. Una alternativa más reciente es el antibiograma por difusión de gradiente (Etest, AB Biodisk, Solna, Suecia) (protocolo 17-3). Las ventajas de las pruebas de dilución es que proporcionan más información cuantitativa y pueden aplicarse en un espectro más amplio de microorganis­ mos aislados que la prueba de difusión. Sin embargo, no exis­ te un potencial definido para una mala interpretación de un resultado cuantitativo si los médicos no comprenden cómo uti­ lizar la información y el laboratorio no proporciona suficiente guía en la interpretación. Las pruebas de difusión con discos tiene un registro de rastreo largo y exitoso. La elección del método que se debe utilizar depende de las necesidades y los recursos locales. Para evaluar las pruebas de sensibilidad, la mayoría de los investigadores utilizan la siguiente convención: • Error muy grave: caracterización de una bacteria aislada resistente como sensible. • Error grave: caracterización de una bacteria aislada sensible como resistente. • Error menor: caracterización de una cepa sensible o resisten­ te como de sensibilidad intermedia, o caracterización de una cepa de sensibilidad intermedia como sensible o resistente. Selección de los antibióticos

La selección final de los antibióticos para el formulario del hospital debe decidirse en consulta con los miembros del per­ sonal médico. En los cuadros 17-9 y 17-10 se enumeran las lis-

Pruebas para determinar la actividad inhibitoria de los antibióticos

Cuadro 17-8

925

Situaciones en las cuales no deben realizarse las p ru e b a s p a ra antibióticos o no se deben co m u n icar sus resultados

CATEGORÍA

ANTIBIÓTICO/S

MICROORGANISMO/S

SITIO

ACCIÓN

FUNDAMENTO

Penicilinas

Streptococcus pyogenes; Streptococcus agalactiae

Todos

No se evalúa de rutina; enviar los aislamientos resistentes a un labo­ ratorio de referencia

N o está indicada la evaluación

N itrafurantoína; trim eto­ prim-sulfam etoxazol

Staphylococcus saprophyticus

Orina

No es necesaria la eva­ luación

Sensibilidad predecible

Resistencia predecible

Trimetoprim-sulfametoxazol; fluoroquinolonas

Streptococcus pyogenes

Todos

No se evalúa de rutina

No está indicada la evaluación

El antibiótico no se acum ula en el sitio de la infección

Cefalosporinas de primera Todos y de segunda generación; clindam icina; macrólidos; tetraciclinas; fluoroquino­ lonas; antibióticos admi­ nistrados por boca

LCR

N o se evalúa

Los antibióticos no penetran en el LCR ni se acumulan en concentraciones tera­ péuticas

Sensibilidad predecible

Las pruebas in vitro no predicen confiable­ m ente resistencia

Varios

Streptococcus pneumoniae

LCR

Evaluar y com unicar sólo penicilina, cefota­ xima, ceftriaxona, m eropenem o vanco­ micina

L a eficacia clínica no está claram ente establecida en las concentraciones logra­ das en el LCR

Cloranfenicol

Todos

Vías urinarias

N o se evalúa

A ntibiótico excretado a tra­ vés de las vías biliares; no es excretado en la orina

Norfloxacina; nitrofurantoína

Todos

Sitios distintos de la orina

N o se evalúa

A ntibiótico excretado en la orina; no alcanza concen­ traciones terapéuticas en otros sitios

Cefalosporinas

Especies de Enterococcus;

Todos

No se evalúa

N o está indicada la evalua­ ción y los resultados de la sensibilidad pueden ser engañosos

Listeria monocytogenes

Am inoglucósidos (dosis bajas)

Especies de Enterococcus

Todos

No se evalúa

N o está indicada la evalua­ ción salvo en las pruebas de dosis altas para determ i­ nar la sinergia; los resulta­ dos de sensibilidad pueden ser engañosos

Clindamicina; trim etoprim; trimetoprim-sulfametoxazol

Especies de Enterococcus

Todos

No se evalúa

No está indicada la evalua­ ción y los resultados de sensibilidad pueden ser engañosos

Todos los antibióticos P-lactámicos

Especies de Staphylococcus resistentes a la oxacilina

Todos

Com unicar como resis­ tente

Los resultados de sensibili­ dad no predicen la eficacia clínica y serán engañosos

Cefalosporinas de prim era Especies de Salmonella ; y de segunda generación; especies de Shigella am inoglucósidos

Todos

No se evalúa o se comu­ nica com o resistente

Los resultados de sensibili­ dad no predicen la eficacia clínica y serán engañosos

Antibióticos p-lactámicos Escherichia coli y salvo los carbapeném icos Klebsiella pneumoniae (imipenem y meropenem) que producen p-lactam a­ sas de espectro ampliado

Todos

No se com unica o se com unica com o resis­ tente

Los resultados de sensibili­ dad no predicen la eficacia clínica y serán engañosos

Adaptado de las referencias217,218

926

C A P IT U L O 17

Cuadro 17-9

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

A grupam ien to s sugeridos de antibióticos a p ro b ad o s p o r la FDA que d eben se r considerados p o r los la b o ra to rio s de m icrobiología clínica p a ra las p ru e b a s y el inform e de ru tin a de m icroorganism os sin req u erim ien to s nutricio n ales especiales PSEUDOMONAS AERUGINOSA Y OTRAS

ENTEROBACTERIACEAE*

ca

ai

§ ”

o

X

- a c7O ' ü ftn W

O

á É5 2 „ H


S §s- 1tí *3 Q ¿ rü a•a" o ^ w oHS I Q1 i g ^ 5

NO ENTEROBACTERIAS'

Ampicilina* Cefazolina0 Cefalotina" Gentam icina

Ceftazidima Gentamicina

Am ikacina

Amikacina

Am oxicilina-ácido clavulánico o am picilina-sulbactam Piperacilina-tazobactam Ticarcilina-ácido clavulánico

Cefepim a

Cefam andol o cefonicida o cefuroxim a

Cefoperazona Aztreonam Ciprofloxacina Im ipenem M eropenem Ticarcilina-ácido clavulánico*

Cefepina Cefm etazol Cefoperazona* Cefotetán Cefoxitina Cefotaxima* ',,i o cefizoxim a* 1o ceftriaxona*'''1 Ciprofloxacina* o levofloxacina* Ertapenem Im ipenem o meropenem M ezlocilina o piperacilina Ticarcilina Trimetoprimsulfametoxazol* Aztreonam Ceftazidim a (ambos son indicadores útiles de las p-lactamasas de espectro ampliado)'

o < > S < b hO 5 OW -c¿ »j - W ft, oí c« cpq °j a¡g w w Ctf rS Q P fe S

Cloranfenicol''* Kanam icina Netilm icina Tetraciclina4 Tobramicina

o o Z ’es vr*' £ ° z az °o 1* § £ ° a ^ r* *.■ — «a“. < •r— Cu O I j OH UO

Carbenicilina Cinoxacina Lom efloxacina o norfloxacina u ofloxacina Gatifloxacina L oracarbef N itrofurantoína Sulfisoxazol Trim etoprim

ESPECIES DE STAPHYLOCOCCUS

ESPECIES DE ENTEROCOCCUS"

Oxacilina' Penicilina'

Penicilina" o ampicilina

Azitrom icina'' o claritrom icina'' o eritromicina'*

Linezolida Quinupristina-dalfopristina'

M ezlocilina o ticarcilina Piperacilina

Vancomicinap

Clindam icina'' Linezolida Trimetoprim-sulfametoxazol Vancomicina

Tobramicina Trimetoprim-sulfametoxazol*

Cefotaxim a o ceftriaxona Cloranfenicol'"'

Cloranfenicol''

Gentam icina (evaluar sólo la resistencia de alto nivel )

Netilm icina

Ciprofloxacina o levofloxacina u ofloxacina G atifloxacina

Estreptom icina (evaluar sólo la resistencia de alto nivel)

G entam icina Q uinupristina-dalfopristina'” Rifam picina' Tetraciclina1’

Cloranfenicol'' Eritromicina'' Rifampicina'' Tetraciclina6 (Estos agentes pueden ser eva­ luados para enterococos resis­ tentes a la vancomicina)’

Carbenicilina

Lom efloxacina o norfloxacina

Ciprofloxacina Levofloxacina Norfloxacina

Ceftizoxima Levofloxacina o lom efloxcina o norfloxacina u orfloxacina Sulfisoxazol Tetraciclina6*

N itrofurantoína Sulfisoxazol Trimetoprim

Nitrofurantoína

Tetraciclina6

(Continúa)

Pruebas para determinar la actividad inhibitoria de los antibióticos

Cuadro 17-9

927

Agrupamientos sugeridos de antibióticos aprobados por la FDA que deben ser considerados por los laboratorios de microbiología clínica para las pruebas y el informe de rutina de microorganismos sin requerimientos nutricionales especiales (cont.)

Advertencia: los siguientes antibióticos no deben ser comunicados de rutina para las bacterias aisladas del LCR y que están incluidas en este docu­ mento. Estos antibióticos no son los fármacos de elección y es posible que no sean eficaces para el tratamiento de las infecciones del LCR causadas por estos microorganismos (las bacterias incluidas en los cuadros 2A y 2J): agentes adm inistrados sólo por vía oral cefalosporinas de prim era y segunda generación (excepto cefuroxim a sódica) clindam icina macrólidos tetraciclinas fluoroquinolonas

Observ ación 1: la selección de los antibióticos más apropiados para evaluar y com unicar es una decisión que tom a cada laboratorio clínico en consulta con los médicos especialistas en enfermedades infecciosas y la farmacia, y con los com ités de farmacia, terapéutica y control de infecciones del personal médico. Las listas para cada grupo de microorganism os com prende agentes de eficacia com probada que muestran un rendim iento aceptable de la prueba in vitro. Las consideraciones acerca de la asignación de los agentes a los grupos A, B, C y U incluyen eficacia clíni­ ca, prevalencia de resistencia, reducción de la aparición de resistencia, costo y recom endaciones de consenso actuales para fárm acos de pri­ m era elección y alternativos, además del com entario específico en las notas al pie f y g. Las evaluaciones de agentes seleccionados pueden ser útiles a los fines del control de las infecciones. Observación 2: los recuadros en el cuadro designan agrupam ientos de agentes com parables que no es necesario duplicar en las pruebas, porque los resulta­ dos de la interpretación suelen ser similares y la eficacia clínica es comparable. Adem ás “o” designa un grupo relacionado de agentes que tiene un espectro de actividad y resultados interpretativos casi idénticos y para los cuales la resistencia cruzada y la sensibilidad son casi completas. Por lo tanto, habitualm ente es necesario seleccionar sólo uno de los agentes dentro de cada recuadro de selección (agrupamiento o grupo relacionado) para las pruebas. Se deben evaluar los agentes que se comunican, a menos que el inform e basado sobre la evaluación de otro agente proporcione un resultado más exacto (p. ej., sensibilidad de los estafilococos a cefazolina o cefalotina sobre la base de las pruebas de oxacilina) y habitualm ente deben equipararse a los incluidos en el vademécum hospitalario; o el inform e debe incluir notas al pie que indiquen los agentes que suelen tener resultados com parables en la interpretación. Por último, se deben considerar para el inform e los resultados inesperados (p. ej., resistencia de las enterobacterias a las cefalosporinas de tercera generación o imipenem). Observación 3: la información en negrita se considera tentativa durante un año. I I

I 1

I [

I

Comentarios generales La cefalotina puede ser utilizada para representar cefalotina, cefapirina, cefradina, cefalexina, cefaclor y cefradoxilo. Cefazolina, cefuroxima, cefpodoxima, cefprozilo y loracarbef 1sólo aislamientos urinarios) pueden ser evaluados en form a individual, porque algunas cepas pueden ser sensibles a estos agentes cuando son resistentes a la cefalotina. Los microorganismos que son sensibles a las tetraciclinas también deben ser considerados sensibles a doxiciclina y minociclina. Sin embargo, algunos microorganismos que son intermedios o resistentes a la tetraciclina pueden ser sensibles a doxiciclina, minociclina o ambas. T ra ta m ie n to : no se debe utilizar la rifampicina sola como quimioterapia. S o se comunica de rutina sobre microorganismos aislados de las vías urinarias. El grupo B representa agentes que pueden justificar una evaluación primaria pero que sólo deben ser comunicados de form a selectiva, como cuando el microorganismo es resistenle a agentes de la misma fam ilia en el grupo A. Otras indicaciones para informar el resultado podrían incluir fuentes de muestras seleccionadas (p. ej., cefalosporinas de tercera generación seleccionadas para el aislamiento de bacterias entéricas de LCR o trimetoprim-sulfametoxazol para los aislamientos de las vías urinarias); alergia o intolerancia esta­ blecida o falta de respuesta a un agente en el grupo A; infecciones polimicrobianas; infecciones que afectan múltiples sitios con diferentes microorganismos o informes para el conrroi de infecciones como auxiliar epidemiológico. El grupo C representa antibióticos alternativos o suplementarios que pueden requerir pruebas en instituciones que albergan cepas endémicas o epidémicas resistentes a uno o más de los agentes (especialmente en la misma familia, p. ej., P-lactámicos o aminoglucósidos) o para el tratamiento de microorganismos inusuales (p. ej., cloranfenicol para algunas especies de Pseudom onas y cloranfenicol, eritromicina, rifampicina y tetraciclina para algunos enterococos resistentes a la vancomicina) o informe al control de infecciones como auxiliar epidemiológico. Enterobacterias Para los aislamientos fecales de especies de Salm onella y Shigella, sólo se deben evaluar y comunicar de rutina ampicilina, una fluoroquinolona y trimetoprim-sulfametoxazol. Además, se deben evaluar y comunicar cloranfenicol y una cefalosporina de tercera generación para los aislamientos extraintestinales de especies de Samonella. La cefotaxima y la ceftriaxona deben ser evaluadas y comunicadas en los aislamientos del LCR en lugar de cefalotina y cefazolina. Las cepas de especies de K lebsiella y E scherichia coli que producen P-lactamasas de espectro ampliado pueden ser clínicamente resistentes al tratamiento con penicilinas, cefalos­ porinas o aztreonam, a pesar de la aparente sensibilidad in vitro a algunos de estos agentes. Algunas de estas cepas muestran CIM por encima de la población sensible normal pero por debajo de los puntos de corte estándares para ciertas cefalosporinas de espectro ampliado o aztreonam; estas cepas pueden ser evaluadas para la producción potencial de p-lactamasas de espectro ampliado utilizando los puntos de corte de examen de detección enumerados al final del cuadro 2A, Prueba de detección inicial. Otras cepas pueden dar un resultado intermedio o resistente por los puntos de corte estándares a uno o más de estos agentes. En todas las cepas con P-lactamasas de espectro ampliado, las CIM para una o más de las cefalosporinas de espectro ampliado o aztreonam deben disminuir en presencia de ácido clavulánico como se describe al fin a l del cuadro 2A, Prueba de confirma­ ción fenotípica. Para todas las cepas productoras de p-lactamasas de espectro ampliado confirmadas, la interpretación de la prueba debe ser comunicada como resistente para ::das las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam. (Véase Glosario 1 para los agentes específicos incluidos en la clase de antibiótico, penicilinas y subclase de antibióticos, cefa­ losporinas). Pseudomonas aeruginosa v otras no enterobacterias Las no enterobacterias incluyen especies de A cinetobacter, Stenotrophom onas m altophilia, especies de Pseudom onas y otros bacilos gramnegativos, no fermentadores de glucosa y sin requerimientos nutricionales especiales. Puede estar indicada para la evaluación primaria de algunas especies de Pseudom onas (fuera de P. aeruginosa), S. m altophila (también se puede evaluar el moxalactam) y espe­ cies de A cinetobacter (se puede evaluar ampicilina-sulbactam y se informa para especies de A cinetobacter resistente a otros agentes). Especies de Staphylococcus Los estafilococos sensibles a la penicilina también son sensibles a otras penicilinas, cefemes y carbapenémicos aprobados para uso por la FDA para las infecciones estafilocócicas. Las cepas resistentes a la penicilina y sensibles a la oxacilina son resistentes a la penicilina lábiles a la penicilinasa pero sensibles a otras penicilinas estables a la penicilina­ sa. las combinaciones (5-lactámicos/inhibidores de la p-lactamasas, los cefemes relevantes y los carbapenémicos. Véase Glosario 1 para los agentes específicos incluidos en la clase de antibiótico o la subclase de antibiótico indicada Los estafilococos resistentes a la oxacilina son resistentes a todos los antibióticos P-lactámicos actualmente disponibles. Por lo tanto, la sensibilidad o la resistencia a un amplio conjunto de antibióticos p-lactámicos puede deducirse de las pruebas sólo sobre penicilina y oxacilina. No se aconsejan las pruebas de rutina de otras penicilinas, combinaciones de inhibidores de P-lactamasas, cefemes y carbapenémicos. Para informar contra Staphylococcus aureus sensible a la meticilina. Especies de Enterococcus Advertencia: para especies de Enterococcus, cefalosporinas, aminoglucósidos (salvo para la evaluación de resistencia de alto nivel), clindamicina y trimetoprim-sulfametoxazol pueden parecer activos in vitro pero no son eficaces desde el punto de vista clínico y no deben ser comunicados como sensibles. Se puede utilizar la sensibilidad a la penicilina para predecir la sensibilidad a ampicilina, amoxicilina, ampicilina-sulbactam, amoxicilina-ácido clavulánico, piperacilina y piperacilina-tazobactam para enterococos no productores de P-lactamasas. Para los aislamientos de sangre y LCR, también se recomienda una prueba para P-lactamasas. Tratamiento: el uso combinado de penicilina o ampicilina, más un aminoglucósido, suele estar indicado para las infecciones enterocócicas graves, como la endocarditis.

928

C A P ÍT U L O 17

Cuadro 17-10

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Agrupamientos sugeridos de antibióticos aprobados por ia FDA que deben ser considerados por los laboratorios de microbiología clínica para las pruebas de sensibilidad y el informe de rutina de microorganismos con requerimientos nutricionales especiales

ESPECIES DE HAEM OPH ILU S '

NEISSERIA GONORRHOEAE '

STREPTOCOCCUS PNEUM ONIAE

Am picilina1'

Eritromicina"

Trim etoprim -sulfam etoxazol

Penicilina' Trimetoprimsulfametoxazol

ffl 2 ! H o

ESPECIES DE STREPTOCOCCUS DISTINTOS DE S. PNEUM ONIAE Eritromicina*'" Penicilina' ” o am picilina' "

0 ^ O < eat É ~ ^2 a. a.ct— £ « B O n

w

ai 0. < 35 J WH 3as a a.

Cefuroxim a sódica (parenteral) C efotaxim a' o ceftazidim a o cefizoxim a' o ceftriaxona'

Cloranfenicol' Meropenem''*

Cefepim a Cefotaxim a' o ceítriaxona1 Clindamicina Gatifloxacina, levofloxaci­ na, m oxifloxacina, esparfloxacina Ofloxacina, gem ifloxacina Tetraciclina'' Vancomicina'

Cloranfenicol” Clindam icina” Vancomicina

Azitrom icina' o claritrom icinaf Aztreonam Am oxicilina-ácido clavulánicof

Cefixim a o cefotaxim a o cefpodoxim a o ceftizoxima o ceftriaxona

Am oxicilina o amoxicilinaácido clavulánico

Cefepim a o cefotaxim a o ceftriaxona

Cefaclorf o cefprozilor o loracarbef

Cefm etazol Cefotetán

Cefuroxim a

Levofloxacina Ofloxacina

C efdinir' o cefixima'’ o cefpodoxima^

Cefoxitina Cefuroxim a

Cloranfenicol Ertapenem Imipenem Linezolida Rifampicina*

Linezolida Q uinupristina-dalfopristina'’

Cefonicid

W J a. S O u < as -

2

a.

Cefuroxim a axetilc/ (oral)

Ciprofloxacina o gatilloxacina u ofloxacina Penicilina

Ciprofloxacina o gatifloxacina o levo­ floxacina o m oxifloxacina u ofloxaci­ na o esparfloxacina Ertapenem o imipenem Rifam picina Espectinom icina Tetraciclina'' Tetraciclina''

Advertencia: los siguientes antibióticos no deben ser comunicados de rutina para las bacterias aisladas del LCR y que están incluidas en este docu­

mento. Estos antibióticos no son los fármacos de elección y es posible que no sean eficaces para el tratamiento de las infecciones del LCR causadas por estos microorganismos (las bacterias incluidas en los cuadros 2A y 2J): agentes adm inistrados sólo por vía oral cefalosporinas de prim era y de segunda generación (excepto cefuroxim a sódica) clindam icina m acrólidos tetraciclinas fluoroquinolonas

(Continúa)

Pruebas para determinar la actividad Inhibitoria de los antibióticos

Cuadro 17-10

929

Agrupamientos sugeridos de antibióticos aprobados por la FDA que deben ser considerados por los laboratorios de microbiología clínica para las pruebas de sensibilidad y el informe de rutina de m icroorganism os con requerimientos nutricionales especiales (cont.)

OBSERVACIÓ N 1: la selección de los antibióticos más apropiados para evaluar y com unicar es una decisión que tom a cada laboratorio clínico en consulta con los médicos especialistas en enfermedades infecciosas y la farmacia, y con los com ités de farmacia, terapéutica y control de infec­ ciones del personal médico. Las listas para cada grupo de microorganismos com prende antibióticos de eficacia com probada que m ues­ tran un rendim iento aceptable de la prueba in vitro. Las consideraciones acerca de la asignación de los antibióticos a los grupos A, B, C y U incluyen eficacia clínica, prevalencia de resistencia, reducción de la aparición de resistencia, costo y recom endaciones de con­ senso actuales para fármacos de primera elección y alternativos, además del com entario específico en las notas al pie b y c. Las evalua­ ciones de agentes seleccionados pueden ser útiles a los fines del control de las infecciones. O BSERVA CIÓ N 2: los recuadros en el cuadro designan grupos de antibióticos com parables que no es necesario duplicar en las pruebas, porque los resulta­ dos de la interpretación suelen ser similares y la eficacia clínica comparable. Además “o” designa un grupo relacionado de antibióticos que tiene un espectro de actividad y resultados interpretativos casi idénticos y para los cuales la resistencia cruzada y la sensibilidad son casi completas. Por lo tanto, habitualm ente es necesario seleccionar sólo uno de los antibióticos dentro de cada recuadro de selec­ ción (grupo relacionado) para las pruebas. Se deben evaluar los agentes que se comunican, a m enos que el informe basado sobre la evaluación de otro agente proporcione un resultado m ás exacto y habitualm ente deben equipararse a los incluidos en el vademécum hospitalario; o el inform e debe incluir notas al pie que indiquen los antibióticos que suelen tener resultados com parables en la interpre­ tación. Por último, se deben considerar para el informe los resultados inesperados. O BSERV A C IÓ N 3: la inform ación en negrita se considera tentativa durante un año. Cj'rcnrarios generales ASe pueden predecir la sensibilidad y la resistencia a azitromicina, claritromicina y diritromicina mediante la evaluación de eritromicina. E. grupo B representa a los antibióticos que pueden justificar pruebas primarias pero que deben ser comunicados sólo selectivamente, como cuando el microorganismo es resisten-

s los agentes de la misma clase en el grupo A. Otras indicaciones para informar el resultado podrían incluir fuentes de muestras seleccionadas (p. ej., cefalosporinas de tercera - nt rat ión seleccionadas para el aislamiento de H. influenzae en el LCR); alergia o intolerancia establecida o falta de respuesta a un agente del grupo A; infecciones polimicrobtanas: infecciones que afectan múltiples sitios con diferentes microorganismos o informes para el control de infecciones como auxiliar epidemiológico. El ¿rapo C representa antibióticos alternativos o suplementarios que pueden requerir pruebas en instituciones que albergan cepas endémicas o epidémicas resistentes a uno o más los antibióticos (especialmente en la misma familia, p. ej.. ¡3-lactámico) o para el tratamiento de microorganismos inusuales o informe al control de infecciones como auxiliar epidemiológico.

Los microorganismos que son sensibles a la tetraciclina también se consideran sensibles a doxiciclina y minociclina. ' de Haemoohilus Sóio el resultado de las pruebas con ampicilina. una de las cefalosporinas de tercera generación, cloranfenicol y meropenem debe ser comunicado de rutina con los aislamientos d e l LCR con H aem ophilus influenzae. Amoxicilina-ácido clavulánico, azitromicina, claritromicina, cefaclor, cefprozilo, loracarbef, cefdinir, cefixima, cefpodoxima y cefuroxima axetilo son agentes orales que pueden ser uiilizados para el tratamiento empírico de las infecciones respiratorias debidas a especies de H aem ophilus. Los resultados de la prueba de sensibilidad con estos antibióticos a menudo no son útiles para el tratamiento de pacientes individuales. Sin embargo, las pruebas de sensibilidad de la especies de H aem ophilus con estos compuestos pueden ser apro­ piadas para los estudios de vigilancia o epidemiológicos. Se deben utilizar los resultados de las pruebas de sensibilidad a la ampicilina para predecir la actividad de amoxicilina. La mayoría de los aislamientos de H. influenzae que son residentes a ampicilina y amoxicilina producen una P-lactamasa tipo TEM. En la mayoría de los casos, una prueba de P-lactamasa directa puede proporcionar un medio rápido para detectar resistencia a ampicilina y amoxicilina. Las indicaciones clínicas y los patógenos relevantes incluyen meningitis bcteriana y bacteriemia simultánea en asociación con meningitis causada por H aem ophilus influenzae cepas productoras y no productoras de P-lactamasas.) Seisseria gonorrhoeae La prueba de p-lactamasa detectará una form a de resistencia a la penicilina en N. gonorrhoeae y también puede ser utilizada para proporcionar información epidemiológica. Las :¿pas con resistencia mediada por cromosomas sólo pueden ser detectadas mediante pruebas adicionales de sensibilidad, como el método por difusión en disco o el método de la CIM por dilución en agar. Srrepiococcus pneumoniae Sólo los resultados de las pruebas con penicilina, cefotaxima, ceftriaxona, meropenem y vancomicina deben ser comunicadas de rutina para los aislamientos en LCR de S. pneu£

moniae.

Tratamiento: no se debe utilizar rifampicina sola como quimioterapia. Especies de Streptococcus Tratamiento: los aislamientos con sensibilidad intermedia a penicilina o ampicilina pueden requerir un tratamiento combinado con un aminoglucósido para la acción bactericida. 'S o se comunica de rutina para los microorganismos aislados de las vías urinarias. W - son necesarias las pruebas de sensibilidad de penicilina y otros p-lactámicos aprobados por la FDA para el tratamiento de Streptococcus pyogenes o Streptococcus agalactiae para fines clínicos y no se deben realizar de rutina, dado que como sucede con la vancomicina, no se han reconocido cepas resistentes. Los criterios de interpretación provienen del desarrollo farmacéutico, la epidemiología o la monitorización para la resistencia emergente. Cualquier cepa que tenga una sensibilidad intermedia o sea resistente debe ser deriva­ da a un laboratorio de referencia para su confirmación. Informar contra Streptococcus pyogenes.

tas de antibióticos que han sido sugeridos por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (antes National Committe for Clinical Laboratory Standards).1

El perm iso para utilizar fragm entos del M 100-S7 (Exam en de las CIM , cuadros com ­ plem entarios, enero de 2003) y del M 100-S13 (D ifusión en disco: cuadros com plem enta­ rios, enero de 2003) ha sido otorgado por el N CCLS. Los datos interpretativos sólo son válidos si se siguen los m étodos M 7-A 6 (M étodos para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos por dilución para bacterias que crecen en condiciones aerobias; estándar apro­ bado 6a ed.) y M 2-A 8 (Estándares de rendim iento para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos en discos; Estándar aprobado 8a ed.). E l N CCLS actualiza periódicam ente los cuadros M 2 y M 7 a través de nuevas ediciones de los estándares y suplem entos. Los usua­ rios deben ser derivados a las ediciones más recientes. Los estándares actuales se pueden obtener en el N CCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, W ayne, PA 19087 o de su sitio w eb (h t t p : / / v i w w . n c c l s . o r g / ).

Obsérvese que muchos antibióticos son agrupados por clase porque el espectro de actividad es similar. Las recomendacio­ nes recientes del CLSI encaran las pruebas selectivas y los informes selectivos, y reconocen que los problemas son com­ plejos y que varían de una institución a otra. Washington ha proporcionado una guía para los agrupamientos de antibióticos (cuadro 17-1 1).333 No es necesario evaluar cada antibiótico de la lista. Cuando se seleccionan los antibióticos para las pruebas es necesario conocer y considerar los patrones de uso de los antibióticos y de resistencia bacteriana en cada comunidad. Se pueden realizar distinciones entre los antibióticos que son eva­ luados de rutina y aquellos cuyos resultados se comunican en forma habitual a los médicos. En los cuadros 17-9 y 17-10 se ofrecen elecciones de anti­ bióticos para las pruebas. En algunos casos, varios antibióticos

930

C A P ÍT U L O 17

Cuadro 17-11

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

A g rupam ien to de los antibióticos recom endados p a ra evaluación e inform e

GRUPO

CATEGORÍA

TIPO DE ANTIBIÓTICO

A

Prueba e inform e primario

B

Prueba primaria, informe selectivo

C

Pruebas com plementarias; informes selectivos

D

Com plem entaria

Incluyen el panel de rutina e inform an de rutina Antibióticos de segunda línea o de refuerzo para grupo A debido a un mayor costo o toxicidad, apropiado para un sitio específico o insuficien­ cia clínica con un antibióti­ co del grupo A Pruebas en instituciones con problem as específicos de resistencia bacteriana o en pacientes que son alérgicos a otros antibióticos o en infecciones inusuales Pruebas sólo de infecciones de las vías urinarias

Adaptado de la referencia333.

pueden tener equivalencia terapéutica, es decir que proporcio­ nan un espectro similar de actividad antimicrobiana. Sin embargo, es posible que los resultados de las pruebas in vitro de una cepa específica ante un agente no predigan el resultado in vitro ante otros antibióticos en el grupo; en efecto, estos anti­ bióticos son equivalentes pero no siempre tienen la misma efi­ cacia contra todas las cepas. Se deben evaluar todos los de un grupo considerados para uso terapéutico. Por el contrario, se pueden aplicar los resultados de las prue­ bas in vitro de algunos antibióticos a los familiares cercanos. No es necesario evaluar cada agente del grupo. Algunas de estas situaciones se detallan en el cuadro 17-12.217,218 Estandarización

La principal mejoría en la guía de laboratorio de las pruebas de sensibilidad en las últimas décadas ha provenido del desa­ rrollo de procedimientos estandarizados que han sido adopta­ dos ampliamente. Es muy importante cumplir con los protoco­ los recomendados para lograr resultados reproducibles. El CLSI publica en forma continua estándares para estas pruebas y otras. (Se pueden obtener copias de los Performance Stan­ dards fo r Antimicrobial Disk Susceptibility Tests y los Methods fo r Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests fo r Bacteria that Grow Aerobically solicitándolas por escrito al CLSI en 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898).217-220 Es importante que todos los laboratorios clínicos adopten rápi­ damente los procedimientos revisados y las recomendaciones actuales. Que una institución sea miembro del CLSI garantiza que recibirá en forma oportuna todas las recomendaciones nue­ vas y revisadas. Washington ha resumido los recursos y proce­ sos de esta organización de consenso nacional que incumben a los microbiólogos clínicos.333 Los siguientes parámetros son algunas de las importantes facetas de las pruebas de sensibilidad que han sido estandari­ zadas.

MEDIO DE CULTIVO

Se ha seleccionado caldo y agar de Mueller-Hinton para eva­ luar las bacterias aerobias y anaerobias facultativas. Estas fór­ mulas se aproximan más estrechamente a los criterios para un medio reproducible. Contienen infusión de carne de vaca deshi­ dratada, digerido ácido de caseína y almidón de maíz. La mayo­ ría de los patógenos crecen satisfactoriamente y los medios tie­ nen un efecto inhibidor mínimo sobre sulfamidas, trimetoprim y tetraciclina.10 Se presentan grandes cantidades de timidina en algunos lotes de medios. Algunos microorganismos pueden uti­ lizar la timidina para evitar el mecanismo de acción de trimeto­ prim y crecer, aun cuando sean innatamente resistentes al anti­ biótico. Se afectan particularmente los enterococos; las colonias aisladas pueden aparecer dentro de la zona establecida de inhibi­ ción alrededor de discos que contienen trimetoprim. Es obvio a partir del examen de la fórmula que incluso el medio de Mueller-Hinton no está definido desde el punto de vista químico.171 El agar es un compuesto natural preparado a partir de algas rojas. La variación ocurre en la composición del agar entre los fabricantes e incluso entre los lotes producidos por una misma compañía, según el origen del alga. Continúan los intentos por reducir la variación entre los lotes de agar de Mueller-Hinton. Un estándar de referencia para los fabricantes puede proporcionar una mayor reproducibilidad.256 Se ha crea­ do un medio formulado especialmente para evaluar Haemo­ philus influenzae que ha sido recomendado por el CLSI para uso habitual.154 Este medio de prueba para Haemophilus puede utilizarse también para especies de Haemophilus, como se des­ cribe más adelante.151

PH

El pH del medio debe estar entre 7,2 y 7,4 a temperatura ambiente. El pH del medio de caldo puede evaluarse en forma directa con un electrodo para pH y los medios de agar pueden evaluarse macerando lo suficiente el agar de modo que se pue­ da sumergir la punta del electrodo, permitiendo que una por­ ción del agar se solidifique alrededor del electrodo o utilizando un electrodo de superficie calibrado. SUERO

Los antibióticos difieren mucho en el grado en el cual se unen a las proteínas. En el torrente circulatorio, el antibiótico libre se encuentra en equilibrio con el antibiótico unido a las proteínas séricas. Se puede medir el antibiótico libre y el anti­ biótico unido a las proteínas, pero no está claro cuál es el resul­ tado más útil. En el laboratorio, se pueden obtener diferentes valores para antibióticos altamente unidos a las proteínas si se agrega suero al medio. El método CLSI no incluye suero agre­ gado debido a la dificultad en la estandarización del producto y la incertidumbre acerca de cómo interpretar los resultados. Perl y cois, estudiaron el efecto del suero en 11 antibióticos de amplio espectro utilizados para tratar infecciones intrahospita­ larias por bacilos gramnegativos.247 Los resultados fueron idén­ ticos con 9 de los 11 antibióticos. Sólo en el caso de la ceftria­ xona (> 95% ligado a las proteínas) y de la cefoperazona (90% ligado a las proteínas) las diferencias fueron sustanciales cuan­ do se incorporó suero en el procedimiento de referencia.

CONCENTRACIÓN DE CATIONES

Como se explicó, la concentración de los cationes divalentes Ca2+ y Mg2+ afecta los resultados de la sensibilidad cuando se

Pruebas para determ inar la actividad inhibitoria de los antibióticos

Cuadro 17-12

M IC R O ­ O R G A N ISM O S

931

Situaciones en las que puede probarse la sensibilidad a un antibiótico para predecir el resultado de las pruebas de sensibilidad in vitro con otros

A N T IB IÓ T IC O

G R U PO S DE A N T IB IO T IC O S S U S T IT U T O S

C O M E N T A R IO S

Estafilococos

Penicilina

A ntibióticos lábiles ante las peniciliasas, agentes estables antes las penicilasas, com binaciones con inhibidores de p-lactamasas

Las determ inación de que el m icroorganismo es sensible (con inclusión de las pruebas de P-lactamasas después de la inducción) predice que es sensi­ ble a todos los antibióticos; la determ inación de que es resistente predice la resistencia a los antibióticos lábiles a las penicilasas, pero otros antibióti­ cos serán eficaces excepto que la cepa tam bién sea resistente la oxacilina.

Estafilococos

Oxacilina

Nafcilina, meticilina, oxacilina, dicloxacilina, aztreonam , todos los cefemos, todos los carba­ peném icos

La determinación de que el m icroorganismo es sensible o resistente predice la respuesta a los antibióticos con labilidad a las penicilasas y a com bina­ ciones con inhibidores de P-lactamasas; no se recom ienda probar antibióti­ cos sustitutos.

Estreptococos

Penicilina

Todos los antibióticos P-lactámicos, incluidos penicilinas, cefemos, carbapeném icos, m onobactám icos y estos agentes en com bi­ nación con inhibidores de p-lactamasas

La determinación de que el m icroorganismo es sensible indica que también es sensible a todos los antibióticos del grupo sustituto; la determ inación de que es resistente no predice restistencia a otros antibióticos.

Todos

Tetraciclina

Tectraciclina, minociclina, doxaciclina

La determ inación de que el m icroorganismo es sensible predice una respues­ ta al grupo sustituto; la determ inación de que es resistente no predice resis­ tencia a antibióticos del grupo sustituto.

Todos

Eritromicina

Eritromicina, azitromicina, claritro­ micina, diritrom icina

La determ inación de que el m icroorganismo es sensible predice que respon­ derá a los antibióticos del grupo sustituto; la determ inación de resistencia no predice resistencia al grupo sustituto.

Enterobacteriaceae

Cefalotina

Cefalotina, cefapirina, cefradina, cefalexina, cefaclor, cefradoxilo

Observar que la respuesta a la cefalotina no predice la respuesta a otras cefa­ losporinas.

Enterococos no pro ductores de p-lactamasas

Penicilina

Todas las penicilinas, con P-lactamasas o sin ellas

Agentes para los que el tratamientc oral es adecuado

Am picilina

A m picilina, amoxicilina

Adaptado de las referencias217-2,H.

evalúan ciertas combinaciones de especies bacterianas y anti­ bióticos.264 Barry propuso que el mecanismo por el cual la con­ centración de cationes afecta la actividad de Pseudomonas aeruginosa , por ejemplo, comprende la permeabilidad de la pared de la célula bacteriana.10 Los lipopolisacáridos en la pared celular de P. aeruginosa tienen uniones cruzadas con cationes divalentes, lo que proporciona estabilidad. Cuando los microorganismos crecen en medios deficientes en cationes, aumenta la permeabilidad de la pared celular a los aminoglu­ cósidos y otros compuestos. Por lo tanto, los microorganismos son más sensibles a la acción de los aminoglucósidos, lo que produce resultados de CIM falsamente bajos o tamaños gran­ des de zonas inhibidoras. El caldo de Mueller-Hinton tiene concentraciones muy bajas de cationes divalentes y debe tener un suplemento hasta concentraciones fisiológicas (20 a 35 |ig/L de M g2+ y 50-100 |ig/L de Ca2+). En realidad, algunos lotes de agar de Mueller-Hinton pueden tener concentraciones anormalmente altas de estos cationes, de modo que se produ­ cen pequeñas zonas inhibidoras cuando se evalúa P. aerugino­ sa contra aminoglucósidos. Estos lotes, que pueden ser identi­ ficados evaluando con cepas de referencia de reactividad cono­ cida, deben descartarse.

La detección de resistencia de ciertas cepas de estafilococos a las penicilinas semisintéticas mejora si se agrega NaCl al 2% en los medios para las .pruebas de sensibilidad por dilución.218 ATMÓSFERA Se incuba el agar o el caldo en una estufa de incubación con aire ambiental. No se debe utilizar una estufa con CCK para pruebas de rutina. El ácido carbónico formado sobre la super­ ficie del agar o en el caldo puede producir una disminución en el pH, que puede afectar la actividad antibacteriana de ciertos antibióticos, como ya se explicó. En los laboratorios que tienen poca carga de trabajo y dónde sólo se cuenta con una estufa con C 0 2, es aceptable colocar las placas o los tubos para sensibili­ dad en una jarra sellada para evitar el acceso del C 0 2 desde la estufa. TEMPERATURA Las placas y los tubos deben ser incubados de rutina a 35 °C. A temperaturas más altas, la detección de estafilococos resis­ tentes a la oxacilina está comprometida. Si se sospecha resis­

932

CAPÍTULO 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

tencia a la oxacilina y no se manifiesta a 35 °C, las placas o los tubos pueden ser incubados a 30 °C. INOCULO En general, el inoculo se prepara a partir de un cultivo en caldo que ha sido incubado durante 4 a 6 horas, cuando se con­ sidera que el crecimiento se encuentra en fase logarítmica. Se deben tomar muestras de varias colonias de aspecto similar para reducir la variación en la población bacteriana. La densi­ dad de la suspensión se ajusta hasta aproximadamente 108 uni­ dades formadoras de colonias (UFC) por mililitro comparando la turbidez con un estándar de B aS 0 4 de McFarland de 0,5. El estándar se prepara agregando 0.5 mL de 0,048 M de BaCL (1,175% p/v de BaCl, • H ,0 ) a 99,5 mL de H2S 0 4 0,36N. Se distribuyen alícuotas de 4 a 6 mL de estándar de turbidez de sulfato de bario en tubos con tapa a rosca del mismo tamaño, se los sella apretadamente y se los almacena en la oscuridad a temperatura ambiente. Se pueden utilizar nefelómetros para determinar la turbidez. Comúnmente, se compara el grado de turbidez en el caldo con el estándar, visualizándose los dos contra un fondo blanco en el cual se han dibujado líneas negras. Otros ajustes hacia el inoculo dependen del tipo de prueba uti­ lizada. Como alternativa, los dispositivos comerciales para pre­ parar un inoculo estandarizado han funcionado bien.11 Si el tiempo no permite la incubación durante 4 a 6 horas, se pueden eliminar de la superficie las colonias jóvenes de una placa de agar que ha sido incubada durante toda la noche y diluida hasta la densidad adecuada (el método de suspensión directo de colonias). Se recomienda este método cuando se evalúan estafilococos para resistencia a la meticilina y cuando se evalúan cepas de Streptococcus penum oniae y Haemophilus influenzae.

Si se utiliza un estándar de McFarland para preparar el ino­ culo, se debe controlar la densidad del estándar utilizando un espectrofotómetro con un camino de luz de 1 cm y cubetas apa­ readas. La absorbencia a 625 nm debe ser de 0,08 a 0,10 para el estándar de McFarland de 0,5. El estándar debe ser reempla­ zado o debe controlarse mensualmente si es adecuado.219 Es útil, pero no esencial, documentar la cantidad de microorganis­ mos en el inoculo en forma periódica inoculando diluciones seriadas de la suspensión en placas de agar. ANTIBIÓTICOS Los polvos del antibiótico de referencia que se van a utilizar en las pruebas de dilución deben obtenerse del fabricante o de la Farmacopea de los Estados Unidos en Rockville, Md. Estos polvos de referencia se documentan con un ensayo de actividad antibiótica. Por ejemplo, el rótulo puede indicar que el polvo contiene 1 075 |ig de la sustancia química activa en cada 1 000 (ig de polvo. La cantidad de polvo pesado se debe ajus­ tar para la actividad de cada lote. No se deben obtener frascos ampolla de la farmacia del hospital porque pueden contener agregados y no se realizan pruebas de actividad biológica. Los antibióticos deben almacenarse en un desecador como se indi­ ca para cada agente. Muchos antibióticos, sobre todo los de la clase de los p-lactámicos, son más estables a temperaturas por debajo de -2 0 °C. Las suspensiones del antibiótico deben alma­ cenarse a -2 0 °C o menos, de preferencia a -7 0 °C; no deben ser recongelados después de distribuirlos. El imipenem, que es particularmente afectado por la congelación y la descongela­ ción,343 debe ser reconstituido cada vez que se prepara un lote de placas o tubos. No se debe utilizar un refrigerador con sis­

temas “sin escarcha" porque producen ciclos repetidos de con­ gelación y descongelación. Los discos impregnados con antibióticos deben almacenarse a -2 0 °C o menos en un estado anhídrido. Según las pautas establecidas por la Food and Drug Administration de los Estados Unidos, los fabricantes de discos con antibióticos deben controlar con cuidado la concentración de los antibióti­ cos en los discos hasta dentro del 60-120% del contenido esta­ blecido; la variación real suele ser mucho menor. Se puede mantener un pequeño suministro a temperaturas de refrigera­ dor en un desecador. Siempre se debe permitir que los discos se calienten hasta temperatura ambiente antes de abrir el dese­ cador, de modo que la condensación de la humedad desde el aire no los rehidrate parcialmente. La falsa resistencia de Sta­ phylococcus aureus a la oxacilina fue el resultado del uso de un lote defectuoso de discos.24 CONTROL DE CALIDAD El control de calidad riguroso es importante para los antibiogramas debido a la gran cantidad de variables que pueden afectar los resultados. Se pueden controlar las características físicas y químicas de los medios, como pH y profundidad del agar, pero el control final es proporcionado por diversas cepas bacterianas de referencia (cuadro 17-13).217-220 Las cepas con­ troles ideales tienen parámetros de sensibilidad en el intervalo medio de las concentraciones antibióticas evaluadas y presen­ tan tendencias mínimas a modificar los patrones de sensibili­ dad con el tiempo. Estas cepas de referencia deben almacenarse en un estado que reduzca al mínimo la posibilidad de una mutación. Pueden almacenarse congeladas (por debajo de -2 0 °C o de preferen­ cia por debajo de -6 0 °C) después de la suspensión en un esta­ bilizador, como sangre entera desfibrinada, suero fetal bovino al 50% en caldo bacteriológico o glicerol al 10% en caldo. Como alternativa, las cepas pueden ser liofilizadas. Para un almacenamiento a corto plazo, las bacterias pueden crecer en agar con digerido de soja y caseína y almacenadas a 2-8 °C. Los tubos con agar inclinados (“picos de flauta”) deben ser pre­ parados cada dos semanas y se debe obtener un nuevo cultivo de reserva cuando se observan resultados aberrantes. Es nece­ sario preparar un subcultivo fresco todos los días en que se uti­ lice la cepa control. El CLSI ha establecido reglas para la frecuencia de las prue­ bas de sensibilidad (cuadro 17-14). Asimismo, definió las acciones adecuadas de corrección que se deben tomar cuando no se cumplen los parámetros de calidad (cuadro 17-15). Garantía de calidad Además del control de calidad tradicional, la participación en un programa de pruebas de eficiencia, exigido actualmente por ley federal de los Estados Unidos, mejora el rendimiento y proporciona datos agregados útiles para evaluar el estado de las pruebas de sensibilidad con base nacional.61'65'142,145 Tam­ bién se han implementado con éxito programas de eficiencia dirigidos.311 Interpretación de los resultados Un médico que recibe los resultados de un antibiograma por dilución conoce las concentraciones de un grupo de fármacos que inhibieron el crecimiento del patógeno en condiciones cui­ dadosamente definidas en el laboratorio. Para efectuar la selec­

Pruebas para determinar la actividad inhibitoria de los antibióticos

Cuadro 17-13

933

Cepas para control de calidad de las pruebas de sensibilidad

i T IP O DE PRU EBA Dilución y difusión con discos I Dilución y difusión con discos

Enterococcus faecalis (ATCC 29212) Enterococcus faecalis (ATCC 51299)

I Dilución y difusión con discos I Dilución y difusión con discos

Escherichia coli (ATCC 25922) Escherichia coli (ATCC 35218)

Dilución y difusión con discos Dilución y difusión con discos

Haemophilus influenzae (ATCC 49247) Haemophilus influenzae (ATCC 49766)

Dilución D ilución y difusión con discos Dilución en agar y difusión con discos D ilución y difusión con discos

H elicobacter pylori (ATCC 43504) Klebsiella pneum oniae (ATCC 700603) Neisseria gonorrhoeae (ATCC 49226) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) Staphylococcus aureus (ATCC 29213) Staphylococcus aureus (ATCC 43300)

Dilución Dilución

C O M E N T A R IO S

CEPA

D ifusión con discos Difusión con discos

Staphylococcus aureus (ATCC 25923) Enterococcus faecalis (ATCC 29212 o ATCC© 33186)

Dilución y difusión con discos

Streptococcus pneum oniae (ATCC 49619)

Sensible a vancomicina y am inoglucósidos en altas dosis; para uso general Resistente a vancom icina y am inoglucósidos en altas dosis; para pruebas de am inoglucósidos en altas dosis y para agar de examen de detección de vancom icina Control general de calidad, que incluye antibióticos betalactám icos Control de inhibidores de las p-lactamasas; se puede utilizar junto con E. coli ATCC 25922 para com binaciones fi-lactámico-inhibidores de las P-lactamasas Resistente a la ampicilina; P-lactamasas negativos Sensibles a la ampicilina; más reproducible que H. influenzae (ATCC 49247) para P-lactámicos seleccionados Para laboratorios especializados Control para pruebas de p-lactamasas de espectro ampliado Pruebas generales Pruebas generales Utilizado junto con S. aureus (ATCC 29213) para controlar las pruebas de evaluación de agar-sal de oxacilina Pruebas generales; cepa sensible para agar de evaluación de vancomicina M onitorización de lotes de agar de M ueller-Hinton para niveles poco satisfactorios de los compuestos inhibidores de sulfamidas, trim etoprim o trimetoprim -sulfametoxazol Pruebas generales

ATCC. American Type Culture Collection. Adaptado de las referencias217-2'8.

ción racional del antibiótico más apropiado para un paciente, el médico necesita al menos otras tres de informaciones: 1) la farmacocinética del antibiótico, que incluye la concentración pico que se puede esperar en el sitio de la infección y la rapidez con la cual disminuirá esa concentración, es decir, la vida media; 2) de qué modo se compara la bacteria aislada con otras cepas de la misma especie y 3) cualquier dato clínico disponible sobre la respuesta in vivo de bacterias aisladas similares en situaciones similares. Sin un conocimiento completo de estos factores, es fácil interpretar erróneamente los datos crudos. Por ejemplo, un antibiótico P-lactámico, con una concentración inhibitoria mínima (CIM) de 2 (J.g/mL para un aislamiento de E. coli, podría ser considerado menos eficaz que un antibiótico amino­ glucósido, como gentamicina, con una CIM de 0,5 Ug/mL. De hecho, las concentraciones del fármaco que se pueden alcanzar en suero son mucho mayores para la ampicilina que para la gentamicina y el riesgo de toxicidad es mucho menor en ausen­ cia de antecedentes de reacciones alérgicas al fármaco. Por lo tanto, la elección correcta del tratamiento sería ampicilina y no el antibiótico con la CIM mínima. El laboratorio debe ayudar al médico a realizar una selec­ ción racional del tratamiento proporcionando interpretaciones sugeridas de los resultados cuantitativos. Las recom endacio­ nes se relacionan con la respuesta esperada en suero y en los líquidos o tejidos corporales donde se acumulan las concen­ traciones similares al suero. El médico debe recordar que las concentraciones más altas de ciertos fármacos se acumulan en

determinados sitios, como orina o bilis; un microorganismo que es clasificado como “resistente” por los criterios para suero bien puede ser tratable si se encuentra en las vías uri­ narias bajas. Por ejemplo, una cepa de E. coli con una CIM de 32 |ig/m L para ampicilina sería considerada resistente en el suero en el cual se presentan concentraciones relativamente bajas del fármaco. Por el contrario, serían esperables concen­ traciones urinarias de ampicilina del orden de cientos de microgramos por mililitro; sería de prever que la utilización de la ampicilina en una infección urinaria baja tendría éxito, aun cuando la cepa sea intrínsecamente algo resistente. Si se acepta que la ampicilina es el antibiótico disponible menos costoso y menos tóxico, el médico debe decidir si el paciente tiene una infección que afecta el parénquima del riñón (pielo­ nefritis), caso en el cual la ampicilina sería inapropiada o si la infección se encuentra en la vejiga, y entonces la ampicilina bien puede ser eficaz contra este microorganismo resistente. Sin duda, la gravedad de la infección y la posibilidad de dañar al paciente por un cálculo equivocado también influyen sobre la decisión. Asimismo, una .cepa de E. coli con una CIM de 8 lig/mL para cefazolina sería considerada sensible en suero o la mayo­ ría de los tejidos. Sin embargo, la cefazolina penetra muy mal a través de las meninges y no se la debe utilizar para tratar a un paciente con meningitis, sin importar cuál sea la CIM. De hecho, si el aislamiento proviene de líquido cefalorraquídeo, el laboratorio no debe ni siquiera comunicar los resultados con este antibiótico.

934

CAPÍTULO 17

Cuadro 17-14

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Frecuencia de control de calidad para las pruebas de sensibilidad de los antibióticos

TIPO DE PRUEBA

ENFOQUE

FRECUENCIA

PRUEBAS DE VALIDACIÓN INICIALES

CRITERIOS PARA LA ACCIÓN CORRECTORA

COMENTARIOS

Difusión con discos o dilución

Control de calidad diario

Diaria

Ninguna

> 1 derivan en 20 pruebas consecutivas fuera de control

Conversión a pruebas sem ana­ les si < 2 de 20 o < 4 de 30 pruebas consecutivas para cada antibiótico está fuera de control

Difusión con discos o dilución

Semanal

Semanal o cuando existe un cam bio en un com ponente reac­ tivo (p. ej., un nuevo lote de discos o ban­ dejas) o del método

Evaluar todas las cepas con­ trol aplicables durante 20 o 30 días de prueba consecu­ tivos; se pueden implementar pruebas sem anales si < 2 de 20 o < 4 de 30 prue­ bas consecutivas para cada antibiótico están fuera de control

Cualquier resultado fuera de control

Si se agrega un nuevo antibió­ tico, debe ser validado. Sólo es apropiado realizar prue­ bas semanales para los anti­ bióticos evaluados de rutina. Los que son evaluados rara vez sólo deben evaluarse el día de su uso

Pruebas de evaluación en agar

Diario

Diaria

Ninguna

> 1 derivan en 20 pruebas consecutivas fuera de control

Las pruebas diarias deben rea­ lizarse si la prueba de detec­ ción se efectúa con una fre­ cuencia m enor de una vez por sem ana o si el antibióti­ co es lábil (p. ej.. prueba de detección de oxacilina para S. aureus)

Pruebas de evaluación en agar

Semanal

Semanal o cuando existe un cam bio en un com ponente reac­ tivo (p. ej„ nuevo lote de discos o ban­ dejas) o cam bio de método

Evaluar todas las cepas con­ trol aplicables durante 20 o 30 días de prueba consecuti­ vos; se pueden implementar pruebas semanales si < 2 de 20 o < 4 de 30 pruebas con­ secutivas para cada antibió­ tico están fuera de control

Cualquier resultado fuera de control

Si se agrega un nuevo agente antibiótico, debe ser valida­ do; sólo es apropiado reali­ zar pruebas semanales para los antibióticos evaluados de rutina; los que son evalua­ dos rara vez sólo deben eva­ luarse el día de su uso

Adaptado de las referencias219-220.

Cuadro 17-15

Acción correctora para las pruebas de antibióticos que están fuera de control

FUENTE DE ERROR

ACCIÓN CORRECTORA

ACCIÓN CORRECTORA ADICIONAL

Obvia (p. ej., cepa control equivoca­ da, tem peratura equivocada, conta­ minación)

Repetir la prueba el día que se observa la falla del control de calidad; continuarla si el nuevo resultado se ajusta al control

Proseguir com o se hace para un error desconocido

Desconocida

1. Evaluar el antibiótico que ha fallado durante cinco días consecutivos de prueba 2. Si todos los resultados están en control, prose­ guir con pruebas semanales 3. Si alguno de los resultados está fuera de con­ trol, proseguir con otras pruebas

1. Las posibles explicaciones para la falla continua se resum en en el cuadro 17-23 2. Después de im plem entar los posibles problemas (p. ej., nue­ vos reactivos), proseguir con las pruebas de validación 3. Continuar las pruebas diarias hasta que se resuelva el pro­ blem a

4. Suprim ir los informes de cualquier antibiótico que esté fuera de control hasta que se resuelva el problem a

4. Suprim ir los informes de cualquier agente antibiótico que esté fuera de control hasta que se resuelva el problem a

Adaptado de las referencias219-220.

Pruebas para determinar la actividad inhibitoria de los antibióticos

El NCCLS reconoce tres categorías de sensibilidad a los antibióticos para las pruebas de dilución (cuadro 17-16) (protocolos 17-2 y 17-3). Un microorganismo es “sensible” si res­ ponde a las dosis habituales del antibiótico administrado por una vía adecuada, que incluye la vía oral. Una sensibilidad intermedia” implica que la cepa puede ser inhibida por con­ centraciones del fármaco que se logran cuando se administran las dosis parenterales máximas; se puede seleccionar el anti­ biótico. pero se deben considerar otras opciones que pueden proporcionar un tratamiento más óptimo. Una bacteria es "resistente” si no es inhibida por las concentraciones del fár­ maco que se pueden alcanzar y, por lo tanto, el fármaco no debe ser seleccionado para el tratamiento, salvo en ciertos líquidos corporales, en los cuales pueden acumularse concen­ traciones altas del antibiótico. La cantidad de “errores graves y muy graves” -aquellos que invierten sensibles y resistentes- se debe mantener en el mínimo absoluto. Si el laboratorio realiza un antibiograma por difusión con discos, se debe comunicar el método estandarizado y las inter­ pretaciones sugeridas por el CLSI (cuadro 17-17) (protocolo 17-1).217'220 En ocasiones, un médico obtiene información útil de la proximidad del tamaño de la zona real en los valores crí­ ticos de la CIM, pero esta información pocas veces se notifica. Un laboratorio que realiza antibiogramas por dilución puede informar sólo la correlación interpretativa -e s decir, sensible, intermedia o resistente- o puede informar el valor de la CIM junto con la correlación interpretativa. Aunque en realidad cada vez más instituciones determinan la CIM se ha decidido infor­ mar sólo la interpretación debido a la posibilidad de que los médicos confundan el valor numérico. Los valores de CIM se reservan para los usuarios informados, como los especialistas en enfermedades infecciosas. Si se incluye en el informe la CIM, se debe instruir a los médicos sobre su propósito. A menudo los médicos deben tomar decisiones en forma empírica sobre el tratamiento antibiótico, porque la decisión no puede esperar el aislamiento de una bacteria y las pruebas de sensibilidad. Para tomar esas decisiones, es esencial el conoci­ miento de los patrones locales de sensibilidad. Es parte del deber de cada laboratorio de microbiología proporcionar esa información. El CLSI ha publicado recomendaciones para el formato de los informes de sensibilidad.216 En el cuadro 17-18 se da una reseña de parámetros seleccionados y el fundamento para su inclusión. En el recuadro 17-4 se sintetizan otros diver­ sos factores que vale la pena destacar. En el cuadro 17-19 se presenta una muestra del resumen anual de antibióticos de una institución, junto con las instruc­ ciones acompañantes. Si se dispone de una página web en un red local (“Intranet”) o un acceso compartido a archivos electrónicos, la publicación de informes través de ellos es una forma conveniente de comu­ nicación general. Los contenidos pueden descargarse en los asistentes personales de datos. Además, es útil proporcionar a los médicos una copia tangible; un formato práctico es una tar­ jeta de bolsillo para CD-Rom que permite su consulta rápida. Además de los datos locales existen varias bases de datos regionales y nacionales para rastrear los perfiles de sensibilidad a los antibióticos.116 Estos recursos también pueden ser valio­ sos, pero no pueden reemplazar a los datos locales. Lo que caracteriza a un verdadero microbiólogo, por oposi­ ción a un tecnócrata en microbiología, es la capacidad de sín­ tesis de datos de diversas fuentes y de realizar inferencias que pueden alertar a los trabajadores del laboratorio o los médicos sobre un posible problema con los datos. En el caso de las prue­ bas de sensibilidad a los antibióticos, la comparación de los

93 5

resultados con la identificación presuntiva del microorganismo puede alertar al microbiólogo sobre un posible problema con una pieza de información o con ambas. Algunos de estos indi­ cios se resumen en el cuadro 17-20. Además de los resultados erróneos de la sensibilidad o las identificaciones erróneas de los microorganismos, el examen inadvertido de cultivos mixtos es una causa frecuente de errores; es esencial la inclusión de una placa de “pureza” con la prueba de sensibilidad, pero la pureza aparente del aislamiento evaluado no es una garantía absoluta de pureza. Selección de los antibióticos para el informe Sólo se deben incluir en un informe los antibióticos apropia­ dos para la infección. No se deben informar los fármacos que sólo son activos en las vías urinarias si el aislamiento proviene de otro sitio. Los antibióticos que no penetran en el sitio, como cefazolina o cefalotina en las meninges, no deben ser informa­ dos para los microorganismos aislados en ese sitio. Es inade­ cuado el uso de cloranfenicol para las infecciones de las vías urinarias porque no se excreta por la orina; los microbiólogos no deben alentar el uso inadecuado al incluir los resultados de las pruebas de sensibilidad en un informe del laboratorio. Asimismo, las cepas de Streptococcus pneumoniae aisladas en líquido cefalorraquídeo (LCR) sólo deben evaluarse contra uno o más de los siguientes antibióticos: penicilina, cefotaxima, ceftriaxona, meropenem y vancomicina.218 Lamentablemente existen muy pocas de estas prohibiciones absolutas. La mayo­ ría de las decisiones se deben tomar en consulta con miembros del personal médico y la farmacia. Todos los hospitales acredi­ tados cuentan con comités de farmacia y terapéutica (o el equi­ valente) que proporcionan una forma útil para un esfuerzo coordinado. En el recuadro 17-5 se mencionan varias estrate­ gias razonables, que dependen de la política local, las necesi­ dades y los recursos. Antibiograma por macrodiluclón en caldo La prueba de sensibilidad en caldo por macrodilución fue una de las primeras en ser desarrolladas y sigue sirviendo como método de referencia. Se realizan varias diluciones del antibió­ tico en caldo o en agar, después de lo cual se agrega una sus­ pensión bacteriana estandarizada. En la figura 17-11 se mues­ tran 10 tubos de ensayo que contienen caldo de Mueller-Hinton con suplem ento de cationes. Se diluyen en form a seriada distintas cantidades del antibiótico desde 100 pg/m L hasta 0,4 pg/mL. El tubo número 10 no tiene el antibiótico y se uti­ liza como control del crecimiento. Se inocula cada uno de los 10 tubos con una suspensión calibrada del microorganismo por evaluar y se lo incuba a 35 °C durante 18 horas. Al final del período de incubación, se examinan visualmente los tubos para detectar turbidez. Obsérvese en la figura 17-11 que los cinco tubos de la izquierda están claros y los cinco de la derecha apa­ recen turbios. La turbidez indica que el crecimiento bacteriano no ha sido inhibido por la concentración del antibiótico conte­ nido en el medio. En la figura 17-12 se muestra que el valor crítico de inhibi­ ción del crecimiento de la figura 17-11 se encuentra entre los tubos 5 y 6, o entre 6,25 pg/mL y 3,12 pg/mL del antibiótico. Este valor crítico representa la CIM, definida como la concen­ tración más baja del antibiótico en microgramos por mililitro que impide el crecimiento in vitro de bacterias. Así, en el ejem­ plo que se muestra en las figuras 17-11 y 17-12, la CIM se ubica en algún lugar entre 6,25 pg/mL y 3,12 pg/mL. Sin

936

CAPÍTULO 17

Cuadro 17-16

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Estándares interpretativos para CIM (|ig/mL) para enterobacterias"

C O N D IC IO N E S D E L A PRU EBA M edio:

Dilución en caldo: caldo de M ueller-Hinton con ajuste de cationes (CAM HB) . Dilución en agar: agar de Mueller-Hinton (MHA)

Inóculo:

Método de cultivo o suspensión directa de las colonias, eq u iv a­ len te a u n e s tá n d a r de M c F a rla n d de 0,5

In cu b ació n :

35 °C; aire ambiente; 16 a 20 horas, 24 h o ra s p a r a Yersinia pestis

R ecom endaciones m ínim as del control de calid ad (véase cuadro 17-3 para los rangos aceptables de control de calidad) Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli ATCC 35218 (para combinaciones p-lactám ico/inhibidor de la p-lactamasa)

C o m en tario s generales 1) Para los aislamientos fecales de especies de Salmonella y Shigella, sólo se deben evaluar e inform ar de rutina ampicilina, una fluoroquinolona y trimetoprim-sulfam etoxazol. Además, se deben evaluar y com unicar cloranfenicol y una cefalosporina de tercera generación para los aislamientos extraintestinales de especies de Salmonella O BSERV A C IO N : la información en negrita se considera tentativa durante un año.

GRUPO DE EVALUACIÓN/ INFORM E PENICILINAS A B B B U U/Inv.

CIM (nG/mL) ESTÁNDAR INTERPRETATIVO A N TIBIÓTICO

Ampicilina Mezlocilina o piperacilina Ticarcilina Carbenicilina Mecilinam

COM ENTARIOS

2) Clase representativa de ampicilina y amoxicilina.

3) Para uso contra E. coli sólo para aislamientos en las vías urinarias.

COMBINACIONES p-LACTÁM ICO/INHIBIDOR B Amoxicilina-ácido < 8/4 clavulánico o B ampicilina-sulbactam B Piperacilina-tazobactam B Ticarcilina-ácido clavulánico CEFEM S (PARENTERALES) (Incluid; Por favor rem ítase al G losario I.

R, resistente; I, intermedio; S, sensible. “Los pedidos son para los documentos de CLSI.

ADVERTENCIA: para las especies de Salmonella y de Shigella, las cefalos­ porinas de primera y de segunda generación pueden parecer activas in vitro pero no son eficaces desde el punto de vista clínico y no deben ser comunica­ das como sensibles. ADVERTENCIA: p ara Yersinia pestis, algunos estudios han dem ostrado que aunque los antibióticos p-lactámicos pueden parecer activos in vitro carecen de eficacia en modelos animales de infección. Estos agentes anti­ bióticos no deben ser comunicados como sensibles. 6) Las cepas de especies de Klebsiella y E. coli que producen P-lactamasas de espectro ampliado pueden ser clínicamente resistentes al tratamiento con penicilinas, cefalosporinas o aztreonam, a pesar de la aparente sensibilidad in vitro a algunos de estos agentes. Algunas de estas cepas muestran una CIM por encima de la población sensible normal pero por debajo de los puntos de corte estándares para ciertas cefalosporinas de amplio espectro o aztreonam. Estas cepas deben ser evaluadas para la producción potencial de P-lactamasas de espectro ampliado utilizando los puntos de corte para el examen de estas P-lactamasas enumerados al final del cuadro antes de informar los resultados para penicilinas, cefalosporinas de amplio espectro o aztreonam. Otras cepas pueden dar intermedias o resistentes por los puntos de corte estándares a uno o más de estos agentes. En todas las cepas con p-lactamasas de espectro ampliado, las CIM para una o más de las cefalosporinas de amplio espectro o aztreonam deben disminuir en presencia de ácido clavulánico según se deter­ mina en las pruebas confirmatorias fenotípicas. Para todas las cepas produc­ toras de p-lactamasas de espectro ampliado, la interpretación de la prueba se debe comunicar como resistente para todas las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam. (Véase cuadro ubicado al final del cuadro para el examen de detección de p-lactamasas de espectro ampliado y pruebas confirmatorias. Remítase al glosario para las definiciones de las penicilinas y las cefalospori­ nas). La decisión de realizar pruebas de detección para p-lactamasas de espectro ampliado sobre todos los aislamientos urinarios se debe tomar sobre una base institucional, considerando las cuestiones de prevalencia, tratamien­ to y control de infecciones.

Pruebas para determinar la actividad inhibitoria de los antibióticos

Cuadro 17-17

937

Estándares interpretativos del diámetro de la zona y puntos de corte equivalentes de CIN para Enterobacteriaceae a

C O N D IC IO N E S D E LA PRUEBA M edio:

agar de M ueller-Hinton

Inoculo:

m étodo de cultivo o suspensión directa de las colonias, eq u iv a­ lente a u n e s tá n d a r de M c F a rla n d de 0,5

In cu b ació n :

35 °C; aire ambiente; 16 a 18 horas

R ecom endaciones m ínim as del control de calid ad (véase cuadro 17-3 para los rangos aceptables de control de calidad) Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli ATC C 35218 (para com binaciones p-lactám ico/inhibidor de la ¡3-lactamasa)

C o m en tario s generales 1 1 Para los aislamientos fecales de especies de Salmonella y Shigella, sólo se deben evaluar e inform ar de rutina ampicilina, una quinolona y trim etoprim -sul­ fametoxazol. Además, se deben evaluar y com unicar cloranfenicol y una cefalosporina de tercera generación para los aislamientos extraintestinales de espe­ cies de Salmonella. O BSERV A C IÓ N : la información en negrita se considera tentativa durani

GRUPO DE EVALUACIÓN/ INFORM E PENICILINAS A B B B U U

ANTIBIOTICO

Ampicilina Mezlocilina o piperacilina Ticarcilina Carbenicilina Mecilinam

PUNTOS DE CORTE EQUIVALENTES DE CIM (pG/mL)

DIAMETRO CONTENI- (MM C O M P E T I DO DEL DISCO R

> 17 >21 >21 > 20 >23 > 15

> > > > > >

32 128 128 128 64 32

<8 < 16 < 16 < 16 < 16 <8

LA p-LACTAMASA 14-17 < 13

> 18

> 32/16

<8/4

12-14 18-20 15-19

> 15 >21 >20

> 32/16 > 128/4 > 128/2

< 8/4 < 16/4 < 16/2

10 p g 75 pg 100 pg 75 p g 100 pg 10 p g

COMBINACIONES p-LACTÁM ICO/INHIBIDOR DE Amoxicilina-ácido clavulá­ 20/10 pg B nico 0 ampicilina-sulbactam 10/10 pg B Piperacilina-tazobactam 100/10 pg B Ticarcilina-ácido clavulá75/10 pg B

COMENTARIOS

< 11 < 17 < 14

2) Clase representativa de ampicilina y amoxicilina

3) Para uso contra E. coli sólo para aislamientos en las vías urinarias

R, resistente; 1,' intermedio; S, sensible. "Los pedidos son para los documentos de CLSI.

embargo, por convención, la CIM se interpreta como la con­ centración del antibiótico, contenido en el primer tubo en la serie, que inhibe el crecimiento visible. Por lo tanto, en este ejemplo, la CIM es de 6,25 |ag/mL. En una sección ulterior se describe la adaptación de esta prueba a pequeños volúmenes para las pruebas de rutina. Antibiograma por dilución en agar El procedimiento por dilución en agar, que es el segundo método de referencia, ha sido adaptado con éxito para el uso de rutina en laboratorios grandes y evalúa sólo concentraciones seleccionadas del antibiótico. Se inocula una suspensión estan­ darizada de bacterias en una serie de placas de agar, cada una de las cuales contiene una concentración diferente del antibió­ tico. que abarca el intervalo terapéutico del fármaco. Por ejem­ plo, si el intervalo terapéutico para un antibiótico dado es 2 a 12 |ig/mL. se podría utilizar una serie de placas de agar que

contuvieran 4, 8, 16 y 32 ¡ig/mL del antibiótico para determi­ nar la sensibilidad del microorganismo que se va a evaluar. Si el microorganismo crece en las tres primeras placas, pero no en la placa que contiene 16 |ig/mL del antibiótico, se puede esta­ blecer un valor de CIM de 16 Ug/mL, similar a la interpretación del parámetro en la técnica por dilución en caldo. En la figura 17-13 se muestran placas de dilución en agar lis­ tas para su interpretación. Obsérvese que los microorganismos que son sensibles a la concentración del antibiótico contenido en cualquier placa de agar dada no producen un círculo de cre­ cimiento en el sitio del inoculo, mientras que aquellas que son resistentes aparecen como colonias circulares. Las placas de agar se marcan con una cuadrícula para que cada microorga­ nismo pueda ser identificado con un número y los resultados ingresados en la hoja de trabajo. Para facilitar el examen de gran cantidad de cultivos, se uti­ liza un instrumento conocido como replicador Steers (fig. 1714). La principal característica de este instrumento es un cabe-

938

CAPÍTULO 17

Cuadro 17-18

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Recomendaciones para la producción de resúmenes institucionales de sensibilidad a los antibióticos

PARÁM ETRO

A C C IÓ N R E C O M EN D A D A

JU S T IF IC A C IÓ N

Institución

Datos separados para cada centro que sirve el laboratorio; indicar el nombre de la institu­ ción en el informe

En un sistem a que incluye m últiples instituciones los resultados pue­ den variar m ucho entre las unidades

Frecuencia

Al m enos anualmente; indicar el m arco tem ­ poral en el inform e

Aum enta la probabilidad de que se incluya una cantidad suficiente de cepas; evita la posible variación estacional en la resistencia

Pruebas duplicadas

Incluir sólo el primer aislamiento (véase el recuadro 17-4 para una explicación de la definición de duplicado)

Los cultivos frecuentes de pacientes problem áticos pueden conducir a una hiperrepresentación de estas cepas en estos datos

Origen de las cepas

Incluir sólo los aislamientos rem itidos con fines diagnósticos

Es posible que los aislamientos rem itidos como parte de un protocolo no sean representativos; es posible que las cepas aisladas en el m edioam biente no tengan im portancia clínica

Cantidad de aislamientos

Incluir sólo las especies bacterianas para las cuales se evaluaron al m enos 10 cepas; resultados basados sobre los números inter­ m edios (p. ej., < 25 o < 50 cepas pueden estar indicados con un asterisco)

Es posible que una cantidad menor de cepas no den resultados clíni­ cam ente significativos

Antibióticos que se com unican de form a selectiva por el m étodo de la “cascada”

Incluir todos los resultados en el resum en, no sólo los que fueron comunicados

La exclusión de antibióticos no comunicados puede introducir un sesgo

Antibióticos que son evaluados o com unicados de form a selectiva (véase recuadro 17-4)

No incluir los resultados en el resum en (o indicar los resultados de las pruebas)

La naturaleza no aleatoria de las pruebas puede introducir un sesgo en los resultados

Interpretaciones “calculadas”

Incluir el resultado de relevancia clínica

Resultados que son m odificados por el protocolo; p. ej., estafilococos y antibióticos p-lactám icos sobre la base de los resultados de la oxacilina; o modificación de los resultados P-lactamámicos para los productores de p-lactam asas de espectro ampliado

Análisis com plem entarios (véase el texto)

Incluir los factores adicionales

D ecisiones basadas sobre parám etros y necesidades locales

Adaptado de la referencia2'6.

zal con mecanismo de resorte provisto de 32 a 36 puntas de inoculación de superficie plana, cada una de unos 3 mm de diá­ metro. El cabezal está unido a un pistón y a un cilindro con resorte por medio del cual se puede mover hacia arriba y abajo en un plano vertical. La contraparte es una placa de siembra de aluminio que contiene 32 a 36 pocilios. Estos pocilios están equipados de forma tal que cuando la placa de siembra está ali­ neada correctamente dentro de la guía en la base del replicador, cada una de las puntas de inoculación sobre el cabezal móvil se ajusta exactamente a los pocilios. Cada celda de la placa pro­ porciona un receptáculo en el cual se pueden colocar diferentes suspensiones bacterianas. La placa de sensibilidad por dilución en agar se inocula colo­ cando una bandeja de siembra con sus diversas suspensiones directamente debajo del cabezal de inoculación. Se desciende la cabeza de modo que las puntas se extiendan por completo en el interior de cada pocilio y así se toman muestras de unos 0,003 mL de cada suspensión bacteriana sobre la superficie de cada punta de inoculación. A continuación, se eleva la cabeza y se mueve una placa de agar ubicada debajo de las puntas, las cuales a su vez se descienden de modo que la superficie plana de cada punta de inoculación toque la superficie del agar. Se eleva nuevamente la cabeza y se hace retroceder la placa de siembra en posición para la inoculación de la siguiente placa de agar. Se repite el procedimiento para evaluar todas las placas del antibiótico. Una vez inoculadas todas las placas, se las incuba a 35 °C durante 18 horas.

Antibiograma por difusión con discos En la figura 17-15 se muestra el principio básico del método de difusión con discos para examen de la sensibilidad a los an­ tibióticos.10 Tan pronto como el disco impregnado en el anti­ biótico entra en contacto con la superficie de agar húmeda, se absorbe agua en el papel de filtro y el antibiótico se difunde en el medio circundante. La velocidad de extracción del antibióti­ co del disco es mayor que su difusión hacia afuera en el medio, de modo que la concentración inmediatamente adyacente al disco puede exceder la del disco propiamente dicho. Sin embargo, a medida que aumenta la distancia desde el disco, existe una reducción logarítmica en la concentración del anti­ biótico. Si la placa ha sido inoculada antes con una suspensión bacteriana, el crecimiento simultáneo de las bacterias ocurre sobre la superficie del agar. Cuando se alcanza una masa celu­ lar crítica de bacterias, se supera la actividad inhibidora del antibiótico y las bacterias proliferan. El tiempo necesario para alcanzar la masa celular crítica (tiempo crítico; 4 a 10 horas para las bacterias evaluadas comúnmente) es característico de cada especie, pero está influido por la composición del medio y la temperatura de la incubación. La extensión lateral de la difusión del antibiótico antes de que se alcance el tiempo críti­ co se verá afectada por la profundidad del agar porque la difu­ sión ocurre en tres dimensiones. Los puntos en los cuales se alcanza la masa celular crítica aparecen como un círculo bien demarcado de crecimiento bacteriano, con el centro del disco

Pruebas para determinar la actividad inhibitoria de los antibióticos

Recuadro 17-4

93 9

Recomendaciones para el form ato de los resúm enes de las pruebas de sensibilidad a los a ntibióticos

1. Las partes interesadas en cada institución deben decidir cómo desean presentar los datos. Es posible que algunos sistem as de inform ación del laboratorio o institucionales no puedan cum plir todas las recomendaciones. 2. Se deben excluir claram ente los resultados duplicados, de m odo de no sesgar los resultados hacia pacientes en los cuales los cultivos se realizan más a menudo. Sin embargo, la definición de "duplicado" es pasible de varias interpretaciones. Por ejem plo, el NCCLS recom ienda incluir en el análisis sólo el primer aislamiento de una bacteria particular de un paciente particular en un período dado (p. ej.. 1 año), independientemente de las otras características de los aislamientos. Será casi imposible para la m ayoría de las instituciones rastrear la condición duplicada durante un año. Lo que es más im portante, esta recom endación excluiría la visualización de m últiples cepas de patógenos im portantes que circulan simultáneam ente en una institución y por cierto dism i­ nuiría la probabilidad de detectar el brote de una infección resistente que com ienza a propagarse. 3. Se deben excluir los antibióticos que son evaluados y comunicados selectivamente, porque no han sido evaluados en form a aleatoria. Por ejem plo, si se eva­ lúa una cefalosporina de tercera generación sólo contra cepas de S. pneum oniae que no son sensibles a la penicilina, utilizando un exam en con disco de oxa­ cilina. los resultados no serán representativos de todos los neum ococos de la institución; en este caso, los resultados pueden ser ajustados aceptando que todos los neum ococos que son claram ente sensibles a la penicilina por el exam en con discos tam bién son sensibles a la cefalosporina de tercera generación. Por el contrario, si se evalúan las cepas de H. influenzae contra ampicilina sólo si no producen fi-lactamasa, los resultados serán sesgados hacia la sensibili­ dad de los aislamientos restantes a la ampicilina. En algunos casos, las solicitudes específicas de pruebas de sensibilidad pueden indicar un sesgo hacia la resistencia. 4. El análisis suplementario puede ser apropiado en varias situaciones clínicas o microbiológicas: a. Aunque se recom ienda no incluir la categoría “intermedia" para la m ayoría de las com binaciones, es conveniente com unicar esta categoría para 5. p n eu ­ moniae y para estreptococos viridans aislados de sitios estériles. b. Para la m ayoría de las com binaciones la interpretación com unicada se basa sobre las concentraciones de los antibióticos alcanzables en suero. Sin em bar­ go. en el caso de S. pneumoniae, se recom ienda com unicar los datos para cefotaxim a y ceftriaxona (y para cefipim a en los países donde existe una indi­ cación para el uso del antibiótico tanto en m eningitis com o en no meningitis) utilizando los puntos de corte interpretativos para los aislamientos de san­ gre y de LCR. c. Los resultados para el estafilococo coagulasa positivo, S. aureus. pueden ser analizados por separado para los aislamientos que son sensibles y resistentes a la oxacilina. Los patrones generales para estos dos grupos son muy diferentes y se pueden perder por la fusión de los datos. d. Si la cantidad de aislamientos lo permite, puede ser útil diferenciar las poblaciones de pacientes (internados frente a ambulatorios, unidades de cuidados intensivos, niños frente a adultos), los sitios corporales (aparato urinario, aparato respiratorio, sangre, etc.), el origen de la infección (intrahospitalario o extrahospitalario) o situaciones clínicas específicas en las cuales existen problem as especiales (fibrosis quística).

formando el centro del círculo si la prueba se ha realizado de manera correcta (fig. 17-16). La concentración del antibiótico difundido en esta interfaz de crecimiento y las bacterias inhibi­ das se conoce como la concentración crítica y se aproxima a la CIM obtenida en las pruebas de dilución. Aunque no se realiza en la práctica el cálculo directo de la concentración inhibitoria, la CIM se calcula en realidad con una exactitud razonable si se conocen las características de la difusión del antibiótico y el crecimiento bacteriano.10 DESARROLLO DE UN PROCEDIMIENTO ESTANDARIZADO PARA PRUEBAS DE DIFUSIÓN CON DISCOS Para finales de la década de 1950, el estado de los antibiogramas en los laboratorios de microbiología de todo el mundo era caótico debido a la falta de un procedimiento estándar ade­ cuado. Las concentraciones de los antibióticos en los discos variaban de manera considerable, se utilizaba una amplia varie­ dad de medios, los métodos de inoculación diferían de un labo­ ratorio a otro, la duración del tiempo de incubación no era uni­ forme y los resultados eran interpretados según varios criterios. Se formó un comité de la Organización Mundial de la Salud para investigar este problema y la deliberación de este comité proporcionó el trabajo basal que condujo al desarrollo de varios procedimientos estándares (protocolo 17-1).' La prueba que se ha convertido en el estándar en los Estados Unidos se basa sobre el trabajo de Bauer, Kirby y cois.1314 Si la prueba se realiza en forma correcta, los bordes de la zona de inhibición deben ser claros y fáciles de medir. En el recuadro 17-6 se enumeran las situaciones en las cuales el téc­ nico debe aprender a interpretar los resultados poco claros.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS El tamaño de la zona observada en un antibiograma por difu­ sión con discos no tiene significado por sí solo. Los estándares de interpretación provistos por el CLSI se obtienen a partir de una correlación entre los tamaños de la zona y las CIM de la especie que pueden ser evaluados mediante el método de difu­ sión con discos. En la figura 17-21 se muestra un prototipo de una curva de regresión que proporciona dicha correlación. Cada triángulo representa los resultados de ambas pruebas para una sola cepa. Se ha dibujado una línea de regresión a través de muchos puntos individuales. Una vez establecida la línea de re­ gresión, se puede inferir un resultado aproximado de la CIM a partir del diámetro de cualquier zona. En este ejemplo, el tama­ ño de una zona de 18 mm corresponde a una CIM de 6,25 |ag/mL, el valor crítico de la prueba de dilución en caldo que se muestra en la figura 17-11. Por lo tanto, un antibiótico que produce una zona de diáme­ tro mayor de 18 mm en teoría tendría una CIM de menos de 6,25 (ig/mL y el microorganismo sería considerado sensible; uno que produjera una zona de tamaño inferior a 18 mm, por el contrario, sería considerado resistente. En la práctica real, las curvas de regresión no están definidas con tanta claridad y se puede establecer una zona de 2 a 4 mm donde no es posible determinar si el microorganismo es sensible o resistente (véase cuadro 17-17). Los aislamientos que producen una zo­ na de inhibición en este intervalo son caracterizados como de sensibilidad intermedia. En los estudios llevados a cabo a finales de la década de 1950. Bauer, Perry y Kirby demostra­ ron por primera vez que las cepas bacterianas evaluadas con­ tra un antibiótico dado tienden a caer en las categorías de resistentes o sensibles; sólo un pequeño porcentaje (5% o

940 CAPÍTULO

Planilla de informe resumido de sensibilidad a los antibióticos

17

C u ad ro 1 7 -1 9

ESPECIES DE ESCHERICH1A Máximo de cepas evaluadas

3 497

ESPECIES ESPECIES DE ENTERO­ DE PROTEUS BACTER KLEBSIELLA MIRABILIS 312

748

269

ESPECIES DE PROTEUS

ESPECIES DE SERRATIA

ESPECIES DE ACINETOBACTER

CITROBACTER FREUND1!

C1TROBACTER KOSER1

PSEUDO­ MONAS AERUGINOSA

STAPHYLO­ COCCUS COAGULASA POSITIVOS

STAPHYLO­ COCCUS COAGULASA NEGATIVOS

ENTERO­ COCCUS‘

STREPTO­ COCCUS PNEUMONIAE

106

107

45

89

24

1 333

2 174

894

1 234

148

*

94

-

% de sensibles

1

Ampicilina

71

1

1

93

14

11

7"

ll6

O4

4

Ampicilina-sulbactam

78

23

75

100"

54"

20

100"

50"

60*

-

-

-

-

-

Ampicilina

-

-

-

-

-

-

-

-

-

89

-

-

-

-

Amikacina

99+

99

99+

99+

100

97"

100"

100

100*

71

-

-

-

Aztreonam

99

82

99

99

94

100"

11"

67

100*

80

-

-

-

Ceftazidima

99

82

98

99+

92

96

97"

65

100*

17

-

-

-

-

Cefotaxima

99+

85

100

99+

97

96b

80"

74

100*

21

-

-

-

-

Ceftriaxona

98

75

100

100

90"

97

31"

-

-

-

-

-

-

-

Clindamicina

-

-

-

-

-

-

-

-

-

68

54

37

-

-

Ciprofloxacina

99

92

95

99

100"

95

100*

1

66

51

-

-

1 !

98

95

Cefotetán

97

61

98

96

100"

99

3"

57*

100*

0

-

-

-

-

Cefazolina

97

7

95

97

15

0

0"

2

100*

0

67

34

-

-

Cefalotina'7

89

1

84

97*

0

0

0"

14»

60*

5

67

34

-

-

Cotrimoxazol

87

93

93

84

83

98

93"

86

100*

-

-

-

-

-

Eritromicina

-

-

-

-

-

-

-

-

-

75

54

37

-

-

Gentamicina

98

97

98

95

96

98

98"

98

100*

78

-

-

-

-

Imipenem

100

100

100

99+

96

99

o

100

100*

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Meropenem

(Continúa)

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS EVALUADA DESDE EL 1 DE JULIO DE 2003 HASTA EL 30 DE JUNIO DE 2004

Cuadro 17-19

Planilla de informe resumido de sensibilidad a los antibióticos (cont.) SENSIBILIDAD A LOS A N TIBIÓ TICO S EVALUADA DESDE E L 1 DE JU L IO DE 2003 HASTA EL 30 DE JU N IO DE 2004

ESPECIES DE ESCHER1CH1A

ESPECIES ESPECIES DE ENTERODE PROTEUS BACTER KLEBSIELLA MIRABILIS

Oxacilina-nafcilina

-

-

Oxacilina-nafcilina

—

-

-

Piperacilina

74

79

92

ESPECIES DE PROTEUS

97

90

ESPECIES DE SERRATIA

94

ESPECIES DE ACINETOBACTER

75"

Piperacilina 97

62"

Piperacilina-tazobactam

-

Tobramicina

99

99

Vancomicina

-

_

Penicilina

-

-

Ceftriaxona (criterios de

-

_

100/'

-

98 _

96 _

-

_

-

100 _

-

_

-

96 _

-

_

100"

100" _

-

_

_

STREPTO­ COCCUS PNEUMONIAE

CITROBACTER KOSERl

PSEUDO­ MONAS AERUGINOSA

STAPHYLO­ COCCUS COAGULASA POSITIVOS

~

~

-

67

-

~

~

~

~

~

-

34

~

~

67

95"

~

-

-

~

~

-

-

90

-

-

~

~

-

-

-

-

-

-

~

-

-

84

-

-

-

-

100

100"

87

-

-

-

~

-

-

-

100

100

97

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

~ 76% sensibles; 14% intermedios

-

ND

LCR) Ceftriaxona (criterios de suero)

ND

-

Sólo para infecciones urinarias Nitrofurantoína

99

67

68

1

19

0a

0"

96

94"

“Para infecciones enterocócicas graves debe utilizarse terapia de combinación con un (i-lactamámico y un aminoglucósido. " < 50 cepas evaluadas. c > 90% de las especies de Staphylococcus son resistentes a la penicilina y la ampicilina. d Cefalotina debe ser utilizada como el fármaco de clase para determinar sensibilidad a las cefalosporinas orales de primera generación. e 69 cepas neumocócicas evaluadas contra ceftriaxona; sólo cepas NO sensibles a penicilina en un procedimiento de detección evaluado contra ceftriaxona. ND, no disponible.

1

100

99+

98

-

Pruebas para determinar la actividad inhibitoria de los antibióticos

Piperacilina-tazobactam

STAPHYLO­ COCCUS COAGULASA ENTERO­ NEGATIVOS COCCUS

CITROBACTER FREUNDU

CD

942

CAPÍTULO 17

Cuadro 17-20

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Datos que sugieren la necesidad de verificar el perfil de sensibilidad a los antibióticos o la identificación del aislamiento bacteriano11

MICROORGANISMO

FENOTIPOS QUE SON RAROS O PUEDEN SER EL RESULTADO DE ERRORES TÉCNICOS

Enterobacterias (cualquiera)

I o R a carbapeném icos

Citrobacter freundii Especies de Enterobacter Serratia marcescens

S a ampicilina, cefazolina o cefalotina

Proteus vulgaris Especies de Providencia

S a ampicilina

FENOTIPOS QUE PUEDEN SER RAROS EN CIERTAS INSTITUCIONES R a am ikacina o fluoroquinolonas

Pseudomonas aeruginosa

R a gentam icina, tobram icina y am ikacina simultáneam ente

Stenotrophom onas maltophilia

S a carbapenémicos

Proteus mirabilis

S a nitrofurantoína

Enterococcus faecalis

R a penicilina o ampicilina; S a quinupristina-dalfopristina; R a linezolida

R a am inoglucósidos de alto nivel (sitios corporales estériles)

Enterococcus faecium

R a linezolida

R a aminoglucósidos de alto nivel (sitios corporales estériles); R a quinupristina-dalfopristina

Staphylococcus aureus

I o R a linezolida; I o R a quinupristina-dalfopristina; I o R a vancomicina

R a oxacilina

Staphylococcus, coagulasa negativo

I o R a linezolida; I o R a vancom icina

Streptococcus pneum oniae

R a fluoroquinolona; I o R a linezolida; I o R a van­ comicina

R a penicilina; R a cefalosporinas de tercera generación

Streptococcus, grupo viridans

I o R a linezolida; I o R a vancomicina

I o R a penicilina

Streptococcus, p-hem olítico

I o R a penicilina o am picilina; I 0 R a las cefalos­ porinas de tercera generación; I o R a linezolida; I o R a vancomicina

Cualquier microorganism o

Resistente a todos los agentes evaluados

R a trim etoprim -sulfametoxazol

Todas estas situaciones están sometidas a cambio a medida que se desarrollan y extienden los nuevos mecanismos de resistencia a los antibióticos. Adaptado de las referencias2'7-2'8. R, resistente; I, intermedio; S, sensible.

menos) caen en el intervalo de sensibilidad intermedia.14 Por lo tanto, si un laboratorio tiene un alto porcentaje de comuni­ caciones con resultados intermedios, está indicado revaluar el procedimiento. Las pautas de interpretación de las pruebas de difusión en disco (véase cuadro 17-18) permiten al usuario determinar valores aproximados de la CIM para cada uno de los antibióti­ cos enumerados (últimas dos columnas), con diámetros de las zonas determinados mediante la técnica de difusión en disco. Estas correlaciones no están destinadas a equipararse con los valores críticos para la sensibilidad y la resistencia establecidos mediante las pruebas de dilución, pero brindan una apreciación del significado del informe. Por ejemplo, un microorganismo que muestra una zona de 11 mm de inhibición contra ampici­ lina sería considerado resistente con una concentración mayor de 32 |xg/mL. Sin embargo, si la infección se encuentra en las vías uri­ narias bajas, se logran concentraciones muy altas de am pici­ lina y el microorganism o podría ser tratable incluso en pre­ sencia de un resultado de aparente resistencia. Puede ser necesaria una prueba de dilución para obtener un resultado más preciso.

CONTROL DE CALIDAD El control de calidad se debe efectuar cada vez que se utili­ za un nuevo lote de discos o agar. En el ínterin, se deben eva­ luar los controles cada día que se realiza un procedimiento a menos que se cumplan criterios estrictos para las evaluaciones semanales. El CLSI ha establecido límites sobre los tamaños de las zonas que son aceptables para las cepas de control de cali­ dad (cuadro 17-21); estos límites proporcionan un medio por el cual se mide la exactitud de la prueba. LIMITACIONES La prueba de Bauer-Kirby, modificada por el CLSI, ha sido aceptada en los Estados Unidos como la técnica estándar para realizar las pruebas de sensibilidad por difusión con discos y ofrece información útil en la mayoría de los casos. Sin embar­ go, existen algunas limitaciones definidas. La prueba sólo se debe aplicar a especies bacterianas que han sido cuidadosamen­ te evaluadas. Las bacterias que crecen en forma lenta, que nece­ sitan nutrientes especiales o que requieren C 0 2 o condiciones anaerobias para el crecimiento no deben ser evaluadas, a menos que se haya documentado la validez del procedimiento.144

Pruebas para determinar la actividad inhibitoria de los antibióticos

Recuadro 17-5

943

E le c c ió n de lo s a n tib ió tic o s q u e s e d e b e n c o m u n ic a r

1. Si el uso de los agentes más costosos o tóxicos está controlado por el personal de la farm acia o los m édicos consultores, el laboratorio puede com unicar los resultados de todos los fárm acos evaluados. El control sobre el uso inapropiado llega en el m om ento en que se ordena el fár­ maco. 2. El laboratorio puede com unicar los resultados de los antibióticos más adecuados y com unicar otros fárm acos sólo si existe resistencia a un agente preferido o si un m édico solicita específicamente el resultado. Por ejem plo, los resultados de la sensibilidad para las cefalosporinas de tercera generación sólo se com unican si el aislam iento es resistente a los antibióticos de prim era generación. 3. Si los recursos son limitados, se pueden evaluar los antibióticos más adecuados y se los com unica en primer lugar, seguidos de otros anti­ bióticos si el m édico lo solicita. El personal m édico debe mantenerse inform ado de los antibióticos adicionales que no son evaluados de ruti­ na. pero que se encuentran en el laboratorio para su evaluación. 4. Algunos laboratorios publican el costo del antibiótico además del resultado de la sensibilidad. El motivo para esta política es obvio, pero no se ha docum entado la eficacia de m ostrar los costos. La reiteración perm anente de datos de costos podría lograr que el m édico revisor los tenga presentes, pero tam bién podría propiciar que se desatienda la información. 5. La decisión acerca de cuál costo se debe incluir en la com unicación no es clara: ¿costo para la farmacia?, ¿costos para el paciente?, ¿por dosis? ¿por día? ¿Se deben incluir los gastos auxiliares com o la adm inistra­ ción y las pruebas de laboratorio para la m onitorización? Los gastos sobre costos pueden parecer muy diferentes según el enfoque adoptado.

Antibiograma por microdilución en caldo Junto con el desarrollo de una prueba útil de difusión con discos, otros investigadores intentaron simplificar la prueba de dilución en caldo. El procedimiento de microdilución en caldo es similar en principio al método del macrodilución, salvo en que la sensibilidad a los antibióticos se determina en una serie de pocilios microtubulares moldeados en una placa de plástico. Cada placa puede contener 80, 96 o más pocilios, según la can­ tidad y la concentración de los antibióticos que van a ser inclui­ dos en el panel de pruebas de sensibilidad.

Figura 17-12 Dibujo de líneas de la prueba de sensibilidad por dilución en caldo que se muestra en la figura 17-11. La CIM para la prueba que se muestra aquí es de 6,25 jig/mL.

Figura 17-11 Ilustración de prueba de sensibilidad a los antibióticos por dilución en caldo en la cual se diluye en form a seriada el antibiótico por exa­ m inar en un intervalo entre 100 Ug/mL y 0,4 (ig/mL. El tubo número 10 sirve com o control positivo.

Las ventajas del método de microtubos son que se utilizan pequeños volúmenes de reactivo y que se pueden evaluar gran­ des cantidades de bacterias en forma simple y económica con­ tra un panel de antibióticos (protocolo 17-2). El intenso traba­ jo que supone la preparación de placas con múltiples pocilios fue un impedimento importante para su uso sistemático. Una gran ventaja de las pruebas por microdilución en caldo provino del desarrollo de instrumentos que distribuían alícuo­ tas exactamente reproducibles de tubos en los cuales se habían preparado grandes volúmenes del antibiótico. Se combinó la precisión de la dilución en grandes volúmenes con la facilidad de la prueba en placas de microtítulos. El instrumento Autospense® (Sandy Spring Technologies, Gaithersburg, MD) (antes Quickspense®) se puede conseguir en el comercio y se utiliza en algunos laboratorios de hospitales. Si se cuenta con los recursos, la producción local de placas permite el uso de un panel ajustado de antibióticos; los usuarios pueden cambiar el panel a voluntad. En la figura 17-22 se muestra una primera versión del instrumento Quickspense. Se preparan las dilucio­ nes en grandes volúmenes, luego de lo cual el líquido se dis­

944

CAPÍTULO 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Figura 17-13 Placas de sensibilidad a los antibióticos por dilución en agar que han sido inoculadas con varias especies de bacterias de un replicador de Steers. Los m icroorganism os sen­ sibles son inhibidos por una concentración de antibiótico con­ tenida en la placa y no se aprecia ningún crecim iento en los puntos de inoculación; los m icroorganismos resistentes apare­ cen com o colonias definidas de crecim iento bacteriano.

pensa en forma automática en las bandejas de microtítulos. Después de completar la preparación de las diluciones, se pue­ den distribuir rápidamente las soluciones de los antibióticos en gran cantidad de placas. Estos instrumentos combinan la preci­ sión de la preparación de diluciones en grandes volúmenes con la conveniencia y la economía de los sistemas de microtítulos. Las placas que contienen antibióticos deben ser congeladas a -2 0 °C o menos hasta su utilización. Las placas preparadas y congeladas se pueden obtener de varias fuentes comerciales. El almacenamiento de gran cantidad de microplacas congeladas puede ser difícil en algunos laboratorios. En este caso, se pue­ den adquirir placas que contienen antibióticos liofilizados, el equivalente de laboratorio del café instantáneo. La rehidratación de las celdas agrega otro paso al procedimiento, pero la vida de estante ampliada de las placas desecadas por congela­ miento es útil, sobre todo para los laboratorios en los cuales se realizan pequeñas cantidades de pruebas. Tanto los sistemas por dilución en caldo congelados como liofilizados, han rendi­ do bien en comparación con los métodos de referencia.99,250-280 Como podría esperarse, la reproducibilidad entre los laborato­

rios de los sistemas comerciales que utilizan lotes estandariza­ dos de volumen muy grande ha sido mayor que la de las placas locales, aun cuando las placas fueran preparadas para uso expe­ rimental.99 Algunos de los sistemas comerciales no han rendi­ do bien en ciertas situaciones especiales, como se explica más adelante. Las pautas de interpretación sugeridas por el CLSI, que deben ser comunicadas junto con los valores reales de las CIM o en lugar de ellos, se mencionan en el cuadro 17-16. El CLSI ha publicado pautas separadas para la interpretación de las especies de H aem ophilus, Streptococcu s pn eu m oniae y N eisseria gonorrhoeae. Las pautas para el control de calidad son similares a aquellas para la prueba por difusión con discos (cuadro 17-22). En general, los parámetros se definen con facilidad (fig. 1723). El examen de microplacas se ve facilitado por el uso de un espejo visualizador (fig. 17-24). En ocasiones, se puede inhibir el crecimiento en un pocilio adyacente a otros con crecimiento no inhibido (pocilio omitido). Si se omite un solo pocilio y no se afecta el resultado, el omitido puede ignorarse. Si se omiten

Figura 17-14 Replicador de Steers: el cabezal de inoculación y las puntas están fijas. U na bandeja deslizante coloca alternativamente un molde que con­ tiene el inóculo y una placa de agar debajo del cabezal. Las partes pueden ser desarm adas para la esterilización en autoclave.

Figura 17-15 Principio de la difusión del antibiótico en el agar. La concen­ tración del antibiótico dism inuye a m edida que aum enta la distancia desde el disco.

Pruebas para determinar la actividad inhibitoria de los antibióticos

945

múltiples pocilios, si el omitido ocurre con una dilución que es fundamental para determinar la sensibilidad del aislamiento o si múltiples aislamientos demuestran el fenómeno, se debe investigar el problema y repetir la prueba. Los resultados de las pruebas del control de calidad pueden dar indicios sobre la naturaleza del problema. Ciertos errores son particularmente frecuentes. Algunos de los posibles pro­ blemas y explicaciones se resumen en el cuadro 17-23. El CLSI ha proporcionado pautas para el examen en situaciones clínicas especiales, que se muestran en el cuadro 17-24. Sistemas comerciales VITEK® (BIOMÉRIEUX VITEK, HAZELWOOD, MO) Y MICROSCAN® (DADE INTERNATIONAL, WEST SACRAMENTO, CA) El instrumento Vitek utiliza un análisis computarizado del crecimiento en tarjetas plásticas para calcular una CIM. En al­ gunos casos, el cálculo de la CIM depende de la identificación bacteriana. La exactitud adicional provista por la correlación compútarizada del patrón de crecimiento y la identificación es contrabalanceada por la incertidumbre acerca del resultado de la sensibilidad si no se conoce aún la identificación o si el sis­ tema no puede proporcionarla con una certeza suficiente. Los productos MicroScan se basan sobre los métodos de CIM tradicionales. La línea recorre toda la gama de las placas -congeladas o liofilizadas- que son interpretadas manualmen­ te en un extremo hasta un instrumento semiautomático, el “Walkaway®” en el otro. Se incorporan reactivos bioquímicos para la identificación de las bacterias en las mismas placas de microtúbulos. Se utiliza la incubación tradicional durante toda la noche para la mayoría de los productos MicroScan. Sin embargo, el sistema Walkaway incorpora un método de detec­ ción por fluorescencia que proporciona una identificación y pruebas de sensibilidad en el mismo día para algunos microor­ ganismos. Existen otros distintos sistemas semiautomáticos, así como varias elecciones para adquirir placas de microdilu­ ción comerciales, congeladas o liofilizadas. En general, los sis­ temas funcionan bien. Los dos sistemas principales general­ mente han rendido bien en comparación contra los métodos de referencia,175 179,250 aunque se observó un número problemático de errores menores en un informe.297 Además, el instrumento Vitek resultó tan preciso como el método de dilución cuando se realizaron pruebas de sensibilidad directas en el material extra­ ído de frascos de hemocultivos positivos.258 De vez en cuando se comunican problemas con cada uno de estos sistemas. Las fórmulas o los sistemas que producen los resultados más rápidos parecen ser más propensos al error. Como ejemplo de los problemas actuales, el instrumento Vitek produjo más errores de los esperados cuando se evaluaron ais­ lamientos de Pseudomonas aeruginosa en pacientes con fibro­ sis quística143 y cuando una especie fue evaluada contra carbapenémicos (imipenem y meropenem).295 La historia indica que todas las compañías controlan estos informes con cuidado y más rápidamente para tratar los problemas. El control de calidad de los resultados automatizados ha sido difícil y en gran parte poco satisfactorio. Para la mayoría de las combinaciones fármacos-microorganismo, las cepas de control estándares producen resultados que están en los extremos del parámetro medido y no se pueden cuantificar con precisión.161 PRUEBA DEL EPSILÓMETRO (ETEST5; AB BIODISK, SUECIA) Un agregado útil al arsenal diagnóstico es el Etest, que con­ siste en bandas impregnadas con antibióticos que se colocan sobre la superficie del agar (protocolo 17-3). El principio es

Figura 17-16 Placa para evaluar la sensibilidad a los antibióticos con discos que muestra el m ism o principio que en la figura 17-15. En el área donde la concentración de antibiótico es insuficiente para evitar el crecim iento bacte­ riano, se puede ver un margen definido.

Recuadro 17-6

In te rp re ta c ió n c o rre c ta d e lo s a n tib ió tic o s : s itu a c io n e s e s p e c ia le s

1. Los m icroorganism os móviles como Proteus mirabilis o P. vuigaris pueden ascender cuando crecen en las superficies del agar, lo que con­ duce a un velo delgado que puede penetrar en las zonas de inhibición que rodean los discos de sensibilidad a los antibióticos (fig. 17-17). Esta zona de movimiento ascendente debe ser ignorada; se debe medir el margen externo, que suele estar claram ente señalado. Asimismo, con los discos de sulfamidas, es posible que el crecim iento no sea totalm en­ te inhibido en el margen externo, lo que conduce a un velo débil, donde el 80% o más de los microorganism os son inhibidos. La zona clara de alrededor del 80% de inhibición debe ser leída com o el diám etro de la zona. 2. El fenóm eno que se muestra en la figura 17-18 debe ser interpretado de m odo diferente del que se muestra en la figura 17-17. Obsérvese que se presentan colonias definidas dentro de la zona de inhibición. Esto no representa movimiento ascendente. M ás bien, estas colonias son m utan­ tes que son más resistentes al antibiótico que la mayor porción de la cepa bacteriana por evaluar o el cultivo no es puro y las colonias sepa­ radas son de una especie diferente. El aislamiento, la identificación y las pruebas de sensibilidad de las colonias resistentes pueden ser nece­ sarios para resolver este problema. Si se determ ina que las colonias separadas representan una variante de una cepa mutante, las especies bacterianas por evaluar deben considerarse m utantes, aun cuando se puede presentar una zona am plia de inhibición por el resto del creci­ miento. 3. La figura 17-19 dem uestra la dificultad para medir el diám etro de una zona cuando existe superposición con las zonas de los antibióticos adyacentes, o cuando la zona se extiende más allá del borde de la placa de Petri. Se pueden presentar zonas ovaladas o elípticas y es difícil determ inar si hay que m edir los diámetros cortos o largos. A m enos que las zonas sean muy anchas y el m icroorganismo por evaluar sea obvia­ mente sensible, la prueba se debe repetir con la colocación más cuida­ dosa de los discos del antibiótico de m odo que no ocurra la superposi­ ción. 4. La figura 17-20 muestra una placa mal preparada. Las líneas de la siembra en estría son irregulares y dejan espacios entre las colonias adyacentes. Los bordes de las zonas son poco claros, lo que hace difícil recoger los puntos exactos en los cuales se deben hacer las m ediciones. No se debe intentar realizar lecturas sobre una placa poco inoculada com o ésta y la prueba debe repetirse.

946

CAPÍTULO 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Figura 17-17 Fotografía de una placa para sensibilidad a los antibióticos que utiliza una especie de Proteus com o m icroorganismo de prueba. Obsérvese el movim iento en la zona de inhibición en los m árgenes periféricos. Se debe uti­ lizar la segunda zona externa de inhibición del crecimiento cuando se mide el ancho de la zona.

Figura 17-19 Placa para sensibilidad a los antibióticos mal preparada que m uestra una superposición objetivable de las zonas de inhibición del creci­ miento desde discos adyacentes.

una expansión del antibiograma por difusión con discos y el protocolo para preparar el inóculo es el mismo. Se gradúa el contenido del antibiótico de las bandas, y la concentración se imprime linealmente a lo largo de la banda (fig. 17-25). Después de la incubación, la CIM se lee a partir del punto en la banda donde pasa la zona de inhibición del crecimiento. Si se colocan las bandas sobre el agar con la parte superior hacia abajo (sin que el lado impregnado entre en contacto con el agar), es probable que ocurran determinaciones erróneas de la C IM .117 Sin embargo, el fabricante indica que una banda con la parte de arriba hacia abajo puede ser reubicada sin proble­ mas si el error se reconoce de inmediato. Los mismos factores que influyen en las pruebas de sensibi­ lidad por difusión con discos se aplican a su “hijastro”, el Etest. Figura 17-20 Placa para sensibilidad a los antibióticos mal sem brada que muestra un crecim iento irregular. Los márgenes de la zona son indefinidos, lo que com prom ete una m edición precisa.

Diámetros de la zona (mm)

Figura 17-18 Placa para sensibilidad a los antibióticos en la cual están cre­ ciendo colonias resistentes a la kanam icina dentro de la zona de inhibición: se deben realizar pruebas bioquím icas para determ inar si la cepa resistente es una mutante de los microorganismos que se están examinando o si representa una se­ gunda especie que crece en cultivo mixto.

Figura 17-21 Curva de regresión prototipo que com para las CIM en m icrogram os por mililitro con el tamaño de la zona en milímetros. Cada triángulo representa la CIM (eje vertical) y la zona inhibitoria (eje horizontal) de una cepa única. El diámetro de 18 mm de una zona se corresponde con el punto de corte de la CIM de 6,25 |ig/m L, una correlación que, en teoría, se podría hacer para la prueba que se muestra en las figuras 17-11 y 17-12.

Cuadro 17-21

Límites de control de calidad para las pruebas por difusión con discos C O N T E N ID O D E L D IS C O

E S C H E R IC H IA C O LI (ATCC 25922)'’

ST A P H Y L O C O C C U S A U R E U S (A TC C 25923)

P SE U D O M O N A S A E R U G IN O SA (ATCC 27853)

30 ng

19-26

20-26

18-26

-

20/10 ng

18-24

28-36

-

17-22

ío ng

16-22

27-35

-

6

10/10 ng

19-24

29-37

-

13-19

Azitrom icina

i s ng

-

21-26

-

-

A zlocilina

75 ng

-

-

24-30

-

Aztreonam

3o ng

28-36

-

23-29

-

Carbenicilina

io o ng

23-29

18-24

-

C efaclor

30 ng

23-27

-

-

Cefam andol

3o ng

26-32

Cefazolina

3o ng

21-27

Cefdinir

5 Hg

24-28

-

-

Cefditorén

5 ng

22-28

-

-

Cefepim a

30 ng

31-37

24-30

-

Cefetam et

10 ng

24-29

-

-

A N T IB IÓ T IC O Amikacina Am oxicilina-ácido clavulánico Am picilina Am picilina-sulbactam

5 Hg

23-27

Cefm etazol

30 ng

26-32

27-31 /

-

/

/

-

¿

y

/ / /

/

/

/ O

js

*

/

y

/

/2 5 -3 4

^

-

,

-

-

-

-

Cefonicida

30 ng

25-29

Cefoperazona

75 ng

28-34

Cefotaxim a

3o ng

Cefotetán

30 ng

Cefoxitina

3o ng

Cefpodoxim a

io ng

Cefprozilo

3o ng

21-27

27-33

-

-

Ceftazidim a

3o ng

25-32

16-20

22-29

-

22-28

-

-

24-33

23-29

-

29-35

25-31

18-22

-

28-34

17-23

-

-

23-29

23-29

-

-

23-28

19-25

-

-

/ /

Ceftibutén

3o ng

27-35

-

-

-

Cefitzoxim a

3o ng

30-36

27-35

12-17

-

Ceftriaxona

3o ng

29-35

22-28

17-23

-

Cefuroxim a

30 ng

20-26

27-35

-

-

Cefalotina

3o ng

15-21

29-37

-

Cloranfenicol

3o ng

21-27

19-26

-

Pruebas para determinar la actividad inhibitoria de los antibióticos

Cefixim a

/

E S C H E R IC H IA C O L1 (ATCC 3 5 2 1 8 /

-

947

(Continúa)

948 CAPÍTULO

Cuadro 17-21

Límites de control de calidad para las pruebas por difusión con discos (c o n t.) E S C H E R IC H IA C O LI

ST A P H Y L O C O C C U S A U R E U S (ATCC 25923)

P SE U D O M O N A S A E R U G IN O SA (ATCC 27853)

E S C H E R IC H IA C O LI

(ATCC 25922)'-'

100 ng

26-32

-

-

-

Ciprofloxacina

5 Hg

30-40

22-30

25-33

-

Claritrom icina

-

(ATCC 35218/

15 ng

-

26-32

-

Clinafloxacina

5 ng

31-40

28-37

27-35

-

Clindam icina

2ng

-

24-30

-

-

Daptom icina''

3o ng

-

18-23

-

-

Diritrom icina

15 ng

-

18-26

-

-

Doxiciclina

3o ng

18-24

23-29

-

-

Enoxacina

10 ng

28-36

22-28

22-28

-

Ertapenem

10 ng

29-36

24-31

13-21

-

Eritromicina

is ng

-

22-30

-

-

21-27

12-20

-

5ng

28-34

Fosfom icina1

200 ng

22-30

25-33

-

-

G aren o x acin a

Fleroxacina

5ng

28-35

30-36

19-25

-

Gatifloxacina

5ng

30-37

27-33

20-28

-

G em ifloxacina

5ng

29-36

27-33

19-25

-

Gentam icina"

10 ng

19-26

19-27

16-21

-

Grepafloxacina

5 ng

28-36

26-31

20-27

-

Im ipenem

10 ng

26-32

-

20-28

-

Kanam icina

3o ng

17-25

19-26

-

-

Levofloxacina

5 ng

29-37

25-30

19-26

-

Linezolida

3o ng

-

25-32

-

-

Lom efloxacina

10 ng

27-33

23-29

22-28

-

L oracarbef

3o ng

23-29

23-31

-

-

M ecilinam

10 ng

24-30

-

-

-

ATCC, American Type Culture Collection.

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Cinoxacina

17

CONTENIDO DEL DISCO

ANTIBIÓTICO

Problemas especiales con las pruebas de sensibilidad

La difusión de los antibióticos comienza inmediatamente des­ pués de la colocación de la banda que, por lo tanto, no puede ser extraída una vez que la superficie impregnada ha tocado el agar. Una placa con pocas estrías puede producir una zona irre­ gular de inhibición en el punto de la CIM. El arremolinamiento de las especies de Proteus y la aparición de colonias mutan­ tes dentro de la zona de inhibición pueden ser problemáticos con el Etest, como sucede con la difusión con discos. El Etest ha resultado eficaz para uso general.8 Su costo hace difícil justificar el examen de múltiples antibióticos contra microorganismos que crecen bien en uno de los procedimien­ tos de dilución o difusión con discos. Sin embargo, es invalo­ rable para la evaluación de antibióticos muy seleccionados contra m icroorganismos con requerim ientos nutricionales especiales que no crecen bien en las otras pruebas (p. ej., Strep­ tococcus pneum oniae'63 o estreptococos viridans272). En el protocolo 17-3 se explica el procedimiento para reali­ zar una prueba de sensibilidad por las bandas Etest. Además de las cuestiones generales comunes a todas las pruebas de sensi­ bilidad, en el recuadro 17-7 se resumen las sugerencias especí­ ficas para resolver los problemas del Etest.

Problemas especiales con las pruebas de sensibilidad

94 9

Figura 17-22 Instrum ento Q uickspense para distribuir líquido en placas de microtítulos. Las diluciones de los antibióticos se preparan en grandes volú­ menes, utilizando un conjunto de 96 macrotubos calibrados (A). Los tubos se colocan en una cám ara dispensadora herm ética (B), cuya parte superior con­ tiene una cánula para cada m acrotubo (C). Estas cánulas están conectadas por medio de una tubuladura plástica a un conjunto de 96 agujas (D), a través de la cual se gotean las soluciones antibióticas en una placa de m icrotítulo (E). Se distribuye un volum en m edido m ediante la introducción por presión en la cám ara dispensadora.

[Mactamasas Las P-lactamasas son enzimas bacterianas heterogéneas que escinden el anillo P-lactámico de las penicilinas y cefalospori­ nas para inactivar el antibiótico. Las P-lactamasas se encuen­ tran en una amplia variedad de especies bacterianas gramposi­ tivas y gramnegativas. Las enzimas producidas por las especies de Staphylococcus, especies de H aem ophilus , M oraxella (Branhamella) catarrhalis y N eisseria gonorrhoeae han sido las de mayor importancia clínica. La importancia de las enzi­ mas convencionales producidas por muchas bacterias entéricas es menos clara y estas bacterias no deben ser evaluadas para p-lactamasa. Sin embargo, la aparición de P-lactamasas con un espectro amplio en bacterias gramnegativas ha concentrado mayor atención sobre este mecanismo de resistencia. La presencia de muchas P-lactamasas se puede detectar en forma rápida y confiable, lo que proporciona un indicio claro de que un aislamiento no responderá a los antibióticos p-lactá­ micos en cuestión. No obstante, las enzimas estafílocócicas y las enzimas de amplio espectro/espectro ampliado de las bac­ terias gramnegativas presentan problemas especiales, como se explica más adelante. La prueba de las cefalosporinas cromógenas, que utilizan nitrocefina (Cefinase®; BD Diagnostic System, Sparks, MD) es la más sensible. Existen en el comercio discos de papel de fil­ tro impregnados con nitrocefina. Se hace un frotis sobre el disco de un puñado de una colonia y se lo coloca en una placa de Petri cerrada para evitar la rápida desecación. Los microor­ ganismos que contienen P-lactamasa cambian el color del disco de amarillo a rojo. En general, la reacción ocurre dentro de los 30 segundos, pero las pruebas se leen finalmente después de 15 minutos. Es menos costoso realizar pruebas acidimétricas, pero son menos sensibles que el ensayo de nitrocefina. La apertura del anillo p-lactámico produce ácido peniciloico, que es más ácido que la penicilina. El cambio de pH se detecta mediante la observación visual de un colorante indicador, rojo fenol. Se ajusta una suspensión de rojo fenol y penicilina G con NaOH a pH 8,5 (punto en el cual el color cambia a violeta) y se alma­ cena a -2 0 °C hasta durante una semana.7 En el momento de la

prueba, se sumerge un tubo capilar en la solución de rojo fenol hasta que se llene 1 cm del tubo. El extremo que se llenó se raspa a través de una colonia de bacterias para que tapone el tubo, luego se incuba a temperatura ambiente durante 60 minu­ tos. Un cambio en el indicador rojo fenol a amarillo indica la presencia de P-lactamasa. En todos los casos la prueba de nitrocefina ha sido el méto­ do más sensible y específico para medir P-lactamasas. Se debe utilizar cuando se evalúa M oraxella catarrhalis. Existen pocas razones para utilizar uno de los otros métodos cuando la prue­ ba de nitrocefina sirve a todos los propósitos. ESPECIES DE STAPHYLOCOCCUS Las P-lactamasas de los estafilococos son inducidas por la exposición a las penicilinas y son responsables de la mayor parte de la resistencia a la penicilina G y los compuestos rela­ cionados, pero no son activas contra las cefalosporinas o las penicilinas resistentes a las penicilinasas, como meticilina y nafcilina, a menos que se produzcan en grandes cantidades. La detección de estas enzimas es muy difícil con la prueba por microdilución en caldo, porque las bacterias en el inoculo rela­ tivamente pequeño utilizado en esta prueba pueden ser destrui­ das antes de que se induzca la enzima. Si la CIM de una cepa de estafilococo para la penicilina es mayor de 0,25 pg/mL, se puede inferir la presencia de una P-lactamasa. Las cepas con una CIM para la penicilina inferior a 0,03 (xg/mL se consideran no productoras de P-lactamasa y sensibles. Los aislamientos para los cuales la CIM cae entre los límites (0,06 o 0,12 pg/mL) deben ser evaluados para detectar la presencia de P-lactamasa antes de que se comuniquen los resultados. El uso de la proliferación bacteriana de un pocilio que contiene un fármaco de la clase de la penicilina o del borde de una zona de inhibición alrededor de un disco que contiene un compuesto penicilínico puede inducir actividad y aumentar la detección de la enzima. Los resultados de las pruebas de la penicilina pueden ser extrapolados a la ampicilina.

950 CAPÍTULO

17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

2-8

-

0,03-0,12

16-64

_

Ceftriaxona

1-8

-

0,03-0,12

8-64

-

C efuroxim a

0,5-2

-

2-8

-

-

0,12-0,5

-

4-16

-

-

2-8

4-16

2-8

-

-

-

-

2-8

-

-

Ciprofloxacina

0,12-0,5

0,25-2

0,004-0,016

0,25-1

-

Claritrom icina

0,12-0,5

-

-

-

-

Clinafloxacina

0,008-0,06

0,03-0,25

0,002-0,016

0,06-0,5

-

Clindam icina

0.06

4-16

-

-

-

D aptom icinac

0,25-1

1-8

-

-

-

D iritrom icina

1-4

-

-

-

-

Doxiciclina

-

-

0,5-2

-

-

Enoxacina

0,5-2

2-16

0,06-0,25

2-8

-

Ertapenem

0,06-0,25

4-16

0,004-0,016

2-8

-

Eritrom icina

0,25-1

1-4

-

-

-

Fleroxacina

0,25-1

2-8

0,03-0,12

1-4

-

Fosfom icina‘<

0,5-4

32-128

0,5-2

2-8

-

G aren o x acin a

0,004-0,03

0,03-0,25

0,004-0,03

0,5-2

-

Gatifloxacina

0,03-0,12

0,12-1,0

0,008-0,03

0,5-2

-

G em ifloxacina

0,008-0,03

0,016-0,12

0,004-0,016

0,25-1

-

0,12-1

4-16

0,25-1

0,5-2

-

G repafloxacina

0,03-0,12

0,12-0,5

0,004-0,03

0.25-2

-

Imipenem

0,016-0,06

0,5-2

0,06-0,25

1-4

-

1-4

16-64

1-4

-

-

0,06-0,5

0,25-2

0,008-0,06

0,5-4

-

1-4

1-4

-

-

-

Cefalotina Cloranfenicol Cinoxacina

G entam icina'

Kanam icina Levofloxacina Linezolida ATCC, American Type Culture Collection.

Problemas especiales con las pruebas de sensibilidad

Cefitizoxim a

co

OI

952

CAPÍTULO 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

alteración en las proteínas de unión a penicilina suelen tener niveles más altos de resistencia a la oxacilina y resistencia a otros diversos antibióticos, como se explica luego. La impor­ tancia clínica de estas cepas no ha sido clara. Sin embargo, Kemodle y cois, describieron un grupo de estas cepas de Staphylococcus aureus de cierto tipo de fago que causaron infecciones de heridas de importancia clínica.164

Figura 17-23 Placa para sensibilidad a los antibióticos por m icrodilución en caldo. Los núm eros en la parte superior indican los diferentes antibióticos que se evalúan dentro de cada colum na vertical; las letras a lo largo del borde izquierdo reflejan la concentración de antibióticos contenida dentro de cada pocilio. La aparición de un botón de crecim iento bacteriano en cualquier poci­ lio indica resistencia a esa concentración de antibiótico.

Los antibióticos P-lactámicos como las cefalosporinas de primera generación y las penicilinas resistentes a la penicilina­ sa (meticilina, nafcilina, oxacilina, dicloxacilina, etc.) tienen un anillo p-lactámico modificado que resiste la digestión enzi­ mática por las p-lactamasas estafílocócicas. Sin embargo, si una cepa produce una pequeña cantidad de enzima, puede inactivar a estos antibióticos in vitro. En general, estas cepas mues­ tran una resistencia límite a la oxacilina (CIM, 4 Ug/mL) y sen­ sibilidad a otros antibióticos de uso frecuente. Por el contrario, las cepas que son resistentes a la oxacilina por medio de una

ESPECIES DE HAEMOPHILUS Hasta el 20-40% de las cepas de Haemophilus influenzae tipo B aisladas en infecciones graves producen P-lactamasas.66 La detección de las enzimas se debe realizar cuando un micro­ organismo aislado se considera patógeno. Algunas cepas tienen una resistencia demostrada a la penicilina por otros mecanis­ mos, de modo que una cepa no productora de enzima también debe ser evaluada contra ampicilina mediante una prueba de sensibilidad por difusión o dilución, al menos para las bacterias que han sido aisladas en sitios estériles y están produciendo infecciones de importancia clínica.17 NEISSERIA GONORRHOEAE

Los gonococos productores de penicilinasa fueron detecta­ dos inicialmente en el Lejano Oriente pero ahora se encuentran ampliamente distribuidos. Todas las cepas deben ser evaluadas para detectar P-lactamasa. Como sucede con las especies de Haemophilus, se han identificado ahora algunas cepas que son resistentes a la penicilina por medios no enzimáticos,267 de modo que también se debe realizar una prueba- de sensibilidad si el tratamiento fracasa o si la frecuencia de la resistencia es alta en la población. MORAXELLA (BRANHAMELLA) CATARRHALIS

En los últimos años se ha reconocido a M oraxella (Branha­ mella) catarrhalis como causa importante de infección respira­ toria y de infección intrahospitalaria de las vías respiratorias bajas. La mayoría de las cepas producen p-lactamasas, que son de dos tipos. La enzima más frecuente (tipo Ravasio) es cromosómica, constitutiva, se encuentra altamente asociada con las células y es bloqueada por los inhibidores de las P-lactama­ sas, como clavulanato y sulbactam.6081 Una segunda enzima menos frecuente (tipo 1908) difiere en varios aspectos impor­ tantes. Es producida con una frecuencia 10 a 100 veces menor que el tipo Ravasio. En consecuencia, la prueba de sensibilidad cuantitativa puede estar en el intervalo de sensibilidad en pre­ sencia de una prueba de P-lactamasa positiva. En ausencia de buenos datos clínicos, es probable que estas cepas deban con­ siderarse resistentes. Existen pocas razones para realizar cual­ quier prueba de rutina fuera de la P-lactamasa sobre M oraxella (Branhamella) catarrhalis porque la sensibilidad del microor­ ganismo a otros antibióticos es predecible.69 Doem y cois, observaron que la prueba del tubo de nitrocefina o la prueba con discos eran los medios más eficaces para detectar p-lactamasa.64,68 El tema ha sido revisado por Doem y Jones.64

Figura 17-24 Espejo visualizador para la visualización del crecim iento bac­ teriano en la prueba por m icrodilución en caldo.

ESPECIES DE ENTEROCOCCUS Se han identificado cepas de enterococos que producen P-lactamasas.213 Esta resistencia de alto nivel a la penicilina puede detectarse con la prueba de la nitrofecina. La P-lactamasa, que se asemeja a los estafilococos, es transportada sobre un plásmido,214 pero los plásmidos propiamente dichos de enterococos

Cuadro 17-23

Detección de problemas en el control de calidad en las pruebas de sensibilidad*

OBSERVACIÓN CIM dem asiado grande o tamaño de la zona demasiado pequeño (aislam ientos dem asiado resistentes)

DIAGNÓSTICO 1. Inóculo dem asiado alto 2. Deterioro del antibiótico 3. Cambio en la cepa de control de calidad 4. Agar dem asiado profundo 5. Lectura incorrecta de los resultados

CIM dem asiado pequeña o tam año de la zona demasiado grande (aislam ientos dem asiado sensibles)

1. Inóculo dem asiado bajo 2. Antibiótico dem asiado potente 3. Cambio en la cepa de control de calidad 4. A gar demasiado delgado 5. L ectura incorrecta de los resultados

PRUEBAS CORRECTORAS* 1. Controlar y ajustar el inóculo si fuera necesario 2. Controlar la potencia de los discos o el polvo; probar un nuevo lote 3. Evaluar nueva reserva de cepas de control de calidad 4. Controlar la profundidad del agar 5. Repetir con diversos observadores 1. Controlar y ajustar el inóculo si fuera necesario 2. Controlar la potencia de los discos o el polvo; probar un nuevo lote 3. Evaluar nueva reserva de cepas de control de calidad 4. Controlar la profundidad del agar 5. Repetir con diversos observadores

Contenido incorrecto de cationes

Utilizar caldo con suplemento de cationes o probar un lote dife­ rente de agar

Am inoglucósidos y macrólidos dem asiado resistentes; tetraciclina dem asiado sensible

M edio dem asiado ácido

Controlar el pH de los medios

Am inoglucósidos y m acrólidos dem asiado sensibles; tetra­ ciclina dem asiado resistente

M edio dem asiado alcalino

Controlar el pH de los m edios

CIM de trim etoprim dem asiado grande o tam año de la zona dem asiado pequeño; resultados difíciles de leer

Exceso de tim idina en el medio

Evaluar el m edio con Enterococcus fa eca lis (ATCC 29212); agregar tim idina fosforilasa o sangre de caballo hem olizada

General

1. Turbidez estándar espirada, alm acenam iento incorrecto, no elabo­ rado hasta el estándar o m ezclado en form a insuficiente antes de la prueba 2. M ateriales o reactivos utilizados después de la fecha de espiración o alm acenados incorrectam ente 3. Tem peratura de la incubadora o atm ósfera establecidos incorrecta­ mente 4. Otro equipam iento (p. ej., pipetas) que funciona en form a inco­ rrecta 5. Placas alm acenadas a tem peratura incorrecta

1. Controlar el estándar de turbidez; preparar nuevo estándar si fuera necesario

6. Cepa control m utada o contam inada 7. Suspensiones del inóculo ajustadas en form a incorrecta 8. Inóculo preparado a partir de una placa que tenía más de 24 horas de antigüedad

2. Controlar la fecha de espiración y la tem peratura de alm acena­ m iento de los medios y reactivos 3. Controlar los registros de las incubadoras 4. Controlar el equipam iento; revalidar si fuera necesario 5. Controlar el alm acenam iento de las placas y los registros de la tem peratura de la localización del alm acenam iento 6. Obtener una cepa control fresca y volver a evaluar 7. Revisar la preparación de las suspensiones con el personal 8. Revisar los estándares para las fuentes del inóculo

* Adenuís de las acciones sugeridas en el cuadro, los resultados que se hallan fuera de control requieren una repetición de la prueba y suspender los resultados hasta que el control de calidad esté nuevamente controlado (véase cuadro 17-15).2'7'220 ATTC, American Type Culture Collection.

Problemas especiales con las pruebas de sensibilidad

Resultados de Pseudomonas y am inoglucósidos fuera de control

953

954

Cuadro 1 7 -2 4

Resumen de los métodos de prueba para m icroorganism os seleccionados

Microdilución en caldo; dilu­ ción en agar

Caldo de M ueller-Hinton ajustado por cationes (CAM HB) o agar de M ueller-Hinton (MHA); CAM HB o M HA m ás NaCI al 2% para oxacilina, m eti­ cilina y nafcilina

Suspensión directa de las colonias (DCS), equivalen­ te a un estándar de M cFarland de 0,5

35 °C; aire ambiente; 16 a 20 horas; 24 Considerar las pruebas m olecu­ horas para oxacilina, nafcilina y m eti­ lares para el gen mecA o las cilina pruebas fenotípicas múltiples; considerar la detección en agar para vancom icina si se utilizan sistem as com erciales autom a­ tizados; confirm ar las cepas de sensibilidad interm edia o resistentes a la vancomicina

Prueba de detección en agar-oxacilina-sales

A gar de M ueller-Hinton (MHA) con NaCI al 4%

DCS

35 °C; aire am biente; 24 horas

Difusión con discos

MHA

DCS

35 °C; aire ambiente; 16 a 20 horas; 24 horas para oxacilina, nafcilina, m eti­ cilina y vancomicina

Considerar la confirm ación de los resultados de la vancom ici­ na con una prueba de CIM, sobre todo para las cepas resistentes a la oxacilina; no se detecta bien la resistencia de bajo nivel

Difusión por gradiente (Etest®)

MHA; MHA con NaCI al 2% para oxacilina, m eticilina y nafcilina

DCS en caldo

35 °C; aire ambiente; 16 a 20 horas; 24 horas para oxacilina, nafcilina y meticilina y vancomicina

Incubar la placa durante 48 horas para detectar estafiloco­ cos coagulasa negativos resis­ tentes a la oxacilina

M icrodilución en caldo; dilución en agar

CAM HB; NHA

M étodo de crecim iento o DCS

35 °C; aire ambiente; 16 a 18 horas; 24 horas para vancom icina

Confirm ar las cepas resistentes a la vancom icina; realizar una prueba para P-lactamasa

Difusión con discos

MHA

M étodo de crecim iento o DCS

35 °C; aire ambiente; 16 a 18 horas; 24 horas para vancomicina

Difusión por gradiente

MHA

DCS en caldo

35 °C; aire ambiente; 16 a 18 horas; 24 horas para vancomicina

Especies de Enterococcus. Resistencia de alto nivel a la gentam icina

M icrodilución en caldo; dilución en agar

C aldo o agar de infusión de cerebro y corazón (NHI); gentam icina 500 (Xg/mL

Método de crecim iento o DCS; inoculo por m icrodi­ lución estándar; gotas de 10 |lL sobre la superficie del agar

35 °C; aire ambiente; 24 horas

Realizar sólo sobre aislamientos en infecciones sistém icas graves

Especies de Enterococcus. Resistencia de alto nivel a la estreptom icina

Microdilución en caldo; dilu­ ción en agar

Caldo o agar BHI; estrepto­ m icina 1 000 |lg/m L (caldo) o 2 000 ng/m L (agar)

M étodo de crecim iento o DCS; inoculo por m icrodi­ lución estándar; gotas de 10 |iL sobre la superficie del agar

35 °C; aire ambiente; 24 horas; reincubar otras 24 horas si es sensible

Realizar sólo sobre aislamientos en infecciones sistém icas graves

Especies de Enterococcus

INCUBACIÓN

COMENTARIOS

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

INOCULO

17

MEDIO

Especies de Staphylococcus

MÉTODO

CAPÍTULO

MICROORGANISMO

Especies de Enterococcus. Resistencia de alto nivel a am inoglucósidos

Difusión con discos

MHA; disco de 120 (ig (genta­ micina); disco de 300 |ig (estreptom icina)

Método de crecim iento o DCS

35 °C; aire ambiente; 16 a 18 horas

Especies de Enterococcus. Resistencia de alto nivel a aminoglucósidos

Difusión por gradiente

MHA; tiritas de gentam icina y altas dosis de estreptom icina

Suspensión en caldo hasta estándar de M cFarland de 0,5-1,0

35 °C; aire am biente; 48 horas

Especies de Enterococcus. Resistencia a vancom icina

Dilución en agar

Agar NHI; vancom icina 6 Ug/mL

Método de crecim iento o DCS; inóculo para microdilución estándar; 1-10 |i,L m anchados en la superficie del agar

35 °C; aire am biente; 24 horas

Especies de Haemophilus

M icrodilución en caldo

Caldo de medio de prueba para Haemophilus (HTM)

DCS

35 °C; C O , al 5%; 20 a 24 horas

Difusión con discos

M edio de prueba para Haemophilus (HTM)

DCS

35 °C; C O , al 5%; 20 a 24 horas

Difusión por gradiente

HTM o MHA con hem oglobina al 1% e Isovitalex (BBL) al 1% si es validado contra NCCLS

DCS en caldo

35 °C; aire ambiente; 24 horas

Dilución en agar

Base de agar GC y suplemento de crecim iento definido al 1% (véase el texto)

DCS

35 °C; C 0 2 al 5%; 20-24 horas

Realizar la prueba de la P-lacta­ masa

Difusión con discos

Base de agar GC y suplemento de crecim iento definido al 1% (véase el texto)

DCS

35 °C; C O , al 5%; 20-24 horas

No se necesita un m edio sin cis­ terna; realizar la prueba de la P-lactam asa

Difusión por gradiente

Base de agar GC y suplemento de crecim iento definido al 1% (véase el texto)

DCS en caldo

35 °C; C 0 2 al 5%; 20-24 horas

M icrodilución en caldo

CAM HB más sangre de caballo hemolizada v/v al 2-5%

DCS

35 °C; C 0 2 al 5%; 16-20 horas

Dilución en agar

MHA más sangre de cam ero v/v al 5%

DCS

35 °C; C 0 2 al 5%; 16-20 horas

Difusión con discos

No validado

Difusión por gradiente

MHA más sangre de cam ero al 5% o MHA más hemoglobina al 1% e Isovitalex al 1% (BBL)

DCS en caldo

35 °C; C O , al 5%; 18-24 horas

M icrodilución en caldo

CAM HB con sangre de caballo hem olizada al 2-5% (v/v)

DCS

35 °C; C O , al 5%; 20-24 horas

Neisseria gonorrhoeae

Streptococcus pneum oniae

Utilizar sangre de caballo hem o­ lizada v/v al 2-5% en lugar de la sangre de carnero si se evalú­ an las sulfamidas

(Continúa)

955

Se puede realizar un exam en de detección con discos de oxacili­ na para determ inar la sensibili­ dad a la penicilina com o prueba prelim inar

Problemas especiales con las pruebas de sensibilidad

Neisseria meningitidis

Confirmar los resultados inmc diatos con una prueba de CIM

956 CAPÍTULO

Resumen de los métodos de prueba para microorganismos seleccionados (c o n t.)

E species de Streptococcus distintas de S. pneum oniae

Vibrio cholerae

Especies de Listeria

MÉTODO

MEDIO

INOCULO

INCUBACIÓN

COMENTARIOS

D ifusión con discos

M HA con sangre de cam ero al 5%

DCS

35 °C; C 0 2 al 5%; 20-24 horas

No se cuenta con pruebas en disco confiables para algunos antibióticos; se recom ienda la prueba de CIM para los aisla­ mientos del LCR

Difusión por gradiente

MHA con sangre de carnero al 5%

DCS en caldo

35 °C; C O , al 5%; 20-24 horas

Si el césped bacteriano es dem a­ siado escaso, repetir utilizando un estándar de M cFarland 1,0

Microdilución en caldo

CAM HB con sangre de caballo hem olizada v/v al 2-5%

DCS

35 °C; aire ambiente; 20-24 horas

Dilución en agar

MHA con sangre de carnero v/v al 5%

DCS

35 °C; aire am biente; 20-24 horas; C 0 2 si es necesario para el crecim iento

U tilizar sangre de caballo hem olizada en lugar de sangre de carnero si se evalúa una sulfamida

Difusión con discos

No validada

Difusión por gradiente

M HA con sangre de cam ero al 5%

DCS

35 °C; C 0 2 al 5%; 20-24 horas

Equipar el inoculo con un están­ dar de M cFarland 1,0 para las cepas mucoides

M icrodilución en caldo: dilución en agar

CAM HB; MHA

M étodo de crecim iento o DCS

35 °C; aire ambiente; 16-20 horas

D ifusión con discos

MHA

Método de crecim iento o DCS

35 °C; aire ambiente; 16-18 horas

M icrodilución en caldo

CM HB más sangre de caballo hem olizada v/v al 2-5%

DCS

35 °C; aire ambiente; 16-20 horas

Adaptado de hojas de aplicación del Etest®. AB Biodisk, Solna, Suecia y de las referencias217'218.

Para am picilina y penicilina < 2 |ig/m L = sensibles (no se caracterizan las cepas resistentes)

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

MICROORGANISMO

17

Cuadro 1 7 -2 4

Problemas especiales con las pruebas de sensibilidad

957

y estafilococos no son homólogos.331 Las cepas de Enteroco­ ccus fa eca lis que producen P-lactamasa y también muestran resistencia de alto nivel a los aminoglucósidos se han vuelto epidémicas en algunas instituciones.341 Si la prueba con discos de nitrocefina no se realiza sobre los aislamientos, es posible que no se reconozca la resistencia a los antibióticos p-lactámicos. En un estudio de los laboratorios de New Jersey realizado por Tenover y cois, una cepa productora de P-lactamasa de E. fa eca lis fue reconocida como resistente a la penicilina sólo por el 66% de 76 participantes y a la ampicilina por un alarmante 8% de los laboratorios. Sólo 3 de los 76 laboratorios recono­ cieron que la cepa producía P-lactamasa, lo que señala la importancia de realizar una prueba de P-lactamasa en los ente­ rococos, sobre todo si han sido aislados en sitios estériles.314 Una combinación de piperacilina y tazobactam es eficaz contra los enterococos productores de p-lactamasas234 y es posible que esta combinación proporcione sinergia con aminoglucósidos para dichas cepas. P-LACTAMASAS DE ESPECTRO AMPLIADO Se puede sospechar la presencia de P-lactamasas de espectro ampliado si una cepa de K lebsiella pneumoniae o de Escheri­ chia coli demuestra resistencia a uno o más de los antibióticos P-lactámicos indicadores, pero sensibilidad a otras cefalospo­ rinas de tercera generación. Lamentablemente no existe ningún antibiótico indicador único que funcione en todas las situacio­ nes. Las P-lactamasas de espectro ampliado se presentan en otras enterobacterias, como especies de Enterobacter y de C i­ trobacter , pero la detección es más difícil debido a la aparición frecuente de otros tipos de P-lactamasas, sobre todo enzimas AmpC, en estas especies. El CLSI ha proporcionado recomen­ daciones, que se resumen en el cuadro 17-25, sólo para K leb­ siella pneumoniae y Escherichia coli. Una vez que se ha sugerido la posibilidad de una P-lactamasa de espectro ampliado mediante las pruebas iniciales, es necesario realizar una prueba confirmatoria, sobre la base del hecho de que estas enzimas casi siempre son bloqueadas por inhibidores de la p-lactamasa. En el cuadro 17-26 se resumen las pruebas actualmente disponibles. Los criterios del CLSI para el cribado y la confirmación de la producción de P-lactamasas de espectro ampliado en Escherichia coli y especies de K lebsiella han probado ser con­ fiables, aunque existe una posibilidad de omitir ciertas cepas si el inóculo es demasiado bajo.260 Aunque las P-lactamasas de espectro ampliado se encuentran en otras especies, en este momento no es útil aplicar los criterios del CLSI a estos micro­ organismos.281 Estas enzimas son transportadas por plásmidos que a menu­ do median la resistencia a otros antibióticos, como aminoglu­ cósidos, tetraciclinas y sulfamidas, de modo que la aparición de patrones de resistencia inusuales también puede servir como indicio de que se presentan enzimas de espectro ampliado.84160 Se han sugerido varios métodos para aumentar la detección de este mecanismo de resistencia. Una prueba de sinergia con doble disco con discos de cefotaxima y amoxicilina-clavulanato colocados con 30 mm de separación de un centro a otro fue eficaz para detectar resistencia mediada por enzimas de tipo E B S-B la.141 Thomson y Sanders evaluaron dos métodos para detectar resistencia.317 Se realizó una prueba de doble disco con discos de ampicilina-clavulanato rodeados por discos de aztre­ onam y cefalosporinas de tercera generación (separados por 30 mm centro a centro). La distorsión de los tamaños de las zonas en forma sinérgica (fig. 17-29C) indicó la producción de enzi-

Figura 17-25 Etest® para Streptococcus pneum oniae en agar de M uellerHinton con sangre. Las placas han sido preparadas com o para la prueba de difusión con disco, después de lo cual se han aplicado las tiras de la prueba. La CIM de la cepa aislada se lee donde la línea de inhibición del crecim iento cruza la tira. (A) Cepa totalm ente sensible con una CIM de 0,016 |ig/m L. (B) Cepa con una sensibilidad interm edia y una CIM de 0,38 (ig/mL.

ma. Este método detectó verdadera resistencia en 22 de 28 cepas (79%). El segundo método fue una prueba tridimensio­ nal en la cual se recortó un hoyo circular en el agar inmediata­ mente por dentro de la posición final de los discos de antibió­ ticos. El hoyo se llenó con inóculo bacteriano. Por otra parte, el procedimiento siguió el protocolo estándar de difusión con dis­ cos. La distorsión de los tamaños de las zonas en el punto del corte en el agar indicó la presencia de la enzima. La prueba tri­ dimensional detectó resistencia en 26 de 28 aislamientos (93%), pero la técnica y la interpretación son rigurosas. Especies de Staphylococcus ANTIBIÓTICOS P-LACTÁMICOS (ESPECIES DE STAPHYLOCOCCUS RESISTENTES A LA OXACILINA) Durante varias décadas los antibióticos penicilínicos esta­ bles a las P-lactamasas (penicilinasa) constituyeron la piedra fundamental del tratamiento antibiótico contra Staphylococcus aureus; por el contrario, la gran mayoría de los estafilococos coagulasa negativos siempre han sido resistentes a estos com­ puestos. Desde el punto de vista clínico, meticilina y nafcilina son los fármacos más utilizados de esta clase, y los aislamien­ tos suelen describirse como S. aureus resistente a la meticilina o Staphylococcus epiderm idis resistente a la meticilina. Es par­ ticularmente difícil detectar esta resistencia en el laboratorio. Los estafilococos son heterorresistentes; es decir, sólo una pequeña fracción de las bacterias en un cultivo expresan resis­ tencia, una característica que está mediada por cromosomas. La unión de la meticilina a la proteína de unión a meticilina 2a se relaciona con la resistencia al antibiótico.43 Las células resis­ tentes crecen más lentamente que las bacterias sensibles, a

958

CAPITULO 17

Recuadro 17-7

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Detección de problemas en las pruebas de sensibilidad Etest®

1. Colocar el Etest sobre la superficie del agar, el cual ha sido sembrado en estría con el inoculo. No mover la tira una vez que la superficie im pregnada con antibiótico ha tocado el agar. Si se coloca accidental­ mente la tira con la parte superior hacia abajo (el lado no im pregnado con antibióticos en contacto con el agar), se puede retirar la tira y colo­ carla correctam ente. 2. Si el crecim iento es insuficiente com o para ver una elipse claram ente definida de inhibición después de la incubación inicial, continuar la incubación dentro de los límites definidos del procedim iento. Si la incu­ bación se debe prolongar m ás allá de los límites recomendados, no se pueden utilizar los puntos de corte publicados sin una evaluación. 3. Leer la CIM donde la elipse cruza la escala de la tira. El punto de inter­ sección es la inhibición com pleta de todo crecimiento, que incluye las zonas esfum adas ("nubosas") y las colonias aisladas. a. Si se presentan microcolonias en la zona de inhibición, controlar la pureza del cultivo (com o para la prueba por difusión con discos); no ignorar estas colonias al determ inar la CIM. b. Inclinar las placas para visualizar las colonias puntiformes y las zonas esfum adas, sobre todo para enterococos. neum ococos y espe­ cies de Stenotrophomonas. Como alternativa, se puede utilizar una lupa para detectar m icrocolonias (a diferencia de lo que se permite en la prueba de difusión con discos). c. Incluir una zona esfum ada com o crecim iento cuando se determ ina la inhibición, pero ignorar la acum ulación producida por las especies de Proteus. d. Cuando se examinan bacterias p-hem olíticas, evaluar la zona de inhi­ bición e ignorar la hem olisis. e. Si ocurre un efecto paradójico (inhibición con baja CIM y nuevo cre­ cim iento con una CIM mayor), leer la CIM com o la zona de inhibi­ ción com pleta final. f. Los agentes bacteriostáticos, como trim etoprim -sulfametoxazol, pue­ den producir crecim iento con un borde rizado y difuso; leer la CIM con una inhibición del 80% (como para la prueba por difusión con disco). g. Cuando se evalúan com binaciones de P-lactamámicos e inhibidores de las P-lactamasas, el inhibidor puede tener actividad intrínseca y producir una elipse am pliada en las CIM más bajas. Extrapolar la elipse superior de inhibición para determ inar la CIM. h. Se puede observar un efecto de "inm ersión” en la CIM cuando se presenta resistencia inducible a los macrólidos, lo que produce una elipse con una prom inencia en el extremo. Extrapolar la curvatura de la elipse primaria para determinar la CIM. i. Ignorar una línea delgada de crecim iento a lo largo de la porción inferior de la tira, fenómeno producido por los microorganismos que crecen en un túnel de agua a lo largo de la tira. 4. Si la zona de inhibición cruza la tira entre dos marcas, leer el valor más alto. Asimismo, si la zona cruza la tira en forma ligeramente diferente en los dos lados, leer el valor más alto. 5. Si la CIM producida por la tira se encuentra entre dos números del esquem a clásico de dilución doble (sobre el cual se basan todas las recom endaciones estándares), redondear la “respuesta” hasta la siguien­ te dilución doble. Por ejemplo, una CIM de 1.5 |ig/m L se com unicaría com o 2,0 |ig/m L.

Adaptado de Etest Technical Guide: Etest fo r MIC determination, AB Biodisk, Solna, Suecia.

menos que sean incubadas a temperatura reducida. El inoculo relativamente bajo utilizado en la prueba de microdilución en caldo puede comprometer la detección de la pequeña fracción de células resistentes. Se han comunicado variaciones en la capacidad de diferentes lotes de agar de Mueller-Hinton para detectar heterorresistencia.125 Estos aislamientos, que expresan PBP 2a, son clínicamente resistentes a todos los antibióticos P-lactámicos, pero la resistencia se detecta más fácilmente con oxacilina en el laboratorio. Serán denominados estafilococos resistentes a la oxacilina, pero todos los antibióticos penicili­ nas, cefalosporinas y carbapenémicos deben ser comunicados como resistentes (cuadro 17-12). En un estudio de 975 aislamientos clínicos, Varaldo y cois, encontraron 122 cepas de S. aureus (12,5%) que tenían una sensibilidad límite a las penicilinas resistentes a las penicilinasas.329 Existen cuatro posibles mecanismos para este resultado. Al principio, McDougal y Thornsberry comunicaron que la hiperproducción de P-lactamasa es el mecanismo por el cual algunas cepas de S. aureus con sensibilidad limítrofe expresan resistencia a la oxacilina y ésta parece ser la explicación más frecuente.198 Las cepas hiperproductoras pueden detectarse rea­ lizando una prueba de CIM con una combinación de un inhibi­ dor de la P-lactamasa y un antibiótico P-lactámico (fig. 17-30). Chang y cois, observaron que en las cepas de S. aureus con una CIM < 64 pg/mL, la CIM se redujo de 4 a 32 veces si se agre­ gaban 4 pg/mL de sulbactam u 8 pg/mL de tazobactam.44 El agregado de un inhibidor a las cepas con una CIM de oxacili­ na > 64 pg/mL no alteró la CIM, aunque estas cepas también produjeron P-lactamasa. El mecanismo para una sensibilidad límite no siempre es la hiperproducción de P-lactamasa con­ vencional.9 Se describió una p-lactamasa que hidroliza especí­ ficamente la meticilina.194 Un tercer mecanismo es la modifi­ cación de la unión del antibiótico a las proteínas de unión a penicilina normales.322 Por último, algunas cepas que tienen una sensibilidad limítrofe poseen el gen mecA y producen pro­ teína de unión a penicilina 2a en un bajo nivel.101 Con estas cepas limítrofes puede ser útil una variante de la prueba por difusión con discos o la demostración de una proteína de unión alterada.83 En general, las cepas límites hiperproductoras tienen una CIM de 4 a 8 Ug/mL. A diferencia de las cepas heterorresistentes, que demuestran resistencia a múltiples fármacos, estas cepas suelen ser sensibles a otros antibióticos. Las pruebas experimentales a partir de un modelo animal de endocarditis sugieren que estas cepas sensibles límites deben responder al tratamiento con oxacilina como lo hacen las cepas completa­ mente sensibles.315 Algunos estudios clínicos limitados indican lo mismo.118193 Si existe alguna duda acerca de la respuesta clí­ nica, la administración de vancomicina es el tratamiento con­ servador adecuado. Es probable que ningún procedimiento fenotípico aislado detecte resistencia del estafilococo a la oxacilina con absolu­ ta confiabilidad. Algunas m anipulaciones aumentan la proba­ bilidad de que se demuestre resistencia (recuadro 17-8). Sin embargo, también es probable que algunas manipulaciones, como la incubación prolongada de las pruebas de sensibili­ dad, puedan generar falsas estimaciones de resistencia 49 Es probable que el más confiable de los métodos fenotípicos sea la evaluación por dilución en agar con 6 Ug/mL de oxacilina. Swenson y cois, investigaron las condiciones óptimas para este enfoque fenotípico.303 El método de referencia (g o ld standard), que aún no se encuentra ampliamente disponible, es la detección del gen mecA por la amplificación de ácidos nucleicos.

Problemas especiales con las pruebas de sensibilidad

Cuadro 17-25

ANTIBIÓTICO

9 59

Pruebas de detección para las P-lactamasas de espectro ampliado PUNTO DE CORTE DE LA CIM

DISCO Y PUNTO DE CORTE DE LA ZONA

COMENTARIOS'’

4 (ig/mL

10 (ig; < 17 mm

Parece ser el indicador general más sensible;318 no es útil para K. oxytoca;316 puede dar resultados positivos falsos con E. coli312

I Ceftazidim a

1 ng/m L

30 |j.g; < 22 mm

Las cepas con resistencia de alto nivel no pueden ser evaluadas en el ensayo confirm atorio de ceftazidim a;296 es posible que no detecte resis­ tencia en K. pneumoniae y E. coli

Aztreonam

1 Ug/mL

30 ng; < 27 mm

Cefotaxim a

1 |lg/m L

30 ng; á 27 mm

Ceftriaxona

1 |ig/m L

30 ng; á 25 mm

Las cepas m uy sensibles no pueden ser evaluadas en el ensayo confirm a­ torio de ceftriaxona296

Cefipim a

1 Ug/mL

ND

No incluido en los documentos del CLSI; puede ser útil para diferenciar las enzimas Am pC de las especies de Enterobacter y las especies de Serrada,296-316

Cefoxitina

Puntos de corte del NCCLS

Puntos de corte del NCCLS

N o está incluido en los docum entos del CLSI; la resistencia puede indi­ car un productor de A m pC50 o puede diferenciar entre los mecanismos de resistencia distintos de las p-lactam asas de espectro am pliado296

Cefpodoxima

“La sensibilidad de detección y la facilidad de la interpretación aumentan si se utiliza más de un antibiótico indicador. bObsérvese que las indicaciones actuales del CLSI pueden diferir de las aplicables en el momento en que se realizaron los estudios de referencia. ND, no disponible. Adaptado de las referencias217-218.

La detección de resistencia es muy aguda con los estafiloco­ cos coagulasa negativos. En un intento por corregir la caracte­ rización inapropiada de las cepas como sensibles a la oxacili­ na, el CLSI ha modificado el valor crítico de sensibilidad para las cepas coagulasa negativas de 2 |lg/m L a 0,25 (ig/mL.217 218 Esta modificación mejoró la situación para S. epiderm idis, la especie aislada más frecuente, pero en el proceso, las cepas de algunas especies menos aisladas, como S. lugdunensis y S. saprophyticus, fueron clasificadas en forma inadecuada como resistentes cuando carecían del gen mecA.85110 Por fortuna, el único mecanismo para la verdadera resisten­ cia de los estafilococos a la oxacilina es la alteración de las PBP 2. Dada la insistente solicitud de caracterización fenotípica, la solución obvia es la detección genotípica de resistencia. De hecho, la prueba de referencia es la detección del gen para la proteína alterada mediante un método de amplificación, como PCR.186 188 En este punto, estas pruebas están limitadas a los laboratorios de especialidad, pero es probable que la técni­ ca esté más difundida en el futuro cercano. Mientras tanto, se pueden conseguir pruebas comerciales simplificadas para la detección del gen o del producto genético y sirven a este pro­ pósito.129140 Aunque en teoría son más convenientes que las pruebas fenotípicas, el conjunto actual de ensayos fenotípicos también presenta dificultades metodológicas, de modo que pro­ bablemente sea prudente usar una combinación de pruebas, ya sea de rutina o selectivas.304 Para los agentes antibióticos dis­ tintos de los p-lactámicos sigue siendo necesario utilizar las pruebas fenotípicas. Como se mencionó, es difícil detectar resistencia a las cefa­ losporinas entre los estafilococos. Existen pruebas clínicas de que las cepas de S. aureus resistentes a la oxacilina no respon­ den in vivo al tratamiento con cefalosporinas; también se ha sugerido el mismo fenómeno para S. epiderm idis ,218-219 Si se

demuestra resistencia a nafcilina, oxacilina o meticilina, la cepa bacteriana debe ser comunicada como resistente a otros antibióticos p-lactámicos, incluidas todas las cefalosporinas, como cefazolina o cefalotina y el antibiótico carbapenémico imipenem (véase cuadro 17-12).

VANCOMICINA Una cepa de S. haemolyticus que desarrolló resistencia a la vancomicina durante el tratamiento de un paciente con episo­ dios recurrentes de peritonitis, descrita en 1987,282 fue el pre­ sagio de la pesadilla de todos: la aparición de una resistencia similar en S. aureus. La producción en el laboratorio de aisla­ mientos de S. aureus con una disminución de cuatro veces en la sensibilidad a la vancomicina fue una advertencia de que sólo era cuestión de tiempo.53 El cambio en la sensibilidad se relacionó con la presencia de una proteína citoplasmática de 39 kDa. Más aún, se pudieron transferir en el laboratorio genes enterocócicos para resistencia a la vancomicina a S. aureus.230 Por fortuna, llevó una década que las cepas clínicas expresa­ ran resistencia. El primer aislamiento, que expresó una sensibi­ lidad reducida más que una resistencia completa a la vancomi­ cina, fue registrado en Japón,2 pero pronto se aislaron cepas similares en pacientes de otras partes del mundo, incluidos los Estados Unidos.310 Las cepas de S. aureus resistentes a la van­ comicina o con resistencia intermedia a este antibiótico reciben la designación de VRSA y VISA, respectivamente, por sus siglas en inglés.294 Aunque la vancomicina es el único antibió­ tico glucopéptido utilizado comúnmente en los Estados Unidos, el problema también concierne a otros glucopéptidos (en inglés GISA o, por extensión, GRSA). La resistencia a la vancomicina puede ser expresada en forma homogénea por los estafilococos pero, como sucede con

960

CAPÍTULO 17

Cuadro 1 7 -2 6

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Pruebas confirmatorias para las |}-lactamasas de espectro ampliado

MÉTODO

CRITERIOS PARA p-LACTAMASAS DE ESPECTRO AMPLIADO

COMENTARIOS

ILUSTRACIÓN

Prueba de doble disco

Aum ento de la zona de inhibición que enfrenta al disco que contiene el inhibidor de la P-lactamasa

La colocación de los discos es fundamental; puede ser necesaria la separación de los centros de los discos tanto por 20 mm como por 30 mm

Figura 17-26

Com paración de la CIM o la zona de inhibición alrededor del disco en presencia o ausencia de un inhibidor de las P-lactamasas

Disminución en la CIM > 8 veces (tres diluciones de duplicación) o aum ento > 5 mm en el tamaño de la zona en presencia del inhibidor de la p-lactam asa

El CLSI recom ienda el uso de ceftazidim a como de cefotaxim a con ácido clavulánico y sin él

Figura 17-27

Prueba para p-lactamasas de espectro ampliado Vitek®

D ism inución en la CIM calculada en presencia del inhibidor de la p-lactam asa

Resultado calculado m ediante software

No se muestra

Etest®

Tira de doble extremo con un P-lactám ico en un extremo y la com binación de P-lactámico e inhibi­ dor de la p-lactam asa en el otro

Reducción en la CIM > 8 veces en presencia del inhibidor de la p-lactam asa

Figura 17-28

Prueba tridim ensional

A gujero circular recortado en el agar entre la posición de los discos; luego llenado con inoculo bacteriano; la distorsión del tam año de la zona en el punto de corte indica P-lactamasas de espectro ampliado

M étodo más sensible, pero de realización técnica más exigente

No se muestra

la oxacilina, las cepas pueden ser heterorresistentes (lo que se expresa en una pequeña porción de las células bacterianas).294 La detección de cepas heterorresistentes puede ser problemáti­ ca y los CDC han establecido recomendaciones para las prue­ bas del laboratorio (recuadro 17-9). La difusión con disco y los métodos en los cuales se reduce el tiempo de incubación son problemáticos. Desde el punto de vista clínico, el problema de la resisten­ cia se torna más complejo por tres factores: 1) los estafiloco­ cos, sobre todo S. aureus, son los principales patógenos; 2) la vancomicina ha sido la red de seguridad terapéutica durante muchos años y 3) las cepas a menudo expresan resistencia a diversos antibióticos, entre ellos oxacilina y quinupristinadalfopristina (un antibiótico antiestafilocócico recién desarro­ llado).342

MACRÓLIDOS, LINCOSAMIDAS Y ESTREPTOGRAMINAS La resistencia a los macrólidos entre los estafilococos está mediada por la salida activa de antibióticos desde las células bacterianas ( msrA ) o por la modificación de los dianas ribosó­ micos (habitualmente ermA o erm C ).176 La modificación ribosómica puede ser expresada constitutivamente o puede ser inducible.271 La resistencia a la eritromicina se detecta con mayor facilidad que la resistencia a la clindamicina. Las cepas sensibles a la eritromicina son confiablemente sensibles a la clindamicina, pero lo opuesto no siempre es cierto. La nomen­ clatura para los mecanismos de resistencia para este grupo de antibióticos ha sido revisada por Roberts y cois.271 Las cepas de estafilococos que expresan una resistencia constitutiva a la eritromicina y la clindamicina presentan poca dificultad, porque serán detectadas como resistentes in vitro.

A Figura 17-26 Prueba de doble disco para la producción de p-lactamasas de espectro ampliado en un aislamiento de Klebsiella pneum oniae. (A) La zona que rodea a un disco de ceftriaxona (CRO) está distorsionada y ensanchada del lado que enfrenta un disco que contiene ácido clavulánico (AMC). (B) Se dem uestra un fenó­ meno sim ilar con un disco que contiene ceftazidim a (CAZ) adyacente a un disco que contiene ácido clavulánico (AMC).

Problemas especiales con las pruebas de sensibilidad

A

Figura 17-27 Prueba de la CIM para la producción de P-lactam asas de espectro ampliado en un aislamiento de Escherichia coli. La CIM de este ais­ lam iento para ceftazidim a es de 16 |J.g/mL (A); cuando se com bina con ácido clavulánico la CIM es < 0,25 |ig/m L (B). La CIM del aislamiento para ceftria­ xona es 2 ng/m L (C); en presencia de ácido clavulánico la CIM es < 0,25 (ig/mL (D). Por lo tanto, en cada caso existe una reducción > 4 veces de la CIM en presencia de ácido clavulánico, lo que dem uestra la presencia de una P-lac­ tam asa de espectro ampliado.

Sin embargo, cuando la resistencia es inducible puede existir una disociación entre los resultados. La resistencia a los macró­ lidos de 14 miembros y de 15 miembros, como la eritromicina, se induce más fácilmente que la resistencia a los macrólidos de 16 miembros y las lincosamidas, como la clindamicina. Existen pruebas de que la resistencia inducible a la clindamici­ na tiene importancia clínica.237,288 Cuando una cepa de S. aureus expresa resistencia disociada, se debe realizar una prue­ ba de inducción antes de que se comunique una prueba como sensible a la clindamicina. El método más simple es aprovechar

A U TO N O M ÍA

B

961

A N TA G O N IS M O

Figura 17-29 Diagram a de las interacciones potenciales en la prueba por difusión con discos para la sinergia bacteriana. Se han colocado los discos que contienen antibióticos A y B en placas de agar de M ueller-Hinton que han sido inoculadas con un aislamiento bacteriano. (A) Efectos aditivos o indiferentes; cada antibiótico produce una zona de inhibición que no es afectada por el anti­ biótico adyacente. (B) Efectos antagónicos, en los cuales las zonas inhibitorias de cada antibiótico están dism inuidas en presencia del otro antibiótico. (C) Dos manifestaciones posibles de interacciones sinérgicas. A la izquierda, apa­ rece una zona de inhibición agrandada donde se encuentran los dos antibióti­ cos. A la derecha, ninguno de los antibióticos es inhibitorio por sí solo, pero el crecim iento bacteriano está inhibido donde los dos antibióticos se difunden juntos.

la tendencia de la eritromicina a inducir resistencia al realizar una prueba de doble disco.86,237 Si se colocan discos que con­ tienen eritromicina y clindamicina en proximidad y la eritro­ micina induce resistencia, se distorsiona la zona de inhibición que rodea al disco de clindamicina. El aplanamiento resultante de la zona de inhibición produce una forma en D que es simi­ lar a la producida por los antibióticos antagónicos en la figura

y 0,38

Figura 17-28 Banda de Etest para la dem ostración de producción de p-lactam asa de espectro ampliado en un aislamiento de Klebsiella pneumoniae. La CIM del aislamiento para ceftazidim a (TZ) es de 6 ng/m L. (Obsérvese que la zona de inhibición interseca la banda más próxima a los 4 Ug/mL del lado infe­ rior, pero la intersección es en los 6 |J,g/mL del lado superior; se registra el valor m ás alto). En el otro extremo de la banda la CIM del aislamiento para ceftazidim a en presencia de ácido clavulánico es de 0,38 jig/mL. L a reducción de la CIM es > 4 veces, lo que indica la presencia de una enzim a P-lactamasa de espectro am pliado en la cepa. O bsérvese la im presión sobre el césped de bacterias de la banda (punta de flecha), que inicialmente se dejó caer de arriba hacia abajo sobre la placa; com o el lado que estaba impregnado con antibióti­ co no tocó el agar, era aceptable recolocar la banda y continuar la prueba.

Figura 17-30 Se ha evaluado un aislamiento de Staphylococcus aureus con sensiblidad lim ítrofe a la oxacilina con el agregado de ácido clavulánico, un inhibidor de la P-lactamasa. o sin él. En ausencia del inhibidor, la CIM de la cepa es de 4 [Xg/mL. D espués del agregado de ácido clavulánico la CIM es de 1 |ig/m L. La resistencia de esta cepa deriva de la hiperproducción de P-lactamasa.

962

CAPÍTULO 17

R ecuadro 17-8

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Aum ento al máxim o de la detección de estafilococos resistentes a la meticilina

1. Para S. aureus, es más probable que la oxacilina detecte resistencia cru­ zada entre las penicilinas resistentes a la penicilinasa que otros com ­ puestos. No se debe utilizar cloxacilina ni dicloxacilina. porque es posi­ ble que no detecten resistencia a la oxacilina.217 Coudron y cois, han sugerido que la m eticilina puede detectar resistencia en S. epidermidis m ejor que la oxacilina.49 2. El agregado de NaCI al 2% al caldo o el agar para las pruebas de dilu­ ción aum enta la detección de resistencia.218 3. El inoculo debe ser preparado por el m étodo directo alternativo, utili­ zando colonias de una placa fresca durante toda la noche (véase proto­ colo 17-1). 4. Los cultivos deben ser incubados a 35 °C durante 24 horas completas. 5. Si se utiliza el procedim iento de difusión con discos, se debe examinar con cuidado el borde de la zona aparente de inhibición. El borde es definido y claro cuando se evalúan m icroorganismos sensibles a la oxa­ cilina. El crecim iento de m icroorganism os resistentes a la oxacilina “se vuelve horizontal” o "se va apagando” a m edida que se aproxim a al disco de m odo que puede ser difícil detectar el borde interior de creci­ m iento (fig. 17-31). 6. Si la sensibilidad de una cepa de S. aureus a la oxacilina no es clara, realizar una prueba para ei gen mecA (véase el texto) o una prueba de detección en agar con oxacilina-sales. Para la prueba de detección, utili­ zar agar de M ueller-Hinton con NaCI v/v al 4% y 6 (ig/mL de oxacilina por mililitro. Realizar una suspensión directa de las colonias hasta una densidad com parable a un estándar de M cFarland 0,5. Utilizando un ansa de 1 jiL. colocar la suspensión en un área que tenga 10 a 1 mm de diámetro. Com o alternativa, realizar una mancha en un área sim ilar o sem brar en estría un cuadrante con un hisopo que ha sido sumergido en la suspensión. Incubar la placa a 35 °C en aire am biente durante 24 horas. Exam inar con luz transm itida para > 1 colonias o una película clara de crecim iento.218

17-29B. Este patrón indica una resistencia inducible; la cepa debe ser comunicada como resistente a la clindamicina. En ausencia de resistencia -y a sea intrínseca o inducible- la cepa puede ser comunicada como sensible a la clindamicina. Aunque la mayor parte de la atención se ha concentrado sobre los estafilococos, también puede hallarse resistencia indu­ cible a la clindamicina en los estreptococos y, más rara vez, los enterococos. Al parecer, la prueba del disco doble detecta este fenómeno en los estreptococos y en los estafilococos. (Véase la explicación de un caso de infección por estreptococos del grupo B en el sitio web de los CDC - https://www.phppo.cdc.gov/dls/master/view_document.axpx?id=2).

FLUOROQUINOLONAS

Las fluoroquinolonas, que al principio constituyeron una alternativa terapéutica potencialmente importante para los esta­ filococos resistentes a la meticilina, se hallan cada vez más comprometidas por la resistencia creciente. Operan dos meca­ nismos: 1) una mutación en la girasa que es el sitio diana de esta clase de antibióticos109 y 2) una bom ba de salida activa de sodio mediada por NorA, una proteína transportadora de múltiples fármacos.223 La resistencia a las fluoroquinolonas es más frecuente en las cepas resistentes a la meticilina (oxacili­ na) que en las cepas sensibles; se puede desarrollar con una rapidez preocupante cuando se utiliza esta clase de antibiótico sin restricción en los hospitales.5

Especies de Haemophilus

Los microorganismos Haemophilus requieren hemina (fac­ tor X) o nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) (factor V) para el crecimiento. Se ha establecido la validez de agregar suplementos tanto a los medios de sensibilidad por dilución como de difusión. Jorgensen y cois, han sugerido un suple­ mento para las pruebas de sensibilidad de H aemophilus.'54 El NCCLS ha adoptado el medio de prueba para Haemophilus, que puede contener suplemento de cationes si fuera apropiado. Las ventajas del medio incluyen claridad visual y confiabilidad de las pruebas con trimetoprim-sulfametoxazol.154 Sin embar­ go, algunos investigadores han experimentado problemas con el rendimiento del medio de prueba para Haemophilus tanto de preparación local como comercial.203 La preparación correcta del inoculo es muy importante para evaluar las especies de Haemophilus. Se debe utilizar el método directo alternativo para estandarizar la suspensión bacteriana de un cultivo durante toda la noche (véase proto­ colo 17-1). Jorgensen y cois, encontraron una buena relación entre el Etest y las pruebas estandarizadas de microdilución para Haemophilus influenzae.' Un estudio reciente de métodos de examen de la sensibilidad para H. influenzae documentó un rendimiento generalmente aceptable entre los métodos de uso frecuente.102 Los procedimientos y las interpretaciones creados para H. influenzae pueden aplicarse también a otras especies de Haemophilus.'50''51

Las pruebas de sensibilidad a los antibióticos de H. influen­ zae han sido revisadas por Doern y Jones.64

PENICILINAS

Doern y cois, documentaron una prevalencia del 15,2% para la producción de P-lactamasas en Haemophilus influenzae. La frecuencia de la degradación enzimática de ampicilina fue del 21% para las cepas encapsuladas de H. influenzae tipo b y del 12% para las cepas no encapsuladas de H. influenzae.6466 La probabilidad de que una bacteria aislada produjera p-lacta­ masa era mayor si era aislada en lactantes y niños pequeños que en adultos y si era aislada de sangre y líquido cefalorra­ quídeo más que en otros líquidos o tejidos. La incidencia de producción de P-lactamasa en un estudio cooperativo nacional fue del 20%, pero otra vez hubo una dico­ tomía entre las cepas encapsulas y no encapsuladas.67 La preva­ lencia de la enzima p-lactamasa fue del 31,7% en las cepas tipo b y del 15,6% en las cepas no encapsuladas de H. influenzae. Se detectó resistencia a la ampicilina, no mediada por p-lactamasa, sólo en el 0,1% de las cepas. Un estudio repetido un año más tarde, limitado a los aisla­ mientos respiratorios, documentó una prevalencia del 16,5% para la producción de P-lactamasa por H. influenzae. La fre­ cuencia de resistencia en las cepas tipo b encapsuladas y en cepas no encapsuladas fue del 29,5% y del 15%, respectiva­ m ente.147 Todos los aislamientos de especies de Haemophilus que son agentes etiológicos de infecciones graves deben ser evaluados para producción de P-lactamasa, preferentemente con el proce­ dimiento de la nitrocefina. Los aislamientos en sitios corpora­ les estériles que no producen la enzima deben ser evaluados para resistencia intrínseca siempre que sea posible. Aunque la resistencia intrínseca ha sido rara, existen pruebas de disemi­ nación clonal de estas cepas en algunos hospitales.156 En cual­ quier caso, los aislamientos deben ser derivados a un laborato-

Problemas especiales con las pruebas de sensibilidad

96 3

Figura 17-31 Se m uestra el efecto de la sal sobre la expresión de resistencia de los estafilococos a la meticilina. Se evaluó una cepa sensible contra un disco de ?\acílin a de 1 |ig en agar de M ueller-Hinton que no tenía un suplemento de sal (A) o que contenía NaCI al 4% (B). L a zona de inhibición bacteriana no fue afec:^da por el agregado de sal. También se evaluó una cepa resistente a la meticilina contra oxacilina en agar de M ueller-Hinton sin (C) el agregado de NaCI al 4% y con él (D). Sin sal, se produjo una zona clara de inhibición (C) y el aislamiento sería considerado sensible. En presencia de sal hubo un crecim iento gradualmente decreciente o “esfum ado” inm ediatam ente arriba del disco; este m icroorganism o debe ser considerado resistente a la oxacilina y a otras penicilinas resistentes a la penicilinasa.

rio de referencia si existe alguna duda acerca de la correlación de los resultados del laboratorio y clínicos.

CLORANFENICOL

Durante años el fármaco de refuerzo para las infecciones graves por Haemophilus fue el cloranfenicol. Si bien es infre­ cuente, también se ha desarrollado resistencia a este antibióti­ co. La frecuencia de resistencia al cloranfenicol entre los aisla­ mientos de H. influenzae fue del 0,5% en un estudio coopera­ tivo nacional.67 En casi todos los casos la resistencia está mediada por degradación enzimática.97 Doern y cois, han halla­ do una prueba en tubo significativamente más precisa que una modificación en disco del ensayo rápido para la cloranfenicol acetiltransferasa.62

CEFALOSPORINAS

Las cefalosporinas de primera generación son poco eficaces contra Haemophilus influenzae y no deben ser evaluadas. Las cefalosporinas de segunda generación, como cefamandol y cefuroxima, son eficaces contra las especies de Haemophilus in vitro, pero lo son menos cuando se las necesita más: para las cepas que producen p-lactam asa.148 Se describieron fracasos terapéuticos con las cefalosporinas de segunda generación. Las cefalosporinas de tercera generación, como ceftriaxona, son uniformemente eficaces contra H. influenzae.

TRIMETOPRIM-SULFAIVIETOXAZOL

Se puede detectar resistencia de Haemophilus influenzae a trimetoprim-sulfametoxazol en menos del 1% de las cepas.147 Aunque no es el fármaco de elección para la enfermedad sisté­ mica grave, el tratamiento con trimetoprim-sulfametoxazol ha sido exitoso para las infecciones pulmonares. Streptococcus pneumoniae PENICILINA Y OTROS ANTIBIÓTICOS (3-LACTÁMIC0S

Durante muchos años, la penicilina fue el tratamiento están­ dar para las infecciones neumocócicas y las pruebas de sensi­ bilidad no estaban indicadas. El surgimiento de cepas que son resistentes a múltiples antibióticos, incluida la penicilina, ha abierto una brecha incluso en este bastión de la antibioticoterapia. Las cepas que tienen CIM entre 0,1 y 1 |ig/m L se conside­ ran relativamente resistentes a la penicilina; aquellas con CIM mayores de 1 fig/mL son designadas como resistentes. Lamen­ tablemente, la frecuencia de cepas que son relativa o totalmen­ te resistentes a la penicilina está aumentando en los Estados Unidos.63'319,344 Sin embargo, sigue existiendo variación geo­ gráfica en la frecuencia de la resistencia.319 Parte de esta razón para esta distribución geográfica irregular puede ser la aparen­ te diseminación de una pequeña cantidad de clones neumocó­ cicos resistentes.270 El mecanismo de la resistencia del neumococo a la penici­ lina es la alteración en las proteínas de unión a penicilina.42 Streptococcus pneum oniae no produce P-lactamasas. Diver-

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CAPÍTULO 17

R ecuadro 1 7 -9

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

D e te c c ió n d e re s is te n c ia a la v a n c o m ic in a e n lo s e s ta filo c o c o s

1. Los métodos cuantitativos (CIM) han sido validados por los CDC para la detección de S. aureus de sensibilidad intermedia a la vancomicina y S. aureus resistente a la vancomicina. Se evaluaron tanto los métodos de m icrodilución com o de dilución en agar. Los sistemas com erciales estudiados incluyeron paneles para CIM M icroScan Conventional (Dade MicroScan. West Sacram ento. CA), los sistemas Vitek y Vitek 2 (BioM érieux, Hazelwood. MO), Sensititer System (TREK Diagnostic Systems, Cleveland, OH), los paneles Pasco Microdilution (BD. Franklin Lakes, NJ) y el Etest utilizando un estándar de M cFarland 0,5 para preparar la suspensión del inóculo (AB Biodisk, Piscataway, N J). Algunos sistemas autom áticos no pudieron detectar todas las cepas de S. aureus resistentes a la vancomicina. de m odo que se recom ienda realizar pruebas adicionales con una placa para detección sistem ática en agar. 2. La prueba de detección sistemática en agar con vancom icina utiliza infusión de cerebro y corazón que contiene 6 |ig/m L de vancomicina. Se siembra en estría o se realiza una mancha con un inóculo de 1 a 10 |iL de una suspensión de M cFarland 0.5 (concentración final de las bacterias, 105 a 106 UFC/mL) en la superficie del agar. El crecimiento de más de 1 colonia después de una incubación durante 24 horas indica resistencia. Las cepas control, que se deben utilizar en cada día de la prueba, son S. aureus (ATCC 25923, sensibles) y E. faecalis (ATCC 51299, resistentes). 3. Se ha acum ulado una cantidad insuficiente de cepas no sensibles para establecer los tam años de las zonas puntos de corte para la prueba por difusión en disco. Una zona de al menos 15 m m se considera sensible; si las zonas son más pequeñas, se debe realizar una prueba de dilución o se debe enviar el aislamiento a un laboratorio de referencia. 4. Los aislamientos con una CIM de 4 (ig/mL u 8 )ig/mL (5. aureus de sensibilidad intermedia a vancom icina o de sensibilidad interm edia a otros glucopéptidos) no son detectados en form a confiable por la prue­ ba por difusión con discos. Por lo tanto, si se utiliza este método, se debe em plear un procedim iento adicional, com o la prueba de detección en agar con vancomicina. Las pruebas se deben realizar en todos los aislamientos; com o alternativa, se pueden seleccionar cepas que son resistentes a la oxacilina, ya que la m ayoría de las cepas que son resis­ tentes a la vancom icina también son resistentes a la oxacilina. 5. Las placas o las bandejas para la determ inación de sensibilidad a la vancom icina en los estafilococos deben ser incubadas en aire ambiente durante 24 horas com pletas a 37 °C. 6 . Las cepas de estafilococos que parecen tener una sensibilidad interme­ dia o ser resistentes a la vancom icina deben ser derivadas a un laborato­ rio de referencia o a un laboratorio de salud pública para otros análisis.

Referencia hallada en http://www.cdc.gov/ncidodAiip/lab/FactSheel/vrsa.htm.

sas proteínas de unión participan en la adquisición de resis­ tencia y producen una disminución escalonada de la sensibi­ lidad. Es interesante señalar que el 70% de las cepas clínicas de neumococos resistentes a la penicilina muestran, además, una lisis defectuosa, propiedad que también aumentaría su supervivencia.208 Se postulan dos tipos de presión de los anti­ bióticos sobre los neumococos como explicaciones para los fenómenos concordantes. Las cepas de neumococos resisten­ tes a la penicilina pueden ser clónales, pero son posibles múl­ tiples vías para la resistencia y han surgido cepas resistentes en forma independiente en diversas localizaciones geográfi­ cas. La resistencia a la penicilina puede ser transferida hori­ zontalmente de una cepa de neumococo a otra, al parecer por

transform ación.189 Ocurre una variación considerable en los genes para las proteínas alteradas a partir de la reparación desequilibrada después de la transferencia. La resistencia a la penicilina ocurre con distintos serogrupos y entre diversas cepas que pueden ser diferenciadas mediante tipificación molecular,74 pero parece que relativamente pocos clones constituyen la fuente dominante de cepas m ultirresistentes.270 Lamentablemente, muchas de las cepas resistentes pertenecen a serotipos que están incluidos en las vacunas neumocócicas de uso frecuente.130 Los factores de riesgo para una infección grave por cepas resistentes incluyen el uso previo de antibióticos |}-lactámicos, la edad inferior a 15 años, la infección de las vías respiratorias altas y el origen hospitalario de la infección.15 Además, la fre­ cuencia con la cual se utilizan antibióticos p-lactámicos en la comunidad puede tener un efecto sobre la aparición de cepas neumocócicas resistentes.98-58 Los neumococos resistentes a la penicilina también tienen m enor sensibilidad a otros antibióticos P-lactám icos.177 Imipenem, meropenem, cefotaxima, ceftriaxona y cefpirona son más activos in vitro que la penicilina. Ampicilina, cefdinir. cefuroxima, cefoperazona, azlocilina, mezlocilina, piperacilina, cefalotina y cefamandol muestran ligeramente menos acti­ vidad que la penicilina. Oxacilina, cefixima, ceftizoxima, cefetamet, cefaclor, ceftazidima, cefoxitina, cefonicid y latamoxef muestran muy poca actividad contra las cepas resistentes. Se ha sugerido que se puede utilizar la penicilina para predecir la sensibilidad a otros antibióticos P-lactámicos, porque las rela­ ciones de las concentraciones inhibitorias mínimas son constan­ tes.28-58 El mecanismo para la resistencia a estos otros antibióti­ cos P-lactámicos también es una alteración en las proteínas de unión a penicilina.210 Se puede agregar sangre de camero al 5% al agar de Mueller-Hinton y sangre de caballo hemolizada al 2-5% a los medios de caldo para el crecimiento de S. pneum oniae. El con­ trol de calidad de estas pruebas debe incluir cepas neumocóci­ cas resistentes conocidas, además de los microorganismos de control estándares. La incubación en CO^ es aceptable si es necesaria para el crecimiento de la cepa. Se ha comunicado que el medio de prueba de Haemophilus descrito antes funciona bien para el apoyo del crecimiento de neumococos en pruebas de microdilución en caldo,152 aunque no ha funcionado bien en todos los laboratorios. En la mayoría de los laboratorios, la prueba más simple para la detección de resistencia es una variante de la prueba de difu­ sión con discos. Aunque se han utilizado discos de penicilina en algunos estudios, el procedimiento recomendado por el NCCLS para la detección de resistencia a la penicilina incor­ pora un disco de 1 |ig de oxacilina. Las cepas que tienen un diámetro de la zona inferior o igual a 19 mm deben ser comu­ nicadas provisoriamente como no sensibles a la penicilina (fig. 17-32); se debe disponer la confirmación mediante una prueba de sensibilidad por dilución. Swenson y cois, observaron que la oxacilina era mejor elemento de predicción de la sensibilidad a la penicilina que la meticilina.302 La prueba de difusión con dis­ cos no diferencia las cepas que son relativamente resistentes (CIM, 0,1 a 1 (ig/mL) de las que son resistentes (CIM, > 2 (j.g/mL). Una cepa de S. pneumoniae que presumiblemente es resistente a la penicilina debe ser evaluada en una prueba de dilución en caldo confiable. Los sistemas comerciales de pruebas de sensibilidad tienen un rendimiento variable para la detección de resistencia a la penicilina en los neumococos. El sistema Pasco y el Etest fun­ cionaron mejor y produjeron resultados que fueron compara­

Problemas especiales con las pruebas de sensibilidad

r e? con los métodos de referencia para todos los antibióticos r . epto para la combinación de Etest y trimetoprim-sulfameto*izo \. Otros sistemas, que incluyen los paneles rápidos MicroScan, no resultaron tan buenos o su rendimiento fue es­ caso.*19Sin embargo, las evaluaciones ulteriores han documen­ t o el mejor rendimiento de varios de los sistemas, incluidos los paneles MicroScan MICroSTREP®.113'153 El Etest ha sido evaluado en forma independiente en un estu­ dio cooperativo, el cual documentó tasas bajas de erorres menores con penicilina (9,5%) y cefotaxima (5,4%) (véase fig. '-2 5 ).149 La vancomicina es el tratamiento estándar para las cepas que producen una infección sistémica grave. Hashemi y cois, han observado que el Etest produce resultados más altos en la CIM que la prueba de microdilución en caldo, lo que r.¿ntea la preocupación de que puedan ocurrir informes de falsa resistencia.120 Aunque las cepas relativamente resistentes han respondido al tratamiento penicilínico en la neumonía neumocócica,87 es posible que la meningitis no sea tratada con éxito porque las . rmcentraciones del antibiótico son más bajas en el líquido cefalorraquídeo.238 Las cepas que tienen una CIM mayor de - Ug/mL es improbable que respondan al tratamiento con penicdína en cualquier situación clínica. El NCCLS tiene valores críticos diferenciados para cefalosporinas potencialmente efi-aces. según que las cepas sean aisladas en el líquido cefalo­ rraquídeo o en otros sitios.217’218

RESISTENCIA MÚLTIPLE

Lam entablem ente, muchas de las cepas neum ocócicas que ' on resistentes a los antibióticos P-lactámicos también lo son a otras clases de antibióticos (cepas m ultirresistentes).63-319 Se han afectado macrólidos, tetraciclinas, cloranfenicol, tri­ metoprim-sulfametoxazol y. en menor grado, fluoroquinolo-

MACRQLIDOS Y LINCOSAMIDAS

La resistencia de S. pneum oniae a los macrólidos ha ido aumentando durante muchos años. Se ha documentado una asociación entre la resistencia a los antibióticos y el uso de antibióticos.98-254 Existen dos clases de mecanismos de resis­ tencia: 1) inactivación del antibiótico a nivel ribosómico por una metilasa (Erm) y 2) bombeado activo del antibiótico fuera de la célula bacteriana por un sistema de expulsión (Mef).287 La bomba de expulsión es el mecanismo más frecuente en las cepas aisladas en los Estados Unidos.287 La resistencia produ­ cida por este mecanismo es menos extensa que la producida por la inactivación ribosómica; además, las cepas ribosómicamente resistentes expresan también a menudo resistencia a la clindamicina.135 Varios investigadores describieron pruebas en doble disco para evaluar la resistencia inducible a la clindami­ cina en cepas neumocócicas.207-330 Como sucede en el caso de los estafilococos, las cepas de neumococos que muestran resis­ tencia inducible a la clindamicina deben ser comunicadas como resistentes; las cepas que carecen tanto de resistencia intrínseca como inducible a la clindamicina pueden ser comu­ nicadas como sensibles. La resistencia a otros macrólidos puede ser inferida a partir del resultado de la eritromicina.218 Se ha sugerido que es posi­ ble que el nivel inferior de resistencia a la eritromicina confe­ rido por el mecanismo M ef no tenga importancia clínica, pero varias comunicaciones han documentado fracasos terapéuticos con estas cepas.138-185

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Figura 17-32 Prueba de detección para resistencia de neum ococos a penici­ lina, que utiliza un disco de oxacilina de 1 |j.g en agar de M ueller-Hinton con sangre de carnero. Una cepa sensible (A) m uestra una zona grande de inhibi­ ción y puede ser com unicada com o sensible sin otras pruebas. L a segunda cepa (B) dem uestra una zona muy pequeña de inhibición. Esta cepa podría ser sen­ sible, intermedia o resistente (aunque la zona m uy pequeña sugiere que no será sensible). Para determ inar la interpretación correcta, se debe realizar una prue­ ba de CIM.

Neisseria gonorrhoeae

Durante muchos años el gonococo fue uniformemente sensi­ ble a la penicilina y el enfoque terapéutico de la infección gonocócica era bastante sencillo. A mediados de la década de 1970 aparecieron cepas de N eisseria gonorrhoeae que produ­ cían p-lactamasa78 y se propagaron con rapidez.289 Esta P-lactamasa se asemeja a la enzima TEM hallada en los bacilos entéricos y Haemophilus influenzae. Un segundo mecanismo de resistencia apareció algunos años más tarde cuando Dougherty y cois, describieron cepas resistentes que carecían de P-lactamasa pero contenían proteínas de unión a penicilina alteradas.72 Estas cepas han causado infección epidémica y esporádica.82 Una segunda arma en el arsenal antigonocócico fue elimina­ da cuando apareció un plásmido que mediaba la resistencia de alto nivel a la tetraciclina en N. gonorrhoeae ,68 Se ha docu­ mentado resistencia a las quinolonas en muchas áreas y tam­ bién se ha desarrollado resistencia a la azitromicina.40,305 Las pruebas recomendadas por el NCCLS para la detección de la resistencia mediada cromosómicamente en N. gonorrho­ eae son las pruebas de dilución en agar y de difusión en agar. El tema ha sido revisado por Doem y Jones.64 El medio reco­ mendado para las pruebas de dilución en agar es agar GC con el agregado después del tratamiento con autoclave de un suple­ mento para el crecimiento definido al 1% (1,1 g de L-cisteína, 0,03 g de HCI de guanina, 3 mg de HCI de tiamina, 13 mg de ácido para-aminobenzoico [PABA], 0,01 g de vitamina B 12, 0,1 g de cocarboxilasa, 0,25 g de NAD, 1 g de adenina, 10 g de L-glutamina, 100 g de glucosa, 0,02 g de nitrato férrico en 1 L de H ,0). Se debe omitir la cisteína cuando se evalúan carbapenémicos o clavulanato.219 Las pruebas de difusión en agar se realizan en una base de agar GC con el agregado de suplemento de crecimiento defini­ do. No se necesita un medio sin cisteína para las pruebas en disco; no se recomienda el agar chocolate enriquecido.220 Las placas de sensibilidad para evaluar N. gonorrhoeae deben ser incubadas a 35 °C en CO,. Una zona menor o igual a 26 mm en la prueba por difusión con discos para penicilina (disco de 10 |ig) indica resistencia. Un tamaño de la zona menor o igual a

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CAPÍTULO 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

19 mm suele indicar la producción de P-lactamasa, pero se pre­ fiere la prueba de la P-lactamasa para evaluar este mecanismo de resistencia. El NCCLS ha establecido criterios para la inter­ pretación de espectinomicina y tetraciclina. Un aislamiento con un tamaño de la zona menor o igual a 19 mm alrededor de un disco de 30 |ig de tetraciclina es probable que tenga un meca­ nismo de resistencia mediado por plásmidos; estas cepas deben ser evaluadas con una prueba de dilución. No ha habido cepas gonocócicas resistentes a ciertas cefalosporinas, de modo que no se ha establecido el valor crítico de resistencia.220 Todos los aislamientos de N. gonorrhoeae deben ser evalua­ dos para la producción de p-lactamasas, preferentemente utili­ zando el método de nitrocefina. Se deben realizar pruebas por dilución en agar o por difusión con discos en los aislamientos P-lactamasa negativos si la frecuencia de resistencia intrínseca a la penicilina o la prevalencia de resistencia a las tetraciclinas en la población es alta. Cualquier cepa aislada en fracasos tera­ péuticos debe ser evaluada localmente o derivada a un labora­ torio de referencia. El Etest ha mostrado buena correlación con las técnicas por dilución en agar para las cepas no productoras de P-lactamasa,328 pero es posible que no se detecte resistencia en las cepas que producen P-lactamasa,347 lo que destaca la necesidad de realizar una prueba para las producción de P-lactamasa en todas las cepas. Neisseria meningitidis

Se ha documentado la transferencia mediada por plásmidos de p-lactamasa a N eisseria m eningitidis.59 Además, se descri­ bieron cepas que son resistentes sobre la base de una altera­ ción de las proteínas de unión a penicilina.349 Al parecer, las proteínas de membrana alteradas fueron transferidas a N. m eningitidis desde especies comensales de N eisseria ,23 Se ha evaluado el Etest para el examen de N. m eningitidis con resul­ tados mixtos. Pascual y cois, han comunicado que este méto­ do exagera el grado de resistencia y sugieren que es necesaria una nueva evaluación de medios adecuados.240 Sin embargo, Marshall y cois, observaron una buena relación entre el Etest y los métodos de referencia, utilizando los criterios de la Food and Drug Adm inistration.192 Las pruebas por difusión con dis­ cos no han resultado fiables para el examen de este microor­ ganismo.22-220 En ocasiones, se solicitan pruebas de sensibilidad de los meningococos a la rifampicina con fines epidemiológicos.222 A menudo es difícil para el laboratorio generar un resultado a tiempo como para guiar la profilaxis, que debe comenzar en el momento en que se hace el diagnóstico clínico de la infección meningocócica. Especies de Enterococcus

La base del tratamiento antibiótico de las infecciones enterocócicas graves ha sido el uso de combinaciones de P-lactámicos y aminoglucósidos.131,323 Las bases de este enfoque han sido socavadas seriamente en los últimos años.187 El tema ha sido revisado por varios autores.124,174,276 En la figura 17-10 se muestran las interacciones entre antibióticos y mecanismos de resistencia. Más recientemente, también se ha detectado resis­ tencia en los “antibióticos de último recurso”, sobre todo en cepas de E. faeciu m ,134 Se han aplicado procedimientos están­ dares a los enterococos con éxito, aunque ocurrieron algunas dificultades con algunos antibióticos cuando se utilizaron prue­ bas de difusión con discos.48 Los fabricantes han encarado rápi­ damente los problemas con los sistemas comerciales.

ANTIBIÓTICOS AMINOGLUCÓSIDOS

Existen tres mecanismos para la resistencia de los enteroco­ cos a los aminoglucósidos. Las enzimas modificadoras de los aminoglucósidos, que incluyen fosfotransferasas, nucleotidiltransferasas y una acetiltransferasa, son producidas en forma constitutiva sobre los plásmidos.174 Estas enzimas se asemejan a las halladas en los estafilococos más que a las producidas en los bacilos gramnegativos. Otros mecanismos son la modifica­ ción del sitio diana ribosómico77 y la interferencia en el trans­ porte del antibiótico. Existen pruebas de la transmisión de las cepas que son resistentes a la gentamicina de animales a seres humanos a través de suministro de alimentos.71 La detección de resistencia de alto nivel de los enterococos a los aminoglucósidos es importante porque estas cepas no son inhibidas en forma sinèrgica por el tratamiento combinado con los antibióticos p-lactámicos. Se puede aceptar la resistencia de E. faecium a kanamicina, amikacina, netilmicina y tobramicina. La resistencia de estas especies a gentamicina y estreptomicina y de E .fa eca lis a todos los aminoglucósidos se puede predecir mediante pruebas in vitro con grandes concen­ traciones de antibiótico en una prueba de dilución o mediante discos con un alto contenido de antibiótico. Se recomiendan como puntos de corte concentraciones de 1 000 )ig/mL de estreptomicina por microdilución, 2 000 |ig/m L de estrepto­ micina por dilución en agar y 500 jj.g/mL de gentamicina por cualquiera de los métodos.218,301 El crecimiento de una sola colonia en placas de dilución en agar indica resistencia. Se recomiendan discos con 120 jjg de gentamicina o 300 |ig de estreptomicina para las pruebas de difusión con discos. La resistencia está indicada por < 6 mm (sin zona) y la sensibili­ dad por una zona > 10 mm. Las cepas que presentan zonas de 7 a 9 mm deben ser evaluadas por métodos de dilución.220 Los problemas con la detección de esta resistencia por los sistemas comerciales de sensibilidad han sido encarados por los fabri­ cantes. Un estudio reciente observó una concordancia casi completa entre los discos de alta potencia, los paneles de microdilución disponibles en el comercio y una placa comer­ cial de “sinergia” por dilución en agar.211

ANTIBIÓTICOS P-LACTÁMICOS

Muchas cepas de enterococos, sobre todo Enterococcus fa eciu m , son intrínsecamente resistentes a los antibióticos Plactámicos porque tienen proteínas de unión con baja afinidad por estos fármacos. En particular, las cefalosporinas son uni­ formemente ineficaces contra los enterococos y no deben ser evaluadas. En general, la ampicilina es más eficaz que la penicilina in vitro. Al menos en un estudio las cepas de E. f a e ­ cium que eran resistentes a la ampicilina fueron distintas por análisis m olecular de las cepas sensibles.155 Se ha explicado antes la aparición reciente de cepas de enterococos que pro­ ducen p-lactamasa.

VANC0MICINA

El último recurso terapéutico para los enterococos fue la vancomicina hasta que Leclercq y cois, describieron cepas de E. faecium que contenían resistencia mediada por plásmidos a los antibióticos glucopéptidos vancomicina y teicoplanina.173 También describieron aislamientos de E. fa eca lis resistentes a la vancomicina.224 La resistencia a los glucopéptidos parece ser transferida por la diseminación de un gen más que por un plásmido.75 Se describieron tres mecanismos genéticos para la resistencia de los enterococos a los glucopéptidos.276 El com­

Problemas especiales con las pruebas de sensibilidad

piejo genético vanA es inducible y es portado por una familia de plásmidos en E. faecium y E. faecalis. Este complejo codi­ fica resistencia de alto nivel tanto a la vancomicina como a la teicoplanina. VanB es un gen inducible en E. faecium que media la resistencia de bajo nivel sólo a la vancomicina por medio de una carboxipeptidasa. VanC es un gen cromosómico constitutivo que media la resistencia de bajo nivel en E. gallinarum, una cepa clínica inusual. La resistencia a la vancomici­ na, sobre todo la mediada por el gen vanB , no es detectada con­ fiablemente por todos los métodos. Lamentablemente, la resistencia de los enterococos a la van­ comicina se ha instalado y estos microorganismos se han vuel­ to epidémicos en algunos hospitales y regiones.95,209 Las carac­ terísticas de las cepas resistentes varían con el tiempo y con la localización geográfica. En un grupo de hospitales de Connecticut. la tasa media de resistencia de alto nivel a la gen­ tamicina fue del 29%; a la ampicilina del 10% (todas las cepas aisladas fueron E. faecium)-, y a vancomicina del 8%, pero nin­ gún aislamiento produjo P-lactamasa.242 Los enterococos son patógenos en entrenamiento comparados con los estafilococos y los estreptococos, pero pueden causar infecciones graves y potencialmente mortales en los pacientes hospitalizados cuyas heces están colonizadas por cepas resistentes. Los factores de riesgo para la colonización y la enfermedad invasora incluyen enfermedad grave y recepción previa de antibióticos, como vancomicina y fármacos activos contra bacterias anaerobias.37 La resistencia a la vancomicina en los enterococos ha sido aso­ ciada con episodios más frecuentes de bacteriemia recurrente, el aislamiento persistente de enterococos de sitios primarios de infección, una mayor frecuencia de infección endovascular y un aumento de la mortalidad.178 La detección de resistencia de los enterococos a la vancomi­ cina, sobre todo del fenotipo vanB , en los laboratorios clínicos no es óptima, sobre todo porque los sistemas comerciales de evaluación, que incluyen los dos métodos más utilizados -sistemas Vitek y distintos sistemas M icroScan- no recogen con eficacia la resistencia de nivel moderado y nivel intermedio.313 En un estudio de los laboratorios de New Jersey, 96% de 76 laboratorios clínicos pudieron reconocer la resistencia en una cepa de E. faecium con resistencia de alto nivel a la vancomi­ cina (CIM, 512 |Jg/mL), pero sólo 27% de los laboratorios comunicaron una cepa de E. faecium con una resistencia mode­ rada (CIM, 64 ng/mL) como resistente.314 Una cepa de E. f a e ­ calis con resistencia de bajo nivel (CIM, 32 |ig/mL), un fenoti­ po vanB típico, sólo fue reconocida como resistente por el 16% de los laboratorios, y una cepa de E. gallinarum con un fenoti­ po vanC típico (CIM, 8 |ig/mL) fue caracterizada correctamen­ te por el 74% de los participantes. En un estudio comparativo de los Centers for Disease Control and Prevention, Tenover y cois, evaluaron 10 sistemas comerciales para la detección de resistencia a la vancomicina en enterococos.313 Se utilizó un método de referencia por microdilución como estándar para la evaluación de 50 cepas de referencia. Una prueba de detección por dilución en agar, el Etest, y algunos sistem as com ercia­ les por microdilución rindieron bien. Se observó una mayor cantidad de errores menores con la prueba por difusión con dis­ cos y otros sistemas comerciales de microdilución. El sistema Vitek produjo tasas de errores muy altas (10,3%) y el sistema MicroScan Rapid 20,7%) el cual fue el único que produjo erro­ res mayores (13,3%). Con las pruebas repetidas con el Vitek los errores muy importantes se redujeron hasta el 3,4%, mientras que los errores con el sistema MicroScan Rapid aumentaron hasta el 27,6%. Un informe reciente confirma la capacidad de los paneles Positive Breakpoint Combo* Tipo 6 convenciona­

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les de MicroScan para detectar resistencia entre los enteroco­ cos a la ampicilina y la vancomicina.136 Catorce de los 15 resul­ tados incorrectos con vancomicina fueron en enterococos móviles, que son aislados con menor frecuencia en infecciones graves que E. faecium y E. faecalis. No hubo ninguna cepa pro­ ductora de p-lactamasa entre los 132 aislamientos estudiados. Los problemas iniciales con el sistema Vitek fueron corregidos con modificaciones del software, y el nuevo sistema Vitek 2 ha probado ser confiable.175,327 Una versión comercial de la prueba de detección en agar, Remel Synergy Quad Píate®, se compara bien con la prueba de referencia.93 Esta prueba incorpora 6 |ig/mL de vancomicina en agar infusión de cerebro y corazón, como lo recomiendan Swenson y cois.299 Se puede solicitar a los microbiólogos clínicos que examinen las heces para detectar enterococos resistentes a la vancomici­ na y determinen la prevalencia de microorganismos resistentes en una institución o para que señalen a los pacientes con mayor riesgo de sufrir una infección invasora por enterococos. Se han recomendado varios métodos. Barton y Doem observaron que el agar azuro de bilis-esculina con suplemento de 8 Ug/mL de vancomicina era un medio útil para el examen de detección.12 Landman y cois, compararon cinco medios selectivos y obser­ varon que el caldo Enterococcosel® (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ), con suplemento de 64 (ig/mL de vancomicina y 60 Ug/mL de aztreonam, era el método más sensible.170 El uso de agar azuro de bilis-esculina con un disco de 30 \xg de vanco­ micina fue menos sensible, pero sería fácil implementarlo en la mayoría de los laboratorios. Los hisopados rectales y perirrectales dan resultados equivalentes.336 Para los laboratorios que trabajan con técnicas moleculares, la amplificación de ácidos nucleicos provee un método más sensible que el cultivo para detectar colonización.243 Los factores de riesgo de la colonización por enterococos resistentes a la vancomicina son similares a aquellos para la adquisición de Clostridium difficile. En consecuencia, no es sorprendente que la detección de pacientes con toxina de C. difficile en sus deposiciones sea un procedimiento de vigilancia útil en la búsqueda de enterococos resistentes a la vancomicina en las heces.114 Este enfoque no reemplazará a la vigilancia sis­ temática, porque todos los pacientes colonizados no habrán sido evaluados para C. difficile. Si se desea hacer el cribado de las cepas enterocócicas en las placas primarias para evaluar la resistencia a la vancomicina sin realizar pruebas de sensibilidad, se puede utilizar el agar CAMPY.286 Se deben evaluar medios provenientes de diferen­ tes fabricantes y tal vez de distintos lotes para un rendimiento aceptable. La batalla entre químicos y bacterias continúa. Se han crea­ do nuevos agentes para el tratamiento de las bacterias grampo­ sitivas. Además de la teicoplanina (otro glucopéptido), se han introducido en el mercado la linezolida (un antibiótico oxazolidinónico) y la quinupristina-dalfopristina (una combinación de estreptograminas);76 aunque la mayoría de las veces son efi­ caces contra los enterococos, comienzan a aparecer informes de resistencia. No sorprende que el mayor riesgo de adquisi­ ción de una cepa resistente a la linezolida se asocie con el uso del antibiótico y con la duración del tratamiento.236 El tema de la resistencia a la vancomicina en los enterococos ha sido revisado en forma amplia.41,103,212 Es importante recor­ dar que las superficies inanimadas en el laboratorio de micro­ biología pueden estar contaminadas con bacterias resistentes, que incluyen enterococos resistentes a la vancomicina, al igual como lo están las superficies en las áreas clínicas.47

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CAPÍTULO 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

Listeria monocytogenes

Las pruebas por microdilución en caldo pueden realizarse en caldo de Mueller-Hinton con suplemento de cationes con san­ gre de caballo hemolizada de 2-5%. Listeria m onocytogenes proporciona un buen ejemplo de los cuidados necesarios al extrapolar los criterios del tamaño de zona en la prueba por difusión con discos a las bacterias que no han sido evaluadas. La prueba por difusión parece ser satisfactoria para la evalua­ ción de L. m onocytogenes, pero los participantes en programas de pruebas de eficiencia no determinaron en forma adecuada las sensibilidades a la penicilina y la ampicilina hasta que el NCCLS aclaró los tamaños de las zonas que se debían utilizar para establecer los puntos de corte.144 Streptococcus pyogenes (Streptococcus p-hemolítico del grupo A) PENICILINA

En ocasiones, se solicita al laboratorio la realización de prue­ bas de sensibilidad a los antibióticos de un aislamiento de Strep­ tococcus P-hemolítico del grupo A. Estas pruebas son adecuadas para fármacos alternativos, como eritromicina, si el paciente es alérgico a la penicilina. Los fracasos terapéuticos son el resul­ tado de una penetración insuficiente del antibiótico en las crip­ tas amigdalinas y el tejido adenoideo, donde las bacterias pue­ den ocultarse. En ausencia de resistencia documentada y sin un método estandarizado y validado para las pruebas, es mucho más probable que la realización de éstas produzca problemas a que los resuelva. Si se cree que están indicadas las pruebas, cualquier resultado de resistencia debe ser validado por un laboratorio de referencia. Si las pruebas se realizan mediante el procedimiento de difu­ sión con discos, se pueden utilizar discos de penicilina o de ampicilina para predecir la sensibilidad; no se recomienda el uso de discos de oxacilina, como para los neumococos.220

ERITROMICINA

Aunque la penicilina sigue siendo uniformemente eficaz,263 la resistencia global a la eritromicina y la tetraciclina ha aumentado en forma constante.18133 La resistencia a la eritro­ micina está mediada tanto por el fenotipo de macrólido M (un mecanismo de expulsión)18 como por un mecanismo recién descrito, denominado tipo fenómeno NR (también un mecanis­ mo de expulsión).158 Menos a menudo el mecanismo M LSBfue responsable de la resistencia. En una serie de 573 cepas de Suecia se observó el fenotipo NR en el 82%; un fenotipo MLSB inducible, en el 17% y un fenotipo M LSB constitutivo, en el 0,4% .158 Las cepas que contienen un mecanismo M LSB induci­ ble y son sensibles a la clindamicina pueden ser evaluadas mediante la prueba del doble disco (prueba D), como se des­ cribe para los estafilococos (antes en este capítulo). Si no se documenta resistencia intrínseca ni inducible, la cepa puede ser comunicada como sensible a la clindamicina. Existen muchos clones diferentes de cepas que son resisten­ tes a la eritromicina y no están limitadas a localizaciones geo­ gráficas específicas.157,159 La probabilidad de resistencia a la eritromicina en las cepas aisladas en niños con faringitis está inversamente relacionada con la edad del paciente.285

FLUOROQUINOLONAS

Además, se describieron aislamientos con resistencia eleva­ da a las fluoroquinolonas.269 Por lo tanto, en los pacientes que son alérgicos a la penicilina, la elección terapéutica puede vol­

verse cada vez más limitada. No se describió resistencia a la vancomicina. Streptococcus agalactiae (Streptococcus p-hemolítico del grupo B)

Como sucede en el caso de Streptococcus pyogenes, no se ha demostrado una sensibilidad reducida a la penicilina,263 pero existe resistencia a los macrólidos. El mecanismo más frecuen­ te de resistencia es mediante una metilasa ribosómica (ermA o ermB), pero una minoría de cepas pueden expresar resistencia a través de un mecanismo de expulsión activa, ya sea aislado o combinado con la metilasa.5457 No se describió resistencia a la vancomicina. Si se realizan pruebas mediante el procedimiento de difusión con discos, se pueden utilizar discos de penicilina o de ampici­ lina para predecir la sensibilidad; no se recomienda el uso de discos de oxacilina, como para los neumococos.220 Se ha recomendado adosar un comentario al informe cuando se aísla S. agalactiae en sitios de importancia clínica (que incluyen cultivos rectovaginales en mujeres embarazadas) para indicar que se puede aceptar sensibilidad a los antibióticos P-lac­ támicos, pero que el laboratorio debe ser consultado para el examen de eritromicina o de clindamicina si el paciente pre­ senta una alergia grave a la penicilina. Como sucede con los estafilococos y otros estreptococos, algunas cepas pueden tener resistencia inducible a la clindamicina. En este caso se debe realizar una prueba de inducción. Estreptococos viridans

Aunque son patógenos menos frecuentes que los neumoco­ cos, los estreptococos viridans causan endocarditis y otras infecciones graves. Las alteraciones en las proteínas de unión a penicilina han producido resistencia a múltiples antibióticos P-lactámicos entre varias de las especies, entre ellas S. mitis,*0 S. sanguis 350 y S. oralis.263 Al parecer la resistencia en los estreptococos viridans se ori­ ginó en cepas neumocócicas resistentes a la penicilina.73 Se puede hallar sensibilidad reducida a la penicilina hasta en el 25% de las cepas.146 Como sucede con los neumococos, estas cepas suelen ser más sensibles a las cefalosporinas de tercera y de cuarta generación.251 No se recomiendan las pruebas de difusión con discos para estreptococos viridans; se debe reali­ zar una determinación de la CIM utilizando un método de dilu­ ción o de difusión de gradiente.220 En un estudio de estreptococos viridans aislados de la orofa­ ringe normal, se documentó a menudo resistencia a eritromici­ na, tetraciclina y quinupristina-dalfopristina; las cepas expresa­ ron resistencia a levofloxacina y moxifloxacina con mucha menor frecuencia.284 La distribución de los fenotipos para la resistencia a la eritromicina se asemejaba a la hallada en S. pyogenes y S. agalactiae. Hasta ahora estas cepas resistentes han seguido siendo sensi­ bles a la vancomicina. En el laboratorio, los resultados de la sensibilidad obtenidos con el Etest® se han correlacionado bien con la dilución en agar para penicilina y cefalosporinas, pero no tan bien con vancomicina.272 En cualquiera de los casos, una cepa que se determine que es resistente a la vancomicina debe ser derivada a un laboratorio de referencia para su confirmación. Otras bacterias grampositivas

La resistencia a la vancomicina suele hallarse comúnmente en cepas de Leuconostoc, Pediococcus y Lactobacillus .300

Referencias

E stos géneros son patógenos pocas veces, pero en ocasiones producen bacteriemia195 y septicemia.107 La resistencia a la van: : micina puede ser un dato útil para la identificación correcta, porque los estreptococos con los cuales se pueden confundir e>íos géneros son uniformemente sensibles a la vancomicina. eudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia y Stenotrophomonas - ’ ftophilia en pacientes con fibrosis quística

Los aislamientos de esta especie constituyen un problema especial tanto para los médicos como para los laboratorios de microbiología, sobre todo las cepas que expresan un fenotipo mucoide. Las cepas mucoides a menudo crecen en forma insu­ ficiente como para determinar un resultado válido. Cuando se comparó la prueba por difusión con discos con un método de referencia, se observó una baja correlación cuando se evaluaron algunos antibióticos con cepas mucoides. Sin embargo, la categoría interpretativa concordó bien entre los dos métodos.32 El Etest (AB Biodisk, Solna, Suecia) se correlacionó bien con el método de referencia, tanto para las cepas mucoides como no mucoides.32 Por el contrario, los dos sistemas comerciales dominantes, Vitek y MicroScan WalkAway produjeron una fre­ cuencia inaceptablemente alta de resultados erróneos cuando -c compararon con un método de referencia.31 Cabe señalar que las pacientes con fibrosis quística presentan un problema incluso para los métodos de referencia. Smith ;• cois, no pudieron encontrar una correlación entre los resulta­ do- de la sensibilidad para tobramicina y ceftazidima, utilizan­ do un método de dilución de referencia y la respuesta clínica.290 Aunque la microdilución en caldo se comparó bien con la téc­ nica de dilución en agar para Pseudom onas aeruginosa , se n'ervaron resultados discordantes con una frecuencia signifi­ cativamente mayor en los aislamientos en pacientes con fibrosis quística que en otros pacientes.277 Muchos laboratorios no evalúan de rutina la sensibilidad de as cepas de Burkholderia cepacia y Stenotrophomonas malrophilia a los antibióticos. Ambos microorganismos siguen 'iendo en su mayor parte sensibles a trimetoprim-sulfametoxa­ zol. que es el tratamiento clínico de elección.38,56Además, la co­ rrelación de los resultados clínicos con los resultados de la sen'íbilidad in vitro es inadecuada y los resultados de las pruebas pueden ser en realidad engañosos.218 No se recomienda el método de difusión con discos para evaluar ninguno de estos microorganismos. Si no se efectúan pruebas, se debe adosar una nota que indique que las pruebas in vitro pueden ser poco útiles o engañosas, y que se debe considerar el tratamiento con trimetoprim- sulfametoxazol. Pruebas de sensibilidad directa

En general, no se recomiendan las pruebas de sensibilidad directa porque el inoculo no está estandarizado y a menudo se presentan especies bacterianas mixtas. Las pruebas de sensibi­ lidad directa de caldos de frascos de hemocultivos positivos se han correlacionado bien con las pruebas estándares de las colo­ nias aisladas. Las pruebas han sido realizadas tanto con caldos no ajustados de los frascos52 como después del ajuste de la den­ sidad del cultivo por comparación con un estándar de dilución McFarland de 0,5.165 Además, la orina de pacientes con infec­ ciones urinarias puede ser evaluada en forma directa si se pre­ senta una única cepa bacteriana.55 A c tu a liz a c ió n d el c a p ítu lo . El suplemento de información más reciente del CLSI (M100-S15, enero de 2005) incluye 1) recomendaciones ampliadas para bacilos gramnegativos no fer­

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mentadores (para cubrir especies de Acinetobacter, Burkholde­ ria cepacia y Stenotrophomonas m altophilia ); 2) criterios revi­ sados para evaluar estafilococos, sobre todo las especies coa­ gulasa negativas, que incluyen criterios separados para Staphylococcus lugdunensis y sugerencias para el uso de un disco de cefoxitina de 30 |ig como alternativa para la oxacilina en la prueba por difusión con discos; 3) puntos de corte inter­ pretativos para las pruebas por dilución de polimixina B (resul­ tados aplicables también a colistina); 4) sugerencias para el examen de ¡3-lactamasas de espectro ampliado de Proteus m irabilis y 5) recomendaciones para evaluación de calidad de la prueba de resistencia inducible a la clindamicina.

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CAPÍTULO 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

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CAPÍTULO 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

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CAPÍTULO 17

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos

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Micoplasmas y ureaplasmas

Taxonomía de los micoplasmas y los ureaplasmas Factores de virulencia de los micoplasmas humanos Importancia clínica de los micoplasmas humanos Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum Mycoplasma genitalium Mycoplasma fermentans Mycoplasma penetrans Mycoplasma pirum Mycoplasma primatum Mycoplasma spermatophilum Infecciones humanas debidas a especies de Mycoplasma de origen animal Especies hemotrópicas de Mycoplasma

Cultivos de micoplasmas humanos a partir de muestras clínicas Consideraciones generales Recolección de la muestra Medios de transporte

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Medios para el cultivo de micoplasmas Aislamiento e identificación de Mycoplasma pneumoniae Detección de Mycoplasma pneumoniae por procedimientos que no utilizan cultivos Aislamiento e identificación de los micoplasmas genitales Detección de micoplasmas genitales por procedimientos que no utilizan cultivos Sistemas comerciales de cultivo para Mycoplasma Aislamiento de micoplasmas en medios de cultivo habituales

Pruebas serológicas para el diagnóstico de infecciones por Mycoplasma pneumoniae Pruebas serológicas para micoplasmas genitales Sensibilidad antimicrobiana y tratamiento de las infecciones por Mycoplasma Diagnóstico y tratamiento de las infecciones por especies hemotrópicas de Mycoplasma en animales

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CAPÍTULO 18

Micoplasmas y ureaplasmas

os micoplasmas y los ureaplasmas son microorganis­ mos que difieren de otras bacterias porque carecen de pared celular rígida. Las células individuales están limitadas por una unidad de membrana trilaminar. Además, la cantidad de material genético que compone el genoma de estos microorganismos es bastante pequeña (peso molecular, 4,5 x 10* a 1 x 109 Da). Debido a su menor contenido genético, estos microorganismos presentan una capacidad biosintética limitada. Por consiguiente, el cultivo de los micoplasmas y los ureaplas­ mas requiere un medio enriquecido que contenga precursores para la biosíntesis de ácidos nucleicos, proteínas y lípidos. Los precursores para los ácidos nucleicos y las proteínas los prove­ en sobre todo el medio peptonado basal enriquecido y el extracto de levadura, mientras que los lípidos lo provee el agre­ gado de suero. De hecho, uno de los criterios principales utili­ zado en la clasificación taxonómica de estos microorganismos es el requerimiento por parte de ciertos micoplasmas y micro­ organismos similares del Iípido complejo colesterol en el medio de crecimiento.427-454 Todas las especies de M ycoplasm a producen adenosintrifosfato (ATP) por fosforilación a nivel de sustrato efectuada por la ácido fosfoglicérico cinasa y la piru­ vato cinasa, dos enzimas de la vía glucolítica desde glucosa a piruvato.350 Estas dos enzimas parecen ser la principal fuente de la mayor parte del ATP sintetizado por los miembros de la clase M ollicutes. Estos microorganismos son también mucho más pequeños que la mayoría de las bacterias, ya que miden de 0,2 a 0,3 (im; por lo tanto, pueden atravesar los filtros bacte­ riológicos. La ausencia de una pared celular bacteriana típica que contenga peptidoglueano determina que estos microorga­ nismos sean resistentes a los antimicrobianos que tienen la pared celular como sitio de acción, como las penicilinas y las cefalosporinas. Por esto, el aislamiento de estas bacterias a par­ tir de muestras clínicas puede tener implicaciones terapéuticas importantes. Los micoplasmas y los ureaplasmas han sido aislados en seres humanos, animales, aves, insectos y plantas y continua­ mente se siguen identificando y comunicando especies nuevas en la literatura taxonómica.454 Algunas especies también tienen una vida libre en el suelo y el agua. Los micoplasmas humanos pertenecen a los géneros M ycoplasm a y Ureaplasma\ este últi­ mo contiene aquellos micoplasmas que pueden hidrolizar la urea. Varias especies del género M ycoplasm a y dos especies del género Ureaplasma, U. urealyticum y JJ. parvum , se encuentran en muestras clínicas humanas. Con excepción de M. pneumoniae, el papel de otros micoplasmas -específicamente M. hominis, U. urealyticum y U. p a rv u m - en las enfermedades humanas es un tema de contro­ versias. M. pneum oniae es una causa bien reconocida de neu­ monía atípica, mientras que M. hominis , U. urealyticum y U. parvum se asocian sobre todo con colonización e infección genital en adultos, y colonización e infección respiratoria en recién nacidos.111391 Estas especies se asocian y están implica­ das como agentes causales en una amplia variedad de cuadros patológicos. Sin embargo, estas mismas especies también pue­ den aislarse en individuos asintomáticos, lo que sugiere que pueden comportarse sobre todo como patógenos oportunis­ tas.289,291,292 M. genitalium ha sido aislado en los aparatos geni­ tal y respiratorio y en la actualidad se está dilucidando su papel como agente productor de uretritis no gonocócica y no clamidial (UNGNC) y de otras infecciones del aparato genital.20,458 Sin embargo, su presencia y comportamiento en el aparato respiratorio son claros. Otras especies de M ycoplasm a se encuentran como parte de la flora normal de la boca, en espe­ cial en las zonas gingivales que rodean los dientes. A finales de

L

la década de 1980, se detectó otra especie “nueva”, denomina­ da en ese momento "M. incognitus”, en muestras de autopsia de pacientes con SIDA, lo que sugiere que este microorganis­ mo puede ser otra infección oportunista o un cofactor transmi­ sible por vía sexual que influye en la progresión de la enfer­ medad.264,309 Este microorganismo fue identificado luego como una cepa de M. ferm entans, una bacteria con requerimientos nutricionales especiales. Otros micoplasmas recientemente descritos se han aislado en pacientes infectados por HIV y estos descubrimientos determinaron un renovado interés en los factores de virulencia de los micoplasmas y en los métodos para su detección e identificación.491 En este capítulo se trata­ rán los micoplasmas humanos, haciendo hincapié en la impor­ tancia clínica de M. pneumoniae y de los micoplasmas genita­ les (M. hominis y U. urealyticum) y los métodos utilizados para el aislamiento y la identificación de estas bacterias en el labo­ ratorio clínico.

Taxonomía de los micoplasmas y los ureaplasmas Los micoplasmas y los ureaplasmas se clasifican en la clase M ollicutes (recuadro 18-1). Él nombre m ollicutes significa

“cáscara blanda”, referido a la falta de una pared celular bacte­ riana rígida. El análisis de las secuencias del RNA ribosómico (rRNA) reveló que estos microorganismos están más estrecha­ mente relacionados con la subdivisión bacilos-lactobacilosestreptococos de las eubacterias, entre los cuales los miembros más cercanos son los clostridios, los lactobacilos, los estrepto­ cocos y el género Erysipelothrix.3*3311,495 La clase M ollicutes contiene cuatro órdenes: M ycoplasm atales, Entomoplasmatales, Acholeplasm atales y Anaeroplasm atales (recuadro 18-1). El orden Entom oplasm atales se creó para contener a las fami­ lias Entom oplasm ataceae y Spiroplasm ataceae. Los géneros Entomoplasma y M esoplasm a de la familia Entom oplasm ata­ ceae se encuentran en insectos y plantas.455 El género Ento­ m oplasma contiene especies que requieren esteral y tienen una temperatura óptima de crecimiento de 30 °C, mientras que el género M esoplasm a contiene especies que no requieren coles­ terol pero crecen mejor a 30 °C en medios sin colesterol ni suero suplementado con Tween 80 (0,04 %). La familia Spiroplasm ataceae incluye el único género Spiroplasm a, microorganismos con forma de espiral que requieren colesterol para su desarrollo y se encuentran en plantas e insectos. Los miembros del orden Acholeplasm atales no requieren esteróles para el crecimiento y se los encuentra sobre todo en plantas, animales e insectos.2,13,460 La presencia de estos microorganis­ mos en tejidos animales está confirmada por la aparición de acholeplasmas como contaminantes en los medios de cultivo de tejido suplementados con suero animal.13 Dos especies, Acholeplasm a laidlaw ii y Acholeplasm a oculi, se aislaron en seres humanos.282,358,481A. laidlaw ii se relaciona desde el punto de vista inmunitario con M. pneumoniae y M. genitalium 65 Como no precisan compuestos con esteróles para su creci­ miento, los acholeplasmas pueden cultivarse en medios que carecen de suero exógeno. El orden Anaeroplasm atales está compuesto por una única familia (Anaeroplasm ataceae) que comprende dos especies, Anaeroplasm a y A steroleplasm a.455 Estas dos especies son anaerobias estrictas en cuanto a su meta­ bolismo. La especie Anaeroplasm a requiere colesterol para el crecimiento, mientras que los miembros del género A stero­ leplasm a no lo necesitan. Ambas especies se encuentran en el rumen del ganado bovino y ovino. La familia M ycoplasm ataceae incluye ahora a los micoplasmas hemotrópicos que antes

Taxonomía de los micoplasmas y los ureaplasmas

estaban clasificados en los géneros Eperythrozoon y Haemobartonella (recuadro 18-1). Estos microorganismos parasitan la superficie de los eritrocitos de diversos animales. Los miembros del orden M ycoplasm atales requieren esteró­ les, como colesterol, para el cultivo in vitro. La única familia del orden, M ycoplasm ataceae, contiene dos géneros: M yco­ plasm a y Ureaplasma. El género M ycoplasm a está compuesto por más de 100 especies que habitan en una amplia variedad de plantas y animales, como mamíferos, insectos, aves y reptiles, y pueden existir como com ensales, parásitos y patóge­ nos.288360454-467 En el recuadro 18-2 se muestran las especies de M ycoplasm a aisladas en seres humanos. M. hominis, M. genitalium, M. fermentans, M. primatum, M. spermatophilum y M. penetrans se aislaron en el aparato genital humano, mientras que M. pneumoniae, M. salivarium, M. órale, M. buccale, M. faucium y M. lipophilum pueden aislarse en las vías respirato­ rias. M. salivarium se encuentra en los surcos gingivales y puede intervenir en ciertos tipos de enfermedad periodontal. M. órale, M. faucium, M. buccale y M. lipophilum se consideran parte de la flora normal del aparato respiratorio y no son pató­ genos. En los últimos años M. genitalium ha generado gran inte­ rés científico como agente etiológico de uretritis no gonocócica aguda y crónica, y otras diversas infecciones genitales.467 M. ferm entans se aisló por primera vez en el aparato urogenital humano y se postula su participación en uretritis, artritis reumatoide y enfermedad progresiva relacionada con el HIV. Esta

R ecuadro 18-1

especie es la misma que “M. incognitus”, aislada en pacientes con SIDA (véase la descripción más adelante).376 M. penetrans , un agregado relativamente nuevo al género, se aisló en la orina de pacientes con SIDA y, como M. fermentans, puede actuar sobre todo como agente infeccioso oportunista en huéspedes inmunodeprimidos. El nicho ecológico de M. pirum en los seres humanos es incierto. Como sucede con otras bacterias, los micoplasmas humanos aislados en muestras clínicas difieren en ciertas características fenotípicas que se aprovecha para su aislamiento e identifica­ ción (cuadro 18-1). M. pneumoniae fermenta la glucosa con la formación de productos finales ácidos, mientras que M. hominis utiliza arginina, con la formación de productos finales básicos. El cultivo de estos microorganismos depende del empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos especiales, enriquecidos con factores necesarios para el crecimiento de micoplasmas además de sustratos de crecimiento específicos, como glucosa y arginina. Desde el punto de vista antigénico, las cepas de M. pneumoniae son homogéneas, con una única serovariedad reco­ nocida. Se desconoce el número de serovariedades diferentes de M. hominis. Los estudios de hibridación genética que emplean sondas de rRNA han apoyado los estudios serológicos, con cepas de M. pneumoniae recolectadas durante muchos años que muestran una composición de rRNA similar y cepas de M. hominis que muestran patrones de rRNA heterogéneos.34-64-503 Además de ciertas similitudes ultraestructurales, también se

T a x o n o m ía d e l f ilo f lr m ic u te s , c la s e M o llic u te s Requerimientos de esteróles Hábitat para el crecimiento

Orden

Familia

Género

M ycoplasm atales

M ycoplasmataceae

M ycoplasma

Sí

Seres hum anos, ani­ males

Ureaplasma

Sí

Seres hum anos, ani­ males Anim ales, incluso primates

“Eperythrozoon ” (ahora miembros del género M ycoplasma)

Anim ales, seres humanos (?)

“H aem obartonella” (ahora m iem bros del género M ycoplasma)

Comentarios Crecim iento óptim o a 35-37 °C; m etaboliza la glu­ cosa o la arginina o ambas Crecim iento óptim o a 35-37 °C; metaboliza la urea Bacterias parásitas sin pared celular, no cultivables, encontradas en las superfi­ cies de las membranas de los eritrocitos Bacterias parásitas sin pared celular, no cultivables, encontradas en las superfi­ cies de las m em branas de los eritrocitos Crecim iento óptimo a 30 °C Crecim iento óptim o a 30 °C; crece en medio sin suero con 0,04% de Tween 80 Crecim iento óptim o a 30-37 °C

Entom oplasmataceae

Entomoplasma M esoplasma

Sí No

Insectos, plantas Insectos, plantas

Spiroplasmataceae

Spiroplasma

Sí

Insectos, plantas

Acholeplasm atales

Acholeplasmataceae

Acholeplasm a

No

Animales, insectos, plantas

Crecim iento óptimo a 30-37 °C

Anaeroplasmatales

Anaem plasm ataceae

Anaeroplasma

Sí

Anaerobio

Asteroleplasma

No

Rumen de ganado bovino y ovino Rumen de ganado bovino y ovino

Entom oplasmatales

977

Anaerobio

978

CAPÍTULO 18

R ecuadro 1 8 -2

Micoplasmas y ureaplasmas

M ic o p la s m a s y u r e a p la s m a s a is la d o s e n s e r e s h u m a n o s

Especie

Sitios comunes de aislamiento

Comentarios (otros sitios de aislamiento, enfermedades asociadas)

M ycoplasm a pneum oniae M ycoplasm a órale

Aparato respiratorio, aparato genital (muy raro), aspirados de líquido articular (muy raro) Orofaringe y nasofaringe

M ycoplasm a salivarium

Orofaringe y nasofaringe

M ycoplasma buccale M ycoplasm a faucium M ycoplasm a lipophilum M ycoplasma spermatophilum M ycoplasma prim atum M ycoplasm a hominis

Orofaringe y nasofaringe Orofaringe y nasofaringe Orofaringe y nasofaringe Cuello uterino, esperm a Orofaringe y nasofaringe; uretra femenina Aparato genitourinario femenino, orofaringe

M ycoplasm a genitalium

Aparato genitourinario, orofaringe

M ycoplasm a ferm entans

Aparato genitourinario, aparato respiratorio

M ycoplasm a penetrans

Aparato genitourinario, orina

M ycoplasm a pirum

Sangre (raro)

Ureaplasma urealyticum

Aparato genitourinario: orofaringe. vías respiratorias bajas, tejidos placentarios

Ureaplasma p a n ’itm

Aparato genitourinario

Neumonía, bronquitis, bronquiolitis. faringitis, laringitis estridulosa; ais­ lam iento ocasional en el aparato genital y aspirados de líquido articular No se asocia con enfermedad; se aisló en m édula ósea leucém ica y gan­ glios linfáticos No se asocia con enfermedad, participación cuestionable en la enferm e­ dad periodontal; aislamiento raro en el cuello uterino/vagina y articula­ ciones artríticas No se asocia con enfermedad N o se asocia con enfermedad No se asocia con enfermedad No se asocia con enfermedad No se asocia con enfermedad; aislado en el sitio umbilical Hemocultivos (septicem ia posparto), vaginosis bacteriana y otras infecciones genitales, m uestras de pulm ón y derrame pleural; infeccio­ nes del trasplante de órgano y tejido; infecciones de las heridas quirúr­ gicas, infecciones asociadas con prótesis; infecciones neonatales; amnionitis Algunos casos de uretritis no gonocócica, no clamidial; papel desconoci­ do en la infección respiratoria, presencia en líquido articular (raro) tal vez secundaria a bacteriem ia y siembra de espacios articulares Linfocitos en sangre periférica y orina en pacientes con SIDA; articula­ ciones artríticas; médula ósea: posible participación en la patogenia de la infección por HIV Orina en pacientes con SIDA; posible participación en la patogenia del HIV; agente infeccioso oportunista Linfocitos en sangre periférica; contam inante en células de cultivo de tejidos de origen humano; ¿papel en la patogenia del HIV? Vías respiratorias bajas, sangre (sepsis neonatal); líquido cefalorraquí­ deo; sitios quirúrgicos, posible participación en la uretritis no gonocó­ cica, infecciones del aparato genital, infecciones neonatales Infecciones del aparato genital

Cuadro 18-1

Características para la identificación de especies de Mycoplasma y Ureaplasma humanas CRECIMIENTO EN UTILIZACIÓN DE

SITIO DE AISLAMIENTO ESPECIE Aparato respiratorio Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma salivarium Mycoplasma órale

Urea

pH ÓPTIMO

-

+ +

' -

6,5-7,5 6-7 7

Glucosa

Arginina

+ -

TIEMPO HASTA LA RECUPERACIÓN

Aerobiosis

co2

Anaero­ biosis

SERO­ VARIEDADES

4-21 días 2-5 días 4-10 días

4+ 2+ 2+

4+ ND ND

1+ 4+ 4+

1 1 1

Aparato genital Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum/ U. parvum Mycoplasma fermentans

-

+ -

+

5,5-8 5,5-6,5

1-5 días \- 4 días

4+ 4+

4+ 4+

4+ 4+

Desconocido 14

+

+

-

7

4-21 días

2+

ND

4+

1

Aparatos respiratorio/genital Mycoplasma genitalium Acholeplasma laidlawii

+ +

-

-

7 6-8

LENTO

2+ 4+

3-4 + 4+

1+ 4+

Desconocido 1

+, positivo; , negativo; ND, datos no disponibles.

1-5 días

Factores de virulencia de los micoplasmas humanos

•ze-cribieron reactividades serológicas cruzadas y homologías ¿enéticas entre M. pneumoniae y M. genitalium.65-254'504 El género Ureaplasma incluye los micoplasmas que especí­ ficamente pueden hidrolizar la urea. En la actualidad, el género contiene siete especies: U. urealyticum, U. parvum, U. diversum. U. gallorale, U. felinum, U. cati y JJ. canigenita//K/n.16-148'149'173'228-394 A JJreaplasma se lo denominó micoplas­

mas "cepa T” por el tamaño muy pequeño (“T ” por la palabra inglesa tiny [diminuto]) de sus colonias en medios sólidos.394 Antes de 1999, se habían descrito 14 serotipos de U. urealytium en seres humanos, primates y otros animales, que se ha­ rían definido por la reactividad con un panel de antisueros poli­ clonales.16,369 Estos serotipos se agruparon en dos biovarieda­ des (biovares): la biovariedad 1 compuesta por los serotipos 1. 3. 6 y 14 y la biovariedad 2, por los serotipos 2, 4, 5 y 7 a 13.147 Los miembros de estas dos biovariedades también mostraron diferencias en otras propiedades, como polimorfismo de longi­ tud de los fragmentos de restricción, patrones de las proteínas de la célula entera en electroforesis en gel de poliacrilamida y sensibilidad a las sales de manganeso.16'147,357’369420 Otros estu­ dios con análisis de proteínas celulares y patrones de endonujieasas de restricción del DNA apoyaron la agrupación seroló­ gica de biovariedades separadas.359 También se observó que los microorganismos que pertenecen a la biovariedad 1 presenta­ ban genomas más pequeños que los de la biovariedad 2, de modo que se los menciona como biovariedad “parvo” (peque­ ños).2(MDentro de las biovariedades, los análisis de rRNA con sondas de ácido nucleico mostraron una importante homología de secuencia de nucleótidos entre los serotipos constituyentes. El porcentaje de hibridación del DNA-DNA entre los serotipos 1. 3 y 6 de la biovariedad 1 fue del 91% al 92 %, mientras que entre los serotipos 2, 4, 5, 7 y 8 de la biovariedad 2 variaron del 69% al 97%. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales con­ tra los serotipos de la biovariedad 1 también reaccionaron con cepas clínicas de la biovariedad 2 en técnicas de inmunotransferencia por Western blot, lo que indica reactividad antigénica cruzada considerable dentro de los serotipos definidos de modo policlonal.58 Los análisis de inmunotransferencia de cepas clí­ nicas de la biovariedad 1 con anticuerpos monoclonales mos­ traron patrones altamente variables entre sí y con cepas con serotipos de referencia específicos, lo que sugiere la existencia de variación antigénica de alto grado dentro de diversos seroti­ pos y entre ellos. Se desarrollaron técnicas de reacción en cade­ na de la polimerasa (PCR) que detectan rRNA 16S específico de la biovariedad y se utilizaron para examinar cepas de refe­ rencia y aislamientos clínicos a fin de determinar relaciones entre biovariedades y enfermedades específicas asociadas con JJ. urealyticum .310 ’444 En 1998, las biovariedades 1 y 2 de (J. urealyticum se clasificaron formalmente como Ureaplasma pari'um y Ureaplasma urealyticum, respectivamente.227 Las otras especies de Ureaplasma se encuentran exclusiva­ mente en animales. U. diversum (tres serovariedades) se aisló en los aparatos respiratorio y genital del ganado vacuno y ovino; es el agente etiológico de infecciones maternas y feta­ les, como amnionitis, aborto, bajo peso de los animales recién nacidos, neumonía y muerte de las crías.173 U. gallorale (una serovariedad) es una especie no patógena que se encuentra en el aparato respiratorio de pollos y otras aves.16'228 Dos especies, U. felinum y U. cati, se han aislado en el aparato respiratorio de gatos domésticos sanos.148 U. canigenitalium, la última especie descrita, se aisló en cultivos de boca, cavidad nasal y prepucio de perros y comprende cuatro serovariedades.149 Además de estas siete especies formalmente definidas se describieron otras especies aviares, porcinas, simianas, bovinas y caprinas/ovinas

97 9

diferenciadas por características genéticas y antigénicas, pero a las que no se les asignó una especie o epíteto definitivo.16,150

Factores de virulencia de los micoplasmas humanos No se han estudiado ampliamente los posibles factores de virulencia de los micoplasmas patógenos humanos, pero se des­ cribieron algunos de ellos como posibles candidatos. M. pneu­ moniae tiene un orgánulo de adherencia, que es una extensión delgada en un polo de la célula con un centro electrodenso y un “botón” terminal.235,236,389Estas estructuras forman parte del citoesqueleto del micoplasma, compuesto por una red de diversas proteínas. Agrupada en el extremo del orgánulo de adherencia se encuentra una proteína asociada con la membrana de 169 kDa denominada P l. que es la principal citoadhesina que determina la adherencia de M. pneumoniae a las células huésped.19,185 Estudios sobre mutantes no citoadherentes de M. pneumoniae han identificado varias proteínas accesorias adicionales (HMW1, HMW2. HMW3, HMW4, P90, P65, P40, P30, P l 16) que son esenciales para la adherencia a los tejidos diana y se localizan y agrupan dentro del orgánulo de adherencia junto con p j 19,116.174,201,411,412,418.494 Q )mo |a citoadherencia es el primer paso necesario para la infección de las superficies mucosas suscepti­ bles, estas proteínas representan verdaderos factores de virulen­ cia en este microorganismo. Los individuos infectados por M. pneumoniae producen una respuesta de anticuerpos vigorosa contra la adhesina P l, lo que sugiere que las proteínas adhesinas purificadas pueden ser útiles en pruebas serológicas para el diag­ nóstico de infecciones por M. p n e u m o n i a e También es numerosa la bibliografía sobre la inducción de diversas citocinas secundarias a la infección por M. pneumoniae y la función de éstas en la patogenia de la enfermedad por micoplasmas.501 En M. hominis también se demostraron proteínas de citoad­ herencia que determinan el comienzo de la colonización y la infección. P50 y P100, dos polipéptidos situados en la superfi­ cie de M. hominis, actúan en la adherencia de esta especie a las células eucariontes.157 M. hominis también se une a glucolípidos sulfatados de manera dependiente del tiempo, la tempera­ tura y la dosis; esta unión puede inhibirse por la preincubación de los microorganismos con sulfato de dextrano de alto peso molecular.329 La unión a la proteína P50 recombinante a las células HeLa también es inhibida por dextranos de alto peso molecular, lo que indica que la proteína de citoadherencia P50 se une a sulfátidos ubicados en la membrana de la célula hués­ ped.223 Los glucolípidos sulfatados y otros glucoconjugados están presentes en concentraciones elevadas en los aparatos genitales femenino y masculino, y la interacción específica de M. hominis con estas moléculas puede ayudar a explicar el tro­ pismo por el tejido urogenital de esta especie. La lipoproteína de citoadherencia P 100 de M. hominis también tiene un domi­ nio de unión al sustrato para el transporte del péptido a través de la membrana celular.158 Las cepas de M. hominis también poseen otra proteína asociada con la adherencia expuesta en la superficie denominada antígeno Vaa (variable asociado con la adherencia), que está codificado por seis tipos de genes vaa separados.38,39 La expresión de estos genes puede activarse o desactivarse; se ha postulado que esta capacidad estimula la diseminación del microorganismo de una célula a otra.509 U. urealyticum también produce varios factores asociados con la virulencia. Las cepas aisladas de U. urealyticum producen tres enzimas fosfolipasas (A p A2 y C) ubicadas en la membrana citoplasmática.97 Estas enzimas hidrolizan fosfolípidos, con la libe­ ración de ácido araquidónico. Como U. urealyticum se asocia

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CAPÍTULO 18

Micoplasmas y ureaplasmas

con amnionitis y morbimortalidad perinatal (abortos espontáne­ os, prematuridad, parto de niño muerto), se ha postulado que la infección del aparato genital femenino puede iniciar una secuen­ cia de cambios patológicos relacionados con la producción de fosfolipasa.111 Es posible que la liberación de ácidos araquidónicos por las membranas amnióticas conduzca a la producción de prostaglandinas, que pueden activar un trabajo de parto prema­ turo.26 También se ha visto que U. urealyticum induce la produc­ ción de citocinas inflamatorias (factor de necrosis tumoral-a [TNF-a], interleucina-6 [IL-6]) en líneas celulares de macrófa­ gos humanos y de ratas, y estimula la liberación de óxido nítrico por macrófagos alveolares cultivados.248-250 La amplia liberación de estas citocinas puede contribuir a la respuesta inflamatoria y a la patología de la enfermedad pulmonar crónica observada en los recién nacidos prematuros de muy bajo peso al nacer. También se ha demostrado que U. urealyticum induce apoptosis en células epiteliales y macrófagos pulmonares humanos; los anticuerpos monoclonales anti-TNF-a suprimen la muerte celu­ lar.249 Estos datos sugieren que la infección pulmonar por U. ure­ alyticum en estos neonatos puede estar implicada en el deterioro crónico de los tejidos pulmonares, ya sea de modo directo o indi­ recto por la producción de citocinas inflamatorias que se sabe que participan en la enfermedad pulmonar crónica de recién nacidos prematuros.230,453 Las tres fosfolipasas descritas antes también pueden contribuir a la enfermedad pulmonar fetal vin­ culada con las infecciones respiratorias por U. urealyticum?19 M. hominis y U. urealyticum también producen proteasas para la inmunoglobulina A, que pueden facilitar la invasión a las muco­ sas al hidrolizar la IgA presente en ellas.206 M. ferm entans (que incluye la cepa "incognitus” [véase más adelante]), M. penetrans y M. pirum, se han asociado con enfermedad en individuaos sanos y en pacientes con SIDA. Estos microorganismos se han implicado como agentes oportu­ nistas o como cofactores que contribuyen a la patología y la patogenia de la enfermedad relacionada con el HIV.309 Los mecanismos implicados en estas funciones comprenden la acti­ vación específica del sistema inmunitario celular, la produc­ ción de superantígenos que estimulan la liberación de diversas linfocinas y citocinas inmunomoduladoras y la generación de radicales libres que contribuyen al estrés oxidativo observado en la infección por HIV. Todos estos micoplasmas “asociados con el SIDA” utilizan la glucosa e hidrolizan la arginina. La arginina desaminasa de los micoplasmas puede causar la depleción de la arginina en los macrófagos infectados. La arginina es un precursor de una molécula que está directamente implicada en la citotoxicidad mediada por macrófagos; en consecuencia, la depleción de arginina por la infección por micoplasmas puede dar por resultado la disminución de la citotoxicidad mediada por los macrófagos. Los micoplasmas también liberan al medio de crecimiento nucleasas que degradan los ácidos nucleicos de las células huésped para generar precursores para la síntesis de sus propios ácidos nucleicos. M. fermentans, M. penetrans y M. pirum también pueden invadir células y sobre­ vivir como patógenos intracelulares.76 La asociación de estos microorganismos con localizaciones intracelulares en linfoci­ tos y macrófagos ayuda a explicar su aislamiento, en especial de M. ferm entans, en la sangre de pacientes con SIDA o sin él.

Importancia clínica de los micoplasmas humanos Mycoplasma pneumoniae M. pneumoniae es una de las causas del proceso neumónico conocido como neumonía atípica, junto con varios agentes

virales (p. ej., influenza, virus sincitial respiratorio, adenovirus), micóticos (p. ej., Pneum ocystis carinii) y bacterianos (p. ej., Chlamydia pneumoniae, Legionella pneum ophila).31-69-121-252 M. pneumoniae se transmite mediante gotitas por el aire que contienen los m icroorganism os y es muy contagioso. Alrededor del 10% al 30% de las neumonías extrahospitalarias son causadas por M. pneumoniae-, sin embargo, estos casos representan sólo del 3% al 10% de las infecciones por este microorganismo, ya que casi todos los individuos infectados manifiestan traqueobronquitis o infecciones menores de las vías respiratorias altas o permanecen asintomáticos.69-121 En poblaciones cerradas (p. ej., campamentos de verano, bases militares, escuelas), M. pneumoniae puede causar del 25% a más del 75% de las infecciones neumónicas. Por lo general, la enfermedad no es estacional y puede aparecer en cualquier momento del año, si bien su incidencia manifiesta suele ser máxima al final del otoño y en el invierno, cuando los jóvenes regresan a la escuela. La infección afecta a niños en edad esco­ lar mayores de 5 años, adolescentes y adultos jóvenes. Sin embargo, la enfermedad endémica y epidémica puede manifes­ tarse en niños más pequeños y en adultos mayores.178Las infec­ ciones de las vías respiratorias altas tienden a afectar a los menores de 3 años, mientras que la traqueobronquitis o la neu­ monía afecta con más frecuencia a los niños mayores y a los adultos. Es interesante destacar que los estudios realizados en poblaciones pediátricas no demostraron la participación de M. pneumoniae en la miringitis aguda ni en la otitis media con derrame.231-415 Casi todas las infecciones causadas por M. pneum oniae son relativamente leves e incluyen faringitis, traqueobronquitis, bronquiolitis y crup; hasta la quinta parte de las infecciones presentan realmente síntomas y pueden representar reinfección.69-121 Las infecciones que requieren internación pueden afectar a pacientes ancianos e inmunode­ primidos y en algunas de estas situaciones pueden ocasionar la muerte.284-341 Tras la exposición en huéspedes susceptibles, los microorga­ nismos se adhieren a las células epiteliales del aparato respira­ torio donde se multiplican; no atraviesan esas células sino que permanecen localizados. Los microorganismos pueden aislarse mediante cultivo durante el período de incubación y varias semanas durante y después de la enfermedad clínica, incluso en presencia de anticuerpos específicos. Luego de un período de incubación de 2 a 3 semanas, la presentación clínica de la neu­ monía por micoplasmas suele ser insidiosa, en lugar de abrup­ ta, con comienzo gradual de síntomas generales y neumónicos que se asemejan a los de la gripe.69 La mayoría de los pacien­ tes presentan a los pocos días fiebre de 38,3 °C a 39 °C, con escalofríos, malestar general, cefaleas, odinofagia, congestión nasal y tos seca no productiva que aparece temprano en la evo­ lución clínica. El recuento de leucocitos a menudo es normal o sólo está levemente elevado. En el 5% a 10% de los pacientes aparecen síntomas de las vías respiratorias bajas; el esputo se torna más mucoide o mucopurulento y en ocasiones aparece sangre.69 Los frotis del esputo con tinción de Gram en este mo­ mento suelen revelar cantidades escasas a moderadas de célu­ las inflamatorias polimorfonucleares y ausencia de microorga­ nismos. Con el comienzo de los síntomas neumónicos, los pacientes pueden sentirse como si padecieran un resfrío inten­ so pero pueden continuar con sus actividades normales; de ahí, la aplicación del término “neumonía ambulatoria” a esta enfer­ medad. El examen del tórax suele revelar roncus localizados y estertores aislados y las radiografías de tórax son compatibles con una bronconeumonía difusa, que suele afectar varios lóbu­ los del pulmón sin consolidación. En la neumonía por M. pneu-

Importancia clínica de los micoplasmas humanos

moniae los patrones radiográficos presentan amplias variacio­

nes y pueden mostrar infiltrados neumónicos peribronquiales, r.electasias, nodulos y linfadenopatías hiliares.69 Los hallazgos '-biológicos suelen ser más extensos de lo que podría sugerir ei examen físico. Los derrames pleurales son relativamente raros en la neumonía por micoplasmas; aparecen en hasta el 2 0 ac de los pacientes. Otras complicaciones pleuropulmonares, como neumotorax y abscesos pulmonares, también son infre­ cuentes. La neumonía por M. pneumoniae suele ser autolimitada, con resolución de la mayoría de los síntomas generales en 3 a 10 días sin antibioticoterapia.69 Las alteraciones de las radiografí­ as de tórax se resuelven con más lentitud y la resolución com­ pleta puede insumir de 10 días a 6 semanas. Si bien la antibio­ ticoterapia con tetraciclina o eritromicina reduce de manera significativa la duración de los signos y los síntomas, y acelera la resolución de las alteraciones observadas en las radiografías de tórax, el microorganismo no suele erradicarse del aparato respiratorio con la farmacoterapia.69 En un estudio se observa­ ron cultivos de fauces para M. pneumoniae positivos aún a los 4 meses después de la resolución de la infección.121 A pesar de la antibioticoterapia adecuada pueden aparecer recurrencias y recidivas. Mediante el empleo de métodos serológicos y técni­ cas de detección molecular varios estudios han mostrado que .V/. pneumoniae puede desempeñar papeles importantes en el asma aguda y crónica en niños y adultos, exacerbaciones de enfermedad pulmonar obstructiva crónica, en especial entre adultos mayores, y síndrome de dificultad respiratoria del adul­ to 30,120,234,297 | j atos recientes también sugieren que M. pneumoniae puede estar implicado en el síntoma torácico agudo, una enfermedad similar a la neumonía en pacientes con drepanoci­ tosis.322 Las complicaciones causadas por la infección por M. pneu­ moniae son raras, pero varían de acuerdo con la cantidad de órganos afectados. Estas complicaciones pueden ser dermato­ lógicas, cardiovasculares, musculoesqueléticas, neurológicas, urológicas, hepatobiliares u oculares. Las complicaciones der­ matológicas incluyen el eritema multiforme mayor (síndrome de Stevens-Johnson), diversos tipos de erupciones cutáneas maculares, morbiliformes y vesiculares, y eritema nudoso.60,246 El eritema multiforme mayor, la manifestación cutánea que con más frecuencia se relaciona con la infección por micoplasma, se presenta como lesiones vesiculares en las zonas mucocutáneas del cuerpo.246375 Las manifestaciones cardiovasculares pueden aparecer en el 10% de los casos e incluyen defectos de la conducción con arritmia cardíaca, pericarditis, taponamien­ to cardíaco e insuficiencia cardíaca congestiva.212-300-380 Aunque las artralgias son una manifestación frecuente de infección por micoplasma, se han comunicado casos de artritis manifiesta, con cultivos de líquido articular positivos, pero son muy poco frecuentes.56-81 Las complicaciones neurológicas pueden ser re­ sultado de la invasión directa del micoplasma al sistema ner­ vioso (meningitis, meningoencefalitis, mielitis transversa, encefalomielitis diseminada aguda), mientras que los síndro­ mes neurológicos posinfecciosos es probable que se produzcan por medio de un mecanismo autoinmunitario inducido por la infección por micoplasma o por episodios tromboembólicos que conducen a la microangiopatía, vasculitis cerebral y desmielinización en áreas perivasculares del sistema nervioso cen­ tral (SNC).28-31-316-344-363-405 Las complicaciones graves del SNC de este último tipo se asociaron con accidentes cerebrovasculares tras una infección aguda por M. pneum oniae ,331-406 Las com­ plicaciones urológicas y hepatobiliares se manifiestan como nefritis aguda y hepatitis colestásica, respectivamente.140-401 Las

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complicaciones oculares, como edema de papila, atrofia del ner­ vio óptico, papilitis óptica, exudados y hemorragias retinianas, también se informaron en relación con infecciones por M. pneum oniae ,305-377 Diversos tipos de complicaciones hemáticas (es decir, anemia hemolítica secundaria a la formación de crioaglutininas, coagulopatía intravascular, neutropenia, trombocitopenia, hemoglobinuria paroxística por el frío) pueden ser el resultado de la formación de anticuerpos específicos y autoanticuerpos dirigidos contra el tejido pulmonar, la cardiolipina y los tejidos musculares.57-59-85 Los estados de inmunodeficiencia humoral y celular también predisponen a los individuos a infecciones más graves por M. pneumoniae, así como por otros micoplasmas.121-334-372 Los indi­ viduos con hipogammaglobulinemia pueden sufrir episodios repetidos de neumonía por M. pneumoniae y presentan dificul­ tad para eliminar el microorganismo del aparato respiratorio a pesar del tratamiento adecuado. Estos pacientes suelen padecer síntomas respiratorios altos y bajos graves, con infiltrados escasos o ninguno en la radiografía de tórax y complicaciones importantes, como erupciones cutáneas, artralgias, artralgias séptica y osteomielitis.200-240-440442 M. pneum oniae también puede causar enfermedad grave en pacientes con enfermedades que deprimen la inmunidad celular, como infección por HIV y drepanocitosis .,<>4.222^22.^4 La enfermedad fulminante y diseminada por M. pneumoniae con afección de múltiples órganos es rara, si bien Kountouras y cois, informaron en un hombre de 50 años, antes sano, un cuadro de dificultad respiratoria progresiva, meningitis asépti­ ca, hepatitis colestásica, insuficiencia renal y coagulación intravascular diseminada.232 Por serología se diagnosticó la infección por M. pneum oniae ; el paciente se trató con eritro­ micina y tuvo una recuperación sin complicaciones. Takiguchi y cois, comunicaron en una mujer de 64 años, antes sana, un cuadro de dificultad respiratoria progresiva, con infiltrados alveolares bilaterales diseminados en las radiografías de tórax.423 Luego sufrió síndrome de dificultad respiratoria aguda y coagulación intravascular diseminada. La infección por M. pneumoniae se diagnosticó por serología. A pesar del trata­ miento enérgico con antimicrobianos y corticosteroides, respi­ ración asistida mecánica, hemodiálisis y plasmaféresis, la paciente falleció por insuficiencia multiorgánica. Koletsky y Weinstein informaron un caso rápidamente mortal de infección diseminada por M. pneumoniae durante la cual se desarrolló enfermedad respiratoria grave, neumonía, shock e insuficiencia renal en una mujer de 30 años después de una evolución clínica de 9 días.225 La paciente falleció a las 24 horas de ser internada. En la autopsia se aisló el microorganismo en pulmones, riñones y cerebro. Los cortes de tejido revelaron condensaciones neu­ mónicas bilaterales y coagulación intravascular diseminada. En ocasiones se aísla M. pneumoniae en localizaciones extrapulmonares no habituales distintas del líquido articular y el SNC. Goulet y cois, aislaron M. pneumoniae en muestras urogenitales de 22 mujeres en un período de 2 años.132 Además, el microorganismo se aisló en la uretra de uno de tres hombres que eran parejas sexuales de una mujer portadora del microor­ ganismo en su aparato genital. M. pneumoniae también se aisló en un absceso tuboovárico.448 Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum

Tanto M. hominis como U. urealyticum pueden aislarse en el aparato genital de hombres y mujeres asintomáticos.289-291-292 McCormack y cois, demostraron que las tasas de colonización por M. hominis y U. urealyticum en hombres variaban de 0% a

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CAPÍTULO 18

Micoplasmas y ureaplasmas

13% y de 3% a 56%, respectivamente.289-290 Datos similares en mujeres mostraron que las tasas de colonización vaginal para M. hominis y JJ. urealyticum varían de 0% a 31% y de 8,5% a 77,5%, respectivamente, de acuerdo con la edad, la raza, las relaciones sexuales y el nivel socioeconómico.289-290'292 Las ta­ sas de colonización del aparato genital tanto en hombres como en mujeres se relacionan con la actividad sexual, y los indivi­ duos con parejas sexuales múltiples tienen mayores probabili­ dades de estar colonizados. Por consiguiente, la epidemiología de adquisición del microorganismo sugiere que estos micoplasmas en realidad son transmitidos por contacto sexual. Otro dato adicional en favor del contagio sexual son las tasas de ais­ lamiento mucho más bajas en las mujeres que utilizan anticon­ ceptivos de barrera.292 Con estos datos, es claro que estos microorganismos son mucho más prevalentes, en particular en la localización vulvovaginal de mujeres sexualmente activas. En los últimos años, U. urealyticum y M. hominis se han implicado en una diversidad de cuadros clínicos relacionados sobre todo con la colonización y la infección de los genitales externos e internos femeninos y, en raras oportunidades en varones, infección de los genitales internos y prostatitjs 111,151,188,339 <§e jla postulado que ambos microorganismos se relacionan con la endometritis temprana y tardía, la corioamnionitis y la rotura prematura de membranas.99 111 137 La presen­ cia de JJ. urealyticum en el aparato genital, en particular, se asoció estadísticamente con prematuridad, recién nacidos con bajo peso al nacer y esterilidad.113'137’151-207 Es complicado reali­ zar estudios controlados sobre la patogenicidad de los micoplasmas genitales porque ambos microorganismos presentan una prevalencia muy elevada en adultos asintomáticos sexual­ mente activos. Como aspectos que confunden aún más la etio­ logía, los micoplasmas genitales suelen aislarse por cultivo junto con otros patógenos genitales reconocidos, como Chlamydia trachomatis, N eisseria gonorrhoeae y estreptoco­ cos del grupo B.8 Estas asociaciones hacen difícil determinar si un cuadro patológico se atribuye sólo a la presencia de micoplasmas genitales per se. Un ejemplo excelente de este dilema es el cuadro clínico conocido como vaginosis bacteriana. M. hominis está asociado con vaginosis bacteriana y a menudo se lo aísla en mujeres con esta infección.160-211-238 Sin embargo, en la actualidad se sabe que la vaginosis bacteriana es la conse­ cuencia de la interacción compleja entre bacterias aerobias y anaerobias. La participación de los micoplasmas genitales en este trastorno no ha sido dilucidada, pero no se ha confirmado una relación causal entre M. hominis y vaginosis bacteriana. Los estudios sobre la patogenicidad de los micoplasmas geni­ tales son aún más confusos por el aislamiento de los microor­ ganismos durante o después de la administración de antimi­ crobianos contra otros patógenos genitales.73 El tratamiento antimicrobiano para estos otros microorganismos pueden pro­ ducir la selección de micoplasmas resistentes a los agentes que se están utilizando (p. ej., penicilinas y cefalosporinas). Tras su aislamiento a partir de un cultivo genital o un sitio de le­ sión, se hace difícil adjudicar un papel etiológico de los mi­ croorganismos en vista de la administración previa o en curso de antibióticos. M. hominis y JJ. urealyticum se han aislado por hemoculti­ vos en mujeres con fiebre posparto.88-m -112-239’293'315 En cerca del 10% de las mujeres con fiebre posparto o posaborto se aísla M. hominis o U. urealyticum en los hemocultivos. En algunos casos, ya sea micoplasma o ambos pueden aislarse en los hemocultivos, junto con otros microorganismos del aparato genital que, como ya se dijo, confunden el papel etiológico de los micoplasmas. La baeteriemia posparto es la consecuencia

del ascenso de los microorganismos desde la vagina al endometrio, donde en apariencia los microorganismos causan endo­ metritis. La infección de las membranas placentarias y el líqui­ do amniótico por micoplasmas sucede con más frecuencia en las mujeres colonizadas que sufren rotura prematura de mem­ branas y trabajo de parto prolongado o pretérmino.125 Desde estos sitios, los microorganismos ingresan en el torrente circu­ latorio durante el trabajo de parto y el parto o después de una cesárea. También se ha documentado baeteriemia por U. ure­ alyticum como complicación en mujeres sometidas a histerectomía.83 El aislamiento de micoplasmas en los genitales externos de mujeres embarazadas se asocia con varias complicaciones del embarazo, como dar a luz a recién nacidos con bajo peso. En un estudio realizado por Kass y cois., en las mujeres cuyo apa­ rato genital estaba colonizado por U. urealyticum y con una respuesta de anticuerpos de cuatro veces o más contra el micro­ organismo hubo una tasa de 30% de recién nacidos con bajo peso, mientras que en las mujeres colonizadas sin respuesta de anticuerpos esta tasa fue de 7,3%.207 Además, la respuesta de anticuerpos fue específica de serotipo, lo que sugiere que la tasa adicional de bajo peso al nacer se relacionaba con infec­ ción reciente por un nuevo serotipo de JJ. urealyticum que dife­ ría del o de los serotipos ya presentes en la vagina. Un estudio que analizó la relación entre las dos bivariedades de U. urealy­ ticum y la evolución del embarazo encontró que la biovariedad urealyticum se asociaba con más problemas de bajo peso al nacer, bajo peso para la edad gestacional y parto prematuro que la biovariedad parvo.' Los estudios de tratamientos con tetraci­ clina o eritromicina mostraron reducciones de las tasas de bajo peso al nacer, lo que implica que la erradicación de micoplas­ mas (u otros microorganismos) del aparato genital puede tener un efecto beneficioso directo sobre ciertas complicaciones del embarazo.207 Las infecciones amnióticas por JJ. urealyticum pueden hallarse en mujeres asintomáticas con membranas fetales intac­ tas y estas infecciones se asocian con frecuencia con complica­ ciones del embarazo.52'138 171-505 U. urealyticum es capaz de ini­ ciar una respuesta tisular inflamatoria intensa, sin síntomas asociados y evidencia serológica de respuesta de anticuerpos contra estos microorganismos y el aislamiento simultáneo de ureaplasmas en la sangre parece confirmar la posibilidad de in­ fecciones amnióticas asintomáticas.52,127 Gray y cois, estudiaron dos grupos de mujeres embarazadas asintomáticas, ajustados por edad materna, edad gestacional e indicación de amniocentesis.138 Las muestras obtenidas por amniocentesis transabdominal se cultivaron para micoplasmas. Entre las 86 mujeres en el grupo negativo para ureaplasma se observó una incidencia del 1,2% de aborto espontáneo en el segundo trimestre y una tasa de prematuridad del 9,3%, para una tasa global de resulta­ dos adversos del 10,5%. Sin embargo, la tasa de complicacio­ nes en las ocho mujeres positivas para ureaplasma fue del 100%, lo que representa un riesgo 8,6 veces mayor. Entre las complicaciones se observaron aborto espontáneo (75%), partos prematuros con una tasa de mortalidad del 50% (25%) y enfer­ medad de las membranas hialinas (observada en el único recién nacido sobreviviente). La introducción de microorganismos en el líquido amniótico es también un paso crucial en el desarro­ llo de corioamnionitis y endometritis. La observación histoló­ gica de los tejidos placentarios de las ocho mujeres infectadas reveló corioamnionitis en la totalidad de ellas y las siete mues­ tras de tejido pulmonar de los lactantes evidenciaron neumo­ nía.138 Cuatro de las cinco placentas y tres de las cinco mues­ tras de tejido pulmonar fetal que se cultivaron mostraron el

Importancia clínica de los micoplasmas humanos

desarrollo de JJ. urealyticum. Horowitz y cois, también mos­ traron que el 50% de seis mujeres con cultivos positivos de liquido amniótico en el segundo trimestre para JJ. urealyticum presentaron complicaciones del embarazo, en comparación con el 12% de 123 mujeres con cultivos de líquido amniótico nega­ tivos.171 Eschenbach hizo una revisión de la información rela­ cionada con la participación de U. urealyticum en las compli­ caciones del embarazo y concluyó que, aunque la presencia de U. urealyticum en los genitales externos no se asoció con parto prematuro, su presencia en el coriamnion se asociaba firme­ mente con evidencia histológica de corioamnionitis y débil­ mente con parto prematuro como complicación.113 En otro estudio que evaluó la colonización endocervical por U. urealyticum y las respuestas serológicas contra este microorganismo, Horowitz y cois, encontraron que la colonización cervical, cuando se asocia con títulos elevados contra JJ. urealyticum, identifica una población de mujeres con riesgo de complica­ ciones del embarazo.169 170Aunque está bien establecido que las mujeres sanas colonizadas con M. hominis en el aparato geni­ tal por lo general dan a luz a recién nacidos sanos colonizados, en ocasiones M. hominis se ha asociado con corioamnionitis, aborto, mortinatos y muerte fetal intrauterina.296 En algunos casos, se observó que la infección placentaria a priori contribuye a endometritis ulterior, rotura prematura de membranas y parto prematuro. La colonización de la placenta permite la infección del endometrio, a partir del cual los micro­ organismos pueden acceder a la circulación. El aislamiento de JJ. urealyticum y M. hominis en el tejido endometrial después del parto ha establecido que los micoplasmas y los ureaplas­ mas, en particular, son causas probables en algunos casos de endometritis de comienzo temprano y tardío. La endometritis posparto es una complicación importante del embarazo y apa­ rece con más frecuencia después de la cesárea que del parto vaginal. En un estudio, la endometritis afectó el 28% de las mujeres con U. urealyticum presente en el corioamnion en el parto por cesárea, en comparación con sólo el 8,4% si el culti­ vo era negativo y el 8,8% si sólo había bacterias distintas de JJ. urealyticum .'2 Estos investigadores concluyeron que la coloni­ zación corioamniótica con JJ. urealyticum en mujeres con membranas intactas sometidas a cesárea fue un factor predictivo independiente de endometritis ulterior. Con posterioridad, un ensayo clínico aleatorizado sobre profilaxis con antimicro­ bianos de espectro ampliado activos contra JJ. urealyticum en mujeres sometidas a cesárea encontró que estos fármacos redu­ cen la incidencia de endometritis posparto.11 Aunque sugerida por algunos estudios, no se ha demostrado de manera inequí­ voca una relación causal definida entre micoplasmas genitales y enfermedad inflamatoria pelviana (salpingitis).41111'253391'419 Debido a las tasas elevadas de colonización de micoplasmas genitales en hombres y mujeres, también se han evaluado estos microorganismos en relación con la esterilidad involuntaria. De nuevo, aunque algunos estudios sugieren una posible participa­ ción de estos microorganismos en esta afección no existen pruebas que indiquen que sean la causa de esterilidad masculi­ na o femenina.426 En un estudio realizado en 2002 de 50 muje­ res estériles y 46 fértiles, M. hominis se aisló en el aparato genital del 8% de las mujeres estériles y en ninguna de los con­ troles.118 U. urealyticum se aisló en el 56% de las mujeres esté­ riles y en el 39% de las mujeres control; esta diferencia no fue estadísticamente significativa, pero los autores sugieren que puede existir una asociación entre esterilidad y JJ. urealyticum. En un estudio de 92 parejas estériles, 12 varones asintomáticos (13%) tenían JJ. urealyticum en su esperma. De nuevo, estos investigadores sugirieron que U. urealyticum puede participar

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en la esterilidad en ausencia de otras alteraciones.247 Se ha observado in vitro que JJ. urealyticum se adhiere a los esper­ matozoides, lo que produce reducciones importantes en su movilidad y alteraciones en las membranas celulares.325 Las imágenes por microscopía electrónica de barrido de estas célu­ las revelan espermatozoides con masas de JJ. urealyticum adhe­ ridos a su cabeza junto con otras alteraciones estructurales. Por consiguiente, estos investigadores también sugirieron una posi­ ble participación de JJ. urealyticum en la esterilidad debido a alteraciones en la estructura y la movilidad de los espermato­ zoides.325 Sin embargo, otro estudio no encontró diferencia en la calidad de los espermatozoides de hombres con cultivos positivos y negativos para M. hominis o U. ureaplasma, eva­ luada por la densidad, la vitalidad, la movilidad y la morfolo­ gía de los espermatozoides.10 JJ. urealyticum puede tener relación con casos de aborto espontáneo por su capacidad para causar corioamnionitis pero, a semejanza con otros trastornos descritos antes, no se han obtenido pruebas definitivas. Joste y cois, examinaron 42 abor­ tos espontáneos durante el primer trimestre y 21 abortos elec­ tivos durante el mismo período y los compararon en cuanto a la histología y los cultivos con 32 partos prematuros en el tercer trimestre, 11 de los cuales presentaban cultivos positivos para JJ. urealyticum.203 Entre las muestras obtenidas de abortos espontáneos ocurridos en el primer trimestre de gestación, en el 26% se observó desarrollo de ureaplasmas, mientras que los cultivos fueron negativos en las 21 muestras de abortos electi­ vos. La evidencia histológica de corioamnionitis no se asoció con la positividad de los cultivos de las muestras de aborto espontáneo. Sin embargo, la presencia de corioamnionitis se relacionó con cultivos positivos para ureaplasma en los 11 par­ tos prematuros en el tercer trimestre. Estos investigadores pos­ tularon que los cambios tempranos causados por la infección por JJ. urealyticum distintos de la corioamnionitis evidencia­ da por la histología pueden ser los determinantes de la patoge­ nia de los abortos espontáneos relacionados con la infección por ureaplasmas.203 Un estudio llevado a cabo en Bélgica entre 1989 y 1994 analizó las posibles relaciones entre el diagnósti­ co de vaginosis bacteriana durante el primer trimestre y aborto espontáneo de menos de 20 semanas de gestación. Se notó una asociación firme entre vaginosis bacteriana y aborto espontá­ neo.100 En un análisis multifactorial, M. hominis y JJ. urealyti­ cum, pero no otros microorganismos, mostraron una asociación estadísticamente significativa con el aumento del riesgo de aborto espontáneo. Sin embargo, otro estudio publicado en 2004 no halló asociación entre abortos espontáneos del primer trimestre y la presencia de micoplasmas o ureaplasmas en las placentas expulsadas.287 Un estudio que examinó muestras para la investigación de biovariedades específicas de JJ. urealyticum encontró que la biovariedad urealyticum era más frecuente en las pacientes con enfermedad inflamatoria pelviana y en las que tuvieron aborto espontáneo.1 También se informaron infecciones urinarias causadas por micoplasmas y, nuevamente, la mayor parte de la investigación en esta área ha sido en mujeres embarazadas. La determinación de la importancia de micoplasmas en muestras urinarias obte­ nidas por micción espontánea en condiciones adecuadas es difícil debido a la probable contaminación por microorganis­ mos que colonizan la vagina y la porción distal de la uretra. Dada la reconocida asociación entre bacteriuria durante el embarazo y el aumento de la incidencia de parto prematuro y preeclampsia, Savige y cois, recolectaron muestras de orina vesical por punción suprapúbica en 72 mujeres embarazadas sanas y en 51 mujeres con preeclampsia y cultivaron las mués-

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CAPÍTULO 18

Micoplasmas y ureaplasmas

tras de orina para micoplasmas.386 U. urealyticum se aisló en la orina del 7% de las mujeres sanas y del 20% de las que pade­ cían preeclampsia. En un estudio posterior sobre bacteriuria en 340 mujeres embarazadas, la presencia de U. urealyticum en la orina durante el primer trimestre se correlacionó con el desa­ rrollo de preeclampsia durante el tercer trimestre de embara­ zo.129 Entre las 21 mujeres que desarrollaron preeclampsia, el 29% tenía ureaplasmas en la orina durante el primer trimestre, en comparación con sólo el 10% de las pacientes en quienes no se desarrolló preeclampsia. En consecuencia, la aparición de preeclampsia fue tres veces más probable en las mujeres que te­ nían ureaplasmas en la orina al comienzo del embarazo que en las que tenían cultivos negativos. Aunque los mecanismos implicados en la patogenia de la preeclampsia no son claros, se sugiere que los ureaplasmas, similar a otras bacterias que pro­ ducen bacteriuria, también pueden contribuir a complicaciones del embarazo. En otro estudio de micoplasmas realizado en 48 mujeres con síntomas crónicos de infección urinaria, 23 (48%) presentaron cultivos positivos; en 22 se aisló U. urealyticum y en 1, Ai. hominis.35' Tras el tratamiento específico, los cultivos de todas las mujeres fueron negativos y 21 de las 23 mujeres infectadas experimentaron alivio de los síntomas crónicos. Estos investigadores concluyeron que tras la exclusión de agen­ tes habituales de infecciones urológicas, alteraciones anatómi­ cas y disfunciones neurológicas, debe hacerse un cultivo para micoplasmas e implementar, eventualmente, un tratamiento específico contra ellos antes de considerar otros procedimien­ tos diagnósticos.351 En los varones, M. hominis es relativamente infrecuente como causa de enfermedad clínica y la mayoría de las investigaciones sobre micoplasmas se han concentrado en la asociación de U. urealyticum con la uretritis no gonocócica y no clamidial (UNGNC). Está bien confirmado que Chlamydia trachomatis es el agente etiológico que produce del 30% al 50% de uretri­ tis aguda no atribuible a N. gonorrhoeae y se ha hecho una aso­ ciación importante entre UNGNC y M ycoplasm a genitalium, que puede determinar del 15% al 25% de los casos de UNGNC aguda.90,91-164Aunque se han realizado varios estudios, el papel de U. urealyticum en la uretritis masculina no está totalmente claro. Aunque los datos más tempranos sugieren que U. ure­ alyticum es la causa de algunas UNGNC, no se sabe qué pro­ porción de infecciones se deben a este microorganismo e inclu­ so si el microorganismo está presente en la uretra de varones sintomáticos, no puede establecerse su papel como agente cau­ sal. Estudios en varones sintomáticos tratados con antibióticos con actividad diferencial entre Chlamydia trachom atis y U. urealyticum y cultivos realizados en hombres con síntomas per­ sistentes de uretritis tras tratamientos específicos contra gono­ cocos y clamidias sugirieron que algunos casos de uretritis no gonocócica son causados por U. urealyticum .13-43' El uso de métodos moleculares altamente sensibles junto con respuestas serológicas ha proporcionado información respecto del papel de U. urealyticum en la uretritis no gonocócica. Un estudio rea­ lizado por Horner y cois, con análisis multifactorial determinó que U. urealyticum no se asocia con UNGNC aguda, pero se asoció con UNGNC crónica, la cual fue definida para el estu­ dio como la uretritis que aparecía 30 a 92 días después del ini­ cio del tratamiento.165,166 Estos investigadores concluyeron que los ureaplasmas eran una causa probable de UNGNC crónica que apareció después del tratamiento. Un estudio realizado en 2004 en Japón informó una asociación significativa entre U. urealyticum y UNGNC y sugirió que la presencia de U. parvum en la uretra puede reflejar colonización y no infección.93 Otros estudios recientes que utilizan técnicas moleculares sensibles

establecieron que U. urealyticum se asocia con algunos casos de UNGNC y que U. parvum se observa con más frecuencia en infecciones asintomáticas, aunque algunos pacientes pueden ser sintomáticos.353,507 Los ureaplasmas también pueden estar implicados en la etio­ logía de la prostatitis crónica. Mediante el empleo de técnicas clásicas para la localización de las infecciones en la próstata, varios investigadores confirmaron U. urealyticum como el cau­ sal de una pequeña proporción de casos de prostatitis crónica 326,327,339,402 £ n un estuclio realizado en 2002 en Croacia, U. urealyticum fue el único agente aislado en el líquido prostático del 2,54% de 276 pacientes con infección prostática crónica.402 En un estudio en Japón. U. urealyticum se aisló en secreciones de líquido prostático de 18 de 143 pacientes con prostatitis.327 El tratamiento dirigido contra el ureaplasma erradicó a los microorganismos junto con la resolución de los síntomas, lo que sugiere que era el agente causal en estos pacientes. U. ure­ alyticum es una causa rara de epididimitis; se ha informado un único caso en que los microorganismos se aislaron en una muestra obtenida por punción y aspiración del epidídimo aso­ ciado con un aumento significativo de anticuerpos contra el microorganismo.188 Con frecuencia, los niños nacidos de madres colonizadas por micoplasmas genitales también están colonizados. En estudios estadísticos, entre el 18% y el 45% de los recién nacidos de madres colonizadas también estaban colonizados por M. homi­ nis, y con cultivos positivos de fauces, aparato genital u ori­ na.99,111 La tasa de transmisión vertical de U. urealyticum varía del 18% al 55% entre los recién nacidos a término y del 29% al 55% entre los prematuros.378 Syrogiannopoulos y cois, reali­ zaron cultivos de muestras de fauces, ojos y vagina de 193 recién nacidos de término de mujeres colonizadas en la vagina por U. urealyticum.422 De éstos, 107 (55%) tenían U. urealyti­ cum presente en al menos un sitio de cultivo. La colonización puede persistir en estos niños durante períodos prolongados sin efectos mórbidos para ellos. En este último estudio, el 68%, el 33% y el 37% de los niños que presentaban colonización en el momento de nacer en fauces, ojos y vagina, respectivamente, seguían colonizados a los 3 meses de edad. En los niños que presentaban colonización del aparato respiratorio, no hubo aumento de la incidencia de enfermedades respiratorias cuan­ do se compararon con niños sin colonización en esa área. En un estudio realizado en Israel, 24% de 99 recién nacidos prematu­ ros estaban colonizados con micoplasmas; U. urealyticum se aisló en 21 recién nacidos y M. hominis, en tres.181 En este estu­ dio, la tasa de colonización presentó una correlación inversa con la edad gestacional; el 80% de los recién nacidos menores de 28 semanas de gestación estaban colonizados, en contrapo­ sición con el 17,9% de los nacidos a las 28 a 36 semanas de gestación.181 De los 27 recién nacidos que precisaron asistencia respiratoria mecánica en este estudio, en el 22% se aisló U. ure­ alyticum de las secreciones respiratorias bajas. Varios estudios han sugerido que U. urealyticum se asocia con enfermedad pulmonar crónica, displasia broncopulmonar, hipertensión pulmonar persistente e infección sistémica en recién nacidos prematuros.29,51,53,142,338,476,478,482 Estudios pros­ pectivos y otros en modelos animales han mostrado una rela­ ción significativa entre infecciones respiratorias por U. urealy­ ticum y el desarrollo de enfermedad pulmonar crónica del recién nacido.74373,482 Cassell y otros investigadores hallaron que el aislamiento de U. urealyticum en la tráquea de recién nacidos con un peso menor de 1 000 g, que también requirie­ ron asistencia respiratoria, se relacionaba con el desarrollo de displasia broncopulmonar y trastornos asociados (p. ej., enfer­

Importancia clínica de los micoplasmas humanos

medad de las membranas hialinas, conducto arterioso permea­ ble y neumonía).51 Un estudio ulterior realizado por Crouse y cois, mostró que los recién nacidos de bajo peso al nacer con dificultad respiratoria, de los que se había aislado U. urealyti­ cum en cultivos de tráquea, tenían más probabilidad de presen­ tar displasia y evidencia de neumonía en la radiografía de tórax que aquellos en quienes no se había aislado este microorganis­ mo.74 La colonización nasofaríngea o traqueal de los recién nacidos prematuros con U. urealyticum también se asoció con un recuento elevado en leucocitos en sangre periférica.328 Sánchez y Regan encontraron que en los recién nacidos colo­ nizados por ureaplasmas en el aparato respiratorio en el 30% de los casos se desarrolla enfermedad pulmonar crónica que requiere asistencia respiratoria mecánica, mientras que la enfermedad respiratoria se observó sólo en el 8% de los recién nacidos no colonizados.379 La infección del torrente circulato­ rio por U. urealyticum se ha documentado en recién nacidos y estas infecciones a menudo se asocian con infecciones respira­ torias coexistentes.45-29,476Estas infecciones sistémicas se vincu­ lan con infecciones urinarias, rotura prolongada de membra­ nas, trabajo de parto prematuro y corioamnionitis en la madre, y con bajo peso al nacer, presencia de anomalías congénitas y asfixia perinatal en el recién nacido.476 La patogenia de este síndrome en el neonato fue apoyada por modelos animales y refleja la naturaleza de estas bacterias como agentes oportunis­ tas y el estado de inmunodepresión del recién nacido prematu­ ro. Estudios con cultivos de fibroblastos de pulmón neonatal han demostrado la inducción de la libración de citocina desde estas células por infección por U. urealyticum in vitro, que sugiere alguna participación de las citocinas en la patogenia de la displasia broncopulmonar en la prematuridad.409 Los estu­ dios serológicos indican que el neonato o el feto con infección sistémica por U. urealyticum elabora anticuerpos de IgM e IgG anti ureaplasma específicos contra la serovariedad, lo que pro­ vee evidencia adicional del potencial patógeno de estos micro­ organismos.356 Varios informes y estudios mostraron que LJ. urealyticum y M. hominis se aíslan con poca frecuencia en el SNC como causa de meningitis asintomática o clínica sintomática en el período neonatal.468 Se describieron numerosos casos de infec­ ciones neonatales por M. hominis del SNC; la mayoría de éstos afectaron a recién nacidos prematuros en quienes se confirmó la rotura prematura de membranas, aunque también se descri­ bieron casos en recién nacidos de término.9,294,496 En un estudio prospectivo de 100 recién nacidos prematuros, Waites y cois, aislaron IJ. urealyticum en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de ocho y M. hominis en el LCR de cinco.479 Entre los niños con infección por LJ. urealyticum , seis presentaban hemorragia intraventricular, tres hidrocefalia y tres murieron. Ninguno de los recién nacidos con infección por M. hominis falleció y uno presentó signos neurológicos de meningitis. Sin embargo, Gilbert y Drew comunicaron un caso de meningitis en un recién nacido prematuro causada por M. hominis que siguió una evolución crónica, con el desarrollo de hemorragia intra­ ventricular.128 En todos estos casos la erradicación de los microorganismos con antibioticoterapia fue difícil. En un estu­ dio de 318 con predominio de recién nacidos de término con signos de presunta sepsis o meningitis y madres con bajo ries­ go, M. hominis se aisló en el LCR de 9 y JJ. urealyticum en el LCR de 5.476 De estos 14 recién nacidos infectados, 12 se recu­ peraron sin tratamiento y 2 murieron: 1 con M. hominis falle­ ció por sepsis por Haemophilus influenzae mientras que el otro, infectado por LJ. urealyticum. presentó hemorragia intraventri­ cular. Este estudio sugirió que los micoplasmas son más fre­

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cuentes en las infecciones neonatales del SNC que lo percibi­ do con anterioridad. Aunque las infecciones del SNC por M. hominis suelen resolverse de modo espontáneo, los ureaplas­ mas pueden desencadenar respuestas inflamatorias que se aso­ cian con hemorragia intraventricular.156 Además de las infecciones del SNC, los micoplasmas, en especial M. hominis, también se han aislado en otras infeccio­ nes extragenitales en niños y adultos. M. hominis adquirido en el período perinatal fue aislado en abscesos subcutáneos del cuero cabelludo por lesiones producidas por fórceps, en el monitor, en infecciones conjuntivales y en ganglios linfáticos submandibulares del recién nacido.43 131,354 M. hominis también se aisló en hemocultivos múltiples de niños de 10 meses de edad que habían sufrido quemaduras graves.79 En adultos, M. hominis se cultivó a partir de una amplia variedad de infeccio­ nes, como baeteriemia, infecciones de heridas posquirúrgicas y poshisterectomía, hematomas, artritis séptica, empiema asocia­ do con aspiración, tromboflebitis séptica, peritonitis, abscesos periorbitales, abscesos intraabdominales y retroperitoneales y abscesos cerebrales.44-68,126,221,245,278,285,295,306,307,337,362 En pacientes sometidos a cirugía cardiotorácica también se observaron bacteriemia e infecciones posquirúrgicas de la herida esternal por M. hominis ,311-404 En otro informe de casos sobre infección de la herida esternal por M. hominis , también se aisló LJ. urealyticum ,348 Se informó endocarditis por M. hominis a causa de una valvuloplastia y ambos, M. hominis y LJ. urealyticum, se aislaron en tejidos o líquidos pericárdicos de pacientes con derrame pericárdico.35,212 Los pacientes con estas infecciones tenían antecedentes de cirugía cardíaca reciente (p. ej., cirugía de bypass coronario, reemplazo de la válvula aórtica, trasplan­ te cardíaco por miocardiopatía dilatada idiopática) o eran inmunodeprimidos (p. ej., lupus eritematoso sistémico, enfer­ medad pulmonar obstructiva crónica).212 M. hominis también se aisló en infección de la herida quirúrgica tras la inserción de una prótesis mamaria de silicona.381 M. hominis y U. urealyticum pueden comportarse como agentes infecciosos oportunistas en pacientes con enfermeda­ des subyacentes, como hipogammaglobulinemia, enfermedad de Hodgkin, lupus eritematoso sistémico, trasplante renal, car­ diopatía, leucemia, linfoma, artritis reumatoide y traumatismo grave.68,205,276,304,307,330,336,435-449 Se informaron cepas de M. homi­ nis y U. urealyticum a partir de artritis séptica en pacientes con hipogammaglobulinemia, procesos hemáticos malignos, trau­ matismo masivo, baeteriemia posparto, lupus eritematoso e inmunodeficiencia común variable; es probable que esta enti­ dad clínica suceda por siembra hemática de los espacios arti­ culares.47-68-202-449En 1994, Kane y cois, comunicaron el primer caso de infección respiratoria con hemorragia alveolar difusa causada por M. hominis en el receptor de un trasplante de médula ósea.205 M. hominis se aisló en hematomas perihepáticos posquirúrgicos que se formaron en el abdomen del recep­ tor de un trasplante hepático un mes después de la cirugía.187 M. hominis y U. urealyticum se aislaron en un hematoma retroperitoneal 12 días después del trasplante hepático en una mujer de 45 años con insuficiencia hepática fulminante.141 También se confirmaron infecciones de articulaciones protésicas por M. hominis e infecciones de heridas quirúrgicas por este microor­ ganismo tras la reducción abierta de fracturas mandibulares como también después de operaciones cesáreas.346-404Las infec­ ciones en la región de la cabeza, el cuello y el tórax, y en el teji­ do contiguo con el aparato genital pueden reflejar la presencia de estos microorganismos en los aparatos respiratorio y uroge­ nital, respectivamente.306-362 Por ejemplo, Kayser y Bhend informaron un caso de infección de los tejidos blandos paraes-

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piñales e intervertebrales en una mujer de 45 años que se pre­ sentó a los 16 días de ser sometida a una histerectomía abdo­ minal.210 M. hominis también se aisló en la orina de pacientes con infección por HIV. En un estudio realizado por Chirgwin y cois, en la State University of New York en Brooklyn, M. homi­ nis se aisló en el 18% de las muestras de orina obtenidas de 180 individuos HIV positivos y en el 21% de las muestras de orina de 38 individuos HIV negativos.62 En este estudio, se aislaron otros 30 micoplasmas que utilizan la glucosa sólo de indivi­ duos HIV positivos.62 La inhibición del crecimiento con anti­ sueros específicos permitió la identificación de 18 de estas cepas: 14 se identificaron como M. ferm entans y 4 como M. pirum. Las 12 cepas aisladas restantes no resultaron viables en los subcultivos. Mycoplasma genitalium

En 1981, Tully y cois, aislaron un micoplasma con caracte­ rísticas inusualmente exigentes, no descrito antes, en muestras uretrales de dos de 13 varones homosexuales con UNGNC.458 Aunque fracasaron varios intentos posteriores para aislar este microorganismo nuevo, otras cepas del mismo microorganismo se aislaron en muestras urogenitales en China.275 En 1983, esta nueva especie se denominó M. genitalium.459 El examen de estas cepas en el microscopio electrónico mostró que el nuevo microorganismo comparte varias características con M. pneu­ moniae, como el aspecto de las células individuales similar a una redoma cónica y la presencia de una estructura apical espe­ cializada que facilita la adherencia del microorganismo a célu­ las tisulares, eritrocitos y material inerte, como plástico y vidrio.459 M. genitalium tiene una proteína específica de espe­ cie de 140 kDa conocida como P140, que es una contraparte estructural y funcional de la proteína citoadhesina Pl de 170 kDa de M. pneum oniae.310 Las variantes no adherentes de M. genitalium tienen una adhesina P140 alterada o han perdido la molécula adhesina asociada con la membrana.299 M. genitalium y M. pneumoniae contienen una proteína de 43 kDa que pre­ senta reacción cruzada que también se detecta en las cepas ais­ ladas de Acholeplasm a laidlaw ii.65 Estos comparten epítopos antigénicos que con probabilidad son los que determinan las reacciones serológicas cruzadas observadas con M. genitalium en la mayoría de las pruebas para anticuerpos contra M. pneu­ moniae, como fijación del complemento, inmunofluorescencia indirecta y pruebas de inhibición m etabólica y de inhibición del crecimiento mediante el empleo de antisueros heterólogos.77-78'254 Los estudios de hibridación del DNA mostraron que los dos microorganismos tienen homología del 6,5-8,1% en la secuencia nucleotídica, lo que tal vez refleje aquellos genes que codifican las proteínas antigénicas que reaccionan en forma cruzada.254504 Otras secuencias génicas son en realidad únicas para esas dos especies, lo que provee evidencia de que M. pneumoniae y M. genitalium son especies separadas.459 En un comienzo, los estudios epidemiológicos por cultivo y serología establecieron una relación entre estas especies de M ycoplasm a con requerimientos nutricionales especiales y UNGNC. En un estudio realizado por Taylor-Robinson y cois., se detectaron títulos de anticuerpos contra M. genitalium en 4 de 14 pacientes con UNG y en 2 de 17 pacientes sin uretritis, pero sólo 1 de los 4 pacientes que presentó seroconversión tenía un cultivo positivo.433 La imposibilidad de aislar los microorganismos en estudios sobre uretritis tal vez refleje la falta de técnicas adecuadas para obtener cultivos confiables de estas especies con requerimientos nutricionales especiales.

Para sortear los problemas inherentes al cultivo, Hooton y cois, investigaron la incidencia de M. genitalium en varones median­ te sondas de ácido nucleico específicas de especie preparadas a partir del DNA genómico de M. genitalium .'63 Estos investiga­ dores detectaron el microorganismo en el 14% de 21 varones con uretritis gonocócica, 10% de 30 varones con uretritis por clamidias, 13% de 31 varones con UNGNC y 27% de 37 varo­ nes con uretritis recurrente o persistente. Sin embargo, el microorganismo también se detectó en el 12% de 84 hombres sin síntomas genitourinarios. En 1996, Jensen y cois, pudieron aislar cuatro cepas de M. genitalium en muestras uretrales de varones con UNGNC; estos pacientes también eran positivos por PCR.193 Mediante el empleo de una técnica de PCR basada en sonda que detectó la secuencia nucleotídica específica del gen para la adhesina de 140 kDa de M. genitalium, Jensen y cois, encontraron DNA de M. genitalium en el 17% de las muestras uretrales de 99 varones; el 20% de las muestras de varones sintomáticos fueron positivas, mientras que sólo el 9% de las los asintomáticos lo eran.195,196 En este estudio, todos los intentos para cultivar el microorganismo de las muestras posi­ tivas por PCR resultaron insatisfactorios. Horner y cois, tam­ bién utilizaron la técnica de PCR mediante sondas para la detección de M. genitalium y hallaron que el 23% de 103 varo­ nes con signos o síntomas de UNGNC aguda y el 6% de 53 varones sin UNGNC eran positivos.164 La presencia de este microorganismo en el aparato urogenital masculino era inde­ pendiente de la presencia de Chlamydia trachomatis. Mediante técnicas de PCR, el mismo grupo de investigación no pudo detectar M. fermentans, M. penetrans ni M. pirum en muestras uretrales de pacientes con UNGNC.89 Estos investigadores con­ cluyeron que M. genitalium era el agente etiológico en muchos casos de UNGNC; esto también estuvo avalado por la respues­ ta clínica de los hombres infectados al tratamiento con doxici­ clina.164 En la actualidad, varios estudios que emplean técnicas mole­ culares han establecido que M. genitalium es la causa del 18,4% al 45,5% de todos los casos de UNGNC en los varones y que la persistencia de los microorganismos en la uretra tras el tratamiento antimicrobiano se asocia con uretritis no gonocóci­ ca persistente o recurrente.91'190'279,298'439'452 Los métodos mole­ culares de detección de M. genitalium incluyen los ensayos de PCR convencionales y en tiempo real que amplifican el gen para la adhesina (MgPa) específica de M. genitalium o regiones específicas de especie del gen rRNA 16S.94,109'192'506 El uso de los ensayos en tiempo real para la detección de M. genitalium, en las muestras de orina de la primera parte de la micción dio resultados cuantitativos que evidencian que las cantidades de M. genitalium en esas muestras de varones sintomáticos son mucho más elevadas que las observadas en varones asintomá­ ticos. En varones con uretritis no gonocócica por Ai. genitalium la proliferación de microorganismos se suprimió durante el tra­ tamiento con levofloxacina y los pacientes se tornaron asinto­ máticos. Tras el tratamiento, a menudo se constató ausencia de síntomas, pero persistencia de microorganismos en la uretra. La reaparición de los síntomas se asoció con un aumento de la cantidad de microorganismos en pacientes en quienes el trata­ miento fracasó. Estos estudios sugieren que para evitar que la uretritis asociada con M. genitalium conduzca a la recurrencia ulterior de UNGNC es necesaria la antibioticoterapia con erra­ dicación del microorganismo del aparato genital.94 En 1988. Baseman y cois, aislaron M. genitalium junto con M. pneumoniae en 4 de 16 muestras congeladas recolectadas de las vías respiratorias de reclutas militares durante un ensayo de vacuna contra M. pneumoniae en 1974 y 1975.20 El papel de

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1/ ¿enitalium en la enfermedad respiratoria no es claro, pero ^ ha sugerido que la asociación con M. pneumoniae puede ;¿usar una infección sinérgica que provoca una enfermedad neumónica más grave o puede contribuir a la patogenia de . r plicaciones extrapulmonares de la infección por M. pneuniae. La presencia de M. genitalium en el aparato respiralorio. con M. pneumoniae o sin este microorganismo, y la reac­ tividad inmunitaria cruzada entre los dos microorganismos rueden no sólo complicar el proceso infeccioso en individuos . :nfectados sino también afectar la respuesta inmunitaria con­ tra la infección. Por consiguiente, estas interacciones pueden interferir en la interpretación de las pruebas serológicas utili­ zadas con frecuencia para diagnosticar las infecciones por M. pneumoniae. El empleo de cebadores de PCR y sondas de áci­ dos nucleicos específicas de M. pneumoniae y M. genitalium puede proporcionar una solución a los problemas clínicos y diagnósticos porque evita la necesidad de cultivar estos agentes y de interpretar las respuestas inmunitarias y las consiguientes reacciones serológicas cruzadas que aparecen con estos micro­ organismos.177 Algunos estudios han evaluado la detección y la importancia de M. genitalium en el aparato genital fem enino.15-436 En un estudio llevado a cabo en una clínica de enfermedades de trans­ misión sexual de Londres, M. genitalium se detectó por PCR en muestras genitales del 18% de 57 pacientes mujeres.333 Otro estudio, realizado en Copenhague, informó el hallazgo de M. genitalium en muestras endocervicales de 5 de 74 mujeres.196 Ninguno de estos estudios investigó la asociación de estas cepas aisladas con la presencia de enfermedad o patología. Aunque faltan datos definitivos sobre la patogenicidad de M. genitalium en el aparato genital femenino, las evidencias indi­ rectas sugieren que también puede estar implicado en la infec­ ción tanto de los genitales externos como internos. Un estudio llevado a cabo en Japón halló M. genitalium en el 7,8% de 64 mujeres con cervicitis purulenta y estudios realizados en Estados Unidos determinaron que, una vez excluidas las infec­ ciones gonocócicas y por clamidias, las pacientes con cervici­ tis purulenta tenían una probabilidad de más del triple de pre­ sentar M. genitalium en el cuello uterino que las que no tenían esa afección.281,463 Por otra parte, Casin y cois, examinaron a 170 mujeres con síntomas genitales que asistían a una clínica de enfermedades de transmisión sexual (ETS) de París y no hallaron relación entre mucocervicitis purulenta y la presencia de M. genitalium, a pesar del hecho de que el 38% de las muje­ res tenían resultados de PCR positivos para M. genitalium en uno o más sitios genitales (por lo general vaginal).50 También existen evidencias de la implicación de M. genitalium en endometritis y enfermedad inflamatoria pelviana aguda. Un estudio realizado en Nairobi, Kenya, en 115 mujeres que presentaban dolor pelviano persistente determinó que el 16% de 58 mujeres con endometritis confirmada por histología eran positivas por PCR para M. genitalium en el cuello uterino, el endometrio o ambos.70 En otro estudio efectuado en Londres, 13% de 45 mujeres con enfermedad inflamatoria pelviana tenían evidencia por PCR de M. genitalium en el endocérvix, en comparación con ninguna de las pacientes control.400 Los estudios serológicos también han documentado títulos elevados de anticuerpos contra M. genitalium en algunas mujeres con enfermedad infla­ matoria pelviana no atribuible a gonococos, clamidias o M. hominis', en chimpancés inoculados de modo experimental con M. genitalium se han desarrollado infecciones de los genitales internos y externos.308,434 Algunos estudios serológicos también indican que la infección por M. genitalium puede ser un factor de riesgo independiente en la patogenia de un proceso infla­

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matorio que puede conducir a la cicatrización de los tejidos uterinos, lo cual da por resultado esterilidad.67 M. genitalium también se ha aislado, además de en los apa­ ratos respiratorio y genital, en muestras de líquido articular de pacientes con artritis obtenidas por punción y aspiración. En un informe sobre dos de estos casos, M. genitalium se detectó por análisis de PCR en la articulación de la rodilla de un varón de 25 años con síndrome de Reiter y en la de otro de 58 años con artritis reumatoide seronegativa 437 M. pneumoniae y M. geni­ talium se detectaron en una muestra de líquido articular de la rodilla de un paciente con hipogammaglobulinemia, neumonía por micoplasma y poliartritis tras una neumonía intensa.456 M. genitalium también se asoció con infección por HIV, aun­ que no en la magnitud de otras especies, como M. ferm entans y M. penetrans. Montagnier y Blanchard detectaron M. genita­ lium por PCR en la sangre de un paciente con SIDA en 1993.309 Sin embargo, una investigación de 1996 para la presencia de seis especies de M ycoplasm a en células mononucleares de san­ gre periférica de 154 pacientes seropositivos para HIV, 40 pa­ cientes de la clínica de ETS seronegativos para HIV y 40 donantes de sangre seronegativos para HIV no pudo detectar M. genitalium por PCR en ninguno de ellos.233 Otra investiga­ ción de micoplasmas en la orina en 15 niños HIV seropositivos realizada en 1999 encontró sólo una única muestra positiva para M. genitalium en 1 de 9 niños con enfermedad por HIV grave.176 M. genitalium también se detectó por PCR en mues­ tras uretrales y rectales de varones homosexuales con UNGNC y sin ella.438 Mycoplasma fermentans M. ferm entans es una especie de micoplasma humano con requerimientos nutricionales especiales que durante años fue considerado un contaminante de cultivo de tejidos.464 El uso creciente de linfocitos y macrófagos provenientes de seres humanos en la investigación inmunológica y viral fue tal vez la razón por la cual se consideró este agente contaminante de cul­ tivo de tejidos. M. ferm entans ha sido detectado por PCR en muestras de saliva de individuos sanos y también en los apara­ tos genitourinario y respiratorio de seres humanos.61-395 En un estudio realizado en Londres, se empleó un ensayo de PCR para detectar M. ferm entans en hisopados de fauces y muestras de orina de estudiantes universitarios sanos y de pacientes con inmunodeficiencias congénitas.5 De 45 estudiantes en los que se habían recogido ambas muestras de fauces y de orina, 12 (27%) presentaban M. ferm entans en al menos una de sus muestras. En 19 pacientes con inmunodeficiencias congénitas, una muestra de hisopado de fauces y tres muestras de orina fue­ ron positivas para M. ferm entans por PCR. En 1986 se alentó el interés en M. ferm entans como patóge­ no humano cuando Lo y cois, en la AFIP y los National Institutes of Health (NIH) informaron el aislamiento de un micoplasma nuevo en tejidos de sarcoma de Kaposi de pacien­ tes con SIDA.255-265 A este micoplasma se le dio el nombre provisorio de M ycoplasm a incognitus.264 Por medio de técnicas inmunohistoquímicas con anticuerpos monoclonales contra este agente nuevo, Lo y cois, detectaron antígenos de M. incog­ nitus en timo, hígado, bazo, ganglios linfáticos y tejido cerebral de pacientes con SIDA y en tejidos placentarios después del parto de mujeres embarazadas con SIDA.258 La histopatología de los tejidos infectados mostró diversas respuestas; en algunos no se observaron cambios histológicos mientras que en otros se notó necrosis con inflamación fulminante. La inoculación intraperitoneal de cuatro monos langur plateados con este

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CAPÍTULO 18

Micoplasmas y ureaplasmas

agente produjo síndrome consuntivo y muerte en 7 a 9 me­ ses.268-270 Estos mismos investigadores también comunicaron sobre seis pacientes, provenientes de seis regiones geográficas diferentes, quienes presentaron una enfermedad aguda gripal y un síndrome con fiebre persistente, linfadenopatía, diarrea e insuficiencia multiorgánica, que produjo la muerte en el trans­ curso de l a 7 semanas. Las autopsias revelaron necrosis ful­ minante de los tejidos de ganglios linfáticos, pulmones, híga­ do, glándula suprarrenal, corazón y cerebro. Las técnicas inmunohistoquímicas y la microscopía electrónica revelaron antígenos de micoplasmas en las áreas de necrosis y una sonda de DNA específica marcada detectó el material genético del agente en los tejidos infectados.257 Ninguno de estos pacientes estaba infectado por HIV-l o HIV-2. Los perfiles de hibrida­ ción de ácidos nucleicos, el mapeo de endonucleasas de res­ tricción y los análisis antigénicos indicaron que M. incognitus no era un micoplasma nuevo sino una cepa de M. ferm entans, un micoplasma “no patógeno” con requerimientos nutriciona­ les especiales, encontrado en el aparato genital.49-376-383 Con posterioridad se encontró que la cepa “incognitus” de M. ferm entans se asocia con otra patología en pacientes con SIDA. Bauer y cois, examinaron tejidos renales de 15 pacien­ tes con SIDA y evidencia por microscopía óptica de neuropatía asociada con el SIDA.21 Los tejidos de estos pacientes mostra­ ron reacciones de inmunofluorescencia con anticuerpos mono­ clonales específicos de la cepa incognitus de M. ferm entans en células endoteliales y epiteliales glomerulares, membranas basales glomerulares, células epiteliales tubulares y cilindros, y células intersticiales mononucleares. Las estructuras de los mi­ coplasmas también se observaron por inmunomicroscopia elec­ trónica en tejidos renales de estos pacientes. Los tejidos renales de pacientes con SIDA sin afectación renal y de pacientes sin SIDA con nefropatía y sin ella no revelaron microorganismos en el examen histopatológico.21 Ainsworth y cois, también comunicaron el caso de un paciente con nefropatía asociada con HIV en quien M. ferm entans se detectó en tejidos renales por PCR cuando se hizo clínicamente evidente la nefropatía; 18 meses después, cuando progresó la enfermedad y se deterioró la función renal del paciente, la PCR detectó M. ferm entans en la orina, las fauces y la sangre periférica.6 El DNA de M. f e r ­ mentans también se detectó en muestras de ganglios linfáticos provenientes de cuatro de siete pacientes con SIDA.384 Lo y cois, informaron tres pacientes sin SIDA en quienes se desa­ rrolló un síndrome de dificultad respiratoria fulminante del adulto asociado con M. ferm entans; los estudios inmunohistoquímicos y de microscopia electrónica revelaron microorganis­ mos en los pulmones y el hígado.269 También se documentó la infección diseminada por M. ferm entans en pacientes HIV positivos con linfoma no Hodgkin.3 Otros investigadores también informaron la asociación de M. ferm entans cepa incognitus con enfermedad por último mortal en pacientes sin SIDA. Macón y cois, describieron un varón homosexual de 35 años con sarcoma de Kaposi y linfoma de linfocitos T con un recuento de linfocitos CD4 periféricos de 43 por milímetro cúbico.277 Con posterioridad el paciente presen­ tó neumonía mortal por Pneum ocystis e infección criptococócica diseminada. Varios enzimoinmunoanálisis y técnicas de inmunotransferencia por Western blot para HIV-l, HIV-2, virus linfotrópico de linfocitos T humanos (HTLV)-I y anticuerpos contra HTLV-II fueron negativos, como también los cultivos retrovirales y los estudios por PCR. La infección sistémica por M. ferm entans se documentó por métodos inmunohistoquímicos y PCR en muestras de tejido pre mórtem y post mórtem. Beecham y cois, informaron un caso similar en un varón de 28

años antes sano, no inmunodeprimido. que presentó un antece­ dente de 7 días de fiebre, dolor abdominal, diarrea, erupción cutánea y disnea. M. ferm entans se detectó en muestras de biopsia de médula ósea por PCR y microscopia electrónica.25 En otro informe de un hombre antes sano, seronegativo para HIV, con síntomas similares al SIDA de fiebre, malestar gene­ ral, pérdida de peso, diarrea y extensa necrosis hepática y esplénica, el tratamiento con doxiciclina (300 mg/día, por vía oral durante 6 semanas) dio por resultado la resolución de los síntomas y la recuperación completa del paciente.256 Estos estu­ dios sugieren que M. ferm entans, o una cepa específica de esta especie, puede ser un patógeno sistémico en pacientes no infec­ tados por HIV. La aplicación de métodos moleculares para la detección de M. ferm entans dio lugar a la aparición de varias publicaciones que documentan la presencia de este microorganismo en diver­ sos sitios corporales de individuos HIV positivos y de HIV negativos. Aunque el aislamiento por cultivo de M. ferm entans es bastante difícil, en ciertos estudios se realizaron intentos para ello. Mediante técnicas de PCR, Dawson y cois, detecta­ ron M. ferm entans en el 23% de 43 muestras de sedimento uri­ nario provenientes de pacientes con nefropatía asociada con SIDA.82 Tres muestras de orina de dos pacientes resultaron positivas por cultivo para M. ferm entans en medios SP-4 modi­ ficado, A-7 y Hayflick. En estos mismos pacientes, en cuatro cultivos se desarrolló JJ. urealyticum y en dos, M. hominis. Ninguna de las 50 muestras de sedimento urinario de 50 pacientes sanos, HIV negativos fue positiva por cultivo o PCR para M. ferm entans, aunque en las 23 muestras se desarrolló JJ. urealyticum y en una, M. hominis. Katseni y cois, examinaron muestras de sangre, fauces y orina de 117 pacientes HIV posi­ tivos, 114 de los cuales eran varones homosexuales y de 73 pacientes HIV seronegativos que se atendían en una clínica de ETS de Londres.208 M. ferm entans se detectó por PCR en el 10% de las 117 muestras de células mononucleares de sangre periférica, en el 23% de las 65 muestras de fauces y en el 8% de 55 muestras de orina de personas HIV positivas. Entre los 73 pacientes HIV seronegativos, M. ferm entans se detectó en muestras de células mononucleares de sangre periférica, fauces y orina en el 9%, el 20% y el 6%, respectivamente. Hawkins y cois, en el NIH detectaron secuencias de DNA de M. ferm en ­ tans en el 11% de las muestras de sangre de 55 pacientes HIV seropositivos pero ninguna en 26 individuos HIV seronegativos de bajo riesgo.152 En Francia, Bebear y cois, realizaron cultivo y PCR en muestras de fauces, endocervicales, uretrales, orina y células mononucleares de sangre periférica de 105 individuos HIV positivos.22 Aunque el cultivo y los ensayos de PCR para M. pneumoniae y M. genitalium fueron negativos, M. ferm en ­ tans se detectó por PCR en al menos un sitio de muestra en el 26,7% de 105 pacientes. La presencia de M. ferm entans en estos pacientes no se asoció con el estadio de la enfermedad por HIV, la carga viral o el recuento de linfocitos CD4. M. ferm entans puede invadir activamente los cultivos celula­ res, una propiedad no asociada con anterioridad en las especies de M ycoplasm a. Aunque una cepa de referencia de M. ferm en ­ tans y la cepa incognitus pudieron invadir las células HeLa, las cepas incognitus de M. ferm entans fueron más invasivas cuan­ do se probaron en cultivos celulares de explantes de células tra­ queales. Los microorganismos de la cepa incognitus se obser­ varon en la localización intracelular, mientras la cepa de refe­ rencia sólo se observó entre las células y adheridas a ellas.408-441 La infección intranasal de ratas y el posterior cultivo por explante de tejidos traqueales de estos animales también reve­ laron la localización intracelular de los microorganismos en los

Importancia clínica de los micoplasmas humanos

cultivos celulares.408 La cepa incognitus de M. ferm entans y las otras cepas de M. ferm entans causan ciliostasis y cambios citor^ológico s en los cultivos por explante traqueales, pero la magnitud y la gravedad de la citopatología variaron considera­ blemente entre las cepas. Los estudios en animales también indicaron que la inmunosupresión puede permitir que M. fermentans crezca y progrese. La administración intravenosa de microorganismos de la cepa incognitus de M. ferm entans pro­ dujo la muerte de ratones BALB/c atímicos pero no de los rato­ nes inmunocompetentes.432 Si bien algunos investigadores han notado diferencias entre la cepa incognitus de M. ferm entans y las otras cepas de M. fermentans, otros no han destacado diferencias. Sasaki y cois, ■compararon la cepa incognitus original con otras tres cepas de referencia y clínicas de M. ferm en tan s ,383 El análisis del poli­ morfismo de longitud de los fragmentos de restricción del DNA a partir de estas cepas mostraron patrones similares en los perfiles en gel e inmunotransferencia de las proteínas celulares, lo que indica un alto grado de homogeneidad anti­ génica entre las cuatro cepas examinadas. La exposición de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) a estos micoplasmas produjo aumentos importantes en la producción de IL -1p. IL-6 y T N F -a; estos aumentos se observaron des­ pués de la exposición a las cuatro cepas de M. ferm entans y no limitados sólo a la cepa incognitus. Por último, la exposi­ ción de CM SP infectadas por HIV frente a cualquiera de las cepas de M. ferm entans derivó en un aumento de 1,8 a 4,3 veces en la actividad de la transcriptasa inversa y de 3,3 a 7 en la producción del antígeno p24 en el cultivo. Estos inves­ tigadores concluyeron que la cepa incognitus de M. ferm en ­ tans no fue exclusiva cuando se comparó con otras cepas del miocroorganismo.383 En la actualidad varios investigadores están analizando el papel de M. ferm entans y otros micoplasmas como cofactores que afectan la progresión de la enfermedad asociada con HIV.4168 Los estudios in vitro en células CEM (una línea celu­ lar del tumor linfoblastoide T enriquecido en CD4) infectadas con HIV mostraron que el tratamiento de las células con aná­ logos de la tetraciclina o fluoroquinolonas inhibió la produc­ ción de efectos citopáticos inducida por virus sin inhibir la replicación y la producción de la progenie viral.243324 Estudios ulteriores han mostrado que en realidad M. ferm entans actúa en forma sinérgica con H IV -1 en células linfoblastoides y promonocíticas para causar la muerte celular; esta capacidad también se demostró con otras especies de M ycoplasm a, entre ellas M. penetrans, M. pirum y M. arginini. 244266Phillips y cois, mostra­ ron que la adherencia de micoplasmas a los linfocitos infecta­ dos por HIV se asoció con sitios de brotación viral, lo que llevó a estos investigadores a suponer que la adherencia de micoplasmas puede activar o aumentar la producción de progenie viral por las células infectadas.345 Se han propuesto varios mecanismos por los cuales los micoplasmas como M. ferm entans pueden actuar como cofac­ tores o inmunomoduladores en la producción de enfermedad asociada con HIV.309 La activación de linfocitos estimula la replicación del HIV y las especies de Mycoplasma, como M. ferm entans y M. penetrans, tienen la capacidad de comportar­ se como activadores policlonales de linfocitos B y t . i17-180-416M. ferm entans puede inducir la producción de linfocinas (TNF-a, IL -1 e IL-6) en diversos tipos celulares (monocitos, macrófa­ gos, astrocitos y células gliales) in vitro.123313314 Muhlradt y Frisch aislaron y purificaron parcialmente una sustancia, deno­ minada MDHM (m ycoplasm a-derived high-molecular-weight m aterial, material de alto peso molecular derivado de mico-

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plasmas), asociada con la membrana, que contiene lípidos y existe en forma de agregados cuando se purifica.312 La presen­ cia de MDHM en cantidades de nanogramos por mililitro acti­ va los macrófagos para liberar óxido nítrico, IL-6 y TNF. Otro grupo identificó un antígeno hidrófobo de 48 kDa asociado con la membrana de M. fermentans, distinto de la MDHM. que también estimula la secreción de TNF e IL -1 a partir de mono­ citos cultivados.229 M. ferm entans también puede producir superantígenos que se unen directamente a las proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad y que estimulan la activación de linfocitos T. También se observó que otra lipoproteína proveniente de M. ferm entans denominada MALP-2 (m acrophage-activating lipopeptide 2, lipopéptido activador de macrófagos 2) induce la liberación de citocinas proinflamatorias, quimiocinas y óxido nítrico por los macrófagos peritoneales murinos.209 M. ferm entans también incrementa la apoptosis de los linfocitos T inducida por concanavalina A.397 Algunos investigadores propusieron que la producción de peróxidos y radicales libres por los micoplasmas o la producción de enzi­ mas que inactivan la catalasa intracelular normal pueden indu­ cir la expresión génica de HIV y activar la replicación viral. Los peróxidos y otras especies reactivas de oxígeno inducen la expresión génica de HIV in vitro por transactivación de regiones promotoras virales y contribuyen a la muerte celular programa­ da.241 La cepa incognitus de M. fermentans puede fusionarse tanto con los linfocitos T como con los linfocitos en sangre peri­ férica.98 La provisión de componentes de micoplasmas dentro de estas células puede afectar de modo directo las funciones normales de los linfocitos. Además, la fusión de las membra­ nas de micoplasmas y linfocito puede cambiar en forma signi­ ficativa la estructura o la orientación de diversos receptores ubicados sobre la superficie del linfocito que, por consiguien­ te, altera la unión, la inducción o la producción de diversas lin­ focinas. Estas alteraciones fundamentales en la estructura y la función del linfocito pueden influir en la adherencia, la inte­ gración y la expresión génica del HIV. M. ferm entans y M. penetrans también tienen la fosfolipasa C asociada con la membrana, que puede inducir una respuesta inflamatoria, cau­ sar daño en la membrana de las células huésped y activar la cascada del ácido araquidónico.396 M. ferm entans también puede participar en las infecciones del aparato genital. En 1989, el microorganismo se detectó en los tejidos placentarios de dos m ujeres con SIDA.258 Blanchard y cois, utilizaron métodos de cultivo y PCR para examinar la presencia de M. genitalium y M. ferm entans en el aparato genital de adultos sexualmente activos y en el líquido amniótico de mujeres con membranas fetales intactas en las que se practicaron cesáreas.32 M. genitalium se detectó por PCR, pero no por cultivo, en el 11 % de 94 hombres y 87 muje­ res con síntomas clínicos de uretritis no gonocócica o cervicitis y no se detectó por cualquiera de los métodos en ninguna de las 232 muestras de líquido amniótico. Por otra parte, M. ferm entans no se detectó por cualquiera de los métodos en ninguna de las muestras urogenitales, pero se detectó por PCR en cuatro de las 232 muestras de líquido amniótico, lo que sugiere que el microorganismo puede transmitirse por vía trasplacentaria. Es interesante destacar que dos de las cuatro pacientes con resultados positivos por PCR para M. ferm en ­ tans mostraron evidencias histológicas de corioamnionitis, lo que implica que M. ferm entans también puede ser un patóge­ no del aparato genital.32 M. ferm entans también es causa de algunos casos de artritis reumatoide y otros trastornos reumáticos.167,199En un estudio de 1996 realizado en Londres, se detectó por PCR en muestras

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Micoplasmas y ureaplasmas

de líquido sinovial en el 21% de 38 pacientes con artritis reu­ matoide, el 20% de 10 pacientes con espondiloartropatía, de 20% de 5 pacientes con artritis psoriásica y el 13% de 31 pacientes con trastornos artríticos no clasificados.388 La carac­ terización genotípica de las cepas aisladas en la sinovial de pacientes con artritis no reveló características exclusivas; algu­ nas se relacionaron con la cepa tipo de M. ferm entans de la American Type Culture Collection (ATCC), mientras que otras se vincularon con cepas aisladas en cultivos de tejidos como contaminantes.387 M. ferm entans, M. salivarium o ambos se detectaron por PCR en muestras de líquido sinovial de la arti­ culación temporomandibular de pacientes con osteoartritis des­ tructiva de la mandíbula.489 Se considera que este trastorno es la consecuencia de la acción de proteasas y citocinas en el car­ tílago de la articulación mandibular. Watanabe y cois, sugirie­ ron que los micoplasmas presentes en la articulación mandibu­ lar lesionan la sinovial y el cartílago por sus actividades enzi­ máticas más su capacidad reconocida para estimular la libera­ ción de citocinas desde las células inmunitarias efectoras 489En un estudio del año 2000, M. ferm entans se detectó por PCR en el líquido sinovial del 88% de 26 pacientes con artritis reumatoide. Siete de ocho pacientes con alguna variedad de otras artritis inflamatorias también fueron positivos para M. ferm en ­ tans ,167 Por último, un estudio publicado en 2001 también encontró DNA de M. ferm entans en el líquido sinovial en el 17% de 35 pacientes con artritis reumatoide, el 25% de 44 pacientes con artritis seronegativa indiferenciada y el 17% de 24 pacientes con artritis psoriásica.130 La infección por M. ferm entans se investigó por su relación con el síndrome de fatiga crónica. Mediante ensayos basados en PCR para M. fermentans, M. hominis y M. penetrans, Choppa y cois, examinaron CMSP de 100 pacientes con sín­ drome de fatiga crónica (SFC).6Í M. fermentans, M. hominis y M. penetrans se detectaron en las CMSP del 32,9% y el 6% de los 100 pacientes con SFC, mientras que se detectaron en el 8%, el 3% y el 2% de los controles sanos, respectivamente. Un estudio ulterior realizado por el mismo grupo de investigación detectó M. ferm entans en CMSP en el 36% de 50 pacientes con SFC típico según la definición de los Centers for Disease Control and Prevention (CDC), el 32% de 50 pacientes con SFC atípico y el 8% de 50 sujetos controles sanos.470 Nasralla, Haier y Nicolson utilizaron métodos de PCR para detectar M. ferm entans, M, pneumoniae, M. penetrans y M. hominis en muestras de sangre de 91 pacientes con SFC, síndromes de fibromialgia o ambos.317 Entre los 91 sujetos, el 59%, el 48%, el 31% y el 20% fueron positivos para M. pneumoniae, M. fe r ­ mentans, M. hominis y M. penetrans, respectivamente. De los 91 individuos, el 53% mostró evidencia molecular de infección sanguínea con múltiples especies de M ycoplasma. En un estu­ dio de 261 pacientes con SFC y 36 voluntarios sanos, la infec­ ción sanguínea para al menos una especie de M ycoplasm a se detectó por una prueba de PCR forense en el 68,6% de los pacientes con SFC y en el 5,6 % de los voluntarios sanos.323 M. hominis se detectó en el 36,8%, seguido de M. ferm entans y M. pneumoniae en un porcentaje similar del 25,7% para cada uno. La infección con múltiples especies de M ycoplasm a se detectó en el 17% de los pacientes con SFC. Aunque estos estu­ dios muestran que en pacientes con SFC se encuentran tasas elevadas de infección por especies de M ycoplasma, no hay evi­ dencia de que estos microorganismos sean los agentes causales del SFC. Es de esperar que el desarrollo de ensayos sensibles y las mejoras en las técnicas de cultivo para estos microorganis­ mos permitan llevar a cabo estudios sobre la evolución natural y el tratamiento.

También se postuló que M. ferm entans participa en la enfer­ medad observada entre los veteranos de la Operación Tormenta del Desierto. Se realizó un estudio serológico entre los vetera­ nos y los militares no desplegados de la guerra del Golfo Pérsico utilizando muestras de suero antes y después de la gue­ rra. Se documentó que las infecciones por M. ferm entans suce­ dieron en esta población militar tanto antes como después del servicio en la guerra, pero estas infecciones fueron indepen­ dientes del despliegue militar al Golfo Pérsico, lo que indica que los datos epidemiológicos y serológicos no apoyan una participación de M. ferm entans en la enfermedad observada en los veteranos de esa guerra.139 Un estudio similar llevado a cabo por el Instituto de las Fuerzas Armadas de Patología (Armed Forces Institute of Pathology; AFIP) también concluyó que no había evidencia serológica para establecer una asocia­ ción entre la infección por M. ferm entans y la “enfermedad de la guerra del Golfo”.263 Aun con su relativamente breve pero fascinante historia epidemiológica y la intensidad de investigaciones realizadas por varios grupos de trabajo no se conoce el papel de M. fe r ­ mentans en la patogenia del HIV, las enfermedades de transmi­ sión sexual, la artritis reumatoide, el síndrome de fatiga cróni­ ca y otras enfermedades. Aunque los métodos moleculares facilitan la detección de secuencias específicas de genes de los microorganismos, la falta de técnicas confiables de cultivo complica los estudios que pueden incluir diversos métodos de tratamiento. M. ferm entans se ha desarrollado en cultivos de muestras de líquido articular, pero a menudo no se sabe si los ensayos moleculares detectan microorganismos viables o no viables. Los estudios moleculares mostraron que M. f e r ­ mentans es heterogéneo desde el punto de vista genotípico, como se evidencia por la presencia de los elementos similares a la secuencia de inserción en diversas localizaciones del DNA, que dan por resultado la variación entre cepas y dentro de la misma cepa.349 En estudios en los cuales el microorganismo se desarrolló de modo satisfactorio en el medio SP-4, la compro­ bación bioquímica definió cuatro grupos fenotípicos sobre la base de la utilización de arginina, glucosa, fructosa y V-acetilglucosamina.332 El análisis sistemático fenotípico y genotípico de las cepas aisladas de M. ferm entans a partir de una diversi­ dad de muestras clínicas y enfermedades puede ayudar a defi­ nir la patogenicidad y la patogenia de las infecciones por M. ferm entans y la participación de este microorganismo en diver­ sos contextos clínicos. Mycoplasma penetrans

En 1991, Lo y cois, en el AFIP de Washington, D.C., comu­ nicaron el aislamiento de una especie nueva de M ycoplasm a proveniente del aparato urogenital de varones homosexuales con infección por HIV.261 Este microorganismo mostró caracte­ rísticas morfológicas singulares, como el cuerpo celular en for­ ma de matraz con compartimentos; uno que contiene gránulos gruesos dispuestos de modo laxo, compatibles con estructuras ribosómicas, y el otro más pequeño y delgado con un conteni­ do denso de gránulos finos.260 Este microorganismo ferm en­ taba la glucosa, hidrolizaba la arginina pero no la urea, reque­ ría colesterol para el crecimiento y pudo cultivarse en medio SP-4. También se adhería a células de mamíferos a las que invadía de modo activo.259 Los microorganismos intracelula­ res se observaban en el interior de vesículas limitadas por una membrana, con la posterior alteración y necrosis de la célula. Esta nueva especie recibió el nombre de M ycoplasm a penetrans ,260’385

Importancia clínica de los micoplasmas humanos

Los estudios seroepidemiológicos probaron una alta fre­ cuencia de anticuerpos contra M. penetrans en individuos infectados por HIV.87 135-461-485 Wang y cois, encontraron que 35,4% de las muestras de suero de 444 pacientes infectados por HIV-1 eran positivas para anticuerpos contra M. penetrans ,485 En 234 varones con SIDA, 41,5% eran seropositivos; 20,3% de 118 individuos asintomáticos infectados por HIV-1 eran tam­ bién seropositivos. Sólo uno de 384 donantes de sangre HIV negativos presentaba anticuerpos contra M. penetrans. Es inte­ resante destacar que 40% de 85 muestras de suero archivadas de pacientes con “GRID” (inmunodeficiencia relacionada con los homosexuales), un término utilizado a comienzos de la década de 1980 para describir el SIDA, también fueron positi­ vas para anticuerpos contra M. penetrans. En 336 muestras de suero de clínicas de enfermedades de transmisión sexual en el sur de California, Brooklyn y Milwaukee, sólo tres fueron posi­ tivas para anticuerpos contra M. penetrans. Ninguna de las 178 muestras de suero obtenidas de individuos seronegativos para HIV-1 con otras enfermedades o trastornos inmunitarios (p. ej., pacientes en diálisis, o pacientes con lupus eritematoso sisté­ mico, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, leucemia, linfoma u otros cánceres) fue positiva para anticuerpos contra M. penetrans. 485 Otros estudios seroepidemiológicos del mismo grupo de investigación encontraron tasas elevadas de anticuer­ pos contra micoplasmas en varones homosexuales, HIV-1positivos, tanto sintomáticos como asintomáticos, pero sólo en el 1% de 308 muestras de drogadictos intravenosos y sólo en el 0,6% de 165 muestras provenientes de pacientes con hemofilia con infección por HIV-1 o sin ella, lo que sugiere que M. pen e­ trans puede transmitirse por vía sexual.486 Grau y cois, infor­ maron hallazgos muy similares sobre la presencia de anticuer­ pos contra M. penetrans en un estudio realizado en Francia.135 Estos investigadores hallaron que la serología positiva para M. penetrans se asociaba con infección por HIV-1 y con prácticas sexuales de alto riesgo entre hombres homosexuales y que la seroprevalencia aumentó con la progresión de la enfermedad relacionada con el SIDA. Durante los comienzos de la década de 1990, algunos investigadores comunicaron una relación epi­ demiológica entre la presencia de anticuerpos contra M. p en e­ trans y el desarrollo del sarcoma de Kaposi (SK). Lo y cois, analizaron la seroprevalencia de M. penetrans en una cohorte de varones homosexuales de los cuales 33 eran seropositivos para HIV y 31 seronegativos que fueron incluidos en un estu­ dio sobre la evolución natural del SIDA realizado en la ciudad de Nueva York en 1984.262 La comprobación de las muestras de suero archivadas entre 1984 y 1985 reveló que el 45,5% de los varones HIV positivos y el 22,5% de los HIV negativos tenían anticuerpos contra M. penetrans, lo que sugiere que M. pen e­ trans estaba presente como un probable agente transmisible por vía sexual al comienzo de la epidemia del SIDA y no necesa­ riamente se asociaba con la infección por HIV. En los 8 años posteriores, en nueve hombres se manifestó el sarcoma de Kaposi (SK); siete presentaron anticuerpos contra M. p en e­ trans y dos eran negativos. La seropositividad inicial contra M. penetrans se asoció estadísticamente con el desarrollo poste­ rior del SK y, entre los hombres HlV-positivos, la aparición del SK era más probable en aquellos con serologías iniciales posi­ tivas para M. penetrans. Estos investigadores concluyeron que la infección por M. penetrans podía actuar como un cofactor con el HIV en la aparición ulterior del SK.262-486 Sin embargo, otros investigadores no hallaron asociación entre la infección por M. penetrans y el sarcoma de Kaposi, que en la actualidad se sabe que está asociada con la infección por herpesvirus humano tipo 8.135

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El empleo de técnicas moleculares sensibles para la detec­ ción directa de M. penetrans mostró que este microorganismo puede estar implicado en infecciones crónicas de células o teji­ dos distintos de las células mononucleares de la sangre. Kovacic y cois, utilizaron ensayos de PCR específicos para M. pneumoniae, M. fermentans, M. genitalium, M. pirum, M. penetrans y M. hominis para investigar la presencia de estos

microorganismos en células mononucleares de sangre periféri­ ca provenientes de individuos infectados o no infectados por HIV-1 .233 Sólo M. ferm entans se detectó en el 5,8% de 154 pacientes seropositivos para HIV y en el 11,1% de seronegati­ vos. Estos investigadores sugirieron que el aparato urogenital es un nicho ecológico probable de este microorganismo, ya que fue aislado originalmente en muestras de orina y detectado por PCR en muestras de orina de pacientes que presentaban anti­ cuerpos contra M. penetrans. 135.260-261 También se comunicó la presencia de bacteriemia por M. penetrans en pacientes no infectados por HIV con síndrome antifosfolipídico.500 No se conoce el papel exacto de M. penetrans en la patoge­ nia de la infección por HIV. La mayor parte de la investigación se centró en su supuesta participación como cofactor en la pro­ gresión de la enfermedad asociada con HIV. Sasaki y cois., del Instituto Pasteur, demostraron que M. penetrans podía activar los linfocitos T humanos para sufrir blastogénesis seguida de proliferación celular y expresión de marcadores de activación de la superficie celular.382 Estos fenómenos se observaron con linfocitos provenientes de donantes sanos y de pacientes sinto­ máticos y asintomáticos infectados por HIV. La caracterización de los linfocitos activados por la exposición a M. penetrans mostró que los linfocitos que expresan CD4 o CD8 sufrían blastogénesis como resultado de esta expresión. La activación se asoció exclusivamente con células de M. penetrans y no con sobrenadantes de los cultivos. En células linfoides cultivadas, la infección con M. penetrans estimula la liberación de TN F-a y aumenta la replicación del HIV-1 coinfectante.180 Estudios serológicos longitudinales también mostraron cargas virales de HIV más elevadas y disminuciones más rápidas en los recuen­ tos de linfocitos CD4 en pacientes con títulos de anticuerpos persistentemente elevados o en aumento contra M. penetrans, lo que hace pensar en una asociación entre infección activa por M. penetrans y progresión de la enfermedad por HIV.136 Mycoplasma pirum

Aunque descrito por primera vez en 1985. sólo en los últi­ mos años M. pirum atrajo cierta atención como otro micoplas­ ma asociado con el SIDA, junto con M. ferm entans y M. p en e­ trans. Antes de esta asociación, M. pirum se aisló en cultivos celulares como presunto contaminante, si bien las líneas celu­ lares de las cuales se aisló eran de origen humano; en la actua­ lidad se considera que estos micoplasmas pueden haber estado naturalmente en los tejidos cultivados.96 M. pirum se aisló en células mononucleares de sangre periférica de un paciente con infección por HIV y se detectó por PCR en células mononu­ cleares sanguíneas de individuos seropositivos para HIV.133 Similar a M. fermentans, los efectos citopáticos in vitro aso­ ciados con el HIV también aumentan por la presencia de M. pirum, lo que llevó a la sugerencia de que, como sucede con M. fermentans, M. pirum puede actuar como cofactor en la pato­ genia de las enfermedades relacionadas con el HIV.309 M. pirum está estrechamente relacionado con M. penetrans y M. pneumoniae y, al igual que a estos dos micoplasmas, pre­ senta forma de matraz con un “extremo” por el cual el micro­ organismo se adhiere al vidrio o al plástico. Se han caracteri­

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CAPÍTULO 18

Micoplasmas y ureaplasmas

zado la proteína adhesina tipo Pl de M. pirum y el gen que la codifica.447 Tras la adherencia, M. pirum, como lo hace M. f e r ­ mentans y M. penetrans, puede invadir de modo activo las célu­ las.430 Se están llevando a cabo investigaciones para definir la interacción de M. pirum y otros micoplasmas con células humanas y determinar la participación de estos microorganis­ mos, si existe, en la patogenia de la enfermedad asociada con el HIV. Mycoplasma primalum M. primatum es una habitante común de la cavidad bucal y del aparato urogenital de los monos cercopitecinos en los que se lo aisló por primera vez en 1971.95 Se encontró que las cepas aisladas de los tejidos de estos animales en 1971 eran similares a los micoplasmas no clasificados que se habían aislado en una infección del ombligo y en la vagina de una paciente en 1955.374 Las nuevas evaluaciones de las cepas aisladas en monos y los no clasificados humanos permitieron establecer que eran iguales. Se observó que este micoplasma utilizaba arginina, requería suero o colesterol para el crecimiento y era negativo para las pruebas de fermentación de la glucosa, ureasa, hemolisis, acti­ vidad de hemadsorción y reducción del tetrazolio. Estas cepas aisladas en seres humanos y primates recibieron el nombre de M. primatum. Hasta la fecha, este micoplasma no ha sido aso­ ciado con infecciones o enfermedad clínica. Mycoplasma spermatophilum M. spermatophilum es una especie anaerobia de M ycoplas­ ma recientemente descrita que se aisló en cinco muestras de

esperma y en una única muestra endocervical, obtenidas de seis pacientes que consultaron a una clínica de esterilidad.159 En cultivos, esta especie anaerobia obligada crece mejor entre 35 °C y 37 °C y produce una hemolisina que lisa los eritrocitos de cobayos, ovejas y seres humanos. Las colonias tienen el as­ pecto típico de huevo frito en medios sólidos. Esta especie requiere esteróles para el crecimiento y no utiliza la glucosa ni hidroliza la arginina ni la urea; aún no se la considera patógena. Infecciones humanas debidas a especies de Mycoplasma de origen animal

M. arginini es uno de los pocos micoplasmas encontrados en varios huéspedes animales, como ovejas y cabras (tejidos respi­ ratorio y ocular), ganado vacuno (aparato respiratorio, sangre, ubres, ojos, aparato urogenital) y felinos (aparato respiratorio). Estos animales pueden exhibir o no síntomas patológicos y aún se desconoce la posible participación de este microorganismo en enfermedades de animales. Yechouran y cois, informaron un caso de neumonía complicada por septicemia mortal causada por M. arginini en un hombre de 64 años con estadio IVB de un linfoma no Hodgkin, que presentaba hipogammaglobuline­ mia y había recibido prednisona.502 Antes de su internación hospitalaria, el paciente trabajaba en un matadero, donde se sacrificaban ovejas, vacas y pollos. M. arginini se desarrolló en tres hemocultivos, una muestra de cepillado bronquial, una muestra de lavado broncoalveolar y la punta del catéter de Swan-Ganz. Los antibiogramas realizados con el procedimien­ to de dilución en caldo determinaron que el microorganismo era sensible a tetraciclina, doxiciclina y ciprofloxacina, y resis­ tente a eritromicina y estreptomicina. Este patrón de sensibili­ dad también se observó e n lí. arginini aislado en animales. Los autores de este informe de caso sugirieron que el paciente

adquirió la infección por la inhalación de partículas en aerosol contaminadas en el ámbito del matadero. Armstrong y cois, comunicaron un caso de infección pulmo­ nar causada por M. canis en una mujer que estaba recibiendo tratamiento antineoplásico por carcinoma metastático del cue­ llo uterino.14 El mismo microorganismo se aisló en el aparato respiratorio de otros miembros de la familia y en el perro mas­ cota, quienes presentaron infecciones de las vías respiratorias altas al mismo tiempo. Bonilla y cois, también comunicaron un caso de artritis séptica de la cadera izquierda y de la rodilla derecha debida a M. canis en una mujer con inmunodeficiencia común variable.40 La paciente tenía antecedentes de exposición a gatos. A pesar del desbridamiento quirúrgico y del tratamien­ to con doxiciclina, se notó una osteomielitis crónica disemina­ da de la cadera que requirió artroplastia. Especies hemotrópicas de Mycoplasma

Las especies de Haem obartonella y Eperythrozoon son bac­ terias similares a los micoplasmas que se adhieren y crecen en las superficies de los eritrocitos de varias especies de vertebra­ dos.237 Hasta hace poco, estos microorganismos se clasificaban en el orden Rickettsiales, dada la similitud que presentaban con las rickettsias con respecto a su tamaño, características de tin­ ción, tropismo por los eritrocitos y transmisión entre animales por artrópodos vectores. Sobre la superficie de los eritrocitos estas bacterias aparecen como estructuras pequeñas, con forma cocoide, bacilar (o anular), azules o violetas cuando se tiñen con el método de W right-Giemsa o con naranja de acridina.36 Desde el punto de vista fenotípico, las especies de Eperythro­ zoon forman estructuras anulares en la superficie de los eritro­ citos y a menudo aparecen sin adherirse a ellos y libres en el plasma. Por el contrario, las especies de Haem obartonella no forman estructuras anulares y raras veces se observan en el estado libre, sin estar adheridas. En algún momento se recono­ ció la arbitrariedad de la diferenciación fenotípica de estas dos especies, lo que llevó a su reciente reclasificación (véase más adelante). Estas bacterias no son cultivables en medios bacte­ riológicos y se mantienen en laboratorios de investigación mediante pasajes seriados en los animales huéspedes. Las in­ fecciones en animales causadas por las especies de Eperythro­ zoon y H aem obartonella suelen ser asintomáticas y pueden persistir en forma latente durante años; se considera que los microorganismos se eliminan de la circulación por el bazo.280 Dado que no se comprenden en su totalidad los factores pre­ disponentes (estrés, etc.), grandes cantidades de microorganis­ mos pueden reaparecer en el torrente circulatorio. En algunos animales puede aparecer una anemia crónica sutil o una anemia hemolítica, manifiesta, grave y con frecuencia m ortal.301302 Por ejemplo, los bien conocidos micoplasmas felinos hemotrópicos no suelen causar enfermedad en los animales infectados natu­ ralmente, pero pueden provocar anemia en los gatos infectados por el virus de la leucemia felina y acelerar el desarrollo de enfermedades mieloproliferativas inducidas por este virus.421 Los micoplasmas hemotrópicos se transmiten de un animal a otro por diversos artrópodos hematófagos, como piojos, garra­ patas, moscas, pulgas y mosquitos. Cuando se descubrieron, las diversas especies de Haem o­ bartonella y Eperythrozoon se denominaron de acuerdo con el huésped al que afectaban, aunque realmente no se conoce la variedad de huéspedes de diferentes especies que afecta. A mediados de la década de 1990, las especies reconocidas de Haem obartonella y Eperythrozoon eran H. canis (caninos), H. felis (felinos), H. muris (roedores), E. coccoides (ratones), E.

C ultivos de m icoplasm as hum anos a partir de m uestras clínicas .is (ovinos), E. suis (cerdos), E. parvum (cerdos) y E. wenyonii (ganado bovino). En 1997, se investigaron las secuencias génicas del rRNA 16S de H. felis, H. muris, E. suis y E. wenmii y se demostró que estas bacterias no estaban relacionadas ic 'd e el punto de vista ñlogenético con las rickettsias pero r-:aban más estrechamente vinculadas con los miembros del género Mycoplasma,321-364 En 2001, estas cuatro especies de microorganismos se retiraron del orden Rickettsiales, familia Anaplasmatales y se les dio la categoría “candidatus” en el .énero Mycoplasma como “Candidatus Mycoplasma hemofelis", “Candidatus Mycoplasma haemomuris”, “Candidatus Mycoplasma haemosuis” y “Candidatus M ycoplasma wenyojjjj-- 198.319,424 ^ a categ0rfa '‘CandidaOis” suele reservarse para los taxones nuevos o descritos de forma incompleta. Por esto, la Judicial Commission of the International Committee on the Systematics of the Prokaryotes resolvió que, al cambiar los nombres de los microorganismos publicados con legitimidad a la categoría taxonómica menor de “candidatus”, los nombres originales perderían el lugar porque no habría ningún nombre nuevo o sustitutivo para agregar a la lista aprobada de nombres bacterianos (Approved List o f Bacteria! Ñames). Como conse­ cuencia, todas las especies que se habían renombrado bajo la categoría “candidatus” fueron revisadas eliminando la catego­ ría "candidatus” y se las renombró como nuevas especies de Mycoplasma.320 Al mismo tiempo que se publicaba esta opi­ nión, se describieron otras tres especies “candidatus” - “candidatus Mycoplasma haemodidelphidis”, “candidatus Mycoplas­ ma haemolamae” y “candidatus Mycoplasma haemominutum”como bacterias hemotrópicas a partir de zarigüeyas, alpacas y gatos, respectivamente, infectados en forma natural.303 Como resultado, las especies originales de Eperythrozoon y Haemobartonella ahora se clasifican en el género Mycoplasma como M. hemofelis (gatos), M. haemomuris (ratones), M. haemosuis (cerdos), M. wenyonii (bovinos), M. ovis (oveja y cabras), M. haemolamae (llamas), M. haemocanis (caninos), M. haemo­ didelphidis (zarigüeya) y “candidatus M. haemominutum",31S-3Í9A2S Juntos, estos micoplasmas hemotrópicos recibie­ ron el nombre común de “hemoplasmas”.

Cultivos de micoplasmas humanos a partir de muestras clínicas Consideraciones generales

Los micoplasmas humanos pueden dividirse en tres grupos sobre la base de la utilización de tres sustratos: glucosa, argini­ na y urea (véase cuadro 18-1). De acuerdo con la especie de micoplasma que se está investigando, un medio peptonado basal enriquecido que contenga extracto de levadura y suero se suplementa con uno de estos tres sustratos y se agrega un indi­ cador de pH (por lo general rojo fenol). M. pneumoniae metaboliza la glucosa para producir ácido láctico, lo que determina el cambio a un pH ácido. M. hominis metaboliza la arginina con la producción de amoníaco y el cambio del pH de neutro a alcalino. De manera similar, U. urealyticum produce la enzima ureasa que hidroliza la urea a amoníaco, lo que causa el cam­ bio a un pH alcalino. M. fermentans produce ácido a partir de la glucosa y también metaboliza la arginina. Las muestras para el aislamiento de micoplasmas, en parti­ cular los micoplasmas genitales de crecimiento más rápido, se inoculan de manera rutinaria tanto en medios sólidos (con agar) como en algún tipo de medio líquido (caldo) de enriqueci­ miento, selectivo o diferencial. Muchas de las fórmulas de los

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caldos utilizados para el aislamiento de micoplasmas son difá­ sicas, con un medio que contiene agar en el fondo de un tubo cubierto con caldo de composición similar pero sin el agrega­ do de agar. Los medios para el aislamiento de micoplasmas también contienen antibióticos (p. ej., ampicilina, penicilina, polimixina B y anfotericina) para inhibir las bacterias y los hongos contaminantes. Antes se agregaba a los medios acetato de talio como agente antibacteriano, pero este compuesto es inhi­ bidor para U. urealyticum y M. genitalium y también es muy tóxico para los seres humanos. Los micoplasmas humanos difieren en su pH óptimo para el crecimiento y en las condiciones atmosféricas requeridas para el aislamiento satisfactorio en muestras clínicas (véase cuadro 18-1). En los medios utilizados para el aislamiento de M. pneu­ moniae se agrega un buffer para amortiguar el pH inicial a cerca de 7,8, mientras que el medio para el crecimiento de M. hominis se amortigua inicialmente a un pH neutro (7). U. ure­ alyticum crece de modo óptimo en un ambiente con un pH levemente ácido, de manera que el medio para el aislamiento primario para esta especie está regulado a un pH cercano a 6. La temperatura óptima para el crecimiento de los micoplasmas es de 35 °C a 37 °C. M. pneumoniae y M. hominis crecen bien en presencia de aire o en una atmósfera compuesta por 95% de nitrógeno y 5% de dióxido de carbono. U. urealyticum tiende a ser capnófilo, con un crecimiento óptimo que se produce en una atmósfera de 10-20% de dióxido de carbono y 80-90% de nitrógeno. El medio sólido inoculado directamente con la muestra o los subcultivos provenientes de medios líquidos deben incubarse en las condiciones adecuadas descritas antes; el caldo puede incubarse siempre en condiciones aerobias. Los caldos suelen inocularse con 0,1 mL a 0,2 mL de la muestra contenida en un líquido de transporte. Las placas de agar se inoculan con una cantidad similar y el inoculo se dise­ mina sobre la superficie del agar con una varilla arqueada de vidrio. Las placas de agar se sellan con cinta de celofán para evitar el secado del agar. Los medios para el aislamiento de M. pneumoniae deben incubarse hasta 4 semanas antes de realizar el informe final del cultivo. Los cultivos para los micoplasmas genitales deben incubarse durante 7 a 8 días; la mayoría de los cultivos en medios líquidos positivos se detectan después de 5 días de incubación. Los medios difásicos se comparan con tubos de los mismos medios inoculados con medio de trans­ porte estéril, incubados al mismo tiempo y en las mismas condi­ ciones, y con tubos inoculados con cepas control de micoplas­ ma para detectar diferencias sutiles en el color o la turbidez. Los cultivos deben inspeccionarse todos los días para determi­ nar cambios sutiles debido a que los microorganismos mueren con rapidez una vez que sucede el crecimiento y se consumen los sustratos. Si se detecta en forma visual un cultivo poten­ cialmente positivo en el medio difásico, el caldo se subcultiva en un medio sólido, como agar SP-4 o agar diferencial A l (véase la descripción más adelante). La identificación de los micoplasmas requiere el reconoci­ miento de las colonias típicas en medios sólidos inoculados directamente con la muestra o con un ansa del medio líquido a partir de un medio líquido difásico presuntamente positivo. Las colonias en medios sólidos pueden examinarse directamente con aumentos de 30 x a 100 x con luz incidente periférica para establecer la morfología y las características del crecimiento. Los colorantes supravitales, como el de Diene, pueden utilizar­ se para caracterizar más las colonias y para diferenciarlas de los artificios de técnica. Diversas pruebas de identificación pueden realizarse directamente sobre el medio sólido, como la prueba de hemadsorción para la identificación presuntiva de M.

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C A P ÍT U L O 18

Micoplasmas y ureaplasmas

pneumoniae, o sustratos como arginina o urea, más el indica­ dor rojo fenol, pueden incorporarse al agar para proporcionar una evaluación directa de la utilización del sustrato y, por con­ siguiente. una identificación presuntiva. Los medios para el cultivo de micoplasmas respiratorios y genitales, y los procedi­ mientos de identificación para M. pneumoniae y U. urealyti­ cum se detallan en los protocolos 18-1, 18-2, 18-3, 18-4, 18-5 y 18-6. Recolección de la muestra

M. pneumoniae puede aislarse en muestras de las vías respi­ ratorias altas y bajas, como hisopado de fauces, hisopados nasofaríngeos, lavados de fauces, esputo, aspirados traqueales y transtraqueales, broncoscopia, lavado broncoalveolar y muestras de tejido pulmonar. El microorganismo puede aislar­ se a partir de estas muestras durante la evolución de la enfer­ medad y durante cierto tiempo después de la desaparición de los síntomas. Debido a los requerimientos nutricionales espe­ ciales de estas bacterias, los medios de cultivo deben inocular­ se lo antes posible después de la recolección. Para el transpor­ te de las muestras de hisopados pueden utilizarse medios de cultivo presentados en pequeños frascos ampollas; otras mues­ tras (p. ej., esputo, tejido, lavados) pueden ser transportadas al laboratorio en recipientes estériles con tapa a rosca. Antes de la inoculación de los medios de crecimiento, las muestras respi­ ratorias deben ser homogeneizadas mediante el pasaje repetido a través de aguja y jeringa; el mucolítico Sputolysin® u otros tratamientos químicos para la licuefacción del esputo resultan tóxicos para los micoplasmas. Los micoplasmas genitales pueden aislarse en diversas muestras, como exudado uretral, vaginal y cervical: secrecio­ nes prostáticas; semen; orina; sangre, otros líquidos corporales (LCR, líquido amniótico, secreciones respiratorias, líquido sinovial, líquido pericárdico) y tejidos (p. ej., lavados y biop­ sias endometriales, tejidos placentarios o amnióticos, tejidos fetales o de aborto, biopsias de la trompa de Falopio, biopsias uterinas, biopsias de herida, tejidos rectales). Las muestras por hisopado deben obtenerse utilizando hisopos de Dacron®, de alginato de calcio o de poliéster con tallos plásticos o de alu­ minio. No deben utilizarse hisopos con tallo de madera porque este material por sí puede ser tóxico para los ureaplasmas. Si se investigan simultáneamente otros patógenos del aparato genital es preferible utilizar hisopos de rayón o dacrón montados en palillos plásticos, ya que no son tóxicos para los patógenos genitales. Debe evitarse el contacto de los hisopos con solucio­ nes antisépticas, cremas, geles o lubricantes. No debe permitir­ se el secado de las muestras del hisopo; para ello deben colo­ carse de inmediato en un medio de transporte o cultivo tras la recolección. Otros líquidos corporales y muestras de biopsia de tejidos deben remitirse en envases estériles. No debe emplear­ se solución fisiológica para humedecer las muestras de tejido porque puede causar la lisis de los microorganismos. En el laboratorio, las muestras de tejido deben triturarse en medio de transporte estéril para producir una suspensión al 10 % (p/v) y diluirse de forma seriada 10 y 100; este procedimiento es nece­ sario para evitar la inhibición del crecimiento de micoplasmas por materia orgánica como hemoglobina, fosfolípidos tóxicos, anticuerpos o complemento que puedan estar presentes en el tejido de la muestra. Estas diluciones luego se utilizan para ino­ cular los medios de crecimiento. Las muestras de sangre pueden cultivarse para micoplasmas por inoculación de los medios de crecimiento en una relación de una parte de sangre con nueve partes de caldo (dilución

1:10). Como óptimo, al menos deben cultivarse 10 mL de san­ gre de pacientes adultos. Lo ideal es que el medio de creci­ miento no contenga polianetol sulfonato de sodio (SPS), que inhibe el crecimiento de las especies de Mycoplasma, pero debe ser un medio con una fórmula específica para micoplas­ mas (véase más adelante). Como sucede con N. gonorrhoeae, la inhibición del crecimiento por el SPS puede superarse mediante el agregado de gelatina estéril al medio de creci­ miento a una concentración final del 1% (p/vol). Los caldos sembrados deben subcultivarse a ciegas, ya que los instrumen­ tos para hemocultivos monitorizados de modo continuo y auto­ matizados, en la mayoría de los casos, no pueden detectar el crecimiento de micoplasmas.472 Medios de transporte

Los micoplasmas son muy sensibles a las condiciones am­ bientales adversas, de modo que las muestras deben colocarse en medios de transporte o de crecimiento adecuados lo antes posible después de su recolección. Pueden emplearse varios medios de transporte para los cultivos de micoplasmas geni­ tales como caldo que contiene tripticasa y soja con el agregado de albúmina sérica bovina al 0,5%, caldo 2SP (suero fetal bovi­ no inactivado por calor al 10% con 0,2 M de sacarosa en 0,02 M de buffer fosfato, pH 7,2) o diversos tipos de medios de cre­ cimiento para micoplasmas (p. ej., SP-4, caldo de Shepard 10B). Por lo general se agregan antibióticos y antimicóticos (penicilina, 100 000 U/’mL; polimixina B. 5 000 |ag/mL; anfotericina B, 2 mg/mL, concentraciones finales) para disminuir la contaminación por otros microorganismos bacterianos y micóticos. Las muestras deben ser transportadas al laboratorio de inmediato y se mantienen hasta 24 horas a 4 °C antes de la siembra en los medios de crecimiento. Si el cultivo se retrasa más de ese tiempo, la muestra debe congelarse a -7 0 °C. Antes del cultivo, estas muestras deben descongelarse rápidamente en un baño a 37 °C. Las muestras de orina para cultivo deben ser centrifugadas y el sedimento diluido en una relación 1:1 con medio de transporte antes del congelamiento. Los estabilizado­ res proteicos en el medio de transporte evitan la pérdida de la viabilidad de los microorganismos que puede suceder si las muestras de orina se congelan sin esta medida protectora. Medios para el cultivo de micoplasmas

En la literatura se describieron diversos tipos de medios para el cultivo de M. pneumoniae y de los micoplasmas genitales.471 Como ya se mencionó, la mayoría de los medios con caldo son difásicos; es decir, los tubos contienen una fase sólida de agar que está cubierta con un medio líquido (caldo) de composición similar. Un medio recomendado por los CDC para el aisla­ miento de M. pneumoniae es el medio difásico azul de metileno-glucosa. Este medio contiene caldo y agar PPLO (microor­ ganismo similar a la pleuroneumonía), extracto de levadura y suplementos de suero junto con glucosa, azul de metileno y ro­ jo fenol. El azul de metileno en el medio inhibe el crecimiento de otros micoplasmas humanos que pueden encontrarse en el aparato respiratorio, lo que lo convierte en un medio selectivo para M. pneumoniae. Durante el crecimiento de M. pneum o­ niae, el medio se tom a más ácido y el rojo fenol vira del color salmón al amarillo. Al mismo tiempo, los microorganismos reducen el azul de metileno y vira del azul al incoloro. Por con­ siguiente, el color de la fase líquida cambia del púrpura al verde o amarillo verdoso, mientras que la fase sólida del agar vira del violeta al amarillo o al amarillo anaranjado. Este medio

C ultivos de m icoplasm as hum anos a partir de m uestras clínicas >e utiliza junto con el medio agar glucosa para micoplasma. Las colonias aisladas, ya sea directamente en este medio o en .:> subcultivos de caldos positivos, son sometidas a procedi­ mientos de observación e identificación. En el protocolo 18-4 se presentan los componentes y las fórmulas de los medios de aislamiento para M. pneumoniae. Otro medio recomendado para el aislamiento de M. pneumoniae a partir de muestras clínicas es el caldo SP-4 y el agar >P-4 que contiene glucosa.457 Estos medios se formularon ori­ ginalmente para el cultivo de espiraplasmas, pero también pro­ porcionan un aislamiento mejor de M. pneumoniae y otros micoplasmas humanos (p. ej., M. genitalium). En un estudio ;: mparativo realizado por Tully y cois., el medio difásico SP- permitió el aislamiento de M. pneumoniae en 69 de 200 muestras que eran negativas cuando se cultivaron por otros métodos “estándares”.457 Como sucede con el medio difásico con azul de metileno-glucosa, el crecimiento se detectó por el cambio del indicador rojo fenol del rojo al amarillo, lo que indica la producción de ácido a partir de la glucosa. Los medios de agar y caldo SP-4 pueden utilizarse para el aislamiento de M. hominis si se agrega arginina en lugar de glucosa. Como M. hominis y U. urealyticum metabolizan sustratos diferentes y difieren en el pH para el crecimiento óptimo, muchos laboratorios emplean dos tipos de medio sólido para >as cultivos. Además, deben sembrarse las formulaciones difá­ sicas con caldo y agar de cada tipo de medio para obtener el aislamiento óptimo de micoplasmas. El caldo H y el agar H se utilizan para aislar M. hominis y son regulados con buffer a un pH neutro (7,0). Algunas fórmulas también contienen arginina como sustrato para el crecimiento, donde se utilizan la turbi­ dez y el cambio de color del indicador rojo fenol en el rango alcalino del medio para detectar el crecimiento de microorga­ nismos. El caldo U y el agar U, utilizados para aislar U. ure­ alyticum, están amortiguados a un pH más bajo (5,5 a 6,0) y contienen urea como sustrato para el crecimiento. Estos últi­ mos medios también son más selectivos para U. urealyticum si se agrega lincomicina, porque los ureaplasmas son resistentes a este antibiótico y las cepas de M. hominis son sensibles. En el protocolo 18-5 se encuentran las fórmulas de los medios pa­ ra el aislamiento de micoplasmas genitales. En la literatura se han presentado otros medios para el aisla­ miento y la identificación de micoplasmas genitales. Los medios líquidos incluyen el U-9 ureasa descrito por Shepard y Lunceford, el caldo con azul de bromotimol, el caldo Boston S-2 y el medio SP-4 utilizados para el aislamiento de micoplasmas respiratorios. 119’242,39a392'393'399'498 El medio SP-4 debe suplementarse con urea o arginina para detectar específica­ mente U. urealyticum y M. hominis, respectivamente. El caldo Boston S-2 es un medio único que contiene medio base enri­ quecido, suero de caballo, extracto de levadura, indicador rojo fenol, L-cisteína, urea y penicilina. El crecimiento de U. urealyticum se determina por la aparición de un color rosa en el medio, mientras que el de M. hominis se pone de manifiesto por color salmón pálido a naranja o por la aparición de una leve turbidez. El medio agar diferencial A7 de Shepard y varias modificaciones de éste (p. ej., A7B y A8) son particularmente útiles, ya que tanto M. hominis como U. urealyticum crecen bien en ellos y pueden ser diferenciados con facilidad entre sí por la morfología de la colonia y por la detección directa de la formación de ureasa por esta última especie (véase la descrip­ ción más adelante).390'392,393 Como se verá, con este medio puede lograrse la identificación presuntiva de M. hominis y la identificación definitiva de U. urealyticum, sin la necesidad de otras pruebas o reactivos.

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Aislamiento e identificación de Mycoplasma pneumoniae

El crecimiento de M. pneumoniae en muestras clínicas suele detectarse por la capacidad de estos microorganismos de pro­ ducir ácido a partir de la glucosa.84 Se inocula el medio difási­ co que contiene azul de metileno y glucosa con 0,2 mL de la muestra en el líquido de transporte. De modo simultáneo, los tubos de medios se inoculan con un medio de transporte estéril y con un cultivo de control positivo y se incuban junto con las muestras. Los cultivos en caldo se incuban a 35 °C con las ta­ pas ajustadas. Los tubos se observan todos los días para deter­ minar cambios de color y turbidez durante 4 semanas. El desa­ rrollo de turbidez macroscópica y el cambio del indicador a ácido o alcalino dentro de 1 a 5 días suelen deberse a la conta­ minación bacteriana. Un cambio leve y gradual en el indicador de pH en un período de 8 a 15 días sin turbidez macroscópica sugiere un verdadero cultivo positivo. Enseguida después de determinar los cambios de color en el medio, el caldo debe subcultivarse en un medio con agar adecuado; a medida que se acumula más ácido en el medio, los micoplasmas se toman no viables con rapidez. Ante la primera indicación de crecimiento, el caldo se subcultiva en un medio sólido (como agar SP-4) y se incuba en aerobiosis durante 5 a 7 días. La observación de la superficie del agar con microscopia de bajo aumento revelará colonias pequeñas de los microorganismos. En ausencia de cambio de color evidente en los medios difásicos, debe reali­ zarse un subcultivo a ciegas en medios sólidos después de 1 y 3 semanas de incubación. En la figura 18-1 se muestra un es­ quema general para el aislamiento de M. pneumoniae. M. pneumoniae puede identificarse por diversos procedi­ mientos, algunos de los cuales son mejores que otros.84 Las pruebas más adaptables a los laboratorios clínicos comprenden la prueba de hemadsorción (protocolo 18-2) y la prueba de re­ ducción del tetrazolio (protocolo 18-6). En el procedimiento de hemadsorción, a las colonias que crecen en la superficie del agar se les agrega una suspensión al 0,2-0,4% de eritrocitos de cobayo lavados. Tras la incubación, la superficie de la placa se cubre cuidadosamente con solución fisiológica estéril y se exa­ mina con un aumento de 50 X a 100 X. Las colonias de M. pneumoniae adsorben los eritrocitos a su superficie y aparecen como colonias redondas recubiertas con eritrocitos (véase lámina en color 18-1 A). Este procedimiento funciona mejor en colonias de 5 a 7 días de formadas; las colonias más viejas tien­ den a perder su capacidad de hemadsorción. Otras especies de Mycoplasma que habitan las vías respiratorias altas son negati­ vas en la prueba de hemadsorción. La prueba de reducción del tetrazolio se aprovecha de la capacidad exclusiva de M. pneumoniae para reducir el com­ puesto incoloro trifenil tetrazolio al compuesto rojo formazán. Para llevar a cabo la prueba, la superficie del agar que tiene las colonias sospechosas se cubre con una solución de clorhidrato de 2-(/?-yododofenil)-3-nitrofenil-5-fenil tetrazolio (0,21%) y se incuba a 35 °C durante una hora. Las colonias de M. pneu­ moniae aparecen rojizas tras ese lapso y pueden tomar un color púrpura a negro después de 3 a 4 horas. Otros micoplasmas son negativos con esta prueba. La prueba de tetrazolio puede reali­ zarse incluso después de llevar a cabo el procedimiento de hemadsorción. También pueden utilizarse métodos serológicos específicos para la confirmación de cultivos de M. pneumoniae. El más rápido es el procedimiento de epifluorescencia. El medio de agar que contiene las colonias se cubre con anticuerpos especí­ ficos contra M. pneumoniae conjugado con isotiocianato de fluoresceína; se lava para eliminar el conjugado no unido y

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C A P ÍT U L O 18

Micoplasmas y ureaplasmas

M uestra (hisopado de fauces hisopado nasofaríngeo, lavados de fauces, esputo, lavado traqueal/transtraqueal, broncoscopio, lavado broncoalveolar, tejido pulm onar)

M edio difásico con azul de m etileno y glucosa

Incubar a 35 °C

C am bio a un pH levem ente ácido después de 8 a 15 días de incubación

I

S ubcultivar el caldo a un m edio sólido de agar glucosa para m icoplasm as

Sin cam bio después de 4 sem anas

C ultivo negativo

Incubar a 35 °C en aerobiosis, 5 a 7 días C recim iento C onfirm ar con prueba de hem adsorción, prueba de reducción del tetrazolio o am bas

P ruebas con firm a to ria s positivas

“A islam iento de Mycoplasma pneumoniae”

Figura 18-1 Protocolo para el aislamiento de Mycoplasma pneumoniae en m uestras respiratorias.

luego se lo observa con un microscopio equipado para proce­ dimientos de epifluorescencia donde se verá la fluorescencia de las colonias de M. pneumoniae. Aunque se lo considera el pro­ cedimiento de referencia, la prueba de inhibición del creci­ miento para la identificación de M. pneumoniae es también el procedimiento más laborioso. En esta prueba, se siembra una placa de agar en toda su extensión a partir de una suspensión en caldo del aislamiento por identificar. A continuación se coloca sobre la superficie del agar un trozo de papel de filtro impregnado con anticuerpos contra M. pneumoniae. Tras la incubación se observará la inhibición del crecimiento de las colonias alrededor del papel de filtro que está saturado con anticuerpos específicos de especie. Otras técnicas también se han aplicado al diagnóstico de infecciones respiratorias por M. pneumoniae. Cimolai y cois, describieron una técnica nueva de amplificación del cultivo similar a los métodos de cultivo en monocapa del tipo shell vial utilizados en la actualidad en virología.66 Los cultivos conven­ cionales en agar y caldo se realizan por duplicado. Durante cada día de incubación se prueban alícuotas de una de las muestras duplicadas de caldo mediante una técnica de inmunotransferencia que utiliza la captura de antígeno por anticuerpo monoclonal dirigido contra la adhesina asociada con la mem­ brana de 43 kDa de M. pneumoniae. El método de inmunotransferencia detectó cultivos positivos ya en 2 a 12 días (media, 4,7), mientras que los cultivos convencionales fueron visiblemente positivos en 7 a 14 días (media, 8,3).

Detección de Mycoplasma pneumoniae por procedimientos que no utilizan cultivos

Dado el crecimiento lento de M. pneumoniae se crearon métodos para la detección directa que no dependen del crecimiento e incluyen ensayos de captura de antígeno, inmu­ nofluorescencia directa, análisis de inmunotransferencia y métodos con sondas de ácido nucleico.224-272 En general, mu­ chas de estas pruebas carecen de la sensibilidad suficiente como para ser consideradas útiles desde el punto de vista clíni­ co. Marmion y cois, describieron un enzimoinmunoanálisis (EIA) con captura de antígeno que emplea anticuerpos policlo­ nales dirigidos contra el antígeno P l purificado.283 En un estu­ dio de muestras respiratorias de 234 pacientes, la prueba del antígeno detectó cuatro de cuatro pacientes que eran positivos por cultivo y serología y cuatro de cinco pacientes que eran positivos sólo por cultivo. Cabe destacar que el 43% de 23 pacientes que eran negativos por cultivo pero seropositivos y el 71% de los pacientes con diagnóstico basado en la elevación del título de anticuerpos a los que no se les habían realizado cultivos fueron positivos con el EIA con captura de antígeno. Estos hallazgos indicaron que la prueba del antígeno y tal vez otras pruebas directas necesitan ser confirmadas mediante la evaluación serológica con respuesta de anticuerpos para verifi­ car que la infección diagnosticada por la prueba directa es una infección actual y no el resultado de un estado de portador, pro­ longado o que continúa, del microorganismo por una infección

C ultivos de m icoplasm as hum anos a partir de m uestras clínicas

pre\ Los ensayos para la detección directa de antígeno han ? en gran medida reemplazados por técnicas moleculares. Antes de la aparición de los métodos basados en la amplifi­ cación se empleaba una sonda de DNA directa, marcada en : rma radiactiva para el diagnóstico de las infecciones respira■ na> por micoplasmas. La sonda de DNA para M. pneumoniae Gen-Probe, San Diego CA) se hibridó con el rRNA 16S del irncroorganismo y se utilizó el l25I radiactivo para generar una señal de detección. Tilton y cois, compararon la sonda de DNA con cultivos y encontraron que la sonda tenía una sensibilidad del 100% y una especificidad del 98% cuando se comparaba con el cultivo.450 Dular y cois, informaron que la sonda tenía una sensibilidad y especificidad del 89% en comparación con el cultivo.106 En ambas publicaciones, los autores destacaron los aspectos prácticos de la sonda como un método rápido, sen­ sible y oportuno para el diagnóstico, ya que los resultados están disponibles en cerca de dos horas, mientras que el cultivo requiere varias semanas. Además, el diagnóstico rápido pror- rcionado por la sonda podría eliminar la dependencia de la comprobación serológica retrospectiva (p. ej., fijación del comriemento) o marcadores serológicos inespecíficos (crioaglutininas) para el diagnóstico y permitiría iniciar antes el trata­ miento antimicrobiano específico. Entre las desventajas de la sonda están su vida útil relativamente breve de 6 semanas, la ne­ cesidad de equipos adicionales, la generación y la eliminación de desechos radiactivos y su costo. Además, como los micro­ organismos pueden estar albergados en el aparato respiratorio durante la convalecencia, pueden encontrarse pruebas de son­ das positivas en muestras de hisopados respiratorios prove­ nientes de individuos sanos. La prueba Gen-Probe fue retirada del mercado en 1992. Desde 1989 se crearon varios métodos moleculares, como PCR anidada y semianidada, ensayos de PCR múltiples, ampli­ ficación basada es la secuencia del ácido nucleico (NASBA), Q(i-replicasa y PCR en tiempo real, para la detección de M. pneumoniae en diversos tipos de muestra,272,465 que compren­ den esputo, hisopado de fauces, aspirados nasofaríngeos y tra­ queales, lavados broncoalveolares, aspirados transtorácicos con aguja, tejidos pulmonares fijados y biopsias de pulmón a cielo abierto. Los principales genes diana para estos ensayos fueron el gen para la adhesina P l, el rRNA 16S específico de especie, los genes para el operón de ATPasa de los micoplas­ mas y el gen tuf, que codifica el factor de elongación 2, un fac­ tor que actúa en la síntesis de proteína al nivel del mRNA ribosómico.46-48-71-86-162-226-271'273-414-451-487-492 Buck y cois, describieron una prueba de PCR en la cual el segmento de DNA amplifica­ do utilizado tenía 375 pares de bases (pb) de la proteína adhe­ sina P l de M. pneumoniae.46 En muestras clínicas simuladas, esta prueba pudo detectar un límite inferior de entre 1 y 10 microorganismos, en comparación con un límite inferior de 1 000 microorganismos para la detección por cultivo. Otros autores informaron sensibilidades similares al utilizar las mis­ mas secuencias diana de DNA.48-86 Varios investigadores dise­ ñaron sondas específicas de especie para M. pneumoniae basa­ das en secuencias del rRNA 16S específicas de M. pneumoniae y encontraron que la amplificación y la ulterior detección por sonda de estas secuencias en muestras clínicas era más sensi­ ble que el cultivo.451-469 Al utilizar la técnica de PCR, Narita y cois, detectaron DNA específico de M. pneumoniae en cuatro de seis muestras de LCR y en tres de cuatro muestras de suero provenientes de pacientes con infección clínica del SNC con­ firmada por serología causada por M. pneumoniae.316 La técni­ ca de huella o impronta del DNA fingerprinting por PCR también se ha utilizado para subtipificar las cepas de M. pneu­

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moniae basada en la divergencia de la secuencia nucleotídica de la proteína citoadhesina P l.466 Aislamiento e identificación de los micoplasmas genitales

Los micoplasmas que pueden aislarse en el aparato genital son M. hominis, M. genitalium, M. fermentans y U. urealyti­ cum. Mientras que M. hominis y U. urealyticum se cultivan con facilidad y suelen desarrollarse en el transcurso de 1 a 5 días, M. genitalium y M. ferm entans crecen con mucha más lentitud y son más difíciles de detectar por cultivo. Además, los siste­ mas actuales de cultivo para el aislamiento de micoplasmas genitales pueden no brindar un crecimiento óptimo de estas especies. Por ejemplo, el medio SP-4 descrito antes para el ais­ lamiento de M. pneumoniae es el medio óptimo para M. geni­ talium porque este microorganismo metaboliza la glucosa, pero la mayoría de los laboratorios no emplean medios de cultivo que contengan glucosa para el cultivo de muestras genitales. Además, la proliferación lenta del microorganismo en los medios de cultivo hace que éstos no tengan utilidad clínica. M. fermentans también utiliza la glucosa, pero tiene un crecimien­ to muy lento. Por estas consideraciones, los micoplasmas geni­ tales distintos de M. hominis y U. urealyticum no suelen inves­ tigarse en las muestras del aparato genital. M. genitalium es extremadamente difícil de aislar por méto­ dos basados en cultivo. Jensen y cois, informaron el aislamien­ to exitoso de M. genitalium en muestras del aparato genital.193 De 11 muestras, 9 se propagaron de modo satisfactorio en cul­ tivos de células Vero a partir de muestras uretrales positivas por PCR de pacientes con uretritis. El crecimiento en cultivos de células Vero fue monitorizado con PCR. De estas nueve cepas aisladas, seis se adaptaron por pasajes seriados para el creci­ miento en medio de Friis, un medio de crecimiento complejo que contiene solución salina tamponada de Hanks, caldo de infusión de cerebro y corazón, extracto de levadura “casero” y hasta un 20% (v/v) de suero de caballo. Estas seis cepas aisla­ das requirieron 1 a 19 pasajes seriados en cultivos de células Vero antes de que pudieran estar adaptadas al crecimiento en caldo y 2 a 6 pasajes en caldo antes de que se visualizaran colo­ nias producidas sobre el agar con una fórmula similar al caldo. En este informe, los autores señalaron que, aunque el desarro­ llo de un medio que permitiera el crecimiento de M. genitalium representaba un avance fundamental, los métodos de PCR eran esenciales para la detección inicial y la monitorización de los cultivos para el crecimiento. Se han creado técnicas molecula­ res que son altamente sensibles y específicas para la detección de M. genitalium en muestras de aparato genital y muestras de la primera porción de la orina, pero estos ensayos no están ampliamente disponibles.94-108"110.191-192-410-483-506-508 Para el cultivo de M. hominis y U. urealyticum, las muestras adecuadas recibidas en medios de transporte se siembran en medios líquidos y sólidos. En general, cerca de 0,2 mL de la muestra deben sembrarse por estría en medios con agar y en medios líquidos. Los caldos se incuban en aerobiosis a 35 °C, pero las placas deben incubarse en estufa con CO, o en una jarra de anaerobiosis por extinción con vela. Ambos microor­ ganismos también pueden aislarse cuando se incuban en anae­ robiosis. Las placas sembradas deben examinarse a diario con un aumento de 40x y luz oblicua para observar las colonias con forma de huevo frito de M. hominis o las colonias peque­ ñas y densas de U. urealyticum. En el caso de los cultivos en caldo, cualquiera de los tubos que muestren el más leve cam ­ bio de color alcalino o turbidez debe ser subcultivado en los medios sólidos adecuados. En el caldo M, M. hominis produ­

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C A P ÍT U LO 18 Micoplasmas y ureaplasmas

ce turbidez leve además del cambio de color. En el caldo U, U. urealyticum tenderá a producir un cambio leve de color al comienzo de la incubación sin una turbidez distinta o eviden­ te. En ambos casos deben realizarse subcultivos en esos tiem ­ pos para asegurar el aislamiento de bacterias viables, ya que hay una disminución rápida de la viabilidad de los microorga­ nismos una vez que se eleva el pH por la utilización y la depleción del sustrato. Al igual que las placas de cultivo primario, las placas de los subcultivos deben examinarse todos los días. La mayoría de las cepas aisladas de M. hominis y U. urealyti­ cum crecen en el transcurso de 5 a 7 días. Si después de este tiempo no se observa proliferación en las placas del cultivo primario o en los subcultivos en caldo, el cultivo puede infor­ marse como negativo para micoplasmas genitales. Es una buena idea congelar alícuotas de los caldos positivos a -70° C por si aparecen problemas con la viabilidad en los cultivos directos en agar o en los subcultivos. El esquema general para el aislamiento de micoplasmas genitales se presenta en la figu­ ra 18-2. La identificación de micoplasmas genitales suele ser bas­ tante sencilla. Las colonias de M. hominis crecen en 1 a 5 días, presentan la morfología típica de huevo frito y tienen un diá­ metro de 50 a 300 fm; para ayudar a su visualización, pueden teñirse con el colorante de Diene (protocolo 18-1) (véase lámi­ na en color 18-IB). No son necesarios otros procedimientos de identificación porque los microorganismos que crecen con rapidez, utilizan la arginina y muestran la morfología típica de la colonia invariablemente son M. hominis. Las colonias pequeñas de U. urealyticum pueden ser difíciles de distinguir de diversos artificios, como células de mamíferos y detritos o materiales celulares presentes en el suero. Por estos proble­ mas, la presunción de que una proliferación de colonias corresponda a U. urealyticum deben ser confirmada. Esto se realiza aprovechando la capacidad de U. urealyticum de hidro­ lizar la urea. Si el medio agar U contiene urea y rojo fenol, la colonia sospechosa de ser ureaplasma aparecerá rodeada por un halo rojo. La confirmación de U. urealyticum en colonias sospechosas también pueden lograrse mediante la prueba de cloruro manganoso-urea (protocolo 18-3). En esta prueba, la placa de agar que contiene la proliferación de colonias se cubre con una solución acuosa de urea (1%) y 0,8% (p/v) de cloruro manganoso. La hidrólisis de la urea por la ureasa libera grupos hidroxilos del agua y éstos oxidan el cloruro manganoso a óxido de manganeso insoluble, lo que causa el depósito de un precipi­ tado castaño dorado en las colonias en el transcurso de unos minutos. Los medios de agar diferencial A7 de Shepard y sus mo­ dificaciones, los agares A7B y A8, tienen la urea y el reactivo para la detección de la hidrólisis de la urea incorporado ya en el medio, de modo que no se requiere cubrir la placa con clo­ ruro manganoso.390-392393 El agar A7 contiene sulfato mangano­ so como agente precipitante junto con penicilina (1 000 U/mL) y anfotericina B (2,5 pg/mL). El agar diferencial A7B es idén­ tico al agar A7, salvo que se agrega la poliamina dihidroclorhidrato de putrescina (10 mM) para aumentar la proliferación de ureaplasmas y la formación del precipitado en las colonias. El agar diferencial A8 incorpora cloruro de calcio (1 mM) como catión divalente indicador para detectar la formación de amo­ níaco a partir de la urea, junto con colistina (7,5 pg/mL), ampi­ cilina (1 pg/m L y anfotericina B (2,5 pg/mL). En las tres fór­ mulas de medio, M. hominis aparece con la morfología carac­ terística de huevo frito después de 1 a 3 días en los agares dife­ renciales A7, A7B y A8. Las colonias de U. urealyticum apare­

cen en el transcurso de 1 a 3 días y tienen de 15 a 50 pm de diá­ metro (de acuerdo con la cantidad de bacterias). Las colonias de U. urealyticum en los agares A7 y A7B son de color casta­ ño oscuro debido a la acumulación de óxido de manganeso, mientras que las colonias en el agar diferencial A8 son doradas a castaño claro (véase lámina en color 18-IB). Varias evalua­ ciones comparativas de los medios A7, A7B y A8 indican que es probable que constituyan los medios sólidos de elección para el cultivo de micoplasmas genitales y, cuando se utilizan con un medio líquido adecuado (p. ej., caldo de azul de bromotimol, caldo Boston), brindan el rendimiento máximo de cultivos positivos.242347498 Como las características de creci­ miento de U. urealyticum en estos medios son patognomónicas, no es necesario el empleo de ninguna otra prueba. Los aga­ res diferenciales A7 y A8 son comercializados por Remel Laboratories (Lenexa, KA). La identificación definitiva de M. hominis puede realizarse mediante la inhibición del crecimiento por antisueros específi­ cos. También se ha publicado un método de inmunoperoxidasa indirecta para la identificación de micoplasmas.179 Este método emplea tiras de papel de filtro impregnadas con antisueros específicos de conejo contra diversas especies de micoplasma que se aplican a los cultivos de estos microorganismos en pla­ cas de agar. Después de una hora se eliminan los papeles y en el mismo sitio se cubre con otra tira de papel de filtro impreg­ nada con antisuero de cabra dirigido contra el antisuero de conejo y conjugado a peroxidasa de rábano. Después de otra hora de incubación, los papeles de filtro se retiran y la placa se cubre con el sustrato de la enzima (1% de 4-cloro-l-naftol). La identidad de la cepa aislada se indica por la aparición de un color azul oscuro donde se habían colocado los antisueros específicos de especie. Este método produce resultados com­ parables con los del procedimiento de inhibición del creci­ miento por antisuero. También se han realizado procedimientos similares mediante el empleo de técnicas de inmunofluores­ cencia e inmunoperoxidasa para el estudio de micoplasmas en animales, en las que las especies que tienen tropismos simila­ res por los tejidos pueden estar presentes en cultivos mixtos.27 Detección de micoplasmas genitales por procedimientos que no utilizan cultivos

También se evaluó la capacidad de los métodos que no utili­ zan cultivos para de detectar micoplasmas genitales. Hirai y cois, crearon una prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para la identificación de M. hominis en muestras vagina­ les.161 La tinción de células Vero infectadas por otras especies de M ycoplasma, como M. órale, M. salivarium y M. fermen­ tans, demostró que el procedimiento de IFI era específico para M. hominis. La prueba de IFI se comparó con cultivos de mues­ tras vaginales recolectadas de 193 mujeres sanas. De las 22 muestras con cultivos positivos, 17 fueron positivas con la prueba de IFI. Es interesante destacar que 48 de las 171 mues­ tras negativas por cultivo fueron positivas con la prueba de IFI, lo que indica que este método fue más sensible que el cultivo. Estos investigadores también comprobaron que la localización de los agregados granulares observados en las células epitelia­ les vaginal teñidos con Papanicolaou con frecuencia se corres­ pondían con las áreas de los frotis que se teñían con los reacti­ vos de IFI específicos para M. hominis.'6' En un comienzo se aprovechó la técnica de sondas para la detección de M. genitalium en muestras urogenital porque este microorganismo es muy difícil de aislar mediante cultivo. Dada la reconocida reactividad antigénica cruzada entre M. genita-

C ultivos de m icoplasm as hum anos a partir de m uestras clínicas

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M uestra (hisopados uretrales, hisopados vaginales, hisopados cervicales, biopsias endom etriales, m em branas placentarias, partes fetales, biopsias uterinas, líquido am niótico, líquido prostático, etc.)

C aldo M Agar M (contienen arginina y rojo fenol)

C aldo U A ga r U (contienen urea y rojo fenol)

Incubar a 35 °C, el caldo en aerobiosis, las placas de agar en estufa de incubación de C 0 2 o en una ja rra de anaerobiosis por extinción con vela 5 a 7 días, observación diaria

C am bio alcalino

O bservación con aum ento 10Ox

C olonias con halos rojos

C am bio alcalino

10CK

C olonias con halos rojos

A usencia de crecim iento (véase protocolo caldo M)

S ubcultivo en agar H

O bservación con aum ento

A usencia de crecim iento (véase protocolo caldo U)

S ubcultivo en agar U o a g a r A 7/A8

J Incubar com o antes

Incubar com o antes

A usencia de crecim iento

Inform ar com o "No se aísla Mycoplasma hominté'

A usencia de crecim iento

C olonias grandes típicas, m orfología de “huevo frito ” (tinción de D ienes)

Inform ar com o “No se aísla Ureaplasma urealyticuni’

C olonias pequeñas típicas, castaño doradas en a g a r A 7/A8, o

A gregar al agar U una solución de M nC L-urea

I

A parecen colonias “castaño doradas” Inform ar com o “A islam iento p resuntivo de Mycoplasma

Inform ar com o “Se aísla Ureaplasma urealyticuni'

hominis

Figura 18-2 Protocolo para el aislamiento de Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum en m uestras genitales.

lium y M. pneumoniae y la similitud de ciertas secuencias nucleotídicas de estos microorganismos, las sondas de ácido nucleico para M. genitalium tuvieron que ser construidas para excluir aquellas secuencias nucleotídicas compartidas con M. pneumoniae con el objeto de evitar los resultados falsos positi­ vos.504 Estas sondas de DNA cuidadosamente construidas se utilizaron junto con las técnicas de amplificación y PCR para detectar en forma directa secuencias nucleotídicas específicas de M. pneumoniae y M. genitalium en muestras clínicas.161196 En un estudio, 10 de 150 muestras genitales provenientes de ocho pacientes (tres hombres y cinco mujeres) fueron positivas para M. genitalium.'96 Estos resultados fueron confirmados por

pruebas de hibridación por Southern blot, ya que no se realiza­ ron cultivos. También se han utilizado ensayos moleculares para la detec­ ción y la identificación específica de M. hominis y U. urealyti­ cum en muestras del aparato genital, líquido amniótico y respi­ ratorias de recién nacidos.34’274-410'508 Los ensayos de PCR para M. hominis utilizaron para la amplificación y la detección secuencias del rRNA 16S específicas de M. hominis, mientras que ensayos similares para U. urealyticum emplearon secuen­ cias rRNA 16S específicas del microorganismo, las secuencias del gen para el antígeno MB (múltiple banded\ bandeo múlti­ ple, variación antigénica) o las secuencias del gen para la ure-

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C A P ÍT U LO 18 Micoplasmas y ureaplasmas

asa para la detección y la identificación de este microorganis­ mo.33-34-186-444Algunas de estas pruebas pueden detectar tan solo una unidad formadora de colonias en muestras del aparato uro­ genital de adultos y en muestras obtenidas por aspiración de líquido amniótico y endotraqueales de recién nacidos. Teng y cois, examinaron 50 muestras clínicas (8 de hisopado uretral, 8 de orina, 12 de hisopados endocervicales, 8 de líquido prosté­ tico y 14 de semen) por cultivo y PCR.443 Los cultivos fueron positivos para cinco muestras y otras cuatro muestras más pro­ dujeron cambios de pH adecuados en caldo, pero no crecieron en los subcultivos en medios sólidos (positivos “dudosos”). La PCR fue positiva en las cinco muestras positivas por cultivo, en las cuatro muestras positivas dudosas, más tres muestras (una de líquido prostático y dos endocervicales) que fueron negati­ vas por el cultivo. Los métodos de PCR para M. ferm entans detectan una secuencia característica de DNA que aparece repetitivamente en el genoma del microorganismo, mientras que las empleadas para la detección de M. hominis, M. penetrans y M. pirum detectan secuencias nucleotídicas características dentro del rRNA 16S de estas especies.133’134-484Aunque los métodos sero­ lógicos y genéticos sugieren que M. ferm entans representa un grupo homogéneo de microorganismos, las cepas asociadas con el SIDA, las aisladas en cultivos celulares y otras cepas clí­ nicas de M. ferm entans pueden diferenciarse entre sí mediante espectrometría de masas con pirólisis.146 Sistemas comerciales de cultivo para Mycoplasma

Los sistemas en frasco Mycotrim® RS y Mycotrim® Triphasic (Irvine Scientific, Irvine CA) son los únicos sistemas comerciales que han sido muy utilizados para el cultivo de M. pneumoniae y los micoplasmas genitales, respectivamente. El sistema Mycotrim® GU está disponible en la forma de caldo de enriquecimiento que puede utilizarse con agares diferenciales convencionales, como los agares A7 o A8, o como un sistema de cultivo completo, denominado sistema en frascos Mycotrim Triphasic. El sistema Mycotrim RS está compuesto por un frasco que contiene una capa de medio enriquecido de agar glucosa y el indicador rojo fenol en un lado y un caldo de composición similar. Treinta minutos antes de la inoculación con la muestra, se agregan a los frascos discos saturados con cefoperazona, nistatina y acetato de talio para permitir que los antimicrobia­ nos eluyan del disco y se difundan en el agar. Para agregar las muestras líquidas y “estriar” la superficie del agar se emplea una pipeta. Las muestras de hisopados se rotan sobre la super­ ficie del agar. El frasco se incuba con el lado del agar hacia arriba durante 2 semanas entre 35 °C y 37 °C. Luego de 3 días se realiza la reinoculación mediante la manipulación del frasco de modo que el caldo bañe la superficie de la fase del agar. El crecimiento está indicado primero por un cambio en el indica­ dor del rojo al amarillo anaranjado sin turbidez notoria. La identificación definitiva se realiza colocando el frasco sobre la platina de un microscopio óptico con el agar hacia arriba y se examina la superficie del agar para determinar la presencia de colonias de micoplasma. Esto puede realizarse con el agregado del colorante de Diene o sin él. El caldo Mycotrim GU y el frasco Mycotrim Triphasic son los únicos sistemas comerciales que son muy utilizados para el aislamiento y la identificación de los micoplasmas genitales M. hominis y U. urealyticum. El caldo Mycotrim GU contiene arginina, urea y rojo fenol como indicador. Este caldo se ino­ cula con 0,1 mL de la muestra y se incuba en aerobiosis a

35 °C. El medio se observa para evaluar cambios en el color del indicador a un pH más alcalino; los subcultivos en medios sóli­ dos como agar diferencial A7 o A8 y la posterior incubación permiten el aislamiento y la identificación de M. hominis y U. urealyticum. El sistema en frasco Mycotrim Triphasic (antes conocido como sistema Mycotrim GU) es un sistema difásico que con­ tiene agar diferencial A8 modificado con cloruro de calcio en un frasco de cultivo de tejido y un medio líquido que contiene arginina, urea y rojo fenol como indicador. Antes de la inocu­ lación se agregan discos impregnados con cefoperazona (100 (ig/mL) y nistatina (50 U/mL) para permitir que los antimicro­ bianos eluyan del disco y se difundan en el agar. El frasco se inocula con 0,10 mL de la muestra y se hace que la mezcla caldo-muestra bañe la fase de agar. El frasco se incuba a 35 °C. El subcultivo se logra al permitir que el caldo bañe la fase de agar después de 24 horas de incubación. Cuando aparece un cambio de color del indicador rojo fenol del rojo al amarillo anaranjado se examina la fase de agar con el microscopio para determinar la presencia de las colonias típicas en huevo frito de M. hominis o las colonias pequeñas, teñidas de castaño por el óxido de calcio de U. urealyticum. Los cultivos se incuban durante 7 días con observaciones diarias. En un estudio publicado en 1985, Wood y cois, hallaron que el sistema Mycotrim GU puede utilizarse como el método con­ vencional con caldo arginina, caldo urea, agar glucosa y agar diferencial A7B.497 Un estudio ulterior que comparó el sistema Mycotrim GU con el cultivo en medio A7 determinó que el sis­ tema Mycotrim detectó el 73% de las cepas de M. hominis y el 84% de las de U. urealyticums en comparación con el 93% y el 89%. respectivamente, de los microorganismos aislados en agar A7.347 Un estudio de 1992 del sistema en frasco Mycotrim Triphasic del mismo laboratorio que realizó el estudio de 1985 comparó este sistema con uno de cultivo utilizando el caldo Mycotrim GU con los agares diferenciales A l y A8 en 129 muestras clínicas.42 De las 64 muestras en las que se desarrolló U. urealyticum, el 25%, el 98% y el 100% se detectaron en el agar Mycotrim Triphasic, agar A l y agar A8, respectivamente. De las 18 muestras a partir de las cuales se aisló M. hominis, todas crecieron en los cultivos de caldo agar A l y caldo agar A8 y el 94% se detectó en el agar Mycotrim Triphasic. En los laboratorios que realizan una cantidad modesta de trabajo sobre micoplasma, parece que el caldo Mycotrim GU combinado con un medio de agar diferencial y el sistema Mycotrim Triphasic son bastante comparables, aunque los componentes para el pro­ cedimiento “convencional" pueden ser menos costosos. Aislamiento de micoplasmas en medios de cultivo habituales

En general, M. pneumoniae y U. urealyticum tienen más requerimientos nutricionales especiales para el crecimiento que M. hominis y ésta es la única que se aísla con mayor fre­ cuencia en sitios distintos del aparato genital, como sangre, heridas y líquido articular. Por consiguiente, M. hominis en ocasiones se aísla en los medios de cultivos bacteriológicos habituales. El microbiólogo clínico debe poder reconocer estos microorganismos en condiciones subóptimas. M. homi­ nis puede crecer en medios enriquecidos como el agar Columbia CNA y el agar chocolate; crece algo menos en agar sangre tripticasa soja.335 Los microorganism os crecen mejor en condiciones anaerobias, con un crecimiento menos rápido en un ambiente aerobio, enriquecido con CO,. El desarrollo de los micoplasmas puede no ser evidente hasta después de una

P ruebas serológicas para el diagnóstico de infecciones por M ycoplasm a pneum oniae

incubación prolongada (72 a 96 horas), de acuerdo con las . adiciones de incubación y la cantidad de microorganismos :*rfentes. Las colonias de M. hominis son extremadamente r-eaueñas y pueden detectarse sólo como una “película” o 'moteado” de la superficie del agar cuando se examina con tina luz reflejada incidente intensa. La observación de este tipo ce crecimiento se facilita mediante el empleo de un microsco­ pio de disección. Las colonias son difíciles de tomar con el ansa y no se tiñen con la técnica de Gram. Las colonias sospechosas de ser micoplasma provenientes de un medio con agar habitual pueden subcultivarse cortando el bloque del agar sangre y frotando el lado que tiene la prolife-_ción bacteriana sobre la superficie de un medio de crecimíento para micoplasma como agar diferencial A l. Otro blo_ae debe ser retirado de modo aséptico y sumergido en un medio líquido como caldo H o caldo Boston. Ambos subculti■ " en medios líquidos sólidos se incuban y el procedimiento -:gue como se describió antes. La inspección de la morfología de la colonia, junto con la velocidad de crecimiento y la eva­ luación de las condiciones óptimas de crecimiento, permitirá realizar la identificación presuntiva de la especie. En ocasiones. M. hominis también se aísla en hemocultivos, en particular en mujeres con fiebre posparto. El polianetol sulronato de sodio (SPS), el agregado anticomplementario y antiragocítico presente en la mayoría de los medios de hemoculti­ vo, es tóxico para los micoplasmas. En general, cuanto mayor es el contenido de SPS (0,025% frente a 0,050%), más inhibi­ torio resulta el medio para el aislamiento de micoplasmas.80 Los micoplasmas se han aislado en medios de hemocultivos radiométricos (el sistema BACTEC®), pero el SPS inhibe o retarda el aislamiento del microorganismo, según el contenido de SPS del caldo. Smaron y cois, aislaron M. hominis en hemo­ cultivos utilizando el sistema radiométrico BACTEC con me­ dios exentos de SPS.403 Los microorganismos se detectaron en los frascos ampolla de hemocultivo en aerobiosis y en anaero­ biosis tras 3 a 7 días de incubación. Los frascos con sangre no presentaban el aspecto macroscópico de positividad y los índi­ ces de proliferación en equipo BATEC aumentaron lentamente con el tiempo. Además, las tinciones de Gram de los frascos positivos no revelaron la presencia de microorganismos, si bien fueron visibles cuando se los observó con la tinción de naranja de acridina. Se observó que el agregado de 10 mg/mL de gela­ tina a los medios de hemocultivo supera en parte los efectos inhibitorios del SPS.80 Asimismo, la presencia de sacarosa en los medios hipertónicos de hemocultivos retrasa el crecimiento de los micoplasmas.80 En el sistema BACTEC puede haber, en cierta medida, crecimiento de micoplasmas, pero el índice de proliferación de los cultivos puede no exceder el valor umbral para considerar positividad. Pratt explicó este fenómeno seña­ lando que la producción de CO, por M. hominis es el resultado de la actividad de la arginina desaminasa producida por el microorganismo al final de la fase de crecimiento logarítmico. La limitación de las concentraciones de arginina puede evitar que la proliferación de micoplasmas alcance los niveles umbra­ les de positividad del equipo BACTEC.355 Si se sospecha bacteriemia por M. hominis, el procedimien­ to óptimo es extraer la sangre a la cabecera del paciente e ino­ cularla en un medio exento de SPS. La incubación de los culti­ vos debe ser prolongada y es necesario realizar subcultivos a ciegas en medios para aislamiento de micoplasma en agar y caldo adecuados, además de agar CNA a intervalos frecuentes. La sangre para el aislamiento de micoplasmas debe inocularse directamente en medios de cultivo para micoplasma. La sangre debe diluirse l : 10 con medio de crecimiento, de modo que el

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cultivo de un volumen importante de sangre puede requerir varios frascos ampolla de medios de cultivo.

Pruebas serológicas para el diagnóstico de infecciones por Mycoplasma pneumoniae Debido a la limitada disponibilidad de cultivos, las dificulta­ des técnicas inherentes al cultivo y el tiempo requerido para obtener los resultados, el diagnóstico de infección por M. pneu­ moniae a menudo se realiza mediante una combinación de ha­ llazgos clínicos y serológicos. El diagnóstico sólo sobre bases clínicas es difícil, ya que muchos otros procesos neumónicos, en especial los causados por virus, se presentan de un modo similar. Además, la persistencia de M. pneumoniae en el aparato respiratorio durante períodos variables después de la resolución del proceso mórbido crea confusión en cuanto a la interpretación de los resultados positivos de los métodos de detección basados en el crecimiento y de los métodos moleculares. La prueba serológica más utilizada para el diagnóstico de infección por M. pneumoniae es la fijación del complemento (FC). El antí­ geno utilizado en la prueba es un glucolípido proveniente del microorganismo que se extrae con cloroformo-metanol (2:1 v/v).220 La prueba de FC determina sobre todo los anticuerpos IgM tempranos contra M. pneumoniae y detecta anticuerpos IgG en una magnitud comparativamente menor.182 Los anti­ cuerpos IgM aparecen durante la primera semana de la enfer­ medad, alcanzan sus títulos máximos en la tercera semana y disminuyen a concentraciones bajas en algunos meses. Los anticuerpos IgG aumentan con más lentitud en la evolución de la enfermedad y alcanzan los títulos máximos alrededor de las 5 semanas después del comienzo de los síntomas.183 En la mayoría de los casos, los anticuerpos IgG contra M. pneum o­ niae no se encuentran durante la primera semana de la enfer­ medad, pero, una vez que se elevan, pueden permanecer así durante 3 a 4 años. Por consiguiente, las concentraciones bajas de IgG pueden indicar una infección pasada o una respuesta temprana de IgG ante una infección reciente. Como estos anti­ cuerpos fijadores del complemento pueden persistir durante años tras la infección, la precisión diagnóstica máxima con la prueba de FC se obtiene cuando las muestras de suero de la fase aguda y de convalecencia muestran un aumento de cuatro veces en el título cuando se prueban al mismo tiempo, lo que indica infección reciente o actual por M. pneumoniae. La muestra de la fase aguda debe recolectarse lo antes posible des­ pués del comienzo de la enfermedad y la muestra de la fase de convalecencia se debe recolectar 2 a 3 semanas más tarde. Los títulos de la FC únicos de 32 o mayor de la muestra recolecta­ da en el período de convalecencia son altamente sugestivos de infección reciente.220 Los títulos de FC comienzan a elevarse a los 7 a 10 días después de la infección por el microorganismo y alcanzan los valores máximos a las 4 a 6 semanas.182 El extracto no procesado de M. pneumoniae que se utiliza en la prueba de FC tiene una estructura similar a los otros glucolípidos bacterianos y de plantas, de modo que pueden aparecer reacciones cruzadas de este antígeno con otros anticuerpos no dirigidos contra los micoplasmas. Los títulos de FC para el diagnóstico de neumonía por micoplasmas pueden ser falsos positivos en individuos con meningitis bacteriana. Además, algunas enfermedades autoinmunitarias también pueden causar resultados serológicos por FC falsos positivos.182 Aunque el diagnóstico serológico de infección mediante la prueba de FC suele ser confiable en las poblaciones pediátricas, no sucede lo mismo con los adultos 488 Los anticuerpos IgM pueden no ser

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C A P ÍT U L O 18

Micoplasmas y ureaplasmas

producidos de modo uniforme en los individuos mayores como consecuencia de infecciones múltiples pasadas. Además, es probable que los huéspedes inmunodeprimidos mayores no monten una respuesta inmunitaria suficiente como para generar resultados detectables y reproducibles en la prueba de FC. La sensibilidad y la especificidad de la prueba de FC en el diagnóstico retrospectivo de infección por M. pneumoniae va­ nan de acuerdo con el momento de la enfermedad en que se recolectaron las muestras, la disponibilidad de muestras apare­ adas y el valor de corte utilizado para la interpretación de los títulos de muestras únicas de suero. En un estudio realizado por Kenny y cois., la elevación de cuatro veces en el título mostró una sensibilidad de sólo el 53% en los pacientes afectados por neumonía con cultivos positivos.220 Esta sensibilidad aumentó al 90% cuando se incluían los títulos únicos mayores de 32. La especificidad de la prueba de FC que emplea un aumento del título de cuatro veces o un título de 32 o mayor fue del 89%. Un estudio numeroso de 12 años de duración sobre la prueba de FC y el cultivo para el diagnóstico de M. pneumoniae deter­ minó que la sensibilidad y la especificidad de la prueba de FC eran del 90% y el 94%, respectivamente, mientras que la sen­ sibilidad del cultivo fue del 64%.182 Además, otras especies de Mycoplasma (M. genitalium) generan la producción de anti­ cuerpos que reaccionan en forma cruzada en la prueba de FC para M. pneumoniae, lo que contribuye aún más a los proble­ mas de especificidad de esta prueba. Se describieron procedi­ mientos de inmunotransferencia por Western blot para sortear estos problemas, pero estos métodos no están disponibles en la mayoría de los laboratorios clínicos. En la actualidad se comercializan de pruebas serológicas que emplean inmunofluorescencia y enzimoinmunoanálisis. El M. pneumoniae Antibody Test System® (Zeus Scientific, Raritan, NJ) emplea inmunofluorescencia indirecta para la detección separada de IgG e IgM específicas contra M. pneumoniae. En una evaluación de este ensayo, la IFI para IgM específica con­ tra M. pneumoniae se comparó con PCR. cultivo y FC para el diagnóstico de infección por micoplasm as.101 Sobre la base de la positividad del cultivo y de la FC como criterios para un diagnóstico positivo de infección, la sensibilidad de la prueba IFI para IgM fue del 78% y la especificidad del 92%. El valor predictivo de la prueba IFI para IgM positiva en este estudio fue de sólo el 57%. En otra evaluación que utilizó resultados consensuados para definir los positivos verdaderos como aque­ llos que brindan resultados positivos en dos o más ensayos de EIA o FC (más revisiones de las historias clínicas), la IFI para IgM tuvo sensibilidad y especificidad del 89% y 99%, respec­ tivamente.7 También se han desarrollado enzimoinmunoanálisis (EIA) para la detección de anticuerpos específicos contra M. pneu­ moniae. Los equipos para microtitulación por EIA incluyen Mycoplasma pneumoniae IgG/IgM antibody test system® (Remel), ImmunoWELL Mycoplasma pneumoniae IgM EIA® (GenBio, San Diego, CA), Zeus Mycoplasma IgM EIA® (Zeus Scientific), Incstar M ycoplasm a IgM ELISA® (Incstar, Stillwater, MN), Platelia IgM and IgG Mycoplasma EIA® (Sanofi-Diagnostica Pasteur, Mames la Coquette, Francia), Biotest anti-M pneumoniae IgG and IgM ELISA® (Biotest, Buc, Alemania) y ETI-M . pneum oniae IgM /IgG assay® (Diasoren, Antony, Francia). Los ensayos ImmunoWELL, Zeus e Incstar emplean placas de microtitulación para detectar anticuerpos IgM contra M. pneumoniae en muestras de suero. Los ensayos ImmunoWELL y Zeus emplean un paso de absor­ ción de la IgG para evitar su interferencia en la muestra, mien­ tras que los métodos de Incstar y Platelia IgM capturan la IgM.

Los EIA de Remel, Platelia, Biotest y ETI detectan IgM e IgG. Estos ensayos con formato de microtitulación varían en el tipo de antígeno utilizado en la fase sólida que incluyen ultrasonicados solubilizados y purificados de cultivos de M. pneum o­ niae (p. ej., Platelia y Biotest), glucolípidos purificados de M. pneumoniae (p. ej., ImmunoWELL) o antígenos proteicos puri­ ficados de la membrana que incluyen la citoadhesina Pl inmunodominante de M. pneumoniae (p. ej., ETI) como el antígeno predominante en la fase sólida. La especificidad de la compro­ bación de IgM por EIA mejora cuando se emplea un método de captura de IgM. En una evaluación comparativa de varios ensa­ yos para IgM sólo se notó una especificidad del 100% en el Platelia IgM EIA, que emplea captura de IgM (es decir, la fase sólida se recubre con anticuerpos anticadena ja), mientras que los ensayos que utilizan absorción de IgG u otros métodos de eliminación de IgG para la detección de IgM tienen especifici­ dades que varían del 90% (ImmunoWELL IgM) al 25% (ETIM. pneumoniae IgM).342 En general, los ensayos para IgM son más sensibles y específicos cuando se comprueban sueros de niños, ya que los adultos pueden no montar una respuesta importante de IgM.398 Además, dado que las poblaciones de adultos tienden a presentar títulos más elevados de IgG especí­ fica contra M. pneumoniae provenientes de infecciones pasa­ das o subclínicas, la comprobación de muestras de suero pa­ readas recolectadas con una separación de 1 a 3 semanas que muestren un aumento del título de anticuerpos de cuatro veces o más es el método más útil para determinar infecciones agu­ das en los adultos.462 En los últimos años aparecieron en el mercado varias prue­ bas serológicas rápidas basadas en membrana para IgM e IgG específicas contra M. pneumoniae. El sistema de Remel para IgG e IgM contra Mycoplasma pneumoniae es un EIA que se realiza en 5 minutos para la detección cualitativa y simultánea de anticuerpos contra M. pneumoniae. El suero del paciente se diluye y reacciona con el antígeno de M. pneumoniae que está inmovilizado sobre una membrana permeable. Después del lavado, se agrega IgG/IgM antihumana marcada con enzimas y se permite que se enjuague a través de la membrana. Después de dos lavados se agrega el sustratocromógeno al filtro y se lo deja reaccionar durante 5 minutos. Thacker y Talkington eva­ luaron esta prueba con 50 muestras pareadas de suero y encon­ traron que la prueba Remel detectó anticuerpos en tres mues­ tras con títulos de FC de 32 y fue positiva en todas menos una muestra con títulos de FC de 64 o mayor.445 Otra evaluación de este sistema comunicó una sensibilidad del 91% y una especi­ ficidad del 91%, con los correspondientes valores predictivos positivos y negativos del 87% y el 93%, respectivamente.15 El sistema Meridian ImmunoCard Mycoplasma IgM assay® (Meridian Biosciences, Cincinnati, OH) es un EIA cualitativo basado en membrana que se lleva a cabo en 10 minutos en el cual el suero se deja reaccionar con extractos antigénicos de M. pneumoniae impregnados en papel de filtro. Este ensayo no requiere la separación de la IgM ni la eliminación de la IgG del suero antes de realizar la prueba. Las evaluaciones de este ensayo sugieren que la prueba ImmunoCard es más sensible que otras pruebas serológicas para detectar concentraciones bajas de anticuerpos IgM.7-107,286-446 En una evaluación del ensa­ yo mediante el empleo de muestras provenientes de 40 pacien­ tes pediátricos, todas las muestras de suero de fase aguda fue­ ron positivas con la ImmunoCard, mientras que las pruebas de FC y aglutinación de partículas fueron positivas en el 30% y el 77,5% de los casos, respectivamente.286 En otra evaluación comparativa con 64 sueros de fase aguda de adultos, la ImmunoCard detectó IgM específica en el 46% de las mués-

P ruebas serológicas para m icoplasm as genitales tras, mientras que la prueba de FC, el Remel EIA y el ImmunoWELL IgM EIA detectaron anticuerpos en el 38%, 41% y 23%, respectivamente.446 Una tercera evaluación con 145 sue­ ros de fase aguda provenientes de niños informó sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos del 85%, 97%, 93% y 93%, respectivamente, cuando se comparó con los métodos de microtitulación de IgM por EIA de Remel y de Zeus.107 Estas evaluaciones del ensayo ImmunoCard para IgM de Mycoplasma sugieren que esta prueba rápida es alta­ mente confiable para establecer un diagnóstico de infección reciente por Ai. pneumoniae tanto en niños como en adultos. También se comercializan ensayos de aglutinación de micropartículas para la detección de anticuerpos contra Ai. pneum o­ niae. La prueba Serodyne Color Vue IgG/IgM® (Serodyne, Indianápolis, IN) utiliza partículas de látex recubiertas con el antígeno lipídico de Ai. pneumoniae, mientras que la prueba Serodia-Myco II® (FujireBio, Tokio, Japón) utiliza partículas de gelatina sensibilizadas de manera similar. Ambas pruebas se realizan mediante la dilución seriada de suero del paciente inactivado por calor en una placa de microtitulación y el agre­ gado de una alícuota fija de las partículas de látex o gelatina recubiertas con el antígeno lipídico de Ai. pneumoniae en cada pocilio que contiene la dilución. Después del mezclado en un agitador para microplacas y de la incubación se determina el título como la última dilución del suero que causa la aglutina­ ción de las partículas sensibilizadas con el antígeno. Thacker y Talkington evaluaron la prueba de aglutinación pasiva Serodyne que se realiza en 40 minutos y la hallaron menos sen­ sible que el EIA de Remel; sólo el 68% de los casos de neu­ monía por micoplasmas pudieron ser diagnosticados serológicamente con este equipo en comparación con el 94% y el 96% de los casos diagnosticados por las pruebas de FC y de Remel, respectivamente.445 Lieberman y cois, evaluaron la prueba de aglutinación de partículas de gelatina Serodia-Myco II y encontraron que la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivos y negativos eran del 48,1%, 86,9%, 49,3% y 86,3%, respectivamente.251 Otros investigadores también no­ taron especificidad inadecuada de esta prueba en comparación con un ÉIA de captura específica de IgM y una IFI para IgM .17 La purificación y la secuenciación de la adhesina P l de Ai. pneumoniae y el reconocimiento de epítopos inmunodominantes de P l y otras moléculas de la superficie celular pueden per­ mitir la elaboración de péptidos sintéticos para utilizar como antígenos específicos, químicamente definidos, en pruebas serológicas futuras para Ai. pneumoniae ,185 Suni y cois, evalua­ ron un método de EIA nuevo (Ai. pneumoniae IgG, IgA and IgM®, Thermolabsystems. Helsinki, Finlandia) en el cual el antígeno en fase sólida está enriquecido por el antígeno protei­ co de citoadherencia Pl de Ai. pneumoniae .4I7 Cuando se lo comparó con los EIA ImmunoWELL y Platelia, la sensibilidad y la especificidad de esta prueba fueron del 100% y del 96,5100%, respectivamente. Otro grupo investigó el desempeño de dos EIA nuevos en comparación con la prueba de FC. En uno de ellos, la fase sólida contenía antígeno recombinante P l; en el otro, la fase sólida contenía antígeno recombinante p 116.102 Ambos antígenos tienen antigenicidad demostrable y generan la formación de anticuerpos específicos en pacientes infecta­ dos.104105,175 Este estudio encontró que los ensayos con antíge­ no recombinante mostraron buena correlación con la prueba de FC, y que el EIA con P l recombinante muestra mejor discri­ minación entre muestras positivas y negativas.102 El empleo de epítopos antigénicos específicos de especie en las pruebas sero­ lógicas para la infección por Ai. pneumoniae puede ayudar a eliminar resultados falsos positivos como consecuencia de

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infecciones respiratorias o urogenitales por Ai. genitalium, ya que se sabe que estos microorganismos tienen antígenos que reaccionan en forma cruzada.254 Asimismo, se investigó el serodiagnóstico mediante la detec­ ción de concentraciones séricas de IgA contra Ai. pneumoniae como un método posible para el diagnóstico de infección por ese microorganismo. Watkins-Riede) y cois, evaluaron un método de EIA para IgA que se realiza en 3 horas (SeroMPIgA kit®; Savyon Diagnostics, Ashdod, Israel) y lo compararon con el ensayo de aglutinación de micropartículas (Serodia Myco II; FujireBio), la prueba de FC, un EIA específico para IgM (SeroMP-IgM kit®; Savyon Diagnostics) y el EIA rápido Immuno-Card IgM (Meridian Diagnostics) en muestras de suero en fase aguda provenientes de 23 pacientes con neumo­ nía por Ai. pneumoniae.490El ensayo para IgA mostró una sen­ sibilidad del 96% al 100% y una especificidad del 91% al 100%. La sensibilidad de los otros ensayos varió del 87% al 91%. Durante el transcurso de este estudio, los investigadores nota­ ron que los pacientes más jóvenes tendían a presentar concen­ traciones de IgM mayores que los adultos, mientras que los pacientes adultos tendían a mostrar concentraciones más eleva­ das de anticuerpos IgA. Al parecer, este ensayo parecía resol­ ver dos de las deficiencias de la serología para micoplasma: la sensibilidad y la especificidad comparativamente menores de la prueba de FC y la presencia no uniforme de IgM específica contra Ai. pneumoniae en pacientes adultos infectados. Una prueba serológica inespecífica que a menudo se utiliza para apoyar el diagnóstico de infección por Ai. pneumoniae es la producción de crioaglutininas. Estas aglutininas reaccionan en frío con los antígenos eritrocíticos humanos I. El antígeno I es inactivado por la a-glucosidasa y la unión de las crioagluti­ ninas a estas células es inhibida por la galactosa.72-499 Además, cuando los eritrocitos que contienen el antígeno I se someten a la extracción con cloroformo-metanol, se extrae un antígeno que fijará el complemento en presencia de anticuerpos contra Ai. pneumoniae.499 Estos datos indican que el antígeno I de eri­ trocitos detectado por crioaglutininas es similar en cuanto a la estructura a ciertos determinantes antigénicos de la membrana glucolipídica de Ai. pneumoniae.189 Al igual que otros anti­ cuerpos IgM, las criohemaglutininas aparecen alrededor de 7 días después de la infección y alcanzan el máximo a las 4 o 5 semanas. A continuación, los títulos disminuyen con rapidez y se tornan indetectables después de casi 5 meses. Como sucede con la FC y otras pruebas serológicas, la elevación de cuatro veces en los títulos de crioaglutininas en presencia de una enfermedad clínica compatible es sugestiva de infección por Ai. pneumoniae. El principal inconveniente en utilizar esta prueba sola para el diagnóstico presuntivo es que sólo entre el 50% y el 60% de los individuos con infección aguda por Ai. pneum oniae presentará títulos de crioaglutininas dem ostrables.172-182 Además, varias otras enfermedades pue­ den causar aumentos en las crioaglutininas, como mononu­ cleosis infecciosa, parotiditis, gripe, rubéola, virus sincitial respiratorio, adenovirus, enfermedad vascular periférica y psitacosis.

Pruebas serológicas para micoplasmas genitales Los métodos serológicos también se investigaron para el diagnóstico de infecciones por M. hominis. Las proteínas de membrana asociadas con los lípidos (LAMP) constituyen un grupo fundamental de proteínas de la superficie celular que son

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C A P ÍT U LO 18 Micoplasmas y ureaplasmas

altamente antigénieas y son objetivos principales en la res­ puesta inmunitaria contra los micoplasmas.267 Las LAMP se han identificado en varias especies de Mycoplasma, como M. salivarium, M. penetrans, M. pirum y M. genitalium y estos antígenos se emplearon en ensayos sero­ lógicos para la comprobación de pacientes con diversos tipos de infecciones.483485-486 Los anticuerpos contra estos antígenos LAMP parecen ser altamente específicos de especie, sin reac­ ciones cruzadas evidentes con los de otras especies. Los anti­ cuerpos contra los antígenos LAMP se emplearon para definir serotipos de M. hominis. En un estudio reciente se compararon la antigenicidad y los perfiles de anticuerpos de 14 cepas dife­ rentes de M. hominis por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) e inmunotransferencia por Western blot.267 Las LAMP de estas 14 cepas mos­ traron perfiles similares de SDS-PAGE y el análisis por inmunotransferencia reveló que estas proteínas eran altamente inmunógenas cuando se probaban con sueros de pacientes infectados. Estos investigadores también demostraron que los sueros de 28 de 31 pacientes HIV positivos con cultivos positi­ vos para M. hominis de muestras de orina reaccionaron con cada uno de los 14 aislamientos diferentes de M. hominis en el examen Western blot. Estos estudios mostraron que las LAMP provenientes de cualquier cepa aislada de M. hominis podrían utilizarse como antígeno específico en una prueba de EIA para la detección de anticuerpos contra M. hominis. Este EIA deri­ vado de LAMP se utilizó para demostrar que la prevalencia de anticuerpos específicos contra M. hominis era significativa­ mente mayor en los pacientes que asisten a clínicas de enfer­ medades de transmisión sexual (prevalencia del 67,8%) que en los donantes de sangre sanos (prevalencia del 34,4%) y que la infección por M. hominis afectaba a una edad mucho menor en las mujeres que en los hombres. Estos EIA para la detección de anticuerpos séricos contra M. hominis están disponibles sólo en el ámbito de la investigación. Los métodos serológicos también se evaluaron como un modo para establecer la presencia de infección por U. urealyti­ cum. Entre estos métodos están las técnicas de EIA, con micro­ organismos purificados y sonicados como antígeno de fase sólida, o técnicas de Western blot, donde los antígenos se pre­ paran a partir del crecimiento de serovariedades representativas de U. urealyticum en cultivo, se efectúa la lisis de los microor­ ganismos con SDS, la separación de antígenos por electrofo­ resis y la transferencia de los antígenos a un papel de nitrocelulosa. Un estudio realizado en 1995 examinó la presencia de U. urealyticum en líquido amniótico junto con la respuesta serológica confirmada por EIA en mujeres en el tercer trimes­ tre de embarazo que habían sido sometidas a amniocentesis por indicaciones genéticas, mujeres internadas por trabajo de parto prematuro con membranas fetales intactas y mujeres con rotu­ ra prematura de membranas.10 Aunque la prevalencia de la infección por U. ureaplasma fue del 2,9%, 4,3% y 17,8%, res­ pectivamente, en los tres grupos las prevalencias correspon­ dientes de anticuerpos fueron del 50%, 86% y 57%. Estos investigadores encontraron que la incidencia de complicacio­ nes del embarazo como nacimiento prematuro, bajo peso al nacer o muerte fetal, fue significativamente mayor en las muje­ res que habían montado una respuesta inmunitaria contra JJ. urealyticum.'0En otro estudio realizado por el mismo grupo, el 30% de las mujeres con endometritis posparto presentaron serologías positivas por EIA para JJ. urealyticum, en compara­ ción con el 6% del grupo control.55 Un estudio serológico de mujeres y lactantes que empleó métodos de inmunotransferencia para IgM e IgA específicas para U. urealyticum estableció

que el 4,5% de los lactantes nacidos con menos de 30 semanas de gestación, menos del 1,7% de los nacidos entre 30 y 34 semanas de gestación y ninguno de los nacidos a las 35 sema­ nas o más tenían anticuerpos IgM o IgA específica detectables, lo que sugiere una posible participación de la respuesta inmu­ nitaria en la evolución del embarazo.75 Los estudios serológicos de este tipo pueden ayudar a clarificar la participación de la res­ puesta inmunitaria específica contra JJ. urealyticum en la pa­ togenia de la infección y proporcionar información para el desarrollo de pruebas serológicas sensibles y específicas para aumentar los enfoques diagnósticos por cultivo y moleculares en el laboratorio clínico. Como sucede con M. hominis, las pruebas serológicas para JJ. urealyticum sólo están disponibles y se utilizan en el ámbito de la investigación.

Sensibilidad antimicrobiana y tratamiento de las infecciones por Mycoplasma La neumonía atípica causada por M. pneumoniae suele tra­ tarse con tetraciclina o eritromicina.69 Aunque el microorganis­ mo aún puede estar presente en las vías respiratorias altas durante el tratamiento y después de éste, las manifestaciones clínicas de infección por lo general mejoran y los infiltrados observados en las radiografías de tórax suelen desaparecer durante el tratamiento. Dada la dificultad para cultivar este microorganismo, su lenta velocidad de crecimiento y la falta de un método disponible con facilidad, ya no es necesario ni ade­ cuado la realización de antibiogramas para M. pneumoniae. Los antibiogramas de cepas de M. pneumoniae indican que este microorganismo es sensible a varios agentes antimicrobianos, como quinolonas (ciprofloxacina, levofloxacina, ofloxacina, gemifloxacina, moxifloxacina, garenoxacina, trovafloxacina, grepafloxacina, rufloxacina), clindamicina, lincomicina, tetra­ ciclina, doxiciclina, minociclina, eritromicina y ciertos amino­ glucósidos (estreptomicina).103,122,145,213,429,473-475 Algunos de los antibióticos macrólidos más nuevos, como claritromicina, azitromicina y fluritromicina, también son eficaces contra M. pneumoniae y muestran un rango muy estrecho de concentra­ ciones inhibitorias mínimas (CIM).23'122-145,474 Las cepas de M. pneumoniae pueden mostrar menor sensibilidad a gentamicina, cloranfenicol. clindamicina y lincomicina y son francamente resistentes a penicilinas, cefalosporinas, ácido nalidíxico y rifam picina429 Casi todas las cepas aisladas de M. hominis y JJ. urealyticum son sensibles a las tetraciclinas. Las cepas de M. hominis sue­ len ser sensibles a clindamicina y lincomicina, pero no a eri­ tromicina y otros macrólidos (azitromicina, claritromicina). Las cepas de JJ. urealyticum suelen ser sensibles a eritromicina y azitromicina, pero no a clindamicina y lincomicina. El creci­ miento de M. hominis y JJ. urealyticum también es inhibido por cloranfenicol. estreptomicina y gentamicina, pero no por los agentes que actúan sobre la pared celular (cefalotina, ampicili­ na y vancomicina). A mediados y finales de la década de 1970 y a comienzos de la de 1980, se aislaron cepas de ambas espe­ cies resistentes a la tetraciclina y se encontró que contenían un determinante genético de resistencia antimicrobiana denomina­ do tetM ,365’366 Este determinante ha sido hallado también en otros microorganismos del aparato genital, como estreptococos del grupo B. Gardnerella vaginalis y Neisseria gonorrhoeae.361 También se describieron cepas de JJ. urealyticum que presen­ tan resistencia o sensibilidad intermedia a la eritromicina y a los macrólidos más nuevos (p. ej., fluritromicina).122,218 En la

Se nsibilidad antim icrobiana y tratam iento de las infecciones por M ycoplasm a

actualidad, casi todas las cepas de M. hominis son resistentes a la eritromicina y algunas, a la tetraciclina y la clindamicina. La resistencia a los macrólidos como eritromicina en M. hominis suele deberse a mutaciones en el rRNA 23S.340 En cepas de U. urealyticum también se describió resistencia a la tetraciclina; estas cepas contienen, además, el determinante de la resisten­ cia tetM ,365-366'413 La eritromicina sigue siendo el fármaco de elección para el tratamiento de U. urealyticum en recién nacidos sin afección del SNC; las infecciones del SNC en este grupo de pacientes se tratan mejor con tetraciclina o cloranfenicol.477 Las cepas de U. urealyticum suelen ser menos sensibles a las quinolonas que M. pneumoniae o M. hom inis}22214216211219 El perfil de sensibilidad a los antimicrobianos de M. genita­ lium parece ser similar al de M. pneumoniae, con sensibilidad a las tetraciclinas y a varios macrólidos.428-429 Renaudin y cois, determinaron la sensibilidad de siete aislamientos de M. geni­ talium mediante el empleo del método de dilución en agar y las compararon con tres cepas de M. pneumoniae.361 Ambas espe­ cies fueron sensibles a los macrólidos (eritromicina, espiramicina, roxitromicina, azitromicina y claritromicina), clindamici­ na, tetraciclina, doxiciclina, minociclina y fluoroquinolonas (ofloxacina, ciprofloxacina, lomefloxacina. esparfloxacina).92 A pesar de la sensibilidad in vitro de M. genitalium a las tetra­ ciclinas, varios estudios mostraron que el tratamiento con tetra­ ciclina a menudo se asocian con fracasos terapéuticos. Un estu­ dio realizado por Johannison y cois, halló que el 62% de 13 varones con uretritis por M. genitalium tratados con tetracicli­ na durante 10 días aún presentaban el microorganismo en la uretra durante el seguimiento.197 En otro estudio, siete varones con uretritis por M. genitalium tratados con doxiciclina aún padecían uretritis en el seguimiento.164 En un estudio sobre tra­ tamiento que comparó tetraciclinas y azitromicina, los seis pacientes que habían recibido azitromicina eran negativos para M. genitalium por PCR después del tratamiento, mientras que el 63% de 16 pacientes tratados con tetraciclina aún eran posi­ tivos por PCR para M. genitalium después del tratamiento.114 La presencia del microorganismo en el aparato urogenital con síntomas o sin ellos tras el tratamiento con estos agentes puede estar directamente relacionada con la dosis y la duración del tratamiento. Según las pautas para el tratamiento de las ETS, la azitromicina para el tratamiento de la uretritis se administra en una única dosis de 1 g.54 Los pacientes con uretritis por M. genitalium que han sido tratados con azitromicina según estas recomendaciones mostraron respuestas clínicas parciales y per­ manecieron positivos por PCR una semana después de com­ pletar el tratamiento.124Whatley y cois, hallaron que 500 mg de azitromicina en una única dosis seguida de 250 mg de azitro­ micina una vez por día durante 2 días era más eficaz para erra­ dicar M. genitalium que 200 mg de doxiciclina durante 7 días o 1 g de azitromicina en una única dosis.493 Con el uso de un procedimiento de dilución en caldo modi­ ficado con el medio SP-4, Hayes y cois, determinaron la sensi­ bilidad a los antimicrobianos de la cepa incognitus de M. fe r ­ mentans junto con cepas de referencia de M. fermentans (cepa PG18 [ATCC 19989]) y M. pneumoniae (ATCC 15 5 31).153155 Como era de esperar, los tres micoplasmas fueron resistentes a los agentes que actúan sobre la pared celular (penicilina, ampi­ cilina). Las cepas PG18 e incognitus de M. ferm entans fueron resistentes a la eritromicina (media de las CIM de eritromicina, 31,2 |ig/mL y 43 |ig/mL, respectivamente), mientras que M. pneumoniae fue sensible (media de las CIM, 0,0073 |j.g/mL). La cepa incognitus de M. ferm entans fue sensible a tetracicli­ na, doxiciclina, clindamicina, lincomicina, cloranfenicol y ciprofloxacina. Ambas cepas de M. ferm entans probadas en

1005

este estudio fueron resistentes a los aminoglucósidos (gentami­ cina, kanamicina, estreptomicina y neomicina), mientras que M. pneumoniae resultó sensible. Las CIM de aminoglucósidos para la cepa incognitus de M. fermentans fueron mayores de 1 000 |ig/mL para estos cuatro fármacos, mientras que las CIM para gentamicina, kanamicina, estreptomicina y neomicina para la cepa PG18 fueron de 15,6, 20,8, 18,2 y 52,1 |ig/mL, respectivamente. Antibiogramas realizados con posterioridad en otros 24 asilamientos de M. fermentans también indicaron que estas especies eran resistentes a la eritromicina y los ami­ noglucósidos.153 Este último estudio también confirmó que sólo la ciprofloxacina y la levofloxacina, ambos antimicrobianos pertenecientes a las fluoroquinolonas, tenían un efecto bacteri­ cida importante.153 Mediante el empleo de la técnica de dilución modificada con caldo de Hayflick. Hannon examinó varias cepas de M. fe r ­ mentans provenientes de infecciones humanas y de células de cultivo de tejido.143 Estas cepas fueron mucho más sensibles a la azitromicina que a la eritromicina o a la claritromicina. La clindamicina y varios congéneres de la tetraciclina también mostraron buena actividad contra las cepas de M. fermentans, aunque las concentraciones bactericidas para micoplasmas fue­ ron siete veces mayores que las concentraciones inhibitorias del antibiótico. Este estudio también demostró que las cepas de M. fermentans aisladas durante la década de 1960 en medios sin células eran sensibles a los aminoglucósidos, mientras que los aislamientos humanos recientes y las cepas obtenidas a par­ tir de células de cultivo de tejido a menudo fueron resistentes a fármacos aminoglucósidos únicos o múltiples, con CIM para estos agentes que superan los 500 jug/ mL. Las cepas de M. fe r ­ mentans desarrollaron resistencia a la estreptomicina y a la gentamicina después de 5 pasajes en caldo que contenía estos agentes, mientras que la resistencia a la tobramicina. kanami­ cina y gentamicina se observó después de 7, 8 y 14 pasajes en medios con estos agentes, respectivamente. Esta resistencia inducida a los aminoglucósidos permaneció estable después de 17 pasajes en caldo sin los aminoglucósidos. La azitromicina fue más activa contra las cepas de M. fermentans que la eritro­ micina o la claritromicina.143 En un estudio posterior, Hannon examinó la sensibilidad a los aminoglucósidos de varias cepas de M. fermentans, que comprendieron tres aislamientos asociados con el SIDA (inclu­ so una cepa incognitus), seis aislamientos respiratorios recien­ tes, un aislamiento asociado con leucemia desde 1962 y ocho aislamientos de células de cultivo de tejido.144 Dos de los tres aislamientos asociados con el SIDA y todos los aislamientos respiratorios no asociados con el SIDA fueron sensibles a los seis aminoglucósidos probados, mientras que la cepa incogni­ tus de M. fermentans y todos los aislamientos recientes de cul­ tivo de tejido fueron altamente resistentes a los seis agentes, con CIM que superan los 250 jig/mL. La cepa aislada en culti­ vo de tejido de médula ósea leucémica en 1962 fue altamente resistente a la estreptomicina (CIM, > 250 |ig/mL), pero sensi­ ble a los otros cinco aminoglucósidos. Estos resultados fueron compatibles con los de los estudios anteriores de Hannon, que habían establecido que M. fermentans incognitus era la única cepa humana de las nueve analizadas que mostró resistencia múltiple a los aminoglucósidos.143 Este perfil de resistencia fue idéntico al de las cepas de cultivos celulares. Estos resultados condujeron a Hannon a postular que el aislamiento original de M. fermentans incognitus por transfección directa de células NIH/3T3 con DNA extraído del tejido de sarcoma de Kaposi de un paciente con SIDA puede haber sido un contaminante, ya sea en el DNA transfectado o en las células 3T3 del cultivo de

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C A P ÍT U LO 18 Micoplasmas y ureaplasmas

tejido en el N IH .144 Esto se ve apoyado por el hecho de que el DNA procarionte no suele ser infeccioso para células euca­ riontes del mismo modo que los ácidos nucleicos virales, y que la capacidad de M. ferm entans de crecer dentro de la célula puede haber posibilitado que esta cepa desarrollara resistencia cruzada contra los aminoglucósidos que se utilizan en los cul­ tivos de tejido para controlar la contaminación. Esto también está apoyado por el conocimiento de que M. ferm entans es un contaminante frecuente de las células de los cultivos de teji­ do.15 Estudios realizados por otros autores también mostraron que la cepa incognitus original de M. fermentans presenta una relación genética más estrecha con las cepas asociadas con cul­ tivos celulares.383 Aun cuando la cepa incognitus original de M. fermentans puede haber sido un contaminante falso, la investi­ gación posterior mostró que M. ferm entans es un patógeno importante en pacientes con SIDA y sin él. Mediante el empleo de un ensayo de inhibición metabólica por macrodilución, Poulin y cois, examinaron la sensibilidad antimicrobiana de diversos micoplasmas “asociados con el SIDA”, como M. fermentans (una cepa de referencia, dos aisla­ mientos clínicos provenientes de pacientes con SIDA y la cepa “incognitus”), M. penetrans (una cepa) y M. pirum (una cepa).352 Todas las cepas aisladas fueron sensibles a azitromici­ na, claritromicina, clindamicina, doxiciclina, ofloxacina y tetra­ ciclina. Las cepas de M. fermentans y M. pirum fueron resis­ tentes a eritromicina, mientras que M. penetrans fue sensible. Estos investigadores también hallaron que los paneles deseca­ dos Sensititre Gram-Positive MIC panels® (BD Microbiology Systems, Irvine, CA) inoculados con una suspensión estandari­ zada de los microorganismos en caldo SP-4 produjeron resulta­ dos comparables con el método de la inhibición metabólica para todos los fármacos probados por ambos métodos. En el panel Sensititre, todas las cepas probadas fueron resistentes a penici­ lina, ampicilina, cefalotina, imipenem, vancomicina, rifampici­ na y trimetoprim-sulfametoxazol. Las cepas de M. fermentans y M. penetrans fueron resistentes a gentamicina, mientras que M. pirum mostró una sensibilidad moderada. Hayes y cois, también examinaron las sensibilidades a los antimicrobianos de las cepas de M. penetrans mediante el pro­ cedimiento de dilución en caldo.154 En su estudio de nueve cepas de M. penetrans, todas fueron sensibles a azitromicina, cloranfenicol, ciprofloxacina, clindamicina, doxiciclina, eritro­ micina, levofloxacina, lincomicina y tetraciclina. Todas las cepas presentaron resistencia a gentamicina y estreptomicina. Las fluoroquinolonas fueron la única clase de antimicrobianos que mostraron acción bactericida, en lugar de bacteriostática, contra M. penetrans,154 Dada la variabilidad en la sensibilidad antimicrobiana, se crearon métodos para la realización de antibiogramas para micoplasmas, pero no están ampliamente disponibles porque requieren medios especiales y pueden acarrear gastos conside­ rables para los laboratorios de microbiología clínica. Spaepen y Kundsin diseñaron un procedimiento relativamente simple por elución de disco en caldo para la realización del antibio­ grama de ureaplasmas, similar a los descritos en el pasado para la comprobación de las bacterias anaerobias.407 Este procedi­ miento proporcionó resultados bastante reproducibles cuando se inoculaba con microorganismos crecidos en cultivo o con muestras de orina que contenía microorganismos. Con poste­ rioridad, Robertson y cois, comunicaron un método de dilución en caldo estandarizado para determinar las CIM de los antimi­ crobianos para las cepas de U. urealyticum.368 En 1986, Kenny y cois, publicaron un procedimiento de dilución en agar para la realización de la prueba que parecía brindar resultados más

reproducibles que los métodos en caldo.218 Las comparaciones simultáneas de los métodos de microdilución en caldo y dilu­ ción en agar indicaron que ambos proveen resultados similares en la comprobación de U. urealyticum para evaluar la sensibi­ lidad a la tetraciclina y la eritromicina.480 Se describieron métodos de dilución en agar y de dilución en caldo para la realización de antibiogramas para micoplasmas.24 El agar H con pH de 7,2 a 7,4 puede utilizarse para M. hominis y M. pneumoniae, mientras que el agar U con pH de 6,3 a 6,5 se utiliza para U. urealyticum. Al medio se le incorporan dilu­ ciones al doble de los agentes antimicrobianos cuando se pre­ paran las placas para dilución en agar. La inoculación se reali­ za mediante el replicador de Steer para proporcionar un inócu­ lo de 30 a 300 unidades formadoras de colonias (UFC) por gota de inóculo. Este inóculo se determina por alícuotas de plaqueo de diluciones al décimo de un cultivo en caldo por triplicado, se realizan el recuento de colonias y la dilución adecuada de la suspensión del microorganismo de modo que el replicador pro­ porcione 30 a 300 UFC por inóculo. La placas se incuban en aerobiosis durante 4 días (U. urealyticum), 5 días (M. hominis) o 14 días (M. pneumoniae). Los procedimientos de microdilución en caldo suelen utili­ zar caldo 10B para la comprobación de ureaplasma y caldo SP para otros micoplasmas. Los antimicrobianos se solubilizan y diluyen en placas de microtitulación con el medio líquido ade­ cuado que contenga el indicador rojo fenol para lograr un rango de concentraciones del fármaco. El inóculo debe prepararse a partir de los cultivos en la fase de crecimiento exponencial, cuando las concentraciones de microorganismos suelen ser de alrededor de 107 UFC/mL para los ureaplasmas y de 108 a 109 UFC/mL para los micoplasmas de colonias grandes, los cuales también se expresan como unidades de cambio de color (UCC) por mililitro. A cada pocilio de microtitulación que contiene las diluciones del antimicrobiano se agrega un inóculo de 104 a 105 UFC (UCC) del microorganismo y luego las placas se sellan e incuban en aerobiosis a 35 °C a 37 °C. Las placas de microtitu­ lación se examinan todos los días hasta que se detecta un cam­ bio de color debido al cambio de pH en el crecimiento del con­ trol sin fármaco. La CIM se define como la menor concentra­ ción del antimicrobiano en la cual se inhibe el metabolismo del microorganismo lo suficiente como para evitar el cambio en el color del medio (por el indicador de pH) en el momento en que el control sin fármaco muestra cambio de color. En el caso de U. urealyticum, el crecimiento por lo general se presentará en el pocilio control después de 24 horas, mientras que el creci­ miento de M. hominis suele requerir 48 horas. Las cepas de M. pneumoniae suelen necesitar 4 a 8 días de incubación antes de que se perciba el cambio en el pocilio control. La actividad bactericida de los antimicrobianos puede evaluarse con el enfo­ que de dilución en caldo al extraer una alícuota del pocilio de la CIM y los pocilios que contienen concentraciones más ele­ vadas del antibiótico, la dilución de la alícuota con medio sin fármaco y la observación de un cambio de color en el medio con la incubación adicional. Con los procedimientos de dilu­ ción en agar y caldo, en cada antibiograma deben incluirse cepas con sensibilidades conocidas y CIM reproducibles para la validación de los resultados. En todos estos procedimientos pueden encontrarse proble­ mas relacionados con las características biológicas de los microorganismos y con el método en sí. Los problemas bioló­ gicos comprenden la posibilidad de cultivos mixtos (p. ej., micoplasmas y ureaplasmas juntos) y la coexistencia de pobla­ ciones sensibles y resistentes en el mismo cultivo. Este último problema puede detectarse sólo en los sistemas basados en

R eferencias

dilución en agar, debido a que el crecimiento de colonias en medios que contienen antibióticos puede ser reidentiñcado directamente mediante la prueba de hidrólisis de la urea o por métodos serológicos. Los problemas que se relacionan con la me­ todología comprenden la falta de un medio estándar para la rea­ lización de la prueba, las discrepancias relacionadas con el pH requerido para el crecimiento óptimo de los micoplasmas en comparación con la actividad óptima del antibiótico, la dificul­ tad en la estandarización del tamaño del inoculo, la falta de tiempo y de condiciones de incubación estandarizados y la falta de valores críticos de sensibilidades estandarizados.215,218 Dados estos problemas, los antibiogramas para los micoplas­ mas suelen realizarse sólo en grandes instituciones con intere­ ses especiales en la investigación del tratamiento de las infec­ ciones genitales por micoplasmas.

Diagnóstico y tratamiento de las infecciones por especies hemotrópicas de Mycoplasma en animales Los miembros de los géneros que con anterioridad corres­ pondían a Eperythrozoon y Haemobartonella no crecen en cul­ tivo, de modo que el diagnóstico se basa en el examen de fro­ tis de sangre teñidos con las técnicas del tipo de Romanowsky, como Giemsa, M ay-Grünwald-Giemsa, Wright y WrightGiemsa o por la tinción con naranja de acridina.301,302,424 Como los microorganismos realizan bacteriemias cíclicas de donde pueden ser eliminados con rapidez de la sangre, el examen de múltiples frotis de sangre recolectada en un período de 24 horas aumenta la probabilidad de un diagnóstico positivo en especies de huéspedes clínicamente compatibles. Los frotis de sangre deben prepararse de inmediato después de su recolec­ ción mediante el empleo de sangre anticoagulada o sangre recolectada en tubos heparinizados; el anticoagulante EDTA puede causar el desprendimiento de los microorganismos de la membrana de los eritrocitos, lo que dificulta el diagnóstico microscópico.301,424 Los microorganismos aparecen como for­ mas cocoides de 0,5 (im a 0,8 (im de diámetro y adheridos a las superficies de los eritrocitos. Duelen encontrarse alrededor de la periferia del eritrocito y se disponen de modo aislado o de a pares, en grupos y en cadenas. Con la tinción fluorescente de naranja de acridina, los microorganismos aparecen como ele­ mentos brillantes, anaranjados o amarillo verdosos. Se han creado ensayos moleculares y serológicos para los micoplas­ mas hemotrópicos pero no están ampliamente disponibles.424 Todas las especies parecen ser sensibles a las tetraciclinas y resistentes a los p-lactámicos. El tratamiento con eritromicina controla de modo eficaz la infección aguda, pero no elimina de manera constante la infección en los animales.301

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Micobacterias

Tendencias actuales en la tuberculosis clínica Aumento mundial de la incidencia de tuberculosis Impacto de la coinfección por HIV y Mycobacterium tuberculosis Personas con riesgo de tuberculosis Enfermedad rápidamente progresiva Implementación de un control de la infección y medidas epidemiológicas más intensivas

Tendencias en el diagnóstico de laboratorio de la tuberculosis Uso de técnicas moleculares Uso de instrumentos automatizados Uso de medios de cultivo en caldo Inoculación de muestras clínicas en medios de cultivo con base de agar Uso de p-nitro-acetilaminohidroxipropiofenona (NAP) Aplicaciones de la cromatografía gas-líquido y la cromatografía líquida de alto rendimiento Uso del tubo de hemocuitivo con sistema de lisis-centrifugación

Laboratorio clínico Optimización de la detección y la identificación de micobacterias Segundad en el laboratorio

Recolección de las muestras Muestras respiratorias Hemocultivos

Muestras de heces Otras muestras “estériles”

Procedimientos de laboratorio para el aislamiento y la identificación de las micobacterias Preparación de las muestras Digestión y descontaminación Centrifugación Muestras de médula ósea y muestras de biopsia Otras muestras líquidas Tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes

Cultivo de muestras para el aislamiento de micobacterias Medios de cultivo Medios de cultivo no selectivos para el aislamiento de micobacterias Medios de Cohén y de Middlebrook Medios selectivos Incubación

Métodos rápidos para establecer un diagnóstico Sensibilidad de los frotis ácido-alcohol resistentes Cromatografía gas-líquido y cromatografía líquida de alto rendimiento Uso de medios de cultivo en caldo

Tendencias actuales en la tuberculosis clínica

Sistemas de detección automatizados Sistema BACTEC AFB Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT, tubo indicador de crecimiento de micobacterias) y MGIT 960 Sistema de detección de micobacterias MB/BacT Sistema de cultivo ESP II BACTEC MYCO/F LYTIC

Sistemas de detección manuales Sistema Septi-Chek AFB

Identificación de micobacterias mediante métodos convencionales Temperatura óptima para el aislamiento y velocidad de crecimiento Producción de pigmento Acumulación de niacina Reducción de nitratos a nitritos Hidrólisis en Tween 80® Actividad de catalasa Actividad de arilsulfatasa Actividad de ureasa Pirazinamidasa Captación de hierro Inhibición del crecimiento por la hidrazida del ácido tiofeno-2-carboxílico Crecimiento en cloruro de sodio al 5% Crecimiento en agar de MacConkey

Clasificación de las micobacterias Identificación de laboratorio de las micobacterias y síndromes clínicos relacionados

1017

Revisión de las especies de Mycobacterium: características de laboratorio y correlaciones clínicas Complejo Mycobacterium tuberculosis Fotocromógenos Escotocromógenos No fotocromógenos Especies de crecimiento rápido Otras micobacterias

Detección e identificación de las micobacterias mediante métodos moleculares Métodos de amplificación de señales Sondas de ácidos nucleicos Hibridación in situ

Métodos de amplificación de ácidos nucleicos Aplicaciones comerciales Ensayos domésticos de PCR, incluida la PCR en tiempo real

Análisis posamplificación Hibridación inversa Secuenciación del DNA Análisis de micromatrices

Tipificación de cepas y huellas moleculares de DNA

Pruebas de sensibilidad Tratamiento a corto plazo Recomendaciones de la American Thoracic Society

Resumen

e están implementando nuevas técnicas y algoritmos gación de procedimientos moleculares derive en productos revisados para el aislamiento, la identiñcación y las comerciales, muchos de los cuales requieren la aprobación de pruebas de sensibilidad de las m icobacterias en la Food and Drug Administration (FDA), la mayoría de los muchos laboratorios en vista de los cambios en las manifesta­ laboratorios podrá diagnosticar la tuberculosis en días -o incre­ ciones clínicas y la epidemiología de la tuberculosis. A corto íblemente incluso en horas- más que en semanas. plazo, se seguirán utilizando los métodos convencionales; sin embargo, se están introduciendo técnicas moleculares rápidas Tendencias actuales en la tuberculosis clínica para la identificación y las pruebas de sensibilidad de las espe­ cies de Mycobacterium aisladas en muestras clínicas. Al menos dos tercios de los artículos de investigación básica y aplicada Las siguientes son tendencias sobre la epidemiología de la en relación con las micobacterias y la tuberculosis publicados tuberculosis que deben ser encaradas por los médicos y el per­ en la bibliografía médica actual se concentran en las posibles sonal de control de infecciones y de laboratorio. aplicaciones de laboratorio de las técnicas moleculares. Aunque la solicitud para la investigación pura en biología Aumento mundial de la incidencia de tuberculosis molecular es una parte integral de esta evolución, la fuerza impulsora para el personal del laboratorio clínico es proporcio­ La incidencia de tuberculosis en los Estados Unidos declinó nar identificaciones de especies y perfiles de sensibilidad de los progresivamente durante las ocho primeras décadas del siglo antibióticos cada vez más rápidos. En la medida que la investixx, pero esta tendencia cambió a comienzos de la década de

S

1018

C A P ÍT U L 0 19

Micobacterias

1980.24 Hacia fines de los años setenta la condescendencia fue reemplazando la vigilancia a medida que la curva de inciden­ cia de la tuberculosis se aproximaba a cero en numerosas par­ tes del mundo y muchos creían que la tuberculosis estaba por ser derrotada.41-144-285 De hecho, ocurrió lo opuesto. Desde 1985 hasta 1992 hubo un aumento en los casos comunicados de tuberculosis en los Estados Unidos.144 Además de la condes­ cendencia, otros factores contribuyeron a esta tendencia, como los cambios en la asignación de fondos federales para el con­ trol de la tuberculosis, la epidemia de HIV/SIDA, el aumento de la inmigración de personas desde zonas con tasas elevadas de endemia, el hacinamiento de los pobres y la aparición de cepas multirresistentes de M. tuberculosis.2*'26-42'59'14*-249335-341’343 Desde 1992 hasta 2002 hubo nuevamente una tendencia decre­ ciente en la cantidad de casos de tuberculosis en los Estados Unidos debido a la mejoría en las medidas de salud pública, que incluyeron el tratamiento con observación directa. Sin embargo, en todo el mundo, el impacto de la tuberculosis es peor que nunca, sobre todo en las regiones que tienen gran can­ tidad de individuos infectados por HIV. En 1993, en un paso sin precedentes, la Organización Mundial de la Salud declaró la tuberculosis una emergencia global. El boletín informativo sobre el estado actual de la tuber­ culosis en el mundo (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/whol04/en/) es impactante y menciona los siguientes datos: 1. Un tercio de la población mundial está infectada actualmen­ te por M. tuberculosis. 2. Se produce una nueva infección por tuberculosis cada segun­ do, lo que conduce a nuevas infecciones por tuberculosis en el 1% de la población mundial por año. 3. La epidemia de tuberculosis está creciendo y mata a alrede­ dor de 2 millones de personas por año. 4. El HIV contribuye significativamente a la propagación de la tuberculosis. 5. Las infecciones recién adquiridas entre 2002 y 2020 se pro­ yectan a 1 000 millones de individuos. De éstos, 150 millo­ nes se enfermarán y 36 millones morirán por tuberculosis. En los países industrializados, el 80% de los casos ocurren en individuos mayores de 50 años; en los países en vías de desarrollo, el 80% de los casos ocurren entre los 15 y los 50 años. Se ha calculado que al menos 15 millones de personas en los Estados Unidos tienen pruebas cutáneas positivas o presen­ tan enfermedad clínica. Las tasas de aumento son incluso mayores en los países en vías de desarrollo, debido a las tasas elevadas de la endemia, las condiciones socioeconómicas en deterioro o crónicamente malas en las ciudades densamente pobladas y la cantidad creciente de individuos infectados por HIV. Impacto de la coinfección por HIV y Mycobacterium tuberculosis

La pandemia por HIV, que en su mayor parte no está con­ trolada en muchas zonas del mundo, ha contribuido significati­ vamente a la propagación de la tuberculosis. La infección por HIV y la tuberculosis son enfermedades que interactúan de manera sinérgica en todo nivel, desde el molecular hasta el epi­ demiológico.25-59 Por ejemplo, la presencia de HIV en un indi­ viduo promueve la replicación intracelular del bacilo de la tuberculosis y, en consecuencia, la propagación de M. tubercu­ losis a otros. En muchas partes del mundo, la tuberculosis es la causa principal de muerte en los individuos infectados por HIV. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha calculado que

un tercio de los 36,1 millones de personas que están infectadas por HIV tienen también tuberculosis.279 El factor de riesgo más poderoso conocido para la reactivación de la tuberculosis laten­ te es la coinfección por HIV.31-88-181-310 Si se considera que la mayoría de los individuos infectados por HIV, M. tuberculosis o ambos viven en condiciones de pobreza con acceso insufi­ ciente a la atención de la salud, esta situación sólo puede agra­ varse. Personas con riesgo de tuberculosis

Se deben realizar pruebas de cribado para tuberculosis en los grupos de alto riesgo establecidos por el Advisory C ouncilfor the Elimination o f Tuberculosis de los CDC (Consejo Asesor para la Eliminación de la Tuberculosis de los Centros de Control y Prevención de Enfermedades), a saber:56 1. Contactos cercanos (aquellos que comparten la misma casa u otro ambiente cerrado) de personas de las que se sabe o se sospecha que tienen tuberculosis. 2. Personas infectadas por HIV. 3. Personas que se inyectan drogas ilegales u otros consumi­ dores de sustancias identificadas como de alto riesgo (co­ mo consumidores de crack de cocaína). 4. Personas que presentan factores de riesgo clínico que se sabe que aumentan la posibilidad de sufrir la enfermedad en el caso de que ocurra la infección. 5. Residentes y empleados de lugares que agrupan individuos de alto riesgo (como instituciones correccionales, asilos, instituciones para enfermos mentales, otras instituciones de residencia prolongada y albergues para individuos sin hogar). 6. Personal sanitario que atiende a pacientes de alto riesgo. 7. Individuos nacidos en el extranjero, incluidos los niños, llegados recientemente (dentro de los 5 años) de países con alta incidencia o prevalencia de tuberculosis. 8. Algunas poblaciones de bajos ingresos que cuentan con poca atención médica. 9. Poblaciones minoritarias raciales o étnicas de alto riesgo, según las definiciones locales. 10. Lactantes, niños y adolescentes expuestos a adultos perte­ necientes a categorías de alto riesgo. Se recomienda que los profesionales que intervienen en los programas de tuberculosis locales o estatales sean los que defi­ nan los grupos por evaluar. En algunas localidades, los depar­ tamentos de salud local deben llevar a cabo el estudio de detec­ ción o deben conversar acerca de la necesidad de realizar esta evaluación con otros individuos adecuados, como el personal de las instituciones correccionales, los funcionarios de control de infecciones de los hospitales y los operadores de los albergues. Los CDC proporcionan varias recomendaciones para conducir los programas y para manejar los grupos de alto riesgo especí­ ficos.56 Enfermedad rápidamente progresiva

La infección por M. tuberculosis de adquisición reciente no siempre sigue la evolución clásica y lentamente progresiva de la enfermedad secundaria. La tuberculosis progresiva primaria o el tipo miliar de tuberculosis de rápida propagación es la regla más que la excepción en los pacientes con inmunosupre­ sión profunda, como los pacientes con SIDA. La progresión de la enfermedad en estos pacientes ya no se mide en términos de

Tendencias en el diagnóstico de laboratorio de la tuberculosis

meses y años, sino más bien, en semanas. La replicación más rápida de las micobacterias en los sitios de infección, tanto de M. tuberculosis como particularmente de cepas pertenecientes al complejo M. avium-intracellulare (MAI), conduce no sólo a altas concentraciones de microorganismos en estos sitios, sino también a septicemia, propagación miliar y a posibles fracasos terapéuticos secundarios a la carga masiva de micobacterias y posiblemente al surgimiento de cepas multirresistentes. Implementación de un control de la infección y medidas epidemiológicas más intensivas

También se están instituyendo medidas más intensivas para que los pacientes con alto índice de sospecha de tuberculosis sean rápidamente aislados. El personal de los hospitales dedi­ cado a la asistencia directa de los pacientes con tuberculosis también corre alto riesgo de infección y es necesario que siga los procedimientos de aislamiento y que use vestimentas y máscaras protectoras con filtros de alta selectividad. El perso­ nal de laboratorio que manipula muestras clínicas de pacientes con tuberculosis también está muy expuesto a sufrir la infec­ ción, pero puede trabajar en forma segura utilizando las pre­ cauciones universales, que incluyen el procesamiento de las muestras con campanas de seguridad biológica con flujo lami­ nar. Se encuentran bajo estrecha vigilancia los sistemas de ven­ tilación de los hospitales y lugares donde existen condiciones de hacinamiento, como prisiones, asilos y albergues urbanos para individuos sin hogar, en los que se han comunicado brotes de tuberculosis. Nardell y cois, observaron que una mala aire­ ación contribuía a la transmisión aérea de infecciones en edifi­ cios equipados con sistemas de tuberías que proveían mezclas deficientes de aire exterior.241 Sin embargo, los problemas sub­ sistirán en circunstancias que no despiertan sospechas, como el brote de tuberculosis entre 41 clientes de un bar local comuni­ cados por Kline y cois.180 El caso inicial en esta comunicación fue un individuo sin hogar que era cliente habitual del bar. que tuvo un intervalo asintomático prolongado antes del diagnósti­ co. El consumo importante de alcohol entre esta población de clientes también puede haber contribuido a la alta tasa de infectividad; se ha demostrado que este factor de riesgo se asocia con la transmisión de la tuberculosis.

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tuberculosis, el complejo MAI, M. kansasii y M. gordonae. El uso de estas sondas redujo significativamente el tiempo de identificación de estos microorganismos y, lo que es más importante, confirmó o excluyó con rapidez la presencia de M. tuberculosis. La detección directa de M. tuberculosis en las muestras clí­ nicas es posible utilizando pruebas de amplificación de ácidos nucleicos. Dos de estos métodos han recibido la aprobación de la FDA para su uso en muestras clínicas; ambos son altamente sensibles y específicos para M. tuberculosis en muestras con frotis positivos. También se describieron distintos ensayos “domésticos”, más recientemente en varios de los formatos en tiempo real. Aunque en teoría, se puede detectar el DNA de una sola célula m icobacteriana después de la am plificación mediante PCR, en realidad se necesita más de una célula por la presencia de inhibidores de la PCR en las muestras clínicas. Por ejemplo, Yajko y cois, determinaron que 42 unidades formadoras de colonias (UFC) era el límite inferior de corte en las muestras directas de esputo con su ensayo, lo cual correspon­ día a ocho UFC que fueron aisladas en cultivo de muestras pro­ cesadas con /V-acetil-L-cisteína (NALC)-NaOH.401 Otras técnicas de biología molecular, como la secuenciación de ácidos nucleicos, la hibridación inversa y el análisis de micromatrices, también han sido satifactorias para la caracteri­ zación rápida de las micobacterias que crecen en cultivo. Estas técnicas tendrán un efecto considerable sobre la forma como se practicará la micobacteriología en el futuro y se explican mejor más adelante. Uso de instrumentos automatizados

El tiempo transcurrido hasta el aislamiento de micobacterias en el esputo y otras muestras, incluidos los hemocultivos, se ha acortado hasta 2 a 3 semanas con el uso de los sistemas auto­ matizados.236,287 BACTEC 460® (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD), BACTEC Mycobacteria Growth Indicator Tube® (MGIT) 960 (BD Diagnostic) y ESP Íl® (Trek Diagnostic Systems, Westlake, OH) también han sido autorizados por la FDA para la realización de pruebas rápidas de sensibilidad a los antituberculosos de primera línea.128-396 Un aumento del cre­ cimiento, según lo determina el instrumento, en el frasco ampo­ lla que contiene el antibiótico dentro de los 3 a 5 días de la ino­ culación con la cepa de prueba indica resistencia al fármaco.

Tendencias en el diagnóstico de laboratorio de la tuberculosis

Uso de medios de cultivo en caldo

En respuesta a estas situaciones clínicas y epidemiológicas alteradas, han surgido varios cambios en las prácticas de labo­ ratorio en los últimos años. Se han introducido varias técnicas nuevas dirigidas a la detección de M. tuberculosis directamente en muestras clínicas mediante la amplificación de ácidos nuclei­ cos, el aislamiento más eficaz de micobacterias en las muestras clínicas, la rápida identificación de las micobacterias y la deter­ minación de los perfiles de sensibilidad a los fármacos. El siguiente es un resumen de varios de estos métodos nuevos:

La tasa de aislamiento y el tiempo hasta la positividad de las micobacterias de las muestras clínicas también se han mejora­ do mediante el uso de los medios de cultivo en caldo. Los sis­ temas de cultivo con base de caldo para las micobacterias incluyen los sistemas MGIT® manual y automatizado (BD Diagnostic), que utilizan caldo 7H9 y un sensor fluorescente sensible al O, para indicar el crecimiento microbiano, el frasco MB/BacT® (BioMérieux, Durham, NC), el frasco lítico BAC­ TEC MYCO/F® (BD Diagnostic), el sistema Septi-Chek manual® (BD Diagnostic) y el ESP Culture System® (Trek Diagnostic).

Uso de técnicas moleculares

Los métodos moleculares han cambiado de manera signifi­ cativa el tiempo que requiere la identificación en los laborato­ rios que los utilizan (véanse los detalles más adelante). Esto comenzó con el uso de las sondas de ácidos nucleicos comer­ ciales para la identificación de miembros del complejo M.

Inoculación de muestras clínicas en medios de cultivo con base de agar

La inoculación de un medio de cultivo transparente con base de agar, como Middlebrook 7H10 o 7H 11® permite la observa­ ción microscópica para microcolonias. Se puede observar con

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Micobacterias

el microscopio el crecimiento de las colonias tan sólo 5 a 7 días después de la inoculación de muestras con frotis positivos. Se ha utilizado también la morfología de las microcolonias reali­ zando identificaciones presuntivas tempranas de M. tuberculo­ sis y miembros del MA1. Esta información a menudo propor­ ciona una guía útil para otras investigaciones del aislamiento, sobre todo para seleccionar el ensayo de sonda de ácidos nucleicos apropiado. Uso de /7-nitro-acetilamino-hidroxipropiofenona (NAP)

La NAP es un antibiótico que inhibe selectivamente el creci­ miento de M. tuberculosis en los medios de cultivo en caldo. Después de la inoculación de un frasco ampolla con cultivo BACTEC que contiene NAP y el microorganismo de prueba, cualquier elevación en el índice de crecimiento, que indica resistencia a la NAP, después de 3 días de incubación incluye la posibilidad de M. tuberculosis. Aplicaciones de la cromatografía gas-líquido y la cromatografía líquida de alto rendimiento

La composición de ácidos micólicos de la pared celular y de los ácidos grasos que contiene, determinada por cromatografía de gas-líquido y cromatografía líquida de alto rendimiento, de­ fine perfiles útiles para la identificación rápida de especies de micobacterias aisladas en las muestras clínicas. Uso de tubos de hemocultivo con sistema de lisis-centrifugación

El aislamiento de micobacterias en las muestras de sangre periférica y médula ósea puede mejorarse liberando las micobacterias del medio intracelular al caldo de hemocultivo. lo que aumenta la tasa de aislamiento y reduce el tiempo necesario. Por lo tanto, se utiliza una combinación de técnicas microbiológicas tradicionales mejoradas y aplicaciones técnicas de diagnóstico molecular como herramienta para la rápida detec­ ción e identificación de las micobacterias en las muestras clíni­ cas y en los cultivos positivos. La identificación más rápida de las micobacterias permite un tratamiento antimicobacteriano dirigido e intensivo, que ayuda a evitar la aparición de cepas resistentes a los fármacos y tiene implicaciones en relación con la transmisión interhumana de la tuberculosis.262 En este capí­ tulo se explicarán con más detalle los nuevos enfoques señala­ dos antes.

Laboratorio clínico Optimización de la detección y la identificación de micobacterias

Salfinger señala lo que denomina un programa de “ejecución rápida”, en referencia a la organización global de los laborato­ rios clínicos y a la necesidad de proporcionar más servicios de laboratorio.298,300 Tres objetivos primarios del programa de eje­ cución rápida son: 1. Utilizar las técnicas más rápidas y confiables a fin de lograr los tiempos de procesamiento más cortos posibles para la identificación del microorganismo y las pruebas de sensibi­ lidad. 2. Centralizar estos servicios para controlar costos. 3. Limitar al menor tiempo posible el confinamiento de los pacientes con infecciones no producidas por M. tuberculo­ sis en habitaciones para aislamiento respiratorio.

La práctica tradicional de esperar que aparezcan las colo­ nias bacterianas en agar sólido, realizar las identificaciones sin técnicas de sondas y efectuar las pruebas de sensibilidad a los antibióticos sólo en medios sólidos lleva demasiado tiempo. Las decisiones referentes a los procedimientos y las pruebas que se realizarán en el laboratorio del lugar y que serán envia­ das a un laboratorio de referencia calificado deben determi­ narse dentro de cada comunidad de asistencia de la práctica. En muchos lugares, las actividades del laboratorio local pue­ den estar limitadas a los procedimientos rápidos de cambio de rumbo, como examinar frotis para microorganismos ácidoalcohol resistentes o la inoculación y la evaluación provisional de los cultivos. Otros procedimientos, que nuevamente deben ser determinados por el personal sanitario, pueden realizarse mejor en el laboratorio de referencia regional. La mayoría de las técnicas para identificaciones directas, como la cromato­ grafía líquida de alto rendimiento, el análisis de sondas de áci­ dos nucleicos, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los ensayos de endonucleasas de restricción y secuenciación del DNA, estarán dentro de la competencia del laboratorio de referencia, pero se encuentran cada vez más ampliamente dis­ ponibles. Se debe establecer un equipo de trabajadores sanita­ rios, que incluya médicos, especialistas de laboratorio y per­ sonal de apoyo para determinar los enfoques diagnósticos que deben coordinarse en el programa de rastreo rápido para alcanzar los objetivos. El diagnóstico temprano, el tratamien­ to adecuado y rápido, y el aislamiento respiratorio son los principales ingredientes para lograr la curación del paciente, evitar el surgimiento de cepas resistentes e interrumpir la transmisión de una persona a otra. Seguridad en el laboratorio

La manipulación incorrecta del material biológico infeccio­ so como muestras clínicas coloca al personal de laboratorio en riesgo de infección. En los Estados Unidos existe una preocu­ pación creciente por la bioseguridad en relación con la mani­ pulación de muestras potencialmente infecciosas y cultivos en los laboratorios de microbiología clínica. En la actualidad, en muchos casos se recomiendan los estándares estrictos de con­ trol de seguridad que se conforman al estándar de bioseguridad de nivel 3, sobre todo cuando se trabaja con aislamientos de cultivos. Específicamente, se requieren prácticas de bioseguri­ dad de nivel 3 para los laboratorios en los cuales se realizan actividades niveles II y III de la American Thoracic Society, que en el caso de las micobacterias son la propagación y la manipulación de cultivos para M. tuberculosis o M. bovis. Los siguientes son los requisitos de bioseguridad propuestos por el Department of Heath and Human Services de los Estados Unidos (Biosafety in Microbiological and Biomedical Labora­ tories, 3a edición, 1993). El ámbito de bioseguridad de nivel 3, que incluye el gabi­ nete de seguridad biológica y la centrífuga, debe tener paredes y superficies de trabajo impermeables, flujo de aire direccional (con la presión de aire más baja en el laboratorio) y un cie­ rre con doble puerta para evitar el flujo retrógrado del aire. El aire proveniente del ámbito de bioseguridad debe ser ventila­ do a través de filtros particulados de alta eficacia para aire directamente hacia el exterior. Los laboratorios y las capuchas deben estar equipados con medidores para controlar la presión de aire. Como el equipamiento y los brazos del trabajador colocados en un gabinete para seguridad biológica pueden interrumpir el flujo de aire laminar y desviar el aire contaminado hacia afue­

R ecolección de las m uestras

ra, quienes trabajan en ese gabinete y en el ámbito de biosegu­ ridad nivel 3 deben utilizar un equipo de protección personal, que incluya una máscara con filtros. Se debe evaluar todos los años al personal para verificar que la máscara se adapta correc­ tamente. Se deben utilizar batas descartables sobre las prendas de trabajo (no se deben utilizar vestimentas de calle en el ámbi­ to de bioseguridad de nivel 3 porque se pueden contaminar), junto con guantes, gorras y protección del calzado para com­ pletar los accesorios de protección personal, ya que pueden ocurrir salpicaduras accidentales. Una vez que se completa el trabajo se deben retirar las vestimentas y colocarlas en una bolsa para su tratamiento en el autoclave. El director debe determinar el grado en que se requieren renovaciones en el ámbito del laboratorio. Estas pueden costar muchos miles de dólares y es posible que no sean rentables en ciertos lugares. En estos casos, hay que considerar la decisión de si sería más eficaz realizar los cultivos para micobacterias en otras instalaciones, como un laboratorio de referencia que pueda cumplir con los estándares recomendados.

Recolección de las muestras Las micobacterias pueden ser aisladas en distintas muestras clínicas, como las de las vías altas (esputo, lavados bronquia­ les, lavado broncoalveolar y biopsias bronquiales), orina, heces, sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR); biopsias titulares y aspiraciones profundas con aguja de casi cualquier tejido u órgano.'84 Las muestras que pueden contener flora bacteriana normal pueden procesarse enseguida después de la recolección para reducir al mínimo el grado de sobrecrecimiento con con­ taminantes. Muestras respiratorias

Las muestras de esputo recogidas con expectoración o con nebulización ultrasónica se obtienen mejor poco después de que el paciente se despierta por la mañana, cuando la concen­ tración de las micobacterias es máxima. En el pasado, se nece­ sitaban muestras de esputo de 24 horas para tener una concen­ tración suficiente de micobacterias para aumentar al máximo el aislamiento; sin embargo, los procedimientos de extracción actuales son más eficientes y basta una muestra más pequeña para lograr el mismo grado de aislamiento. No se recomiendan las recolecciones de 24 horas porque la muestra que contiene la máxima concentración de micobacterias estará proporcional­ mente diluida por las muestras de bajo rendimiento ulteriores y las posibilidades de un hipercrecimiento de bacterias y de hon­ gos durante el proceso de recolección prolongada aumentan en forma significativa.166 La liberación irregular e intermitente de micobacterias en la luz bronquial desde las úlceras mucosas o las cavidades loculadas a menudo conduce a un patrón variable de aisla­ miento desde las muestras respiratorias. Los cultivos obteni­ dos de pacientes con tuberculosis pulm onar o renal, en parti­ cular, pueden ser positivos un día pero negativos el siguiente; por lo tanto, se debe recoger un mínimo de tres esputos de las primeras horas de la mañana o cinco muestras de orina de las primeras horas de la mañana en períodos sucesivos de 24 horas para aumentar al máximo la posibilidad de aislamiento de micobacterias. Todas las muestras deben ser transportadas rápidamente al laboratorio y refrigeradas si se difiere el pro­ cesamiento.

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Hemocultivos

Se pueden utilizar varios métodos para el aislamiento de micobacterias en los hemocultivos. Berlin y cois, comunicaron sobre el uso de un sistema bifásico que utiliza albúmina-ácido oleico-7Hl I modificado como fase de agar e infusión de cerebro y corazón como fase de caldo. Se obtuvieron cultivos positivos para MAI tan sólo a los 6 a 8 días.20 Sin embargo, Agy y cois, informaron que sólo el 43,8% de los hemocultivos de pacientes con hemocultivos positivos fueron aislados utilizando un sistema bifásico similar.3 El uso del sistema de hemocuitivo por lisis-centrifugación (Isolator®; Wampole Laboratories, Cranbury, NJ) ha aumentado el rendimiento y acortado el tiempo hasta el aisla­ miento de micobacterias en los hemocultivos.104212 El tubo de lisis-centrífuga contiene un anticoagulante y un agente que lisa para lograr la rotura de eritrocitos y neutrófilos. Así, se liberan las micobacterias intracelulares en el medio de caldo, enriqueci­ do además por la lisis de los eritrocitos. Cada tubo tiene 5 mL de sangre y la lisis celular puede aumentarse inviniendo con suavi­ dad el tubo varias veces inmediatamente después de agregar la muestra. Luego de la centrifugación del tubo a 3 000 g durante 20 a 30 minutos, se descarta el líquido que queda y se dividen 1,6 mL de sedimento en alícuotas de 0,2 mL para su transferencia a los medios de cultivo apropiados. Uno de los primeros sistemas de hemocultivos semiautomatizados para micobacterias fue el BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD); la detección de frascos positivos se basó sobre la detección del l4CO, radiactivo liberado en el frasco de hemocultivo a partir del metabolismo del ácido l-[14C]-palmítico que fue incluido en el medio de caldo (Middlebrook). Se ha propuesto la teoría de que el reactivo de lisis-anticoagulante (LAR) contenido en el tubo Isolator® puede ser tóxico para el MAI cuando se transfiere el producto de la lisis a un sis­ tema líquido cenado, al contrario del subcultivo en medios sólidos, para el cual el componente puede difundirse en el agar o evaporarse en el espacio aéreo suprayacente. Whittier y cois, llevaron a cabo un estudio de aislamiento en Isolator en el cual el aislamiento de MAI de medios bifásicos Septic-Check AFB fue superior a su aislamiento en los frascos BACTEC 12B ino­ culados en paralelo.38311 Sin embargo, Doem y Westerling observaron que el efecto inhibidor de LAR en los frascos de BACTEC 12B se reduce si se utiliza un inóculo pequeño (0,2 mL) del producto de la lisis del Isolator.77-78 Sin embargo, Wasislauskas y M onell contraargumentan que el uso de un inóculo más pequeño puede com ­ prometer el aislamiento en las infecciones leves.372 Tal vez si se va a utilizar un sistema líquido cenado para la transferencia de muestras de sangre con lisis, centrifugadas y procesadas, puede estar indicada la inoculación de medios sólidos en paralelo, sobre todo en los pacientes con SIDA, en los cuales el aisla­ miento de microorganismos MAI es altamente probable. El problema se elude en muchos laboratorios utilizando los frascos para hemocuitivo lítico, lo que evita posibles inconve­ nientes asociados con el sistema Isolator. En un estudio de 32 casos de sepsis por micobacterias, se detectó crecimiento en 30 de los frascos ampollas 13A (93,7%), en 27 placas de agar de Middlebrook 7H11 inoculadas con sedimento obtenido del tubo Isolator (84,4%) y en 26 frascos BACTEC 12B inocula­ dos con el sedimento de Isolator (81,2%).3 Se detectó creci­ miento en el frasco 13B y en los frascos 12B a los 14,2 y 13,7 días, respectivamente, en comparación con 20,8 días para las placas M7H11. Este estudio llegó a la conclusión de que el frasco BACTEC 13A es igual o mejor que el sistema Isolator, tanto en la tasa de aislamiento de micobacterias de los hemo-

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C A P ÍT U LO 19 Micobacterias

cultivos como en el tiempo hasta él, conclusión que también han alcanzado otras investigaciones.390 Strand y cois, observa­ ron que el frasco BACTEC 13A era comparable con el proce­ dimiento en agar de lisis-centrifugación/7H 11 en la tasa de ais­ lamiento (96,9% y 98,5%, respectivamente) y el tiempo de detección de 64 hemocultivos positivos para M. avium y uno para M. tuberculosis,337 Se presentarán en este capítulo los detalles de los frascos líticos para hemocultivos y sus aplica­ ciones en el laboratorio de micobacteriología. Existen varias opciones comerciales más nuevas para el cul­ tivo de sangre para micobacterias, algunas de las cuales contie­ nen agentes líticos que ayudan a liberar las micobacterias de los fagocitos. Estas opciones incluyen el ESP Culture System II (Trek Diagnostics), el sistema lítico BACTEC MYCO/F (BD Diagnostic Systems) y el frasco MB/BacT (BioMérieux) y se explican a continuación. Cualquiera que sea el sistema de hemocultivos que se utili­ ce, es posible que la política de obtener por lo menos dos con­ juntos de cultivos no sea costo-eficaz para los pacientes en los cuales se sospecha una micobacteriemia.334 De un total de 1 047 hemocultivos para micobacterias obtenidos en 273 pacientes con MAI diseminado, Stone y cois, observaron que sólo uno de los dos frascos era positivo en sólo cuatro de 98 cultivos posi­ tivos (4%).334 En el 85%, ambos frascos fueron negativos y en el 11%, ambos frascos fueron positivos. Por lo tanto, como rutina recomiendan obtener sólo un único hemocultivo para el diagnóstico de septicemia por micobacterias y ordenar otro cultivo sólo si existe una prueba clínica firme de infección dise­ minada. Se ha destacado la importancia de obtener hemoculti­ vos en los pacientes en los que se sospecha tuberculosis.29 El 14% de los pacientes con tuberculosis diseminada tuvieron hemocultivos positivos (el consumo de drogas intravenosas y el alcoholismo crónico fueron factores de riesgo); en el pasado, hasta el 26-42% de los pacientes con SIDA tuvieron infeccio­ nes por micobacterias en algún momento durante el curso de su enfermedad y en el 33%, los hemocultivos positivos propor­ cionaron el aislamiento inicial del microorganismo. Por lo tanto, los hemocultivos positivos para bacilos ácido-alcohol resistentes proporcionan un procedimiento no invasor para diagnosticar una enfermedad diseminada. Muestras de heces

En ciertos pacientes con SIDA, la concentración de micobacterias, sobre todo MAI, puede ser lo suficientemente alta en el colon como para ser aislada en cultivo. Kiehn y cois, sugi­ rieron un procedimiento para procesar muestras de heces para cultivo de micobacterias;170 • Las muestras se recogen en un recipiente limpio (no nece­ sariamente estéril) con una tapa bien ajustada, como para los cultivos bacterianos de rutina. • Se prepara en primer lugar un frotis directo de una pequeña cantidad de la muestra y se lo tiñe para bacilos ácido-alcohol resistentes, utilizando las técnicas de carbolfucsina de Ziehl-Neelsen o de Kinyoun o el método de fluorescencia de rodamina-auramina. • Si los frotis son negativos para bacilos ácido-alcohol resis­ tentes, la muestra no se procesa más. • Si se observan bacilos ácido-alcohol resistentes, se suspen­ de 1 g de heces en 5 mL de caldo de Middlebrook 7H9 o equivalente y se lo somete a la misma descontaminacióndigestión con NaOH como se utilizó para las muestras de esputo, lo que se describirá más adelante.

• La contaminación del cultivo con bacterias intestinales está significativamente disminuida durante el procedimiento de digestión. Se podría plantear la duda acerca de la importancia de la detección de micobacteriás en muestras de heces. En un estu­ dio de 89 pacientes con enteropatía relacionada con SIDA rea­ lizado en Lusaka, Zambia, Conlon y cois, observaron que el síntoma de la diarrea crónica no se relacionaba con la presen­ cia de micobacterias en las muestras de heces.54 Llegaron a la conclusión de que las micobacterias desempeñan un papel sin importancia en la patogenia de la enteropatía en los pacientes con SIDA. Como alternativa, Chin y cois, observaron que el aislamiento de los microorganismos MAI de muestras de heces es predictivo de enfermedad diseminada.44 Se puede aplicar la técnica descrita antes; el hecho de que el procedimiento deba estar disponible en un laboratorio dado debe ser una decisión individual. Otras muestras “estériles”

Las muestras remitidas para cultivo de bacilos ácido-alcohol resistentes que normalmente son estériles, como líquido cefa­ lorraquídeo, líquido sinovial y otros líquidos corporales, no necesitan ser descontaminadas antes del cultivo. El procesa­ miento puede comenzar con la centrifugación, como se descri­ be luego y se transfiere una pequeña alícuota del sedimento a un medio de cultivo apropiado. Se pueden agregar directamen­ te muestras de líquidos de bajo volumen a alrededor de 10 mL de caldo 7H9 o 7H 11 que se incuban directamente. En general, las muestras de orina pueden procesarse sin descontaminación y centrifugarse, y se utiliza para el cultivo una porción del sedi­ mento, como ya se describió. Se prefiere la primera muestra de la mañana más que una recolección de 24 horas. La práctica de algunos laboratorios es establecer cultivos bacterianos antes de cultivar para micobacterias a fin de determinar si las muestras requieren descontaminación. Además, se pueden agregar 10 o 15 mL de cloruro de calcio al 10% a la muestra de orina hasta que se forma un precipitado para eliminar los factores inhibi­ dores. Luego de la centrifugación, se cultiva una porción del sedimento, como ya se describió. Los tejidos y el material de la biopsia con aguja deben colocarse en una pequeña cantidad de caldo 7H9 o 7H11 como medio de sostén. Según el tamaño y la naturaleza del material obtenido, se coloca la muestra en una pequeña cantidad de caldo con un mortero y una mano de mor­ tero y se transfieren alícuotas de la suspensión a los medios de cultivo apropiados. No existe casi ninguna indicación para obtener material para el cultivo de micobacterias con un hisopo porque la natu­ raleza hidrófoba de la pared celular de las bacterias que con­ tiene lípidos inhibe la transferencia de los microorganismos desde el hisopo hasta el medio de cultivo acuoso. Si se recibe un hisopo en el laboratorio, se debe colocar directamente el extremo sobre la superficie del medio de cultivo o en un tubo que contenga unos 5 mL de caldo 7H9 y se lo incuba durante 4 a 8 semanas. Si hay micobacterias, se las puede hallar for­ mando colonias en las fibras del hisopo en la unión de los medios de cultivo. Como alternativa, el director del laborato­ rio puede considerar que un hisopo es una muestra inapropiada y rechazarla para el cultivo de micobacterias. Las decisiones de no procesar estas muestras de bajo o ningún rendimiento pueden ahorrar al hospital una cantidad considerable de dinero con el tiempo. Es necesario educar al personal m édi­ co acerca del razonam iento de estas decisiones y debe ser

P rocedim ientos de laboratorio para el aislam iento y la identificación de las m icobacterias

notificado antes de im plem entar protocolos de rechazos de las muestras.

Procedimientos de laboratorio para el aislamiento y la identificación de las micobacterias El enfoque clásico de laboratorio del diagnóstico de las infecciones por micobacterias comprende la caracterización fenotípica de las colonias que crecen en el m edio de Lowenstein-Jensen. El empleo de una serie de pruebas bioquí­ micas lleva demasiado tiempo para las aplicaciones actuales. La figura 19-1 es un algoritmo que refleja la práctica del pro­ cesamiento de las muestras de esputo en muchos laboratorios. Otras muestras pueden requerir tratamiento alternativo. La recomendación actual es utilizar una combinación de ensayos fenotípicos y moleculares para la identificación rápida de las micobacterias, sobre todo, para la de M. tuberculosis. Los frotis deben prepararse con el material remitido para la tinción ácido-alcohol resistente. La mayoría de los laboratorios utilizan la tinción de auramina O para el examen de selección y el seguimiento con una tinción con base de carbolfucsina i Ziehl-Neelsen o Kinyoun) para la confirmación de los resulta­ dos positivos. La mayoría de los laboratorios tratan las muestras de esputo con NALC-NaOH, un procedimiento de descontaminación-digestión para concentrar cualquier célula micobacteriana que pueda estar presente. En la actualidad, se recomienda inocular todas las muestras de esputo tratadas y otras muestras en medios de cultivo en caldo además de los medios de Lowen­ stein-Jensen o agar de Middlebrook. Las elecciones de los cal­ dos de cultivo incluyen los frascos BACTEC 12A en los labo­ ratorios donde se dispone de un instrumento 460 BACTEC o la inoculación del Septi-Chek® (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD) o el sistema de cultivo MGIT® (BD Diagnostic). Si cual­ quiera de estos cultivos muestra indicios de proliferación, se deben realizar estudios con sondas de ácidos nucleicos tan pronto como la concentración de los microorganismos exceda el umbral de sensibilidad para el ensayo. En los laboratorios que utilizan el sistema BACTEC, se debe inocular un frasco de ÑAP para descartar M. tuberculosis. La observación de microcolonias en agar de Middlebrook puede servir como guía para saber cuál es la sonda que se debe utilizar: si se observa un patrón de entretejido con formación de cordones, se debe realizar una sonda para M. tuberculosis; si las colonias son planas y transparentes, está indicada la sonda para MAI. Metchock y Diem sugieren que si los frotis son 3+ o 4+ y se detecta crecimiento dentro de los 5 días, se debe rea­ lizar una sonda para M. tuberculosis ,225 Para los frotis 1+ o 2+ que crecen en cultivo después de 7 días, se debe realizar la sonda MAI. Si todas las sondas son negativas y se considera que el aislamiento tiene importancia clínica, se deben efectuar estudios bioquímicos convencionales utilizando las colonias que crecen en el medio de Lowenstein-Jensen si fuera positivo. Se deben realizar estudios de sensibilidad in vitro a los fárma­ cos si fuera necesario. Al seguir el algoritmo que se muestra en la figura 19-1, puede ser posible la identificación de M. tuberculosis, MAI, M. kansasii y M. gordonae en los casos con frotis positivo en 2 a 3 semanas. Puede ser necesaria otra semana o dos para el ais­ lamiento y la identificación de estas cuatro especies en los casos con frotis negativo. Se requiere otra semana una vez que el cultivo en caldo se vuelve positivo para los resultados de las pruebas de sensibilidad contra los cuatro fármacos de primera línea: isoniazida, ácido /?-aminosalicílico, etambutol y estrep­

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tomicina. Se necesitarán otras 2 a 4 semanas para identificar las especies de micobacterias distintas de las que se acaba de men­ cionar, según los resultados de las pruebas bioquímicas, y para determinar los perfiles de los fármacos con el uso de los méto­ dos de crecimiento en agar convencionales. Preparación de las muestras

La alta concentración de lípidos en la pared celular de la ma­ yoría de las micobacterias las vuelve más resistentes a la des­ trucción por las soluciones ácidas y alcalinas fuertes que otras bacterias que pueden estar presentes en la muestra. En conse­ cuencia, las muestras que probablemente contengan una flora bacteriana mixta son tratadas con un agente descontaminante para reducir el sobrecrecimiento bacteriano indeseable y licuar el moco. Después del tratamiento con el descontaminante durante un período cuidadosamente controlado, el ácido o el álcali utilizado se neutraliza y la mezcla se centrifuga a alta velocidad para concentrar las micobacterias. Digestión y descontaminación

Algunas soluciones descontaminantes, como hidróxido de sodio al 6%, son tan fuertes que pueden destruir o dañar grave­ mente a las micobacterias hasta el punto en que crecen sólo en forma muy lenta o no crecen en absoluto. La reducción de la potencia de la solución para descontaminación ácida o alcali­ na ha conducido a una mejoría en el aislamiento de las micobacterias por cultivo, pero a menudo al precio del sobrecreci­ miento del cultivo por contaminantes. La exposición de las muestras a hidróxido de sodio fuerte, ácido oxálico al 5% u otros agentes debe cronometrarse con cuidado para evitar una lesión excesiva de las paredes de las micobacterias por el agen­ te químico. El empleo de descontaminantes suaves, como fosfato trisódico solo o combinado con cloruro de benzalconio (Zephiran; Winthrop Laboratories, Nueva York, NY), es popular en algu­ nos laboratorios. Las muestras que contienen gran cantidad de M. tuberculosis pueden resistir la acción de estos agentes hasta durante toda la noche y no es necesario un cronometrado cui­ dadoso de la exposición.75 Las muestras tratadas con TSPZephiran deben inocularse en un medio de cultivo con base de huevo para neutralizar la inhibición del crecimiento del Zephiran. Si se utilizan medios con base de agar, la neutraliza­ ción del Zephiran se puede lograr agregando lecitina. En el recuadro 19-1 se muestra el procedimiento de digestión-des­ contaminación convencional. En general, se utiliza HC1 o NaOH concentrados para neu­ tralizar los agentes descontaminantes. Debido a la potencia de estas soluciones, a veces es difícil lograr un punto final neutro. Una ventaja del procedimiento NALC es que el agregado de un volumen grande de buffer de fosfato hace menos probable los desplazamientos fuertes del pH. El agregado de buffer sirve para “lavar” la muestra, diluye las sustancias tóxicas y reduce la densidad de la muestra de modo que la centrifugación es más eficaz en la sedimentación de los microorganismos. En el cuadro 19-1 se enumeran otros agentes para desconta­ minar y concentrar muestras, junto con comentarios acerca de su uso. El micobacteriólogo debe seleccionar los agentes que utilizará en su laboratorio sobre la base de la cantidad y los tipos de muestras recibidas y el tiempo y el personal técnico disponible para procesarlas. Como se menciona en el cuadro 19-1, el ditiotreitol es también un agente mucolítico eficaz cuando se lo utiliza con NaOH al 2%. También se ha recomen-

1024

C A P ÍT U LO 19 Micobacterias

ESPUTO PARA E STU D IO S DE BAC ILO S Á C ID O -A L C O H O L R ES IS TEN TE S

Frasco de NAP (usuarios de BACTEC)

T índice de crecimiento +

1 M. tuberculosis presuntivo

t índice de crecimiento -

Nido de aves con formación de cordones

Sonda de áci­ dos nucleicos

Pruebas bioquímicas

Colonias delgadas y planas

Observar microcolonias

Nido de aves sin formación de cordones

Colonias lisas y amarillas

1 Realizar pruebas bioquímicas

Otro patrón

r M. tuberculosis presuntivo. Confirmar con sonda para tuberculosis o pruebas bioquímicas

Complejo M. avium presuntivo. Confirmar con sonda o pruebas bioquímicas

M. kansasii presuntivo. Confirmar con sonda o pruebas bioquímicas

M. gordonae presuntivo. Confirmar con sonda o pruebas bioquímicas

.«

Realizar pruebas bioquímicas

Figura 19-1 Algoritm o que refleja la práctica del procesamiento de las muestras de esputo.

dado el cloruro de cetilpiridio para la descontaminación de las muestras, sobre todo de las enviadas desde sitios remotos de recolección.321 El procedimiento de digestión-descontaminación se describe mejor en el protocolo 19-1. Ratnam y cois, describieron un procedimiento simplificado con acetilcisteína-alcalina que combina los pasos de contami­ nación y descontaminación y la inoculación de la muestra en medios de cultivo selectivos (que contienen antibióticos, que se describirán más adelante).278 Se mezclan las muestras con solu­ ción de NALC-NaOH en un agitador vorticial y, sin nada de espera ni agregado de buffer ni agua a las muestras digeridas, se centrifuga la muestra a 3 000 g durante 15 minutos. Se decanta el sobrenadante y se suspende el sedimento en 1 a 2 mL de buffer de fosfato (0,067 M, pH 5,3). La concentración de NaOH en la solución puede estar reducida desde el 2% habi­ tual hasta el 1,5% si fuera necesario o factible. El método modificado elimina dos pasos: el tiempo de des­ contaminación de 15 a 20 minutos luego de la digestión de las

muestras y el agregado de buffer de fosfato o agua. Según estos autores,278 la máxima destrucción de micobacterias ocurre durante los primeros minutos de exposición al líquido de diges­ tión de los álcalis y se pueden perder hasta 10J micobacterias, según la especie. El método modificado elimina la posibilidad de que las muestras goteen desde la tapa o discurran por la superficie externa del tubo cuando se agrega diluyente después de la mezcla en el agitador vorticial y reduce la posibilidad de contaminación cruzada. Por lo tanto, los autores observaron que el método modificado era más simple, más rápido y más seguro que el procedimiento original y también es probable que la menor manipulación reduzca la posibilidad de contamina­ ción cruzada en el procesamiento secuencial de las muestras. La eliminación del paso de digestión inicial no tiene ningún efecto adverso sobre el aislamiento de micobacterias. De hecho, a veces, el agregado de buffer de fosfato o de agua con­ duce a un aislamiento más bajo, debido a una mayor disolución de la materia particulada en las muestras. La tolerancia a los

P rocedim ientos de laboratorio para el aislam iento y la identificación de las m icobacterias

Recuadro 19-1

1025

Proced im iento de dig estió n -d esco n tam in ació n están d ar d e sarro llad o por K ubica y cois, en los C enters for D isease C ontrol and P reven tio n 190

1. Preparar el digestivo de acetilcisteína-álcali de esta forma: com binar 50 mL de citrato trisódico al 2,94% -3 H ,0 (0,1 M ) con 50 m L de NaOH al 4%. Agregar a esta solución 0,5 g de /V-acetil-L-cisteína (NALC) en polvo, inm ediatam ente antes del uso. El NaOH (que se convierte en una solución al 2% después de m ezclar partes iguales con la muestra) sirve como agente descontaminante. En ocasiones, la concentración de NaO H debe aum entarse hasta el 3% (solución original al 6%) cuando el clim a es cálido o al tratar muestras provenientes de pacientes con grandes cavidades pulm onares asociadas con contam inación bacteriana persistente. El NALC es un m ucolítico sin actividad bactericida que licúa el moco al dividir los enlaces disulfuro. Las micobacterias se liberan cuando el moco se licúa, lo que las vuelve fáciles de concentrar m ediante centrifugación a alta velocidad. 2. Utilizar tubos de centrífuga de plástico de 50 m L con tapas bien ajustadas para el procesam iento de todas las muestras. Agregar la mezcla digestiva de NALC en un volumen igual al de la muestra. En condiciones típicas, se utiliza un volum en de 10 a 15 mL de la muestra. A justar la tapa a rosca. 3. Hom ogeneizar la mezcla con un m ezclador vorticial durante 15 a 20 segundos o hasta que esté bien m ezclada y perm itir que sedimente a tem peratura ambiente durante 15 a 20 m inutos, sacudiendo los tubos periódicamente. Se debe prestar la correcta atención de m odo que el tiem po de digestión no exceda 20 m inutos, porque las m uestras “sobretratadas” conducen a m enos cultivos positivos. 4. Después del paso de digestión-descontam inación, agregar buffer fosfato, de pH 6,8 (se prefiere sobre el agua estéril), hasta el anillo de la parte superior en el tubo. M ezclar bien. El buffer fosfato vuelve menos probables los desplazam ientos fuertes del pH y sirve tam bién para “lavar” la muestra, diluir y neutralizar las sustancias tóxicas, y reducir la densidad de la muestra de m odo que la centrifugación sea más eficaz en la sedimentación de los m icroor­ ganismos. 5. Concentrar la m uestra por centrifugación a 2 000-3 000 g durante 15 a 20 minutos. Se puede utilizar una centrífuga refrigerada a velocidades más altas para aum entar el rendim iento de las m icobacterias. 6. Después de la centrifugación, decantar todo el sobrenadante con cuidado en un receptáculo a prueba de salpicaduras que contenga un desinfectante fenólico. Secar la tapa del tubo con una torunda de algodón em bebida en fenol al 5%. Agregar una pequeña cantidad de buffer fosfato, pH 6,8 (1 a 2 mL) y volver a suspender el sedimento con una pipeta de Pasteur. Aunque se ha recom endado el agregado de una pequeña cantidad de albúmina sérica en el pasado, en la actualidad se evita porque aumenta las posibilidades de contam inación y de demora en el tiem po de detección. 7. Preparar frotis en portaobjetos lim pios para m icroscopios con la tinción de Ziehl-Neelsen (o Kinyoun) o de fluorocromo. Utilizar un palillo aplicador estéril o un ansa bacteriológica de 3 mm de diám etro calentada y extender una porción del sedimento sobre un área de 1 x 2 cm. Si la cantidad de sedi­ mento es muy pequeña, diferir los frotis hasta después del paso siguiente (agregado de albúmina). Agregar 1 m L de albúm ina bovina estéril al 0,2%. 8. Transferir una pequeña cantidad (0,2 a 0,4 mL) del concentrado a un medio de cultivo apropiado. La inoculación de una dilución 1 en 10 del concentra­ do en agua estéril hasta un segundo m edio de cultivo tam bién se realiza en algunos laboratorios. En general se utilizan las porciones inclinadas con tin­ ción de Low enstein-Jensen y las placas de agar de M iddlebrook 7H10 o 7 H 1 1.

álcalis no fue una característica constante entre las especies de micobacterias y las cepas evaluadas, y las especies de creci­ miento rápido fueron las más sensibles a un pH alto. Al reducir o eliminar el tiempo estándar de tratamiento de 15 a 20 minu­ tos o al disminuir la concentración de NaOH en la solución de

Cuadro 1 9-1

digestión del 2% habitual hasta 1,5% o 1%, se pueden superar fácilmente los efectos adversos. A causa de la aparición de cepas de M. tuberculosis resis­ tentes a los fármacos, pueden requerirse pruebas rápidas de laboratorio con el propósito de determinar el perfil de sensibi­

Agentes de uso frecuente para la descontaminación y concentración de muestras

AGENTE

C O M E N T A R IO S

W-acetil-L-cisteína más NaOH al 2%

Solución de descontam inación suave con agente m ucolítico NALC para liberar las micobacterias atrapa­ das en el moco. Lim itar la exposición a NaOH a 15 minutos

Ditiotreitol más NaOH al 2% a

Agente mucolítico m uy eficaz utilizado con N aOH al 2%. El nom bre com ercial del ditiotreitol es Sputolysin®. El reactivo es m ás caro que NALC. Lim itar la exposición a NaO H a 15 minutos

Fosfato trisódico, 13% m ás cloruro de benzalconio (Zephiran®)

Preferido por los laboratorios que no pueden controlar con cuidado el tiempo de exposición a la solución de descontam inación. El cloruro de benzalconio debe neutralizarse con lecitina y no inocularse en un medio de cultivo con base de huevo

NaOH, 4%

Solución de descontam inación y concentración tradicional. El tiem po de exposición debe controlarse con cuidado hasta no más de 15 m inutos. El NaOH al 4% logra acción m ucolítica para prom over la concen­ tración por centrifugación

Fosfato trisódico, 13%

Puede utilizarse para la descontam inación de muestras cuando el tiem po de exposición puede controlarse por completo. N o es tan eficaz com o la mezcla TSP-cloruro de benzalconio

Acido oxálico, 5%

M ás útil en el procesamiento de m uestras que contienen Pseudomonas aeruginosa com o contam inante

Cloruro de cetilpiridio, 1%, m ás NaCl al 2%b

Eficaz como solución de descontam inación para m uestras de esputo enviadas de centros clínicos am bula­ torios. Los bacilos tuberculosos han sobrevivido el tránsito de 8 días sin una pérdida im portante

a Véase Shah and Dye.3'3 b Véase Smithwick et al.32'

1026

C A P ÍT U L O 19

Micobacterias

lidad a los antibióticos para guiar el tratamiento temprano.98 Muchas de las pruebas nuevas para identificar los perfiles de re­ sistencia a los fármacos se basan sobre los procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos. En consecuencia, puede ser necesario almacenar muestras o concentrados digeridos para efectuar pruebas futuras en los lotes o para el envío hasta un laboratorio de referencia alejado. Puede ser aconsejable tratar estas muestras para que no sean infecciosas en las primeras eta­ pas del procesamiento a fin de reducir el peligro biológico para el personal del laboratorio. Williams y cois, observaron que la fijación con etanol de los sedimentos de esputo que contenían M. tuberculosis servía para volver a las bacterias no viables, mientras conservaba todavía la integridad del DNA genómico en un estado apropiado para la evaluación mediante técnicas de PCR.387 En sus estudios, diluyeron 0,25 mL de sedimentos de esputo con 0,583 mL de etanol al 100% para llevar la concen­ tración final del etanol hasta el 70%. Estos autores recomien­ dan el almacenaje de las muestras tratadas con etanol a 4 °C para diferir las pruebas de PCR. Zwadyk y cois, revisaron varios métodos para hacer que las muestras sean seguras para otras pruebas411 y explicaron los efectos destructivos y la pre­ servación del DNA genómico de las micobacterias en las mues­ tras después del tratamiento con diversos desinfectantes. También introdujeron la técnica de calentar las muestras a 100 °C durante 30 minutos en un baño de agua hirviendo o en una estufa con circulación forzada de aire, tanto con micobacterias muertas como Usadas, lo que libera fragmentos cortos de DNA apropiados para la amplificación. Centrifugación

Rickman y Moyer han llamado la atención sobre la impor­ tancia de controlar con cuidado la fuerza centrífuga en el aisla­ miento de las micobacterias de las muestras clínicas, sobre todo en la correlación de los frotis positivos con los cultivos positivos.284 El centro de su estudio fue comprender las carac­ terísticas físicas singulares que confieren a las micobacterias el alto contenido de lípidos de la pared celular (de hasta un 30% del peso seco). El Iípido tiene el efecto de disminuir mucho la densidad de los microorganismos. Para que la sedimentación del microorganismo sea máxima durante la centrifugación de la muestra, la densidad del líquido de suspensión debe ser míni­ ma y la fuerza centrífuga que se aplica a la muestra debe ser la más alta posible. Se observó una mejoría en el aislamiento de las micobacterias por cultivo a medida que se aumentó la fuer­ za centrífuga relativa (FCR) desde 1 260 hasta 3 000 g (cuadro 19-2).284 Cuando se aumentó la FCR hasta 3 800 g, se observó un aumento de dos veces en la correlación de los frotis positi­ vos con los cultivos positivos del 40% al 82%, o un aumento mayor de tres veces de la correlación cuando la FCR fue sólo de 1 260 g. La evaluación ulterior para el aislamiento de micobacterias de las muestras de esputo sembradas con concentraciones conocidas de microorganismos luego de la centrifugación con­ firmó que la tasa de aislamiento aumenta con el tiempo y la velocidad de centrifugación.277 Sin embargo, las tasas de aisla­ miento en estas muestras experimentales no fueron significati­ vamente más bajas cuando se utilizó una FCR de 2 074 g durante 20 minutos (67-71%) en comparación con las tasas de aislamiento en las FCR de 3 005 g y 3 895 g durante 15 minu­ tos (76-80%). La sensibilidad de los frotis ácido-alcohol resis­ tentes para 25 000 muestras procesadas con una FCR de 3 800 g durante 20 minutos fue del 71%. Sin embargo, la sensibilidad siguió siendo del 69%, según lo determinaron otras 30 000

Cuadro 1 9 -2

Efecto del aumento de la fuerza centrífuga sobre los frotis y cultivos positivos para micobacterias F U E R Z A C E N T R ÍF U G A RELA TIVA (g)

1 260

3 000

Frotis positivos

1,8%

4,5%

9,6%

Cultivos positivos

7,1%

11,2%

11,6%

Correlación de frotis/cultivos positivos

25%

40%

82%

3 800

Adaptado de la referencia284.

muestras procesadas en forma similar, pero con una FCR de 2 000 g. Los autores arribaron a la conclusión de que las tasas reales de aislamiento de micobacterias viables de las muestras clínicas también dependen del método de tratamiento y de las especies individuales y las diferencias de las cepas de micobacterias para la tolerancia a los álcalis. Por lo tanto, aunque la centrifugación a una FCR de 3 000 g durante 15 minutos puede ser óptima para el aislamiento de micobacterias en las muestras clínicas, las posibilidades de aislamiento no estarán sustancial­ mente comprometidas en los laboratorios donde existan centrí­ fugas de menor costo que alcanzan sólo un máximo de 2 074 g, si el tiempo se aumenta hasta 20 minutos. Como lo señalaron Sommers y Good, con las fuerzas de centrifugación producidas en una FCR de 3 000 g o más altas, los tubos centrífugos de vidrio o plástico pueden romperse o colapsar y deben colocar­ se en recipientes sellados.324 Además, las velocidades elevadas generan un calor considerable y pueden requerirse centrífugas refrigeradas cuando las FCR exceden los 3 000 g. Muestras de médula ósea y muestras de biopsia

Mycobacterium tuberculosis es un parásito intracelular facul­ tativo que puede estar presente en macrófagos de médula ósea, hígado, sangre y ganglios linfáticos de pacientes con infec­ ciones diseminadas. Como las biopsias tisulares no suelen estar contaminadas por otros microorganismos, pueden ser homogeneizadas e inoculadas directamente en los medios de cul­ tivo sin utilizar una solución descontaminante. Es mejor cultivar los trayectos fistulosos u otras lesiones cutáneas sospechosas de albergar micobacterias obteniendo una pequeña porción de teji­ do infectado o secreción. También se están utilizando biopsias con aguja fina con mayor frecuencia para obtener material para el cultivo tisular de distintas lesiones subcutáneas y viscerales profundas. En un estudio de 390 casos en los cuales se obtuvie­ ron muestras de biopsia con aguja para diagnosticar una sospe­ cha de linfadenitis tuberculosa, la tasa global de positividad de los frotis fue del 23,6% y la positividad de los cultivos fue del 35%.273 Fue más probable que las lesiones caseificadas produ­ jeran cultivos positivos (40%) que las no caseificadas (9%). Otras muestras líquidas

Las muestras líquidas (p. ej., LCR, líquido pleural u otros) deben centrifugarse, teñirse para bacilos ácido-alcohol resis­ tentes e inocularse directamente en medios de cultivo líquidos

P rocedim ientos de laboratorio para el aislam iento y la identificación de las m icobacterias

o sólidos. Las muestras de líquido pleural son diluidas con buf­ fer en algunos laboratorios para disminuir la densidad, lo que mejora así la sedimentación de las micobacterias. Las muestras líquidas con bajo contenido en proteínas, como LCR, pueden filtrarse a través de una membrana de nitrato de celulosa de 0,22 (im. La membrana puede cortarse en pedazos, los cuales se colocan luego en diferentes tipos de medios de cultivo sóli­ dos y líquidos. Las centrífugas utilizadas para el procesamiento de muestras que potencialmente contienen bacilos ácido-alcohol resistentes deben estar equipadas con recipientes para centrífuga de 50 o 250 mL con tapas que no contengan aerosoles y que puedan adaptarse para sostener tubos de centrífuga de 50 mL. Estas centrífugas no deben ventilarse hacia el exterior por el peligro del flujo aéreo invertido a través de las tuberías durante las tor­ mentas de viento. Se deben tomar precauciones para evitar la rotura espontánea de las membranas de tensión superficial del líquido cuando se inoculan cultivos en caldo o muestras líqui­ das. Por ejemplo, si se rompe una de estas membranas en un ansa de inoculación, se pueden crear gotitas de aerosol que per­ sisten en el aire durante períodos prolongados. Todas estas transferencias deben realizarse en una campana de seguridad biológica.

Tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes

Las paredes celulares de las micobacterias, debido a su alto contenido en lípidos, tienen la capacidad singular de unirse al colorante fucsina de modo que no sea eliminado (desteñido) por alcohol ácido. Esta reacción de tinción ácido-alcohol resis­ tente de las micobacterias, junto con su tamaño y forma carac­ terísticos, es un auxiliar útil en la detección temprana de infec­ ción y en la monitorización del tratamiento para la enfermedad por micobacterias. La presencia de bacilos ácido-alcohol resis­ tentes en el esputo, combinada con el antecedente de tos, pér­ dida de peso y pruebas en la radiografía de tórax de un infiltra­ do pulmonar, sigue siendo evidencia presuntiva de tuberculosis activa. Se ha calculado que cuando se utilizan técnicas de concen­ tración convencionales, es necesario detectar alrededor de 10 000 bacilos ácido-alcohol resistentes por mililitro de esputo con el microscopio óptico.134 Los pacientes que presentan una enfermedad extensa eliminan gran cantidad de micobacterias, con una buena correlación entre un frotis positivo y un culti­ vo positivo. Muchos pacientes tienen una enferm edad mínima o menos avanzada, y la correlación de los extendidos positi­ vos con los cultivos positivos en este grupo puede ser sólo del 25-40%. Los frotis ácido-alcohol resistentes también son útiles para seguir la respuesta al tratamiento. Una vez iniciada la adminis­ tración de antibióticos, los cultivos se vuelven negativos antes de que lo hagan los frotis, lo que sugiere que los microorganis­ mos no son capaces de replicarse pero pueden unirse a la tin­ ción. Con el tratamiento continuo, se destruyen más microor­ ganismos y se eliminan menos, de modo que la evaluación de la cantidad de microorganismos en el esputo durante el trata­ miento puede proporcionar una medida objetiva incipiente de la respuesta. Si la cantidad de microorganismos no disminuye­ ra después de iniciado el tratamiento, se debe considerar la posibilidad de resistencia a los fármacos, y se deben obtener cultivos y estudios de sensibilidad adicionales. Se utilizan comúnmente dos tipos de tinciones ácido-alcohol resistentes (cuadro 19-3):

1027

1. Tinciones de carbolfucsina: una mezcla de fucsina con fenol (ácido carbólico) a. Ziehl-Neelsen (tinción caliente) b. Kinyoun (tinción fría) 2. Tinción con fluorocromos: auramina O sola o con el agre­ gado de un segundo fluorocromo, la rodamina. Los colorantes de carbolfucsina y auramina O utilizados en estas técnicas funcionan uniéndose a ácidos micólicos en la pared celular de las micobacterias. Los frotis teñidos con la téc­ nica de carbolfucsina deben observarse con un objetivo de inmersión en aceite. Esto limita el área total del portaobjetos que se puede observar en una unidad dada de tiempo. A dife­ rencia de las tinciones de carbolfucsina, los frotis teñidos por el procedimiento de auramina pueden observarse con un obje­ tivo 25x, lo que aumenta el campo de visión y reduce el tiem­ po necesario para explorar un área dada del portaobjetos. Los frotis teñidos con fluorocromo necesitan una fuente luminosa intensa: un quemador de vapor de mercurio de 1 200 W o una luz azul intensa con un filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC). Las bacterias teñidas con fluorocromos son amarillo brillan­ tes (rodamina) o rojo anaranjadas (rodamina) contra un fondo oscuro, lo que permite recorrer el portaobjetos bajo una ampli­ ficación menor sin perder sensibilidad. El contraste pronuncia­ do entre las micobacterias de color brillante y el fondo oscuro ofrece una ventaja definida al explorar el portaobjetos (véase lámina en color 19-1A). Las modificaciones de la tinción con el fluorocromo auramina incluyen el agregado de rodamina, lo cual da un aspecto dorado a las células o el uso de naranja de acridina como contratinción, lo que conduce a un fondo rojo a anaranjado. Las reacciones positivas falsas pueden deberse a la fluorescencia de tejido inespecífico o restos celulares que pue­ den ser confundidos con bacilos con el objetivo 25x. Se debe utilizar el objetivo 40x para confirmar cualquier forma sospe­ chosa. Las células micobacterianas muertas también se tiñen con rodamina y auramina, lo que conduce a una situación de cultivo negativo y frotis positivo alrededor del 10% de las veces. También es importante recordar esta característica cuan­ do se utilizan frotis con tinción ácido-alcohol resistente para evaluar la eficacia del tratamiento -la presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes en los frotis teñidos con fluorocromo no siempre indica un fracaso terapéutico- y también deben rea­ lizarse tinciones de carbolfucsina. Los frotis teñidos con fluo­ rocromo deben teñirse luego con carbolfucsina: no se aplica la situación opuesta. Con la carbolfucsina, la tinción para bacterias ácido-alcohol resistentes (AFB) brilla de rojo contra un fondo azul o verde, según la contratinción utilizada (véase lámina en color 19-1B). Aunque en teoría las técnicas de Ziehl-Neelsen y de Kinyoun son las mismas, según algunas experiencias la primera es más sensible para detectar microorganismos que tienen una tinción leve, sobre todo ciertas micobacterias de crecimiento rápido. La propiedad de ácido-alcohol resistencia se debe a la cápsula gruesa y cerosa que rodea a las células de las micobacterias. Para que la carbolfucsina acuosa penetre a través de la cera, la cápsula debe estar “reblandecida”. Esto se hace con calor en el procedimiento de Ziehl-Neelsen, en forma muy similar a la fusión de una película de parafina por los rayos calientes del sol. El colorante que penetra la cápsula reblandecida por el calor se une a la pared celular: cuando las células bacterianas se enfrían luego de eliminado el calor, la cera se endurece otra vez, lo que protege al colorante unido de la acción decolorante del alcohol ácido (“ácido-alcohol resistente”). En la técnica de

1028

C A P ÍT U L O 19

Cuadro 1 9 -3

Micobacterias

P r o c e d im ie n to p a r a la tin c ió n á c id o -a lc o h o l-r e s is te n te PROCEDIM IENTO DE FRÍO DE KINYOUN

PRO CEDIM IENTO DEL FLUORURO DE AURAM INA

Carbolfucsina: disolver 3 g de fucsina básica en 10 m L de etanol al 90-95% . Agregar 90 mL de solución acuosa al 5% de fenol

Carbofucsina: disolver 4 g de fucsina básica en 20 m L de etanol al 90-95% y luego agregar 100 mL de una solución acuosa al 9% de fenol (9 g de fenol disueltos en 100 m L de agua destilada)

Auram ina fenólica: disolver 0,1 g de auram ina O en 10 m L de etanol al 90-95% y luego agregar a una solución de 3 g de fenol en 87 mL de agua destila­ da. Alm acenar la tinción en un frasco marrón

Alcohol ácido: agregar lentamente 3 mL de HCI concentrado a 97 m L de etanol al 90-95% , en este orden. ¡La solución puede calentarse!

Alcohol ácido: agregar lentamente 3 mL de HCI concentrado a 97 m L de etanol al 90-95% en este orden. ¡La solución puede calentarse!

Alcohol ácido: agregar 0,5 mL de HCI concentrado a 100 mL de alcohol al 79%

Contratinción de azul de metileno: disolver 0,3 g de cloruro de azul de metileno en 100 mL de agua destilada

C ontratinción con azul de metileno: disolver 0.3 g de cloruro de azul de metileno en 100 mL de agua destilada

Perm anganato de potasio: disolver 0,5 g de perm anganato de potasio en 100 raL de agua destilada

Procedim iento Cubrir un frotis desecado y fijado con calor con un rectángulo pequeño ( 2 x 3 cm) de papel de filtro Aplicar 5 a 7 gotas de tinción de carbolfucsina al papel de filtro cuidadosam ente humedecido Calentar el portaobjetos cubierto con la tinción hasta el vapor, pero no perm itir que se seque El calentam iento puede realizarse m ediante un mechero de gas o sobre una cubeta de tinción (eléctrica) Retirar el papel con pinzas, enjuagar el portaob­ jeto s con agua y escurrir Quitar el color con alcohol ácido hasta que no aparezca m ás tinción en el lavado (2 min) Contrateñir con azul de m etileno (1 -2 min) Enjuagar, escurrir y secar con aire (1 -2 min) Exam inar con objetivo de inm ersión en aceite lOOx Las m icobacterias se tiñen de rojo y el fondo de azul claro

Procedimiento C ubrir un frotis desecado y fijado con calor con un rectángulo pequeño ( 2 x 3 cm) de papel de filtro A plicar 5 -7 gotas de tinción de carbolfucsina para hum edecer m inuciosam ente el papel de filtro. Perm itir que se deposite durante 5 min Agregar m ás tinción si el papel se seca. ¡No calen­ tar al vapor! R etirar el papel con pinzas, enjuagar el portaobje­ tos con agua y escurrir Q uitar el color con alcohol ácido hasta que ya no aparezca tinción en el lavado (2 min) Contrateñir con azul de m etileno (1 -2 min) Enjuagar, escurrir y secar al aire (1 -2 min) Exam inar con objetivo de inm ersión en aceite 1003. Las m icobacterias se tiñen de rojo y el fondo de azul claro

Procedim iento Cubrir un frotis desecado y fijado con calor con carbol auram ina y perm itir que se tiña durante 15 min. N o calentar ni cubrir con papel de filtro Enjuagar con agua y escurrir Quitar el color con alcohol ácido (2 min) Enjuagar con agua y escurrir Irrigar el frotis con perm anganato de potasio como m ínim o durante 2 y no más de 4 min E njuagar con agua corriente. Escurrir Exam inar con el objetivo 253 utilizando un mechero de vapor de m ercurio y un filtro BG -12 o una luz azul fuerte Las m icobacterias se tiñen de amarillo-anaranjado contra un fondo oscuro

PRO CEDIM IENTO DE ZIEH L-NEELSEN

Kinyoun o de “frío”, se utiliza un agente activo superficial­ mente para aumentar la permeabilidad del colorante a través de la cápsula cerosa; sin embargo, la nueva formación de la cáp­ sula cerosa puede ser incompleta, lo que permite extraer la mayor parte del colorante unido, si no todo, mediante el alco­ hol ácido decolorante. Sin duda, las células micobacterianas provistas de una cápsula cerosa delgada serán más sensibles a la decoloración, como puede suceder con muchas cepas de cre­ cimiento rápido. En estas circunstancias, el uso de un decolo­ rante menos estricto, como HCI al 1% (tinción “ácido-alcohol resistente parcial”) puede revelar la propiedad innata de la ácido-alcohol resistencia. El procedimiento basado sobre carbolfucsina se describe en el protocolo 19-2. Aunque algunos laboratorios pueden estar en favor del méto­ do de tinción con carbolfucsina mientras que otros lo están a favor del de la fluorescencia, la especificidad de la detección de las micobacterias con ambos métodos es aproximadamente la misma, con la posible excepción de la tinción de las bacterias de crecimiento rápido. En un estudio de 15 cepas de M. fortuitum , cinco de ellas no se tiñeron con auramina, pero las 15 se tiñeron con carbolfucsina.163 Uribe-Botero y cois., que utiliza­

ron la tinción de auramina-rodamina de Truant de los aspirados y las biopsias de médula ósea con procesamientos de rutina, describen un éxito considerable en la detección de las micobacterias con este método.357 Estudiaron 51 muestras de médu­ la ósea de 47 pacientes HIV positivos y detectaron micobacte­ rias en el 72%. Si la tinción fluorescente era positiva, el valor predictivo positivo para el cultivo de micobacterias era del 87%. McCarter y Robinson estudiaron 782 frotis primarios de esputo evaluados a ciegas mediante el método de la rodaminaauramina tanto a temperatura ambiente como a 37 °C y obser­ varon que la preparación teñida a temperatura ambiente detec­ taba sólo el 85,7% de los frotis positivos; el 43,3% de los frotis tenían más bacilos ácido-alcohol resistentes en los teñidos a 37 °C, en comparación sólo con un 13,3% más de bacilos ácido-alcohol resistentes en los teñidos a temperatura ambien­ te.219 Estos autores arribaron a la conclusión de que la tinción a 37 °C con este método aumenta la detección de bacilos ácidoalcohol resistentes. Independientemente de que los frotis se elaboraran a partir de la centrifugación o de la concentración con NALC-NaOH tradicional, Woods y cois, no observaron ningún aumento en la detección de bacilos ácido-alcohol resis­

C ultivo de m uestras para el aislam iento de m icobacterias

tentes en 844 frotis de esputo citocentrifugados y teñidos con auramina O cuando se compararon con el método de concen­ tración NALC-NaOH tradicional.398 La tinción con fluorocromo ofrece la ventaja de una mayor sensibilidad en comparación con el método de la carbolfucsina, dado que se puede rastrear un área signiñcativamente mayor por unidad de tiempo con la tinción de fluorocromo de auramina. Algunos investigadores utilizan el método de fluorocro­ mo a los fines del barrido y luego confirman sus hallazgos vol­ viendo a examinar la preparación después de desteñir y volver a teñir con el método de la carbolfucsina. Una vez que el per­ sonal del laboratorio se ha familiarizado con el método de fluo­ rocromo de auramina, la mayoría los prefiere sobre el procedi­ miento de la carbolfucsina. La introducción de iluminadores de luz azul de relativamente bajo costo ha hecho que la microsco­ pía de fluorescencia se encuentre disponible para los laborato­ rios clínicos donde se ofrece la detección y el aislamiento de las micobacterias como servicio.267 En los laboratorios que no puedan adquirir iluminadores costosos, el uso del adaptador UV ParaLens (Becton Dickinson, Sparks, MD), un epiiluminador liviano, manual y económico es una alternativa. Patterson y cois, observaron una sensibilidad y una especificidad compa­ rables en la detección de bacilos ácido-alcohol resistentes fluo­ rescentes utilizando el adaptador UV ParaLens cuando se com­ pararon con los frotis teñidos con Kinyoun.253 La implementación de este adaptador ofrece aplicaciones en el examen de pre­ parados de muestras para la detección de otros microorganis­ mos, como Giardia y Pneumocystis, que han sido teñidos con reactivos de fluoresceína. Cabe señalar que ni la tinción de auramina ni la de fluoro­ cromo de auramina-rodamina son técnicas antígeno-anticuerpo fluorescentes; más bien, cada una de ellas es una unión fisico­ química directa de la tinción con la pared celular rica en ácido micólico. Se describió el uso de anticuerpos marcados con fluorescencia para ayudar en la identificación de distintas espe­ cies de micobacterias, pero no se los utiliza comúnmente ni se los encuentra en el comercio. En el cuadro 19-4 se presentan las recomendaciones de la American Lung Association para el informe de micobacterias observadas en los frotis con tinción ácido-alcohol resistente. Estas recomendaciones son seguidas por muchos laboratorios para dejar constancia de las observaciones entre los técnicos en un laboratorio dado y unificar los informes de un laboratorio a otro. En los protocolos 19-2 y 19-3 se resumen las técnicas basadas sobre carbolfucsina y fluorescencia para la tinción de las micobacterias.

Cultivo de muestras para el aislamiento de micobacterias Medios de cultivo

El aislamiento de micobacterias de los medios de cultivo en agar fue bajo cuando se lograron los primeros intentos ya avan­ zado el siglo xix. A través de la experimentación se observó que un medio de cultivo que contenía huevos enteros, harina de papas, glicerol y sales, solidificado por el calentamiento a 8590 °C durante 30-45 minutos era eficaz para el aislamiento de M. tuberculosis. El proceso de solidificación del medio que contiene proteínas por acción del calor se conoce como espe­ samiento. Un medio de cultivo espesado está más sometido a licuefacción por los efectos de las enzimas proteolíticas produ­ cidas por las bacterias contaminantes que un medio solidifica­ do por el agregado de agar. Sin embargo, pronto se descubrió

Cuadro 1 9 -4

1029

M étodo para comunicar la cantidad de bacilos ácido-alcohol resistentes observados en los frotis teñidos"

CANTIDAD DE BACI­ LOS OBSERVADOS

INFO RM E DEL M ETODO DE LOS CDC

0

Negativo

-

1-2/300 campos

Núm ero observado*

±

1-9/100 campos

Prom edio núm ero/100 cam pos

1+

1-9/10 campos

Prom edio núm ero/10 cam pos

2+

1-9/cam po

Prom edio núm ero/cam po

3+

M ás de 9/cam po

M ás de 9/cam po

4+

Se acepta un examen de 800x a lOOOx. La amplificación de menos de 800x debe establecerse con claridad. Si un microscopista utiliza un procedimiento constante para el examen de los frotis, para el médico las comparaciones relativas de múlti­ ples muestras deben ser fáciles, independientemente de la amplificación utilizada. Para igualar la cantidad de bacilos observados a menos de 800x con los observa­ dos con un objetivo de inmersión en aceite, adaptar los recuentos como sigue: para amplificaciones de alrededor de 650x, dividir el recuento por 2; cerca de 450x, dividir por 4; cerca de 250x, dividir por 10; por ejemplo, si se observaron 8 bacilos por 10 campos a 4 5 0 x el recuento en 1 OOOx sería equivalente a aproximadamente 2/10 campos (8 -r 4). h Los recuentos de menos de 3/3 000 campos a 800x a 1 OOOx no se consideran positivos; se debe procesar otra muestra (o la repetición del frotis de la misma muestra) si se encuentra disponible. Adaptado de la American Thoracic Society. Diagnostic standards and classification o f tuberculosis and other mycobacterial diseases. Am Rev Respir Dis 1981;123: 343-358.

que el uso de colorantes de anilina, como verde malaquita o violeta de genciana, en el medio espesado ayudaba a controlar a las bacterias contaminantes. La concentración del colorante debe controlarse con cuidado; si la concentración es demasia­ do alta, se puede inhibir también el crecimiento de las micobacterias junto con las bacterias contaminantes. El verde mala­ quita es el colorante incorporado con mayor frecuencia en medios de cultivo no selectivos, en concentraciones que varían entre 0,0025 g/100 mL y 0,052 g/100 mL (cuadro 19-5). Medios de cultivo no selectivos para el aislamiento de micobacterias

En el cuadro 19-5 se mencionan varios de los medios de cul­ tivo con base de huevo para el aislamiento de micobacterias. El medio de Lowenstein-Jensen (LJ) es el más utilizado en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico clínico; es menos inhibidor del crecimiento de las micobacterias que el medio de Petragnani, el cual se utiliza sobre todo para aislar micobacte­ rias de muestras muy contaminadas con bacterias. Por el con­ trario, el medio de la American Thoracic Society (ATS), que sólo contiene 0,02 g/100 mL de verde malaquita, es menos inhibidor para el crecimiento de las micobacterias y se reco­ mienda para muestras que suelen ser estériles, como LCR, líquido pleural y biopsias tisulares. Como el medio de LJ es menos sensible en el aislamiento de las micobacterias de las muestras clínicas que los medios de cul­ tivo en caldo y el medio de agar Middlebrook 7H10, y como la detección del crecimiento se difiere cuando es positiva, se ha suspendido su utilización en muchos laboratorios. El uso de los medios de cultivo en caldo seguido de la identificación mole­ cular a menudo establece la identificación del microorganismo antes de que sea visible el crecimiento en el agar inclinado del medio de LJ. Los estudios cromogénicos y las pruebas bioquí­

1030

C A P ÍT U LO 19 Micobacterias

C uadro 1 9 -5

M edios de aislamiento no selectivos para micobacterias

MEDIO

AGENTE INHIBIDOR

COMPONENTES

AGENTE INHIBIDOR

Lówenstein-Jensen

Huevos enteros coagulados, sales definidas, glicerol, harina de patata

Verde m alaquita, 0,025 g/100 mL

M iddlebrook 7H10

Sales definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúm ina, catalasa, glice­ rol, dextrosa

Verde malaquita, 0,0025 g/100 mL

Petragnani

Huevos enteros coagulados, yem a de huevo, leche entera, patata, harina de patata, glicerol

Verde m alaquita, 0,052 g/100 mL

M iddlebrook 7H 11

Sales definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúm ina, catalasa, glice­ rol, hidrolizado de caseína al 0,1%

Verde malaquita, 0,0025 g/100 mL

M edio de la American Thoracic Society

Yemas de huevo frescos coagulados, harina de patata, glicerol

Verde malaquita, 0,02 g/100 mL

micas son más precisos cuando se realizan en subcultivos del medio de LJ. Por lo tanto, los cultivos de caldo positivos son transferidos al medio de LJ cuando pueden ser necesarias las pruebas bioquímicas. Medios de Cohén y de Middlebrook

Durante la década de 1950, Cohén y Middlebrook crearon diversos medios de cultivo definidos para uso en investigación y en laboratorios clínicos. Estos medios se prepararon a partir de sales y sustancias químicas orgánicas definidas; algunos contenían agar, pero se observó que todos requerían el agrega­ do de albúmina para el crecimiento óptimo de las micobacte­ rias. Los medios de Middlebrook que contienen agar son trans­ parentes y permiten la detección del crecimiento luego de 10 a 12 días, en lugar de los 18 a 24 días de incubación necesarios con otros medios. Esto se debe en parte a la inclusión de biotina y catalasa para estimular el aislamiento de los bacilos daña­ dos en las muestras clínicas. También se incorpora albúmina para que se una a las cantidades tóxicas de oleato y otros com­ puestos que podrían ser liberados de la hidrólisis espontánea del Tween 80. La albúmina no parece ser metabolizada por los bacilos.374 En la actualidad no se utilizan muchos de los primeros medios de cultivo de Cohén y Middlebrook. Sin embargo, 7H9 es un medio líquido popular y tanto el medio de agar 7H10 como 7 H 11 se utilizan ampliamente para el aislamiento y las pruebas de sensibilidad.396 Se debe incorporar antibióticos en el medio inmediatamente antes de que se solidifique para reducir la pérdida de actividad que se sabe que ocurre con ciertos fár­ macos durante el largo período de calentamiento necesario para preparar los medios espesados con base de huevo. Esta aplica­ ción se explicará con detalles más adelante en este capítulo. El medio 7H 11 difiere del 7H10 sólo en que contiene hidrolizado de caseína al 0,1%, un aditivo que mejora la velocidad y la can­ tidad del crecimiento de las micobacterias resistentes a la isoniazida (INH).52 Ambos contienen verde malaquita, pero un décimo de la cantidad de lo que suele utilizarse en los medios con base de huevo, lo que explica en parte la mayor incidencia de contaminación. Otra ventaja del uso del agar de M iddlebrook es que los micobacteriólogos experimentados a menudo pueden hacer una identificación presuntiva de M. tuberculosis y otros grupos

MEDIO

COMPONENTES

de micobacterias dentro de los 10 días al examinar las microcolonias tempranas en agar de Middlebrook y observar algunas características morfológicas bien definidas.296 En la lámina en color 19-1C (M. tuberculosis) y la lámina en color 19-2A y 2B (complejo MAI) se muestran microfotografías de microcolo­ nias representativas. Aunque esencialmente todos los medios de cultivo arrojan un mayor crecimiento y colonias más grandes de micobacterias cuando son incubados en C 0 2 al 5-10%, los medios de Middlebrook requieren en forma absoluta la incubación con CO, para un rendimiento correcto. La exposición de 7H10 y 7H I l a una luz fuerte o el almacenamiento de los medios a 4 °C durante más de 4 semanas puede conducir al deterioro y la libe­ ración de formaldehído, una sustancia química muy inhibidora de las micobacterias.231 Medios selectivos

Se utilizan medios de cultivo que contienen antibióticos para suprimir la contaminación bacteriana y micótica. Aunque se sabe que algunos antibióticos reducen la contaminación, tam­ bién pueden inhibir el crecimiento de las micobacterias. Por lo tanto, se debe controlar con cuidado el tiempo de exposición. El uso de medios selectivos puede conducir a un aislamiento muy mejorado de micobacterias. En el cuadro 19-6 se enume­ ran los nombres y los componentes de varios medios selecti­ vos. En la actualidad, se utiliza comúnmente el medio selectivo descrito por Gruft, que consiste en el medio de LówensteinJensen con penicilina, ácido nalidíxico y RNA.117 Petran des­ cribió luego un medio selectivo que contiene cicloheximida, lincomicina y ácido nalidíxico para controlar los contaminan­ tes micóticos y bacterianos.259 Al variar las concentraciones de estos agentes, el medio se puede preparar con LówensteinJensen o con base 7H10. El medio 7H11 selectivo es una modificación de un medio de agar-ácido oleico descrito por primera vez por Mitchison.232 El medio estaba diseñado en su origen para utilizarlo con muestras de esputo sin el uso de un agente descontaminante. El medio de Mitchison contiene carbenicilina, polimixina, trime­ toprim lactato y anfotericina B. McClatchy sugirió reducir la concentración de carbenicilina desde 100 (ig/mL hasta 50 |ig/m L y utilizar el medio 7H11 en lugar de agar-ácido olei-

M étodos rápidos para establecer un diagnóstico

Cuadro 1 9 -6

1031

M edios selectivos para el aislamiento de micobacterias

MEDIO

COMPONENTES

AGENTE INHIBIDOR

MEDIO

AGENTE INHIBIDOR

COMPONENTES

M odificación de Gruft del medio de Lowenstein-Jensen

Huevos enteros coagulados, sales definidas, glicerol, harina de patata, RNA, 5 m g/100 mL

Verde m alaquita, 0,025 g/100 mL Penicilina, 50 U/mL A cido nalidíxico, 35 mg/m L

M iddlebrook 7H10

Sales definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, glice­ rol, glucosa

Verde m alaquita, 0,0025g/l 00 m L Cicloheximida, 360 |ig/m L Lincomicina, 2 |ig/m L Ácido nalidíxico, 20 ng/m L

L owenstein-Jensen

Huevos enteros coagulados, sales definidas, glicerol, harina de patata

Verde m alaquita, 0,025 g/100 mL Cicloheximida. 400 Ug/mL Lincomicina. 2 |ig/m L Acido nalidíxico, 35 Ug/mL

Selectivo 7H11 (m edio de M itchison)

Sales definidas, vitaminas, cofactores, ácido oleico, albúmina, catalasa, glice­ rol, glucosa, hidrolizado de caseína

Carbenicilina, 50 |Ig/mL Anfotericina B, 10 ng/m L Polim ixina B, 200 U/m L Lactato de trimetoprim , 20 Ug/mL

co.220 Este autor denominó a esta modificación 7H11 selectivo o S7H11. Con el uso del medio S 7H 11 más Lowenstein-Jensen y 7H 11 se mejora definitivamente el aislamiento de micobacte­ rias, sobre todo cuando se utiliza el medio S7H 11 con el pro­ cedimiento de descontaminación de NALC-NaOH al 1%.220 Después de esta comunicación, un estudio de 3 años de dura­ ción que comparó el medio S7H10 con muestras no desconta­ minadas ha mostrado significativamente menos contaminación en las placas de S7H10 con muestras homogeneizadas que en el medio 7H10 con descontaminación, utilizando NaOH al 2% con NALC. Además, el medio S7H10 aisló un 18% más de cul­ tivos positivos, habitualmente con más colonias por cultivo y con menos contaminación que los cultivos inoculados en 7H10 después de una descontaminación con NALC-NaOH al 2%. A diferencia de la descontaminación en el informe de McClatchy, la carbenicilina se mantuvo en 100 Ug/mL en lugar de 50 |J,g/mL. Las muestras inoculadas directamente en placas de 7H10 fueron homogeneizadas luego del agregado de cantida­ des iguales de NALC en citrato de sodio 0,1 M a un pH de 8,1 y se las dejó asentar durante 15 minutos antes de la centrifuga­ ción. La inoculación de muestras concentradas, pero no des­ contaminadas puede predisponer al aislamiento de micobacte­ rias parcialmente dañadas o con requerimientos especiales de cultivo, con preservación del daño adicional por la exposición a NaOH. Aunque mediante las muestras no descontaminadas en S7H10 se aislaron más especies de micobacterias que los medios no selectivos, los antibióticos en el medio tienen un efecto inhibidor distinto sobre el crecimiento y el aspecto de las colonias de algunas especies. Durante el desarrollo de medio de caldo de l- [ 14C]-ácido palmítico 7H12, se observó que las cantidades menores de antibióticos eran tan eficaces como las concentraciones más altas utilizadas en S7H11. Se pueden agregar antibióticos al cultivo en caldo antes de la inoculación de la muestra no descontaminada.

cen mejor a la temperatura de ésta (30-32 °C) y muy poco o en absoluto a 37 °C. M. tuberculosis crece mejor a 37 °C y poco o nada a 30 °C o 42-45 °C (la temperatura corporal de los pája­ ros). Mycobacterium xenopi, una especie poco común como causa de infección en seres humanos, crece mejor a 42 °C y ha sido implicada como contaminante ambiental en el sistema de agua caliente de un hospital grande.115 El aislamiento óptimo de las diferentes especies de micobacterias depende de la incubación al menos de parte de la muestra concentrada a una temperatura que muy probablemen­ te promueve el crecimiento de esa especie. Se debe utilizar una estufa de incubación regulada a 30 °C para todas las muestras de infecciones micobacterianas cutáneas o subcutáneas sospe­ chosas. Si no se cuenta con ella, las muestras pueden mantener­ se en una caja cerrada con monitorización de la temperatura y resguardada de las comentes cálidas o frescas. La temperatura de la caja debe mantenerse entre 24 °C y 25 °C y registrarse todos los días. Una estufa de incubación mantenida a 42 °C puede ser útil para aislar M. xenopi. Las micobacterias crecen mejor en una atmósfera con CO, al 3-11% (fig. 19-2). Es obligatorio el uso de CO, en el medio de Middlebrook 7H11. Sin embargo, si la falta de espacio en la estufa de incubación para mantener los cultivos constituye un problema, se puede retirar los cultivos de la atmósfera de CO, después de 7-10 días porque los microorganismos estarán en una fase logarítmica de crecimiento y son menos dependientes del CO,. Por razones todavía no conocidas, las micobacterias no crecen bien en jarras de anaerobiosis por extinción con vela. La concentración de CO, en las estufas debe controlarse todos los días y se debe mantener un registro tanto de la temperatura de la estufa como de su concentración de COr

Métodos rápidos para establecer un diagnóstico Sensibilidad de los frotis ácido-alcohol resistentes

Incubación

Las diferentes especies de micobacterias muestran una dependencia notable sobre la temperatura de incubación para un crecimiento óptimo. Las especies que tienden a infectar la piel (como M. marinum, M. ulcerans y M. haemophilum) cre­

Uno de los métodos más prácticos y más fáciles de conseguir para mejorar el diagnóstico rápido de tuberculosis es aumentar la FCR aplicada a las muestras clínicas para mejorar la sedi­ mentación de las células micobacterianas cargadas de lípi­ dos.284 La mejor correlación entre los frotis positivos con los

1032

C A P ÍT U LO 19 Micobacterias

a? g g. gg § »

% de d ió x id o de c a rb o n o

Figura 19-2 Efecto del C 0 2 sobre el crecim iento (tamaño de las colonias y cantidad de colonias) de M. tuberculosis después del aislam iento prim ario del esputo. (Extraído de David HL. Bacteriology of the M ycobacterioses. DHEW Publication No. [CDC] 76-8316, Atlanta: Ram a de M icobacteriología de los Centers fo r D isease Control and Prevention, 1976).

cultivos positivos ha vuelto algo más confiable el examen de un frotis con tinción ácido-alcohol resistente como índice de infección por micobacterias. En una revisión de los factores que afectan el valor clínico de la microscopia para los bacilos ácido-alcohol resistentes, Lipsky arribó a la conclusión de que cuando se consideran los resultados globales de todas las mues­ tras de cada paciente, el frotis ácido-alcohol resistente tiene un valor predictivo superior al 96% y sigue siendo una de las prue­ bas realizadas con mayor facilidad en la detección de las infec­ ciones por micobacterias.207 Cromatografía gas-líquido y cromatografía líquida de alto rendimiento

El análisis de los ácidos grasos celulares de cadena larga mediante cromatografía gas-líquido se ha utilizado para ayudar a la caracterización de las micobacterias. El método de gaslíquido por pirólisis de Reiner, en el cual los ácidos micólicos de cadena larga son divididos en productos de escisión carac­ terísticos, está limitado en gran parte a los laboratorios de investigación.280 Tisdall ideó un procedimiento de cromatogra­ fía gas-líquido para saponificar microorganismos en NaOH metabólico que permite la identificación correcta de la mayo­ ría de las especies de micobacterias.346 Guerrant y cois, utiliza­ ron la metanólisis ácida para el aislamiento de los ésteres metí­ licos del ácido micólico de las células bacterianas, un método que no sólo lleva menos tiempo que la saponificación sino que también es más sensible para detectar una pequeña cantidad de células.118 Se puede utilizar tan sólo un puñado de 1 mm de microorganismos y el tiempo total para el análisis es inferior a 2 horas.288 Un sistema comercial aprobado por la FDA, el MIDI Sherlock Microbial Identification System® (Microbial ID, Newark DE), que consiste en cromatografía líquida de alto ren­ dimiento 1100 y un ordenador es un método rápido y confiable para la confirmación con cultivo de las micobacterias. El siste­ ma computarizado incluye una colección de 40 perfiles posi­

bles de lípidos de la pared celular para las especies de M yco­ bacterium de mayor importancia clínica, derivadas de los ais­ lamientos adquiridos de la American Type Culture Collection que incluye muchos aislamientos clínicos. El uso de la espec­ trometría de masa negativa para iones para detectar el ácido tuberculoesteárico en las muestras clínicas también parece promisorio para la detección rápida de micobacterias en estas muestras para los laboratorios equipados con los instrumentos necesarios.195 Se ha empleado la cromatografía líquida de alto rendimiento que utiliza detección por fluorescencia de ésteres de ácido micólico 6,7-dimetoxicumarina para la identificación rápida de M. tuberculosis y M. avium directamente de muestras de espu­ to con frotis positivo teñidas con fluorocromos y cultivos BAC­ TEC 12B® con crecimiento incipiente. En un estudio de 132 muestras de esputo positivas para M. tuberculosis y 48 positi­ vas para M. avium-intracellulare, la cromatografía líquida de alto rendimiento con el uso de detección de fluorescencia hizo identificaciones directas con sensibilidades del 56,8% y del 33,3%, respectivamente.164 Cuando se realizó el examen con esta prueba de los cultivos que crecen en frascos de BACTEC 12B®, se lograron sensibilidades del 99% y el 94,3%. La espe­ cificidad fue del 100% en ambas evaluaciones. Cage también identificó con éxito 117 de 126 especies de micobacterias (93%) que crecieron en el medio BACTEC 7H12B comple­ mentado con ácido oleico.6 Glickman y cois, describieron un archivo computarizado que contenía los patrones de los ácidos micólicos característicos de 45 especies de Mycobacterium,107 Con el uso de su sistema en la evaluación de 1 333 cepas que representaban 24 especies de Mycobacterium, el 97% fue iden­ tificado correctamente (la identificación de M. tuberculosis tuvo una exactitud del 99,85%; la del complejo MAI, una exac­ titud del 98%). Por lo tanto, para aquellos que poseen el equi­ pamiento y utilizan los perfiles de reconocimiento de patrones computarizados, se pueden identificar con precisión y rapidez las micobacterias utilizando los datos cromatográficos genera­ dos por cromatografía líquida de alto rendimiento. Estos siste­ mas están en competencia directa con los métodos basados sobre ácidos nucleicos para la identificación rápida de micobacterias. Uso de medios de cultivo en caldo

Durante muchos años, los que utilizaron los frascos de culti­ vo en caldo BACTEC 12B lograron una tasa mayor de aisla­ miento de M. tuberculosis y otras especies de Mycobacterium 1 a 2 semanas antes que los grupos que utilizan sólo medios de cultivo sólidos. Por lo tanto, se recomienda ahora altamente el uso de un medio de cultivo en caldo para el aislamiento tem­ prano de las micobacterias; de hecho, esto se ha agregado como un elemento de deficiencia de fase a la Lista de Control de Inspección y Acreditación del College of American Patho­ logists. A continuación se describen brevemente los sistemas semiautomatizados, automatizados y manuales para el cultivo de las micobacterias.

Sistemas de detección automatizados Existen cinco sistemas semiautomatizados y automatizados para la detección de micobacterias: el sistema BACTEC 460, honrado por el tiempo y bien evaluado (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD) y sistemas no radiométricos más nue­ vos, el sistema MGIT 960® (BD Diagnostic Systems), el siste-

S istem as de detección autom atizados

ma MBA/BacT (BioMérieux, Durham, NC), el frasco para hemo­ cultivo BACTEC MYCO/F Lytic (BD Diagnostic Systems) y el ESP Culture System II (Trek Diagnostic). Dos alternativas via­ bles son el Septi-Chek System manual (BD Diagnostic) y la ver­ sión manual del sistema MGIT (BD Diagnostic) para utilizar en los laboratorios sin sistemas automatizados. Sistema BACTEC AFB

Los componentes del sistema automatizado BACTEC 460 (BD Diagnostic) incluyen un contador de centelleo, una cone­ xión para aspiración con aguja y un cursor extraíble sobre el cual se pueden colocar hasta 60 frascos de cultivo. Este cursor se ali­ nea de modo que cada frasco de cultivo pasa, a su vez, por deba­ jo del ensamblaje de aspiración con aguja a la velocidad aproxi­ mada de uno por cada 80 segundos. Cuando el frasco de prueba está inmediatamente por debajo del ensamblaje con aguja, se hace atravesar la aguja hacia abajo a través de la tapa de goma del espacio superior. Se aspira una muestra del gas de la parte superior y se la coloca en la cámara del contador de centelleo. El gas de la parte superior es reemplazado por un bolo fresco de CO, al 10% inmediatamente después de aspirar la muestra. El sistema se acondiciona con una cubierta que proporciona aire fil­ trado con HEPA bajo presión negativa en el área de prueba y una fuente de luz ultravioleta como elemento de seguridad agregado. Se esteriliza con calor eléctrico la aguja durante el intervalo pre­ vio a la toma de la muestra del siguiente frasco. El frasco de cultivo en caldo BACTEC 12B es la clave para la operación. Consiste en un frasco ampolla de vidrio de 20 mL con un cuello corto, cuya boca está cerrada con una tapa del­ gada de goma. Este frasco contiene 4 mL del medio de cultivo con una base de caldo M iddlebrook 7H9; albúmina de suero bovino (BSA); hidrolizado de caseína, catalasa y estearato de polioxileno como reforzadores del crecimiento; pequeñas can­ tidades de una mezcla antibiótica de polimixina B, anfoterici­ na B, ácido nalidíxico, trimetoprim y azlocilina para suprimir el crecimiento de los contaminantes; y ácido palmítico marca­ do con l4C como detector del crecimiento. El frasco se inocula con 0,5 mL de la muestra procesada y se coloca en una estufa de incubación a 35 °C. Si se presentan micobacterias en el inoculo, se libera 14C 0 2 en el espacio superior, cuya cantidad es proporcional al grado de crecimiento en el frasco ampolla. Se utiliza el sistema detector de radiactividad muy sensible porque las micobacterias de metabolismo lento producen sólo cantida­ des muy pequeñas de COv Cuando ha pasado un período designado de incubación, habitualmente de unos 3 días, los frascos ampollas se colocan sobre el cursor del sistema BAC­ TEC 460 preparados para su lectura. Se mide la cantidad de radiactividad en el gas de la parte superior aspirada, lo cual se traduce en un valor numérico denominado índice de creci­ miento. Un índice de crecimiento mayor de 10 se considera positivo; sin embargo, las tinciones ácido-alcohol resistentes se deben realizar sobre una alícuota pequeña de caldo, porque otras bacterias pueden abrirse paso a través de la inhibición del antibiótico. Con el uso del sistema BACTEC se logra un aumento del rendimiento de cultivos positivos de las muestras clínicas y una disminución del tiempo hasta la detección, en comparación con los medios sólidos convencionales.246308 El tiempo de detección para M. tuberculosis promedia 9-14 días; puede ser inferior a 7 días para algunas cepas de micobacterias distintas de M. tuber­ culosis. Las desventajas del sistema son el costo de la instru­ mentación, la incapacidad para observar la morfología de las colonias y detectar cultivos mixtos, el sobrecimiento por con­

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taminantes, la necesidad de la eliminación de los materiales radiactivos y el uso extenso de agujas. Se han comunicado casos de infecciones seudomicobacterianas cuando la aguja se esteriliza en forma incompleta luego de la aspiración de un frasco ampolla con una alta concentración del microorganis­ mo.57'239 No se pueden utilizar muestras procesadas que requie­ ren reactivos distintos de NALC-NaOH (como cloruro de benzalconio o Zephiran-fosfato trisódico) con el sistema BACTEC porque las cantidades residuales en el caldo pueden inhibir el crecimiento de las micobacterias. Los estudios iniciales de la sensibilidad de este sistema en la monitorización del crecimiento de las micobacterias mostraron que un inoculo de 200 bacilos viables de M. tuberculosis se podría detectar en 12-13 días, mientras que si se esperaba duran­ te 14-17 días, se podían detectar hasta 20 bacilos viables.226 Se ha demostrado el valor del sistema B ACTEC en la detec­ ción de micobacterias de las muestras de esputo, sangre y otras muestras clínicas en varios ensayos y estudios de correlación clínica.15'34'112,134 En un estudio cooperativo multicéntrico, se logró el aislamiento deM . tuberculosis en las muestras clínicas que se sabían que eran positivas mediante el sistema BACTEC en 14 días, en comparación con 21 días por el método de culti­ vo estándar.287 En este mismo estudio, el tiempo total para el aislamiento y las pruebas de sensibilidad a los antibióticos de M. tuberculosis se completó en un promedio de 18 días mediante el método radiométrico en comparación con un pro­ medio de 38 días con los procedimientos estándares. Asimis­ mo, las muestras con frotis negativo y cultivo positivo fueron positivas para el crecimiento de M. tuberculosis en un prome­ dio de 14 días con el método radiométrico, en comparación con 25 días con el procedimiento de cultivo estándar.67-236 La capacidad para realizar estudios rápidos de sensibilidad a los antimicobacterianos es otra ventaja del sistema BAC­ TEC.126 También se lo puede utilizar para diferenciar M. tuber­ culosis y M. bovis de micobacterias no tuberculosas utilizando frascos de hemocultivo que contienen p-nitro-a-acetilamino-Phidroxi-propiofenona (NAP). M. tuberculosis y M. bovis no pueden crecer en medios de cultivo que contengan NAP y, por lo tanto, no producen un GI positivo luego de varios días de incubación. La prueba NAP se presenta en el protocolo 19-4. La detección de M. tuberculosis en muestras clínicas contami­ nadas también se puede lograr utilizando un frasco de cultivo 7H12A que contenga los mismos antibióticos utilizados en el agar S7H11, sólo en concentraciones más pequeñas (polimixi­ na, 50 |ig/mL; anfotericina, 5 (^g/mL; carbenicilina, 25 |J.g/mL y trimetoprim, 2,5 |J,g/mL (PACT). Aunque el sistema BACTEC 360 posiblemente representa hasta la fecha el mejor sistema con base de caldo para el aisla­ miento rápido de las micobacterias, está siendo reemplazado por los sistemas no radiométricos, debido en gran parte a los problemas asociados con el mantenimiento de los materiales radiactivos y la eliminación de sus desechos. Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT, tubo indicador de crecimiento de micobacterias) y MGIT 960

El sistema MGIT (BD Diagnostic) consiste en un tubo de vidrio con base redonda de 16 x 100 mm que contiene 4 mL de base de caldo 7 H l 1 modificado, al cual se ha agregado 0,5 mL de enriquecimiento OADC (ácido oleico, albúmina bovina, dextrosa y catalasa) y 0,1 mL de una mezcla antibiótica PANTA (polimixina B, anfotericina B, ácido nalidíxico, trime­ toprim y azlocilina). La mezcla de antibióticos inhibe el creci­ miento de las bacterias contaminantes; el suplemento OADC

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C A P ÍT U L 0 19

Micobacterias

proporciona ácido oleico, un importante estimulante metabóli­ co para las micobacterias; albúmina, que se une a los ácidos grasos libres tóxicos; dextrosa, como fuente de energía; y catalasa, para destruir los peróxidos tóxicos que pueden presentar­ se en el medio. Se introduce un compuesto fluorescente en siliconas en la parte inferior del tubo, el cual es sensible al oxíge­ no disuelto en el caldo; es decir, la presencia de oxígeno en el medio uniloculado sirve para apagar la emisión de luz fluores­ cente. A medida que las bacterias que crecen activamente con­ sumen el oxígeno disuelto, la fluorescencia es desenmascarada y puede detectarse observando el tubo bajo luz ultravioleta de onda larga (lámpara de Wood). También se puede detectar cre­ cimiento observando la turbidez heterogénea o pequeños gra­ dos o copos en el medio de cultivo. Al realizar la prueba, se agregan al tubo en condiciones asép­ ticas 0,1 mL de mezcla PANTA y 0,5 mL de mezcla OADC y se reconstituye el medio liofilizado. Esto es seguido de 0,5 mL de la muestra o de concentrado de la muestra; el agregado de más de 0,5 mL de la muestra puede afectar adversamente el rendimiento del tubo. Se reemplaza la tapa, se mezcla los ingredientes inviniendo el tubo varias veces y se coloca el tubo en una estufa de incubación a 37 °C. Se leen los tubos día por medio comenzando el segundo día después de la inoculación con la aplicación manual. Se leen los tubos con lámpara de Wood, se coloca el tubo con la mezcla de prueba entre un con­ trol positivo (solución de sulfito de sodio) y un control negati­ vo (tubo de MGIT inoculado). Se usan gafas protectoras contra los rayos UV cuando se busca un color anaranjado brillante en la parte inferior de los tubos positivos; también se observa un reflejo anaranjado en el menisco. Los tubos positivos se tiñen para bacilos ácido-alcohol resistentes, de preferencia con el uso de la técnica de Ziehl-Neelsen. Se retoman los tubos negativos a la rejilla de incubación y se observa nuevamente a intervalos regulares hasta durante 6 semanas. Ahora se cuenta con una plataforma automática que examina cada tubo periódicamente para detectar positividad. Hanna y cois, utilizaron el sistema MGIT a fin de evaluar 193 muestras (44 pacientes) de distintos sitios corporales para detectar la presencia de especies de M ycobacterium ,124 Se estu­ diaron las concentraciones en el esputo de 32 pacientes de los cuales se observó por lo menos un frotis ácido-alcohol resis­ tente positivo. Los cultivos de MGIT fueron positivos en 31 (complejo M. tuberculosis, 25; MAI, A y M. haemophilum, 2) casos. Los tubos MGIT fueron positivos en otros tres pacientes con frotis negativos; la única prueba MGIT falsa negativa ocu­ rrió en un paciente en el que se observaron muy pocos bacilos ácido-alcohol resistentes en el frotis. El tiempo medio transcu­ rrido hasta la detección fue de 10,4 días (rango, 4 a 26). Las dos cepas de M. haemophilum se aislaron agregando un disco X (hemina) al tubo MGIT e incubando a 30 °C. Todas las reac­ ciones positivas con este sistema deben confirmarse mediante una tinción ácido-alcohol resistente, dado que otras bacterias que consumen oxígeno pueden abrirse paso a través de la mez­ cla de antibióticos PANTA. Una desventaja importante es el costo de cada tubo, pero esto puede superarse en cierta medida porque se observa fluorescencia visualmente y no requiere un equipamiento elaborado ni costoso. El MGIT 960 es un sistema automatizado no radiométrico que utiliza medios BD BBL MGIT y sensores para detectar la fluorescencia que se interpreta visualmente en la versión manual descrita antes. Tiene 960 tubos de plástico, que son controlados con cuidado. En una de las primeras comparacio­ nes de esta técnica con BACTEC 460 y el medio de LJ utili­ zando 2 567 muestras clínicas, Tortoli y cois, observaron que

MGIT 960 tenía el tiempo medio más corto hasta la positividad en 13,3 días, en comparación con 14,8 días para el sistema BACTEC 460 y 25,6 días para el medio de LJ.349 Sin embargo, el mejor rendimiento fue el del sistema BACTEC 460 (201 ais­ lamientos), seguido de 190 aislamientos con el sistema BAC­ TEC MGIT 960 y 168 aislamientos con el medio de LJ. En esta comparación, el MGIT 960 también tuvo la tasa más alta de contaminación (10%), en comparación con el sistema radiomé­ trico (3,7%) y el medio de LJ (17%). La tasa de contaminación ha sido mejorada por otros, con sólo un aumento leve en el tiempo hasta la positividad.384 Sistema de detección de micobacterias MB/BacT

El MB/BacT® es un sistema automatizado para detectar micobacterias, de diseño similar al sistema de hemocuitivo BacT/Alert. Los frascos de MB/BacT contienen 10 mL de caldo de Middlebrook 7H9 reforzado en una atmósfera de CO„ nitrógeno y oxígeno al vacío. Por lo tanto, este frasco propor­ ciona condiciones nutricionales y ambientales apropiadas para aislar las especies de Mycobacterium halladas con mayor fre­ cuencia en muestras clínicas distintas de la sangre. Se agrega en cada frasco un suplemento reconstituido de antibióticos antimicobacterianos (0,5 mL), que contiene anfotericina B, azlocilina, ácido nalidíxico, polimixina B, trimetoprim y facto­ res de crecimiento patentados, inmediatamente antes de su uso para aumentar la proliferación de las especies de M ycobac­ terium y restringir la de las bacterias contaminantes que pue­ den sobrevivir a la descontaminación y al procedimiento de concentración. Se coloca un sensor permeable al gas en la parte inferior de cada frasco de caldo que pasa del verde oscuro al amarillo brillante cuando se produce CO, en el caldo al metabolizar las micobacterias. Se colocan los frascos con la parte inferior hacia abajo dentro de celdas individuales en la cámara de incubación y se utiliza la luz reflejada para controlar conti­ nuamente la producción del CO, generado por los microbios. Los ensayos multicéntricos de campo patrocinados por el fabricante indican que el sistema MB/BacT aísla un porcentaje mayor de micobacterias con menos tiempo hasta la detección respecto de los métodos convencionales y se comparó favora­ blemente en los cultivos paralelos con el sistema BACTEC 460 TB. Gil-Setas y cois, compararon el sistema MB/BacT, las pla­ cas de agar de Middlebrook 7H 11 utilizando el método de las microcolonias para la detección de crecimiento y el medio de LJ convencional para el aislamiento de micobacterias de 2 101 muestras no seleccionadas consecutivas.105 De las 111 muestras positivas para M. tuberculosis, 100 fueron aisladas con el siste­ ma MB/BacT, 99 de las placas de agar M7H1 y 86 del medio de LJ. El tiempo hasta la detección fue de 11 días para las pla­ cas de agar M 7H 11, de 16 días para el sistema MB/BacT y de 19,5 días para el medio de LJ. Este sistema también puede uti­ lizarse como un medio confiable para realizar pruebas de sen­ sibilidad basadas sobre caldo.18 Una ventaja definida es la detección no radiométrica y calorimétrica del crecimiento de micobacterias, que elimina la necesidad de manipular y des­ cartar los radioisótopos. Se han realizado otros estudios que examinan la utilidad de este método de detección automatiza­ d o 9,19,142,202,265,291,388

Sistema de cultivo ESP II

El sistema de cultivo ESP II® (Trek Diagnostic) es una adap­ tación del sistema de hemocultivos ESP. Cuando se coloca cada frasco de hemocuitivo en un cajón especial en el módulo de

S istem as de detección m anuales

incubación está unido a un sensor, que consiste en una cámara plástica, una aguja retráctil y una membrana hidrófoba. Por lo tanto, cada frasco se controla en forma continua para detectar algún cambio en la presión del gas debido a la actividad metabólica de los microorganismos en el frasco de cultivo. Un cam­ bio importante en la presión puede estar señalado temprana­ mente por el consumo de oxígeno o más tarde, con la produc­ ción de gases por los microorganismos metabolizadores. Los frascos contienen medio 7H9 de M iddlebrook modifica­ do, Casitone®, glicerol y esponjas de celulosa. Las esponjas proporcionan un soporte para el crecimiento de las micobacte­ rias, que simulan los alvéolos de los pulmones. Inmediata­ mente antes de la inoculación de las muestras, se coloca un suplemento en cada frasco con una mezcla de antibióticos que contiene polimixina B, vancomicina, ácido nalidíxico y anfote­ ricina B (PVNA). Los ensayos de campo patrocinados por el fabricante indican que el porcentaje total de cultivos positivos detectados por el sistema ESP MYCO se compararon favorablemente con el sis­ tema BACTEC 460. Cabe señalar que las muestras de los pacientes que recibieron tratamiento antituberculoso a veces no fueron positivas en ninguno de los sistemas de caldo, lo que indicó la necesidad de inocular medios de cultivo sólidos en paralelo con los frascos de caldo. Los resultados de este estu­ dio indican además que el sistema ESP MYCO® detectó culti­ vos positivos por primera vez con una frecuencia aproximada­ mente tres veces mayor que el sistema BACTEC 460 y más de 7 días antes en alrededor del 50% de los cultivos, presumible­ mente sobre la base de la señal incipiente obtenida durante la fase de consum o de oxígeno del ciclo de crecim iento. Williams-Bouyer y cois, compararon el sistema de cultivo ESP II con el BACTEC M GIT 960 y el agar selectivo de Middlebrook 7H11 y 7H11 y examinaron un total de 3 151 muestras.388 Las tasas de aislamiento para todas las micobacte­ rias fueron del 71,2% para el ESP II, del 63,9% para el MGIT 960 y del 61,8% para los medios de Middlebrook. Sin embar­ go, con la exclusión de M. gordonae, las tasas de aislamiento para las micobacterias restantes fueron del 70,2%, el 72,6% y el 66,3%. Estas diferencias no fueron estadísticamente signifi­ cativas. Para las cepas aisladas en ambos sistemas automatizados, los tiempos medios hasta la detección de todas las micobacterias y los miembros del complejo de M. tuberculosis, respectivamen­ te, fueron de 15,8 y 17,4 días para ESP II y de 12,5 y 11.9 días para BACTEC MGIT 960 (p < 0.05). Se presentaron menos a menudo señales positivas falsas con los cultivos BACTEC MGIT 960 (23% [0,7%]) en comparación con los cultivos ESP II (84 [2,7%]) (p < 0,01). En relación con el sistema BACTEC 460, se observó que el ESP II era comparable para las pruebas de sensibilidad.295 El método de detección no radiométrico uti­ lizado también excluye la necesidad de manipular y eliminar materiales radiactivos. BACTEC MYC0/F LYTIC

El frasco de cultivo BACTEC MYCO/F LYTIC® contiene un agente lítico para liberar las micobacterias que han sido fagocitadas por los leucocitos. Se incuba y controla automáti­ camente en forma similar a otros frascos de hemocultivo BAC­ TEC. Además de aislar micobacterias, es un buen sistema de cultivo para bacterias y hongos que pueden presentarse en el torrente circulatorio.100-361 En una comparación directa de muchos de los productos comerciales, Crump y cois, evaluaron el rendimiento de los sistemas BACTEC 13A (BD Diagnostic),

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BACTEC MYCO/F LYTIC (BD Diagnostic), BacT/ALERT MB (BioMérieux) y de centrifugación-lisis ISOLATOR 10 (Wampole Laboratories) para la detección de micobacterias en los adultos.64 De los 600 pacientes evaluados, en 85 (14%) se aisló el complejo M. avium/M. intracellulare (MAI) y en 9 (2%) otras especies de micobacterias. De 26 conjuntos com­ pletos (tres frascos y un tubo) y llenados en forma adecuada (5 ± 1 mL) de los cuales se aisló MAI, BACTEC 13A fue positi­ vo para 19 (73%), BACTEC MYCO/F LYTIC fue positivo para 21 (81%), BacT/ALERT MB fue positivo para 22 (85%) e ISO­ LATOR 10 fue positivo para 21 (81%). De las seis posibles comparaciones bidireccionales, los tiempos medios hasta la detección para el aislamiento de MAI de cada frasco en los conjuntos suficientemente apareados fueron 15,3 días para BACTEC 13A frente a 12,8 días para BACTEC MYCO/F LYTIC para 33 de 340 pares; 14,1 días para BACTEC 13 A frente a 11,6 días para BacT/ALERT MB para 38 de 380 pares; 12,6 días para BACTEC 13A frente a 20 días para ISOLATOR 10 para 26 de 261 pares; 12,8 días para BACTEC MYCO/F LYTIC frente a 11 días para BacT/ALERT MB para 33 de 340 pares; 13,2 días para BACTEC MYCO/F LYTIC frente a 20,4 días para ISOLATOR 10 para 24 de 230 pares; y 9,9 días para BacT/ALERT MB frente a 19 días para ISOLATOR 10 para 24 de 257 pares. No se observó ninguna diferencia en los rendi­ mientos entre los sistemas. Sin embargo, hubo diferencias en el tiempo medio hasta la detección entre los sistemas. El tiempo hasta la detección fue más corto para BacT/ALERT MB, segui­ do de BACTEC MYCO/F LYTIC y BACTEC 13A y luego ISOLATOR 10. Estos autores observaron que los sistemas con m onitorización continua (BACTEC M Y CO/F LYTIC y BacT/ALERT MB) son sensibles y, en el balance, más rápidos para la detección de bacteriemia por MAI que los sistemas ISOLATOR 10 manual estándar y BACTEC 13A radiométrico. Otros autores también observaron que este método es superior a los métodos tradicionales.216

Sistemas de detección manuales Los sistemas manuales MGIT y Septi-Chek AFB son las dos opciones de sistemas de cultivo para micobacterias manuales con base de caldo disponibles en el comercio. El MGIT manual se describió antes, junto con la versión automatizada, el M GIT 960. Sistema Septi-Chek AFB

El sistema Septi-Chek AFB® es un frasco con tapa que con­ tiene 20 mL de caldo de Middlebrook 7H9 modificado bajo C 0 2 al 20%. Un segundo componente es un tubo de plástico, al que se ajusta en un extremo una tapa a rosca extraíble, dentro de la que está encerrada una paleta de dos caras, a ambos lados de la cual están introducidos medios de cultivo sólidos. Una su­ perficie de la paleta está cubierta por agar de Middlebrook 7H11; el lado inverso está dividido en dos secciones: una con­ tiene el medio de LJ modificado y la otra, agar chocolate para detectar el crecimiento de las bacterias contaminantes. El siste­ ma se procesa retirando la tapa del frasco que contiene el medio de cultivo, al cual se agrega 1 mL de un suplemento reconstituido que también provee el fabricante, compuesto por glucosa, glicerina, ácido oleico, piridoxina, HCI, catalasa, albúmina, azlocilina, ácido nalidíxico, trimetoprim, polimixina B y anfotericina B. Se inocula a continuación el caldo con

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C A P ÍT U LO 19 Micobacterias

suplemento con 0,5 mL de una muestra procesada con NALCNaOH. Se retira la tapa a rosca de la parte inferior de la paleta y se asegura el conjunto al frasco de cultivo en caldo. Se ino­ culan los medios de cultivo sólidos de la paleta inviniendo el conjunto, lo que permite que la mezcla de cultivo en caldo bañe todas las superficies del agar. Luego se coloca el sistema en una estufa de incubación a 35 °C en posición vertical. Las superfi­ cies del agar y los medios de cultivo se examinan cada tres días para detectar proliferación, después de lo cual, si es negativo, se invierte nuevamente el conjunto para volver a inocular el medio de agar. Si se observa proliferación, se pueden realizar frotis ácido-alcohol resistentes de las colonias aisladas que cre­ cen sobre la superficie del agar y se pueden realizar subcultivos del caldo en medios selectivos apropiados o pueden ser prepa­ rados para el análisis con sonda de DNA. En un estudio de cuatro centros en los cuales se estudiaron más de 3 000 muestras clínicas, Isenberg y cois, observaron que el sistema Septi-Chek era más sensible que LJ. 7H 11 y caldo BACTEC en el porcentaje de aislamientos de micobacterias.150 Los autores llegaron a la conclusión de que esta tasa mejor de aislamiento podía atribuirse a la naturaleza bifásica del sistema y a la ventaja obtenida de la exposición temprana y repetida del medio de agar a los microorganismos en proliferación activa en la fase de caldo. En comparación con LJ y 7 H 11, la cantidad promedio de días para el aislamiento de las micobacterias fue inferior para el sistema Septi-Chek AFB, que promedió 3 días menos para la detección de M. tuberculosis y 9 días menos para MAC. Aunque el tiempo de aislamiento con el sistema BAC­ TEC fue inferior en un promedio de 3 días para M. tuberculosis y de 12 días para MAC en comparación con el sistema SeptiChek, el primero no abastece las colonias aisladas; por lo tanto, el tiempo hasta la identificación final fue casi igual entre los dos sistemas. Se observaron resultados similares en un estudio de seguimiento de D ’Amato y cois, del sistema Septi-Chek AFB revisado, en el cual se agregó agar de LJ a la paleta.66 Un estu­ dio ulterior también confirmó que tanto la tasa como el tiempo de aislamiento de M. tuberculosis, MAC y M. gordonae de las secreciones respiratorias con frotis positivos mejoraron con el sistema Septi-Chek AFB respecto del medio de LJ.311 En este estudio, los frascos de BACTEC 12A detectaron el crecimiento de estas especies de Mycobacterium antes que Septi-Chek; sin embargo, como se observó en el estudio de D'Am ato y cois., el último proporcionó colonias aisladas antes y no requirió un equipamiento especial para la detección del crecimiento.

Identificación de micobacterias mediante métodos convencionales Aunque se están utilizando cada vez más las aplicaciones de las técnicas moleculares para la detección directa de M. tuber­ culosis en muestras clínicas, la identificación de las micobac­ terias cultivadas y en los estudios epidemiológicos, la evalua­ ción directa de las muestras clínicas mediante los métodos con­ vencionales sigue siendo el estándar de la práctica en la mayo­ ría de los laboratorios de micobacteriología clínica.134 Los pro­ tocolos 19-1 a 19-16 proporcionan una presentación detallada de los principios, los reactivos, los procedimientos y la inter­ pretación de las distintas técnicas de laboratorio, que incluyen los métodos de digestión-descontaminación, las pruebas bio­ químicas (incluidas en el cuadro 19-7) y las pruebas de sensi­ bilidad a los antibióticos. Se explica por separado el uso de los ensayos moleculares, que incluyen el análisis de sondas de áci­ dos nucleicos.

Temperatura óptima para el aislamiento y velocidad de crecimiento

Cada especie de Mycobacterium tiene una temperatura ópti­ ma para el crecimiento y un intervalo para el aislamiento en cultivo (cuadro 19-7). El tiempo hasta el aislamiento varía de acuerdo con el tipo de medio utilizado; el tiempo promedio de aislamiento de las micobacterias en los medios con base de huevo es de unos 21 días, pero varía desde tan sólo 3-5 días hasta 60 días, según la especie. En general, el tiempo hasta el aislamiento en los medios sólidos es varios días más corto cuando se utiliza agar 7H10 o 7H11 si se usa la técnica de observación microscópica para microcolonias (descrita más adelante). El cultivo con base de caldo, para la inoculación de los hemocultivos en caldo y otros líquidos corporales, puede acortar considerablemente los tiempos de detección.66 177'287 Se puede utilizar cualquier medio de cultivo no selectivo estándar cuando se evalúa el tiempo de crecimiento, ya sea en tubos con agar inclinados (“pico de flauta”) o en placas de Petri. Una colonia bien aislada del microorganismo de prueba se subcultiva en un caldo 7H9 que contiene Tween 80 y se incu­ ba durante varios días o hasta que el medio esté ligeramente turbio. Se diluye el caldo 1:100 y se hacen líneas de aislamien­ to en el medio de prueba, ya sea en tubos con agar inclinados o en placas de Petri, para obtener colonias aisladas. Para deter­ minar con precisión la velocidad de crecimiento, es necesario utilizar un inóculo lo suficientemente diluido como para pro­ ducir colonias individuales. Un inóculo de gran cantidad de micobacterias de crecimiento lento puede formar una colonia visible en algunos días y da una impresión errónea de la velo­ cidad de crecimiento. Se deben utilizar cultivos de reserva de M. tuberculosis con velocidades de crecimiento conocidas como control para los microorganismos de crecimiento lento; asimismo, se pueden utilizar cultivos de reserva de M. fortuitum como comparación de control para los microorganismos de crecimiento rápido. Se prefieren las placas de Petri de agar 7H10 o equivalente al uso de los medios en tubo porque se puede estudiar la apari­ ción de microcolonias en desarrollo con un microscopio de disección o de poco aumento. Con experiencia, una evaluación de la morfología de estas microcolonias puede ser útil para excluir ciertas micobacterias, y potencialmente la clasificación preliminar de otras. Runyon publicó pautas por medio de las cuales los que han obtenido experiencia con este enfoque pue­ den distinguir las microcolonias de distintas especies de micobacterias.296 En el laboratorio de microbiología clínica en la University of Illinois, Chicago, Koneman y cois, pudieron detectar las microcolonias de 29 aislamientos clínicos con frotis positivo de especies de Mycobacterium que crecen en agar 7H10 en un promedio de 6,1 días (intervalo, 3 a 12) en comparación con tiempos de aislamiento promedio con el uso de observaciones visuales estándares de 32,4 días con Lowenstein-Jensen y 27,9 días con agar 7H11 (comunicación personal). El tiempo de detección promedio para estos 29 aislamientos fue de 5,8 días por el sistema BACTEC, con el uso de los frascos 12B radiométricos. Los resultados de este estudio indican que las micobacterias pueden detectarse observando microcolonias en el mismo período acortado que el logrado con el sistema BAC­ TEC. El método de las microcolonias también permite una evaluación de la morfología de las colonias, lo que proporcio­ na otra pieza de información que no brinda el sistema BAC­ TEC, lo cual es útil para hacer una caracterización presuntiva temprana de una especie de Mycobacterium desconocida. En un estudio que examinó el tiempo hasta la detección, el tiem-

Identificación de m icobacterias m ediante m étodos convencionales

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po promedio hasta la detección de microcolonias de M. tuber­ culosis fue de 11 días en agar de Middlebrook 7 H 11, mientras que fue de 16 días con los frascos de MB/BacT y de 19,5 días con el medio de LJ.105 Algunas especies de Mycobacterium, como M. marinum y algunas de las bacterias de crecimiento rápido, crecen mejor a temperaturas que son ligeramente inferiores a la temperatura corporal central. Esto también puede asociarse con el hecho de que la enfermedad producida por estos microorganismos, sobre todo M. marinum, afecta sobre todo las extremidades, que se encuentran ligeramente más frías que la temperatura corporal central. Por lo tanto, los laboratorios deben incubar cultivos de micobacterias de muestras que pueden contener estos microor­ ganismos (p. ej., biopsias cutáneas de las extremidades) y tem­ peraturas ligeramente reducidas.

Tween 80 es el nombre comercial de un detergente que puede ser útil para la identificación de micobacterias que tienen una lipasa que divide el compuesto en ácido oleico y sorbitol polioxietilado. Esta prueba es útil para identificar a M. kansa­ sii, que puede producir un resultado positivo de la prueba tan sólo en 3 a 6 horas. Se pueden diferenciar dos escotocromógenos con colonias de aspecto similar: M. gordonae (positivo) y M. scrofulaceum (negativo), utilizando la prueba de hidrólisis de Tween 80. En el cuadro 19-8 se mencionan las reacciones de hidrólisis de Tween 80 para otras micobacterias; el proce­ dimiento de la prueba se describe en detalle en el protocolo 19-15 y en la lámina en color 19-2G se muestra una reacción positiva.

Producción de pigmento

Actividad de catalasa

La determinación de si una especie de Mycobacterium des­ conocida puede producir pigmentación de las colonias en la oscuridad (escotocromógeno) o sólo después de la exposición a la luz (fotocromógeno) no es muy útil para la identificación final de la especie, pero puede serlo para estrechar las posibili­ dades (véase protocolo 19-6). M. tuberculosis no produce pig­ mento, más allá de un color beige claro, aun después de la exposición a la luz. Las capacidades productoras de pigmento de otras especies de Mycobacterium se enumeran en el cuadro 19-7 (véase lámina en color 19-2C-E).

La mayoría de las micobacterias producen catalasa; sin embargo, no todas las especies son capaces de producir una reacción positiva después del calentamiento del cultivo a 68 °C durante 20 minutos (catalasa termoestable). La mayoría de las cepas de M. tuberculosis y otros miembros del complejo M. tuberculosis no producen catalasa termoestable, salvo por cier­ tas cepas resistentes a la isoniazida (INH), para las cuales los resultados de esta prueba tienen un valor particular como posi­ ble marcador reemplazante. La actividad de catalasa se evalúa en forma semicuantitativa midiendo la altura lograda por la columna de burbujas producida cuando se agrega peróxido de hidrógeno a las colonias en crecimiento en un cultivo en tubo (véase protocolo 19-7). Para realizar esta prueba, se deben ver­ ter los tubos del medio de Lowenstein-Jensen en posición erec­ ta para producir una superficie plana en lugar de inclinada. Esta superficie recibe un inoculo importante de este microorganis­ mo y se incuba durante 14 días antes de agregar el reactivo de peróxido de hidrógeno. Una columna de más de 45 mm se con­ sidera una prueba positiva (véase lámina en color 19-2H). Se puede determinar una evaluación rápida de la actividad de catalasa colocando algunas gotas de peróxido de hidrógeno en las colonias que crecen sobre la superficie del agar de Middle­ brook 7H10 y observando la rápida efervescencia de las burbu­ jas (lámina en color 19-21).

Acumulación de niacina

Todas las micobacterias producen niacina; sin embargo, sólo M. tuberculosis, M. simiae y cepas ocasionales de M. africanum, M. bovis, M. marinum y M. chelonae carecen de la enzima nece­ saria para convertir la niacina a ribonucleótido de niacina. Por lo tanto, la determinación de si la niacina se ha acumulado en el medio de cultivo es una prueba diferencial útil para identifi­ car a estas especies de micobacterias, sobre todo M. tuberculo­ sis (véanse los detalles en el protocolo 19-11). Se han creado tiritas de papel de filtro impregnadas con reactivo que eliminan la necesidad de utilizar bromuro de cianógeno, una sustancia altamente tóxica, como se requiere en el método original para realizar esta prueba. La aparición de un color amarillo en el medio de prueba incubado con una tirita reactiva es indicativa de la acum ulación de niacina y una prueba positi­ va (véase lámina en color 19-1D). Es esencial tener el creci­ miento suficiente en el medio prim ario con base de huevo, de otro modo aum enta el riesgo de obtener resultados falsos negativos. Reducción de nitratos a nitritos

Sólo algunas especies de micobacterias, sobre todo M. tuberculosis, producen nitrorreductasa, que cataliza la reduc­ ción de nitrato a nitrito. La aparición de un color rojo además del ácido sulfánico y iV-naftiletilenediamina a un extracto de un cultivo desconocido es indicativa de la presencia de nitrito y una prueba positiva (véase protocolo 19-12). La prueba debe realizarse con cuidado utilizando tres cultivos de control: uno conocido por dar una reacción positiva fuerte; uno, una reac­ ción débil y el último, una reacción negativa. Además de apo­ yar la identificación de M. tuberculosis, la prueba de reducción de nitratos es clave para la identificación de M. kansasii y M. szulgai (véanse cuadro 19-7 y lámina en color 19-1E).

Hidrólisis de Tween 80®

Actividad de arilsulfatasa

La determinación de la actividad de la enzima arilsulfatasa en las micobacterias es útil para identificar ciertas especies, en especial para diferenciar las micobacterias de crecimiento rápi­ do de las micobacterias no fotocromogénicas del grupo III (véase lámina en color 19-2J). M. marinum, M. kansasii, M. szulgai y M. xenopi también pueden producir pequeñas canti­ dades de esta enzima (véase cuadro 19-8). Sin embargo, estas especies de crecimiento más lento no producen la enzima sufi­ ciente como para dar una reacción constantemente positiva. La aparición de un color rojo en el medio de prueba, que indica la liberación de fenolftaleína libre, es un resultado positivo (véase protocolo 19-5). Actividad de ureasa

La evaluación de la actividad de ureasa es una prueba impor­ tante para diferenciar M. scrofulaceum (positivo) de M. gordo­ nae (negativo). También es útil para diferenciar M. gastri (posi­

1038

C A P ÍT U L 0 19 Micobacterias

tivo) de otros miembros de las micobacterias no cromogénicas del grupo III (véase cuadro 19-7). La determinación de si cual­ quier especie de micobacteria dada puede producir ureasa se puede realizar inoculando el microorganismo en agua destilada que contiene un concentrado con base de urea o con el uso de discos de papel de filtro que contienen urea que se agrega al agua destilada.253,391 En el protocolo 19-16 se presentan los detalles de la prueba de la ureasa según se aplica a la identifi­ cación de las especies de Mycobacterium (véase también lámi­ na en color 19-2K).

Cuadro 1 9 -7

Pirazinamidasa

Otra prueba útil para distinguir M. kansasii y M. marinum, M. bovis y M. tuberculosis débilmente niacina positivos y los miem­ bros del complejo de M. avium de otras especies es la prueba para la pirazinamidasa (todos positivos). La pirazinamidasa es una enzima que desamina la pirazinamida para formar ácido pirazinoico, que produce una banda roja en el medio de cultivo.373 En el protocolo 19-13 se presentan los detalles de esta prueba y se muestra la reacción final en la lámina en color 19-12L.

Características diferenciales de las micobacterias TEMPERATURA DE AISLAMIENTO Y TIEMPO PARA CRECIMIENTO OPTIMOS

CRECIMIENTO CON PIGMENTACIÓN EN Luz

Oscuridad

PRUEBA DELA NIACINA

REDUCCIÓN DE NITRATO

HIDRÓLISIS DE TWEEN 80 -10 DIAS

M. tuberculosis

37 °C 12-25 d

Color beige

C olor beige

+

+

V

M. africanum

37 »C 31-42 d

Color beige

C olor beige

V

V

■-

M. bovis

37 °C 24-20 d

Color beige

C olor beige

V

-

-

M. ulcerans

32 °C 28-60 d

Color beige

C olor beige

-

-

-

M. kansasii

37 °C 10-20 d

Amarillo

C olor beige

-

+

+

M. marinum

30 °C 5-14 d

Amarillo

C olor beige

V

-

+

M. simiae

37 °C 7-14 d

Amarillo

C olor beige

+

-

+ /-

M. asiaticum

37 °C 10-21 d

Amarillo

C olor beige

-

-

+

M. szulgai

37 °C 12-25 d

Am arillo a naranja

A m arillo-37 °C Color beige- 25 °C

-

+

V

M. scrofulaceum

37 °C 10 d

Amarillo

Amarillo

-

-

-

M. gordonae

37 °C 10 d

Am arillo a naranja

Amarillo

-

-

+

M. thermoresistible

45 °C 7 d

Amarillo

Amarillo

-

+

+

M. flavescens

37 °C 7-10 d

Amarillo

Amarillo

-

+

+

M. xenopi

42 °C 14-28 d

Amarillo

Amarillo

-

-

-

Com plejo M. avium

37 °C 10-21 d

Color beige a amarillo pálido

C olor beige a amarillo pálido

-

-

-

M. haemophilum

30 °C 14-21 d

Gris

Gris

-

-

-

-

-

+

M. malmoense

37 °C 21-28 d

Color beige

C olor beige

M. shimoidei

37 °C 14-28 d

Color beige

C olor beige

-

-

+

M. genavense

37 °C 14-28 d

Color beige

Color beige

-

-

+

M. celatum

37 °C 14-28 d

Color beige

C olor beige

-

-

-

M. gasti

37 °C 10-21 d

Color beige

Color beige

-

-

+

Com plejo M. terrae

37 °C 10-21 d

Color beige

C olor beige

-

V

+

M. triviale

37 °C 10-21 d

Color beige

Color beige

-

+

+

M. fortuitum

37 °C 3-5 d

Color beige

C olor beige

-

+

V

V

-

V

-

-

V

-

+

+

M. chelonei

28 °C 3-5 d

Color beige

C olor beige

M. abscessus

35 °C 3-5 d

Color beige

C olor beige

M. smegmatis

37 °C 3-5 d

Color beige a amarillo

Color beige a amarillo

+, positivo;

negativo; V, variable; espacios en blanco, pocos datos o ninguno.

.

Identificación de m icobacterias m ediante m étodos convencionales

Inhibición del crecimiento por la hidrazida del ácido tiofeno-2-carboxílico

Captación de hierro

Las micobacterias de crecim iento rápido tienen muchas similitudes. La capacidad de M. fortuitum para captar sales solubles de hierro del medio de cultivo y para producir un aspecto pardo oxidado con el agregado de una solución acuo­ sa de citrato de amonio férrico al 2%, es una característica útil que diferencia a este microorganismo de M. chelonae y de M. abscessus, que carecen de esta propiedad (véase protocolo 19-10).374

La hidrazida del ácido tiofeno-2-carboxílico (T2H) inhibe selectivamente el crecimiento de M. tuberculosis, mientras que la mayoría de las otras micobacterias pueden crecer en un medio que contiene este compuesto; esto es muy útil para dife­ renciar ciertas cepas de M. bovis (véanse protocolo 19-9 y lámina en color 19-1F). Por ejemplo, el 30% de las cepas de BCG de M. bovis pueden ser débilmente niacina positivas, y

CRECIM IENTO EN

CATALASA

Af. tuberculosis

1039

Semicuantitativa

pH 7,0; 68 °C

ARILSULFATASA 3 DIAS

PIRAZINAMIDASA

INGRESO DE HIERRO

T,H (1 |Xg/mL)

5% NaCI

UREASA

<45

-

-

+

+

-

+

-

28 °C

-

V

-

-

+

-

-

+

-

-

-

-

+

-

V

-

-

+

-

-

+

+

-

+

-

M. africanum

>45

M. bovis

<45

M. ulcerans

>45

M. kansasii

>45

+

-

M. marinum

>45

-

V

+

+

-

+

M. simiae

>45

+

-

+

-

-

+

-

M. asiaticum

>45

+

-

-

-

-

+

-

M. szulgai

>45

+

-

+

-

-

+

-

M. scrofulaceum

>45

+

-

+

V

-

+

-

M. gordonae

>45

+

-

-

V

-

+

-

M. thermoresistible

>45

+

-

+

M. flavescens

>45

+

-

+

+

-

+

V

M. xenopi

>45

+

+

-

+

-

+

-

Com plejo M. avium

<45

-

-

-

+

-

+

M. haemophilum

<45

-

-

-

+

-

+

-

M. malmoense

<45

V

-

V

V

-

+

-

Agar de M acConkey

+

-

V

M. shimoidei

<45

-

-

-

+

-

+

M. genavense

>45

+

-

+

+

-

+

-

M. celatum

<45

+

+

-

+

-

+

-

M. gasti

<45

-

-

+

-

-

+

-

Com plejo M. terrae

>45

+

+

-

V

-

+

M. triviale

>45

+

V

-

V

-

+

+

M. fortuitum

>45

+

+

+

+

+

+

+

M. chelonei

>45

+

+

+

+

-

+

-

M. abscessus

>45

+

+

+

+

-

+

+

M. smegmatis

>45

+

-

+

+

-

V

+

+

o

O CAPÍTULO 19

Nomenclatura de micobacterias seleccionadas en orden de presentación

NOMBRE RECONOCIDO DE LA ESPECIE

PATOGENICIDAD RELATIVA PARA LOS SERES HUMANOS

GRUPO EQUIVALENTE DE RUNYON

NOMBRE COMÚN ACEPTABLE

NOMBRES NO RECONOCIDOS Y COMENTARIOS

M. tu b ercu lo sis

+++

Bacilo tuberculoso humano

Produce tuberculosis hum ana -altam en te contagiosa

M. b ovis

+++

Bacilo tuberculoso bovino

Produce tuberculosis bovina y hum ana; se utilizan las cepas avirulentas para las vacunas del bacilo de Calm ette-G uérin (BCG)

M. ulcera n s

+++

Asociada con infecciones cutáneas en el trópico -M . b u ru li

M. a fric a n u m

+++

M. k a n sa sii

+++

Fotocrom ógeno I

Cepas raras, no pigm entadas, escotocrom ógenas y nia­ cina positivas

M . m a rin u m

+++

Fotocrom ógeno I

M. balnei, M . p la ty p e o cilu s; asociados con infecciones

Form a interm edia entre M. b o v is y M. tuberculosis. Se encuentra en el norte y centro de Africa

cutáneas M . sim ia e

++

Fotocrom ógeno I

M . habana', patógeno facultativo; la fotorreactividad

puede ser inestable; niacina positivo M . g e n a ve n se

++

M. asia ticu m

++

Fotocromógeno I

Sim ilar a M . sim ia e pero difiere antigénicam ente

M . scro fu la ceu m

++

Escotocrom ógeno 11

M. m a rin u m y MAI; pueden producir linfadenitis cervical

Fotocrom ógeno I a 25 °C Escotocrom ógeno II a 37 "C

A sociado con enferm edad pulm onar y extrapulm onar crónica; com posición lipídica definida de las paredes celulares

No fotocrom ógeno III

M. littorale, M . x e n o p i ; crece lentamente; mejor a 42 °C;

M . szu lg a i

M. xenopi

+++

++

Crece sólo en cultivo en caldo. Tendencia a producir enferm edad disem inada pulm onar en pacientes con SIDA

puede contam inar los sistem as de agua corriente

Micobacterias

Cuadro 1 9 -8

M. celatum

M. gordonae

M. thermoresistible

M. avium/M. intracellulare

Tendencia a producir infecciones respiratorias en pacientes con SIDA. Se asem eja estrechamente a M. xenopi

+

0/+

+

+++

Escotocrom ógeno II

Escotocrom ógenos del agua corriente

hum anos Crecim iento a 52° C. Potencialm ente patógeno. Crecim iento lento

Escotocrom ógeno II

N o fotocrom ógeno III"

M. aquae; en ocasiones patógeno para los seres

Bacilo de Battey

M. batteyi, M. battey', a m enudo resistente a los fárm a­ cos A m enudo causa com pleja de infección en pacientes con SIDA

M. terrae M. shimoidei

Rara

No fotocrom ógeno III

Bacilo del rábano

P uede estar estrecham ente relacionado con M. triviale Se asem eja al com plejo M. terrae C asos raros de infecciones pulm onares

+

0/+

N o fotocrom ógeno III

M. malmoense

+++

N o fotocrom ógeno III

Bacilo V

Ha sido denom inado Mycobacterium atípico-atípico

Mycobacterium de crecim iento lento que suele causar enferm edad pulm onar

M. haemophilum

M. fortuitum

+++

++

N o fotocrom ógeno III

Asociado con infecciones cutáneas habitualm ente en pacientes inm unosuprim idos

Bacilo de crecim iento rápido IV

M. ranae; M. minetti: infecciones cutáneas y pulm ona­ res. Puede causar enferm edad en huésped inmunosuprimido. Puede causar infección hospitalaria

M. cheloneae

++

Bacilo de crecim iento rápido IV

Puede causar infecciones cutáneas, sobre todo en per­ sonas con inm unidad celular com prom etida. Causa im portante de enfermedad pulm onar en pacientes con enferm edad respiratoria crónica

M. abscessus

++

Bacilo de crecim iento rápido IV

Puede causar infecciones cutáneas, sobre todo en per­ sonas con inm unidad celular com prom etida. Causa im portante de enfermedad pulm onar en pacientes con enferm edad respiratoria crónica

aLas cepas aisladas en pacientes con SIDA a menudo son escotocromógenas. Adaptado de Sommers HM. The Clinically Significant Mycobacteria. Chicago: American Society o f Clinical Pathologists, 1974.

Identificación de micobacterias mediante métodos convencionales

M. triviale

1041

1042

C A P ÍT U L 0 19 Micobacterias

otras pueden ser reductores débiles del nitrato, lo que a veces dificulta la diferenciación de estas cepas de M. tuberculosis. Crecimiento en cloruro de sodio al 5%

La capacidad de crecer en un medio de cultivo con base de huevo que contiene NaCl al 5% cuando se lo incuba a 28 °C es una característica compartida por M. triviale, algunas cepas de M. flavescens, M .fortuitum y M. abscessus (véase cuadro 19-8). Otras micobacterias no toleran este aumento de las concentra­ ciones de sales. Existen porciones inclinadas del medio de Lowenstein-Jensen que contienen NaCl al 5%. La prueba no se puede realizar en un medio con base de agar (véase protocolo 19-14 para los detalles).189 Crecimiento en agar de MacConkey

El agar de MacConkey, del cual se ha eliminado el violeta de genciana (“cristal violeta”), es el sustrato de crecimiento de las micobacterias de crecimiento rápido. Sin embargo, la mayoría de las otras especies de M ycobacterium no pueden crecer en este medio. El procedimiento de prueba se detalla en el proto­ colo 19-8.

Clasificación de las micobacterias El reconocimiento de que un microorganismo desconocido es “ácido-alcohol resistente” suele ser el primer indicio de que puede ser una micobacteria. La denominación de ácido-alcohol resistente se utiliza para describir bacterias que resisten a la decoloración con alcohol acidificado una vez que han sido teñi­ das con carbolfucsina. Algunas especies de bacterias, sobre todo las de Nocardia y las de Rhodococcus, sólo retienen la carbolfucsina si se utiliza un agente decolorante menos restric­ tivo, como un ácido inorgánico en baja concentración; por ejemplo, H 2S 0 4 al 1% o HC1 al 1%. Estas especies se denomi­ nan “parcialmente ácido-alcohol resistentes”. Wayne y Kubica consideran que las especies de Corynebac­ terium, Nocardia y Rhodococcus están agrupadas en un supergénero basado sobre muchas similitudes.375 Designaron este grupo de microorganismos como grupo CNM. Se han presen­ tado en otros sitios los detalles para la identificación de estas especies distintas de las micobacterias. El lento crecimiento, la presencia de bacilos ligeramente curvos o rectos grampositivos arrosariados que pocas veces se ramifican, la resistencia a la lisozima y los patrones de reacciones en las pruebas bioquími­ cas presentadas antes son las características que permiten el reconocimiento de las micobacterias y por medio de las cuales se pueden identificar las especies. Sin embargo, la taxonomía y la clasificación de las especies de M ycobacterium se han vuel­ to algo complejas. Las relaciones y la identidad de estos micro­ organismos se están redefiniendo a través de la secuenciación del DNA. A finales de la década de 1950, a medida que se encontraban especies de micobacterias distintas de M. tuberculosis con una frecuencia creciente en el ejercicio médico, Runyon propuso el agrupamiento de estos microorganismos “atípicos” sobre la base de la velocidad de crecimiento y la producción de pigmen­ to (recuadro 19-2). Los progresos en nuestro conocimiento de la genética, la estructura celular y las propiedades fenotípicas no convencionales de las cepas de micobacterias ya conocidas y de las recién descubiertas han adelantado nuestro conocimiento más allá de la categorización impecable de las especies bajo el

sistema de Runyon clásico de clasificación, que ha servido a los laboratorios de microbiología durante las tres últimas déca­ das. Además, Sommers y Good señalan que algunas cepas de M. kansasii, por ejemplo, tienen pigmento en la oscuridad o son no pigmentadas (lo que califica para el grupo II o grupo III de Runyon, respectivamente).324 También se han hallado espe­ cies pigmentadas en el complejo MAI. Por lo tanto, puede ser engañoso confiar en estos criterios fenotípicos, y Sommers y Good aconsejan que cada aislamiento debe ser identificado y considerado en forma definitiva por su identidad individual a la luz de los posibles síndromes patológicos asociados. Asi­ mismo, Woods y Washington han sugerido una clasificación con orientación clínica de las micobacterias (recuadro 19-3), refinada a partir de una propuesta publicada anterior de Wolinski.393-399 No obstante, para el micobacteriólogo con entrenamiento tradicional, la separación de M. tuberculosis (y de M. bovis) de las micobacterias distintas de M. tuberculosis (“M ycobacte­ rium other than M. tuberculosis", MOTT) y la separación pre­ liminar de MOTT en los cuatro grupos de Runyon seguirá pro­ porcionando una orientación inicial significativa. El hecho de que ciertas cepas de M. kansasii habitualmente fotocromógenas pueden ser no pigmentadas o incluso escotocromógenas, que algunas cepas del complejo MAI pueden ser levemente pigmentadas, e incluso que M. szulgai es escotocromógena a 37 °C pero fotocromógena a 25 °C (lo que altera por cierto el esquema de Runyon) no sugiere que las orientaciones pasadas deban descartarse por completo, sino más bien que se debe reconocer la variabilidad fenotípica de estos microorganismos y se la debe incorporar en los esquemas de identificación con­ vencionales. Identificación de laboratorio de las micobacterias y síndromes clínicos relacionados

La identificación de las micobacterias por los métodos tradi­ cionales no es difícil pero requiere paciencia, familiaridad con los parámetros de las diferentes características de identifica­ ción y un conjunto de cepas control. No es preciso que todo laboratorio cuente con la capacidad de identificar todas las especies de micobacterias. La cantidad de pacientes con tuber­ culosis en cualquier hospital de los Estados Unidos no es gran­ de, y puede ser prudente utilizar los servicios de un laboratorio de referencia para proporcionar las identificaciones definitivas y las pruebas de sensibilidad de las cepas de importancia clínica aisladas en el laboratorio de atención primaria. Cada director del laboratorio o supervisor de microbiología debe determinar el grado de los servicios provistos para cubrir las necesidades del ejercicio clínico local. El cuadro 9-9 es una lista de las

Recuadro 19-2

E sq uem a de clasificación d e R u y n o rr

Grupo I: fotocrom ógenos Grupo II: escotocrom ógenos Grupo III: no fotocrom ógenos Grupo IV: de crecimiento rápido

“No incluye complejo M. tuberculosis, incluido M. bovis.

C lasificación de las m icobacterias

R ecuadro 1 9 -3

Esq uem a de clasificación de W oods y W ashington, actu alizado

Especies potencialmente patógenas en seres humanas Complejo M. avium/M. intracellulare M. kansasii De crecim iento rápido: M. fortuitum, M. chelonae, M. abscessus M. scrofulaceum M. xenopi M. szulgai M. malmoense M. simiae M. genavense M. marinum M. ulcerans M. haemophilum M. celatum

Micobacterias saprofitas que pocas veces causan enfermedad en seres humanos M. M. M. M. M. M. M.

gordonae asiaticum terrae triviale shimoidei gastri nonchromogenicum A/, paratuberculosis

Especies con velocidad de crecimiento intermedia M. flavescens

Otras especies de crecimiento rápido M. thermoresistible M. smegmatis M. vaccae Com plejo M. parafortuitum M. phlei

opciones del grado o el nivel de los servicios, de acuerdo con las pautas de inspección y acreditación provistas por el College of American Pathologists. La experiencia en los últimos años con el estudio Special Mycobacterial Interlaboratory Survey del College of American Pathologists ha mostrado que cada vez más laboratorios están limitando sus servicios para infecciones por micobacterias a la preparación y la interpretación de los frotis teñidos para baci­ los ácido-alcohol resistentes, el establecimiento de cultivos pri­ marios y la derivación de los cultivos positivos a laboratorios de referencia para la identificación y las pruebas de sensibili­ dad.323,397 Las medidas de restricción de costos impuestas en la mayoría de los laboratorios clínicos y la disponibilidad comer­ cial de sondas de ácidos nucleicos, que pueden proporcionar resultados más exactos y rápidos están estimulando a los labo­ ratorios a brindar no más servicios que los requeridos para los laboratorios de nivel 1 o, a lo sumo, de nivel 2.

1043

Revisión de las especies de Mycobacterium: características del laboratorio y correlaciones clínicas

Aunque se puede hacer un diagnóstico presuntivo de tuber­ culosis pulm onar sobre la base de la anamnesis, los síntomas de presentación, el examen físico, las pruebas radiológicas de enfermedad y la presencia de bacilos ácido-alcohol resisten­ tes en el esputo, el diagnóstico definitivo requiere el aisla­ miento de los microorganismos causales en cultivo o su demostración mediante métodos de amplificación de ácidos nucleicos. En la actualidad, se reconocen varias especies de Mycobacterium distintas de M. tuberculosis como patógenos pulmonares importantes, cada una con un potencial diferente para causar enfermedad y a menudo con perfiles singulares de sensibilidad a los antibióticos que deben ser determinados con las pruebas de laboratorio. Se puede aislar una amplia variedad de especies de Mycobacterium en sitios extrapulmonares, como sangre, piel, tejidos blandos, y huesos y articula­ ciones. En el recuadro 19-4 se enumeran las características de los cultivos de laboratorio y las manifestaciones clínicas de enfermedades humanas seleccionadas producidas por micobacterias. COMPLEJO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS M ycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis, la

causa más frecuente de enfermedad por micobacterias en los seres humanos, es a menudo un foco importante de la identifi­ cación definitiva en muchos laboratorios. Tradicionalmente, se ha enseñado que las cepas clásicas de M. tuberculosis pueden diferenciarse fenotípicamente de M. bovis y las especies inter­ medias, M. microti y M. africanum .375 Sin embargo, varios parámetros, entre ellos, análisis de extractos antigénicos, epíto­ pos diana para anticuerpos monoclonales y estudios antigéni­ cos y de relación de DNA, indican que M. tuberculosis, M. bovis, M. microti y M. africanum representan una única espe­ cie considerada actualmente bajo el término general “comple­ jo M. tuberculosis”. Se necesitan algunas pruebas relativamente simples para identificar a la mayoría de los aislamientos del complejo M. tuberculosis. Algunas son más fáciles en los laboratorios donde se utilizan cultivos con base de caldo. Las siguientes son carac­ terísticas fenotípicas por medio de las cuales se puede realizar una identificación de M. tuberculosis: 1. Formación de colonias no pigmentadas, rugosas y color beige después de 14 a 28 días de incubación a 37 °C en los medios de Lowenstein-Jensen o de Middlebrook (véase lámina en color 19-1G y H). 2. A parición de m icrocolonias luego de 5 a 10 días de in ­ cubación en los agares de M iddlebrook 7H10 o 7H11, con form ación de cordones en serpentina debido a la producción del “factor cordón” (véase lám ina en color 19-1C e I). 3. Acumulación de niacina (M. simiae, algunas cepas de M. bovis y cepas ocasionales de M. marinum y M. chelonae también pueden ser niacina positivas); por lo tanto, se debe utilizar esta característica junto con los otros hallazgos (véase lámina en color 19-ID). 4. Reducción de nitratos a nitritos (véase lámina en color 19-1E). 5. Capacidad para crecer en presencia de hidrazida de ácido tiofeno-2-carboxílico (T2H; véase lámina en color 19-1F). 6. Falta de actividad de catalasa.

1044

C A P ÍT U LO 19 Micobacterias

Cuadro 19-9

Extensiones o niveles de servicio autodeterminados por el laboratorio según lo propone el College of American Pathologists y la American Thoracic Society

EXTENSIONES DE SERVICIO DEL COLLEGE OF AMERICAN PATHOLOGISTS PARA LA PARTICIPACIÓN EN LOS ESTUDIOS DE COMPARACIÓN INTERLABORATORIO PARA MICOBACTERIAS

1. No se realizan procedim ientos para m icobacterias

2. Tinción ácido-alcohol resistente de exudados, derrames y líquidos corporales, con inoculación y derivación de los cultivos a laboratorios de referencia para una m ejor identificación

3. A islamiento de micobacterias; identificación de M. tuberculosis e identificación prelim inar de las form as atípicas com o fotocrom óge­ nos, escotocrom ógenos, no fotocromógenos y bacilos de crecim iento rápido. Se pueden realizar o no pruebas de sensibilidad a los fármacos 4. Identificación definitiva de las m icobacterias aisladas en la m edida necesaria para establecer un diagnóstico clínico correcto y ayudar en la selección de un tratam iento seguro y eficaz. Se realizan pruebas de sensibilidad a los fármacos

7. Inhibición selectiva del crecimiento en medios de cultivo en caldo que contienen NAP (véanse los detalles de este pro­ cedimiento en el protocolo 19-4). La inhibición de NAP por M. tuberculosis se utiliza en muchos laboratorios como prueba clave para las identificacio­ nes iniciales, sobre todo para los aislamientos en hemocultivos. NAP inhibe selectivamente el crecimiento de M. tuberculosis, y en el sistema BACTEC, la capacidad del microorganismo para liberar 14CO, del ácido palmítico 1-[I4C] radiactivo conte­ nido en el medio. En los sistemas de cultivo en caldo también se utiliza NAP para la inoculación de otras muestras frotis posi­ tivas para aumentar el aislamiento y acortar el tiempo hasta la detección. Aunque la identificación definitiva de la mayoría de las cepas de micobacterias NAP negativas requiere el aisla­ miento y la caracterización por el espectro de pruebas explica­ das antes o métodos moleculares, los aislamientos que también producen microcolonias con formación de cordones serpenti­ nos en agar 7H109 pueden ser identificarse presuntivamente como M. tuberculosis y confirmarse luego con otros estudios (véase lámina en color 19- IC). Las colonias aparecen “rugosas y color beige" después de 2-4 semanas de incubación en el medio de Lowenstein-Jensen (LJ). Estas observaciones son cri­ terios suficientes para justificar el comienzo del tratamiento empírico cuando está indicado desde el punto de vista clínico. La morfología celular típica de M. tuberculosis como se observa en las tinciones ácido-alcohol resistentes es un bacilo

NIVELES DE SERVICIOS DE LA AMERICAN THORACIC SOCIEY PARA LOS LABORATORIOS DE MICOBACTERIAS Nivel I la. Recogen muestras clínicas suficientes, que incluyen esputos inducidos por nebulizaciones Ib. Transportan las muestras a un laboratorio de nivel superior para el aislamiento y la identificación le. Pueden preparar y exam inar frotis para el diagnóstico presuntivo o com o medio de seguir el progreso de los pacientes diagnosticados que reciben trata­ m iento antibiótico Nivel II 2a. Pueden realizar todas las funciones de los laboratorios de nivel I y procesar muestras como sea necesario para cultivo en medios estándares basados sobre agar y huevo 2b. Identifican M. tuberculosis 2c. Se pueden realizar estudios de sensibilidad a fármacos contra M. tuberculosis con agentes antituberculosos primarios 2d. Retienen los cultivos de m icobacterias durante un tiem po razonable Nivel III 3a. Pueden realizar todas las funciones de los laboratorios de los niveles inferio­ res e identificar todas las especies de Mycobacterium de las muestras clínicas 3b. Realizan estudios de sensibilidad a fármacos contra micobacterias 3c. Retienen cultivos de m icobacterias durante un tiem po razonable 3d. Pueden llevar a cabo una investigación y proporcionar entrenam iento

delgado, ligeramente curvo que mide 0,3-0,6 x 1-4 mm, de tin­ ción rojo intenso (fuertemente ácido-alcohol resistente), con un aspecto arrosariado definido (véase lámina en color 19-15). En la preparación de los frotis provenientes de cultivos, a menudo es difícil dispersar las células individuales, las cuales parecen agregados irregulares o se ubican en bandas paralelas. Se pue­ den observar cordones definidos en las preparaciones de culti­ vos de caldo, en donde los agregados de bacilos ácido-alcohol resistentes forman largos cordones en serpentina. Se pueden observar micobacterias en la tinción de Gram como bacilos arrosariados grampositivos. El aspecto arrosariado se debe a la tinción no uniforme del bacilo. También se puede sospechar la presencia de una especie de Mycobacterium en las tinciones de Gram si se observan bacilos que se tiñen poco o nada rode­ ados por un halo claro (véase lámina en color 19-1J). El colo­ rante violeta de genciana en el reactivo de la tinción de Gram no penetra la gruesa pared celular lipídica y cerosa del los microorganismos y pueden aparecer como una imagen arrosariada o casi negativa contra el fondo contrateñido. Mycobacterium bovis. En la actualidad, Mycobacterium bovis está incluido en el complejo M. tuberculosis. Las característi­ cas fenotípicas por las cuales M. bovis puede ser diferenciado de las cepas clásicas de M. tuberculosis son las siguientes: 1. La mayoría de las cepas son niacina negativas. 2. Los nitratos no se reducen a nitritos. 3. No se produce pirazinamidasa.

C lasificación de las m icobacterias

Recuadro 19-4 Especies de

Mycobacterium: orden

de presentació n Complejo Mycobacterium tuberculosis M. M. M. M.

tuberculosis bovis africanum ulcerans (genéticam ente relacionado con M. marinum )

Fotocromógenos M. M. M. M.

kansasii marinum simiae genavense (genéticam ente relacionado con M. simiae pero no

crom ógeno)

M. asiaticum

Escotocromógenos M. scrofulaceum M. szulgai (fotocrom ógeno a 25 °C) M. xenopi M. celatum M. gordonae M. flavescens

No fotocromógenos Com plejo M. avium-intracellulare M. paratuberculosis M. terrae y M. triviale M. shimoidae

De crecimiento rápido M. fortuitum M. chelonae M. abscessus M. thermoresistible

4. Inhibición selectiva del crecimiento por T2H; M. bovis no crece en un medio que contiene T2H. Las cepas humanas clásicas tienen un ritmo de crecimiento muy lento, y producen colonias de aspecto “disgónico” en el medio de LJ. Por lo tanto, puede surgir un problema para reco­ nocer M. bovis en los laboratorios donde se descartan los culti­ vos LJ después de 4 semanas, porque a menudo se necesitan 6 a 8 semanas para un crecimiento visible. El crecimiento de la mayoría de las cepas es mejor en el medio de LJ que en el medio de Middlebrook 7H11 o equivalentes. El medio más favorable para M. bovis contiene piruvato al 0,4% sin glicerol. Las colonias típicas son de color beige, bajas y pequeñas, y pueden parecer lisas o rugosas en el medio que contiene huevo. En agar de Middlebrook 7H 11, las colonias son muy delgadas y a menudo muestran poca o ninguna formación de bandas (denominada “similar a gotitas de agua”). Estas colonias tam­ bién pueden simular formas disgónicas de microorganismos en el complejo MAI. Sin embargo, los últimos son catalasa posi­

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tivos a 68 °C, no producen ureasa y son pirazinamidasa positi­ vos. Si se ha agregado piruvato al medio, las colonias pueden mostrar cordones serpentinos similares a los de M. tuberculo­ sis eugónico. Algunas cepas de laboratorio de M. bovis, conocidas como BCG (bacilo de Calmette-Guérin), utilizadas como vacuna en regiones altamente endémicas del mundo, simulan M. tubercu­ losis por ser “eugónicas” o tener un crecimiento más rápido (3 a 4 semanas en el medio de LJ), presentar un aspecto rugoso y de color beige y, en algunos casos, acumular niacina. Sin embargo, estas cepas siguen siendo sensibles al T2H y se las puede diferenciar sobre esa base.116 La morfología microscópi­ ca de las células de M. bovis en los frotis con tinción para ácido-alcohol resistentes no es característica. FOTOCROMÓGENOS Mycobacterium kansasii. M. kansasii es una causa importante de enfermedad pulmonar que puede asemejarse desde el punto de vista clínico e histopatológico a la tuberculosis. Sin embar­ go, la enfermedad pulmonar debida a M. kansasii no tiene las mismas consecuencias para la salud pública que la tuberculosis y no es transmitida de una persona a otra. Conocido en un prin­ cipio como el “bacilo amarillo”, luego de la primera descrip­ ción de Buhler y Pollak en 1953, M. kansasii es un fotocromó­ geno clasificado dentro del grupo I de Runyon. Aunque ocurren infecciones en todos los Estados Unidos, la mayoría de los casos han sido comunicados en los estados del sur (Texas, Louisiana y Florida), el medio oeste (Illinois) y California. Kim y cois, informaron una declinación en la incidencia global de la enfermedad en ese país en la última década.175 Los varo­ nes se infectan más a menudo que las mujeres, con un cocien­ te de aproximadamente 3:1. La enfermedad es infrecuente en los niños y en los individuos con ingresos más altos y mejores estándares de vida.301 C aracterísticas de laboratorio. Las cepas típicas de M. kansasii crecen casi al mismo ritmo o algo más rápidamente que M. tuberculosis a 37 °C. El rasgo característico es la depen­ dencia de la exposición a la luz para la producción de un pig­ mento amarillo visible (véase lámina en color 19-2C y D) y la formación de cristales de caroteno rojizos con una incubación prolongada. En los casos típicos, las colonias son intermedias entre completamente rugosas y completamente lisas; sin embargo, algunas cepas son completamente una o la otra. Las microcolonias muestran centros elevados con bandas curvas de bacilos en los bordes externos más delgados que pueden con­ fundirse con la formación de cordones serpentinos de M. tuber­ culosis. El grupo de propiedades fenotípicas, además de la fotocromogenicidad, por el cual se puede confirmar la identifi­ cación de M. kansasii incluye: 1. 2. 3. 4.

Hidrólisis rápida de Tween dentro de los 3 días. Fuerte reducción de nitrato a nitrito. Reacción rápida de catalasa, que incluye la prueba a 68 °C. Actividad fuerte de pirazinamidasa.

Menos a menudo, se pueden hallar cepas escotocromógenas o no cromógenas, que incluyen algunas cepas con baja activi­ dad de catalasa. En los casos característicos, las células bacte­ rianas en los frotis ácido-alcohol resistentes son largas y anchas y definidamente con bandas tranversales o enrejado (véase lámina en color 19-2M), tal vez por la utilización del material graso del medio. Aunque los micobacteriólogos experimenta­ dos pueden hacer una identificación presuntiva sobre la base de

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C A P ÍT U L 0 19 Micobacterias

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-1

Mycobacterium tuberculosis

El aislamiento de M . tu b ercu lo sis de muestras clínicas casi siempre se asocia con infección y se sabe que la tuberculosis es una enfermedad altamente trans­ misible. La m ayoría de las infecciones com ienzan en los pulm ones donde se pueden observar infiltrados difusos, finamente nodulares o focales, que predo­ minan en las porciones apicales de los lóbulos superiores, pero que también se extienden a otros focos en la form a m iliar o com o tuberculosis exudativa progresiva (véase lám ina en color 19-3A). Son frecuentes las lesiones cavitarias, sobre todo en las regiones apicales de los lóbulos superiores y se puede observar un tuberculom a solitario o una “lesión num ular” que puede form ar parte del com plejo de oro de Gohn (véase lám ina en color 19-3B y C). Son fre­ cuentes los brotes en poblaciones cerradas com o escuelas, barcos y grupos familiares hacinados. En ciertas poblaciones ocurre la propagación diseminada o m iliar de la infección, por lo habitual en personas con desnutrición, inm unosupresión u otras enfermedades debilitantes crónicas. Jereb y cois., utilizando el estudio de polim orfism o de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) por PCR, pudieron rastrear la fuente de un brote de M. tu b erculosis en 10 receptores de trasplantes de riñón de un hospital hasta un único paciente que tuvo una exposición postrasplante en otro hospital antes del traslado.158 El tiempo medio de incubación para el inicio de la tuberculosis en los receptores de trasplantes renales con infecciones recientes fue de 7,5 semanas. Esta situación m uestra de qué m odo las nuevas técnicas m oleculares pueden ser útiles para detectar fuentes puntuales de tuberculosis de m anera que se pueda im plem entar un aislam iento tem prano para evitar la transmisión hospitalaria de la enfermedad. Las infecciones por M. tu b ercu lo sis son más frecuentes en las personas que participan en las siguientes ocupaciones:56 1. Individuos con exposición ocupacional a tuberculosis: directores de funerarias y personal sanitario. 2. Individuos con exposición ocupacional al sílice: trabajadores de la construcción, albañiles y obreros que trabajan con ladrillo y piedra, carpinteros, ope­ radores de m áquinas para minería. 3. Ocupaciones de bajo nivel socioeconómico: preparación de los alimentos y em pleados de servicios. 4. Riesgo desconocido: operarios de granjas, corredores y m ecánicos de automóviles, carniceros, artistas. La tuberculosis por reactivación o del tipo adulto es un proceso inflamatorio lentam ente progresivo en los pulm ones, caracterizado por una inflamación granulom atosa crónica intensa, casi siem pre con la formación de muchas células gigantes de tipo Langhans, necrosis y caseificación, con una tendencia del proceso a erosionar los bronquios (véase lám ina en color 19-3D). Cuando una cavidad se rompe, gran cantidad de bacilos tuberculosos se propagan hacia nuevos focos dentro del pulmón, y si la cavidad se rompe hacia un bronquio puede producirse una expectoración profusa, lo que potencialm ente infecta a otros bronquios que se encuentran en las proximidades. Los signos y síntomas clínicos habituales de la tuberculosis pulmonar progresiva crónica son tos, pérdida de peso, fiebre leve, disnea y dolor torácico. Ésta es una descripción del tipo de tuberculosis producida por reactivación secundaria. En los pacientes con SIDA, la enfermedad recuerda más una tuberculosis progresiva primaria, y se caracteriza por una progresión m ás rápida, septicemia y diseminación miliar, m enos fibrosis y caseificación focal, y diseminación m iliar que afecta a cualquier órgano del cuerpo. La m eningitis tuberculosa es relativamente rara en los Estados Unidos y ocurre casi siempre com o com plicación de la tuberculosis pulm onar primaria. Los pacientes pueden estar asintomáticos, presentar cefaleas vagas, cam bio del sensorio o, pocas veces, progresión con manifestaciones de meningitis grave. En la m ayoría de los casos, estará alterada una de las tres m ediciones de laboratorio del líquido cefalorraquídeo: aumento del recuento celular, habitualmente linfocitosis; dism inución de las concentraciones de glucosa o aum ento de las concentraciones de proteínas, aunque cualquiera de estos parámetros puede ser normal. En raros casos, los tres parám etros pueden ser normales, lo que brinda pocas pruebas objetivas para establecer el diagnóstico. Se pueden observar m icroorganism os ácido-alcohol resistentes en muestras centrifugadas en alrededor del 40% de los casos; este porcentaje es m ayor cuando se realizan más extracciones de líquido cefalorraquídeo. Desde el punto de vista patológico, la afectación m eníngea es más pronunciada en la base del encéfalo, donde los cambios visibles varían desde una opacidad difusa hasta la presencia de un exudado gelatinoso grueso, que se observa prim ariam ente en el área que cubre la protuberancia y adyacente al quiasm a óptico (véase lámina en color 19-3E). Tradicionalm ente se considera que la septicemia por M. tu b ercu lo sis es rara; sin embargo. Bouza y cois., en un estudio de 285 pacientes con tuberculosis probada por cultivos en los cuales se obtuvieron hemocultivos, observaron que 50 (14%) tenían baeteriemia.2'’ De éstos, el 81% estaba infectado por HIV. En 14 pacientes, la sangre fue la primera m uestra en la cual se aislaron m icroorganismos. Archibald y cois., cuando estudiaron a 517 pacientes con posibles infecciones del torrente circulatorio adquiridas en la com unidad en el Africa subsahariana, observaron que de los 145 pacientes con infección circulatoria com probada, el 81% de los cuales estaba infectado por HIV. el patógeno aislado más a menudo fue M. tuberculosis, con un 39%.® M ás del 93% de las cepas de M. tu b ercu lo sis aisladas en pacientes no tratados son sensibles a los antituberculosos y responden con rapidez al tratam iento con dos o, de preferencia, tres fármacos. M ás adelante en este capítulo se presentan las pruebas de sensibilidad de las micobacterias.

la tinción ácido-alcohol resistente, la determinación de las pro­ piedades fenotípicas suele ser necesaria y se recomienda antes de hacer una identificación definitiva. Mycobacterium m arinum . En 1926, mientras investigaba enferme­ dades infecciosas en peces de agua salada, Aronson descubrió una especie nueva de Mycobacterium, más tarde denominada Mycobacterium marinum (“del mar”).10376 El microorganismo también ha sido denominado M. platypoecilus por las infeccio­ nes observadas en los peces platys mexicanos y como M. balnei (nombre que se refiere al baño o al balneario). Todos son el mismo microorganismo. C aracterísticas de lab o rato rio . Cuando M. marinum se aísla en muestras clínicas crece en condiciones óptimas a 30 °C a 32 °C. El crecimiento es bajo, o no ocurre en absoluto, a 37 °C. Sin embargo, los subcultivos pueden crecer a esa temperatura.

Las colonias aparecen en 8 a 14 días; las que crecen en la oscu­ ridad pueden parecer no pigmentadas. Cuando se expone a la luz, se desarrolla una pigmentación amarilla intensa. Las colo­ nias varían entre estriadas y rugosas hasta lisas y hemisféricas, sobre todo si crecen en medios 7H10 o 7H 11 (que contiene ácido oleico y albúmina). Desde el punto de vista microscópi­ co, las células son bacilos relativamente largos con barras cru­ zadas frecuentes. Por lo tanto, la fotocromogenicidad y la preferencia por el crecimiento a 30 °C son indicios iniciales para la identificación de M. marinum. Las siguientes son otras características por las cuales se puede hacer una identificación definitiva: 1. Algunas cepas pueden acumular niacina. 2. Los nitratos no se reducen a nitritos.

C lasificación de las m icobacterias

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-2 Mycobacterium bovis M. bovis causa tuberculosis típicam ente en el ganado vacuno, pero puede infectar tam bién otros anim ales, como perros, gatos, cerdos, conejos y tal vez. algunas aves de presa. Fanning y Edwards rastrearon 446 contactos de seres hum anos con alces dom esticados en Alberta, Canadá, 81 de los cuales tenían pruebas cutáneas positivas para M. bovis.90 De éstos, 50 habían estado en contacto con anim ales con cultivos positivos, incluido un caso de infección pulm onar activa por M. bovis diagnosticada por una muestra de esputo positiva. Con los ensayos de huellas m oleculares del DNA con IS 6 1 10 com o m arcador genético. Van Soolingen y cois, pudie­ ron determ inar que las cepas de M. bovis que causaban infección hum ana en la Argentina fueron transm itidas por el ganado vacuno, mientras que las que causaban enferm edad hum ana entre los individuos que vivían en Holanda fueron contraídas de animales distintos del ganado vacuno (varios anim ales salvajes y de zoológico).360 En algunas regiones de Escocia y el este de Europa, donde el ganado vacuno y las granjas leche­ ras siguen siendo el principal sustento. M. bovis puede constituir aun hasta el 39% de todos los casos de tuberculosis.386 L a tuberculosis pulm o­ nar bovina hum ana se asem eja estrecham ente a la causada por M. tuber­ culosis, en deferencia a Robert Koch. cuya fam a al final menguó entre sus colegas a m edida que sostuvo firmem ente la posición de que la tuberculo­ sis bovina causaba sólo enferm edad intestinal en los seres humanos. En la actualidad se sabe que estas dos especies forman parte de un com plejo y la tuberculosis pulm onar por M. bovis se trata en form a similar a la enfer­ m edad causada por M. tuberculosis. Durante la época en que los seres hum anos ordeñaban a las vacas a mano, m ucho más que en la actualidad, eran frecuentes las infecciones cutáneas de los dedos, a m enudo con osteomielitis y artrosis subyacentes (véase lám ina en color 19-3F). Un sitio frecuente de aislamiento de M. bovis en los laboratorios clínicos es en las m uestras de orina, ya que la cepa del bacilo de Calm ette-Guérin (BCG) se utiliza en irrigaciones vesi­ cales com o estim ulante inm unológico para el tratam iento del carcinom a de las células uroteliales. Se debe considerar esta posibilidad cuando se aísla una m icobacteria de crecim iento lento en m uestras de orina, y cual­ quiera de estos aislamientos no debe ser considerado com o un comensal. En algunos individuos, la cepa BCG por utilizar no está totalm ente ate­ nuada y puede causar cistitis.

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1. Acumulación de niacina positiva. 2. Hidrólisis de Tween (puede ser lenta y necesita más de 10 días). 3. Actividad elevada de catalasa termoestable. La escasa reproducibilidad de las reacciones de la prueba por algunas cepas puede hacer algo difícil la identificación. Algunas cepas de M. simiae pueden ser confundidas con miem­ bros del grupo M. avium/M. intracellulare/M. scrofulaceum (MAIS). Mycobacterium asiaticum . Mycobacterium asiaticum es de mu­ chas formas fenotípicamente similar a M. gordonae; ambos tie­ nen actividad alta de catalasa, hidrolizan el Tween 80 y son negativos para ureasa y reducción de nitrato.376 Sin embargo, es fotocromógeno. También es bioquímicamente similar a M. simiae, salvo en que es niacina negativo. M. asiaticum tiene un perfil de rRNA 16S distinto, lo que justifica su condición de especie separada.329 Han aparecido raros casos de infección humana en la biblio­ grafía. La primera indicación de que este microorganismo podría ser patógeno fue en un informe de Australia de Blacklock.23 Dos de los cinco pacientes tuvieron una enferme­ dad pulmonar cavitaria progresiva; tres no tenían pruebas de una enfermedad pulmonar progresiva y se pensó que los aisla­ mientos del esputo representaban la colonización secundaria. El primer caso de infección pulmonar causado por M. asiati­ cum en los Estados Unidos fue aislado en un hombre de 62 años que vivía en Los Ángeles.342 También se han comunicado cuatro aislamientos en la Florida.109 Dawson y cois, informaron el aislamiento de M. asiaticum del líquido aspirado de una bolsa olecraniana en un caso de infección posquirúrgica.69 La infección desapareció con drenaje, cambios regulares de ven­ dajes e inmovilización, sin necesidad de tratamiento antibióti­ co. M. asiaticum es fotocromógeno y similar desde el punto de vista bioquímico a M. simiae, pero es negativo para la produc­ ción de niacina.

ESC0T0CR0MÓGEN0S Mycobacterium scrofulaceum . El nombre de la especie scrofula-

3. 4. 5. 6.

Se hidroliza el Tween. La ureasa es positiva. Se produce pirazinamidasa. No se produce catalasa termoestable.

Mycobacterium sim iae. Weiszfeiler y Karczag lo denominaron M. simiae en 1969,379 en reconocimiento del primer descubri­ miento del microorganismo cuatro años antes por Karassova y cols.,378a en monos Macaca mulatta importados a Hungría desde la India. Luego se descubrió que este microorganismo era idéntico a una cepa niacina positiva de una micobacteria del grupo III aislada en Cuba por Valdivia y cois, en pacientes con tuberculosis pulmonar. Estos autores denominaron al microor­ ganismo M. habana y más tarde se observó que era el mismo microorganismo que M. simiae?15 C aracterísticas de lab o rato rio . Las colonias de M. simiae se desarrollan en 2 a 3 semanas en medios con base de huevo y en los casos típicos son lisas. La mayoría de las cepas son fotocromógenas. Puede ser necesaria una exposición prolon­ gada a la luz para los aislamientos que no producen pigmento. Las reacciones bioquímicas identificatorias claves son las si­ guientes:

ceum, derivado de escrófula fue acuñado en 1956 por Prissick y Masón en referencia a la forma más frecuente de enfermedad producida por este microorganismo: la linfadenitis cervical en los niños.269 Sin embargo, M. scrofulaceum no es la única micobacteria que produce linfadenitis cervical. Gilí y cois, revisaron los casos de 16 niños con esta enfermedad; 6 fueron causados por M. scrofulaceum, 4 por M. tuberculosis y 4 por el complejo M. avium.103 Por lo tanto, se necesita el cultivo y la identificación de la especie de los microorganismos aislados. M. scrofulaceum se asocia rara vez con el SIDA. Es mucho más probable que las micobacterias aisladas en la linfadenitis cervi­ cal en esta población de pacientes sean M. tuberculosis o miembros del complejo MAI. Kirschner y cois, aislaron gran cantidad de M. scrofulaceum en agua de pantano en varios lugares de Georgia, West Virginia y Virginia, lo que indicó que es probable que las fuentes de agua ambientales estén relacionadas con la mayor incidencia de infecciones por escrófula observada en estas regiones.179 Se observaron altas concentraciones de microorganismos en agua tibia con bajo pH, bajo contenido de oxígeno disuelto, altas concentraciones de cinc soluble y concentraciones elevadas de los ácidos húmico y fúlvico. C aracterísticas de laboratorio. Las colonias de M. scrofu­ laceum crecen lentamente (4 a 6 semanas) a distintas tempera-

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C A P ÍT U L 0 19 Micobacterias

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-3 Mycobacterium kansasii La enferm edad pulm onar crónica que sim ula la tuberculosis clásica es la m anifestación más frecuente y afecta clásicam ente los lóbulos superiores. Se apre­ cia cavitación con form ación de cicatrices en la mayoría de los casos y la enfermedad es lentam ente progresiva.301 Las infecciones extrapulm onares o disem i­ nadas son m enos frecuentes, aunque se han com unicado casos de linfadenitis similares a una escrófula, infecciones cutáneas sim ilar a esporotricosis, osteo­ mielitis, infecciones de tejidos blandos y tenosinovitis. Dillon y cois, en particular citan el daño progresivo de las estructuras profundas de la m uñeca y la mano que puede ocurrir en casos de tenosinovitis.14 Se puede observar una enfermedad disem inada en presencia de inm unosupresión grave y se ha inform a­ do en pacientes con SIDA. Jacobson e Isenberg com unicaron un caso relacionado con SIDA de neum onitis intersticial granulom atosa difusa causada por M. kansasii, pero inform aron que sólo el 0,2% de los pacientes con SIDA tienen infecciones superpuestas por ese m icroorganism o.153 Sin embargo, Valainis y cois., en Louisiana, una región endém ica para M. kansasii, en una revisión de 60 meses de pacientes que asistieron a dos centros im portantes de derivación en New Orleans, observaron que el 31,9% de los pacientes con infección por H IV -1 estaban infectados, además, por M. kansasii.359 En un estudio retrospec­ tivo de 35 pacientes llevado a cabo en Kansas City, ia incidencia de infecciones por M. kansasii en los pacientes con SIDA fue tres veces m ás alta que las infecciones por M. tuberculosis.14 La m ayoría de los pacientes respondieron a varias com binaciones diferentes de antituberculosos que incluyeron isoníazida, rifam picina, etam butol y ciprofloxacina. Algunos pacientes toleraron mal el tratam iento; se desarrolló una hepatitis inducida por isoniazida en uno. Los auto­ res recom iendan utilizar al m enos dos agentes activos, com o etam butol y rifampicina. En general, las infecciones por M. kansasii en los pacientes con SIDA ocurren durante los últim os estadios, cuando los recuentos de linfocitos CD4 son inferiores a 50, con com plicaciones graves y potencialm ente mortales en muchos casos. Levine y Chaisson revisaron a 19 pacientes con M. kansasii e infec­ ción por HIV. 14 de los cuales tenían una infección pulm onar exclusiva, tres enfermedad pulm onar y extrapulm onar y dos afectación extrapulm onar exclusi­ va.203 Todos los pacientes con infección pulm onar presentaron fiebre y tos de por lo m enos 2 semanas de evolución. En las radiografías de tórax se observa­ ron infiltrados focales en los lóbulos superiores, infiltrados intersticiales difusos o lesiones cavitarias de paredes delgadas o una com binación de ellas. Nueve pacientes que recibieron tratam iento antituberculoso m ostraron la resolución de la fiebre y los síntomas respiratorios, con desaparición de los infiltrados radiológicos. Se han inform ado otros casos de infecciones por M. kansasii relacionados con el SID A.137306 En un caso, se observaron granulom as caseifica­ dos en la pared intestinal y en los ganglios linfáticos m esentéricos, con acum ulación de histiocitos espum osos que se asem ejaba a la enferm edad de W hipple. Giladi y cois, com unicaron un caso de peritonitis por M. kansasii asociada con catéter en una m ujer de 62 años que se som etió a una diálisis peritoneal am bulatoria continua, presum iblem ente la prim era comunicación de uno de estos casos.102 Se logró una buena respuesta con terapia com binada de isoniazida y rifam picina y extracción del catéter. Tortoli y cois, observaron un grupo de cepas de M. kansasii que no hibridaron con la prueba de identificación por cul­ tivo para M. kansasii A ccuProbe (Gen Probe, San Diego, CA) y que se asociaron defm idamente con el estado del SIDA.354 Esto sugiere que M. kansasii puede diferir en virulencia y que pueden ser necesarias otras pruebas para la identificación de cepas AccuProbe-negativas. Se han com unicado cepas de M. kansasii resistentes a la rifam picina. Wallace y cois, informaron sobre 36 pacientes en quienes se había aislado M. kansa­ sii resistente a la rifam picina, el 90% de los cuales había recibido antes tratam iento con este agente.367 Sin embargo, la mayoría de los pacientes respondieron al régimen de cuatro agentes, sobre la base de los estudios de sensibilidad in vitro, y los cultivos de esputo se volvieron negativos en el 90% de los tratados en una media de 11 semanas.

turas (25 °C, 31 °C y 37 °C)y producen colonias típicamente lisas, de consistencia untuosa, globoides, con pigmentación que varía desde el amarillo claro hasta el anaranjado intenso (véase lámina en color 19-2D). La producción de pigmento no depen­ de de la exposición a la luz; por lo tanto, el microorganismo es incluido en el grupo II de escotocromógenos de Runyon. Las reacciones de pruebas bioquímicas claves incluyen las siguientes: 1. 2. 3. 4.

Falta de hidrólisis de Tween. Los nitratos no se reducen a nitritos. La prueba de la catalasa a 68 °C es positiva. Se produce ureasa.

Otros escotocromógenos de crecimiento lento incluyen algu­ nas cepas del complejo MAI, M. gordonae y M. szulgai. Se evalúa la hidrólisis del Tween (los dos últimos dan una prueba positiva [M. szulgai puede requerir 7 días o más], mientras que M. scrofulaceum es negativo) y la actividad de la ureasa (Ai. scrofulaceum hidroliza la urea, mientras que las otras especies, incluidas las cepas pigmentadas del complejo M. avium, son negativas). Dos grupos de microorganismos pigmentados den­ tro del complejo MAI, intermedios en reactividad bioquímica con M. scrofulaceum, han sido designados con el término com­ plejo M AIS.127 Un grupo de microorganismos MAIS produce una columna de espuma de más de 45 mm en la prueba de catalasa semicuantitativa y es ureasa negativo; el otro es catalasa negativo pero ureasa positivo.

Mycobacterium szulgai. M. szulgai, comunicado oficialmente como una especie en 1972 por Marks y cois., recibe ese nom­ bre en honor al microbiólogo polaco T. Szulg.215 375 La caracte­ rística singular de esta especie es la producción de pigmento dependiente de la temperatura. Cuando crece a 37 °C, el micro­ organismo es escotocromógeno, mientras que es fotocromóge­ no cuando crece a temperatura ambiente (25 °C). Por lo tanto, para evaluar la fotocromogenicidad de una cepa desconocida de M. szulgai, se deben incubar las placas expuestas a la luz a temperatura ambiente y no a 37 °C. El pigmento escotógeno producido a la temperatura más alta enmascarará cualquier cambio para visualizar todo pigmento fotogenético que pueda producirse (véase protocolo 19-6). C arac te rísticas de la b o rato rio . El crecimiento es relati­ vamente rápido y se desarrollan colonias lisas o rugosas den­ tro de las 2 semanas a 37 °C. Se puede observar un pigmento anaranjado, que se intensifica con la exposición a la luz con­ tinua. En los preparados de frotis ácido-alcohol resistentes, las células bacterianas aparecen como bacilos moderadamen­ te largos, con ciertas barras transversales, que recuerdan a M. kansasii. Las reacciones de las pruebas bioquímicas claves para M y­ cobacterium szulgai son las siguientes:

1. Hidrólisis lenta de Tween. 2. Nitratos reducidos a nitritos. 3. Actividad de catalasa positiva. 4. Intolerancia a NaCl al 5%.

C lasificación de las m icobacterias

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-4

Mycobacterium

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RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-5 Mycobacterium simiae

marinum Las infecciones típicas por M. marinum afectan la piel y suelen ocurrir cuando la piel traum atizada entra en contacto con agua dulce o salada insuficientem ente clorada (piscinas, acuarios de peces tropicales, torres de enfriam iento de agua). Fisher com unicó tres casos de infecciones cutáneas en salvavidas, y cita esta infección com o un peligro del oficio.1'3 En el artículo de este autor se incluyen buenas fotografías en color de las lesio­ nes cutáneas. Varios casos se observaron en Denver, Colorado, en la déca­ da de 1950, secundarios a la contam inación masiva de una piscina de un balneario en la com unidad m ontañosa de Glenwood Springs. Hoyt y cois, com unicaron varias infecciones de tejidos profundos y tenosinovitis des­ tructiva entre pescadores del área de la Bahía de Chesapeake.141 Otras varias citas de infecciones cutáneas profundas, casi siempre de las manos y asociadas com únm ente con la actividad acuática, com o lim pieza de peces, incluyen un caso de tenosinovitis, artritis y bursitis, y osteom ielitis.17-48143 Puede ser eficaz la antibioticoterapia con cierta com ­ binación de fárm acos, com o rifam picina y etam butol, pero a menudo puede ser necesaria la cirugía. Es m enos probable que la antibioticotera­ pia sea eficaz en los pacientes que fueron tratados con corticosteroides inyectables y evitar estos fárm acos es la clave para el m anejo exitoso.48162 Algunos pacientes presentan lesiones sim ilares a la esporotricosis, con propagación linfática centrípeta desde el área ulcerada del sitio primario de inoculación.246 M ás típicam ente, las lesiones se presentan com o nodu­ los subcutáneos dolorosos a la palpación, rojos o azul rojizos, que afectan el codo, la rodilla, el dedo del pie y el dedo de la mano ("granulom a de la piscina” ). Estas lesiones pueden confundirse con nodulos reum atoideos.11 Estos autores citan otros casos de infecciones subcutáneas profundas, que en algunos casos afectan bolsas subcutáneas, vainas tendinosas, articula­ ciones y hueso. En general, el tratam iento está dirigido a resecar las lesiones primarias siempre que sea posible (curetaje, electrodesecación, escisión). Puede ser necesario el tratam iento antituberculoso para curar los casos crónicos en los cuales se aprecia la propagación linfática. La m ayoría de las cepas son sensibles a la rifam picina y el etambutol. pero resistentes a la isoniazida y la estreptom icina.

Mycobacterium xenopi. M. xenopi (Xenopus, un género de rana), fue aislado por primera vez en un sapo africano.375 Las aguas corrientes calientes y frías, como las de los tanques de almace­ namiento de agua y los generadores de agua corriente de los hospitales, son fuentes potenciales para las infecciones hospi­ talarias. Antes considerado no patogénico, M. xenopi ha sido incriminado en varias infecciones. Wolinski comunicó 50 casos de infecciones humanas por M. xenopi, fundamentalmente en Inglaterra, Francia, D inam arca, A ustralia y los Estados Unidos.393 Las aves que frecuentan las regiones costeras en Gran Bretaña constituyen un reservorio importante. C aracterísticas de lab o rato rio . Las colonias de Mycobac­ terium xenopi son de crecimiento lento, pequeñas, erectas y producen un pigmento amarillo característico (algunas cepas ocasionales son no pigmentadas). El crecimiento es más lento a 42 °C que a 37 °C y está ausente a 25 °C. Si bien antes fueron incluidas con las micobacterias no fotocromógenas, las colo­ nias de pigmento amarillo brillante que suelen hallarse en ais­ lamiento primario sugieren que sería mejor considerar al microorganismo con los escotocromógenos. Las colonias tien­ den a ser rugosas y puede observarse un micelio aéreo. El exa­ men de microcolonias jóvenes en agar 7H10 pone en evidencia un aspecto característico en “nido de ave”, con proyecciones en forma de palillos. Se presentan ramificación y extensiones fila-

Los inform es de infección hum ana por M. simiae son relativamente pocos. Se han citado com unicaciones de infecciones pulmonares que ocurren en Francia. Israel, Tailandia y los Estados U nidos.204 Estos autores com unica­ ron un caso de un hombre de 43 años con SIDA en el cual se desarrolló una infección disem inada por m icobacterias. Se aislaron m icroorganism os en sangre, líquido yeyunal, y biopsias duodenales y rectales. Aunque se han inform ado algunos otros casos de infecciones por M. simiae en pacientes con SIDA, la asociación es infrecuente y no sirve como m arca­ dor.257 La experiencia israelí con M. simiae es interesante, ya que se aisla­ ron 399 cepas en 287 personas durante el período de 1975 a 1981, princi­ palmente entre los habitantes de la llanura costera de Tel Aviv.™ La m ayoría de los aislamientos eran m icroorganism os com ensales relaciona­ dos con fuentes de agua ambientales. Se produjeron algunas infecciones pulm onares entre los pacientes, de los cuales se aislaron diversas cepas, que com plicaron trastornos pulm onares crónicos preexistentes. Se informaron dos casos de enferm edad disem inada, con afectación renal luego de una infección pulmonar.294 Aunque la mayoría de las cepas de M. simiae son resistentes a los antituberculosos en las pruebas in vitro, se inform ó un caso de enfermedad intraabdom inal que fue tratado con éxito con antibioticoterapia com binada.132

mentosas en las colonias más antiguas, sobre todo en las que crecen en agar harina de maíz glicerol. Desde el punto de vista microscópico, los frotis ácido-alcohol resistentes muestran bacilos filamentosos largos aguzados en ambos extremos, con tendencia a disponerse en empalizada. Las reacciones de prueba bioquímicas claves para M ycobac­ terium xenopi son las siguientes: 1. Crecimiento óptimo a 42 °C. 2. Pigmento escotocromógeno amarillo. 3. Sin acumulación de niacina. 4. Reducción de nitrato negativa. 5. Catalasa producida sólo a 68 °C. 6. Arilsulfatasa positiva. 7. Pirazinamidasa positiva. Mycobacterium celatum . M. celatum es el nombre propuesto para esta especie de Mycobacterium por Butler y cois.35 Se asemeja más estrechamente a M. xenopi (de hecho, no fue descubierto hasta hace poco porque estaba oculto [celatum, “ocultar”] entre cepas de MAI y M. xenopi) y sólo difiere por su escaso creci­ miento a 45 °C, el crecimiento de grandes colonias en agar 7H10 y la producción sólo de cantidades pequeñas del ácido graso 2-docanosol.246,353 Esta nueva especie ha sido aislada en cultivos de las vías respiratorias y, menos a menudo, en la san­ gre, heces y líquido cefalorraquídeo, en cultivos obtenidos de pacientes que residen en distintas localizaciones geográficas, incluidos los Estados Unidos, Finlandia y Somalia. En la comunicación original de Butler y cois., alrededor de un tercio de las cepas se aislaron en pacientes con SIDA.35 También observaron reactividad cruzada para 8 de 20 cepas con M. tuberculosis utilizando la sonda de DNA marcada con éster de acridinio, AccuProbe (Gen-Probe, San Diego CA), un proble­ ma que, aunque se ha encarado, sigue sin resolución. Esta reac­ tividad cruzada con M. tuberculosis y la necesidad de la secuenciación genómica o la cromatografía líquida de alto ren­ dimiento de los ácidos micólicos de la pared celular para hacer

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C A P ÍT U LO 19 Micobacterias

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-6

Mycobacterium

scrofulaceum La linfadenitis es el síntom a de presentación clásico de la infección por M. scrofula ceu m , que ocurre principalmente en niños de 18 meses a 7 años, período en el cual se rom pe la barrera de la mucosa bucal para la dentición. L a siguiente incidencia m ayor de enfermedad ocurre en adultos jóvenes cuando afloran los dientes m olares. La linfadenitis es unilateral, afecta los ganglios de la parte superior del cuello adyacentes a la mandí­ bula y luego por detrás de las orejas (véase lámina en color 19-3G y H). Los ganglios a m enudo drenan desde la superficie de la piel sin com plica­ ciones, excepto por grados variados de form ación de cicatrices residuales en los sitios de penetración superficial de los trayectos fistulosos. La enferm edad suele afectar a niños sanos; el dolor suele ser m ínim o y los síntomas constitucionales están ausentes. Se presume que el sitio de ori­ gen es la colonización del m icroorganism o en la boca y las fauces. Se cree que la alta incidencia de enfermedad entre los niños pequeños está relacionada con la interrupción de las encías durante las erupciones cutá­ neas, edad durante la cual el sistema inm unitario sigue siendo bastante inmaduro. Sólo se han citado algunos casos de enfermedad pulm onar pro­ gresiva y disem inación a otros órganos, sobre todo en pacientes con una enfermedad debilitante grave.101 La enfermedad local se trata m ejor con incisión quirúrgica y drenaje de los ganglios afectados; sólo pocas veces se necesitan agentes antituberculosos. Los patrones de sensibilidad varían hacia los agentes antituberculosos y otros antibióticos, com o sulfam idas y eritrom icina. El tratamiento de las infecciones graves debe com prender el uso de por lo m enos tres de los siguientes fármacos: INH, estreptom icina, rifam picina y cicloserina.301

una identificación correcta plantean problemas para quienes trabajan en los laboratorios clínicos. Tortoli y cois, informaron dos casos en pacientes con SIDA. En el primer paciente, M. celatum fue aislado en múltiples hemocultivos, primero un conjunto de cuatro cultivos positivos, seguido de otro de tres cultivos 9 meses más tarde.353 El segundo aislamiento se obtu­ vo en un cultivo de esputo y el trastorno pulmonar del pacien­ te mejoró luego del tratamiento farmacológico combinado con claritromicina, ciprofloxacina y amikacina. Haase y cois, comunicaron un caso de linfadenitis cervical unilateral similar a la escrófula en un niño inmunocompetente.121 Mycobacterium gordonae. Mycobacterium gordonae es una espe­ cie de Mycobacterium que pocas veces causa infecciones hu­ manas, pero posiblemente sea la micobacteria que se aísla en

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-8 Mycobacterium

xenopi La m ayoría de los casos hum anos de infecciones por M. x en o p i han sido pulmonares y se asem ejan a los observados en pacientes con infecciones por M . tu berculosis, M. k a n sa sii o MAI. A m enudo se observan en las radiografías densidades m ultinodulares, que m uestran cavitación y fibro­ sis. En general, las infecciones ocurren en pacientes con enfermedad pul­ m onar preexistente o trastornos predisponentes (alcoholismo, cáncer, dia­ betes mellitus). Contreras y cois., al revisar 89 casos de pacientes adultos con infecciones pulm onares, com unicaron que M. x e n o p i fue el segundo aislamiento en frecuencia (38% de los casos).55 Asim ismo, en una revisión de cultivos positivos para m icobacterias no tuberculosas, excluido el com ­ plejo M A I y M. gord o n a e, de 86 pacientes en el State University o f New York Health Sciences Center en Brooklyn. M . x e n o p i fue la especie aisla­ da más a menudo (33 casos).312 La m ayoría fueron aislamientos de m ues­ tras respiratorias en pacientes con SIDA. También se han com unicado 28 aislamientos de M. x en o p i en pacientes que residían en la provincia de Ontario, Canadá.317 En 19 pacientes, el aislamiento se consideró insignifi­ cante; nueve provinieron de varones de edad m ediana con otras enferm e­ dades pulmonares. En la provincia de Ontario, M . x e n o p i ha sido el segundo patógeno m icobacteriano no tuberculoso más frecuente, sólo segundo al com plejo MAI. En general, la propagación intrapulm onar ocurre en pacientes con SIDA; en los casos diseminados, los m icroorganism os también pueden aislarse en aspirados de m édula ósea.12 Las infecciones por M . x e n o p i se encuentran pocas veces en los pacientes HIV positivos. En dos casos de varones infectados por HIV con infección pulm onar sintomática, se com u­ nicaron sudores nocturnos, tos y dolor pleurítico.154 Este m icroorganism o creció en cultivos de m últiples muestras respiratorias obtenidas de cada paciente. Ambos pacientes m ejoraron con el tratam iento con múltiples fárm acos que incluyó isoniazida y rifam picina, lo cual fue inesperado, aunque en un caso se dem ostró resistencia in vitro a isoniazida y rifam pi­ cina. Se com unicó un caso de infección pulm onar en un receptor de aloinjerto renal de 39 años.377 También se citaron casos aislados de infección extrapulmonar que afectaban hueso, ganglios linfáticos, epidídim o, trayec­ tos fistulosos y una articulación tem poromandibular protésica.393 Se infor­ maron infecciones de la colum na lumbar: un paciente fue una mujer de 77 años inm unocompetente que presentó un absceso paravertebral.270-274 Se com unicó un brote de 13 casos de infección pulm onar en residentes de un proyecto de alojam iento en Praga.™ Se consideró que la fuente puntual era el suministro local de agua, a m edida que se aislaron los m icroorga­ nismos en las canillas de agua en cinco de los pisos. Tortoli y cois, revisa­ ron los casos de 64 cepas de M. x e n o p i aisladas en pacientes que vivían en Florencia, Italia, durante un período de 15 años.353 La hom ogeneidad de los patrones bioquímicos, de cultivo y de sensibilidad a los antibióticos de estos aislamientos indica que pueden constituir un foco endém ico en el área de Florencia.

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-7 Mycobacterium

szulgai M aloney y cois, presentaron tres casos de infecciones hum anas por M. szu lg a i y revisaron 24 casos com unicados previamente en la literatura

antes de 1987.214 En dos tercios de los casos se presentaron infecciones pulm onares, y las radiografías de tórax mostraron enfermedad apical uni­ lateral o bilateral, con cavitación, que sim ulaba M . tu b ercu lo sis. También se informó un caso de enferm edad pulm onar persistente causada por M. s zu lg a i ,53Fiebre, tos, hem optisis y pérdida de peso fueron los síntomas frecuentes. Las infecciones extrapulm onares por M . szu lg a i citadas en la revisión anterior incluyen bursitis olecraniana, tenosinovitis y síndrome del túnel carpiano, osteom ielitis y enfermedad cutánea localizada.

los laboratorios clínicos con mayor frecuencia. Se encuentra sobre todo en ambientes acuosos, lo que condujo a la designa­ ción alternativa de M. aquae o el “bacilo del agua corriente-’.375 C aracterísticas de laboratorio. Mycobacterium gordonae es un escotocromógeno reconocido fácilmente por las colonias lisas con pigmentación amarilla intensa que se desarrollan luego de 7 días de incubación a 37 °C (véase lámina en color 19-2E y M). El microorganismo hidroliza el Tween 80 y pro­ duce una catalasa termoestable; es ureasa negativo y no reduce nitratos a nitritos. Es resistente a isoniazida, estreptomicina y ácido /j-aminosalicíiico pero es sensible a rifampicina y etam­ butol. Un microorganismo que puede ser confundido desde el punto de vista fenotípico con M. gordonae es M. flavescens,

C lasificación de las m icobacterias

que es un escotocromógeno; sin embargo, M. flavescens tiene actividad de ureasa y reduce los nitratos a nitritos, dos caracte­ rísticas no demostradas por M. gordonae. M. flavescens es un comensal para los seres humanos y no se sabe que produzca enfermedad.375

NO FOTOCROMÓGENOS Complejo Mycobacterium aviu m /M . in tracellulare. Las cepas de M.

avium y M. intracellulare se denominan también a menudo complejo MAI (MAC). Este es el mismo microorganismo que produjo un brote de infecciones pulmonares en el Battey State Hospital en Rome, Georgia, en la década de 1950 y durante algún tiempo llevó la designación de “bacilo de Battey”. MAI está ampliamente distribuido en el agua, el suelo, el polvo, los animales y las aves de corral. En los seres humanos, se lo con­ sideraba de baja patogenicidad y pocas veces producía enfer­ medad. Sin embargo, la epidemia de SIDA ha demostrado su patogenicidad en personas con depleción de la inmunidad de células T y en la actualidad sólo se aísla M. tuberculosis con más frecuencia que M A I.10 Los miembros del complejo MAI de bacterias son ubicuos y pueden ser aislados en los estuarios de agua, piscinas, suelos, polvo doméstico, plantas y materiales para jardinería. Las fuen­ tes naturales de agua, incluida el agua potable, plantean un ries­ go considerable para la adquisición de infecciones humanas.364 Las aguas con una salinidad moderada (sal al 1-2%) y acidez relativamente alta (pH 4,5 a 6,5) que se localizan a menores altitudes son ideales para la proliferación de los microorganis­ mos MAI.32 Las infecciones humanas por MAI pueden ocurrir por la ingestión de agua y alimentos contaminados (se consi­ dera que el aparato digestivo es la vía primaria de infección en los pacientes con SIDA) o por la inhalación de microorganis­ mos contenidos en aerosoles acuosos. Wendt y cois, observaron microorganismos MAI en gotitas de un tamaño de 0,7 a 3,3 mm por encima de las superficies de aguas dulces, suficientemente pequeñas como para alcanzar los espacios alveolares y los microorganismos pueden tener una concentración alta en las corrientes en chorro que emanan de las interfaces aire-agua marina.381 Aunque las aves de corral, los cerdos y otras especies de aves y animales se infectan y excretan microorganismos en las heces que se pueden mantener viables durante períodos pro­ longados en el suelo, la transmisión del animal al ser humano es un acontecimiento raro. La transmisión interhumana tam­ bién se considera un factor de riesgo mínimo.149 El complejo MAI tiene una distribución mundial; sin embar­ go, las regiones endémicas se han hallado en áreas geográficas templadas, que incluyen los Estados Unidos, Canadá, Gran Bretaña, Europa, los Países Bajos y Japón.149 A partir de una encuesta realizada en 1979 en los Estados Unidos, la prevalen­ cia global de M AI era de 3,2 casos por 100 000 habitantes con una incidencia máxima en Hawai (10,8 casos), Connecticut (8,9 casos), Florida (8,4 casos) y Kansas (6,8 casos).110Aunque M. gordonae es la micobacteria no tuberculosa más frecuente aislada en fuentes humanas, los miembros del complejo MAI son los microorganismos asociados más a menudo con enfer­ medad humana. Las tasas de infecciones humanas en la pobla­ ción que no tiene SIDA se han mantenido estables o han dis­ minuido ligeramente; en San Francisco, el aumento global en la incidencia de infecciones debidas al complejo MAI corrió paralelo a la incidencia de casos de SIDA al comienzo del curso de la epidemia.199 Por ejemplo, de los 161 073 casos de SIDA informados a los CDC hasta diciembre de 1990, también se comunicaron más de 12 000 casos de infecciones por mico-

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-9

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Mycobacterium

gordonae Woods y W ashington citaron varias com unicaciones aisladas de infeccio­ nes por M. gordonae'. m eningitis secundaria a derivaciones ventriculoauriculares, enfermedad hepatoperitoneal, endocarditis en una válvula aórtica protésica, lesiones cutáneas de la m ano y posibles casos de afectación pulm onar.19" El caso de peritonitis en un paciente que se som etió a diálisis peritoneal sugiere que las infecciones por M. gordonae. ai ser tan prevalentes en el m edioam biente, pueden surgir com o un problem a im portan­ te.209 Se piensa que no se lo debe elim inar autom áticam ente com o conta­ minante cuando se lo aísla en material clínico.378 En junio de 1992 se publicó la clasificación de las características clínicas halladas en 23 casos humanos com unicados de infección por M. gordonae que se ajustaban a los criterios de inclusión.378 La distribución por órgano de estos casos pre­ viam ente com unicados fue la siguiente: pulmones en ocho casos, tejido blando (siete), cavidad peritoneal (tres), córnea (uno) y enferm edad dise­ m inada (cinco). Estos autores com unicaron otro caso de enfermedad dise­ m inada en una niña de 11 años. Se observaron múltiples lesiones granula­ res redondeadas dispersas en am bos cam pos pulm onares durante una biopsia pulm onar a cielo abierto. Se observa inflamación granulom atosa necrosante en el exam en histológico del material de biopsia, que incluye muchos bacilos ácido-alcohol resistentes en los frotis para esta tinción. En los m edios sólidos crecieron colonias amarillas lisas, más tarde identifica­ das com o M. gordonae. después de 14 días de incubación a 37 °C en C O , al 8%. El paciente se recuperó luego de 15 meses de tratam iento antitu­ berculoso, y com enzó con una com binación de isoniazida, rifampicina, am ikacina y etambutol, seguida de una serie de un año de rifampicina y etambutol. Jarikre informó dos casos de infección por M. gordonae, cada uno de ellos en am as de casa de 40 años. Uno provino de una m ujer con una infección urinaria crónica de la cual se aisló repetidas veces M. gordonae en m uestras de orina; el otro era una paciente paquistaní con una infec­ ción sistémica, de la cual se aisló el m icroorganismo en el esputo y la orina.15515'' La biopsia hepática puso en evidencia m últiples granulom as en los cuales tam bién se aisló M. gordonae. La segunda paciente respondió en form a espectacular a un tratam iento antituberculoso con estreptom ici­ na, isoniazida. rifam picina y pirazinam ida. Se com unicó un caso de infec­ ción cutánea nodular crónica que desde el punto de vista histológico pre­ sentaba granulom as tuberculoides clásicos llenos de bacilos ácido-alcohol resistentes, en los que se aisló M. gordonae.m Sin embargo, W ayne y Sramek, después de revisar muchos de los casos alegados y com unicados de infección por Af. gordonae, advirtieron que las descripciones de los m icroorganism os y las correlaciones clínicas convincentes a m enudo faltan en muchos de los artículos y que se sigue cuestionando su verdadera patogenicidad.576 Cuando se aíslan en las muestras, cada aislam iento debe ser identificado con exactitud y se debe realizar una correlación clínica cuidadosa para determ inar la im portancia clínica para lo que en la m ayoría de los casos será un contam inante.

bacterias no tuberculosas; en el 96% de éstas, el agente causal era un miembro del complejo M AI.140 La infección por HIV es el factor de riesgo primario para las infecciones diseminadas por este microorganismo.244 La incidencia de infecciones dise­ minadas por MAI en los pacientes infectados por HIV ha dis­ minuido en forma espectacular desde la introducción del trata­ miento antirretroviral altamente activo. Características de laboratorio. Los miembros del comple­ jo MAI pueden presentarse como una de las tres variantes de colonias: 1) lisas, opacas y con forma de cúpulas; 2) lisas, transparentes y planas y 3) rugosas (véase lámina en color 192N y O). Las cepas aisladas con más frecuencia en pacientes

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RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-10 Mycobacterium avium/M. intracellulare Los trastornos que predisponen a las infecciones pulm onares por m iembros del com plejo M. avium/M. intracellulare (MAI) incluyen enfermedad pulmonar obstructiva crónica por cualquier causa primaria, bronquiectasias, neum onía aspirativa crónica o recurrente, tuberculosis inactiva o activa, neum oconiosis y carcinom a broncógeno.86 También se informó una asociación con fibrosis quística.'7- Se observa, adem ás, enfermedad pulm onar en mujeres de edad avanza­ da sin trastornos predisponentes, el denom inado síndrome de lady W indermere, por el personaje Victoriano de Oscar Wilde que tenía el hábito peculiar de inhibir la tos. En los pacientes sin inmunosupresión, las m anifestaciones pulm onares de las infecciones por MAI son similares a las de M. tuberculosis', tos, fatiga, pérdida de peso, fiebre leve y sudores nocturnos. En general, se puede dem ostrar radiológicamente una enfermedad cavitaria o se pueden observar nodulos solitarios o infiltrados más difusos. En ocasiones, los pacientes están asintomáticos. El máximo recrudecim iento de las infecciones por MAI durante la última década se observó en pacientes con SIDA, hasta el punto en que, en algunas circunstancias, se aísla m ás a m enudo MAI que M. tuberculosis. En una revisión de infecciones por M A I en pacientes HIV positivos antes del uso amplio del tratam iento antirretroviral altamente activo (HAART), se observó que las infecciones por MAI eran casi siempre diseminadas y ocurrían tarde en el curso de la infección por HIV.211 El riesgo de contraer infecciones por M AI en pacientes con SIDA que tienen recuentos de CD4 por debajo de 50 es alto (45% dentro del año del diagnóstico).44 Cuando los microorganism os se encontraban en el esputo o en el aparato digestivo, el 60% de los pacientes tuvieron una enfermedad diseminada. Por lo tanto, estos autores aconsejan que los pacientes con SIDA que tienen esputo o heces positivas para MAI reciban tratamiento profiláctico con rifabutina. Las infecciones diseminadas se caracterizan por fiebre intermitente, sudores, debilidad, anorexia y pérdida de peso rápidam ente progresiva. En algunos se presentó dolor abdom inal o diarrea con malabsorción. No se observó una afectación pulm onar im portante, a pesar del aislamiento de m icroorganism os M A I en m uestras de esputo. Se produce baeteriem ia en más del 90% de los pacientes con enfermedad diseminada, y los m icroorganis­ m os se encuentran dentro de los monocitos circulantes; por lo tanto, para el cultivo en estos pacientes se recom ienda el hemocuitivo para micobacterias. Se han com unicado recuentos de hasta 10fl unidades form adoras de colonias (UFC)/mL, aunque son más frecuentes los recuentos en el intervalo de 10' a 102.394 En un estudio de infecciones por m icobacterias en 94 pacientes con SIDA, sólo ocurrió una enfermedad pulm onar im portante en un 25% de los pacientes con MAI, a diferencia del 83% de los pacientes con infecciones por M. tuberculosis que tenían enfermedad pulm onar.234 Adem ás, la tuberculosis clásica cau­ sada por M. tuberculosis precedió al diagnóstico de SIDA en dos tercios de los casos, al contrario de las infecciones por MAI, que fueron com plicaciones secundarias del SIDA en todos los casos estudiados. También se han aislado miem bros del com plejo M AI en 15 de 16 casos de m eningitis tuberculosa.151 El aislamiento de los microorganismos en el líquido cefalorraquídeo siempre indicó enfermedad diseminada y el pronóstico en este grupo de pacientes fue malo. El aislamiento de M AI en m uestras de esputo en esta población de pacientes también es un indicador de enferm edad disem inada.152 Sin embargo, la enfermedad disem inada causada por M AI se ha vuelto mucho menos frecuente desde la introducción del HAART para la infección por HIV. A partir de nuestra experiencia, parecen evidentes las siguientes características de las infecciones por MAI en los pacientes con SIDA. La cantidad de m icroorganism os en los cortes de tejido de biopsia o de necropsia a menudo es extrem adam ente num erosa y se observan agregados bacterianos intracelulares dentro de los m acrófagos espum osos grandes, que sim ulan las células de la lepra observadas en las infecciones por M. leprae (véanse láminas en color 19-2P y 19-31 y J). La afectación gastrointestinal tam bién suele ser importante. En algunos casos, grandes m acrófagos espum osos, que sim ulan las células observa­ das en la enfermedad de W hipple, predom inan en las áreas de inflamación. Los pacientes que presentan pruebas histológicas de afectación gastrointestinal (y pulm onar) siempre tienen enferm edad diseminada.44 Bien podría ser el m odo principal de transmisión la ingestión de agua o alimentos contaminados. Las lesiones en otros órganos, en especial pulm ones, hígado, bazo y ganglios linfáticos, tam bién pueden m ostrar una invasión masiva con bacilos ácido-alcohol resistentes. En algunos casos, se observa poca inflamación en el m om ento de la muerte. La inflamación necrosante, más que la form ación de granulomas y la necrosis con caseificación, es más característica del aspecto histológico de estas lesiones. Otros investigadores tam bién observaron cargas importantes de m icroorganism os y reacciones inflamatorias atípicas en pacientes con SIDA e infecciones por m icobacterias, y citan particularm ente la alta incidencia de septicem ia por m icobacterias y hemocultivos positivos en estos enferm os.126,344'408 Los m icroorganism os M AI tam bién causan linfadenitis cervical similar a la escrófula en los niños.176-193 Woods y W ashington mencionan otras infecciones por MAL com o sinovitis granulom atosa. enferm edad urinaria, lesiones cutáneas, osteom ielitis, m eningitis y úlceras colónicas.399 En la enferm edad ulcerosa intestinal cada vez hay m ás pruebas399 de que existe una relación causal entre la enteritis regional o enfermedad de Crohn y las m icobacterias, sobre todo una especie de m icobacteria estrecham ente relacionada con M. avium y probablem ente clasificada dentro del com plejo MAI. M. paratuberculosis.

producen la variante de colonias lisas, transparentes y planas, como se observa en las microcolonias (véase lámina en color 19-2A y B). Algunos autores consideran que estos tipos de colonias planas y translúcidas corresponden a cepas más viru­ lentas que las que producen otros tipos de colonias.63'297305 Aunque M. avium fue clasificado originariamente en Runyon III (no cromógenos), según diversas experiencias, la mayoría de las cepas aisladas en pacientes con SIDA tienen grados variados de pigmentación amarilla, que se intensifica a medida que la colonia envejece. Sin embargo, Doern y cois, observa­ ron que la mayoría de sus cepas eran no pigmentadas.77 Stormer y Falkingham determinaron que las cepas aisladas en pacientes HIV positivos no eran pigmentadas y era más proba­ ble que fueran resistentes a los antibióticos en comparación con las cepas pigmentadas.336 El examen microscópico de frotis con tinción para microor­ ganismos ácido-alcohol resistentes pone en evidencia células que en los casos típicos son cortas y cocobacilares. Al comien­

zo del cultivo y en ciertas condiciones, se pueden observar bacilos largos y delgados. La tinción suele ser uniforme, sin arrosariado ni formación de bandas. Aunque en la mayoría de los laboratorios se utilizan tinciones basadas sobre carbolfucsi­ na convencionales, como Ziehl-Neelsen y Kinyoun, la tinción de auramina-rodamina con microscopia fluorescente puede ser útil en algunos casos. Como pueden ocurrir infecciones mixtas, no se recomienda una identificación predicha sobre la base de la morfología microscópica aislada. Desde el punto de vista fenotípico, las cepas del complejo MAI se caracterizan mejor con una serie de reacciones negati­ vas (véase cuadro 19-7). El microorganismo no produce catalasa termoestable y tiene la capacidad de crecer en T2H; por otra parte, las reacciones bioquímicas son inertes. Con la dis­ ponibilidad de una sonda de ácidos nucleicos para la confirma­ ción con cultivo de los miembros del complejo MAI, ya no se justifica la demora para obtener la identificación de la especie con los métodos convencionales. Aunque la aplicación de la

C lasificación de las m icobacterias

PCR para la identificación directa de micobacterias, incluidos 1 s miembros del complejo MAI, en el esputo y otras muestras clínicas, está recibiendo mucha atención en los laboratorios de investigación, no existe un producto comercial para los labora­ torios diagnósticos. Aunque es frecuente realizar la sonda de combinación para el complejo MAI, puede ser importante determinar si el agente causal es M. avium o M. intracellulare, jad o que algunos autores sugieren que la enfermedad por M. avium parece más grave que la causada por M. intracellulare.404 La mayoría de las cepas del complejo MAI son resistentes a los antituberculosos de uso frecuente. El mecanismo subyacen­ te de resistencia se basa sobre la impermeabilidad de la pared celular.276 No se ha demostrado la síntesis de enzimas inactivadoras de aminoglucósidos y péptidos, aunque algunas cepas producen betalactamasas.233 El efecto tensioactivo del Tween 80 sobre la pared celular puede potenciar la acción de ciertos antibióticos; el etambutol también tiene un efecto sobre la per­ meabilidad de la pared celular, lo que refleja el modo en que este agente puede funcionar en forma sinérgica para potenciar la acción de algunos otros antituberculosos.139 Así, en el pasa­ do. el etambutol era incluido habitualmente en el grupo de fár­ macos utilizados para tratar a los pacientes con infecciones causadas por el complejo MAI, como INH, rifabutina, clorfazimina y otros.2 El agregado de macrólidos a los regímenes tera­ péuticos ha mejorado en forma espectacular los resultados para los pacientes no infectados por HIV que presentan enfermedad pulmonar por MAI. Mycobacterium paratuberculosis y enfermedad de Crohn. HermonTaylor y cois, citan el trabajo de un cirujano de Glasgow, T. K. Dalziel. quien en 1913 publicó una descripción detallada de la enteritis crónica en los seres hum anos.136 Este autor propuso que la enfermedad era causada por los mismos microorganis­ mos responsables de la enfermedad de Johne, un trastorno intestinal ulcerativo asociado con diarrea crónica en el ganado. La enfermedad de Johne había sido conocida desde 1895 y se creía que se asociaba con bacilos ácido-alcohol resistentes, los cuales podían observarse en los tejidos de los animales infecta­ dos pero, en estos primeros días, no podían ser cultivados. Sin embargo, no mucho después se aisló finalmente una micobac­ teria de crecimiento lento en la mucosa intestinal de los ani­ males infectados, que al inicio se conoció como bacilo de Johne, pero que más tarde fue identificada como M. paratu­ berculosis. En 1984, Chiodini y cois., que trabajaron con HermonTaylor y cois, en el St. George’s Hospital en Londres, comuni­ caron el aislamiento de una especie de Mycobacterium no cla­ sificada con requerimientos nutricionales extremadamente especiales en tres pacientes con enfermedad de Crohn.46 Después de un esfuerzo considerable, estos investigadores identificaron que el m icroorganismo pertenecía al grupo Runyon III, estrechamente relacionado con los complejos MAI y M. paratuberculosis. Se han citado otros distintos casos que relacionan M. paratuberculosis y enfermedad de Crohn de los Estados Unidos, Holanda, Australia y Francia.45 Otro indicio de que el microorganismo de la enfermedad de Crohn y M. paratuberculosis son una misma micobacteria fue provisto en otra publicación del grupo hospitalario del St. George, que halló fragmentos idénticos obtenidos por restricción de DNA en estos grupos de bacterias.221 Gitnick y cois, comunicaron el aislamiento de micobacterias con requerimientos nutricionales especiales, que incluyen M. paratuberculosis, en 5 de 82 muestras intestinales resecadas quirúrgicamente de pacientes, 27 de los cuales tenían enferme­ dad de Crohn.106 Estas cepas necesitaron entre 4 y 8 meses para

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el cultivo, lo cual puede ser una razón de por qué este microor­ ganismo no ha sido aislado en los laboratorios clínicos. Prantera y cois, proporcionaron indicios indirectos de la aso­ ciación entre la enfermedad de Crohn y M. paratuberculosis al demostrar concentraciones séricas elevadas de anticuerpos antibacterianos que fueron halladas en los pacientes que siguie­ ron un tratamiento exitoso con dapsona, fenómeno similar al observado después del tratamiento de los casos clásicos de tuberculosis.268 Mediante PCR y la utilización de una porción de la secuencia de inserción de M. paratuberculosis IS900 como sonda, Sanderson y cois, pudieron identificar el DNA de M. paratuberculosis en el 65% de las muestras de biopsia rec­ tal en pacientes con enfermedad de Crohn, en comparación con sólo un 4,3% y un 12,5% de pacientes con colitis ulcerosa e individuos sanos, respectivamente.302 Asimismo, Fidler y cois, observaron que era mucho más probable que el material de gra­ nulomas de tejidos con enfermedad de Crohn (31 muestras de biopsias en el estudio) diera DNA específico de M. paratuber­ culosis en la amplificación por PCR que los tejidos no afecta­ dos por la enfermedad de Crohn (10 biopsias de colitis ulcero­ sa como controles negativos).92 Si realmente las micobacterias fueran la causa de las enfermedades intestinales, pueden estar indicados nuevos métodos de prevención y tratamiento de estos trastornos, en especial de la enfermedad de Crohn. La asocia­ ción no ha sido probada por los postulados de Koch (véase Cocito y cois, para un comentario sobre paratuberculosis51). Mycobacterium terrae, M . gastri y M . triv ia le . Estas micobacterias también son bacterias no fotocromógenas de crecimiento lento, no reconocidas en el pasado como patógenos, pero que pocas veces se encuentran en el laboratorio clínico. Se las puede dife­ renciar por las características mencionadas en el cuadro 19-7. Las colonias de M. triviale pueden asemejarse a las del com­ plejo MAI y en algunos casos pueden ser tan rugosas que se confunden con bacilos tuberculosos; sin embargo, estas cepas son niacina negativas y pueden crecer en medios que contienen

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-11 terrae y Mycobacterium triviale

Mycobacterium

Si bien M. terrae y M. triviale eran agrupadas antes en un complejo, tam ­ bién pueden considerarse por separado. Estas micobacterias han sido incriminadas en varios casos de infecciones hum anas, según lo cita Woods y Washington: artritis séptica causada por M. triviale en un lactante, sinovitis y osteom ielitis causadas por M. terrae en un hombre joven con pancitopenia de Fanconi y una posible infección disem inada por M. terrae en lina m ujer joven con tuberculosis m iliar previa.399 Se han inform ado varios casos de infección pulm onar por M. terrae.191347 K rishner y cois, com uni­ can un caso y citan seis casos previos de infección respiratoria.187 Peters y M orice informaron sobre un caso de infección pulm onar por M. terrae en una m ujer de 64 años con carcinom a de ovario, que se presentó como infiltrados m iliares caseificados en las radiografías de tórax y acom paña­ dos por una erupción en los m iem bros.256 Las lesiones pulm onares y cutá­ neas se resolvieron luego de 6 semanas de tratam iento con isoniazida, rifam picina y pirazinam ida, a pesar de la “resistencia" de estos fármacos, según lo determinaron las pruebas de sensibilidad in vitro. Petrini y cois, inform aron de un caso de tenosinovitis de la mano por M. terrae.™-11’' Tanto el tendón com o las vainas tendinosas se encontraban tum efactos y se observó desde el punto de vista histológico inflamación crónica, form a­ ción de granulomas y necrosis. Se comunicó un caso de tenosinovitis del dedo de la mano en un pescador de edad m ediana que sufrió heridas pun­ zantes mientras m anipulaba aletas de m ojarras.186

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C A P ÍT U L O 19

Micobacterias

NaCl al 5% . M. triviale también hidroliza Tween 80 dentro de los 5 días, mientras que los microorganismos del complejo MAI son Tween negativos. M. gastri y M. terrae son otras especies no fotocromógenas que pueden necesitar una diferen­ ciación bioquímica (véase cuadro 19-7). M. terrae también se conoce como el “bacilo del rábano”, dado que fue aislado ini­ cialmente en el agua de lavado de estos vegetales. Las colonias de M. terrae tienden a ser más lisas que las colonias rugosas de M. triviale. Mycobacterium shimoidei. M. shim oidei es el nombre propuesto para un microorganismo similar a M. terrae aislado en múlti­

ples ocasiones en un período de 11 años en un residente de 56 años de Japón que sufría una enfermedad pulmonar similar a la tuberculosis.375 En 1988, sobre la base de estudios de homolo­ gía de DNA, Imaeda y cois: oficializaron a M. shim oidei como una especie distinta.148 Este difiere fenotípicamente de los miembros del complejo M. terrae por las reacciones de catala­ sa negativa y beta-galactosidasa positiva y de M. m alm oense por una reacción de fosfatasa ácida positiva. Como las reaccio­ nes de beta-galactosidasa y fosfatasa ácida pocas veces se rea­ lizan en los laboratorios clínicos, puede ser difícil establecer la identificación de la especie sobre la base de las propiedades fenotípicas. Se han informado otros casos clínicos de infecciones causa­ das por M. shim oidei desde la comunicación del caso inicial. Se ha comunicado este microorganismo como causa de infeccio­ nes pulmonares en pacientes que viven en Australia y en Alemania, y el último caso complicó una silicosis de larga data.129,376 El tratamiento inicial con isoniazida, propionamida y rifampicina fracasó porque el microorganismo fue tanto resis­ tente a la isoniazida como a la rifampicina; se logró una cura­ ción con una serie de 14 días de estreptomicina e isoniazida. Por lo tanto, cuando una especie de M ycobacterium es fenotí­ picamente similar al complejo M. terrae o se aísla M. m alm o­ ense en muestras respiratorias obtenidas de pacientes con infecciones pulmonares, se debe considerar M. shim oidei y se debe intentar una identificación de la especie. Mycobacterium malmoense. En 1977, Schroder y Juhlin aislaron una nueva especie de M ycobacterium en cuatro pacientes con enfermedad pulmonar.308 Estos autores denominaron el micro­ organismo M ycobacterium m alm oense, por la ciudad sueca de Malmó, en la cual vivían los pacientes. También se ha obser­ vado la enfermedad en Escocia.96 Se comunicó el aislamiento de los microorganismos en los Estados Unidos: 12 cepas por Good y cois, en 1980,110 y más recientemente, en cuatro pacientes con enfermedad pulmonar crónica por Albers y cois., en dos de los cuales se desarrolló una enfermedad progresiva. Características de laboratorio. En los casos típicos, este microorganismo crece lentamente, algunas cepas ya se obser­ van en 2 a 3 semanas de incubación a 37 °C; sin embargo, algu­ nas pueden requerir hasta 12 semanas antes de que las colonias se vuelvan visibles. Esta necesidad de una incubación prolon­ gada, más allá de un período utilizado en la mayoría de los laboratorios clínicos, puede conducir a un subdiagnóstico. Las colonias típicas de M. m alm oense son blanco grisáceas, lisas, brillantes, opacas y tienen cúpula. Son incoloras y la exposi­ ción a la luz no produce pigmentación. En los frotis con tinción para microorganismos ácido-alcohol resistentes aparecen for­ mas cocoides o bacilares cortas sin bandas transversales. Las reacciones de pruebas bioquímicas claves de M ycobac­ terium m alm oense son las siguientes: 1. No hay acumulación de niacina. 2. No reduce el nitrato a nitrito.

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-12 Mycobacterium malmoense En la última década, se ha comunicado M. malmoense con frecuencia cre­ ciente como patógeno pulmonar. Se informaron más de 180 casos y la mayoría afectan a pacientes con enfermedades pulmonares previas, a menudo hombres de edad mediana con neumoconiosis.41" En los casos típicos, las radiografías muestran un cuadro indistinguible de M. tubercu­ losis. Jenkins y Tsukamura 157 describieron dos casos de adenitis cervical, mientras que Warren y cois . 371 presentaron a un paciente de los Estados Unidos con enfermedad pulmonar crónica. Albers y cois, creen que las infecciones por M. malmoense pueden ser más frecuentes en los Estados Unidos de lo que se sospechaba y están subcomunicadas, ya que algunas cepas necesitan 8 a 1 2 semanas o más de incubación antes de que ocurra un crecimiento visible, un período más prolongado de lo que se mantie­ nen los cultivos en la mayoría de los laboratorios.*’ El crecimiento es sig­ nificativamente más rápido en las muestras que crecen en frascos de caldo BACTEC en comparación con el crecimiento diferido en el medio de Lowenstein-Jensen.HWSe debe utilizar en paralelo un medio de cultivo en caldo para mejorar el rendimiento de las cepas de crecimiento muy lento . 138 Otras comunicaciones de casos incluyen linfadenitis en una niña de 5 años, infección cutánea séptica en un paciente con tricoleucemia y varios casos de infección en pacientes HIV positivos. 37-4 9 -6 0 -264-389*4 0 7 En un caso, la infección fue tratada con éxito con etambutol, cicioserina e iso­ niazida, a pesar de la multirresistencia en las pruebas de sensibilidad in vitro . 37 Se comunicó hace más de una década la falta de correlación clara entre las pruebas de sensibilidad in vitro y la respuesta clínica . 15 En la experiencia de estos autores, la omisión del etambutol del régimen tera­ péutico, aun cuando mostrara resistencia en los estudios in vitro, condujo a una respuesta poco satisfactoria.

3. Hidroliza el Tween 80. 4. Produce catalasa a 68 °C. 5. La prueba de pirazinamidasa es positiva. La mayoría de las cepas son resistentes a isoniazida, estrep­ tomicina, ácido p-aminosalicílico y rifampicina, pero son sen­ sibles a etambutol (1 g/mL) y cicioserina (16 g/mL). Mycobacterium haemophilum. Sompolinsky y cois, aislaron por primera vez M. haem ophilum en 1978 en una lesión subcutánea de un paciente israelí con enfermedad de Hodgkin.326 Como lo indicaría el nombre de la especie, M. haem ophilum requiere hemoglobina o hemina para el crecimiento. Agar chocolate, agar de Colombia sangre de camero al 5%, agar de MuellerHinton con suplemento de Fildes o medio de LJ que contiene citrato amónico férrico al 2% son apropiados para el aisla­ miento de este microorganismo.399 McBride y cois, comunica­ ron el éxito en el aislamiento de M. haem ophilum utilizando un medio que contiene base de Casman, sangre de carnero al 5% calentada y violeta de genciana.218 Debido a la posibilidad remota de aislar este microorganismo en la mayoría de los laboratorios en los Estados Unidos, el uso de una tira de factor X en el área de inoculación en agar 7H10, como lo sugieren Vadney y Hawkins, ofrece una alternativa apropiada en los casos sospechosos.358 La mayoría de las infecciones afectan la piel y el tejido sub­ yacente, lo que posiblemente refleja la tendencia del microor­ ganismo a crecer a una temperatura más baja.188 Gupta y cois, comunicaron un caso de osteomielitis e infección cutánea en un paciente con SIDA, que fue tratado con éxito con minocicli­ na.120 Kiehn y cois, informaron cuatro casos en pacientes inmu-

C lasificación de las m icobacterias

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-13 haemophilum

Mycobacterium

Los nodulos subcutáneos dolorosos, las tumefacciones y las úlceras que pueden progresar hasta abscesos y fístulas que drenan son presentaciones clínicas frecuentes de M. haemophilum. Rogers y cois, comunicaron casos de enfermedad diseminada en pacientes con SIDA, en los cuales las lesio­ nes cutáneas fueron múltiples, y afectaron el brazo, las manos y los pies (remítase a este artículo para obtener excelentes radiografías en color de estas lesiones ) . 2 9 0 En un estudio de 13 pacientes con infecciones por M. haemophilum recogidos de siete hospitales metropolitanos en Nueva York, las manifestaciones clínicas incluyeron lesiones cutáneas diseminadas, bacteriemia y enfermedades de los huesos y las articulaciones, los gan­ glios linfáticos y los pulmones. 338 Los autores de este estudio destacan que las técnicas de cultivo incorrectas pueden diferir o incluso omitir un diagnóstico de laboratorio, y que las infecciones pueden ser más frecuen­ tes de lo que se reconoce. Se han informado otros casos en pacientes con SIDA, que incluyen el aislamiento en la muñeca y el tobillo en sitios de tenosinovitis grave, y el aislamiento en una lesión cutánea, un ganglio linfático y el ojo de un paciente que representó el primer caso comunicado de infección por M. haemophilum en Canadá (un segundo caso de linfadenitis en una niña canadiense de 3 años que también estaba incluida en este informe ) . 2 1 3 -345 Los pacientes con linfopenia tienen un riesgo muy alto de sufrir infeccio­ nes; se ha demostrado que la diálisis renal y el tratamiento con corticosteroides son trastornos predisponentes de la infección por M. haemophil um.11™

nodeprimidos: dos tenían SIDA y dos eran receptores de alotrasplantes de médula ósea.171 Debido a los requerimientos úni­ cos de hierro y a la temperatura más baja para el crecimiento óptimo, estos autores sugieren que se debe considerar M. ha e­ m ophilum cuando de las muestras de pacientes inmunodepri­ midos con una enfermedad inexplicable no se aíslan micobac­ terias bajo condiciones de cultivo de rutina o cuando se obser­ van bacilos ácido-alcohol resistentes en los frotis. Características de laboratorio. El crecimiento óptimo ocu­ rre a 28-32 °C; algunas cepas crecen a 20 °C; ocurre poco cre­ cimiento o ninguno a 37 °C. El crecimiento es estimulado por una atmósfera de incubación de C 0 2 al 10%. Las colonias típi­ cas pueden ser rugosas o lisas después de 2 a 4 semanas de incubación a 32 °C en medio con huevo o agar 7H10 (con suplemento de hemina o sobre la superficie de la cual se ha colocado una “tira X”, como ya se explicó). No se desarrolla pigmento, incluso después de la exposición a la luz. Bajo el microscopio, las células son cortas, curvas y fuertemente ácido-alcohol resistentes, sin formación de bandas ni arrosariado. Este microorganismo también es inerte desde el punto de vista bioquímico, con la producción de pirazinamidasa como única reacción positiva entre las pruebas comunes utilizadas para identificar las micobacterias. ESPECIES DE CRECIMIENTO RÁPIDO Mycobacterium fortuitum, M. chelonae y M . abscessus. M. fo r tu i­ tum fue descrito por primera vez en 1938 por daCosta Cruz y

categorizado por completo en 1955 por Gordon y Smith.375 Se observó que este microorganismo era singular entre las micobacterias conocidas debido a su velocidad comparativamente rápida de crecimiento (3 a 5 días). Sin embargo, en la edición

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de 1923 del M anual de Bergey, se describió otro microorganis­ mo de crecimiento rápido denominado M. chelonae , que tenía varias características metabólicas en común con el microorga­ nismo de daCosta Cruz. Estos dos microorganismos son dos de las micobacterias de crecimiento rápido más importantes y ais­ ladas con mayor frecuencia. La tercera micobacteria de creci­ miento rápido que merece mencionarse es M. abscessus, que puede considerarse parte del complejo M. chelonae. No es difí­ cil diferenciar este microorganismo de M. chelonae, lo que es recomendado aquí, dado que puede causar una enfermedad grave y es altamente resistente al tratam iento antibiótico 33,65,303,402 Estas micobacterias son microorganismos terres­ tres y acuáticos ubicuos que contaminan los suministros de agua, incluidos los reactivos y las soluciones de lavado utiliza­ das en los hospitales. Características de laboratorio. Se puede sospechar que un aislamiento desconocido es una micobacteria de crecimiento rápido si se observa el crecimiento del microorganismo ácidoalcohol resistente después de 2 a 4 días de incubación. Sin embargo, en algunos casos el crecimiento puede ser diferido. Las micobacterias pueden ser categorizadas como microorga­ nismos de crecimiento rápido, por definición, si crecen dentro de los 7 días después del subcultivo. Las colonias jóvenes parecen lisas y hemisféricas, habitualmente con una consis­ tencia untuosa o cerosa. En los casos típicos, las colonias son no cromogénicas, pero pueden tener color de hueso o ligera­ mente crema (véase lámina en color 19-2Q). M. fortuitum puede producir ramificación, extensiones filamentosas de colonias de 1 a 2 días en agar harina de maíz glicerol o agar de M iddlebrook 7H1. Algunas cepas producen colonias más rugosas con hifas aéreas cortas, que se observan mejor bajo estereomicroscopia. M. chelonae carece de estas extensiones filamentosas. Estas micobacterias a menudo tienen la capacidad de crecer en agar de MacConkey sin violeta de genciana. También apare­ cen como colonias lisas con forma de cúpula que pueden tener una pigmentación rosa claro (véase lámina en color 19-2R). Asimismo, se puede observar crecimiento con algunas cepas en agar sangre de camero al 5%, que aparecen como pequeñas colonias puntiformes (véase lámina en color 19-2S). Los micro­ biólogos deben alertar sobre esta posibilidad y efectuar tincio­ nes ácido-alcohol resistentes, además de las tinciones de Gram, para que la identificación sea correcta. Desde el punto de vista microscópico, en los preparados con tinción ácido-alcohol resistente, las células bacterianas suelen ser pleomorfas y varían desde formas filamentosas largas hasta bacilos gruesos y cortos. No presentan ramificaciones o son rudimentarias; a veces las células pueden aparecer arrosariadas o tumefactas, con cuerpos ovoides que no se tiñen presentes en un extremo. Algunas cepas de M. fo rtu itu m pueden crecer den­ tro de las 48 horas en agar sangre de camero al 5% de rutina. Las células bacterianas aparecen como bacilos grampositivos cortos, delgados, filamentosos y de tinción débil (véase lámina en color 19-2T). Silcox y cois, han identificado las siguientes característi­ cas para definir una cepa como m icobacteria de crecim iento rápido:316 1. 2. 3. 4. 5.

Acido-alcohol resistente. Ausencia de producción de pigmentación. Proliferación en menos de 7 días en su temperatura óptima. Pruebas de actividad de arilsulfatasa a los 3 días. Crecimiento a 28 °C en agar de MacConkey especial (des­ provisto de violeta de genciana).

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C A P ÍT U L O 19

Micobacterias

Se pueden realizar otras pruebas para las características a fin de diferenciar M. fortuitum , M. chelonae y M. abscessus: 1. M. chelonae y M. abscessus no reducen los nitratos (M fo rtu itu m es positivo). 2. M. chelonae y M. abscesos son incapaces de asimilar hie­ rro a partir de citrato amónico férrico, propiedad que posee singularmente M. fortuitum (véase protocolo 19-10). 3. M. fo rtu itu m es sensible a la ciprofloxacina y al ácido pipemídico, pero resistente a la polimixina B; M. chelo­ nae tiene las reacciones opuestas.332 4. M. chelonei no puede crecer en el medio de LJ que con­ tiene NaCl al 5% a 28 °C, pero puede utilizar citrato, mientras que las reacciones opuestas definen a M. a b s­ cessus.

Es posible identificar subespecies de M. fortu itu m , pero tiene poca importancia clínica; sin embargo, puede ser útil para cier­ tas aplicaciones epidemiológicas. M. fo rtu itu m existe en tres biovariantes: biovariante fortuitum, biovariedades: fortuitum, peregrinum y una biovariedad sin nombre designada “tercer grupo”. M. sm egm atis es otra micobacteria de crecimiento rápido que se asemeja estrechamente a M. fortu itu m , y sólo difiere en su reacción negativa en la prueba de arilsulfatasa de 3 días, su capacidad para crecer a 45 °C y una producción diferida de pig­ mento después de 2 semanas de incubación.243 Mycobacterium thermoresistible. Como lo indica el nombre de la especie, M. therm oresistible tiene la característica singular de crecer a 52 °C. Este microorganismo es potencialmente pató­ geno; sin embargo, la poca frecuencia de comunicaciones de casos indica que la exposición es mínima o el microorganismo tiene muy baja virulencia. Weitzman y cois, comunicaron un caso de infección humana por M. therm oresistible en una mujer blanca inmunodeprimida con fiebre, tos y pérdida de peso.380 Se observó una enfermedad pulmonar cavitaria en las radiografías. Se aislaron microorganismos en el esputo y en una muestra de broncoscopio. El examen histológico de una biopsia pulmonar puso de manifiesto muchos microabscesos y granulomas con células gigantes de tipo Langhans, típicas de tuberculosis. Wolfe y Moore informaron sobre un caso de infección mamaria en una mujer luego de una mamoplastia de aumento.392 El microorganismo puede crecer lentamente como un esco­ tocromógeno en medio para aislamiento primario y puede ser confundido con M. gordonae. La mayoría de las cepas de M. gordonae son ureasa negativas y no crecen en el medio que contiene cloruro de sodio al 6,5%. OTRAS MICOBACTERIAS Mycobacterium ulcerans. La mayoría de los casos de infecciones por M. ulcerans han sido comunicados en Africa Central y

O ccidental, M alasia, Nueva Guinea, Guyana, M éxico y Australia. Se ha utilizado el nombre “úlcera de Baim sdale” para las lesiones cutáneas de las infecciones por M. ulcerans, nombre en honor de la ciudad australiana donde Alsop y Searls reconocieron por primera vez el microorganismo en la década de 1930.272 La mayoría de las infecciones humanas ocurren en las regiones tropicales luego de alteraciones de los bosques húmedos.131 Se propone que las micobacterias son transporta­ das desde el suelo a los sistemas lacustres de drenaje, donde se multiplican en meses o años. Los seres humanos se infectan por el contacto con estos microorganismos en los estuarios contaminados.

C aracterísticas de lab o rato rio . M. ulcerans crece en con­ diciones óptimas a 33 °C y en absoluto a 37 °C. Las colonias rugosas, color beige claro o no pigmentadas, convexas o pla­ cas, con un borde irregular, que a menudo simulan las de M. tuberculosis, se desarrollan después de 6 a 12 semanas. Desde el punto de vista microscópico, las células ácido-alcohol resis­ tentes son moderadamente largas y con forma de bacilos, sin formación de bandas ni arrosariado. M ycobacterium ulcerans es bioquímicamente inerte y sólo muestra actividad de catalasa termoestable entre las distintas pruebas que suelen utilizarse para identificar a las micobacterias. Mycobacterium genavense. M. genavense es una micobacteria no tuberculosa, no pigmentada, de crecimiento lento y de aisla­ miento infrecuente que causa infección en los pacientes con SIDA. El microorganismo fue reconocido por Boettger y cois, por el hallazgo de un patrón único que utiliza DNA extraído de las micobacterias que crecen en medios de hemocuitivo BAC­ TEC 13A.28 Se secuenciaron directamente los fragmentos genéticos amplificados y se determinaron los perfiles electroforéticos en gel de agarosa al 0,8% teñido con bromuro de etidio. Los autores estudiaron 16 casos cuyos microorganismos tenían este perfil singular de secuencia de DNA y designaron oficialmente el microorganismo como M. genavense por el paciente de 28 años con SIDA que vivía en Ginebra del cual se aisló la primera cepa. Con posterioridad, Coyle y cois., utili­ zando ensayos para secuenciar el gen para rRNA 16S que había sido extraído de aislamientos no identificados de micobacterias de 15 hemocultivos obtenidos de siete pacientes con SIDA, también confirmaron la identidad de M. genavense como una especie separada.61 El patrón de secuencia se relacionó más estrechamente con M. sim ia e ; sin embargo, la presentación clí­ nica, la respuesta al tratamiento y las manifestaciones de la necropsia se asemejan más a las infecciones por complejo M. avium .2' Desde el punto de vista histopatológico, M. gen a ven ­ se en los pacientes HIV positivos produce lesiones caracteriza­ das por masas de histiocitos espumosos y granulomas bien definidos, cuyo desarrollo depende de la reactividad inmunita­ ria del huésped.217 En una serie de necropsias, los más afecta­ dos fueron el intestino delgado, el bazo, el hígado y los gan­ glios linfáticos; se respetaron los pulmones, el miocardio y el riñón, una distribución similar a la observada en los pacientes con enfermedad diseminada causada por un miembro del com­ plejo MAI. Los aislamientos iniciales fueron identificados en muestras obtenidas de pacientes con SIDA en Suiza (de ahí el nombre genavense), pero se describieron infecciones diseminadas en Europa, Estados Unidos y Australia.28,255 Esta distribución geo­ gráfica puede reflejar más el conocimiento del personal sanita­ rio sobre esta especie nueva que las áreas seleccionadas de endemicidad. M. genavense puede ser subreconocido porque sólo crece en medios de cultivo en caldo (como caldo BACTEC 13A, en el cual fue descubierto inicialmente) y requiere una incubación prolongada.246 Los síntomas más frecuentes son fie­ bre, pérdida de peso, diarrea, hepatoesplenomegalia y anemia.

Detección e identificación de las micobacterias mediante métodos moleculares Como lo indica el algoritmo presentado antes en este capítu­ lo, los laboratorios clínicos intentan alejarse de la tarea prolon­ gada y tediosa de realizar las pruebas bioquímicas para hacer la identificación de una especie de las micobacterias aisladas en cultivo. Cada vez más a menudo se están utilizando métodos

D etección e identificación de la m icobacterias m ediante m étodos m oleculares

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-14 Mycobacterium abscessus

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Bacilos de crecimiento rápido: Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chelonae y

Ai. fortuitum, M. chelonae y M. abscessus, este último incluido en el complejo de Ai. chelonae, son las micobacterias de crecimiento rápido de mayor impor­ tancia clínica. Una amplia variedad de infecciones se han asociado con estas micobacterias, entre ellas las de los pulmones, la piel, el hueso, el sistema ner­ vioso central, las válvulas cardíacas protésicas y la enfermedad diseminada . 316-399 Las infecciones cutáneas son muy frecuentes y a menudo evolucionan en abscesos subcutáneos que drenan . 125 Wallace y Brown revisaron 100 aislamientos de M. chelonae en la piel, el tejido blando y el hueso en un período de 10 años . 366 Se halló más frecuentemente infección cutánea (53%), celulitis u osteomielitis localizada (35%) e infecciones de catéteres (12%). Los factores de riesgo subyacentes para las infecciones fueron trasplante de órganos, artritis reumatoide y otros trastornos autoinmunitarios, traumatismo y procedimientos médicos invasivos. Wallace y cois, habían revisado antes 125 infecciones humanas causadas por micobacterias de crecimiento rápido . 368 El 59% de estos casos involucró la piel (infecciones de heridas posquirúrgicas, traumatismo accidental e inyecciones con aguja). Se comunicó un brote de infecciones cutáneas en una sala hospitalaria causado por M, fortuitum por la exposición a una máquina de hielo contaminada y la contaminación de una máquina de desinfección de broncoscopio automático como otras fuentes de infecciones hospitalarias. 9 7 1 9 7 Se informó un síndrome cutáneo clínicamente definido, asociado con infecciones causadas por el entonces complejo Ai. chelonae (Ai. abscessus no era distinguido de rutina de Ai. chelonae en ese momento) en receptores de trasplantes renales, que consistió en lesiones nodulares indolentes y sensibles a la palpación sobre las extremida­ des.'" La propagación esporotricoide de estas infecciones puede ocurrir en pacientes inmunosuprimidos y, pocas veces, las infecciones cutáneas con micobacterias de crecimiento rápido pueden representar la extensión de la enfermedad diseminada . 7 9 -238 Se informaron otras distintas entidades clínicas causadas por micobacterias de crecimiento rápido. Se comunicaron varios casos de queratitis en personas que usan lentes de contacto blandas o duras . 31’168 La mayoría de las infecciones siguen al traumatismo y a menudo el tratamiento antibiótico tópico fracasa; por lo tanto, suele requerirse una queratoplastia para lograr una curación. Se recomienda realizar frotis ácido-alcohol resistentes de los raspados cornéanos en todo paciente con úlceras corneanas crónicas . 283 Los pacientes que reciben diálisis peritoneal ambulatoria continua también están expuestos a adquirir peritonitis causada por micobacterias de crecimiento rápido . 4 7 -8 4 -182-2 2 4 3 2 7 Las recomendaciones colectivas consisten en realizar cultivos para micobacterias en los pacientes con peritonitis asociada con diálisis peritoneal ambulatoria continua cuando los cultivos habituales no muestran microorganismos. Se deben considerar las micobacterias de crecimiento rápido cuando se examinan placas de cultivo y tinciones de Gram preparadas de aislamientos en líquidos perito­ neales o diálisis que tienen el aspecto de difteroides mal caracterizados. La extracción del catéter, el drenaje de las colecciones líquidas y el uso adecuado de antibióticos suelen conducir a una rápida curación. Cualquiera de estos microorganismos son causas importantes de infecciones pulmonares, pero las infecciones por M. abscessus pueden ser particularmen­ te graves. 369 Las micobacterias de crecimiento rápido son ubicuas en muchas fuentes acuosas y muchas colonizan las vías respiratorias de los pacientes que tienen los mecanismos de defensa local comprometidos, que están debilitados o inmunodeprimidos o que padecen una enfermedad pulmonar obstructiva cró­ nica de larga data. Los procedimientos invasivos sobre las vías respiratorias también colocan a los pacientes en riesgo de sufrir una infección por Ai. absces­ sus. Burns y cois, estudiaron un brote de cultivos positivos de esputo para M. fortuitum en 16 pacientes que eran tratados en una sala de rehabilitación para alcoholismo . 3 4 La electroforesis de campo pulsado de grandes fragmentos de DNA genómico obtenidos con enzimas de restricción reveló que los 16 aisla­ mientos eran idénticos. Se observó que la fuente era una canilla conectada a la vía de agua que proveía a las duchas que utilizaban estos pacientes; no ocu­ rrieron otros casos después de desconectar y descontaminar esos artefactos. Se han informado varios casos de infecciones de catéteres causadas por micobacterias de crecimiento rápido. Raad y cois, revisaron 15 pacientes oncoló­ gicos infectados en el M. D. Andersen Cáncer Center. 9 causados por M. fortuitum y 6 por M. chelonae.1’1 Cuatro pacientes con bacteriemia e infecciones asociadas de catéter se recuperaron después de extraído el catéter y de la institución rápida del tratamiento antibiótico. La bacteriemia se repitió en siete pacientes en los cuales el catéter quedó colocado y que fueron tratados sólo con antibióticos. Los pacientes con infecciones del túnel del catéter requirieron cirugía para lograr la curación. Se comunicaron tres casos de infecciones por M. chelonae en pacientes febriles con neutropenia, considerada un factor de riesgo definido para desarrollar una enfermedad progresiva y diseminada. 222 Otras infecciones causadas por las micobacterias de crecimiento rápido incluyen un brote de otitis media por M. chelonae en un centro clínico, donde la transferencia ocurrió entre los pacientes por instrumentos contaminados, aortitis luego de reemplazo de válvula aórtica e infección de heridas esternales por Ai. fortuitum-, endocarditis por Ai. fortuitum en una mujer de 54 años con insuficiencia renal crónica que recibía hemodiálisis; una serie de infecciones rela­ cionadas con bypass cardíaco; casos raros de hepatitis y sinovitis; un absceso retroperitoneal infectado por Ai. chelonae que complicó una herida por arma de fuego en el flanco; y un caso de infección diseminada por M. fortuitum en un paciente con SIDA . 146-2 1 0 -2 8 9 3 0 7 3 1 8 3 8 0 3 9 9 Se comunicaron dos casos de infecciones postraumáticas de los tejidos blandos por M. smegmatis en un varón de 21 años y en una mujer de 29 años que sufrieron accidentes automovilísticos. 243 El primer paciente presentó una lesión secretante en la pierna izquierda y ladenopatía inguinal y la última un área subcutánea de celulitis con secreción crónica de la cara posterolateral del muslo. Los autores también citan 12 casos de infecciones por Ai. smegmatis publicados, lo que disipa cierta duda de que este microorganismo sea no patógeno. Newton y Weiss informaron luego un caso de neumonía aspirativa causada por Ai. smegmatis?*2 Las micobacterias de crecimiento rápido varían en su sensibilidad in vitro. 143 La amikacina es predeciblemente activa; otros aminoglucósidos, cefoxitina. doxiciclina y eritromicina también son selectivamente activos. Los agentes más nuevos que han mostrado actividad in vitro contra algunas cepas son imipenem-cilastatina. amoxicilina-clavulanato y ciprofloxacina . 307

sin cultivo basados sobre biología molecular para la confirma­ ción con cultivo de las cepas de especies de M ycobacterium aisladas en cultivo. Por ejemplo, los ensayos de sonda de áci­ dos nucleicos prácticamente han reemplazado a las pruebas bioquímicas convencionales en la identificación de M. tubercu­ losis y el complejo MAI. También se han producido sondas de

ácidos nucleicos para la identificación de M. kansasii y M. g o r­ donae. Varios grupos describieron la utilidad de estas sondas en el laboratorio clínico.62’227'282,304,352 Existen cuatro aplicaciones principales para las técnicas moleculares cuyo uso se encuentra disponible en los laborato­ rios clínicos:

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Micobacterias

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 19-15 ulcerans

Mycobacterium

La infección se presenta como un “furúnculo" o una masa indolora por debajo de la piel, que en los casos típicos se desarrolla en el sitio de un traumatismo previo y prosigue hasta una úlcera superficial que no cicatri­ za, con una base necrótica en algunas semanas. Algunas de las lesiones estudiadas por Igo y Murthy fueron muy graves y la necrosis por coagula­ ción avascular se extendió en la profundidad del tejido subcutáneo . 147 También se pueden desarrollar nodulos satélite que se ulceran. Se ha comunicado un tratamiento exitoso con la aplicación de calor local, esci­ sión e injertos.31" Igo y Murthy proporcionan las características clínicas, histológicas y microbiológicas de 46 casos de infecciones por M. ulcerans estudiados en varios pueblos a lo largo del río Sepik en Nueva Guinea . 147 En general, las lesiones se encuentran sobre los miembros inferiores y consisten en úlceras poco profundas que aparecen en áreas de induración subcutánea en los sitios de un traumatismo previo. Se pueden desarrollar nodulos satélites y úlceras superficiales. En general, son indoloras a menos que haya una infección secundaria. Delaporte y cois, informaron sobre uno de los primeros casos de infecciones por M. ulcerans en una paciente con SIDA . 7 2 Era una mujer de Zaire de 30 años, embarazada, con una lesión ulcerante crónica y dolorosa de la rodilla. Una biopsia en saca­ bocados no dio ningún microorganismo; sin embargo, una biopsia más profunda de la aponeurosis puso en evidencia muchos bacilos ácido-alcohol resistentes. La lesión cicatrizó con un régimen de 2 meses de isoniazi­ da. rifampicina y etambutol. A pesar de la asociación de infección por M. ulcerans y SIDA en esta paciente, esta asociación es demasiado infre­ cuente como para servir como enfermedad marcadora.

1. Confirmación con cultivo de las cepas aisladas en mues­ tras clínicas utilizando sondas de DNA. 2. Identificación de micobacterias a través de la secuencia­ ción de DNA. 3. Detección directa de M. tuberculosis en esputo y otras muestras clínicas utilizando ensayos de amplificación de ácidos nucleicos. 4. Determinación de huellas moleculares de DNA y tipifica­ ción de cepas de especies de M ycobacterium . La literatura médica relacionada con el diagnóstico molecu­ lar según se aplica a la identificación de las micobacterias es amplia. En este momento es difícil predecir cuál de las varias técnicas específicas soportará la prueba del tiempo; por lo tanto, también lo es determinar qué referencias y aplicaciones deben incluirse en un libro de texto general. Aunque las herra­ mientas moleculares precisas utilizadas en los laboratorios de micobacteriología varían, casi todos los laboratorios modernos utilizan en cierta medida diagnósticos moleculares. Se están determinando los estándares para el uso del diagnóstico mole­ cular. Independientemente de su empleo en el futuro, existe la necesidad de una experiencia continua con las técnicas con­ vencionales que se siguen utilizando en la mayoría de los labo­ ratorios clínicos. El estudio de estas técnicas también propor­ ciona un conocimiento fundamental de la biología básica de las micobacterias y ayuda a determinar el mejor papel para las téc­ nicas más nuevas cuando son introducidas en el laboratorio clí­ nico. La detección y la caracterización de las micobacterias mediante métodos moleculares pueden separarse en métodos no basados sobre la amplificación y métodos basados sobre la amplificación. Después de la amplificación, el/los producto/s de la amplificación pueden ser analizados mediante secuencia­

ción de DNA para adquirir información de la identificación o mediante otras técnicas o tipificación. A continuación describi­ mos las características sobresalientes de estas aplicaciones. Métodos de amplificación de señales SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Las sondas de ácidos nucleicos constituyeron la primera téc­ nica basada en ácidos nucleicos utilizada de rutina en el labo­ ratorio de microbiología clínica para la identificación de micobacterias en cultivos positivos. Estas sondas, que al principio eran radiomarcadas, pero que ahora son no isotópicas, fueron utilizadas por primera vez y comercializadas por Gen-Probe (San Diego, CA). La precisión, la sensibilidad y la especifici­ dad de estas sondas son muy altas cuando se las utiliza para identificar las micobacterias en cultivo, según las instrucciones del fabricante y han sido autenticadas en varios estu­ d i o s . 99,227,240,304 Existen sondas de ácidos nucleicos para la identificación de microorganismos del complejo M. tubercu­ losis, el complejo M. avium/M . intracellulare, M. kansasii y M. gordonae. También existen sondas separadas para M. avium y M. intracellulare si se desea la diferenciación de estas micobacterias. En resumen, esta técnica utiliza sondas de DNA monocatenario marcadas con éster de acridina que forman híbridos con el RNA recombinante (rRNA) proveniente de la bacteria en estudio por acción de un agente lítico, calor y sonificación. El rRNA ribosómico es un punto diana genético útil para la iden­ tificación de los microorganismos, dado que a menudo contie­ ne secuencias “firma” (signature ) y está presente en las células y el cultivo en grandes cantidades secundarias al crecimiento del microorganismo (amplificación biológica). La sonda de DNA y el rRNA se hibridan según el apareamiento tradicional de bases de Watson y Crick para un complejo DNA:RNA esta­ ble.288 Después de la inactivación de la sonda no hibridada, se realiza un paso de generación de señales y se produce luz que es registrada por un equipo. La luz producida es proporcional a la cantidad de sonda presente y se utiliza un umbral predeter­ minado para establecer la positividad. Las dos horas necesarias para la determinación basada sobre sonda de la especie para la cual existen sondas genéticas representa un adelanto importan­ te respecto de la identificación mediante métodos convencio­ nales.227,304 Los aislamientos negativos por sonda requieren aún la identificación utilizando métodos fenotípicos para los labo­ ratorios que no utilizan secuenciación de DNA, pero esto repre­ senta una minoría definida de aislamientos, habitualmente < 10%. Los sistemas comerciales tienen una duración amplia­ da. que también extiende la utilidad a una gran cantidad de laboratorios. Véase el protocolo 19-17 para una descripción detallada de este procedimiento. Una ventaja pronto reconocida fue el uso de estas sondas en los cultivos positivos en caldo, que aísla más rápidamente las micobacterias que los medios sólidos en la mayoría de los casos. Como el aislamiento de micobacterias en cultivo requie­ re 2 a 3 semanas, varios estudios indicaron que los ensayos de sonda podían realizarse en microorganismos aislados en culti­ vo en caldo, específicamente en frascos de BACTEC.87,258 La técnica implica la aspiración de 1 a 1,3 mL de líquido de un frasco de hemocuitivo después de alcanzar por lo menos un índice de crecimiento de 100 (GI = 999 logra el máximo nivel de sensibilidad). Se coloca la alícuota de caldo de cultivo en un tubo de 1,5 mL con tapa de rosca y se lo coloca en una microcentrífuga. Se utiliza la centrifugación a 9 000 g durante 5 a 7 minutos para concentrar las bacterias. Después de descartar el sobrenadante, se suspende la pñdora en un reactivo de sonica-

D etección e identificación de la m icobacterias m ediante m étodos m oleculares

ción-lisado y se completa el procedimiento como ya se describió en este capítulo. Kiehn y Edwards combinaron el sistema BACTEC TB con la sonda de ácidos nucleicos dirigida al rRNA de M. avium para identificar con rapidez esta especie cuando era aislada en hemocultivos de pacientes con SIDA.169 En un estudio llevado a cabo por Ellner y cois., la combinación ¿el aislamiento en BACTEC y el ensayo con sonda de DNA identificó el 89% de 176 aislamientos de M. tuberculosis y el 89% de 110 aislamientos de M. a viu m }1 Lo más impresionan­ te fue la reducción de alrededor de 5 a 7 semanas del tiempo transcurrido hasta el resultado final en comparación con los métodos de aislam iento y bioquím icos convencionales. Asimismo, se hizo una identificación rápida de M. tuberculosis con la combinación BACTEC TB-sonda de DNA en el 83% de 64 casos y en el 92% de los aislamientos de M. avium y el 86% de los aislamientos de M. intracellulare .258 En un estudio de 359 aislamientos ácido-alcohol resistentes positivos en frascos BACTEC 12, se identificaron los siguien­ tes porcentajes de microorganismos en el examen de detección directo inicial de las píldoras centrifugadas con AccuProbes quimioluminescentes no isotópicas específicas de especie (Gen-Probe): complejo M. tuberculosis, 87,2%; complejo M. avium, 78,6%; M. kansasii, 91,7% y M. gordonae, 85,9%.281 Los autores llegaron a la conclusión de que el menor porcenta­ je de detección, cuando se compara con los estudios previos, es en parte el resultado de la fuerza centrífuga utilizada (3 000 g en lugar de 9 000 a 10 000 g). Cuando no se cuenta con centrí­ fugas de alta velocidad, la extensión del tiempo de centrifuga­ ción hasta 30 minutos puede mejorar el rendimiento. En un esfuerzo similar por disminuir aún más el tiempo de detección, Forbes y cois, aplicaron amplificación con PCR para detectar M. tuberculosis aislado en cultivos en caldo BACTEC 12B.94 Con la PCR, se pudo hacer el ensayo de los frascos BACTEC 12B cuando el GI alcanzaba 100 o más. El uso de la PCR en este estudio condujo a un tiempo medio hasta la detección de M. tuberculosis de 9 días, en comparación con 14 días utili­ zando sondas de ácidos nucleicos a partir del crecimiento de subcultivos BACTEC 12B en medios sólidos. Kaminski y Hardy sugieren que la observación de formación de cordones en tinciones ácido-alcohol resistentes realizadas en frascos BACTEC 12B positivos se puede utilizar como guía para seleccionar inmediatamente el ensayo por sonda de M. tuber­ culosis.165

HIBRIDACIÓN IN SITU

La hibridación in situ es una herramienta diagnóstica mole­ cular utilizada durante años en anatomía patológica, pero que ha tenido poca repercusión en microbiología clínica. Esta téc­ nica utiliza una sonda de oligonucleótidos marcada con una molécula detectora. Si la molécula detectora es fluoresceina y la interpretación se hace mediante observación directa utilizan­ do un microscopio de fluorescencia, se denomina hibridación in situ por fluorescencia (FISH). Sin embargo, si la detección de la sonda hibridada se logra a través de una reacción secun­ daria y el color, más que la luz producida, la reacción se deno­ mina hibridación in situ cromogénica (CISH). Varios investiga­ dores han utilizado tanto las reacciones FISH como CISH para la detección de los agentes infecciosos. Más recientemente, la FISH ha sido utilizada para identificar patógenos bacterianos y levaduras en hemocultivos positivos. Esta técnica se ha empledo para identificar M. tuberculosis en cultivos que se vuelven positivos y en muestras respiratorias directas que contienen bacilos ácido-alcohol resistentes. También ha sido utilizada por

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los patólogos para identificar micobacterias en tejidos fijados con formalina e introducidos en parafina y para confirmar la identidad de M. leprae. Lamentablemente, no existen sistemas comerciales para micobacterias, pero puede haberlos, ya que los hay para S. aureus y C. albicans. Métodos de amplificación de ácidos nucleicos APLICACIONES COMERCIALES

En pocas ocasiones, la cantidad de microorganismos de la muestra clínica es lo suficientemente grande como para lograr la detección con una sonda génica quimioluminescente. Sin embargo, muchas veces este método es muy poco sensible para su uso directo en muestras clínicas.43 Se recomienda un ensayo basado sobre la amplificación de ácidos nucleicos si se va a intentar la identificación directa de micobacterias a partir de las muestras clínicas. A finales de la década de 1990 dos ensayos de amplificación de ácidos nucleicos comerciales para la detec­ ción de M. tuberculosis recibieron la aprobación por la FDA para su uso en muestras respiratorias. Estas pruebas, tanto el ensayo PCR para M. tuberculosis Amplicor (Roche Diagnos­ tics, Indianápolis, IN) como la prueba directa para M ycobac­ terium tuberculosis amplificada (Amplified M ycobacterium tuberculosis Direct test, AMTD), que utiliza amplificación mediada por transcripción, han sido aprobadas para uso con muestras con frotis positivos, mientras que sólo la última se aprobó para muestras respiratorias con frotis negativos. Ésta es la culminación de diversos estudios del desarrollo y ensayos de campo en varios años, que condujeron a los productos que están estandarizados y diseñados para reducir los problemas de contaminación con DNA extraño e inhibición de las reacciones de amplificación por inhibidores endógenos. Los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos tienen buen rendimiento en las muestras con frotis positivos, pero en forma subóptima en las muestras respiratorias con frotis negativos, cuando se compa­ ran con el cultivo.73-250'299 Escapa al alcance de este libro revisar todos los trabajos de otros investigadores publicados sobre la evolución de las apli­ caciones de AMTD y PCR en las pruebas directas para la detección de micobacterias en las muestras clínicas, pero exis­ ten muchos.27,229-263 Se describen varios de los estudios impor­ tantes para cada una de estas técnicas aprobadas por la FDA. Uno de los primeros ensayos de campo de la prueba Gen­ Probe AMTD (GenProbe, Inc., San Diego, CA) fue publicado por Joñas y cois, en 1993.161 En un estudio de 758 sedimentos de esputo procesados, 119 (16%) de los cuales fueron positivos para M. tuberculosis, el ensayo Gen-Probe tuvo una sensibili­ dad, una especificidad y un valor predictivo positivo y negati­ vo del 82%, 99%, 97% y 96%, respectivamente, que fueron comparables con los resultados derivados del cultivo y mejores que los del análisis de los frotis. M iller y cois, realizaron una evaluación retrospectiva de tres muestras respiratorias separadas de cada uno de 250 pacientes utilizando el AMTD, que comparó los resultados con los de la microscopia, el cultivo y la revisión de las historias clínicas de los pacientes.229 De estos pacientes, 198 (de los cuales se reco­ gieron 594 muestras) fueron negativos para M. tuberculosis por criterios de cultivo y clínicos y 52 fueron positivos (156 mues­ tras). La especificidad global del AMTD fue del 98,5%. De las 156 muestras obtenidas de los pacientes con tuberculosis, se aislaron microorganismos en 142 (91%), la microscopia para ácido-alcohol resistentes fue positiva para 105 (67,3%) y la AMTD fue positiva para 142 (91%). Cuando se evaluaron las tres muestras de cada uno de los pacientes, la AMTD indicó que los 52 pacientes era positivos para tuberculosis.

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Micobacterias

En un estudio de 938 muestras respiratorias, Pfyffer y cois, observaron que la prueba AMTD tenía sensibilidad del 93,9%, especificidad del 97,6%, valor predictivo positivo del 80,7% y valor predictivo negativo del 99,3% después de la resolución de los resultados discrepantes por revisión de la historia clínica.263 Estos autores llegaron a la conclusión de que es una prueba altamente sensible y específica para detectar microorganismos del complejo M. tuberculosis en algunas horas. Sin embargo, los resultados de otro estudio fueron menos alentadores.27 De 617 muestras de las vías respiratorias, 590 tuvieron un cultivo y una prueba AMTD negativos. Veintiún cultivos (3,4%) arro­ jaron M. tuberculosis; de éstos, 15 (71,4%) fueron detectados por la prueba AMTD y 6 fueron omitidos. M. tuberculosis no creció en cultivo de seis muestras con prueba AMTD positiva (28,6%) obtenidas de tres pacientes en tratamiento para tuber­ culosis. Por lo tanto, la sensibilidad, la especificidad y los valo­ res predictivos negativo y positivo para la prueba AMTD fue­ ron del 71,4%, 99%, 99% y 71,4%, respectivamente. Estos autores juzgaron que la prueba era fácil de realizar y altamen­ te específica, pero que carecía de sensibilidad y sugirieron que puede ser útil la inclusión de un control de amplificación in­ terna. Vuorinen y cois, llevaron a cabo estudios que compararon el rendimiento del producto Gen-Probe con la prueba para M. tu b ercu lo sis A m plicor de Roche (Roche M olecular Diagnostics, Indianápolis, IN), antes de la aprobación por la FDA del último ensayo en los Estados Unidos.365 Evaluaron 256 muestras respiratorias obtenidas de 243 pacientes para detectar la presencia del complejo M. tuberculosis , tanto con la prueba AMTD como con la prueba para M. tuberculosis Amplicor de Roche PCR (Amplicor PCR). Cuando se compa­ ró con los resultados del cultivo realizado en paralelo, la sensi­ bilidad de la tinción, la prueba AMTD y la prueba Amplicor PCR fueron del 80,8%, 84,6% y 84,6%. La especificidad para las tres pruebas fue del 99,1%, 98,7% y 99,1%, respectivamen­ te. Las conclusiones de estos autores fueron que ambos méto­ dos de amplificación de ácidos nucleicos eran rápidos, sensi­ bles y específicos para la detección de M. tuberculosis en las secreciones respiratorias. Los siguientes son resúmenes de algunos otros estudios de la prueba para M ycobacterium tuberculosis PCR A mplicor Roche. Ichiyama y cois., en un estudio paralelo de 422 mues­ tras de esputo obtenidas de 170 pacientes con infecciones por micobacterias, también observaron que el sistema AMTD y el sistema para M ycobacterium Amplicor tenían un rendimiento igualm ente bueno, con una concordancia del 98,7% .145 D'Am ato y cois, evaluaron la prueba Roche Amplicator en 985 muestras de 372 pacientes.68 La sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivos y negativos comparados con el cultivo y el diagnóstico clínico fueron del 66,7%, 99,6%, 91,7% y 97,7%, respectivamente, comparables con los resulta­ dos del cultivo. Los autores citan la gran ventaja de que se dis­ pone de los resultados de las pruebas a las 6,5 horas después de que la muestra llega al laboratorio. En un estudio de 1 480 muestras clínicas obtenidas en 1155 pacientes, Wobester y cois, hallaron que la sensibilidad, especificidad, valores predic­ tivos positivo y negativo del ensayo Amplicator PCR fueron del 79%, 99%, 93% y 98%, respectivamente.391 En muestras con frotis positivos, la sensibilidad fue del 98%, frente al 59% para las muestras con frotis negativos. La sensibilidad y la especifi­ cidad de las muestras que demostraron un índice de prolifera­ ción positivo en el sistema BACTEC 460 fueron del 98% y del 100%, respectivamente. Delacourt y cois., en un estudio de 68 niños con distintos estadios de tuberculosis, observaron que la

PCR era positiva en el 83,3% de 199 muestras obtenidas de niños con enfermedad activa, pero también en el 38,9% de los niños sin síntomas.71 El último grupo puede requerir una reno­ vación o una continuación del tratamiento. Existen otros dos ensayos de amplificación para M. tubercu­ losis para uso fuera de los Estados Unidos que no han sido aprobados por la FDA: el ensayo M. tuberculosis BD ProbeTec (BD Diagnostic), que utiliza amplificación por desplazamiento de hebras, y el ensayo Abbott LCx M. tuberculosis (LCR; Abbott Laboratories, Chicago, IL), que utiliza la reacción en cadena de la ligasa. El ensayo BD ProbeTec M. tuberculosis, que no se comercializa en los Estados Unidos, ha sido utiliza­ do para estudiar muestras respiratorias directas y cultivos posi­ tivos.16,370 Barrett y cois, estudiaron las muestras respiratorias directas de 205 pacientes que tenían alta probabilidad de pre­ sentar tuberculosis. De los 109 pacientes con tuberculosis pro­ bada por cultivo, 101 fueron positivos por el ensayo BD ProbeTec, lo que dio una sensibilidad del 92,7% .16 Hubo tres reacciones falsas positivas comunicadas en este estudio de pacientes con micobacterias no tuberculosas, lo que dio una especificidad del 96%. Los estudios que utilizaron el ensayo Abbott LCx M. tuberculosis también mostraron resultados excelentes de sensibilidad y especificidad.89,200,205,235 Lindbrathen y cois.,205 en un estudio grande en Noruega, examinaron 482 muestras de 457 pacientes con el ensayo para M. tubercu­ losis Abbott LCx y hallaron una sensibilidad del 90,2% y una especificidad del 99,2%. El uso de productos comerciales no impide que los usuarios encuentren problemas en la aplicación y la prueba. Los direc­ tores y supervisores que deciden poner en práctica una de estas pruebas para la detección directa de micobacterias en muestras clínicas deben verificar que se siguen con cuidado las reco­ mendaciones del fabricante y se aplican con rigidez los están­ dares de control de calidad. Estas pruebas todavía no son un reemplazo del cultivo. Aún existen casos en los cuales se aísla M. tuberculosis del cultivo pero que no se detecta mediante métodos moleculares. Además, no contamos todavía con un perfil molecular completo de todos los determinantes de la resistencia, de modo que se deben realizar las pruebas habitua­ les de sensibilidad. Se deben utilizar en forma simultánea los métodos de aislamiento de rutina para cada muestra recibida, controlar con cuidado los aspectos clínicos de cada caso y man­ tener una comunicación constante entre los profesionales del laboratorio y los médicos de atención primaria. Si se aplican estas provisiones, la capacidad de un diagnóstico temprano de los nuevos casos de tuberculosis tendrá un efecto importante sobre el tratamiento y el control de la infección, con prevención del contagio interhumano de la enfermedad. ENSAYOS DOMÉSTICOS DE PCR, INCLUIDA LA PCR EN TIEMPO REAL

Además de los ensayos aprobados por la FDA, se han crea­ do y evaluado muchos ensayos de PCR “domésticos” y, más recientemente, la PCR en tiempo real.247 Si bien estas aplica­ ciones no han sido aprobadas por la FDA, pueden ser herra­ mientas diagnósticas importantes en las manos de operadores entrenados. La posibilidad de un acortamiento hasta horas, en lugar de días y semanas, y la detección e identificación direc­ tas de especies de M ycobacterium en distintas muestras clíni­ cas hace atractivos estos ensayos. El costo de la PCR domésti­ ca suele ser muy inferior al de los productos comerciales com­ parables, pero la validación apropiada del ensayo reside en el usuario de la prueba. Quienes trabajan en diagnóstico molecu­ lar tienen un futuro interesante y brillante, y llegará el día en

D etección e identificación de la m icobacterias m ediante m étodos m oleculares

que los tediosos y a menudo poco precisos métodos de identiñcación de especies que se detallaron en este capítulo serán recordados como procedimientos históricos. Nolte y cois, idearon uno de los primeros ensayos de PCR para el diagnóstico rápido de la tuberculosis pulmonar; en este artículo describieron información de fondo importante que será ce interés para quienes desean aprender más acerca del desarro11o y el establecimiento de un ensayo de PCR.247 Algunos de los r- 'ibles problemas que se deben encarar con los ensayos de _mplificación basados en ácidos nucleicos son la inhibición ce la amplificación y la reproducibilidad del ensayo, los cuales fueron tratados en un estudio de multilaboratorios realizado por Xoordhoek y cois.248 Estos autores hicieron circular 200 muestras de esputo, saliva y agua que contenían cantidades conocidas de células de BCG de M. bovis junto con controles negativos para análisis de PCR. entre siete laboratorios que uti­ lizaron la secuencia de inserción IS 6110 como punto diana para la amplificación del DNA. Cada laboratorio utilizó su pro­ pio protocolo para pretratamiento, extracción de DNA y detec­ ción del producto de amplificación. Se observaron altos niveles de resultados falsos positivos de la PCR entre los laboratorios participantes, que variaron entre el 3% y el 20% (con un extre­ mo del 77% en un laboratorio). Este rendimiento relativamen­ te bajo fue el resultado de la falta de monitorización de cada paso del procedimiento y destaca la necesidad de un control cuidadoso de la calidad durante todos los estadios del ensayo. Además, la inhibición de la amplificación y la comunicación errónea de resultados falsos negativos pueden ser un problema con la PCR. Por esta razón, el uso de un control de amplifica­ ción interna, o la documentación y la monitorización de la tasa de falsos negativos de un ensayo, son necesarios para la acre­ ditación del laboratorio por el College of American Patholo­ gists para los laboratorios que utilizan estas pruebas. La amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real es un método más rápido para realizar la PCR u otros métodos de amplificación, donde amplificación y detección ocurren en el mismo recipiente de reacción. Este está cerrado, lo que dismi­ nuye en forma significativa la posibilidad de contaminación por amplicones del laboratorio. Se han diseñado varios ensayos para la detección rápida de M. tuberculosis, disponibles en una gran variedad de formatos. Se describieron varios ensayos que utilizan el sistema LightCycler (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN). Algunos son específicos de M. tuberculosis que usa un conjunto único de sondas para transferencia de energía por resonancia de fluo­ rescencia (FRET).185,228 Miller y cois, examinaron 135 mues­ tras con tinción ácido-alcohol resistente positiva, de las cuales 105 dieron M. tuberculosis. Tanto el ensayo LightCycler como la prueba de PCR para M. tuberculosis Amplicor con la cual se comparó detectaron 103 de 105, lo que dio una sensibilidad del 98,1% para cada uno de ellos. Estos autores también estudia­ ron 232 frascos de cultivo BacT/Alert MP de muestras respira­ torias, 114 de los cuales fueron positivos para M. tuberculosis. Todos los cultivos positivos fueron detectados mediante el ensayo LightCycler.228 Shrestha y cois, abordaron otro enfoque e idearon una PCR de amplio espectro para detectar todas las micobacterias, pero que no diferenciaba M. tuberculosis de las micobacterias no tuberculosas sobre la base de un análisis de la curva de fusión posamplificación.315 Una vez completada la amplificación, se pueden generar curvas de fusión con algunos tipos de ensayos de amplificación en tiempo real. Los ensayos que utilizan sonda FRET producen curvas de fusión muy distintas que dis­ tinguen incluso la diferencia en un solo nucleótido en los sitios

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de hibridación de la sonda. Shrestha y cois, utilizaron esta carac­ terística para diferenciar M. tuberculosis de no tuberculosis uti­ lizando tanto 186 aislamientos cultivados como 50 muestras clí­ nicas que fueron positivas para M. tuberculosis. Tanto el ensayo LightCycler como la prueba de PCR para M. tuberculosis Amplicor con la cual se comparó detectaron 48 de 50 muestras. Los resultados de los ensayos de PCR en tiempo real son innatamente cuantitativos, y cuando se los utiliza con estánda­ res se puede determinar la cantidad definitiva de un microorga­ nismo presente. Kramme y cois, describen un ensayo de PCR en tiempo real, donde no sólo se detecta la presencia del micro­ organismo, sino que se puede determinar su cantidad.183 Asimismo, Rondini y cois, crearon un ensayo basado en la prueba Taqman para la detección de otro patógeno micobacteriano cutáneo importante: M. ulcerans.293 Análisis posamplificación HIBRIDACIÓN INVERSA

La hibridación inversa es similar en muchas formas al Southern blot tradicional, en que la reacción de hibridación por sondas de amplicones ocurre sobre un sustrato de nitrocelulosa o similar. En esta técnica, las múltiples sondas se inmovilizan en una tira de nitrocelulosa y se aplica el amplieón a la tira, que es la inversa de un Southem blot. Se forman líneas o puntos en el sitio de hibridación de la sonda de amplicones. Cuando se compara este patrón con una clave, es posible interpretar los resultados de la reacción (fig. 19-3). La ventaja sobre el Southem blot tradicional es que se prueban simultáneamente muchas sondas y no se utilizan radioisótopos. La hibridación inversa se comercializa como ensayos de sondas en línea (LiPA) (Innogenetics, Gent, Bélgica y Bayer Diagnostics, Tarrytown) o tiras de transferencia inversa de pun­ tos (reverse d ot blot strips) (Roche). Además de los ensayos para genotipificación de HCV, genotipificación de HIV para mutaciones asociadas con resistencia a los antirretrovirales, subtipificación de papilomavirus humano (HPV) y detección de hongos patógenos, existe un ensayo para la identificación rápida de micobacterias. La primera versión examinada del ensayo de hibridación inversa fue el LiPA Mycobacteria (Innogenetics). Este ensayo utilizaba una PCR de amplio espectro dirigida contra la región espaciadora de 16S a 23S y sondas para el complejo M. tuberculosis, el complejo MAI y las siguientes especies de micobacterias: M. avium, M. intra­ cellulare, M. kansasii, grupo de M. chelonae, M. gordonae, M. xenopi y M. scrofulaceum 230 Miller y cois, estudiaron 60 cepas clínicas de micobacterias aisladas en 59 pacientes utilizando este producto y no observaron ninguna discrepancia con la identificación de laboratorio de rutina con la mayoría de las cepas, aunque algunas especies no fueron identificadas.230 De los aislamientos evaluados, 26 fueron del complejo M. tuber­ culosis, 9 de M. avium , 3 del complejo MAI, 3 de M. kansasii, 4 de M. gordonae y 5 del grupo M. chelonae. Las muestras de tres pacientes tuvieron reacciones positivas para el complejo MAI y luego se determinó que tenían M. intracellulare mediante análisis de PCR-RFLP. Otras siete especies de micobacterias fueron identificadas sólo en su categoría de género (especies de M ycobacterium)', seis de éstas fueron M. fo rtu itu m y una fue M. szulgai. Otros distintos grupos han examinado este producto con resultados similares y durante estos estudios detectaron problemas menores que condujeron al desarrollo de una versión nueva y mejorada.304,339’351 También se ha utilizado la PCR seguida de hibridación inversa en muestras clínicas directas, con resultados excelentes de las muestras con frotis positivos.160 La versión más nueva, la INNO-LiPA

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Micobacterias

Línea m arcadora C ontrol conjugado - 1 G énero M YC - 2 C om plejo M. tuberculosis - 3 MKA-1 - 4 M K A-2 - 5 M K A-3 -6 M X E -7 M G O -8 M G V -9 MSI - 10 MM U - 11 M C E - 12 M AIS - 13 M A V - 14 MIN-1 - 15 M IN -2 -16 M C S - 17 M M L - 18 M H P - 19 MCH-1 - 2 0 M C H -2 - 21 M C H -3 - 22 M FO - 23 M SM - 24

C ontrol conjugado G énero de M ycobacterium C om plejo M. tuberculosis M. ka n sa sii I M. ka n sa sii II M. ka n sa sii lll, IV, V M. xe n o p i M. gord o n ae M. genavense M. sim iae M. m arinum + M. ulcerans M. celatum C om plejo M AIS M. avium M. intracellulare 1 M. intracellulare 2 M. scrofulaceum M. m alm oense M. haem ophilum M. chelonae I, II, lll, IV M. chelonae lll M. chelonae I C om plejo M. fortuitum M. sm egm atis

Figura 19-3 Se muestra el ensayo de hibridación inversa INNO-LiPA MYCOBACTERIA V2 (Innogenetics, Gent, Bélgica). Esta tira contiene una línea de control conjugada y sondas de hibridación para detectar el género Mycobacterium y la información de la identificación de 16 especies diferentes. (La fotografía proviene del prospecto del envase de la compañía).

M ycobácteria v2, ha ampliado la cantidad de especies de micobacterias hasta 16. Tortoli y cois, evaluaron 197 micobacterias pertenecientes a 81 taxones con este producto y observaron una especificidad y una sensibilidad del 100% para 20 de 23 son­ das. Las sondas específicas para el complejo M. fortu itu m , para el grupo MAI-escrofuláceo y para M. intracellulare tipo 2 mos­ traron reactividad cruzada con varias micobacterias que pocas veces se aíslan en las muestras clínicas. La sensibilidad global fue del 100% y la especificidad global fue del 94,4%.350 También se ha mostrado que los ensayos de hibridación inversa son útiles para la detección de los determinantes gené­ ticos de resistencia a la rifampicina.4'4070-159'314’325 Como sucede con la identificación de especie, se ha logrado la detección de los determinantes genéticos de resistencia directamente de la muestra clínica.159 A diferencia de la secuenciación de DNA descrita más adelante, la LiPA es técnicamente mucho más fácil de realizar que la secuenciación de DNA, con un análisis posanalítico más simple. SECUENCIACIÓN DEL DNA

La secuenciación del DNA para el análisis de un produc­ to amplificado es ahora un método frecuente de análisis

posam plificación. Si bien es útil, es un técnica más com pli­ cada que la hibridación simple con sonda y a menudo requiere que el usuario tenga experiencia con la alineación de secuencias y el software de edición, y las bases de datos genéticos. El análisis de estas regiones variables interpues­ tas entre regiones conservadas que sirven como sitios de hibridación de cebadores de amplio rango se convierte en una herram ienta poderosa para la identificación de los m icroorganism os 3°.i°uo8,ii4,194,208,275,309,363,382,400 La secuenciación tradicional del DNA, también conocida como secuenciación de Sanger, se utilizaba en otra época sólo en laboratorios de investigación, pero también se ha vuelto fre­ cuente en muchos laboratorios de patología y microbiología molecular (véase la sección '‘Secuenciación del DNA” en el cap. 4). Estos métodos se han empleado con éxito para la iden­ tificación de bacterias, micobacterias, nocardias y hongos. Los genes que codifican las subunidades ribosómicas de estos microorganismos son los puntos diana genéticos más utilizados de identificación basada sobre secuencias. Esta técnica está revolucionando la identificación de labora­ torio de los microorganismos de crecimiento lento, como micobacterias y nocardias.50 122-167-223'254-260 Una de las regiones más útiles del complejo genético 16S para la identificación de micobacterias involucra la región A hipervariable. Esto se ha usado para lograr una identificación rápida y precisa basada sobre secuencias de las micobacterias de mayor importancia clínica.76 123 También se utilizó para ayudar a identificar y dife­ renciar los aislamientos más difíciles de caracterizar.328 Esta región ha sido utilizada con éxito para la identificación de las micobacterias de mayor relevancia clínica mediante una técni­ ca más nueva; la pirosecuenciación o la secuenciación por sín­ tesis (véase cap. 4).356 MicroSeq (Applied Biosystems, Inc. [ABI], Foster City, CA) es un sistema comercial para la identificación de microorganis­ mos por secuenciación de DNA. Después del cultivo, se reali­ za una PCR utilizando los cebadores provistos. Se determina la secuencia a través del sistema de secuenciación capilar ABI y se remite el producto como interrogante a una base de datos genéticos que es mantenida y actualizada por el fabricante. Hall y cois.122 examinaron esta base de datos utilizando 59 cepas de la A m erican Type Culture C ollection (ATCC) y 328 aislamientos clínicos. La identificación basada en las secuen­ cias permitió que con < 1% de la denominada puntuación de distancia se reconociera el 98,3% (58 de 59) de las cepas ATCC, el grupo o complejo correcto y el 90,1% (219 de 243) de las cepas clínicas. De las cepas restantes que tuvieron pun­ tuaciones de distancia > 1%, el 41,1% (35 de 85) se identifica­ ron correctamente en el nivel de especie, el complejo o el grupo, mientras que el 15,3% (13 de 85) se identificaron en la categoría de especie. Lo más importante es señalar que el tiem­ po de respuesta informado para la identificación de micobacte­ rias es de menos de 24 horas, lo que implica una diferencia enorme con respecto al tiempo de identificación requerido por los métodos fenotípicos tradicionales. Los genes rpoB, hsp y tu f también fueron utilizados con éxito como puntos diana genéticos para la identificación sobre la base de secuencias de distintas bacterias.81'82'95 167 192'251'252'286 El gen rpoB. que codifica una RNA polimerasa DNA-dependiente, ha sido utilizado por varios grupos para la identificación de micobacterias.173 174'201'355 La secuenciación de este punto diana génico tiene aceptación porque no sólo proporciona información para la identificación, sino que también brinda información relativa a la sensibilidad de la cepa aislada a la rifampicina.325-362

Detección e identificación de la m icobacterias m ediante m étodos m oleculares

ANALISIS DE MICROMATRICES

Las micromatrices, dispositivos llamados comúnmente chips . . vélicos, han sido utilizadas extensamente para la investiga­ ción. También se las utilizó para la identificación de micobac­ terias y la detección de los determinantes genéticos de resis­ tencia. Troesch y cois, describen el uso de un microensayo que examinó dos regiones genéticas: la 16S rDNA y el gen rpoB.355 Estos autores examinaron 70 micobacterias que representaban 17 especies diferentes y 15 aislamientos resistentes a la rifampicina de M. tuberculosis con este microensayo y pudieron identificar 26 de 27 especies y todas los mutantes resistentes. Las micromatrices se muestran muy promisorias, pero son cos­ tosas, y actualmente siguen siendo una herramienta de investi­ gación. No se ha determinado aún el papel preciso que desem­ peñarán en el laboratorio común de micobacteriología. Tipificación de cepas y huellas moleculares de DNA

El advenimiento de las técnicas moleculares permite el aná­ lisis específico de cepa de los aislamientos de M. tuberculosis a los fines de los estudios epidemiológicos. Se identificó espe­ cíficamente la secuencia de inserción, IS6110, como el punto diana de una sonda de DNA que se iba a utilizar en el análisis de huellas moleculares (fing erprinting ).38,39 Todas las cepas de M. tuberculosis conservan un gran número de copias de \S6110. La técnica específica de huellas moleculares descrita requiere la digestión del DNA genómico con la endonucleasa de restricción Bam H \. seguida de la separación de los frag­ mentos mediante electroforesis en gel de agarosa, que transfie­ re los fragmentos de DNA a una membrana de nailon y la hibri­ dación de la membrana con segmentos de DNA clonados que representan dos porciones diferentes de IS6110. Varios investigadores han utilizado la secuencia de inserción IS6110 como punto diana para llevar a cabo estudios epide­ miológicos. Yang y cois, compararon los patrones de huellas moleculares de 68 aislamientos de micobacterias obtenidos de pacientes HIV seropositivos con tuberculosis en la región de Dar es Salaam de Tanzania, con 66 cepas aisladas en pacientes HIV negativos que vivían en la misma región.405 Observaron 101 patrones de huellas moleculares entre este grupo de pacientes, con un nivel de diversidad igual entre los dos. De estos aislamientos, el 8,8% mostró resistencia al menos a un fármaco, nuevamente, sin ninguna tendencia a incluirse dentro de ninguno de los grupos. En un estudio de los patrones de hue­ llas moleculares IS6110 de M. tuberculosis aislado en 64 pacientes que vivían en la Polinesia Francesa, se identificaron 11 gmpos separados.348 Se identificó un grupo de cepas con patrones idénticos entre grupos familiares, lo que indicó que la transmisión activa desempeña un papel tan importante como la enfermedad por reactivación en esa región geográfica. Asimismo, en un estudio ulterior, se observó un alto grado de probabilidad en los patrones de huellas moleculares IS6110 entre individuos con parentesco cercano 406 Uno de los grupos prevalentes definidos por IS 6110 en Groenlandia representó el 91% de 245 casos de tuberculosis detectados en Dinamarca durante el mismo período. La pesquisa epidemiológica de estos casos condujo a un grupo de inmigrantes de Groenlandia que vivían en una región pequeña y definida de Dinamarca. Van Soolingen y cois, detectaron 43 patrones diferentes de huellas moleculares IS 6110 de 153 cepas de M. bovis origina­ das en ganado vacuno y seres humanos en Holanda y la Ar­ gentina, en varios animales de los zoológicos holandeses y en un parque de vida salvaje en Arabia Saudita, y de focas y gatos enfermos en la Argentina.360 Las cepas que presentaban una

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banda única fueron características de las cepas aisladas en el ganado vacuno. De los 20 aislamientos en seres humanos en la Argentina, 18 mostraron una banda única, similar a la observa­ da en las cepas de ganado vacuno, lo que sugiere con firmeza una transmisión bovina-humana. Los patrones de huellas mole­ culares de los aislamientos de M. bovis humanos en Holanda fueron difusos, salvo por patrones similares en cinco pacientes, todos vivían en Ámsterdam y tres de ellos provenían de la misma familia. Cave y cois, observaron que los patrones de polimorfismo de longitud de los fragmentos IS6110 entre seis aislamientos de M. bovis de 1 paciente y 42 aislamientos repe­ tidos de M. tuberculosis de 18 pacientes se mantuvieron esta­ bles por un período de 8 meses a 4,5 años y no fueron alterados por los cambios en los perfiles de resistencia a los fármacos.38 Estos estudios muestran la utilidad de los análisis de endonu­ cleasas de restricción en los estudios epidemiológicos de la tu­ berculosis humana y animal. Gran cantidad de investigadores han utilizado otros distintos elementos repetitivos de DNA como marcadores para la tipifi­ cación de cepas de M. tuberculosis y otras especies de M yco­ bacterium . El espacio permite cubrir sólo algunas de estas apli­ caciones de la plétora de manuscritos publicados en los últimos diez años. Hermans y cois, descubrieron una inserción de DNA micobacteriano específico del complejo que hibridaba especí­ ficamente con DNA de cepas del complejo M. tuberculosis .l35 Se amplificó un fragmento de 158 pares de bases no repetitivo de esta secuencia con PCR y se utilizó para la detección selec­ tiva de micobacterias del complejo de M. tuberculosis directa­ mente en líquido pleural, lavados bronquiales y biopsias, hasta un límite inferior de sensibilidad de 20 células bacterianas (aproximadamente 103 células en una muestra de esputo). Wiid y cois, utilizaron el oligonucleótido GTG5 como marcador para la identificación de cepas de M. tuberculosis, que hallaron útil en casos en los cuales ciertas cepas tienen poco o ningún elemento de inserción como IS6110.3*5 Friedman y cois, utili­ zaron amplificación con PCR de segmentos de DNA localiza­ dos entre dos copias de elementos repetitivos \S 6 1 10 y la secuencia repetitiva rica en GC polimorfo (PGRS).99 Se Utilizó un segmento de 439 pares de bases amplificado por PCR del gen de la proteína del choque térmico (HSP) de 65 kDa para desarrollar patrones de polimorfismo de longitud de fragmen­ tos de restricción de varias especies de M ycobacterium de cre­ cimiento rápido, que incluyeron M. fo rtu itu m , M. chelonae, M. sm egm atis y M. m ucogenicum .333 El elemento de secuencia de inserción repetitiva IS1245 fue utilizado en un estudio de aisla­ mientos humanos y animales de M. aviu m ,119 En otro estudio, se utilizaron las secuencias de inserción repetitivas IS1311 y ID 900 como sondas de DNA en la evaluación del polimorfis­ mo de longitud de fragmentos de restricción de 75 cepas clíni­ cas de M. avium .292 Se han utilizado dos marcadores, uno de los cuales codifica una proteína de 40 kDa (p40) y la secuencia de inserción IS901-IS902 como marcadores moleculares en la tipificación de 184 cepas de campo del complejo M. avium .5 Para tipificar 16 cepas de M. haem ophilum se utilizó elec­ troforesis de campo pulsado de los fragmentos de restricción generados por la digestión del DNA cromosómico y 12 de esas cepas mostraron patrones similares, incluidas 6 del mismo hos­ pital.403 Esta técnica también se utilizó para identificar a varios pacientes que estaban infectados por más de una cepa del com­ plejo M AI.320 En el estudio de varios cebadores se utilizó DNA polimorfo amplificado aleatorio (random am plified polim orphic DNA, RAPD; también denominado PCR de cebador arbi­ trario) para determinar cuáles logran una mayor discriminación en la obtención de huellas moleculares reproducibles para la

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tipificación de las cepas de M. tuberculosis.206 Esta técnica también ha sido utilizada para tipificar 15 cepas de M. tuber­ culosis, con una región amplificada por PCR que separa los genes que codifican rRNA 16S y 23S que sirven como marca­ dor.1 Según estos autores, la tipificación molecular por RAPD es más rápida y menos exigente desde el punto de vista técni­ co que la mayoría de los otros métodos de tipificación mole­ cular. Además, se necesitan cantidades menores de DNA puri­ ficado que para otros métodos, lo que permite un análisis más temprano de los aislamientos primarios jóvenes de M. tuber­ culosis.

Kirschner y cois, han creado colecciones de perfiles de frag­ mentos de restricción de subunidades de rRNA 16S extraídas de varias especies de M ycobacterium caracterizadas antes mediante pruebas bioquímicas o sondas de ácidos nucleicos.178 Se puede comparar fácilmente el perfil específico de endonucleasas de restricción de una especie desconocida de M ycobacterium con el perfil de la colección, lo que proporcio­ na un medio rápido de identificación precisa sin cultivo. Asimismo, Avaniss-Aghajani y cois, desarrollaron un método para identificar aislamientos de micobacterias directamente en agua y muestras clínicas.13 La PCR fue utilizada primero para amplificar una porción del rRNA de subunidad pequeña (SSU) de 13 especies diferentes de micobacterias, utilizando un ceba­ dor 5 ’ PCR que llevaba una marca fluorescente para permitir la detección del producto amplificado. El producto de la PCR fue digerido con endonucleasas de restricción y se determinaron los tamaños de los fragmentos de restricción marcados median­ te un secuenciador de DNA automático. Se ha desarrollado una colección de longitudes de los fragmentos de restricción 5’ pro­ ducida mediante cinco endonucleasas de restricción que puede categorizar 20 especies de M ycobacterium . Cada especie de M y­ cobacterium tiene una longitud singular del fragmento de res­ tricción 5 ’ para cada endonucleasa específica, cuyas seleccio­ nes se pueden utilizar para hacer identificaciones de especies desconocidas. Las ventajas de estas técnicas sobre los métodos de PCR rápidos son el menor costo y la capacidad para carac­ terizar varias especies de M ycobacterium y detectar más de una especie en la misma muestra. También se han empleado métodos de tipificación en la detección de cepas de M. tuberculosis resistentes a los fárma­ cos. En estudios separados, Whelen y cois.383 y Felmlee y cois.91 utilizaron métodos específicos para detectar las muta­ ciones de la subunidad beta de la RNA polimerasa de M. tuber­ culosis ( rpoB ) que se asocian con mayor frecuencia con la resistencia a la rifampicina. Plikaytis y cois., en el estudio de un brote de tuberculosis resistente a múltiples fármacos en la ciudad de Nueva York, utilizaron un ensayo de PCR múltiple dirigida a una repetición directa de IS 6110 con una secuencia interpuesta de 556 pares de bases (NTF-1), para identificar a los pacientes que estaban infectados con lo que ellos designa­ ron como cepas “W ” de M. tuberculosis multirresistentes.266 Su ensayo identificó en forma correcta la totalidad de los 48 aisla­ mientos de la cepa W de M. tuberculosis, entre un total de 193 cepas estudiadas. Estos estudios son indicativos del grado de sofisticación alcanzado por las técnicas moleculares y de las aplicaciones prácticas para las cuales se han utilizado.

Pruebas de sensibilidad Desde el surgimiento de cepas multirresistentes, la necesi­ dad de pruebas de sensibilidad a los antibióticos rápidas y pre­ cisas para M. tuberculosis se ha convertido en un requisito. Un

estudio nacional realizado por los CDC a comienzos de la década de 1990 mostró que el 14,9% de los aislamientos en pacientes con tuberculosis eran resistentes al menos a uno de los agentes antituberculosos y el 3,3% eran resistentes tanto a INH como a rifampicina.56'83 En un punto en la ciudad de Nueva York, se aislaron cepas resistentes al menos a un fárma­ co, incluida la resistencia emergente a las fluoroquinolonas en el 33% de los casos, y la incidencia de resistencia a INH y rifampicina en el 19%.340 Además de la resistencia asociada con el mal uso de tratamientos antibióticos, la resistencia de las micobacterias a los fármacos puede ocurrir como un pro­ ceso de evolución aleatoria, independiente de la exposición a los agentes. En un cultivo de bacilos tuberculosos, la frecuencia de los mutantes resistentes a los fármacos se ha calculado en alrede­ dor de 1:105 bacterias para INH y en 1:106 para estreptomicina. Si se administran juntos dos fármacos (INH y estreptomicina), la incidencia de resistencia es de l:1 0 u , la cual es la suma (1:105 + 1:106) de las dos tomadas por separado. El conoci­ miento de la incidencia de mutantes se torna importante porque se ha determinado que los pacientes que tienen una cavidad pulmonar abierta pueden tener una población total de bacilos de 107 a 109 bacterias. Por lo tanto, si estos pacientes son trata­ dos con un único antituberculoso, sus cultivos pueden mostrar pronto la aparición del fenotipo resistente a ese agente, y el tra­ tamiento fracasa. En consecuencia, los pacientes con tubercu­ losis siempre deben ser tratados con dos o. de preferencia, tres fármacos. Por consiguiente, si los pacientes no reciben más de un fármaco, esto puede conducir al rápido surgimiento de un bacilo tuberculoso resistente a agentes específicos (fig. 19-4). Después de seguir a un grupo de pacientes infectados simultá­ neamente por M. tuberculosis y el virus del SIDA, Nolan observó que el incumplimiento del tratamiento antituberculoso era la razón primaria para el fracaso terapéutico.245 La falta de cumplimiento del tratamiento instituido también puede contri­ buir a la aparición de resistencia a los fármacos. Un segundo principio de las pruebas de sensibilidad a los agentes contra las micobacterias, que es muy relevante para las de M. tuberculosis, se basa sobre la correlación in vitro entre la respuesta clínica a un antimicobacteriano y el resultado de las pruebas de sensibilidad in vitro. Si más del 1% de los bacilos tuberculosos presentes son resistentes a un fármaco in vitro, el tratamiento con ese fármaco no es clínicamente útil. Por lo tanto, la mayoría de los métodos para las pruebas de sensibili­ dad a los fármacos de las micobacterias deben ser capaces de determinar la proporción de bacilos sensibles y resistentes a un agente dado. Cuando se utilizan los métodos de dilución en agar, el inóculo debe ser adaptado de modo que la cantidad de mutantes espontáneamente resistentes no conduzca al error de in­ terpretar el cultivo como resistente. Del mismo modo, debe existir una cantidad suficiente de colonias en la placa para poder determinar la incidencia de resistencia a los fármacos en el intervalo del 1%. Esto se logra mejor cuando se presentan 100 a 300 UFC en cada cuadrante de una placa de Petri de cua­ tro cuadrantes. Para determinar la incidencia de resistencia, suele ser necesario inocular dos conjuntos de placas de pruebas de sensibilidad, el segundo conjunto con una dilución de 100 veces del inóculo utilizado para el primer conjunto. Este pro­ cedimiento se conoce como método de prueba de sensibilidad proporcional. La prueba se realiza en placas de Petri de plástico divididas en cuatro cuadrantes. Se colocan cinco mililitros de medio de agar en cada cuadrante: el primero, sin ningún antimicobacte­ riano, se utiliza como control del crecimiento; los otros tres,

P ruebas de sensibilidad

contienen concentraciones variadas del fármaco por evaluar. Aunque en el pasado los fármacos se incorporaban en medios espesados con base de huevo, el uso de agar 7H10 como base es el medio actual y recomendado, si se va a realizar este tipo de prueba.396 Los fármacos se agregan después de enfriar el agar a 45 °C, lo que disminuye cualquier pérdida de actividad que pueda ocurrir durante el espesamiento. Puede haber una pérdida adicional de actividad del fármaco en los medios con base de huevo como resultado de algunos agentes que se unen a la albúmina y a otras proteínas. Debido a la necesidad de un tiempo de producción más rápi­ do de los resultados y a superar ciertos problemas inherentes a las pruebas de sensibilidad a los antituberculosos por dilución en agar in vitro, en la actualidad se recomienda una prueba basada sobre un cultivo en caldo porque los resultados son más exactos y precisos y se obtienen antes que con las pruebas rea­ lizadas en medios sólidos.149 Heifets cita tres desventajas del uso de los medios de agar:133 1. La actividad de algunos antituberculosos está comprome­ tida por la unión al agar o a los componentes proteicos en el medio. 2. Los resultados finales cuando se utiliza agar requieren tiempos de incubación prolongados, lo que puede reducir la potencia de ciertos antibióticos. 3. Por razones desconocidas, algunas especies de M ycobac­ terium pierden su potencia cuando se evalúan en agar, al contrario de lo que sucede cuando crecen en caldo. Para establecer en caldo que M. tuberculosis era “sensible”, el parámetro de inhibición del 99% debía ser equivalente a la falta de aumento del índice de crecimiento en el caldo de prueba durante al menos 4 a 5 días luego de la inocu­ lación de una dilución 1:100 del inoculo en comparación con un control en caldo no inoculado. En el pasado, la mayoría de las pruebas de sensibilidad a los antibióticos en caldo para micobacterias utilizaban el sistema radiométrico BACTEC, que incluye el instrumento BACTEC 460 ajustado a una “capucha” para TB (TB hood) y frascos BACTEC 12B. La base de esta prueba en caldo es la detección radiométrica del 14C liberado del medio líquido 7H12 que con­ tiene ácido 1-[14C] palmítico por las bacterias metabolizadoras.226 El instrumento BACTEC 460 ha sido adaptado en muchos laboratorios para realizar pruebas de sensibilidad. El principio de operación del instrumento implica la aspiración del gas del espacio del cabezal por encima del medio de un frasco ampolla inoculado y la detección cuantitativa de la can­ tidad de radiactividad del aspirado que, a su vez, refleja el grado de crecimiento en el frasco ampolla. Se comparan los recuentos de radiactividad del gas del cabezal con un nivel basal predeterminado y se puede establecer un crecimiento ini­ cial. (Véase protocolo 19-18 para los detalles en la ejecución de esta prueba). Varios estudios publicados confirman que el nivel de con­ cordancia entre los métodos estándar y radiométrico de las pruebas de sensibilidad excede el 90%, al menos para los microorganismos sensibles.196-287 Los primeros problemas en la exactitud de la detección radiométrica de cepas resistentes se resolvieron adaptando la concentración del antibiótico incluido en los frascos de cultivo.126 Por ejemplo, al aumentar la con­ centración de estreptomicina de 4 a 6 g/mL mejoró la correla­ ción con 10 g/mL en el método 7H10; un ajuste del etambutol hasta 2,5 g/mL se correlaciona con 5 g/mL para las cepas resis­ tentes evaluadas por el método convencional.126-395 En relación

1065

Sensible

R esistente a INH

R esistente a SM R esistente a INH

R esistente a SM

Figura 19-4 Surgimiento de resistencia a los antibióticos de las micobacte­ rias con el tratamiento con uno o dos fármacos. (A) El paciente es tratado sólo con isoniazida (INH). Aunque la pequeña cantidad de mutantes resistentes a la estreptomicina (SM) son inhibidos por la INH, los mutantes resistentes a la INH son refractarios y, con el tiempo, constituyen la mayoría de la población. Esto representa un fracaso del fármaco. (B) El paciente es tratado tanto con estreptomicina como con INH. Los mutantes resistentes a la estreptomicina son inhibidos por la INH y los mutantes resistentes a la INH son inhibidos por la estreptomicina. Por lo tanto, ninguna de estas cepas mutantes puede crecer de forma exagerada y el tratamiento farmacológico es exitoso. (Extraído de Crofton J. Some principies in the chemotherapy of bacterial infections. BMJ 1969;2:209-212).

con INH en la detección de resistencia, Hawkins y cois, deter­ minaron que la mayoría de las discrepancias eran causadas por cepas resistentes a INH a 0,2 g/mL pero no a 0,1 g/mL; por lo tanto, la reducción de la concentración del fármaco en el fras­ co ampolla con INH hasta 0,1 g/mL redujo el problema.130 El BACTEC MGIT 960 (BD Diagnostic) y el ESP II System (Trek Diagnostics) son métodos no isotópicos en caldo para realizar pruebas de sensibilidad en micobacterias. Estos méto­ dos, así como el BACTEC 460, son los únicos aprobados por la FDA para este propósito, pero se están desarrollando otros métodos.396 En la actualidad, los fármacos utilizados en el tratamiento de las infecciones por micobacterias son los utilizados primaria­ mente para la tuberculosis clásica, aquellos para las micobac­ terias no tuberculosas y los utilizados para el tratamiento de la lepra.404 Los fármacos de primera línea para el tratamiento de la tuberculosis son isoniazida, rifampicina, etambutol, estrep­ tomicina y pirazinamida. Los agentes de segunda línea son

1066

C A P ÍT U L 0 19

Micobacterias

ácido /j-aminosalicílico, cicioserina, etionamida, kanamicina, amikacina, viomicina y capreomicina.322331 Los agentes de pri­ mera línea, excepto el etambutol, se consideran bactericidas; el resto incluido en la lista secundaria sólo debe utilizarse cuando se desarrolla resistencia a los agentes primarios. En el cuadro 19-10 se enumeran las concentraciones sugeridas de los fárma­ cos seleccionados utilizados para las pruebas de sensibilidad de las m icobacterias del docum ento aprobado del Clinical Laboratory Standards Institute (antes, Comité Nacional para los Estándares de Laboratorios Clínicos, National Committee for Clinical Laboratory Standards, o NCCLS) sobre pruebas de sensibilidad de las micobacterias. Aun si existe resistencia primaria a un fármaco, como INH, el tratamiento con la terapia recomendada de tres agentes pro­ porciona una cobertura suficiente. Las pruebas de sensibilidad deben realizarse en todos los aislamientos iniciales de M. tuberculosis y en los aislamientos de pacientes que siguen teniendo cultivos positivos después de 3 meses o que muestran pruebas clínicas de fracaso terapéutico.396 La probabilidad de resistencia inducida en los últimos grupos de pacientes es alta. Si no se siguen las recomendaciones y no se efectúan las prue­ bas de sensibilidad en los aislamientos obtenidos de pacientes que previamente no fueron vistos por un laboratorio, se debe guardar como mínimo un cultivo durante 6 meses a un año en el caso de que el paciente no responda al tratamiento. Las cepas de control que se utilizan en los estudios de sensi­ bilidad se deben probar con cada grupo de aislamientos eva­ luados. Los controles deben incluir una cepa sensible, una cepa de sensibilidad intermedia (p. ej., M. kansasii resistente a 0,2 g/mL de INH, pero sensible a 1 g/mL de INH) y una cepa resis­ tente. No existe ningún método estándar para evaluar los agen­ tes en combinación. Aunque no se establecen los criterios inter­ pretativos de sensibilidad y resistencia para evaluar múltiples agentes en combinación, la velocidad de destrucción determi­ nada por las curvas de tiempo/destrucción puede tener más relevancia clínica que el grado de destrucción.330 El único fármaco para el cual se recomiendan pruebas de sensibilidad in vitro cuando se evalúan miembros del MAI es la claritromicina. No se puede utilizar como guía el empleo de los criterios de interpretación aplicados a M. tuberculosis para el tratamiento de los pacientes con M A I.149 Los miembros del

Cuadro 19-10

MAI son previsiblemente resistentes a la isoniazida y la pirazinamida y sensibles a la rifampicina y el etambutol sólo con algunas variaciones de grado. No existe ninguna correlación entre los resultados de las pruebas de sensibilidad in vitro y el resultado clínico de los pacientes con MAI para los fármacos distintos de claritromicina. Además, algunos autores creen que los perfiles de sensibilidad de los fármacos son más variables cuando se evalúa MAI en comparación con M. tuberculosis. Se estima que las variantes de colonias translúcidas son más resis­ tentes a los antibióticos que las cepas rugosas, y que las cepas no pigmentadas son más resistentes que las que producen pig­ mento. Sin embargo, las variantes pigmentadas crecen más rápidamente y es posible que una cepa no pigmentada de cre­ cimiento más lento, aunque esté presente, pueda ser enmasca­ rada por una variante pigmentada de crecimiento más rápido; por lo tanto, el examen de las cepas pigmentadas más obvias puede conducir a resultados de falsa sensibilidad.336 Para las pruebas de sensibilidad de las especies de creci­ miento rápido, se puede utilizar microdilución en caldo, pero también puede ser útil el Etest (AB Biodisk North America, Piscataway NJ). Biehle y cois, realizaron Etests para 100 cepas clínicas de micobacterias de crecimiento rápido contra seis fár­ macos: amikacina, cefoxitina, ciprofloxacina, claritromicina, doxiciclina e imipenem.22 El Etest es una tira impregnada en antibiótico en la cual se absorbe el antibiótico de prueba para producir un gradiente de concentración de la parte superior de la tira a la parte inferior, por lo menos a través de 15 duplica­ ciones de diluciones. El antibiótico que se difunde proporciona un gradiente de concentración inhibitoria mínima (CIM) conti­ nuo en el agar, que puede interpretarse mediante la lectura del menisco de inhibición del crecimiento con una escala de cali­ bración impresa en la tira. Estos autores encontraron una con­ cordancia del 85% entre los resultados del Etest y las CIM por dilución en agar dentro de 1 log2 y una concordancia del 97% en dos diluciones log2. Las tasas de errores mayores y meno­ res fueron del 2,2% y del 11,7% respectivamente; no hubo errores muy importantes (desacuerdo de tres o más diluciones log2). La concordancia interlaboratorio entre las CIM del Etest determinadas en dos laboratorios separados fue del 81% dentro de una dilución log2 y del 92% dentro de dos diluciones log2. Estos autores llegaron a la conclusión de que Etest puede ser un

C on cen tración de fárm acos para las pruebas de sensib ilidad m ediante el m étod o de proporción con d istin tos m edios de cultivo CONCENTRACIONES DEL FÁRMACO (Ug/mL)

FÁRMACO Isoniazida

M iddlebrook 7H10 0

,2 ,

1

Lowenstein-Jensen 0

,2 ;

2

4

Rifampicina

1

40

Etambutol

2

2

Etionamida

5

20

Estreptomicina

Kanamicina

5

2 0

Capreomicina

10

2 0

Cicioserina

2 0

30

Pirazinamida

50

-

1

Tomado de McClatchy JK. En: Lorian V, ed. Antibiotics in Laboratory Medicine. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980.

Tratam iento a corto plazo

método exacto y reproducible para determinar la sensibilidad de las micobacterias de crecimiento rápido. El Clinical Laboratory Standards Institute ha publicado un documento que proporciona una guía considerable para las pruebas de sensibilidad de las micobacterias, nocardias y otros actinomicetos aerobios.493 Las recomendaciones de las pruebas de sensibilidad a los antimicobacterianos para micobacterias que no son cubiertas en esta sección se explican en este docu­ mento. Nosotros sugerimos que todos los laboratorios que rea­ lizan pruebas de sensibilidad estén familiarizados con él. En conclusión, las pruebas de sensibilidad para M. tuberculo­ sis basadas sobre caldo, cuando son realizadas según condicio­ nes de prueba bien controladas con las concentraciones adecua­ das de los fármacos, son confiables para los agentes de prime­ ra línea.130 Varios sistemas comerciales hacen que esta prueba sea más fácil de realizar. Los resultados pueden ser determina­ dos en 4 a 5 días, lo que es considerablemente menor que las 3 a 7 semanas necesarias con el uso de las técnicas estándares.

Tratamiento a corto plazo Gosset ha proporcionado una ilustración gráfica de los tres tipos principales de lesiones tuberculosas que albergan micobacterias viables y la actividad de los agentes tuberculocidas más importantes en estas lesiones. Se propone que, en un paciente con tuberculosis pulmonar, se presentan tres poblacio­ nes de micobacterias:111 1. Las localizadas extracelularmente en cavidades abiertas. 2. Las localizadas intracelularmente en los macrófagos. 3. Las que se encuentran en lesiones caseosas cerradas. Los microorganismos en cada sitio tienen actividades meta­ bólicas y velocidades de replicación diferentes. La tercera característica mencionada es de considerable importancia, porque la mayoría de las micobacterias son sensi­ bles a los efectos bactericidas de los antibióticos sólo cuando se están preparando para dividir. Como M. tuberculosis es un aerobio estricto, la actividad metabólica y la velocidad de repli­ cación varían con el aporte de oxígeno disponible. Esta veloci­ dad puede ser alta, como en una cavidad en la cual los bacilos están sufriendo una división rápida o baja, sólo con una repli­ cación infrecuente de bacilos, como en las lesiones caseosas cerradas. Una cavidad tuberculosa puede contener 107 a 109 microorganismos que se multiplican activamente en un medioambiente neutro o ligeramente alcalino. En la medida en que uno de cada 105a 106 micobacterias puede ser resistente a un único antimicobacteriano, la cavidad puede contener hasta 102 a 104 microorganismos resistentes a los fármacos. Esta pobla­ ción potencialmente grande de bacilos resistentes a los fárma­ cos destaca la necesidad de utilizar al menos dos agentes bac­ tericidas para el tratamiento eficaz de estas lesiones. El segundo grupo de microorganismos hallado en un pacien­ te con tuberculosis se localiza en los fagosomas de los macró­ fagos. El medioambiente intracelular en los macrófagos es ácido (pH 5,5), lo que conduce al crecimiento lento de las micobacterias. Se ha calcuado que los fagosomas de los macró­ fagos no contienen más de I04 a 105 microorganismos y, por lo tanto, no es probable que contengan muchas cepas resistentes a los fármacos. La destrucción exitosa de las micobacterias en los macrófagos depende del uso de un antibiótico resistente al entorno ácido de los fagolisosomas de los macrófagos (p. ej.,

1067

pirazinamida). Este requisito excluye a la estreptomicina y a otros antibióticos aminoglucósidos que no penetran con facili­ dad en los macrófagos y pierden rápidamente actividad en un entorno de pH inferior. La tercera población de micobacterias presentes en los pacientes con tuberculosis crónica se encuentra en la lesión caseosa cerrada. Estos microorganismos están presentes en zonas de necrosis, donde la irrigación está muy disminuida y la actividad metabólica de cualquier microorganismo supervi­ viente presumiblemente es muy baja. Puede existir un total de 104 a 105 microorganismos en las lesiones caseosas cerradas donde, aunque el pH es neutro, la multiplicación es lenta o intermitente. La estreptomicina, el primero de los agentes micobactericidas, es más eficaz para destruir activamente los microorganis­ mos extracelulares en multiplicación que se encuentran en las cavidades. A diferencia de la INH y la rifampicina, la estrepto­ micina tiene poco efecto contra los microorganismos en las lesiones caseosas cerradas o aquellos que se encuentran en los fagosomas ácidos de los macrófagos. La isoniazida es activa contra todos los grupos de micobacterias en división rápida y contra las micobacterias de división lenta que se encuentran en el entorno ácido de los macrófagos. Aunque no es tan activa contra la rifampicina contra los microorganismos en las lesio­ nes caseosas cerradas, la INH tiene cierto efecto bactericida sobre este grupo de micobacterias. La rifampicina es eficaz contra todos los grupos de microorganismos, sobre todo aque­ llos de las lesiones caseosas cerradas, donde la actividad de los microorganismos puede ser lenta y episódica. La rifampicina es el antimicobacteriano más universal. La pirazinamida es sin­ gular entre los bactericidas eficaces contra las micobacterias, ya que sólo es activa a pH ácido y, por ende, sólo es eficaz con­ tra aquellos microorganismos que están en los fagosomas de los macrófagos.85 Al contrario de los otros agentes que se acaba de mencionar, el etambutol no se considera un bactericida y no puede ser uti­ lizado sólo con otro agente en un tratamiento breve. Sin embar­ go, puede penetrar tanto el medioambiente extracelular como el intracelular de las micobacterias e impedir la selección de mutantes resistentes. Algunos estudios recientes han sugerido que cuando se utiliza etambutol con tres o cuatro agentes bac­ tericidas, puede desempeñar un papel en el acortamiento de la duración del tratamiento. Además de los antituberculosos descritos, existen en los Estados Unidos capreomicina, kanamicina, etionamida y cicloserina. Los dos primeros son bactericidas para los microorga­ nismos extracelulares de las cavidades grandes, mientras que los dos segundos son bacteriostáticos para los microorganis­ mos intracelulares y extracelulares. Sin embargo, cuando es posible, se prefiere el tratamiento con estreptomicina, isoniazi­ da y rifampicina, pirazinamida o etambutol o una combinación de esos sobre los agentes menos utilizados. El régimen más simple para el tratamiento de la tuberculosis pulmonar no complicada es administrar INH y rifampicina durante un período de 9 meses. Se puede agregar estreptomici­ na o etambutol durante las 2 a 8 primeras semanas. La duración del tratamiento de 9 meses contrasta notablemente con el perí­ odo habitual previo de 18 a 24 meses, necesario cuando se uti­ liza INH y etambutol. La combinación de INH y rifampicina ha introducido el concepto de tratamiento de “curso breve” sobre la base de la capacidad de estos dos fármacos para esterilizar el tejido humano durante un período de 9 meses.96 Otro aspecto importante adicional del tratamiento de curso breve es el hallazgo de que, luego de un mes inicial de tratamiento, se

1068

C A P IT U L 0 19

Micobacterias

puede administrar tanto INH como rifampicina dos veces por semana en lugar de diariamente. Este esquema permite tanto un ahorro de dos tercios en el uso del costoso fármaco rifampici­ na, como una mejor adherencia de los pacientes que reciben la medicación, sobre todo aquellos considerados poco confiables. Con este régimen, menos del 3% de los que completan la serie de tratamiento sufren una recaída. Un factor importante en el tratamiento de la tuberculosis cavitaria es la rápida eliminación de microorganismos por la acción bactericida de INH y rifam­ picina. Esto reduce en gran medida la aparición de microorga­

Recuadro 19-5

nismos resistentes a los fármacos, lo que ocurre muy a menu­ do cuando se utiliza un único antibiótico. Recomendaciones de la American Thoracic Society

Un comité de la reunión científica de la American Thoracic Society (ATS) sobre microbiología, tuberculosis e infecciones pulmonares ha publicado recomendaciones para el tratamiento de la tuberculosis en adultos y niños; éstas pueden encontrarse en http://www.thoracic.org/statements. En el recuadro 19-5 se

R eco m en d acio n es para la prevenció n y el tratam ien to de la tu berculosis

I. Tratamiento preventivo de los individuos con una conversión reciente de la prueba cutánea. A. Los criterios para la interpretación de una prueba cutánea positiva son: 1. Para los adultos y niños con infección por HIV, contactos ínti­ mos de casos infecciosos y aquellos con lesiones fibróticas en las radiografías de tórax, se considera positiva una reacción de 5 mm o más grande. 2. Para otros adultos y niños en riesgo, se considera positiva una reacción de 1 0 mm o más grande. 3. Para los individuos con un factor de riesgo definido para la infección, se considera positiva una reacción de 15 mm o más grande. En general no se debe realizar una prueba cutánea en los individuos que no corren riesgo de infección. B. En los individuos con una prueba cutánea positiva y cualquiera de los siguientes factores de riesgo, administrar isoniazida durante 6 - 1 2 meses para disminuir el riesgo de tuberculosis futura: 1. Aquellos con infección por HIV (se recomienda un régimen de 1 2 meses) 2. Aquellos que corren un riesgo de una infección por HIV con un estado HIV desconocido 3. Contactos íntimos de individuos con esputo positivo con tuber­ culosis infecciosa de diagnóstico reciente 4. Individuos que tienen cualquiera de los trastornos siguientes que se sabe que aumentan el riesgo de tuberculosis: a. Diabetes mellitus b. Tratamiento adrenocorticosteroide e inmunosupresor c. Adictos a drogas intravenosas d. Neoplasias hematológicas y reticuloendoteliales e. Enfermedad renal en estadio terminal f. Pérdida rápida de peso o desnutrición 5. En ausencia de los factores de riesgo anteriores, los individuos menores de 35 años con una prueba cutánea positiva que pertenecen a uno o más de los siguientes grupos de alta inci­ dencia deben recibir 6 meses de tratamiento profiláctico con isoniazida: a. Nacidos en el extranjero en un país con alta prevalencia b. Individuos de bajos ingresos y con escasos servicios médicos provenientes de poblaciones de alta prevalencia: individuos de descendencia africana, hispanos y americanos nativos. c. Residentes en instituciones de cuidados prolongados 6 . En los individuos mayores de 35 años se deben controlar las concentraciones de las enzimas hepáticas antes de comenzar el tratamiento y mensualmente en adelante durante el curso del tratamiento. 7. Los individuos de los cuales se presume que están infectados por microorganismos resistentes a la isoniazida deben ser trata­ dos con rifampicina.

II. Tratamiento de los individuos con tuberculosis conocida por cepas sensibles a la isoniazida A. Un régimen de 6 meses, comenzando con isoniazida, rifampicina y pirazinamida durante los 2 primeros meses, seguidos de isoniazida y rifampicina durante los 4 meses siguientes. B. Se debe incluir etambutol en el régimen inicial hasta contar con los resultados de las pruebas de sensibilidad a los fármacos. C. El régimen recomendado se aplica tanto a los individuos infecta­ dos por HIV como a los no infectados. El tratamiento prolongado más allá del periodo recomendado puede ser necesario en los individuos infectados por HIV, según el estado clínico y bacteriológico. D. Como alternativa, es aceptable un régimen de 9 meses de isoniazi­ da y rifampicina para los individuos que no pueden o no deben recibir pirazinamida. E. La tuberculosis multirresistente plantea problemas terapéuticos difíciles. El tratamiento debe ser individualizado sobre la base de los estudios de sensibilidad in vitro. E La tuberculosis extrapulmonar debe ser manejada según los princi­ pios y con los regímenes farmacológicos señalados para la tubercu­ losis pulmonar. G. Un régimen de 4 meses de isoniazida y rifampicina es una terapia aceptable para los adultos que tienen una tuberculosis activa, pero que tienen frotis y cultivos negativos, si existen pocas posibilidades de resistencia a los fármacos. III. El cumplimiento del tratamiento farmacológico es obligatorio: cual­ quier régimen es irrelevante si el paciente no recibe los fármacos. Deben considerarse las siguientes técnicas: A. Interrogar de rutina al paciente acerca del cumplimiento del trata­ miento. B. Se pueden utilizar recuentos de píldoras y pruebas de orina perió­ dicas para controlar la ingestión de fármacos. C. Rastrear con cuidado a los individuos que no retoman a las visitas de seguimiento. D. Establecer las horas de las visitas clínicas para cubrir las necesida­ des del paciente. E. Proporcionar un tratamiento observado en el centro clínico, hogar, lugar de trabajo u otra localización. E Ofrecer incentivos como alimentos, viajes en automóvil, servicios de niñera o pequeños regalos.

R eferencias

resumen las recomendaciones para el tratamiento de la tuber­ culosis.

Resumen “La erradicación de la tuberculosis requiere una red organi­ zada y dinámica de servicios primarios y de derivación susten­ tada en la cooperación entre médicos y funcionarios de salud pública, entre las instituciones de asistencia sanitaria y los pro­ gramas de alcance comunitario, y entre los sectores privado y público de atención médica” .7 REFERENCIAS 1. Abed Y, Davin-Regli A, Bollet C. De Micco P. Efficient discrimination of Mycobacterium tuberculosis strains hy 16S-23S spacer reion-based random ampli­ fied polymorphic DNA analysis. J Clin Microbiol 1995;33:1418-1420. 2. Agins BD, Berman DS, Spicehandler D, et al. Effect of combined therapy with ansamycin, clofazimine, ethambutol. and isoniazid for Mycobacterium avium infec­ tion in patients with AIDS. J Infect Dis 1989;159:784-787. 3. Agy MB, Wallis. CK, Plorde JJ. et al. Evaluation of four mycobacterial blood cultu­ re media: BACTEC 13A, Isolator/BACTEC 12B, Isolator/Middlebrook agar and biphasic médium. Diagn Microbiol Infect Dis 1989;12:303-308. 4. Ahmad S, Mokaddac E, et al. Characterization of rpoB mulations in rifampin-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Kuwall and Dubai. Diagn Microbiol Infect Dis 2002;44:245-252. 5. Ahrens P, Giese SB, Kauasen J, Inglis NF. Two markers IS901-IS902 and p40, identified by PCR and by using monoclonal antibodies in Mycobacterium avium strains. J Clin Microbiol 1995;33:1049-1053. 6. Albers WM, Chandler KW, Solomon DA, Goldman AL. Pulmonary disease caused by Mycobacterium malmoense. Am Rev Respir Dis 1987;135:1375-1378. 7. Control of tuberculosis in the United States. Am Rev Respir Dis 1992; 146:16231633. 8. Archibald LK, den Dulk MO, et al. Falal Mycobacterium tuberculosis blood-stream infection in febrile hospitalized adults in Dar es Salaam, Tamzania. Clin Infect Dis 1998;26:290-296. 9. Ardito F, Posteraro B, et al. Evaluation of BACTEC Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT 960) automated system for drug susceptibility testing of Mycobac­ terium tuberculosis. J Clin Microbiol 2001;39(12):4440-4444. 10. Aronson, JD. Spontaneous tuberculosis in salt waler fish. J Infect Dis 1926;39:315320. 11. Aubrey M, Fam AG. A case of clinically unsuspected Mycobacterium marinum infection. Arthritis Rheum 1987;30:1317-1318. 12. Ausina V, Barrio J, Luyuin M, et al. Mycobacterium xenopi infections in AIDS. Ann Intem Med 1988;109:927-928. 13. Avanis-Ayhajani E, Jones K, Hollzman A, et al. Molecular technique for rapid iden­ tification of mycobacteria. J Clin Microbiol 1996;34:98-102. 14. Bamberyer DM, Driks M, Gupta MR, et al. Mycobacterium kansasii among patients infected with human immunodeficiency virus in Kansas City. Clin Infect Dis 1994;18:395-400. 15. Banks J, Jenkins PA, Smilh AP. Pulmonary infection with Mycobacterium malmoen­ se— problems with treatment and diagnosis— a review of treatment and response. Tubercle 1985;66:197-203. 16. Barrell A, Mayee JG, et al. An evaluation of the BD ProbeTec ET system for the direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory samples. J Med Microbiol 2002;51:895-898. 17. Beckman EN, Pankey GA, McFarland GB. The histopathology of Mycobacterium marinum synovitis. Am J Clin Pathol 1985;83:457-462. 18. Bemer P, Bodmer T, et al. Multicenter evaluation of the MB/BACT system for suscep­ tibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2004;42:1030- 1034. 19. Bemer P, Palicova F, et al. Multicenter evaluation of fully automated BACTEC Mycobacteria Growth Indicator Tube 960 system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2002;40:150-154. 20. Berlín GG, Zakowsky P, Bruckner DA, Johnson BL Jr. New biphasic culture system for Isolation of mycobacteria from blood cultures of patients with the acquired immunodeficiency syndrome. J Clin Microbiol 1984;20:572-574. 21. Berman SM, Kim RC, Haghighat D, et al. Mycobacterium genavense infection pre­ senting as a solitary brain mass in a patient with AIDS: case report and review. Clin Infect Dis 1994;19:1152-1154. 22. Biehle JR, Cavalieri SJ, Saubolle MA, Getsinger LJ. Evaluation of Etest for suseptibility testing of rapidly growing mycobacteria. J Clin Microbiol 1995;33:1760-1764. 23. Blacklock, Z. Mycobacterium asiaticum a a potential pulmonary pathogen for humans: a clinical and bacteriological review of 5 cases. Am Rev Respir DB 1983;127:241-244. 24. Bioch AB, Rieder HL, Kelly GD, Cauthen GM, Hayden CH, Snider DE Jr. The epi­ demiology o f tuberculosis in the United States: implications for diagnosis and treat­ ment. Clinics Chest Med 1989;10:297-313.

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Infecciones producidas por espiroquetas Taxonomía

Treponema Treponema pallidum subespecie pallidum Período de incubación Sífilis primaria Sífilis secundaria Sífilis latente Sífilis tardía Epidemiología Inmunidad

Treponema pallidum subespecie pertenue Treponema pallidum subespecie endemicum Treponema carateum Diagnóstico de laboratorio de las enfermedades treponémicas Pruebas serológicas

Innovaciones: pruebas provisionales y en fase de investigación

Borrelia Fiebre recurrente Epidemiología Enfermedad clínica Diagnóstico de laboratorio

Enfermedad de Lyme Epidemiología Enfermedad clínica Diagnóstico de laboratorio

Leptospira Leptospirosis Epidemiología Enfermedad clínica Diagnóstico de laboratorio

Spirillum minor (fiebre por mordedura de rata)

as últimas décadas han sido una época de fluctuaciones en el papel de las espiroquetas. Por un lado, Treponema p a llid u m , un azote para la huma­ nidad durante siglos, casi fue eliminado por la penicilina, pero tuvo un retorno inesperado que continúa en este nuevo siglo. En el otro extremo del espec­ tro, Borrelia burgdorferi, descubierta hace sólo veinte años, se ha transformado en la infección por espiroquetas más frecuente de los Estados Unidos.45 47 Este grupo grande y diverso de bacterias incluye patógenos y saprofitos. Hay microaerófilos, anaerobios estrictos, especies que sólo han sido cultivadas in vivo y otras que nunca lo han sido en ninguna condición. Algunos microorganismos tie­ nen relaciones ecológicas complejas y los seres humanos sólo son víctimas acci­ dentales. Otras espiroquetas infectan sólo a los seres humanos y deben ser trans­ mitidas directamente de una persona a otra.

L

Taxonomía El orden Spirochaetales contiene los principales patógenos para los seres huma­ nos. Todos ellos son bacterias de forma helicoidal, móviles, que miden 0,1 a 3 jim

Treponem a

de diámetro por 5 a 120 (im de longitud.42 Los flagelos de la mayoría de las espiroquetas están incluidos dentro de la mem­ brana externa multicapa, llamada vaina externa. Sin embargo, el género Spirillum tiene flagelos externos. A diferencia de otras bacterias, las espiroquetas se autopropulsan por rotación a través de un medio líquido y pueden mantener su motilidad incluso en líquidos de alta viscosidad. La clasificación de las espiroquetas patógenas se detalla en el cuadro 20-1. Los patógenos se agrupan en tres géneros: Tre­ ponem a, B orrelia y Leptospira.

Treponema Los cuatro patógenos principales del género Treponema están genéticamente relacionados, infectan sólo a los seres humanos y no han sido cultivados en forma indefinida in vitro. A pesar de estas similitudes, causan enfermedades muy diferentes. Treponema pallidum subespecie pallidum T. pallidum subespecie pallidum (en adelante, T. pallidum ) es el patógeno dominante entre las espiroquetas. T. pallidum , la causa de la sífilis venérea, ha gozado de muy mala fama duran­ te 500 años. Tiene un “ 100%” de homología genética con T. pallidum subespecie pertenue, que causa una enfermedad cutá­ nea no venérea que difiere en la mayoría de sus aspectos de la sífilis.177 Un grupo de investigadores que probaron una cepa de referencia de cada microorganismo informaron una diferencia de sólo un nucleótido en el gen que codifica una proteína de 19 kDa,192 pero la inmunorreactividad de esta proteína era idénti­ ca en las dos subespecies.191 En 1998 se secuenció todo el genoma de T. p a llid u m ,88 El origen de T. pallidum es incierto. La enfermedad no era relevante en Europa hasta el siglo xvi. Fornaciari y cois, estu­ diaron una momia del Renacimiento que contenía estructuras identificadas por inmunofluorescencia y microscopia electróni­

Cuadro 20-1

1077

ca como T. pallidum.*6 Los partidarios de una escuela de pen­ samiento creen que Colón y sus marineros llevaron la enfer­ medad a su regreso del Nuevo Mundo.22 Estos historiadores identifican a T. pallidum como la causa del great p o x (“mal francés”, antiguo nombre de la sífilis) en tanto que el virus de varióla producía sm all p o x (viruela, en inglés). Se supone que la sífilis evolucionó a partir de una enfermedad clínica más leve de los aborígenes americanos. Hay abundantes datos de cam­ bios óseos similares a los de la sífilis en esqueletos del Nuevo Mundo.229 También se han encontrado lesiones similares en esqueletos precolombinos del Viejo Mundo; la cuestión no se ha aclarado definitivamente, porque las lesiones óseas de la sífilis venérea y no venérea son difíciles de diferenciar. Rothschild y Rothschild han sugerido elementos discriminadores entre las especies de treponemas si se dispone del material adecuado.230 Sea cual sea la fuente original, cada país europeo decidió asociar la enfermedad con su vecino. Para los ingleses, la sífilis era la “enfermedad francesa.” Los franceses la consi­ deraban la “varicela italiana” . Parece que ningún país o cultura deseaba hacerse cargo de este azote particular. La presentación clínica de la sífilis venérea es variada y compleja. Sir William Osler, uno de los fundadores de la medi­ cina moderna, se refirió a la enfermedad como “el gran imita­ dor” y decía a los estudiantes que, si conocían la sífilis, sabían medicina. La enfermedad clínica se ha dividido, en forma un poco arbitraria, en una serie de estadios que se describen a con­ tinuación.115-259'291

PERÍODO DE INCUBACIÓN

Los treponemas se introducen en el cuerpo a través de una mucosa o un corte o abrasión de la piel. Se ha estimado epide­ miológicamente que hasta el 50% de los contactos sexuales de personas que pueden infectar a otros no sufren la infección. Sin embargo, estudios experimentales en voluntarios humanos han documentado que la DI,,, (dosis infecciosa 50, el número de microorganismos necesarios para infectar al 50% de las perso-

Clasificación de las espiroquetas ENFERMEDAD

LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA

MICROORGANISMO Orden Spirochaetales Familia Spirochaetaceae Género III. T reponem a T. p a llid u m subespecie p a llid u m

Mundial

Sífilis venérea

T. p a llid u m subespecie p e rte n u e

Asia tropical, Africa, América del Sur y Centroamérica

Frambesia

T. p a llid u m subespecie e n d em ic u m

África. SE Asia. Medio Oriente, Yugoslavia

Sífilis no venérea endémica

T. carateum

América Central y del Sur

Pinta

“Espiroquetas bucales similares a T. p a llid u m "

Mundial

Gingivitis necrosante

Género IV. B o rrelia Especies de B o rrelia

Mundial

Fiebre recurrente transmitida por garrapatas

B orrelia recurrentis

América del Sur, Europa, África, Asia

Fiebre recurrente transmitida por piojos

B orrelia b u rg d o rferi

América del Norte, Europa

Enfermedad de Lyme

Mundial

Leptospirosis

Familia Leptospiraceae Género I. L ep to sp ira L e p to sp ira interro g a n s

Adaptado de Krieg NR, Holt JR, eds.: Bergey’s Manual o f Systematic Bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins. 1984:38-64.

1078

C A P ÍT U L O 2 0

Infecciones producidas por espiroquetas

ñas expuestas) para T. pallidum son sólo 57 microorganis­ m os.166 Poco después de la inoculación las espiroquetas se dise­ minan por todo el cuerpo, donde por último pueden causar enfermedad. El período de incubación varía de 3 a 90 días, con una media de 3 semanas.

mina más adelante. Las anomalías del LCR en un paciente con diagnóstico serológico de sífilis proporcionan evidencia pre­ suntiva de que se ha comprometido el sistema nervioso. SÍFILIS LATENTE

SÍFILIS PRIMARIA

Esta fase comprende el desarrollo de la lesión primaria en el sitio de inoculación. La reacción inflamatoria crea una lesión ulcerada denominada chancro. Este tiene una base limpia, lisa y bordes elevados y duros. La úlcera es casi siempre indolora, aunque ligeramente sensible a la palpación. Hay poco exudado, a menos que el chancro luego se infecte. Es habitual un solo chancro primario, pero en los pacientes con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) pueden verse úlceras pri­ marias múltiples. La base contiene espiroquetas, que pueden visualizarse por microscopia de campo oscuro o inmunofluo­ rescencia después de raspar de la lesión. El chancro aparece en el sitio de la inoculación, la mayor parte de las veces en los genitales. En ocasiones, la sífilis se produce sin una úlcera visible.268 Los ganglios linfáticos regio­ nales están agrandados, pero son indoloros y duros. El chancro se cura en 3 a 6 semanas (intervalo, 1 a 12). El diagnóstico de laboratorio de la sífilis primaria depende de la demostración de espiroquetas en las lesiones por microscopia de campo oscuro o inmunofluorescencia directa, además de la serología.116 Las pruebas no treponémicas para la sífilis son negativas en el 10% a 30% de los pacientes con sífilis pri­ m aria.146 SÍFILIS SECUNDARIA

La fase secundaria de diseminación es la etapa más mani­ fiesta de la enfermedad y es el período en el cual los microor­ ganismos son más numerosos. Esta fase empieza 2 a 8 semanas después de la aparición del chancro y dura de algunos días a meses. La presentación más alarmante es una erupción cutánea diseminada, que puede ser macular, maculopapular o pustular, pero no vesicular, y que compromete en forma característica las palmas de las manos y las plantas de los pies. En las áreas de intertrigos, las placas anchas, húmedas, de color blanco gri­ sáceo, llamadas condiloma lata, están repletas de espiroquetas vivas que pueden visualizarse por microscopia de campo oscu­ ro o inmunofluorescencia de los raspados de las lesiones. Asimismo, pueden hallarse lesiones tegumentarias infectadas llamadas parches mucosos. Puede haber pérdida de pelo o adel­ gazamiento de las cejas. Los síntomas sistémicos son linfadenopatías generalizadas, fiebre y malestar general. Cualquier órgano puede estar com­ prometido en la sífilis secundaria. Es posible que se desarrolle queratitis, hepatitis y osteítis. La infección del sistema nervio­ so central ocurre en cualquier estadio de la sífilis, pero es más frecuente en la fase secundaria.239 El meningismo y la cefalea son frecuentes. Puede presentarse una meningitis aséptica. Las espiroquetas también pueden cultivarse del líquido cefalorra­ quídeo (LCR) aun en ausencia de inflamación y de enfermedad clínica.160 La demarcación entre las fases primaria y secundaria no está bien definida. En ocasiones, el chancro primario todavía está pre­ sente cuando aparece la erupción cutánea secundaria. El diagnóstico de laboratorio de sífilis secundaria puede hacerse por lo general fácilmente mediante técnicas serológi­ cas. El diagnóstico de neurosífilis es más difícil, como se exa­

Después de la fase secundaria, la enfermedad se hace subclínica, aunque no necesariamente inactiva. La fase latente se ha dividido en forma arbitraria en un período inicial de 4 años, llamado fase latente temprana, y un período latente tardío pos­ terior.44 Durante la latencia temprana puede haber recidivas y el paciente puede transmitir la infección. El 90% de las recidivas ocurren dentro del primer año. El período latente tardío es de duración indefinida y las complicaciones pueden no aparecer nunca. Durante el estadio latente de la sífilis la presencia de la enfermedad puede detectarse sólo serológicamente. SÍFILIS TARDÍA

Las complicaciones tardías de la sífilis son la enfermedad del sistema nervioso central, las anomalías cardiovasculares y los tumores, llamados gomas, en cualquier órgano. La sífilis neurovascular tardía puede ser sintomática o asintomática.117 La enfermedad asintomática se caracteriza por las anomalías del LCR en ausencia de síntomas. Suelen encontrarse en el LCR pleocitosis, concentraciones elevadas de proteína o con­ centraciones de glucosa reducidas. Una prueba serológica positiva en el LCR, clásicamente la prueba VDRL, define la enfermedad, aunque las espiroquetas rara vez pueden demos­ trarse por cultivo o, en los últimos años, por métodos molecu­ lares. La infección sintomática es meningovascular o parenquimatosa, pero hay una superposición considerable en las categorías. La sífilis meningovascular se parece a la meningi­ tis aséptica del estadio secundario. Cualquier nervio craneal puede verse afectado por la inflamación, y la sordera o las alteraciones visuales pueden ser el resultado. La enfermedad parenquimatosa puede comprometer las neuronas del cerebro o de la médula espinal. El compromiso cerebral se manifiesta como una amplia variedad de trastornos neuropsiquiátricos, que incluyen cambios físicos, como parálisis, y problemas psi­ quiátricos, entre ellos la megalomanía (“demencia paralítica”). Las columnas posteriores (¡os haces sensitivos) de la médula espinal son los más afectados, lo que causa dolores intensos e incapacidad para percibir los impulsos sensitivos de las extre­ midades. La enfermedad, llamada tabes dorsal, tiene como características una peculiar marcha “taconeante” y la defor­ mación de las rodillas (articulaciones de Charcot), que son causadas por la falla del circuito de retroalimentación que, en condiciones normales, indica al cuerpo el modo cuidadoso de desplazar las articulaciones. El intervalo entre la enfermedad primaria y la complicación neurológica es de 5 a 10 años para la sífilis meningovascular, de 15 a 20 años para la parálisis general y de 25 a 30 años para la tabes dorsal. Sífilis cardiovascular. La lesión cardiovascular de la sífilis, la aortitis sifilítica, ocurre en alrededor del 10% de los casos no tratados. Es causada por la inflamación de los vasos pequeños que irrigan la aorta (endarteritis sifilítica) y afecta sobre todo la aorta ascendente. Puede causar dos complicaciones: un aneu­ risma aórtico y la dilatación del anillo aórtico, que causa insu­ ficiencia y regurgitación de la sangre a través de la válvula aór­ tica. Los aneurismas aórticos pueden crecer hasta alcanzar un tamaño tal que erosionan el esternón y se visualizan bajo la piel del tórax.

Treponem a

Sífilis tardía “benigna”. Esta fase se caracteriza por la formación de lesiones granulomatosas inespecíficas llamadas gomas. Esta lesión es la complicación más frecuente de la sífilis tardía y ocurre en un 15% de los pacientes no tratados. La formación del granuloma indica que existe una respuesta inmunitaria celular totalmente activa. Sin embargo los gomas pueden des­ truir el tejido circundante a medida que aumentan de tamaño.222 Clínicamente, los gomas son lesiones ocupantes, destructivas, que se encuentran casi en cualquier órgano y pueden confun­ dirse al principio con carcinomas. El diagnóstico de laboratorio de la sífilis tardía requiere la demostración de reactividad serológica con una prueba treponémica o no treponémica. La única prueba universalmente reconocida como demostración de la neurosífilis es la prueba no treponémica VDRL, adaptada para el líquido cefalorraquí­ deo. Lamentablemente, es muy poco sensible, pero otras prue­ bas serológicas son propensas a la inespecificidad. Se ha suge­ rido usar la prueba treponémica de inmunofluorescencia con absorción del suero (FTA-ABS) como prueba de cribado más sensible para descartar por completo sífilis en pacientes con líquido cefalorraquídeo no reactivo, pero no hay ninguna prue­ ba aprobada en los Estados Unidos para este propósito. Sífilis congénita. Una de las consecuencias más trágicas de la sífilis es la infección intrauterina del feto.302 Como reflejo del aumento en la población general, la sífilis congénita ha aumen­ tado en forma constante desde 1983.63 La infección transplacentaria tiene más probabilidades de ocurrir durante el esta­ dio primario o secundario de la sífilis (véase lámina en color 20-1A). Las espiroquetas pueden infectar al feto en cualquier momento durante el embarazo, pero la probabilidad de que se produzca enfermedad clínica aumenta a medida que éste pro­ gresa. Muchos de los fetos infectados mueren. En algunas zonas de los Estados Unidos, la sífilis congénita es la causa más fre­ cuente de hidropesía fetal no inmunitaria, una enfermedad de la placenta que causa muerte del feto.21 De los que sobreviven, la mitad son asintomáticos y el resto tiene las lesiones de la sífilis secundaria, sin lesiones primarias detectables, porque no tienen ninguna puerta primaria de entrada. La infección se caracteriza por hepatoesplenomegalia, meningitis, plaquetopenia, anemia y lesiones óseas.154 La infección intrauterina del hueso puede causar anomalías visibles de huesos y dientes, como tibias deformadas (tibias en sable) o dientes anómalos (molares en forma de mora). Para evitar esta consecuencia trágia, se han recomendado las pruebas de cribado en las mujeres durante el embarazo. En las poblaciones de alto riesgo es nece­ sario además hacer pruebas en suero materno y del recién naci­ do para buscar anticuerpos en el momento del parto. La sangre del cordón es menos adecuada que el suero del recién nacido.50 La interpretación de las pruebas serológicas en la infección congénita es difícil. Los lactantes sintomáticos nacidos de madres seropositivas no tratadas requieren tratamiento antimi­ crobiano. Si la madre ha recibido un tratamiento adecuado con penicilina, la infección congénita es improbable y se ha reco­ mendado el seguimiento estrecho del lactante.108 La prueba VDRL suele retornar a la normalidad en el término de 6 meses y la prueba FTA-ABS se normaliza al año.49 Las pruebas tradi­ cionales para detectar anticuerpos IgM en el lactante no se uti­ lizan por su falta de sensibilidad y especificidad. Sin embargo, las nuevas estrategias y las variaciones de los métodos tradicionales proporcionan medios adicionales para la evaluación de los lactantes nacidos de madres con serología positiva para sífilis. Se han empleado modificaciones de los métodos para la detección de IgM. pruebas de inmunotransfe-

1079

rencia con antígenos definidos,33 detección de espiroquetas por inmunofluorescencia directa y detección de ácidos nucleicos con técnicas de amplificación.237 Puede demostrarse funisitis (inflamación del cordón umbilical) con necrosis o sin ella en un poco menos de la mitad de las madres con evidencia serológi­ ca de sífilis.101 La etiología treponémica puede demostrarse por inmunohistoquímica, pero pocos laboratorios tienen la capaci­ dad para hacer este diagnóstico. Una combinación de serología y detección de antígeno o su genoma en el lactante de una madre infectada ofrece la mejor probabilidad de demostrar la sífilis congénita, incluso la neu­ rosífilis.178 Si no hay pruebas claras de que la madre ha sido tratada de manera adecuada, está indicado el tratamiento empírico del lactante hasta que se cuente con pruebas con la sensibilidad suficiente para eliminar la posibilidad de infección intrauterina. EPIDEMIOLOGÍA

La sífilis puede transmitirse sólo a través de unas pocas vías: contacto sexual,223 introducción directa en el sistema vascular por utilización compartida de agujas compartidas o a través de transfusiones,48 contacto cutáneo directo con las lesiones in­ fecciosas o transferencia transplacentaria de espiroquetas (cua­ dro 20-2). A pesar del tratamiento antitreponémico exitoso y del cono­ cimiento de la epidemiología durante décadas, el problema de la sífilis persiste y la incidencia de la infección está en aumen­ to. Entre 1981 y 1989 la incidencia de sífilis primaria y secun­ daria en los Estados Unidos creció de 13,7 a 18,4 casos por 100 000 personas, un aumento del 34%.224 En 1987 la inciden­ cia de sífilis congénita aumentó el 21%.43 Durante esta década, la prostitución y el abuso de la cocaína se reconocieron como factores de riesgo. Después de una reversión aparente de estas tendencias en la década de 1990, la tasa aumentó de nuevo en 2001, causada principalmente por la reaparición de prácticas sexuales no protegidas entre varones homosexuales/bisexua-

Cuadro 20-2

T ra n s m isió n d e las e sp iro q u e ta s

MICROORGANISM O

TRANSMISIÓN

Treponema pallidum pallidum

Venérea Transfusión sanguínea (sólo seres humanos)

T. pallidum pertenue

Contacto directo con la piel (sólo seres humanos) Contacto directo con la piel (sólo seres humanos) Contacto directo con las mucosas (sólo seres humanos) Recipientes de comida o bebida contaminados Huésped humano, vector: el piojo humano {Pediculus humanus humanus) Roedores, primates, huésped humano; vector: garrapatas (Ornithodoros, Rhipicephalus) Roedores, huésped: ciervo; vector: garrapata {lxodes) Huésped: rata; aguas contaminadas

T. carateum T. pallidum endemicum

Borrelia recurrentis Especies de Borrelia

B. burgdorferi Leptospira interrogans

1080

C A P ÍT U L O 2 0

Infecciones producidas por espiroquetas

les.6 Persisten otros bolsones recalcitrantes de enfermedad. En 1997, las mujeres que fueron encarceladas varias veces en la ciudad de Nueva York tuvieron una incidencia de sífilis más de 1 000 veces mayor que todas las demás mujeres de la ciudad.28 Un estudio epidemiológico nacional de serorreactividad para la sífilis indicó que la raza, la edad, la educación, los ingresos y el lugar de residencia se correlacionaban con la positivi­ dad.105 En los varones el diagnóstico suele realizarse durante el estadio primario, en tanto que la lesión primaria a menudo no se detecta en las mujeres, que son diagnosticadas durante la fase latente temprana.148 Se ha calculado que, en un periodo de 6 años, se detectaron 1 200 casos de sífilis insospechada me­ diante las pruebas de cribado en sangre donada, casi el 60% de la cual provenía de voluntarios.92 Lo más alarmante es que el 81% de los dadores voluntarios y el 64% de los donantes paga­ dos no informaron ningún factor de riesgo para la sífilis. Como reflejo de los cambios importantes producidos en la sociedad norteamericana en los últimos cincuenta años, un estudio de sífilis prenatal realizado en el Boston City Hospital demostró un desplazamiento de las mujeres blancas casadas en 1951 a las mujeres de razas minoritarias solteras en 1991. Una prueba serológica positiva se asociaba con la drogadicción y la presencia de otras enfermedades de transmisión sexual.135 Una manifestación muy diferente de la influencia de la vida moder­ na sobre una enfermedad vieja fue la observación de que por lo menos en un grupo de casos de sífilis la pesquisa epidemiolo­ gía condujo hasta los contactos establecidos a través de un sitio de chat por Internet.136 Las técnicas epidemiológicas tradicionales de notificación del compañero sexual han resultado inadecuadas para los cam­ bios en las condiciones socioeconómicas de la América moder­ na.14,94 Entre 1983 y 1984 Alejandro-Rodríguez y cois, estudia­ ron a 285 niñas y 2 236 niños de 9 a 18 años que ingresaron en una institución de detención.11 La tasa de prevalencia para la gonorrea fue del 3% en los niños y del 18,3% en las niñas. Para la sífilis la tasa fue del 0,63% en los varones y del 2,5% en las mujeres. En teoría, las herramientas moleculares modernas deberían hacer que el rastreo de contactos y la identificación de focos locales fueran más sofisticados. Sin embargo, en algunos informes de aplicación de la epidemiología molecular se han identificado numerosos subtipos genéticos en una zona geo­ gráfica.208-287 T. p a llid um y el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) interactúan de varias maneras. Se ha sugerido que las úlceras genitales producidas por diversas etiologías facilitan la adquisi­ ción del HIV.271 La inmunosupresión que acompaña a la infec­ ción por HIV puede afectar la respuesta serológica a la sífilis. En los individuos inmunocompetentes, las pruebas serológicas son uniformemente positivas durante la fase secundaria de la sífilis. Sin embargo, Haas y cois, observaron 109 varones homo­ sexuales que habían sido tratados para la sífilis.103 Todos los que no habían sido infectados por el HIV mantuvieron su reactivi­ dad al antígeno treponém ico. En cam bio, el 7% de los que tenían una infección por HIV subclínica y el 38% de los que te­ nían enfermedad por el HIV habían perdido la reactividad a los antígenos treponémicos. Para empeorar las cosas, las reaccio­ nes biológicas falsas positivas en las pruebas no treponémicas parecen ser más frecuentes en los pacientes infectados por el HIV que en los que no tienen esa infección.16,227 El mecanismo de esta asociación es incierto y hay muchos posibles factores de confusión en estos pacientes complicados. Por ejemplo, también se describió una asociación de reacciones biológicas falsas positivas en pacientes infectados por el virus de la hepa­

titis C.289 No obstante, la mayoría de las pruebas no treponémi­ cas positivas en los pacientes infectados por el HIV indican la presencia de sífilis y se ha sugerido que los resultados confir­ matorios con FTA-ABS pueden ser falsos negativos.73 Los pacientes infectados por el HIV tienen más probabilida­ des de presentar una sífilis secundaria y chancros persistentes que los pacientes no infectados.120 Si bien algunos investigado­ res han sugerido que la epidemia de HIV se ha acompañado por un aumento de la neurosífilis,187 otros no han identificado el virus como un factor de riesgo para la infección del sistema ner­ vioso. En todo caso, los pacientes se detectan casi siempre en los estadios tempranos de la neurosífilis.84 Varios investigadores informaron que el tratamiento de la sífilis es infructuoso en los pacientes infectados por el HIV.27 La norma de tratamiento para la sífilis sigue siendo la peni­ cilina. La demostración de fracasos del tratamiento, sobre todo en los pacientes infectados por el HIV, ha hecho surgir la pre­ ocupación de que el régimen conveniente con penicilina benzatínica de efecto prolongado puede ser inadecuado en algunos enfermos.114,308 En ciertas situaciones puede ser adecuado administrar antibióticos recientemente desarrollados.15 Una de las complicaciones raras del tratamiento es la reacción de Jarisch-Herxheimer, que es local y generalizada. Esta reacción, que se asocia con endotoxinas circulantes liberadas de los microorganismos,93 se describió clásicamente en el tratamiento de la fiebre recurrente transmitida por piojos. INMUNIDAD

Los estudios experimentales han demostrado la importancia del sistema inmunitario celular en la resistencia a T. pallidum .2M Hay pruebas firmes en los seres humanos de que la inmunidad contra T. p a llid u m es parcial o de aparición tardía. Algunos lactantes con infección congénita se han reinfectado al llegar a la adolescencia.81 Asimismo, se logró reinfectar con éxito a voluntarios humanos que antes habían padecido sífilis. La probabilidad de que ocurra una reinfección disminuye con el tiempo transcurrido después de la infección primaria.82 Existe un período de resistencia parcial, durante el cual puede ocurrir reinfección sin formación de un chancro. Al llegar al estadio tardío, el paciente es completamente inmune a la rein­ fección. Treponema pallidum subespecie pertenue T. p a llid u m subespecie p ertenue (de ahora en adelante, T. pertenue) es la causa del pian o frambesia, una enfermedad tre-

ponémica crónica, no venérea (véase cuadro 20-1).139 El pian es endémico en Africa central y partes del subcontinente de la India, América del Sur y el sudeste asiático. La enfermedad tiene estadios primario, secundario y terciario. La piel y los huesos son los principalmente afectados. La enfermedad empieza en la niñez y se transmite por contacto con lesiones cutáneas infecciosas (véase cuadro 20-2). En la fase terciaria las lesiones pueden ser similares a sifilíticos. La penicilina benzatínica es curativa, aunque las lesiones pueden tardar meses en desaparecer. Los anticuerpos contra T. perten u e son indistin­ guibles de los anticuerpos contra T. pallidum . Treponema pallidum subespecie endemicum T. p a llid u m subespecie endem icum (de ahora en adelante, T. endem icum ) es la causa de la sífilis no venérea endémica o

bejel (véase cuadro 20-1). Es endémico en partes de África,

Treponem a

1081

Medio Oriente, India y Asia. La infección ocurre en la infancia, en zonas rurales con higiene deficiente. Se transmite por con­ tacto con lesiones de las mucosas o a través de utensilios para beber y comer contaminados (véase cuadro 20-2). La lesión primaria de la sífilis endémica se ve rara vez, pero la enferme­ dad es por lo demás similar a la sífilis venérea. La penicilina benzatínica es el tratamiento de elección. La corrección de las condiciones sanitarias y de higiene puede ser preventiva. Los anticuerpos de los pacientes con sífilis endémica reaccionan en forma cruzada con T. pallidum . Treponema carateum T. carateum , agente etiológico de la pinta, es tal vez el más antiguo de los treponemas humanos. La enfermedad se carac­ teriza por lesiones cutáneas ulcerosas o papuloescamosas, que a menudo pierden su pigmentación. La pinta es endémica en partes de América del Sur y Central (véase cuadro 20-1) y se disemina por contacto con las lesiones cutáneas infectadas (véase cuadro 20-2). No hay ningún efecto a largo plazo sobre la salud general, pero el deterioro estético es considerable. Los antisueros de los pacientes con pinta reaccionan en forma cru­ zada con los antígenos específicos de T. p allidum ,85

Figura 20-1 Examen en campo oscuro positivo para Treponema pallidum. La forma espiralada con espiras muy apretadas de los microorganismos es evidente. El fondo contiene detritos y algunos eritrocitos, lo que indica que la muestra es adecuada. 1 0 0 0 X . (Microfotografía cortesía de los CDC, Atlan­ ta GA).

Diagnóstico de laboratorio de las enfermedades treponémicas

El diagnóstico de laboratorio de la sífilis ha sido amplia­ mente revisado por Larsen y cois.,146 y Hart ha elaborado una estrategia de diagnóstico y tratamiento eficaz en relación con los costos.108 El procedimiento de referencia para el diagnóstico de sífilis es el cultivo, que debe realizarse in vivo, casi siempre mediante inoculación intratesticular de conejos con el material clínico (cuadro 20-3). El procedimiento es caro y engorroso, y requie­ re varios meses para el subcultivo del material testicular si el animal original no presenta conversión serológica. Por razones obvias, el cultivo sigue siendo una herramienta de investigación. En la sífilis primaria, antes de la aparición de los anticuer­ pos, la detección directa de espiroquetas en el chancro es el único medio de diagnóstico (protocolo 20-1). El método tradi­ cional ha sido la microscopia de campo oscuro del material ras­ pado de la superficie de una lesión (fig. 20-1). La observación de la motilidad de la espiroqueta es fundamental para diferen­ ciar T. pallidum de las espiroquetas saprofitas, por lo que la observación microscópica debe llevarse a cabo inmediatamen-

Cuadro 20-3

te después de obtener la muestra, lo cual es muy difícil de lo­ grar en la mayoría de los laboratorios clínicos. El examen de las lesiones bucales no se recomienda debido a la presencia fre­ cuente de treponemas saprofitos en la boca. Las lesiones cutá­ neas y viscerales de la sífilis secundaria suelen contener gran­ des cantidades de espiroquetas que pueden demostrarse por microscopia de campo oscuro de raspados o improntas. Un enfoque alternativo, más satisfactorio que la microscopia de campo oscuro, es demostrar la presencia de espiroquetas en las lesiones, por inmunofluorescencia (véase lámina en color 20-1B). Se han creado reactivos monoclonales con mayor espe­ cificidad.122 Hook y cois.116 demostraron la presencia de treponemas fluorescentes en 30 de 30 pacientes con sífilis primaria, 29 de los cuales también tenían exámenes de campo oscuro positivos. En algunos casos de gingivitis necrosante221 se des­ cribió una espiroqueta bucal antigénicamente relacionada con T. pallidum , por lo que existe la posibilidad de encontrar resul­ tados falsos positivos cuando se evalúan las lesiones bucales, incluso con un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclo-

Cultivo de espiroquetas

MICROORGANISMO

IN VITRO

IN VIVO

Treponema pallidum pallidum

Testículos de conejo; hámster; cobayo

Ninguno

T. pallidum pertenue

Testículos de conejo; hámster; cobayo

Ninguno

T. pallidum endemicum

Testículos de conejo; hámster; cobayo

Ninguno

T. carateum

Ninguno (chimpancé ±)

Ninguno

Borrelia recurrentis

Diversos

Medio de Kelly modificado

Especies de Borrelia

Diversos

Medio de Kelly modificado

B. burgdorferi

Diversos

Medio de Kelly modificado

Leptospira interrogans

Diversos

Medio de Fletcher; medio de Korthof; medio Tween 80-albúmina

1082

C A P ÍT U L O 2 0

Infecciones producidas por espiroquetas

nal conjugado con fluoresceína se puede obtener en los Cen­ ters for Disease Control and Prevention (CDC) (número de catálogo: BE3051). Para realizar la prueba de fluorescencia directa para T. p a lli­ dum (DFA-TP), se obtiene material de una lesión o tejido como se describió para el examen de campo oscuro, sólo que el mate­ rial se deja secar en el portaobjetos (protocolo 20-1). En forma alternativa, los frotis secos pueden enviarse a un laboratorio de referencia o pueden obtenerse secreciones en tubos capilares que se sellan y guardan a 4 °C para mandarlos por correo. El método de inmunofluorescencia directa ha sido eficaz para T. pertenue, así como para T. pallidum .205 Las espiroquetas presentes en tejidos fijados con formol pue­ den demostrarse con una de las muchas variaciones de una tin­ ción por impregnación argéntica, como los procedimientos de Steiner, Warthin-Starry o Dieterle (véase lámina en color 201A).295 Aunque el hallazgo de espiroquetas en la situación clí­ nica apropiada es evidencia presuntiva de sífilis, la tinción en sí misma es inespecífica. La aplicación de un anticuerpo fluoresceinado proporciona especificidad, además de sensibilidad. Ito y cois, han demostrado T. pallidum en tejidos fijados en formol mediante antisueros policlonales123 o anticuerpos monoclona­ les después del tratamiento con NH4OH o tripsina para exponer los sitios antigénicos.

U.S. Public Health Service.145 Algunos de ellos se resumen en los cuadros con fines didáctios. Cuando estas pruebas se reali­ zan en el laboratorio, es indispensable que se consulte y se siga exactamente el manual o las instrucciones del fabricante. Pruebas no treponémicas. Las pruebas no treponémicas utilizan los anticuerpos contra un lípido tisular, llamado cardiolipina, que se produce como un subproducto de la infección treponé­ mica. La asociación se reconoció a principios del siglo pasado cuando se crearon diversas pruebas de fijación del complemen­ to. Los procedimientos actuales son predominantemente prue­ bas de floculación. Usan cardiolipina en forma de complejo con colesterol y lecitina. Los procedimientos habituales son las pruebas del Venereal Diseases Research Laboratory (VDRL) y la reagina plasmática rápida (RPR). Las pruebas RPR en tarje­ ta alcanzaron popularidad porque la prueba de VDRL es técni­ camente muy engorrosa y difícil. Cuando se dejaron de fabri­ car los frascos requeridos para la preparación del antígeno VDRL se desató una lucha por una alternativa aceptable.211 Otras pruebas usadas son la prueba de detección de reaginas (reagin screen test. RST), la prueba de reaginas en suero no calentado ( unheated serum reagin, USR) y la prueba de rojo de toluidina en suero no calentado ( toluidine red unheated serum test, TRUST). Las pruebas no treponémicas tienen una sensibilidad del 70-99%, según el estadio de la enfermedad. Las pruebas pue­ den no ser positivas en la sífilis primaria, por lo que deben repetirse después de 1 semana, 1 mes y 3 meses si se obtiene un resultado negativo en un paciente con presunta sífilis. La sensibilidad de estas pruebas es cercana al 100% durante la fase secundaria de la enfermedad. El plasma y la sangre del cordón no deben usarse, porque pueden obtenerse reacciones fronterizas.143 Las pruebas no treponémicas son afectadas por el tratamien­ to antitreponémico. Como resultado, son útiles para seguir la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento. Los resultados de cualquier prueba positiva deben ser titulados hasta una dilución de punto final. Además, el suero de los pacientes con grandes cantidades de anticuerpos puede produ­ cir un fenómeno de prozona. Cuando ocurre este fenómeno, las concentraciones relativas de anticuerpo y antígeno no están en equilibrio, y la precipitación o la floculación no tienen lugar. Los resultados falsos negativos causados por el fenómeno de prozona siguen siendo un problema clínico. La existencia de un fenómeno de prozona a menudo produce un aspecto “rugoso” del antígeno no floculado. Cualquier suero que produzca este aspecto rugoso debe ser titulado. Además, el suero debe ser

PRUEBAS SEROLÓGICAS

Las pruebas serológicas para la sífilis pueden dividirse en dos grupos: pruebas no treponémicas y pruebas treponémicas. Ambos grupos tienen características distintivas que los hacen útiles para diferentes propósitos. Estos grupos son complemen­ tarios, no mutuamente excluyentes. Las pruebas no treponémi­ cas son muy útiles como estudios de cribado. Las pruebas tre­ ponémicas deben reservarse como estudios confirmatorios cuando una prueba no treponémica es positiva o cuando la sos­ pecha clínica de sífilis es alta, a pesar de que una prueba no tre­ ponémica sea no reactiva. Hart108 señaló que la “mayor” espe­ cificidad de las pruebas treponémicas obedece a un artificio derivado de su uso actual como pruebas de confirmación des­ pués de efectuar una prueba no treponémica. Cuando las prue­ bas se comparan como procedimiento serológico inicial, la prueba no treponémica VDRL realmente es tan específica o más que la prueba treponémica FTA-ABS.144 Las característi­ cas generales de estas pruebas se resumen en el cuadro 20-4. Los procedimientos para la realización de estas pruebas se han estandarizado y han sido publicados con gran detalle por el

Cuadro 20-4

C aracterísticas de las pru eb as serológicas para la sífilis % POSITIVIDAD EN EL ESTADIO INFECCIOSO

PRUEBA

TIPO

Primario

Secundario

Tardío

VDRL

No treponémica

70

99

1

RPR

No treponémica

80

99

0

FTA-ABS

Treponémica

85

too

98

TPHA

Treponémica

65

too

95

TPI

Treponémica

50

97

95

Adaptado de Tramont EC. Treponema pallidum (syphilis). En: Mandell GL, Douglas RG, Bennett JE (eds). Principies and Practice o f Infectious Diseases. 3 ed. Nueva York: Churchill Livingstone, 1990.

Treponem a

diluido y probado nuevamente si la sospecha clínica de que un paciente con resultados negativos de la prueba tiene sífilis es fuerte. En la población general la frecuencia de reacciones de prozona es tan baja que la dilución rutinaria del suero no es efi­ caz en relación con los costos.70 Si el título de anticuerpos no disminuye en forma progresiva con el tratamiento, debe considerarse la posibilidad de un fra­ caso de éste. Debe haber una disminución de por lo menos cua­ tro veces en el título de anticuerpos después de 3 meses de tra­ tamiento antitreponémico. En los pacientes que son tratados en los estadios tardíos de la sífilis o que se han reinfectado, los títulos disminuyen muy lentamente o permanecen estables. Algunos de estos “persistentes” crónicos pueden mantener las pruebas no treponémicas positivas toda la vida. Las pruebas no treponémicas no pueden usarse para diagnos­ ticar la sífilis tardía, sobre todo si está tratada, porque el título de anticuerpos disminuirá por último a niveles no detectables. La prueba de VDRL se ha transformado en la prueba no tre­ ponémica estándar. La preparación del antígeno debe hacerse con gran precisión y prestando atención a los detalles. Es la única prueba serológica con aceptación universal para el diag­ nóstico de neurosífilis. En la figura 20-2 se muestran ejemplos de reacciones VDRL. El procedimiento se resume en el proto­ colo 20-2.

Figura 20-2 Prueba VDRL: las reacciones en esta prueba se evalúan micros­ cópicamente. (A) Suero no reactivo. Las partículas de antígeno VDRL se encuentran dispersas de forma uniforme, sin agruparse. (B) Suero reactivo: las partículas de antígeno VDRL están fuertemente aglutinadas por este suero sifi­ lítico. Las partículas aisladas se agrupan en cúmulos y grandes grumos. lOOx. (Cortesía de Burton Wilcke. PhD y Mary Celotti.)

1083

R eactivo (m ínim o a m oderado)

Reactivo No reactivo

Figura 20-3 Prueba RPR en tarjeta: las reacciones en esta prueba se leen a simple vista, usando iluminación con luz incandescente. Esta tarjeta control contiene sueros Reactivo (R), Débilmente reactivo (D) y No reactivo (N). El antígeno VDRL modificado se hace visible al formar complejos con partículas de carbón. Las partículas de carbón-antígeno están dispersas en forma unifor­ me y finamente distribuidas en el suero no reactivo y forman grumos visibles en el suero reactivo. El suero con actividad mínima a moderada produce pequeños agregados y grumos de las partículas de carbón- antígeno VDRL.

La prueba RPR es una adaptación del principio de floculación a un formato en tarjeta. La visibilidad de la floculación aumenta por la incorporación de partículas de carbón. Los usos de la prueba RPR son similares a los de la prueba VDRL, sólo que la prim era no puede utilizarse en LCR. La simplicidad de la prueba RPR ha llevado a que la mayoría de los laborato­ rios la adopte como prueba primaria de cribado (fig. 20-3). El procedimiento se describe en el protocolo 20-3. La especificidad de las pruebas no treponémicas alcanza en promedio el 98%, con un rango de 93% a 99%. La falta de especificidad es un problema sobre todo cuando las pruebas se usan para el cribado en poblaciones con baja prevalencia de sí­ filis, en las que es probable que las reacciones positivas sean falsas. Las reacciones falsas positivas ocurren en los pacientes que tienen otras infecciones treponémicas, pero también en aquellos con enfermedades que producen anticuerpos anticardiolipina. Estos “falsos positivos” biológicos pueden ser transi­ torios, causados casi siempre por infecciones virales, o pueden ser persistentes, relacionados con enfermedades mediadas por mecanismos inmunitarios. Se han informado reacciones falsas positivas biológicas en drogadictos, una población con riesgo aumentado de contraer sífilis.132 Como ya se explicó, los pacientes con infección por HIV también tienen mayor fre­ cuencia de resultados falsos positivos en las pruebas biológi­ cas. En un estudio, estas reacciones positivas estaban asociadas con la infección por el virus de la hepatitis C. También se ha sugerido que un determinante importante de los resultados fal­ sos positivos en las pruebas biológicas es el uso de drogas ilí­ citas por vía intravenosa.112 Por consiguiente, una reacción positiva en una prueba no treponémica debe confirmarse con una prueba treponémica más específica. Sin embargo, cabe hacer notar que debe considerarse la posibilidad de obtener resultados falsos negativos con las pruebas treponémicas. Se han introducido diversas variaciones en las pruebas no treponémicas, pero no han reemplazado a las pruebas tradicio­ nales. Pruebas treponémicas. Las pruebas treponémicas incorporan antígenos treponémicos específicos en el sistema. La prueba de referencia tradicional era la prueba de inmovilización de T. pallidum (TPI), en la que se inhibe la motilidad de treponemas vivos, virulentos, por la presencia de anticuerpos específicos. Esta prueba cara y engorrosa se ha reemplazado por la prueba

1084

C A P ÍT U L O 2 0

Infecciones producidas por espiroquetas

FTA-ABS. Luego se creó otra prueba específica para los antí­ genos treponémicos: la prueba de microhemaglutinación para T. pallidum (MHA-TP). La prueba FTA-ABS se resume en el protocolo 20-4. La especificidad del ensayo se aumenta por la absorción del suero por probar con una espiroqueta no patógena: la cepa Reiter de T. phagedenis. La prueba FTA-ABS tiene mayor tasa de positi­ vidad en la sífilis temprana que las pruebas no treponémicas (véase cuadro 20-4). La tasa de positividad es cercana al 100% en el estadio secundario y persiste toda la vida. No es afectada por el tratamiento antitreponémico. Por consiguiente, la prueba FTA-ABS es buena para la detección sistemática de la sífilis tardía, pero no puede usarse para seguir el tratamiento. El grado de positividad de la prueba FTA-ABS no tiene ningún significado biológico, por lo que no se informa la intensidad de la fluorescencia y los sueros positivos no se titulan. La especi­ ficidad de la prueba FTA-ABS es alta. Con pocas excepciones, no tiene los resultados falsos positivos de las pruebas biológi­ cas no treponémicas. El suero de algunos pacientes, sobre todo los que padecen lupus eritematoso sistémico u otras enferme­ dades del tejido conectivo, puede producir una reacción de tin­ ción en cuentas de collar poco frecuente.141 Se ha calculado que el 1% de la población normal tiene una prueba FTA-ABS posi­ tiva. Existen reacciones cruzadas con otros treponemas patóge­ nos. Si la prueba FTA-ABS se usa para el cribado en poblacio­ nes con prevalencia muy baja de sífilis, las reacciones falsas positivas pueden ocurrir incluso con esta prueba tan específica. Una variación de la prueba FTA-ABS es el procedimiento de doble tinción. Esta prueba es muy similar a la FTA-ABS, sólo que se usan anticuerpos IgG antitreponémicos conjugados con rodamina para localizar las espiroquetas. En la prueba FTAABS clásica, se usa la iluminación en campo oscuro para esta localización. Los resultados de los procedimientos tradicional y de doble tinción son comparables.220 La prueba FTA-ABS puede adaptarse para detectar anticuer­ pos IgG o IgM. Una ventaja de la detección de anticuerpos IgM es demostrar una infección in útero. Las inmunoglobulinas clase G atraviesan la placenta y entran en la circulación fetal, pero los anticuerpos IgM no atraviesan la placenta. Los anti­ cuerpos IgM son producidos por el feto in útero; por consi­ guiente, la detección de anticuerpos IgM antitreponémicos específicos en un recién nacido indica la existencia de infec­ ción intrauterina.12 Sin embargo, existen problemas potenciales con los análisis de IgM y debe tenerse mucho cuidado para validar una prueba determinada antes de usarla. Si en el suero fetal existen antiglobulinas, como el factor reumatoide o anti­ cuerpos antiidiotipo, se obtendrán resultados falsos positivos. Si están presentes en cantidades excesivas, los anticuerpos IgG pueden bloquear los sitios antigénicos y dar resultados falsos positivos. Rosen y Richardson demostraron un buen rendi­ miento con un ensayo experimental, pero tuvieron dificultades cuando usaron reactivos comerciales.228 La prueba de microhemaglutinación, que usa antígenos espe­ cíficos de T. pallidum , es mucho menos complicada y no requie­ re un microscopio de fluorescencia. El rendimiento es similar al del procedimiento de fluorescencia, pero es menos sensible en la sífilis temprana. La prueba FTA-ABS debe estar disponible para hacer pruebas en sueros que dan reacciones equívocas.285

INNOVACIONES: PRUEBAS PROVISIONALES Y EN FASE DE INVESTIGACIÓN

El desempeño insatisfactorio de la prueba FTA-ABS para IgM ha conducido a la investigación de otros métodos. La

prueba FTA-ABS para IgM 19S incluye el fraccionamiento del suero para obtener la especificidad de la IgM, en lugar de depender de los reactivos antiglobulina.283 Esta prueba parece evitar los problemas de inespecificidad, por lo que puede usar­ se como procedimiento confirmatorio, pero su falta de sensibi­ lidad impide su uso como prueba de cribado. La evaluación secuencial con pruebas cuantitativas no treponémicas sigue siendo una parte importante de la evaluación de laboratorio de la sífilis congénita. Se han ideado inmunoanálisis enzimáticos y de aglutinación de partículas para la detección de antígenos treponémicos espe­ cíficos.67'75-104'212'235-245-306 Estas pruebas tienen sensibilidad y especificidad comparables con las de las pruebas de referencia, pero a menudo se presentan en formatos más fáciles de usar. A medida que aumente su uso, aumentará sin duda la facilidad para abandonar los métodos tradicionales. Las técnicas moleculares modernas pueden ayudar en situa­ ciones problemáticas. Sánchez y cois, usaron el Western blot (transferencia Western o inmunoelectrotransferencia; véase cap. 3) para identificar un antígeno de 47 kDa que no se encuentra en los pacientes control y se relaciona con la infec­ ción intrauterina.236 La sensibilidad de la inmunoelectrotransfe­ rencia para la detección de anticuerpos IgM en 14 recién naci­ dos sintomáticos fue del 92%, en tanto que el 83% de 12 recién nacidos asintomáticos que luego resultaron estar infectados fueron detectados por Western blot. Veintisiete de 30 (90%) niños no infectados fueron clasificados en forma correcta.176 Dobson y cois.59 demostraron reactividad contra antígenos pro­ teicos de 47 y 37 kDa en el suero de niños con infección con­ génita. Aunque el factor reumatoide puede en teoría causar pro­ blemas en los ensayos de electroinmunotransferencia, su elimi­ nación del suero no afecta los resultados. La inmunoelectro­ transferencia también se ha usado con éxito como prueba con­ firmatoria para la sífilis.39 Una ventaja de esta técnica es que el antígeno purificado puede usarse como sustrato y el patrón de reactividad de los sueros puede usarse para determinar la posi­ tividad. Sin embargo, si no se estandarizan los criterios para determinar la positividad de las pruebas de inmunoelectro­ transferencia, las variaciones de interpretación entre laborato­ rios pueden causar problemas de diagnóstico. A medida que avanzan los conocimientos acerca de la naturaleza de los antí­ genos proteicos de T. pallidum ,210 es indudable que aumentarán el número y la calidad de las pruebas en los próximos años. Las técnicas moleculares también se han aplicado a la detec­ ción directa de espiroquetas en los tejidos y líquidos corpora­ les. Los investigadores han centrado su atención en la infección intrauterina y del sistema nervioso central, porque las técnicas serológicas no son adecuadas para estos importantes problemas clínicos.100 193 Las sondas de DNA no han sido suficientemente sensibles, por lo que los esfuerzos se han enfocado en las téc­ nicas de amplificación, como la reacción en cadena de la polimerasa.155 168 Aunque las nuevas técnicas son un agregado va­ lioso al arsenal diagnóstico, la presencia de inhibidores en las muestras clínicas puede producir resultados falsos negativos de las pruebas, sobre todo en el LCR. El DNA treponémico en el líquido cefalorraquídeo parece ser estable, de modo que es pro­ bable que los resultados negativos no sean consecuencia del deterioro de los ácidos nucleicos en las muestras.296 En los protocolos de investigación hubo muy pocos resulta­ dos falsos positivos producidos por contaminación, pero en un estudio fue necesario solucionar los problemas de inespecifici­ dad. Sin embargo, la estrecha correlación entre la reacción en cadena de la polimerasa y las pruebas muy poco prácticas de infecciosidad utilizadas en otros estudios con conejos sugieren

Borrelia

que aquel método permitirá en el futuro la solución de los pro­ blemas de diagnóstico difícil.

Borrelia Las especies de Borrelia son bacterias helicoidales que miden 0.2 a 0,5 |im de diámetro y 3 a 20 (im de largo, con 3 a 10 espiras flojas y 15 a 29 flagelos periplásmicos (véase lámi­ na en color 2 0 -IC, D y F). Las especies cultivadas in vitro son microaerófilas (véase cuadro 20-3). Las bacterias son gramne­ gativas y se tiñen bien con la coloración de Giemsa.134 Los patógenos humanos se transmiten por insectos vectores (véase cuadro 20-2). La fiebre recurrente transmitida por piojos es causada por B. recurrentis, la fiebre recurrente transmitida por garrapatas es causada por una variedad de especies, y la enfer­ medad de Lyme es causada por B. burgdorferi y especies rela­ cionadas. Las borrelias también causan infección en los anima­ les y algunas especies todavía no se han relacionado con ningún proceso patológico. Las relaciones entre las diversas especies han sido evaluadas por la caracterización de sus genes de la flagelina.90 Fiebre recurrente

La fiebre recurrente es una enfermedad clínica característica, que es muy probable que ya haya sido reconocida por Herodoto en la antigua Grecia. Existen dos formas: 1) la enfermedad epi­ démica transmitida por piojos y 2) la enfermedad endémica transmitida por garrapatas. Las características epidemiológi­ cas, ecológicas y clínicas se comparan en el cuadro 20-5. Hay varias revisiones, antiguas, pero todavía válidas.36'79,266 EPIDEMIOLOGÍA

La fiebre recurrente transmitida por piojos es una enferme­ dad relacionada con la pobreza, el hacinamiento y la carencia de servicios sanitarios, como lo es el tifus transmitido por pio­ jos. Se ha observado en Africa, Medio Oriente y Asia, pero no en el Nuevo Mundo. El piojo del cuerpo humano sólo parasita a los seres humanos y B. recurrentis no se transmite vertical­ mente a las generaciones siguientes de piojos. El microorga­ nismo debe mantenerse por el pasaje del piojo a un huésped humano y después de nuevo a otro piojo. El piojo permanece

Cuadro 2 0-5

1085

infectado toda su vida. La enfermedad epidémica ocurre por lo tanto sólo en condiciones de extrema miseria. En la primera mitad del último siglo las epidemias ocurrieron alrededor de cada 20 años. En épocas más recientes, Etiopía ha sido el único sitio geográfico de infección importante. La fiebre recurrente transmitida por garrapatas tiene distri­ bución mundial. Muchas garrapatas de cuerpo blando del géne­ ro Ornithodoros son portadoras de borrelias que las diferen­ cian. En los Estados Unidos, los taxónomos han intentado usar el mismo nombre para una garrapata y su espiroqueta asociada. Así, O. h en n sii es el vector de B. hermsii. Las características epidemiológicas de la fiebre recurrente transmitida por garra­ patas dependen de los hábitos del vector local. O. h en n sii es el vector más frecuente y B. herm sii la borrelia más frecuente en California, el noroeste del Pacífico y Canadá.66 O. h en n sii vive en los restos de árboles muertos y parasita roedores, que a menudo la transportan a las cabañas de cazadores. O. parkeri habita en cuevas y madrigueras de ardillas y perros de la pra­ dera en el este de los Estados Unidos. Es un patógeno poco fre­ cuente de los seres humanos debido a la inaccesibilidad de su vector. O. turicata habita cuevas y madrigueras de animales en el oeste de los Estados Unidos, México y América del Sur, pero también se ha encontrado en asociación más cercana con los seres humanos, bajo los cimientos de casas en Texas. Las borrelias transmitidas por garrapatas tienen un nicho ecológico estables, casi sin ninguna posibilidad de erradicación. Las espi­ roquetas pueden pasarse de una generación de garrapatas a otra sin la intervención de un huésped vertebrado. Se ha informado que O. turicata sobrevive sin comer durante 5 años, y también se sabe que la supervivencia de las borrelias en las garrapatas, sin pérdida de infecciosidad, alcanza hasta 12 años. La fiebre recurrente transmitida por garrapatas es fundamen­ talmente endémica y afecta a las infortunadas personas que se transforman en un huésped accidental. Sin embargo, en condi­ ciones adecuadas, la enfermedad puede hacerse epidémica. En 1968 hubo un brote de fiebre recurrente transmitida por garra­ patas en 42 escultistas y sus líderes que estaban acampando cerca de Spokane, Washington.290 La enfermedad clínica se desarrolló en 1 de las 42 personas en riesgo. En 9 casos pudo calcularse el período de incubación exacto, porque sólo estu­ vieron en riesgo durante una noche (promedio, 6,9 días; rango, 3 a 9). La tasa de ataque fue más alta entre los que durmieron en las cabañas abandonadas que entre los que lo hicieron en carpas, hecho también notado por Horton y Blaser en Colo­

C aracterísticas de la fieb re recurrente

CARACTERÍSTICA

TRANSMITIDA POR PIOJOS

TRANSMITIDA POR GARRAPATAS

Epidemiología

Epidémica

Habitualmente endémica

Agente etiológico

B. recurrentis

Diversos; B. hennsii, B. turicatae, B. parkeri en EE.UU.

Vector

Pediculus humanus spp. humanus

Diversos; Ornithodoros hermsii, O. turicatae, O. parkeri en EE.UU.

Duración promedio del ataque primario

5,5 días

3,1 días

Duración promedio (rango) del intervalo asintomático

9,25 días (3-27)

6 ,8

Número promedio (rango) de recidivas

3(0-13)

1 (0-3+)

Duración promedio de la recidiva

1,9 días

2,5 días

Adaptado de la referencia266.

días (1-63)

1086

C A P ÍT U L O 2 0

Infecciones producidas por espiroquetas

rado.118 Los autores señalaron el “resarcimiento” en la distribu­ ción de casos de la enfermedad, con más afectados entre los líderes y los exploradores más antiguos, que se reservaron las cabañas para ellos y dejaron a los exploradores más jóvenes “al raso.” En zonas en las que no existen espiroquetas de la fiebre recu­ rrente autóctonas, la importación de la enfermedad desde las regiones endémicas representa un desafío diagnóstico.51 La infección transmitida por garrapatas es más probable que la transmitida por piojos para los turistas que visitan África. Los parasitólogos deben tener presente esta posibilidad de diagnós­ tico cuando examinan frotis obtenidos para la detección de parásitos del paludismo. ENFERMEDAD CLÍNICA

La presentación clínica de los dos tipos de fiebre recurrente es similar. Las diferencias en la frecuencia y en el momento de las recaídas se presentan en el cuadro 20-5. Las garrapatas del género O rnithodoros se alimentan en forma muy poco eviden­ te de los seres humanos y durante períodos cortos. Por consi­ guiente, la mayoría de los pacientes no recuerda haber sufrido una picadura de garrapata. El comienzo típico de la enferme­ dad es abrupto, con fiebre alta, de alrededor de 40 °C, escalo­ fríos intensos, delirio, intenso dolor muscular y dolor en los huesos y articulaciones. Puede haber hepatoesplenomegalia y dolor a la palpación y el paciente puede estar ictérico. Las com­ plicaciones neurológicas, como meningitis linfocítica y paráli­ sis facial, se parecen a las de la infección por B. burgdorferi .41 Es característico que haya una crisis después de la cual la fie­ bre desaparece y el paciente se siente bien. La muerte es muy rara. Cuando hay recidivas, cada ciclo tiende a ser menos grave que el precedente. Puede presentarse una erupción cutánea durante el ataque inicial, pero no suele aparecer en las recidi­ vas. Un brote de fiebre recurrente transmitida por piojos en tropas etíopes que se registró después de terminada la guerra civil proporcionó hace poco la desafortunada oportunidad de revisar las características clínicas.29 La mortalidad fue del 3,6%, y el 1,8% de los pacientes tuvieron recrudescencia de la enfermedad. Aunque la penicilina es eficaz contra las borrelias, las tetra­ ciclinas o la eritromicina son más eficaces para eliminar las espiroquetas. Durante el tratamiento pueden ocurrir reacciones de Jarisch-Herxheimer (JH). En la reciente epidemia etíope de enfermedad transmitida por piojos, el 43% de los pacientes experimentaron esta complicación. El uso de penicilina en dosis bajas conduce a recidivas más frecuentes, pero con menos reacciones de JH que con tetraciclina o dosis más altas de penicilina.250 La administración de paracetamol e hidrocortisona modifica los cambios de los signos vitales observados durante la reacción de JH, pero no previenen el intenso escalo­ frío.38 Existen aumentos transitorios del factor de necrosis tumoral y de las interleucinas 6 y 8 que se relacionan tempo­ ralmente con la reacción,190 aunque no todos los investigadores han podido detectar las elevaciones de estas citocinas. El con­ trol del vector es también esencial para el control de la infec­ ción epidémica transmitida por piojos.286

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

Las borrelias de la fiebre recurrente pueden cultivarse en una modificación20 del medio de Kelly para borrelias,133 pero el ais­ lamiento no es un medio práctico de diagnóstico en la mayoría de las situaciones. En forma similar, aunque se han creado

varias pruebas serológicas, no son útiles desde el punto de vista del diagnóstico. Alrededor del 5% de los pacientes tienen una prueba VDRL positiva. El principal apoyo del diagnóstico es la demostración de las espiroquetas en los líquidos corporales, casi siempre en los fro­ tis de sangre periférica (véase lámina en color 20-IC). El diag­ nóstico a menudo se hace en el laboratorio de hematología, porque la presentación clínica puede ser enigmática para los médicos no familiarizados con la enfermedad. Horton y Blaser118 informaron un caso en el que las espiroquetas fueron pasadas por alto por un escáner diferencial automatizado, pero fueron vistas por un técnico atento que revisó el frotis. A dife­ rencia de otras espiroquetas, las borrelias de la fiebre recurren­ te se tiñen bien con los colorantes de anilina ácidos, como las tinciones de W right o de Giemsa. Los borrelias son microorga­ nismos delgados, ondulados o francamente espiralados, muy visibles cuando se encuentran entre los eritrocitos (véase lámi­ na en color 20-IC). Felsenfeld79 propone la tinción de Wright seguida de la aplicación de una solución de violeta de gencia­ na al 1% durante 10 a 30 segundos. Es probable encontrar borrelias en la sangre durante los epi­ sodios febriles. Se calcula que la sensibilidad de los frotis de sangre periférica teñidos es del 70%. Es improbable detectar las espiroquetas durante los intervalos afebriles entre los ata­ ques, aunque todavía están presentes en el cuerpo. Deben hacerse extensiones “de gota gruesa” y frotis de gota fina como para el paludismo, porque en algunos casos las espiroquetas sólo se detectarán por el examen de los preparados de gota gruesa. Goldschmid y Mahomed usaron una técnica de centrifuga­ ción de microhematocrito para concentrar las borrelias en la capa rica en leucocitos y sobre ella.98 Este procedimiento no se ha usado ampliamente, pero ha sido comprobado en un estudio realizado en África Occidental, que incluyó el aislamiento de B. crocidurae.294 Sciotto y cois, usaron la técnica de fluores­ cencia con naranja de acridina para demostrar la presencia de borrelias en los frotis de sangre periférica (véase lámina en color 2 0 -ID ).249 El procedimiento de fluorescencia aumenta en gran medida la visibilidad de las espiroquetas. Se describió un anticuerpo monoclonal para la identificación de B. hem sii en los frotis de sangre periférica y técnicas de am­ plificación para la identificación del ácido nucleico de las borre­ lias, pero estos procedimientos no están al alcance de todos los laboratorios.248 Enfermedad de Lyme

En 1977, Steere y cois., de la Universidad de Yale, informa­ ron que había ocurrido una epidemia de artritis en los residen­ tes de varias comunidades de Connecticut circundantes, desde por lo menos 1972.278 La alarma fue dada por dos madres aten­ tas. En 1975 una madre de Oíd Lyme, Connecticut, informó al Departamento de Salud Estatal sobre 12 casos de artritis en niños ocurridos en su pequeña comunidad de 5 000 personas. Una segunda mujer concurrió a la División de Reumatología de la Universidad de Yale con una historia de artritis aguda en ella, su marido, dos hijos y varios vecinos. La enfermedad se había diagnosticado en todos los niños como artritis reumatoide juve­ nil, diagnóstico clínico que depende de la exclusión de causas conocidas de artritis. Los investigadores de Yale creyeron que estaban tratando con una nueva enfermedad que denominaron artritis de Lyme. Steere y cois, encontraron que la artritis casi siempre era pre­ cedida por una erupción cutánea muy característica, una pápu­

Borrelia

la eritematosa que evolucionaba a una lesión anular de exten­ sión rápida. Muchos de los médicos que examinaron las lesio­ nes cutáneas creyeron que una picadura de insecto había empe­ zado el proceso, pero se reconoció un artrópodo (en ese caso una garrapata) en sólo un paciente. La naturaleza de la lesión primaria y la ocurrencia de casos en el verano y principios del otoño hicieron pensar en un artrópodo vector. En el trabajo publicado inicial los autores hacen notar el parecido de la erup­ ción cutánea con una lesión llamada eritema crónico migrato­ rio que se había descrito en Europa, sobre todo en los países escandinavos. Las dos madres no imaginaron las grandes olas que produci­ ría la piedra que arrojaron en su pequeña piscina de Connecticut. En lugar de descubrir una nueva enfermedad, habían hecho iniciar una investigación que descubriría la causa de una enfermedad de siglos de antigüedad de alcance mundial. La larga historia de las investigaciones europeas se resume en el recuadro 20-1.273 La enfermedad de Lyme se ha revisado por completo en los últimos años.256,274 Los sitios web pertinentes han sido resumidos por Sood.264 En 1982, sólo 5 años después de la descripción original de la artritis de Lyme, Burgdorfer y cois, determinaron su etiología al aislar una espiroqueta en la garrapata vector implicada, con lo que demostraron que las espiroquetas causaban las lesiones cutáneas en los conejos y que el suero de los pacientes con artritis de Lyme contenía anticuerpos contra la espiroqueta.37 El año siguiente, Steere y cois, concluyeron el problema al aislar una espiroqueta en sangre, lesiones cutáneas o LCR de pacien­ tes infectados, así como en garrapatas.276 Poco después se ais­ laron espiroquetas en las lesiones del eritema crónico migrato­ rio y el síndrome de Bannwarth en Europa.7,214 La espiroqueta recientemente aislada está relacionada con otras especies de Borrelia,243 pero no presenta casi ninguna homología con las especies de Treponema y Leptospira.'21 Se ha denominado Borrelia burgdorferi en honor de Willy Burgdorfer que aisló el microorganismo por primera vez.127 B. burgdorferi es la más larga y delgada de las borrelias. Actualmente se reco­ nocen tres genoespecies como patógenos humanos definidos dentro del complejo de B. burgdorferi (B. burgdorferi sensu lato): B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii y B. afzelii. Se ha demostrado la existencia de un número creciente de otras espe­ cies. algunas aún sin denominación, dentro del complejo de B. burgdorferi sensu lato;213,298 la magnitud de su asociación con la enfermedad humana no está todavía aclarada. La evidencia de

Recuadro 20-1

1921-1923

1944

1948 1951

Investigaciones eu ro p eas sobre la enferm edad de Lym e

Afzelius en Suecia y Lipschiitz en Austria describen el eritema crónico migratorio. Más tarde, la lesión cutá­ nea atrófica crónica descrita por Herxheimer en 1902 se reconoció como parte del mismo proceso. Bannwarth describió una radiculitis crónica, a veces precedida por eritema, acompañada por meningitis linfocitaria crónica y neuritis craneana o periférica. Luego la enfermedad se asoció con las garrapatas. Lennhoff describió la presencia de espiroquetas en la lesión del eritema crónico migratorio. Hollstrom describió el tratamiento exitoso del eritema crónico migratorio con penicilina.

1087

relación con la enfermedad humana es más fuerte para B. bissettii sp. nov. y para B. valaisiana. Además, una enfermedad humana parecida a la enfermedad de Lyme se ha asociado con una espiroqueta no cultivable, denominada B. lonestari. que se encuentra en la garrapata “estrella solitaria” (lone sta r en inglés, A m blyom m a am ericanum ).'25 m Esta especie puede ser respon­ sable de muchos de los casos de enfermedad de Lyme encon­ trados en el sudeste de los Estados Unidos. Se ha determinado la secuencia genética completa de B. burgdorferi ,87 Contiene numerosos antígenos que pueden ser importantes para la patogenia y el diagnóstico, incluso nume­ rosas proteínas de superficie externa, las más importantes de las cuales son OspA y OspF, que se localizan sobre plásmidos, y una proteína flagelar de 41 kDa. B. burgdorferi sensu stricto tiene distribución mundial. Las otras dos especies patógenas se encuentran en Europa57 y Asia.189 B. garinii parece estar parti­ cularmente asociada con la neuroborreliosis, en tanto que B. afzelii se asocia con la artritis y las lesiones cutáneas cróni­ cas.60 Una significativa minoría de las garrapatas I. ricinus en Europa están infectadas con más de un miembro del complejo B. burgdorferi ,218 Las cepas encontradas en los Estados Unidos son relativamente homogéneas y cumplen la definición de B. burgdorferi sensu stricto. La homogeneidad inmunitaria de la mayoría de las cepas norteamericanas fue demostrada por el análisis de anticuerpos borrelicidas in vitro.158 Sin embargo, dentro de las cepas de B. burgdorferi sensu stricto, algunos investigadores han notado una variación mayor en las cepas de los Estados Unidos que en las de Europa.153 Un hallazgo poten­ cialmente importante para los estudios de homogeneidad gené­ tica es la demostración de una mayor variación de B. burgdor­ fe r i cuando se comparan productos de amplificación de las lesiones cutáneas con las espiroquetas aisladas en las mismas lesiones, lo que sugiere que las técnicas de cultivo actuales pueden seleccionar ciertos tipos genéticos.156 Las proteínas A y C de la superficie externa son muy impor­ tantes en la biología de la enfermedad de Lyme. OspA se expresa sobre todo en el intestino medio de las garrapatas, donde es responsable de la adherencia al epitelio.202 Después de que la garrapata ingiere la sangre, las espiroquetas migran a través del hemocele hasta las glándulas salivales. En el proce­ so, la expresión de OspA se regula negativamente y la cantidad de OspC producida aumenta en forma notable.217 Aunque se produce una respuesta inmunitaria mediada por células y humoral contra múltiples antígenos, la respuesta de anticuerpos temprana predominante está dirigida contra OspC. También parece que OspC es un determinante importante de la enfer­ medad clínica; ciertas variantes se asocian con la infección diseminada, otras con la enfermedad limitada o localizada y otras más sólo se encuentran en las garrapatas.252 Lin y cois.153 han sugerido que los aislamientos predominantes de B. burg­ dorferi sensu stricto encontrados en el sudeste de los Estados Unidos contienen variantes de OspC que no están asociadas con la enfermedad invasora, lo que tal vez explica, por lo menos en parte, la escasez relativa de casos bien documentados de enfermedad de Lyme clásica en esta región. El estudio retrospectivo de garrapatas lxodes ricinus conser­ vadas en museos húngaros y austríacos desde 1884 y 1888, res­ pectivamente, demostró la presencia de DNA de un miembro del complejo B. b u rgdorferi}12 Asimismo, las secuencias de OspA de B. burgdorferi fueron demostradas por técnicas mole­ culares en ratones de patas blancas capturados en Massachusetts en 1894.170 Por consiguiente, parece que los focos americano y europeo estuvieron presentes en forma inde­ pendiente durante por lo menos cien años.

1088

C A P ÍT U L O 2 0

Infecciones producidas por espiroquetas

EPIDEMIOLOGÍA

scapularis. El ciclo de B. burgdorferi'5' y de B abesia m icroti 269

La enfermedad de Lyme es la infección actual transmitida por artrópodos más frecuente en los Estados Unidos (fig. 20-4). De 1982 a 1989 hubo un aumento de 18 veces en los casos informados a los CDC. De 1986 a 1989 el número de casos se duplicó por año después de que la incidencia parecía haber alcanzado una meseta. Sin embargo, en 1994 se informaron 13 083 casos provenientes de 44 estados, un aumento del 58% con respecto a 1993 (fig. 20-4). Se han informado casos en casi todos los estados, pero se concentran en el nordeste, la región central norte y, en menor grado, en la Costa oeste (fig. 20-5). La infección se encuentra en todo el hemisferio norte, incluso en las repúblicas soviéticas.56 En los Estados Unidos, la distribución de la enfermedad de Lyme coincide con la de las garrapatas del género Ixodes. En las regiones del noreste277 y central del norte97 el vector suele ser 1. scapularis (véase lámina en color 20-IE), en tanto que 1. p acificus es la portadora de las espiroquetas en el noroeste.241 En Europa. I. ricinus es el vector más frecuente, en tanto que /. persulcatus es el huésped artrópodo principal en Asia. Estas especies comparten muchas características y también se cono­ cen como garrapatas de patas negras o del ciervo. Ha habido controversias acerca de la nomenclatura de las garrapatas de patas negras encontradas en el este de los Estados Unidos. La mayoría de los investigadores consideran en este momento que I. dam m ini es sinónimo de I. scapularis.200-261 Se ha informado una enfermedad clínica parecida a la artri­ tis de Lyme en Australia.89Ni el vector ni el agente infeccioso responsable se han identificado todavía, a pesar de las numero­ sas pruebas realizadas en garrapatas por cultivo y reacción en cadena de la polimerasa.232 La frecuencia de infección de las garrapatas en algunas zonas alcanza el 75% ,13 y el rango de carga de espiroquetas en garrapatas adultas capturadas en varias zonas endémicas varió de 950 a 4 350 espiroquetas por garrapata en un estudio.35 B abesia m icroti y E hrlichia de granulocitos humanos recien­ temente reconocida, A naplasm a (Ehrlichia) phagocytophila, también son transmitidas por la garrapata del ciervo del este y tienen una distribución geográfica que coincide con la de /.

en la naturaleza se mantiene por varios roedores pequeños, notablemente el ratón de patas blancas (Peromyscus leucopus) que mantiene una parasitemia o espiroquetemia asintomática. Otros mamíferos pequeños, como la rata de Noruega de la Isla de Monhegan en Maine, también pueden servir como reservorios.260 Los ciervos de cola blanca son importantes para la supervivencia de la garrapata. Aunque no intervienen de modo directo en la transmisión de la infección, la reducción de las poblaciones de ciervos disminuye el número de garrapatas vec­ toras, después de lo cual la incidencia de la infección disminu­ ye.55 No es sorprendente que se haya demostrado la infección con diversas combinaciones de Babesia microti, A. phag o cy­ tophila y B. burgdorferi en un mismo paciente.180 Aunque al hablar de garrapatas, ratones y ciervos se evocan imágenes campestres, o por lo menos de los suburbios, se han encontra­ do todos los componentes necesarios, incluso los agentes infec­ ciosos, en el Van Cortlandt Park de la ciudad de Nueva York.54 La importancia de los factores medioambientales para el desarrollo de la enfermedad humana es ilustrada por la varia­ ción geográfica en la frecuencia de la enfermedad de Lyme clí­ nica. Lo más notable es que existe un ciclo enzoótico de infec­ ción por B. burgdorferi entre la garrapata I. spinipalpus y la rata arborícola del norte de Colorado, una zona en la que no se ha registrado la enfermedad de Lyme.174 La falta de contacto entre los seres humanos y esta especie de garrapatas parece la explicación más probable de la ausencia de infección humana. Aunque la enfermedad clínica se encuentra en el noroeste del Pacífico, donde el vector es I. pacificus, es mucho menos fre­ cuente que en los estados centrales del norte y el noreste. Una posible explicación es cuál es el huésped animal pertinente. En los estados del centro y del este, el ratón de patas blancas per­ mite una gran proliferación de espiroquetas y proporciona abundante material para un nuevo estadio de garrapatas ham­ brientas. En los estados del Pacífico, en cambio, las garrapatas se alimentan con sangre de lagartos, en los que las borrelias se multiplican poco, lo que limita la intensidad de la infección en las poblaciones de garrapatas.34,171 Un producto químico borrelicida no identificado que producen los lagartos puede ser la

Figura 20-4 Número casos de enfermedad de Lyme informados por año en los Estados Unidos, 1982-2000. (Adaptado de la referencia5).

B orrelia

1089

Zonas según el riesgo de transm isión de la enfermedad de Lyme R iesgo alto R iesgo m oderado Riesgo bajo R iesgo m ínim o o inexistente

Figura 20-5 Representación geográfica del riesgo de contraer enfermedad de Lyme en los Estados Unidos, compilado por los CDC. http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/lyme/riskmap.htm

explicación biológica de este fenómeno. Se ha visto que I. scapularis en los estados del sudeste también se alimentan prefe­ rentemente con sangre de lagartos, en lugar de ratones, lo que quizá contribuye a la poca frecuencia de enfermedad de Lyme clásica en esta región. El ciclo vital de las garrapatas ixodídeas comprende tres estadios bien definidos, con una vida de 2 años de duración. Las garrapatas se alimentan a fines del verano como larvas y el año siguiente como ninfas (principio de la primavera) y adultos (fin del verano). Es necesario que ingieran sangre para la muda de larva a ninfa y de ninfa a adulto, así como para la postura de huevos en la hembra adulta. Los estadios de larva y ninfa son tan pequeños que muchos pacientes no recuerdan haber sido picados. Sin embargo, para poder transmitir la infección, una garrapata tiene que haberse alimentado con la sangre de un roe­ dor infectado. B. burgdorferi no se transmite verticalmente de los padres a la descendencia, por lo que los estadios larvales de las garrapatas nunca están infectados y no pueden transmi­ tir la infección. El estadio de la garrapata más eficaz para la transmisión es la ninfa, que es prevalente durante el fin de la primavera y principios del verano, cuando se registra la mayo­ ría de los casos de enfermedad humana. Una de las razones que explica la eficacia de la transmisión de las ninfas es sin duda su tamaño pequeño, que les permite pasar inadvertidas durante más tiempo que las garrapatas adultas. El macho adulto tiene el potencial para transmitir la infección, pero rara vez se alimen­ ta con sangre humana, porque no necesita ingerir sangre como la hembra adulta antes de poner sus huevos. Según datos experimentales, las garrapatas deben permane­ cer prendidas durante por lo menos 24 horas para transmitir las espiroquetas con eficacia.207 Durante las primeras 12 horas des­ pués de la picadura, el cuerpo de la garrapata permanece plano.

Tras alimentarse durante 24 horas, cuando alrededor del 5% de las garrapatas infectadas transmiten espiroquetas, el cuerpo posterior de la ninfa empieza a expandirse. Después de 48 horas de alimentarse, la parte posterior del cuerpo se dilata por completo y parece opalescente; en este momento, cerca del 50% de las garrapatas infectadas transmiten Borrelia. Después de 4 días de alimentarse, casi todas las garrapatas infectadas transmitirán espiroquetas, momento en el que las garrapatas están opacas y tan hinchadas que el cuerpo es tan grueso como ancho.173 Los intentos para cultivar espiroquetas de la piel inmediatamente después de desprender una garrapata infecta­ da, realizados en una zona hiperendémica, tuvo éxito en sólo 2 de 48 pacientes en los que la garrapata había estado prendida durante unas 24 horas.25 La valoración del grado de ingurgitación de una garrapata es siempre subjetiva. Se ha propuesto un método para hacer más objetiva esta determinación, denominado “índice del escudo” (véase cap. 22).74,197,265 Este índice se basa en que el cuerpo de una ninfa o una hembra adulta se hinchará a medida que ingie­ re sangre, pero el escudo rígido no se modificará. Por consi­ guiente, la relación de tamaños entre el escudo y el cuerpo es una indicación aproximada del grado de ingurgitación. El requisito de que debe haber una alimentación prolongada para que ocurra la transmisión se debe a varios factores: las espiro­ quetas deben pasar del intestino medio al hemocele, de allí a las glándulas salivales y regular en forma negativa la produc­ ción de OspA y en forma positiva, la producción de OspC. Estudios epidemiológicos cuidadosos realizados en varias zonas endémicas han demostrado la magnitud del problema. En Fire Island, Nueva York, el 0,7-1,2% de los residentes vera­ niegos sufrieron enfermedad sintomática.107 Cuatro (3,1%) de 129 personas estudiadas serológicamente al principio y el fin

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C A P ÍT U L O 2 0

Infecciones producidas por espiroquetas

del verano produjeron anticuerpos, pero sólo 2 de ellas tenían síntomas. En Great Island, Massachusetts, la enfermedad de Lyme se desarrolló en alrededor del 3% de la población todos los años y afectó al 16% de la población durante el período de 4 años del estudio.282 Históricamente, el primer caso ocurrió en 1962. La tasa de enfermedad clínica:subclínica se calculó en 1:1. La prevención es la mejor manera de proceder con cualquier enfermedad. La prevención de la exposición a los artrópodos vectores es el modo lógico de evitar una infección transmitida por garrapatas.209 La recomendación de evitar las zonas arbola­ das es lógica, pero tal vez ineficaz, porque la mayoría de las per­ sonas contraen la infección en el jardín de su casa. Las medidas que indica el sentido común, como usar camisas de manga larga, pantalones largos y repelentes de insectos, son razonables (http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/lyme/prevent.htm), pero no han resultado eficaces en estudios controlados. Se recomienda la extracción inmediata de las garrapatas prendidas con pinzas de punta fina; deben asirse con firmeza tan cerca de la piel del huésped como sea posible y se extraen con cuidado e intactas, pero si el aparato bucal queda prendido no es tan grave porque las espiroquetas están en la glándula salival. No se recomienda el uso de un fósforo caliente, esmalte de uñas, vaselina u otros instrumentos de agresión. Después de extraer la garrapata, se limpia la zona con un antiséptico (http://www.cdc.gov/ncidod/ dvbid/lyme/prevent.htm). El paso lógico siguiente para la prevención era una vacuna. Se eligió OspA como antígeno inmunizante, porque los anti­ cuerpos borrelicidas que se producirían podrían matar las espi­ roquetas en la glándula salival de la garrapata o en el sitio de la picadura antes de que se diseminara la infección. Dos estudios controlados demostraron una eficacia del 49-68% en el primer año después de dos dosis de vacuna. Al segundo año, después de una tercera inyección, la eficacia fue del 76-92%.258-280 Lamentablemente, se hizo evidente que era necesaria una inyección de refuerzo a intervalos regulares para mantener la eficacia. Un panel de revisión nacional recomendó limitar el uso de la vacuna a los individuos de entre 15 y 70 años que estuvieran expuestos en zonas de riesgo alto o moderado durante períodos considerables.3 Aunque los efectos secunda­ rios de la vacuna parecían mínimos en los informes originales, comenzaron a acumularse informes anecdóticos de varios pro­ blemas y la preocupación creció. El fabricante anunció en febrero de 2002 que suspendería la fabricación de la vacuna. Quizá sea un reflejo de nuestra sociedad el hecho de que una búsqueda en Internet de referencias sobre la vacuna para la enfermedad de Lyme conduzca predominantemente a sitios webs de abogados especializados en lesiones personales. La profilaxis con antibióticos después de una picadura de garrapata sigue siendo motivo de controversias. Magid y cois., que intentaron cuantificar el análisis, recomendaron que los pacientes no se traten si el riesgo de desarrollar enfermedad de Lyme es de menos de 0,01.162 Los factores como el contacto prolongado con una garrapata en proceso de alimentación en una región endémica aumentarían la probabilidad de transmi­ sión. Si se cuenta con la garrapata para el examen y no es una especie de Ixodes, o si la enfermedad de Lyme no es endémica en la zona, está claro que la profilaxis no está indicada. La detección de B. burgdorferi por culivo o por métodos molecu­ lares proporciona un posible método para tomar una decisión racional sobre la profilaxis. Sin embargo, pueden plantearse argumentos de peso contra este curso de acción. La evaluación de la garrapata en forma lo suficientemente rápida como para permitir tomar una decisión clínica sobre el tratamiento es difí­ cil en la mayoría de las zonas. Si la garrapata no contiene

borrelias, no hay ninguna seguridad de que otra garrapata que pasó inadvertida no estuviera infectada. Una garrapata infecta­ da con espiroquetas puede no haber transmitido la enfermedad, como ya se explicó. En un estudio de contacto con garrapatas, Sood y cois.265 encontraron que la duración del contacto y el grado de ingurgitación medido por el índice del escudo eran factores de predicción de la probabilidad de transmisión de B. burgdorferi, pero la evaluación por PCR de la garrapata no pre­ dijo la transmisión. Des Vignes y cois, investigaron la transmisión de B. burg­ dorferi en garrapatas infectadas extraídas de pacientes en una zona endémica.58 Las garrapatas extraídas se alimentaron en ratones que luego fueron evaluados para ver si estaban infecta­ dos. Se calculó una tasa de transmisión global del 4,6% de estas garrapatas infectadas. La demostración de que una sola dosis de doxaciclina, admi­ nistrada dentro de las 72 horas posteriores a la picadura de I. scapularis, es tan eficaz como los tratamientos más largos con antibióticos para evitar el desarrollo de la enfermedad de Lyme proporcionó un nuevo ímpetu a la prevención rutinaria después de sufrir picaduras de garrapata en las zonas endémicas.188 La eficacia del tratamiento comparado con un placebo fue del 87%. Por otro lado, los efectos secundarios, aunque leves, fue­ ron más frecuentes en los pacientes que recibieron una sola dosis de doxaciclina que en los que recibieron el placebo, de tal forma que la profilaxis sigue siendo una cuestión de aprecia­ ción personal.255 ENFERMEDAD CLÍNICA

Las manifestaciones clínicas de la infección con B. burgdor­ fe r i son proteiformes. Esta espiroqueta ha sido denominada el “último gran imitador”, 272 después de su pariente T. pallidum . Como sucede en el caso de la sífilis, las manifestaciones de la enfermedad de Lyme pueden catalogarse en tres estadios, que se describen a continuación. El estadio uno es en el que la picadura de la garrapata pro­ duce la lesión clásica, el eritema (crónico) migratorio. La lesión cutánea eritematosa expansiva se presenta en localiza­ ciones anatómicas múltiples y con extensión variable.24 En Nueva Jersey, el eritema migratorio se observó en el 93% de los pacientes y alrededor de la mitad tenían síntomas sistémicos, incluso linfadenopatías.31 Asimismo, el 90% de los niños infec­ tados en Connecticut tenían la erupción cutánea.95 Se ha desta­ cado la presencia de edema periférico con curación central de la lesión, pero el enrojecimiento homogéneo o central fue más característico en una serie grande de casos microbiológicamente confirmados.261 La curación central fue más frecuente en pacientes eslovenos infectados por B. afzelii que en neoyorqui­ nos infectados por B. burgdorferi sensu stricto.284 La espiro­ queta se cultiva con mayor facilidad en este estadio de la infec­ ción y puede visualizarse en hasta el 40% de las muestras de biopsia por técnicas de impregnación argéntica. El segundo estadio de la enfermedad de Lyme es el resulta­ do de la diseminación de las espiroquetas por todo el organis­ mo.275 La reacción en cadena de la polimerasa fue alrededor de tres veces más sensible para detectar espiroquetemia que el cul­ tivo. Se demostró la presencia de DNA de Borrelia en el suero de 14 de 76 pacientes (18,4%) con eritema migratorio. La can­ tidad de síntomas clínicos fue el factor de predicción indepen­ diente más preciso de espiroquetemia.99 Parece que la espiro­ quetemia es de bajo nivel e intermitente.297 El examen del LCR de pacientes con eritema migratorio crónico mostró DNA de B orrelia en 8 de 12 pacientes, 4 de los cuales no tenían ningu­

Borrelia

na anomalía neurológica ni síntomas. Se demostró la presencia de DNA de espiroquetas en el LCR extraído de 4 de 9 pacien­ tes con síntomas neurológicos.159 Las lesiones más frecuentes fueron la artritis aguda279 y la meningitis.201 Bowen y cois.31 encontraron artritis en el 26% de sus pacientes, meningitis en el 10% y parálisis de pares craneales en el 8%. La meningitis puede ser purulenta.30 Puede haber lesiones cutáneas secunda­ rias, infección ocular, hepatitis y daño del miocardio. La tercera fase, crónica, de la enfermedad se caracteriza por las lesiones cutáneas y los síntomas neurológicos y artritis cró­ nicos. Los episodios recurrentes de artritis disminuyen en fre­ cuencia y gravedad cada año, pero algunos pacientes tienen sinovitis crónica e invalidez permanente. Como sucede en la sífilis, B. burgdorferi puede transmitirse de la madre al feto,240,301 pero todavía no se conocen todos los efectos de la infección congénita. Se ha demostrado experi­ mentalmente que las espiroquetas sobreviven hasta 45 días en eritrocitos almacenados, por lo que la transmisión por transfu­ siones sanguíneas es posible.17 Sin embargo, hasta ahora ese riesgo sigue siendo teórico. No se encontró ningún caso de enfermedad de Lyme asociada con transfusiones en 149 pacientes que recibieron más de 600 unidades de sangre en una zona endémica para la enfermedad de Lyme. Un paciente con­ trajo babesiosis, lo que representa un riesgo del 0,17%.96 Las manifestaciones de la enfermedad de Lyme en Europa son similares a las de los Estados Unidos, pero la artritis puede ser algo menos frecuente y la meningitis crónica algo más fre­ cuente, debido quizás a la presencia de la especie neurotrópica, B. garinii, en Europa. A la inversa, la diseminación amplia de la infección parece ser más frecuente en los Estados Unidos que en Europa. Como ya se explicó, se han notado diferencias clínicas entre los pacientes infectados en Nueva York por B. burgdorferi sensu stricto y los pacientes eslovacos infectados por B. afzelii. El tratamiento antimicrobiano inmediato en los estadios ini­ ciales de la enfermedad de Lyme es casi siempre eficaz para controlar los síntomas y evitar la progresión de la enfermedad. La Infectious Diseases Society of America ha publicado pautas de práctica.304 No se sabe con tanta certeza si el tratamiento antimicrobiano es útil en los estadios más tardíos de la enfer­ medad.137 Aunque en apariencia son raros, hay ejemplos bien compro­ bados de reinfección con una nueva cepa de B. burgdorferi (determinada por análisis molecular de aislamientos secuenciales) en pacientes que han sido tratados por un eritema migrato­ rio.195 No está aclarado si las reinfecciones ocurren después de una enfermedad natural no tratada. Aparentemente, los animales silvestres no tienen infección sintomática, pero los animales domésticos pueden sufrir la enfermedad. Komblatt y cois, describieron la artritis de Lyme en perros.140 Duray detalló la anatomía patológica quirúrgica de la enfermedad de Lyme.65

exposición, varíe entre 0,2 y 0,8. Por supuesto, el problema reside en la dificultad de calcular la probabilidad previa a las pruebas en un paciente determinado. Los síntomas indefinidos, como la fatiga o las artralgias, no son razones suficientes en sí mismas para comenzar las pruebas. La eficacia comparativa de varias técnicas de laboratorio para el diagnóstico de 47 pacien­ tes con eritema se resume en el recuadro 20-2. El diagnóstico de laboratorio de la enfermedad de Lyme ha sido revisado por Reed.219 Aunque la lesión del eritema migratorio no es patognomónica, se observa en un porcentaje muy alto de infecciones agudas y se encuentra en algunas otras enfermedades. Por consiguien­ te, la enfermedad de Lyme puede diagnosticarse con confianza si esta lesión está presente y tal vez no es necesario efectuar pruebas adicionales. Incluso después de más de dos décadas de experiencia, el uso inadecuado de pruebas de diagnóstico y el tratamiento antimicrobiano innecesario siguen causando pro­ blemas.83'186,215 Cultivo. B. burgdorferi se ha aislado en medios acelulares (véa­ se cuadro 20-3). El proceso es bastante fácil cuando se trituran y cultivan garrapatas infectadas (véase lámina en color 20-IE). El subcultivo de caldo en agar produce la formación de colo­ nias de espiroquetas de morfología variable.142 El medio de elección es una modificación del medio de Kelly para espiro­ quetas, creado por Barbour (recuadro 20-3). Se han sugerido modificaciones a ese medio.210 El cultivo es muy eficaz en la enfermedad de Lyme tempra­ na y rara vez positivo en los estadios más tardíos. Sin embargo, incluso en el estadio primario sólo se aislaron espiroquetas en las lesiones cutáneas en el 51% y en sangre en el 45% de 47 pacientes adultos con diagnóstico clínico de enfermedad de Lyme.194 El rendimiento del cultivo parece ser mayor cuando las lesiones son grandes y múltiples, como en la fase secunda­ ria diseminada de la enfermedad.181 Debe cultivarse sangre citratada. Los tubos se incuban a una temperatura de entre 34 °C y 37 °C en la oscuridad. Se examinan en microscopio de campo oscuro después de una incubación de 2 a 3 semanas. La identidad de cualquier microorganismo espiralado detectado debe confirmarse por inmunofluorescencia con reactivos espe­ cíficos. Detección morfológica. La visualización de espiroquetas en los tejidos por métodos morfológicos también carece de sensibili­ dad en la mayoría de las muestras y estadios de la enfermedad. Puede usarse cualquiera de los métodos de impregnación

Recuadro 20-2

Investigación d e labo ratorio de 47 pacien­ tes adultos con eritem a m igratorio

Procedimiento de laboratorio PCR cuantitativa de biopsia cutánea

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

La enfermedad de Lyme puede diagnosticarse por cultivo de las espiroquetas, por demostración de la presencia de espiro­ quetas en los tejidos mediante técnicas inmunológicas o mole­ culares, o por la detección de una respuesta serológica. Las recomendaciones sobre métodos de diagnóstico que proporcio­ nó un grupo de consenso 19971-292 no han cambiado de manera apreciable. Se recomienda efectuar las pruebas sólo cuando la probabilidad de enfermedad de Lyme antes de hacer las prue­ bas, de acuerdo con los síntomas clínicos y antecedentes de

1091

Pruebas serológicas en dos etapas de muestras de suero de convaleciente

Rendimiento diagnóstico (%) 80,9 6 6

PCR “anidada” (nested) convencional

63,8

Cultivo de piel

51,1

Hemocultivo

44,7

Pruebas serológicas en muestras agudas

40,4

Adaptado de la referencia194.

1092

C A P ÍT U L O 2 0

Recuadro 20-3

Infecciones producidas por espiroquetas

M edio de B arb our-S toenner-K elly para el cultivo de B orrelia bu rg d o rferi (m edio B SK II)

1. Lavar todo el material de vidrio con detergente, enjuagar cuidadosa­ mente con agua destilada en vidrio y esterilizar en autoclave. 2. A 900 mL de agua destilada en vidrio agregar 100 mL de concentrado lOx del medio CMRL 1066 sin glutamina. 3. Agregar al medio CMRL 1066 en el orden siguiente: 5 g de neopeptona (Difeo Laboratories, Detroit MI) 60 g de albúmina sérica bovina, fracción V (Miles Laboratories, Elkhart IN N° 81-003) 2 g de Yeastolate (Difeo) 6 g de ácido Af-2-hidroxietilpiperazina-A,-2-etanesulfónico (HEPES; Sigma Chemical Co., St. Louis MO) 5 g de glucosa 0,7 g de citrato de sodio 0 , 8 g de piruvato de sodio 0.4 g de /V-acetilglucosamina (Sigma) 2,2 g de bicarbonato de sodio 4. Ajustar el pH del medio, a 20 a 25 °C, a 7,6 con NaOH 1 N. 5. Agregar 200 mL de gelatina al 7% (Difeo) disuelta previamente en agua hirviendo. 6 . Esterilizar por filtración con presión de aire (filtros de nitrocelulosa de 0.2 fm, Millipore Corp.. Bedford MA). Almacenar el medio a 4 °C. 7. Antes de usar, agregar suero de conejo no calentado ("con trazas de hemolisis”. Pel-Freez Biologicals, Inc.. Rogers AR) hasta una concen­ tración final del 6%. 8 . Fraccionar en tubos o frascos de vidrio o poliestireno. Llenar los reci­ pientes hasta el 50 a 90% de su capacidad y cerrarlos herméticamente.

De la referencia20.

argéntica para la demostración de espiroquetas en los tejidos (Warthin-Starry, Steiner, Dieterle) para teñir los microorganis­ mos, pero la identificación específica debe confirmarse con antisueros, porque las tinciones argénticas detectan cualquier tipo de bacteria. Defección molecular. Las técnicas de amplificación han demos­ trado tener mayor sensibilidad que el cultivo o la detección morfológica en las lesiones cutáneas de eritema migratorio,157 en sangre periférica y en líquido articular.206 Los resultados de la detección molecular en LCR y orina han sido desalentado­ res.62 La sensibilidad de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es menor en LCR que en orina de los pacientes con enfermedad neurológica sintomática.147 Bergmann y cois, han formulado recomendaciones para aumentar el rendimiento de la PCR en orina.26 Las pruebas de PCR en tiempo real han sido validadas en diversos materiales clínicos.106-247 Schmidt efectuó una revisión extensa de los métodos de amplificación molecular para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme.244 Las técnicas moleculares tienen cierta importancia para demostrar una infección aguda o para resolver casos difí­ ciles, pero las pruebas de amplificación completamente valida­ das no están disponibles en la mayoría de los laboratorios. Las pruebas de amplificación tienden a tener resultados falsos posi­ tivos por la contaminación cruzada o por la presencia de secuencias de ácido nucleico compartidas con otros microorga­ nismos. Se ha registrado una PCR positiva falsa para B. burgdorferi en un laboratorio privado.183 Las pruebas de amplifica­ ción no tienen valor agregado significativo para el diagnóstico

de enfermedad de Lyme temprana, pero pueden ser de gran ayuda en los estadios más tardíos de la infección, sobre todo para el diagnóstico de neuroborreliosis. La detección de DNA de B orrelia en LCR puede ser muy útil, debido a la dificul­ tad de interpretación de los anticuerpos presentes en el sistema nervioso central. Sin embargo, la especificidad de las pruebas moleculares puede aumentarse evaluando primero si el pacien­ te posee anticuerpos IgG, que deben estar casi siempre presen­ tes en el suero en ese estadio de la infección. Se ha creado un equipo comercial para la detección de antí­ geno de la espiroqueta en la orina, pero ha recibido serias crí­ ticas.138 Detección serológica. El método de elección de diagnóstico pre­ determinado es el análisis serológico. Los CDC recomiendan un procedimiento de dos pasos para el diagnóstico. Debe usar­ se como prueba inicial un enzimoinmunoanálisis o una prueba de inmunofluorescencia con sensibilidad alta. Los sueros nega­ tivos no necesitan estudiarse más, pero debe obtenerse suero durante la convalecencia si está clínicamente indicado. Los resultados positivos deben confirmarse con electroinmunotransferencia de IgM e Ig G 46 Las pruebas de inmunofluorescencia y los enzimoinmunoa­ nálisis son los usados con mayor frecuencia. Se ha recomenda­ do la inmunofluorescencia indirecta,165 el inmunoanálisis de fluorescencia cuantitativo204 y un fluoroinmunoanálisis,111 pero muchos investigadores encontraron que el enzimoinmunoaná­ lisis es más satisfactorio.52’231 Los anticuerpos pueden estar ausentes al principio de la infección, pero casi siempre se detectan después de varias semanas. La respuesta contra OspA tiende a ser tardía, pero puede detectarse en títulos bajos o complejado a espiroquetas al comienzo de la infección si se usan técnicas especiales.246 La respuesta a la proteína OspC o al antígeno menos específico de la flagelina es más frecuente en sueros tempranos.164 Para obtener la sensibilidad máxima en la enfermedad de Lyme temprana, se ha recomendado el uso de un ensayo de IgM, ya sea por inmunofluorescencia179 o técni­ cas de inmunoelectrotransferencia.9 Los títulos de IgM especí­ fica pueden permanecer elevados durante toda la enfermedad e incluso años después del tratamiento, por lo que la presencia de IgM no puede usarse para establecer una infección aguda.130 Se ha recomendado la obtención de una segunda muestra 8 a 14 días después de la primera, para demostrar la seroconversión en la enfermedad de Lyme temprana. Si sólo se detecta IgM un mes o más después de la infección, es probable que el resulta­ do de la IgM sea falso positivo. Para el diagnóstico de neuroborreliosis se ha usado el exa­ men de líquido cefalorraquídeo en busca de anticuerpos produ­ cidos intratecalmente. La presencia de títulos más altos de anti­ cuerpos en LCR que en sangre periférica demuestra en teoría la infección del sistema nervioso.307 En vista de las numerosas dificultades con el análisis serológico en sangre periférica, estos enfoques deben reservarse para laboratorios de referencia experimentados que hayan demostrado la eficacia de las prue­ bas que realizan. La mayoría de los ensayos disponibles en este momento usan espiroquetas enteras sonicadas y los reactivos no están estandarizados. Como resultado, hubo problemas serios de reproducibilidad y exactitud, lo que aumenta las dificultades del diagnóstico clínico. En un programa de control de calidad, el 21% de los participantes pasaron por alto la presencia de anticuerpos en títulos de 512 o m ás.18 Con concentraciones más bajas de anticuerpos, el 55% de los participantes no pudieron reconocer el suero como positivo. A la inversa, la tasa de falsos positivos alcanzó el 7% con un conjugado polivalente y llegó al

Borrelia

27% con un conjugado de IgG. La reproducibilidad de los resultados cuando el mismo suero se envió como suero pro­ blema en diferentes momentos también fue deficiente. El hecho de que estos problemas de rendimiento de las pruebas existe en el mundo real fue puesto en evidencia por el informe de un centro de referencia para la enfermedad de Lyme: el 45% de los pacientes que habían sido enviados con un diag­ nóstico incorrecto de enfermedad de Lyme habían tenido prue­ bas serológicas positivas para B. burgdorferi que no pudieron confirmarse en el laboratorio de referencia.281 Además, en cierto laboratorio pudo confirmarse por electroinmunotransferencia sólo el 16,3% de los resultados positivos obtenidos con un enzimoinmunoanálisis.53 Los autores sostienen que la falta de sensibilidad de la electroinmunotransferencia no explica los resultados, porque se detectaron más casos de eritema migratorio con la electroinmunotransferencia que con el enzi­ moinmunoanálisis. Nuestros colegas clínicos tampoco han tenido éxito en el manejo de esta enfermedad enigmática. En una clínica univer­ sitaria para enfermedad de Lyme, en el 38% de los niños se hizo un diagnóstico positivo equivocado y en el 8% se pasó por alto el diagnóstico.76 La cuarta parte de los pacientes que ha­ bían sido diagnosticados correctamente fueron tratados des­ pués de manera incorrecta. En un estudio de pruebas de diag­ nóstico efectuado en un sistema prepago de atención sanitaria de California, sólo el 19% de las pruebas de laboratorio se pidieron porque el médico sospechaba enfermedad de Lyme.152 El 60% de estas pruebas se solicitaron como parte de un con­ junto de pruebas para pacientes con síntomas poco precisos. En una zona en la que la enfermedad de Lyme es rara, esta forma indiscriminada de pedidos conspira aún más contra pruebas serológicas que ya tienen problemas más que sufi­ cientes por sí mismas. Se han encontrado reacciones cruzadas con diversos agentes infecciosos en el suero de pacientes en los que se sospecha enfermedad de Lyme. El suero de pacientes con otras infeccio­ nes causadas por borrelias,163 infecciones treponémicas,23-119,216 HIV, virus de Epstein-Barr e infecciones producidas por rickett­ sias puede reaccionar en las pruebas para B. burgdorferi. Los informes sobre reacciones cruzadas con sueros antileptospira son contradictorios. Aunque se desarrollan reacciones cruzadas con antígenos treponémicos específicos, la prueba de VDRL no es positiva en los pacientes con enfermedad de Lyme. Se ha informado en varias oportunidades que las reacciones inespecíficas se concentran en la clase IgG2 de anticuerpos.254 Como pasa a menudo, la interpretación de los resultados serológicos es más sencilla cuando menos se necesita, es decir, cuando se encuentra la erupción cutánea del eritema migrato­ rio crónico clásica. Cuando la presentación es atípica, el diag­ nóstico suele ser serológico y la posibilidad de obtener resulta­ dos engañosos aumenta, con graves consecuencias. Steere273 señaló que la evidencia serológica de infección puede ser correcta, pero que la enfermedad de Lyme puede ser subclínica y los problemas del paciente pueden estar causados por otro agente. Kaell y cois, describieron cuatro pacientes provenientes de una zona endémica para la enfermedad de Lyme, que tenían una enfermedad multisistémica confusa que se atribuyó al prin­ cipio a B. burgdorferi.129 Los cuatro pacientes tenían anticuer­ pos contra la espiroqueta y en tres de ellos los resultados eran positivos en las pruebas de Western blot; sin embargo, el estu­ dio posterior reveló que la causa de la enfermedad en los cua­ tro casos era una endocarditis bacteriana subaguda. Más tarde, estos investigadores observaron un aumento de los anticuerpos

1093

contra B. burgdorferi en 13 de 30 pacientes (43%) con endo­ carditis no causada por espiroquetas.128 La especificidad de la serología para la enfermedad de Lyme en esta población fue sólo del 60%. Cuando se realizaron las pruebas de inmunoelectrotransferencia, sólo un paciente tenía un patrón de reacti­ vidad que sugería una exposición anterior a la espiroqueta. Los autores proponen la hipótesis de que las reacciones cruzadas con la bacteria infectante podrían ser responsables de la alta frecuencia de resultados inespecíficos. Los problemas serológicos se han focalizado en dos formas principales: el desarrollo de inm unoelectrotransferencia (Western blot) y una búsqueda de antígenos definidos, y por consiguiente reproducibles, que reaccionen con el suero de la mayoría de los pacientes infectados. El hallazgo de reacciones Western blot positivas en los pacientes con endocarditis bacteriana indica que la inmunoe­ lectrotransferencia no es una garantía de especificidad per se. Como sucede en la infección por el HIV, la inmunoelectro­ transferencia puede usarse para mejorar la especificidad de otras pruebas inmunológicas. Dressler y cois, propusieron cri­ terios para definir las inmunoelectrotransferencias positivas en un estudio retrospectivo.61 La mejor discriminación se obtuvo si se exigía la detección de dos de las ocho bandas más frecuen­ tes de IgM (18, 21, 28, 37, 41, 45, 58 y 93 kDa) para conside­ rar el resultado positivo en la enfermedad temprana y la detec­ ción de por lo menos 5 de las 10 bandas más frecuentes de IgG (18, 21, 28, 30, 39, 41, 45, 58, 66 y 93 kDa) para el diagnósti­ co después de las primeras semanas de infección. La aplicación de estos criterios a más de 300 pacientes en un estudio pros­ pectivo tuvo como resultado una sensibilidad del 32% y una especificidad de 100% para la prueba de IgM. La sensibilidad y la especificidad de la prueba de IgG fueron 83% y 95%. Engstrom y cois, han sugerido criterios algo diferentes.72 Sus criterios de positividad para las inmunoelectrotransferencias de IgM son el reconocimiento de por lo menos dos de las proteí­ nas siguientes: 24 kDa (OspC), 39 kDa y 41 kDa (flagelina). La sensibilidad de las inmunoelectrotransferencias de IgG e IgM en 55 pacientes con eritema migratorio demostrado fue 58,5% y 54,6% respectivamente, en el momento del diagnóstico, y 100% después de 8 a 12 días más. Ma y cois, han subrayado la importancia de los anticuerpos contra el antígeno de 39 kDa para hacer un diagnóstico específico.161 Los CDC y la Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors recomiendan actualmente los cri­ terios de IgM de Engstrom y los criterios de IgG de Dressler. Usando estos criterios, Aguero-Rosenfeld y cois.10 observaron inmunoelectrotransferencias de IgM positivas en el momento del estudio inicial en el 43% de un grupo de 46 pacientes con eritema migratorio positivo por cultivo y en el 84% de los pacientes de 8 a 14 días después. Aunque el 89% de los pacien­ tes formaron anticuerpos contra B. burgdorferi, las inmunoe­ lectrotransferencias de IgG fueron positivas, según los criterios recomendados, en sólo el 22% de los sueros tomados en la etapa de convalecencia. Después de un año, el 38% de las inmunoelectrotransferencias de IgM eran todavía positivas. Los anticuerpos IgM reactivos con los antígenos de 39, 58, 60, 66 y 93 kDa se vieron con mayor frecuencia durante el primer mes después del diagnóstico, y estos investigadores proponen que la presencia de estas bandas puede ser útil para sugerir una infección reciente en los pacientes de las zonas endémicas. Hilton y cois, sugieren que se agreguen dos antígenos a los criterios para positividad de IgG: los antígenos de 31 kDa (OspA) y de 34 kDa (OspB).113 De 136 pacientes evaluados para determinar la presencia de enfermedad de Lyme, 4 (8%)

1094

C A P ÍT U L O 2 0

Infecciones producidas por espiroquetas

sólo habrían sido considerados positivos si se incluían estos dos antígenos entre los criterios. Estos 4 pacientes tenían erite­ ma migratorio o artritis y vivían en zonas endémicas. Es obvio que los criterios para la interpretación de las inmunoelectrotransferencias todavía están en evolución. Sin duda, los criterios para considerar positivas las pruebas serológicas continuará perfeccionándose, pero la confirmación de un resultado indeterminado o cuestionable obtenido con un enzimoinmunoanálisis debe intentarse mediante una prueba de inmunoelectrotransferencia realizada en un laboratorio experi­ mentado. Sin embargo, Wormser y cois, han hecho notar que las propiedades confirmatorias de la inmunoelectrotransferen­ cia se ven reducidas porque los dos ensayos no son completa­ mente independientes.303 Los intentos para mejorar la especificidad del diagnóstico serológico también incluyen el desarrollo de antígenos recombinantes para los enzimoinmunoanálisis, sobre todo OspA,80 OspB y OspC.91 El reconocimiento de la diversidad antigénica entre cepas puede ser importante para obtener mayor sensibili­ dad en ciertas regiones.288 La vacuna contra la enfermedad de Lyme, que contiene la proteína de superficie externa OspA, ha planteado un nuevo problema. Si una prueba serológica detecta OspA, será imposi­ ble decir si un individuo inmunizado también ha tenido una infección. El suero de personas vacunadas puede causar reac­ ciones positivas en los enzimoinmunoanálisis, pero no produce un número suficiente de bandas en los Western blots como para dar resultados positivos.10 El desarrollo de enzimoinmunoaná­ lisis que no contengan OspA también debería ayudar a resolver este dilem a.182

diámetro y 6 a 12 ¡im de longitud. Son gramnegativos y sólo se tiñen débilmente con los colorantes de anilina. Para visualizar leptospiras sin tinción debe usarse microscopia de campo oscu­ ro (fig. 20-6). Se reconocen dos especies tradicionales de L eptospira : L. interrogans, que contiene todos los patógenos humanos, y la especie saprofita, L. biflexa. L. interrogans con­ tiene muchos serotipos diferentes que causan enfermedad en los seres humanos. Las serovariedades antigénicamente rela­ cionadas se reúnen en serogrupos a los fines de la clasificación. La cepa prototipo es L. interrogans serovariedad icterohaemorrhagiae,126 y la enfermedad clínica es la leptospirosis. Existen varias revisiones amplias, que aunque son antiguas, todavía reflejan el estado del conocimiento actual en muchos aspectos.68,77-109 110 Yasuda y cois, estudiaron el parentesco del DNA entre sero­ grupos y serovariedades de Leptospira.305 Por razones genéti­ cas, estos autores propusieron por lo menos cinco nuevas especies entre los patógenos humanos. El análisis de ácidos nucleicos no se correlaciona bien con la clasificación serológi­ ca. Una sola serovariedad puede encontrarse en varias especies. No es sorprendente que el número de genoespecies continúe ampliándose.149 Las genoespecies y los serogrupos correspon­ dientes reconocidos en la actualidad se presentan en detalle en el cuadro 20-6. Leptospirosis

Levett149 ha publicado una revisión excelente de todos los aspectos de la leptospirosis.

EPIDEMIOLOGÍA

Leptospira Los microorganismos del género Leptospira son bacilos móviles, helicoidales, aerobios estrictos, que miden 0,1 |im de

Figura 20-6 Examen en campo oscuro de un cultivo de Leptospira interrogans. La conformación en espiral, que no se ve con claridad, aparece como zonas brillantes y oscuras alternadas. El extremo superior muy brillante del microorganismo puede representar el extremo curvo que tienen muchas leptospiras. Es fácil, para los observadores inexpertos, confundir detritos celula­ res y artefactos con leptospiras en las muestras clínicas. lOOOx. (Microfotografía cortesía de David Miller, DVM, MS).

Las leptospiras tienen distribución mundial e infectan muchos tipos de animales domésticos y salvajes. Los seres humanos son huéspedes accidentales, “callejones sin salida”, porque no existe la transmisión del hombre a los animales o a otros seres humanos. Clásicamente las ratas se asocian con esta enfermedad, pero también pueden infectarse ovejas, vacas, perros y otros animales domésticos. En la naturaleza, los zorros, mapaches, mofetas, arpías y erizos son portadores de leptospiras. Existen asociaciones entre serovariedades (sv.) y las especies de animales, como L. interrogans sv. icterohaemorrhagiae y las ratas, o L. interrogans sv. canicola y los perros. Sin embargo, un determinado género de animales puede ser portador de varias serovariedades diferentes de Leptospira, y una determinada serovariedad puede asociarse con más de un huésped animal. En general, los huéspedes animales no son sintomáticos y no desarrollan anticuerpos, a pesar de la infec­ ción masiva. La leptospirosis se ha considerado siempre una enfermedad ocupacional. concentrada en las personas que trabajan en las cloacas, los sembradíos de arroz o de caña de azúcar y los mataderos. Sin embargo, en la década de 1970 en los Estados Unidos, sólo el 30% de las personas con infección informada a los CDC tenían exposición laboral. Había niños, amas de casa y jubilados o desempleados entre las personas infectadas. Se ha sugerido que la mayor cantidad de tiempo libre y las excursio­ nes más frecuentes al campo han aumentado la probabilidad de exposición casual. Se han informado casos de leptospirosis relacionados con la navegación en kayak.257 Las asociaciones con las actividades recreativas continúan en aumento. Se regis­ tró enfermedad epidémica durante un triatlón realizado en Illinois, donde se relacionó con una exposición brevísima al agua de un estanque.185 y entre un grupo que practicaba rafting

Leptospira

Cuadro 20-6

G en oesp ecies y serogru pos de L eptospira

GENOESPECIES L. interrogans

L noguchii

L. santarosai

L. meyeri L wolbachii* L. biflexa* L fainei L. borgpetersenii

L. kirschneri

L weilii

L. inadia

L parva* L. alexanderi

SEROGRUPO Icterohaemorrhagiae, Canicola, Pomona, Australis, Autumnalis, Pyrogenes, Grippotyphosa, Djasiman, Hebdomadis, Sejroe, Bataviae, Ranarum, Louisiana, Mini, Sarmin Panama, Autumnalis, Pyrogenes, Louisiana, Bataviae, Tarassovi, Australis, Shermani, Djasiman, Pomona Shermani, Hebdomadis, Tarassovi, Pyrogenes, Autumnalis, Bataviae, Mini, Grippotyphosa, Sejroe, Pomona, Javanica, Sarmin, Cynopteri Ranarum, Semaranga, Sejroe, Mini, Javanica Códice Semaranga, Andamana Hurstbridge Javanica. Ballum. Hebdomadis, Sejroe, Tarassovi, Mini, Celledoni, Pyrogenes, Bataviae, Australis, Autumnalis Grippotyphosa, Autumnalis, Cynopteri, Hebdomadis, Australis, Pomona, Djasiman, Canicola, Icterohaemorrhagiae, Bataviae Celledoni, Icterohaemorrhagiae, Sarmin, Javanica, Mini, Tarassovi, Hebdomadis, Pyrogenes, Manhao, Sejroe Lyme, Shermani, Icterohaemorrhagiae, Tarassovi, Manhao, Canicola, Panama, Javanica Tumeria Manhao, Hebdomadis, Javanica, Mini

* No hay ningún serogrupo patógeno asociado con esta especie hasta la fecha. Adaptado de la referencia'4

en Costa Rica.2 El episodio más célebre fue el registrado entre los participantes de una carrera Eco-Challenge realizada en Borneo, que experimentaron un “desafío ecológico” (eco-challenge, en inglés) mucho mayor del que suponían, ya que con­ trajeron leptospirosis aguda durante la carrera.4 La enfermedad se asoció con la navegación en kayak, la espeleología y la nata­ ción o la ingestión de agua en el río Segama. Los factores epidemiológicos asociados con la leptospirosis en Hawaii fueron la recolección de agua de lluvia para uso doméstico, el contacto con ganado bovino y su orina, o la manipulación de tejidos de animales.238 Feigin y cois, registra­ ron una pequeña epidemia en University City, Missouri, un suburbio de clase media alta de St. Louis.78 Estos autores pudieron aislar Leptospira interrogans sv. icterohaemorrhagiae en ratas y animales domésticos y en la tierra de los jardines de las casas. Algunos de los perros a partir de los cuales aislaron leptospiras habían sido inmunizados con vacunas contra Leptospira que se adquieren en el comercio. La enfermedad epidémica puede ocurrir a partir de una fuente común, como se encontró hace poco en un brote transmitido por agua en Italia.40 En esa epidemia se sugirió que el brote asociado con una fuen­ te del pueblo fue causado por un erizo atrapado en un depósito de agua. La pesquisa epidemiológica de un brote reciente en

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Illinois condujo hasta un estanque contaminado; se adelantó la hipótesis de que una época de sequía había aumentado el ries­ go de exposición a excretas de anim ales infectados.124 Leptospira tiene distribución mundial, por lo que la enferme­ dad importada debe considerarse en los viajeros.293

ENFERMEDAD CLÍNICA

La leptospirosis clásica es una enfermedad bifásica que con­ siste en una fase septicémica inicial y una fase inmunitaria secundaria. La gravedad varía desde la infección subclínica hasta la enfermedad sistémica mortal, conocida como enferme­ dad de Weil, por el primero que describió la fiebre icterohemorrágica en 1886. En los casos graves, las dos fases se confun­ den y no existe un intervalo asintomático. Los estudios serológicos realizados en trabajadores con ries­ go profesional han demostrado la presencia de anticuerpos, sin un episodio reconocido de leptospirosis, en el 5-16% de ellos. En una revisión clásica, se describió la enfermedad de Weil en el 5-10% de los casos de pacientes con una infección conocida por leptospiras. Sin embargo, más recientemente, la ictericia se observó en el 39% de los casos producidos en Hawaii entre 1974 y 1998. La inyección conjuntival se encontró en el 28% de los pacientes.131 La fase septicémica inicial de la enfermedad es de comienzo abrupto, precedido por fiebre alta, dolor intenso de cabeza, malestar general y dolores musculares. En forma característica, hay dolor de ojos, fotofobia e inyección conjuntival o incluso hemorragias. Debe subrayarse que no hay inflamación o ver­ dadera conjuntivitis visible. Los infiltrados pulmonares son relativamente frecuentes. La enfermedad es por lo general leve, pero la leptospirosis puede presentarse como un síndrome de dificultad respiratoria del adulto71169,196 y se describió hemorra­ gia pulmonar.251 Los pacientes pueden presentar erupción cutánea macular, maculopapular, urticariana o hemorrágica. Una erupción cutá­ nea pretibial característica acompañó una infección epidémica de L. interrogans sv. autumnalis, que se denominó fiebre de Fort Bragg. Esta erupción cutánea pretibial se ha visto asocia­ da con infecciones por otras serovariedades. Después de un intervalo asintomático de 1 a 3 días, comien­ za la fase inmunitaria de la infección. Se han informado reac­ ciones de Jarisch-Herxheimer después del tratamiento tempra­ no. Las leptospiras se eliminan con rapidez de la sangre y del LCR. y comienza un proceso inflamatorio. El 90% de los pacientes presentan pleocitosis del LCR durante la segunda semana de la enfermedad, pero sólo la mitad de ellos tienen síntomas de meningitis aséptica. L. interrogans fue responsable del 5-13% de los casos de meningitis aséptica en una serie. Las características distintivas de la enfermedad de Weil son la ictericia y la insuficiencia renal aguda. La ictericia y otros signos de disfunción hepática aparecen ya en la tercera semana y pueden demorarse hasta la novena semana después de la infección. El diagnóstico de infección clásica es bastante sencillo, pero es mucho más difícil en el caso promedio sin exposición ocu­ pacional. Schmid y cois, informaron un caso muy raro de lep­ tospirosis en el que los síntomas clínicos imitaban la enferme­ dad de Lyme. El agente etiológico fue una leptospira antes no reconocida, que estos autores denominaron “L. inadai" sv. lyme.242 DuPont y cois, evaluaron los factores pronósticos en 68 pacientes de las Antillas francesas.64 Por análisis de multivarianza, hay cinco factores asociados con la mortalidad; disnea,

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C A P ÍT U L O 2 0

Infecciones producidas por espiroquetas

oliguria, recuento leucocitario superior a 12 900/mm3, altera­ ciones de la repolarización en los electrocardiogramas e infil­ trado alveolar en las radiografías de tórax. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

La leptospirosis puede diagnosticarse por cultivo de la espi­ roqueta, por la demostración de los microorganismos en las muestras, por la detección de antígenos o de ácidos nucleicos, o por serología. Delección directa. La demostración directa de Leptospira puede intentarse por examen de campo oscuro de sangre, LCR u orina. Se ha recomendado la centrifugación a baja velocidad de sangre oxalatada o heparinizada para eliminar los elementos celulares, y después a velocidad alta para concentrar las lep­ tospiras. Lamentablemente, el diagnóstico por examen directo suele ser rápido pero erróneo, porque las fibrillas eritrocíticas o los eritrocitos crenados se interpretan equivocadamente como espiroquetas. Aunque el examen del LCR y la orina es un poco menos erróneo, puede tener dificultades similares.262 Se descri­ bió la identificación directa de leptospiras con antisueros mar­ cados, pero los reactivos no se comercializan. Cultivo. Los medios de cultivo habituales son el medio semisólido de Fletcher, el medio líquido de Korthof y el medio albúmina sérica bovina-Tween 80, que puede ser líquido o sólido. Los m edios pueden alm acenarse a tem peratura ambiente durante períodos largos. Casi siempre se agregan antibióticos cuando hay probabilidades de que las muestras como la orina estén contaminadas con bacterias, pero algunos de los antibióticos, en la concentración requerida, también inhiben las leptospiras. Se ha encontrado que la combinación de fosfomicina y 5-fluorouracilo es eficaz para usar con el medio de Korthof, pero los autores advierten que los resulta­ dos no pueden extrapolarse automáticamente a otros medios para L ep to sp ira .19* Leptospira puede aislarse con facilidad en sangre y LCR durante la primera semana de enfermedad. Durante el estadio inmune los microorganismos desaparecen de la sangre y del LCR. Sin embargo, el riñón es un sitio privilegiado y Leptospira se excreta en la orina hasta durante un mes (véase lámina en color 2 0 -IG). Se recomienda sembrar por lo menos cuatro tubos de 5 mL de medios de cultivo con dos porciones diferentes de la mues­ tra clínica. Para el aislamiento de serotipos con requerimientos nutricionales especiales, puede agregarse 0,4% a 1% de suero de conejo estéril al medio albúmina sérica bovina-Tween 80. Deben sembrarse sólo volúmenes pequeños de sangre u orina, porque los más grandes pueden introducir sustancias que inter­ fieren en el desarrollo. Los medios deben sembrarse con una a dos gotas de muestra por tubo. Si el procedimiento no puede hacerse a la cabecera del paciente, puede enviarse sangre oxa­ latada o heparinizada al laboratorio. También puede sembrarse un coágulo desmenuzado, pero la sangre citratada puede ser inhibitoria. Cuando se realiza el cultivo de orina, debe sem­ brarse una muestra pura y otra diluida al décimo. Cuando se usa LCR, deben sembrase 0,5 mL a 5 mL. Los cultivos se incuban en la oscuridad a 28 °C a 30 °C hasta 6 semanas y se examinan semanalmente por microscopia de campo oscuro para buscar leptospiras (véase fig. 20-6). A menudo el desarrollo tarda varias semanas pero ocurre mucho más temprano en el medio Tween 80-albúmina. Leptospira se desarrolla típicamente como una banda, 0,5 a 1 centímetros debajo de la superficie del medio de cultivo semisólido (véase lámina en color 20-IH).

Manca y cois, informaron el aislamiento de L. interrogans en muestras simuladas y en sangre humana mediante un sistema de hemocultivo radiométrico comercial. Usaron el medio de Stuart y de Middlebrook para TB (12A) con el agregado de al­ búmina sérica bovina, catalasa e hidrolizado de caseína marca­ do con ácidos grasos C. El tiempo de aislamiento en sangre humana fue de 2 a 5 días.167 Serología. El cultivo establece un diagnóstico de certeza de lep­ tospirosis, pero requiere técnicas especializadas y difíciles de mantener en la mayoría de los laboratorios si la prevalencia de la enfermedad es baja. Por consiguiente, el procedimiento principal para el diagnóstico en la mayoría de los hospitales es el análisis serológico, y la técnica de referencia es la prueba de microaglutinación, con leptospiras vivas. La dificultad de man­ tener un gran número de cultivos de Leptospira es obvia. En la práctica se usan leptospiras muertas por formol, pero tienen una sensibilidad algo menor. La prueba de referencia de microaglutinación, a menudo considerada específica para serovarie­ dades es, de hecho, específica para serogrupos. No obstante, debe probarse un gran número de antígenos contra los sueros para detectar las serovariedades locales con certeza. Se usan antígenos de leptospiras específicos de serogrupo disponibles en el comercio, en una prueba de aglutinación macroscópica que puede usarse para la detección sistemática. Las reacciones positivas deben confirmarse en laboratorios de referencia con la prueba de microaglutinación. Varias versiones de una prueba de hemaglutinación se usan con menos frecuencia. Seki y cois, describieron una prueba rápida de aglutinación de microcápsulas,253 pero no ha sido evaluada por otros investigadores. Varios grupos han publicado enzimoinmunoanálisis que parecen prometedores.8'203,300 Los anticuerpos IgM son los más específicos para detectar infec­ ción actual. La prueba parece funcionar bien y puede reempla­ zar en el futuro la engorrosa microaglutinación, pero hay reac­ ciones cruzadas. Se requieren más investigaciones antes de aceptarlas como nuevos procedimientos de referencia, como lo demuestran dos informes recientes. Los investigadores de las Antillas hallaron una sensibilidad del 100% para una prueba de hemaglutinación indirecta comercial,150 pero los investigadores de Hawaii observaron una sensibilidad de sólo el 68% en pacientes infectados con la serovariedad icterohaemorhagiae y una sensibilidad del 47% en pacientes infectados con la sero­ variedad Australis.69 Las diferencias de sensibilidad entre los dos estudios puede representar las diferencias de serovarieda­ des en las dos localidades. Esta experiencia es un llamado de atención para todos aquellos que intenten el diagnóstico sero­ lógico de las infecciones por Leptospira. Se han informado otras técnicas serológicas, como la agluti­ nación del látex,263 la aglutinación de partículas32 y una prueba de inmunotransferencia en tiras por inmersión.102 Estos ensayos no se comercializan o no han sido ampliamente evaluados. Los investigadores de los CDC observaron que una prueba con tiras por inm ersión com ercial (Dip-S, PanBio INDX, Inc., Baltimore, MD) producía más resultados positivos (al parecer verdaderos positivos) que el enzimoinmunoanálisis en fase sólida comercial para IgM (P Brisbane, Australia). Los CDC sugieren un título superior a 1:200 en una muestra aislada de suero por la prueba de microaglutinación como evi­ dencia presuntiva de leptospirosis en un paciente con una enfermedad clínica compatible, pero otros expertos proponen un título de 1:800 o 1:1 600 como mejores valores de corte. Los títulos pueden alcanzar niveles sumamente altos y tardan meses o años en disminuir, por lo que la magnitud del título no puede usarse para determinar infección reciente.226

R eferencias

Detección de antígeno y ácidos nucleicos. Se han usado anticuer­

pos monoclonales para detectar antígeno de leptospiras en orina en muestras de Thailandia, con resultados prometedores.233 Las técnicas de amplificación molecular se han utilizado con éxito para el diagnóstico de leptospirosis.19175 El DNA de Leptospira estaba presente en orina incluso en los estadios tem­ pranos de la infección, cuando predomina la espiroquetemia. Se encontró que un porcentaje alto de pacientes con meningitis aséptica tenía DNA de leptospiras en el LCR, pero no se hicie­ ron cultivos ni análisis serológicos de las muestras de sangre en este estudio, por lo que es difícil interpretar los resultados.225 Estas pruebas no están ampliamente disponibles, pero pueden ser de importancia en los laboratorios de referencia.

Spirillium minor (fiebre por mordedura de rata) Spirillum m inor es un bacilo corto, grueso, espiralado, con espiras muy juntas, que mide 0,2 (im a 0,5 |im de diámetro por 3 Jim a 5 |irn de longitud. Causa gran parte de los cuadros de fiebre por mordedura de rata en Asia, pero es raro en los Estados Unidos. La transmisión es, como su nombre lo indica, por la mordedura de ratas. No se ha demostrado la transmisión interhumana. Una a cuatro semanas después de la mordedura, comienza una enfermedad sistémica caracterizada por escalo­ fríos, cefalea y fiebre. El sitio de la mordedura, que había cura­ do, se reactiva y se acompaña por linfadenitis regional y una erupción cutánea macular. La fiebre recurrente puede durar semanas, meses o años. La complicación más seria es la endo­ carditis infecciosa.299 Aunque rara, esta infección todavía es una amenaza cuando la exposición a las ratas es una posibilidad.199 Spirillum m inor no puede cultivarse in vivo y no hay ningu­ na prueba serológica específica. Hasta el 50% de los pacientes infectados tienen resultados falsos positivos en las pruebas serológicas para sífilis. Las espiroquetas pueden visualizarse en sangre, exudados o tejidos mediante la tinción de Giemsa o de W right o por microscopia de campo oscuro.

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Micología Pacientes con riesgo de contraer infecciones micóticas Signos y síntomas generales que sugieren infección micótica

Clasificación clínica de las infecciones micóticas Términos comunes en micología

Procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de infecciones micóticas Recolección y transporte de la muestra Procesamiento de la muestra Examen directo Preparación en fresco para estudio Selección e inoculación de medios de cultivo Incubación de los cultivos para hongos

Procedimientos de laboratorio para la identificación presuntiva de aislamientos de hongos Importancia de la identificación del género o la especie en el laboratorio Identificación del género y la especie de los principales grupos de hongos

Morfología de la colonia Características microscópicas

Aspergillus fumigatus Aspergillus flavus Aspergillus niger Aspergillus terreus Aspergillus nidulans

Histopatología Diagnóstico mediante técnicas sin cultivo

Otros hongos filamentosos hialinos de crecimiento rápido Características de las colonias

Géneros de hongos filamentosos hialinos productores de conidios en cadenas Especies de Penicillium Especies de Paecilomyces Especies de Scopulariopsis

Identificación de hongos filamentosos hialinos productores de conidios en racimos Especies de Acremonium Especies de Fusarium Especies de Gliocadium Especies de Trichoderma

Identificación de los géneros de hialohifomicetos productores de conidios aislados Especies de Scedosporium Especies de Chrysosporium

Especies de Zygomyces y zigomicosis

Especies de Sepedonium

Histopatología de las infecciones causadas por zigomicetos

Especies de Beauveria

Hongos filamentosos hialinos e hialohifomicosis Especies de Aspergillus y aspergilosis Presentación en el laboratorio

21

Identificación de los dermatófitos Identificación de especies de Microsporum Microsporum canis

1103

Microsporum gypseum

Especies de Nigrospora

Microsporum nanum

Especies de Phoma

Identificación de especies de Trichophyton Trichophyton mentagrophytes Trichophyton rubrum Trichophyton tonsurans Trichophyton verrucosum Epidermophyton floccosum

Diagnóstico mediante técnicas sin cultivo

Hongos dimorfos Blastomyces dermatitidis y blastomicosis Presentación en el laboratorio Diagnóstico mediante técnicas sin cultivo

Coccidioides immitis y coccidioidomicosis Presentación en el laboratorio

Histoplasma capsulatum e histoplasmosis Presentación en el laboratorio Diagnóstico mediante técnicas sin cultivo

Sporothrix schenckiiy esporotricosis Presentación en el laboratorio Diagnóstico mediante técnicas sin cultivo

Paracoccidioides brasiliensis y paracoccidioidomicosis Presentación en el laboratorio Diagnóstico mediante técnicas sin cultivo

Hongos dematiáceos Agentes de feohifomicosis Presentación en el laboratorio

Macroconidios con tabiques transversales y longitudinales (muriformes)

Especies de Chaetomium

Agentes de cromomicosis y micetomas Cladophialophora (Cladosporium) carrionii Phiaiophora verrucosum Phiaiophora richardsiae Fonsecaea pedrosoi Exophiaia jeanseimei

Identificación por el laboratorio de las levaduras Tubo germinal Preparaciones a partir del agar harina de maíz Patrones de crecimiento de las levaduras en agar harina de maíz CHROMagar

Candida albicans Candida trop¡calis Candida parapsilosls Candida kefyr(pseudotroplcalis) Otras especies patógenas emergentes de Candida Especies de Candidas candidlasis

Especies que producen hifas verdaderas Especies que no producen hifas verdaderas Criptococosis y Cryptococcus neoformans Diagnóstico mediante técnicas sin cultivo

Otras levaduras de importancia médica que no forman hifas Candida (Torulopsis) glabrata Especies de Rhodotorula

Especies de Alternaria

Especies de Saccharomyces

Especies de Ulocladium

Hansenula anómala

Especies de Stemphylium Especies de Epicoccum

Macroconidios con tabiques transversales Especies de Bipolaris Especies de Drechslera Especies de Curvularia Especies de Exserohilum

Macroconidios que nacen de modo individual o por conidiación especial

Malassezia furfur

Identificación en el laboratorio de las “ levaduras negras” Aureobasldium pullulans Phaeoannellomyces werneckü

Sistemas comerciales para la identificación de levaduras Pruebas de sensibilidad a los antimicóticos (antifungigrama)

Diagnóstico serológico de las enfermedades micóticas

1104

C A P ÍT U L O 21

Micología

l diagnóstico de una infección micótica requiere la colaboración entre el médico de atención primaria, el anatomopatólogo quirúrgico y el microbiólogo. El médico de atención primaria es responsable de evaluar los signos y los síntomas de las infecciones micóticas, y de investigar el tipo de muestras adecuadas para recolectar y transportar al laboratorio en condiciones óptimas sin retraso. El anatomopatólogo quirúrgico debe estar alerta a las reac­ ciones del tejido que hacen pensar en una infección micótica o debe poder reconocer los elementos micóticos en cortes teñidos de tejido. El micólogo del laboratorio es responsable de llevar a cabo las técnicas de laboratorio para el aislamien­ to óptimo de hongos por cultivo y realizar las identificacio­ nes precisas de género y especie.

E

Pacientes con riesgo de contraer infecciones micóticas • Individuos inmunodeprimidos o que presentan reducción de

• •

•

•

• •

la cantidad o alteraciones de la función de los leucocitos polimorfonucleares circulantes. Receptores de trasplantes de órganos, en especial durante el período de inmunosupresión posterior al trasplante. Pacientes con neoplasias malignas, en especial los afectados por leucemia y linfoma, más aún durante los períodos de qui­ mioterapia. Pacientes con diversos trastornos inmunitarios y metabólicos debilitantes, como lupus eritematoso sistémico y otras colagenopatías, diabetes mellitus, alteraciones de las y-globulinas, alcoholismo y drogadicción intravenosa. Pacientes que recibieron tratamientos con corticosteroides, agentes citotóxicos o antibióticos durante un tiempo prolon­ gado. Residentes o viajeros hacia regiones del mundo conocidas como endémicas de ciertas infecciones micóticas. Participantes en actividades u ocupaciones que implican el contacto directo de la piel con animales infectados, con materiales contaminados o ambos, o que presentan riesgo de ingestión o inhalación de aerosoles o polvo contaminados con esporas de hongos.

Sobre esta base, una revisión reciente de N ucci199 hace hin­ capié en que la incidencia de infecciones por hongos filamen­ tosos que no pertenecen al género A spergillus ha aumentado durante la última década, en especial en los receptores de tras­ plantes. Según sugieren los datos epidemiológicos recientes, una causa fundamental parece ser la profundidad mayor de la inmunosupresión en los protocolos cambiantes de trasplantes. Estas infecciones micóticas tienden a diseminarse y el pronós­ tico suele ser desfavorable porque los hongos son resistentes a la mayoría de los agentes antimicóticos disponibles. Signos y síntomas generales que sugieren infección micótica

• Los síntomas de presentación tempranos que suelen llevar a la sospecha de una infección micótica son atípicos, vagos e inespecíficos, lo que reduce la posibilidad de realizar el diag­ nóstico clínico correcto. • Algunos síntomas frecuentes son fiebre de baja intensidad, sudores nocturnos, pérdida de peso, lasitud, fatiga fácil, tos y dolor torácico. • Las micosis profundas o diseminadas pueden asemejarse a otras infecciones, como tuberculosis, brucelosis, sífilis, sarcoidosis y carcinomatosis diseminada.

• Siempre debe realizarse el examen cuidadoso de la piel y las mucosas, ya que las micosis sistémicas a menudo se acom­ pañan de lesiones mucocutáneas. • Las lesiones ulcerosas del intestino, la laringe, la faringe, los órganos genitales y la lengua pueden complicar la histoplasmosis diseminada hasta en el 50% de los casos. • Los pacientes con blastomicosis pueden presentar al comienzo lesiones cutáneas verrugosas o pustulosas o gra­ nulomas ulcerados de las mucosas laríngea,66 esofágica y bucal, incluso con afectación de la lengua.207 • La coccidioidomicosis en el SIDA puede presentarse como lesiones cutáneas papulares o maculares.226 • En el cuadro 21-1 se mencionan los signos, los síntomas y los agentes probables de las micosis pulmonares. • Los signos, los síntomas y los agentes probables de las mico­ sis extrapulmonares se resumen en el cuadro 21-2. • Los hallazgos de laboratorio inespecíficos, como el aumento de la velocidad de eritrosedimentación, el aumento de la pro­ teína C-reactiva, las elevaciones de la y-globulina, o las ele­ vaciones de baja intensidad y persistentes de los neutrófilos, los monocitos o ambos de sangre periférica pueden propor­ cionar los indicios iniciales para sospechar una infección micótica.

Clasificación clínica de las infecciones micóticas Desde una perspectiva amplia, las micosis pueden denomi­ narse “superficiales” o “profundas” (o “sistémicas”). Sin embargo, esta clasificación ya no sirve para las necesidades de la práctica clínica, dado que varias especies de hongos consi­ derados productores de enfermedad “superficial” pueden cau­ sar enfermedad diseminada. Por eso fueron surgiendo varios términos específicos con los que los médicos y los micólogos se comunican mejor. Los términos profundo y sistémico clásicamente se referían a un grupo de micosis causadas por agentes que en esencia pue­ den ser muy virulentos, invadir profundamente los tejidos y los órganos y diseminarse por todo el cuerpo. Hasta hace poco, la mayoría de estas infecciones eran ocasionadas por hongos dimorfos, es decir, las especies que existen en la forma de hon­ gos filamentosos en el ambiente (“la temperatura de incubación ambiente”), pero como levaduras cuando se incuban a 35-37 °C (la temperatura del cuerpo). En la actualidad, debido al aumen­ to del número de individuos inmunosuprimidos o que presen­ tan una afección intensa de la inmunidad celular, otros agentes micóticos, considerados antes sólo como “saprofitos” o “con­ taminantes” son ahora agentes de enfermedad sistémica. Un excelente ejemplo es el hongo filamentoso hialino Penicillium m a m e ffii , que causa infección reticuloendotelial diseminada que se asemeja desde el punto de vista clínico y anatomopato­ lógico a la histoplasmosis. El término oportunista se utiliza ahora para describir a los hongos “no patógenos” que pueden causar infecciones subcu­ táneas y diseminadas. Estos hongos presentan una capacidad de virulencia baja o limitada; no obstante, pueden causar enfer­ medad local o diseminada en los drogadictos intravenosos, los debilitados, los inmunodeprimidos o los portadores de disposi­ tivos intravasculares o protésicos. Las especies de Aspergillus, de C andida y de Z ygom yces (mucormicosis) son los tres gru­ pos de hongos considerados clásicamente oportunistas. En los últimos tiempos, las infecciones localizadas y profundas se han atribuido a varias otras especies de hongos filamentosos claros (hialinos) y oscuros (dematiáceos) de crecimiento rápido antes

C lasificación clínica de las infecciones m icóticas

Cuadro 21-1

1105

Signos y síntomas de las micosis pulmonares

TIPO DE INFECCIÓN General

SIGNOS Y SÍNTOMAS Síndrome gripal transitorio o neumonía localizada en un lóbulo o diseminada a otros en la infección temprana Tos, producción mínima de esputo, disnea, taquipnea, hemoptisis Dolor torácico, con frecuencia de naturaleza pleurítico En la auscultación pueden detectarse estertores, roncus y frote pleural La radiografía de tórax puede revelar infiltrados pulmonares pequeños y adenopatías hilares u opacidades más difusas y confluentes

Broncopulmonar alérgica

Síntomas característicos del asma: tos no productiva, sibilancias, opresión en el tórax Episodios de broncoespasmo Atelectasia segmentaria causada por el taponamiento de los bronquíolos por el moco Cristales de Charcot-Leyden y eosinófilos en el esputo; eosinofilia de sangre periférica Reacción de hipersensibilidad cutánea a los antígenos de especies de Aspergillus Concentración elevada en suero de IgE y anticuerpos IgG contra Aspergillus.

Bola micótica

Crecimiento de la colonia del hongo dentro de una cavidad preexistente Hemoptisis, a pesar de la escasa o ninguna invasión de la pared de la cavidad La diseminación es rara, incluso en los pacientes que reciben corticosteroides

Invasora

Síntomas de neumonía aguda. Fiebre ondulante de baja intensidad La tos puede ser productiva o no; el dolor torácico suele estar presente Disnea progresiva La hemoptisis puede indicar infarto y necrosis del parénquima La radiografía de tórax puede revelar un infiltrado difuso que se irradia desde los hilios, fibrosis nodulillar fina, abscesos multifocales o cavitación, lo que depende de la especie del hongo. Indicios de agentes específicos: Fibrosis como "semillas de mijo” : histoplasmosis Lesión periféricas numulares: coccidioidomicosis Lesiones cavitarias: histoplasmosis o coccidioidomicosis Bolas micóticas: aspergilosis, seudoalesqueriasis, zigomicosis Enfermedad broncopulmonar alérgica: Aspergillus fumigatus, A. flavus

consideradas contaminantes. Con la comprensión de que diver­ sas especies micóticas pueden causar casi todas las formas clí­ nicas de micosis, Ajello 56 ha sugerido los términos genéricos de feohifomicosis y hialohifomicosis en referencia a los hon­ gos saprofitos que aparecen oscuros o negros en los cultivos (dematiáceos) y que producen hifas incoloras y transparentes (hialina), respectivamente. Esta terminología evolucionó para eliminar la necesidad de usar los términos peniciliosis, fusariosis y curvulariosis en referencia a cada una de la miríada de especies oportunistas de hongos que en ocasiones actúan como agentes de infecciones micóticas. Así, los términos globales de feohifomicosis y hialohifomicosis también liberan al médico de tener que recordar los nombres de muchos agentes micóticos específicos que sólo se encuentran rara vez en la práctica clínica. Términos comunes en micología

Antes de continuar, deben definirse algunos otros términos que se utilizan en este libro. La palabra micología proviene del griego m ykes , la contraparte directa de la palabra latina fungus, que a su vez se considera una modificación de las palabra grie­ ga sponges, de la cual proviene “esponja”. Zigomicosis ha reemplazado el término fícomicosis más antiguo para hacer referencia a las enfermedades micóticas causadas por este

grupo importante de hongos oportunistas. El prefijo “zigo” proviene del griego zygon, para indicar una fusión o unión a la manera de un yugo. Esta derivación se refiere a la fase sexual de reproducción en la que hay una unión o fusión de las dos células sexuales independientes para formar la zigospora. La designación anterior, ficomiceto (del griego p hykos para signi­ ficar “alga marina”) para este grupo de hongos se ha reempla­ zado más correctamente por el término zigomiceto. La mucormicosis también es un término más antiguo para este grupo de enfermedades micóticas, derivado del término utilizado para el orden "M ucorales” del latín m ucere, que significa “mohoso”. El término anamorfo se refiere a la reproducción asexual de los hongos, mientras que teleomorfo alude a la forma sexual de reproducción en que cada célula nueva se origina de la unión de dos células separadas. La mayoría de los micólogos consi­ deran que cada hongo tiene una fase sexual que puede mani­ festarse si se le proporcionan las condiciones medioambienta­ les y nutricionales adecuadas. En un contexto amplio, los hongos son miembros del reino vegetal que están desprovistos de hojas, tallos o raíces. Los hongos son eucariontes, es decir, cada célula tiene un núcleo, membrana nuclear, retículo endoplasmático, aparato de Golgi y mitocondrias. También tienen una pared celular rígida com­ puesta por quitina (/V -acetil-D -glucosam ina unida por enlaces glucosídicos fil-4), mananos (polímeros de glucosa en los

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C A P ÍT U L O 21

Cuadro 21-2

Micología

Signos, síntomas y agentes etiológicos probables de las micosis extrapulmonares

TIPO DE INFECCION Cutánea

SIGNOS Y SINTOMAS Lesiones superficiales descamativas. que varían en tamaño, forma y color, del tórax o de la espalda: tiña versicolor secunda­ ria a la infección por Malassezia fúrfur Prurito, lesiones descamativas conocidas como tiña: dermatofitosis Afección fungoide exofítica e hiperqueratósica que produce engrosamiento y costras conocida como tiña fávica: Trichophyton tonsurans, T. violaceum y T. schoenleinii Lesiones descamativas o con costras limitadas a las zonas intertriginosas húmedas de piel sugieren infecciones por levadu­ ras: Candida albicans Infección pustular subcutánea primaria en el sitio de inoculación, con diseminación proximal y evolución de úlceras cutáne­ as secundarias a lo largo de los trayectos linfáticos: Sporothrix schenckii. Pústulas que no curan, úlceras o fístulas: enfermedades micóticas diseminadas por hongos dimorfos y micetomas secunda­ rios a una diversidad de hongos Lesiones purpúricas y quistes subcutáneos: feohifomicosis Lesiones fungoides, hemorrágicas y con cambio de coloración: cromomicosis

SNC

Comienzo insidioso de cefaleas que aumentan en frecuencia e intensidad, acompañado por náuseas, irritabilidad y torpeza; criptococosis Meningitis y meningoencefalitis: zigomicosis, en especial en diabéticos. Abscesos cerebrales: Xylophyla bantiana, otros hongos dematiáceos; especies de Aspergillus

Urinaria

Pielitis y pielonefritis asociadas con la administración prolongada de antibióticos, corticosteroides, inmunosupresores, fár­ macos antineoplásicos y la inserción durante períodos prolongados de sondas urinarias, en especial en mujeres mayores: candidiasis Piuría limitada, dolor abdominal en hipogastrio, polaquiuria: cistitis no bacteriana en mujeres de mediana edad: Torulopsis glabrata

Ocular

Conjuntivitis, infecciones de la córnea y queratoconjuntivitis: especies de Fusarium, Aspergillus, Cladosporium, Acremonium y otros. Las infecciones intraoculares, por lo general secundarias a traumatismo o cirugía ocular: Candida albicans, especies de Aspergillus o de Zygomyces

Endocarditis

Fiebre de baja intensidad, soplos cardíacos, vegetaciones en la ecocardiografía: especies de Candida, de Aspergillus, de Paecilomyces

Sinusitis

Dolor facial e hiperemia cutánea, cefalea, fiebre de baja intensidad, evidencia radiográfica de senos paranasales ocupados o con niveles líquidos: Aspergillus fumigatus, Sporothrix schenckii, especies de Alternaría y Pseudallescheria boydii

enlaces glucosídicos a o (31-4) y a veces celulosa. Estos cons­ tituyentes de la pared adsorben varios colorantes, lo cual per­ mite la aplicación de diversas tinciones especiales por las que pueden identificarse en las preparaciones en fresco y en los cortes de tejidos en el laboratorio. Las formas de hongos que tienen una sola célula se conocen como levaduras; las que presentan múltiples células que for­ man un micelio filamentoso se denominan hongos filamento­ sos (mohos). Los hongos se reproducen por esporas, ya sea de modo sexual o asexual, que pueden originarse directamente del micelio vegetativo (artrosporas, clamidosporas, blastosporas) o de la superficie de cuerpos de fructificación aéreos espe­ ciales (conidios). La morfología, la disposición y el modo de origen de las esporas sirven como criterios importantes por los cuales puede hacerse la identificación de género y especie. En el recuadro 21-1 se presentan otros términos utilizados en el proceso diagnóstico del laboratorio para los hongos.

Procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de infecciones micóticas Una vez que se reconoce un hongo en el cultivo, primero se realiza una identificación presuntiva basada en el examen

visual de la morfología de la colonia o de las observaciones microscópicas de una preparación directa en fresco. Con la identificación presuntiva presente, puede consultarse al médico de cabecera para determinar si la historia clínica exige la iden­ tificación completa de género o especie. Aunque la mayoría de las identificaciones de los hongos se basa sobre todo en la evaluación de la morfología de la colonia y de las características microscópicas, pueden requerirse prue­ bas bioquímicas especiales para diferenciar entre géneros o especies estrechamente relacionadas dentro de un grupo dado. Cada vez con más frecuencia se están utilizando ensayos con sondas de ácidos nucleicos para proporcionar una confirmación temprana del cultivo en los casos sospechosos de micosis pro­ fundas. En algunos casos se requieren estudios serológicos para establecer el diagnóstico clínico definitivo, evaluar el esta­ do de una micosis diagnosticada con anterioridad o determinar la eficacia del tratamiento. Por consiguiente, en este capítulo se establecerán pautas para ayudar al micólogo a realizar estas diversas tareas y ampliar las observaciones del laboratorio para incluir evaluaciones de los parámetros clínicos y los criterios histopatológicos que deben entrecruzarse para realizar el diag­ nóstico definitivo. La identificación definitiva de un hongo en el laboratorio depende de la visualización de la morfología de la colonia y las

P rocedim ientos de laboratorio para el diagnóstico de infecciones m icóticas

Recuadro 21-1

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T érm in o s útiles en el exam en de los hongos

La unidad microscópica fundamental de un hongo es la estructura en forma de hebra denominada hifa. Varias hifas se combinan para formar la maraña de crecimiento conocida como micelio. Las hifas que se subdividen en células individuales por paredes o tabiques transversales se denominan tabicadas; las que no los tienen se denominan sin tabiques. Las seudohifas se forman a partir de un alargamiento de las células levaduriformes que emiten un brote i blastoconidio) y muestra estrechamientos similares a una ristra de salchichas entre los segmentos (fig. 2 1 - 1 ). La porción del micelio que se extiende en el sustrato del medio de cultivo y determina la absorción del agua y los nutrientes es el micelio vegetativo; la porción que se proyecta sobre el sustrato es el micelio aéreo, también denominado micelio reproductor, ya que de esta porción se originan esporas espe­ ciales o cuerpos de fructificación productores de conidios. La identificación y la clasificación de los hongos se basan sobre todo en las diferencias morfológicas en las estructuras reproductivas y en la manera en que las esporas o los conidios se forman a partir de células especializadas denominadas células conidiógenas. En las especies de hongos de importancia médica suelen observarse tres tipos generales de reproducción: esporulación vegetativa, esporulación aérea y esporulación sexual. Reproducción vegetativa

Tres tipos de esporas o conidios pueden formarse directamente del micelio vegetativo: blastoconidios, clamidioconidios y artroconidios (el término anti­ guo para las esporas vegetativas era talosporas). El término espora debe reservarse para los elementos reproductivos que se originan por meiosis (repro­ ducción sexual), como ascosporas, oosporas o zigosporas, o por mitosis (reproducción asexual) dentro de un esporangio (como en los zigomicetos). El término endospora también se usa para las esporas producidas dentro de un espacio confinado (la forma tisular de Coccidioides immitis, por ejemplo). Todas las otras esporas '‘asexuales" son conidios. Blastoconidios son las formas tan conocidas que producen brotes de las levaduras. En el punto en el cual el conidio se desprende queda una cicatriz del brote (disyuntor). Los clamidioconidios (clamidosporas) se forman a partir de células preexistentes en la hifa, que se engrosa y a menudo se agranda. Aunque clamidioconi­ dios es el término correcto, se utiliza clamidosporas en la mayoría de los círculos de laboratorio clínicos. Las clamidosporas puede encontrarse dentro de la hifa (intercalar), junto a uno de sus lados (sésil) o en su extremo (terminal). Este tipo de conidiación es característico de Candida albicans. Los artroconidios también se forman de células preexistentes en las hifas que se agrandan y engrasan. Cuando maduran, estos conidios se liberan por la lisis de las células adyacentes de la hifa. Este tipo de esporulación es característico de la forma filamentosa de Coccidioides immitis y de especies de Geotrichum, entre otros. Reproducción aérea

De las hifas se originan y se extienden por la superficie del micelio cuerpos de fructificación especializados que dan lugar a una variedad de esporas o coni­ dios. Los cuerpos de fructificación pueden formar bolsas cerradas denominadas esporangios, dentro de los cuales se producen las esporas conocidas como esporangiosporas. El segmento especializado de la hifa que sostiene o sirve de apoyo al esporangio se denomina esporangióforo (el sufijo “foro" [del griego phoros], "que sostiene”) (fig. 21-2). Este tipo de esporulación es característico de Zigomyceres. Muchos otros hongos producen cuerpos de fructificación elaborados que dan origen a las esporas formadas desde la superficie, para las cuales se aplica el término conidios (polvo). El segmento especializado de la hifa que sostiene la cabeza de fructificación que tiene los conidios se llama conidlóforo (fig. 2 1 - 2 ). Los conidióforos pueden ramificarse en segmentos secundarios denominados métulas, que a su vez forman segmentos productores de conidios: las fiálides. Esta propiedad de ramificarse en métula y fiálides es característica del cuerpo de fructificación digitiforme de las especies de Penicillium. Las fiálides por definición son células conidiógenas que producen conidios desde un locus dentro de su ápice, que no aumenta de ancho ni de longitud durante la conidiogénesis. Esto es diferente de la formación del anélido. en el cual la punta de la fiálide se extiende y se retrae cíclicamente cuando se forman los conidios, lo que deja una sucesión de cicatrices o anillos. Los conidios de las especies de Scopulariopsis. por ejemplo, son anelidoconldios: es decir, se forman en una secuencia basípeta en la cual la parte conidiógena de cada conidio se alarga en el momento en el que se forma uno nuevo, luego se contrae para for­ mar una cicatriz anular, anillo o collar en la base truncada. Los conidios pueden ser individuales, en cadenas largas (catenulados) o en grupos firme­ mente unidos. Acrópeta es un término para describir el proceso de formación de la cadena en que cada nuevo conidio se origina a continuación del ante­ rior, de modo que la célula más joven esté en el ápice (especies de Penicillium, por ejemplo), en contraste con la esporulación basípeta, en el que cada conidio nuevo se forma en la base de la cadena y empuja a los otros conidios de la cadena hacia adelante, de modo que la célula más vieja queda en el ápice (especies de Paecilomyces). Una única célula diminuta de los conidios, originada directamente de los lados de la hifa o sujeta por un conidióforo del tipo de un pelo, se denomina microconidio. en contraposición al macroconidio, mucho más grande y multicelular que asume diversos tamaños y formas. Un macroconidio que se encuentra dividido por tabiques transversales y longitudinales, que da un aspecto de mosaico, es una dictiospora, denominado con más frecuencia muriforme (porque recuerda a una pared de piedra). El término aleuriospora se refiere a un conidio, por lo general un macroconidio, que está adherido a la hifa por una célula de apoyo que se fractura cuando el conidio se libera (p. ej., Microsporum canis). (Continúa)

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C A P ÍT U L O 21

Recuadro 21-1

Micología

Térm in o s útiles en el exam en de los hongos (cont.)

Esporulación sexual

El esporulación sexual requiere la fusión y la recombinación nuclear de dos células fértiles especializadas (cada una de las cuales ha sufrido el proceso de meiosis) que se origina sobre las hifas aéreas. Si las células reproductivas se originan por la fusión de células morfológicamente idénticas, a menudo de la misma hifa (homotálica), la espora se denomina zigospora. característica de Zigomycetes. Si la fusión de las células reproductivas proviene de dos células diferentes, a menudo originadas de segmentos separados de hifas, la espora resultante se denomina oospora (fig. 21-3). Las esporas sexuales de varios miembros de la clase Ascomycetes ya mencionados, que tienen importancia médica se denominan ascosporas. Por ejemplo, ciertas cepas de las especies de Aspergillus, notablemente de los grupos A. nidulans y A. glaucas, producen estructuras cerradas y grandes, como una bolsa, denominadas cleistotecios, que a su vez contienen estructuras más pequeñas, con forma de sacos, conocidas como ascos (fig. 21-3). Dentro de cada asco se observan cuatro ascosporas, producto de la división meiótica. Los hongos importantes desde el punto de vista médico, distintos de las especies de Aspergillus, en los que puede observarse la esporulación sexual incluyen especies de Saccharomyces y Pseudallescheria boydii (fig. 21-3). La forma sexual de un hongo se conoce como teleomorfo. en contraste con el término ananiorfo, que se refiere a las diversas formas reproductivas asexua­ les o estructuras producidas por un hongo imperfecto (como fiálides, anélidos o cadenas ramificadas). Así, por ejemplo. Pseudallescheria boydii es el tele­ omorfo de esta especie y pueden observarse varias formas “perfectas” como cleistotecios, ascos y ascosporas. Scedosporium monosporium es la forma imperfecta de esta especie, que produce principalmente conidios unicelulares anamorfos.

características microscópicas, que se tratarán después con mayor detalle. Deben llevarse a cabo varias prácticas y proce­ dimientos previos para asegurar que el aislamiento en el culti­ vo sea óptimo. Cualquier interrupción en la cadena de eventos, comenzando con la recolección inadecuada de la muestra, la falta de conservación durante el traslado, el retraso del proce­ samiento una vez recibida en el laboratorio y, por último, la inoculación a medios de cultivo primarios para hongos selec­ cionados de modo incorrecto ponen en peligro las posibilida­

r LEVA D UR A Individual ■

des de hacer la identificación final. También deben implementarse pautas para el estudio microscópico de un aislamiento desconocido y la selección apropiada de pruebas diferenciales cuando sean necesarias para hacer una identificación importan­ te de género y especie. Los párrafos que siguen detallan estos pasos. Cuando sea adecuado, también se incluirán secciones breves para describir los métodos que no usan cultivos para establecer la identidad de especies determinadas de hongos, mediante técnicas que utilizan anticuerpos y antígenos, ya sea por méto­ dos convencionales como por otros más nuevos basados en la biología molecular. Con vista al futuro, cabe mencionar que la secuenciación de ácidos nucleicos es promisoria para conver­ tirse en el método estándar para la identificación de los hongos en los “laboratorios de referencia.111 En este momento, debido a la especialización técnica requerida y al costo de instrumen-

B lastoconidio D im orfism o Tubo germ inal

0 ^

N úcleo

C 3I

L HONGO F IL A M E N ­ TOSO

J

Seudohifa

)

Hifa (verdadera)

Tabique M ic e lio

Figura 21-1 Esquema que ilustra las estructuras básicas de los hongos.

Figura 21-2 Esquemas que ilustran las estructuras del micelio aéreo y la re­ producción asexual.

P rocedim ientos de laboratorio para el diagnóstico de infecciones m icóticas

OOSPORAS

Z IG O S P O R A S

ASCOSPORAS

E species de P ythium (O om ycete)

Especies de R hizopus (Zygom ycete)

A je llo m yce s derm atidis (A scom ycete)

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O ospora

A scospora C leístotecio

Figura 21-3 Esquemas que ilustran las estructuras de la reproducción sexual.

tación y suministros, esta técnica no se implementa en los labo­ ratorios más pequeños en los que sólo se realizan prácticas básicas. El único sistema que se comercializa en la actualidad es el equipo para secuenciación de la subunidad grande del rDNA de los hongos Applied Biosystems (Foster City, CA) MicroSeq D2. Un estudio del uso de la secuenciación de ácidos nucleicos para la identificación de levaduras reveló que permitía identifi­ car el 98% de 19 especies diferentes de C andida observadas en el laboratorio clínico en comparación con la identificación por métodos fenotípicos.110 La secuenciación de DNA identificó 32 aislamientos de levaduras que pertenecen a nueve géneros, incluso Trichosporon, Cryptococcus y otros. Alrededor del 81% se identificó correctamente y la principal razón para la mayoría de las identificaciones incorrectas fue el resultado de la falta de entradas de datos en la genoteca que contiene las secuencias de muchas levaduras. En otro estudio realizado en la Clínica Mayo para determi­ nar la utilidad de la secuenciación para la identificación de los hongos filamentosos, la secuenciación del ácido nucleico y los métodos fenotípicos identificaron 234 aislamientos (67,5%) al nivel correcto de género o especie.111 Las identificaciones inco­ rrectas se debieron sobre todo a la lista incompleta de secuen­ cias en la base de datos. Cada laboratorio puede construir una base de datos personalizada de secuencias, lo que incrementa en gran medida la precisión del diagnóstico. Esta técnica es muy promisoria para simplificar la identificación de levaduras y hongos filamentosos aislados en muestras clínicas, así como de los que son importantes para la industria y la agricultura. Sin duda, en el futuro puede convertirse en el estándar para la iden­ tificación de los hongos. Recolección y transporte de la muestra

En el capítulo 2 se dieron las pautas generales para la reco­ lección y el transporte de muestras para el cultivo. En el cuadro 21-3 se presentan las pautas para la recolección de diversos tipos de muestras. Médicos, enfermeras, personal de guardia y técnicos del laboratorio deben trabajar juntos en la elaboración de protocolos que aseguren la recolección adecuada y el trans­ porte rápido de muestras remitidas para cultivos de hongos. La

selección correcta de los dispositivos para la recolección y de los recipientes de transporte, el pegado de etiquetas que inclu­ yan la información pertinente del paciente y el establecimiento de un medio de comunicación para solicitudes especiales son tal vez las consideraciones más importantes para asegurar el diagnóstico exacto de las infecciones micóticas. Las muestras deben remitirse al laboratorio rápidamente. Las que no se procesan de inmediato deben mantenerse a tem­ peratura ambiente. Cryptococcus neoform ans, H istoplasm a capsulatum y Blastom yces derm atitidis no sobreviven bien en muestras congeladas o en hielo. Varias especies de hongos, incluso las especies antedichas y las especies de A spergillus pueden aislarse en muestras que han estado en tránsito durante 16 días siempre que no sufran desecación; por consiguiente, siempre debe hacerse el intento de aislar los hongos aun cuan­ do el procesamiento se retrase.243 Deben usarse recipientes de transporte estériles y sellados para todas las muestras líquidas o húmedas. Los raspados de piel, los fragmentos de uñas y los pelos pueden transportarse en seco en un sobre, caja de Petri u otro vehículo conveniente. Para reducir el crecimiento de bac­ terias comensales posiblemente presentes en las muestras no estériles en las que puede retrasarse el procesamiento o deben enviarse por correo a un laboratorio de referencia, puede agre­ garse penicilina (20 U/mL), estreptomicina (100 000 |ig/mL) o cloranfenicol (0,2 mg/mL). En el capítulo 2 se describen las directivas para el envase y rotulado adecuados de las muestras que deben transportarse o enviarse por correo. Los criterios por los que una muestra se considera inacepta­ ble para el cultivo y se rechaza deben registrarse en el protoco­ lo del laboratorio. En el recuadro 21-2 se presentan criterios de rechazo seleccionados y las acciones para tomar cuando se pro­ cesan muestras inaceptables. Estos criterios también deben ser considerados por médicos, enfermeras y el personal asignados para recolectar la muestra, ya que no sólo se ahorrará tiempo y dinero en el laboratorio de micología, sino que puede evitarse un retraso inaceptable para establecer el diagnóstico. Deben determinarse criterios individuales dentro de cada ámbito de práctica para adaptarse a la situación local. Con experiencia, el individuo que obtiene la muestra puede hacer una observación preliminar del material obtenido y recolectar de inmediato una segunda muestra si lo cree necesario.

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C A P ÍT U L O 21

Cuadro 21-3

Micología

Recomendaciones de la American Thoracic Society para la recolección de muestras para el cultivo de hongos

MUESTRA

PROCEDIMIENTO RECOMENDADO

Esputo

Debe recolectarse la primera muestra de la mañana después de levantarse, pero antes del desayuno. Se les indica a los pacientes que se enjuaguen en forma vigorosa la boca con agua inmediatamente antes de expectorar 15 a 30 mL de espu­ to en un recipiente estéril, con tapa a rosca. Si no puede obtenerse una muestra suficiente puede ser necesaria la inducción del esputo con una nebulización con solución salina tibia

Broncoscopia

Las muestras de cepillado bronquial, biopsia o líquido de lavado broncoalveolar deben transportarse enseguida al laborato­ rio en recipientes estériles y con cierre hermético En algunos laboratorios se utiliza el caldo Middlebrook 7H 11 como medio de transporte porque también se conservarán las micobacterias. Cuando sea posible debe recolectarse una muestra de esputo posterior a la broncoscopia

Líquido cefalorraquídeo

Para el cultivo de hongos debe usarse tanto líquido cefalorraquídeo (LCR) como sea posible. Si se retrasa el procesamiento, las muestras deben dejarse a temperatura ambiente porque el LCR es un medio de cultivo líquido adecuado en el que los elementos micóticos pueden sobrevivir hasta que sean subcultivados

Orina

Se prefiere la primera muestra de orina de la mañana; son aceptables muestras al azar. Las muestras deben recolectarse de modo aséptico en recipientes estériles, con tapa a rosca y enviarse de inmediato para su procesamiento. Si se prevé un retraso para el procesamiento de más de 2 horas, la muestra de orina debe refrigerarse a 4 °C para inhibir la proliferación de bacterias de crecimiento rápido

Secreciones prostéticas

Algunas micosis profundas, en especial blastomicosis y, con menos frecuencia, histoplasmosis o coccidioidomicosis, pue­ den diagnosticarse mediante la recolección de secreciones prostáticas. Primero se vacía la vejiga, seguido por el masaje prostático. Las secreciones deben inocularse directamente en los medios de cultivo para hongos apropiados; también, deben recolectarse 5-10 mL de orina en un recipiente separado

Exudados

Debe desinfectarse la piel que recubre las lesiones pustulosas y los exudados aspirados mediante una aguja y jeringa estéri­ les. La jeringa también puede servir como recipiente de transporte si la aguja se tapa. Puede ser necesaria la biopsia de la lesión si el aspirado no muestra la presencia de hongos

Piel, uñas y pelos

Primero, limpiar el área de la piel con alcohol al 70% para eliminar de la superficie los contaminantes bacterianos. La muestra se toma del borde de crecimiento periférico y eritematoso de las lesiones típicas de la tiña, Taspando con el borde de un portaobjetos o de una hoja de bisturí. Las muestras de las uñas infectadas deben tomarse de la parte inferior de la uña para obtener el material ablandado del lecho ungular. Si esto no es posible, debe rasparse lejos de la superficie de la uña antes de recolectar rasurados colectivos de las porciones más profundas. Los pelos deben recolectarse de las áreas de descamación o alopecia, u obtener aquellos que presentan fluorescencia cuando se observan con la lámpara ultravioleta de Wood (longitud de onda larga)

Biopsias de tejidos

Las biopsias del tejido de sitios sospechosos de infección deben transportarse en una gasa estéril humedecida con solución fisiológica estéril no bacteriostática en un recipiente con tapa a rosca. La muestra no debe congelarse ni debe permitirse su deshidratación antes del cultivo

Sangre

Los frascos con medio bifásico agar-caldo, diseñados específicamente para los cultivos de hongos son superiores a los frascos utilizados habitualmente para el aislamiento de patógenos bacterianos. También se recomiendan los sistemas de lisis-centrifugación, como el Isolator (Wampole Laboratories, Cranbury, NJ), en especial para aislar H. capsulatum y otras levaduras

Procesamiento de la muestra

Una vez recibida por el laboratorio, la muestra debe exami­ narse lo antes posible. Las muestras de hisopados suelen ser inadecuadas para el aislamiento de hongos filamentosos y tam­ bién son subóptimas para las levaduras; debe procurarse recibir material aspirado o biopsias de tejido. Deben realizarse prepa­ raciones directas en fresco o frotis, si se considera convenien­ te, y transferir una porción de la muestra a los medios de culti­ vo para hongos. Este último paso también es importante en la recuperación final de hongos y no puede descuidarse o dele­ garse al personal sin la capacitación suficiente. En el cuadro 21-4 se presentan pautas adicionales para el procesamiento y el examen directo de muestras clínicas. Examen directo

Es muy recomendable realizar el examen microscópico directo de la mayoría de las muestras remitidas para el cultivo

de hongos. No sólo puede brindar un diagnóstico presuntivo inmediato al médico; también puede ayudar en la selección de los medios de cultivo adecuados. La preparación en fresco con tinta china y KOH/calcoflúor, las preparaciones con cintas transparentes teñidas con el colorante de anilina azul de lactofenol y los cortes obtenidos por congelación de biopsias de teji­ dos son distintos métodos que se utilizan para los exámenes microscópicos directos rápidos. El microscopio con contraste de fase es un valioso auxiliar en el examen directo de las muestras. Las ventajas son: 1) pue­ den hacerse las preparaciones en fresco y examinarse rápida­ mente, 2) no hay necesidad de realizar la tinción directa y 3) los objetos pueden visualizarse con claridad.

PREPARACIÓN EN FRESCO PARA ESTUDIO

La preparación en fresco por disección, la preparación con cinta transparente y la técnica de microcultivo en portaobjetos son los tres métodos que suelen utilizarse para el examen micros-

P rocedim ientos de laboratorio para el diagnóstico de infecciones m icóticas

Recuadro 2 1-2

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C riterio s para el rechazo de la m uestra

Situación: falta de identificación del paciente en el recipiente o una diferencia entre el formulario de solicitud y el rótulo del recipiente. Acción: retornar al remitente para la resolución. Situación: muestra de esputo con > 25 células epiteliales pavimentosas por campo de bajo aumento (criterios para el rechazo de muestras respiratorias remitidas para el cultivo bacteriano). Acción: los criterios para el rechazo de muestras remitidas para el cultivo bacteriano no necesariamente pueden pertenecer a las muestras para hongos. Pueden aislarse hongos patógenos en estas muestras a pesar de la contaminación oral, en especial si se utilizó un medio de cultivo selectivo que contiene antibiótico. Sin embargo, el informe final debe indicar que había contaminación oral significativa, lo que deja al médico la opción de hacer una interpreta­ ción basada en la información clínica u obtener una muestra de mejor calidad si se necesita una diferenciación más clara entre infección respiratoria alta o baja. Situación: se recibe un hisopo seco o el material recolectado presenta un volumen insuficiente. Acción: informar a la persona que remite la muestra para que envíe una segunda muestra si es posible. Como criterio general, las muestras con hisopo no son convenientes para el aislamiento de hongos y deben rechazarse, excepto en circunstancias ocasionales. En cambio, puede ser necesaria la aspiración profunda o la biopsia del sitio afectado, lo cual depende de la presentación clínica. Situación: la muestra se remite en un recipiente inadecuado o en una condición incorrecta (evidencia de secado, pérdida o falta de esterilidad). Acción: notificar al individuo que remite la muestra acerca de que se ve afectada la posibilidad de obtener resultados relevantes. Si no puede obtenerse una segunda muestra de modo adecuado, la muestra puede procesarse, pero debe indicarse en el informe final que la calidad de la muestra era deficiente y que el resultado sólo puede interpretarse considerando la presentación clínica. Situación: se recibe una muestra de esputo o de orina de 24 horas para el cultivo de hongos. Acción: en el protocolo de rechazo debe aclararse que las muestras de esputo y de orina de 24 horas son subóptimas para el aislamiento y la identificación de hongos. Las posibilidades de contaminación con bacterias y hongos filamentosos ambientales son altas, lo que presta a confusión cualquier resultado que pueda obtenerse. Establecer en el protocolo que las muestras de la mañana deben obtenerse en tres días sucesivos. Como sucede con las micobacte­ rias, los hongos también tienden a eliminarse en las secreciones a intervalos intermitentes, lo cual aumenta la posibilidad de aislamiento si se recolectan muestras sucesivas durante 3 días.

cópico de los hongos filamentosos.147 En cada caso, una porción de la colonia del hongo se coloca con una gota de la anilina azul de lactofenol (colorante azul de algodón) sobre un portaob­ jetos y se examina con el microscopio. La técnica para llevar a ca­ bo la preparación por disección se presenta en el recuadro 21-3; para la preparación con cinta transparente, en el recuadro 21 -4, y para el procedimiento de microcultivo, en el recuadro 21-5. En el recuadro 21-1 se presentan otros términos utilizados durante la secuencia diagnóstica del laboratorio para los hongos.

SELECCIÓN E INOCULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

La serie de medios de cultivo para el aislamiento de hongos en muestras clínicas no necesita ser detallada. Aunque la tasa de aislamiento puede aumentarse en cierta medida mediante diversos medios, las consideraciones respecto del costo, el espacio para el almacenamiento y la incubación, y las deman­ das de tiempo del técnico microbiólogo por lo general deter­ minan, en la mayoría de los laboratorios, un enfoque más con­ servador. Dos tipos generales de medios de cultivo son esenciales para asegurar el aislamiento primario de los hongos clínicamente importantes en las muestras clínicas. Un medio no debe ser selectivo (como el agar de infusión de cerebro y corazón), es decir, que permitirá el crecimiento de casi todas las especies de hongos importantes en clínica. Se desalienta el uso del agar dextrosa de Sabouraud como medio de aislamiento primario porque es insuficientemente enriquecido para aislar ciertas especies patógenas con requerimientos nutricionales especia­ les, sobre todo la mayoría de los hongos dimorfos. Se reco­ mienda el uso de agar con láminas de patata (potcito fla k e ag a r ,

PFA), el agar inhibidor de hongos filamentosos ( inhibitory m old agar, IMA) o la combinación de agar dextrosa de Sabouraud con infusión de corazón (SABHI).147 El agar dex­ trosa de Sabouraud es suficiente para el aislamiento de dermatófitos de muestras cutáneas o de levaduras de los cultivos vagi­ nales. Los agares Mycosel o Mycobiotic, que en esencia son agar dextrosa de Sabouraud con el agregado de cicloheximida y cloranfenicol, pueden considerarse para el aislamiento de dermatófitos. El agar dextrosa de Sabouraud (2%) es muy útil como medio para el subcultivo de hongos aislados en un medio enriquecido para aumentar la esporulación típica y proporcionar la morfo­ logía de la colonia más característica. Si la morfología de la colonia es un criterio de identificación importante para cual­ quier aislamiento desconocido de especies de A spergillus debe usarse el subcultivo en agar de Czepak. Para el aislamiento de los hongos dimorfos con requeri­ mientos nutricionales espeiales, como B lastom yces derm atitidis e H istoplasm a capsulatum , debe utilizarse un agar base enriquecido como el agar inhibidor de hongos filamentosos, SABHI (agar dextrosa de Sabouraud más agar infusión de corazón) o infusión de cerebro y corazón (con cicloheximida y cloranfenicol). En el cuadro 21-5 se detallan los medios de ais­ lamiento para hongos utilizados con mayor frecuencia, los ingredientes importantes de cada fórmula y las aplicaciones específicas para las cuales está diseñado cada uno. Para el ais­ lamiento óptimo de algunas especies con requerimientos nutri­ cionales especiales, sobre todo H istoplasm a capsulatum , se recomiendan medios de cultivo con el agregado de 5-10% de sangre de carnero. Si se utilizan estos medios enriquecidos con sangre puede ser necesario subcultivar en un medio menos

1112

C A P ÍT U L O 21

Cuadro 21-4

Micología

Pautas para el examen directo y el procesamiento de muestras remitidas para cultivos de hongos

Respiratorias

El sistema de graduación de la calidad del esputo descrito en el capítulo 2 no es aplicable a las muestras remitidas para culti­ vos de hongos. Seleccionar las partes más purulentas o manchadas de sangre de la muestra. Si la muestra es muy viscosa, debe homogeneizarse mediante el agregado de una pequeña cantidad de W-acetil-L-cistina cristalina a la muestra. No deben usarse NaOH u otros agentes que digieren el material utilizado para el procesamiento de muestras para el aislamiento de micobacterias. Realizar la preparación en fresco de la muestra homogeneizada para el examen microscópico directo e ino­ cular alrededor de 0,5 mL a cada uno de los medios de cultivo que se van a usar Como las secreciones respiratorias a menudo están contaminadas con bacterias, deben usarse medios de cultivo que conten­ gan antibióticos. Se recomienda una combinación de agar no selectivo, como agar inhibidor de hongos filamentosos o agar SABHI y agar inhibitorio, como infusión de cerebro y corazón con cloranfenicol y cicloheximida

Líquido cefalorraquídeo

Las muestras de LCR pueden centrifugarse a 1 500-2 000 g durante 20 min y el sedimento inoculado en la superficie de medios de cultivo no inhibidores, como agar inhibidor de hongos filamentosos o agar SABHI. Si se dispone de más de 2 mL de líquido es preferible filtrar el líquido a través de una membrana de 0,45 |im, mediante el empleo de una jeringa Swinnex. Colocar el lado filtrado del papel de filtro boca abajo en la superficie del medio de cultivo apropiado. El papel debe colocarse en otros sitios con una pinza estéril utilizando un esquema de día por medio. Si sólo se dispone de una can­ tidad escasa de líquido, inocular tipo mancha la superficie del agar directamente en alícuotas de tres o cuatro gotas Las preparaciones en fresco con tinta china (la nigrosina es un sustituto aceptable) son útiles cuando se sospecha Cryptococcus neoformans. Para realizar la preparación se mezcla una gota del sedimento centrifugado o una cantidad pequeña de material de la superficie de la membrana con una gota de tinta china en un portaobjetos. Se aplica un cubre­ objetos y se lo observa con el microscopio para determinar la presencia de formas levaduriformes encapsuladas con brotes

Orina

Centrifugar alrededor de 10 mL de muestra de orina, inocular 0,5 mL del sedimento en un agar no inhibidor, como agar inhibidor de hongos filamentosos o agar de SABHI y a un medio inhibidor, como el agar de infusión de cerebro y corazón, que contenga cloranfenicol y cicloheximida. Pueden realizarse preparaciones directas en fresco y examinarse con el microscopio para determinar la presencia de levaduras o formas filamentosas

Piel, uñas y pelo

Las escamas de piel, los raspados de uñas y los pelos deben examinarse después del tratamiento con KOH. Esta preparación se realiza emulsionando la muestra en una gota de KOH al 10% sobre un portaobjetos. El propósito del KOH es eliminar cualquier resto de escamas o las membranas celulares que pueden confundirse con las hifas de hongos. El aclarado de la muestra puede acelerarse calentando la mezcla suavemente sobre la llama de un mechero Bunsen. Se aplica un cubreobje­ tos y la muestra se examina para determinar la presencia de hifas angostas y regulares que de modo característico terminan en artroconidios. La visualización de las hifas se mejora mediante el agregado de blanco de calcoflúor al reactivo de hidróxido de potasio y la observación con un microscopio de fluorescencia adaptado con filtros de longitudes de onda apropia­ dos. En el caso de los pelos puede observarse la disposición en mosaico de las esporas sobre la superficie del tallo (infec­ ción ectotrix) o los fragmentos de hifas y artroconidios en el interior (infección endotrix) Las escamas de piel, los raspados de uñas o los pelos pueden colocarse directamente sobre la superficie del medio de culti­ vo, como agar infusión de cerebro y corazón con cloranfenicol y cicloheximida (disponible comercialmente como agares Mycosel o Mycobiotic). Con un alambre recto de inoculación se sumerge uno de los fragmentos debajo de la superficie del agar. Examinar en las áreas de inoculación a intervalos frecuentes para determinar la aparición de colonias en la superficie. Los cultivos deben incubarse durante un mínimo de 30 días antes de desecharlos como negativos

Tejido

Cuando se procesan tejidos para el aislamiento de hongos, debe evitarse el uso de morteros u homogeneizadores de tejidos. Las hifas pueden destruirse con facilidad por la molienda, lo que dificulta el aislamiento de microorganismos viables en el cultivo (en especial si hay hifas no tabicadas de alguno de los zigomicetos). Es mejor desmenuzar el tejido en cubos de 1 mm con tijeras estériles o una hoja de bisturí afilada y colocar los fragmentos diminutos directamente sobre el agar, sumer­ giéndolos apenas debajo de la superficie con una aguja de inoculación Una muestra de 5 a 10 mL de tejido homogeinado, médula ósea o sedimento de la muestra líquida debe colocarse sobre la superficie de medios de cultivo apropiados. Los medios de cultivo no selectivos, sin antibióticos, como agar inhibidor de hongos filamentosos o SABHI, son probablemente adecuados, ya que estas muestras suelen ser estériles y no es necesaria la inhibición por antibióticos

Sangre

Los frascos comerciales para hemocultivos diseñados para el aislamiento de bacterias de sangre no son convenientes para la recuperación de muchas especies de hongos. El sistema Isolator (Wampole Laboratories, Cranbury, NJ) resultó promisorio para el aislamiento más directo de hongos en muestras de sangre obtenidas de pacientes con sepsis por hongos. Si se utili­ za este sistema, deben seguirse estrictamente las instrucciones del fabricante. En particular, debe tenerse cuidado durante la fase de subcultivos para evitar la contaminación con microorganismos ambientales. Durante este procedimiento se acon­ seja trabajar en una cámara con flujo laminar

enriquecido, como el agar dextrosa de Sabouraud o el agar dex­ trosa patata de manera que pueda observarse la morfología característica de la colonia y los modos de esporulación. También debe usarse un segundo medio más selectivo para el aislamiento de hongos. El agregado de uno o más antibióti­

cos, como penicilina (20 U/mL), estreptomicina (40 U/mL), gentamicina (5 (ig/mL) o cloranfenicol (16 lig/mL) puede utili­ zarse para inhibir el crecimiento de bacterias. La cicloheximida (Acti-Dione®) en una concentración de 0,5 Lig/mL. también puede agregarse para evitar el sobrecrecimiento de ciertos hon-

P rocedim ientos de laboratorio para el diagnóstico de infecciones m icóticas

Recuadro 21-3

Procedim iento: preparación en fresco por disección

• Con un par agujas de disección o palillos aplicadores puntiagudos, des­ prender una porción pequeña de la colonia por examinar, incluso las porciones del agar por debajo de la superficie. • Colocar el fragmento de la colonia en un portaobjetos con una gota del colorante de anilina azul de lactofenol, disgregar la colonia con las agu­ jas de disección (fig. 21-4) y cubrir con un cubreobjetos. • Ejercer una presión suave sobre la superficie del cubreobjetos con el extremo de goma de un lápiz puede ayudar a dispersar la preparación, en especial si hay pequeños trozos cortos y gruesos de agar. • Examinar la preparación con el microscopio, primero con objetivo de bajo aumento (1 Ox) y luego de gran aumento (40x) o con inmersión ( lOOx) si se observan estructuras sospechosas de hongos. • Al disgregar la colonia a menudo se rompen las delicadas estructuras de fructificación de los hongos filamentosos, lo que en algunos casos difi­ culta visualizar las disposiciones características de las esporas o las uniones a las hifas necesarias para la identificación definitiva. En estos casos puede requerirse la preparación con cinta transparente o microcultivo en portaobjetos.

gos filamentosos ambientales de crecimiento rápido. Los hongos patógenos oportunistas, como C ryptococcus neoform ans y A spergillus fu m igatus, pueden ser inhibidos de modo parcial o total por la cicloheximida; por consiguiente, siempre debe usarse en paralelo un medio no selectivo.

Recuadro 21-4

1113

P rocedim iento: preparación con cinta transparente

• El método de preparación de cultivos con cinta transparente para el exa­ men microscópico suele ser útil porque se conserva bien la disposición de las esporas de los hongos filamentosos más delicados. • Presionar el lado adhesivo la cinta de celofán clara no esmerilada, en forma suave pero firme sobre la superficie de la colonia, recogiendo una porción del micelio aéreo (fig. 21-5A). Este procedimiento siempre debe realizarse bajo una campana de seguridad biológica. También debe tenerse cuidado de que los dedos expuestos no entren en contacto con la superficie del hongo filamentoso. Para máxima seguridad, deben usarse guantes. • La preparación se realiza colocando una gota del colorante de anilina azul de lactofenol sobre un portaobjetos. • Pegar un extremo de la cinta a la superficie del portaobjetos adyacente a la gota del colorante. • Extender la cinta sobre el colorante, bajándola suavemente para que el micelio se embeba con aquel (fig. 21-5B). • Estirar de modo tirante la cinta y pegar el extremo opuesto al vidrio, evitando todo lo posible el atrapamiento de burbujas de aire. • Puede necesitarse cierta práctica para retirar la superficie pegajosa de la cinta si se usan guantes. • La preparación puede examinarse ahora al microscopio de la misma manera como se describió para la preparación en fresco por disección, con excepción de que el uso de aceite de inmersión no es satisfactorio debido a la interferencia de la sustancia de la cinta. • El método de la cinta transparente es económico, rápido, simple de rea­ lizar y, con algunas excepciones, permite una identificación exacta.

INCUBACIÓN DE LOS CULTIVOS PARA HONGOS

En la actualidad se recomienda la incubación de todos los cultivos para hongos a la temperatura controlada de 30 °C. La incubación de un segundo conjunto de placas a 35 °C para el aislamiento de las formas levaduriformes de los hongos dimor­ fos no es rentable. La práctica anterior de intentar convertir los aislamientos sospechosos de hongos filamentosos dimorfos a su forma levaduriforme fue reemplazada en gran medida por los ensayos con sondas de ácidos nucleicos. Este último méto­ do puede realizarse en cuanto se visualizan las colonias en los medios de aislamiento primarios, antes de la observación de la esporulación diagnóstica. Todos los cultivos para hongos deben incubarse durante un mínimo de 30 días antes de desecharlos como negativos, aun cuando las placas parezcan contaminadas por bacterias u otros hongos. Las colonias de H. capsulatum , por ejemplo, pueden observarse creciendo en la superficie de colonias de C. albicans o en la parte superior de hongos filamentosos contami­ nantes. La elección entre el uso de tubos o placas es opcional. Para los laboratorios con bajo volumen de trabajo, con personal que puede no estar familiarizado con el manejo de los hongos o en los casos en que puede escasear el espacio en la estufa de incu­ bación y para el almacenamiento se recomienda el uso de tubos, en especial de tubos de cultivos grandes (150 x 25 mm) con tapas a rosca, firmemente ajustadas. Los medios deben ver­ terse en forma de agar inclinado grueso para evitar la deshidratación durante el período prolongado de incubación. Después de inocular el medio, hay que asegurarse de no ajustar dema­ siado la tapa porque es necesario que los hongos “respiren” para poder sobrevivir. Una ventaja adicional de los cultivos en tubo es la facilidad para su transporte. La desventaja principal

es la dificultad para realizar las preparaciones teñidas para el examen microscópico. Las placas de Petri tienen la ventaja de proporcionar una superficie de crecimiento más grande, lo que produce mejor separación de las colonias y facilita la observación y la realiza­ ción de subcultivos. Las colonias de hongos en cultivos mixtos

Figura 21 -4 Preparación en fresco que ilustra la disección del fragmento con agujas en una gota del colorante de anilina azul de lactofenol antes de la colo­ cación del cubreobjetos.

1114

C A P ÍT U L O 21

Micología

Figura 21-5 A. Preparación con cinta transparente: el lado adhesivo de la cinta se presiona en la superficie de la colonia del hongo. B. Preparación con cinta trans­ parente: la cinta inoculada se estira sobre una gota del colorante azul de lactofenol en la superficie de un portaobjetos.

son más fáciles de separar y trabajar como colonias individua­ les. Las preparaciones por disección o con cinta transparente se efectúan de modo eficaz de los cultivos en placas, lo que tal vez determina mejores posibilidades de realizar la identificación presuntiva en menos tiempo. Como los cultivos en placa pue­

Recuadro 21-5

den deshidratarse durante el período de incubación prolongado, pueden sellarse, colocarse en bolsa de poliéster hidratada o el borde de la placa de Petri puede sellarse con cinta permeable al oxígeno. Si se utiliza una estufa de incubación sólo para los cultivos de hongos, la colocación en el último estante del piso

P roced im iento: técn ica de m icro cultivo en portao bjeto s

En los casos en que ni la preparación en fresco por disección ni la de la cinta transparente permitan establecer una identificación exacta, o cuando se deseen preparaciones permanentes para el estudio ulterior o para el uso con fines didácticos, se recomienda la técnica de microcultivo. Aunque algo tediosa para realizar, pueden hacerse preparaciones de alta calidad en las que se conservan a la perfección las estructuras y las disposiciones de las esporas. La técnica es la siguiente: 1. Colocar un trozo redondo de papel del filtro o de gasa en el fondo de una placa de Petri estéril. Colocar un par de varillas de vidrio delgadas o palillos de un aplicador cortados a la longitud necesaria para poner encima del papel del filtro y que sirva como apoyo a un portaobjetos de 7,5 x 2,5 cm (fig. 21-6A). 2. Colocar un bloque o tapón de agar harina de maíz o agar dextrosa patata (fig. 21-6B) en la superficie del portaobjetos (fig. 21-6C). Si se desea más de una preparación, pueden colocarse dos bloques, separados por cerca de 2.5 cm. 3. Inocular los márgenes del tapón de agar en tres o cuatro lugares con una porción pequeña de la colonia por estudiar, usando un alambre de inoculación recto o la punta de una aguja de disección (fig. 21-6D y E). 4. Calentar en forma suave un cubreobjetos pasándolo con rapidez a través de la llama de un mechero Bunsen y colocarlo de inmediato directamente en la superficie del bloque del agar inoculado. Al calentar el cubreobjetos se produce un sellado firme entre su fondo y la superficie de agar que se funde brevemente por el vidrio caliente. 5. Pipetear una cantidad pequeña de agua en el fondo de la placa de Petri para saturar el papel del filtro o la gasa. Colocar la tapa de la placa de Petri e incubar a temperatura ambiente (o 30 °C) durante 3 a 5 días. 6 . Cuando el crecimiento parece estar maduro a simple vista (fig. 21-6F). el cubreobjetos pueden levantarse con suavidad de la superficie del agar con un par de pinzas. Debe tenerse cuidado para no romper el micelio que se adhiere al fondo del cubreobjetos más de lo necesario (fig. 21-6G). 7. Colocar el cubreobjetos en una gota pequeña del colorante azul de lactofenol aplicada a la superficie de un segundo portaobjetos de 7,5 x 2,5 cm (fig. 2I-6H). La preparación puede conservarse para el estudio sellando los bordes externos del cubreobjetos con líquido de montar o esmalte de uñas claro. Esta actividad debe realizarse bajo una capucha de seguridad biológica. 8 . Después de retirar el cubreobjetos del bloque (o bloques) de agar, éste puede sacarse del portaobjetos mediante el palillo de un aplicador. Esto se reali­ za sobre un recipiente que contenga líquido de desinfección con fenol al 5% donde se dejan caer los bloques de agar. El micelio que queda adherido a la superficie del portaobjetos original después de haber retirado el bloque también puede teñirse con azul de lactofenol y cubrirlo con un cubreobjetos, lo cual sirve como segunda preparación en fresco. De nuevo, esta preparación puede conservarse para el estudio futuro sellando el cubreobjetos con líquido de montar o esmalte de uñas claro, como ya se describió. No hay que preocuparse si los bloques de agar están completamente secos antes de cosechar el cubreobjetos. Aun cuando éste esté firmemente adherido a la superficie del vidrio, puede colocarse una gota de azul de lactofenol adyacente a un borde del portaobjetos. Por acción capilar el colorante se difundirá entre la superficie inferior del cubreobjetos y el portaobjetos. De hecho, a menudo hay menos rotura de los elementos del micelio y se obtienen preparaciones de mejor calidad.

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Figura 21-6 Serie de fotografías que describen la preparación de un microcultivo. Para los detalles, véase el recuadro 21-4. 1115

1116

CAPÍTULO 21

Cuadro 21-5

Micología

Medios de cultivo para el aislamiento primario de hongos comunes e indicaciones para su uso

MEDIOS DE CULTIVO Agar infusión de cerebro y corazón

INGREDIENTES ESENCIALES Infusiones de cerebro de ternero y corazón de vaca; proteosa peptona, NaCl. fosfato disódico y agar

INDICACIONES PARA EL USO Aislamiento prim ario de hongos saprofitos y dimorfos

(Pueden agregarse cicloheximida y cloranfenicol para el aislamiento selectivo de hongos filamen­ tosos dimorfos) Agar inhibidor de hongos filamentosos (IMA)

Triptona, extracto de carne, extracto de levadura, dextrosa. almidón, dextrina. cloranfenicol. gen­ tam icina y tam pones (buffers) salinos

Aislamiento primario de hongos patógenos dim or­ fos. No se aislarán hongos saprofitos y derm ató­ fitos

Agares Mycosel/M ycobiotic

Peptona de fitona, dextrosa, agar, ciclohexim ida, cloranfenicol,

Aislamiento primario de dermatófitos

Agar SABHI (agar infusión de corazón de Sabouraud)

Láminas de patata, dextrosa, agar

Aislamiento primario de hongos saprofitos y dimorfos, en especial las cepas con requerim ien­ tos nutricionales especiales

Agar dextrosa de Sabouraud

Dextrosa, neopeptona. agar

No recom endado com o medio de aislamiento pri­ mario. Es m ejor para la secuencia diagnóstica secundaria de los cultivos

Agar patata

Láminas de patata, dextrosa, agar

Aislamiento primario de hongos saprofitos y dim orfos, en especial las cepas con requerim ien­ tos nutricionales especiales y de crecim iento lento

de un recipiente plano y abierto con agua sirve para proporcio­ nar la humedad necesaria para el aislamiento óptimo. Sin embargo, debe tenerse cuidado de controlar el crecimiento de hongos filamentosos ambientales en el agua.

Procedimientos de laboratorio para la identificación presuntiva de aislamientos de hongos Una vez que la observación de la placa de cultivo revela el crecimiento probable de un hongo, pueden evaluarse varias características de la colonia para determinar a qué grupo prin­ cipal puede pertenecer el aislamiento. En el cuadro 21-6 se presenta una guía para la identificación de género y especie de los hongos importantes en medicina basada en la morfología de la colonia y las características microscópicas mediante la observación de los cultivos primarios incubados a 30 °C. Si el hongo se presenta con un micelio aéreo velloso o algodonoso característico debe considerarse una de las varias especies de hongos filamentosos. Si el hongo filamentoso tiene creci­ miento rápido, que llena la placa de Petri sin un borde exter­ no en el transcurso de 48-72 horas, debe considerarse uno de los hongos zigomicetos (véase diagrama 21-1 al final de este capítulo). Los hongos filamentosos que crecen en 3-5 días, con un borde distintivo y de color blanco o pastel en la superficie, a menudo con una zona blanca de crecimiento nuevo en la peri­ feria, lo más probable es que pertenezcan al grupo hialino de los hongos filamentosos. En el diagrama 21-2 se presentan las claves para la identificación de los hongos filamentosos hiali­ nos y en el diagrama 21-3 para la identificación de los hongos filamentosos aislados en raspados de piel, uñas o pelos, que con posibilidad pertenezcan al grupo de dermatófitos.

En el caso de los hongos filamentosos que suelen presentar crecimiento más lento (7-14 días) o que presentan un micelio aéreo delicado o similar a una telaraña, gris o gris castaño, debe considerarse una de las especies dimorfas. Los hongos fila­ mentosos dimorfos se encuentran en la forma filamentosa cuando se incuban a temperatura ambiente (25-30 °C) y en la forma levaduriforme cuando se incuban a la temperatura cor­ poral (35-37 °C). A veces, las colonias de ciertos hongos fila­ mentosos dimorfos aparecen focalmente como levaduriformes cuando se incuban a 30 °C. Los hongos dimorfos pueden con­ vertirse, a veces con dificultad, de la forma filamentosa a la levaduriforme cuando el subcultivo en agar enriquecido se incuba a 35-37 °C. El enfoque para la identificación de especie de este tipo se presenta en el diagrama 21-4. En las colonias que desarrollan un micelio gris oscuro o negro, especialmente notorio cuando se observa el reverso de la colonia, debe considerarse uno de los hongos filamentosos dematiáceos. En el diagrama 21-5 se muestra la diferenciación de género y especie de hongos saprofitos de crecimiento más rápido. Las claves para la identificación de las especies de dematiáceos patógenos de crecimiento lento se muestran en el diagrama 21-6, asociadas con cromomicosis y micetomas. Si la colonia tiene un aspecto liso, cremoso, viscoso y pastoso debe considerarse una levadura. Para la identificación de género y especie de las levaduras comunes y menos comunes encontra­ das con mayor frecuencia, incluso las especies levaduriformes productoras de artroconidios que pueden producir un micelio aéreo bajo y las "levaduras negras”, véase el diagrama 21-7. Una vez realizadas las observaciones iniciales descritas en el cuadro 21-6 y ubicado el hongo dentro de uno de los grupos indicados allí, se requerirán estudios adicionales para hacer la identificación final de género y especie, utilizando los siguien­ tes criterios microscópicos:

Cuadro 21-6

Id e n tific a c ió n d e h o n g o s im p o r ta n te s d e s d e el p u n to d e v ista m é d ic o , c r e c im ie n to in ic ia l a

H IALINO

Rhizopus Absidia Syncephalastrum Circinella Cunninghamella Mucor

DEM ATIÁCEOS

COLO NIAS FILAM ENTOSAS

Crecim iento de 3-5 días Crecim iento de 3-5 días Hifas hialinas y tabica­ Colonias a menudo gra­ nulares y pigm enta­ das Sospecha de agentes das; hifas tabicadas. hialinas productores de hia­ Sospecha de lohifom icosis Conidios en cadenas: derm atófito Género M icrosporum Aspergillus Frecuentes: Penicillium

Pciecilomyces Scopulariopsis

Microsporum canis Microsporum gypseum

Conidios en grupos:

Infrecuentes:

Acremonium Fusarium Trichoderma Gliocladium

Microsporum audouinii Microsporum nanum

Conidios que se disponen indivi­ dualmente:

Trichophyton Trichophyton grophytes Trichophyton Trichophyton sum

Género Trichophyton Frecuentes:

rubrum menta-

tonsurans Scedosporium apiospermum verruco­ Scedosporium prolificans (inflatum) Infrecuentes: Trichophyton violaceum Chrysosporium Sepedonium Trichophyton schoenleinii

Crecim iento > 5 días Hifas hialinas y delga­ das Crecim iento en agar cicloheximida La levadura se form a cuando se incuba a 35 °C Sospecha de hongos dimorfos:

Crecim iento de 3-5 días Crecim iento > 5 días Colonia oscura; negra C olonia oscura; negra en el reverso; hifas en el reverso; hifas pigm entadas de am a­ pigm entadas de am a­ rillo y tabicadas rillo y tabicadas Sospecha de agentes Sospecha de agentes de crom om icosis o de feohifomicosis: C onidios muriformes: micetom as Esporulación tipo claAlternaría Ulocladium dosporio:

Blastomyces dermatitidis Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Sporothrix schenckii Pa racoccidioides brasiliensis

Stemphylium Epicoccum C onidios divididos sólo por tabiques transversales:

Curvularia Bipolaris ( Drechslera) Exserohilum

Cladophialophora carrionii Cladophialophora bantianum Esporulación tipo fialófora:

COLO NIAS DE LEVADURAS Crecim iento de 2-5 días Colonias lisas, pasto­ sas o m ucoides Sospecha de levaduras Frecuentes:

Crecim iento de 2-5 días Colonias parecidas a las levaduras con bajo m icelio aéreo Producción de artroconidios Sospecha:

Candida albicans Cryptococcus neoformans Cryptococcus Rhodotorula

Geotrichum candidum Com plejo Trichosporon beigelii Blastosch izomyices capitus

Infrecuentes:

Hansenula anómala Malassezia fúrfur Saccharomyces cerevisiae

Producción de picnidios:

Phiaiophora verucosa Phiaiophora richardsiae Exophiala jeanselmei

Phoma Chaetomium

Esporulación tipo acroteca:

Especies de

Fonsecaea pedrosoi Fonsecaea compacta

Levaduras negras:

Raros: Especies de

Basidiobolus Conidiobolus Pullularia pullulans Phaeoannellomyces werneckii

Género Epidermophyton:

Especies de

Epidermophyton floccosum

Formas de levaduras de los hongos dim orfos (incuba­ ción a 35 °C) Véase diagram a 21-7 para las características de identificación de especie

Véase diagram a 21-1 Véase diagram a 21-2 Véase diagram a 21-3 para las característi­ para las característi­ para las caracterís­ cas de identificación cas de identificación ticas de identifica­ de especie de especie ción de especie

CO LO NIAS LEVADURIFORM ES

Phaeococcomyces

Véase diagram a 21-6 Véase diagram a 21-4 Véase diagram a 21-5 para las característi­ para las característi­ para las característi­ cas de identificación cas de identificación cas de identificación de especie de especie de especie

Véase diagram a 21-7 para las característi­ cas de identificación de especie

Procedimientos de laboratorio para la identificación presuntiva de aislamientos de hongos

Crecim iento < 3 días Hifas anchas y sin tabiques Sospecha de zigom icetos

30 °C

1117

1 11 8

CAPÍTULO 21

Micología

• Si se observan hifas, determinar su estructura. Son: • ¿tabicadas o no tabicadas? • ¿ramificadas (en ese caso, en qué ángulos) o no rami­ ficadas? • ¿pigmentadas o no pigmentadas? • ¿con un ancho regular o irregular? • ¿compuestas por artroconidios o seudohifas? • Determinar la estructura y el origen de los cuerpos de fructi­ ficación. • Visualizar el tipo de conidiación: • El tamaño y la forma de las esporas o los conidios. • El tamaño, la forma y la disposición de las esporas. • Buscar la presencia de estructuras diagnósticas especiales: picnidios, cleistotecios, células de Hülle. • Si sólo se observan levaduras: • Considerar su tamaño, forma y disposición. • Buscar la presencia o la ausencia de cápsulas. • Determinar el tipo de células hijas de la blastoconidiación; ¿son únicas o múltiples? En el cuadro 21-7 se presentan otras pautas para la identifi­ cación presuntiva de hongos basada en el examen microscópi­ co directo de muestras clínicas. Im p o rta n c ia de la id e n tific a c ió n del g é n e ro o la e s p e c ie en el la b o ra to rio

El cuadro 21-6 también puede usarse como una guía de hasta qué punto se requieren las identificaciones de género y especie en la mayoría de las situaciones clínicas. Como casi cualquier hongo filamentoso aislado en cultivo puro de los sitios del cuerpo normalmente estériles puede representar un patógeno oportunista, antes de descartar el aislamiento como insignifi­

Cuadro 21-7

cante se recomienda realizar las correlaciones clínicas. Las identificaciones de especie no necesitan ir más allá de las men­ cionadas en el algoritmo; otros aislamientos no identificados específicamente deben informarse con el nombre del género adecuado y anteponiendo especies de (p. ej., especies de Asper­ gillus). Dado que las levaduras suelen aislarse como comensales de muestras de piel y respiratorias, la secuencia diagnóstica defi­ nitiva debe ser limitada y sólo debe realizarse cuando está indi­ cada por la clínica. Las cepas clínicas relevantes aisladas en te­ jidos (en especial si se observan los elementos micóticos en cortes teñidos de tejido), líquidos corporales normalmente esté­ riles y aspirados deben identificarse en cuanto a género y espe­ cie. La identificación de ciertas especies, Candida krusei por ejemplo, predice la resistencia para seleccionar agentes antimicóticos, como los imidazoles. Si también se aíslan otros micro­ organismos, debe considerarse la posibilidad de contaminación y se recomienda la correlación clínica antes de proceder con la secuencia diagnóstica extensa. Los hongos aislados en hisopos o heridas superficiales deben evaluarse acerca de su importan­ cia clínica. Se siguen los criterios por los cuales pueden identi­ ficarse los hongos que figuran en el cuadro 21-6. La presenta­ ción de los diversos grupos de hongos seguirá el orden de las columnas del cuadro 21-6, con enlaces a los diagramas 21-1 a 21-7 (que figuran al final de este capítulo) para los criterios de identificación más detallados. Identificación del género y la especie de los principales grupos de hongos ESPECIES DE ZYGOMYCES Y ZIGOMICOSIS

Los hongos que pertenecen a la subclase Zygomycetes son habitantes del medioambiente y están extensamente distribui­ dos en el suelo, el estiércol y la materia orgánica. Los seres

Identificación presuntiva de hongos basada en la observación microscópica directa del material proveniente de muestras clínicas

OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS DIRECTAS

IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA

Hifas relativamente pequeñas (3-6 |im ) de tam año regular que se ramifican en form a dicotóm ica en ángulos de 45° con tabiques diferenciados transversales

Especies de Aspergillus

Hifas de tam año irregular (6-50 (im), en forma de cintas y desprovistas de tabiques

Zygomicetes (Phycomycetes)

Rhizopus-Mucor-Absidia Hifas pequeñas (2-3 flm) y regulares, algunas ram ificadas con artrosporas rectangulares a veces vistas; se encuentran sólo en piel, raspados de uña y pelo

Grupo de dermatófitos Especies de Microsporum Especies de Trichophyton Especies de Epidermophyton

Hifas de diám etro regular (3-6 ¡im), paredes paralelas, bifurcación irregular, tabicadas, am arillo oscuro, castañas o hialinas

Especies de Phaeohyphomyces Especies de Hyalohyphomyices

Hifas con puntos separados de contracción que simula la unión de una ristra de salchichas (seudohifas); a m enudo se observan form as de levaduras que em iten brotes (blastosporas)

Especies de Candida

Formas de levadura, células esféricas y de tamaño irregular (5-20 |im ), clásicam ente con una cápsula polisacárida gruesa (no todas las células son encapsuladas), con uno o más brotes adheridos por una unión estrecha

Cryptococcus neoformans Especies de Cryptococcus, no encapsulados

Levadura pequeña que em ite brotes, de tamaño relativamente uniforme (3-5 pm ), con un solo brote unido por una base estrecha, extracelular o dentro de macrófagos

Histoplasma capsulatum

Formas de levadura, grandes (8-20 |im ), con células que parecen tener una pared gruesa, con doble contorno y un solo brote unido por una base ancha

Blastomyces dermatitidis

Grande, de tam año irregular (10-50 pm ), esférulas de pared gruesa m uchas de las cuales contienen endosporas pequeñas (2-4 pm ) y redondas

Coccidioides immitis

P ro c e d im ie n to s de la b o ra to rio p a ra la id e n tific a c ió n p re s u n tiv a d e a is la m ie n to s de h o n g o s

1119

m W K \ N ü m F ig u r a 21 -7 Microfotografía de las hifas anchas y acintadas de especies de Zv-

gomyces. Nótense el endoplasma claro y la ausencia de tabiques transversales.

humanos suelen sufrir infecciones de las vías respiratorias altas a través de la inhalación de esporas transportadas por el aire, aunque la ingestión de productos alimenticios contaminados puede causar enfermedad gastrointestinal primaria. La inocula­ ción directa por traumatismos de la piel y las mucosas puede producir infección mucocutánea primaria. La mayoría de los miembros de los zigomicetos tiene una proclividad para produ­ cir la invasión por hifas de las paredes de los vasos sanguíneos una vez que se ha establecido la infección primaria, lo que a menudo causa la diseminación de trombos micóticos y el desa­ rrollo de focos metastásicos en muchos órganos. Los hongos importantes desde el punto de vista médico den­ tro de la subclase Zygomycetes incluyen varios géneros, de los cuales seis se presentan aquí, como figura en el diagrama 21-1. Las especies de Rliizopus, de Absidia, de Syncephalastrum, de Circinella, de Cunninghamella y de M ucor pueden identificar­ se por los criterios indicados. Rhizomucor pusillus, Saksenaea vasiformis, Apophysomyces elegans y los agentes del orden Entomoftorales entomophthoromycotic, Conidiobolus coronatus y especies de Basidiobolobus, raras veces se aíslan en los laboratorios clínicos y no se presentarán aquí. Como se describe en el diagrama 21-1, el indicio inicial en el diagnóstico de las zigomicosis es el aislamiento de una colonia de crecimiento rápido en el medio de cultivo primario, por lo general dentro de las 48-72 horas, con la superficie del agar cubierta con un micelio velloso que se extiende de un borde al otro de la placa de Petri (“levantador de tapa”) (véase lámina en color 21-1A y B). El examen microscópico de la preparación en fresco de la colonia revela hifas anchas, irregulares, como cintas, no tabicadas (con escasos tabiques en los cultivos más viejos) (fig. 21-7) y las esporas producidas en estructuras con forma de bolsa conocidas como esporangios (fig. 21-8). El pri­ mer paso para realizar la identificación del género es observar la presencia o la ausencia de rizoides similares a raíces (fig. 21-9). Las identificaciones del género pueden entonces hacerse siguiendo los criterios descritos en el diagrama 21-1; a conti­ nuación se presentan las descripciones y las referencias a la figura. Especies de Rhizopus. La clave para la identificación de las espe­ cies de Rhizopus es la producción de rizoides característicos, similares a raíces. Los rizoides que de modo típico se originan de la hifa inmediatamente adyacente al esporangióforo se de­

F ig u r a 2 1 -8 M icrofotografía de un esporangio de especies de Mucor, el órgano reproductor asexual de los zigomicetos. Nótense la extensión de la colum ela en el esporangio y la agregación de esporangiosporas.

nominan “nodal” (fig. 21-10). Los esporangióforos que miden hasta 1 000 |im terminan en una columela cóncava que se ex­ tiende al interior del esporangio sacular. El colapso en forma de paraguas del esporangio posmaduro se ilustra mejor en la imagen detallada de la figura 21-11. Este colapso se observa a menudo como un rasgo secundario en los cultivos más viejos, particularmente útil para identificación preliminar cuando los rizoides están desarrollados de manera insuficiente. Especies de Absidia. Las especies de Absidia comparten con las especies de Rhizopus la producción de rizoides. Sin embargo, los rizoides de las especies de Absidia difieren, ya que suelen ser más delicados y se originan de hifas entre los conidióforos, un origen conocido como “internodal" (fig. 21-12). Los espo­ rangióforos pueden ramificarse. Una característica secundaria de importancia, en especial en cepas en que los rizoides se desarrollan de modo deficiente, es la expansión en forma de embudo del conidióforo terminal en una estructura conocida como apófisis (fig. 21-13). Especies de Syncephalastrum. Las especies de Syncephalastrum difieren de los otros zigomicetos en la forma y la disposición de los esporangios. En lugar de formar una esfera, los “meros-

F ig u r a 2 1 -9 M icrofotografía de los rizoides sim ilares a raíces de especies de

Rhizopus, característicos de los zigomicetos.

1 12 0

CAPITULO 21 Micología

F i g u r a 2 1 - 1 0 M icrofotografía de la estructura de fructificación de especies de Rhizopus. Nótese el origen de los esporangióforos adyacentes a los rizoides similares a raíces (flecha), denom inado “nodal” .

F i g u r a 2 1 -1 1 Imagen con mayor aumento de un esporangio posmaduro de especies de Rhizopus que ilustran el colapso característico en forma de paraguas.

porangios” de Syncephalastrum son cilindricos y dispuestos como “pétalos de margarita” alrededor de una columela esféri­ ca, relativamente pequeña (10-50 |im ) (ñg. 21-14). Las espo­ rangiosporas están alineadas en serie, una detrás de la otra, dentro de cada esporangio. Este aspecto hace recordar a Aspergillus flavas; sin embargo, cuando se examina la morfo­ logía de la colonia y la estructura de las hifas, la diferenciación se realiza con rapidez. En ocasiones se visualizan rizoides rudi­ mentarios. Especies de Circinella. La característica de identificación impor­ tante de las especies de Circinella es la curva hacia atrás dis­ tintiva de los esporangióforos. Estos nacen lateralmente de la hifa, se curvan directamente en sentido inverso y terminan en un esporangio globuloso que suele estar repleto de esporan­ giosporas (fig. 21-15). Las especies de Circinella no producen rizoides. Especies de Cunninghamella. La esporulación de las especies de Cunninghamella difiere de la de otros zigomicetos porque pro­ duce esporas esféricas especializadas, denominadas esporan-

giolas. a partir de la superficie de una columela grande, globulo­ sa, sin estar envueltas por un esporangio (fig. 21-16). Cuando se ajusta el foco del objetivo del microscopio, puede observarse que cada esporangiola está adherida a la columela por una estructura diminuta, similar a un pelo, que se denomina dentículo. Especies de Mucor. La identificación de especies de Mucor a menudo se realiza después de que se ha descartado cada una de las especies anteriores. Las especies de Mucor no producen rizoides. Los esporangióforos se originan individualmente del micelio, que puede ser ramificado o no. Cada esporangióforo acaba en una columela ligeramente bulbosa que se extiende dentro de un esporangio esférico de pared lisa (fig. 21-17). Las esporangiosporas son esféricas o elipsoidales y pueden ser hia­ linas o pigmentadas de color amarillo castaño.

A

F i g u r a 2 1 - 1 2 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de especies de Absidia, que m uestran el origen internodal característico de los conidióforos.

HISTOPATOLOGÍA DE LAS INFECCIONES CAUSADAS POR ZIGOMICETOS

Las hifas no tabicadas, anchas, en forma de cinta de los zigo­ micetos suelen ser distintivas de otros hongos productores de

H o n g o s fila m e n to s o s h ia lin o s y h ia lo h ifo m ic o s is

hifas en cortes de tejido. Las hifas varían de 3 a 25 |im de ancho, con paredes no paralelas que a menudo tienden a rom­ perse en fragmentos pequeños (fig. 21-18). Con frecuencia las hifas no se tiñen bien, incluso con las tinciones para hongos, como ácido peryódico de Schiff (PAS) o metenamina argéntica de Gomori. La reacción del tejido es típicamente purulenta y se observan tanto hifas intactas como fragmentadas en medio de una enorme cantidad de neutrófilos segmentados. Pueden observarse tabiques ocasionales. En cortes transversales de las hifas. éstas también pueden imitar esporas o esférulas inmadu­ ras pequeñas de Coccidioides immitis, por lo que existe la posi­ bilidad de arribar a una conclusión incorrecta. Los zigomicetos también tienen predilección por invadir los vasos sanguíneos, lo que causa infarto hemorrágico (una razón por la que el teji­ do infectado suele aparecer como carbonizado). Los zigomice­ tos también pueden presentarse como una bola micótica en las cavidades del cuerpo y, de vez en cuando, se observan las cabe­ zas de fructificación típicas y completas con el esporangio y las esporangiosporas. Los síndromes clínicos producidos por los zigomicetos se presentan en la recuadro de correlación clínica 21-1.

F ig u ra 2 1 -1 3

1121

Imagen con m ayor aumento de la apófisis de especies de

Absidia ; se observa la expansión del extrem o term inal del esporangióforo en form a de embudo.

Hongos filamentosos hialinos y hialohifomicosis Ajello6 acuñó originalmente el término “hialohifomicosis” para representar un grupo de infecciones micóticas oportunis­ tas causadas por una variedad de hongos filamentosos saprofi­ tos de crecimiento rápido. Este autor supuso que esa designa­ ción sería menos confusa para los médicos que utilizar los nombres individuales, como peniciliosis, paecilomicosis o escopulariopsis. Sin embargo, desde ese momento el personal de laboratorio se puso más hábil para realizar las identificacio­ nes de género de los diversos hongos incluidos en el grupo y los médicos han tenido la experiencia adicional en las aplica­ ciones clínicas de informes del laboratorio que mencionan el nombre del género o de la especie de los hongos filamentosos hialinos aislados con mayor frecuencia. En particular, debe rea­ lizarse la identificación por cultivo de Scedosporium apiospermwn (y también su teleomorfo, Pseudallescheria boydii) y de especies de Fusarium. Es importante distinguir estos hongos, muchas de cuyas cepas son resistentes a la anfotericina B, de

m,

A F i g u r a 2 1 - 1 4 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de especies de Syncephalastrum, que m uestran los esporangios dispuestos en form a radiada alrededor de una columela esférica.

las especies de Aspergillus y otros hongos filamentosos hialinos que pueden parecer similares en cortes de tejido. Cada micólogo debe determinar hasta qué punto debe extenderse la identifi­ cación de género y especie que se informa para adaptarse mejor a las necesidades de los médicos con los cuales trabaja. Especies de Aspergillus y aspergilosis

Debido a su ubicuidad en la naturaleza y la frecuencia con que se aíslan en los laboratorios clínicos como agentes de enfermedades micóticas, las especies de Aspergillus suelen tra­ tarse como un subconjunto separado de hongos filamentosos hialinos. Las especies de Aspergillus están extensamente distribuidas en la naturaleza; se encuentran en el suelo, en la vegetación en descomposición y en una amplia variedad de materia orgánica. La inhalación de polvo contaminado por esporas es el modo más frecuente de infección para los seres humanos y causa

1122

A

CAPÍTULO 21 Micología

>2S

F i g u r a 2 1 - 1 5 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de especies de Circinella, que m uestran la curva dirigida hacia atrás característica de los esporangióforos.

sinusitis o enfermedad broncopulmonar. Para la rinosinusitis micótica, Schubert248 describe tres formas invasoras (necrosan­ te aguda, invasora crónica e invasora granulomatosa) y dos no invasoras (granuloma micótico y alérgica). Durante los períodos de mayor construcción edilicia, en espe­ cial en las zonas lindantes a los hospitales, suele ser un au­ mento en la tasa de infección. Es oportuno mencionar un infor­ me de hace muchos años de un brote de aspergilosis en pacientes con cáncer, relacionado con la realización de pruebas contra incendio en un hospital.4 Los estudios de vigilancia siempre deben incluir el muestreo de los filtros de aire hospitalarios que normalmente revelan recuentos elevados de esporas del hongo.258 Los conductos de ventilación pueden contaminarse con suciedad y fragmentos de materia orgánica que son trans­ portados por el aire provenientes de la descomposición del suelo y las malezas.205 La incidencia de aspergilosis intrahospi-

F i g u r a 2 1 - 1 6 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de especies de Cunninghamella, que muestran la esporangiola esférica a partir de la superficie globular de la columela.

B

talaria guarda relación directa con la media del recuento de esporas transportadas por el aire ambiental, que es máxima cuando se liberan ráfagas mínimas de esporas al aire por agita­ ción de ropas contaminadas o por el movimiento de polvo con­ taminado acumulado en suelos u otras superficies durante las tareas de limpieza.231 Los pacientes inmunodeprimidos o los que reciben fármacos inmunosupresores, en especial los recep­ tores de trasplantes de médula ósea y de órganos, y los que pre­ sentan procesos malignos hemáticos tienen una susceptibilidad especial a la infección.

PRESENTACIÓN EN EL LABORATORIO

Las especies de Aspergillus que con mayor frecuencia se encuentran en los laboratorios clínicos son Aspergillus fum igatus, A. flavus, A. niger y A. terreus. Casi todas las infecciones

B

H o n g o s fila m e n to s o s h ia lin o s y h ia lo h ifo m ic o s is

F i g u r a 2 1 -1 7 M icrofotografía de la estructura de fructificación de especies de Mucor. Nótese la falta de rizoides y conidióforos que term inan en una colu­ m ela globular dentro de los esporangios que contienen las esporangiosporas.

graves están causadas por A. fu m ig a tu s'54 A. nidulans también se menciona en esta sección porque la mayoría de las cepas producen con facilidad formas sexuales o teleomórficas, es decir, cleistotecios que encierran ascosporas específicas de especie.

MORFOLOGÍA DE LA COLONIA

El desarrollo de colonias de especies de Aspergillus puede sospecharse si se observa en el cultivo una proliferación rápida (dentro de 3-5 días) con un margen exterior distintivo, a menu­ do con una zona blanca de crecimiento nuevo. El aspecto como se describe debajo puede variar, lo que depende del medio de cultivo que se utilice. Las colonias tempranas pueden presentar una consistencia algodonosa; sin embargo, cuando maduran la superficie adquiere una consistencia azucarada o granular a medida que se producen los conidios. A continuación figuran las descripciones de las colonias cuando crecen en agar dextro­ sa de Sabouraud, características de cada una de las especies.

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS

Observadas con el microscopio, las especies de Aspergillus se caracterizan por la producción de hifas tabicadas hialinas, uniformes, de 4-6 |im de diámetro, con paredes paralelas. La ramificación dicotómica en ángulo de 45°, tan característica del micelio invasor vista en los cortes de tejidos, suele obser­ varse con menos frecuencia en las preparaciones microscópicas en fresco hechas a partir de placas de cultivo. Un segmento especializado de la hifa, conocido como célula pie o basal, sirve como base de origen del conidióforo (fig. 21-19). Los conidióforos terminan en una vesícula dilatada, a partir de cuya superficie nace una (uniseriada) o dos (biseriada) hile­ ras de fiálides (técnicamente, la hilera interna de células se denomina métula), que dan lugar a cadenas de conidios pig­ mentados (fig. 21-20). La longitud y el ancho de los conidiófo­ ros, el tamaño y el contorno de la vesícula, la disposición de las fiálides, y el color, el tamaño y la longitud de la cadena de coni­ dios son características utilizadas para realizar las identifica­ ciones de especie. Algunas especies producen cleistotecios teleomorfos que contienen ascosporas (fig. 21-21).

1123

F i g u r a 2 1 - 1 8 M icrofotografía de un corte de tejido que m uestra las anchas hifas fragm entadas, no tabicadas, de tamaño irregular, características de una de las especies de Zygomyces (H-E, 400x).

ASPERGILLUS FUMIGATUS Las colonias de A. fum igatus son granulares a algodonosas y suelen tener cierto tono de pigmentación azul verdoso, verde grisáceo o verde castaño (véase lámina en color 21-IC). En la microscopia debe buscarse específicamente la produc­ ción de una sola hilera de fiálides sobre la mitad superior de una vesícula con forma de maza (fig. 21-22). Los conidios son esféricos, por lo general lisos y dispuestos en cadenas lar­ gas que tienden a inclinarse hacia adentro, hacia un eje cen­ tral. Pueden presentar pigmentación amarillo verdosa o verde. Los conidióforos son relativamente largos (300-500 |im ) y ca­ da uno se origina de un segmento especial de una hifa tabicada conocido como célula pie o basal (véase fig. 21-18).

ASPERGILLUS FLAVUS Las colonias de A. flavus son granulares a vellosas y presen­ tan cierto tinte amarillo, amarillo verdoso o amarillo casta­ ño (véase lámina en color 21-1D). En el examen microscópico, lo que capta el ojo de inmedia­ to es la disposición en pétalos de margarita de las cadenas de conidios, de las cuales se origina una sola hilera o dos de fiá­ lides que recubre la circunferencia completa de una vesícula esférica (fig. 21-23). El conidióforo es relativamente largo (500-800 |im), con una parte que presenta una rugosidad carac­ terística de la pared sólo proximal a la unión de la vesícula. Los conidios son esféricos, lisos o ligeramente ásperos cuando maduran y presentan una pigmentación amarillo castaño.

ASPERGILLUS NIGER La superficie de una colonia madura de A. niger está cubier­ ta por un agregado denso de conidios negro azabache, lo que le da un aspecto característico como sazonada con pimienta (véase lámina en color 2 1 -IE). El reverso de la colonia es de color beige o amarillo grisáceo, en contraste con la pigmenta­ ción más oscura gris a negra de los hongos dematiáceos que se describen más adelante. La observación microscópica revela esporulación profusa, con agregados densos de conidios individuales o en cadenas cortas negro azabache que suelen cubrir la superficie de la

1124

CAPÍTULO 21 Micología

R E C U A D R O D E C O R R E L A C IÓ N C L ÍN IC A 21-1

Z ig o m ic o s is

Los hongos que pertenecen a los zigom icetos son habitantes am bientales extensam ente distribuidos en el suelo, el estiércol y la m ateria orgánica. Los seres hum anos suelen sufrir infecciones respiratorias altas a través de la inhalación de esporas transportadas por el aire, aunque la ingestión de productos alim en­ ticios contam inados puede provocar enferm edad gastrointestinal primaria o la inoculación directa por traum atism os de la piel y las mucosas puede causar infección m ucocutánea primaria. La proclividad de las hifas para invadir las paredes de los vasos sanguíneos una vez que se ha establecido la infección pri­ m aria produce la diseminación de trombos micóticos y el desarrollo de focos m etastásicos en muchos órganos. La zigom icosis afecta con mayor frecuencia en form a de infecciones oportunistas a huéspedes inm unodeprim idos. Los factores de riesgo del huésped son la diabetes mellitus, en especial durante los períodos de acidosis; la neutropenia; el tratam iento inm unosupresor sostenido (como puede suceder en los trasplantes de m édula ósea ) ; 55 el uso prolongado de antibióticos y la alteración de la integridad de la barrera cutánea secundaria a traumatismo, heridas qui­ rúrgicas. punciones con aguja o quem aduras . 2 ’ 2 Estos autores tam bién indican que la enferm edad angioinvasora es una com plicación común y causa trom ­ bosis vascular, infarto del tejido afectado y destrucción tisular por acción de proteasas, lipasas y micotoxinas. La liberación de trombos m icóticos desde los sitios prim arios puede conducir a la enferm edad diseminada. Las form as de la enfermedad más frecuentes son la rinocerebral. la pulmonar, la cutánea y la diseminada. Una revisión realizada por Prabhu y Patel 225 reitera la mayoría de los factores de riesgo de base ya mencionados. En particular, los procesos malignos de la sangre, el trasplante de m édula ósea o de células madre de sangre periférica, la neutropenia, el trasplante de órganos sólidos, la diabetes m ellitus con cetoacidosis o sin ella, el uso excesivo de corticosteroides y el tratam iento con deferoxam ina para la sobrecarga de hierro se citan com o causales de predis­ poner a los pacientes a la infección. El interés está en reducir la elevada m ortalidad que puede alcanzar al 100%, de acuerdo con las enferm edades subya­ centes. Los resultados exitosos dependen del diagnóstico temprano, el tratam iento de la enfermedad m édica de base, la cirugía cuando está indicada y el tratam iento con anfotericina B. Las fórmulas de anfotericina B con dosis elevadas de lípidos y el uso de oxígeno hiperbárico son estrategias particulares que han m ostrado valor potencial en el tratam iento de la zigomicosis, como lo señalan González, Rinaldi y Sugar . 97 Rhizopus es el género de Zygomyces aislado más a m enudo por cultivo en las infecciones humanas, seguido en incidencia de las especies de Mucor. Otras especies de Zygomyces se aíslan con menor frecuencia. No es habitual aislar especies de Cunninghamella en los laboratorios clínicos. N o obstante, varios inform es de casos indican que se ha aislado este m icroorganism o com o agente causal de cada una de las form as más com unes de zigomicosis: rino­ cerebral, pulm onar, cutánea y enfermedad diseminada. Kontoyianis y cois . 148 describen las predisposiciones clínicas com unes de las infecciones por Cunninghamella bertholetiae ; a saber, corticoterapia previa, granulocitopenia intensa prolongada y diabetes m ellitus. La fiebre y la neum onía fueron las presentaciones clínicas m ás com unes en esta serie de pacientes, por lo general una indicación de enfermedad diseminada. Las infecciones por Cunninghamella suelen ser rápidam ente progresivas y el resultado en la mayoría de los casos inform ados en la bibliografía ha sido casi siempre mortal. El tratam iento enérgico con anfotericina B, la resección de los tejidos infectados y el control de la enferm edad subyacente pueden revertir esta tendencia. Enferm edad rinocerebral Esta form a de infección com ienza a m enudo como sinusitis, que progresa a la enfermedad local invasora, con edem a de párpados, proptosis, anestesia m alar y oftalm oplejía interna y externa. En muchos casos, la infección es rápidam ente progresiva, aunque tam bién se inform aron form as con progresión lenta."'' Puede observarse secreción nasal espesa, oscura, teñida con sangre; los m ateriales correspondientes a detritos del seno pueden parecer teñidos de negro y hem orrágicos debido a la invasión vascular y al infarto. La m eningitis y la encefalitis pueden ocurrir por diseminación directa y suelen ser mortales. La enferm edad cerebral localizada es rara, pero más frecuente en drogadictos intravenosos . 182 N enoff y cois . 193 inform aron un caso de infección cerebral ascendente en un paciente después del trasplante en quien se manifestó am aurosis total bilateral (ceguera). La enferm edad cerebral también se ha informado en pacientes con SIDA, relacionada tal vez con la inyección de drogas. La confusión y las perturbaciones del estado de ánimo son los signos de presenta­ ción más com unes del com prom iso cerebral. En los drogadictos tam bién se ven masas ocupantes y abscesos cerebrales. Una vez que se m anifiestan los sín­ tom as cerebrales, el proceso suele ser rápidam ente m ortal, com o sucedió en el caso de N enoff ya citado. También pueden verse infecciones con granulom as m icóticos no invasores de los senos nasales. Enferm edad pulm onar En las radiografías pueden verse infiltrados difusos o finam ente nodulares mal definidos.181' También puede observarse afectación por bolas m icóticas en lesiones naturales preexistentes o posinfección. El dolor torácico, la hemoptisis y la tos productiva purulenta o teñida con sangre del esputo son presenta­ ciones clínicas frecuentes. La enfermedad pulm onar subaguda suele ser intrabronquial. con la form ación de tapones de mucina. En ocasiones se afecta la pleura. Enferm edad cutánea L a enfermedad cutánea suele ser secundaria al traum atism o y la contam inación con tierra , 276 en pacientes con quem aduras , 51 y episódica, por la im planta­ ción directa de vendas adhesivas E lastoplast ® . 2 1 1 En ocasiones, el com prom iso subcutáneo por la disem inación hem ática com plica la enfermedad disem ina­ da. Las lesiones varían de placas violáceas pequeñas hasta celulitis, ulceración y gangrena. En los últim os tiem pos se citaron casos de enfermedad subcutá­ nea por zigom icetos que pertenecen al orden Entomophthorales, en especial en niños y adultos jóvenes. G ugnaniw ha revisado infecciones causadas por Basicliobolus ranarum, que se presentan sobre todo com o lesiones granulom atosas fluctuantes de las piernas y el tronco, secundarias a traum atism o, picadu­ ras de insectos o am bos. El yoduro de potasio, la anfotericina B y los azoles se utilizaron con éxito en el tratam iento de estos casos. Enferm edad disem inada Casi cualquier órgano puede estar afectado, a partir de la diseminación de infecciones prim arias en pulm ón, senos paranasales y aparato digestivo . 234 Los individuos afectados con m ayor frecuencia son los inm unodeprim idos debido a su edad (muy pequeños y ancianos), al tratam iento con fármacos o a enfer­ medades subyacentes, com o procesos m alignos hem áticos (en especial durante los períodos de leucopenia), diabetes mellitus y lupus eritem atoso . 251 Aunque no define al SIDA, la enfermedad diseminada sucede con más probabilidad en los pacientes HIV positivos, com o lo analizaron Van den Saffele y Boelaert . 27 9 La diseminación m etastásica ocurre por la propensión de las hifas para invadir la vasculatura, lo que causa trombosis y la liberación de émbolos micóticos a la circulación. La zigom icosis tam bién se ha inform ado en casos de sobrecarga de hierro, específicamente en pacientes que sufren hemodiálisis secundaria al tratam iento con deferoxam ina.26 El crecim iento de muchos microorganismos, incluso los m iembros de los zigom icetos, se refuerza por el aum ento de las concentraciones de hierro. La relación entre zigom icosis y el tratam iento con deferoxam ina depende de la acción quelante prim aria del fárm aco, lo que origina un aum ento de la concentración local de hierro que estim ula la proliferación del hongo.

H o n g o s fila m e n to s o s h ia lin o s y h ia lo h ifo m ic o s is

1125

vesícula (fig. 21-24, recuadro superior). En la madurez, los conidios se tornan ásperos (equinulados). Las vesículas desrudas. cuando se observan, son globulosas y cubren la superfi.ie completa con una hilera doble de fiálides similar en el ¿specto a Aspergillus flavus) (fig. 21-24, recuadro inferior).

ASPERGILLUS TERREUS Las colonias de A. terreus son granulares, con rugosidad radial y de color beige a canela, castaño o anaranjado castaño i véase lámina en color 21-1F). A primera vista, las cabezas de fructificación de A. terreus aparecen microscópicamente similares a las de A. fum igatus (la esporulación desde la mitad superior de una vesícula con forma de maza). El examen más detallado revela que las vesí­ culas de A. terreus son más pequeñas y las fiálides son mucho más largas, que de hecho representan una hilera doble e inter­ digitada de modo que la línea de división entre las dos suele ser oscura (fig. 21-25). Las fiálides primarias (métulas) son más cortas (5-8 |im ) que las terminales (8-12 jim), las que a su vez dan lugar a cadenas largas de conidios lisos, casi esféricos. La identificación de A. terreus puede confirmarse mediante la demostración, en preparaciones de la zona de excavación del agar o por disección del micelio subyacente, de los microconidios lisos y esféricos adheridos lateralmente a las hifas vegeta­ tivas (fig. 21-26).

ASPERGILLUS NIDULANS A. nidulans rara vez se aísla en los laboratorios clínicos, pero se incluirá aquí una descripción breve porque esta especie suele producir estructuras reproductivas sexuales (telomorfa) (cleis­ totecios y ascosporas) que se describirán a continuación. Las colonias suelen ser blancas o blanco grisáceas, con consisten­ cia algodonosa a granular y pueden tener pliegues radiales (véase lámina en color 21-2G). En las colonias maduras apare­ ce un moteado oscuro cuando se producen los cleistotecios. Aspergillus glaucus también pueden producir cleistotecios y ascosporas. La colonia suele ser algodonosa a granular y pre­ senta pigmentación multicolor verde y amarilla (véase lámina en color 21-1H). Los aspergilos, que pertenecen a la clase Ascom ycetes, pue­ den reproducirse “sexualmente” a través de la unión de dos células con la formación de estructuras saculares conocidas

Figura 21-19 M icrofotografía de la estructura de fructificación de una espe­ cie de Aspergillus que m uestra el conidióforo originado de una “célula pie” o basal.

como cleistotecios (véase fig. 21-21). Dentro de cada cleistotecio se encuentran miríadas de ascos en el cada uno contiene cuatro u ocho ascosporas (infinidades de estructuras saculares pequeñas ilustradas en la fig. 21-27). Algunas cepas también producen cuerpos hialinos y esféricos conocidos como células de Hülle, mostradas en la figura 21-28 (cuerpos esféricos gran­ des arriba y a la izquierda). Estas estructuras “telomorfas” raras veces se observan en las muestras clínicas. Aspergillus nidulans y Aspergillus glaucus son dos especies asiladas con poca frecuencia en los laboratorios clínicos que de modo carac­ terístico producen cleistotecios y ascosporas. Las ascosporas son más grandes que los conidios, se tiñen de modo más inten­ so y tienen una morfología exclusiva para cada especie que puede ser reconocida por los especialistas en la disciplina. Histopatología

Las hifas de las especies de Aspergillus, como se observan en los cortes teñidos de tejidos, son hialinas, tabicadas, con contorno regular y paredes paralelas. Miden de 3 a 6 um de diá­ metro y están divididas por tabiques transversales (fig. 21-29).

Figura 21-20 M icrofotografía y esquem a de una cabeza de fructificación de especies de Aspergillus, que m uestran la vesícula dilatada que da origen a las fiáli­ des, a partir de las cuales se producen cadenas de conidios.

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CAPÍTULO 21 Micología

Figura 21-21 M icrofotografía de un cleistotecio (flecha) de Aspergillus glaucus, que m uestra la form a de reproducción sexual o teleomorfa. A la izquierda se observa una cabeza de fructificación anam orfa típica.

La ramificación dicotómica regular en ángulos de 45° es útil para diferenciar a estos hongos de otros que también forman hifas. Estas últimas no se tiñen bien en los cortes teñidos con hematoxilina y eosina (H-E), pero se visualizan bien con las tinciones de PAS y metenamina argéntica de Gomori. La reac­ ción del tejido en huéspedes inmunocompetentes infectados por estos hongos puede ser primero purulenta y luego granulomatosa. Con más frecuencia la invasión de las hifas a los teji­ dos no se acompaña por una respuesta celular y sólo se obser­ van grados variables de necrosis. Las especies de Aspergillus

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Figura 21 -22 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de Aspergillus fumigatus, que muestran una sola hilera de fiálides proveniente de la mitad superior de una vesícula a partir de la cual se producen cadenas de coni­ dios.

tienen una predilección particular para invadir los vasos san­ guíneos y causar trombosis e infarto hemorrágico. Como cier­ tas cepas producen ácido oxálico, en el tejido invadido pueden observarse depósitos locales de oxalato de calcio, que aparecen como cristales birrefringentes. Cuando una colonia del hongo crece dentro de una cavidad preexistente, como en un seno nasal o dentro de un quiste pul­ monar congénito o inflamatorio, la lesión se conoce como “bola micótica” o aspergiloma. Con frecuencia, las hifas son amorfas y se tiñen de modo deficiente. Pueden verse las cabe­ zas de fructificación con vesículas bien formadas y cadenas de conidios dentro de cavidades que están conectadas para abrirse a los bronquios y quedar expuestas al aire (fig. 21-30). El revestimiento de la cavidad suele estar intacto, sin evidencia de extensión en el tejido circundante. En la aspergilosis bronco­ pulmonar, los bronquios y los bronquíolos suelen dilatarse y se llenan con material viscoso, mucinoso, en el que quedan atrapados detritos celulares, muchos eosinófilos, neutrófilos esparcidos, linfocitos, plasmocitos y fragmentos de hifas. La ramificación a 45° típica de estos fragmentos puede verse en las preparaciones directas en fresco del esputo que, cuando se acompaña por eosinófilos y cristales de Charcot-Leyden, pro­ porciona la evidencia suficiente para hacer un diagnóstico pre­ suntivo de aspergilosis.

DIAGNÓSTICO MEDIANTE TÉCNICAS SIN CULTIVO

El sistema de prueba Platelia Aspergillus® es un equipo para el ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) en sánd­ wich que en la actualidad está disponible en muchos laborato­ rios de referencia y que proporciona un medio para la detección del galactomanano circulante de Aspergillus temprano en el curso de la enfermedad progresiva.180Aunque en ensayos clíni-

H o n g o s fila m e n to s o s h ia lin o s y h ia lo h ifo m ic o s is

1 12 7

B Figura 21-23 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de Aspergillus flavus . que m uestran una vesícula esférica central que sostiene una hile­ ra doble de fiálides proveniente de toda la superficie.

A

Figura 21-24 M icrofotografías y esquem a de la estructura de fructificación de Aspergillus niger. La esporulación suele ser tan densa que cubre toda la superficie de la vesícula (A). Las cabezas de fructificación desnudas consisten en una vesícula esférica a partir de la cual se origina una doble hilera de fiáli­ des que cubre toda la superficie (B).

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CAPÍTULO 21 Micología

B Figura 21-25 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de Aspergillus terreus que revela conidióforos que term inan en una vesícula dilatada desde la m itad superior de la cual se origina una hilera doble de esterigmas que da lugar a las cadenas de conidios.

Figura 21-26 M icrofotografía y esquem a del m icelio vegetativo profundo d e Aspergillus terreus, que m uestran los microconidios esféricos característicos de las especies.

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Figura 21-28 M icrofotografía de un cleistotecio de Aspergillus nidulans en Figura 21 -27 M icrofotografía de varios cleistotecios de Aspergillus nidulans que incluyen ascos saculares más pequeños que contienen ascosporas.

cuya adyacencia se encuentran grupos de células de Hülle esféricas, hialinas y con paredes delgadas.

H o n g o s fila m e n to s o s h ia lin o s y h ia lo h ifo m ic o s is

Figura 21-29 Microfotografía de la ramificación dicotóm ica de las hifas de especies de Aspergillus como se observan en un corte de tejido teñido con H-E.

eos y estudios de investigación diferentes se ha encontrado variación en la sensibilidad y la especificidad de este procedi­ miento, representa un adelanto fundamental en el tratamiento de los pacientes con riesgo de enfermedad diseminada, en es­ pecial en los que padecen SIDA. Se están investigando los posi­ bles factores que afectan la liberación del antígeno de Aspergillus, la naturaleza del epítopo que reacciona con el anti­ cuerpo monoclonal utilizado en el ELISA, su escape desde el sitio de infección y la manera como se une a sustancias pre­ sentes en la sangre. Una vez resueltos estos problemas, este sis­ tema de ELISA ofrece gran esperanza para el futuro. Musher y cois.191 evaluaron el rendimiento del ensayo de galactomanano (GM EIA, Bio-Rad, Benicia, CA) en la detec­ ción del antígeno o del DNA de Aspergillus o en líquido de lavado broncoalveolar obtenido de pacientes con aspergilosis pulmonar invasora. En el estudio de 47 pacientes con esta forma de la enfermedad y 46 pacientes de control, el ensayo GM EIA mostró una sensibilidad del 76% y una especificidad del 94%. Estos autores citan el costo relativamente bajo, la facilidad del proceso y los resultados rápidos obtenidos con este ensayo que usa la broncoscopia como una alternativa via­ ble a una biopsia para establecer un diagnóstico de aspergilosis invasora, en especial en pacientes de alto riesgo. En el recuadro de correlación clínica 21-2 se muestran las diversas presentaciones clínicas de la aspergilosis. Otros hongos filamentosos hialinos de crecimiento rápido CARACTERÍSTICAS DE LAS COLONIAS

Como se muestra en el diagrama 21-2, puede sospecharse un hongo filamentoso hialino que pertenece al grupo general conocido como hialohifomicetos, si se aíslan colonias de creci­ miento rápido, algodonosas, vellosas o granulares en el cultivo dentro de los 3-5 días y que por lo general presentan una diver­ sidad de colores pasteles pálidos en la superficie. Las colonias tienen típicamente un borde externo liso, salvo las de especies de Gliocladium y Trichoderma, cuyas colonias cubren toda la superficie y forman un crecimiento confluente (“en césped”) verde o amarillo. Las colonias parecen más granulares en la superficie, lo cual depende del grado de esporulación. El rever­ so de las colonias sigue siendo de tinte gris pálido o beige.

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Figura 21-30 M icrofotografía del material proveniente de la infección con bolas m icóticas de Aspergillus (aspergiloma) que ilustra las vesículas con for­ m a de m aza con la esporulación sólo en la m itad superior de las vesículas, características de Aspergillus fumigatus (H-E, 400x).

Aunque suelen considerarse saprofitos no perjudiciales, durante las últimas dos décadas algunos de los hongos fila­ mentosos hialinos han surgido como agentes de micosis opor­ tunistas con la morbimortalidad consiguiente en los pacientes con enfermedades de base graves y compromiso de las defen­ sas. Las últimas tendencias epidemiológicas indican un cambio en el aumento de las infecciones causadas por hongos oportu­ nistas antes considerados infrecuentes, como las especies de Fusarium, de Acremonium, de Paecilomyces, Pseudallescheria boydii y Scedosporium prolificans. El aumento llamativo en los procedimientos de trasplantes de órganos y los nuevos trata­ mientos inmunosupresores más enérgicos son los principales determinantes de este cambio. Los hongos filamentosos hialinos de importancia médica y aislados con mayor frecuencia en los laboratorios clínicos se dividen en tres subgrupos, de acuerdo con si los conidios son: • producidos en cadenas desde las fiálides • producidos en grupos desde los conidióforos o • nacen de modo individual y directo desde las hifas (véase diagrama 21-2) Estos subgrupos se presentan en los párrafos siguientes. Géneros de hongos filamentosos hialinos productores de conidios en cadenas

Los hongos filamentosos hialinos descritos aquí se caracte­ rizan por la producción de conidios en las cadenas. Especies de importancia en el laboratorio Especies de Penicillium Especies de Paecilomyces Especies de Scopulariopsis Las especies que se describen aquí están caracterizadas por la producción de conidios en cadenas. En el diagrama 21-2 se brindan las pautas para la separación de estas tres especies.

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CAPÍTULO 21 Micología

R E C U A D R O D E C O R R E L A C IÓ N C L ÍN IC A 21-2 A s p e r g ilo s is La infección puede presentarse com o síndrom es clínicos bien definidos que afectan varios sitios y órganos: aspergilosis pulmonar, diseminada, del sistema nervioso central, cutánea, endocárdica y nasoorbitaria. La aspergilosis pulm onar puede dividirse además en subgrupos: colonización saprofita, micetom as o infección por "bolas m icóticas” o aspergilomas; form a broncopulm onar alérgica; e invasora . 254 Estas form as clínicas de la enfermedad pulm onar constitu­ yen un espectro continuo, que varía desde la enfermedad invasora en el paciente gravem ente inmunodeprim ido hasta las reacciones de hipersensibilidad en pacientes con respuesta inm unitaria hiperactiva a la colonización no invasora del árbol bronquial en personas por lo demás normales con áreas antes enfer­ mas del pulmón. La aspergilosis diseminada ocurre con mayor frecuencia en pacientes gravemente inm unosuprim idos y puede estar afectado cualquier órgano. A spergilosis broncopulm onar alérgica Esta forma afecta sobre todo los bronquios y los bronquíolos. Las características distintivas consisten en inflamación peribronquiolar, con infiltrados de eosinófilos y cristales de Charcot-Leyden atrapados dentro de los tapones de m ucina expectorados en las muestras de esputo. Lee y cois . 156 sugieren que para hacer un diagnóstico de aspergilosis broncopulm onar alérgica deben seguirse los siguientes criterios: • obstrucción bronquial episódica • eosinofilia en sangre periférica • reactividad cutánea frente al antígeno de A. fumigatus • anticuerpos precipitantes en suero contra A. fumigatus • elevación de IgE total en suero • antecedentes de infiltrado pulm onar • elevación de IgE e IgG específicas en suero contra A. fumigatus • bronquiectasia proximal En los casos de aspergilosis broncopulmonar, las concentraciones de IgE e IgG contra Aspergillus fumigatus pueden estar elevadas tanto en suero com o en m uestras de lavado broncoalveolar. Las especies de Aspergillus que con m ayor frecuencia causan la enfermedad broncopulm onar alérgica son A. flavus y A.

fumigatus. Infecciones con bolas m icóticas (aspergilom as) Las infecciones con form ación de aspergiloma se desarrollan en cavidades preexistentes, ya sean naturales (senos paranasales) o adquiridas (neumoquistes inflamatorios, por lo general secundarios a una tuberculosis antigua). El aspergilom a a menudo consiste en una m asa enredada de hifas, casi siempre m uer­ tas. En los aspergilomas pulm onares, cavidades provistas de aire a través de un bronquio abierto que pueden contener las cabezas de fructificación viables, la detección de éstas puede llevar al diagnóstico definitivo. En la mayoría de los casos, el aspergilom a perm anece lim itado a la cavidad sin invasión del parénquim a circundante. Sin em bargo, Nolan y cois . 198 advierten que los aspergilom as no deben considerarse un cuadro inactivo, ya que se han inform ado casos de hemoptisis interm itentes o exangües y, en ocasiones, la erosión de las estructuras adyacentes causa enfermedad o muerte. Aspergilosis pulm onar invasora Esta form a aparece casi con exclusividad en los pacientes inm unodeprim idos o neutropénicos. en especial en los que padecen leucem ias y linfom as . 282 La enfermedad a m enudo se presenta com o neum onía (tos, fiebre, signos de dificultad respiratoria). L a invasión pleural puede producir causar dolor torácico y frote pleural. D ebido a la propensión de las hifas por crecer e invadir los vasos sanguíneos, es posible la enfermedad diseminada con focos m etastásicos en el sistema nervioso central y otros órganos. Aunque Aspergillus fumigatus y, con m enor frecuencia, Aspergillus flavus, son las dos especies más im plicadas , 154 en los últimos tiempos tam bién se m encionó la participación de Aspergillus terreus. Woods y Goldsm ith31" inform aron cuatro casos de enfermedad disem inada causados por A. terreus y encontraron cinco casos más publicados en la literatura médica. En una revisión más reciente de infecciones invasoras porA . terreus. Iwen y cois . 127 selec­ cionaron 13 pacientes de la literatura, 10 de los cuales fallecieron com o consecuencia de la disem inación a distancia de la enfermedad. Casi todas las cepas im plicadas eran resistentes a la anfotericina B. Aspergilosis disem inada Com o las especies de Aspergillus son propensas a invadir los vasos sanguíneos, la diseminación extensa a casi cualquier tejido u órgano sigue siendo una am enaza en todo caso de enfermedad localizada. Denning y Stephens , 61 en una revisión de más de 2 000 casos de aspergilosis escogidos de la literatura, encontraron que la aspergilosis en los receptores de trasplante de médula ósea es especialmente devastadora, con una mortalidad del 94% en los casos inform ados, a pesar del tratamiento. La tasa global de respuesta al tratamiento con anfotericina B de todos los casos revisados en esta serie fue del 55%. Ho y Yuen 121 postularon que la elevada m ortalidad causada por la aspergilosis invasora entre los receptores de trasplante de m édula ósea se debe al retra­ so en el diagnóstico porque disminuye la respuesta inflamatoria por la inmunosupresión. Aunque el síndrome de inm unodeficiencia adquirida (SIDA) no se considera por sí un factor de riesgo para la aspergilosis pulm onar invasora, los facto­ res de riesgo de base, com o la neutropenia, el uso de corticosteroides y el abuso de drogas intravenosas, expone a estos pacientes a un riesgo particular. En una revisión de una serie de pacientes de SIDA con aspergilosis realizada por Singh y cois . , 259 se encontró que el 79% presentaba uno o m ás de estos facto­ res de riesgo predisponentes conocidos. La aspergilosis invasora es más frecuente en las fases más tardías del SIDA, cuando el recuento de linfocitos CD 4+ es bajo y cuando se lo diagnostica tiene un pronóstico desfavorable. Sólo el diagnóstico tem prano puede m ejorar el pronóstico . 138 Otra enfermedad asociada con las infecciones por Aspergillus es la otitis externa (“oído del nadador” , una inflamación local crónica del conducto auditi­ vo caracterizada por prurito, dolor y descam ación) que en su m ayoría puede estar causada porA . niger. Casi todos los pacientes pueden curarse con el trata­ m iento con antim icóticos tópicos y evitando la exposición al agua. L a sinusitis por Aspergillus, a m enudo indistinguible por la clínica de la sinusitis viral, bacteriana o alérgica y que aparece en huéspedes inm unocom petentes, ha sucedido al menos en 29 casos inform ados desde 1987 4 6 Se han inform ado varios casos aislados de aspergilosis que afectan casi cualquier órgano, con enferm edades predisponentes en estos estudios relacionados a menudo con neutrope­ nia prolongada, procesos malignos hem áticos. traum atism o o cirugía de la colum na vertebral y uso prolongado de corticosteroides.

H o n g o s fila m e n to s o s h ia lin o s y h ia lo h ifo m ic o s is

ESPECIES DE PENICILLIUM

Las colonias de las especies de Penicillium son granulares, de bordes lisos, por lo general con varias tonalidades de verde, aunque a veces se encuentran variantes amarillas y amarillo castañas (lámina en color 21-2A). Una especie implicada recientemente en infecciones sistémicas es Penicillium marneffe i y puede sospecharse si se observa un pigmento rojo vino que se difunde en el agar (véase lámina en color 21-2B). Como se observa con el microscopio, el "penicilio” (cepillo) se produce por la bifurcación del conidióforo en la métula pri­ maria y las fiálides secundarias, a partir de cuyos extremos se originan cadenas de conidios (fig. 21-31). Es importante obser­ var que los extremos de las fiálides son romos, es decir, como si el corte fuera transversal con un elemento cortante, en lugar de largos y adelgazados. Los conidios son esféricos, de tama­ ño regular y con una tinción uniforme, lo que representa un tipo de conidiación acrópeta en la cual se forman conidios idénticos en secuencia desde los extremos de los conidios ya formados (véase recuadro 21-1).

ESPECIES DE PAECILOMYCES

Las colonias de las especies de Paecilomyces pueden pare­ cer similares a las de las especies de Penicillium, aunque sue­ len tener un color pastel más claro y se encuentran con mayor frecuencia las variantes amarillo castañas o castañas. La superficie tiende a ser bastante granular debido a la produc­ ción de enorme cantidad de conidios (véase lámina en color 21-2C). Dos observaciones microscópicas importantes conducen a la identificación de las especies de Paecilomyces. Las puntas de las fiálides son largas y adelgazadas y terminan en un "pun­ to”, a diferencia de los extremos finos y romos de las fiálides

Figura 21-31 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de especies de Penicillium, que m uestran la ramificación de las fiálides a partir de las cuales se producen cadenas de conidios esféricos.

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observadas en las especies de Penicillium (fig. 21-32). La se­ gunda es que los conidios son ovales a elípticos, de tamaño irregular y tinción no uniforme, lo que representa la conidia­ ción basípeta en la que cada conidio nuevo se forma directa­ mente de la punta de la fiálide, lo cual empuja al conidio ante­ rior delante de él. Los conidios “más viejos” en las puntas son más grandes y con una tinción más oscura que los producidos con anterioridad. Por lo tanto, incluso en ausencia de fiálides características, la morfología de los conidios descrita permite la identificación.

ESPECIES DE SCOPULARIOPSIS

Las colonias presentan de modo característico una colora­ ción amarillo castaña a beige, son granulares y tienen pliegues radiales que surgen desde el centro a la periferia (véase lámina en color 21-2D). La identificación de las especies de Scopulariopsis puede hacerse por la microscopia mediante la observación del tama­ ño y la morfología de los conidios. Estos son dos a tres veces más grandes que los de las especies de Penicillium y de Paecilomyces, con forma de “limón” y tienen una base trun­ cada y plana. Se disponen en cadenas, con la base truncada de cada conidio sucesivo adherida al extremo redondo del anterior (fig. 21-33). En un comienzo los conidios son lisos; sin embar­ go, cuando la colonia madura, la pared externa se tom a áspera (equinulada). El ajuste del foco del objetivo del microscopio puede evidenciar una conexión en forma de bastón entre los conidios adyacentes. La producción de conidios en las especies de Scopulariopsis es anelógena; es decir, cada conidio nuevo se forma a partir de una extensión del anterior, seguido de una contracción, lo que deja la base truncada engrosada o cicatriz conocida como anélido.

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CAPÍTULO 21 Micología

Figura 21-32 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de especies de Paecilomyces, que muestran las fiálides largas, adelgazadas, de cuyas puntas se producen cadenas de conidios elípticos.

Identificación de hongos filamentosos hialinos productores de conidios en racimos

Especies de importancia en el laboratorio Especies Especies Especies Especies

de de de de

Acremonium Fusarium Gliocladium Trichoderma

Este grupo de hongos hialinos se caracteriza por la forma­ ción de conidios en racimos. Los conidios pueden ser alargados o elípticos, como en las especies de Acremonium y de Fusarium, o esféricos, como en las especies de Gliocladium y de Trichoderma. Las especies de Fusarium tienen la caracte­ rística exclusiva de producir microconidios y macroconidios. En el diagrama 21-2 se muestran las pautas para la diferencia­ ción de estas tres especies.

ESPECIES DE ACREMONIUM

Las colonias de las especies de Acremonium suelen aparecer menos vellosas o granulares que las de otros hongos filamen­ tosos hialinos; más bien presentan un aspecto liso y sin vello debido a la producción de un micelio muy delicado. Las colo­ nias pueden ser blancas o con varias tonalidades de verde pas­ tel pálido y amarillo (véase lámina en color 21-2E). Cuando se observan con el microscopio, los conidios de las especies de Acremonium son alargados y dispuestos en racimos laxos con formación entrecruzada, simulando las letras chi­ nas o "patrón difteroide” (fig. 21-34). Cada racimo nace del extremo de un conidióforo delicado, largo y delgado, que ter­ mina en una punta roma. No se observan macroconidios.

ESPECIES DE FUSARIUM

Las colonias son casi siempre algodonosas o vellosas y tie­ nen una superficie lavanda, rosada a roja o magenta distintiva y pigmentación en el reverso (véase lámina en color 21-2F).

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Figura 21-33 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de especies de Scopulariopsis, que m uestran las cadenas de aneloconidios grandes, con form a de limón característica.

H o n g o s fila m e n to s o s h ia lin o s y h ia lo h ifo m ic o s is

1 13 3

B Figura 21-34 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de especies de Acremonium, que muestran el conidióforo delicado que sostiene un raci­ mo laxo de conidios elípticos dispuestos en un patrón “difteroide” .

De los hongos filamentosos hialinos, las especies de Fusarium son las únicas que producen microconidios y macroconi­ dios. Los microconidios son similares a los producidos por las especies de Acremonium; de hecho, algunos micólogos consi­ deran que ambas especies están genéticamente relacionadas y es probable que sean especies variantes dentro del mismo género. La clave para la identificación de las especies de Fusarium es la observación de macroconidios multicelulares largos, con forma de hoz, cuyas células están separadas por tabiques transversales (fig. 21-35). Estos macroconidios a veces se describen como “canoas” o “barcos”. El ajuste exacto del foco del microscopio sobre las células que forman filamentos revela una extensión similar a un pelo, denominada “célula pie”. La formación de esta estructura es útil para la diferencia­ ción de las especies de Fusarium (con célula pie) de las espe­ cies de Cylindrocarpon (sin célula pie), este último un microor­ ganismo del suelo rara vez asilado en los laboratorios clínicos.

ESPECIES DE GLIOCLADIUM

Las colonias de las especies de Gliocladium son verdes o verde amarillentas y se extienden de un borde al otro de la

placa de agar como una “alfombra”, sin un margen. La super­ ficie suele ser pulverulenta (véase lámina en color 21-2H). Los conidios de tamaño regular y esféricos de las especies de Gliocladium, cuando se observan con el microscopio, están agrupados de modo compacto y se asemejan a los producidos por las especies de Trichoderma. Sin embargo, a diferencia de estos últimos, en los cuales cada “ovillo” de conidios se origi­ na en la punta de un solo conidióforo, cada racimo de las espe­ cies de Gliocladium está sostenido a las puntas de tres o cua­ tro conidios adelgazados, como si un racimo de moras estu­ viese sujeto en las puntas de tres dedos y el pulgar de la mano humana (fig. 21-36).

ESPECIES DE TRICHODERMA

Las colonias, similares a las de las especies de Gliocladium, también producen un crecimiento confluente (“en césped”) granular que se extiende de un borde al otro de la placa. El color tiende a ser más amarillo que verde. En la m icroscopia, los conidios de las especies de Trichoderma presentan un tamaño regular, son esféricos y firmemente arracimados (fig. 21-37). Se considera que la

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CAPÍTULO 21

Micología

\ %■ Figura 21-36 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de especies de Gliocladium, que muestran las fiálides digitiformes que sostienen gru­ pos com pactos de conidios esféricos.

adhesión de estos “ovillos” de conidios es secundaria a la pro­ ducción simultánea de una sustancia mucinosa que los man­ tiene unidos. Los “ovillos” de conidios también son similares a los producidos por las especies de Gliocladium; sin embargo, en las especies de Trichoderma estos racimos están ubicados en las puntas de fiálides adelgazadas (similares a los de las espe­ cies de Paecilomyces) que se originan lateralmente de las hifas. Identificación de los géneros de hialohifomicetos productores de conidios aislados

te al del ratón doméstico. Las colonias de las otras especies tiene bordes continuos, son blancas a grises, lisas a ligeramen­ te granulares y a menudo rugosas. Para realizar la diferencia­ ción del género se requiere el examen microscópico. Vistos con el microscopio, este grupo de hongos hialinos se caracterizan por la formación de conidios individuales a partir de los extremos de conidióforos individuales, rectos o ramifi­ cados. A continuación se describen las características micros­ cópicas particulares de cada una de estas especies, como se destaca en el diagrama 21-2.

Especies de importancia en el laboratorio ESPECIES DE SCEDOSPORIUM

Especies Especies Especies Especies

de de de de

Scedosporium Chrysosporium Sepedonium Beauveria

La morfología de las colonias de este grupo de hongos fila­ mentosos hialinos no es característica, salvo por el color gris de las colonias maduras de Scedosporium apiospermum, semejan­

Scedosporium apiospermum (forma anamorfa), también conocido como Pseudallescheria boydii (forma sexual o “teleomorfa”), es la especie de este grupo de hongos filamentosos hialinos que se encuentra con mayor frecuencia en la práctica clínica. Scedosporium prolificans (inflatum), una especie recientemente designada, también causa infecciones humanas. Ambos producen una superficie sedosa de la colonia, de un característico color gris como el del ratón doméstico, sobre la

B Figura 21-37 M icrofotografía y esquem a de la estructura de fructificación de especies de Trichoderma, que m uestran las fiálides adelgazadas ubicadas lateralm ente que sostienen grupos compactos de conidios esféricos.

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F ig u ra 2 1 -3 8 M icrofotografía y esquem a de los conidióforos largos, rectos, delicados, cada uno de los cuales sostiene un solo conidio ovalado, con tinción oscu­ ra, característicos de Scedosporium apiospermum.

cual tienden a agregarse gotas diminutas de agua (véase lámi­ na en color 21-2G). El pigmento oscuro puede extenderse al reverso de la superficie, lo que sugiere un hongo dematiáceo. En la microscopia, las hifas de ambas especies son hialinas y tabicadas. La característica es la producción de conidios de pared lisa y delgada, ovoides, de 3-5 ¡im de diámetro a partir de los extremos de conidióforos no ramificados, espaciados de modo irregular (similares a “chupachús”) (fig. 21-38). Los conidióforos de S. apiospermum son rectos y angostos, a dife­ rencia de los de S. prolificans, en el cual la base está caracte­ rísticamente dilatada y da el aspecto de una urna (fig. 21-39). Los conidios maduros asumen una pigmentación oscura con el tiempo, por lo que producen el color gris de la colonia descri­ to antes. Las puntas de los conidióforos en realidad se extien­ den cuando se produce la espora, con la formación de anélidos que son difíciles de observar con el microscopio óptico, pero que se evidencian con facilidad en las microfotografías por barrido. En ciertas especies puede observarse el entrelazado paralelo de los conidióforos, el morfotipo graphium (fig. 21-

F ig u ra 2 1 -3 9 M icrofotografía de conidios de Scedosporium prolificans, que m uestra la característica dilatación de la base del conidióforo con form a de urna (véase la flecha).

40). Los conidios aislados también pueden agregarse en raci­ mos laxos.

ESPECIES DE CHRYSOSPORIUM

Las colonias de las especies de Chrysosporium no son dis­ tintivas. Después de 2 a 4 días de incubación se forma el mice­ lio algodonoso o velloso, blanco o grisáceo. Con el microsco­ pio se observan conidios subglobulosos o piriformes que nacen de modo individual a partir de las puntas de los conidióforos laterales largos (“chupachús”), que se asemejan mucho a los conidios de Blastomyices dermatitidis (fig. 21-41). Las bases de los conidios pueden parecer aplanadas y con cicatrices. Las colonias de las especies de Chrysosporium suelen crecer con más rapidez que las de B. dermatitidis, no crecen en medios de cultivo selectivos con cicloheximida y no pueden convertirse a una forma de levadura tras la incubación a 35-37 °C. En la

F ig u ra 2 1 -4 0 M icrofotografía de especies de Scedosporium. que muestra la forma graphium en la que la cabeza de fructificación se dispone en haces com o abanicos que simulan las espigas del trigo.

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CAPÍTULO 21 Micología

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Figura 21-42 M icrofotografía que ilustra los conidios grandes, esféricos, finamente espiculados de especies de Sepedonium. Figura 21 -41 M icrofotografía de especies de Chrysosporium , que ilustra los conidios esféricos u ovales, cada uno sostenido por un conidióforo corto y recto (“chupachús”).

ESPECIES DE BEAUVERIA

práctica, pueden realizarse ensayos de exoantígeno o con son­ das de ácidos nucleicos sobre los extractos de la colonia para establecer una identificación rápida y descartar blastomicosis.

ESPECIES DE SEPEDONIUM

Las colonias de las especies de Sepedonium son similares a las de las especies de Chrysosporium y no pueden distinguirse a simple vista. En la microscopia, es característica la observa­ ción de macroconidios grandes, esféricos, claramente espiculados, que simulan a los de Histoplasma capsulatum (fig. 21-42). Las colonias de las especies de Sepedonium crecen con más rapidez que las de H. capsulatum, se inhiben en medios selec­ tivos que contienen cicloheximida y no puede convertirse a una forma de levadura con la incubación a 35-37 °C. En algunas cepas también pueden observarse conidios más pequeños, ovoides, que nacen individualmente de conidióforos cortos. En los casos de sospecha de histoplasmosis, pueden realizarse pruebas con sondas de ácidos nucleicos o ensayos de exoantí­ geno sobre extractos miceliales de colonias jóvenes para esta­ blecer una identificación rápida.

Las colonias tienen una superficie blanca, algodonosa o vellosa. El reverso de la colonia es beige claro. La m icrosco­ pia revela microconidios diminutos y globulosos que se agre­ gan densamente alrededor de conidióforos ramificados, cortos y delicados que se incurvan de una manera singular con des­ víos en zigzag (aspecto geniculado o en forma de rodillas) (fig. 21-43). Cada conidio se origina en un plano, después del cual el conidióforo gira antes de que se presente otro conidio en otro plano y así sucesivamente. Este tipo de conidiación se denomina sim podial. En el recuadro de correlación clínica 21-3 se presentan diversas manifestaciones clínicas de las infecciones oportunis­ tas por hongos filamentosos hialinos.

Identificación de los dermatófitos Los dermatófitos son un grupo separado de hongos que infectan la piel, el pelo y las uñas de los seres humanos y los animales, y causan diversas infecciones cutáneas, familiarmen­ te conocidas como “tiñas”. Cualquier hongo filamentoso aisla­ do en cultivo de muestras de piel, uñas o pelos debe ser eva-

Figura 21-43 M icrofotografía y esquem a que ilustran los delicados conidióforos en zigzag de especies de Beauveria, cada uno de los cuales sostiene un solo coni­ dio ovalado.

Id e n tific a c ió n d e los d e rm a tó fito s

113 7

R E C U A D R O DE CO R R E LA C IÓ N CLÍNICA 21-3 H ia lo hifo m ico sis Los micetomas, las onicomicosis™ y las queratitis 153 micóticas suelen ser las infecciones más com unes causadas por este grupo de hongos filamentosos. Informes de otras infecciones, com o sinusitis (incluso la form ación de bola micótica). meningitis, osteomielitis, endocarditis y otom icosis son infrecuentes en la literatura médica. Rippon realizó un resum en de varios de los primeros inform es . 234 Quizás la notoriedad m ás reciente ha sido la em ergencia de Penicillium mameffei com o patógeno hum ano importante. BIum : 4 revisó 155 casos inform a­ dos y concluyó que P. mameffei es la tercera infección oportunista más común en los pacientes infectados por el HIV en ciertas partes del sudeste asiático, donde la infección es endémica. P. mameffei puede causar dos tipos de enfermedad: focal y una form a progresiva y diseminada mortal que simula por la clínica a la histoplasm osis . 197 La propensión de este hongo para invadir y diseminarse se basa en su propiedad '‘dim orfa" exclusiva de convertirse en una entidad levaduriforme cuando se encuentra en el tejido enfermo o se lo cultiva a 37 °C . 50 En un informe de cinco casos, Kurup y cois . 152 encontraron que la fiebre, la pérdida de peso, la anemia y las lesiones cutáneas papulares eran las m anifestaciones clínicas m ás frecuentes. L a capacidad de aislar el m icroorga­ nismo en cultivos de sangre fue un rasgo exclusivo adicional en los pacientes de esta serie. La clave para establecer el diagnóstico de peniciliosis m ameffei es el reconocimiento de cuerpos intracelulares pequeños que se asemejan a las formas de levadura de Histoplasma capsulalum en los cortes histológicos obtenidos de las lesiones focales típicas. Kaufm an y cois., en los Centers for Disease Control and Prevention . 136 elaboraron anticuerpos m onoclonales contra antígenos obtenidos por filtrado del cultivo levaduriforme de P. mameffei, después de la absorción con la form a de levadura de H. capsulatum, lo que produjo un reactivo sensible para la realización de la técnica de inm unofluorescencia indirecta. Así, los autores pudieron detectar la form a levaduriforme de P mameffei en 43 aislamientos y en los cortes de tejidos de seis seres hum anos con peniciliosis m am effei. No se encontró ningún resultado falso positivo en el estudio de cortes de tejido que contenían levaduras de H. capsulatum. Cooper y M cG innis , 5 0 en una revisión global, mostraron la presentación clínica, el diagnóstico diferencial, la micología. la histopatología. la serología diagnóstica, las pruebas de sensibilidad in vitro (antifungigrama) y el tratamiento de las infecciones por P. mameffei en pacientes con SIDA. Las especies de Penicillium distintas de P. mameffei sólo raras veces causan infecciones hum anas oportunistas. Chan y cois . 39 informaron dos casos de peritonitis relacionada con diálisis peritoneal causados por Paecilomyces variotii. Cada uno de estos pacientes había recibido m últiples antibióticos como tratam iento para la peritonitis bacteriana, lo que tal vez contribuyó a la aparición de la infección oportunista por Paecilomyces. Las infecciones relacionadas con especies de Paecilomyces tam bién han sido informadas por Chan-Tack y cois .40 (fungem ia en un receptor adulto de trasplante de m édula ósea), Gucalp y cois . 9 8 (sinusitis resistente a la anfotericina B en un adulto inm unodeprim ido), Okhravi y cois . 201 (endoftalm itis secun­ daria a una queratoplastia penetrante) y W estenfeld y cois . 2 8 6 (un caso de infección subcutánea con bursitis prerrotuliana). Castro y cois . 37 inform aron un caso de infección subcutánea profunda del antebrazo izquierdo por Paecilomyces lilacinus en un receptor de trasplante renal que respondió al tratamiento oral con griseofulvina. Estos autores revisaron 42 casos de micosis hum ana debida a especies de Paecilomyces, por lo general junto con injertos protésicos o inmunosupresión. Casi todas las cepas de P. lilacinus son resistentes a la anfotericina B; la mayoría de las cepas P. variotii presentan sensibilidad. Se inform ó que las especies de Scopulariopsis causan infecciones de uñas, tejido subcutáneo y pulm ones . 274 Phillips y cois .222 inform aron varios casos hum anos de micosis por S. brevicaulis que afectan la uña del pie en receptores de alotrasplantes de m édula ósea. Otras infecciones citadas fueron neum oni­ tis por hipersensibilidad, form ación de bola m icótica en el pulmón e infecciones subcutáneas profundas en huéspedes inmunodeprimidos. Las infecciones por otras especies de Scopulariopsis incluyen casos aislados de sinusitis m icótica invasora informados por Ellison y cois . 73 y por Jabor y cois . ; 128 en este último caso la invasión produjo la destrucción nasal en un huésped no inmunodeprim ido; un caso mortal de endocarditis relacionada con valvuloplastia por S. brevicaulis inform ado por M igrino y cois.181; y un caso de infección subcutánea recurrente en un paciente de 6 años después del trasplante hepático, inform ado por Sellier y cois . 2 5 0 Schell y Perfect 246 publicaron un caso de infección disem inada por Acremonium strictum en un paciente con neutropenia. En este caso, el aislamiento del m icroorganism o en los cultivos de sangre tras la recuperación anterior de m uestras de heces indica al tubo digestivo com o la fuente primaria de infección. Vajpayee y co is . 2 7 7 determ inaron que las especies de Fusarium eran la causa más común de queratitis m icótica en 156 pacientes con úlcera de córnea micó­ tica, con más frecuencia com o com plicación de conjuntivitis alérgica y una com binación de antibioticoterapia y corticoterapia. Una revisión global de la taxonom ía, la micología, las características de laboratorio y los síndromes clínicos relacionados con las especies de Fusarium también fue publicada por Nielsen y cois . 194 Estos autores citan las especies de Fusarium com o la causa más com ún de queratitis m icótica en los Estados Unidos, por lo general tras el traum atism o de córnea secundario a la im plantación ocular de fragm entos vegetales o materia del suelo durante las actividades al aire libre. La queratitis m icótica se ha inform ado en 4-27% de usuarios de lentes de contacto, en los que las especies de Fusarium son las que se aíslan con mayor frecuencia . 294 Low y cois . 166 inform aron un caso de queratitis relacionado con Beauveria que se curó con la disección profunda. Las causas predisponentes incluyen el cuidado inadecuado de las lentes, la presencia de una infección de córnea subyacente com o infección por herpes sim ple y el uso prolongado de medicación local con corticosteroides y antibióticos. En un estudio retrospectivo de 10 años (1986-1995) de pacientes con procesos malignos hemáticos. Boutati y A naissie 29 encontraron infección disem ina­ da por especies de Fusarium en 43 pacientes, 40 con enfermedad diseminada y 3 con infección pulm onar invasora. Aunque la farm acoterapia resultó eficaz en 13 de estos pacientes, en uno la recuperación de la infección sólo ocurrió con la reversión de la mielosupresión y la neutropenia. Krcmery y cois . 150 inform aron el aislamiento de especies de Fusarium en el torrente circulatorio de pacientes con diversos procesos malignos. Las infecciones cutáneas pueden ser secundarias a la penetración directa de la piel por vegetales contam inados. El autor actuó com o consultor de un caso no com unicado de m icetom a postraumático por Fusarium en una m ujer de 35 años. Inicialmente, se había recuperado de una biopsia superficial de la lesión una especie de Alternaría, sensible a la anfotericina B en los estudios in vitro. Com o la paciente no mejoró con el tratam iento con anfotericina B. se realizó una biopsia más profunda de la que se aisló una cepa de .especie de Fusarium resistente a la anfotericina. La enfermedad rem itió con la adm inistra­ ción de itraconazol.

Scedosporium apiospermum es una de las causas más com unes de m icetom as subcutáneos en los Estados Unidos. Las infecciones pulm onares por este m icroorganism o suelen ser similares a las infecciones por especies de Aspergillus y las hifas tienen un aspecto semejante en los cortes teñidos de tejido. La presencia de granos esféricos, blandos a firmes, blancos a am arillos indica la infección por una especie de Scedosporium. Rippon 2 3 4 realizó una revisión am plia de otras infecciones causadas por Scedosporium, com o sinusitis, incluso las infecciones por granulom as micóticos, m eningitis, osteomielitis, endo­ carditis, queratitis micótica. endoftalm itis y otomicosis. Pérez y cois . 214 inform aron un caso de absceso cerebral por Pseudallescheria boydii asociado con un catéter venoso central infectado.

(Continúa)

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CAPÍTULO 21 Micología

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N CLÍNICA 21-3 H ia lo h ifo m ico sis (cont.) Tamm y cois . 271 informaron infecciones por Scedosporium apiospeimum (Pseudallescheria boydii) en siete receptores de trasplantes pulm onares en quienes se m anifestaron infecciones pulmonares. En todos los pacientes se confirmó la presencia de Scedosporium apiospermum en las m uestras de lavado broncoalveolar. Todos los pacientes manifestaron problem as de las vías aéreas, com o estenosis isquémica temprana de la vía aérea en uno y síndrome de bronquiolitis obliterante en los otros seis. El tratamiento com binado con itraconazol y fluconazol no erradicó a Scedosporium. Cuatro de los siete pacientes fallecieron por la bronquiolitis obliterante avanzada 3-35 meses después del diagnóstico de infección pulm onar por Scedosporium. Salkin y cois . 2 4 0 citan a Scedosporium prolificans (inflatum) com o patógeno emergente e informaron 15 casos de infección en seres humanos. W ilson y cois . 298 agregaron otros 11 casos de infección por el mismo hongo, casi siempre en pacientes que habían sufrido traumatismo penetrante o cirugía. Las especies de Scedosporium. en particular S. prolificans, resultan resistentes a la anfotericina B. el m iconazol. ei ketoconazol y otros antimicóticos, una razón im portante para diferenciarlos de las especies de Aspergillus. Sin em bargo, Pickles y cois . 223 com unicaron el tratamiento exitoso con curaciones mediante el em pleo de fluconazol. Alvarez y cois . 10 inform aron un brote intrahospitalario de cuatro casos mortales por Scedosporium prolificans (inflatum) en pacientes con neutropenia intensa secundaria a la quim ioterapia contra la leucemia. Las infecciones sucedieron de m odo secuencial dentro de un período de un m es en dos habitacio­ nes durante una fase de reconstrucción del hospital cuando los pacientes se alojaban en una unidad provisoria de hematología. Los autores concluyeron que. a pesar de la incapacidad para aislar S. proliferans en las habitaciones de los pacientes o en los corredores adyacentes, la evidencia circunstancial indicó un brote intrahospitalario. Los antifungigramas realizados de los aislamientos revelaron resistencia a anfotericina B, ketoconazol y miconazol, lo que confirm a el perfil de resistencia observado por otros autores. Sim arro y cois . 257 comunicaron dos casos relacionados similares. Ambos pacientes se internaron en la guardia hem atológica en salas cercanas durante el trabajo de construcción en el hospital. Tras una sepsis bacteriana previa en la fase neutropénica. que mejoró con el tratam iento antibiótico, el estado respira­ torio de los pacientes se deterioró y presentaron disnea aguda, con infiltrado pulmonar en uno de ellos. Después de algunas horas am bos pacientes fallecie­ ron. Los cultivos de sangre resultaron positivos para S. prolificans. De Battle y cois . 5 9 describieron un caso de infección disem inada por S. prolificans en un paciente con leucem ia durante el período de neutropenia indu­ cido por la quimioterapia. El hongo se aisló en los cultivos de cuatro muestras de sangre. En la necropsia, se halló infección micótica generalizada, con trombosis intravascular m últiple m icótica en pulm ones, hígado, bazo y otros órganos. Los autores insisten en que se realicen todos los intentos posibles para proteger a los pacientes con leucem ia de la invasión de hongos saprofitos durante los períodos de neutropenia inducida por el tratamiento. Un cuadro reconocido en los últimos tiempos que implica a los hongos filamentosos hialinos se ha designado “síndrome del edificio enferm o ” . 171 Se les está solicitando a los m édicos que evalúen en los pacientes las enferm edades relacionadas con el medioambiente, que suelen manifestarse com o estomatitis, rinitis, conjuntivitis, pancitopenia y trastornos neurológicos, tanto aisladas como combinadas. También se inform ó la muerte de caballos y de otros anim a­ les. Stachybotrys chartarum se ha implicado com o un hongo filamentoso hialino asociado con este síndrome. Este hongo es im portante porque produce m icotoxinas (tricotecenos), que son biológicamente activas y pueden causar la diversidad de cuadros patológicos citados tanto en los seres humanos com o en los anim ales. Pueden aislarse en cereales contam inados, tabaco, espum a aislante y paredes de edificios dañadas por el agua con gran humedad. Pieckova y Jesenska 2 2 4 publicaron una revisión de la incidencia cuantitativa y cualitativa de hongos filamentosos en las m oradas, los problem as de salud de los ocupantes de estas "casas húm edas” y los enfoques para la detección y el aislamiento de estos hongos com o agentes etiológicos. Perfect y Schell 215 abordaron varios problem as relacionados con la patogenia, la epidem iología, el diagnóstico y el tratam iento de la exposición frecuente y prolongada de pacientes inm unodeprim idos a estos hongos filamentosos en diversas condiciones medioam bientales.

luado para determinar la presencia de un dermatófito. Sin embargo, es necesario estar alerta, ya que otros hongos patóge­ nos, incluso los hongos filamTentosos dimorfos, también pue­ den afectar la piel y tener características microscópicas simila­ res a los dermatófitos. Además, pueden aislarse muchos hongos filamentosos medioambientales saprofitos, sobre todo en las uñas. Los errores diagnósticos podrían tener consecuencias importantes. La observación de segmentos típicos de hifas en las preparaciones en fresco directas de las escamas de piel tra­ tadas con KOH (fig. 21-44) o la invasión ectotrix o endotrix de pelos infectados son hallazgos preliminares útiles (fig. 21-45). Como las colonias de las diversas cepas de dermatófitos varían considerablemente en la velocidad de crecimiento, la morfolo­ gía y la producción de pigmento, incluso dentro de las mismas especies, las designaciones del género y de la especie dependen de la observación de las características microscópicas. Sin embargo, algunas características de las colonias, cuando están presentes, pueden ser útiles para identificar una especie dada. Las colonias representativas de los dermatófitos se ilustran en la lámina en color 21-4. Las especies de im portancia médica que se aíslan con mayor frecuencia en los laboratorios clíni­ cos son:

Microsporum canis Microsporum gypseum Trichophyton mentagrophytes Trichophyton rubrum Trichophyton tonsurans Trichophyton verrucosum Epidermophyton floccosum En un estudio de infecciones por dermatófitos realizado en los Estados Unidos entre 1993 y 1995 por Weitzman,285 Tricho­ phyton tonsurans fue la especie de dermatófito aislado con mayor frecuencia (44,5% de casos) seguido de Trichophyton rubrum (41,3%) y, en menor proporción, por Trichophyton men­ tagrophytes (8,5%), Microsporum canis (3,5%) y Epidermo­ phyton floccosum (1,1%). Los dermatófitos se dividen en tres géneros: Microsporum, Trichophyton y Epidermophyton, sobre la base de las diferen­ cias en la morfología microscópica y los modos de esporula­ ción. Un enfoque para la identificación de géneros y especies de dermatófitos se presenta en el diagrama 21-3. El género M icrosporum se caracteriza por la producción de muchos macroconidios y escasos o ningún microconidio. Los

Id e n tific a c ió n d e los d e rm a tó fito s

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Figura 21-44 M icrofotografía de una preparación en fresco con KOH de raspado de piel que ilustra un segm ento de la hifa de uno de los hongos derm ató­ fitos. N ótese que el fragm ento de la hifa está rom piéndose en artroconidios diminutos (objetivo de inmersión). Figura 21-45 M icrofotografía tom ada a través de un corte longitudinal del tallo del pelo en un caso de derm atofitosis. Nótese la invasión del endotrix con hifas tabicadas en el centro y conidios en la periferia. (Objetivo de inmersión, tinción de m etenam ina argéntica de Gomori, 400x).

macroconidios son multicelulares, de pared gruesa, equinulada o verrucosa. La identificación de especie se basa en las dife­ rencias de la morfología de los macroconidios. Los microconidios son pequeños, hialinos y con forma de lágrima o elípticos y adheridos directamente a los lados de las hifas. El género Trichophyton se caracteriza por la producción de muchos microconidios y alguno o ningún macroconidio. Los macroconidios, cuando se forman, al contrario de los de las especies de Microsporum, son de paredes delgadas y lisas. El tamaño y la disposición de los microconidios son importantes para la identificación de la especie. La producción de pigmen­ to, la actividad de la ureasa, el modo de afección al pelo y los patrones de crecimiento diferencial en los medios de cultivo con tiamina y niacina, y sin estos componentes (agares dife­ renciales para Trichophyton) también son útiles para la identi­ ficación de la especie. El género Epidermophyton se caracteriza por la producción de macroconidios constituidos por dos a cuatro células, con forma de clava y paredes lisas que nacen, ya sea de modo ais­ lado de las hifas, o más característicamente, en grupos de dos

o tres. De fundamental importancia en la identificación de Epidermophyton es la ausencia de microconidios. Identificación de especies de Microsporum

MICROSPORUM CANIS El crecimiento es rápido, en 3 a 5 días. Al comienzo las colo­ nias son blancas y sedosas; más tarde desarrollan una pigmen­ tación amarilla limón en la periferia (lámina en color 21-4A). El reverso de la colonia se torna amarillo castaño cuando la colonia madura. Microscópicamente, pueden observarse macroconidios y microconidios, con predominio de los primeros. La producción de macroconidios multicelulares, fusiformes, puntiagudos y con el extremo algo doblado sobre un lado, es característica de Microsporum canis (fig. 21-46). Los microconidios pueden estar esparcidos y nacer directamente del lado de las hifas. En las infecciones del pelo, se disponen en grupos, con forma de mosaico por fuera del tallo (ectotrix).

Figura 21 -46 M icrofotografía y esquem a de un m acroconidio m ulticelular de Microsporum canis , que m uestran el aspecto fusiform e, con pared equinulada grue­ sa, tabiques transversales y extrem os afinados.

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CAPÍTULO 21 Micología

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Figura 21-47 M icrofotografía y esquem a de un macroconidio m ulticelular de Microsporum gypseum. que revelan la pared gruesa, equinulada, los tabiques trans­ versales y una célula term inal redondeada.

MICROSPORUM GYPSEUM El crecimiento es rápido, en 3 a 5 días. Las colonias son pla­ nas. al comienzo blancas pero toman un color beige a castaño o rojizo ocre a medida que maduran (lámina en color 21-4B). La superficie se tom a azucarada o granular cuando se producen los conidios. Los macroconidios de M. gypseum suelen ser más numero­ sos que los de M. canis, pero la forma de barril es menos noto­ ria y presentan las puntas redondeadas (fig. 21-47). Estos ras­ gos no siempre son bien definidos y otros criterios, como el sitio y la naturaleza de la infección, el antecedente de exposi­ ción a los animales y la morfología de la colonia, pueden ser útiles para la identificación diferencial.

cas, con la superficie algodonosa y más tarde de color beige que se toman rojo parduscas en el reverso. Con la madurez pueden aparecer penachos en la superficie. La microscopia revela la presencia característica de macro­ conidios de tres células, ovalados con forma de clavas. Las paredes celulares son finamente verrucosas (fig. 21-48), a dife­ rencia de los conidios de E. floccosum que tienen paredes lisas. De los lados de las hifas se originan microconidios pequeños de 3-5 (im, cilindricos con forma de clavas, una observación adicional importante para la diferenciación entre M. nanum y E. floccosum. Sólo se han informado casos ocasionales de infecciones humanas por M. nanum, sobre todo en los criado­ res de cerdos.235 Identificación de especies de Trichophyton

MICROSPORUM NANUM Los macroconidios de Microsporum nanum pueden parecer­ se a los de Epidermophyton floccosum. Las colonias de M. nanum crecen con rapidez en 3 a 5 días; al comienzo son blan-

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Figura 21-48 M icrofotografía del m acroconidios de Microsporum nanum , los cuales difieren de los de E. floccosum porque están form ados por dos célu­ las, con pared gruesa y equinulada.

TRICHOPHYTON MENTAGROPHYTES El crecimiento es relativamente rápido y llegan a la madura­ ción en 3 a 5 días. Pueden observarse dos tipos de colonias: algodonosas o granulares. Las variantes algodonosas son ini­ cialmente blancas, pero pueden tomarse de color crema a ocre con la madurez. A menudo se desarrollan hifas estériles que forman telarañas con una zona central umbilicada. La periferia y el reverso de la colonia pueden ser rosados a ocres (lámina en color 21-4D). Las variantes granulares producen colonias pla­ nas que se diseminan con una superficie granular gruesa. Al comienzo las colonias son blancas o amarillo intensas, pero después se toman de color ocre a castaño. También puede haber un pigmento rojo similar al observado en T. rubrum; sin embargo, la pigmentación nunca es tan intensa en T. mentagrophytes, en especial cuando las colonias se desarrollan en paralelo en agar harina de maíz o agar patata dextrosa (lámina en color 21-4F). Los microconidios tienden a formar grupos laxos, similares a racimos de uvas (fig. 21-49). Es característica la ausencia de macroconidios o se presentan en escaso número; éstos son más comunes en cultivos granulares y son largos, multicelulares, con forma de lápiz, y paredes delgadas y lisas. A menudo se observan hifas espiraladas y clamidosporas en las hifas vegeta­ tivas. La mayoría de las cepas presentan gran actividad de ure­ asa y en las infecciones de los pelos las hifas invaden los tallos (endotrix). El crecimiento es igual en los agares diferenciales para Trichophyton.

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Figura 21-49 M icrofotografía y esquem a de las formas microscópicas de Trichophyton mentagrophytes, que muestran conidios diminutos, esféricos dispuestos en grupos (“racim os”) laxos.

TRICHOPHYTON RUBRUM El crecimiento en el agar dextrosa de Sabouraud es relativa­ mente lento y requiere 4 a 7 días hasta la madurez. Al comien­ zo, la superficie de la colonia es blanca y la consistencia puede ser algodonosa, aterciopelada o granular, lo cual depende de la cepa, el medio de cultivo que se emplea y la magnitud de la esporulación. Como indica el nombre de la especie, una obser­ vación importante es la producción de un pigmento hidrosoluble, de color rojo vino en el reverso de la colonia que se difun­ de al agar (lámina en color 21-4E y F). La producción de pig­ mento es más intensa en las colonias que crecen en agar harina de maíz o agar patata dextrosa que en el agar dextrosa de Sabouraud. Vistos con el microscopio, los microconidios de T. rubrum tienden a presentar formas de lágrimas y suelen distribuirse a cada lado de las hebras de las hifas, lo que origina un aspecto de “pájaros en un cerco”, en lugar de la agrupación laxa obser­ vada con M. mentagrophytes (fig. 21-50). Raras veces se obser­

van macroconidios multicelulares; cuando están presentes son largos y con forma de lápiz, con paredes lisas, delgadas, simi­ lares a los generados por T. mentagrophytes. No producen ure­ asa, el tallo del pelo no está invadido en la prueba de la perfo­ ración del pelo in vitro y el crecimiento es igual en los agares diferenciales para Trichophyton.

TRICHOPHYTON TONSURANS De crecimiento lento, requieren de 7 a 10 días para alcanzar la madurez. Las colonias presentan una superficie granular característica, de color beige, con la formación de pliegues radiales profundos cuando están maduras (lámina en color 214G). Casi nunca se observan macroconidios en los aislamien­ tos de laboratorio. La observación microscópica revela microconidios distinti­ vos. Presentan variaciones considerables en el tamaño y son alargados, en forma de maza, o grandes con forma de globos y

Figura 21-50 M icrofotografía y esquem a de las form as microscópicas de Trichophyton rubrum. que muestran la producción de conidios diminutos desde los lados de las hifas en una disposición com o “pájaros en un cerco” .

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Micología

CAPÍTULO 21

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Figura 21 -51 M icrofotografía y esquem a de conidios con form as de maza y esféricos de Trichophyton tonsurans que nacen lateralm ente de hifas delicadas y hialinas.

pueden mezclarse con microconidios ovalados más pequeños o con forma de lágrima (fig. 21-51). La identificación puede con­ firmarse por el crecimiento deficiente en agar Trichophyton 1 (deficiente en tiamina, lo cual es un requisito de crecimiento absoluto para T. tonsurans) y buen crecimiento en agar Tricho­ phyton 4 (con alto contenido en tiamina).

TRICHOPHYTON VERRUCOSUM El crecimiento es lento, requiere de 7 a 14 días para alcanzar la madurez. Presenta escaso desarrollo en agar Trichophyton 1, que es deficiente en tiamina e inositol. Se observará crecimien­ to en agares Trichophyton 2, 3 y 4, todos los cuales contienen cualquier tiamina, inositol o ambos. Las colonias son peque-

B

ñas, redondas, aplanadas, sin vello al comienzo o vellosas des­ pués, y blancas a amarillo intenso. El reverso de la colonia sigue sin mostrar pigmento. Observada con el microscopio, la esporulación suele ser esca­ sa. Pueden verse hifas tipo astas y también es característica la producción de numerosas clamidosporas dispuestas en cadenas (fig. 21-52). Los macroconidios son raros, pero cuando se pre­ sentan son distintivos; son multicelulares, con paredes finas, lisas y delgadas con una configuración en paleta, “palillo” o “cola de rata”. Los microconidios, cuando están presentes, son pequeños, piriformes y nacen directamente de los lados de las hifas.

EPIDERMOPHYTON FLOCCOSUM Las colonias crecen con rapidez, en el término de 3 a 5 días; en un comienzo son blanco grisáceas y luego, cuando maduran, adquieren una pigmentación característica verde caqui. Pueden verse serpentinas de hifas blanco amarillentas que se irradian desde el centro de la colonia hacia la periferia (lámina en color 21-4H). La superficie se tom a granular al madurar y producir conidios. N unca se producen m icroconidios, un dato importante. Por lo tanto, si se observan microconidios en un cultivo desconoci­ do de un dermatófito, puede descartarse la consideración de E. floccosum. Los m acroconidios suelen ser abundantes, con forma de maza, de tres a cinco células y paredes lisas y delga­ das (fig. 21-53). A menudo forman grupos de a tres o cuatro. Los clamidioconidios están típicamente presentes, en especial en los cultivos más viejos. Diagnóstico mediante técnicas sin cultivo

Figura 21-52 M icrofotografía del aspecto m icroscópico de cadenas de cla­ midosporas, característico de Trichophyton verrucosum.

Como los procedimientos convencionales del laboratorio para la identificación de dermatófitos son lentos o carecen de especificidad, hacemos aquí una breve mención a la aplicación de la tecnología de amplificación de ácidos nucleicos que posi­ bilitó la identificación rápida y precisa de los dermatófitos. Estudios recientes publicados por Liu y cois.162 mostraron que

H o n g o s d im o rfo s

cuando se utilizó uno de los cuatro cebadores aleatorios (OPAA11, OPD18, OPAAI7 y OPU15) en la reacción en cade­ na de la polimerasa con cebado aleatorio (AP-PCR), podrían distinguirse hasta 20 de las 25 especies o subespecies de dermatófitos en investigación sobre la base de sus patrones de bandas característicos detectados por electroforesis en gel de agarosa. Aunque raras veces puede requerirse el uso de esta técni­ ca, aquí se proporcionan las citas bibliográficas para aquellos casos en que se necesita una definición más precisa. En el recuadro de correlación clínica 21-4 figuran las mani­ festaciones clínicas de las diversas infecciones por dermatófitos.

Hongos dimorfos Un subconjunto de hongos filamentosos hialinos, los hongos dimorfos, suelen considerarse por separado porque presentan características singulares. En primer lugar, son dimorfos; es decir, existen en la forma filamentosa en el ambiente (incuba­ ción a temperatura ambiente), pero como levaduras cuando se los incuba a 35-37 °C (la temperatura corporal). El hábitat natural para los hongos dimorfos es el suelo donde, en condi­ ciones ambientales, existen como hongos filamentosos y sufren esporulación. La forma filamentosa es la infectante. Los seres humanos y los animales se infectan a través de la inhalación o por la implantación traumática directa de material contamina­ do con conidios o elementos de las hifas. Cuando se incuban a 35-37 °C o acceden a la temperatura corporal de los tejidos humanos, los conidios se transforman en una forma de levadu­ ra (o forma de esférula para Coccidioides immitis). En segun­ do lugar, los hongos dimorfos son patógenos y causan “infec­ ciones profundas” en los seres humanos. Como grupo, pueden ser muy virulentos en los huéspedes susceptibles, invadir pro­ fundamente los tejidos y los órganos, y diseminarse por todo el cuerpo. Las especies de importancia médica son: Blastomyces dermatitidis Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Sporothrix schenckii Paracoccidioides braziliensis

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Es característico el crecimiento lento de las colonias (10 a 30 días) cuando se aíslan en cultivo primario a partir de m ues­ tras clínicas. En los casos en que la concentración de esporas en la muestra clínica es alta, en especial en el esputo, el cre­ cimiento puede observarse en el transcurso de 4 a 7 días. Raras veces se observa un crecimiento fino y delicado a las 24-72 horas en placas de agar sangre incubadas a 35 °C. A 30 °C, la temperatura usual de incubación del laboratorio, las colonias aparecen como filamentosas con un micelio deli­ cado, sedoso, velloso o en telaraña. En algunos casos pueden aparecer áreas focales levaduriformes (lámina en color 215A). Las colonias típicas son blanco grisáceas o beige, aun­ que algunas cepas pueden mostrar un tinte amarillo pastel claro dentro de una pigmentación rosa. Los hongos dimorfos como grupo también crecen en medios de cultivo que contie­ nen cicloheximida, una valiosa propiedad para diferenciarlos de los hongos filamentosos saprofitos, en especial en su forma ambiental similar, que presentan un desarrollo defi­ ciente o nulo. Si la temperatura de incubación aumenta, como en el proce­ so de conversión a la forma de levadura, puede observarse una fase de transformación espinosa antes de que aparezcan las colonias levaduriformes típicas (lámina en color 21-5C). Cuando se completa la conversión a levadura, las colonias son pastosas, lisas, de bordes continuos y tienen una pigmentación de blanca intensa a amarilla (lámina en color 21-5E). En la mayoría de los laboratorios rara vez se intenta la conversión a levadura de los cultivos filamentosos; en cambio, se realizan identificaciones rápidas poco después de que las colonias sos­ pechosas aparecen en el cultivo, mediante sondas de ácidos nucleicos o ensayos del exoantígeno. Puede sospecharse alguno de los hongos filamentosos dimorfos si en la microscopia se observan hifas hialinas deli­ cadas, tabicadas, con paredes paralelas. Por lo general, las hifas se alinean en haces paralelos. Las identificaciones de especie suelen realizarse mediante el examen de las colonias aisladas en el cultivo, sobre la base del tamaño, la forma, la posición y el origen de los conidios. También es posible hacer una identi­ ficación basada en la morfología de la levadura, como se obser­ va en los cortes teñidos de tejidos. Los criterios para la identi­ ficación de los hongos filamentosos dimorfos individuales se presentan en los párrafos siguientes.

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CAPÍTULO 21 Micología

R E C U A D R O D E C O R R E L A C IÓ N C L ÍN IC A 21-4

D e rm a tó fito s

Las form as de infecciones por derm atófitos recibieron diversos nombres, com o tiña del cuero cabelludo (tinea capitis), tiña del cuerpo ( tinea corporis), tiña del pie ( tinea pedis) y tiña inguinal ( tinea critris). Onicom icosis se refiere a las infecciones de las uñas. Con el advenim iento de la griseofulvina y los com ­ puestos antim icóticos tópicos, la identificación por el laboratorio de los derm atófitos se requiere en la actualidad con m enor frecuencia. En la mayoría de las prácticas clínicas, se realizan preparaciones en fresco con KOH de escam as de piel, raspados de uña o pelos en el consultorio del médico y se observan con el m icroscopio para la detección de hifas típicas que tienden a romperse en artroconidios. El tratam iento suele instituirse sin la realización de cultivos. Sin em bargo, esto puede cambiar, ya que se han inform ado casos de infecciones subcutáneas locales pero invasoras por T. rubrum y otras especies de der­ matófitos en casos ocasionales de infecciones diseminadas por tiña . 249 El térm ino "tiña" proviene de la Edad M edia y se refiere a los agujeros redondos en vestidos causados por la polilla de la ropa, un aspecto sim ilar a las lesiones anulares de la piel provocadas por los hongos dermatófitos. En la actualidad, el térm ino se utiliza para describir los diversos síndrom es clínicos causados por dermatófitos. Las tiñas tam bién son com unes en perros, gatos, caballos, ganado bovino y otros anim ales, los que m antienen la fuente de infec­ ciones zoofílicas humanas. El siguiente es un resum en de los diversos tipos clínicos de infecciones por tiñas. Tiña del cuero cabelludo Pueden observarse varios tipos de infección: 1) tiña con placas grises, una infección extotrix transm isible de los niños causada por Microsporum audouimi o M. canis 2) infección extotrix inflamatoria producida por T. mentagrophytes, de origen animal 3) tiña con puntos negros, una infección endotrix en la que los pelos infectados se rompen en la superficie de la piel y producen lo que se asem eja a un punto negro, causada por T. tonsurans 4) m asa exofítica fungoide (kerión) producida por T. tonsurans o infecciones fávicas causadas por T. schoenleinii (en Escandinavia y norte de Europa) y por T. violaceum (en las regiones del sur de Europa m editerránea) Durante los últim os 50 años, T. tonsurans ha reem plazado a T. audouinii com o el agente etiológico predom inante de la tiña del cuero cabelludo en los Estados U nidos y Europa Occidental . 7 0 1 0 1 ' 2 9 7 Las infecciones por T. tonsurans son contagiosas, com o se evidencia por un brote de infecciones de tiña del cuerpo entre cuatro m iem bros del personal sanitario en una guardia de pacientes internados en rehabilitación que contrajeron la enfermedad de un paciente infectado . 160 De reciente interés, la diseminación contagiosa de T. tonsurans se ha convertido en una molestia entre los jóvenes que participan en com peten­ cias de lucha. Dado que las lesiones parecen algo diferentes en el subconjunto de estos jóvenes cuando se las com para con la población pediátrica en con­ junto, a esta form a de infección se le aplicó el térm ino "tiña del gladiador” (tinea gladiatorum),'*’ Lo más frecuente es que la tiña del cuero cabelludo se adquiera por el contacto directo con un niño infectado o a través de diversos fómites; un estado de portador adulto asintom ático puede contribuir a la persis­ tencia de la infección en un ámbito dado . 19 En un estudio de infección por dermatófitos en 202 niños que residen en Kuwait, al-Fouzan y cois . 7 encontraron que la tíña del cuero cabelludo era la infección más frecuente y que M. canis era la especie con mayor prevalencia (96% de los casos en esta serie). Aunque en la gran m ayoría de los casos la infección perm anece limitada a la superficie de la piel, los inform es han indicado que el hongo puede invadir tejidos más profundos en huéspedes inm unodeprim idos. King y cois . 142 informaron el caso de infección papular subcutánea en un receptor de trasplante renal, con ele­ m entos m icóticos invasores observados en una biopsia profunda de la piel. El segundo caso fue en un paciente con SIDA y un recuento de linfocitos CD4 de 81, en el que se observó la penetración subcutánea profunda de los nodulos eritematosos del cuero cabelludo y la cara. Tiña del cuerpo Las lesiones anulares típicas sobre la piel de las partes lisas del cuerpo con un borde de crecimiento hem orrágico que se disemina suelen estar producidas por T. rubrum. T. mentagrophytes y T. tonsurans. Este último hongo se está aislando cada vez con m ayor frecuencia com o causa de tiña del cuerpo en los Estados Unidos. T. rubrum en particular está bien adaptado para sobrevivir en la superficie de la piel, lo que lleva a la infección crónica que suele perdurar durante toda la vida del paciente . 53 Los m ananos de T. rubrum parecen ser más capaces de suprim ir las reacciones inmunitarias mediadas por células que los m ananos de otros hongos, por lo que evaden la respuesta del huésped y perm iten la supervivencia. T. rubrum tam bién puede sobrevivir fuera del cuerpo hum ano cuando las esporas se descaman junto con las escamas, lo cual estim ula el contacto interhumano en diversos hábitats. En ocasiones, T. canis, un hongo zoofílico y T. gypseum, geofílico, también se encuentran com o productores de infecciones en la práctica clínica. Tiña de la barba Esta infección zoofílica se observa con mayor frecuencia en las personas que trabajan en granjas y con productos de la leche. T. mentagrophytes es el agen­ te más com ún aislado en las infecciones humanas y las lesiones tienden a ser inflamatorias. Trichophyton verrucosum tam bién se asocia con la tiña de la barba, adquirida de la piel del ganado vacuno. Sabota y cois . 258 han informado la infección por T. verrucosum en cinco pacientes, tres de los cuales presen­ taban tiña de la barba pustulosa grave y dos de ellos, erupciones en los antebrazos. Los cinco pacientes eran ganaderos. La preparación en fresco con KOH mostró hifas y los cultivos revelaron la presencia de T. verrucosum en los tres casos. T. verrucosum puede causar la tiña de la barba pustular en granjeros que los m édicos, incluso los especialistas en enfermedades infecciosas, pueden confundir con una infección por Staphylococcus aureus. La respuesta a la pregunta simple: ¿Usted es ganadero? puede sugerir el diagnóstico de T. verrucosum en el contexto clínico apropiado. Tiña inguinal Las lesiones tienden a ser circinadas y serpiginosas, con bordes inflamatorios, vesiculares, que se agrandan, la m ayoría de las veces causada por

Epidermophyton floccosum. Esta infección puede alcanzar proporciones epidémicas en atletas, soldados y tripulantes de em barcaciones que comparten toa­ llas, ropa de cam a y ropa de vestir. Tiña del pie (pie de atleta) Esta es la infección m icótica más com ún en los seres humanos, que de modo típico se m anifiesta com o lesiones cutáneas con prurito, descam ación o hum e­ dad de las plantas de los pies, entre los dedos o en am bas localizaciones. Las infecciones son más frecuentes durante los meses cálidos y húmedos. T. men­ tagrophytes, T. rubrum y E. floccosum suelen ser las especies de derm atófitos m ás aisladas. La gran cantidad de queratina en las plantas de los pies y las palmas de las m anos hace a estos dos sitios selectivamente vulnerables a la infección por T. mentagrophytes y otros dermatófitos. Debido a la capacidad de T. rubrum para sobrevivir com o esporas en las escam as de piel descam adas, estas áreas hiperqueratósicas son muy propensas a contraer las infecciones a través de toallas de baño contam inadas, pisos de vestuarios y otros hábitats humanos.

(Continúa)

H o n g o s d im o rfo s

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N CLÍNICA 21-4

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Derm atófitos (cont.)

Tiña de las uñas T iña de las uñas es el térm ino para describir el com prom iso de las uñas por hongos derm atófitos que debe diferenciarse de la onicomicosis, la cual se refie­ re a las infecciones causadas por una am plia variedad de hongos que no pertenecen a los dermatófitos, com o las especies de Aspergillus, Candida albicans, especies de Geotrichum y varias especies de feohifom icetos dem atiáceos hialinos. Las tiñas de las uñas com ienzan en el borde lateral o distal de la placa ungular y producen inflamación paroniquial. A m edida que la lesión progresa, la uña se engrasa y se torna quebradiza, con acum ulación subungular de detritos queratinizados. Los derm atófitos implicados con mayor frecuencia son T. rubrum y T. mentagrophytes. Lugo-Som olinos y Sánchez , ' 6 8 en un estudio de 100 pacientes consecutivos con diabetes no hallaron incidencia m ayor de infecciones por dermatófitos en relación con una población control. Se encontraron infecciones por algún tipo de dermatófitos en el 31% de los pacientes diabéticos y en el 33% de los del grupo control. Así, contrariam ente a la creencia popular, la diabetes mellitus no parece predisponer a las dermatofitosis.

Blastomyces dermatitidis y blastomicosis Blastomyces dermatitidis es un hongo filamentoso del suelo que es endémico en los estados adyacentes a los valles de los nos Mississippi y Ohio (Kentucky, Arkansas, Mississippi, Carolina del Norte, Tennessee, Louisiana, Illinois y Wisconsin). Al contrario de lo que sucede con la histoplasmo­ sis, en la que la magnitud de la zona endémica se ha trazado con claridad sobre la base de las pruebas cutáneas positivas, las regiones de infección por blastomicosis sólo se han determina­ do de acuerdo con los resultados de casos individuales debido a la falta de una prueba cutánea sensible.57 Se presume que los seres humanos se infectan por la inhalación de polvo contami­ nado por esporas; sin embargo, la forma filamentosa del hongo sólo se ha aislado aislado recientemente del suelo y de madera en descomposición a lo largo del trayecto de los ríos en Wisconsin.21144 En los perros existe una incidencia alta de infección.

PRESENTACIÓN EN EL LABORATORIO

De modo característico las colonias presentan un crecimien­ to lento en los cultivos primarios (10 a 30 días), salvo en los casos de infecciones con gran cantidad de hongos en que el cre­ cimiento puede verse en el transcurso de una semana. A 30 °C, las colonias aparecen como un micelio filamentoso velloso o sedoso, blanco grisáceo a beige pálido (lámina en color 21-5B).

Cuando se convierte a la forma de levadura, puede verse una fase espinosa durante la transformación antes de que aparezcan las colonias levaduriformes típicas. Las colonias se tornan lisas y más levaduriformes, salvo la protuberancia de espículas deli­ cadas, que aparecen como pelos en el extremo (lámina en color 21-5C). La microscopia de la forma filamentosa del hongo revela hifas delicadas (1-2 |im de diámetro), hialinas y tabicadas. Los conidios ovalados o piriformes, que miden 1-4 (im de diáme­ tro, nacen de modo individual en los extremos de los conidió­ foros largos o cortos (en forma de “chupachús”) (fig. 21-54). Los conidios de las especies saprofitas del suelo de Chrysospo­ rium presentan un aspecto similar en la microscopia. Cuando las colonias se convierten a las formas de levaduras a 35 °C en agar enriquecido son pequeñas, de bordes continuos, algo convexas, lisas y pueden tener una pigmentación amarillo intenso o beige. Con el microscopio se observan levaduras grandes (10-15 ¡im) y de modo característico presentan un solo brote adherido por una base ancha (fig. 21-55). Estas formas de levadura con brote de base ancha también pueden observarse en los cortes de tejidos contra un fondo celular purulento o granulomatoso (fig. 21-56, izquierda). Estas formas pueden con­ fundirse en los cortes de tejidos con las esférulas de Cocci­ dioides immitis que pueden estar una al lado de la otra. Sin embargo, el desarrollo de endosporas dentro de las esférulas proporciona la identificación de certeza de C. immitis (fig. 2156, derecha).

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CAPÍTULO 21 Micología

-O

0:

a o CJ

O Q .'

FS

B F ig u ra 2 1 -5 5 M icrofotografía y esquem a de levaduras grandes de Blastomyces dermatitidis, muchas de las cuales producen un brote con base ancha.

Las manifestaciones clínicas de las blastomicosis se encuen­ tran en el recuadro de correlación clínica 21-5.

DIAGNÓSTICO MEDIANTE TÉCNICAS SIN CULTIVO

Las pruebas serológicas para la detección de anticuerpos suelen considerarse inadecuadas para el diagnóstico de la blas­ tomicosis. Sólo en alrededor del 25% de los casos conocidos son positivas las técnicas de inmunodifusión y fijación del complemento. Los enzimoinmunoanálisis (EIA) son más sen­ sibles que la inmunodifusión (ID), pero menos específicos. Se cita un brote con una fuente común en el que la sensibilidad del EIA (77%) fue más alta que la de la ID (28%) o la fijación del complemento (FC) (9%), pero su especificidad fue más baja: 92%, en comparación con el 100% para la ID y la FC.67 Una prueba recientemente desarrollada para el antígeno de Blastomyces detectó antigenuria en el 92,9% de los casos de blas­ tomicosis, que incluye 89,3% de formas diseminadas y 100% de formas pulmonares de la enfermedad.68 Otros líquidos cor­ porales también pueden ser convenientes para la comprobación

del antígeno; se lo detectó en suero, líquido cefalorraquídeo (LCR) y líquido de lavado broncoalveolar (LBA). La detección de antígeno en LBA puede mejorar la sensibilidad para el diag­ nóstico en los pacientes con enfermedad pulmonar, en especial en los casos más leves. La detección del antígeno en el LCR puede ser útil para establecer el diagnóstico de meningitis por Blastomyces, cuando no se observan las formas de levaduras en los exámenes directos y los cultivos son negativos en cerca del 50% de los casos. La falta de eliminación del antígeno tras un ciclo de tratamiento puede anunciar el fracaso de éste; una recurrencia de la enfermedad puede detectarse si las concentra­ ciones de antígeno se elevan dos o tres veces.68 Las manifestaciones clínicas de blastomicosis se presentan en el recuadro de correlación clínica 21-5. Coccidioides immitis y coccidioidomicosis Coccidioides immitis es un hongo dimorfo del suelo, origi­ nario del valle de San Joaquín en California, las regiones del sur de Arizona y las del norte de México. Las regiones locales

F ig u ra 2 1 -5 6 Izquierda, m icrofotografía de un corte de tejido teñido con m etenam ina argéntica de Gomori, que ilustra grupos laxos de levaduras teñidas de negro de Blastomyces dermatitidis, algunas con un brote de base ancha característico. Derecha, m icrofotografía de un corte de tejido teñido con H-E que ilustra esféru­ las inm aduras, vacías y pequeñas de Coccidioides immitis, junto con formas maduras y grandes que contienen endosporas. Las esférulas vacías que quedan una al lado de la otra pueden sim ular las formas que emiten brotes con base ancha de B. dermatitidis (flecha).

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R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N CLÍNICA 21-5 B la sto m ico sis Las presentaciones clínicas de la blastom icosis fueron clasificadas por Davies y Sarosi 57'58 com o sigue: 1. asintom ática. en la actualidad sólo descubierta en situaciones de un brote 2 . enfermedad de tipo gripal, de duración breve, que se asem eja a otras infecciones respiratorias altas 3. enfermedad que se asem eja a la neum onía bacteriana, con com ienzo agudo de fiebre de alta intensidad, infiltrado lobular y tos productiva 4. enfermedad respiratoria subaguda o crónica con un complejo de síntomas que se asemejan a la tuberculosis o al cáncer del pulm ón, con hallazgos radiológicos de infiltrado fibronodular o lesiones en m asa 5. síndrom e de dificultad respiratoria del adulto fulminante con fiebre elevada, infiltrado difuso e insuficiencia respiratoria progresiva En el ámbito clínico, la blastom icosis com ienza casi siempre en los pulm ones com o la forma pulm onar primaria de la enfermedad cuya manifestación clínica inicial más común es la neum onía . 10 Esta puede ser aguda e im itar la neum onía bacteriana, o puede tornarse m enos activa; de vez en cuando, puede ser progresiva y grave. En la mayoría de los casos los síntomas se resuelven de modo espontáneo después de un síndrom e gripal breve. En las infecciones agudas, la tos seca, la fiebre de baja intensidad, la pérdida de peso, los sudores nocturnos, el dolor torácico pieurítico y las mialgias pueden ser los primeros síntomas de presentación. El dolor torácico localizado persistente, la pérdida de peso, los sudores nocturnos y el m alestar general pueden indicar la progre­ sión a la forma crónica. M ississippi tiene la prevalencia más alta de blastom icosis en A m érica del N orte . 158 Incluso en esta región endém ica reconocida por los m édicos, el diag­ nóstico es difícil de establecer. La blastom icosis fue correctam ente sospechada en el exam en inicial en sólo el 18% de 123 pacientes evaluados en el University o f M ississippi M edical Center en Jackson . 157 Los diagnósticos erróneos más frecuentes fueron la neum onía inespecífica (40%), los tum ores m alignos (16%) y la tuberculosis (14%). Sólo en presencia de com prom iso cutáneo la sospecha inicial se elevaba al 64% . Estos diagnósticos erróneos lleva­ ron a menudo a cirugías innecesarias, retrasos en el tratam iento o administración de antibioticoterapia ineficaz durante meses. La inm unosupresión (25% de los casos) y la diabetes mellitus ( 2 2 %) fueron las causas predisponentes más comunes. Durante las dos décadas previas al 2000. sólo tres em barazos estuvieron com plicados por la blastomicosis en el University o f M ississippi Medical Center (un total de 120 pacientes con blastom icosis se trataron durante este período ) . 159 El riesgo fetal excedió el riesgo materno. De los 20 recién nacidos de m adres con blastom icosis, sólo dos (10%) tuvieron infección transplacentaria y fallecieron. No sólo ninguna de las 18 madres afectadas m urió a causa de la enfermedad, sino que adem ás no hubo progresión, con 14 curaciones com pletas y regresiones considerables de las lesiones en el posparto en las otras cuatro mujeres. El hueso es un sitio común para la infección extrapulmonar. De la bibliografía más antigua, Farr y cois . 79 informaron un caso de osteom ielitis del hueso temporal secundario a B. dermatitidis que se m anifestó com o otitis m edia serosa. En un estudio de 17 pacientes realizado por M acDonald y cois . , 170 los más afectados fueron las metáfisis de los huesos largos y los huesos pequeños. Las lesiones de las metáfisis tienden a ser excéntricas, bien circunscriptas y líticas. M ás recientem ente, Hadjupavlou y cois . 103 informaron un caso de blastom icosis de la colum na vertebral lumbar con deform idad incapacitante y grave. Los autores hacen hincapié en la importancia del tratam iento precoz y enérgico para evitar la deformidad y la invalidez. Según los datos seleccionados por Kwon-Chung y Bennett 153 de la bibliografía m ás temprana, otros sitios extrapulm onares que se ven afectados son el aparato genitourinario, en especial la próstata, el epidídim o y el riñón; el cerebro, con la form ación de absceso local; los ganglios linfáticos y la glándula suprarrenal. Las m anifestaciones clínicas suelen ser las de epididimitis y prostatitis inespecíficas, y el diagnóstico debe hacerse m ediante la dem ostración de los microorganism os en el material de biopsia y puede pasarse por alto en ausencia de un alto grado de sospecha. Hanson y cois . 115 inform aron dos casos de blastom icosis laríngea que se diagnosticaron de modo erróneo por carcinom a epidermoide. En uno de los casos, este error diagnóstico fue tratado con radioterapia y laringectomía. En el segundo caso, en el que el diagnóstico clínico fue de carcinom a epiderm oi­ de de glotis, se identificaron levaduras con brotes de blastom icosis en la m uestra de biopsia. La revisión de la literatura publicada en inglés durante los últi­ mos 80 años reveló varios casos que fueron diagnosticados de modo erróneo por la clínica y la m icroscopia com o carcinom a epidermoide. R eder y cois . 2 2 6 realizaron la revisión de una serie grande de blastom icosis diagnosticada en la M ayo Clinic entre 1960 y 1990. El com promiso de la piel y las mucosas (incluso la laringe) era bastante frecuente, a menudo con características clínicas e histológicas que se sem ejaban al carcinom a epiderm oide bien diferenciado. La afectación de la piel o las mucosas suele indicar enfermedad sistém ica y, en muchos casos, éstas pueden ser las lesiones iniciales. El diagnóstico de blastom icosis debe ser considerado en el diagnóstico diferencial de todo paciente con lesiones cutáneas que no se curan asociadas con facto­ res de riesgo, com o vivir en un área endém ica y tener una ocupación o vocación que implica el contacto frecuente con el suelo . 16 Las pápulas o pústulas simples o múltiples de la piel que se ulceran, que afectan la cara, las m anos o la parte inferior de las piernas, pueden progresar lentam ente a un granulom a verrucoso ulcerado con un borde activo serpiginoso. Las lesiones cutáneas primarias que se producen en el sitio de lesiones penetrantes de la piel no se extienden de m odo sistém ico. También se publicaron casos de enfermedad intraocular . 165 La blastom icosis no se considera una de las infecciones que definen el SIDA; no obstante, en algunos ám bitos de la práctica se observó un aum ento dis­ tintivo de la incidencia y la gravedad de la enfermedad que ocurre en huéspedes inm unodeprim idos . 287 La enferm edad es particularm ente progresiva en los pacientes con SIDA cuando los recuentos de linfocitos CD 4 se encuentran por debajo de 200/m L .209 Fraser y cois . 86 estudiaron en paralelo dos amigos, uno de ellos con SIDA, que se infectaron con la m ism a cepa de B. dermatitidis (dem ostrado por el análisis de endonucleasa de restricción). En el paciente con SIDA se manifestó la blastom icosis pulm onar grave y progresiva que condujo a la muerte a pesar del tratam iento enérgico con fluconazol y anfotericina B; su am igo HIV negativo respondió por com pleto al m ism o ciclo de tratamiento. Los autores concluyeron que la inmunidad celular desem peña un papel fun­ damental en la progresión de la enfermedad en los pacientes con blastom icosis. Resulta de gran interés la revisión de 123 historias clínicas de pacientes con diagnóstico de blastom icosis en el University o f Mississippi Medical Center desde enero de 1980 a mayo de 2000 para determ inar la im portancia de las preparaciones en fresco, la citología, la histología y el cultivo en el diagnóstico de esta enfermedad m icótica . 157 El agente etiológico se detectó por citología en el 56.1% de todos los pacientes y en el 71,8% de los casos pulmonares. La preparación en fresco fue la segunda en im portancia para detectar el hongo (37,4%); la histología fue la tercera (32,5%). Los cultivos fueron positivos en el 64,2% de todos los casos, pero proporcionó el diagnóstico inicial en sólo el 3,2% de los pacientes. Se observó com prom iso pulm onar en el 87% de los pacientes, cutáneo en el 20%, óseo en el 15% y del sistem a nervioso central en el 3%.

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CAPÍTULO 21 Micología

del sur de Utah, Nevada, sur de Nueva México y la faja estre­ cha del territorio que llega hasta Texas actúan como áreas endé­ micas de infección. La forma filamentosa crece bajo las arenas calientes del desierto en las que las temperaturas elevadas de la subsuperficie son ideales para la propagación. Las hifas se ramifican y fragmentan en artroconidios individuales cuando la tierra se remueve. Estos artroconidios son diminutos, livianos y se transmiten con facilidad por el viento en las nubes de arena y polvo que vuelan. Con la inhalación, estos artroconidios escapan a las defensas mecánicas de las vías respiratorias altas y alcanzan las profundidades del árbol bronquial. Cuando lle­ gan a los alvéolos, los artroconidios se transforman en esféru­ las de pared gruesa dentro de las cuales, en la madurez, se for­ man miles de endosporas. Las esférulas con las endosporas en su interior son las formas diagnósticas observadas en los cortes teñidos de tejido. En los cortes de tejidos pueden encontrarse formas filamen­ tosas, en particular si el sitio afectado ha estado expuesto al aire. Hagman y cois.104 informaron cinco casos de coccidioido­ micosis en los que se encontraron hifas en tejido cerebral o líquido cefalorraquídeo. Estos autores sugirieron que en estos casos la presencia de dispositivos plásticos en el sistema ner­ vioso central parece asociarse con la reversión morfológica de la forma saprofita. La incidencia de coccidioidomicosis en las áreas endémicas ha aumentado en los últimos años, con máximos en 1991 y 1992 durante los períodos de lluvia intensa seguidos de se­ quías.185 Un aumento marcado en la incidencia también se pro­ dujo en la década siguiente al terremoto del Valle Simi.208 Kirkland y Fierer143 estimaron que este brote costó más de 66 millones de dólares sólo en gastos médicos directos y en tiem­ po perdido de trabajo en el Condado de Kern, California. Los informes recientes indican que la coccidioidomicosis continúa siendo un problema creciente en el sudoeste de los Estados Unidos.12 Se relaciona con un aumento paralelo de la supresión de la inmunidad celular en los individuos, en espe­ cial en los que presentan infección por HIV, en los que han recibido un alotrasplante y en los que consumen medicaciones inmunosupresoras. Logan y cois.163 informaron que la cocci­ dioidomicosis sigue siendo la micosis endémica más común en América del Norte, sobre todo relacionada con el aumento de los trasplantes de órganos sólidos. Estos autores citan la enfer­ medad renal y hepática de base, la supresión de linfocitos T por la medicación contra el rechazo y la activación de virus inmunomoduladores, como el citomegalovirus, entre estos pacien­ tes, como factores que aumentan el riesgo para la coccidioido­ micosis. Es importante destacar que en más de la mitad de todos los casos se notó la reactivación de la infección por cocciodiodes adquirida previamente durante el primer año después del trasplante. Feldman y Snyder80 también citan el incremento de los via­ jes a regiones endémicas del sudoeste de los Estados Unidos como factor que contribuye a la persistencia de la coccidioido­ micosis. Por consiguiente, es probable que estos pacientes pre­ senten manifestaciones pulmonares, como neumonía, cavida­ des y nodulos, cuando regresan a sus hogares en regiones no endémicas del país. Así, la coccidioidomicosis es de importan­ cia nacional. Los médicos de todas partes deben conocer y mantenerse actualizados sobre esta enfermedad y obtener una anamnesis cuidadosa acerca de los viajes de pacientes que pre­ sentan signos y síntomas pulmonares a fin de evitar retrasos en el diagnóstico y el tratamiento. En las áreas endémicas, debe prestarse atención particular a rancheros, granjeros, operarios de la construcción y otros que

realizan actividades al aire libre que requieren una exposición íntima con el polvo y el suelo. Los arqueólogos que participan en excavaciones en áreas endémicas presentan un riesgo eleva­ do especial para la infección. Los estadounidenses de origen africano y filipino, y las mujeres embarazadas están expuestas al mayor riesgo para la enfermedad diseminada.

PRESENTACIÓN EN EL LABORATORIO

Las colonias de C. immitis varían en la morfología, pero por lo general aparecen como una telaraña delicada, con un mice­ lio blanco grisáceo. Debe tenerse cuidado extremo cuando se examinan cultivos sospechosos de este hongo. Cuando crece en agar sangre, las colonias pueden parecer verde oscuro o negras en áreas donde se absorben los pigmentos de hemoglobina (lámina en color 21-5F). En la microscopia, la forma filamentosa que se desarrolla a 30 °C presenta hifas delicadas que cuando se rompen forman artroconidios con forma de barril separados por espacios vací­ os (tinción alterante) (fig. 21-57). Las especies de Malbranchia y de Gymnoascus pueden parecer similares. C. immitis no presenta forma de levadura. Como se expresó antes, las formas diagnósticas observadas en cortes de tejidos son las esférulas que varían de 20 a 200 |im de diámetro, reple­ tas de endosporas de 2-4 um cuando están maduras (fig. 21-58). Las manifestaciones clínicas de la coccidioidomicosis se presentan en el recuadro de correlación clínica 21-6. Histoplasma capsulatum e histoplasmosis La histoplasmosis, causada por el hongo dimorfo Histoplas­ ma capsulatum, es una enfermedad micótica sistémica fre­ cuente en los Estados Unidos. También es la infección micóti­ ca más común en los pacientes con SIDA.183 Las principales áreas endémicas de histoplasmosis en América del Norte son las cuencas vertientes fluviales de los valles de St. Lawrence, Ohio, Mississippi y Missouri, donde un porcentaje alto de la población nativa presenta pruebas cutáneas positivas, lo que indica infección pasada. La histoplasmosis también se encuen­ tra en América Central; se han informado sólo casos autócto­ nos ocasionales en otras partes del mundo. Se han informado casos autóctonos aislados en Europa: Alemania, Bélgica, Holanda y Dinamarca. La histoplasmosis se conoce como una “enfermedad exoeuropea”, aunque en Italia se han comunicado algunos casos. Confalonieri y cois.40 informaron dos casos nuevos de enfermedad, confirmados por histología, en pacientes italianos que nunca habían estado en el extranjero. Una incidencia relativamente elevada de prueba cutánea positiva a la histoplasmina en un estudio llevado a cabo en la Provincia de Cremona, Italia, confirmó la posibilidad de infecciones endógenas. Calza y cois.34 informaron un caso reciente de histoplasmosis diseminada con lesiones cutáneas atípicas, papulares y ulceradas, en un paciente italiano con HIV sin antecedentes de viaje fuera de su región nativa. Los autores citan este caso como el quinto autóctono de histoplasmosis aso­ ciado con SIDA descrito en Italia. O ’Sullivan y cois.204 infor­ man un caso de histoplasmosis oral en Brisbane, Queensland, lo que indica que esta enfermedad está reconociéndose cada vez más en Australia, aunque la fuente local permanece sin aclararse. La realidad de que esta infección puede ser subdiagnosticada sugiere una distribución geográfica más extendida. La forma filamentosa de Histoplasma capsulatum está pre­ sente en los suelos templados y húmedos con alto contenido de compuestos orgánicos, como los producidos por la acumula-

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Figura 21-57 M icrofotografía y esquem a de las hifas de Coccidioides immi­ tis. que m uestran los artroconidios con formas de barril característicos, con células individuales separadas por espacios vacíos teñidos de modo pálido.

ción densa de deyecciones de aves o murciélagos. Las perchas para aves, las granjas avícolas, las cuevas o los edificios viejos frecuentados por murciélagos son posibles sitios contamina­ dos. Se aconseja que los pacientes con SIDA o quienes presen­ tan inmunodepresión grave de otra causa eviten trabajar en estas áreas. Las excavaciones de estas zonas o las tareas de lim­ pieza pueden exponer a los seres humanos a enormes cantida­ des de esporas transportadas por el aire. Se han citado tres bro­ tes grandes de histoplasmosis en el área metropolitana de Indianápolis, Indiana: en 1978 junto con la demolición de un parque de entretenimientos, en 1980 relacionado con la cons­ trucción de una piscina y en 1988-1993 durante el tiempo de construcción de un complejo grande de tenis.296 Durante este brote, Williams y cois.296 detectaron antígeno en el 92%, 21% y 39% de los pacientes con formas disemina­ das. pulmonares y autolimitadas crónicas, respectivamente. Los autores concluyen que las pruebas séricas de detección del antígeno son muy útiles en los pacientes con hallazgos clínicos de infección diseminada o durante el primer mes de la enfer­ medad en los casos de compromiso pulmonar grave cuando las pruebas serológicas para anticuerpos pueden ser negativas.

lando los microconidios observados en los cultivos filamento­ sos de T. rubrum, B. dermatitidis y S. schenckii. Las caracterís­ ticas microscópicas de las especies de Sepedonium presentan un aspecto similar. Las colonias de levaduras que se desarrollan en cultivos pri­ marios incubados a 37 °C o después de la conversión de la forma filamentosa, son típicamente lisas, blanco amarillentas y algo brillantes, de consistencia pastosa (lámina en color 21-5E). La microscopia de las levaduras revela células pequeñas, de 2-4 um de diámetro y pueden mostrar un solo brote conectado por un filamento delicado. En los cortes de tejidos, las levadu­ ras se presentan en racimos dentro de los macrófagos y están

PRESENTACIÓN EN EL LABORATORIO

La forma filamentosa de Histoplasma capsulatum crece len­ tamente (10-30 días), aunque en las muestras con una concen­ tración densa de microorganismos el crecimiento puede obser­ varse ya a los 5 días. Es típica la observación de un micelio aéreo delicado como telaraña o pulverulento, en un comienzo blanco, pero que se torna blanco grisáceo o gris castaño con el tiempo (lámina en color 21-5D). En la microscopia, las estructuras diagnósticas observadas en la forma filamentosa son los macroconidios grandes, rugo­ sos o espiculados que miden de 10 a 20 jim de diámetro (fig. 21-59). En los cultivos más tempranos, pueden verse microco­ nidios ovales y pequeños que se originan de los lados de hifas delicadas, que se disponen como si fuera un manguito simu­

Figura 21-58 M icrofotografía de dos esférulas de Coccidioides immitis adyacentes entre sí, que simulan las levaduras con brotes de base ancha de Blastomyces dermatitidis. Nótese la form ación de endosporas, muy bien ilus­ trada en la esférula superior que sale a través de una fractura de la pared.

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CAPÍTULO 21 Micología

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N CLÍN ICA 21-6

C o c c id io id o m ic o sis

Tras la exposición a los artroconidios del coccidioides, en la m ayoría de los individuos se presenta un síndrome gripal conocido com o “fiebre del valle” ; en casi todos los casos, se circunscribe al pulm ón y es autolimitado: se resuelve en un período de sem anas o meses sin tratam iento . 90 El 60% de las personas infectadas están asintom áticas; muchos individuos con pruebas cutáneas positivas no recuerdan haber teniendo síntom as. Los que son sintom áticos experi­ m entan una infección respiratoria baja aguda, de corta duración, con grados variables de tos, producción de esputo, dolor torácico, fiebre y artralgias. Es infrecuente la presentación de un síndrom e sim ilar a la neum onía bacteriana, aunque se han inform ado dos casos . 167 Por último, se desarrolla la enfermedad pulm onar crónica con secuelas en sólo el 2% al 5% de los individuos infectados. Las lesiones num ulares" solitarias o los granulomas, sólidos o cavitarios, norm almente localizados en la periferia dentro del parénquim a pulmonar, son hallazgos residuales frecuentes, sobre todo en los individuos que no residen de m odo perm anente en el área endém ica en que se contrajo la infección. En las áreas endém icas, la infección por el virus de la inm unodeficiencia hum ana (HIV) tam bién es un factor de riesgo para coccidioidom icosis . 12 Sobre la base del trabajo original de Fish y cois . , 8 3 más tarde m ejorado por M inam oto y Rosenberg , 183 se proponen seis categorías de enferm edad de acuerdo con la presentación clínica primaria: Grupo 1, enferm edad pulm onar focal: infiltrados alveolares localizados; nodulos pulm onares separados, sólidos y cavitarios; adenopatía hiliar. Grupo 2, enferm edad pulm onar difusa: síndrom e clínico que simula la infección por Pneumocystis carinii. Grupo 3, coccidioidom icosis cutánea: por lo general simultánea con la enfermedad pulmonar, con pápulas, pústulas, nodulos, abscesos subcutáneos, úlce­ ras, granulom as verrucosos o cualquier com binación de ellos. Grupo 4, m eningitis: pleocitosis del LCR, sobre todo linfocitos. hipoglucorraquia y aum ento de las concentraciones de proteínas. Grupo 5, enferm edad disem inada: afectación de los ganglios linfáticos extratorácicos (con mayor frecuencia inguinales) o com prom iso hepático; la dise­ m inación a distancia más inform ada es a riñones, tiroides, corazón, hipófisis, esófago y páncreas. Grupo 6, serología positiva para coccidiodom icosis: sin un foco clínico de infección. En un estudio realizado por Singh y cois . 260 de 91 pacientes coinfectados por SIDA y C. immitis. los síntom as más com unes fueron fiebre, escalofríos, pérdida de peso y sudores nocturnos. L a mortalidad en este grupo fue del 60% , y la presencia de enfermedad pulm onar difusa y recuento de linfocitos CD4 < 510/p.L fueron factores de predicción independientes de muerte. La serología para coccidioides reveló títulos positivos en las dos terceras partes ( 6 8 %) de estos pacientes, con resultados negativos encontrados en el 23%. El porcentaje más alto de reacciones serológicas falsas negativas se observó en el grupo de pacientes con enfermedad pulm onar invasora y progresiva. La anfotericina B sigue siendo el tratam iento de elección, aunque los azoles, en especial el keto­ conazol, son m enos tóxicos e igual de eficaces. En su estudio de coccidioidom icosis e infección por HIV, A ntoniskis y cois . 15 encontraron que dos de ocho pacientes fueron repetidam ente seronegativos y concluyeron que la histopatología y el cultivo siguen siendo los métodos m ás confiables para establecer el diagnóstico en los pacientes con SIDA. Por el contrario, A rguinchona y co is . 17 hallaron que individuos asintom áticos con títulos serológicos por FC positivos cursaban una coccidiodom icosis activa. En referencia a la exactitud de las biopsias de tejido, de 54 pacientes con coccidioidom icosis inform ada por diTomasso y cois . 62 la biopsia transbronquial m os­ tró una sensibilidad del 1 0 0 % en brindar un diagnóstico rápido, a diferencia del examen citológico del líquido bronquial o del lavado broncoalveolar, que proporcionaron un diagnóstico en sólo el 34% de los casos. Aún no se ha dilucidado la asociación con un riesgo m ayor de coccidioidom icosis diseminada durante el em barazo. W ack y cois . 281 refutan muchos de los estudios anteriores en los que se considera la coccidioidom icosis durante el em barazo una enfermedad devastadora con elevada m ortalidad y hallaron sólo 10 casos entre 47 120 em barazos de m ujeres que viven en Tucson. Arizona. La infección se resolvió en siete de las mujeres en quienes la coccidioido­ micosis se diagnosticó durante el prim ero o el segundo trim estre: la enfermedad progresiva se m anifestó en dos de tres mujeres que fueron diagnosticadas en el tercer trimestre. Las m ejoras en la atención m édica y la iniciación de tratam iento antim icótico relativam ente tem prano en el curso de la coccidioido­ m icosis pueden explicar las tasas de m ortalidad actuales más bajas en las mujeres embarazadas. Aunque la coccidioidom icosis es sobre todo una afección pulm onar, A m old y cois . 18 establecieron que la enfermedad diseminada que afecta la piel, el tejido subcutáneo, los huesos, las articulaciones y las meninges aparece en cerca del 0,5-1% de los individuos infectados. En una revisión de 47 casos de la literatura m édica, estos autores encontraron que casi todas las m anifestaciones en la cabeza y el cuello de los pacientes con coccidioidom icosis diseminada afectaban la piel, con una predilección por la parte central de la cara. A menudo, las lesiones tienden a ser m últiples e incluyen aquellas de las vías aéreas potencialm ente mortales. Un informe de prostatitis por coccidioides realizado por Truett y C rum 275 sirve com o recordatorio de que los agentes micóticos deben ser incluidos en el diagnóstico diferencial de enfermedades en los que podrían ser m enos esperados. Las piurías estériles persistentes, la prostatitis y la enferm edad granulom atosa de la próstata fueron signos y síntom as de presentación en los casos informados.

rodeadas por un espacio claro que da el aspecto de seudoencapsuladas (fig. 21-60). Se observa una reacción inflamatoria granulomatosa de fondo. La cavitación y la necrosis caseosa en las lesiones más antiguas pueden simular la tuberculosis. A menudo resulta difícil que aparezca en cultivo la conver­ sión de la forma filamentosa de H. capsulatum a la forma de levadura. Por esta razón, se recomienda la realización de la prueba de exoantígenos o las sondas de ácidos nucleicos para confirmar la identificación definitiva, que puede hacerse con precisión un día después de la aparición del crecimiento inicial en el cultivo. Los cultivos no necesitan estar maduros o que hayan desarrollado conidios para la realización de la prueba con sondas. Huffnagle y Gander126 demostraron el 100% de especificidad y de sensibilidad en la comprobación de 95 hon­ gos en la fase filamentosa: se incluyeron 41 aislamientos de H.

capsulatum y una variedad de otros hongos filamentosos. Mediante el empleo de una sonda quimioluminiscente de DNA de una sola cadena marcada con éster de acridina complemen­ taria del rRNA de la forma filamentosa de H. capsulatum (AccuProbe: Gen Probe, San Diego, CA), Padhye y cois.206 identificaron de modo correcto 103 de 105 cultivos de H. cap­ sulatum. Asimismo, también mediante el empleo de ensayos AccuProbe, Hall y cois.109 identificaron correctamente 53 de 54 aislamientos de H. capsulatum y Stockman y cois.264 demos­ traron 100% de sensibilidad y especificidad en el estudio de 86 cepas de H. capsulatum y 154 de otros hongos no especifica­ dos. La edad del cultivo, el medio para el aislamiento y el esta­ do morfológico no afectaron los resultados, lo que indica que la identificación puede hacerse antes de que se produzcan las esporas características.

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F i g u r a 2 1 -5 9 M icrofotografía y esquem a que ilustran la form a filam entosa da Histoplasma capsulatum, con macroconidios grandes, esféricos y espiculados.

El diagnóstico de histoplasmosis puede realizarse mediante la identificación de las pequeñas levaduras con brotes intrace­ lulares en cortes de tejidos o en frotis teñidos, o mediante la detección de antígeno en los líquidos corporales. Blumenfeld y cois.25 pudieron identificar los microorganismos intracitoplasmáticos en frotis teñidos con las técnicas de Diff-Quik y Papanicolaou de muestras de líquido de lavado broncoalveolar. Los estudios de seguimiento de cortes teñidos de tejido con metenamina argéntica revelaron levaduras con brotes intracelu­ lares, lo que confirma que correspondían a H. capsulatum. El antígeno de H. capsulatum se detectó en el líquido de lavado broncoalveolar en 19 de los 27 casos (70,3%) de histoplasmo­ sis pulmonar estudiados por Wheat y cois.289

DIAGNÓSTICO MEDIANTE TÉCNICAS SIN CULTIVO

Para el diagnóstico de histoplasmosis se han creado métodos moleculares, en especial las sondas de ácidos nucleicos que se consiguen en el comercio. Se ha logrado reducir el tiempo para la identificación definitiva de los cultivos positivos, ya que pue­ den realizarse en los elementos del micelio, en lugar de esperar el desarrollo de esporas para el diagnóstico. Hay investigacio­ nes en curso para detectar DNA de H. capsulatum var. capsu­ latum en líquidos corporales y cortes de tejido, en especial para establecer un diagnóstico definitivo de enfermedad granulomatosa cuando las tinciones para hongos no descubren las formas diagnósticas.292 Las pruebas serológicas para anticuerpos contra Histoplas­ ma son positivas en más del 90% de los pacientes con las for­ mas cavitarias o diseminadas de histoplasmosis. Sin embargo, estas pruebas son menos sensibles en los pacientes inmunode­ primidos (50-80%), muchos de los cuales no producen anti­ cuerpos. Las pruebas para detectar anticuerpos también tienen la desventaja de una demora de 4 a 6 semanas antes de que pueda alcanzarse un título lo suficientemente elevado como para ser detectado. También pueden elevarse los anticuerpos contra Histoplasma en los pacientes con blastomicosis, coccidioidomicosis y paracoccidioidomicosis.291 La prueba de fijación del complemento (FC) que utiliza antí­ genos de la forma de levadura y filamentosa es más sensible que la prueba de ID. En la histoplasmosis pulmonar aguda, la

prueba de FC es positiva en títulos de al menos 1:8 en el 90% de los pacientes, las bandas M están presentes en alrededor del 76% y las bandas H, en el 23%.67 Los títulos en el rango de ES­ LIÓ pueden ser residuales de una infección pasada. Un único título de 1:32 o mayor, o un aumento de cuatro veces es diag­ nóstico de histoplasmosis activa. La inmunodifusión es lo sufi­ cientemente insensible, por lo que se recomiendan otras prue­ bas serológicas. El radioinmunoanálisis y el enzimoinmunoanálisis no se recomiendan, aunque pueden detectarse anticuerpos más pron­ to y en una proporción más alta de pacientes. Estos ensayos están mal estandarizados y resulta difícil cuantificarlos e inter­ pretarlos. La especificidad también es baja, con tasas relativa­ mente elevadas de falsos positivos en personas con otras infec­ ciones micóticas o micobacterianas.291 La detección del antígeno proporciona una prueba útil en el diagnóstico de histoplasmosis pulmonar en los pacientes con SIDA y en la valoración de la eficacia del tratamiento en los

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Figura 21-60 M icrofotografía de un corte de tejido que revela m acrófagos que contienen grupos laxos de levaduras seudoencapsuladas, intracitoplasmáticas de 2-3 |im de diám etro, teñidas de negro de Histoplasma capsulatum (HE. 400x, tinción de metenam ina argéntica de Gomori).

1 15 2

CAPÍTULO 21 Micología

casos de enfermedad progresiva. En un estudio de 226 pacien­ tes de 18 años de edad o menos en quienes se detectó antígeno de H. capsulatum en muestras de orina por radioinmunoanálisis, Fojtasek y cois.84 encontraron que el 85% presentaba enfer­ medad diseminada y el 15%, enfermedad pulmonar autolimitada, cuando al menos una prueba estándar diferente era positiva para corroborar el resultado. Las diversas manifestaciones clínicas de la histoplasmosis se presentan en la recuadro de correlación clínica 21-7. Sporothrix schenckii y esporotricosis Sporothrix schenckii es un hongo que presenta una distribu­ ción mundial en el suelo y en la materia vegetal en descompo­ sición, en especial las plantas, la astillas de madera y las espi­ nas de rosales. Es el agente causal de la esporotricosis, una infección crónica de los seres humanos y los animales. Ciertos animales silvestres y domésticos, y los roedores pueden ser portadores. Los seres humanos se infectan cuando el microor­ ganismo penetra la piel de individuos que manipulan sustancias contaminadas. La infección se caracteriza por la formación de lesiones nodulares de los tejidos cutáneo y subcutáneo, a menudo con compromiso linfático (enfermedad linfocutánea). La diseminación sistémica puede afectar huesos, músculos, sis­ tema nervioso central y pulmones. Ciertas ocupaciones plantean un riesgo mayor de infección. Un brote de esporotricosis sucedió en un vivero de árboles en Florida, según informaron Hajjeh y cois.108 La esporotricosis linfocutánea se desarrolló en 9 de 65 (14%) operarios encarga­ dos de la poda y la producción de musgo esfagno. El riesgo se relacionó directamente con el tiempo de trabajo con ese musgo, en particular con la tarea de llenado de almácigos y en los indi­ viduos con menos experiencia en jardinería. El uso de guantes protege de la infección. Dooley y cois.65 comunicaron un brote interesante. En un período de 5 semanas, cinco pacientes que viven en Oklahoma presentaron esporotricosis cutánea, cuatro de los cuales habí­ an mantenido fardos de heno en una víspera de “noche de bru­ jas” (Halloween). Al parecer, el quinto paciente contrajo la enfermedad mientras visitaba la casa. Así, el contacto con el heno, en especial cuando se cosecha de la región centroccidental de los Estados Unidos, puede representar aun otro fac­ tor de riesgo. Pappas y cois.210 informaron un área donde la esporotricosis es altamente endémica. En una región montañosa del sur y cen­ tro de Perú, se observaron 238 casos de esporotricosis compro­ bados por cultivo en un período de 3 años entre 1995 y 1997. La incidencia de la esporotricosis en esta región se calculó entre 48 a 60 casos por 100 000 personas, con la incidencia más alta entre los niños de 7-14 años. La piel de la cara fue el sitio más afectado. En todos los pacientes la enfermedad se limitó clínicamente a los tejidos cutáneo y subcutáneo.

PRESENTACIÓN EN EL LABORATORIO

El crecimiento de Sporothrix schenckii en cultivo suele manifestarse en el transcurso de 3 a 5 días a 30 °C, aunque ya a las 36-48 horas pueden observarse colonias levaduriformes cuando las muestras se siembran en agar sangre de camero al 5% y se incuban a 35 °C. Las colonias suelen ser lisas y pue­ den tomarse duras y rugosas o plegadas. Cuando las colonias maduran puede verse un micelio aéreo delicado, oscuro y riza­ do. El color es al comienzo blanco grisáceo pero puede tornar­ se beige, castaño o castaño negruzco (lámina en color 21-5G).

Cuando se incuban a 35-37 °C, las colonias adquieren las características levaduriformes y cuando maduran son castaño oscuro o negras (lámina en color 21-5H). La identificación puede hacerse en la microscopia al obser­ var en la forma filamentosa hifas delicadas, hialinas y tabica­ das a partir de las cuales nacen conidios lisos, hialinos y ovales que miden de 2-4 |im de diámetro, sujetos por un conidióforo delicado, que se asemeja a un pelo, dispuesto en cualquiera de los lados de las hifas; o, más característicamente, en racimos que se asemejan a una margarita en el extremo de un conidió­ foro recto y delicado (fig. 21-61). Si se ajusta el foco del microscopio y se utiliza objetivo de inmersión, es posible observar las uniones características similares a pelos entre los conidios y el conidióforo (del cual deriva el nombre de la espe­ cie). Sporothrix cyanescens tiene un aspecto similar a 5. schenckii, sólo que se forman conidios secundarios, que apare­ cen como levaduras con brotes nacidos de los extremos de los conidios primarios. La publicación de Sigler y cois.255 incluye excelentes microfotografías que ilustran esta característica microscópica. Las levaduras miden de 2 a 4 |im de diámetro y tienden a ser ovales o elípticas, a menudo con un solo brote (fig. 21-62). Más útil para hacer la identificación microscópica de las for­ mas de levaduras de S. schenckii es la observación de formas de cigarro que miden 3 x 1 0 lim, que pueden ser difíciles de ver en cortes de tejidos humanos teñidos y para demostrarlas puede ser necesaria la inoculación en animales. En la figura 21-63 se ilustra un corte de un granuloma subcutáneo teñido con metenamina argéntica que presenta las levaduras elípticas. Nótense los brotes con forma de cigarro de una de las células madre.

DIAGNÓSTICO MEDIANTE TÉCNICAS SIN CULTIVO

Las técnicas serológicas mostraron un beneficio mínimo en el diagnóstico de la esporotricosis. En el pasado se utilizaron pruebas de aglutinación del látex con éxito limitado, en espe­ cial en el diagnóstico de infecciones primarias de la piel en que los resultados suelen ser negativos. Los títulos de aglutinación de 1:80 o superiores resultaron útiles en el diagnóstico de infecciones activas extracutáneas.56 Las manifestaciones clínicas de esporotricosis figuran el recuadro de correlación clínica 21-8. Paracoccidioides brasiliensis y paracoccidioidomicosis La paracoccidioidomicosis es un infección micótica granu­ lomatosa y sistémica que presenta una evolución progresiva subaguda a crónica, causada por el hongo térmicamente dimor­ fo Paracoccidioides brasiliensis. Las formas filamentosas de este hongo residen en el suelo y en los seres humanos se desa­ rrolla la infección pulmonar por la inhalación de los conidios pequeños (4 (im de diámetro) o las infecciones de la piel por la inoculación directa de suciedad contaminada con esporas. En América del Sur, el 80% de los casos informados provienen de Brasil, seguidos en orden de incidencia de informes de casos en Colombia y Venezuela; en el sur de México y en todos los paí­ ses de América Central, salvo Belice y Nicaragua, también existen áreas endémicas.32 Es difícil obtener la tasa de prevalencia global de la para­ coccidioidomicosis. Aunque se han hecho estimaciones de un millón o más de casos, muchos no se informan o siguen sin diagnosticarse. Botteon y cois.28 han publicado el análisis de un estudio reciente de dos grupos de donantes de sangre. Un

H o n g o s d im o rfo s

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N CLÍNICA 21-7

1153

H istop la sm o sis

L a m ayoría de los casos de histoplasm osis se resuelven después de una enfermedad pulm onar aguda de gravedad variable, caracterizada por fiebre, cefalea, escalofríos, tos y dolor torácico. A menudo se observa neum onía de base y aum ento de tamaño de los ganglios linfáticos mediastínicos. En m enos del 1% de los casos puede haber una form a pulm onar crónica, caracterizada por tos persistente, fiebre de baja intensidad y episodios ocasionales de hem optisis. En los estudios radiográficos de adultos pueden observarse lesiones cavitarias, o uno o m ás "histoplasm om as” espesos, lam inados y calcificados. La formación de granulom a m ediastínico seguida de m ediastinitis fibrosante y esofagitis son com plicaciones raras, pero se han inform ado algunos casos . 175 Las com plica­ ciones asociadas son disnea, hemoptisis, neum onía posobstructiva y obstrucción de la vena cava superior. La intensa fibrosis encontrada en estos casos difi­ culta la cirugía. Kilburn y M cK insey14' inform aron una com plicación rara de derram e pleural y fibrosis pericárdica. Con posterioridad en este paciente se observó pericarditis constrictiva confirm ada por la necropsia. Com o H. capsulatum es un m icroorganism o intracelular estricto que reside en los macrófagos del sistem a reticuloendotelial, pueden observarse grados variables de hepatomegalia, esplenom egalia y linfadenopatía en los casos de enfermedad disem ina­ da aguda y crónica que suelen ser más frecuentes en los huéspedes inmunosuprim idos. Histoplasm osis disem inada progresiva La histoplasm osis disem inada progresiva suele ser una enferm edad que define al SIDA y en el 50-75% de los pacientes con SIDA e histoplasm osis repre­ senta la prim era m anifestación . 244-2 9 0 Las m anifestaciones clínicas son fiebre, fatiga y pérdida de peso, esta últim a a m enudo se presenta com o una enferm e­ dad devastadora . 101 Nightingale y cois . 196 encontraron una prevalencia del 4% de histoplasm osis en 980 pacientes con SIDA estudiados en Dallas, Texas; el examen del frotis de sangre periférica y m édula ósea estableció el diagnóstico en el 8 8 % de estos pacientes. Además. H uang y cois . 125 informaron cinco casos de histoplasm osis disem inada en pacientes con SIDA; todos tenían fungem ia y tres fallecieron en el transcurso de las 4 semanas después de confirm ar el diagnóstico. L a presencia de SIDA determ ina que la histoplasm osis sea resistente al tratamiento. Kurtin y cois . 151 realizaron una revisión de m uestras de m édula ósea y de sangre periférica en 13 pacientes con SIDA e histoplasm osis diseminada. Encontraron anem ia, leucopenia y trombocitopenia en 12, 10 y 7 pacientes, respectivam ente. Se observaron m icroorganism os circulantes en los frotis de sangre o en las preparaciones enriquecidas en leucocitos en cinco pacientes, por lo general asociados con la presencia de norm oblastos circulantes y m onocitopenia absoluta intensa. Las muestras de m édula revelaron uno de cuatro patrones morfológicos: • ninguna evidencia m orfológica de infección • granulom as separados • agregados linfohistiocíticos • infiltrados difusos de m acrófagos El diagnóstico puede hacerse m ediante lisis por centrifugación para aislar el m icroorganism o en cultivos de sangre y exam en de m édula ósea, frotis teñi­ dos de sangre periférica y secreciones respiratorias . 190 Otros órganos afectados por histoplasm osis en los pacientes con SIDA, com o se registra en la literatura m édica reciente, son el sistem a nervioso central, que puede tom ar la forma de m eningitis crónica, lesiones de m asa cerebrales o medulares que simulan los neoplasias, o encefalitis y un caso raro de sinusi­ tis publicado por Butt y Carreon . 13-33-288 W heat y co is . 288 encontraron m anifestaciones del SNC en el 10-20% de los pacientes con histoplasm osis diseminada y el microorganism o puede ser la causa de m eningitis crónica sin otra evidencia de diseminación en determ inados pacientes. Las lesiones en m asa cerebrales o de la m édula espinal que se asem ejan a neoplasias o abscesos y encefalitis fueron las formas m ás frecuentes de presentación en esta serie. Aparato digestivo La histoplasm osis del aparato digestivo, por lo general del intestino delgado, puede presentarse com o úlceras o com o una masa, im itando a menudo la enfermedad inflam atoria intestinal o el carcinom a . 41 El aparato digestivo sufre afección secundaria en el 70-90% de los casos de histoplasm osis diseminada, aunque la enferm edad entérica prim aria se encuentra con poca frecuencia . 266 Jain y cois . 129 inform aron un caso reciente de un hom bre de 67 años que pre­ sentó diarrea crónica que no respondió al tratam iento convencional, incluso no reveló Clostridium difficile. Se le diagnosticó infección aislada del colon por histoplasm osis y se lo trató con itraconazol. También se inform aron casos de histoplasm osis de la orofaringe en que las lesiones pueden confundirse con carcinom a en la presentación inicial , 120 en especial cuando están afectadas las cuerdas vocales. En una revisión de la literatura desde el inform e del primer caso en 1952, Sataloff y cois .2 4 5 encontra­ ron m enos de 100 casos de histoplasm osis que se presentaron com o carcinom a laríngeo. Q uizá de mayor im portancia, E conom opoulou y cois .69 revisaron 20 informes de casos de la literatura de histoplasm osis bucal en pacientes infectados por HIV, en muchos de ellos las lesiones bucales parecen ser la m ani­ festación prim aria o única de la enfermedad. Histoplasm osis cutánea Las lesiones cutáneas pueden ser la presentación inicial de la histoplasmosis en alrededor del 10% de los casos y pueden servir com o un m arcador para el SIDA. Las m anifestaciones cutáneas m ás frecuentes son las pápulas eritem atosas o hiperpigmentadas, las pústulas, la foliculitis, las alteraciones eccematosas. el eritem a multiform e y las erupciones del tipo rosácea . 2 8 7 Chalub y cois . 38 inform aron acerca de cuatro pacientes con histoplasm osis diseminada y SIDA. En ellos se observó la presencia de múltples m aculopápulas pequeñas (hasta 3 mm de diám etro) y eritem atosas en los m iem bros, la cara y el tronco, a m enudo centradas alrededor de los folículos pilosos. En la histología, el infiltrado perivascular con leucocitoclasia llamativa, la falta de una respuesta de m acrófagos y la ausencia de granulom as y m icroorganism os que yacen libres en la dermis, intraneurales y en los anexos de la piel fueron las diferencias características de las presentaciones observadas en los pacientes que no tenían SIDA. Histoplasm osis genitourinaria Aunque las infecciones m icóticas genitourinarias se ven m ás con mayor frecuencia en la blastomicosis. se han inform ado casos de histoplasm osis, en espe­ cial en los pacientes con SIDA. Kahn y T hom m es 132 com unicaron un caso de orquitis granulom atosa masiva y epididim itis con necrosis caseosa. Friskel y cois . 87 publicaron otros dos casos actuales.

(Continúa)

1154

C A P ÍT U L O 21

Micología

R E C U A D R O D E C O R R E L A C I Ó N C L ÍN IC A 21-7

H is to p la s m o s is (copnt.)

Histoplasmosis ocular Ciulla y cois . 45 realizaron una revisión del síndrome de histoplasmosis ocular. L a tríada clínica clásica incluye cicatrices atróficas de la coroides en la m ácu­ la o en la periferia m edia conocidas com o manchas "histo” , atrofia peripapilar y neovascularización de la coroides. La pérdida de la visión central es una com plicación importante.

Septicemia Aunque la septicem ia por agentes m icóticos es rara, la oportunidad de establecer un diagnóstico precoz puede perderse si no se utilizan las técnicas adecua­ das para el cultivo de sangre. Paya y cois . 212 encontraron que la técnica de lisis-centrifugación en tubos para el cultivo era la óptim a por aislar la form a de levadura de H. capsulatum en sangre en los casos sospechosos de enfermedad diseminada, porque aum enta de m anera significativa el rendim iento de culti­ vos positivos y acorta el tiempo de recuperación. La superioridad de este sistem a tam bién está avalada por las observaciones de M urray , 190 quien en un estu­ dio de 182 aislamientos de hongos de todos los tipos encontró que H. capsulatum sólo se aisló en el sistema de lisis-centrifugación. El diagnóstico tem pra­ no es im portante, ya que la diseminación puede ser rápidam ente progresiva y mortal en los pacientes con SIDA.

grupo consistió en donantes que viven en un área rural donde la paracoccidioidomicosis es endémica; el otro es un grupo de residentes urbanos de Sao Paulo. Los resultados mostraron que el 21% de 700 muestras obtenidas de los que viven en las áreas rurales endémicas y el 0,9% de 350 muestras de los de áreas urbanas eran positivas por serología. Así, con una pobla­ ción de alrededor de 150 millones, aun cuando se utilice la tasa de prevalencia urbana más baja de paracoccidioidom ico­ sis, más de un millón de los residentes de Brasil sólo están infectados. Los países de las islas del Caribe, Guyana y Chile han esta­ do exentos de la enfermedad. En las áreas endémicas, la mayo­ ría de los casos se producen en regiones arboladas húmedas y sus alrededores. La enfermedad afecta con mayor frecuencia a adultos mayores de 30 años, es rara en los niños y tiene una incidencia mayor en los varones, con una relación global de 15:1. Aunque casi todos los pacientes son agricultores, se han informado casos ocasionales en individuos con exposición directa al suelo y la vegetación, como lo indicó el informe cita­ do. La raza blanca es más propensa a las infecciones que los indios estadounidenses; las infecciones más graves tienden a desarrollarse en inmigrantes que van a áreas endémicas.32

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M icrofotografía y esquem a de la form a filamentosa de

Sporothrix schenckii, que m uestran hifas delicadas y con form a de “margarita” que form an racim os de conidios pequeños, ovales de los lados o las puntas de conidióforos rectos.

PRESENTACIÓN EN EL LABORATORIO

Las colonias presentan un aspecto sim ilar a las de Blastomyces dermatitidis, con un crecimiento lento a 30 °C, requieren de 10 a 20 días para madurar y tienen un micelio sedoso o velloso, blanco grisáceo. Cuando se incuba a 25-30 °C, P. brasiliensis crece con más lentitud y forma filamentos en 10 a 30 días, sedosos, blancos a gris ocre. La identificación y la diferenciación de otros hongos filamentosos de aspecto similar pueden realizarse mediante la observación microscópica de las hifas delicadas, hialinas y tabicadas que constituyen el micelio de fondo. Los conidios característicos miden de 2-4 (im, son ovales, no pigmentados, nacen de modo individual a partir de conidióforos cortos y del­ gados directamente de las hifas, de manera de “chupachús”, similares en aspecto a los producidos por Blastomyces derma­ titidis (fig. 21-64). La identificación puede confirmarse por la conversión de la forma filamentosa a la de levadura, que se logra mediante la ino­ culación de una porción pequeña de la colonia filamentosa al agar enriquecido con infusión de cerebro y corazón. Esta con­ versión es lenta. Las levaduras madre de P. brasiliensis obser­ vadas en cultivos miden 6-15 jim y parecen similares a las de

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Figura 21-62 M icrofotografía y esquem a de la form a de levadura de Spororhríx schenckii, que revelan levaduras bicelulares, alargadas, muchas de las

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cuales con cuerpos que se asem ejan a un “cigarro”.

B. dermatitidis, salvo que en el primero se observan múltiples brotes de base estrecha, a diferencia del brote único de base ancha de Blastomyces. En la forma infectante a 37 °C (“temperatura corporal”), Paracoccidioides brasiliensis existe como levadura. Por consi­ guiente, el diagnóstico de paracoccidioidomicosis puede esta­ blecerse con más rapidez mediante la demostración directa en las muestras clínicas de las levaduras esféricas de 10-30 pm características, de paredes gruesas, con múltiples brotes unidos cada uno por un cuello estrecho que da el aspecto de “rueda de timón” (fig. 21-65). Estas levaduras se observan mejor en pre­ paraciones en fresco con KOH, ya sea directamente o con blan­ co de calcoflúor o reactivos de inmunofluorescencia. En algu­ nos casos, cuando las células hijas brotan forman cadenas cor­ tas. En los cortes de tejidos, la inflamación de fondo suele ser granulomatosa, mezclada con concentraciones variables de leucocitos polimorfonucleares. El diagnóstico se establece por el hallazgo de levaduras con múltiples brotes como se descri­

Figura 21-63 M icrofotografía de una biopsia de piel de un caso de esporo­ tricosis que revela num erosas levaduras esféricas u ovales de Sporothrix schenckii, algunas de las cuales m uestran brotes bicelulares, alargados, con form a de “cigarro” (tinción de m etenam ina argéntica con gran aumento).

bió antes, que se observan mejor en cortes teñidos con PAS o metenamina argéntica de Gomori.

DIAGNÓSTICO MEDIANTE TÉCNICAS SIN CULTIVO

La prueba de exoantígeno, recientemente perfeccionada por Camargo y cois.,35 es un modo de confirmar la identificación del cultivo de aislamientos desconocidos. Las técnicas de inmunofluorescencia indirectas, enzimoinmunoanálisis y, las más recientes pruebas de amplificación por PCR, fueron utili­ zadas por muchos investigadores para confirmar el diagnóstico. Brummer y cois.32realizaron una revisión de los procedimien­ tos inmunodiagnósticos actuales para la paracoccidioidomico­ sis. Las concentraciones elevadas de anticuerpos séricos espe­ cíficos del tipo IgG pueden detectarse durante al menos un año después de la infección. Por lo general, no se observan con­ centraciones elevadas de anticuerpos IgM salvo en los casos de compromiso amplio de los ganglios linfáticos.

Figura 21-64 M icrofotografía de la forma filamentosa de Paracoccidioides brasiliensis, que muestra conidios pequeños, lisos y esféricos que nacen de los lados y del extremo de conidióforos cortos originados a partir de hifas tabicadas.

1156

CAPÍTULO 21 Micología

RE C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N CLÍNICA 21-8

E sp o ro trico sis

En los Estados Unidos, las infecciones micóticas subcutáneas son causadas en su mayoría por Sporothrix schenckii.'1 La form a m ás común de esporotrico­ sis es la linfocutánea. L a aparición de una pústula pequeña, roja e indolora en una extrem idad, junto con lesiones postulares o ulcerativas secundarias m últi­ ples, dispuestas linealm ente a lo largo de los linfáticos proxim ales es suficiente para sospechar el diagnóstico. La pústula primaria puede agrandarse con lentitud, ulcerarse y segregar una cantidad pequeña de exudado serosanguinolento. Pueden observarse grados variables de celulitis con edem a y eritem a del tejido subcutáneo circundante. Las lesiones satélites secundarias se presentan al com ienzo com o placas verrucosas, eritem atosas o escamosas, que a m enu­ do evolucionan a úlceras que también segregan m aterial purulento. Con frecuencia, el diagnóstico se retrasa porque la colonización bacteriana secundaria asociada puede confundirse con el agente infeccioso primario. Las sobreinfecciones bacterianas pueden confundir el aspecto macroscópico. En los casos de enfermedad progresiva, la infección puede extenderse a articulaciones, vainas tendinosas, bolsas sinoviales, huesos y m úsculos.301'Purvis y cois . 227 inform aron un caso de artritis poliarticular bilateral de las m uñecas y los codos. Aunque la artritis es una m anifestación rara de la esporotricosis, este caso señala el amplio espectro de enfermedad que puede estar causado por este hongo . 42 La artritis esporotricótica es una enferm edad rara, con sólo 51 casos inform ados en la literatura inglesa. Howell y Toohey 123 com unicaron los resultados de 13 pacientes con artritis esporotricótica que habían sido tratados en hospitales de la región de W ichita desde 1979. La presentación típica era la de un paciente afebril con una articulación que m ostraba calor y cierto edem a sin eritema. Se observó el com prom iso de 17 articulaciones, que abarcaban 10 de rodilla, 3 interfalángicas, 1 de codo, 1 mediotarsiana. 1 intercarpiana y 1 m etatarsofalángica. Casi todos los pacientes eran hom bres de m ediana edad y en el 77% de ellos se registró la ingestión de cantidades im portantes de alcohol. Wang y cois . 283 inform aron el caso de un paciente con una bursitis prerrotuliana infectada por Sporothrix schenckii. La infección persistió a pesar del tratam iento con itraconazol y la curación sólo se logró después de la extirpación quirúrgica de la sinovial. La esporotricosis pulm onar primaria es rara. Sin embargo, England y Hochholzer 75 inform aron ocho casos de esporotricosis pulm onar primaria en pacientes tras la inhalación de conidios transportados por el aire, un hecho poco frecuente. Los síntomas de presentación usuales son tos. producción de esputo y fiebre de baja intensidad. En los pacientes infectados por el virus de la inm unodeficiencia humana, la esporotricosis puede tener presentaciones atípicas, en que la enfermedad tiende a extenderse y diseminarse. La enferm edad cutánea que com ienza com o lesiones localizadas puede diseminarse a otros sitios de la piel, con disem i­ nación a las meninges en un informe de casos . 6 4 El diagnóstico puede ser difícil cuando la esporotricosis se presenta inicialm ente com o fungem ia y enfer­ m edad disem inada . 5 Aunque la esporotricosis localizada es un trastorno inocuo que responde bien al tratam iento, estos autores encontraron que en los hués­ pedes inm unodeprim idos la enfermedad es potencialm ente mortal y a m enudo difícil de tratar, y requiere tratam iento prolongado con m edicaciones que pueden ser tóxicas, com o la anfotericina B. La infección progresiva fue más frecuente en los individuos con recuentos de linfocitos CD4 m enores de 100 células/m m 3.

Mendes-Giannini y cois.179 demostraron anticuerpos especí­ ficos de los tipos IgG, IgA e IgM contra el antígeno de 43 kDa de Paracoccidioides brasiliensis en los pacientes con paracoccidioidomicosis y además comprobaron que la disminución de los títulos durante un ciclo de tratamiento se relacionaba con la mejoría de los síntomas. Mediante el empleo de anticuerpos m onoclonales dirigidos contra la form a de levadura de Paracoccidioides brasiliensis, Gómez y cois.96 pudieron crear una prueba de inhibición del ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) capaz de detectar cantidades pequeñas de

antígeno circulante en el suero de pacientes con enfermedad activa. De 46 pacientes con paracoccidioidomicosis, 37 resul­ taron positivos (80,4%). Sandu y cois.241 crearon una sonda de DNA de 14 bases específica para las secuencias 5 ’ terminal del gen ribosómico 28S de P. brasiliensis. Al aplicar un protocolo de diagnóstico uniforme, que consistía en los procedimientos comunes de lisis celular y la purificación del DNA seguidos de la amplificación por PCR, estos autores demostraron la identi­ ficación selectiva de P. brasiliensis de otras 47 especies de hon­ gos que representan 25 géneros.

A Figura 21-65 M icrofotografía y esquem a de la form a de levadura de Paracoccidioides brasiliensis, que m uestran el cuerpo central grande que da lugar a brotes m últiples, form ando una “rueda de tim ón” .

H o n g o s d e m a tiá c e o s

Los resultados de estos estudios proporcionan varios enfo­ gues alternativos que no utilizan cultivos para establecer el diagnóstico de paracoccidioidomicosis. Las manifestaciones clínicas de la paracoccidioidomicosis >e muestran en el recuadro de correlación clínica 21-9.

Hongos dematiáceos Agentes de feohifomicosis

A diferencia del grupo de hongos hialinos, un segundo gran grupo de hongos filamentosos saprofitos de crecimiento rápido producen un pigmento similar a la melanina que da por resul­

115 7

tado hifas con pigmentación oscura, reconocidas a simple vista como colonias gris oscuro o negras, tanto en la superficie como en el reverso. A este grupo de hongos dematiáceos se le aplicó el término feohifomicetos (phaeohyphom yces; del griego phaeo = oscuro, gris). Ajello y cois.6 fueron los primeros en proponer en 1986 el concepto de “feohifomicosis” para “cubrir todas las infeccio­ nes de naturaleza cutánea, subcutánea y sistèmica causadas por hongos hifomicetos que se desarrollan en los tejidos del hués­ ped en la forma de elementos dematiáceos con hifas tabicadas de paredes oscuras”. Estos elementos del micelio de los dema­ tiáceos se acompañan de modo característico por una reacción inflamatoria granulomatosa cuando se observan en cortes de tejidos. Por lo tanto, como se explicó en un principio, la “feohi-

R E C U A D R O D E C O R R E L A C I Ó N C L ÍN IC A 21-9 P a ra c o c c id io id o m ic o s is Tras la inhalación de polvo contam inado por esporas, los conidios pequeños (4 flm de diám etro) alcanzan la porción distal del parénquim a pulm onar donde se desarrollan en levaduras que pueden quedar confinadas localm ente o pueden propagarse y diseminarse a órganos distales en los casos de enfermedad diseminada progresiva. En un huésped com petente, el crecim iento local se retrasa y la infección puede finalizar sin el desarrollo de lesión. Cuando es sinto­ mática. Brum m er y cois . 3 2 dividieron la paracoccidioidom icosis en dos categorías generales: 1) la form a juvenil, aguda o subaguda y 2) la form a crónica, del adulto. Form a juvenil, aguda o subaguda La form a juvenil de la enfermedad incluye sólo del 3% al 5% de los casos, y com prende sobre todo a niños o adultos jóvenes inm unodeprim idos. La evolu­ ción de la enfermedad es relativamente rápida (sem anas a meses), m arcada por la afectación difusa del sistem a reticuloendotelial. L a hepatoesplenom egalia. las linfadenopatías y la hiperplasia de la m édula ósea son presentaciones clínicas frecuentes. La disfunción de la m édula ósea puede ser tan grave com o para sim ular un trastorno linfoproliferativo . 164 Las biopsias de los órganos o tejidos afectados revelan gran cantidad de levaduras con proliferación activa, sin la form ación de granulom a. En esta forma de la enfermedad, los pulmones raras veces están com prom etidos, aunque los m icroorganism os pueden detectarse en las secreciones respiratorias. En ocasiones, los ganglios linfáticos m esentéricos aum entan tanto de tam año que causan obstrucción intestinal. El pronóstico de la forma juvenil de la enfermedad es desfavorable. Forma crónica, tipo adulto A lrededor del 90% de los pacientes padecen esta form a de la enfermedad, que en su m ayoría afecta a varones adultos. La enfermedad es lentam ente progre­ siva, tiende a perm anecer lim itada sobre todo a los pulm ones y puede tardar meses o años para establecerse en su totalidad. Los pulm ones están afectados en más del 90% de los pacientes infectados y en muchos casos representan el único sitio de infección. Las lesiones pulmonares, com o se observan en las radiografías, son nodulares, infiltrativas, fibrosas o cavitarias y se localizan de preferencia en los lóbulos inferiores de los pulm ones . 164 Los síntom as fre­ cuentes son tos, expectoración y disnea, a menudo acom pañados por fiebre intermitente de baja intensidad, pérdida de peso y anorexia. El cuadro pulm onar imita a m enudo a la tuberculosis. La enferm edad crónica puede ser leve, m oderada o grave, de acuerdo con el estado general del paciente y el estado inmunitario; la fibrosis intensa conduce a la enfermedad pulm onar obstructiva crónica y al cor pulmonar, que son secuelas mortales. Brum m er y cois . 32 citan algunos informes de casos de com prom iso extrapulmonar. como ojos, sistem a nervioso central, huesos y aparato genital. Varios informes también aparecen en la literatura más reciente, por lo general de A m érica del Sur. Sant' Anna y cois . 242 revisaron los casos de siete pacientes con enfermedad laríngea, todos varones de m ediana edad, predom inantem ente granjeros. Los síntom as de presentación principales fueron disfonía, disfagia. dis­ nea y tos. En cada uno de estos pacientes la primera impresión diagnóstica fue carcinoma. De más reciente preocupación es el recrudecim iento del com prom iso bucal y las m icosis profundas de la boca . 8-94 Alm eida y cols.s inform aron que las infecciones m icóticas (m icosis) bucales adquirieron una im portancia particular desde el advenim iento de las infecciones por el HIV, así como el aumento de viajes por el mundo, con m ayor exposición a las infecciones endém icas de los trópicos. Alm eida y cois, informan adem ás acerca de 21 pacientes argentinos que viven en la provincia de Corrientes y presentaron m anifestaciones bucales de Paracoccidioides brasiliensis. Todos los pacientes excepto uno tenían com prom iso pulm onar detectable. La adm inistración a largo plazo de itraconazol proporcionó la curación en estos casos. Los autores hacen hincapié en la necesidad de realizar el diagnóstico tem prano y el tratam iento adecuado para evitar la destrucción extensa del tejido. También es obligatorio el seguimiento a largo plazo, ya que la tasa de recidiva es elevada. La m anifestación clínica encontrada entre los 27 pacientes con SIDA inform ados por Goldani y Sugar 95 recorrió el espectro desde la infección inactiva hasta la evolución rápidam ente progresiva. La enfermedad disem inada fue la form a más frecuente, en que los sitios más comunes de infección fueron el pulm ón, la piel y los ganglios linfáticos. En la m ayoría de los casos se observó fiebre prolongada, linfadenopatía. hepatoesplenom egalia y lesiones cutáne­ as; de hecho, representan un cuadro de síntomas que puede servir como m arcador para el SIDA. El diagnóstico se realiza m ejor por el exam en directo y el cultivo de muestras de esputo, biopsias de piel y aspiración de ganglios linfáticos. Como se m encionó, los ensayos por PCR de estas muestras promete aum entar en gran m edida las posibilidades de realizar el diagnóstico. M ás de la mitad de los pacientes en esta serie m urieron a pesar del tratam iento enérgi­ co con antimicóticos. Severo y cois . 252 inform aron un caso de com promiso del aparato genital m asculino en un nativo de Brasil e incluyeron la revisión de otros 18 casos reco­ gidos de la literatura brasileña. M anns y cois . 172 describieron el caso de un hom bre de 59 años que presentó paracoccidioidom icosis m ás de 15 años después de dejar América del Sur. Los médicos de todo el m undo deben tener presente esta infección al evaluar a un paciente con antecedentes pertinentes de viajes que presenta m anifestaciones pulmonares, de mucosas o cutáneas sugestivas de esta enfermedad, junto con pérdida de peso y otros síntomas generales.

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CAPÍTULO 21 Micología

fomicosis” fue el término usado para describir una entidad histopatológica en lugar de representar cualquier enfermedad clí­ nica particular o especie de hongo como se identifica en los cultivos del laboratorio. No obstante, el término feohifomicosis se aplica en la actualidad a varias entidades clínicas: sinusitis, queratitis, endocarditis y neumonía, entre otras. De Hoog60 aconseja que este término se considere estrictamente una pala­ bra descriptiva artificial, sin importancia biológica. Todavía, muchos micólogos recomiendan que el término genérico se reemplace con informes como "queratomicosis causada por especies de Bipolaris” o “micetomas causado por Phialophora richardsiaeP3 En esta presentación, los agentes de cromomicosis y micetomas se incluyen en la categoría general de feohi­ fomicosis. haciendo referencia en términos más amplios a los hongos dematiáceos oscuros.

PRESENTACIÓN EN EL LABORATORIO

Este grupo de hongos dematiáceos puede sospecharse en el cultivo como agentes de feohifomicosis al observar la superficie vellosa, algodonosa o aterciopelada gris oscuro, castaño o ne­ gra, con una pigmentación gris humo a negro azabache en el reverso de la colonia (otros hongos pueden producir conidios negros en los que el pigmento sólo oscurece la superficie de la colonia). Como la morfología de la colonia no es distintiva entre este grupo de hongos, es necesario el examen microscópico para la identificación de género y de especie. Los agentes de cromomicosis y micetomas suelen ser de crecimiento lento y las colo­ nias tienden a ser pequeñas. Las colonias representativas de los hongos filamentosos dematiáceos saprofitos de crecimiento más rápido se muestran en la lámina en color 21-3A-D. En la microscopia, los hongos dematiáceos tienen un mice­ lio amarillo oscuro a castaño compuesto por hifas uniformes con paredes paralelas y tabiques característicos. Los hongos incluidos en este grupo de hongos filamentosos de crecimiento

rápido están caracterizados por la formación de macroconidios con tinción oscura. Los géneros de importancia médica son: Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies Especies

de de de de de de de de de de de

Alternaría Ulocladium Stemphylium Epicoccum Bipolaris Drechslera Curvularia Exserohilum Nigrospora Phoma Chaetomium

La identificación de estos hongos puede simplificarse si se consideran los siguiente tres subgrupos sobre la base de la mor­ fología de los macroconidios: • Los en que los macroconidios son multicelulares y divididos por tabiques longitudinales y transversales, denominados “muriformes” (como una pared de albañilería). • Los en que los macroconidios son multicelulares sólo dividi­ dos por tabiques transversales. • Los que pertenecen a un grupo misceláneo en que los macro­ conidios son células individuales o que manifiestan otros modos específicos de conidiación. Macroconidios con tabiques transversales y longitudinales (muriformes)

Los géneros de hongos de importancia médica incluidos en este grupo son: Especies Especies Especies Especies

de de de de

Alternaría Ulocladium Stemphylium Epicoccum

ESPECIES DE ALTERNARIA

La formación de cadenas cortas de macroconidios grandes, multicelulares, de paredes lisas, separados por tabiques trans­ versales y longitudinales (muriformes) es característica de las especies de Alternaría. Los macroconidios tienen forma de palillos de tambor, con el palillo largo de un conidio que ensambla contra el extremo redondeado y romo del siguiente (fig. 21-66).

ESPECIES DE ULOCLADIUM

Las especies de Ulocladium también producen macroconi­ dios muriformes; sin embargo, son más esféricos que los de las especies de Alternaría, no se disponen en cadenas y nacen de conidióforos cortos, curvos como si fuera una “rodilla” o geni­ culados (fig. 21-67). Este origen simpodial de los macroconi­ dios es una característica importante para la identificación.

ESPECIES DE STEMPHYLIUM

Figura 21-66 M icrofotografía de una cadena corta de m acroconidios muriform es, oscuros, de especies de Alternaría.

Se producen macroconidios muriformes que se asemejan a los de las especies de Ulocladium; sin embargo, nacen de modo individual en el ápice de un conidióforo no geniculado y recto. Los macroconidios están levemente dilatados y redonde-

H ongos dem atiáceos

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dios en la punta que, junto con el conidióforo de apoyo, tiene el .i'pecto de una “bala de algodón sobre un palo” (fig. 21-68). ESPECIES DE EPICOCCUM

De modo típico las hifas forman ramificaciones repetidas focales que a su vez se vuelven a ramificar de ciertas hebras y forman masas conocidas como el esporodoquia. De estas masas se forman conidióforos cortos que tienen macroconidios multicelulares, muriformes, esféricos o con forma de maza, que pueden presentar una superficie rugosa que da el aspecto de una verruga negruzca (fig. 21-69).

II

Macroconidios con tabiques transversales ESPECIES DE BIPOLARIS

La característica distintiva de las especies de Bipolaris es la producción de macroconidios multicelulares, elípticos a ovala­ dos. de pared gruesa con superficies lisas, nacidos de conidióforos que tienen curvaturas similares a rodillas (geniculados) en una disposición simpodial (fig. 21-70). La designación Bipolaris surge de la propiedad de formar tubos germinales que se originan desde ambos extremos de los macroconidios en paralelo con el eje longitudinal de la célula (cuando se exami­ nan en preparaciones directas en fresco con agua o solución fisiológica de los conidios y se incuban a 25 °C durante 8-24 horas).

-

Figura 21-67 M icrofotografía de m acroconidios m uriform es. oscuros, naci­ dos de conidióforos geniculados, característicos de las especies de Ulocladium.

conidióforos curvos. Las células centrales crecen más rápi­ damente y son más grandes que las de los extremos, lo que da por resultado el aspecto característico curvo o de “búmeran” (fig. 21-71).

ESPECIES DE DRECHSLERA

Las especies de Drechslera también producen macroconi­ dios multicelulares y cilindricos que nacen de conidióforos geniculados, indistinguibles de los de las especies de Bipolaris. Los conidios presentan contornos redondeados que no sobresa­ len de la célula basal. En preparaciones en fresco con solución fisiológica, un solo tubo germinal surgido en la mitad del camino entre la base del conidio y el tabique, y que se extien­ de en ángulo recto al eje longitudinal, es una característica de identificación importante. En la práctica, la mayoría de los ais­ lamientos clínicos que presentan conidios como los descritos pertenecerán al género Bipolaris.

ESPECIES DE EXSEROHILUM

Los conidios de las especies de Exserohilum son similares a los de las especies de Bipolaris, sólo que son más largos, con forma de lápiz, formados por más células y de modo caracte­ rístico presentan un nudo protuberante, prominente y exten­ so desde la célula hilar (fig. 21-72). Macroconidios que nacen de modo individual o por conidiación especial

Los géneros de los hongos filamentosos dematiáceos inclui­ dos en este grupo son:

ESPECIES DE CURVULARIA

Los macroconidios de las especies de Curvularia son fáciles de reconocer, ya que tienen cuatro a cinco células separadas por tabiques transversales, nacidos de modo simpodial de dos

Especies de Nigrospora Especies de Phoma Especies de Chaetomium

i B Figura 21 -68 M icrofotografía y esquem a de m acroconidios muriform es sostenidos de m odo característico sobre el extrem o de un conidióforo corto y recto, como una bala de algodón sobre un palo, característico de las especies de Stemphylium.

1160

CAPÍTULO 21 Micología

fusiformes o esféricos, hialinos que se liberan a partir de una fractura de la pared celular. Como los picnidios pueden parecer similares a los cleistotecios producidos por las especies de Aspergillus y otros hongos teleomorfos, es necesario determi­ nar si las esporas contenidas son conidios (como es el caso en las especies de Phoma) o son las ascosporas más grandes y con tinción más oscura características de los hongos ascosporógenos. Esta diferenciación puede hacerse en las preparaciones con cinta transparente mediante la presión suave de la cinta con la punta de un lápiz sobre las estructuras saculares desconoci­ das (visualizadas con el objetivo de campo de un microscopio) hasta que se rompa. La liberación de conidios hialinos unicelu­ lares como se describió antes confirma la identificación de especies de Phoma.

ESPECIES DE CHAETOMIUM Figura 21-69 Microfotografía de macroconidios muriformes inmaduros y maduros de especies de Epicoccum, nacidos de modo característico en racimos laxos.

Las colonias de las especies de Chaetomium al comienzo son blancas, pero pueden tornarse amarillas, amarillo verdosas o cobre en la madurez. En la microscopia pueden observarse hifas especuladas y grandes que se extienden a través de la pared de las estructuras saculares que constituyen los cleistote­ cios, dando el aspecto de patas de una araña que se extienden (fig. 21-75).

ESPECIES DE NIGROSPORA

Las colonias de las especies de Nigrospora presentan un cre­ cimiento rápido y algodonoso; al principio de color blanco sucio, que vira al gris con la madurez cuando las hifas vegeta­ tivas se pigmentan. El reverso de la colonia también tiene pig­ mentación oscura. La microscopia revela conidios solitarios, grandes, subglobulosos, lisos y de color azabache y nacen de los extremos dilatados de conidióforos con forma de urna (fig. 21-73).

ESPECIES DE PHOMA

Las colonias de las especies de Phoma son beige a castaño oscuro, y se diseminan sobre la superficie con un margen exter­ no indiferenciado. La consistencia es más lisa que algodonosa porque las hifas aéreas se desarrollan de modo deficiente. En la microscopia se observan estructuras saculares grandes y carac­ terísticas, castaño oscuro a negras, de paredes lisas, coriáceas, denominadas picnidios (fig. 21-74). Dentro de los picnidios se originan gran cantidad de conidios unicelulares, cilindricos,

Agentes de cromomicosis y micetomas La cromomicosis es el término original utilizado para des­ cribir una infección cutánea y subcutánea caracterizada por la formación de vegetaciones verrugosas, multicolores, elevadas, rugosas, que con más frecuencia se extienden sobre las super­ ficies dorsales de los pies y de la parte inferior de la pierna, causada por un grupo de hongos dematiáceos de crecimiento lento que pertenecen a los géneros Cladophialophora, Phialo­ phora, Cladosporium y Fonseceae.7' El término micetomas se refiere a un cuadro en el que la infección se localiza principalmente en el tejido subcutáneo, donde forma un absceso o masa granulomatosa con la forma­ ción de trayectos fistulosos que alcanzan la superficie de la piel. A menudo, de estos trayectos se libera material purulento que contiene granos o gránulos de elementos micóticos y tam­ bién se observa en cortes histológicos de la masa. Estos agentes ingresan en la piel a través de heridas traumá­ ticas y lesiones penetrantes. En los tejidos pueden observarse

rÍ S § )

B Figura 21-70 Microfotografía y esquema de los macroconidios multicelulares, cilindricos, de paredes lisas, característicos de las especies de Bipolaris.

A g e n te s de c ro m o m ic o s is y m ic e to m a s

1161

B Figura 21-71 M icrofotografía y esquem a de m acroconidios oscuros, multicelulares, divididos por tabiques transversales e inclinados debido al sobrecrecim iento de la célula central, característicos de las especies de Curvularia.

Figura 21 -72 M icrofotografía y esquem a de m acroconidios largos, con form a de lápiz de las especies de Exserohilum, caracterizados por una protuberancia sim i­ lar a una tetina desde la célula hilar.

Figura 21-73 M icrofotografía de la form a filamentosa de las especies de Nigrospora. que revela un fondo de hifas dematiáceas y conidios esféricos, negro azabache, cada uno sostenido por un conidióforo bulboso {flecha).

Figura 21-74 M icrofotografía de un picnidio sacular grande de las especies de Phoma, con conidios hialinos diminutos dispersos observados sobre el fondo.

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CAPÍTULO 21 Micología

Figura 21-75 M icrofotografía del picnidio con form a de araña de las espe­ cies de Chaetomium, en el que brotan conidios que se extienden a través de la pared.

las hifas dematiáceas. Más característica para el diagnóstico es la presencia de cuerpos levaduriformes muriformes, con una tinción amarillo pálido, agrupados en racimos o en cadenas cortas, conocidos como “cuerpos de M ediar” o “peniques de cobre” (fig. 21-76). Características histológicas frecuentes son los microabscesos, los nodulos granulomatosos, la acantosis extrema y la hiperplasia seudoepiteliomatosa con grados varia­ bles de fibrosis y cicatrización. Las siguientes especies de crecimiento lento de los hongos dematiáceos son las causas más frecuentes de cromomicosis, micetomas y otras infecciones micóticas profundas: Cladophialophora (Cladosporium) carrionii Cladophialophora (Xylohypha) bantiana Phiaiophora verrucosa Phiaiophora richardsiae Fonsecaea pedrosoi Especies de Exophiala Especies de Wangiella La distinción entre cada una de las especies enumeradas depende de la observación de diferencias importantes en el modo de conidiación, la estructura de los conidióforos y las fiá­ lides, y la morfología y la disposición de los conidios. Los hongos de este grupo que causan cromomicosis y mice­ tomas producen cuatro tipos de esporulación: cladosporio, fialófora, acroteca y rinocladiela. Las hifas que se observan en el fondo de la preparación microscópica en cada una de estas especies micóticas son oscuras y tabicadas. En la esporulación tipo cladosporio se producen conidios elípticos y oscuros en cadenas largas y ramificadas, cada uno separado por una cicatriz delicada conocida como disyuntor (fig. 21-77). La esporulación tipo fialófora se caracteriza por la produc­ ción de fiálides que presentan forma de urna o son largas y adelgazadas. Dentro de las fiálides se producen conidios y salen en racimos pequeños de los extremos (fig. 21-78). En la esporulación tipo acroteca se producen ramas simpodiales de conidióforos de los lados de las hifas, que simulan las puntas de una percha de chaquetas. De estos racimos nacen cadenas cortas de conidios (fig. 21-79). La esporulación tipo rinocladiela es una variante de la esporulación tipo acroteca en

Figura 21-76 M icrofotografía de un corte de tejido en un caso de crom om i­ cosis subcutánea. N ótese la inclusión de diversos cuerpos escleróticos esféri­ cos dentro de la célula gigante ubicada en el cuadrante inferior derecho en este cam po (objetivo de inmersión, H-E).

que los conidios se producen de modo individual, directo y lateral de los lados de las hifas (fig. 21-80). Cladophialophora (Cladosporium) carrionii Las hifas libremente ramificadas dan lugar a largas cadenas de conidios elípticos, con tinción oscura. Los conidios a menu­ do muestran cicatrices o disyuntores en los sitios de unión (véase fig. 21-77). Cladophialophora bantiana (antes Phiaiophora bantianum, antes Cladosporium trichoides) es una especie estrechamente relacionada que también produce esporas del tipo cladosporio; sin embargo, las cadenas de conidios son muy largas, con cerca de 30 células cada una y dan origen a conidios no pig­ mentados sin disyuntores. Cladophialophora bantiana crece a 43 °C y no produce la licuefacción de la gelatina, dos carac­ terísticas adicionales por las que puede diferenciarse de Cladophialophora carrionii que carece de estas propiedades. Phiaiophora verrucosum Las fiálides con forma de botella o urna, que varían de 4 |j.m a 7 (im de longitud, nacen directamente de los lados de las hifas (véase fig. 21-78). La porción terminal de la fiálide es caracte­ rísticamente larga, lo que simula la parte superior de una bote­ lla de bebida gaseosa. Desde el interior de cada fiálide se pro­ ducen conidios esféricos u ovales, con pigmentación amarilla y se agrega en racimos similares a balones en la apertura termi­ nal. Estos conidios pueden soltarse y agregarse a lo largo de los lados de las fiálides y junto a las hifas adyacentes que los sos­ tienen. Phiaiophora richardsiae A diferencia de las fiálides similares a botellas estrechas de Phiaiophora verrucosum, las de Phiaiophora richardsiae son planas y con forma de plato (fig. 21-81). Phiaiophora richard-

A gentes de crom om icosis y m icetom as

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Figura 21-77 M icrofotografía y esquem a que ilustran la esporulación tipo cladosporio en que cadenas de conidios elípticos están conectadas por disyun­ tores con tinción oscura.

siae se aísla con frecuencia en los quistes feohifomicóticos. Forman conidios hialinos, esféricos o elípticos que nacen en racimos compactos en los extremos de estas fiálides y se mantienen unidos por un material mucinoso. Estos conidios también pueden desprenderse y agregarse a lo largo de los lados de las fiálides.

conidios individuales y laterales a lo largo de los lados del conidióforo, en un disposición de rinocladiela (véase fig. 2180). En ciertas cepas de F. pedrosoi, pueden mezclarse las esporulaciones tipos cladosporio y fialófora. Los conidios en una especie relacionada que se encuentra con menor frecuen­ cia, Fonsecaea compacta, se disponen en racimos compactos.

Fonsecaea pedrosoi

Exophiala jeanselmei

Los conidios se originan en dentículos cortos adheridos late­ ralmente a los lados de las células conidiógenas que de modo periódico se dilatan, se convierten en simpodiales y producen conidios adicionales que se disponen en cadenas cortas en los puntos de tabicación (véase fig. 21-79). Este tipo de esporula­ ción se conoce como “acroteca”. Algunas cepas producen

Esta especie y la estrechamente relacionada “similar”, Wangiella dermatitidis, producen conidióforos largos y adel­ gazados que se extienden desde las hifas en ángulos rectos u

Figura 21-78 M icrofotografía de la esporulación tipo fialófora, que muestra conidióforos cortos, con form a de urna, cada uno con un cuello estrecho simi­ lar a una botella de bebida gaseosa a partir del cual se producen conidios esfé­ ricos, dispuestos en racim os laxos en la punta.

Figura 21-79 M icrofotografía de la esporulación tipo acroteca, en la cual se producen de modo sim podial cadenas cortas de conidios elípticos de los extrem os de los conidióforos, una im agen que se asem eja a un perchero.

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C A P ÍT U L O 21

Micología

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Figura 21-80 M icrofotografía y esquem a de esporulación tipo rinocladiela, en la cual los conidios elípticos nacen de modo directo y lateral en hileras com pactas desde los lados del conidióforo.

obtusos. Las puntas de los conidióforos de E. jeanselm ei pue­ den ser filosas, como resultado de una extensión implicada en la formación del anélido (fig. 21-82). Los anillos o anélidos pueden observarse debajo de la punta adelgazada de la fiálide cuando se ajusta el foco del microscopio y se disminuye la luz del condensador. Se observan cicatrices delicadas o anélidos en E. jeanselm ei que están ausentes en W. dermatitidis. KwonChung y Bennett han encontrado anélidos producidos por ambas especies y consideran que la especie Wangiella es una variante de las especies de Exophiala.'53 En los extremos de las fiálides pueden observarse racimos de conidios elípticos que se sueltan y se alinean hacia abajo a lo largo del curso de sus tallos largos. Las levaduras negras de las especies de Phaeoannellomyces, consideradas como sinanamorfa de las especies de Exophiala, se describirán más adelante en la sección de leva­ duras de esta presentación.

Figura 21-81 M icrofotografía de conidióforos largos de Phiaiophora ri­ chardsiae. que muestran el extremo en forma de plato aplanado característico.

B

Las manifestaciones clínicas de feohifomicosis. incluso cro­ momicosis y micetomas, se presentan en el recuadro de corre­ lación clínica 21-10.

Identificación por el laboratorio de las levaduras Las especies de levadura monomórficas de importancia médica que suelen aislarse con mayor frecuencia en los labora­ torios de microbiología clínica son: Candida albicans Especies de Candida Cryptococcus neoformans Especies de Cryptococcus Candida (Torulopsis) glabrata Especies de Geotrichum Especies de Trichosporon Especies de Rhodotorula Especies de Saccharomyces Hansenula anómala Malassezia furfur Aureobasidimn pullulans Phaeoannellomyices werneckii En el diagrama 21-7 se proporciona una guía para la identi­ ficación por el laboratorio de estas levaduras. Los aislamientos de levaduras más importantes en clínica crecen dentro de las 36 a 72 horas en cultivos en agar sangre de camero y la mayoría de otros medios de aislamiento primario no selectivos. De modo típico las colonias son blancas o blan­ co amarillentas con una consistencia homogénea o pastosa (lámina en color 21-6A). Cuando en el cultivo se observan colonias sospechosas de ser una de las levaduras monomórfi­ cas, el primer paso es determinar si se producen seudohifas y en ese caso efectuar una preparación para establecer el tubo germinal. Si el aislamiento produce tubos germinales con las

Id e n tific a c ió n p o r el la b o ra to rio d e las le v a d u ra s

A

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B

Figura 21-82 M icrofotografía y esquem a de especies de Exophiala, que m uestran los conidióforos largos y adelgazados de cuyos extremos se liberan aneloconidios alargados que se disponen en racim os laxos.

condiciones de la prueba, puede informarse como identifica­ ción presuntiva de Candida albicans y no es necesario realizar otros estudios. Tubo germinal

El tubo germinal se define como una extensión filamentosa de una levadura que tiene casi la mitad del ancho y tres a cua­ tro veces la longitud de la célula madre (fig. 21-83). El verda­ dero tubo germinal producido por Candida albicans no tiene estrechamientos en el cuello. En su estructura, el tubo germinal es una hifa verdadera y por consiguiente no tiene la caracterís­ tica de los estrechamientos de las seudohifas. Una descripción del procedimiento para determinar la formación del tubo ger­ minal se incluye en el recuadro 21-6. Como ya se mencionó, si hay presencia de tubos germinales puede hacerse la identifica­ ción presuntiva de C. albicans. Como no todas las cepas de C. albicans producen tubos germinales, deben realizarse cultivos en placa con agar harina de maíz. Al final del período de incu­ bación, se realizan preparaciones en fresco para observar por microscopia la presencia de clamidosporas que, si están pre­ sentes, también perm iten la identificación presuntiva de Candida albicans (fig. 21-84). Preparaciones a partir del agar harina de maíz

En el recuadro 21-7 se describe la preparación a partir del agar harina de maíz. Nuevamente, hay que seguir el diagrama 21-7. Si hay pre­ sencia de seudohifas y blastoconidios puede hacerse la identifi­ cación presuntiva de especies de Candida. Los diferentes pa­ trones de crecimiento en las preparaciones a partir del agar hari­ na de maíz a menudo son lo suficientemente distintivos como para establecer una identificación presuntiva de la especie.

género Candida. La mayoría de las infecciones humanas se deben a Candida albicans. Sin embargo, con el aumento de la inmunosupresión vinculada al trasplante de órganos y otras enfermedades relacionadas y la emergencia de patógenos micóticos oportunistas, no puede ignorarse el aislamiento de especies de Candida no albicans en cultivos puros o predomi­ nantes de sangre u otros sitios corporales estériles. Es necesa­ rio realizar una correlación clínica cuidadosa para determinar si se requieren otros estudios. Los patrones de crecimiento en el agar harina de maíz son útiles para hacer la identificación presuntiva y sirven como verificación del control de calidad en las identificaciones de especie proporcionadas por los biocódi­ gos indicados por los sistemas automatizados y los equipos comerciales. Como ninguno de los patrones en agar harina de maíz es diagnóstico (con la excepción de la producción de cla­ midosporas por Candida albicans), es necesario realizar estu­ dios de asimilación de hidratos de carbono u obtener los resul­ tados provenientes de algunos de los sistemas comerciales de identificación de levaduras antes de informar una identificación definitiva. Si no puede hacerse una identificación presuntiva por la observación de la preparación a partir del agar harina de maíz, resulta útil la realización de pruebas para la reducción de nitra­ to, la actividad de ureasa, la asimilación de inositol y la pro­ ducción de ácido cafeico (mediante el empleo de placas con agar semillas de niger o negrillo, o la realización de la prueba con tiras de papel de filtro), además de los estudios de asimila­ ción de hidratos de carbono, para diferenciar estas varias espe­ cies. Aunque estos estudios pueden lograrse por técnicas con­ vencionales, en la actualidad se utilizan en la mayoría de los laboratorios equipos o sistemas comerciales para la identifica­ ción de levaduras. En los casos poco habituales en los que se requiera la referencia a los perfiles de asimilación de hidratos de carbono, el lector podrá consultar los cuadros 19-8, 19-9 y 19-10 de la quinta edición de este texto.

PATRONES DE CRECIMIENTO DE LAS LEVADURAS EN AGAR HARINA DE MAÍZ

CHROMAGAR

Al observar el crecimiento de una preparación en agar hari­ na de maíz se debe determinar al comienzo si hay presencia de seudohifas. La observación de seudohifas y blastoconidios per­ mite ubicar el aislamiento desconocido como perteneciente al

El CHROMagar, un medio de cultivo cromogénico diferen­ cial, se está utilizando en muchos laboratorios para facilitar el aislamiento y la identificación presuntiva de ciertas especies de levaduras importantes en la clínica, en especial Candida albi-

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CAPÍTULO 21 Micología

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N CLÍNICA 21-10

Fe o hifo m ico sis

Como se m encionó en el texlo, las m anifestaciones clínicas de la crom om icosis y los m icetom as serán incluidas com o subconjuntos bajo la categoría más amplia de feohifom icosis. Brandt y W arnock,3' de los Centers for Disease Control and Prevention, han publicado una revisión de la epidemiología, las m anifestaciones clínicas y el tratam iento de las infecciones causadas por estos hongos dem atiáceos. Estos autores mencionan especies de Alternaría, espe­ cies de Bipolaris, Cladophialophora bantiana, especies de Cumularía, especies de Exophiala, Fonsecaea pedrosoi, especies de Madurella, especies de Phialophora, Scedosporium prolificans. Scytalidium dimidiatum y Wangiella dermatitidis com o los patógenos hum anos m ás im portantes dentro de este grupo. D escriben estos hongos com o am pliamente distribuidos en el am biente y se los encuentra en el suelo, la m adera y los detritos de los vegetales en descomposición. Las infecciones cutáneas, subcutáneas y de la córnea asociadas con estos hongos dem atiáceos aparecen en todo el mundo, pero son m ás frecuentes en los clim as tropicales y subtropicales. La infección suele ser el resultado de la implantación traum ática en la piel u otros tejidos. La m ayoría de los casos progresivos suceden en individuos inm unocompetentes. Los autores tam bién citan a los hongos dem atiáceos com o causas im portantes de sinusitis invasora y sinusitis m icótica alérgica, debidas por lo general a la inhalación de esporas infectantes. Aunque la infección cerebral es la form a más com ún de feohifo­ micosis sistémica, se inform aron tam bién otras form as profundas localizadas de la enfermedad, com o artritis y endocarditis. La infección disem inada es rara, pero su incidencia está aumentando, en especial entre los individuos inm unodeprim idos. Scedosporium prolificans es el agente m ás frecuente im plica­ do en la infección diseminada. En la literatura m édica reciente se han informado cientos de casos aislados de infecciones m icóticas causadas por especies de hongos filamentosos dem atiáceos saprófitos de crecim iento rápido. Aquí sólo se describen algunos ejem plos. Las tres m anifestaciones clínicas más com unes de feohifomicosis causadas por hongos saprófitos son la queratitis, la sinusitis y la onicomicosis. Com o ejem plo reciente de queratitis, W ilhelmus y Jones 255 inform aron su experiencia del laboratorio con el aislamiento y la identificación de especies de Curvularia com o causa de queratitis en un período de m ás de 30 años. Se analizaron las historias clínicas de 32 individuos y se determ inó que el trau­ matismo, por lo general con plantas o suciedad, era el factor de riesgo en la mitad de los casos. L a mayoría de las infecciones (69% ) se produjeron durante los meses cálidos y húm edos del verano a lo largo de la Costa del Golfo estadounidense. Los signos de presentación variaron desde infiltrados leves y superficiales de la parte central de la córnea hasta la ulceración supurativa de la porción periférica de la córnea. La sinusitis tam bién es un sitio frecuente de infección por hongos dematiáceos. De la bibliografía más antigua, Adam y cois . 2 inform aron nueve casos de sinusitis que se presentó com o rinitis alérgica o poliposis nasal, causados por especies de Bipolaris y de Exserohilum. Más recientem ente, Fernandez y cois . 82 inform aron los resultados derivados de una búsqueda de la literatura para las infecciones pediátricas por Curvularia entre los años 1968 y 1998. De 16 casos identificados, 13 presentaron sinusitis alérgica, una form a singular de sinusitis en la que el antecedente de asma o pólipos nasales es una causa predisponente. Los pacientes en esta revisión solían ser adolescentes inm unocom petentes que tenían una duración prolongada de síntomas, por lo general de más de 3 semanas. Para el tratamiento de la sinusitis invasora crónica se recom endaron los desbridam ientos quirúrgicos extensos com binados con trata­ miento con anfotericina B. La onicom icosis causada por especies de Alternaría se está inform ando cada vez con m ayor frecuencia, en especial en los pacientes con inm unodefi­ ciencias. Rom ano y co is . 2 3 ' 1 informaron nueve casos de onicom icosis causados por Alternaría alternata observados en Toscana, Italia, en el período 19851999. El diagnóstico m icológico se realizó sobre la base del exam en m icroscópico directo repetido y los cultivos. En la m ayoría de los casos las m anifesta­ ciones clínicas primarias fueron distrofia e hiperqueratosis subungular distal de una o dos uñas de los pies o las manos. Siete casos se trataron con itraconazol oral; este tratam iento tuvo éxito en seis casos. Varios hongos dem atiáceos son neurotrópicos. com o Cladophialophora bantiana, Ramichloridium mackenziei y Wangiella dermatitidis. Aunque han aparecido casos en personas inmunodeprim idas, la feohifomicosis cerebral es más frecuente en los individuos inm unocom petentes que pueden tener o no factores de riesgo evidentes . 6 3 Revankar y cois . 2 2 5 realizaron la revisión de 101 casos de feohifomicosis primaria del sistema nervioso central com probados por cultivo publicados en la literatura inglesa entre 1966 y 2002. Estos autores encontraron que la especie aislada con frecuencia era Cladophialophora bantiana. Las tasas de m ortalidad eran altas entre estos casos publicados, sin tener en cuenta el estado inmunitario. El tratam iento no se ha estandarizado, aunque la com binación de anfotericina B, flucitosina e itraconazol, junto con un enfoque m édico y quirúrgico enérgico, puede m ejorar las tasas de supervi­ vencia. Crom om icosis W ortman 3112 inform ó un caso de crom om icosis causado en form a sim ultánea por Fonsecaea pedrosoi y Nocardia brasiliensis, com o com plicación de una lesión traum ática penetrante. La cromomicosis se extiende en las regiones tropicales de América del Sur y se observa con m ayor frecuencia en varones dedicados a trabajos de granjas y plantaciones. Silva y cois . 2 5 6 realizaron la revisión de 325 casos inform ados en la región de desagüe del río Amazonas de Brasil. Los datos obtenidos revelaron un espectro de la media de la edad de los individuos afectados entre 41 y 70 años, el 93,2% de los cuales eran varo­ nes. Los obreros agrícolas com prendieron el 86,1% del total. Se encontraron lesiones en los miembros inferiores (pies y piernas) en el 80.7%. En el 24% de los pacientes (78 casos), el agente etiológico se aisló e identificó por medio de los cultivos. Fonsecaea pedrosoi se encontró en 77 casos y Phialophora verrucosa en sólo un paciente. M inotto y cois . 184 informaron resultados similares en un estudio de 100 pacientes residentes de Rio Grande do Sul, Brasil. De nuevo, hubo un predom i­ nio de pacientes m asculinos (4:1); la m ayoría eran granjeros de raza blanca con una edad que oscilaba entre 50 y 59 años. Lo más común era la presencia de lesiones verrugosas graves que aparecían en los m iem bros inferiores, con una media del tiempo entre la aparición de la enfermedad y el diagnóstico m édico de 14 años. En el 16% de los casos la enfermedad se asoció con heridas por espinas. El análisis estadístico mostró recrudecim iento de la enferm e­ dad en el 43% de los pacientes a pesar del tratamiento. Fonsecaea pedrosoi se aisló en el 96% de los casos; Phialophora verrucosa, en el 4%. M icetom as

Micetomas se refiere a infecciones subcutáneas en las que el tejido está muy edem atizado, con formación de fístulas que penetran profundam ente a través de la superficie de la piel y segregan material purulento. Los pies (pie de m adura) y las m anos son las partes más afectadas, se tornan notablem ente tum e­ factos y deform ados en las infecciones graves. Los micetom as tienen dos causas principales: bacterias que pertenecen al orden Actinomycetales (Actinomyces, Nocardia y especies de Streptomyces) y hongos verdaderos (micetomas eum icóticos), sobre todo el hongo dem atiáceo Exophiala jeanselmei y el hongo filamentoso hialino Pseudallescheria boydii encontrados en casos esporádicos en los Estados Unidos.

(Continúa)

Identificación por el laboratorio de las levaduras

R E C U A D R O D E C O R R E L A C IÓ N C L ÍN IC A 21-10

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F e o h ifo m ic o s is (cont.)

Los micetomas se ven con m ayor frecuencia en otras partes del mundo, en especial en el oeste y el este de África. Es habitual un antecedente de lesión. En la m ayoría de los casos están afectados los m iembros inferiores y, con m enor frecuencia, los superiores y otros sitios, com o las regiones glútea, lumbar, subm andibular y la cara. L a descripción realizada por Tham m ayya y cois . 2 7 3 hace muchos años sobre la presentación de un micetom a de un paciente que también vivió en la India sigue siendo clásica para la enfermedad: “La parte inferior de la pierna derecha y el pie estaban irregularm ente edem atizados, firmes, indoloros y pre­ sentaban muchos nodulos pequeños y trayectos fistulosos sobre la tumefacción. Estaban afectados el extremo distal de la tibia y los huesos del pie. La secreción de las fístulas y los nodulos contenían gránulos irregulares, de 0.5-2 m m, castaño negruzcos, blandos, vermiculares, en form a de m edia luna y estaban com puestos sobre todo por células esféricas hinchadas, de 4-8 ¡im de diámetro y escasas hifas, de 2,5-3 ¡im de diámetro". U na incidencia relativamente alta tam bién se ha encontrado en Japón. M urayam a y cois . 187 informaron un caso de m icetom a que afectó la parte inferior de la pierna de una m ujer de 34 años con lupus eritem atoso sistém ico. En una revisión de la literatura acompañante sobre infecciones por Exophiala jean­ selmei en Japón, estos autores encontraron referencia a 54 casos (24 en hom bres y 30 en mujeres). Cincuenta de estos casos (21 hom bres y 29 mujeres, un cam bio interesante en la relación hom bre:mujer) estaban causados por hongos dematiáceos. M ás de la m itad de estos pacientes tenían enfermedades subya­ centes y los sitios de las lesiones eran sobre todo las extremidades. La enfermedad sistém ica suele ocurrir en huéspedes inm unodeprimidos. Por lo general, estas infecciones com ienzan en los pulm ones tras la inhalación de conidios que conduce a infecciones invasoras que pueden disem inarse a órganos distales. Las infecciones invasoras, sistémicas y diseminadas causadas por muchas especies de hongos feohifom icóticos m encionados por Rippon 234 suelen afectar a pacientes inm unosuprim idos, con sitios primarios de infec­ ción en los pulm ones, los senos paranasales o los sitios de traum atism o de la piel. También se incluyen casos de endocarditis com o consecuencia de la im plantación durante la cirugía o la inyección intravenosa de m ateriales contam inados en los drogadictos.

cans. Para separar las especies de levaduras se emplean la observación de la morfología de la colonia y los patrones dis­ tintivos de color, en especial cuando se observan en cultivos mixtos. Candida albicans forma colonias características ama­ rillo verdosas a azul verdosas. Ainscough y Kibbler3 evaluaron la rentabilidad y la ventaja de tiempo de CHROMagar en comparación con el agar dextro­ sa de Sabouraud. Se observó una sensibilidad global del 95,2% en el estudio de 21 cepas de levaduras aisladas en 298 muestras clínicas de pacientes con neutropenia y SIDA. En este estudio se encontró que CHROMagar es 100% sensible y 100% espe­ cífico para C. albicans. Proporcionó el enfoque más económi­

co y que insume menos tiempo para el cultivo inicial y la iden­ tificación presuntiva de los aislamientos de levaduras. Los autores también recomiendan la inoculación directa para los cultivos de sangre cuando las células de levadura se observan en la microscopia.

CANDIDA ALBICANS Dos patrones de crecimiento en el agar harina de maíz son útiles para identificar Candida albicans: 1) producción de cla­ midosporas, 2) blastoconidios que se disponen en los racimos densos distribuidos de modo uniforme a lo largo de las seudohifas (fig. 21-84) o ambos. La revisión de estos patrones en agar harina de maíz es muy útil para la identificación de cepas que no producen tubos germinales. El crecimiento de colonias de Candida albicans también puede llevar a una identificación presuntiva. Los bordes de las colonias a menudo presentan espículas radiadas en los cultivos más viejos (lámina en color 21-6B). Si la prueba del tubo germinal es negativa y no se observan clamidosporas en las preparaciones en fresco del agar harina de maíz, es probable que se haya aislado una levadura distinta de Candida albicans. Aunque alrededor del 5% de C. albicans no produce tubos germinales, sería bastante raro tener una cepa

Recuadro 2 1-6

P ro ce d im ie n to : pru e b a del tu b o g e rm in a l

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1. Se suspende en un tubo de ensayo que contiene 0,5 mL de plasm a o suero de conejo o humano una porción pequeña de una colonia aislada en la levadura por probar. 2. El tubo de ensayo se incuba a 35 °C por no más de 2 horas. 3. U na gota de la suspensión en suero de la levadura se coloca sobre un portaobjetos, se recubre con un cubreobjetos y se examina con el m icroscopio para determ inar la presencia de tubos germinales (fig. 21-83).

M icrofotografía de un tubo germinal, característico de Candida albicans (objetivo de inmersión). F ig u ra

2 1 -8 3

4. La prueba no es válida si se exam ina después de 2 horas.

1168

C A P ÍT U L O 21

Micología

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Figura 21-84 M icrofotograffas de preparaciones a partir del agar ha harina de maíz de Candida albicans. que revelan la producción de clam idosporas ( izquierda) y agrupación regular de blastoconidios a lo largo de las hifas (derecha).

que tampoco produce clamidosporas. Siguiendo el diagrama 21-7, el paso siguiente es observar los patrones de crecimiento en el agar harina de maíz para realizar una identificación pre­ suntiva de otra especie de Candida. Para reiterar, es importan­ te revisar los patrones de crecimiento en el agar harina de maíz como una verificación del control de calidad en las identifica­ ciones de la especie proporcionadas por sistemas automatizados y equipos comerciales, ya que éstos no siempre son correctos. Con este fin, a continuación se describen los patrones clásicos para las especies de Candida no albicans aisladas con mayor frecuencia.

CANDIDA TROPICALIS Candida tropicalis produce seudohifas con blastoconidios que nacen de modo individual o en racimos irregulares peque­ ños a lo largo de las seudohifas en los puntos de estrechamien­ to (fig. 21-85). Como este patrón no es específico, son necesa­ rios los estudios de asimilación de hidratos de carbono o la identificación a través del uso de alguno de los sistemas de iden­ tificación de levaduras.

CANDIDA PARAPSILOSIS Lo importante para la identificación presuntiva de C. parapsilosis en las preparaciones de agar harina de maíz es la obser­ vación de áreas focales múltiples de crecimiento satélite adya­ cente a las líneas de siembra, que forman lo que familiarmente se ha descrito como patrones de “artemisia’', de “cerillas entre­ cruzadas” o de “arañas” (fig. 21-86). Una vez observado, este patrón se comparará con los códigos de identificación de los sistemas comerciales.

CANDIDA KEFYR (PSEUDOTROPICALIS) Lo fundamental es la observación de abundantes blastoconi­ dios alargados o rectangulares que forman racimos laxos entre­ cruzados característicos que se asemejan a la disposición de “leños en el arroyo” (fig. 21-87). C. krusei también produce un patrón similar, salvo que los puntos de origen están agrupados de modo secuencial como ramas de un árbol. Para diferenciar estas dos especies pueden ser necesarios los estudios de asimi­ lación de hidratos de carbono.

OTRAS ESPECIES PATOGENAS EMERGENTES DE CANDIDA

Es importante la identificación definitiva de las especies de Candida no albicans para detectar las cepas patógenas emere.

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Recuadro 21-7

P roced im iento para la siem bra del agar harina de m aíz con Tw een 80

1. Realizar tres cortes paralelos de 0,5 cm o 1 cm, separados en la superfi­ cie del agar harina de maíz, sosteniendo el ansa recta de inoculación en un ángulo de 45°.

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Figura 21-85 M icrofotografía de una preparación a partir del agar harina de m aíz de Candida tropicalis, que muestra la producción leve de conidios que se disponen de m odo irregular a lo largo de las hifas.

2. Colocar un cubreobjetos en la superficie del agar. que cubra una por­ ción de las estrías sembradas. 3. Incubar las placas sem bradas a 30 °C durante 24-48 horas en una cám a­ ra cerrada y húmeda. Al final del período de incubación, exam inar con el microscopio a través del cubreobjetos y observar el patrón de creci­ miento para hacer una identificación presuntiva.

Id e n tific a c ió n p o r el la b o ra to rio de las le v a d u ra s

Figura 21-86 M icrofotografía de una preparación a partir del agar harina de m aíz de Candida parapsilosis, que muestra la form ación característica de co­

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Figura 21-87 M icrofotografía de una preparación a partir del agar harina de maíz que ilustra la disposición de "leños en el arroyo” característica de los blastoconidios largos de Candida kefyr.

lonias satélites con form as de araña a lo largo de la línea de siembra.

gentes, en especial las que han adquirido resistencia a los fár­ macos antimicóticos.200 Candida krusei es resistente al ketoco­ nazol.299 Candida dubliniensis, con un fenotipo estrecham en­ te relacionado con Candida albicans, en particular las cepas aisladas en pacientes con muguet orofríngeo. ha adquirido resistencia inducida al fluconazol.174 Estas cepas pueden iden­ tificarse en el laboratorio mediante la demostración de las siguientes características:267

• Aumento de la utilización de quimioterapia y de trasplantes de médula ósea y de otros órganos, con inmunosupresión intensa acompañante. • Intemacioness prolongadas en hospitales. • Cateterismo vascular. • Administración prolongada de antimicrobianos de amplio espectro. • Uso profiláctico extenso de antimicóticos.

• Incapacidad para crecer a 45 °C. • Aspecto de colonias rugosas con “pies” en el agar semillas de níger (C. albicans produce colonias de bordes lisos). • Producción de seudohifas y clamidosporas en el agar semi­ llas de níger (C. albicans sólo produce blastoconidios redon­ dos u ovales262 (véase fig. 21-88). • Presencia de colonias azul oscuro en CHROMagar Candida.

En una revisión de pacientes con candidiasis intrahospitalaria, Wright y Wenzel303 citan las quemaduras, la asistencia me­ cánica respiratoria, la colonización por especies de Candida y las transfusiones repetidas como factores de riesgo adicionales. Estos autores mencionan un estudio nacional de participación de hospitales de 1996, dirigido bajo el programa de Vigilancia y Control de Patógenos de Importancia Epidemiológica (Sur­ veillance and Control of Pathogens of Epidemiologic Importance, SCOPE) en el que las especies de Candida figuran detrás de las especies de Staphylococcus como la causa más frecuen­ te de septicemia en los pacientes hospitalizados.

• P erfiles de asim ilació n de hid rato s de carbono en los sis­

tem as de id e n tificació n de levaduras API 20C AUX o V itek. C. dubliniensis, a d iferen c ia de C. albicans, no pued e u tilizar la D -xilosa, la treh alo sa ni la m etil-D -glucosid a sa .89

• Sondas de DNA específicas de especie.72 En ciertos linajes de Candida lusitaniae ha surgido resisten­ cia esporádica a la anfotericina B a través de un mecanismo del cambio de colonias antes sensibles.304 De nuevo, es importante identificar estas cepas patógenas emergentes en el laboratorio clínico para evitar la administración empírica de agentes anti­ micóticos a los cuales presentan resistencia.

ESPECIES DE CANDIDA Y CANDIDIASIS

De los datos obtenidos de 180 hospitales estadounidenses que participan en el Sistema Nacional de Vigilancia de Infecciones Intrahospitalarias (National Nosocomial Infections Surveillance, NNIS) se informaron 27 200 aislamientos micó­ ticos asociados con infecciones intrahospitalarias en los Estados Unidos entre enero de 1980 y abril de 1990. De éstos, las especies de Candida determinaron 19 621 (72,1%).130 Los factores predisponentes para esta frecuencia elevada de infec­ ciones por levaduras son:

Figura 21-88 M icrofotografía de una m uestra de esputo con tinción de Gram que m uestra seudohifas y la brotación de blastoconidios característicos de las especies de Candida (objetivo de inmersión).

1170

CAPÍTULO 21 Micología

Los pacientes con cáncer, en especial los que sufren leuce­ mia y trastornos linfoproliferativos en quienes los recuentos de leucocitos en sangre periférica están disminuidos, también tie­ nen un riesgo mayor. Kalin y Petrini133 citan un aumento de la mortalidad en los pacientes con leucemia causada por infec­ ciones micóticas desde un mínimo del 5% antes de la era anti­ biótica hasta una frecuencia actual del 40%. Los agentes pri­ marios aislados con mayor frecuencia fueron las especies de Candida. No obstante, la edad avanzada, aunque no directa­ mente relacionada con las infecciones por levaduras, contribu­ ye al aumento de la morbimortalidad. Por ejemplo, la candi­ diasis mucocutánea en los ancianos, incluso el muguet y la estomatitis por la dentadura postiza, se asocia con irritación mecánica local de la mucosa bucal.118 En el extremo opuesto del espectro de la edad, los recién nacidos extremadamente enfermos también tienen un riesgo alto de adquirir infecciones intrahospitalarias por levaduras, con afectación particular del sistema nervioso central. Otras causas predisponentes para las infecciones por levaduras incluyen las alteraciones de las defensas del huésped debidas a disminuciones en las reservas de proteínas o de la produc­ ción de anticuerpos, supresión de la flora bacteriana normal, embarazo y diabetes mellitus u otras enfermedades metabólicas crónicas. En los casos en que un aislamiento clínico es de gran impor­ tancia o cuando no puede hacerse la identificación exacta de la especie por las características fenotípicas, se dispone de técni­ cas moleculares que utilizan sondas de DNA específicas de especie a través de los Laboratorios de Salud Pública estadou­ nidenses y los Centers for Disease Control and Prevention que proporcionan la diferenciación rápida e inequívoca de estas diversas especies de Candida. La estandarización de las pruebas de sensibilidad in vitro a los antimicóticos (antifungigramas) en gran parte por las investiga­ ciones del Clinical Laboratory Standards Institute (antes, National Committee for Clinical Standards) de los Estados Unidos, ha hecho posible determinar el grado de resistencia de los aislamientos de levaduras.220-230Las aplicaciones de la prueba E también permitieron que los laboratorios clínicos determinen los perfiles de sensibilidad a determinados antimicóticos.218-221 Las manifestaciones clínicas importantes de la candidiasis se presentan en el recuadro de correlación clínica 21-11 (Candida albicans) y en el recuadro de correlación clínica 21-12 (especies de Candida no albicans). Especies que producen hifas verdaderas

Las colonias de las especies de Geotrichum y de Trichosporon son blanco grisáceas y al comienzo presentan un aspecto levaduriforme, pero enseguida forman una superficie delicada y sedosa como hifas verdaderas y artroconidios en la madurez. En las preparaciones de agar harina de maíz, las especies de Geotrichum y Trichosporon producen hifas verdaderas que se segmentan y se rompen para formar artroconidios. Las espe­ cies de Geotrichum pueden diferenciarse porque producen un solo tubo germinal en un ángulo del artroconidio, que simula un palo de joquey (fig. 21-89). Por el contrario, en las especies de Trichosporon típicamente los blastoconidios se forman de ambos ángulos del artroconidio y simulan “orejas de conejo" (fig. 21-90). En los casos en que estas características de identi­ ficación no sean evidentes en el agar harina de maíz, casi todas las cepas de las especies de Trichosporon son productoras de ureasa y dan un resultado positivo en esta prueba, mientras que todas las especies de Geotrichum son negativas.

Las manifestaciones clínicas de la tricosporonosis y la geotricosis se presentan en la recuadro de correlación clínica 21-13. Especies que no producen hifas verdaderas

Los aislamientos que no forman hifas en el agar harina de maíz incluyen especies de Cryptococcus, Candida (Torulopsis) glabrata y especies de Rhodotorula y de Saccharomyces. Las levaduras de las especies de Cryptococcus son esféricas, con un tamaño variable y están ampliamente separadas por el material capsular. Las levaduras de Candida glabrata son más peque­ ñas, de tamaño regular y tienden a disponerse en racimos com­ pactos. A continuación se describen con mayor detalle los géneros característicos junto con los rasgos diferenciales de otros géneros aislados con menor frecuencia, como Rhodoto­ rula, Saccharomyces, Hansenula y Malassezia. Cepas ocasio­ nales de las especies de Candida pueden producir sólo seu­ dohifas rudimentarias o ninguna; por consiguiente, en toda colonia en la que se sospecha alguna especie de Candida deben hacerse preparaciones del agar harina de maíz.

CRIPTOCOCOSIS Y CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS

El aislamiento de Cryptococcus neoformans en las muestras clínicas siempre debe considerarse importante hasta demostrar lo contrario. Hasta el comienzo de la epidemia de SIDA en la década de 1980, la incidencia de la criptococosis en los Estados Unidos era baja (alrededor de 300 casos por año). La mayoría de estos casos tempranos sucedía en pacientes con inmunodeficiencias celulares, en especial en individuos con enfermedad de Hodgkin.149 En la actualidad, C. neoformans es uno de un grupo selecto de microorganismos que causan infección en los pacientes con SIDA y se lo encuentra en el 6-13% de los casos, según el lugar de residencia.186 La incidencia de la criptococo­ sis en los pacientes con SIDA llega al 15% o más en algunos sitios de África subsahariana.183 Cryptococcus neoformans es el criptococo que causa la mayoría de las infecciones humanas. Esta especie es una leva­ dura encapsulada cuyo hábitat natural es el suelo que, al estar contaminado con deyecciones de paloma, pollo o pavo que pro­ ducen un pH alcalino y aumentan la concentración de nitróge­ no, favorece la multiplicación del microorganismo. Las levadu­ ras pueden ser transportadas por el aire en las nubes de polvo creadas en las tareas de barrido, limpieza y excavaciones. Por consiguiente, las personas que trabajan en granjas de pollos, los encargados de parques de la ciudad frecuentados por estorninos y otros pájaros y los espeleólogos que pueden explorar cuevas infestadas por murciélagos tienen un riesgo especial de adqui­ rir la infección. Se aconseja a las personas inmunosuprimidas, en especial los que presentan SIDA, que no participen en estas actividades. En los casos en que no sea evidente la exposición inmediata, el comienzo de la criptococosis aguda puede repre­ sentar la revelación de infecciones latentes. La síntesis de la cápsula es un determinante de virulencia fundamental, ya que proporciona un mecanismo de adherencia a los revestimientos de la mucosa y protección de la fagocito­ sis, tanto durante el tránsito a través del torrente circulatorio como en los sitios de infección."3 Cryptococcus neoformans tiene un tropismo particular por el sistema nervioso central y en muchos casos la primera manifestación clínica es la meningi­ tis. La producción del pigmento melanina también es un deter­ minante de la virulencia, ya que protege a la levadura contra el daño inducido por los oxidantes. La producción de proteinasas y manoproteínas y la liberación de metaboiitos poliólicos

Id e n tific a c ió n p o r el la b o ra to rio de las le v a d u ra s

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N CLÍNICA 21-11

1171

C a n d id ia sis (Candida albicans)

L a causa más frecuente de candidiasis hum ana es Candida albicans. Los principales factores de virulencia que contribuyen al aum ento en su capacidad de infectar son la germ inación rápida en los tejidos después de diseminarse por el torrente circulatorio; la producción de proteasas, las adhesinas para las pro­ teínas de la m atriz extracelular, los receptores de unión al com plem ento y los cam bios fenotípicos . 52-200 M cC ullough 16 y Pfaller 217 realizaron una revisión de la historia; la taxonom ía, la epidem iología y los factores de virulencia de Candida albicans. Las principales m anifestaciones clínicas de Candida albicans son de tres tipos: m ucocutánea, cutánea y sistémica. Candidiasis m ucocutánea L a candidiasis de las mucosas afecta sobre todo la cavidad bucal y el conducto vaginal. La candidiasis bucal, una enferm edad conocida com o muguet, es la m anifestación clínica m ás frecuente de candidiasis en los seres hum anos. La infección se m anifiesta com o placas blancas en la m ucosa bucal y la lengua , 20 que, en las infecciones m ás graves, pueden unirse en una membrana. Estas se adhieren firmem ente al epitelio y cuando se las retira revelan una base enroje­ cida y edem atosa. El diagnóstico puede hacerse m edíante la observación de las seudohifas y los blastoconidios característicos en la microscopia de las pre­ paraciones teñidas con Gram de frotis del exudado (fig. 21-88). Entre las causas predisponentes figuran la alteración de la flora norm al después de la anti­ bioticoterapia prolongada, el pH bajo de las secreciones salivales en los recién nacidos, la hipertrofia de las papilas de la lengua (“lengua negra vellosa”) y la glositis crónica . 25 La candidiasis bucal se reconoce ahora com o una enfermedad que define al SIDA y se observa casi en el 100% de estos pacientes .270 Aunque clásicam ente está causada por Candida albicans, la especie estrecham ente relacionada. Candida dubliniensis, ha surgido hace poco com o el agente m ás problem ático en m uchos casos, lo que expresa la resistencia inducida a ciertos agentes antim icóticos derivados de los azoles, en especial el íluconazol , 17 4 2 6 7 Por consiguiente, puede estar indicada la identificación por el laboratorio de C. dubliniensis para los casos de muguet bucal antes de adm inis­ trar el tratam iento em pírico con un antimicótico azólico. Las m ucosas de la tráquea y los bronquios, y casi cualquier de parte del tubo digestivo, pueden sufrir infecciones por Candida, que en su mayoría repre­ sentan propagación de la enfermedad orofaríngea. Se inform aron casos de esofagitis, gastritis, enteritis y enfermedad perianal, si bien la unión gastroesofágica es un sitio frecuente de infecciones por Candida. U n ambiente con pH bajo puede explicar esta predisposición, en especial en los pacientes con proce­ sos m alignos de la sangre. La difagia, el dolor retroestem al, la hem orragia gastrointestinal alta y las náuseas son síntom as asociados. Los candidiasis esofá­ gica tam bién puede suceder com o una propagación orofaríngea. sobre todo en los recién nacidos. Candidiasis cutánea Las infecciones de la piel suelen afectar las partes húm edas e intertriginosas, com o las zonas interdigitales de las m anos y los pies, debajo de las mamas, las axilas y los pliegues de la ingle. La infección de las uñas se conoce com o onicomicosis, o paroniquia si están afectados los pliegues de la piel que encie­ rran las uñas. La derm atitis del pañal de los recién nacidos tam bién es una m anifestación frecuente. La candidiasis m ucocutánea crónica es una infección oportunista de la piel y las mucosas, asociada con varios trastornos genéticos que afectan la función de los leucocitos o del sistem a endocrino. La displasia tímica, con hipogam m aglobulinem ia o sin ella, el hipoparatiroidism o y la enfermedad granulomatosa crónica, esta últim a que abarca la deficiencia de mieloperoxidasa de los fagotitos e impide la m uerte de las levaduras después de la fagocitosis, figuran entre las enfermedades predisponentes presentadas por Rippon . 234 Candidiasis disem inada L a candidiasis sistém ica es una enfermedad relativam ente rara, que suele suceder com o un episodio term inal en los pacientes con neoplasias debilitantes (crisis blásticas de leucem ias y linfomas. por ejemplo), enfermedades inm unosupresoras y luego del trasplante de órganos, en especial durante el síndrome de rechazo agudo. A bi-Said 1 realizó una revisión de las enfermedades de base para la disem inación hem ática de la candidiasis. A continuación se describen los órganos en los cuales puede producirse la siembra tras la diseminación de las especies de Candida a partir de los sitios primarios de infección m ucocu­ tánea. Candidiasis del aparato urinario Esta presentación es relativamente rara y se manifiesta com o cistitis, causada con mayor frecuencia por Torulopsis (Candida) glabrata y pielonefritis, ya sea por vía ascendente a partir de la infección vesical o por diseminación hem ática desde un sitio primario distante de infección. Pueden verse agregados de seudohifas y blastoconidios en la histología de los glom érulos, probablem ente en un m ícroam biente que favorece el crecim iento debido a la disminución del pH por el intercam bio de iones de N a+ e H+. En la actualidad, Candida ( Torulopsis) glabrata es el segundo o tercer agente causal de infecciones superfi­ ciales (bucal, esofágica, vaginal o urinaria) o sistémicas candidiásicas. com o lo indican Fidel y cois . 81 La emergencia de C, glabrata com o patógeno intrahospitalario puede relacionarse con su resistencia a los azoles que se han usado de m anera eficaz en el tratamiento de otras infecciones por levaduras. Zm ierczak y co is . 3* 7 inform an un caso de artritis crónica y recurrente por C. glabrata que afectó en un com ienzo el tobillo derecho. Un año después del tra­ tam iento exitoso, la infección recidivó en la rodilla izquierda; se consideró que esto representaba la diseminación hemática. Endocarditis E sta infección se ve más a m enudo en personas con valvulopatías preexistentes, en especial tras episodios de septicemia asociados con el uso de catéteres perm anentes, infusiones intravenosas prolongadas y abuso de drogas intravenosas. Hogevik y A lestigt 122 presentaron siete casos de endocarditis en el oeste de Suecia. E n cuatro casos las infecciones se asociaron con la colocación de prótesis valvulares; en tres casos estaban afectadas las válvulas propias. D ebido a la alta mortalidad, los autores hacen hincapié en la necesidad del diagnóstico temprano, el tratamiento antim icótico inmediato y la cirugía de urgencia si la ecografía revela una falta de respuesta. La septicem ia por Candida también puede observarse en los pacientes que reciben antibióticos y corticosteroides por períodos muy prolongados. Aunque la m ayoría de las cepas de C. albicans pueden aislarse en los cultivos de sangre realizados én los fras­ cos para hem ocultivos com erciales, M arcelis y cois . 173 inform aron que los m edios de cultivo que contienen resina (específicam ente, en su estudio utilizaron BACTEC PLUS que tiene un alto contenido en resina) puede reforzar la recuperación, en especial en pacientes que reciben antibióticos. M en ingitis por Candida E sta enfermedad rara es secundaria a la diseminación a partir de los sitios de infección en los aparatos gastrointestinal o respiratorio, émbolos sépticos libera­ dos de las válvulas cardíacas infectadas, traumatism o o com o com plicación de la neurocirugía. En una revisión retrospectiva de 21 casos de especies de Candida aisladas en el líquido cefalorraquídeo luego de una neurocirugía, G eers y Gordon 91 encontraron que el 8 6 % de estos pacientes tenían válvulas cere­ broespinales perm anentes (desviaciones). Gelfand y co is . 9 2 inform aron casos de sobreinfección tras meningitis bacteriana aguda en adultos que sufrieron trau­ m atism o del sistema nervioso central o intervención quirúrgica. Estos autores aconsejan que en todo paciente con meningitis bacteriana que no mejora con tratam iento antim icrobiano debe investigarse la sobreinfección por Candida, en especial en los casos en que hay colocados catéteres permanentes.

1172

C A P ÍT U L O 21

Micología

R E C U A D R O D E C O R R E L A C IÓ N C L ÍN IC A 21-12

In fe c cio n e s p o r e s p e c ie s d e Candida no albicans

Las especies de Candida distintas de C. albicans suelen considerarse flora norm al de la piel y las superficies m ucocutáneas y sólo raras veces se atribuyen com o agentes infecciosos. En una revisión de 1 591 casos de infecciones por Candida publicados en 37 informes entre 1952 y 1992 W ingard 299 encontró que las especies de Candida no albicans eran los agentes causales en el 46% de las infecciones sistémicas. Candida tropicalis produjo el 25% de las infec­ ciones, C. glabrata el 8 %. C. parapsilosis el 7% y C. krusei el 4% . De estos informes, los pacientes con leucem ia serían infectados con más probabilidad por C. albicans o C. tropicalis; los receptores de trasplante de m édula ósea lo serían por C. krusei o C. lusitaniae. En un estudio similar, más reciente. W right y W enzel311’ determinaron que Candida albicans se aisló en el 58% de las infecciones intrahospitalarias. C. tropicalis en el 25% , C. parapsilosis en el 15%, C. glabrata en el 6 % y C. lusitaniae en el 2%. C. tropicalis y C. krusei se aislaron con mayor frecuencia en los pacientes con neutropenia secundaria a linfoma o leucemia, C. parapsilosis en recién nacidos que reciben líquidos para la hiperalimentación y C. gla­ brata en el posquirúrgico de pacientes tras la extirpación de tum ores sólidos. Estas especies no albicans también se encuentran cada vez con mayor fre­ cuencia com o agentes de otras infecciones, lo que determina que sea importante su identificación exacta en el laboratorio clínico .47 En una revisión extensa de levaduras patógenas nuevas y em ergentes. Hazen relacionó 30 levaduras em ergentes con 168 referencias . 117 Aunque entre las especies de C. no albicans, C. parapsilosis, C. glabrata (en especial aisladas en cultivos de sangre), C. krusei. C. guilliermondii. C. lipolytica y C. kefyr (C. pseudotropicalis) estaban en aumento. Hazen también menciona la em ergencia y el aumento significativo en la incidencia de Malassezia, Rhodotorula. Hansenula y especies de Trichosporon aisladas en materiales clínicos, con varias citas a inform es de casos específicos de infecciones causadas por estos agentes. Se han propuesto varias causas para la em ergencia súbita de especies de levaduras como agentes de infecciones invasoras, com o el uso de antibióticos del amplio espectro y de agentes antineoplásicos, la administración amplia de vancomicina, el cateterism o intravenoso y el aum ento de pacientes con neu­ tropenia e inmunosupresión. El uso tan difundido de fluconazol puede ser la causa de la disminución relativa en el aislamiento de Candida albicans en cul­ tivos de sangre en relación con otras especies de Candida. Candida lusitaniae en particular, muchas de cuyas cepas son resistentes a los fármacos antim icó­ ticos utilizados para tratar las infecciones por Candida albicans. ha surgido com o un patógeno oportunista im portante . 23 La contam inación indirecta a través del personal del hospital también puede explicar los aumentos en las infecciones por levaduras en ciertos ambientes. Por ejem plo, un estudio reciente de personal del hospital realizado por Strausbaugh y cois . 265 reveló que el 70% del personal de enfermería y de otras sec­ ciones era portador de levaduras en las manos, con las especies de Rhodotorula y C. parapsilosis com o las aisladas con mayor frecuencia. En este aspecto, los recién nacidos que tienen una relación estrecha con el personal de enfermería dedicado a su cuidado representan otra población que es susceptible a la candidiasis . 139 Para una revisión más com pleta de la patología clínica de C. parapsilosis véase el trabajo de Weems . 284

explican la invasión y la destrucción de las células observadas en los sitios de infección. Puede sospecharse Cryptococcus neoformans si las colonias de levaduras producen el típico aspecto mucoide. Sin embargo, cabe mencionar que no todas las cepas pueden producir cápsu­ las. Las cepas no encapsuladas a menudo desencadenan una reacción granulomatosa más pronunciada, como se observa en los cortes de tejidos, en contraste con la necrosis de licuefac­ ción que se asocia más a menudo con la invasión por cepas no encapsuladas. El crecimiento se observa dentro de las 36 a 72 horas en agar sangre de carnero al 5% y en la mayoría de los otros medios de aislamiento primario (lámina en color 21-6).

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En la microscopia, la identificación de las especies de Cryptococcus puede hacerse mediante la demostración de le­ vaduras esféricas de tamaño irregular (4-10 |im ), rodeadas por una cápsula espesa de polisacáridos (las células pueden alcanzar los 20 (im o más de diámetro si se incluye la cápsu­ la en la medición). En las preparaciones de agar harina de maíz, no se forman seudohifas; las levaduras esféricas de ta­ maño irregular están separadas de las otras por espacios pro­ ducidos por el material capsular (fig. 21-91). Las células encapsuladas, a menudo con un solo brote adherido por una hebra muy delgada, también pueden observarse en las prepa­ raciones con tinta china (fig. 21-92). Debido a su falta de sen-

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bf i_ . F i g u r a 2 1 -8 9 M icrofotografía de Geotrichum candidum, que muestra artro­ conidios, algunos de los cuales presentan la extensión característica, sim ilar al tubo germinal, desde uno de los ángulos, simulando un “palo de joquey” .

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F i g u r a 2 1 - 9 0 M icrofotografía de Trichosporon beigelii, que muestra artro­ conidios. uno de los cuales presenta los blastoconidios con brotes característi­ cos desde dos ángulos, sim ulando “orejas de conejo” .

Id e n tific a c ió n p o r el la b o ra to rio d e las le v a d u ra s

R E C U A D R O DE CO R R E LA C IÓ N CLÍNICA 21-13

1173

Levaduras productoras de a rtrocon id ios

Tricosporonosis

Trichosporon beigelii. una de las especie formadoras de artroconidios encontradas con mayor frecuencia en los laboratorios clínicos, clásicam ente causa la piedra blanca. El ser hum ano puede ser portador de este hongo en la piel, en especial alrededor del ano. La piedra blanca es una infección que afecta el pelo del cuero cabelludo o del cuerpo, o el vello pubiano y se presenta como nodulos pequeños y circunscriptos o concreciones en el tallo piloso. Cada nodulo contiene hifas retorcidas que pueden observarse con facilidad en las preparaciones directas con KOH a partir de las cuales puede aislarse el microor­ ganismo. A m enudo la infección puede erradicarse con el simple afeitado; sólo en raras ocasiones se necesitan azoles, tópicos o sistém icos, para erradicarla. La enfermedad diseminada, con más probabilidad de origen endógeno y que representa la propagación desde localizaciones de colonización cutánea o gastrointestinal, puede manifestarse en personas inm unodeprimidas y en algunos casos es m ortal . 76 Hoy y cois . 124 realizaron la revisión de 19 casos de infecciones diseminadas por T. beigelii en pacientes con diversas enfermedades neoplásicas tratados en el M. D. Anderson Hospital en Houston en un perío­ do de 10 años. La manifestación clínica más común entre este grupo de pacientes fue la enfermedad febril o la neum onía inespecífica. Las tres cuartas par­ tes de estos pacientes fallecieron; respecto de la discusión en otra parte, el diagnóstico no se sospechó hasta la muerte en el 25% de los casos en que se practicó la necropsia. Otras especies de Trichosporon pueden causar infección invasora. en especial en los pacientes con procesos hem áticos m alignos . 135 La publicación de Sweet y Reed 2 6 9 indica que los neonatos no son inmunes a la enfermedad diseminada. Yoss y cois . 305 hallaron que los recién nacidos con bajo peso presentan una susceptibilidad particular, una situación de gran preocupación porque la mayoría de los casos han sido mortales. Lamentablemente, muchas veces el diagnóstico se retrasa porque no se reconoce la enfermedad o el m icroorganism o no se identifica con rapidez en el labo­ ratorio. Es im portante que los m icrobiólogos reconozcan los artroconidios característicos en las preparaciones del agar harina de m aíz com o indicio inicial para la identificación y realicen las pruebas confirm atorias adecuadas. Trichosporon beigelii es un productor rápido de ureasa y de actividad sacarolítica con la formación de ácido a partir de la mayoría de los hidratos de car­ bono. Como advertencia, Trichosporon beigelii com parte determinantes antigénicos con Cryptococcus neoformans ; por consiguiente, el suero y el líquido cefalorraquídeo de los pacientes con enfermedad disem inada pueden dar un resultado falso positivo en la prueba de aglutinación del látex para el criptococo. Geotricosis Las infecciones disem inadas por especies de Geotrichum suelen encontrarse con menor frecuencia. Se han informado casos aislados.de este tipo de infec­ ción disem inada por Geotrichum candidum, dos en pacientes con leucemia aguda . 247 Uno de estos pacientes evolucionó a la insuficiencia renal 3 días antes de la muerte. Los glom érulos estaban bloqueados con segmentos de hifas del hongo. El caso más reciente, informado por André y cois . 14 fue el de una muchacha joven a quien se estaba tratando por hepatoblastoma. Después de las com plicaciones por infecciones bacterianas secundarias, la paciente sobrevi­ vió tras un ciclo de 5 semanas con anfotericina B por vía intravenosa seguido de 6 meses de itraconazol por vía oral. Aunque no se han establecido regíme­ nes terapéuticos en pacientes con infección disem inada por Geotrichum, se recom ienda el uso de dosis altas de itraconazol y anfotericina B liposóm ica . 247 Si bien se han inform ado casos de neum onitis secundaria por especies de Geotrichum, su aislamiento en las secreciones respiratorias suele representar contam inación o com ensalism o y deben descartarse otras causas. G. candidum asim ila sólo la glucosa, la galactosa y la xilosa que, salvo la utilización de esta última, es un patrón sim ilar al de T. capitatus. La m ayoría de las cepas de Geotrichum no producen ureasa.

sibilidad, el procedim iento con tinta china se está realizando con menor frecuencia en las muestras de líquido cefalorra­ quídeo remitidas a los laboratorios clínicos donde se utilizan pruebas más sensibles para la detección del antígeno criptococócico.

Un aislamiento en el que se sospecha C. neoformans puede confirmarse mediante la demostración de la producción de ácido cafeico o a través de la producción de un pigmento cas­ taño rojizo, ya sea en el medio agar semillas de niger (lámina en color 21-6D) o en forma directa mediante la inoculación de

Figura 21-91 M icrofotografía de una preparación de agar harina de maíz de Cryptococcus neoformans, que ilustra levaduras esféricas, de tam año irregular.

Figura 21-92 M icrofotografía de una preparación con tinta china, quem uestra levaduras de tam año irregular, encapsuladas y esféricas de Cryptococcus

separadas por material polisacárido.

neoformans.

1174

CAPÍTULO 21 Micología

una tira de papel de filtro impregnada con reactivo en una por­ ción de la colonia desconocida y la observación de la aparición de un pigmento negro. Aunque en los seres humanos pueden aislarse otras espe­ cies de Cryptococcus, su papel como agentes causales de infección es poco habitual. Las presentaciones clínicas de estos casos varían desde lesiones cutáneas hasta fungemia. La mayoría de los casos de fungemia producidos por las especies no neoformans se adquieren en el ámbito hospitalario, por lo general en pacientes con neutropenia asociada con catéteres intravasculares perm anentes.131 Estos autores también infor­ man dos casos de fungemia causados por Cryptococcus laurentii y advierten que casi todos los aislam ientos de Cryptococcus no neoformans son más resistentes al fluconazol y a la flucitosina que la mayoría de los de C. neoformans, por lo que en los casos clínicamente importantes se requiere una identificación de especie.

DIAGNÓSTICO MEDIANTE TÉCNICAS SIN CULTIVO

Los ensayos para la detección de antígeno en las muestras de líquido cefalorraquídeo son los más utilizados para establecer el diagnóstico de meningitis criptococócica y han reemplazado a la técnica consagrada de la tinta china, que es menos sensi­ ble. El material capsular actúa como reactivo, lo que produce la reacción de aglutinación con los reactivos utilizados en estas pruebas.85 La prueba de aglutinación del látex disponible en la actualidad por varios fabricantes es confiable, fácil de realizar y lo suficientemente sensible y específica para ser llevada a cabo ampliamente en la mayoría de los laboratorios de micolo­ gía clínica. No se requiere equipo especial y el procedimiento es fácil de dominar. Las reacciones falsas positivas pueden reducirse si se hierve el líquido antes de realizar la prueba o mediante el tratamiento previo con pronasa para destruir las proteínas extrañas que pueden unirse o bloquear el acopla­ miento antígeno-anticuerpo. Los desinfectantes y los jabones contaminantes también pueden causar reacciones falsas positi­ vas.22 El líquido de sinéresis proveniente de las placas de agar puede contaminar las agujas de inoculación durante la toma de muestra de la colonia, lo que puede determinar resultados fal­ sos positivos. Estas reacciones falsas positivas pueden detec­ tarse mediante el empleo de partículas de látex de control recu­ biertas con globulinas normales. Información clínica adicional sobre criptococosis se presen­ ta en el recuadro de correlación clínica 21-14. Otras levaduras de importancia médica que no forman hifas

CANDIDA (TORULOPSIS) GLABRATA Candida glabrata es el nombre aceptado en la actualidad para este microorganismo. Es agente de infecciones urinarias y comprende alrededor del 20% de todas las levadura aisladas en muestras de orina.88 Se han informado casos de endocarditis36 y de infección diseminada119 causados por C. glabrata. Este hongo asimila la glucosa y la trehalosa, un patrón de asimila­ ción que es útil para la identificación en el laboratorio. Las colonias de C. glabrata crecen con más lentitud que otras levaduras y a menudo requieren 48 a 72 horas para visualizarse. Por lo tanto, si se aísla una levadura de creci­ miento lento en el agar sangre de una muestra clínica (en especial de la orina), que forma colonias pequeñas, enteras, convexas, brillantes y lisas (lámina en color 21-6E) y que en la m icroscopia aparece como células de 2 a 3 um de diáme­ tro, con un brote único, de tamaño regular, sin la formación de seudohifas, debe considerarse Candida (Torulopsis) gla­

brata. En las preparaciones de agar harina de maíz, las célu­ las de C. glabrata se disponen en racimos relativamente fir­ mes, sin la separación observada con las especies de Crypto­ coccus (fig. 21-93).

ESPECIES DE RH0D0T0RULA

Las especies de Rhodotorula son contaminantes transporta­ dos por el aire que pueden convertirse en comensales de la piel o pueden aislarse en orina y heces. El aislamiento de las secre­ ciones respiratorias suele tener poca importancia. En el pasado las infecciones eran raras; sin embargo, en la actualidad Rhodotorula rubra se menciona entre los agentes “emergentes” de infección. La fungemia se asocia con mayor frecuencia con los catéteres colonizados o las soluciones intravenosas conta­ minadas.43140 Especies de Rhodotorula se han aislado en corti­ nas de duchas, juntas de bañeras y cepillos de dientes. Otras infecciones poco habituales causadas por este microorganismo son septicemia relacionada con sondas permanentes: meningi­ tis y peritonitis en pacientes que reciben diálisis peritoneal con­ tinua. La observación de colonias levaduriformes con una red o pigmentación rojo anaranjada (lámina en color 21-6F) con más probabilidad corresponde a especies de Rhodotorula. La mor­ fología microscópica no es diagnóstica. No se forman seudohi­ fas; en cambio se observan células ovaladas con brotes que se disponen en racimos irregulares y laxos. Casi todas las cepas son productoras rápidas de ureasa.

ESPECIES DE SACCHAROmCES

Las colonias, que aparecen en el transcurso de 36 a 48 horas, son blanco grisáceas y pastosas con pliegues irregulares. El aspecto es inespecífico y puede ser necesario realizar estudios de asimilación de hidratos de carbono para confirmar la identi­ ficación. Los resultados negativos en la asimilación de la celo­ biosa y la xilosa son útiles para la diferenciación de las espe­ cies de Saccharomyces de otras especies bioquímicamente relacionadas. La morfología microscópica tampoco es específica. Se observan racimos laxos de levadura grandes, ovales, con brotes en las preparaciones de agar harina de maíz. Cuando las colo­ nias crecen en agar para ascosporas deficiente desde el punto de vista nutricional (contiene acetato de potasio, extracto de levadura, glucosa, agua y agua destilada), la identificación puede confirmarse mediante la observación de las ascosporas. Después de la incubación durante 7-10 días de una placa ino­ culada, puede hacerse el frotis de una de las colonias aisladas y teñirlo para ácido-alcohol resistencia. Con esta técnica se observan ascosporas que aparecen como células grandes, de paredes gruesas y esféricas, con un pigmento rojo característi­ co (lámina en color 21-6H). Saccharomyces cerevisiae, la levadura común “de cerveza” o “de panadería”, suele colonizar las mucosas de los seres huma­ nos, pero por lo general no se la considera patógena. En la lite­ ratura antigua se han publicado casos ocasionales de fungemia en pacientes inmunosuprimidos.44'77'194,272 Oliver y cois.202 des­ cribieron tres casos de receptores de trasplante de médula ósea en una unidad de hematología en quienes se produjo infección invasora por S. cerevisiae. Dos de los pacientes fallecieron. La genotipificación de las cepas invasoras y portadoras demostró una cepa indistinguible de la de los pacientes que habían esta­ do al mismo tiempo en la unidad, lo que sugiere una infección cruzada.

Id e n tific a c ió n p o r el la b o ra to rio d e las le v a d u ra s

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N CLÍNICA 21-14

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C rip to c o c o sis

Las siguientes son las diversas m anifestaciones clínicas de la criptococosis. En la actualidad se la considera una enfermedad que define al SIDA y deben realizarse pruebas para HIV siempre que se aísla C. neoformans en muestras clínicas o cuando las pruebas de detección de antígeno sean positivas. No obs­ tante, y com o se indica a continuación, se han detectado casos recientes de criptococosis en huéspedes inmunocom petentes. Aunque no habitual, especies de Cryptococcus no neoformans también pueden ser agentes de fungem ia y de enfermedad disem inada,131 Sistem a nervioso central La enfermedad del sistema nervioso central puede aparecer sin evidencia de enfermedad en otra localización. El com ienzo de los síntomas puede ser insi­ dioso. con cefaleas leves, fallas de la mem oria o cam bios de la personalidad com o únicos indicios. También puede haber fiebre de baja intensidad. A m edi­ da que la enfermedad progresa se m anifiestan lentamente signos y síntomas sugestivos de meningitis, es decir, rigidez de nuca, dolor de cuello y pruebas positivas ante la flexión de la rodilla y de la pierna (signos de Brudzinki y de Kemig). En los casos de granulom as criptococócicos localizados, pueden evi­ denciarse signos y síntomas com o parálisis, hem iparesia y convulsiones jacksonianas. La visión borrosa, la diplopía, la oftalmoplejía, los trastornos del habla, la visión doble y la inestabilidad de la marcha suelen ser m anifestaciones de una lesión que se expande (criptococoma). El edem a de papila suele ser el signo de aum ento de la presión intracraneal. A m edida que la enfermedad progresa pueden experim entarse pérdida de peso, m alestar general, persistencia de la fiebre, náuseas, vóm itos y vértigos. En los casos progresivos fulminantes o mortales las alteraciones m entales pueden ser m ás m arcadas (agitación, irritabilidad, confusión, alucinaciones, psicosis), que evolucionan en delirio, com a y, por último, la muerte. El exam en del líquido cefalorraquídeo puede revelar un aum ento de los linfocitos, concentraciones bajas de glucosa y elevadas de proteínas. La criptococosis del SNC de com ienzo espontáneo es una enfermedad que define el SIDA. Criptococosis pulm onar Puede observarse neum onía localizada o generalizada. U n caso recién publicado por Sweeney y cois.-'’8 indica que la criptococosis pulm onar puede afectar a huéspedes inm unocom petentes. Estos autores informan el caso de un niño de 10 años con histiocitom a fibroso m aligno de hueso y nodulo pulm onar secundario a la infección por C. neoformans. El diagnóstico del paciente se sugirió por la aparición de una lesión pulm onar en un estudio de tom ografía computarizada. En una revisión de 13 casos, 6 fueron asintom áticos. La enfermedad criptococócica pulm onar a menudo se reconoce com o resultado de estudios por imágenes realizados por otras razones. Zhu y cois.3"6 también com unicaron cuatro casos de criptococosis pulm onar en pacientes no infectados por HIV. asociados con m eningitis criptococócica. De nuevo, ninguno de los cuatro pacientes tenía síntomas evidentes de enfermedad pulmonar. Lee y cois.155citan la tinción de Riu (utilizada para demostrar flagelos bacterianos) com o un modo excelente para dem ostrar los microorganism os en frotis prepa­ rados de cepillados broncoscópicos o aspirados con aguja en casos en que el diagnóstico no puede hacerse debido a la falta de signos o síntomas primarios, o hallazgos radiográficos. Kerking y cois.137 explicaron la evolución natural, la presentación clínica, el diagnóstico y el tratam iento de la criptococosis pulm onar prim aria en una rev isión de 41 pacientes. Pudieron establecer el diagnóstico cuando la radiografía de tórax anormal se asociaba con el aislamiento de C. neoformans de las secreciones respiratorias, la observación de m icroorganismos de aspecto típico que aparecen com o mucicarmín positivos o ambos, en cortes de tejido pul­ monar. La m ayoría de los pacientes en su serie tenían enfermedades subyacentes que predisponen a la infección criptococócica: tratam iento inmunosupresor (28 de 41), diabetes m ellitus (20 de 41), procesos m alignos hem áticos o neoplasias linforreticulares (12 de 41), trasplante renal reciente (10 de 41) y enfermedades del tejido conectivo por hepatitis crónica activa (5 de 41). Siete de los pacientes no presentaron ninguna alteración de base detectable. Predominaron los síntomas generales; la fiebre y el malestar se observaron en m ás de la mitad de los pacientes. El dolor torácico, la disnea, la pérdida de peso y los sudores nocturnos en com binaciones variables se observaron en un cuarto a un tercio de los pacientes. Sólo siete de los pacientes refirieron tos. Siete pacientes fueron asintom áticos y se estudiaron sólo por radiografías anorm ales. Las alteraciones en la radiografías de tórax incluían lesiones en masa circunscriptas, infiltrado alveolar o intersticial, abscesos con niveles hidroaéreos o lesiones cavitarias (7 de 41). lesiones solitarias en moneda y opacidades redondeadas pequeñas y múltiples. Criptococosis cutánea La infección criptococócica primaria de la piel es rara; la enfermedad cutánea suele ser una m anifestación de infección sistém ica.106 Murakawa y cois.186 encontraron en su institución que el 5,9% de los pacientes tratados por infección criptococócica y SIDA también presentaban lesiones cutáneas. Los autores describen una variedad de lesiones: pápulas um bilicadas, nodulos y placas violáceas, que a veces se asemejan a las del molusco contagioso o en otros casos recuerdan más al sarcom a de Kaposi. Las lesiones se observaron con mayor frecuencia en la cabeza y el cuello. Pem a y cois.213 com pararon las m anifesta­ ciones clínicas de la criptococosis en las eras anterior y posterior al SIDA. Hamann y cois.112 describieron un caso de celulitis criptococócica prim aria del brazo derecho en un hom bre australiano de 75 años. El agente etiológico era C. neoformans var. gattii, un hongo que es endém ico en Australia y puede cau­ sar infecciones en los seres hum anos inmunocom petentes. Criptococosis disem inada Com o las cepas de C. neoformans que producen material capsular pueden resistir a la fagocitosis por los neutrófilos segmentados o pueden sobrevivir en el citoplasm a de los fagocitos mononucleares, estos m icroorganism os pueden distribuirse am pliam ente en el huésped humano. En los casos disem inados, pue­ den verse afectadas casi todas las visceras u órganos. Com o se m encionó, la m ayoría de las lesiones criptococócicas cutáneas representan la enfermedad diseminada. Aun cuando un episodio inicial de m eningitis se cura, los síntomas pueden repetirse por la reinfección desde un sitio remoto. M inamoto y Rosenberg183 inform aron que la prostatitis criptococócica persiste después del tratam iento en apariencia exitoso en el 29% de los varones con enfermedad disem inada y sirve com o reservorio para la recurrencia de la m eningitis. L iu161 seleccionó de la literatura 40 casos de osteomielitis cripto­ cocócica que en el 75% de los casos se limitaba a un solo hueso. Las vértebras representaron el sitio m ás afectado. En estos casos, la sarcoidosis, la tuber­ culosis y la corticoterapia previa fueron las principales causas predisponentes de la criptococosis. La miositis criptococócica sólo se inform a en raras oca­ siones, en su mayoría en pacientes con infección por HIV. O 'N eill y cois.203 inform aron un caso raro de m iositis criptococócica no relacionada con SIDA en un receptor de trasplante cardíaco som etido a tratam iento inmunosupresor. La enfermedad hepática primaria puede predisponer a la peritonitis criptococóci­ ca, aunque es un hecho raro.263 Las infecciones criptococócicas urinarias también son infrecuentes.261 Los riñones, en particular los glom érulos, a m enudo albergan grandes cantidades de microorganism os (siem pre que haya un pH ligeramente ácido debido al intercam bio de Na* e H~). Cuando se aísla C. neoformans en las vías urinarias, debe realizarse una búsqueda de la enfermedad diseminada. En los casos de meningitis con cultivos negativos, por ejemplo, el diagnóstico de criptococosis puede hacerse m ediante el aislamiento de los m icroorganism os en la orina.

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CAPÍTULO 21 Micología

de la iniciación del tratamiento antimicrobiano con teicoplani­ na. El recién nacido se curó después de 10 días de tratamiento con antimicóticos. Kalenic y cois. 134 informaron un brote reciente de infección por Hansenula anómala en ocho pacien­ tes adultos tratados en una unidad quirúrgica de cuidados inten­ sivos. No se identificó la fuente de las infecciones ni la vía de transmisión.

Figura 21-93 M icrofotografía de una preparación a partir del agar harina de m aíz de Candida glabrata, que ilustra racim os com pactos de levadura dim i­ nutas, uniform es, no separados por material capsular.

HANSENULA ANOMALA A pesar de aislarse raras veces en los laboratorios clínicos, Hansenula anómala se incluye aquí porque, además de las especies de Saccharomyces, produce ascosporas ácido-alcohol resistentes cuando se observan en un frotis con la tinción espe­ cífica para demostrar esta propiedad. Las ascosporas de Hansenula difieren de las de Saccharomyces porque son apla­ nadas en uno de los lados en lugar de esféricas, con un margen externo o labio bien diferenciado en la base plana, simulando un sombrero de policía inglés (fig. 21-94). Se han informado infecciones aisladas en pacientes inmunosuprimidos, asociadas por lo general con los catéteres permanentes. Murphy y Buchanan188 informaron 52 recién nacidos colonizados por Hansenula anómala, algunos de los cuales tenían evidencia de infección sistémica. M a y cois.169 comunicaron un caso de un recién nacido prematuro con osteomielitis estafilocócica al que se le determinó fungemia por Hansenula anómala justo antes

Figura 21-94 M icrofotografía de una preparación con tinción para ácidoalcohol resistencia, que rev ela levaduras ácido-alcohol resistentes de Hansenula anómala, con la form a característica de som brero de policía inglés, com pleto con ala (flechas).

MALASSEZIA FURFUR El aislamiento en cultivo puede ser difícil porque el micro­ organismo requiere ácidos grasos para el crecimiento. Cuando se prevé su aislamiento sobre la base de la historia clínica, deben agregarse algunas gotas de aceite de oliva virgen a la superficie de la placa de agar sangre de camero inmediatamen­ te después de la siembra. En algunos laboratorios de micología, es de práctica habitual recubrir las placas de agar preparadas de todos los cultivos de sangre provenientes de salas de cuidados intensivos neonatales porque estos recién nacidos reciben nutrición parenteral total y tienen un riesgo alto de presentar septicemia por Malassezia?* Los microorganismos crecen bien como colonias levaduriformes pequeñas debajo de las gotas de aceite (lámina en color 21-6G). En la microscopia se observan levaduras pequeñas con brotes, aisladas o en racimos laxos. Las hifas observadas en las preparaciones en fresco directas con KOH de los raspados de piel no se observan en las prepa­ raciones provenientes de los cultivos de levaduras. Malassezia fúrfur, una levadura lipofílica que es comensal habitual de la piel, es la causa de una infección cutánea super­ ficial en personas con higiene deficiente, conocida como tiña (pitiriasis) versicolor. Se presenta como lesiones cutáneas descamativas, sobre todo del tórax y la espalda, que a veces se extiende al cuello, la cara y los brazos. Las lesiones son planas, de contorno irregular y pueden tener pigmentación castaña, que a menudo aparecen como manchas blancas que cambian de color, en especial en la piel expuesta a la luz del sol. Los ele­ mentos micóticos en estas lesiones producen fluorescencia rojo ladrillo cuando se los examina con una longitud de onda larga con luz ultravioleta (lámpara de Wood). El examen directo de los raspados de piel revela hifas y células de 3-5 |am de diáme­ tro que emiten brotes (familiarmente conocidos como “espa­ gueti y albóndiga”), con la formación de un collar característi­ co en el borde entre la célula madre y la célula hija. También se han informado infecciones sistémicas y septice­ mia, la mayoría asociada con catéteres vasculares profundos, en especial en pacientes que reciben hiperalimentación a largo plazo. El informe de casos de Rosales y cois.237 de meningitis por Malassezia fúrfur en recién nacidos de muy bajo peso que reciben nutrición parenteral total e infusión líquida lipídica en el espacio subaracnoideo a través de una guía periférica por el cuero cabelludo indica que esta fuente de fungemia no ha sido eliminada. Muchas de las emulsiones para la hiperalimentación tienen alto contenido de ácidos grasos de cadena larga. Se esta­ blece un microambiente ideal en el sitio del catéter donde puede agruparse una cantidad pequeña de emulsión con alto contenido en aceite, que favorece el crecimiento de microorga­ nismos lipofílicos endógenos presentes en la superficie cutá­ nea. El catéter proporciona una interrupción de la barrera en la piel a través de la cual pueden ingresar en el torrente circulato­ rio los microorganismos proliferantes. Identificación por el laboratorio de las “levaduras negras”

AUREOBASIDIUM PULLULANS Las especies de Aureobasidium crecen como colonias lisas y húmedas que aparecen como “levaduras negras” . En la mi-

Id e n tific a c ió n p o r el la b o ra to rio d e las le v a d u ra s

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Figura 21-95 Microfotografía y esquema del aspecto microscópico de Aureobasidium pullulans, que muestran cadenas de células grandes, similares a artroconi­ dios, teñidos de oscuro con conidios pequeños y hialinos en el fondo.

croscopia, las hifas dematiáceas oscuras se engrasan a medida que la colonia madura y aparecen como artroconidios. Desde los brotes se forman grandes cantidades de conidios unicelula­ res, hialinos, pequeños y elípticos a partir de los centros de los segmentos de las hifas individuales (fig. 21-95). Se han infor­ mado casos ocasionales de feohifomicosis cutánea secundaria a Aureobasidium pullulans en seres humanos.239 Los informes de casos más recientes incluyen el caso raro comunicado por Bolignano y Criseo27 de infección micótica intrahospitalaria diseminada debido a Aureobasidium pullulans var. melanigenum en un paciente con traumatismo grave y el comunicado por Gupta y Elewski102 en un paciente de 50 años con una úlce­ ra de córnea infectada. A los 5 días posteriores a la cirugía pre­ sentó escleritis que revirtió tras el tratamiento antimicótico, el desbridamiento quirúrgico y la crioterapia.

PHAEOANNELLOMYCES WERNECKII El género “Phaeoannellomyces” fue creado en 1985 por McGinnis y cois.177para ubicar a esas levaduras negras que se

caracterizan por la formación de células que funcionan como anélidos” (phaeo = oscuro; annello = anélidos; myces = hongo). Phaeoannellomyces werneckii (Exophiala werneckii) produ­ ce levaduras bicelulares. La célula hija se forma a partir de una extensión de la célula madre que luego se acorta para formar una cicatriz (anélido), que da el aspecto de tabique con tinción oscura que separa las dos células (fig. 21-96). Esta formación del anélido exige la inclusión en el nuevo género Phaeoanne­ llomyces, según el esquema de McGinnis. Engleberg y cois.74 informaron un caso de quiste feohifomicótico causado por Phaeoannellomyces elegans. Las levaduras en esta especie son unicelulares y pueden formar paredes oscuras gruesas y seu­ dohifas cuando maduran. Aún existen controversias acerca de si el género “Phaeoanne­ llomyces” tiene legitimidad taxonómica. Kwon-Chung y cois.153 encontraron que “las características de la colonia levaduriforme son invariablemente inestables y la colonia se convierte en micelial cuando los cultivos se mantienen en el laboratorio”. Esta autora continúa describiendo un cultivo de Phaeo­ annellomyces elegans derivado a su laboratorio que, cuando

Figura 21-96 Microfotografía y esquema de la forma de levadura de especies de Phaeoannellomyces, que revelan levaduras dobles, largas y separadas por una barra transversa que toma una tinción oscura distintiva (anélido).

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C A PÍTU LO 21

Micología

llegó, ya había asumido las características morfológicas indis­ tinguibles de Exophiala jeanselmei. Sobre la base de estas observaciones, Kwon-Chung opina en contra de crear una designación de género separado para la forma de levadura, ya que considera que son sinónimos. Quizás en respuesta a este hallazgo, la escuela de McGinnis citada antes ha sugerido el tér­ mino sin a m o rfa para designar una de las varias formas ana­ mórficas con las que puede presentarse un hongo. Sistemas comerciales para la identificación de levaduras

Varias compañías han introducido equipos comerciales para identificar levaduras (recuadro 21-8).280 El uso de estos siste­ mas requiere pericias técnicas y familiaridad suficiente con cada prueba realizada para posibilitar interpretaciones precisas. En cada caso, deben seguirse de modo minucioso las instruc­ ciones del fabricante. Cada director o supervisor de laboratorio debe evaluar factores como el costo, la disponibilidad, el ven­ cimiento y la estabilidad de los reactivos, la adaptabilidad al flujo de trabajo y las necesidades específicas de los servicios clínicos antes de tomar la decisión de implementar estos siste­ mas en su laboratorio. Pruebas de sensibilidad a los antimicóticos (antifungigrama)

Mediante un proceso con acuerdo general que se llevó a cabo en la década pasada, el Subcomité sobre Pruebas de Sensibilidad para los Antimicóticos del Clinical Laboratory Standards Institute estableció métodos estandarizados y reproducibles para la realización de las pruebas de sensibilidad de las levaduras (antifungigramas).192'219'22a230El establecimiento de estas normas de laboratorio, en especial para las levaduras, ha proporcionado valiosas pautas para el tratamiento con antimicó­ ticos que se correlacionan mejor con los resultados clínicos.93 El método de macrodilución y su modificación de microdilución sirven en la actualidad como estándares de referencia. Al con­ trario de otros sistemas elaborados para realizar los antifungigramas, estos métodos les permiten ahora a muchos laborato­ rios de microbiología clínica proporcionar esos servicios. Sewell y cois.,253 en un estudio comparativo sobre estas prue­ bas para el fluconazol, mostraron que el Epsilometer Etest® (AB Biodisk, Solna, Suecia) se correlaciona bien con los méto­ dos de referencia, con una coincidencia global del 84%, que llega al 90% para la mayoría de las especies de Candida, salvo C. tropicalis (56%). Candida (Torulopsis) glabrata también mostró valores de comparación bajos en este estudio (34%). El Etest® emplea una tira plástica que contiene un gradiente continuo definido del fármaco antimicrobiano que se coloca sobre la superficie de un placa del agar después de que se ha sembrado de modo uniforme con un inoculo que contiene una concentración estandarizada de la levadura por probar (fig. 2197). Al hidratarse, la tira plástica libera el agente antimicótico en el agar circundante y produce un aumento logarítmico en la concentración de antibiótico desde sólo 0,002 jig/mL hasta tanto como 256 (J.g/mL, de acuerdo con el antimicótico que se va a probar. Los detalles para realizar el Etest, como el medio recomendado para la prueba, la preparación del inoculo están­ dar, los pasos del procedimiento y la lectura también pueden encontrarse en la publicación de Colombo y cois.48 Este infor­ me incluye, además, los resultados del Etest para 200 aisla­ mientos de levaduras y los compara con los métodos estándares para varios fármacos individuales. Las coincidencias esenciales entre los dos métodos dentro de una ± 1 dilución fueron del 71% para el ketoconazol, el 80% para el fluconazol y el 84%

para el itraconazol. Desde la publicación de este trabajo, el uso de un medio estandarizado (R M PI1640), con lectura final a las 48 horas y otros ajustes han elevado el porcentaje de coinci­ dencia esencial lo suficiente como para establecer el Etest como un método alternativo para las pruebas de sensibilidad para los hongos de la mayoría de las especies de levaduras. Como ya se mencionó, puesto que el Etest es menos laborioso y más fácil de realizar, estas pruebas están ahora dentro del alcance de muchos laboratorios de microbiología clínica. En un estudio posterior realizado en múltiples sitios, Pfaller y cois.218 demostraron un nivel elevado de reproducibilidad del método de la concentración inhibitoria mínima (CIM) del Etest entre las cuatro instituciones participantes. Cada laboratorio que participó recibió subcultivos de dos cepas de Candida uti­ lizadas para el control de calidad de la American Type Culture Collection (ATCC) ( C. parapsilosis, ATCC 22019 y C. krusei ATCC 6258), tiras Etest y placas de agar RPMI suficientes para realizar 20 pruebas replicadas con cada uno de los cinco fár­ macos: anfotericina B, fluconazol, flucitosina, itraconazol y ketoconazol. En casi todas las combinaciones de fármaco y ce­ pas problema probadas, se observó una distribución muy firme, entre el 98% y el 100% de las CIM, dentro de un rango de tres diluciones. Las diferencias selectivas de los resultados entre el Etest y el método estándar para flucitosina y fluconazol con­ tra C. krusei se relacionaron con el crecimiento desigual entre el agar Etest enriquecido con glucosa y el caldo sin suplementar utilizado en la prueba de macrodilución en caldo de refe­ rencia. El Etest detectó una subpoblación resistente de cepas no recogida por el método de referencia. Después de analizar todos los datos, los autores concluyeron que el estudio estable­ ció un nivel de coincidencia excelente entre los laboratorios y dentro del mismo laboratorio entre los dos métodos, lo que pro­ porciona amplia documentación de la utilidad del Etest para determinar los perfiles de sensibilidad a los antimicóticos. Esta estandarización de los métodos de prueba, el establecimiento de valores críticos interpretativos para ciertas combinaciones de fármaco-levadura y la reproducibilidad de los resultados, tanto entre los laboratorios como dentro del mismo laboratorio clínico, proporcionarán la base sobre la cual pueden medirse los resultados clínicos.78 La motivación de realizar los antifungigramas en los labora­ torios clínicos va más allá de establecer los perfiles de resis­ tencia de un aislamiento dado. La aparición de resistencia a los antimicóticos se está convirtiendo en un problema de preocu­ pación cada vez mayor. Por ejemplo, con el uso más extendido del fluconazol, también aumentaron los informes de resistencia a este fármaco en especies de Candida y Cryptococcus neoformans.m Estos investigadores citan, además, el aumento en la resistencia de Candida lusitaniae y Cryptococcus neoformans a la anfotericina B, tal vez como consecuencia del uso de tra­ tamiento con un solo fármaco. Peyron y cois.216 encontraron que el Etest proporciona los medios óptimos para la discrimi­ nación entre aislamientos de C. lusitaniae resistentes a la anfo­ tericina B y aquellos que son sensibles al fármaco. Estos auto­ res encontraron que los aislamientos supuestamente resistentes tenían un valor crítico de la CIM > 0,38 |ig/mL utilizando el medio de cultivo estándar RPMI del Instituto para Estándares en el Laboratorio Clínico. Asimismo, se observó menor sensibilidad al itraconazol con­ tra aislamientos seleccionados de Aspergillus fumigatus. La resistencia a los azoles también se observa en aislamientos de Candida albicans de pacientes con SIDA, que tal vez sea la consecuencia del uso excesivo de este fármaco en el tratamien-

Identificación por el laboratorio de las levaduras

Recuadro 21-8

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E s tu d io d e s ie te s is te m a s d e id e n tific a c ió n d e le v a d u ra s

Vitek® (BioMérieux Vitek, Hazelwood, M0)

■4-

La tarjeta Vitek utilizada en este estudio comprende 30 pocilios que se inoculan con una suspensión de la levadura desconocida y se incuba a 30 °C durante 24-48 horas en la cámara de incubación provista con el sistema. Los cambios de color se leen por espectrofotometría y se informa como un código numé­ rico de nueve dígitos. La base de datos incluye 36 especies de levaduras. En este estudio, el 59,6% de los 52 aislamientos se identificaron sin pruebas adi­ cionales. Sin embargo, con el uso de la tarjeta ID-YST, que comprende 64 pocilios con 47 pruebas bioquímicas fluorescentes, junto con el sistema nuevo VITEK 2, Graf y cois, informaron que el 92.1% de 222 cepas fueron leídas de manera inequívoca, con sólo 11 aislamientos identificados con una discri­ minación baja. Sistem as API ID 32C ® y API 20C AUX® (B io M é rie u x , Lyon, Francia)

El API ID 32 C y 20C AUX contienen 32 y 20 microtubos, respectivamente. Las reacciones se leen en forma visual después de 24, 48 o 72 horas de incu­ bación a 30 °C comparando la turbidez del medio dentro de cada uno de los microtubos con la de los controles. Puede calcularse un número perfil de 10 y 7 dígitos, respectivamente. La base de datos de API ID 32 incluye 63 especies de levaduras y la de API 20C AUX, 43. En el presente estudio, los siste­ mas API ID 32C y API 20C Aux identificaron el 63.5% y el 59,6% de los 52 aislamientos sin las pruebas adicionales. Sin embargo, estas tasas relativa­ mente bajas de rendimiento se mejoran mucho, hasta el 98%, si las lecturas se realizan a las 72 horas en lugar de a las 24 horas. La dificultad principal con este sistema radica en la lectura visual de la turbidez relativa dentro de cada una de las cúpulas, lo que origina una variabilidad considerable entre los observadores. Y east S tar® (CLARC Laboratories, H eerlen , Países Bajos)

El sistema Yeast Star se basa en los efectos inhibitorios de colorantes específicos sobre el crecimiento de las levaduras. Se coloca un panel de seis coloran­ tes encima de un medio de crecimiento sólido sembrado e incubado durante 24-48 horas a 37 °C. Los resultados se registran en la forma de un código de seis dígitos. La base de datos contiene 16 especies de levaduras. En este estudio, el sistema Yeast Star identificó el 59,6% de 52 aislamientos sin necesi­ dad de pruebas adicionales. El nivel relativamente bajo de rendimiento se debió sobre todo a la falta de identificación por la pequeña base de datos de la que se dispone. Este sistema no es muy empleado. Auxacolor® (Sanofi Diagnostics Pasteur, M arnes-La-C oquette, Francia)

El sistema de identificación Auxacolor se basa en la utilización de hidratos de carbono y el crecimiento se visualiza por el cambio de color del indicador de pH. La placa de microtitulación contiene 16 pocilios y se lee después de 24-72 horas de incubación a 30 °C. Además, se incluyen otras características, como la capacidad de crecer a 37 °C. la formación de micelio o artrosporas y la presencia de cápsula. La base de datos contiene 26 especies de levaduras. En este estudio, el sistema Auxacolor identificó correctamente el 80.8% de las 52 cepas; fue el que presentó mejor rendimiento entre los sistemas analiza­ dos. En un estudio realizado por Campbell y cois., el rendimiento fue del 91,2%, con sólo 2 de 146 aislamientos que se identificaron de modo incorrecto. S istem a RaplD Yeast Plus® (Innovative Diagnostics S ystem s, Norcross, GA)

El sistema RaplD Yeast Plus se basa en la utilización de hidratos de carbono como sustrato, la hidrólisis de ácidos grasos y urea, y la hidrólisis enzimática de sustratos glucósido y arilamida. Un panel de 18 cavidades se incuba durante 4 horas a 30 °C y se lee después del agregado de reactivos específicos. A partir de los resultados obtenidos se crea un código de seis dígitos y se lo compara con los de una base de datos que incluye 43 especies de levaduras. En el presente estudio se identificó el 76,9% de 52 cepas sin pruebas adicionales. Espinel-Ingroff y cois, informaron un rendimiento del 79,1% en la identifi­ cación de especies emergentes de Candida; sin embargo, el rendimiento fue del 94,2% en la identificación de las especies que se encuentran con más fre­ cuencia en los laboratorios clínicos. API C andida® (B ioM érieux, Lyon, Francia)

El sistema API Candida consiste en 10 tubos que contienen sustratos deshidratados y se basa en la acidificación de los azúcares o en reacciones enzimáti­ cas. Las tiras se leen después de 24-48 horas de incubación a 30 °C. Se obtiene un perfil numérico de cuatro dígitos que se compara con los de una base de datos con 26 especies de levaduras. En este estudio, se identificó de modo correcto el 78,8% de 52 cepas sin pruebas adicionales. En un estudio reali­ zado por Frickler-Hidalgo y cois., el 75,2% de todos los aislamientos de levaduras estudiados se identificaron correctamente sin pruebas adicionales; sin embargo, se identificó correctamente el 90% de las especies encontradas en los laboratorios clínicos. Los niveles más bajos de rendimiento se debieron a las dificultades en la lectura de ciertas reacciones de color, en especial en las cúpulas que contenían /V-acetil-glucosamina y P-xilosa. R eferencias citadas

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C A PÍTU LO 21

Micología

Figura 21-97 Fotografía de la superficie de un placa del agar que muestra el Etest®. Se han colocado varias tiras para la difusión en gradiente sobre un cre­ cimiento confluente (“en césped”) de Candida kruzei. Las interpretaciones de las CIM de las tiras se leen en el sentido de las agujas del reloj que comienza con fluconazol en la posición 11: FL (fluconazol), > 256 |Xg/mL; FL (flucito­ sina) > 32 |J.g/mL; IT (itraconazol), 0,38 (ig/mL; VO (voriconazol) 0,38 |ig/mL, AP (anfotericina B), 2 |Xg/mL.

to de la candidiasis orofaríngea {muguet). La resistencia intrín­ seca de Candida krusei a los imidazoles y la aparición de resis­ tencia de Candida glabrata a este grupo de antimicóticos tam­ bién representan un problema. White y cois.293 han publicado una revisión de los factores clínicos, celulares y moleculares que subyacen en la aparición de cepas resistentes, en especial de Candida albicans. En resumen, se está tomando indispensable que los laboratorios de microbiología clínica provean datos acerca de las pruebas de sensibilidad in vitro a los antimicóticos para detectar estos patrones emergentes de resistencia.

Diagnóstico serológico de las enfermedades micóticas En la actualidad, la serología para hongos sólo se realiza en determinados laboratorios de referencia. Los procedimientos consagrados por la tradición, como la prueba de precipitinas en tubo, la inmunodifusión, la aglutinación del látex y las pruebas de fijación del complemento están siendo reemplazados por técnicas más nuevas y sensibles. Las técnicas de inmunoanáli­ sis (EIA) que utilizan anticuerpos monoclonales específicos de especie, los análisis con sondas de ácidos nucleicos y la reac­ ción en cadena de la polimerasa (PCR) se están utilizando cada vez más en los laboratorios de micología clínica.114 Como regla, los resultados únicos de las reacciones seroló­ gicas específicas de especie en títulos de 1:32 o mayores indi­ can enfermedad; sin embargo, la demostración de una eleva­ ción del cuádruple o mayor de un título en muestras tomadas con 3 semanas de diferencia puede ser de mayor significa­ ción.56 Los títulos menores de 1:32 o los que no muestran un aumento de cuatro veces entre muestras pareadas indican la presencia de infección temprana o reactividad cruzada inespe­ cífica con otros antígenos. No obstante, los resultados de todos los estudios serológicos deben considerarse presuntivos.

Los anticuerpos de la clase IgM (determinados mediante el empleo de métodos de precipitación en tubo, aglutinación del látex o inmunodifusión) suelen detectarse alrededor de las 2 semanas después de adquirir la enfermedad e indican infección reciente. Por lo general, los anticuerpos IgM ya no se detectan después de los 6 meses. Los anticuerpos IgG (detectados por fijación del complemento o por inmunodifusión) aparecen poco después del aumento en el título de IgM, no alcanzan el máximo hasta alrededor de las 6 a 12 semanas y pueden per­ manecer elevados durante muchos meses después de la infec­ ción. En consecuencia, no puede usarse un solo título elevado de anticuerpos IgG para distinguir entre infecciones recientes y pasadas. Los métodos serológicos que no utilizan cultivos y las nue­ vas técnicas moleculares se han revisado en las secciones den­ tro de la presentación de cada infección micótica cuando eran útiles para establecer el diagnóstico de enfermedad invasora. En la actualidad, gran parte de la atención se está derivando al desarrollo de análisis sensibles para la detección directa de antígenos de los hongos en muestras clínicas y líquidos bioló­ gicos, que a menudo permiten conocer los resultados el mismo día de la obtención de la muestra. Todos los meses se publican grandes adelantos en las aplicaciones prácticas de las técnicas moleculares, lo que obliga a los directores y los supervisores de los laboratorios de micología clínica a mantenerse actualizados con la bibliografía médica a fin de determinar cuáles pueden aplicarse a ámbitos clínicos específicos.145 REFERENCIAS 1. Abi-Said D, Anaissie E, Uzur O, et al. The epidemiology of hematogenous candi­ diasis caused by different Candida species. Clin Infect DB 1997;24:1122-1128. 2. Adam RD, Piquin ML, Peterson EA, et al. Phaeohyphomycosis caused by the fungal genera Bipolaris and Exserohilum: a report of 9 cases and review of the literature. Medicine (Baltimore) 1986;65:203-217. 3. Ainscough S, Kibbler CC. An evaluation of the cot-effectivenes of using CHROMagar for yeast identification in a routine microbiology laboratory. J Med Microbiol 1998;47:623-628. 4. Aisner JA, Schlmpff SC, et al. Aspergillus infection in cáncer patient: association with fire-proofing materials in a new hopital. JAMA 1996;235:411-412. 5. Ajello L. Hyalohyphomycosis: a disease entity whose time has come. Newslett Med Mycol So; NY 1982;10:305. 6. Ajello L. Hyalohyphomycosis and phaeohyphomycosis: two global disease entities of public health importance. Eur J Epidemiol 1986;2:243-251. 7. Al-Fouzan AS, Nanda A, Kubec K. Dermatophytosis of children in Kuwait: pros­ pective survey. Int J Dermatol 1993;32:798-801. 8. Almeida OP, Jacks J Jr, Scully C. Paracoccidioidomycosis of the mouth: an emerging deep mycosis. Cnt Rev Oral Biol Med 2003;14:377-383. 9. Al-Tawfiq JA, Wools KK. Disseminated sporotrichosis and Sporothrix schenkii fun­ gemia as the initial presentation. Clin Infect Dis 1998;26:1403-1406. 10. Alvarez M, Ponga BL, Rayón C, et al. Nosocomial outbreak caused by Scedospo­ rium prolificans (infltum): four fatal cases in leukemic patient. J Clin Microbiol 1995;33:3290-3295. 11. Amanio PC. Fungal infections of the hand. Hand Clin 1998;14:605-612. 12. Ampel NM, Dols CL, Galgiani JN. Coccidioidomycosis during human immunodefi­ ciency virus infection: results of a prospective study in a coccidioidal endemic area. Am J Med 1993;94:235-240. 13. Anaissie E, Fainstein V, Samo T, et al. Central nervous system histoplasmosis. An unappreciated complication of the acquired immunodeficiency syndrome. Am J Med 1988;84:215-217. 14. Andre N, Coze C, Gentet JC, et al. Geotrichum candidium septicemia in a child with hepatoblastoma. Pediatr Infect Dis J 2004;23:86. 15. Antoniskis D, Larsen RA, Akil B, et al. Sero-negative diseminated coccidioidomy­ cosis in patients with HIV infection. AIDS 1990;4:691-693. 16. Areno JP IV, Campbell GD Jr, George RB. Diagnosis of blasomycosis. Semin Respir Infec 1997;12:252-262. 17. Arguinchona HL, Ampel NM, Dols CL, et al. Positive coccidioidal serologics in HIVinfected patients without evidence of active coccidioidomycosis. International Conference on AIDS Augus 7-12, 1994. 10:160. 18. Amold MG, Amold JC, Bloom DC, et al. Head and neck manifesations of dissemi­ nated coccidioidomycosis. Laryngoscope 2004;114:747-752. 19. Babel DE, Rogers AL, Beneke ES. Dermaophyosis of the scalp: incidence. immune response and epidemiology. Mycopathologia 1990;109:69-73.

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D iagram as

1185

O bservaciones prelim inares sugestivas de Z yg o m ycetes • • • •

Colonias que crecen rápidamente con un margen mal definido, que cubren la placa de Petri en 48-72 horas La superficie de la colonia presenta una consistencia vellosa y puede tornarse espiculada a medida que se producen los esporangios Las hifas presentan diámetros irregulares, son anchas y acintadas y no tabicadas Las esporangiosporas nacen dentro de esporangios saculares esféricos o cilindricos sujetos en los extremos de los esporangióforos

Form ación de rizoides sim ilares a raíces Sí Esporangióforos que se originan en forma nodal

Especies de Rhizopus

No Esporangióforos que se originan en forma internodal Apófisis prominente

Conidios esféricos que se originan en la superficie de un esporangio globuloso

Especies de Absidia

Especies de

Especies de

Cunninghamella

Syncephalastrum

Esporangiosporas que se originan en los esporangios cilindricos y dispuestos como “pétalos de margarita” alrededor de una columela esférica

Esporangióforos ampliamente curvados hacia atrás

Especies de Circinella

D iagram a 21-1 Algoritmo que muestra la identificación de géneros de zigomicetos.

Esporangióforos a menudo ramificados, sin dilatación, donde se unen el esporangióforo y el esporangio

Especies de Mucor

oo

o> CAPÍTULO

O bservaciones prelim in ares sugestivas de un hongo fila m e n to s o hialino

C onid ios en racim os

C onid ios que se originan de m odo aislado

Colonias verdes y granulares; fiálides ramificadas y romas; conidios de 2-3 nm. esféricos

Colonias verdes a verde amarillentas; fiálides adelgazadas; conidios de 2-3 (Jm elípticos, con tamaño y tinción irregulares

Colonias beige. granulares y rugosas de modo radial; 4-6 |i,m. conidios con paredes rugosas y forma de limón con bases truncadas

Colonias blanco grisáceas a salmón, lisas y sin vellosida­ des; conidios elípticos dis­ puestos como cúmulos de letras chinas

Colonias algodonosas. con la superfi­ cie y el reverso con pigmento rosa intenso o púrpura; macroconidios grandes, multi­ celulares, con forma de hoz

Colonias verdes que se extien­ den como el césped sin un margen; ovillos de conidios esféricos sostenidos por fiálides adelga­ zadas y digiti­ formes

Colonias que se extienden como un césped verde o amarillo sin un margen; ovi­ llos de conidios esféricos que se originan lateral­ mente en las puntas adelga­ zadas de las fiá­ lides

Colonias algodonosas de color gris ratón; conidios elípticos que se oscurecen con el tiempo y nacen de las puntas de conidióforos delicados

Colonias algo­ donosas blanco grisáceas; coni­ dios elípticos y no pigmentados que nacen de las puntas de conidióforos delicados, simi­ lares a los de Blastomyces dermatitidis

Colonias algodonosas blanco grisáceas; macroconidios grandes y esféricos, de paredes rugosas que se asemejan a los de Histoplasma capsulatum

Colonias algodonosas blanco grisá­ ceas; conidios pequeños y elípticos en racimos laxos, cada uno adhe­ rido por un delicado comdióforo geniculado

Especies de Penicillium

Especies de Paecilomyces

Especies de Scopulariopsis

Especies de Acremonium

Especies de Fusarium

Especies de Gliocladium

Especies de Trichoderma

Especies de Scedosporium

Especies de Chrysosporium

Especies de Sepedonium

Especies de Beauveria

G É N E R O A S P E R G IL L U S E sp orulación desde la m itad s u perior de la vesícu la

Fiálides dispuestas de form a circu lar

Fiálides uniseriadas y compactas

Fiálides biseriadas y compactas

Fiálides biseriadas laxas

Conidios lisos y claros o beige

Conidios rugosos y negros

Colonias verdes, granulares y a menudo rugosas

Colonias beige. granulares y con rugosidades radiales

Colonias gris verdosas a castañas con placas amarillas

Colonias beige, algodonosas o granulares

Superficie de la colonia negro azabache

Aspergillus fumigatus

Aspergillus terreus

Aspergillus versicolor

Aspergillus flavus

Aspergillus niger

O bservación de cleistotecios Colonias blancas y lisas

Colonias multicolores, verdes, amarillas, blancas

Aspergillus nidulans

D iagram a 21-2 Algoritmo que muestra la identificación por el laboratorio de los hongos filamentosos hialinos de crecimiento rápido.

Aspergillus glaucus

Micología

C o n id io s en cadenas

21

• Colonias que crecen rápidamente, enteras, algodonosas a granulares, blancas o con colores pastel variables • Las hifas son angostas, tabicadas, hialinas y tienen paredes paralelas

D iagram as

1187

O b servacio n es prelim in ares sugestivas de derm ató fito s • Las colonias crecen en 3 a 5 días con márgenes diferenciados • La superficie de la colonia presenta un aspecto entre algodonoso y granular. La pigmentación de la superficie vana del blanco grisá­ ceo al beige amarillento • Las hifas son angostas, hialinas y tabicadas • Se producen combinaciones de microconidios y macroconidios, cuyo tamaño, forma y disposición proporcionan las identificaciones de género y especie

E XA M EN M IC R O S C Ó P IC O Macroaleuriosporas grandes, multicelula­ res, con forma de mazas, paredes delgadas y lisas

Colonia de color caqui

Macroaleuriosporas multicelulares, paredes gruesas y rugosas. Microconidios escasos o ausentes

Macroaleuriosporas fusiformes, extremo puntiagudo y curvo

Macroaleuriosporas en forma de maza y extremo redondeado

Reverso de la colonia de color amarillo limón

Colonias de color canela

Epidermophyton flocossum

Microsporum canis

Microsporum gypseum

Aleuriosporas: no suelen estar presentes; sólo se observan hifas

Microconidios abundantes; macroaleuriosporas escasas o ausentes, paredes delgadas y lisas

Microconidios esféricos, uniformes, en racimos laxos

Microconidios con forma de lágrima que nacen lateral­ mente de las hifas

Microconidios de tamaño irregular: se observan formas de globo

Hifas tipo astas y clamidosporas en cadenas

Pigmento rojo vino en el agar

No crecen en el agar Trichophyton 1

Crecimiento lento. La superficie de la colonia es lisa, apilada y parcialmente sumergida

Trichophyton mentagrophytes

Trichophyton rubrum

Trichophyhton

tonsurans

Trichophyton verrucosum

D iagram a 21-3 Algoritmo que muestra la identificación de género de los dermatófitos encontrados con mayor frecuencia.

O bservaciones prelim inares sugestivas de un hongo dim orfo • • • •

Colonias que crecen lentamente; por lo general requieren de 7 a 14 días para el aislamiento primario La superficie de la colonia es blanco grisácea y de consistencia de telaraña Las hifas son delicadas, tabicadas y hialinas. Puede observarse la disposición en haces paralelos La identificación de especie se hace sobre la base del tamaño, la forma, la morfología y la disposición de los conidios

E XA M EN M IC R O S C Ó P IC O Conidios en forma de maza, con paredes delga­ das y lisas que nacen en los extremos de conidió­ foros largos y rectos (piruletas o chupetines) Blastomyces dermatitidis

Hifas segmentadas en artroconidios con forma de barril, separados por células que no se tiñen (tinción alternante)

Coccidioides im m itis

Microconidios diminutos, producidos temprano. Más tarde, los macroconidios grandes, esféricos y espe­ culados son diagnósticos Histoplasma capsulatum

Conidios pequeños, en forma de maza, producidos de modo radial en el extremo de un conidióforo recto con una disposición que se asemeja a una margarita

Conidios pequeños, de pared delgada, que nacen de los extremos de conidióforos largos y rectos

Sporothrix schenckii

Paracoccidioides brasiliensis

CONFIRMAR LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIE MEDIANTE LA CONVERSIÓN A LEVADURA (0 SONDA DE ÁCIDO NUCLEICO)

Levaduras esféricas, 10-15 pm de diámetro, con un solo brote de base ancha

Esférulas grandes, 75-200 |um de diámetro, que con­ tienen endosporas de 3-5 Um observadas en cortes teñidos de tejido

Conidios diminutos, esféri­ cos, hialinos, de paredes lisas, dispuestos en racimos Se observan intracelulares en cortes teñidos de tejido

Conidios alargados, de 2-8 ¡im de longitud que brotan en forma individual, a menu­ do con forma de cigarro

Célula madre grande, esféri­ ca, lisa, de pared gruesa, con brotes múltiples similar a una rueda de timón

D iagram a 21-4 Algoritmo que muestra la identificación de género de los hongos dimorfos.

00 00 CAPÍTULO 21 Micología

O bservaciones prelim in ares sugestivas de un hong o fila m e n to s o dem atiáceo • Las colonias crecen en 3 a 5 días, son algodonosas o vellosas, gris castaño o negro castaño; el reverso es negro azabache • Hifas angostas, tabicadas, con pigmento castaño y paredes paralelas

M acroco nidios m uriform es

M acroco nidios con tab iq u es tran sversales

Macroconidios multicelulares, muriformes, como palillos de tambor. que nacen en cadenas aisladas o ramificadas. con el extremo romo de uno que se ensambla con el extremo adelgazado del siguiente

Macroconidios multicelulares, muriformes, que nacen individualmente desde los extremos de conidióforos geniculados con un origen simpodial

Macroconidios multicelulares, muriformes, que nacen de modo individual desde los extremos de conidióforos cortos simulando una “bala de algodón sobre un palo"

Macroconidios multicelulares. muriformes, maduros e inmaduros, que nacen de modo individual y se agregan en racimos laxos

Macroconidios de 3 a 4 células divididas sólo por tabiques transversales. El centro de las células crece con más rapidez, se agranda y da el aspecto de un búmeran

Conidióforos oscuros, simples o ramificados. geniculados, que tienen conidios cilindricos en un patrón simpodial. Los conidios con múltiples células están recubiertos de paredes grue­ sas tabicadas. Los que germi­ nan presentan tubos germinales en cada extremo de los conidios

Especies de Alternaría

Especies de Ulocladium

Especies de Stemphillium

Especies de Epicoccum

Especies de Curvularia

Especies de Bipolaris

Conidióforos y conidios similares en el aspecto a los de las especies de Bipolaris. Se observa un solo tubo germinal que surge en ángulo recto de los conidios que germinan

Especies de Drechslera

P icnidios o conidio s in dividuales Conidióforos oscuros, erectos y geniculados. Cotí ¡dios alar­ gados, con forma de lápiz, multitabicados que se originan individualmente en un patrón simpodial. Cada conidio tiene un nudo protuberante prominente y oscuro desde la célula hilar

Especies de Exserohilum

Conidios gran­ Conidios des, oblongos a pequeños, esféricos, negro hialinos. azabache, que esféricos a nacen de modo elípticos que se individual forman dentro desde los extre­ de picnidios mos de conidió­ saculares. foros cortos y globulosos o anchos, cada subglobulosos. uno con una dispersos entre concavidad hifas tabicadas semejante a un castañas, con cáliz dentro del paredes cual están los paralelas conidios

Especies de Nigrospora

D iagram a 21-5 Algoritmo que muestra la identificación de los hongos filamentosos dematiáceos de crecimiento rápido.

Especies de Phoma

Peritecios grandes y globulosos, con forma de botella, castaño oscuro a negros, formados en el subestrato entre hifas tabicadas con tinción castaña. Hitas alargadas distintivas, similares a pelos, que salen desde el interior y dan aspecto de patas de araña Especies de Chaetomium

D iagram as

1189

O bservaciones prelim inares sugestivas de los agentes de crom om icosis y m icetom as • Colonias que crecen en 3 a 5 días con márgenes diferenciados • La superficie de la colonia presenta consistencia algodonosa a granular. La pigmentación de la superficie es blanco grisácea a castaño negruzca; el rever­ so es negro azabache • Las hifas son relativamente anchas, con paredes paralelas, con tabiques distintivos y amarillo oscuro a castañas • Los conidios nacen en cadenas, racimos o aislados desde los extremos o los lados de las fiálides distintivos para cada género

E XA M EN M IC R O S C Ó P IC O C onid ios o riginad os en cad en as Cadenas cortas y ramificadas de conidios elípticos con cicatrices (zonas libres de citoplasma) conocidas como disyuntores

Cadenas largas (35 células o más) de conidios elípticos sin disyuntores

Cladophialophora carrionii

Cladophialo­ phora bantiana

Colonias de crecimiento rápido a 42 °C. Esporulación tipo cladosporio

Especies de Cladosporium

C o n id io s o riginad os en racim os Fiálides cortas con forma de urna Extremo de la fiálide con forma de botella

Phialophora verrucosa

Fiálide larga y adelgazada

Extremo de la fiálide con forma de plato

Phialophora richardsiae

C onid ios o riginad os en form a individual Fiálides simpodiales que tienen conidios elípticos (esporulación tipo acroteca) Conidios dispuestos de modo laxo

Exophiala jeanselmei

Fonsecaea* pedrosoi

Conidios dispuestos de modo compacto

Fonsecaea compacta

Conidios que nacen lateralmente desde las hifas (esporulación tipo rinocladiela)

Especies de Rhinocladiella

* Las diferentes especies de Fonsecaea pueden mostrar varias combinaciones de esporulación tipo cladosporio, fialófora y acroteca.

D iagram a 21-6 Algoritmo que muestra la identificación de género de los agentes de cromomicosis y micetomas.

(O

O CAPÍTULO

O bservaciones prelim inares sugestivas de levaduras Las colonias crecen en 24-72 horas La superficie de la colonia es lisa a mucoide; puede desarrollar pies o micelio aéreo bajo. La pigmentación de la superficie varía del blanco al amarillo y del rosa rojizo al negro Ausencia de hifas verdaderas, salvo las especies que producen artroconidios Puede haber seudohifas o no Se producen blastoconidios cuyos tamaño, forma y disposición permiten las identificaciones de género o especie

21 Micología

• • • • •

E XA M EN M IC R O S C Ó P IC O

Producción de seudohifas y blastoconidios

Producción de hifas verdaderas y artroconidios

Ausencia de hifas

Levaduras negras

Prueba del tubo germinal

Prueba de la ureasa

Prueba de la ureasa

Aneloconidios

Positivo Clamidosporas en agar harina de maíz

Negativo

Positiva

Negativa

Ausencia de clamidosporas en agar harina de maíz

Positiva

Positiva

Prueba del ácido cafeico

Colonias anaranjadas a rojas

Positiva Candida albicans

Especies de Candida

Especies de Trichosporon

Especies de Geotrichum

Negativa

No Hifas con tinción oscura que producen blastoconidios hialinos

Sí Levaduras formadas por dos células con tabiques transversales que las dividen (anélidos)

Negativa

Cryptococcus Especies de neoformans Cryptococcus

Especies de Rhodotorula

Especies de Saccharomyces

Aureobasidium pullulans

Especies de Phaeoannellomyces

Especies de Hansenula Especies de Malassezia

Realizar identificación presuntiva sobre la base de los patrones de crecimiento en el agar harina de maíz

Buscar los blastoconidios en los ángulos de los artroconidios (“orejas de conejo”) en el agar harina de maíz

Buscar los tubos germinales en ángulo recto desde los ángulos de los artroconidios (“palo de jockey”) en el agar harina de maíz

Buscar las levaduras de tamaño irregular rodeadas por material capsular

Inositol negativo

Especies de Blastoschizomyces

D iagram a 2 1 -7 Algoritmo que muestra la identificación de género de las levaduras encontradas con mayor frecuencia.

Pueden producir hifas y fiálides cuando maduran

■ ■

Riesgo y prevención de las infecciones parasitarias Manifestaciones clínicas de las enfermedades parasitarias Recolección, transporte y procesamiento de las muestras M u e stras fecales Conservación de muestras clínicas Examen visual Procesamiento de muestras de heces recién emitidas para el examen de huevos y parásitos Exam en de m uestras intestinales no fecales Exam en de m uestras extraintestinales

Protozoos de clasificación incierta Flagelados intestinales

Giardia lamblia Otros flagelados intestinales Ciliados: Balantidium coli Coccidios

Cryptosporidium parvum Cyclospora cayetanensis Isospora belli Especies de Sarcocystis Filo Microsporum: especies de Microsporidium

Nematodos A scariasis y Ascaris lumbricoides Tricocefalosis (trichu riasis) y Trichuris

tríchiura

Esputo

Enterobius vermicularis (o xiu ro s)

Orina y líquidos corporales

U ncinarias

Biopsias y aspirados de tejidos

E strongiloidiasis y Strongyloides

Raspados o biopsia de córnea

stercoralis

Biopsia de músculo

Especies de Trichostrongylus

Sangre

Capillaria philippinensis

Identificación y diferenciación de parásitos Ciclos vitales de los parásitos hum anos

Protozoos intestinales A m eb a s intestinales

Cestodos Taenia solium y Taenia saginata Diphyllobothrium latum: tenia gigante de los peces E species de Hymenolepis

Dipylidium caninum

Amebiasis y Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica y Entamoeba coli

Tremátodos

Diagnóstico serológico de amebiasis

E squlstosom as

Entamoeba histolytica no patógena: Entamoeba dispar

Fasciola hepaticay Fasciolopsis buski

Otras amebas intestinales

Paragonimus westermani

Clonorchis sinensis

1192

C A PÍTU LO 22

Parasitología

Parásitos de la sangre y los tejidos P aludism o

Babesia H em oflagelados: especies de Leishmania y de

Triquinosis Larva migrans visceral Larva migrans cutánea -Toxocara Anisakiasis

Trypanosoma

Gnatostomiasis

Leishmaniasis y especies de Leishmania

Angioestrongiliasis

Tripanosomiasis

Hidatidosis (enfermedad hidatídica o equinococosis)

Filarías y filariasis Oncocercosis y Onchocerca votvulus Dracunculiasis Dirofilariasis

Especies de Multiceps - cenurosis Esparganosis: Spirometra mansonoides

Diagnóstico serológico de las infecciones parasitarias

Infecciones tisulares por protozoos

Toxoplasma gondii Pneumocystis jiroveci Infecciones parasitarias por otras larvas tisulares

l conocimiento de los parásitos comunes data desde tiempos remotos. En escritos antiguos de muchos paí­ ses se mencionan gusanos cuya descripción es com­ patible con Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides y tenias. También se describieron ciertos síntomas que causan estos parásitos.135 Los ectoparásitos, como piojos, pulgas y garrapatas, no han sido pasados por alto. Ruffer231 informó sobre la observación de huevos calcificados de Schistosoma haematobium en los riñones de dos momias egipcias de la dinastía 20 (1200-1090 a. C.), lo que prueba la existencia de esta infección en el antiguo Egipto. Los colonos chinos de las épocas primitivas estaban familiarizados con el cuadro clínico de infecciones graves por uncinarias, la denominada “lenta enfermedad”. Los parásitos imaginarios han desempeñado un papel impor­ tante en medicina desde tiempos remotos. El dolor de muelas se atribuyó a la acción perforante particular de un “gusano de los dientes”. De manera similar, el exudado purulento de los oídos y de los ojos provenía de los gusanos que afectaban esas estructuras. Los gusanos cardíacos eran la causa de la muerte súbita; se describían los “gusanos sonoros”, tal vez relaciona­ dos con los ovillos de áscaris en el intestino, con la advertencia de que los que recibían medicación permanecieran callados du­ rante el tratamiento por la posibilidad de que el parásito pudie­ se escuchar y no se eliminara.135 Durante siglos se consideró que el origen de los parásitos, entre otras criaturas pequeñas, se debía a la generación espon­ tánea. La opinión habitual acerca de los parásitos, así como de otros organismos vivos, era que podían crearse por cierta com­ binación adecuada de elementos opuestos. Se sabía que las tenias se asociaban con la ingestión de carne cruda; considera­ ban que su origen estaba en el estómago por los alimentos macerados, antes de que se eliminaran por las heces. Desde la época de los romanos se creía que las tenias eran tiras de muco­ sa intestinal; para muchos, los gusanos áscaris se originaban en la flema. Según los teóricos antiguos, algo imperceptible o invisible estaba dotado de todas las potencialidades; entonces,

E

Fármacos utilizados con frecuencia en el tratamiento de las enfermedades parasitarias

por acción de un principio metafísico o de una fuerza funda­ mental podían crearse los seres vivos.25 Las mejoras en el microscopio compuesto permitieron una mayor comprensión de los parásitos protozoos. Se le adjudica a van Leeuwenhoek haber realizado la primera observación de los protozoos, un “animáculo móvil” en el intestino del tábano, que poco después encontró en sus propias heces. La opinión actual es que se trataba de Giardia lamblia. Sin embargo, debió pasar más de un siglo antes de que se avanzara en el estudio de los protozoos. Con el amplio uso del microscopio compuesto, a principios del siglo xx se definieron las morfologías y los ciclos vitales de casi todos los parásitos que afectan a los seres humanos. La cronología de estos adelantos está bien detallada en las explicaciones históricas de Foster.84 A pesar de la implementación de medidas preventivas para reducir la prevalencia de enfermedades parasitarias en la mayo­ ría de los países subdesarrollados o en vías de desarrollo, los parásitos humanos aún determinan inestimables pérdidas de vidas, amplia morbilidad y retraso del desarrollo económico. Según un informe de la distribución de parásitos humanos en China, “las tasas de prevalencia (de las enfermedades parasita­ rias) son de tal magnitud que resulta difícil concebir la estadís­ tica descriptiva”.295 Como se afirmó en este informe, “el núme­ ro total de infecciones por protozoos y helmintos que existen en la actualidad en el mundo supera al de la población total ya que las infecciones son la norma más que la excepción”. En el recuadro 22-1 se mencionan las prevalencias estimadas de las enfermedades parasitarias humanas, sobre la base de estadísti­ cas publicadas por la Organización Mundial de la Salud y otras fuentes de información. En los Estados Unidos, ciertas especies de parásitos son más frecuentes que otras y lo más importante debe ser la experien­ cia para su identificación. En un programa de vigilancia sobre parásitos intestinales de los Centers for Disease Control and Prevention (CDC), se encontraron formas parasitarias en 64 901 (15,6%) de más de 400 000 muestras de heces exami­ nadas.29 Giardia lamblia se halló en el 3,8% de todas las mués-

R iesgo y prevención de las infecciones parasitarias

1193

Blastocystis hominis infectó a 662 pacientes (72% de 916 ca­ Recuadro 22-1

P re v a le n c ia m u n d ia l e s tim a d a d e las e n fe rm e d a d e s p a ra s ita ria s *

Enfermedad parasitaria Amebiasis Giardiasis Ascariasis Tricocefalosis (trichuriasis) Uncinariasis Estrongiloidiasis Enterobiasis (oxiuriasis) Teniasis (cisticercosis) Difilobotriasis Esquistosomiasis Fascioliasis Clonorquiasis Paragonimiasis Paludismo Leishmaniasis Tripanosomiasis africana Tripanosomiasis americana (enfermedad de Chagas) Oncocercosis Filariasis Hidatidosis

Prevalencia global (millones de personas) 500 2 0 0

800 800 900 50-100 42 (países desarrollados) 1 % de la población en países endémicos 5-10 2 0 0 1 -2

20 (China) 4-5 100-270 12 2 0

0 0 0

casos nuevos/año

15 2 0

90 1/100 000-150/100 000

* Las cifras de incidencia registradas aquí son estimaciones aproximadas que sólo tra­ zan de ilustrar la enorme magnitud de las infecciones. Hay variaciones en las cifras publicadas en diferentes fuentes, lo cual refleja tal vez el acceso incompleto a la infor­ mación o a diferencias de extrapolación de datos conocidos a toda la población.

tras de heces, huevos de Trichuris trichiura en el 2,7%, huevos de Ascañs lumbricoides en el 2,3%, huevos de Enterobius vermicularis en el 1,6% (no es un verdadero reflejo de la inciden­ cia de esta enfermedad, ya que el examen de la muestra de heces no es el método más sensible para establecer el diagnós­ tico) y Entamoeba histolytica en el 0,6% de todas las muestras de heces. La difilobotriasis, como esparganosis y anisakiasis también aumentaron la frecuencia a medida que se puso de moda la ingestión de pescados frescos. Los médicos de aten­ ción primaria y los funcionarios de salud pública deben estar atentos a un posible aumento de las infecciones por tenias, incluso la neurocisticercosis y otras enfermedades parasitarias, por el “Acuerdo de libre comercio estadounidense” y un inter­ cambio libre de productos alimenticios entre los países de América del Norte. El recuadro 22-2 es un resumen de los parásitos encontrados por Bruckner y cois, en un estudio de 6 meses de duración de muestras de heces de pacientes ambulatorios tratados en el Olive View Medical Center y en el Harbor General Hospital de Los Angeles.21 En este estudio, en el 3% del total de las muestras de heces se identificaron otros protozoos; en el 3% otros nematodos y en el 0,5% otros cestodos. En un estudio más reciente realizado por el Parasitology Center de Tempe, Arizona, Amin7 informó que un tercio de las 5 792 muestras fecales provenientes de 2 896 pacientes de 48 estados y el Distrito de Columbia duran­ te el año 2000 resultaron positivas para parásitos intestinales. Las infecciones múltiples con dos a cuatro especies de parási­ tos constituyeron el 10% de 916 pacientes infectados.

sos), una prevalencia en aumento en los últimos años. Se iden­ tificaron otras 18 especies de parásitos intestinales: Cryptosporidium parvum y Entamoeba histolytica/E. dispar ocuparon el segundo y el tercer lugar en la prevalencia, respectivamente. La prevalencia de la infección fue mínima (22-27%) en invierno, aumentó de modo gradual durante la primavera, alcanzó el máximo de 36-43% entre julio y octubre y disminuyó de a poco hasta llegar al 32% en diciembre. El paludismo es infrecuente en los Estados Unidos y se lo suele encontrar en viajeros que visitaron áreas endémicas. Los CDC recibieron informes de 1 167 casos de paludismo con co­ mienzo de los síntomas durante 1995 en personas de los Estados Unidos o uno de sus territorios.288 Esta cifra represen­ ta un aumento del 15% de los 1 014 casos informados en 1994. P. vivax, P. falciparum, P. malariae y P. ovale se diagnostica­ ron en el 48,2%, 38,6%, 3,9% y 2,2% de los casos, respectiva­ mente. En tres pacientes había más de una especie presente (0,3% del total). En 80 casos (6,9%) no se diagnosticó la espe­ cie infectante. La cantidad de casos de paludismo informados, adquiridos en Africa (n = 519) siguió siendo casi la misma que en 1994 (n = 517); los casos adquiridos en Asia aumentaron un 32,4% (n = 335) y los adquiridos en el continente americano, el 37,4% (n = 246). Dada la proliferación de viajes internacionales, los estudian­ tes y los técnicos que trabajan en los laboratorios de diagnósti­ co deben tener un amplio conocimiento de las enfermedades parasitarias. Los acuerdos comerciales entre los países, algunos de los cuales se sabe que son endémicos para las enfermedades parasitarias, también abren sus fronteras al ingreso de bienes que pueden estar contaminados con parásitos animales. Los viajeros de los Estados Unidos a tierras extranjeras deben recordar que varias enfermedades parasitarias son endémicas en la mayoría de los países en vías de desarrollo y que deben tomar precauciones adecuadas. Lamentablemente, no se cono­ cen con precisión las cifras exactas y la prevalencia de los pará­ sitos específicos debido a la falta de un sistema de registro legal que exija la notificación obligatoria de ciertas enfermedades. Con frecuencia, las enfermedades parasitarias se pasan por alto o se las diagnostica de manera errónea, ya que los síntomas pueden ser inespecíficos y similares a los de otras enfermeda­ des infecciosas o a los del cáncer. La incidencia frecuente de ciertas infecciones parasitarias en los pacientes con SIDA ha despertado gran interés en el perso­ nal de los laboratorios parasitológicos de regiones no endémi­ cas. Vermud y cois.272 observaron que la epidemia de SIDA

Recuadro 22-2

In c id e n c ia d e p a rá s ito s e n m u e s tra s d e h e c e s 2’

Organism o Giardia tamblia Endolimax nana Entamoeba col i Entamoeba histolytica Ascaris lumbricoides Hymenolepis nana Dientcimoeba fragilis

Olive View (1 350 muestras)

Harbor General (493 muestras)

% 14.5 13,0 10,5 4,5 3,9 3,3

% 8,7 8,5 7,7 5,3

2 .1

2 ,8

2 ,0

1,4

1194

C A PÍTU LO 22 Parasitología

tuvo una influencia definida en la prevalencia relativa de las enfermedades parasitarias. Por ejemplo, las especies de Cryptosporiclium, raras veces reconocidas en los seres humanos antes de 1983, comprenden el 13,8% de todos los protozoos patógenos en 1984. En un estudio realizado en el New York Columbia-Presbyterian Medical Center de 41 958 muestras de heces remitidas para su análisis durante el período 1971-1984, Strongyloides stercoralis fue alcanzando la incidencia de Tricliuris trichiura como el nematodo identificado con mayor frecuencia. En una publicación reciente, Harms y Feldmeier122 proponen que las infecciones por HIV y parasitarias pueden interactuar y afectarse mutuamente. Aunque la evolución natu­ ral de las enfermedades parasitarias puede verse alterada por la coinfección por el HIV, las parasitosis a su vez facilitan la pro­ gresión desde una infección asintomática al SIDA. Según estos autores, la base inmunopatogénica de los efectos perjudiciales que las enfermedades parasitarias pueden tener en el curso natural de la infección por HIV implica una activación preferencial de los linfocitos T helper (Th) 2. Estos autores conclu­ yeron que para ayudar a combatir la pandemia de HIV también es necesario el control de las enfermedades parasitarias.

Riesgo y prevención de las infecciones parasitarias Warren y Mahmoud analizaron los factores de riesgo para la adquisición de las infecciones parasitarias durante viajes a áreas infestadas del mundo y las medidas profilácticas para evi­ tarlas.276 El riesgo más bajo es para los hombres de negocios que se alojan en hoteles de primera clase de las grandes ciuda­ des durante períodos breves. En el extremo opuesto del espec­ tro se encuentran los voluntarios y los misioneros que viven en tiendas de campaña o en moradas nativas en el ámbito rural. La mayoría de las enfermedades parasitarias se contraen ya sea por ingestión de agua o alimentos contaminados, o a través de la picadura de un vector artrópodo. El hecho de beber agua no tratada o cepillarse los dientes con agua contaminada puede ser particularmente riesgoso. Como la mayoría de los parásitos intestinales resisten la congelación, el agua congelada conta­ minada es también insegura. El agua caliente de la canilla es bastante segura porque las formas infecciosas de la mayoría de los parásitos intestinales son sensible al calor; sin embargo, el agua corriente no siempre excede la temperatura crítica de 43 °C y su seguridad no pueden garantizarse. En áreas endémi­ cas también debe evitarse la ingestión de leche fresca sin pasteurizar. La leche embotellada y las bebidas gasificadas suelen ser seguras. La ingestión de carnes poco cocidas o de pescados de agua dulce crudos puede llevar a la infección por tremátodos, tenias, nematodos como Trichinella spiralis y bradizoítos de Toxoplasma gondii. Los vegetales crudos son bastante seguros si se pelan antes de comer; sin embargo, en las verduras como lechuga y otras es muy difícil eliminar los huevos y los quistes infectantes de los parásitos. Deben tomarse precauciones para evitar las picaduras de insectos en las regiones tropicales. Se recomienda el uso de mosquiteros, fumigaciones con insectici­ das en aerosoles, repelentes de insectos y ropa protectora de manga larga. Los viajeros a los países extranjeros, en particu­ lar los que visitan regiones subdesarrolladas de climas tropica­ les o subtropicales, deben consultar a las autoridades sanitarias locales acerca de los programas de inmunización adecuados. Los viajeros a regiones endémicas de paludismo deben recibir profilaxis con fármacos. Los individuos que planean visitar ciertos países deben consultar a las autoridades sanitarias esta­

tales locales para conocer la magnitud y la distribución geo­ gráfica de los diferentes parásitos palúdicos y cuál de los regí­ menes profilácticos debe comenzarse. También debe advertirse a los viajeros a regiones tropicales acerca del riesgo de nadar en los estuarios naturales de agua dulce. Las cercarías infecciosas de especies de Schistosoma abundan en muchos ríos, lagos y canales y pueden penetrar con facilidad la piel intacta de un pescador confiado. El cloro en la concentración utilizada en las piscinas no garantiza la pureza del agua. Las cercarías de Schistosoma que infestan a los seres humanos no se encuentran en el agua de mar; sin embargo, el prurito del nadador puede ocurrir después de vadear en el agua salobre tras la penetración de la piel por las cercarías de espe­ cies que infectan a los animales. Los médicos deben procurar obtener información de algún viaje reciente a regiones donde las enfermedades parasitarias son endémicas e interrogar acer­ ca de las condiciones de vida en esos lugares. Es necesario informar al laboratorio si se sospecha una enfermedad parasi­ taria para poder recolectar las muestras pertinentes y llevar a cabo los procedimientos adecuados para la recuperación ópti­ ma de las formas diagnósticas. De acuerdo con la presencia de enfermedades inmunosupresoras subyacentes, el antecedente de un viaje reciente hacia o desde una región endémica de enfermedades parasitarias o ambos, debe considerarse la reali­ zación de exámenes de heces para la investigación de parásitos, en particular las formas larvarias de S. stercoralis, para todos los pacientes antes de que reciban fármacos inmunosupresores.

Manifestaciones clínicas de las enfermedades parasitarias El síntoma más frecuente de la infección parasitaria intestinal es la diarrea, que puede ser acuosa, sanguinolenta o purulenta. El dolor abdominal cólico puede ser una característica impor­ tante en las enfermedades en las cuales el parásito invade la mucosa o la pared intestinal, como sucede en las infecciones por uncinarias, los esquistosomas de Manson u orientales o los tre­ mátodos intestinales. La infección con gran cantidad de Ascaris lumbricoides puede producir la obstrucción del intestino delga­ do. Los pacientes con tenias pueden ser asintomáticos, salvo por la pérdida de peso a pesar del aumento del apetito y de la inges­ ta de alimentos. El meteorismo, los eructos y la esteatorrea pue­ den observarse en los pacientes con giardiasis. La eosinofilia en sangre periférica (15-50% o mayor) es uno de los marcadores más importantes de la infestación parasita­ ria. La eosinofilia también puede observarse en diversas secre­ ciones, como esputo, heces diarreicas, exudados supurativos o líquidos de seudoquistes o diversas cavidades corporales. Sin embargo, la falta de eosinófilos en sangre o líquidos corporales no excluye el diagnóstico de enfermedades parasitarias en las cuales la eosinofilia no es una manifestación habitual o la can­ tidad de parásitos puede ser escasa. La presencia de una erup­ ción cutánea urticariana generalizada, considerada como reacción de hipersensibilidad secundaria a productos metabólicos o líticos de organismos muertos absorbidos a la circula­ ción, también puede sugerir infección parasitaria. Si bien es un hallazgo inespecífico, la elevación de las concentraciones séri­ cas de inmunoglobulina, en especial IgE, puede ayudar a la presencia de una enfermedad parasitaria, en especial cuando se asocia con eosinofilia. La hepatoesplenomegalia es una manifestación habitual de la leishmaniasis (kala-azar) y de los tremátodos hepáticos. La hipertensión portal, en particular, puede ser causada por Schistosoma japonicum y la ictericia es un signo de presenta­

R ecolección, transporte y procesam iento de las m uestras

ción común. Las masas ocupantes quísticas de hígado, cerebro \ otros órganos pueden encontrarse en la amebiasis, la hidatidosis y las infecciones por cisticercos (estadios larvarios de

1195

revisión sucinta, actual y práctica de estos procedimientos, el lector puede remitirse a la sección “Procedimientos diagnósti­ cos” en la edición actual del texto clásico de García.96

Taenia solium).

El dolor suprapúbico, la polaquiuria (aumento de la frecuencia miccional) y la hematuria son muy sugestivas de la infección por Schistosoma haematobium. La neumonitis transitoria puede experimentarse durante las fases migratorias larvarias de las infecciones por áscaris o uncinarias. Este cuadro puede sospe­ charse si se observa gran cantidad de eosinófilos en el esputo. La tos, el dolor torácico y la hemoptisis, junto con la formación de quistes parabronquiales, son manifestaciones usuales del tremalodo pulmonar Paragonimus westermani. La fiebre de baja intensidad, la pérdida de peso, el edema facial y el dolor del músculo esquelético indican la posible infección por Trichinella spiralis. El prurito focal de la piel puede suceder en los sitios de penetración de las larvas de uncinarias o las cercarias de las especies de Schistosoma. Los síntomas generalizados se experimentan con mayor fre­ cuencia después de infecciones con parásitos sanguíneos. Entre las manifestaciones frecuentes del paludismo, la leishmaniasis y la tripanosomiasis se encuentran: fiebre, escalofríos, sudoraciones nocturnas, lasitud, mialgias y pérdida de peso. En estas enfermedades pueden observarse también grados variables de hepatoesplenomegalia y linfadenopatía. En varias enfermeda­ des parasitarias pueden presentarse signos y síntomas neuroló­ gicos secundarios a encefalitis, meningitis o neuropatías loca­ lizadas. El compromiso del sistema nervioso central (SNC) -uele ser difuso en la tripanosomiasis africana (enfermedad del sueño), el paludismo por Plasmodium falciparum y la toxoplasmosis, mientras que los abscesos o quistes se observan más a menudo en infecciones por Entamoeba histolytica, T. solium (cisticercosis) y Echinococcus granulosas. La miocardiopatía es una de las complicaciones más graves de la enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana, producida por Trypanosoma cruzi), la toxoplasmosis y las diversas infecciones por lanas migratorias. Los edemas masivos de piernas, brazos y escroto (elefantiasis) son habituales en la filariasis porque los parásitos adultos bloquean los vasos linfáticos y causar infla­ mación crónica extensa y fibrosis. Los nodulos subcutáneos localizados o las zonas inflamatorias serpiginosas en la piel pueden verse en enfermedades como oncocercosis, dracunculiasis o larva migrans cutánea, que representa las formas migra­ torias larvarias de las uncinarias de los perros y otros animales. Tan262 publicó un análisis sucinto de los aspectos clínicos y de laboratorio de diversas enfermedades parasitarias frecuentes y no frecuentes.

Recolección, transporte y procesamiento de las muestras Las muestras adecuadas del paciente deben ser recolectadas y transportadas al laboratorio con los métodos de conservación pertinentes para permitir la detección y la identificación de todas las formas parasitarias. El diagnóstico de infecciones parasitarias se basa en gran medida en la observación macros­ cópica o microscópica de heces, orina, sangre, esputo y tejidos. La implementación confiable de las técnicas de procesamiento de laboratorio es un paso integral. No es posible revisar más que algunos de los procedimientos de laboratorio utilizados con frecuencia que pueden ayudar al aislamiento y la identifi­ cación de formas parasitarias en muestras clínicas. Para una

Muestras fecales

Las muestras de heces deben recolectarse en un recipiente limpio, de boca ancha con tapa de rosca. Las que están mez­ cladas con agua (contaminación del inodoro o de la chata) u orina son inadecuadas porque los trofozoítos pueden perder su movilidad o sufrir lisis. Las medicaciones que contienen vase­ lina, bismuto, antibióticos, antipalúdicos u otras sustancias quí­ micas pueden afectar la detección de los protozoos intestinales. Por lo tanto, la observación de muestras debe retrasarse una semana o más después de ciertos procedimientos diagnósticos (enema de bario) o de haber interrumpido el tratamiento. Los pacientes que han recibido un enema de bario pueden no excre­ tar organismos en sus heces durante al menos una semana des­ pués del procedimiento. La tapa del recipiente debe ajustarse de modo firme tras la recolección de la muestra para mantener la humedad adecuada. Todos los recipientes de muestras deben ser rotulados como se describió en el capítulo 1 de este libro. Para obtener muestras fecales para el examen de parásitos, deben evitarse los catárticos con base oleosa, ya que el aceite retrasa la movilidad de los trofozoítos y distorsiona la morfo­ logía de otras formas. Las muestras deben recolectarse antes de la administración de ciertos fármacos y compuestos que pue­ den afectar la observación o retrasar la recolección hasta que hayan pasado los efectos de estos agentes. Estas sustancias incluyen antiácidos, caolín, vaselina y otros materiales oleosos, preparaciones antidiarreicas no absorbibles, bario o bismuto (se necesitan de 7-10 días para la eliminación de los efectos), agentes antimicrobianos (2-3 semanas) y colorantes vesicales (3 semanas). La recolección de tres muestras fecales suele ser suficiente para establecer el diagnóstico de enfermedad parasitaria intes­ tinal: dos obtenidas en días sucesivos durante las deposiciones normales y una tercera después de una purga con fosfato de so­ dio o sulfato de magnesio. No debe aceptarse más de una mues­ tra fecal por día. Algunos autores aconsejan una única muestra para diagnosticar la mayoría de las infecciones parasitarias intestinales. Este enfoque depende de la experiencia del microscopista y de la cantidad de parásitos en la muestra o puede implementarse si el paciente se torna asintomático entre las recolecciones.96 Hiatt y cois.132 encontraron que con exámenes adicionales, la posibilidad de aislamiento de Entamoeba his­ tolytica aumenta un 22,7%; de Giardia lamblia, un 11,3% y de Dientamoeba fragilis, un 31,1%. Si se sospecha amebiasis o giardiasis intestinal puede necesitarse un total de seis muestras, recolectadas en días sucesivos. El examen de más de seis mues­ tras en un período de 10 días rara vez proporciona más infor­ mación. Las muestras posteriores al tratamiento deben exami­ narse a las 3 a 4 semanas después de su finalización en los pacientes con infecciones por protozoos y 5 a 6 semanas des­ pués del tratamiento por infecciones por Taenia. Si se solicita un ensayo de PCR en una muestra de heces, se recomienda la implementación del siguiente protocolo: 1. Recolectar la muestra sin conservantes. 2. Conservar y enviar la muestra ya sea refrigerada (4 °C) o congelada (con hielo seco). 3. De manera alternativa, las muestras de heces pueden mez­ clarse con bicromato de potasio (dilución 1:1 con 5% p/v) o en etanol absoluto (dilución 1:1) y enviarlas refrigeradas.

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C A PÍTU LO 22

Parasitología

Los frotis con tinciones tricrómicas, para ácido-alcohol re­ sistencia o ambas deben acompañar la muestra de heces cuan­ do se solicita la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de G. lamblia y E. histolytica/dispar o Cryptosporidium parvum o Cyclospora cayetanensis, respectivamen­ te. Todos los frotis teñidos deben revisarse con minuciosidad porque la realización de PCR es innecesaria si se identifica el parásito. Los detalles del procedimiento de extracción y los pasos para la amplificación del DNA fueron publicados por da Silva y cois.54 CONSERVACIÓN DE MUESTRAS CLÍNICAS

Muchas muestras de heces para el examen de huevos y pará­ sitos se recolectan ya sea en el hogar, en el consultorio médico o en una clínica a cierta distancia del laboratorio que realiza el análisis. Como los trofozoítos se desintegran con rapidez des­ pués de la defecación y no forman quistes, las muestras de heces líquidas deben examinarse antes de los 30 minutos des­ pués de la recolección (no 30 minutos después de ser recibidas en el laboratorio), o las heces poco consistentes antes de los 60 minutos, con el objeto de detectar trofozoítos móviles, en par­ ticular si se sospechan infecciones por E. histolytica. Las heces sólidas, en las cuales no se espera observar trofozoítos, pueden examinarse hasta 24 horas después de su eliminación. Las muestras de heces nunca deben ser congeladas y descongeladas ni colocadas en estufas de incubación porque las formas para­ sitarias pueden deteriorarse con rapidez. Se dispone de varios conservantes para la fijación perma­ nente de muestras de heces que se mantienen con fines docen­ tes futuros o que deben enviarse a laboratorios de referencia para el análisis. En el recuadro 22-3 se presentan las fórmulas y el modo de preparación de varios conservantes utilizados en la actualidad. A continuación se resumen las ventajas y las des­ ventajas de estos elementos. Fijadores alternativos. Las preocupaciones acerca de la toxicidad del formaldehído y la dificultad de eliminar los conservantes que contienen cloruro mercúrico llevaron a varias compañías a comercializar alternativas al método de referencia: el reactivo alcohol polivinílico de baja viscosidad (LV-PVA). En un estu­ dio de 68 muestras de heces recién emitidas, que en conjunto contenían 31 formas parasitarias, Jensen y cois.146 concluyeron que Proto-Fix® (Alpha-Tec Systems, Vancouver, WA) y EcoFix® (Meridian Diagnostics, Cincinnati, OH) fueron susti­ tutos seguros para el ambiente del PVA, que causan una distor­ sión mínima del parásito. En un estudio de 20 muestras positi­ vas de heces que contenían uno o más parásitos con diferentes estadios de huevos, larvas y quistes, Pietrzak-Johnston y cois.215también concluyeron que EcoFix es comparable con el tradicional LV-PVA para la visualización de protozoos en fro­ tis teñidos de modo permanente, lo que confirma los hallazgos tempranos de García y Shimizu.94 En cada uno de estos estu­ dios, las formas parasitarias presentan detalles nucleares bien definidos; incluso ciertos parásitos se identifican mejor en las muestras conservadas con EcoFix que en las fijadas por el método tradicional PVA. Cuando se tiñen de manera adecuada con estas técnicas, los organismos presentan un citoplasma azul verdoso a violáceo y la cromatina roja a violeta rojiza contra un fondo verde. Los huevos y las larvas de helmintos tienen un aspecto rojo o vio­ leta. Recuérdese que los huevos de Trichuris trichiura y los quistes de Giardia lamblia no se concentran tan bien en PVA como en el material fijado con formol, que la morfología de las formas larvarias de Strongyloides stercoralis es deficiente en

las heces fijadas con PVA y que Isospora belli puede ser pasa­ do por alto. Se comercializan varios dispositivos para la concentración fecal, que fueron presentados por García,93 como el tubo FPC JUMBO® y los sistemas FPC HYBRID® (Evergreen Scien­ tific, Los Angeles, CA), el sistema de concentración PARASED® (Medical Chemical, Torrance, CA) y el sistema de con­ centración MACRO-CON® (Meridian Diagnostics, Cincinna­ ti, OH), además de una terminal de trabajo automatizada para el análisis microscópico de los concentrados fecales (DiaSys., Waterbury, CT). Puede recomendarse cualquiera de estos productos utilizados en la actualidad en los laboratorios clí­ nicos. EXAMEN VISUAL

Las muestras de heces emitidas recientemente y enviadas para la detección de parásitos deben ser sometidas a la obser­ vación visual para determinar la presencia de bario, aceites u otros materiales que pueden hacer que el material resulte ina­ decuado para el procesamiento ulterior. La porción del mate­ rial que muestra sangre o moco debe ser específicamente seleccionada para el estudio microscópico porque puede pro­ venir de úlceras o abscesos purulentos, donde la concentración de amebas puede ser máxima. El examen visual también puede utilizarse a fin de determinar los procedimientos ade­ cuados para llevar a cabo. Es poco probable que las heces sóli­ das contengan trofozoítos; por lo tanto, suelen ser innecesarias las preparaciones en fresco y sólo se requiere preparar con­ centrados. Los huevos y las larvas de helmintos y los quistes de protozoos pueden observarse en el sedimento de los con­ centrados. Los preparados directos deben limitarse a las heces diarreicas y deben prepararse frotis teñidos para evaluar mejor las estructuras internas de cualquiera de las formas parasitarias observadas. Estos enfoques se detallan en la sección que sigue. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE HECES RECIÉN EMITIDAS PARA EL EXAMEN DE HUEVOS Y PARÁSITOS

Las muestras de heces líquidas deben examinarse antes de los 30 minutos de su eliminación (no de la llegada al laborato­ rio) para aumentar al máximo la posibilidad de observar los trofozoítos móviles. Las muestras blandas, que pueden conte­ ner trofozoítos, quistes o ambos, deben examinarse antes de una hora de su eliminación. En los casos en los que los retrasos son inevitables, la muestra debe conservarse como se describió antes para evitar la posible desintegración de trofozoítos. Las muestras de heces sólidas deben rechazarse o, como es poco probable que contengan trofozoítos, pueden mantenerse hasta un día, con refrigeración a la noche si es necesario. En las muestras remitidas para el examen parasitológico deben hacerse tres tipos de preparaciones: 1) en fresco directas, 2) concentrados y 3) frotis teñidos permanentes. Las preparaciones directas en solución fisiológica son valio­ sas para la detección de trofozoítos. Los huevos y las larvas de helmintos y protozoos también pueden observarse en prepara­ ciones directas en solución fisiológica; el agregado de una gota de yodo puede ayudar a la visualización de estas formas. En el caso de las muestras fecales acuosas o líquidas, la centrifuga­ ción de la muestra sola puede ser suficiente porque los trofo­ zoítos no se concentran bien a partir de las heces líquidas y los quistes se observarán en el sedimento. El examen directo puede omitirse para el procesamiento de las heces blandas, ya que

R ecolección, transporte y procesam iento de las m uestras

Recuadro 22-3

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Fijadores habituales para muestras fecales: fórm ulas y preparación

Form aldehído al 1 0 % en solución fisiológica

En un recipiente de almacenamiento adecuado con tapa de rosca ajustada, agregar 100 mL de formaldehído en 900 mL de solución de cloruro de sodio al

0.85%. Ventajas

• • • •

Está disponible con facilidad, es fácil de preparar y actúa como un fijador para todos los propósitos. El reactivo preparado tiene un vencimiento prolongado. Se conserva bien la morfología de huevos de helmintos, larvas, quistes de protozoos y formas de coccidios. Las muestras conservadas con formaldehído son adecuadas para los procedimientos de concentración, microscopia de epifluorescencia y realización de tin­ ciones para ácido-alcohol resistencia, safranina y cromótropa y son compatibles con los equipos de inmunoanálisis.

Desventajas

• Las muestras conservadas con formaldehído no son adecuadas para la preparación de frotis para tinción tricrómica. • La conservación es inadecuada para mantener la morfología de trofozoítos de protozoos. • La realización de los procedimientos de PCR puede verse dificultada, en especial después de un tiempo de fijación amplio. Algunos parasitólogos prefieren una fórmula con formaldehído al 5%, ya que se afirma que es menos perjudicial para los protozoos y emite menos vapores de formaldehído en el ambiente del laboratorio. LV-PVA (alcohol polivinílico de baja densidad)

Fórmula Alcohol polivinílico, 10 g 95% alcohol etílico, 62.5 mL Cloruro mercúrico, en solución acuosa saturada, 125 mL Glicerina, 3 mL Preparación Los ingredientes líquidos se mezclan en un vaso de precipitación de 500 mL y se agrega PVA en polvo sin mezclar. Cubrir el vaso de precipitación con papel o papel metálico y permitir que el PVA se remoje durante una noche. Calentar la mezcla lentamente a 75 °C y agitar con suavidad durante 30 segun­ dos hasta que se logre una suspensión levemente lechosa. Ventajas

• • • •

Se conserva bien la morfología de trofozoítos y quistes de protozoos. Se preparan con facilidad los frotis para tinciones tricrómicas permanentes. Las formas parasitarias se conservan y adhieren al portaobjetos. Las muestras conservadas permanecen estables durante varios meses.

D esventajas

• • • • •

La morfología de los huevos y las larvas de helmintos, los coccidios y los microsporidios se conservan de manera inadecuada. El cloruro mercúrico es el principal componente, lo que hace difícil y costoso el desecho del fijador. El reactivo es difícil de preparar en el laboratorio. No puede utilizarse para procedimientos de concentración o equipos de inmunoanálisis. Inadecuado para las tinciones de ácido-alcohol resistencia, safranina y cromótropo.

M IF (m ertiolate-yodo-form ald ehíd o)

Fórmula Las dos soluciones deben prepararse y almacenarse de modo separado y se mezclan inmediatamente antes de su empleo. Solución I Tintura de timerosal, 1: 1 000, 40 mL Formaldehído. solución acuosa al 10% (USP), 5 mL Glicerol, 1 mL Agua destilada, 50 mL Solución II Yoduro de potasio, cristales (Kl), 10 g Yodo, cristales (agregar después de disolver el Klj, 5 g de agua destilada, 100 mL Preparación El vencimiento de cada solución es de varios meses si se mantiene a temperatura ambiente en una botella oscura. En un frasco ampolla, mezclar 9,4 mL de la solución I con 0,6 mL de la solución II justo antes de su uso. Agregar el equivalente de cerca de 1/4 de cuchara de té de heces recién emitidas y mezclar bien con un aplicador. Dejar que la suspensión se estabilice durante 24 horas; luego, con una pipeta, eliminar una pequeña porción de la capa media anaran­ jada pálida y la capa inferior de coloración más intensa para la preparación de frotis. (Continúa)

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Recuadro 22-3

Parasitología

Fijadores habituales para muestras fecales: fórm ulas y preparación (cont.)

Ventajas

• Los componentes del reactivo fijan y tiñen las formas parasitarias. • La preparación es sencilla y perdurable. • Adecuado para los procedimientos de concentración. D esventajas

• Como sucede con el conservante formaldehído. no es adecuado para la preparación de frotis para tinciones tricrómicas permanentes. • La morfología de los trofozoítos de protozoos se conserva de modo inadecuado. • El componente yodo puede interferir en otras tinciones y en la fluorescencia; puede causar distorsión de los protozoos. Acetato de sodio, ácido acético, form aldehído (SAF)

Fórmula Formaldehído (solución al 37-40%). 0,6 mL Ácido acético glacial, 0,3 mL Acetato de sodio, 225 mg Agua destilada, 13,88 mL Preparación Disolver el acetato de sodio en el agua destilada, agregar lentamente las soluciones de ácido acético glacial y formaldehído. mezclar y almacenar. El venci­ miento es de varios meses. Ventajas

• • • •

Fácil de preparar y el reactivo tiene un vencimiento prolongado. Adecuado para las tinciones para ácido-alcohol resistencia, safranina y cromótropo. No interfiere en los equipos de inmunoanálisis. Exento de la sustancia química tóxica cloruro mercúrico.

Desventajas

• Debe utilizarse el aditivo albúmina-glicerina o similar para la adherencia de la muestra al portaobjetos. • Las tinciones permanentes son inferiores a las obtenidas con PVA o el fijador de Schaudinn. Fijador de Schaudinn

Fórmula: Cloruro mercúrico, solución acuosa saturada (HgCl,), 110 g Agua destilada, 1 000 mL Preparación En un vaso de precipitación en baño María colocado en una campana, hervir el cloruro mercúrico hasta su disolución y dejarlo varias horas hasta que se formen cristales. Fijador de Schaudinn (solución madre) Cloruro mercúrico, solución acuosa saturada, 600 mL Alcohol etílico, 95%, 300 mL Agregar 5 mL de ácido acético glacial por 100 mL de solución madre justo antes de su uso. V entajas

• Se conservan bien los trofozoítos y los quistes. • Los frotis teñidos de modo permanente se preparan con facilidad. Desventajas

• • • •

El cloruro mercúrico es el principal componente, lo que hace difícil y costoso el desecho del fijador. La morfología de los huevos y las larvas de helmintos, los coccidios y los microsporidios se conserva de manera inadecuada. Debe utilizarse el aditivo albúmina-glicerina o similar para la adherencia de la muestra al portaobjetos. Menos adecuado que otros conservantes para los procedimientos de concentración.

R ecolección, transporte y procesam iento de las m uestras

r.inguna de las formas parasitarias presentes aún se detectará en la preparación concentrada. Las identificaciones finales de los parásitos no deben hacer>e del examen de preparaciones directas solas; en cambio, deben prepararse frotis teñidos de modo permanente y exami­ narse para confirmar las características morfológicas típicas. Deben prepararse tinciones permanentes sobre cualquiera de ias muestras en las que se prevé un retraso en el transporte. Para ello, se deben mezclar una o dos gotas de la muestra con tres a cuatro gotas de alcohol polivinílico, dispersarlas sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio y dejarlas secar al aire; o puede agregarse una pequeña cantidad a un volumen igual de fijador de Schaudinn en un tubo tapado. Preparados directos en fresco. El procedimiento para los prepa­ rados en fresco es útil para identificar trofozoítos de protozoos, quistes, ooquistes, y huevos y larvas de helmintos. Los prepa­ rados en solución fisiológica se realizan mediante la emulsificación de una pequeña porción de las heces en una gota de solución fisiológica sobre un portaobjetos, luego se cubre la mezcla con un cubreobjetos. De manera ideal deben realizarse dos preparaciones en el mismo portaobjetos, el segundo con yodo. La dilución del preparado debe ser la que se precisa para que se pueda leer un diario a través del portaobjetos. Si el pre­ parado es demasiado espeso, en especial las preparaciones con yodo, las formas parasitarias se tiñen de modo deficiente y puede ser difícil diferenciarlas de los detritos de fondo. Si son demasiado delgadas, las formas parasitarias con cantidades bajas de parásitos pueden diluirse y no advertirse durante la observación microscópica habitual. Las preparaciones con solución fisiológica también se utilizan para observar la movi­ lidad de los trofozoítos. Los quistes de protozoos parecen más refringentes en solución fisiológica que en las preparaciones con yodo. Las estructuras internas de los trofozoítos o los quis­ tes de protozoos suelen estar mal delineados en las preparacio­ nes con solución fisiológica, lo que dificulta la identificación definitiva. Siempre deben prepararse frotis teñidos de modo permanente, en especial si se sospecha Giardia lamblia. Los ooquistes de las especies de Cyclospora pueden obser­ varse en preparaciones en fresco con microscopia de fluores­ cencia UV, en la cual aparecen como estructuras azul intenso (el filtro de excitación UV actúa a 330-365 nm). El uso de microscopia de campo claro y fluorescencia proporciona un método eficaz y fiable para el diagnóstico. En el caso de que no se hayan realizado las preparaciones originales también deben prepararse otros frotis. El yodo se utiliza como una tinción para destacar las estruc­ turas internas de los parásitos intestinales. Deben utilizarse soluciones de yodo al 1% (p. ej., yodo de D ’Antoni, preparado por el agregado de 1 g de yoduro de potasio y 1,5 g de crista­ les de yodo en polvo en 100 mL de agua destilada). El yodo de Lugol, utilizado para las tinciones de Gram, en su potencia completa es demasiado fuerte para teñir las formas de proto­ zoos, pero puede utilizarse como solución recién preparada diluida 1:5 con agua destilada (que tiene el aspecto de un té cargado). Sin embargo, el examen de preparaciones con yodo solas puede no ser satisfactorio porque los trofozoítos ya no son móviles. Ambas preparaciones, en solución fisiológica y con yodo, pueden realizarse en un único portaobjetos, lo que permite la comparación de todas las formas sospechosas. Si se desea, el cubreobjetos puede sellarse. Para ello se apli­ ca una preparación fundida de vaselina y parafina en una rela­ ción 1:1 en los bordes del cubreobjetos mediante la punta de un hisopo de algodón. La parafina y la vaselina deben calentarse a cerca de 70 °C para mezclarlas inmediatamente antes de su

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uso. El sellado se realiza asegurando primero los cuatro ángu­ los con una gota del sellador en caliente para fijar el cubre­ objetos. Luego se esparce una capa delgada de la mezcla alre­ dedor de los bordes. El sellado del cubreobjetos impide el movimiento de los organismos cuando se utilizan objetivos de inmersión y evita el desecado de la preparación. También pue­ den utilizarse otras preparaciones selladoras (p. ej., esmalte de uñas claro). Debe examinarse de modo sistemático toda el área del cubreobjetos con movimiento superpuesto hacia atrás y hacia adelante con objetivo lOx. Si se observa una forma sospecho­ sa, puede ser necesario un aumento mayor a fin de determinar los detalles internos. Métodos de concentración fecal. Los huevos, los quistes y los tro­ fozoítos suelen estar en escasa cantidad en las heces que son difíciles de detectar directamente en los frotis o en las prepa­ raciones en fresco; por consiguiente, siempre deben llevarse a cabo procedimientos de concentración. Los dos métodos utili­ zados con mayor frecuencia son: 1) flotación y 2) sedimenta­ ción. Ambos están destinados a separar los protozoos y los huevos de helmintos intestinales de los detritos fecales excesi­ vos. En el protocolo 22-1 se describen los detalles de estos procedimientos. Técnicas de flotación. Las técnicas de flotación se utilizan con menor frecuencia en los laboratorios clínicos que el proce­ dimiento de sedimentación. Se emplean soluciones que tienen una densidad relativa mayor que los organismos que flotan, de modo que ciertas formas parasitarias se dirigen hacia la parte superior mientras que los detritos fecales descienden hasta el fondo. Con frecuencia se utiliza sulfato de cinc, que tiene una densidad relativa de 1,018. En comparación, la densidad de los protozoos y de muchos de los huevos de helmintos es menor. Por ejemplo, la densidad relativa de los huevos de uncinarias es de 1,055, la de un huevo de Ascaris de 1,110; la de un huevo de Trichiura de 1,150 y la de los quistes de Giardia lamblia de 1,060. La ventaja principal de la técnica de flotación es que produ­ ce un material más limpio, en el cual las formas parasitarias se distinguen con facilidad. Las desventajas más importantes resi­ den en que las paredes de los huevos y los quistes a menudo se colapsan, lo que dificulta la identificación; asimismo, algunos huevos de parásitos no flotan. Los huevos operculados de tre­ mátodos y cestodos pueden no detectarse porque la elevada concentración de sulfato de cinc hace que el opérculo se abra, el huevo se llena con líquido y se hunde en el fondo del tubo. Por esta razón, deben examinarse con el microscopio tanto el filtrado de la parte superior como el sedimento de la parte infe­ rior del tubo. Bartlett y cois.14 describieron una técnica de flotación con sulfato de cinc modificada que puede adaptarse para utilizarla con muestras fijadas con formol. La fijación con formaldehído no sólo evita que los huevos operculados estallen de modo que pueden detectarse en los eluidos de la flotación, sino que tam­ bién evita la distorsión de las formas parasitarias causadas por las soluciones salinas de densidad relativa elevada. Técnicas de sedimentación. Se utilizan soluciones de den­ sidad relativa más baja que los parásitos, de modo que la concentración de huevos, quistes y otras formas se produce en el sedimento. Las técnicas de sedimentación se recomiendan para los laboratorios de diagnóstico general porque son más fáciles de realizar y hay menos posibilidades de errores téc­ nicos. La concentración de parásitos intestinales por técnicas de sedimentación, ya sea por gravedad o centrifugación, conduce

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Parasitología

a una recuperación adecuada de protozoos, huevos y larvas, aunque éstos pueden ser más difíciles de detectar en las prepa­ raciones microscópicas en fresco y en los frotis teñidos, por la comparativamente gran cantidad de detritos en el fondo. En el procedimiento de concentración de formaldehído utilizado en la mayoría de los laboratorios, el éter dietílico se ha reempla­ zado por acetato de etilo. Young y cois.304 demostraron que el acetato de etilo es menos inflamable y peligroso que el éter die­ tílico y que no se ve afectada la capacidad de concentrar los quistes y los huevos. Debe tenerse cuidado durante los pasos de lavado del procedimiento para decantar el sobrenadante; si no, puede perderse una cantidad significativa de formas parasita­ rias. Neimeister y cois.197 han demostrado que Hemo-De (PMP Medical Industries, Irving, TX y distribuido por Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) es un sustituto eficaz del acetato de etilo. Hemo-De es un solvente con una densidad relativa y una solubilidad similares a las del acetato de etilo; no es inflamable ni tóxico y es biodegradable (clasificado como GRAS [generally regarded as safe ; por lo general considerado seguro] por la US Food and Drug Administration). Frotis teñidos de modo permanente. Aunque las preparaciones en fresco temporarias del material fecal para el examen microscó­ pico directo facilitan la detección rápida de parásitos intestina­ les en muestras fecales, los protozoos más pequeños pueden pasarse por alto. Por consiguiente, García96 recomienda prepa­ rar tinciones permanentes como parte del examen de cada muestra de heces remitida para el análisis parasitológico. En particular, puede aumentar la detección y la identificación de Entamoeba histolytica, Giardia lamblia y otras infecciones por protozoos.246 La morfología de los quistes y los trofozoítos se visualiza mejor en los frotis teñidos. Las preparaciones perma­ nentes también pueden realizarse de estos frotis, para usos en docencia y para consultas futuras con especialistas cuando se observan formas inusuales. Los dos tipos de tinciones permanentes más utilizadas para visualizar protozoos intestinales en frotis fecales son: 1) tin­ ción con hematoxilina férrica y 2) tinción tricrómica de Gomori modificada (de Wheatley). La tinción con hematoxili­ na férrica es una técnica popular utilizada para la definición más exacta de la morfología de los parásitos intestinales. El procedimiento es algo difícil de controlar y es mejor si lo rea­ liza una persona con experiencia para lograr resultados ópti­ mos. La tinción tricrómica es muy utilizada en los laboratorios diagnósticos porque su realización es fácil y se obtienen bue­ nos resultados tanto en muestras fecales recién emitidas como én las conservadas con PVA. En el protocolo 22-2 se describe en detalle el procedimiento de tinción tricrómica. Cuando se presentan síndromes diarreicos, en especial en los pacientes inmunosuprimidos o infectados con SIDA, que im­ plican patógenos emergentes nuevos -especies de Cryptosporidium, especies de Cyclospora y especies de Microsporumpueden requerirse otras tinciones en el análisis de las heces líquidas y blandas. Los ooquistes de las especies de Cryptosporidium y de Cyclospora se tiñen bien con la tinción para ácido-alcohol resistencia modificada en la cual se emplea como decolorante ácido sulfúrico al 1%. También se dispone de un método con anticuerpos fluores­ centes para la detección de especies de Cryptosporidium , a menudo en combinación con un anticuerpo monoclonal dirigi­ do contra quistes de Giardia lamblia (detallado más adelante en este capítulo). Recuérdese que para realizar las técnicas para ácido-alcohol resistencia y anticuerpos monoclonales deben utilizarse materiales recién emitidos o fijados con formaldehí­ do, no pueden utilizarse muestras conservadas con PVA.93

Los microorganismos diminutos de las especies de Microsporum no se colorean bien con la mayoría de las tincio­

nes. La tinción de Weber279 y la de Ryan232 se han utilizado con éxito en los laboratorios clínicos. Más recientemente, en los CDC se ha desarrollado la tinción con cromótropo R. En esta tinción, la concentración del componente cromótropo 2R ha sido aumentada 10 veces para facilitar la penetración del colo­ rante en las formas parasitarias diminutas. Es importante pre­ parar un frotis delgado (gota fina) utilizando alrededor de 10 (iL de una suspensión de heces no concentradas fijada con for­ maldehído al 10% sobre un portaobjetos (también pueden uti­ lizarse concentrados con formol, pero no aumenta de manera sustancial la cantidad de microorganismos, que no se concen­ tran bien, por campo microscópico). El procedimiento rápido cromótropo-Gram en caliente es una tinción alternativa rápida, fiable y simple de realizar.190 Para esta técnica, primero se efec­ túa una tinción de Gram sobre el frotis de gota fina, pero en lugar de agregar safranina, al portaobjetos se le coloca una tin­ ción cromótropa calentada (50-55 °C) durante al menos un minuto. Las esporas de microsporidios aparecen como estruc­ turas ovoideas violetas contra un fondo verde pálido. En cada corrida de tinción debe agregarse un portaobjetos control de esporas de microsporidios provenientes de la muestra conser­ vada con formaldehído al 10%. Este control proporciona un punto de referencia para distinguir las esporas verdaderas de otros elementos similares. Estas tinciones se describen en deta­ lle más adelante en este capítulo. Examen de muestras intestinales no fecales

Los parásitos como Giardia lamblia y Strongyloides sterco­ ralis son habitantes habituales del duodeno y el yeyuno, por lo que para demostrarlos pueden requerirse muestras de conteni­ do duodenal. Se realiza una preparación en fresco del material aspirado y se la examina con el microscopio. Si se observan organismos móviles puede resultar útil una segunda prepara­ ción con yodo para destacar las estructuras internas, de modo que pueda hacerse la identificación definitiva. El contenido duodenal puede examinarse con la prueba del hilo.148 El elemento utilizado es una cápsula de gelatina pesada que contiene un hilo de nailon de cola larga (comercializado como Enterotest, por Hedeco, Palo Alto, CA). Un extremo del hilo que sobresale de la cápsula se adhiere a la cara del pacien­ te. Se deglute la cápsula y por el peristaltismo el hilo pesado se dirige al duodeno. Después de 4 a 6 horas, se elimina el hilo y todo el moco teñido de bilis adherido al extremo distal se utili­ za para realizar preparaciones en fresco y frotis teñidos para estudios microscópicos. El examen del contenido duodenal debe realizarse sólo en los pacientes con signos y síntomas sugestivos de giardiasis. McHenry y cois.184 obtuvieron aspira­ dos duodenales de 144 pacientes a quienes se les estaban reali­ zando endoscopias por otras razones. Giardia lamblia se aisló sólo en un paciente (0,7%). La infección por Enterobius vermicularis del conducto rec­ tal se detecta mejor mediante la cinta engomada de celulosa. Para efectuar el examen se aplica la superficie adhesiva de una cinta de celulosa transparente de 7,5 a 10 cm sobre los pliegues perianales de un paciente con presunta infección por oxiuros. Las muestras recogidas a la mañana temprano, enseguida des­ pués de despertarse y antes de bañarse, son óptimas para la detección de los huevos. Para proporcionar un apoyo firme a la cinta puede usarse un bajalengua. La cinta se coloca con el lado adhesivo hacia el portaobjetos y se examina para determinar los huevos característicos de E. vermicularis. Para obtener la

R ecolección, transporte y procesam iento de las m uestras

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muestra puede utilizarse un “aplicador” desechable disponible en el comercio, con una superficie plana y pegajosa (“Swube”"Falcon 2012 disposable applicator”; Falcon, Oxnard, CA). En la figura 22-1 se ilustra el aspecto microscópico de una prepa­ ración positiva. En algunos casos de infección por Entamoeba histolytica puede ser necesario realizar exámenes histológicos de biopsia del sigmoides, cuando los exámenes repetidos de heces no revelan los organismos. El procesamiento de estas muestras se describe más adelante en este capítulo. Examen de muestras extraintestinales ESPUTO

En raras ocasiones, los estadios larvarios de uncinarias, Ascaris lumbricoides o Strongyloides stercoralis o los huevos de P. westermani se ven en muestras de esputo. La preparación

en freso directa con solución fisiológica suele ser suficiente. Si el esputo es extraordinariamente mucoide o espeso, para licuar la muestra puede agregarse una cantidad igual de A'-acctil-Lcisteína al 3% o de hidróxido de sodio al 3% (o cloro de lejía doméstica pura) que se mezcla durante 2 o 3 minutos y luego se centrifuga. Tras la centrifugación, con el sedimento se reali­ za la preparación en fresco para el examen microscópico. Si el examen de la muestra de esputo se retrasa por cualquier razón, debe agregarse formaldehído al 10% para conservar los huevos o las larvas de helmintos.

Figura 22-1 Microfotografía de la preparación realizada con cinta de celulo­ sa engomada de un paciente en el que se sospecha oxiuriasis, que ilustra el resultado positivo con varios huevos ovales, de paredes delgadas de Enterobius vermicularís.

inmediato en un fijador, como la solución de Schaudinn. Pue­ den realizarse tinciones tricrómicas u otras. La porción restan­ te del material de biopsia se remite entonces para examen his­ tológico.

ORINA Y LÍQUIDOS CORPORALES

En el caso de muestras con volúmenes grandes es necesario dejarlas reposar durante 1 o 2 horas. Luego se toman alrededor de 50 mL del fondo del sedimento obtenido por centrifugación. El sedimento altamente concentrado puede entonces observar­ se mediante una preparación directa en fresco. Si se observan elementos que sugieren parásitos, es útil el agregado de yodo o teñir la preparación para destacar las estructuras internas diag­ nósticas. BIOPSIAS Y ASPIRADOS DE TEJIDOS

En las úlceras cutáneas (como las observadas en la leishmaniasis), los nodulos cutáneos (observados en la oncocercosis y en las infecciones por Mansonella streptocerca ) y los ganglios linfáticos se puede realizar aspiración con aguja fina o biopsia. En los casos en los que se sospecha leishmaniasis cutánea, el material debe aspirarse con aguja y jeringa desde el fondo del lecho de la úlcera. Puede obtenerse un “corte de piel” para diagnosticar la leishmaniasis subcutánea mediante la toma de una porción pequeña de piel con una pinza o elevándola con la punta de una aguja. La punta de un “cono” pequeño de piel se corta con un instrumento quirúrgico afilado o con una hoja de afeitar. El corte debe ser lo suficientemente profundo para incluir la papila dérmica; sin embargo, no tanto como para oca­ sionar sangrado. Pueden indicarse biopsias de las mucosas rec­ tal y vesical para identificar huevos característicos en casos de sospecha de esquistosomiasis intestinal o urinaria. Todo el tejido de la biopsia debe remitirse al laboratorio sin el agregado de fijador formol. Si no puede evitarse un retraso en el procesamiento, las muestras deben colocarse en el fija­ dor PVA. Si la muestra es blanda, se raspa una porción peque­ ña y se coloca en una gota de solución fisiológica para el exa­ men en fresco. También deben prepararse frotis por impronta, realizados apretando una superficie de corte reciente del teji­ do contra la superficie de un portaobjetos, el cual se coloca de

RASPADOS 0 BIOPSIA DE CÓRNEA

Los raspados de córnea son útiles para hacer el diagnóstico en casos de sospecha de queratitis por Acanthamoeba. Los ras­ pados de córnea, obtenidos por un médico, se colocan sobre un portaobjetos y se fijan en alcohol metílico durante 3-5 minutos. García96 sugiere que la tinción debe realizarse con blanco de calcoflúor, un blanqueador textil que se adquiere en el comercio. Se disuelve en agua destilada una solución de blanco de calcoflúor al 0,1% y azul de Evans al 0,1%. Se agre­ gan algunas gotas de esta solución en el frotis fijado con metanol durante 5 minutos. Se inclina el portaobjetos y el líquido se escurre en una toalla de papel absorbente; se agrega un cubreobjetos y se lo examina para investigar la presencia de quistes de amebas de color verde manzana (los trofozoítos no se tiñen), los cuales presentan una fluorescencia verde manza­ na o blanco azulada de acuerdo con la combinación de luz excitadora/filtro utilizada. BIOPSIA DE MÚSCULO

Las formas larvarias en espiral características de Trichinella spiralis se demuestran mejor en una preparación tomada de una biopsia de músculo esquelético (véase lámina en color 2211G). García96 sugiere tratar el material de biopsia con un líquido de digestión antes del examen. Este líquido se prepara mediante el agregado de 5 g de pepsina a una mezcla de 1 000 mL de agua destilada y 7 mL de C1H concentrado. El tejido se coloca en un frasco Erlenmeyer de boca ancha y el líquido de digestión se agrega en la relación de 1 parte de tejido y 20 par­ tes de líquido. La mezcla de digestión se mantiene a 37 °C durante 12 a 24 horas. Después de la digestión, se examinan con el microscopio algunas gotas del eluido para determinar la presencia de larvas. Si no se observan, se debe centrifugar una alícuota de 15 mL de la mezcla y se examina el sedimento.

1202

C APÍTULO 22

Parasitología

SANGRE

Se coloca una gota de la sangre anticoagulada sobre un por­ taobjetos al que se le agrega un cubreobjetos; la muestra se exa­ mina con el microscopio para evaluar la presencia de formas extraeritrocíticas grandes, a menudo móviles, como tripanosomas y microfilarias. La presencia de microfilarias en la sangre circulante tiene una marcada periodicidad que depende de la especie involucrada; por consiguiente, es crítico el momento de la recolección de la muestra. Si se sospecha una infección por filarías, los momentos óptimos para la recolección a fin de demostrar su presencia son: Loa loa, al mediodía (10 a. m. a 2 p. m.); Brugia o Wuchereria, a la noche, después de las 8 p. m. Mansonella, en cualquier momento; Onchocerca, en cualquier momento. Cuando se examina por primera vez un frotis de sangre teñi­ do, se lo debe revisar con bajo aumento (250x o menos) en busca de las formas parasitarias más grandes que pueden pasar­ se por alto si se utiliza sólo microscopia de inmersión. La mor­ fología de los plasmodios intraeritrocíticos (paludismo, Babesia, Theileria ) se observa mejor en los frotis de sangre periférica teñidos con Wright o con Giemsa. Los frotis de sangre preparados para la detección de palu­ dismo deben recolectarse específicamente para este propósito y no deben permanecer en la bandeja durante la ronda de reco­ lección. Los frotis deben prepararse con muestras de sangre anticoagulada lo antes posible después de la recolección, ya que la exposición prolongada al anticoagulante puede distor­ sionar la morfología de los esquizontes maduros y los gametocitos. Asimismo, los estadios sexuales continúan su desarrollo durante el almacenamiento de la muestra hemática en el ambiente templado del laboratorio. Con la exposición de la muestra de sangre al aire, los microgametocitos pueden dar ori­ gen a los microgametos (exflagelación), éstos se liberan al plasma y pueden confundirse microscópicamente con especies de Borrelia. Los merozoítos, en particular los de Plasmodium vivax , pueden liberarse de los esquizontes maduros y reinvadir otros eritrocitos, donde pueden aparecer con un aspecto similar a las pequeñas formas en “anillo de sello” de Plasmodium falciparum. Por consiguiente, es preferible la recolección de muestras de sangre capilar. Deben prepararse frotis de sangre de gota fina y gruesa. El frotis de gota fina, utilizado sobre todo para la identificación definitiva de especies de plasmodios y otros parásitos intraeri­ trocíticos, se prepara exactamente igual que el utilizado para realizar el recuento diferencial de leucocitos. Se efectúan al menos dos frotis por paciente. Los frotis de gota fina se forman con sangre esparcida en una capa de modo tal que el espesor de la capa disminuye progresivamente hacia el borde esfumado o “cola”, donde los eritrocitos no se superponen; este extremo debe tener 1,5 a 2 cm de largo. Hay que tener cuidado al pre­ parar un frotis de gota fina para ver que la cola esté esparcida en forma regular y no presente espacios vacíos, rayas u otros artefactos de técnica. La preparación de los frotis de gota fina y gruesa se describe en el protocolo 22-3. Los frotis de gota gruesa constan de una capa gruesa de eri­ trocitos deshemoglobinizados (lisados). Un frotis de gota gruesa adecuado es aquel que apenas permite leer las palabras de un periódico a través de la película. Estos frotis contienen una concentración 30x de elementos parasitarios cuando se compara con un área igual de una gota fina. Por lo tanto, la preparación de frotis de gota gruesa tiene una utilidad particu­ lar para la detección de los parásitos del paludismo en las infecciones leves; sin embargo, la morfología de los trofozoí­ tos muchas veces está afectada, lo que dificulta la identifica­

ción de especie. Si se observan elementos sospechosos de palu­ dismo, debe prepararse una gota fina para hacer la identifica­ ción de la especie. El frotis de gota gruesa se prepara colocando dos o tres gotas de sangre en la superficie de un portaobjetos para cubrir un área del tamaño de una moneda de diez centavos de dólar. La sangre debe obtenerse por punción del pulpejo del dedo y dejar que fluya libremente; debe evitarse presionar el dedo. La gota se debe revolver continuamente durante alrededor de 30 segun­ dos para evitar la formación de coágulos de fibrina. Hay que dejar el portaobjetos sobre una mesada plana y permitir que se seque por completo al aire, ya que cualquier resto de humedad puede causar su desprendimiento. El tiempo de secado será de al menos 30 minutos o más prolongado si el clima es húmedo. El tiempo de secado puede acortarse si se lo ventila con un aba­ nico o con un secador de pelo (en la posición “frío”). La posi­ bilidad de desprendimiento aumenta en los frotis hechos con sangre anticoagulada. Una vez seca la película, debe Usarse la sangre colocando el portaobjetos en agua o solución buffer inmediatamente antes de la tinción. Si se utiliza sangre anticoagulada (que en la actualidad es la práctica habitual), no es necesario revolver la muestra porque no se forman filamentos de fibrina. El EDTA potásico es el anticoagulante de elección. García (comunicación personal) describió una técnica en la cual pueden realizarse los frotis de gota gruesa y fina en el mismo portaobjetos. Para ello se colo­ can dos o tres gotas de sangre anticoagulada en uno de los extremos del portaobjetos y luego, con el palillo de un aplicador, se extiende la gota sobre la superficie del resto del porta­ objetos mediante un movimiento rodante continuo. Se formarán ambas áreas, fina y gruesa, en las intersecciones de los círculos concéntricos. Si las muestras iniciales son negativas para pará­ sitos, deben tomarse al menos tres muestras sucesivas. Ambos frotis deben teñirse lo antes posible después de la preparación (siempre dentro de las 48 horas) con la técnica de Giemsa o de Wright. Cabe recordar que el pH del colorante y el del buffer deben controlarse con cuidado entre 7 y 7,2; los colorantes utilizados en el laboratorio de hematología tienen un pH cercano a 6,8, lo que elimina la posibilidad de observar los gránulos de Schuffner. Debe evitarse el uso de instrumentos de tinción automatizados. Los frotis de gota gruesa pueden reque­ rir un tiempo de exposición algo más prolongado que el emple­ ado en las preparaciones de gota fina. Se recomienda examinar al menos 300 campos microscópi­ cos de objetivo de inmersión con un aumento 1 OOOx en gota fina y alrededor de 100 campos en los de gota gruesa. La can­ tidad de microorganismos puede ser muy escasa en los pacien­ tes con recidivas, en los que presentan infección temprana y en los que recibieron un tratamiento inadecuado o profilaxis par­ cial. En estos casos, debe duplicarse la cantidad de campos examinados. La interpretación adecuada del frotis de gota gruesa requiere considerable experiencia y la realización de controles positivos para su comparación.

Identificación y diferenciación de parásitos Aunque ciertos signos y síntomas clínicos pueden sugerir la posibilidad de una enfermedad parasitaria, el diagnóstico defi­ nitivo se realiza mediante la demostración del organismo cau­ sal en muestras recolectadas de manera adecuada. Como muchos artefactos de técnica pueden tener similitud con formas parasitarias, la identificación final siempre debe hacerse sobre la base de criterios morfológicos bien establecidos. Las inter­

Identificación y diferenciación de parásitos

pretaciones microscópicas, en particular, no pueden basarse en conjeturas y no debe darse un diagnóstico de laboratorio de una enfermedad parasitaria hasta que puedan demostrarse con cla­ ridad y de modo objetivo las características de identificación adecuadas. En la lámina en color 22-1 se muestran artefactos seleccionados que tienen características que sugieren parásitos verdaderos. Un problema con el que se enfrenta tanto el estudiante nuevo como el docente de parasitología clínica es la falta de un crite­ rio unificado para la taxonomía de los parásitos. En este libro se sigue el enfoque tradicional de separar los parásitos en diver­ sos grupos morfológicos (protozoos, nematodos, cestodos, tre­ mátodos, etc.) con pleno conocimiento de que puede perderse cierto grado de correlación entre la clínica y el laboratorio. Por ejemplo, aunque las uncinarias y los oxiuros se incluyen desde el punto de vista taxonómico en los nematodos, existen consi­ derables diferencias en lo que respecta a sus ciclos vitales, los modos de infección y la gravedad de las enfermedades que cau­ san. De hecho, cada especie de parásito es única y los intentos de agruparlos con cualquiera de los criterios siempre conllevan algún grado de deficiencia. El microscopio para el examen de los parásitos debe tener un ocular al cual se le adapta un micrómetro ocular calibrado con precisión. En el protocolo 22-4 se presenta el procedimiento de calibración del micrómetro ocular. La capacidad de medir con exactitud el tamaño de las formas parasitarias encontradas en las muestras clínicas suele ser vital para la identificación correcta de los parásitos. En las descripciones que siguen se destacan las variaciones de tamaño de varias formas parasita­ rias diagnósticas. Ciclos vitales de los parásitos humanos

Muchos de los ciclos vitales de los parásitos humanos se incluyen en las secciones sobre identificación de laboratorio que siguen. No se pretende que los estudiantes memoricen las fases de cada ciclo vital; antes bien, estas descripciones son úti­ les para indicar las formas infectantes, invasivas y diagnósticas de cada parásito, un conocimiento de lo que es necesario para el diagnóstico. La figura 22-2 se diseñó para proporcionar una orientación global de los ciclos vitales de los parásitos importantes para los seres humanos. Los parásitos pueden dividirse en tres grupos principales sobre la base de sus ciclos de vida: 1) los que no tie­ nen huésped intermediario, 2) los que utilizan un huésped intermediario y 3) los que requieren dos o más huéspedes inter­ mediarios. Los parásitos que no tienen huésped intermediario se trans­ miten directamente entre los seres humanos (o entre los ani­ males) a través de alimentos o agua contaminados por heces. Esto es cierto para la mayoría de los protozoos y para ciertos nematodos como Enterobius vermicularis y Trichuris tríchiura. La transmisión interhumana ocurre por la transferencia de quistes o huevos que pueden sobrevivir en las condiciones ambientales externas y contaminan los alimentos o los sumi­ nistros de agua. Los huevos de Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura y las uncinarias requieren un período de maduración después de la eliminación por las heces en el ambiente antes de convertirse en infectantes. El ciclo vital de Ascaris lumbricoi­ des, aunque sigue la vía fecal-oral sin necesidad de un huésped secundario, es más complejo porque después de la eclosión en el intestino delgado, las larvas ingeridas ingresan en la circula­ ción a través de los linfáticos y pasan por los pulmones antes de ser deglutidas con las secreciones orales. El modo de infec­

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ción de las uncinarias y de Strongyloides stercoralis no es a tra­ vés de la vía fecal-oral, sino la penetración directa de la piel descubierta de larvas filariformes que se encuentran en el estiér­ col o en el suelo contaminado. Los parásitos que precisan un huésped intermediario suelen involucrar un mamífero de gran tamaño, roedores, crustáceos o insectos vectores dentro de los cuales completan sus ciclos vitales, un proceso que puede ser simple o complejo. Por ejem­ plo, el intestino humano actúa como el huésped primario para los parásitos adultos de Taenia solium y Taenia saginata. El cerdo y la vaca, respectivamente, son huéspedes secundarios para estas tenias, cuando los adultos no habitan el intestino; en ellos, las larvas residen en el músculo esquelético. Los seres humanos se infectan mediante la ingestión de carne infestada, carne con cisticercosis. Por último, las larvas eclosionadas encuentran su camino hacia el intestino para madurar en pará­ sitos adultos. La forma larvaria de ciertas tenias también puede causar una enfermedad' en los seres humanos conocida como cisticercosis. Cuando se ingieren huevos de Taenia solium, por ejemplo, estas larvas de primer estadio pueden enquistarse den­ tro del hígado, el cerebro y otros órganos. La hidatidosis es un segundo ejemplo de enfermedad larvaria quística en los seres humanos, en la cual los cánidos, como huésped primario o defi­ nitivo, albergan la tenia Echinococcus en el intestino. En el ciclo vital normal de la hidatidosis, la oveja suele actuar como huésped secundario; en éste, tras la ingestión de huevos infec­ tantes se forman las lesiones quísticas, sobre todo en el hígado y probablemente también en otros órganos. El ciclo vital del parásito se completa cuando perros y otros carnívoros ingieren visceras de ovinos muertos infectados por la larva. Los parásitos que implican a crustáceos e insectos siguen una serie compleja de estadios de desarrollo antes de que se libere la forma infectante. Por ejemplo, en el paludismo, los plasmodios sufren la gametogénesis sexual dentro del mos­ quito antes de que los esporozoítos infectantes sean inoculados de nuevo al huésped humano. Un ciclo vital similar es caracte­ rístico de otras infecciones parasitarias de la sangre, como tri­ panosomiasis, leishmaniasis y filariasis. Los parásitos que requieren dos huéspedes intermediarios (Diphyllobothrium latum y la mayoría de los tremátodos) siguen ciclos vitales similares. Los huevos eliminados por el parásito adulto que infectan al huésped primario eclosionan en un ambiente acuoso adecuado y liberan formas ciliadas que nadan libremente denominadas miracidios. Estos son muy móviles y se desplazan con mucha rapidez (2 mm/s). Por la acción de fotorreceptores, receptores del tacto y quimiorreceptores, los miracidios son atraídos a su huésped caracol complementario. La adherencia tiene lugar en algunas horas porque su vida es muy breve. En su parte ante­ rior tienen glándulas que segregan enzimas proteolíticas para atravesar el tegumento del caracol. La penetración en el cara­ col se produce en alrededor de 30 minutos, tiempo durante el cual el miracidio pierde su epitelio ciliado. Una vez en su inte­ rior, cada miracidio se redondea y forma el estadio de esporoquiste, en el cual tiene lugar la multiplicación en estructuras similares a quistes conocidas como redias. Por lo tanto, un único miracidio se multiplica en numerosas cercarías infeccio­ sas que nadan libremente. Las cercarías, de varias formas de acuerdo con la especie, cuando se liberan del caracol buscan e invaden la carne de crus­ táceos o peces, por la acción de enzimas producidas por diversas glándulas de penetración parabucales. Mediante la ingestión de las metacercarias contenidas en la carne de cangrejo o de pesca­ do cruda o poco cocida también se infecta un segundo huésped.

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C A P ÍT U L O 2 2

Parasitología

Sin huésped interm ediario

Un huésped interm ediario

Dos huéspedes interm ediarios

fi C erdo

i

ñ

Taenia solium Trichinelia spiralis

k Crustáceo Vaca

Taenia saginata

n

8

M iracidio

C ercaría C aracol

Perro

P aragonim us w esterm ani E chinococcus gra n u lo su s

Enterobius vermicularis Trichuris trichiura Ascaris lumbricoides' U ncin adas* Strongyioides stercoralis Hymenolepsis nana Entam oeba histolytica y otras am ebas Balantidium coli Giardia lamblia Chilomastix mesnili Trichomonas hominis

Pulga

D yp ilidiu m caninum H ym e n ole p is dim inuta

C yciops

M iracidio

D ip hyllo bothrium

V inchuca ■ (chinche reduvídea)

M osquito

C aracol

* R equieren un período de m aduración d espués de su elim inación antes ser infec­ ciosos

Trypanosom a cruzi I i

Esp. de P lasm odium W uchereria ban cro fti B rugia m alayi Flebótom o: esp. de Leishm ania

+

Especies de S chistosom a

U

C opépodo

Caracol

C lono rchis s in en sis

D racuncuiis m edinensis

n * M osca

Tsetse: especies de Tripanosom a C hrysops: Loa toa S im ulium : O nchocerca volvulus

P lanta

C ercaría

M iracidio C aracol

E sp ecies de Fasciola

Figura 22-2 Esquema general de los ciclo vitales de parásitos de importancia para los seres humanos. Las especies de parásitos se dividen de acuerdo con su nece­ sidad de ningún huésped intermediario, de uno o de dos. También se incluyen diagramas de los huéspedes intermediarios frecuentes.

Protozoos intestinales

En el ciclo vital de Fasciola y especies de Fasciolopsis, las cer­ carías se adhieren a las plantas acuáticas como metacercarias encapsuladas e inactivas. Los seres humanos se infectan al inge­ rir plantas acuáticas crudas o cocidas de modo deficiente sobre las cuales están adheridas estas metacercarias.

Protozoos intestinales En la actualidad se reconocen cuatro amplios grupos de pro­ tozoos intestinales, como se mencionan a continuación: 1) las amebas, 2) los flagelados, 3) los ciliados y 4) los coccidios. La tarea de aprender las características diferenciales de estos pro­ tozoos es algo menor cuando se comprende que sólo algunas especies dentro de cada uno de estos grupos principales son de importancia médica. De acuerdo con la clasificación propuesta por Levine y cois.163los siguientes son los protozoos intestina­ les que presentaremos aquí: Amebas Entamoeba histolytica (Entamoeba hartmanni) (Entamoeba dispar) Entamoeba coli (Entamoeba polecki) Iodamoeba bütschlii Endolimax nana

Flagelados Giardia lamblia Chilomastix mesnili Dientamoeba fragilis * Especies de Trichomonas

Ciliados Balantidium coli

Coccidios Especies de Cryptosporidium Isospora belli Especies de Sarcocystis Especies de Cyclospora Especies de Microsporidium Amebas intestinales

Tres géneros de amebas pueden habitar el intestino de los se­ res humanos: Entamoeba, Iodamoeba y Endolimax. Los miem­ bros de los últimos dos géneros, es decir, Iodamoeba bütschlii y Endolimax nana, suelen considerarse no patógenos. Desde la perspectiva del laboratorio es importante identificarlos de modo objetivo en las muestras de heces y no confundirlos con otros protozoos que pueden causar enfermedad. De las amebas, sólo

* Dientamoeba fragilis, antes clasificada como una ameba, en la actualidad se considera un flagelado, específicamente en el género Histomonas o en el géne­ ro Trichomonas, sobre la base de estudios inmunológicos y estructurales por microscopia electrónica en los últimos años. Como en la mayoría de los labo­ ratorios clínicos se utiliza el microscopio óptico para examinar las muestras, el cambio actual en la clasificación de Dientamoeba fragilis es de valor más teó­ rico que práctico. La tarea importante es aislar el organismo en pacientes con síntomas intestinales y realizar una identificación precisa.

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Entamoeba histolytica se considera potencialmente patógena

para los seres humanos. Al comienzo de la capacitación, los estudiantes deben desarrollar un enfoque por el cual puedan identificar, sin dudas, este parásito cuando se observa en mues­ tras de heces. La ameba E. hartmanni que “imita” a Entamoeba histolytica y la especie recientemente designada como Entamoeba dispar, que se describirá luego con más detalle, se han encontrado como no patógenas y de poca importancia clí­ nica cuando se observan en muestras de heces. AMEBIASIS Y ENTAMOEBA HISTOLYTICA

La disentería amebiana está causada por las cepas patógenas de E. histolytica. El organismo se transmite de modo directo por la vía fecal-oral a través de suministros de agua o alimen­ tos contaminados, ya sea en forma directa por las deposiciones de las personas infectadas o indirecta por cucarachas o moscas que actúan como vectores mecánicos. Las mejoras en las medi­ das de higiene y las condiciones socioeconómicas, y las altera­ ciones en prácticas específicas, como el lavado de las manos, el control de las moscas, las mejoras en la calidad del agua y las instalaciones sanitarias son objetivos a corto y a largo plazo en los que lamentablemente fallan la mayoría de las áreas endé­ micas del mundo. Se estima que entre el 5% y el 50% de los individuos de áreas endémicas portan Entamoeba histolytica en el intestino. De éstos, el 10% manifestará la enfermedad intes­ tinal disentérica e invasiva y el 0,5% presentará la enfermedad extraintestinal, con mayor frecuencia abscesos hepáticos. De estos últimos, entre el 2% y el 10% fallece. La tasa de mortali­ dad puede ascender al 70% en personas con colitis fulminante. Los síndromes clínicos asociados con infecciones por E. his­ tolytica se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-1. El ciclo vital de E. histolytica, como prototipo de todas las amebas intestinales, se muestra en la figura 22-3. Identificación por el laboratorio. Las formas parasitarias verdade­ ras deben diferenciarse de una diversidad de artefactos del fondo que se prestan a confusión y que pueden encontrarse en las preparaciones microscópicas en fresco y en los frotis de heces. Welsh285 indica que el diagnóstico correcto de amebiasis reside en las observaciones precisas del personal de laboratorio hábil y lamenta la alta frecuencia de excesos o defectos en la identificación de amebas en muestras de heces. Se citaron varios estudios que indican que hasta en un tercio de los labo­ ratorios de los Estados Unidos y otros países, E. histolytica no se identificó de manera correcta; además, varios brotes de pre­ sunta amebiasis investigados por los CDC fueron alarmas fal­ sas debido a errores en la identificación del laboratorio. Los granos de polen, los elementos vegetales digeridos de manera incompleta y las células somáticas derivadas del huésped están entre los artefactos que pueden prestarse a confusión. En la lámina en color 22-1 se ilustran varios de los artefactos encon­ trados con frecuencia. En particular, los quistes amebianos deben diferenciarse de los leucocitos polimorfonucleares activos que presentan dos o más lóbulos; sin embargo, el citoplasma de los leucocitos es grueso sin evidencia de un cariosoma distintivo y la membrana nuclear es gruesa sin evidencia de cromatina adherida (lámina en color 22-2A). Los microscopistas pueden reducir las posibi­ lidades de error asegurándose de que las estructuras parasita­ rias se identifican objetivamente antes de realizar una identifi­ cación positiva. Si existe alguna duda, se debe revisar y buscar formas más convincentes en la misma preparación, examinar preparaciones adicionales de la misma muestra o solicitar la recolección de muestras de heces nuevas.

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C A PÍTU LO 22 Parasitología

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 22-1 Amebiasis Los síndromes mórbidos secundarios a la infección por E. histolytica han sido señalados por Guerrant. 115 Casi todos los seres humanos infec­ tados por E. histolytica (80-99%) son asintomáticos. determinado por la observación de quistes excretados en los exámenes de cribado fecales o de los datos de encuestas serológicas. Una mayoría de los que presentan síntomas tienen enfermedad limitada al aparato digestivo, luego de un período de incubación promedio de 1 a 4 semanas después de la infec­ ción. Las lesiones en el intestino grueso típicas se denominan úlceras en "botón” porque los trofozoítos que penetran a través de la mucosa son incapaces de digerir la musculatura de la pared intestinal y, por consi­ guiente, se extienden lateralmente a lo largo de la submucosa. (En la lámina en color 22-2D. se ilustran varios trofozoítos en la submucosa). Los síntomas de presentación habituales son dolor en la porción inferior del abdomen, fiebre de baja intensidad y diarrea sanguinolenta con tenesmo o sin él. El embarazo, la desnutrición, las enfermedades metabólicas de base y el tratamiento con corticosteroides predisponen a la enfermedad más grave. Las complicaciones son relativamente infrecuen­ tes, aparecen en el 1% al 4% de los casos e incluyen perforación intesti­ nal y peritonitis. Se han informado casos de amebomas paracecales que a veces forman una masa inflamatoria anular que simulan un carcinoma de colon. La amebiasis extraintestinal sucede con frecuencia variable en dife­ rentes regiones geográficas. En México, la enfermedad invasiva se manifiesta en uno de cada cinco individuos infectados, en comparación con sólo 1 de cada 100-1 000 en los Estados Unidos. El comienzo de los síntomas puede ser en el transcurso de días después del episodio agudo de disentería, o retrasarse meses o incluso años. El hígado es el órgano extraintestinal afectado con mayor frecuencia. Adams y McLeod3 informaron que hasta en el 50% de los casos de abscesos amebianos hepáticos falta el antecedente de amebiasis intestinal y no pueden detectarse trofozoítos ni quistes en las muestras de heces. Los síntomas son pérdida de peso, fiebre de baja intensidad, debilidad y sensación de malestar en el cuadrante superior derecho y dolor provocado a la palpa­ ción entre las costillas. La anemia, la leucocitosis y el aumento de las concentraciones de la fosfatasa alcalina son otros signos que apoyan el diagnóstico. Éste suele hacerse mediante la observación del defecto característico de gran tamaño y único en el lóbulo derecho observado en la gammagrafía hepática. Es infrecuente la extensión directa a la pleura o al pericardio, o la presencia de focos metastásicos en el cerebro, el pulmón o el riñón.

Una vez que se determina que la forma observada en una muestra de heces es realmente ameba, sea trofozoíto o quiste, hay que investigar si los núcleos tienen cromatina depositada en la membrana externa, lo que da el aspecto de un anillo teñi­ do densamente (lámina en color 22-2B). Este anillo de cromatina es característico del núcleo tipo “E n ta m o e b a Los núcleos de amebas que pertenecen a otros géneros, lodamoeba y Endolimax, carecen de esta disposición periférica de la cromatina y se asemejan más a una “bola en un hoyo” (lámina en color 22-2 I, J y K). ENTAMOEBA HISTOLYTICA Y ENTAMOEBA COLI Criterios microscópicos definitivos para la diferenciación entre Entamoeba histolytica / Entamoeba coli

• Los trofozoítos de E. histolytica presentan una movilidad unidireccional, es decir, emiten seudópodos a lo largo de un

único plano y realmente salen del borde del campo del foco cuando se observan en una preparación microscópica en fresco. • Por otra parte, los trofozoítos de Entamoeba coli emiten seu­ dópodos en múltiples planos y se mueven sin rumbo en una dirección y luego en otra. • Los trofozoítos de E. histolytica también tienen la capacidad singular de ingerir eritrocitos; es muy raro que los eritrocitos ingeridos se observen en los trofozoítos de Entamoeba coli. Gonzalez-Ruiz y cois.104 hallaron que las cepas eritrofagocíticas de E. histolytica siempre muestran un patrón enzi­ mático o zimodemo patógeno. Los autores concluyeron que la fagocitosis de eritrocitos es casi 100% específica para Entamoeba histolytica y cuando se observa en preparacio­ nes en fresco de heces es pronóstico de infección con una cepa invasiva. • Un quiste tipo Entamoeba que tiene más de cuatro núcleos descarta E. histolytica (lámina en color 22-2F). Criterios microscópicos secundarios para la diferenciación entre Entamoeba histolytica y Entamoeba coli. Todas las otras caracte­

rísticas de identificación entre estas dos amebas son secunda­ rias, pueden ser variables y sólo conducen a una identificación presuntiva cuando se observan. • Los trofozoítos y los quistes de Entamoeba coli (15-50 |_un y 10-35 Lim, respectivamente) en promedio son más grandes que los de Entamoeba histolytica (12-40 |_um y 10-20 Lim, respectivamente); sin embargo, hay suficiente superposición en el tamaño para simplificar la importancia de esta obser­ vación. • Los cariosomas intranucleares de E. histolytica, si se obser­ van en trofozoítos o en quistes, tienden a ser diminutos y se ubican en la región central (lámina en color 22-2B), a dife­ rencia de los cariosomas relativamente más grandes y con localización excéntrica en Entamoeba coli (lámina en color 22-2E). • El anillo de cromatina nuclear de E. histolytica está disperso de manera uniforme y se asemeja a cuentas (lámina en color 22-2B), a diferencia de la distribución borroneada observada en Entamoeba coli (lámina en color 22-2E). • El citoplasma de los trofozoítos de E. histolytica tiende a ser liso o finamente granular (debido a las poderosas enzimas proteolíticas que digieren por completo a las partículas fagocitadas) (lámina en color 22-2B), a diferencia del citoplasma “sucio” de los trofozoítos de Entamoeba coli (lámina en color 22-2E). • Aunque las barras de los cuerpos cromatoides sólo se obser­ van en el 10-15% de los quistes, cuando están presentes, en E. histolytica (y E. hartmanni) tienen extremos lisos y redon­ deados (lámina en color 22-2H) en contraste con el aspecto fragmentado y deshilachado de las observadas en los quistes de Entamoeba coli (lámina en color 22-2F). Al combinar dos o más de estas características cuando se observan varias formas amebianas en una preparación micros­ cópica en fresco, suele hacerse una identificación altamente presuntiva, si no definitiva. La observación crítica de un núcleo tipo Entamoeba de una forma amebiana en una preparación microscópica también puede ser útil en otras dos situaciones. A menudo los prequistes de E. histolytica y Entamoeba coli (formas intermediarias en la fase del ciclo vital cuando el trofozoíto comienza a enquistarse) forman vacuolas intracitoplasmáticas prominen-

Protozoos intestinales

1207

C IC LO VITAL DE E n tam o eb a histolytica A bsce so s extraintestinales (hígado, pulm ones, etc.)

Invade las paredes del colon y se m ultiplica

Se m ultiplica por fisión binaria Transform ación en form as tró fica s en la parte distal del íleon

Trofozoíto en la luz del colon

C irculación

R egresa a la luz P erm anece en la luz del colon y se m ultiplica

S ER ES H U M AN O S Ingestión

Se enquista

Q uiste m aduro (estadio infectante)

Trofozoíto en quistes en las heces (etapa diagnóstica)

Q uiste m aduro (4 núcleos)

Q uiste inm aduro (1 núcleo) Trofozoíto

A M B IE N TE E XTE R N O

Se desintegra Q uiste inm aduro (2 núcleos)

Figura 22-3 El ciclo vital de Entamoeba histolytica es simple y no requiere huéspedes intermediarios. Las formas quísticas resistentes se encuentran en el ambien­ te externo; cuando son ingeridas por un ser humano en alimentos o agua contaminados, se transforman en formas tróficas en el intestino y dan origen a los trofo­ zoítos móviles y de vida libre. Estos trofozoítos pueden invadir la mucosa intestinal, llegar a la circulación y causar abscesos extraintestinales en varios órganos, en particular en el hígado.

tes, que simulan masas de glucógeno características de Iodamoeba bütschlii (lámina en color 22-21). Entamoeba hart­ manni forma trofozoítos y quistes que son en promedio más pequeños, de 5-15 jim menor que los de Endolimax nana. De nuevo, la diferenciación de los núcleos tipo Entamoeba carac­ terísticos de E. histolytica de la presentación en “bola en un hoyo” de Endolimax nana reducirá la confusión entre ambas especies. (En la lámina en color 22-2, compárense las fotogra­ fías B y K). Entamoeba polecki es otro miembro del género Entamoeba que rara vez se encuentra en muestras de heces humanas, y se halla en particular en individuos que pueden estar en contacto estrecho con cerdos. Es necesaria gran experiencia para identi­ ficar de manera objetiva las formas microscópicas de este orga­ nismo. El trofozoíto se asemeja al de Entamoeba coli en tama­ ño, comparte el patrón lento de movilidad, la excentricidad del

cariosoma nuclear y el aspecto “sucio” del citoplasma. De modo típico los quistes tienen un solo núcleo (nunca más de dos) con un cariosoma pequeño, excéntrico y distribución fina y regular de la cromatina junto a la membrana nuclear. En el citoplasma pueden observarse masas pequeñas y múltiples de glucógeno que se tiñen con yodo. Un caso de infección huma­ na se comunicó en un refugiado japonés. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE AMEBIASIS

Lotter y cois.171demostraron métodos sensibles y específicos para el serodiagnóstico en la amebiasis invasiva, mediante téc­ nicas de inmunotransferencia y ensayo inmunosorbente ligado a enzimas para detectar la proteína recombinante específica de la superficie de E. histolytica patógena. Cummins y cois.50 uti­ lizaron una prueba de aglutinación del látex rápida, no comer-

1208

C APÍTULO 22

Parasitología

cial, para detectar el antígeno de E. histolytica en suero de pacientes con amebiasis extraintestinal, que proporcionó resul­ tados comparables con otras técnicas serológicas estándares utilizadas en paralelo. Haque y cois.119 informaron hace poco que el equipo TechLab E. histolytica II permitió detectar antí­ geno sérico (Gal/GalNAc lectina) en casi todos los pacientes con absceso hepático amebiano que no habían recibido trata­ miento con metronidazol. Los laboratorios locales de salud pública estatal y de los CDC brindan servicios para la compro­ bación del antígeno. ENTAMOEBA HISTOLYTICA NO PATÓGENA: ENTAMOEBA DISPAR

Ya en 1925, Brumpt reconoció por primera vez que la disen­ tería grave o el absceso hepático amebiano afectaban a sólo el 10% de los individuos infectados por E. histolytica, mientras que el 90% de los portadores intestinales permanecían asinto­ máticos, por lo que surgió la hipótesis de que las infecciones amebianas eran causadas por dos especies con la misma mor­ fología pero con diferente patogenicidad.22 Así, la presencia de quistes de E. histolytica en muestras de heces no siempre reve­ la infección activa, lo que indica que sólo ciertas cepas pueden invadir los tejidos y causar citólisis.249 En 1978, Sargeaunt y Williams234 utilizaron electroforesis en gel de almidón para demostrar que los extractos obtenidos de amebas crecidas en cultivos axénicos presentan patrones de isoenzimas diferentes. Específicamente, la reactividad de cuatro en­ zimas: glucosa fosfato isomerasa, fosfoglucomutasa, malato deshidrogenasa y hexocinasa produjeron 18 patrones de zimodemo. Este grupo de investigadores encontró con posterioridad que sólo las cepas de E. histolytica que demuestran ciertos patrones de zimodemo se asocian con infecciones humanas. Además, sólo los patrones de zimodemo no patógenos se encontraron en el 20% de varones homosexuales que se aten­ dían en una clínica de enfermedades de transmisión sexual y que albergaban E. histolytica intestinal.6 La demostración ulte­ rior realizada por Weinke y cois.282 de que sólo las cepas de E. histolytica con zimodemos patógenos se aislaron en cinco via­ jeros que regresaban de los trópicos, en contraste con un grupo de 320 varones homosexuales que no presentaban zimodemos patógenos ni síntomas de amebiasis, creó la necesidad de crear métodos en los cuales puedan diferenciarse las cepas patógenas de las no patógenas. Durante la última parte de la década de 1980 y comienzos de la de 1990, muchos interrogantes permanecieron sin responder respecto de la patogenicidad de ciertas cepas de E. histolytica. Se consideró que la flora bacteriana autóctona y la capacidad de E. histolytica de modular su virulencia de acuerdo con las condiciones de cultivo desempeñaban alguna función.185 Geurrant115 y Ravdin222 describieron otros mecanismos de viru­ lencia característicos de E. histolytica para causar enfermedad: 1) factores de adherencia químicamente definidos (adhesina específica de galactosa) que determinan si el organismo puede adherirse a la mucosa intestinal, 2) la secreción de citotoxinas, como hialuronidasa, tripsina, pepsina, gelatinasa y enzimas hidrolíticas para caseína, fibrina y hemoglobina y 3) la produc­ ción de enzimas proteolíticas. El huésped utiliza diversas defensas para protegerse contra la invasión por parásitos.212 Las proteasas pancreáticas, las sales biliares y las glucosidasas bac­ terianas pueden destruir la adhesina específica de galactosa de la superficie de las amebas y bloquear la adherencia. Las muci­ nas colónicas, producidas en respuesta al contacto de las célu­ las epiteliales por amebas, también pueden bloquear la adhe­ rencia mediante la unión del dominio de reconocimiento de

hidratos de carbono de la adhesina galactosa. Los seres huma­ nos con enfermedades debilitantes, desnutridos o con respues­ tas inmunitarias defectuosas están particularmente propensos tanto a la enfermedad intestinal como extraintestinal. Clark y Diamond42 determinaron finalmente el mecanismo subyacente de la patogenicidad de E. histolytica mediante el empleo de métodos moleculares basados en el análisis de poli­ morfismos estables de DNA para identificar patrones de DNA únicos en diferentes cepas de E. histolytica. A través de estos estudios basados en la biología molecular, junto con los reali­ zados por Orozco y cois.,203 quienes clonaron, secuenciaron y caracterizaron diversos clones y cepas de E. histolytica, se pudo establecer que las diferencias en las cepas patógenas y no patógenas de E. histolytica y la expresión de sus varias dife­ rencias en los patrones de zimodemo se basaban en diferencias en su código genético. Clark y Diamond42 retuvieron de modo oficial el nombre de la cepa clásica y patógena como Entamoeba histolytica y denominaron a la cepa no patógena como Entamoeba dispar.22 Se han creado técnicas eficaces para diferenciar estas dos especies. Las más utilizadas consisten en la detección de antí­ geno y los métodos basados en PCR para la amplificación de genes para el rRNA. Las pruebas para la detección de antígeno son de realización relativamente simple, proporcionan resulta­ dos rápidos y se adaptan mejor para su uso en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico parasitológico y para estudios de campo. Los equipos de enzimoinmunoanálisis (EIA) para la detección de antígenos fecales se venden en el comercio para el diagnóstico de amebiasis intestinal. Estos estudios emplean anticuerpos monoclonales que detectan la proteína de adheren­ cia inhibible por la galactosa de E. histolytica patógena. Su des­ ventaja principal es que se requieren muestras de heces recién emitidas y sin conservantes. En los Estados Unidos se dispone de varios equipos de EIA para la detección de antígeno del grupo E. histolytica!E. dispar, pero sólo el de TechLab kit, al que nos referiremos después, es específico para E. histolytica. Yau y cois.302 desarrollaron anticuerpos monoclonales contra una subunidad recombinante de 170 kDa de la lectina Gal o GalNAc de Entamoeba histolytica que reconoce de manera específica E. histolytica, pero no Entamoeba dispar en mues­ tras conservadas de heces. Se encontró que estos anticuerpos no reaccionan en forma cruzada con otros protozoos intestina­ les, como Entamoeba coli, Giardia lamblia y Dientamoeba fragilis. Haque y cois.120 demostraron que el rendimiento del equipo para la detección de antígeno de E. histolytica, TechLab (Blacksburg, VA), destinado a identificar de modo específico E. histolytica y diferenciarlo de E. dispar en muestras de heces, era comparable respecto de la sensibilidad con el procedimien­ to de PCR anidada (nested) hecha en paralelo. Aunque en este momento también se cuenta con otros equipos para la detec­ ción de antígenos, sólo el de TechLab es específico para E. his­ tolytica.

Otros investigadores encontraron que las pruebas de PCR son más sensibles que los procedimientos para la detección de antígenos en la identificación de E. histolytica/dispar. Katzwinkel-Wladarsch y cois.,149 mediante un método de extracción simple de DNA y amplificación por PCR, pudieron detectar antígeno específico de E. histolytica directamente en muestras de heces que contienen tan poco como un trofozoíto por miligramo de heces. Acuna-Soto y cois.2 demostraron que las técnicas de PCR también pueden utilizarse para detectar antígeno de E. histolytica en muestras de heces fijadas con for­ maldehído. En los últimos tiempos, Blessmann y cois.,19 con una técnica de PCR en tiempo real, realizada con el sistema

Protozoos intestinales

LightCycler que emplea la detección de sondas marcadas con fluorescencia, pudieron detectar cantidades mínimas de 0, l parásito por gramo de heces. Cabe destacar que la sensibilidad de este procedimiento de PCR indicó que tanto el examen microscópico de las muestras de heces como el cultivo, en par­ ticular, subestiman la presencia de infecciones por E. histolyti­ ca. Entre las desventajas de los procedimientos de PCR se men­ cionan el tiempo que insume la realización de la prueba, su rela­ tiva complejidad, la incomodidad para ejecutarlos, la necesidad de equipamiento especial y el costo relativamente elevado. Por lo tanto, dado que hay un alto porcentaje de personas en las que se observan elementos morfológicos que se asemejan a E. histolytica en muestras de heces y que no requieren trata­ miento, en el futuro habría que realizar el seguimiento de la detección de antígeno o de procedimientos de PCR para iden­ tificar de manera correcta el subgrupo de E. dispar no patóge­ na. Los equipos de reactivos disponibles en la actualidad para el transporte de muestras a un laboratorio de referencia requie­ ren el procesamiento de muestras de heces recién emitidas. Si no está indicado el tratamiento en casos en los que se identifi­ can organismos E. histolytica!dispar en esas muestras, los pacientes deben al menos ser informados de que pueden portar organismos potencialmente virulentos y que, por consiguiente, se requiere tomar medidas preventivas. Cuando está indicado, el metronidazol (Flagyl®) es el tratamiento de elección. OTRAS AMEBAS INTESTINALES

Como ya se mencionó, los otros protozoos intestinales en­ contrados con frecuencia, Iodamoeba biitschlii y Endolimax nana, no se consideran patógenos. Desde la perspectiva del laboratorio, es importante identificarlos de modo objetivo en las muestras de heces y no confundirlos con otros protozoos que pueden causar enfermedad. Por consiguiente, los criterios de identificación para cada uno son los siguientes. Iodamoeba biitschlii. Este protozoo puede identificarse median­ te la demostración de: • El trofozoíto, que varía de 6-25 lim. tiene un núcleo del tipo “bola en un hoyo”. Las formas más pequeñas son difíciles de distinguir de Endolimax nana y debe realizarse la búsqueda de los quistes más característicos. (Véase lámina en color 22-21). • El quiste, que varía de 6 a 15 |im, además del núcleo en “bola en un hoyo”, tiene una vacuola de glucógeno única, grande, que se tiñe positiva con yodo (la estructura a partir de la cual deriva el nombre del género). (Véase lámina en color 22-2J). • Nota: los prequistes tempranos de Entamoeba coli y, con menor frecuencia, de E. histolytica, también pueden tener inclusiones citoplasmáticas de aspecto similar (lámina en color 22-2G). Sin embargo, puede observarse más de un núcleo, cada uno con un anillo de cromatina sobre la mem­ brana nuclear, característica del denominado núcleo del tipo Entamoeba. Endolimax nana. Este protozoo puede sospecharse en el examen

inicial por: • Su tamaño relativamente pequeño, que varía de 5 a 8 (im. • La observación de trofozoítos con movilidad lenta, con un núcleo único desprovisto de cromatina periférica y un cariosoma grande en “bola en un hoyo” (lámina en color 22-2K). • Identificación de los quistes, que también son pequeños (514 ¡im) y presentan hasta cuatro núcleos, cada uno con cariosoma similar a un manchón. (Véase lámina en color 22-2L).

1209

• Entamoeba hartmanni, aunque con las mismas variaciones de tamaño que E. nana, puede distinguirse sobre todo porque tanto el trofozoíto como los quistes tienen un núcleo de tipo Entamoeba , a diferencia del núcleo en “bola en un hoyo” de E. nana. • Los quistes de Entamoeba hartmanni típicamente contienen

una o más barras cromatoides con extremos redondeados y lisos (lámina en color 22-2H). PROTOZOOS DE CLASIFICACIÓN INCIERTA

Blastocystis hominis. Este protozoo, alguna vez considerado una levadura, fue clasificado hace poco como protozoo, específica­ mente en las amebas, sobre la base de las características des­ critas por Zierdt.307 El organismo:

• No tiene pared celular. • Crece sólo en presencia de bacterias y no en medios de cul­ tivos para hongos. • Tiene preferencia por el pH alcalino y un ambiente levemen­ te hipotónico. • Se reproduce por fisión binaria y no por brotación. • Extiende y retrae los seudópodos e ingiere bacterias. • Presenta una actividad óptima a 37 °C, no crece a 25 °C y es destruido a 4 °C. Yet, Stenzel y Boreham258 señalaron que es escaso el cono­ cimiento sobre su biología básica y existen controversias acer­ ca de su taxonomía y patogenicidad. Desde el punto de vista morfológico se describieron tres formas (vacuolar, granular y ameboide), aunque también se observaron otras formas (quísti­ ca, avacuolar y multivacuolar). Se conoce poco sobre la bio­ química del organismo y en las células existen orgánulos y estructuras de función y composición desconocidas. Se han pro­ puesto varios ciclos vitales, pero no han sido validados en forma experimental y no se ha definido la forma implicada en la trans­ misión. Desde el punto de vista morfológico, las formas parasitarias de B. hominis: • Aparecen como células esféricas de tamaño irregular, que

varían de 5 a 15 (im de diámetro, aunque en ocasiones se hallan formas más pequeñas (lámina en color 22-2M). • Tienen un cuerpo central con tinción homogénea (verde en las tinciones tricrómicas) que ocupa alrededor del 70% de la célula. • Presentan material nuclear, disperso en fragmentos indefini­ dos entre el cuerpo central y la membrana externa o aparecen como una o dos masas alargadas en una distribución bipolar. MacPherson y MacQueen173 señalaron la variabilidad mor­ fológica en el tamaño, la forma, los detalles nucleares y el cuer­ po central característicos entre las células, que en cierta medi­ da pueden determinar las diferencias en la incidencia de la detección de B. hominis en varios estudios de casos. Sobre la base de los estudios iniciales realizados por Zierdt,307 otras publicaciones de mediados de la década de 198090’161,269 se ofrecieron como evidencia de que B. hominis puede ser una causa de enfermedad gastrointestinal. Su naturaleza potencialmente patógena está apoyada por los casos de diarrea recurren­ te informados por Vannatta269 y Lebar.161 En este último estudio se observaron numerosas formas de B. hominis (5 por campo microscópico de bajo aumento) en muestras de heces donde los cultivos para patógenos bacterianos y las pruebas para partícu­

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C A PÍTU LO 22

Parasitología

las de rotavirus fueron negativos. Los síntomas remitieron cuan­ do estos pacientes recibieron tratamiento contra los protozoos. La diarrea recurrente sin ñebre, los episodios de vómitos y dolor abdominal cólico han sido los síntomas principales. Blastocystis hominis puede ser un patógeno cuando no se encuentra otro agente o cuando la cantidad de parásitos es ele­ vada. García y cois.,91 en una revisión de más de 6 000 mues­ tras de heces, encontraron que 289 (4,8%) fueron positivas para B. hominis (en dos tercios de los casos fue el único parásito hallado). Dentro de este grupo, los síntomas gastrointestinales se notaron en 24 pacientes; casi todos presentaban enfermedad debilitante de base o estaban inmunosuprimidos. El cuadro clí­ nico de B. hominis consiste en dolor abdominal inespecífico, diarrea acuosa, anorexia, vómitos y pérdida de peso. En raras oportunidades sucede una forma más invasiva de la enferme­ dad con hemorragia rectal. Antonelli y cois.9 describieron el caso de una niña de 10 años que fue internada por diarrea, dolor abdominal y fiebre. En sus heces se demostraron muchas for­ mas de B. hominis y respondió de modo satisfactorio al trata­ miento con metronidazol. Por esto, los autores citan este caso como otro más para admitir que B. hominis debe considerarse un patógeno humano. Por el contrario, Markell y Udkow,177 en un estudio de 32 personas con infección por B. hominis, en quienes se realizaron al menos seis exámenes de heces, encontraron que 27 tenían otros patógenos reconocidos: E. histolytica, Giardia lamblia o Dientamoeba fragilis. En todos estos casos, los síntomas remi­ tieron con el tratamiento. En los cinco pacientes restantes en los que sólo se encontró B. hominis, el tratamiento con yodoquinol erradicó los protozoos, pero persistieron los síntomas más compatibles con síndrome de intestino irritable. Nagler y cois.,192 en un estudio de 12 pacientes con enfermedad infla­ matoria intestinal en quienes las muestras de heces fueron posi­ tivas para B. hominis, también concluyeron que éste no es un patógeno importante para esa entidad. Todos sus pacientes mejoraron con el tratamiento médico, tres con tratamiento con corticosteroides solos y uno con reposo intestinal sin medica­ ción. Cinco pacientes no mejoraron con metronidazol, si bien cuatro respondieron a ciclos ulteriores de corticosteroides. Keystone y Kozarsky,152 mediante análisis de antígeno, isoenzima y DNA, indicaron que Blastocystis hominis puede ser más que un protozoo, con cepas virulentas y avirulentas identifica­ das. Estos hallazgos pueden determinar las diferencias en la virulencia como lo informaron varios investigadores. Hasta que se acuerde el problema de la patogenicidad, los parasitólogos del laboratorio clínico deben indicar la detección de B. hominis en muestras de heces en el informe final. Debe hacerse alguna forma de cuantificación (esporádicos, escasos, moderada cantidad, numerosos); específicamente, la presencia de cinco o más células de B. hominis por campo de gran aumento se considera en la categoría de cantidad moderada a numerosa y así la informan la mayoría de los laboratorios. El médico debe evaluar si estos informes tienen importancia clí­ nica y decidir si se trata al paciente sobre la base del cuadro clínico. Flagelados intestinales

Como su nombre lo indica, todos los flagelados tienen un orgánulo para la movilidad, los flagelos, que actúa como medio de locomoción. Otras estructuras también sirven como parte integral del órgano locomotor, es decir, el cinetoplasto al cual se adhieren los flagelos, y el axostilo y los cueipos parabasales. Por consiguiente, cuando se identifica cualquiera de estas

estructuras en una forma parasitaria, el parásito puede ser tenta­ tivamente agrupado con los flagelados. A diferencia de las ame­ bas. que asumen varias formas, los flagelados son más rígidos y tienden a retener formas distintivas, una característica que suele ser útil en su identificación. Giardia lamblia, Chilomastix mesnili, Trichomonas hominis y Dientamoeba fragilis son las espe­ cies de flagelados observados con mayor frecuencia en las muestras de heces humanas remitidas para examen. GIARDIA LAMBLIA

A finales de la década de 1980, G. lamblia se convirtió en el agente más importante de la enfermedad gastrointestinal para­ sitaria en los Estados Unidos214 y ha llegado a ser un problema fundamental de salud pública mundial.243 Se encontró en el 3,8% de las 414 820 muestras de heces remitidas a los labora­ torios de salud estatal de los Estados Unidos como parte de un estudio de vigilancia de las parasitosis intestinales de los CDC en 1976.30 Se informaron a la Organización Mundial de la Salud más de 50 brotes transmitidos por el agua que afectaron a cerca de 20 000 personas. A pesar de los programas de vigi­ lancia activa en muchos estados, la cantidad de casos de giardiasis informados por año se duplicó en los Estados Unidos desde 12 793 en 1992 hasta 27 778 casos en 1996.89 Los casos por 100 000 habitantes estatales variaron de 0,9 a 42,3, con 10 estados que informaron > 20 casos/100 000 habitantes. El esta­ do de Nueva York informó la cantidad máxima de casos tota­ les: 3 673 o 14,5% de todos los casos y Vermont informó la tasa de incidencia máxima de 42,3/100 000 habitantes. La alta prevalencia de giardiasis es un problema mundial, con áreas endémicas informadas en Inglaterra, Rusia, varios países de Europa del Este y muchas áreas costeras del Mediterráneo.243 Giardia lamblia se encontró en el 10% de los niños que residen en los orfelinatos Ain-Shams y El-Mowassa de El Cairo,237 la giardiasis fue la enfermedad parasitaria más común (11,63%) entre los musulmanes que vuelven de la pere­ grinación anual “Haj y Omra” a la Mecca. En la figura 22-4 se muestra el ciclo vital de Giardia lam­ blia, representante de los flagelados intestinales. Los síndromes clínicos asociados con infecciones por Giardia lamblia se presentan en el recuadro de correlación clí­ nica 22-2. Giardia lamblia no es difícil de identificar en las prepara­ ciones microscópicas de muestras fecales. Las características principales para la identificación son: Trofozoíto • Varía entre 9 y 21 |im de largo por 5-15 lim de ancho, tiene simetría bilateral y dos núcleos, uno de cada lado de un axos­ tilo central (lo que le da el aspecto de “facies simiana”). (Lámina en color 22-20). • El citoplasma es finamente granular. Dos cuerpos parabasa­ les medianos, que simulan un “bigote”, se ubican a cada lado del axostilo. Los discos suctorios ocupan la mitad de la superficie ventral. • Retiene la movilidad en la luz intestinal y los organismos se adhieren a la superficie de las células epiteliales (lámina en color 22-2N). • En preparaciones en fresco, tiene una movilidad elegante como “hojas que caen”, una característica útil para la identi­ ficación, que lo diferencia de C. mesnili, que es más lento, con movimientos más rígidos y de 71 hominis, con un movi­ miento rápido, entrecortado y como un dardo.

Protozoos intestinales

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C IC LO VITAL DE G iardia lam blia

M ultiplicación por fisión binaria longitudinal

Trofozoítos en la m ucosa del duodeno

Transform ación duodenal en form as tróficas

S ER ES H U M AN O S

Trofozoíto y quiste en las heces (estadio diagnóstico)

Q uiste (estadio infeccioso)

A M B IE N TE E XTE R N O Trofozoíto

Se desintegra

Figura 22-4 El ciclo vital de Giardia lamblia también se completa de modo simple por la vía de transmisión fecal-oral; los quistes proporcionan una supervi­ vencia a largo plazo en el ambiente externo en condiciones adversas. Los quistes suelen encontrarse en corrientes y pozos de sistemas cloacales controlados de manera inadecuada y con frecuencia se encuentran contaminadas las corrientes montañosas río abajo desde áreas residenciales. Los seres humanos se infectan al ingerir agua o alimentos frescos mal lavados y contaminados con heces. En el intestino humano, la multiplicación de los trofozoítos es por fisión binaria. Los tro­ fozoítos y los quistes se eliminan por las heces para completar su ciclo vital.

Quiste • Mide de 8 a 12 |im y presenta un contorno ovalado; puede estar levemente teñido con bilis. • Cuando madura, tiene cuatro núcleos, con un cariosoma pequeño colocado de modo excéntrico. • No tiene cromatina periférica sobre la membrana nuclear. • Tiene un espacio claro por debajo de la pared delgada del quiste, lo que produce un efecto de “halo” fácil de reconocer (lámina en color 22-2P). • Tiene fibrillas longitudinales mal definidas y cuatro cuerpos medianos. Dada la eliminación irregular de los protozoos en las heces, pueden requerirse varias muestras obtenidas en días no sucesi­

vos para establecer un diagnóstico en casos sospechosos, en particular en la enfermedad crónica. En un estudio publicado por Heymans y cois.,131 el 53% de los pacientes tuvieron sínto­ mas atribuibles a giardiasis de 6 meses o más de duración. El rendimiento puede mejorarse mediante la preparación de frotis teñidos de concentrados de muestras fecales, dado que los pro­ tozoos a menudo se pasan por alto cuando se realizan procedi­ mientos en fresco con solución fisiológica.95'246 Heymans y cois.131 también encontraron que la “prueba fecal triple” (el examen de tres muestras de heces en días no consecutivos) tuvo una sensibilidad del 95,7% para detectar los protozoos en casos conocidos de giardiasis. Estos se encontraron sólo en 3 de 109 biopsias duodenales en pacientes cuyos exámenes de heces eran negativos (tasa de falsos negativos de 2,8%). De manera similar, McHenry y cois.184 hallaron sólo 1 resultado positivo

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C A PÍTU LO 22

Parasitología

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 22-2 Giardiasis292 Síntomas Giardia lamblia es una causa conocida de diarrea aguda, dolor abdomi­ nal y, en algunos casos, síntomas generales, como pérdida de peso y lasitud. En los casos crónicos puede experimentarse malabsorción y esteatorrea que simulan el esprue. Se desconoce el mecanismo exacto por el cual G. lamblia causa la enfermedad. La oclusión física de la mucosa, la desconjugación de las sales biliares, la producción de enterotoxina, la liberación de prostaglandina y la lesión de los bordes en cepillo de las células epiteliales de la mucosa son diversas hipótesis analizadas por Smith y Wolfe. 253 Los fármacos de elección en el tratamiento de la giar­ diasis cuando está clínicamente indicado son la quinacrina (Atabrine®) o el metronidazol (Flagyl®). Epidemiología Casi todas las infecciones son esporádicas, contraídas después de la exposición a alimentos o agua contaminados en diversas circunstancias. Smith y Wolfe253 han citado brotes transmitidos por el agua en regiones tan diversas como Colorado. Rusia y Nueva York y entre campistas en el oeste de los Estados Unidos. En el seguimiento de un brote en Aspen/Snowmass. Lapham y cois . 160 hallaron sólo dos casos de giardia­ sis entre 225 visitantes, una tasa mucho menor que la informada durante el brote ya citado. Brotes más recientes transmitidos por el agua han sido informados por Fraser y Cooke8 6 en individuos que bebieron de suministros de agua municipal no filtrada en Dunedin, Nueva Zelanda; en un suministro de agua comunitaria clorada en Pencticton, Columbia Británica; 188 entre niños de edad preescolar que bebieron de suministros de agua escolar en Lesotho ; 78 y por el uso de un tobogán de agua de un hotel nuevo que fue limpiado con bromuro y filtración por arena . 109 Aunque Holtan 138 y Starko y cois . 255 han citado a los campistas como un grupo de alto riesgo para contraer giardiasis, Welch284 encontró este riesgo como mínimo, basado en una revisión reciente de 104 de los tra­ bajos publicados más actuales relacionados con el agua de campo como fuente potencial para adquirir la infección. El autor puso mayor énfasis en la observación cuidadosa de las técnicas de lavado de las manos sobre la purificación del agua para disminuir el riesgo de infección. Existe la posibilidad zoonótica de que la giardiasis también sea transmi­ tida por animales domésticos, como terneros y corderos (y tal vez tam­ bién por roedores silvestres), los que pueden actuar como reservorios. En el pasado también se colocó a los niños que asisten a guarderías en el grupo de alto riesgo de contraer giardiasis, evidenciado por tres bro­ tes pasados informados en Wisconsin , 2 6 0 con tasas de ataque del 47%, 17% y 37% respectivamente, y en el sur de Ontario, Canadá, 294 donde casi el 10% de los niños entre los 2 y los 5 años de edad albergaban quistes de Giardia lamblia.

en 144 aspirados duodenales en pacientes con síntomas gas­ trointestinales inespecíñcos. La conclusión a la que puede arribarse es que no se necesitan procedimientos extraordina­ rios para establecer el diagnóstico ante exámenes de heces ne­ gativos. En casos en que la sospecha es alta pero no se ha estableci­ do el diagnóstico, la prueba del hilo es una alternativa a los pro­ cedimientos de aspiración o biopsia duodenal.148 El dispositivo consiste en una cápsula pesada que contiene gelatina y un hilo de sutura firmemente enrollado (disponible como “Enterotest” de Hedeco, Mountain View, CA). La cápsula se ingiere y el extre­ mo del hilo se pega al lado de la mejilla. Después de casi 5 horas el hilo se retira y el material adherente se separa sobre la superficie de uno o más portaobjetos. Una pequeña cantidad de material puede mezclarse con una o dos gotas de solución fisio­

lógica; se aplica un cubreobjetos y la muestra se examina direc­ tamente para evaluar la presencia de las formas diagnósticas. Si el resultado de la preparación en fresco resulta equívoco, tam­ bién puede prepararse un portaobjetos teñido en forma perma­ nente. García y cois.93 informaron sensibilidad y especificidad del 100% en la detección de quistes de Giardia lamblia y ooquistes de Cryptosporidium en muestras fecales, utilizando el siste­ ma de inmunofluorescencia directa Merifluor (Meridian Diagnostics). Los quistes de las especies de Giardia aparecen como formas ovales con fluorescencia de color verde manzana, de 11-14 um de diámetro; los ooquistes de Cryptosporidium miden 4-6 (im de diámetro y muestran una fluorescencia verde manzana brillante. Los autores citan la capacidad de revisar los frotis con poco aumento y de detectar formas en concentracio­ nes bajas como las principales ventajas del sistema de fluores­ cencia directa. No es infrecuente encontrar protozoos por el pro­ cedimiento de fluorescencia que no se observan mediante el examen habitual de huevos y parásitos. Detección de antígenos. La detección de antígenos en la superfi­ cie de los protozoos en muestras de heces es la prueba de elec­ ción actual para el diagnóstico de giardiasis y provee mayor sensibilidad que las técnicas microscópicas más comunes. Existen catorce productos comerciales (cuatro estudios de fluo­ rescencia directa, once EIA y tres pruebas rápidas) en los Estados Unidos para el inmunodiagnóstico de giardiasis. La mayoría de los equipos de EIA pueden utilizarse sobre mues­ tras de heces recién emitidas o congeladas y en las conservadas en formol, mertiolate-yodo-formaldehído (MIF) y acetato de sodio-ácido acético-formaldehído (SAF) como fijadores, pero no en PVA. La sensibilidad y la especificidad de estos equipos se aproximan al 100% cuando se comparan con la microscopia. Pueden utilizarse para la cuantificación de quistes y ooquistes y por lo tanto pueden ser útiles en estudios epidemiológicos y de control. Se dispone de tres estudios inmunocromatográficos rápidos para la detección combinada de Cryptosporidium y Giardia o Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia y Entamoeba his­ tolytica. Estos ofrecen la ventaja del tiempo breve necesario para la realización de la prueba y la obtención de resultados múltiples en un solo dispositivo de reacción. Las evaluaciones iniciales indican sensibilidad y especificidad comparables con las de las pruebas ya existentes. A comienzos de la década de 1990 el diagnóstico de giar­ diasis se establecía por el empleo de métodos inmunológicos para detectar directamente antígeno de Giardia lamblia en muestras fecales.157 Los estudios inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA) que utilizan anticuerpos improntas contra una variedad de antígenos de Giardia constituyen la técnica utilizada con mayor frecuencia. Knisley y cois.,157 con el empleo de antisueros de conejo y de cabra luego de la inmuni­ zación con trofozoítos de Giardia, informaron sensibilidades del 92% y el 87% y especificidades del 87% y el 91%, respec­ tivamente. Carlson y cois.29 comunicaron una correlación del 97% entre el enzimoinmunoanálisis y el examen microscópico directo en 353 muestras de seres humanos en los Estados Unidos. Stibbs,259 mediante la técnica de enzimoinmunoanáli­ sis con captura de antígeno con anticuerpos monoclonales para la detección de antígeno de Giardia lamblia en muestras de he­ ces humanas también encontró una correlación del 97% con los exámenes microscópicos, incluso las muestras fijadas con for­ maldehído (la absorbancia realmente aumentó en 20 de 26 muestras positivas de G. lamblia probadas, ya sea fijadas con formaldehído o sin fijar).

Protozoos intestinales

Rostoff y cois.230 evaluaron un enzimoinmunoanálisis comercial (ProSpecT/Giardia; Alexon, Mountain View, CA) que detecta antígeno específico 65 de Giardia (GAS 65). Las 93 muestras obtenidas en pacientes sintomáticos y muestras de heces positivas para O y P de giardias dieron resultados visua­ les y espectrofotométricos intensamente positivos. De las 232 muestras recolectadas al azar, 6 muestras O y P negativas die­ ron resultados por EIA positivos. La evidencia clínica de que estos seis pacientes en efecto tenían giardiasis era firme. Tomando en consideración estos resultados, la prueba de EIA mostró una sensibilidad del 96% y una especificidad del 100%. Scheffler y Van Etta239 también demostraron que la detección de antígeno es altamente sensible y específica cuando se reali­ za sobre muestras de heces conservadas con formaldehído. El equipo ProSpecT/Giardia tiene una sensibilidad del 95%, una especificidad del 100%, un valor predictivo positivo del 99,5% y un valor predictivo negativo del 100% en relación con la microscopia convencional en el estudio de 223 muestras de heces conservadas con formaldehído. OTROS FLAGELADOS INTESTINALES Chilomastix mesnili. Chilomastix mesnili es un flagelado de distribución cosmopolita, que se encuentra con mayor fre­ cuencia en personas que viven en climas cálidos. Se lo consi­ dera no patógeno y no se requiere tratamiento cuando se encuentra en muestras fecales. Las infecciones se adquieren a través de la ingestión de alimentos y agua contaminados con heces; las mejoras en la higiene personal y en los servicios sanitarios son fundamentales para reducir la incidencia de la infección. Id e n tific a c ió n p o r el la b o r a to r io . La clave para la identifi­ cación de formas observadas en muestras fecales consiste en la detección de: T ro fo zoítos

• Son piriformes, miden de 6 a 24 (im de longitud y 4 a 8 (im de ancho (lámina en color 22-3A). • Tienen un núcleo grande y único ubicado inmediatamente por debajo de la membrana externa. • Tienen un citostoma prominente adyacente al núcleo. • Tienen tres flagelos anteriores inmediatamente adyacentes al núcleo, que a menudo son difíciles de visualizar, pero se observan mejor reduciendo la cantidad de luz del condensa­ dor y ajustando el foco. Q u istes

• Presentan forma de pera o de limón y su tamaño varía de 6 a 10 |Jm de largo por 4 a 6 |jm de ancho (lámina en color 22-3B). • Tienen un botón hialino característico en uno de los lados (lámina en color 22-3C). • Tienen un núcleo único con un pequeño cariosoma central. • De manera característica tienen un citostoma curvo, que apa­ rece como un “bastón con un extremo en forma de gancho” que es diagnóstico cuando se observa. Dientamoeba fragilis. Dientamoeba fragilis se clasifica ahora como un flagelado,300 aun cuando los flagelos no se observan con el microscopio óptico. En la práctica, este protozoo puede aparecer como un trofozoíto amebiano, más que como flagela­ do en las preparaciones microscópicas en fresco.

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Dientamoeba fragilis causa un síndrome caracterizado por diarrea persistente, dolor abdominal, inapetencia y pérdida de peso, flatulencia y prurito anal.289 Los microbiólogos en los laboratorios clínicos deben conocer que D. fragilis se aís­ la en muestras de heces cada vez con mayor frecuencia; se ha informado en el 1,4% y el 19% de las muestras remitidas para examen de rutina y en hasta el 47% de poblaciones defi­ nidas, como en los internos en instituciones mentales.300 También se ha informado una alta prevalencia entre ciertos grupos de indígenas que residen en Arizona. En algunos ámbitos, la identificación de D. fragilis en muestras de heces es tan frecuente como Giardia lam blia ; de hecho, en los laboratorios donde se identifica G. lamblia está indicado rea­ lizar una revisión de los métodos de recolección y diagnósti­ cos para la exclusión de D. fragilis. Como el citoplasma es muy frágil, Dientamoeba fragilis puede ser difícil de identi­ ficar en las preparaciones en fresco y se requiere una prepa­ ración con tinción permanente para evaluar los detalles mor­ fológicos. Grendon y cois.110 advierten que la falta del empleo de las técnicas recomendadas para la fijación y la tinción permanente de las heces prácticamente impide la identificación de D. fra ­ gilis. Para aumentar la probabilidad, recomiendan con firmeza que todas las heces remitidas para el examen sean fijadas en alcohol polivinílico, acetato de sodio-ácido acético-formaldehído o en el fijador de Schaudinn y que todas las muestras, cualquiera que sea la consistencia, sean teñidas antes del exa­ men microscópico. Chan y cois.34 utilizaron de manera satis­ factoria una prueba de inmunofluorescencia indirecta para mejorar la detección de D. fragilis en muestras conservadas de heces y sugirieron, además, que el desarrollo de técnicas de ELISA para antígenos de D. fragilis en muestras fecales podría mejorar su detección. Identificación por el laboratorio. La identificación de D. fragilis se realiza en preparaciones fecales mediante la obser­ vación del trofozoíto. No se ha identificado el estadio de quis­ te. Las características morfológicas diagnósticas son:

• El aspecto de una forma “ameboide” y asimétrica, que mide de 5 a 12 |im. • La presencia de dos núcleos (lámina en color 22-3D). Alrededor del 20% de las formas presentan un núcleo único y puede ser difícil diferenciarlo de los trofozoítos de Endolimax nana. La observación de todo el frotis suele reve­ lar las formas diagnósticas con núcleos dobles más caracte­ rísticas. • Cariosomas prominentes que están fragmentados en cuatro a ocho gránulos (difícil de observar en la mayoría de las pre­ paraciones teñidas). • Seudópodos claros, con lóbulos relativamente amplios que determinan la movilidad cuando se observan en preparacio­ nes en fresco. Como D. fragilis no presenta un estado de quiste identifica­ do, la transmisión directa de un huésped a otro por los alimen­ tos y el agua es menos probable. La incidencia nueve veces mayor de D. fragilis en pacientes con infección por oxiuros sugiere que los huevos de Enterobius vermicularis pueden estar infectados por el flagelado y actúa como el principal vector para el contagio a los seres humanos. Esta posibilidad puede también explicar que casi el 50% de los casos informados de dientamebiasis ocurren en pacientes menores de 20 años. Los fármacos de elección en el tratamiento de los casos sintomáti­ cos son la tetraciclina y el metronidazol.

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Trichomonas hominis. Trichomonas hominis se ha encontrado en todo el mundo. Aunque aislado en muestras de heces diarrei­ cas. no se considera patógeno. Puede ser algo más difícil iden­ tificarlo en forma definitiva en preparaciones teñidas porque los trofozoítos son frágiles y no se tiñen bien. No presenta esta­ dio de quiste. Identificación por el laboratorio. La identificación se rea­ liza mediante la detección de los trofozoítos, que presentan las siguientes características:

• Miden de 7 a 15 |im de largo y de 4 a 7 |J.m de ancho, con una forma de lágrima y tienen un núcleo único situado en la parte anterior (que está levemente desplazado por la mem­ brana externa, lo que ayuda a diferenciarlos de Chilomastix mesnili) (lámina en color 22-3E). • Tienen una membrana ondulante que se extiende a todo lo largo del parásito (en teoría sirve como una característica útil para diferenciarlo de Trichomonas vaginalis, en el cual la membrana ondulante se extiende sólo en la mitad de distan­ cia del cuerpo). En la práctica esto es discutible, ya que las membranas ondulantes no se observan en los frotis teñidos de manera habitual con las tinciones tricrómicas; en realidad se requieren preparaciones de cultivos anaerobios. • En preparaciones en fresco, presentan una movilidad rotato­ ria, algo rígida, por la acción de un flagelo único ubicado a lo largo de la membrana ondulante que se extiende en la lon­ gitud completa del cuerpo del parásito, a diferencia de Trichomonas vaginalis, en que sólo se extiende en la mitad de su cuerpo. • Las formas típicas observadas en muestras de heces con más probabilidad corresponden a T. hominis, aunque en las muje­ res T. vaginalis puede observarse como contaminante de al­ gunas preparaciones. Ciliados: Balantidium coli

Balantidium coli es el único miembro de los ciliados que se sabe que infecta a los seres humanos. El modo de transmisión es por medio de la vía fecal-oral y no se requiere huésped inter­ mediario para completar el ciclo vital, el cual se muestra en la figura 22-5. Aunque Balantidium coli se encuentra sobre todo en los por­ cinos y con menor frecuencia en otros animales, tiene distribu­ ción mundial. La balantidiosis humana tiene una prevalencia mayor en los sitios de cría y matanza de cerdos.95 Son infre­ cuentes los informes de infección, pero la mayoría provienen de América Latina, el Lejano Oriente y Nueva Guinea. La infestación en seres humanos no suele ser invasiva, es asintomática y autolimitada. En pacientes debilitados con una gran cantidad de trofozoítos, puede manifestarse disentería sangui­ nolenta, deshidratación intensa o, en casos raros, la muerte. En la lámina en color 22-3F se observan varios trofozoítos de B. coli que invaden la submucosa del intestino. Esta microfoto­ grafía se preparó de un caso mortal de infección por Balantidium. En casos aislados de autopsias se observaron úlceras intestinales, linfadenitis mesentérica y raras veces extensión extraintestinal a hígado, pulmón y otros órganos.156 La tetraciclina o, de manera alternativa, el diyodohidroxiquina o el metronidazol, son los fármacos de elección en los casos de infecciones sintomáticas. Identificación por el laboratorio. Suele ser fácil de reconocer Ba­ lantidium coli en muestras de heces por su gran tamaño (100 |im o más de diámetro). Las características diagnósticas adiciona­ les son:

T rofo zoíto

• Una membrana externa cubierta en toda su circunferencia por cilios cortos y delicados. • Un macronúcleo grande, con forma de riñón (más visible en preparaciones teñidas con yodo) (lámina en color 22-3G). • Un micronúcleo pequeño y esférico adyacente al macronú­ cleo. • Movilidad rotatoria, lenta, cuando se observa en preparacio­ nes en fresco. Q u iste

• Forma esférica a elipsoidal, de 50 a 65 |im. • Un macronúcleo único con forma de riñón, dentro del cual hay un micronúcleo pequeño y esférico (lámina en color 223H). • En el citoplasma persisten vacuolas pequeñas. • Los cilios están retraídos dentro de la pared gruesa y resis­ tente del quiste. COCCIDIOS

Coccidia, un subgrupo de protozoos dentro del subfilo Sporozoa, son parásitos tisulares estrictos con estadios sexua­

les y asexuales en sus ciclos vitales. A este grupo pertenecen los parásitos sanguíneos del paludismo, las especies de Plasmodium, los protozoos tisulares Toxoplasma gondii y los coc­ cidios intestinales Isospora belli, especies de Cryptosporidium, especies de Cyclospora y especies de Sarcocystis. El ciclo vital de la mayoría de los coccidios requiere un huésped intermediario externo, como gato, bovinos u otros ani­ males, en los cuales se lleva a cabo la esporogénesis y la for­ mación del ooquiste. El ciclo vital de Isospora belli difiere sólo en que ambos estadios de la gametogénesis, sexual y asexual, puede realizarse en el huésped humano sin necesidad de un segundo huésped. El ciclo vital de Isospora belli, como repre­ sentativo de los coccidios, se muestra en la figura 22-6. CRYPTOSPORIDIUM PARVUM

Los criptosporidios son protozoos coccidios diminutos que se los ha conocido asociados con enterocolitis en diversos ani­ males domésticos, como terneros, cerdos y pollos.8Con la dise­ minación del SIDA en la década de 1980, la criptosporidiosis evolucionó como una enfermedad infecciosa emergente nueva.51196 La detección de especies de Cryptosporidium o Isospora belli en pacientes en quienes no se sospechaba SIDA condujo a la comprobación de infección por el HIV. Los seres humanos se infectan ya sea por el contacto directo con anima­ les infectados o por la ingestión de alimentos o agua contami­ nados con heces. La transmisión por agua es muy problemáti­ ca para las especies de Cryptosporidium porque los ooquistes no se eliminan por la cloración y puede persistir en suministros de agua después del tratamiento.252 Dos brotes importantes de gastroenteritis y enfermedad diarreica se han informado en los últimos tiempos: uno en Milwaukee,12 que afectó a 300 000 personas, el otro en Carroll County, Georgia,124 con una esti­ mación de 90 000 casos documentados de gastroenteritis aguda. El único factor de riesgo colectivo determinado en cada uno de estos brotes fue la exposición a un suministro de agua pública, filtrada y clorada según las normas de la Environ­ mental Protection Agency (Oficina de Protección Ambiental) de los Estados Unidos.

Protozoos intestinales

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Figura 22-5 El ciclo vital de Balamidium coli es simple y no requiere huésped intermediario. Los huevos se eliminan por las heces al ambiente externo, madu­ ran en el suelo en condiciones ideales y se toman infectantes. Después de la ingestión de alimentos o agua contaminados con huevos, el protozoo se libera en el intestino delgado y luego se multiplica por fisión binaria; los trofozoítos pasan a la luz del colon donde residen. Con el enquistamiento, los quistes vuelven a eli­ minarse por las heces para completar el ciclo vital.

Durante todas las etapas del desarrollo el protozoo está limi­ tado a las microvellosidades de las células epiteliales del intes­ tino. Por lo tanto, el diagnóstico puede realizarse en cortes del intestino delgado teñidos con hematoxilina y eosina (H-E) mediante la observación de ooquistes diminutos, a menudo en cantidades enormes, adheridos a la superficie de las células epiteliales que recubren las vellosidades (véase lámina en color 22-4A). Los ooquistes tienen una predisposición a adherirse al borde en cepillo de las células epiteliales con pérdida o dege­ neración de las microvellosidades en la zona de adherencia.196 La pérdida de las microvellosidades puede causar deficiencias en la digestión, malabsorción y diarrea, que conforman el sín­ drome clínico. Las manifestaciones clínicas de la criptosporidiosis se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-3.

Identificación por el laboratorio. El diagnóstico suele hacerse por la identificación de los ooquistes en muestras fecales. Presentan las siguientes características:

• Miden de 5 a 6 |im de diámetro, son ovoides a esféricos y aparecen muy refringentes cuando se observan en las prepa­ raciones por flotación (fig. 22-7). • En el interior pueden observarse pequeños gránulos o, con microscopia con contraste de fase, hasta cuatro esporozoítos finos con forma de lazo en cada ooquiste.51196 • Aparecen como ooquistes esféricos, teñidos de rojo, homo­ géneos, de 4 a 6 |jm de diámetro, cuando se observan en pre­ paraciones de heces teñidas para ácido-alcohol resistencia (lámina en color 22-4B).

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Figura 22-6 Ciclo vital de Isospora belli. Los ooquistes inmaduros que contienen un esporoquiste se eliminan al medio externo por las heces. En condiciones ambientales ideales, el ooquiste madura y desarrolla dos esporozoítos que actúan como formas infecciosas. Con la ingestión de los ooquistes infectantes en ali­ mentos o agua contaminados por un huésped humano, se liberan los esporoquistes en el intestino e invaden las células epiteliales de la mucosa, en las cuales se desarrollan esquizogonias. Se liberan los esporozoítos maduros de las células intestinales. En el proceso de gametogenia se forman gametocitos masculinos y feme­ ninos. Después de la fecundación del gametocito femenino por el masculino liberado del esporozoíto se forma un ooquiste de pared gruesa. La liberación de estos ooquistes inmaduros en el ambiente externo completa el ciclo vital.

Notas del laboratorio. En el caso de infecciones con gran canti­ dad de parásitos, las técnicas de concentración habituales para el aislamiento de huevos y parásitos en la mayoría de los labo­ ratorios son adecuadas para los ooquistes de Cryptosporidium. En el caso de infecciones leves se recomienda el método de flo­ tación con azúcar de Sheather y puede realizarse como lo des­ cribe Garza98 (recuadro 22-4). Es de uso habitual una técnica modificada de concentración con formol-acetato de etilo (FEA) para detectar ooquistes de criptosporidios en muestras de heces. Luego del procedimien­ to habitual de FEA, el sedimento aparece en capas y flota sobre una solución salina hipertónica para separar los parásitos de los detritos de las heces. Esta técnica mostró ser la mejora más sig­

nificativa en el aislamiento de ooquistes en muestras de heces sólidas y no grasas. La tinción para ácido-alcohol resistencia modificada puede utilizarse para detectar ooquistes de Cryptosporidium en frotis secados al aire y fijados con metanol improntas directamente de una muestra fecal.98 La tinción con carbolfucsina se aplica al frotis de la misma manera que la técnica habitual para ácidoalcohol resistencia; sin embargo, se utiliza H ,S04 al 1% como decolorante en lugar del alcohol-ácido. Los ooquistes aparecen rosados a rojos contra el fondo verde claro del colorante de contraste. Para la detección de ooquistes de Cryptosporidium en mues­ tras fecales existen varios equipos comerciales de inmunoaná-

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Parasitología

a las especies de Isospora y Cryptosporidium parvum, salvo que tienen dos esporoquistes por ooquiste y dos esporozoítos por esporoquiste (Isospora belli tiene dos esporoquistes por ooquis­ te y cuatro esporozoítos por esporoquiste; las especies de Cryptosporidium tienen cuatro esporozoítos “desnudos” o no enquistados por ooquiste). La especie se denominó Cyclospora cayetanensis en honor de la Universidad Peruana Cayetano Heredia de Lima, Perú, la institución donde se realizó gran parte de la investigación epidemiológica y taxonómica original. En muestras de heces no concentradas y sin teñir, los ooquis­ tes de las especies de Cyclospora no presentan refringencia, son esféricos u ovales, con cuerpos algo rugosos, miden 8 a 10 |im de diámetro (casi el doble del tamaño de los ooquistes de las especies de Cryptosporidium ), con una agrupación interna de glóbulos unidos a la membrana.17 Son ácido-alcohol resis­ tentes y se tiñen de color rosa pálido o rosa rojizo con estruc­ turas internas más oscuras (lámina en color 22-4C). Es posible que las células más viejas no se tiñan. Los ooquistes se tiñen de rojo anaranjado con safranina; no se tiñen con hematoxilina férrica, metenamina argéntica de Grocott-Gomori, yodo ni ácido peryódico de Schiff (PAS).166 Los ooquistes tienen fluo­ rescencia propia verde intensa (filtro de excitación de 450-490 DM) o azul intenso (filtro de excitación de 365 DM) con epifluorescencia. Los directores y supervisores de los laboratorios de microbiología deben decidir si las muestras de heces serán examinadas de manera habitual para la presencia de Cryptosporidium y Cyclospora. En los ámbitos donde se reci­ ben muestras de heces de muchos pacientes con SIDA, se reco­ mienda realizar de rutina preparaciones teñidas para ácidoalcohol resistencia de los frotis fecales. El ciclo vital, aunque no comprendido en su totalidad, se considera similar al de las especies de Cryptosporidium. Los esporozoítos se exquistan a partir de los ooquistes en el tubo digestivo enseguida después de su ingestión por alimentos o agua contaminados e ingresan en las células epiteliales del intestino delgado. Se desconoce el mecanismo que causa la diarrea; la endoscopia revela eritema moderado a intenso de la porción distal del duodeno. Las biopsias de duodeno y yeyuno revelan vellosidades yeyunales romas, atrofia de las vellosida­ des e hiperplasia de las criptas de grado variable. La ausencia de leucocitos y eritrocitos fecales indica que el proceso no es invasivo; la alteración de la absorción de la D-xilosa implica un síndrome típico de malabsorción. La enfermedad suele seguir a la ingestión de agua y es más frecuente en los meses templados del verano. También se ha implicado la leche en polvo diluida con agua antes de su con­ sumo.297 En un brote en el Cook County Hospital de Chicago, la diarrea afectó al personal médico y a los empleados en una habitación luego de fallar la bomba de agua del lugar.296 La enfermedad relacionada con Cyclospora suele manifestarse como “diarrea del viajero”, con varias citas en la bibliografía de diarrea en viajeros que regresan de Haití, México, Guatemala, Puerto Rico, Marruecos, Camboya, Pakistán, In­ dia, las islas Salomón y en particular Nepal.136'218 Específica­ mente, los brotes en los Estados Unidos y Canadá durante los meses de la primavera de 1996 y 1997 se relacionaron con la ingestión de frambuesa importada de Guatemala.128 El período de incubación es de 2 a 7 días. El comienzo de la diarrea puede ser abrupto (68% de los casos) o gradual (32%).240 La diarrea acuosa, que es autolimitada en los pacientes inmu­ nocompetentes (rara vez tiene una duración mayor de 12 días), puede acompañarse por náuseas, cólicos abdominales, fatiga y malestar general. En los pacientes inmunosuprimidos, en espe­ cial en los pacientes con SIDA, que con frecuencia están infec­

tados, la diarrea puede prolongarse y durar de 4 a 6 semanas; puede simular al esprue tropical y asociarse con enfermedad biliar. En 450 pacientes con SIDA, Pappe y cois.204 encontraron especies de Cryptosporidium en las muestras de heces de 135 (30%), Isospora belli en el 12%, Cyclospora en el 11%, Giardia lamblia en el 3% y Entamoeba histolytica en el 1%. La farmacoterapia específica tiene eficacia limitada. La aso­ ciación de trimetoprim y sulfametoxazol administrada por vía oral resultó eficaz en el tratamiento de algunos casos; en otros se utilizaron metronidazol, norfloxacina, quinacrina, ácido nalidíxico y furoato de diloxanida con éxito variable.204 En los pacientes con SIDA, el tratamiento suele estar limitado a medi­ das de apoyo con hidratación y suplementos nutricionales, aun­ que Pappe y cois.204 establecieron que trimetoprim-sulfameto­ xazol resultó eficaz en algunos casos, en especial cuando se indicaron dosis mayores. En un estudio realizado en Nepal, la eliminación de ooquistes y la desaparición de los síntomas sucedieron después de 7 días de tratamiento.136 ISOSPORA BELLI

La isosporiasis, una enfermedad caracterizada por diarrea y malabsorción, antes sólo se la encontraba en raras oportunida­ des y se la consideraba de importancia clínica limitada. En al­ gunos casos puede experimentarse una enfermedad grave, en la cual se observan concentraciones elevadas de protozoos en el intestino. En casos prolongados puede haber fiebre, cefalea, esteatorrea y pérdida de peso; en infecciones abrumadoras se informaron muertes debidas a pérdidas de agua y al desequili­ brio electrolítico. La enfermedad puede persistir durante me­ ses, en particular en los pacientes con SIDA, en que se aísla Isospora belli con frecuencia creciente como una de las causas del síndrome diarreico. García96 informó varios casos de enfer­ medad intestinal y extraintestinal debilitantes en pacientes coinfectados con SIDA e Isospora belli , y concluyó con la recomendación de que los médicos consideren este parásito en los pacientes con SIDA que han inmigrado o viajado a América Latina o que son hispánicos nacidos en los Estados Unidos, sobre todo si también son adultos jóvenes. Además, se reco­ mienda que los pacientes con SIDA que viajan a América Latina y otros países en vías de desarrollo sean advertidos de la trans­ misión por agua y alimentos de I. belli y se considere la posibi­ lidad de la farmacoprofilaxis. El fármaco de elección es trime­ toprim-sulfametoxazol; la pirimetamina es una alternativa. Las infecciones humanas por I. belli difieren de las de otros coccidios en que las formas sexual y asexual habitan en el intestino humano y no se requiere un segundo huésped para completar el ciclo vital. La transmisión interhumana ocurre después de la ingestión de los ooquistes infectantes en los ali­ mentos o el agua contaminados por heces; por esto, la enfer­ medad no es una zoonosis. Los ooquistes son las formas diag­ nósticas observadas en las muestras fecales humanas; miden de 25 a 30 |im de diámetro, con una pared lisa y delgada y son inmóviles. Los ooquistes inmaduros contienen un esporoquiste único (lámina en color 22-4E); lo más típico en muestras feca­ les es la observación de ooquistes maduros que contienen dos esporoquistes (lámina en color 22-4F). ESPECIES DE SARCOCYSTIS

Las especies de Sarcocystis utilizan dos mamíferos para las fases sexual y asexual de sus ciclos vitales. Los seres humanos pueden actuar como huésped intermediario o definitivo. Como huésped definitivo, las personas se infectan por la ingestión de

Protozoos intestinales

carne de vaca o de cerdo cocida de manera deficiente; el ciclo sexual del organismo se realiza en la porción subepitelial de la mucosa del intestino delgado. Las infecciones intestinales se asocian con 5. hominis o S. suihominis (antes Isospora homi­ nis ) y a menudo son asintomáticas, pero en ocasiones causa un síndrome diarreico similar al producido por Isospora belli. Las formas diagnósticas en muestras de heces son ooquistes ovales que miden entre 10 y 20 pm. Contienen dos esporoquistes, con un aspecto similar a los de I. belli. También pueden observarse esporoquistes únicos de 13 a 17 pm. Como huésped intermediario, que sucede cuando los seres humanos ingieren de modo inadvertido ooquistes provenientes de otras fuentes animales contaminadas con heces, se desarro­ llan sarcoquistes en la musculatura esquelética y pueden verse en biopsias de músculo esquelético, o se han observado en músculo esquelético en autopsias,15 donde se visualizan estos sarcoquistes con un tamaño de 100 x 300 pm (lámina en color 22-4G). Esta forma suele ser asintomática, aunque en casos raros se informaron polimiositis y eosinofilia. Más reciente­ mente, Amess y cois.10 comunicaron un brote de miositis eosinófila aguda entre 15 hombres de un equipo militar estadouni­ dense que trabajaban en las zonas rurales de Malasia. En siete soldados se observaron grados variables de fiebre, mialgias, broncoespasmos, erupciones pruriginosas fugaces, linfadeno­ patía transitoria y nodulos subcutáneos; todos estos síntomas son comunes para sarcocistosis. Las alteraciones del laborato­ rio incluían eosinofilia, aumento de la velocidad de eritrosedimentación y concentraciones elevadas de creatincinasa en el músculo. Las especies de Sarcocystis se aislaron en una mues­ tra de biopsia de músculo esquelético obtenida del caso inicial. Los síntomas persistieron en algunos soldados durante 5 años. En estos casos prolongados se observó en la histología miosi­ tis crónica, fasciculitis y mionecrosis con calcificación. Filo Microsporum: especies de Microsporidium

Los microsporidios son parásitos intracelulares estrictos lo suficientemente particulares para ser clasificados en un filo separado: Microspora.'63 La característica singular de los miembros de este filo es la producción de esporas que contie­ nen un mecanismo de extrusión tubular complejo por el cual el material infeccioso, “esporoplasma”, se inyecta en las células huésped. Esto sucede después de la ingestión por el huésped, estimulado por cambios en el pH y en la concentración iónica del contenido intestinal. El túbulo enrollado se evierte y pene­ tra en la célula huésped. Alrededor de 80 géneros y más de 700 especies se incluyen en este grupo “comodín”, que en conjunto se denomina Mi­ crosporidium y que afecta sobre todo a huéspedes no humanos de importancia comercial, como insectos, peces, roedores de laboratorio, conejos, animales para uso en peletería y prima­ tes.-3 Son eucariontes verdaderos (quizá se originan como una rama temprana de los eucariontes), con núcleo, membrana nuclear y una serie de membranas intracitoplasmáticas. Dentro del filo hay varios géneros, de los cuales sólo cuatro causan enfermedad en los seres humanos: Encephalitozoon, Nosema, Pleistophora y Enterocytozoon. Un quinto género recién deno­ minado Septata se encontró que está estrechamente relaciona­ do con Enterocytozoon y ya no pertenece a la categoría de un género separado. La diferenciación de especies es casi imposi­ ble mediante la microscopia óptica. Identificación por el laboratorio. El diagnóstico de microsporidiosis puede realizarse por la identificación de las esporas de los microsporidios en cortes histológicos incluidos en parafina.

1219

Aunque pueden observarse en cortes teñidos con H-E, se visua­ lizan mejor en cortes teñidos con PAS, sales argénticas (GMS), ácido-alcohol resistencia o Giemsa. Las esporas aparecen den­ tro de los enterocitos intestinales, ubicados de modo caracte­ rístico entre el núcleo de la célula y la luz del intestino. En las preparaciones teñidas con PAS, puede observarse un gránulo PAS positivo en el extremo anterior de cada espora. Aparecen como puntos oscuros cuando se tiñen con Giemsa. En el traba­ jo de García se encuentran varias microfotografías que mues­ tran estas esporas.96 La microscopia electrónica sigue siendo el método de refe­ rencia. La identificación de las esporas con un tubo polar es característica de todos los géneros. Los miembros del género Encephalitozoon están encerrados en una vesícula limitante, similar a un fagosoma, producida por el huésped. Las especies de Enterocytozoon y de Nosema se desarrollan en contacto directo con el citoplasma de la célula huésped sin una vesícula limitante; las especies de Nosema se diferencian porque tienen núcleos pareados colindantes.23 El diagnóstico de laboratorio se realiza con mayor frecuen­ cia en la sección de parasitología clínica mediante la demos­ tración de esporas en preparaciones teñidas de muestras feca­ les. Presentan las siguientes características: • Las esporas son diminutas y miden, de 1,5-2,5 x 2,5-4 (im. • Presentan una forma oval o cilindrica, con paredes gruesas que determinan la resistencia a las condiciones ambientales y son difíciles de teñir. • Una banda transversal y rosa en la mitad de la célula es la característica distintiva para la identificación (lámina en color 22-4H). • Las esporas se tiñen de manera deficiente con H-E, pero pueden visualizarse mejor con técnicas de Gram, ácidoalcohol resistencia, PAS, Giemsa y una tinción tricrómica modificada. • Son grampositivas y ácido-alcohol resistentes; en las tincio­ nes con PAS se observa un gránulo anterior PAS-positivo. • La tinción ideada por Weber y cois.279 puede ser muy reco­ mendada para la detección de las esporas de los microspori­ dios en aspirados duodenales y en heces (recuadro 22-5). DeGirolami y cois.60 hallaron que la tinción tricrómica mo­ dificada de Weber y las tinciones fluorocrómicas Uvitex 2B mostraron una sensibilidad igual y elevada cuando se compa­ raron con las biopsias duodenales para la detección de esporas de microsporidios en frotis de material de biopsia de aspirados duodenales provenientes de 43 pacientes. Ryan y cois.232 des­ cribieron una tinción modificada en la cual se disminuye la concentración de ácido fosfotúngstico a 0,25 g/dL y se utiliza azul de anilina en lugar de verde rápido (fast green) como colo­ rante de contraste. Cada procedimiento de tinción requiere 90 minutos y la selección entre la tinción de Weber y de Ryan depende de la preferencia personal. Kokoskin y cois.158 encon­ traron que la realización de la tinción a la temperatura de 50 °C y la disminución del tiempo a 10 minutos produjeron una tin­ ción más profunda y más fácil de interpretar. Como las esporas de microsporidios son muy pequeñas y pueden semejarse a células bacterianas o de levaduras muy pequeñas, siempre es necesario realizar un control positivo cuando se efectúa cual­ quiera de estas tinciones. Aunque todas las especies de microsporidios pueden causar infecciones diseminadas y pueden encontrarse en diversos órganos, como hígado, riñón y cerebro, Enterocytozoon bieneusi es la especie que tiende a infectar de modo preferencial a

1220

C A PÍTU LO 22 Parasitología

Microsporidium en la microscopia óptica, la prevalencia de las Recuadro 2 2-5

T in ció n de W eb er para la detecció n de e sp o ras de m icro sporid io s en heces y aspirados du o d en ales280

1. Preparar los portaobjetos para el examen por microscopia óptica de heces tomando una alícuota de 10 fiL de heces líquidas sin concentrar, con formaldehído al 10% (relación 12:3), esparcida finamente en un área de 45 x 25 mm. 2. Fijar los frotis en metanol durante 5 minutos. 3. Teñir durante 90 minutos con la tinción cromotrópica de Weber. Para preparar el colorante, mezclar: Cromótropo 2R (Harleco, Gibbstown. NJ) 6,00 g Colorante (Allied Chemical & Dye. New York) 0.15 g Acido fosfotúngstico 0,70 g Permitir que estos ingredientes reposen ("maduren") durante 30 minu­ tos en 3 mL de ácido acético glacial. Luego mezclar con 100 mL de agua destilada. 4. Después de la tinción, enjuagar el portaobjetos con ácido alcohol (4.5 mL de ácido acético y 995,5 mL de alcohol etílico al 90%) durante 10 segundos y enjuagar brevemente con alcohol al 95%. 5. Deshidratar en forma sucesiva los frotis en alcohol al 95% durante 5 minutos alcohol al 1 0 0 % durante 1 0 minutos Hemo-De (sustituto de xileno, Fisher Scientific) durante 10 minutos. 6 . Examinar 100 campos con objetivo de inmersión por cada portaobjetos, durante alrededor de 10 minutos. Buscar las pequeñas esporas cilindri­ cas de 1-4 (im, que se tiñen de rosa a rojo brillante.

los enterocitos en la mucosa del intestino delgado, en especial en los pacientes con SIDA.85 Sin embargo, varios informes de casos, según la revisión de Pol y cois.,216 indican que E. bieneusi puede colonizar el epitelio del conducto biliar que con­ duce a la colangitis. La prevalencia estimada de la infección intestinal por microsporidios en pacientes con SIDA suele ser del 12%,158 o incluso mayor si se utilizan técnicas especiales, como citocentrifugación, detección con anticuerpos fluores­ centes y serología. Encephalitozoon cuniculi se asocia con ma­ yor frecuencia con la infección diseminada, con predilección para infectar el cerebro y los riñones. Nosema corneum se encontró en varios casos de queratoconjuntivitis;32 sin embar­ go, Encephalitozoon cuniculi y Encephalitozoon hellem tam­ bién se aislaron en la córnea y la conjuntiva en pacientes con SIDA y queratoconjuntivitis.67 La conjuntivitis, la escleritis, la sensación de cuerpo extraño y la visión borrosa son síntomas de presentación comunes. El personal con experiencia puede identificar las esporas intracitoplasmáticas diminutas (2 ¡im de diámetro) característi­ cas en cortes de tejido teñidos en biopsias intestinales. Las esporas se demuestran mejor mediante las tinciones de Gram modificadas por Brown-Brenn o Brown-Hopps para tejidos o de improntas teñidas con Giemsa. Los protozoos también pue­ den observarse en cortes semidelgados incluidos en plástico teñidos con azul de metileno-azur II con fucsina básica o azul de toluidina como colorantes de contraste.23 Cuando se utilizan estas tinciones siempre deben prepararse en paralelo portaob­ jetos como control positivo. Las esporas también se han demostrado en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y en la orina por microscopia óptica de fluorescencia. Cuando el personal del laboratorio comienza a utilizar las diversas técnicas descri­ tas y se familiariza con la morfología de las especies de

infecciones aumenta en forma evidente y la probabilidad de subdiagnóstico es menor. Aldras y cois.5 demostraron la superioridad de la detección de esporas de microsporidios en las heces de pacientes con SIDA en tinciones de inmunofluorescencia indirecta, mediante el empleo de antisueros policlonales contra E. cuniculi y E. hellem y anticuerpos monoclonales contra E. hellem. En los laboratorios de investigación existen varias técnicas para la detección no microscópica de esporas de microspori­ dios en la espera del momento en que pueda simplificarse el diagnóstico de laboratorio. Zierdt y cois.308 utilizaron diversos antisueros policlonales de ratón y de conejo contra las esporas de E. cuniculi y Encephalitozoon hellem en una prueba indi­ recta con anticuerpos fluorescentes para identificar de modo satisfactorio esporas de microsporidios en 11 de 12 muestras fecales, además de utilizarlos en la detección de antígeno en líquidos de colon y duodenal y en preparaciones de biopsia por impronta de duodeno. Franzen y cois.85 utilizaron con éxito amplificación del DNA de microsporidios por PCR en seis muestras de biopsia duodenal que se sabía que eran positivas para detectar el fragmento específico de 353 pares de bases de DNA de Enterocytozoon bieneusi. Los autores sugirieron que la PCR puede ser un enfoque útil para diagnosticar microsporidiosis en pacientes infectados por el HIV. De hecho, los CDC consideran que el diagnóstico molecular con cebadores para PCR específicos de especie es el método de referencia para la identificación de especies de microsporidios.54 Se ha encontra­ do que los métodos de PCR utilizados en los laboratorios de los CDC no amplifican en forma cruzada con otras 20 especies no patógenas de Microsporidium. El tratamiento eficaz para la microsporidiosis es limitado. El tratamiento de las infecciones intestinales debidas a Enterocy­ tozoon bieneusi con pirimetamina, metronidazol o trimeto­ prim-sulfametoxazol (SXT) puede obtener buenos resultados. De Groote y cois.61 informaron el tratamiento exitoso de un paciente con SIDA con albendazol, un caso en el cual la PCR se utilizó para proporcionar el diagnóstico precoz. Para una revisión global de las infecciones humanas por microsporidios, que incluye 250 referencias, véase Weber y cois.,280 quienes introducen varias técnicas diagnósticas nuevas que “facilitarán estudios futuros sobre incidencia, factores de riesgo, orígenes de la infección, modos de transmisión, manifestaciones clíni­ cas, patogenia y tratamiento de este patógeno emergente”.

Nematodos Los nematodos son helmintos cilindricos; los adultos se ca­ racterizan por un cuerpo algo aguzado, con músculos orientados en sentido longitudinal y un esófago trirradiado. Las especies de nematodos intestinales que con mayor frecuencia infectan a los seres humanos son: Ascaris lumbricoides Trichuris trichiura

Uncinarias: Necator americanus Ancylostoma duodenale Strongyloides stercoralis Enterobius vermicularis Capillaria philippinensis Especies de Trichostrongylus

N em atodos

Se estima que alrededor de 3,2 mil millones de personas están infectadas por nematodos intestinales en el mundo.2535 La magnitud de estas cifras refleja la morbimortalidad considera­ ble secundaria a los efectos de estos parásitos y la elevada pro­ babilidad de que los laboratorios clínicos detecten una o más de estas formas parasitarias en los exámenes habituales de mues­ tras de heces. En este grupo de helmintos los ciclos vitales varían en com­ plejidad y modos de infección. Estos nematodos no tienen huésped intermediario, como se muestra en la figura 22-8; sin embargo, la mayoría requiere una fase fuera del huésped huma­

1221

no para que los huevos evolucionen a una forma infecciosa. El huevo es un gameto maduro producido por las hembras adultas que residen en el intestino y es expulsado por las heces. Éste es el estadio de reposo, que sirve como forma diagnóstica, infec­ ciosa o ambas. Los huevos de la mayoría de las especies de nematodos requieren etapas intermediarias de desarrollo en el ambiente externo en una forma larvaria y a menudo infecciosa, de acuerdo con la temperatura, la humedad y la naturaleza del suelo en el cual se eliminan. En este capítulo se incluyen esquemas de los ciclos vitales con notas explicativas para varias de las especies de nematodos.

C IC LO VITAL DE A s c a ris lu m b ricoides m

Tráquea

—

Pulmones

Faringe D eglución

C irculación

/

A dultos en la luz del intestino delgado

Eclosión de la larva en el intestino S ER ES H U M AN O S

Huevos en las heces Huevo em brionado con larva de segundo estadio (estadio infectante) Fecundada (1 célula)

Sin fecundar

A M B IE N TE EXTE R N O

Partición avanzada

Estadio de 2 células

Figura 22-8 Ciclo vital de Ascaris lumbricoides. El ciclo vital no involucra un huésped intermediario externo. Es algo complejo y requiere un período para la maduración del huevo en el ambiente externo y una fase migratoria larvaria transpulmonar en los seres humanos que pueden causar síntomas asmatiformes transi­ torios en las infecciones con gran cantidad de parásitos. Los huevos fecundados que son eliminados por las heces al suelo requieren 2 a 3 semanas en condiciones ideales de humedad y temperatura para evolucionar desde el estadio inicial de dos células a la partición avanzada y el estadio embrionado final e infectante. Cuando un huésped humano ingiere alimentos o agua contaminados con huevos infectantes, en el intestino emergen las formas larvarias e ingresan en la circulación. Después de su pasaje a través de los capilares pulmonares, las larvas pasan a los alvéolos pulmonares y con la tos ascienden y son digeridas. En el intestino maduran en pará­ sitos adultos machos o hembras, donde permanecen limitados a la luz o migran hacia diversos conductos u orificios. Las hembras grávidas depositan una gran can­ tidad de huevos que son eliminados por las heces para completar el ciclo vital.

1222

C A PÍTU LO 22

Parasitología

Ascariasis y Ascaris lumbricoides R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N C LÍN IC A 22-4 A scariasis

Se estima que Ascaris lumbricoides afecta a cerca del 25%, o mil millones, de la población mundial.25 La prevalencia máxi­ ma se observa en personas desnutridas que residen en países en vías de desarrollo. Las regiones con tratamientos modernos de agua y desechos cloacales tienen una incidencia baja de la enfermedad. En la figura 22-8 se esquematiza el ciclo vital de Ascaris lumbricoides, representativo de los nematodos como grupo. Las manifestaciones clínicas de la ascariasis se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-4. Identificación por el laboratorio. El diagnóstico de laboratorio de la ascariasis se efectúa mediante la observación de los parási­ tos adultos cuando salen por los orificios del cuerpo, in situ en el intestino, o en sistemas de conductos contiguos, como el biliar o el pancreático (como puede observarse en la cirugía o en la autopsia). Con mayor frecuencia, la identificación se rea­ liza mediante la detección de los huevos característicos en muestras de heces. Las características de identificación princi­ pales de Ascaris lumbricoides son: Parásitos adultos

• Miden entre 15 y 35 cm de longitud. • Los machos son más pequeños y pueden identificarse por su cola curva (lámina en color 22-5A). • La cutícula es lisa y carece de las estriaciones musculares anulares características de las lombrices de la tierra. H uevos

• Los huevos fecundados miden entre 45 y 60 lim y los huevos no fecundados, entre 90 x 40 (im. • Son amarillo castaño (teñidos con bilis), ovales o esféricos y presentan una cáscara gruesa, transparente y hialina recubierta por una capa albuminoide (lámina en color 225B). • Los huevos con una exposición prolongada a las secreciones pancreáticas pueden carecer de la capa albuminoide (decorticados). • Los huevos fecundados pueden reconocerse por la partición de la yema interna; los huevos no fecundados carecen de la organización interna. Los huevos embrionados en los últimos estadios del desarrollo pueden contener la forma larvaria (lámina en color 22-5C). • Los huevos no fecundados y decorticados recuerdan a las células vegetales y pueden ser extremadamente difíciles de reconocer en las muestras de heces (lámina en color 22-5D). En la mayoría de los casos, el examen de campos microscó­ picos adicionales suele revelar los huevos con la capa exter­ na albuminoide y mamelonada. Los huevos de Ascaris lumbricoides no fecundados son demasiado pesados para flotar en el procedimiento de flotación con sulfato de cinc y suelen pasarse por alto si no se examina también el sedimento. La presencia de huevos no fecundados sólo en las muestras de heces puede indicar infección con un único parásito hembra. Una hembra adulta de Ascaris lumbri­ coides produce cerca de 200 000 huevos por día; por consi­ guiente, la cuantificación de huevos en muestras fecales mediante el recuento de huevos, un procedimiento valioso para evaluar la magnitud de las infecciones por uncinadas, no siem­ pre refleja la cantidad de parásitos.

Los pacientes con infecciones leves pueden ser asintomáticos. En las infecciones intestinales con gran cantidad de parásitos, los síntomas fre­ cuentes son dolor abdominal, malestar y diarrea. En contraposición con las uncinarias, en las que el requisito previo para la presencia de enfer­ medad es la abundante cantidad de parásitos, la infestación intestinal humana por A. lumbricoides puede ser importante sólo con un gusano, debido a su gran tamaño. Los parásitos adultos tienen la propensión de migrar y deambular en el interior de los conductos biliares, el conducto pancreático o la luz del apéndice o, en raras oportunidades, penetran el intestino. Maddem y cois . 14 informaron un caso mortal de pancreatitis en el cual un único Ascaris lumbricoides se encontraba impactado den­ tro de la ampolla de Vater. La apendicitis, la pancreatitis, la obstrucción biliar y la formación de absceso hepático son posibles complicaciones, incluso en las infecciones leves. 118 Esta propensión de Ascaris de deambular desde la luz del intestino, en particular durante el tratamiento con fármacos, es una de las razones por las cuales los ciclos inadecuados o incompletos de tratamiento pue­ den ser muy peligrosos. En las infecciones intensas, los parásitos adul­ tos pueden salir del recto o ser expectorados. La obstrucción intestinal, la intususcepción, el vólvulo o la perforación intestinal son posibles complicaciones de la infección intensa. La obstrucción intestinal sucede en alrededor de 2 de cada 1 0 0 0 individuos infectados; causa una morta­ lidad de 6 por cada 100 000 niños . 264 Baird y cois . 13 publicaron un caso mortal de ascariasis en una niña sudafricana de raza negra de 2 años en la que se eliminó en la autopsia un conglomerado de 796 Ascaris lumbricoides que pesaba 550 g. La causa de la muerte fue la torsión y la gangrena del íleon por la gran cantidad de parásitos. También se halla­ ron parásitos en el estómago, el esófago, los conductos biliares intrahepáticos y extrahepáticos, y la vesícula biliar. El tratamiento se realiza con mebendazol (Vermox®), que se admi­ nistra como comprimidos masticables de 100 mg. Los efectos colatera­ les incluyen dolor abdominal y diarrea, en especial si la infección es intensa y se eliminan muchos gusanos. El empleo de este fármaco está contraindicado durante el embarazo. Hay pocos indicios sobre la utili­ dad de los fármacos durante el estadio de migración de las larvas .96

Tricocefalosis (trichuriasis) y Trichuris trichiura

No se conoce la incidencia global de las infecciones por Tri­ churis trichiura, aunque se ha citado una prevalencia del 90% en ciertas poblaciones de Camerún, Malasia y países del Ca­ ribe. Vermud y cois.,272 encontraron que T. trichiura era el nematodo más frecuente aislado en 41 958 muestras de heces remitidas al Columbia-Presbyterian Medical Center en Nueva York durante 1971 1984. El ciclo vital de Trichuris trichiura sigue una vía de trans­ misión simple fecal-oral sin fase intermediaria en un huésped externo y se ilustra en la figura 22-9. Las manifestaciones clínicas de la tricocefalosis se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-5. Identificación por el laboratorio. El diagnóstico de laboratorio de la tricocefalosis suele realizarse mediante la observación de los huevos con forma de barril característicos en muestras fecales. Los adultos miden de 30 a 50 mm de longitud; en promedio, los machos son algo más pequeños. Estos pueden reconocerse por su extremidad caudal larga y delgada que forma una espi­ ral de 360°, de la cual proviene la denominación informal de “lombriz látigo”. En las infecciones intestinales, la cabeza está clavada en la mucosa del intestino grueso; por consiguiente, los

N em atodos

1223

C IC LO VITAL DE Trichuris trichiura P enetración y desarrollo en la m ucosa

E closión de la larva en el intestino

Ingestión

Huevo em brionado (estadio infectante)

Partición avanzada

Figura 22-9 El ciclo vital de Trichuris trichiura es similar al de Ascaris lumbricoides, salvo que no presenta el estadio larvario circulatorio. Los huevos, después de la eliminación en el ambiente externo, también requieren un período de alrededor de 2 1 días en condiciones favorables antes de que se vuelvan infectantes. Cuando el huésped humano ingiere los huevos embrionados, las larvas eclosionan en el intestino. Sin embargo, a diferencia de lo que sucede con Ascaris, estas lar­ vas penetran sólo en la mucosa del intestino, sobre todo en el ciego, donde se fijan y evolucionan a parásitos adultos, machos y hembras. Las hembras grávidas depositan huevos que son eliminados por las heces para completar el ciclo vital.

adultos rara vez se observan en las muestras de heces. En la lámina en color 22-5E se muestra una fotografía con aumento de un parásito adulto. H uevos

• Miden alrededor de 54 x 22 |im. • Están entre las formas que se reconocen con más facilidad en las preparaciones microscópicas por su forma de barril característica y los “tapones” polares hialinos, convexos y refringentes en cada extremo (lámina en color 22-5F). • Estos huevos pueden confundirse sólo con los de Capillaria philippinensis', sin embargo, sus tapones polares son menos prominentes, son aplanados y la cáscara es más gruesa y estriada (lámina en color 22-5P).

Enterobius vermicularis (oxiuros)

Las infecciones por “oxiuros” se conocen desde la antigüe­ dad y es probable que representen las más comunes de todas las infecciones por nematodos. Una frase bien conocida es “Usted puede haber tenido una infección cuando era niño; o, si no. es probable que la adquiera cuando tenga niños”. El ciclo vital de Enterobius vermicularis es bastante simple, no requiere un huésped externo y la principal vía es la fecal-oral a través de la transmisión interhumana directa mano-boca, similar a la de las amebas intestinales. En la mayoría de los casos, los huevos ya han madurado en el momento de su detección en muestras de heces o en las preparaciones provenientes de la piel perianal. En estas muestras suelen observarse larvas bien desarrolladas y muy infecciosas.

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C APÍTULO 22 Parasitología

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 22-5 Tricocefalosis (trichuriasis) En las infecciones leves, los pacientes suelen ser asintomáticos. Los parásitos adultos habitan en el intestino grueso. En las infecciones inten­ sas puede haber diarrea, disentería y malestar abdominal debidos en gran medida al daño mecánico de la mucosa intestinal. La anemia, la restric­ ción del crecimiento y la filtración intestinal se identificaron como con­ secuencias predecibles de la infección intensa y pueden servir como indicio de la magnitud de la infestación . 44 También se observaron grados variables de malabsorción y como la diarrea tiende a ser acuosa, las alte­ raciones del equilibrio del sodio y del potasio pueden constituir un pro­ blema. El prolapso rectal en los niños es una de las complicaciones de la infección intensa por Trichuris.113 Como los parásitos adultos son visi­ bles a simple vista como corpúsculos diminutos, su presencia da una apariencia en “pastel de coco” a este prolapso. El tratamiento de elección es con mebendazol. en comprimidos masticables de 1 0 0 mg.

correlación clínica 22-6. Las características útiles para la iden­ tificación son: Parásitos adultos

• La hembra adulta mide alrededor de 8 a 13 mm de largo x 0,4 mm de diámetro. • Puede reconocerse por la expansión alar de la cutícula en el extremo anterior (lámina en color 22-5G) y la cola larga pun­ tiaguda (en forma de “alfiler”). H uevos

• Miden alrededor de 30 x 50 |tm. • Tienen una cáscara delgada, lisa y transparente. • Presentan un contorno oval y asimétrico, con un lado apla­ nado, que simula una pelota de fútbol americano algo desin­ flada (Lámina en color 22-5F). • Suele contener una larva bien desarrollada (lámina en color 22-5F, derecha). Uncinarias

Identificación por el laboratorio. El diagnóstico de infección por oxiuros puede realizarse mediante la observación de los parási­ tos adultos, ya sea directamente en el esfínter anal, o por microscopia en preparaciones con cinta engomada transparen­ te. Estas preparaciones se realizan al presionar el lado pegajo­ so de un segmento corto de la cinta sobre los pliegues alrede­ dor del ano o la piel perineal, y luego pegando la superficie de la cinta en un portaobjetos para el estudio microscópico. No es habitual encontrar los huevos característicos en muestras de heces; sin embargo, suelen observarse en estas mismas prepa­ raciones con cinta engomada (lámina en color 22-4F). El ren­ dimiento de estas formas de diagnóstico es mejor en los niños si la prueba se lleva a cabo en las primeras horas de la mañana cuando la migración del parásito es máxima, inmediatamente antes de levantarse y antes de las deposiciones. Las manifesta­ ciones clínicas de la enterobiasis se ilustran en el recuadro de

RECUADRO DE CORRELACION CLINICA 22-6 Entero­ biasis Los parásitos adultos residen en el ciego y el recto. En ocasiones, el diagnóstico se realiza mediante la observación de los parásitos en prepa­ raciones histológicas teñidas del apéndice u otras porciones del intesti­ no. Los síntomas aparecen cuando la hembra grávida deposita los hue­ vos en los pliegues de la piel perianal durante las últimas horas de la noche. El prurito anal nocturno es el síntoma de presentación habitual debido a la irritación causada por los huevos depositados. Las infeccio­ nes son más frecuentes en los niños y las mujeres, que son más propen­ sos a la infección que los hombres. En las infecciones con gran cantidad de parásitos puede haber vaginitis con secreción mucoide o uretritis en las mujeres jóvenes.* El nerviosismo, el insomnio y las pesadillas son otros síntomas de presentación. El pamoato de pirantelo o el mebendazol, este último en una dosis única de 1 0 0 mg en forma de cápsulas masticables, constituyen los tra­ tamientos de elección. Como las infecciones pueden recidivar, suele ser necesario repetir el tratamiento después de 1 o 2 semanas si los sínto­ mas reaparecen.

Ancylostoma duodenale es la especie de uncinarias del Viejo Mundo y Necator americanus es la del Nuevo Mundo, defini­ das por las áreas de enfermedad endémica. Como los ciclos vitales de estas dos especies son en esencia iguales y no pue­ den diferenciarse por el aspecto de sus huevos, suele utilizarse el término “uncinarias” para ambas. Se estima que hay en el mundo entre 700 y 900 millones de personas infectadas por uncinarias (sobre todo Ancylostoma duodenale ), de las cuales el 0,2% sufre anemia grave. Aunque no se precisa un segundo huésped para completar el ciclo vital, importantes diferencias mantienen separadas a las uncinarias de los otros nematodos. El ciclo vital se ilustra en la figura 22-10. Las manifestaciones clínicas de la enfermedad por uncina­ rias se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-7. Diagnóstico de laboratorio. Lo habitual es realizar el diagnóstico de laboratorio mediante la observación de los huevos caracte­ rísticos en las muestras de heces, aunque el diagnóstico en raras ocasiones puede hacerse por la observación de parásitos adultos en el intestino cuando están fijados a la cubierta mucosa y no son eliminados por las heces. Es importante identificar los hue­ vos de las uncinarias en muestras de heces y tal vez realizar un recuento, ya que la enfermedad potencialmente grave puede asociarse con las infecciones intensas por este nematodo. Los huevos de A. duodenale y N. americanus son idénticos y tam­ poco pueden diferenciarse de los de Strongyloides stercoralis. Parásitos adultos

• Miden hasta 1,5 cm de longitud y residen en la parte superior del intestino, donde se adhieren con firmeza a la mucosa por la acción penetrante de las partes cortantes de la cápsula bucal. • La observación de la cápsula bucal puede servir para dife­ renciar ambas especies. • Ancylostoma duodenale tiene dos pares de dientes quitinosos (lámina en color 22-51). • Necator americanus se fija mediante un par de láminas cortantes (lámina en color 22-5J). • Los machos se distinguen por su bolsa copulatriz posterior, con aspecto deshilachado.

N em atodos

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C IC LO VITAL DE LAS uncinarias

Faringe '

D eglución A dheridos al intestino

Figura 22-10 Ciclo vital de las uncinarias. Los huevos de las uncinarias suelen eliminarse por las heces en estadios tempranos de partición de las hembras grá­ vidas. En alrededor de 24 horas en el suelo y en condiciones ideales de temperatura y humedad, los huevos eclosionan en el primer estadio larvario, la larva rabditoide de vida libre. Cerca de 5 a 7 días después, la larva rabditoide se transforma en la larva filariforme del tercer estadio, la forma infectante para los seres huma­ nos. De acuerdo con la temperatura y la humedad del suelo, la larva filariforme puede permanecer infectante hasta 6 semanas. Los seres humanos se infectan por la penetración de la larva filariforme que entra en contacto con la piel, ya sea de las manos cuando se excava en el suelo infestado por la larva, o de los pies cuan­ do se camina sin calzado en el suelo contaminado con heces humanas. De manera similar a lo que sucede con Ascaris, las larvas de uncinarias también penetran la mucosa intestinal, ingresan en la circulación, rompen los alvéolos pulmonares, ascienden con la tos y son deglutidas. Estas larvas "procesadas" de nuevo excavan en la mucosa intestinal, donde evolucionan a parásitos adultos machos y hembras. Estos parásitos adultos permanecen firmemente adheridos a la mucosa ya sea mediante las láminas cortantes o los pares de dientes según la especie, mientras se aprovechan de un aporte constante de sangre del huésped. Las hembras deposi­ tan grandes cantidades de huevos que se eliminan por las heces para completar el ciclo vital.

H uevos

• Miden alrededor de 60 x 40 |im y son perfectamente ovales. • Las cáscaras son delgadas, lisas, transparentes y sin pigmen­ tación. • Las células de la yema se retraen y dejan un espacio claro debajo de la cáscara (lámina en color 22-5K). L arvas rabditoides

• A diferencia de las especies de Strongyloides en las cuales los huevos eclosionan mientras aún están en el intestino y se

observan en preparaciones microscópicas en fresco de mues­ tras fecales, las larvas rabditoides de uncinarias rara vez es­ tán presentes. • Las larvas rabditoides de las uncinarias tienen una cavidad bucal larga (lámina en color 22-5L, izquierda), una carac­ terística que las distingue de Strongyloides stercoralis. Los huevos de uncinarias rara vez eclosionan dentro del intes­ tino. • Las larvas rabditoides de Strongyloides stercoralis tienen una cavidad bucal corta (véase lámina en color 22-5L, dere­ cha).

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C A PÍTU LO 22 Parasitología

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 22-7 Infeccio­ nes por uncinarias Los síntomas pueden aparecer en relación con los diversos estadios del ciclo de vida. Las infecciones de la piel pueden experimentarse en los sitios de penetración de las larvas filariformes. en especial cuando los seres humanos se infectan por especies de uncinarias no humanas que afectan de modo habitual a otros animales (“prurito del suelo ” ) . 273 El síndrome de Loeffler en los pulmones y la eosinofilia suelen obser­ varse durante la etapa migratoria de la larva pulmonar. Las uncinarias hembras adultas producen sólo 2 500 a 5 000 huevos por día; por lo tanto, el recuento de huevos fecales puede reflejar el número de uncina­ rias adultas y. a su vez, indica la gravedad de la infección. La presencia de más de 2 0 0 0 huevos de uncinarias por mililitro de heces en las mujeres y los niños, y más de 5 000 por mililitro en los hombres suele asociarse con anemia. Garcia* describe las técnicas para el recuento de los huevos. En las infecciones intensas de 500 o más parásitos, el huésped podría perder el equivalente de 1/4 a 1/2 L de sangre por semana, lo que causa una anemia hipocrómica grave por deficiencia de hierro e hiperplasia eritroide acentuada de la médula ósea, que a su vez puede conducir a la osteoporosis y la formación de quistes óseos. Las complicaciones de las infecciones graves pueden ser debilidad, fatiga, restricción del creci­ miento, edema periférico e insuficiencia cardíaca congestiva. De impor­ tancia fundamental en todo el mundo es la falta de desarrollo mental por la hipoxia asociada con la anemia en millones de niños infectados por uncinarias . 158 La diarrea, el dolor abdominal y las náuseas son manifesta­ ciones de la fase intestinal de la infección. Kelley y cois . 151 informaron que las infecciones por uncinarias se desarrollaron en 35 de 684 solda­ dos que participaron en las operaciones militares de Granada; en su mayoría se asociaron con exposición al suelo cerca de los hogares donde las condiciones sanitarias eran mínimas. Se recomienda el tratamiento con mebendazol, en comprimidos masticables, 100 mg cada 12 horas durante 3 días.

Estrongiloidiasis y Strongyloides stercoralis

Las peculiaridades en el ciclo vital separan a las infecciones por Strongyloides stercoralis de las de los otros nematodos. Por ejemplo, el diagnóstico de laboratorio de estrongiloidiasis suele realizarse mediante la observación de las larvas rabditoides móviles más que de los huevos en muestras de heces (lámi­ na en color 22-5M). El ciclo vital se ilustra en la figura 22-11. La magnitud mundial de la estrongiloidiasis es similar a la de la prevalencia de las infecciones por uncinarias, con una estimación en alza de 800 millones de personas infectadas, que afecta hasta el 10% de la población en algunas regiones. La incidencia de la infección en cualquier región dada es muy irre­ gular ya que las larvas filariformes requieren considerable humedad y crecen mejor donde el nivel freático es elevado. En los Estados Unidos, la estrongiloidiasis es endémica en las regiones rurales del sur y del sudeste, con 3% a 5% de las per­ sonas infectadas en algunas regiones.273 Las infecciones tam­ bién tienen alta prevalencia en los internados en instituciones mentales y prisiones y en los inmigrantes que antes residieron en regiones tropicales endémicas. Las manifestaciones clínicas de la estrongiloidiasis se presentan en el recuadro de correla­ ción clínica 22-8.

Identificación por el laboratorio L a rv a s ra b d ito id e s

• Las larvas rabditoides de uncinarias tienen una cavidad bucal larga (lámina en color 22-5L, izquierda), a diferencia de la de S. stercoralis, que es corta (lámina en color 22-5L, derecha). • Las larvas rabditoides de Strongyloides stercoralis también tienen un esbozo genital prominente ubicado aproximada­ mente a un tercio de distancia de la cola. A menudo las infecciones crónicas se asocian con poca can­ tidad de organismos, lo que dificulta el diagnóstico objetivo. Puede necesitarse el examen de varias muestras de heces en días sucesivos o puede estar indicado el procedimiento de concen­ tración de Baermann. En este procedimiento, se induce a las lar­ vas activas a migrar fuera de la masa fecal en un recipiente con agua a través de una malla de alambre cubierta con gasa, como lo describe García.96 DeKaminsky,63 en un estudio de 427 mues­ tras de heces, encontró que se diagnosticaron 33 casos más cuando se utilizó la técnica de Baermann modificada y otros 28 casos más cuando se utilizó el cultivo en placas con agar. Especies de Trichostrongylus

Las especies de Trichostrongylus, detectadas con muy poca frecuencia en los Estados Unidos, son nematodos adultos simi­ lares a las uncinarias que residen en el epitelio del intestino del­ gado con sus cabezas incrustadas en él. Los parásitos adultos habitan en el aparato digestivo de ovejas, bovinos, cabras y otros herbívoros. Aunque la larva de tercer estadio yace sobre los pastos y la vegetación, la infección sucede por ingestión oral, dado que estas larvas carecen de la capacidad de invadir la piel. Asimismo, en las infecciones humanas, como no tienen las cápsulas bucales especiales características de las uncina­ rias, no se produce la filtración de sangre. Las infecciones con gran cantidad de parásitos pueden causar dolor abdominal, diarrea y eosinofilia leve, pero en la mayoría de los casos los síntomas son mínimos. Los huevos se asemejan a los de unci­ narias, si bien son más largos (78-98 x 40-50 |iin), con extre­ mos afilados. Es importante reconocer estas diferencias sutiles en la morfología del huevo de modo de evitar el diagnóstico incorrecto de infección por uncinarias. El tratamiento reco­ mendado es tiabendazol, en dosis de 25 mg/kg cada 12 horas durante 2 días. Capillaria philippinensis Capillaria philippinensis es un nematodo extremadamente pequeño; los adultos miden de 1,5 a 3,9 mm de longitud y el ancho varía de 5 (0,m en su cabeza filamentosa a 30 |J.m en la parte media del cuerpo. Después de considerable investigación para hallar los huéspedes reservorios, en la actualidad se con­ sidera que las aves que se alimentan de peces son los huéspe­ des naturales dentro del ciclo vital pez-ave.47 Los seres huma­ nos se infectan cuando comen carne de pescado poco cocida. La enfermedad es endémica en las Filipinas, Tailandia y regiones adyacentes al mar de la China meridional. Los hábitos de alimentación locales incluyen la ingestión de órganos cru­ dos de animales y el uso de los jugos intestinales de los anima­ les para sazonar arroz y otros productos comestibles, y comer cangrejos y pequeños peces de agua dulce sin cocinar, que se considera una delicadeza en muchas poblaciones indígenas. La infección por C. philippinensis siempre causa enfermedad y puede conducir a la muerte si no se trata. Desde 1967 hasta

N em atodos

1227

Figura 22-Í1 Ciclo vital de Strongyloides stercoralis. El ciclo vital de Strongyloides stercoralis es similar al de las uncinarias, excepto que la mayoría de los hue­ vos eclosionan en larvas rabditoides mientras se encuentran en la luz intestinal. En los pacientes que presentan una pérdida de la inmunidad, las larvas rabditoides pueden emerger de nuevo en larvas filariformes dentro de la luz intestinal, a partir de la cual pueden invadir directamente la mucosa, lo que produce una reinfec­ ción diseminada. En casos de enfermedad diarreica, los huevos, indistinguibles de los de uncinarias, se observan en ocasiones en las heces. En condiciones ideales de humedad y temperatura en el ambiente externo, las larvas rabditoides mudan y rápidamente se transforman en larvas filariformes infectantes. Los seres huma­ nos se infectan por penetración de las larvas filariformes en la piel por el contacto directo. La migración de estas larvas invasivas en la circulación es similar a la de las uncinarias que por último evolucionan a parásitos adultos en el intestino.

1990, se documentaron 1 884 casos confirmados de capilariasis intestinal, de los cuales 110 fueron mortales.47 El comienzo gradual con dolor abdominal, ruidos de borbo­ teo en el estómago y diarrea intermitente en un período de 4 a 8 semanas es el cuadro clínico de presentación habitual. También se observa con frecuencia enteropatía perdedora de proteínas grave, malabsorción de grasa y azúcares, y excreción disminuida de la xilosa. Puede haber pérdida de líquidos y alte­ raciones del equilibrio electrolítico caracterizadas por concen­ traciones bajas de potasio, sodio y calcio plasmáticos. Hay con­ centraciones elevadas de IgE y bajas de IgG, IgM e IgA. En los casos mortales se observó infección intensa en el yeyuno, híga­ do graso y vacuolización del citoplasma de las células del túbu-

lo contorneado proximal del riñón con depósito citoplasmático intenso de pigmento lipocrómico. En los cortes histológicos de intestino delgado se observó atrofia focal de la mucosa en los sitios de invasión del organismo47 Identificación por el laboratorio • Sobre la base del examen de las heces, este parásito puede confundirse con Trichuris trichiura porque los huevos tienen

un aspecto similar. • Los huevos de C. philippinensis tienen extremos, poseen tapones polares menos notorios y una cáscara estriada y gruesa (lámina en color 22-5P).

1228

C A PÍTU LO 22 Parasitología

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 22-8 Estrongiloidiasis La puerta de entrada cutánea puede presentar dermatitis crónica leve con irritación local y prurito . 37 El verdadero prurito característico de las infecciones cutáneas por uncinarias por lo general no sucede. Sin embargo, Leighton y MacSween 162 informaron el caso de una mujer de 74 años con un antecedente de 65 años de erupciones similares a las urticarianas. Por último, estos síntomas se correlacionaron con la persistencia a largo plazo de hiperinfección por estrongiloidiasis. Gordon y cois.1*tam bién realizaron el diagnóstico de estrongiloidiasis diseminada a través del reconocimiento de la larva filariforme en biopsias de piel. Las manifestaciones intestinales de las infecciones por estrongiloides varían desde síntomas casi nulos en las infecciones leves hasta la enfermedad intes­ tinal necrosante grave en las infecciones intensas. En algunos pacientes los síntomas pueden sugerir úlcera péptica; en otros, la afección del intestino delga­ do puede simular en las radiografías la enfermedad de Crohn. Bhatt y cois . 18 publicaron un caso de hemorragia gastrointestinal alta masiva que afectó a un inmigrante africano de raza negra de 29 años, causada por una infección intensa del duodeno por 5. stercoralis. Con una dosis infectante intensa puede producirse la enfermedad pulmonar sugestiva de neumonía de Loeffler, manifestada por sibilancias y eosinofilia; o en casos de síndrome por hiperinfección, que se describirá más adelante en este capítulo, pueden aparecer neumonía verdadera, tos y disnea. Harris y cois . 123 comunicaron dos casos de estrongiloidiasis diseminada en los cuales el diagnóstico se había hecho por la observación de larvas en el esputo. Los autores sugirieron que en los pacientes inmunosuprimidos en quienes se desarrolla neumonía no bacteriana, en especial ante la presencia de eosinofilia, se deben controlar muestras de heces y de esputo para determinar la infección por S. stercoralis. La corticoterapia a largo plazo también puede predisponer a las infecciones diseminadas por Strongyloides. Chu y cois . 39 describieron un caso de neumo­ nía en un hombre de 65 años con enfermedad pulmonar obstructiva crónica dependiente de esteroides. Las larvas rabditoides de Strongyloides se detectaron en una muestra de esputo expectorado. En general, la neumonitis causada por las larvas del nematodo es transitoria y se caracteriza por tos y fiebre; en los casos más graves, se observan dolor torácico, disnea y hemoptisis. Los huéspedes inmunodeprimidos presentan una vulnerabilidad particular a las infecciones diseminadas por Strongyloides. La propensión de los huevos a eclosionar con rapidez y producir larvas filariformes intraintestinales (lámina en color 22-5N) convierte a los pacientes en vulnerables a la autoinfección, lo que causa un cuadro conocido como síndrome por hiperinfección . 143 Purtilo y cois . , 220 después de observar la ausencia de respuesta de tejido granulomatoso frente a las larvas en la autopsia de varios casos mortales de estrongiloidiasis, concluyeron que es necesario el sistema inmunitario mediado por células intacto para mantener controlado al organismo. Una vez que la inmunidad se compromete o anula, es probable que en pacientes que albergan el parásito suceda la hiperinfección por invasión directa de la mucosa intestinal (lámina en color 22-50) con diseminación de las larvas a muchos órganos y tejidos. Genta* ofreció el argumento alternativo de que los corticosteroides, en lugar de actuar a través de la supresión de la inmunidad, pueden hacerlo directa­ mente sobre el parásito como "hormonas que estimulan la muda” que promueven de modo directo la proliferación del organismo, lo que determina que la enfermedad diseminada sea la principal posibilidad. Aunque el síndrome de hiperinfección por Strongyloides no se ha asociado de manera específica con la positividad del HIV y el SIDA, se han informado algunos casos . 121 Los seres humanos pueden ser portadores de S. stercoralis con infestación subclínica durante muchos años tras el contacto inicial. Por esta razón los pacientes en quienes se desarrolla la estrongiloidiasis diseminada no necesitan haber tenido una exposición reciente. Klein y cois . 155 reiteran la necesidad de examinar muestras de heces para estrongiloidiasis antes de tratar con un ciclo de tratamiento inmunosupresor a los pacientes que viven en áreas endémicas. Los receptores de trasplantes de órganos representan otro grupo de alto riesgo en los que se deben realizar exámenes de heces para detectar larvas de Strongyloides antes de comenzar el tratamiento inmunosupresor. 5 6 El síndrome de hiperinfección se complica aún más por el mayor riesgo de desarrollar sepsis por microorganismos gramnegativos, debido tal vez a que las bacterias intestinales pueden invadir a través de soluciones de continuidad de la mucosa producidas por la penetración de las larvas de Strongyloides. El régimen terapéutico de elección es el tiabendazol, en dosis de 25 mg/kg cada 12 horas durante 2 días.

• El error en la identificación puede conducir a una enferme­ dad innecesaria o incluso a la muerte, ya que los casos de C. philippinensis suelen progresar si no se tratan.

Cestodos Los cestodos son una subclase de helmintos que compren­ den las tenias verdaderas, con un escólex y una serie de seg­ mentos del cuerpo hermafroditas, que producen huevos deno­ minados proglótides. Los cestodos de importancia humana que se describen son: Taenia saginata Taenia solium Diphyllobothrium latum Hymenolepis nana Hymenolepis diminuta Dipylidium caninum

El cuerpo de un cestodo adulto o tenia, conocido como estró­ bilo, consta de dos partes: el escólex y los proglótides (lámina en color 22-6A). El escólex es la parte anterior con ganchos o

ventosas, por los que el parásito se adhiere y se fija a la muco­ sa intestinal. La corona del escólex, denominada rostelo, puede tener ganchos (armada) (lámina en color 22-6B) o estar desprovista de ellos y ser lisa (desarmada). Estas diferencias morfológicas son útiles para establecer la identificación de la especie. La porción principal del cuerpo de una tenia está compuesta por una larga serie de segmentos denominados proglótides. Cada proglótide tiene las estructuras reproductivas masculinas y femeninas, las ramificaciones uterinas, las que están repletas de huevos cuando maduran (lámina en color 22-6C). Los hue­ vos son eliminados por las heces, donde se observan en prepa­ raciones microscópicas en fresco para establecer el diagnóstico de laboratorio. Las diferencias sutiles de tamaño, forma y estructuras internas de los proglótides sirven como ayuda para establecer la identificación de especie. Con excepción de Hymenolepis nana, en el cual puede haber transmisión interhumana de las infecciones a través de la inges­ tión de alimentos o agua contaminados con heces que contie­ nen los huevos infectantes, los ciclos vitales de los cestodos requieren uno o más huéspedes intermediarios para llevar a cabo los estadios de desarrollo larvarios. En la figura 22-12 se ilustra el ciclo vital de Taenia solium.

C estodos

C isticerco en pulm ones, cerebro, ojos, tejido conectivo

C IC LO VITAL DE Taenia solium

♦ —

Proglótide grávido en las heces o en el am biente

1229

E closión de la oncosf er a, penetra la pared intestinal

Ingestión ocasional de huevos em brionados o proglótides

(estadio diagnóstico)

C isticerco en el m úsculo (estadio infectante)

P O R C IN O C irculación

\ E closión de la oncosfera, penetra la pared intestinal

Ingestión de huevos e m brionados o proglótides

Figura 22-12 Ciclo vital de Taenia solium. Un ser humano infectado con una tenia intestinal elimina con las heces proglótides o huevos maduros al ambiente externo, donde el suelo, el agua y la materia vegetativa se contaminan con las heces. En el caso de Taenia solium, los huevos embrionados son ingeridos por un cerdo; en su intestino eclosiona la oncosfera y penetra la mucosa. Las larvas liberadas ingresan en la circulación y migran hasta el músculo esquelético para enquistarse en la forma de un quiste similar a una vejiga denominado cisticerco. Con la ingestión de carne de cerdo infestada por cisticerco por un ser humano confiado, el escólex se evagina en el intestino y se adhiere a la mucosa intestinal. La tenia crece a través de la proliferación de cientos de proglótides hasta que alcanza una longitud de varios metros. Los huevos y los proglótides se liberan de nuevo a la luz intestinal y se eliminan por las heces para completar el ciclo vital.

Taenia solium y Taenia saginata

Las infecciones por tenias se conocen desde la época bíblica y su conocimiento primitivo puede relacionarse con la prohibi­ ción del judaismo de ingerir cerdo. La diferenciación entre Taenia saginata y Taenia solium es más que un ejercicio aca­ démico. Como ya se mencionó, los seres humanos adquieren las infecciones intestinales de una tenia adulta por la ingestión de carne de cerdo (T. solium ) o de vaca (T. saginata) poco cocida que contiene la larva (lámina en color 22-6D). Las infecciones intestinales por las tenias adultas de estas dos especies ocasio­ nan síntomas similares en los seres humanos, como se descri­ be más adelante. Sin embargo, éstos pueden actuar también

como huéspedes intermediarios si ingieren los huevos de T. solium. En este caso, la larva viaja por la circulación, con una propensión a alojarse en el cerebro en lugar de hacerlo en el músculo esquelético, lo que causa una enfermedad conocida como cisticercosis (lámina en color 22-6E). El personal de laboratorio debe ser cuidadoso cuando manipula los proglóti­ des de T. solium cargados de huevos para evitar la transmisión inadvertida mano-boca. La cisticercosis humana no sucede con T. saginata; sin embargo, como la identidad verdadera no se co­ noce de inmediato, debe tenerse mucho cuidado cuando se ma­ nipula cualquier proglótide. La cisticercosis tiene una prevalencia elevada en México y América Latina, donde se estima que hay cerca de 350000 per­

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C A PÍTU LO 22

Parasitología

sonas infectadas. La enfermedad se detectó en el 2-3% de casos de autopsias en la ciudad de México, y determina el 25% de todas las masas intracraneanas encontradas por tomografía computarizada.217 Hasta la década pasada, la neurocisticercosis era infrecuente en los Estados Unidos (sólo unos cientos de casos registrados desde que comenzó la vigilancia en 1957); sin embargo, se ha notado un aumento destacado reciente, en paralelo con el de la inmigración de personas de México, América Central y del Sur y de Asia.45 En 1989, la cisticerco­ sis se convirtió en una enfermedad de comunicación obligato­ ria en California.76 Durante el primer año se informaron cerca de 134 casos, casi todos (117) de personas de origen hispano que habían inmigrado de países donde T. solium es endémica. Además de la incidencia mayor de la enfermedad en California, se han informado varios casos individuales de diversas regiones de los Estados Unidos, como Texas, Colo­ rado, Pensilvania y Misuri.183 Tal vez por esta experiencia, Román y cois.227 propusieron que la neurocisticercosis sea declarada una enfermedad de comunicación obligatoria inter­ nacional. Diversas publicaciones recientes reflejan tasas eleva­ das de incidencia de cisticercosis sintomática en muchas regio­ nes del mundo, ejemplificadas por áreas endémicas de las comunidades andinas y en Burundi, como lo informaron Cruz y cois.48 y Newell y cois.,198 respectivamente. Las manifesta­ ciones clínicas de las teniasis y las infecciones por cisticercos se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-9. Identificación por el laboratorio. El diagnóstico de laboratorio de las infecciones por tenias suele hacerse mediante la observa­ ción de los huevos característicos en preparaciones microscó­

picas en fresco de las heces; para la identificación de especie se requiere la observación de los parásitos adultos o porciones de ellos. Los huevos para las dos especies presentan una morfolo­ gía idéntica. Las características de identificación de las especies de Taenia son: H uevos

• Forma esférica, de 30 x 45 pm de diámetro. • Cáscara lisa y gruesa característica con estriaciones radiales (lámina en color 22-6H). En la lámina en color 22-6G se muestra una fotografía de estos huevos in situ dentro del útero grávido. • En el interior pueden observarse tres pares de ganchos en una estructura denominada oncosfera. P arásitos adultos

Las características por las cuales se diferencian T. saginata y T. solium son:

Estróbilo: Escólex:

TAENIA SAGINATA

TAENIA SOLIUM

4-10 m de largo Hasta 2 000 proglótides Cuatro ventosas Rostelo inerme

2-4 m de largo 800-1000 proglótides Cuatro ventosas Rostelo armado (lámina en color 22-6B) Menos.de 13 ramificaciones uterinas laterales (lámina en color 22-6C)

Proglótide: Más de 13 ramificaciones uterinas laterales

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 22-9 Teniasis y cisticercosis Teniasis Los síntomas intestinales suelen ser insignificantes. La eliminación de proglótides en las heces puede ser el primer indicio de enfermedad. Puede experi­ mentarse dolor epigástrico, sensación vaga de malestar abdominal, nerviosismo y aumento del apetito. La pérdida de peso es mínima y la eosinofilia suele ser moderada.

Cisticercosis Cisticercosis se refiere al desarrollo de formas larvarias enquistadas extraintestinales de T. solium en diversos órganos tras la ingestión de huevos grávidos en alimentos o agua contaminados con heces. Aunque casi todos los casos humanos son causados por T. solium, otras especies de tenias animales pueden, en raras ocasiones, producir también cisticercos con morfología similar. El sistema nervioso central está afectado en el 60% a 96% de los pacientes, un cuadro conocido como neurocisticercosis (lámina en color 22-6E). La mayoría de los pacientes con neurocisticercosis presentan más de un quiste y en un caso se observaron 2 0 0 en la autopsia . 183 Los síntomas presentan variaciones entre los pacientes. Las lesiones en la corteza cerebral pueden causar convulsiones o trastornos neurológicos locali­ zados. Con frecuencia se observan parálisis de los nervios craneales que afectan sobre todo al quinto y al séptimo, y reflejos anormales. La cisticercosis es la causa identificada con mayor frecuencia de epilepsia en adultos jóvenes que viven en áreas endémicas y es la única manifestación en hasta la tercera parte de los casos. 2 3 6 Las convulsiones focales aparecen en hasta las tres cuartas partes de los infectados. Los quistes cerebrales intraventriculares pueden obstruir el flujo de líquido cefalorraquídeo, lo que conduce a síntomas de hipertensión intracraneana aguda (cefalea, vértigos, náuseas, vómitos, edema de papila y trastornos visuales); los cambios de la personalidad y del estado mental se presentan en el 40% de los pacientes . 183 Las larvas invasivas (oncosferas) son sensibles a los anticuerpos circulantes y al complemento en el huésped humano ; 286 sin embargo, títulos importantes sólo se forman después que las larvas se han transformado en metacestodos resistentes a los anticuerpos. De hecho, el anticuerpo puede unirse al parásito por medio de los receptores Fe, al que pueden utilizar como fuente de proteína. La taeniaestatina y otras moléculas del parásito pueden interferir en la proli­ feración de los linfocitos y la función de los macrófagos, por lo tanto se paraliza la respuesta inmunitaria celular. Herrera y cois . 127 informaron un aumento de tumores cerebrales y procesos malignos de la sangre asociado con cisticercosis, relacionados tal vez con la posible inducción de daño del DNA en las células que rodean los cisticercos y de una respuesta inflamatoria persistente. El praziquantel y el albendazol han sido ampliamente probados y utilizados con éxito para el tratamiento de la neurocisticercosis, por lo general en com­ binación con corticosteroides. 278 En un esfuerzo masivo reciente para tratar la cisticercosis en una comunidad rural de México (dosis únicas de praziquantel de 5 mg/kg). la teniasis humana se redujo el 56% y las convulsiones de comienzo tardío, el 70% en un período de 42 meses. 236 En este mismo estudio, las concentraciones de anticuerpos contra el cisticerco se redujeron en los seres humanos el 75% y en los cerdos tratados, el 55%. Se han desarrollado vacunas contra la hidatidosis que emplean antígenos recombinantes y en estudios experimentales en ovejas se halló que inducen una protección mayor del 90% cuando se exponen a la enfermedad, lo que alienta la investigación de una probable vacuna para su empleo también en seres humanos . 165

C estodos

Chapman y cois.36 han creado una sonda de DNA específica de especie que diferencia los huevos de T. solium de los de T. saginata. Estos autores describen el aislamiento y la caracteri­ zación de clones recombinantes que contienen secuencias repe­ titivas de DNA (una secuencia de 158 pb) para T. solium y una secuencia no relacionada de T. saginata que codifica una por­ ción del gen de la citocromo c oxidasa I mitocondrial, cada una hibrida específicamente con DNA genómico de cualquiera de las especies. Cuando esta sonda esté al alcance en el comercio, existirá la posibilidad de realizar una prueba diagnóstica rápi­ da, sensible y no invasiva para la detección de huevos de T. solium. Por medio de los CDC se dispone de pruebas serológi­ cas de hemaglutinación indirecta para la confirmación del diag­ nóstico de cisticercosis en casos de sospecha. Los títulos de 1:64 o mayores suelen indicar infección activa.

1231

Diphyllobothríum latum: tenia gigante de los peces D. latum , la tenia gigante de los peces, utiliza dos huéspedes intermediarios en el desarrollo de sus formas larvarias. Las áreas endémicas incluyen las regiones de los lagos claros y fríos de Escandinavia, norte de Europa, norte de Japón, región superior del Oeste Medio de los Estados Unidos, Canadá y Alaska. La figura 22-13 es una ilustración del ciclo vital. Las manifestaciones clínicas de la difilobotriasis se pre­ sentan en el recuadro de correlación clínica 22-10. Identificación por el laboratorio P arásito adulto

Aunque los proglótides rara vez se eliminan por las heces, son característicos.

C IC LO VITAL DE D ip h yllo b o th riu m latum

El escólex se adhiere al intestino

Ingestión A dulto en el intestino delgado S ER ES H U M AN O S

Huevo no e m brionado en las heces IB fli’ V£: (estadio diagnóstico)

P lerocercoide en el m úsculo del pez (estadio infectante)

C R U S TA C E O S El crustáceo es Ingerido por el pez de agua dulce

PEC ES

\

Procercoide en la cavidad del crustáceo Es ingerido por un crustáceo

Huevo em brionado en el agua

El coracldio eclosiona a p a rtir del huevo

Figura 22-13 El ciclo vital de Diphyllobothrium latum comprende dos huésped intermediarios. Los huevos no embrionados son eliminados con las heces prove­ nientes de un ser humano infectado en un estuario de agua dulce, sufren la embriogénesis durante un período de varios días y eclosionan liberando un coracidio de vida acuática. A su vez, estos coracidios son ingeridos por crustáceos (copépodos o Cyclops). en cuyo interior se desarrollan las larvas procercoides. Los copépo­ dos constituyen una de las principales fuentes de alimentos para una diversidad de peces de agua dulce en Norteamérica. Tras la ingestión del copépodo por el pez, se desarrollan las larvas plerocercoides del parásito (espargano) dentro de la carne del pez. Los seres humanos ingieren estas larvas plerocercoides en pescados cru­ dos o deficientemente cocidos donde evolucionan a parásitos adultos en el intestino. Con la maduración, los huevos del parásito adulto son eliminados por las heces para completar el ciclo vital.

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C APÍTULO 22

Parasitología

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 22-10 Difilobotriasis Los pacientes pueden albergar el parásito adulto hasta 20 años. Los sín­ tomas intestinales son mínimos. Los parásitos adultos grandes pueden causar obstrucción intestinal mecánica, acompañada por dolor abdomi­ nal y diarrea. En una minoría de pacientes infectados por D. latum, en especial en el norte de Europa y específicamente en Finlandia, no es infrecuente la anemia megaloblástica secundaria a la deficiencia de vita­ mina B 1 2 por competición selectiva del parásito por esta vitamina esencial. Los seres humanos también pueden infectarse por las larvas plerocer­ coides de las tenias difilobotrioides estrechamente relacionadas con D. latum, que causa una infección conocida como esparganosis. Los parási­ tos adultos se encuentran en perros y gatos; la forma larvaria se desarro­ lla en los seres humanos tras la ingestión de copépodos o carne cruda de anfibios y reptiles infectados por la larva. Las larvas plerocercoides (espargano) se desarrollan en nodulos pruriginosos en los tejidos subcu­ táneos en un período de meses. La eosinofilia de sangre periférica es un indicio inespecífico de la posibilidad de esparganosis; sin embargo, las larvas características deben demostrarse en los nodulos subcutáneos antes de realizar un diagnóstico definitivo. Una única dosis de 2 g de niclosamida o hasta 10 mg/kg de prazi­ quantel son los regímenes terapéuticos de elección.

• El estróbilo mide de 3 a 10 m de longitud y tiene más de 3 000 proglótides. • De manera característica, los segmentos individuales son más anchos que largos (latum en latín significa ancho) (lámi­ na en color 22-61). • El escólex rara vez se aísla en las muestras de heces. Pre­ senta: • Forma de almendra y mide 2-3 x 1 mm. • Se distingue por sus dos surcos profundos dorsoventrales (,bothria = fosa [botrios], demarcados por pliegues similares a labios laterales (phyllon = hojas) (lámina en color 22-6J). • Cada proglótide incluye un útero enrollado indefinido que forma una roseta compacta (lámina en color 22-6K).

dos (p. ej., gorgojos), que albergan las formas larvarias infec­ tantes, pueden actuar como huéspedes intermediarios. En la lámina en color 22-6F se ilustra una fotografía de un cisticerco de Hymenolepis como aparece dentro del insecto. Los seres humanos se infectan a través de la ingestión de estos insectos infectados con las larvas. Este huésped intermediario no es imprescindible para la transmisión interhumana de Hymenolepis nana. Es más común que los seres humanos se infecten por la ingestión de alimentos o agua contaminada con huéspedes de Hymenolepis. En la figura 22-14 se ilustra el ciclo vital de Hymenolepis diminuta. Las manifestaciones clínicas de himenolepiasis se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-11. Identificación por el laboratorio. El diagnóstico de laboratorio de las infecciones por Hymenolepis suele realizarse mediante la detección microscópica de los huevos característicos en fresco o en frotis teñidos de muestras fecales. H uevos

• Los huevos presentan una morfología distintiva que permite la diferenciación entre H. nana y H. diminuta. Cada uno tiene una cáscara externa lisa y una membrana interna, que contienen el embrión hexacanto (seis ganchos). • Los huevos de H. nana presentan un contorno oval, son pequeños (47 x 57 (im) y tienen un par de filamentos polares característicos que se originan de engrasamientos polares a cada lado de la membrana del embrión hexacanto (lámina en color 22-6M). • Los huevos de H. diminuta son esféricos, más grandes (58 x 86 (im) que los de H. nana y están desprovistos de filamen­ tos polares (lámina en color 22-6N). Parásitos adultos

• Los parásitos adultos de H. nana son pequeños, miden no más de 3,7 cm cuando es maduro. • A menudo simulan filamentos de moco; por lo tanto, no sue­ len observarse en muestras de heces. • El escólex diminuto sobresale y es armado con una hilera de 20 a 30 ganchos. Dipylidium caninum

H u ev o s

El diagnóstico de laboratorio de la infección humana por D. latum suele hacerse mediante la identificación de los hue­

vos operculados característicos en muestras de heces. Estos huevos: • Miden alrededor de 55-75 x 40-55 lim y son alargados. • Tienen una cáscara lisa con un opérculo no prominente y poco evidente en un extremo y un engrosamiento en forma de botón en el otro (lámina en color 22-6L). • Puede diferenciarse de los de Paragonimus westermani (se describe más adelante), que tiene un opérculo saliente carac­ terístico (lámina en color 22-7P). Especies de Hymenolepis

Hymenolepis nana, conocida como tenia enana, tiene distri­ bución mundial y es una de las causas más graves de infec­ ciones por cestodos en los seres humanos, en especial en los niños. Por el contrario, Hymenolepis diminuta es sobre todo un parásito de las ratas y los ratones y se lo encuentra con poca frecuencia en los seres humanos. Varias especies de artrópo­

El ciclo vital de Dipylidium caninum es similar al de Hyme­ nolepis diminuta. Los seres humanos actúan como huésped accidental y se infectan tras la ingestión de las pulgas de perros o gatos que están infectadas por la forma cisticercoide de D. caninum. La tenia adulta reside en el intestino de los perros o los gatos. Los huevos, eliminados en las heces, son ingeridos por diversas especies de pulgas o piojos de perros, dentro de la cavidad del cuerpo de la cual se desarrollan los cisticercoides infectantes. Con la ingestión de una pulga del perro por un ser humano, la larva cisticercoide penetra la mucosa del intestino delgado y se convierte in situ en parási­ tos adultos. Las infecciones humanas afectan sobre todo a los niños, que tienen contacto más íntimo con las mascotas. Los síntomas suelen ser mínimos o están ausentes. En las infec­ ciones intensas pueden experimentarse grados variables de trastornos de la digestión, pérdida del apetito y sensación vaga de malestar abdominal. El praziquantel es el tratamiento de elección; la niclosamida también es eficaz. La infección humana puede prevenirse man­ teniendo sin tenias ni pulgas a los perros y los gatos que son mascotas de las casas.

C estodos

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C IC LO VITAL DE H ym en o lep sis dim inuta

Figura 22-14 Ciclo vital de Hymenolepis diminuta. Los huevos embrionados, eliminados en el suelo o el agua por las heces de un ser humano infectado son inge­ ridos a su vez por un insecto. Eclosiona una oncosfera en el intestino del insecto y penetra por la pared intestinal. En la cavidad se desarrolla el cisticercoide infec­ tante. Con la ingestión accidental del insecto infectado por un ser humano las larvas se liberan y penetran las vellosidades de la parte superior del intestino delga­ do. El escólex se adhiere a la mucosa intestinal, donde se desarrolla el parásito adulto. Cuando madura, libera huevos embrionados de los proglótides grávidos y se eliminan por las heces para completar el ciclo vital.

Identificación por el laboratorio

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 22-11 Himenolepiasis

H u ev o s (p a q u etes d e h u ev o s) P a rá sito a d u lto

A diferencia de lo que sucede en las infecciones por las especies de Taenia y Diphyllobothrium, en las cuales lo más habitual es que sólo un parásito habite el intestino, puede haber hasta 1 000 H. nana. Los sínto­ mas en las infecciones leves pueden estar ausentes o limitados a un dolor abdominal bajo difuso y heces blandas. En las infecciones inten­ sas puede observarse anorexia, dolor abdominal, diarrea, cefalea, ner­ viosismo y prurito. La eosinofilia periférica es leve a moderada (416%). La autoinfección, en las cuales los huevos eclosionan en el intes­ tino y reinfectan por medio del ciclo de vida normal descrito en el texto, puede producir una enorme carga de parásitos que pueden causar com­ plicaciones graves en los pacientes inmunosuprimidos. El tratamiento de elección es niclosamida, 2 g por día durante 7 días en los adultos, y 1 g de dosis inicial, seguida de 500 mg por día durante 6 días en los niños.

• El estróbilo varía de 15 a 70 cm de longitud y tiene de 60 a 175 proglótides. • El escólex presenta una forma romboidal, con un rostelo cónico, retráctil y armado. • El proglótide mide de 12 x 2,7 mm y se caracteriza por tener doble polo genital (Dipylidium ) (lámina en color 22-600). • El proglótide puede separarse del estróbilo y migrar sólo o como cadenas cortas desde el ano de gatos y perros, lo que da el aspecto de granos de arroz diminutos cuando se depo­ sitan en el suelo.

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C A PÍTU LO 22 Parasitología

Huevos El diagnóstico de laboratorio en las infecciones humanas suele realizarse mediante la observación de los paquetes de huevos característicos en la microscopia, cada uno de los cuales: • Contiene 15-25 huevos globulares (lámina en color 22-6P). • Cada huevo mide 35-60 pm de diámetro. • Cada huevo también contiene una oncosfera con seis ganchos.

pueden causar la obstrucción de la vena porta en los sitios donde residen, la enfermedad se origina con mayor frecuencia por el daño tisular extenso como consecuencia del depósito de la gran cantidad de huevos que la hembra produce por día.261 En el recuadro de correlación clínica 22-12 se muestran las manifestaciones clínicas de la esquistosomiasis. Identificación por el laboratorio. El diagnóstico de laboratorio se realiza mediante la detección de los huevos característicos en las heces o, en casos de infecciones por S. haematobium, en la orina. Huevos

Tremátodos Los tremátodos son una clase de helmintos que incluyen aquellos que son parásitos para los seres humanos. Presentan forma de hoja, son planos y hermafroditas, salvo los esquistosomas y tienen dos ventosas: una oral, a través de la cual se abre el tubo digestivo, y la otra ventral, para la adherencia. Los tremátodos de importancia humana presentados en este capítu­ lo son: Esquistosomas: Duelas hepáticas: Duela intestinal gigante: Duela pulmonar:

S. mansoni, S. haematobium, S. japonicum Fasciola hepático y Clonorchis sinensis Fasciolopsis buski Paragonimus westermcmi

Los ciclos vitales de los tremátodos son similares y requie­ ren dos huéspedes intermediarios antes de evolucionar a los estadios infectantes para los seres humanos (las especies de Schistosoma son la excepción). Los estadios iniciales de los ciclos vitales son casi idénticos, con miracidios que nadan li­ bremente, liberados a partir de los huevos grávidos eliminados en estuarios de agua adecuados con las heces de un ser huma­ no infectado. Las etapas del desarrollo de los estadios restantes en los ciclos vitales de las especies de tremátodos incluidos en este capítulo se diagraman en los esquemas presentados más adelante. Esquistosomas

El nombre esquistosoma proviene del aspecto del parásito macho adulto, cuyo cuerpo presenta un surco genital longitudi­ nal, o canal, que actúa como receptáculo para la hembra duran­ te la copulación (lámina en color 22-7A). La mayoría de las infecciones humanas están causadas por tres especies de Schistosoma: S. mansoni, S. haematobium y S. japonicum', S. mekongi, que se asemeja a S. japonicum y S. intercalatum, con huevos que se parecen a los de S. haematobium, pero con la enfermedad clínica que simula la infección por S. mansoni, son

otras dos especies con distribuciones geográficas en la cuenca del Mekong y en el centro y oeste de Africa, respectivamen­ te.261 El ciclo vital es similar al de los otros tremátodos, salvo que no se requiere un segundo huésped intermediario para transmitir la enfermedad. En la figura 22-15 se ilustra el ciclo vital de Schistosoma. De acuerdo con la especie, los esquistosomas adultos pueden estar en diversas localizaciones en el sistema venoso portal: 1) en las venas porta del intestino grueso para S. mansoni y S. in­ tercalatum, 2) en el intestino delgado para S. japonicum y S. mekongi y 3) en las venas de la vejiga en el caso de S. haema­ tobium. Aunque los parásitos adultos, que miden cerca de 2,5 a 3 cm de longitud y 0,5 mm de diámetro cuando están maduros,

• Los huevos son muy grandes. Las siguientes son las varia­ ciones del tamaño de cada una de las tres especies que afec­ tan a los seres humanos: • Schistosoma mansoni: 116-180 x 45-58 |im • Schistosoma haematobium: 112-180 x 40-70 |im • Schistosoma japonicum : 75-90 x 60-68 jim • Los huevos de S. mansoni y S. haematobium presentan la característica de ser ovales. • Los huevos de S. mansoni tienen una espícula lateral pro­ minente (lámina en color 22-7B). • Los huevos de S. haematobium tienen una espícula termi­ nal (lámina en color 22-7C). • Los huevos de la especie menos frecuente, S. intercalatum, también tienen una espícula terminal. • Los huevos de S. japonicum son ovales a semiesféricos; puede observarse una espícula rudimentaria en forma de botón lateral si se corrige el plano del foco (lámina en color 22-7D). En la lámina en color 22-7E se ilustra una microfotografía de cercaría con cola bifurcada, la forma infectante en el ciclo vital de las especies de Schistosoma. Diversas técnicas inmunológicas, como procedimientos de inmunofluorescencia indirecta, ensayo inmunosorbente ligado a enzimas, radioinmunoanálisis y fijación del complemento se utilizan en los laboratorios de referencia para ayudar a estable­ cer el diagnóstico. Mediante el empleo de anticuerpos mono­ clonales formados contra el antígeno del tegumento de 15 kDa de parásitos adultos S. mansoni, Da Silva y cois.53desarrollaron un ensayo competitivo inmunosorbente ligado a enzimas con una sensibilidad del 94% para la detección de anticuerpos con­ tra S. mansoni en pacientes infectados. De Jonge y cois.62 efec­ tuaron importantes investigaciones en la década pasada sobre serodiagnóstico de la esquistosomiasis, mediante el empleo de anticuerpos monoclonales biotinilados para detectar antígenos anódicos y catódicos en el suero de pacientes infectados por S. mansoni. Van Etten y cois.268 informaron una sensibilidad del 95,5% y una especificidad del 96,7% en la detección de antí­ geno catódico circulante del esquistosoma en la orina de pacientes infectados por S. mansoni, mediante una tira reactiva de nitrocelulosa o de polivinilo recubierta con anticuerpos monoclonales. Esta tira pretende ser de valor en el diagnóstico cualitativo de las infecciones por S. mansoni en los programas de control. Fasciola hepatica y Fasciolopsis buski

La fascioliasis es una causa importante de enfermedad para­ sitaria zoonótica hepática en las ovejas. Por otra parte, los parásitos adultos de Fasciolopsis buski permanecen en el in­ testino, donde se adhieren a la mucosa del duodeno y del ye-

Tremátodos

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CICLO VITAL DE LOS esquistosomas

M aduran en la sangre p~ portal intrahepática ” C irculación

A dultos en los vasos sanguíneos C ercarías (pierden la cola durante la penetración)

S chistosom a m ansoni: p arte inferior del intestino S chistosom a ja p o n ic u m : intestino S chistosom a hae m a to b iu m : vejiga

/

Penetran la piel S ER ES H U M AN O S

C ercarlas que nadan librem ente (estadio infectante)

(E stadio diagnóstico)

S. ja p o n ic u m CARACOLES

E sporoquistes en el caracol ‘A (dos generaciones)

S. m a n so n i

/

S. haem atobium

E m ergen los m iracidios

Penetran en el tejido del caracol

Figura 22-15 Ciclo vital de los esquistosomas. Los huevos eliminados por las heces en los lagos, canales y lagunas de agua dulce eclosionan en condiciones ade­ cuadas y liberan el miracidio que nada libremente. El miracidio penetra los tejidos de caracol específico de especie apropiado, dentro del cual madura y sufre la división para formar cientos de cercarías. Las cercarías que nadan libremente, liberadas por los caracoles infectados, pueden penetrar de modo directo la piel mace­ rada por el agua de los nadadores y de los que caminan desprevenidos en estuarios de agua dulce. Una vez en los tejidos subcutáneos, las cabezas de las cercarías ingresan en la circulación y migran al sistema venoso portal, donde se desarrollan a parásitos adultos machos y hembras. Las hembras, que ocupan el canal ginecóforo de los machos, producen una miríada de huevos que se liberan en un estuario acuático adecuado para completar el ciclo vital.

yuno. Otros herbívoros, como ciervos, conejos, vacas, cabras, cerdos y caballos, entre otros, también pueden infectarse. Las duelas pueden permanecer en los conductos biliares durante muchos años y causar gran daño por irritación mecánica en los sitios de invasión local y la producción de derivados tóxicos. Fasciola hepatica y Fasciolopsis buski son las dos especies de tremátodos más frecuentes y, salvo por el hábitat final de los parásitos adultos, sus ciclos vitales son iguales. Ambos ciclos vitales son algo complejos y requieren dos huéspedes inter­ mediarios. En la figura 22-16 se ilustra el ciclo vital de Fasciola hepatica.

Las manifestaciones clínicas de fascioliasis y fasciolopsiasis se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-13.

Identificación por el laboratorio

Duela adulta Las duelas adultas se observan sólo si se extirpan en la ciru­ gía. Pueden reconocerse por: • F. hepatica adulta, que mide 20-30 x 8-13 mm, presenta un aspecto de hoja aplanada, con una protrusión anterior con forma de cono (lámina en color 22-7F); las duelas adultas de F. buski tienen un extremo cefálico redondeado (lámina en color 22-7G). • Cada duela adulta presenta una ventosa anterior y una ventral y son hermafroditas, con un útero convoluto en la parte anterior.

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C A PÍTU LO 22

Parasitología

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 22-12 Esquistosomiasis Davis57 ha dividido las manifestaciones clínicas de la esquistosomiasis en cuatro estadios separados, con síntomas que a menudo se superponen en indivi­ duos que están constantemente reexpuestos a la infección. Estadio 1: “Prurito del nadador”. La invasión temprana por las cercanas causa una sensación de picazón o prurito de la piel afectada. En los individuos no inmunes pueden observarse reacciones cutáneas, que varían de petequias diminutas a una erupción papular pruriginosa. Los signos y los síntomas de estas erupciones suelen ser más intensos en las reacciones frente a las cercarías de los esquistosomas no humanos (aves). Davis-Reed y Theis5 9 publicaron un caso de infección cutánea por Schistosoma haematobium que apareció como la única manifestación clínica 3 años después de la exposición. Estos autores aconsejan que los dermatólogos tengan en cuenta la esquistosomiasis en los pacientes que presentan lesiones cutáneas no habituales, en especial con antecedentes de viajes a regiones endémicas. Estadio 2: Síndrome de Katayama. Durante el segundo estadio, o maduración, durante el cual los esquistosomas están migrando a sus sitios anatómicos preferidos y se aparean antes de la postura de los huevos, los síntomas pueden ser mínimos o constituyen el denominado síndrome de Katayama, caracte­ rizado por grados variables y combinaciones de fiebre, malestar general, dolor de espalda, artralgias, anorexia, tos. cefalea y toxemia. Puede detectarse hepatoesplenomegalia leve y la eosinofilia en sangre periférica puede ser importante. Como en este estadio los huevos a menudo aún no son excretados, el diagnóstico se basa en la obtención de antecedentes de exposición, la presencia de dermatitis típica y uno o más de los síntomas mencionados antes. Estadio 3: Inflamación granulomatosa. El tercer estadio implica la reacción inflamatoria secundaria a la postura y la migración de los huevos en los teji­ dos. La postura de los huevos es de cerca de 300 por día por hembra de S. haematobium y S. mansoni y de 3 000 por día para S. japonicum. Después de invadir la pared de las venas en las cuales reside la hembra adulta, los huevos tienen una propensión a penetrar en el interior de la viscera adyacente donde desencadenan una inflamación granulomatosa supurativa intensa que causa fibrosis y cicatrización. El engrosamiento marcado de las paredes del intestino o de la vejiga, con pérdida de la función, produce diarrea sanguinolenta, dolor abdominal vago y, en casos graves, obstrucción intestinal en las infecciones por S. mansoni. S. japonicum y S. mekongi. S. haematobium causa inflamación de la vejiga, con hematuria intermitente, dolor abdominal bajo y. por último, contracción. Estadio 4: Inflamación crónica. En el cuarto estadio de la enfermedad o estadio crónico, se produce una fibrosis progresiva apreciable alrededor de las áreas del granuloma, con una disminución marcada de la cantidad de huevos excretados. Los pacientes con infección crónica por S. haematobium presen­ tan aumento persistente de la frecuencia urinaria y disuria, ya que la vejiga continúa contrayéndose y tienen un riesgo alto de carcinoma de vejiga. En el estadio tardío de las infecciones por S. mansoni la hepatoesplenomegalia, la cirrosis y la ascitis son complicaciones frecuentes cuando los huevos son transportados hacia las venas porta y se alojan en el hígado. También pueden observarse poliposis intestinal y masas inflamatorias en el colon que simu­ lan el carcinoma de intestino. S. japonicum puede provocar síntomas similares; sin embargo, debido a su mayor capacidad de depositar huevos, la morbi­ lidad puede ser mucho mayor. El tratamiento recomendado es praziquantel, 20 mg/kg por vía oral en tres dosis separadas por 8 horas.

H u ev o s

El diagnóstico de laboratorio es más frecuente mediante la detección de huevos en preparaciones de heces. Los huevos pueden reconocerse por su: • Tamaño muy grande (150 x 80 p.m), ovoide y amarillo cas­ taño. • Cáscara delgada y lisa, con un opérculo sin características especiales en uno de los bordes estrechos (lámina en color 22-7H). • División del material interno que está mal organizado y se extiende al borde de la cáscara sin dejar un espacio claro. Como los huevos del parásito pueden diseminarse sólo des­ pués de 8 semanas o más de la infección o de modo intermi­ tente más tarde, en los laboratorios de referencia se han utili­ zado las pruebas serológicas para el diagnóstico de fascioliasis. Espino y Finlay77 desarrollaron un anticuerpo monoclonal a partir de antígenos excretorios-secretorios de F. hepatica y un anticuerpo policlonal de conejo conjugado con peroxidasa para identificar el antígeno ES de Fasciola en muestras de heces. Estos autores indicaron que su prueba de detección de antíge­ nos tiene ventajas sobre otros métodos para la detección de anticuerpos porque los títulos séricos pueden permanecer ele­ vados incluso después de la curación. También citan ventajas para la detección de antígeno en muestras de heces con respec­ to al suero porque 1) evita el problema de la formación de inmunocomplejos que disminuye la tasa potencial de detec­ ción, 2) evita la venopunción en muchas regiones del mundo donde el procedimiento es inaceptable y 3) se logra una prue­ ba disponible con facilidad para la curación.

El tratamiento recomendado es praziquantel, 25 mg/kg por vía oral en tres dosis separadas por 8 horas. Clonorchis sinensis Clonorchis sinensis, la duela hepática china, es un trematodo relativamente pequeño cuyo tamaño varía (12-20 x 3-5 mm) cuando es maduro y reside dentro de los conductos biliares o en la vesícula biliar de los seres humanos. El ciclo vital es simi­ lar al de Fasciola hepatica, salvo que su segundo huésped intermediario es un pez en lugar de las plantas acuáticas. Los seres humanos se infectan mediante la ingestión de carne cruda o poco cocida de diversos peces de agua dulce. En la figura 2217 se muestra su ciclo vital. El nombre del género (del griego clon, división y orchis, tes­ tículos) proviene del órgano testicular profusamente ramifica­ do en el parásito adulto hermafrodita. La enfermedad es más frecuente en una amplia región del Lejano Oriente, en especial en Indochina, Japón. Corea, Formosa y sur de China. Las mani­ festaciones clínicas de la clonorquiasis se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-14. Identificación por el laboratorio

Duela adulta • El parásito adulto es plano y blando, con un tamaño que varía de 12-20 x 3-5 mm. • La cabeza, con forma de botella y saliente, se observa en el extremo cefálico (lámina en color 22-71). • Una ventosa anterior lleva a un esófago que se ramifica en un ciego que se extiende lateralmente hasta el extremo posterior (lámina en color 22-7J).

Trem átodos

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C IC LO VITAL DE F asciola hepatica

C avidad abdom inal

P enetra la pared Intestinal

Ingresa en el hígado

\

D egradación de la pared quística en el duodeno

M.

A dulto en el conducto biliar

H ER BIVO R O S S ER ES H U M AN O S Ingestión H uevos no em brionados en las heces /£* (estadio diagnóstico)

M etacercaria en plantas acuáticas (estadio infectante) CARACOL PLANTAS A C U ÁTIC AS

H uevos em brionados en el agua C ercarla que nada librem ente

Redia en el tejido del caracol

M iracidio que eclosiona y penetra en el caracol E sporoquiste en el tejido del caracol

Figura 22-16 Ciclo vital de Fasciola hepatica. Con la eliminación de huevos maduros en canales, lagos y cursos de agua, los huevos embrionados eclosionan y liberan miracidios que nadan libremente. Después de la penetración en la carne de un caracol adecuado, se forman los esporoquistes en el tejido. Dentro del cara­ col se produce la maduración y la multiplicación en redias, lo que por último conduce a la liberación de cientos de cercanas que nadan libremente y que presentan cola recta. Las cercarías se adhieren a las plantas acuáticas y se enquistan como metacercarias infectantes. Los seres humanos se infectan por la ingestión de plan­ tas acuáticas crudas o deficientemente cocidas infestadas por metacercarias. Tras la ingestión, se degrada la pared quística de las metacercarias en el duodeno del ser humano y se liberan las formas larvarias. Éstas invaden la pared intestinal, migran a la cavidad abdominal e ingresan en el hígado, donde evolucionan las due­ las maduras en los conductos biliares. Estos tremátodos son hermafroditas y liberan huevos en la luz de los conductos biliares. Los huevos a su vez son transporta­ dos hacia la luz intestinal, desde donde se eliminan por las heces para completar el ciclo vital.

• Una ventosa ventral se ubica justo anterior al útero enrollado de modo laxo (lámina en color 22-7K). • Inmediatamente posterior al útero se encuentra el ovario conectado con conductos vitelinos delicados (lámina en color 22-7L). • Testículos muy ramificados, de los cuales proviene el nom­ bre del género, se extienden en la parte posterior del cuerpo (lámina en color 22-7M). En esta fotografía también se observa la terminación ciega del ciego y una vejiga excreto­ ra mal definida.

El diagnóstico de laboratorio se realiza mediante la identifi­ cación de los huevos pequeños, con forma de urna característi­ cos en muestras de heces. Huevos • El huevo típico es relativamente pequeño, con forma de urna y mide 27-35 x 14-16 |im. • Se observa una pigmentación parda amarillenta por la tinción con bilis.

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C A PÍTU LO 22 Parasitología

RECUADRO DE CORRELACIÓN CLÍNICA 22-13 Fascioliasis y fasciolopsiasis Con la ingestión de hígado crudo de oveja o de cabra infectado por parásitos adolescentes, los tremátodos pueden adherirse a la mucosa faríngea y causar laringofaringitis local, denominada halzoun. La fascioliasis humana se manifiesta por cefalea, escalofríos, fiebre y dolor en el hipocondrio derecho. En las infecciones graves puede haber hepatomegalia, ictericia, diarrea y anemia; la cirrosis biliar hepática es una com­ plicación tardía. El régimen terapéutico recomendado es praziquantel, en dosis de 25 mg/kg tres veces por día durante 6 días. F. buski es una duela similar a F. hepatica, salvo que es algo más grande (20-75 mm x 8-20 mm) y tiene una porción anterior redondeada en lugar de cónica (lámina en color 22-7G). Estos parásitos residen en el intestino delgado y se adhieren a la mucosa intestinal por medio de una pequeña ventosa oral. Las úlceras locales de la mucosa producen grados variables de epigastralgia, náuseas y diarrea, en especial por la mañana. En las infecciones con gran cantidad de parásitos puede obser­ varse ascitis y obstrucción intestinal. El diagnóstico de laboratorio se realiza mediante la identificación de los huevos grandes en las heces, que presentan un aspecto idéntico a los de F. hepatica. El tratamiento recomendado es una dosis única de 25 mg/kg de praziquantel.

• El opérculo saliente, prominente y convexo es una caracte­ rística útil para la identificación (lámina en color 22-70). • Puede observarse con el microscopio un pequeño botón pos­ terior cuando se corrige el plano del foco. • Este huevo presenta una morfología similar a los de Heterophyes heterophyes y Metagonimus yokogawai, dos duelas intestinales pequeñas que también son prevalentes en el Le­ jano Oriente y que infectan a los seres humanos que ingieren pescados crudos o en escabeche. Paragonimus westermani Paragonimus westermani y otras especies de Paragonimus son duelas pulmonares que causan enfermedad endémica en el oeste de Africa, el Oriente y ciertas regiones de América Central y del Sur. Los parásitos adultos miden de 8-16 x 4-8 mm y presentan una forma de cuchara, con un extremo contraí­ do y el otro alargado. Las ventosas anterior y ventral tienen el mismo tamaño. El ciclo vital de estos tremátodos representa un ejemplo clá­ sico de organotropismo; es decir, la afinidad especial que un parásito tiene para buscar y residir dentro de un órgano dado. Los seres humanos se infectan tras la ingestión de carne cruda o poco cocida de cangrejo o de langosta que contenga las meta­ cercarias enquistadas. Tras la ingestión, la metacercaria eclosiona en el duodeno y libera las larvas que se adhieren a la mu­ cosa duodenal. Las larvas penetran todo el espesor de la pared del intestino ingresan en la cavidad abdominal, atraviesan el diafragma, ingresan en el espacio pleural y llegan al tejido pul­ monar periférico donde maduran. La figura 22-18 es una ilus­ tración del ciclo vital. Las manifestaciones clínicas de paragonimiasis se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-15. Identificación por el laboratorio. El diagnóstico de laboratorio suele realizarse mediante la detección microscópica de los hue­ vos característicos en preparaciones de heces.

Huevos Varían de 80 a 120 x 48 a 60 (im. Son amarillo castaño oscuro y tienen una cáscara lisa con un opérculo saliente prominente. Esta opérculo saliente sirve para distinguir los huevos de Paragonimus de los de Diphyllobothrium latum, cuyo opércu­ lo es liso y no sobresale (lámina en color 22-7P). Los huevos de P. westermani tampoco tienen la protrusión similar a un botón en el sentido opuesto al opérculo caracte­ rística de los huevos de Diphyllobothrium.

Parásitos de la sangre y los tejidos Los parásitos encontrados en la sangre o en otros órganos suelen describirse separados de los que habitan en el tubo digestivo. Sin embargo, debe comprenderse que los parásitos de la sangre y los tejidos incluyen protozoos, nematodos y ces­ todos con diversas formas de sus ciclos vitales con morfologías similares a sus contrapartes intestinales. Por ejemplo, Toxoplasma gondii es un coccidio de los tejidos, los tripanosomas son hemoflagelados, las larvas migrans visceral y cutánea son causadas por las formas larvarias de los nematodos ascarídeos del perro y del gato y la hidatidosis es la forma larvaria de un cestodo del perro. Los plasmodios que causan el paludismo son esporozoos que tienen su contraparte intestinal, Isospora hominis, que puede encontrarse en las heces. En general, los ciclos vitales de los parásitos de la sangre y los tejidos son más complejos que los de sus contrapartes intes­ tinales, con estadios sexuales y asexuales. Casi todos los pará­ sitos de la sangre se transmiten a los seres humanos por un artrópodo vector dentro del cual se realiza la fase sexual del ciclo vital. Muchos parásitos que causan infecciones tisulares utilizan una diversidad de especies de insectos para el desarro­ llo de los estadios intermediarios en sus ciclos vitales. En los tejidos, los parásitos pueden ser intracelulares o extracelulares, según las especies y la fase del ciclo parasita­ rio. A continuación se menciona una serie de parásitos hemáticos y tisulares como guía para la descripción posterior en el capítulo: P rotozoos tisulares Paludismo:

Plasmodium falciparum Plasmodium vivax Plasmodium malariae Plasmodium ovale

Babesias:

Babesia microti

Leishmaniasis:

Leishmaniasis Leishmaniasis Leishmaniasis Leishmaniasis

donovani trópica brasiliensis mexicana

Trypanosomiasis

Trypanosoma Trypanosoma Trypanosoma Trypanosoma

brucei gambiense brucei rhodesiense cruzi rangeli

Filarías:

Wuchereria bancrofti Brugia malayi Loa loa Mansonella ozzardi Mansonella perstans Onchocerca volvulus Dirofilaria immitis

Parásitos de la sangre y los tejidos

1239

C IC LO VITAL DE C lono rchis sin ensis M igra a los 'c o n d u c to s biliares'

D egradación de la pared quística en el duodeno

S ER ES H U M AN O S

Ingestión Huevos e m brionados en las heces ^§1

(estadio diagnóstico)

M etacercaria en el pez de agua dulce (estadio infectante)

\

C A R A C O LE S

P enetra debajo de las escam as del pez de agua dulce

P EC ES

Ingerido por el caracol

F ig u ra 22-17 Ciclo vital de Clonorchis sinensis. Con la eliminación de los huevos maduros en canales, lagos y cursos de agua, los huevos embrionados eclosionan y liberan miracidios que nadan libremente. Estos son ingeridos por un determinado tipo de caracol dentro del cual eclosionan y forman un esporoquiste en los tejidos. El esporoquiste a su vez madura en redia, dentro de la cual tienen lugar la maduración y la multiplicación, lo que conduce a la liberación de cientos de cercarías con cola recta que nadan libremente. Las cercarías se adhieren y penetran las escamas de diversas especies de peces de agua dulce y forman metacerca­ rias. Los seres humanos se infectan a través de la ingestión de pescado crudo o poco cocido infestado con metacercarias. Luego de ingeridas, las metacercarias se exquistan en el duodeno y salen las larvas que migran a los conductos biliares. Estos tremátodos son hermafroditas y liberan huevos en la luz de los conductos bilia­ res. Los huevos, en cambio, son transportados al intestino y se eliminan a través de las heces, con lo que se completa el ciclo vital.

C occidias tisulares:

Toxoplasma gondii Pneumocystis jiroveci

N em atodos tisulares: Trichinella spiralis Toxocara canis (larva migrans visceral) Ancylostoma braziliensis o A. caninum (larva migrans cutánea) Dracunculus medinensis

C estodos tisulares:

Especies de Anisakis Especies de Gnathostoma Echinococcus granulosus Echinococcus multilocularis Especies de Multiceps (cenurosis) Spirometra mansonoides (esparganosis)

Paludismo

En los Estados Unidos, la mayoría de los casos de paludis­ mo se encuentran en viajeros, estudiantes nacidos en el extran­ jero o refugiados que han estado expuestos a los mosquitos en áreas endémicas. En 1980 se informaron 566 casos a los CDC, una incidencia del 243% mayor que los 165 casos informados en 1988.31 Aunque la mayoría de los pacientes con paludismo recientemente diagnosticado en los Estados Unidos nacieron en el extranjero o regresaron recientemente de regiones endé­ micas, los vectores del género Anopheles se encuentran en muchos sitios. Por ejemplo, se han informado casos inexplica­ bles de paludismo en el condado de San Diego en California y

1240

C A P ÍT U L O 22

Parasitología

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N C LÍN IC A 2 2-14 C lo norquiasis En las infecciones leves, el daño de las células del parénquim a hepático es mínim o y no se produce cirrosis. Al com ienzo de la infección puede haber leucocitosis leve y eosinofilia. Aunque los conductos biliares en las infecciones hum anas pueden engrosarse y dilatarse, en especial en los puntos donde los parásitos se adhieren al revestim iento interno, la obs­ trucción biliar y la ictericia son raras salvo en las infecciones extrem ada­ m ente intensas (lám ina en color 22-7N ). En la mayoría de los casos, la enfermedad tiende a perm anecer leve y crónica; los organismos persisten durante cuatro o cinco décadas y producen sólo síntom as menores de m alestar abdom inal, diarrea interm itente y dolor espontáneo o a la palpa­ ción del hígado. U na preocupación especial plantea el posible desarrollo de colangiocarcinom a en asociación con las infecciones crónicas por Clonorchis.241 245

en el condado de Bay en F lo rid a.100 N inguno de los individuos afectados refirió un viaje reciente al extranjero, transfusiones de sangre recientes o uso de drogas intravenosas. Sin em bargo, habían frecuentado o acam pado en áreas infestadas por m os­ quitos adyacentes a cam pam entos de trabajadores itinerantes. Los estudios epidem iológicos revelaron que ninguno de esos trabajadores tenía una historia clínica sugestiva de paludism o; sin em bargo, el m osquito vector com petente, A nopheles herms i, se encontró a lo largo del río San L uis Rey en California. Hace poco se inform aron dos casos de paludism o autóctono del condado de Suffolk, N ueva York, en personas que no habían viajado fuera de los Estados U nidos.33 L a conclusión del estu­ dio de estos casos aislados es que el paludism o debe ser inclui­ do en el diagnóstico diferencial de todo paciente con un

C IC LO VITAL DE P a ra g o n im u s w e s te rm a n i

C avidad abdom inal

A traviesa el diafragm a C avidad pleural

Atraviesa la pared intestinal

X A dulto en cavidades qu ística s en los pulm ones (y otros sitios)

D egradación de la pared quística en el estóm ago

S ER ES H U M AN O S

Huevo no em brionado en el esputo (estadio diagnóstico)

M etacercaria en el crustáceo (estadio infectante)

(En las heces si es deglutido) C AR AC O L C R U S TÁC EO

En el agua el huevo desarrolla el em brión

C ercaría en el crustáceo

E sporoquiste en el tejido del caracol

R edia en el tejido del caracol HM

E closiona el m iracidio y penetra en el caracol

Figura 22-18 Ciclo vital de Paragonimus westermani. Los huevos no em brionados se elim inan al medio acuático ya sea por el esputo o por las heces o por ambos. Estos huevos se em brionan en el agua y liberan un miracidio que nada libremente y que penetra en los tejidos de un caracol específico de la especie. En éste, se desarrollan los esporoquistes y las redias en cuyo interior se m ultiplican las cercarías. Cuando maduran, las cercarías que nadan libremente salen del caracol y pene­ tran en las branquias, los m úsculos o las visceras de un crustáceo de agua dulce en cuyo interior se enquistan com o m etacercarias inactivas. Los seres hum anos se infectan tras la ingestión de carne cruda o deficientem ente cocida de cangrejo o de langosta que contenga la m etacercaria enquistada. Tras la ingestión, la m etacer­ caria eclosiona en el duodeno y libera las larvas que penetran todo el espesor de la pared intestinal, ingresan en la cavidad abdom inal, atraviesan el diafragm a e ingresan en espacio pleural. Las larvas llegan al tejido pulm onar periférico donde m aduran en duelas adultas que residen dentro de quistes parabronquiales. Los huevos se liberan por el esputo, donde son expectorados o deglutidos para ser eliminados, por últim o, por las heces para com pletar el ciclo vital.

P a rá s ito s de la s a n g re y los te jid o s

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N C LÍN IC A 22-15 P aragonim iasis Durante la fase migratoria del parásito pueden observarse escalofríos, fiebre y eosinofilia pronunciada. Con el tiempo, las duelas adultas lle­ gan a residir dentro de un seudoquiste pequeño en el tejido pulmonar. El quiste se agranda a m edida que la duela adulta crece y puede abrirse cam ino al bronquíolo adyacente. Cuando el seudoquiste se rompe en un bronquio, la tos y la hem optisis son síntomas habituales. Los huevos producidos por las duelas maduras son elim inados en los bronquios y, por último, deglutidos por el paciente de las secreciones que llegan a la orofaringe por la tos. La enferm edad tiende a ser crónica, lo que conduce a grados varia­ bles de fibrosis y cicatrización pulmonares. El dolor torácico intermiten­ te. la fiebre y los escalofríos pueden ser m anifestaciones tardías. La paragonim iasis abdom inal puede suceder si la duela permanece localiza­ da en el abdomen. El dolor abdominal sordo y la diarrea sanguinolenta son los síntom as principales. Se han informado casos ocasionales de enfermedad cerebral, que debe diferenciarse de la hidatidosis; para el tratam iento se recom ienda praziquantel, en dosis de 25 mg/kg tres veces por día durante 2 días, seguido de 30-50 mg/kg día por medio durante 10-15 días.

com ienzo agudo de fiebre cíclica, aun cuando no existan ante­ cedentes de viajes recientes al extranjero. L a prevalencia m undial de paludism o es de casi 100 m illo­ nes; un m illón de m uertes por año suceden sólo en África. La m ayoría de los casos afectan a refugiados, sobre todo del sudeste asiático. Por consiguiente, los m édicos deben perm a­ n ecer alertas a la posibilidad de paludism o en ciertos grupos de la población. A unque se han realizado grandes progresos en su

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elim inación de algunos sitios, el paludism o perm anece en m ovim iento y la reaparición de la infección es una preocupa­ ción actual. M artens y H all179 atribuyen este resurgim iento a la reagrupación de personas de bajos recursos, que tienen más probabilidad de estar infectadas, provenientes de áreas endé­ m icas, que viajan a regiones sin paludism o en busca de una vida mejor. Las m anifestaciones clínicas del paludism o se pre­ sentan en el recuadro de correlación clínica 22-16. El ciclo vital del plasm odio tiene dos fases: un ciclo sexual, conocido com o esporogonia, que transcurre dentro del tubo digestivo del m osquito, y un ciclo asexual, conocido com o esquizogonia, que sucede en el huésped hum ano. El ciclo vital de P lasm odium m alariae, com o prototipo de todas las especies de paludism o, se m uestra en la figura 22-19. En el recuadro de correlación clínica 22-16 se presentan las m anifestaciones clínicas del paludism o. Identificación por el laboratorio. La identificación por el labora­ torio de los parásitos del paludism o en los seres hum anos, com o y a se describió, se efectúa m ediante la observación de frotis de gota fina y gruesa de sangre periférica. Estos frotis deben obtenerse en diferentes m om entos del día de los p acien­ tes en los que se sospecha la infección porque la parasitem ia puede ser interm itente y la cantidad de parásitos circulantes p ue­ de variar. Las tres especies de P lasm odium que con m ayor frecuencia causan el paludism o hum ano son P. vivax, P. fa lcip a ru m y P. m alariae. U na cuarta especie, P lasm odium ovale, es rara en gran parte del mundo, pero relativam ente com ún en el oeste de Á frica. A continuación se describen las características diferen­ ciales de las tres especies frecuentes. La m orfología m icroscó­ pica de las form as intraeritrocíticas se ilustra en la lám ina en color 22-8. La identificación por el laboratorio de las diversas especies de P lasm odium no es difícil si se sigue un enfoque ordenado

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N C LÍN IC A 22-16 Paludism o L a fiebre es el síntom a de presentación constante de las infecciones por todas las especies de Plasmodium. Los picos de tem peratura comienzan 7 a 10 días después de la picadura de un m osquito infectado del género Anopheles durante un período cuando los parásitos están sufriendo la m ultiplicación preeritrocítica en las células del hígado. Los síntom as prodróm icos de cefalea, mialgias, m alestar general y fatiga son sugestivos de un síndrome gripal que puede experim en­ tarse durante este período. Sin embargo, una vez que una progenie de merozoítos abandona las células hepáticas e invade los eritrocitos, com ienzan los ciclos de fiebre espaciados de m odo regular. L a periodicidad de cada acceso de fiebre elevada se relaciona con la rotura de eritrocitos a m edida que los merozoítos se liberan a la circulación. Las designaciones de este ciclo de fiebre, paludism o "terciano", para Plasmodium vivax y Plasmodium falciparum y paludism o “cuartano” para Plasmodium malariae son algo confusas. Los picos de fiebre para el paludism o terciano suceden con una periodicidad de día por m edio; sin em bar­ go, com o cualquier acceso febril se cuenta com o día 1, el pico siguiente no sucederá hasta el tercer día (por eso terciano). De m anera similar, los accesos febriles del paludism o cuartano suceden en un ciclo de un día cada tres; sin embargo, al contar el prim er episodio com o día 1. el próximo pico sucederá en el cuarto día. N o obstante, estos patrones clásicos de fiebre pueden ser irregulares y no sirven para basar el diagnóstico presuntivo exclusivam ente en ellos. Cada acceso febril se caracteriza por un período corto de “frío” que dura alrededor de 1 hora, cuando la piel está fría, y los labios y los lechos ungueales aparecen cianóticos por la vasoconstricción periférica. Este período corto es seguido por el com ienzo súbito del “período caliente", cuando la piel se siente calurosa y seca, y la fiebre asciende a 40.5-40,7 °C que dura de 3 a 6 horas. Los picos de fiebre suelen acom pañarse por cefaleas, dolor de tórax y espalda, taquicardia, tos, vómitos y delirio de intensidad variable. C ada acceso febril es seguido por fatiga y sueño. Entre los accesos febriles, los pacientes suelen estar asintomáticos. En grado variable se observa anem ia hemolítica, esplenom egalia y hepatomegalia dolorosa. Los pacientes son muy susceptibles a la rotura del bazo y durante el exam en físico debe evitarse la palpación profunda del hipocondrio y del flanco izquierdo. No hay linfadenopatía y si se observa aumento de tam año de los ganglios linfáticos siempre indica otra enfermedad. De sum a preocupación son las com plicaciones del sistema nervioso central que pueden ser secunda­ rias a las infecciones por P. falciparum. Los eritrocitos infectados por trofozoítos de P. falciparum sufren cam bios de m em brana en los cuales aparecen “bul­ tos'' sobre la superficie, que los tom a "pegajosos” y se adhieren a los receptores específicos sobre el revestimiento de células endoteliales de los c a p ila re s* La m icrocirculación del cerebro presenta una vulnerabilidad particular al bloqueo con eritrocitos infectados por P. falciparum. lo que produce pequeñas áreas de infarto cerebral y hem orragia.4 Puede haber alteraciones de la conciencia que varían de la som nolencia al coma, trastornos de la conducta, alucinaciones, con­ vulsiones m otoras y, en ocasiones, temblores, parálisis m usculares focales y otros signos localizados. En los casos fulminantes puede haber un em peoram iento rápidamente progresivo que conduce a la muerte.

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C A P ÍT U LO 22 Parasitología

C IC LO VITAL DE P lasm odiu m vivax, P lasm odiu m m alariae, P lasm odiu m falciparum

P. vivax C iclo asexual preeritrocítico (en el hígado) P. m a la ria e

___________________________

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1R ara vez obse rvado en sang re p erifé rica

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1

C élulas del parénquim a hepático

9

El m osquito pica a los seres hum anos y los esporozoítos ingresan por la piel M O S Q U ITO

.itei

Liberación de esporozoítos (ingresan en las glándula salivales del m osquito)

ví'V o '.r/ El m osquito ingiere m icrogam etocitos con la sangre

V /

j / Fecundación

En la pared del estóm ago se form a el ooquiste

En el interior del ooquiste se producen esporozoítos

¡ J

Form ación de m icrogam etos (exflagelación)

C igoto

El o ocineto penetra la pared del estóm ago

Figura 22-19 Ciclo vital de Plasmodium malariae. Tras producirse varios ciclos eritrocíticos, algunos de los merozoítos se transform an en las formas sexuales de m acrogam etocitos (hembras) y m icrogam etocitos (machos). Cuando un m osquito no infectado por plasmodio pica a un ser humano infectado por paludism o, estos gam etocitos son ingeridos junto con los eritrocitos infectados que contienen trofozoítos com o parte de su alim entación con sangre. En el estómago del m osquito, los m icrogam etocitos (machos) adoptan seis a ocho flagelos. Los m icrogam etocitos penetran en los macrogametocitos hem bra y producen cigotos fecundados. Estos cigotos penetran la pared del estómago del mosquito, donde los esporozoítos por último se rom pen en la cavidad general y migran a las glándulas salivales. Cuando el mosquito pica a un nuevo huésped, los esporozoítos salen de las glándulas salivales y se inyectan a través de la probóscide. Los esporozoítos, la form a infectante para los seres humanos, se encuentran en las glándulas salivales de los mosquitos del género Anopheles hembra. La sali­ va que contienen los esporozoítos infecciosos es inyectada en el torrente circulatorio de los seres hum anos a través de la probóscide del mosquito. Después de cir­ cular en la sangre periférica durante 20-30 minutos, los esporozoítos ingresan en las células del parénquim a hepático, donde com ienzan a m ultiplicarse (etapa exoeritrocítica). Al cabo de 10 días, múltiples form as pequeñas, denom inadas merozoítos, salen de los hepatocitos y se liberan a la circulación, donde buscan y pene­ tran en los eritrocitos. En su interior (ciclo intraeritrocítico), tienen lugar una serie de etapas del desarrollo (lám ina en color 22-8). Estos organism os evolucionan a una “form a anular” conocida com o trofozoíto, el cual, según la especie, se agranda y divide en un estado conocido com o esquizonte. Los segmentos individuales de los esquizontes son los m erozoítos. Cuando maduran, los esquizontes rompen los eritrocitos y los m erozoítos se liberan a la circulación. Estos m erozoítos bus­ can entonces eritrocitos no infectados y el ciclo continúa.

basado en la observación de determ inadas estructuras m orfoló­ gicas. Es bastante im portante que las infecciones por P. fa lc i­ parum sean reconocidas lo antes posible, dado que la enferm e­ dad puede tener una gravedad especial, con un progreso rápido a un desenlace m ortal. U n enfoque del laboratorio sugerido p a­ ra la identificación de las especies de Plasm odium es el si­ guiente:

1. P rim ero, descartar Plasm odium fa lcip a ru m . Com o se m encionó, esta especie es la más peligrosa y las infecciones deben diagnosticarse lo antes posible. Buscar en sangre periférica: • Form as anulares dim inutas que ocupan m enos de la te r­ cera parte del diám etro del eritrocito (lám ina en color 22-8A).

P a rá s ito s de la s a n g re y los te jid o s

•

A m enudo se observan form as m últiples dentro de un eri­ trocito, con dos núcleos en el m ism o anillo. • Las infecciones pueden ser intensas y afectan al 20% o más de los eritrocitos, lo que indica una infección fulm i­ nante. • Los anillos dim inutos suelen ubicarse sobre la m em bra­ na celular del eritrocito, lo que se conoce com o aspecto en “anillo de sello” (lám ina en color 22-8B). • En los frotis de sangre periférica teñidos rara vez se observan las form as anulares en desarrollo o los esqui­ zontes. Las únicas form as que se observan, salvo en las infecciones fulm inantes term inales, son las anulares tem ­ pranas y los gam etocitos. • L a presencia de gam etocitos en form a de banana o de m edia luna es diagnóstica (lám ina en color 22-8C). Pueden estar ausentes en los estadios tem pranos de infec­ ción y suelen aparecer sólo después de 7-10 días del com ienzo de la fiebre. 2. Si lo anterior no se observa, a continuación se debe realizar la identificación objetiva de Plasm odium vivax. Buscar: • E ritrocitos infectados con form a algo irregular, agranda­ dos, pálidos y que contengan gránulos im portantes de color rosado a rojo, denom inados gránulos de Schüffner (lám ina en color 22-8D). • Puede haber form as anulares en todos los estadios del desarrollo. • Los anillos jóvenes miden más de un tercio del diám etro del eritrocito infectado. • A m edida que los trofozoítos m aduran, com ienzan a lle­ nar el eritrocito con un citoplasm a que “fluye” o “ameboide” . • L a p resen cia de m ás de un núcleo en un trofozoíto indica la form ación de u n a form a segm entada te m p ra­ na, co n o cid a com o esquizonte. Los esq u izo n tes de P. vivax están com puestos por 12 a 14 o m ás segm entos in d iv id u a le s d e n o m in a d o s m e ro z o íto s (lá m in a en co lo r 22-8E ). • Los gam etocitos son grandes y circulares (Nota: cual­ quier célula con un núcleo único que ocupa más de la m itad del diám etro celular es un gam etocito). • Los trofozoítos siempre pueden diferenciarse de los gam etocitos porque, en el m om ento que alcanzan el tam a­ ño de la mitad del diám etro de la célula, debe observarse más de un segm ento nuclear (lám ina en color 22-8F). • El pigm ento palúdico en la form a de gránulos finos de color pardusco puede ser abundante tanto en el gam etocito com o en el esquizonte. 3. A unque la identificación de Plasm odium m alariae suele ser por exclusión tras haber descartado las características de P. fa lcip a ru m y P. vivax, com o ya se describió, observar las siguientes características por las cuales pueda realizarse la identificación objetiva: • La presencia de trofozoítos en desarrollo que se extien­ den hasta los bordes de la m em brana del eritrocito y adoptan la form a de “bandas” (lám ina en color 22-8G). • Los eritrocitos infectados no son alargados ni pálidos. • Los gránulos de Schüffner están ausentes. • Los esquizontes están com puestos por no más de 6-12 segm entos, con los segm entos nucleares que se disponen para form ar una “roseta” (lám ina en color 22-8H). • El pigm ento palúdico es abundante y m ás tosco (o inclu­ so “volum inoso”) que el observado en P. vivax, a m enu­ do condensado dentro del agujero del citoplasm a que alberga el núcleo de los gam etocitos.

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• Los gam etocitos están contenidos dentro de los eritroci­ tos de tam año norm al sin gránulos de Schüffner. La identificación de las especies de Plasm odium no suele ser difícil si se aplican los principios m encionados. Sin em bargo, se originan problem as en la interpretación de los frotis de san­ gre periférica en los pacientes que fueron tratados de m odo p ar­ cial o inadecuado cuando puede haberse bloqueado la m adura­ ción norm al de los parásitos y sólo se observan form as atípicas. El cuadro de sangre periférica tam bién puede ser confuso si un individuo determ inado se infecta por más de una especie de P lasm odium . En la década pasada se adelantó m ucho en los aspectos m oleculares de la infección palúdica. Estos avances, com o el esclarecim iento de los genes var que codifican la pro­ teína de m em brana 1 del eritrocito de P lasm odium fa lcip a ru m , y las proteínas codificadas rosetina y rifina sobre la superficie de los eritrocitos infectados, se revisan en la publicación de C hen y cois.38 Los individuos que planean viajes a regiones del mundo endém icas para paludism o deben consultar con las autoridades de salud pública locales para asesorarse respecto de las m edi­ das profilácticas y de protección. Las recom endaciones sobre la profilaxis son publicadas periódicam ente por los CDC (w w w .cdc.gov). Para determ inar el tipo de la profilaxis reco­ m endable deberá considerarse si los lugares a donde se prevé viajar se asocian con un riesgo elevado de transm isión de palu­ dism o resistente a la cloroquina. si la persona tuvo reacciones previas a los fárm acos antipalúdicos y si se dispondrá con faci­ lidad de atención médica. La profilaxis con cloroquina debe com enzar 1 a 2 sem anas antes de realizar el viaje y se extiende durante 4 sem anas después del regreso. En todas las regiones endém icas para paludism o se han encontrado cepas de P. fa lc i­ parum resistentes a la cloroquina. A ctualm ente, la m efloquina ha reem plazado a los fárm acos utilizados con anterioridad para la profilaxis del paludism o que han desarrollado resistencia del parásito. En una serie de ensayos clínicos, C roft y G arner46 enco n traro n que la m eflo q u in a previene el paludism o, aunque se están investigando los efectos adversos neuropsicológicos en pacientes ocasionales, así com o los aspectos de la tolerabilidad. Babesia Persing y cois.209 exam inaron el estado de las infecciones por B abesia m icroti en los Estados U nidos. B. m icroti causa la m ayoría de las infecciones hum anas en pacientes no esplenectom izados; B. bovis y B. divergens son otras especies que cau­ san infecciones en personas esplenectom izadas. B. microti sigue de cerca a Borrelia burgdorferi, la espiroqueta que causa la enferm edad de Lyme. ya que am bos agentes tienen el ratón de patas blancas, Perom yscus leucopus. com o el principal hués­ ped reservorio. La m ayoría de los brotes sucedieron en las regiones del noreste de los Estados U nidos, en especial en Connecticut, Isla de N antucket, Long Island y C ape Cod. El vector predom inante para am bos agentes es la garrapata Ixodes dam m ini, que en el 40% de los casos está coinfectada con am bos parásitos. La incidencia m ucho m enor de la babesiosis respecto de la enferm edad de Lyme en las personas que viven en áreas endém icas puede reflejar la tendencia de B. m icroti para causar infecciones subclínicas. Los estudios serológicos indican que el 10% de los nativos de C onnecticut seropositivos para B. burgdorferi tam bién poseen anticuerpos contra B. m icroti, lo que indica que las infecciones son m ucho más fre­ cuentes de lo que se sospechaba.

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C A P ÍT U L O 2 2

Parasitología

Identificación por el laboratorio. El diagnóstico de laboratorio se realiza con m ayor frecuencia m ediante la detección de las inclusiones parasitarias intraeritrocíticas en frotis teñidos de sangre periférica. Presentan las siguientes características:

advierta al laboratorio sobre la sospecha diagnóstica, los casos de babesiosis y de paludism o pueden pasar inadvertidos.

• Las form as anulares son dim inutas, varían entre 1 y 3 (im, que recuerdan a los trofozoítos tem pranos de P. falciparu m (lám ina en color 22-9A). • Los núcleos son m uy pequeños y pueden observarse uno o dos gránulos de crom atina. • Las form as m aduras pueden aparecer com o dobletes, lo que les da el aspecto de orejas de conejos; o en tétradas y sim u­ lan la Cruz de M alta. • Los eritrocitos no están agrandados, son norm ocróm icos y no presentan pigm entos.

L a fam ilia de protozoos Trypanosom atidae incluye m iem ­ bros de los géneros L eishm ania y Trypanosom a, que son flage­ lados que habitan la sangre y los tejidos hum anos. Pueden observarse cuatro estadios de desarrollo de los pará­ sitos. L a form a adulta, o tripanosom a, presenta un cuerpo alar­ gado con un flagelo posterior en form a de látigo adherido por una delicada m em brana ondulante que recorre todo el cuerpo. T res esp ecies se aso cian co n la en ferm ed ad hum ana: Trypanosom a gam biense y Trypanosom a rhodesiense causan la enferm edad del sueño africana, m ientras que Trypanosom a cruzi es el agente de la enferm edad de Chagas o tripanosom ia­ sis am ericana. Las form as m enos desarrolladas de estos proto­ zoos, conocidas com o am astigoto o form as leishm anoides, están desprovistas de flagelos y se encuentran com o parásitos intracelulares en las células reticuloendoteliales. Leishm ania donovani, la causa del kala-azar visceral en los seres hum anos y el com plejo Leishm ania trópica, los agentes de las úlceras cutáneas tropicales, son las especies de Leishm ania que se aso­ cian con m ayor frecuencia con las enferm edades hum anas. T. cruzi tam bién existe en la form a de am astigoto e infecta las fibras del m úsculo cardíaco y células de otras visceras. Los estadios de desarrollo de leptom onas y critidias están alberga­ dos en el insecto vector; este últim o estadio representa la form a infectante para los seres hum anos.

Las m anifestaciones clínicas de la babesiosis se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-17. Tam bién se han com u­ nicado infecciones relacionadas con transfusiones; específica­ m ente, un grupo de seis casos de babesiosis asociados con transfusiones en el estado de N ueva York, rastreado a un único donante asintom ático.69 Se ha establecido que B. m icroti puede perm anecer infecciosa a 4 °C durante 30 días, el tiem po nor­ m al de alm acenam iento de la sangre de donantes.75 Tam bién se ha inform ado un caso reciente en el estado de W ashington rela­ cionado con transfusión con la cepa W A 1.130 El diagnóstico m ediante las escasas form as intraeritrocíticas descritas antes es difícil y puede ser pasado por alto, incluso por m icroscopistas experim entados. M attia y cois.181 utilizaron una técnica de capa enriquecida de leucocitos (buffy-coat) para m ejorar la detección de la parasitem ia en casos de babesiosis. G arcía96 ha publicado una nota de precauciones que advierte sobre los posibles problem as diagnósticos provenientes de los diferentes instrum entos. La cantidad de cam pos exam inados de m anera habitual cuando se exam inan los frotis es dem asiado pequeña y estos instrum entos no están diseñados para detectar parásitos intracelulares. Por consiguiente, a m enos que se

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IO N C LIN IC A 22-17 B abesiosis Com o lo señalaron Persing y cois.,205 los síntomas en la babesiosis tem ­ prana pueden ser m ínimos: m alestar general, anorexia y fatiga son sínto­ m as inespecíficos que se confunden con facilidad con otras enferm eda­ des infecciosas. Aunque los síntomas de las infecciones contraídas en el noreste de los Estados U nidos tienden a ser relativamente leves, infor­ mes recientes de estudios de casos de California y otras partes del mundo indican que las presentaciones de enfermedad fulminante, febril y hem olítica se encuentran con mayor frecuencia.27'210 Los estudios genéticos revelan que estas infecciones más graves pueden ser causadas por una cepa m ás estrechamente relacionada con un patógeno canino conocido, B. gibsoni. o con especies de Theileria. más que con B. microti.209 Esta cepa, designada WA1 (Washington 1), se encuentra en am plia investigación. Dormán y cois.71 inform aron el caso de un hombre de 58 años, infectado por la picadura de una garrapata, en quien se desa­ rrolló anem ia hem olítica grave seguida de coagulación intravascular disem inada e insuficiencia renal aguda y respiratoria. Se notó una rápida m ejoría después del tratam iento con clindam icina. 300 mg cuatro veces por día (com enzada 2 días antes de la internación), quinina (650 mg tres veces por día) durante la internación y una transfusión de intercambio, en la cual la proporción de eritrocitos parasitados se redujo del 13,8% al 4,2%.

Hemoflagelados: especies de Leishmania y de Trypanosoma

LEISHMANIASIS Y ESPECIES DE LEISHMANIA

La leishm aniasis hum ana puede adquirir dos form as: la enferm edad disem inada, el kala-azar, que afecta el hígado, el bazo y otras partes del sistem a reticuloendotelial y una form a cutánea prim aria, que se m anifiesta com o úlceras de la piel y las m ucosas (lám ina en color 22-9B). Los seres hum anos se infectan a través de la regurgitación de los prom astigotos infec­ tantes del parásito en el tejido subcutáneo en el m om ento en que se alim entan de la sangre diversas especies de m osquitos del género Phlebotom us. E n la figura 22-20 se m uestra el ciclo vital de las especies de Leishm ania. La leishm aniasis visceral está causada por varias especies que pertenecen al com plejo Leishm ania donovani-, es decir, L. donovani donovani, L. donovani infantum y L. donovani chagasi. Cuando los flagelados ingresan al cuerpo hum ano, en p ri­ m er lugar invaden los m onocitos inflam atorios del tejido sub­ cutáneo en el sitio de la picadura. Estas células inflam atorias se rom pen y liberan parásitos que a su vez invaden otros m onoci­ tos y m acrófagos, dentro de los cuales se disem inan a través del sistem a reticuloendotelial. E l período de incubación varía de 3 a 8 m eses. L a progresión o no de la enferm edad depende de la capacidad de los linfocitos T del huésped para activar los m acrófagos a fin de m atar los parásitos. Las m anifestaciones clínicas de la leishm aniasis se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-18. Identificación por el laboratorio. Para la leishm aniasis disem ina­ da (kala-azar) el diagnóstico se realiza m ediante la dem ostra­ ción de los am astigotos en frotis teñidos, en im prontas o en biopsias de tejidos infectados. Presentan las siguientes caracte­ rísticas: • Los protozoos tienen una form a oval, son intracelulares y muy pequeños, de 2 a 4 (im.

P a rá s ito s d e la s a n g re y los te jid o s

1245

CICLO VITAL DE Leishmania

Los prom astigotos son fagocitados por los m acrófagos

Los prom astigotos se transform an en am astigotos dentro de los m acrófagos)

£ |f ^ \ Los am astigotos se m ultiplican en las células (incluso m acrófagos) de diversos tejidos

\

El flebótom o se alim enta con sangre (inocula en la piel el estadio prom astigoto) S ER ES H U M AN O S

FLE BÓ TO M O (m osquito)

El flebótom o se a lim enta con sangre al picar (ingiere m acrófagos infectados con am astigotos)

Se dividen en el intestino m edio y migran a la probóscide

A

estadio infectante

A

estadio diagnóstico

/

Ingestión de células parasitadas Los am astigotos se transform an en el estadio de prom astigotos en el intestino m edio

Figura 22-20 Ciclo vital de las especies de Leishmania. En el sitio de la picadura del flebótomo se form a una pápula cutánea, pero rara vez progresa a una úlce­ ra. Los prom astigotos se transform an en amastigotos, los cuales proliferan localm ente en el tejido subcutáneo y se diseminan a través del sistem a reticuloendotelial para afectar bazo, hígado, m édula ósea y ganglios linfáticos, donde los organismos se encuentran com o parásitos intracelulares estrictos (lám ina en color 22-9C). El ciclo vital simple luego se com pleta cuando los am astigotos son captados por el flebótomo durante su alim entación siguiente con sangre del huésped infectado. Los am astigotos se transform an en promastigotos infectantes en el intestino medio del mosquito.

• Se asem ejan a las células levaduriform es de H istoplasm a capsulatum . • Los am astigotos tienen un cinetoplasto en barra adyacente al núcleo, una estructura que es útil para la distinción de estos organism os de las form as levaduriform es de Histoplasm a capsulatum (lám ina en color 22-9C, D y E). Leishm aniasis cutánea. El diagnóstico de laboratorio se realiza m ediante la dem ostración de los am astigotos intracelu­ lares en preparados de im prontas o cortes de tejidos de lesiones activas. Las biopsias deben obtenerse de los bordes sobreeleva­ dos e inflam ados de la lesión; los aspirados deben obtenerse m ediante la extensión profunda de la punta de la aguja por debajo del lecho de la úlcera. Los m étodos de cultivo, utiliza­ dos sobre todo en los laboratorios que prestan servicios en áreas endém icas, se detallan en la publicación de G arcía.96 López-V elez y co is.170 tam bién describen un m étodo de cultivo que utiliza m uestras separadas en capa enriquecida de leucoci­ tos de sangre periférica que fueron de valor en el diagnóstico de leishm aniasis en pacientes con SID A con cuadros clínicos atípicos. Las técnicas de inoculación en anim ales se utilizan en

estos laboratorios para diagnosticar infecciones cuando las concentraciones del parásito son bajas. Las técnicas de E L lSA , que em plean anticuerpos m onoclo­ nales específicos de especies y las sondas de DNA fueron sa tisfac to rias p ara la d etecció n d ire c ta de an tíg en o de L eishm ania en extractos de m uestras de tejido en laboratorios donde se dispone de reactivos. Piarroux y cois.213 utilizaron un ensayo de PCR que am plifica una secuencia repetida del g eno­ m a de L eishm ania infantum en un estudio de 73 pacientes con diagnóstico clínico presuntivo de leishm aniasis visceral; estos autores dem ostraron una sensibilidad superior del m étodo (82% ) para hacer el diagnóstico cuando se com paró con el exa­ men de aspirados de m édula ósea (55% ) y m ielocultivos (55%). Concluyeron que la PCR puede servir com o ayuda en el diagnóstico de leishm aniasis visceral en pacientes inm unodeprim idos. R odríguez y cois.,226 m ediante la técnica de hibri­ dación por PCR que em plea oligonucleótidos dirigidos contra regiones conservadas del D N A del cinetoplasto, pudieron detectar la presencia de Leishm ania en el 98% de los pacientes con diagnóstico clínico de leishm aniasis cutánea por la prueba cutánea de M ontenegro positiva. Estos autores consideran que

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C A P ÍT U L O 22

Parasitología

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N C LÍN IC A 2 2-18 Leishm aniasis Leishmaniasis diseminada: kala-azar Los síntomas pueden ser leves y autolimitados en las infecciones con escasa cantidad de parásitos o puede haber un com ienzo súbito de síntomas, con fiebre en picos (un patrón de dos o tres picos por día), anorexia, m alestar general y una sensación de enfermedad, que sim ula la fiebre tifoidea o el paludismo. Si la enfermedad progresa y se tom a crónica, la fiebre de baja intensidad, el dolor abdominal vago, el aum ento de tam año del abdomen por la hepatom egalia y la esplenom egalia (que puede tom arse enorm e), la linfadenopatía generalizada, la anem ia y la leucopenia pueden persistir. Recientem ente se ha reconocido kalaazar com o una infección oportunista relacionada con el SIDA.191

Leishmaniasis cutánea primaria La enfermedad se clasifica en las form as del Viejo M undo y del Nuevo Mundo. La enfermedad del Viejo M undo, denom inada úlcera de Oriente, está causada con m ayor frecuencia por m iem bros del com plejo de L. trópica (que com prende L. major. L. trópica minor y L. aetliiopica). Esta form a de enferm edad es endém ica en las regiones tropicales y subtropicales de Asia Menor, China, sur del M editerráneo. India y África. En el sitio de las picaduras del insecto en las partes expuestas del cuerpo, los prom astigotos inoculados en la piel son captados por las células retieuloendoteliales, donde evolucionan a amastigotos. La especie que causa la leishm aniasis cutánea no circula salvo en muy raros casos. En el sitio de la picadura se m anifiesta un prurito intenso que en el transcurso de varias semanas o meses progresa a una úlcera crónica y bien circunscripta con bordes eritem atosos y sobreelevados y un lecho poco profundo (lámina en color 22-6J). Las úlceras causadas por L. major tienden a ser húm edas y múltiples; las de L. trópica minor son más secas y forman una costra que las recubre. Casi todas las lesiones son benignas y se curan solas; desarrollan inmunidad permanente. Las lesiones cutáneas de L. aethiopica pueden no ulcerarse, pero a m enudo causar infecciones subcutáneas profundas que se diseminan y esta especie también tienen predilección para provocar enfermedad diseminada indistin­ guible de las infecciones por L. donovani. 207 La leishm aniasis cutánea del Nuevo M undo está causada por el com plejo L. braziliensis (que también incluye L. braziiiensis guyanensis y L. braziliensis panamensis), que es endém ico en casi todos los estados de América del Sur y en varias regiones de A m érica Latina, y por el com plejo Leishmania mexicana. que incluye varias especies separadas endém icas en diversas regiones de México. Guatemala, Venezuela y en la cuenca del Am azonas de Brasil. Los organis­ mos del com plejo L. braziliensis causan úlceras cutáneas crónicas agresivas, con diseminación a las mucosas (bucal, nasal, faríngea), un cuadro clínico deno­ m inado espundia. Los organism os del com plejo L. mexicana con más probabilidad producen úlceras cutáneas autolimitadas (el 60% de las lesiones aparecen en los lóbulos de las orejas96 y se conocen com o "úlceras de los chicleros”). Las mucosas están m enos afectadas, aunque es probable que L. peruviana produz­ ca una enfermedad cutánea difusa conocida com o "uta” en Perú. El tratam iento de elección es el estibogluconato de sodio.

la técnica es valiosa desde el punto de vista epidem iológico para la discrim inación taxonóm ica entre especies.

TRIPANOSOMIASIS

L a tripanosom iasis hum ana está causada por un protozoo flagelado que habita en la sangre y los tejidos. L a form a adul­ ta, que m ide 1,5-30 |im x 1,5-3,5 (im, tiene un cuerpo alargado con un flagelo posterior en form a de látigo que se adhiere a una delicada m em brana ondulante que recorre toda la longitud del cuerpo. Los anim ales silvestres actúan com o huéspedes reservorios. Se observan con facilidad un núcleo central y un cinetoplasto posterior. Estas form as diagnósticas se observan en los frotis teñidos de sangre periférica (lám ina en color 22-9E) y en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con infección activa. Sin em bargo, en las infecciones crónicas o leves, Bailey y S m ith ,12 en un estudio de m uestras de sangre de 134 pacientes con infección por Trypanosom a gam biense, encontraron que la prueba con enriquecim iento de leucocitos desarrollada para el diagnóstico de paludism o constituye la prueba diagnóstica más sensible para la detección de las form as de los tripanosom as. El ciclo vital incluye anim ales y seres hum anos com o hués­ pedes definitivos, en los cuales los tripanosom as m aduros cir­ culan y se dividen en la sangre periférica y, por últim o, invaden el sistem a nervioso central, y un huésped interm ediario, la m osca tsetsé (género G lossina), en la que se desarrollan las for­ mas inm aduras en las glándulas salivales que por último forman los tripom astigotos m etacíclicos infectantes. El ciclo vital se ilustra en figura 22-21. Las m anifestaciones clínicas de la tripanosom iasis africana se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-19.

En un inform e de la O rganización M undial de la Salud em i­ tido en 1986, se consideraba que alrededor de 50 m illones de personas están en riesgo de tripanosom iasis africana; se han diagnosticado 20 000 casos nuevos por año.295 En la form a afri­ cana de la enferm edad, los seres hum anos se infectan a través de las picaduras de las m oscas tsetsé infectadas que albergan los tripom astigotos procíclicos infectantes en sus glándulas salivales. Las m oscas glosina se encuentran sólo en A frica. La capacidad de estos organism os de perm anecer viables en una población de personas infectadas de m odo crónico se debe a la propiedad singular de cam biar la estructura antigénica de las glucoproteínas dentro de sus m em branas de superficie, lo que evita los efectos de los anticuerpos del huésped.70 Se han creado m étodos para la detección de antígeno a fin de diagnosticar la tripanosom iasis africana. En un ensayo de cam ­ po realizado en Zaire, N antulya y co is.195 utilizaron de m odo eficaz E L IS A para antígenos en la evaluación de 77 casos de tripanosom iasis gam biense com probados por m étodos parasi­ tológicos. De estos pacientes, 69 (89,6% ) m ostraron antígenos en suero y 35 (45,5% ) en el LCR. De estos últim os, 34 (97,1% ) tuvieron recuentos de leucocitos elevados en el LCR, 29 (82,9% ) m ostraron concentraciones elevadas de proteínas y 23 (65,7% ) revelaron tripanosom as identificados p o r m icroscopia en el LCR. Los autores indican que su prueba de ELISA puede ser útil en la estadificación de la enferm edad y en el segui­ m iento hasta el tratam iento. K yam badde y co is.159 encontraron que la PCR dem ostró infección en 20 de 35 (57% ) m uestras de sangre obtenidas de pacientes con sospecha de tripanosom iasis en U ganda y en 21 de 34 m uestras de LCR (61% ). D e las 21 m uestras de sangre negativas para las form as diagnósticas cir­ culantes, 6 fueron positivas p o r PC R (28,6% ), y 8 de 21 m ués-

P a rá s ito s d e la s a n g re y los te jid o s

1 24 7

CICLO VITAL DE Trypanosom a g am bien se, Trypanosom e rhodiense

D esarrollo de tripom astigotos (sangre, linfa, LCR)

S ER ES H U M AN O S

Introducción del estadio infectante por la m osca tsetsé

\

M O S C A TS ETS E

(Glossina)

En las glándulas salivales evolucionan a epim astigotos

La m osca ingiere sangre (ingestión de tripom astigotos)

/

Los prom astigotos se m ultiplican en el intestino m edio y posterior

Figura 22-21 Ciclo vital de Trypanosoma brucei gambiense. El ciclo vital com prende los seres humanos y un insecto, la mosca tsetsé. Cuando el insecto pica a una persona infectada ingiere su sangre que contiene tripom astigotos. En el estómago de la m osca se liberan promastigotos que se multiplican en el intestino medio y posterior; por últim o migran a las glándulas salivales com o epimastigotos. A su vez, los seres humanos se infectan a través de la picadura de una mosca infecta­ da que inocula epimastigotos. En el sitio de la picadura del insecto se form a un chancro dentro del cual, en un período de varias sem anas, los tripanosom as sufren su multiplicación y m aduración. Por último, éstos invaden los vasos linfáticos y sanguíneos, y se diseminan a los ganglios linfáticos y al sistema nervioso central. L a multiplicación del organismo continúa en el torrente circulatorio a pesar de la inm unidad hum oral del huésped infectado, una diferencia fundam ental con T. crnzi.

tras de LCR (38% ) que fueron negativas por centrifugación doble resultaron positivas por PCR. Los fárm acos de elección en el tratam iento de la tripanoso­ m iasis africana son la suram ina o la pentam idina. El m elarsoprol puede utilizarse en los estadios tardíos con enferm edad del SNC. Enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana): La enferm e­ dad de Chagas, causada por Trypanosom a cruzi, se extiende desde el sur de los E stados U nidos por toda A m érica L atina y del Sur hasta la A rgentina. Se estim a que hay entre 10 y 12 m illones de personas infectadas, de las cuales cerca de la m itad vive en Brasil.66 Si bien T. cruzi se ha encontrado en perros, m am íferos silvestres e insectos vectores en el sur de los Estados U nidos, sólo m uy rara vez se com unicaron casos au­

tó cto n o s h u m a n o s.117-263 El d ia g n ó stic o puede realizarse m ediante la observación de los tripom astigotos circulantes en sangre periférica, aunque el período de circulación es más corto que el observado en la tripanosom iasis africana. Los tri­ pom astigotos presentan un aspecto sim ilar a los de su contra­ parte africana, salvo por su tendencia característica de form ar la letra “C ” (lám ina en color 22-9G). El últim o caso inform ado en los Estados U nidos fue en la región rural de Tennessee, cuando una m adre encontró un triatom a (chinche reduvídea o “vinchuca”) en la cuna de su niño de 18 m eses.129 Se halló que el contenido intestinal de la v in­ chuca estaba infectado por Trypanosom a cruzi tanto por m icroscopia óptica com o por PCR. U n preparado enriquecido de leucocitos de una m uestra de sangre del niño fue negativo

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C A P ÍT U L O 2 2

Parasitología

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N C LÍN IC A 22-19 Tripanosom iasis africana La tripanosom iasis africana, tam bién conocida com o enfermedad del sueño, es causada por una de las dos especies. Trypanosoma brucei rhodesiense. endém ico en las regiones de la sabana y de los bosques del centro y el este de Africa, y Trypanosoma brucei gambiense. endémico en las regiones selváticas lluviosas tropicales del centro y oeste de Áfri­ ca. La enfermedad clínica causada por T. brucei rhodesiense presenta un com ienzo más rápido con una tendencia mayor a tornarse rápidam ente progresiva, incluso llevar a la muerte. El cuadro m ás crónico del dete­ rioro neurológico progresivo, que culm ina en la “enfermedad del sueño” característico de la tripanosom iasis gambiense. a m enudo no tiene tiem ­ po de desarrollarse en las cepas rhodesiense. Los pacientes infectados por T. brucei gambiense experim entan pri­ m ero fiebre recurrente interm itente asociada con linfadenopatías. Los ganglios linfáticos de la región cervical posterior del cuello son los afec­ tados con frecuencia y producen la lesión conocida com o signo de W interbottom. Orm erod202 ha m ostrado datos experim entales de una relación fisiológica entre los ganglios linfáticos cervicales y los ventrículos cerebrales, lo que sugiere que el signo de W interbottom puede ser un m arcador de la infección cerebral. La hepatoesplenom egalia también puede evidenciarse durante este estadio tem prano de la infección. Cuando la enfermedad se torna cróni­ ca, la invasión por parte del organismo del sistema nervioso central pro­ duce el estadio de sueño de la enfermedad, caracterizado inicialm ente por cam bios conductuales y de la personalidad, que conducen a la apa­ tía, la fatiga, la confusión y la som nolencia, signos de la meningoencefalitis progresiva. La em aciación y el com a profundo llevan por último a la muerte, a m enudo causada por sobreinfecciones.

para determ inar la presencia de organism os; sin em bargo, fue positivo p or PCR, lo que indica parasitem ia de bajo grado. Por lo tanto, este quinto caso inform ado de infección autóctona por T. cruzi en los Estados U nidos se hubiera pasado por alto sin la atención de la m adre y la técnica de PCR altam ente sensible. Tanto los roedores com o los anim ales dom ésticos, entre ellos perros, gatos y cerdos, actúan com o reservorios de T. cruzi. En los Estados U nidos se han encontrado zarigüeyas y m apaches infectados. En el caso inform ado antes, tres mapaches en la vecindad del caso inicial tenían hem ocultivos positi­ vos para T. cruzi. Las casas construidas con adobe, barro o m aterial vegetativo, con num erosas grietas en las paredes, pro­ porcionan los sitios óptim os para la cría de los triatom as (lám i­ na en color 22-9H). Estas chinches tienen hábitos nocturnos y atacan a sus víctim as m ientras duerm en. P or consiguiente, la prevención de la enferm edad está dirigida a m ejorar las condi­ ciones de las viviendas. El ciclo vital de T. cruzi difiere del de las especies africanas en que el triatom a (reduvídeo) actúa com o el artrópodo vector y que las visceras pueden ser infectadas con las form as de am astigotos (leishm anias) del parásito. El ciclo vital se ilustra en la figura 22-22. Las presentaciones clínicas de la enferm edad de Chagas se encuentran en el recuadro de correlación clínica 22-20. Trypanosom a raiigeli es otro tripanosom a transm itido a los seres hum anos por chinches reduvídeas. Las infecciones hum a­ nas suelen ser asintom áticas. Los tripom astigotos pueden iden­ tificarse en frotis de gota gruesa y fina de sangre periférica y la m orfología se asem eja a la de la tripanosom iasis africana. Sin em bargo, a m enos que se obtenga una historia clínica detalla­

da, puede realizarse un diagnóstico erróneo de infección por T. cruzi. L a com probación serológica puede ser de valor para la diferenciación de las infecciones por T. rangeli de la enferm e­ dad de Chagas; sin em bargo, pueden aparecer infecciones dobles que confunden los resultados. Se están desarrollando m étodos para el diagnóstico serológi­ co a fin de detectar anticuerpos séricos contra T. cruzi que ayu­ den al diagnóstico de la enferm edad de Chagas. G odsel y co is.101 identificaron en el suero de pacientes con enferm edad de C hagas un antígeno recom binante nuevo denom inado FCaBP, una proteína de unión al calcio flagelar de 24 kDa. Esta proteína puede utilizarse com o com ponente de una preparación de m últiples antígenos recom binantes eficaz en la detección sistem ática de T. cruzi en sangre de donante. Tantowitz y cois.263 en una revisión global, analizan la im portancia de la detección sistem ática de enferm edad de Chagas en sangre de donantes. E sta cuestión afecta no sólo a los individuos que viven en países donde la enferm edad es endém ica sino tam bién a los Estados U nidos, donde más de 50 000 inm igrantes de paí­ ses endém icos pueden estar infectados. Avila y co is.11 sugieren una prueba de detección sistem ática sensible para el diagnósti­ co de la enferm edad de Chagas crónica en donantes para ban­ cos de sangre. Estos autores dem ostraron una sensibilidad del 100% en com paración con las pruebas serológicas en la detec­ ción de productos del DNA m inicircular del cinetoplasto de T. cruzi am plificado por PCR en 114 m uestras de sangre obteni­ das de pacientes crónicos con en ferm edad de C hagas y sin ella, m ediante la sonda de oligonucleótido m arcada con digoxigenina. C om o en la enferm edad de Chagas crónica el núm ero de tri­ pom astigotos circulantes es m uy bajo, la detección de D N A del cinetoplasto de T. cruzi p o r PCR provee un m étodo altam ente sensible para establecer el diagnóstico. M uchos estudios han m ostrado un alto grado de sensibilidad, com parable con el xenodiagnóstico, capaz de detectar tan sólo un tripom astigoto circulante en 20 m L de sangre.20,103 E ste m étodo tam bién se encontró útil com o prueba para determ inar la curación en el control de los pacientes que están realizando tratam iento. Filarías y filariasis

Estos nem atodos descritos aquí son parásitos con form a de hebras. Los adultos habitan sobre todo en los vasos sanguíneos y linfáticos, pero tam bién pueden encontrarse en m úsculos, tejido conectivo y cavidades serosas. Tres especies de filarías son las que con frecuencia causan enferm edad en los seres hum anos: W uchereria bancrofti, B rugia m alayi y Loa loa. En 1989 se estim ó que 90 a 150 m illones de personas en todo el m undo estaban afectadas, m ás del 90% por W. bancrofti y m enos del 10%, por B. m a la yi.m En 1999, la estim ación fue de 120 m illones de personas.1493 L a filariasis por W. bancrofti se observa sobre todo en regiones urbanas del sudeste asiático, debido a las m alas condiciones sanitarias y a la cría intensa de m osquitos de los géneros Culex. La filariasis por B. m alayi es principalm ente una enferm edad rural transm itida por m osqui­ tos de los géneros A nopheles y Aedes. Se cree que la cantidad de personas infectadas está en aum ento debido a la aparición de barrios de viviendas precarias por m igraciones desde las zonas rurales a las urbanas, lo que brinda condiciones favorables para la reproducción de los m osquitos.275 Los seres hum anos adquieren la enferm edad tras la picadura de un m osquito (W. bancrofti y B. m alayi) o tábanos del géne­ ro Chrysops infectados. Los m osquitos actúan com o huéspedes interm ediarios para las especies M. p erstans y M. ozzardi, que

Parásitos de la sangre y los tejidos

1249

CICLO VITAL DE Trypano som a c ru zi

Los trip o m a stig o to s (en fo rm a de “C " o co rto s y gruesos) circu la n en la sangre

Introducción de las form as infectantes por: 1. H eces de triato m a 2. Transfusiones de sangre 3. C ultivos de laboratorio 4. Infecciones congénitas

Invasión a los te jid o s y m ultiplicación de los am a stig o to s en los m úsculos e stria d o s (algunos trip o m a stig o to s aún presentes en la sangre)

S E R E S H U M AN O S

TRIATO M A IN FE STA N S (“V inchuca”)

El tria to m a se a lim enta de sangre (ingiere tripom astigotos)

/ E pim astigotos que se desarrollan en el intestino p o sterior de la vinchuca y son elim inados por sus heces

P rom astigotos que se m ultiplican en el intestino m edio dei tria to m a

F ig u ra 22-22 Ciclo vital de Trypanosoma cruzi. Los seres humanos se infectan cuando la vinchuca con tripanosom as deposita sus heces sobre la herida que pro­ duce al picar y chupar sangre. La picadura es bastante dolorosa y al frotarse, las heces infectadas penetran en la herida. En el huésped hum ano, los tripanosom as con form a de C circulan por el torrente circulatorio durante el com ienzo de la fase aguda de la enferm edad (lám ina en color 22-9G) y aparecen episodios febriles intermitentes. El ciclo se com pleta cuando la vinchuca reduvídea (lám ina en color 22-9H) pica de nuevo a un huésped infectado.

carecen de vaina. El ciclo vital de W uchereria bancrofti com o prototipo de filarías se ilustra en la figura 22-23. Identificación por el laboratorio. El diagnóstico de laboratorio se realiza m ediante la observación de las m icrofilarias circulantes en frotis teñidos de sangre periférica.112 Las m icrofilarias cir­ culan por la sangre periférica con una periodicidad regular; las de W. bancrofti y B. m alayi son nocturnas y las de L oa loa son diurnas. Por consiguiente, para diagnosticar filariasis por W. bancrofti, las m uestras de sangre deben obtenerse de m odo óptim o entre la m edianoche y las 2 de la m adrugada. En casos de infecciones leves o cuando las m uestras se recolectan en m om entos subóptim os, las técnicas de filtración por m em bra­ na, centrifugación, sedim entación (concentración de K nott) y la preparación de gotas gruesas pueden ayudar a detectar las m icrofilarias circulantes.224 El em pleo de filtros de policarbo-

nato (Nuclepore®) para atrapar las m icrofilarias sobre un filtro después de haber lisado los eritrocitos es una técnica de co n ­ centración alternativa.64 C om o los filtros con un tam año de poro de 3-5 |im son transparentes cuando están húm edos, pu e­ den exam inarse directam ente en el m icroscopio sobre un p o r­ taobjetos para determ inar la presencia de m icrofilarias. L ong y co is.168 describen un m étodo interesante para el diag­ nóstico de laboratorio de filariasis que em plea una técnica de naranja de acridina, en un tubo para m icrohem atocrito. Este tubo, que incorpora heparina, EDTA y naranja de acridina, constituye la base para esta prueba. C on la centrifugación, los parásitos se concentran en la capa enriquecida de leucocitos y pueden visualizarse a través de la pared de vidrio transparente del tubo. El colorante naranja de acridina tiñe el DNA de los parásitos y pueden observarse las características m orfológicas,

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CAPÍTULO 22 Parasitología

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N C LÍN IC A 22-20 E nferm e. dad de C hagas (T ripano som iasis am ericana) Los niños son los afectados con m ayor frecuencia, aunque los adultos no están exentos de adquirirla. En la form a aguda de la enfermedad puede aparecer un chagom a inflamado y edem atoso en el sitio de la picadura del triatom a (vinchuca). C om o esta chinche suele atacar m ientras las personas duerm en, son m ás com unes las picaduras de la cara. Cuando la puerta de entrada es la conjuntiva aparece un edem a indoloro del tejido periocular que causa el clásico signo de Romaña. Los ganglios linfáticos locales son los afectados con mayor frecuencia. Puede observarse fiebre, m alestar general, anorexia, linfadenopatía generalizada, edem a de los miem bros inferiores y hepatoesplenom egalia de grado variable de inten­ sidad. Los antiprotozoos nifurtimox, un derivado nitrofurfurilideno y el benznidazol, un im idazol. son los fárm acos recom endados para el trata­ miento de la enfermedad de Chagas. Am bos presentan posibles efectos colaterales graves, com o polineuropatía, alergias cutáneas, trastornos gástricos y leucopenia. En la form a crónica, el estadio de amastigoto (leishm ania) se encuen­ tra con m ayor frecuencia en los tejidos, por lo com ún en las células reticuloendoteliales o en el músculo cardíaco (lámina en color 22-11 A). La m iocardiopatía, secundaria al edem a y a la destrucción de las fibras miocárdicas y una m iocarditis intersticial, son la causa principal de muerte. El m egaesófago y el m egacolon son otras com plicaciones de la enferm e­ dad de Chagas crónica. Aunque la afectación del sistem a nervioso cen­ tral no es típica, puede haber m eningoencefalitis que progresa a la con­ fusión, la apatía, el estupor, el com a y la muerte. M anzullo y C huit,176 en un estudio de 4 593 personas con al m enos dos resultados serológicos positivos para infección por T. cruzi, encon­ traron que hubo 89 muertes (1,5%). De estos casos m ortales, las tres cuartas partes fallecieron por insuficiencia cardíaca y el cuarto restante, por arritm ias ventriculares graves. Aquellos con bajo riesgo de muerte mostraron ECG y seguimiento clínico normales; los pacientes de alto riesgo fueron sintom áticos y presentaban ECG anormales, con bloqueo de rama derecho, alteraciones de la repolarización.

com o los patrones nucleares en cortes de la cola, por m icroscopia de fluorescencia y realizar la identificación de especie. Las hem bras m aduras producen una m iríada de prelarvas co ­ nocidas com o m icrofilarias que circulan por la sangre y cons­ tituyen el m odo de transm isión cuando el m osquito vector se alim enta con sangre de un individuo infectado. La identifica­ ción puede realizarse m ediante la observación de las caracte­ rísticas claves, particulares para cada especie de filaría. M icrofilarias: • M iden entre 240-300 X 7-10 |im . • Se asem ejan a cintas y pueden observarse en preparaciones m icroscópicas en fresco de sangre anticoagulada por su m ovim iento ondulante que desplaza a los eritrocitos de un lado hacia el otro a m edida que ellas se mueven. • En los frotis teñidos de sangre periférica con la especie pató­ gena se observa que se extiende una vaina im portante más allá del corte de la cola. La vaina es una m em brana ajustada que envuelve a las m icrofilarias y representa los restos de la m em brana del huevo a partir de la cual se form a. • Las especies pueden diferenciarse m ediante la observación del tam año y del patrón de extensión de los núcleos en los cortes de la cola: • W. bancrofti: los núcleos no se extienden en la cola (lám i­ na en color 22-10A).

• B. malayi: dos núcleos se extienden en la cola, espaciados por cerca de 10 pm (lám ina en color 22-10B). • Loa loa: una colum na ininterrum pida de núcleos se extien­ de en la cola (lám ina en color 22-10C). Las m icrofilarias de las otras dos especies, M ansonella perstans (antes D ipetalonem a perstans) y M ansonella ozzardi tam ­ bién pueden observarse en sangre periférica: sin em bargo, los pacientes con estas infecciones suelen estar asintom áticos. En ocasiones, se ha observado en individuos infectados eosinofi­ lia, linfadenitis, fiebre de baja intensidad, erupción m aculopapular y urticaria. Las m icrofilarias de estas dos especies están desprovistas de vaina. C om o la detección de m icrofilarias circulantes por la obser­ vación directa de sangre es relativam ente insensible para esta­ blecer el diagnóstico de filariasis y depende de la recolección de m uestras en m om entos específicos del día, se han introduci­ do varios procedim ientos de detección de antígeno. En un estu­ dio previo, Weil y cois.281 dem ostraron antígeno de filaría en los sueros de 56 de 57 pacientes con m icrofilarem ia por W. bancrofti que vivían en regiones endém icas del sur de la India. La cantidad de antígeno puede ser irregular, en especial d uran­ te las horas en que no se detectan las m icrofilarias circulantes; por lo tanto, incluso estos enfoques carecen de sensibilidad. Los ensayos de PC R resultaron útiles no sólo para establecer el diagnóstico en casos de infecciones con escasa o nula cantidad de m icrofilarias en sangre sino tam bién para controlar el trata­ m iento y discrim inar entre una infección pasada y presente.80 De gran interés actual es la aplicación de la técnica de PC R en el diagnóstico de filariasis p o r W. bancrofti para el exam en de m uestras de esputo recolectadas durante el día).1 Los datos p re­ lim inares de este estudio inicial son bastante alentadores y auguran una gran posibilidad para el futuro. Sim onson y D unyo248 tam bién encontraron m uy prom isorios tres enfoques recién introducidos para la detección de antígeno: la prueba IC T en tarjeta, la TropB io E L ISA para m uestras de suero y la TropB io E L ISA p ara m uestras en papel de filtro.

0NC0CERC0SIS Y ONCHOCERCA VOLVULUS

L a oncocercosis es una enferm edad causada por filarías que afecta sobre todo el tejido subcutáneo en la form a de nodulos densos y fibrosos que varían de 5 a 25 m m , en los sitios de las picaduras del vector, la m osca negra o m osca búfalo del géne­ ro Sim ulium . Se estim a que 17,7 m illones de personas están infectadas por O nchocerca volvulus en el m undo, de las cuales 270 000 son ciegas y otras 500 000 presentan deterioro visual. La oncocercosis es la principal causa m undial de ceguera. La m osca del género Sim ulium tiene com o hábitat la m aleza que recubre los bancos de los arroyos de corriente rápida. La oncocercosis africana afecta sobre todo el Congo, Zaire, A ngola y Sudán; en el continente am ericano se encuentra en la altiplanicie de G uatem ala, los estados de O axaca y C hiapas en M éxico, en C olom bia y en el noreste de Venezuela. Los nodu­ los se d istrib u y en con m ay o r frecu en cia en el tronco, los m uslos y los brazos en los individuos africanos, pero se locali­ zan en el cuello y los hom bros de los habitantes de A m érica Central. El ciclo vital de O nchocerca volvulus se ilustra en la figura 22-24. L a sospecha clínica del diagnóstico surge cuando un p acien­ te de un área endém ica presenta nodulos subcutáneos pruriginosos asociados con derm atitis, pérdida de la elasticidad e hiperpigm entación. El prurito es un síndrom e im portante en algunos pacientes, y produce fatiga, debilidad e insom nio hasta

P a rá s ito s d e la s a n g re y los te jid o s

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R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N C LÍN IC A 22-21 Filariasis206 Al com ienzo de las infecciones por W. bancrofti y B. malayi aparecen fiebre elevada y escalofríos, que duran hasta 5 días antes de rem itir y que suelen aso­ ciarse con linfadenitis. Estos episodios febriles pueden recidivar cuando la linfangitis persistente se extiende en sentido distal desde los ganglios linfáticos, a m edida que los parásitos adultos migran para llegar a su residencia final en los vasos linfáticos. A diferencia de lo que sucede con los esquistosom as. las fila­ rías adultas son lo suficientem ente grandes como para bloquear los vasos linfáticos. La obstrucción linfática, la inflamación y la tumefacción que producen linfedema extenso se conoce com o elefantiasis. La manifestación clínica característica de W. bancrofti es la enfermedad genital con funiculitis, epididimoorquitis e hidrocele y, m enos a menudo, elefantiasis.201 En la filariasis por B. malayi es más frecuente la linfadenitis de la región inguinal y la elefantiasis, que afecta sobre todo la pierna por debajo de la rodilla y dejan la rodilla y el codo no afectados con contornos norm ales. En los vasos linfáticos en los que se alojan los parásitos se observa infiltración densa de eosinófilos, plasmocitos y macrófagos. El daño local de los vasos conduce a un aumento de la perm eabi­ lidad de la pared de éstos y a la fuga de líquidos con alta concentración de proteínas en los tejidos circundantes (linfedem a), que por último causa la elefan­ tiasis clásica. La linfangitis aguda ocurre cuando los parásitos adultos mueren. Algunos pacientes pueden albergar parásitos adultos sin microfilarias circu­ lantes; otros pueden tener m icrofilaremia circulante im portante sin síntomas clínicos acorde con esta situación. Loa loa causa una enferm edad en la cual los parásitos adultos migran a través del tejido subcutáneo y puede observarse com o una elevación serpiginosa de las partes delgadas de la piel o por debajo del revestimiento conjuntival del ojo. Estas lesiones cutáneas angioedematosas m igratorias se conocen como edem a de Calabar y constituyen una manifestación diagnóstica. Debido al aum ento de los viajes en todo el mundo, Rakita y cois.221 aconsejan que la infec­ ción por Loa loa sea considerada en el diagnóstico diferencial de los pacientes que presentan angioedem a migratorio, vasculitis urticariana, eosinofilia o cualquier com binación de ellos. El térm ino "gusano ocular” proviene de la propensión de este organism o a infiltrarse por debajo del epitelio conjuntival. Beaver16analizó 56 casos de filariasis hum ana intraocular. En 10 casos, las filarías extirpadas se identificaron com o Loa loa. Sin embargo, W. bancrofti. especies de Dipetalonema y especies de Dirofilaria fueron las otras especies de filarías detectadas en los casos restantes.

el punto de quedar incapacitado física y socialm ente. Las áreas afectadas de la piel pueden tom arse calientes y edem atosas, con cam bio de color y arrugas prem aturas, una afección cono­ cida en A m érica Central com o mal m orado. E n A frica, la afec­ tación de la región de la cadera, en especial alrededor de los ganglios linfáticos inguinales, causa un cuadro conocido com o “ingles péndulas” , que suele conducir a hernias fem orales e inguinales. D iversas fotografías excelentes que ilustran estas presentaciones clínicas fueron publicadas por G arcía.96 L a lám ina en color 22-10D es un corte de un nodulo teñido con H-E, que incluye el corte de una hem bra grávida dentro de la cual se observan m uchas m icrofilarias. A unque éstas pueden perm anecer localizadas en el sitio de infección, pueden deam ­ bular a través de la piel adyacente y alcanzar otros tejidos, inclu­ so el ojo. El com prom iso ocular es la com plicación m ás grave y suele llevar a grados variables de pérdida de la visión, conocida com o “ceguera de los ríos”. El ojo actúa com o una tram pa para las m icrofilarias itinerantes, las cuales pueden m orir o vivir en la cám ara anterior, la córnea, la coroides y el hum or vitreo. Se considera que la acción m ecánica o los efectos de las toxinas secretorias liberadas por el parásito adulto en un paciente hipersensible y la producción de anticuerpos contra los antígenos de la retina pueden participar en el desarrollo de la ceguera bilate­ ral. L a gravedad de la ceguera en diversas regiones endém icas depende de la cepa de O. volvulus im plicada, com o se determ i­ nó por análisis de la secuencia de D N A .200 El enzim oinm unoa­ nálisis descrito antes puede ser útil para establecer el diagnósti­ co en los pacientes que presentan ceguera de los ríos. El diagnóstico de laboratorio se establece m ediante la dem ostración de las m icrofilarias en biopsias de piel. P uede ser necesario el exam en de m últiples tiras para establecerlo. Z im m erm an y cois.309 utilizaron con éxito la PC R para detectar m icrofilarias en biopsias de piel, lo que brinda un aum ento sig­ nificativo de la sensibilidad en la detección de la infección acti­ va que la lograda por la observación m icroscópica habitual o las pruebas serológicas. O gunrinade y cois.200 evaluaron un en z im o in m u n o an á lisis con antígenos rec o m b in an tes de O nchocerca volvulus O C 3.6 y O C 9.3 com o una ayuda para el diagnóstico de pacientes en los que se sospechaba oncocercosis. D em ostraron que 40 de las 42 (95% ) m uestras de suero

probadas de pacientes con oncocercosis conocida fueron reac­ tivas para el antígeno OC 3.6, m ientras que el 81% fueron p o ­ sitivas para el antígeno OC 9.3. O tros estudios revelaron que el antígeno O C 3.6 fue el m ás útil p ara detectar infecciones hum anas antes de su m anifestación; el antígeno O C 9.3 fue m ás sensible en los pacientes con infecciones definidas y m ani­ fiestas. El tratam iento consiste en la extirpación quirúrgica de los nodulos detectables cuando resulte eficaz. L a iverm ectina se considera en la actualidad el fárm aco de elección cuando no es posible la extirpación quirúrgica de las lesiones. E ste fárm aco reduce las cantidades de m icrofilarias porque bloquea la libe­ ración de las hem bras, es bien tolerado y los efectos colatera­ les, com o prurito, artralgia y edem a cutáneo, suelen ser m eno­ res. L a dietilcarbam azina, com enzando con dosis pequeñas m ás la suram ina, son fárm acos alternativos que han resultado exitosos, aunque los efectos colaterales secundarios a la m uer­ te de las m icrofilarias pueden requerir el uso de antiinflam ato­ rios. La adm inistración de m ebendazol o flubendazol (deriva­ dos del benzim idazol) tam bién resultó beneficiosa, con escasos efectos secundarios.

DRACUNCULIASIS

D racunculus m edinensis es un nem atodo de los tejidos aso­ ciado a m enudo con las filarías. E s el gusano de G uinea que probablem ente represente la “serpiente abrasadora” de la tradi­ ción b íb lica.135 H opkins y co is.,139 en un a actualización recien­ te, indican que A sia está ahora libre de dracunculiasis, con Pakistán, India y Yemen sin nuevos casos desde 1993, 1996 y 1997, respectivam ente. Tam poco hay nuevos casos de la enfer­ m edad en Cam erún y Senegal desde 1997, y hubo sólo tres casos inform ados en Chad en 1998. E n la actualidad, la dra­ cunculiasis está confinada a sólo 13 países de Á frica, con una reducción del núm ero global de casos de 3,2 m illones en 1986 a 78 557 en 1998 (dism inución del 97% ). Esta reducción fue el resultado de un program a intensivo de detección y contención de casos, con recom pensas para su com unicación. Los seres hum anos adquieren la infección a través de la ingestión del copépodo infectado. Las larvas evolucionan en

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CAPÍTULO 22 Parasitología

CICLO VITAL DE W uchereria b a n c ro fti

se desarrollan las larvas de las filarías

Las m icrofilarias ingresan en el torrente circulatorio

S ER ES H U M AN O S

0

El m osquito se a lim enta de una pe rson a e in ocula

la s

m osquito ingiere m icrofilarias cuando

en el m osquito

Figura 22-23 Ciclo vital de Wuchereria bancrofti. Los seres humanos adquieren la enfermedad tras la picadura de un m osquito infectado ( W. bancrofti y B. malayi) o de un tábano (Loa loa). Los mosquitos picadores pequeños actúan com o huéspedes intermediarios para las especies sin vaina, M. perstans y M. ozzardi. Cuando el vector pica a un huésped hum ano infectado, se ingieren las microfilarias infectantes y penetran la pared del estómago del insecto. En el estóm ago evolucionan a un tercer estadio larvario infectante, el que a su vez m igra a los m úsculos torácicos del insecto y luego a la probóscide. Cuando el insecto pica a otro huésped hum a­ no, estas larvas infectantes se movilizan hacia la probóscide y se inoculan en la herida cutánea mientras el m osquito se alim enta con su sangre. Estas larvas infec­ tantes se reproducen en form a local en el tejido subcutáneo y por últim o ingresan en los linfáticos periféricos y se dirigen a los ganglios linfáticos y vasos linfáti­ cos en diversas partes del cuerpo. En un período de varias semanas, las larvas evolucionan a parásitos adultos blancos y con form a de hebras. Los linfáticos de los m iem bros inferiores y los ganglios linfáticos epitrocleares y fem orales son los sitios afectados con m ayor frecuencia. Las hem bras m aduras liberan microfilarias que circulan por la sangre y son ingeridas por el insecto adecuado durante su próxim a alim entación con sangre para com pletar el ciclo vital.

parásitos adultos en las cavidades serosas y las hem bras grávi­ das m igran al tejido subcutáneo. Estas hem bras pueden m edir hasta 100 cm y causan una sensación de quem azón y ulcera­ ción de la piel en los sitios de infección. Pueden ser extirpadas del tejido subcutáneo m ediante una incisión quirúrgica, enro­ llándolas después lentam ente con un palillo. El ciclo vital del parásito se com pleta cuando las larvas producidas por la hem ­ bra escapan de la am polla cutánea y se liberan en el agua donde vive el copépodo. La interrupción de esta parte del ciclo vital en las poblaciones infectadas perm itirá la erradicación com ple­ ta de la dracunculiasis en la próxim a década.

DIROFILARIASIS

Las especies de D irofilaria, transm itidas por m osquitos, son filarías que de m anera habitual infectan a los anim ales. En el huésped definitivo, con frecuencia el perro, las form as larvarias infectantes inoculadas en el tejido subcutáneo de la probóscide del m osquito ingresan en la circulación y por últim o encuen­ tran su recorrido al corazón, donde evolucionan a adultos (gusanos del corazón del perro) (lám ina en color 22-10E). El diagnóstico se realiza en los perros infectados m ediante la observación de m icrofilarias circulantes en sangre periférica. Cuando los seres hum anos (que actúan com o huéspedes acci-

Parásitos de la sangre y los tejidos

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C IC LO VITAL DE O n c h o c e rc a v o lv u lu s

M icrofilarias

ii i y c í

Migran a la cabeza y a la probóscide

/

MOSCA

\

A traviesan la pared del estóm ago

S egundo estadio larvario M úsculos torácicos P rim er estadio larvario

F ig u ra 2 2 -2 4 Ciclo vital de Onchocerca volvulus. En el ciclo vital, los seres hum anos se infectan por picaduras de la m osca del género Simulium. en cuya boca se encuentran las form a larvarias del tercer estadio infectantes del parásito. Los parásitos adultos se desarrollan en masas enrolladas dentro de los nodulos debajo de la piel y las hem bras producen microfilarias (lám ina en color 22-9D). Las m icrofilarias perm anecen localizadas en los sitios de infección y no circulan en la san­ gre periférica salvo en raras ocasiones. El ciclo vital se com pleta cuando una m osca negra pica de nuevo a una persona enferma en uno de los sitios de infección, tom ando microfilarias en su parte bucal. Las microfilarias evolucionan en la m osca al penetrar la pared del estómago, ingresando en los m úsculos torácicos y trans­ form ándose en larvas del prim ero y segundo estadio. Éstas m aduran a las form a larvarias infectantes del tercer estadio para com pletar el ciclo vital.

dentales) son picados por m osquitos infectados, las larvas, debido a que están en un huésped equivocado, son incapaces de com pletar su ciclo vital. En cam bio, se alojan y obstruyen las arteriolas pulm onares, donde se desarrollan en nodulos granulom atosos locales que, en ocasiones, alcanzan el tam año sufi­ ciente para ser diagnosticados com o lesiones num ulares” en las radiografías. Las m icrofilarias nunca circulan en la sangre hum ana. El diagnóstico se efectúa m ediante la observación his­ tológica de las larvas de filarías inm aduras dentro de los nodu­ los granulom atosos pulm onares. F lieder y M oran82 realizaron una revisión reciente de 39 casos de infección pulm onar por dirofilarias com probadas por histología. A lrededor de la m itad de este grupo era asintom ático, con sólo un nodulo pulm onar

detectado en las placas radiográficas obtenidas en exám enes físicos de rutina; la m itad restante presentó síntom as respirato­ rios. Sólo el 10% presentó eosinofilia en sangre periférica. Infecciones tisulares por protozoos

TOXOPLASMA GONDII Toxoplasma gondii es un parásito protozoo que tienen una predilección particular por infectar el SNC hum ano. Su ciclo vital se ilustra en la figura 22-25. Tres m odos de transm isión conducen a la m ayoría de las infecciones hum anas: 1) directam ente por la ingestión de ooquistes infectantes en alim entos (p. ej., verduras de hoja sin lavar) o agua contam inada con heces de gato; 2) indirectam en-

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C A P ÍT U L O 2 2

Parasitología

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N C LÍN IC A 22-22 Toxoplasm osis154 En casos de toxoplasm osis hum ana puede encontrarse un am plio espectro de signos y síntomas. Sobre la base de la alta prevalencia de seropositividad en ciertas poblaciones, del 90% en algunas regiones del Salvador, Tahití y Francia (un prom edio del 20% en los Estados U nidos),182 millones de personas sanas están o han estado infectadas por Toxoplasma gondii. Así. los síntomas están ausentes o son pasados por alto excepto en el 10% de los casos y la incidencia de la enfermedad progresiva es m uy baja. La toxoplasm osis aguda sintomática en personas inm unocom petentes se presenta com o una linfadenopatía generalizada, en especial de la región cervical. Se acom paña por odinofagia. fiebre y mialgias, y la enferm edad en conjunto puede sim ular la mononucleosis infecciosa. En la mayoría de los casos la enfer­ m edad es autolim itada; sin embargo, en raras oportunidades puede haber una enferm edad disem inada manifiesta. La miocarditis, la neum onitis y la encefali­ tis pueden aparecer en grados variables de intensidad y sim ular otras enfermedades diseminadas, com o tuberculosis, sarcoidosis, tularemia, linfom a o leuce­ mia. En los casos graves puede haber un desenlace mortal. Se halló un aum ento acentuado en la incidencia de la enfermedad sintom ática entre varones hom osexuales y en drogadictos intravenosos. De hecho, debe sospecharse SIDA o drogadicción en todo paciente diagnosticado con toxoplasmosis. La enfermedad suele localizarse en el SNC con síntomas de encefalitis o m eningoencefalitis o con m anifestación de una lesión ocupante.114 Puede progresar con rapidez y por lo general term ina con la muerte si no se m odifica el estado de inmunodepresión. La enfermedad pulm onar, cardíaca y linforreticular también puede estar presente. De m odo típico, el LCR muestra concentra­ ciones elevadas de proteínas y aum ento de las células inflamatorias mononucleares. Los taquizoítos que circulan en la sangre de una m ujer em barazada infectada pueden atravesar la placenta y distribuirse en los tejidos fetales. Los recién nacidos de térm ino con un com ponente com pleto de anticuerpos IgG m aterno a menudo resisten las infecciones; los recién nacidos prematuros o deficientes de anticuerpos son más sensibles a la enfermedad progresiva. Pueden observarse síntomas generales com o esplenom egalia, ictericia, fiebre y linfadenopatía. El SNC es especialm ente sensible y los síntomas pueden variar; entre los más frecuentes se observan deterioro de la visión, convulsiones, retraso mental, espasticidad. hidrocefalia, m icrocefalia y sordera. En los recién nacidos asintomáticos al nacer puede desarrollarse la enfermedad de comienzo tardío; en los casos sospechosos deben realizarse punciones raquídeas o subaracnoideas a fin de establecer el diagnóstico. Grover y cois.114 aplicaron la técnica de PCR para el diagnóstico precoz de la infección congénita por Toxoplasma. Esta técnica se basa en la lisis directa de las células centrifugadas del líquido amniótico seguida de am plificación por PCR de una secuencia génica específica de T. gondii. La PCR identificó correctam ente la presencia de T. gondii en cinco m ues­ tras de líquido am niótico obtenidas de cuatro pacientes con infección congénita com probada en el estudio citado. El exudado del vitreo y la retinocoroiditis bilateral de la m ácula son signos oculares frecuentes de la toxoplasmosis congénita. Los síntom as pueden no m anifestarse hasta la segunda o tercera década de la vida. La coriorretinitis con visión borrosa, la fotofobia y el dolor ocular pueden observarse en los casos adquiridos; sin embargo, suele ser unilateral. El tratam iento recom endado es pirim etam ina. en dosis de 25-100 mg/día durante 3 a 4 semanas más espiramicina, 2-4 g/día durante 3 a 4 semanas en los adultos. Los niños deben recibir dosis de pirim etam ina de 2 m g/kg/día durante 3 días (m áximo, 25 mg/día), luego 1 m g/kg/día durante 4 semanas, más espi­ ram icina 50-100 m g/kg/ día durante 3 a 4 semanas.

te, por la ingestión de carne de anim ales cruda o poco cocida que tiene los ooquistes ingeridos (se estim a que el 25% de la carne de cordero y de cerdo vendida en los superm ercados con­ tiene quistes tisulares viables) y 3) transplacentaria, transferida al feto de una m adre infectada durante el em barazo. Las tasas de infección m aterna durante los años reproductivos se estim an entre el 3% y el 5% .87 Las m ujeres em barazadas debieran ser firm em ente advertidas de que eviten la m anipulación con gatos y la ingestión de carne poco cocida. Los síntom as clínicos pue­ den ser m ínim os o estar ausentes en los estadios agudos de la infección y los recién nacidos pueden no m ostrar los signos cardinales de la infección -retinocoroiditis, calcificación cere­ bral, hidrocefalia o m icro cefa lia- durante varios m eses o in ­ cluso años. L as infecciones adquiridas en los adultos suele m anifestarse com o linfadenitis y linfadenopatía, grados varia­ bles de m iocarditis, m eningoencefalitis, neum onía atípica y rinocoroiditis. En las infecciones hum anas participan dos estadios parasita­ rios. Tras la ingestión de los ooquistes o las form as infectantes enquistadas en carne deficientem ente cocida se liberan los taquizoítos (lám ina en color 22-10F) en el intestino delgado e invaden en prim er lugar las células epiteliales de la m ucosa a partir de las cuales ingresan en la circulación y luego se distri­ buyen am pliam ente por el cuerpo. Puede haber un daño tisular considerable cuando los taquizoítos destruyen las células que parasitan; sin em bargo, a m edida que se desarrolla la respuesta inm unitaria, los taquizoítos se tornan m enos activos y por últi­ mo se agregan dentro de un quiste encerrado por una m em bra­

na (lám ina en color 22-10G y H). A unque inactivos, los taqui­ zoítos dentro de estos quistes pueden perm anecer viables durante sem anas o años. Lo m ás com ún es que por últim o se desintegren y queden enredados en una cicatriz hialina o sufran calcificación. L a detección de calcificación intracerebral en el cráneo en las radiografías es un m étodo para establecer la infección previa. Diagnóstico de laboratorio. El diagnóstico de la toxoplasm osis aguda puede realizarse m ediante la dem ostración de grupos de taquizoítos en frotis teñidos con PAS o H-E. Las tinciones con técnicas de anticuerpos fluorescentes y peroxidasa-antiperoxidasa se han utilizado para dem ostrar m ejor los organism os en tejidos fijados con form aldehído e incluidos en parafina. Tal vez, los taquizoítos se observan m ejor en aspirados con aguja o im prontas teñidos con W right-G iem sa. • Los taquizoítos presentan una form a típica de arco, m iden 34 x 6-7 |im y presentan un núcleo central oscuro (fig. 22-26 y lám ina en color 22-10F). L a presencia de uno o m ás quistes en cortes de tejidos de pacientes suele indicar infección crónica y por lo general un estadio de infección inactiva, pero sirve com o im portante fuen­ te de reactivación aguda de la toxoplasm osis. • Los quistes m iden hasta 200 (im de diámetro y contienen varios cientos de bradizoítos de 2-3 Lim de diám etro (fig. 22-27 y lámina en color 22-10G y H).

P a rá s ito s d e la s a n g re y los te jid o s

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CICLO VITAL DE Toxoplasma gondii

||J E squizonte | e j | M acrogam etocito M icrogam etocito

E sporogenia en las heces 1-4 días 19-48 días

3-10 días H U E SP ED D EFIN ITIVO

H U E SP ED IN TE R M E D IA R IO Aves, ratones, etc. B radizoitos

Ingestión de ooquistes presentes en heces de gato o en carne contam inada

O oquistes con esporoquistes

F ig u ra 2 2 -2 5 Ciclo vital de Toxoplasma gondii. El ciclo vital de T. gondii tiene estadios sexual y asexual. El estadio sexual se produce en el intestino de los gatos, donde los ooquistes infectantes, que miden entre 10 y 12 |im de diám etro, se replican dentro de las células epiteliales de la m ucosa intestinal y se eliminan por las heces. El estadio asexual suele producirse en una diversidad de animales herbívoros y carnívoros que ingieren los ooquistes infectantes cuando com en en el suelo contam inado. Los seres hum anos tam bién se infectan por la ingestión de alim entos y agua contam inados con ooquistes. Las cucarachas, las lom brices de tierra, los caracoles y las babosas también pueden actuar com o huéspedes de transporte para los ooquistes.

El diagnóstico serológico de toxoplasm osis es com plejo y un análisis com pleto está m ás allá del alcance de esta presenta­ ción. Las investigaciones innovadoras, realizadas por M cCabe y R em ington,182 se resum en en el recuadro 22-6. D ada la alta prevalencia de títulos elevados de anticuerpos contra Toxoplas­ ma en la población general, los resultados de la prueba deben interpretarse con cuidado antes de establecer un diagnóstico definitivo. La prueba de Sabin-Feldm an, en honor de sus crea­ dores, basada en el principio de que los taquizoítos vivos de Toxoplasm a gondii pierden su afinidad por el colorante azul de m etileno en presencia de suero inm une, es m uy sensible y específica y aún sigue siendo el m étodo de elección. N o obs­ tante, en la m ayoría de los laboratorios de referencia se ha reem plazado por técnicas m ás nuevas para evitar la necesidad

de trabajar con organism os vivos. A sim ism o, esta prueba m ide anticuerpos IgG, que aparecen en el suero en el transcurso de 1 a 2 sem anas después de la infección, alcanzan su m áxim o a las 6 a 8 sem anas y declinan en los m eses siguientes, pero en la m ayoría de los pacientes nunca desaparecen por com pleto. D ado que los títulos en suero tan altos com o 1:512 pueden per­ sistir durante m uchos años en personas sanas, las interpretacio­ nes de m uestras únicas deben evaluarse con cuidado. En los últim os años se introdujeron varios m étodos nuevos para el diagnóstico serológico de toxoplasm osis, que incluyen enzim oinm unoanálisis, ELISA , pruebas de aglutinación direc­ ta, inm unofluorescencia indirecta y técnicas de inm unocaptura e inm unotransferencia. Varias de estas pruebas fueron evalua­ das por Cubitt y cois.49 W ong y col.293 han evaluado las aplica-

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C A P ÍT U L O 2 2

Parasitología

Figura 22-26 Im agen con gran aum ento de un preparado por im pronta teñi­ do con Giem sa donde se observan trofozoítos del toxoplasma. Nótense la form a de arco característica y el núcleo central oscuro (1000 x).

ciones de la determ inación de anticuerpos inm unoglobulina E (IgE) contra toxoplasm a com o prueba diagnóstica. M ediante un estudio de aglutinación inm unosorbente (ISA GA ) y ELISA , se determ inaron las concentraciones séricas de IgE en varios grupos de pacientes con toxoplasm osis y sin ella. Los anticuer­ pos IgE no se detectaron en m uestras de suero de los individuos seronegativos, en los que tenían infección crónica por toxo­ p lasm a o en los lactantes sin toxoplasm osis congénita. Las m ujeres em barazadas en las que se produjo la seroconversión durante la gestación, los pacientes con linfadenopatía por toxo­ plasm a, los lactantes con signos de toxoplasm osis congénita,

B ecuadro 2 2 -6

Figura 22-27 Imagen con gran aum ento de los seudoquistes de toxoplasm a ilustrados en la figura 22-25. C ada seudoquiste contiene varios trofozoítos. Estos seudoquistes se observan con m ayor frecuencia en los pacientes con enfermedad latente. N ótese la ausencia de reacción inflam atoria adyacente a estos seudoquistes (H-E 1000 x).

los niños y los adultos con coriorretinitis por toxoplasm a y los pacientes adultos con SID A y encefalitis por toxoplasm a pre­ sentaron títulos de IgE por encim a de los valores lím ites. Los autores concluyeron que la recrudescencia de anticuerpos IgE en suero puede ser útil para ayudar al diagnóstico en los pacientes con reactivación de la enferm edad. Li y co is.164 han creado una prueba de E L ISA que incorpora una protem a recom binante (antígeno rP35 de Toxoplasma gondii) que detec-

Interpretación de los resultados sero ló g ico s en los sínd rom es clínicos de to xo p la sm o s is 182

A. Toxoplasm osis adquirida aguda: paciente inmunocompetente. El diagnóstico puede tener un alto grado de sospecha si: 1. Se dem uestra la seroconversión de negativa a positiva. 2. Un aum ento de dos veces en el título entre la muestra basal y otra prueba repetida 3 semanas m ás tarde. 3. Un título elevado de IgM con un único título elevado de IgG (> 1: 1000 ). 4. Un título bajo de IgM indica que la infección se adquirió hace 4 meses o más. El título de IgM suele revertir a lo normal dentro de los 9 meses. Nota-, una prueba de Sabin-Feldm an o de inm unofluorescencia negativa en una persona inm unocompetente casi siempre descarta el diagnóstico de toxo­ plasmosis aguda. B. Toxoplasm osis adquirida aguda: paciente no inmunocompetente. Los criterios citados para los pacientes inm unocom petentes se aplican tam bién a los individuos no inm unocom petentes. Sin em bargo, los anticuerpos IgM o el aum ento de dos veces en los anticuerpos IgG a m enudo no se detectan; por consiguiente, una prueba negativa no descarta toxoplasmosis aguda. Los organismos deben dem ostrarse en biopsias de tejido o frotis por im pronta de aspirados antes de que pueda realizarse un diagnóstico seguro en este grupo de pacientes. C. Toxoplasm osis ocular. El diagnóstico puede sospecharse si: 1. Títulos bajos de anticuerpos IgG en presencia de una lesión retiniana típica. 2. Si la relación de anticuerpos “C ” es igual o mayor de 8 utilizando la siguiente fórm ula cuando se prueba líquido de hum or acuoso: Título de anticuerpos en el hum or acuoso x concentración de y-globulina en suero Título de anticuerpos en suero x concentración de y-globulina en el hum or acuoso D. Toxoplasm osis congénita. El diagnóstico de infección por toxoplasm a en el recién nacido puede establecerse si: 1. Hay un título persistente o que se eleva en la prueba de Sabin-Feldm an o en la inm unofluorescencia. 2. Se dem uestra una prueba de IgM positiva con cualquier título después del nacimiento en ausencia de filtración placentaria (la prueba preferida es DS-IgM -ELISA) en biopsias de tejido o frotis por impronta de los aspirados.

P a rá s ito s de la s a n g re y los te jid o s

ta anticuerpos IgG producidos sólo durante el estadio agudo de la infección; por eso sirve com o m arcador serológico para dife­ renciar entre infección adquirida en form a reciente e infección antigua latente. L as técnicas de detecció n de antígeno tam bién m ejoraro n de m anera significativa en los últim os años, en especial con la in tro d u cción de la técn ica de PC R . V arias publicacion es describen el gen B 1 de T. gondii com o el m arcador para ser detectado por am plificación génica por P C R .79 134-153-205 El pro­ cedim iento de am plificación del gen B I es lo suficientem ente sensible para detectar un único parásito aislado y tan poco com o 10 parásitos sobre un fondo de 100 000 leucocitos.205 Las técnicas de am plificación génica son m ás sensibles y pueden reem plazar a los cultivos de células com o m étodos de elección para detectar parasitem ia por toxoplasm a.134 L a detección de ésta en pacientes con SID A que presentan fiebre inexplicada o alteraciones del sistem a nervioso central m ediante la determ i­ nación génica tras la am plificación por PC R tam bién resulta prom isoria.79 El exam en de sangre por PCR puede ser útil ade­ m ás en el diagnóstico de toxoplasm osis extracerebral prove­ niente de la reactivación local de quistes cerebrales latentes.74 D upon y cois.73 hallaron que el exam en por PCR de L C R san­ gre es un auxiliar valioso para detectar la reactivación de la toxoplasm osis cerebral latente. A dem ás de detectar secuencias de ácido nucleico B 1 de T. gondii, citan otros estudios satis­ factorios que utilizan genes p30, TGR1 y el rD N A 18S com o objetivos.

PNEUMOCYSTIS JIROVECi En la actualidad y sobre la base del análisis de la secuencia del DNA, por su genética, P neum ocystis jiroveci, denom ina­ ción actual para Pneum ocystis carinii, está m ás estrecham ente vinculado con los hongos y, por lo tanto, ha sido reclasificado com o una levadura ascosporógena. Los criterios específicos para realizar esta reclasificación, según H adley y N g ,116 son los siguientes: • P. jiro veci y los hongos tinen ultraestructuras sim ilares de las paredes celulares. • Las crestas de las m itocondrias de P. jiroveci son lam inillares (los protozoos presentan crestas tubulares). • Las form as quísticas que contienen cuerpos intraquísticos rem edan a las ascosporas que form an los A scom ycota. • Tiene una alta hom ología de los dom inios m ás conservados de la subunidad 16S del rRN A con A scom ycota. • El gen de p-tubulina presenta una hom ología del 89-91% con el de los hongos filam entosos. • P. jiro veci tiene proteínas separadas para las actividades de tim idilato sintasa y dihidrofolato reductasa (los protozoos producen una única proteína bifuncional). • Las subunidades 1, 2, 3 y 6 de la N A D H deshidrogenasa; la subunidad II de la citocrom o oxidasa y una subunidad peque­ ña del rRN A tienen una sim ilitud prom edio del 60% con los hongos (sólo del 20% con los protozoos). Infecciones parasitarias por otras larvas tisulares

Los seres hum anos pueden ser huéspedes accidentales invo­ luntarios de diversos nem atodos y cestodos que tienen ciclos vitales en otros anim ales. Los adultos de estas especies suelen residir en el tubo digestivo o en tejidos determ inados de los huéspedes definitivos; las personas se infectan m ediante la ingestión de las larvas en carne poco cocida o por la ingestión

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de huevos fértiles. D e particular preocupación en los Estados U nidos es la posibilidad de una m ayor exposición a una diver­ sidad de helm intos a través de la ingestión de peces o frutos de m ar crudos com o sushi, sashim i, salm ón lom i lomi, arenque en vinagre y sim ilares. C om o los seres hum anos no son los hués­ pedes definitivos naturales para algunos de estos parásitos, las larvas a m enudo m igran sin rum bo entre tejidos y órganos, ya sea form ando lesiones cisticercoides o áreas de inflam ación granulom atosa. Se brinda una breve descripción de las siguien­ tes enferm edades causadas p o r larvas de parásitos. N em atodos Trichinella spiralis (nem atodo intestinal de cerdos, osos, m orsa) Toxocara canis o Toxocara cati (áscaris de perros y gatos) A ncylostom a braziliense o A. caninum (uncinaria de perros y gatos) E species de A nisakis (nem atodos de peces o m am íferos m ari­ nos) G nathostom a spinigerum (nem atodo gástrico de perros y gatos) E species de Angiostrongylus (ratas) C estodos E chinococcus granulosus (tenia del perro) E chinococcus m ultilocularis (tenia de perros, zorros, lobos y gatos) Especies de M ulticeps (cenurosis) Spirom etra m ansonoides (esparganosis) (tenia D iphyllobo­ thrium de perros o gatos)

TRIQUINOSIS

L a triquinosis es una enferm edad de los carnívoros causada por la infección con el nem atodo Trichinella spiralis, que resul­ ta de la ingestión de carne cruda o poco cocida. L os seres hum anos son huéspedes accidentales y lo m ás frecuente es la infección a través de la ingestión de cerdo o sus derivados que contienen larvas enq u istad as.108 Tam bién se inform aron infec­ ciones tras la ingestión de carne de oso cocida de m anera defi­ ciente.41 El ahum ado, el salado o el desecado de la carne no destruye las form as larvarias infectantes; sin em bargo, la co n ­ gelación prolongada (en prom edio 20 días en el congelador del hogar) descontam ina la carne. La enferm edad presenta una dis­ tribución m undial; en 1968 se encontró en los Estados U nidos que el 4% de los cadáveres hum anos estaban infectados. En 1985, se inform aron m enos de 50 casos nuevos por año,41 un tributo al program a de inspección de la carne y a las leyes estrictas contra la alim entación de los cerdos con desechos no cocidos. El ciclo vital en las infecciones hum anas se inicia con la ingestión de las larvas infectantes provenientes de la carne poco cocida. El ciclo vital se ilustra en la figura 22-28. Las m anifestaciones clínicas de la triquinosis se presentan en el recuadro de correlación clínica 22-23. Diagnóstico de laboratorio. La form a m ás com ún de realizar el diagnóstico de laboratorio de la triquinosis es m ediante la de­ tección de las larvas espiraladas en el tejido m uscular (lám ina en color 22-1 IG y H). El m úsculo deltoides de la parte supe­ rior del brazo y el gastrocnem io de la pantorrilla suelen elegir­ se para la biopsia. La m uestra puede exam inarse con el m icros­ copio tras la digestión de las fibras m usculares con tripsina y

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C A P ÍT U L O 2 2

Parasitología

CICLO VITAL DE Trichinella sp ira lis

por el torrente circulatorio Las larvas penetran el revestim iento intestinal del intestino delgado, sufren 4 m udas y se convierten en adultos sexualm ente m aduros

4¡¡i

La ca rn e infectada es ingerida por: • Seres hum anos A nim ales salvajes

Las larvas se enquistan en el m úsculo estriado

:S.a

F ig u ra 2 2 -2 8 Ciclo vital de Trichinella spiralis. Cuando los seres humanos ingieren carne contam inada con triquinosis, se liberan las larvas enquistadas en el intestino y se introducen en las vellosidades. Las larvas m aduran, copulan y se convierten en parásitos adultos m achos y hem bras que miden de 2 a 4 mm de lon­ gitud. El prom edio de vida de los adultos en el intestino humano es de alrededor de un mes. Durante este tiempo, cada hem bra libera cerca de 3 000 larvas, las que viajan a través del sistema linfático, ingresan en la circulación y se depositan en los tejidos del cuerpo. Casi todas las larvas mueren; sin em bargo, muchas de las que alcanzan el m úsculo esquelético se enquistan y sobreviven. El período de mayor invasión m uscular es alrededor de los 10 días después de la infección. Entre los 17 y 20 días, estas form as larvarias se diferencian y encapsulan, y form an una espiral dos veces y m edia sobre sí mismas, rodeadas en un com ienzo por una reacción inflam atoria aguda y más tarde por una reacción crónica granulomatosa. (Lám ina en color 20-1 IG y H). Las fibras m usculares adyacentes se degeneran, lo que deja un quiste que m ide entre 0,25 m m y 0,50 mm. En cerca de 3 meses los parásitos m ueren y las lesiones quísticas sufren un proceso de calcificación que se com pleta en 6 a 12 meses.

realizando el m ontaje de parte del tejido digerido sobre un por­ taobjetos. En form a alternativa puede efectuarse la preparación presionando un fragm ento pequeño de m úsculo con una gota de solución fisiológica entre dos portaobjetos; en cualquiera de los casos se buscan con el m icroscopio las form as larvarias enrolladas. Las form as lineales o espiraladas de las larvas tam ­ bién pueden observarse en cortes de tejidos teñidos, aunque su m orfología no suele estar bien delineada. Las pruebas serológicas tam bién son útiles para realizar el diagnóstico. M ahannop y co is.,175 m ediante el em pleo de antí­ genos crudos obtenidos del estadio larvario infectante de

Trichinella spiralis en un sistem a de ELISA para la detección de anticuerpos séricos de la clase IgG contra T. spiralis, infor­ m aron una sensibilidad del 100% en un grupo de pacientes con triquinosis confirm ada. Estos autores hallaron reacciones cru­ zadas en los sueros de pacientes con capilariasis, gnatostom iasis, opistorquiasis y estrongiloidiasis.

LARVA MIGRANS VISCERAL

Toxocara canis, el nem atodo intestinal del perro, con un ciclo vital sim ilar al de A scaris lum bricoides hum ano, es la

P a rá s ito s d e la s a n g re y los te jid o s

R E C U A D R O DE C O R R E LA C IÓ N C LÍN IC A 22-23 Triquinosis En la m ayoría de los casos, los síntom as son leves, ya que la cantidad de larvas suele ser pequeña. M uchos individuos presentan síntomas gri­ pales. El núm ero mínimo de larvas ingeridas para producir síntom as es de alrededor de 100 y una dosis m ortal se estim a en 300 000.,os Con la ingestión de carne contam inada, los primeros síntomas en aparecer son los gastrointestinales, com o náuseas, diarrea y cólicos abdominales, lo que sugiere una intoxicación aguda por alimentos. Estos síntom as pue­ den persistir con grados variables de intensidad durante 10 semanas. Durante el estadio de invasión larvaria puede haber dolor, tumefacción y debilidad de los músculos afectados, acom pañados por fiebre. La eosi­ nofilia en sangre periférica, con recuentos diferenciales que alcanzan hasta el 50% , se observa durante el estadio de invasión muscular. El edem a periorbitario es un signo diagnóstico, ya que los m úsculos extraoculares suelen estar afectados. El daño a los m úsculos puede ocasionar trastornos para masticar, deglutir y respirar según los músculos afecta­ dos y el grado de com prom iso. Entre el 10% y el 20% de los pacientes presentan síntom as del SNC en grados variables, com o polineuritis, m iastenia grave o paresia de grupos m usculares localizados. La m iocar­ ditis aguda es la com plicación más grave, que puede causar la muerte en casos en que la cantidad de parásitos es importante. Watt y cois.277 hicie­ ron una evaluación de los fárm acos antiparasitarios eficaces para la m io­ sitis por Trichinella. El tratam iento recom endado es m ebendazol, en dosis de 200-400 mg tres veces por día durante 3 a 5 días

causa m ás frecuente de larva m igrans hum ana. La larva m i­ grans es una enferm edad en la cual las larvas de nem atodos de anim ales inferiores m igran en los tejidos de los seres hum anos sin el desarrollo ulterior. Puede estar causada por diferentes especies de parásitos y afectar tejido cutáneo o visceral, según las áreas del cuerpo afectadas y los parásitos im plicados. En la infección por T. canis, los seres hum anos se convierten en un huésped accidental a través de la ingestión de huevos em brionados presentes en el suelo. L a enferm edad es m ás fre­ cuente en los niños por la ingestión inadvertida de tierra y su estrecha relación con los perros. Los huevos em brionados eclo­ sionan en el intestino del huésped hum ano, liberan las larvas, las que a su vez penetran la pared intestinal e ingresan en la cir­ culación. Sin em bargo, com o los seres hum anos son huéspedes anorm ales, el ciclo pulm onar no se com pleta; en cam bio, las larvas quedan retenidas en diversos órganos, en especial el hígado. Pueden causar reacciones tisulares locales o granulo­ m as, pero por últim o m ueren sin secuelas. L a infección puede sospecharse en un niño con hepatom egalia, enferm edad pul­ m onar inespecífica y un grado elevado de eosinofilia en sangre periférica que puede llegar al 50-90% . A unque el diagnóstico definitivo sólo se confirm a por la identificación de larvas en m uestras de autopsia o biopsia, se recom ienda la com probación serológica para dirigir la terapéu­ tica. Los títulos en suero de 1:32 o m ayores son indicativos de larva migrans visceral; un título de 1:8 se considera diagnósti­ co de larva m igrans ocular. La detección de títulos elevados en m uestras de líquido ocular es confirm atoria de esta últim a enferm edad. Buijs y cois.24 com unicaron que la seroprevalen­ cia de Toxocara en los niños pequeños en edad escolar en H olanda a partir de 1994 era del 11% en La H aya y del 6% en Rotterdam . E ncontraron una correlación significativa de asm a recu rren te y bronquitis en los niños se ropositivos para Toxocara y especularon que el aum ento de la IgE específica

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para el alergeno en estos pacientes puede ser el determ inante del asma. Jacquier y co is.145 evaluaron un equipo de ELISA co m ercializad o p o r B io k em a-A ffin ity P roducts (C rissierLausanne, Suiza), que se basa en la detección de antígeno excretor/secretor proveniente de las larvas de segundo estadio de T. canis. En un estudio de 1 000 m uestras de suero recogi­ das al azar de donantes de sangre sanos y niños de Suiza, la seroprevalencia de toxocariasis fue del 2,7% . D e las m uestras positivas, el equipo de B iokem a m ostró una sensibilidad diag­ nóstica global del 91% y una especificidad del 86%. La m enor especificidad se debió a la reactividad cruzada con filariasis, estrongiloidiasis e infección por Trichinella. En la interpreta­ ción de los resultados serológicos se debe recordar que un p o r­ centaje pequeño de la población estadounidense, estim ada en el 2%, puede tener títulos residuales bajos por alguna infección anterior.

LARVA MIGRANS CUTÁNEA - TOXOCARA

Las larvas filariform es de las uncinarias del perro o del gato, por lo general de las especies A ncylostom a braziliense y A. caninum , pueden penetrar la piel expuesta de los seres hu m a­ nos y causar un trastorno popular y pruriginoso conocido com o “erupción reptante” . Las larvas penetran en la profundidad del tejido subcutáneo y producen trayectos lineales que se extien­ den varios m ilím etros por día. Las principales m anifestaciones clínicas locales de las infecciones cutáneas son el im pétigo, las reacciones alérgicas vesiculares y el prurito intenso, que p er­ sisten por períodos prolongados. La m igración a los tejidos profundos puede conducir a infecciones pulm onares. Las infec­ ciones por especies de A ncylostom a deben incluirse en el diag­ nóstico diferencial cuando se detecta eosinofilia en sangre p eri­ férica y cristales de C harcot-L eyden en la m icroscopia de las m uestras de esputo. El diagnóstico se realiza por los antece­ dentes de exposición y la presencia de trayectos lineales sub­ cutáneos. Trem blay y cois.266 describieron un brote de larva m igrans cutánea en un gran porcentaje de un grupo de 140 turistas en Barbados. Los factores de riesgo fueron la edad m ás joven, el uso infrecuente de calzado protector y cam inar con los pies desnudos por la playa. Las biopsias de lesiones sospechosas a m enudo suelen ser de escasa ayuda para establecer el diagnóstico, ya que sólo m ues­ tran un infiltrado celular eosinófilo. Y am asaki y cois.299 han desarrollado un antígeno recom binante de Toxocara canis que resultó altam ente específico para toxocariasis, lo que propor­ ciona un procedim iento diagnóstico fiable en los ám bitos donde se dispone de este m étodo. C am ous28 inform ó el trata­ m iento satisfactorio de esta enferm edad con una única dosis de 400 m g de albendazol por vía oral (tasa de curación, 46-100% ) o una única dosis de 12 m g de iverm ectina (tasa de curación, 81-100% ).

ANISAKIASIS

La anisakiasis es una enferm edad zoonótica en la que los seres hum anos, a través de la ingestión de peces o frutos de m ar crudos, ahum ados o en vinagre com o sushi, sashim i, salm ón lom i lomi, arenque en vinagre y sim ilares, se convierten en huéspedes accidentales para las larvas de nem atodos que p erte­ necen a los géneros A nisakis, P hocanem a y Contracaecum . El núm ero de infecciones en los Estados U nidos ha aum entado a m edida que se hizo más popular la com ida con pescado crudo com o los nom brados. D eardorff y K ent68 inform aron que sólo el salm ón del Pacífico (Rey o C heenok) estaba infectado; el

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C A P ÍT U L O 2 2

Parasitología

salm ón del A tlántico estaba libre de infección. Por lo tanto, el conocim iento del origen del pescado fresco puede ayudar a evi­ tar las infecciones. A l ingresar en el estóm ago con la carne de pescado conta­ m inada, las larvas penetran en la pared intestinal, form an túne­ les pequeños y hurgan entre una densa reacción inflam atoria granulom atosa. En algunos casos se identifican úlceras de la m ucosa. En el transcurso de las 24 horas de la ingestión del pescado contam inado pueden presentarse náuseas y vóm itos. L as m anifestaciones tardías com prenden dolor abdom inal alto, periódico y agudo, y diarrea, que sim ulan gastritis, úlcera duo­ denal o, en oportunidades, apendicitis aguda. D aschner y cois.52 inform aron m anifestaciones alérgicas de hipersensibilidad en una serie de 40 pacientes con anisakiasis. Los síntom as frecuentes de presentación son urticaria, angioedem a, eritem a, broncoespasm os y grados variables de anafilaxia. LopezSerrano y co is.169 publicaron 22 casos m ás de pacientes con anisakiasis gastroalérgica. D os o más parásitos se detectaron por gastroscopia en tres de estos pacientes. M oneo y co is.186 dem ostraron que estas reacciones alérgicas se debían a un poderoso alergeno (Ani S I ) producido en la glándula excreto­ ra del parásito adulto A nisakis sim plex. C om o estos síntom as a m enudo son m ás tardíos, el diagnóstico de anisakiasis puede ser difícil, pero debe considerarse, en especial si hay antece­ dentes clínicos de ingestión de pescado crudo o deficientem en­ te cocido. En ocasiones, la larvas de A nisakiasis m igran m ás allá del estóm ago y producen infecciones m etastásicas en el epiplón, el hígado, el páncreas y los pulm ones.233 Ikeda y co is.142 com unicaron el tratam iento exitoso de nueve pacientes con ani­ sakiasis gástrica m ediante la elim inación de las larvas del pará­ sito causal por endoscopia, lo cual alivió de inm ediato el dolor abdom inal agudo. L a extirpación quirúrgica del granulom a parasitario, la adm inistración de tiabendazol, en dosis de 25 m g/kg tres veces por día durante 3 días o am bos es la terapéu­ tica recom endada. Yaquihashi y cois.301 inform aron el diagnóstico exitoso de anisakiasis con un m icroanálisis inm unosorbente ligado a enzi­ m as, con anticuerpos m onoclonales dirigidos contra larvas específicas de A. sim plex. Sin em bargo, este enfoque está lim i­ tado a algunos laboratorios de investigación o de referencia, ya que hasta ahora no se cuenta con reactivos com erciales.

GNATOSTOMIASIS

G nathostom a spinigerum es un nem atodo que norm alm ente infecta el aparato digestivo de gatos y perros; no obstante, los seres hum anos se convierten en huéspedes accidentales por la ingestión de m ariscos poco cocidos o en vinagre que contienen las form as larvarias inm aduras. La enferm edad es endém ica en gatos y perros en el Lejano O riente. Tras la ingestión del pez contam inado por un perro o un gato, las larvas liberadas evolu­ cionan en el estóm ago o la pared intestinal en adultos que que­ dan encerrados en nodulos inflam atorios granulom atosos. Sin em bargo, en los seres hum anos las larvas no m aduran; en cam ­ bio, penetran la pared gástrica y m igran por los tejidos. Se fo r­ m an túneles cutáneos o subcutáneos profundos que sim ulan la larva m igrans cutánea, o pueden aparecer tum efacciones duras y dolorosas, no depresibles. H ira y co is.133 com unicaron el caso de un residente tailandés que vivía en K uw ait que presentó d o ­ lor agudo en la fosa ilíaca derecha. Se le extirpó una m asa del íleon term inal y del ciego que reveló parásitos m achos inm a­ duros de G. spinigerum . H ace poco, G robusch y co is.113 publi­ caron un caso de granulom a cutáneo del brazo de una m ujer de B angladesh que vivía en A lem ania. Tam bién se observó eosi­

nofilia m arcada y aum ento m anifiesto de IgE. El diagnóstico se realizó con la dem ostración de anticuerpos séricos específicos contra G nathostom a m ediante el em pleo de la técnica de enzi­ m oinm unoanálisis.

ANGIOESTRONGILIASIS

L a angioestrongiliasis está causada por las larvas de los nem atodos que en su estadio adulto viven en ratas com o su huésped definitivo. La enferm edad se presenta en los seres hum anos en dos form as clínicas, de acuerdo con la especie: A. cantonensis, endém ico de Tailandia, Tahití y Taiwán entre otras regiones del sur del Pacífico, causa un síndrom e de m eningitis, pleocitosis eosinófila en L C R y eosinofilia en sangre periférica (conocida com o m eningitis eosinofílica). A. costaricensis, el p arásito pulm onar de la rata, endém ico sobre todo en C osta Rica, con casos tam bién inform ados en M éxico y en A m érica Central y del Sur, causa enferm edad abdom inal, en especial en la parte distal del intestino delgado y el colon ascendente, los sitios de penetración de las larvas en desarrollo. L a hem bra adulta produce huevos en el sitio de infección en el pulm ón de la rata, que son deglutidos y elim inados por las heces. Las babosas, los caracoles de tierra y otros m oluscos (con m enor frecuencia tam bién los langostinos de agua dulce, los cangrejos de tierra y las ranas) ingieren estos huevos y ac­ túan com o huésped interm ediario dentro de los cuales se d esa­ rrolla la larva infectante del tercer estadio. Los seres hum anos adquieren la infección m ediante la ingestión de alim entos, por lo general vegetales de hojas, contam inados con caracoles y babosas infectados. Tras la ingestión por los seres hum anos, las larvas m igran al cerebro y causan la m eningitis eosinofílica. Los síntom as varían desde cefalea leve, rigidez de cuello y debilidad hasta los síntom as típicos que incluyen náuseas, vóm itos, erupción cutánea pruriginosa y diversos síntom as neurológicos, com o parestesias, parálisis del cuarto y el sexto par craneal e infecciones con gran cantidad de parásitos, com a y m uerte. W itoonpanich y cois.291 inform aron dos casos m ortales de tres pacientes infectados de una fam ilia. Dos días después de la ingestión de caracoles del género Pila, apareció una erupción m aculopapular generalizada y pruriginosa en los tres pacientes, seguida de m ialgias, parestesia acentuada, fiebre y cefalea. Dos de los pacientes m anifestaron debilidad en los m iem bros, retención de orina y obnubilación que progresó al com a con un desenlace m ortal. La autopsia reveló trayectos y cavidades m últiples con la presencia de A. cantonensis en el cerebro y en varios niveles de la m édula espinal. En el huésped norm al, la rata, los parásitos adultos de A. co s­ taricensis ocupan las arterias y las arteriolas de la porción ileocecal del intestino. Los huevos depositados en el tejido de la rata eclosionan y se elim inan por las heces. Las babosas tam ­ bién actúan com o huéspedes interm ediarios y los seres hum a­ nos se infectan por la ingestión de alim entos contam inados por ellas. Las larvas penetran los tejidos en la porción ileocecal del intestino hum ano, incluso el apéndice, donde una com binación de parásitos adultos y huevos depositados causa una reacción in­ flam atoria granulom atosa intensa que da por resultado la for­ m ación de una m asa sim ilar a un tumor. H ulbert y co is.141 infor­ m aron dos casos de infecciones por A. costaricensis en niños adquiridas dentro de los E stados U nidos. Un paciente presentó síntom as sugestivos de apendicitis aguda; el otro, un posible divertículo de M eckel. El diagnóstico suele hacerse en pacientes de áreas endém i­ cas sobre la base de los síntom as descritos ju n to con el aum en­

P a rá s ito s d e la s a n g re y los te jid o s

to de eosinófilos en el líquido cefalorraquídeo y la sangre peri­ férica. Las larvas o los parásitos adultos jóvenes pueden aislar­ le en el LCR. El aum ento del título de anticuerpos por ELISA , en especial cuando se encuentra en suero y LCR, tam bién puede ayudar al diagnóstico.301

HIDATIDOSIS (ENFERMEDAD HIDATÍDICA 0 EQUINOCOCOSIS)

La hidatidosis es quizás una de las enferm edades parasitarias m ás difíciles de com prender por las lesiones quísticas peculia­ res que se form an cuando los estadios larvarios del parásito invaden las visceras. Pueden encontrarse dos especies con cier­ ta m orfología y patrones de com portam iento algo diferentes: Echinococcus granulosas y Echinococcus m ultilocularis. Los seres hum anos actúan com o huéspedes accidentales para am bas especies. El ciclo vital norm al de E. granulosus abarca perros o zorros com o huéspedes definitivos, en cuyos intestinos residen las tenias adultas. M iden cerca de 3-6 m m de longitud y tienen tres proglótides y un escólex arm ado con una doble corona de ganchos (lám ina en color 22-1 IF). Las ovejas, las vacas o los cerdos actúan com o huéspedes interm ediarios en los que se desarrolla la enferm edad quística larvaria, descrita más adelan­ te. Echinococcus m ultilocularis difiere en que los huéspedes definitivos son perros, zorros, lobos y gatos, m ientras que los huéspedes interm ediarios son pequeños roedores, com o ardillas y ratones de cam po. Si los seres hum anos se infectan, tam bién son huéspedes interm ediarios que albergan la form a larvaria del parásito. El ciclo vital se ilustra en la figura 22-29. Los quistes de E. granulosus crecen con lentitud y suelen perm anecer inactivos durante m uchos años. Sólo en raras opor­ tunidades se rom pen, a veces en la vía biliar y otras a través de la cápsula hepática en la cavidad peritoneal. Si el quiste se rom pe, ya sea de m odo espontáneo o durante la cirugía, el peli­ gro de m uerte por shock anafiláctico es elevado. En casi todos los órganos pueden form arse lesiones quísticas m etastásicas si el quiste prim ario se rom pe. Si el m aterial del quiste se dise­ m ina al revestim iento peritoneal puede haber una proliferación m asiva con invasión vascular y disem inación a otros órganos. En ocasiones, pueden hallarse quistes cerebrales. Los quistes de E. m ultilocularis crecen con m ás rapidez, con invasión del parénquim a hepático que sim ula un carcinom a. En la lám ina en color 22-1 IB y C se ilustran ejem plos de quistes hidatídicos. Diagnóstico de laboratorio. El diagnóstico de laboratorio puede realizarse m ediante la dem ostración de los quistes hijos o las cápsulas prolígeras con protoescólices en el tejido extirpado por cirugía. El revestim iento interno del quiste es la m em brana germ inativa de la cual se form an num erosos em briones hijos. E stas form as son estructuras polipoides dim inutas (cápsulas prolígeras) que recubren la m em brana reproductiva interna a partir de la cual se producen grandes cantidades de quistes hijos (arenilla hidatídica) (lám ina en color 22-1 ID ). Cuando los em briones se liberan de la m em brana y flotan en el líquido dentro del quiste, se conocen com o arenilla hidatídica (lám i­ n a en color 22-1 IE). Si se exam ina con el m icroscopio, cada grano de arena es, de hecho, un em brión dim inuto que repre­ senta el com ienzo de una tenia nueva com pleta, con el escólex invertido y el rostelo arm ado con ganchos (lám ina en color 2211H). Varias técnicas inm unodiagnósticas perm iten confirm ar el diagnóstico clínico. En 1992 G ottstein107 realizó una revisión global de los enfoques m olecular e inm unológico para el diag­ nóstico de la enferm edad hidatídica. Casi todas las técnicas inm unodiagnósticas im plican la detección de anticuerpos espe­ cíficos para E chinococcus en el suero de pacientes en los que

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se sospecha la enferm edad m ediante una diversidad de antíge­ nos crudos. El problem a con los m étodos que em plean este tipo de antígenos es la reactividad serológica cruzada de las pruebas para anticuerpos contra la hidatidosis con otras enferm edades parasitarias, cirrosis hepática y colagenopatías. Los problem as con la reactiv id ad cru zad a se han m ejo rad o de m odo sustan­ cial con el desarrollo de un antígeno seleccionado conocido com o arco 5. E n un estu d io rea liza d o p o r S ch an tz y M cA uley,238 se observó que un porcentaje elevado de personas positivas para el arco 5 con posterioridad albergaban quistes hidatídicos. Se dem ostró reactividad cruzada del antígeno del arco 5 en sueros de pacientes con cisticercosis; sin em bargo, en estos casos el diagnóstico diferencial se realiza por la clínica. V erastegui y cois.271 brindan un análisis de inm unoelectrotransferencia ligado a enzim a para el diagnóstico de la enfer­ m edad hidatídica que sortea el problem a de la reactividad cru­ zada con la cisticercosis. El antígeno, preparado del líquido hidatídico bovino liofilizado, contiene tres bandas de 8 ,1 6 y 21 kD a, que reaccionan de m odo cruzado en sólo el 12,4% y el 4% , respectivam ente, de los sueros provenientes de pacientes con cisticercosis, una reducción significativa respecto de la m ayor parte de los m étodos de ELISA . L os enzim oinm unoa­ nálisis m ás nuevos proveen sensibilidad y especificidad m ayo­ res del 90% para la detección de anticuerpos específicos contra E chinococcus. M ediante el procedim iento de ELISA , Poretti y cois.219 dem ostraron sensibilidad del 91% y especificidad del 82% para detectar antígeno específico de E. granulosus en el análisis directo de líquido de quiste, lo que provee una discri­ m inación del 99% entre casos seropositivos de hidatidosis e infecciones parasitarias no causados p o r cestodos o procesos m alignos. H elbig y co is.126 pudieron diferenciar entre enferm e­ dad quística y alveolar con un análisis que utiliza antígenos lar­ varios recom binantes que resultaron m ás específicos que las im ágenes radiológicas. L a evolución de la PCR ju n to con la producción de sondas de D N A específicas resultan m uy pro­ m isorias en el diagnóstico de la hidatidosis, en especial en la detección del antígeno específico en m aterial de biopsia obte­ nido con aguja fina de las lesiones sospechosas.107

ESPECIES DE MULTICEPS- CENUROSIS

La cenurosis es otra enferm edad hum ana relacionada con una tenia del perro, un cestodo del género M ulticeps, en el que los huéspedes interm ediarios norm ales son los ovinos, los bovinos, los equinos y otros anim ales herbívoros. Los seres hum anos se infectan m ediante la ingestión de alim entos o agua contam inados con heces de perro que contienen huevos de M ulticeps', en ellos, la enferm edad afecta sobre todo el sistem a nervioso central, donde las larvas que m igran evolucionan a quistes sim ilares a los de la hidatidosis conocidos com o cenuros, de los que difieren por presentar m últiples escólices pero sin cápsulas prolígeras ni quistes hijos. Los síntom as suelen ser los de una lesión ocupante y consisten en cefalea, vóm itos y síntom as neurológicos localizados, com o hem iplejía, paraplejía , afasia y convulsiones. L a aracnoiditis basal que conduce al síndrom e de la fosa posterior y la hidrocefalia interna tam bién son síntom as de presentación. El diagnóstico suele realizarse tras la extirpación quirúrgica del quiste y el reconocim iento histológico de los cenuros.

ESPARGANOSIS: SPIROMETRA MANSONOIDES

Los perros y los gatos actúan com o los huéspedes definitivos para diversas especies de tenias difilobotroides pertenecientes

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C A P ÍT U L O 2 2

Parasitología

CICLO VITAL DE E ch inoco ccu s g ranulosus, E ch in o co ccu s m u ltilocularis

El protoescólex ingerido se evagina en el intestino del perro y fo rm a el parásito adulto

Los parásitos adultos m aduran en el intestino

El quiste hidatídico o los protoescólices desprendidos son ingeridos p or el perro P ER RO

H uevos o proglótides en las heces

D esarrollo en quiste hidatídico infectante (larvas) H U E S P E D IN TE R M E D IA R IO O veja E m briones tra n sp o rta d o s por el torrente circulatorio a los tejidos (hígado, pulm ón, cerebro)

H uevos ingeridos por la oveja

Q uistes hídatídicos form ados en hígado, pulm ón y cerebro

Los huevos eclosionan y los em briones liberados penetran en el intestino E m briones tran sp o rta d o s por el torrente H uevos ingeridos circulatorio a los tejidos por los seres hum anos (hígado, pulm ón, cerebro) H U É SP ED AC C ID E N TA L S eres hum anos

F ig u ra 2 2 -2 9 Ciclo vital de Echinococcus granulosus. Los huevos, ya sean solos o dentro de los proglótides, que se asemejan a los de las especies de Taenia, se elim inan por las heces del perro y se embrionan en el suelo. En circunstancias normales estos huevos son ingeridos por los huéspedes intermediarios naturales (ovi­ nos, bovinos o porcinos) o por roedores pequeños m encionados en el texto en el caso de E. multilocularis. En el intestino de los huéspedes interm ediarios los hue­ vos eclosionan y liberan el em brión hexacanto, que por medio de sus ganchos atraviesan la pared del intestino e ingresan en la circulación. Los em briones circulantes son retenidos en los capilares de diversos órganos, por lo general el hígado, ya que es el primer órgano en drenar la sangre mesentérica. Echinococcus granulosus produce un quiste único con m últiples capas a partir de las cuales pueden formarse pequeños quistes denom inados vesículas (lám ina en color 22-1 IB). Los quistes de E. multilocularis, com o su nombre lo indica, presentan numerosas cavidades. En algunos casos pueden verse quistes múltiples de hasta 5 cm de diám etro, que se asem ejan a lo que A ristóteles denominó granizo (lám ina en color 22-1 IC). Los seres humanos también pueden convertirse en hués­ ped intermediario por la ingestión de huevos de Echinococcus, cuyas larvas también pueden migrar a varios órganos, en especial hígado, pulmón y cerebro, y m adu­ ran en lesiones cisticercoides. El ciclo vital se com pleta cuando un perro, zorro u otro carnívoro relacionado, come visceras infectadas del huésped intermediario.

al género Spirom etra. Los huevos de este parásito con elim ina­ dos por las heces de perros o gatos al agua dulce donde eclo­ sionan y son ingeridos por crustáceos dim inutos del género Cyclops, dentro de los cuales evolucionan a larvas procercoides. A su vez, éstas m aduran en la carne de un segundo hués­ ped interm ediario (peces, serpientes, ranas) que se alim entan de Cyclops com o larvas plerocercoides, cada una de las cuales recibe el nom bre de espargano. Los seres hum anos se infectan ya sea por la ingestión de C yclops infectado, por com er la carne cruda infectada del segundo huésped interm ediario o por

la práctica de ciertas culturas de aplicar pescados crudos a la piel, los ojos o la vagina para curar otras enferm edades. U na vez ingeridos, los esparganos penetran la pared intestinal e ingresan en la circulación. Casi todas las lesiones en los seres hum anos son subcutá­ neas, donde se form an nodulos edem atosos de crecim iento lento, dolorosos y rojos. E l diagnóstico definitivo se realiza sólo después de extirpar el espargano e identificar el parásito blanco delgado y delicado que m ide 60-80 x 1-2 m m de ancho. Esparaganos aberrantes se han observado en la parte externa

Diagnóstico serológico de las infecciones parasitarias

del ojo, donde la tum efacción edem atosa del párpado sim ula el signo de R om aña (enferm edad de Chagas); en los vasos linfá­ ticos, donde causan tum efacciones sim ilares a la elefantiasis, y en el cerebro, en la form a de abscesos cerebrales.

Diagnóstico serológico de las infecciones parasitarias El enfoque serológico de la evaluación de las enferm edades parasitarias es m ás aplicable cuando para establecer el diag­ nóstico se requieren técnicas invasivas distintas del exam en habitual de sangre, heces u otros líquidos corporales. P or ejem ­ plo, las form as parasitarias infectantes de toxoplasm osis, am e­ biasis extraintestinal, triquinosis y cisticercosis a m enudo se alojan en la profundidad de tejidos y órganos, y para confirm ar el diagnóstico se necesitan biopsias por aspiración con aguja fina o a cielo abierto. En estos casos, el diagnóstico serológico puede ser posible si se consideran probables problem as, com o lo determ ina G arcía:96 1. C iertos parásitos que pasan a través de varias fases del desa­ rrollo pueden no proporcionar estím ulos antigénicos cons­ tantes o continuos suficientes para desencadenar la form a­ ción de anticuerpos. 2. En casos específicos pueden faltar las respuestas de anti­ cuerpos, ya sea porque hay un estím ulo antigénico lim itado o porque no está presente en el sistem a de prueba. 3. Los antígenos utilizados en los estudios a m enudo son m ez­ clas heterogéneas o extractos de form as parasitarias mal definidos. E stas preparaciones antigénicas pueden m ostrar reactividad cruzada o sensibilidad inadecuada, lo que difi­ culta la interpretación. 4. L os pacientes que viven en áreas endém icas pueden tener títulos de anticuerpos basales m ás elevados que los de áreas no endém icas; por lo tanto, si es posible, deben determ inar­ se los cam bios del título. 5. L os equipos de prueba fiables para el uso diagnóstico gene­ ral a m enudo no los proveen fuentes com erciales. Aun cuando estén disponibles, la incidencia de la enferm edad parasitaria suele ser tan baja en la m ayoría de los laborato­ rios que los reactivos se vencen sin ser utilizados. A dem ás, estas pruebas pueden ser efectuadas por personal de labo­ ratorio que sólo pocas veces se siente capacitado para inter­ pretarlas. Varias de las aplicaciones de la detección de anticuerpos y antígenos proporcionadas en la revisión de G arcía están refle­ ja d as en este libro en secciones cortas incluidas dentro de la descripción de cada parásito. H em os elegido incluirlas en cada sección en lugar de hacer una presentación única aquí. M uchos de los detalles de los diversos m étodos em pleados en la actua­ lidad en los laboratorios de investigación exceden el alcance de este texto. C om o el volum en de enferm edades parasitarias encontradas en la m ayoría de los ám bitos de la práctica en los Estados U nidos es bajo o inexistente, la realización de las prue­ bas serológicas es poco práctica en los laboratorios de m icro­ biología diagnóstica. En la m ayoría de los casos, las m uestras se envían a los laboratorios de referencia local y regional, incluso a los diversos laboratorios de salud pública estatal. Cada laboratorio de la referencia tendrá en funcionam iento téc­ nicas consagradas por la tradición y otras m ás nuevas que son exclusivas para ese laboratorio y es necesario consultar para inform arse sobre cuál es su aplicación y los tipos de m uestras requeridas que correspondan. L os procedim ientos para la

R ecuadro 2 2 -7

1263

P ruebas serológ icas realizadas en los C enters fo r D isease Control

Enferm edad

Prueba

Títulos diagnósticos

Tripanosomiasis africana Am ebiasis Ascariasis Enferm edad de Chagas Cisticercosis Hidatidosis Fascioliasis Filariasis Leishm aniasis Paludism o Paragonimiasis Neumocistosis Esquistosom iasis Estrongiloidiasis Toxocariasis Toxoplasmosis Triquinosis

IFA IHA ELISA FC. IHA IHA IHA IHA IHA IFI IFI FC IFI IFI IHA ELISA IH . IFI-IgM Floc. de la bentonita

> > > > 2 > 2 2 > 2 2 2 2 > > >

1:16 1:256 1:32 1:8; 1:64 1:64 1:256 1:128 1:128 1:16 1:64 1:8 1:16 1:16 1:64 1:32 1:256; 1:16 1:16

detección de antígenos y anticuerpos para las enferm edades parasitarias m ás frecuentes pueden encontrarse en el capítulo 22 de la edición actual del texto de G arcía.96 El recuadro 22-7 es la lista de las pruebas serológicas realizadas en los CD C para diversas enferm edades parasitarias, ju n to con los títulos consi­ derados im portantes desde el punto de vista diagnóstico, com o lo publicaron originalm ente W alls y Sm ith.274 La m ayoría de los adelantos en el diagnóstico de la parasito­ logía clínica en los últimos cinco años implican la introducción de técnicas serológicas nuevas para la detección de anticuerpos y antígenos en sangre y otros líquidos y secreciones. Los enzi­ moinm unoanálisis (EIA), las pruebas de inhibición de la hemaglutinación indirecta (IHA), las pruebas de inm unofluorescencia indirecta y directa, y la fijación del com plem ento constituyen el espectro de los procedim ientos utilizados en los laboratorios de parasitología clínica y de referencia. L a aplicación de la b io­ logía m olecular en el diagnóstico parasitológico o el uso de la cita corta de Persing208 “desde las trincheras a la m esa de tra­ bajo”, es una evolución atractiva que surge de los laboratorios de investigación. Sin em bargo, com o lo señala W eiss,283 el entusiasm o debe ser atenuado por ciertas realidades. Varias de las pruebas m ole­ culares nuevas para el diagnóstico de enferm edades parasita­ rias se han incluido en este libro com o segm entos cortos en las secciones sobre diagnóstico de laboratorio de los diversos pará­ sitos descritos antes. Estas citas se centran en el trabajo que se están realizando en laboratorios de investigación; sin em bargo, com o lo señala ese autor, m uy pocas de estas técnicas han sido som etidas a estudios de cam po o a evaluaciones clínicas en gran escala. Las aplicaciones prácticas de la PC R pueden citar­ se com o ejem plo. E sta técnica proporciona un gran aum ento en la sensibilidad y especificidad de los estudios con sondas de D NA, lo que resulta del aum ento de señales producidas por las m iles de replicaciones de determ inadas secuencias repetitivas de D NA específicas de especie. E sto brinda la posibilidad de identificar de m anera rápida y directa determ inados antígenos en m uy bajas concentraciones o en cantidades ínfim as en m uestras clínicas. N o obstante, en la actualidad la PCR sólo

1264

CAPÍTULO 22 Parasitología

C uadro 2 2-1 FÁRMACO

Fárm acos utilizados con frecuencia en el tratamiento de las infecciones parasitarias TIPO DE AGENTE

MODO DE ACCIÓN

COMENTARIOS

A nfotericina B

M acrólido poliénico

Aum enta la perm eabilidad de la m em brana celular, lo que conduce a una pérdida por fuga, primero de iones y luego de otros com ponentes celulares. La unión se efectúa por los esteróles de la membrana

Las células de m am íferos tam bién pueden ser afectadas con varios efectos colaterales. U tilizada en el tratam iento de infecciones por especies de Acanthamoeba y en casos avanza­ dos de leishmaniasis mucocutáneas

Cloroquina

4 am ino quinolina (quinina)

La concentración del fárm aco alcanzada en los eri­ trocitos parasitados por paludism o es varios cien­ tos de veces m ayor que en los eritrocitos norm a­ les. El fárm aco se une a la ferriprotoporfirina DC (FP), un producto de degradación de la he­ m oglobina presente en la vacuola alim entaria del parásito. El com plejo cloroquina-FP produce la lisis del parásito.

El pilar del tratam iento antipalúdico durante dos décadas. En cepas de P. falciparum que pue­ den secuestrar algo de FP puede haber farmacorresistencia, de m odo que no se une a la clo­ roquina. Este fárm aco no es curativo para P.

vivax

Emetina

Alcaloide (cicloheximida)

Directam ente letal para los trofozoítos de E. histoly­ tica al causar cam bios degenerativos en ellos. El fárm aco interrum pe la división celular porque inhibe de m anera irreversible la síntesis de proteí­ nas al im pedir el m ovim iento del mRNA a lo largo de la subunidad ribosóm ica 60S

Utilizada en el tratamiento de diversas am ebiasis intestinales o en abscesos hepáticos am ebianos com o alternativa al metronidazol También afecta las células de mamíferos y pro­ duce graves efectos colaterales, lo que limita su uso terapéutico

Dietilcarbam azina

Derivado de piperazina (dos nitrógenos en un anillo benceno)

Se considera que el fárm aco altera las propiedades de superficie y la m ovilización de las microfilarias y determ ina que abandonen la circulación a través de un efecto neurom uscular específico. Las m icro­ filarias quedan atrapadas en el hígado y sufren fagocitosis

Utilizada sobre todo en el tratam iento de las infecciones por filarías. El fárm aco presenta buena absorción, alcanza las concentraciones séricas máximas en el transcurso de las 3 horas y se distribuye am pliam ente por el cuerpo

Iverm ectina

Un 22,23 dihidroderivado de averm ectina B, un com plejo lactónico macrocíclico producido por

El fármaco actúa sobre los receptores para el ácido gam m a-am inobutírico (GABA) en la m usculatura del parásito. Se estim ulan las neuronas inhibidoras que causan la liberación de GABA desde las ter­ m inales presinápticas, en esencia m ediante el blo­ queo de la transm isión de la señal desde las term i­ naciones a las neuronas excitadoras. El efecto es la pérdida de la actividad locom otora del parásito, lo que hace a los parásitos norm almente m óviles muy susceptibles a las diversas defensas del huésped

El fárm aco tiene un amplio espectro de actividad contra los nematodos, pero no tiene acción sobre los trem átodos y las tenias. Se utilizó de m anera eficaz contra la oncocercosis, la larva m igrans cutánea y visceral, Angiostrongylus meningitis y diversas infecciones gastrointesti­ nales por nematodos

Streptomyces avermitilis

M ebendazol

Benzim idazol-bencina + estructura de cinco ani­ llos, que incluye tres moléculas de carbono y dos de nitrógeno

Inhibición selectiva de la captación de glucosa en los nem atodos y cestodos, lo que conduce a un aum ento de la utilización de glucógeno del parási­ to; por consiguiente, los parásitos quedan privados de sus fuentes principales de energía. Bajo la acción del fárm aco, el parásito se inm oviliza y se interrum pe in vitro el desarrollo larvario

El mebendazol es activo contra nematodos y se utiliza sobre todo para el tratam iento de tricocefalosis, ascariasis, uncinariasis y estrongiloi­ diasis. El fármaco presenta una absorción m ínim a por el tubo digestivo, por lo tanto, es m ás eficaz para el tratam iento de los parásitos intraintestinales

M elarsoprol

Arsenical (un derivado dim ercaprol del óxido de p-m elam inilfenilarsonato sódico [melarsen])

Los arsenóxidos se adhieren a los tripanosom as por enlaces covalentes; los grupos que contienen azu­ fre en el arsenóxido ejercen un efecto letal m ediante el bloqueo de grupos enzim áticos glucolíticos esenciales biológicam ente activos. Los arsenicales reaccionan con los grupos sulfhidrilos, lo que inactiva diversas enzim as sintetiza­ das por el parásito para la glucólisis

Utilizado en el tratam iento de la tripanosom iasis. El fárm aco ingresa en las células del parásito con más rapidez que en las células hum anas y, por lo tanto, es más tóxico para el parásito. Atraviesa la barrera hem atoencefálica e ingre­ sa en el líquido cefalorraquídeo, por lo que es muy eficaz para el tratam iento de la infección del SNC

(Continúa)

Diagnóstico serológico de las infecciones parasitarias

Cuadro 22-1

1265

Fárm acos utilizados con frecuencia en el tratamiento de las infecciones parasitarias (cont.)

FÁRMACO

TIPO DE AGENTE

MODO DE ACCIÓN

COMENTARIOS

M etronidazol

5-nitroim idazol

El m etronidazol se m etaboliza en derivados, incluso radicales superóxidos, que interfieren en el m eta­ bolism o del DNA de los parásitos, causan amplias roturas en las cadenas de DNA e interrumpen la estructura helicoidal. Por esto se altera la síntesis proteica del parásito

Utilizado para el tratam iento de la amebiasis inva­ siva y tam bién para infecciones por Trichomonas vaginalis y Giardia lamblia Dado que sólo el 10% del fárm aco se une a las proteínas séricas, alcanza concentraciones eleva­ das en los tejidos, incluso pulmón, bilis, hueso, hígado y cerebro, que exceden las concentracio­ nes requeridas para inhibir los organism os con­ tra los cuales es activo

N iclosam ida

Derivado de pirazinoisoquinolina heterocíclica

Se interrum pe la fosforilación oxidativa de las mitocondrias de los cestodos. El efecto sobre los pará­ sitos adultos m aduros es letal, ya que en ciertas especies induce la parálisis m uscular completa. El fárm aco induce el desprendim iento de los escólices y los parásitos se desintegran antes de ser eli­ m inados por las heces

L a niclosam ida es un fárm aco alternativo para el tratam iento de las tenias. Para el tratam iento de los parásitos Hymenolepsis la adm inistración aumenta a 5 días porque las oncosferas evolu­ cionan en las vellosidades yeyunales y las larvas cisticercoides emergen en la luz intestinal cerca de 4 días m ás tarde

Praziquantel (pirazinoquinolina)

Derivado de 8-aminoquinolina

El fárm aco actúa al aumentar la perm eabilidad de la m em brana al calcio, lo que causa contracciones y parálisis de la m usculatura de los parásitos. Los efectos neurom usculares aum entan la movilidad y la parálisis espástica, lo que causa el desprendi­ m iento y la desintegración de los parásitos en el intestino

Utilizado para el tratam iento de la esquistosom ia­ sis, la cisticercosis, las infecciones por tenias y los trem átodos hepáticos, pulm onares e intesti­ nales. El fármaco alcanza excelentes niveles terapéuticos en el hígado, la bilis y los tejidos m usculares y com o atraviesa la barrera hematoencefálica, también en el líquido cefalorraquídeo

Prim aquina

Pirim idina tetraédrica

El fármaco es gam eticida y esquizonticida para todas las especies de paludism o hum ano. Se des­ conoce su m ecanism o de acción, aunque lo más probable es que inhiba la síntesis de DNA

La prim aquina es un mal esquizonticida sanguí­ neo, pero es eficaz contra los hipnozoítos exoeritrocíticos. Por consiguiente, es eficaz para evi­ tar las recidivas por P. vivax y P. ovale. L a cura­ ción radical del paludism o puede lograrse por una com binación de cloroquina y primaquina

Pam oato de pirantelo

Ácido sulfónico de naftilam ina, un colorante polianiónico

El pirantelo (y sus análogos) actúa como un antago­ nista colinérgico y causa la despolarización de las células musculares dentro del parásito que produ­ cen contracciones irreversibles

U tilizado sobre todo para el tratam iento de infec­ ciones con áscaris, uncinarias, oxiuros y Trichostrongylus. El fárm aco es insoluble en agua y se absorbe mal por el tubo digestivo, por lo que tienen escasa toxicidad

El fárm aco inhibe la glicerol 3-fosfato oxidasa y la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa, que impide la reoxidación del nicotinam ida-adenina dinucleótido y dism inuye la síntesis de adenosintrifosfato. E sta interrupción del m etabolism o es letal para el parásito

El fárm aco se distribuye ampliam ente por el cuer­ po, porque tiene gran avidez por las proteínas de unión del suero, no atraviesa la barrera hematoencefálica. El fárm aco se utiliza para el trata­ miento de la tripanosom iasis temprana; sin embargo, com o no ingresa en el sistem a nervio­ so central, no es eficaz para el tratam iento de la enfermedad progresiva del SNC

Suram ina

Tiabendazol

Benzimidazol

M ecanism o de acción desconocido

El fárm aco se adapta bien para el tratam iento de la infección disem inada por Strongyloides y todas las form as larvarias que causan larva migrans visceral y cutánea. La mayor parte del fármaco absorbido se m etaboliza en el hígado y se excreta com o metabolitos por la orina

Estibogluconato de sodio

Un com puesto que con­ tiene antimonio

Se considera que el fármaco actúa sobre las enzimas que contienen sulfhidrilo sódico dentro del parási­ to, lo que dism inuye el flujo de glucosa en el ciclo del ácido tricarboxílico y causa la acum ulación de subproductos glucolíticos que son tóxicos para los amastigotos en desarrollo

Utilizado sobre todo para el tratamiento de la leishmaniasis. A las 2 horas de la administración intramuscular o intravenosa se alcanza la con­ centración máxima en suero y más del 90% del fárm aco se excreta en 8 horas. Sin embargo, se acumula de m odo gradual en los tejidos, lo que explica la necesidad de ciclos prolongados de tratamiento

126 6

CAPÍTULO 22

Parasitología

está al alcance de m uy pocos laboratorios de diagnóstico po r­ que es m uy costosa y por la gran exigencia técnica del m étodo. D ebe destinarse una instalación separada del laboratorio y tener gran cuidado en el m anejo de las m uestras a fin de evitar la contam inación con D N A extraño. Los costos elevados, la necesidad de una capacitación especial del personal y los requerim ientos de equipos y reactivos especiales im pedirán el uso am plio de la PC R en países en vías del desarrollo. A un así está m ás cerca que lejos el día en que los m étodos de am plifi­ cación se conviertan en procedim ientos estándares en m uchos de los laboratorios clínicos. E stas técnicas de diagnóstico directo no sólo ayudarán al diagnóstico tem prano de las enfer­ m edades parasitarias en los seres hum anos, sino que tam bién proporcionarán la oportunidad de estudiar los vectores que albergan parásitos, lo que conducirá a la prevención de enfer­ m edades parasitarias a través del control m ás eficaz del vector. L a autom atización, las leyes de m ercado, la especialización técnica y la necesidad de acortar el tiem po del procesam iento para establecer un diagnóstico de enferm edad parasitaria co n ­ tribuirán a llevar la biología m olecular “a las m esas de trabajo” .

Fármacos utilizados con frecuencia en el tratamiento de las enfermedades parasitarias L a farm acoterapia de las enferm edades parasitarias está d iri­ gida a suprim ir la capacidad invasiva de los parásitos. Las in­ fecciones que suceden sobre todo dentro del aparato digestivo se tratan m ejor con com puestos que no se absorben bien, lo que produce concentraciones elevadas del principio activo en la luz intestinal. Los agentes que se absorben bien y alcanzan co n ­ centraciones elevadas en suero y tejidos son los requeridos para el tratam iento de las enferm edades parasitarias invasivas, en especial las form as larvarias. En algunos casos de am ebiasis extraintestinal, puede requerirse la com binación con un fárm a­ co no absorbible para tratar los organism os restantes en el intestino. M uchos parásitos existen en la form a quística, en la cual los fárm acos tienen dificultad de penetrar, lo que conduce a una probable reactivación posterior de la infección. Un ejem ­ plo excelente lo constituyen las form as enquistadas e inactivas de Toxoplasma gondii, las que son resistentes a los fárm acos y propensas a reactivarse cuando se pierde la inm unidad, en especial en los pacientes con SIDA, que raras veces se curan. En el cuadro 22-1 se resum e el m odo de acción y otros atri­ butos de los fárm acos antiparasitarios utilizados con m ayor fre­ cuencia. Para una revisión com pleta de todos los fárm acos actuales, incluso los m ás recom endados y las dosis por utilizar para la m ayoría de las enferm edades parasitarias hum anas, véanse el capítulo 25 del libro de G arcía96 y la publicación de M oore.187

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CAPÍTULO 22

Parasitología

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1270

CAPÍTULO 22

Parasitología

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causadas por virus,

Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados Introducción Reseña histórica Evolución de las técnicas de cultivos celulares

Calicivirus Astrovirus Adenovirus entéricos

Coronavirus

Evolución de los servicios de diagnóstico virológico

Coltivirus

Niveles de servicio

Herpesvirus

Retrovirus

Taxonomía y nomenclatura

Virus del herpes simple

Manifestaciones clínicas de las infecciones virales

Virus de Epstein-Barr

Citomegalovirus

Virus de la varicela-zóster

Oriomixovirus

Herpesvirus humanos 6 y 7

Paramixovirus

Herpesvirus humano 8

Virus parainfluenza

Virus B

Virus de la parotiditis

Adenovirus

Virus del sarampión

Poxvirus

Virus sincitial respiratorio

Papovavirus

Otros paramixovirus

Picornavirus

Virus del papiloma Virus del polioma

Rhabdovirus

Parvovirus

Arenavirus

Virus de las hepatitis

Filovirus

Virus de la hepatitis A

Togavirus

Virus de la hepatitis B

Bunyavirus

Virus de la hepatitis C

Virus de la encefalitis de California

Virus de la hepatitis D

Hantavirus

Virus de la hepatitis E

Virus de la gastroenteritis humana Rotavirus

Enfermedades causadas por priones (encefalopatías espongiformes transmisibles)

1271

1272

CAPÍTULO 23

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Clasificación clínica de las infecciones virales Diagnóstico de las infecciones virales Obtención de muestras para el diagnóstico Transporte y conservación de las muestras Aislamiento de virus en cultivo Preparación y mantenimiento de cultivos celulares Contaminación de cultivos celulares Aspectos técnicos de los cultivos celulares Selección de cultivos celulares para el aislamiento de virus Siembra e incubación de cultivos celulares Detección de virus e identificación provisoria Efecto citopático Hemaglutinación y hemadsorción M icroscopia óptica M icroscopia electrónica Diferenciación bioquímica Asociación con las células Detección de antígenos virales Artefactos y alteraciones no causados por virus

Identificación definitiva de los aislamientos Conservación de los aislamientos virales Resumen de la detección e identificación de los virus en cultivo

Detección directa de virus en muestras clínicas

Coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave (SRAG) Otras infecciones virales

Selección de pruebas para diagnóstico rápido

Diagnóstico serológico de las infecciones virales Virus de la inmunodeficiencia humana Virus de la hepatitis B y virus de Epstein-Barr Virus de la hepatitis A Virus de la hepatitis C Parvovirus Virus del herpes simple Virus de la varicela-zóster Citomegalovirus Virus del Nilo Occidental Rubéola Coronavirus del SRAG Anticuerpos IgM Procedimientos serológicos diversos Diagnóstico de otras infecciones virales Pruebas de sensibilidad a los antivirales

Infecciones causadas por especies de Chlamydia Chlamydia trachomatis Características clínicas y epidemiología Obtención de muestras Aislamiento de Chlamydia trachomatis en cultivos celulares

Detección de cuerpos de inclusión por microscopia óptica

Detección directa de Chlamydia trachomatis en muestras clínicas

Detección de partículas virales por microscopia electrónica

Diagnóstico serológico

Detección inmunológica de antígenos virales

Otros métodos de diagnóstico

Virus respiratorios Virus del grupo herpes Otros virus

Técnicas moleculares Virus de la inmunodeficiencia humana Virus de la hepatitis C Virus de la hepatitis B Virus del papiloma humano Parvovirus B19 Virus del Nilo Occidental Virus del herpes simple Citomegalovirus Enterovirus

Diagnóstico de abuso sexual

Chlamydia psittaci Chlamydia pneumoniae

Infecciones por Rickettsia, Coxiella, Ehrlichia y Anaplasma Rickettsia y Coxiella Características clínicas y epidemiología Obtención de muestras Aislamiento de Rickettsia y Coxiella en cultivo Detección directa de antígeno y ácidos nucleicos en muestras clínicas Diagnóstico serológico

Especies de

Ehrlichia y Anaplasma

In tro d u c c ió n

Introducción El diagnóstico virológico es un agregado reciente a los ser­ vicios ofrecidos por los laboratorios de m icrobiología clínica. Se han recorrido tres etapas bien definidas a m edida que los laboratoristas han proporcionado datos objetivos a los m édicos para evaluar a los pacientes con infecciones virales.

1273

identificación definitiva de los aislam ientos, la ausencia de una terapéutica antiviral eficaz y la escasez de instalaciones para cultivos de tejidos se com binaron para lim itar la incorporación de estas pruebas al laboratorio de m icrobiología clínica. Levine ha presentado una descripción m ás detallada del desarrollo h is­ tórico de la virología.308 Evolución de los servicios de diagnóstico virológico

Reseña histórica

La prim era etapa de interés histórico abarca los años duran­ te los cuales se estableció la existencia de infecciones por par­ tículas subm icroscópicas. D urante m uchas décadas después de que Carlos Finlay adelantara la hipótesis de que la fiebre am a­ rilla era transm itida por la picadura de un m osquito, los únicos m edios disponibles para el aislam iento de agentes virales eran la inoculación de anim ales o huevos em brionados. Los huevos em brionados de gallina todavía se inoculan para la vigilancia de las infecciones causadas por el virus de la influenza A si no se cuenta con cultivos celulares. Los nuevos agentes continúan siendo descubiertos sólo por el uso de prim ates no hum anos (kuru y virus de C reutzfeldt-Jakob)171 e incluso voluntarios hum anos (agente N orw alk de la gastroenteritis infecciosa).272 Evolución de las técnicas de cultivos celulares

El siguiente gran adelanto en virología diagnóstica fue pro­ porcionado por Enders y cois., quienes dem ostraron que el virus que causaba la poliom ielitis podía ser aislado en células de origen no neurológico in vitro.143 En las décadas de 1950 y 1960 hubo u na rápida expansión del conocim iento de las carac­ terísticas clínicas, la epidem iología y el diagnóstico de las infecciones virales com unes, proporcionado en su m ayoría por la utilización m asiva de los cultivos celulares. Los esfuerzos diagnósticos, que constituyeron parte integral de los estudios clínicos, fueron incorporados a los planes de los laboratorios de investigación estatales y universitarios. El elevado costo de la

R ecuadro 23-1

El prim er paso fue la incorporación de servicios de diagnós­ tico en los laboratorios de m icrobiología clínica, m uchos de los cuales ya habían lim itado sus servicios a la bacteriología (incluida la m icobacteriología), la m icología y la parasitología. En el recuadro 23-1 se resum en algunos de los factores que facilitaron y estim ularon esta transferencia de los laboratorios de in v estig ació n de un d ep artam en to clín ico a los la b o ra to ­ rios de diagnóstico, ubicados casi siem pre en un departam ento de anatom ía patológica o de m icrobiología. En las ediciones anteriores de este libro puede consultarse una exposición más detallada de esta transición. La com plejidad y la m odernización del diagnóstico virológi­ co tradicional hicieron que la m ayoría de los laboratorios clíni­ cos capaces de asum ir este desafío se encontraran en centros m édicos im portantes, m uchos de los cuales estaban asociados con centros académ icos. En la década pasada, el ritm o de d esa­ rrollo tecnológico se ha acelerado, de m odo que ciertas pruebas de diagnóstico virológico pudieron introducirse en los hospita­ les de la com unidad. E n el recuadro 23-1 se resum en algunos de los d esarro llo s que fav o reciero n la co n cen tració n ad icio ­ nal de servicios de diagnóstico en los laboratorios clínicos, ya sea de hospitales o privados. A dem ás de los problem as cientí­ ficos, un determ inante sustancial fue la prom ulgación y entra­ da en vigor de las C LIA ’88 (Enm iendas para la m ejora del laboratorio clínico, 1988), el prim er proyecto im portante acer­ ca de la vigilancia de laboratorios desde la Ley de m ejora de laboratorios clínicos de 1967 (CLIA ’67). Los num erosos requisitos para el personal y la realización de las pruebas eran

A lg u n o s fa c to re s q u e fa c ilita n la re m is ió n d e un la b o ra to rio d e in v e s tig a c ió n a un la b o ra to rio d e d ia g n ó s tic o

Factores que prom ueven la rem isión de pruebas al laboratorio clínico

Desarrollos recientes en viro lo gía diagnóstica

Aparición de cuadros clínicos en los que el diagnóstico viral es esencial; por ejem plo, herpes sim ple en las mujeres em barazadas.

Frecuencia creciente de cuadros clínicos que dependen del diagnóstico viral; por ejemplo, aumento de la capacidad en virología de la inm unodeficien­ cia hum ana, control de infecciones en los receptores de trasplantes. Aum ento del núm ero de enfermedades para las que es posible la terapéutica antiviral, incluso la terapia de combinación. Fuentes com erciales de células sobre cubreobjetos para cultivos en frascos ampolla; desarrollo de m ezclas de células. Desplazam iento de la técnica de amplificación de ácidos nucleicos del labo­ ratorio de investigación a la clínica; disponibilidad com ercial de sistem as o reactivos validados para la amplificación. Introducción del diagnóstico sum am ente rápido por la aplicación de la PCR en tiem po real a la detección de agentes en m uestras clínicas.

D esarrollo de terapéutica antiviral. Disponibilidad de fuentes com erciales fiables de células de m am ífero para cultivo. A plicación de la técnica de anticuerpos m onoclonales al diagnóstico, con disponibilidad com ercial de reactivos fiables. Posibilidad de un diagnóstico m ás rápido por la aplicación de las técnicas de anticuerpos m onoclonales y de am plificación por centrifugación (shell

vial). Aplicación de enzim oinm unoanálisis para el diagnóstico directo. Reglam entación de los laboratorios de hospital según la CLIA '67. A poyo para la epidem iología de salud pública de las enferm edades transmisibles.

D esarrollo de inm unoanálisis sobre mem branas, que pueden realizarse en form a rápida y sencilla. Extensión de la reglam entación a todos los laboratorios, incluso los consul­ torios m édicos, según la CLIA ‘88. A poyo a la investigación de am enazas bioterroristas.

1274

CAPÍTULO 23 Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia , Rickeltsia y microorganismos relacionados

R ecuadro 2 3 -2

N iv e le s d e s e rv ic io s d e d ia g n ó s tic o

Nivel 1

No presta ningún servicio de virología. Las muestras se obtienen para el traslado a un laboratorio de referencia.

Nivel 2

Se realizan procedim ientos virológicos limitados. Estos laboratorios pueden o no tener la capacidad para detectar antígenos virales o de clamidias en las secreciones y líquidos corporales. Estos laboratorios pueden o no tener la capacidad de sem brar muestras en cultivo de tejidos para el traslado a los laboratorios de referencia.

Nivel 3

Estos laboratorios pueden aislar determ inados grupos virales que se desarrollan en los cultivos celulares norm alm ente usados. También pueden realizar la identificación lim itada de determ inados agentes para los que existen en el com ercio sistemas de transporte, de aislamiento celular y de confirm ación simple inmunológica, y envían otros aislamientos a los laboratorios de referencia.

Nivel 4

Estos laboratorios deben disponer de personal con un grado alto de especialización en virología, que pueda aislar todos los grupos virales com unes y realizar las identificaciones clínicam ente pertinentes.

Nivel 5

Laboratorios con capacidad para realizar las pruebas de am plificación m olecular com plejas, incluso la am plificación en tiempo real.

fam iliares para la m ayoría de los laboratorios clínicos, pero extraños (y m uy mal recibidos) para gran parte de los laborato­ rios de investigación, y casi fuera del alcance de los laboratorios de los consultorios m édicos. Niveles de servicio

C ada director o supervisor de laboratorio debe decidir el nivel de servicios conveniente para las necesidades clínicas locales. Es m ucho m ejor lim itar los alcances del esfuerzo a las pruebas que puedan realizarse con alta eficiencia que intentar u na cobertura am plia cuando los recursos son insuficientes. P ueden determ inarse diferentes niveles posibles de servicio, que se enum eran en el recuadro 23-2. L a m ayoría de los laboratorios de los hospitales pequeños probablem ente caen dentro de los niveles 1 o 2,454 en tanto que los laboratorios de hospitales com unitarios grandes y los labo­ ratorios universitarios pueden ofrecer servicios de nivel 3, 4 o 5. Estos hospitales tienen m ayores probabilidades de atender a pacientes que necesiten servicios de virología integrales. Es posible utilizar dichos laboratorios com o recursos de diagnós­ tico regional.

Taxonomía y nomenclatura La taxonom ía es la ciencia de clasificación sistem ática que usa reglas y principios generales; el térm ino se em plea con m ayor frecuencia para el estudio de los seres vivos. La nom en­ clatura es la actividad de atribuir nom bres a los sujetos taxonó­ m icos. M uchas infecciones virales, com o la gripe, la varicela, el saram pión y la hepatitis, se caracterizaron perfectam ente desde el punto de vista clínico m ucho antes de que se descubriera el agente etiológico. U na vez aislado, se adjudicó al virus el nom ­ bre del correspondiente cuadro clínico. En un intento de poner orden en el esquem a de clasificación, los taxonom istas han uti­ lizado los m odernos conocim ientos de estructura viral y com ­ posición antigénica para construir una clasificación sistem áti­ ca.107 Los órdenes, las fam ilias y los géneros tienen raíz latina, pero el concepto de especie ha sido m ás difícil para los virólogos.56,491 A m enudo, se utilizan los nom bres vernáculos com o designación de especie. E l Com ité Internacional de Taxonom ía de Virus (Interna­ tional Com m ittee on Taxonom y o f V iruses, ICTV ) ha propues­

to el Sistem a U niversal de T axonom ía V iral ICTV. E n el recua­ dro 23-3 se resum en las convenciones de nom enclatura viral. Los nom bres jerárq u ico s se escriben en bastardilla y pueden ser precedidos por el taxón, que no se escribe en bastardilla. En el caso del nom bre de las especies, nos encontram os con la situación p eculiar de que las m ism as palabras pueden ponerse en bastardilla o no, según form en parte de una designación taxonóm ica o se usen com o nom bre vernáculo. L a designación taxonóm ica sólo debe utilizarse una vez en una publicación cien ­ tífica. P o r ejem plo, una descripción podría referirse al virus del saram pión (virus d el saram pión, género M orbillivirus, fam ilia Param ixoviridae). Si bien en este m om ento este enfoque de la taxonom ía y de la nom enclatura parece tener preferencia, el tem a no se ha resuelto enform a definitiva. G ran parte de la taxonom ía viral deriva del conocim iento detallado de la estructura de los virus. Éstos se encuentran entre los m ás pequeños agentes infecciosos (fig. 23-1). Los poxvirus, que son los m iem bros m ás grandes de la fam ilia de los virus y que tienen un tam año sim ilar a las bacterias más pequeñas, están cerca del lím ite de resolución del m icroscopio óptico; para los otros virus se necesita un m icroscopio electrónico. Casi sin excepción, los virus contienen DNA o RNA, pero no am bos. El centro de cualquier partícula viral, el core de nucleoproteína, contiene ácido nucleico espiralado y proteí­ na.215 A lrededor del core se encuentra una cubierta protectora com puesta por unidades repetitivas denom inadas capsóm eros, que en su conjunto form an la cápside. Junto con la nucleopro­ teína, se com pleta la nucleocápside. L a arquitectura de la m ayoría de los virus tiene una sim etría que puede ser helicoi­ dal, sim ilar a la de los ácidos nucleicos, o icosaédrica, que es

R ecuadro 2 3 -3

C onvencio nes p a ra la nom enclatura de virus

Jerarquía taxonómica

Desinencia

Ejemplo

Orden Familia Subfamilia Género Especie

-virales -viridae -virinae -virus

Mononegavirales Paramyxoviridae Pneumovirinae Pneumovirus

N inguna

Virus sincitial respiratorio humano

T a xo n o m ía y n o m e n c la tu ra F ig u ra 23-1 Los virus son los agentes infecciosos más peque­ ños. En la figura se com para el tam año relativo de una bacteria, Staphylococcus, con Chlamydia , con el grupo de virus de mayor tam año (poxvirus) y con uno de los virus m ás pequeños (poliovirus, m iem bro del grupo de los enterovirus).

127 5

l____ i 0,2 pm

POXVIRUS

C U E R PO ELEM ENTAL DE C H LA M Y D IA S TA P H Y LO C O C C U S

& '# • m H E R PE SV IR U S

la estructura de una cúpula geodésica. Estas dos sim etrías, ilus­ tradas en la figura 23-2, proporcionan la form a m ás eficiente de ensam blaje de las capas estructurales, econom ía esencial para estas partículas extrem adam ente pequeñas con recursos genéti­ cos lim itados. Com o regla, los virus de D N A se replican y se ensam blan en el núcleo; los virus de RN A se ensam blan en el citoplasm a. Los com plejos eventos que se suceden después de que un virus infecta a una célula se reflejan sólo de form a incom pleta com o

V IR US DE LA G R IPE

PO LIO VIR U S

alteraciones m orfológicas celulares. Sin em bargo, en algunos casos se ve con claridad cóm o el virus se ha apropiado de los recursos genéticos de la célula (fig. 23-3A y B). E l ensam blaje final de algunos virus tiene lugar en la m em brana citoplasm ática o nuclear. A m edida que el virión se desplaza del núcleo al citoplasm a o del citoplasm a al espacio extracelular, se agrega a la nucleocápside una envoltura externa que contiene lípidos (véanse figs. 23-2, 23-3A y F, y cuadro 23-2). Los solventes de los lípidos inactivan a estos virus envueltos, en tanto que no

U nidad m orfológica

M em brana lipídica N ucleoproteína

M em brana lipídica

U nidad m orfológica (capsóm ero)

N ucleoproteína

Y

C ápside Y V irión

C ápside Y

Virión F ig u ra 2 3 -2 Estructura viral. Los virus están organizados de una manera muy ordenada. Un core central de nucleoproteína se encuentra rodeado por una cápside proteica, constituida por capsóm eros individuales. A lgunos virus también tienen una mem brana lipoproteica alrededor de la nucleocápside. Los dos patrones de sim etría de organización más comunes son la simetría icosaédrica (A ) y la helicoidal (B). Cuando se los observa con el m icroscopio electrónico, los virus icosaédricos parecen esféricos, aunque a veces se visualizan sus facetas (véase la ilustración del adenovirus del cuadro 23-2).

1 27 6

CAPÍTULO 23 Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia , Rickettsia y microorganismos relacionados

F ig u ra 2 3 -3 M icrofotografías electrónicas de diversos virus. (A) Los herpesvirus se ensam blan en el núcleo de la célula (N). La crom atina celular (C) es despla­ zada hacia los bordes del núcleo por la desoxirribonucleoproteína viral, que está ligeram ente teñida en la m icrofotografía. Este m aterial corresponde a la inclusión intranuclear eosinófila que se observa con el m icroscopio óptico (véase lám ina en color 23-1). Los viriones desnudos (no envueltos) (flechas) se ensam blan en el núcleo. Fuera de la célula, se observan algunos viriones m aduros que han adquirido una envoltura lipídica a partir de la célula (puntas de flecha) (células M RC-5, infectadas por virus del herpes simple tipo 1, 22 400x). (B) Los adenovirus se ensam blan en el núcleo (N). Tienen sim etría icosaédrica y son no envueltos. Con fre­ cuencia se encuentran agrupados densamente en disposición paracristalina (flechas). A m edida que los virus se acumulan, la totalidad del núcleo puede estar repleta de viriones, que producen las inclusiones que se observan con el m icroscopio óptico (véase lám ina en color 23-IE ) (células HEp-2 infectadas, 22 400x). (C) El virus sincitial respiratorio se ensam bla en el citoplasm a y m adura a nivel de la m embrana celular. Pueden verse inclusiones en el citoplasma de las células infectadas, tanto in vivo com o in vitro (véase lámina en color 23-IG). Las inclusiones (flechas) son intracitoplasm áticas y están compuestas por ribonucleoproteína fibrilar.

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s d e las in fe c c io n e s v ira le s

afectan a sus congéneres no envueltos. L a replicación de algu­ nos virus causa la m uerte de la célula, con liberación de las nucleocápsides ensam bladas. Los virus envueltos que m aduran a nivel de la m em brana citoplasm ática se liberan de la célula por ' ‘brotación” a través de la m em brana (véanse ñgs. 23-3F y 23-16). D urante este proceso, la envoltura incorpora porciones de la m em brana lipídica, así com o glucoproteínas especifica­ das por el virus, que se insertan dentro de la m em brana. En los cuadros 23-1 y 23-2 se resum en los principales gru­ pos de virus. Se han agregado m icrofotografías electrónicas ilustrativas de partículas virales con tinción negativa (propor­ cionadas por Frederick A. M urphy) yuxtapuestas a una breve descripción de las fam ilias y los géneros. L a lista no es exhaus­ tiva. pero incluye los patógenos hum anos m ás im portantes. Las características taxonóm icas se resum en en los cuadros, pero en el texto se siguen usando los nom bres vernáculos. Las características estructurales y bioquím icas que se utili­ zan para la clasificación son el tipo de ácido nucleico (DN A o RN A ), la configuración o sim etría de la nucleocápside (heli­ coidal, icosaédrica o com pleja), la presencia o la ausencia de una envoltura lipídica, el tam año del virión, la cantidad de capsóm eros, la estabilidad del virión frente a los tratam ientos quí­ m icos y la com posición antigénica. L os virus contienen RNA o DNA. La m ayoría de los virus de RN A son de cadena sim ­ ple y se replican en el citoplasm a; los virus de D N A son de doble cadena y se reproducen en el núcleo. L as principales excepciones respecto del sitio de replicación son los virus de la gripe (RN A ), cuya replicación em pieza en el núcleo, y los poxvirus (DNA), que se replican en el citoplasm a. Los reovirus son virus de RN A de cadena doble; los parvovirus son virus de D N A de cadena simple. La polaridad de los virus de RN A se considera positiva si un virus puede funcionar com o m R N A (es decir, las proteínas necesarias para construir el virión pueden sintetizarse directa­ m ente a partir del ácido nucleico viral, una vez que es liberado en el interior de la célula por la disgregación de la cápside del virión). Un virus de RN A con polaridad negativa debe usar una RN A polim erasa RN A -dependiente (una enzim a que debe encontrarse em paquetada con el ácido nucleico en el virión infectante) para sintetizar un RNA con polaridad positiva, des­ pués de lo cual pueden sintetizarse las proteínas necesarias. El genom a de la m ayoría de los virus de RN A está contenido en un segm ento lineal, pero en algunos casos hay segm entos m úl­ tiples. El genom a segm entado perm ite un m ayor potencial de reordenam iento genético cuando dos cepas infectan la m ism a célula. U na de las explicaciones para la asom brosa habilidad del virus de la gripe para cam biar y adaptarse es su genom a

1277

segm entado, que facilita la recom binación de segm entos cuan­ do dos viriones diferentes infectan la m ism a célula.

Manifestaciones clínicas de las infecciones virales Las m anifestaciones clínicas de una infección viral son muy num erosas. Los síntom as generales son fiebre con escalofríos o no, m alestar general y m ialgias. Los síntom as específicos deri­ van fundam entalm ente de la propensión del virus para infectar diferentes células y tejidos (tropism o), pero tam bién pueden depender de la vía de infección, de la virulencia de la cepa, del nivel inm unitario del paciente y de otros factores predisponen­ tes, com o las cardiopatías o neum opatías subyacentes. El lec­ tor puede consultar varios excelentes libros de texto para obte­ ner otros detalles.284-418 Ortomixovirus

Los ortom ixovirus, que incluyen los virus de la gripe o virus influenza A, B y C, causan una am plia variedad de infecciones respiratorias.58’393 El síndrom e gripal com ienza súbitam ente con cefalea, fiebre, escalofríos y tos seca; luego, aparecen fiebre alta, m ialgias, m alestar general y anorexia. En los niños peque­ ños los síntom as gastrointestinales pueden ser considerables. Casi todos los casos de gripe se registran durante el invierno. Los virus influenza A y B son responsables de la m ayor parte de las enferm edades respiratorias epidém icas en las que hay exce­ so de m ortalidad. Rara vez se aíslan en ausencia de infección. El virus influenza A infecta diversas especies de m am íferos y aves. Se describió la transm isión ocasional de influenza porcina del cerdo al hom bre.512 La preocupación acerca de la infección hum ana con el virus porcino originó una cam paña de vacuna­ ción de alcance nacional en 1976, con la aparición de casos inesperados e indeseables de síndrom e de G uillain-Barré com o resultado. El virus influenza C es una causa poco frecuente de infección hum ana, pero puede causar bronquitis y neum onía.356 Los virus de la gripe pueden provocar infecciones graves de las vías respiratorias bajas por sí m ism os o, con m ayor frecuencia, predisponer al paciente a una infección bacteriana secundaria.509 Un giro reciente en los cuadros de infección secundaria ha sido la producción de síndrom e de shock tóxico por la invasión de Staphylococcus aureus.3'9 Otras com plicaciones de la gripe son la m iocarditis144 y la encefalopatía,233'468 aunque el virus casi nunca se detecta en estas situaciones. L a estructura y la función del virus de la gripe están íntim a­ m ente relacionadas con la patogenia y el diagnóstico de labo-

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Com párese la densidad del nucléolo (punta de flecha) con la de las inclusiones (células HEp-2 infectadas, 3 150x). (D) Coxsackievirus B. Los enterovirus son peque­ ños virus de RNA con sim etría icosaédrica y suelen ordenarse en masas paracristalinas (flechas). Se ensam blan en el citoplasma. Con el m icroscopio óptico, no se observan cuerpos de inclusión (células de riñón de mono Macaca mulatta infectadas, 56 OOOx). (E) Virus de la rabia. Este rhabdovirus con form a de bala se ensam ­ bla en el citoplasm a. L a nucleoproteína fibrilar (P) y los virus alargados (flechas) se encuentran juntos. La m asa de material viral corresponde a los cuerpos de Negri que se observan por m icroscopia óptica (véase lám ina en color 23-1H). La estructura interna que puede verse dentro del cuerpo de Negri clásico es el resultado de la incorporación de m aterial citoplasm ático al cuerpo de inclusión (cerebro hum ano infectado. 25 OOOx). (F) Virus de la encefalitis equina del Este. Este togavirus ilustra la m aduración de partículas virales en la superficie de la célula. Los viriones maduros (flechas) se encuentran en el espacio extracelular. Se destaca un virión en proceso de m aduración (brotación ) por el core denso de nucleoproteína y una condensación de la m em brana celular en el punto en que se está form ando la envol­ tura (punta de flecha). Algunos virus, como los mixovirus, insertan sus hem aglutininas dentro de la m em brana en esta etapa; pueden detectarse por la adherencia de eritrocitos a la hem aglutinina viral presente en la m em brana celular (hem adsorción) (cerebro de ratón infectado, 60 OOOx). (E. cortesía de Daniel Perl; F. corte­ sía de Frederick Murphy).

1278

CAPÍTULO 23

Cuadro 23-1

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia , Rickettsia y microorganismos relacionados

Clasificación de los virus de RNA (géneros y especies seleccionados que infectan al hombre)

F am ilia; Orthomyxoviridae Género Influenza virus A Género Influenza virus B Género Influenza virus C Género Influenza virus D

(Thogotovirus)

Tamaño: 100 nm, esféricos o pleom orfos A cido nucleico: RNA segmentado, de polaridad negativa, cadena simple Simetría: helicoidal Envoltura lipídica: presente Antígenos: hem aglutinina y neuram inidasa H ábitat natural: hom bre y anim ales Distribución: mundial

Forma de transm isión: diseminación por microgotas en aerosol de una persona a otra; rara vez de ani­ males al hombre Vía de infección; respiratoria Enfermedades: infecciones respiratorias incluidas coriza (resfriado común), traqueobronquitis y neumonía. Los síntomas extrapulm onares son prom inentes en el síndrom e gripal; raras veces se presenta enferm edad extrapulm onar, como m io­ carditis

Virus influenza A. Las partículas son groseram ente esféricas pero irregula­ res. La estructura helicoidal interna es difícil de observar, pero las proyec­ ciones similares a flecos de la hem aglutinina y la neuram inidasa son evi­ dentes. 135 OOOx.

F am ilia: Paramyxoviridae Subfam ilia Paramyxovirinae Género Respirovirus Especie Virus parainfluenza

humano 1 Especie Virus parainfluenza

humano 3 Género Rubulavirus Especie Virus parainfluenza

humano 2

Tamaño: 150-300 nm, esféricos o pleomorfos A cido nucleico: RNA no segmentado, de polari­ dad negativa, cadena simple Simetría: helicoidal Envoltura lipídica: presente Antígenos: hem aglutinina, neuram inidasa, proteí­ na de fusión, nucleocápside (depende del virus) Hábitat natural: hom bre y animales Distribución: mundial

Form a de transmisión: aerosoles de gotitas o ino­ culación directa Vía de infección: respiratoria Enfermedades: resfriado común, traqueobronqui­ tis, rara vez neum onía (parainfluenza); traqueobronquitis, bronquiolitis y neum onía (virus sin­ citial respiratorio); parotiditis, pancreatitis, orquitis, m eningitis (virus de la parotiditis); exantema, neum onía, encefalitis, panencefalitis esclerosante subaguda (virus del sarampión)

Especie Virus parainfluenza

humano 4 Especie Virus de la parotiditis Género Morbillivirus Especie Virus del sarampión Subfam ilia Pneumovirinae Género Pneumovirus Especie Virus sincitial respiratorio Género Metapneumovirus Especie Metapneumovirus humano

Virus parainfluenza 1. El virión irregular ha sido destruido y libera una larga cadena de RNA no helicoidal. Son evidentes las proyec­ ciones de la hem aglutinina en el virión. 72 OOOx.

(Continúa)

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s de las in fe c c io n e s v ira le s

Cuadro 23-1

1279

Clasificación de los virus de RNA (géneros y especies seleccionados que infectan al hombre) (cont .)

Fam ilia: Rhabdoviridae Género L yssa viru s Especie Virus d e la rabia

Tamaño: 50-95 nm por 130-389 nm, en form a de bala Ácido nucleico: RNA no segmentado, de polari­ dad negativa, cadena simple Simetría: helicoidal Envoltura lipídica: presente Hábitat natural: anim ales dom ésticos y salvajes Distribución: m undial

Form a de transm isión: secreciones infectadas, la rabia se transm ite habitualmente por mordeduras Vía de infección: cutánea o respiratoria Enfermedades: encefalitis (rabia)

Virus de la estomatitis vesicular. La form a de bala del virión es evi­ dente. La naturaleza helicoidal de la ribonucleoproteína interna se refleja en las estriaciones. 216 OOOx.

F am ilia: Filovirídae Género “Virus tipo M arburg” , tenta­ tivamente M a rb u rg viru s Especie M a rb u rg viru s Género “Virus tipo Ebola” , tentati­ vam ente E b o la viru s Especie Zaire Especie Suda n Especie R e sto n Especie C ote d ’Ivoire

,

Tamaño: 80 nm por 800-1 000 nm, filamentosos Acido nucleico: RNA no segmentado, de polari­ dad negativa, cadena simple Simetría: helicoidal Envoltura lipídica: presente Hábitat natural: primates Distribución: Africa, Filipinas

Form a de transmisión: desconocida, pero se requiere contacto estrecho Enfermedades: fiebre hem orrágica con tasas de m ortalidad de hasta el 90%

-

Virus Ébola. La form a larga, filamentosa, ha adoptado una morfolo­ gía en “cayado” . 59 OOOx.

(Continúa)

128 0

CAPÍTULO 23

Cuadro 23-1

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsla y microorganismos relacionados

Clasificación de ios virus de RNA (géneros y especies seleccionados que infectan al hombre) (cont .)

Familia: Bunyaviridae Género Bunyavirus Especie Virus de la encefalitis de California Especie Virus LaCrosse Género Hantavirus Especie Virus Hantaan Especie Virus Sin Nombre Género Nairovirus Especie Virus de la fiebre hemorrágica de

Tamaño: 90-120 nm Acido nucleico: RNA segmentado, de cadena simple. Puede tener polaridad negativa (Bunyavirus, Hantavirus y Nairovirus) o conte­ ner ejem plos de cada polaridad (Phlebovirus) Simetría: helicoidal Envoltura lipídica: presente Antígenos: hem aglutinina de superficie Hábitat natural: pequeños animales

Crimea-Congo

Distribución: mundial. Form a de transmisión: picadura de m osquitos infec­ tados (Bunyavirus, Nairovirus, Phlebovirus ) o exposición a excretas de roedores (Hantavirus) Enfermedades: enfermedad febril; meningitis asép­ tica (Bunyavirus)', enfermedad febril, fiebre hem orrágica, insuficiencia respiratoria CHantavirus); enfermedad febril, fiebre hem orrá­ gica (Nairovirus ); enfermedad febril, encefalitis, fiebre hem orrágica (Phlebovirus)

Género Phlebovirus Especie Virus de la fiebre del Valle del Rift Especie Virus de la fiebre siciliana por flebó­

tomos

Virus LaCrosse. Partículas virales irregulares; la envoltura lipídica y las proyecciones superficiales son evidentes. 117 OOOx.

Familia; Coronaviridae Género Coronavirus Especie Coronavirus humano 229E Especie Coronavirus humano OC43 Especie Virus del SARS humano (tentativa)

Tamaño 80-130 nm Acido nucleico: RNA no segmentado, de polari­ dad positiva, cadena simple Simetría: helicoidal Envoltura lipídica: presente H ábitat natural: seres hum anos o animales ( Coronavirus)

Distribución: mundial Transmisión: persona a persona, presum iblem ente por aerosoles Vía de infección: respiratoria Enfermedades: Resfriado com ún; en raras ocasio­ nes enferm edades de las vías respiratorias bajas; síndrom e respiratorio agudo grave

Coronavirus hum ano OC43. Las proyecciones en form a de m aza son la característica más distintiva de estas partículas pleomorfas. 180 OOOx.

(Continúa)

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s de las in fe c c io n e s v ira le s

Cuadro 23-1

1281

Clasificación de los virus de RNA (géneros y especies seleccionados que infectan al hombre) (cont.)

F am ilia: Picornaviridae Género Enterovirus Especie Poliovirus (3 serotipos) Especie Coxsackievirus (23 serotipos) Especie Echuvirus (28 serotipos) Especie Enterovirus (4 serotipos) Género Hepatovirus Especie Virus de la hepatitis A humana Género Parechovirus Especie Parechovirus humano (2 serotipos, antes incluidos en el género Echovirus com o serotipos 22 y 23) Género Rhinovirus Especie Rinovirus hum anos (103 serotipos)

Tamaño: 22-30 nm Acido nucleico: RNA no segmentado, de pola­ ridad positiva, cadena simple Simetría: icosaédrica Envoltura lipídica: ausente Hábitat natural: aparato gastrointestinal hum a­ no; sobrevive en el medioambiente (Enterovirus, Hepatovirus, Parechovirus)', vías respiratorias altas del hombre ( Rhinovirus)

Distribución: mundial Forma de transmisión: fecal-oral interhumana o por agua contam inada (Enterovirus. Hepatovirus, Parechovirus)', por aerosoles del aparato respira­ torio hum ano o por las m anos (Rhinovirus) V ía de infección: gastrointestinal (Enterovirus, Hepatovirus, Parechovirus)', respiratoria (Rhinovirus) Enfermedades: enfermedad febril, m eningitis, ence­ falitis. m iocarditis (Enterovirus, Parechovirus)', hepatitis (Hepatovirus), resfriado com ún (Rhinovirus)

Poliovirus 1. Las partículas son pequeñas, regulares y sin envoltu­ ra. 180 OOOx.

F am ilia: CaUciviridae Género Virus tipo Norwalk (tentativo) Género Virus tipo Sapporo (tentativo)

Tamaño: 35-39 nm A cido nucleico: RNA no segmentado, de polaridad positiva, cadena simple Simetría: icosaédrica Envoltura lipídica: ausente H ábitat natural: aparato gastrointestinal humano

Distribución: mundial Form a de transmisión: fecal-oral; agua contam inada Vía de entrada: gastrointestinal Enfermedades: gastroenteritis

Virus del exantema porcino. Partículas muy pequeñas, regulares, con notables depresiones en form a de taza. Las depresiones super­ ficiales de los virus humanos similares al agente Norwalk no son tan pronunciadas.

(Continúa)

128 2

C A P ÍT U L O 2 3

Cuadro 23-1

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Clasificación de los virus de RNA (géneros y especies seleccionados que infectan al hombre) (cont.)

Familia: Reoviridae Género Orthoreovirus Serotipos 1-3 Género Rotavirus Serotipos A-G (D-G sólo en anim ales) Género Coltivirus Especie tipo Virus de lafiebre por garrapa­ tas de Colorado

Tamaño: 60-80 nm, m orfología variable Acido nucleico: RNA segmentado, de cadena doble Simetría: icosaédrica Envoltura lipídica: ausente Hábitat natural: aparato gastrointestinal del hom bre (Reovirus y Rotavirus) y de los ani­ m ales (Rotavirus)

Distribución: m undial Forma de transmisión: fecal-oral por contacto direc­ to; animales al hom bre Vía de entrada: aparato gastrointestinal Enfermedades: gastroenteritis (Rotavirus); ninguna (Reovirus)

Rotavirus humano. La característica distintiva de los Reoviridae es la presencia de una doble envoltura, cada una de las cuales tiene simetría icosaédrica. 135 OOOx.

Familia: Astroviridae Género Astrovirus E specie Astrovirus humano

Tamaño: 28-30 nm Ácido nucleico: RNA no segmentado, de polaridad positiva, cadena simple Simetría: icosaédrica Envoltura lipídica: ausente Hábitat natural: aparato gastrointestinal del hombre

Distribución: m undial Forma de transmisión: fecal-oral; agua contam inada Vía de entrada: aparato gastrointestinal Enfermedades: gastroenteritis

Familia: Togaviridae Género Alphavirus Especie Virus de la encefalitis equina del Este Especie Virus de la encefalitis equina venezo­ lana (otras especies de arbovirus) Género Rubivirus Especie Virus de la rubéola

Tamaño: 70 nm Ácido nucleico: RNA no segmentado, de polaridad positiva, cadena simple Simetría: icosaédrica Envoltura lipídica: presente Hábitat natural: pequeños m am íferos e insectos (Alphavirus ); hombre (Rubivirus)

Distribución: mundial Form a de transmisión: por picadura de m osquitos (Alphavirus)', aerosoles o transplacentaria (Rubivirus ) V ía de entrada: cutánea (Alphavirus ); respiratoria o vascular (Rubivirus) Enfermedades: hepatitis, m eningitis, encefalitis, artritis, enferm edades febriles (Alphavirus); enfer­ medad eruptiva, infección congénita (rubéola)

Virus de la rubéola. Los viriones esféricos tienen una m embrana lipídica y proyecciones de una hem aglutinina de superficie. 135 OOOx.

(Continúa)

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s d e las in fe c c io n e s v ira le s

Cuadro 23-1

1283

Clasificación de los virus de RNA (géneros y especies seleccionados que infectan al hombre) (cont.)

Familia: Flavivirídae Género Flavivirus Especie Virus de la fiebre amarilla Especie Virus de la encefalitis de San Luis Especie Virus de la encefalitis japonesa Especie Virus del Nilo Occidental Especie Virus del dengue (Numerosas especies más, muchas transm iti­ das por artrópodos) Género Hepacivirus Especie Virus de la hepatitis C Virus no asignados (agentes GB)

Tamaño: 40-60 nm Ácido nucleico: RNA no segmentado, de pola­ ridad positiva, cadena simple Simetría: icosaédrica Envoltura lipídica: presente Hábitat natural: pequeños m am íferos e insectos (Flavivirus); seres hum anos ( Hepacivirus)

Familia: Retroviridae G énero Deltaretrovirus Especie Virus linfotrópicos T humanos, tipos

Tamaño: 100 nm Acido nucleico: RNA no segmentado, de pola­ ridad negativa, dímero de cadena simple (envuelto por DNA polim erasa RNA depen­ diente) Simetría: variable Envoltura lipídica: presente H ábitat natural: hombre

1 y 2 (HTLV) G énero Lentivirus Especie Virus de la inmunodeficiencia huma­ na, tipos 1 y 2 (HIV)

Distribución: mundial Form a de transmisión: picadura de m osquitos o garrapatas (Flavivirus); por sangre (Hepacivirus) Vía de entrada: cutánea (Flavivirus) vascular, sexual (Hepacivirus ) Enfermedades: hepatitis, m eningitis, encefalitis, enfermedades febriles, fiebre hem orrágica ( Flavivirus): hepatitis, cirrosis, carcinom a hepatocelular (Hepacivirus)

Distribución: mundial Form a de transmisión: sexual, agujas contam inadas, transfusiones, m atem o-fetal/recién nacido. Vía de entrada: mucosas, vascular Enfermedades: leucem ia y linfom a de células T (HTLV); síndrome de inmunodeficiencia adquiri­ da (HIV)

Virus de la inm unodeficiencia humana. M icrofotografía electrónica por barrido de un linfocito T hum ano con partículas virales que brotan de su superficie.

(Continúa)

ratorio.294 El antígeno de la nucleoproteína presente en el core viral define el tipo de virus; por ejem plo, influenza A o B. Este antígeno es estable y es reconocido por m uchos de los antisue­ ros diagnósticos, que son capaces de detectar todas las cepas circulantes de un tipo determ inado. E xisten dos antígenos glucoproteicos en la superficie del virión de influenza que son im portantes para la patogenia, la epidem iología y la inm unoterapia. El antígeno dom inante es la hem aglutinina, que es res­ ponsable de la adsorción del virus a las células epiteliales res­ piratorias y, por lo tanto, una diana im portante de las vacunas antivirales. L a enzim a de superficie neuram inidasa participa en la penetración del virus en la célula. Estos antígenos de super­ ficie están en constante cam bio, de m odo que constituyen un blanco m óvil para los anticuerpos que se utilizan con fines tera­ péuticos y diagnósticos. Las epidem ias recurrentes de gripe son provocadas por los cam bios constantes y acum ulados (despla­ zam iento antigénico) y por los cam bios periódicos y cuantita­ tivos (variación antigénica). Los virus se denom inan según su estructura y consideracio­ nes geográficas. Por ejem plo, un aislam iento puede denom i­

narse influenza A /L eningrado/360/86 (H3N 2), lo cual significa que esta cepa es el aislam iento núm ero 360 de influenza A en Leningrado, realizado en 1986 y que contiene el tercer tipo de hem aglutinina y el segundo tipo de neuram inidasa. La hem a­ glutinina y la neuram inidasa no son antígenos útiles desde el punto de vista diag n ó stico , pero su estudio es esen cial para el epidem iólogo, de m anera que la vacuna del año próxim o pueda inducir la form ación de anticuerpos contra los antígenos actuales en circulación. A unque todavía no se h a logrado, se continúa tratando de predecir el desplazam iento futuro de las cepas de virus influenza A, para que la vacuna para la próxim a tem porada de gripe pueda form ularse en form a m ás racional.50 H asta la fecha se han encontrado nueve hem aglutininas dife­ rentes. Se supuso que el antígeno inicial ( Hl ) era un constitu­ yente de la cepa que causó la pandem ia de gripe en 1918, sobre la base de análisis serológicos. Hace m uy poco, se obtuvo evi­ dencia de otro tipo usando las técnicas m oleculares m odernas en tejidos de víctim as de la gripe.411 D os m uestras provenían de tejido pulm onar fijado con form alina en Inglaterra, pero la m uestra que proporcionó la secuencia m ás com pleta se tom ó

128 4

CAPÍTULO 23

Cuadro 23-1

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsiay microorganismos relacionados

Clasificación de los virus de RNA (géneros y especies seleccionados que infectan al hombre) (cont.)

F am ilia: Arenaviridae Género Arenavirus Grupo del Viejo M undo Especie Virus de la coriomeningitis Hnfocítica (LCM) Especie Virus Lassa Grupo del Nuevo M undo Especie Virus Junín Especie Virus Machupo Especie Virus Sabia Especie Virus Guanarito

Tamaño: 62 > 200 nm Acido nucleico: RNA bisegmentado, bipolar, de cadena simple Simetría: pleom orfa Envoltura lipídica: presente Hábitat natural: roedores

Distribución: m undial (LCM); Sudam érica (Junín, Machupo, Sabiá, Guanarito); Africa (Lassa) Form a de transmisión: contacto con secreciones provenientes de roedores o seres humanos Vía de entrada: respiratoria, cutánea (laceraciones) Enfermedades: enfermedad febril, meningitis (LCM); fiebre hem orrágica (virus Junín,

Machupo, Sabiá, Guanarito)

Virus de la coriom eningitis linfocítica. El virus esférico tiene grandes proyecciones en su superficie. El nombre deriva de la palabra latina arenosus (arenoso) y fue sugerido por las partí­ culas internas similares a ribosom as que se ven con el m icros­ copio electrónico de transm isión. 225 OOOx.

del cuerpo de una m ujer inuit sepultada en las nieves eternas de Alaska. Se encontró una hom ogeneidad notable entre las tres m uestras provenientes de distintas localidades geográficas. Las epidem ias m ayores siguientes se han asociado con varia­ ciones im portantes en la hem aglutinina: H2 durante la epide­ m ia de gripe asiática en 1957 y H3 durante la epidem ia de gripe de H ong Kong de 1968. Más tarde, circularon cepas con las hem aglutininas H l o H3 hasta que una nueva cepa de gripe aviar (hem aglutinina H 5) m ató a 6 de 18 personas infectadas en H ong Kong. Este virus, que se disem inó en form a directa de los pollos a los seres hum anos sin otro interm ediario, parece tener características particularm ente virulentas.216 Por fortuna, la disem inación interhum ana parece ser lim itada. Luego apareció en Hong Kong otra cepa (hem aglutinina H9) con característi­ cas epidem iológicas sim ilares, pero con m enos m ortalidad. H ace poco, el virus H5 ha reaparecido en el Sudeste asiático, una vez m ás con tasas de m ortalidad altas, en pacientes expues­ tos a aves de corral, pero sin transm isión interhum ana im por­ tante.224'282 La frecuencia con la que los virus de la gripe aviar han cru­ zado la barrera de las especies para infectar a los seres hum a­ nos es desconcertante. Está claro que la enferm edad pandém i­ ca devastadora espera sólo la com binación de virulencia alta y la transm isión interhum ana eficaz. Los Centers for D isease C ontrol and Prevention (CD C) han form ulado recom endacio­ nes provisorias para procesar m uestras provenientes de pacien­ tes con posible gripe aviar. Se recom ienda el uso de instalacio­ nes con nivel de bioseguridad 3 para algunas m anipulaciones; se aconseja el envío de las m uestras a una institución, com o los C D C , que tengan las instalaciones adecuadas.82

Paramixovirus VIRUS PARAINFLUENZA

Los paramixovirus constituyen un grupo variado. Los cuatro serotipos de virus parainfluenza son causas importantes de enfer­ medad respiratoria, que suele ser leve en los adultos, pero que puede ser grave en los niños pequeños.207 Los virus parainfluen­ za 1 y 2 causan crup (laringotraqueobronquitis) en los niños entre los 2 y 6 años de edad durante la tem porada de invierno de virosis respiratorias. El virus parainfluenza 3 es una causa im portante de bronquiolitis en los niños m enores de 2 años; las infecciones se presentan durante todo el año, con picos en el otoño y la primavera.

VIRUS DE LA PAROTIDITIS

El virus de la parotiditis causa parotiditis epidém ica (“pape­ ras”). Con frecuencia produce m eningitis aséptica, que suele ser leve, y puede afectar tam bién el páncreas, las gónadas y, en raras ocasiones, las articulaciones. La introducción de vacunas eficaces ha reducido en gran m edida la incidencia de esta infec­ ción. En la M ayo Clinic, se aisló virus de la parotiditis en 185 ocasiones en la década de 1960, pero sólo 3 veces en la década de 1970.453Cabe destacar que desde la introducción de la vacu­ na contra la parotiditis, las cepas circulantes, que habían sido hom ogéneas, se hicieron m ás divergentes.259

VIRUS DEL SARAMPIÓN

Es poco probable encontrar virus del saram pión en el labo­ ratorio,453 pero lam entablem ente el virus está reapareciendo clí-

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s de las in fe c cio n e s v ira le s

Cuadro 23-2

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Clasificación de los virus de DNA (Géneros y especies seleccionados que infectan al hombre)

Familia: H erpesviridae Subfam ilia Alphaherpesvirinae Género Simplexvirus Especie Virus del herpes simple 1 (HHV1) Especie Virus del herpes simple 2 (HHV2) Género Varicellovirus Especie Virus varicela-zóster (VZV) Subfam ilia Betaherpesvirinae Género Citomegalovirus Especie Citomegalovirus humano (CMV) Género Roseolovirus Especie Herpesvirus humano 6A (HHV6A) Especie Herpesvirus humano 6B (HHV6B) Especie Herpesvirus humano 7 (HHV7) Subfam ilia Gammaherpesvirinae Género Lymphocryptovirus E specie Virus de Epstein-Barr (EBV) Género Rhadinovirus Especie Herpesvirus humano 8 (Herpesvirus con el sarcoma de Kaposi) (HHV8)

Tamaño: 120-300 nm Simetría: icosaédrica Envoltura lipídica: presente Hábitat natural: hombre Distribución: mundial Form a de transmisión: por secreciones bucales o genitales infectadas, por sangre o a través de la placenta Vía de entrada: respiratoria, cutánea, intravascular, transplacentaria

Enfermedades: faringitis, cervicitis, lesiones locali­ zadas de piel, neumonía, esofagitis, encefalitis, infecciones diseminadas (HSV1); lesiones cutáne­ as, meningitis, sepsis neonatal (HSV2); infección congènita, hepatitis, mononucleosis, neumonía (CMV); varicela, infecciones diseminadas, zóster/culebrilla (VZV); faringitis, mononucleosis, hepatitis (EBV); exantem a súbito (HHV6, HHV7); sarcom a de Kaposi, linfom a (HHV8)

Virus del herpes simple (izquierda). Las nucleocápsides no envueltas m uestran la estructura regular del virión. Las unida­ des estructurales claram ente definidas parecen tener una depresión central (derecha). La partícula envuelta tiene, ade­ más, una m em brana lipídica derivada de la célula infectada. 189 OOOx.

Familia: Adenovirídae Género Mastadenovirus Especie Adenovirus (49 serotipos)

Tamaño: 70-90 nm Simetría: icosaédrica Envoltura lipídica: ausente Hábitat natural: hombre

Distribución: m undial Forma de transmisión: fecal-oral, ¿gotitas en aero­ sol? Vía de entrada: respiratoria, gastrointestinal Enfermedades: conjuntivitis, queratitis, faringitis, traqueobronquitis, neumonía, cistitis; gastroente­ ritis (tipos 40 y 41)

Adenovirus tipo 5. La disposición regular de las unidades estructu­ rales del virión es claram ente evidente. 234 OOOx.

(Continúa)

1 28 6

CAPÍTULO 23 Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia , Rickettsia y microorganismos relacionados

Cuadro 23-2

Clasificación de los virus de DNA (Géneros y especies seleccionados que infectan al hombre) (cont .)

Familia: Papovaviridae Género Papillomavirus Especie Virus de las verrugas humanas (>100 genotipos) Género Polyomavirus Especie Virus simiano 40 (SV40) Especie Virus JC (JCV) Especie Virus BK (BKV)

Tamaño: 45-55 nm Simetría: icosaédrica Envoltura lipídica: ausente Hábitat natural: hombre (virus de las verrugas, JCV y BKV); m onos (SV40)

Distribución: mundial Form a de transmisión: por contacto con secreciones infectadas, contacto sexual; los virus permanecen latentes en los tejidos o se integran al genoma (virus de las verrugas) Vía de entrada: cutánea, genital, respiratoria (papi­ loma); ¿respiratoria? (polioma) Enfermedades: papilom as cutáneos, genitales y del aparato respiratorio (verrugas); neoplasias epite­ liales (virus del papilom a); leucoencefalopatía multifocal progresiva (virus poliom a)

Virus de las verrugas hum anas. Estos virus nunca han sido pro­ pagados con éxito en cultivos celulares. Las enfermedades se han asociado por demostración de los viriones. de antígenos virales o del ácido nucleico en las lesiones. 135 OOOx.

Familia: Parvnviridae Subfam ilia Parvovirinae Género Erythrovirus Especie Virus B19

Tamaño: 18-26 nm Acido nucleico: DNA no segm entado de cade­ na simple Simetría: icosaédrica Envoltura lipídica: ausente Hábitat natural: hombre

Distribución: mundial Forma de transmisión: interhumana (vía descono­ cida); transfusiones Vía de entrada: desconocida; vascular Enfermedades: eritem a infeccioso (quinta enfer­ medad); enferm edad hem olítica del recién naci­ do, anemia

Virus H -1. Los viriones son muy pequeños y regulares en form a y tamaño. Los parvovirus tienen la particularidad de contener DNA de cadena simple.

(Continúa)

nicam ente. La relajación de los controles y de las prácticas de refuerzo de la vacunación ha dado origen a brotes explosivos tanto en los adultos jóvenes, que pueden tener inm unidad en desaparición, com o en los niños, sobre todo en zonas urbanas en las que los niveles de vacunación son bajos.64 La afección de equipos deportivos universitarios y la cancelación de contien­ das deportivas de afluencia m asiva atraerán sin duda la aten­

ción de los m edios de com unicación y del gran público. El aná­ lisis m olecular sugiere la presencia de m últiples casos im por­ tados, m ás que la existencia de una sola cepa endém ica.423 Las im plicaciones que los frecuentes desplazam ientos actua­ les de personas tienen en la salud pública por exposición a enferm edades quedó ilustrada por una epidem ia de 247 casos que com enzó en un a zona de práctica del esquí en Brecken-

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s de las in fe c c io n e s v ira le s

Cuadro 23-2

1287

Clasificación de los virus de DNA (Géneros y especies seleccionados que infectan al hombre) (cont.)

Familia: H epadnaviridae Género Hepadnavirus Especie Virus de la hepatitis B

Tamaño: 42-47 nm A cido nucleico: DNA circular no segmentado Simetría: compleja Envoltura lipídica: presente Hábitat natural: hombre Antígenos: Antígeno de superficie (HBsAg) Antígeno del core (HBcAg) Antígeno tem prano (HBeAg)

Distribución: mundial Form a de transmisión: secreciones y sangre infecta­ das, sexual, transfusiones Vía de entrada: cutánea, vascular, genital Enfermedades: hepatitis, cirrosis, carcinom a hepatocelular

Virus de la hepatitis B. Estas partículas de 42 nm, que son el agente infeccioso, se conocían antiguam ente como partículas de Dañe. 225 OOOx.

Familia: Poxviridae Subfam ilia Chordopoxvirinae Género Orthopoxvirus E specie Virus varióla (viruela) E specie Virus vaccinia E specie Virus de la viruela vacuna (Cowpox) E specie Virus de la viruela simiana Género Parapoxvirus E specie Virus orf Género Molluscipoxvirus Especie Virus del molusco contagioso Género Yatapoxvirus Especie Tanapoxvirus

Tamaño: 300-450 x 170-260 nm A cido nucleico: DNA no segmentado de doble cadena Simetría: compleja Envoltura lipídica: ausente H ábitat natural: hom bre y animales

Distribución: mundial; la viruela está “extinguida” Forma de transmisión: respiratoria, cutánea V ía de entrada: respiratoria, cutánea Enfermedades: lesiones cutáneas ulceradas, enfer­ m edad disem inada ( Orthopoxvirus); lesiones cutáneas ulceradas ( Parapoxvirus, Yatapoxvirus); m olusco contagioso (Molluscipoxvirus )

Virus vaccinia. La cubierta externa enrollada de esta gran partícula en form a de ladrillo es evidente. Cuando existía la viruela, la m icroscopia electrónica con tinción negativa era una herram ienta útil para la diferenciación de las vesículas de la viruela de las producidas por la varicela. 49 500x.

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CAPÍTULO 23

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia , Rickettsia y microorganismos relacionados

ridge, C olorado.69 D espués de la dispersión de las personas infectadas, se detectaron casos de saram pión en 10 estados. Dos factores dism inuyen la probabilidad de aislar virus del saram pión: el diagnóstico suele ser clínico y casi nunca se envían m uestras al laboratorio. A dem ás, el virus se aísla en secreciones respiratorias y de orina sólo en las prim eras etapas de la infección. El exantem a diagnóstico es producido por com plejos de antígeno viral y anticuerpos. Por lo tanto, en el m om ento en que se realiza el diagnóstico, el virus está siendo neutralizado y es probable que los cultivos sean negativos. En el pasado se veían síntom as clínicos atípicos en pacientes que habían recibido las prim eras vacunas inactivadas,12 pero este fenóm eno ya no es habitual. La neum onía y la encefalitis son las com plicaciones m ás graves del saram pión.142265 A dem ás, el virus del saram pión (o una de sus variantes) causa, en raras ocasiones, una encefalitis crónica conocida com o panencefalitis esclerosante subaguda.390

m ente en H ong Kong, pero ya se ha encontrado en todo el mundo. Es un m iem bro de la subfam ilia Pneum ovirinae, que incluye el RSV ;345 el virus hum ano está estrecham ente relacio­ nado con dos virus aviarios. C línica y epidem iológicam ente se parece al RSV.34 Se han obtenido aislam ientos en células LLCM K 2 (una línea celular continua de riñón de m ono M acaca m ulatta que no suele usarse en los laboratorios de diagnóstico). El virus se reconoció p o r su efecto citopático, pero la identifi­ cación se ha hecho por técnicas m oleculares. O tros dos param ixovirus encontrados hace poco se han aso­ ciado con enferm edades neurológicas graves, en lugar de con infecciones respiratorias. El virus N ipah ha causado encefalitis en criadores de cerdos en M alasia y S ingapur.191 E stá estrecha­ m ente relacionado con el virus H endra, que produjo enferm e­ dad en caballos y algunas infecciones hum anas en A ustralia. Se han observado infecciones adquiridas en el laboratorio. Picornavirus

VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO

El virus sincitial respiratorio (RSV ) causa infecciones respi­ ratorias recidivantes desde la infancia hasta la edad adulta. Las epidem ias son frecuentes y pueden ser intrahospitalarias. E xisten dos grupos serológicos bien definidos de virus sincitial respiratorio (A y B). En la m ayoría de las epidem ias predom i­ na un único grupo, 364 pero el tipo viral no se relaciona con la gravedad de la infección.332 Los casos de enferm edad se con­ centran en los m eses invernales, aunque pueden ocurrir infec­ ciones en verano en los clim as calurosos.507 La infección se disem ina por m edio de grandes gotas con partículas y por fóm ites (partículas am bientales contam inadas, com o el polvo dom éstico), más que por aerosoles de partículas pequeñas. E sta infección viral es una causa im portante de infecciones intrahospitalarias; la observación cuidadosa de los principios de control de infecciones es esencial.192 Se requiere un buen apoyo diagnóstico de laboratorio, no sólo para el m anejo de cada paciente, sino tam bién para lim itar la disem i­ nación hospitalaria de la infección. El virus sincitial respiratorio puede causar laringitis estridulosa, bronquitis, bronquiolitis o neum onía intersticial.207 Es la causa más frecuente de enferm edad respiratoria en los lactan­ tes hospitalizados m enores de 1 año. Las infecciones causadas por este virus suelen ser graves en los niños pequeños. Si exis­ ten cardiopatías congénitas o inm unodeficiencias, la enferm e­ dad puede ser m ortal; en un estudio, m urieron 8 (73% ) de 11 lactantes con cardiopatías congénitas e hipertensión pulm o­ nar.320 M uchos niños antes sanos, sobre todo lactantes, se enfer­ m an lo suficiente com o para necesitar asistencia respiratoria. La apnea es un com ponente prom inente del síndrom e. L a inm unidad contra el virus sincitial respiratorio es de corta duración e incom pleta. Se pensó durante m ucho tiem po que era una enferm edad de lactantes y niños pequeños, pero la infec­ ción de adultos, con producción- de enferm edad grave, se co n ­ sidera un problem a clínico actual im portante.152,208 Se han inform ado epidem ias en instituciones geriátricas.153 Se ha dem ostrado la naturaleza grave de las infecciones cau­ sadas por el virus sincitial respiratorio en adultos inm unode­ prim idos.333 Tam bién se observan infecciones graves en ancia­ nos y en adultos con enferm edades crónicas, com o diabetes, cirrosis y enferm edad pulm onar obstructiva crónica.205 OTROS PARAMIXOVIRUS

Varios param ixovirus nuevos han aparecido en la últim a década. E l m etaneum ovirus hum ano fue reconocido inicial­

Los picornavirus, que incluyen los rinovirus y los enterovi­ rus, constituyen otro grupo im portante y grande de virus del RNA. Los rinovirus son causas frecuentes de resfriado com ún. Son sensibles a los ácidos y no infectan el aparato gastrointes­ tinal. Su transm isión probablem ente tiene lugar por la genera­ ción de aerosoles respiratorios,110 com o se ha sugerido para otros virus respiratorios. Estos resistentes virus tam bién pue­ den transm itirse a través del contacto con superficies inanim a­ das contam inadas. Existen tantos serotipos de rinovirus (hasta el m om ento 100), que el diagnóstico inm unológico es poco práctico. Los cultivos se solicitan con muy escasa frecuencia ya que las infecciones causadas por rinovirus son incómodas, pero casi nunca poten­ cialm ente mortales. Los enterovirus clásicos son los virus de la poliom ielitis 1 a 3, los virus Coxsackie A y B y los echovirus.382 El grupo de virus C oxsackie recibió su nom bre por una pequeña ciudad del estado de N ueva York, en la que se realizaron los primeros aislamientos. “Echo” significa enteric cytopathic /minan orphan, nom bre que se utilizaba antes de reconocer el potencial patógeno de estos virus. Luego, se encontraron otros m iem bros del género, desig­ nados enterovirus 68 a 71. Pueden aislarse enterovirus en el 40% al 80% de los pacientes con m eningitis aséptica.96 Es probable que existan m uchos casos más de m eningitis aséptica esporádica y epidém ica causados por enterovirus, según se desprende del hallazgo de que la curva epidém ica de todos los casos de m enin­ gitis aséptica sigue un curso exactam ente paralelo a la curva de los casos en los que se aíslan enterovirus. El pico de incidencia es en el verano y com ienzos del otoño. Los enterovirus, sobre todo el virus Coxsackie B, tam bién causan m iocarditis, pericarditis y pleurodinia epidém ica. Se ha sugerido una asociación entre estos virus y la m iocardiopatía, trastorno no inflam atorio del m úsculo cardíaco, pero el tem a es controvertido.482 El virus Coxsackie A causa herpangina y enferm edad de m ano, pie y boca. Los enterovirus tam bién pro­ ducen enferm edad febril con exantem a, que suele ser m aculopapular, pero en raras ocasiones vesicular. D os enterovirus patógenos recién encontrados son el enterovirus 70, que causa conjuntivitis hem orrágica epidém ica, y el enterovirus 71, que provoca infecciones del sistem a nervioso central (SNC), entre ellas una parálisis sim ilar a la poliom ieitis. L a infección por enterovirus es m ucho más frecuente en los lactantes y los niños pequeños. Paradójicam ente, la enferm e­ dad paralítica producida p o r poliovirus es m ás frecuente en los adultos jóvenes. L a disem inación de los enterovirus se facilita

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s d e las in fe c c io n e s v ira le s

por la m ala higiene, los servicios sanitarios deficientes y el hacinam iento. En las poblaciones en las que el virus se disem i­ na activam ente (de nivel socioeconóm ico bajo), la infección tiene lugar en edades tem pranas y la enferm edad paralítica es infrecuente. Las personas pertenecientes a grupos socioeconó­ m icos más altos escapan a la infección cuando niños y tienen m ayores probabilidades de sufrir una parálisis cuando la co n ­ traen en la adolescencia. Se ha dem ostrado un fenóm eno sim i­ lar con los virus de la varicela-zóster, de E pstein-B arr y de la rubéola. Por fortuna, la enferm edad paralítica era causada casi en form a exclusiva por serotipos virulentos de poliovirus que han sido virtualm ente erradicados por la vacunación en la m ayoría de los países. E n la actualidad el tipo silvestre de poliovirus ha sido erradicado en tres de las seis regiones de la O rganización M undial de la Salud (OM S), con casos recalci­ trantes en A frica, el M editerráneo oriental y el sudeste asiáti­ co.79 La enferm edad paralítica puede ser causada por los virus C oxsackie y los enterovirus tradicionales, pero sólo en muy raras ocasiones. Se ha registrado la producción de enferm edad paralítica por enterovirus 71. La patogenia de la m ayoría de las infecciones causadas por enterovirus consiste en la infección prim aria del aparato respi­ ratorio o gastrointestinal, seguida de virem ia e infección de un órgano diana distante, com o la piel, el corazón o las m eninges. La vacuna inactivada (Salk) contra la poliom ielitis estim ula la form ación de anticuerpos séricos neutralizantes, pero no de anticuerpos en las m ucosas. L a vacuna funciona porque los anticuerpos séricos bloquean la disem inación del virus a las m eninges durante la virem ia. L a incapacidad de la vacuna Salk para prevenir la infección gastrointestinal leve no es un proble­ m a grave para el individuo, pero perm ite la circulación conti­ nua de la cepa virulenta. En los últim os años la m ayoría de los casos de poliom ielitis paralítica en los países desarrollados han sido causados por cepas atenuadas de vacunas (Sabin). Por consiguiente, la vacu­ na inactivada (Salk) se recom ienda una vez m ás para el uso en los Estados U nidos. Los síntom as de la m ayoría de las infecciones causadas por enterovirus son ocasionados por el efecto citopático directo sobre el órgano diana. L a m eningoencefalitis se acom paña por una infección productiva del SNC po r parte del virus que se replica activam ente. Sin em bargo, el síndrom e clínico de m io­ carditis se produce por una reacción inm unitaria contra el teji­ do cardíaco infectado por el enterovirus. E n el m om ento en que el paciente se torna sintom ático, el virus casi siem pre ya ha sido elim inado del corazón. D el conocim iento de la patogenia de la infección por ente­ rovirus surge con claridad que el cultivo tiene sentido en los pacientes con m eningitis aséptica (infección productiva), pero que en los pacientes con m iocarditis (enferm edad inm unopatológica) es im probable que dé com o resultado el aislam iento del virus. Rhabdovirus

Se describieron otros virus im portantes de RNA, algunos de los cuales causan infecciones con alta m ortalidad. Estos virus son fundam entalm ente tropicales y, por lo tanto, es m enos pro­ bable hallarlos en los laboratorios clínicos, en com paración con los picom avirus y los m ixovirus. E ntre estos virus se encuen­ tran los rhabdovirus, que incluyen el agente productor de la rabia, de im portancia m undial. El diagnóstico de rabia se realiza por detección de antígeno viral en m uestras clínicas provenientes de anim ales o seres

1289

hum anos. El cultivo del virus de la rabia se hace con poca fre­ cuencia, debido a la sim plicidad, precisión y rapidez de la inm unofluorescencia directa. Este flagelo histórico es endém i­ co en los anim ales salvajes en los E stados U nidos, pero es excepcional en el hom bre. Sin em bargo, la exposición hum ana sigue existiendo, por contacto con perros de caza expuestos a anim ales salvajes infectados, m urciélagos infectados y anim a­ les dom ésticos.375 Los m urciélagos pueden ser insectívoros y el contacto puede ser sólo casual. E n algunos casos el único co n ­ tacto reconocido fue encontrar un m urciélago en una alcoba, en ausencia de una m ordedura evidente. Puede ser im posible id en ­ tificar una fuente para la rabia hum ana. N o es raro que el diag­ nóstico no se sospeche hasta la autopsia. Las posibles exposiciones causan gran ansiedad debido a la letalidad de la infección. El costo de la prevención de la enfer­ m edad hum ana puede ser enorm e, com o quedó dem ostrado en N ew H am pshire cuando num erosas personas estuvieron poten­ cialm ente expuestas a un gato rabioso en una tienda de m asco­ tas.70 Los costos calculados de la investigación epidem iológica y de la profilaxis fueron de 1,5 m illones de dólares. La enfer­ m edad epizoótica actual de los m apaches del este de los Estados U nidos causa particular preocupación, debido a la fre­ cuencia con la que estos agresivos anim ales invaden las vivien­ das hum anas. L a estructura m olecular de las cepas del virus de la rabia refleja su huésped anim al. E n la actualidad, es posible identificar el origen probable de un aislam iento viral de la com ­ posición de su ácido nucleico. Se ha publicado un caso de transm isión quirúrgica inadvertida de rabia en ocasión de un trasplante de córnea.245 Arenavirus

Los arenavirus son una fam ilia de virus de RN A que co m ­ parten características biológicas fascinantes.48 Sus huéspedes naturales son una variedad de roedores, que persisten infecta­ dos sin que haya una respuesta inm unitaria eficaz por parte del huésped ni enferm edad sintom ática. El virus infeccioso se excreta por orina, que es la fuente de infección hum ana. Por lo tanto, las personas que tienen riesgo de infección son las que entran en contacto con excretas de roedores infectados, y a sea en sus casas o durante el trabajo en el cam po. L a transm isión interhum ana se observa con regularidad sólo en el caso del virus Lassa, por lo general entre m iem bros del personal sanita­ rio que han estado expuestos a líquidos corporales infectados, sobre todo durante autopsias. A parentem ente, varias de las fie­ bres hem orrágicas han sido transm itidas por varones convale­ cientes a sus parejas sexuales. El paciente infectado no repre­ senta un riesgo particular para los individuos que entran en contacto ocasional con él. Las infecciones de laboratorio por estos agentes han sido un riesgo infrecuente pero constante. H ace m uy poco, un investigador se infectó con el virus Sabiá.67 El origen de la infección fue la form ación de aerosoles de m edios de cultivo infectados y probablem ente de orina de roe­ dores. Se han registrado epidem ias de coriom eningitis linfocítica entre investigadores que trabajaban con hám sters o en per­ sonas que poseían esos anim ales com o m ascotas.201 Los principales patógenos hum anos, su distribución geográ­ fica, el roedor reservorio, la enferm edad clínica y la fecha de descubrim iento se resum en en el cuadro 23-3. El virus de la coriom eningitis linfocítica (CM L) fue descubierto en el curso de las investigaciones de la epidem ia de encefalitis de St. Louis en 1933. Pronto se reconoció que este virus producía m eningi­ tis aséptica en el hom bre. Es probable que la frecuencia de la infección esté subestim ada ya que los m édicos no la sospechan

1290

CAPÍTULO 23 Diagnóstico de intecciones causadas por virus, Chlamydia , Rlckettsia y microorganismos relacionados

Cuadro 2 3 -3

Características de los arenavirus patógenos para el hombre

VIRUS

DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

HUÉSPED ROEDOR

ENFERMEDAD HUMANA

TASA DE MORTALIDAD

AÑO DE DESCUBRIMIENTO

Virus de la coriom eningitis linfocítica (LCM) Virus Junín Virus M achupo Virus Lassa Virus G uanarito

Europa, Am érica del Norte y del Sur

Mus domesticus; Mus musculus

M eningitis aséptica

< 1%

1939

Argentina Bolivia Africa Occidental Venezuela

Calomys musculinus Calomys callosus Especies de Mastomys Zygodontomys brevicauda; Sigmodon alsoni

Fiebre Fiebre Fiebre Fiebre

15-30% 25% 15% 25%

1958 1963 1969 1990

Virus Sabiá

Brasil

Desconocido

Fiebre hem orrágica

1990

Virus Arroyo W hite Water

Sudoeste de los Estados Unidos

Neotoma albicula

Fiebre hem orrágica

D em asiado pocos casos para deter­ minarla Varios casos identi­ ficados presunti­ vamente

y no se dispone fácilm ente de m edios diagnósticos. Los inves­ tigadores han encontrado anticuerpos contra el virus de la CM L en el 5,1% de las m ujeres sanas de B irm ingham , A labam a.469 El virus Junín fue el prim er arenavirus conocido com o productor de fiebre hem orrágica, la fiebre hem orrágica argentina de la región pam peana. Los m isterios de su epidem iología fueron revelados algunos años después por Karl Johnson y cois, durante la investigación de un brote de fiebre hem orrágica boliviana en la provincia del Beni, causado por el virus M a­ chupo.261 E stos virus ganaron m ás notoriedad por la aparición de casos de enferm edad hem orrágica grave en varios países de Á frica O ccidental, causados por el virus Lassa. Los agregados m ás recientes provienen de Sudam érica: el virus G uanarito de V enezuela y el virus Sabiá de Brasil. Los antiguos virus toda­ vía conviven con nosotros: ha ocurrido un brote de fiebre hem orrágica boliviana en 1994 en las provincias de El Beni y Santa C ruz.68 Los arenavirus tienen una m orfología distintiva (véase cu a­ dro 23-1), que ha conducido al reconocim iento del grupo.367 Son partículas aproxim adam ente esféricas, envueltas, con pro­ m inentes estructuras sim ilares a ribosom as en su interior. El nom bre del grupo deriva del latín arenosas (arenoso), que fue sugerido por estas partículas internas. La propuesta original, arenovirus, fue luego m odificada para evitar la confusión con los adenovirus. Filovirus

D urante m uchos años, el único m iem bro conocido de este grupo fue el virus M arburg, que produjo una m isteriosa y m or­ tal enferm edad entre cuidadores de m onos en M arburg, A lem a­ nia, en 1967.429 El origen del virus fueron m onos verdes afri­ canos, pero los intentos de aislarlo en m onos recién capturados en Á frica no tuvieron éxito. En el curso de la siguiente década, hubo pocos aislam ientos del virus, que quedó com o curiosidad, aunque una curiosidad mortal. En 1977, un nuevo virus, deno­ m inado virus Ebola, se aisló en brotes sim ultáneos de enfer­ m edad en Zaire y Sudán. Los brotes com partían características clínicas y epidem iológicas y los virus estaban estrecham ente relacionados, aunque eran antigénicam ente diferentes. La enferm edad se caracterizaba por fiebre alta, shock, com prom i­

hem orrágica hem orrágica hem orrágica hem orrágica

1999

so de varios sistem as orgánicos y hem orragias difusas. La tasa de m ortalidad del virus M arburg era del 25% ; la del ÉbolaSudán, 50% y la del Ebola-Zaire, 90% . C om o sucedió con el virus M arburg, el origen de la infección no se conoció, pero la transm isión estaba claram ente asociada con la exposición a líquidos corporales de pacientes infectados. El personal m édi­ co de algunos de los pequeños hospitales m isioneros fue diez­ m ado por la m isteriosa enferm edad. Las dos epidem ias en zonas rem otas del Sudán y del Zaire produjeron alarm a en los círculos dedicados a la salud pública y a las enferm edades infecciosas, pero no alcanzaron al públi­ co general. E sta situación cam bió radicalm ente cuando sucedió un gran brote en 1995 en K ikw it, N igeria. Se registraron más de 300 casos en un corto período; m ás de un tercio de los casos tuvieron lugar en personal sanitario y la m ortalidad fue de aproxim adam ente el 80%. La epidem ia pudo controlarse por la puesta en vigencia de estrictas precauciones de barrera para evitar que los m iem bros de la fam ilia y el personal sanitario entraran en contacto con las secreciones de los pacientes infec­ tados. El origen de esta extensa epidem ia no se aclaró. U na tercera cepa de virus E bola se detectó en C osta de M ar­ fil en 1994. Las conjeturas acerca del origen en la naturaleza de este virus se han concentrado en los m onos debido al origen sim iano del virus M arburg, pero no se han encontrado eviden­ cias sólidas para apoyar esta hipótesis. U na cepa de virus Ebola m uy estrecham ente relacionada con el tipo Z aire se aisló en la sangre de un investigador que probablem ente adquirió la infec­ ción m ientras realizaba la autopsia de un chim pancé infectado. La epidem ia, m uy letal entre los chim pancés, fue la prim era dem ostración de la infección natural en los anim ales salvajes. El acicalam iento y otros tipos de contacto íntim o no eran fac­ tores de riesgo para adquirir la infección para los chim pancés, pero el consum o de carne sí lo era.163 E sta observación hace que la costum bre de com er carne de caza (de anim ales silves­ tres) sea una práctica de m al augurio. D ebido a la alta m ortali­ dad entre los chim pancés, es im probable que estos prim ates sean el reservorio natural de la infección. Las pruebas adicionales del origen sim iano del virus Ébola provienen de una epidem ia de infecciones letales entre m aca­ cos de Java (M acaca fascicularis) en dos instalaciones de cría de anim ales: la prim era en Reston, Virginia, y la segunda en

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s de las in fe c c io n e s v ira le s

Texas. En am bos casos los anim ales habían sido im portados de las Filipinas, y el virus era antigénicam ente diferente de las cepas aisladas en Sudán, Zaire y C osta de M arfil. Se han dem ostrado sólo cinco casos de infección hum ana con la cepa R eston del virus Ébola, todos ellos asintom áticos. E xisten evi­ dencias de transm isión de la infección entre anim ales por aero­ soles, característica epidem iológica terrorífica, que por fortuna no se ha encontrado en las epidem ias hum anas. Tam bién se han publicado datos que indican la existencia de enferm edad epi­ dém ica entre M acaca fa scicu la ris en cautiverio en las Filipinas antes de su exportación. La m ortalidad en los m onos infectados fue del 82% y los m onos m antenidos en grupo en una m ism a ja u la tenían m ayor probabilidad de contraer la infección que los alojados en jaulas individuales. Los filovirus son virus de RNA con una ultraestructura (véase cuadro 23-1) y una m orfología filam entosa característi­ cas que dan su nom bre a la fam ilia. Los dos virus, M arburg y É bola, pueden diferenciarse por su m orfología ultraestructural, y los tipos de virus E bola son antigénicam ente diferentes. Es im probable que estos agentes de nivel 4 de bioseguridad se encuentren en los laboratorios de diagnóstico clínico. Los lectores interesados pueden consultar varios análisis excelentes de la biología de estos virus fascinantes y de las enferm edades que provocan.394-429 Togavirus

En la actualidad, Togaviridae y B unyaviridae incluyen la m ayoría de los virus antes conocidos com o arbovirus (virus transm itidos por artrópodos).55 A m bos grupos com prenden virus de RNA de cadena sim ple, con una envoltura lipídic a 437,439 l os togavirus reciben su nom bre por la “toga” lipídica que rodea al virus. Estos agentes biológicam ente diversos tie­ nen una ecología com pleja; suelen infectar pequeños m am ífe­ ros o aves (reservorios) y son transm itidos de un anim al a otro por garrapatas o m osquitos (vectores). M uchos de ellos tam ­ bién se m antienen por pasaje transovárico desde el insecto adulto a las larvas. El hom bre es un huésped accidental cuando es infectado inadvertidam ente en lugar de los reservorios ani­ m ales habituales. Dos m iem bros de la fam ilia Togaviridae no coinciden con el perfil y se tratarán en su contexto tradicional. Se trata del virus de la rubéola, un alfavirus, y del virus de la hepatitis C, un fla­ vivirus. Existen dos divisiones dentro de Togaviridae. Los alfavirus (antes arbovirus del grupo A) están constituidos por los agen­ tes de la encefalitis equina del Este, la encefalitis equina del O este y la encefalitis venezolana. Los flavivirus (antes arbovi­ rus del grupo B) incluyen los agentes de la encefalitis de San L uis, el dengue (fiebre quebrantahuesos), la fiebre am arilla y la fiebre del N ilo O ccidental. Todos los años se registran pequeñas cantidades de casos de encefalitis equina del Este y de encefalitis equina del Oeste. La enferm edad hum ana puede presagiarse por un aumento de la in­ cidencia de la enferm edad en los caballos. Las epidemias de ence­ falitis de San Luis ocurren aproxim adam ente cada 10 años en la zona sur de los Estados Unidos, sobre todo en Texas, los estados de la C osta del G olfo y en Florida. El reservorio de la encefa­ litis de San Luis son las aves y los mosquitos vectores varían de acuerdo con la localidad geográfica. La enfermedad es más grave en el anciano y los casos se encuentran concentrados en zonas densamente arboladas con casas mal protegidas de los insectos. El dengue es prevalente en el Caribe y en el sudeste asiático. En los Estados U nidos se ven casos im portados cada vez m ás a

1291

m enudo y se describió la transm isión dom éstica ocasional del virus dentro del país, en especial en Texas. U na vía de entrada en los Estados U nidos muy poco habitual se descubrió cuando se encontraron m osquitos infectados en el agua estancada que se había acum ulado en neum áticos de autom óvil im portados del sudeste asiático. L a infección por dengue no com plicada es una enferm edad febril indiferenciada, a veces acom pañada por exantem a y artralgias o artritis. El diagnóstico diferencial in ­ cluye otras infecciones virales, com o la rubéola. Existen cuatro serotipos de virus del dengue. H alstead propuso la hipótesis de que la infección sucesiva con diferentes serotipos desencadena m ecanism os inm unopatológicos que causan el síndrom e de fie­ bre hem orrágica del dengue.210,327 L im itada años atrás al sudes­ te asiático, la form a hem orrágica letal de la enferm edad se ha observado en el Caribe con frecuencia creciente. Entre estos virus, el que m ás recientem ente ha concitado la atención es el virus del N ilo O ccidental, que causa un espectro de enferm edades neurológicas com o encefalitis, m eningitis y un síndrom e sim ilar a la poliom ielitis.443 H asta 1999 había pro­ ducido infecciones localizadas en A frica, M edio O riente y E uropa O riental. En ese año hizo su aparición sorpresiva en la ciudad de N ueva York y desde entonces se ha expandido a to ­ dos los Estados U nidos. Se creyó que los prim eros casos de encefalitis estabn causa­ dos por el virus de la encefalitis de San Luis, relacionado inm unológicam ente con el virus del N ilo O ccidental. A m bos virus com parten otras características, com o tener las aves com o huésped frecuente (una característica que puede estar vincula­ da a su rápida disem inación). Así, en unos pocos años, el virus del N ilo O ccidental ha pasado de ser una trivialidad exótica a tener im portancia cotidiana.396 Bunyavirus

La fam ilia B unyaviridae está constituida por un grupo gran­ de y heterogéneo de virus transm itidos al hom bre por artrópo­ dos vectores, sobre todo garrapatas y m osquitos, y por las excretas de roedores. E xisten cuatro géneros de im portancia m édica: 1) los bunyavirus, que incluyen el grupo de la encefa­ litis de C alifornia; 2) los nairovirus, que incluyen los virus de la fiebre hem orrágica del C ongo-C rim ea; 3) los flebovirus, que incluyen los virus de la fiebre del valle del R ift y el virus de la fiebre por flebótom os y 4) los hantavirus, que incluyen los agentes de la fiebre hem orrágica de Corea, la nefropatía epidé­ m ica y el síndrom e pulm onar por hantavirus.55,374

VIRUS DE LA ENCEFALITIS DE CALIFORNIA

Los bunyavirus más importantes en los Estados Unidos son los pertenecientes al grupo de virus de la encefalitis de California. A pesar del nombre “de California” estos virus causan enfermedad con m ayor frecuencia en los estados centrooccidentales y del cen­ tro y norte. Los virus de la encefalitis de California suelen produ­ cir meningitis aséptica, enfermedad que aparece en verano y que es clínicam ente indistinguible de la enfermedad causada por ente­ rovirus.55,374 El virus de la encefalitis de California propiam ente dicho es poco frecuente; el virus L aC rosse es el patógeno hum a­ no más frecuente del grupo. La m ayoría de los pacientes se recuperan de la infección sin secuelas.

HANTAVIRUS

Los hantavirus son un grupo de virus en constante expansión que se han transform ado de agentes infecciosos exóticos en

1 29 2

CAPÍTULO 23

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia , Rickettsia y microorganismos relacionados

am enazas endém icas en los Estados U nidos.439 Las caracterís­ ticas uniform es del grupo son la infección persistente, asinto­ m ática de un huésped roedor, la probable transm isión al hom ­ bre a través de excretas de roedores infectados y la infección del endotelio vascular. El estado de conocim iento actual de estos virus, su huésped roedor y las enferm edades clínicas aso­ ciadas se resum en en el cuadro 23-4. D urante la guerra de Corea, se detectó una grave fiebre hem orrágica entre los soldados norteam ericanos. El shock y la insuficiencia renal, que eran los síntom as m ás destacados, pro­ porcionaron el descriptivo nom bre de fiebre hem orrágica con síndrom e renal (FH SR). El cuadro clínico clásico com prende fiebre, plaquetopenia e insuficiencia renal. La recuperación de las plaquetas presagia la recuperación de la función renal nor­ mal. El shock y el fallo m ultiorgánico, sim ilares a los de una sepsis bacteriana, caracterizan a los casos m ás graves. Las m anifestaciones m enos frecuentes son hem orragias retroperitoneales y edem a pulmonar. A lgunos pacientes tienen una enfer­ m edad febril indiferenciada con función renal norm al. En G recia, donde las cepas prevalentes recuerdan al virus asocia­ do con las infecciones de Corea, se describió un síndrom e clí­ nico con enferm edad hepática grave. Luego de la dem ostración de la enferm edad en Corea, se reconoció que este grave síndrom e clínico ocurría en el este de la Unión Soviética y en M anchuria. El agente etiológico no fue aislado hasta 1982, cuando se aisló el virus H antaan (cuyo nom ­ bre deriva del río de Corea donde se observó enferm edad epi­ dém ica). Este virus causa una infección asintom ática persisten­ te en su huésped roedor, Apodem us agm rius. M ás tarde, se aisló un segundo agente relacionado, el virus Seúl, que causa una infección m enos grave. Los huéspedes roedores del virus Seúl son las ratas urbanas, Rattus norvegicus y Rattus rattus. Este virus se ha encontrado en ratas de laboratorio y ha causado infección en personal de laboratorio. No existen casos docu­ m entados de infección por virus H antaan en los Estados Unidos, pero se han dem ostrado serológicam ente casos de FHRS causa­ da por el virus Seúl en Baltimore. Los hantavirus asociados con ratas en los Estados U nidos se han relacionado con frecuencia con la enferm edad renal hipertensiva, pero no con otras enfer­ m edades renales crónicas.186 A unque la enferm edad hipertensi­

Cuadro 2 3 -4

va renal no suele asociarse con agentes infecciosos, la lección proporcionada por H elicobacter pylo ri y la gastritis debe aler­ tam os acerca de no despreciar esta asociación. U na versión m ás leve de esta infección, conocida com o ne­ fropatía epidém ica, es causada por el virus P uum ala y se obser­ va en E scandinavia (cuadro 23-4).439 El virus produce infeccio­ nes asintom áticas en ratones cam pestres; en el hom bre es una enferm edad febril aguda con dolor lum bar y poliuria, pero con m anifestaciones hem orrágicas leves o sin ellas, y sin shock. Los pacientes se recuperan sin secuelas. Los síntom as son casi siem pre inespecíficos y el diagnóstico clínico fue correcto sólo en el 28% de los casos en un estudio finlandés. La atención se centró en los hantavirus en 1993, cuando se observó un brote de enferm edad respiratoria grave en la zona de Four C om ers, en el sudoeste de los Estados U nidos.395439 Los pacientes tenían un síndrom e prodróm ico con fiebre, m ial­ gias, tos o disnea, síntom as gastrointestinales y cefalea, que progresaba rápidam ente al edem a pulm onar irreversible. El agente causal fue reconocido con sorprendente rapidez com o un nuevo m iem bro del género hantavirus, denom inado virus Sin N om bre (inicialm ente virus Four Corners). El huésped ro e­ dor del virus Sin N om bre es el ratón ciervo, Perom yscus maniculatus. Se ha adelantado la hipótesis de que las lluvias copio­ sas increm entan las fuentes de alim entación, lo que ocasiona un gran aum ento del núm ero de ratones y del contacto del h om ­ bre con éstos, alterando así la epidem iología, que pasa de ser una enferm edad esporádica, endém ica, a una infección epidé­ m ica. No existen evidencias de transm isión interhum ana del síndrom e pulm onar por hantavirus. El diagnóstico retrospecti­ vo de casos de infección por virus Sin N om bre o un virus rela­ cionado, ocurridas hace tanto com o en 1978, se ha hecho por tinción con inm unoperoxidasa de tejidos incluidos en parafina y conservados desde esa fecha.534 La totalidad de las 12 infec­ ciones identificadas retrospectivam ente habían ocurrido al oeste del río M isisipi, la m ayoría en el Lejano Oeste. Con posterioridad al descubrim iento del virus Sin N om bre se han identificado otros hantavirus relacionados en los Estados Unidos: en Louisiana, Florida y en el este (cuadro 23-4). Se des­ conoce la frecuencia de la infección por hantavirus fuera de las áreas endém icas.

Hantavirus seleccionados: huéspedes y enferm edades clínicas"

VIRUS

DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

HUÉSPED ROEDOR

Hantaan

Lejano Oriente

Apodemus agrarius (form a oriental)

Seúl Dobrava Puum ala Sin Nom bre

Mundial Balcanes Escandinavia; Europa Sudoeste de los Estados Unidos

Rattus rattus; Rattus norvegicus (ratas de ciudad) Apodemus flavicolis Clethrionomys glariolus (ratones campestres) Peromyscus maniculatus (ratón ciervo)

Bayou Black Creek Canal New York M onongahela

Louisiana Florida Noreste de los Estados Unidos Este de los Estados Unidos

Oligoryzomys palustris (rata del arroz) Sigmodon hispidus (rata del algodón) Peromyscus leucopus (ratón de patas blancas) Peromyscus maniculatus nubiterrae (form a silvestre

Andes

A m érica del Sur y Central

Oligoryzomys longicaudatus

ENFERMEDAD CLÍNICA Fiebre hem orrágica con síndrome renal (FHSR) FHSR leve FHSR Nefropatía endémica Síndrome pulm onar por hantavirus (SPH) SPH Desconocida SPH SPH

del ratón ciervo)

0Para más información sobre otros virus, consultar referencia 439.

SPH

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s de las in fe c c io n e s v ira le s

El pulm ón es el órgano diana, tanto desde el punto de vista anatom opatológico com o clínico.395 El edem a y los depósitos de fibrina con m em branas hialinas localizadas en los espacios aéreos se acom pañan por un exudado intersticial mononuclear. G randes células inm unoblásticas infiltran m uchos órganos. Los hallazgos hem atológicos son leucocitosis con neutrofilia y des­ viación a la izquierda, plaquetopenia, inm unoblastos circulan­ tes y (en los casos graves) hem oconcentración. El antígeno viral se concentra en las células endoteliales, sobre todo en el lecho vascular pulm onar, y pueden verse partículas sim ilares a virus dentro de estas células.533 Los antígenos de hantavirus tam bién se encuentran en las células dendríticas, los m acrófa­ gos y los linfocitos foliculares. Virus de la gastroenteritis humana

L a gastroenteritis viral ocupa el segundo lugar, después de las enferm edades virales respiratorias, com o causa de m orbili­ dad en los Estados U nidos. Su incidencia se ha estim ado en cerca del 11% por año.127 La m ortalidad es rara. En la década pasada, se aprendió m ucho acerca de sus agentes etiológicos, pero puede asignarse una etiología a sólo el 50% de las gastro­ enteritis virales. La m ayoría de estos agentes han sido identifi­ cados por inm unom icroscopia electrónica. En esta técnica, se m ezcla suero inm une con una suspensión de virus o una m ues­ tra de heces. Puede observarse la aglutinación de partículas subm icroscópicas exam inando con el m icroscopio electrónico preparaciones con tinción negativa. La m ayoría de estos agen­ tes no son fáciles de cultivar. P or lo tanto, no se conocen deta­ lles acerca de su com posición; por razones de conveniencia, serán tratados junto con el agente patógeno m ás frecuente: los rotavirus. Los agentes de la gastroenteritis viral pueden dividirse en seis grupos. La clasificación se encuentra en etapa em brionaria debido al lim itado conocim iento que se posee acerca de algu­ nos de ellos: Rotavirus Calicivirus (virus redondos pequeños) A gentes sim ilares al N orw alk (norovirus) Sapovirus A strovirus A denovirus entéricos La frecuencia de estos virus en los Estados U nidos se resum e en el cuadro 23-5. Los datos provienen de un estudio m ulticéntrico, realizado con m icroscopia electrónica.309 La identificación de los agentes en este estudio fue puram ente morfológica; es probable que los adenovirus estén representados en exceso, por­ que el enfoque ultraestructural no diferencia los serotipos gas­ trointestinales de los respiratorios. M uchos aspectos de estas infecciones gastrointestinales virales son sim ilares. C ausan vóm itos o diarrea agudos, casi siem pre leves, autolim itados y no inflam atorios. No hay diarrea sanguinolenta. El análisis m icroscópico de biopsias provenien­ tes de voluntarios hum anos que han ingerido estos agentes infecciosos m uestra aplanam iento de las vellosidades intestina­ les y cam bios inflam atorios leves de la subm ucosa, alteraciones que son indicativas de m alabsorción del intestino delgado. Las células deterioradas en las puntas de las vellosidades son reem ­ plazadas por células de la base de las criptas en el térm ino de 5 a 10 días. L a diarrea que dura m ás de 7 a 10 días tiene pocas probabilidades de ser de etiología viral. El tratam iento es la reposición de los líquidos y electrolitos perdidos, en general

1293

por los vóm itos. Lam entablem ente, la inm unidad parece ser sólo p arcial.127 Cabe destacar la ausencia de virus intestinales convenciona­ les en la lista de agentes patógenos. Existen pocas evidencias de que los enterovirus o los adenovirus respiratorios produzcan enferm edad gastrointestinal.

ROTAVIRUS

Los rotavirus son los patógenos hum anos más im portantes dentro de los R eoviridae. En sí m ism os no se asocian con enferm edades hum anas, pero han sido útiles para el estudio de los m ecanism os m oleculares de la patogenia viral. "R eo” sig­ nifica respiratory-enteric-orfan, nom bre proveniente del origen de los aislam ientos del virus y de la falta de asociación con enferm edad clínica. Los rotavirus recibieron su nom bre por el aspecto en rueda del virión en las m icrofotografías electrónicas (véase cuadro 23-1). Los rotavirus incluyen patógenos tanto hum anos com o ani­ males, pero los rotavirus anim ales no infectan al hom bre. Los rotavirus hum anos han sido clasificados serológicam ente y la m ayoría de las cepas patógenas para el hom bre encontradas en los Estados U nidos y E uropa pertenecen al grupo A. Los rotavirus hum anos son causa frecuente de gastroenteritis en lactan­ tes y niños pequeños.271 L a presentación clínica es variable, pero los vóm itos y la deshidratación son características clínicas prom inentes en com paración con la gastroenteritis causada por otros virus. La com binación de vóm itos y la aparición estacio­ nal en los m eses de invierno han llevado a los investigadores a d enom inar a este cuadro “enferm edad de vóm itos del invier­ no” . L a frecuencia y la especificidad de los síntom as respirato­ rios en la infección por rotavirus son controvertidas. Es posible que la prevalencia de los vóm itos en las infecciones por rotavi­ rus refleje la edad del paciente m ás que una propiedad del virus, ya que el agente N orw alk causa m ucho más vóm itos en los niños. U hnoo y Svensson com pararon las características del grupo A, subgrupos 1 y 2 en lactantes suecos.485 Los pacientes con infecciones por cepas del subgrupo 1 tuvieron fiebre de hasta 39 °C en form a significativam ente más frecuente que los infectados por el subgrupo 2, pero los lactantes que tenían in­ fecciones por el subgrupo 2 estaban m ás enferm os, fueron hos­ pitalizados con m ayor frecuencia y tenían m ayores probabili­ dades de sufrir síntom as respiratorios. La frecuencia de diarrea y vóm itos en los dos grupos fue similar.

Cuadro 2 3 -5

Prevalencia de los agentes virales productores de gastroenteritis en los Estados Unidos y Canadá

Cantidad de positivos Rotavirus Astrovirus Calicivirus SRV/SRSV» Adenovirus Coronavirus Otros

8 262 48% 2,4% 1,3% 10,0/0,4% 17,2%fc 6,6% b

14,6%

" Virus redondos pequeños/virus redondos pequeños estructurados, incluso los simila­ res al agente Norwalk. bIncluye tanto cepas respiratorias como intestinales. Adaptado de la referencia309.

1294

CAPÍTULO 23 Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Puede haber infecciones crónicas por rotavirus en niños inm unosuprim idos. En los adultos, la infección suele ser asintom ática. Estos virus son notorios causantes de infecciones intrahospitalarias, incluso de epidem ias, en los niños.

CALICIVIRUS

Estos virus, identificados al principio por m icroscopia elec­ trónica, se caracterizaron descriptivam ente com o virus peque­ ños de estructura redonda.200 Existen dos grupos principales de virus dentro de los calicivirus, que se describen a continuación. Virus sim ilares a l Norwalk (Norovirus). El agente N orw alk de la gastroenteritis se reconoció com o una partícula de 27 nm en m uestras de heces de un brote de gastroenteritis en la com uni­ dad de N orw alk, Ohio. M ás tarde, se han aislado virus de RNA sim ilares en otras epidem ias. El análisis m olecular ha revelado que existen dos grupos principales.11 Estos agentes se denom i­ nan norovirus.274 Los virus sim ilares al N orw alk han causado epidem ias de enferm edad con frecuencia y tam bién producen infecciones esporádicas;200 originan infección y enferm edad activa en per­ sonas de todas las edades, a diferencia de la m ayoría de otros agentes virales, que producen enferm edad sintom ática sobre todo en lactantes y niños pequeños. Son la principal causa de gastroenteritis infecciosa en los adultos. Los agentes sim ilares al N orw alk se han asociado con alim entos y agua contam ina­ dos y son una de las posibilidades para considerar cuando un paciente ha ingerido recientem ente m ariscos. Se describió enferm edad epidém ica en ám bitos que varían desde juegos de fútbol hasta cruceros de placer o institutos geriátricos. Virus sim ilares a l Sapporo (Calicivirus clásicos). Estos agentes son m orfológicam ente parecidos a los virus sim ilares al N orw alk, pero difieren desde el punto de vista inm unitario y genético. A lgunos autores los consideran agentes im portantes de gastro­ enteritis en los niños, a veces transm itida por alim entos.93 Otras autoridades en la m ateria se reservan su ju icio .200

ASTROVIRUS

Los astrovirus tam bién contienen RNA y han sido difíciles de cultivar in vitro, aunque algunas cepas se han desarrollado con éxito.339 Su nom bre proviene de su aspecto ultraestructural en form a de estrella. Los astrovirus son elim inados en grandes cantidades en las heces, pero parecen ser m enos patógenos que los agentes tipo N orw alk. Han causado enferm edades epidém i­ cas en niños pequeños, en guardias pediátricas, en guarderías y en sanatorios. Se describió la infección sim ultánea con astrovi­ rus y calicivirus. ADENOVIRUS ENTÉRICOS

N o puede establecerse una relación causal de los serotipos clásicos de adenovirus con la enferm edad diarreica, pero se han dem ostrado serotipos “no cultivables” por inm unom icroscopia electrónica. Los adenovirus tipos 40 y 41, que no se desarrollan bien en los tipos habituales de cultivo de tejidos, son patógenos intestinales.244 Estos adenovirus entéricos son la segunda causa en orden de frecuencia de gastroenteritis viral en los lactantes. Causan infecciones esporádicas, aunque se notificaron epide­ mias. La m ayoría de los pacientes son m enores de 2 años. Coronavirus

Los coronavirus clásicos son causantes del resfriado co­ m ún.236 L a m ayoría requiere el uso de cultivos de órganos para

el aislam iento fiable y es im probable que se los encuentre en el laboratorio clínico. En 2003 se produjo un espectacular agregado al género, cuando un nuevo coronavirus se identificó com o la causa de una nueva y m isteriosa enferm edad respiratoria en China. Esta infección se llam ó síndrom e respiratorio agudo grave (SRAG). A diferencia de las infecciones conocidas antes por coronavi­ rus, el SRAG se caracteriza por una infección de las vías respi­ ratorias bajas que a m enudo requiere la hospitalización en una unidad de cuidados intensivos; puede ser m ortal.3694 O tra característica problem ática de esta infección es su propensión a infectar al personal de los hospitales, en especial a los que han estado en contacto estrecho con los pacientes.230 Con asom brosa rapidez, con la colaboración de científicos de todo el m undo y por m edio de técnicas m oleculares, la causa de la infección fue identificada com o un nuevo coronavirus. La im portancia de un m etaneum ovirus hum ano que fue aislado en algunos pacientes no se ha aclarado.86 Cabe destacar que un coronavirus convencional, O C243, produjo un brote reciente de infecciones respiratorias que incluyeron neum onías. Coltivirus

Este grupo incluye el virus de la fiebre por garrapatas del C olorado, una enferm edad febril indiferenciada, casi siem pre leve y autolim itada, pero que puede ser grave o incluso m or­ tal.424 Se transm ite por la picadura de garrapatas. Este virus estaba incluido antes en el grupo O rbivirus, que está com pues­ to por patógenos para los anim ales. Los orbivirus son m iem ­ bros de la fam ilia R eoviridae, ju n to con los rotavirus. Retrovirus

Los retrovirus son virus de RNA; reciben ese nom bre porque contienen una enzim a que transcribe el RNA a DNA, a la inver­ sa de lo que sucede norm alm ente, que el DNA se transcribe a RNA. Durante m uchos años, estos virus fueron conocidos com o causantes de tum ores en los anim ales. En la década de 1970, se encontraron dos virus que causaban linfom as linfocíticos de células T en seres hum anos, que se denom inaron virus del linfom a hum ano de células T (HTLV-I y HTLV-II). Este descu­ brim iento fue im portantísim o desde el punto de vista biológi­ co, pero los tum ores son poco frecuentes.190 El grupo de los retrovirus adquirió un súbito aum ento de su notoriedad en 1983, cuando se identificó un tercer retrovirus com o causante del síndrom e de inm unodeficiencia adquirida (SID A ).165 El SIDA había sido reconocido clínicam ente varios años antes, cuando se detectaron infecciones oportunistas en varones jóvenes hom osexuales, bisexuales o drogadictos, pero que no tenían los factores de riesgo convencionales para la neu­ m onía por P neum ocystis ni para la candidiasis. Se han aislado virus sim ilares en varios laboratorios, que han recibido indistintam ente el nom bre de HTLV-III, virus asocia­ do con linfadenopatía (LAV) y virus relacionado con el SIDA (ARV). Un panel de expertos determ inó el nom bre definitivo: virus de la inm unodeficiencia hum ana (HIV). A unque el HIV fue aislado por prim era vez en 1983, el análisis retrospectivo de sueros y tejidos congelados sugiere que un virus sim ilar había infectado a un adolescente sexualm ente activo en St. Louis en 1968.176 M ás tarde, se aisló un virus serológicam ente relacio­ nado que se denom inó HIV-2. La distribución del HIV-1 es m undial. El HIV-2, que se encuentra fundam entalm ente en A frica O ccidental, tam bién causa un síndrom e de inm unodefi­ ciencia adquirida. Se han inform ado casos de infección por

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s d e las in fe c c io n e s v ira le s

HIV-2 en los Estados U nidos, pero la m ayoría de estos pacien­ tes tenían alguna conexión con A frica O ccidental. Existen reacciones inm unitarias cruzadas entre el H IV -l y el HIV-2. D eben realizarse inm unoanálisis específicos para distinguir entre am bas infecciones y tam bién para detectar los antígenos tipo específicos con la m áxim a sensibilidad. Para com plicar aún m ás las cosas, se ha identificado al m enos un paciente infectado por am bos virus. El H IV es m iem bro de la subfam i­ lia lentivirus (lenti = lento) de Retroviridae. O tros virus de este grupo causan infecciones crónicas con largos períodos de latencia clínica. A lgunos retrovirus de anim ales tam bién produ­ cen inm unodeficiencias, com o el virus de la inm unodeficiencia sim iana y el virus de la leucem ia felina. N o se ha dem ostrado la infección entre especies. Al contrario de otros lentivirus, el HIV es m uy heterogéneo desde el punto de vista genético, al extrem o que cada aisla­ m iento es casi único (denom inados cuasi-especies). Sin em bar­ go, existen grupos relacionados genéticam ente, que a su vez se dividen en subtipos o ciados. Las cepas del grupo M (m ajor) representan el 95% de los aislam ientos y se dividen en por lo m enos ocho subtipos (A, B, C, D, F, G, H y J). Todos los cia­ dos se encuentran en A frica; en los Estados U nidos y E uropa el ciado B es el subtipo predom inante. (Cabe hacer notar que los ciados genéticos no m apean en serotipos virales definidos). Las cepas del grupo O, que predom inan en A frica O cci­ dental, tienen m enos del 50% de hom ología con las cepas del grupo M. Los virus del grupo N (no-M u O) se encuentran en Cam erún. Todos los retrovirus tienen adem ás tendencia a la recom bi­ nación cuando se superponen m últiples cepas. Se supuso que los pacientes infectados por el HIV deberían ser resistentes a la infección por una segunda cepa. L am entablem ente, la ausencia de inm unidad com pleta y la frecuencia de exposiciones m últi­ ples al virus han tenido com o resultado las infecciones por varias cepas, situación en la que puede tener lugar la recom bi­ nación.30 N o existen dudas acerca de que el HIV es la peste m ás de­ vastadora que enfrentam os al entrar en el siglo xxi. Este virus ha alterado el rostro de nuestra sociedad y continuará causan­ do estragos durante m uchos de los años venideros, sobre todo en el Tercer M undo. Si bien la aparición del tratam iento antirretroviral de alta actividad ha reducido la velocidad de avance de la infección y dism inuido la m ortalidad en los países que pueden conseguir los fárm acos, la epidem ia continúa avanzan­ do. En el cuadro 23-6 se resum e el estado actual de la epidem ia m undial. El análisis que sigue es un breve intento de presentar algu­ nas de las características m ás prom inentes de este virus m ultifacético y de la enferm edad que causa. Es un tributo a la cien­ cia m oderna que un agente infeccioso haya sido aislado sólo 3 años después de los prim eros inform es del síndrom e clínico. Sin el m oderno arsenal de la biología y la virología m olecula­ res, todavía estaríam os indefensos ante este flagelo. El virión del H IV -1 es icosaédrico y tiene 72 espículas exter­ nas.165 Es considerablem ente m ás com plejo que el HTLV-1 y el HTLV-2, en consonancia con su evolución natural m ás com pli­ cada. Los productos genéticos pueden dividirse en tres grupos. Las proteínas virales que representan los antígenos m ás im por­ tantes para el diagnóstico se resum en en el cuadro 23-7. L a proteína de envoltura g p l2 0 tiene la inform ación para el ingreso del virus H IV -l en el paciente.165 E sta proteína tiene una afinidad destacable por un com plejo de receptores existen­ te en la superficie de células distribuidas por todo el organism o. El principal com ponente del com plejo, el receptor CD 4, se

Cuadro 2 3 -6

1295

La epidemia mundial de HIV en el año 2003

PARAMETRO

REGIÓN GEOGRAFICA

PERSONAS AFECTADAS

Personas que viven con SIDA

Todo el mundo N orteam érica Africa subsahariana

34 a 46 millones 790 000 a 1,2 millones 25 a 28,2 millones

Nuevos casos de adul tos y niños infecta­ dos por el HIV

Todo el m undo N orteam érica Africa subsahariana

4,2 a 5,8 millones 36 000 a 54 000 3 a 3,4 millones

M uertes de adultos y niños debidas al SIDA

Todo el m undo N orteam érica Africa subsahariana

2,5 a 3,5 millones 12 000 a 18 000 2,2 a 2,4 millones

Fuente: Annual UN AIDS Epidemic Update Repon en http://www.unaids.org.

encuentra en los linfocitos T helper, m acrófagos y células de L angerhans de la piel. La segunda parte del com plejo de recep­ tores es una quim iocina receptora. Las cepas virales que inte­ ractúan con el receptor C X C R 4 (virus X 4) tienen m ayores p ro ­ babilidades de infectar los linfocitos T in vitro; las cepas que interactúan con el receptor CCR5 (virus R5) se asocian in vitro con líneas celulares de m acrófagos. A lgunos virus, que interac­ túan con am bas quim iocinas correceptoras, pueden infectar tanto linfocitos com o m acrófagos. Se ha adelantado la hipótesis de que los hom bres no circun­ cidados tienen m ayores probabilidades de desarrollar infeccio­ nes por H IV porque el prepucio tiene abundantes células de L angerhans, así com o m acrófagos y linfocitos.3 La m ayor sus­ ceptibilidad a la infección por el HIV de los pacientes con úlce­ ras genitales puede ser el resultado de la accesibilidad de los m acrófagos y linfocitos CD 4+ en las bases inflam adas de las úlceras.444 Sin em bargo, las células diana m ás im portantes del virus son los linfocitos T C D 4 + .103 Estos linfocitos helper representan el centro neural del sistem a inm unitario celular. Sin ellos, el orga­ nism o tiene m ayores riesgos de sufrir m uchas infecciones oportunistas. A dem ás de la anorm alidad de las células T, se ha dem ostrado tam bién una respuesta defectuosa de las células B a antígenos T independientes. Los m acrófagos son m uy im por­ tantes, ya que proporcionan un sitio donde el virus queda o cu l­ to, incluso después de que las células T han sido destruidas y la m ayor parte del virus ha sido elim inada por la quim ioterapia. L a prim oinfección por el virus HIV causa una enferm edad febril transitoria, que puede estar acom pañada por linfadeno­ patía, faringitis o una erupción cutánea difu sa.103 D urante la enferm edad aguda se encuentran altos niveles de virus circu­ lante, en ausencia de anticuerpos específicos. En el curso natu­ ral de la infección, los anticuerpos se desarrollan después de varias sem anas a varios meses. La siguiente fase subclínica de la enferm edad está acom pa­ ñada p o r la presencia de anticuerpos, antígeno p24 circulante, inm unocom plejos y bajos niveles de virus circulante. Se ha introducido la realización de pruebas para detectar el virus en hem oderivados, en un intento de reducir al m ínim o el riesgo de transfundir unidades infectadas. D urante la fase de virem ia cró­ nica, m utaciones repetitivas del genom a viral abortan los inten-

1296

CAPÍTULO 23 Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Cuadro 2 3 -7

Las infecciones oportunistas m ás frecuentes que afectan a los pacientes infectados por el HIV se encuentran entre las enferm edades definitorias de SIDA enum eradas en el cuadro 23-9. A lgunas de esas infecciones son características de una fase particular de la enferm edad. Por ejem plo, la candidiasis bucal suele ser una característica de presentación de la en fer­ m edad. L a neum onía por P neum ocystis jiro veci (carinii) apa­ rece por prim era vez cuando los recuentos de linfocitos se encuentran relativam ente altos, al com ienzo del proceso pato­ lógico. Las infecciones por el com plejo M ycobacterium avium tienden a presentarse tardíam ente en el curso de la enferm edad, cuando los recuentos de linfocitos C D 4+ son bajos. A unque las infecciones con agentes patógenos asociados con células (m icroorganism os intracelulares facultativos) se relacionan m ás estrecham ente con defectos de la inm unidad celular, las infecciones bacterianas para las cuales la inm unidad hum oral es im portante para la defensa del huésped tam bién son m ás fre­ cuentes en los pacientes infectados por el HIV. La búsqueda de la etiología de una infección oportunista no debe detenerse cuando se identifica el prim er agente, ya que m uchas de las infecciones en los pacientes con SIDA son polim icrobianas. N o todas las enferm edades relacionadas con el H IV son cau­ sadas por infecciones oportunistas. El virus es citopatogénico por sí m ism o y causa enferm edades clínicas com o encefalitis y dem encia relacionada con el SIDA. El colapso del sistem a inm unitario celular y sus m ecanism os de vigilancia conduce a com plicaciones neoplásicas, algunas de las cuales pueden ser producidas por virus. Los linfom as son frecuentes.350 U na neoplasia antes rara, el sarcom a de K aposi, se ha registrado a m enudo en los pacientes con SIDA, m uchas veces com o m ani­ festación precoz de la enferm edad. O tras m anifestaciones pu e­ den tener un m ecanism o inm unopatológico o ser de m ecanis­ m o desconocido. A lgunas infecciones que deberían afectar a pacientes con SIDA, com o la legionelosis o la aspergilosis, son bastante infrecuentes. Sin duda, el sistem a inm unitario celular contribuye al control de la aspergilosis y la legionelosis invasoras, pero otros m ecanism os, no destruidos por el HIV-1 son tal vez de im portancia. A m edida que ha m ejorado el tratam iento para la infección por el H IV y para las com plicaciones infecciosas de la inm u­ nodeficiencia, el patrón de infecciones encontradas ha cam bia­ do. U n análisis de autopsias realizadas en Los A ngeles entre 1982 y 1993 dem ostró una dism inución del núm ero de infec­ ciones m ortales causadas por P neum ocystis jiroveci, sepsis

Principales antígenos del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1

GEN

P R O D U C T O S G E N É T IC O S

Antígeno grupoespecífico/core (GAG)

p (proteína) 18. p24, p55

Polim erasa (POL)

p 3 1, p 5 1, p66

Envoltura (ENV)

gp(glucoproteína)41, gp l2 0 , g p l6 0

Adaptado de la referencia62.

tos del sistem a inm unitario del huésped para elim inar la infec­ ción. El com ienzo de la enferm edad clínica se asocia con un aum ento de la cantidad de virus, tanto en las células m ononu­ cleares de sangre periférica com o en el plasm a. D espués de la infección por el HIV-1 puede aparecer un am plio espectro de cuadros clínicos. La clasificación de los CD C de la enferm edad por HIV se resum e en los cuadros 23-8 y 23-9.61 C iertas enferm edades (grupo C del cuadro 23-9) se asocian con alta frecuencia con el HIV y se denom inan enfer­ m edades definitorias del SIDA. Las com plicaciones infecciosas de la infección por el HIV incluyen infecciones virales, m icóticas, m icobacterianas, bac­ terianas y parasitarias. La práctica de la infectología y de la m icrobiología clínica ha sido irrevocablem ente alterada por este virus. N um erosas infecciones, antes consideradas exóticas o poco frecuentes, se han transform ado en cuadros com unes en centros que atienden a gran cantidad de pacientes infectados por el HIV. Las antiguas reglas deben descartarse cuando el enferm o está tan intensam ente inm unosuprim ido com o lo están los pacientes con SIDA o los pacientes con trasplante de órga­ nos im portantes. Todo es posible y la respuesta inflam atoria del huésped que se ha asociado con un agente infeccioso en parti­ cular puede estar presente o no. Lo que en un paciente norm al sería m icrobiología indiscrim inada, se transform a en buena práctica en este grupo de enferm os. Es necesaria la integración de datos clínicos, epidem iológicos y de laboratorio para deci­ dir cuáles son los recursos de laboratorio que deben aplicarse a un paciente determ inado.

Cuadro 2 3 -8

Sistema de clasificación revisado en 1993 para adolescentes y adultos positivos para HIV CATEGORÍAS CLÍNICAS

CATEGORÍAS SEGÚN LINFOCITOS T CD4+

(A) Asintomático. HIV primario (agudo) o linfadenopatía persistente generalizada

(B) Sintomático, cuadros diferentes de (A) o (C) (véase cuadro 23-9)

(C) Cuadros marcadores de SIDA (véase cuadro 23-9)

(1) > 500/pL

Al

Bl

Cl»

(2) 200-499/pL

A2

B2

C2"

(3) < 200/pL

A3

B3

C3“

" Estas categorías indican SIDA.

Para la clasificación debe utilizarse el menor recuento de linfocitos T CD4+ confirmado, pero no necesariamente el más reciente. Adaptado de la referencia6'.

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s d e las in fe c c io n e s v ira le s

C uadro 2 3 -9

1297

Enfermedades accesorias (categoría B) y enfermedades incluidas en la definición de vigilancia de casos (categoría C) de SIDA de 1993

C a te g o ría B Angiom atosis bacilar Candidiasis orofaríngea (muguet) Candidiasis vulvovaginal; persistente, frecuente, o con mala respuesta al tratamiento Displasia cervical (moderada o grave)/carcinom a in situ Enferm edad inflam atoria pelviana, particularm ente si está com plicada con abscesos tuboováricos Herpes zóster (zona), que incluya al m enos dos episodios diferentes o más de un dermatom a L eucoplasia vellosa bucal Listeriosis N europatía periférica Otros cuadros no especificados Púrpura trom bocitopénica idiopática Síntomas generales, com o fiebre (38.5 °C) o diarrea de más de un mes de duración C a te g o ría C “ Candidiasis de bronquios, tráquea o pulm onar Candidiasis de esófago Cáncer cervical invasor Coccidioidomicosis, diseminada o extrapulm onar Com plejo M y c o b a cteriu m a viu m o M y c o b a cteriu m k ansasii, diseminado o extrapulm onar Criptococosis extrapulmonar Criptosporidiosis intestinal crónica (de más de un mes de duración) Encefalopatía relacionada con el HIV Enferm edades producidas por citom egalovirus (excepto hígado, bazo, ganglios linfáticos) Herpes simple: úlceras crónicas (de más de 1 mes de duración); o bronquitis, neum onitis o esofagitis Histoplasmosis, disem inada o extrapulmonar Isosporiasis intestinal crónica (de más de un mes de duración) Leucoencefalopatía multifocal progresiva Linfom a de Burkitt (o térm ino equivalente) Linfom a inm unoblástico (o térm ino equivalente) Linfom a primitivo de cerebro M yco b a cteriu m tu b ercu lo sis en cualquier localización (pulmonar o extrapulmonar)

Neum onía por P n e u m o c ystis jiro v e c i Neum onía recidivante Otras especies de M y c o b a cteriu m o especies no identificadas, diseminadas o extrapulmonares Retinitis por citomegalovirus con pérdida de visión Sarcom a de Kaposi Septicem ia recidivante por S a lm o n ella Síndrome de em aciación producido por el HIV Toxoplasmosis cerebral

“ Estas categorías indican SIDA. Adaptado de la referencia6'.

bacteriana, citom egalovirus, com plejo M ycobacterium avium y Toxoplasm a gondii entre 1989 y 1993, en com paración con el período 1982-1988.281 En el curso del tiem po, la institución de la profilaxis para las infecciones relacionadas con el SID A y de tratam ientos m ás eficaces ha cam biado las causas de m uer­ te de las personas con SID A .314 A unque las enferm edades definitorias de SID A siguen siendo im portantes, otras enferm eda­ des crónicas y las com plicaciones del tratam iento han cobrado m ayor relevancia.

Estos cam bios tam bién afectan la form a en que se lleva a cabo la vigilancia para la infección.72 La nueva definición del cuadro conserva los criterios clínicos e inm unológicos que eran el cuerpo central de los estándares de vigilancia previos (cua­ dros 23-8 y 23-9), pero agrega un criterio virológico (cuadro 23-10). Según el nuevo enfoque, se incluyen los pacientes infectados, pero en los cuales todavía no se ha desarrollado la enferm edad clínica. En el nuevo estándar se incluyen pautas para niños. Las recom endaciones revisadas para la detección

1298

CAPÍTULO 23 Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia , Rickettsia y microorganismos relacionados

Cuadro 2 3 -1 0 Definiciones de caso revisadas para la vigilancia de la enfermedad por HIV

GRUPO DE PACIENTES

CRITERIOS DE LABORATORIO

CRITERIOS CLÍNICOS Y OTROS CRITERIOS (SI NO SE CUMPLEN LOS CRITERIOS DE LABORATORIO)

Adultos, adolescentes o niños > 18 meses

Serología positiva para HIV» O BIEN Prueba viral positiva11

Diagnóstico de infección por el HIV, sobre la base de criterios de laboratorio, consignado en una historia clínica por un m édico O BIEN E nferm edades incluidas en la definición de casos de SIDA (cuadros 23-8 y 23-9)

Niños < 1 8 meses

Prueba viral positiva en dos oportunidades dife­ rentes (excluida sangre del cordón) O BIEN Prueba viral positiva (presuntiva) en una oportunidad (excluida sangre del cordón) y ninuna prueba viral o resultados de serología posteriores

Diagnóstico de infección por el HIV, sobre la base de criterios de laboratorio, consignado en una historia clínica por un m édico O BIEN E nferm edades que cum plan la definición de caso de SIDA de la vigilancia pediátrica de 198752

Los niños < 18 meses nacidos de una madre infec­ tada por el HIV se consideran no infectados si el niño NO reúne los criterios para infección por el HIV pero SI cum ple los criterios de la columna adyacente

> 2 pruebas para anticuerpos negativas en dife­ rentes m uestras tom adas cuando el niño tiene > 6 meses de edad O BIEN Por lo menos dos pruebas virales negativas, ambas realizadas a la edad de > 1 m es y una realizada a los > 4 meses de edad Y Ninguna otra evidencia de laboratorio o clínica de infección por el HIV O BIEN Una prueba para anticuerpos negativa (presunti­ va) efectuada a los > 6 meses de edad y ningu­ na prueba viral positiva O BIEN U na prueba viral negativa ralizada a los > 4 meses de edad y ninguna prueba viral positiva O BIEN Una prueba viral positiva con > 2 pruebas virales posteriores negativas (por lo m enos una de ellas realizada a los > 4 meses de edad) o una prueba de anticuerpos negativa (por lo m enos una de ellas realizada a los > 6 m eses de edad)

Definido por un m édico com o “no infectado” y con los resultados de las pruebas de diagnóstico de HIV consignados en la historia clínica Y N inguna otra evidencia de laboratorio o clínica de infección por el HIV

Se considera que los niños < 1 8 meses nacidos de una madre infectada por el HIV han tenido exposición perinatal si el niño no reúne los crite­ rios para infección por HIV o los criterios de “no infectado por el H IV ” " Serología positiva para HIV = enzimoinmunoanálisis reiteradamente positivo, seguido de una prueba confirmatoria positiva, p. ej., Western blot. bPrueba viral positiva para HIV = prueba positiva para ácido nucleico del HIV, prueba positiva para antígeno p24 o cultivo viral positivo. Adaptado de la referencia7'.

sistem ática en m ujeres em barazadas se han publicado por sepa­ rado.76 El H IV -l se excreta en la saliva, la leche, el semen y otros líquidos corporales, pero se ha dem ostrado que la transm isión de la infección sólo ocurre después de la exposición a secrecio­ nes genitales o sangre. La im portancia de la leche m aterna en la transferencia del virus de la m adre al niño no está aclarada.

Los grupos m ás im portantes con riesgo de infección por el H IV son los que han recibido hem oderivados (receptores de transfusiones de sangre, hem ofílicos), los que han com partido agujas co ntam inadas (adictos a drogas), los que han tenido re ­ laciones sexuales con una p ersona in fectad a y los niños de m adre infectada. Al co m ienzo de la epidem ia, la m ayoría de las infecciones transm itidas sexualm ente en los E stados

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s de las in fe c c io n e s v ira le s

U nidos y E uropa se registraban entre varones hom osexuales o bisexuales, pero rápidam ente se dem ostró la transm isión heterosexual. E sta ha sido predom inante en A frica desde el com ienzo de la epidem ia. El riesgo de transm isión de la infección p o r el H IV de la m adre al lactante y la gravedad de la en ferm edad en el lactante están directam ente relacionados con la gravedad de la infección de la m adre en el m om ento del parto. El tratam iento de la infección ha representado una batalla constante entre el virus y la industria farm acéutica, con regoci­ jo y desesperación alternados entre los pacientes y los profe­ sionales de la salud. H acia 1996, los esfuerzos terapéuticos se concentraron en la quim ioterapia de com binación, usando un inhibidor de la D N A polim erasa RNA dependiente (transcriptasa inversa), ju n to con un inhibidor de la proteasa viral.139 El inhibidor de la transcriptasa inversa puede ser un nucleótido/nucleósido o un no nucleósido. El tratam iento de los pacien­ tes con estos poderosos fárm acos, conocido com o tratam iento antirretroviral activo (TARAA) se ha transform ado en una subespecialidad dentro de la infectología. El virus, por supues­ to, tam bién ha sido elástico y ha desarrollado resistencia a las principales clases de fárm acos antivirales,99 en especial si el tratam iento es incom pleto o inadecuado. A unque ningún tratam iento ha dem ostrado hasta ahora ser capaz de erradicar la infección por el HIV, la sentencia de m uerte que representaba su diagnóstico se ha revertido por el TARAA en las sociedades que pueden financiar estos costosos fárm acos. C uando se com bina con una m ejor educación de los grupos de alto riesgo, el TA RA A tiene com o resultado la esta­ bilización o la dism inución de la incidencia de nuevas prim oinfecciones. El desafío es encontrar fuentes de financiación para ofrecer los nuevos tratam ientos a países con m agras reser­ vas económ icas. Lam entablem ente, la curva epidem iológica ha com enzado a trepar nuevam ente debido a la continua aparición de resistencia a los fárm acos, a la dificultad de llegar a los usuarios de drogas intravenosas y al resurgim iento de la activi­ dad sexual por la (incorrecta) percepción de que la pena de m uerte ha sido conm utada.80 El riesgo de transm itir el HIV por transfusiones de sangre se ha reducido de m anera notable por m edio de la detección siste­ m ática en todas las unidades de sangre en busca de anticuerpos y por la solicitud a los integrantes de grupos de alto riesgo de no donar sangre. El resultado ha sido una dism inución cons­ tante en la incidencia de las infecciones por el H IV producidas por transfusiones, a m edida que la sensibilidad de las pruebas utilizadas para el control de hem oderivados ha aum entado. La introducción de pruebas de am plificación extrem adam en­ te sensibles para la detección sistem ática en todas las unidades de sangre adm inistradas en los Estados U nidos ha reducido al m ínim o absoluto el riesgo por transfusión. L a exposición laboral a agentes infecciosos es un hecho ine­ vitable en la vida del personal m édico. Los patógenos transm i­ tidos por sangre son un com ponente im portante del problem a, debido a su frecuencia y a la exposición a sangre. Los objetos cortantes (p. ej., agujas e instrumental quirúrgico) son los vehícu­ los de transm isión m ás com unes. Los agentes virales re­ presentan el riesgo laboral más peligroso; entre ellos, el HIV encabeza la lista. Los C D C han publicado recom endaciones para el m anejo, preferentem ente por prevención, de las exposi­ ciones laborales.73-75'77 En el recuadro 23-4 se ofrece un resu­ m en de las recom endaciones generales. El tratam iento de los pacientes con infección por el H IV es com plicado y requiere el apoyo de m uchas áreas del laborato­ rio. En alguna form a, la expansión de las posibilidades diag-

Recuadro 23-4

1299

M anejo d e las e xposiciones labo rales a sangre"

Proporcionar atención inm ediata al sitio de exposición: Lavar las heridas y la piel con agua y jabón. Enjuagar las mucosas con agua. D eterm inar el riesgo asociado con la exposición por: Tipo de líquido (p. ej„ sangre, líquido visiblemente sanguinolento, otros líquidos o tejidos potencialm ente infecciosos o virus concentrado)

Y Tipo de exposición (lesión percutánea, exposición de piel o mucosas no intactas, o mordeduras que produzcan exposición a la sangre). Evaluar la fuente de exposición. Evaluar el riesgo de infección usando la inform ación disponible. Realizar pruebas en las fuentes conocidas para detectar HBsAg, antiHCV y anticuerpos anti-HIV (considerar usar pruebas rápidas). En el caso de fuentes desconocidas, evaluar el riesgo de exposición a HBV. HCV o HIV. No efectuar pruebas para contam inación viral en agujas o jeringas dese­ chadas. Evaluar a la persona expuesta: D eterm inar su nivel inm unitario contra la infección por HBV (p. ej., por antecedentes de vacunación y de respuesta a la vacuna). A dm inistrar la profilaxis posexposición para exposiciones que plantean riesgo de infección, de acuerdo con las recomendaciones en vigencia. Realizar pruebas de seguimiento y proporcionar asesoramiento.

0 Hepatitis B (HBV), hepatitis C (HVC) y virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Adaptado de las referencias73'75-77.

nósticas ha sim plifcado el enfoque, com o se resum e en el cua­ dro 23-11. Herpesvirus

Los virus del grupo de los herpesvirus hum anos son los ais­ lam ientos m ás frecuentes en los laboratorios generales. El grupo consta de los siguientes m iem bros: Virus del herpes sim ple tipo 1 Virus del herpes sim ple tipo 2 C itom egalovirus hum ano Virus de E pstein-B arr Virus de la varicela-zóster H erpesvirus hum ano 6 H erpesvirus hum ano 7 H erpesvirus hum ano 8 A lgunos m iem bros del grupo de los herpesvirus puede in te­ grar su D N A con el de la célula huésped. L a m ayoría causa u n a infección latente en células linfoides o en ganglios del SNC y se reactivan luego p ara producir enferm edades recid i­ vantes. E n general, las prim oinfecciones son m ás graves que las recidivas. Las prim oinfecciones producidas por varios virus de este grupo son m ás graves cuando ocurren en la ad o ­ lescencia y la edad adulta que cuando suceden en la infancia. Los virus circulan m ás librem ente y antes en el curso de la vida en los grupos socioeconóm icos bajos y no aparecen hasta la adolescencia en las capas sociales m ás pudientes. P or lo tanto, las infecciones en los grupos socioeconóm icos altos tienden a ser m ás graves.

1300

CAPÍTULO 23

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia , Rickettsia y microorganismos relacionados

Cuadro 23-11 Apoyo de laboratorio para tratar a los pacientes infectados por el HIV

PARÁMETRO

MÉTODO PRINCIPAL

MÉTODO SECUNDARIO/ CONFIRMATORIO

D iagnóstico inicial

Enzim oinm unoanálisis (repetidam ente positivo)

Western blot o inm unofluorescencia: pruebas para ácido nucleico viral (carga viral) para pacientes con síntomas agudos269 y recién nacidos de madres infectadas

Pronóstico y com ienzo del tratamiento

Cuantificación de la concentración de virus en plasma (carga viral) Cuantificación de linfocitos CD4

Pueden ser necesarias pruebas ultrasensibles

Cuantificación de la concentración de virus en plasm a (carga viral) Pruebas de resistencia fenotípicas o genotípicas

Pueden ser necesarias pruebas ultrasensibles

Com ienzo del tratam iento y profilaxis de infeccio nes oportunistas Control del tratamiento Evaluación de las recaídas clínicas o virológicas

VIRUS DEL HERPES SIMPLE

Los virus del herpes sim ple producen una am plia variedad de infecciones.518 Dos serotipos del virus infectan a los seres hum anos. Los antígenos com partidos entre los grupos 1 y 2 com plican la diferenciación serológica de antígenos y anti­ cuerpos, pero en este m om ento se com ercializan reactivos fia­ bles.656 En las personas sanas, predom inan las infecciones de la cavidad bucal y del aparato genital. Las infecciones por el tipo 1 son más frecuentes en la porción superior del cuerpo, en tanto que el tipo 2 causa lesiones genitales; pero hay excepciones a esta regla. H asta un tercio de los aislam ientos del aparato geni­ tal son cepas del tipo 1. En cam bio, muy pocos aislam ientos de la cavidad bucal son cepas del tipo 2. La tipificación de los aislam ientos de herpes en localizacio­ nes genitales proporciona una valiosa inform ación pronostica, ya que las causadas por el herpes sim ple tipo 1 tienen m enos tendencia a recidivar que las producidas por el tipo 2.292 En un grupo de 457 m ujeres que habían tenido prim oinfección geni­ tal (definida por la ausencia de anticuerpos contra el virus tipo 2 y un cultivo positivo de las lesiones genitales), el 89% tuvo una recidiva después de una m ediana de 391 días.26 H ubo al m enos seis recidivas durante el prim er año en el 38% de las pacientes y el 20% tuvo m ás de 10 recidivas. Un estudio secuencial de pacientes con infecciones recidivantes dem ostró que el paciente era asintom ático y carecía de lesiones visibles durante un tercio del período durante el cual elim inaba virus.498 Las infecciones genitales con cualquiera de am bos tipos de virus tienen m ayores probabilidades de recidivar que las infec­ ciones bucales con el m ism o tipo.292 A dem ás, el m ecanism o de infección puede ser diferente para am bos serotipos. La exposi­ ción al serotipo 1 com ienza en la infancia, y entre el 25% y el 50% de los estudiantes secundarios presentan anticuerpos con­ tra el virus. La adquisición de anticuerpos contra el tipo 2 no com ienza hasta la adolescencia y continúa durante todo el p e­ ríodo de actividad sexual. El aislam iento de virus del tipo 2 en una localización genital im plica transm isión sexual, m ientras que la vía de transm isión para el tipo 1 puede ser la autoinoculación con secreciones bucales. El virus del herpes es transm itido de una persona a otra por secreciones infectadas o por lesiones. La infección suele ser esporádica, pero se describió una epidem ia de infecciones cutá­ neas en un cam pam ento de luchadores (herpes gladiatorum ).24

Las infecciones m ás graves producidas por el herpes sim ple son las encefalitis, que afectan con m ayor frecuencia el lóbulo tem poral y la cara orbital del lóbulo frontal en los adultos, y la infección disem inada en los lactantes, que puede ser adquirida durante o después del nacim iento. El virus del herpes sim ple produce encefalitis esporádicas. En el período neonatal, las cepas infectantes son del tipo 2, lo que refleja su origen en el aparato genital m aterno. Las cepas tipo 1 son abrum adoram en­ te predom inantes en los niños m ayores y los adultos. El diag­ nóstico puede hacerse en form a definitiva por biopsia de cere­ bro y cultivo, pero la disponibilidad del tratam iento antiviral no tóxico ha llevado a los m édicos a tratar en form a em pírica a los pacientes, evitando así este procedim iento invasivo. L am enta­ blem ente, com o resultado pueden pasarse por alto otras enfer­ m edades potencialm ente tratables. W hitley y cois, estudiaron a 432 pacientes som etidos a biopsia de cerebro por sospecha de encefalitis por herpes sim ple com o parte de un estudio coope­ rativo, de alcance nacional, sobre tratam iento.519 Se detectó encefalitis por herpes sim ple en el 45% de los pacientes. O tro 18% tenía alguna otra enferm edad infecciosa identificable, la m itad de las cuales eran tratables. A sí, el 10% de la población total tenía una infección tratable que se hubiera pasado por alto sin la biopsia de cerebro. H asta hace poco, la única prueba diagnóstica no invasiva era el electroencefalogram a, en el que las descargas anorm ales del lóbulo tem poral eran característi­ cas, cuando estaban presentes. El advenim iento de las m oder­ nas técnicas de obtención de im ágenes ha revolucionado el enfoque clínico. La resonancia m agnética (RM ) es m ás sensi­ ble que la tom ografía com putarizada. L a encefalitis por herpes sim ple se observa rara vez o nunca en presencia de un estudio norm al de RM. Sin em bargo, las lesiones no se lim itan a lesio­ nes unilaterales del lóbulo tem poral. Las anom alías detectadas por RM pueden ser m ultifocales o difusas.438 Al com ienzo de la enferm edad, es posible que las únicas anorm alidades se en­ cuentren en el electroencefalogram a.422 El virus del herpes sim ple se aísla rara vez en el líquido cefa­ lorraquídeo (LCR). En el estudio cooperativo de alcance nacio­ nal citado sólo se aisló en el LCR de 2 de 45 casos (4% ) de encefalitis herpética com probados por biopsia.370 El diagnósti­ co serológico es m uy poco sensible, inespecífico y dem asiado lento com o para ser de utilidad en la tom a de decisiones tera­ péuticas. El uso de técnicas de am plificación m olecular para la

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s de las in fe c c io n e s v ira le s

detección del genom a del herpesvirus en el LCR de pacientes con encefalitis o m eningoencefalitis representa un avance diag­ nóstico im portante. Los virus herpéticos perm anecen en form a latente en los ganglios espinales después de la prim oinfección. El virus tipo 1 se aísla en los ganglios dorsales y el tipo 2, en los sacros. La m eningitis aséptica herpética es poco frecuente y suele ser causada por el virus tipo 2. La m eningitis viral se asocia con un nivel de glucosa norm al en el LC R , a diferencia de los nive­ les m uy dism inuidos de las m eningitis bacterianas. Sin em bar­ go, los niveles de glucosa en la m eningitis herpética pueden ser m uy bajos y el recuento celular puede alcanzar m agnitudes del orden de los m iles.358 Al com ienzo de la evolución de cual­ quier m eningitis viral, pueden predom inar los neutrófilos y sugerir la posibilidad de un proceso bacteriano. El virus del herpes sim ple, casi siem pre el tipo 2, tam bién causa m eningi­ tis linfocítica recidivante (m eningitis de M ollaret); el cultivo suele ser negativo, pero puede dem ostrarse la presencia de genom a viral en el L C R por reacción en cadena de la polim erasa (PC R ).477 Se calcula que la infección herpética neonatal se observa en 1:2 000 a 1:5 000 partos. C asi siem pre es sintom ática y con fre­ cuencia, m ortal. En un estudio en colaboración, la tasa de m or­ talidad fue del 50% al 60% en los lactantes con infección dise­ m inada tratados con aciclovir o vidarabina.517 E n cam bio, no se registraron m uertes en los lactantes con enferm edad lim itada a la nariz, los ojos o la boca. El diagnóstico es sugerido por el desarrollo de lesiones vesiculares cutáneas, pero éstas pueden estar ausentes en el 20% de los pacientes. Los factores de mal pronóstico son la enferm edad disem inada, el estado com atoso en el m om ento de la internación en el hospital, la coagulación intravascular disem inada o la prem aturidad. Las altas tasas de m orbim ortalidad de la enferm edad del lac­ tante han im pulsado grandes esfuerzos para diagnosticar la infección m aterna. En la m ayor parte de los casos de herpes sim ple neonatal, la infección se contrae durante el parto vagi­ nal y puede evitarse por cesárea. Se han ideado com plejos pro­ tocolos para la detección sistem ática en m ujeres em barazadas, pero lam entablem ente no han funcionado bien. La infección m aterna suele ser asintom ática en el m om ento del parto, aun­ que el riesgo para el niño parece ser bajo si la infección es reci­ divante y existen anticuerpos m atem os contra el tipo 2. M uchas m ujeres no reconocen su prim oinfección genital. En un estu­ dio, se detectaron anticuerpos específicos contra herpes sim ple tipo 2 en 439 de 1 355 m ujeres em barazadas sin historia clíni­ ca de herpes genital (32% ).167 Se detectó la elim inación asinto­ m ática del virus al fin del em barazo y en el parto en 5 de 1 160 cultivos (0,43% ). D urante el em barazo, 43 de las m ujeres que habían tenido anticuerpos contra el virus tipo 2 reconocieron su prim oinfección genital sintom ática. Los esfuerzos para evitar la infección neonatal se han des­ viado a la evaluación del nivel de anticuerpos en m ujeres em barazadas y al exam en físico cuidadoso en busca de enfer­ m edad clínica activa en el m om ento del parto. L a com erciali­ zación de pruebas fiables para detectar anticuerpos tipoespecíficos facilita la identificación de las m ujeres expuestas a con­ traer una prim oinfección.359 Las personas con m ecanism os de defensa com prom etidos están predispuestas a la esofagitis, la traqueobronquitis o la neum onía herpéticas, y a las infecciones disem inadas, entre ellos la hepatitis. Las infecciones por herpes sim ple pueden ser necrosantes y sugerir una etiología bacteriana si no se encuen­ tran los cuerpos de inclusión característicos o no se realizan cultivos para virus.372 L a inm unosupresión no es un requisito

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previo para la infección de las vías respiratorias bajas o la eso­ fagitis. Los riesgos de infección respiratoria baja incluyen la intubación, lo que sugiere que la patogenia puede ser sim ilar a la de la neum onía bacteriana: la aspiración de secreciones orofaríngeas contam inadas.408 L os pacientes con quem aduras extensas tienen riesgo de infección, tanto de la piel denudada com o de las vías respiratorias bajas.159 La infección ocular consiste en una conjuntivitis, que puede estar acom pañada por fiebre, fotofobia y linfadenopatía regio­ nal. La queratitis herpética, que tiene un aspecto ram ificado o dendrítico, es la segunda causa en frecuencia de ceguera co r­ neal (después de los traum atism os) en los Estados U nidos. El virus del herpes sim ple es una de las causas virales de faringitis y am igdalitis, por lo general com o prim oinfección. L a m ucosa puede estar ulcerada y las lesiones lim itarse a la pared posterior de la faringe.189 La am igdalitis necrosante puede sim ular un absceso bacteriano periam igdalino. Se ha inform ado la presencia de cistitis hem orrágica com o parte de la infección disem inada121 y puede haber proctitis herpética en varones hom osexuales.193

CITOMEGALOVIRUS

E l citom egalovirus (CM V ) es un m iem bro de una fam ilia de virus relacionados que son específicos para especies determ i­ nadas.351 El CM V del ratón no infecta al hom bre y viceversa. A islado por prim era vez en ratones por M argaret Sm ith, luego se aisló el virus hum ano en tejido de glándulas salivares de un lactante infectado. E sa autora reconoció la especificidad de especie de estos virus, aunque los revisores de su publicación, inicialm ente rechazada, no lo aceptaron.510 El aislam iento del virus hum ano fue publicado en form a sim ultánea por Sm ith, W eller y Rowe. C on la generosidad de un caballero, que llegó a ganar un prem io N obel, W eller cedió a la doctora Sm ith el m érito de la prioridad en el descubrim iento. El CM V es un patógeno oportunista que puede causar infecciones persisten­ tes, incluso de por vida.386 Se lo ha reconocido desde hace m uchas décadas com o patógeno del hom bre por la peculiar citopatología que produce (véase lám ina en color 2 3 -ID ). Al principio, los investigadores consideraron el CM V un protozoo invasor de los tejidos hum anos.258 Este virus se asocia con los leucocitos y puede ser transm i­ tido por transfusiones sanguíneas o trasplante de órganos. Cuando se detecta por m edio de anticuerpos m onoclonales o sondas genéticas, se concentra en la fracción de neutrófilos de la capa rica en leucocitos, m ás que en la fracción m ononuclear. El virus replicante se halla en am bas fracciones, de m anera que el m aterial para cultivo debe incluir todos los leucocitos. Tam bién se excreta por la saliva y el semen. L a transm isión venérea es sugerida con firm eza por la existencia de grupos de casos relacionados epidem iológicam ente. El C M V puede transm itirse de la m adre al hijo a través de la placenta, por las secreciones cervicales durante el parto o por la leche. L a variedad de enferm edades infecciosas causadas por este patógeno es am plia y abarca infecciones congénitas y neonata­ les, m ononucleosis con anticuerpos heterófilos negativos, hepatitis, neum onía e infección disem inada en pacientes inm u­ nodeprim idos.386 Al m ism o tiem po, puede ser m uy difícil deci­ dir si un paciente determ inado tiene una enferm edad inducida por CM V o sólo tiene una infección persistente, debido a que el virus replicante se encuentra en órganos y líquidos corpora­ les que son estériles en ausencia de enferm edad clínica. Se han observado m últiples variantes genéticas de CM V en un m ism o paciente infectado.97

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C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Resulta bastante fácil demostrar la infección por cultivo del virus o por la presencia de anticuerpos específicos. A diferen­ cia de la demostración de una infección producida por CMV, la comprobación de que una determinada enfermedad es causada por el CMV suele requerir biopsia y examen histológico. Aun así, no siempre es fácil confirmar con certeza el diagnóstico. Por ejemplo, algunos pacientes excretan CMV en la orina durante años sin estar enfermos, sobre todo los que tienen infección congénita. El aislamiento de CMV en lavados broncoalveolares se correlaciona mal con la neumonía producida por CMV,425 que debe diagnosticarse finalmente por considera­ ción de todos los datos en conjunto, a menudo incluidos los de las biopsias pulmonares. La detección de anticuerpos séricos es el método más sensible para determinar si el paciente ha esta­ do infectado alguna vez por CMV. Sin embargo, la presencia de anticuerpos es de poca utilidad para determinar si el paciente está actualmente infectado o hay una enfermedad producida por CMV, aunque existe la presunción de que el virus puede persistir en ciertos tejidos o células del huésped. La determina­ ción cuantitava del antígeno o del DNA virales es lo que mejor diferencia la infección de la enfermedad. Un virus latente o uno clínicamente silencioso puede reacti­ varse para causar enfermedad. Un paciente puede experimentar enfermedad por CMV después de la reactivación de una infec­ ción latente o después de la primera exposición al virus. La diferencia es importante desde el punto de vista del pronóstico, ya que las primoinfecciones son clínicamente más graves y tie­ nen mayores probabilidades de causar enfermedad sintomática en un recién nacido. Algunas situaciones pueden ser manejadas para aumentar las ventajas contra las primoinfecciones. Por ejemplo, los recepto­ res de trasplantes pueden ser controlados de tal forma que los pacientes seronegativos no reciban sangre o un órgano prove­ nientes de dadores seropositivos. La infección viral de personas antes sanas suele manifiestarse como un síndrome de mononucleosis autolimitado. Como ocurre en el caso de la infección por virus de Epstein-Barr, ciertas evidencias indican que en la mononucleosis causada por CMV los síntomas son producidos por linfocitos citotóxicos, que intentan eliminar las células infectadas por CMV. El espectro de enfermedades es mucho más amplio en los pacientes inmunodeprimidos, de acuerdo con la magnitud de la inmunosupresión. En los pacientes moderadamente inmunode­ primidos, como los receptores de un trasplante renal, la neu­ monía por CMV es una manifestación frecuente. Cuando la inmunosupresión es más extrema y extensa, puede haber una infección fulminante. Los receptores de trasplantes de corazón, hígado o médula ósea, o los pacientes infectados por el HIV pueden presentar hepatitis o complicaciones antes insólitas, como la perforación de una pared intestinal infectada. Otra complicación que se observa en los receptores de tras­ plantes de órganos es la asociación de la infección por CMV con el rechazo del trasplante renal o cardíaco. La patogenia de este proceso no está aclarada. Aunque se describió una glomerulopatía en riñones trasplantados de pacientes infectados por CMV, la anatomía patológica de los riñones rechazados sugie­ re casi siempre un proceso inmunitario más que infeccioso. Más aún, las evidencias señalan que los pacientes que reciben un trasplante de corazón y están infectados por CMV sufren más infecciones sobreagregadas por bacterias y hongos que los trasplantados que no tienen CMV. La mayoría de las infecciones congénitas y neonatales son asintomáticas, pero algunos lactantes que parecen sanos al nacer presentan síntomas sutiles. En el otro extremo se encuen­

tra la infección diseminada con enfermedad multiorgánica y anomalías congénitas graves, como la microcefalia. La fre­ cuencia de la transmisión intrauterina del CMV se ha estimado en un 20% a 40% y el riesgo de un resultado final adverso es mayor durante la primera mitad del embarazo. VIRUS DE EPSTEIN-BARR

El virus de Epstein-Barr (EBV) es la principal causa de mo­ nonucleosis infecciosa419 Este virus versátil origina enfermeda­ des que varían desde la infección aguda autolimitada hasta las neoplasias malignas. El síndrome de mononucleosis consiste en fiebre, malestar general, faringitis exudativa, linfadenopatías y linfocitos atípicos circulantes en sangre periférica. La espleno­ megalia es habitual y la rotura del bazo es una complicación grave. La hepatitis aguda también puede ser parte del síndrome. El virus, descubierto durante estudios acerca del linfoma de Burkitt en Africa y después asociado con la mononucleosis infecciosa,419 ingresa en el organismo por infección del epitelio faríngeo. Sin ambargo, su célula diana fundamental son los lin­ focitos B circulantes, a los que infecta y luego inmortaliza. El linfoblasto B activado, junto con el EBV que transporta, madu­ ra a un linfocito de memoria de larga vida en los centros ger­ minales de los ganglios linfáticos.481 El resultado de esta inte­ racción es una estimulación policlonal del sistema inmunitario humoral, que produce una variedad de anticuerpos contra muchos antígenos. Al mismo tiempo, el sistema inmunitario celular es estimulado para eliminar la infección por EBV. Lo que se ve en sangre periférica como linfocitos atípicos son los linfocitos T activados. El círculo se cierra cuando el virus se excreta, a través de la mucosa bucal, por la saliva. En los niños pequeños la infección suele ser asintomática o con pocos sín­ tomas, y la prueba diagnóstica de anticuerpos heterófilos es casi siempre negativa. Si ocurre la integración del genoma del EBV en cierto tipo de células, puede producirse una neoplasia en lugar de una infección aguda. El crecimiento descontrolado del EBV en pacientes con infección por el HIV, que han perdido el control regulador de la inmunidad celular, puede conducir a un aumen­ to de los tumores causados por el EBV. La mayoría de estos tumores son de la estirpe de los linfocitos B, como el linfoma de Burkitt y el linfoma primitivo de cerebro, pero el carcinoma nasofaríngeo también se ha asociado estrechamente con el EBV. Se ha adjudicado además la infección por EBV un sub­ grupo de carcinomas gástricos y de colon. Otros diversos pro­ cesos son la neumonía linfocítica intersticial y el síndrome hemofagocítico. Establecer la asociación con un virus persis­ tente o latente como el EBV no es suficiente para probar una relación causal, prueba que puede provenir sólo de la asociación reiterada y del análisis molecular cuidadoso. La relación entre el EBV y los linfomas parece ser especialmente compleja481 A mediados de la década de 1980 se sugirió que un síndro­ me mal definido de fatiga crónica podría representar una infec­ ción crónica por el EBV. Ésta existe y puede ser penosa, pero el síndrome inespecífico de fatiga crónica no parece estar rela­ cionado con el virus.115 Las células que mejor permiten la replicación viral, con pro­ ducción de partículas infecciosas, son las células epiteliales de la orofaringe. La saliva de los pacientes con infección crónica o con enfermedad aguda contiene virus viable, que puede demostrarse por cocultivo con linfocitos periféricos normales. En forma alternativa, los linfocitos de sangre periférica de indi­ viduos infectados pueden cultivarse en presencia de un agente que elimine los linfocitos T, como la ciclosporina. El diagnós­

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s d e las in fe c c io n e s v ira le s

tico de las manifestaciones neoplásicas puede hacerse por demostración molecular de que el virus se ha integrado al genoma de las células malignas. Las células de los tumores producidos por el EBV pueden cultivarse como líneas celulares inmortalizadas in vitro. VIRUS DE LA VARICELA-ZÓSTER

El virus de la varicela-zóster (VZV) causa varicela como pri­ moinfección.13 El virus puede permanecer latente en los gan­ glios sensitivos de la médula espinal durante muchos años antes de reactivarse y producir enfermedad por segunda vez. La enfermedad reactivada recuerda la varicela, pero se limita al dermátomo inervado por el nervio infectado. La enfermedad de reactivación se conoce como zona o herpes zóster (culebrilla). El dermatoma más problemático es la rama oftálmica del tri­ gémino, ya que, como parte de la enfermedad de reactivación, puede haber una infección destructiva de la córnea. Antes de reconocer la identidad del proceso, el virus de la varicela se denominaba varicela y el de la culebrilla, herpes zóster. El virus de la varicela-zóster provoca una considerable inco­ modidad en las personas sanas y puede causar neumonía, pero en personas inmunosuprimidas la enfermedad puede transfor­ marse en una infección diseminada potencialmente mortal. Las mujeres embarazadas tienen mayor riesgo de sufrir varicela grave y los recién nacidos dentro de los 4 días de la infección materna tienen grandes riesgos, ya que aún no se han desarro­ llado anticuerpos matemos. El riesgo de embriopatía para el feto después de la infección materna con VZV en las primeras 20 semanas de embarazo es de alrededor del 2%. Según el conocimiento convencional la inmunidad contra la varicela es de por vida y toda enfermedad posterior es un recru­ decimiento. Sin embargo, la existencia de reinfecciones ha sido sugerida por cuidadosos estudios serológicos de personas inmunes en una casa con un caso reciente de varicela.14 Los convivivientes que tenían anticuerpos preexistentes permane­ cieron en buen estado de salud, pero sus títulos de anticuerpos aumentaron, lo que indica infección subclínica. Existe gran preocupación en los hospitales acerca de la segu­ ridad de los pacientes inmunodeprimidos que entran en con­ tacto con una persona infectada. La exposición puede tener lugar inadvertidamente, ya que los pacientes con VZV son infecciosos poco antes de la aparición de la erupción cutánea característica. Las medidas para reducir los riesgos incluyen el uso de personal sanitario inmune para la atención de pacientes inmunosuprimidos y la limitación de visitas. La administración inmediata de inmunoglobulina antizóster después de una expo­ sición inadvertida tiene efecto protector.

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(las células infectadas producen partículas virales infecciosas maduras). En 1990, se aisló un nuevo virus en los linfocitos T CD4+ de un individuo sano, utilizando técnicas que producen la activa­ ción de linfocitos T. El vims, denominado herpesvirus humano 7 (HHV-7), es diferente pero está estrechamente relacionado con el HHV-6. Los dos virus no tienen inmunidad cruzada. El HHV-6 y el HHV-7 causan una enfermedad común de la infancia denominada exantema súbito (también conocida como roseóla infantil, enfermedad de Duke o cuarta enfermedad). El exantema súbito se observa en los niños entre los 6 meses y los 3 años de edad. Casi todos los niños mayores de 13 meses tie­ nen anticuerpos contra el HHV-6. Los anticuerpos contra el HHV-7 aparecen un poco más tarde. El exantema súbito comienza con fiebre brusca, seguida de una erupción cutánea cuando desaparece la fiebre, al tercero o cuarto día. En un 8% de los pacientes con infección aguda se observan convulsiones febriles. Es muy improbable que exista esta infección en un niño afebril. La enfermedad suele resolver­ se sin secuelas, pero en raras ocasiones la enfermedad es grave. En los adultos inmunosuprimidos, el HHV-6 ha causado enfer­ medades graves después del trasplante de médula ósea y de órganos sólidos en pacientes infectados por el HIV. Se ha suge­ rido que estos vims son los agentes etiológicos del síndrome de fatiga crónica, de la esclerosis múltiple y de enfermedades neo­ plásicas, pero el tema no está resuelto. La frecuente reactivación de los herpesvirus durante el curso de otras enfermedades com­ plica la determinación definitiva de un papel etiológico. HERPESVIRUS HUMANO 8

El último agregado al grupo de herpesvirus linfotrópicos es el herpesvirus asociado con el sarcoma de Kaposi, denomina­ do herpesvirus humano 8 (HHV-8). Como su nombre lo indica, el virus fue detectado por primera vez en tejidos provenientes de sarcoma de Kaposi en pacientes infectados por el HIV utili­ zando técnicas moleculares.354 Las investigaciones posteriores demostraron que se encontraban secuencias genéticas virales en varios tipos clínicos de sarcoma de Kaposi: el que se pre­ senta en los pacientes con SIDA, el sarcoma de Kaposi clásico no relacionado con la infección por el HIV y el sarcoma de Kaposi de varones homosexuales que no están infectados por el HIV. Las secuencias han sido identificadas en linfomas de cavi­ dades corporales relacionados con el SIDA, que también con­ tienen secuencias genéticas del EBV. Por último (quizá), se han encontrado secuencias del HHV-8 en tejidos de la enfermedad multicéntrica de Castleman, que es una hiperplasia linfoide atípica que puede progresar al linfoma o al sarcoma de Kaposi. Las secuencias también se encuentran en tejidos no neoplásicos de pacientes infectados por el HIV y con sarcoma de Kaposi.

HERPESVIRUS HUMANOS 6 Y 7

Un nuevo agregado a la lista de patógenos del gmpo herpes es el herpesvirus humano 6 (HHV-6). Este virus fue aislado por primera vez en pacientes con enfermedades linfoproliferativas y se lo denominó virus B-linfotrópico humano.392 El virus tiene la estructura morfológica de un herpesvirus, pero no está rela­ cionado genéticamente con los cinco herpesvirus identificados antes. Por eso, fue denominado herpesvirus humano 6. Existen en la actualidad dos subtipos reconocidos, designados A y B; el subtipo B es el que predomina. Este virus comparte con el EBV la capacidad de reproducirse en los linfocitos humanos. A dife­ rencia del EBV, que infecta los linfocitos en forma latente y que no se reproduce activamente en las células, el HHV-6 pare­ ce causar sólo infecciones productivas en linfocitos humanos

VIRUS B

En la década de 1930, se aisló un vims del gmpo herpes en un paciente que sufrió una enfermedad neurológica mortal des­ pués de haber sido mordido por un mono. Casi en el mismo momento, Sabin aisló un virus en otro paciente que desarrolló una mielitis transversa después de la mordedura de un mono. Este autor denominó al aislamiento vims B por el nombre del paciente afectado. También ha sido denominado herpesvirus simiano, que es en cierta forma un nombre que lleva a confu­ sión, dado que en los monos se encuentran diversos virus herpéticos. El nombre taxonómico recomendado es cercopithecine herpesvirus 1. Se han documentado por lo menos 25 casos

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C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

de infección por el virus B en seres humanos, de los cuales 16 han sido mortales.520 El virus B tiene la rara característica de cruzar la barrera entre especies. Es autóctono en los monos del Viejo Mundo, como Macaca mulatta y Macaca fascicularis, en los que causa una infección latente. Se han informado infecciones humanas localizadas, pero la mayoría son generalizadas y graves. La forma habitual de infección es la mordedura de un animal, pero se ha publicado la infección después de una lesión por pincha­ dura con una aguja. A menudo aparece una erupción vesicular alrededor de la mordedura, seguida de linfadenopatía regional y fiebre. La diseminación sistémica se acompaña por encefali­ tis, mielitis transversa o necrosis visceral. Dos acontecimientos recientes han renovado el interés acer­ ca del virus B. El primer caso documentado de transmisión interhumana se registró como parte de un grupo de casos en un establecimiento de investigación. El segundo acontecimiento fue el descubrimiento de que células de riñón de mono comer­ cializadas por laboratorios de diagnóstico estaban contamina­ das con el virus B. No se registraron infecciones humanas, pero las células fueron retiradas del mercado.513 La capacidad del virus B de replicarse en monocapas de riñón de mono se cono­ ce desde hace años. De hecho, el estrés del procesamiento de los riñones puede estimular la activación del virus B latente. El efecto citopático del virus consiste en el agrandamiento y la fusión celulares, que se puede extender a toda la monocapa. Pueden verse cuerpos de inclusión tipo A de Cowdry, idénticos a los del virus del herpes simple o del VVZ en preparados teñi­ dos de células. El subcultivo a otras células de riñón de mono o a células de riñón de conejo (de uso habitual para el aisla­ miento de virus del herpes simple) transmite el virus. Adenovirus

Los adenovirus fueron reconocidos originalmente cuando se observó degeneración espontánea en cultivos de tejido de ori­ gen adenoideo. Se denominaron agentes de degeneración ade­ noide, adenoideo-faringoconjuntivales y productores de enfer­ medad respiratoria aguda.450 Estos virus pueden estar presentes en la faringe y en la heces sin causar enfermedad. La designa­ ción de un agente infeccioso como agente etiológico debe efec­ tuarse con cuidado, de manera de no confundirse con una aso­

Cuadro 23-12

ciación fortuita. Por ejemplo, en algún momento los adenovi­ rus se consideraron causantes del síndrome de la tos ferina, debido a que fueron aislados en ausencia del agente bacteriano habitual, Bordetella pertussis. El papel de los adenovirus en el síndrome pertussis es motivo de discusiones. Se ha sugerido que, por tener requerimientos nutricionales especiales, B. per­ tussis puede no haberse aislado en muchos casos de tos con­ vulsa, en tanto que los adenovirus representan aislamientos accidentales o copatógenos.244 La enfermedad por adenovirus puede ser esporádica o presen­ tarse en epidemias. Estos virus causan alrededor del 5% de las enfermedades respiratorias agudas en los niños menores de 5 años y pueden ser responsables del 10% de las neumonías de la infancia. Producen una faringitis exudativa que puede simular la enfermedad por estreptococos P-hemolíticos del grupo A. Los adenovirus pueden causar otitis, faringitis y gastroenteritis. Cier­ tos serotipos se asocian con conjuntivitis aguda, con faringitis o sin ella. Las infecciones por adenovirus del aparato gastro­ intestinal ya fueron tratadas, junto con otras causas de gastroen­ teritis viral. Las principales infecciones causadas por adenovirus y sus serotipos asociados se resumen en el cuadro 23-12. Poxvirus

Los poxvirus son un grupo hetrogéneo.168La mayoría de sus integrantes son patógenos para los animales, pero algunos tam­ bién pueden infectar a los seres humanos. El rey del grupo de los poxvirus era el virus varióla, agente etiológico de la virue­ la y el único miembro del grupo que infectaba sólo a los seres humanos. En la actualidad ha pasado de la categoría de especie en peligro a la de especie extinguida.146 Después de que se registró el último caso natural, las reservas de virus se conser­ vaban sólo en los Estados Unidos y en la Unión Soviética; sin embargo, tras la disolución de esta última, existe la posibilidad de que se hayan dispersado fuera de Moscú. Se ha secuenciado el genoma del virus varióla y de otros cinco poxvirus.362 El reconocimiento de que el virus varióla representa una amenaza importante como agente de bioterrorismo ha renova­ do el interés por estos virus. La población mundial actual es sensible en su mayoría o tiene sólo inmunidad parcial y los médicos no están familiarizados con la presentación clínica y el diagnóstico. Se han vuelto a examinar los registros de brotes

In feccion es causq das por adenovirus

SÍNDROME

GRUPOS ETARIOS

Faringitis aguda febril

Niños pequeños

1,2, 3, 5, 6 ,7

Fiebre faringoconjuntival

Niños pequeños y adolescentes

3, 7, 14

Enfermedad respiratoria aguda

Reclutas militares

3,4 . 7, 14,21

Neumonía

Niños pequeños

1, 2, 3, 7

Reclutas militares

4 ,7 8, 11, 19, 37

SEROTIPOS

Queratoconjuntivitis epidémica

Todos

Cistitis hemorrágica aguda

Niños pequeños

11, 21

Gastroenteritis

Niños pequeños

39, 40

Meningoencefalitis

Niños y pacientes inmunodeprimidos

1, 2, 5

Hepatitis

Niños y pacientes inmunodeprimidos

1, 2, 5

Adaptado de la referencia244.

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s d e las in fe c c io n e s v ira le s

históricos, como una epidemia ocurrida en Boston a principios del siglo xx, para actualizar los datos.539 La vacunación con el virus vaccinia, uno de los logros señeros de la medicina moder­ na, se abandonó en 1970 debido a los efectos secundarios bien conocidos de la vacuna.41 Sin duda, el cambio de circunstancias ha modificado el balance costos-beneficios de la vacuna­ ción,169170 pero hay discusiones respecto de las medidas ade­ cuadas para tomar.42,321 Se ha demostrado la presencia de anti­ cuerpos residuales en individuos previamente inmunizados, pero no está aclarada su eficacia.173 Los ortopoxvirus de los animales, como el pox vacuno y los virus del pox simiano. pueden infectar en ocasiones al hombre. Estas infecciones se parecen clínicamente a la viruela. El ries­ go del pox simiano ha adquirido nuevas dimensiones después del reconocimiento de que algunos casos de infección humana se han adquirido de perritos de la pradera usados como masco­ tas.412 Las mascotas pueden haberse infectado de roedores afri­ canos importados, que se sabe son sensibles al virus. El diag­ nóstico diferencial de todas las infecciones causadas por pox­ virus incluye el virus de la varicela-zóster.346 Por lo tanto, el apoyo del laboratorio es esencial toda vez que surja la posibili­ dad de que se trate del virus varióla. El origen del virus vaccinia no está aclarado. Tiene muchas características de una especie diferente, pero puede haberse originado por mutación o recombinación de alguno de varios virus posibles (entre ellos, el cowpox). Los miembros de otros dos géneros, Parapoxvirus y Yatapoxvirus, son patógenos para los animales, pero pueden infec­ tar a los seres humanos. Los tanapoxvirus causan infecciones en zonas de África, pero han producido enfermedad en viajeros después de regresar de una zona endémica.124 El virus del molusco contagioso, el único miembro del géne­ ro Molluscipoxvirus, provoca una lesión cutánea característica; como el virus varióla, infecta sólo a los seres humanos.146 Los parapoxvirus incluyen agentes que producen enfermeda­ des de las ovejas (virus orí' o de la dermatitis pustulosa conta­ giosa) y en las vacas (nodulo de los ordeñadores o seudocowpox). También causan infecciones localizadas en las personas expuestas profesionalmente a los virus. Es improbable aislar poxvirus en el laboratorio clínico. Papovavirus

Los papovavirus, un grupo heterogéneo de virus de DNA, están constituidos por los virus del papiloma (Pa), polioma (PO) y el virus vacuolante (VA). Los subgrupos difieren mucho en su biología. Los virus vacuolantes son autóctonos de los ani­ males y los microbiólogos pueden encontrarlos sólo como agentes contaminantes en cultivos de tejido de células de riñón de mono. VIRUS DEL PAPILOMA

Los virus del papiloma humano (HPV) producen verrugas comunes, verrugas venéreas de transmisión sexual y tumores de los aparatos respiratorio, intestinal y genital. La naturaleza viral de las verrugas se conoció a comienzos del siglo pasado, cuan­ do fueron transferidas por medio de filtrados libres de células, y Shope definió el papilomavirus del conejo como agente causal de papilomas en 1933.315 El estudio del HPV estuvo detenido hasta que se desarrollaron las técnicas moleculares necesarias para la tarea en la década de 1970. Se describieron más de 60 tipos genéticos de HPV. Existen fuertes asociaciones entre ciertos genotipos y las lesiones clí­

1305

nicas (cuadro 23-13). La verruga común es la lesión más fre­ cuente, pero la mayor atención se ha dirigido a las infecciones genitales, incluida su asociación con neoplasias. Las parejas sexuales de los pacientes infectados por el HPV también se in­ fectan con frecuencia por el mismo genotipo. La asociación del HPV con la neoplasia de cuello uterino se ha determinado a partir de muchos estudios. Aunque el virus representa el mayor riesgo, otros factores no definidos parecen necesarios para el desarrollo del cáncer. Más que una violenta transición del epitelio normal al neoplásico en el cuello uteri­ no, existe un espectro continuo, reconocido como grados de gravedad creciente de la neoplasia intraepitelial cervical. El estadio final del proceso es el desarrollo de un tumor maligno franco, el carcinoma invasor, que puede ser glandular o esca­ moso. En forma similar, existe una gradación en la expresión de los genes y antígenos del HPV. En el epitelio normal las células de la capa basal se diferencian de manera progresiva para formar epitelio plano no queratinizado en la superficie. A medida que el epitelio cervical cambia de apenas displásico a intensamente displásico, se observan las siguientes alteracio­ nes: 1) las células se hacen menos diferenciadas en todo el epi­ telio, 2) el contenido cromosómico de los núcleos se transfor­ ma progresivamente en anormal, 3) la expresión de productos genéticos del HPV (antígenos) es menos intensa y 4) la expre­ sión de los genes de HPV se vuelve cada vez más difícil de demostrar. Una característica de la célula infectada por el HPV es la coilocitosis, un halo perinuclear del epitelio escamoso acompañado por atipia nuclear, aunque esta alteración no se presenta en todas las células infectadas. El aspecto de la atipia coilocítica en células cervicales exfoliadas se muestra en la figura 23-4. La biología celular del HPV apoya su papel fundamental en el desarrollo de neoplasias.315 Los tipos virales asociados más estrechamente con el cáncer cervical, en particular el HPV-16, son capaces de transformar células en cultivo de manera que éstas pierden sus mecanismos normales de control de creci­ miento. El DNA de estos tipos se integra al DNA del huésped, en un caso cerca de los oncogenes celulares. La integración viral puede producir reordenamiento cromosómico y conducir a la diferenciación anormal in vitro. Zur Hausen ha adelantado la hipótesis de que la neoplasia cervical es el resultado de una falla de un mecanismo primordial de vigilancia celular que ha sido diseñado para controlar genomas virales persistentes.539 Se ha demostrado DNA de papilomavirus en el epitelio cer­ vical normal adyacente a verrugas genitales y a tumores malig­ nos. La omisión de extirpar todo el tejido infectado puede dar lugar a recidivas. También puede demostrarse DNA de HPV en el 5% al 10% de las mujeres con frotis o biopsias cervicales normales. La infección puede ser transitoria; la asociación de los genotipos de alto riesgo con las neoplasias cervicales es muy evidente cuando el DNA del HPV está siempre presente. Las recomendaciones consensuadas nacionales de los Estados Unidos para el tratamiento de las pacientes con riesgo de contraer neoplasia de cuello uterino, que evolucionan de modo continuo, incluyen parámetros morfológicos (citología exfoliativa cervical) y determinantes virales (detección de HPV). El enfoque actual para clasificar la citología de endo­ cérvix es el Sistema Bethesda.460 En el cuadro 23-14 se resu­ men las recomendaciones actuales para tratar a las pacientes con anomalías.527 El papel del laboratorio en el manejo de la enfermedad endo­ cervical tiene muchas facetas.1 Las recomendaciones para el manejo de la enfermedad por HPV están en continua evolu­ ción. El American College of Obstetricians and Gynecologists

1306

CAPÍTULO 23

Cuadro 23-13

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsla y microorganismos relacionados

A sociación de pap iiom aviru s hu m anos (H P V ) seleccion ad os con enferm ed ad es clín icas

TIPO DE VIRUS

ENFERMEDAD CLÍNICA

HPV-1 HPV-2

Verruga plantar profunda Verruga común Veruga en mosaico Lesiones labiales Verruga plana Verruga común Placas de la epidermodisplasia verruciforme

HPV-3 HPV-4 HPV-5 HPV-6

HPV-7 HPV-11 HPV-13 HPV-16

Genital: condiloma exofítico; condiloma plano; condiloma gigante Papilomas respiratorios Papilomas conjuntivales Verruga común de los carniceros Véase HPV-6 Hiperplasia epitelial focalizada de la cavidad bucal Anogenital: papulosis de Bowen; condiloma plano

HPV-18

Genital: condilomas planos

HPV-31 HPV- 32 HPV-33, 35, 39. 51, 52, 56, 58, 59, 68 HPV-45

Genital: condilomas planos Hiperplasia epitelial focalizada de la cavidad bucal Genital Genital

POTENCIAL NEOPLÁSICO No descrito No descrito

No descrito No descrito Puede desarrollarse carcinoma de células planas en zonas expuestas al sol Asociación débil, en especial en la vulva

No descrito Véase HPV-6 No descrito Asociación estrecha en el cuello uterino Asociación moderada en vagina, vulva, ano y pene También se encuentra en aparato respiratorio, incluso laringe, amígdalas y cavidad bucal Asociación estrecha en el cuello uterino; es infrecuente en lesiones precursoras Asociación estrecha con el carcinoma de cuello uterino No descrito Asociación moderada con el carcinoma de cuello uterino Asociación estrecha con el carcinoma de cuello uterino

Adaptado de la referencia3'5.

sugiere la opción de efectuar citología y pruebas para HPV en combinación para mujeres de 30 o más años de edad; si ambas pruebas son negativas, sólo es necesario repetir la detección sistemática cada 3 años. VIRUS DEL POLIOMA

El más importante de los virus del polioma humanos es el virus JC, que causa una encefalitis destructiva (leucoencefalo-

*

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■ ■

*

patía multifocal progresiva) en pacientes inmunodeprimidos.323 El SV40 (virus simiano 40) también produce la misma enfer­ medad y constituye otro ejemplo de un virus simiano que atra­ viesa la barrera de las especies. El aspecto histológico de la leucoencefalopatía multifocal progresiva, como los cuerpos de inclusión virales intranucleares, es diagnóstico. Los poliomavirus son reactivados con frecuencia en los receptores de trasplantes, casi siempre mucho después del tras­ plante que otros virus humanos latentes. El virus JC y el virus

2 •• w

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M "H P

Figura 23-4 Tinción de Papanicolaou. (A) Células epiteliales planas cervicales normales exfoliadas. El núcleo es pequeño y compacto y el citoplasma es abun­ dante en estas células epiteliales maduras, queratinizadas. (B) Atipia coilocítica. Los núcleos de algunas de estas células superficiales se encuentran agrandados, con cromatina gruesa y agrumada, y existe una zona pálida o aclaramiento del citoplasma {flecha) (250x).

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s d e las in fe c c io n e s v ira le s

Cuadro 23-14 Clasificación de Bethesda de la citología cervical ANOMALÍA OTOLÓGICA

ACTITUD RECOMENDADA

Negativo para lesión o tumor maligno epiteliales Células planas atípicas de importancia indeterminada (ASC-US)'1

Continuar con las pruebas citológicas periódicas Realización de pruebas citológicas rápidas 0 BIEN Pruebas para HPVfc O BIEN Examen colposcópico

Células planas atípicas, no se puede descartar una lesión intraepitelial plana de alto grado (ASC-H) Lesión intraepitelial plana de bajo grado (LSIL) Lesión intraepitelial plana de alto grado (HSIL) Carcinoma de células planas

Examen colposcópico

1307

nitaria (enfermedad por Rh) los que causan el daño son anti­ cuerpos dirigidos contra los eritrocitos fetales. Un síndrome hemofagocítico viral en niños y adultos se ha asociado con el parvovirus humano. Se ha demostrado la transmisión de la infección por parvovirus de pacientes con grandes cantidades de virus a personal sanitario. Las manifestaciones clínicas de la infección humana por parvovirus durante una epidemia en Cádiz, España, incluyeron manifestaciones hematológicas en el 13,9% de 43 pacientes, lesiones dermatológicas en el 53,4%, artralgias o artritis en el 20,9% e infección durante el embarazo en el 7% de los pacien­ tes (dos de estas mujeres sufrieron aborto). La fiebre y las adenopatías fueron los síntomas de presentación en el 37% de los casos.175 Virus de las hepatitis

Examen colposcópico Examen colposcópico Confirmación por biopsia

" Consultar las referencias para ver las recomendaciones en circunstancias especia­ les: mujeres posmenopáusicas, mujeres inmunosuprimidas y embarazo. bSe recomienda hacer pruebas para HPV si hay material disponible de la visita ini­ cial (evitar los exámenes pelvianos repetidos). Adaptado de las referencias460-527.

BK son los que se encuentran más a menudo. Ambos se han asociado con cistitis hemorrágica grave en los receptores de trasplante de médula ósea.

Muchos virus pueden causar daño infeccioso en el hígado. El EBV y el CMV producen en ocasiones hepatitis sintomáti­ ca como parte del síndrome de mononucleosis. Los virus de las hepatitis primarías son un grupo heterogéneo. La “sopa de letras” de las hepatitis se resume en el cuadro 23-15. Se des­ cribieron varios otros virus como posibles agentes de hepatitis, pero la evidencia a favor de su papel como agentes etiológicos no es concluyente; estos virus son el virus de la hepatitis G (o variante GB del virus de la hepatitis C, un miembro de la fami­ lia Flavoviridae3I2), así como los virus TT y SEN, ambos miembros de la familia Circoviridae. Aunque no se ha demos­ trado que el virus de la hepatitis G cause hepatitis, los pacien­ tes con infección por el HIV coinfectados por el virus de la hepatitis G 5 a 6 años después de la seroconversión para HIV tienen menos probabilidades de morir que los pacientes infec­ tados por el HIV que no están crónicamente infectados por el virus de la hepatitis G.400-521

Parvovirus

Como su nombre lo indica, los parvovirus son muy peque­ ños; son fuera de lo común en el sentido que contienen DNA de cadena simple. Se ha demostrado que el único parvovirus humano, conocido como Bl9, causa una enfermedad febril común de la infancia con erupción cutánea. El eritema infec­ cioso también se conoce como quinta enfermedad (la quinta enfermedad de la infancia después del sarampión, la rubéola, la varicela y la roséola).35'532 Se caracteriza por fiebre y una erup­ ción cutánea característica en “mejillas abofeteadas” en los niños pequeños. La mayoría de las personas son inmunes al lle­ gar a la edad adulta, pero las personas sensibles pueden expe­ rimentar artritis o artralgias. Este patrón de enfermedad leve con erupción cutánea en la infancia y de artritis grave en la edad adulta recuerda al virus de la rubéola. La erupción cutá­ nea del eritema infeccioso es maculopapular, pero se ha publi­ cado una lesión vesicopustulosa en un adulto. El parvovirus Bl9 tiene afinidad por los precursores inma­ duros de los eritrocitos. El receptor para el parvovirus Bl9 existente sobre los eritrocitos humanos es el antígeno P y los individuos que carecen de este antígeno son naturalmente resis­ tentes a la infección. Lamentablemente, muy pocos individuos carecen de antígeno P eritrocitario. El parvovirus B19 puede causar anemia transitoria en las personas sanas y anemia grave crónica o crisis aplásicas en los pacientes con tumores malig­ nos o hemoglobinopatías. Si una mujer embarazada sufre una primoinfección con parvovirus, puede haber una eritroblastosis fetal con hidropesía fetal. En este caso el virus produce una anemia crónica grave, en tanto que en la eritroblastosis inmu­

VIRUS DE LA HEPATITIS A

El virus de la hepatitis A causa hepatitis infecciosa esporá­ dica y epidémica. La enfermedad se conoce desde la antigüe­ dad, pero el virus no fue identificado hasta la década de 1970. El virus de la hepatitis A se clasificó inicialmente como ente­ rovirus 72, sobre la base de sus características bioquímicas y físicas. Más tarde, se encontró que tenía notables diferencias con los enterovirus clásicos. En la actualidad ha sido transferi­ do a un nuevo género, los Hepatovirus, dentro de la familia Picornaviridae.234Existen siete genotipos de virus de la hepati­ tis A; la mayoría de las cepas pertenecen al genotipo I. El virus de la hepatitis A produce una hepatitis aguda autolimitada. El período de incubación entre la exposición y la enfermedad clínica es corto (< 1 mes). Durante los 7 a 10 días antes de la enfermedad clínica hay replicación no citopatogénica en los hepatocitos, viremia y eliminación fecal de virus infeccioso. Sigue un período de replicación viral con daño del hepatocito, incluida la clásica degeneración “en globo” de las células hepáticas. En este momento se completa prácticamente el período de contagiosidad. La infección por virus de la hepa­ titis A se transmite raras veces por transfusiones de sangre, ya que hay poco virus en ella y la duración de la viremia es limi­ tada. Se describió en Europa y los Estados Unidos transmisión de la infección a pacientes con hemofilia por el concentrado de factores de la coagulación, que contiene sueros de muchos dadores. La necrosis masiva del hígado y la cirrosis posinfec­ ción son raras. La hepatitis crónica y la neoplasia no son com­ plicaciones.

1308

C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Cuadro 23-15 Principales causas virales de hepatitis VIRUS

TAXONOMÍA

TRANSMISIÓN

CRONICIDAD

NEOPLASIAS

Hepatitis A

Hepatovirus RNA

Entérica: Agua Alimentos Mariscos

No

No

Hepatitis B

Hepadnavirus

Parenteral: Sangre Sexual Agujas Entérica

Sí

Sí

Hepatitis C

? Togavirus Viriones de 27 nm RNA

Parenteral: sangre

Sí

Sí

Hepatitis D

Virión de 42 a 47 nm RNA

Hepatitis E

Virión de 27 a 34 nm

Entérica

? No

? No

La hepatitis A se transmite por agua y alimentos contamina­ dos. Los moluscos bivalvos obtenidos de aguas contaminadas han originado numerosos brotes porque suelen ingerirse crudos o cocidos al vapor, a una temperatura que no mata al virus.286 En un brote ocurrido en Shangai, más de 300 000 personas se infectaron después de comer almejas crudas provenientes de aguas contaminadas.234También existe la transmisión sexual.268 La transmisión del virus de la hepatitis A, como sucede con la del EBV o la de la poliomielitis, está determinada por las condiciones sanitarias y socioeconómicas. El virus circula con libertad en condiciones de mala infraestructura sanitaria e infecta al hombre a edades tempranas, cuando la infección suele ser asintomática. Los ciudadanos más pudientes escapan a la infección hasta la edad adulta, cuando ocurre hepatitis sin­ tomática.234 (Véase el texto sobre “Poliovirus” y “Virus de Epstein-Barr”). VIRUS DE LA HEPATITIS B

El virus de la hepatitis B es un hepadnavirus de DNA. Causa hepatitis crónica y aguda y un agente etiológico del carcino­ ma hepatocelular.174 El virus tiene un largo período de incuba­ ción (45-120 días) y se transmite sobre todo por vía parenteral.235 Hasta que se inició el control de rutina para este virus, la hepati­ tis B era la causa más frecuente de hepatitis asociada con trans­ fusiones. Otras vías parenterales son la acupuntura y el tatuaje. Se ha encontrado antígeno de hepatitis B en mosquitos, pero la transmisión de la infección por artrópodos no se ha demostrado. Este virus puede transmitirse por contacto sexual y ha producido enfermedad epidémica en varones homosexuales, prostitutas y adictos a drogas intravenosas. Existe la infección perinatal, pero la leche materna no parece ser importante en la transmisión. A diferencia del virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis B puede causar una hepatitis fulminante aguda mortal, denomina­ da necrosis hepática masiva. Se ha sugerido que esta manifesta­ ción grave es causada por una mutación del virus. La variedad de mecanismos de transmisión de la infección por virus de la hepatitis B recuerda al HIV. Sin embargo, la concentración de virus de hepatits B en sangre y líquidos cor­

porales es mucho mayor que la del HIV y, en consecuencia, las infecciones intrahospitalarias son un problema mucho más serio. La hepatitis B ha sido una causa importante de infeccio­ nes laborales entre el personal médico, pero la frecuencia ha disminuido mucho por el amplio uso de la vacunación del per­ sonal sanitario. El virus de la hepatits B es un virus esférico de 47 nm que tiene varios antígenos de importancia para el diagnóstico y la patogenia. Varios genotipos del virus tienen implicaciones clí­ nicas definidas. La infección con el genotipo A tiene una mayor tasa de supervivencia y la enfermedad es menos grave; el geno­ tipo B se encuentra casi siempre en las infecciones que tienen como resultado un carcinoma hepatocelular: el genotipo C pro­ duce enfermedad grave; el genotipo D se encuentra en la hepa­ titis fulminante.235 Existen tres polipéptidos de envoltura que se conocen como HBsAg (antígeno de superficie de la hepatitis B), HBcAg (antígeno de core de la hepatitis B) y HBeAg (antígeno de la hepatitis B). Este virus no ha sido cultivado in vitro, pero la va­ riedad de antígenos y sus correspondientes anticuerpos propor­ cionan gran cantidad de elementos para la demostración de la enfermedad clínica. Aunque esto no es absoluto, la presencia de antígeno se correlaciona bien con la presencia de DNA y DNA polimerasa y con la infecciosidad viral. La fascinante his­ toria del descubrimiento del antígeno Australia (conocido como HBsAg) y su relación con la hepatitis ha sido analizada por Blumberg.33 Sirve como recordatorio de que nadie puede prede­ cir dónde hará impacto la investigación básica. ¿Quién hubiera dicho que un grupo de investigación dedicado a polimorfismos genéticos de proteínas sanguíneas descubriría la clave de una de las causas más importantes de la hepatitis humana? Por razones no aclaradas, algunas personas que han estado infectadas por el virus de la hepatitis B desarrollan anticuerpos y eliminan el virus de su organismo, en tanto que en otras los an­ tígenos virales continúan circulando. Un subgrupo de estos portadores crónicos desarrollan enfermedad hepática crónica. Otra complicación grave de esta infección es la integración del DNA viral en el genoma del hepatocito y el desarrollo de car­ cinoma hepatocelular.

M a n ife s ta c io n e s c lín ic a s de las in fe c c io n e s v ira le s

VIRUS DE LA HEPATITIS C

Después de que estuvieron disponibles los reactivos diag­ nósticos para la hepatitis A y B, se hizo evidente que había otras causas de hepatitis asociada con transfusiones.324 El virus o virus desconocidos se denominaron virus de la hepatitis no A, no B. Gracias a la compleja técnica de la biología molecular, reconocemos ahora la hepatitis C como la causa de la mayoría de los casos de hepatitis no A, no B, asociados con las transfu­ siones. El virus, que no ha sido cultivado, fue finalmente carac­ terizado por técnicas moleculares, en lo que constituyó uno de los primeros triunfos de la biología molecular. Resultó sor­ prendente que el agente recién caracterizado estaba más estre­ chamente relacionado con un grupo de virus transmitidos por artrópodos; en la actualidad es un género (Hepacivirus) de la familia Flaviviridae. Los conceptos de las relaciones genéticas entre cepas del virus de la hepatitis C están en evolución. Se describieron al menos 11 genotipos, pero otros investigadores asignan los genotipos a seis ciados. Los pacientes infectados por cepas pertenecientes a los ciados la y Ib (que correspon­ den a los genotipos la y 1 b) no responden tan bien al trata­ miento con interferón y progresan más rápidamente a la hepatopatía crónica que los individuos infectados por otras cepas. Por lo demás, parece haber pocas diferencias fenotípicas entre cepas genéticamente distintas. La epidemiología de las infecciones por hepatitis C tiene muchas similitudes con la de la hepatitis B, pero son evidentes ciertas diferencias importantes. La vía más frecuente de dise­ minación es a través de hemoderivados, como la inmunoglobulina, la cirugía y la adicción a drogas intravenosas. La detec­ ción sistemática en los hemoderivados en busca de virus de la hepatitis C ha disminuido sustancialmente el riesgo de trans­ misión por esta vía. Existe la transmisión sexual, pero la fre­ cuencia es mucho menor que para la infección por hepatitis B. La frecuencia de los anticuerpos contra la hepatitis C entre el personal sanitario en Baltimore fue igual a la de la población general, lo que sugiere que el personal sanitario está expuesto a bajos niveles de virus o que la transmisibilidad no es impor­ tante.479 La infección aguda por el virus de la hepatitis C suele ser menos grave que la hepatitis B, pero la frecuencia de hepatitis C crónica es alta. El tema ha sido estudiado por Iwarson y cois.255 La mortalidad a largo plazo de los pacientes infectados por el virus de la hepatitis C es similar a la de los controles, aun­ que los pacientes infectados tienen un riesgo ligeramente supe­ rior de morir por enfermedad hepática. Sin embargo, una vez que se comprueba la infección crónica, el pronóstico es mucho peor. La cirrosis es una complicación importante de la infec­ ción crónica. La infección por hepatitis C es un factor de ries­ go independiente para el carcinoma hepatocelular después del desarrollo de cirrosis. Las manifestaciones inmunitarias extrahepáticas, como la crioglobulinemia y los factores reumatoideos, son parte importante de la infección por hepatitis C, como lo son para la hepatitis B. VIRUS DE LA HEPATITIS D

El virus de la hepatitis D, conocido también como agente delta, es un virus de RNA de 35 nm, con doble envoltura que es incapaz de multiplicarse sin el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B.182 El virus delta maduro se recubre a sí mismo con la cubierta del HBsAg antes de infectar otras célu­ las. Así, la biología de la hepatitits D está indisolublemente unida a la de la hepatitis B. El virus de la hepatitis D puede cau­ sar infección y enfermedad sólo en los pacientes infectados en

1309

forma simultánea por el virus de la hepatitis B o que están pro­ duciendo HBsAg por una infección previa. No es sorprendente que la hepatitis D esté concentrada en bolsones de poblaciones con infección por el virus de la hepatitis B, como los adictos a las drogas y los varones homosexuales. Cuando existe coinfección, la enfermedad clínica es similar a la producida por la hepatitis B y suele ser autolimitada. Cuando el virus de la hepatitis D infecta a un individuo que es portador crónico del virus de la hepatitis B, la enfermedad clí­ nica es mucho más grave, se hace crónica en hasta el 80% de los casos y las tasas de mortalidad pueden aumentar de mane­ ra espectacular, hasta alcanzar un 12%. VIRUS DE LA HEPATITIS E

El agregado más reciente a la sopa de letras de los virus de las hepatitis es un virus lábil de RNA de 27 nm.406 El virus de la hepatitis E causa una hepatitis aguda transmisible por vía enteral, muy similar a la hepatitis A. El genoma viral ha sido clo­ nado por técnicas similares a las utilizadas para identificar el virus de la hepatitis C. La ubicación taxonómica del virus no está aclarada todavía. Tiene similitudes con los calicivirus, pero su pariente genético más cercano es el virus de la rubéo­ la, clasificado actualmente como togavirus. Cuando los siste­ mas sanitarios son deficientes se producen grandes epidemias transmitidas por el agua, pero la infección no se ha encontrado aún en forma autóctona en los Estados Unidos. Sin embargo, los viajeros a áreas endémicas han regresado con la infección. Enfermedades causadas por priones (encefalopatías espongiformes transmisibles)

Las encefalopatías espongiformes transmisibles son un grupo fascinante de infecciones del SNC que se definen por una anatomía patológica celular distintiva, que produce un aspecto vacuolado de la materia blanca cerebral. Las infeccio­ nes y sus huéspedes naturales se resumen en el cuadro 23-16. Se ha propuesto una clasificación molecular y clínica de estas enfermedades.495 Durante décadas se ha sabido que el agente del scrapie (“tembladera” de las ovejas o encefalopatía espongiforme ovi­ na) era novedoso: un agente aparentemente transmisible que no presentaba evidencias de contener ninguno de los tipos de ácido nucleico. El patógeno responsable se consideró en prin­ cipio un “virus lento”, pero el agente era más resistente a la inactivación por rayos X, luz ultravioleta y tratamientos quími­ cos enérgicos, incluida la inmersión en formalina al 10%, que cualquier otra partícula infecciosa conocida. En la década de 1960, Pattison propuso que el agente era una proteína básica y Griffith sugirió varios mecanismos hipotéticos, uno de los cua­ les resultó ser el correcto.404 La naturaleza de las partículas infecciosas fue develada por Prusiner. Este autor prosiguió su batalla para convencer a sus colegas escépticos y finalmente recibió un premio Nobel por sus esfuerzos. Este peculiar agen­ te infeccioso, denominado prion, resultó ser una proteína celu­ lar normal (PrPc) modificada por un cambio de conformación. La proteína PrPc se convierte en la proteína anormal (PrPsc) por el plegamiento adicional de una parte de su estructura de a hélice a una hoja (i402-404 Aunque la teoría de la proteína infec­ ciosa está aceptada en general, el consenso acerca de la natura­ leza del agente infeccioso no es unánime.91 Las enfermedades producidas por priones se denominan encefalopatías espongiformes transmisibles (EET).264-404’405 Eran enfermedades de interés veterinario hasta que se encontró

1310

C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsiay microorganismos relacionados

Cuadro 2 3 -1 6 E ncefalop atías esp on giform es transm isibles (en ferm ed ad es causad as por priones) AGENTE

HUÉSPED NATURAL

INFECCIÓN HUMANA

Scrapie

Ovejas

No

Encefalopatía transmisible del visón

Visón

No

Enfermedad consuntiva crónica

Ciervo, caribú

No

Kuru

Seres humanos

Sí

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) (formas familiar, esporádica y iatrogénica)

Seres humanos

Sí

Síndrome de Gertsmann-Straussler-Scheinker (GSS)

Seres humanos

Sí

Insomnio mortal (formas esporádica y familiar)

Seres humanos

Sí

Encefalopatía espongiforme bovina (EEB)

Ganado bovino

Sí

la primera EET humana. El kuru se observó en una remota y aislada tribu de aborígenes de las tierras altas de Nueva Guinea.171 Gajdusek ganó un premio Nobel por develar la mis­ teriosa enfermedad que comenzaba con ataxia cerebelosa y un temblor similar al de los escalofríos, progresaba a la pérdida completa de la función motora y del habla y causaba la muerte en el término de un año. El agente se transmitía a través de las prácticas de canibalismo ritual, como parte del rito de duelo por los muertos. La transmisión de la enfermedad se detuvo cuando la tribu fue convencida de alterar sus prácticas. Más tarde, se encontró que dos demencias humanas raras, la enfer­ medad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) y una variante de ella, el síndrome de Gertsmann-Straussler-Scheinker (GSS), eran cau­ sadas por un agente similar. Estas enfermedades degenerativas, que se observan en forma familiar y esporádica, producen la rápida aparición de demencia. La pérdida de la memoria y los problemas de conducta aparecen en algún momento posterior en la mayoría de los pacientes. La muerte ocurre en meses o dentro del año de la aparición de los síntomas. La encefalopatía espongiforme bovina (EEB) apareció en el sur de Inglaterrra en 1986 y para finales de 1993 se habían documentado alrededor de 100 000 casos.40 El scrapie ha sido transmitido experimentalmente de los ovinos al ganado bovi­ no184 y se ha conjeturado que la enfermedad se transmite al ganado bovino a través del cerebro de oveja incluido en el ali­ mento balanceado como suplemento proteico.40 La EEB puede haber surgido también como una mutación al azar, como suce­ de con la EEJ en el hombre. Cualquiera que haya sido el origen del primer caso, la inclusión de productos de origen animal en los alimentos balanceados para animales permitió la disemina­ ción amplia de la infección en el ganado bovino.254 Lo que fuera un desastre económico se transformó en una pesadilla política y científica en 1996, cuando se anunció que algunos casos de “enfermedad de Creutzfeld-Jakob atípica” en Inglaterra podían haberse originado por la ingesta de carne pro­ cedente de vacas con EEB. El gobierno británico reacionó tibiamente, los gobiernos europeos lo hicieron en forma exage­ rada, y se produjo una crisis con más política que ciencia. Rápidamente quedó claro que la variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vECJ) era real. Varios autores creen que es el resultado de comer carne contaminada,104-254495 aunque Prusiner ha sido más circunspecto en su análisis.403'405 La vECJ se diferencia de la forma clásica de varias maneras, como el comienzo a edades tempranas. La epidemia de EEB, y aparen­ temente la de vECJ, se controló finalmente en Gran Bretaña

por la matanza masiva de ganado bovino y la prohibición de usar productos de origen animal para elaborar alimento para animales. Los largos períodos de incubación de las EET hacen que la cautela adoptada antes de cantar victoria sea una políti­ ca prudente.254 La saga de la EEB y de la vECJ destruyó la (reconfortante) teoría aceptada antes de que las enfermedades transmitidas por priones eran específicas de especie. Aunque las EET se cono­ cen desde hace muchos años, nunca antes la transmisión cruzó las barreras de la especie. Resultó devastador reconocer que estas barreras pueden no ser absolutas y que los seres humanos pueden no estar exentos de riesgo. El hecho es que por lo menos una de las víctimas de la ECJ había participado en un banquete en el que se consumió carne de animales de caza.78 No se sabe si los animales silvestres estaban afectados por una enfermedad crónica consuntiva, como la que afecta las mana­ das de renos y ciervos del oeste y norte central de los Estados Unidos. De todas maneras, el riesgo adicional para los seres humanos es más que obvio. Otra reconfortante ilusión fue des­ truida cuando se identificó EEB en Canadá y los Estados Unidos.81128 Hasta este momento, todas las transmisiones de enfermeda­ des por priones han tenido lugar a través de tejidos nerviosos, incluso la transmisión de ECJ por hormonas derivadas de teji­ do hipofisario humano, por trasplante de duramadre y córneas, y por electrodos para encefalograma infectados.405 Algunos casos se han hecho clínicamente evidentes más de 14 años des­ pués de la probable exposición. No se poseen pruebas definiti­ vas de la transmisión por tejidos extraneurales,264 pero se ha demostrado la presencia de priones fuera del SNC en la ECJ clásica187 y en la vECJ.495 Ante la sospecha clínica de una EET. deben tomarse precau­ ciones extremas en el cuarto de autopsias y en el laboratorio de histología, porque los agentes de estas infecciones sobreviven la fijación con formalina y son demostrables incluso en tejidos embebidos en parafina.

Clasificación clínica de las infecciones virales Aunque la taxonomía viral es importante desde el punto de vista científico, los esquemas clínicos de clasificación tienen validez práctica cuando se considera a un paciente en particu­ lar. Los síndromes clínicos y los virus asociados con ellos con mayor frecuencia se resumen en el cuadro 23-17. Nótese que

C la s ific a c ió n c lín ic a d e las in fe c c io n e s v ira le s

1311

Cuadro 23-17 Síndromes clínicos asociados con infecciones virales SISTEMA CLÍNICO

SÍNDROME

Respiratorio

Coriza (resfriado común)

Faringitis

AGENTES MÁS PROBABLES

AGENTES MENOS PROBABLES

Rinovirus

Influenza A y B

Coronavirus

Parainfluenza 1 y 2

Adenovirus

RSV

Parainfluenza 3

Enterovirus

Adenovirus

Influenza A y B

Herpes simple 1

RSV

Enterovirus

Parainfluenza 1 y 2

EBV

Rinovirus Coronavirus

Laringitis estridulosa

Parainfluenza 1

Influenza A

Parainfluenza 2

RSV

Parainfluenza 3

Sarampión Coronavirus

Bronquiolitis

Parainfluenza 3

Adenovirus

RSV

Parainfluenza 1 y 2 Influenza A y B Rinovirus

Neumonía

Influenza A

Parainfluenza 1 y 2

RSV

Rinovirus

Parainfluenza 3

EBV

Adenovirus

Influenza B

CMV (en pacientes inmunosuprimidos)

Coronavirus del SRAG Metapneumovirus

Pleurodinia

Coxsackie B

Coxsackie A

Meningitis aséptica

Echovirus

Virus de la parotiditis

Coxsackie A

LCM

Coxsackie B

Herpes simple 2

Echovirus Sistema nervioso central

VZV Adenovirus Bunyavirus Parainfluenza 3 Poliovirus (cepas vacunantes) Encefalitis

Herpes simple 1

Togavirus Flavivirus Bunyavirus EBV Enterovirus Virus de la rabia CMV

Gastrointestinal

Diarrea (lactantes)

Rotavirus

Calicivirus (Norwalk)

Adenovirus 40 y 41 Astrovirus (Continúa)

1312

C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Cuadro 23-17 Síndromes clínicos asociados con infecciones virales

(c o n t.)

SISTEMA CLÍNICO

SÍNDROME

AGENTES MÁS PROBABLES

AGENTES MENOS PROBABLES

Gastrointestinal (cont.)

Diarrea (adultos)

Calicivirus (virus tipo Norwalk)

Rotavirus Adenovirus 40 y 41 Astrovirus

Hepatitis

Hepatitis A

EBV

Hepatitis B

CMV

Hepatitis C

Hepatitis D Hepatitis E

Cutáneo

Parotiditis

Virus de la parotiditis

Parainfluenza

Erupción vesicular

Herpes simple 1 y 2

Echovirus

VZV

Coxsackie A Vaccinia

Erupción maculopapular

Echovirus

Adenovirus

Coxsackie

EBV

Herpesvirus humano 6 y 7

Dengue Sarampión Rubéola

Erupción petequial

Ninguno frecuente

Adenovirus Echovirus Coxsackie Virus de las fiebres hemorrágicas

Urogenital

Cistitis hemorrágica

Ninguno frecuente

Adenovirus Virus del herpes simple 1

Cardíaco

Miocarditis/pericarditis

Coxsackie A, B

Adenovirus

Echovirus

Virus del herpes simple 1 Influenza A Virus de la parotiditis

Ocular

Queratitis/conjuntivitis

Herpes simple 1

Vaccinia

VZV

Sarampión

Adenovirus Adaptado de Mclntosh K: Diagnostic virology. En: Fields BN, Knipe DM, Melnick JL, et al., eds., Virology, 2a ed. Nueva York: Raven Press, 1990:411-440.

virus de diferentes grupos taxonómicos pueden ocasionar los mismos síntomas.

Diagnóstico de las infecciones virales La técnica primaria de diagnóstico para la mayoría de las infecciones virales es el aislamiento del virus en cultivo de teji­ dos. Las técnicas serológicas también pueden ser de utilidad, sobre todo si el virus fue aislado en una localización no estéril. En algunos casos, el diagnóstico serológico es la única con­ ducta práctica en un laboratorio clínico. La detección directa de antígeno en líquidos corporales o tejidos también ha sido eficaz para algunos virus. Sin duda, la lista de agentes para los cuales es útil la detección directa de antígeno continuará indudable­

mente en expansión. El diagnóstico molecular es el enfoque del futuro. En el cuadro 23-18 se resumen los métodos utilizados con mayor frecuencia en los laboratorios de hospitales para diagnosticar infecciones virales. Las ventajas y las desventajas de cada uno de estos enfoques se comparan en el cuadro 23-19. Los lectores interesados en el tema pueden consultar varias excelentes referencias para obtener más información.248-462 Obtención de muestras para el diagnóstico

En general, debe hacerse un intento de obtener material del órgano u órganos infectados. En el caso de las infecciones vira­ les más frecuentes de la piel, las lesiones cutáneas son las mejores muestras para cultivo. Para el diagnóstico de las infec­ ciones de los aparatos respiratorio y gastrointestinal, deben cul-

D ia g n ó s tic o de las in fe c cio n e s v ira le s

1313

Cuadro 23-18 Métodos de diagnóstico de las infecciones virales MÉTODO AUXILIAR

VIRUS

MÉTODO PRINCIPAL

MÉTODO RÁPIDO

Adenovirus

Cultivo-, TMA4

F, EIA, PCR-TR4

Serología'

Adenovirus entéricos

EIA, F

PCR-TR4

IME4

COMENTARIOS

Alfavirus

Cultivo4'7, TMA4

PCR-TR4

Serología

Arenavirus

Cultivo'1, TMA4

EIA4, PCR-TR4

Serología

Astrovirus

TMA4

PCR-TR4

EIA4, IME4

Bunyavirus

TMA"-4

PCR-TR"-4

Serología"-4

Calicivirus

TMA4

PCR-TR4

EIA4, IME4

Coronavirus

Cultivo*, TMA1”

PCR-TR4

Serología"-4

Se realiza sólo en epidemias o ante un posible SRAG

Citomegalovirus

Cultivo", TMA" '’

CFA", antígeno en sangre por P-4, PCRC"-4

Serología

Serología para nivel inmunitario; antigenemia y PCRC para control

Enterovirus

Cultivo", TMA6

PCR-TR4

Serología"

La gran cantidad de serotipos hace poco práctica la serología

Virus de Epstein-Barr

Serología", TMA6

PCR-TR4

Cultivo4-"

Filovirus

Cultivo4, TMA4

PCR-TR4

Serología4

Flavivirus

Cultivo"-4, TMA4

PCR-TR4

Serología4

Virus de la hepatitis A

Serología para IgM"

TMA4 TMA4

Prueba realizada sólo en laboratorios NBS-4

Se recomiendan tanto las pruebas moleculares como la serología para hantavirus

Prueba realizada sólo en laboratorios NBS-4

Histología

Virus de la hepatitis B

Serología"

Virus de la hepatitis C

Serología", TMA"4

Virus de la hepatitis D

Serología"-4

Virus de la hepatitis E

Serología"-4'

PCR-TR4"

TMA4-"

Todos los procedimientos están en etapa de investigación en los Estados Unidos

Virus del herpes simple

Cultivo", TMA"-4

CFA", F", EIA". PCR-TR4

Serología (tipoespecífica)"

Serología para nivel inmunitario

Herpesvirus humano 6 y 7

TMA"4

PCR-TR4

Serología4

TMA4

Serología para el diagnóstico inicial; TMA para confirmación de infec­ ción activa y monitorización

Herpesvirus humano 8

TMA"-4

PCR-TR4

Virus de la inmunodeficien­ cia humana (HIV)

Serología", TMA"4

Serología

Cultivo4'

Serología para el diagnóstico inicial; control molecular

Influenza

Cultivo", TMA4

CFA", F", EIA", PCR-TR4

Serología"

Se necesita el aislamiento viral para la tipificación

Sarampión

Serología"

F", PCR-TR4

Cultivo"

Rara vez aislado

Metapneumovirus

Cultivo4, TMA4

PCR-TR4

Serología4

Parotiditis

Cultivo", TMA4

PCR-TR4

Serología"

Papilomavirus

TMA"

Parainfluenza

Cultivo", TMA4

CFA", F", EIA", PCR-TR4

Serología"

Parvovirus B 19

TMA4

PCR-TR4

Serología4 (Continúa)

1314

C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, fíickettsia y microorganismos relacionados

Cuadro 2 3-18 M étod os de diagn óstico de las in feccion es virales (cont.) VIRUS

MÉTODO PRINCIPAL

Virus polioma

TMA6

Poxvirus

MÉTODO RÁPIDO

MÉTODO AUXILIAR

Cultivo", TMA0'’

ME"-", PCR-TR"

Serología'

Serología para nivel inmunitario; pruebas realizadas sólo en laboratorios NBS-4

Virus de la rabia

Cultivo"", TMA*

F“", PCR-TR""

Virus sincitial respiratorio

Cultivo", TMA*

CFA", F", EIA", PCR-TR"

Serología'

F es más sensible que EIA

Rhinovirus

Cultivo1, TMA6,0

PCR-TR"c

Rotavirus

EIA"

Virus de la rubéola

Serología"

PCR-TR"

Cultivo"', TMA"

Virus de la varicela-zóster

Cultivo", TMA",C

CFA", F“, PCR-TR"

Serología"

COMENTARIOS

Serología"

Rara vez se hacen pruebas Cultivo1", IME",C, Serología"'

Serología para nivel inmunitario

TMA: prueba de amplificación molecular; F: inmunofluorescencia directa o indirecta; EIA: enzimoinmunoanálisis; PCR-TR: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; SRAG: síndrome respiratorio agudo grave; CFA: cultivo en frascos-ampolla (con amplificación por centrifugación); NBS-4: laboratorio con nivel de bioseguridad 4 (el más alto grado de seguridad); PCRC: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (incluye TaqMan); ME: microscopia electrónica; IME: inmunomicroscopia electrónica. ° Método estándar. hDisponible en laboratorios especializados o de referencia. ' Se lleva a cabo rara vez.

tivarse las secreciones de estas áreas. Las muestras recomenda­ das para el cultivo viral se enumeran en el cuadro 23-20. La mayoría de los virus ingresan en el organismo a través de los aparatos respiratorio o gastrointestinal. Aunque las mani­ festaciones clínicas más evidentes de enfermedad pueden ocu­ rrir en un órgano distante, suele ser adecuado tomar una mues­ tra del punto de entrada. La toma de muestras de múltiples localizaciones es muy útil si es difícil obtener una muestra de

un órgano interno o si el virus es difícil de aislar en el órgano diana. Por ejemplo, la piel es la más evidentemente afectada en la infección sarampionosa, pero el virus del sarampión puede aislarse en las vías respiratorias o en la orina. En forma similar, los sistemas cardíaco y nervioso central están así siempre afectados por las infecciones por enterovirus, pero el virus puede aislarse en las vías altas o en el aparato gastroin­ testinal.

Cuadro 2 3-19 C om p aración de m étod os diagn ósticos MÉTODO

TIEMPO

VENTAJAS

DESVENTAJAS

Cultivo

Días a semanas

Especificidad máxima; sensibilidad casi siem­ pre adecuada; se dispone del aislamiento para su caracterización

Se necesitan instalaciones para cultivo de teji­ dos; el tiempo necesario para hacer el diag­ nóstico puede ser prolongado (se acorta por amplificación con centrifugación)

Detección de antígeno

Horas a un día

Rapidez del diagnóstico; utilizado para virus de difícil cultivo

Falsos negativos y falsos positivos; dificultoso para pruebas masivas

Amplificación molecular

Uno a varios días

Máxima sensibilidad; especificidad casi siempre adecuada

Se necesitan instalaciones para análisis mole­ culares; posible contaminación cruzada; pro­ blemas con los inhibidores

Amplificación en tiempo real

Horas

Excelente sensibilidad y especificidad; veloci­ dad de diagnóstico; puede ser el método de elección en el futuro

Se necesitan instalaciones para análisis mole­ culares

Serología

Semanas

Determinación de la inmunidad; utilizado para virus de difícil cultivo

Potenciales reacciones cruzadas; necesidad de contar con muestras del período agudo y convaleciente

D ia g n ó s tic o de las in fe c c io n e s v ira le s

Si el virus se aísla rara vez en estos sitos no estériles (como es el caso del sarampión), la recuperación de un virus estable­ ce el diagnóstico etiológico. Si el virus se aísla en localizacio­ nes donde puede ser encontrado en ausencia de enfermedad (p. ej., enterovirus en muestras de fauces o de heces), el aisla­ miento de un virus potencialmente patógeno proporciona un diagnóstico presuntivo. Los virus colonizan las superficies mucosas con menor fre­ cuencia que las bacterias, pero pueden estar presentes más a menudo durante los meses en los que hay aumento de la circu­ lación de virus: invierno para los virus respiratorios y verano para los enterovirus. La frecuencia con la cual los enterovirus colonizan el aparato gastrointestinal es máxima en los lactan­ tes y mínima en los adultos. En Cincinnati, la tasa de portación para echovirus fue del 5,2% entre los niños de 1 a 4 años, del 2,6% en los niños de 5 a 9 años y sólo del 0,2% en los niños de 10 a 14 años.428 El virus del herpes simple y el CMV pueden causar infecciones crónicas y ser eliminados en forma intermi­ tente con secreciones y líquidos.386'518

1315

La asociación de una enfermedad clínica con un virus que ha sido aislado en una localización no estéril puede ser reforzada por la demostración de una respuesta serológica contra el virus aisla­ do, aunque rara vez se usa este poco conveniente plan de acción. Las muestras óptimas para el cultivo de virus son los aspira­ dos de líquidos, exudados o secreciones; los tejidos; las irriga­ ciones de las vías aéreas superiores o las muestras de heces. Los hisopados, que son convenientes y más aceptables para los pacientes que las irrigaciones o aspirados, son aceptables en la mayoría de las circunstancias. Los hisopados y las irrigaciones nasofaríngeas suelen ser equivalentes para el aislamiento de virus respiratorios. Algunos investigadores han encontrado que el RSV se aísla en forma más fiable en los aspirados nasofa­ ríngeos que en los hisopados,222 pero esta experiencia no es generalizada.455 Puede usarse casi cualquier material para la punta del hisopo, con la notable excepción del alginato de cal­ cio (por lo menos para el virus del herpes simple).455 La viremia es frecuente en el curso de las infecciones vira­ les, pero a menudo no se la detecta. La viremia por CMV se

Cuadro 23-20 M uestras recom en dad as para cultivo viral

SÍNDROME

MUESTRAS ÓPTIMAS

ALTERNATIVAS PERMISIBLES Y MUESTRAS ADICIONALES

Coriza Laringitis estridulosa

Aspirados nasofaríngeos

Hisopado nasofaríngeo

Faringitis

Lavado o hisopado de fauces

Bronquiolitis Neumonía

Aspirados nasofaríngeos Aspirados traqueales Aspirados o biopsia de pulmón

Hisopado nasofaríngeo

Pleurodinia

Aspirado nasofaríngeo m ás heces

Hisopado nasofaríngeo Hisopado rectal

Meningitis aséptica Encefalitis Mielitis transversa

Líquido cefalorraquídeo (es discutida la utilidad de heces, hisopados rectales y muestras de nasofaringe)

(Hisopado rectal) (Hisopado nasofaríngeo) Biopsia cerebral para herpes simple; orina para sarampión o paperas

Gastroenteritis

Heces

Hisopado rectal

Parotiditis

Aspirados nasofaríngeos m á s orina

Hisopado nasofaríngeo

Erupción cutánea vesicular

Aspirado o hisopado de la vesícula

Erupción cutánea maculopapular

Aspirado nasofaríngeo m á s heces

Cistitis hemorrágica

Orina

Miocarditis Pericarditis

Aspirado nasofaríngeo m á s heces

Orina para virus urliano Hisopado nasofaríngeo Hisopado rectal

Queratitis Conjuntivitis

Raspado conjuntival o de córnea más aspirado nasofa­ ríngeo

Hisopado conjuntival o de córnea Hisopado nasofaríngeo

Hisopado nasofaríngeo Hisopado rectal

Adaptado de Mclntosh K. Diagnostic virology. En: Fields BN, Knipe DM, Melnick JL et al., eds. Virology, 2a ed. Nueva York: Raven Press, 1990:411-440.

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C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

observa regularmente y puede detectarse por varios métodos. La sangre puede ser una muestra útil para el diagnóstico de infecciones por enterovirus en niños pequeños y en lactantes.401 Para el cultivo de lesiones vesiculares de la piel, ésta se limpia con una torunda de algodón embebida en alcohol y se deja secar durante por lo menos un minuto. La vesícula debe abrirse con un bisturí estéril y tocar su base repetidamente con un hisopo esté­ ril. A continuación se coloca el hisopo en un medio de transpor­ te para virus, como se describe más adelante. Como alternativa, puede aspirarse el contenido de la vesícula con una jeringa de tuberculina y una aguja de calibre 26, si la vesícula es lo sufi­ cientemente grande. El material para realizar un preparado de Tzanck puede obtenerse por raspado enérgico de la base de la lesión con una hoja de bisturí; el material que queda sobre la hoja se coloca sobre un portaobjetos de vidrio y se deja secar al aire. Como regla general, la frecuencia con la que se aíslan virus disminuye a medida que aumenta la duración de la enferme­ dad, de manera que debe procurarse obtener muestras lo antes posible en el curso de la infección. Transporte y conservación de las muestras

Los aspirados, líquidos y tejidos deben transportarse al labo­ ratorio en recipientes estériles a prueba de derrames. Es impe­ rioso reducir al mínimo el intervalo que transcurre entre la recolección de la muestra y su siembra en cultivos celulares. La siembra de los cultivos celulares a la cabecera del paciente se ha recomendado para algunos virus lábiles, en especial el RSV. La siembra inmediata no es practicable en muchos medios aistenciales; por fortuna, otros investigadores no han encontrado problemas con el transporte de la muestra al laboratorio para su siembra, incluso en el caso del RSV.455 Los hisopos deben colocarse en un medio de transporte que contenga antibióticos; los hisopos secos no son aceptables. El tipo de medio de transporte probablemente no sea crítico, aun­ que es difícil llevar a cabo estudios comparativos en los que se controlen todas las variables. Los datos más completos son los referentes al virus del herpes simple. Los medios de transporte comerciales, como los hisopos Culturette® (BD Diagnostics, Franklin Lakes, NJ) han sido satisfactorios. El medio de sacarosa-fosfatos-glutamato (SPG), creado para Chlamydia tracho­ matis, también es un medio de transporte eficaz, así como la variante sin glutamato (medio 2SP).260 Tradicionalmente el medio nutritivo se ha suplementado con una fuente de proteí­ nas con la intención de estabilizar los virus frágiles, y con anti­ bióticos, para reducir al mínimo la contaminación bacteriana. Las muestras deben refrigerarse hasta su siembra en cultivos celulares. Para seleccionar la mejor temperatura de conserva­ ción, debe hacerse un balance entre la disminución de los títu­ los virales que ocurre progresivamente a 4 °C y la disminución súbita que se observa cuando las muestras se congelan y des­ congelan. Es claro que 1) las muestras deben mantenerse a -70 °C si deben conservarse durante períodos prologados (se­ manas o meses) y 2) la mejor temperatura es 4 °C si la demora será corta (menos de 24 horas). Una recomendación razonable es que las muestras se refrigeren por períodos de hasta 96 horas y se congelen a -70 °C si la demora será mayor. La peor tem­ peratura es -20 °C, sobre todo en congeladores de descongela­ ción automática, en los que los ciclos repetidos de desconge­ lación y congelación son extremadamente traumáticos para todas las formas de vida. Las muestras nunca deben congelar­ se en el congelador de un frigorífico común. Johnson ha efec­ tuado un análisis extenso del transporte de muestras para diag­ nóstico virológico.260

Aislamiento de virus en cultivo

Aunque algunos de los laboratorios de los hospitales más grandes pueden tener instalaciones para la inoculación de ani­ males, la mayoría de las instalaciones para diagnóstico están restringidas a la utilización de análogos in vitro. Preparación y mantenimiento de cultivos celulares

Los cultivos celulares son el cultivo in vitro de células aisla­ das disociadas. El cultivo de tejidos y órganos es el manteni­ miento in vitro de una porción de un órgano, casi siempre por períodos cortos y determinados. El cultivo de órganos está prácticamente restringido a los laboratorios de investigación. Por ejemplo, se han usado cultivos de tráquea para aislar coro­ navirus humanos, la mayoría de los cuales no se desarrollan en cultivos celulares. A veces, se combinan cultivos de órganos y celulares. Por ejemplo, se utilizó un explante de cerebro infec­ tado y una capa indicadora de células sensibles para el aisla­ miento del virus del sarampión en pacientes con panencefalitis esclerosante subaguda. Los huevos embrionados son una forma barata de cultivar determinados virus, como los ortomixovirus, pero se usan rara vez en los laboratorios de diagnóstico.302 Los cultivos celulares son de tres tipos (cuadro 23-21). Los cultivos celulares primarios consisten en una mezcla de células, por lo general de riñón, pulmón o piel, obtenidas por disocia­ ción de las células de trozos del órgano. Estas células pueden mantenerse en cultivo sólo por períodos limitados. Una vez que se subcultivan repetidas veces in vitro, los cultivos primarios se transforman en líneas celulares. Las líneas celulares utilizadas con mayor frecuencia están compuestas por fibroblastos, obte­ nidos de piel o pulmón embrionario. Una línea celular es diploide si por lo menos el 75% de las células tienen un con­ junto normal de cromosomas. Una línea celular es heteroploide si más del 25% de las células tienen un conjunto anormal de cromosomas. En el cuadro 23-22 se presentan algunas de las opciones en expansión de líneas celulares. La imaginación creadora ha producido una variedad aún ma­ yor de posibilidades de cultivos celulares. La combinación de líneas celulares puede ampliar el espectro de virus detectados y reducir al mismo tiempo el número de tubos necesarios e inclu­ so evitar el uso de cultivos celulares primarios.249 Algunas de las combinaciones de líneas celulares que se han creado, como Fresh Cells® o R-Mix® (Diagnostic Hybrids, Athens, OH) se incluyen en el cuadro 23-21. Las líneas celulares mezcladas pueden combinarse con otros métodos, como la amplificación por centrifugación (frascos ampollas con cubreobjetos) para aumentar aún más la detección.21,137 Una innovación adicional es el almacenamiento de los cultivos mixtos a -80 °C hasta 4 meses antes de su siembra.251 Otra innovación ha sido el diseño de cultivos celulares por ingeniería genética para facilitar el aislamiento de determina­ dos virus o mejorar su detección. Una de las líneas celulares usada con éxito para la detección de enterovirus son las células de riñón de mono verde búfalo (BGMK). Mediante técnicas de ingeniería genética destinadas a que las células BGMK expre­ sen un receptor para enterovirus (factor acelerador de la degra­ dación, DAF), los investigadores han logrado aumentar los resultados diagnósticos.250 Un enfoque diferente de la modificación por ingeniería ge­ nética de células es el sistema para detección del HSV llamado ELVIS (enzyme /inked virus-mducible .system) (Diagnostic Hybrids). En este caso, una secuencia promotora específica para el HSV de la línea celular de riñón de hámster lactante

D ia g n ó s tic o de las in fe c cio n e s v ira le s

1317

Cuadro 23-21 Tipos de cultivos celulares TIPO DE CULTIVO Primario

Diploide; tipos celulares mezcla­ dos; 1 o 2 pasajes

Líneas celulares

Diploides; fibroblastos; cantidad limitada de pasajes (< 50 a 70)

Líneas celulares continuas

Heteroploide; pasaje continuo in vitro

Líneas celulares mixtas

Líneas celulares modificadas genéticamente

EJEMPLOS

CARACTERÍSTICAS

Combinaciones de líneas celulares continuas

Introducción de un gen para producir un cambio indicador visi­ ble después de la infección

USO PRINCIPAL

Primario de riñón de mono

Influenza; parainfluenza; algunos enterovirus

Primario de riñón de conejo Fibroblastos diploides humanos (WI-38, MRC-5, HEL, FS-9)

Herpes simple Herpes simple; citomegalovirus; varicela-zóster; rinovirus

HeLa; HEp-2

Adenovirus; RSV; virus Coxsackie B

A549 MDCK LLC-MK2 Vero; células ML Células RD Células BGM Células 293

Herpes simple; adenovirus; varicela-zóster; algunos enterovirus Virus influenza Virus parainfluenza Herpes simple Algunos virus Coxsackie A Virus Coxsackie B Adenovirus entéricos

M RC-5+ CV-1

Herpes simple; varicela-zóster

Células ML + A549 RD + H292; BGMK + A549

Virus respiratorios Enterovirus

Sistema enzimático inducible por virus (ELVIS)

Herpes simple

(baby hámster kidney BHK) se une a un gen indicador, P-galac­ tosidasa. Cuando las células se infectan con cualquiera de los dos serotipos de HSV, el gen promotor se estimula y el gen indicador se activa, lo que deriva en un cambio visible en el color de la monocapa.387 Como sucede con las líneas celulares mixtas, las células ELVIS pueden almacenarse a -80 °C hasta su utilización.251 El HSV es el virus que se busca con mayor frecuencia en los laboratorios de diagnóstico y son útiles los métodos de detección de este agente. La expectativa de vida de las células diploides normales es de alrededor de 50 pasajes in vitro;218 las líneas celulares que tienen por lo menos 70 pasajes se consideran líneas celulares establecidas. Estas líneas establecidas o continuas pueden pro­ venir de tejidos normales, como la línea de células Vero de riñón de mono verde africano. Alternativamente, pueden origi­ narse de epitelios neoplásicos, como las células HeLa, que derivan de un adenocarcinoma cervical y las células Hep-2, que provienen de un carcinoma de laringe. El aspecto de los cultivos sin sembrar se muestra en la figura 23-5. Las células fibroblásticas suelen ser largas, ahusadas y orientadas en forma paralela, en tanto que las líneas establecidas constan de células epiteliales poligonales. Los cultivos primarios contienen natu­ ralmente una mezcla de tipos celulares. Las condiciones para el desarrollo y el mantenimiento de cultivos celulares varían de manera considerable y sólo es posi­ ble hacer algunas generalizaciones. La temperatura de incuba­ ción óptima es de 36 °C a 37 °C, pero puede reducirse hasta 35 °C después de que se obtiene una monocapa confluente. Esta maniobra puede facilitar el aislamiento de virus que, como los mixovirus y los rinovirus, crecen óptimamente a 33 °C. Debe mantenerse un pH fisiológico. Suele utilizarse un sistema

buffer C 0 2-bicarbonato, en el que la fuente de C 0 2 son las célu­ las metabólicamente activas en un tubo o frasco cerrado. En un sistema abierto, debe aportarse una mezcla de CO, y aire. Los compuestos amortiguadores que no dependen del sistema C 0 2bicarbonato, como el buffer HEPES (ácido Af-2-hidroxietilpiperazin-Af-2-etansulfónico) pueden usarse en sistemas abiertos si no se dispone de una estufa de CO,. Con frecuencia se inclu­ ye en el medio un indicador de pH para el control estrecho de los cambios de pH durante la incubación. Se utiliza a menudo el rojo fenol, que es rojo a pH fisiológico y que vira al amari­ llo a pH ácido y al púrpura a pH alcalino. Los medios de cultivo para virus deben contener vitaminas y aminoácidos esenciales.248 Estos compuestos son estables cuando se almacenan a 4 °C, excepto la L-glutamina, que debe reponerse en forma periódica.361 El medio utilizado con mayor frecuencia es el medio esencial mínimo de Eagle (Eagle Mínimum Essential Médium, MEM), tanto para el crecimiento como para el mantenimiento de las células. Casi siempre se lo suplementa con pequeñas cantidades de suero (hasta el 5%) para mantener la monocapa una vez que las células han alcan­ zado la confluencia. Para aumentar el crecimiento inicial, se utilizan concentraciones de suero más elevadas (por lo habitual del 10%). Es importante que el suero esté libre de agentes infecciosos, como micoplasmas, y que no contenga anticuerpos contra ningún virus que pueda estar presente en las muestras clínicas. Por esta razón, lo más común es utilizar suero fetal bovino, de ternera recién nacida o de ternera agammaglobulinémica. Otras fórmulas, como el medio 199 o el RPMI 1640, contienen una mezcla más rica en nutrientes y pueden ser ópti­ mos para el mantenimiento de algunas líneas celulares. Existen dos formas de soluciones salinas balanceadas que se usan con

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Cuadro 23-22

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

O rigen de las lín eas celulares

TIPO DE LÍNEA CELULAR

NOMBRE

Heteroploide continua

A549

Heteroploide continua

BMG

Heteroploide continua

BHK

Heteroploide continua

CV-1

Diploide Heteroploide continua

FS-9 Células 293 de Graham

Heteroploide continua

HeLa

Heteroploide continua

HEp-2

Heteroploide continua

LLC-MK2

Heteroploide continua

McCoy

Heteroploide continua

MDCK

Diploide

MRC-5

Heteroploide continua Heteroploide continua

ML RD

Heteroploide continua

Vero

Diploide

WI-38

ORIGEN DE LAS CÉLULAS Carcinoma de células alveo­ lares humano (células epi­ teliales tipo II) Células de riñón de mono verde Buffalo Células de riñón de hámster lactante Células de riñón de mono verde africano Fibroblastos de prepucio Células de riñón embrionario humano (HEK) transfor­ madas por fragmentos de DNA de adenovirus tipo 5 Adenocarcinoma de cuello uterino; el HPV-18 está integrado al genoma Carcinoma de células planas de laringe; transfectadas con HPV-16 Células de riñón de mono Macaca mulatta Línea de células murinas de origen desconocido Células de riñón de perro con características de epi­ telio tubular y carcinoma papilar Fibroblastos de pulmón embrionario humano Células de pulmón de visón Células de rabdomiosarcoma humano Células de riñón de Cercopithecus aethiops (mono verde africano) Fibroblastos de pulmón embrionario humano

mayor frecuencia, tanto para el lavado de células como incor­ poradas a medios completos. Las fórmulas de las soluciones de Hanks y de Earle difieren en varios aspectos, sobre todo en la capacidad buffer. Las dos soluciones se utilizan en forma indis­ tinta, pero la solución balanceada de Earle puede ser más con­ veniente para el mantenimiento prolongado de monocapas, debido a su mayor poder buffer. Contaminación de cultivos celulares

La contaminación de los medios de cultivo se reduce me­ diante el uso de antibióticos. Por lo habitual se utiliza penicili­ na (200 pg/mL) y estreptomicina (200 pg/mL) o gentamicina (50 pg/mL) para la supresión del desarrollo bacteriano; para la inhibición del desarrollo de hongos se utiliza anfotericina B (1,25 pg/mL).248 Sin embargo, el uso de antibióticos no sustitu­ ye la técnica aséptica rigurosa. La contaminación de los medios de cultivo con especies de Mycoplasma es un problema habitual y complicado.344 Las es­ pecies de Mycoplasma suelen introducirse con el suero o con fuentes de virus contaminadas; una vez en el cultivo son muy difíciles de erradicar. Los efectos sobre las células incluyen el desarrollo subóptimo y alteraciones en la interacción de las cé­ lulas y los virus. La presencia de especies contaminantes de Mycoplasma puede detectarse por cultivo, por tinción para el DNA del Mycoplasma, por determinación bioquímica de incorporación de uracilo o por técnicas de la actividad de la nucleósido fosforilasa. Los proveedores comerciales de célu­ las deben poder demostrar las medidas que adoptan como con­ trol de calidad. Además, los cultivos celulares pueden estar contaminados con virus (casi siempre los que están presentes en el tejido origi­ nal)248 o incluso con otras células.373 El tipo más frecuente de contaminación viral es la presencia de virus simianos autóctonos en los cultivos celulares primarios de mono, como el agente vacuolante (SV40), los virus espumosos o el virus de parain­ fluenza simiano (SV5). Los virus simianos que tienen hema­ glutinina (p. ej., el virus SV5) pueden producir resultados erró­ neos si se realizan pruebas de hemadsorción para detectar virus respiratorios humanos. Cuando se buscan mixovirus, es impor­ tante realizar pruebas de hemadsorción de control con tubos no sembrados provenientes del mismo lote de células que se utili­ zó con las muestras clínicas (véanse protocolo 23-1 y fig. 2312E). La frecuencia con la que se contaminan los tubos en una

------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ ► Figura 23-5 Cultivos celulares normales. (A) Monocapa normal de riñón de mono Macaca nmlatta. Este cultivo primario se encuentra exactamente en el momento de confluencia: no existen espacios entre las células, pero éstas aún no han comenzado a superponerse unas con otras. La variabilidad de las células de la monocapa es reflejo de su origen de diferentes tipos celulares (180x). (B) Monocapa normal de riñón de Macaca mulatta. Después de continuar la incubación, se han hecho evidentes zonas de crecimiento más exuberante. Todavía se nota la variabilidad de las células de la monocapa (180x). (C) Monocapa normal de riñón de Macaca mulatta. Después de continuar la incubación, se han hecho evidentes zonas de crecimiento más exuberante. Todavía se nota la variabilidad de las células de la monocapa (180x). (C) Monocapa normal de fibroblastos MRC-5. Estas células diploides fibroblásticas tienen las características elongadas, ahusadas, correspondientes a su tipo celular. Se encuentran alcanzando su confluencia; quedan unos pocos espacios entre células (180x). (D) Monocapa normal de fibroblas­ tos MRC-5. Después de continuar la incubación, se hace evidente el patrón de entrecruzamientos de los fibroblastos superpuestos entre sí. Los detalles de las células individuales son menos evidentes. Estas monocapas envejecidas no deben ser sembradas (180x). (E) Células HEp-2 normales. Se ha subcultivado una línea continua de células y las nuevas han comenzado a desarrollarse. Existen grandes espacios entre las células aisladas, que adoptan un aspecto ahusado a medi­ da que se extienden sobre la nueva superficie de vidrio (180x). (F) Células HEp-2 normales. Las células subcultivadas se han multiplicado ahora hasta el punto de confluencia, pero aún se distinguen como células netamente poligonales. El momento ideal para la siembra de la mayoría de los virus es este estadio o uno ligera­ mente anterior (180x). (G) Células HEp-2 normales. Después de continuar la incubación, la línea celular se ha multiplicado de manera que las células se apilan

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unas sobre otras. Las células en división o que se están desprendiendo del vidrio tienen aspecto redondeado. A medida que las monocapas envejecen, se hacen menos sensibles a la acción citopatogénica de los virus y es cada vez más difícil la detección visual de la acción citopatogénica. (H) Células McCoy normales. Esta línea celular continua, cuyo origen se desconoce, se muestra en el momento en que se ha obtenido crecimiento confluente. Las células son compactas y poligonales. Las muestras deben sembrarse en este estadio o cuando las células son un poco menos confluentes (180x).

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Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

partida de células de riñón de mono puede variar del 5% al 100%. El método de reservar unos pocos tubos no sembrados para hacer los controles de hemadsorción no es por completo seguro. Si una cantidad inhabitual de pacientes presentan virus hemadsorbentes en un día determinado, debe considerarse la posibilidad de contaminación con un virus simiano. La conta­ minación de un lote comercial de células A549 con virus de la rinotraqueítis infecciosa bovina causó problemas diagnósticos en varios laboratorios.161 La acción citopatogénica observada en las monocapas contaminadas se asemejó a la del virus del herpes simple, pero el agente no pudo ser tipificado con los antisueros disponibles. Otro problema fue la inhibición por el virus contaminante de adenovirus presentes en dos de las muestras. Los adenovirus aislados crecieron con posterioridad por siembra de un nuevo lote de células A549 con sobrantes de las muestras originales. Un problema excepcional, pero potencialmente grave, puede ser causado por la presencia de virus patógenos en los tejidos de los monos. Aunque por fortuna es muy raro, el virus del herpes simiano y el virus Marburg, que produce una fiebre hemorrági­ ca, han provocado infecciones de laboratorio mortales.102-427'429 Estos agentes justifican el trabajo con cultivos celulares prima­ rios de origen simiano en gabinetes de bioseguridad. La contaminación de los cultivos celulares con otras células ha dado por resultado la suposición errónea de que se había establecido una nueva línea celular en más de un laboratorio de investigación. En efecto, una resistente célula HeLa puede ha­ ber ingresado en el frasco y predominar sobre las demás.373 En el laboratorio de diagnóstico, la contaminación cruzada de una línea celular establecida sobre una línea celular diploide o un cultivo celular primario puede dar el aspecto de acción citopa­ togénica en los cultivos celulares contaminados (fig. 23-6D). Aspectos técnicos de los cultivos celulares

Se utiliza una diversidad de recipientes como soporte de las monocapas de células. Los cultivos celulares de uso más común se comercializan en tubos o frascos ampolla que están listos para la siembra de las muestras. Muchos laboratorios pueden preferir, por razones de economía, mantener las líneas celulares en sus propios laboratorios. Los frascos plásticos en forma de T han reemplazado a los de vidrio para la propagación de las lí­ neas celulares (fig. 23-7). Las líneas celulares pueden mantenerse en el laboratorio por disociación de las células, que luego son distribuidas en nuevos recipientes (recuadro 23-5). Las monocapas establecidas se disocian por una breve incu­ bación en una solución de tripsina o una mezcla de tripsina y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), conocida también como Versene. Puede aparecer daño en las células si la solución de tripsina está muy concentrada o si el contacto es demasiado prolongado. La neutralización de la tripsina se realiza por el suero presente en el medio de crecimiento que se agrega des­ pués de disociar las células. El desprendimiento de las células de la superficie puede aumentarse físicamente por agitación o por raspado con una varilla de vidrio cuyo extremo se encuen­ tra cubierto por un tubo de goma, dispositivo conocido como rubber policeman (“bastón policial”) (véase fig. 23-7). A con­ tinuación las células disociadas se colocan en tubos para la siembra de muestras o en nuevos frascos para continuar la pro­ pagación de la línea celular. La densidad de la suspensión puede ajustarse como para obtener monocapas confluentes des­ pués de uno o más días de incubación. Después de la siembra de muestras clínicas, puede utilizarse el mismo protocolo para

preparar células infectadas a fin de subcultivarlas en nuevas monocapas. Los recipientes utilizados con mayor frecuencia para el ais­ lamiento de virus son los tubos de vidrio de fondo redondo (16 x 125 mm) (fig. 23-8). Estos tubos se incuban en un ángulo fijo de 5o de manera que la monocapa se forme sobre un lado del tubo. La concentración más densa se observa cerca del centro y en el fondo de los tubos; la capa más delgada se encuentra en los bordes y hacia la boca del tubo. Para fines diagnósticos se utilizan con menor frecuencia placas de Petri redondas o por­ taobjetos sobre los que se fijan cámaras de plástico. El sistema de portaobjetos con cámaras de plástico es costoso, pero muy útil si se contempla el estudio morfológico de una monocapa intacta. Los frascos ampolla que se utilizaban para el aislamiento de Chlamydia trachomatis se usan ahora para aumentar la fre­ cuencia y la velocidad de los aislamientos virales (técnica de shell vial). Se prepara una monocapa celular sobre un cubreob­ jetos redondo de vidrio colocado en el fondo de un frasco ampolla de fondo plano (fig. 23-9). Si el inoculo se centrifuga sobre la monocapa, paso esencial para el aislamiento de C. tra­ chomatis, y la monocapa se tiñe con antisuero marcado con fluoresceina o si se prueba con una sonda molecular, casi todos los aislamientos del virus del herpes simple pueden detectarse dentro de las 24 horas.148 Dada la rapidez con que se aísla este virus en cultivos convencionales, el agregado de un procedi­ miento costoso puede ser cuestionable. Se ha publicado una mejora asombrosa en la velocidad de aislamiento del CMV.162388 La técnica es más sensible que el cultivo convencional para la mayoría de las muestras que no sean sangre, pero el uso de ambos procedimientos mejora los resultados. El método preferido para detectar CMV en sangre (y la mejor forma de diferenciar infección de enfermedad) es realizar pruebas para antígeno o ácido nucleico virales. Las ventajas del cultivo en frasco ampolla provienen tanto de la centrifugación como del uso de un suero monoclonal fluoresceinado de alta calidad. Aun los reactivos supuestamente uni­ formes, como los anticuerpos monoclonales, pueden tener va­ riaciones entre lotes. Con algunas partidas de antisueros puede haber tinción inespecífica de los núcleos celulares. En la lámi­ na en color 23-2F se muestra el aspecto de un cultivo de CMV en frasco ampolla. Paya y cois, han estudiado la cantidad de frascos ampolla necesarios para cada muestra.389 Estos autores encontraron que se requieren tres frascos ampolla para obtener el máximo rendimiento de muestras de sangre, en tanto que para orina, lavados broncoalveolares y tejidos son necesarios dos frascos ampolla. Fedorko y cois, encontraron que la anti­ güedad de los fibroblastos en los frascos ampolla afectaba mucho la proliferación de citomegalovirus. Las monocapas viejas (de 8 a 15 días) eran menos sensibles para la recupera­ ción del virus, pero más sensibles a los efectos tóxicos de com­ ponentes de las muestras que las monocapas más recientes.154 Es difícil para los fabricantes proporcionar monocapas recien­ tes y lamentablemente la mayoría de los laboratorios dependen de fuentes comerciales para su provisión de frascos ampolla. Gleaves y cois, han comunicado haber tenido éxito con un tercer herpesvirus asociado con células: el VZV.188 En un estu­ dio de 68 muestras provenientes de 60 pacientes, el VZV fue identificado por algún método en el 57% de ellos. La sensibili­ dad de las técnicas diagnósticas, en orden decreciente, fue la inmunofluorescencia directa de raspados de piel, el cultivo en frascos ampolla y el cultivo convencional. Schirm y cois, han confirmado la utilidad del cultivo en frascos ampolla para el VZV.436 Estos autores pudieron detectar la mitad de los pacien­

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Figura 23-6 Artefactos en cultivos celulares. (A) Células de riñón de mono Macaca mulatta. El tubo se ha sembrado con una muestra que contiene material tóxi­ co inespecífico. Las células de la monocapa se han redondeado en focos y muchas se han desprendido de! vidrio. El efecto no viral puede distinguirse del efecto citopático viral por el patrón general, por la rapidez de aparición y por la imposibilidad de reproducir el efecto después del subcultivo en monocapas nuevas (180x). (B) Células de riñón de Macaca mulatta. Una muestra de heces ha sido inadecuadamente descontaminada antes de su siembra. Son evidentes las bacterias y las hifas micóticas sobre la monocapa, que tiene aspecto granuloso y se degenerará con rapidez. El medio puede estar ácido y turbio. Es necesario tratar nuevamente la muestra con antibióticos. También puede filtrarse la muestra, pero en ese caso pueden perderse los virus asociados con células (180x). (C) Fibroblastos MRC-5. Se ha sembrado sobre la monocapa un filtrado de heces que contiene Clostridium difficile 24 horas antes. La desorganización generalizada de la monocapa, con redondeamiento y desprendimiento celular, es típica de esta toxina. La identificación de la causa de la toxicidad se realiza mediante la neutralización del efec­ to con antisuero específico. La toxina de C. difficile puede dar al principio la impresión de un efecto citopático, pero éste no se reproduce cuando el tubo sospe­ choso se subcultiva sobre monocapas nuevas (180x). (D) Fibroblastos MRC-5. En estos fibroblastos inoculados con LCR se observa agrandamiento y redondea­ miento celulares en focos, que sugieren una acción citopatogénica viral. La progresión atípica del efecto citopático y la observación de que algunos de los focos parecen superpuestos a los fibroblastos sugieren que se trata de una contaminación celular. Más tarde se aislaron células HEp-2 en este tubo, con un cariotipo idén­ tico a las utilizadas en el laboratorio. El mecanismo de contaminación no fue dilucidado nunca (180x).

tes positivos en el término de 3 días utilizando frascos ampolla y un anticuerpo monoclonal, en tanto que con el método con­ vencional en tubos se detectó un tercio de los pacientes en un tiempo promedio de 7,5 días. Un factor importante en el rendi­ miento de los cultivos celulares es la línea celular elegida. Los fibroblastos diploides humanos son los utilizados con mayor frecuencia, pero el agregado de células de riñón de Macaca mulatta514 o de células A54944mejora en forma sustancial la tasa de aislamiento en los cultivos convencionales en tubo. El incre­ mento de la recuperación es menos evidente en el caso de los cultivos en frasco ampolla.44 Es probable que la técnica de cen­ trifugación utilizada con los frascos ampolla aumente el contac­ to del inóculo con la monocapa, pero los mecanismos exactos se desconocen. Se ha informado otra manipulación exitosa para el VZV, que consiste en la congelación y descongelación de la muestra antes de la centrifugación.45 El mecanismo de este efec­ to no está aclarado, ya que la velocidad de la centrifugación no es suficiente para sedimentar el virus libre.

La técnica de frascos ampolla se aplicó además a virus dis­ tintos de los pertenecientes al grupo herpes, en especial el virus de la gripe.137 Si bien otros virus respiratorios también se detectan con la técnica de frascos ampolla, la experiencia es más limitada y menos satisfactoria que con el virus influenza. La técnica de frascos ampolla se ha usado asimismo para el virus BK.330 Selección de cultivos celulares para el aislamiento de virus

Los requerimientos mínimos para el aislamiento de virus en cultivo son un cultivo primario de células de riñón de mono (para el aislamiento de mixovirus y enterovirus) y una línea de células diploides de origen humano (esencial para el aisla­ miento de CMV, rinovirus y VZV; útil para el aislamiento de virus del herpes simple). El agregado de una línea continua de origen humano (p. ej., HEp-2 o A549) también útil para el aislamiento de adenovirus y del virus sincitial respiratorio.

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CAPÍTULO 23

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Recuadro 2 3-5

P roced im iento d e m an tenim iento de líneas celulares

1. La monocapa se lava con buffer de fosfatos pH 7,5. 2. Se agrega una solución al 0,25% o de partes iguales de tripsina al 0,25% y Versene 1:2 000 durante 15 a 30 segundos y luego se retira. 3. Se incuba la monocapa a 35 °C hasta que las células se despegan. La agitación suave de la botella puede aumentar la disociación. 4. Se agrega medio de cultivo y las células se resuspenden a la concen­ tración deseada para el subcultivo. Como alternativa, las células pue­ den fraccionarse en forma arbitraria (1:2 o 1:3) según lo indique la experiencia.

Figura 23-7 Frasco plástico en forma de T y varilla de vidrio con un tubo de goma en su extremo, conocida como rubber policeman (“bastón policial”). Las monocapas de líneas celulares pueden cultivarse en frascos grandes. De un solo frasco pueden prepararse muchos tubos para cultivo viral. El raspado mecánico por pipeteo o con la varilla de vidrio ayuda a desprender las células durante la tripsinización para el subcultivo.

Otras líneas celulares pueden representar sustitutos satisfac­ torios de estos tres tipos celulares básicos, si se desea el aisla­ miento de un virus determinado (cuadro 23-21). Las líneas celu­ lares adicionales pueden utilizarse como sustituto de las líneas simianas si no se dispone de estas últimas; en forma alternativa, pueden utilizarse selectivamente para aumentar la proporción de aislamientos de virus específicos durante los períodos del año en que se espera que ocurran dichas infecciones. No existen sus­ titutos para los fibroblastos diploides humanos. La calidad y la procedencia de las células utilizadas para el aislamiento son importantes. Estudios minuciosos de fibroblas­ tos clonados de un solo feto hallaron una gran variación en el grado con el cual cada clon sustentaba el desarrollo de los virus respiratorios.484 Las variantes de líneas celulares continuas, como las HeLa y la HEp-2, difieren asimisimo en su sensibilidad para el desarrollo de ciertos virus. Es importante asegurarse de que la variante celular elegida tenga la sensibilidad adecuada.

Una vez que se ha encontrado una línea celular aceptable, deben congelarse múltiples alícuotas en nitrógeno líquido. Las células para uso diario pueden mantenerse en cultivo continuo. La provisión original debe utilizarse en forma periódica para renovar la reserva de trabajo, de modo que las células no muten a un estado que sea menos sensible al desarrollo viral. Las células de riñón de Macaca mulatta y Macaca fascicularis son comparables en lo que respecta al aislamiento de mixovirus. Por otro lado, se ha publicado que los fibroblastos MRC5 son más sensibles que los fibroblastos WI-38 para el aisla­ miento de CMV.202 La sensibilidad de todas las líneas diploides diminuye a medida que aumenta el número de pasajes. Algunos proveedores comerciales están utilizando células que han sido subcultivadas hasta 30 veces. Debe buscarse el pasaje más bajo disponible de un proveedor fiable. Si las capas celulares, sobre todo las de líneas continuas, son demasiado gruesas, puede reducirse el aislamiento de virus y la evaluación de la acción citopatógena es difícil. Para algunos virus, es preferible tener islotes de células o una monocapa apenas confluente que una capa de células totalmente confluente.483 Además, las células deben estar en condiciones lo suficien­ temente buenas como para soportar las varias semanas necesa­ rias para el aislamiento de los virus de desarrollo lento. Para asegurar tasas de aislamiento máximas, debe verificarse la ausencia de contaminación con especies de Mycoplasma. Los virus que se diseminan en forma directa de una célula a otra,

Figura 23-8 Los tubos para cultivos virales se incli­ nan en un ángulo fijo de 5° en una gradilla fija. Los resortes de metal sostienen los tubos en su lugar. Las etiquetas redondas en las tapas de los tubos facilitan la identificación de los cultivos, sin necesidad de sacar­ los de la gradilla.

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como el VZV, y no a través del medio de cultivo, requieren una monocapa saludable. El uso de medio de crecimiento con 10% de suero puede aumentar el desarrollo y la progresión de la acción citopatógena causada por estos virus,511 aunque no creemos que esta maniobra sea necesaria. En cambio, el suero contiene inhibi­ dores de los mixovirus y los paramixovirus. El medio de man­ tenimiento de las células utilizadas para estos virus (por lo general cultivos primarios de riñón de mono), debe estar libre de suero. Algunos fabricantes incluyen (u ofrecen) antisueros contra los virus simianos endógenos más comunes (p. ej., SV5 o SV40). Este procedimiento no está ampliamente aceptado; en la práctica, el antisuero será eliminado cuando el medio de envío se reemplace por medio fresco sin el antisuero. Siembra e incubación de cultivos celulares

Los recipientes de transporte que contienen hisopos deben agitarse en forma mecánica y exprimir el material contenido en el hisopo en el medio que contiene antibióticos. Los tejidos se fragmentan y homogeneizan en un pequeño volumen de caldo de transporte. Puede ser necesario suspender las muestras de heces en 10 volúmenes de medio de transporte. Las heces, los tejidos y los aspirados respiratorios que contengan un exceso de detritos o moco deben centrifugarse a baja velocidad. La mayoría de los medios de transporte y medios de cultivo con­ tienen antibióticos. Si se supone que hay contaminación bacte­ riana o fúngica de la muestra, se deben agregar antibióticos antes de su siembra (penicilina y estreptomicina o gentamicina más anfotericina B al doble de la concentración utilizada en los medios de cultivo).248 Después de procesada, la muestra puede sembrarse en el medio de cultivo. Como alternativa, el inóculo puede colocarse directamente sobre la monocapa después de eliminar la mayor parte del medio de cultivo. El contacto más directo de las partículas virales con las células aumenta la infecciosidad y puede incrementar tanto la cantidad de aisla­ mientos como la velocidad con que se recuperan. Después de un período de adsorción del inóculo de 30 a 60 minutos a 36 °C a 37 °C, se agrega medio de cultivo y se continúa con la incu­ bación. Las sustancias tóxicas presentes en la muestra también pueden ser más evidentes después de la adsorción del inóculo. Si se utilizan dos tubos de cada tipo celular, uno puede inocu­ larse por adsorción y el otro por agregado directo de la muestra al medio de cultivo. Toda muestra sobrante debe mantenerse a 4 °C o congelada a -70 °C por si aparece toxicidad o contami­ nación bacteriana. Si se observa desarrollo bacteriano o fúngico, pueden añadirse más antibióticos a la muestra. La muestra puede filtrarse a través de filtros de microporo de 0,45 |jm antes de sembrar nuevos cultivos, pero los virus asociados con célu­ las, como el CMV y el VZV, pueden perderse cuando las células infectadas quedan atrapadas en los filtros.307 La toxici­ dad inespecífica para la monocapa suele hacerse evidente den­ tro de las 24 horas; en ese caso, la muestra puede sembrarse nuevamente despues de diluirla 1:10 en solución salina tampo­ nada. También debe controlarse el pH de la muestra y corregir­ se la neutralidad si es muy ácida o muy alcalina. Si se observa degeneración inespecífica de la monocapa tras una incubación de varios días, las células y el medio pueden subcultivarse sobre una monocapa nueva. Para el aislamiento de la mayoría de los virus, las monoca­ pas deben incubarse entre 36 °C y 37 °C. La temperatura ópti­ ma de incubación para los virus respiratorios, en especial los rinovirus, es de 33 °C, pero a esa temperatura puede disminuir el aislamiento de otros virus. El uso de tambdres giratorios (fig.

Figura 23-9 Frascos ampolla para el aislamiento de Chlamydia trachomatis y virus (técnica de shell vial). Los frascos son cilindricos, con fondo plano y contienen un cubreobjetos circular sobre el que se desarrollan las células. La tapa puede ser de goma o plástico, como se muestra aquí. El cubreobjetos se extrae con pinzas o por medio de una aguja.

23-10) facilita el aislamiento de patógenos en cultivos prima­ rios de riñón de mono y en fibroblastos diploides, sobre todo en muestras respiratorias. Para el aislamiento de la mayoría de los demás virus es ade­ cuada una incubación de dos semanas. El CMV puede necesitar incubaciones más prolongadas, pero Gregory y Menegus encon­ traron que el 92% de las cepas de CMV se aislaron antes de los 14 días cuando se utilizaron fibroblastos MRC-5.202 Si se desea sólo aislar virus del herpes simple, el período de incubación puede acortarse a 7 días. La centrifugación del inóculo y la detección de antígeno acortan de manera notable el tiempo de detección para varios virus, como el CMV y el VZV. Las pruebas de hemadsorción deben realizarse después de la incuba­ ción de cultivos primarios de riñón de mono durante 5 y 10 días.

Figura 23-10 Tambor giratorio para cultivos virales. El efecto citopático de muchos virus, sobre todo los que causan infecciones respiratorias, aumenta por la rotación lenta de los tubos, aproximadamente a una revolución cada 3 mi­ nutos.

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C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Detección de virus e identificación provisoria EFECTO CITOPÁTICO

El método más común para detectar un virus es la observa­ ción de los cultivos en busca de los daños que causó en la monocapa, o sea su efecto citopático. Las monocapas deben obser­ varse diariamente si se busca virus del herpes simple y al menos tres veces por semana si se sospecha la presencia de virus de crecimiento más lento. Los tubos de vidrio pueden examinarse con un microscopio convencional, utilizando soportes sencillos para .evitar que rueden de la platina (fig. 23-11). Si la monoca­ pa por examinar se encuentra en frascos ampolla, debe utilizar­ se un microscopio invertido. Puede hacerse a menudo una identificación provisoria de un virus específico (o al menos de un grupo viral específico) sobre la base del tipo de efecto citopático y el tipo de célula afecta­ da. En el cuadro 23-23 se resumen los patrones típicos de acción citopatogénica y la frecuencia de aislamiento para los virus que se encuentran con mayor frecuencia en los laborato­ rios hospitalarios. Cuando se examina un cultivo en el laboratorio, se ve el pa­ trón de acción citopatogénica, pero no se conoce el nombre del virus. En el cuadro 23-24 se presenta un diagrama de flujo para analizar la acción citopatogénica de una muestra clínica. Este cuadro presenta los patrones más frecuentes de acción citopa­ togénica. La inclusión de todas las combinaciones posibles para todas las cepas haría que el cuadro fuera muy confuso y probablemente inútil. Los efectos de los virus sobre las células pueden ser al prin­ cipio sutiles. Aunque la cuantificación del inoculo viral sobre la base de la magnitud de la acción citopatogénica no es precisa, es útil hacer un registro de las estimaciones semicuantitativas, con fines comparativos (1+, < 25% de la monocapa afectada; 2+, 25% a 50%; 3+, 51% a 75%; 4+, > 75%). Estas estimacio-

Figura 23-11 Observación de cultivos en busca de efecto citopático. La observación de cultivos en busca de acción citopatogénica puede hacerse con un microscopio invertido o uno tradicional. Un soporte que calza en el sopor­ te de muestras de la platina del microscopio evita que los tubos redondos rue­ den sobre ella. No es posible utilizar aumentos grandes, pero tampoco es nece­ sario para el reconocimiento y la caracterización del efecto citopático.

nes hacen más sencillo documentar la progresión del efecto citopático y establecer la presencia de un agente citopático. Puede ser necesario subcultivar las células de un tubo con posi­ ble acción citopatogénica sobre monocapas nuevas. Si es posible, estos subcultivos deben hacerse después de alcanzar un grado 2+ de acción citopatogénica, mediante tripsinización, suspen­ sión física de la monocapa con un rubber policeman o por ciclos repetidos de congelación y descongelación rápida. Luego, se siembra una alícuota sobre el tipo de célula en el cual se haya observado originalmente la acción citopatogénica y en cualquier otro tipo celular que pueda ser de utilidad para hacer un diagnóstico provisorio. El efecto citopático en tres cultivos celulares de uso fre­ cuente se muestran en forma secuencial en las figuras 23-12 a 23-15. En la mayoría de los casos se han representado las alte­ raciones precoces y tardías. Existen relativamente pocas formas de expresión celular de citotoxicidad. El redondeamiento celular es una expresión habi­ tual de daño, pero las células pueden aparecer hinchadas o con­ traídas y granulosas o lisas. Algunos virus producen factores que conducen a la fusión celular, lo que lleva a la formación de células gigantes multinucleadas, denominadas sincitios; el virus sincitial respiratorio, los virus parainfluenza 2 y 3, el virus del sarampión y el virus de las paperas pueden producir células sincitiales gigantes. Además, el virus del herpes simple y el VZV producen células gigantes multinucleadas más pequeñas. No todos los aislamientos de virus sincitial respiratorio pro­ ducen sincitios. La producción de la glucoproteína F(usión) es necesaria para que haya fusión celular. Shahrabadi y Lee de­ mostraron que el medio de cultivo debe contener calcio para que el virus sincitial respiratorio produzca fusión en células HEp-2.449 La formación de sincitios gigantes también parece relacionada, al menos en parte, con la concentración de gluta­ mina en el medio de cultivo.328 La acción citopatogénica suele comenzar en forma de focos y se ve con mayor facilidad en los bordes de la monocapa, donde la densidad celular es menor. En el caso de virus que se diseminan de una célula a otra a través del medio de cultivo, la acción citopatogénica progresa desde los focos hasta incluir la totalidad de la monocapa, a veces con gran rapidez. Si la cantidad de viriones en la muestra es muy grande, la mayoría de la monocapa puede infectarse simultáneamente; en este caso la acción citopatogénica diseminada debe diferenciarse de la citotoxicidad inespecífica subcultivando el medio sobre culti­ vos celulares nuevos. En el caso de virus que se diseminan en forma directa de una célula a otra (CMV y VZV), el efecto citopático progresa más lentamente y por extensión local desde los focos iniciales. Sin embargo, hemos visto cultivos en los que una gran cantidad de CMV en la muestra produjo acción cito­ patogénica en toda la monocapa, simulando la acción del virus del herpes simple. Por supuesto, en cierta forma es artificial intentar capturar la considerable variabilidad de un proceso biológico en una sola toma fotográfica. En el laboratorio clínico, es posible examinar otras zonas de la monocapa, observar otros cultivos e incluso reexaminar el cultivo sospechoso después de incubarlo algunas horas más. Por lo tanto muchas veces es posible detectar cam­ bios citológicos que son más precoces que los que demuestran las fotografías más convincentes. HEMAGLUTINACIÓN Y HEMADSORCIÓN

Muchos virus tienen componentes de superficie que agluti­ nan eritrocitos de diferentes especies animales. Algunos virus,

D ia g n ó s tic o de las in fe c cio n e s v ira le s

1325

Cuadro 2 3 -2 3 Diagnóstico diferencial del efecto citopático viral

VIRUS

CULTIVO CELULAR ---------------------------------------PMK HDF HEP-2

DÍAS NECESARIOS PARA EL AISLAMIENTO ---------------------------------------Mayo Mt. Zion, Promedio11 promedio6

Virus influenza

+++

-

-

4

3,8

Virus parainfluenza

+++

+

+

11

6,4

Virus sincitial respiratorio

++

+

+++

8,3

6,1

Virus de la parotiditis Virus del sarampión

+++ +

+ -

+

6,9

Virus de la poliomielitis

+++

+++

+++

4,6

Virus Coxsackie B

+++

*

+++

3,5

4,2

Echovirus

+++

+++

+

3,9

4,2

Rinovirus Adenovirus

+ ++

+++ +

+++

6,6 6,2

6,4

Virus del herpes simple

++

+++

++

3,5

2,7

Virus varicela-zóster

++

++

7,6

6,1

10

5,8

Citomegalovirus

+++

—

DESCRIPCION Ninguna o células granulosas localizadas agrandadas seguido de desprendimiento; progresión rápida Ninguna o redondeamiento localizado y célu­ las gigantes multinucleadas (tipos 2 y 3) Células agrandadas, gigantes sincitiales bri­ llantes; o células granulosas, redondas Células agrandadas, sincitiales gigantes Células sincitiales gigantes vacuoladas; aisla­ das rara vez Células hinchadas, brillantes, dispersas; progresión rápida y desprendimiento de células del vidrio Células hinchadas, brillantes, localizadas; des­ prendimiento del vidrio Células hinchadas, brillantes, localizadas; des­ prendimiento del vidrio Células hinchadas o granulosas, localizadas Células hinchadas, agrupadas (en racimo de uvas o en entramado) Células agrandadas o contraídas granulosas que comienzan en los bordes; progresión rápida y desprendimiento; puede haber célu­ las gigantes Focos bien definidos, alargados, de células agrandadas o contraídas; diseminación por contigüidad lenta aumentada por el uso de medio de crecimiento Focos compactos de células agrandadas; pro­ gresión lenta por contigüidad

+ + +: células óptimas para la detección del efecto citopático (ECP); ++: ECP frecuente, puede ser el mejor sistema para la detección de ECP; + : ECP observado en ocasiones; - habitualmente no se observa ECP; PMK: células primarias de riñón de mono; HD F: fibroblastos diploides humanos; HEp-2: línea continua de origen humano. “De la Mayo Clinic, resumido de Herrmann EC Jr. Experience in providing a viral diagnostic laboratory compatible with medical practice. Mayo Clin Proc 1967;42:112-123; y Herrmann EC Jr. Efforts toward a more useful viral diagnostic laboratory. Am J Clin Pathol 1971;56:681-686 . bDe Mount Zion Hospital and Medical Center, San Francisco, resumido de Drew WL. Controversies in viral diagnosis. Rev Infect Dis 1986;8:814-824. Adaptado de Mclntosh K. Diagnostic virology. En: Fields BN, Knipe DM, Melnick JL, et al., eds. Virology, 2a ed. Nueva York: Raven Press, 1990:411-440.

en especial los de los grupos mixovirus y paramixovirus, tam­ bién insertan hemaglutininas en las membranas de las células infectadas cuando el virus madura en la membrana citoplasmática. Algunos aislamientos de virus de influenza A y los virus parainfluenza pueden detectarse sólo por hemaglutinación o hemadsorción (véase fig. 23-12A y B). La prueba de hemaglutinación se realiza con menor frecuen­ cia que la prueba de hemadsorción para la detección de aisla­ mientos en cultivos celulares, pero es necesaria si se han ino­ culado huevos embrionados. La hemaglutinación de eritrocitos se realiza en tubos o placas de microtitulación, después del agregado de material proveniente de huevos o cultivos infecta­ dos. Si es necesaria la caracterización de la cepa, el procedi­ miento más económico es la inhibición de la hemaglutinación con sueros antivirales específicos. En los laboratorios de refe­ rencia, las nuevas cepas de virus influenza se tipifican por este

método; la inhibición cruzada producida por antisueros contra cepas anteriores permite determinar cuán estrecha es la rela­ ción de la nueva cepa con los aislamientos previos. La prueba de hemadsorción para mixovirus (véase fig. 2312A a E) se realiza agregando eritrocitos frescos de cobayo a una monocapa infectada (véase protocolo 23-1).493 La prueba puede efectuarse sin dañar la monocapa y después de ello pue­ de proseguirse la incubación. Además de la hemadsorción, puede verse hemaglutinación de los eritrocitos en la fase líqui­ da. Los procesos de hemadsorción y hemaglutinación se mues­ tran en la figura 23-16. La hemadsorción es más conveniente que la hemaglutina­ ción para detectar la presencia de virus en la mayoría de los laboratorios clínicos. La inhibición de la hemadsorción tam­ bién puede ser útil para identificar aislamientos, pero consume mucho más antisuero que la inhibición de la hemaglutinación.

1326

C A P ÍT U L O 2 3

Cuadro

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

2 3 -2 4 D iagn óstico diferen cial del efecto citop ático viral

AISLAMIENTO PRIMARIO EN: PM K

HDF

HEP-2

+

+

+

HAD DE GR

TIPO DE ECP

-

Hinchazón/re tracción/hialina

Poliovirus

NT, FA

Sincitios en HEp-2 y PMK

Virus sincitial respira torio Herpes simple

NT, FA, EIA

Células redondeadas, hin­ chadas, especialmente en fibroblastos Grupos hinchados/en entra­ mado

+

+

-

2

-

1

2

FA, EIA

NT, FA, CF

Hinchazón/retracción/hialina

Echovirus y Coxsackie A

NT, FA

Focalizada, hinchazón line­ al/células gigantes

Varicela-zóster

Asociación con células en el pasaje

NT, FA

Hinchazón/retracción

Rinovirus

Sensibilidad a pH 3

NT

Sincitios grandes granulosos

Paperas

Rara vez aislado

HAI, NT

Hinchazón/retracción/hialina

Coxsackie B

NT, FA

Grupos hinchados/en entramado

Adenovirus

NT, FA, CF

+ (Mono)

Sincitios vacuolados

Sarampión

Rara vez aislado; histo­ ria clínica; HAd

NT, FA

+ (Cobayo)

Redondeamiento, sincitios

Parainfluenza 2 y 3

HAd

FA. HAI

+ (Cobayo)

Ninguna/redondeamiento

Influenza y Parainfluenza 1 - 3

HAd 4 °C = 20 °C HAd 4 °C < 20 °C

HAI, FA, CF HAI, FA. CF

Sincitios

Parainfluenza 2

HAd

HAI, FA, CF

Sincitios grandes granulosos

Paperas

Rara vez aislado

HAI, NT

+ (Mono)

Sincitios vacuolados

Sarampión

Rara vez aislado, histo­ ria clínica, HAd

NT, FA

2

Focal/células agrandadas

Citomegalovirus

Asociación con células

FA, H-E

Focal, placas lineales

Varicela-zóster

FA, CF

Focal/hinchazón

Rinovirus

Asociación con células; H-E Sensibilidad a pH 3

-

+

+

Desarrollo en riñón de conejo

CONFIR­ MACIÓN

Adenovirus

+ (Cobayo) +

COMENTARIOS Y PRUEBAS AUXILIARES

VIRUS SOSPECHADO

NT

PMK : células primarias de riñón de mono; HDF :fibroblastos diploides humanos; HEp-2: línea celular continua de origen humano; ECP: efecto citopático; citopatogénica; Had: hemadsorción; FA: inmunofluorescencia; NT: neutralización; CF: fijación de complemento; EIA: enzimoinmunoanálisis en fase sólida; H-E: tinción para cuerpos de inclusión.

MICROSCOPIA ÓPTICA

A medida que se replican, algunos virus producen masas de nucleoproteína y viriones en diferentes estadios de ensambla­ je. El anatomopatólogo o el citólogo utilizan estas inclusiones virales para detectar la presencia de una infección viral e iden­ tificar en forma presuntiva el agente.470,526 Si bien las caracte­

rísticas de la acción citopatogénica en monocapas sin teñir suelen ser suficientes para hacer un diagnóstico provisorio, el virólogo puede obtener más información sencillamente tiñen­ do las células con hematoxilina-eosina, con la tinción de Papapanicolaou o con naranja de acridina (véase lámina en color 23-1).

D ia g n ó s tic o d e la s in fe c c io n e s v ira le s

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F ig u ra 23-12 Efecto citopático de los mixovirus. (A) Células de riñón de mono Macaca mulatta infectadas por virus influenza A. Este aislamiento no produce efecto citopático en la monocapa. Una prueba de hemadsorción detecta la presencia de virus. Muchas de las cepas actuales de virus influenza A y la mayoría de las cepas de influenza B producen efecto citopático, que suele desarrollarse con mayor rapidez que la producida por los virus parainfluenza (180x). (B) Células de riñón de Macaca mulatta infectadas por virus influenza A. La monocapa está intacta, pero se encuentra cubierta por numerosos eritrocitos de cobayo. Los eritrocitos se han adherido a las hemaglutininas virales presentes en la superficie de las células infectadas. Puede observarse hemaglutinación de los eritrocitos en la fase líqui­ da, producida por el virus libre, pero no se muestra en la fotografía ( 180x). (C) Células de riñón de Macaca mulatta infectadas por parainfluenzavirus 3. La monocapa ha degenerado y las células se han desprendido del vidrio. Muchas de las células remanentes son granulosas o están agrandadas. Con frecuencia, los aisla­ mientos de virus parainfluenza no producen efecto citopático evidente y deben detectarse por hemadsorción (180x). (D) Células de riñón de mono Macaca mulat­ ta infectadas por virus parainfluenza 3. Se ha realizado una prueba de hemadsorción. Las células remanentes están cubiertas con eritrocitos de cobayo que se han unido a la hemaglutinina viral presente en la superficie de las células (180x). (E) Células de riñón de Macaca mulatta no infectadas, que muestran una reacción negativa de hemadsorción. Hay unos pocos eritrocitos pegados a la monocapa, pero no se observa la masiva adherencia de eritrocitos que caracteriza a una prueba positiva. Las células sedimentadas también se desprenden con mayor facilidad por agitación de la monocapa no infectada que de una monocapa infectada por mixo­ virus. (F) Células HEp-2 infectadas por virus parainfluenza 3. Se han formado grandes células gigantes multinucleadas (conocidas como sincitios) en la monoca­ pa por fusión de células adyacentes. Este tipo de efecto citopático es característico de los virus parainfluenza 2 y 3 en células de riñón de mono y del virus parain­ fluenza 3 en células HEp-2. Otros virus también pueden formar sincitios, en especial el virus sincitial respiratorio. Los virus parainfluenza pueden diferenciarse del virus sincitial respiratorio con facilidad por medio de una prueba de hemadsorción (180x).

1328

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickeltsia y microorganismos relacionados

CAPÍTULO 23

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Figura 23-13 Efecto citopático de otros virus respiratorios. (A) Células HEp-2 infectadas por adenovirus. Se observan varios focos de células agrandadas, gra­ nulosas. Las células infectadas por adenovirus suelen agruparse en forma de racimos de uvas, muy similar a como lo hacen los estafilococos en una coloración de Gram (180x). (B) Células HEp-2 infectadas por adenovirus. La mayoría de las células de la monocapa son ahora redondeadas; muchas se han desprendido del vidrio y dejaron múltiples agujeros. En varias zonas puede verse agrupación de las células. Algunas de las células residuales están comunicadas por filamentos de cito­ plasma, lo que produce el comienzo de un aspecto en encaje o entramado (180x). (C) Células de riñón de mono Macaca mulatta infectadas por adenovirus. Se observa un grumo de células agrandadas, granulosas. Si se encuentran múltiples focos en un cultivo, puede emitirse un informe preliminar. Si se encuentran sólo algunos, es mejor seguir observando la monocapa en espera de la progresión del efecto citopático (180x). (D) Células de riñón de Macaca mulatta infectadas por adenovirus. La magnitud del efecto citopático ha aumentado en forma considerable. Son evidentes los grupos de células hinchadas con puentes citoplasmáticos intercelulares. Muchas se han desprendido del vidrio. Finalmente sólo habrá unas pocas células diseminadas en el tubo, como evidencia de que alguna vez hubo una monocapa (180x). (E) Células HEp-2 infectadas por virus sincitial respiratorio. Muchas de las células de la monocapa han sido fusionadas por el virus para for­ mar células sincitiales gigantes, muy similares a las formadas por los virus parainfluenza. Otras células están agrandadas o se han desprendido del vidrio. Una prue­ ba de hemadsorción sobre esta monocapa sena negativa (180x). (F) Células de riñón de Macaca mulatta infectadas por virus sincitial respiratorio. Se ha formado un gran sincitio en la monocapa. Puede diferenciarse este aislamiento de un virus parainfluenza por hemadsorción o por identificación de antígenos específicos.

D ia g n ó s tic o d e las in fe c c io n e s v ira le s

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

En los laboratorios que disponen de un microscopio electró­ nico, la morfología ultraestructural de un aislamiento puede identificar el grupo al que pertenece.6366 La tinción negativa para microscopia electrónica es sencilla y puede efectuarse con rapidez en sobrenadantes o células Usadas. Esta técnica puede ser muy útil para la diferenciación de la toxicidad inespecífica de la acción citopatogénica producida por un inoculo con grandes cantidades de virus. DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA

Las alteraciones citolíticas causadas por los rinovirus pue­ den ser semejantes a las de los enterovirus, aunque los rinovi­ rus se replican con menor rapidez y tienen la labilidad propia de los rinovirus al medio ácido. Para realizar esta determina­ ción, se toman alícuotas de cultivos celulares infectados y se llevan a pH 3 o 7,4 durante 3 horas. Luego se obtiene una esti­ mación de la infecciosidad residual sembrando diluciones seriadas al décimo en cultivos celulares. Si el virus es un rino­ virus debe observarse una disminución de la infecciosidad de 2 a 4 log10.248 En la práctica, puede demostrarse la sensibilidad al ácido sin recurrir a las diluciones seriadas. ASOCIACIÓN CON LAS CÉLULAS

La demostración de la asociación de los viriones con las células infectadas es útil para diferenciar los miembros del grupo herpes. El virus del herpes simple se libera al medio de cultivo, en tanto que el CMV y el VZV permanecen asociados con las células. El virus del herpes simple infecta con rapidez toda la monocapa (véase fig. 23-14B). La acción citopatogéni­ ca del CMV y del VZV es casi siempre en focos (véase fig. 21 14E a H), porque los viriones no se diseminan por el medio. Sin embargo, grandes cantidades de partículas virales presen­ tes en el inoculo pueden producir una acción citopatogénica diseminada similar a la del herpes simple. El subcultivo por separado del medio de cultivo y de las células rotas demuestra la asociación con las células del aislamiento. DETECCIÓN DE ANTÍGENOS VIRALES

Además de utilizarse para la confirmación de la identidad de un agente citopatogénico, la demostración de antígenos especí­ ficos en cultivos se ha utilizado como método para detectar la presencia de un virus, aun en ausencia de acción citopatogéni­ ca. Las pruebas para detección de antígenos pueden realizarse después de una breve incubación, si se desea realizar un diag­ nóstico rápido, procedimiento que se ha usado con más fre­ cuencia con amplificación por centrifugación. Las mejoras más notables en la rapidez con la cual se detectan aislamientos tie­ nen lugar con los virus que presentan el crecimiento más lento en sistemas convencionales, como el virus sincitial respirato­ rio, el citomegalovirus y el virus de la varicela zóster (lámina en color 23-2D y F). La bibliografía abunda en informes disímiles acerca de la sensibilidad de estos métodos acelerados para el diagnóstico virológico. Por ejemplo, el porcentaje de aislamientos de virus influenza recuperados por amplificación por centrifugación ha variado del 56%149 al 98%.137Las diferencias en las variables de operación, como las líneas celulares y el origen de los anti­ cuerpos monoclonales, así como las variaciones en las pobla­ ciones de pacientes, hacen que las recomendaciones generales sean traicioneras. Está claro que las técnicas de cultivo acele­

1329

rado pueden aportar información útil, pero existe un conflicto entre la sensibilidad y la rapidez cuando se decide la duración del tiempo de incubación. La inclusión de cultivos convencio­ nales o tomar muestras varias veces de los frascos ampolla aumenta la sensibilidad, pero también incrementa los costos. Aunque es difícil de demostrar, la provisión más rápida de resultados puede tener importancia clínica y económica.20 En el futuro, la detección molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), puede hacer estéril esta discusión. Aunque la mayoría de los laboratorios no encontrarán virus de la rubéola, Schmidt y cois, han informado que la tinción con inmunoperoxidasa de células RK-13 o BSC-1 facilita la detec­ ción de este virus con requerimientos nutricionales especiales.440 ARTEFACTOS Y ALTERACIONES NO CAUSADOS POR VIRUS

A medida que las células envejecen en los cultivos pueden aparecer cambios morfológicos no relacionados con la infec­ ción viral (véase fig. 23-5). La densidad de las células en las líneas celulares diploides y, en particular, en las líneas celula­ res establecidas, puede hacerse muy alta; las células en proce­ so de necrosis o de división pueden aparecer redondeadas o granulosas. En cualquier cultivo pueden aparecer células atípi­ cas aisladas que son especialmente notables en las áreas menos densas, como los bordes de la monocapa, donde asimismo puede hacerse evidente en primer lugar el efecto citopático de un virus. Por lo tanto, es importante mantener controles no ino­ culados de células del mismo lote utilizado para la siembra de las muestras. Los cultivos primarios de células de riñón de mono pueden estar infectados por virus simianos que causan diversos cam­ bios degenerativos,248 como un aspecto espumoso o vacuolado de la monocapa. La presencia de células extrañas que sedimentan sobre la monocapa también puede ser causa de confusión (véase fig. 23-6D). En estas circunstancias puede parecer que hay efecto citopático debido a que las células contaminantes tienen un aspecto distinto del de la monocapa original. El efecto suele ser similar al de un virus que ocasiona alteraciones focalizadas en la monocapa, como el CMV. El artefacto puede sospecharse porque las células se hallan sobre la monocapa en lugar de for­ mar parte integral de ella. Las células contaminantes pueden ser de origen humano, como células epiteliales o mesoteliales que se encuentren en la muestra, o provenir de otros cultivos celulares, sobre todo si se ha realizado un subcultivo de una línea celular a otra. Existen diversos agentes no virales o sustancias presentes en las muestras clínicas que pueden ser tóxicos para las monoca­ pas celulares (véase fig. 23-6A). Si hay desarrollo bacteriano o micótico (véase fig. 23-6B), la naturaleza del problema es evi­ dente; la muestra debe tratarse nuevamente con antibióticos o filtrarse y sembrarse en cultivos celulares adicionales. La naturaleza de la citotoxicidad casi siempre se desconoce. La solución habitual es diluir la muestra y sembrar monocapas adicionales. Howell y cois, encontraron que la toxicidad del semen de pacientes con SIDA puede evitarse sembrando la monocapa con un sedimento celular, obtenido por centrifuga­ ción a alta velocidad.247 El CMV, que es un patógeno frecuen­ te en los pacientes con SIDA, se asocia con los leucocitos. Por otro lado, las sustancias tóxicas se concentran en el sobrena­ dante. El efecto citopático puede a veces ser “específico”, aunque la causa sea inesperada y quizás indeseable. La toxina de

1330

C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Figura 23-14 Efecto citopático de los herpesvirus. (A) Fibroblastos MRC-5 infectados por el virus del herpes simple. Se observa en la monocapa un foco de célu­ las redondeadas, agrandadas. Muchas se han desprendido del vidrio. Estos focos se agrandarán rápidamente y afectan con frecuencia la totalidad de la monocapa en algunos días (180x). (B) Fibroblastos MRC-5 infectados por el virus del herpes simple. El efecto citopático ha progresado de tal forma que casi todas las célu­ las de la monocapa están afectadas. Nuevamente se observan células agrandadas, incluso globulosas, y granulosas. Este tipo de efecto citopático generalizado

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Clostridium difficile presente en muestras de heces (véase fig. 23-6C) puede causar un efecto citopático similar al daño que producen los enterovirus.441 Gentry y cois, publicaron el aislamiento de Trichomonas va­ ginalis en cultivos de células BHK.181 Estos flagelados causan un efecto citopático similar al virus del herpes simple; el efecto citopático se reprodujo cuando se agregaron Trichomonas via­ bles o lisados de cultivos axénicos a los cultivos celulares. Cuando los cultivos se examinaron con cuidado pudieron visua­ lizarse tricomonas móviles. Se ha publicado el aislamiento de Pneumocystis jiroveci (carinii) en pacientes con SIDA. La proliferación seriada de este parásito unicelular es difícil de lograr en el laboratorio, pero los microorganismos han desarrollado en cultivos celula­ res, incluidos fibroblastos diploides humanos MRC-5.303 Los aislamientos de P. jiroveci produjeron una acción citopatogéni­ ca que simulaba una acción viral. Toxoplasma gondii puede crecer en líneas de cultivos celulares, como fibroblastos diploi­ des humanos, aunque no se ha evaluado la sensibilidad de los cultivos.90 Identificación definitiva de los aislamientos

En un laboratorio de diagnóstico, la combinación de historia clínica y acción citopatogénica proporciona información sufi­ ciente para identificar algunos virus, como el del herpes sim­ ple, CMV, VZV, adenovirus y sincitial respiratorio. Los enterovirus pueden identificarse casi siempre a nivel de género. La identificación completa de los aislamientos, incluida la serotipificación, requiere la caracterización inmunológica de los antígenos virales o del ácido nucleico viral. Las pruebas inmunológicas pueden adaptarse para identifi­ car antígenos o anticuerpos dirigidos contra estos antígenos. Los antisueros, que tradicionalmente eran policlonales, están siendo reemplazados cada vez más por sueros monoclonales (véase cap. 3). La prueba inmunológica más específica para la mayoría de las infecciones virales es la prueba de neutraliza­ ción. La identificación de un aislamiento viral desconocido se realiza por el análisis del grado con el cual un antisuero de reactividad conocida impide que el virus infecte células de cul­ tivo de tejidos, huevos o animales. Las desventajas de las prue­ bas de neutralización son el tiempo y el costo necesarios para su realización. Se utilizan con mayor frecuencia en los labora­ torios de referencia.

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La prueba de inhibición de la hemaglutinación representa una alternativa conveniente y económica de la prueba de neu­ tralización para los virus que producen hemaglutininas. El principio es similar al de la prueba de neutralización, pero el punto final es la inhibición de la reacción de aglutinación mediada por el virus en lugar de la inhibición de su infecciosi­ dad. Para caracterizar un aislamiento viral se utilizan sueros de referencia de reactividad conocida. La prueba de fijación del complemento, la piedra angular del diagnóstico virológico durante muchos años, ha sido reempla­ zada por otros ensayos, más sencillos y fiables en la mayoría de los laboratorios. Muchas pruebas virales son importantes para el análisis epi­ demiológico pero, con excepción de los mixovirus, rara vez son necesarias con fines diagnósticos de rutina. En los casos en los que se requiere una caracterización completa (p. ej., una enfermedad paralítica), el aislamiento puede enviarse a un laboratorio de referencia. Una exposición completa de la carac­ terización antigénica, que se encuentra más allá del alcance de este capítulo, puede encontrarse en los libros de texto sobre virología y diagnóstico virológico.248,284-462 Para numerosos laboratorios de hospital, las pruebas de inmu­ nofluorescencia e inmunoenzimáticas proporcionan una alter­ nativa viable por medio de las cuales puede realizarse la identi­ ficación definitiva de muchos virus a nivel de género o especie. Por fortuna, el catálogo cada vez más amplio de reactivos que se venden en el comercio, cuya calidad va en aumento, simplifica la tarea. Los enterovirus y los rinovirus son excepciones notables porque sus complicadas composiciones antigénicas dificultan la identificación definitiva sin las pruebas de neutralización. Las pruebas de inmunofluorescencia e inmunoenzimáticas tienen un principio similar, y difierien principalmente en el sis­ tema de detección (véase cap. 3). La prueba de inmunofluores­ cencia se ha utilizado durante muchos años con diversas variantes. La prueba de fluorescencia directa es la más fácil de realizar, pero se requieren antisueros conjugados específicos. Las pruebas de inmunofluorescencia indirecta, con antiglobuli­ na, proteína A del estafilococo o complemento, son más sensi­ bles, pero a menudo menos específicas. A diferencia de la prue­ ba directa, no son necesarios múltiples reactivos conjugados para realizar la prueba indirecta, pero el procedimiento es más largo ya que requieren múltiples pasos. La fase sólida de las pruebas inmunoenzimáticas puede ser la misma muestra colocada en un portaobjetos. En este caso, la

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------puede verse en ocasiones con el citomegalovirus. si se encuentran presentes cantidades muy grandes de virus, como sucede en los pacientes con SIDA. El citome­ galovirus puede distinguirse del virus del herpes simple por identificación de antígenos específicos y por demostración de que es necesaria la transferencia celular para reproducir el efecto citopático en forma eficaz en cultivos nuevos (180x). (C) Células de riñón de Macaca mulatta infectadas por el virus del herpes simple. Como sucede casi siempre al principio, este foco de efecto citopático se encuentra en el borde de la monocapa. Células agrandadas y redondeadas rodean el centro del foco, en el que las células ya se han desprendido del vidrio (180x). (D) Células HEp-2 infectadas por el virus del herpes simple. Se observa un gran foco de células hinchadas. Algunas tienen características de células gigantes multinucleadas, aunque es difícil delinear la morfología celular en un preparado sin teñir y con bajo aumento (180x). (E) Fibroblastos MRC-5 infectados por el virus de la varicela-zóster. El foco de efecto citopático consiste en grandes células degeneradas, hinchadas y granulosas. El foco se está extendiendo en dirección de los fibroblastos subyacentes. La aparición y la progresión lentas de los focos son característi­ cas. La transferencia del efecto citopático requiere la transferencia de células infectadas. El efecto citopático tiene cierta similitud a la causada por el citomegalo­ virus; los focos de citomegalovirus tienden a ser más compactos y a diseminarse en forma centrífuga, sin tener una orientación lineal tan pronunciada (180x). (F) Células de riñón de mono Macaca mulatta infectadas por el virus de la varicela-zóster. El foco de células agrandadas e hinchadas es menos evidente que sobre célu­ las MRC-5. Puede diferenciarse del producido por el virus del herpes simple por la velocidad con la que aparece y progresa. El citomegalovirus no causa efecto citopático en células de mono (180x). (G) Fibroblastos WI-38 infectados por citomegalovirus. Se observa en la monocapa un pequeño foco de células granulosas agrandadas (180x). (H) Fibroblastos MRC-5 infectados por citomegalovirus. Es evidente un foco de efecto citopático en evolución. Las células están hinchadas y el foco es bastante compacto. El efecto citopático del citomegalovirus aparece en forma tardía y progresa con lentitud. Tiende a ser más compacta y menos lineal que la producida por el virus de la varicela-zóster. La diferenciación con la varicela se efectúa por la historia clínica, por la demostración de células gigantes mul­ tinucleadas en el caso de la varicela y por la demostración de antígenos específicos (180x).

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CAPÍTULO 23

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

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Figura 23-15 Efecto citopático de los enterovirus. (A) Células de riñón de mono Macaca mulatta infectadas por virus Coxsackie B. Se observa un foco de efec­ to citopático en el que las células están o bien pequeñas y contraídas, o bien agrandadas. Algunas tienen el aspecto refringente o vidrioso típico del efecto citopáti­ co de los enterovirus. Las células alargadas con forma de "renacuajo” también son características de la citopatología producida por este grupo de virus (180x). (B) Células de riñón de Macaca mulatta infectadas por virus Coxsackie B. El efecto citopático progresa de forma relativamente rápida en el caso de los enterovirus; el virus de la poliomielitis puede destruir por completo la monocapa de un día para el otro. En esta microfotografía casi todas las células de la monocapa están daña­ das y grandes segmentos de la capa celular se han desprendido por completo (abajo a la derecha) (180x). (C) Fibroblastos MRC-5 infectados por echovirus 11. Se observa un foco de efecto citopático temprano. Las células aparecen agrandadas y granulosas. Puede ser difícil en este estadio certificar la identidad del virus. La mayoría de las cepas de echovirus se desarrollan bien en fibroblastos diploides humanos, en tanto que los aislamientos de virus coxsackie no lo hacen (180x). (D) Fibroblastos MRC-5 infectados por echovirus 11. El efecto citopático se ha extendido para afectar casi toda la monocapa. El virus se disemina en forma extracelular a través del medio de cultivo, de modo que el efecto citopático tiende a variar de localizado a generalizado, de manera bastante rápida ( 180x). (E) Células HEp2 infectadas por virus coxsackie B. Un pequeño foco de efecto citopático se manifiesta en las células HEp-2 por células pequeñas, contraídas y desprendimiento de las células del vidrio. El efecto citopático temprano es mucho más difícil de detectar si la monocapa es muy densa y las células están superpuestas unas con otras (180x). (F) Células HEp-2 infectadas por virus coxsackie B. Casi todas las células de la monocapa se han desprendido del vidrio. Las que quedan tienen caracte­ rísticas anormales. La mayoría de los aislamientos de virus coxsackie B se desarrollan bien en células HEp-2, en tanto que el coxsackie A y los echovirus no lo hacen (180x).

D ia g n ó s tic o d e las in fe c cio n e s v ira le s

1333

Figura 23-16 Microscopia electrónica de la hemadsorción y la hemaglutinación causadas por virus influenza A. (A) Dos eritrocitos (R) se han adherido a la monocapa de células de riñón de mono Macaca mulatta (C). El adhesivo que los mantiene unidos es la gran cantidad de viriones de influenza que están brotando (budding) en la superficie de las células renales (flechas) o que se encuentran adheridos a los eritrocitos (puntas de flecha) (35 OOOx). (B) Con mayor aumento, pueden verse con claridad las proyecciones de la membrana celular en los sitios de brotación {flechas). La espículas de la hemaglutinina y la neuraminidasa sobre las par­ tículas virales tienen el aspecto de “flecos” (80 OOOx).

reacción se detecta visualmente con el microscopio. Los inmunoanálisis en fase sólida también pueden realizarse en tubos o microcubetas. Los inmunoanálisis enzimáticos y por fluorescencia pueden considerarse equivalentes para la mayoría de las aplicaciones, aunque las pruebas de fluorescencia han sido ligeramente más sensibles en algunos casos.298 La inespecifícidad ha sido un problema en algunos inmunoanálisis enzimáticos y deben incluirse controles de especificidad. Por otro lado, los ensayos visuales, como la inmunofluorescencia directa, están sujetos a una considerable variación entre observadores. Las pruebas en las cuales la reacción positiva se determina por microscopia tie­ nen dos ventajas: 1) puede evaluarse la celularidad (y la cali­ dad) de la muestra y 2) puede determinarse la relación del antí­ geno con las células.130 La decisión acerca de qué prueba utilizar dependerá de los recursos locales, de la experiencia y de la cantidad de ensayos por realizar. La inmunofluorescencia es más sencilla que la mayoría de los inmunoanálisis enzimáticos para procesar pequeñas cantidades de muestras. Cuando la cantidad de mues­ tras aumenta y las pruebas pueden realizarse en lotes, los enzi­ moinmunoanálisis o las nuevas sondas moleculares son más atractivos porque pueden utilizarse sistemas automatizados. El advenimiento de inmunoanálisis sencillos sobre membranas ha hecho que esta técnica sea rápida y muy conveniente. Estos paquetes unitarios están destinados a la detección directa, pero también pueden usarse para la confirmación de cultivos. En estas pruebas deben incluirse controles positivos y nega­ tivos, como se indica en el prospecto del envase. La especifici­ dad de los enzimoinmunoanálisis clásicos puede mejorarse mediante una prueba de bloqueo.46 También se ha realizado la identificación de aislamientos virales por hibridación de ácidos nucleicos. Los métodos moleculares continuarán sin duda aumentando su popularidad, pero la extrema sensibilidad de la amplificación no es esencial cuando el cultivo ya ha proporcionado la amplificación que se precisa.

Conservación de los aislamientos virales

Si se cree que será necesaria una caracterización adicional de un aislamiento determinado, el sobrenadante del cultivo celular infectado debe congelarse a -70 °C. Si el laboratorio tiene los medios, es de buena práctica conservar todos los aislamientos durante un tiempo determinado. Una regla general es que las células de mamíferos deben congelarse lentamente, en tanto que los agentes infecciosos deben congelarse con rapidez. El notable descenso de viabilidad que acompaña al proceso de congelación se reduce al mínimo si los cultivos se congelan en forma súbita (snap freezing) y se incluye un agente estabiliza­ dor en el medio. Una forma conveniente para la congelación súbita de agentes virales es una mezcla de hielo seco y alcohol. Se han utilizado muchos agentes estabilizadores. Howell y Miller encontraron que el caldo sacarosa fosfato que se usa como medio de transporte para el aislamiento de Chlamydia funciona tan bien como el sorbitol al 70% para el manteni­ miento de algunos de los virus con requerimientos nutriciona­ les especiales, como el citomegalovirus y el virus sincitial res­ piratorio.246 Resumen de la detección e identificación de los virus en cultivo

Los ortomixovirus, los paramixovirus y el virus sincitial res­ piratorio (véanse figs. 23-12 y 23-13) producen una variedad de acciones citopatogénicas en cultivos de tejidos. Muchos ais­ lamientos de virus influenza y parainfluenza no causan altera­ ciones visibles en la monocapa y deben ser detectados por otros métodos. Las cepas citopatogénicas pueden diferenciarse de otros virus con efectos similares poniendo de manifiesto la res­ tricción de la acción citopatogénica a células de riñón de mono y por demostración de hemadsorción, como ya se describió. En las monocapas que han sido infectadas por virus del sarampión, virus sincitial respiratorio (véase fig. 23-13E y F), parainfluen­ za (véase fig. 23- 12F) y virus de la parotiditis, se observan célu­ las gigantes multinucleadas; estas células son el resultado de la

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C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Ricketlsia y microorganismos relacionados

fusión de células adyacentes causada por el virus (formación de sincitios). Este tipo de células también puede observarse en pacientes infectados (véase lámina en color 23-1F y G).470,526 Los aislamientos se identifican en forma definitiva por méto­ dos inmunológicos. Se cuenta con antisueros de buena calidad para la mayoría de los mixovirus habituales. El género o el tipo del virus (p. ej., virus influenza A o virus sincitial respiratorio) puede identificarse por inmunofluorescencia de las células infectadas. La caracterización de cepas de virus influenza debe realizarse por inhibición de la hemaglutinación. Los adenovirus (véase fig. 21-13A a D) pueden identificarse presuntivamente por observación de la citopatología caracterís­ tica en cultivos celulares. Son típicos los grupos de células infectadas edematosas o el aspecto en encaje de la monocapa. Se han identificado antígenos específicos de grupo comunes a todos los serotipos de adenovirus y se han preparado anticuer­ pos monoclonales contra los determinantes comunes. Para la mayoría de las aplicaciones clínicas es suficiente la confirma­ ción del género adenovirus por inmunofluorescencia. Si debe determinarse el tipo de adenovirus, es necesario realizar prue­ bas de neutralización. El grupo de los herpesvirus produce diversas acciones cito­ patogénicas en los cultivos celulares. El EBV no crece en los cultivos celulares habituales en los laboratorios clínicos; las infecciones causadas por este virus se diagnostican casi siem­ pre por serología. El CMV y el VZV están íntimamente aso­ ciados con las células (véase fig. 23-14E a H). Su crecimiento es difícil en cultivos celulares y crecen con lentitud. El subcul­ tivo exitoso requiere la transferencia de células infectadas. Tanto el CMV como el VZV producen células edematosas en focos que crecen lentamente por diseminación directa; las pla­ cas de VZV, en particular, tienden a seguir la orientación de los fibroblastos del cultivo de tejidos. En cambio, el virus del her­ pes simple se disemina en forma extracelular (véase fig. 2314A a D); el efecto citopático comienza de manera localizada pero se disemina con rapidez para afectar otras zonas de la monocapa. La centrifugación del inóculo sobre la monocapa ha acelera­ do el aislamiento de virus del herpes simple, VVZ y CMV. Los anticuerpos monoclonales han resultado valiosos tanto para la detección como para la identificación de CMV, VZV y virus del herpes simple. La separación de aislamientos de virus del her­ pes simple en tipos 1 y 2 puede lograrse de forma fiable median­ te anticuerpos monoclonales con marcación fluorescente.311 Los enterovirus crecen con bastante rapidez en cultivos celu­ lares y producen un efecto citopático diseminado (véase fig. 23-15). Las células afectadas pueden estar contraídas y con granulaciones o tener un aspecto refringente vidrioso. La mayoría de los serotipos de Coxsackie A no crecen bien en los cultivos celulares habituales. Los aislamientos de Coxsackie B no suelen crecer bien en líneas diploides de fibroblastos huma­ nos; las cepas de echovirus no crecen bien en células HEp-2. La identificación definitiva de un enterovirus requiere la iden­ tificación serológica. En el comercio se venden anticuerpos monoclonales con marcación fluorescente dirigidos contra un antígeno específico de género y serotipos seleccionados. La inmunoflurescencia no es infalible, en especial para los enterovirus diferentes de los de la poliomielitis.420El método de refe­ rencia para la identificación es la prueba de neutralización. Se ha demostrado que la secuenciación genética se correlaciona bien con los tipos serológicos.326 El coronavirus del SARS se detectó en un principio por téc­ nicas de aislamiento, pero los métodos moleculares han supe­ rado a los cultivos debido a su rapidez y comodidad. El virus

se detecta con mayor facilidad en muestras respiratorias duran­ te las primeras 2 semanas de la enfermedad y se aísla con poca frecuencia después de 3 semanas, aunque todavía puede detec­ tarse el RNA viral.85

Detección directa de virus en muestras clínicas El deseo de obtener mayor rapidez en el diagnóstico de las infecciones virales ha sido estimulado por la disponibilidad de métodos de diagnóstico rápido en otras áreas del laboratorio y por el desarrollo de una terapéutica antiviral eficaz. Se dispone de numerosos métodos que varían desde los tradicionales hasta los experimentales. Detección de cuerpos de inclusión por microscopia óptica

La detección de cuerpos de inclusión virales en frotis o teji­ dos por microscopia óptica ha sido el método tradicional para demostrar directamente una infección viral.470526 En general, los virus que se ensamblan en el núcleo (habitualmente virus de DNA) producen inclusiones intranucleares, en tanto que el ensamblaje citoplasmático (en forma predominante, virus de RNA) da como resultado cuerpos de inclusión citoplasmáticos. Las inclusiones intranucleares se encuentran en células que han sido infectadas por virus del herpes simple, VZV, CMV, adenovirus y papovavirus. Las inclusiones del virus del herpes simple (véase lámina en color 23-1 A, B y C) y las del VZV son indistinguibles entre sí. Los núcleos presentan un aspecto homogéneo, eosinofílico o ligeramente basófilo y la cromatina nuclear basófila, granular, está desplazada contra el borde de la membrana nuclear. Otras células infectadas pueden presentar un cuerpo de inclusión más eosinófilo, que está acentuado por la presencia de un halo entre el cuerpo de inclusión y la mem­ brana nuclear. Este halo es un artefacto de fijación, pero es útil desde el punto de vista diagnóstico. Ultraestructuralmente, los cuerpos de inclusión están compuestos por una mezcla de desoxirribonucleoproteína y viriones ensamblados (véase fig. 233A); a medida que los viriones atraviesan la membrana nuclear adquieren una membrana que contiene lípidos. Las células infectadas pueden ser mononucleadas o multinucleadas. El citomegalovirus produce inclusiones basófilas en una célula agrandada (véase lámina en color 23-1D). Estas células distintivas, patognomónicas de infección por CMV, se conside­ raron al principio protozoos que estaban invadiendo el tejido.258 Con frecuencia se encuentra un halo alrededor del cuerpo de inclusión. En el citoplasma de algunas células infectadas pue­ den encontrarse inclusiones granulares basófilas. En las infecciones causadas por adenovirus pueden encon­ trarse diversos cuerpos de inclusión. Las inclusiones tempranas son eosinófilas y pueden ser muy parecidas a las de las células infectadas por herpesvirus. Las inclusiones se hacen más basófilas a medida que maduran y llenan en forma progresiva el núcleo (véase lámina en color 23-IE). Por último, se hacen extremadamente basófilas y pueden deformar por completo la célula; estas células diagnósticas se denominan “células tizna­ das” y deben diferenciarse de las células no infectadas con núcleos hipercromáticos. Los cuerpos de inclusión de los ade­ novirus están compuestos por nucleoproteína y numerosos viriones, que suelen exhibir un ordenamiento paracristalino porque su forma icosaédrica permite la agrupación cercana de las partículas (véase fig. 23-3B). Los virólogos clínicos no encuentran a menudo las inclusio­ nes intranucleares del grupo papovavirus, ya que es difícil o

D e te c c ió n d ire c ta d e v iru s en m u e s tra s c lín ic a s

imposible obtener desarrollo de estos virus en cultivo. Las inclusiones en las verrugas humanas comienzan como un mate­ rial eosinófilo granular que más tarde se condensa para formar masas basófilas redondeadas; las inclusiones citoplasmáticas en las células epidérmicas de las verrugas están compuestas por queratina condensada y no son producidas por el virus. Las inclusiones de la leucoencefalopatía multifocal progresiva se observan en los astrocitos y en la oligodendroglía (células no nerviosas que tienen función de sostén); las inclusiones varían entre un material en gránulos pequeños y grandes masas basófilas que llenan el núcleo. En las células infectadas por virus sincitial respiratorio, virus de la rabia y virus del grupo pox se pueden encontrar inclusio­ nes intracitoplasmáticas. Las del virus sincitial respiratorio son eosinófilas y brillantes (véase lámina en color 23-IG); suelen hallarse en cultivos celulares, pero con menor regularidad en muestras clínicas y consisten ultraestructuralmente en ribonucleoproteína fibrilar (véase fig. 23-3C). Las inclusiones intraci­ toplasmáticas del virus de la rabia se conocen como cuerpos de Negri (véase lámina en color 23-IH). Pueden ser únicas o múl­ tiples y se presentan en neuronas que tienen por otra parte aspecto saludable. Los bordes de las inclusiones están neta­ mente definidos, como si estuvieran limitados por una mem­ brana. Los espacios claros o el punteado basófilo que pueden observarse dentro del cuerpo de inclusión son el resultado de la incorporación de cierta cantidad de material citoplasmático a la masa de ribonucleoproteína viral (véase fig. 23-3E). Por fortu­ na, es improbable encontrar en la actualidad las inclusiones intracitoplasmáticas de los poxvirus, conocidas como cuerpos de Guamieri. En las infecciones sarampionosas se encuentran inclusiones intranucleares e intracitoplasmáticas. En el estadio prodrómico del sarampión aparecen células gigantes en el tejido linfoide de todo el organismo. Estas células gigantes, denominadas células de Warthin-Finkeldey, contienen hasta 100 núcleos y rara vez contienen cuerpos de inclusión. Más tarde puede originarse un segundo tipo de células gigantes del tejido epitelial, como el que tapiza las vías respiratorias bajas. Estas células gigantes tienen menos núcleos, pero las inclusiones son casi constantes. Las inclusiones intranucleares recuerdan las producidas por los virus herpes, pueden ser únicas o múltiples y varían en su grado de eosinofilia (véase lámina en color 23-1F). La detección de los cuerpos de inclusión proporciona infor­ mación valiosa en determinadas situaciones clínicas. La prueba de Tzanck, que se realiza preparando frotis teñidos de raspados de las vesículas, puede usarse para demostrar la presencia de un herpesvirus por la observación de células gigantes multinucleadas (véase lámina en color 23-IC). También pueden utilizarse tinciones con hematoxilina-eosina o de Papanicolaou. Los nú­ cleos deben tener un aspecto de vidrio esmerilado y estar multifacetados o moldeados.459 Las inclusiones intranucleares, que se acentúan en los cortes histológicos por el artefacto en forma de halo causado en los tejidos por la fijación con formalina, no siempre se ven en los frotis. Puede hacerse un diagnóstico pre­ suntivo de infección por herpes, aunque la diferenciación en­ tre herpes simple y VZV no es posible sólo por criterios mor­ fológicos. Solomon y cois, encontraron pruebas de Tzanck positivas en 11 pacientes con varicela clínica (virus de la varicela) y en 12 de 15 pacientes (80%) con “culebrilla” (virus del herpes zóster). Sin embargo, se aisló el virus de la varicela en sólo 7 de los 11 pacientes con varicela.459 En lesiones cutáneas prove­ nientes de 18 de 21 pacientes (86%) en las cuales se aisló virus del herpes simple, se demostraron células gigantes multinu-

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cleadas, cuerpos de inclusión o ambos.363 Un análisis de la efi­ cacia con la que los dermatólogos interpretaron en forma correcta un estudio compuesto por 10 frotis demostró la exis­ tencia de una “curva de aprendizaje inversa” (o de pérdida de sinapsis neuronales con el aumento de la edad).203 Los residen­ tes de segundo y tercer año interpretaron en forma correcta, en promedio, el 91% de los frotis; los dermatólogos con menos de 10 años de práctica tuvieron un promedio del 84% de respues­ tas correctas; los dermatólogos con más de 10 años de práctica obtuvieron un 67% en promedio de diagnósticos correctos. Aunque los frotis directos han funcionado bien para el estu­ dio de las lesiones cutáneas, lamentablemente su sensibilidad ha sido baja para otras aplicaciones. Sólo una minoría de mues­ tras positivas en cultivos, provenientes del aparato genital478 o del aparato respiratorio371 contenían células con cuerpos de inclusión. Asimismo, Nahmias y cois, hallaron inclusiones intranucleares en sólo el 56% de 113 casos de encefalitis cau­ sada por el virus del herpes simple.370 La especificidad fue mucho más alta (86%) que la sensibilidad en este estudio en colaboración sobre terapéutica antiviral, pero los resultados positivos falsos son peligrosos si llevan a omitir el tratamiento para algún otro cuadro, como un acceso cerebral bacteriano. Se informaron inclusiones intranucleares en 10 pacientes en los cuales no se aisló virus del herpes simple; en 7 de éstos, se esta­ bleció un diagnóstico alternativo no asociado con los cuerpos de inclusión. Estos resultados subrayan la importancia de la utilización cuidadosa e informada de las pruebas morfológicas “sencillas”. La detección histológica de cuerpos de inclusión del CMV en tejidos es menos sensible que el cultivo, pero puede ser equivalente a la de técnicas más “sofisticadas”, como la inmunohistoquímica y la hibridación in situ, para revelar la presen­ cia de citomegalovirus en los tejidos.471 Los métodos morfoló­ gicos tienen la ventaja de correlacionarse mejor con la enfer­ medad causada por el citomegalovirus que el cultivo, aunque éste sea más sensible. En la infección por parvovirus B19 se hallan también cuer­ pos de inclusión intranucelares dentro de pronormoblastos gigantes, que se encuentran en la médula ósea.288 Estas células características también pueden verse en sangre periférica y otros tejidos en fetos infectados. Detección de partículas virales por microscopía electrónica

La microscopia electrónica puede aplicarse al estudio tanto de muestras clínicas como de cultivos celulares, ya sea en cor­ tes de tejido delgados o por microscopia con tinción negativa. La falta de disponibilidad de un microscopio electrónico en la mayoría de los laboratorios clínicos y los errores de muestreo inherentes al examen de pequeñas muestras de tejido han cons­ pirado en contra de la aplicación sistemática de esta técnica para el diagnóstico virológico. En un estudio, el uso de la microscopia electrónica fue específico para el diagnóstico de encefalitis causada por herpes simple (98%), pero los viriones herpéticos se detectaron sólo en el 45% de los casos.370 La téc­ nica se utilizó eficazmente para la detección de los agentes virales de la gastroenteritis, en especial los que no se aíslan en cultivos celulares convencionales (rotavirus, agentes similares al Norwalk y adenovirus entéricos). No obstante, el diagnósti­ co ultraestructural sigue siendo una técnica de investigación en la mayoría de los laboratorios. La microscopia electrónica con tinción negativa ha desperta­ do renovado interés como resultado de la preocupación plan­ teada por el bioterrorismo. Cuando se examina una muestra

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C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

con el microscopio electrónico, no hay requisitos previos de qué antígeno o ácido nucleico debe ser detectado. El diagnós­ tico de infecciones virales importantes, como la viruela, puede hacerse con rapidez y seguridad si la muestra puede inactivarse antes de ser examinada.219 Detección inmunológica de antígenos virales

Las técnicas inmunológicas, y más recientemente, las técni­ cas moleculares, se han utilizado con eficacia para acelerar el diagnóstico de ciertas infecciones virales. La tinción por inmu­ nofluorescencia o inmunoenzimática de muestras clínicas o tejidos son técnicas utilizadas con frecuencia. Los ensayos moleculares están complementando o reemplazando cada vez más a las técnicas inmunológicas. Estas técnicas tienen muchas ventajas y funcionan bien cuan­ do son utilizadas por personal entrenado. El riesgo de resultados erróneos es grande si no existe el equipamiento y el entrena­ miento adecuados.130 Para casi todos los procedimientos el es­ tándar sigue siendo el cultivo del agente infeccioso. Siempre que sea posible, los cultivos deben efectuarse en paralelo con pruebas inmunológicas rápidas hasta que se demuestre la efi­ ciencia en la realización de la técnica. VIRUS RESPIRATORIOS

El método de detección antigénica más fiable para los virus respiratorios es la inmunofluorescencia directa (IFD). En un estudio, la IFD fue tan eficaz como el cultivo para todos los virus respiratorios, excepto los adenovirus. Cuando los porta­ objetos para inmunofluorescencia se preparan en una citocentrífuga, menos del 10% de las pruebas tienen una cantidad ina­ decuada de células respiratorias.297 En cambio, la sensibilidad de las pruebas inmunoenzimáticas, sobre todo en sus formatos rápidos, ha sido mucho más baja en la mayoría de los infor­ mes.2'84-298-414 Además, algunos inmunoanálisis han producido la suficiente cantidad de positivos falsos como para hacer nece­ saria la confirmación por un segundo método.2 Aunque la inmunofluorescencia directa es sin duda el mejor de los dos métodos, por razones prácticas a menudo se eligen pruebas inmunoenzimáticas. Estas últimas se realizan con rapi­ dez y simplicidad sin necesidad de poseer un microscopio de fluorescencia ni de un entrenamiento especial del personal. VIRUS DEL GRUPO HERPES Virus del herpes simple. La inmunofluorescencia directa en gene­

ral ha tenido buenos resultados en comparación con el cultivo, sobre todo cuando se efectúa en lesiones visibles y se perfec­ ciona por citocentrifugación.299-415-430 Los resultados variables pueden reflejar las diferencias de reactivos, de poblaciones de pacientes, de tipo de lesiones y de serotipos del virus. Sin embargo, el virus del herpes simple se desarrolla con rapidez en el cultivo, por lo que las ventajas de un diagnóstico acelera­ do no son tan marcadas como con otros virus de crecimiento más lento. Virus de la varicela-zóster. El VZV se desarrolla lentamente en el cultivo. No es sorprendente que la inmunofluorescencia direc­ ta tenga mejor rendimiento con el VZV que con el virus del herpes simple. En realidad, la IFD de lesiones de la piel puede ser la mejor forma de establecer el diagnóstico.111 Además del examen directo de frotis del material, la tinción de los prepara­ dos obtenidos por citocentrifugación del medio de transporte han demostrado ser útiles.342

Citomegalovirus. Los anticuerpos monoclonales han facilitado el diagnóstico inmunológico rápido de las infecciones por CMV en muestras de pacientes, así como en cultivos celulares. Hackman y cois, pudieron detectar CMV por inmunofluores­ cencia en 25 de 27 muestras de biopsia de pulmón, de las cua­ les luego se cultivó el virus;206 se demostraron cuerpos de inclusión por microscopia óptica en sólo 20 de las muestras. Estudios preliminares con muestras de lavado broncoalveolar provenientes de pacientes inmunosuprimidos108141,331 han arro­ jado estimaciones muy diferentes en lo que respecta a la sensi­ bilidad, que varía del 31,6% al 100%. La cantidad de pacientes en estos estudios era pequeña, los anticuerpos eran diferentes y la composición de los grupos de pacientes puede haber sido distinta. La correlación de la detección inmunológica de antí­ geno viral en tejidos (sin cuerpos de inclusión o anomalías histopatológicas) con la enfermedad clínica no está aclarada. La detección de antigenemia para el CMV es más sensible que el cultivo,31-508se vende en el comercio y ha reemplazado al cultivo en muchos laboratorios. La toxicidad de la sangre para las monocapas celulares ha limitado la utilidad de los cultivos. En la prueba para antigenemia. la fracción abundante en leuco­ citos de una muestra de sangre periférica se examina en busca de la presencia de pp65, un antígeno temprano/intermedio que se produce en el curso de la infección de las células por CMV. Una de las mayores desventajas de la prueba de antigenemia, la cantidad de horas-hombre requeridas, se ha superado en gran medida por el desarrollo de procedimientos de inmunofluores­ cencia comerciales rápidos.296464 La prueba ha resultado de uti­ lidad para predecir la enfermedad clínica y para controlar la respuesta a la terapéutica antiviral en los pacientes de alto ries­ go, en especial los receptores de trasplantes de órganos.54 El valor de la prueba en pacientes infectados por el HIV es más discutido.31,92 Los protocolos para el momento y la frecuencia de realización de la prueba varían entre los principales centros de trasplante. En algunos casos, la prueba se realiza de manera habitual durante un período después del trasplante; en otros, la aparición de síntomas clínicos determina el pedido de la prue­ ba. Cuando la densidad de la suspensión celular está estandari­ zada, puede hacerse una determinación cuantitativa del grado de antigenemia. La leucopenia intensa a veces dificulta el exa­ men de una cantidad suficiente de células. La cuantificación del nivel de antigenemia es importante: la antigenemia de alto nivel (> 50 neutrófilos infectados cada 2 x 105 células) indica el mayor riesgo de enfermedad inminente, de ineficacia de la terapéutica antiviral o de posible recaída. La prueba de antige­ nemia para CMV sigue siendo el método de referencia y es muy útil cuando se examinan pocos pacientes.341

OTROS VIRUS

Los rotavirus humanos son difíciles de aislar en cultivos ce­ lulares. Las infecciones causadas por estos virus pueden diag­ nosticarse en forma eficaz, ya sea por un enzimoinmunoanáli­ sis o por aglutinación de partículas del látex. La sensibilidad para ambos métodos ha variado entre el 80% y el 90%; la espe­ cificidad ha sido del 90% al 100%.98-140-480 Krause y cois, han cuestionado la fiabilidad del inmunoanálisis Rotazyme® en recién nacidos.289 Técnicas moleculares

La era molecular se encuentra inextricablemente unida a las enfermedades infecciosas desde su mismo origen, y el ritmo de innovaciones no parece disminuir. Ya hemos atravesado varias

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etapas, comenzando con la hibridación de ácidos nucleicos hasta concluir con la técnica de amplificación molecular (véase cap. 4). La reacción en cadena de la polimerasa y otros méto­ dos de amplificación han ganado un lugar en los laboratorios clínicos para algunos patógenos muy importantes, lo que ha justificado la presentación de productos comerciales.492 VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA

Las únicas pruebas aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (Food and Drug Administration, FDA) para el diagnóstico inicial de infecciones por HIV son las pruebas para anticuerpos. La detección molecular no se reco­ mienda para este propósito, porque existen reacciones positivas falsas ocasionales.417 Esta política es análoga al enfoque para la sífilis, en la que la especificidad de la prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-ABS) se salva­ guarda usándola sólo en una población de pacientes con una probabilidad anterior alta de tener sífilis porque ya han tenido una prueba VDRL o de reagina plasmática rápida (RPR) posi­ tivas (véase cap. 20). Una vez que se hace el diagnóstico, el manejo de la infección por HIV-l se basa por completo en los métodos moleculares. Sin embargo, hay dos situaciones en las que la comprobación de la carga viral es adecuada para el diagnóstico inicial. En ambos casos puede no haber habido tiempo suficiente para que se desarrolle una respuesta serológica. La primera situación es la infección aguda por el HIV. que puede manifestarse como una enfermedad febril multifacética con síntomas referibles a cualquier sistema orgánico.269 Esta enfermedad inicial es tran­ sitoria y no suele durar más de 14 días. Puede haber grandes cantidades de virus antes de que se genere la respuesta inmuni­ taria. La segunda situación clínica es la infección neonatal, cuando se sabe que la madre está infectada. En este caso es necesaria la detección molecular del virus, porque los anticuer­ pos transferidos pasivamente a través de la placenta al recién nacido complican el análisis serológico. La columna vertebral del control del curso de la infección y de la respuesta a la terapéutica antiviral es la medida cuan­ titativa del RNA viral, las denominadas pruebas de carga viral. La detección cualitativa de RNA es el método actual para la detección sistemática en hemoderivados antes de la transfusión, pero no se usa para manejar las infecciones de pacientes. La detección cuantitativa del RNA viral se ha hecho en diversas muestras, como líquidos corporales, suero y leucocitos de sangre periférica. Sin embargo, la muestra estándar es el plasma. Se han usado tres métodos moleculares en las pruebas de carga viral aprobadas por la FDA y un cuar­ to se ha utilizado como ensayo cualitativo para la detección sistemática en bancos de sangre. La reacción en cadena de la polimerasa de la transcriptasa inversa (RT-PCR) ha sido la plataforma predominante. Las pruebas Amplicor HIV-l monitor® y COBAS Amplicor HIV1 monitor® (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) se presen­ tan en un formato estándar y como prueba ultrasensible, que fue introducida para descubrir bajas cantidades de copias des­ pués del tratamiento antiviral eficaz. Las versiones manuales y automatizadas tienen un rendimiento similar.226-238 El rango dinámico es de 400 a 750 000 copias por mililitro (estándar) y 50 a 75 000 copias por mililitro (ultrasensible). El segundo enfoque usa DNA de cadena ramificada (bDNA; Versant HIV1 Assay®; Bayer Diagnostics, Tarrytown. NY) que proporcio­ na resultados reproducible en un rango de copias de 75 a 500 000 por mililitro.365

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Otros enfoques incluyen la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA; NucliSens HIV-l QT®; BioMérieux, Ditrham, NC)185 para la determinación cuantitati­ va de carga viral y un análisis cualitativo de amplificación mediado por transcripción (TMA; Gen-Probe, San Diego, CA).183 Estos análisis no han sido aprobados todavía por la FDA para probar muestras clínicas, aunque el procedimiento TMA ha sido autorizado para la detección sistemática de mues­ tras de bancos de sangre. Se describieron análisis en tiempo real de varios tipos que tendrán, sin duda, mayor importancia en el futuro.118-383 Las dos estrategias principales (PCR y bDNA) tienen un rendimiento equivalente para la cuantificación de cepas del grupo M (las cepas predominantes en los Estados Unidos), pero las pruebas de PCR no son tan buenas para detectar las cepas del grupo O474 o las cepas no pertenecientes al ciado B256 como los procedimientos de bDNA. El coeficiente de variación de las pruebas de carga viral es alto, y varía en los casos típicos de 30 a 40 (según la cantidad de virus presente) y el número de copias no puede compararse directamente entre diferentes enfoques moleculares. Por consiguiente, es esencial seguir a los pacientes en forma secuencial con el mismo tipo de prueba; si el ensayo se cambia a un enfoque diferente, debe establecerse un nuevo valor basal para el paciente. Los tubos de plástico y los tubos Vacutainer® de vidrio para la obtención de sangre para realizar pruebas de carga viral son equivalentes.300 Los tubos Vacutainer para preparación de plasma (PPT) son un método conveniente para obtener sangre si se congelará o se enviará a un laboratorio de referencia para efectuar las pruebas.237 Se ha registrado una amplia variación en los informes de pacientes proporcionados a los médicos por los laboratorios clínicos, incluidos informes incompletos o inútiles.164 Con el advenimiento de la terapéutica antiviral eficaz, la detección de resistencia en los aislamientos clínicos se ha transformado en una prioridad. La relevancia clínica de las pruebas de resistencia pronto se hizo evidente138 y se han publi­ cado recomendaciones consensuadas actualizadas.229 Las prue­ bas de resistencia se recomiendan en las mujeres embarazadas y después del fracaso de la terapéutica antiviral, ya sea la tera­ pia primaria o regímenes posteriores. En este momento está claro que la evaluación de la resistencia es útil para tratar a los pacientes recién infectados (infectados dentro de los 12 meses anteriores a la prueba), en particular si se sabe que el individuo que es la fuente de infección ha estado tomando antirretrovirales. Además, la realización de pruebas a pacientes que han esta­ do infectados durante 2 años (y quizá más) se ha encontrado útil para diseñar regímenes terapéuticos.228 Se han usado dos enfoques para detectar resistencia. La eva­ luación de la resistencia fenotípica involucra el aislamiento del virus y la evaluación tradicional de inhibición por fármacos anti­ virales. La complejidad del aislamiento viral ha llevado a usar un mecanismo alternativo, en el que el RNA plasmático de los genes de la polimerasa y la proteasa se amplifica y se usa para fabricar un virus recombinante con estructuras de laboratorio. Usando de soporte un virus estándar en el que se han insertado los dos genes más importantes de la cepa del paciente, se ha mejorado la estandarización del ensayo. Las pruebas de sensibi­ lidad a los fármacos pueden realizarse en el término de varias semanas, usando métodos automatizados y genes indicadores. Los ensayos fenotípicos son Pheno-Sense® (ViroLogic, South San Francisco, CA) y The Anti-virogram® (VIRCO Lab USA, Raritan, NJ).

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Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

A diferencia de los ensayos fenotípicos, que miden la sensi­ bilidad viral, los ensayos genotípicos detectan las mutaciones que confieren la resistencia fenotípica.447 El paso inicial en los ensayos basados en PCR es similar al enfoque recombinante fenotípico: amplificación de las secuencias de HIV-l de mues­ tras de plasma que contienen 500 a 1 000 copias por mililitro. Por consiguiente, este enfoque genotípico no funciona con muestras que contienen una cantidad pequeña de virus. El siguiente paso consiste en genotipificar todos los codones perti­ nentes o en detectar codones seleccionados por hibrida­ ción.212’229 Varias compañías han intentado predecir el fenotipo por el análisis del resultado genotípico: el denominado fenoti­ po virtual. Los ensayos genotípicos son The VirtualPhenotype® (VIRCO), GeneSeq HIV® (ViroLogic), ViroSeq® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) y Trugene HIV-l® (Bayer Diag­ nostics, Tarrytown, NY). Los ensayos fenotípicos tienen el atractivo de proporcionar una evalaución más directa (y tradicional) de la resistencia, aunque la interpretación clínica de los resultados no está com­ pletamente definida ni es sencilla. En el caso de los pacientes en los que han fracasado varios regímenes de tratamiento, los ensayos genotípicos pueden documentar muchas mutaciones virales que son difíciles de interpretar; en esta situación, los análisis fenotípicos pueden proporcionar una mejor orienta­ ción. Los fenotipos tienen la considerable desventaja de ser laboriosos y caros. Los ensayos genotípicos son más sencillos, más rápidos y menos caros; el problema reside en que a veces la resistencia fenotípica importante no se detecta con precisión y la impor­ tancia de las nuevas mutaciones no es clara. Para ambos enfo­ ques, la reproducibilidad y la complejidad de los análisis son factores importantes. Otro problema es que una minoría de viriones resistentes en la población de diferentes viriones que constituye la cepa infectante de un paciente determinado pue­ den ser pasados por alto (en forma análoga al problema de detectar células resistentes en una población de bacterias heterorresistentes, como se explica en el cap. 17).447 Aunque la preocupación sobre los ensayos genotípicos no se ha disipado, estudios comparativos han demostrado una buena correspondencia entre los ensayos genotípicos y fenotípicos para los mecanismos de resistencia clínicamente importantes.43 A medida que se adquiere experiencia y se perfeccionan los productos comerciales, se ha establecido la reproducibilidad y fiabilidad de la genotipificación.172197 Hay evidencias de que las pruebas de resistencia pueden predecir la respuesta a la terapia antiviral o el tiempo que transcurrirá hasta la supresión del virus.196538 Sin embargo, los factores que determinan el éxito o el fracaso del tratamiento de cualquier infección son complejos. Como sucede con todos los informes de laboratorio, los resultados de las pruebas de resis­ tencia del HIV deben ser interpretados por un médico experi­ mentado a la luz de todos los datos disponibles. Continúa la búsqueda de un algoritmo útil que facilite la toma de decisio­ nes clínicas.447 VIRUS DE LA HEPATITIS C

El enfoque diagnóstico para el virus de la hepatitis C es simi­ lar al de las infecciones por HIV.25-398 La identificación de pacientes infectados se realiza en forma óptima por métodos serológicos. Sin embargo, para diferenciar los pacientes en quienes se ha eliminado la infección de aquellos que están infectados crónicamente y tienen riesgo de enfermedad cróni­ ca, es necesario determinar si hay virus circulante.398 La detec­

ción molecular es la única opción, porque el virus de la hepati­ tis C nunca ha sido cultivado in vitro. Se comercializan varios ensayos cualitativos: prueba Cobas Amplicor HCV versión 2.0® (Roche Diagnostics) que usa la técnica PCR, y Versant HCV RNA Qualitative Assay® (Bayer Diagnostics), que emplea TMA (pruebas de amplificación molecular). Los dos ensayos tienen un rendimiento similar, aunque el enfoque con TMA es algo más sensible y menos engorroso.287 Las pruebas cuantitativas (carga viral) son necesarias para el control del tratamiento. Existen ensayos comerciales basa­ dos en PCR (Cobas Amplicor HCV Monitor Test v2.0®; Roche Diagnostics) y en bDNA (Versant HCV RNA Test v3.0®; Bayer Diagnostics). La prueba basada en bDNA se considera de alta fiabilidad y reproducibilidad. Es menos sen­ sible que la prueba basada en PCR, pero esta última infrava­ lora la carga viral.23,355 Es probable que se disponga de prue­ bas en tiempo real en el futuro. Como sucede con el HIV, un paciente determinado debe ser seguido con la misma prueba. Aunque son útiles para controlar la terapéutica antiviral, no se ha demostrado que ninguna de las pruebas tenga correlación con el pronóstico. El tercer componente del enfoque molecular al virus de la hepatitis C es la genotipificación, que es necesario realizar una sola vez.25 Se han usado como diana varias partes del genoma; dos ensayos comerciales usan como diana la región 5' no codi­ ficante. por un método de secuenciación directa estandarizado (Trugene HCV 5 ’NC®; Visible Genetics, Toronto, ON, Canadá) o por una sonda de hibridación inversa (INNO-LiPA HCV II®; Bayer Diagnostics). Los dos ensayos proporcionaron resultados genotípicos congruentes en el 99,4% de 172 mues­ tras clínicas, que incluyeron seis genotipos del virus de la hepa­ titis C.177376 Sin embargo, a nivel de subtipo, hubo sólo un 68,2% de concordancia. En alrededor del 15% de las muestras de cada ensayo no se determinó el serotipo o la determinación del subtipo fue ambigua. Por lo tanto, estos dos métodos comerciales son útiles para la genotipificación, pero no deben usarse para la subtipificación. VIRUS DE LA HEPATITIS B

Las pruebas para el diagnóstico molecular para el virus de la hepatitis B no han logrado la utilización que alcanzaron las de la hepatitis C, porque la variedad de pruebas serológicas disponibles para la hepatitis B ha cubierto la mayor parte de las necesidades. Sin embargo, la detección de DNA viral en sangre, que es la definición de infección activa, es más sensi­ ble que la presencia de HBeAg y pueden encontrarse precore de virus mutantes en ausencia de seroconversión para HBeAg.25 No obstante, la detección molecular no se reco­ mienda aún para todos los pacientes infectados; debe reser­ varse para los que son candidatos a la administración de anti­ virales. Los métodos comerciales, ninguno de los cuales ha sido aprobado todavía por la FDA para uso clínico, son la captura de híbridos, bDNA y PCR.529 Los ensayos que usan PAM y PCR en tiempo real están en desarrollo. Se ha plante­ ado la preocupación de que algunos de ellos no sean sufi­ cientemente sensibles para el control fiable de la terapéutica antiviral eficaz.487 Además, se han creado varios ensayos comerciales de genotipificación. Sin duda, a medida que aumente la experiencia con el tratamiento de la infección crónica por el virus de la hepatitis B y la resistencia se haga más prevalente, estas pruebas asumirán cada vez mayor im­ portancia.

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VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO

El diagnóstico molecular es el único enfoque práctico para este grupo de virus. Las técnicas laboriosas, como la hibridación de ácidos nucleicos por el método de Southem blot (véase la edi­ ción anterior de este libro) han sido reemplazadas por métodos más convenientes y sensibles. La única prueba comercial apro­ bada por la FDA para uso diagnóstico es el ensayo de captura híbrida (Hybrid Capture II HPV®, Digene, Gaithersburg, MD). La segunda generación de esta prueba ha mejorado mucho en sensibilidad en comparación con la versión inicial; los resultados son reproducibles,59 aunque debe tenerse gran cuidado con los detalles técnicos del procedimiento. Sólo está aprobada para pro­ bar muestras genitales y está disponible para dos grupos de virus: HPV con riesgo mínimo para neoplasia cervical y genoti­ pos con riesgo moderado a alto. Las recomendaciones consen­ suadas sugieren usar sólo el panel de alto riesgo.527 Una tercera generación del ensayo de captura híbrida, que está en desarrollo, puede tener una sensibilidad ligeramente superior y una especificidad similar.60 Se han informado méto­ dos de amplificación dirigida, como PCR y PCR en tiempo real, pero no están aprobados para el uso diagnóstico.448 PARVOVIRUS B19

Las infecciones por parvovirus suelen diagnosticarse en forma clínica o serológica; la valoración de riesgo se basa en el nivel inmunitario (inmune). Sin embargo, a veces es útil la documentación virológica de una infección grave. El parvovi­ rus no crece en cultivo, de modo que la detección molecular es el único método disponible. Se han ideado varios ensayos de amplificación;112122,213 aunque no está aprobada por la FDA, la detección molecular se realiza en los laboratorios de referencia. VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL

El recién llegado a la lista de virus transmitidos por artrópo­ dos, el virus del Ni lo Occidental, se ha transformado en un pro­ blema clínico importante en los Estados Unidos. Los medios preferidos de diagnóstico son el análisis serológico de sangre y LCR.396 La detección molecular de ácido nucleico viral en LCR no es suficientemente sensible para reemplazar las pruebas serológicas y sigue siendo un tema de investigación.295385 VIRUS DEL HERPES SIMPLE

El principal abordaje de diagnóstico de las infecciones por el virus del herpes simple es el cultivo, que proporciona un resul­ tado relativamente rápido con este virus. Se han necesitado biopsias de cerebro para conseguir una muestra apropiada para el diagnóstico por cultivo de la encefalitis, que es la infección herpética más grave en los adultos, porque el virus no se aísla en forma fiable en el LCR. Sin embargo, la detección amplifi­ cada por PCR es suficientemente sensible para lograr la identi­ ficación del DNA viral en el LCR, tanto en las encefalitis como en las meningitis recurrentes.349,452 Aunque no hay ningún pro­ ducto comercial aprobado por la FDA, la prueba se ha adapta­ do al protocolo de PCR en tiempo real y está fácilmente dispo­ nible como prueba validada en varios laboratorios de referen­ cia. La preparación de DNA para la amplificación puede lograrse bien tanto por métodos manuales como automatiza­ dos.147 Por fortuna, el DNA es lo suficientemente estable como para que puedan guardarse las muestras sin una disminución en la sensibilidad a 4 °C, ya sea como DNA extractado o como muestra sin extraer, durante un máximo de 16 meses antes de

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hacer la prueba de PCR en tiempo real.257 Los recursos del laboratorio pueden mejorarse mediante la detección sistemáti­ ca de muestras en busca de pleocitosis en el LCR antes de ha­ cer las pruebas, porque se ha demostrado la presencia de neu­ trófilos en todas las muestras positivas, por lo menos en los adultos 451 Sin embargo, los niños con encefalitis pueden tener muy pocos neutrófilos en el LCR y las pruebas de PCR inicia­ les pueden ser negativas si se realizan muy temprano en el curso de la infección.119 Aunque la PCR en tiempo real es muy útil para diagnosticar la encefalitis herpética, la amplificación molecular ha resultado más sensible que el cultivo para detectar infecciones de las mucosas 497 A medida que estos ensayos se simplifican, podrá proporcionar­ se una detección sistemática a las mujeres embarazadas cerca del término con mayor facilidad que en este momento. CITOMEGALOVIRUS

El ensayo de antigenemia se ha transformado en el método de referencia para controlar las infecciones por CMV en pacientes inmunosuprimidos. Los intentos iniciales de sustituirla por ensayos de amplificación molecular se vieron impedidos por la mala correlación con la enfermedad clínica, debido a su alta sensibilidad. Más tarde, diversos ensayos cuantitativos se han correlacionado bien con la enfermedad clínica y con el ensayo de antigenemia. Los métodos que se usaron con éxito son PCR, PCR en tiempo real y la captura híbrida.53’125,232,310,341 Uno de los factores que pueden considerarse para seleccionar un ensayo es la cantidad de pruebas que se prevé realizar.341 Los usuarios de la amplificación molecular deben tener pre­ sente una particularidad: a diferencia del virus del herpes sim­ ple, la cantidad de CMV detectada en plasma aumenta con el tiempo cuando la muestra se guarda a 4 °C, al parecer por la liberación de ácido nucleico de leucocitos infectados.434 En el caso de muestras positivas en el ensayo de antigenemia hubo pocos cambios en el resultado de la amplificación; sin embar­ go, si el paciente estaba infectado en forma latente y la prueba de antigenemia había sido negativa, la cantidad de virus en plasma aumentó significativamente con el tiempo. ENTEROVIRUS

Se sospecha que el cultivo, que ha sido el apoyo diagnóstico principal para los enterovirus, es bastante insensible. Esta impresión se ha confirmado con la aparición de pruebas gené­ ticas de amplificación actualmente en uso en muchos laborato­ rios de referencia (aunque ninguna ha sido aprobada todavía por la FDA para uso diagnóstico). Los ensayos incluyen PCR, PCR en tiempo real y NASBA.37,293,301 Como no existe ningún agente antiviral de uso general para las infecciones por enterovirus, el diagnóstico rápido no es tan imprescindible como en el caso del virus del herpes simple, pero el diagnóstico rápido de laboratorio facilitaría el manejo clínico. CORONAVIRUS DEL SÍNDROME RESPIRATORIO AGUDO GRAVE (SRAG)

El RNA viral es detectable en las muestras clínicas durante más de un mes en algunos pacientes. La recuperación de ácido nucleico aumenta progresivamente hasta alcanzar un máximo a los 11 días después del inicio de la enfermedad clínica. El ácido nucleico pudo detectarse en el 60% de los pacientes con infección diagnosticada clínicamente y en un número muy pequeño de pacientes sin enfermedad evidente. Las muestras más útiles en los primeros 5 días fueron los aspirados nasofa­

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Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

ríngeos, los hisopados de fauces y el esputo. En etapas poste­ riores de la enfermedad, el virus se detectó más fácilmente en muestras de heces.85 También se han creado ensayos de PCR en tiempo real para este virus.537 En este momento, las pruebas de diagnóstico están restringidas a los laboratorios de referencia.

que en el curso de la próxima década este método reemplace a la detección de antígenos en los laboratorios más avanzados y quizá también en otros ámbitos.

Diagnóstico serológico de las infecciones virales OTRAS INFECCIONES VIRALES

Se han desarrollado ensayos de amplificación molecular para casi todos los agentes infecciosos, incluso PCR en tiempo real para la mayoría de ellos. Con la disponibilidad creciente de reactivos comerciales fiables (aun en ausencia de instrumental o reactivos de diagnóstico), se puede esperar el mismo tipo de expansión que ocurrió después de que los reactivos para inmu­ nofluorescencia e inmunoenzimáticos estuvieron al alcance de todos. Es probable que los ensayos para algunos de los agentes per­ manezcan en el ámbito de los laboratorios de referencia. Los ejemplos son los virus exóticos, como los virus de las fiebres hemorrágicas;131 los agentes muy virulentos que tienen uso potencial para el bioterrorismo, como la viruela;458 y los virus que rara vez se consideran, como los poliomavirus (JC y BK,515 el del sarampión,122 el de la rubéola122 y el de la parotiditis.399 Cada vez muchos más de los agentes que en este momento se detectan en forma rutinaria por cultivo serán identificados por métodos moleculares más rápidos. Los ejemplos son los virus respiratorios y otros virus herpéticos.109,204-490,494,516 Selección de pruebas para diagnóstico rápido

La elección de una técnica para la detección directa de virus debe depender de la disponibilidad de equipos, de la experien­ cia del personal y de la cantidad de muestras por evaluar. La detección microscópica de cuerpos de inclusión es sencilla y económica, pero poco sensible; funciona bien para la determi­ nación de lesiones herpéticas cutáneas. La microscopia elec­ trónica tiene indicaciones restringidas. Los inmunoanálisis en fase sólida microscópicos (inmunofluorescencia y pruebas enzimáticas) tienen ventajas sobre las pruebas para detección de antígenos solubles: 1) la localización y el tipo de tinción pueden evaluarse morfológicamente y 2) pueden procesarse con rapidez pequeñas cantidades de muestras. Estas ventajas pueden ser contrarrestadas por las desventajas que representan la subjetividad de la interpretación y la necesidad de adquirir un costoso microscopio para fluorescencia. Los enzimoinmunoanálisis son más útiles cuando deben eva­ luarse grandes cantidades de muestras o cuando éstas pueden recogerse y evaluarse en lotes. El punto final puede leerse por medio de un espectrofotómetro, lo que elimina las decisiones subjetivas. Los nuevos enzimoinmunoanálisis sobre membrana, de un solo uso, se han transformado en la forma más conve­ niente para proporcionar resultados rápidos con mínima com­ plejidad, aunque muchas veces se ve afectada la sensibilidad. Para el estudio de corte de tejidos en busca de elementos vira­ les, la inmunoperoxidasa tiene como ventajas sobre otros mar­ cadores que los antígenos virales suelen estar disponibles para la reacción sin necesidad de otros tratamientos. Deben bloque­ arse por completo las peroxidasas endógenas presentes en los cortes. Antes de realizar una inmunofluorescencia para la detec­ ción de algunos antígenos, el tejido fijado e incluido debe ser tratado con un agente proteolítico como la tripsina.87,239 Ha habido y seguirá habiendo una tendencia a usar la detec­ ción molecular como el procedimiento de elección, en particu­ lar la técnica de amplificación en tiempo real. Es muy probable

Las pruebas serológicas son la piedra angular del diagnósti­ co de ciertas infecciones virales, como las causadas por los virus de hepatitis, el EBV y el virus de la rubéola. Siempre que el aislamiento del virus en cultivo sea difícil o imposible, la demostración de una respuesta inmunitaria contra el agente seguirá siendo importante. En ciertos casos, como ocurre en la evaluación de las infecciones por rubéola, el diagnóstico sero­ lógico puede ser tan rápido como el cultivo del virus, aun cuan­ do haya que esperar 2 o 3 semanas para obtener una muestra de suero del período convaleciente. En las situaciones en las que el cultivo del virus es fiable y fácil de obtener, el diagnóstico serológico tiene un papel auxiliar o de apoyo. Los principios inmunológicos generales también tienen apli­ cación cuando se establece el diagnóstico de una enfermedad viral utilizando métodos serológicos. Los anticuerpos contra muchos agentes virales persisten durante meses o años después de una infección aguda. La demostración de un aumento signi­ ficativo (por lo general un aumento de 4 veces) en el título de anticuerpos se considera diagnóstico de infección reciente con el agente en cuestión (a menos que exista la posibilidad de reacciones cruzadas). Si en la muestra inicial no se encuentran anticuerpos, este aumento diagnóstico del título de anticuerpos se denomina seroconversión. En estos casos es probable que la infección represente el primer contacto con el virus. La infección puede ser primaria o una reactivación de una infección latente si se encuentran anticuerpos, aun en títulos bajos, en la muestra ini­ cial.3711 El diagnóstico serológico de las infecciones herpéticas suele complicarse por la enfermedad recidivante. Por ejemplo, en un paciente con enfermedad del SNC, las lesiones bucales herpéticas pueden reactivarse por el estrés de la enfermedad aguda. La respuesta serológica que pueden producir las lesio­ nes bucales reactivadas puede interpretarse falsamente como evidencia de que la enfermedad del SNC está causada por un herpesvirus. Existen reacciones serológicas cruzadas dentro de muchos grupos de virus e incluso entre grupos, notablemente entre los enterovirus, paramixovirus y togavirus. Por lo tanto, todos los diagnósticos serológicos deben considerarse hasta cierto punto presuntivos. Una disminución de cuatro veces o más en los títulos de anti­ cuerpos sugiere una infección pasada. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos desaparece lentamente, de modo que suele ser difícil estar seguro de cuán reciente fue la infección. Cuando se realiza un diagnóstico debe tenerse en cuenta el cuadro clínico. Incluso una seroconversión demuestra sólo una infección reciente por el agente en cuestión. La asociación con la enfermedad manifiesta es una inferencia clínica. Virus de la inmunodeficiencia humana

El virus de la inmunodeficiencia humana persiste en los pacientes que han desarrollado anticuerpos contra él. Las prue­ bas serológicas para HIV han utilizado para detección sistemá­ tica porque el aislamiento del virus en cultivos celulares es difí­ cil y no está siempre disponible. Las pruebas moleculares para

D ia g n ó s tic o s e ro ló g ic o d e la s in fe c c io n e s v ira le s

detección de ácido nucleico viral se reservan para el control de los pacientes que ya tienen una infección demostrada serológicamente. El método serológico de referencia es una prueba de inmunotransferencia Western blot, en el cual el suero se hace reac­ cionar con proteínas virales separadas antes por electroforesis en gel de poliacrilamida y transferidas sobre papel de nitrocelulosa. Esta prueba requiere para su realización experiencia y cuidado considerables. Se han creado otros sistemas de ensayo de realización más sencilla. El que se ha evaluado más amplia­ mente es un enzimoinmunoanálisis. La prueba es sensible y específica para la mayoría de las cepas M que se encuentran en los Estados Unidos.285 En los pacientes con SIDA el valor pro­ nóstico de un resultado positivo es alto. En la población gene­ ral de dadores de sangre, entre los cuales la infección por HIV es muy infrecuente, incluso unos pocos falsos positivos dan como resultado un valor pronóstico inaceptablemente bajo. En la mayoría de los laboratorios una muestra que contenga anti­ cuerpos contra HIV por enzimoinmunoanálisis se confirma pri­ mero con el mismo enzimoinmunoanálisis; si es nuevamente positiva, la especificidad de la reacción se documenta por Western blot.106 No todos los Western blot producen resultados concluyentes. La prueba no se interpreta como positiva a menos que existan múltiples bandas de proteínas que puedan conside­ rarse realmente independientes.62 En el cuadro 23-25 se resu­ men los criterios sugeridos por varios grupos de expertos para la determinación de Western blot positivos. La falta de uniformidad entre los laboratorios para aplicar los criterios de interpretación de la prueba dificultó la comparación de los resultados. En una encuesta realizada en 1990, el 22% de los laboratorios utiliza­ ban varios conjuntos de criterios. Incluso en el 78% de los labo­ ratorios que seguían un solo criterio existían varios estándares.65 Por esta razón se han hecho considerables esfuerzos para pro­ mulgar estándares nacionales de interpretación.

Cuadro 23-25

1341

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Figura 23-17 Western blot para anticuerpos contra el HIV-l. El virus degra­ dado se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida, después de lo cual fue transferido (blotted) sobre papel de nitrocelulosa. Luego se hizo reaccionar el suero del paciente con las tiras de nitrocelulosa y se agregó gammaglobulina antihumana marcada con enzimas. El desarrollo de la reacción enzimática reveló múltiples bandas con este suero de un paciente infectado por el HIV-l. La electroforesis separó las diversas proteínas y glucoproteínas de acuerdo con su peso molecular. Las bandas están marcadas según la proteína viral que han detectado.

Criterios para Western blots positivos para anticuerpos contra el virus de la inmunodefi­ ciencia humana

ORGANIZACIÓN

CRITERIOS

Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors/CDC

Dos cualesquiera de: p24

Prueba DuPont aprobada por la FDA

p24 y p31 y gp41 o gp 120/gpl60

Cruz Roja Americana

> 3 bandas: 1 de cada grupo de productos genéticos: GAG y POL y ENV

Consortium for Retrovirus Serology Standardization

> 2 bandas: p24 o p31 más gp41 o gpl20/gpl60

Adaptado de la referencia62.

gp41 gpl20/gpl60

En la figura 23-17 se muestra un ejemplo de un Western blot positivo. Se observan Western blot indeterminados en el 10% al 20% de los sueros positivos por enzimoinmunoanálisis.83 El riesgo de desarrollar SIDA de las personas con un enzimoin­ munoanálisis repetidamente positivo y un Western blot indeter­ minado depende de los factores de riesgo individuales. Si no existen factores de riesgo de infección por el HIV, el paciente o dador no requiere seguimiento posterior. Hay un período determinado, poco después de la infección, en el cual puede encontrarse virus infeccioso en ausencia de anticuerpos detectables. Se han introducido varias innovaciones en la serología para el HIV. El Oral Fluid Vironostika HIV-l Microelisa System® (BioMérieux) usa secreciones bucales como medio de prueba, evitando así la punción venosa y las muestras de sangre. En este momento, este ensayo es la única prueba aprobada por la FDA para uso en muestras bucales. No es tan sensible como los análisis inmunológicos realizados en muestras de sangre y no puede emplearse para la detección sistemática en dadores de sangre. En segundo lugar, la FDA ha aprobado tres inmunoanálisis rápidos para uso clínico (http://www.cdc.gov/hiv/pbs/rtlab.

1342

C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

htm):377 1) el dispositivo para obtención de muestras Orasure HIV-l®, para pruebas en saliva y el Oraquick Rapid HIV-l An­ tibody Test® (OraSure Technologies, Bethlehem, PA) (una prue­ ba exenta de cumplir la ley Clinical Laboratory Improvement Amendments de 1988 [CLIA] para uso en sangre entera), 2) el Reveal Rapid HIV Antibody Test® (MedMira, Halifax, NS, Canadá) (una prueba de moderada complejidad según la CLIA, para suero o plasma) y 3) el Uni-Gold Recombigen® HIV Test (Trinity Biotech, Bray, Irlanda) (una prueba exenta de cumplir la CLIA para sangre total, suero o plasma). La prueba Oraquick está aprobada por la FDA para uso en sangre obtenida por pun­ ción digital así como por punción venosa; otros fabricantes están solicitando una aprobación similar de la FDA. Las pruebas rápidas deben interpretarse de la misma forma que los análisis convencionales. Los resultados negativos deben ser seguidos por la repetición de la prueba, si está clíni­ camente indicado. Los resultados positivos deben confirmarse con una prueba de fluorescencia o un Western blot. No pueden usarse inmunoanálisis convencionales para confirmación. Un ensayo convencional negativo tampoco demuestra que una prueba positiva rápida es incorrecta. No es sorprendente que individuos inescrupulosos hayan comercializado pruebas que no han sido aprobadas por la FDA o hayan presentado declaraciones falsas. En algunos casos, se han iniciado acciones legales (http://www.fda.gov/ora/about/ enf_s tory/archi ve/2001/ch6/default.htm).

P eríodo de incubación

Virus de la hepatitis B y virus de Epstein-Barr

Existen pocas excepciones a la regla general que dice que para establecer un diagnóstico debe demostrarse una serocon­ versión. En unas pocas infecciones virales aparecen anticuer­ pos dirigidos contra una variedad de antígenos, a diferentes tiempos después de la infección, que persisten por períodos variables. Es posible establecer un diagnóstico definitivo con una única muestra de suero cuando se detecta un anticuerpo que aparece sólo en la fase aguda. Los dos ejemplos principa­ les son la mononucleosis infecciosa causada por el EBV (fig. 23-18) y la hepatitis B (fig. 23-19). En ambos casos, ciertos anticuerpos, como el anticuerpo IgG contra el EBV, persisten durante largos períodos; debe detectarse una seroconversión con­ tra estos antígenos. Otros anticuerpos, como los dirigidos contra el antígeno temprano (EA) del EBV, aparecen en forma tran­ sitoria y pueden servir como marcadores de infección aguda.411 Si el agente infeccioso no es eliminado por la respuesta inmunitaria. la presencia de anticuerpos significa que el paciente puede ser aún portador del microorganismo. Por ejem­ plo, los pacientes que tienen anticuerpos contra CMV, que causa a menudo una infección latente, tienen mayores probabi­ lidades de transmitir el virus si se utiliza su sangre para trans­ fusiones o sus órganos para trasplante que los individuos sero­ negativos.231

Días depués del com ienzo

Figura 23-18 Evolución de las infecciones causadas por el virus de Epstein-Barr (EBV) y la respuesta serológica. Aunque el virus puede ser detectado en secre­ ciones bucales, las técnicas de cultivo son dificultosas y están disponibles sólo en laboratorios de investigación. La respuesta de anticuerpos heterófilos es el méto­ do clásico de demostrar mononucleosis infecciosa y sigue siendo la prueba de mayor utilidad. La aparición transitoria de los anticuerpos heterófilos, de IgM diri­ gida contra antígenos de la cápside viral y de anticuerpos contra antígeno temprano (EA) permite asociar la presencia de anticuerpos con la enfermedad actual. Los anticuerpos neutralizantes y los anticuerpos IgG contra el antígeno de la cápside viral (VCA) persisten meses o años. Estas pruebas son útiles para determinar que el paciente ha estado antes infectado y que, por lo tanto, es inmune; también pueden ser de utilidad para el diagnóstico si la primera muestra se toma en forma ade­ cuadamente precoz y puede demostrarse seroconversión. Si el paciente es visto cuando la enfermedad ya está avanzada, el diagnóstico puede hacerse por detección de una seroconversión contra el antígeno nuclear viral (EBNA). (Modificado con autorización de James C. Niederman. Yale University School of Medicine, New Haven, CT).

D ia g n ó s tic o s e ro ló g ic o de las in fe c c io n e s v ira le s

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!

10

20

S em anas

30

2

6

10

Años

Tiem po tra nscurrido desde la infección por HBV Figura 23-19 Antígenos y anticuerpos después de la infección autolimitada por virus de la hepatitis B. La aparición de antígenos y anticuerpos después de la infección autolimitada con virus de la hepatitis B es un ejemplo de cómo el conocimiento de la biología de la infección conduce a estrategias diagnósticas muy efi­ caces, aunque el virus en sí mismo sea muy difícil o imposible de cultivar. Deben buscarse tanto antígenos como anticuerpos para una detección eficaz de casos. El antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) es el que aparece en primer lugar; después de que se elimina de la sangre pueden detectarse anticuerpos contra este antígeno (anti-HBsAg). Sin embargo, puede existir un período durante el cual el antígeno se ha eliminado pero aún no hay anticuerpos detectables; esta even­ tualidad se cubre mediante la detección de anticuerpos contra el antígeno del core (anti-HBc). La presencia de HBs no es sinónimo de infección aguda autolimita­ da, porque algunas personas pueden ser portadoras. (Modificado con autorización de William S. Robinson, Stanford University Medical Center, Stanford, CA).

El conocimiento de la secuencia de acontecimientos es muy importante para el diagnóstico de la infección causada por el virus de la hepatitis B. La detección de antígeno viral, sobre todo el antígeno de superficie (HBsAg), tiene un importante papel en el diagnóstico de la infección aguda. El antígeno e del virus de la hepatitis B se detecta al mismo tiempo que la activi­ dad de DNA polimerasa, lo que constituye un marcador de virus infeccioso; la presencia de antígeno e se ha correlaciona­ do con la enfermedad aguda y contagiosa en muchos estu­ dios,368 como ya se explicó. Los anticuerpos contra el core viral (HBc) son importantes desde el punto de vista diagnóstico durante el período en el cual el antígeno de superficie ha sido eliminado de la circulación y todavía no son detectables los anticuerpos contra él. La presencia de antígeno del core se correlaciona con el DNA viral circulante.279Algunos pacientes desarrollan una infección crónica en la cual la antigenemia per­ siste en ausencia de anticuerpos séricos; este grupo tiene mayor riesgo de sufrir enfermedad hepática crónica. En la actualidad es evidente que muchos de estos pacientes tienen anticuerpos circulantes que no son detectados por los sistemas comerciales porque se encuentran unidos al antígeno.335 Además, se ha demostrado que algunos pacientes que tienen anticuerpos cir­ culantes sin antígeno de superficie detectable poseen DNA viral circulante, detectable por técnicas de amplificación durante períodos de hasta 5 años.347 En forma similar, el diagnóstico de mononucleosis infeccio­ sa puede hacerse con una única muestra de suero si se detectan

anticuerpos contra el antígeno temprano y anticuerpos IgM contra el antígeno de la cápside viral (VCA). Un título alto de anticuerpos IgG contra VCA, en ausencia de anticuerpos con­ tra EA y anticuerpos IgM anti-VCA, sugiere una infección pasada. Es importante conocer la evolución de la infección en el tiempo cuando se interpretan los resultados serológicos.411 La prueba más común para detectar infecciones causadas por el EBV es la prueba de anticuerpos heterófilos. Estos anti­ cuerpos son inmunoglobulinas que reaccionan con sustancias pertenecientes a otras especies. En el curso de una infección por EBV, se producen anticuerpos contra una variedad de antí­ genos extraños. Se producen aglutininas para eritrocitos de oveja y de caballo, hemolisinas para eritrocitos vacunos y anti­ cuerpos contra el antígeno 0X19 de Proteus, detectables por la reacción de Weil-Felix. Los anticuerpos heterófilos que son muy específicos para la mononucleosis infecciosa son absorbi­ dos por eritrocitos vacunos, pero no por riñón de cobayo. La prueba de Paul-Bunnell-Davidsohn diferencial se diseñó para caracterizar estos anticueipos heterófilos. Es altamente especí­ fica de EBV y es un diagnóstico de laboratorio confirmatorio de mononucleosis infecciosa.116 En la actualidad se cuenta con diversas pruebas simplificadas para detectar la respuesta heterófila de la mononucleosis infecciosa; la mayoría utiliza aglu­ tinación de eritrocitos equinos después de la absorción adecua­ da de los sueros.158-243 Los resultados que no concuerdan con los datos clínicos o hematológicos deben ser evaluados por rea­ lización de la prueba diferencial en tubo o por la detección de

1344

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Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

anticuerpos específicos para EBV. Las pruebas de aglutinación para anticuerpos heterófilos son pruebas “simples” que pueden ser realizadas por “cualquier persona” sin dificultades. En 1990 se detectó una seudoepidemia de mononucleosis infecciosa en Puerto Rico.66 Los resultados de los controles de calidad y de realización de las pruebas no revelaron ningún problema, pero una investigación cuidadosa indicó que dos técnicos con poca experiencia habían informado los resultados de las pruebas como positivos sobre la base de “reacciones débiles”, categoría que no existía para el método utilizado. El 90% de los adultos con mononucleosis infecciosa pre­ senta anticuerpos heterófilos. En ios niños pequeños, la fre­ cuencia de estos anticuerpos es mucho menor. Sólo 3 de 11 niños menores de 2 años desarrollaron anticuerpos heterófilos después de una primoinfección por EBV, en tanto que 16 de 21 niños entre 2 y 4 años desarrollaron dichos anticuerpos.241 La mononucleosis infecciosa con anticuerpos hetrófilos negativos y linfocitos atípicos circulantes suele ser causada por el EBV (demostrable por la presencia de anticuerpos específicos contra componentes virales) o por CMV.242 Horwitz y cois, encontraron que los sueros del 38,1% de los pacientes con mononucleosis con anticuerpos heterófilos positivos reaccio­ naban en forma cruzada en una prueba para IgM anti-CMV, pe­ ro el suero de los pacientes con infección aguda por CMV no reaccionaba en la prueba de IgM anti-VCA del EBV.242 Se detectaron anticuerpos de reacción cruzada contra componen­ te D o R del antígeno temprano en sueros de 9 de 36 pacien­ tes (25%) con mononucleosis causada por agentes diferentes del EBV (seis casos de infección por CMV, un caso de toxo­ plasmosis, un caso de probable hepatitis y un caso de etiolo­ gía desconocida). Virus de la hepatitis A

El virus de la hepatitis A es el único virus de hepatitis impor­ tante que se ha cultivado in vitro. El virus se desarrolla en una variedad de células de origen simiano, en especial en los pri­ meros pasajes de células de riñón de mono verde africano.28 Sin embargo, el cultivo no es una opción de diagnóstico viable por­ que el aislamiento en muestras primarias no es fiable. La hepati­ tis A se diagnostica serológicamente por detección de anticuer­ pos IgM específicos.407-457’472 Muy al principio de la infección, los anticuerpos IgM pueden no ser detectables, de modo que la prueba debe repetirse 2 semanas después si la sospecha clínica es alta.227 Virus de la hepatitis C

El diagnóstico de laboratorio de la infección por el virus de la hepatitis C requiere una combinación de pruebas serológicas y moleculares. La primera generación de enzimoinmunoanáli­ sis carecía de sensibilidad y especificidad, pero la segunda y la tercera generación presentan mejoras sustanciales con respecto a las primeras pruebas. Un panel de expertos ha recomendado un criterio para el diagnóstico similar al usado para el HIV. La evaluación inicial se hace con un enzimoinmunoanálisis sensi­ ble. Si esta prueba de detección sistemática es positiva, el resul­ tado se confirma mediante un método diferente.7 La FDA ha aprobado varios inmunoanálisis para uso diag­ nóstico: Abbott HCV EIA 2.0® (Abbott Laboratories), Ortho HCV versión 3.0 Elisa® (Ortho-Clinical Diagnostics. Raritan, NJ) y Vitros Anti-HCV Assay® (un ensayo de quimioluminis­ cencia intensificada; Ortho-Clinical Diagnostics). Los tres ensayos usan antígenos recombinantes del HCV.7

La única prueba confirmatoria aprobada por la FDA para uso diagnóstico es un ensayo de inmunoelectrotransferencia: el Chiron RIBA HCV 3.0 SIA® (Chiron, Emeryville, CA). Una vez establecido el diagnóstico serológico de infección por el virus de la hepatitis C, se necesitan herramientas mole­ culares para la caracterización completa de la infección. Parvovirus

La infecciones por parvovirus en los niños suelen ser transi­ torias y no requieren apoyo del laboratorio para su diagnóstico. La mayor preocupación son los pacientes inmunosuprimidos, los que padecen drepanocitosis y las mujeres embarazadas. Se han creado enzimoinmunoanálisis, pruebas de inmunolectrotransferencia y radioinmunoanálisis.47 La determinación de IgG es suficiente para determinar el nivel inmunitario de una mujer embarazada que ha estado expuesta al virus; la determi­ nación de IgM es necesaria para demostrar infección aguda. Si se teme o se sospecha hidropesía fetal, los enfoques serológico y virológico se complementan.536 Virus del herpes simple

El diagnóstico serológico de infección por el virus del her­ pes simple no ha sido de utilidad debido a la alta prevalencia de anticuerpos contra el herpes simple tipo 1 desde edades tem­ pranas y la incapacidad de los equipos comerciales de diferen­ ciar ambos serotipos. El antígeno de la glucoproteína G del virus del herpes sim­ ple induce la formación de anticuerpos específicos; en la actua­ lidad existen equipos comerciales de enzimoinmunoanálisis y de inmunoelectrotransferencia para detección de IgG. Estas pruebas proporcionan una forma conveniente de demostrar el nivel inmunitario de las mujeres embarazadas y (probando muestras de período agudo y convaleciente) infección reciente en pacientes inmunosuprimidos y mujeres embarazadas.16496 Aunque se han planteado dudas acerca del momento de la sero­ conversión, uno de los equipos comerciales, que usa la proteí­ na gG, dio resultados similares a un procedimiento de inmuno­ electrotransferencia de referencia.15 Cuando se prueban en infecciones genitales demostradas por cultivo, los ensayos serológicos específicos para tipo tienen buena especificidad y sensibilidad.360 También se dispone de pruebas para el virus tipo 1, aunque la urgencia diagnóstica es menor que para el virus tipo 2.496 Potencialmente, el uso principal de estas pruebas serológicas es definir el riesgo de una primoinfección herpética que se pre­ senta en una mujer embarazada cerca del término, cuando puede transmitirla al recién nacido. El mayor riesgo existe en una mujer que carece de anticuerpos (que no ha estado previamente infectada) y tiene una pareja seropositiva. En esta situación es indispensable evitar la primoinfección. Debe hacerse notar que la eliminación recurrente de virus no es infrecuente en mujeres seropositivas,499 aunque el riesgo para el recién nacido es menor en las infecciones recurrentes que en la primoinfección. Virus de la varicela-zóster

El papel de la serología en el diagnóstico de las infecciones por el VZV es la determinación del nivel inmunitario del paciente o del personal de atención médica. La prueba de aglu­ tinación del látex es comparable con la prueba de fluorescen­ cia,283-467 y es más sensible que los enzimoinmunoanálisis.467 Sin embargo, estos últimos han dado resultados satisfactorios.126

D ia g n ó s tic o s e ro ló g ic o d e las in fe c c io n e s v ira le s

1345

Citomegalovirus

Anticuerpos IgM

La serología es de importancia secundaria en el diagnóstico de infección y enfermedad por citomegalovirus.329 No obstante, tiene un papel importante en la evaluación de riesgo de receptores de trasplantes. La infección por citomega­ lovirus, que a menudo es asintomática, puede acompañarse por la presencia de DNA en sangre periférica durante muchos meses después de la primoinfección, aun cuando existe una vigorosa respuesta de anticuerpos.535 El recrudecimiento de es­ te virus latente puede acompañarse por una respuesta de IgM, de modo que este marcador tradicional de primoinfección queda eliminado en esta situación.130 Los problemas con la detección válida de anticuerpos IgM complican el cuadro. En un cuidadoso estudio de enfermedad intrauterina causada por CMV, sólo el 10% de las mujeres con anticuerpos IgM, deter­ minados por un enzimoinmunoanálisis, dieron a luz a un niño infectado congénitamente.304 Sin embargo, cuando la presencia de anticuerpos IgM se confirmó mediante una prueba de inmunoelectrotransferencia específica305 el riesgo fue similar al de una infección demostrada durante el primer trimestre. El mayor riesgo de desarrollo de una infección grave por CMV se presenta en un trasplante de órganos de un dador seropositivo a un receptor seronegativo.473 Siempre que sea posible debe evitarse esta combinación.

En general, los anticuerpos IgM aparecen antes que los IgG después de una infección aguda y son transitorios. Además, la IgM no atraviesa la placenta, de modo que la demostración de estos anticuerpos en un recién nacido indica una infección con­ génita o perinatal, y no la transferencia pasiva de anticuerpos de la madre. Por lo tanto, la demostración de anticuerpos IgM contra cualquier antígeno sugiere una infección reciente. La prueba debe utilizarse sólo en los laboratorios en los que los resultados han sido controlados con cuidado, ya que existen varios incon­ venientes teóricos y prácticos que pueden conducir a interpre­ taciones erróneas. Lo más importante es que muchas veces las decisiones clínicas críticas dependen de un resultado exacto. Es importantísimo que el procedimiento para la detección de la clase IgM sea demostrablemente específico. La presencia de anticuerpos IgM suele realizarse por demostración de la dis­ minución de los títulos de anticuerpos después de eliminar la IgM, por demostración de la actividad residual después de eli­ minar la IgG, por la utilización de antiglobulinas específicas antilgM o por una combinación de estos procedimientos. Si se utiliza un anticuerpo anti-IgM para determinar que una infección es aguda, debe demostrarse la especificidad de esta antiglobulina. Los resultados negativos falsos pueden deberse a la presencia de muy altos niveles de IgG, que pueden bloquear los sitios que podrían haber reaccionado con la IgM. Los resul­ tados positivos falsos pueden encontrarse cuando existen en el suero del paciente antiglobulinas como el factor reumatoideo. Si un suero reacciona con varios antígenos (p. ej., rubéola, CMV, virus del herpes simple y Toxoplasma gondii) debe sos­ pecharse la presencia de una antiglobulina. Por último, aunque los anticuerpos IgM en suero son en general transitorios, se han demostrado casos en los cuales han persistido durante meses e incluso años. Además, ahora se sabe que puede detectarse IgM cuando se reactivan ciertas infeccio­ nes latentes.130

Virus del Nilo Occidental

Como sucede con otros flavivirus, el virus del Nilo Occidental no crece con facilidad en los cultivos celulares que se usan en la mayoría de los laboratorios de virología. El diag­ nóstico de esta infección se hace por serología y, todavía en menor medida, por técnicas moleculares. La enfermedad clíni­ ca es principalmente una encefalitis, de manera que la muestra preferida es el LCR. Pueden detectarse en forma fiable anti­ cuerpos IgG e IgM en suero y LCR.402 La presencia de anticuer­ pos IgM específicos demuestra la infección. Al principio se supuso que el brote inicial era encefalitis de San Luis, ya que estos dos flavivirus comparten antígenos. Por lo tanto, las prue­ bas positivas para anticuerpos deben confirmarse con un segun­ do método. Hasta que no se adquiera más experiencia, se ha sugerido que la validación continua de las pruebas es un curso de acción prudente.325 Rubéola

La prueba tradicional para evaluar la inmunidad contra la rubéola es la inhibición de la hemaglutinación, pero ha sido reemplazada en la mayoría de los laboratorios por pruebas más convenientes, en particular enzimoinmunoanálisis.195 Estas pruebas funcionan bien para determinar el nivel inmunitario. Para el diagnóstico de infecciones congénitas, es necesaria la determinación de anticuerpos IgM con un método validado en forma rigurosa. Coronavirus del SRAG

Los anticuerpos contra el coronavirus del SRAG pueden detectarse en más del 90% de los pacientes con enfermedad clí­ nica evidente, mediante una técnica de inmunofluorescencia indirecta.85 Un muy pequeño porcentaje de pacientes sin enfer­ medad evidente también muestran seroconversión. En este momento, el diagnóstico serológico parece ser el método más sensible para diagnosticar la infección.

Procedimientos serológicos diversos

Existe una gran variedad de procedimientos que pueden uti­ lizarse para el diagnóstico serológico de las infecciones virales (cuadro 23-26). Los enzimoinmunoanálisis y las pruebas de inmunofluorescencia se utilizan cada vez con mayor frecuencia en los laboratorios clínicos; muchas de estas pruebas se comer­ cializan en forma de equipos. Diagnóstico de otras infecciones virales

El diagnóstico de algunas infecciones virales está más allá del alcance de la mayoría de los laboratorios de hospital, por­ que las infecciones son raras o exóticas, los agentes etiológicos son peligrosos o es necesario disponer de instalaciones espe­ ciales para el diagnóstico. Las pruebas para rabia, para infec­ ciones causadas por arbovirus y para fiebres hemorrágicas vira­ les se realizan casi siempre en laboratorios de referencia como los instalados en los departamentos sanitarios estatales o en los CDC de los Estados Unidos. Pruebas de sensibilidad a los antivirales

La resistencia a los antivirales es un hecho lamentable, aun­ que todavía no ha alcanzado proporciones epidémicas. La eva­ luación de pacientes en los cuales fracasa el tratamiento antivi­

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C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Cuadro 2 3-26 Diagnóstico serológico de las infecciones virales VIRUS

PRUEBAS REALIZADAS HABITUALMENTE

COMENTARIOS

Infecciones respiratorias Influenza A y B Parainfluenza Sincitial respiratorio Adenovirus Coronavirus

FC, IHA, EIA FC, IHA, EIA IF, EIA, IB FC, IHA, EIA NT, EIA, IF. IB

IHA usada para el antígeno específico de cepa

NT FC, IHA, IF, EIA EIA, IB NT, EIA

No se hace habitualmente

Infecciones del sistema nervioso central Enterovirus Paperas Herpes simple Rabia Hepatitis Hepatitis A Hepatitis B Hepatitis C Hepatitis D Hepatitis E Infecciones cutáneas Sarampión Varicela-zóster Infecciones genitales Herpes simple HIV

Otras infecciones Citomegalovirus Rubéola Epstein-Barr Parvovirus Herpes humano 6 y 7

Eritrocitos de M a c a c a m ula tta o de rata para la IHA Datos limitados para el virus SARS

Se requieren reactivos específicos de tipo Para nivel de inmunidad

EIA EIA, RIA EIA, IB

Véase el texto Prueba de detección sistemática seguida por una prueba confirmatoria Se hace raras veces

EIA, RIA EIA

IHA, EIA EIA, ACIF, FAMA, AL

Para determinación de nivel inmunitario

EIA, IB EIA, IB

Se requieren reactivos específicos de tipo Prueba de detección sistemática seguida de una prue­ ba confirmatoria

EIA, IFA, Aglutinación pasiva de partículas de látex IHA, EIA, AL, IB FC. IF, EIA RIA, EIA NT, IF, EIA, IB

Fundamentalmente para determinación de nivel inmunitario IHA es el método de referencia Véase la explicación

ACIF: inmunofluorescencia anticomplemento; FC: fijación del complemento; EIA: enzimoinmunoanálisis; IF: inmunofluorescencia; FAMA: prueba de anticuerpos fluorescentes contra antígenos de membrana: IHA: inhibición de la hemaglutinación; IB: inmunoblot o inmunocromatografía; AL: gllitinación de partículas del látex; NT: neutralización (la prueba de referencia para la mayoría de los virus, aunque no es necesaria con frecuencia); RIA; radioinmunoanálisis

ral contra el HIV es una parte habitual del tratamiento, como ya se explicó. La resistencia de otros agentes virales, en particular los pertenecientes al grupo de los virus herpéticos, es bien conocida, pero por fortuna, infrecuente. Las pruebas de sensi­ bilidad para aislamientos clínicos están disponibles en deter­ minados laboratorios de referencia.475

Infecciones causadas por especies de Chlamydia Las clamidias son patógenos bacterianos intracelulares es­ trictos. Tres especies de Chlamydia causan enfermedad huma­ na. Chlamydia psittaci provoca infecciones respiratorias agu­ das, por lo general transmitidas por aves infectadas 435 Las infecciones por Chlamydia trachomatis, que tiene 15 variantes serológicas (serovariedades) son mucho más frecuentes 432 Las serovariedades L l. L2 y L3 producen una enfermedad de trans­ misión sexual: el linfogranuloma venéreo. El tracoma, una con­

juntivitis crónica complicada a menudo con ceguera, se asocia con las serovariedades A, B l, B2 y C. El miembro más nuevo del género, Chlamydia pneumoniae, fue al principio denomi­ nado bacilo TWAR por las iniciales de los dos pacientes en los que se aisló la bacteria. Los estudios genéticos demostraron que las tres especies están íntimamente relacionadas.178 Todas las clamidias pueden aislarse en huevos embrionados y en cultivos celulares. No debe intentarse el aislamiento de C. psittaci en estos últimos, a menos que se cuente con instalacio­ nes estrictas de aislamiento para la protección del personal del laboratorio. Asimismo, deben tomarse precauciones para evitar las infecciones adquiridas en el laboratorio si se sospechan serovariedades que causan el linfogranuloma venéreo. Chlamydia trachomatis CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS Y EPIDEMIOLOGÍA

La conjuntivitis de inclusión (una infección que difiere del tracoma por la ausencia de cicatriz de la córnea), la neumonía

In fe cc io n e s c a u s a d a s p o r e s p e c ie s d e C hlam ydia

en los recién nacidos y las infecciones transmitidas sexualmente en los adultos, todas las cuales están causadas por las serova­ riedades D a K, son las enfermedades producidas por clamidias de mayor importancia para los laboratorios diagnósticos.266 Las infecciones transmitidas sexualmente son la uretritis, la cervicitis mucopurulenta y la salpingitis. Estas infecciones y las infec­ ciones del recién nacido están, de hecho, relacionadas en forma directa. Schachter y cois, realizaron el seguimiento de 131 recién nacidos de madres de cuyo cuello uterino se había culti­ vado C. trachomatis433 El 18% de los niños desarrollaron conjuvitis de inclusión confirmada por cultivos y el 16% presentó neumonía neonatal por clamidias. OBTENCIÓN DE MUESTRAS

Las muestras cervicales y oculares se obtienen en forma óptima por raspado de la mucosa. Los hisopos son fáciles de conseguir y son mínimamente traumáticos. Deben evitarse los hisopos de madera y los fabricados con alginato de calcio; algunos hisopos de algodón han sido tóxicos para Chlamydia', se prefiere el dacrón o el rayón.101 Las muestras uretrales y nasofaríngeas pueden obtenerse con un hisopo fino hecho sobre un alambre flexible. El hisopo debe insertarse hasta 3 a 5 cm dentro de la uretra. El semen y las secreciones uretrales purulentas no se consideran muestras adecuadas para cultivo.101 C. trachomatis puede detectarse en muestras de la primera orina de la mañana con técnicas de amplificación, como se explica más adelante. Las muestras cervicales se recogen del endocérvix después de una eliminación cuidadosa del moco. La tasa de aislamien­ to aumenta si los hisopos uretral y cervical se colocan en el mismo frasco de transporte. AISLAMIENTO DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS EH CULTIVOS CELULARES

Aunque las clamidias son bacterias, son patógenos intrace­ lulares estrictos. Los métodos para el aislamiento en cultivo son similares a los que se emplean en los laboratorios de virología. Sin embargo, es esencial que los cuerpos elementales infeccio­ sos de las clamidias se centrifuguen sobre la monocapa en un frasco ampolla (véase fig. 23-9). El aislamiento de las bacterias se optimiza si se alcanza una fuerza centrífuga de 3 000 g duran­ te 60 minutos.456 Para los cultivos se utilizan células que han sido irradiadas o tratadas con un inhibidor metabólico. Las células de McCoy tratadas con cicloheximida son la línea celu­ lar más utilizada;531 se agrega cicloheximida (1 pg/mL) a los medios de cultivo celulares que se utilizan después de la infec­ ción de la monocapa. El polibreno, un policatión utilizado para aumentar la infecciosidad de los retrovirus, también aumenta la cantidad de inclusiones de clamidias y la tasa de aislamientos en materiales clínicos.431 Sabet y cois, utilizaron con éxito célu­ las HeLa 229 que habían sido tratadas con DEAE-dextrano y cicloheximida para el aislamiento de C. trachomatis.426 Se ha informado que las células de mono verde Buffalo son superio­ res a las células de McCoy.290 Los cuerpos de inclusión de C. trachomatis contienen glu­ cógeno, que puede colorearse con yodo. Después de una incu­ bación durante 48 a 72 horas, los cubreobjetos se extraen y se tiñen con yodo o, para una sensibilidad algo mayor, con anti­ cuerpos monoclonales marcados con fluoresceína465 (véase lámina en color 23-2C). Se dispone de anticuerpos monoclona­ les específicos de especie dirigidos contra las proteínas de membrana externa y de anticuerpos específicos de género diri­

1347

gidos contra el lipopolisacárido. Las inclusiones de clamidias son estructuras citoplasmáticas bien definidas. Si el cultivo es negativo después de un único pasaje, se puede lograr una mayor de manera considerable. Se describieron micrométodos para el cultivo en los que se siembran microplacas de 96 cubetas con células de McCoy, ya sea antes o en el momento de la siembra con las muestras clí­ nicas.476531 Las cubetas se examinan con el microscopio des­ pués de la tinción con yodo o antisuero conjugado con fluores­ ceína. Las microplacas son mucho más económicas que los frascos ampolla individuales y diferentes investigadores han encontrado que presentan una sensibilidad equivalente.531 Sin embargo, otros investigadores consideran menos sensible el micrométodo que los cultivos convencionales.267 Gran parte de los argumentos acerca de si los subcultivos a ciegas aumentan el aislamiento de Chlamydia derivan probablemente de la variación de protocolos de los cultivos primarios.267 En general, hay poco rendimiento de los subcultivos a ciegas si se siembran envases con una gran superficie y se utilizan anticuerpos mono­ clonales para detectar las inclusiones. Los micrométodos dan mejores resultados que los subcultivos de rutina. DETECCIÓN DIRECTA DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS EN MUESTRAS CLÍNICAS Detección morfológica de inclusiones. Si hay gran cantidad de

cuerpos de inclusión de clamidias, el diagnóstico puede esta­ blecerse con facilidad por los métodos de coloración de frotis de Giemsa o de Giménez. Se prefiere la coloración de Giménez, que contiene fucsina fenicada, porque se colorean bien las inclusiones, pero casi siempre está más al alcance la coloración de Giemsa. Las inclusiones, que se ubican en el citoplasma de las células epiteliales, a menudo tienen una loca­ lización perinuclear y deben diferenciarse de los artefactos, como los núcleos fragmentados (véase lámina en color 23-2A). La frecuencia con la que se detectan inclusiones en los frotis es máxima en la conjuntivitis neonatal, más baja en la conjuntivi­ tis de inclusión del adulto y en el tracoma, y mínima en las ure­ tritis y cervicitis, en los que rara vez se las encuentra. En la práctica casi nunca se intenta la visualización directa. Detección de antígenos. Los procedimientos iniciales de diag­ nóstico de laboratorio diferentes del cultivo fueron la inmu­ nofluorescencia directa (véase lámina en color 23-2B) y, con posterioridad, los enzimoinmunoanálisis. Aunque aún se dis­ pone de productos comerciales para algunas de estas pruebas han sido sustituidos por los métodos moleculares. Los lecto­ res interesados pueden consultar la edición anterior de este libro. Detección de ácidos nucleicos. La primera prueba molecular co­ mercial aplicada a C. trachomatis fue una sonda de DNA diri­ gida contra rRNA (Pace 2 System Assays®, Gen-Probe, San Diego, CA). La sensibilidad de la prueba osciló entre el 80% y el 95%, según la población de pacientes estudiados, el origen de la muestra, la versión de la prueba evaluada y el método de referencia aplicado. La segunda generación de pruebas moleculares son las prue­ bas de amplificación de varios tipos. La mayoría de los estu­ dios comparativos han evaluado ya sea ensayos de hibridación (o ensayos de antígenos) o ensayos de amplificación en com­ paración con el cultivo. La evidencia acumulada sugiere que los ensayos de amplificación son el método más sensible, pero la conclusión se obtuvo por vía indirecta. Sin embargo, en un estudio que comparó los tres métodos nuevamente los ensayos de amplificación fueron más sensibles que sus competidores.528

1348

C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Las pruebas moleculares empleadas con mayor frecuencia en este momento son la reacción en cadena de la polimerasa (Amplicor CT/NG Test® y Cobas Amplicor Chlamydia tracho­ matis [CT]INeisseria gonorrhoeae [NG] Test®; Roche Diag­ nostics),313 la amplificación por desplazamiento de hebra (prue­ bas BD ProbeTec CT® y CT/GC®; BD Diagnostics),488 la amplificación mediada por transcripción (prueba Gen-Probe Aptima Combo 2®; Gen-Probe)179y el método de captura híbri­ da (prueba Hybrid Capture 2 CT/NG DNA®; Digene).113 Un producto, que usaba la reacción de ligasa en cadena, ha sido retirado del mercado. Los diversos métodos de amplificación parecen funcionar en forma similar. Todos son más sensibles que otros métodos, pero también son más costosos. El precio parece ser el princi­ pal factor que ha impedido que los laboratorios adopten un método que es claramente el más sensible de los enfoques diag­ nósticos.22 Además de su sensibilidad, los métodos de amplifi­ cación también son convenientes. Pueden aplicarse a muestras de orina, que es una alternativa más aceptable para los hombres y para las mujeres que no requieren un examen pelviano por otras razones. Los estudios de investigación han demostrado la aceptabilidad de los hisopos vaginales obtenidos por la misma paciente,446 por lo que éste puede ser un método de obtención aceptado en el futuro. En general, las muestras de endocérvix son apenas más sensibles que las de orina en las mujeres, pero esta última es más sensible que los hisopados uretrales en los varones asintomáticos.262 También existen diferencias entre las pruebas. Aunque este no es un problema para C. trachomatis, se han demostrado reacciones cruzadas entre N. gonorrhoeae y las especies comensales de Neisseria con pruebas que usan la reacción en cadena de la polimerasa y el desplazamiento de hebra,263 lo que llevó a un grupo de investigadores a recomendar que los resul­ tados positivos sean confirmados.489 Las reacciones cruzadas no se han demostrado con el método de amplificación mediada por transcripción. Cabe hacer notar que la mayoría de las autoridades en el tema consideran presuntivas todas las pruebas de detección sis­ temática positivas,263 y que requieren confirmación, a menos que la especificidad sea absoluta (criterio que sólo cumple el cultivo). El tema es más candente para N. gonorrhoeae que para C. trachomatis debido a la menor prevalencia de la pri­ mera. La mayoría de las pruebas para C. trachomatis se efec­ túan en ausencia de síntomas clínicos y, por lo tanto, son prue­ bas de detección sistemática. El director de cada laboratorio debe tomar la decisión. Si por consideraciones económicas la repetición confirmatoria de pruebas no puede generalizarse, la repetición está indicada cada vez que haya alguna duda clí­ nica acerca de la validez del resultado. La complejidad del tema ha sido revisada con cuidado por un panel de expertos.263 Por ejemplo, si la prueba se repite, ¿debe usarse un método diferente? ¿Una segunda muestra? Si los dos resultados difie­ ren, ¿cuál es el correcto? Un problema importante de las pruebas de amplificación es la presencia de inhibidores de la amplificación en las muestras clínicas. Algunos productos comerciales ofrecen un control de amplificación, pero no lo requieren de modo específico. Si una sustancia normalmente presente en la muestra (p. ej., (3-globina) no es amplificada, un resultado negativo debe considerarse sos­ pechoso. Lamentablemente, el costo de la prueba aumenta con este procedimiento. La amplificación mediada por transcripción no parece afectarse por los inhibidores.95 Al menos en un estu­ dio, los resultados obtenidos por el método de desplazamiento de hebra no se vieron afectados cuando se usó un control de

amplificación.488 El tema no es sólo académico, debido a que la sensibilidad de la prueba aumenta probando mayores volúme­ nes de orina, lo que no es sorprendente (aumentan los inhibido­ res si es que afectan los resultados de la prueba).352 Un enfoque frecuente de la citología endocervical es el uso de un medio líquido de recolección. Esta muestra también puede usarse para la detección de virus del papiloma y es también de utilidad para la amplificación de DNA de C. trachomatisP DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO

Los anticuerpos contra C. psittaci y las serovariedades de C. trachomatis pueden detectarse por pruebas de fijación del com­ plemento. Una prueba de microinmunofluorescencia para anti­ cuerpos contra C. trachomatis es más sensible para el diagnóstico de infecciones por linfogranuloma venéreo y puede también uti­ lizarse para demostrar infecciones por otras serovariedades.166 Esta prueba es menos común y deben probarse múltiples antíge­ nos. Es de máxima utilidad para estudios seroepidemiológicos de poblaciones con alto riesgo de infecciones por clamidias.263 OTROS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

La detección citológica de Chlamydia no suele considerarse fiable. Sin embargo, Kiviat y cois, han informado un patrón citológico inflamatorio que sugiere con firmeza la presencia de infección por clamidias.280 Cuando había presencia de linfoci­ tos “transparentes” y una cantidad aumentada de histiocitos, se aisló C. trachomatis en el 53% de los pacientes; en ausencia de esos hallazgos, C. trachomatis se aisló sólo en el 4% de los pacientes. Si se observan estas características en un frotis cer­ vical, debe considerarse la posibilidad de realizar pruebas espe­ cíficas para clamidias. Se dispone de pruebas para realizar a la cabecera del pacien­ te, con menos requerimientos. Son menos sensibles y más caras que las que se efectúan en el laboratorio.263 DIAGNÓSTICO DE ABUSO SEXUAL

Entre los aspectos menos atractivos de las infecciones por Chlamydia se encuentra la aparición del microorganismo en los niños que han sufrido abuso sexual.114 La prueba de elección para la investigación de sospecha de abuso sexual o para otros fines legales es el cultivo.263 Chlamydia psittaci

Chlamydia psittaci es el agente etiológico de la psitacosis u ornitosis. La fuente de la infección es una variedad de aves, en especial las especies de psitácidos, como los loros.214 En Carolina del Norte ocurrió un brote de psitacosis en una planta de procesamiento de pavos.63 En el huésped natural pueden afectarse múltiples sistemas orgánicos. En el ser humano, el blanco de la infección primaria es el pulmón.435 La neumonía resultante suele ser subaguda o crónica, aunque puede mani­ festarse una infección leve asintomática,357 o una infección aguda fulminante.51 C. psittaci también causa endocarditis con cultivos negativos.506 El diagnóstico de psitacosis suele llevarse a cabo por serolo­ gía. La prueba tradicional era la fijación del complemento, pero la de microinmunofluorescencia se ha transformado en la prue­ ba serológica de referencia para esta infección.166 Se detectaron anticuerpos fijadores de complemento para C. psittaci en 36 de 78 sueros (46%) enviados para serología para clamidias.524

In fe cc io n e s p o r R ickettsia, Coxieila, E hrlichia y A napiasm a

Otros 12 sueros (15%) fueron positivos por microinmunofluorescencia y 9 sueros más tenían anticuerpos contra C. pneumo­ niae por microinmunofluorescencia. El microorganismo puede aislarse en cultivos celulares utili­ zando los métodos ideados para C. trachomatis, pero este agen­ te tiene mayor potencial para causar infecciones de laboratorio, de modo que deben tomarse más precauciones con las mues­ tras. Se necesitan antisueros específicos de especie para la identificación definitiva de los aislamientos. Si la monocapa reacciona con anticuerpos contra el lipopolisacárido, pero no contra la proteína de la membrana externa de C. trachomatis, sugiere que hay otra especie de Chlamydia presente. Se ha informado la identificación presuntiva de C. psittaci directa­ mente en secreciones respiratorias utilizando antisueros para lipopolisacáridos de clamidias.378 Se ha utilizado la PCR para identificar el microorganismo directamente en muestras clíni­ cas120 y después del aislamiento en cultivo.150 Chlamydia pneumoniae

Chlamydia pneumoniae fue al principio aislada en pacientes con infecciones respiratorias y se denominó TWAR, por el nombre de los pacientes de los que provenía. Causa enferme­ dad respiratoria baja esporádica y epidémica caracterizada como una neumonía atípica.199 Se ha calculado que el 10% de las neumonías de todo el mundo son originadas por este micro­ organismo,277 pero la mayoría de las infecciones no requieren hospitalización. La infección asintomática ocurre en el 2% al 5% de los individuos. C. pneumoniae fue detectada por cultivo o por PCR en la nasofaringe de 2 de 104 (1,9%) adultos asintomáticos.253 La prevalencia de anticuerpos contra C. pneumo­ niae en esta población fue del 82%. La primoinfección tiene lugar en niños y adultos jóvenes, pero la inmunidad no es permanente y son frecuentes las rein­ fecciones en los adultos.277 El comienzo de la neumonía a menudo es insidioso, sin esputo purulento ni leucocitosis. La radiografía de tórax varía de normal hasta un compromiso amplio y no hay características diagnósticas. En la infección primaria, el patrón más común es el infiltrado alveolar unilate­ ral.343 Pueden ocurrir infecciones pulmonares crónicas y los pacientes pueden tener síntomas durante semanas o meses.211 Chlamydia pneumoniae es una causa de faringitis por sí sola y combinada con otros agentes252 y puede ser una causa de endocarditis con cultivos negativos.180 Múltiples estudios han demostrado una asociación entre C. pneumoniae y la aterosclerosis, con enfermedad coronaria o sin ella.270 El microorganis­ mo ha sido demostrado en repetidas ocasiones en las lesiones anatomopatológicas. Sin embargo, la causalidad de la asocia­ ción sigue siendo motivo de discusión y de más investigación.198 Chlamydia pneumoniae puede cultivarse en el laboratorio utilizando células HeLa 229 con dextrano, células HL,100 célu­ las HEp-2318 o células NCI-H292.318’523 Si se utilizan las célu­ las HL o células 292, puede no ser necesario tratar las monocapas o realizar un pasaje ciego.523 El medio mínimo esencial de Eagle o el glutamato-sacarosa fosfato, con el agregado de una fuente proteica, como el suero fetal bovino, como se utiliza para los virus y para C. trachomatis, son medios de transporte úti­ les.316 Las cepas de C. pneumoniae adaptadas al laboratorio son bastante estables, pero las cepas silvestres son más lábiles y no sobreviven bien más de algunas horas, aun a 4 °C. Las muestras deben ser congeladas, de preferencia a -70 °C, si no pueden procesarse el día de la recolección. Se dispone de antisueros monoclonales marcados con fluoresceína para la detección e identificación de aislamientos en cultivos.353 Los cultivos se

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incuban durante 72 horas. Se ha informado que la incubación en un medio sin suero aumenta la infecciosidad de las cepas adap­ tadas al laboratorio para las células HL de 10 a 50 veces y la can­ tidad de inclusiones producidas por una cepa silvestre.317 El diagnóstico de laboratorio de las infecciones causadas por C. pneumoniae se complica por la dificultad de su cultivo y por la inexistencia de un método de referencia fiable alternativo. La mayoría de las infecciones se diagnostican en forma serológica. La serología puede ser más complicada de lo que se cree en la actualidad. La variación antigénica entre aislamientos fue lo suficientemente grande en un estudio como para que los pacientes produjeran anticuerpos dosables sólo contra sus pro­ pios aislamientos.29 La prueba de referencia es la microinmu­ nofluorescencia. Se han creado enzimoinmunoanálisis, pero su rendimiento es variable.223 Se recomienda la demostración de seroconversion haciendo pruebas en suero de fase aguda y con­ valeciente129 y representa el método serológico más reproduci­ ble entre diferentes laboratorios.391 La reproducibilidad de las determinaciones de IgM entre laboratorios trabajando en cola­ boración fue muy variable.391 Se han desarrollado métodos de amplificación molecular para la detección de C. pneumoniae en muestras respiratorias debido a las dificultades inherentes a los enfoques de cultivo y serológicos. En este momento, la falta de estandarización limi­ ta la utilidad de estas pruebas potencialmente importantes.35 Es lamentable que menos del 25% de las pruebas de PCR cumplan los criterios de validación sugeridos por un panel de expertos.129

Infecciones por Rickettsia, Coxieila, Ehrlichia /Anapiasma El orden Rickettsiales incluye las familias Rickettsiaceae y Anaplasmataceae.135 El género más numeroso e importante es Rickettsia. Rickettsia tsutsugamushi ha sido reclasificada como Orientia tsutsugamushi. Estos microorganismos se encuentran dentro del subgrupo alfa-I de Proteobacteria. Coxieila, antes clasificada dentro del orden Rickettsiales, se encuentra ahora más relacionada con Legionella y Francisella, miembros del subgrupo gamma de Proteobacteria.340 El diagnóstico de labo­ ratorio de las infecciones causadas por rickettsias y la identifi­ cación de rickettsias en garrapatas han sido analizados por La Scola y Raoult.291 Un siglo después del reconocimiento de estos agentes infecciosos, David Walker describió los orígenes del campo de la rickettsiología y la vida de Howard Ricketts, que finalmente sucumbió al tifus en la ciudad de México.503 Rickettsia y Coxieila CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS Y EPIDEMIOLOGÍA

Las especies de Rickettsia infectan las células del endotelio vascular. Las manifestaciones clínicas de la infección son en consecuencia preoteiformes y pueden reflejar el daño de cual­ quier sistema orgánico. La piel, los pulmones y el cerebro son los comprometidos por los síntomas con mayor frecuencia. El género Rickettsia puede dividirse en los grupos del tifus, de la fiebre fluvial japonesa y de la fiebre manchada (cuadro 23-27). El agente de la fiebre Q, Coxieila burnetii, es también un pató­ geno intracelular estricto. El principal medio de transmisión de las infecciones por rickettsias es la picadura de un artrópodo infectado, con la excepción de C. burnetii, que también puede transmitirse a través de leche infectada o de aerosoles. El tifus epidémico ha sido uno de los grandes flagelos de la humanidad, que aparecía durante los períodos de hacinamiento

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C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

Cuadro 2 3-27 Infecciones causadas por R ickettsias ENFERMEDAD Grupo del tifus Tifus epidémico" Tifus murino” Tifus recurrente (enfermedad de Brill-Zinsser)" Grupo de las fiebres manchadas Fiebre manchada de las Montañas Rocosas” Fiebre manchada del Mediterráneo (fiebre botonosa) Tifus por garrapatas de Siberia Tifus por garrapatas de Queensland Tifus por garrapatas israelí Fiebre manchada japonesa (oriental) Fiebre manchada de la Isla Flinders Fiebre de Astracán Fiebre por picadura de garrapatas africana Pox rickettsial'1 “Tifus por pulgas de gato” Fiebre manchada innominada

ESPECIE

INSECTO VECTOR

R ickettsia p ro w a ze kii

Piojo del hombre Pulga

R. typ h i R. p ro w a ze kii

Especies de D e rm a c en to r Especies de H a em a p h ysa lis Especies de H a e m aphysalis, Especies de D e rm a c e n to r

R. rickettsii R. co n o rii R. sib irica R. a u stra lis

lx o d e s holocyclus. lx o d e s tasm anii

Rickettsia del tifus por garrapatas israelí

Especies de R h ip ice p h a lu s

R. ja p ó n ic a

H a e m a p h y sa lis long ico rn is; D e rm a c e n to r taiw a n en sis

R. ho n ei

A p o n o m m a h y drosauri

Rickettsia de la fiebre de Astracán R. a frica e

Especies de R hip icep h a lu s Especies de A m b ly o m m a

R. a k a ri

A llo d erm a n y ssu s sa n g u in eu s (ácaro)

R. fe lis “R. m o n g o lito m o n a e "

C ten o cep h a lid es fe lis (pulga de gato) Especies de H ya lo m m a

Grupo de la fiebre fluvial japonesa (scrub typhus) Fiebre fluvial japonesa

O rien tia tsu tsu g a m u sh i

L ep to tro m b id iu m (larvas de ácaros)

Grupo de la fiebre Q Fiebre Q“

C o xiella b u m e tii

Animales parturientes, productos lácteos sin pasteurizar

0 Se encuentra en los Estados Unidos. Adaptado de la referencia409.

e inanición. R. prowazeckii se ha demostrado en las ardillas voladoras en el este de los Estados Unidos525 y ha ocurrido una pequeña cantidad de infecciones humanas asociadas. También se ha registrado un caso de tifus epidémico en el sudoeste.336 Aunque el tifus epidémico (transmitido por piojos) no es un problema grave en los Estados Unidos, hace muy poco, en 1996-1997, esta enfermedad clásica mató a 6 000 personas en Burundi. En los Estados Unidos, el tifus endémico (trans­ mitido por pulgas o murino) ha recibido renovada atención. En la década de 1990 se identificó un foco de tifus murino en el sur de California y el sur de Texas. Fue transmitido por la pulga del gato y se perpetuó en gatos y zarigüeyas.461 Los agentes etiológicos eran R. typhi clásica461 y un nuevo agente, denominado inicialmente ELB.442-522 Es difícil la diferencia­ ción serológica entre ambas rickettsias, de manera que es necesario el análisis molecular.442 La rickettsia ELB se clasifi­ ca actualmente como R. felis.225 Por análsis molecular perte­ nece al grupo de las fiebres manchadas de las rickettsias, en lugar del grupo del tifus.38 En los Estados Unidos, la infección por rickettsias más importante es la fiebre manchada de las Montañas Rocosas, causada por R. rickettsii.500 Esta enfermedad febril multisistémica suele acompañarse por una erupción cutánea que comien­ za en las extremidades.501 La infección está diseminada por todo el país, siempre que existan las garrapatas vectores (véan­ se cap. 22 y apéndice I). Paradójicamente, la infección es más común en los estados del medio oeste y centrales del sur que en el oeste y en los estados montañosos.217 Infecciones similares, causadas por otras especies de rickettsias, se distribuyen en todo el mundo (cuadro 23-27)409

La fiebre fluvial japonesa no es endémica en los Estados Unidos. El agente causal se ha reclasificado como Orientia tsutsugamushi. La fiebre fluvial japonesa se acompaña a menu­ do por una escara primaria, que se ve sólo muy rara vez en la fiebre manchada de las Montañas Rocosas. Las escaras prima­ rias se observan también en el rickettsiosis pustulosa, causado por Rickettsia akari. La infección se demostró por primera vez en la ciudad de Nueva York y se asoció con la picadura de ácaros hematófagos. La rickettsiosis pustulosa es una enfermedad leve que no se encuentra a menudo, pero que existe en todo el mundo. Sigue estando presente en la ciudad de Nueva York.275 La fiebre Q suele causar infección asintomática, enfermedad febril indiferenciada, hepatitis granulomatosa o neumonía atípica.340-410 Puede ser transmitida por la leche, productos de la concepción o excretas de vacas, ovejas y cabras infectadas. El microorganismo se transmite fácilmente a los seres humanos sensibles y han ocurrido brotes epidémicos en laboratorios donde se utilizan ovejas para investigación.209 Una forma cró­ nica de infección puede dar por resultado una endocarditis bac­ teriana subaguda. La erupción cutánea es rara en la fiebre Q. OBTENCIÓN DE MUESTRAS

El cultivo de Rickettsia se realiza sólo en laboratorios de referencia. La sangre o los tejidos de biopsia provenientes de una lesión deben ser congelados a -70 °C. La inmunofluores­ cencia directa puede realizarse sobre una muestra de biopsia o autopsia congeladas o fijadas con formalina. Las infecciones por rickettsias se diagnostican casi siempre por serología, utili­ zando suero de la etapa aguda y de convalecencia.

In fe cc io n e s p o r R ickettsia, Coxiella, E hrlichia y A naplasm a

AISLAMIENTO DE RICKETTSIA Y COXIELLA EN CULTIVO

Rickettsia y Coxiella pueden aislarse en pequeños animales de laboratorio o en huevos embrionados.504 Coxiella burnetii ha sido aislada en cultivos en frascos ampolla de fibroblastos de pulmón de embrión humano en la sangre del 17% de los pa­ cientes no tratados con fiebre Q aguda y del 53% de los pacien­ tes no tratados con enfermedad crónica.369 Todas estas bacterias son altamente infecciosas cuando se forman aerosoles. Han sido responsables de muchas infecciones adquiridas en el labo­ ratorio, algunas de las cuales fueron mortales.379 El aislamien­ to de los agentes debe intentarse sólo en los laboratorios donde la contención adecuada de la infección es posible. Puede culti­ varse sangre entera o tejidos biopsiados. DETECCIÓN DIRECTA DE ANTIGENO Y ACIDOS NUCLEICOS EN MUESTRAS CLÍNICAS

Los antígenos de Rickettsia rickettsii, el agente etiológico de la fiebre manchada de las Montañas Rocosas, pueden detectar­ se directamente por tinción de cortes de lesiones de piel infec­ tada utilizando las técnicas de inmunofluorescencia directa o indirecta o enzimoinmunoanálisis.504 La sensibilidad del proce­ dimiento se aproxima al 70% y la especificidad es cercana al 100%. Habitualmente se toman biopsias de las lesiones pete­ quiales cutáneas. Es más probable que las rickettsias estén en los vasos sanguíneos en el centro de la lesión, de modo que es importante asegurarse de que estos vasos se incluyen en los cortes. Los antígenos también pueden demostrarse en muestras incluidas en parafina y fijadas en formalina si el corte se trata primero con tripsina para exponer los antígenos.505 Aunque la prueba de inmunofluorescencia es de valor para realizar un diagnóstico precoz de la fiebre manchada de las Montañas Rocosas, está disponible en muy pocos laboratorios. Los pacientes con enfermedad mortal por lo general mueren antes de desarrollar una respuesta serológica. La identificación de antígenos de rickettsias (y potencialmente de ácidos nuclei­ cos) en tejidos es el único método para hacer un diagnóstico etiológico específico en esta situación.381 Se describieron pruebas de amplificación molecular para demostrar la presencia de rickettsias en muestras clínicas, pero no son muy accesibles.145'291

única prueba positiva es diagnóstica.220 La sensibilidad ha osci­ lado entre el 70% y el 95%.220'273 Después de la infección por Coxiella burnetii, pueden producirse anticuerpos para las dos fases biológicas del microorganismo. Los anticuerpos para la fase II se producen primero. Los anticuerpos para la fase I, que aparecen semanas o meses más tarde, pueden alcanzar niveles altos en los pacientes con endocarditis por fiebre Q. Si los anti­ cuerpos contra ambas fases de Coxiella son altos en un pacien­ te con endocarditis con cultivos negativos, es probable el diag­ nóstico de fiebre Q .278'463 Históricamente, la prueba diagnóstica más común para la enfermedad causada por rickettsias ha sido la prueba de WeilFelix, en la que se detectan anticuerpos antirrickettsia que reac­ cionan en forma cruzada con cepas de especies de Proteus. La prueba se originó de la observación casual de que los sueros provenientes de pacientes con tifus aglutinaban cepas de Proteus vuigaris. A medida que se acumuló experiencia con pruebas serológicas inmunológicamente específicas se ha hecho evidente que la prueba de Weil-Felix no es sensible ni específica 221,273,504 g n aigunas poblaciones, un resultado de una prueba de Weil-Felix positivo ha sido más frecuente en quienes no te­ nían fiebre manchada de las Montañas Rocosas que en quienes estaban infectados.504 Todos estos hechos son fuertes argumen­ tos a favor de la relegación de esta prueba a los archivos. Especies de Ehrlichia y Anaplasma

La familia Anaplasmataceae incluye bacterias similares a las rickettsias, que pueden infectar a seres humanos y a diver­ sas especies animales y producir enfermedades como la pancitopenia canina tropical y la fiebre equina del Potomac (cuadro 23-28).421 Son parásitos intracelulares estrictos y, a semejanza de las rickettsias, crecen en el citosol de las células infectadas.

Cuadro 2 3-28

Algunas E h rlic h ia y microorganismos relacio­ nados con sus enfermedades asociadas"

MICROORGANISMO

ENFERMEDAD

HUÉSPED

E hrlich ia chciffeensis

Ehrliquiosis monocítica humana Ehrliquiosis monocítica canina “Ehrliquiosis ewingii” Ehrliquiosis granulocítica canina Ehrliquiosis monocítica canina Anaplasmosis granulocítica humana Anaplasmosis granulocítica equina Anaplasmosis granulocítica canina Fiebre sennetsu Fiebre equina del Potomac Enfermedad por enve­ nenamiento con salmón

Seres humanos

DIAGNOSTICO SEROLOGICO

La mayoría de los diagnósticos de infecciones por rickettsias se realizan por serología.132 En los últimos años, la prueba de microinmunofluorescencia se ha convertido en la prueba de re­ ferencia.397 Este procedimiento parece ser el método más sen­ sible y específico para el diagnóstico de infecciones por ric­ kettsias.273 El grado de reacciones cruzadas entre las especies de rickettsias varía de un paciente a otro.397 Las reacciones cru­ zadas tienen su máxima intensidad dentro de los subgrupos de rickettsias. Puede ser difícil distinguir entre tifus endémico y epidémico o entre la fiebre manchada de las Montañas Rocosas y la rickettsiosis pustulosa.504 Los anticuerpos aparecen a los 7 a 10 días después de la infección. Para el diagnóstico, es de­ seable una elevación de cuatro veces en los anticuerpos séricos, aunque un único título de más de 1:64 es muy sugestivo. La prueba de microinmunofluorescencia requiere personal bien entrenado y un microscopio de fluorescencia. Las pruebas de aglutinación del látex, que actualmente se comercializan para la fiebre manchada de las Montañas Rocosas, son de uso más general. Las pruebas del látex parecen provocar reacciones positivas sólo durante una infección aguda, de modo que una

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E h rlic h ia ew ingii

E hrlich ia canis A n a p la sm a p h a g o c yto p h ilu m

N eo ric k ettsia sennetsu N eo ric k ettsia risticii N eo ric k ettsia h elm in o th eca

" Cortesía de J. Stephen Damler.

Perros Seres humanos Perros Perros Seres humanos Caballos Perros Humanos Caballos Salmón

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C A P ÍT U L O 2 3

Diagnóstico de infecciones causadas por virus, Chlamydia, Rickettsia y microorganismos relacionados

La infección humana por Ehrlichia, un fenómeno recién reconocido, está causada por varias especies distintas, dos de las cuales son las más importantes: Ehrlichia chaffeensis, que infecta células monocíticas humanas8117 y una segunda especie que infecta células granulocíticas (Anaplasma phagocytophilum, en su origen designada Ehrlichia granulocítica humana).88 Ambas especies se transmiten al ser humano por garrapatas y causan una enfermedad febril con leucopenia, trombocitope'nia y elevación de los niveles de aminotransferasas séricas.134 Ehrliquiosis monocítica humana. La variedad monocítica de ehrliquiosis, causada por Ehrlichia chaffeensis, fue reconocida pri­ mero. Se distribuye ampliamente por el sudeste, medio oeste y lejano oeste de los Estados Unidos. En zonas donde las garra­ patas vectores son prevalentes, se observaron seroconversiones para Rickettsia rickettsii en el 2,5% y para E. chaffeensis en el 1,3% del personal militar.530 En el sur de Georgia, la ehrliquio­ sis monocítica humana fue de siete a ocho veces más prevalente que la fiebre manchada de las Montañas Rocosas.157 El con­ tacto con garrapatas es un factor de riesgo para contraer ehrli­ quiosis monocítica y fiebre manchada de las Montañas Rocosas.9 Ocurrió un brote de ehrliquiosis monocítica en una comunidad de jubilados dedicados al golf (comunidad A) que lindaba con un área de vida salvaje natural.466 No se manifesta­ ron casos en una comunidad vecina con campos de golf (comu­ nidad B) que no estaba rodeada por un área naturaí. La preva­ lencia de anticuerpos contra E. chaffeensis en la comunidad A fue del 12,5%, en tanto que en la comunidad B fue del 3,3%. En la comunidad A se encontraron miles de garrapatas A. americanum, pero se hallaron sólo tres en la comunidad B. Los factores de riesgo para contraer ehrliquiosis son picaduras de garrapatas, contacto con formas de vida silvestre, omisión del uso de repe­ lentes de insectos y jugar al golf. Entre los jugadores de golf, los que tenían mayor riesgo fueron los hookers y los slicers, que recogen constantemente la pelota de terrenos escabrosos. La moraleja es que si usted juega al golf en un área rural, debe uti­ lizar repelente de insectos y simplemente pegarle a la pelota. Los síntomas clínicos de la ehrliquiosis monocítica varían desde una enfermedad febril inespecífica hasta una infección sistémica grave con insuficiencia multiorgánica.134156 En un estudio que incluyó a 237 pacientes infectados, el 60,8% fue hospitalizado.156 La ehrliquiosis monocítica grave con insufi­ ciencia de múltiples sistemas orgánicos se ha confundido con la púrpura trombótica trombocitopénica334 y con el síndrome de shock tóxico.155 En los individuos infectados por el HIV la enfermedad es potencialmente mortal.380 Dentro del citoplasma de los monocitos infectados pueden verse masas de ehrlichias (mórulas; lámina en color 23-2G), pero estas estructuras diagnósticas se observan con poca fre­ cuencia en las infecciones causadas por E. chaffeensis.134,136 El diagnóstico es serológico, por cultivo del agente89 o por méto­ dos moleculares.10,151 Anapiasmosis granulocítica humana (antes ehrliquiosis granulocíti­ ca humana). El segundo microorganismo patógeno principal es

el agente de la anapiasmosis granulocítica humana (AGH), detectado por primera vez en Minnesota y Wisconsin por un infectólogo que reconoció la similitud de las inclusiones gra­ nulocíticas intracelulares con las descritas para la infección causada por E. chaffeensis.18,88 El agente de la anapiasmosis granulocítica humana aún se ha clasificado como Anaplasma phagocytopilunv, se lo considera estrechamente relacionado con el agente granulocítico humano, E. phagocytophila y con E. equi.135 Aunque se describieron variantes,337 las cepas de A. phagocytophilum muestran un alto grado de uniformidad gené­ tica en los Estados Unidos.133

El vector más importante en los Estados Unidos es Ixodes scapularis (véanse caps. 20 y 22 y apéndice I), el mismo vec­ tor que transmite la enfermedad de Lyme y la babesiosis.384 La duración del contacto requerida para la transmisión de A. pha­ gocytophilum parece ser un poco menor que la necesaria para la infección por Borrelia burgdorferi,m21t pero la dinámica exacta de la infección no se ha aclarado todavía. Los pacientes de la parte norte del centro de los Estados Unidos parecen haber estado infectados, según los estudios serológicos, por los tres agentes patógenos.348 No es sorprendente que la distribu­ ción de la anapiasmosis granulocítica humana se esté expan­ diendo para cubrir la distribución de la garrapata huésped. En la actualidad, se han informado infecciones en varias zonas centrales del norte y el este de los Estados Unidos. La AGH también se ha demostrado en California,160 así como en Europa y Asia. En algunas partes del país, deben incluirse todas las enfermedades causadas por Rickettsia y Ehrlichia en el diag­ nóstico diferencial de las enfermedades febriles.57 Se descri­ bieron infecciones dobles por ehrlichias y rickettsias.445 Por lo tanto, puede ser importante incluir antígenos de todos los pató­ genos posibles cuando se intenta el diagnóstico serológico; la demostración de la seroconversión cobra una importancia aún mayor.105 La enfermedad clínica parece ser similar a la producida por E. chaffeensis. La plaquetopenia es más frecuente que la leu­ copenia. La leucocitosis se acompaña por linfopenia absoluta y relativa.17También ocurren casos de neumonitis intersticial416 y de diplejía facial.306 Se ha informado la reinfección.240 El diagnóstico de laboratorio recién está en sus comienzos. Las inclusiones intracelulares (mórulas) en los granulocitos (lámina en color 23-2H) parecen ser más frecuentes que las inclusiones en la ehrliquiosis monocítica,18 pero puede haber un sesgo en las determinaciones cuando no se dispone fácil­ mente de apoyo del laboratorio de diagnóstico. Se ha publica­ do el cultivo del microorganismo in vitro,194 pero la confirma­ ción de la mayoría de los casos se realiza por técnicas seroló­ gicas que están disponibles en laboratorios de referencia.502 La técnica más común es la inmunofluorescencia indirecta. Los anticuerpos alcanzan su máximo alrededor de un mes después de la infección y son detectables todavía un año más tarde en cerca de la mitad de los pacientes.4 La mayoría de los pacien­ tes hacen una seroconversión y un pequeño porcentaje perma­ necen seropositivos durante años.19 Aunque algunos antígenos bacterianos tienen reacción cruzada con los agentes de la ehrliquiosis/anaplasmosis monocítica y granulocítica, las principa­ les proteínas de membrana externa no comparten determinan­ tes antigénicos.486 El análisis por Western blot puede ayudar a resolver los resultados serológicos confusos. Se describieron pruebas de amplificación molecular para A. phagocytophilum y existen reactivos comerciales.338 Las prue­ bas, que no están ampliamente disponibles, deben considerarse en fase de desarrollo. Otras infecciones causadas por Ehrlichia. Un tercer agente del género Ehrlichia se ha identificado como la causa de una enfer­ medad semejante a la ehrliquiosis en Missouri. El agente etio­ lógico, Ehrlichia ewingii, se conocía antes como causante de ehrliquiosis canina.49 Otras dos bacterias pueden infectar al hombre en ciertas oca­ siones: Ehrlichia canis, que también infecta a los perros,156,322 y Neorickettsia (antes Ehrlichia) sennetsu.421 A c tu a liz a c ió n d e l c a p ítu lo : La preocupación en ámbitos científicos y públicos acerca de la aparición de nuevas infec­ ciones virales y el resurgimiento de otras está en aumento. Los

R e fe re n c ia s

vims de la gripe aviar, que han demostrado su capacidad para infectar al hombre, son la principal intranquilidad (tipos de hemaglutinina H5, H7 y H9)(http://www.cdc.gov/flu/avian/geninfo/). Hasta la fecha, no ha habido una transmisión eficaz entre seres humanos, pero existe el temor generalizado de que una cepa capaz de hacerlo se encuentre “a la vuelta de la esqui­ na”. Además, los virus H2N2. que no estaban en circulación desde la década de 1960, han atraído la atención, porque no han sido incluidos en las vacunas y grandes segmentos de la pobla­ ción son sensibles. El uso de una cepa H2N2 (una cepa adap­ tada al laboratorio que parece haber sido no patógena) pone el tema en el frente de batalla. Los CDC recomiendan ahora que las cepas H2N2 y todas las cepas aviarias sean manejadas como agentes de bioseguridad de nivel 3, en lugar del nivel 2 asignado antes (http://www.cdc.gov/flu/han050305.htm). Una epidemia de virus Marburg (un filovirus) en Angola (http:// www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5412a5.htm) y una de virus de la coriomeningitis linfocítica (un arenavirus) en pacientes inmunosuprimidos, que se asoció con hámsteres mantenidos como mascotas (http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm54d526al .htm) subrayan la relevancia continua de los virus “exóticos”. Aunque el coronavirus del SARS ha disminuido como amenaza por el momento, parece que el metaneumovirus humano, que resultó no ser la causa del SARS, es una causa relativamente frecuente de infección res­ piratoria en niños y adultos, pero poco frecuente en individuos asintomáticos (Falsey y cois., J Clin Virol, mayo de 2005). En una nota positiva varios investigadores han demostrado la utili­ dad de la detección sistemática de la infección por el HIV (N Eng J Med, 10 de febrero de 2005). REFERENCIAS 1. Strategic Science Symposium: human papillomavirus testing-are you ready for a new era in cervical cáncer screening? Arch Pathol Lab Med 2003;127:927-996. 2. Abéis S, et al. Reliable detection of respiratory syncytial virus infection in children for adequate hospital infection control management. J Clin Microbiol 2001 ;39:31353139. 3. Ackerman SJ. HIV-1 link prompts circumspection on circumcision. J NIH Res 1991; 3:44-46. 4. Aguero-Rosenfeld ME, et al. Serology of culture-confirmed cases of human granuloytic ehrlichiosis. J Clin Microbiol 2000;38:635-638. 5. Albert MR, et al. Smallpox manifestations and survival during the Boston epidemic of 1901 to 1903. Ann Intern Med 2002;137:993-100. 6. Almeida JD. Uses and abuses of diagnostic electrón microscopy. Curr Top Microbiol Immunol 1983;104:147-158. 7. Alter MJ, et al. Guideline for laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep 2003;52(RR-03):1-15. 8. Anderson BE, et al. Ehrlichia chaffeensis, a new species associated with human ehr­ lichiosis. J Clin Microbiol 1991;29:2838-2842. 9. Anderson BE, et al. Amblyomma americanum: a potential vector of human ehrli­ chiosis. Am J Trop Med Hyg 1993;49:239-244. 10. Anderson BE, et al. Detection of the etiologic agent of human ehrlichiosis by poly­ merase chain reaction. J Clin Microbiol 1992;30:775-780. 11. Ando T, et al. Genetic classification of “Norwalk-like viruses.” J Infect Dis 2000; 181:Suppl:48. 12. Annunziato D, et al. Atypical measles syndrome: pathologic and serologic findings. Pediatrics 1982;70:203-209. 13. Arvin AM. Varicella-zoster virus. In: Fields BN, Knipe DM. Melnick JL, et al., eds. Virology. Ed. 2. New York: Raven Pres, 1990;2731-2767. 14. Arvin AM, et al. Immunologic evidence of reinfection with varicella-zoster virus. J Infect Dis 1983;148:200-205. 15. Ashley RL, et al. Ability of a rapid serology test to detect seroconversion to herpes simplex virus type 2 glycoprotein G soon after infection. J Clin Microbiol 1999;37: 1632-1633. 16. Ashley RL, Wald A. Genital herpes: review of the epidemic and potential use of typespecific serology. Clin Microbiol Rev 1999;12:1-8. 17. Bakken JS, et al. Serial measurements o f hematologic counts during the active phase of human granulocytic ehrlichiosis. Clin Infect Dis 2001;32:862-870. 18. Bakken JS, et al. Human granulocytic ehrlichiosis in the upper Midwest United States: a new species emerging? JAMA 1994;272:212-218.

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Ectoparásitos y otros invertebrados en el laboratorio clínico: una guía breve Con contribuciones de Fred Westenfeld y Fred Patterson

Envío de especímenes al laboratorio Arachnida: garrapatas, ácaros y arañas Ixodidae Biología de las garrapatas duras Relación con las enfermedades D istribución geográfica Identificación Resumen de identificación

Especies de Ornithodoros Relación con las enfermedades Identificación Distribución geográfica

Ácaros Sarcoptes scabiei (sarna) Relación con las enfermedades Identificación Distribución geográfica

Demodex folliculorum (folículos pilosos) y Demodex brevis (glándulas sebáceas) Relación con las enfermedades

Arañas Loxosceles reclusa Relación con las enfermedades Identificación Distribución geográfica

Latrodectus mactans Relación con las enfermedades Identificación Distribución geográfica

Tegenaria agrestis Relación con las enfermedades Identificación Distribución geográfica

Insecta: moscas, chinches, pulgas y piojos Larvas de moscas productoras de miasis Dermatobia hominis (larva de la mosca humana) Relación con las enfermedades Identificación Distribución geográfica

Cordylobia anthropophaga (mosca Tumbu)

Identificación

Relación con las enfermedades

Distribución geográfica

Identificación

1362

A P É N D IC E I Ectoparásitos y otros invertebrados en el laboratorio clínico: una guía breve

Distribución geográfica

Otras moscas Mosquitos Relación con las enfermedades Identificación Distribución geográfica

Chinches Cimex lectularius

Pulgas Relación con las enfermedades Identificación Distribución geográfica

Piojos Pediculus humanus Pediculus capitis Phthirus pubis

Vinchucas: especies de Panstrongylus, Rhodniusy Triatoma

os ectoparásitos son organismos que viven dentro o sobre la piel de un huésped, del que obtienen su ali­ mento. Por consiguiente, la relación es parasitaria o posiblemente simbiótica. La intimidad del contacto varía desde el tiempo requerido para alimentarse una vez con sangre hasta días, semanas o incluso meses de asociación. Los organismos que entran en contacto con un huésped en forma casual (p. ej, moscas comunes) o sin obtener beneficios (p. ej., escorpiones, abejas y arañas) no son, en sentido estricto, ectoparásitos.64 Los artrópodos son invertebrados con patas articuladas (de ahí proviene su nombre) y un dermatoesqueleto quitinoso. Han sido reconocidos desde hace mucho como causantes directos o indirectos de enfermedades humanas y pueden provocar daño al huésped humano por sí mismos. En forma alternativa, pue­ den actuar como vectores para la transmisión de agentes infec­ ciosos y la entrada del agente en el huésped humano. En algu­ nos casos, el artrópodo actúa sólo como portador y deposita el agente infeccioso en el ambiente inmediato, desde donde puede entrar en contacto con la posible víctima. Un ejemplo de ello es la transmisión de patógenos bacterianos de un sitio a otro sobre el cuerpo de moscas o cucarachas.245Una relación mucho más íntima tiene lugar cuando el artrópodo es el mediador directo de daño celular o cuando un insecto picador transmite un agente infeccioso a los tejidos de la víctima. La mayoría de los insectos picadores ingieren el agente infeccioso cuando se alimentan de sangre de un ser humano infectado o de otro mamífero infectado, denominado reservorio de infección. Cuando un insecto pica a un animal o a un ser humano, a menu­ do inyecta secreciones salivales que contienen enzimas y anti­ coagulantes diseñados para permitir la ingestión de sangre. Si el agente infeccioso ha pasado del intestino del insecto a la hemolinfa y después a las glándulas salivales, la infección se transmite en las secreciones salivales en el momento de la pica­ dura.43 Si está en el intestino, con presencia de material infec­ cioso en la saliva o no, puede excretarse con las heces cuando el artrópodo defeca después de la ingestión de sangre. La entra­ da del agente desde las heces en el sitio de la picadura se faci­ lita cuando el huésped se rasca el sitio irritado. La lista de artrópodos importantes desde el punto de vista médico continúa aumentando, así como la de enfermedades que pueden causar. Al mismo tiempo, los laboratorios clínicos están recibiendo cada vez más muestras para su identificación. Muchos artrópodos que son muy importantes en las enferme­ dades infecciosas humanas se ven rara vez o nunca en los labo­ ratorios de microbiología clínicos, porque no se encontraron

L

los insectos, se exterminaron o no fueron capturados para su examen. Se ven otros insectos importantes, como los escorpio­ nes, en distribuciones geográficas localizadas. Por otro lado, los microbiólogos clínicos pueden ser llamados para identificar insectos que causaron alarma por su presencia, aunque no hayan hecho daño. Esta sección está destinada a ayudar al lector a conocer la importancia médica y la identificación de laboratorio de algu­ nos artrópodos que pueden encontrarse en el laboratorio clíni­ co. En el cuadro A -1 se presenta un esquema de clasificación abreviado y en el recuadro A -1 se enumeran definiciones selec­ cionadas y la taxonomía relacionada de ectoparásitos de impor­ tancia para los seres humanos. El lector puede consultar varios excelentes libros de texto de referencia para obtener informa­ ción más detallada.17'20' 40'49'54’56

Envío de especímenes al laboratorio Debido a la diversidad de especímenes que pueden encon­ trarse en entomología médica, es difícil recomendar un solo método para su envío. En general, el etanol al 70% funcionará bien como conservante para la mayoría de ellos y al mismo tiempo impide el escape o la autoinfección. Debe agregarse a la muestra en un recipiente limpio, de modo que el artrópodo quede sumergido por completo. Los especímenes pueden oscu­ recerse después de un tiempo prolongado de preservación, lo que anula la utilidad de las diferencias de color para la identi­ ficación después de lapsos largos de fijación. No hemos obser­ vado ninguna degradación del color en muestras conservadas en etanol al 70% durante períodos de días, que es el tiempo habi­ tual que transcurre entre la obtención y el procesamiento. La formalina y la solución fisiológica estéril pueden ser satisfactorias, pero suelen tener desventajas respecto del etanol. Los insectos voladores deben matarse usando gases, como el cloroformo y después conservarse como preparado seco.18 García ha presentado una receta para el medio de Berelese, que esta autora señala como buena solución para usar con la mayo­ ría de las muestras.18 Para el examen de larvas de mosca, se ha sugerido matarlas con agua caliente.17Si existen dudas, se debe consultar con la institución que examinará la muestra para obtener recomendaciones específicas. El método preferido para la extracción de garrapatas es asir­ las con pinzas finas tan cerca del sitio de penetración como sea posible, sin pellizcar la piel. La presión externa continua, mien­

A ra c h n id a : g a rra p a ta s , á c a ro s y a ra ñ a s

1363

Cuadro A-1 Clasificación de los artrópodos de importancia médica ORDEN O SUBCLASE

CLASE Diplopoda Chilopoda Hexapoda (Insecta)

Hemiptera

Hexapoda Hexapoda Hexapoda Hexapoda Hexapoda Hexapoda

Siphonaptera Anoplura Dictyoptera Hymenoptera Coleóptera Díptera

(Insecta) (Insecta) (Insecta) (Insecta) (Insecta) (Insecta)

Hexapoda (Insecta) Pentastomida Arachnida Arachnida Arachnida

Lepidoptera Subclase: Scorpiones Subclase: Araneae Subclase: Acari

LESIÓN DIRECTA O INFECCIONES QUE TRANSMITEN

EJEMPLOS Milpiés Chinches Ciempiés Chinches reduvídeas Pulgas Piojos Cucarachas Hormigas, avispas, abejas Escarabajos Moscas, mosquitos, moscas enanas Polillas, mariposas, orugas Gusanos lengua Escorpiones Arañas Garrapatas, ácaros, niguas

tras se eleva la garrapata hacia arriba y adelante, casi siempre extrae la garrapata intacta.36 El capitulum de las garrapatas duras es un rasgo identificatorio importante. Las muestras dete­ rioradas debido a un desprendimiento inadecuado son más difí­ ciles de identificar. Los materiales y las técnicas requeridas para el examen de artrópodos son simples. Pueden obtenerse mediante aumento con una lupa o con un estereomicroscopio, que es lo óptimo. Los aumentos bajos a moderados también pueden lograrse con un objetivo de bajo aumento (p. ej. 2x o 4x) y un microscopio compuesto. Una buena fuente de luz es esencial para la obser­ vación. Las luces de fibra óptica proporcionan una iluminación excelente sin calentar ni secar en exceso la muestra. Las lám­ paras con brazos flexibles permiten un control máximo del ángulo de iluminación. La muestra puede manipularse mejor con un par de agujas de disección. En el caso excepcional que se considere cultivar el posible agente patógeno a partir del vector, el insecto no debe estar fija­ do. Si la muestra se ha fijado antes de enviarla al laboratorio, los métodos moleculares modernos permiten la identificación específica de agentes infecciosos por amplificación de ácidos nucleicos.

Arachnida: garrapatas, ácaros y arañas Las garrapatas son artrópodos del suborden Ixodida, que se divide en tres familias, dos de las cuales, Ixodidae (garrapatas duras) y Argasidae (garrapatas blandas), son vectores de enfer­ medades humanas.3651 En la familia Ixodidae la porción ante­ rior del cuerpo está esclerosada e incluye un escudo (“escudo dorsal”) y un capitulum orientado hacia delante (“cabeza”), de donde proviene el término, “garrapata dura”.51Los géneros que se envían con mayor frecuencia a los laboratorios de microbio­ logía son Ixodes, Dermacentor y Amblyomma. Los miembros de la familia Argasidae tienen una superficie externa coriácea, sin escudo y el aparato bucal se ubica ventralmente.51 Durante

Directa Directa Directa Directa Directa; tifus; fiebre de las trincheras; fiebre recurrente Problemas sanitarios; reacciones alérgicas Directa Directa Directa; arbovirus; infecciones parasitarias; Bartonella; Francisella Directa Directa Directa Directa Directo; Borre//a;arbovirus; Ehrlichia; Anaplasma, Rickettsia; Francisella

las últimas décadas se han reconocido cada vez más garrapatas duras como vectores importantes de una amplia variedad de enfermedades humanas, cuya diversidad es mayor que para cualquier otro grupo de artrópodos.51En los Estados Unidos las garrapatas duras son más prevalentes que las blandas y son vec­ tores más importantes de patógenos humanos. La identifica­ ción de una garrapata enviada al laboratorio debe incluir la des­ cripción de la especie, el estadio del ciclo vital, el sexo en el caso de los adultos, el grado de distensión del cuerpo (por ingurgitación de sangre) y el estado del aparato bucal. Ixodidae BIOLOGÍA DE LAS GARRAPATAS DURAS

Las garrapatas duras tienen un ciclo evolutivo que consta de cuatro estadios (instares): huevo, larva, ninfa y el adulto sexualmente dimórfico. Las larvas de garrapata tienen seis patas, lo que constituye un rasgo de identificación importante (lámina en color A-l A), en tanto que las ninfas y los adultos tienen ocho. Los estadios inmaduros carecen de poro genital, pero por lo demás parecen hembras adultas. Los dos tienen un escudo que cubre de un tercio a la mitad del dorso y permite la succión abundante de sangre y líquidos tisulares (lámina en color A-IB). La alimentación es necesaria para la fecundidad de las hembras y su peso corporal puede aumentar hasta 100 veces mientras se alimentan.36,51 Los machos tienen un escudo que cubre casi todo el dorso (lámina en color A-IB), así como pla­ cas ventrales esclerosadas que limitan la ingurgitación en la mayoría de las especies, si es que la garrapata macho se ali­ menta. Los vectores importantes de enfermedades humanas en los Estados Unidos son las garrapatas de tres huéspedes, lo que significa que cada instar se alimenta una vez en el huésped, después de lo cual la garrapata abandona al huésped para hacer su muda al siguiente instar en un microclima conveniente, como hojas en descomposición o un nido.51 El proceso conti­ núa hasta que tiene lugar el apareamiento de los adultos. Éste puede ocurrir en el huésped o fuera de él, según la especie.

1364

A P É N D IC E I Ectoparásitos y otros invertebrados en el laboratorio clínico: una guía breve

Recuadro A-1

Ectoparásitos: definiciones y taxo nom ía

Arthropoda: Los organismos de este filo tienen un exoesqueleto duro, articulado y pares de patas simétricas, articuladas. De las cinco clases de artrópodos, sólo Arachnida e Insecta actúan como vectores de enfermedades humanas. Cíase Arachnida (garrapatas, ácaros y arañas): clase de artrópodos caracterizados por la ausencia de alas, la presencia de cuatro pares de patas y la fusión de la cabeza y el tórax en un cefalotórax. Las garrapatas son más grandes que los ácaros, tienen un cuerpo coriáceo que carece de pelos o está cubierto de vellos cortos, un hipostoma expuesto y un par de espiráculos cerca del coxal del cuarto par de patas. Se dividen en argásidos o garrapatas blandas (las especies de Ornithodoros son de importancia humana), y los ixodídeos, o garrapatas duras, que incluyen los géneros Dermacentor, Amblyomma e lxodes, que son responsables de la transmisión de los agentes de varias enfermedades causadas por rickettsias, virus, bacterias y espiroquetas. Los ácaros son de menor tamaño que las garrapatas, carecen de cubierta coriácea y tienen un hipostoma que puede estar desarmado. Para los seres humanos son importantes los ácaros trombicúlidos. como las niguas, que causan ronchas dolorosas y los ácaros de la sarna, de la familia Sarcoptidae, que incluye S. scabiei, el agente de la sarna, y Demodex folliculorum, que infesta los folículos pilosos y las glándulas sebáceas. Las arañas son no segmentadas, tienen un abdomen velloso y cuatro pares de patas unidas al cefalotórax. También tienen un par de mandíbulas venenosas a través de las que fluye el veneno proveniente de un par de glándulas ubicadas en el cefalotórax. Las arañas parda, viuda negra y vagabunda son las que causan con mayor frecuencia picaduras dolorosas y tóxicas en los seres humanos. Clase Insecta (moscas, mosquitos, chinches, pulgas y piojos): clase de artrópodos que incluye organismos con cuerpo dividido en tres segmentos -cabeza, tórax y abdomen- y que tienen tres pares de patas. El orden Hemiptera incluye chinches aladas o sin alas y el orden Phthiraptera incluye a los piojos, que tienen un aparato bucal adaptado para perforar y chupar; el orden Díptera (dos alas) incluye moscas, jejenes y mosquitos, y el orden Siphonaptera incluye las pulgas, que carecen de alas y tienen un aparato bucal adaptado para chupar sangre. Las moscas son insectos con dos alas que actúan como vectores para la transmisión de diversos agentes de enfermedades humanas. Comprenden Simulium o mosca negra (oncocercosis). Chrysops o mosca del ciervo (Loa loa), y Glossina o mosca tsetsé (tripanosomiasis). Los mosquitos transmiten una variedad de enfermedades producidas por virus, protozoos y helmintos, las más notables de las cuales son el paludismo y la filariasis. Los seres humanos también pueden infestarse con las formas larvales de moscas, enfermedad conocida como miasis. Los flebótomos (Phlebotomus) transmiten la leishmaniasis. Las chinches picadoras y succionadoras de sangre de importancia en las enfermedades humanas son Cimex lectularius, la chinche común, y las chinches reduvídeas o vinchucas, de la familia Reduviidae, que transmiten el agente causal de la tripanosomiasis de América del Sur (enfermedad de Chagas). Las pulgas son insectos pequeños, de color castaño, sin alas, lateralmente comprimidos, que succionan sangre, cuya característica más notable es que actúan como vectores para la transmisión de los agentes de la peste bubónica y el tifus murino. También están involucradas en la transmisión de enfermedades parasitarias, como la tenia del perro. Dipylidium caninum, y la tenia de la rata. Hymenolepis diminuta. Los piojos son insectos aplanados dorsoventralmente, sin alas, que incluyen tres especies de importancia para los seres humanos: Pediculus liumanus var. capitis (piojo de la cabeza), Pediculus humanus var. corporis (piojo del cuerpo) y Phthirus pubis (piojo cangrejo). El orden incluye piojos masticadores y chupadores; sin embargo, sólo los últimos, la suborden Anoplura, son ectoparásitos para los seres humanos. Los piojos son vectores importantes del tifus epidémico y de la fiebre recurrente.

Después del apareamiento, las hembras buscan un ambiente conveniente, ponen cientos a miles de huevos según la espe­ cie36-51 y luego mueren. La duración de un ciclo vital, en pro­ medio 1 a 2 años, varía con la presencia o la ausencia de con­ diciones medioambientales convenientes y la disponibilidad de un huésped adecuado.51 En condiciones adversas, las garrapa­ tas pueden entrar en períodos largos de diapausa, una fase latente en la que secretan una saliva higroscópica que les per­ mite absorber la humedad, lo que aumenta la supervivencia hasta que mejoran las condiciones de búsqueda de huéspedes. La mayoría de las garrapatas duras viven en madrigueras o nidos, y su vida transcurre en un ambiente cerrado, alimentán­ dose sobre un huésped fácilmente disponible. El contacto de los seres humanos con estas especies es raro o inexistente.51 lxodes spinipalpus y las ratas de la madera perpetúan un ciclo enzoótico de infección por B. burgdorferi en Colorado.31 La ausencia de infección humana puede atribuirse a la falta de contacto entre 1. spinipalpus y los seres humanos. Sólo en algunos pocos casos la especificidad de huésped coloca las garrapatas infectadas en un ambiente propicio para el contacto con seres humanos, lo que las hace más competen­ tes como vectores de la enfermedad. El huésped preferido de I. scapularis en los estadios de vida tempranos es Peromyscus leucopus, el ratón de patas blancas, conocido como reservorio de Babesia microti, así como de Borrelia burgdorferi en esas localidades. Aunque el reservorio de Anaplasma (Ehrlichia)

phagocytophila no se conoce con certeza, I. scapularis es su vector demostrado. El huésped preferido de las garrapatas adultas es el ciervo de cola blanca (Odocoileus virginianus), un animal de amplia distribución que se está extendiendo para incluir zonas densamente pobladas. Debido a su capacidad de albergar y transmitir patógenos múltiples y a su predisposición a alimentarse en los seres humanos, la capacidad de actuar como vector que tiene I. scapularis es muy grande. En cambio, I. scapularis en el sudeste e I. pacificus en el noroeste de los Estados Unidos son menos idóneos como vectores de la borre­ liosis de Lyme. La selectividad de huésped parece ser la razón de ello. Los huéspedes preferidos en ambos casos son lagartos, en los que las espiroquetas se multiplican mal. Este fenómeno biológico podría ser responsable de que haya pocos casos informados en el oeste y la ausencia virtual de casos informa­ dos en el sudeste.31-55 Las garrapatas procuran su huésped al acecho, en una suerte de emboscada pasiva en la cual la garrapata trepa al césped y a las hierbas a la espera de aferrarse a un huésped de paso.51 Por otro lado, unas pocas especies buscan su presa en forma activa. Amblyomma americanum es la única especie del grupo de garrapatas que se trata aquí que utiliza esa forma de búsque­ da.36 Las especies que suelen buscar huéspedes humanos pare­ cen tener preferencias anatómicas para su unión.14 Derm a­ centor variabilis prefiere la cabeza y el cuello, en tanto que es más probable que Amblyomma americanum se prenda a las nal-

A rachnida: garrapatas, ácaros y arañas

gas, la ingle o las patas. Ixodes scapularis es ubicua y se pren­ de a todas las partes del cuerpo sin ninguna preferencia por un sitio particular. La distribución geográfica de las garrapatas parece estar en expansión. La explosión de la población del ciervo de cola blanca en las zonas de población humana densa puede ser una razón. Otra explicación podría ser que los estilos de vida actua­ les en los Estados Unidos promueven las actividades al aire libre y ponen a las personas en el camino de las garrapatas, que siempre han estado allí. Dentro del ciclo vital, una garrapata puede adquirir un agen­ te patógeno de una de dos maneras: 1) entre estadios (horizon­ tal; es decir, de la larva a la ninfa, de la ninfa al adulto) o 2) transovárica (vertical; de la madre al huevo).51 Las larvas de Ixodes scapularis son incapaces de transm itir la enfermedad de Lyme porque B. burgdorferi no se transmite verticalmente, sino que se adquiere de un huésped reservorio.36'51-54 El huésped preferido para las larvas y las ninfas de I. scapularis es el ratón de patas blancas (Peromyscus leucosis), uno de los reservorios principales de Borrelia burgdorferi, Babesia microti y A. p h a ­ gocytophilum en las zonas endémicas. Se ha demostrado un ciclo paralelo para A. phagocytophilum en los conejos del desierto e Ixodes dentatus ,21 aunque esta especie se alimenta en seres humanos con mucha menor frecuencia que I. scapularis. Las garrapatas adquieren B. burgdorferi o A. phagocytophilum mientras se alimentan. En cambio, Rickettsia rickettsii, el agen­ te de la fiebre manchada de las Montañas Rocosas, se transmi­ te verticalmente de las hembras de Dermacentor variabilis infectadas a su progenie,36-51 lo que hace que las larvas sean vectores potenciales. El grado de ingurgitación representa una estimación aproxi­ mada del tiempo de alimentación. B. burgdorferi vive en el intestino medio de I. scapularis infectadas. Cuando la garrapa­ ta se alimenta, las espiroquetas se multiplican y empiezan a migrar a la hemolinfa. La espiroqueta necesita de 2 a 3 días para alcanzar las glándulas salivales de la garrapata13-41-52 donde, en el proceso de eliminar el exceso de agua para hacer lugar a la sangre ingerida, la garrapata “escupe" sobre el sitio donde picó, inoculando así las espiroquetas.50 En estudios experimentales, se dejó que ninfas y hembras de I. scapularis picaran roedores durante períodos definidos. En vista de que la longitud del cuerpo aumenta mientras el tamaño del escudo rígido permanece constante, se desarrollaron ecuaciones de regresión basadas en la relación de la longitud corporal con el ancho del escudo, denominadas “índice del escudo”. El índice del escudo se considera un medio más exacto para calcular el tiempo de alimentación que los cálculos visuales subjetivos.13,52 En el caso de la borreliosis de Lyme, la identificación de un ejemplar no ingurgitado de /. scapularis con el aparato bucal intacto sugeriría un contacto breve con el huésped y haría dudosa la transmisión, aun cuando el paciente haya viajado a una zona endémica. Anaplasma (Ehrlichia) phagocytophilum parece ser transmitido algo más rápidamente que B. burgdorfe­ ri. por lo que el grado de congestión y el índice del escudo pue­ den ser menos útiles para evaluar la probabilidad de que el agente patógeno haya sido inoculado al paciente.10-26 Se necesi­ tan más estudios para dilucidar este problema. Las ninfas se consideran el instar más probable para trans­ m itir la enfermedad, porque su tamaño pequeño les permite a menudo completar su alimentación sin ser detectadas (lámina en color A -IB). Un alto porcentaje de las enfermedades rela­ cionadas con garrapatas se presenta a fines de la primavera y en los meses de verano, debido al aumento de actividad de las ninfas.

1365

RELACIÓN CON LAS ENFERMEDADES

Los antecedentes de Ixodidae en medicina veterinaria y, más recientemente, en las enfermedades humanas, son abundantes. Ixodidae (las garrapatas duras) son los vectores de una amplia variedad de agentes patógenos asociados con enfermeades humanas,51 que incluyen espiroquetas, rickettsias, bacilos gramnegativos, virus, protozoos y neurotoxinas. Las especies descritas aquí se asocian con uno solo o con una combinación de estos agentes (cuadro A-2). Las infecciones transmitidas por garrapatas pueden presentar­ se con síntomas tempranos, similares y vagos, de fiebre, fatiga y otros síntomas gripales que dificultan el diagnóstico exacto rápido,11’32-36-54 teniendo en cuenta que el tratamiento antibióti­ co difiere de acuerdo con el agente involucrado. En la mayoría de los casos, las enfermedades transmitidas por garrapatas son leves y se resuelven con un diagnóstico exacto temprano, seguido del tratamiento correcto. Los diagnósticos erróneos pueden conducir a un aumento de la morbilidad, a la infección crónica y, en raros casos, a la muerte. Las infecciones simultáneas después de las picaduras de ga­ rrapata parecen probables.32-39Aunque no son prueba de coinfec­ ción, en lugar de infección secuencial, los estudios serológicos han demostrado que, en las zonas endémicas superpuestas, los pacientes con enfermedad de Lyme clínica tienen además anti­ cuerpos contra Babesia o Ehrlichia ,32 En un tiempo, Babesia fue considerada el agente de la enfermedad de Lyme porque los pacientes con diagnóstico de babesiosis presentaban eritema migrans, una característica de la infección por B. burgdorferi. Ciertas especies son vectores de patógenos específicos. Por ejemplo, para la borreliosis de Lyme esto está bien demostrado en todo el mundo. Ixodes scapularis está definido como el vec­ tor de Borrelia burgdorferi, la espiroqueta de la enfermedad de Lyme, en las zonas del noreste y superiores del oeste medio de los Estados Unidos. En otras partes, los vectores son /. ricinus (Europa), I. persulcatus (Asia) e I. pacificus (noroeste esta­ dounidense). En la actualidad, otras especies de Ixodes no se consideran vectores competentes. En el este de los Estados Unidos, la identificación de una especie de Ixodes diferente de I. scapularis descartaría por completo la enfermedad de Lyme, aunque si la presentación clínica fuera clásica (con eritema migrans)35-50-54 sería necesario considerar la existencia de una segunda garrapata desconocida. Hace poco, en el sur de los Estados Unidos, una borreliosis similar a la enfermedad de Lyme, causada por Borrelia lonestari, similar a B. theileri (el agente de la borreliosis bovina), se ha atribuido a la exposición a Amblyomma americanum (garrapata Lonestar).24 La parálisis por garrapatas es una curiosa enfermedad de patogenia desconocida.12-15,46 La parálisis flácida aguda puede simular un botulismo y síndrome de Guillain-Barré; la extrac­ ción de la garrapata causa una regresión rápida y notable de la parálisis. No queda ninguna secuela. Aunque más de 60 espe­ cies de garrapatas pueden provocar parálisis en los animales, sólo Dermacentor andersoni, Dermacentor variabilis e Ixodes holocyclus (la garrapata de marsupiales australianos) pican a los seres humanos. En América del Norte la enfermedad se ve con mayor frecuencia en los estados del sudeste y noroeste de los Estados Unidos y en la Columbia Británica. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

La distribución geográfica de las garrapatas duras se resume en el cuadro A-2. Ixodes scapularis. Antes llamada Ixodes dammini en el noreste e Ixodes scapularis en otras partes, las dos son consideradas ahora por la mayoría de las autoridades variedades del norte y

1366

A P É N D IC E I Ectoparásitos y otros invertebrados en el laboratorio clínico: una guía breve

Cuadro A-2

Garrapatas duras y enfermedades asociadas con la distribución geográfica

ESPECIES DE GARRAPATAS

ENFERMEDAD

DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

lxodes scapularis

Enfermedad de Lyme Anaplasmosis granulocítica humana Babesiosis

Este y medioeste superior de los EE.UU.

lxodes pacificus Dermacentor variabilis

Enfermedad de Lyme Fiebre manchada de las Montañas Rocosas Tularemia Parálisis por garrapatas

Noroeste de los EE.UU. Dos tercios orientales de los EE.UU., costa oeste de los EE.UU.

Dermacentor andersoni

Fiebre manchada de las Montañas Rocosas, fiebre por garrapatas de Colorado Parálisis por garrapatas

Estados de las Montañas Rocosas

Amblyomma americanum

Ehrliquiosis monocítica humana

Centro-sur de los EE.UU., sudeste de los EE.UU, estados mesoatlánticos; alcanza hacia el norte hasta el sur del estado de Nueva York

lxodes cookei

Tularemia Vims de Powassan

Noreste de los EE.UU. y sudeste de Canadá

lxodes marxi

Virus de Powassan

Noreste de los EE.UU. y sudeste de Canadá

del sur de la misma especie, debido a la capacidad de aparear­ se con éxito entre sí.34-54 El nombre lxodes scapularis tiene la prioridad. I. scapularis ocupa una amplia zona al este de las Montañas Rocosas, aunque las poblaciones infecciosas parecen estar centralizadas en el centro-noroeste y en el noreste, desde Maryland al sur de Nueva Inglaterra. lxodes cookei. La distribución de lxodes cookei (la garrapata de la marmota) se superpone con la de I. scapularis; se encuentra principalmente en el noreste de los Estados Unidos y en el sudeste de Canadá. lxodes marxi. lxodes marxi (la garrapata de la ardilla) también tiene una distribución que se superpone a I. scapularis en el noreste de los Estados Unidos y en el sudeste de Canadá.

C

Especies de Dermacentor. Dermacentor variabilis (la garrapata del perro) se distribuye extensamente en todos los Estados Unidos al este de las Montañas Rocosas. Su amplia distribu­ ción y sus hábitos de búsqueda de huéspedes aumentan la inci­ dencia de contacto con los seres humanos en comparación con otras especies de Dermacentor. Dermacentor andersoni se encuentra en los estados de las Montañas Rocosas y es la garrapata que describió Ricketts como el vector de la fiebre manchada de las Montañas Rocosas en el Bitter Root Valley de Idaho.60 Amblyomma americanum. Amblyomma americanum (la garra­ pata Lonestar) está extensamente distribuida en el sur (al este de la M ontañas Rocosas) y en el este, hasta el sur del Estado de Nueva York. Hay indicios de que puede estar extendiéndo­ se a Nueva Inglaterra. A. americanum tiene la peculiaridad, entre las especies de garrapatas descritas aquí, de ser la única que busca activamente un huésped.36'51 IDENTIFICACIÓN

Los integrantes de la familia Acari (garrapatas y ácaros) se diferencian de otros arácnidos por la ausencia de segmentación evidente. El prosoma anterior (apéndices) está fusionado con el opistosoma (abdomen). El gnatosoma (capitulum) donde se encuentran las piezas bucales, es peculiar de esa familia.51 Las figuras A-1 y A-2 representan la vista dorsal y ventral, respecti­ vamente, de una garrapata dura. Los dibujos fueron hechos para señalar la mayoría de los rasgos importantes. A continua­ ción se presenta un glosario de las características de identifi­ cación representadas en estas figuras; todas ellas son útiles para la identificación de las garrapatas; el tamaño, la ubicación, el color y la presencia o la ausencia de cada característica pueden ser importantes.

F ig u ra A-1 Esquema genérico del dorso de una garrapata dura.

A. Capitulum: porción anterior del cuerpo, que comprende la base del capitulum, el hipostoma, los quelíceros y los palpos. B. Base del capitulum: base del capitulum a la que se asocian las piezas bucales. (La longitud del capitulum en relación con su base es útil para la identificación).

Arachnida: garrapatas, ácaros y arañas

1367

F ig u ra A -3 Superficie ventral de un macho adulto de Ixodes scapularis, que muestra el ano (A), el surco anal en forma de U (£/), el poro genital (G), las placas ventrales (V) y las placas de los espiráculos (S).

F ig u ra A -2 Esquema genérico de la superficie ventral de una garrapata dura.

C. Hipostoma: estructura media de las piezas bucales, parale­ las y entre los palpos. El hipostoma tiene estructuras simi­ lares a dientes, llamadas dentículos. Estos se encuentran en el hipostoma en una disposición específica, llamada “fór­ mula de dentición” (la proporción de dentículos izquierdos con relación a los dentículos derechos). Ixodes scapularis, por ejemplo, tiene una fórmula de dentición 3/3, que cam­ bia a 2/2 a medida que evoluciona. D. Palpos: par de apéndices móviles, paralelos al hipostoma. E. Escudo: placa dorsal esclerosada posterior al capitulum. F. Coxales: segmentos basales de las patas. Los coxales se numeran del I al IV; el coxal I es el más cercano al capitu­ lum. G. Espolones coxales: proyección que se encuentra en el borde posterior del coxal. Los espolones del lado medial se lla­ man internos y los del lado lateral, externos. Hay pocas variaciones, o ninguna, en el tamaño de los espolones y su configuración entre ejemplares de la misma especie. H. Poro genital: orificio externo de los órganos genitales, ubi­ cado ventralmente en el eje medio, entre los coxales. I. Surco anal: ranura semicircular que rodea el ano de algunas especies. En las especies de Ixodes, la curva es anterior al ano. En otros géneros la curva es posterior o falta. J. Placas de los espiráculos: orificios externos del sistema res­ piratorio, ubicados ventralmente, por detrás del coxal IV en los bordes laterales (son útiles para diferenciar el macho de I. scapularis de los machos de I. cookei y de I. marxi). K. Festones: zonas rectangulares separadas por ranuras bien definidas, ubicadas en el borde posterior de algunas garra­ patas duras. Las especies de Ixodes no tienen festones. L. Placas ventrales: grupo de placas de forma y tamaño defi­ nidos en la superficie ventral de los machos adultos. Nos referiremos específicamente a la placa anal cuando se des­ criban las especies de Ixodes. M. Ornamentación: algunas garrapatas se llaman garrapatas ornadas por la presencia de marcas coloreadas distintivas de ciertas especies. D. variabilis y A. americanum son garrapatas ornadas.

N. Ojos: marcas ovoides ornadas en los bordes laterales del escudo de algunas garrapatas. O. Zonas porosas: zonas que parecen “ojos” , que se encuen­ tran en la base dorsal del capitulum de las garrapatas adultas. Ixodes scapularis. Una característica importante de todas las especies de Ixodes es una ranura en forma de U que mira hacia adelante, rodea el ano y termina en el borde posterior de la superficie ventral (fig. A-3 y lámina en color A-1C). Otros géneros de garrapatas duras carecen de esta característica.51 Las ninfas y las hembras adultas de I. scapularis tienen un escudo ovalado (lámina en color A -IB ) de un tamaño aproxi­ mado a la mitad del dorso en los ejemplares no ingurgitados. El escudo de los machos adultos cubre casi todo el dorso (lámina en color A- IB), característica de todas las garrapatas duras que no se mencionará en las descripciones posteriores. La presencia de pelos gruesos sobre el escudo es una de las características que distinguen a los machos de I. scapularis de los ejemplares de I. cookei y de I. marxi, en los que son delgados o faltan. Visto desde abajo (lámina en color A -IC ) el aparato bucal tiene el doble de longitud que la base del capitulum. El hipostoma de ninfas y hembras adultas tiene una fórmula de dentición 3/3, que progresa a 2/2 de adelante hacia atrás. Los machos adultos tienen un hipostoma más “práctico” que la mayoría de las otras especies de Ixodes, con dentículos laterales que se hacen romos a crenados a medida que se acercan a la línea media. El color puede ayudar a diferenciar I. scapularis de otras especies de Ixodes. La porción anterior esclerosada de ninfas y hembras adultas (que incluye el capitulum, las patas y el escu­ do) es de color castaño oscuro, en marcado contraste con el abdomen, que se ve de color castaño rojizo a gris bronceado en los ejemplares no ingurgitados (lámina en color A -IB), de donde surge el nombre de garrapata de patas negras. Los machos adultos tienen un color castaño oscuro uniforme (lámi­ na en color A-IB). Hay espolones coxales (lámina en color A1D y fig. A-4), y el coxal I tiene un espolón interno que se superpone al coxal II. Los coxales I a IV tienen espolones exter­ nos romos. El espolón interno del coxal I parece menos agudo en las ninfas. Las placas de los espiráculos de ninfas y hembras son redondas (lámina en color A-1C); en los machos son elon-

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A P É N D IC E I Ectoparásitos y otros invertebrados en el laboratorio clínico: una guía breve

F ig u ra A -4 Detalle de la lámina en color A-ID. Espolones coxales de lxodes scapularis adulto. El espolón en el coxal I es largo, puntiagudo y orientado hacia adentro. Las espolones de los coxales II a IV son cortos, romos y orien­ tados hacia afuera.

gadas de adelante hacia atrás (fig. A-3). Las placas de los espiráculos en los machos de I. cookei e I. marxi parecen redondas. La placa anal de los machos es corta en sentido anteroposterior, en comparación con las de I. cookei e I. marxi (fig. A-3). lxodes cookei. El escudo de las ninfas y las hembras adultas es angulado, desde el extremo posterior hasta la porción media de los bordes laterales (lámina en color A-1E). En las hembras adultas, el ancho del escudo se ve de aproximadamente el mismo tamaño que la longitud anteroposterior, en tanto que en las ninfas parece más ancho que largo. Las piezas bucales de todos los estadios evolutivos parecen proporcionadas a la lon­ gitud de la base del capitulum (lámina en color A -IE). En com­ paración con el de I. scapularis, el hipostoma de las hembras y de las ninfas es similar, con una fórmula de dentición 3/3, que progresa a 2/2, aunque en las hembras de I. cookei la punta es más redondeada. El hipostoma de las ninfas es aún más redon­ deado y el de los machos es corto, redondo y crenado. Una característica interesante, más pronunciada en las ninfas de esta especie, es la proyección lateral del primer segmento de los palpos a partir de borde posterior. Estas proyecciones tienen el aspecto de espolones y a menudo se denominan espolones de los palpos. En todos los estadios, el color es castaño, como café con leche claro y es uniforme en toda la garrapata. La dis­ posición de los espolones coxales es similar a la de /. scapu­ laris, con un espolón interno pronunciado en el coxal I y espo­ lones externos romos en los coxales I a IV. Las placas de los espiráculos de ninfas y hembras son similares a las de 1. sca­ pularis. En los machos parecen más redondas, no alargadas, como es el caso en los machos de I. scapularis. La placa anal de los machos de esta especie se ve dos veces más larga que ancha, lo que ayuda a diferenciarla de /. scapularis. lxodes marxi. El escudo de las ninfas y las hembras de esta espe­ cie es similar al de I. cookei, en el sentido de que es angulado desde la porción media del borde externo hasta el extremo pos­ terior (lámina en color A-1F). Esto puede confundir la identifi­ cación de estas especies. En las hembras hay diferencias en la longitud y el ancho. El escudo de las hembras de I. marxi es mucho más largo que ancho. En I. cookei, el largo y el ancho son proporcionales. En las ninfas de I. marxi el largo y el ancho son básicamente iguales, en tanto que en I. cookei, el escudo es más ancho que largo. Dada la similitud de las proporciones del escudo entre una ninfa de /. marxi y una hembra adulta de I.

cookei, la identificación debe hacerse observando la presencia o la ausencia de poro genital. El escudo masculino parece care­ cer de pelo. Visto desde el lado ventral, el aparato bucal de los tres esta­ dios es proporcional a la longitud de la base del capitulum. El hipostoma de ninfas y hembras es similar al de /. scapularis, con una fórmula de dentición de 3/3 en la punta y 2/2 a medi­ da que se aproxima el extremo posterior. La punta, en las hem­ bras, es muy puntiaguda. El hipostoma masculino es corto, redondeado en la punta y crenado. El color de esta especie es similar al de /. cookei; todo el cuerpo de los tres estadios es de color castaño, como café con leche claro. La disposición de los espolones coxales es una característica importante para la iden­ tificación de /. marxi. Las ninfas y las hembras tienen un espo­ lón interno romo y un vestigio de espolón externo en el coxal I. La ausencia notable de espolones en los coxales II a IV dife­ rencia las hembras y las ninfas de esta especie de las de otras lxodes descritas aquí. La disposición de los espolones coxales de los machos es similar a la de I. cookei, con las excepciones de que hay un espolón interno menos pronunciado en el coxal I y ausencia notable de espolones en el coxal IV. Las placas de los espiráculos redondas en todos los estadios ayudan a diferenciar a los machos de esta especie de I. scapularis, en los que son alargados. La placa anal en el macho de /. marxi es más largo que ancho en comparación con /. scapularis, en la que las medidas parecen iguales. Dermacentor variabilis. D. variabilis es una garrapata ornada, lo que significa que es bastante coloreada, con marcas contras­ tantes. El color de las garrapatas ornadas se describe como el color básico (el color global predominante de la garrapata) y el patrón de colores (marcas contrastantes) (lámina en color A1G y lámina en color A-1 H).8 El patrón de colores se observa en el escudo, así como en las patas de D. variabilis. Se encuen­ tran once festones dispuestos en semicírculo alrededor del borde posterior (lámina en color A-1 G). Estos festones pueden verse tanto en el dorso como en el vientre de todos los estadios. El escudo de las hembras es angulado y es tan largo como ancho. El patrón de color es perlado a gris y contrasta con el resto de la garrapata, en el que el color básico es castaño marrón. Se encuentran líneas y manchas de color castaño dis­ tribuidas al azar, diferentes entre ejemplares. Puede observarse la presencia de “ojos” en la porción media de los bordes late­ rales (lámina en color A-1 H). El color y el contraste son simi­ lares en los machos y las hembras. Las marcas ornamentales cubren todo el dorso debido a la naturaleza del escudo mascu­ lino. Las zonas de color básico parecen más grandes a medida que se acercan a la porción media del borde lateral y al borde posterior. Las marcas a cada lado del eje medio son aproxima­ damente especulares. El escudo de las ninfas es largo y no parece tan angulado como en la hembra; se redondea desde la porción media de los bordes laterales hasta la línea media pos­ terior. El patrón de color parece ser más prominente. Hay “ojos" en los ángulos de los bordes laterales, a medida que se acercan al extremo posterior. (Nota: no se han visto ninfas en nuestro laboratorio y se sabe que el contacto con seres huma­ nos es poco frecuente).8 La base del capitulum de todos los estadios parece más ancha que larga (lámina en color A-1 H). En las ninfas, en la vista dor­ sal, esta base tiene proyecciones pronunciadas similares a espo­ lones posteroextemos, que hacen que la base parezca triangular. El hipostoma de todos los estadios es corto y redondeado. Los palpos son cortos y gruesos en los adultos, pero delgados en las ninfas. Las espolones coxales son similares en los adultos. El coxal I tiene espolones internos y externos grandes que conver­

E species de Ornithodoros

gen en la línea media, lo que le confiere un aspecto de muesca. Los coxales II a IV tienen espolones externos más pequeños. Las ninfas tienen un espolón externo predominante y un espo­ lón interno menos dominante en el coxal I, con espolones exter­ nos muy pequeños en los coxales II y III y ninguno en el coxal IV. En el noreste, no debe confundirse D. variabilis con Dermacentor albipictus (la garrapata del alce, también llamada garrapata de invierno). Así como un alce es más grande que un perro o un ciervo, D. albipictus es mucho más grande que D. variabilis o I. scapularis (fig. A-5). Los ejemplares de estas especies ingurgitados de sangre tienen una diferencia media de tamaño de 2 mm.8 Una D. variabilis ingurgitada puede alcanzar dimensiones impresionantes (lámina en color A-1G), pero una hembra de D. albipictus totalmente ingurgitada puede tener el tamaño de la uña del cuarto dedo de un adulto. En condiciones medioambientales óptimas, se sabe que D. albipictus puede desangrar un alce debido al número de garrapatas que se ali­ mentan en forma simultánea. Por fortuna, el contacto de seres humanos con D. albipictus es mínimo a inexistente. Amblyomma americanum. A. americanum es otra garrapata orna­ da (lámina en color A-2A). Tiene once festones. El color bási­ co es más predominante que en D. variabilis y los patrones de color son más constantes. El escudo de las hembras es angula­ do y casi igual de largo que de ancho. En las cercanías de los bordes laterales se hace más oscuro que el color básico, que es bronce rojizo. Se ven “ojos” en los extremos laterales (lámina en color A-2B). El patrón destacable del escudo de las hembras es un parche iridiscente en el extremo posterior (lámina en color A-2A). Según el ángulo de la fuente de iluminación esta marca aparece de color azul verdoso a rosa perlado y recuerda a la gasolina en agua. Este aspecto caracteriza a todos los patro­ nes de marcas de color de A. americanum en todos los estadios. El escudo de las ninfas es más ancho que largo, con “ojos” en los extremos laterales. Falta el parche iridiscente que se encuentra en el extremo posterior de las hembras. El escudo masculino es muy notable por la presencia de dos “herraduras” invertidas, coloreadas, en el borde posterior (lámina en color A2C). Se ven “ojos” en los bordes laterales. El patrón de marcas de color se extiende desde debajo de los “ojos” hacia la línea media y confiere el aspecto de un seudoescudo parecido al de la hembra. Los ejemplares macho y hembra pueden ser con­ fundidos por un observador inexperto. También se observan patrones de marcas de color distribuidas al azar a lo largo de la parte posterior de los bordes laterales. El aparato bucal en todos los estadios son largos en compa­ ración con la base del capitulum. El hipostoma parece bulboso, porque es estrecho en su parte posterior y ancho y redondeado en su porción anterior. La disposición de los espolones coxales es similar en todos los estadios. Hay un espolón interno mar­ cado y un espolón corto externo redondeado en el coxal I. Un espolón corto, puntiagudo en los coxales II a IV parece más cerca de la línea media, aunque lo más probable es que sea un espolón interno. Los machos tienen un espolón interno marca­ do y largo en el coxal IV (lámina en color A-2D). Todos los estadios tienen una ranura anal. La ranura se ve como un semi­ círculo posterior al ano. De la porción media del semicírculo desciende una ranura única hacia el margen posterior. El aspec­ to global es el de una copa de vino o el de un cáliz (lámina en color A-2D). RESUMEN DE IDENTIFICACIÓN

Las descripciones previas siguen la secuencia de observa­ ción usada en nuestro laboratorio. Cuando se encuentra un

1369

F ig u ra A -5 Comparación del tamaño de garrapatas ingurgitadas. Una garra­ pata de alce ingurgitada, Dermacentor albopictus (A), supera mucho en tama­ ño a una garrapata americana del perro ingurgitada, Dermacentor variabilis (V), que a su vez es más grande que la garrapata del ciervo ingurgitada, Ixodes scapularis (S). Todas son hembras adultas.

ejemplar con un surco en forma de U dirigido hacia adelante, debe identificarse o descartarse como Ixodes scapularis. Para distinguir I. cookei de I. marxi, la disposición de los espolones coxales y la configuración del escudo son elementos claves. Cuando la garrapata es ornada, las diferencias se establecen sobre la base de la configuración del escudo, el patrón de mar­ cas de color comparado con el color básico, la configuración del patrón de marcas de color, la longitud del aparato bucal res­ pecto de la base del capitulum y la disposición de los espolo­ nes coxales. Las características diagnósticas se resumen en el cuadro A-3. Los buenos libros de referencia hacen descripciones más exhaustivas.8-9,27’37 El tema de las enfermedades transmitidas por garrapatas no se ha agotado. Las enfermedades emergentes, así como las ya establecidas, que se asocian actualmente con la transmisión por garrapatas es objeto de extensos estudios. La identificación exacta de una garrapata en un paciente que pre­ senta síntomas gripales vagos puede y debe influir en el trata­ miento inicial.

Especies de Ornithodoros Relación con las enfermedades

Las especies de Ornithodoros transmiten las especies de Borrelia que causan fiebre recurrente endémica. Identificación

Las especies de Ornithodoros son garrapatas blandas. Por definición, su aparato bucal no es visible de frente y carecen de escudo. Tienen un hipostoma prominente, cubierto con dientes (véase lámina en color A-2E). Distribución geográfica

Es difícil distinguir las diversas especies que pueden trans­ mitir fiebre recurrente. En el noroeste de los Estados Unidos y

1370

ESPECIE lxodes scapularis

Dermacentor variabilis

Amblyomma americanum

ESTADIO

APARATO BUCAL/BASE DEL CAPITULUM

FES­ TONES

ESCUDO

SURCO ANAL

Ninfa

Ovalado; cubre un tercio del dorso y es oscuro en contras­ te con el abdomen

En forma de U miran­ do hacia adelante, rodeando el ano

Espolón interno prominente en el coxal I; espolones externos romos de I a IV

Aparato bucal el doble de largo que la base del capitulum cuando se mira desde la cara ventral

No

Ausentes Capitulum, patas y escudo de color café negro con el abdomen rojo bron­ ceado contrastante

Hembra adulta

Cubre medio dorso, por lo demás se parece a la ninfa

Igual a la ninfa

Igual a la ninfa

Igual a la ninfa

No

Ausentes Igual a la ninfa

Macho adulto

Cubre todo el dorso; velloso

Igual a la ninfa

Igual a la ninfa

Igual a la ninfa; hiposto­ ma más "práctico” que otras especies de lxodes.

No

Ausentes Color café negro global

Ninfa

Cubre medio dorso; patrón de color predominante

Ausente

Espolón externo prominente en el coxal I; espolones externos menos romos en II y III

La base del capitulum dorsal parece triangu­ lar; los palpos son estrechos

Sí

Presentes Patrones de color más predominantes

Hembra adulta

Angular; igual de largo que de ancho; patrón de color con marcas de color base distri­ buidas al azar

Ausente

Espolones internos y externos prominentes en el coxal I, con aspecto de muescas

Palpos gruesos; base del capitulum más ancha que el largo del aparato bucal

Sí

Presentes El color base es castaño; el patrón de color es blanco grisáceo

Macho adulto

Color base y patrón de color aproximadamente iguales

En forma de cáliz

Igual a la hembra

Igual a la hembra

Sí

Presentes Igual a la hembra

Ninfa

Angular; más ancho que largo; color base predominante; “ojos” en los extremos laterales

En forma de cáliz

Los espolones aparecen en la El aparato bucal parece porción media posterior de mucho más largo que los cuatro coxales; el espo­ la base del capitulum; lón en el coxal I es más pro­ el hipostoma es nunciado bulboso

Sí

Presentes Color base predominan­ te caramelo; el patrón de color es iridiscente azul verdoso a amarillo

Hembra adulta

Angular; tan ancho como largo color base predominante con “ojos”; parche de patrón de color en el extremo posterior

En forma de cáliz

El coxal I tiene un espolón medial prominente; los espolones parecen ausentes de II a IV

Sí

Presentes Igual a la ninfa

ESPOLONES COXALES

Igual a la ninfa

OJOS

COLOR

(Continúa)

APÉNDICE I Ectoparásitos y otros invertebrados en el laboratorio clínico: una guía breve

Cuadro A-3 Características diagnósticas de las garrapatas duras

Cuadro A-3 Características diagnósticas de las garrapatas duras (cont.)

ESPECIE

lxodes cookei

lxodes marxi

ESTADIO

ESCUDO

SURCO ANAL

ESPOLONES COXALES

APARATO BUCAL/BASE DEL CAPITULUM

OJOS

FES­ TONES

COLOR

Color base predominante; “herraduras” con patrón de color invertido en el borde posterior

En forma de cáliz

Similar a la hembra con un espolón interno marcado en el coxal IV

Igual a la ninfa

Sí

Presentes

Igual a la ninfa

Ninfa

Angular; más ancho que largo

En forma de U miran­ do hacia adelante, rodeando el ano

Similar a I. scapularis

Aparato bucal de igual No longitud que la base del capitulum; hipostoma similar a I. scapularis, aunque más redondeado en la punta; espolones palpales presentes

Ausentes

Castaño café con leche claro

Hembra adulta

Angular; tan ancho como largo

Igual a la ninfa

Igual a la ninfa

Igual a la ninfa

No

Ausentes

Igual a la ninfa

Macho adulto

Menos velloso en comparación con I. scapularis

Igual a la ninfa

Igual a la ninfa

Proporcional a la ninfa; hipostoma redondeado y crenado

No

Ausentes

Igual a la ninfa

Ninfa

Angular; tan ancho como largo

En forma de U miran­ do hacia adelante, rodeando el ano

Espolón interno romo y pre­ Aparato bucal de igual sencia de espolón externo en longitud a la base del el coxal I; ausencia de espo­ capitulum lones en II a IV

No

Ausentes

Castaño café con leche claro

Hembra adulta

Angular; más largo que ancho

Igual a la ninfa

Igual a la ninfa

Igual a la ninfa; el hiposto­ No ma es muy puntiagudo

Ausentes

Igual a la ninfa

Macho adulto

No se observa vello

Igual a la ninfa

El coxal I tiene un espolón Proporcional a la ninfa; interno prominente y un hipostoma redondeado y espolón externo romo; de II crenulado a IV tienen espolones exter­ nos romos; espolones ausen­ tes en el coxal IV

Ausentes

Igual a la ninfa

No

Especies de Ornithodoros

Macho adulto

co

1372

A P É N D IC E I Ectoparásitos y otros invertebrados en el laboratorio clínico: una guía breve

el oeste de Canadá, O. hermsi es el principal vector. Esta espe­ cie se alimenta sobre roedores pequeños, así como en seres humanos, y habita en agujeros y hendeduras de chozas y caba­ ñas. Un brote famoso en un contingente de escultistas se con­ centró en los exploradores mayores y guías que pernoctaron en una cabaña abandonada y dejaron a los más jóvenes pasar la noche bajo las estrellas, sin ser picados.58 En el sudoeste y el sur centrooccidental, el vector común es O. turicata, que se encuentra en diversos mamíferos pequeños y grandes, roedores, aves y reptiles. Esta especie habita a menudo en madrigueras de animales.

Ácaros Existen numerosas especies de ácaros en la naturaleza. Las especies de la familia Trombiculidae (bicho colorado o ninguas) producen prurito intenso o dermatitis cuando se alimen­ tan temporalmente. Los miembros del género Leptotrombidium transmiten la fiebre fluvial japonesa en el sudeste asiático y Australia.65 Los ácaros del polvo doméstico del género Dermatophagoides son alergénicos para ciertas personas. El ácaro del ratón, Liponyssoides (Allodermanyssus) sanguineus, transmite Rickettsia akari, el agente causal del tifus pustuloso (.rickettsialpox). Esta enfermedad se describió por primera vez en la ciudad de Nueva York y continúa siendo allí un proble­ ma.25 El ácaro de la sama, Sarcoptes scabiei, y el ácaro de los fo­ lículos, Demodex folliculorum, son los dos ácaros que tienen una asociación parasitaria estrecha y prolongada con los seres humanos. Sarcoptes scabiei (sarna) RELACIÓN CON LAS ENFERMEDADES

Sarcoptes scabiei se conoce como el “ácaro de la comezón”. El ácaro causa la sarna al excavar la piel y depositar sus huevos en las madrigueras. Los estadios de larva y ninfa resultantes del ácaro viven en las madrigueras y los folículos pilosos adyacen­ tes. Las deposiciones de los ácaros provocan prurito intenso, que conduce a una irritación importante y pérdida del pelo. La recidiva de la enfermedad suele ocurrir por la reinfestación de ácaros presentes en contactos tratados de manera inadecuada, pero las recaídas también pueden suceder después de un trata­ miento adecuado.61

Demodex folliculorum (folículos pilosos) y Demodex brevis (glándulas sebáceas) RELACIÓN CON LAS ENFERMEDADES

Las infecciones suelen comprometer la cara. Los microorga­ nismos pueden causar prurito y reacción tisular local cuando excavan la piel. Sin embargo, también se encuentran en indivi­ duos asintomáticos. IDENTIFICACIÓN

El examen microscópico de muestras de piel revela el ácaro característico, que mide 0,1 a 0,4 mm de longitud. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

Los ácaros de los folículos tienen distribución mundial.

Arañas Existen miles de especies de arañas en la naturaleza. La mayoría de ellas tienen toxinas potentes, pero sólo algunas pueden atravesar la piel humana cuando pican.17 Loxosceles reclusa RELACIÓN CON LAS ENFERMEDADES

Loxosceles reclusa, conocida como araña parda, prefiere vivir en ropa guardada y sacos de dormir, sótanos, armarios y otros sitios con actividad humana reducida.1718 Su veneno se inyecta a través de la picadura y puede causar descamación intensa y necrosis de la piel. Las dosis grandes de veneno se asocian con diseminación y mortalidad importante. La picadu­ ra de la araña parda no produce una lesión diagnóstica; varios informes sugieren que muchas veces se atribuyen incorrecta­ mente lesiones dermonecróticas a las arañas.59 IDENTIFICACIÓN

La araña parda se caracteriza por su color amarillo a bron­ ceado, un tamaño de 1 a 2 cm y una marca en forma de violín en la cabeza (véase lámina en color A-2G).1718 Existen varias especies relacionadas, que pueden requerir la ayuda de un especialista para su identificación correcta.

IDENTIFICACIÓN

El examen microscópico de raspados de piel revela el ácaro característico (que mide 0,2 a 0,4 mm de longitud), sus huevos o pelotillas fecales (escíbalos) (véase lámina en color A-2F). Los ejemplares se obtienen colocando una gota de vaselina líquida sobre una hoja de bisturí estéril y dejando que parte de la vaselina cubra la pápula. Se raspa la pápula vigorosamente seis o siete veces para quitar el techo y luego se transfiere el material raspado, que debe contener algunas manchas de san­ gre en la vaselina, a un portaobjetos de vidrio, usando un pali­ llo de madera si es necesario. Después de agregar un par de gotas de vaselina líquida al preparado y mezclar, se coloca un cubreobjetos de vidrio.18 DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

Los ácaros de la sarna tienen distribución mundial.

DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

La araña parda se encuentra en la mayor parte de los Estados Unidos continentales, salvo en las secciones occidentales ex­ tremas.

Latrodectus mactans RELACIÓN CON LAS ENFERMEDADES

Existen varias especies de arañas viudas. Latrodectus mac­ tans, la araña viuda negra más común, puede causar una reac­ ción sistémica seria, incluso la muerte, después de la inyección de su veneno. Por fortuna, la mayoría de los pacientes no se enferman con gravedad y se recuperan con rapidez.1718 Las picaduras ocurren casi siempre en las manos.56 La picadura de las arañas macho provocan pocos síntomas o ninguno.20

Insecta: m oscas, chinches, pulgas y piojos

IDENTIFICACIÓN

La hembra de la viuda negra mide 3 cm de largo (incluidas las patas), es de color negro brillante y muestra una marca roja en forma de reloj de arena característica en el abdomen (véase lámina en color A-2H).17-18-56 La diferenciación entre especies relacionadas es difícil y es mejor dejarla en manos de expertos. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

Existen diferentes especies de arañas viudas en todos los Estados Unidos continentales. Latrodectus mactans se encuen­ tra desde el sur de Nueva Inglaterra hasta el sur de Florida y al oeste hasta California y Oregón; es más frecuente en la parte sur de esta zona. La araña viuda negra del norte, L. variolus, se encuentra en Nueva Inglaterra y sur del Canadá hasta Florida y hacia el oeste hasta el este de Texas, Oklahoma y Kansas; es más frecuente en la parte norte de su zona de dispersión. Tegenaria agrestis RELACIÓN CON LAS ENFERMEDADES

En los últimos años, ha habido cada vez más informes de reacciones tóxicas a la picadura de la araña vagabunda, T. agrestis. M uchas picaduras no tienen consecuencias graves, pero algunas pueden causar una lesión derm onecrótica simi­ lar a la ocasionda por la araña parda. Al eritem a sigue la for­ mación de ampollas y después la ulceración. Se forma una escara que luego se desprende, con formación de una cicatriz o no. Los efectos sistémicos son casi siempre leves, pero pue­ den ser graves. La araña macho es más venenosa que la hem­ bra.7

1373

Dermatobia hominis (larva de la mosca humana) RELACIÓN CON LAS ENFERMEDADES

Para entender cómo se desarrolla la infección es preciso des­ cribir algunas características del fascinante ciclo evolutivo de este organismo. La hembra deposita sus huevos a otro insecto vector, a menudo un mosquito. Cuando el insecto pica a un huésped, los huevos liberan larvas que penetran de inmediato la piel. Las larvas maduran en la piel durante unas 6 a 12 sema­ nas, después de las cuales abandonan el tejido subcutáneo para caer a la tierra, donde requieren otras 3 semanas de maduración antes de que emerja una mosca adulta.4-4962 Mientras están en la piel, las larvas producen una lesión simi­ lar a una magulladura, a menudo muy pruriginosa y, en ocasio­ nes, dolorosa. La extirpación completa de las larvas elimina la enfermedad y permite confirmar el diagnóstico. A veces ocurren infecciones bacterianas secundarias de las lesiones.

IDENTIFICACIÓN

Las larvas varían de tamaño desde pocos milímetros hasta 18 a 25 mm, según su madurez en el momento de la extracción. Están rodeadas de filas de espinas fácilmente visibles con un microscopio de disección (véase lámina en color A-3A). Los estadios larvales pueden tener una forma de “frasco” bien defi­ nida, con un cuello largo que se adelgaza progresivamente. El examen microscópico de los espiráculos (placa de los estig­ mas) es útil para la identificación.17-18 DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

Dermatobia hominis es común en América Central y del Sur.4-17-47 IDENTIFICACIÓN

La araña vagabunda es castaña con manchas grises. Es mo­ deradamente grande: su cuerpo mide de 7 a 14 mm de longitud y alcanza 27 a 45 mm con las patas estiradas. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

Tegenaria agrestis se encuentra en todo el noroeste del Pacífico, sudoeste de Canadá y la faja territorial de Alaska. La distribución de esta araña no se superpone con la de Loxosceles reclusa. Las arañas vagabundas tejen telas en forma de embu­ do en lugares húmedos, como pilas de madera y espacios entre pisos para tubería y cables. Rara vez se la encuentra más arri­ ba de los cimientos o el nivel del piso.

Cordylobia anthropophaga (mosca Tumbu) RELACIÓN CON LAS ENFERMEDADES

Las larvas surgen de huevos que han contaminado ropa de cama, prendas de vestir u otros materiales y penetran en la piel del huésped poco después del contacto.4-28 El desarrollo en la capa subdérm ica ocurre mucho más rápido que el de Dermatobia hominis, habitualmente en 2 semanas,4 lo que reduce el número relativo de casos importados.28 Los pacientes suelen exponerse a una cantidad más grande de huevos, de manera que es más probable observar numerosas lesiones en la infección por Cordylobia que por Dermatobia.4 IDENTIFICACIÓN

Insecta: moscas, chinches, pulgas y piojos

Las larvas alcanzan 7 a 12 mm en el momento de la madura­ ción. Su forma más cónica las distingue con facilidad de Dermatobia.2S En el extremo más ancho se encuentran espiráculos.

Larvas de moscas productoras de miasis DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

La miasis se produce cuando larvas de mosca infectan accidentalm ente a seres humanos o penetran la piel para for­ mar lesiones subcutáneas, con el propósito de alimentarse en los tejidos. Los casos importados de miasis están aum entan­ do debido a la mayor frecuencia de viajes a zonas endémi­ cas.4,62 Los dos géneros que parasitan más a menudo a los seres humanos son Dermatobia y Cordylobia. Las moscas de los géneros Wohlfahrtia, Cochliomyia, Hypoderma y Oestrus suelen afectar mucho menos a los seres humanos y no se des­ cribirán aquí.17,20-49

Cordylobia se encuentra principalmente en África subsahariana. Otras moscas

Existen varias moscas importantes desde el punto de vista médico que justifican una descripción breve, aunque rara vez se envían ejemplares a los laboratorios clínicos. Las especies de Chrysops, conocidas como moscas ciervo, están involucradas en la transmisión de Loa loa, la filaría ocu­

1374

A P É N D IC E I Ectoparásitos y otros invertebrados en el laboratorio clínico: una guía breve

lar africana. Las moscas negras (especies de Simulium) son los vectores de las microfilarias que causa la oncocercosis. Existen diferentes especies de Simulium en distintas regiones geográfi­ cas, pero todas se reproducen en los canales de agua de flujo rápido, cerca de los cuales se registra el número más grande de picaduras. La mosca tsetsé (especies de Glossina) sólo existe en Africa tropical y transmite la tripanosomiasis africana (enfermedad del sueño). Estas moscas alargadas tienen una probóscide poderosa, capaz de infligir picaduras dolorosas.56 Mosquitos

Los mosquitos son responsables de la transmisión de enfer­ medades que causan mayor morbimortalidad que cualquier otro artrópodo.17,18,20,56

que el vector primario, Aedes aegypti, estaba confinado a los depósitos de agua estancada en la vecindad de las moradas humanas. Se pensó que la enfermedad podía ser eliminada por completo con el control del mosquito vector. Lamentable­ mente, el control de la fiebre amarilla urbana reveló la existen­ cia de un ciclo selvático entre los monos y varias especies de mosquitos selváticos, y pronto se hizo evidente que el virus po­ día controlarse pero nunca eliminarse (a menos que tengamos éxito en destruir todas las selvas tropicales).56 Los mosquitos son uno de los beneficiarios del comercio globalizado. Aedes albopictus, también conocido como “mos­ quito tigre”, reside en el Sudeste asiático, pero logró pasar a los Estados Unidos poniendo huevos en el agua acumulada en neu­ máticos de automóvil.33 Esta agresiva especie de mosquito es un vector competente para patógenos humanos importantes, aunque sólo se han aislado los virus de la encefalitis equina del este y de Cache Valley de mosquitos naturalmente infectados.

RELACIÓN CON LAS ENFERMEDADES

Los mosquitos causan lesiones cutáneas pruriginosas que aparecen poco después de que se alimentaron con sangre. También son capaces de transmitir infecciones graves. Las especeis de Anopheles son los artrópodos vectores responsa­ bles de la transmisión del paludismo. La filariasis es disemina­ da por algunas especies de Aedes, de M ansonia y de Anopheles. Una variedad de virus transmitidos por artrópodos (los arbovirus) usan especies de Aedes, de Culex, de Culiseta, de Haemagogus y de Sabethes como vectores de infecciones graves, com o la encefalitis equina, la fiebre del Nilo Occidental, la fiebre amarilla y el dengue.54256 Tanto los mos­ quitos machos como las hembras se alimentan de néctar y poli­ nizan las flores. El mosquito hembra debe ingerir sangre para completar el desarrollo de los huevos.20 Los mosquitos flebótomos que pertenecen a los géneros Lutzomyia y Phlebotomus son responsables de la transmisión de la leishmaniasis. Son insectos velludos, pequeños y tienden a mantener las alas en forma de V erecta. Los mosquitos usan indicios olfativos para encontrar sus huéspedes humanos. Un componente específico del sudor hu­ mano ha sido identificado como uno de los principales com­ puestos para Anopheles gambiae, un vector importante de Plasmodium falciparum .72 Para quienes no pueden dejar de su­ dar, existen diversos repelentes de insectos para evitar la pica­ dura de los mosquitos. Los productos basados en sustancias vegetales son opciones atractivas para las personas que desean evitar los disuasivos químicos; lamentablemente, las opciones actuales no son tan eficaces como los productos que contienen /V,/V-dietil-3-metilbenzam¡da (DEET).16 Quizás en el futuro los compuestos que bloquean los componentes relevantes del sudor serán disuasivos eficaces. IDENTIFICACIÓN

Los mosquitos son insectos voladores de aspecto delicado, fácilmente reconocidos por la mayoría de las personas. La identificación de género y especie requiere bastante experien­ cia y debe recurrirse a los especialistas. Las picaduras de mos­ quito son tan comunes que los pacientes rara vez llevan ejem­ plares al laboratorio clínico para su identificación. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

Los mosquitos habitan en todo el mundo, pero algunas espe­ cies tienen nichos medioambientales bien definidos. Por ejem­ plo, la fiebre amarilla clásica era una enfermedad urbana por­

Chinches

Las chinches de cama (especies de Cimex) y los reduvídeos (familia Reduviidae) succionan la sangre de vertebrados, inclu­ so seres humanos, y pueden actuar como vectores importantes en la transmisión de enfermedades.17,56 Son de hábitos noctur­ nos, se alimentan por la noche y se esconden y descansan durante el día. A veces se envían ejemplares de la chinche de cama común (C. lectularius) a los laboratorios de microbiolo­ gía para su identificación.

CIMEX LECTULARIUS Relación con enfermedades. La chinche de cama común puede

causar numerosas lesiones pequeñas en la piel donde succiona sangre. La gravedad de las lesiones se relaciona con la sensibi­ lidad del individuo. Las chinches se alimentan principalmente por la noche; el resto del tiempo se esconden en la ropa de cama, el papel de las paredes desprendido y los colchones.17 No actúan como vectores de agentes infecciosos. Identificación. Tienen un color naranja claro a bronceado y 5 mm de largo por 3 mm de ancho.17,18,20 Los adultos tienen unos peque­ ños apéndice alares no funcionantes (lámina en color A-3B). Distribución geográfica. Cimex lectularius tiene distribución mun­ dial, aunque es más común en las zonas templadas, en tanto que C. hemipterus es más habitual en climas tropicales.56

VINCHUCAS: ESPECIES DE PANSTRONGYLUS, RHODNIUS Y TRIATOMA Relación con las enfermedades La familia Reduviidae tiene al­

gunos nombres populares. Estas chinches a veces se llaman “chinches de nariz cónica” debido a la forma alargada de la cabeza. La mayoría de los integrantes del grupo se conocen como chinches asesinas por su agresividad letal contra otros insectos. Las chinches asesinas también pueden picar a los seres humanos y causar lesiones dolorosas.20 Desde el punto de vista médico, el grupo más importante son las “chinches besadoras” (vinchucas), así llamadas porque pue­ den succionar sangre de la piel de alrededor de los labios. Las vinchucas transmiten el agente causal de la enfermedad de Chagas, Trypanosoma cruzi. No pueden picar a través de la ropa, por lo que las lesiones son más comunes en las partes expuestas del cuerpo.20 Los excrementos que contienen T. cruzi se depositan sobre el huésped mientras la chinche se alimenta. El rascado de la piel pruriginosa en el sitio de la picadura intro­ duce los microorganismos en la herida. La transmisión también

Insecta: m oscas, chinches, pulgas y piojos

1375

ocurre cuando los dedos contaminados con heces se frotan en los ojos, la nariz o la boca.56 Identificación. A diferencia de las chinches de cama, los reduvídeos (triatomídeos) tienen alas funcionales. Varían en tamaño de 1 a 4 cm, son más alargadas que las chinches comunes y tie­ nen cabezas relativamente largas y delgadas (véase lámina en color A-3C).17,18,20,56 Distribución geográfica. Las vinchucas se encuentran en partes del sur de los Estados Unidos y en América Central y del Sur.

potencialmente mortales. Como agentes de lesión directa pro­ vocan infestaciones menores, aunque irritantes de la piel y el pelo. Como artrópodos vectores son capaces de transmitir pató­ genos bacterianos importantes. Aunque algunas especies se asocian con diferentes partes del cuerpo, hay algunas superpo­ siciones.

Pulgas

cuerpo humano) parasita la mayoría de las partes del cuerpo, salvo la cabeza. Los piojos del cuerpo se encuentran principal­ mente en las regiones más vellosas, desde donde viajan ida y vuelta de la ropa hasta la piel para alimentarse.17 La succión de sangre causa heridas irritantes, pruriginosas, en el lugar de la picadura, una característica general de las infestaciones por piojos. La mayoría de los huevos, llamados liendres, se deposi­ tan en la ropa. Los piojos del cuerpo transmiten Borrelia recurrentis, el agente causal de la fiebre recurrente,3-57 y Rickettsia prowazekii y Bartonella {Rochalimaea) quintana29 que causan el tifus epi­ démico y la fiebre de las trincheras, respectivamente.17-56 En la fiebre recurrente, los piojos aplastados liberan los microorga­ nismos sobre la piel, desde donde luego penentran a través de las abrasiones. Los agentes del tifus y de la fiebre de las trin­ cheras, que están presentes en los excrementos del piojo, pene­ tran cuando el huésped se rasca la piel.56 La mortalidad del tifus epidémico no tratado puede ser quizá de hasta un 60%56 debi­ do a la presencia de otros factores de complicación, pero el tra­ tamiento antimicrobiano controla con eficacia la infección.38 Los piojos del cuerpo se diseminan por el contacto bastante íntimo con individuos infectados. La vestimenta y la ropa de cama compartidas y las habitaciones comunales cerradas se asocian con la transmisión.17 No es sorprendente que las infec­ ciones transmitidas por piojos tengan lugar en condiciones de extrema privación, como las guerras y las hambrunas. Identificación. Los piojos del cuerpo alcanzan 2 a 4 mm de lon­ gitud, con un abdomen relativamente largo y delgado. Tienen tres pares de patas, con ganchos similares a tenazas en las pun­ tas, que los ayudan a fijarse a su huésped (lámina en color A-3F). Distribución geográfica. Los piojos del cuerpo se encuentran en todo el mundo.

RELACIÓN CON LAS ENFERMEDADES

Las pulgas pueden causar picaduras irritantes, pruriginosas al extraer sangre de un huésped. Las especies más comunes que normalmente transmiten las infecciones más serias al ser humano se expondrán aquí. La pulga de la rata oriental, Xenopsylla cheopis, es el vector clásico de la peste30y del tifus murino.20 Tunga penetrans, la pulga jigger que se encuentra en África y América Central y del Sur, penetra la piel y pone hue­ vos dentro del huésped (lámina en color A-3D). La pulga del gato, Ctenocephalides felis, y la pulga del perro, Ctenocephalides canis, pueden infectar cualquier espe­ cie de animal doméstico (lámina en color A-3E). En América del Norte, la pulga del perro es rara y la mayoría de las enfer­ medades humanas son causadas por la pulga del gato.20 Cualquier especie puede picar a los seres humanos. La tenia del perro, Dipylidium caninum, puede infectar a los seres humanos cuando una pulga que contiene el cisticercoide de la tenia se ingere accidentalmente.1718 Varias especies de pulgas, además de otros insectos, pueden transmitir las larvas de la tenia de la rata, Hymenolepis diminuta, a los seres humanos. Se ha reco­ nocido hace poco que la peste endémica puede asociarse con la exposición a los gatos, y el tifus endémico, causado por Rickettsia typhi, puede ser transmitido por la pulga de esos ani­ males.53 Una rickettsia recién descrita, conocida como agente ELB,48-63 también infecta la pulga del gato y causa una enfer­ medad parecida al tifus murino. Este nuevo microorganismo del tipo de las rickettsias puede mantenerse por transmisión transovárica en las pulgas del gato.1 El agente ELB ha sido cla­ sificado como Rickettsia felis.23 En los países desarrollados los gatos pueden ser más importantes que las ratas en la transmi­ sión de estas infecciones. IDENTIFICACIÓN

El reconocimiento de las pulgas es relativamente fácil. Carecen de alas y tienen patas largas1718-56 musculosas, que cuelgan de un cuerpo “encorvado hacia arriba” (lámina en color A-3D y E). La determinación de las especies de pulgas es muy difícil y suele requerir una experiencia considerable. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

Las pulgas se encuentran en todo el mundo, coincidiendo con la distribución del huésped mamífero. Xenopsylla cheopis se asocia fundamentalmente con las ratas pardas (Rattus nor­ vegicus, también conocidas como ratas de cloaca noruegas) y las ratas negras (Rattus rattus, también conocidas como ratas domésticas o de tejado). Las especies de Ctenocephalides se encuentran en gatos y perros. Piojos

Los piojos son un problema de salud pública considerable y causan enfermedades que varían de relativamente benignas a

PEDICULUS HUMANUS Relación con las enfermedades. Pediculus humanus (el piojo del

PEDICULUS CAPITIS Relación con las enfermedades. Los piojos de la cabeza causan

infecciones irritantes de la cabeza, el pelo y el cu ello 44 Infectan sólo al hombre; los animales domésticos y otros animales no son sensibles. A diferencia del piojo del cuerpo, los de la cabe­ za no funcionan como vectores para la transmisión de bacte­ rias, aunque puede ocurrir la infección bacteriana secundaria de las herida de picaduras.6 Las liendres (huevos) de 1 mm de tamaño se pegan al tallo de un pelo cerca del cuero cabelludo (lámina en color A-3G). Las infestaciones son muy comunes en los niños.6 Ocurren a través del contacto estrecho y por compartir fómites como pei­ nes, gorras y bufandas.17 Identificación. Los piojos de la cabeza se parecen mucho a los piojos del cuerpo. Aunque hay superposición de tamaños, pue­ den ser ligeramente más cortos, en promedio 1 a 3 m m .17-18-20 El abdomen largo y los tres pares de patas con ganchos son casi idénticos a los del piojo del cuerpo. Las liendres se confunden con facilidad con la caspa, la descamación seborreica, rocíos para pelo o una infección micótica (lámina en color A-3G).6

1376

A P É N D IC E I Ectoparásitos y otros invertebrados en el laboratorio clínico: una guía breve

Los ejemplares deben ser enviados a los expertos para la con­ firmación. Distribución geográfica. El piojo de la cabeza se distribuye en todo el mundo. PHTHIRUS PUBIS Relación con las enfermedades. Phthirus pubis, también conoci­

do como piojo cangrejo o pubiano, causa una infección irritan­ te de la zona pubiana. Puede encontrarse con menor frecuencia en las axilas, el pecho, los muslos y el vello facial de bigotes, cejas y pestañas.1718,20 Los piojos dejan una herida de picadura pruriginosa en la piel después de alimentarse. Puede ocurrir la infección secundaria de la herida de la picadura, pero es rara. Las liendres se adhieren en la porción inferior del tallo del pelo, como ocurre con los piojos de la cabeza. Los piojos pubianos no transmiten agentes infecciosos. La transmisión ocurre principalmente a través del contacto sexual. Identificación. Los piojos pubianos tienen 1 a 2 mm de largo y un abdomen corto y redondeado. Su forma se describió como “similar a una tortuga”. Tienen tres pares de patas, con garras que parecen más grandes y más gruesas que las de los piojos del cuerpo o de la cabeza (lámina en color A-3H). Distribución geográfica. Los piojos pubianos pueden encontrarse en todo el mundo. REFERENCIAS 1. Azad AF, et al. Genetic characterization and transovarial transmission of a typhus-like rickettsia found in cat fleas. Proc Nati Acad Sci USA 1992;89:43-46. 2. Bennett G. Cockroaches as carriers of bacteria. Lancet 1993;341:732. 3. Borgnolo G, et al. Louse-bome relapsing fever: a clinical and an epidemiological study of 389 patients in Asella Hospital, Ethiopia. Trop Geogr Med 1993;45:66-69. 4. Brewer TF, et al. Bacon therapy and furuncular myiasis. JAMA 1993;270:2087-2088. 5. Calisher CH. Medically important arbovirues of the United States and Cañada. Clin Microbiol Rev 1994;7:89-116. 6. Carson DS. Detection and treatment of pediculosis capitis. IM 1990; 11:74-86. 7. Centers for Disease Control and Prevention. Necrotic arachnidism— Pacific northwest, 1988-1996. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1996;45:433-436. 8. Cooley RA. The genus Dermacentor and Otocenter (Ixodidae) in the United States, with studies in variation. National Institutes of Health Bulletin No. 171, United States Government Printing Office, Washington, DC, 1938. 9. Cooley RA, Kohls GM. The genus lxodes in North America. National Institutes of Health Bulletin No. 184, United States Government Printing Office, Washington, DC, 1945. 10. des Vignes F, et al. Effect of tick removal on transmission of Borrelia burgdorferi and Ehrlichia phagocytophila by lxodes scapularis nymphs. J Infect Dis 2001;183:773-778. 11. Dumler IS, Bakken JS. Ehrlichial diseases of humans: emerging tick-borne infections. Clin Infect Dis 1995;20:1102-1110. 12. Dworkin MS, et al. Tick paralysis: 33 human cases in Washington State, 1946-1996. Clin Infect Dis 1999;29:1435-1439. 13. Falco RC, et al. Duration of tick bites in a Lyme disease-endemic area. Am J Epidemiol 1996;143:187-192. 14. Felz MW, Durden LA. Attachment sites of four tick species (Acari: Ixodidae) parasitizing humans in Georgia and South Carolina. J Med Entomol 1999;36:361-364. 15. Felz MW, et al. A six-year-old girl with tick paralysis. N Engl J Med 2000;342:90-94. 16. Fradin MS, Day JF. Comparative efficacy of insect repellents against mosquito bites. N Engl J Med 2002;347:13-18. 17. Fritsche TR. Anthropods of medical importance. In: Murray PR, Barón EJ, Jorgensen JH, et al, eds. Manual of Clinical Microbiology. 8th Ed. Washington, DC: ASM Press, 2003:2061-2078. 18. Garcia LS. Diagnostic Medical Parasitology. 4th Ed. Washington, DC: ASM Press, 2001. 19. Goddard J. Arthropods, tongue worms, leeches, and arthropod-borne diseases. In: Guerrant RL, Walker DH, Weller PF, eds. Tropical Infectious Diseases. Principies, Pathogens, & Practice. Philadelphia: Churchill Livingstone, 1999:1325-1342. 20. Goddard J. Physician’s Guide to Arthropods of Medical Importance. 4th Ed. Boca Ratón, FL: CRC Press, 2003. 21. Goethert HK, Telford SR III. Enzootic transmission of the agent of human granu­ locytic ehrlichiosis among cottontail rabbits. Am J Trop Med Hyg 2003;68:633-637. 22. Hallem EA, et al. Olfaction: mosquito receptor for human-sweat odorant. Nature 2004;427:212-213. 23. Higgins JA, et al. Rickettsia felis: a new species of pathogenic Rickettsia isolated from cat fleas. J Clin Microbiol 1996;34:671-674. 24. James AM, et al. Borrelia lonestari infection after a bite by an Amblyomma america­ num tick. J Infect Dis 2001;13:1810-1814.

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Amebas de vida libre

Ecología, epidemiología, patogenia y enfermedades Meningoencefalitis amebiana primaria Queratitis por Acanthamoeba

Diagnóstico de laboratorio Obtención y transporte de las muestras Examen microscópico directo

Cultivo de amebas de vida libre Cultivo de tejidos Características morfológicas

Interpretación de la importancia de las amebas de vida libre aisladas en cultivo Tratamiento

as amebas pequeñas de vida libre presentes en agua y suelos de los géneros Naegleria y Acanthamoeba pueden causar infecciones oportunistas en los seres humanos. Las principales enfermedades producidas por este grupo son formas de meningoencefalitis devastantes, casi siempre mortales, y la queratitis por Acantha­ moeba, una infección ulcerada, que puede provocar la pérdida de la vista, que afecta la córnea y el ojo, causada por ciertas especies de Acanthamoeba, pero no de Naegleria.28 Las amebas de vida libre no están relacionadas con las amebas intestinales analizadas antes y no habitan el intestino del hombre ni de otros mamíferos.

L

Ecología, epidemiología, patogenia y enfermedades Naegleria y Acanthamoeba, junto con muchos otros géneros de amebas de vida libre, tienen distribución mundial en diversos hábitats de agua dulce, como ríos, lagos, estan­ ques, fuentes de agua termal y de agua mineral, sistemas de agua dimésticos, sistemas de aire acondicionado, humidificadores y torres de refrigeración.18,19 Se cree que tienen rela­ ción con la neumonitis por hipersensibilidad conocida como fiebre de los humidificado­ res.39 Son ubicuos en suelos, polvo, aire y residuos orgánicos en descomposición; se han encontrado en la superficie de verduras y se han aislado en el sedimento de aguas servi­ das y en agua potable contaminada con desechos domésticos o industriales. Se han ais­ lado especies de Acanthamoeba en agua de mar, especialmente asociadas con la descar­ ga de aguas servidas inadecuadamente tratadas de hoteles y vertederos municipales (D.A.

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A P É N D IC E II Amebas de vida libre

Munson: comunicación personal, 1991).19 Naegleria y Acan­ thamoeba también se han relacionado con vertederos con conta­ minación térmica en estanques y lagos conectados con plantas térmicas eléctricas, nucleares o fábricas que producen conta­ minación térmica.1819 En la naturaleza, las amebas de vida libre se alimentan de bacterias, como especies de Legionella,3-35-39-42 y las amebas forman quistes que son más resistentes a las condiciones adver­ sas del medioambiente (como la desecación en suelos) que las formas vegetativas ameboides. De Jonckheere y Van de Voorde informaron que los quistes de algunas cepas de Acanthamoeba son muy resistentes al cloro y no mueren con las concentracio­ nes de cloro usadas en los suministros de agua municipales o domésticos o en las piscinas de natación.20 En cambio, los quis­ tes de Naegleria fow leri son más sensibles al cloro; estos auto­ res concluyeron que no es probable encontrar N. fow leri viable en agua limpia en la que se mantienen concentraciones bajas de cloro (p. ej., 0,5 pg de cloro libre disponible por mililitro).20 Rowbotham fue el primero en señalar que L. pneumophila puede desarrollarse dentro de especies de Acanthamoeba, lo que proporciona una explicación de por qué las legionelas con requerimientos nutricionales especiales pueden mantener la viabilidad en aguas limpias, con bajo contenido de cloro.39 Las especies de Legionella proliferan también dentro de varias otras amebas de vida libre.42 Se ha especulado que las legione­ las pueden ser transmitidas por aerosoles a través del aire a los seres humanos en gotículas de agua mientras se encuentran dentro de amebas.39 Esto tiene sentido, sobre todo si los quistes amebianos pueden proteger a las legionelas del cloro presente en los suministros domésticos de agua (véase cap. 10). Además, las amebas de vida libre, como Naegleria fowleri, es­ pecies de Hartmanella y diversas especies de Acanthamoeba, se han aislado en las fauces y las vías nasales humanas,1,6,26,38,42,43 probablemente como quistes inhalados con el polvo suspendido en el aire, en aerosoles o que han estado presentes en los ali­ mentos o agua ingeridos.16 No se ha demostrado la presencia de trofozoítos de Naegleria ni Acanthamoeba en la nasofaringe humana en ausencia de enfermedad del SNC.16 Meningoencefalitis amebiana primaria

Antes de 1958, ninguna ameba de vida libre del agua y la tie­ rra se había reconocido como patógena. Más tarde, Culbertson y cois, observaron una ameba contaminante de células de culti­ vos de tejidos.17 Esta cepa, llamada ahora Acanthamoeba culbertsoni cepa A-l, cuando se instila por vía intranasal en ratones jóvenes y otros animales, causa una infección de la mucosa y la submucosa nasales que se disemina desde allí a lo largo del nervio olfatorio y a través de la lámina cribriforme del cráneo, para causar la invasión del cerebro y una meningoencefalitis rápidamente m ortal.121317 Sobre la base de su trabajo experi­ mental con animales, Culbertson predijo que una enfermedad similar podría ocurrir en los seres hum anos.121517 En 1965, Fowler y Cárter informaron el primer caso en un niño de Australia.22 El año siguiente, Butt, de Florida, informó tres casos más y denominó a la enfermedad “meningoencefalitis amebiana primaria”.9Así, conceptualmente, la meningoencefa­ litis amebiana primaria difiere de las enfermedades amebianas del SNC causadas por Entamoeba histolytica porque la menin­ goencefalitis amebiana primaria no era “secundaria” a la enfer­ medad amebiana del colon. Se sabe ahora que la puerta de entrada de Naegleria es la nariz, y el verdadero sitio “primario” de la infección son las vías respiratorias altas.10'1316 La mayoría de los pacientes con

infecciones del SNC causadas por Naegleria han sido niños o adultos jóvenes que estaban nadando en lagos o ríos o habían tenido la oportunidad de que les entrara agua (con Naegleria) en la nariz.3,4’29’31 Después de infectar la mucosa nasal, N. fo w ­ leri se disemina a lo largo del nervio olfatorio, a través de la lámina cribriforme, hasta el cerebro siguiendo la ruta original observada en los animales por Culbertson y cois.12’17 Los hallaz­ gos anatomopatológicos en seres humanos con meningoencefa­ litis aguda causada por N. fow leri han sido notablemente simi­ lares a los observados en modelos experimentales en animales por Culberston y cois, con Acanthamoeba culbertsoni cepa A-l (la más virulenta de las especies de Acanthamoeba).9'm3~'6’23'28,30 Otras especies de Acanthamoeba no son tan virulentas y tien­ den a causar abscesos cerebrales subagudos o crónicos, con granulomas o sin ellos. En los seres humanos, las enfermedades del SNC asociadas con especies de Acanthamoeba no han sido tan frecuentes como las producidas por N. fowleri. Se calcula que han ocurri­ do más de 140 casos de meningoencefalitis amebiana primaria en todo el mundo, en tanto que sólo se han informado 40 o más casos de infecciones del SNC por Acanthamoeba .28 La mayo­ ría de los pacientes con enfermedad del SNC por Acantha­ moeba eran personas inmunodeprimidas y no tenían antece­ dentes de exposición al agua.16,28,30,31 Sin embargo, dado que los quistes de Acanthamoeba pueden estar en la tierra o en el polvo doméstico, es posible que los microorganismos hayan sido inhalados para alcanzar la cavidad nasal o incluso las vías res­ piratorias bajas.16 Es posible que, en los seres humanos, las especies de Acanthamoeba puedan diseminarse desde la cavi­ dad nasal hasta el cerebro a lo largo del nervio olfatorio o por vía intravascular desde los pulmones, o tal vez desde lesiones cutáneas (informadas rara vez).16,31 N. fow leri causa una meningoencefalitis difusa y fulminan­ te, caracterizada por zonas grandes de necrosis hemorrágica, que afecta sobre todo los bulbos olfatorios, los lóbulos frontales, la base del cerebro, la médula espinal proximal y los lóbulos temporales del cerebro. También pueden estar afectados los ló­ bulos parietales y la corteza occipital. En las leptomeninges y dentro de la corteza se encuentra un exudado purulento agudo. Los trofozoítos amebianos pueden verse diseminados o en raci­ mos localizados dentro de la corteza necrótica. Tienen predilec­ ción especial por los vasos sanguíneos; las arterias pequeñas, arteriolas, venas, vénulas y capilares pueden estar rodeados por trofozoítos de Naegleria de 10 a 15 pm, que contienen grandes nucléolos prominentes.13,15,31 Dentro del cerebro, las especies de Acanthamoeba provocan una inflamación aguda en las etapas tempranas de la enferme­ dad en los animales. Sin embargo, las especies menos virulen­ tas que A. culbertsoni cepa A -l tienden a producir abscesos crónicos focalizados o multifocales, con granulomas o sin ellos (incluso con la presencia de células gigantes de cuerpo extra­ ño). Los trofozoítos y los quistes pueden estar focalizados o esparcidos en número pequeño en todas las zonas afectadas, pero pueden encontrarse en el espacio perivascular y dentro de las paredes de los vasos pequeños, en asociación con hemorra­ gias perivasculares y trombosis intravascular. Los quistes ame­ bianos se ven dentro del tejido en las infecciones por Acanthamoeba, pero no han sido observados en tejidos infec­ tados por Naegleria,13-15,31 Queratitis por Acanthamoeba

La queratitis por Acanthamoeba es una infección grave, a menudo devastadora, de la córnea, causada por ciertas especies

D iagnóstico de laboratorio

de Acanthamoeba (p. ej., A. polyphaga, A. castellanii, A. rhysodes, A. culbertsoni y A. hatchetti)5-28-33 Desde que se descri­ bió el primer caso en 1975,24 se han informado más de 200 casos en todo el mundo.28 Hasta alrededor de 1984, la mayoría de las infecciones se asociaban con traumatismos de la córnea y exposición a agua contaminada; más recientemente, muchos casos se han relacionado con el uso de lentes del contacto, sobre todo lentes blandas de uso diario o continuo.51 '-33-41 Otros factores involucrados en la queratitis por Acanthamoeba son los traumatismos de la córnea y el uso de solución fisiológica casera contaminada o el uso de agua corriente para limpiar las lentes, la omisión de desinfectar las lentes adecuadamente o con la frecuencia recomendada por los fabricantes y el uso de lentes mientras se practica natación.8-28'41 Las acantamebas pue­ den encontrarse en los estuches de lentes de contacto y en las soluciones para lavarlos, y son capaces de adherirse a la super­ ficie de las lentes.8-27-33-41-44 La queratitis por Acanthamoeba se presenta como una urgencia oftalmológica. Normalmente ocu­ rre en los niños, sobre todo de 12 años de edad y más, pero también es común en los adultos jóvenes y menos frecuente en las personas mayores.41 La infección progresa implacablemen­ te, con ulceración corneal y puede causar ceguera. Es difícil de diagnosticar y de tratar. La enfermedad ha sido a menudo diag­ nosticada erróneamente como una queratitis por herpes simple, una queratitis fúngica o bacteriana (o por micobacterias), lo que a veces produce demoras de semanas o meses antes de que se establezca el diagnóstico y se empiece el tratamiento ade­ cuado. Se han publicado los hallazgos clínicos detallados en varias revisiones excelentes.27-33,37'41'44

Diagnóstico de laboratorio Obtención y transporte de las muestras

Cuando se sospecha una enfermedad amebiana, debe obte­ nerse líquido cefalorraquídeo o tejido (p. ej., biopsia de córnea, raspados de córnea, tejido del SNC) en forma aséptica y exa­ minarlo de inmediato. Nunca deben congelarse ni refrigerarse las muestras destinadas a cultivo y deben mantenerse a 20 °C a 30 °C durante el transporte o antes de procesarlas en el labora­ torio.3-14 Cuando el examen debió proponerse, se vio que las amebas sobrevivieron en el líquido estéril o en otros tejidos estériles durante varios días a temperatura ambiente antes de ser procesadas en el laboratorio. Si se necesita un medio de transporte para biopsias de tejido o raspados corneales, el medio esencial mínimo que se usa en los laboratorios de viro­ logía es mejor (véase cap. 23) que la solución fisiológica para amebas de Page (D. Place, F. Curtis, E. Powell y A. Newsome; comunicación personal, 1991). Examen microscópico directo

Deben examinarse gotas pequeñas de líquido cefalorraquí­ deo, otros líquidos corporales o suspensiones de tejidos como preparados en fresco (en portaobjetos bajo cubreobjetos) con microscopia óptica bajo luz reducida o por microscopia de con­ traste de fase para ver los trofozoítos móviles (con un objetivo 40 x). Si se mantiene la platina del microscopio calentada a 30 °C a 37 °C se puede aumentar la motilidad, sobre todo de las especies de Acanthamoeba,14 Naegleria puede ser activamente móvil a 22 °C a 25 °C, pero la motilidad de las especies de Acanthamoeba a temperatura ambiente es muy lenta. Estas amebas tienden a ser más activamente móviles que los leucoci­

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tos, y los núcleos y nucléolos de Naegleria y de las especies de Acanthamoeba difieren de los de los granulocitos o macrófagos. El material para teñir sobre portaobjetos debe fijarse prime­ ro en formalina al 10% en buffer neutro. Después de secar el portaobjetos al aire, pueden teñirse con una coloración tricró­ mica, Papanicolaou o hematoxilina y eosina.3-14 Los cortes de tejidos deben teñirse con hematoxilina y eosina. Otras colora­ ciones preferidas por algunos autores para los preparados para examen directo son el azul de algodón de lactofenol, Giemsa, naranja de acridina y blanco de calcoflúor.28 Ciertos laborato­ rios de referencia y de investigación, como los de las CDC y del Departamento de Anatomía Patológica del Indiana University Medical Center, han creado procedimientos de inmunofluores­ cencia indirecta específicos o procedimientos del inmunocoaglutinación indirectos, que proporcionan una identificación inmunológica directa rápida de amebas en las muestras.3-28 Cultivo de amebas de vida libre

El método de C ulbertson para cultivar amebas con Escherichia coli en agua con agar sin sales,14 una ligera modi­ ficación del procedimiento original de Singh, ha resultado útil para cultivar líquidos corporales, suspensiones de tejidos del ojo y otras muestras. Se preparan placas de agar con 20 a 25 mL de agar al 1,5% en agua destilada (sin nutrientes ni sales agregados). Se dispersa el contenido de un ansa o una gota de una suspensión densa de E. coli, proveniente de un cultivo de 24 a 48 horas en placas de agar sangre, en el centro de la placa, cubriendo una superficie de 1 cm de diámetro. Como alternativa, E. coli puede extenderse en forma de cruz (dos estrías de suspensión de E. coli que se cruzan en el medio de la placa) (C. G. Culbertson: comunicación personal, 1989). El inóculo (una gota de suspensión celular, sedimento o frag­ mentos de tejido) se coloca encima del centro del extendido bacteriano y la placa se sella con cinta adhesiva. Placas dupli­ cadas se incuban a 30 °C y 37 °C o se incuba una sola placa a 34 °C a 35 °C. Después de 18 a 24 horas de incubación, la placa se mantiene sellada y se examina, con el agar hacia arri­ ba, con un objetivo 10 x. También puede usarse un microsco­ pio invertido. Si no se ve ninguna ameba, la placa se incuba nuevamente y se examina a diario durante 10 días. Las amebas pueden encontrarse en racimos o aparecer como cuerpos refringentes pequeños que migran desde el inóculo, dejando a menu­ do senderos irregulares o huellas tortuosas detrás de ellos, donde se han desplazado a través de las bacterias.14 Pueden transferirse amebas aisladas del agar a un portaobjetos para observarlas en fresco o teñidas. Pueden hacerse subcultivos extrayendo un cilindro de agar del “frente” que contiene ame­ bas (con un bisturí estéril), fuera de la zona que contiene bac­ terias, donde es más probable que las amebas no estén mezcla­ das con bacterias; luego se transfieren las amebas a otra placa de agar con E. coli (el agregado de anfotericina B a una con­ centración final de 2,5 mg/mL en el agar ayuda a reducir la contaminación fúngica) (E. Powell: comunicación personal, 1991). De allí, las amebas se transfieren a un medio líquido (p. ej., caldo de tripticasa soja) con antibióticos (p. ej., penicilina 1 000 pg/mL y estreptomicina 0,1 mg/mL, concentración final). Después de que las amebas están libre de bacterias (axénicas), pueden transferirse al caldo tripticasa soja sin antibióticos, que se usa como medio de desarrollo.3-14 Naegleria no se desa­ rrolla en caldo tripticasa soja, a menos que contenga 10% de suero fetal bovino estéril. El desarrollo de las amebas en ese caldo se mejora usando tubos para cultivo de tejido de plástico,

1380

APÉNDICE II Amebas de vida libre

para que las amebas se adhieran al tubo.314 Los cultivos se incu­ ban en posición casi horizontal a 35 °C en un ángulo de 15° a 20°, en forma similar a lo que se hace a menudo con los culti­ vos celulares en los laboratorios de virología. No todas las ame­ bas se desarrollan en caldo tripticasa soja. Los medios de culti­ vo alternativos son el Píate Count Broth® (Difeo Laboratories, Detroit, MI) y los cados recomendados en el catálogo de la American Type Culture Collection (www.atcc.org), que son el medio para Acanthamoeba, el medio PYNFH® y el medio Fresh Water Amoeba® (E. Powell: comunicación personal, 1991). Neroad y cois.34 también describieron un medio químicamente definido por cultivar especies de Naegleria patógenas y toleran­ tes a temperaturas altas.

reactivos inmunológicos específicos de especie (p. ej., inmunofluorescencia, coaglutinación) y pruebas de patogenicidad (en ratones). Esa identificación puede ser útil en una investigación epidemiológica o para proyectos de investigación, pero su valor práctico en el laboratorio clínico como ayuda a los médicos para el tratamiento de pacientes no se ha demostrado. Mirando hacia el futuro, Flores y cois, describieron el uso de anticuer­ pos monoclonales específicos y aplicaciones de la citometría de flujo como apoyo para diferenciar Naegleria fow leri de las especies de Acanthamoeba; también se cuenta con sondas experimentales de ácidos nucleicos para efectuar esta diferen­ ciación (véase cap. I).21

Cultivo de tejidos

Interpretación de la importancia de las amebas de vida libre aisladas en cultivo

Las amebas de vida libre más virulentas (p ej, A. culbertsoni cepa A -1) se desarrollan en cultivos celulares de mamíferos, como riñón de mono, células de McCoy y otros, y pueden cau­ sar un efecto citopatogénico (ECP) similar al que se ve con los virus.17'43 Las amebas menos virulentas se desarrollan poco en cultivo de tejidos (celulares), sin producir ACP. Las amebas pue­ den ser extremadamente difíciles de visualizar cuando se desa­ rrollan con las células de cultivo de tejidos; debe extraerse el líquido de un tubo o frasco de cultivo, centrifugarse a 500 a 800 g (durante 5 minutos) o puede hacerse un preparado con un Cytospin® y usar el sedimento para hacer un preparado en fres­ co, que se examina con microscopio óptico o de contraste de fase, con poca iluminación. Como alternativa, el preparado puede secarse, fijarse en formalina y teñirse con H-E para observar las características amebianas.3 Una vez aisladas en cultivo de tejidos, las cepas pueden transferirse a caldo o a agua con agar y E. coli (como se describe en la sección anterior).

Como las amebas de vida libre son ubicuas en el agua, la tie­ rra, el polvo y el aire, es posible que los quistes, transportados por el aire, puedan contaminar la superficie de un raspado de córnea, una biopsia de tejidos o muestras líquidas mientras se obtiene la muestra, cuando se procesa, durante la inspección de placas primarias para ver si hay desarrollo o después de la incu­ bación prolongada. Las amebas también podrían estar en la piel, en el borde de los párpados o en el saco conjuntival sin causar queratitis, aunque esto no se ha demostrado. Por eso, como lo han subrayado Alien y Culbertson, el personal no debe aceptar los cultivos positivos de amebas por sí mismos como prueba clínicamente significativa con respecto a la causa de la enfermedad, a menos que puedan demostrarse trofozoítos en el examen microscópico directo de la muestra o puedan verse por microscopia dentro del tejido en el examen histopatológico.3

Características morfológicas

Cuando adoptan form a redondeada, los trofozoítos de Naegleria miden de 8 a 15 pm y son casi siempre más pequeños que los de las especies de Acanthamoeba, que por lo general tie­ nen 10 a 25 pm de diámetro.2-4 Los núcleos de ambos géneros son similares y contienen grandes nucléolos muy prominentes. Naegleria tiene uno o más seudópodos lisos lobulados y es acti­ vamente móvil a temperatura ambiente o a 35 °C a 37 °C. Las especies de Acanthamoeba son muy lentas a 22 °C a 25 °C, pero pueden ponerse más activas a 35 °C y 37 °C. Acanthamoebae tiene numerosos seudópodos espinosos en la superficie, llama­ dos acantópodos. Las especies de Naegleria se caracterizan por tener una fase temporal de formas ameboflageladas cuando se colocan los trofozoítos de Naegleria en agua destilada, pueden volverse piriformes y activamente móviles, con dos o más fla­ gelos (en el lapso de 1 a 3 horas). Los quistes de Acanthamoeba tienen paredes más gruesas que los de Naegleria y un aspecto peculiar que ayuda a la identificación de las especies.36 Además, las especies de Naegleria producen una forma distin­ tiva de mitosis (promitosis) en la que la membrana nuclear permanece intacta.36 En cambio, Acanthamoeba produce un tipo más clásico de mitosis (metamitosis) en la que el nucléolo y la membrana nuclear desaparecen y el huso mitótico aparece con los cromosomas en metafase.14-36-54,194 Para obtener una información descriptiva más detallada, los lectores pueden con­ sultar las referencias3-14-16-25-28-36. La identificación de Naegleria y Acanthamoeba más allá del género no sólo requiere un estudio morfológico detallado, sino también el uso de otros procedimientos, como pruebas con

Tratamiento Por lo menos dos pacientes con meningoencefalitis por Naegleria han sobrevivido. Ambos recibieron anfotericina B. Uno de los pacientes, además de anfotericina B, recibió miconazol, rifampicina y sulfasoxazol.3-7-37-40 No se ha establecido el tratamiento de elección para la enfermedad del SNC causada por Acanthamoeba, ya que la mayoría de los casos se han diag­ nosticado en la autopsia. Sin embargo, Culbertson y cois, observaron que la sulfadiazina era muy activa in vivo contra algunas cepas de Acanthamoeba en modelos animales.3-16 El tratamiento de la queratitis por Acanthamoeba ha tenido éxito en varios pacientes usando un protocolo intensivo que consiste en isetionato de propamidina tópico (gotas Brolene®) y gotas de sulfato de neomicina-sulfato de polimixina B-gramicidina (Neosporin Ophtalmic Solution®).32-33-37-45

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Protocolos

v

Protocolos

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P rotocolo 1-1

C

a t a l a sa

I. Principio La catalasa es una enzima que descompone el peróxido de hidrógeno (H ,0 2) en agua y oxígeno. Químicamente, es una hemoproteína de estructura similar a la hemoglobina, salvo porque los cuatro átomos de hierro de su molécula están en estado oxidado (Fe3+) en lugar de en estado reducido (Fe2+). Excepto los estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas tienen acti­ vidad catalasa. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales de oxidación del metabolismo aerobio de ios hidratos de car­ bono. Si se permite que se acumule, resulta letal para las células bacterianas. La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno según la siguiente reacción: 2 H.O, — 2 H ,0 + 0 2 (burbujas de gas)

II.

III.

IV.

V.

La prueba de la catalasa se usa con mucha frecuencia para diferenciar los miembros de la familia Micrococcaceae de los miembros de la familia Streptococcaceae. Reactivos A. Peróxido de hidrógeno al 3% almacenado en frascos color caramelo, en frío. B. Un cultivo de 18 a 24 horas del microorganismo por probar. Control de calidad El reactivo peróxido de hidrógeno se debe probar con microorganismos control negativos y positivos, todos los días o inmediatamente antes de probar bacterias desconocidas. A. Control positivo: Staphylococcus aureus. B. Control negativo: especies de Streptococcus. Procedimiento 1. Con una aguja de inoculación o con un palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la superficie de un porta­ objetos de vidrio. 2. Agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% y observar la formación de burbujas. Resultados A. Interpretación La aparición rápida y sostenida de burbujas o de efervescencia constituye una reacción positiva. Como algunas bacterias tienen enzi­ mas distintas de la catalasa que pueden descomponer el peróxido de hidrógeno, la formación de unas pocas burbujas pequeñas des­ pués de 20 a 30 segundos no se considera un resultado positivo. Además, los eritrocitos tienen catalasa, por lo cual debe tenerse cui­ dado de no tomarlos junto con el material de la colonia.

P r o t o c o l o 1-2

P rueba

d e l a s o l u b i l id a d e n b il is

I. Principio Las sales biliares, específicamente el desoxicolato de sodio y el taurocolato de sodio, tienen la propiedad de lisar selectivamente a Streptococcus pneumoniae cuando se agregan a las bacterias en fase de crecimiento activo agar o caldo. S. pneumoniae produce enzi­ mas autolíticas (autolisinas) responsables de la depresión central o umbilicación característica de las colonias viejas de neumococos en agar. El agregado de sales biliares activa las autolisinas y acelera la reacción lítica natural observada en los cultivos de neumococos. La prueba de solubilidad en bilis se puede realizar con un cultivo líquido del microorganismo o con colonias que se desarrollan en agar. Si el microorganismo es soluble, la turbidez de un cultivo en caldo se aclara visiblemente cuando se agregan sales biliares. En agar, las colonias solubles en bilis “desaparecen” cuando se colocan gotas del reactivo sobre ellas. Debido a que el desoxicolato de sodio puede precipitar a pH 6,5 o menor, el cultivo en caldo utilizado debe ajustarse a pH 7 para evitar las reacciones falsas negativas. II. Medios y reactivos 1. Un cultivo puro del microorganismo por probar desarrollado a 35 °C durante 18 a 24 horas en caldo de Todd-Hewitt (o similar). 2. Placa de agar sangre de camero. 3. Desoxicolato de sodio (al 10% para la prueba en tubo, al 2% para la prueba en placa). 4. Solución de rojo fenol (1% en agua). 5. Solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0,10 N. III. Control de calidad A. Control positivo (soluble en bilis): Streptococcus pneumoniae. B. Control negativo (insoluble en bilis): estreptococos del grupo viridans.

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Protocolos

P ro tocolo 1-2

P r u e b a d e l a s o l u b i l i d a d e n b i l i s ( c o n t .)

IV. Procedimiento A. Prueba en caldo 1. Transferir aproximadamente 0,5 mL de un cultivo en caldo de 18 a 24 horas a dos tubos de ensayo limpios. Alternativamente puede prepararse una suspensión del microorganismo en solución salina tamponada con fosfato (buffer fosfato) a pH 7,0, a par­ tir del desarrollo en agar. Si se hace esto último, no es necesario corregir el pH. 2. Agregar una gota de indicador de rojo fenol a cada tubo. 3. Agregar NaOH 0,10 N para corregir el pH a 7 (el indicador vira a un color rosa pálido). 4. Agregar 0,5 mL de desoxicolato de sodio al 10% a uno de los tubos (marcado “prueba”). 5. Agregar 0,5 mL de solución fisiológica estéril al otro tubo (marcado “control'’). 6. Agitar con suavidad ambos tubos y colocarlos en estufa de incubación o baño María a 35 °C durante 3 horas, observando cada hora. B. Prueba en placa 1. Colocar una gota de desoxicolato de sodio al 2% sobre unas pocas colonias bien aisladas del microorganismo por probar desa­ rrollado sobre agar sangre de camero. 2. Sin invertir la placa, colocarla en una estufa de incubación a 35°C durante 30 minutos. V. Resultados A. Interpretación 1. Prueba en caldo Soluble en bilis (reacción positiva): hay un aclaramiento visible de la suspensión del tubo que contiene desoxicolato de sodio, sin cambios en la suspensión control con solución fisiológica. Insoluble en bilis (reacción negativa): no hay cambios en la turbidez de la suspensión del tubo que contiene desoxicolato de sodio, en comparación con la suspensión control en solución fisiológica. 2. Prueba en placa Soluble en bilis (reacción positiva): las colonias sobre las cuales se ha colocado el reactivo desaparecen y dejan una zona par­ cialmente hemolizada en el lugar donde estaban. Insoluble en bilis (reacción negativa): las colonias sobre las cuales se ha colocado el reactivo permanecen intactas y visibles. VI. Limitaciones de la prueba Sólo el 86% de las cepas de neumococos se lisan por completo y puede ser necesaria una prueba adicional (p. ej.. pruebas de hincha­ zón capsular de Neufeld [Quellung]) para las cepas restantes, que se lisan en forma incompleta.

P ro tocolo 1-3

Prueba

d e l a c o a g u l a s a e n po r t a o b je t o s

I. Principio La coagulasa es una protema de composición química desconocida, que tiene actividad similar a la protrombina. capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina. Como resultado se forma un coágulo visible. Se piensa que in vivo la coagulasa produce una barrera de fibrina en el sitio de la infección estafilocócica. Esta enzima probablemente desempeña cierto papel en el confinamiento local de abscesos (p. ej., carbunclos y furúnculos). En el laboratorio, la prueba de la coagulasa se utiliza para identificar Staphylococcus aureus y dife­ renciarlo de la mayoría de las otras especies de estafilococos. La coagulasa existe en dos formas: libre y unida; cada una tiene diferentes propiedades que requieren el uso de distintos procedi­ mientos de ensayo. Coagulasa unida (prueba en portaobjetos): la coagulasa ligada (unida), también conocida como factor de aglutinación, se encuentra unida a la pared celular bacteriana y no en los filtrados de cultivos. Entre las células bacterianas se forman bandas de fibrina cuando se suspenden en plasma (fibrinógeno), que hacen que las bacterias se agrupen formando grumos visibles. Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una sustancia similar a la trombina presente en filtrados de cultivos. Cuando en un tubo de ensayo se prepara una suspensión en plasma de microorganismos productores de coagulasa, se forma un coágulo visible como resultado de la reacción de la coagulasa con una sustancia del suero (factor de reacción con la coagulasa), para formar un com­ plejo que a su vez reacciona con el fibrinógeno para producir el coágulo de fibrina. II. Medios y reactivos Plasma de conejo con EDTA (en el comercio se obtiene en forma liofilizada). El plasma reconstituido debe refrigerarse. III. Control de calidad La coagulabilidad del plasma puede comprobarse agregando una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5 mL del plasma reconstituido. Debe formarse un coágulo en el término de 10 a 15 segundos. Una cepa conocida de Staphylococcus aureus y una de S. epidermidis

Protocolos

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P rotocolo 1-3

P r u e b a d e l a c o a g u l a s a e n p o r t a o b j e t o s ( c o n t.)

pueden servir de control positivo y negativo, respectivamente. Cada frasco de plasma de conejo con EDTA reconstituido debe probar­ se con cultivos de 18 a 24 horas de las cepas control. IV. Procedimiento 1. Prueba en portaobjetos (coagulasa unida): colocar dos gotas de agua o solución fisiológica estériles dentro de dos círculos dibu­ jados con un lápiz de cera en un portaobjetos de vidrio. Emulsificar suavemente material de colonias del microorganismo por identificar en el líquido que se encuentra dentro de cada uno de los círculos. Agregar una gota de plasma para la prueba de la coagulasa a la suspensión en uno de los círculos y mezclar con un palillo de madera. Colocar otra gota de agua o solución fisio­ lógica en el otro círculo, como control. Rotar el portaobjetos hacia adelante y atrás, buscando aglutinación en la suspensión de prueba. 2. Prueba en tubo (coagulasa libre): emulsificar una pequeña cantidad de la colonia del microorganismo en un tubo que contenga 0,5 mL de plasma para la prueba de la coagulasa. Incubar el tubo a 35 °C durante 4 horas y observar si se forma un coágulo incli­ nando suavemente el tubo. Si en ese momento no se observan coágulos, reincubar el tubo a temperatura ambiente y leer otra vez después de 18 horas. V. Resultados A. Interpretación 1. Prueba en portaobjetos: una reacción positiva se detectará dentro de los 10 a 15 segundos de mezclar el plasma con la suspensión por la formación de un precipitado blanco y la aglutinación de los microorganismos de la suspensión. La prueba se considera nega­ tiva si no se observa aglutinación en el término de 2 minutos. El control con solución fisiológica debe permanecer uniforme y lechoso. Si la suspensión control también se aglutina, la prueba no puede leerse. Todas las cepas coagulasa positivas pueden informarse como Staphylococcus coagulasa positivo o, con menor precisión, como Staphylococcus aureus. Todas las cepas que producen pruebas negativas en portaobjetos deben ser probadas mediante la prueba en tubo. 2. Prueba en tubo: la prueba de la coagulasa en tubo se considera positiva si se detecta cualquier grado de formación de coágulos. El tubo debe inclinarse con suavidad y no agitarse, ya que la agitación puede deshacer los coágulos parcialmente formados. Las fibrinolisinas producidas por los microorganismos también pueden disolver los coágulos poco después de su formación. Los tubos que son negativos después de 4 horas deben incubarse a temperatura ambiente durante la noche y leerse después de 18 horas.

P rotocolo 1-4

Prueba

d e l in d o l

I. Principio El indol. un bencilpirrol, es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que tienen la enzi­ ma triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano. con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La produc­ ción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos, de particular utilidad en la diferenciación de Escherichia coli (positiva) de los miembros del grupo Klebsiella-Enterobacter-Hajhia-Serratia (la mayoría nega­ tivas). La prueba del indol se basa en la formación de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehido del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el producto químico activo de los reactivos de Kovac y de Ehrlich. Debe utilizarse un medio rico en triptófano. En la práctica se utilizan medios combinados, como el medio de sulfuro indol para motilidad (SIM), el medio para motilidad indol omitina (MIO) o el medio indol nitrato. Las pruebas rápidas en mancha, utilizando tiras de papel de filtro impreg­ nadas con el reactivo p-dimetilaminocinnamaldehído, son útiles para la detección sistemática de bacterias que producen indol con rapidez. II. Medios y reactivos A. Caldo triptófano (triptófano al 1%) P e p to n a o d ig e rid o p a n c re á tic o d e c a s e ín a (trip tic a s a ) C lo ru ro d e s o d io A g u a d e s tila d a

B. Reactivo de Kovac A lc o h o l a m ílic o o is o a m ilic o p u ro p -d im e tila m ln o b e n z a ld e h íd o H C I c o n c e n tra d o

150 m L 10 g 50 mL

2 g 0 ,5 g 10 0 m L

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Protocolos

P rotocolo 1-4

P rueba

d e l in d o l

(cont.)

B. Reactivo de Ehrlich p -d im e tila m in o b e n z a ld e h íd o A lc o h o l e tílic o a b s o lu to H C I c o n c e n tra d o

2 g 19 0 m L 40 m L

III. Control de calidad Cada lote nuevo de medios o de reactivos debe ensayarse con pruebas negativas y positivas para indol. Los siguientes microorganismos son útiles como controles: A. Control positivo: Escherichia coli. B. Control negativo: Klebsiella pneumoniae. IV. Procedimiento Sembrar el caldo triptófano (u otros medios apropiados para indol) con el microorganismo por probar e incubar a 35 °C durante 18 a 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 gotas del reactivo haciendo que se deslicen por la pared del tubo. Si se utiliza el reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por el agregado de 1 mL de xilol. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac. V. Resultados A. Interpretación El desarrollo de un color rojo fucsia brillante en la interfaz del reactivo y del medio líquido (o de la capa de xilol) segundos después de agregar el reactivo indica la presencia de indol y constituye una prueba positiva (véanse láminas en color 6-4C y 7-2C). VI. Bibliografía Blazevic DJ, Ederer GM. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley, 1975:63-67. Isenberg HD, Sundheim LH. Indole reactions in bacteria. J Bacteriol 1958;75:682-690. MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification o f Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:173-183. Miller JM, Wright JW. Spot Índole test: Evaluation o f four reagents. J Clin Microbiol 1982;15:589-592. Vracko R, Sherries JC. Indole-spot test in bacteriology. Am J Clin Pathol 1963;39:429-432.

M E C A N IS M O D E LA R E A C C IÓ N D E L IN D O L

CHO

H 20

B N (C H 3)2

In dol

p -N ,N -d im e tila m ¡n o -b e n z a ld e h íd o

C o m p u e s to q u in o id a l ro jo v io lá c e o d i[4 -(in d o l-3 -il-m e tile n )-2 ,5 c ic lo -h e x a d ie n -1 -ilid e n o ]-d im e tilsal a m ó n ic a (R o s a -ro jo )

A gua

Protocolos

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P rotocolo 1-5

P rueba

d e l a c it o c r o m o o x id a s a

I. Principio Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como último eslabón de la cadena de respiración aerobia, transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con la formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en microorganismos aerobios o microaerófílos y anaerobios facultativos, de modo que la prueba de la oxidasa es importante para identificar a los microorganismos que care­ cen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba tiene su mayor utilidad para diferenciar colonias sospechosas de pertenecer a alguna de las Enterobacteriaceae (todas negativas) y para identificar las sospechosas de pertenecer a otros géneros como Aeromonas, Pseudomonas, Neisseria, Campylobacter y Pasteurella (positivas). La prueba de citocromo oxidasa utiliza ciertos colorantes reactivos, como el dihidrocloruro de p-fenilendiamina. que sustituye al oxí­ geno como aceptador artificial de electrones. En estado reducido, el colorante es incoloro; sin embargo, en presencia de citocromo oxi­ dasa y de oxígeno atmosférico la p-fenilendiamina se oxida y forma azul de indofenol. II. Medios y reactivos A. Diclorhidrato de te trame ti1-p -fe ni lend i am ina al 1% (reactivo de Kovacs). B. Diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina al 1% (reactivo de Gordon y McLeod). III. Control de calidad Deben probarse especies bacterianas que muestran reacciones positivas y negativas como control a intervalos frecuentes. Se sugieren las siguientes: A. Control positivo: Pseudomonas aeruginosa. B. Control negativo: Escherichia coli. IV. Procedimiento La prueba suele realizarse por uno de dos métodos: 1) la técnica directa en placa, en la cual se añaden dos a tres gotas de reactivo direc­ tamente sobre colonias aisladas desarrolladas en agar, y 2) el procedimiento indirecto con tiras de papel, en el cual se añaden unas gotas de reactivo a una tira de papel de filtro o se utilizan tiras o discos comerciales impregnados con reactivo desecado. Se recomienda el derivado tetrametilo de la/?-fenilendiamina, debido a que el reactivo es más estable y más sensible para la detección de citocromo oxi­ dasa y menos tóxico que el derivado dimetilo. Con cualquiera de los métodos, una colonia sospechosa se dispersa con el ansa sobre la zona reactiva del papel. V. Resultados A. Interpretación Las colonias bacterianas que tienen actividad de citocromo oxidasa desarrollan un color azul oscuro en el sitio de inoculación en el término de 10 segundos (lámina en color 6-1G). Cualquier microorganismo que produzca color azul entre los 10 y 60 segundos debe ser probado nuevamente, ya que es probable que no pertenezca a las Enterobacteriaceae. Para esta prueba no deben utilizarse ansas de acero inoxidable o níquel-cromo, porque los productos de oxidación superficiales producidos, cuando se esterilizan en llama, pueden provocar reacciones falsas positivas. VI. Bibliografía Gordon J. McLeod IW. The practical application of the direct oxidase reaction in bacteriology. I Pathol Bacteriol 1928;31:185-190. MacFaddin IF. Biochemical Tests for Identification o f Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:249-260. Steel KJ. The oxidase reaction as a taxonomic tool. I Gen Microbiol 1961;25:297-306. Weaver DK, Lee EKH, Leahy MS. Comparison of reagent impregnated paper strips and conventional methods for identification of Enterobacteriaceae. Am J Clin Pathol 1968;49:494-499.

M E C A N IS M O D E LA R E A C C IO N D E LA C IT O C R O M O O X ID A S A N (C H 3)2

N (C H ,)2 C ito c ro m o + O2

+ 2 HO o x id a s a

OH E n z im a N ,N -d im e til-p fe n ile n d ia m in a

a -n a fto l

O x íg e n o

1388

Protocolos

P rotocolo 1-6

P rueba PYR I. Principio La prueba PYR fue descrita por primera vez por Facklam y cois, en 1982 y desde entonces ha ganado aceptación como prueba rápida para la identificación presuntiva de los estreptococos P-hemolíticos del grupo A y de los enterococos. Si bien la prueba original fue des­ crita como una prueba en agar de 16 a 20 horas de duración, los formatos posteriores incluyeron un ensayo en caldo de 4 horas de dura­ ción y varias pruebas rápidas (de 10 a 15 minutos), en las cuales el reactivo PYR se impregna en discos o tiras de papel de filtro que se siembran con el material en estudio. La prueba PYR también es parte integrante de varios de los equipos comerciales para identifi­ cación de estreptococos y de bacterias similares a estreptococos. Este protocolo describe la prueba PYR de 4 horas en caldo. Los dis­ cos impregnados con el sustrato PYR también pueden usarse para una prueba aún más rápida. El sustrato utilizado para la prueba PYR es la L-pirrolidonil-P-naftilamida. Este compuesto es hidrolizado por una aminopeptidasa espe­ cífica bacteriana. La hidrólisis del sustrato por esta enzima libera P-naftilamida libre, que se detecta por el agregado de AW-dimetilaminocinnamaldehído. Este reactivo de detección se une a la naftilamida para formar una base de Schiff roja. II. Medios y reactivos 1. Caldo PYR (caldo Todd-Hewitt con 0,01% de L-pirrolidonil-P-naftilamida) fraccionado en tubos estériles, en volúmenes de 0,20 mL. 2. Reactivo PYR (p-dimetilaminocinnamaldehído al 0,01%). III. Control de calidad A. Control positivo: Enterococcus faecalis o Streptococcus pyogenes. B. Control negativo: Streptococcus agalactiae. IV. Procedimiento 1. Con un ansa bacteriológica estéril, tomar dos o tres colonias morfológicamente similares y emulsificarlas en un pequeño volu­ men de caldo PYR. 2. Incubar el tubo a 35 °C durante 4 horas. 3. Agregar una gota del reactivo PYR y observar el cambio de color. La reacción debe leerse y registrarse un minuto después del agregado del reactivo. V. Resultados A. Interpretación 1. Positivo: desarrollo de un color rojo cereza oscuro dentro del minuto del agregado del reactivo. 2. Negativo: color amarillo o naranja. VI. Notas acerca del procedimiento Antes de hacer la prueba PYR es esencial que se compruebe que el microorganismo es un estreptococo (cocos grampositivos, catalasa negativos). Otros microorganismos (p. ej., algunos aerococos, estafilococos, variantes nutricionales de estreptococos. Arcanobacterium haemolyticum) también pueden ser PYR positivos.

P rotocolo 3-1

Prueba

d e f ij a c ió n d e l c o m p l e m e n t o

(FC)

I. Principio La prueba de fijación del complemento es una de las principales reacciones tradicionales utilizadas para la detección de antígenos infecciosos y anticuerpos. Requiere un verdadero zoológico de reactivos y numerosos pasos preparatorios. Existen casi tantas versio­ nes como usuarios; la versión en placas de microtitulación desarrollada en los Centers for Disease Control and Prevention (prueba LBCF) incluye controles rigurosos y es la que se emplea habitualmente. La reacción de FC no depende de la actividad hemaglutinante de los virus, sino que los anticuerpos deben fijar complemento y los sueros deben estar libres de actividad anticomplementaria. La prueba ha sido superada, en muchos casos, por otras más modernas, como los enzimoinmunoanálisis (EIA). Los componentes terminales de la cascada del complemento, C l, C8 y C9 (el complejo de ataque a la membrana), pueden dañar las membranas celulares en presencia de anticuerpos específicos, que fijan el complemento a la superficie de las células. En la reacción de FC se utilizan eritrocitos como célula diana porque el aumento de permeabilidad de la membrana inducida por el complemento se puede visualizar o medir colorimétricamente como un aumento de la hemoglobina libre. En presencia de anticuerpos específicos con­ tra un agente infeccioso, se fija todo el complemento presente en el sistema, sin dejar complemento libre para reaccionar con los anti­ cuerpos dirigidos contra los eritrocitos indicadores. Así, la ausencia de hemolisis indica la presencia de anticuerpos específicos.

Protocolos

1389

P rotocolo 3-1

P r u e b a d e f i j a c i ó n d e l c o m p l e m e n t o ( co n t..)

II. Materiales y reactivos Suspensión de eritrocitos de camero. Hemolisina (anticuerpos de conejo antieritrocito de camero). Complemento de cobayo, libre de anticuerpos contra el agente en estudio. Diluyente buffer de barbital. Placa plástica de microtitulación. Adaptador para centrífuga para las placas de microtitulación. Baño María para incubar las placas. Estándares de color para evaluar la hemolisis (se preparan Usando diferentes concentraciones de eritrocitos). III. Control de calidad Anticuerpos o antígenos positivos conocidos. Anticuerpos o antígenos negativos conocidos. Control de suero sin antígeno (para detectar actividad anticomplementaria). Control de antígenos sin suero (para detectar actividad anticomplementaria). Control de tejido (el tejido o células en los que se preparó el antígeno). Control de buffer sin antígeno ni anticuerpos. Titulación de complemento para demostrar que se están utilizando 5 unidades ch^. Control de células para demostrar ausencia de hemolisis. Estándares de hemolisis de referencia. IV. Procedimiento 1. Sensibilización de eritrocitos Se incuban diluciones seriadas de hemolisina con una suspensión de eritrocitos de camero al 2,8% en buffer barbital. A medida que aumenta la concentración de hemolisina, el porcentaje de hemolisis se incrementa hasta alcanzar una meseta. Para la prue­ ba se utiliza la concentración de hemolisina que representa el segundo punto de la meseta. 2. Titulación del complemento Se incuban cantidades variables de una dilución 1:400 de complemento de cobayo reconstituido, en frío, con células sensibili­ zadas. El volumen de complemento que produce el 50% de hemolisis (unidad c h 50) se calcula a partir de la representación grá­ fica de los resultados de la hemolisis. El lote de complemento puede fraccionarse y conservarse a -7 0 °C, pero antes de ser uti­ lizado en la prueba debe demostrarse que su reactividad es adecuada. 3. Reacción de fijación del complemento Se realiza una titulación de diluciones seriadas de antígeno y anticuerpo en presencia de 5 ch50 de complemento, a 4 °C, duran­ te 18 horas. El suero se calienta a 56 °C durante 30 minutos para inactivar el complemento endógeno. Deben conocerse las carac­ terísticas del antígeno o del anticuerpo; las diluciones seriadas del elemento conocido pueden reducirse, incluida la dilución siguiente y anterior a la concentración óptima esperada. Después se agregan eritrocitos de carnero sensibilizados con la dilu­ ción óptima de hemolisina y la reacción se incuba a 37 °C durante 30 minutos. Las placas se centrifugan a baja velocidad para sedimentar los eritrocitos no Usados. V. Resultados A. Interpretación El punto final es la mayor dilución de antígeno o anticuerpo que produce una fijación de complemento 3+ o 4+ (< 30% de hemo­ lisis). Todos los reactivos deben estar desprovistos de actividad anticomplementaria, se debe agregar la cantidad correcta de com­ plemento y las muestras control deben reaccionar como corresponde. VI. Bibliografía Hsiung GD. Diagnostic Virology, 3a ed. New Haven, CT: Yale University Press, 1982. Standardized diagnostic complement fixation method and adaptation to microtest. Atlanta: Public Health Service. 1965. Publicación 1228 (Public Health Monograph 74).

1390

Protocolos

P ro tocolo 3-2

P rueba

d e in h ib ic ió n d e

la

h e m a g l u t in a c ió n

(IHA)

I. Principio Los ácidos nucleicos de muchos virus codifican proteínas de superficie que aglutinan eritrocitos de varias especies. El fenómeno se emplea con mucha frecuencia para el diagnóstico de las infecciones causadas por ortomixovirus, paramixovirus y los arbovirus-togavirus (incluido el virus de la rubéola), flavivirus y bunyavirus. La presencia del virus en cultivos celulares infectados puede detectarse por hemaglutinación; la identidad del virus o de los anticuerpos presentes en el suero de un paciente puede determinarse por la inhibi­ ción específica de esta hemaglutinación. Aunque los virus de la gripe pueden detectarse por hemadsorción (véase protocolo 23-1), la tipificación del aislamiento más eficiente se logra por inhibición de la hemaglutinación. Los reactivos y las condiciones de la prueba varían según el virus. La reacción de las hemaglutininas virales con los eritrocitos da como resultado un retículo de células aglutinadas que sedimentan en forma irregular en un tubo o cubeta de microtitulación. Las células no aglutinadas sedimentan en forma de botón compacto. II. Materiales y reactivos 1. Eritrocitos de una especie adecuada (pollo, ganso, cobayo o seres humanos grupo 0 procesados con tripsina) obtenidos en solu­ ción de Alsever o heparina. 2. Diluyente de pH adecuado. 3. Soluciones para eliminar las hemaglutininas inespecíficas del suero. 4. Medio de cultivo infectado o antígeno estándar para serología. III. Control de calidad A. Suero positivo conocido. B. Suero negativo conocido. C. Suero y células sin antígeno (para detectar aglutinación inespecífica). D. Titulación de la actividad hemaglutinante del antígeno (para asegurarse de que en la prueba se utilizan 4 unidades hemaglutinantes [UHA]). IV. Procedimiento A. Determinación del título hemaglutinante 1. Se incuba una suspensión diluida de eritrocitos a 4 °C o a temperatura ambiente con diluciones seriadas del antígeno hasta que los eritrocitos de los tubos sin virus sedimenten en forma de botón compacto (1 a 4 horas). La mayor dilución que produce hema­ glutinación parcial o completa representa 1 UHA. B. Tratamiento del suero 1. Para la mayoría de los virus es necesario eliminar los inhibidores inespecíficos presentes en el suero. Esta eliminación puede efectuarse por medios físicos, como el caolín; por medio de enzimas, como la neuraminidasa o la enzima destructora de los receptores de Vibrio cholerae, o por una combinación de estos métodos. La elección varía de acuerdo con el virus en estudio. C. Prueba de inhibición 1. Se mezcla una dilución de antígeno que contenga 4 UHA con los glóbulos rojos adecuados y diluciones seriadas al medio del suero tratado. La suspensión se incuba de la misma forma descrita para la prueba de hemaglutinación. V. Resultados A. Interpretación El punto final es la última cubeta en la que se observa aglutinación parcial o completa de los eritrocitos. Una película de bordes dentados o un botón irregular indican aglutinación. La observación de cómo se mueve el sedimento de eritrocitos cuando se incli­ na la placa puede ayudar a aclarar el punto final. VI. Bibliografía Hsiung GD. Diagnostic Virology. 3a ed. New Haven. CT: Yale University Press, 1982. Lennette EH, Schmidt NJ eds. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, 5a ed. Washington DC: American Public Health Association, 1979. Smith TF Viruses. En: Washington JA, ed. Laboratory Procedures in Clinical Microbiology, 2a ed. Nueva York: Springer-Verlag, 1985.

Protocolos

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P r o t o c o l o 6-1

O -N lTR O FE N ÍL -p-D -G A L A C T O PIR A N Ó SID O

1. Principio El o-nitrofenil-p-D-galactopiranósido (ONPG) tiene estructura similar a la lactosa, excepto porque la glucosa ha sido sustituida por un grupo ortonitrofenilo, como se muestra en la siguiente reacción química:

ORTONITROFENIL-p-o-GALACTOPIRANÓSIDO CH2OH

CH.OH h 2o

N° 2

p-galactosidasa

-O

HO ,OH

H/ OH

H O rto n itro fe n il-p -D -g a la c to p ira n ó s id o

OH

Galactosa

Ortonítrofenol

(ONPG) (Incoloro)

II.

III.

IV.

V.

(Amarillo)

Por hidrólisis, a través de la acción de la enzima P-galactosidasa, el ONPG produce dos residuos: galactosa y o-nitrofenol. El ONPG es un compuesto incoloro: el o-nitrofenol es amarillo, lo que permite la visualización de la hidrólisis. Las bacterias fermentadoras de lactosa tienen tanto lactosa permeasa como P-galactosidasa. dos enzimas necesarias para la produc­ ción de ácido en la prueba de fermentación de la lactosa. La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa pueda penetrar en el interior de la célula bacteriana, donde la P-galactosidasa puede degradar el puente galactósido y producir glucosa y galactosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa carecen de ambas enzimas y son incapaces de producir ácido a partir de la lactosa. Algunas espe­ cies bacterianas parecen ser no fermentadoras de la lactosa debido a que carecen de permeasa, pero tienen P-galactosidasa y dan una reacción de ONPG positiva. Estos denominados fermentadores lentos de la lactosa pueden producir ácido en forma tardía a partir de la lactosa debido a la actividad permeasa deficiente. En estos casos, una prueba ONPG positiva puede proporcionar una identificación rápida de la fermentación retardada de la lactosa. Medios y reactivos 1. Buffer fosfato de sodio, 1 M, pH 7. 2. o-nitrofenil-P-D-galactopiranósido (ONPG), 0.75 M (se dispone en el comercio de comprimidos de ONPG amortiguado). 3. Solución fisiológica. 4. Tolueno. Control de calidad A. Control positivo: Escherichia coli. B. Control negativo: especies de Proteus. Procedimiento Las bacterias que se han desarrollado en medios que contienen lactosa, como el agar hierro de Kligler (KIA) o el agar triple azúcar hie­ rro (TSI), producen resultados óptimos en la prueba ONPG, Se emulsiona un ansa de bacterias en 0,5 mL de solución fisiológica para producir una suspensión densa. Se agrega una gota de tolueno a la suspensión y se mezcla enérgicamente durante algunos segundos para liberar la enzima de las células bacterianas. Se agrega una cantidad igual de solución mortiguada de ONPG a la suspensión y la mezcla se coloca en baño María a 37 °C. Cuando se utilizan comprimidos de ONPG se agrega un ansa de suspensión bacteriana directamente al sustrato ONPG que se obtiene mediante el agregado de 1 mL de agua destilada al comprimido en un tubo de ensayo. Esta suspensión también se coloca a 37 °C en baño María. Resultados A. Interpretación La velocidad de hidrólisis del ONPG a o-nitrofenol puede ser rápida en el caso de algunos microorganismos y produce un color amarillo visible en el término de 5 a 10 minutos (véase lámina en color 6-4A). La mayoría de las pruebas son positivas dentro de la hora: sin embargo, las reacciones no deben considerarse negativas antes de las 24 horas de incubación. El color amarillo suele ser bien definido e indica que el microorganismo ha producido o-nitrofenol a partir del sustrato de ONPG por acción de la p-galactosi­ dasa.

1392

Protocolos

P ro tocolo 6-1

o - N it r o f e n il - P - d -g a l a c t o p ir a n ó s id o

(cont.)

VI. Bibliografía Belliveau RR, Grayson JW Jr. Butler, TJ. A rapid, simple method of identifying Enterobateriaceae. Am J Clin Pathol 1968;50:I26128. Blazevic DJ, Ederer GM. Principies o f Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley, 1975:83-85. Lederberg J. The beta-c/ -galactosidase o f Escherichia coli, strain K-12. J Bacteriol 1950:60:381-392. Lowe GH. The rapid detection of lactose fermentation in paracolon organisms by the demonstration of P-galactosidase. J Med Lab Technol 1962;19:21-25. MacFaddin JE. Biochemical Tests for Identification o f Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams &Wilkins, 1980:120-128.

P rotocolo 6-2

R e d u c c ió n

d e n it r a t o s : a p l ic a c io n e s g e n e r a l e s

I. Principio La capacidad de un microorganismo para reducir los nitratos a nitritos es una característica importante, que se utiliza para identificar y diferenciar especies de muchos grupos de microorganismos. Todas las Enterobacteriaceae, excepto ciertos biotipos de Pantoa agglomerans y ciertas especies de Serraría y Yersinia, reducen los nitratos. La prueba también es de utilidad para identificar miembros de los géneros Haemophilus, Neisseria y Moraxella. Los microorganismos que reducen los nitratos pueden extraer oxígeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reduc­ ción. La ecuación química es NO,- + 2e- + 2H NO, + H ,0 Nitrato Nitrito La presencia de nitritos en el medio de prueba se detecta por el agregado de a-naftilamina y ácido sulfanílico, con formación de un colorante rojo de diazonio, p-sulfobencenoazo-a-naftilamina. Véase la figura del protocolo 19-12. II. Medios y reactivos A. Caldo o agar (pico de flauta) para nitratos E x tra c to d e c a rn e P e p to n a N itra to d e p o ta s io ( K N 0 3) A g a r (lib re d e n itrito s ) A g u a d e s tila d a e s p

3 g 5 g 1 g 12 g 1 L

B. Reactivo A a -n a ftila m in a Á c id o a c é tic o (5 N ), 3 0 %

5 g 1 L

C. Reactivo B Á c id o s u lfa n ílic o Á c id o a c é tic o (5 N ), 3 0 %

8 g 1 L

III. Control de calidad Es importante probar cada lote nuevo de medio y cada preparación nueva de los reactivos de prueba con reacciones negativas y positi­ vas. Se sugieren los siguientes microorganismos: A. Control positivo: Escherichia coli. B. Control negativo: Acinetobacter baumannii. IV. Procedimiento 1. Inocular el medio para nitratos con un ansa con los microorganismos en estudio aislados en cultivo puro en agar e incubarlo a 35 °C durante 18 a 24 horas. 2. Finalizada la incubación, agregar 1 mL de cada uno de los reactivos A y B al medio de prueba, en ese orden.

Protocolos

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P rotocolo 6-2

R e d u c c i ó n d e n i t r a t o s : a p l i c a c i o n e s g e n e r a l e s ( c o n t.)

V. Resultados A. Interpretación El desarrollo de color rojo dentro de los 30 segundos después de agregar los reactivos de prueba indica la presencia de nitritos y representa una reacción positiva para reducción de nitratos (véase lámina en color 6-1H). Si no se observa color después de agregar los reactivos de prueba, esto puede indicar que no se han reducido los nitratos (reacción realmente negativa) o que han sido reduci­ dos a productos diferentes de los nitritos, como amoníaco, nitrógeno molecular (denitrificación), óxido nítrico (NO) u óxido nitro­ so (N ,0 ) e hidroxilamina. Como los reactivos de prueba sólo detectan nitritos, los últimos procesos dan resultados falsos negativos. Por lo tanto, es necesario agregar una pequeña cantidad de polvo de cinc a todas las reacciones negativas. Los iones cinc reducen los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo después de agregar el polvo de cinc indica la presencia de nitratos residuales y confirma que la reacción es verdaderamente negativa. VI. Bibliografía Finegold SM, Martin WJ. Scott EG. Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, 5a ed. St. Louis: Mosby, 1978:490. MacFaddin JE Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:236-245. Wallace GI, Neave SL. The nitrite test as applied to bacterial cultures. J Bacteriol 1927;14:377-384.

P rotocolo 6-3

R o jo

d e m e t il o

I. Principio El rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (amarillo) y 4,4 (rojo). El pH al cual el rojo de metilo detecta los ácidos es mucho másibajo que el pH correspondiente a otros indicadores utilizados en medios de cultivo bacteriológicos. Por lo tanto, para provocar un cambio de color, el microorganismo en estudio debe producir grandes cantidades de ácido del sustrato de hidratos de car­ bono que se utilice. La prueba del rojo de metilo es una prueba cuantitativa de la producción de ácido, que requiere que los microorganismos positivos produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico) de la glucosa a través de la vía de fermentación ácida mixta (véase fig. 6-2). Como muchas especies de la familia Enterobacteriaceae pueden producir suficientes cantidades de ácidos fuertes que pueden detectarse mediante el indicador rojo de metilo durante las fases iniciales de la incubación, sólo los microorganismos que pueden mantener este pH bajo después de incubaciones prolongadas (48 a 72 horas), superando el sistema buffer del medio, pueden ser llamadas positivas para rojo de metilo.

R E A C C IÓ N D E L R O J O D E M E T IL O C H 2O H Ó.

H /l

V\ O H

H Ol

h

OH H

COOH

de E m b d e n -M y e rh o ff

V ía d e á c id o s --------------------- ► Á c id o s m ix to s + m ix to s

2 C 02

OH

a -D -g lu c o s a

Q

O 2 H 3C — C,

H

\

V ía m e ta b ó lic a g lu c o lítlc a

Á c id o p irú v ic o

Ip H

D ió x id o d e c a rb o n o

R o jo d e m e tilo ----------------------------------------------------------------------------------------------------- ► R ojo d e m e tilo (A m a rillo )

(R o jo )

pH 6 ,0

pH 4 ,4 o m e n o r

II. Medios y reactivos El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metilo-Voges-Proskauer (MR/VP) según la fórmula de Clark y Lubs. Este medio también sirve para realizar la prueba de Voges-Proskauer.

1394

Protocolos

P rotocolo 6-3

R o jo

d e m e t il o

(cont.)

A. Caldo VP/RM P o lip e p to n a G lu c o s a F o s fa to d ip o tá s ic o A g u a d e s tila d a , es p pH fin a l = 6,9

III.

IV.

V.

VI.

79

5g 5g 1 L

B. Indicador de pH rojo de metilo. Rojo de metilo, 0,1 g en 300 mL de alcohol etílico al 95%. Agua destilada, 200 mL. Control de calidad Realizar controles positivos y negativos después de la preparación de cada lote de medio y luego de hacer cada lote de reactivos. Los controles sugeridos son los siguientes: A. Control positivo: Escherichia coli. B. Control negativo: Enterobacter aerogenes. Procedimiento 1. Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo en estudio. Incubar el caldo a 35 °C durante 48 a 72 horas (no menos de 48 horas). 2. Finalizada la incubación, agregar 5 gotas del reactivo de rojo de fenol directamente al caldo. Resultados A. Interpretación El desarrollo de color rojo estable en la superficie del medio indica la suficiente producción de ácido como para disminuir el pH a 4,4 y constituye una prueba positiva (véase lámina en color 6-4C). Como otros microorganismos pueden producir pequeñas canti­ dades de ácido del sustrato probado, puede observarse un color naranja, intermedio entre amarillo y rojo. Esto no indica una prue­ ba positiva. Bibliografía Barry AL. et al. Improved 18-hour methyl red test. Appl Microbiol 1970:20:866-870. Blazevic DJ. Ederer GM. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley, 1975:75-77. Clark WM. Lubs HA. The differentiation of bacteria of the colon-aerogenes family by the use o f indicators. J Infect Dis 1915; 17:160. MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:209-214.

P rotocolo 6-4

P rueba

de

V

o g e s-P r o sk a u er

I. Principio Voges-Proskauer es un epónimo doble, en honor de dos microbiólogos que trabajaron a principios del siglo xx. Estos investigadores fueron los primeros en observar la reacción de color rojo producida en medios de cultivo adecuados después del tratamiento con hidró­ xido de potasio. Luego se descubrió que el producto activo del medio, formado por el metabolismo bacteriano, es el acetil metil car­ binol, producto de la vía del butilenglicol. El ácido pirúvico, el principal compuesto formado durante la degradación fermentativa de la glucosa, se metaboliza más tarde a tra­ vés de diferentes vías metabólicas, según los sistemas enzimáticos que tengan las diferentes bacterias. Una de esas vías da como resul­ tado la producción de acetoína (acetil metil carbinol), un producto final de reacción neutra. Los microorganismos del grupo KlebsiellaEnterobacter-Hafnia-Serratia producen acetoína como producto metabólico final principal del metabolismo de la glucosa y forman cantidades pequeñas de ácidos mixtos. En presencia de oxígeno atmosférico e hidróxido de potasio al 40%, la acetoína se convierte a diacetilo y el a-naftol sirve de catalizador para producir un complejo de color rojo.

Protocolos

1395

P ro tocolo 6-4

P r u e b a d e V o g e s - P r o s k a u e r ( c o n t.)

V ía g lu c o lític a -----------------------------------► 2 H 3C — C d e E m b d e n -M y e rh o ff x COOH

. OH H

Vía del -►

.O

I

HO— C— C

b u tile n g lic o l

+

2 C 02

"C H 3 CH3

H

OH

a -D -g lu c o s a

-►

Á c id o p irú v ico

A c e to ín a (A M C )

D ió x id o d e c a rb o n o

□ „04 -o f --- ^ ---- ^„,C-<0 CH, I

CH,

Xc '

on,

■,

A c e to ín a

□

D ia c e tilo

H3C ~ c f

ch3

+

NH II HN — C — N H 2

C o n d e n s a c ió n ► P ro d u c to ro s a a rojo

I

II

R

O D ia c e tilo

G ru p o g u a n id in o (a rg in in a )

C o lo ra n te

II. Medios y reactivos A. Medios 1. El medio es el caldo MR/VP descrito en el protocolo 6-3. B. Reactivos 1. oc-naftol al 5%. intensificador de color a -n a fto l A lc o h o l e tílic o a b s o lu to

5 g 100 m L

2. Hidróxido de potasio al 40%, agente oxidante H id ró x id o d e p o ta s io A g u a d e s tila d a e s p

40 g 100 m L

III. Control de calidad Deben hacerse controles negativos y positivos después de la preparación de cada lote de medio y de cada lote de reactivos. Los con­ troles sugeridos son los siguientes: A. Control positivo: Enterobacter aerogenes. B. Control negativo: Escherichia coli. IV. Procedimiento Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo por probar. Incubar 24 horas a 35 °C. Finalizada la incuba­ ción, transferir 1 mL del caldo a un tubo de ensayo limpio. Agregar 0,6 mL de a-naftol al 5%, seguidos de 0,2 mL de KOH al 40%. Es esencial que los reactivos sean agregados en ese orden. Agitar suavemente el tubo para exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejar el tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.

1396

Protocolos

P ro to c o lo 6-4

Prueba

de

V o g es-P r o sk a u er

(cont.)

V. Resultados A. Interpretación El desarrollo de color rojo 15 minutos o más después del agregado de los reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el produc­ to de oxidación de la acetoína, constituye una prueba positiva (véase lámina en color 6-4D). La prueba no debe leerse más allá de una hora después de dejar los tubos en reposo, porque los cultivos Voges-Proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, que se puede interpretar como un positivo falso. VI. Bibliografía Barritt MM. The intensifícation of the Voges-Proskauer reaction by the addition of a-naftol. J Pathol Bacteriol 1936;42:441-454. Barry AL, Feeney KL. Two quick methods for Voges-Proskauer test. Appl Microbiol 1967; 15:1138-1141. Blazevic DJ. Ederer GM. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley. 1975:105-107. MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification o f Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:308-320. Voges O, Proskauer B. Beitrag zur Ernáhrungsphysiologie und zur Differential-diagnose der Bakterien der hámorrhagischen Septicaemia. Z Hyg 1898;28:20-32.

P rotocolo 6-5

U

t il iz a c ió n d e l c it r a t o

I. Principio El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, compuesto orgánico simple que se encuentra como uno de los metabolitos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (ciclo de Krebs). Algunas bacterias pueden obtener energía de fuentes distintas de la fermentación de los hidratos de carbono, con el citrato como única fuente de carbono. La medición de esta característica es importante para identificar muchos miembros de la familia Enterobacteriaceae. Cualquier medio usado para detectar la utilización del citrato por las bacterias que se van a probar debe carecer de proteínas e hidratos de carbono como fuente de carbono. La utilización del citrato por la bacteria que se va a probar se detecta en el medio de citrato por la producción de subproductos alca­ linos. El medio contiene citrato de sodio, que es un anión, como única fuente de carbono, y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar el citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amo­ níaco (NH+), lo que produce la alcalinización del medio por conversión del N H ;\ a hidróxido de amonio (NH4OH). El indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de pH 6 y azul por encima de pH 7,6.

P R U E B A D E L C IT R A T O

E nzim a C itra to d e s o d io ------------- > - P ro d u c to s m e ta b ó lic o s a lc a lin o s - T p H A z u l d e b ro m o tim o l ------------- ► A z u l d e b ro m o tim o l (V erd e) (A zu l) pH 6 ,9 pH 7,6

II. Medios y reactivos El medio para citrato utilizado con mayor frecuencia es la fórmula de Simmons. El medio se coloca en tubos inclinados (agar en pico de flauta). La fórmula del medio de citrato de Simmons es la siguiente:

Protocolos

1397

P rotocolo 6-5

U

t il iz a c ió n d e l c it r a t o

(cont.)

F o s fa to d e a m o n io d ih id ro g e n a d o F o s fa to d ip o tá s ic o C lo ru ro d e s o d io C itra to d e s o d io S u lfa to d e m a g n e s io A gar A zu l d e b ro m o tim o l A g u a d e s tila d a c s p pH fin a l = 6 ,9

1g

1g 5g 2g 0 ,2 0 15 0 ,0 8 1

g g g L

III. Control de calidad Cada lote nuevo de medio debe ser probado con un microorganismo de reacción positiva y uno de reacción negativa. Las siguientes especies son los controles sugeridos: A. Control positivo: Enterobacter aerogenes. B. Control negativo: Escherichia coli. IV. Procedimiento 1. Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario y se siembra en forma de estría única en el pico de flauta (agar inclinado) del tubo de agar citrato. El tubo se incuba a 35 °C durante 24 a 48 horas. V. Resultados A. Interpretación La prueba positiva está representada por la producción de color azul oscuro en el término de 24 a 48 horas, que indica que el micro­ organismo en prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con formación de productos alcalinos (véase lámi­ na en color 6-4D). La prueba también puede considerarse positiva sin que haya color azul, si hay desarrollo visible en la estría de siembra. Esto es válido porque para que el desarrollo sea visible, el microorganismo debió haber ingresado en la fase logarítmica de crecimiento, lo que sólo es posible si ha asimilado carbono y nitrógeno. Una interpretación positiva basada en la lectura del trazo se puede confirmar incubando el tubo durante 24 horas más, momento en que habitualmente se produce el color azul. VI. Bibliografía BBL Manual of Products and Laboratory Procedures, 5a ed. Cockeysville MD: BioQuest, 1968:115,138. Blazevic DJ. Ederer GM. Principies o f Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley, 1975:15-18. Koser SA. Utilization of the salts o f organic acids by the colon-aerogenes groups. J Bacteriol 1923;8:493-520. MacFaddin JE. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:59-63. Simmons JS. A culture médium for differentiating organisms of typhoid-colon aerogenes groups and for isolation of certain fungi. J Infect Dis 1926;39:209-214.

P rotocolo 6-6

Prueba

d e l a u r e a s a : c o n v e n c io n a l

I. Principio La urea es una diamida del ácido carbónico con la fórmula

O II NH2 — C — NH, Todas las amidas se hidrolizan fácilmente, con liberación de amoníaco y dióxido de carbono. La ureasa es una enzima que tienen muchas especies de microorganismos que pueden hidrolizar la urea según la siguiente reacción quí­ mica

NH, + 2HOH

CO, + H ,0 + 2NH3 ; = ± (NH4)2CO} Ureasa

1398

Protocolos

P ro tocolo 6-6

P rueba

d e l a u r e a s a : c o n v e n c io n a l

(cont.)

El amoníaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, lo que produce alcalinización y aumento de pH del medio.

M E C A N IS M O D E L A R E A C C IÓ N D E LA U R E A S A /N H 2

U re a s a

n

I 'lil3

□

nh

T

C.

.

U re a

Agua

E n z im a A m O n ia C U

U IO X IQ O

d e c a rb o n o F e n o lfta le ín a

B

A m o n ía c o -------------------►

F e n o lfta le ín a

(In c o lo ra )

(R o s a -ro jo )

pH < 8,1

pH > 8,1

II. Medios y reactivos Los dos medios utilizados con mayor frecuencia en los laboratorios clínicos para la detección de actividad ureasa son el caldo urea de Stuart y el agar urea de Christensen. C ALD O UREA DE STUART E x tra c to d e le v a d u ra F o s fa to m o n o p o tá s ic o F o s fa to d is ó d ic o U rea R o jo fe n o l A g u a d e s tila d a e s p

pH fin a l = 6,8

A G A R U R E A D E C H R IS T E N S E N 0,1 9,1 9,5 20 0,01 1

g g g g g L

P e p to n a 19 G lu c o s a 1g C lo ru ro d e s o d io 5g F o s fa to m o n o p o tá s ic o 2g U rea 20 g R o jo fe n o l 0 ,0 1 2 g A gar 15 g A g u a d e s tila d a esp 1 L pH fin a l = 6,8

III. Control de calidad Deben probarse microorganismos de reacción positiva y negativa con cada nuevo lote de medio. Se sugieren los siguientes microorga­ nismos: A. Control positivo: especies de Proteus. B. Control positivo (débil): especies de Klebsiella. C. Control negativo: Escherichia coli. IV. Procedimiento El medio líquido se siembra con un ansa de cultivo puro del microorganismo por probar; la superficie inclinada del agar (pico de flau­ ta) se siembra en estría con el microorganismo por probar. Ambos medios se incuban a 35 °C durante 18 a 24 horas. V. Resultados A. Interpretación Los microorganismos que hidrolizan la urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en l o 2 horas; las especies menos activas pueden requerir 3 días o más. Las reacciones son las siguientes: 1. Caldo de Stuart Un color rojo en todo el medio indica alcalinización e hidrólisis de la urea. 2. Agar de Christensen Degradadores rápidos de la urea (especies de Proteus): color rojo en todo el medio. Degradadores lentos de la urea (especies de Klebsiella): inicialmente color rojo sólo en el pico de flauta, que gradualmente se extiende a todo el tubo. 3. Ausencia de hidrólisis de la urea: el medio conserva su color amarillo original (véase lámina en color 6-4E).

Protocolos

1399

P rotocolo 6-6

P r u e b a d e l a u r e a s a : c o n v e n c i o n a l ( c o n t.)

VI. Bibliografía BBL Manual of Products and Laboratory Procedures, 5a ed. Cockeysville MD: Bio-Quest, 1968:154. Christensen WB. Urea decomposition as a means o f differentiating Proteus and paracolon cultures from each other and from Salmonella and Shigella types. J Bacteriol 1946;52:461-466. MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:298-308. Stuart CA, Van Stratum E, Rustigian R. Further studies on urease production by Proteus and related organisms. J Bacteriol 1945:49:437-444.

P rotocolo 6-7

D

e sc a r b o x il a s a s

I. Principio Las descarboxilasas son un grupo de enzimas con sustrato específico capaces de reaccionar con el residuo carboxilo (COOH) de los aminoácidos, para formar aminas de reacción alcalina. Esta reacción, conocida como descarboxilación, forma dióxido de carbono como producto secundario. Cada descarboxilasa es específica para un aminoácido. Los tres aminoácidos que se prueban habitualmente para la identificación de las Enterobacteriaceae son lisina, ornitina y arginina. Los productos animados específicos son los siguientes: Lisina —> cadaverina Ornitina —> putrescina Arginina -> citrulina La conversión de arginina a citrulina es una reacción de dihidrolasa y no de descarboxilasa, en la que un grupo NH, se elimina de la arginina como primer paso. La citrulina se convierte a continuación a ornitina. que a su vez se descarboxila para formar putrescina. El medio para descarboxilasas de Moeller es la base utilizada con mayor frecuencia para determinar la capacidad de descarboxila­ ción de Enterobacteriaceae. El aminoácido por probar se agrega a la base de descarboxilasa antes de la siembra con el microorganis­ mo en estudio. También debe sembrarse en paralelo un tubo control, que contiene la base sin el aminoácido agregado. Ambos tubos se incuban en condiciones anaerobias, lo que se logra cubriendo la siembra con una capa de vaselina líquida. Al principio de la incuba­ ción ambos tubos viran al amarillo, debido a la fermentación de la pequeña cantidad de glucosa que contiene el medio. Si el aminoá­ cido es descarboxilado, se forman aminas alcalinas y el medio vira nuevamente a su color púrpura original.

M E C A N IS M O D E LA R E A C C IÓ N D E

NH:

Q

L IS IN A D E S C A R B O X IL A S A

H2N - C - H

U s in a d e s c a rb o x ila s a

COOH E n z im a C a d a v e rin a

L -lisin a

B

P ú rp u ra d e b ro m o c re s o l

D ió x id o d e c a rb o n o

C a d a v e rin a -► P ú rp u ra d e b ro m o c re s o l

(A m a rillo )

(P ú rp u ra -la v a n d a )

pH < 5,2

pH > 5,2

1400

Protocolos

P ro tocolo 6-7

D

e sc a r b o x il a s a s

(cont.)

II. Medios y reactivos A. Caldo base de Moeller para descarboxilasa P e p to n a E x tra c to d e c a rn e P ú rp u ra d e b ro m o c re s o l R o jo c re s o l G lu c o s a P irid o x a l A g u a d e s tila d a es p pH fin a l = 6

5g 5g 0,01 g 0 ,0 0 5 g 0 ,5 g 0 ,0 0 5 g 1 L

B. Aminoácido Agregar 10 g (concentración final = 1%) de la forma L (levo) del aminoácido (lisina, omitina o arginina). Duplicar esta cantidad si se utiliza la forma d (dextro)- l , debido a que sólo es activa la forma L. III. Control de calidad Los siguientes microorganismos son los sugeridos como controles positivos y negativos: A M IN O Á C ID O

C O N T R O L P O S IT IV O

C O N T R O L N E G A T IV O

L is in a O rn itin a A rg in in a

Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae

Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae Enterobacter aerogenes

IV. Procedimiento Sembrar dos tubos de medio de descarboxilasa de Moeller. uno con el aminoácido por probar y el otro sin aminoácido, que será usado como control, a partir de una colonia aislada del microorganismo en estudio que previamente se desarrolló en agar de aislamiento pri­ mario. Cubrir ambas superficies de siembra con vaselina líquida estéril, hasta aproximadamente 1 cm por encima de la superficie e incu­ bar a 35 °C durante 18 a 24 horas. V. Resultados A. Interpretación El viraje del tubo control a color amarillo indica que el microorganismo es viable y que el pH del medio ha descendido lo suficien­ te como para activar las enzimas descarboxilasas. La reversión del tubo que contiene el aminoácido a un color azul púrpura indica una prueba positiva, debido a la formación de aminas a partir de la reacción de descarboxilación (véase lámina en color 6-4F). VI. Bibliografía Blazevic DJ. Ederer GM. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley, 1975:29-36. Carlquist PR. A biochemical test for separating paracolon groups. J Bacteriol 1956;71:339-341. Falkow S. Activity of lysine decarboxylase as an aid in the identification of salmonellae and shigellae. Am J Clin Pathol 1958;29:598600. Gale EF. The bacterial amino acid decarboxylases. En: Nord FF, ed. Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. Vol. 6. Nueva York: Interscience Publishers, 1946. MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:78-93. Moeller V. Simplified tests for some amino acid decarboxylases and for the arginine dihydrolase system. Acta Pathol Microbiol Scand 1955;36:158-172.

Protocolos

1401

P r o t o c o l o 6 -8

F e n il a l a n in a

d e s a m in a s a

I. Principio La fenilalanina es un aminoácido que forma un cetoácido por desanimación, el ácido fenilpirúvico. Entre las Enterobacteriaceae, sólo los miembros de los géneros Proteus, Morganella y Providencia tienen la enzima desaminasa necesaria para esta conversión. La prueba de la fenilalanina se basa en la detección de ácido fenilpirúvico en el medio de prueba después del desarrollo del microor­ ganismo en estudio. La prueba es positiva si se observa color verde después del agregado de una solución de cloruro fénico al 10%.

M E C A N IS M O DE R E A C C IÓ N DE LA FE N ILA LA N IN A D E S A M IN A S A

.O '/

COOH

NHaT

'C O O H (F e n ila la n in a d e s a m in a s a )

(E n z im a ) L -fe n ila la n in a -------------------------- ► A c id o fe n ilp irú v ic o

□

Á c id o fe n ilp irú v ic o

+ ló n fé rric o (F e *++)

Á c id o

A m o n ia c o

► C o m p le jo v e rd e

II. Medios y reactivos Se vierte agar fenilalanina en un tubo inclinado para formar un pico de flauta. No pueden utilizarse extractos de carne o hidrolizados proteicos debido a su contenido natural, variable, de fenilalanina. El extracto de levadura sirve como fuente de carbono y nitrógeno. La fórmula es la que se muestra a continuación: Medio: D L - f e n ila la n in a

E x tra c to d e le v a d u ra C lo ru ro d e s o d io F o s fa to d is ó d ic o A gar A g u a d e s tila d a c s p p H = 7 ,3

2 g 3 g 5 g 1 g 12g 1 L

Reactivo: C lo ru ro fé rric o H C I c o n c e n tra d o A g u a d e s tila d a c s p

12 g 2 ,5 m L 100 m L

III. Control de calidad Cada lote nuevo de medio o reactivo debe probarse con microorganismos de reacción positiva o negativa. Se sugieren los siguientes: A. Control positivo: especies de Proteus. B. Control negativo: Escherichia coli.

1402

Protocolos

P rotocolo 6-8

F e n il a l a n in a

d e s a m in a s a

(cont.)

IV. Procedimiento El agar inclinado (pico de flauta) se siembra con una sola colonia del microorganismo en un estudio, aislado en un cultivo puro pri­ mario en agar en placa. Después de una incubación a 35 °C durante 18 a 24 horas, se agregan 4 o 5 gotas de reactivo de cloruro férri­ co directamente sobre la superficie del agar. A medida que se agrega el reactivo, se rota el tubo para desprender las colonias de la super­ ficie. V. Resultados A. Interpretación La aparición inmediata de color verde intenso indica la presencia de ácido fenilpirúvico y la prueba es positiva (véase lámina en color 6-4E). VI. Bibliografía Blazevic DJ, Ederer GM. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley, 1975:23-28. Hendriksen SD. A comparison of the phenylpyruvic acid reaction and urease test in the differentiation of Proteus from other enteric organisms. J Bacteriol 1950;60:225-231. Hendriksen SD. Closs K. The production of phenylpyruvic acid by bacteria. Acta Pathol Microbiol Scand 1938;15:101-113. MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:269-274. Shaw C, Clarke PH. Biochemical classification of Proteus and Providencia cultures. J Gen Microbiol 1955;13:155-161.

P rotocolo 7-1

P rueba

d e o x id a c ió n - f e r m e n t a c ió n

(H u g h

y

L e if s o n )

I. Principio Los microorganismos sacarolíticos degradan la glucosa, ya sea por fermentación o por oxidación, como se muestra en la figura 7-1. Los productos finales de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que pueden detectarse en un medio convencional de fermentación. Sin embargo, los ácidos formados por degradación oxidativa de la glucosa son en extremo débiles y para detectarlos es necesario el medio más sensible de oxidación-fermentación de Hugh y Leifson (medio OF). El medio OF de Hugh y Leifson difiere de los medios para fermentación de hidratos de carbono en los siguientes aspectos: La concentración de peptona se reduce del \% al 0,2%. La concentración del hidrato de carbono aumenta del 0.5% al 1,0%. La concentración de agar se reduce del 1.5% al 0,3%, lo que hace que el medio sea semisólido. La baja relación proteína/hidratos de carbono reduce la formación de aminas alcalinas que pueden neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles que pueden formarse a partir del metabolismo oxidativo. Las cantidades relativamente elevadas de hidratos de carbo­ no sirven para aumentar la cantidad de ácido que es posible formar. La consistencia semisólida del agar permite que los ácidos que se forman en su superficie se difundan a través del medio, lo que facilita la visualización del cambio de pH del indicador. En este medio también puede observarse la motilidad. II. Medios y reactivos A continuación, se muestran las fórmulas de un medio convencional para fermentación de hidratos de carbono y del medio OF para su comparación: M E D IO P A R A F E R M E N T A C IO N D E H ID R A T O S D E C A R B O N O

M E D IO D E H U G H Y L E IF S O N

P e p to n a C lo ru ro d e s o d io D -g lu c o sa P ú rp u ra d e b ro m o c re s o l A g a r* A g u a d e s tila d a e s p pH = 7 ,0

P e p to n a C lo ru ro d e s o d io D -g lu c o sa A zu l d e b ro m o tim o l A gar F o s fa to d ip o tá s ic o A g u a d e s tila d a e s p

10 g

5g 5 0 ,0 2 15 1

g g g L

pH 7,1

2 g

5g 10 g 0 ,0 3 g 3 g 0 ,3 0 g 1 L

Protocolos

1403

P rotocolo 7-1

P r u e b a d e o x i d a c i ó n - f e r m e n t a c i ó n ( H u g h y L e i f s o n ) ( c o n t.)

Las reacciones para azúcares del medio OF enumeradas en las tablas de Weaver de los CDC, descritas en el capítulo 7. se basan en pruebas con una base “especial” con rojo fenol como indicador: Bacto casitone, 2 g Bacto agar, 3 g Rojo fenol, solución acuosa al 1,5%, 2 mL Agua destilada hasta completar 1 L El medio basal se ajusta a pH 7,3 y se coloca en autoclave. Las soluciones de hidratos de carbono se esterilizan a través de un filtro Seitz y se agregan al medio base hasta una concentración final del 1%. Los estudios realizados en los CDC revelaron que la correla­ ción de los resultados de la prueba entre el medio de Difeo y el medio basal especial OF de los CDC era excelente y que puede usarse cualquiera de ellos cuando se utilizan las tablas de Weaver para la interpretación. El medio OF debe vertirse sin formar un pico de flauta en tubos con un diámetro interno de 15 a 20 mm para incrementar la super­ ficie. III. Control de calidad A. Fermentador de glucosa: Escherichia coli. B. Oxidador de glucosa: Pseudomonas aeruginosa. C. No sacarolítico: especies de Moraxella. IV. Procedimiento Se necesitan dos tubos para la prueba OF, ambos sembrados con el microorganismo desconocido mediante un ansa recta; es preciso sembrar en profundidad tres a cuatro veces hasta la mitad de la distancia existente hasta el fondo del tubo. Un tubo de cada par se cubre con una capa de 1 cm de vaselina líquida estéril o parafina fundida, y el otro se deja expuesto al aire. Incubar ambos tubos a 35 °C y observar a diario durante varios días. V. Resultados A. Interpretación La producción de ácido se detecta en el medio por la aparición de color amarillo. En el caso de los microorganismos oxidativos, la producción de color se puede notar primero cerca de la superficie del medio. Los patrones de reacción son los siguientes: T U B O A B IE R T O

T U B O S C U B IE R T O S

M E T A B O L IS M O

Á c id o (a m a rillo ) Á c id o (a m a rillo ) A lc a lin o (v e rd e o a z u l)

A lc a lin o (v e rd e ) Á c id o (a m a rillo ) A lc a lin o (v e rd e o a z u l)

O x id a tiv o F e rm e n ta tiv o N o s a c a ro lític o

Estas reacciones se muestran en la lámina en color 7 -ID. Para las especies de desarrollo lento, puede necesitarse una incubación durante 3 días o más para detectar las reacciones positivas. VI. Bibliografía BBL Manual of Products and Laboratory Procedures, 5a ed. Cockeysville MD: BioQuest, 1973:129-130. Hugh R, Leifson E. The taxonomic significance o f fermentative versus oxidative metabolism o f carbohydrates by various gram-negative bacilli. J Bacteriol 1953;66:24-26. MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:260-268.

P rotocolo 7-2

T in c ió n

para flagelos

I. Principio La mayoría de las bacterias móviles tienen flagelos, cuyas formas, cantidad y posición son características importantes para la identifi­ cación de géneros y especies, en particular cuando las reacciones bioquímicas son débiles o confusas. La técnica de coloración de Leifson (o sus modificaciones) es la empleada con mayor frecuencia en los laboratorios clínicos y no es difícil de realizar, siempre y cuando se sigan los detalles exactos de cada paso del procedimiento. Los flagelos bacterianos pueden colorearse con soluciones alcohólicas de colorantes de rosanilina, que forman un precipitado cuan­ do el alcohol se evapora durante el procedimiento de coloración. Se utiliza fucsina básica (acetato de pararosanilina) como colorante principal con el agregado de ácido tánico a la solución, como mordiente. Se puede utilizar un colorante de contraste, como el azul de metileno, para visualizar mejor las bacterias, en los casos en que la coloración principal es débil o no reacciona en absoluto con la pared celular de la bacteria.

1404

Protocolos

P r o t o c o lo

T in c ió n

7-2

para flagelos

(cont.)

II. Medios y reactivos A. Método de Leifson 1. Fucsina básica al 1,2% en alcohol al 95%. a. El producto comercial debe estar certificado para coloración de flagelos. b. Se prefiere el acetato de pararosanilina. Si la solución colorante es una mezcla de acetato de pararosanilina y clorhidrato de pararosanilina, el compuesto en la forma de clorhidrato no debe ser más de los dos tercios de la solución. c. El colorante, para ser satisfactorio, debe tener olor a ácido acético. d. Cuando se prepara un colorante nuevo, debe dejarse pasar por lo menos un día antes de usarlo, para que se solubilice por com­ pleto. 2. Acido tánico al 3% en agua. a. La suspensión, para ser satisfactoria, debe tener color amarillo pálido. b. Agregar fenol en una concentración de 1:200 para evitar el desarrollo de hongos durante el almacenamiento. 3. Cloruro de sodio al 1,5% en agua. 4. Colorante final a. Combinar volúmenes iguales de las tres soluciones madre. El colorante está listo para su uso inmediatamente después de la pre­ paración y debe conservarse en frascos con cierre hermético. b. Durante el almacenamiento se formará un precipitado. Este no debe agitarse; en lugar de eso, recuperar la solución colorante de la parte superior con una pipeta. c. La duración de la solución colorante es de una semana a temperatura ambiente, un mes en el frigorífico e indefinida si se con­ gela. B. Método de Ryu 1. Solución I a. Fenol al 5%, 10 mL b. Acido tánico en polvo, 2 g c. Sulfato de aluminio y potasio saturado con 12 H ,0 (cristales) (preparar 14 g de alumbre de potasio en 100 mL de H ,0 desti­ lada), 10 mL 2. Solución II a. Solución saturada de violeta de genciana (cristal violeta) en alcohol (preparar 12 g en 100 mL de etanol al 95%) 3. Colorante final a. Diez partes de la solución I (mordiente) se mezclan con una parte de la solución II y la mezcla se conserva en un frasco plás­ tico a temperatura ambiente. III. Control de calidad Las siguientes especies bacterianas pueden servir como controles: A. Positivas: peritrico, Escherichia coli; polar monotrico, Pseudomonas aeruginosa: multitrico. Burkholderia cepacia. B. Negativas: Acinetobacter baumannii. IV. Procedimiento A. Método de Leifson 1. Preparar una suspensión poco densa de bacterias en agua a partir de un cultivo joven en un agar apropiado. 2. Colocar 2 gotas de la suspensión bacteriana en un extremo de un portaobjetos lavado con ácido. Dejar secar al aire. Con un lápiz de cera, dibujar una línea perpendicular en la superficie del vidrio del lado interno de la suspensión seca. 3. Colocar el portaobjetos en un soporte inclinado y cubrir la suspensión bacteriana seca con una capa fina de colorante. La marca hecha con el lápiz de cera impide que el colorante se escurra del extremo del portaobjetos. 4. Colorear durante 5 a 15 minutos, dejando que se forme un precipitado a medida que se evapora el alcohol. El tiempo de tinción disminuye si el colorante es fresco, si la temperatura ambiente es alta, si hay corrientes de aire en el laboratorio o si la capa de colorante es muy delgada. Las condiciones opuestas aumentan el tiempo de coloración. 5. Cuando se forma el precipitado, enjuagar el portaobjetos suavemente con agua destilada, eliminar el exceso de agua y dejar secar al aire. B. Método de Ryu 1. Preparar un frotis tomando bacterias de un cultivo joven en un medio de cultivo libre de hidratos de carbono con una aguja de siembra, tocando levemente el centro de cada una de dos gotas de agua destilada colocadas en un portaobjetos nuevo, lavado antes. Dejar que las gotas se sequen al aire a temperatura ambiente. 2. Cubrir los frotis secados al aire con abundante solución colorante durante 1 a 5 minutos (puede ser necesario realizar algunas pruebas para determinar el tiempo exacto en el que se produce la coloración satisfactoria de los flagelos, pero sin que haya exce­ sivos detritos en el fondo). Eliminar la solución colorante por lavado con agua corriente.

Protocolos

1405

P ro tocolo 7-2

T inción

para f la g e lo s

(cont.)

3. Una vez secos los frotis. observarlos con el microscopio con objetivo de inmersión. Los cuerpos celulares y los flagelos se tiñen de violeta. V. Resultados A. Interpretación Observar el portaobjetos teñido con el microscopio con objetivo de inmersión en aceite (lO O x ). Deben verse los flagelos coloreados de rojo oscuro a azul negro. Comparar la morfología con las microfotografías proporcionadas en el Atlas o f Bacterial Flagellation de Leifson, citado en la bibliografía y véase también la figura 7-3. VI. Bibliografía Clark WA. A simplified Leifson flagella stain. J Clin Microbiol 1976;3:632-634. Leifson R. Atlas of Bacterial Flagellation. Nueva York: Academic Press, 1960. Ryu E. A simple method of staining bacterial flagella. Kitasato Arch Exp Med 1937;14:218-219.

P r o t o c o l o 7-3

F l u o r e s c e n c ia -

d e n it r if ic a c ió n

I. Principio La capacidad para producir pigmento fluorescente y para reducir por completo los nitratos o nitritos a gas nitrógeno son dos caracte­ rísticas importantes para la identificación de los Pseudomonadales y otros bacilos no fermentadores. La fórmula del medio de fluorescencia-denitrificación (FN) permite detectar ambas características. El medio de fluorescencia lactosa nitrato (FLN) es una modificación en la cual se agregan lactosa y rojo fenol como indicador, para permitir la detección del ácido formado de la utilización de la lactosa, lo cual es de ayuda para identificar el grupo de no fermentadores fuertemente lactosa positivos. A. Prueba de fluorescencia La fluoresceina es un pigmento orgánico luminiscente que al ser excitado con luz ultravioleta emite una fluorescencia verde amari­ llenta. Unos pocos bacilos no fermentadores, en especial Pseudomonas aeruginosa. son capaces de producir fluoresceina, cuya detección es útil para su identificación. La fluorescencia de las colonias puede no detectarse en un medio de aislamiento común, como el agar sangre o el agar de MacConkey; con frecuencia deben utilizarse medios que contienen sales catiónicas, como sulfato de magnesio (incluido en el medio FN). que actúan como activadores o coactivadores para intensificar la luminiscencia. B. Prueba de denitrificación La reducción del nitrato a gas nitrógeno (N2) u óxido nitroso (N ,0 ) se denomina denitrificación y se demuestra por la siguiente ecua­ ción química: 2 N 0 3- + 10 e- + 12 H --> N , t + 6 H ,0 En este proceso de reducción, el radical nitrato acepta cinco electrones, lo que da por resultado la formación de nitrógeno gaseoso y seis moléculas de agua. La prueba de denitrificación es útil para separar el grupo de Pseudomonas stutzeri (la mayoría de las cepas son positivas) de otros bacilos no fermentadores (véase cuadro 7-5). II. Medios y reactivos A. La fórmula del medio FN es la siguiente: P ro te o s a p e p to n a 3 (D ife o L a b o ra to rie s , D e tro it M l) S u lfa to d e m a g n e s io ■7 H 20 F o s fa to d ip o tá s ic o h id ro g e n a d o N itra to d e p o ta s io N itrito d e s o d io A gar A g u a d e s tila d a c s p pH = 7 ,2

1 0 ,1 5 0 ,1 5 0 ,2 0 ,0 5 1,5 10 0

9 g g g g g mL

1. Suspender todos los componentes en agua destilada, excepto el sulfato de magnesio. Éste se disuelve por separado en una peque­ ña cantidad de agua antes de agregarlo al medio con agar para evitar la formación de un precipitado insoluble. 2. Si va a prepararse el medio FLN, agregar 2 g de lactosa y 0,002 g de indicador rojo fenol. Fraccionar 4 mL de medio en tubos de 13 mm con tapa de rosca y dejar solidificar, de modo que la profundidad y la longitud del agar inclinado (pico de flauta) sean aproximadamente iguales.

1406

Protocolos

P rotocolo 7-3

F l u o r e s c e n c i a - d e n it r i f ic a c i ó n (c o n t. )

3. El medio de Sellers, disponible en ei comercio, también es apropiado para ia determinación de la fluorescencia y la denitrifica­ ción por parte de bacterias no fermentadoras. B. La fórmula del medio para la reducción de nitratos/nitritos es la siguiente: C a ld o in fu s ió n d e c o ra z ó n (D ife o L a b o ra to rie s , D e tro it M I)* N itra to d e p o ta s io C.P. A g u a d e s tila d a e s p pH = 7

25 g 2 g 1 L

III. Control de calidad Los siguientes microorganismos son controles apropiados: Fluorescencia positiva/denitrificación positiva: Pseudomonas aeruginosa. Fluorescencia negativa/denitrificación positiva: Pseudomonas stutzeri. Fluorescencia negativa/denitrificación negativa: Escherichia coli. IV. Procedimiento Sembrar el medio con una suspensión densa del cultivo en profundidad y luego se siembra en estría el pico de flauta. Incubar a 35 °C durante 24 a 48 horas. V. Resultados A. Interpretación Examinar el tubo con una fuente de luz ultravioleta (lámpara de Wood) para ver la producción de fluorescencia. Una luz brillante amarillo-verdosa constituye una prueba positiva. La presencia de burbujas de gas en la profundidad del medio indica que se ha pro­ ducido nitrógeno por denitrificación y la superficie amarilla en el medio FLN señala que el microorganismo produjo ácido por uti­ lización de la lactosa. En caldo, la formación de gas nitrógeno se detecta por la presencia de burbujas de gas en la parte superior del tubo de Durham invertido (lámina en color 7-2B). VI. Bibliografía Pickett MJ. Pedersen MM. Screening procedure for partial identification of nonfermentative bacilli associated with man. Appl Microbiol 1968:16:1631-1632.

* Para el caldo se omite el agar y se agregan tubos de Durham invertidos para detectar gas.

P rotocolo 7-4

Prueba

d e h id r ó l is is d e l a e s c u l in a

I. Principio El medio de esculina sin bilis es útil para diferenciar varias especies de bacilos no fennentadores. La esculina es un glucósido sustitui­ do que puede ser hidrolizado por ciertas bacterias para producir glucosa y eseuletina. La esculina es un compuesto fluorescente bajo la luz ultravioleta de onda larga, a 360 nm. Cuando se hidroliza la esculina, la fluorescencia se pierde y el medio vira al negro, debido a la reacción de la eseuletina con los iones férricos presentes en el medio. Varias especies de Chryseobacterium, Sphingobacterium, así como C. luteola, B. vesicularis, S. paucimobilis, S. maltophila, R. radiobacter y algunas especies de B. cepacia, B. pseudom allei y O. anthropi son esculina positivas. II. Medios y reactivos La fórmula del medio de esculina es la siguiente: Agar esculina modificado: E s c u lin a C itra to fé rric o A g a r in fu s ió n c o ra z ó n A g u a d e s tila d a e s p

1 g 0 ,5 g 40 g

1 L

Protocolos

1407

P rotocolo 7-4

Prueba

d e h id r ó l is is d e l a e s c u l in a

(cont.)

Caldo esculina: In fu s ió n d e m ú s c u lo c a rd ía c o D ig e rid o p é p tic o d e te jid o s a n im a le s C lo ru ro d e s o d io E s c u lin a A g u a d e s tila d a c s p

10 g 10 9 5 g 1 g 1 L

III. Control de calidad A. Control positivo: Aeromonas hydrophila ATCC 7965. B. Control negativo: P. aeruginosa ATCC 27853. IV. Procedimiento Después de tocar el centro de una colonia bien aislada con un ansa o palillo de madera estériles, sembrar el microorganismo en la super­ ficie del agar inclinado (pico de flauta) o en un tubo con caldo. Incubar 18 a 24 horas a 35 °C. V. Resultados A. Interpretación El desarrollo de color negro o la pérdida de fluorescencia bajo luz ultravioleta (360 nm) se interpreta como una prueba positiva. La presencia de fluorescencia o la ausencia de color negro se interpretan como una prueba negativa (lámina en color 7-2E). VI. Bibliografía MacFadding JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:4-12. Shigei J. Tests methods used in the identification of commonly isolated aerobic gram-negative bacteria. En: Isenberg HH, ed. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Vol. I. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992; 1.19.38-1.19.40.

1408

Protocolos

P r o t o c o lo

Prueba

8-1

CAMP

I. Principio La identificación presuntiva de los estreptococos P-hemolíticos del grupo B puede hacerse por medio de la prueba CAMP, que es fia­ ble y de realización sencilla. El fenómeno hemolítico fue descrito por primera vez en 1944 por Christie, Atkins y Munch-Petersen, cuyos nombres proporcionan el acrónimo (CAMP) de la prueba. La actividad hemolítica de la P-hemolisina causada por la mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus es intensificada por una pro­ teína extraeelular producida por los estreptococos del grupo B. La interacción de la P-hemolisina con este factor produce ''hemolisis sinérgica”, que puede observarse con facilidad en una placa de agar sangre. Este fenómeno se advierte tanto con los aislamientos hemo­ líticos como con los no hemolíticos de los estreptococos del grupo B. II. Materiales 1. Cepa de Staphylococcus aureus productora de P-hemolisina. 2. Placa de agar sangre de carnero. III. Control de calidad A. Control positivo: estreptococo del grupo B. B. Control negativo: estreptococo del grupo A. IV. Procedimiento 1. Hacer en el centro de una placa de agar sangre una sola estría en línea recta con S. aureus productor de P-hemolisina. 2. Teniendo cuidado de no tocar la estría del estafilococo, hacer una estría con los estreptococos P-hemolíticos por identificar, en forma perpendicular a la estría del estafilococo. Realizar estas estrías de tal manera que, después de la incubación, el desarrollo de los dos microorganismos no se junte. La estría de estreptococos debe ser de 3 a 4 cm de longitud. En la misma placa deben sembrarse en forma similar cepas conocidas de estreptococos del grupo A y del grupo B como controles negativo y positivo, res­ pectivamente. 3. Incubar la placa a 35 °C en aire atmosférico durante 18 a 24 horas. V. Resultados A. Interpretación Como se ilustra más adelante, la zona de aumento de la hemolisis se observa en el punto en que se intersecan la P-hemolisina secre­ tada por el estafilococo y el factor CAMP secretado por el estreptococo del grupo B. Cualquier estreptococo P-hemolítico resisten­ te a la bacitracina, resistente a trimetoprim-sulfametoxazol y positivo en la prueba de CAMP, puede informarse como “estreptoco­ co P-hemolítico presumiblemente grupo B por prueba de CAMP".

VI. Limitaciones Algunos estreptococos del grupo A serán positivos en la prueba de CAMP si la placa se incuba en una jarra de anaerobiosis por extin­ ción con vela, en atmósfera de CO, o en condiciones de anaerobiosis. Por lo tanto, la incubación debe realizarse en aire atmosférico.

Protocolos

1409

P rotocolo 9-1

P rueba

d e r e q u e r im ie n t o s d e f a c t o r e s

X

y

V

I. Principio El factor X (hemina, hematina) y el factor V (NAD) son necesarios, ya sea solos o en combinación, para facilitar el crecimiento de dife­ rentes especies de Haemophilus en agar. Se comercializan tiras o discos de papel de filtro impregnados con factor X y con factor V. Los factores X y V son hidrosolubles y por eso se difunden con facilidad en medios de agar. Las tiras o discos de papel de filtro impreg­ nados con estos factores se colocan sobre la superficie de un medio deficiente en ellos, como agar tripticasa soja o agar infusión de cerebro y corazón, que han sido sembrados en superficie con el microorganismo por probar. Los requerimientos del microorganismo para cada factor se determinan después de una noche de incubación, observando los patrones de crecimiento alrededor de las tiras o discos de papel (véase la ilustración siguiente). II. Medios y reactivos 1. Tiras o discos de papel de filtro impregnados con factores X y V. 2. Un medio sólido deficiente en factores X y V. El agar tripticasa soja o el agar infusión de cerebro y corazón son adecuados. 3. Caldo infusión de cerebro y corazón. III. Control de calidad A. Haemophilus parainfluenzae: requiere solamente factor V. B. Haemophilus influenzae: requiere tanto factor X como V. IV. Procedimiento 1. Preparar una suspensión poco densa en el caldo infusión de cerebro y corazón de un cultivo puro del microorganismo por iden­ tificar. Cuando se transfiere el cultivo hay que tener cuidado de no tomar ninguna porción del medio con hemina de la placa de cultivo. Con esta suspensión, sembrar en superficie el medio sólido deficiente en factores. 2. Colocar una tira de factor X y una de factor V sobre la superficie del agar en la zona de siembra. 3. Colocar las tiras con una separación aproximada de 1 cm. 4. Incubar la placa en C 0 2 al 3-5% y 35 °C durante 18 a 24 horas. V. Resultados A. Interpretación Inspeccionar la superficie del agar en busca de crecimiento visible entre o alrededor de una o más de las tiras o discos. Los siguien­ tes patrones indican la necesidad de factor X solo (izquierda), de factor V solo (centro) o de ambos (derecha)-.

F a c to r X re q u e rid o

F a c to r V re q u e rid o

F a c to re s X y V re q u e rid o s

VI. Bibliografía Parker RH, Hoeprieh PD. Disk method for rapid identification of Haemophilus sp. Am I Clin Pathol 1963;37:319-327.

1410

Protocolos

P rotocolo l l - I

P r u e b a d e u t i l i z a c i ó n r á p i d a d e h i d r a t o s d e c a r b o n o p a r a l a i d e n t i f i c a c i ó n d e e s p e c i e s d e N e is s e r ia

I. Principio Las pruebas rápidas de utilización de hidratos de carbono han suplantado en su mayor parte el uso del agar semisólido de cistina-digerido tríptico con hidratos de carbono para la identificación de especies de Neisseria. El procedimiento descrito aquí es una modifica­ ción del detallado en Cumitech 4, de la American Society for Microbiology. La prueba de utilización rápida de hidratos de carbono emplea una solución equilibrada de buffer de fosfatos que contiene rojo fenol como indicador. Se fraccionan alícuotas pequeñas (de 0,10 mL) del buffer en una serie de tubos estériles, uno para cada hidrato de car­ bono por probar. Se agrega una gota de cada hidrato de carbono (al 20% p/v) a cada tubo. Se prepara una suspensión densa del micro­ organismo en buffer sin hidratos de carbono y se agrega una gota de esta suspensión a cada tubo con hidratos de carbono. Después de 4 horas de incubación, se leen las reacciones. La producción de ácido de los hidratos de carbono se observa por un cambio de color del indicador rojo fenol, del rojo al amarillo. II. Medios y reactivos A. Solución amortiguadora (buffer) de fosfatos equilibrada (BBS): solución madre 10 x con la siguiente fórmula: K2H P 0 4 K H 2P 0 4 KCI A g u a d e s tila d a

III.

IV.

V.

VI.

0 ,4 0 g 0 ,1 0 g 8 g I0 0 m L

Esterilizar por filtración y almacenar entre 4 y 8 °C. B. Solución de trabajo Agregar 10 mL de BBS lOx a 90 mL de agua destilada. Después de esto se agregan 0,5 a 0.8 mL de una solución acuosa al 1% de rojo fenol a la solución, de modo que el producto final tenga un color “rojo cereza”. Esta solución de trabajo se esteriliza luego por filtración. Para asegurarse de que el agua tiene el pH adecuado, se recomienda el uso de agua destilada de grado farmacéutico. C. Soluciones madre de hidratos de carbono Pesar 10 g de glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa (y, si se desea, fructosa) por separado. Disolver cada una de ellas en 50 mL de agua destilada. Las soluciones se esterilizan por filtración, se fraccionan en frascos ampolla estériles y se congelan a -2 0 °C. Es importante utilizar hidratos de carbono de grado analítico, debido a que la maltosa proveniente de ciertos proveedores de medios para bacteriología puede estar contaminada con glucosa. Los hidratos de carbono pueden obtenerse de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), Fisher Scientific Company (Fairlawn, NJ) o de Mallinckrodt Chemical Works (St. Louis. MO). Control de calidad A. Glucosa positivo: N. gonorrhoeae. B. Maltosa positivo: N. meningitidis. C. Lactosa positivo: N. lactamica. D. Sacarosa y fructosa positivo: N. mucosa. Procedimiento 1. Se marca una serie de tubos estériles de 12 x 75 mm con el nombre del azúcar por probar. Por lo general, se prueba glucosa, mal­ tosa, sacarosa y lactosa. Algunos laboratorios también incluyen fructosa en la serie de pruebas. Se incluye un tubo adicional, marcado con el número de aislamiento de la muestra, para la preparación del inoculo. 2. Se agrega a cada uno de los tubos para hidratos de carbono 0,10 niL de BSS de trabajo. En el tubo del inoculo se colocan 0,30 a 0,40 mL de BSS. 3. Se agrega una sola gota del hidrato de carbono correspondiente a cada uno de los tubos marcados, con una pipeta de Pasteur. 4. Con un ansa bacteriológica estéril se prepara una suspensión densa del microorganismo por probar en el tubo inoculo. El inocu­ lo se prepara de un subcultivo puro de 18 a 24 horas en agar chocolate del microorganismo. La suspensión del inoculo se agita con cuidado con una agitadora mecánica para obtener una suspensión densa y uniforme. 5. Se agrega una gota de inoculo a cada uno de los tubos que contienen hidratos de carbono. Los tubos se agitan brevemente para asegurar una mezcla completa y se colocan en baño María o estufa a 35 °C durante 4 horas. Resultados A. Interpretación El desarrollo de color amarillo en cualquiera de los tubos que contienen hidratos de carbono indica que el microorganismo utilizó ese hidrato de carbono. Las pruebas negativas permanecen de color rojo o naranja rojizo. Bibliografía Janda WM. Identification of Neisseria species and Branhamella catarrhalis. En: Identification of Aerobic Gram-Positive and GramNegative Cocci. Washington DC: American Society for Microbiology. 1986:115-131. Kellogg DS, Holmes KK, Hill GA. Cumitech 4. En: Marcus S. Sherris JC, eds. Laboratory Diagnosis o f Gonorrhea. Washington DC: American Society for Microbiology, 1976.

Protocolos

1411

P rotocolo 12-1

P rueba

d e f u r a z o l id o n a c o n d is c o s

I. Principio Hay varios métodos para diferenciar estafilococos de micrococos (cuadro 12-1). Uno de ellos es la sensibilidad al compuesto furoxona (también denominado furazolidona). La prueba se realiza como otros procedimientos de sensibilidad con discos: los estafilococos son sensibles a este compuesto, en tanto que los micrococos son resistentes. II. Reactivos 1. Discos de furazolidona de 100 (ag (FX 100. BD Microbiology Systems. Franklin Lakes, NJ). 2. Placa con agar sangre de camero. III. Control de calidad Con cada lote nuevo de discos, o semanalmente, deben probarse cepas conocidas de Staphylococcus (ya sea S. aureus o una cepa coa­ gulasa negativa) y especies de Micrococcus. IV. Procedimiento 1. Preparar una suspensión del microorganismo por probar en agua destilada o caldo estériles. La suspensión debe tener una turbi­ dez equivalente al estándar 0,5 de McFarland. 2. Con un hisopo, distribuir la suspensión sobre la mitad de una placa de agar sangre. 3. Colocar en forma aséptica un disco FX en el centro de la zona sembrada y presionarlo con suavidad para que se adhiera a la super­ ficie del agar. 4. Incubar la placa a 35 °C en una estufa con aire atmosférico durante 18 a 24 horas. V. Resultados A. Interpretación 1. Las especies de Micrococcus son resistentes al FX y presentarán halos de inhibición de 6 mm (ausencia de halo) a 9 mm. 2. Las especies de Staphylococcus son sensibles al FX y presentarán halos de inhibición de 15 mm o mayores.

P r o t o c o lo

Prueba

12-2

d e l a n o v o b io c in a

I. Principio Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensibles y resistentes a la novobiocina. Entre las especies resis­ tentes, S. saprophyticus es el único que suele aislarse en muestras humanas como causante de infecciones urinarias. Por lo tanto, el cri­ bado de los estafilococos coagulasa negativos aislados en cultivos cuantitativos de orina en lo que respecta a la sensibilidad a la novo­ biocina proporciona una identificación presuntiva fiable de esta especie. II. Reactivos 1. Discos de novobiocina de 5 (ig (NB 5, BD Microbiology Systems, Franklin Lakes, NJ). 2. Placa de agar sangre de camero. III. Control de calidad Debe probarse una cepa conocida de S. saprophyticus y una de S. epidermidis con cada nuevo lote de discos de novobiocina o una vez por semana. IV. Procedimiento 1. Preparar una suspensión del microorganismo por identificar en agua destilada o caldo estériles. 2. La suspensión debe tener una turbidez equivalente al estándar 0,5 de McFarland. 3. Con un hisopo estéril, distribuir parte de la suspensión sobre la mitad de la placa de agar sangre. 4. Colocar en forma aséptica un disco de novobiocina sobre la zona sembrada. Puede determinarse la sensibilidad a la furazolidona (véase protocolo 12-1) en la misma placa, colocando los discos sobre la zona sembrada, separados aproximadamente 4 cm. Presionar con suavidad el o los discos con pinzas estériles para asegurar el contacto con la superficie del agar. 5. Incubar la placa en aerobiosis durante 18 a 24 horas a 35 °C. V. Resultados A. Interpretación 1. S. saprophyticus es resistente a la novobiocina y presentará halos de inhibición de 6 mm (ausencia de halo) a 12 mm. 2. Otros estafilococos coagulasa negativos y S. aureus son sensibles a la novobiocina y presentarán halos de 16 mm o mayores.

1412

Protocolos

P r o t o c o l o 13-1

Pruebas

d e s e n s ib il id a d a l a b a c it r a c in a y

SXT

I. Principio La sensibilidad a bajas concentraciones del antibiótico polipeptídico bacitracina y a la combinación de sulfonamidas trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) proporciona un método sencillo y económico para la identificación presuntiva de los estreptococos (3-hemolílicos de los grupos A y B. Aunque aún se utiliza en muchos laboratorios, esta prueba se ha reemplazado ampliamente por procedimientos serológicos fiables y bastante económicos. Los estreptococos del grupo A son sensibles a concentraciones relativamente bajas de bacitracina y resistentes a la SXT. Los estrepto­ cocos del grupo B son resistentes a ambos antibióticos. Otros estreptococos ¡3-hemolíticos muestran sensibilidad variable a la bacitra­ cina, pero estos microorganismos suelen ser sensibles a la SXT. Por lo tanto, la realización de la prueba para SXT junto con la prueba de la bacitracina aumenta la sensibilidad y el valor pronóstico de la prueba de la bacitracina. II. Reactivos A. Placa con agar sangre de carnero.

B. Discos diferenciales de bacitracina Taxo “A" (0,04 unidades/disco). C. Discos de SXT (trimetoprim-sulfametoxazol, 1,25 ja.g/23,75 |ag). III. Control de calidad A. Bacitracina S, SXT R: estreptococo del grupo A. B. Bacitracina R, SXT R: estreptococo del grupo B. C. Bacitracina S o R, SXT S: estreptococo p-hemolítico, grupos C, F o G. IV. Procedimiento 1. Tomar tres o cuatro colonias aisladas del estreptococo P-hemolítico y sembrar en estría el inoculo en el centro de la mitad de una placa de agar sangre. 2. Con un hisopo estéril o un ansa diseminar el inoculo formando una capa sobre toda la mitad de la placa. 3. Colocar en forma aséptica un disco de bacitracina Taxo “A” y un disco de SXT sobre la zona sembrada. Asegurarse de que los discos estén igualmente separados. Utilizando pinzas flameadas, golpear con suavidad los discos para que se adhieran a la super­ ficie del agar. 4. Incubar la placa en aire ambiente a 35 °C. V. Resultados A. Interpretación 1. Sensible (S): cualquier tamaño de halo alrededor de cualquiera de los discos. 2. Resistente (R): desarrollo hasta el borde del disco. B a c itra c in a S R S /R

STX R R S

Id e n tific a c ió n P re s u m ib le m e n te g ru p o A P re s u m ib le m e n te g ru p o B N i A ni B

3. Los resultados deben informarse como “estreptococo p-hemolítico, presumiblemente grupo A, por prueba de bacitracina-SXT” o “estreptococo p-hemolítico, presumiblemente no grupo A, por prueba de bacitracina-SXT". 4. Como estas pruebas suelen realizarse sobre aislamientos de fauces, en los cuales se sospecha la presencia de estreptococos del grupo A. la presunción de grupo B por lo general no se informa. VI. Limitaciones de la prueba

Deben probarse sólo los estreptococos P-hemolíticos, ya que muchos estreptococos a-hemolíticos (incluidos los neumococos) son sen­ sibles a bajas concentraciones de bacitracina. No se dispone de datos que indiquen que deben medirse los halos de inhibición. La interpretación a la sensibilidad a SXT puede ser difícil, ya que los microorganismos pueden desarrollarse ligeramente antes de que haya inhibición total del crecimiento. La capa del inoculo bacteriano debe ser confluente. Un inoculo demasiado diluido puede hacer que los estreptococos no pertenecien­ tes al grupo A parezcan sensibles a la bacitracina.

Protocolos

1413

P r o t o c o l o 1 3 -2

P rueba

d e l a b il is e s c u l in a

I. Principio La prueba de la bilis esculina se basa en la capacidad de ciertas bacterias, en particular los estreptococos del grupo D y especies de Enterococcus, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis (4% de sales biliares o 40% de bilis). La esculina es un derivado glucosídico de la cumarina (6-|3-glucósido-7-hidroxicumarina). Los dos residuos de la molécula (glucosa y 7-hidroxicumarina) se encuentran unidos por una unión éster de oxígeno. Para esta prueba la esculina se incorpora en un medio que contenga 4% de sales biliares. Las bacterias bilis esculina positivas son, ante todo, capaces de desarrollarse en presencia de sales biliares. La hidrólisis de la escu­ lina en el medio da como resultado la formación de glucosa y un compuesto denominado esculetina. Esta a su vez reacciona con los iones férricos (aportados por el componente inorgánico del medio, el citrato fénico) para formar un complejo negro que se difunde.

II. Materiales A. Medio El medio de agar bilis esculina se prepara en un tubo inclinado (pico de flauta) o en placas; tiene la siguiente fórmula: P e p to n a E x tra c to d e c a rn e B ilis E s c u lin a C itra to fé rric o A gar A g u a d e s tila d a p H = 7 ,0

5 3 40 1 0 ,5 15 1

g g g g g g L

III. Control de calidad A. Control positivo: especies de Enterococcus (p. ej„ E. faecalis). B. Control negativo: estreptococo del grupo viridans, no grupo D. IV. Procedimiento 1. Con un ansa o aguja de siembra tomar dos o tres colonias morfológicamente similares de estreptococos y sembrar el pico de flau­ ta del medio bilis esculina con un movimiento en S, o sembrar en estría la superficie de una placa de bilis esculina para obtener colonias aisladas. 2. Incubar el tubo o placa a 35 °C durante 24—48 horas en estufa con aire atmosférico. V. Resultados A. Interpretación El ennegrecimiento difuso de más de la mitad del pico de flauta dentro de las 24—48 horas indica hidrólisis de la esculina. En las placas se observarán halos negros alrededor de las colonias aisladas y cualquier grado de ennegrecimiento se considera positivo. Todos los estreptococos del grupo D son bilis esculina positivos en el término de 48 horas. VI. Limitaciones de la prueba Algunos estreptococos del grupo viridans (aproximadamente el 3%) también pueden hidrolizar la esculina en presencia de bilis.

1414

Protocolos

P r o t o c o l o 13-3

Prueba

d e s e n s ib il id a d a l a o p t o q u in a

I. Principio El clorhidrato de etildihidrocupreína (optoquina). un derivado de la quinina, inhibe en forma selectiva el crecimiento de Streptococcus pneumoniae en muy bajas concentraciones (5 )ig/mL o menos). Asimismo, la optoquina puede inhibir otros estreptococos del grupo viridans. pero sólo en concentraciones mucho más altas. La prueba tiene una sensibilidad de más del 95%, es sencilla de realizar y barata. La optoquina es soluble en agua y se difunde con facilidad en agar. Por lo tanto, pueden utilizarse discos de papel de filtro impreg­ nados con optoquina en una prueba de difusión con discos para determinar la sensibilidad de presuntos neumococos y. por medio de ella, confirmar su identidad. Las células de S. pneumoniae que rodean el disco se lisan debido a los cambios de tensión superficial y se produce un halo de inhibición. II. Medios y reactivos 1. Colonias bien aisladas en agar sangre de carnero del microorganismo por probar. 2. Placa de agar sangre de carnero. 3. Discos de optoquina (5 fig): Bacto Differentiation Disks, Optochin (Difeo), discos Taxo “P" (BD Microbiology). 4. Los discos deben conservarse a 4 °C mientras no se utilizan. III. Control de calidad A. Control positivo: Streptococcus pneumoniae. B. Control negativo: estreptococos del grupo viridans o Enterococcus faecalis. IV. Procedimiento 1. Seleccionar con un ansa común o recta tres o cuatro colonias bien aisladas del microorganismo por probar y sembrarlas en estría sobre una mitad a un tercio de la placa de agar sangre. La zona sembrada debe ser de alrededor de 3 cm2. 2. Colocar un disco de optoquina en el tercio superior del área sembrada. Presionar el disco con pinzas flameadas de tal forma que el disco se adhiera con firmeza a la superficie del agar. 3. Incubar la placa a 35 °C durante 18 a 24 horas en jarra de anaerobiosis por extinción con vela o en estufa con 5-7% de CO,. V. Resultados A. Interpretación Un estreptococo del grupo viridans puede identificarse en forma presuntiva como S. pneumoniae si muestra un halo de inhibición de 14 mm o más alrededor de un disco de 6 mm (Taxo A) o una zona de 16 mm o más alrededor de un disco de 10 mm (Bacto). Los microorganismos con halos menores que los mencionados deben ser probados para determinar su solubilidad en bilis. VI. Limitaciones del procedimiento En ocasiones, los estreptococos viridans muestran pequeños halos de inhibición alrededor de los discos de optoquina. Sin embargo, estos microorganismos no son solubles en bilis.

P r o t o c o l o 13-4

P rueba

d e t o l e r a n c ia a l a s a l

I. Principio La capacidad de desarrollarse en presencia de cantidades variables de cloruro de sodio (NaCl) es una prueba utilizada para caracterizar varias bacterias, entre ellas los estreptococos del grupo viridans. Sin embargo, es de particular utilidad para la identificación presunti­ va de los microorganismos pertenecientes a los enterococos del grupo D. que tienen la capacidad específica de desarrollarse en pre­ sencia de NaCl al 6,5% incorporado a caldo o agar. Esta prueba, junto con la de bilis esculina, se utiliza en muchos laboratorios para distinguir las especies de Enterococcus de los estreptococos del grupo D . S. bovis y S. equinus. El caldo infusión de corazón es un caldo nutritivo de uso general que se utiliza para el cultivo de muchas bacterias. Normalmente con­ tiene 0,5% de NaCl. Si se aumenta la concentración del NaCl al 6.5% el medio se hace semiselectivo para el desarrollo de enteroco­ cos. II . Medio 1. El caldo con 6.5% de NaCl tiene la siguiente fórmula: C a ld o in fu s ió n d e c o ra z ó n C lo ru ro de s o d io In d ic a d o r (1 ,6 g d e p ú rp u ra d e b ro m o c re s o l en 10 0 m L d e e ta n o l al 9 5 % ) G lu c o s a A g u a d e s tila d a

25 g 60 g 1 mL 1 g 1 L

Protocolos

1415

P r o t o c o l o 1 3 -4

P r u e b a d e t o l e r a n c ia a l a s a l

(cont.)

2. Puede omitirse el indicador. 3. Fraccionar en tubos, en volúmenes de 3 a 5 mL, y colocar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. III. Control de calidad A. Desarrollo positivo: Enterococcus faecalis.

B. Desarrollo negativo: Streptococcus bovis. IV. Procedimiento 1. Inocular dos o tres colonias en el caldo. 2. Incubar toda la noche a 35 °C en estufa con aire ambiente. V. Resultados A. Interpretación Una prueba positiva se manifiesta por la presencia de desarrollo bacteriano evidente en el medio, con cambio de color del indicador o sin él. Si el microorganismo es bilis esculina positivo y se desarrolla en el caldo con 6.5% de NaCI, es una especie de Enterococcus. Si es bilis esculina positivo, pero no se desarrolla en el caldo con NaCI al 6,5%, es un estreptococo del grupo D. VI. Limitaciones del procedimiento 1 . Si el medio se siembra con una cantidad excesiva de bacterias, el inoculo puede ser confundido con desarrollo, lo que da resul­ tados falsos positivos. 2. Para evitar la interpretación errónea de la prueba como negativa, agitar con suavidad el tubo antes de la lectura, ya que el desa­ rrollo puede sedimentar durante la incubación. 3. Hasta el 80% de los estreptococos del grupo B pueden ser tolerantes a la sal, así como ocasionales aislamientos de estreptococos del grupo A. Los aerococos también pueden ser bilis esculina positivos y desarrollarse en NaCI al 6,5%.

P r o t o c o lo

C o l o r a c ió n

14-1

d e a z u l d e m e t il e n o d e l o e f f l e r

I. Principio El azul de metileno es una coloración simple muy útil para la identificación de especies de Corynebacterium. Los gránulos metacromáticos de C. diphtheriae toman con facilidad el azul de metileno y aparecen con un color azul intenso. Aunque algunos autores han sostenido que la formación de gránulos citoplasmáticos característicos de C. diphtheriae se ve rara vez en las espe­ cies saprofitas de Corynebacterium. este criterio es poco fiable y no puede utilizarse para la identificación definitiva de C. diphtheriae sin realizar otros estudios. II. Medios y reactivos A zu l d e m e tile n o (c o n te n id o d e c o lo ra n te d e l 8 0 % ) A lc o h o l e tílic o (9 5 % ) A g u a d e s tila d a

0 ,3 g 30 m L 100 m L

III. Procedimiento 1. Fijar el frotis por calor. Cubrir su superficie con la solución colorante de azul de metileno durante un minuto. Lavar el portaob­ jetos con agua y secar con papel. 2. En el pasado era necesario agregar un álcali a la solución antes de usar. Sin embargo, los colorantes de azul de metileno prepa­ rados en los últimos años no requieren este paso adicional porque las impurezas áridas encontradas en los antiguos colorantes han sido eliminadas. IV. Resultados A. Interpretación Las corinebacterias son bacilos pleomorfos de tamaño variable, entre 0,5 a 1 J im de espesor y de 2 a 6 (tm de longitud, con forma de bastones rectos, curvos o en forma de maza. Son característicos de estos microorganismos los gránulos metacromáticos que toman el azul de metileno y aparecen de un color azul intenso. Aunque este hallazgo es típico de las corinebacterias, algunas espe­ cies de Propionibacterium, algunos actinomicetos, las cepas pleomorfas de estreptococos y otras bacterias, también pueden ser simi­ lares morfológicamente a las corinebacterias y deben ser diferenciadas por otras características de cultivo y bioquímicas.

1416

Protocolos

P r o t o c o l o 14-2

M

e d io c o n s u e r o d e

L oeffler

I. Principio El medio con suero de Loeffler se utiliza fundamentalmente para el aislamiento de C. diphtheriae de muestras clínicas. Debido a su contenido de suero, el medio también puede utilizarse en forma más general para determinar la actividad proteolítica de diversos micro­ organismos. C. diphtheriae produce células con morfología característica en el medio de Loeffler. El medio también es útil para la determinación de producción de pigmento por parte de algunas bacterias. II. Medios y reactivos A. Fórmula S u e ro b o v in o C a ld o in fu s ió n d e x tro s a (e n p o lv o ) H u e v o (e n te ro d e s e c a d o ) pH fin a l = 7 ,6

III.

IV.

V. VI.

7 0 g/L 2,5 g/L 7,5 g/L

B. Preparación 1. Para rehidratar el medio, disolver 80 g de medio de Loeffler (BBL) en 1 L de agua destilada y calentar hasta 42 a 45 °C. El polvo se agrega en forma gradual mientras se hace rotar con suavidad el frasco, para reducir al mínimo la mezcla con aire de la sus­ pensión. 2. El medio se fracciona en tubos y se coagula-esteriliza en el autoclave de la siguiente forma: a. Una vez que la suspensión es uniforme, se fracciona en tubos. b. Disponer los tubos en forma inclinada, en pilas de no más de cuatro, con varias capas de papel de diario o toallas de papel por encima y debajo para evitar la coagulación rápida. c. Cerrar herméticamente el autoclave, prenderlo y dejar que la presión de vapor se mantenga en 10 psí durante 20 minutos. d. Durante este tiempo no permitir la salida de aire ni de vapor. e. Regular la válvula de entrada del vapor y abrir la de salida de aire, de manera de mantener la presión de 10 psi. Los cambios bruscos de presión pueden formar burbujas en el medio. f. Cerrar la válvula de salida cuando todo el aire haya sido reemplazado por vapor, permitir que la presión alcance 15 psi y man­ tenerla así durante 15 minutos. g. Dejar que el autoclave se enfríe lentamente. Los picos de flauta, cuando se preparan en forma adecuada, son lisos y de un color blanco grisáceo. Los tubos deben incubarse antes de la siembra a 35 °C durante 24 horas como control de esterilidad. Procedimiento 1. Cuando se sospecha C. diphtheriae, sembrar el medio de Loeffler lo antes posible después de la toma de la muestra. 2. Revisar los tubos en pico de flauta en busca de desarrollo después de 8 a 24 horas de incubación. 3. Preparar frotis y colorear con azul de metileno. Resultados A. Interpretación Para la interpretación de estos frotis teñidos, véase protocolo 14-1. Comentario Debido a que el medio de Loeffler es difícil de preparar, se recomienda su adquisición en el comercio en tubos sellados. Bibliografía BBL Manual of Products and Laboratory Procedures, 5a ed. Cockeysville MD: BBL, División of Becton, Dickinson, and Co, 1973:118119. Buck T. A modified Loeffler’s médium for cultivating Corynebacterium diphtheriae. J Lab Clin Med 1949;34:582-583.

Protocolos

P r o t o c o lo

A gar

de

1417

14-3

T in s d a l e ( M

o d if ic a c ió n d e

M

oore y

Pa r so n s)

I. Principio El medio de Tinsdale sustenta el desarrollo de todas las especies de Corynebacterium y simultáneamente inhibe el crecimiento de los habitantes normales de las vías respiratorias altas. Moore y Parsons modificaron la fórmula original de Tinsdale simplificando su com­ posición, pero reteniendo la especificidad para el aislamiento de C. diphtheriae y C. ulcerans. El telurito de potasio se deposita dentro de las colonias de Corynebacterium, tornándolas de color negro. El medio de Tinsdale consta de cistina telurito tiosulfato de sodio, que es de utilidad específica para la identificación de C. diphtheriae, cuyas colonias se encuen­ tran rodeadas por un halo marrón (véase lámina en color 14-2F). II. Medios y reactivos A. Fórmula (base de Tinsdale modificada) P e p to n a tio to n a C lo ru ro d e s o d io A gar L -c is tin a T io s u lfa to d e s o d io A g u a d e s tila d a

20 g 5 g 14 g 0 ,2 4 g 0 ,2 4 g 1 L

B. Preparación 1. Suspender 39 g de polvo en 1 L de agua destilada y calentar mientras se agita. Hervir durante 1 minuto. Colocar en autoclave durante 15 minutos a 121 °C. 2. Enfriar la base modificada a 50 °C y agregar: S u e ro b o v in o e s té ril S o lu c ió n d e te lu rito al 1 %

100 m L 30 m L

3. Verter 15 a 20 mL de este medio en placas de Petri y dejar solidificar. 4. El medio base de Tinsdale sin suero ni telurito es estable indefinidamente si se almacena en tubos o frascos cerrados con tapa de rosca. Sin embargo, después del agregado de suero y telurito el medio suele ser estable sólo durante 2 o 3 días en frigorífico. III. Procedimiento Sembrar la placa en estría de modo de obtener colonias bien aisladas. Se recomienda hacer punciones en el agar a intervalos, porque el cambio al color marrón del medio puede detectarse antes en las zonas punzadas. IV. Resultados A. Interpretación La presencia de un halo marrón alrededor de la colonia se considera evidencia presuntiva de C. diphtheriae. Este halo se ve a veces después de 10 a 12 horas de incubación, aunque pueden necesitarse 48 horas para que aparezcan los halos típicos de color marrón oscuro. La única especie relacionada, diferente del C. diphteriae, que produce estos halos es C. ulcerans. Otras bacterias, como los estafilococos coagulasa positivos, crecen bien en este medio, pero no presentan halo marrón. Las bacterias que producen un fuerte ennegrecimiento difuso del medio, como las especies de Proteus. pueden distinguirse por la coloración de Gram y las característi­ cas bioquímicas. V. Bibliografía Moore MS, Parsons El. A study of modified Tinsdale’s médium for the primary isolation of Corynebacterium diphteriae. J Infect Dis 1958;102:88-93. Tinsdale GFW. A new médium for the isolation and identification of C. diphteriae based on production of hydrogen sulfide. J Pathol Bacteriol 1947;59:61-66.

1418

Protocolos

P r o t o c o l o 1 4 -4

A gar

s a n g r e c is t in a t e l u r it o

I. Principio El agar sangre cistina telurito es un medio utilizado para el aislamiento primario de Corynebacterium diphteriae. Tiene algunas venta­ jas en comparación con el medio de Tinsdale, ya que es de preparación más sencilla y dura más. El telurito de potasio presente en este medio inhibe el desarrollo de la mayoría de las bacterias que normalmente habitan las vías res­ piratorias altas, como la mayor parte de las cepas de Streptococcus y Staphylococcus. C. diphtheriae se desarrolla bien, con producción de colonias grisáceas o negras después de 24 a 48 horas de incubación. II. Medios y reactivos A. Fórmula A g a r in fu s ió n d e c o ra z ó n , s o lu c ió n al 2 % T e lu rito d e p o ta s io , s o lu c ió n al 0 ,3 % L-cistina S a n g re d e c a m e ro

10 0 15 5 5

mL mL mg mL

B. Preparación Fundir la solución estéril de agar infusión de corazón y enfriar a 45 o 50 °C. Mantener con cuidado esta temperatura mientras se rea­ lizan los siguientes pasos. Agregar en condiciones de asepsia la solución estéril de telurito de potasio (esterilizada antes en autocla­ ve) y la sangre de camero. Mezclar bien. Agregar la cistina en polvo, mezclar bien y verter el medio en placas de Petri estériles. Rotar la frasco con frecuencia mientras se vierten las placas, porque la cistina no se solubiliza totalmente. III. Procedimiento Sembrar la placa en estrías con el material clínico por cultivar para obtener colonias bien aisladas. IV. Resultados A. Interpretación C. diphteriae desarrolla colonias grises o negras después de 24 a 48 horas de incubación. En forma ocasional, las colonias de esta­ filococos no inhibidos por el medio también aparecen negras; sin embargo, pueden distinguirse por su reacción característica con la coloración de Gram. Pueden distinguirse tres biotipos de C. diphtheriae en agar sangre telurito cistina: 1) las colonias del biotipo gravis son planas, de color gris oscuro, con estrías radiales, secas y de bordes irregulares; 2) las colonias del biotipo mitis son pequeñas, negras, brillan­ tes y convexas, con bordes lisos y aspecto húmedo: 3) las colonias del biotipo intermedius son pequeñas y planas, con un centro negro elevado. V. Bibliografía Frobisher M Jr. Cystine-tellurile agar for C. diphteriae. J Infect Dis 1937;60:99-105.

P r o t o c o l o 1 5 -1

H

id r ó l is is d e l a x a n t i n a , h ip o x a n t i n a , t ir o s in a y c a s e ín a

I. Principio Los actinomicetos aerobios pueden caracterizarse por su capacidad de hidrolizar xantina, hipoxantina, tirosina y caseína. Estos com­ puestos se incorporan al agar nutritivo y sobre su superficie se siembran grandes cantidades de microorganismos. Los resultados se leen observando el aclaramiento del medio por debajo y alrededor del desarrollo bacteriano, que indica hidrólisis. II. Medios y reactivos A. Suspensiones de xantina, hipoxantina y tirosina. 1. Medio basal E x tra c to d e c a rn e P e p to n a A gar A g u a d e s tila d a

3 5 15 1

g g g L

Protocolos

P r o t o c o lo

1419

15-1

H i d r ó l i s i s d e l a x a n t i n a , h i p o x a n t i n a , t i r o s i n a y c a s e í n a ( c o n t.)

2. Suspensiones T iro s in a X a n tin a H ip o x a n tin a A g u a d e s tila d a

0 ,5 g 0 ,4 g 0 ,4 g 100 m L

Calentar el medio hasal para disolver los ingredientes y fraccionar en alícuotas de 100 mL en frascos de 250 mL. Esterilizar en autoclave a 15 psi durante 15 minutos. Dejar enfriar el medio hasta que esté casi solidificado. Agregar a cada frasco 10 mL de suspensiones de xantina, hipoxantina o tirosina. Las suspensiones se esterilizan en autoclave antes de agregarlas al medio basal. Es esencial que ios gránulos de xantina. hipoxantina y tirosina se mantengan en suspensión hasta que el medio se solidifique; por lo tanto, el agregado de los gránulos de las sustancias bioquímicas y el vertido del medio en las placas de Petri deben hacer­ se en el momento en que el medio basal se ha enfriado casi hasta la solidificación. Los medios se vierten en placas de Petri esté­ riles de 15 x 100 mm. 3. Medio de caseína a. Solución A (1 ) L e c h e d e s c re m a d a (p o lv o ) (2 ) A g u a d e s tila d a

10 g 100 m L

b. Solución B (1 ) A g a r (2 ) A g u a d e s tila d a

III.

IV.

V.

VI.

2 ,0 g 100 m L

Colocar las soluciones A y B por separado en el autoclave, dejar enfriar hasta aproximadamente 50 °C, mezclarlas y verter en placas de Petri estériles de 15 x 100 mm. Control de calidad A. Control negativo; Nocardia asteroides. B. Control positivo: especies de Streptomyces. Procedimiento Cada placa de xantina, hipoxantina. tirosina y caseína se divide habitualmente en tercios en forma sectorial, lo que permite contar con una zona para sembrar un control positivo y uno negativo junto al microorganismo por identificar. Las placas se incuban a 30 °C y se leen a los siguientes tiempos: A. Hidrólisis de la caseína: leer después de 2 semanas. B. Hidrólisis de la xantina: leer después de 3 semanas. C. Hidrólisis de la hipoxantina: leer después de 3 semanas. D. Hidrólisis de la tirosina: leer después de 3 semanas. Interpretación La hidrólisis de la caseína se evidencia por un aclaramiento completo, hasta la transparencia, del medio originalmente blanco y lecho­ so. Las otras tres hidrólisis se leen observando la disolución de los compuestos cristalinos alrededor de las colonias que se desarrollan en el medio. Bibliografía Gordon RE, Mihm JM. Identification of Nocardia caviae (Erickson) nov. comb. Ann NY Acad Sci 1962;98:628-636.

1420

Protocolos

P r o t o c o l o I7-1

P

r u e b a d e s e n s ib il id a d p o r d if u s ió n c o n d is c o s

(B

a u e r - K ir b y ) p a r a b a c t e r ia s sin r e q u e r im ie n t o s n u t r ic io n a l e s e s p e c ia l e s

I. Principio Un comité del Clinical Laboratory Standards Institute (antes National Committee for Clinical Laboratory Standards) ha evaluado y revi­ sado continuamente el procedimiento de difusión con discos. El establecimiento de una prueba estándar nacional para la difusión con discos no sólo ha permitido un control de calidad más exacto, sino también una comparación válida de los resultados entre diferentes laboratorios que utilizan este procedimiento. El comité publica actualizaciones periódicas con nueva información y los cambios suge­ ridos por los usuarios. Es importante mantener la actualización del procedimiento. Este protocolo resume el procedimiento básico; con­ sultar el documento del Clinical Laboratory Standards Institute que figura en la Bibliografía para ver las variaciones que se usan para probar bacterias con requerimientos nutricionales especiales. El principio del procedimiento de difusión con discos se describe en el texto. El diámetro de los halos que se forman con la prueba no tiene sentido sin referencia a los correlatos y guías interpretativas de la concentración inhibitoria mínima (CIM) publicados por el Clinical Laboratory Standards Institute. II. Medios y reactivos A. Aislamiento bacteriano proveniente de un proceso infeccioso. B. Caldo nutritivo (se recomienda caldo soja digerido de caseína) para el desarrollo del inóculo. C. Estándar 0,5 de McFarland para ajustar la turbidez del inóculo. D. Agitadora vorticial para suspender el inóculo. E. Caja visora para la comparación del caldo con el estándar. Puede utilizarse un fotómetro si se demuestran resultados satisfactorios. F. Placas de agar de Mueller-Hinton (de 100 mm de diámetro para 5 discos como máximo; de 150 mm para 12 discos como máximo) provenientes de un lote que produzca resultados satisfactorios en el control de calidad. El pH debe ser de 7.2 a 7.4 y la profundidad del agar de aproximadamente 4 mm. G. Calibres, regla o patrón para medir los diámetros de los halos de inhibición. III. Control de calidad Las cepas de referencia de Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa deben probarse cada vez que se utili­ za un nuevo lote de discos o agar. Deben realizarse controles adicionales todos los días en los que se lleva a cabo la prueba, a menos que el laboratorio pueda justificar el control de calidad en forma semanal según los criterios publicados (véase cuadro 17-14). IV. Procedimiento A. Preparación del inóculo (método de desarrollo) 1. Tocar con un ansa metálica la superficie de cuatro o cinco colonias bien aisladas de aspecto similar de un cultivo en placas de agar. Transferir a un tubo de caldo con 4 a 5 mL de un medio líquido apropiado. 2. Incubar el cultivo a 35 °C hasta que la turbidez coincida con la del estándar preparado con anterioridad (casi siempre 2 a 6 horas antes). Mezclar en forma enérgica el estándar en la agitadora vorticial (Vortex) inmediatamente antes de usar. Utilizar una luz adecuada para leer el tubo contra un fondo blanco con una línea negra de contraste. Si fuera necesario, agregar solución fisioló­ gica estéril o caldo para obtener a simple vista una turbidez comparable con la del estándar. En el caso de la cepa de E. coli para control de calidad, esto equivale a alrededor de 1 a 2 x 108 unidades formadoras de colonias (UFC). Como alternativa, puede usarse una suspensión directa en caldo o solución fisiológica de las colonias de un cultivo de 18 a 24 horas en placa de agar, ajus­ tada al estándar. En ese caso, las bacterias deben haberse desarrollado en un medio nutritivo, no selectivo, como el agar sangre. Los dispositivos comerciales para estandarizar el inóculo sin control de la turbidez ni preincubación en medio líquido también han tenido un rendimiento aceptable. 3. Antes de transcurridos 15 minutos después de hacer coincidir la turbidez de la suspensión del inóculo con la del estándar, sumer­ gir un hisopo de algodón no tóxico, estéril, dentro de la suspensión del inóculo y rotarlo varias veces con una presión firme sobre las paredes del tubo, para eliminar el exceso de líquido. 4. Sembrar la superficie seca de una placa de agar de Mueller-Hinton que haya sido llevada a temperatura ambiente, estriando el hisopo tres veces sobre toda la superficie del agar. haciendo rotar la placa aproximadamente 60° cada vez, para asegurar una dis­ tribución uniforme del inóculo sobre toda la superficie del agar. Para finalizar, pasar el hisopo por el borde del agar. Colocar la tapa de la placa. Dejar pasar por lo menos 3 a 5 minutos, pero no más de 15 minutos, para que se seque la superficie del agar antes de agregar los discos de antibióticos. B. Preparación alternativa del inóculo (suspensión directa de colonias) 1. Hacer una suspensión directa en caldo o solución fisiológica de colonias provenientes de un cultivo en placa de agar nutritivo, no selectivo (p. ej.. agar sangre), incubadas durante 18 a 24 horas. 2. Hacer coincidir de inmediato la densidad del inóculo con la densidad del estándar, como se hace en el método de desarrollo. 3. Este método se recomienda para las especies de Haemophilus, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae y especies de Staphylococcus cuando se prueba la sensibilidad a la oxacilina. C. Pruebas con antibióticos 1. Colocar los discos adecuados, impregnados en los antimicrobianos sobre la superficie del agar, utilizando pinzas o aplicadores de multidiscos.

Protocolos

P r o t o c o lo

1421

17-1

P r u e b a d e s e n s i b i l i d a d p o r d i f u s i ó n c o n d i s c o s ( B a u e r - K i r b y ) p a r a b a c t e r i a s s in r e q u e r i m i e n t o s n u t r i c i o n a l e s e s p e c i a l e s ( c o n t.)

2. Presionar con suavidad cada disco sobre la superficie del agar, para que el contacto sea uniforme. No mover el disco una vez que se haya puesto en contacto con el agar, ya que parte del fármaco se difunde casi de inmediato. Los discos deben distribuirse de manera uniforme sobre el agar. de modo que la distancia centro a centro no sea menor de 24 mm. 3. Invertir las placas y colocarlas en una estufa de aire atmosférico a 35 °C durante 16 a 18 horas (24 horas cuando se prueban esta­ filococos con meticilina u oxacilina, o enterococos con vancomicina). V. Resultados A. Interpretación Medida de los diámetros de los halos: examinar las placas después de incubarlas durante la noche. Mediante un calibre, regla o patrón, se miden con cuidado los halos de inhibición completa del desarrollo alrededor de cada disco, redondeando al milímetro más próximo; el diámetro del disco debe incluirse en esta medición. Todas las mediciones se hacen a simple vista, observando la placa de Petri desde abajo, con luz reflejada, contra un fondo negro que no refleje. La observación de las placas debe realizarse en sentido vertical, para evitar cualquier paralaje que pueda producir una lectura errónea. Las placas para determinaciones de sensibilidad preparadas con sangre deben observarse desde la superficie del agar y las mediciones se harán sin la tapa colocada, también con luz dirigida para iluminar la placa. Los problemas frecuentes en la deter­ minación de los tamaños de los halos se tratan en el texto. En las referencias de las normas publicadas se proporciona un correlato de interpretación (sensible, moderadamente sensible, intermedio o resistente) (véase cuadro 17-17). Los halos que corresponden al rango intermedio deben considerarse dudosos; si se desea hacer tratamiento con ese fármaco, debe realizarse una prueba de sensibilidad por dilución para aclarar el tema. VI. Bibliografía 1. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests: Approved standard (M2-A8). Wayne. PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2003. 2. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Disk Diffusion. Supplemental Tables, M100-S13 (M2). Wayne. PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003.

P r o t o c o lo

17-2

R e a l iz a c ió n

d e l a s p r u e b a s d e s e n s ib il id a d p o r m ic r o d il u c ió n e n c a l d o c o n b a c t e r ia s s in r e q u e r im ie n t o s n u t r ic io n a l e s e s p e c ia l e s

I. Principio La prueba por microdilución es una adaptación de la prueba de referencia macroscópica. Pueden probarse con facilidad grandes canti­ dades de aislamientos contra varios fármacos, de modo que el procedimiento se adapta bien al uso de rutina. Esta prueba genera mayor cantidad de información cuantitativa que la de difusión con discos, información que puede ser de utilidad o incluso esencial en ciertas circunstancias. Este protocolo resume el procedimiento básico: consultar el documento que figura en la bibliografía, del Clinical Laboratory Standards Institute (antes, National Committee for Clinical Laboratory Standards) para ver las variaciones que se usan para probar bacterias con requerimientos nutricionales especiales. El principio de la prueba de microdilución es el mismo que el de la prueba macroscópica. Los aislamientos bacterianos se exponen a diluciones seriadas de cada antimicrobiano, después de lo cual la concentración de fármaco que inhibe el desarrollo se determina por observación visual. II. Medios y reactivos A. Caldo nutritivo (se recomienda el caldo de digerido de caseína soja). B. Estándar de McFarland 0,5 para corregir el inoculo. C. Fondo blanco con líneas negras para la comparación de la turbidez del inoculo con el estándar 0,5 de McFarland. D. Placas de microtitulación congeladas o liofilizadas, con antibióticos en medio de Mueller-Hinton suplementado con cationes. E. Inoculadores múltiples, ya sea ansas de alambre o puntas plásticas descartables. F. Espejo de lectura y patrón para la determinación de los puntos finales. Puede hacerse un análisis fotométrico o fluorométrico de los puntos finales si se demuestra que son equivalentes a la observación visual. III. Control de calidad Debe hacerse un cpntrol de calidad con cada nuevo lote de placas. Durante su utilización, los controles pueden realizarse a diario o a intervalos semanales, si se cumplen criterios estrictos. Los microorganismos utilizados para las pruebas de dilución son Staphylococcus aureus (American Type Culture Collection [ATCC] 29213), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27583), Neisseria gonorrhoeae (ATCC 49226) y Haemophilus influenzae (ATCC 49247). Nótese que la cepa de S. aureus es distinta de la que se usa para las pruebas de difusión con discos. Como control de combinaciones que incluyan ácido clavulánico. un inhibidor de las P-lactamasas, puede utilizarse E. coli (ATCC 35218) (Véase cuadro 17-22).

1422

Protocolos

P r o t o c o lo

17-2

R e a l iz a c ió n

d e l a s p r u e b a s d e s e n s ib il id a d p o r m ic r o d il u c io n e n c a l d o c o n b a c t e r ia s s in r e q u e r im ie n t o s n u t r ic io n a l e s e s p e c ia l e s

( c o n t .)

IV. Procedimiento A. Preparación del inoculo: como para la prueba de difusión con discos (véase protocolo 17-1). B. Siembra de las placas Sembrar la suspensión bacteriana en cada pocilio de la placa de microtitulación antes de transcurridos 15 minutos luego de haber ajustado la densidad del inoculo. Un pocilio debe contener bacterias sin antibióticos (control de desarrollo) y otro debe contener caldo solo (control de esterilidad). Si el volumen del inoculo supera el 10% del volumen del pocilio, debe calcularse el efecto de dilución del antibiótico. Para evitar la desecación, colocar las placas dentro de una bolsa de plástico y cerrarla con cinta adhesiva plástica o con una cubierta plástica hermética. Debe sembrarse una parte de una placa de agar nutritivo, como agar sangre, para detectar contaminaciones. C. Incubación Incubar las placas a 35 °C durante 16 a 20 horas (24 horas cuando se prueban estafilococos contra oxacilina. meticilina o vancomi­ cina. o cuando se prueban enterococos contra vancomicina) en una estufa con circulación de aire. No colocar más de cuatro placas en una pila, de modo de mantener la temperatura de incubación constante. V. Resultados A. Interpretación La concentración inhibitoria mínima (CIM) es la menor dilución de antibiótico que inhibe el desarrollo del aislamiento. Puede deter­ minarse mediante la observación de las cubetas a simple vista, comparando el desarrollo de los pocilios que contienen antibióticos con el del pocilio control de desarrollo. La observación se facilita con un espejo de lectura, con el cual puede verse el fondo de los pocilios. Es de utilidad un patrón en el que se encuentre detallado el contenido de cada pocilio. Para que una prueba sea válida, debe haber desarrollo adecuado (turbidez difusa o un botón de sedimento de por lo menos 2 mm). En el caso de trimetoprim-sulfametoxazol, el punto final es por lo menos un 80% de inhibición del desarrollo. Un solo pocilio omitido puede ignorarse; si hay más poci­ lios omitidos, la prueba debe repetirse. Consultar las directivas para interpretación de resultados de CIM, como sensible, moderadamente sensible, intermedio o resisten­ te (véase cuadro 17-16). Examinar la placa de pureza y si se encuentra contaminación repetir la prueba. VI. Bibliografía 1. National Committee for Clinical Laboratory Standards. M7-A6 methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically: Approved standard. 6a ed. Wayne, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2003. 2. National Committee for Clinical Laboratory Standards. M100-S13 (M7) MIC testing. Supplemental Tables. Wayne. PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2003.

P r o t o c o lo

P rueba

17-3

d e d if u s ió n d e g r a d ie n t e s

(E t e st )

p a r a s e n s ib il id a d b a c t e r ia n a

I. Principio La prueba de difusión de gradientes utiliza una tira de plástico no porosa que se ha calibrado con valores de concentración inhibitoria mínima (CIM) que abarcan 15 diluciones al medio. Sobre la superficie de la tira opuesta a la escala de CIM se fija un gradiente prede­ finido del antibiótico. Cuando se transfiere al medio sólido, el antibiótico se difunde desde la tira (en forma similar a lo que sucede en la prueba de difusión con discos). Este protocolo resume el procedimiento general, que debe usarse sólo para combinaciones de anti­ bióticos y microorganismos que hayan sido validadas por comparación con métodos de referencia. II. Materiales y reactivos A. Caldo nutritivo o solución fisiológica al 0,85%. B. Hisopos estériles (con el algodón no demasiado apretado). C. Estándar de McFarland 0,5 o 1. D. Tiras Etest. E. Equipo aplicador para Etest o pinzas. F. Placas de agar de Mueller-Hinton (de 100 mm o 150 mm) con suplementos, si corresponde. III. El control de calidad se realiza con cepas adecuadas para las pruebas de dilución (véase protocolo 17-2).

Protocolos

1423

P rotocolo 17-3

P r u e b a d e d if u s ió n d e g r a d i e n te s ( E t e s t ) p a r a s e n s ib ilid a d b a c t e r i a n a

(cont.)

IV. Procedimiento A. Llevar las tiras Etest a temperatura ambiente (aproximadamente 30 minutos después de sacarlas del congelador a -2 0 °C). B. La preparación del inóculo es igual a la que se usa para las pruebas de difusión-con discos o para microdilución en caldo (véanse protocolos 17-1 y 17-2). C. Sembrar la placa de agar como para la prueba de difusión con discos (véase protocolo 17- 1). D. Dejar secar la superficie del agar 10 a 15 minutos a temperatura ambiente o en estufa antes de continuar. E. Abrir el envase dei Etest y colocar la tira o tiras en una palca de Petri seca o en la rejilla aplicadora. F. Aplicar la tira o tiras sobre la superficie del agar con pinzas o el aplicador, con la escala de CIM hacia arriba. Si la tira se coloca al revés, puede corregirse si se hace de inmediato. Si la tira se incuba en posición invertida, la prueba no es válida. G. Incubar como corresponda para el microorganismo por probar. V. Resultados A. Transcurrido el tiempo de incubación adecuado, leer la prueba sólo si hay desarrollo y la elipse de inhibición es claramente visible. B. Leer la CIM en el punto en el que un halo de inhibición bien definido interseca la tira. Los factores que deben considerarse en la determinación de la CIM se exponen en el texto y en el recuadro 17-7. C. Como el gradiente de antibióticos es continuo (lineal) y los criterios de interpretación son discontinuos (diluciones al medio), redon­ dear el valor de la CIM a la dilución al medio más próxima cuando se informe el resultado. VI. Referencia Etest Technical Guide 3B. Sona, Sweden: AB Biodisk.

P r o t o c o l o 1 8 -1

C o l o r a c ió n

de

D

ie n e p a r a l a id e n t if ic a c ió n d e m ic o p l a s m a s

I. Principio Las colonias de Mycoplasma provenientes de cultivos genitales se identifican con facilidad mediante la observación de colonias típicas en agar. La visualización de la morfología de las colonias se facilita aplicando el colorante de Dienes directamente sobre la superficie del agar. La coloración de Dienes es una tinción inespecífica que imparte un aspecto contrastante a las colonias de Mycoplasma sobre agar. lo que facilita la visualización de la morfología y las características de la colonia. II. Reactivos A. Colorante de Dienes modificado (solución madre) A z u l d e m e tile n o A z u r II M a lto s a N a2C 0 3 A g u a d e s tila d a

2 ,5 g 1,25 g 10 g 0 ,2 5 g I0 0 m L

La solución de trabajo del colorante de Dienes se prepara por dilución de una alícuota de la solución madre 1:3 con agua destilada. III. Procedimiento 1. Cubrir una placa de agar que contenga desarrollo de micoplasmas con 1 mL de solución de trabajo del colorante de Dienes. 2. Enjuagar de inmediato la superficie del agar con agua destilada para eliminar el colorante. 3. Decolorar el medio con 1 mL de etanol al 95%. Dejar en contacto con el agar durante 1 minuto, luego eliminar. Repetir el paso de lavado una segunda vez. 4. Enjuagar la placa con agua destilada y dejar secar. 5. Observar las colonias con un microscopio de bajo aumento (50 a lOOx). IV. Resultados A. Interpretación Los micoplasmas con la morfología de las colonias en “huevo frito” se tiñen con un centro de color azul oscuro y una periferia azul clara y tienen aspecto muy granuloso. El fondo del agar puede ser transparente o ligeramente violeta.

1424

Protocolos

P r o t o c o l o 18-1

C o l o r a c i ó n d e D i e n e p a r a l a i d e n t i f i c a c i ó n d e m i c o p l a s m a s ( c o n t.)

Los micoplasmas que no son M. pneumoniae permanecerán coloreados; M. pneumoniae reduce el azul de metileno después de un tiempo y se pone incoloro. Si el aislamiento proviene del aparato genital y produce colonias y coloración típicas, puede infor­ marse como M. hominis. V. Bibliografía Velleca WM, Bird BR. Forrester FT. Laboratory Diagnosis of Mycoplasma Infections. Atlanta: Department of Health and Human Services, 1980.

P rotocolo 18-2

P r u e b a d e h e m a d s o r c i ó n p a r a l a i d e n t i f i c a c i ó n d e M y c o p l a s m a p n e u m o n ia e

I. Principio Entre los micoplasmas respiratorios, M. pneumoniae es la única especie que adsorbe específicamente eritrocitos. Por lo tanto, esta pro­ piedad representa un método para su identificación presuntiva. Cuando se observa desarrollo de colonias en medios para aislamiento de micoplasmas sembrados con muestras provenientes de las vías respiratorias, se coloca una suspensión de eritrocitos de cobayo sobre la superficie del agar durante un tiempo determinado y luego se elimina por lavado. Las colonias de M. pneumoniae adsorberán algunos eritrocitos sobre la superficie de la colonia. II. Reactivos A. Agar glucosa para micoplasmas con colonias sospechosas. B. Eritrocitos de cobayo lavados (0,2 a 0,4%) suspendidos en caldo para micoplasma. III. Control de calidad A. Control positivo: M. pneumoniae. B. Control negativo: especies de Mycoplasma. IV. Procedimiento 1. Cubrir la superficie de la placa de agar con 2 mL de la suspensión de eritrocitos. 2. Incubar la placa a 35 °C durante 30 minutos, rotándola en ocasiones para evitar que sedimenten los eritrocitos. 3. Lavar la superficie de la placa tres veces con 3 mL de caldo para micoplasma, rotando suavemente la placa. Eliminar el líquido de lavado por aspiración con una pipeta. 4. Observar las colonias con aumento 50 x a 100 x con microscopio de disección. V. Resultados A. Interpretación Prueba positiva: colonias con eritrocitos adsorbidos en la superficie = M. pneumoniae. Negativa: colonias sin eritrocitos adsorbidos = especies de Mycoplasma no M. pneumoniae. VI. Bibliografía Manchee RJ. Taylor-Robinson D. Hemadsorption and hemagglutination by mycoplasmas. J Gen Microbiol 1968:50:465.

P r o t o c o l o 1 8 -3

P r u e b a d e c l o r u r o m a n g a n o s o u r e a p a r a l a i d e n t i f i c a c i ó n d e U r e a p l a s m a u r e a l y t ic u m

I. Principio U. urealyticum es la única especie de micoplasmas humanos capaz de hidrolizar la urea a amoníaco. Esta propiedad no sólo facilita el aislamiento del microorganismo, sino que también representa un método rápido y conveniente para identificar la especie en los culti­ vos. La prueba del cloruro manganoso (MnCL,)-urea proporciona un método para detectar visualmente la formación de amoníaco por parte de U. urealyticum. La actividad ureasa de U. urealyticum se detecta exponiendo las colonias a una solución de MnCl2 en presencia de urea. La ureasa del microorganismo hidroliza la urea a amoníaco, según la siguiente reacción: 2NH3 + 2 H ,0

2NH4OH -> 2NH4+ + 20H

MnCl2 + 20H - h>MnO, + 2HC1

Protocolos

1425

P r o t o c o l o 18-3

P r u e b a d e c l o r u r o m a n g a n o s o u r e a p a r a l a i d e n t i f i c a c i ó n d e U r e a p l a s m a u r e a l y t ic u m ( c o n t.)

El óxido de manganeso formado en la reacción es insoluble y produce un precipitado marrón oscuro alrededor de las colonias. Esta reacción se detecta por observación con un microscopio de disección. II. Reactivos A. Reactivo MnCl2-urea U re a (S ig m a , S t L o u is , M O ) M n C I2 (F is h e r S c ie n tific , H a m p to n , N H ) A g u a d e s tila d a

1 g 0 ,8 g 100 m L

B. Esterilizar por filtración, fraccionar en alícuotas de 3 mL y congelar a -2 0 °C C . Cultivos de colonias sospechosas en agar

III. Control de calidad A. Control positivo: U. Urealyticum. B. Control negativo: M. hominis. IV. Procedimiento 1. Cubrir la placa con 2 a 3 mL del reactivo MnCl -urea. 2. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, examinar las colonias con un microscopio de disección con aumento 50x a lOOx. V. Resultados A. Interpretación Las colonias de U. urealyticum se tiñen de color marrón oscuro. Otros micoplasmas (p. ej.. M. hominis) permanecen sin teñir. VI. Comentarios Esta prueba funciona en forma óptima en colonias que no están demasiado próximas entre sí en agar. Las colonias no deben tener más de 48 horas cuando se realiza la prueba. VII. Bibliografía Shepard MC. Howard DR. Identification of "T" mycoplasmas in primary agar cultures by means o f a direct test for urease. Ann NY Acad Sci 1970:174:809.

P r o t o c o l o 1 8 -4

M e d i o p a r a a i s l a m i e n t o d e M y c o p l a s m a p n e u m o n ia e

I. Reactivos básicos para la preparación del medio completo A. Agar base para micoplasmas: este medio puede prepararse utilizando agar PPLO obtenido en el comercio, de acuerdo con las ins­ trucciones del prospecto del producto, o puede prepararse de materias primas utilizando la siguiente fórmula: In fu s ió n d e c o ra z ó n v a c u n o P e p to n a NaC l A g a r p u rific a d o A g u a d e s tila d a

50 10 5 14 1

g g g g L

Mezclar todos los reactivos y poner en baño María hirviendo para fundir el agar. Fraccionar en alícuotas de 70 mL y colocar en auto­ clave a 15 psi durante 15 minutos. Conservar a 4 °C. B. Extracto de levadura 1. Adquirir extracto de levadura comercial al 25% o prepararlo como sigue: pesar 250 g de levadura de repostería activa y colocarla en 1 L de agua destilada. Calentar hasta ebullición, enfriar y filtrar para eliminar el material no disuelto. Ajustar el pH a 8 y este­ rilizar por filtración. 2. A continuación, el extracto de levadura (20 mL) se mezcla con suero de caballo inactivado (10 mL) en relación 2:1 y se conge­ la en alícuotas de 30 mL a -2 0 °C. C. Solución de rojo fenol (0,4%): se disuelve rojo fenol (1 g) en 3 mL de NaOH 1 N y se le agregan 247 mL de agua destilada. La solución se esteriliza por filtración y se conserva entre 4 y 8 °C. D. Solución de azul de metileno (1%): se disuelve azul de metileno (1 g) en 100 mL de agua destilada y se coloca en autoclave duran­ te 15 minutos.

1426

Protocolos

P r o to c o lo 18-4

M e d i o p a r a a i s l a m i e n t o d e M y c o p l a sm a p n e u m o n ia e ( c o n t.)

E. Solución de acetato de talio (10%): se disuelven 10 g de acetato de talio en 100 mL de agua destilada y se esteriliza por filtración. F. Solución de glucosa: se disuelve glucosa (50 g) en 100 mL de agua destilada y se esteriliza por filtración. G. Solución de penicilina: se disuelve penicilina en polvo en agua destilada liasta una concentración de 100 000 unidades/mL. II. Medio bifásico azul de metileno glucosa 1. Fundir 70 mL de agar para micoplasma en baño M ana hirviendo. Enfriar a 50 °C y agregar 30 mL de mezcla de extracto de leva­ dura-suero precalentado. 2. Agregar los siguientes elementos: Solución Solución Solución Solución Solución

de de de de de

azul de metileno (1%) rojo fenol (0,4%;) glucosa acetato de talio (10%) penicilina

0,1 0,5 2 0,25 3

mL mL mL mL mL

3. Ajustar el pH a 7,8 con NaOH 1 N estéril. 4. Fraccionar el agar en alícuotas de 1 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm con tapa de rosca. 5. Mezclar 140 mL de caldo para micoplasma (como A, más aniba. sin agar) con 60 mL de la mezcla de extracto de levadura-suero. Agregar a esta mezcla lo siguiente: Solución solución Solución Solución Solución

de de de de de

azul de metileno (1%) rojo fenol glucosa acetato de talio (10%) penicilina

0,2 1 4 6 0,5

(Di­ mL mL mL mL

Ajustar el pH a 7,8 con NaOH l N estéril. Agregar 2 mL a cada uno de los tubos que contienen el medio sólido ya solidificado. III. A gar con glucosa para micoplasmas 1. Fundir 70 mL de agar para micoplasma en baño M aría hirviendo. Enfriar a 50 °C. 2. Precalentar 30 mL de la mezcla extracto de levadura-suero y mezclar con el agar. 3. Agregar con técnica aséptica los siguientes reactivos: Solución de glucosa Solución de acetato de talio (10%) Solución de penicilina

2 mL 0,25 mL 3 mL

4. Ajustar el pH a 7,8 con NaOH 1 N estéril. 5. Verter 6 mL del medio en placas de Petri de 60 x 15 mm. Dejar enfriar. Conservar el medio a 4 °C. IV. M edio SP-4 (también utilizado para el cultivo de M. pneunoniae, pero fundamentalmente para el cultivo de especies con requerimien­ tos nutricionales especiales) A. M edio basal Caldo base para micoplasmas (BBL) 3,5 g/L Bacto Tryptone (Difeo)® 10 g/L Bacto Peptone (Difeo)® 5 g/L Glucosa 5 g/L Agua desionizada 615 mL Ajustar el pH a 7,5 - 7,6 Esterilizar en autoclave a 121 °C, 15 minutos

Protocolos

1427

P r o to c o lo 18-4

M e d i o p a r a a i s l a m i e n t o d e M yc o p l a sm a p n e u m o n ia e ( c o n t.)

B. Suplementos estériles: Suplemento para cultivo de tejidos con glutamina CMRL 1066 (Gibco) Extracto de levadura fresco (solución al 25%) Yeastolate (solución al 2%) Suero fetal bovino (calentado a 56 °C una hora) Penicilina (concentración de 100 000 U/mL) Solución de rojo fenol (acuosa, 0,1%)

50 35 100 170 10 20

mL mL mL mL mL mL

C. Fórmula final Combinar el medio basal (615 mL) con los suplementos (385 mL) y fraccionar en forma aséptica en volúmenes de 3 mL, en fras­ cos de 4 mL con tapa de rosca. V. Bibliografía Velleca WB, Bird BR. Forrester FT. Laboratory Diagnosis of Mycoplasma Infections. Atlanta: Department of Health and Human Services, 1980.

P r o to c o lo 18-5

M e d io p a r a a is l a m ie n t o d e m ic o p l a s m a s g e n it a l e s

I. Caldo y agar U para aislam iento de Ureaplasma urealyticum A. Caldo U 1. Agregar los siguientes ingredientes a 70 mL de caldo base para micoplasmas (BBL) (véase protocolo 18-4): Extracto de levadura-suero de caballo Solución de urea (50%) Solución de rojo fenol (0,4%) Solución de penicilina Solución de polimixina B (5 000 Mg/mL) Solución de lincomicina (1 500 pg/mL) Solución de anfotericina B (5 000 pg/mL)

30 0,1 0,5 0,5 0,5 1 0 ,1

mL mL mL mL mL mL mL

2. Ajustar el pH a 6 con HC1 IN. 3. Fraccionar en alícuotas de 2 mL en tubos estériles de 12 x 75 mm con tapa de rosca o en frascos ampolla estériles de 3,88 g. Conservar entre 4 y 8 °C. B. Agar U 1. Agregar 30 g de caldo de tripticasa soja a 1 L de agua destilada. Añadir 11,3 g de agar purificado (p. ej., Noble agar, Ion agar 2) y calentar hasta ebullición para disolver. Fraccionar en alícuotas de 80 mL y conservar en frigorífico. 2. Fundir 80 mL de agar base en un baño M aría hirviendo y enfriar a 50 °C. Ajustar el pH a 6 con HC1 IN. 3. En otro recipiente estéril, mezclar lo siguiente: Suero de Solución Solución Solución Solución

caballo de rojo fenol (0,4%) de urea (50%) de penicilina de lincomicina (1 500 pg/mL)

2 0,5 0,1 0,5 1

mL mL mL mL mL

4. Agregar el agar al contenido del recipiente, mezclar y fraccionar en alícuotas de 3 mL en placas de Petri de 60 x 15 mm. Colocar en bolsas de plástico y alm acenar entre 4 y 8 °C.

1428

Protocolos

P rotocolo

18-5

M e d i o p a r a a i s l a m i e n t o d e m i c o p l a s m a s g e n i t a l e s (cont.)

II. Caldo y agar H para aislamiento de M ycoplasm a hom inis

A. Caldo H 1. Agregar los siguientes ingredientes a 70 mL de caldo base para micoplasmas (BBL) (véase protocolo 18-4). Extracto de levadura-suero de caballo Clorhidrato de L-arginina (30%) Solución de rojo fenol (0,4%) Solución de penicilina Polimixina B (5 000 pg/mL) Anfotericina B (5 000 pg/mL)

30 0,66 0,5 0,5 1 0,1

mL mL mL mL mL mL

2. Ajustar el pH a 7 con HC 1 1N. 3. Fraccionar en alícuotas de 2 mL en tubos estériles de 12 x 75 mm con tapa de rosca o en frascos ampolla estériles de 3.88 g. Conservar entre 4 y 8 °C. B. Agar H 1. Fundir 70 mL de agar base en un baño M aría hirviendo y dejar enfriar a 50 °C. 2. Ajustar el pH del agar a 7 con H CI IN. 3. Precalentar 30 mL de extracto de levadura-suero y agregar lo siguiente: Clorhidrato de L-arginina (30%) Solución de rojo fenol (0,4%) Solución de penicilina

0,66 mL 0,5 mL 0,5 mL

4. M ezclar el agar base con el extracto de levadura-suero y los suplementos, y fraccionar en alícuotas de 3 mL en placas de Petri de 60 x 15 mm. Almacenar en bolsas de plástico entre 4 y 8 °C. VI. Bibliografía Velleca W M, Bird BR, Forrester FT. Laboratory Diagnosis of Mycoplasma Infections. Atlanta: Department of Health and Human Services, 1980.

P r o t o c o l o 18-6

P r u e b a d e r e d u c c i ó n d e l t e t r a z o l i o p a r a l a i d e n t i f i c a c i ó n p r e s u n t i v a d e M yc o p l a sm a p n e u m o n ia e

I. Principio M. pneum oniae es capaz de reducir el compuesto incoloro tetrazolio al compuesto de color rojo formozán. Entre los micoplasmas que forman colonias grandes, ésta es una característica peculiar de M. pneu m o n ia e que representa para el laboratorio un método rápido y fácil para identificar colonias de M. pneum oniae directamente en el medio de aislamiento. Mediante la utilización de enzimas asociadas con la membrana celular del microorganismo, M. pneu m o n ia e puede reducir el com ­

puesto cloruro de 2-(¿>-yodofenil)-3-nitrofenil-5-fenil tetrazolio a formozán. un compuesto rojo insoluble que precipita en las células y hace que las colonias tomen un color rojo a negro violáceo si la exposición al sustrato es prolongada. II. Reactivos 1. Colonias aisladas en agar glucosa para micoplasmas. 2. Cloruro de 2-(/>yodofenil)-3-nitrofenil-5-fenil tetrazolio (Aldrich Chemical): 0,21 g/100 mL de agua destilada. Esterilizar por filtración y conservar en frascos color caramelo a temperatura ambiente. III. Control de calidad A. Control positivo: M. pneum oniae. B. Control negativo: especies de M ycoplasm a. IV. Procedimiento 1. Cubrir la superficie de la placa de agar que contiene las colonias del microorganismo con 2 mL del reactivo de tetrazolio. 2. Incubar la placa a 35 °C durante 30 a 60 minutos (la incubación durante 60 minutos intensifica las reacciones que ya son evi­ dentes a los 30 minutos). 3. Examinar las colonias con aumento entre 50x y lOOx con un microscopio de disección.

Protocolos

1429

P r o t o c o l o 18-6

P r u e b a d e r e d u c c i ó n d e l t e t r a z o l i o p a r a l a i d e n t i f i c a c i ó n p r e s u n t i v a d e M yc o p l a sm a p n e u m o n ia e (c o n t.)

V. Resultados A. Interpretación 1. Prueba positiva: las colonias de M. pneum oniae se oscurecerán visiblemente y se verán de color rojo o púrpura después de 60 minutos. Con incubación prolongada (3 a 4 horas) las colonias se ponen negras. 2. Prueba negativa: no se notan cambios de color después de 60 minutos. VI. Comentarios Aunque es equivalente a la prueba de hemadsorción, la reducción de tetrazolio puede hacerse en la misma placa después de efectuar la prueba de hemadsorción. VII. Bibliografía Johnson JE, Smith TF. A simplified tetrazolium reduction test for Mycoplasma pneumoniae. M ed Lab Sci 1976;33:235.

P r o t o c o l o 19-1

D ig e s tió n y d e s c o n ta m in a c ió n : /V - a c e til- l- c is te ín a - h id r ó x id o d e s o d io

(NALC)

I. Principio Las micobacterias se aíslan de m anera óptim a en muestras clínicas cuando se las libera de mucina, líquidos corporales y células (digestión). La A'-acetil-L-cisteína (NALC) es un agente mucolítico que, en concentraciones del 0,5-2% , puede digerir con rapidez los esputos muy viscosos y otras muestras mucoides en el término de 2 minutos. El desarrollo de micobacterias en los medios de cultivo también se incrementa cuando la concentración de microorganismos competidores es mínima (descontaminación). El agregado de hidróxido de sodio al 4% a la mezcla de digestión, hasta alcanzar una concentración final del 2%, es el procedimiento descontaminan­ te utilizado con mayor frecuencia. II. M uestra A. Tipo de muestra Cualquier muestra de consistencia mucoide o que se sabe que está contaminada con bacterias debe someterse a un proceso de diges­ tión y descontaminación. Se incluyen todas las muestras respiratorias, líquido de lavado gástrico, heces, orina (cuando la coloración de Gram muestra la presencia de bacterias), tejidos post mortem y muestras de biopsia. B. Preparación del paciente Cuando se recogen muestras que deben atravesar una zona contaminada, como esputo expectorado, debe hacerse todo lo posible para limpiar o descontaminar la zona. Por ejemplo, antes de indicar a los pacientes que expectoren, deben enjuagar muy bien su boca dos o tres veces con agua o con un medicamento para lavado bucal. La piel adyacente a un sitio de biopsia debe desinfectarse con cuidado con solución yodada y después con un hisopo con alcohol. C. Procedimientos especiales de recolección En el caso de pacientes en los que se sospecha tuberculosis pulmonar y que no pueden producir un esputo adecuado, debe obtener­ se un esputo inducido. Cuando es difícil establecer el diagnóstico, pueden ser necesarios procedimientos invasivos, como biopsias por cepillado bronquial, lavados bronquiales o lavados broncoalveolares. D. Condiciones especiales de manipulación Todas las muestras rem itidas para cultivo de micobacterias deben manipularse dentro de una campana de bioseguridad que funcio­ ne adecuadamente. También hay que tener cuidado durante la preparación, observación y conservación de las muestras coloreadas, ya que es posible que durante el procedimiento de fijación y coloración no mueran todos los bacilos ácido-alcohol resistentes. Hay que tener cuidado de no producir aerosoles cuando se realizan subcultivos, se centrifugan las muestras y se llevan a cabo las dife­ rentes pruebas bioquímicas. III. Materiales A. Equipo 1. Centrífuga con camisas que im pidan la formación de aerosoles. 2. Agitadora vorticial. B. Materiales 1. Recipiente con solución desinfectante para desechar materiales. 2. Tubos cónicos de polipropileno de 50 mL con tapa de rosca (que eviten la formación de aerosoles y graduados). 3. Pipetas estériles de 10 mL. 4. Portaobjetos de 2,5 x 7,5 cm, limpios, sin rayaduras. C. Reactivos N-acetil-L -cisteína (NALC) para digerir y descontaminar: TB base digestant®, 50 mL (disponible en el comercio).

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Protocolos

P r o t o c o l o 19-1

D ig e s tió n y d e s c o n ta m in a c ió n : íV - a c e til- l- c is te ín a - h id r ó x id o d e s o d io

(NALC) (cont.)

2. Buffer fosfato TB: 0.067 M, pH 6,8. 250 mL (disponible en el comercio). 3. ¿ V -a c e til-L -c is te ín a (NALC): Mucomyst®. solución al 20% (disponible e n el comercio, provista por Bristol Laboratories, Evansville, IN). IV. Control de calidad El porcentaje de muestras clínicas que m uestran desarrollo de contaminantes bacterianos en los cultivos para TB después del procedi­ miento de digestión y descontaminación debe ser de alrededor del 3% en promedio. Una tasa de contaminación significativamente menor del 3% puede indicar una descontaminación demasiado intensa y hay que reducir la concentración de NaOH. Una tasa de con­ taminación significativamente mayor del 5% sugiere una descontaminación demasiado débil o una digestión incompleta. El aumento de la concentración del NaHO o del tiempo de exposición, o ambas cosas, puede corregir este problema. V. Procedimiento 1. Agregar 1.5 mL de NALC a 50 mL de base homogeneizante para TB, para preparar la solución de trabajo. 2. En un tubo de centrífuga cónico, estéril, de polipropileno, de 50 mL con tapa de rosca, agregar un volumen de la solución de tra­ bajo NALC-NaHO (preparado no más de 24 horas antes) igual al volumen de la muestra. Si se envían más de 20 mL de mues­ tra, utilizar una pipeta estéril para seleccionar 10 mL de la porción más purulenta, sanguinolenta o mucoide. Cerrar bien la tapa. 3. Agitar los tubos en una agitadora vorticial durante no más de 30 segundos. Asegurarse de mover el tubo de modo que el NALCNaHO se ponga en contacto con toda la superficie interna del tubo. 4. D ejar el tubo en reposo durante 15 minutos a temperatura ambiente para descontaminar la muestra. 5. Diluir la mezcla, agregando agua destilada estéril o buffer fosfato 0,067 M estéril (pH 6,8) hasta la marca de 50 mL. Esto redu­ cirá la acción continua del NaHO y disminuirá la viscosidad de la mezcla. 6. Volver a tapar bien los tubos e invertirlos varias veces para mezclar el contenido. 7. Centrifugar los tubos a 3 000 g durante 15 a 20 minutos. Utilizar camisas de centrífuga selladas para evitar los aerosoles. 8. Verter el sobrenadante en un recipiente desechable a prueba de salpicaduras que contenga desinfectante. 9. Mediante un ansa bacteriológica estéril de 3 mm de diámetro o el extremo de dos palillos de madera estériles, tom ar una por­ ción del sedimento y preparar un frotis sobre una superficie de 1 x 2 cm sobre un portaobjetos de vidrio nuevo, limpio y sin rayaduras. 10. Si los medios van a sembrarse de inmediato, suspender el sedimento restante en 1 a 2 mL de buffer TB o en agua destilada esté­ ril. De lo contrario, suspender el sedimento en 1 a 2 mL de albúmina bovina fracción V al 0,2% estéril. Si la cantidad de sedi­ mento es muy pequeña, reconstituirlo en sólo 1 mL. 11. Agregar 3 gotas a cada lado de un tubo de agar 7 H 1 1 en pico de flauta. 12. Sembrar 0,5 mL en un frasco ampolla BACTEC. VI. Resultados No corresponde. VII. Notas acerca del procedimiento 1. Debe evitarse agitar en exceso la solución de NALC-NaHO porque el NALC es inestable en presencia de oxígeno. 2. La albúmina bovina sirve como buffer para el inóculo y aumenta la adherencia de la muestra al medio sólido. 3. Sólo debe utilizarse agua estéril: el agua corriente puede contener micobacterias ambientales que pueden confundir las obser­ vaciones de los frotis coloreados y contam inar los medios de cultivo. VIII. Limitaciones del procedimiento La concentración de NaHO y el tiempo de exposición de la muestra al reactivo durante el procedimiento de descontaminación deben controlarse con cuidado para evitar la pérdida de micobacterias durante el procedimiento. IX. Bibliografía Good RC. Silcox V. Kilbum JO. Tuberculosis and other mycobacterioses. En: Balows A. Hausler WJ. eds. Diagnostic Procedures for Bacterial, Mycotic and Parasitic Infections, 6a ed. Washington DC: American Public Health Association. 1985:675-703. Kubica GP. Dye WE, Cohn ML, Middlebrook G. Sputum digestión and decontamination with A'-acetyl-L-cysteine-sodium hydroxide for culture of mycobacteria. Am Rev Respir Dis 1963:87:775-779. Strong BE, Kubica GP. Isolation and Identification o f M ycobacterium tuberculosis: A Guide for the Level II Laboratory. Atlanta: Centers for Disease Control, 1976, Public Health Service publication 81-8390.

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P r o t o c o l o 19-2

C o l o r a c io n e s c o n c a r b o l f u c s i n a

I. Principio Los ácidos carbólicos existentes dentro de la pared celular cérea rica en lípidos de las micobacterias tienen la capacidad particular de unirse al colorante fucsina de una forma tal que no pueden desteñirse con alcohol-ácido. La tinción de Ziehl-Neelsen se conoce como “coloración en caliente" porque se utiliza calor para que el colorante atraviese la pared celular. La tinción de Kinyoun se conoce com o “coloración en frío" porque la alta concentración de fenol presente en el reactivo sirve para “disolver" el material lipídico de la pared celular, lo que permite la penetración del colorante carbolfucsina sin utilizar calor. Una vez teñida, la pared celular mantiene el colorante en forma “resistente", lo que le confiere el característico color rojo. II. Muestra Se prepara un frotis directamente de la muestra o de una suspensión de microorganismos obtenidos de colonias desarrolladas en medios de cultivo primarios. III. Materiales A. Equipo: portaobjetos de vidrio de 75 x 25 mm y reactivos. B. Medios: no corresponde. C. Reactivos 1. Carbolfucsina (disponible en el comercio). 2. Alcohol-ácido (disponible en el comercio). 3. Coloración de contraste con azul de metileno (disponible en el comercio). IV. Control de calidad A. Se preparan frotis control positivos sin teñir (M. tuberculosis) y frotis control negativos (N ocardia asteroides). B. Antes de leer los frotis del paciente se revisan los frotis control para confirmar que las bacterias toman la coloración ácido-alcohol resistente: 1. Positivo: especies de M ycobacterium : rojo magenta en un fondo azul. 2. N. asteroides: no hay células ácido-alcohol resistentes: fondo azul. C. Si los frotis control son inaceptables, revisar los procedimientos y la preparación de reactivos. Los siguientes son frotis control ina­ ceptables: 1. Los bacilos en los controles positivos no se tiñen de rojo. 2. Los controles negativos permanecen rojos después de la decoloración. 3. El fondo no está adecuadamente decolorado. V. Procedimiento A. Ziehl-Neelsen 1. Colocar una tira de papel de filtro de 2 x 3 cm sobre el portaobjetos, para mantener el colorante sobre éste y filtrar los cristales no disueltos. 2. Cubrir la tira de papel con fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen. 3. Con un mechero Bunsen o con un dispositivo eléctrico para coloraciones, calentar lentamente el portaobjetos hasta la emisión de vapores, pero sin llegar a la ebullición. 4. Dejar teñir durante 5 minutos. Si el colorante se seca, agregar más sin calentar. 5. Quitar con cuidado la tira de papel del portaobjetos con pinzas. 6. Lavar con abundante agua. 7. Cubrir el frotis con decolorante alcohol-ácido al 3% durante 2 minutos. 8. Lavar con agua y eliminar el exceso. 9. Cubrir el portaobjetos con la coloración de contraste de azul de metileno durante 1 minuto. No secar con papel. 10. Examinar el frotis con un objetivo de inmersión en aceite lOOx. B. Kinyoun 1. Fijar con calor los frotis en un calentador para portaobjetos a 72-75 °C. 2. Cubrir el frotis con el reactivo de carbolfucsina de Kinyoun. Puede aplicarse un pequeño trozo rectangular de papel de filtro de 5 x 7,5 cm sobre el frotis y aplicar el colorante sobre él, para evitar el derrame por los lados del frotis. No calentar. 3. Teñir durante 5 minutos. 4. Retirar el papel de filtro con pinzas, lavar el colorante con agua destilada. 5. Decolorar durante 3 minutos con alcohol-ácido o hasta que no salga más color rojo. 6. Cubrir el frotis durante 3-4 minutos con colorante de contraste de azul de metileno. 7. Lavar, secar y examinar el frotis con un objetivo de inmersión en aceite 100 x.

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P r o t o c o l o 19-2

C o l o r a c i o n e s c o n c a r b o l f u c s i n a ( c o n t .)

VI. Resultados Exam inar el frotis con un objetivo de inmersión en aceite 100 x e informar como sigue: Observación microscópica 1 o 2 cada 300 campos (3 barridos) 1-9 cada 100 campos 1-9 cada 10 campos 1-9 por campo de inmersión 9 por campo

Informe (Dudoso, repetir e informar el resultado de la repetición) Muy escasos, 1+ Pocos, 2+ Abundantes, 3+ 4+

VIL Notas acerca del procedimiento 1. Evitar la decoloración insuficiente con alcohol-ácido. Los microorganismos verdaderamente ácido-alcohol resistentes son muy difíciles de decolorar en exceso. 2. Evitar hacer frotis gruesos, que pueden interferir en la decoloración adecuada. 3. Si se encuentra una cantidad no habitual de resultados positivos en los frotis, con cultivos negativos, controlar que en los depósi­ tos de agua no haya microorganismos ácido-alcohol resistentes contaminantes. La transferencia de materiales de un portaobjetos a otro y en el aceite de inmersión son otras posibles causas de resultados falsos positivos de los frotis. 4. Las tinciones de contraste muy intensas pueden enmascarar la presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes. El verde brillante puede ser levemente más ventajoso que el azul de metileno como colorante de contraste. VIII. Limitaciones del procedimiento 1. Los frotis ácido-alcohol resistentes no significan nada por sí mismos; la interpretación final siempre debe hacerse teniendo en cuenta los resultados del cultivo. 2. Existen microorganismos distintos de las micobacterias que pueden tener grados variables de ácido-alcohol resistencia: especies de Rhodococcus, especies de Nocardia. Legionella micdadei y los quistes de especies de Cryptosporidium. Utilizar las diferencias morfológicas y la correlación con el aspecto de los cultivos y los resultados de otras pruebas bioquímicas. 3. Las micobacterias de crecimiento rápido pueden teñirse mal o no teñirse. La coloración de Ziehl-Neelsen puede teñir mejor que el método de Kinyoun los microorganismos débilmente ácido-alcohol resistentes. IX. Bibliografía Berlin OGW. Mycobacteria. En: Barón EJ, Finegold SM, eds. Bayley and Scott’s Diagnostic Microbiology. St. Louis: Mosby, 1990:597-640. Ebersole LL. Acid-fast stain procedures. En: Isenberg HD. M ycobacteriology Section, Clinical Microbiology Procedure Handbook, Washington DC: American Society for Microbiology, 1992. Kent PT, Kubica GP. Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory. Atlanta: Centers for Disease Control, 1985. Department of Health and Human Services publication 86-21654.

P r o t o c o l o 19-3

C o l o r a c ió n f l u o r e s c e n t e : A u r a m i n a

O; A u r a m in a - r o d a m in a

I. Principio Los microorganismos ácido-alcohol resistentes emiten una fluorescencia amarilla brillante cuando se activan con luz ultravioleta de onda corta. La coloración de contraste con perm anganato de potasio hace que el fondo de detritos inespecíficos emitan fluorescencia de color amarillo pálido, que contrasta con el aspecto amarillo brillante de los bacilos ácido-alcohol resistentes. II. Muestra Los frotis se preparan directamente del material clínico o de una suspensión de microorganismos provenientes de colonias desarrolla­ das en un medio de cultivo primario. III. Materiales A. Equipo 1. Portaobjetos de 2,5 cm x 7,5 cm. B. Reactivos 1. Auramina O a. Solución 1: disolver 1,5 g de auramina O en 10 mL de etanol al 95%. b. Solución 2: disolver 3 g de cristales de fenol en 87 mL de agua destilada. c. Solución de trabajo: mezclar las soluciones 1 y 2. Rotular con el nombre del reactivo y las fechas de preparación y vencimiento. El vencimiento es de 3 meses si se conserva en un frasco color caramelo.

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P ro to c o lo

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C o lo r a c ió n f lu o r e s c e n t e : A u ra m in a

O; A u r a m i n a - r o d a m i n a (cont.)

2. Auramina-rodamina a. Solución 1: disolver 1,5 g de auramina O y 0,75 g de rodam ina B en 75 mL de glicerol. b. Solución 2: mezclar 10 mL de fenol con 50 mL de agua destilada. c. Solución de trabajo: mezclar las soluciones 1 y 2 durante 24 horas en una agitadora magnética. Filtrar el colorante a través de lana de vidrio y conservar en un frasco de vidrio. Rotular con el nombre del reactivo y las fechas de preparación y vencimien­ to. La fecha de vencimiento es a los 3 meses si se conserva en un frasco color caramelo. 3. Coloración de contraste de permanganato: 0,5% a. Disolver 0,5 g de perm anganato de potasio en 100 mL de agua destilada. b. Rotular con el nombre del reactivo y las fechas de preparación y vencimiento. 4. Acido-alcohol al 0.5% decolorante a. Agregar 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado a 100 mL de etanol al 70% b. Rotular con el nombre del reactivo y las fechas de preparación y vencimiento. c. El vencimiento se produce a los 3 meses si se conserva a tem peratura ambiente. C. Materiales especiales 1. Microscopio de fluorescencia provisto con un filtro primario BG-12 o 52112 y un filtro barrera OG-1. D. Instrucciones de bioseguridad 1. M anipular todos los portaobjetos con cuidado. La fijación por calor puede no matar todas las micobacterias. Desechar los porta­ objetos en un recipiente de bioseguridad. 2. Esterilizar por calor las ansas bacteriológicas en el incinerador eléctrico que se encuentra dentro de la campana de bioseguridad. 3. Realizar todas las operaciones en una campana de bioseguridad. Colocar una toalla de papel embebida con desinfectante debajo del campo de trabajo. Limpiar con cuidado todas las superficies de trabajo con una solución desinfectante antes y después de su uso. 4. Carcinógeno. 5. Trabajar bajo campana en el laboratorio de quím ica especial. IV. Control de calidad A. M ateriales de control para utilizar En cada serie de coloraciones se incluye un frotis control positivo y uno negativo para micobacterias. Los frotis control se observan antes de leer el frotis del paciente, para confirmar que el control positivo contiene micobacterias fluorescentes y que el negativo no tiene células fluorescentes. 1. Control positivo: especies de M ycobacterium; bacilos con fluorescencia amarilla a naranja. 2. Control negativo: Nocardia asteroides; ausencia de células fluorescentes. Si cualquiera de los frotis control es inaceptable, revisar las preparaciones y el procedimiento. V. Procedimiento 1. Fijar los frotis por calor sobre un calentador de portaobjetos a 72 a 75 °C. 2. Cubrir la superficie del frotis con auramina O. Dejar actuar durante 15 minutos a tem peratura ambiente. 3. Lavar con agua corriente. Escurrir. 4. Decolorar con ácido-alcohol al 0,5% durante 2 minutos. 5. Lavar con agua corriente. Escurrir. 6. Cubrir la superficie del frotis con colorante de contraste de permanganato de potasio al 0,5% durante 2 minutos. 7. Lavar con agua corriente. Escurrir. 8. Secar al aire. No secar con papel. 9. Exam inar los frotis lo antes posible utilizando el microscopio de fluorescencia. Si hay una demora, refrigerarlos a 4 °C en la oscu­ ridad. VI. Resultados A. Interpretación (lectura o cálculos) Los bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) miden de 1 a 10 (im de largo, tienen forma de bastón, son delgados y emiten una fluo­ rescencia amarilla brillante contra un fondo amarillo pálido. Primero realizar un barrido rápido de los frotis con objetivo 25x; cam ­ biar a un objetivo 63x para confirmar la morfología bacteriana de cualquier forma sospechosa fluorescente. Examinar por comple­ to cada portaobjetos en busca de bacilos ácido-alcohol resistentes. Los bacteriólogos especialistas en micobacterias recomiendan que se examinen como mínim o 100 campos antes de informar un frotis como negativo. Tres pasajes a todo lo largo del eje longitu­ dinal del portaobjetos o nueve pasajes a lo largo del eje transversal suelen proporcionar una amplia superficie de lectura. Esta téc­ nica reduce al mínimo la posibilidad de leer la mism a zona más de una vez.

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P r o t o c o l o 19-3

C o l o r a c ió n f l u o r e s c e n t e : A u r a m i n a

O; A u r a m i n a - r o d a m in a (cont.)

B. Formato del informe La American Lung Association recom ienda el siguiente método para las coloraciones con fucsina, aplicables también a las colora­ ciones fluorescentes: Número de bacilos

0 1-2 en todo ei frotis 1-9 cada 10 campos 1-9 por campo 10-90 por campo > 90 por campo

Informe No se observan BAAR Informar la cantidad observada y solicitar la repetición Escasos o 1+ Pocos o 2+ Abundantes o 3+ 4+

VII. Notas acerca del procedimiento Los frotis coloreados con fluorocromos pueden colorearse de nuevo directamente con cualquiera de los procedimientos de colora­ ción con carbolfucsina. Esto se hace para confirmar los preparados positivos y para estudiar la morfología de los microorganismos presentes. VIII. Limitaciones del procedimiento Otros microorganismos distintos de las micobacterias, como las especies de Rhodococcus y de Nocardia, Legionella micdadei y los quistes de Cryptosporidium y de especies de Isospora pueden tener grados variables de ácido-alcohol resistencia. A menudo esto puede ser sugerido por diferencias en la morfología; en los casos confusos puede ser necesario el aislamiento de las bacterias conta­ minantes por subcultivo. Las micobacterias de crecimiento rápido pueden variar en su capacidad para retener los colorantes para ácido-alcohol resistencia. La mayoría de las especies no emiten fluorescencia en los frotis coloreados con fluorocromos y se recom ienda un procedimiento con carbolfucsina. Los bacilos ácido-alcohol resistentes muertos pueden teñirse con las coloraciones fluorescentes, característica que hay que tener en cuenta cuando los frotis se utilizan para evaluar la eficacia del tratamiento. IX. Bibliografía Joseph SW, Vaichulis EMK, Houk VN. Lack of Auramina Rhodamine fluorescence o f Runyon Group IV mycobacteria. Am Rev Respir Dis 1967;95:114-115. Koneman LW, Alien SD, Janda WM. Schreckenberger PC, Winn WC Jr. Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology, 4a ed. Filadelfia: Lippincott, 1992:713-715. Pollock HM, Wieman EJ. Smears results in the diagnosis of mycobacteriosis using blue light fluorescence microscopy. J Clin Microbiol 1977;5:329-331. Uribe-Botero G, Prichard JG, Kaplowitz HJ. Bone marrow in HIV infections: a comparison of fluorescent staining and culture in the detection of mycobacteria. Am J Clin Pathol 1989;91:313-315.

P r o t o c o l o 1 9-4

P r u e b a N A P (/ j - N it r o - oc-A c e t i l a m i n o - P - H id r o x i p r o p i o f e n o n a );

(BACTEC)

I. Principio Los miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis no se desarrollan en presencia de />nitro-a-acetilamino~P-hidroxipropiofenona (NAP). Cada frasco ampolla BACTEC contiene 5 (tg de NAP. Cuando se agrega I mL de un cultivo en desarrollo activo en medio 12B a este frasco ampolla, el desarrollo de las micobacterias pertenecientes al complejo M. tuberculosis se inhibe. Las micobacterias no tuberculosis (MOTT) no muestran inhibición significativa. La presencia de desarrollo se detecta por control de la producción de 1*C02 mediante el detector de radiactividad del instrumento, cuya ausencia (falta de aumento del índice de desarrollo) es compatible con el complejo M. tuberculosis. II. Muestra Medio BACTEC 12B con un índice de desarrollo mayor de 50. III. Materiales A. Equipo 1. Instrumento BACTEC 560 (Becton Dickinson, Sparks. MD). 2. Tubo de dióxido de carbono con 5-10% de CO, y 90-95% de aire, conectado al instrumento. 3. Campana BACTEC TB (Becton Dickinson).

Protocolos

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P r o t o c o l o 19-4

P r u e b a N A P (p - N itro -c c -A c e tila m in o -P -H id r o x ip ro p io f e n o n a );

(BACTEC)

( c o n t .)

4. Gabinete de bioseguridad. 5. Estufa, bien calibrada a 37 ± 1 °C. 6. Agitadora vorticial. B. Materiales 1. Jeringas descartables de tuberculina con agujas incorporadas. 2. Desinfectante Amphyl® (desinfectante fenólico) 3. Guantes, máscaras, delantales. 4. Compresas de algodón o gasa. 5. Hisopos con alcohol. C. Medios y reactivos 1. Medio de M iddlebrook 7H12 (BACTEC 12B) (contiene caldo base 7H9, albúm ina sérica bovina, hidrolizado de caseína, catalasa y un sustrato marcado con l4C). 2. Frascos ampolla BACTEC NAP. IV. Control de calidad A. Medio: el control de calidad del medio 12B lo efectúa el fabricante. B. Incluir como controles M. tuberculosis American Type Culture Collection (ATCC) 27294 y M. kansasii ATCC 35775. C. Probar los microorganismos control junto con los cultivos en estudio por lo menos una vez por mes y cada vez que se utilice un lote nuevo de NAP. El índice de desarrollo del M. tuberculosis debe ser plano; el de M. kansasii debe mostrar una curva ascendente a medida que aumenta el tiempo de incubación. V. Procedimiento 1. Leer los frascos ampolla positivos para BAAR diariamente, hasta que el índice de desarrollo alcance alrededor de 50 a 100. 2. M ezclar bien el medio y transferir con técnica aséptica 1 mL del medio de cultivo de este frasco ampolla a un frasco ampolla NAP. 3. Limpiar los bordes de los frascos ampolla con Amphyl y luego con alcohol etílico al 70%. 4. Agitar el frasco ampolla para m ezclar el contenido. 5. Leer todos los días los frascos ampolla NAP originales y los sembrados durante 2 a 5 días y registrar las lecturas del ID. 6. En el caso de que los cultivos hayan superado un ID de 100, es necesario diluir la muestra antes de realizar la prueba NAP. Para determinar la dilución debe utilizarse la siguiente tabla: Lectura de ID 50-100 101-200 201-400 401-600 601-800 801-999

Dilución No diluir 0,8 mL en 0,6 mL en 0,4 mL en 0,3 mL en 0,2 mL en

4 4 4 4 4

mL mL mL mL mL

de de de de de

7H12/12B 7H12/12B 7H12/12B 7H12/12B 7H12/12B

Mezclar la dilución con cuidado y transferir 1 mL del contenido a un frasco ampolla NAP. Incubar el resto de la dilución y uti­ lizarla como control de la prueba. VI. Resultados A. Informe 1. El informe se realiza entre los 2 y 7 días, a los 4 días en promedio. Informar como: la prueba NAP indica complejo M. tuberculosis, si el índice de desarrollo es plano; la prueba NAP indica MOTT, si el índice de desarrollo aumenta. 2. El complejo M. tuberculosis no debe ser informado antes de los 4 días. 3. Entre las bacterias distintas del complejo M. tuberculosis, ciertas cepas de M. kansasii, M. gastri, M. szulgai, M. terrae y M. tri­ viale son inhibidas parcialmente por el NAR En esos casos, existe una fase latente más prolongada en presencia de NAP y los resultados interpretados en los primeros 2 a 4 días pueden ser erróneos. Continuar la incubación y tom ar muestras 2 o 3 días más antes de informar. 4. La tem peratura de incubación óptima es crítica para la prueba NAP. Algunas micobacterias (M. marinum, M. chelonae) crecen a 30 °C. En esos casos, se producirá una inhibición por NAP a 37 °C. Los resultados del ensayo serán claros y pueden informarse dentro de los 4 días si los cultivos se incuban a 30 °C. La prueba NAP para muestras provenientes de heridas o piel deben incu­ barse a 37 y 30 °C.

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P r o t o c o l o 1 9-4

Prueba NAP (/7-NiTR0-a-AcETiLAMiN0-p-HiDR0xiPR0Pi0FEN0NA); (BACTEC) (cont.) B. Interpretación 1. Interpretación de los resultados de la prueba NAP: el ID diario del frasco ampolla control (con el cultivo original) continuará en aumento o disminuirá. En el frasco ampolla NAP, el aumento o la disminución depende de la especie de micobacteria: a. Complejo TB: dos descensos consecutivos significativos del ID después de la siembra = complejo TB; aumento ligero pero no significativo en los primeros 2 días y luego ausencia de aumento, o descenso del ID = complejo TB. b. MOTT: incremento diario en las lecturas de ID hasta más de 400 antes de los 4 días = MOTT; falta de aumento o ligero des­ censo en los primeros 1 a 2 días después de la siembra y luego dos días consecutivos de aumentos significativos después del día 2 = MOTT. VII. Limitaciones del procedimiento La prueba NAP es de utilidad para diferenciar el complejo del M. tuberculosis de las MOTT sólo si se utilizan cultivos puros del ais­ lamiento. Un cultivo mixto de TB y MOTT dará un aumento del ID e indicará sólo la presencia de MOTT. La contaminación con bacterias también puede dar falsos aumentos del ID; por lo tanto, debe realizarse una tinción para ácido-alcohol resistentes y en algu­ nos casos una coloración de Gram, para confirmar la existencia de un cultivo mixto o de contaminación bacteriana. VIII. Bibliografía Siddiqi SH. BACTEC NAP test. En: Isenberg HD, ed. Clinical M icrobiology Procedure Handbook, M ycobacteriology Section. Washington DC. American Society for Microbiology, 1992.

P ro to c o lo

19-5

A r il s u l f a t a s a

I. Principio La arilsulfatasa es una enzima que produce fenolftaleína libre a partir de la sal tripotásica del disulfito de fenolftaleína. L a prueba para la identificación de especies de Mycobacterium se realiza en un tubo que contiene el sustrato de fenolftaleína en agar ácido oleico. Al cabo de 3 (o 14) días de incubación de un subcultivo de la especie desconocida, la aparición de color rosa después del agregado de car­ bonato de sodio indica una reacción positiva. II. Muestra Una colonia bien desarrollada de la especie desconocida de Mycobacterium, aislada en un material clínico, desarrollada en un pico de flauta de medio de Lowenstein-Jensen o en agar de Middlebrook 7H-10. Preparar una suspensión del microorganismo en agua estéril e incubar durante 3 días (14 días). III. Materiales A. Equipo 1. Gabinete de bioseguridad. B. Medios 1. Sustrato concentrado de arilsulfatasa. a. Disolver 2,6 g de sal tripotásica de disulfito de fenolftaleína en 50 mL de agua desionizada estéril. b. Esterilizar por filtración a través de membrana (filtro de 0.22 (im de tamaño de poro). c. Conservar en frigorífico a 2-8 °C. d. La duración es indefinida si se almacena en forma adecuada. Descartar si la solución se enturbia. 2. Caldo para arilsulfatasa: prueba de 3 días. a. Agregar en forma aséptica 2,5 mL del sustrato concentrado a 200 mL de caldo Dubos Tween® estéril. b. Fraccionar en forma aséptica volúmenes de 2 mL en tubos con tapa de rosca (16 x 125 mm). c. Conservar a 2-8 °C. Descartar si la solución se enturbia. 3. Caldo para arilsulfatasa: prueba de 2 semanas. a. Agregar en forma aséptica 7,5 mL del sustrato concentrado a 200 mL de caldo Dubos Tween estéril. b. Fraccionar en forma aséptica volúmenes de 2 mL en tubos con tapa de rosca (16 x 125 mm). c. Conservar a 2-8 °C. El agar para arilsulfatasa de Wayne se obtiene en el comercio proveniente de varias firmas. C. Reactivos 1. Carbonato de sodio (Na^CO,) 2 N: disolver 10.6 g de carbonato de sodio anhidro en 100 mL de agua destilada.

Protocolos

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P r o t o c o l o 19-5

A rils u lfa ta s a

(cont.)

IV. Control de calidad A. Prueba de 3 días 1. Control positivo: Mycobacterium fortuitum de la American Type Culture Collection (ATCC) 6841 (si el control positivo es negati­ vo, repetir las pruebas con un subcultivo nuevo del microorganismo positivo. Si los controles negativos son positivos, repetir la prueba con un nuevo lote de medios). 2. Control negativo: Mycobacterium intracellulare ATCC 13950. 3. Medio sin sembrar y reactivo solo: no se obtiene desarrollo de color. B. Prueba de 14 días 1. Control positivo: Mycobacterium fortuitum ATCC 23292. 2. Control negativo: M ycobacterium intracellulare ATCC 13950. 3. Medio sin sem brar y reactivo solo: no se obtiene desarrollo de color. V. Procedimiento 1. Sembrar cada tubo de sustrato con una suspensión ligeramente turbia en agua estéril del microorganismo por probar. Emulsionar por completo el cultivo en el caldo. 2. Incubar el tubo durante 3 o 14 días (prueba de 2 semanas) a 35 °C en estufa sin COr 3. Después de la incubación, agregar 1 mL del reactivo de carbonato de sodio 2 N, mezclar y observar los cambios de color. VI. Resultados A. Interpretación (lectura o cálculos). Observar visualmente el cambio de color de rosa pálido a rojo oscuro. La ausencia de cambio de color indica una reacción nega­ tiva. VII. Notas acerca del procedimiento Incluir un microorganismo de control en fase de desarrollo activo en cada prueba. Para los microorganismos de crecimiento lento, utilizar un subcultivo de 3 a 5 semanas; para los de crecimiento rápido utilizar un subcultivo de 1 a 3 semanas. Si el control positi­ vo es negativo, repetir las pruebas con un subcultivo joven del microorganismo positivo. Si los controles negativos son positivos, repetir la prueba con un nuevo lote de medios. VIII. Limitaciones del procedimiento A. Los resultados falsos negativos pueden deberse a que los cultivos control son demasiado viejos. B. Los resultados falsos positivos pueden presentarse cuando el medio contiene fenolftaleína libre. IX. Bibliografía Kubica GP, Ridgon AL. The arylsulfatase activity of mycobacteria. III. Preliminary investigation of rapidly growing mycobacteria. Am Rev Respir Dis 1961:83:737-740. Kubica GP, Vestal AL. The arylsulfatase activity of acid fast bacilli: I. Investigation of stock cultures of mycobacteria. Am Rev Respir Dis 1961;83:728-732. Lutz B. Arylsulfatase test. En: Isenberg HD. Mycobacteriology Section, Clinical Microbiology Procedure Handbook. Washington DC. American Society for Microbiology, 1992. Wayne LG. Recognition o f Mycobacterium fortuitum by means of a three-day phenolphtalein sulfatase test. Am J Clin Pathol 1961;36:185-187.

P r o t o c o l o 19-6

D e t e r m in a c ió n d e l a f o t o r r e a c t iv id a d d e l a s m ic o b a c t e r ia s

I. Principio La aparición de pigmento amarillo en las colonias de las micobacterias fotocromógenas es el resultado de la producción de cristales de caroteno, de color naranja amarillento, por parte de los microorganismos metabólicamente activos después de la exposición a la luz intensa. Las especies escotocromógenas tienen la capacidad de producir pigmento amarillo sin exposición a la luz; sin embargo, el tipo de pigm ento se desconoce. La pigm entación de las colonias jóvenes de micobacterias después de desarrollarse en la oscuridad o des­ pués de ser expuestas a la luz puede ser una ayuda importante para identificar ciertas especies de Mycobacterium. II. Muestra Un cultivo primario en caldo del microorganismo por probar, lo suficientemente diluido como para producir colonias aisladas cuando se siembra en agar.

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Protocolos

P r o t o c o l o 1 9-6

D e t e r m in a c ió n d e l a f o t o r r e a c t iv id a d d e l a s m i c o b a c t e r ia s

III.

IV.

V.

VI.

VII.

VIII.

IX.

(cont.)

Materiales A. Equipo 1. Gabinete de bioseguridad. 2. Estufa de incubación a 37 °C. B. Materiales 1. Tubos de ensayo estériles con tapa de rosca de 20 x 110 o 20 x 125 mm. 2. Pipetas de Pasteur estériles. 3. Ansas y agujas para sembrar. C. Medio 1. Tres tubos en pico de flauta de medio de Lowenstein-Jensen. 2. Tres placas de agar de M iddlebrook 7H10. Estándares y controles (incluir los controles en cada prueba) A. Fotocromógeno positivo: M. kansasii ATCC 12478, B. Escotocromógeno positivo: cepas de reserva de M. scrofulaceum o M. gordonae. C. Cromógeno negativo: M. tuberculosis ATCC 25177. Procedimiento 1. Inocular la superficie de los tres tubos de agar inclinado (pico de flauta) de Lowenstein-Jensen o de las tres placas de agar de Middlebrook 7H10 con el líquido proveniente de un cultivo diluido en caldo del microorganismo por probar. Envolver dos de los tubos o placas con papel de aluminio: dejar el tercero expuesto a la luz ambiente dentro de la estufa de incubación. 2. Incubar uno de los tubos o placas envueltos a 25-30 °C; incubar los otros tubos o placas envueltos a 37 °C. 3. Varios días después de detectar desarrollo en la placa o tubo control expuestos a la luz, examinar los tubos o placas envueltos para ver si hay desarrollo. 4. Si se detecta desarrollo precoz en las placas o tubos envueltos, exponer uno de cada par a una luz fuerte durante aproximada­ mente 5 horas. Para esto, una lámpara de tungsteno o fluorescente de 100 W es adecuada. Aflojar la tapa del tubo durante este período de exposición a la luz. 5. Después de la exposición a la luz, el tubo o la placa se coloca nuevamente en la estufa y se observa a las 24 o 48 horas en busca de pigm ento amarillo. Resultados A. Interpretación Las micobacterias escotocromógenas producen la mism a cantidad de pigmento cuando se las expone a la luz o se las deja en la oscuridad. M. scrofulaceum, M. gordonae, M. flavescens. M. xenopi y M. szulgai (este último sólo es escotocromógeno cuando se incuba a 37 °C) integran el grupo de escotocromógenos. Las micobacterias fotocromógenas producen pigmento amarillo sólo después de la exposición a la luz. Los fotocromógenos encontrados con m ayor frecuencia son M. kansasii, M. marinum, M. simiae y M. asiaticum. Las micobacterias no cromógenas son incapaces de producir pigmento, ya sea en la oscuridad o después de la exposición a la luz. Los no cromógenos encontrados con mayor frecuencia son M. tuberculosis, M. bovis, M. ulcerans, M. fortuitum, M. chelo­ nae y las cepas clásicas de M. avium. Notas acerca del procedimiento Cuando se sospecha M. szulgai. los tubos o placas expuestos a la luz deben incubarse a 25 °C durante 3-5 días. Si se incuban a 37 °C, el potencial fotocromógeno quedará enmascarado por el desarrollo de pigmento escotocromógeno que se observa a esa tem ­ peratura. Limitaciones del procedimiento En la actualidad una alta proporción de cepas de M. avium/M. intracellulare aisladas en pacientes con SIDA muestran producción de pigmento. Por lo tanto, ciertas cepas clasificadas antes como no cromógenas pueden ser en realidad cromógenas. Esta desviación, junto con la crom ogenicidad dependiente de la tem peratura de M. szulgai, son las razones que se esgrimen en este momento contra la validez de la clasificación clásica de las micobacterias de Runyon. Bibliografía Wayne LG, Doubek SR. The role o f air in the photochromogenic behavior of M. kansasii. Am J Clin Pathol 1964;42:431-435.

Protocolos

P ro to c o lo

C a talasa a

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19-7 68 °C

I. Principio La catalasa descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. La producción de oxígeno se evidencia como burbujas. Algunos tipos de catalasa son inactivados por calentamiento a 68 °C durante 20 minutos, característica valiosa para identificar ciertas especies de Mycobacterium. El peróxido de hidrógeno empleado para la identificación de especies de Mycobacterium es diferente del que se usa para detectar catalasa en otros tipos de bacterias; se utiliza en una concentración del 30% (Superoxol) en una solución fuerte de deter­ gente (Tween 80 al 10%). El detergente ayuda a dispersar las micobacterias hidrófobas fuertemente agrumadas, convirtiendo los gran­ des acúmulos en bacilos aislados, lo que maximiza la detección de catalasa. II. Muestra Colonia madura de la especie desconocida de Mycobacterium aislada en un material clínico y cultivada en agar inclinado (pico de flau­ ta) de Lowenstein-Jensen o en agar de Middlebrook 7H-10. III. Materiales A. Equipo 1. Baño M aría a 68 °C o platina caliente. B. Medios 1. Caldo de M iddlebrook 7H9. 2. M edio de Lowenstein-Jensen para siembra en profundidad, en tubos de ensayo de 25 x 150 mm con tapa de rosca. C. Reactivos 1. Peróxido de hidrógeno al 30% (se obtiene en el comercio como Superoxol®). 2. Tween 80 al 10%. 3. Buffer de fosfatos M /l 5 (0.067 M). IV. Control de calidad A. Control negativo: M. tuberculosis American Type Culture Collection® (ATCC) 15177 produce burbujas a 22-25 °C, pero no a 68 °C. B. Control positivo: M. fortuitum ATCC 6841 produce burbujas a 22-25 °C y a 68 °C. C. Los controles deben incluirse con cada lote de pruebas. V. Procedimiento A. Prueba de la catalasa termoestable 1. Preparar un tubo con tapa de rosca por cada muestra de microorganismo por probar en agua estéril. 2. M arcar cada tubo con el número de la muestra. 3. Agregar a cada tubo 0,5 mL de buffer de fosfatos 0,067 M estéril. 4. Sembrar el buffer con una punta de espátula llena de un subcultivo en fase de crecimiento activo del microorganismo por pro­ bar (de 2 a 4 semanas de desarrollo). 5. Emulsionar por completo el cultivo en el buffer. 6. Incubar los tubos en baño María a 68 °C exactamente 20 minutos. 7. Retirar los tubos del baño María. Enfriar a tem peratura ambiente. 8. Agregar 0,5 mL de reactivo Tween 80®-peróxido de hidrógeno recién preparado. 9. Dejar los tubos en reposo a tem peratura ambiente durante 20 minutos. No agitarlos. 10. Observar la aparición de burbujas. B. Prueba de la catalasa semicuantitativa 1. Sembrar un medio líquido, como caldo Dubos Tween o caldo de Middlebrook 7H9. con una punta de espátula o un ansa llena del cultivo por probar. Incluir controles. 2. Incubar 7 días a 37 °C. 3. M ezclar durante 5 a 10 segundos en una agitadora vorticial. 4. Transferir 6 gotas a un medio de Lowenstein-Jensen para siembra en profundidad (preparado en tubos de 25 x 150 mm). 5. Incubar los tubos sembrados en profundidad 14 días a 37 °C. Asegurarse de que las tapas estén flojas. 6. Agregar 1 mL de reactivo Tween 80-peróxido de hidrógeno recién preparado. Evitar el contacto del reactivo con la piel. 7. Dejar los tubos de prueba a tem peratura ambiente 5 minutos. 8. M edir la altura de la columna de burbujas. VI. Resultados A. Interpretación (lectura o cálculos) 1. Prueba de catalasa termoestable: la aparición de burbujas indica un resultado positivo; la falta de burbujas es una reacción nega­ tiva. M. tuberculosis y otras micobacterias pierden su actividad catalasa cuando se las calienta a 68 °C. 2. Prueba de catalasa semicuantitativa: Reacción de catalasa alta: > 45 mm de espuma. Reacción de catalasa baja: < 45 mm de espuma.

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Protocolos

P r o t o c o l o 19-7

C a t a l a s a a 68 °C (cont.)

VII. Notas acerca del procedimiento La falta de los resultados esperados en los cultivos control se debe por lo general al uso de cultivos demasiado viejos; utilizar sólo cultivos en fase de crecimiento activo. VIII. Limitaciones del procedimiento Los resultados falsos negativos pueden deberse a la utilización de cultivos con desarrollo inadecuado, demasiado viejos o al uso de reactivos vencidos. El desarrollo inadecuado puede ser el resultado de un inoculo deficiente o del cierre excesivo de las tapas de rosca. Pueden observarse resultados falsos positivos si los cultivos están contaminados con especies bacterianas catalasa positivas. IX. Bibliografía Kubica GP, et al. Differential identification of mycobacteria: I. Tests on catalase activity. Am Rev Respir Dis 1966;95:400-405. Lutz B. Catalase tests. En: Isenberg HD, ed. Clinical M icrobiology Procedure Handbook. Mycobacteriology Section. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992.

P ro to c o lo

19-8

D esa rro llo en a gar d e M a cC onkey

I. Principio La capacidad de desarrollarse en agar de MacConkey especial, sin violeta de genciana (cristal violeta), diferencia M. fortuitum, M. chelonae y M, abscessus, que pueden mostrar desarrollo en el término de 5 días, de otras micobacterias de crecimiento rápido que muestran sólo un desarrollo leve después de 11 días. II. Muestra Se prueba una colonia madura de la especie de Mycobacterium desconocida, aislada en materiales clínicos, desarrollada en un pico de flauta de Lowenstein-Jensen o en agar de Middlebrook 7H-10. III. M ateriales A. Equipo: ninguno. B. Medios: agar de MacConkey sin violeta de genciana. Comercializado por Remel Laboratories (Lenexa, KS). Conservado en fri­ gorífico común a 4 °C. C. Reactivos: ninguno. D. Materiales: ninguno. IV. Control de calidad A, Control positivo: M. fortuitum American Type Culture Collection (ATCC) 6841. B. Control negativo; M. phlei ATCC 11758; medio sin sem brar y reactivo solo. V. Procedimiento 1. Sembrar una placa de MacConkey recién preparada con 3 gotas del microorganismo desarrollado durante 7 a 10 días en caldo 7H9 y esparcir en estría para obtener colonias aisladas. 2. Incubar entre 28 y 30 °C durante 11 días sin CO,. 3. A los 5 y 11 días, inspeccionar la superficie del agar en busca de desarrollo de colonias. VI. Resultados A. Interpretación (lectura o cálculos) U na prueba positiva para M. fortuitum mostrará desarrollo en toda la estría y posiblemente un cambio de color en el medio a los 5 días. La ausencia de desarrollo indica un resultado negativo. VII. Notas acerca del procedimiento Incluir controles con cada lote de pruebas. Si los resultados no son los esperados, repetir la prueba con microorganismos control y un lote de medio nuevos. VIII. Limitaciones del procedimiento Alrededor del 25% de las cepas de M. smegmatus se desarrollan en agar de MacConkey sin violeta de genciana. A fin de evitar cual­ quier dificultad diagnóstica puede utilizarse la prueba de arilsulfatasa de 3 días para diferenciar M. smegmatus (negativo) de M. fo r ­ tuitum, M. chelonae y M. abscessus (positivos). IX. Bibliografía Jones WD. Kubica GP. The use o f MacConkey agar for differential typing o f M. fortuitum . Am J Med Technol 1946;30:182-195. Lutz B. Nitrate reduction. En: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedure Handbook, Mycobacteriology Section. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992.

Protocolos

P r o t o c o lo

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19-9

I n h i b i c i ó n p o r l a h id r a z id a d e l á c i d o t io f e n -2 - c a r b o x íl ic o

(T2H, 1 |ig/mL)

í. Principio La hidrazida del ácido tiofen-2-carboxílico tiene la propiedad de inhibir el desarrollo de Mycobacterium bovis, pero no de otras espe­ cies de micobacterias, característica útil para diferenciar M. bovis de M. tuberculosis. II. Muestra Un cultivo de 3 a 4 semanas del microorganismo por probar, desarrollado en medio de Lowenstein-Jensen o agar de Middlebrook 7H10. III. Materiales A. Equipo 1. Gabinete de bioseguridad. 2. Estufa de incubación con C 0 2 al 10% a 37 °C. B. Materiales 1. Palillos de madera estériles. 2. Tubos para dilución con 9 mL de agua estéril. 3. Agua desionizada estéril. 4. Placas de Petri en cuadrantes. C. Medios 1. Medio para sensibilidad a hidrazida del ácido tiofen-2-carboxílico (T,H, también conocido como TCH, 10 (ig/mL) a. Preparar dos lotes de 200 mL de medio de Middlebrook 7 H 10 en frascos separados. b. Esterilizar en autoclave. Enfriar a 50 °C en baño de agua. c. Pipetear 5 mL de medio enfriado de uno de los frascos en los cuadrantes I y III de una placa de Petri en cuadrantes. d. Agregar 2 mL de una solución madre de TCH de 1 000 |ig/m L al otro frasco (concentración final 10 (ig/mL). Agitar bien para mezclar. e. Colocar 5 mL de este medio en los cuadrantes II y IV de cada placa. f. Proteger las placas de la luz cubriéndolas con papel marrón. Almacenarlas entre 2 y 8 °C; la duración es de aproximadamen­ te un mes. IV. Control de calidad A. Control positivo: M. bovis American Type Culture Collection (ATCC) 35734 (sensible a concentraciones de 10 |ig/m L de TCH). B. Control negativo: M. tuberculosis ATCC 25177 (resistente). V. Procedimiento 1. Preparar una suspensión de la micobacteria desconocida en agua estéril, con una turbidez equivalente al estándar 1 de McFarland. 2. Diluir en agua desionizada estéril para hacer una suspensión entre 10~3 a lO-1. 3. Sembrar tres gotas de cada dilución en un cuadrante control y en un cuadrante TCH de las placas en cuadrantes. 4. Cubrir las placas con papel marrón para evitar la exposición a la luz y dejarlas a temperatura ambiente sin mover para permitir la adsorción del inóculo. 5. Colocar cada placa en una bolsa con cierre relámpago permeable al CO ,, invertirlas e incubar a 37 °C en 8 a 10% de CO, duran­ te 3 semanas. 6. Finalizada la incubación, contar las colonias en el cuadrante control y en el cuadrante que contiene TCH en concentración de 10 |ig/mL. VI. Resultados A. Calcular el porcentaje de resistencia de la siguiente forma: Número de colonias en el cuadrante con TCH x 100 ---------------------------------------------------------------------------- = Porcentaje de resistencia Número de colonias resistentes en el cuadrante control B. Registrar el cultivo problema como resistente a la TCH si la cifra calculada es m ayor del 1%. VII. Bibliografía Harrington R, Karlson AG. Differentiation between M. tuberculosis and M. bovis by in vitro procedures. Am J Vet Res 1967:27:11931196. Lutz B. Identification tests for mycobacteria: Inhibition by thiophene-2-carboxylic acid hydrazide. En: Isenberg HD. ed. Clinical Microbiology Procedure Handbook. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992. Wayne LG, et al. Highly reproducible techniques for use in systematic bacteriology in the genus Mycobacterium: tests for niacin and catalase and for resistance to isoniazid, thiophene-2-carboxylic acid hydrazide, hydroxylamine and p-nitrobenzoate. Int J Syst Bacteriol 1976;26:311-318.

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Protocolos

P rotocolo 19-10

C a p t a c ió n d e h ie r r o

I. Principio La capacidad de captar hierro de un reactivo que contenga hierro inorgánico ayuda a diferenciar Mycobacterium fortuitum y M. phlei (positivos) de M. chelonae y M. abscessus, que no captan hierro. II. M uestra Colonia madura de la especie desconocida de Mycobacterium aislada en un material clínico, desarrollada en agar inclinado (pico de flauta) en medio de Lowenstein-Jensen. III. Materiales A. Equipo 1. Gabinete de bioseguridad. 2. Estufa de incubación entre 28 y 30 °C. 3. Pipetas de Pasteur estériles. B. Medios 1. Tubos de Lowenstein-Jensen en pico de flauta (comercializados por Remel Laboratories, Lenexa, KS). C. Reactivos Citrato amónico férrico al 20%. 1. Agregar 20 g de citrato amónico férrico a 100 mL de agua desionizada. 2. Agitar para disolver. 3. Colocar en autoclave durante 15 minutos a 121 °C. 4. Conservar en frigorífico entre 2 y 8 °C. IV. Control de calidad A. Control positivo: M. fortuitum , American Type Culture Collection (ATCC) 6841. B. Control negativo: M. chelonae ATCC 35751; medio sin sembrar y reactivo solo. V. Procedimiento 1. Utilizar un subcultivo en la fase activa de crecimiento (de 1 a 2 semanas) de una micobacteria de desarrollo rápido en agar incli­ nado (pico de flauta) de Lowenstein-Jensen. 2. Agregar tantas gotas de citrato amónico férrico al 20% como mililitros de medio contenga el agar inclinado. Por ejemplo, para 8 mL de medio, agregar 8 gotas de citrato amónico férrico. 3. Reincubar el pico de flauta entre 28 y 30 °C hasta 3 semanas. 4. Observar la superficie de los picos de flauta en busca de la presencia de color oscuro, marrón oxidado. VI. Resultados El color de una prueba verdaderamente positiva de captación de hierro debe ser de óxido muy oscuro. U na reacción positiva obser­ vada con una cepa de micobacteria de desarrollo rápido es indicativa de M. fortuitum. VII. Notas acerca del procedimiento Si los resultados no son los esperados, controlar la edad y la pureza de los cultivos control y en estudio. Repetir las pruebas con reac­ tivo de citrato amónico férrico nuevo y con nuevos cultivos control. VIII. Limitaciones del procedimiento Algunos aislamientos de M. chelonae producen un color marrón bronceado, denominado a veces “parecido al de una tortuga”, que representa una reacción falsa positiva. Buscar un color de óxido muy oscuro. IX. Bibliografía Lutz B. Iron uptake. En: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedure Handbook, Mycobacteriology Section. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992. Silcox VA, Good RA, Floyd MM. Identification of clinically significant M ycobacterium fortuitum complex. J Clin Microbiol 1981;14:686-691.

P r o to c o lo 19-11

A c u m u l a c ió n d e n ia c in a

I. Principio Todas las especies de Mycobacterium producen ribonucleótido de niacina; sin embargo, casi todas las cepas de M. tuberculosis, M. simiae y algunas cepas de M. chelonae carecen de las enzimas necesarias para convertir la niacina a dinucleótido de adenina nicotinamida (NAD). La niacina se acumula en el medio de cultivo, del que puede ser extraída con agua o solución fisiológica estériles. El extracto se coloca en un pequeño tubo de ensayo al cual se agrega una tira de papel de filtro impregnada en reactivo para niacina.

Protocolos

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P r o to c o lo 19-11

A c u m u l a c ió n d e n ia c in a ( cont. )

II. Muestra Un cultivo con desarrollo denso de más de 3 semanas en Lowenstein-Jensen del microorganismo por probar. El crecimiento en otros medios de cultivo no produce la niacina suficiente como para obtener una reacción positiva de la prueba por este método. III. Materiales A. Equipo 1. Gabinete de bioseguridad. 2. Estufa de incubación a 37 °C. B. Materiales 1. Tubos de ensayo estériles con tapa de rosca, de 20 x 110 o de 20 x 125 mm. 2. Pipetas de Pasteur estériles. 3. Pipetas estériles de 5 mL. C. Reactivos 1. Tiras de papel de filtro para niacina (Difeo). 2. H ,0 estéril. IV. Estándares y controles (incluir controles con cada determinación) A. Control positivo: M. tuberculosis American Type Culture Collection (ATCC) 25177. B. Control negativo: M. intracellulare ATCC 13950. V. Procedimiento 1. Cubrir la superficie de agar inclinado (pico de flauta) de Lowenstein-Jensen sobre el crecimiento denso del microorganismo por probar con 1 mL de H ,0 estéril. Punzar el medio con la punta de la pipeta para permitir la entrada de agua en el medio subya­ cente. 2. Inclinar el tubo de tal forma que el agua cubra todo el pico de flauta. Dejar en reposo durante 20 a 30 minutos. 3. Rotar el tubo de modo que el agar inclinado mire hacia abajo. Extraer con cuidado 0,6 m L de extracto, sin tocar el agar inclina­ do y transferir a un tubo de ensayo con tapa de rosca. 4. Con una pinza, dejar caer una tira de prueba para niacina con la flecha hacia abajo, dentro del tubo. Tapar el tubo de inmediato. 5. Agitar el tubo con suavidad y repetir la agitación después de 5 y 10 minutos. 6. Después de 12 a 15 minutos, y no más de 30, observar la reacción en busca de color amarillo. VI. Resultados A. Interpretación El desarrollo de color amarillo indica una prueba positiva. Si un cultivo se asemeja a M. tuberculosis, pero la prueba de niacina es negativa, reincubar el agar inclinado 2 a 4 semanas más y repetir la prueba. VII. Limitaciones del procedimiento Puede haber reacciones falsas negativas. Las razones son: 1) poco crecimiento en el agar inclinado, 2) no punzar el agar si el desa­ rrollo es confluente y 3) la presencia de bacterias contaminantes que puedan metabolizar la niacina que se haya acumulado. M. simiae y algunas cepas de M. bovis, M. marinum y M. chelonae pueden acumular niacina en el medio de prueba. Estas espe­ cies pueden diferenciarse con facilidad de M. tuberculosis por varias características claves descritas en la sección de interpretación de este manual. VIII. Bibliografía Gungadharam PR, Droubi DSA. A comparison of four different methods for testing the production o f niacin by mycobacteria. Am Rev Respir Dis 1971:104:434-437. Kilburn JO, Kubica GP. Reagent impregnated paper for detection of niacin. Am J Clin Pathol 1968;50:530-531. Konno K et al. Niacin metabolism in mycobacteria. Am Rev Respir Dis 1966;93:41-46. Lutz B. Nitrate reduction. En: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedure Handbook, M ycobacteriology Section. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992. Runyon EH, Selin MJ, Hawes HW. Distinguishing mycobacteria by the niacin test. Am Rev Tubercu 1959:79:663-665. Young WE Jr, et al. Development of paper strip test for the detection of niacin produced by mycobacteria. Appl Microbiol 1970;20:939-945.

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Protocolos

P ro to c o lo

19-12

R e d u c c ió n d e n it r a t o s : m ic o b a c t e r ia s

I. Principio Las micobacterias que producen nitrorreductasa son capaces de catalizar la reducción de nitratos a nitritos. En la reacción, se extrae oxígeno del nitrato de acuerdo con la siguiente fórmula: N O, + 2e~ + 2H -> NO, + H ,0 El nitrito producido se detecta por el agregado de a-naftilam ina y ácido sulfanílico, con formación del colorante rojo de diazonio p-sulfobenceno-azo-a-naftilamina. II. Muestra Un cultivo de 3 a 4 semanas del microorganismo por probar, desarrollado en medio de Lowenstein-Jensen u otro medio con huevo coa­ gulado. III. Materiales A. Equipo 1. Gabinete de bioseguridad. 2. Baño M aría a 37 °C o platina caliente. B. Materiales 1. Pipetas de Pasteur estériles. 2. Pinzas estériles. C. Reactivos 1. Sustrato para la prueba de nitratos (0,01 M) en buffer fosfatos M/45 (0,02 M, pH 7) NaN03 KH2P 0 4 Na2H P 04 H20

0,8 g 1,17 g 1,93 g 999 mL (volumen final)

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' "

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,

P rotocolo 19-12

R e d u c c ió n d e n it r a t o s : m ic o b a c t e r ia s

{cont.)

Disolver y m ezclar las sustancias. Ajustar el pH a 7,0. Colocar en autoclave y almacenar en alícuotas de 0.2 mL en tubos estéri­ les. Conservado entre 2 y 8 °C, la duración es de 1 a 2 meses. 2. Sulfanilamida al 0.2%: disolver por completo 0,1 g de sulfanilamida en 50 mL de agua desionizada. Puede ser necesario calen­ tar el agua entre 47 y 50 °C para que haya disolución completa. Si se almacena en frascos color caramelo entre 2 y 8 °C, la dura­ ción es de alrededor de un mes. 3. Diclorhidrato de iV-(l-naftil)etiiendiamina al 0.1%: disolver 0,05 g de diclorhidrato de ;V-(l-naftil)etilendiamina en 50 mL de agua desionizada. La duración es de un mes si se almacena en frascos color caramelo entre 2 y 8 °C. IV. Control de calidad A. Control positivo: M. tuberculosis American Type Culture Collection (ATCC). B. Control negativo: complejo M. avium ATCC. C. Control de reactivo negativo: tubo sin sembrar con el sustrato adecuado. V. Procedimiento 1. Emulsificar un ansa o una punta de espátula cargada con colonias provenientes del medio sólido en 2 mL de sustrato para nitratos. 2. Agitar en forma manual para mezclar e incubar entre 35 y 37 °C durante 2 horas. 3. Agregar los reactivos a la mezcla anterior en el siguiente orden: 1 gota de HC1 concentrado 2 gotas de sulfanilamida al 0,2% 2 gotas de diclorhidrato de V-(l-naftil)etilendiamina al 0,1% 4. Dejar la mezcla en reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos. 5. Observar el desarrollo de color rosado a rojo. VI. Resultados La aparición de color rosado a rojo indica una prueba positiva. Puede hacerse una lectura cuantitativa si se compara con estándares de reducción de nitratos. En la mayoría de los laboratorios no se realiza la cuantificación. VII. Notas acerca del procedimiento Si no hay cambio de color, confirmar el resultado negativo agregando una pequeña cantidad de cinc en polvo. La aparición de color rojo intenso o rosado después de agregar el polvo de cinc indica que el nitrato ha sido reducido. Conservar los reactivos en frigorífi­ co, a 2 a 8 °C, protegidos de la luz directa. VIII. Limitaciones del procedimiento En algunos casos, el color puede desvanecerse con rapidez y pueden obtenerse resultados falsos negativos si la lectura no se realiza de inmediato después de agregar los reactivos. IX. Bibliografía M aster RN. Nitrate reduction. En: Isenberg HD. ed. Clinical Microbiology Procedure Handbook. Mycobacteriology Section. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992. Virtanen S. A study of nitrate reduction o f mycobacteria. Acta Tuberc Scand Suppl 1960:418:119. Wayne LC. Doubek SR. Classification and identification of mycobacteria: II. Tests employing nitrite as substrates. Am Rev Respir Dis 1965:91:478-745.

P rotocolo 19-13

P ir a z in a m id a s a

I. Principio La desanimación de la pirazinamida a ácido pirazinoico en 4 días es una característica fenotípica útil por la cual puede diferenciarse M. marinum (positivo) de M. kansasii (negativo) y que permite distinguir las cepas de M. bovis débilmente niacina positivas (negativas) del complejo de M. tuberculosis (positivo). II. Muestra Colonias maduras de la especie desconocida de M ycobacterium aisladas en materiales clínicos, desarrolladas en agar inclinado (pico de flauta) del medio de Lowenstein-Jensen o en agar de M iddlebrook 7H-10. III. Materiales A. Equipo: ninguno B. Medio 1. Medio sustrato para pirazinamidasa a. Disolver 6,5 g de caldo base de Dubos en 1 L de agua destilada.

1446

Protocolos

P r o t o c o l o 1 9 -1 3

P ir a z in a m id a s a

(cont.)

b. Agregar Pirazinamida Piruvato de sodio Agar

IV.

V.

VI.

VII. VIII.

0,1 g 2,0 g 15 g

c. Calentar para disolver. Fraccionar de a 50 rnL en tubos con tapa de rosca. d. Colocar en autoclave durante 15 minutos a 121 °C. e. D ejar solidificar el agar con los tubos en posición vertical. f. La duración es de 6 meses si se almacenan entre 2 y 8 °C. Descartar si el agar parece deshidratado o contaminado. C. Reactivos Sulfato amónico ferroso al 1% (preparar inmediatamente antes de usar): colocar 0,1 g de sulfato amónico ferroso en tubos estériles con tapa de rosca. Agregar 10 mL de agua desionizada estéril inmediatamente antes de usar y dejar que los cristales se disuelvan. D. Materiales 1. Palillos de madera estériles. 2. Pipetas estériles de 1 o 5 niL. Control de calidad A. Control positivo: M. intracellulare American Type Culture Collection (ATCC) 13950. B. Control negativo: M. kansasii ATCC 12478. Procedimiento 1. Sembrar el contenido de un ansa bien cargada con un subcultivo en fase de desarrollo activo sobre la superficie de dos tubos de agar pirazinamidasa para siembra en profundidad. 2. Incubar los tubos con las tapas flojas a 37 °C. 3. Sacar uno de los tubos de la estufa de incubación después de 4 días. Sacar también uno de los tubos control. 4. Agregar 1 mL de sulfato amónico ferroso al 1% recién preparado a cada tubo. 5. Observar los tubos en busca de una banda rosada en el agar después de dejarlos 30 minutos a temperatura ambiente. 6. Colocar los tubos negativos en frigorífico y examinarlos nuevamente a las 4 horas en busca de la banda rosada. Resultados A. Interpretación Después de 4 horas, observar los tubos en busca de la aparición de una banda rosada en la capa de reactivo que se encuentra sobre la superficie del agar (reacción positiva), utilizando luz incidente contra un fondo blanco. Repetir el procedimiento con el tubo res­ tante después de 7 días de incubación. Notas acerca del procedimiento Realizar todos los procedimientos en una campana de bioseguridad. Bibliografía Wayne LG. Simple pyrazinamidase and urease tests for routine identification o f mycobacteria. Am Rev Respir Dis 1974; 109:147-151. Lutz B. Identification tests for mycobacteria: Pyrazinamidase. En: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedure Handbook, M ycobacteriology Section. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992.

P r o to c o lo 19-14

T o l e r a n c ia a l c l o r u r o d e s o d i o : m ic o b a c t e r ia s

I. Principio De las micobacterias de desarrollo lento, sólo M. triviale crece en medios que contienen 5% de NaCI; de las micobacterias de desarro­ llo rápido de importancia médica, sólo M. chelonae subespecie chelonae no se desarrolla en esos medios. II. Muestra Un cultivo de 3 a 4 semanas del microorganismo por probar, desarrollado en un medio de Lowenstein-Jensen u otro medio con huevo coagulado.

Protocolos

P rotocolo

1447

19-14

T o l e r a n c i a a l c l o r u r o d e s o d io : m ic o b a c te r i a s

(cont.)

III. Materiales A. Equipo 1. Campana de bioseguridad. 2. Gradillas inclinadas. B. Materiales 1. Palillos de madera estériles. 2. Pipetas estériles de 1 mL. 3. Estándar 1 de McFarland. C. Medios 1. Lowenstein-Jensen sin NaCI al 5% en agar inclinado (pico de flauta). 2. Lowenstein-Jensen con NaCI al 5% en pico de flauta. 3. Caldo Dubos Tween o M iddlebrook 7H9. IV. Control de calidad A. Control positivo: M. fo r tu itu m American Type Culture Collection (ATCC) 6841. B. Control negativo: M. gordonae ATCC 14470. Hacer controles para cada nuevo número de lote de medio que se reciba. Descartar el medio si los resultados con los microorganis­ mos control no son los esperados. Adquirir el medio de Lowenstein-Jensen con NaCI y sin él en tubos del mismo tamaño, para que la interpretación de los resultados sea coherente. V. Procedimiento 1. Utilizar un cultivo en crecimiento activo (de 2 a 4 semanas para las micobacterias de desarrollo lento; 1 a 2 semanas para las de desarrollo rápido). H acer una suspensión de los microorganismos en caldo de Middlebrook 7H9 equivalente al estándar 1 de McFarland. 2. Tomar un pico de flauta de Lowenstein-Jensen con NaCI al 5% y uno sin NaCI al 5% y sembrar en cada tubo 0,1 mL de la sus­ pensión descrita. 3. Incubar los picos de flauta con las tapas flojas en una estufa con 5 a 10% de CO,. Colocar los picos de flauta acostados en una gradilla durante la incubación. Incubar durante una semana a 29 a 30 °C para los microorganismos de desarrollo rápido y a 37 °C para los de desarrollo lento. Colocar los tubos negativos en posición vertical; incubar 3 semanas más. Examinar visualmente los picos de flauta una vez por semana en busca de desarrollo. VI. Resultados 1. Cuando se observen numerosas colonias en el tubo control y más de 50 colonias en el medio que contiene NaCI al 5%, conside­ rar la prueba como positiva. 2. Si hay colonias en el tubo control y no hay desarrollo visible en el pico de flauta con NaCI, continuar la incubación hasta 4 semanas. VII. Notas acerca del procedimiento Utilizar el tubo sin NaCI al 5% para controlar la viabilidad del microorganismo. No es necesario que haya el mismo desarrollo en ambos tubos. Si el microorganismo no se desarrolla en el pico de flauta sin NaCI, repetir la prueba. VIII. Limitaciones del procedimiento Algunas cepas de M. fortuitum y de M. chelonae se desarrollan en medios con NaCI sólo a temperaturas inferiores a 35 °C. Por esta razón, todas las muestras deben incubarse a 29 a 30 °C. IX. Bibliografía Lutz B. Sodium chloride tolerance. En: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedure Handbook, M ycobacteriology Section. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992. Silcox VA, Good RA, Floyd MM. Identification of clinically significant Mycobacterium fortuitum complex. J Clin Microbiol 1981;4:686-691.

P ro to c o lo

19-15

H i d r ó l is is d e l T w e e n - 8 0

I. Principio Tween-80® es la marca registrada del derivado polietilenado del monooleato de sorbitano. Algunas especies de Mycobacterium tienen una enzima que libera ácido oleico a partir del Tween-80. El cambio de color del naranja al rosado se debe a la hidrólisis del Tween-80. que modifica la rotación óptica de la luz que atraviesa el sustrato. II. Muestra Colonia madura de la especie de Mycobacterium desconocida aislada en materiales clínicos, desarrollada en agar inclinado (pico de flau­ ta) en medio de Lowenstein-Jensen.

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Protocolos

P rotocolo

19-15

H id ró lis is d e l T w e e n -8 0

(cont.)

III. Materiales A. Insumos 1. Palillos de madera estériles. 2 . Tubos con tapa de rosca (1 2 x 1 0 0 mm) con 2 ,0 mL de agua destilada cada uno. B. Medios 1. Pico de flauta en medio de Lowenstein-Jensen. C. Reactivos 1. Reactivo para hidrólisis del Tween-80. 2. Dos gotas de reactivo Difeo (Detroit, MI) agregadas al agua destilada de los tubos con tapa de rosca. D. Equipo 1. Campana de bioseguridad. IV. Control de calidad A. Control positivo: M. kansasii, American Type Culture Collection (ATCC) 12478 incubado durante 12 días. B. Control negativo: cultivo madre de M. intracellulare ATCC 13950. C. Reactivo negativo: tubo sin sembrar de sustrato, incubado durante 12 días. V. Procedimiento 1. Agregar 2 gotas de reactivo Tween a 1 mL de agua destilada estéril en tubos con tapa de rosca. 2. Sembrar una ansada del microorganismo por probar. 3. Incubar a 35 °C en la oscuridad, con las tapas bien cerradas. 4. Inspeccionar los tubos a las 24 horas. Si son negativos, leer otra vez a los 5 y a los 10 días. Comparar el color del líquido con el de los tubos control. VI. Resultados El resultado se considera positivo cuando el líquido, no las células, vira de un naranja pálido al rosa o rojo. En general. M. kansasii se tom a positivo dentro de las 24 horas. Leer nuevamente a los 3, 5 y 10 a 12 días. Anotar los resultados y descartar los positivos. Descartar todos los tubos a los 12 días. VII. Notas acerca del procedimiento Mantener el reactivo para hidrólisis del Tween en la oscuridad. No alm acenar ni incubar los tubos a la luz. El color rojo de una reac­ ción positiva no se debe a un cambio de pH. sino a la liberación de rojo neutro. VIII. Bibliografía Lutz B. Tween-80 hydrolysis. En: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedure Handbook, M ycobacteriology Section. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992. Kilbum JO, et al. Preparation of a stable mycobacterial Tween hydrolysis test substrate. App Microbiol 1973:26:826. Wayne LG, Doubek JR. Russell RL. Classification and identification o f mycobacteria: I Tests employing Tween-80 as substrate. Am Rev Respir Dis 1964;90:588-597.

P r o t o c o l o 1 9 -1 6

U r e a s a : m ic o b a c t e r ia s

I. Principio La ureasa es una enzima que tienen muchas especies de Mycobacterium, que puede hidrolizar la urea para form ar amoníaco y dióxido de carbono. El amoníaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, lo que produce alcalinización y aumento de pH del medio. II. Muestra A. Tipo de muestra Colonia madura de la especie de M ycobacterium desconocida, aislada en materiales clínicos y desarrollada en agar inclinado (pico de flauta) en medio de Lowenstein-Jensen. III. Materiales A. Equipo 1. Gabinete de seguridad biológica. 2. Estufa de incubación a 37 °C.

Protocolos

P ro to c o lo

1449

19-16

U r e a s a : m i c o b a c t e r i a s (c o n t.)

IV.

V.

VI.

VII. VIII.

IX.

B. Medio 1. Caldo urea a. Agregar 10 g de Bacto agar base urea Difeo (Detroit. MI) concentrado a 90 mL de agua desionizada estéril. Mezclar bien para disolver. b. Fraccionar asépticamente en alícuotas de 3 mL en tubos de ensayo estériles con tapa de rosca. c. Almacenar entre 2 y 8 °C; la duración es de un mes. Control de calidad A. Control positivo: M. kansasii American Type Culture Collection (ATCC) 12478. B. Control negativo: M. avium/intracellulare ATCC 13950. Procedimiento 1. Sembrar cada tubo de sustrato con una punta de espátula llena de un cultivo en fase de crecimiento activo. Emulsificar por completo el cultivo en el caldo. 2. Incubar a 37 °C durante 5 días. 3. Leer los tubos a los 1, 3 y 5 días. Resultados El cambio de color del amarillo al rosa fuerte o al rojo indica una reacción positiva. La ausencia de cambios de color es una reacción negativa. Notas acerca del procedimiento Repetir las pruebas que tengan color rosa pálido; si la repetición de la prueba es también ±, informar como negativa. Limitaciones del procedimiento 1. Las pruebas falsas positivas por lo general se deben a una interpretación incorrecta de los resultados, a una incubación más allá de los 5 días o a la contaminación de los cultivos de prueba o controles. 2. Los resultados falsos negativos se deben al uso de un medio incorrecto (alguno utilizado para probar bacterias diferentes de los bacilos ácido-alcohol resistentes), a un inoculo insuficiente o a que los cultivos son demasiado viejos. Bibliografía Kent PT. Kubica GP. Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory. Atlanta: Centers for Disease Control, 1985. Department of Health and Human Services publication 86-21654-6. Lutz B. Identification tests for mycobacteria: urease. En: Isenberg HD, ed. Clinical M icrobiology Procedure Handbook. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1992. Murphy DB. Hawkins JE. Use of urease disks in the identification o f mycobacteria. J Clin Microbiol 1975;1:465-468.

P ro to c o lo

Sondas de

19-17 DNA

p a r a l a id e n t i f ic a c ió n d e m ic o b a c t e r ia s

I. Principio Se comercializa un sistema, AccuProbe Culture Confirmation Tests (GenProbe, Inc., San Diego, CA). para la identificación de aisla­ mientos de varias especies de micobacterias (complejo M. tuberculosis, M. avium. M. intracellulare, M. gordonae, complejo M. avium y M. kansasii). El sistema se basa en el uso de sondas de DNA complementarias al rRNA específico de especie. Las células micobacterianas se lisan por sonicación, se matan por calor y se exponen a DNA marcado con un colorante quimioluminiscente. La sonda de DNA marcada se combina con el rRNA del microorganismo para formar un híbrido estable de DNA-RNA. Un reactivo de selección "m ata” las señales emitidas por todo el DNA no unido. La quimioluminiscencia producida por los híbridos DNA-RNA se mide con un luminómetro. II. Muestra Puede usarse cualquier cultivo en crecimiento activo de menos de un mes, aislado en un medio líquido o sólido (M iddlebrook 7H9. 7H10, 7H11, 7 H 1 1 selectivo o Lowenstein-Jensen).

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Protocolos

P ro to c o lo

Sondas de

19-17 DNA p a r a l a i d e n t i f i c a c i ó n d e m i c o b a c t e r i a s (co n t.)

III. Materiales A. Reactivos Reactivo Tubos para lisado Reactivo sonda Reactivo 1 Reactivo 2 Reactivo 3 Detección I Detección II Aumentador ultrasónico

Descripción Buffer y perlas de vidrio liofilizados DNA especie-específico liofilizado en tubos Diluyente de la muestra Diluyente de la sonda Reactivo de selección H20 2 en solución de ácido nítrico con NaOH 1 N H20 2 en solución de ácido nítrico con NaOH 1 N Solución símil detergente para aumentar la sonicación

Temperatura de almacenamiento (°C) 23-25 4 23-25 23-25 23-25 23-25 23-25 23-25

B. Materiales 1. M icropipetas (100 |iL) 2. M icropipeteador (300 |iL ) 3. Repipeteador (300 |iL) 4. Jeringas para repipeteador 5. Ansas estériles de plástico (1 (ig) C. Equipo 1. Luminómetro (Leader 1, Leader 250 o PAL). 2. Agitadora vorticial. 3. Baño de agua o platina caliente, 90 ± 5 °C. 4. Baño de agua o platina caliente, 60 ± 5 °C. IV. Control de calidad A. Frecuencia y tolerancia de los controles 1. Correr un control positivo y uno negativo con cada lote de microorganismos por probar. 2. Si los controles no se encuentran dentro de los límites preestablecidos, controlar la edad del cultivo (debe ser de menos de 2 meses), el nivel de agua del sonicador, la calidad del sonicador (observando los patrones de ondas de agua cuando está encendi­ do: el agua debe "bailar”) y la tem peratura de hibridación; si fuera necesario, correr un estándar de tritio. B. M icroorganismos de control Sonda por probar M. avium M. intracellulare Complejo M. tuberculosis M. gordonae Complejo M. avium M. kansasii

Control Positivo M. avium American Type Culture Collection (ATCC) 25291 M. intracellulare ATCC 13950 M. tuberculosis ATCC 14470 M. gordonae ATCC 14470 M. intracellulare ATCC 13950 M. kansasii ATCC 12478

Negativo M. intracellulare ATCC 13950 M. avium ATCC 25291 M. avium ATCC 25291 M. scrofulaceum ATCC 19073 M. gordonae ATCC 14470 M. tuberculosis ATCC 25177

V. Procedimiento 1. Agregar una taza de aumentador ultrasónico al agua del sonicador. Desgasificar el agua durante 15 minutos. Prender el baño M aría (o platina caliente) a 95 °C y el baño María (o platina caliente) a 60 °C. 2. Agregar 100 mL de reactivo 1 (diluyente de la muestra) y 100 mL de reactivo 2 (diluyente de la sonda) a cada tubo de lisado. 3. Trabajando en un gabinete de bioseguridad, transferir el volumen de un ansa (1 pL) del microorganismo en estudio. Frotar el ansa contra las paredes del tubo para descargar todo el inóculo. 4. Colocar los tubos de lisado en el sonicador. Asegurarse de que el nivel de agua cubra el contenido de los tubos. No permitir que los tubos toquen las paredes del sonicador y accionarlo a tem peratura ambiente durante 15 minutos.

Protocolos

1451

P rotocolo 19-17

S o n d a s d e DNA p a ra l a id e n tific a c ió n d e m ic o b a c te ria s

(cont.)

5. 6. 7. 8. 9.

Colocar los tubos de lisado en el baño María (o platina caliente) a 95 °C durante 15 minutos. Dejar enfriar los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos. Pipetear 100 mL del lisado muerto dentro del tubo con reactivo de sonda. Incubar los tubos en baño María (o platina caliente) a 60 °C durante 15 minutos. Pipetear 300 mL de reactivo 3 (reactivo de selección) en cada tubo. Tapar los tubos, agitar en la agitadora vorticial y colocarlos de inmediato otra vez en baño M aría (o platina caliente) a 60 °C. Incubar 5 minutos. 10. Preparar el luminómetro para usar haciendo un ciclo completo de lavado. Para evitar las cargas estáticas y asegurarse de que no queden residuos por fuera de los tubos, limpiar cada uno con papel tisú húmedo antes de colocarlo en el luminómetro. Leer cada tubo y los controles. El luminómetro registra unidades relativas de luz (URL). VI. Resultados A. Un resultado positivo es > 30 000 URL. B. Las señales menores de 30 000 URL se consideran negativas. C. Repetir todas las pruebas con resultados entre 20 000 y 29 999 URL. VII. Notas acerca del procedimiento A. Es importante m antener la platina caliente a 60 ± 1 °C ya que la configuración circular del híbrido DNA-RNA es sensible a la temperatura. B. El nivel de agua del sonicador debe ser suficiente para cubrir el buffer de hibridación, las perlas y el microorganismo. C. Otras fuentes de error incluyen la omisión de agitar en agitadora vorticial después de agregar la mezcla microorganismo-buffer al tubo con sonda y después de agregar el reactivo 3, que inactiva el éster de acridinio no unido al rRNA. D. Este método se encuentra en evaluación para utilizarlo con frascos BACTEC. VIII. Limitaciones del procedimiento A. Este método no puede llevarse a cabo directamente sobre muestras clínicas recién obtenidas; sólo se usa para la confirmación de cultivos. B. Una pequeña cantidad de aislamientos, determinados bioquímicamente como pertenecientes al complejo M. avium. no dan resul­ tados positivos con la sonda para el complejo M. avium. En la actualidad, la ubicación taxonómica de estas cepas es dudosa. C. La prueba para confirmación de un cultivo del complejo M. tuberculosis no diferencia entre M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, Al africanum y M. microti. D. La confirmación de un cultivo del complejo M. avium no diferencia entre M. avium y M. intracellulare. IX. Bibliografía Gen-Probe. Product Information: AcuProbe M ycobacterium Culture Confirmation Tests. San Diego CA: Gen-Probe, 1990. Stockman L. Identification o f Mycobacteria in DNA probes. En: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedure Handbook. Washington DC: American Society for Microbiology, 1992.

P r o to c o lo 19-18

D e te c c ió n , id e n tific a c ió n y p ru e b a s d e s e n s ib ilid a d a fá rm a c o s d e

M.

t u b e r c u l o sis p o r m é t o d o s r a d i o m é t r i c o s

I. Principio El metabolismo del [14C] ácido palmítico a “CO, por parte de miembros del género M ycobacterium es un método sensible y específi­ co para aislar, identificar y probar la sensibilidad de las micobacterias a los fármacos. El !4CO, se detecta en la cámara de ionización del BACTEC 460 (Becton Dickinson Instruments Systems, Sparks, MD). Debido a la sensibilidad del instrumento para detectar l4C O „ la capacidad de hallar desarrollo en presencia de alguno de los diversos agentes antituberculosos incorporados al medio proporciona un método rápido para determinar la resistencia a los fármacos. Las muestras clínicas pueden controlarse diariamente en busca de activi­ dad. El desarrollo se determina por el hallazgo de un aumento de las lecturas de l4CO, en la cám ara de ionización. II. Muestra Se utiliza un cultivo positivo sospechoso de ser M. tuberculosis (determinado por la inhibición del desarrollo en un frasco de NAP sem­ brado en paralelo, por observación de formación de cordones en las tinciones AAR, o por examen de las microcolonias en una placa con medio de Middlebrook 7H10), proveniente de un frasco ampolla de caldo BACTEC 12A que haya alcanzado un índice de desa­ rrollo de 500 o más.

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Protocolos

P rotocolo 19-18

D e t e c c i ó n , i d e n t i f i c a c i ó n y p r u e b a s d e s e n s i b i l i d a d a f á r m a c o s d e M. tuberculosis p o r m é t o d o s r a d i o m é t r i c o s (cont.)

III. Materiales A. Equipo: Instrumento BACTEC 460 B. Medios 1. Frascos para cultivo en caldo BACTEC 12A (dos por cada muestra desconocida). 2. Frasco ampolla BACTEC NAP. 3. Frascos para cultivo en caldo BACTEC 12A, cada uno de ellos contiene uno de los siguientes fármacos antituberculosos: a. Isoniazida b. Estreptomicina c. Rifampicina d. Etambutol IV. Control de calidad El control de calidad de los frascos ampolla que contienen antibióticos es realizado por el fabricante antes de su envío. La práctica local determinará si es necesario efectuar un control de calidad de cada lote nuevo de frascos ampolla que contienen antibióticos con una cepa de M. tuberculosis que tenga un perfil de resistencia conocido. V. Procedimiento 1. El procedimiento comienza con la detección de un frasco ampolla BACTEC 12A positiva que haya alcanzado un índice de desa­ rrollo de 100 en el cual se determina la presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes. 2. Inocular 1 mL del cultivo en un frasco ampolla que contenga medio 12A más p-nitroacetil-aminohidroxipropiofenona (NAP; véase protocolo 19-4). Sembrar también 1 mL del cultivo positivo en otro frasco ampolla que contenga sólo medio 12A. 3. Si el desarrollo es inhibido después de 3 a 5 días de incubación, el aislamiento es M. tuberculosis o M. bovis; la falta de inhi­ bición del desarrollo indica que el microorganismo es una especie de M ycobacterium diferente de M. tuberculosis, caso en el cual no puede realizarse la prueba de sensibilidad BACTEC. 4. Si el desarrollo es inhibido en el frasco NAP, observar el índice de desarrollo en el frasco ampolla con medio 12A sin NAP que se ha sembrado en paralelo. Cuando el índice de desarrollo llega a 500. la concentración es suficiente para realizar estudios de sensibilidad a antimicobacterianos en la cepa desconocida de M. tuberculosis. 5. Sembrar 0,1 mL del cultivo positivo en cada uno de los frascos ampolla que contienen fármacos provistos por el fabricante (en la actualidad, isoniazida, estreptomicina, rifampicina y etambutol) y con cepas control representativas. 6. Al mismo tiempo, sembrar otro frasco ampolla de medio 12A sin fármacos con 0.1 mL de una dilución 1:100 del cultivo posi­ tivo utilizado para sembrar los frascos ampolla con fármacos. Esto equivaladrá a un desarrollo del 1% en el método proporcio­ nal para prueba de sensibilidad a los fármacos. 7. Incubar los fascos ampolla y leerlos diariamente hasta que el índice de desarrollo en el frasco ampolla control alcance 30. En ese momento, registrar el índice de desarrollo de los frascos ampolla que contienen fármacos. VI. Resultados A. Interpretación Si el aumento del índice de desarrollo en el medio que contiene fármacos es m ayor que el cambio de índice de desarrollo del con­ trol (30 o más), la cepa de M. tuberculosis está creciendo en presencia de ese fármaco y se considera resistente. VII. Notas acerca del procedimiento La concentración final de fármaco en cada uno de los frascos ampolla es el 90% de la concentración nominal, debido al factor de dilu­ ción (2 mL de medio más 0,1 mL de solución de fármaco más 0,1 mL de inóculo = 2,2 mL). VIII. Bibliografía Damato JJ, Collins MT, Rothlauf MV, et al. Detection of mycobacteria by radiometric and standard píate procedures. J Clin Microbiol 1983;17:1066-1073. Gross WM, Hawkins JE. Radiometric selective inhibition tests for differentiation o f Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium bovis and other mycobacteria. J Clin Microbiol 1985:21:565-568. Morgan MA, Horstmeier CD, De Young DR. Comparison o f a radiometric method (BACTEC) and conventional culture media for recovery of mycobacteria from smear-negative specimens. J Clin Microbiol 1983:18:384-388. Roberts GD, Goodman NL, Heifets L, et al. Evaluation of the radiometric method for recovery of mycobacteria and drug susceptibi­ lity testing of Mycobacterium tuberculosis from acid-fast smear positive specimens. J Clin Pathol 1983;18:689-696.

Protocolos

1453

P rotocolo 20-1

M ic r o s c o p ía e n c a m p o o s c u r o d e l e s i o n e s g e n it a l e s

I. Principio La detección de espiroquetas en campo oscuro permite el diagnóstico presuntivo de sífilis durante el período primario, antes de que se desarrollen los anticuerpos. Existen pocas espiroquetas contaminantes en los genitales, de modo que la detección de espiroquetas de mor­ fología compatible con Treponema pallidum subespecie pallidum representa un diagnóstico firme. La prevalencia de espiroquetas en la cavidad bucal impone mayor precaución. Lo mejor es no realizar la prueba en la cavidad bucal: si se ven espiroquetas, su identidad debe establecerse por métodos inmunológicos específicos. II. Equipos y reactivos Microscopio de luz transmitida y un condensador de campo oscuro. Utilizar un objetivo lOx para enfocar la muestra y centrar el con­ densador de campo oscuro. Usar un objetivo 40x o 63x para examinar la muestra. La identificación final se hace con un objetivo lOOx. Portaobjetos, de 26 mm x 76 mm. Su espesor debe concordar con lo recomendado en el manual del microscopio. Cubreobjetos # 1, de 22 mm x 22 mm. Aceite de inmersión no secante, Cargille® tipo A o similar. Papel y líquido de limpieza para lentes. Palillos de madera. Solución fisiológica estéril. Desinfectante, como yodo o alcohol al 70%. III. Control de calidad Para regular el condensador de campo oscuro puede usarse como control un raspado de mucosa gingival. IV. Procedimiento A. Obtención de la muestra 1. General a. Eliminar toda escara o costra que cubra la lesión. b. Eliminar el exudado con una gasa o esponja. c. Si es necesario, oprimir la base de la lesión o aplicar una ventosa para producir la acumulación de líquido tisular en la super­ ficie de la úlcera. d. Hacer un frotis con un ansa estéril. e. Colocar un cubreobjetos sobre la muestra y presionar para eliminar las burbujas de aire. f. Examinar de inmediato. 2. Lesiones papuloescamosas secas de piel a. Eliminar con suavidad la capa superficial de piel, tratando de evitar el sangrado. b. Comprimir la lesión en caso de que aparezca muy poca cantidad de líquido. c. Tocar con un portaobjetos la lesión o transferir una pequeña cantidad de líquido a un portaobjetos, por medio de un ansa de bacteriología. d. Como alternativa, puede inyectarse una pequeña cantidad de solución fisiológica dentro de la lesión, aspirarla de nuevo y colo­ carla sobre el portaobjetos. e. Colocar un cubreobjetos y examinar de inmediato. 3. Lesiones vaginales y de cuello uterino a. Eliminar todo exudado cervical o vaginal bajo observación con un espéculo. b. Obtener exudado seroso con un ansa bacteriológica. c. Si es necesario, el exudado seroso puede producirse comprimiendo la lesión con una pinza de Kelly. d. Hacer los preparados como se describió antes. 4. Placas en mucosas a. Utilizando un ansa estéril, recoger parte del moco y colocarlo sobre un portaobjetos. b. Colocar un cubreobjetos y examinar de inmediato. V. Observación de la muestra Preparar el microscopio de campo oscuro antes de recoger la muestra. Recorrer en forma sistemática el preparado usando un objetivo 40x a 63x. Cuando se encuentre una estructura sospechosa, examinar con aumento lOOx. Una vez finalizada la observación, descartar el preparado en desinfectante. Características de T. pallidum y de la especie genital saprofita, T. refringens.

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Protocolos

P ro tocolo 20-1

M i c r o s c o p ía e n c a m p o o s c u r o d e l e s i o n e s g e n it a l e s

Característica Morfología Forma Longitud Ancho Separación entre espiras Motilidad Traslación Rotación Flexión

Distorsión

VI.

VII.

(cont.)

T. pallidum

T. refringens

Delicado tirabuzón 6-14 pm 0,25-0,3 pm Aproximadamente 1-1,5 pm

Espiras flojas, gruesas 8-20 pm 0,4-0,75 pm

Movimiento lento, deliberado, hacia adelante y atrás Rotación lenta a rápida (tirabuzón); puede rotar en el mismo sitio Rotación acompañada por acodaduras y flexiones suaves Acodaduras rígidas en la porción media del microorganismo Puede verse como un anillo o adherido a células

Movimiento rápido, contorsivo Rotación activa en serpentina Flexión marcada

Ninguna destacable

Resultados A. Interpretación Puede haber resultados falsos positivos si no se confirman las espiroquetas bucales o si se interpreta erróneamente la motilidad de las espiroquetas genitales. Unos pocos eritrocitos en el preparado son índice de que se ha obtenido exudado, pero la muestra no debe ser sanguinolenta. Deben eliminarse con cuidado las burbujas de aire. Pueden obtenerse resultados falsos negativos si se obtiene insuficiente cantidad de exudado, si ha transcurrido mucho tiempo entre la toma de la muestra y la observación, si la lesión es tardía o si el paciente ha sido tratado con fármacos antitreponémicos. Bibliografía Larson SA. Hunter EF. Kraus SJ, eds. Manual o f Tests for Syphilis. 8a ed. Washington. DC: American Public Health Association, 1990.

P ro tocolo 20-2

P r u e b a s é r ic a e n p o r t a o b j e t o s d e l V e n e r e a l D is e a s e R e s e a r c h L a b o r a t o r y ( V D R L )

I. Principio La prueba VDRL en portaobjetos es la prueba no treponémica de referencia para sífilis. Es la única prueba ampliamente reconocida para el diagnóstico de neurosífilis. La VDRL es una prueba no treponémica de microfloculación. Utiliza un antígeno que contiene cardiolipina, lecitina y colesterol. El antígeno forma grumos microscópicos cuando se mezcla con anticuerpos dirigidos contra el complejo cardiolipina. II. Equipos y reactivos A. Equipo 1. Agujas no descartables sin bisel, a. Para probar suero: calibre 18. 2. Frascos: redondos, de 30 mL. de boca estrecha, de 35 mm de diámetro, con tapones de vidrio o similar y fondo interior de super­ ficie plana (Corning Glass Works, Corning, NY, catálogo LG-1 MW-90530). 3. Dispositivo de seguridad para pipetear con puntas descartables, que descargue 50 (tL. 4. Pipetas serológicas, graduadas hasta la punta: a. de 1 mL. graduadas en 1/100 mL. b. de 5 mL, graduadas en 1/10 mL. c. de 10 mL, graduadas en 1/10 mL.

Protocolos

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P r u e b a s é r i c a e n p o r t a o b j e t o s d e l V e n e r e a l D i s e a s e R e s e a r c h L a b o r a t o r y ( V D R L ) (cont.)

5. Portaobjetos a. Para probar suero: de 25 x 75 mm, con 12 anillos de parafina o cerámica de alrededor de 14 mm de diámetro (los anillos deben ser lo suficientemente altos como para evitar derrames durante la rotación). b. 12 concavidades de 16 m m de diámetro y 1,75 mm de profundidad. 6. Soporte para portaobjetos de 25 x 75 mm. 7. Molde para anillos de parafina si no se utilizan anillos de cerámica. 8. Placa rotatoria mecánica regulable a 180 ± 2 rpm, que describa un círculo de 19 mm de diámetro en el plano horizontal. 9. Recipientes para residuos o desinfectantes, guantes de látex descartables. 10. Cubiertas humectantes (en climas secos). B. Reactivos 1. Antígeno VDRL: conservar en la oscuridad a tem peratura ambiente o en frigorífico. Descartar los frascos que contengan preci­ pitado. 2. Solución salina tam ponada (amortiguada) VDRL, pH 6 ± 0,1 (NaCI al 1%) (adquirida o preparada). 3. Muestras de suero control: reactivo (R), reactivo débil (D). no reactivo (N). 4. Solución fisiológica al 0,9%. 5. Solución fisiológica al 10%. III. Procedimientos para las pruebas serológicas A. Preparación de la suspensión antigénica 1. Preparar una nueva suspensión de antígeno VDRL todos los días. La tem peratura de los reactivos debe ser de 23 a 29 °C. 2. Pipetear 0,4 mL de solución salina tamponada VDRL en el fondo de un frasco redondo de 30 mL con tapón de vidrio y con fondo interno de superficie plana. 3. Agregar 0,5 mL de antígeno VDRL directamente a la solución fisiológica mientras se hace girar el frasco en forma continua, pero con suavidad, sobre una superficie plana. Agregar el antígeno gota a gota, a una velocidad aproximada de 6 segundos para cada 0,5 mL de antígeno. Mantener la punta de la pipeta en el tercio superior del frasco y no salpicar solución fisiológica sobre la punta de la pipeta. La velocidad adecuada de rotación se obtiene cuando el centro del frasco describe una circunferencia de 5 cm de diámetro, aproximadamente tres veces por segundo. 4. Expulsar la última gota de antígeno de la pipeta sin que ésta toque la solución fisiológica. Continuar girando el frasco durante 10 segundos. 5. Con una pipeta de 5 mL, agregar 4,1 mL de solución salina tamponada. 6. Tapar el frasco y agitar invirtiéndolo alrededor de 30 veces en 10 segundos. La suspensión de antígeno debe utilizarse dentro de las 8 horas de su preparación. 7. M ezclar la suspensión por agitación suave cada vez que se utilice. No m ezclar aspirando y expeliendo con jeringa y aguja. B. Comprobación de la precisión de la aguja distribuidora de la suspensión de antígeno 1. La precisión de la prueba depende de la cantidad de antígeno utilizada. Controlar periódicamente la precisión de la aguja cali­ brada. 2. Para las pruebas cualitativas y cuantitativas en suero, distribuir la suspensión de antígeno por medio de una jeringa con aguja calibre 18 sin bisel, que distribuya 60 ± 2 gotas de suspensión de antígeno por mililitro (17 ¡iL/gota) cuando se mantiene en posi­ ción vertical. 3. Colocar la aguja en una jeringa de 2 mL o en una pipeta de 1 mL y llenar la jeringa o la pipeta con suspensión de antígeno VDRL. Manteniendo la jeringa o la pipeta en posición vertical, contar la cantidad de gotas contenidas en 0,5 mL. La aguja está correc­ tamente calibrada si produce 30 ± 1 gota cada 0,5 mL. Corregir o reemplazar la aguja si no cumple con estas especificaciones. C. Prueba y almacenamiento de la suspensión de antígeno VDRL 1. Preparar una nueva suspensión de antígeno todos los días. Almacenarla a temperatura ambiente, entre 23 y 29 °C. 2. Probar la suspensión de antígeno con los sueros control reactivo, débilmente reactivo y no reactivo. 3. Utilizar sólo las suspensiones de antígeno que reproducen el patrón de reactividad establecido para los controles. 4. Después de terminar las pruebas del día, desechar la suspensión de antígeno y limpiar la aguja y la jeringa de distribución por lavado con agua, alcohol y acetona, en ese orden. Sacar la aguja de la jeringa después de la limpieza. D. Preparación y conservación de las muestras 1. Observar las medidas de seguridad recomendadas para la manipulación de sueros humanos. 2. Centrifugar la sangre coagulada a temperatura ambiente entre 1 500 y 2 000 rpm durante 5 minutos para sedimentar los ele­ mentos celulares. 3. Transferir el suero a un tubo de ensayo limpio y seco y calentar a 56 °C en baño M aría durante 30 minutos.

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P r o t o c o l o 20-2

P r u e b a s é r ic a e n p o r ta o b je to s d e l V e n e r e a l D is e a s e R e s e a r c h L a b o r a t o r y (V D R L )

(cont.)

4. Volver a centrifugar toda muestra que contenga detritos después de la inactivación por calor. 5. Si la prueba se demora más de 4 horas, calentar nuevamente el suero a 56 °C durante 10 minutos. 6. Las muestras deben estar a tem peratura ambiente (23 a 29 °C) en el momento de la prueba. E. Realización de la prueba cualitativa en suero 1. Una vez que todos los reactivos alcanzan la tem peratura ambiente, poner 50 |iL de suero dentro de un anillo de parafina o cerá­ mica colocado sobre un portaobjetos, utilizando un dispositivo de seguridad para pipetear. No usar portaobjetos con concavida­ des, cubetas o pocilios de vidrio. 2. Resuspender suavemente la suspensión de antígeno VDRL. 3. M anteniendo la jeringa y la aguja de distribución de antígeno VDRL en posición vertical, dejar salir varias gotas para eliminar el aire de la aguja. Luego agregar exactamente una gota producida por caída libre (17 |0.L) de suspensión de antígeno dentro de cada círculo que contenga suero. 4. Colocar el portaobjetos sobre la placa rotatoria mecánica. Rotar durante 4 minutos a 180 ± 2 rpm. En climas secos, cubrir el por­ taobjetos con una cubierta humectante durante la rotación. 5. Inmediatamente después de terminada la rotación, sacar el portaobjetos de la placa y leer los resultados de la prueba en micros­ copio, utilizando un ocular lOx y un objetivo lOx. 6. Informar los resultados de la siguiente forma: LECTURA Grumos grandes o medianos Grumos pequeños Ausencia de grumos o ligera irregularidad

INFORME Reactivo (R) Reactivo débil (D) No reactivo (N)

7. Probar en forma cuantitativa hasta punto final todas las muestras que tengan resultado reactivo, reactivo débil o no reactivo "con rugosidades” en la prueba cualitativa. E Realización de la prueba cuantitativa en suero 1. Cuantificar las muestras de suero hasta título final. Pueden hacerse pruebas cuantitativas hasta dilución 1:8 de tres muestras en un solo portaobjetos. 2. Colocar 50 uL de solución fisiológica al 0,9% en círculos numerados del 2 al 4, sin distribuir la solución fisiológica. 3. Utilizando un dispositivo de seguridad para pipetear, colocar 50 |iL de suero en el círculo 1 y en el círculo 2. 4. M ezclar la solución fisiológica y el suero del círculo 2, aspirando y expulsando la solución con la pipeta de seguridad ocho veces. Evitar la formación de burbujas. 5. Transferir 50 )iL del círculo 2 (1:2) al círculo 3 y mezclar. 6. Transferir 50 jiL del círculo 3 al círculo 4 y mezclar. Descartar los últimos 50 |iL. 7. Resupender con suavidad la suspensión de antígeno VDRL. 8. Manteniendo la jeringa y la aguja de distribución de antígeno VDRL en posición vertical, descartar varias gotas para eliminar el aire de la aguja. Luego, agregar exactamente 1 gota producida por caída libre (17 (iL) de suspensión de antígeno a cada círculo. 9. Colocar el portaobjetos en la placa rotatoria mecánica. Rotar durante 4 minutos a 180 ± 2 rpm. En climas secos, agregar una cubierta humectante. 10. Inmediatamente después de terminada la rotación, leer los resultados de la prueba en microscopio, utilizando un ocular lOx y un objetivo lOx. 11. Si la dilución más alta probada (1:8) es reactiva, proceder de la siguiente forma: a. Preparar una dilución 1:8 de la muestra por probar. Agregar 0.1 mL de suero a 0.7 mL de solución fisiológica al 0,9% y m ez­ clar por completo. b. Colocar 50 |iL de solución fisiológica al 0,9% en el segundo, tercero y cuarto anillo de parafina de una hilera del portaobje­ tos. Preparar diluciones seriadas adicionales para muestras fuertemente reactivas. c. Agregar 50 jiL de la dilución 1:8 de la muestra por probar a los anillos de parafina 1 y 2. 12. Informar los títulos en términos de la mayor dilución que presenta resultado reactivo (no reacción débil): DILUCIONES DE SUERO No diluido 1:2 W R R R R R W W N (rugoso) W W N

INFORME 1:4 N W R R R N

1:8 N N W R R N

1:16 N N N W R N

1:32 N N N N N N

Reactivo, sin diluir, 1 dil Reactivo, dilución 1:2. 2 dils Reactivo, dilución 1:4, 4 dils Reactivo, dilución 1:8, 8 dils Reactivo, dilución 1:16,16 dils Débilmente reactivo, sin diluir, 0 dil

Protocolos

P ro to c o lo

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20-2

P r u e b a s é r i c a e n p o r ta o b je to s d e l V e n e r e a l D is e a s e R e s e a r c h L a b o r a t o r y (V D R L )

(cont.)

IV. Resultados A. Interpretación 1. La reacción VDRL es una ayuda para el diagnóstico de sífilis. U na reacción positiva puede indicar infección pasada o presente. Los resultados falsos positivos se deben a errores del laboratorio, a infecciones por otros treponemas o a la presencia de anti­ cuerpos no relacionados con la infección treponémica. El valor pronóstico de una prueba VDRL positiva aumenta cuando se combina con una prueba treponémica reactiva, como la prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes (véase protocolo 20-4) o la prueba de microhemaglutinación. 2. Un resultado no reactivo puede indicar ausencia de infección, infección bien tratada o infección en el pasado lejano. Puede obte­ nerse un resultado no reactivo durante el período de incubación o en la sífilis primaria temprana. Se observan fenómenos de zona, en especial en presencia de títulos altos, en la sífilis secundaria. Los sueros deben diluirse si se obtienen resultados rugosos o si la información clínica indica la probabilidad de que exista sífilis. 3. Un aumento de cuatro veces en el título puede indicar reinfección o fracaso del tratamiento. Un descenso de cuatro veces en el título en la sífilis temprana por lo general indica un tratamiento adecuado. 4. Todos los sueros deben titularse hasta punto final. Pueden encontrarse títulos desusadamente altos en algunos pacientes con infección simultánea por el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. En algunos pacientes con linfomas pueden encontrar­ se títulos falsos positivos muy altos. V. Fuentes de error 1. Si la temperatura del suero, del ambiente de la prueba o de los reactivos es m enor de 23 °C, la reactividad disminuye. Si la tem ­ peratura de cualquiera de ellos es m ayor de 29 °C, la reactividad aumenta. 2. Si se utilizan sueros hemolizados, contaminados o extremadamente turbios, los resultados de la reacción son impredecibles. 3. La reactividad es impredecible si los reactivos están vencidos, la prueba se realiza en forma incorrecta o no se siguen estricta­ mente los procedimientos. La aspiración y la expulsión repetidas del antígeno VDRL con la jeringa y aguja pueden hacer que el antígeno pierda reactividad. VI. Limitaciones de la prueba 1. El fenómeno de zona descrito puede producir resultados falsos negativos en sueros de título alto. 2. La suspensión de antígeno VDRL debe prepararse a diario. 3. La prueba VDRL en líquido cefalorraquídeo (LCR) debe realizarse sólo si la prueba en suero es reactiva. 4. Para la prueba VDRL no puede utilizarse plasma. 5. Se observan resultados biológicos falsos positivos con los antígenos de la cardiolipina, en especial en muestras provenientes de drogadictos. de pacientes con enfermedades como lupus eritematoso, mononucleosis, paludismo, lepra o neumonía viral, o de los que han sido recientemente vacunados. 6. Nota: la prueba VDRL en portaobjetos para LCR es similar a la que se hace con suero, pero existen importantes diferencias meto­ dológicas (véase bibliografía). En el caso del LCR, los resultados sólo se informan como reactivo o no reactivo. VII. Bibliografía Larson SA, Hunter EF. Kraus SJ. eds. Manual of Tests for Syphilis, 8a ed. Washington DC: American Public Health Association, 1990.

P rotocolo 20-3

P r u e b a r á p id a d e r e a g in a p l a s m á t i c a ( R P R ) e n t a r je t a

I. Principio La RPR (circle) Card Test fue instituida como prueba de detección sistemática en los M aryland State Department o f Health Laboratories el 13 de enero de 1964. Las principales ventajas de la RPR en comparación con la prueba VDRL son que el suero no necesita ser tra­ tado con calor, las lecturas son macroscópicas en lugar de microscópicas, el antígeno es estable y los componentes, desechables. Las pruebas pueden llevarse a cabo en forma rápida y económica, lo que hace que la técnica sea adecuada para operaciones de gran volu­ men. La sensibilidad y la especificidad de la prueba RPR son iguales a las de la VDRL y otras pruebas serológicas no treponémicas. La suspensión de antígeno RPR es un antígeno de cardiolipina que contiene carbón y detecta “reagina”, sustancia similar a un anti­ cuerpo, presente en el plasma y el suero de las personas con sífilis o con exposición previa al treponema. Cuando una muestra contie­ ne anticuerpos específicos, se produce floculación con coaglutinación de las partículas de carbón del antígeno RPR en tarjeta, que se ve como grumos negros contra el fondo blanco de la tarjeta recubierta con plástico. Esta coaglutinación puede leerse a simple vista; las muestras no reactivas tienen un color gris claro lechoso uniforme.

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Protocolos

P r o t o c o l o 20-3

P r u e b a r á p id a d e r e a g in a p l a s m á t ic a

(RPR)

e n t a r je t a

(cont.)

II. Equipos, materiales y reactivos 1. Aguja calibre 20 descartable, sin bisel, tratada con silíconas. 2. Frasco de plástico para distribuir antígeno. de 3,89 g. 3. Tarjetas RPR recubiertas de plástico con diez círculos, de aproximadamente 18 mm de diámetro cada uno. 4. Dispositivos plásticos desechables (Dispenstir®). para distribución-agitación, que libera 50 ¡tL. 5. Placa rotatoria mecánica, de velocidad tija o regulable a 100 ± 2 rpm, que describa un círculo de 1,8 cm de diámetro en el plano horizontal. 6. Cubierta humectante para la placa rotatoria. 7. Lámpara incandescente de alta intensidad. 8. Dispositivo de seguridad para pipetear, con puntas descartables de 50 (tL. 9. Recipientes para residuos y desinfectantes. 10. Guantes de látex desechables. anteojos de seguridad y ropa protectora. 11. Suspensión de antígeno RPR (una variante del antígeno para VDRL): combinación estabilizada de cardiolipina al 0,003%, lecitina al 0,020-0,022%, colesterol al 0,09%. cloruro de colina al 10%, EDTA 0.0125M, carbón al 0,1875%, N a2H P 0 4 0,1 M, K H ,P 0 4 0,01 M, timerosal al 0,1% y agua destilada. 12. Muestras de suero control: sueros liofilizados sobre una tarjeta reactivo (R), de reacción mínim a (MR) y no reactivo (N). 13. Solución fisiológica al 0.9% como diluyente. III. Procedimientos A. Comprobación de la precisión de la aguja para antígeno 1. Controlar periódicamente la aguja calibrada para asegurarse de que libera 60 + 2 gotas/mL (17 JiL). La precisión de la prueba depende de la cantidad de antígeno que se utiliza. 2. Consultar el procedimiento de calibración de agujas para la prueba VDRL (véase protocolo 20-2). B. Control y alm acenamiento de la suspensión de antígeno 1. Conservar las ampollas de antígeno entre 2 y 8 °C. No almacenar bajo luz solar directa, por encima de 29 °C, ni congelar. El antí­ geno de una ampolla abierta es estable hasta 12 meses. 2. Fijar el mandril de la aguja a la pieza correspondiente del frascco plástico para distribución. Abrir la ampolla, después de agitarla para resuspender las partículas. Oprimir el frasco plástico para colapsarlo, insertar la aguja en la ampolla y aspirar toda la sus­ pensión de antígeno con el frasco de distribución. Agitar con suavidad el frasco antes de colocar cada serie de gotas de antígeno. 3. Probar cada lote de suspensión de antígeno junto con un antígeno de reactividad estándar conocida antes de ponerlo en uso. 4. Con cada serie de determinaciones, comprobar la reactividad del antígeno con tarjetas control o con sueros de reactividad cono­ cida. Utilizar sólo suspensiones que produzcan la reactividad adecuada. 5. Después de terminar el trabajo del día, sacar la aguja del frasco de distribución, lavarla con agua destilada y secar al aire. No fro­ tar la aguja con elementos absorbentes (puede eliminarse la cubierta de siliconas). C. Preparación y conservación de las muestras 1. Para las pruebas puede utilizarse suero o plasma. El plasma se obtiene recolectando sangre en un tubo que contenga EDTA como anticoagulante. 2. No probar muestras que estén macroscópicamente contaminadas, hemolizadas en exceso o quilosas. D. Realización de la prueba cualitativa 1. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (23 a 29 °C) antes de realizar la prueba. 2. Colocar 50 |aL de suero o plasma en uno de los círculos de 18 mm de la taijeta de prueba RPR, por medio de un Dispenstir o un dispositivo de seguridad para pipetear. 3. Con el Dispenstir invertido (el extremo cerrado) o con un palillo de madera plano, distribuir el suero o plasma para que cubra la totalidad del círculo, pero sin sobrepasar sus límites. 4. Agitar con suavidad el frasco de distribución para resuspender las partículas. 5. Manteniendo el frasco y la aguja en posición vertical, descartar varias gotas para elim inar el aire de la aguja. A continuación, agregar exactamente 1 gota producida por caída libre (17 (tL) de suspensión de antígeno a cada círculo que contenga suero o plasma. No mezclar el antígeno con el suero o plasma. 6. Colocar la tarjeta en la placa rotatoria mecánica bajo una cubierta humectante. Rotar la tarjeta durante 8 minutos a 100 ± 2 rpm. 7. Sacar inmediatamente la tarjeta de la placa. Inclinarla y rotarla con suavidad con la mano, como ayuda para distinguir los resul­ tados no reactivos de los de reacción mínima. Leer las reacciones de la prueba mientras todavía están húmedas, utilizando una luz incandescente de alta intensidad, sin emplear aumento.

Protocolos

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P rotocolo 20-3

P r u e b a r á p id a d e r e a g in a p l a s m á t i c a

(RPR)

e n t a r je t a

(cont.)

8. Informar los resultados de la siguiente forma: LECTURA Formación característica de grumos, de marcada e intensa (reactivo) a leve pero bien definida (reactividad mínima) Irregularidad leve o ausencia de grumos

INFORME Reactivo (R) No reactivo (N)

9. Realizar la prueba cuantitativa en las muestras que tengan cualquier grado de reactividad o “rugosidad". IV. Realización de la prueba cuantitativa 1. Cuantificar a punto final todas las muestras de suero con resultados reactivos o no reactivos rugosos en la prueba cualitativa. Probar cada muestra sin diluir (1 :1) y en diluciones 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16. 2. Colocar 50 pL de solución fisiológica en círculos numerados del 2 al 5. No distribuir la solución fisiológica. 3. Utilizando un dispositivo de seguridad para pipetear, colocar 50 |tL de suero en el círculo 1 y 50 ¡iL de suero en el círculo 2. Mezclar la solución fisiológica y el suero aspirando y expulsando la mezcla ocho veces con la pipeta de seguridad. Evitar la for­ mación de burbujas. 4. Transferir 50 jtL del círculo 2 (1:2) al círculo 3 y mezclar. 5. Transferir 50 ¡.tL del círculo 3 (1:4) al círculo 4 y mezclar. 6. Transferir 50 |iL del círculo 4 (1:8) al círculo 5 (1:16) y mezclar. Descartar los últimos 50 JJ.L. 7. Utilizando el extremo ancho de un Dispenstir limpio, distribuir la dilución de suero hasta cubrir toda la superficie del círculo 5, la dilución más alta (1:16). Con el mismo Dispenstir, hacer lo mism o con los círculos 4 (1:8), 3 (1:4), 2 (1:2) y 1 (sin diluir). 8. Agitar con suavidad el frasco de distribución para resuspender las partículas. 9. M anteniendo el frasco y la aguja en posición vertical, descartar una o dos gotas para eliminar el aire de la aguja. A continuación, agregar exactamente 1 gota producida en forma espontánea (17 |iL) de suspensión de antígeno a cada círculo. No mezclar. 10. Colocar la tarjeta en la placa rotatoria mecánica bajo una cubierta humectante y rotar la tarjeta durante 8 minutos a 100 ± 2 rpm. 11. Sacar de inmediato la tarjeta de la placa; inclinar y rotar con suavidad la tarjeta con la mano (tres o cuatro movimientos de ida y vuelta), como ayuda para distinguir los resultados no reactivos de los de reacción mínima. Leer los resultados mientras la prue­ ba todavía está húmeda, sin utilizar aumento, usando una luz incandescente intensa. 12. Informar los resultados en términos de la mayor dilución que sea reactiva, incluidos los resultados mínimamente reactivos de la siguiente forma: DILUCIONES DE SUERO INFORME 1:2 1:4 1:8 1:16 No diluido N N N N Reactivo, sin diluir RM N Reactivo, dilución 1:4 R R N R R RM N Reactivo, dilución 1:8 R R R, Reactivo; RM, Reactividad mínima; N, No reactivo Nota: informar los resultados como reactivo o no reactivo; no informar reactividad mínima con la prueba RPR en tarjeta.

V. Resultados A. Interpretación 1. Los médicos deben combinar los resultados de esta prueba con la información clínica y epidemiológica. El valor pronóstico de una prueba RPR positiva aumenta si la muestra también es positiva en una prueba treponémica específica, como la prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-ABS). 2. Una prueba reactiva indica infección actual o pasada inadecuadamente tratadas, o una reacción falsa positiva. La reacciones fal­ sas positivas por razones técnicas pueden detectarse porque cuando se repite la prueba los resultados son negativos. Las reac­ ciones falsas positivas por razones biológicas se detectan mediante una prueba treponémica específica negativa, como la prueba FTA-ABS. 3. Una prueba negativa en ausencia de síntomas clínicos puede indicar ausencia de infección o una infección pasada tratada de forma adecuada. También puede haber reacciones negativas durante el período de incubación antes de que se manifiesten los pri­ meros síntomas. Puede haber pruebas negativas en presencia de síntomas clínicos en los primeros estadios de la sífilis primaria, como manifestación de un fenómeno de zona en la sífilis secundaria u, ocasionalmente, en la sífilis terciaria.

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Protocolos

P r o t o c o l o 2 0 -3

P r u e b a r á p id a d e r e a g in a p l a s m á t i c a

(RPR)

e n t a r je t a

(cont.)

4. Cuando se realiza una prueba RPR en pacientes con sífilis, un aumento de cuatro veces en los títulos puede indicar infección activa, reinfección o fracaso del tratamiento. Un descenso de cuatro veces en los títulos por lo general señala un tratamiento antisifilítico adecuado. 5. Todas las pruebas RPR cualitativas reactivas deben titularse hasta punto final e informarse el título de punto final. Pueden encontrarse títulos muy altos de RPR en tarjeta en pacientes con infección por el HIV. En los pacientes con linfomas pueden encontrarse títulos falsos positivos muy altos. B. Variaciones aceptables 1. Preparar una dilución 1:16 para cuantifícación adicional, utilizando 50 pL de muestra y 750 uL de solución fisiológica al 0.9%. 2. Si después de la detección sistemática parece probable que el suero por titular exceda 1:16, preparar todas las diluciones direc­ tamente en la tarjeta, utilizando suero no reactivo 1:50 como diluyente, comenzando con el círculo 6 (1:32) y continuando con el resto de la tarjeta. VI. Fuentes de error 1. Si la temperatura del suero, de los reactivos o del ambiente en el que se realiza la prueba son menores de 23 °C, la reactividad disminuye; si es m ayor de 29 °C, la reactividad aumenta. 2. Si la velocidad de la placa rotatoria es muy baja o muy alta, la mezcla inadecuada del antígeno con el suero puede dar resulta­ dos impredecibles. 3. Si la tarjeta se rota e inclina excesivamente con la mano después de sacarla de la placa rotatoria, puede haber reacciones falsas positivas. 4. Si la iluminación produce un reflejo en la tarjeta, los resultados pueden ser confusos. 5. Si el antígeno está vencido o no se ha probado su reactividad, los resultados pueden ser impredecibles. 6. Si el suero se distribuye de manera no uniforme dentro del círculo, el antígeno y el anticuerpo pueden no mezclarse adecua­ damente. 7. Si se utilizan muestras de suero o plasma hemolizadas, contaminadas o recolectadas en forma inadecuada, la reacción puede quedar enmascarada. 8. Las muestras de plasma almacenadas a - 20 °C durante más de una semana son inadecuadas para esta prueba. 9. Si no se utiliza una cubierta humectante para tapar las tarjetas mientras se someten a rotación, no se mantendrá la humedad adecuada y los componentes pueden secarse sobre la tarjeta, lo que producirá reacciones falsas positivas. VII. Limitaciones del procedimiento 1. Las pruebas RPR en tarjeta no pueden utilizarse con líquido cefalorraquídeo. 2. A veces puede encontrarse un fenómeno de prozona. En estas reacciones, hay inhibición parcial o total de la reactividad en el suero sin diluir. El fenómeno de prozona puede ser tan intenso como para que un suero que en la prueba cuantitativa es fuer­ temente positivo, produzca sólo una reacción im precisa en la prueba cualitativa. Todas las muestras que produzcan cualquier grado de rugosidad o reactividad en la prueba cualitativa deben probarse de nuevo con una prueba cuantitativa. 3. La prueba RPR en tarjeta puede ser reactiva en personas procedentes de zonas en las que el pian, la pinta o la sífilis no vené­ rea sean endémicos. Como regla general, los títulos residuales de estas enfermedades son menores de 1:8. 4. En ocasiones, se observan reacciones falsas positivas por razones biológicas, en particular en drogadictos, en personas que tie­ nen enfermedades como lupus eritematoso, mononucleosis, paludismo, lepra o neumonía viral, o en las que han sido vacuna­ das recientemente. 5. Los títulos de las pruebas no treponémicas de las personas que han sido tratadas en los estadios latentes o tardíos de la sífilis o que se han reinfectado no disminuyen con tanta rapidez como los de las personas tratadas precozmente durante la infección primaria. Algunos de estos individuos pueden hacerse "seropersistentes” y conservar su reactividad de por vida. VIII. Bibliografía Fiumara NJ. Serologic responses to treatment of 128 patients with late latent syphilis. Sex Transm Dis 1979;6:243-246. Larson SA. Hunter EF, Kraus SJ, eds. Manual o f Tests for Syphilis, 8a ed. Washington DC: American Public Health Association, 1990.

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(FTA-ABS)

I. Principio La prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-ABS) es una técnica indirecta de anticuerpos fluorescentes (véase cap. 3). El suero del paciente, que se ha diluido 1:5 en un absorbente (extracto proveniente de cultivos de Treponema phagadenis, el treponema de Reiter) se coloca en una capa sobre un portaobjetos al que se ha fijado T. pallidum subespecie pallidum. Si el suero contiene anticuerpos contra T. pallidum. éstos cubrirán los treponemas. Cuando se agrega antiglobulina humana marcada con isotiocionato de fluoresceína (FITC), se unirá a los anticuerpos del paciente que se habían fijado a las espiroquetas. La reacción fluorescen­ te se visualiza con un microscopio de fluorescencia. II. Materiales A. Equipo Estufa de incubación de 35 a 37 °C. Baño de agua regulable a 56 °C. Dispositivo de seguridad para pipetas. M icropipeteadores graduables de 10 a 200 uL. Ansa bacteriológica estándar de platino, de 2 mm, calibre 26. Papel absorbente. Soporte para portaobjetos con cámara húmeda y toallas de papel. Placas de coloración, de vidrio o plástico, con soporte para portaobjetos desmontable. Portaobjetos de 2,5 x 7,5 cm, con un extremo mate, de 1 mm de espesor, con dos círculos grabados, de 1 cm de diámetro interno. Cubreobjetos, n" I, de 2 mm2. Tubos de ensayo (12 x 75 mm) y gradillas. Recipientes para descartar el material y desinfectantes. Guantes de látex descartables, anteojos de seguridad y ropa protectora. M icroscopio de fluorescencia equipado para microscopia con fluoresceína. Agitadora; agitadora vorticial Jr. o equivalente B. Reactivos 1. Comerciales a. Antígeno de T. pallidum: una suspensión de T. pallidum (cepa Nichols) obtenida en tejido testicular de conejo y lavada con solución salina tamponada. para eliminar las globulinas de conejo. b. Suero anti-IgG humana marcado con FITC. c. Absorbente: preparado de cultivos de treponemas de Reiter no patógenos, habitualmente sin el agregado de conservantes. A menudo se venden fraccionados en cantidades de 5 mL y liofilizados, aunque también se venden en estado líquido. d. Suero control reactivo: una mezcla de muestras de suero humano obtenidas de dadores sifilíticos que son reactivos 4+. Se uti­ lizan para preparar sueros control 4+ y controles mínimamente reactivos 1+. El control 1+ muestra el grado mínimo de fluo­ rescencia informado como reactivo y se utiliza como estándar de lectura. e. Suero control inespecífico: una mezcla de sueros obtenida de individuos no sifilíticos. Sin agregado de conservantes. Este control muestra una reactividad inespecífica > 2+ en una dilución 1:5 en buffer de fosfatos (PBS) y casi no se tiñe cuando se diluye 1:5 en absorbente. f. Aceite: aceite de inmersión de baja fluorescencia, no secante, tipo A, Cargille 1248. g. Acetona: reactivo grado ACS. 2. Preparados a. PBS, pH 7,2. b. Tween 80 (polisorbato 80) al 2% en PBS. Calentar los reactivos en baño M aría a 56 °C. Agregar a 49 mL de PBS estéril 1 mL de Tween 80, medido desde el extremo de una pipeta, lavando la pipeta con la mezcla. Controlar el pH y llevarlo a 7,2 con NaOH 1 N. D esechar si se forma un precipitado o el pH cambia. c. Medio de montaje: agregar una parte de PBS a 9 partes de glicerina (reactivo proanálisis). d. Agua destilada. III. Preparación de los reactivos de la prueba A. Antígeno de T. pallidum 1. Rehidratar el antígeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los frascos ampolla abiertos, conservados a 2 a 8 °C, son estables durante una semana. 2. Para preparar los portaobjetos, mezclar completamente la suspensión del antígeno en una agitadora durante 10 segundos. Determ inar por microscopia de fondo oscuro que los treponemas estén adecuadamente dispersos antes de realizar los frotis para la prueba FTA-ABS. 3. Limpiar los portaobjetos con una gasa limpia para eliminar las panículas de polvo. Limpiar los portaobjetos por vibración sóni­ ca o frotándolos con alcohol si los treponemas no se ven con claridad después de la coloración.

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(FTA-ABS) (cont.)

4. Preparar frotis muy delgados de I pallidum dentro de cada círculo mediante un ansa de alambre de 2 mm. Colocar el antígeno contenido en un ansa dentro de dos círculos de 1 cm. Dejar secar al aire al menos durante 15 minutos. 5. Fijar los portaobjetos en acetona durante 10 minutos y secar al aire. No fijar más de 60 portaobjetos con 200 mL de acetona. Conservar los frotis fijados con acetona a - 20 °C. No descongelar y congelar nuevamente los frotis. 6. Conservar los frascos ampolla de antígeno no abiertos a 2 a 8 °C. El antígeno no abierto es estable hasta la fecha de venci­ miento. B. Titulación de la anti-IgG humana 1. Rehidratar el conjugado de acuerdo con las instrucciones. Si está turbio, centrifugarlo a 500 g durante 10 minutos. Fraccionar en alícuotas pequeñas y conservar a -2 0 °C. No congelar nuevamente el conjugado descongelado; conservarlo a 2 a 8°C. 2. Preparar diluciones 4+ y 1+ del suero reactivo de control, para determinar la dilución de trabajo del conjugado. 3. Correr el patrón control con una referencia o un conjugado conocido. Se muestra un ejemplo:

DILUCIONES DE CONJUGADO

TINCIÓN INESPECÍFICA DE CONTROL (PBS)

SUERO REACTIVO DE CONTROL (4+) (1:5 en PBS)

SUERO DE CONTROL DE LA REACCIÓN (1+)

Conjugado de referencia Dilución 1:400

O

o

CM

*

Conjugado nuevo 1 12,5 1 25 1 50 1 100 1 1 400 1 800

< 1+ -

-

4+

1+

4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+

3+ 3+ 3+ 2+ 1+ < 1+ ±

* La dilución seleccionada para el título de trabajo es 1:200, una dilución al medio por debajo del punto final 4+ (1:400), con tinción 1+ con la dilución control 1+ (1:200) y ausencia de tinción inespecífica hasta tres diluciones al doble por deba­ jo de la dilución de trabajo (1:25).

C. Adsorbente 1. Rehidratar el material liofilizado con agua destilada estéril o de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El absorbente rehidratado puede conservarse a 2 a 8 "C o a -2 0 °C. Puede utilizarse todo el tiempo que se desee mientras la reactividad obtenida sea aceptable y el producto no esté contaminado.

D. Suero problema 1. Seguir las medidas de seguridad recomendadas para la manipulación de sueros humanos. 2. Calentar el suero problema y el suero control a 56 °C durante 30 minutos, antes de realizar la prueba. 3. El día de la prueba recalentar el suero problema durante 10 minutos a 56 °C. E. Suero control 1. Rehidratar el suero de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 2. Fraccionar en alícuotas de 0,25 mL y conservar a -2 0 °C durante todo el tiempo en que la reactividad sea aceptable. 3. Preparar los siguientes controles para cada determinación: a. Suero control reactivo (R) 4+: un suero sifilítico que muestre fluorescencia 4+ en una prueba sin absorción y fluorescencia sólo levemente reducida en la prueba absorbida. Para producir suero no absorbido, agregar 50 |iL de suero control reactivo a un tubo que contenga 200 |lL de PBS y mezclar bien. Para producir suero absorbido, transferir 50 |iL del suero control reac­ tivo a un tubo con 200 |iL de absorbente y mezclar bien. b. Suero control mínimamente reactivo (MR). Es una dilución en PBS del suero control reactivo, que dé el mínimo grado de fluorescencia (1+) considerada reactiva. c. Suero control inespecífico (NS): un suero no sifilítico que muestre fluorescencia > 2+ en la prueba no absorbida. Para pro­ ducir el suero no absorbido, transferir 50 |iL del suero control inespecífico a un tubo que contenga 200 (tL de PBS y mezclar bien. Para producir el suero absorbido, transferir 50 (tL del suero control inespecífico a un tubo con 200 |iL de absorbente y mezclar bien. d. Los controles para tinción inespecífica de los conjugados consisten en un frotis de antígeno cubierto con 30 |iL de PBS en lugar de suero y un frotis de antígeno cubierto con 30 |iL de absorbente en lugar de suero.

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(FTA-ABS) (cont.)

F. Prueba FTA-ABS 1. Identificar los portaobjetos preparados antes con antígeno numerándolos en el extremo mate. 2. Numerar cada tubo y portaobjetos para que se correspondan con el suero problema y el suero control por utilizar. 3. Preparar diluciones del suero control reactivo (4+), mínimamente reactivo (1+) y control inespecífico en absorbente o PBS de acuerdo con las instrucciones. 4. Pipetear 200 (tL de absorbente en un tubo de ensayo para cada suero problema. 5. Agregar 50 ¡iL de suero problema calentado al tubo correspondiente y mezclar ocho veces. 6. Cubrir los frotis de antígeno que corresponda con 30 (iL de las diluciones suero control reactivo (4+), mínimamente reactivo (1 +) y control inespecífico. 7. Cubrir los frotis de antígeno que corresponda con 30 |tL de PBS y 30 (tl. de de absorbente para los controles a y b de tinción inespecífica. Los controles deben mostrar el siguiente patrón: PATRÓN DE CONTROL PARA LA PRUEBA FTA-ABS Control reactivo a. Dilución en PBS 1:5 b. Dilución en absorbente 1:5 Control mínimamente reactivo 1+ Dilución control Controles de suero inespecífico a. Dilución en PBS 1:5 b. Dilución en absorbente 1:5 Controles de tinción inespecífica a. Antígeno, PBS, conjugado b. Antígeno, absorbente, conjugado

R4+ R(4+ a R1 + R(2+ a N- ± N N

8. C ubrir los frotis de antígeno que correspondan con 30 (tL de las diluciones del suero problema. 9. Evitar la evaporación colocando los portaobjetos en cámara húmeda e incubar a 35 a 37 °C durante 30 minutos. 10. Al finalizar la incubación realizar los siguientes lavados: a. Colocar los portaobjetos en los soportes para tinción y lavar 5 segundos con PBS corriente. b. Colocar durante 5 minutos los portaobjetos en cubetas de coloración que contengan PBS. c. Agitar los portaobjetos sumergiéndolos y retirándolos del PBS al menos 30 veces. d. Repetir los dos pasos anteriores con PBS nuevo. e. Lavar los portaobjetos durante 5 segundos con agua destilada corriente y secar en forma suave con papel absorbente. 11. Diluir la anti-IgG humana marcada con FITC hasta su título de trabajo en PBS con 2% de Tween 80 y colocar aproximadamen­ te 30 (tL de conjugado diluido sobre cada frotis. 12. Repetir la incubación y los lavados de los portaobjetos. 13. M ontar los portaobjetos de inmediato, colocando una pequeña gota de medio de montaje y un cubreobjetos sobre cada frotis. 14. Colocar los portaobjetos en una habitación oscura y leer antes de transcurridas 4 horas. 15. Controlar los frotis por microscopia de fondo oscuro, utilizando primero la lámpara de tungsteno, para verificar la presencia de treponemas en el frotis, luego leer la fluorescencia FITC (prueba). 16. Utilizando el portaobjetos de control mínimamente reactivo (1+) como estándar de lectura, registrar la intensidad de fluorescen­ cia de los treponemas: r e g i s t r o d e l a in t e n s i d a d d e l a f l u o r e s c e n c i a

Lectura 2+ a 4+ 1 +* ± a < 1+ Atípica**

Intensidad de la fluorescencia Moderada a intensa Equivalente al control mínimamente reactivo (1+) Tinción visible pero menor de 1+ Ninguna o vagamente visible pero sin fluorescencia definida Variada: los treponemas parecen estar “apolillados” o tener “cuentas” de fluorescencia en toda su longitud

* Probar nuevamente todos los materiales que dan ¡nicialmente una intensidad 1+ de fluorescencia. ** Los patrones de fluorescencia atípicos o en cuentas se describieron en pacientes con lupus y otras enfermedades autoinmunltarias.

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(FTA-ABS) (cont.)

17. Informar los resultados de la siguiente forma: SISTEMA DE INFORME PARA LA PRUEBA FTA-ABS

Lectura inicial de la prueba 4+ 3+ 2+ 1+ 1+ 1+ <1+ N Fluorescencia en rosario

Lectura de la repetición

Informe

> 1+ 1+ < 1+

Reactivo Reactivo Reactivo Reactivo Mínimamente reactivo* No reactivo No reactivo No reactivo Fluorescencia atípica observada’

* En ausencia de signos de infección treponémica, este resultado de la prueba debe considerarse dudoso. Debe obtener­ se una segunda muestra 1 a 2 semanas después de la muestra inicial y enviarla al laboratorio para realizar pruebas sero­ lógicas. ** La fluorescencia en rosario ha sido observada en pacientes con lupus eritematoso sistémico activo o con otras enfer­ medades autoinmunitarias. El procedimiento de absorción del DNA puede solicitarse al Treponemal Pathogenesis and Immunobiology Branch, División of Sexually Transmitted Diseases, CDC, Atlanta, GA 30333. La solicitud debe enviarse a través del correspondiente State Health Department.

IV. Variaciones aceptables 1. Las lecturas de los portaobjetos puede demorarse m ás de 4 horas si los portaobjetos se protegen de la luz y se conservan a 2 a 8 °C. Para que la prueba sea válida con una lectura demorada, toda el patrón de control debe ser claramente satisfactorio cuan­ do se leen los portaobjetos. 2. El conjugado que ha sido esterilizado por filtración y contiene un conservante, como la azida sódica, para evitar la contam ina­ ción bacteriana, puede mantenerse a 2 a 8 °C. Debe eliminarse por centrifugación todo precipitado o turbidez. 3. Los portaobjetos se pueden mantener de 30 minutos a 1 hora en PBS si se interrumpe la prueba. Para que los resultados sean válidos, los portaobjetos control deben reaccionar en forma adecuada cuando se lee la prueba. 4. Pueden utilizarse portaobjetos con círculos múltiples en lugar de los de dos círculos. Agregar volúmenes de sólo 10 ¡tL a los fro­ tis de antígeno. Tener cuidado al manipular y lavar los portaobjetos, para evitar la mezcla de sueros. 5. Con micropipetas de precisión, la dilución problema 1:5 puede prepararse pipeteando 25 pL de suero en 100 jaL de diluyente. V. Fuentes de error 1. Si no se observan estrictamente los procedimientos de evaluación de los reactivos, los resultados no serán fiables. 2. Si se utilizan portaobjetos con círculos múltiples y el suero de uno de los círculos se derrama sobre otro, el suero de una perso­ na sin sífilis podrá parecer reactivo. 3. Si los portaobjetos no están limpios, la prueba puede ser difícil de leer y los resultados no serán fiables. 4. Si se utiliza una prueba FTA-ABS como procedimiento de cribado, en lugar de para confirmar los resultados reactivos de una prueba no treponémica, o como una prueba diagnóstica específica en pacientes con síntomas o signos de sífilis tardía, el valor pronóstico positivo de la prueba FTA-ABS se reduce. 5. Si el microscopio no está bien centrado y no se obtiene el patrón control, los resultados de la prueba no son válidos. 6. Si los reactivos se contaminan con bacterias, el título de anticuerpos puede disminuir y los resultados no serán válidos. 7. Si no se respetan las instrucciones de conservación de los reactivos, no se obtendrán resultados control satisfactorios. 8. Si los portaobjetos con antígeno congelados se descongelan y congelan nuevamente, los treponemas serán difíciles de visualizar y los resultados no serán satisfactorios. 9. Si un suero está contaminado con bacterias o hemolizado en exceso, los resultados de la prueba pueden no ser válidos. 10. Si los portaobjetos no se secan y conservan de acuerdo con el procedimiento o si se coloca demasiado volumen sobre el porta­ objetos, el antígeno puede desaparecer. El contenido de antígeno de un ansa es suficiente para dos círculos de 1 cm. 11. Si se fijan demasiados frotis en un volumen dado de acetona, puede aumentar la tinción de fondo. 12. Si el antígeno rehidratado no se adhiere al portaobjetos, pueden observarse muy pocos treponemas.

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(FTA-ABS) (c o n t.)

13. Si se forma un precipitado en la preparación del conjugado, puede observarse una tinción inespecífica. 14. Si no se reconoce el patrón de coloración atípico en cuentas de collar, es posible que esas muestras se informen erróneamente como reactivas. 15. Si los portaobjetos para FTA-ABS se leen en un microscopio equipado con luz incidente, los no reactivos deben observarse en campo oscuro para verificar la presencia de treponemas. VI. Limitaciones del procedimiento 1. La prueba FTA-ABS no es apta para el uso de rutina o como procedimiento de cribado. Su mayor valor reside en distinguir los resultados verdaderamente positivos de las pruebas no treponémicas de los resultados falsos positivos y para establecer el diag­ nóstico de sífilis latente o tardía. 2. Se originan problemas cuando la FTA-ABS se utiliza como procedimiento de cribado ya que cerca del 1% de la población gene­ ral da resultados falsos positivos. 3. A pesar de que los resultados falsos positivos en la prueba FTA-ABS son a menudo transitorios y la causa se desconoce, existe una asociación definida entre esos resultados y el diagnóstico de las variedades discoide, sistémico e inducido por fármacos del lupus eritematoso. 4. En los pacientes ancianos pueden darse resultados FTA-ABS reactivos inexplicables. VII. Bibliografía Larson SA, Hunter EF, Kraus SJ, eds. Manual of Tests for Syphilis, 8a ed. Washington DC: American Public Health Association, 1990.

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T é c n i c a s d e c o n c e n t r a c ió n d e h e c e s p a r a e l a is l a m ie n t o d e p a r á s it o s in t e s t in a l e s

I. Principio La cantidad de parásitos existente en muestras de heces suele ser muy escasa como para detectarla por microscopia en preparados direc­ tos en fresco o en frotis teñidos. Por lo tanto, deben emplearse procedimientos de concentración para poder detectarlos. Las dos técni­ cas utilizadas con m ayor frecuencia son la de sedimentación y la de flotación. A. Técnicas de sedimentación Las técnicas de sedimentación son las efectuadas con m ayor frecuencia en los laboratorios de diagnóstico microbiológico genera­ les porque son las más fáciles de realizar y las menos propensas a los errores técnicos. La sedimentación se basa en que la densidad de los quistes de protozoos y de los huevos de helmintos es mayor que la del agua. Su tendencia natural a sedimentar en soluciones acuosas puede ser acelerada por centrifugación a baja velocidad. Puede agregarse a la suspensión final una mezcla de formalina ace­ tato de etilo u otros conservantes para evitar el problema de la posible inflamabilidad del éter, con la finalidad de eliminar los detri­ tos fecales y fijar las formas parasitarias que pudieran estar presentes. B. Técnicas de flotación La principal ventaja de las técnicas de flotación es que los preparados microscópicos tienen un fondo más limpio. La técnica se basa en la propiedad de muchos quistes de protozoos y huevos de helmintos de flotar en la superficie de una solución de alta densidad. La utilizada con mayor frecuencia es una solución de sulfato de cinc con densidad de 1,180. Los parásitos que flotan en la superfi­ cie pueden aislarse barriendo la capa superior de la solución con un ansa. Las técnicas de flotación tienen la desventaja de que algu­ nos huevos de parásitos no flotan y en el caso de que sí lo hagan, las paredes de los huevos y los quistes a menudo se colapsan, lo que dificulta su identificación. II. Reactivos 1. Procedimiento de sedimentación Acetato de etilo Formalina amortiguada al 10% NaCl al 0,85% Yodo de D ’Antoni o de Lugol 2. Procedimiento de flotación Formalina amortiguada al 10% NaCl al 0,85% Sulfato de cinc (solución acuosa al 33%) Sulfato de cinc 330 g Agua destilada 670 mL

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T é c n i c a s d e c o n c e n t r a c i ó n d e h e c e s p a r a e l a i s l a m i e n t o d e p a r á s i t o s i n t e s t i n a l e s (co n t.)

Disolver el sulfato de cinc en agua destilada en un frasco adecuado con una agitadora magnética. Llevar la densidad a 1,20 agregando más sulfato de cinc o agua destilada, según sea necesario. Almacenar en frasco con tapón de vidrio. La duración es de 2 años. III. Procedimiento A. Técnica de sedimentación 1. Usar guantes para manipular muestras fecales. 2. En un recipiente adecuado, mezclar por completo una porción de muestra de heces de aproximadamente el tamaño de una nuez con 10 mL de solución fisiológica. Mezclar con cuidado. 3. Filtrar la emulsión a través de una gasa fina dentro de un tubo cónico de centrífuga. 4. Centrifugar con una fuerza de centrifugación relativa (FCR) de 600 g (aproximadamente 2 000 rpm) durante no menos de 10 minutos. L a suspensión debe producir alrededor de 0,75 mL de sedimento para las muestras frescas y 0,5 mL para heces formalinizadas. 5. Volcar el sobrenadante y lavar el sedimento con 10 mL de solución fisiológica. Centrifugar otra vez y repetir los lavados hasta que el sobrenadante esté límpido. 6. Después del último lavado, descartar el sobrenadante y agregar al sedimento 10 mL de formalina al 10%. M ezclar y dejar en reposo durante 5 minutos para fijar los elementos. 7. Agregar 1 a 2 mL de acetato de etilo. Tapar el tubo y agitar en forma vigorosa. 8. Centrifugar con una FCR 450 g (aproximadamente 1 500 rpm) durante 10 minutos. Se deben obtener cuatro capas: 1) una capa superior de acetato de etilo, 2) un tapón de detritos, 3) una capa de formalina y 4) sedimento. 9. Separar el tapón de detritos de las paredes del tubo, haciendo movimientos circulares con un palillo de madera. Descartar con cuidado las tres capas superiores. 10. Con una pipeta, mezclar el sedimento con la pequeña cantidad de líquido remanente y transferir una gota de la suspensión a una gota de solución fisiológica y a una de yodo colocadas sobre un portaobjetos: cubrir con un cubreobjetos y observar con el microscopio en busca de formas parasitarias. Examinar en forma sistemática toda la superficie de cada cubreobjetos con el objtivo de lOx; si no se observa nada, examinar la mitad de cada cubreobjetos con el objetivo de 40x. B. Técnica de flotación 1. Agregar una parte de heces (cantidad suficiente para producir alrededor 0.75 mL de sedimento) a 3 a 5 partes de formalina al 10%. M ezclar por completo y dejar que se fije durante 30 minutos. 2. Filtrar la suspensión bien mezclada de heces y formalina a través de una capa de gasa en un tubo de fondo redondo (100 x 26 mm). hasta una altura de 20 mm del borde. 3. Centrifugar la suspensión a una FCR de 600 g (aproximadamente 2 000 rpm) durante 3 a 5 minutos. Dejar que la centrífuga se detenga sin aplicar el freno. 4. Descartar el sobrenadante y secar la última gota sobre un trozo de papel absorbente limpio. 5. Agregar solución de Z n S 0 4 hasta una altura de 25 mm del borde del tubo. 6. Con dos varillas de madera resuspender el sedimento compactado hasta que no queden partículas grandes. 7. De inmediato, centrifugar la suspensión a una FCR de 450 g (alrededor de 1 500 rpm) durante 1.5 minutos. Nuevamente, dejar detener la centrífuga sin aplicar el freno. 8. Llevar con cuidado el tubo a una gradilla que lo mantenga derecho en posición vertical. Dejar en reposo durante 5 a 10 minutos. 9. Con un ansa de 7 mm de diámetro, doblada en ángulo recto respecto del mango, transferir el contenido de dos ansas de la pelí­ cula superficial a una gota de solución salina al 0,85% y a una gota de reactivo de yodo de D ‘Antoni o de Lugol colocadas sobre un portaobjetos, y lo suficientemente separadas entre sí como para que los líquidos no se mezclen cuando se coloquen los cubre­ objetos. M ezclar cada suspensión con un palillo de madera. 10. Colocar sobre cada preparado un cubreobjetos limpio, número 1. Examinar con el microscopio antes de transcurrida 1 hora. Examinar sistemáticamente toda la superficie de cada cubreobjetos con el objetivo lOx; si no se ve nada, examinar alrededor de la mitad de cada uno con el objetivo 40x. IV. Control de calidad 1. Controlar las soluciones cada vez que se usen para asegurarse de que están h'mpidas y no presentan contaminación bacteriana. 2. Procesar muestras positivas conocidas durante el procedimiento para verificar el aislamiento de microorganismos. Esto debe hacerse por lo menos dos veces por año. V. Resultados Informar los quistes y trofozoítos de protozoos, y los huevos o larvas de helmintos como sea adecuado. La semicuantificación de los resultados puede ser de utilidad en algunos casos. Puede ser necesario hacer un frotis con una tinción permanente para confirmar la identificación de especie de formas parasitarias vistas en preparados del sedimento u obtenidos por flotación.

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T é c n i c a s d e c o n c e n t r a c i ó n d e h e c e s p a r a e l a i s l a m i e n t o d e p a r á s i t o s i n t e s t i n a l e s (c o n t.)

VI. Notas acerca del procedimiento A. Sedimentación 1. El procedimiento de sedimentación también puede usarse para procesar muestras fijadas en alcohol polivinílico (PVA). Modificar el procedimiento llenando la mitad de un tubo con la mezcla heces-PVA y agregar NaCl al 0.85% casi hasta el borde del tubo. Luego, filtrar la mezcla a través de gasa húmeda en un tubo de centrífuga de 15 mL y seguir el resto del procedimiento estándar. 2. Si se usa acetato de etilo, enjuagar las paredes internas del tubo con un hisopo de algodón después de eliminar el tapón de detri­ tos y decantar el exceso de líquido. El exceso de acetato de etilo en el sedimento formará burbujas en el momento de preparar los frotis, que pueden ocultar las formas parasitarias que se están tratando de observar. 3. Puede haber errores de interpretación si se usa mucha cantidad, o poca, para el procedimiento de sedimentación. Debe respetar­ se la fórmula recomendada de 0,75 mL de sedimento para las muestras en fresco y de 0,5 mL para las heces en formol, como se describe en el paso 4 del procedimiento. 4. Dejar que la centrífuga alcance su velocidad máxima antes de empezar a contar el tiempo. Si el tiempo de centrifugación es demasiado corto, ciertas formas parasitarias pequeñas, como los ooquistes de las especies de Cryptosporidium, pueden no sedi­ mentar. B. Flotación 1. Las técnicas de flotación con sulfato de cinc tienen la ventaja general de que se elimina el fondo de detritos fecales, lo que pone en evidencia cualquier quiste o huevo que pueda estar presente. 2. Los preparados de flotación deben realizarse no más de 12 horas después de su preparación porque los quistes y los huevos comienzan a sedimentar de nuevo tras ese lapso. 3. Cuando se prepara el frotis, no usar el ansa como “cuchara” . Sólo debe tocarse la superficie más externa de la mezcla de flota­ ción; asegurarse de que el ansa no pasa debajo de la película de flotación. 4. Un procedimiento alternativo para preparar el frotis es agregar una pequeña cantidad de sulfato de cinc al tubo después de la cen­ trifugación final para formar un menisco ligeramente convexo. Puede colocarse suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del menisco y dejarlo sin mover durante 5 minutos. Sacar con cuidado el cubreobjetos y colocarlo sobre un portaobjetos para su examen. 5. Cuando se calibra la densidad del sulfato de cinc, hacer girar el higrómetro suavemente sin que toque las paredes del tubo. Leer el fondo del menisco y hacer la corrección correspondiente a la temperatura (agregar o restar 0.001 por cada grado por encima o por debajo de la tem peratura de calibración del higrómetro, que suele ser 20 °C). VII. Limitación del procedimiento Ciertos parásitos, como Giardia lamblia, huevos de uncinarias y huevos de Trichuris pueden no concentrase bien de muestras conser­ vadas en PVA. Los ooquistes de Isospora belli no suelen aparecer en los concentrados. Por lo tanto, se recomienda enfáticamente el examen de preparados con tinciones permanentes. Los quistes de protozoos y los huevos de helmintos con cáscaras delgadas pueden colapsarse por la exposición prolongada al medio de alta densidad de sulfato de cinc. Por lo tanto, los preparados deben hacerse lo más rápidamente posible después de que se detiene la centrífuga. Los huevos operculados pueden estallar, lo que hace que sedimenten. Por consiguiente, debe examinarse tanto la pelí­ cula superficial como el sedimento para asegurarse de no pasar por alto ninguna forma parasitaria. Tanto con la técnica de sedimentación como con la de flotación, la identificación de especie puede no ser posible en todos los casos, según la claridad de las formas observadas. Casi siempre se necesitan frotis teñidos en forma permanente para hacer la identificación final, en especial cuando se intenta confirmar un diagnóstico de quistes de Entamoeba histolytica. V. Bibliografía Bartlett MS, Harper K, Smith N, et al. Comparative evaluation o f a modified zinc sulfate flotation technique. J Clin Microbiol 1977;7:524-528. García L. Examination o f Fecal Specimens. En: Diagnostic Medical Parasitology. Washington, DC: American Society for Microbiology, 2001. Smith JW, Gutiérrez Y. Medical parasitology. En: Henry JB. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 18a ed. Filadelfia: Saunders, 1992. Young KH, Bullock SL, Melvin DM. et al. Ethyl acetate as substitute for diethyl ether in the formalin-ether sedimentation technique. J Clin M icrobiol 1979:10:852-853.

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T é c n i c a d e t in c ió n t r ic r ó m ic a p a r a f r o t is d e h e c e s

I. Principio Como el índice de refracción de los quistes de protozoos y de algunos huevos de helmintos es cercano al del agua, se necesitan técni­ cas de tinción para estudiar los detalles de sus estructuras internas. Las tinciones permanentes también aumentan la detección de Entamoeba histolytica y de Giardia lamblia, dos de los protozoos encontrados con m ayor frecuencia y más importantes. La técnica tri­ crómica de Wheatley, una modificación de la técnica original de Gomori, que utiliza cromótropo 2R y verde brillante SF como agen­ tes colorantes primarios, es la coloración usada en la mayoría de los laboratorios de parasitología clínica. Los frotis de heces frescas deben fijarse: las muestras conservadas en alcohol polivinílico (PVA) ya están fijadas y no necesitan tratamiento adicional. II. Reactivos Cromótropo 2R Verde brillante SF Ácido fosfotúngstlco Ácido acético (glacial) Agua destilada

0,6 g 0,3 g 0,7 g 1,0 mL 100 mL

Agregar 1,0 mL de ácido acético glacial a los componentes secos. Dejar reposar la mezcla durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente y luego agregar 100 mL de agua destilada. El colorante debe tener color púrpura. Si se almacena adecuadamente en fras­ cos de vidrio o de plástico a temperatura ambiente, el vencimiento es a los 2 años. Solución de alcohol yodado Etanol al 70% más yodo. Agregar a alcohol al 70% la suficiente cantidad de cristales de yodo como para hacer una solución madre oscura, concentrada. En el momento de usar, diluir la cantidad deseada de solución madre con alcohol al 70%, hasta obtener una solución de trabajo color vino de Oporto. La concentración exacta no es crítica. III. Control de calidad 1. Se recomienda que se tiñan varios frotis de material que contenga microorganismos parasitarios de propiedades tintoriales cono­ cidas, en paralelo con cada frotis problema. Si la tinción es de mala calidad, los frotis pueden ser muy gruesos o estar mal fija­ dos. o tal vez no se haya eliminado el HgCl2 residual debido a la utilización de una mezcla de alcohol yodado demasiado débil. Los frotis fijados adecuadamente producen un citoplasma de color verde azulado en los trofozoítos, con un leve tono violáceo. Los núcleos y las inclusiones son rojos, con tonos violáceos. Los preparados turbios pueden ser el resultado de una deshidratación incompleta, por no haber reemplazado las soluciones de alcoholes, que pueden haberse contaminado con agua. La calidad de la tinción puede mejorarse escurriendo los portaobjetos entre los cambios de un reactivo a otro. IV. Procedimiento 1. Usar guantes cuando se manipulan muestras de heces. 2. Preparar dos frotis sobre portaobjetos de una pequeña porción de la muestra fresca de heces, usando palillos o un pincel. 3. Sumergir de inmediato los frotis en la solución fijadora de Schaudinn y dejar fijar durante por lo menos 30 minutos. Es preferi­ ble la fijación hasta el día siguiente. 4. Si la muestra es líquida, mezclar varias gotas de heces con tres o cuatro gotas de PVA sobre un portaobjetos y dejar secar varias horas en estufa de incubación a 37 °C. 5. Si la muestra se encuentra en PVA, colocar una porción de la mezcla sobre un trozo de papel absorbente para elim inar el PVA. Preparar frotis del material que queda en el papel como se describió antes. V. Procedimiento de tinción 1. Después de fijar y secar adecuadamente los frotis, colocar los portaobjetos en alcohol etílico al 70% durante 3 minutos. 2. Colocar en solución de alcohol yodado de trabajo durante 2 a 5 minutos. 3. Lavar con dos cambios de alcohol etílico al 70%. uno de 5 minutos y el otro de 2 a 5 minutos. 4. Colocar en la solución colorante tricrómica durante 10 minutos. 5. Colocar en alcohol etílico al 90% acidificado durante 5 segundos. 6. Sumergir y sacar los portaobjetos varias veces en alcohol etílico al 100%. 7. Hacer dos cambios de alcohol etílico al 100%. 8. Eliminar el alcohol con dos cambios de xileno o tolueno, de 2 a 5 minutos cada uno. 9. Colocar medio de montaje y cubrir con un cubreobjetos número 1. Dejar secar toda la noche. 10. Examinar con objetivo de inmersión en aceite en busca de formas parasitarias.

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T é c n i c a d e t i n c i ó n t r i c r ó m i c a p a r a f r o t i s d e h e c e s (c o n t . )

VI.

Resultados El citoplasma de los quistes y trofozoítos bien fijados y teñidos es azul verdoso, con manchas púrpura. La cromatina nuclear, los cuerpos cromatoides y los eritrocitos fagocitados aparecen rojos o rojo púrpura. El fondo es verde. VII. Notas acerca del procedimiento 1. Si las muestras no están fijadas de manera adecuada. los protozoos pueden verse de un color rojo sucio. 2. La eliminación incompleta del cloruro mercúrico (fijador de Schaudinn) puede producir el depósito de gránulos muy refringentes que pueden interferir en la detección de formas parasitarias. Hay que asegurarse de cambiar la solución de alcohol etílico al 70%-yodo a intervalos regulares para que esto 110 suceda. 3. Los frotis que tienen demasiado color verde pueden indicar una eliminación inadecuada del yodo por el alcohol al 70%. La pro­ longación del tiempo de los lavados con etanol al 70% y el cambio frecuente de la solución reducirá este problema. VIII. Bibliografía García L. Examination of Fecal Specimens. En: Diagnostic Medical Parasitology. Washington, DC: American Society for Microbiology, 2001:759-764. Gomori G. A rapid one-step trichrome stain. Am J Clin Pathol 1950:20:661-663. Wheatley W. A rapid staining procedure for intestinal amoebae and flagellates. Am J Clin Pathol 1951;21:990-991.

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P r e p a r a c ió n d e f r o t is d e s a n g r e d e g o t a f in a y d e g o t a g r u e s a

Preparación de una película delgada de sangre (gota fina) I. Principio El frotis de sangre de gota fina, preparado en forma similar a la que se usa para hacer fórmulas leucocitarias, permite la evaluación ópti­ ma de la morfología de cualquier forma parasitaria que pueda haber. II. Muestra El frotis de sangre puede prepararse de sangre fresca obtenida por punción digital o de una muestra con EDTA como anticoagulante obtenida por punción venosa. III. Materiales A. Equipo: ninguno. B. Insumos 1. Portaobjetos de 25 x 75 mm, lavados con alcohol. 2. Marcador para vidrio. 3. Elementos para extracción de sangre. C. Reactivos 1. Metanol absoluto para la coloración de Giemsa. IV. Control de calidad A. A simple vista, el frotis debe tener un aspecto uniforme, sin ondulaciones, suciedad ni rayas, con adelgazamiento gradual hasta for­ mar un extremo redondeado, esfumado. V. Procedimiento: frotis de gota fina 1. Sangre de punción digital: Punzar la piel del costado del dedo con una lanceta afilada y eliminar con cuidado por absorción la primera gota de sangre. A continuación, tocar con un portaobjetos limpio la siguiente gota de sangre, aproximadamente a 1 cm de uno de sus extremos. Invertir el portaobjetos para que la sangre quede hacia arriba y colocar sobre una superficie horizontal. 2. Muestra obtenida por punción venosa: Colocar un portaobjetos limpio sobre una superficie horizontal. Colocar con la punta de la aguja una pequeña gota de sangre sobre la superficie del portaobjetos, aproximadamente a 1 cm de uno de los extremos. 3. Con otro portaobjetos, colocado en un ángulo de 40° con respecto al portaobjetos donde está la gota de sangre, tocar la gota, espe­ rar un momento hasta que la sangre se extienda hasta ambos bordes del portaobjetos superior y luego hacerlo avanzar con un movimiento continuo y rápido hasta el borde opuesto del portaobjetos inferior. El resultado es una película delgada, en forma de pluma, que se hace progresivamente más delgada.

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P r o t o c o l o 22-3

P r e p a r a c i ó n d e f r o t i s d e s a n g r e d e g o t a f i n a y d e g o t a g r u e s a (co n t.)

4. Rotular el frotis y dejarlo secar al aire alrededor de 10 minutos. 5. Teñir el frotis con Giemsa o con W right. Si se usa la coloración de Giemsa, primero debe fijarse el frotis con alcohol absoluto. 6. Notas acerca del procedimiento a. Usar un lápiz de diamante para rotular el frotis. b. Asegurarse de que los frotis están protegidos del polvo durante el secado. 7. Limitaciones del procedimiento a. Las formas parasitarias pueden pasarse por alto en las infecciones leves. En esos casos, debe examinarse una gota gruesa. b. Los frotis de sangre con anticoagulante deben prepararse antes de transcurrida una hora de la punción venosa. La morfología de las formas parasitarias y de los eritrocitos comienza a hacerse atípica después de ese lapso, por la acción directa del anti­ coagulante. Preparación de la gota gruesa I. Principio La gota gruesa representa una muestra de sangre relativamente grande, que proporciona más oportunidades de aislar formas parasita­ rias en las infecciones leves. Los eritrocitos se lisan, lo que facilita la detección de formas parasitarias al hacer más transparente el fondo del preparado. II. Muestra El frotis de sangre puede prepararse de sangre fresca obtenida por punción digital o de una muestra con EDTA como anticoagulante obtenida por punción venosa. Pueden usarse muestras de sangre anticoaguladas con heparina o citrato de sodio si se sospecha la pre­ sencia de tripomastigotas o de microfilarias. III. Materiales A. Equipo: ninguno. B. Insumos 1. Portaobjetos de 25 x 75 mm, lavados con alcohol. 2. M arcador para vidrio. 3. Elementos para extracción de sangre. 4. Diario. 5. Palillos de madera. C. Reactivos 1. Alcohol metílico absoluto para la tinción de Giemsa. IV. Control de calidad A. A simple vista, la gota gruesa debe tener el aspecto de una mancha redonda u ovalada de alrededor de 2 cm de diámetro. Debe tener el espesor suficiente como para que el texto del diario sea apenas visible a través de la gota, en estado líquido o ya seca. B. La distribución de la sangre debe ser pareja, sin crestas, suciedad ni rayas. V. Procedimiento 1. Sangre de punción digital: Punzar la piel del costado del dedo con una lanceta afilada y eliminar con cuidado por absorción la primera gota de sangre. A continuación, tocar con la parte m edia de un portaobjetos limpio una gota grande de sangre. Sin dejar de hacer contacto con la sangre, hacer girar el portaobjetos sobre el dedo para formar un círculo de un tamaño aproximado al de una moneda de 5 centa­ vos de dólar. Retirar el portaobjetos y colocarlo sobre una superficie horizontal. El espesor debe ser el suficiente como para que el texto del diario sea apenas visible a través del portaobjetos. Si es demasiado grueso, distribuirlo en un círculo más grande con un palillo de madera hasta obtener el espesor correcto. Si es demasiado delgado, debe prepararse otro portaobjetos. 2. Muestra de punción venosa: Poner un portaobjetos limpio sobre una superficie horizontal. Colocar con la punta de la aguja una gota grande de sangre sobre el portaobjetos. 3. Distribuir la sangre con la punta de un palillo de madera formando un círculo de un tamaño aproximado al de una moneda de 5 centavos de dólar, hasta lograr un espesor a través del cual sea apenas visible el texto de un diario. 4. Rotular el frotis y dejarlo secar al aire durante varias horas o durante toda la noche. 5. Teñir el frotis con Giemsa o Wright. Si se usa la tinción de Giemsa, no deben pasar más de 3 días de la preparación de la gota gruesa; si se usa W right, lisar los eritrocitos por inmersión del preparado en agua amortiguada (pH 7,2) durante 10 minutos. Luego colocar el portaobjetos en posición vertical para dejarlo secar por goteo. No fijar la gota gruesa. 6. Notas acerca del procedimiento: a. Usar un lápiz de diamante para rotular el frotis. b. Asegurarse de que los frotis estén protegidos del polvo durante el secado.

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P rotocolo 22-3

P r e p a r a c i ó n d e f r o t i s d e s a n g r e d e g o t a f i n a y d e g o t a g r u e s a (c o n t.)

7. Limitaciones del procedimiento a. La identificación de parásitos del paludismo puede ser difícil o imposible, incluso por observadores experimentados. b. Siempre debe examinarse un frotis de gota fina si se requiere una identificación definitiva basada en la morfología. c. Los frotis de sangre anticoagulada deben prepararse antes de transcurrida una hora de la punción venosa. La morfología de las formas parasitarias y de los eritrocitos comienza a hacerse atípica después de ese lapso, por la acción directa del anticoa­ gulante. VI. Bibliografía García L. Examination o f Fecal Specimens. En: Diagnostic Medical Parasitology. Washington, DC: American Society for Microbiology, 2001:759-764. García L. Parasitology. En: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedure Handbook. Washington. DC: American Society for Microbiology, 1992.

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C a l ib r a c ió n d e l o c u l a r m ic r o m é t r ic o

I. Principio Los oculares micrométricos están grabados con una escala fija, que habitualmente consta de 50 líneas paralelas. Según el aumento del juego de objetivos utilizados en un microscopio compuesto, cada división del micrómetro representa medidas diferentes. Por lo tanto, para cada juego de oculares y objetivos que se utilice, la escala del ocular se debe calibrar utilizando un micrómetro de platina graba­ do con una escala (las divisiones habituales son de 0,1 mm). Es importante recordar que la calibración de un juego determinado de ocu­ lares y objetivos no puede utilizarse con los componentes correspondientes de otro microscopio. II. Muestra: no corresponde. III. Materiales A. Equipo 1. M icroscopio binocular con objetivos lOx, 40x y lOOx. Pueden usarse objetivos con otros aumentos si es necesario. 2. Los oculares deben ser lOx. Puede usarse un solo ocular para calibrar todos los microscopios del laboratorio. B. Insumos 1. Ocular micrométrico con escala lineal con divisiones cada 50 U. Se consiguen en varias empresas. 2. M icrómetro de platina con divisiones de 0,1 y 0,01 mm. 3. Aceite de inmersión. 4. Papel para limpiar lentes. C. Reactivos: no corresponde. IV. Control de calidad 1. Todos los microscopios usados para exámenes parasitológicos deben calibrarse nuevamente una vez por año. como mínimo. 2. El diámetro de los eritrocitos puede usarse para controlar las calibraciones con diferentes aumentos. 3. Pueden usarse partículas de látex o de poliestireno de diámetro estandarizado para controlar los cálculos y las mediciones. Se recomiendan las partículas de diámetros de 10 y 90 pm. Se consiguen en varias compañías de elementos de laboratorio. V. Procedimiento 1. Retirar el ocular del microscopio que se va a utilizar. Si se usa un microscopio binocular, lo habitual es retirar el ocular lOx derecho. 2. Desenroscar la lente más próxima al ojo (lente superior) del ocular e insertar el micrómetro de tal forma que descanse sobre el diafragma que se encuentra en el interior del ocular. Colocar el micrómetro con el lado grabado hacia abajo. El micrómetro se manipula con papel para lentes a fin de evitar que se adhiera suciedad a su superficie. 3. Colocar otra vez el ocular en su sitio. Cuando se mira a través del ocular, la escala micrométrica aparece como una serie de divi­ siones limitadas por líneas, como se muestra en A.

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P rotocolo 2 2 -4

C a l i b r a c i ó n d e l o c u l a r m i c r o m é t r i c o (c o n t.)

4. Colocar el micrómetro de platina bajo el objetivo del microscopio por calibrar. Enfocar la escala micrométrica de platina, que aparece como una serie de líneas separadas por espacios de 0,1 y 0,01 mm, como se muestra en la imagen microscópica simu­ lada en B. 5. Regular el micrómetro de la platina de tal manera que la línea del 0 del ocular micrométrico coincida exactamente con la línea del 0,0 de la escala micrométrica de la platina. Cuando se observa con gran aumento (450x), la superposición de ambas escalas aparece como se muestra en la imagen microscópica simulada en C. 6. Sin realizar más maniobras, mirar a lo largo de ambas escalas para encontrar el primer par de líneas que coincidan exactamen­ te. En D (una imagen simulada con gran aumento, 450x), las líneas coincidentes se encuentran en la marca 40 de la escala ocu­ lar y en la marca de 0,09 mm de la escala micrométrica de platina (flecha). 7. El objeto de la calibración es determinar el ancho en micrones de cada división de la escala ocular, cuando se calibra en com ­ paración con la escala micrométrica de platina. Hacer la calibración como sigue: a. Como se ilustra en D, 40 unidades de la escala ocular equivalen a 0,09 mm de la escala micrométrica de platina. b. Por lo tanto, cada división ocular equivale a 0,09 mm/40 o sea 0,00225 mm. Debido a que cada milímetro son 1 000 pm, cada división del micrómetro ocular, para la calibración ilustrada en D , es igual a 0,00225 x 1 000 o sea, 2,25 pm.

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P rotocolo 22-4 P r o t o c o l o 2 2 - 4 C a l i b r a c i ó n d e l o c u l a r m i c r o m é t r i c o (c o n t . )

VI.

Resultados Así. de acuerdo con el procedimiento descrito, si un objeto observado con el microscopio ocupa 10 divisiones de la escala ocular, su medida será 2.25 x 10 o sea 22,5 |jm. Este mismo cálculo se puede utilizar para otros aumentos. Una vez medido el número de lí­ neas de ocular correspondientes al ancho y largo del microorganismo, según la lente del objetivo que se use, puede aplicarse el fac­ tor de multiplicación en micrones del ocular al número de líneas del ocular que abarca el ancho y la longitud del microorganismo que se está observando. Pueden compararse estas mediciones con los resultados publicados en los libros de texto para hacer una iden­ tificación final. VII. Notas acerca del procedimiento 1. Como regla general, el factor del objetivo seco de gran aumento (40x) debe ser aproximadamente 2,5 veces el factor obtenido con el objetivo de inmersión (lOOx). En forma similar, el factor del objetivo de bajo aumento (lOx) debe ser de alrededor de 10 veces el del objetivo de inmersión en aceite. 2. Los factores de multiplicación de cada objetivo deben consignarse en un cartel fijado a la base de cada microscopio que se use para exámenes parasitológicos. VIII. Bibliografía García L. Examination of Fecal Specimens. En: Diagnostic Medical Parasitology. Washington. DC: American Society for Microbiology. 2001:759-764. García L. Parasitology. En: Isenberg HD, ed. Clinical Microbiology Procedure Handbook. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1992.

P rotocolo 22-5 P r e p a r a d o s c o n c in t a a d h e s iv a d e c e l u l o s a p a r a e x a m e n d e o x iu r o s

I. Principio Los huevos eliminados por las hembras adultas de Enterobius vermicularis se depositan en la piel perianal durante los períodos de migración extraintestinal. Estos huevos se adhieren a la superficie engomada de la cinta adhesiva. Cuando se pega la cinta a un porta­ objetos de vidrio, el preparado puede examinarse con el microscopio. II. Muestra La m uestra se obtiene de la piel perianal. La muestra óptima es la que se obtiene a la m añana temprano, antes de bañarse o de ir al baño. Deben obtenerse hasta 6 muestras matutinas en días sucesivos antes de considerar que el resultado es negativo. III. Materiales A. Equipo 1. M icroscopio binocular con objetivos lOx, 40x y lOOx. Pueden usarse otros aumentos según sea necesario. 2. Los oculares deben ser lOx. Puede usarse un solo ocular para calibrar todos los microscopios del laboratorio. B. Insumos 1. Cinta adhesiva de celulosa. 2. Bajalenguas. 3. Portaobjetos de vidrio de 25 x 75 mm. C. Reactivos 1. Xileno o similar. IV. Control de calidad 1. Todos los microscopios usados para parasitología deben calibrarse una vez por año como mínimo. 2. Puede ser de utilidad disponer de un libro de texto o atlas con microfotografías o ilustraciones de huevos de E. vermicularis. para confirmar los resultados. V. Procedimiento 1. H acer el preparado pegando un trozo de cinta adhesiva con la goma hacia abajo sobre un portaobjetos, aproximadamente a 1,5 cm de uno de los extremos. Plegar la cinta alrededor del borde y a todo lo largo del extremo opuesto y cortarla a nivel del extremo opuesto. Pegar un trozo de papel bajo este último extremo para que sirva como asa para despegar la cinta.

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P r o t o c o l o 2 2 -5

P r e p a r a d o s c o n c i n t a a d h e s i v a d e c e l u l o s a p a r a e x a m e n d e o x i u r o s (c o n t.)

2. Para obtener la muestra de la piel perianal. tomar el trozo de papel y despegar la cinta del portaobjetos. Colocar el portaobje­ tos sobre un bajalenguas de tal forma que la cinta quede enrollada alrededor del extremo del bajalenguas con la superficie engomada hacia arriba en una extensión de alrededor de 2,5 cm. El bajalenguas se usa a continuación como soporte para pre­ sionar el lado engomado de la cinta en varias zonas de la piel perianal. 3. Una vez obtenida la muestra, pegar la cinta con el lado engomado hacia abajo sobre el portaobjetos. Etiquetar el portaobjetos con el nombre del paciente y la fecha de obtención. 4. Examinr el portaobjetos con el objetivo de bajo aumento (lOx) del microscopio. Los huevos pueden hacerse más visibles des­ pegando la cinta del portaobjetos, agregando una gota de xileno o tolueno y pegando nuevamente la cinta. VI. Resultados Los huevos de E. vermicularis miden alrededor de 50-60 (jm x 20-30 pm y tienen una cáscara lisa, bastante gruesa y una forma ova­ lada aplanada en un lado, muy parecida a una pelota de rugby parcialmente inflada y aplastada. A veces se ven gusanos adultos en los preparados de cinta adhesiva. Los adultos miden alrededor de 1 cm de largo, tienen cola puntiaguda y dos alas transparentes a los lados del extremo anterior. VII. Notas acerca del procedimiento 1. La persona que obtiene las muestras debe tomar precauciones, ya que los huevos son infecciosos si se ingieren. Pueden usar­ se guantes o lavarse con cuidado las manos después del procedimiento. En el comercio existe una paleta con una cubierta adhe­ siva engomada (BD Falcon®, Swube®, Pinworm Paddle. BD Diagnostic Dystems, Sparks, MD) que representa un dispositivo de obtención de muestras menos engorroso y más seguro. 2. Si se usó cinta opaca por error, el agregado de aceite de inmersión a la superficie facilitará el examen microscópico. VIII. Limitaciones del procedimiento 1. Las hembras de E. vermicularis depositan huevos en forma irregular. Por lo tanto, deben obtenerse varias muestras en días diferentes antes de descartar la infección. IX. Bibliografía García L. Examination of Fecal Specimens. En: Diagnostic Medical Parasitology. Washington, DC: American Society for Microbiology, 2001:759-764. García L. Parasitology. En: Isenberg HD. ed. Clinical M icrobiology Procedure Handbook. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1992.

P r o t o c o l o 2 3-1

P r u e b a d e h e m a d s o r c ió n

I. Principio La prueba de hemadsorción es el método más sencillo para detectar la presencia de ortomixovirus o paramixovirus. La identificación del aislamiento también puede llevarse a cabo por inhibición de la hemadsorción, aunque la inhibición de la hemaglutinación (IHA) es menos engorrosa y más barata. Entre los virus que producen aglutinación de eritrocitos, los ortomixovirus y los paramixovirus maduran en la membrana plasmática de las células infectadas. A medida que “brotan” de la membrana plasmática, insertan en la membrana hemaglutininas codificadas por ellos. La presencia de células infectadas en una monocapa puede detectarse por la adherencia de los eritrocitos a la monocapa. Como algunos virus simianos que pueden estar presentes en tejidos de mono también producen hemaglutininas, es importante incluir como controles monocapas sin infectar. II. Materiales y reactivos A. Cultivos primarios de células de riñon de mono, infectados y control. B. Suspensión de eritrocitos frescos de cobayo, lavados, al 0,4% en medio sin suero. III. Control de calidad A. Control positivo (virus hemaglutinante). B. Control negativo (monocapa no infectada). IV. Procedimiento 1. Agregar 0,2 mL de eritrocitos de cobayo por cada 1 mL de medio. 2. Incubar en gradilla inclinada durante 1 hora a 4 °C. 3. Observar con el microscopio en busca de aglutinación en la fase líquida y de adherencia de los eritrocitos a la monocapa. 4. Incubar los cultivos 1 hora a más a 20 °C. 5. Observar nuevamente en busca de aglutinación y adherencia.

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P r o t o c o l o 23 -1

P r u e b a d e h e m a d s o r c i ó n ( c o n t.)

V. Resultados A. Interpretación Aglutinación de los eritrocitos en la fase líquida o adherencia de los eritrocitos a la monocapa. Si hay hemadsorción en el control negativo, la prueba no es válida. La elución de los eritrocitos a 20 °C sugiere la presencia de virus de parainfluenza 1 a 3. VI. Bibliografía Smith TF. Viruses. En: Washington JA, ed. Laboratory Procedures in Clinical Microbiology, 2a ed. Nueva York: Springer-Verlag, 1985.

P r o t o c o l o A-1

F ó r m u l a s d e c o n s e r v a n t e s d e h e c e s u s a d o s h a b it u a l m e n t e

I. Tim erosal-yodo-formalina (MIF) A. Solución I Tintura de timerosal, 1:1 000, 40 mL Formaldehído, solución acuosa al 10% (USP), 5 mL Glicerol, 1 tnL Agua destilada, 50 mL B. Solución II Cristales de yoduro de potasio (Kl), 10 g. Cristales de yodo (agregar después de que se disuelve el Kl), 5 g. Agua destilada, 100 mL. La fecha de vencimiento de ambas soluciones es de muchos meses si se almacenan a temperatura ambiente en frascos color cara­ melo. Combinar en un frasco pequeño 9,4 mL de la solución I con 0,6 mL de la solución II inmediatamente antes de usar. Agregar el equivalente de alrededor de un cuarto de cucharadita de heces recién emitidas y mezclar bien con una varilla de madera. Dejar que la suspensión sedimente durante 24 horas; luego, extraer con una pipeta una fracción de la capa media de color naranja pálido y de la capa inferior, de color más intenso, para preparar frotis. II. LV-PVA A. Fórmula Alcohol polivinílico. 10 g. Alcohol etílico al 95%, 62,5 mL. Cloruro mercúrico, solución acuosa saturada, 125 mL. Glicerina, 3 mL. Los componentes líquidos se mezclan en un vaso de precipitado de 500 mL y se agrega el alcohol polivinílico (PVA) en polvo, sin mezclar. Cubrir el vaso con papel o película transparente y dejar humedecer el PVA durante la noche. Calentar con suavidad la mezcla a 75 °C y agitar con delicadeza durante 30 segundos hasta que se obtiene una suspensión algo lechosa. III. Acetato de sodio-ácido acético-formalina (SAF) A. Fórmula Formaldehído (solución al 37-40%), 0,6 mL. Acido acético glacial, 0,3 mL. Acetato de sodio, 225 mg. Agua destilada, 13,88 mL. Disolver el acetato de sodio en el agua destilada, agregar lentamente el ácido acético glacial y la solución de formalina, mezclar y guardar. La fecha de vencimiento es de varios meses. IV. Fijador de Schaudinn (cloruro mercúrico en alcohol etílico y ácido acético glacial) A. Fórmula Cloruro mercúrico, solución acuosa saturada (Hg C l2). 110 g Agua destilada, 1 000 mL Colocar en una probeta dentro de un baño de agua de modo que hierva hasta que el cloruro mercúrico se disuelva; luego dejar reposar varias horas hasta que se formen cristales. V. Fijador de Schaudinn (solución concentrada) Cloruro mercúrico, solución acuosa saturada, 600 mL. Alcohol etílico al 95%, 300 mL. Agregar 5 mL de ácido acético glacial por cada 100 mL de solución madre inmediatamente antes de usar.

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E v a l u a c ió n

por t in c ió n d e

G ram

d e fro tis d e esputo

La calidad de las muestras de esputo se puede evaluar mediante recuento del número relativo de células epi­ teliales pavimentosas y neutrófilos segmentados por campo de bajo aumento en un frotis con tinción de Gram. La presencia de células epiteliales pavimentosas indica contaminación con secreciones orofaríngeas. Por el contrario, la neumonía bacteriana produce grandes cantidades de neutrófilos segmentados que pue­ den detectarse en las muestras de esputo. Las siguientes son microfotografías de frotis de muestras de espu­ to con tinción de Gram que ilustran la presencia relativa de varios componentes celulares. A. Vista de un campo de bajo aumento de un frotis de esputo con tinción de Gram que revela la presencia de un campo cubierto de células epiteliales pavimentosas y la ausencia de neutrófilos segmentados. Esta mues­ tra representa saliva, daría una calificación de baja calidad y no es aceptable para el cultivo. B.

La célula epitelial pavimentosa que se muestra aquí se encuentra altamente colonizada por bacterias grampositivas. El sobrecrecimiento de bacterias en las muestras de esputo suele indicar una demora en el envío de la muestra al laboratorio y que cualquier resultado semicuantitativo será de escaso valor.

C. Este frotis de esputo coloreado con tinción de Gram muestra una mezcla de células epiteliales pavimento­ sas y neutrófilos segmentados. La presencia de neutrófilos segmentados indica que existe un foco infeccio­ so en algún lugar de las vías respiratorias; sin embargo, la presencia de células epiteliales pavimentosas indi­ ca contaminación con las secreciones de las vías respiratorias altas. Este tipo frotis de esputo es difícil de interpretar porque las infecciones respiratorias altas no pueden distinguirse de las infecciones de las vías res­ piratorias bajas. D. Campo cubierto de neutrófilos y ausencia virtual de células epiteliales pavimentosas. Esta es una muestra

de esputo de alta calidad, con buena probabilidad de producir resultados significativos. E. Vista de un campo con gran aumento de la muestra en D, que revela neutrófilos segmentados dispersos con­ tra un fondo de hebras de moco teñido de rosado. F.

Frotis de una muestra de esputo inducido teñido con Diff-Quik, que muestra varias células epiteliales cilin­ dricas ciliadas. Estas células tienen su origen en las vías respiratorias bajas y cuando están presentes en un frotis de esputo, como aparece aquí, indican una muestra de alta calidad a partir de la cual se pueden obte­ ner resultados valiosos.

G. Vista con campo de gran aumento de una muestra de esputo con tinción de Gram que ilustra la morfología de una célula epitelial cilindrica ciliada. Nótense los cilios claros en la parte superior del extremo terminal brillante de esta célula epitelial cilindrica eosinófila teñida. H. Tinción con azul de toluidina de una muestra de esputo inducido que muestra la presencia de células infla­

matorias mononucleares compatibles con macrófagos alveolares. Como las células epiteliales cilindricas, los macrófagos alveolares tienen su origen en lo profundo de las vías respiratorias bajas, y su presencia en las muestras de esputo incrementa la importancia de cualquier especie bacteriana que se aísle.

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Dado que muchos de los m icroorganism os de im portancia médica tienen índices de refracción cercanos al del agua, las tinciones son necesarias para hacer posible su detección y estudio. A lo largo del tiempo, se han creado diversas tinciones, cada una diseñada para destacar orgánulos internos o com ponentes específi­ cos de la pared celular. Las siguientes son ilustraciones de tinciones seleccionadas y algunas de sus aplica­ ciones. A. Tinción de Gram. La más com ún de las tinciones utilizadas en el laboratorio de m icrobiología está diseña­ da para diferenciar entre las bacterias que pueden retener el colorante violeta de genciana (cristal violeta) y aparecer de color azul intenso-negro luego de la decoloración (bacterias grampositivas) y aquellas que no lo pueden retener y se colorean de rojo (bacterias gramnegativas). Se ilustra una preparación coloreada con la tinción de Gram que m uestra bacilos gramnegativos teñidos de rojo. B.

Tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes. Esta tinción se utiliza para observar una variedad de micro­ organism os ácido-alcohol resistentes, com o las especies de Nocardia en m uestras de esputo y los ovocitos de Cryptosporidium en m uestras fecales. A quí se observan cúmulos de bacilos ácido-alcohol resistentes teñidos de rojo en una muestra de una biopsia hepática de un paciente con SIDA. Los m icroorganism os se tiñen de rojo con la coloración para bacilos ácido-alcohol resistentes; los que aquí se m uestran fueron iden­ tificados com o pertenecientes al com plejo Mycobacterium avium-intracellulare.

C. Fluorescencia directa. Los colorantes fluorescentes (rodam ina y auramina) reaccionan directam ente con la pared celular de las m icobacterias. También se dispone de anticuerpos conjugados con fluoresceína para detectar una variedad de agentes microbianos usando la prueba directa con anticuerpos fluorescentes. Aquí se muestran micobacterias con fluorescencia am arillo verdosa en un esputo concentrado de un paciente con tuberculosis pulmonar. D. Naranja de acridina. Esta tinción fluorescente rápida se usa para observar formas bacterianas en frotis direc­ tos y preparados con líquidos biológicos. Se utiliza sobre todo para la detección de bacterias gramnegativas en los hem ocultivos positivos, los cuales pueden perderse con la tinción de Gram por la intensa tinción roja de los detritos del fondo. Aquí se m uestra una bacteria larga en form a de bastón con un característico res­ plandor naranja, cuando se observa con un microscopio de fluorescencia. E . Azul de metileno. Esta tinción rápida e inespecífica se utiliza para m ostrar la presencia de bacterias y otros microorganism os en frotis directos. A quí se m uestran bacilos que han tom ado la tinción azul. U na impor­ tante aplicación es la detección de bacterias en frotis directos de líquido cefalorraquídeo en casos de sospe­ cha de m eningitis aguda, sobre todo de especies gramnegativas, que pueden ser oscurecidas por la tinción roja que tom a el m aterial proteico del fondo. E

Blanco de calcoflúor. Este agente blanqueador autofluorescente tiene la propiedad de acoplarse con la parte de hidratos de carbono de la pared celular de los hongos. Aquí se muestran hifas de color amarillo verde bri­ llante en un preparado teñido con blanco de calcoflúor observado con un m icroscopio de fluorescencia.

G.

Wright-Giemsa. Esta coloración suele utilizarse para observar los elem entos celulares en frotis de sangre peri­ férica y de médula ósea. En microbiología, esta tinción se utiliza con mayor frecuencia para la detección de parásitos intraeritrocíticos (plasmodio, babesia) y exoeritrocíticos (tripanosoma, microfilaria), inclusiones de clamidias y, como se muestra aquí, las formas intracelulares de la levadura Histoplasma capsulatum.

H . Acido peryódico de Schiff (PAS). Esta tinción general se utiliza para m ostrar las paredes celulares ricas en polisacáridos. Tiene aplicaciones específicas en la detección de hongos en cortes de tejidos y frotis. A quí se reconoce el cuerpo de fructificación de las especies Aspergillus en el m aterial aspirado de una bola fúngica pulm onar (aspergiloma), rodeada de las esporas de Aspergillus teñidas de rojo.

LÁMINAS EN COLOR 1-3

I d e n t i f ic a c i ó n p r e s u n t i v a d e b a c t e r i a s b a s a d a e n l a o b s e r v a c ió n d e l a m o r f o l o g ía c e l u l a r e n p r e p a r a c io n e s d e f r o t is t e ñ i d o s

La coloración de bacterias con tinción de Gram, sumada a otras técnicas de tinción, es una de las determ i­ naciones m ás im portantes en la identificación presuntiva de m icroorganism os. La m orfología de las bacte­ rias, su organización y sus características de tinción suelen ser suficientem ente distintivas para perm itir una identificación presuntiva en un frotis teñido con Gram. En esta lám ina se incluyen las características m icros­ cópicas indicativas de varios grupos de bacterias. A. Bacilos gramnegativos relativam ente delgados organizados en un patrón de letras chinas, que sugiere una de las bacterias corineform es (difteroides). B.

Bacilos form adores de esporas gram positivos. Los formadores de esporas aerobios pertenecen al género

Bacillus; los form adores de esporas anaerobios pertenecen al género Clostridium. Las que aquí se ilustran son bacterias form adoras de esporas de Bacillus sphaericus. C . Tinción de G ram directa de un exudado purulento que m uestra cocos grampositivos organizados en peque­ ños grupos o cúmulos, característicos de las especies de Staphylococcus. D. Frotis directo de un exudado necrótico obtenido proveniente de un paciente con mionecrosis. Los dim inu­ tos cocos gram positivos que se observan en esta m icrofotografía son estreptococos. E . Tinción de Gram directa de un frotis de esputo purulento en el que se observan diplococos grampositivos, característicos de Streptococcus pneumoniae. F.

Exudados purulentos obtenidos de la pared torácica de un paciente con em piem a supurativo agudo. Contra el fondo de neutrófilos segmentados se encuentran num erosos bacilos ram ificados grampositivos. Las espe­ cies de Actinomyces y las especies de Nocardia pueden causar un cuadro sim ilar a éste; sin embargo, en este caso, un cultivo puro de especies de Bifidobacterium se aisló a partir de un cultivo anaerobio.

G . Preparación con tinción de Gram de un frotis directo de sedimento de orina obtenido de un paciente con cis­ titis aguda. N ótense los numerosos bacilos gramnegativos en m edio de un fondo de neutrófilos segmenta­ dos. Se aisló Escherichia coli en un cultivo puro. H . Preparación con tinción de Gram de un frotis directo de sedimento de orina obtenido de un exudado uretral de un hombre sexualmente activo, que muestra diplococos gram negativos intracelulares característicos de Neisseria gonorrhoeae. En esta fotografía las células bacterianas presentan una tinción m ás pálida que la observada por el exam en m icroscópico directo. I.

M icrofotografía de un frotis de esputo que m uestra un fondo con pocos neutrófilos segm entados y un infil­ trado difuso con muchos bacilos gramnegativos cortos, algunos de los cuales parecen estar rodeados por un halo. En el cultivo creció Klebsiella pneumoniae.

J.

M icrofotografía de filamentos delicados ram ificados gram positivos sugestivos de especies de Actinomyces. En el cultivo creció Propionibacterium acnés.

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D

if ic u l ta d e s y artefacto s e n l a t in c ió n d e

G ram

A. Especies de Acinetobacter en un hemocultivo. Este género de cocobacilos tiende a retener el colorante vio­ leta de genciana. De este modo, los frotis con tinción de Gram pueden ser interpretados en form a errónea com o cocos gramnegativos, cocos grampositivos (flecha) o bacilos grampositivos. El m icroscopista debe evaluar el patrón de todas las bacterias presentes en el frotis. L a presencia de células que se tiñen de viole­ ta es un indicio de que la verdadera reacción puede ser gramnegativa. Aumento original, 1 OOOx. B.

Los estafilococos sobrecoloreados de una muestra genital se interpretan en form a errónea com o cocos gram­ negativos. A pesar de que los gonococos y los estafilococos pueden aparecer como diplococos, salvo una rara excepción (flecha) la form a de “habichuela” de los gonococos no se encuentra presente aquí y las bac­ terias no son intracelulares. Es im portante no sugerir la presencia de Neisseria gonorrhoeae a menos que la m orfología sea característica. Aumento original, 1 OOOx.

C. Las células alargadas de Streptococcus pneumoniae (flechas) presentes en un frotis de esputo pueden inter­ pretarse de m anera errónea com o bacilos grampositivos y en consecuencia se puede subestim ar su im por­ tancia com o uno de los principales patógenos respiratorios. Otras células en el frotis tienen la apariencia característica en form a de “lanceta” de los neumococos. El microscopista debe evaluar el patrón global y no confundirse por ocasionales im ágenes de estructuras engañosas. Aum ento original, 1 OOOx. D.

Clostridium perfringens cam bia de color fácilm ente y parece gramnegativo. L a presencia ocasional de bac­ terias grampositivas (flecha) y la apariencia de “contenedor” que no se asem eja a un típico bacilo entérico, proporcionan los indicios de la verdadera naturaleza de las bacterias. Las especies de Bacillus también pue­ den cam biar de color y aparecer com o gramnegativas. A um ento original, 1 OOOx.

E.

Los restos de la tinción de Gram parecen cocos grampositivos. El tamaño pequeño y la variación en tam a­ ño sugieren la verdadera naturaleza del material. Los artefactos a menudo aparecen refringentes cuando se varía el foco. A um ento original, 1 OOOx.

F.

Los bastones y los conos de la retina parecen cocos grampositivos y bacilos en una muestra de hum or vitreo. El sitio anatóm ico y su apariencia refringente sugieren la verdadera naturaleza de las estructuras. Aumento original, 1 OOOx.

G . Los conidios de Aspergillus fumigatus m im etizan a los cocos gram positivos en una m uestra de esputo. El tam año agrandado y los bordes ásperos de los conidios si están presentes, sugieren la verdadera naturaleza de las estructuras. El exam en del frotis puede revelar la presencia de hifas. Aum ento original, 1 OOOx. H . Los cilios exfoliados de una célula del aparato respiratorio (flecha) pueden asem ejarse a los bacilos gram ­ negativos. Puede sugerirse com o un bacilo teñido pálidam ente, com o Fusobacterium nucleatum. Sin em bar­ go, cuando se inspeccionan más de cerca, las estructuras no contienen los detalles morfológicos de una bac­ teria. Si se continúa la búsqueda se encuentran casi siempre células intactas con sus cilios pegados. Magnificación original, 1 OOOx (imagen aumentada).

LÁMINAS EN COLOR 1-5

I d e n t i f i c a c i ó n p r e s u n t i v a d e l a s b a c t e r i a s b a s a d a e n l a o b s e r v a c ió n d e l a m o r f o l o g ía d e l a s c o l o n ia s

Los m icrobiólogos utilizan diversas características de las colonias bacterianas que crecen sobre la supeficicie de los medios de cultivo de agar para establecer la identificación presuntiva del grupo o del género del m icroorganism o aislado o como guía para seleccionar las pruebas diferenciales que perm itan determ inar la identificación definitiva de la especie. Por lo general, los criterios que se consideran son tamaño, forma, consitencia, color y pigm entación de las colonias, así com o la presencia de reacciones de hem olisis en agar sangre. A.

Placa de agar sangre sobre la cual crecen colonias redondas, blancoamarillentas, completas, convexas, no hem olíticas de especies de Staphylococcus.

B. Colonias que crecen sobre agar sangre y muestran diferentes zonas de P-hem ólisis alrededor de las colonias. La relación entre el tam año de las colonias y las zonas de hem olisis se utiliza para diferenciar ciertas espe­ cies. Aquí se m uestran especies de Streptococcus que, por lo general, tienen una relación baja entre el tam a­ ño de las colonias y las zonas de hemolisis, en contraste con las especies de Staphylococcus, con una rela­ ción que habitualm ente es mayor. Aquí se muestran especies de Streptococcus, en las cuales el tamaño rela­ tivo de las colonias suele ser mayor. C. Las placas de agar sangre muestran el cambio de color del agar al tono verdoso característico de la a-h em ó ­ lisis. El crecim iento en esta placa corresponde a colonias pequeñas y claras de Streptococcus viridans con grandes zonas de a-hem ólisis. I).

Se observan colonias opacas, gris apagado, algo húm edas que crecen en agar sangre (derecha) o agar de M acConkey (izquierda), y sugieren corresponder a uno de los miembros de la fam ilia Enterobacteriaceae. El crecim iento en agar de MacConkey m uestra ausencia de pigm entación roja, lo cual indica que el m icro­ organismo no es ferm entador de lactosa. Las bacterias que se m uestran aquí son especies de Salmonella.

E.

Colonias secas y rugosas de especies de Bacillus. Con Pseudomonas stutzeri se observan colonias rugosas de aspecto similar.

F.

Colonias pigm entadas de amarillo en agar sangre. La pigm entación es una característica im portante para la identificación diferencial de muchas especies bacterianas, sobre todo aquellas que pertenecen a varios gru­ pos de bacilos no ferm entadores. Las colonias que se m uestran aquí corresponden a especies de Flavobacterium luego de 48 horas de incubación, las últimas 24 horas, a tem peratura ambiente. La intensi­ dad de la pigm entación a m enudo se intensifica luego de una incubación adicional a esa tem peratura.

G. Distintas colonias mucosas que crecen en agar sangre. La consistencia mucosa de la colonia suele ser secun­ daria a la producción de cápsulas, un m ecanism o de protección utilizado por muchas especies bacterianas en defensa contra la fagocitosis. Pseudomonas, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae y Cryptococcus neoformans se encuentran entre las especies m icrobianas recubiertas más comunes que pro­ ducen colonias mucosas. L a colonia que se muestra aquí es Streptococcus pneumoniae. H. Colonias grises, sem itranslúcidas de Eikenella corrodens que crece en agar sangre. Nótese la apariencia de halo alrededor de las colonias, lo cual ilustra el “poceado” característico de la especie. I.

Colonias grises, lisas, sem itransparentes de Capnocytophaga ochracea. N ótese la propagación en form a de rocío de las colonias, característica de las especies de Capnocytophaga.

J.

Colonia blanca, seca, calcárea de especies de Nocardia. Las especies de Streptomyces producen colonias de apariencia similar. Esta identificación presuntiva puede confirm arse si se detecta el olor a “sótano enm ohe­ cido” característico de estas especies.

LÁMINAS EN COLOR 6-1

Id e n tific a c ió n p re s u n tiv a de E nterobacteriaceae La identificación presuntiva de Enterobacteriaceae se basa en el aspecto de las colonias que crecen en los m edios de aislamiento primario y en una evaluación de ciertas reacciones bioquím icas. Por definición, para que un m icroorganism o sea clasificado como Enterobacteriaceae debe ferm entar la glucosa, produciendo ácido o ácido y gas; reducir nitratos a nitritos y no m ostrar ninguna actividad de citocrom o oxidasa. A. Tinción de Gram de un frotis de esputo que muestra los bacilos gramnegativos pletóricos y cortos caracte­ rísticos de los miem bros de Enterobacteriaceae. También se m uestran dos leucocitos polimorfonucleares, lo que sugiere un proceso infeccioso continuo en este paciente. En este caso el cultivo confirm ó que el m icro­ organism o era K. pneumoniae. B.

Cultivo m ixto que m uestra el crecim iento a las 24 horas en agar sangre de dos m orfotipos de bacilos gram ­ negativos grandes y un tercer m orfotipo de un m icroorganism o más pequeño del que se puede sospechar que es una especie grampositiva. Un m orfotipo se puede observar como colonias blancas, grandes y brillantes, mientras que el otro aparece com o grandes colonias grises con bordes irregulares. Se puede sospechar que ambos tipos de colonias contienen bacilos gramnegativos típicos de los m iem bros de Enterobacteriaceae. También se presentan muchas colonias completas, blancas y pequeñas, típicas de uno de los cocos grampositivos.

C . Colonias rosadas, grandes, mucoides y brillantes en agar de MacConkey típicas de muchas especies de Klebsiella y Enterobacter. Sólo sobre la base de su apariencia, se puede sospechar que estas colonias cons­ tituyen una especie de Enterobacteriaceae. D. Patrón en form a de enjam bre de una cepa móvil de especie de Proteus en una placa de agar chocolate. E.

Serie de tubos con agar hierro de Kigler (KIA) “en pico de flauta” (agar inclinado) que m uestra varios patro­ nes de reacción. El tubo del extremo izquierdo ilustra una porción inclinada ácida (amarilla) y un extremo ácido (am arillo), lo que indica tanto ferm entación de glucosa com o de lactosa. También obsérvese el espa­ cio en la parte inferior del tubo y la división en el agar en el medio del tubo que indica la producción de gas ( C 0 2) por parte del microorganismo. Las cantidades abundantes de C 0 2, com o se observan aquí, suelen ser producidas sólo por m icroorganismos pertenecientes a la tribu V ( Klebsielleae ). El segundo tubo desde la izquierda ilustra una reacción acida/ácida pero sin presencia de gas, típica del tipo de reacción que se ve con E. coli. El tercer tubo de la izquierda m uestra un agar inclinado alcalino (rojo)/profundidad ácida caracte­ rísticos de un no ferm entador de lactosa. El cuarto tubo ilustra un agar inclinado rojo/profundidad negra, que indica la producción de sulfuro de hidrógeno (H,S). Cuando se observa este tipo de reacción con un m icro­ organismo oxidasa negativo, se presum e que la porción profunda del tubo es ácida (amarillo), lo que indica ferm entación de glucosa aun cuando el color am arillo está enm ascarado debido a la producción de H,S. La reacción en el quinto tubo (extremo derecho) rojo/rojo es típica de los bacilos gramnegativos no fermentadores que no ferm entan lactosa ni glucosa.

F.

Tres tubos de m edios de cultivo violeta que contienen tubos de Durham para dem ostrar la form ación de gas. Los dos tubos de la derecha m uestran ácido a partir de glucosa (color amarillo), com parados con el control negativo de la izquierda. El tubo del extremo derecho muestra la colección de gas dentro del tubo de Durham, característica de un m icroorganismo que produce tanto ácido com o gas a partir de glucosa.

G. Prueba de citocrom o oxidasa que muestra una reacción color violeta positiva ( izquierda) com parada con una reacción negativa (derecha: no se observó ningún color azul dentro de los 10 segundos; véase protocolo 1-5). Cualquier m icroorganismo que da una reacción positiva puede ser excluido de la familia Enterobacteriaceae. H.

M edios de prueba de nitrato que contienen tubos de Durham para dem ostrar la formación de gas nitrógeno. E l tubo de la izquierda m uestra una reacción positiva (roja) después del agregado de a-naftilam ina y ácido sulfánico. El m icroorganism o de prueba ha reducido los nitratos en el medio a nitritos, los cuales reaccio­ naron con los reactivos para form ar el pigm ento rojo p-sulfobenceno-azo-a-naftilam ina (véase protocolo 6-2). El tubo del medio tam bién m uestra una reacción de nitrato positiva, pero en este caso todo el nitrato fue reducido prim ero a nitrito y luego reducido a su vez a gas nitrógeno, indicado por la colección de gas dentro del tubo de Durham. Como no hay nitrito en el tubo, no hay color rojo cuando se agregan reactivos. El tubo del extremo derecho no muestra ningún color rojo ni gas y muestra una prueba negativa para la reducción de nitrato.

LÁMINAS EN COLOR 6-2

A s p e c t o d e l a s c o l o n i a s d e E n t e r o b a c t e r ia c e a e e n a g a r e s d e M a c C o n k e y y E M B

El agar de MacConkey y el agar eosina azul de metileno (EMB) son dos medios de aislamiento primario de uso frecuente para la diferenciación presuntiva de los miembros de Enterobacteriaceae fermentadores y no fermentadores de lactosa. En agar de MacConkey, las colonias que fermentan la lactosa aparecen rojas debi­ do a la conversión ácida del indicador, el rojo neutro. En agar EMB, los fermentadores ávidos de lactosa producen un brillo metálico verde cuando la producción del ácido es suficiente como para reducir el pH hasta aproximadamente 4,5 o menos. A. Superficie de agar de MacConkey con crecimiento de 24 horas de colonias rojas, fermentadoras de lactosa. El color rojo difuso en el agar que rodea las colonias es causado por microorganismos que fermentan con avidez la lactosa, con producción de grandes cantidades de ácidos mixtos y precipitación de las sales bilia­ res en el medio (p. ej., Escherichia coli). B. Superficie de agar de MacConkey que muestra tanto colonias rojas, fermentadoras de lactosa, como colo­ nias claras más pequeñas, que no fermentan la lactosa. C y D. Superficie de placas de agar EMB que muestran el brillo verde producido por los miembros de Enterobacteriaceae ávidos fermentadores de lactosa (o sacarosa). La mayoría de las cepas de E. coli pro­ ducen colonias con este aspecto de agar EMB y, como E. coli se encuentra entre las cepas más frecuentes de muestras clínicas, el aspecto de estas colonias puede servir a menudo para su identificación presuntiva. Sin embargo, se deben evaluar las características distintas de la producción de un brillo verde en EMB antes de poder identificar en forma definida a un microorganismo como E. coli, ya que otras enterobacterias que fermentan la lactosa pueden tener un aspecto similar. E y F. Superficie de placas de agar EMB que muestran un cultivo mixto de E. coli (colonias brillantes verdes) y especies de Shigella. La mayoría de las especies de Shigella no fermentan lactosa y, por lo tanto, producen colonias semitranslúcidas y no pigmentadas en agar EMB. Otras especies incapaces de fermentar lactosa producen colonias de aspecto similar a las ilustradas en estas fotografías.

LÁMINAS EN COLOR 6-3

A s p e c t o d e E n t e r o b a c t e r ia c e a e e n p l a c a s d e a g a r

XLD

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HE

En los laboratorios de microbiología clínica se utilizan varios tipos de medios más selectivos que los agares de MacConkey o EMB para la recuperación de ciertos miembros de Enterobacteriaceae. Se utilizan más a menudo agares de xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) y entérico de Hektoen (HE); sólo se utilizan medios altamente selectivos como agar sulfato de bismuto para aplicaciones especiales. Estos medios no sólo tie­ nen la capacidad de separar los fermentadores de lactosa de los no fermentadores sino que también pueden detectar microorganismos productores de sulfuro de hidrógeno (H,S). A. Superficie de agar XLD que muestra la conversión amarilla del medio por las colonias de E. coli producto­ ras de ácido.

B. Colonias no fermentadoras de lactosa (sin conversión ácida del medio) de especies de Salmonella sobre la superficie de agar XLD. Obsérvese la pigmentación negra de algunas de las colonias, lo que indica la pro­ ducción de H,S. C. Fotografía que muestra una placa de agar XLD inoculada con una mezcla 50/50 de especies de E. coli y Salmonella. Obsérvese el crecimiento preponderante de las especies de Salmonella (colonias rojas) compa­ rado con las pocas colonias amarillas fermentadoras de lactosa que han sido inhibidas en forma eficaz. El halo rosado definido que rodea a las colonias de Salmonella indica la descarboxilación de lisina, una carac­ terística útil para diferenciar las especies de Salmonella (positivas) de las colonias de especies de Proteus que producen HLS. D. Placa de agar XLD inoculada con una cepa productora de H,S de una especie de Proteus. Obsérvese la ausencia de un halo rosado claro alrededor de las colonias, lo que indica la ausencia de descarboxilación de lisina (compárese con las colonias que se muestran en el panel C). E. Superficie de agar HE que muestra la producción de ácido por colonias de E. coli. F.

Superficie de agar HE que muestra las colonias verdes pálidas (incoloras) de miembros no fermentadores de lactosa de las enterobacterias.

LÁMINAS EN COLOR 6-4

C a r a c t e r í s t i c a s d i f e r e n c i a l e s d e E n t e r o b a c t e r ia c e a e

A. Prueba de ono-nitrofenil-(3-D-galactopiranósido (ONPG) que muestra una reacción positiva (amarilla) (izquierda) comparada con el control negativo (derecha). Una reacción positiva indica que el microorganis­ mo es capaz de producir P-galactosidasa, enzima requerida para la degradación inicial de lactosa, liberando el orfo-nitrofenol de color amarillo. B. Tubo de agar semisólido SIM (sulfuro indol motilidad) (derecha) y de agar hierro de Kligler (KIA) “en pico de flauta" (izquierda), que muestra las diferencias en sensibilidad para detectar sulfuro de hidrógeno (H,S) por los diferentes medios. El delicado ennegrecimiento difuso en el tubo SIM es producido por un micro­ organismo móvil productor débil de H,S (en este caso S. typhi). Obsérvese que el H,S producido en el tubo KIA menos sensible aparece sólo en el medio del tubo, en la interfaz del agar inclinado y la profundidad, típico de S. typhi en este medio. C y D. Cuatro tubos en los que se realizaron las pruebas de indol (I), rojo de metilo (RM), Voges-Proskauer (VP) y citrato (C). Cuando estas cuatro pruebas se realizan juntas constituyen las reacciones IMViC clásicas. La formación de indol a partir del triptófano está indicada por un color rojo con el agregado de reactivo de Kovac (tubo de la extrema izquierda, panel C). El desarrollo de un color rojo en el tubo de RM señala una caída en el pH hasta 4,4 o más bajo, que indica fermentadores fuertes de ácidos mixtos (segundo tubo desde la izquierda, panel C). Un color rojo en el tubo VP indica la presencia de acetoína (acetilmetilcarbinol) for­ mada a partir del piruvato en la vía metabólica del butilenglicol (tercer tubo desde la izquierda, panel D). El crecimiento en el pico de flauta del agar citrato de Simmon y la conversión del indicador de azul de bromotimol a un color azul alcalino indica que el microorganismo puede utilizar citrato de sodio como única fuente de carbono (tubo más a la derecha, panel D). C muestra las reacciones para E. coli (+ + — ). El panel D muestra las reacciones para Klebsiella/Enterobacter (— + +). E. Los dos tubos de la izquierda muestran reacciones de fenilalalina desaminasa negativa (amarillo claro) y positiva (verde oscuro). El color verde es producido por la reacción entre el reactivo FeCl3 y el ácido fenilpirúvico en el medio, resultante de la desaminación de fenilalanina (véase protocolo 6-8). Los tres tubos de la derecha son los picos de flauta del agar urea de Christensen. El tercero desde la derecha muestra una reac­ ción positiva fuerte (color rojo en todo el medio, que indica una reacción alcalina por la degradación de la urea), comparado con el control negativo de la extrema derecha (color totalmente amarillo). La reacción en el segundo tubo desde la derecha (color rojo sólo en el agar inclinado) es producida por microorganismos como especies de Klebsiella y algunas especies de Enterobacter que son productores débiles de ureasa. F.

Cuatro tubos que contienen medio de descarboxilasa de M0ller cubierto con una capa de vaselina para lograr un medioambiente anaerobio (véase protocolo 6-7). De izquierda a derecha: tubo de control de crecimien­ to desprovisto de aminoácidos (el crecimiento está indicado por la conversión a un color amarillo debido a la fermentación de glucosa en el medio), arginina, lisina y ornitina. El indicador violeta de bromocresol es amarillo a un pH ácido y violeta a un pH alcalino. Por lo tanto, cualquier tubo que aparezca violeta indica un pH alcalino, reacción producida por los microorganismos que pueden descarboxilar el aminoácido con­ tenido en el medio. El microorganismo que se muestra aquí es arginina negativo y ornitina positivo y es la reacción típica observada con E. aerogenes.

G. El agar lisina hierro (LIA) se utiliza para diferenciar los microorganismos entéricos sobre la base de su capa­ cidad para descarboxilar o desaminar lisina y formar H,S. Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen una reacción alcalina (violeta) en el extremo del tubo (tubo intermedio). Los microorganismos que desaminan la lisina producen un agar inclinado rojo sobre una profundidad ácida (amarilla) (tubo más a la izquierda). Las bacterias que generan H S producen ennegrecimiento del medio principalmente en el centro y la profundidad del tubo (también se observa en el tubo del extremo izquierdo). El tubo del extremo izquier­ do es lisina desaminasa positivo y lisina descarboxilasa negativo. El tubo intermedio es lisina desaminasa negativo y lisina descarboxilasa positivo. El tubo del extremo derecho es negativo tanto para lisina desami­ nasa como para lisina descarboxilasa. (Profundidad rojiza pero no amarilla). H. Tubos de medio de motilidad. Los microorganismos móviles muestran un crecimiento difuso lejos de la línea de inoculación (tubo de la izquierda)', los microorganismos inmóviles sólo muestran crecimiento a lo largo de la línea de corte (tubo de la derecha). También se encuentra disponible un medio de motilidad al que se agrega cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC). El crecimiento de microorganismos capaces de redu­ cir el TTC aparece rojo a lo largo de la línea de corte y en el área a la que han migrado las células, lo que facilita la diferenciación entre bacterias móviles e inmóviles (véase lámina en color 7-1E). (Fotografía cor­ tesía de Health and Education Resources, Bethesda, MD).

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P este hum a n a

A. La diseminación hematógena de Y. pestis desde la puerta de entrada a otros órganos y tejidos puede produ­ cir coagulación intravascular y shock endotóxico, que genera pequeñas hemorragias sobre la piel. (CDC. Public Health Image Library). B. Tinción de Gram de Y. pestis que muestra bacilos gramnegativos cortos y pletóricos con tinción bipolar. Los microorganismos aparecen rosados en los extremos polares con un área blanca o sin tinción en el centro. C. Frotis de sangre periférica con tinción de Wright que muestra un aspecto en “imperdible” de Y pestis. Las bacterias se tiñen de azul oscuro, los leucocitos, de azul claro con núcleos de tinción violeta y los eritroci­ tos, de color ocre claro. (CDC, Public Health Image Library). D. Colonias de Y. pestis en una placa de agar sangre a 72 horas. Yersinia pestis crece bien en la mayoría de los medios de laboratorio convencionales, después de 48-72 horas, que muestran una morfología en “huevo frito” irregular y elevada opaca blanco grisácea a levemente amarillenta; como alternativa las colonias pue­ den tener una superficie brillante con aspecto de "cobre repujado”. (CDC. Public Health Image Library ). A g a r c r o m o g é n ic o

E. BBL“ CHROMagar® 0157 está ideado para uso como placa primaria para coprocultivos cuando se realiza un cribado de E. coli 0157. Distingue E. coli 0157 (colonias malva) de E. coli no 0157 (colonias azules). También inhibe la mayoría de las cepas de Proteus, Pseudomonas y Aeromonas utilizando agentes selecti­ vos. (Cortesía de BD Diagnostic Systems). F y G. El medio BBL® CHROMagar* Orientation es un medio diferencial no selectivo para la identificación presuntiva de bacterias aisladas en muestras clínicas primarias. Permite el aislamiento y la identifica­ ción presuntiva tanto de patógenos grampositivos como gramnegativos con una única placa. Es útil para la identificación y la enumeración de patógenos urinarios. Identifica a E. coli (colonias rosadas) y Enterococcus (colonias azules o turquesas, pequeñas) de la placa primaria. El cuadro F muestra agar Orientation con un cultivo puro de E. coli. El cuadro G muestra una mezcla mixta de E. coli y Enterococcus junto con algunas colonias de especies de Proteus (beige con halo pardo). (Cortesía de BD Diagnostic Systems). H. BBL* CHROMagar® Salmonella está ideado para uso en el cribado de Salmonella de muestras clínicas o industriales. Detecta Salmonella con una reacción cromogénica altamente específica (colonias violetas con halo violeta), mientras reduce la interferencia de otras colonias productoras de sulfuro de hidrógeno como especies de Proteus y Citrobacter. (Cortesía de BD Diagnostic Systems).

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S i s t e m a s d e id e n t i f i c a c ió n c o m e r c i a l e s

En la actualidad se comercializan algunos sistemas de identificación que contienen reactivos estables y medios diseñados para determinar características bioquímicas. Estos productos varían desde aquellos que se inoculan y se leen en forma manual hasta los que son totalmente automáticos. A. Bandas API 20E que muestran el método de inoculación y la aparición de una banda luego de inoculación e incubación. Se transfiere una suspensión del microorganismo por evaluar con una pipeta en cada uno de los 20 compartimentos de medios. Las reacciones de color se leen después de 18 a 24 horas de incubación a 35 °C. El fabricante provee planillas para registrar la interpretación visual de las reacciones de color, que son luego convertidas en un número biotípico de siete dígitos. B. El sistema de identificación BBL Crystal Enteric/Nonfermenter contiene una tapa con 30 sustratos deshi­ dratados sobre los extremos de las pinzas de plástico. Se prepara y agrega una suspensión de prueba a 30 pocilios en la unidad base. Se alinea luego la tapa con la base y se ajusta en el lugar, donde el inoculo de prueba rehidrata los sustratos desecados e inicia reacciones de prueba. Después de la incubación, los pane­ les se leen de arriba hacia abajo utilizando el transiluminador de BBL Crystal. Se examinan los pocilios para detectar cambios de color y se genera un número de perfil de 10 dígitos que se ingresa a un ordenador per­ sonal en el cual se ha instalado el libro de códigos de BBL Crystal Electronic, para obtener la identificación. C. El panel REMAL RapID ONE (Oxidase Negative Enterobacteriaceae) tiene 19 sustratos para la identifica­ ción de más de 70 microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. El sistema consiste en una bandeja plástica con 18 pocilios de reacción. Los pocilios de reacción contienen reactivos deshidratados y la bandeja permite la inoculación simultánea de cada cavidad con una cantidad predeterminada de inocu­ lo. La prueba 18 es bifuncional y contiene dos pruebas separadas en el mismo pocilio. Cada prueba es inter­ pretada visualmente para detectar cambios de color después de 4 horas de incubación a 35 °C. Se puntúan los resultados de 19 pruebas más oxidada en las cajas apropiadas del formulario de comunicación y se gene­ ra un código de siete dígitos similar al que se muestra en A. El número de biocódigo se ingresa en una PC en la cual se ha instalado el ERIC (Electronic RapID Compendium), para obtener la identificación. D. El sistema Biolog GN Microplate consiste en una placa de microtitulación de 96 pocilios que contiene 95 sustratos de carbono y un indicador rédox y colorante de tetrazolio. Si las bacterias inoculadas utilizan un sustrato de carbono, el colorante incoloro se reduce en forma irreversible y forma un color violeta. Con el uso de la pantalla de un ordenador, se codifican las celdas violetas como positivas y las celdas incoloras como negativas. El ordenador compara luego “la huella metabólica” del microorganismo inoculado con las de la base de datos y genera la identificación más probable. E y F. En el panel de identificación para gramnegativos MicroScan, se inoculan los pocilios de microtitulación con una suspensión concentrada del microorganismo por identificar y se incuban a 35 °C durante 15 a 18 horas. Los paneles pueden interpretarse visualmente (fig. E), después de lo cual los resultados bioquímicos son convertidos en un número biotípico de siete u ocho dígitos que se consulta en un libro de códigos pro­ visto por el fabricante. También se puede utilizar una lectora automática de bandejas, autoSCAN-4, System junto con información LabPro. Algunas bandejas incluyen antibióticos para realizar tanto pruebas de sensi­ bilidad por microdilución como la identificación bacteriana en el mismo panel. Los mismos paneles pueden utilizarse, además, con el WalkAway, System completamente automático (fig. F). El instrumento procesa tanto el panel rápido como el panel convencional de toda la noche en un sistema y se encuentra disponible en modelos de capacidad de 40 y 96 paneles. (Cortesía de Dade Behring). G. El VITEK®2 es un nuevo sistema de bioMérieux que realiza los análisis de identificación bacteriana y prue­ bas de sensibilidad utilizando un inoculo estandarizado. El VITEK 2 caracteriza al AES (Advanced Expert System, sistema experto avanzado) que integra las tecnologías de inteligencia artificial en el instrumento VITEK 2. AES interpreta los resultados de la prueba de sensibilidad a los antibióticos utilizando una base de datos de conocimiento altamente desarrollado. Esta base contiene la mayoría de los mecanismos de resis­ tencia conocidos (alrededor de 2 000 fenotipos, 20 000 distribuciones de CIM). (Cortesía de bioMérieux). H. El sistema microbiológico automatizado para identificación y pruebas de sensibilidad BD PHOENIX® ofre­ ce pruebas de identificación y sensibilidad completamente automáticas sin que se necesite ninguna prueba off-line, rótulos manuscritos ni agregados de reactivos. El panel de pruebas sellado nunca se mueve una vez que está colocado en el interior, de modo que no puede ser desalojado, atascarse, romperse ni perder mien­ tras esté en el instrumento. El PHOENIX viene con un software integrado combinado con el BD EpiCenter®. (Cortesía de BD Diagnostic Systems).

LÁMINAS EN COLOR 7-1

C a r a c t e r í s t i c a s i m p o r t a n t e s p a r a d i s t i n g u i r l o s b a c il o s g r a m n e g a t i v o s no ferm entadores

A. Detección de fermentación. El tubo con agar hierro de Kligler (KIA) de la derecha muestra una reacción caracterítica con el agar “en pico de flauta” alcalino y la profundidad alcalina para un microorganismo no fermentador; el tubo a la izquierda muestra una reacción con el pico de flauta alcalino y la profundidad acida que indica la fermentación de dextrosa pero la falta de fermentación de lactosa (características de las espe­ cies lactosa-negativas de las enterobacterias). La falta de producción de ácido en KIA o en agar triple azú­ car-hierro (TSI) indica la incapacidad de las bacterias no fermentadoras para utilizar la lactosa o dextrosa en KIA (o la lactosa, dextrosa o sacarosa en TSI). B. Prueba de citocromo oxidasa. La formación de un color azul dentro de los 10 segundos después del exten­ dido de una colonia de prueba en papel de filtro saturado con el reactivo oxidasa (dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilenediamina) indica actividad de la citocromo oxidasa, característica útil para identificar a muchas especies de no fermentadores. Todos los miembros de las enterobacterias son citocromo oxidasanegativos. C. La falta de crecimiento en agar de MacConkey o el crecimiento inhibido en agar de MacConkey es un indi­ cio de que un bacilo gramnegativo puede ser un no fermentador. Aunque muchas especies de no fermenta­ dores son capaces de crecer en agar de MacConkey, la falta de crecimiento en este medio, como se muestra del lado derecho de este marco dividido, excluye a las enterobacterias, todos cuyos miembros crecen bien en agar de MacConkey (lado izquierdo). D. Utilización oxidativa de glucosa. Se muestran aquí dos tubos de medio oxidativo-fermentativo (OF) de Hugh-Leifson. El tubo de la derecha está abierto a la atmósfera, mientras el tubo de la izquierda está cubier­ to con vaselina para excluir la exposición a oxígeno atmosférico. Se observa ácido (color amarillo) sólo en la porción superior del tubo abierto, lo que indica que el microorganismo es capaz de oxidar glucosa pero incapaz de fermentarla. E. Tubos de medio de motilidad B que contienen cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC). A menudo es difí­ cil observar motilidad con las bacterias no fermentadoras dado que los microorganismos tienden a crecer sólo en la porción sueporior (la más aerobia) del tubo. El agregado de tetrazolio ayuda a detectar motilidad porque los microorganismos capaces de reducir TTC aparecen rojos a lo largo de la línea de corte y en el área en la cual las células han migrado, lo que hace más fácil diferenciar entre las bacterias móviles (izquier­ da) e inmóviles (derecha). F.

Placa de agar sangre inoculada con una bacteria productora de pigmento amarillo. La producción de pig­ mento es una característica diferencial importante para la identificación de bacilos gramnegativos no fer­ mentadores. El microorganismo que se muestra aquí es Sphingomonas paucimobilis.

G. Tubos de agar de Fio y Tech inoculados con Pseudomonas aeruginosa visualizados bajo luz visible. Estos medios se utilizan para aumentar la producción de dos pigmentos: pioverdina (fluoresceína), que aparece como un pigmento difusible amarillo en agar de Fio (izquierda) en luz visible, y piocianina, que aparece como un pigmento azul-turquesa en agar de Tech (derecha) en luz visible. Aunque tres especies de bacilos no fermentadors producen pioverdina (P. aeruginosa, P. fluorescens y P. putida), sólo una especie (P. aeruginosa) produce piocianina. H. Tubos de agar de Fio y Tech inoculados con Pseudomonas aeruginosa visualizados bajo luz ultravioleta (UV) utilizando una lámpara de Wood. Obsérvese que el tubo de agar de Fio (a la izquierda) fluoresce bajo luz UV, mientras que el tubo de agar de Tech (a la derecha) no lo hace. Sólo el pigmento de pioverdina, que aumenta haciendo crecer el microorganismo en agar de Tech, fluoresce bajo luz UV.

LÁMINAS EN COLOR 7-2

P r u e b a s u t il iz a d a s e n l a id e n t i f i c a c i ó n d e b a c il o s g r a m n e g a t i v o s n o f e r m e n t a d o r e s

A. Dos tubos de urea de Christensen que muestran el color rojo fucsia de una prueba positiva (derecha) com­ parados con un control negativo (izquierda). Se observa una reacción de ureasa positiva rápida (< 4 horas) con las siguientes especies de bacilos no fermentadores: Bergeyella zoohelcum, Bordetella bronchiseptica, Cupriavidus pauculus y Oligella ureolytica. B. Dos tubos que muestran reducción de nitrato (izquierda) y reducción de nitrito (derecha). Ambos tubos con­ tienen un tubo de Durham para demostrar la formación de gas nitrógeno. Obsérvese que se ha formado más gas en el tubo de la derecha lo que indica que se forma cuantitativamente más gas nitrógeno a partir de nitri­ to que de nitrato durante el mismo período de incubación. La producción de gas tanto a partir de nitrato como de nitrito es típica del grupo Pseudomonas stutzeri y Alcaligenes denitrificans. C. Tres tubos de caldo de infusión de corazón que muestran una reacción de indol positiva (izquierda), una reacción de indol anaranjada (centro) y una reacción de indol negativa (derecha). Las reacciones que se muestran aquí se obtuvieron utilizando el método de extracción de xileno seguido por el agregado de reac­ tivo de Ehrlich (véase protocolo 1-4). Una reacción de indol positiva se nota por la aparición de una banda roja en la interfaz del caldo de triptófano y la capa de xileno. Los bacilos no fermentativos indol-positivos incluyen: Balneatrix, Bergeyella, Chryseobacterium, Empedobacter, Weeksella y algunos grupos sin nom­ bre de los CDC. Se observa una reacción de indol anaranjada peculiar (tubo central) con Delftia acidovorans que se debe a la formación de ácido antranílico a partir del triptófano por esta bacteria. Se produce un pigmento anaranjado con el agregado de reactivo de Ehrlich o de Kovac. La reacción puede tardar en desa­ rrollarse más de 1 hora luego del agregado de los reactivos. D. Cuatro tubos de medio de descarboxilasa de M(íeller cubierto con una capa de vaselina. Lectura de izquier­ da a derecha: lisina, arginina, ornitina y tubo de control desprovisto de aminoácido. Con los bacilos no fer­ mentadores, las pruebas negativas conservan el mismo color que los tubos no inoculados originales, mien­ tras que las reacciones de descarboxilación positivas aparecen violetas más oscuras debido a la formación de aminas alcalinas que producen un pH más alcalino en el tubo. La reacción de lisina descarboxilasa posi­ tiva ilustrada aquí ocurre sólo con dos especies de bacilos no fermentadores: Stenotrophomonas maltophilia y complejo Burkholderia cepacia. E. Imagen dividida que muestra dos tubos de agar-esculina observados bajo luz visible (a la izquierda) y los dos mismos tubos observados bajo la luz ultravioleta de una lámpara de Wood (a la derecha). Cuando la esculina es hidrolizada por un microorganismo, el glucósido esculina se convierte en esculetina y glucosa. La esculetina reacciona con una sal de hierro (citrato férrico) en el medio para formar un pardo oscuro de complejo negro (segundo tubo desde la izquierda). Puede ser difícil discernir la formación de un pardo oscu­ ro de pigmento negro si el microorganismo propiamente dicho produce un pigmento pardo o de color pro­ fundo. El tubo brillantemente fluorescente del recuadro derecho (segundo tubo desde el extremo derecho) muestra la reacción observada con una reacción de esculina negativa. El tubo en el extremo derecho mues­ tra una atenuación pronunciada de la fluorescencia, sobre todo en la porción inclinada, lo que indica que el microorganismo de prueba es capaz de hidrolizar la esculina. F.

Placa de agar sangre que demuestra el aspecto típico de Pseudomonas aeruginosa después de 24 horas de incubación a 35 °C. Las colonias son grandes con una periferia que se extiende y a menudo son betahemolíticas. Las colonias de la parte más importante del crecimiento parecen tener un brillo metálico y un aspec­ to descamado que a veces se describe como morfología en piel de caimán. En los casos típicos, las colonias semejantes a ésta producen un olor similar a las uvas dulces.

G. Placa de agar de MacConkey que muestra el crecimiento de dos tipos de colonias. Las colonias violetas oscuras son lactosa positivas y tienen el aspecto típico de E. coli. Las colonias lactosa negativas están pro­ duciendo un pigmento difusible azul turquesa que se observa mejor en el área de mayor crecimiento. Este es el aspecto típico de las colonias de Pseudomonas aeruginosa que están produciendo piocianina. H. Placa de agar de MacConkey que demuestra crecimiento de una variedad mucoide de Pseudomonas aeru­ ginosa típica de las cepas aisladas del esputo de pacientes con fibrosis quística. Las colonias pueden ser extremadamente mucoides y líquidas. Se pueden ver distintas variantes de colonias que es la presentación típica para estas variantes mucoides de P. aeruginosa. Obsérvese que en el área de crecimiento más impor­ tante parece que se está desarrollando algo de pigmento de piocianina.

LÁMINAS EN COLOR 7-3

M o r f o l o g í a d e l a s c o l o n i a s y m i c r o s c ó p i c a d e a l g u n o s b a c il o s n o f e r m e n t a d o r e s

Algunas especies de bacilos gramnegativos no fermentadores tienen rasgos característicos que pueden observarse en medios de crecimiento o en preparados con tinción de Gram. El conocimiento de estas fun­ ciones puede ser un auxiliar para la identificación correcta de una especie. A. Pseudomonas stutzeri en medio de agar sangre. Obsérvense las colonias arrugadas y secas características típicas de esta especie. Se debe pensar inmediatamente en P. stutzeri cuando un bacilo no fermentador oxidasa positivo produce este tipo de colonia en agar sangre. B. Placa de agar sangre que muestra el aspecto amarillo, seco y arrugado de Pseudomonas luteola. Las colo­ nias a menudo son adherentes al agar y difíciles de extraer. La morfología de las colonias se asemeja a la de Pseudomonas oryzihabitans y Pseudomonas stutzeri. Tanto P. luteola como P. oryzihabitans son oxidasa negativos, mientras que P. stutzeri es oxidasa positivo. C. Agar de MacConkey (izquierda) y BAP (derecha) inoculados con un cultivo puro de Brevundimonas vesicularis. Obsérvese que este microorganismo no crece en agar de MacConkey y aparece como colonias lige­ ramente rugosas de color amarillo intenso en BAP. Este microorganismo también es sensible a la vancomicina y resistente a la polimixina B. otras características que pueden ayudar a su identificación. D. Placa de agar sangre que ilustra el crecimiento de Strenotrophomonas maltophilia. El pigmento amarillo mate es característico de esta especie pero a veces puede ser difícil visualizarlo. Las colonias también pue­ den aparecer de color ocre oscuro a lavanda con la incubación continua, sobre todo si se las deja a tempe­ ratura ambiente. E. Especies de Methylobacterium que crecen en agar dextrosa de Sabouraud. Las colonias aparecen secas y muestran una pigmentación rosada profunda o coral. Estas colonias absorben la luz ultravioleta y aparecen oscuras cuando se mantienen bajo la luz de Wood. F.

Tinción de Gram de especies de Methylobacterium que muestran bacilos gramnegativos característicos que contienen vacuolas.

G. Tinción de Gram de especies de Roseomonas que muestran formas cocoides gramnegativas, con tinción páli­ da característica, algunas con contenido de vacuolas. H. Especies de Roseomonas que crecen en agar-dextrosa de Sabouraud. Se presentan como colonias rosadas claras, mucoides y casi líquidas. Al igual que las especies de Methylobacterium, las especies de Roseomonas crecen mejor en agar de Sabouraud; sin embargo, no absorben la luz ultravioleta ni aparecen oscuras cuan­ do se mantienen bajo una lámpara de Wood.

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M o r f o l o g í a d e l a s c o l o n i a s y m i c r o s c ó p i c a d e a l g u n o s b a c il o s n o f e r m e n t a d o r e s (CONTINUACIÓN)

A. Placa de agar sangre que muestra el crecimiento de Alcaligenes faecalis después de 48 horas de incubación a 35 °C. Las colonias son blancas y brillantes; en los cultivos más viejos las colonias tienden a propagarse en el borde externo de las colonias y tornan verde el agar. Esta especie produce un olor frutal típico que a veces se describe como similar al de las manzanas verdes. B. Placa de agar de MacConkey que muestra el crecimiento de Rhizobium radiobacter. Aun cuando estas bac­ terias son no fermentadoras, oxidan rápidamente la lactosa y, en consecuencia, aparecen como colonias de color rosado y extremadamente mucoides en agar de MacConkey. Estos microorganismos pueden confun­ dirse con facilidad con un fermentador lactosa-positivo; sin embargo, son oxidasa positivos, lo que excluye automáticamente a cualquier miembro de las enterobacterias. C. Placa de agar sangre que muestra el crecimiento de Chryseomonas indologenes. Las colonias tienen un color amarillo intenso a anaranjado después de 48 horas de incubación sobre todo si son incubadas a 30 °C. Las colonias tienen un aspecto amarillo intenso a anaranjado después de 48 horas de incubación sobre todo si son incubadas a 30 °C. Fenotípicamente, estos microorganismos son difíciles de distinguir de Chryseomonas gleum y algunos laboratorios deciden informar estas cepas como C. indologenes/gleum. D. Placa de agar sangre que muestra el crecimiento característico de Myroides odoratus. Las colonias son ama­ rillas y extendidas. La mayoría de las cepas muestran un olor frutal característico similar al de Alcaligenes faecalis. E y F. Una prueba útil para distinguir entre las especies de Neisseria y las especies de Moraxella es hacer cre­ cer a los microorganismos en agar sangre alrededor de un disco de penicilina. Ambos microorganismos son sensibles a la penicilina y demostrarán una zona de inhibición alrededor del disco (E). Después de la incu­ bación durante toda la noche, se puede realizar una tinción de Gram en las colonias tomadas del borde de las zonas de inhibición. Las especies de Neisseria son cocos verdaderos y en presencia de concentraciones subinhibidoras de penicilina se siguen tiñendo como diplococos gramnegativos (lado izquierdo. F). Las especies de Moraxella son cocobacilos y en presencia de concentraciones subinhibidoras de penicilina for­ man células extrañas con forma de bastones (lado derecho. F). G. Placas de agar sangre (izquierda) y agar de MacConkey que muestran el crecimiento de Paracoccus yeii (grupo EO-2 de los CDC) después de 72 horas de incubación a 30 °C. Las colonias aparecen blancas y tie­ nen un aspecto mucoide. En agar de MacConkey tienen un color ligeramente rosado. H. Tinción de Gram de Paracoccus yeei (grupo EO-2 de los CDC) preparada del cultivo en caldo. Estos micro­ organismos se tiñen periféricamente y dan el aspecto de células con "forma de O”.

LÁMINAS EN COLOR 7-5

M o r f o l o g í a d e l a s c o l o n i a s y m i c r o s c ó p i c a d e a l g u n o s b a c il o s NO FERMENTADORES (CONTINUACIÓN)

A. Tinción de Gram que muestra cocobacilos gramnegativos. Las especies de Acinetobacter y Moraxella son los bacilos no fermentadores que tienen característicamente esta morfología de tinción. El frotis que se muestra aquí se hizo de un cultivo en caldo de A. baumanii. Las especies de Acinetobacter tienden a rete­ ner el violeta de genciana (cristal violeta) y pueden aparecer como grampositivas en algunos preparados con tinción de Gram, sobre todo los tomados directamente de frascos de hemocultivo positivos. B. Acinetobacter baumanii en agar de MacConkey que muestra un color rosado a lavanda claro típico de esta especie. A menudo se puede observar una pigmentación rosada, particularmente notable en las colonias que crecen en agar EMB. donde se describe como color "azul aciano”. C. Algunos acinetobacteres que oxidan la glucosa pueden producir un cambio de color pardo singular del agarinfusión de corazón con tirosina o el agar sangre en el que se incorpora glucosa. Este fenómeno también se puede observar en los agares de MacConkey y de Mueller-Hinton. Aquí se muestra un aislamiento clínico de A. baumannii que produce un pigmento difusible pardo en agar de MacConkey. D. Tiras de API 20 NE que muestran las reacciones a las 24 horas (arriba) y a las 48 horas (abajo). Obsérvese que las ocho primeras pruebas (lectura de izquierda a derecha) son reacciones colorimétricas convenciona­ les, mientras que las 12 pruebas restantes son reacciones de asimilación de carbono que se leen como posi­ tivas si hay turbidez y negativas en ausencia de turbidez. Los que utilicen este sistema deben observar que la tira es incubada a 30 “C y no a los 35 °C habituales utilizados para la mayoría de los otros equipos de identificación comerciales. (Fotografiado por León J. LeBeau. University of Illinois en Chicago). E.

Sistema Remel Uni-N/F que ilustra la placa circular que contiene 11 pocilios periféricos sellados de forma independiente y un pocilio central que contiene medio para detectar la producción de indol y sulfuro de hidrógeno. El tubo GNF estrangulado (segundo tubo desde la izquierda) se utiliza para la detección de fer­ mentación de glucosa y gas nitrógeno (debajo del estrangulamiento) y la producción de fluoresceína sobre la porción inclinada (por encima del estrangulamiento). El tubo 42P no estrangulado (primer tubo desde ¡a izquierda) se utiliza para evaluar el crecimiento a 42 °C y la producción de pigmento de piocianina.

F.

El sistema Remel RapID NF Plus consiste en una bandeja de plástico que contiene 10 pocilios de reacción. Siete de los pocilios de reacción (4 a 10) son bifuncionales y contienen dos pruebas separadas en la misma cavidad. Este sistema es inoculado con una suspensión importante del microorganismo de prueba e incuba­ do durante 4 horas a 35 °C. Luego de la incubación, las pruebas bifuncionales se puntúan primero antes del agregado del reactivo, lo que proporciona el resultado de la primera prueba (hilera superior). Las mismas cavidades se puntúan nuevamente después del agregado del reactivo para proporcionar el resultado de la segunda prueba (hilera inferior). Las reacciones obtenidas con estas 17 pruebas más oxidasa proporcionan 18 puntuaciones de prueba.

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Pseudomonas aeruginosa

LÁMINAS EN COLOR 8-1

I d e n tif ic a c ió n d e l a b o r a t o r i o d e e s p e c ie s d e C a m p ylo b a c ter

A. Tinción de Campylobacter jejuni que muestra bacilos gramnegativos pleomorfos con formas cortas, curvas y espiraladas. Obsérvese que algunas células se unen y adoptan formas en alas de gaviotas y en “S”. B. C. jejuni que crece en placa de agar para Brucella no selectivo luego del aislamiento de las heces utilizan­ do la técnica de filtro de membrana (descrita en el texto). Obsérvese que el crecimiento ha ocurrido sólo en el área de la placa subyacente al lugar donde se ha colocado el filtro. C. Vista cercana de C. jejuni en agar sangre, que muestra colonias elevadas, blanco grisáceas y algo mucoides. D. Crecimiento de C. jejuni en agar Campy BAP que muestra la tendencia del microorganismo a crecer a lo largo de las líneas de siembra en estría. E. Tubos que muestran la reacción de hipurato rápida. Se desarrolla un color violeta con el agregado de ninhidrina cuando el hipurato ha sido hidrolizado para formar glicina y ácido benzoico (tubo positivo a la izquier­ da comparado con el control negativo a la derecha). De las especies de Campylobacter. sólo C. jejuni da una reacción de hipurato positiva. F.

Placa de agar sangre para Brucella que muestra el crecimiento de C. jejuni alrededor de los discos de cefalotina y ácido nalidíxico. Obsérvese que con C. jejuni se forma una zona de inhibición alrededor del disco de ácido nalidíxico (.derecha), que indica que esta especie es sensible al ácido nalidíxico pero resistente a la cefalotina. Esta prueba es fácil de realizar y permite la identificación presuntiva de C. jejuni.

G. Reacciones del pico de flauta en agar-triple azúcar-hierro (TSI) que muestran las reacciones de sulfuro de hidrógeno (H,S) de varias especies. El tubo del extremo izquierdo muestra la ausencia de H,S característi­ ca de C. jejuni. C.fetus subespecie fetus y C.fetus subespecie venerealis. Los tubos 2, 4 y 5 (lectura desde la izquierda) muestran una reacción fuerte en la profundidad, característica de C. sputorum biovariedad bubulus, C. sputorum biovariedad fecalis o C. sputorum biovariedad sputorum. El tubo 3 muestra una reac­ ción fuerte del agar inclinado, característica de C. mucosalis. Leyenda: "Reacciones diferentes en los picos de flauta de agar TSI. Crecimiento en atmósfera para campilobacterias. Especies de Campylobacter'. H. Corte tisular con tinción argéntica de mucosa gástrica superficial que demuestra agrupamientos de bacilos que se tiñen de negro azulado a lo largo del revestimiento epitelial, compatibles con las formas bacilares de Helicobacter pylori. Cuando se observa en un preparado con tinción de Gram, las células individuales son largas, gruesas y curvas.

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I d e n t i f i c a c i ó n d e l a b o r a t o r i o d e V i b r i o c h o l e r a e y o t r a s e s p e c i e s d e V i b r io

A. Aspecto de Vibrio cholerae en agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS). Las colonias amarillas son el resultado de la utilización de citrato y la formación de ácido a partir de la utilización de la sacarosa en el me­ dio. La aparición de colonias amarillas en este medio es prácticamente diagnóstico de V. cholerae. B. Colonias de V. parahaemolyticus que crecen en agar TCBS que muestran el aspecto gris verdoso semitranslúcido característico. C. Agar gelatina con colonias opacas blancas de V. cholerae. Obsérvese la opalescencia del agar adyacente a las colonias, que indica la hidrólisis y la desnaturalización de la gelatina. D. Tinción de Gram de V. vulnificus que muestra las células bacterianas gramnegativas con la morfología en bacilos curvos típica de las especies de Vibrio. E. Prueba de la cuerda positiva con V. cholerae. Cuando se mezclan colonias de V. cholerae en una gota de desoxicolato de sodio al 0,5%, producen una suspensión viscosa que puede ser transformada en una cuerda cuando se eleva el ansa inoculadora lentamente desde el costado. F.

Prueba de aglutinación en portaobjetos positiva para V. cholerae utilizando antisuero O polivalente.

G. Placa de agar sangre que muestra las colonias intensamente p-hemolíticas relativamente grandes del biotipo El Tor de V. cholerae. H. Prueba de aglutinación de eritrocitos de pollo. Las cepas clásicas de V. cholerae no aglutinan los eritrocitos de pollo (arriba), a diferencia del biotipo El Tor (abajo), que puede aglutinarlos.

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I d e n t i f i c a c i ó n d e e s p e c ie s d e H a e m o p h il u s

A. Frotis con tinción de Gram de líquido cefalorraquídeo centrifugado que muestra células polimorfonucleares y bacilos gramnegativos dispersos de Haemophilus influenzae. Estos microorganismos característicamente aparecen como cocobacilos pequeños que se tiñen poco en las tinciones de Gram de las muestras clínicas. En ocasiones, se observan bacilos más largos y filamentosos. B. Crecimiento de colonias grises, lisas y húmedas de H. influenzae tipo b en agar chocolate después de 24 horas de incubación a 35-37 °C en CO, al 5-7%. Este medio contiene hematina (factor X) y está enriqueci­ do con otros factores, como NAD (factor V), que permiten el crecimiento de Haemophilus y otros microor­ ganismos con requerimientos nutricionales especiales. C. Crecimiento satélite de Haemophilus alrededor de estrías de Staphylococcus aureus en agar sangre de car­ nero. El factor X o hemina es aportado por eritrocitos de carnero lisados que rodean a la estría de estafilo­ coco, mientras que los propios estafilococos proporcionan el factor V o NAD. Estos factores permiten que las pequeñas colonias con forma de gota de Haemophilus crezcan adyacentes a la estría del estafilococo. D. Prueba de factores de crecimiento para la identificación de H. influenzae. Se inocula el microorganismo en una placa de agar tripticasa soja o agar infusión de encéfalo y corazón y se colocan discos que contienen factor X y factor V en proximidad uno de otro sobre la superficie de la placa inoculada. Después de la incu­ bación en un medio enriquecido con CO, a 37 °C, se determinan los requerimientos de factores observando el patrón de crecimiento del microorganismo en relación con los dos discos. En este cuadro, se observa el crecimiento entre los discos de factor X y factor V, lo que indica que el microorganismo requiere tanto el fac­ tor X como el factor V exógenos para su crecimiento. E. Prueba de factor de crecimiento para H. influenzae. Se inocula el microorganismo como se describió para D. pero en esta fotografía se colocan tiras de papel de filtro impregnadas con el factor X, factor V y con ambos factores sobre la siembra del inoculo. Después de la incubación en un medio enriquecido con CO, a 35-37 °C. se observa crecimiento alrededor de la tirita del factor V y alrededor de la tirita del factor XV, pero no alrededor de la tirita del factor X. Este patrón de crecimiento indica que el microorganismo necesita sólo factor V para su crecimiento. F.

Prueba de agar ALA-porfirina. Se trata de un método alternativo para determinar los requerimientos de fac­ tor X de las cepas de Haemophilus. El medio de agar contiene ácido 8-aminolevulínico (ALA). Se inoculan los microorganismos en el medio y, después de una incubación durante toda la noche a 35-37 °C en un medio enriquecido con CO,, se observa el crecimiento bajo una luz de Wood (ultravioleta). Si el crecimiento de la colonia da fluorescencia “rojo ladrillo”, el microorganismo es capaz de sintetizar factor X (hemina) a partir de ALA y no necesita factor X exógeno. Este cuadro muestra tanto el crecimiento de H. influenzae (izquier­ da), con su prueba de ALA-porfirina negativa (necesita hemina exógena para su crecimiento), como de H. parainfluenzae (derecha), con su prueba de ALA-porfirina positiva (sintetiza hemina a partir de ALA).

G. Método del disco de ALA-porfirina. Este cuadro también muestra la prueba de ALA-porfirina, pero en este enfoque, se utiliza un disco impregnado con ácido 8-aminolevulínico. Se humedece el disco con agua y se frota algo del crecimiento de las colonias sobre la superficie del disco. Después de una incubación durante 4 horas a 35-37 °C, se observan los discos en la oscuridad bajo luz de Wood. Si el disco da fluorescencia “rojo ladrillo”, el microorganismo es capaz de sintetizar su propio factor X. Si no se observa fluorescencia, el microorganismo requiere factor X exógeno. En este cuadro, H. influenzae (izquierda) no muestra fluo­ rescencia (requiere factor X exógeno) mientras que H. parainfluenzae (derecha) muestra fluorescencia (sin­ tetiza factor X a partir de ALA). H. Reacciones de reducción de nitrato y biotipificación para H. influenzae biotipo I. Las cepas de H. influen­ zae y H. parainfluenzae reducen el nitrato a nitrito y pueden agruparse en distintos tipos por sus reacciones en tres pruebas bioquímicas: producción de indol, ornitina descarboxilasa y ureasa. Este cuadro muestra las reacciones de nitrato y biotipificación de H. influenzae biotipo I. Las pruebas que se muestran (izquierda a derecha) son una prueba de reducción de nitrato positiva, producción de indol en caldo de triptona luego de la extracción con xileno (positiva), base de caldo descarboxilasa de Moeller (negativa), caldo de ornitina descarboxilsa de Moeller (positiva) y una porción inclinada de urea (positiva).

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I d e n t i f i c a c i ó n d e e s p e c i e s d e H a e m o p h i l u s ( c o n t in u a c ió n )

A. Panel para identificación de Haemophilus-Neisseria MicroScan (HNID) (Dade-MicroScan, West Sacramento, CA). El sistema de formato de microtitulación manual identifica tanto especies de Haemo­ philus como de Neisseria y proporciona designaciones de biotipo para H. influenzae y H. parainfluenzae. Esta figura muestra un panel inoculado con H. influenzae biotipo I (ureasa [URE] positivo, ornitina descar­ boxilasa [ODC] positivo e indol [IND] positivo). (Cortesía de Dade-MicroScan). B. Una lesión de chancroide sobre los genitales femeninos externos. Si bien las lesiones de chancroide pueden asemejarse a los chancros de la sífilis, suelen ser dolorosas y blandas, mientras que las de la sífilis primaria habitualmente son indoloras e induradas. El agente etiológico del chancroide, Haemophilus ducreyi, puede ser cultivado a partir de estas lesiones. C. Panel RapID NH (Remel) inoculado con H. ducreyi. El panel superior es antes del agregado de reactivos a las tres celdas bifuncionales de la cubeta (P04/N 02, 0R N /N 03 y URE/IND), mientras que el panel infe­ rior es después del agregado de reactivos para el desarrollo de las reacciones de NO,, N 0 3 e IND. Las úni­ cas reacciones positivas observadas con H. ducreyi en el panel RapID NH son la reacción de fosfatasa (arri­ ba, octava reacción desde la izquierda [amarillo]) y la reacción de reducción de nitrato reductasa (abajo, novena reacción desde la izquierda [rojo]). D. Frotis con tinción de Gram en el que se observan Haemophilus aphrophilus, cocobacilos pequeños de colo­ ración pálida. E. Crecimiento de H. aprhophilus en agar sangre de carnero (izquierda) y agar chocolate (derecha) después de 48 horas de incubación a 35-37 °C en CO, al 5-7%. H. aphrophilus es la única especie de Haemophilus que no necesita los factores X o V exógenos y, en consecuencia, es capaz de crecer en agar sangre de carnero. Las colonias son característicamente pequeñas y tienen una ligera pigmentación amarillenta. F.

Haemophilus paraphrophilus en agar sangre de camero (izquierda) y agar chocolate (derecha) después de 48 horas de incubación a 35-37 °C en C 0 2 al 5-7%. H. paraphrophilus es bioquímicamente idéntico a H. aphrophilus, pero necesita el factor V para su crecimiento. En consecuencia, H. paraphrophilus crece en agar chocolate (derecha) pero no en agar sangre de camero (izquierda).

G. Pruebas bioquímicas para la identificación de H. aphrophilus. Los tubos que se muestran en esta fotografía (izquierda a derecha) incluyen caldo de nitrato, caldo de indol triptona, caldo de base de descarboxilasa de Moeller, caldo de lisina descarboxilasa de Moeller, caldo de ornitina descarboxilasa de Moeller y una por­ ción inclinada de agar urea. Como se muestra aquí, H. aphrophilus es nitrato positivo, pero negativo para indol, lisina descarboxilasa, ornitina descarboxilasa y ureasa. H. Pruebas rápidas de utilización de hidratos de carbono para H. aprhophilus. En este procedimiento, se pre­ para una solución balanceada de sales-rojo fenol (BSS) en una serie de tubos en alícuotas de 0,10 mL. Se agrega una única gota de solución de hidratos de carbono esterilizada por filtro (0,20% p/v) a cada tubo. Se prepara una suspensión importante del microorganismo en la BSS sin agregar hidratos de carbono y se agrega una única gota de esta suspensión a cada uno de los tubos de BSS-hidrato de carbono. Después de 4 horas de incubación a 35-37 °C, se interpretan las reacciones. Con la producción de ácido, el indicador de rojo fenol vira de rojo a amarillo. En este marco, los tubos (izquierda a derecha) son la suspensión de micro­ organismos BSS (sin agregado de hidratos de carbono), BSS sin glucosa (G), maltosa (M), sacarosa (S), lac­ tosa (L), manitol (MN), xilosa (X) y mañosa (MA). Como puede observarse a partir de estas reacciones, H. aphrophilus produce ácido a partir de glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa y mañosa, pero no de manitol o xilosa. Los detalles de este procedimiento, que también se pueden utilizar para identificar especies de Neisseria, se presentan en el protocolo 11-1.

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LAMINASEN COLOR 9-3

E s p e c i e s d e A c t in o b a c il l u s , C a r d io b a c t e r iu m y E ik e n e l l a

A. Frotis con tinción de Gram de Actinobacillus actinomycetemcomitans, que muestra los bacilo;' > ; x baci­ los gramnegativos de tinción pálida de esta especie. B. A. actinomycetemcomitans que crece en agar chocolate después de 72 horas de incubación a 35-?” ;C en CO, al 5-7%. C. Pruebas rápidas de utilización de hidratos de carbono para A. actinomycetemcomitans. Como se ~ _e-stra aquí, produce ácido a partir de glucosa (G), manitol (MN) y mañosa (MA), pero no a partir de mait. sa M), sacarosa (S), lactosa (S) o xilosa (X). La falta de producción de ácido a partir de lactosa, junto con una prue­ ba de catalasa positiva, ayuda a diferenciar a A. actinomycetemcomitans de H. aphrophilus (véase lámina en color 9-2H). Las reacciones de reducción de nitrato, lisina y ornitina descarboxilasa y ureasa son mis­ mas tanto para A. actinomycetemcomitans como para H. aphrophilus (véase lámina en color 9-2G D. Extendido teñido con Gram de Cardiobacterium hominis. Estos microorganismos a menudo son gramvariables, pero se están tiñendo uniformemente como gramnegativos en esta fotografía. En general, las célu­ las de C. hominis son más largas que las otras bacterias HACEK y muestran un pleomorfismo variabie ip. ej., células con extremos puntiagudos o tumefactos, células con forma de lágrima y pesa). También se apre­ cia en este cuadro la formación de una empalizada característica por parte de las células en las disposicio­ nes en “cerca” y el agrupamiento de las células para formar rosetas compactas. E. Crecimiento de C. hominis en agar sangre de camero después de 72 horas de incubación a 35-37 °C en CO. al 5-7%. Las colonias de este microorganismo son pequeñas, opacas y brillantes. Algunas cepas también pueden deprimir el agar, como E. corrodens. F.

Frotis con tinción de Gram de Eikenella corrodens. Las células aparecen como bacilos gramnegativos ''regu­ lares” y no son cocobacilares ni pleomorfos como otros miembros de las bacterias HACEK.

G. Crecimiento de E. corrodens en agar sangre de camero después de 72 horas de incubación a 35-37 °C en CO, al 5-7%. La luz incidente sobre la placa en esta fotografía demuestra la depresión de la superficie de agar que es característica de la mayoría de las cepas. También se pueden identificar cepas que no tienen depresión y se pueden observar en el mismo cultivo tanto cepas con depresión como sin ella. H. Pruebas bioquímicas para la identificación de E. corrodens. Los tubos que se muestran aquí son (de izquier­ da a derecha) caldo de nitrato, caldo de indol triptona, base de descarboxilasa de Moeller, caldo de lisina descarboxilasa de Moeller, caldo de ornitina descarboxilasa de Moeller y porción inclinada de urea. E. corrodens es nitrato positivo, ureasa negativo y es el único miembro HACEK que es tanto lisina como omitina descarboxilasa positivo. E. corrodens también difiere de las otras bacterias HACEK en que no produce ácido a partir de hidratos de carbono de forma fermentativa ni oxidativa.

A

B

LÁMINAS EN COLOR 9-4

E s p e c ie s d e K in g e l l a , C a p n o c y t o p h a g a y D ysg o n o m o n a s

A. Kingella kingae en agar sangre de camero. La placa de la izquierda es después de 24 horas de incubación a 35-37 °C en C 0 2 al 5-7% mientras que la placa de la derecha es la misma cepa después de 48 horas de incu­ bación. La (3-hemólisis producida por este microorganismo puede ser evidente sólo por debajo e inmediata­ mente adyacente a la colonia después de 24 horas de incubación, pero después de 48 horas de incubación se la aprecia mejor. B. Colonias de Kingella denitrificans en agar chocolate después de 24 horas de incubación a 35-37 °C en CO, al 5-7%. Las colonias de este microorganismo se asemejan a los pequeños tipos de colonias de Neisseria gonorrhoeae. C. Panel RapID NH (Remel) inoculado con K. denitrificans. En esta fotografía se muestran dos paneles idén­ ticos. El panel superior es antes del agregado de los reactivos de nitrato e indol a los pocilios apropiados de la cubeta bifuncional. Las reacciones positivas en el panel para este microorganismo oxidasa positivo, catalasa negativo incluyen las pruebas de prolil aminopeptidasa (PRO), fermentación de glucosa (GLU) y reduc­ ción de nitrito positiva (N 0 2) y reducción de nitrato (N 0 3). Todos los resultados de las otras pruebas son negativos. D. Especies de Capnocytophaga aisladas en humanos después de 48 horas de incubación a 35-37 °C en C 0 2 al 5-7% en agar sangre de camero. Esta fotografía muestra la morfología característica de las colonias de estos microorganismos e ilustra la banda de "motilidad deslizante” en la periferia de las colonias. Hacia los cen­ tros de las áreas de crecimiento, las colonias tienen un aspecto moteado. E. Frotis con tinción de Gram de especies de Capnocytophaga humanas. Estos microorganismos característi­ camente aparecen como bacilos fusiformes gramnegativos ligeramente curvos con extremos puntiagudos. A este respecto, estas bacterias se asemejan a la especie anaerobia estricta Fusobacterium nucleatum. F.

Colonias de Capnocytophaga canimorsus en agar sangre de camero después de 5 días de incubación a 35 °C en Co2 al 5-7%. Las colonias de estas especies son íntegras, circulares, convexas y brillantes, como se mues­ tran aquí.

G. Frotis con tinción de Gram de C. canimorsus. Esta fotografía muestra las células fusiformes típicas del géne­ ro. Al igual que las especies Capnocytophaga que se encuentran en la orofaringe humana, algunas de las células de esta especie también son ligeramente curvas. H. Colonias de Dysgonomonas capnocytophagoides (antes grupo DF-3 de los CDC). Este microorganismo crece como colonias puntiformes después de 24 horas de incubación que luego forman colonias más gran­ des. grises a blancas. Esta fotografía muestra un cultivo de 48 horas que crece en agar sangre de carnero des­ pués de la incubación a 35-37 °C en C 0 2 al 5-7%. Se ha comunicado que el crecimiento de las colonias de este microorganismo tiene un olor característicamente "dulce”.

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E s p e c ie s d e P a ste u r ella . B ru cella y B o rd etella

A. Colonias de Pasteurella multocida que crecen en agar sangre de camero después de 48 horas de incubación a 35-37 °C en C 0 2 al 5-7%. El microorganismo es no hemolítico y no crece en agar de MacConkey. EMB (eosina-azul de metileno) u otros medios entéricos selectivos/diferenciales. P. multocida se aísla más a menudo de heridas de mordedura de animales domésticos, sobre todo gatos y perros. B. Frotis con tinción de Gram de P. multocida, que muestra los cocobacilos gramnegativos pequeños caracte­ rísticos de esta especie y otras especies del género Pasteurella. C. Reacción de indol inmediata positiva de P. multocida. Se satura un trozo de papel de filtro con algunas gotas de reactivo de p-dimetilaminocinnamaldehído, se extrae el crecimiento de la colonia del microorganismo de la superficie de agar y se lo frota en el reactivo junto con un microorganismo control negativo. La aparición de un color turquesa en el papel de filtro es una prueba positiva, mientras que el microorganismo control nega­ tivo conduce a un color rosado pálido, como se muestra aquí. P. multocida también es oxidasa positivo. D. Brucella melitensis que crece en agar sangre de carnero después de 48 horas de crecimiento en una atmós­ fera enriquecida con CO, al 5-7% a 35-37 °C. Las colonias son pequeñas, no pigmentadas, no hemolíticas, enteras y convexas. E. Prueba de anticuerpos inmunofluorescencia directa (IFD) para Bordetella pertussis. La prueba de IFD es un auxiliar importante del cultivo para la detección de B. pertussis en muestras nasofaríngeas. Esta fotografía muestra un preparado con IFD positiva, y los microorganismos aparecen como cocobacilos fluorescentes de color verde manzana. Como se muestra aquí, las bacterias pueden aparecer aisladas o en grupos, resultado de su atrapamiento en bandas mucosas. (Fotografía cortesía de Marty Roe, Children’s Hospital, Denver, Co). F.

Frotis con tinción de Gram de B. pertussis, que muestra la morfología cocobacilar pequeña característica.

G. Crecimiento de B. pertussis en agar de Regan-Lowe sin (izquierda) y con (derecha) cefalexina incorporada en el medio. Las pequeñas colonias blancas presentes en ambas placas son colonias de B. pertussis, mien­ tras que las colonias grandes en el medio que carece de cefalexina representan microorganismos contami­ nantes presentes en la muestra. El cultivo para B. pertussis debe incluir medios con antibióticos y sin ellos, dado que algunas cepas de B. pertussis y B. parapertussis pueden ser inhibidas por la cefalexina. H. Colonias de B. pertussis en agar de Regan-Lowe después de 72 horas de incubación a 35-37 °C en C 02 al 5-7%. Este medio contiene sangre de caballo (10% p/v) en una base de agar carbón. La alta concentración de sangre y la incorporación de carbón activado en el medio ayudan a neutralizar cualquier material tóxico que pueda estar presente en la muestra y a facilitar la recuperación de las bacterias.

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D ia g n ó s t ic o d e l a b o r a t o r io d e l a l e g io n e l o s is

A. Tinción de Gram de cultivo de Legionella pneumophila que utiliza fucsina básica en lugar de safranina para la contratinción. Los microorganismos son bacilos delgados de distintas longitudes.

B. Preparado por impronta de muestra de biopsia pulmonar a tórax abierto con tinción de Gram-Weigert que muestra pequeños bacilos intracelulares y extracelulares delgados (amplificación original, lOOx; lente obje­ tivo). Obsérvense los bacilos cortos y pletóricos en el macròfago más cercano al centro del portaobjetos. L. pneumophila serogrupo 1 fue el único microorganismo aislado en cultivo; una impronta tisular del pulmón fue DFA-positiva cuando se tiñe con el conjugado específico para este microorganismo. C. La proliferación importante en agar carbón-extracto de levadura con buffer (BCYEa) después de 3 días o más de incubación y la falta de crecimiento en agar sangre son características de las especies de Legionella. D. Vista con microscopio de disección de colonias de L. pneumophila en BCYEa. Obsérvense las estructuras internas de aspecto cristalino dentro de las colonias de 3-5 mm que tienen márgenes enteros (amplificación original aproximada 40x). E.

Autofluorescencia azul-blanca de L. bozemanii en BCYEa; fotografiado bajo luz ultravioleta de onda larga. Otras especies que dan autofluorescencia son L. dumoffii, L. gormanii, L. anisa, L. tucsonensis, L. cherrii, L. parisiensis y L. steigerwaltii. Esta característica está ausente en L. pneumophila, L. micdadei, L. feeleii, L. longbeachae, L. oakridgensis y muchas otras especies de Legionella.

F.

Tinción ácido-alcohol resistente de Kinyoun modificada de L. micdadei que crece en BCYEa. Algunas de las bacterias con forma de bastón en el preparado son ácido alcohol resistentes (rojas), mientras que algu­ nas no lo son (azules); por lo tanto, son “parcialmente ácido-alcohol resistentes”. Utilizando la tinción de Ziehl-Neelsen tradicional o una tinción de auramina-rodamina, no es probable que sean ácido-alcohol resis­ tentes (véanse los detalles en el texto).

G. Corte con parafina del tejido pulmonar de un paciente con enfermedad de los legionarios aguda. El corte muestra un área de consolidación. Exudados inflamatorios que consisten en fibrina, muchos neutrófilos, pocos macrófagos y algunos eritrocitos llenan los espacios y los conductos alveolares (tinción de hematoxilina y eosina; amplificación original aproximada 200x). H. Corte con parafina del pulmón de otro paciente diferente con una forma más crónica de enfermedad de los legionarios. Los alvéolos están llenos con macrófagos espumosos sobresalientes y el intersticio está edematizado. Una tinción de impregnación argéntica (p. ej., de Dieterle o de Warthin-Starry [no se muestra]) ayuda a detectar los microorganismos.

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I d e n t i f i c a c i ó n d e e s p e c i e s d e N e is s e r i a

A. Frotis con tinción de Gram de una secreción uretral de un varón con uretritis gonocócica. Nótese la presen­ cia de diplococos gramnegativos intracelulares dentro de los neutrófilos segmentados con una tinción pálida. B. Lesión cutánea de infección gonocócica diseminada en el dedo índice de la mano izquierda. Las lesiones cutáneas asociadas con ETS suelen ubicarse en las extremidades. C. Colonias típicas de Neisseria gonorrhoeae en medio de Thayer-Martin modificado (MTMj después de 24 horas de incubación a 35-37 °C en 5-7% de CO,. MTM es una fórmula a base de agar chocolate que con­ tiene vancomicina, colistina y nistatina para inhibir el desarrollo de microorganismos grampositivos, gram­ negativos y hongos, respectivamente. Las especies de Neisseria patógenas, en especial N. gonorrhoeae y N. meningitidis, crecen bien en el medio MTM. D. Vista de cerca de las colonias de N. gonorrhoeae que crecen en agar MTM después de 24 horas de incuba­ ción a 35-37 °C en 5-7% de C 0 2. E. Agar semisólido digerido de cistina y tripticasa (CTA) convencional para la identificación de especies de Neisseria. Esta fotografía muestra la batería típica de medios con hidratos de carbono usados para la iden­ tificación. Se incluyen (de izquierda a derecha) CTA-glucosa, CTA-maltosa, CTA-sacarosa y CTA-lactosa (el tubo CTA control sin hidrato de carbono no se muestra). El medio basal CTA contiene un indicador rojo fenol y un cambio en el color del medio de rojo a amarillo indica la producción de ácido a partir del hidra­ to de carbono correspondiente. En esta fotografía, el ácido se ha producido sólo de la glucosa e identifica el microorganismo como N. gonorrhoeae. F.

Vista ampliada de colonias de Neisseria meningitidis que crecen en agar sangre de carnero después de 24 horas de incubación a 35-37 °C en 5-7% de C 0 2.

G. Prueba de utilización rápida de hidratos de carbono para la identificación de especies de Neisseria (véase protocolo 11-1). Esta prueba se realiza usando una solución de rojo de fenol salina equilibrada (BSS, 0,10 mL por tubo), con una sola gota de hidrato de carbono (20% p/v de solución acuosa, filtrada y esterilizada) agregada por cada tubo de prueba. Se prepara una suspensión densa del microorganismo en BSS sin hidra­ to de carbono y se agrega una sola gota de esta suspensión cargada a cada tubo con BSS-hidrato de carbo­ no. Los tubos inoculados se incuban a 35 °C durante 4 horas. Esta fotografía muestra una serie de hidratos de carbono-BSS compuestos de (de izquierda a derecha) BSS sola (para la suspensión del microorganismo), BSS-glucosa, BSS-maltosa, BSS-fructosa, BSS-sacarosa y BSS-lactosa. Porque se ha producido ácido en los tubos BSS-glucosa y BSS-maltosa (cambio de color de rojo a amarillo), el microorganismo se identifi­ ca como /V. meningitidis. H. GONOCHEK II® (EY Laboratories. San Mateo, CA). Tres sustratos cromogénicos están incluidos en un tubo de plástico único para detectar las enzimas glucosidasa y aminopeptidasa específicamente encontradas en N. meningitidis, N. lactamica y N. gonorrhoeae. La hidrólisis de los sustratos en el tubo deriva en el volumen de inoculo pequeño que vira a varios colores. Los patrones de identificación observados son: azul (arriba a la izquierda), N. lactamica (hidrólisis de (3-galactosidasa); amarillo (arriba a la derecha), N. me­ ningitidis (hidrólisis de y-glutamil-p-nitroanilida) y rojo (abajo a la izquierda), N. gonorrhoeae (hidrólisis de prolil-P-naftilamida). La falta de una reacción de color (abajo a la derecha) posterior a los 30 minutos de incubación identifica el microorganismo como Moraxella catarrhalis.

LÁMINAS EN COLOR 11-2

I d e n t i f i c a c i ó n d e e s p e c i e s d e N e i s s e r i a y M o r a x e l l a c a t a r r h a l is

A. BactiCard Neisseria® (Remel Laboratorios, Lenexa K.S). Esta tira de identificación contiene cuatro pruebas cromogénicas de enzima-sustrato para la identificación de las especies de Neisseria patógenas y Moraxella catarrhalis. Después de la hidratación de cada uno de los cuatro círculos de prueba con una gota de buffer se aplica el cultivo desarrollado en un medio selectivo o en un subcultivo en cada una de las cuatro áreas de la prueba. Si se observa un color azul verdoso en el área de la prueba IB (butirato esterasa) dentro de los 2 minutos (la tira a la izquierda), el microorganismo se identifica como M. catarrhalis. Si no desarrolla color en esa área, la tira se incuba durante unos 13 minutos adicionales. Si aparece un color azul verdoso en el área de prueba BGAL (P-galactosidasa) (la tira más alejada a la derecha) durante ese tiempo, el microor­ ganismo se identifica como N. lactamica. Si no desarrolla reacción de color en esta área durante el período de incubación, se agrega una gota del reactivo que desarrolla color a las áreas de prueba PRO y GLUT. La aparición de color rojo en el área de prueba PRO (propil aminopeptidasa) identifica el aislamiento como N. gonorrhoeae (segunda tira a partir de la izquierda), mientras que la aparición de un color rojo en el área de prueba GLUT (y-glutamil aminopeptidasa) identifica el aislamiento como N. meningitidis (tercera tira a partir de la izquierda). B. Prueba de inmunofluorescencia para la confirmación del cultivo de N. gonorrhoeae (Microtrak® N. gonorr­ hoeae Culture Confirmation Kit, Wicklow, Irlanda). En una prueba positiva, se observan diplococos fluo­ rescentes color verde manzana, como se observa en esta fotografía. C. Sistema RapID NH® (Remel®). RapID NH es un sistema comercial de 4 horas para la identificación de espe­ cies de Neisseria, especies de Haemophilus y varias otras especies de bacterias gramnegativas con requeri­ mientos nutricionales especiales. La fotografía muestra dos paneles duplicados inoculados con N. meningi­ tidis. El panel superior es el sistema antes del agregado de los reactivos, mientras que el panel inferior es el sistema después de la adición de los reactivos a los últimos tres pocilios bifuncionales de prueba. Las reac­ ciones que identifican el aislamiento como N. meningitidis son las reacciones prolil aminopeptidasa (PRO) y y-glutamil aminopeptidasa (GLU) positivas, la reacción glucosa (GLU) positiva y la prueba de NO, (reducción de nitrito) positiva. D. Panel MicroScan HNID® (Dade-MicroScan, West Sacramento, CA). MicroScan HNID es un panel de prue­ bas de 4 horas para la identificación de especies de Haemophilus y Neisseria. Las pruebas positivas en el panel observadas en la fotografía incluyen las pruebas de reducción de nitrato (N 03), reducción de nitritito (NO,), producción de ácido a partir de glucosa (GLU), sacarosa (SUC), maltosa (MAL), fructosa (FRU) y prolil aminopeptidasa (PRO). Estas características identifican este aislamiento como N. mucosa. E. Panel API NH® (BioMérieux, Durham, NC). El API NH es un sistema de identificación en formato de tira para la identificación en 2 horas de las especies de Haemophilus y Neisseria. La tira incluye siete cúpulas de sustrato único y tres cúpulas bifuncionales. Las pruebas de sustrato único incluyen (de izquierda a dere­ cha), una P-lactamasa (PEN), producción de ácido de glucosa (GLU), fructosa (FRU), maltosa (MAL), saca­ rosa (SUC), omitina descarboxilasa (ODC) y ureasa (URE). Las cúpulas bifuncionales incluyen butirato esterasa más prolil aminopeptidasa (LIP/PRO A), fosfatasa alcalina más y-glutamil aminopeptidasa (PAL/GGT) y p-galactosidasa más indol (PGAL/IND). Primero se lee la tira entera, incluidas las pruebas LIP. PAL y PGAL. y luego se agrega un reactivo que desarrolla color a los pocilios PRO y GGT. y el reac­ tivo de indol se agrega al pocilio IND. Estas tres últimas cúpulas luego se releen para producir el cuarto número de un bicódigo de cuatro dígitos. Las cúpulas de los hidratos de carbono, LIP, PRO A, GGT y PGAL se destinan a la identificación de especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis, mientras que las cúpulas de los hidratos de carbono ODC, URE, PAL, pGAL e IND se usan para la identificación y biotipificación de especies de Haemophilus. En esta fotografía, las pruebas GLU y PRO A son positivas, lo que provee un bicódigo de 1001. La consulta con la base de datos NH proporciona una identificación de N. gonorrhoeae. El pocilio PEN es una cúpula de detección de p-lactamasa acidométrica que no se usa con propósitos de identificación. Aquí la prueba PEN es positiva, lo que indica que el aislamiento es P-lactamasa positivo. F. API NH inoculada con N. meningitidis. Las pruebas positivas sobre la tira incluyen glucosa (GLU), malto­ sa (MAL), propil aminopeptidasa (PRO A) y GGT (y-glutamil aminopeptidasa). Estas reacciones derivan en un bicódigo API de 5003, que provee una identificación de N. meningitidis. Este aislamiento es p-lactamasa negativo, como se indica por el color azul en la cúpula PEN. G. La prueba en disco M. cat butirato (Carr-Scarborough Microbiologicals, Decatur, GA). Las cepas de M. catarrhalis producen una enzima butirato esterasa capaz de hidrolizar indoxil butirato. Un disco de papel de filtro impregnado con indoxil butirato se humedece con agua y se frota el cultivo con colonias sobre el disco. La enzima butirato esterasa hidroliza el compuesto y aparece un color azul verdoso en el disco dentro de los 2 minutos. Esta figura muestra tres discos de M. cat butirato positivos sobre un portaobjetos de vidrio. H. API NH inoculado con M. catarrhalis. En esta fotografía, la única prueba positiva es la cúpula LIP (azul es una reacción positiva). El bicódigo API para estas reacciones es 0010, que lo identifica como M. catarrha­ lis. La cúpula PEN no se usa para determinar el bicódigo API, sino sólo para detectar la producción de p-lactamasa. El color azul en la cúpula PEN indica que esta cepa es P-lactamasa negativa.

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LÁMINAS EN COLOR 12-1

I d e n t i f ic a c i ó n d e e s t a f i l o c o c o s y e s p e c i e s r e l a c i o n a d a s

A. Paciente adulto con celulitis estafilocócica en el labio superior. B. Paciente adulto con ampollas, lesiones vesiculares del impétigo estafilocócico facial. El cultivo del líquido serosanguinolento del interior de esas vesículas revela un gran número de Staphylococcus aureus. C. Recién nacido con síndrome estafilocócico de la piel escaldada. Este síndrome se observa en recién nacidos infectados con cepas de S. aureus que producen exfoliatinas (toxinas epidermolíticas). Estas toxinas disuel­ ven la matriz de mucopolisacáridos de la epidermis, lo que causa la rotura intraepitelial de las conexiones celulares en la capa granulosa. La formación de ampollas sucede en grandes áreas del cuerpo, con la desca­ mación ulterior de las capas superficiales de la piel, como se muestra aquí. D. Frotis con tinción de Gram de una lesión de celulitis estafilocócica. Los microorganismos aparecen como pequeños cocos grampositivos extracelulares dispuestos en grupos junto a los leucocitos polimorfonucleares teñidos de rosado. E. Colonias de S. aureus en agar sangre de camero. Esta fotografía muestra las colonias típicas de S. aureus después de 24 horas de incubación a 35-37 °C. Se observa una zona de (3-hemólisis debida a la actividad hemolítica de la oc-hemolisina estafilocócica que rodea las colonias. El área roja más oscura por fuera del área de hemolisis alrededor de cada colonia representa la acción de la p-hemolisina (o hemolisina “frío/calor”). Esta es la P-hemolisina que interactúa con el factor CAMP producido por los estreptococos del grupo B que causa la hemolisis sinèrgica observada en la prueba de CAMP para la identificación pre­ suntiva de estreptococos del grupo B (cap. 13). F.

Frotis con tinción de Gram de un cultivo en caldo de S. aureus, que muestra los típicos cocos grampositivos en forma de racimos.

G. Prueba de catalasa positiva. La prueba de la catalasa diferencia estafilococos y micrococos de estreptoco­ cos, enterococos y bacterias similares a estreptococos (cap. 13). Esta prueba se realiza colocando una colo­ nia crecida en un portaobjetos de vidrio y agregando una gota de peróxido de hidrógeno al 3% al inoculo. Un burbujeo inmediato y vigoroso debido a la producción de oxígeno gaseoso, como se muestra aquí, indi­ ca una prueba positiva. Los micrococos y los estafilococos son catalasa positivos, mientras que los estrep­ tococos y los enterococos son catalasa negativos. Rothia mucilaginosa, otro microorganismo que crece como cocos grampositivos en grupos, es catalasa positivo débil o puede ser catalasa negativo. H. Colonias de Micrococcus luteus en agar sangre de carnero. Esta especie produce colonias pigmentadas ama­ rillas. Otros micrococos y microorganismos relacionados con el género pueden ser no pigmentados o pue­ den producir colonias pigmentadas naranjas o rojas en agar. Los micrococos y los microorganismos rela­ cionados pueden diferenciarse de los estafilococos por la resistencia a la furazolidona, la sensibilidad a la bacitracina o por otros métodos como se muestra en el cuadro 12-1.

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LÁMINAS EN COLOR 12-2

I d e n t i f ic a c i ó n d e e s t a f i l o c o c o s

A. Prueba en disco de furazolidona con una especie de Micrococcus. Son accesibles varias pruebas para la dife­ renciación de los micrococos y géneros relacionados de los estafilococos. La prueba de sensibilidad a la furazolidona es un método fiable para esta diferenciación. Los micrococos son resistentes a la furazolidona y por lo general crecen en el borde del disco de 6 mm de furazolidona (FX, 100 p.g. BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). B. Prueba con disco de furazolidona en una especie de Staphylococcus. El crecimiento de los estafilococos se inhibe por la furazolidona y muestra un área de inhibición del desarrollo alrededor del disco, como se repre­ senta en esta figura. C. Prueba de oxidasa modificada (Remel®. Lenexa, KS). Esta prueba es un método de 30 segundos, rápido para la diferenciación de los estafilococos de los micrococos y especies relacionadas. El reactivo oxidasa (dihidroclorotetrametil-p-fenilendiamina) se prepara con dimetil sulfóxido (DMSO), lo que le permite penetrar la pared celular estafilocócica. La prueba se realiza frotando una porción del desarrollo de la colonia de una placa en un disco de papel de filtro que está impregnado con el reactivo. La mayoría de los micrococos y especies relacionadas son oxidasa modificada positiva y producen un color azul violeta en el disco dentro de los 30 segundos, mientras que la mayoría de las especies de Staphylococcus son oxidasa modificada negativas. D. Prueba de la coagulasa en portaobjetos. Esta prueba es un método rápido para la identificación de S. aureus. La mayoría de las cepas de esta especie producen una coagulasa unida a la célula o “factor de aglutinación" que se detecta mezclando una suspensión salina del microorganismo con plasma con EDTA de conejo. Debe incluirse un control con solución salina (izquierda) para cada prueba para evaluar la autoaglutinación. No todas las cepas de S. aureus tienen factor de aglutinación, de modo que las pruebas coagulasa negativas deben confirmarse con la prueba de coagulasa en tubo (véase lámina en color 12-2E). E. Prueba de coagulasa en tubo. En esta prueba, la coagulasa extracelular producida por S. aureus forma un complejo con un componente del plasma, llamado factor reactante de coagulasa. Este complejo, a su vez. reacciona con el fibrinógeno en el plasma para formar fibrina y, como consecuencia, el desarrollo de un coá­ gulo visible en el tubo. Se muestra una prueba positiva en la parte inferior de la figura y una prueba negati­ va en la parte superior. E

Prueba de aglutinación del látex para la identificación de S. aureus. Esta prueba de coagulasa alternativa usa partículas de látex recubiertas con plasma. El fibrinógeno unido al látex detecta el factor de aglutinación y las inmunoglobulinas, también presentes en el látex, detectan la proteína A en la superficie de la célula de S. aureus. Formulaciones más recientes de esta prueba también contienen partículas de látex recubiertas con anticuerpos contra los tipos capsulares 5 y 8 de S. aureus. que permiten una detección más fiable de las cepas resistentes a la oxacilina. Mezclando el desarrollo de las colonias de S. aureus con el reactivo del látex resul­ ta una aglutinación rápida (izquierda). También se muestra (derecha) un estafilococo coagulasa negativo que produce una reacción de aglutinación del látex negativa.

G. Medio DNasa con azul de toluidina. Este medio detecta la producción de desoxirribonucleasa por S. aureus. Los microorganismos se inoculan en motas grandes en la superficie del agar y la placa se incuba a 35-37 °C durante 24 horas. Una prueba positiva se indica por la presencia de un color rosado debajo y alrededor del inoculo. Como se muestra aquí, S. aureus (“SA” en la placa) es DNasa positivo, mientras que el control (5. saprophyticus. “SS” en la placa) es DNasa negativo. La prueba de DNasa sirve como un método adjunto útil para las cepas de S. aureus que tienen resultados débiles o ambiguos en la prueba de la coagulasa. H.

Sistema API ID32 Staph® (BioMérieux) para la identificación de estafilococos y micrococos. Este sistema en formato de tira contiene 26 sustratos bioquímicos. Las reacciones positivas y negativas se graban para generar un número de biotipo que se usa en una base de datos del ordenador (APIWEB) para identificar el microorganismo. Este sistema tiene la base de datos más completa de todos los productos comerciales dis­ ponibles para la identificación de estafilococos.

LÁMINAS EN COLOR 12-3

I d e n t i f i c a c i ó n d e e s t a f i l o c o c o s ( c o n t in u a c ió n )

A. Colonias de Staphylococcus epidermidis en agar sangre de carnero (SBA) después de 24 horas de incuba­ ción a 35-37 °C. B. S. saprophyticus en SBA con discos de furazolidona y novobiocina. S. saprophyticus es causa de infeccio­ nes urinarias en mujeres jóvenes. Como otros estafilococos, esta especie es sensible a la furazolidona (FX), como se observa por la zona de inhibición alrededor del disco FX. El otro disco (designado c) en este por­ taobjetos es de novobiocina. 5. saprophyticus es una de las varias especies de estafilococos resistentes a la novobiocina. C. Panel de identificación API Staph® inoculado con S. saprophyticus. Esta lámina muestra las reacciones en la primera mitad del panel. Las interpretaciones de las reacciones de la prueba mostradas son como sigue: CHO Control MNE TRE MEL

Negativo Negativo Positivo Negativo

GLU Positivo MAL Positivo MAN Positivo

FRU Positivo LAC Positivo XLT Negativo

D. Panel de identificación API Staph® inoculado con S. saprophyticus. Esta lámina muestra la segunda mitad del panel. Las interpretaciones de las reacciones de la prueba mostradas son como sigue:

VP Positivo SAC Positivo ADH Negativo

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El código de números API para estas reacciones, mostradas en la lámina en color 12-3C y D, es 6634112. La consulta a la base de datos API Staph asistida por el ordenador proporciona una lista de posibles identi­ ficaciones, incluidos S. saprophyticus (71,9% de probabilidad), S. warneri (19,3% de probabilidad) o S. hominis (6,6% de probabilidad). Como S. saprophyticus es la única especie resistente a la novobiocina, el microorganismo puede ser identificado como S. saprophyticus. E. Este portaobjetos muestra el crecimiento de un aislamiento en agar sangre de camero después de una incu­ bación de 24 horas a 35-37 °C. Esta cepa se aisló en varios hemocultivos de un paciente de 38 años con endo­ carditis estafilocócica presuntiva. Es una cepa no pigmentada y no hemolítica, y también sensible a furazo­ lidona y novobiocina (no mostrada). F.

Esta fotografía muestra la reacción de aglutinación del látex del aislamiento de la lámina en color 12-3E. El aislamiento es coagulasa positivo para la prueba del látex. Como el aislamiento no "parece" S. aureus, el técnico de laboratorio inoculó una tira de indentificación API Staph. Estas reacciones se muestran en la lámina en color 12-3G y H.

G. Tira de identificación API Staph® inoculada con el aislamiento del hemocultivo mostrado en la lámina en color 12-3E. Esta fotografía muestra las reacciones en la primera mitad de la tira. Las interpretaciones de las reacciones de la prueba son como sigue: CHO Control MNE TRE MEL

Negativo Positivo Positivo Negativo

GLU Positivo MAL Negativo MAN Negativo

FRU Negativo LAC Negativo XLT Negativo

H. Tira de identificación API Staph® inoculada con el aislamiento del hemocultivo mostrado en la lámina en color 12-3E. Esta fotografía muestra las reacciones en la segunda mitad de la tira. Las interpretaciones de las reacciones de la prueba son como sigue:

VP Positivo SAC Negativo ADH Positivo

NIT RAF MDG URE

Positivo Negativo Negativo Negativo

PAL Positivo XYL Negativo NAG Positivo

El doble código API para las reacciones que se muestran en la lámina en color 12-3G y 12-34H es 2116141. La consulta en la base de datos de ordenador API Staph identifica a esta cepa como S. schleiferi. Esto es coincidente con la reacción del látex positiva que se muestra en la lámina en color 12-3F, ya que estas espe­ cies pueden dar pruebas en portaobjetos, del látex y coagulasa en tubo positivas.

LÁMINAS EN COLOR 13-1

I d e n t i f ic a c i ó n d e e s t r e p t o c o c o s

A. Paciente con erisipela debida a estreptococos P-hemolíticos del grupo A. Esta infección afecta los tejidos blandos y los linfáticos cutáneos y conduce a manifestaciones sistémicas de infección, que incluyen fiebre. Obsérvense las lesiones ampollares adyacentes al mentón. B. Frotis con tinción de Gram de estreptococos que crecen en un caldo de cultivo. Como su nombre lo sugie­ re, los estreptococos característicamente crecen en cadenas. Estas cadenas se observan con mayor frecuen­ cia cuando los microorganismos crecen en caldo. En los frotis con tinción de Gram preparados con cultivos crecidos en medios de agar. los microorganismos suelen aparecer en pares o en cadenas más cortas. C. Frotis con tinción de Gram de Streptococcus pneumoniae. Esta fotografía muestra el aspecto típico de los neumococos en caldo de hemocultivo. En los casos característicos, estas bacterias crecen de a pares en los cuales las células tienen una morfología “lanceolada” ligeramente alargada. Con algunas células en esta fotografía, se puede observar un área clara o “halo” que rodea a pares de los microorganismos, lo que indi­ ca la presencia de la cápsula de polisacárido de S. pneumoniae. D. Estreptococos p-hemolíticos en agar sangre de carnero. Los estreptococos p-hemolíticos producen hemolisinas que lisan los eritrocitos de carnero, lo que conduce al aclaramiento del medio que rodea las colonias. El estreptococo del grupo A que se muestra acá demuestra este tipo de hemolisis, como los estreptococos de los grupos B, C y G. Sin embargo, las zonas de P-hemólisis que rodean a las colonias de los estreptoco­ cos del grupo B no son tan grandes en relación con el tamaño de las colonias como las que se observan con los estreptococos P-hemolíticos de los grupos A, C y G. E. Estreptococos a-hemolíticos en agar sangre de camero. Los estreptococos inicialmente pueden ser clasifi­ cados sobre la base de sus propiedades hemolíticas en agar sangre de carnero. La hemolisis parcial de estos eritrocitos conduce a un “enverdecimiento" del medio de agar que rodea a las colonias (cx-hemólisis). Los estreptococos que son a-hemolíticos incluyen S. pneumoniae, el grupo viridans de estreptococos y la mayo­ ría de las especies de Enterococcus (antes Streptococcus). F.

Estreptococos P-hemolíticos en agar sangre de camero. La P-hemólisis más intensa se observa en las áreas donde el medio ha sido “punzado”, lo que empuja a algunas de las bacterias debajo de la superficie del medio. La p-hemólisis en estas áreas se debe a las actividades combinadas de estreptolisina O y estreptolisina S, las principales hemolisinas de los estreptococos del grupo A. La estreptolisina O es lábil al oxígeno y no muestra actividad máxima sobre la superficie del agar; la p-hemólisis superficial se debe en gran parte a la estreptolisina S, que es estable al oxígeno.

G. Prueba directa de aglutinación del látex para estreptococos del grupo A. En la actualidad, existe tar.to un inmunoanálisis de aglutinación del látex como un inmunoanálisis rápido para la detección directa de estrep­ tococos del grupo A en muestras de hisopados faríngeos. Con el método de aglutinación del látex que se muestra aquí, se trata enzimàticamente el hisopado faríngeo para extraer el antígeno A y se hace reaccionar el extracto con una suspensión de partículas de látex recubiertas con anticuerpos contra estreptococos del grupo A y con una suspensión de látex no recubierta de control. La aglutinación del látex con el reactivo de látex de prueba (izquierda) pero no el látex control (derecha) es una prueba positiva. Aunque la mayoría de estas pruebas son altamente específicas para el antígeno de la pared celular grupo A. las sensibilidades de estos ensayos varían ampliamente. H. Strep OIA® (Biostar, Boulder, CO). El Strep OIA es un inmunoanálisis para la detección directa de estrep­ tococos del grupo A en muestras de hisopados faríngeos. Se extrae el hisopo con ácido acético, se lo neu­ traliza y luego se lo mezcla con anticuerpos antigrupo A unidos a peroxidasa de rábano picante. Se coloca una gota de esta mezcla sobre la superficie de un portaobjetos OIA. que es revestido con anticuerpos contra estreptococos del grupo A. Después de 2 minutos de incubación, se enjuaga el portaobjetos y se agrega el sustrato peroxidasa de rábano picante dejándolo reaccionar sobre el portaobjetos OIA durante 4 minutos. Después de enjuagado se procede a la lectura del portaobjetos mediante el examen del color de luz refleja­ da en el área de reacción del portaobjetos OIA. Si se presenta antígeno de estreptococo del grupo A, el por­ taobjetos muestra una mancha violácea (izquierda). Si no se presenta antígeno, la superficie del portaobje­ tos retiene su color amarillo, con un punto azulado pequeño, como se muestra aquí (derecha).

LÁMINAS EN COLOR 13-2

I d e n t i f ic a c i ó n d e e s t r e p t o c o c o s y e n t e r o c o c o s

A. Colonias de S. pneumoniae en agar sangre de carnero. Se pueden utilizar dos características de S. pneumo­ niae para la identificación presuntiva. A la izquierda se muestra una cepa mucoide a-hemolítica típica de S. pneumoniae que crece en agar sangre de camero. Su aspecto se debe a la producción de grandes cantidades de polisacárido capsular. A la derecha hay una fotografía cercana que muestra el colapso de la porción cen­ tral de las colonias debido a la autólisis del microorganismo, lo que conduce a las denominadas morfologí­ as de las colonias “en piezas de damero" y “en cabezas de clavo”que se muestran aquí. B. Prueba de sensibilidad a la bacitracina. Los estreptococos del grupo A son sensibles a bajas concentracio­ nes de bacitracina. El disco de bacitracina Taxo A® (BD Microbiology Systems) que se muestra aquí con­ tiene 0,04 unidades de bacitracina. Esta fotografía muestra las reacciones de prueba de la bacitracina para un estreptococo p-hemolítico del grupo A (izquierda) y un estreptococo p-hemolítico del grupo B (derecha). Cualquier zona de inhibición alrededor del disco de bacitracina se considera una prueba positiva. C. Sensibilidad a la bacitracina y el trimetoprim-sulfametoxazol. El estreptococo p-hemolítico que se muestra aquí es sensible a bacitracina (derecha), pero también muestra una zona grande de inhibición del creci­ miento alrededor del disco de trimetoprim-sulfametoxazol (izquierda). Los estreptococos P-hemolíticos del grupo A son sensibles a la bacitracina, pero resistentes al trimetoprim-sulfametoxazol, mientras que los estreptococos p-hemolíticos del grupo B son resistentes tanto a la bacitracina como al trimetoprim-sulfa­ metoxazol. Algunos estreptococos P-hemolíticos no pertenecientes al grupo A (p. ej., grupos C, F y G) son sensibles a la bacitracina, pero también serán sensibles al trimetoprim-sulfametoxazol, como se muestra aquí. Por lo tanto, la realización conjunta de estas dos pruebas aumenta la especificidad de la identificación presuntiva que se obtendría utilizando sólo la prueba de bacitracina. Este aislamiento sería denominado “estreptococo p-hemolítico presuntivo, no grupos A ni B, por bacitracina/trimetoprim-sulfametoxazol”. D. Prueba de CAMP para la identificación presuntiva de estreptococos p-hemolíticos del grupo B. La reacción de la prueba de CAMP depende de la interacción entre el factor CAMP, un producto del estreptococos del grupo B, con la P-hemolisina de Staphylococcus aureus. Los posibles estreptococos del grupo B son sem­ brados en estría en ángulos rectos con una siembra en estría de S. aureus (sin que las estrías se toquen) sobre una placa de agar sangre de camero. Luego de una incubación durante toda la noche a 35-37 °C, se encuen­ tra un área con forma de punta de flecha de hemolisis sinergista en el área de intersección donde el factor CAMP y la P-hemolisina se han difundido en el medio. Las variantes no hemolíticas de estreptococos del grupo B también son prueba de CAMP positivas. Esta fotografía muestra tres pruebas de CAMP positivas. E.

Sensibilidad a la optoquina para la identificación de S. pneumoniae. Se utiliza la sensibilidad al clorhidrato de hidrocupreno etílico (optoquina) para diferenciar S. pneumoniae de otros estreptococos viridans. Se subcultivan las colonias a-hemolíticas sobre una placa de agar sangre de camero y se coloca un disco de optoquina (disco P; BD Microbiology Systems) sobre el inoculo. La presencia de una zona de inhibición del cre­ cimiento de 14 mm alrededor de un disco de optoquina de 6 mm después de la incubación durante toda la noche a 35-37 °C identifica el microorganismo como S. pneumoniae.

F.

Pruebas de hidrólisis de bilis-esculina y tolerancia a la sal. Estas pruebas se utilizan para la identificación presuntiva de especies de Enterococcus y estreptococos del grupo D. Se realiza la prueba de bilis-esculina (derecha) inoculando una porción inclinada del medio de bilis-esculina e incubándola durante toda la noche a 35-37 °C. Los enterococos y los estreptococos del grupo D pueden crecer en presencia de bilis al 40% e hidrolizar la esculina a esculetina (que forma el precipitado negro). La prueba de tolerancia a la sal (izquier­ da) se realiza con un medio de caldo que contiene NaCl al 6,5%. Las especies de enterococos crecen, mien­ tras que los estreptococos del grupo D no enterococos no crecen en este medio. La fotografía muestra una reacción positiva para ambas pruebas, lo que indica a este microorganismo como una especie de Enterococcus del grupo D.

G. Prueba PYR. La hidrólisis de L-pirrolidonil-a-naftilamida (PYR) es una prueba presuntiva para la identifi­ cación de estreptococos p-hemolíticos del grupo A y especies de Enterococcus que puede reemplazar a las pruebas con discos de bacitracina-trimetoprim-sulfametoxazol y las pruebas de tolerancia a la sal, respecti­ vamente. En la prueba con disco que se muestra, se aplica el crecimiento de las colonias a un disco hume­ decido e impregnado con el sustrato PYR. Después de 2 minutos, se coloca una gota de reactivo dimetilaminocinamaladehído sobre el disco para detectar la naftilamida libre que se libera con la hidrólisis de PYR (rojo). H. Tri-Placa para la identificación presuntiva de estreptococos. Esta placa única está diseñada para proporcio­ nar los resultados de varias pruebas para la identificación presuntiva de estreptococos y enterococos. Los tres sectores de la placa contienen agar sangre de camero, agar bilis-esculina y agar PYR, respectivamente. Se realiza la determinación de hemolisis y una prueba de CAMP en el sector de agar sangre y se leen las reacciones de bilis esculina y PYR en los otros dos sectores. Esta fotografía muestra la triplaca inoculada con una especie de Enterococcus: a-hemolítica, prueba de CAMP negativa, bilis-esculina positiva y PYR positiva.

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LÁMINAS EN COLOR 13-3

I d e n t i f ic a c i ó n d e e s t r e p t o c o c o s y e n t e r o c o c o s y b a c t e r i a s s im i l a r e s a e s t r e p t o c o c o s

A. Prueba del látex para el agrupamiento serológico de estreptococos p-hemolíticos. Aunque el método de extracción de Lancefield y las pruebas de precipitinas capilares son las técnicas más honradas por el tiem­ po para la identificación definitiva de los estreptococos agrupables, otros métodos, como el que se muestra aquí, han sido adoptados en la mayoría de los laboratorios y se los considera procedimientos estándares. En esta prueba, el antígeno de agrupamiento de la pared celular es extraído de la pared de la célula bacteriana por medios enzimáticos y el extracto se hace reaccionar ulteriormente con partículas de látex a las cuales se unen anticuerpos específicos de grupo. Una prueba positiva está indicada por la aglutinación de cuentas de látex en el reactivo de látex homólogo. Como se muestra aquí, ha ocurrido aglutinación con el reactivo del grupo A, pero no con los reactivos de los grupos B, C, D, F o G, lo que identifica así la cepa como un estrep­ tococo p-hemolíticos del grupo A. B. Prueba de hinchazón capsular de Neufeld (Quellung) para la identificación de S. pneumoniae. Esta “prueba de precipitina” microscópica se puede utilizar para identificar neumococos o para determinar el serotipo capsular de cepas neumocócicas individuales. La reacción de los anticuerpos anticapsulares con el material de hidratos de carbono de la cápsula produce una reacción de microprecipitación sobre la superficie del microorganismo y un cambio en el índice de refracción de la cápsula propiamente dicha. Desde el punto de vista microscópico, la cápsula parece "hincharse”. Se agrega una pequeña cantidad de azul de metileno al preparado para permitir la visualización de las células y proporcionar el contraste de modo que se puedan discernir más fácilmente cambios refráctiles sutiles. C. Prueba de aglutinación del látex Pneumoslide® (BD Microbiology Systems). La prueba Pneumoslide utili­ za partículas de látex sensibilizadas con anticuerpos antineumocócicos. La mezcla del látex sensibilizado con el material de las colonias de una placa de cultivo conduce a una aglutinación visible de la suspensión, lo que identifica así la cepa como S. pneumoniae. D. Especies de Abiotrophia/Granulicatella. Estos microorganismos eran denominados antes estreptococos satélites o variantes nutricionales porque requieren compuestos del tiol, cisteína o la forma activa de vita­ mina B6 (piridoxal o piridoxamina) para el crecimiento en los medios. Este requerimiento se puede cumplir realizando siembras cruzadas en estrías con un estafilococo a través de un inoculo de la cepa variante nutricional probable, como se muestra en esta fotografía. Se observan las pequeñas colonias del microorganismo que crecen adyacentes a la estría del estafilococo luego de la incubación de una forma similar a la prueba satélite para la identificación presuntiva de especies de Haemophilus. Los miembros de los estreptococos satélites han sido colocados ahora en el género Abiotmphia o el género Granulicatella. E. Enterococcus faecium. Esta fotografía muestra una placa de agar sangre de camero inoculada por E. faecium. Las colonias de este microorganismo son lisas, grises y no hemolíticas o a-hemolíticas. El hisopo, que fue utilizado para recoger algo del crecimiento de la colonia de la placa, muestra que el microorganismo no está pigmentado. Esto se vuelve importante para la identificación de algunas otras especies de enterococos. F.

Panel de identificación API Strep® (BioMérieux) inoculado con E. faecium. Esta fotografía muestra la pri­ mera mitad del panel de identificación. Las interpretaciones de las reacciones son las siguientes: VP Positiva PYRA Positiva P-GAL Positiva

HIP Negativa a-GAL Positiva PAL Negativa

ESC Positiva P-GUR Negativa LAP Positiva

G. Panel de identificación API Strep inoculado con E. faecium. Esta fotografía muestra la segunda mitad del panel de identificación. Las interpretaciones de las reacciones son las siguientes: ADH MAN TRE AMD

Positiva Positiva Positiva Negativa

RIB SOR INU GLYG

Positiva Positiva Negativa Negativa

ARA LAC RAF HEM

Positiva Positiva Positiva Negativa

El biocódigo API para las reacciones que se muestran en la lámina en color 13-3F y G es 5357750. La con­ sulta con la base de datos computarizada API proporciona una identificación de E. faecium, con una proba­ bilidad del 99%. H. Agar de cribado para vancomicina. El agar de cribado para vancomicina consiste en agar de infusión de cere­ bro y corazón que contiene vancomicina (6 (ig/mL). Este medio puede utilizarse para detectar enterococos resistentes a la vancomicina, la mayoría de los cuales son E. faecium. Como se muestra en esta fotografía, las cepas A, B, C y D son resistentes a la vancomicina y pueden crecer en este medio. La cepa E es una variedad de E. faecalis, la mayoría de las cuales son sensibles a la vancomicina, como lo indica la inhibi­ ción del crecimiento en este medio.

LÁMINAS EN COLOR 13-4

I d e n t i f ic a c i ó n d e e n t e r o c o c o s y e s t r e p t o c o c o s d e l g r u p o V ir id a n s

A. Enterococcus casseliflavus en agar sangre de camero. E. casseliflavus es una de las dos especies móviles de Enterococcus. Además, produce un pigmento amarillo. Este pigmento se aprecia en la inspección del hiso­ po en la fotografía, que ha sido utilizado para recoger algo del crecimiento de la colonia. B. Enterococcus gallinarum en agar semisólido para motilidad. Como ya se dijo, E. gallinarum y E. casseli­ flavus son las dos especies móviles de Enterococcus. En esta fotografía se ha inoculado con corte E. gallinarum en un tubo de medio semisólido para motilidad que contiene tetrazolio. En la incubación del tubo inoculado, los microorganismos móviles se mueven fuera de la línea de estría para crear turbidez en el medio. El color violeta es el resultado de los microorganismos móviles que reducen el tetrazolio a formazán, que aparece como un precipitado violáceo en cualquier sitio donde haya microorganismos viables. C. Streptococcus bovis en agar sangre de carnero. S. bovis es un estreptococo del grupo D no enterococo. Este microorganismo es bilis-esculina positivo, pero no crece en caldo de NaCl al 6,5% y es PYR negativo. El aislamiento de S. bovis de hemocultivos se asocia con neoplasias colónicas. D. Panel de identificación API Strep inoculado con S. bovis. Esta fotografía muestra la primera mitad del panel de identificación. Las interpretaciones de las reacciones son las siguientes: VP Positiva PYRA Negativa p-GAL Positiva

HIP Negativa a-GAL Positiva PAL Negativa

ESC Positiva p-GUR Negativa LAP Positiva

E. Panel de identificación API Strep inoculado con S. bovis. Esta fotografía muestra la segunda mitad del panel de identificación. Las interpretaciones de las reacciones son las siguientes: ADH MAN TRE AMD

Negativa Positiva Positiva Positiva

RIB SOR INU GLYG

Negativa Negativa Positiva Positiva

ARA LAC RAF PHEM

Negativa Positiva Positiva Negativa

El código API para las reacciones que se muestran en la lámina en color 13-4D y E es 5250573. La consul­ ta con la base de datos computarizada API proporciona una identificación de esta cepa aislado como S. bovis I (probabilidad del 99,9%). Según la nueva nomenclatura para este complejo de microorganismo, 5. bovis I se denomina ahora Streptococcus gallolyticus subespecie gallolyticus (cuadro 13-7). F.

Streptococcus mitis que crecen en agar sangre de camero luego de 24 horas de incubación. Esta cepa parti­ cular parece ser y-hemolítica o no hemolítica. Otras cepas de esta especie pueden ser a-hemolíticas.

G. Panel de identificación API Strep inoculado con S. mitis. Esta fotografía muestra la primera mitad del panel de identificación. Las interpretaciones de las reacciones son las siguientes: VP Negativa PYRA Negativa p-GAL Negativa

HIP Negativa a-GAL Negativa PAL Positiva

ESC Negativa P-GUR Negativa LAP Positiva

H. Panel de identificación API Strep inoculado con S. mitis. Esta fotografía muestra la segunda mitad del panel de identificación. Las interpretaciones de las reacciones son las siguientes: ADH MAN TRE AMD

Negativa Negativa Positiva Positiva

RIB SOR INU GLYG

Negativa Negativa Negativa Negativa

ARA LAC RAF PHEM

Negativa Positiva Negativa Negativa

El biocódigo para las reacciones que se muestran en la lámina en color 13-4G y H es 0060411. La consul­ ta con la base de datos computarizada API proporciona una identificación de esta cepa como S. mitis (80%)/oralis (20%). S. mitis y S. oralis pertenecen al “grupo mitis” de estreptococos viridans. Se ha demos­ trado que algunas cepas de S. mitis son resistentes a la penicilina y pueden ser resistentes también a otros antibióticos.

LÁMINAS EN COLOR 14-1

E s p e c i e s d e L is t e r ia y E r y s i p e l o t h r i x

A. Frotis con tinción de Gram de Listeria monocytogenes, que muestra bacilos grampositivos cortos. B. Colonias p-hemolíticas pequeñas de L. monocytogenes en agar sangre de camero (SBA) después de 72 horas de incubación a 35-37 °C. C. L. monocytogenes que crece en SBA después de 24 horas (izquierda) y 48 horas (derecha) de incubación. Después de 24 horas, es posible que no sea obvia la naturaleza P-hemolítica del microorganismo. Después de 48 horas, la zona de hemolisis se extiende más allá del margen de la colonia, pero aún es algo sutil. D. L. monocytogenes en agar bilis esculina (derecha). El tubo de la izquierda es una porción inclinada de agar bilis esculina. Al igual que los enterococos, L. monocytogenes hidroliza la esculina en presencia de bilis al 40%. La hidrólisis de la esculina está indicada por el ennegrecimiento del medio. E. Zona de crecimiento en forma de paraguas producida por Listeria monocytogenes después de 24 horas de cultivo en medio de motilidad semisólido a 25 °C. F.

Panel API Coryne® inoculado con Listeria monocytogenes. El biocódigo API de la cepa que se muestra es 0170164. La consulta con el índice de perfiles API proporciona una identificación como “L. monocytogenes/innocua, probabilidad del 97,1%”. La diferenciación de L. monocytogenes y L. innocua está determina­ da por la evaluación de la hemolisis en agar sangre de carnero y por la reactividad de L. monocytogenes en la prueba de CAMP con S. aureus.

G. Frotis con tinción de Gram de Erysipelothrix rhusiopathiae, que muestra los bacilos grampositivos delga­ dos y largos de esta especie. H. Colonias de Erysipelothrix rhusiopathiae en SBA después de 24 horas de incubación a 35 °C.

LÁMINAS EN COLOR 14-2

E s p e c i e s d e E r y s ip e l o t h r ix y B a c il l u s

A. Erysipelothrix rhusiopathiae después del cultivo durante toda la noche en un tubo inoculado por estría y punción en agar hierro de Kligler. Obsérvese la producción de H2S a lo largo de la línea de punción en el extremo del tubo. B. Frotis con tinción de Gram de una especie de Bacillus. Obsérvese la presencia de endosporas centrales/ter­ minales carentes de tinción que no edematizan la célula. C. Muestra macroscópica intestinal de un paciente que murió por carbunco gastrointestinal. Se observa el apén­ dice en la parte inferior izquierda de la fotografía. En general, las lesiones del carbunco gastrointestinal se observan en el ciego y las zonas adyacentes del intestino. Los síntomas son dolor abdominal, hematemesis y diarrea sanguinolenta. D. Tinción de Gram (izquierda) y tinción de esporas con verde de malaquita (derecha) de B. anthracis. B. anthracis crece como bacilos grampositivos algo grandes y las células individuales tienen extremos cuadrados o ligeramente cóncavos. A menudo los microorganismos están dispuestos en cadenas que tienen el aspecto del bambú como se muestra aquí. La tinción muestra las esporas ovoides que no edematizan la célula. (Cortesía de Elmer W. Koneman). E. Colonias no hemolíticas, mate y blanco hueso de Bacillus anthracis en SBA. F.

Vista ampliada de colonias de B. anthracis en SBA. Las colonias tienen una morfología en vidrio esmerila­ do con excrecencias con forma de coma a lo largo de los bordes, como se muestra aquí. Estas excrecencias son incluso más evidentes desde el punto de vista microscópico. Las colonias han sido descritas como colo­ nias “en cabeza de Medusa”, en alusión a la hechicera griega cuya cabellera estaba compuesta por serpien­ tes. (Cortesía de Elmer W. Koneman).

G. Vista ampliada de las colonias no hemolíticas rugosas de B. anthracis. Se han tocado algunas con un ansa inoculadora, lo que provoca que las colonias “se paren” como claras de huevo batido. H. Grandes colonias P-hemolíticas de Bacillus cereus en SBA. B. cereus es una de las especies de Bacillus ais­ ladas con mayor frecuencia en el laboratorio clínico. A diferencia de B. anthracis, esta especie es P-hemo­ lítica, móvil y p-lactamasa positiva.

LÁMINAS EN COLOR 14-3

E s p e c ie s d e C o r y n e b a c t e r iu m A. Frotis con tinción de Gram que muestra la morfología típica de los miem bros del género Corynebacterium. Se pueden observar en esta fotografía bacilos de form a regular, bacilos con form a de porra ("en maza”) y disposiciones celulares “en letras chinas” y “en cerca” . B.

Agar BHI inoculado con una especie de Corynebacterium lipofílica y una no lipofílica. Del lado derecho de la placa, se ha inoculado una especie lipofílica como un césped sobre la placa y se ha colocado una gota de Tween 80 al 0,1% en el centro del inoculo. Se inocula una especie no lipofílica de Corynebacterium como un césped sobre la mitad izquierda de la placa. Después de la incubación durante 24 horas a 35-37 °C, sólo se observa crecim iento de la especie lipofílica donde se colocó la gota de Tween 80, mientras que la espe­ cie no lipofñica crece en toda la superficie del medio sobre el lado derecho de la placa.

C.

Corynebacterium amycolatum que crece en SBA después de 3 días de incubación a 35 °C. Obsérvese el aspecto m ate y seco de las colonias y el crecim iento “rugoso” en áreas confluentes. C. am ycolatum es la especie de Corynebacterium aislada más a menudo y se encuentra sobre la piel.

D. Panel API Coryne® inoculado con Corynebacterium amycolatum. Esta fotografía ilustra prim ero la mitad del panel de identificación. Las interpretaciones de las reacciones que se muestran son: NIT PAL ot-GLU URE E.

Positiva Positiva Negativa Negativa

PYZ Positiva (3-GUR Negativa p-NAG Negativa

PYRA Negativa P-GAL Negativa ESC Negativa

Panel API Coryne inoculado con Corynebacterium am ycolatum. Esta fotografía ilustra la segunda mitad del panel de identificación. Las interpretaciones de las reacciones que se muestran son: GEL GLU M AN SAC

Negativa Positiva Negativa Positiva

Control CHO Negativa RIB Positiva M AL Negativa GLY G Negativa

XYL Negativa LAC Negativa CAT Positiva

El biocódigo API Coryne para las reacciones que se m uestran en la lám ina en color 14-3D y E es 3100305, que da una identificación cruzada de Corynebacterium del grupo G, C. striatum o C. amycolatum. C. am y­ colatum es no lipofílico, mientras que las cepas de corineform es del grupo G son lipofñicas, de m odo que este m icroorganismo no es un corineforme del grupo G. Se necesitan otras pruebas (p. ej., crom atografía gas-líquido de cultivos en caldo de glucosa) para diferenciar C orynebacterium am ycolatum y Corynebacterium striatum entre sí. Esta cepa produjo ácido propiónico a partir de glucosa según lo deter­ minó el análisis m ediante crom atografía gas-líquido del caldo de cultivo, de modo que este microorganismo puede ser diferenciado de C. amycolatum. F.

Inflam ación local y form ación de seudomem branas en la orofaringe producida por cepas toxigénicas de Corynebacterium diphtheriae.

G. Cultivo de Corynebacterium diphtheriae en agar de Tinsdale modificado. En este medio, C. diphtheriae crece com o colonias negras con halos pardos. Las cepas cuyas colonias tienen esta m orfología son identifi­ cadas inicialm ente com o C. diphtheriae y el exam en ulterior requiere dem ostrar la producción de toxina diftérica. H. Cultivo de C. diphtheriae en medio de suero coagulado de Loeffler. Este medio es inoculado con material proveniente de la faringe posterior (la seudom em brana diftérica), se prepara un frotis después de unas 8 horas de incubación y se tiñe con azul de metileno. Com o se m uestra aquí, C. diphtheriae aparece como bacilos arrosariados pleom orfos. El aspecto arrosariado se debe a la producción de granulos metacromáticos por el microorganism o en este medio.

LÁMINAS EN COLOR 14-4

E s p e c ie s d e C o r y n e b a c t e r iu m (c o n t in u a c ió n ) A. Cultivo de C. diphtheriae en SBA después de 24 horas de incubación a 35 °C. Las colonias de este m icro­ organismo son no lipofílicas, blancas y cremosas. Esta cepa fue inoculada en el sistema de identificación API Coryne, y las reacciones bioquímicas para la identificación se m uestran en B y C a continuación. B.

Panel API Coryne® inoculado con C. diphtheriae. Esta fotografía ilustra la prim era mitad del panel de iden­ tificación. Las interpretaciones de las reacciones que se m uestran son: NIT PAL a-G L U URE

Positiva Negativa Positiva Negativa

PYZ Negativa p-GUR Negativa p-NAG Negativa

PY RA Negativa P-GAL Negativa ESC Negativa

C. Panel API Coryne inoculado con C. diphtheriae. Esta fotografía ilustra la otra m itad del panel de identifi­ cación. Las interpretaciones de las reacciones que se m uestran son: GEL GLU MAN SAC

Negativa Positiva Negativa Negativa

Control CHO RIB MAL GLYG

Negativa Negativa Positiva Negativa

XYL Negativa LAC Negativa CAT Positiva

El biocódigo API Coryne para estas reacciones es 1010124, que corresponde a una identificación de Corynebacterium diphtheriae (probabilidad del 97,8%). Se deben realizar otras pruebas para determ inar si la cepa produce toxina diftérica. D.

Corynebacterium jeikeium en SBA después de 48 horas de incubación a 35-37 °C. Esta especie lipofílica produce colonias no hemolíticas pequeñas en SBA.

E.

Panel API Coryne inoculado con Corynebacterium jeikeium . Esta fotografía ilustra la prim era mitad del panel de identificación. Las interpretaciones de las reacciones que se muestran son: NIT PAL a-G L U U RE

Negativa Positiva Negativa Negativa

PYZ Positiva P-GUR Negativa P-NAG Negativa

PY RA Negativa p-GAL Negativa ESC Negativa

F. Panel API Coryne inoculado con C. jeikeium . Esta fotografía ilustra la segunda mitad del panel de identifica­ ción. Las interpretaciones de las reacciones que se m uestran son: GEL GLU MAN SAC

Negativa Positiva Negativa Negativa

Control CHO RIB MAL GLYG

Negativa Positiva Negativa Negativa

X YL Negativa LAC Negativa CAT Negativa

El biocódigo API Coryne para estas reacciones es 2100304, que corresponde a la identificación de C. je i­ keium (93,6% de probabilidad). G. Frotis con tinción de Gram que m uestra los bacilos grampositivos algo pletóricos de Corynebacterium glucuronolyticum (“C. seminale”). H. C. glucuronolyticum en SBA después de 24 horas de incubación a 35-37 °C.

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LÁMINAS EN COLOR 14-5

E s p e c ie s d e C o r y n e b a c t e r iu m ( c o n t in u a c ió n ) A.

Panel API Coryne® inoculado con C. glucuronolyticum. Esta fotografía ilustra la primera mitad del panel de identificación. Las interpretaciones de las reacciones que se m uestran son: NIT PAL a-G L U URE

B.

Negativa Negativa Negativa Positiva

PY Z Positiva P-GUR Positiva p-NAG Negativa

PYRA P-GAL ESC

Negativa Negativa Positiva

Panel API Coryne inoculado con C. glucuronolyticum. Esta fotografía ilustra la segunda mitad del panel de identificación. Las interpretaciones de las reacciones que se m uestran son: GEL GLU MAN SAC

Negativa Positiva Negativa Positiva

Control CHO Negativa RIB Negativa MAL Positiva GLYG Negativa

XYL LAC CAT

Negativa Negativa Positiva

El biocódigo API para estas reacciones es 2241125, que corresponde a una identificación de C. glucuro­ nolyticum (probabilidad del 99,9%). Esta especie ha sido aislada en muestras de semen y es la única espe­ cie de Corynebacterium que es P-glucuronidasa (P-GUR) positiva. Esta especie tam bién fue descrita por otro grupo de investigadores y recibió el nombre de “C. sem inóle". Sin embargo, el nombre “C. glucuro­ nolyticum '’ tiene precedentes taxonóm icos. C. Colonias cremosas, lisas, no lipofílicas y no hemolíticas de Corynebacterium pseudodiptheriticum que cre­ cen en SBA después de 24 horas a 35-37 °C. D.

Panel API Coryne inoculado con Corynebacterium pseudodiphtheriticum. Las interpretaciones de las reac­ ciones que se muestran son: NIT PAL a-G L U URE GLU MAN SAC

Positiva Negativa Negativa Positiva Negativa Negativa Negativa

PYZ P-GUR P-NAG GEL RIB MAL GLYG

Positiva Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa

PYRA P-GAL ESC Control CHO XYL LAC CAT

Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Positiva

El biocódigo API para estas reacciones es 3001004, que corresponde a una identificación de C. pseudo­ diphtheriticum (probabilidad del 96,7%). E.

Colonias crem osas, no lipofílicas y no hem olíticas de C. riegelii en SBA después de 24 horas de incubación a 35-37 °C.

F.

Reacción de ureasa rápida de C. riegelii. C. riegelii, al igual que C. urealyticum, es rápidamente ureasa posi­ tivo. Esta fotografía m uestra un "pico de flauta” de agar urea sin sembrar (arriba) y un pico de flauta de agar urea inoculado con C. riegelii (abajo). Esta reacción fue fotografiada una vez incubado el pico de flauta a la derecha durante 30 m inutos a 35-37 °C.

G. Panel API Coryne inoculado con C. riegelii. Esta fotografía ilustra la prim era mitad del panel de identifica­ ción. Las interpretaciones de las reacciones que se m uestran son: N IT PAL a -G L U U RE

Negativa Negativa Negativa Positiva

PYZ Positiva p-GUR Negativa p-NA Negativa

PYRA Negativa p-GAL Negativa ESC Negativa

H. Panel API Coryne inoculado con C. riegelii. Esta fotografía ilustra la segunda mitad del panel de identifi­ cación. Las interpretaciones de las reacciones que se muestran son: GEL GLU M AN SAC

Negativa Negativa Negativa Negativa

Control CHO RIB MAL GLYG

Negativa Positiva Positiva Negativa

XYL Negativa LAC Negativa CAT Positiva

El biocódigo API para estas reacciones es 2001204. Este biocódigo no está incluido en la base de datos de A PI Coryne en la actualidad, pero es el m ism o publicado con la descripción original de esta nueva especie. C. riegelii se asocia con infecciones urinarias. Adem ás de ser rápidam ente ureasa positiva, esta especie tam ­ bién es atípica en que produce ácido a partir de m altosa y ribosa, pero no de glucosa, como se muestra aquí.

LÁMINAS EN COLOR 14-6

E s p e c ie s d e C o r y n e b a c t e r iu m . A r c a n o b a c t e r iu m y B r e v ib a c t e r iu m A. Colonias cremosas, no lipofílicas, no hemolíticas de Corynebacterium striatum en SBA después de 48 horas de incubación a 35-37 °C. Obsérvese la m orfología “en diana” de las colonias individuales. B.

Panel API Coryne® inoculado con C. striatum. Se muestran aquí las interpretaciones de las reacciones: NIT PAL ct-GLU URE GLU M AN SAC

Positiva Positiva Negativa Negativa Positiva Negativa Positiva

PYZ p-GUR (3-NAG GEL RIB MAL GLYG

Positiva Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa Negativa

PYRA Negativa p-GAL Negativa ESC Negativa Control CHO Negativa XYL Negativa LAC Negativa CAT Positiva

El biocódigo API para estas reacciones es 3100105, que corresponde a una identificación del Corynebacterium del grupo C, 55,5%/C. striatum-amycolatum. 43,6%. Com o las cepas grupo G son lipofí­ licas, este m icroorganism o es C. striatum o C. amycolatum y no produjo ácido propiónico a partir de glu­ cosa en el análisis por crom atografía gas-líquido, de modo que se identifica como C. striatum. C.

Corynebacterium del grupo G después de 24 horas de incubación a 35-37 °C. Después de 24 horas, las colo­ nias individuales son extrem adam ente pequeñas y ocurre un buen crecim iento sólo en las áreas con un inoculo importante. Esta especie lipofílica ha sido aislada en muestras de vitreo, sangre, líquido cefalorra­ quídeo y aparato urogenital.

D.

Panel API Coryne inoculado con Corynebacterium del grupo G. Se muestran aquí las interpretaciones de las reacciones: NIT PAL a-G L U URE GLU MAN SAC

Negativa Positiva Negativa Negativa Positiva Negativa Positiva

PYZ P-GUR P-NAG GEL RIB MAL GLYG

Positiva Negativa Negativa Negativa Positiva Positiva Negativa

PYRA Negativa P-GAL Negativa ESC Negativa Control CHO Negativa XYL Negativa LAC Negativa CAT Positiva

El biocódigo API para estas reacciones es 2100325. La consulta con una base de datos com putarizada pro­ porciona una identificación de Corynebacterium del grupo G (probabilidad del 76,6%)/C. striatum/amycolatum (probabilidad del 22,7%). Dado que este m icroorganism o es lipofílico y tanto C. striatum com o C. amycolatum son no lipofílicos, esta cepa puede ser identificada como Corynebacterium del grupo G. E.

F.

Cultivo de Arcanobacterium haemolyticum en SBA luego de 48 horas de incubación a 35-37 °C. Obsérvese la zona de p-hem ólisis que rodea a las colonias. Panel API Coryne inoculado con A. haemolyticum. Se m uestran aquí las interpretaciones de las reacciones: NIT PAL a-G L U URE GLU MAN SAC

Negativa Positiva Positiva Negativa Positiva Negativa Negativa

PYZ p-GUR P-NAG GEL RIB M AL GLYG

Positiva Negativa Positiva Negativa Positiva Positiva Negativa

PYRA Positiva P-GAL Positiva ESC Negativa Control CHO Negativa XYL Negativa LAC Positiva CAT Negativa

El biocódigo API para estas reacciones es 6530360, que corresponde a una identificación de A. haem olyti­ cum del 99,9% (identificación excelente). G. Cultivo de Brevibacterium casei en SBA después de 24 horas de incubación a 35-37 °C. Las colonias de este m icroorganism o tienen un pigm ento amarillo pálido, que se intensifica durante la incubación más ailá de las 24 horas. Estas cepas también tienen un fuerte olor que recuerda a la gomosis (“podredum bre del pie”). Esta cepa particular se aisló en hemocultivos múltiples de un paciente con SIDA que tenía una infec­ ción asociada con una vía central. H. Panel API Coryne inoculado con B. casei. Se m uestran aquí las interpretaciones de las reacciones: NIT PAL a-G L U URE GLU MAN SAC

Negativa Positiva Positiva Negativa Negativa Negativa Negativa

PYZ p-GUR P-NAG GEL RIB MAL GLYG

Positiva Negativa Negativa Positiva Negativa Negativa Negativa

PYRA Positiva p-GAL Negativa ESC Negativa Control CHO Negativa XYL Negativa LAC Negativa CAT Positiva

El biocódigo API para estas reacciones es 6112004, que corresponde a una identificación de especie de Brevibacterium. Pruebas adicionales confirm aron que la cepa de este hemocultivo era en efecto B. casei.

LÁMINAS EN COLOR 14-7

E s p e c ie s d e R o t h ia . C e l l u l o s im ic r o b iu m , C e l l u l o m o n a s / M

ic r o b a c t e r iu m y

L a c t o b a c il l u s

A. Crecim iento de Rothia dentocariosa en SBA después de 48 horas de incubación a 35-37 °C. Este microor­ ganismo bacilar grampositivo está relacionado con microorganismos nocardiform es y form a colonias secas, blancas y cerebriform es en medios de agar, com o se muestra aquí. B.

Panel API Coryne® inoculado con R. dentocariosa. Se m uestran aquí las interpretaciones de las reacciones: NIT PAL cc-GLU URE GLU MAN SAC

Positiva Negativa Positiva Negativa Positiva Negativa Positiva

PYZ p-GUR P-NAG GEL RIB M AL GLYG

Positiva Negativa Negativa Negativa Negativa Positiva Negativa

PYRA P-GAL ESC Control CHO XYL LAC CAT

Positiva Negativa Positiva Negativa Negativa Negativa Positiva

El biocódigo API para estas reacciones es 7050125, que corresponde a una identificación de R. dentocario­ sa, con una probabilidad del 99,5%. C.

Cultivo de Cellulosimicrobium cellulans en SBA después de 24 horas a 35-37 °C. Este m icroorganism o de pigm ento amarillo brillante era denom inado antes Oerskovia xanthineolytica.

D.

Panel API Coryne inoculado con C. cellulans. Se muestran aquí las interpretaciones de las reacciones: NIT PAL oc-GLU URE GLU MAN SAC

Positiva Positiva Positiva Negativa Positiva Negativa Positiva

PYZ P-GUR P-NAG GEL RIB MAL GLYG

Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva Positiva Positiva

PYRA Positiva P-GAL Positiva ESC Positiva Control CHO Negativa XYL Positiva LAC Negativa CAT Positiva

El biocódigo API para estas reacciones es 7572727, que corresponde a una identificación de Oerskovia xanthineolytica (C. cellulans), con una probabilidad del 99.9%. E.

Cultivo de una especie de Microbacterium con pigm entación am arilla en SBA después de 24 horas a 3537 °C.

F.

Panel API Coryne inoculado con especies de Microbacterium. Se muestran aquí las interpretaciones de las reacciones: NIT PAL (X-GLU URE GLU MAN SAC

Negativa Positiva Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva

PYZ p-GUR P-NAG GEL RIB M AL GLYG

Positiva Negativa Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva

PYRA Negativa p-GAL Positiva ESC Positiva Control CHO Negativa XYL Positiva LAC Negativa CAT Positiva

El biocódigo API para este microorganism o es 2570737, que corresponde a una identificación de especies de Cellulomonas/especies de Microbacterium (probabilidad del 99,9% ). Se necesitan otras pruebas para separar estos dos géneros. G. Frotis con tinción de Gram de un hemocultivo que dio especies de Lactobacillus. Estos microorganismos son bacilos grampositivos regulares que se presentan solos, de a pares o en cadenas cortas. H. Colonias pequeñas de una especie de Lactobacillus no hem olítica que crece en SBA después de 24 horas de incubación a 35-37 °C.

LÁMINAS EN COLOR 14-8

E s p e c ie s d e L a c t o b a c il l u s y G a r d n e r e l l a A. Especies de Lactobacillus inoculadas com o un césped en una placa de SBA con un disco de vancomicina. Algunos lactobacilos son resistentes a los antibióticos glucopéptidos vancom icina y teicoplanina, com o lo indica el crecim iento de los microorganism os hasta el borde del disco de vancom icina que se muestra aquí. B.

Frotis con tinción de Gram de una muestra vaginal normal. Obsérvese la presencia de las grandes células epiteliales y los bacilos grampositivos que corresponden al “morfotipo de lactobacilo” .

C. Frotis con tinción de Gram de material recogido de la vagina de una paciente con vaginosis bacteriana. La célula epitelial que se m uestra en el portaobjetos está cubierta por una preponderancia de bacilos y cocobacilos gramnegativos, que representan bacilos gramnegativos anaerobios y “morfotipos de Gardnerella". D. Cultivo de G. vaginalis en agar sangre CNA con 48 horas de incubación a 35-37 °C en C O , al 5-7%. Después de este período, las colonias son muy pequeñas y es m ejor observarlas en áreas de crecim iento con­ fluente. E.

Colonias p-hem olíticas pequeñas de Gardnerella vaginalis que crece en medio HBT (bicapa de sangre humana-Tween) después de 72 horas de incubación a 35-37 °C en C O , al 5-7%. Este m icroorganismo es P-hemolítico en medio que contiene sangre hum ana (al igual que agar HBT).

F.

Técnica de utilización rápida de hidratos de carbono para la identificación de G. vaginalis. Este procedi­ miento de identificación de 4 horas es similar al utilizado para la identificación de especies de Neisseria (cap. 11). Se fraccionan en tubos pequeños volúmenes de 0,10 m L una solución salina am ortiguada con rojo fenol y sin hidratos de carbono (BSS) y se agrega una gota de hidratos de carbono esterilizados con filtro a la BSS. Se prepara una suspensión densa del m icroorganismo en BSS sin hidratos de carbono (0,5 mL) y se agrega una gota de esta suspensión a los tubos que contienen hidratos de carbono. En la fotografía, los tubos individuales son (de izquierda a derecha) la suspensión del microorganism o en BSS, BSS-glucosa, BSS-m altosa y BSS-manitol. El último tubo (extremo derecho) es una prueba de hidrólisis de hipurato. Com o se muestra, G. vaginalis produce ácido a partir de glucosa y maltosa, pero no de manitol, y es fuer­ tem ente hidrólisis de hipurato positivo.

LÁMINAS EN COLOR 15-1

I d e n t if ic a c ió n

d e b a c il o s g r a m p o s it iv o s a e r o b io s y a n a e r o b io s fa c u lt a t iv o s

A. Vista am pliada de Nocardia asteroides después de 7 días de incubación a 30 °C en agar de M iddlebrook 7H 1 1. Se observan aquí las colonias onduladas, lisas y anaranjadas típicas que tienden a adherirse a la super­ ficie del agar. Otras especies producen colonias correosas, secas y blancas (véase lám ina en color 1-5J). Cabe m encionar que las especies de Nocardia crecen en los medios de aislam iento selectivos utilizados para aislar las especies de M ycobacterium ; de hecho, el diagnóstico de laboratorio de nocardiosis a menudo se sospecha por prim era vez en la sección de m icobacteriología del laboratorio. Reconocer el olor a “sótano húm edo” característico es un dato inicial útil para la identificación. B.

Crecim iento de un cultivo de especies de Rhodococcus luego de 48 horas de inoculación en una placa de agar de M iddlebrook 7H 11. Las colonias son relativamente grandes, varían en tam año de 2 a 4 m m de diá­ metro, y son enteras y lisas. Obsérvese la pigm entación rosa salmón, un dato inicial para la identificación de esta especie.

C. Tinción ácido-alcohol resistente parcial de un exudado que contiene filamentos ram ificados delicados ácidoalcohol resistentes característicos de las especies de Nocardia. Se aisló Nocardia asteroides del cultivo obte­ nido de esta muestra. D. Tinción de Gram de las especies de Rhodococcus que muestra cocobacilos grampositivos cortos dispuestos solos y en grupos en form a de caracteres chinos. E.

Tinción ácido-alcohol resistente de especies de Rhodococcus. Se observan cocobacilos cortos, m uchos de los cuales son ácido-alcohol resistentes.

LÁMINAS EN COLOR 16-1

I d e n t if ic a c ió n

d e b a c t e r ia s a n a e r o b ia s : b a c il o s g r a m n e g a t iv o s

A. Bacteroides fragilis. Tinción de Gram de células a las 48 horas de un cultivo en caldo de tioglicolato. B.

B. fragilis. Colonias en agar sangre para anaerobios después de 48 horas de incubación a 35 °C.

C.

Prevotella melaninogenica. Tinción de Gram de las células de una colonia luego de 48 horas del cultivo en agar sangre.

D. P. melaninogenica. Colonias negras en agar sangre después de 5 días de incubación a 35 °C. E.

Fusobacterium nucleatum. Tinción de Gram de las células de una colonia luego de 48 horas en agar sangre para anaerobios. Nótense bacilos gramnegativos alargados con extremos aguzados.

F.

F. nucleatum. Colonias características desarrolladas en agar sangre para anaerobios después de 48 horas de incubación a 35 °C, que ilustra el efecto opalescente.

G. F. necrophorum. Tinción de Gram de células desarrolladas a las 48 horas en un medio anaerobio con agar sangre. Se evidencia gran pleomorfismo. H. F. necrophorum. Colonias en agar sangre para anaerobios después de 48 horas de incubación a 35 °C.

LÁMINAS EN COLOR 16-2

I d e n t if ic a c ió n

d e b a c t e r ia s a n a e r o b ia s : m ic r o o r g a n is m o s g r a m p o s it iv o s

no fo r m a d o r es d e espo ra s

A.

Frotis directo con tinción de Gram de un exudado purulento que muestra neutrófilos desintegrados y una m ezcla de bacilos gramnegativos de distintos tamaños. Los cocobacilos más pequeños indican una de las especies de Prevotella-Porphyromonas pigm entadas; los más grandes, bacilos pleomorfos sugieren un miembro del grupo Bacteroides fragilis.

B. Frotis directo con tinción de Gram de un exudado purulento de un absceso intraabdom inal, que m uestra neu­ trófilos segmentados, cocos grampositivos en pares y cadenas cortas, y bacilos gramnegativos minúsculos. Las infecciones anaerobias a menudo contienen una flora bacteriana mixta. C . Vista con m icroscopio de bajo aumento de los gránulos de azufre actinom icóticos (lOx). (Exudado de una infección de herida abdominal fotografiada dentro de una placa de Petri). D. Aspecto de un frotis con tinción de Gram de la m ism a m uestra que en C, en la que se observa gránulos de azufre con filamentos ram ificados delgados de una especie de Actinom yces (800x). E . A ctinom yces israelii. Preparación con tinción de Gram del crecim iento de una colonia en agar sangre. Nótense las células ramificadas. F.

A. israelii. Colonias características en forma de "m olar" desarrolladas en agar con infusión de cerebro y corazón después de 7 días de incubación anaerobia a 35 °C.

G . Eubacterium alactolyticum. Tinción de Gram de células provenientes de un cultivo en caldo de tioglicolato enriquecido después de 48 horas de incubación a 35 °C. H. E. alactolyticum. Colonias de 48 horas en agar sangre para anaerobios.

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LÁMINAS EN COLOR 16-3

I d e n t if ic a c ió n

d e b a c t e r ia s a n a e r o b ia s : c l o s t r id io s

A.

Clostridium perfringens. Tinción de Gram de células de una colonia de 24 horas en agar sangre. N ótese la falta de esporas y de algunas células que tienden a teñirse de rojo (gramnegativas).

B.

C. perfringens. Tinción de Gram de células a partir de cultivo de 24 horas en caldo de tioglicolato. Nótese la falta de esporas y la presencia de unas pocas form as filamentosas.

C. Apariencia típica de C. perfringens en agar sangre después de 24 horas de incubación a 35 °C. Nótese la doble zona de hemolisis. La zona interna de hem olisis com pleta se debe a la toxina theta y la zona externa de hemolisis incom pleta a la toxina alfa (con actividad lecitinasa). D.

C. perfringens. Tinción de Gram directa de un tejido m uscular aspirado de un paciente con m ionecrosis por gangrena gaseosa. Hay un fondo necròtico, sin células inflamatorias ni células m usculares, y bacilos gram ­ positivos en form a de “furgón de carga” relativamente grandes y un bacilo gramnegativo que es una célula C. perfringens gram variable u otro microorganismo.

E.

Colonias de C. perfringens en agar yem a de huevo de M cClung modificado. El precipitado alrededor de las colonias indica actividad lecitinasa de la toxina alfa producida por el m icroorganismo.

E

Producción de lipasa en agar yema de huevo. Unos pocos clostridios, com o C. botulinum, C. sporogenes y C. novyi tipo A, muestran actividad lipasa en agar yem a de huevo, com o se muestra aquí. Nótese la capa per­ lada opalescente sobre la superficie de las colonias que se extiende encim a de la superficie del medio y las rodea.

G . C. septicum. Colonias extendidas, rizoides, chatas, irregulares, rugosas en una placa de agar sangre para ana­ erobios luego de 48 horas de incubación. H . Frotis directo con tinción de Gram de un hemocultivo positivo que contenía C. septicum. Se observan num e­ rosas esporas subterminales ovoides o en forma de limón.

LÁMINAS EN COLOR 16-4

I d e n t i f i c a c i ó n d e b a c t e r i a s a n a e r o b i a s : C l o s t r i d i o s ( c o n t in u a c ió n ) A. Colonias de C. tetani en agar sangre condensado (4% de agar), que se usa para inhibir el desplazam iento de los microorganism os de m odo que puedan ser aislados a partir de otras bacterias presentes en cultivos mixtos. B.

C. tetani. Tinción de Gram de las células de un cultivo en caldo con glucosa y carne picada. Algunas de las células tienen esporas term inales redondas, características de C. tetani.

C.

C. sporogenes. Colonias en forma de “cabeza de m edusa” a las 48 horas del cultivo en agar sangre para ana­ erobios.

D.

C. ramosum. Tinción de Gram de un cultivo en caldo con tioglicolato después de 48 horas de incubación.

E.

C. difficile luego de 48 horas de incubación en agar sangre para anaerobios (m agnificación original 2,8x).

F.

C. difficile en agar fructosa cicloserina-cefoxitina después de 48 horas de incubación.

G . C. sordellii en agar sangre para anaerobios luego de una incubación prolongada en anaerobiosis. La colonia es de 5 x 10 mm. H . C. sordellii. Tinción de Gram a partir de una placa de agar sangre de 2 días que revela grupos de esporas libres y bacterias distendidas con esporas subterminales ovoideas.

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LÁMINAS EN COLOR 16-5

I d e n t i f ic a c i ó n d e b a c t e r i a s a n a e r o b i a s : u s o d e p l a c a s c u a d r a n t e s p r e s u m p t o y d i s c o s e n a g a r s a n g r e p a r a a n a e r o b io s

A. Vista de tres placas en cuadrantes (descritas en detalle en el texto). B.

Una placa en cuadrantes Presum pto 1 y una placa de agar sangre para anaerobios de los CDC. Después de la inoculación con un cultivo de caldo activo o una suspensión celular de la cepa por identificar, los discos de antibióticos (penicilina, 2 U; rifam picina, 15 g; kanamicina, 1 000 g) se colocan en el medio de agar san­ gre, y se coloca un disco de papel de filtro en blanco sobre la porción de agar LD de la placa cuadrante para usarlo en la detección de la producción de indol. La placa Presum pto 1 contiene los siguientes medios: agar LD, esculina LD, agar yem a de huevo LD y agar bilis LD.

C. Cultivo de Bacteroides fragilis en una placa Presum pto 1 después de 48 horas de incubación a 35 °C. En el prim er cuadrante (arriba, a la derecha), el agar LD muestra un crecim iento moderado. La producción de indol puede detectarse por el agregado de una gota de para-dim etilam inocinam aldehído a un disco de papel (véase F). El agar esculina LD hacia la izquierda del agar LD está oscuro en form a difusa a causa de la hidrólisis de la esculina. El agar yema de huevo LD debajo del agar esculina muestra buen crecim iento pero no evidencia actividad lecitinasa, lipasa o proteolítica. Hay un crecim iento abundante en el agar bilis LD (abajo, a la derecha) y se produce un precipitado característico en el medio por esta cepa.

D. Pruebas con discos de antibióticos. Se observa una zona de inhibición del desarrollo alrededor del disco de 15 g de rifam picina. pero no se advierte inhibición del desarrollo alrededor del disco de 2 unidades de peni­ cilina o del disco de 1 000 g de kanamicina. Este patrón es característico del grupo B. fragilis. E.

Reacciones en placa en cuadrantes Presum pto 1 de B. thetaiotaomicron. El prim er cuadrante (arriba. a la derecha) m uestra una reacción positiva débil de indol, como lo indica el círculo celeste sobre el agar LD después del agregado del reactivo para-dimetilaminocinamaldehído. El color negro (ambarino) del agar escu­ lina (izquierda del prim er cuadrante) indica hidrólisis de esculina. Hay un desarrollo adecuado pero no hay actividad lecitinasa, lipasa o proteólisis en agar yem a de huevo LD (abajo, a la izquierda). Hay un buen cre­ cimiento en agar bilis LD pero no hay precipitado com o el que tiene B. fragilis (abajo, a la derecha).

F.

Reacciones en placa Presum pto 1 de Fusobacterium necrophorum después de 48 horas de incubación a 35 °C. El prim er cuadrante (abajo, a la derecha) m uestra una fuerte reacción de indol evidenciada por el color azul oscuro del disco de papel en el agar LD después del agregado del reactivo para-dim etilam inoci­ nam aldehído. El desarrollo se inhibe en agar bilis LD (arriba, a la derecha). Aunque no está visible en esta fotografía a causa de la distribución de la ilum inación, hay un buen crecim iento en agar yem a de huevo LD (arriba, a la izquierda) y actividad lipasa característica com o se evidencia por un brillo iridiscente -u n a capa p erlada- sobre la superficie de las colonias y en el medio que rodea el crecim iento bacteriano. Esto se dem uestra m ejor con luz reflejada. En agar esculina LD (abajo, a la izquierda), F. necrophorum muestra un buen crecim iento y producción de sulfuro de hidrógeno, com o se evidencia por el color negro de las colo­ nias, pero no oscurece el medio para sugerir hidrólisis de esculina.

G . Placa en cuadrantes Presum pto 2 (sin inocular). La placa contiene los siguientes cuadrantes (en el sentido de las agujas del reloj, com enzando a las 12 en punto): agar alm idón LD, agar glucosa LD, agar DNA-LD y agar leche LD. H . Placa en cuadrantes Presum pto 2 luego de inoculación, incubación y agregado de reactivos. Nótense las reacciones positivas para hidrólisis, actividad desoxirribonucleasa y ferm entación de glucosa.

LÁMINAS EN COLOR 18-1

M

ic o p l a s m a s y

U

r ea pla sm a s

A. Colonia de M. pneum oniae en agar glucosa para micoplasm a. Esta fotografía muestra una colonia aislada del m icroorganism o a la cual se le han adsorbido entrocitos de cobayo. M. pneyumoniae es la única especie que dem uestra la propiedad de hemadsorción. (La fotografía es cortesía de Health and Education Resources. Bethesda, MD). B.

Colonia de M. hominis y U. urealyticum que crece en el agar diferencial A7B de Shepard. Las colonias de M. hominis tienen la m orfología típica en huevo frito, el color azul se debe a la tinción de Diene. Las colo­ nias de U. urealyticum son más pequeñas y densas, y presentan una pigm entación castaña debido a la pre­ cipitación de óxido de manganeso por la acción de la enzima ureasa de los microorganismos. (La fotogra­ fía es cortesía de Health and Education Resources. Bethesda, MD).

IT

A

LÁMINAS EN COLOR 19-1

Id e n tific a c ió n d e la b o r a to r io d e M

y c o b a c t e r iu m t u b e r c u l o s is

A.

M icrofotografía de un frotis de una colonia sim ilar a la ilustrada en la lám ina en color 19-1C, teñido con auram ina-rodam ina. Obsérvese la fluorescencia am arillo brillante de los bacilos muy cortos y ligeram ente curvos. Aunque la morfología celular es sugestiva de Ai. tuberculosis, se debe realizar un examen bajo óptica de mayor potencia y la confirmación con cultivo antes de lograr la identificación de una especie definitiva.

B.

M icrofotografía de una tinción ácido-alcohol resistente de Kinyoun de un frotis de m aterial obtenido de un tuberculom a necròtico del pulmón. Obsérvense los bacilos relativamente cortos, delgados, arrosariados, ligeram ente curvos y teñidos de rojo. Aunque no se pueden hacer identificaciones de especies sólo a partir de frotis ácido-alcohol resistentes, el aspecto aquí es altam ente com patible con M. tuberculosis.

C. M icrocolonia que crece sobre la superficie del agar de M iddlebrook 7H10, observada con m icroscopio ópti­ co de baja potencia. A dviértase que las células bacterianas están dispuestas en un patrón ondulante y serpi­ ginoso. Esto indica la producción de un factor productor de cordones, como se observa en la tinción ácidoalcohol resistente que se m uestra en la lám ina en color 19-11. D. Prueba de acum ulación de niacina. Los tubos contienen una tira de papel de filtro im pregnada con brom u­ ro de cianògeno. El líquido en el tubo de la derecha ha sido extraído de la superficie del medio de cultivo de Lowenstein-Jensen después del crecim iento de colonias de una especie de M ycobacterium desconocida, en com paración con el control de agua negativo de la izquierda. El desarrollo de un color amarillo sobre la tira y en el líquido subyacente indica la presencia de niacina. Ai. tuberculosis tiene la propiedad singular de acum ular niacina cuando las colonias crecen en el m edio de Low enstein-Jensen, propiedad com partida por Ai. simiae en form a m enos frecuente y por cepas ocasionales de Ai. marínum. E.

Tubos que m uestran la prueba de reducción de nitrato. El tubo de la derecha ha sido inoculado con una espe­ cie de M ycobacterium desconocida, en com paración con un control no inoculado de la izquierda. El desa­ rrollo de color rojo luego del agregado de los reactivos de sulfamida y oi-naftiletilenediamina indica la pre­ sencia de nitritos y una prueba positiva. M. tuberculosis es un reductor activo de nitratos.

F.

Placa de cuadrante que contiene agar de M iddlebrook 70H10 en el cual se había incorporado hidrazida del ácido tiofeno-2-carboxílico (T2H). Los tres cuadrantes en los cuales se observa crecim iento son cepas dife­ rentes de Ai. tuberculosis (resistentes a T,H); el cuadrante sin crecim iento fue inoculado con una cepa de Ai. bovis. L a capacidad para crecer o no crecer en el medio que contiene T ,H es útil para separar M. tuberculo­ sis de M. bovis, respectivamente.

G. Frasco de m edio de Low enstein-Jensen en el cual están creciendo colonias de M. tuberculosis después de una incubación de 22 días a 35 °C en una estufa de incubación con C O z al 10%. Las colonias que se obser­ van aquí son claram ente rugosas; sin embargo, tienen m ás de una pigm entación amarilla que las colonias de color beige que se observan habitualm ente. H. Colonias de un subcultivo de Ai. tuberculosis que crecen en agar de M iddlebrook 7H10 después de una incu­ bación de 25 días a 35 °C en una estufa de incubación con C 0 2 al 10%. Las colonias tienen un aspecto rugo­ so y de color beige, característico de la especie. I.

M icrofotografía de una tinción ácido-alcohol resistente de Kinyoun preparada de caldo de un frasco de cul­ tivo de sangre BACTEC 12A después de una incubación de 10 días a 35 °C. Se observan muchos bacilos ácido-alcohol resistentes, dispuestos en vainas paralelas. Cuando se observa el agregado de células bacte­ rianas, com o se m uestra aquí, en frotis de un preparado de caldo, se puede hacer una identificación presun­ tiva de M ycobacterium tuberculosis, porque el fenóm eno se debe a la producción del factor form ador de cor­ dones, que se cree que es un factor de virulencia.

J.

M icrofotografía de una tinción de Gram de un frotis de líquido pleural de un caso de em piem a en un pacien­ te con SIDA. Obsérvense los bacilos relativamente largos, delgados, con arrosariado delicado y escasa tin­ ción. Debido a su cubierta externa cérea y gruesa, las células bacterianas de las m icobacterias no se tiñen bien con violeta de genciana, la tinción prim aria utilizada en la tinción de Gram. Obsérvese el halo defini­ do alrededor de los bacilos, un indicio de que el m icroorganism o está encapsulado y es sugestivo de una especie de M ycobacterium . E n este caso Ai. tuberculosis creció en cultivo.

LÁMINAS EN COLOR 19-2

I d e n t i f i c a c i ó n d e l a b o r a t o r i o d e e s p e c ie s d e M DE M . TUBERCULOSIS

y c o b a c t e r iu m

d is tin ta s

A. M icrofotografía de microcolonias de M. avium que crecen en agar de M iddlebrook 7H10 después de una incubación de 6 días a 35 °C en C 0 2 al 10%. Las m icrocolonias translúcidas, delgadas y planas, con una ele­ vación um bilicada más oscura central, semejante a un huevo frito, son características de las cepas lisas de M. avium aisladas com únm ente en pacientes con SIDA. La observación de este tipo de m icrocolonias puede ser útil para inducir la realización de una sonda de ácidos nucleicos del com plejo M. avium/M . intracellu­ lare en la confirm ación rápida con cultivo de un aislam iento desconocido. B.

M icrofotografía con más aum ento de una única microcolonia del com plejo M. avium/M. intracellulare, que m uestra nuevamente la colonia delgada y translúcida descrita en la lám ina en color 19-2A. Las proyeccio­ nes periféricas de aspecto rizoide, com o se m uestran aquí, se observan a m enudo y proporcionan un indicio agregado para la identificación presuntiva de m icroorganismos del com plejo M. avium/M. intracellulare.

C. Dos placas de agar de M iddlebrook 7H10, cada una inoculada con el m ism o subcultivo de M. kansasii. La placa de la izquierda fue expuesta a la luz; la de la derecha se mantuvo en la oscuridad hasta inm ediatamente antes de que se tom ara la microfotografía. El pigm ento am arillo de las colonias en la placa expuesta a la luz es característico de un fotocromógeno.

D. Dos placas de agar de M iddlebrook 7H10 cada una inoculada con el m ism o subcultivo de M. scrofulaceum. La placa de la izquierda fue expuesta a la luz; la de la derecha se mantuvo en la oscuridad hasta inm ediata­ mente antes de que se tom ara la m icrofotografía. El pigm ento am arillo de las colonias tanto en la placa expuesta a la luz com o en la no expuesta a la luz es característico de un escotocrom ógeno. E.

Una placa de agar de M iddlebrook 7H 10 previam ente inoculada con una cepa de M. gordonae; M. gordonae es un escotocrom ógeno y produce característicam ente una pigm entación amarilla intensa, com o se m uestra aquí.

F.

Se inoculan varios tubos que contienen concentraciones de nitrato de sodio con buffer con distintas cepas de especies de M ycobacterium para ilustrar las reacciones 1+ (segundo tubo desde la izquierda) a 4+ (el tubo más hacia la derecha). Se desarrolla color rojo luego del agregado de los reactivos sulfanilam ida y N-naftiletilenediam ina; la intensidad del color refleja la concentración de los nitritos producidos. La prueba cuan­ titativa de reducción de nitratos puede ser útil para diferenciar las cepas de M. tuberculosis (4+ positiva) de M. bovis (1+ positiva) y M. kansasii (4+ positiva) de otro fotocrom ógeno (negativo a 1+ positivo).

G. Dos tubos que contienen reactivo Tween 80. El tubo de la izquierda había sido inoculado con una cepa con­ trol negativa, el tubo de la derecha, con un subcultivo de M. kansasii. El desarrollo de color rojo (tubo de la derecha) después de la incubación durante 3 a 10 días es una prueba positiva, lo que indica la capacidad de la cepa de la prueba para hidrolizar Tween 80. El cambio de color de amarillo a rojo en este ensayo no se de­ be a un cam bio del pH, antes bien, es el resultado de un cam bio en la densidad óptica a m edida que se produ­ ce ácido oleico y sorbitol polioxietilado com o productos de degradación de la hidrólisis de Tween 80.

H. Dos tubos de profundidad de Lowenstein-Jensen previamente inoculados con un control catalasa-negativo (tubo de la izquierda) y un subcultivo de M. kansasii (tubo de la derecha). Obsérvese el área alta de form a­ ción de burbujas en el tubo de la derecha después del agregado de peróxido de hidrógeno a la superficie del agar, que excede los 45 mm, lo que indica una prueba positiva y una actividad de catalasa fuerte. I.

Prueba de la catalasa positiva. Inm ediatam ente antes de tomar la microfotografía. se colocaron algunas gotas de peróxido de hidrógeno en las colonias aisladas de las colonias fotocrom ógenas de M. kansasii. La evo­ lución de burbujas rápidas, com o se m uestra aquí, indica una prueba positiva, lo que señala una actividad de catalasa activa.

J.

Dos tubos de base de caldo de Dubos, el de la derecha contiene reactivo bisulfato de fenoftaleína tripotásico (reactivo de arilsulfatasa) y se com para con un tubo control negativo a la izquierda desprovisto de reac­ tivo. Am bos tubos habían sido inoculados con un subcultivo de una cepa de M. fortuitum . El desarrollo de color rosado luego del agregado de un reactivo de carbonato de sodio en el tubo de la izquierda indica una prueba positiva y actividad de arilsulfatasa de la cepa de prueba.

LÁMINAS EN COLOR 19-2

K. Dos tubos de caldo de urea inoculados previam ente con un control negativo (tubo de la izquierda) y un subcultivo de M. gordonae (derecha). Las cepas de m icobacterias que tienen actividad de ureasa viran el rosado del caldo en varias horas (positivo fuerte) a algunos días, debido a la liberación de amoníaco y a la alcalinización del medio. L a evaluación de la actividad de ureasa puede ser útil para separar M. gordonae (positivo fuerte) de otros escotocrom ógenos y el com plejo M. fortuitum -chelonae de otros bacilos de cre­ cim iento rápido. L.

Dos tubos de base de caldo de Dubos, el de la izquierda contiene pirazinam ida y el de la derecha, un con­ trol negativo desprovisto de reactivo. Ambos tubos habían sido inoculados con un subcultivo de una cepa de M. avium. El desarrollo de una banda rosado roja en la capa de reactivo hacia la superficie del agar en el tubo de la izquierda, después del agregado de reactivo de sulfato am ónico ferroso, indica una prueba posi­ tiva y la capacidad de esta cepa para desam inar la pirazinamida.

M. M icrofotografía de un frotis ácido-alcohol resistente de un subcultivo de M. kansasii. Las células bacteria­ nas de M. kansasii se describen como rectangulares, rectas y con bandas, lo que está razonablem ente repre­ sentado aquí. A causa de la variación entre las cepas y entre las otras especies, en el m ejor de los casos es riesgoso hacer una identificación presuntiva de la especie de M ycobacterium sobre la base de una m orfolo­ gía de la tinción ácido-alcohol resistente. N.

Placa de agar de M iddlebrook 7H10 inoculada previam ente con un subcultivo de una cepa clásica de M. avium. Las cepas clásicas de M. avium fueron incluidas al principio en los no fotocrom ógenos del grupo III en la clasificación de Runyon. Estas colonias son relativamente pequeñas, lisas y blanco grisáceas, sin evi­ dencia de pigmentación.

O. Placa de agar de M iddlebrook 7H10 inoculada previam ente con una cepa del com plejo M. avium-intracellulare (MAI) aislada en un paciente con SIDA. M uchas de las cepas de M A I aisladas en pacientes con SIDA tienen esta pigm entación am arilla definida. La m ayoría de las cepas aisladas en el Denver Veterans Hospital a com ienzos de la década de 1990 han producido colonias peculiares con form a de rosquilla, pero proba­ blem ente no sea una característica definida de todas las cepas. P.

M icrofotografía con bajo aum ento de una biopsia hepática de un paciente con SIDA también infectado por M. avium-intracellulare. Obsérvense los cúmulos intracelulares densos de bacilos ácido-alcohol resistentes y cortos en la porción central de la fotografía.

Q. Placa de agar de M iddlebrook 7H10 inoculada 3 días antes con una cepa de M .fortuitum e incubada a 35 °C en C O , al 10%. Las colonias prom edian 1 a 2 mm de diámetro, son enteras, lisas, húmedas y están despro­ vistas de pigm entación. El com plejo M. fortuitum -chelonae de m icroorganism os fue asignado originaria­ mente al grupo IV de Runyon, los bacilos de crecim iento rápido. R. Placa de agar de M acConkey modificado (desprovisto de violeta de genciana) sobre la cual crecen colonias tomadas de un subcultivo de M. fortuitum . Las cepas que pertenecen a M. fortuitum -chelonae tienen la capa­ cidad singular de crecer en agar de M acConkey modificado. Las colonias miden en prom edio 2 mm de diá­ m etro y tienen bordes continuos, son húm edas y presentan un tinte am arillo-rosado leve debido al pigm en­ to derivado del agar. S.

Placa de agar sangre de cam ero al 5% con un crecim iento de M .fortuitum . Las cepas que pertenecen al com ­ plejo M. fortuitum -chelonae crecen en agar sangre de cam ero al 5% dentro de las 48 a 72 horas y pueden confundirse con otros microorganism os bacilares gram positivos si no se realiza una tinción parcial ácidoalcohol resistente.

T. M icrofotografía de una tinción de Gram de un frotis de una colonia aislada que se m uestra en la lám ina en color 19-2S. Las células bacterianas aparecen com o cocobacilos grampositivos cortos, delgados y casi fila­ m entosos y de tinción débil. Los microscopistas deben tener en cuenta esta imagen y no deben hacer una identificación presuntiva erróna de una especie de A ctinom yces o una corinebacteria atípica. Una tinción ácido-alcohol resistente parcial de un segundo frotis ayuda a la identificación correcta.

LÁMINAS EN COLOR 19-3

M

a n if e s t a c io n e s c l ín ic a s d e a l g u n a s e n f e r m e d a d e s m ic o b a c t e r ia n a s

A.

Radiografía de tórax de un paciente con tuberculosis pulmonar. Obsérvese el área extensa de infiltración densa del lóbulo superior derecho.

B.

Se observa una lesión nodular solitaria con bordes bien definidos en el segm ento superior del campo pul­ monar inferior izquierdo. U na lesión num ular de coccidioidom icosis pulm onar debe incluirse en el diag­ nóstico diferencial de esta lesión. Esto resultó un tuberculoma.

C. Lóbulo pulm onar resecado que m uestra un nodulo central bien circunscripto de 2,5 cm de diámetro, blanco y de aspecto firme. Desde el punto de vista histológico fue un tuberculoma, sim ilar al que se pudo haber extirpado del paciente cuya radiografía de tórax se m uestra en la lám ina en color 19-3B. D. M icrofotografía de un corte teñido con hem atoxilina y eosina tom ado a través de un tuberculoma. que m ues­ tra grados variados de fibrosis basal y una infiltración celular com puesta por linfocitos y macrófagos; muchos de los últim os form an células gigantes de Langhans características. E.

Base del encéfalo en un paciente que m urió por meningitis tuberculosa. La piaracnoides que cubre la base del encéfalo, sobre todo en el área del quiasma óptico, aparece turbia como m anifestación de la reacción inflamatoria crónica.

F.

Un caso de tuberculosis cutánea del quinto dedo. La lesión que se muestra aquí aparece activa e inflam ato­ ria. De hecho, una radiografía puso en evidencia afectación ósea y articular de las falanges m edia y distal. En una época, las lesiones de los dedos de la m ano similares a ésta eran frecuentes en los individuos que ordeñaban vacas.

G. Esta región posterior del cuello muestra un ganglio linfático posauricular agrandado con trayectos fistulo­ sos cicatrizados a lo largo del recorrido del drenaje linfático. Es un cuadro clásico de “escrófula” o linfade­ nitis tuberculosa, causada típicam ente por M. scrofulaceum y m icobacterias distintas de M. tuberculosis. El cam ino de la infección es oral y suele ocurrir en dos grupos etarios durante la dentición: en niños de 3 a 7 años, cuando aparecen los dientes secundarios, y al final de la segunda década de vida, cuando afloran los molares. H. Porción anterior del cuello que m uestra múltiples trayectos fistulosos cicatrizados en un caso de linfadeni­ tis tuberculosa crónica. Nuevamente la vía de infección es la oral, con drenaje de las micobacterias infec­ tantes a lo largo de los canales linfáticos. I.

M icrofotografía con bajo aumento de un corte de intestino delgado teñido con una tinción ácido-alcohol resistente con base de carbol-fucsina. El m oteado rosado que se observa en la subm ucosa corresponde a agregados densos de bacilos ácido-alcohol resistentes de un caso de infección intestinal causada por el com ­ plejo M. avium/M . intracellulare en un paciente con SIDA.

J.

M icrofotografía con gran aum ento de un área que se m uestra en la lámina en color 19-31, que ilustra mejor los agregados intracelulares densos de bacilos ácido-alcohol resistentes. Este cuadro histopatológico es simi­ lar a las “células de la lepra” observadas en los pacientes con enfermedad de Hanson (lepra).

LÁMINAS EN COLOR 20-1

D

ia g n ó s t ic o d e l a b o r a t o r io d e l a s e n f e r m e d a d e s p r o d u c id a s p o r e s p ir o q u e t a s

A. Treponema pallidum. Esta m icrofotografía muestra un corte histológico de placenta con tinción de WarthinStarry de un paciente con sífilis congènita. Se evidencian con facilidad las espirales firm emente enrolladas con el aum ento original (1 OOOx). B.

Treponema pallidum. Este control de la prueba FTA-ABS m uestra tinción 4+ de las espiroquetas. Se obser­ van la form a helicoidal y las espirales firmem ente enrolladas en algunas de las células bacterianas. Esta m icrofotografía es una preparación con inm unofluorescencia indirecta de T. pallidum que utiliza antiglobu­ lina hum ana conjugada con fluoresceína (aumento original. 600x). (Cortesía de Burton W ilcke y Mary Celotti, Vermont Departm ent of Public Health, Burlington).

C . Frotis de sangre periférica con tinción de W right de un paciente con infección por Borrelia. Se observa el enrollam iento laxo de los m icroorganism os Borrelia, pero la estructura delgada puede pasarse por alto con facilidad. Estas espiroquetas pueden detectarse cuando se exam inan frotis para paludism o o para la m orfo­ logía celular, incluso si el m édico no sospecha el diagnóstico (aumento original, 1 OOOx). (Cortesía del doc­ tor Thomas Fritsche). D. Tinción con naranja de acridina de sangre periférica que muestra claram ente especies de Borrellia. Si se sos­ pecha el diagnóstico, puede utilizarse esta técnica, que puede ser m ás sensible que las tinciones de Giemsa o de W right (aum ento original, 1 OOOx). (Cortesía del doctor Brian Lauer). E.

Garrapatas Ixodes scapularis (dammini). Estas garrapatas duras, de color oscuro, también conocidas com o garrapatas de patas negras o garrapatas del ciervo, tienen un escudo dorsal que cubre todo el dorso del m acho (M) pero sólo una porción en la hembra (F), ninfa (N) y larva (L). Es el principal vector de Borrelia burgdorferi, el agente de la enfermedad de Lyme, en el este de los Estados Unidos. Ixodes pacificus, el vec­ tor en la región del Pacífico, es m uy similar. Los vectores principales son ninfas y adultos hembras. Los machos adultos pican sólo en raras ocasiones y el estadio larvario no suele infectarse cuando pica a los seres humanos. Los estadios de ninfas representan un problem a particular porque su tam año pequeño dificulta su detección.

F.

Borrelia burgdorferi en el sedimento de un cultivo teñido con anticuerpos m onoclonales contra la proteína OspA, conjugada con estreptavidina-fosfatasa alcalina. Se m uestra el polim orfism o típico de B. burgdorfe­ ri. (Cortesía del doctor Paul Duray).

G. Corte histológico de riñón de perro teñido con una técnica de im pregnación argéntica (W arthin-Starry) que m uestra varios túbulos renales con orientación longitudinal. Incluso con bajo aumento, se observan masas de Leptospira que oscurecen la superficie del epitelio tubular. Es evidente que este sitio de privilegio, donde las leptospiras están protegidas de las defensas del huésped, puede actuar com o fuente de producción para la diseminación de la infección cuando la orina contam inada por las leptospiras se elim ina en el suelo (aum ento original, 1 OOOx). (Cortesía de David M iller). H. Tubos del medio sem isólido polisorbato 80-albúm ina bovina (PSO-BA). El tubo de la derecha se inoculó con Leptospira interrogans. La subsuperficie de crecim iento en el medio de cultivo semisólido es típica de leptospiras, com o L. interrogans serovariedad pom ona. El crecim iento aparece com o una banda horizontal blanca grisácea alrededor de 1 cm por debajo de la superficie del medio tras la incubación durante 2 a 6 sem anas a tem peratura ambiente. La banda se torna más densa cuando continúa la incubación, pero puede ser muy escasa en las cepas con requerim ientos nutricionales especiales, como en el caso de L. interrogans serovariedad hardjo. (Cortesía de David Miller).

LÁMINAS EN COLOR 21-1

M o r f o l o g í a d e l a c o l o n i a d e e s p e c ie s d e Z d e A s p e r g il l u s

yg o m ycetes

y e s p e c ie s s e l e c c i o n a d a s

Los miem bros de Zygomycetes y ciertas especies de Aspergillus se aíslan con frecuencia en los laboratorios clínicos com o agentes de infecciones oportunistas. Estos hongos crecen rápidam ente en el cultivo, en espe­ cial las especies de Zygomycetes, que pueden cubrir la placa del cultivo dentro de las 48 horas. De los aspergilos. A. fum igatus, A. flavus, A. niger. y A. terreus son los que se aíslan m ás en m uestras obtenidas en pacientes con aspergilosis. Cuando se aíslan otros aspergilos, por lo general no se identifica la especie a la que corresponden. A. nidulans y A. glaucus son dos especies infrecuentes que a menudo producen cleistotecios, la form a teleom orfa que contiene ascosporas. A. Placa de agar dextrosa de Sabouraud inoculada con una especie de Zygomyces. N ótese que la placa en su totalidad está cubierta por el m icelio con la superficie blanco grisácea y vellosa. B. Im agen en prim er plano de una colonia de una especie de Zygom yces tras 96 horas de incubación. A m edi­ da que la colonia m adura, asum e un color gris castaño, a m enudo con un punteado negro como pimienta, que indica la producción de esporangios. C. Superficie de una colonia de Aspergillus fum igatus después de una incubación de 5 días en agar dextrosa de Sabouraud. Las colonias m aduras de A. fum igatus suelen ser pulverulentas o granulares y tienen cierto tono verdoso por la producción de conidios pigmentados. El margen de crecim iento a m enudo aparece com o una zona blanca de crecim iento nuevo, com o se ilustra aquí. D.

Superficie de una colonia de Aspergillus fla vu s que crece en agar dextrosa de Sabouraud. L a textura de las colonias maduras suele ser granular por la producción de conidios y, com o lo sugiere el nombre de la espe­ cie, es característica cierta pigm entación amarilla.

E.

Superficie de una colonia de Aspergillus niger después de una incubación de 4 días en agar dextrosa de Sabouraud. Es característico observar la superficie densamente punteada de castaño oscuro a negro. La pig­ m entación negra de la superficie de A. niger puede distinguirse de la de uno de los hongos dem atiáceos observando el reverso de la colonia. En el caso de A. niger es gris claro a beige, ya que la pigm entación está causada por los conidios de la superficie; el reverso de los hongos dematiáceos es negro azabache porque las hifas vegetativas son las que tienen el pigmento.

F.

Superficie de una colonia de Aspergillus terreus después de una incubación de 6 días en agar dextrosa de Sabouraud. A. terreus presenta una superficie granular y cierto tinte am arillo o castaño característico. A m enudo se observan pliegues que irradian desde el centro y no son infrecuentes las zonas concéntricas de pigm entación clara y oscura com o se observa aquí.

G . Superficie de una cepa albina de Aspergillus nidulans. Aunque la mayoría de las cepas tienen cierta pig­ m entación clara, en ocasiones se encuentran cepas albinas y deben tenerse en cuenta en la identificación diferencial. También es com ún observar la superficie granular, con pliegues radiales. H . Superficie de una colonia de Aspergillus glaucus. El aspecto multicolor verde y amarillo observado aquí no es específico, porque otras especies de Aspergillus pueden tener un aspecto similar. Es necesario el exam en m icroscópico para arribar a la identificación de la especie.

LÁMINAS EN COLOR 21-2

M

o r f o l o g ía d e l a s c o l o n ia s d e h o n g o s f il a m e n t o s o s h ia l in o s a is l a d o s c o n f r e c u e n c ia

Las colonias de los hongos hialinos tienen un aspecto variado. L a mayoría muestra pigm entación pastel claro o más oscura, con com binaciones de colores verdes, amarillos, anaranjados y castaños que son com u­ nes. La textura de las colonias puede ser lisa, granular, algodonosa o vellosa, de acuerdo con su madurez y grado de esporulación. D eben realizarse estudios microscópicos para confirmar la identificación de género y especie. A. Superficie de una colonia de especies de Penicillium después de una incubación de 5 días en agar dextrosa de Sabouraud, que m uestra el color verde distintivo, la superficie granular, los pliegues radiales y el borde blanco de crecim iento nuevo en la periferia. Aunque la m ayoría de las cepas de las especies de Penicillium m uestran cierto tinte verde, a veces se observan variantes amarillas. B.

Superficie de una colonia de Penicillium m arneffei después de una incubación de 4 días en agar dextrosa de Sabouraud, que m uestra la pigm entación roja distintiva de una porción de la colonia. N ótese que el pigm ento ha filtrado hacia el agar y tiene una coloración rojo vinosa clara. La superficie tiende a ser granular a suave y esponjosa, de acuerdo con el grado de esporulación; nótese el borde blanco bien definido de crecimiento nuevo en la periferia.

C. Superficie de una colonia de especies de Paecilomyces. Las colonias de estas especies suelen ser granulares y a m enudo tienen pigm entación am arillo castaña, com o se ilustra aquí. Sin embargo, otras cepas pueden tener un aspecto verde pastel claro, verde am arillento o azulado. D. Superficie de una colonia de especies de Scopulariopsis después de 5 días de crecim iento en agar dextrosa de Sabouraud. L a pigm entación amarilla, la textura granular y los pliegues radiales, com o se ilustra aquí, son características distintivas de estas especies. E.

Superficie de una colonia de especies de Acremonium después de 5 días de incubación en agar dextrosa de Sabouraud. Las colonias de las especies de Acremonium suelen tener aspecto liso, casi levaduriforme, com o se ilustra aquí, debido a la naturaleza sumamente delicada de las hifas y los cuerpos de fructificación. Pueden observarse colores amarillo pastel claro, verde claro y rojo melocotón.

F.

Superficie de una colonia típica de especies de F usarium después de 6 días de crecim iento en agar dextro­ sa de Sabouraud. Pueden sospecharse especies de Fusarium cuando se observan colonias granulares o algo­ donosas de crecim iento rápido, con pigm entación rosada a roja, lavanda o púrpura característica.

G. Superficie de una típica colonia gris “ratón" algodonosa de Scedosporium apiospermum (form a anamórfica de Pseudallescheria boydii) después de 5 días de incubación en agar dextrosa de Sabouraud. L a colonia de crecim iento rápido con aspecto gris ratón, como se ilustra aquí, siempre sugiere especies de Scedosporium. La pigm entación característica es causada por los conidios con pigm ento oscuro. H. U na colonia de especies de Gliocladium después de 5 días de crecim iento en agar dextrosa de Sabouraud. El pigm ento verde, la extensión de la colonia de borde a borde sin un m argen de crecim iento bien definido y la textura granular (denom inado “césped verde”) son exclusivos de las especies de Gliocladium y Trichoderma. Este últim o muestra con m ayor frecuencia pigm entación am arilla en lugar de verde.

LÁMINAS EN COLOR 21-3

M o r f o l o g í a d e l a s c o l o n i a s d e h o n g o s f il a m e n t o s o s d e m a t iá c e o s a i s l a d o s c o n f r e c u e n c ia

Los hongos filamentosos dem atiáceos (oscuros) se caracterizan por el crecim iento de colonias de color verde oscuro, castaño o negro, con pigm entación negra en el reverso de la superficie. La m ayoría de las espe­ cies am bientales crecen con rapidez y producen colonias maduras dentro de los 5 días. Las especies de cre­ cim iento lento, que requieren dos semanas o a veces más antes de poder observar colonias maduras, a m enu­ do se aíslan en m uestras clínicas tom adas de pacientes con micetom as o crom om icosis. Aquí se m uestran las fotografías de colonias representativas de los hongos filamentosos dem atiáceos que crecen en agar dex­ trosa de Sabouraud. A. Superficie algodonosa gris a negra, de una colonia de especies de Alternaría después de 6 días de creci­ miento. El aspecto mostrado aquí no es distintivo de estas especies, también puede observarse en otras espe­ cies de hongos filam entosos dem atiáceos ambientales. B. Reverso de la colonia de un hongo filamentoso dematiáceo, que ilustra la m ayor tonalidad causada por la pigm entación castaño oscuro de las hifas vegetativas. C. Vista de la superficie de un subcultivo de especies de Ulocladium. que ilustra el aspecto velloso con pig­ m entación castaño oscuro a negro. Aunque en ciertas cepas de hongos dematiáceos con frecuencia se obser­ van anillos concéntricos claros y m ás oscuros, aquí no se distinguen. D. Vista de la superficie de una colonia de Phialophora verrucosum después de 14 días de incubación. Esta cepa particular tiene un color gris oscuro a negro, con una textura vellosa. Es necesario realizar el estudio m icroscópico, porque otras especies de crecim iento lento pueden form ar colonias con aspecto similar. E.

Vista de la superficie de una colonia de Fonsecaea pedrosoi después de 16 días de incubación. La colonia es bastante pequeña, típica para la especie y se observa la pigm entación castaño oscuro a negra caracterís­ tica. Esta cepa tiene un aspecto más aplanado con consistencia sim ilar al ante.

F.

Vista de la superficie de una colonia de crecim iento más rápido (5 días), de la cepa ambiental de especies de Cladosporium, que ilustra la superficie verde oscuro, con aspecto de ante , interrum pida por pliegues irre­ gulares. Las cepas am bientales de las especies de Cladosporium pueden aparecer verde oscuro, com o se m uestra aquí, o pueden ser grises, gris castaño o castaño negruzco y simulan otros hongos dematiáceos.

G. Vista de la superficie de otra variante de una especie de Cladosporium del am biente que muestra una con­ sistencia coriácea, gris oscuro. La textura de la colonia entre los hongos dem atiáceos puede ser algodonosa, vellosa, sim ilar al ante o coriácea. H. Aspecto de la superficie levaduriforme, plana y lisa de Aureobasidiwn pullulans después de 6 días de incu­ bación. Estas especies deben ser las prim eras en las que se piense cuando se observe una “levadura negra,” sim ilar a la m ostrada aquí; sin embargo, tam bién deben considerarse ciertas cepas de E xophiala w em ickii (llamadas sinamorfas Phaeoannelomyces) que form arán un micelio bajo, velloso con hifas verdaderas des­ pués de varios días adicionales de incubación.

LÁMINAS EN COLOR 21-4

M

o r f o l o g ía d e l a s c o l o n ia s d e d e r m a t ó f it o s

Las colonias representativas de los hongos filamentosos derm atófitos en medios de cultivo artificiales no son características. H ay variación suficiente de cepas y diferencias en el aspecto de la m ism a cepa, de acuerdo con el tipo de medio de cultivo utilizado y las condiciones am bientales durante la incubación, de modo que la m orfología de la colonia no es un criterio fiable para hacer identificaciones presuntivas. Casi siempre son necesarios los estudios m icroscópicos para arribar a la identificación definitiva. Aquí se m uestran fotografí­ as de colonias seleccionadas de derm atófitos que crecen en agar dextrosa de Sabouraud a 30 °C, escogidas para m ostrar ciertas características que pueden brindar indicios para la identificación presuntiva. A. Colonia de M icrosporum canis después de 5 días de incubación. Las colonias tienden a ser algodonosas o, a veces, granulares si la conidiación es densa. El crecim iento am arillo limón observado aquí, con pigm ento que tam bién se extiende al reverso de la superficie, es un indicio que sugiere M. canis. B.

Superficie de una colonia pulverulenta, am arillo intenso de M icrosporum gypseum después de 6 días de incubación. M. gypseum tiende a presentar una esporulación densa; por consiguiente, es más propenso a pro­ ducir colonias granulares que M. canis.

C. Superficie de una variante lisa y blanca de Trichophyton mentagrophytes, sin evidencia de pigmentación de fondo en el agar. La colonia ilustrada aquí no es típica y se requiere el estudio m icroscópico para su identi­ ficación. D.

Superficie de una variante suave y esponjosa de Trichophyton mentagrophytes que muestra pigm entación rojiza del agar de base. La pigm entación rojo vinosa es un rasgo que sugiere T. rubrum; sin embargo, cier­ tas cepas de T. mentagrophytes también pueden producir pigm ento rojizo al crecer en agar dextrosa de Sabouraud. No obstante, la pigm entación nunca es tan intensa com o en T. rubrum cuando las colonias cre­ cen en agar harina de m aíz o agar dextrosa patata.

E.

Reverso de una colonia de Trichophyton rubrum que crece en agar dextrosa patata. La pigm entación rojo vinoso intensa es característica de las especies y es especialm ente intensa cuando la colonia crece en agar dextrosa patata o agar harina de maíz.

F.

Crecim iento comparativo de T. mentagrophytes (parte inferior) y T. rubrum (parte superior) en agar harina de maíz, que muestra la diferencia distintiva en la pigm entación entre ambas especies.

G. Superficie de una colonia pequeña de Trichophyton tonsurans después de 14 días de incubación T. tonsurans crece más lento en el agar dextrosa de Sabouraud. La mayoría de las cepas producen cierta pigm enta­ ción amarillo castaña. La superficie tiende a ser granular y con frecuencia se observan pliegues radiales. Salvo el crecim iento m ás lento, las colonias de T. tonsurans parecen sim ilares a las de las especies de Scopulariopsis y Aspergillus terreus. H. Superficie de una colonia de Epidermophyton floccosum después de 6 días de incubación. Esta colonia pare­ ce más suave y esponjosa que granular y tiene una pigm entación amarillo intensa. Las colonias clásicas de E. floccosum se describen com o verde caqui. La textura de la colonia tiende a ser más suave y esponjosa que granular, ya que este género no produce microconidios.

LÁMINAS EN COLOR 21-5

M

o r f o l o g ía d e l a s c o l o n ia s d e h o n g o s d im o r f o s

Los hongos dimorfos, denominados así porque crecen en form a de hongo filamentoso entre 25 °C y 30 °C (tem peratura am biente) y en form a de levadura a 37 °C, son patógenos para los seres hum anos y causan micosis profundas. Aunque la identificación de la especie definitiva depende del estudio microscópico, la confirm ación de que una especie dada pertenece al grupo de hongos dim orfos depende de la demostración en el laboratorio de am bas formas: filamentosa y levaduriforme. La form a filamentosa del hongo puede con­ vertirse a la forma de levadura m ediante la incubación de subcultivos en m edios enriquecidos a 37 °C y observando en la m icroscopia la aparición de las levaduras típicas de las especies. Con el advenim iento de técnicas de extracto de exoantígeno y ensayos de sondas de ácidos nucleicos, las pruebas de conversión se realizan sólo de m odo infrecuente en la m ayoría de los laboratorios clínicos. A. Superficie de la colonia de un hongo filamentoso dimorfo, que ilustra tanto la forma de levadura (central) com o la form a filam entosa (periferia). Esta colonia se incubó durante 14 días a 30 °C. Cuando se observa esta m ezcla de form as de levadura y filamentosa, puede sospecharse uno de los hongos dimorfos, en espe­ cial si la colonia presenta crecim iento relativamente lento y el hongo filamentoso tiene consistencia vellosa o de telaraña. B.

Colonias de Blastomyces dermatitidis que crecen en agar sangre de cam ero al 5% después de 5 días de incu­ bación. Nótese el aspecto de telaraña de estas colonias, un indicio de que el aislamiento puede correspon­ der a un hongo dim orfo y alertando para que se tom en precauciones especiales al realizar los subcultivos o las preparaciones m icroscópicas en fresco a fin de evitar una infección adquirida en el laboratorio.

C . Aspecto de las colonias de Blastomyces dermatitidis cuando la incubación se realiza a 37 °C, durante una conversión de la fase filamentosa a la de levadura. Hay una form a intermedia de las colonias entre filam en­ tosa y de levadura conocida como “fase espinosa”. Nótense las espículas bastante toscas formadas por estas colonias blancas. D. Colonias de Histoplasma capsulatum en agar infusión de cerebro y corazón después de 25 días de incuba­ ción a 30 °C. Las colonias son blancas y su consistencia es sim ilar a la de las telarañas. Estas colonias no tienen ninguna característica distintiva y es necesario el exam en m icroscópico para la identificación. E.

Superficie de una placa de agar sangre de cam ero al 5% incubada a 37 °C en la cual crecen colonias de leva­ duras pequeñas, am arillentas de Histoplasma capsulatum después de la conversión exitosa de la form a fila­ mentosa. Las form as de levadura son similares a otras levaduras verdaderas, sólo que el crecim iento es muy lento y las colonias siguen siendo bastante pequeñas.

F.

Superficie de colonias de Coccidioides immitis que crecen en agar sangre de cam ero al 5% después de 7 días de incubación. Las colonias son blanco grisáceas y tienen una suave textura vellosa. Las colonias de C. inmitis que crecen en el agar sangre a m enudo muestran un cam bio de color al rojo por la hem oglobina que fil­ tra del m edio de cultivo (no m ostrado aquí).

G . Superficie de una colonia de levadura lisa, gris castaño, de Sporothrix schenckii. Debido a la esporulación sum amente delicada de S. schenckii, las colonias a m enudo aparecen más com o levaduras que filamentosas, incluso cuando se incuban entre 25 °C y 30 °C. D espués de la incubación prolongada, las colonias de S. schenckii tienden a oscurecerse considerablem ente y en algunas cepas se tornan negro azabache (véase lám i­ na en color 21-5H). H. Tubos de agar infusión de cerebro y corazón, uno de los cuales contiene cicloheximida, en los que crecen las form as de levadura (parte superior) y filamentosa (parte inferior) de S. schenckii. Debido a la naturale­ za delicada de las hifas y las estructuras de fructificación, la colonia del hongo filamentosa aparece bastan­ te levaduriforme. Las colonias tienden a oscurecerse cuando maduran y en algunos casos, com o el que se ilustra aquí, adquieren una pigm entación negra característica.

LÁMINAS EN COLOR 21-6

M

o r f o l o g ía d e l a s c o l o n ia s d e l e v a d u r a s a is l a d a s c o n f r e c u e n c ia

La identificación por el laboratorio de las levaduras im portantes en m edicina implica la evaluación visual de las características de la colonia y la interpretación de los resultados de las pruebas de ferm entación y de asi­ m ilación de hidratos de carbono. A. Superficie de una colonia de levadura lisa, blanquecina obtenida de un subcultivo de Candida albicans des­ pués de 3 días de incubación. La colonia que se m uestra aquí no es distintiva de Candida albicans, sino que puede verse con otras especies de Candida y levaduras de otras especies. Cuando en el laboratorio de m icro­ biología se aísla una colonia levaduriforme, como la ilustrada aquí, es necesario realizar otros estudios. B.

Superficie de una placa de agar sangre de cam ero al 5% en la que crecen colonias blancas de una levadura. Las extensiones similares a pies desde los m árgenes de las colonias son producidas típicam ente por Candida albicans.

C. Colonias de Cryptococcus neoformans en agar dextrosa de Sabouraud después de 4 días de incubación. La consistencia m ucoide característica de las colonias es indicativa de una levadura form adora de cápsula y sugiere especies de Cryptococcus. Para identificar C. neoformans se requieren otras pruebas. D. Colonias de Cryptococcus neoformans que crecen en placas con agar semillas de níger. La pigm entación castaño rojiza de las colonias cuando crecen en este medio es característica de C. neoform ans y perm ite la distinción de otras especies de Cryptococcus que son incapaces de producir colonias pigm entadas oscuras. E.

Colonias de Torulopsis (Candida) glabrata que crecen en agar dextrosa de Sabouraud después de 3 días de incubación a 30 °C. Se sugiere la presencia de T. glabrata cuando se observan colonias más pequeñas y translúcidas, aunque para confirm ar la identificación son necesarios otros estudios.

F.

Colonias de las especies de Rhodotorula. que ilustran la pigm entación rojo anaranjada distintiva de este género. Algunas cepas de especies de Cryptococcus tam bién pueden producir una pigm entación rojiza; por consiguiente, pueden ser necesarios otros estudios para realizar la identificación definitiva.

G. Superficie de una placa de agar sangre en la que sólo crecen colonias levaduriformes de M alassezia fú rfu r en el área donde se había agregado aceite de oliva virgen. M. fú rfu r es una levadura lipofílica que se encuen­ tra en la piel hum ana. U n medio con alto contenido en aceite (como el aceite de oliva virgen extendido en la superficie mostrado aquí") es necesario para el aislamiento de esta levadura. Debe notificarse al personal de laboratorio si se sospecha tiña versicolor de modo que pueda hacerse la preparación de cubierta con aceite. H . M icrofotografía de un frotis teñido para ácido-alcohol resistencia a partir de una colonia aislada de Saccharomyces cerevisiae que crece en la superficie de agar para ascosporas. Los cuerpos esféricos, teñidos de rojo (ácido-alcohol resistentes) observados aquí son las ascosporas. H ansenula anómala tam bién produ­ ce ascosporas ácido-alcohol resistentes cuando crecen en agar para ascosporas; sin embargo, presentan un contorno con forma de gorra en lugar de ser esféricas.

LÁMINAS EN COLOR 22-1

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A. M ateria vegetal que simula un huevo de Ascaris lumbricoides decorticado. B.

Fibra del m úsculo esquelético de carne roja ingerida que simula un form a larvaria de un parásito.

C. Partículas de talco que a m enudo contam inan las m uestras recolectadas cuando se utilizan guantes de gom a y que simulan quistes de amebas. D. Cristales que simulan huevos de parásitos. E.

Fibras vegetales que sim ulan larvas rabditoides.

F.

Grano de polen equinulado que sim ula un huevo de especies de Taenia.

G. Grano de polen que sim ula un huevo de uncinaria, de Strongyloides o de Ascaris decorticado. H. Pelusa de durazno que simula una larva filariforme.

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LÁMINAS EN COLOR 22-2

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A. M icrofotografía de un frotis de heces con tinción tricrómica. En el centro del cam po hay un neutrófilo seg­ mentado con dos lóbulos que se asem eja a un quiste del tipo Entamoeba. Siem pre debe tenerse cuidado de que los leucocitos polim orfonucleares en las m uestras fecales no se confundan con quistes de amebas. B.

M icrofotografía de un frotis de heces teñido con hem atoxilina férrica, que ilustra un trofozoíto único de Entam oeba histolytica de 10 p,m en su m áxim a dim ensión. N ótese el núcleo esférico que contiene el cariosoma dim inuto y com pacto ubicado en el centro y la distribución uniforme, como cuentas, de la crom atina a lo largo de la m em brana nuclear (núcleo tipo Entamoeba). La extensión de un seudópodo único refleja la m ovilidad direccional con un propósito definido.

C. M icrofotografía de una preparación en fresco directa con yodo de un quiste de Entamoeba histolytica, de 12 |im de diámetro. Se observan cuatro núcleos, cada uno de los cuales contiene un cariosom a pequeño y central, y una delicada banda de crom atina nuclear alrededor de la m em brana nuclear. D. Corte de la m ucosa del colon teñido con hem atoxilina y eosina que ilustra la infiltración por gran cantidad de trofozoítos de Entamoeba histolytica. Los trofozoítos aparecen com o cuerpos esféricos irregulares y páli­ dos en la tinción, algunos de los cuales m uestran un núcleo tipo Entamoeba. (400x). E.

Frotis de heces teñido con hem atoxilina férrica que ilustra un trofozoíto solo de Entam oeba coli. Nótense el gran cariosom a, la distribución irregular de la crom atina a lo largo de la m em brana nuclear y el citoplasm a tosco y “sucio” que contiene detritos sin digerir y varias vacuolas de tamaño irregular. Los trofozoítos de E. coli tienden a ser más grandes que los de E. histolytica, que varían entre 14 y 25 pm de diámetro.

F.

Quiste de Entamoeba coli con tinción tricróm ica que ilustra cinco núcleos, cada uno de los cuales contiene un cariosom a relativamente grande ubicado en la parte central o levemente excéntrico. La presencia de más de cuatro núcleos descarta Entamoeba histolytica. Se observa un cuerpo crom atoide único intracitoplasm ático con forma de barra en la posición en hora 2, teñido de rojo, con extrem os puntiagudos.

G. Tinción con hem atoxilina férrica de un prequiste de Entam oeba histolytica de 8 pm de diámetro. Los prequistes a m enudo tienen una vacuola única que sim ula un quiste de lodam oeba biitschlii. N ótese en la foto­ grafía la distribución característica “tipo Entam oeba” de la crom atina alrededor de la m em brana nuclear, lo que descarta I. biitschlii. H. Tinción con hem atoxilina férrica de un quiste pequeño (6 pm de diámetro) de Entamoeba hartmanni. El tamaño es sim ilar al de E ndolim ax nana; sin embargo, el núcleo tipo Entamoeba y las barras cromatoides con extremos redondeados descartan esa posibilidad.

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LÁMINAS EN COLOR 22-2

I.

Frotis de heces con tinción tricróm ica que ilustra un trofozoíto de Iodamoeba biitschlii. Esta form a mide alrededor de 14 |im de diám etro; el tam año varía de 6 a 25 |im . Nótese el núcleo con un gran cariosom a rodeado por un espacio vacío, sin una m em brana nuclear visible (conocido com o núcleo en “bola en un ho­ yo”). Los trofozoítos m ás pequeños son difíciles de distinguir de los de Endolimax nana. Para hacer un diag­ nóstico definitivo deben examinarse otros cam pos a fin de detectar quistes más característicos.

J.

Frotis de heces con tinción tricróm ica que ilustra un quiste de Iodamoeba biitschlii de 10 |im de diámetro. El núcleo tiene un gran cariosom a central rodeado por una zona clara con ausencia de crom atina periférica (núcleo en “bola en un hoyo”). Nótese la gran vacuola única en el citoplasma, que se tiñe positiva con la tin­ ción de yodo, lo que indica su contenido de glucógeno.

K . Frotis de heces con tinción tricróm ica que ilustra un trofozoíto pequeño de E ndolim ax nana (flecha), que mide 8 |im de diámetro. Nótense el pequeño núcleo central con un cariosom a prom inente rodeado por un espacio claro y estrecho, y la ausencia de crom atina nuclear. L.

Preparación teñida con azul de metileno que ilustra un quiste de Endolimax nana, de 6 X 8 fim de diámetro. Nótense los cuatro núcleos diminutos, cada uno de los cuales contiene un cariosom a muy pequeño, rodea­ do por un espacio claro.

M . Frotis de heces con tinción tricróm ica que ilustra una form a esférica de Blastocystis hominis, con un cuer­ po central prom inente rodeado por m aterial nuclear dispuesto en grumos contra la m em brana interna de la pared del quiste. La form a aquí mide 10 |im ; sin em bargo, presentan considerables variaciones de tamaño, entre 5 y 20 |im , presentes en la m isma preparación. N. M icrofotografía de un corte del epitelio del intestino delgado teñido con hem atoxilina y eosina. Nótese el pequeño trofozoíto con form a de pera de Giardia lamblia, con su fam iliar “facies sim iana”, que aparece com o un avión que busca un lugar para aterrizar. De hecho, los trofozoítos de Giardia se adhieren a la m uco­ sa, donde causan daño local y producen los síntomas característicos de diarrea y flatulencia. O . Frotis con tinción tricróm ica que ilustra un trofozoíto de G. lamblia reconocido por su form a característica, oval a elíptica, los dos núcleos, con cariosom as centrales prom inentes, que yacen en la parte anterior sobre cada lado del axostilo en form a de vara que recorre la longitud del organismo. N ótese tam bién el cuerpo parabasal eosinófilo (el “bigote” ) ubicado hacia atrás del axostilo. Estas características dan el aspecto de facies simiana. Los trofozoítos de G. lamblia tienen seis flagelos, dos anteriores, dos posteriores y dos cau­ dales; sólo tres de éstos se observan en la fotografía. P.

Frotis con tinción tricróm ica de detritos intestinales que incluye un quiste de Giardia lamblia. El quiste pre­ senta una form a típica oval y una pared externa delgada. Mide de 9 a 12 |im de diámetro y de modo típico incluye el doble de orgánulos observados en el trofozoíto. Cada quiste tiene cuatro núcleos, sólo dos o tres suelen observarse en un único plano de foco, dos axostilos. m últiples cuerpos parabasales y flagelos que están envueltos debajo de la pared lisa del quiste; todo esto no puede observarse en un único plano de foco.

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LÁMINAS EN COLOR 22-3

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A. M icrofotografía de dos trofozoítos de Chilomastix mesnili, uno en un extremo, el otro en una vista lateral. El trofozoíto presenta una form a típica de pera y puede identificarse con facilidad m ediante la observación en el extrem o anterior de un núcleo único, la protrusión posterior del axostilo y un surco espiralado, que es difícil de observar en las preparaciones en fresco. La presencia de un m echón de tres flagelos anteriores, adyacentes al núcleo, es una característica de identificación adicional que es difícil de observar en la mayo­ ría de las preparaciones microscópicas en fresco. B.

M icrofotografía de un quiste de C. mesnili en el que se observan con facilidad un núcleo único, con cariosoma central y un citostom a diferenciado, que aparece com o un área clara bien delineada. En esta m icrofo­ tografía se advierte el contorno del citostoma. descrito como bastón con un extrem o en forma de gancho. Los quistes presentan una form a típica de limón, con pared celular lisa y un diámetro de 6 |im a 70 p.m. A dem ás del citostom a, a m enudo tienen un bulto hialino anterior que. cuando se lo observa, es útil para la identificación (véase lám ina en color 22-3C).

C . Imagen de otro quiste de Chilomastix mesnili, en el cual se observa m ejor el bulto hialino anterior (flecha). También se observan el núcleo y el citostoma. D. Frotis de heces con tinción tricróm ica que destaca un trofozoíto único de Dientamoeba fragilis. Este quiste m ide 8 x 1 2 |im y se puede observar con facilidad el núcleo doble característico; cada uno presenta un cariosoma grande y la m em brana nuclear poco definida. El citoplasma de este trofozoíto es finamente granular y muestra evidencia tem prana de desintegración, com o lo refleja el nombre de la especie. E.

Preparación con hem atoxilina férrica que ilustra un trofozoíto único de Trichomonas hominis. Nótense la for­ ma típica de gota y el núcleo único ubicado en la parte anterior, pero no contra la pared celular com o es ca­ racterístico del trofozoíto de Chilomastix mesnili (lámina en color 22-3A). En esta m icrofotografía se obser­ va el axostilo que corre en sentido longitudinal como un flagelo posterior único. Los típico es que T. hominis tenga tres a cinco flagelos anteriores, un flagelo posterior y una m embrana ondulante que recorre la longi­ tud total del cuerpo, una estructura que se advierte con facilidad sólo en preparaciones realizadas de culti­ vos celulares.

F.

M icrofotografía de un corte teñido con hem atoxilina y eosina de una biopsia de intestino que ilustra la invasión por m uchos trofozoítos de Balantidium coli. N ótese el m acronùcleo definido con form a de bastón o de herradura, una característica que, junto con su gran tam año (80 um de diám etro), es útil para la iden­ tificación.

G . Im agen de un trofozoíto de Balantidium coli, que ilustra un contorno oval con una pared lisa recubierta en toda su circunferencia por cilios cortos y delicados. Estos trofozoítos miden entre 40 (im y 70 |im de ancho y entre 50 (im y 100 de largo. La presencia de un citostom a anterior, la circunferencia recubierta de ci­ lios y el m acronùcleo con form a de bastón o de herradura son las características claves que conducen a la identificación. H. Se ilustra un quiste de Balantidium coli en una preparación con tinción tricrómica. Estos quistes varían de 50 a 75 |im de diámetro, son esféricos o elipsoidales y presentan un núcleo característico con form a de pesa, observado claram ente en esta fotografía. Adyacente al m acronùcleo hay un núcleo único poco definido y el citoplasm a incluye una vacuola metabòlica.

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LÁMINAS EN COLOR 22-4

C o c c id io s A. M icrofotografía de un corte teñido con hem atoxilina y eosina de la m ucosa intestinal a lo largo del borde en cepillo de las células epiteliales a las cuales están adheridos muchos ooquistes diminutos de 2 |im a 3 |im de diám etro de especies de Cryptosporidium. Es posible realizar el diagnóstico histológico cuando se obser­ van estos agregados. B.

Tinción para ácido-alcohol resistencia de un frotis de heces que ilustra dos ooquistes rojos, ácido-alcohol resistentes, con tinción homogénea, esféricos, de 4 Jim a 5 ¡J.m de diámetro de especies de Cryptosporidium. Estas form as son diagnósticas cuando se observan en preparaciones con esta tinción.

C. M icrofotografía de un frotis de heces teñido para ácido-alcohol resistencia que ilustra un ooquiste único, esférico y ácido-alcohol resistente de especies de Cyclospora. Estos ooquistes tienen un tam año aproxim a­ do del doble de los de las especies de Cryptosporidium, que varían de 8 |im a 10 |im de diámetro. Asimismo, los ooquistes de Cyclospora tienen una estructura interna mal definida, en lugar de la tinción hom ogénea de los de Cryptosporidium. D. Im agen con bajo aum ento (250x) de un ooquiste ácido-alcohol resistente con form a de huso de Isospora belli ubicado en el centro del campo de visión. Estos ooquistes miden de 25 |j.m a 30 |im de largo, un tam a­ ño relativamente grande que no puede apreciarse en esta imagen con bajo aumento, salvo cuando se com ­ para con los ooquistes muy dim inutos como manchas, de 5 |im de diámetro, de las especies de Cryptosporidium que están dispersos por el campo microscópico. La coexistencia de estas dos especies en la m ism a m uestra de heces es altam ente sugestiva de una persona con infección por HIV y siempre debe descartarse SIDA cuando se observa esta imagen. E.

M icrofotografía de una preparación en fresco directa que ilustra un ooquiste inmaduro, con form a elíptica de Isospora belli. Estos ooquistes miden 25-30 |im en el eje longitudinal y cuando son inmaduros, encierran sólo un único esporoquiste esférico, como se muestra en la fotografía. Com párese con el ooquiste maduro ilustrado en la lám ina en color 22-4F.

F.

Im agen de una preparación directa en fresco de heces que ilustra un ooquiste maduro de Isospora belli, que encierra dos esporoquistes esféricos. Los esporoquistes, ahora maduros, son infectantes para un segundo huésped y están listos para liberar esporozoítos en el intestino cuando se ingieren.

G . Corte de músculo esquelético teñido con hem atoxilina y eosina dentro del cual se observan dos quistes de especies de Sarcocystis. Estos quistes miden 300 |im de diámetro y están repletos de bradizoítos enquistados inactivos. Los seres humanos se infectan con esta form a si, com o huéspedes intermediarios accidenta­ les, ingieren los ooquistes infectantes en alim entos o agua contaminados. H . Tinción de Weber de una preparación de heces que ilustra muchas esporas pequeñas, de 2 )im a 3 |im , con form a de bastón de especies de M icrosporidium. Con esta tinción, las esporas se tiñen de salmón am ari­ llento. Nótese el tabique transverso y delgado característico que divide algunas de las esporas (flecha) obser­ vadas en este cam po m icroscópico, una característica útil para la identificación de género.

LÁMINAS EN COLOR 22-5

N em a to d o s A. Parásitos adultos m achos y hem bras de Ascaris lumbricoides. Los machos adultos suelen ser más cortos (20-25 cm) que las hem bras (25-30 cm) y presentan una cola curva (parásito en la parte inferior de la foto­ grafía). La cutícula lisa y no segm entada es una característica útil para distinguir estos parásitos de los gusa­ nos de la tierra, que en ocasiones pueden encontrarse en inodoros y sistem as de aguas servidas donde pue­ den confundirse por los parásitos elim inados por las heces. B.

Huevo de Ascaris lumbricoides algo ovoide, am arillo castaño, teñido con bilis, que mide de 45 (im a 60 p.m de diámetro. Tiene una cáscara gruesa recubierta por una m em brana album inoide ondulante característica. La retracción y el desarrollo de la división interna indican fecundación y posible capacidad infectante.

C. Se observa un huevo esférico, decorticado, de Ascaris lumbricoides que muestra una larva bien desarrolla­ da próxima a la eclosión. Es obvio que este huevo es altam ente infectante. D.

Huevo fecundado de Ascaris lumbricoides que muestra una cáscara externa lisa. Cuando se expone a la bilis dentro de la luz intestinal, la cubierta externa album inosa se disuelve y deja una superficie decorticada como la que se observa aquí.

E.

Fotografía com puesta que ilustra un parásito adulto de Enterobius vermicularis en el recuadro de la izquier­ da. Estos parásitos, que m iden entre 0,3 mm y 0,5 mm de diám etro y entre 8 mm y 1,3 mm de largo, tienen un tubo digestivo bien desarrollado y órganos de reproducción interna. La cola puntiaguda y las alas parabucales (flecha en la fotografía de la izquierda) son diagnósticas. La imagen en primer plano en el recuadro de la derecha m uestra m ejor las alas parabucales.

F.

Fotografía en dos recuadros que ilustra huevos de Enterobius vermicularis grávido, el de la derecha tiene la larva bien desarrollada. Estos huevos tienen una pared delgada y lisa, y miden alrededor de 55 nm x 25 |im . Cada huevo es alargado y aplanado en uno de los lados, que se asem eja a un balón de fútbol am ericano desinflado.

G. Fotografía de parásitos adultos Trichuris trichiura que muestra el segm ento anterior largo, con form a de láti­ go característico y el cuerpo posterior más corto y grueso que se asem eja a un mango. Estos parásitos son relativamente pequeños; miden alrededor de 35-45 mm de longitud. H . M icrofotografía de un huevo típico de Trichuris trichiura teñido con bilis, amarillo castaño, con una pared lisa, relativamente gruesa. Nótese la característica form a de barril y el tapón hialino distintivo con form a de cúpula en cada extrem idad polar. De A Pictorial Presentation o f Parasites, de H. Zaiman.

B

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LÁMINAS EN COLOR 22-5

I.

Fotografía de la cápsula bucal de una uncinaria adulta. Los dientes quitinosos observados aquí son caracte­ rísticos de la uncinaria del Viejo Mundo, Ancylostoma duodenale. Esta cápsula bucal está bien adaptada para la adherencia profunda del parásito a la mucosa intestinal y producir la rotura de capilares, lo que le permi­ te alimentarse con la sangre de la circulación.

J.

Imagen similar de la cápsula bucal de la uncinaria del Nuevo Mundo, Necator americanus, que ilustra las láminas cortantes características. Como sucede con Ancylostoma duodenale, esta cápsula bucal está bien adaptada para la adherencia profunda del parásito a la mucosa intestinal.

K . Microfotografía de una preparación directa en freso con yodo de heces que contiene un huevo ovalado típi­ co de uncinarias, que mide alrededor de 40 (im x 60 |im, con su pared delgada y lisa característica, que al desprenderla en el proceso de división interno deja un espacio claro debajo de la cáscara. Estos huevos no pueden distinguirse de los de Strongyloides stercoralis. Por lo general esta identificación diferencial no es necesaria, ya que los huevos de S. stercoralis rara vez se eliminan por las heces. L.

Microfotografía en dos recuadros en los que se comparan las cavidades bucales de las larvas rabditoides de uncinarias (izquierda) y de estrongiloides (derecha). La cavidad bucal de la larva rabditoide de uncinaria es larga cuando se la compara con la de estrongiloides. Las larvas rabditoides de las uncinarias rara vez se observan en las muestras fecales.

M . Campo microscópico de una preparación directa de heces en la que se observa una larva rabditoide peque­ ña y enrollada de Strongyloides stercoralis, vista con bajo aumento (lOOx). Estas larvas son muy móviles cuando se las observa en preparaciones en fresco. Es necesaria la observación de la cavidad bucal como se describió antes para confirmar el diagnóstico. Estas larvas miden en promedio 15 |im de diámetro y más de 200 )lm de largo. N. Larvas rabditoides que, tras un breve período de alimentación de 2 a 3 días, evolucionan en larvas filariformes infectantes largas y delgadas que no se alimentan y que pueden alcanzar 700 nm de largo. Estas larvas filariformes pueden penetrar directamente por la piel del huésped humano con el contacto directo. O. Corte de intestino delgado teñido con hematoxilina y eosina en el que se observan larvas filariformes redon­ das y lisas de Strongyloides stercoralis, características de los hallazgos histológicos de individuos con rein­ fección de estrongiloidiasis, que horadan en la lámina propia. En los pacientes con estrongiloides e inmunodeprimidos, el ciclo de vida desde la ovipostura, la formación de larva rabditoide y la de larva filariforme puede ser lo suficientemente breve para causar la autoinfección dentro del intestino antes de que las heces estén formadas, como se observa en esta fotografía. P.

Microfotografía de un huevo amarillo castaño, teñido con bilis de Capillaria philippinensis. Estos huevos presentan forma de limón o alargados; miden alrededor de 60 |im x 35 |im, y se asemejan a los de Trichuris trichiura, salvo que la cáscara es estriada y las protuberancias polares son amplias y planas.

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LÁMINAS EN COLOR 22-6 C estodos A.

Ejemplar adulto de Taenia saginata que ilustra el escólex pequeño (flecha blanca) y el estróbilo que se extiende a varios metros de largo y está compuesto por una cadena larga de proglótides.

B.

Imagen de cerca del escólex de Taenia solium que muestra las cuatro ventosas características del género. El rostelo armado protruye y presenta una corona de ganchos que permite la identificación de Taenia solium. El escólex de Taenia saginata no es armado.

C.

Imagen ampliada de un proglótide aislado de Taenia saginata al que se la ha inyectado tinta china a través del poro genital para marcar el contorno de las ramificaciones uterinas. Los proglótides de T. saginata tie­ nen más de 13 ramas uterinas laterales, como se muestra en la fotografía, para diferenciarlos de los de Taenia solium, que de modo típico presentan menos de 13 ramas. Esta observación permite la identificación de especie sobre la base del examen de los proglótides que fueron eliminados intactos por las heces.

D.

Fotografías en dos recuadros de un trozo de carne de cerdo con cisticercosis (izquierda) que presenta varios espacios quísticos pequeños, cada uno habitado por una larva cisticerco de Taenia solium. En el recuadro de la derecha se observa el cisticerco con más detalle. Dentro del saco lleno de líquido está el escólex invaginado. Las ventosas y los ganchos están ocultos por el colorante.

E.

Corte de tejido teñido con hematoxilina y eosina que ilustra el espacio quístico ocupado por el cisticerco de Taenia solium. El quiste tiene dos paredes: la externa compuesta por tejido fibroso reactivo producido por el tejido del huésped y la segunda es una membrana delgada interna producida por el parásito (parásito vesi­ culoso). En esta fotografía se observa un corte transversal del escólex invaginado y no se identifican las estructuras internas.

F.

Fotografía de un cisticerco de la tenia de la rata Hymenolepis diminuta. En este campo se visualiza mejor el escólex invaginado. Estos cisticercos se forman en el insecto que es el huésped intermediario, como pulgas, cucarachas y escarabajos. Los seres humanos se infectan a través de la ingestión de alimentos contamina­ dos con el insecto y los parásitos adultos se forman en el intestino después de la evaginación y adherencia del escólex a la mucosa.

G. Fotografía del útero de una hembra grávida de una especie de Taenia, que ilustra la agregación densa de hue­ vos esféricos de pared gruesa, algunos los cuales muestran las estriaciones características. H. Imagen de cerca de huevos de especies de Taenia como se podrían observar en la microscopía de prepara­ ciones en fresco de material infectado. Estos huevos miden en promedio 30 |im a 45 |lm de diámetro y pre­ sentan una pared lisa y gruesa, interrumpida por estriaciones radiadas características. Muchos huevos tam­ bién encierran tres pares de ganchos (embrión hexacanto) no observados en esta fotografía, pero con un aspecto similar a los de la membrana interna del huevo de Hymenolepis diminuta de la lámina en color 226N. Estos huevos no son específicos de especie y también presentan un aspecto similar a los de las especies de Echinococcus.

LÁMINAS EN COLOR 22-6 I.

Fotografía del escólex diminuto y los proglótides anchos y estrechos de Diphyllobothrium latum. la tenia adulta gigante. Esta tenia es la más larga que infecta a los seres humanos y alcanza entre 3 m y 10 m de lon­ gitud con más de 3 000 proglótides.

J.

Imagen de cerca del escólex con forma de espátula de D. latum, que muestra el surco característico central y longitudinal (botrio), limitado a cada lado por un pliegue característico (phyllo = "hoja” ), las estructuras a partir de las cuales proviene el nombre del género Diphyllobothrium.

K.

Imagen de cerca de un proglótide de Diphyllobothrium, que muestra las dimensiones características de los segmentos más anchos que largos de los cuales proviene el nombre del género “ latum” . Nótese el útero ramificado sin ninguna característica definida ubicado en el centro y linealmente, que aparece como una roseta compacta.

L.

Microfotografía de un huevo de Diphyllobothrium latum. Estos huevos son relativamente grandes, de 60 |im a 75 (xm de largo por 40 nm a 50 |^m de ancho. Son ovales y presentan una cáscara delgada y lisa, y la divi­ sión se extiende hasta la membrana interna de la cáscara. La característica es la presencia de un opérculo oculto y no saliente que lo diferencia del huevo de Paragonimus westermani, con un opérculo saliente carac­ terístico (lámina en color 22-7P).

M . Microfotografía de un huevo de Hymenolepis nana, compuesto por una membrana doble: la cáscara delga­ da externa y lisa, y una membrana interna que encierra la oncosfera. Como se observa en la fotografía, suele contener tres pares de ganchos (hexacanto). Estos huevos miden de 40 |im a 60 (im de diámetro y presen­ tan un contorno oval a subesférico. Los huevos de H. nana también se distinguen por la presencia de engra­ samientos polares sobre cada lado de la membrana interna del hexacanto, a partir de los cuales salen cuatro a ocho filamentos delgados, que se extienden en el espacio intermembrana (véase la fotografía). N.

Fotografía de un huevo de Hymenolepis diminuta. Estos huevos son más grandes que los de Hymenolepis nana, con un diámetro promedio de 60-80 |im y presentan un contorno esférico característico. La ausencia de engrasamientos polares y filamentos intermembrana también los diferencia de los de H. nana. Se obser­ van con claridad los seis ganchos (flecha).

O. Microfotografía de un conjunto de huevos de D. caninum, que demuestra el agregado de huevos esféricos sostenidos en una matriz. Los huevos mostrados aquí son inmaduros, ya que la presencia de ganchos inter­ nos indica madurez e infecciosidad. P.

Fotografía de un proglótide de Dipylidium caninum, que muestra un poro genital a cada lado, en el cual flu­ yen los delicados conductos vitelinos. Esta disposición de poros dobles es exclusiva para D. caninum (del cual proviene el nombre del género, pyle = “ entrada u orificio” ), ya que los proglótides de otras tenias tie­ nen sólo un poro genital lateral que alterna de un lado al otro sobre segmentos adyacentes. Los proglótides tienen forma de florero, más largos que anchos.

LÁMINAS EN COLOR 22-7 T remátodos A.

Fotografía de parásitos adultos macho y hembra de Schistosoma. El macho en esta fotografía es más pálido y tiene un canal ginecóforo por el cual copula la hembra, más oscura, que se ha desprendido. Los machos adultos miden de 20 mm a 30 mm de longitud, y las hembras, de 17 mm a 14 mm. Estos tremátodos pre­ sentan el diámetro de una hebra, lo que les permite ocupar la luz de las vénulas y causar el bloqueo del flujo sanguíneo que produce un edema mínimo.

B.

Microfotografía de un huevo de Schistosoma monsoni, con su pared lisa y delgada característica, y el con­ torno oval con una espícula lateral prominente. Estos huevos son relativamente grandes, de 115 (im a 180 |im de largo por 45 nm a 70 ¡im de ancho. Cuando llegan a la madurez, eclosiona la larva miracidio intacta, lo que evita el período de desarrollo en el ambiente externo.

C.

Microfotografía de un huevo de Schistosoma haematobium, que también tiene una cáscara delgada y lisa, y un contorno oval, pero se diferencia del huevo de S. monsoni porque tiene una espícula terminal en lugar de lateral. Estos huevos también son relativamente grandes, de 110 |j.m a 170 |im de largo y 40 (im a 70 |j.m de ancho.

D.

Aquí se ilustra un huevo de Schistosoma japonicum, que es más pequeño (80 a 100 (xm de diámetro), más oval a esférico y tiene una división interna que se extiende hasta la cáscara interna. Aunque no se observa la espina, es característico el pequeño botón lateral (no presente en esta fotografía).

E.

Microfotografía de una cercaría con cola bifurcada, el estadio infectante en el ciclo de vida de Schistosoma. Estas cercanas que nadan libremente se liberan a partir de las redias, presentes en los caracoles infectados y tienen la capacidad, a través de la actividad enzimàtica, de penetrar directamente la piel de un ser huma­ no desprevenido que puede vadear o nadar en estuarios de agua dulce infestados.

G. Ejemplar de la duela adulta Fasciola hepatica. Estas duelas son hermafroditas y tienen órganos reproducto­ res femeninos y masculinos. La porción anterior de F. hepatica se proyecta en un cono cefálico, justo por detrás del cual se encuentra la ventosa anterior. Inmediatamente por detrás de la ventosa y oscuro en esta fotografía, se observa el útero convoluto ramificado. Por detrás del útero se encuentra la ventosa ventral. La parte más gruesa de la porción posterior de la duela incluye los testículos, que aparecen como una malla rosada en la fotografía. Estos parásitos miden cerca de 3 cm x 1 cm (casi el tamaño de un portaobjetos). De A Pictorial Presentation o f Parasites, de H. Zaiman. G. Ejemplar adulto del trematodo Fasciolopsis buski, la duela intestinal gigante, que también es hermafrodita y tiene estructuras similares a las descritas para F. hepatica. En contraposición, el extremo cefálico es redon­ deado y desprovisto de la protrusión cónica. Estas duelas miden alrededor de 2 cm a 7,5 cm de largo y 0,8 cm a 2 cm de ancho. H. Microfotografía de un huevo de F. hepatica (que no puede distinguirse del de F. buski), que muestra una pared delgada y lisa, y una división interna que se extiende a la membrana interna de la cáscara. Nótese la muesca sobre cada lado de la cáscara hacia el extremo estrecho, que representa el opérculo, una estructura similar a una tapa que se abre en el momento en que eclosiona la larva. Estos huevos son grandes, alrede­ dor de 150 |im x 80 pm en su máxima dimensión.

LÁMINAS EN COLOR 22-7

I.

Fotografía de un ejemplar adulto del trematodo Clonorchis sinensis, en el que se observa el extremo cefáli­ co largo, con forma de botella y una ventosa terminal prominente, con el útero color castaño oscuro y los testículos ampliamente ramificados, rosa pálido en la parte posterior. Estas estructuras internas, que se mue­ ven desde la boca hasta la cola, se ilustran con más detalle en la lámina en color 22-7J-M.

J.

En esta fotografía se ilustra la boca anterior o ventosa oral, que lleva a un tubo digestivo en fondo de saco denominado ciego, una rama del cual transcurre por los bordes laterales del parásito.

K.

Posterior a la ventosa oral se encuentra la ventosa ventral, ubicada exactamente enfrente del útero que pre­ senta una tinción oscura, limitada a cada lado por las ramas del ciego. Las glándulas vitelinas con tinción pálida se observan en el borde superior del parásito entre el ciego y el tegumento externo. Estas glándulas producen la yema de los huevos formados en los ovarios.

L.

Este campo de la imagen es posterior al útero y muestra el ovario. Nótese el delicado conducto vitelino que ingresa en el ovario en el lado derecho.

M . Este campo de la imagen es la parte posterior del parásito y destaca los testículos extensamente ramificados, a partir de los cuales proviene el nombre del género (clon = dividido; orchis = testículos). Nótese que el cie­ go termina como un conducto sin salida. La vejiga excretora es el espacio blanco y mal definido en el borde inmediato posterior. N.

Corte teñido con hematoxilina y eosina a través del conducto biliar dilatado dentro del cual residen tres ejemplares adultos de Clonorchis sinensis que se observan en un corte transversal. Aunque hay un infiltra­ do inflamatorio crónico leve en la mucosa circundante, no se evidencia fibrosis extensa ni oclusión de la luz.

O. Microfotografía de un huevo de Clonorchis sinensis, que ilustra una pared delgada y lisa. Lo característico es el opérculo prominente y saliente del extremo más ancho. Un pequeño botón posterior, no visible en esta fotografía, puede observarse en el extremo más estrecho, antiopercular del huevo. Estos huevos son relati­ vamente pequeños; miden de 25 |im a 35 |im de largo por 14 |j.m a 17 |im de ancho.

P.

Microfotografía de un huevo de Paragonimus westermani. La cáscara es lisa, relativamente delgada e inte­ rrumpida en uno de los extremos por un opérculo prominente y saliente. Este huevo presenta un aspecto morfológico similar al de Clonorchis sinensis; sin embargo, estas fotografías comparativas son engañosas, ya que los huevos de P. westermani tienen un tamaño dos a tres veces mayor; miden de 65 |im a 120 |im de largo por 40 |im a 70 (im de ancho. Con este gran tamaño, los huevos de P. westermani parecen similares a los de Diphyllobothrium latum; sin embargo, este último puede distinguirse por su opérculo saliente plano en lugar de sobreelevado.

LÁMINAS EN COLOR 22-8 P lasmodium A.

Microfotografía de un frotis de sangre periférica con tinción de Wright-Giemsa que ilustra varios eritroci­ tos infectados por formas anulares de especies de Plasmodium. Los eritrocitos infectados no presentan un tamaño mayor que las células que los rodean y no hay presencia de gránulos de Schüffner. El tamaño peque­ ño de los anillos sin el desarrollo en formas de trofozoítos y la infección intensa indica una infección por Plasmodium falciparum.

B.

Los eritrocitos infectados en esta microfotografía de un frotis de sangre periférica teñido también indica a Plasmodium falciparum, tanto por el intenso compromiso como por la ubicación de los diminutos anillos junto a las membranas celulares internas, conocido como aspecto en "anillo de sello” . De hecho, este frotis se obtuvo de un paciente con paludismo fulminante por la especie P. falciparum.

C.

El paludismo por P. falciparum puede identificarse de modo definitivo si en el frotis de sangre periférica se observa el gametocito grande en forma de plátano o de media luna, como se ilustra en la parte inferior de de esta fotografía (flecha azul). También nótese el pequeño anillo del plasmodio en la célula cerca de la parte superior del campo de la imagen (flecha roja), de nuevo compatible con Plasmodium falciparum.

D. El eritrocito infectado ilustrado en este frotis de sangre periférica teñido es más grande y pálido que las célu­ las circundantes y también tiene un citoplasma característico punteado por la presencia de gránulos de Schüffner. Nótese también que el trofozoíto anular es relativamente grande. Estas características son diag­ nósticas de infección por Plasmodium vivax. E.

Plasmodium vivax también puede sospecharse si en el frotis de sangre periférica teñido se observa el esquizonte multicelular como el que se ilustra por el eritrocito agrandado en el centro de esta microfotografía. De modo típico, estos esquizontes tienen más de 13 segmentos.

F.

En este frotis de sangre periférica teñido se observa un eritrocito agrandado y pálido que contiene un game­ tocito con un solo núcleo de Plasmodium vivax.

G. Microfotografía de un frotis de sangre periférica con tinción de Wright-Giemsa que ilustra un eritrocito infectado por un trofozoíto de Plasmodium malariae. Nótese que el citoplasma está condensado, no se desa­ rrolla en una forma ameboide y adopta la forma de bandas que se extienden de un lado al otro de la mem­ brana celular. El eritrocito no está agrandado y los gránulos de Schüffner están ausentes. H. Plasmodium malariae también puede sospecharse si se observa un esquizonte multinucleado con menos de 13 segmentos. De modo característico, los segmentos están dispuestos en un patrón de roseta circular como se observa en esta fotografía, a menudo rodeado por una masa densa de pigmento palúdico que está ausen­ te en esta célula infectada particular.

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LÁMINAS EN COLOR 22-9 B a besio sis /Leish m aniasis /Tripanosomiasis A.

Microfotografía de un frotis de sangre periférica con tinción de Wright-Giemsa que ilustra varios eritroci­ tos infectados por especies de Babesia con diminutas formas anulares pleomórficas. Pueden observarse for­ mas anulares diminutas sugestivas de Plasmodium falciparum, como se observan en uno de los eritrocitos en la parte central inferior de esta imagen. Los eritrocitos infectados no están agrandados, no son pálidos y nunca acumulan pigmento palúdico. Cabe destacar la disposición de estas formas en dobletes que recuerdan las orejas de conejos; o más característico aún, en tétradas que recuerdan la cruz de Malta.

B.

Fotografía de los miembros inferiores de un paciente infectado por Leishmania trópica, una especie que causa la leishmaniasis cutánea, también conocida como úlceras de Chiclero. Las lesiones ulcerativas como se observan en esta fotografía son el resultado de la inflamación granulomatosa causada por los amastigotos que infiltran el tejido.

C.

Corte de tejido subcutáneo teñido con hematoxilina y eosina tomado del borde de una úlcera similar a la mostrada en la lámina en color 22-9B. Nótense las diminutas formas levaduriformes observadas en el cito­ plasma de muchos de los histiocitos y macrófagos que infiltran el tejido. Éstos representan los amastigotos, las formas infectantes de las leishmaniasis visceral y cutánea. Estas formas son difíciles de diferenciar de las formas levaduriformes intracitoplasmáticas de Histoplasma capsulatum, pero a menudo pueden diferenciar­ se en frotis de aspirados teñidos mediante la demostración de los cinetoplastos en forma de bastón, como se ilustra en la lámina en color 22-9D y E.

D. Frotis por impronta con tinción de Wright-Giemsa que ilustra escasos macrófagos de fondo y nu-merosos amastigotos diminutos de 2 a 3 mm de especies de Leishmania. Como ya se mencionó, estas formas suelen ser difíciles de diferenciar de las formas levaduriformes de Histoplasma capsulatum. Sin embargo, la obser­ vación cuidadosa revelará que muchas de ellas tienen cinetoplastos en forma de bastón (flecha azul), carac­ terística de los amastigotos de Leishmania. E.

Imagen con mayor aumento de un aspirado teñido que ilustra amastigotos de especies de Leishmania, iden­ tificados por los cinetoplastos característicos dentro de muchas de estas formas.

F.

Microfotografía de un frotis de sangre periférica con tinción de Wright en el que se observan varios tripanosomas extracelulares. Este frotis se obtuvo de un paciente con tripanosomiasis africana. Cada organismo individual es largo, delgado y mide de 15 mm a 30 mm de largo por 1,5 mm a 4 mm de ancho. La estruc­ tura más oscura observada en la parte posterior, similar a un punto, de cada tripanosoma es el cinetoplasto, a partir del cual se origina el flagelo. Cada flagelo sigue el contorno externo de una membrana ondulante que recorre toda la longitud del cuerpo del parásito y luego se extiende cierta distancia más desde el extre­ mo anterior.

G. Microfotografía de un frotis de sangre periférica con tinción de Wright obtenido de un paciente con tripa­ nosomiasis americana, también conocida como enfermedad de Chagas. Nótese la característica forma de “ C” de los tripanosomas. Cada tripanosoma tiene una estructura similar a un punto, teñida de oscuro, en la parte posterior que corresponde al cinetoplasto, a partir del cual se origina un único flagelo. H. Fotografía de un triatoma (chinche reduvídea o vinchuca), el vector para la transmisión de la enfermedad de Chagas. En el intestino posterior de este triatomídeo se desarrollan los tripanosomas metacíclicos, tras la ingestión de tripanosomas a través de la picadura de un paciente infectado. Los tripanosomas reingresan al tejido subcutáneo después de la picadura del segundo huésped humano, no por la picadura en sí sino cuan­ do las deyecciones contaminadas de la vinchuca penetran en la herida dolorosa por el rascado.

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LÁMINAS EN COLOR 22-10

F il a r ía s

A.

Microfotografía de un frotis de sangre periférica que muestra una microfilaria con vaina. Las microfilarias son parásitos extracelulares que miden cerca de 245-295 mm de longitud y 7-10 mm de ancho. Se liberan a la circulación de las hembras grávidas que residen dentro de los vasos linfáticos en las partes infectadas del cuerpo. Las microfilarias liberadas por especies patógenas para los seres humanos tienen vaina, como se ilustra en esta fotografía (flecha). Como la columna de núcleos observada en el parásito de esta fotografía no parece extenderse hasta la punta de la cola, la especie más probable es Wucherería bancrofti.

B.

Microfotografía de un frotis de sangre periférica que ilustra el corte de la cola de una microfilaria y desta­ ca la disposición nuclear. Nótese que los dos núcleos se extienden al interior de la cola, un rasgo caracte­ rístico de Brugia malayi.

C.

Una columna de núcleos que se extienden a la cola de una microfilaria, como se observa en esta microfoto­ grafía, es característica de Loa loa.

D.

Microfotografía de un corte teñido con hematoxilina y eosina de un nodulo subcutáneo que muestra el corte transversal de la filaría hembra Onchocerca volvulus. Dentro de la cavidad de este organismo se observan numerosas microfilarias, que por último se liberan en el tejido circundante donde producen una reacción inflamatoria que termina en fibrosis. Las microfilarias de O. volvulus rara vez circulan en la sangre perifé­ rica, o lo hacen en cantidades tan pequeñas que casi nunca pueden detectarse en frotis teñidos.

E.

Fotografía de un corazón de perro infestado con gran cantidad de parásitos adultos Dirofilaria immitis. Los cánidos actúan como huéspedes definitivos de este nematodo tisular. En los seres humanos, que pueden actuar como huéspedes accidentales, las formas larvarias nunca alcanzan el corazón ya que los pulmones actúan como filtros, en los que producen granulomas inflamatorios multifocales.

F.

Microfotografía de un frotis por impronta con tinción de Giemsa en la que se observan numerosos taquizoítos con forma de arco, teñidos de azul de Toxoplasma gondii. Cada taquizoíto mide alrededor de 3-6 mm, presenta forma piriforme o de arco y tiene un núcleo y diversos orgánulos internos, como mitocondrias, retículo endoplasmático y aparato de Golgi, observado sólo con el microscopio electrónico. Los taquizoítos son las formas infectantes del parásito, los cuales ingresan en la circulación y son transportados a varios órganos, en especial el sistema nervioso central donde causan lesiones inflamatorias microfocales. Los taquizoítos pueden atravesar la placenta de una mujer embarazada, ingresar en la circulación fetal y causar infecciones congénitas en los recién nacidos.

G. Microfotografía de un corte histológico teñido con Giemsa de una biopsia de cerebro obtenida de un pacien­ te con toxoplasmosis cerebral. Se observan tres quistes, que miden entre 15 |jm y 30 pm de diámetro, den­ tro de los cuales hay gran cantidad de bradizoítos teñidos de azul. En los seres humanos con un sistema inmunitario competente, los taquizoítos se enquistan e inactivan como se muestra en la fotografía. H. Imagen con mayor aumento del quiste de toxoplasma repleto de bradizoítos. Si bien la enfermedad está dete­ nida en esta forma quística, la supresión de la inmunidad en una persona infectada previamente puede deter­ minar que estos quistes se rompan y liberen de nuevo taquizoítos activos que, ya libres, causan la reinfec­ ción por toxoplasmosis.

LÁMINAS EN COLOR 22-11 P arásitos tisulares A.

Corte de músculo cardíaco teñido con hematoxilina y eosina, que incluye una fibra de mayor tamaño desde la parte superior a la inferior a lo largo del centro del campo de la imagen que está habitada por una colec­ ción densa de formas de amastig-otos de Trypanosoma cruzi. La afectación cardíaca en pacientes con enfer­ medad de Chagas suele producir insuficiencia cardíaca y muerte.

B.

Fotografía de un quiste hepático que contiene múltiples quistes hidatídicos pequeños, de tamaño variable.

C.

Imagen de cerca de dos quistes hidatídicos extirpados del mesenterio de una persona con hidatidosis, que ilustra la membrana externa delgada y lisa de la superficie externa con agregados de grasa adheridos.

D. Corte teñido con hematoxilina y eosina a través del quiste hidatídico. La pared del quiste está compuesta por una capa densa de tejido fibroso proveniente de la reacción del huésped. La membrana interna del pará­ sito es la membrana germinativa, a partir de la cual se formaron tres embriones hijos (cápsulas prolígeras), cada uno con un escólex invertido. Cuando los embriones se liberan de la membrana germinativa, estos quis­ tes hijos junto con los protoescólices liberados flotan en el líquido dentro del quiste y forman la arenilla hidatídica. E.

Se observan protoescólices (fragmentos de la “ arenilla hidatídica” ), cada uno de los cuales contiene un rostelo invertido con una corona de ganchos prominente, que representa el germen del rostelo armado que sobresale del parásito adulto.

F.

Microfotografía de la tenia adulta Echinococcus granulosus. Estos parásitos adultos, que residen en el intes­ tino de los perros y otros cánidos, son muy pequeños, miden no más de 6 mm de longitud, y están com­ puestos sólo por tres segmentos: un escólex armado, un cuello y un proglótide único, a partir del cual se libe­ ra una cantidad relativamente pequeña de huevos. Sin embargo, como hay varios cientos de estos parásitos en el intestino del perro y el tiempo de supervivencia de cada parásito puede alcanzar los 20 meses, el núme­ ro total de huevos liberados en un período prolongado puede ser enorme, lo que da garantía de completar el ciclo de vida.

G. Corte de músculo esquelético teñido con hematoxilina y eosina que muestra una larva enquistada y enrolla­ da de Trichinella spiralis. La infiltración densa de células inflamatorias en el tejido circundante del quiste indica la infección relativamente reciente, asociada con más probabilidad con síntomas locales y tal vez generales. H. Una segunda imagen de una muestra de biopsia de músculo en la que se observa la larva enrollada de Trichinella spiralis. La ausencia de reacción inflamatoria y la menor cantidad de tejido fibroso denso alre­ dedor del quiste indican una infección crónica. Con el tiempo este quiste inactivo se calcifica, lo que repre­ senta la última etapa de la infección.

LÁMINAS EN COLOR 23-1 I nclusión v ir a l A.

Hepatitis por virus de la varicela-zóster. Los núcleos de varios hepatocitos contienen inclusiones típicas de los herpes virus. La masa de la inclusión es eosinófila y adquiere un color rojo, y la cromatina nuclear resi­ dual, que es basófila y está coloreada de azul, se agrupa alrededor del borde de la membrana nuclear. La inclusión se destaca debido a un halo nítido, que se debe a un artefacto de técnica, entre la inclusión y la cromatina nuclear desplazada hacia la periferia. Este artefacto está producido por la fijación con formol. Las inclusiones del virus del herpes simple y de la varicela-zóster no pueden diferenciarse. (Tinción con hematoxilina y eosina).

B.

Cervicitis por herpes simple. La tinción de Papanicolaou muestra numerosas células gigantes multinucleadas en el raspado de cuello uterino. Los núcleos aparecen moldeados contra los otros y se observan inclu­ siones. Estas aparecen homogéneas y la cromatina nuclear está desplazada hacia la periferia sobre la mem­ brana nuclear. La preparación citológica se fijó enseguida con etanol y no se observa el halo, como resulta­ do del artefacto por la fijación con formol. La célula madura del epitelio pavimentoso se tiñe de rosa.

C.

Lesión vesicular por herpes simple; prueba de Tzanck. Estas células provienen del raspado de la base de una vesícula herpética. La célula multinucleada es característica de la infección por herpes, pero no se pueden diferenciar los efectos del virus del herpes simple de los de los virus de la varicela-zóster. Los múltiples núcleos están moldeados con los otros y son homogéneos, pero las inclusiones son difíciles de observar en los frotis secados al aire y con tinción de Giemsa o similar. Los raspados directos también pueden teñirse con el método de Papanicolaou o hematoxilina y eosina.

D.

Sialadenitis por citomegalovirus. Las células epiteliales de la glándula salival contienen las inclusiones de citomegalovirus. Las grandes inclusiones basófilas (azul o púrpura) ocupan gran parte del núcleo. En algu­ nas células se observan halos claros entre la inclusión y la membrana nuclear debidos al artefacto causado por la fijación con formol. En algunas células también se observan inclusiones citoplasmáticas granulares. La arquitectura de la glándula salival está distorsionada por un intenso infiltrado linfocítico. El aumento de tamaño de las células infectadas y de los núcleos inspiró la denominación del virus. El nombre original fue virus de la glándula salival y la infección que producía se conoció como enfermedad por inclusión de la glándula salival, debido a la prominencia de la infección de este órgano en la enfermedad neonatal. (Tinción con hematoxilina y eosina).

E.

Neumonía por adenovirus. En este caso de infección por adenovirus hay una gran cantidad de exudado proteináceo (que es eosinófilo) en los espacios aéreos, pero se observan escasas células inflamatorias. Los núcleos de las células infectadas del epitelio respiratorio están completamente reemplazados por D N A viral, que produce una inclusión basófila densa. Las inclusiones se asemejan a las causadas por el virus del her­ pes simple. Las inclusiones maduras, como las observadas aquí, ocupan el núcleo y desdibujan el contorno de la membrana nuclear. Se conocen como células manchadas. (Tinción con hematoxilina y eosina).

F.

Neumonía por sarampión. En las vías aéreas de este paciente con neumonía por sarampión se observan varias células multinucleadas gigantes. Los núcleos múltiples contienen inclusiones nucleares eosinófilas que se asemejan a las del virus del herpes simple. La cromatina nuclear está desplazada hacia el borde de la membrana nuclear, pero en este corte no se observa el artefacto del halo claro causado por la fijación con formol. Además, en este caso hay también inclusiones citoplasmáticas eosinófilas, algunas de las cuales se fusionan o se rodean por un espacio claro. (Tinción con hematoxilina y eosina).

G. Infección por virus sincitial respiratorio. Monocapa de células HEp-2 infectadas por el virus sincitial respi­ ratorio. En la monocapa se han formado dos células sincitiales gigantes. No se observan inclusiones en los núcleos, pero pueden verse varias inclusiones intracitoplasmáticas eosinófilas brillantes. (Tinción con hema­ toxilina y eosina). H. Encefalitis por rabia. En dos neuronas se observan inclusiones intracitoplasmáticas eosinófilas conocidas como cuerpos de Negri. En la inclusión se evidencian algunas vacuolas. El aspecto irregular proviene de la combinación de estructuras citoplasmáticas normales con masas de ácido ribonucleico viral. (Tinción con hematoxilina y eosina). (Gentileza de Daniel Perl).

LÁMINAS EN COLOR 23-2 Diagnóstico de infecciones causadas por virus A.

Chlamydia y E hrlichia

Conjuntivitis de inclusión por Chlamydia trachomatis. Se observa una célula epitelial que contiene un cuer­ po de inclusión clamidial. La célula sufrió un proceso de degeneración y dejó sólo el núcleo y la gran inclu­ sión. Esta última está amoldada o recubre al núcleo subyacente. Frotis con tinción de Giemsa. (Fotografía reproducida con autorización de Julius Schachter y PSG Publishing Company. Inc., Littleton, M A).

B.

Cervicitis por C. trachomatis. En esta infección con abundante cantidad de microorganismos se observan innumerables cuerpos elementales. La tinción de contraste con azul de Evans determina que la célula pre­ sente fluorescencia roja y las inclusiones aparezcan amarillas en la microfotografía. En las zonas con menor cantidad de material de fondo o sin tinción de contraste, el anticuerpo marcado con fluoresceína determina que los cuerpos elementales presenten fluorescencia verde manzana. En el centro de la fotografía se obser­ va una célula con infección intensa. Estos casos no plantean problemas diagnósticos, pero la detección de muestras positivas en las cuales sólo hay escasos cuerpos elementales es mucho más difícil.

C.

Monocapa de células de M cCoy infectadas por C. trachomatis. La muestra se centrifugó sobre esta monocapa de células tratadas con cicloheximida, incubadas durante 48 horas. Las células se tiñieron con anti­ cuerpos monoclonales conjugados con fluoresceína contra una proteína mayor de la membrana externa (M O M P ) de C. trachomatis. Múltiples inclusiones intracitoplasmáticas, que corresponden a la inclusión mostrada en la lámina en color 23-2A, se tiñen de verde brillante.

D.

Células HEp-2 infectadas por el virus del herpes simple tipo 1. Cuando se hizo evidente el efecto citopático, las células se separaron de la monocapa y se colocaron en un portaobjetos. Las células se tiñeron con anticuerpos monoclonales conjugados con fluoresceína contra virus del herpes simple tipo 1. Se observa fluorescencia brillante específica, tanto nuclear como citoplasmàtica.

E.

Aspirado nasal infectado por virus sincitial respiratorio. Dos células en el frotis muestran fluorescencia cito­ plasmàtica verde brillante. Además de la fluorescencia difusa, la que se presenta como un punteado dife­ renciado representa inclusiones virales, característico de este virus y ayuda a confirmar la especificidad de la fluorescencia. (Anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína contra virus sin­ citial respiratorio).

F.

Fibroblastos diploides humanos infectados por citomegalovirus en cultivos por la técnica shell vial. Los fibroblastos alargados se colorean con la tinción de contraste. Las células infectadas se distinguen por la fluorescencia verde brillante de los núcleos ovales. (Anticuerpos monoclonales conjugados con isotiociana­ to de fluoresceína contra el antígeno temprano-intermedio del citomegalovirus).

G. Ehrliquiosis monocítica humana causada por Ehrlichia chaffeensis. Una célula mononuclear circulante con­ tiene una inclusión citoplasmàtica bien definida (mórula) formada por células bacterianas individuales. Las inclusiones rara vez se observan en casos de ehrliquiosis monolítica. (Tinción de Wright. Material propor­ cionado por J. Stephen Dumler). H. Ehrliquiosis granulocítica humana causada por una especie de Ehrlichia sin nombre particular. Se observa una inclusión azulada en el citoplasma de un neutrófilo circulante. No está clara la frecuencia con la cual se encuentran inclusiones en la ehrliquiosis granulocítica humana. (Tinción de Wright. Material proporciona­ do por J. Stephen Dumler).

LÁMINAS EN COLOR A-1 I dentificación de garrapatas A.

Larvas de garrapatas, en este caso Ixodes scapularís, que se distinguen por la presencia de seis patas, tres de cada lado. Las ninfas y los adultos presentan un total de ocho patas.

B.

Ixodes scapularís en distintos estadios de su desarrollo ( “ instares” ) vistos sobre una moneda de diez centa­ vos de dólar para la comparación del tamaño. De izquierda a derecha: hembra adulta (F), macho adulto (M ), ninfa (N ) y larva (L).

C.

Cara ventral de la hembra adulta de Ixodes scapularís que demuestra la relación del aparato bucal con la base del capitulum (B), palpos (P), hipostoma (H), poro genital (G), ano (A ), surco anal (U ) y placa de los espiráculos (S). Los agregados muestran detalles de los aparatos bucales. Nótense los dentículos similares a dientes que sobresalen desde los bordes laterales del hipostoma.

D.

Espolones coxales de un ejemplar adulto de Ixodes scapularís. El espolón coxal es largo, con extremo en punta y orientado hacia adentro. Los espolones en los coxales I a IV son cortos, romos y se orientan hacia afuera.

E.

Dorso de un ejemplar hembra de Ixodes cookei. El escudo (S) es angular. La longitud de los palpos (P) es casi igual que las base del capitulum (B). En este ejemplar el hipostoma (H ) está roto.

F.

Dorso de un ejemplar hembra de I. marxi. El escudo (S ) es angular y se asemeja al de I. cookei (compáre­ se con lámina en color A-1F), pero el escudo de I. marxi es más largo que ancho cuando se lo compara con I. cookei.

G. Hembras adultas de Dermacentor variabilis. El escudo muestra ornamentación (O). Los festones (F) están presentes en el margen posterior. Uno de los ejemplares está considerablemente ingurgitado (E), lo que pro­ duce un cambio de color del dorso del castaño al crema. H. Hembras adultas de Dermacentor variabilis. El escudo está intensamente ornamentado (O). La base del capitulum (B ) es más ancha que alta. Nótense los “ ojos” en ambos márgenes laterales (flechas).

LÁMINAS EN COLOR A-2 I dentificación de garrapatas y otros artrópodos A.

Dorso de un ejemplar hembra de Amblyomma americanum. La ornamentación sobre el escudo (S) adquie­ re la forma de una placa en el borde posterior: la estrella solitaria (flecha). Se observan festones (F) alrede­ dor del borde posterior de la garrapata. Presenta “ ojos” , pero son difíciles de ver en este ejemplar parcial­ mente ingurgitado.

B.

Dorso de un ejemplar macho de Amblyomma americanum. Un “ ojo” muy prominente (flecha) en el borde lateral del escudo cubre todo el dorso. No se observa el aparato bucal.

C.

Dorso de un ejemplar macho de Amblyomma americanum. Los festones (F) prominentes se observan en el margen posterior. Las flechas indican dos marcas con forma de herradura a ambos lados de la línea media

D.

Superficie ventral de un ejemplar macho de Amblyomma americanum. Se observa un espolón interno pro­ minente en el coxal IV (flechas). En el recuadro (I) se muestra el detalle del espolón. El ano (A ) está rode­ ado por una ranura de concavidad posterior (GR), en contraste con la ranura de concavidad anterior de las especies de Ixodes. El poro genital (G ) es prominente. En este ejemplar faltan los aparatos bucales y la base del capitulum.

E.

Vista dorsal de especies de Ornithodoros. Esta garrapata blanda carece de escudo y los aparatos bucales no se observan desde arriba.

F.

Sarcoptes scabiei en su galería. El ácaro ha depositado huevos y defecado en su nuevo hábitat, lo que moles­ ta a quien lo padece.

G. Loxosceles recluso, la araña parda. El color castaño y la marca característica en la cabeza distinguen a esta araña venenosa. (Fotografía cortesía de Robert Suter). H. Araña viuda negra. Se observan con claridad el color negro intenso y la marca roja en forma de reloj de arena característica en el abdomen. (Fotografía cortesía de Robert Suter).

LÁMINAS EN COLOR A-3 I dentificación de otros artrópodos A. Dermatobia hominis. La larva de mosca humana se ha extraído de una lesión pustular. Se observan la forma de "frasco” bien definida, con un cuello largo que se adelgaza progresivamente y las espinas que la rodean. El cuello fue dañado en el momento de la extirpación quirúrgica.

B. Vista ventral de especies de Cimex, la chinche de cama. El color naranja amarronado y la forma proporcio­ nan las características útiles para la identificación. C.

Vista dorsal de especie de Triatoma, una chinche reduvídea (vinchuca). Su característica es el cuerpo alar­ gado y la cabeza larga y delgada. Se observa un par de alas.

D. Tunga penetrans, la pulga “jig ge r". La mayoría pica a su huésped rápidamente y lo abandona para comple­ tar su ciclo de vida, pero esta pulga permanece incrustada en la piel donde se desarrollan sus huevos. E.

Ejemplar hembra de especies de Ctenocephalides, la pulga del perro o del gato. Las patas largas y muscu­ losas cuelgan del cuerpo y convierten a la pulga en un extraordinario saltarín. Se observa el aspecto “ encor­ vado” del cuerpo.

F. Ejemplar hembra de Pediculus humanus, el piojo del cuerpo humano. El cuerpo largo y delgado se apoya en tres pares de patas, cada una de las cuales presenta ganchos similares a tenazas en la punta. G. Liendre del piojo de la cabeza. El huevo se adhiere con firmeza al tallo del pelo. H. Ejemplar hembra de Phthirus pubis, el piojo cangrejo o pubiano. El cuerpo corto y redondeado y las tena­ zas sobre los tres pares de patas justifican el nombre popular. El piojo cuelga sobre el tallo piloso, que sos­ tiene una liendre.

ín d ic e

a n a lític o

A Abbott LCx, ensayo para M. tuberculosis, identi­ ficación de micobacterias, 1060 Abceso(s), 7, 94 - diagnóstico, 92 - encefálico, 91 - presentación clínica, 94 - pulmonar, 75 Abiotrofia, especies, 671 - identificación, 693, 698c Absidia, especies, identificación, 1119, 1120f Abuso sexual en niños, infecciones por C. tra­ chomatis y, 1348 Ácaros, identificación, 1365, 1366f Achromobacter, especies, 324, 325c, 326c - asacarolíticos, 324, 325c - grupos B, E y F, 292c - sacarolíticos, 324, 326c Ácido 2-ceto-3-desoxioctonoico (CDO), 181 Ácido desoxirribonucleico (D N A ), Véase tam­ bién DNA - bases de nucleótidos, 130, 132f - definición, 130 - estructura, 129, 131f - función, 131, 13 l f - monofosfatos de nucleótidos, 130, 131f - ramificado, 135 - replicación, 132, 132f - - bacterias y, 172 Ácido dipicolínico, 184 Ácido etilenediaminotetraacético (ED TA), tripsi­ na y, diagnóstico de infección viral, 1320 Ácido hialurónico liasa, 198, 650 Ácido L-acetilmurámico, 178, 178f Ácido lipoteicoico, 650 - factor de virulencia en especies de Enterococcus, 667 - S. pneumoniae, 656 Ácido meso-diaminopimélico, 750 Ácido micólico, 182 Ácido ribonucleico (R N A ) - bases de nucleótidos, 130, 132f - estructura, 130 - función, 131, 13 l f Ácido teicoico - de S. aureus, 600r - de S. pneumoniae, 656 Ácidos grasos - celulares, especies de Legionella, 533c, 534c - del glicerol en presencia de eritromicina, dife­ renciación de micrococos y estafiloco­ cos, 613 - volátiles, identificación, determinación de pro­ ductos metabólicos de anaerobios, 864, 867f, 867r Ácidos micólicos, 182 Ácidos no volátiles, en determinación de produc­ tos metabólicos de anaerobios, 866, 869r Ácidos nucleicos, 129, 130f - C. trachomatis, detección, 1348 - categorías, 130 - especies de Legionella, examen, 531, 531r, 533c, 534c - especies de Rickettsia, detección, 1351

- infecciones del SNC, detección, 92 Acinetobacter, especies, 341, 344c, 345, 541 - A. baumanii identificación, 340 Acremonium, especies, grupos de conidios produ­ cidos, 1132,1133f Acrópeta, 1107r Acroteca, 1163, 1163f Actinobacillus, especies, 429 - A. actinomycetemcomitans, 429, 43 Ir - - características de cultivo, 432, 433c - - factores de virulencia, 43 Ir - - importancia clínica, 430, 43 Ir - - sensibilidad a los antibióticos, 432 - A. hominis, 434 - A. ureae, 434 - descritas, 429 - especies animales, 434, 435c - identificación, características bioquímicas, 435c Actinobacterias, 170r Actinobaculum, especies, 771, 772r - identificación, algoritmo, 778f Actinomadura, especies, 822, 823c - anatomía patológica, 822, 822c - enfermedad clínica, 822, 822c - epidemiología, 822 Actinomicetos, 823, 824r - aerobios, 817 - - agrupamiento fenotípico, 818, 818c - - clasificación, 817, 818c, 819f - - composición de la pared celular, 818, 820c - - especies de Nocardia, diagnóstico de labo­ ratorio, perfiles de sensibilidad a antibióticos in vitro, 831c - - infecciones, diagnóstico de laboratorio, 825, 826c, 829c, 829r, 830f, Protocolo 15, Lámina en color 1 - aislamiento primario, 825 pruebas bioquímicas y fisiológicas, 825, 826c - - introducción, 817 - - taxonomía, 817,819r - - terminología relacionada, 818, 819r - anatomía patológica, 820 - epidemiología, 820 - patogenia, 820 - termofílicos, 823 identificación, 833 Actinomicosis - abdominal, 773 - cervicofacial, 773 - pélvica, 773 - del sistema nervioso central, 773 - torácica, 773 Actinomyces, especies - A. bovis, 775r - A. cardiffensis, 775r - A. europaeus, 775r - A. funkei, 775r - A. georgiae, 775r - A. gerencseriae, 775r - A. graevetenitzii, 775r

-

A. hongkongensis, 776r A. houstonensis, 116r A. israelii, 775r A. meyeri, 776r A. naeslundii, 776r A. nasicola, 776r A. neuii, subspespecie Neuii, 776r A. odontolycus, 777r A. oricola, 777r A. radicidentis, 777r A. radingae, 777r A. turicensis, H i t A. urogenitalis, 777r A. viscosus, 777r aisladas en animales, 778. 780c aisladas en seres humanos, 772, 775r, 778f, 780c - identificación, 885 - - algoritmo, 778f - miembros, 775r - taxonomía, 746, 748c Adenosintrifosfato (ATP), 192 Adenoviridae, especies, descritas, 1285c Adenovirus - entéricos, manifestaciones clínicas, 1293c, 1294 - manifestaciones clínicas, 1303, 1305c - tipo 5, 1285c, 1285f Adhesina(s), 186 - como factor de virulencia, 197 Aerobio(s) - descritos, 837 - estrictos, 189 Aerococcus, especies, 671 - identificación, 693, 697, 701c Aeromonas, especies, 394, 394c, 398, 398c, 398r, 400c - características, 395r - cultivo, agares, 398, 399r - identificación de laboratorio, 399, 400c - importancia clínica, 397 - preparados medicinales, 398 - recuperación de laboratorio de muestras clíni­ cas, 398, 399r - taxonomía, 397, 397r Afipia, especies, 487 - aislamiento, 487, 488c - identificación, 487, 488c - - características bioquímicas, 488c - importancia clínica, 487, 488c - sensibilidad a los antibióticos, 487 - taxonomía, 487 Agar(es) - aislamiento de Haemophilus, en diagnóstico de infección por especies de Haemophilus, 423 - chocolate, en especies de Haemophilus, diag­ nóstico de infección, 422 - cromogénicos, en identificación de enterobacterias, 271 - dextrosa de Sabouraud, usos, 1110c - diferencial(es), 28c, 29, 29f - entérico de Hektoen, para enterobacterias, 213c

1-1

1-2 ìn d ic e a n a l ì t i c o Agar(es) (Cont.) - eosina azul de metileno (EM B), aislamiento de enterobacterias, 212c, Lámina en color 6 - especies de Aeromonas. cultivo, 398, 399r - harina de maíz, identificación de levaduras, 1165, 1168f, 1168r, 1169f - HE, Véase Agar entérico de Hektoen (H E ) - hierro de Kliger, detección de fermentación de hidratos de carbono, 209f, 210, 210r - infusión de cerebro y corazón, usos, 1110c - infusión de corazón de Sabouraud, usos, 1110c - inhibidor de hongos filamentosos, usos, 1110c - inhibidores, 28c, 29, 29f - láminas de patata, usos, 1110c - de MacConkey - - crecimiento, 1440 - identificación de micobacterias, 1042, Protocolo 19 - - falta de crecimiento, 297 - - recuperación de enterobacterias, 212c - micosel/micobiótico, usos, 1110c - NBG, recuperación y caracterización de espe­ cies de Salmonella, 246c - NBG L, recuperación y caracterización de especies de Salmonella, 246c - de Rambach, recuperación y caracterización de especies de Salmonella, 246c - reacciones, identificación de bacterias, 35r - SABHI, usos, 1110c - sales de manitol, 616 - para Salmonella-Shigella, recuperación de enterobacterias, 213c - sangre de Skirrow, aislamiento de C. Jejuni, 376c - sangre, cistina-telurito, 1418 - SM-ID, recuperación y caracterización de especies de Salmonella, 246c - de Tinsdales, 1417 - TSI, detección de fermentación de hidratos de carbono, 209 - urea de Christensen, 218 - X LD , recuperación de enterobacterias, 213c Agencias federales, laboratorio y práctica médi­ ca, 45, 45r Agentes biológicos - clasificación, 50, 51c - potencial de terrorismo, 58, 59c - precauciones de seguridad, 50, 51c, 52c, 53f Agentes infecciosos - celulares, innatos, 7 - clases, 3 - defensas celulares inmunológicas adaptativas, 8 - defensas celulares innatas, 7 - defensas humorales innatas, 6 - defensas no celulares inmunológicas adaptati­ vas, 8 - efectos indirectos en seres humanos, 9 - enfermedades infecciosas debidas, 2, 3c - huéspedes, interacciones, 4, 4c - inflamación y, 7 - medioambiente y, 5, 6c, 6r - objetivo en la naturaleza, 4 - puertas de entrada, 6, 6c - recién identificados, 3c - vías de transmisión, 6, 6c - virulencia y, 4, 5c, 6c, 6r Aglutinación del látex, identificación de estrepto­ cocos, 685 Aglutinina(s) fría(s), 1003 Agresiva, factores de virulencia, 198 Agrobacterium, especies, 326c, 328 Agujas, precauciones de seguridad, 49 Aislamientos - bacterianos, identificación preliminar, procedi­ mientos, 37

-

identificación definitiva, 1331 micóticos, procedimientos de laboratorio de identificación presuntiva, 1116, 1117c, 1119f, 1124r - - de especies de Absidia, 1119, 1120f - - de especies de Circinella, 1120, 1127f - - de especies de Cunninghamella, 1120, 1122f - - de especies de Cyncephalastrum, 1121f - - de especies de Mucor, 1120, 1123f - - de especies de Rhizopus, 1119, 1119f. 1120f - - de especies de Zygomycete, 1118, 1120f - - de especies de Zyncephalastrum, 1120 - - extensión, 1116, 1117c - - identificación de género y especie, 1118, 1119f - virales, almacenamiento, 1333 Alcaligenáceas, 324, 325c, 326c Alcaligenes faecalis, 292c Alcaligenes, especies, 324, 325c Aleureosporas, 1107r Alishewanella fetalis, 321, 321c Alloiococcus, especies, 674 - identificación, 703, 707c Alternaría, especies, 1158, 1158f Alteromonadáceas, 320, 325c Amblyomma americanum - distribución geográfica, 1206 Ameba(s), intestinal(es), B, 1205, 1205r, 1207f American Society o f Clinical Pathologists (ASCP), 48 American Thoracic Society (ATS), recomenda­ ciones para el tratamiento de la tuberculosis, 1068, 1068r American Type Culture Collection (ATCC), 162 Aminoglucósido(s), especies de Enterococcus resistentes, 966 Amplificación de ácidos nucleicos, 137, 139f - análisis posamplificación, 143, 143f, Veáse también Análisis posamplificación - con desplazamiento de hebras, 140 - mediada por transcripción, 140 - métodos, identificación de micobacterias, 1059 - N ASB A, 140 - PCR, 137, 138f, 139f - reacción en cadena de la ligasa, 140 - en tiempo real, 147, 149f - - aplicaciones clínicas, 150, 152f - - productos, métodos de detección, 147, 148f - - reactivos moleculares, 150, 151 f - - sondas FRET, 147, 148. 149f, 150f - - sondas de hibridación, 147, 149f, 150f - - sondas de hidrólisis, 147, 148f - - sondas TaqMan, 148 - - verde de SYBR, 147, 148f - T M A , 140 Anaerobic Bag Culture Set, 856, 857f Anaerobio! s), 840, 840c - aerotolerantes, 189, 837 - descritos, 837 - estrictos, 189 - facultativos, 189, 837 - tolerancia al oxígeno, 837 Análisis de micromatrices, 146 - identificación de micobacterias, 1062 Análisis posamplificación, 143, 143f - análisis de Southern blot, 144 - detección enzimàtica de productos amplifica­ dos, 143, 143f - electroforesis en gel, 143 - hibridación inversa, 144, 144f - secuenciación de DNA, 144, 146f Análisis de riesgos en puntos críticos de control (Hazard Analysis at Criticai Control Points, HACCP), 733

Anamorfo, 1108r >■ definido, 1105 Anaplasma, especies, 1351, 1351c Anaplasmosis, granulocítica, 1352 Anélido(s), 1107r, 1131 Aneloconidios, 1107r Angina, Véase Infecciones respiratorias, altas, faringitis - de Vincent, 71 Angioestrongiliasis, 1260 Angiomatosis bacilar, especies de Bartonella y, 477 Anillo(s), 1107r Anisakiasis, 1259 Antibióticos - actividad inhibidora, pruebas en determina­ ción, 924 - - agrupamiento de agentes, 930c - - atmósfera, 931 - - concentración de cationes, 930 - - control de calidad, 932, 933c, 934c - - estandarización, 930 - - Etest, 949, 957f, 958r - - garantía de calidad, 932 - - indicaciones, 9 24,925c - - inoculo, 932 - - interpretación de resultados, 932, 933, 936c, 939r, 940c - - medio de crecimiento, 930 - - pH, 930 prueba de sensibilidad por difusión con discos, 938, 945f, 945r, 946f, 947c - - prueba de sensibilidad por dilución en agar, 937, 944f - - prueba de sensibilidad por macrodilución en caldo, 935, 943f - - prueba de sensibilidad por microdilución en caldo, 943, 944, 949f, 950c, 952f, 953c - - selección del agente, 924, 926c, Protocolo 17 - - selección de la prueba, 922, Protocolo 17 - - sistemas comerciales, 945 - - situaciones para las pruebas, 924, 925c - - suero, 930 - - temperatura, 931 - clasificación, 905c - especies de Enterococcus, resistencia, 966 - especies de Haemophilus, resistencia, 962 - - cefalosporinas, 963 - - cloranfenicol, 963 S. pneumoniae, 963 - de especies de Haemophilus, resistencia, peni­ cilina, 962 - de especies de Staphylococcus, resistencia - - P-lactámicos, 952r, 957, 961f, 963f - - estreptograminas, 960 - - fluoroquinolonas, 962 lincosamidas, 960 - - macrólidos, 960 - - vancomicina, 9 59,964r - guía de laboratorio, 919, 922, 922c, 922r, 923r - interacciones entre mecanismos de resistencia, 919, 919f, 920f - interferencia con la formación de las paredes de las células bacterianas, 910, 912, 914f, 916c, 917c, 918r - de N. gonorrhoeae, resistencia, 965 - de N. meningitidis, resistencia, 966 - procedimientos de la prueba, 922, 922r - que no ejerce ningún efecto sobre las paredes celulares, 918 - resistencia bacteriana, 903, 904 mecanismos de resistencia, 906, 906c, 906f, 908c, 909f, 917c, 918r, 920f, 92 l f - - variables que intervienen, 904, 906c - S. pneumoniae, resistencia

ÌNDICE ANALÌTICO

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- /J-lactámicos, 962,965f - lincosamidas, 965 - macrólidos, 965 - penicilina, 962,965f sensibilidad de los patógenos, pruebas, 39. 39r transporte activo fuera de la célula bacteriana, 909 - transporte a través de la pared celular y las membranas celulares, 906, 909f Anticuerpo(s) - anti-IgM, diagnóstico serológico, 1345 - definición, 110 - detección - - EIA, 117f, 118, 119f técnicas de inmunofluorescencia, 123, 124f, 125f - monoclonales, 111, 113r - - producción, 112, 113r Antígeno(s) - asociados con la violencia, de N. meningitidis, 545r - asociados con la virulencia de Moraxella catarrhalis, 558r - C, 650 - capsulares polisacáridos, 649 - definición, 110 - detección - - EIA, 120, 122, 122f examen de especies de Legionella, 530 - - técnicas de inmunofluorescencia, 123, 124f, 1173f - estructuras, 111 - infecciones del SNC. detección, 92 - muestras clínicas de C. trachomatis, detec­ ción, 1347 - muestras clínicas de especies de Coxielta, detección directa, 1351 - muestras clínicas de especies de Rickettsia, detección directa, 1351 - de N. gonorrhoeae, 547r - O, 180 - polisacárido capsular, 649 - proteico, 649 - somático, 181 - virales, detección e identificación provisional de infecciones virales, 1329 Antisueros policlonales, 112 Aparato respiratorio, flora comensal y patógenos potenciales, 77, 78c Aparato urinario, candidiasis, 1171r A P I Coryne, 750 A P I Rapid Strep, identificación de estreptococos, enterococos y bacterias “ similares a Streptococcus” seleccionadas, 709 A P I Staph, identificación de estafilococos coagulasa-negativos, 624 A P I Staph-IDENT, identificación de estafiloco­ cos coagulasa-negativos, 624 Arabinogalactano(s), 183 Arachnida, especies, 1363, Veáse también Araña; Garrapata Araña(s), 1372 - distribución geográfica, 1372 - identificación, 1372 Arcanobacterium, especies, 779, 784c - faringitis por A. haemolyticum, 71 - identificación, diagrama de flujo, 778f Arcobacter, especies, 379c, 381 - A. butzleri, 379c, 381 - A. cryaerophilus, 319c, 381 - A. nitrofigilis, 379c, 381 - A. skirrowi, 379c, 381 Arenaviridae, especies, descritas, 1282c Arenavirus, manifestaciones clínicas, 1289, 1290c Arginina. descarboxilación, identificación de enterobacterias, 218, Protocolo 6, Lámina en co lor 6

Arilsulfatasa, 1436 - identificación de micobacterias por la activi­ dad de, 1037, 1040c, Protocolo 19, Lámina en color 19 Armed Forces Institute o f Pathology (A F IP), 990 Arsenophonus nasoniae, 264c Arthrobacter, especies, 779, 786c Articulaciones, infecciones, 89 Artificio(s) - cultivos celulares, 1321 f - detección e identificación provisoria de infec­ ciones virales, 1329 Artritis séptica - S. aureus y, 603r - síntomas, 89 Artroconidios, 1107r Artrópodo(s), Veáse también Acaro - clasificación, 1362, 1363r - descritos, 1362. 1363c, 1364r - especies de Arachnida, 1363, Veáse también Araña; Garrapata - muestras, remisión al laboratorio, 1362 Artrosporo(s), 1106 Ascaridiasis, 1221 f, 1222r, Lámina en color 22 Ascaris lumbricoides, 1221, 1221 f, 1223r - ciclo vital, 1221 f Ascomiceto(s), 1108r, 1109f Ascosporo(s), 1108r, 1109f Asociación celular, detección e identificación provisoria de infecciones virales, 1329 Aspergillus, especies, 1121 - A.flavus, 1123, 1127f - A. fumigatus, 1126, 1126f - A. nidulans, 1125, 1128f - A. niger, 1123, 1136f - A .terrus, 1125, 1128f - características microscópicas, 1123, 1123f - descritas, 1121 - histopatología, 1125, 1128f, 1130r - morfología de las colonias, 1123 - presentación de laboratorio, 1122 Aspergiloma, 1130r Aspergilosis, 1121, 1130r, Veáse también Aspergillus, especies - broncopulmonar alérgica, 1130r - diseminada, 1130r - infecciones por bola micótica, 1130r - pulmonar invasiva, 1130r Aspiración - duodenal, esporas de microsporidios, tinción de Weber en detección, 1219, 1220r - endotraqueal, diagnóstico de infecciones del tracto respiratorio inferior, 1219, 1220r - - recolección, 76 - materia fecal, esporas de microsporidios, tin­ ción de Weber en detección, 1219, 1220r - suprapúbica, 84, 84f - translaríngea, diagnóstico de infecciones del aparato respiratorio inferior, 75 - transtraqueal, examen directo, diagnóstico de enfermedad infecciosa, 22c - transtraqueal, examen directo, diagnóstico de enfermedades infecciosas, 22c Astroviridae, especies, descritas, 1282c Astrovirus, manifestaciones clínicas, 1293c, 1294 ATCC, Véase American Type Culture Collection (A TC C ) Atmósfera, evaluación de la actividad inhibidora de agentes antibióticos, 931 ATP, Véase Adenosintrifosfato (A TP) ATP sintetasa, 194 Auramina O, 1432 Auramina-rhodamina, 1432 Aureobacterium, especies, 791c, 792 Aureobasidium pullulans, 1177, 1177f Autolisina de S. pneumoniae, 656 Autoxipo, 571 Aztreonam, pruebas de cribado, 959c

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Azul de metileno de Loeffler, examen microscó­ pico de muestras, 26 B B. parapertussis, importancia clínica, 493, 496c Babesia, especies, 1238, 1244r Babesiosis, 1244r Bacillus, especies, 738 - aislamiento, 743, 744c - B. anthracis, 739, Véase también Carbuno identificación, 744, 745c - B. cereus, 741 - - factores de virulencia, 741 - - gastroenteritis, debida a, 741 - - identificación, 744,745c - B. mycoides, identificación, 744, 745c - B. thuringiensis, identificación, 744, 745c - bacteriemia debida a, 742 - endocarditis debida a. 742 - identificación, 744, 744c - - procesamiento de muestras, 743, 746c - - recolección de muestras, 743, 746c - - seguridad del laboratorio, 743, 746c - infecciones hospitalarias, 743 - infecciones en los huéspedes inmunocomprometidos, 742 - infecciones musculoesqueléticas, 743 - infecciones oculares, 743 - infecciones oportunistas, 742 - sensibilidad a los antibióticos, 745 - taxonomía, 738 Bacilos, 169r - con forma de bastones, inmóviles, oxidasapositivos, identificación de no fermentadores, 347c - definidos, 172, 174f Bacilos ácido-alcohol resistentes, tinción, recupe­ ración e identificación de micobacterias, 1027, 1028c, 1029c, Protocolo 19, Lámina en color 19 Bacilos curvos, 372 Bacilos gramnegativos - anaerobios - - no esporulados clasificación, 870 identificación, 870 - nomenclatura asociada, 870 - - pigmentados, identificación, 871, 873c, 878r - curvos, 372 - enterobacterias, 206 - fermentadores oxidasa positivos, 387 - no fermentadores, 210, 289, - - acetamida-positivos, identificación de no fermentadores, 349c - - definidos, 291 - - descritos, 301 - - desnitrificantes, identificación de no fer­ mentadores, 352c - - dextrosa-negativo, identificación de no fermentadores, 354c - - dextrosa-positivo, identificación de no fer­ mentadores, 353c - - fluorescente, identificación de no fermen­ tadores, 348c - - fluorescentes, identificación de no fermen­ tadores, 348c - - géneros de importancia médica, taxono­ mía, características bioquímicas e importancia clínica, 301, 302r identificación - descarboxilación, 300, Protocolo 6, Lámina en co lor 1 - enfoque práctico, 342, 343c - esquemas computarizados, 342 - factores y dificultades, 339r - falta de crecimiento en agar de MacConkey, 297

1-4 ÍNDICE ANALÍTICO

Bacilos gramnegativos (Cont.) falta de evidencia para la fermenta­ ción de glucosa, 297 - - falta de motilidad oxidasa-negativa, 344c - - hidrólisis de esculina, 300, Protocolo 7, Lámina en color 1 - hidrólisis de urea, 299, Protocolo 6, Lámina en color 7 - sistema A P I 20E, identificación de no fermentadores, 345, 355r - método de tinción de Leifson, 300, Protocolo 7, Lámina en co lor 7 - método de tinción Ryu, 300, Protocolo 7 - morfología de los flagelos, 301 - motilidad, 298, 299f, Protocolo 7, Lámina en color 1 - motilidad oxidasa-positiva, 348c - - niveles de servicio, 339, 339r P. aeruginosa, 339 - - pigmentación, 351c - - problemas asociados, 339,339r - producción de indol, 300, Protocolo 1, Lámina en color 7 producción de pigmentos, 298 - - prueba de utilización de glucosa, 297, 297f, Protocolo 7, Lámina en co lor 1 - pruebas convencionales, 340, 341r, 343c pruebas. Protocolos 1-4, Lámina en color 7-1D-H, Lámina en color 7-2 A-E.6-2,6-6,6-7,7-1-7-4, 297, 298f, 299f, 300r - reacción de la citocromo oxidasa positiva, 297, Protocolo 5, Lámina en color 1 - reducción de nitratos, 299, Protocolo 6 - señales iniciales, 297, Protocolo 1, Lámina en color 1 - sistema A P I 20NE, 345, 355r Sistema AutoScan-4, 358 - - Sistema Biolog, 357 - sistema Crystal Enteric/no fermenta­ dores, 356 sistema de identificación automatiza­ do, 358 - - sistema de microbiología automatiza­ do Phoenix, 359 - sistema RapID N F Plus, 356, 357r - sistema Remel N/F, 345, 350, 356r - sistema Sensititre AP80, 359 - - sistema Vitek 2, 358 - sistema Vitek Legacy, 358 - sistemas de equipos comerciales, 342, 345, 350, 355r, 358 - sistemas, selección, 358 - técnica del montaje húmedo, 300 tubo Oxi/Ferm, 345 - Walkaway-40,358 - Walkaway-96,358 - - indol-positivos, características, 331c - - inmóviles, oxidasa-negativos, identifica­ ción de no fermentadores, 344c lactosa-positivos, identificación de no fer­ mentadores, 348c - - lisina-positivos, identificación de no fer­ mentadores, 350c - - metabolismo, 291 - - fermentativo, 291,296f - - móviles, oxidasa-positivos, identifica­ ción de no fermentadores, 348c - - oxidativo, 291,296f - vía ED, 294, 294f - - víaEM P, 291,296f

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vía de hexosa monofosfato de Warburg-Dickens, 296, 296f nomenclatura, 347c - - pigmentados, identificación de no fermen­ tadores, 351c - recuperación, pautas, 339 - nomenclatura, 292 - - nomenclatura, 292c - con requerimientos nutricionales especiales, 407 - shock endotóxico, 205 Bacilos grampositivos - aerobios y facultativos, 728 bacterias de dominio, clasificación, 730r - anaerobios, no esporulados, identificación, 881, 885, 887c, 888c Bacitracina, sensibilidad - diferenciación de micrococos y estafilococos, 612 - identificación de estreptococos, 680, Protocolo 13, Lámina en color 13 BACTEC, 1434 BACTEC Myco/F Lytic, detección de micobacte­ rias, 1035 Bacterias - anaerobias, 836 - - antibiogramas, 896 - - características, 859,860r - - caracterización, 859, 859r - pruebas bioquímicas convencionales en tubos grandes, 862 - - clasificación, 840c - - clasificación taxonómica, 839, 840c cultivo - cámara de anaerobiosis, 855, 855f. 856f - jarra de anaerobiosis, 856, 857f, 857r - recuperación óptima, 853r - resultados, informe preliminar, 859 - - sistema de bolsas para anaerobios, 856 sistema de giro y siembra en estría, 856 - - sistemas anaerobios, 853, 853f, 853r, 857r técnicas en jarra de anaerobiosis, 853, 854f determinación de productos metabólicos, GLC, 864, 865c, 866c, 867f, 867r, 869r, 873c - - diferenciación - - determinación de las características de cultivo y bioquímicas, 859, 859r, 860r, 861c - identificación presuntiva, 859. 860r - medios de agar diferenciales, 860, 861c, 862r - - microsistemas comerciales, 863 placas Presumpto. 860, 861c, 862r - - placas de sensibilidad a los antibióti­ cos. 862 prueba de CAMP, 863 - - prueba de Nagler, 863 - - hábitat, 838,838r - - identificación, 849, 849c, 852c, 853r, 866 - agar sangre para anaerobios de los CDC, 853r bacilos gramnegativos no esporula­ dos, 870 - bacilos grampositivos anaerobios no esporulados, 882, 887c, 888c - cocos, 881, 883c, 884c equipos comerciales, 863 - especies de Bacteroides, 870, 873c, 878r examen directo de materiales clínicos, 850 - - hemocultivo, 849

incubación de cultivos, 857 pruebas de aerotolerancia, 858, 859f infecciones humanas, 840, 847f, 848c, 848r descritas, 840, 847f, 848c, 848r - incidencia, 848r - origen endógeno, 848r - - origen exógeno, 848r - - sitios, 847f inspección y subcultivo de colonias, 858 - - medios, 851, 852c, 853r - - muestras que no deben cultivarse, 849c - - nombres actuales y anteriores, 841c - - nomenclatura asociada, 839. 840c - - recolección y transporte de muestras, 849 - - selección de muestras para cultivo, 849, 849c - anatomía, 165 - cápsulas, 184 - citoplasma, 175 - clasificación jerárquica, en Manual de Bacteriología Sistemática de Bergey, 166r - clasificación, criterios filogenéticos, 163, 166r - corineformes. 746. 750. 75 Ir, 759c, 771 - - antibiogramas, 7 59,759c - - pruebas de sensibilidad a los antibióticos, 759, 759c - crecimiento, cinética, 191, 19l f - denominación, 162, 162r - descripción, 3 - efectos de la utilización de piruvato, 193, 195f, 196f - estructuras de superficie, 184,184f - fermentación, 191, 193f - fimbrias, 185 - fisiología, 165 - flagelos, 185, 187f - generación de energía, 189, 191, 192f - gramnegativas, membrana celular, componen­ tes, 91 l f - grampositivas - - pared celular, componentes, 910f - - tratamiento antibiótico, resistencia. 968 - identificación abreviada. 40c colonias utilizadas, características, 33, 35r - - reacciones en agar, 35r tipos de colonias, 36c - identificación fenotípica, 162, 164r - intercambios genéticos. 186, 187f - litótrofas, 188 - metabolismo, 191, 192f - - requerimientos, 188, 188c. 190f - morfologías, 174f - nocardioformes, 819 prueba de sensibilidad por difusión con discos, 1420 - - prueba de sensibilidad por microdilución en caldo, rendimiento, 1420 sin requerimientos nutricionales especiales - pili, 185 - quimiolitótrofas, 189 - recombinación, 186, 187f - relaciones con el oxígeno, 837 - requerimientos, 187f, 188, 188c - resistencia a antibióticos, mecanismos, 908c - sin requerimientos nutricionales especiales - prueba de sensibilidad por difusión en disco, 1420 - - prueba de sensibilidad por dilución en microcaldo, rendimiento, 1422 - taxonomía, 162. 162r, 166r - ultraestructura, 909f - “ similares a Streptococcus" , 639 Bacteriemia - asociada con catéteres, 98 -

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ÍNDICE ANALÍTICO

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consideraciones especiales relacionadas, 103 - B. henselae, 478 - descritas, 96 - especies de Bacillus y, 741 - especies de Haemophilus y, 418 - factores de riesgo. 96, 97c, 165, 173r - posparto, especies de Haemophilus y, 41 Ir, 419 - pronóstico, 96, 96c - S. aureus y, 603r - S. epidermidis y, 608r - tasas de mortalidad, 97, 97c, 165, 173r - tipos, 96, 97c Bacteriófagos lisogénicos, 187 Bacteriuria - detección, cultivo, 85 - examen microscópico, 84 - pruebas de cribado, 84 Bacteroides, 171r Bacteroides, especies - B. fragilis - - características diferenciales, 875c - - identificación, 870,873c - B. ureolyticus, 381, 879 - identificación, 870, 872r, 873c - - características, 878c - productos metabólicos, 877c BactiCard, identificación de especies de Neisseria, 566 Balantidium coli, 1214, 1215f - ciclo vital, 1215f Balneatrix, especies, 318, 319c Banda API 20E, 273, 273c Bartlett, Raymond, 17 Bartoneüa, especies, 474 - aislamiento, 481 - - cultivo, 481 - - morfología de las colonias, 482 - - tinción de Gram, 482 - B. bacilliformis - - fiebre de Oroya, 476 - - verruga peruana, 476 - B. henselae - - angiomatosis bacilar, 477 - - bacteriemia, 478 - - peliosis, 477 - B. quintana - - angiomatosis bacilar, 477 - - endocarditis, 479 - - fiebre de las trincheras, 477 - descritas, 474 - detección, 481 - diagnóstico serológico, 484 - distribución geográfica, 475 - endocarditis, 479 - enfermedad del arañazo del gato. 480 - epidemiología, 474 - identificación, 481, 483c - - características bioquímicas, 483c - importancia clínica, 476 - neurorretinitis, 481 - otras infecciones, 481 - recuperación, tipos de muestras, 481 - reseña, 474 - sensibilidad a los antibióticos in vitro, 486 - taxonomía, 474 Bases de ácidos nucleicos, estructura molecular, 175f Beauveria, especies, conidios producidos en forma aislada, 1136, 1136f, 1137r Bergeyella, especies, 331c, 332 - B. zoohelcum, 292c Bergey’s Manual o f Systematic Bacteriology. cla­ sificación jerárquica de bacterias de impor­ tancia clínica, 166r (3-hemólisis/citolisina, 650 (3-lactamasa(s), 912, 916c, 917c

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de amplio espectro - evaluación de sensibilidad, 957, 959c, 960c, 960f - - pruebas confirmatorias. 960c - - pruebas de cribado, 957 - de amplio espectro, mediada por plásmidos, características, 915, 917c - características, 918r - esquema de clasificación funcional de BushJacoby-Medeiros, 915, 916c - evaluación de sensibilidad, 949 - - descrita, 949 - relacionada con N. gonorrhoeae, 952 - - relacionada con especies de enterococos, 952 - - relacionada con especies de estafilococos, 949 relacionada con especies de Haemophilus, 952 - - relacionada con Moraxella-catarrhalis, 952 P-lactámico(s) - especies de Enterococus resistentes, 966 - especies de Staphylococcus resistentes. 957. 96lf, 962r, 963f - S. pneumoniae resistente, 963, 964f Bifidobacterium, especies, identificación, 885 Bilophila, especies, 880, 880r BioBASE, 272 Biopsia muscular, detección de parásitos, 1201 Biopsia tisular, detección de parásitos. 1201 Biopsia(s) - manipulación. 103 - muscular, detección de parásitos, 1201 - tisular, detección de parásitos, 1201 Bioterrorismo, laboratorio de microbiología, 58, 59c, 60c Biplaca agar sangre-agar de MacConkey, 3l f Bipolaris, especies, 1159, 1160f Blastoconidios, 1107r, 1108f Blastomicosis, 1145, 1145f, 1146f, 1147r - diagnóstico con el uso de técnicas sin cultivo, 1146, 1147r - presentación de laboratorio, 1145, 1145f, 1146f, 1147r, Lámina en color 21 Blastosporas, 1106 Boca de trinchera, 71 Bolsas de plástico desechables anaerobias, 856 Bordetella, especies, 292c, 324. 325c, 337c, 487, 489, Véase también Tos convulsa - aislamiento, 493, 494r, 496c - - medios de cultivo, 494, 494r - - muestras, 494 - B. bronchiseptica, importancia clínica, 493, 496c - B. hinzii, importancia clínica, 493, 496c - B. holmesii, 338. 338c - - importancia clínica, 493, 496c - B. pertussis - - aislamiento, medios de cultivo, 494, 495r - - detección, nuevas tecnologías. 497 - - factores de virulencia, 49Ir identificación, 496, 497 - - importancia clínica, 489, 49Ir - B. trematum, importancia clínica. 494, 496c - características culturales. 492 - detección, prueba IFD, 495 - identificación, 492, 494, 494f, 496c - - características bioquímicas. 496c - medios de cultivo, 494c, 495, 496c - pruebas de sensibilidad a los antibióticos, 499 - taxonomía, 487, 489 Borrelia, especies, 1077c, 1079c, 1081c, 1085 - B. burgdorferi, medio de cultivo de BarbourStoenner-Kelly, 1091, 1092r - descripción, 1085 - enfermedad de Lyme, 1085, Véase también Enfermedad de Lyme

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- epidemiología, 1085 - fiebre recurrente, 1085 Botulismo, 895 - causas, 199 Brevibacterium, especies, 785, 787c Brevundimonas, especies, 292c, 316 - B. diminuta, 316 - B. vesicularis, 316 Brochothrix, especies, características, 730c Broncoscopia rígida, diagnóstico de infección del aparato respiratorio inferior, 76 Broncoscopio - flexible, diagnóstico de infecciones del apara­ to respiratorio inferior, 76 - rígido, diagnóstico de infecciones del aparato respiratorio inferior, 76 Bronquiolitis, 73 - infecciones virales y, 1311c Bronquitis, especies de Haemophilus y, 41 Ir, 417 Bruceláceas, 326c, 328 Brucella, especies, 459, Veáse también Brucelosis - aislamiento, 466c - características de cultivo, 461 - identificación, 465, 466c - taxonomía, 461 - virulencia, 461 Brucelosis, Véase también Brucella, especies - diagnóstico serológico, 463 - distribución geográfica, 459 - epidemiología, 459 - espectro clínico. 462, 464r - incidencia, 460 - trabajadores de laboratorio, 460 - transmisión, 459 - tratamiento, 465 Budvicia aquatica, 264c - reacciones bioquímicas, 228c Bunyaviridae, especies descritas, 1280c Bunyavirus, manifestaciones clínicas, 1291, 1291c Burkholderia, especies, 292c - B. cepacia, 310, 312c - B. gladioli, 311, 312c - B. pseudomallei, 306, 308c, 309r - Burkholderiaceae, 306, 308c, 309r, 312c, 313r, 314c - complejo B. cepacia, 310, 312c Buttiaxuella, especies - más nuevas, 264c - - características diferenciadoras, 263, 266c - reacciones bioquímicas, 228c C Cabello(s), examen directo, diagnóstico de enfer­ medades infecciosas, 23c Cadena de transporte de electrones, 195 Cadherina-E, factor de virulencia para L. monocytogenes, 731 Caliciviridae, especies, descritas, 1281c Calicivirus, manifestaciones clínicas, 1293c, 1294 Cálculo de frecuencia de aparición y probabilidad porcentual, 275c Caldo(s) - diagnóstico de tuberculosis, 1019 - enriquecimiento para enterobacterias. 214, 216c - para gramnegativos, recuperación de enterobacterias, 215, 216c - medio de cultivo y micobacterias, 1032 - de selenita para enterobacterias, 215, 216c Cámara de anaerobiosis, 855 - modelo 1024, 856f Campilobacterias, exespecies de Wolinella y Bacteroides, 381, 382c Campylobacter, especies - C. co li, 377, 378c - C. concisus, 377, 378c

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ÍNDICE ANALÍTICO

Campylobacter, especies (Cont.) - C. fetus - C. curvus, 378c, 381, 382c - - subespecie/eíus, 377,378c - - subespecie venereal, 377, 378c - C. gracilis, 378c, 382, 382c - C. helveticus, 377, 378c - C. hyoilei, 378c, 380 - C. hyointestinalis, 378c, 380 - C. jejuni - - reseña, 373 - - subespecie doylei, 378c, 380 - - subespecie jeju n i, 373, 374c, 376c, 377r, 378c - aislamiento de laboratorio, 373, 375c, 376c, 377r - identificación por cultivo, 373, 378c - identificación presuntiva en heces, 374 - importancia clínica, 373 - C. lari, 377, 378c - C. mucosalis, 378c, 380 - C. rectus, 378c, 381, 382c - C. showae, 378c, 380 - C. sputorum, 378c, 380 - C. upsaliensis, 378c, 381 - características, 374c, 377, 378c - clasificación, 372, 374c, 375c, 375r, 376c, 378c, 381c, 383c - descritas, 374 - enterohepáticas, identificación, 387 - identificación, 384, 384r, 385c - - colonias y muestras de heces, 385, 385r - - métodos de detección directos, 385 - - pruebas sin cultivo, 384 Candida, especies, 1168, 117Ir - C. albicans, identificación, agar harina de maíz, 1167 - C. glabrata, 1174, 1174f - C.kefyr, 1168, 1168f - C. parapsilosis, 1168, 1168f - C. tropicalis, 1168, 1168f - infecciones, 1172r - patogénicas emergentes, 1168, 1169f Candidiasis, 1169, 1171r - cutáneas, 117 Ir - diseminadas, 1171r - mucocutánea, 1171r - de las vías urinarias, 1171r Capa mucilaginosa (glucocáliz), 184 Capillaria Philippinensis, 1226 Capnocytophaga, especies - caninas, 453, 455c - - características bioquímicas, 455c - - características del cultivo, 453c, 455c - - identificación, 453c, 455c - - sensibilidad a los antibióticos, 452 - - taxonomía, 451 - humanas, 451 - - características bioquímicas, 448c - - características de cultivo, 451, 452 - - importancia clínica, 451 - - sensibilidad a los antibióticos, 452 - - taxonomía, 451 Cápsula - bacteriana, 184 - de polisacáridos, 656 Captación de hierro, 1442 - identificación de micobacterias, 1037, Protocolo 19 Captura de híbridos, 134, 135f Carbono, crecimiento y metabolismo bacteriano, 188, 189c Carbunco - cutáneo, 739 - epidemiología, 739 - gastrointestinal, 740 - industrial, 739

- inhalatorio, 740 - no industrial, 739 - orofaríngeo, 740 - presentación clínica, 740 - prevención, 741 - pulmonar, 740 - tratamiento, 740 Cardiobacterium hominis, 445, 448c - características de cultivo, 445 - identificación, 445 - - características bioquímicas, 448c - importancia clínica, 445 - sensibilidad a los antibióticos, 446 - taxonomía, 445 Caries dental, 71 Caseína, hidrólisis, 1418 Catalasa, 198, 1383 - identificación de micobacterias por la activi­ dad de, 1037, Protocolo 19, Lámina en color 19 Catalasa a 68 °C, 1439 Catéter(es) - bacteriemia, 98 consideraciones especiales, 103 - infecciones, intravenosas, S. epidermidis y, 607r - sepsis, 98 - - consideraciones especiales, 103 Catión(es) - concentración, examen de actividad inhibidora de agentes antibióticos, 930 - tratamiento antibiótico, 922 Caulobacterias, 316 - grupo Brevundimonas diminuta, 316 - grupo rRNA, 316 Cavidad oral, infecciones, 71, 72f CDC, Véase Centersfor Disease Control and Prevention (C D C ) y Véase Grupos bacte­ rianos de los CDC CDC, esquema de identificación de no fermenta­ dores, 341 Cedecea, especies - más nuevas, 264c - - características de diferenciación, 263, 266c - reacciones bioquímicas, 228c Cefalosporina(s), especies de Haemophilus resistentes, 963 Cefipima, pruebas de cribado, 959c Cefotaxima, pruebas de cribado, 959c Cefoxitina, pruebas de cribado, 959c Cefpodoxima, pruebas de cribado, 959c Ceftazidima, pruebas de cribado. 959c Ceftriaxona, pruebas de cribado, 959c Cellulomonas, especies, 786, 788, 789c Cellulosimicrobium, especies, 788, 789c Célula(s) - bacteriana(s) - - crecimiento, cinética, 191, 19l f - - estructura nuclear, 172, 175f - - forma, 165. 174f, 175f - - membrana citoplasmàtica, 176 - - replicación de D NA, 172 - - tamaño, 165, 174f, 175f - - transcripción, 173 - conidiógena, 1107r - eucariontes, 165, 173r - Hfr, 188 - “pie” , 1133 - procariontes, 165, 173r Celulitis, 7, 94 - diagnóstico, 92 - especies de Haemophilus y, 420 - estreptococos y, 646 - presentación clínica, 94 Centers for Disease Control and Prevention (CD C ) Advisory Council for the

Elimination o f Tuberculosis, 1018 Centers for Disease Control and Prevention (CDC), designación alfanumèrica para espe­ cies bacterianas, 295c Centrifugación - precauciones de seguridad, 48 - recuperación e identificación de micobacte­ rias, 1026, 1026c Cenurosis, 1261 Cepa de referencia, 163 Cereolisina, 741 Cereulida, 742 Cervicitis, 86 - diagnóstico, 87 Cestodo(s), 1228 - descritos, 1228, 1229f - Diphyllobothrium latum, 1231, 1231f, 1232r - Dipylidium caninum, 1232 - especies de Hymenolepsis, 1232, 1233f, 1233r - especies de Taenia, 1229f, 1230, 1230r - H. nana, 1232, 1233f, 1233r - del pez gigante, 1231, 1231f, 1232r Chaetomium, especies, 1160, 1162f Chagas, enfermedad, 1247 Chancroide, especies de Haemophilus y, 41 Ir Chinche(s), 1364, 1364f - reduvídea(s), 1363f CHROMagar, 1165 Chromobacterium, especies, 401 Chryseobacterium, especies, 292c, 329, 330, 331c Chrysosporium, especies, conidios producidos en forma aislada, 1135, 1136f Ciclo de los ácidos tricarboxílicos de Krebs. 193, 196f Ciclo diagnóstico - análisis de resultados, 44, 44r - criterios para rechazo de muestras, 14, 15r - examen microscópico, 15, 17, 17r, 18c, 24r, 26r - fases, 10, lOf, 13c, 15r, 16c, 17r, 18c, 21r, 25r, 28c, 29f, 33c, 33r, 37f, 39r, 40c, 44r - - fase analítica, 15, 17, 17r, 18c, 24r, 26r, 28c, 30f, 35c, 35r, 37f, 39r, 40c - - fase posanalítica, 43, 43c, 44r - - fase preanalítica, 9f, 10, 12c, 15r, 16c - informe de resultados, 43, 43c - interacciones con epidemiólogos, 44 - mantenimiento de muestras y registros, 44 - observaciones preliminares de muestras, 14 - recepción de muestras, 14 - recolección de muestras, 9f, 10, 12c - relaciones costo-eficacia, 15, 16c - transporte de muestras, 10, 12, 12c, 14, 14r Cigomiceto(s), 1107r, 1108f - histopatología, infecciones, 1123f - observaciones preliminares sugestivas, 1185 - identificación, 1118 Cigospora(s), 1108r, 1109f Cimex lectularius, 1374 Circinella, especies, identificación, 1120, 1122f Cisticercosis, 1230r Cistitis - hemorrágica. infecciones virales y, 1312c - incrustada alcalina, 770 Citocina, 7, 8 Citocromooxidasa - identificación por la actividad de, 209, Protocolo 1, Lámina en color 6 Citolisina/hemolisina, factor de virulencia en especies de Enterococcus, 667 Citología - cervical, clasificación de Bethesda, 1307c - detección de C. trachomatis, 1348 Citomegalovirus (C M V )

ÍNDICE ANALÍTICO

- detección inmunológica, 1336 - detección molecular, 1339 - diagnóstico serológico, 1344 - manifestaciones clínicas, 1301 Citoplasma, bacteriano, 176 Citrobacter, especies, 249c - características de identificación, 226c - especies, diferenciación, 250c - reacciones bioquímicas, 228c Citrobacterreae (tribu), 221c, 249, 249c, 250c - características de identificación, 226c Cladophialophora (Cladosporium) carrionii, 1162, 1162f Clamidias. 171r Clamidoconidio. 1107r Clamidospora, definida, 1106 Clamydia, especies - C. pneumoniae, infecciones, 1349 - C. psittaci, infecciones, 1348 - C. trachomatis, 1346, 1347 - - aislamiento, cultivo celular. 1347 detección de ácidos nucleicos, 1347 - - detección de antígenos, 1347 - - detección citológica, 1348 - - detección directa en muestras clínicas, 1347 detección morfológica de inclusiones. 1347 - - diagnóstico serológico, 1348 infecciones - - características clínicas, 1346 - - epidemiología, 1346 - - niños con abuso sexual, 1348 - - recolección de muestras, 1347 - infecciones, 1345, 1347 Clasificación de la citología cervical de Bethesda, 1307c Clasificación, definida, 162 Cleistotecia, 1125, 1128f CLO-3, 379c, 383. 383c Clonorchis sinensis, 1236, 1239f, 1239r Clonorquiasis, 1240r Cloranfeniciol, especies de Haemophilus resis­ tentes, 963 Cloroquina, infecciones parasitarias, 1264c Cloruro de sodio al 5%, crecimiento, identifica­ ción de micobacterias, 1042, Protocolo 19 Clostridios, 168r - histotóxico, mionecrosis por clostridios o gan­ grena gaseosa, 889 Clostridium, especies - C. botulinum, 895 - C. difficile - - diagnóstico de laboratorio, 894, 894r - - enfermedad intestinal asociada, 893, 894r - - recolección y transporte de muestras que contienen, 893 - C. perfringens enfermedad intestinal que involucra, 892 - - prueba CAMP, 863 - C. ramosum, 893 - C. tetani, 896 - identificación, 886, 890c, 895r Coaglutinación, identificación de estreptococos, 685 COBAS AM PLICO R , identificación de especies de Neisseria, 569 Coccidioides, especies, C. immitis, 1146, 1149f, 1150r Coccidioidomicosis, 1146, 1149f, 1150r, Lámina en color 21 Coccidios, intestinales, 1214, 1216f, 1217f, 1217r Coco(s) - anaerobio, identificación, 881, 883c, 884c - definido, 172, 174f - grampositivo

-

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estafilococo, 593 estreptococo, 639 Cocobacilar, definido, 172, 174f Cocobacilo(s), inmóvil(es), oxidasa-positivos, identificación de no fermentadores, 346c Cocolisina, factor de virulencia en especies de Enterococcus, 667 Códigos de Current Procedural Terminology (CPT), 48 Cólera - Bengala, 388 - causas, 388, 388c, 389r - hemisferio occidental, 389 - reseña mundial, 388 - toxinas, acción, 389r, 390f Colitis, hemorrágica, 239r College o f American Pathologists (C A P), Comisión sobre inspección y acreditación de laboratorios. 60, 1043 Colonias, características macroscópicas, 33, 34f, 35c, 35r, 36c Coloraciones ácido-alcohol resistentes - examen microscópico de muestras, 25 - Ziehl-Nielsen, examen microscópico de muestras, 20c Coltivirus, manifestaciones clínicas, 1294 Comamonadaceae, 315 - grupo acidovorans, 315 - grupo facilis-delafieldii, 316 Comámonos, especies, 293c Combinación BACTEC TB-sonda de DNA, iden­ tificación de micobacterias. 1058 Comensalismo, 4 Comisión sobre inspección y acreditación de laboratorio, College o f American Pathologists (C A P), 60 Comité sobre abuso y abandono infantil, American Academy o f Pediatrics, 574 Complejo Streptococcus bovis/streptococcus equinus, 663 Compuesto, medios selectivos en recuperación de Enterobacteriaceae, 211, 214r Confidencialidad, relacionada con el paciente, laboratorio de microbiología, 47 Conidióforo(s), 1107r, 1108f, 1123, 1123f Conidios - células conidiógenas, 1107r - definición, 1106 - hongos hialinos productores de cadenas, 1131, 1131 f , 1132f - hongos hialinos productores de grupos, 1132, 1132f Conjugación, 187 Conjuntivitis - Haemophilus, especies y, 41 Ir - presentación clínica, 94 Contrainmunoelectroforesis (CIE), 112 Control de calidad - desarrollo de procedimiento de perfusión en disco estandarizado, 942, 947c - evaluación de la actividad inhibidora de los agentes antibióticos, 932, 933c, 934c - identificación de resultados de sensibilidad a los antibióticos, 39 - laboratorio de microbiología, 59 - - monitorización de equipamiento de labo­ ratorio, 60, 61c monitorización de medios de cultivo, reactivos e insumos, 61, 62c - - programa, componentes, 60 Cordylobia anthropophaga, 1373 Corineforme. definido. 172, 174f Coriza, infecciones virales y, 1311c Coronaviridae, especies, descritas, 1280c Coronavirus - manifestaciones clínicas, 1293, 1293c - OC43, humano, 1280c - SRAG

-

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detección molecular, 1339 diagnóstico serológico, 1348 Corynebacterium, especies, 746 - aislamiento, 768f - algoritmo de identificación, 767f - C. accolens, 75 Ir - C. afermentans. 75Ir - C. amycolatum, 75 Ir, 759, 762c, 763c - C. appendicis. 75 Ir - C. argentoratense, 75 Ir - C. atypicum, 75 Ir - C. aurimucosum, 752r - C. auris, 751r - C. bovis, 752r - C. confusum, 752r - C. coyleae, 752r - C. diphtherieae, 753r, 761c, 763c. 765, 766, Protocolo 14, Lámina en color 14 - C. durum, 753r - C. freneyi, 753r - C. glucuronolyticum, 753r - C. imitans, 753r - C. jekeium, 762c, 769 - C. kroppenstedtii, 754r - C. lipophiloflavum, 754r - C. macginleyi, 754r - C. matruchotii, 754r - C. minutissimum, 754r - C. mucifaciensy, 755r - C. nigricans, 755r - C. propinquum, 755r - C. pseudodiphtheriticum, 755r, 763c, 769 - C. riegelii, 756r - C. sanguinis, 756r - C. seminóle, 753r - C. simulans, 756r - C. singulare, 757r - C. striatum, 756r, 763c, 769 - C. sundsvallense, 757r - C. thomssenii, 757r - C. ulcerans, 757r - C. urealyticum, 754r, 763c, 770 - C. xerosis, 753r - características, 748c - grupo Fl,7 5 8 r - grupo F2, 758r - grupo G, 758r - grupo I, 758r - identificación, 746, 750, 751r, 759c - miembros aislados de seres humanos, 759, 761c, 766, 767, Protocolo 14, Lámina en color 14.E.F - pruebas de sensibilidad a los antibióticos, 752, 759c - relacionadas con animales, 770, 772c Coxiella, especies - aislamiento en cultivo, 1351 - características clínicas, 1349 - detección directa de antígeno y ácido nucleico en muestras clínicas, 1351 - epidemiología, 1349 - infecciones, 1349 diagnóstico serológico, 1351 Crioaglutininas, 1003 Criptococosis, 1170, 1173f, 1175r - cutánea, 1175r - diseminada, 1175r - pulmonar, 1175r Criptosporidiosis, 1217r Cromatografía gas-líquido - controles, 866, 866f, 873c - determinación de productos metabólicos de anaerobios, 864, 864c, 865c, 867f, 867r, 869r, 873c análisis de ácidos no volátiles, 864, 869r identificación de ácidos grasos volátiles. 866, 867f, 873c

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ÌNDICE ANALÌTICO

Cromatografía gas-líquido ( Cont.) - recuperación de micobacterias, 1032 Cromatografía líquida de alto rendimiento (H PLC ) - diagnóstico de tuberculosis, 1020 - recuperación de micobacterias, 1032 - con uso de fluorescencia (H PLC-FL), recuperación de micobacterias, 1032 Cromomicosis, 1166r - agentes, 1160 - definida, 1160 Cromomicosis/micetoma, observaciones preliminares sugestivas de los agentes, 1189 Crup, Véase Laringitis, estridulosa Cryptococcus, especies - C. neoformans, 1170, 1173f, 1175r - C. neoformans, meningitis, 90 Cryptosporidium, especies, C. parvum, 1214, 1216f, 1217r - anotaciones de laboratorio, 1216, 1217r - descritos, 1214, 1217r - identificación de laboratorio, 1215, 1217f Cultivo(s) - aislamiento viral, diagnóstico de infecciones virales, 1316 - basado en carbón selectivo libre de sangre, en aislamiento de C. jejuni, 376c - celulares - - aislamiento de C. trachomatis, 1347 - - artificios, 1321f diagnóstico de infección viral - - aspectos técnicos, 1320, 1322f, 1322r - - contención, 1318, 1320, 1321f - inoculación e incubación, 1323, 1323f - preparación y mantenimiento, 1316, 1317c, 1318c - selección, 1321 - - diagnóstico virológico, evolución, 1273 - - normales, 1316, 1318f - - tambor giratorio. 1323, 1323f - - tipos, 1317, 1317c - detección de bacteriuria, 84 - diagnóstico de infección por especies de Haemophilus, 422 - diagnóstico de infección del SNC, 92 - de esputo, interpretación, 77, 77r - esputo,interpretación, 77, 77r - de fauces - - examen directo, diagnóstico de enferme­ dades infecciosas, 22c - - recolección, 7 2 ,72f - infecciones oculares, 95 - interpretación, 33, 33c, 33f, 33r, 34f, 37f - médula ósea, 104 - microbianos cuantitativos, 95 - mixtos,separación de morfotipos bacterianos, 35,37c - muestras de orina, 83 - muestras titulares, manipulación, 104 - nasofaríngeos, 72 - sangre, recolección, infecciones de transmi­ sión sanguínea, 98, 99f, lOlr, Véase también Hemocultivos, recolección, infecciones de transmisión sanguínea - tinción de Gram, 36, 37f - virales, tambor giratorio, 1323, 1323f Cunninghamella, especies, identificación, 1120, 1122f Cupriavidus, especies, 311, 313r, 314c - C. pauculus, 293c Cumularía, especies, 1159, 1161f Cyclospora cayetanensis, 1217 D Deferoxamina, sensibilidad, identificación de estafilococos coagulasa-negativos, 623

Delftia acidovorans, 293c Demodex brevis, 1372 Demodex folliculorum , 1372 Dermabacter, especies, 789c, 790 Dermacentor, especies - D. variabilis, identificación, 1368, 1369f, 1370c - distribución geográfica, 1365, 1365c Dermatobia hominis, 1366c Dermatófito(s), 1144r - descritos, 1136 - identificación, 1136, 1137, 1139f, 1144r - - técnicas sin cultivo, 1142, 1144r - observaciones preliminares sugestivas, 1187 Dermatophilus, especies, 824 Derrame(s), manipulación, precauciones de segu­ ridad, 50 Desarrollo de toxoide, 199 Descarboxilación, identificación de no fermenta­ dores, 300, Protocolo 6, Lámina en color 7 Descarboxilasa(s), 1399, 1399f, Protocolo 6, Lámina en color 1 Descontaminación - digestión y, 1429 - tipos, 49c Desechos, manipulación, precauciones de seguri­ dad, 50 Desinfección, tipos, 49c 3-Desoxi-D-mannooctulosonato, 181 Desoxirribonucleasa, factor de virulencia estreptocócico, 645 Detección inmunológica, de virus en muestras clínicas, 1336 Detección de quorum, 197 Determinación de fenilalanina desaminasa, iden­ tificación de enterobacterias, 219, Protocolo 6, Lámina en color 6 Diagnóstico virológico, 1271 - revisión histórica, 1273 - servicios - - evolución, 1273, 1273r - - niveles, 1274, 1274r - técnica de cultivo celular, Véase también Cultivos celulares - - evolución, 1273 Diagramas de flujo, identificación de enterobac­ terias, 271, 272f Diarrea - enfermedad sistèmica, causas, 79c - infecciones virales y, 1311c - inflamatoria, causas, 79c - no inflamatoria, causas, 79c - del viajero, 79 Dictiospora(s), 1116r Dientamoeba fragilis, 1213f Dietilcarbamazina, infecciones parasitarias, 1264c Dietzia, especies, 822 Diferenciación bioquímica, detección e identifi­ cación provisoria de infecciones virales, 1329 Difilobotriasis, 1232r Difosfato de hexosa, definido, 192 Difteria, 71 - causas, 200 Difusión, doble, 112 Digestión, descontaminación y, 1429 Dióxido de carbono, crecimiento y metabolismo bacteriano, 189 Diphyllobothrium latum, 1231, 1231f , 1232r Dipylidium caninum, 1232 Dirofilaria, especies, 1251 Dirofilariasis, 1252 Disco M UG, 270 Disentería, 241r - definida, 78, 79c Disentería bacilar, 241r DNA, Véase Acido desoxirribonucleico (D N A )

D N A polimorfo amplificado aleatorio (R APD ), 1063 D N A ramificado, 135 Dolosicoccus, especies, 675 - identificación, 706, 707c Dolosigranulum, especies, 675 - identificación, 706, 707c Dominio(s), 165 Dracunculiasis, 1251 Dracunculus medinensis, 1251 Drechslera, especies, 1159 Dysgonomonas, especies, 455, 457c E Echinococcus granulosus, ciclo vital, 1256f Ectima diftérico, 766 Ectoparásito(s), 1192, 1361 - ácaros, 1372 - arañas, 1372 - definiciones asociadas, 1364r - escritos, 1362 - especies de Ornithodoros, 1369 - insectos, 1372 - taxonomía relacionada, 1364r EDTA, Véase Acido etilenediaminotetraacético (ED TA) Edwardsiella, especies - características de la identificación, 226c - E. tarda, 240, 243c - reacciones bioquímicas, 228c Edwardsielleae (tribu), 221c, 240, 243c - especies, diferenciación, 243c Efecto citopático - detección e identificación provisional de infecciones virales, 1324, 1324f, 1325c, 1326c, 1327f - - enterovirus, 1332f - - examen de cultivos, 1324, 1324f - - mixovirus, 1327f - - virus respiratorios, 1328f - viral, diagnóstico diferencial, 1325c Eh, Véase Potencial de oxidorreducción (Eh) Ehrlichia, especies, infecciones, 1351, 1351c Ehrliquiosis, monocítica. 1352 Eikenella corrodens, 446 - características culturales, 445, 446 - - características bioquímicas, 448c - importancia clínica, 447 - sensibilidad a los antibióticos, 451 - taxonomía, 446 - - factores de virulencia, 446 Electroforesis en gel - análisis posamplificación, 143 - de campo pulsado, 152, 152f Electroporación, 186 Elementos genéticos transponibles, definidos, 188 Emetina, infecciones parasitarias, 1264c Empedobacter brevis, 293c, 330, 331c Empiema, 74 Encefalitis, 91 - infecciones virales y, 1311c Encefalopatías espongiformes transmisibles, manifestaciones clínicas, 1309, 1310c Endocarditis, 117 Ir - especies de Bacillus y, 741 - especies de Bartonella y, 479 - especies de Haemophilus y, 41 Ir, 418 - por estreptococos viridans, 660 - microorganismos de requerimientos nutricionales especiales y consideraciones espe­ ciales relacionadas, 103 - S. aureus y, 603r - de válvula nativa, S. epidermidis y, 607r - de válvula protésica, S. epidermidis y, 607r Endoftalmitis, presentación clínica, 95 Endolimas nana, 1209 Endospora(s), 1107r

ÍNDICE ANALÍTICO

- bacteriana(s), 183 Endotoxina(s) - descritas, 200 - factores de virulencia, 199 Enfermedad por arañazo del gato, especies de Bartonella y, 480 Enfermedad broncopulmonar alérgica, 75 Enfermedad contagiosa, definición, 6r Enfermedad de Crohn. M. paratuberculosis y, 1052 Enfermedad intestinal necrotizante, C. perfringens y, 892 Enfermedad de los legionarios, manifestaciones clínicas, 525, 525c Enfermedad de Lyme - descrita, 1087, 1087r - diagnóstico de laboratorio, 1091, 1091r - - cultivo, 1091, 1091 r - - detección molecular, 1092 - - detección morfológica, 1091 - - detección serológica, 1091 - epidemiología, 1088, 1088f - especies de Borre lia y, 1085 - garrapatas y, 1364 - investigaciones europeas, 1087, 1087r - manifestaciones clínicas, 1090 Enfermedad meningocócica - prevención, 554 - vacunas, 554 Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), especies de Haemophilus y, 417 Enfermedad transmisible, definición, 6r Enfermedad ulcerosa genital, 86 - diagnóstico, 88 Enfermedad de Whipple - anatomía patológica, 824 - descripción, 824 - sitios extraintestinales, 825c Enfermedades infecciosas. Véase también Infección; Agentes infecciosos - agentes infecciosos, Véase Agentes infecciosos - categorías, definición, 6r - ciclo diagnóstico, fases, pruebas de laborato­ rio, 9f, 10, 12c, 14r, 15r, 16c, 17r, 18c, 24r, 26r, 28c, 30f, 35c, 35r, 37f, 39r, 40c, 44r, Veáse también Ciclo diagnósti­ co, fases - definición, 6r - diagnóstico - - examen directo de muestras de cultivo, 21, 22c - - laboratorio de microbiología, rol, 1 - huésped infectado. 2 - medioambiente y, 2 - mundo, 2 - signos y síntomas clínicos, 8 - tríada, 2, 3c Enfermedades micóticas, diagnóstico serológico, 1180 Enfermedades parasitarias, Veáse también Infecciones parasitarias - manifestaciones clínicas, 1194 - muestras, 1194 - - aspirados, 1201 - - biopsia muscular, 1201 - - biopsias titulares, 1201 - - distintas de heces, examen, 1200, 1201 f. Protocolo 22 - - esputo, 1201 - - extraintestinales, examen, 1201 - - fecales, 1195, 1197r - examen visual, 1196 - preservación de muestras clínicas, 1196, 1197r - procesamiento para examen de hue­ vos y parásitos, 1196, Protocolo 22 - - líquidos corporales, 1201

- - orina, 1201 - - procesamiento, 1195 - - raspados corneales, 1201 - - recolección, 1195 - - sangre, 1202, Protocolo 22 - - transporte, 1195 - tratamiento, fármacos, 1264c, 1266 Enfermedades de transmisión sexual. 85, Véase también Infecciones del aparato genital, Infecciones de transmisión sexual y cada infección específica Enlace(s) galactosídico(s), 207, 208f Ensayo A P T IM A Combo 2, identificación de N. gonorrhoeae, 570 Ensayo BD ProbeTec-SDA, 140 Ensayo de galactomannano (G M E IA ) en diag­ nóstico de hongos filamentosos hialinos, 1126 Ensayo inmunoabsorbente enzimático (E LISA), diagnóstico de hongos filamentosos hiali­ nos, 1126 Ensayo de lisado de límulus, diagnóstico de shock endotóxico, 205 Ensayo para M. tuberculosis BD ProbeTec, iden­ tificación de micobacterias, 1060 Ensayo de PCR para N. gonorrhoeae AM PLICOR, identificación de N. gonorrohoeae, 569 Ensayos A P T IM A , 140 Ensayos de PCR - identificación de micobacterias, 1060 - identificación de N. gonorrhoeae, 571 Entamoeba, especies - E. coli, versus E. histolytica, 1206 - E. dispar, 1208 - E. histolytica Lámina en color 22-1, Lámina en color 22-1, Lámina en color 22-2 A.I-K, 1205. 1205r - - ciclo vital, 1207f - - identificación de laboratorio, 1205 - - no patógenas, 1208 - - versus E. coli, 1206 Enterobacter, especies - características de identificación, 226c - E. aerogenes, 253, 253c - E. annigenus, 253c, 254 - E. asburiae, 253c, 254 - E. cancerogenus, 253c, 254 - E. cloacae, 253, 253c - E. cowanii, 253c, 254 - E. gergoviae, 253c, 254 - E. hormaechei, 253c, 254 - E. intermedius, 253c, 254 - E. sakazakii, 253, 253c - especies, diferenciación, 253, 253c - reacciones bioquímicas, 228c Enterobacterias. 204 - bacilos gramnegativos, 205 - características de identificación clave de las especies más frecuentes, 220, 225, 226c, 227r, 228c - clasificación, por tribus, 220, 221c - estándares interpretativos de CIM. 933, 936c - estándares interpretativos de diámetro de zona y referencias de C IM equivalentes, 937c - géneros, establecidos, cambios recientes importantes, 221c - identificación, 226c - - actividad de la citocromooxidasa, 209, Protocolo 1, Lámina en color 6 agar cromogénico, 271 - - agar TSI, 210, Lámina en color 6 - - características de cribado, 206, 207f - - características diferenciales, 215, 217f, 219c, 220r, 226r características de screening - - descarboxilación de arginina, 218,

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Protocolo 6, Lámina en color 6 descarboxilación de omitina, 218, Protocolo 6, Lámina en color 6 - - diagramas de flujo, 271, 272f - - equipos comerciales de screening, 270 - - esquemas computarizados, 272 fermentación de hidratos de carbono, medios de cultivo, 209, 209f, 21 Or, 21 Ir - - matriz en damero, 271 métodos de cribado rápidos, 269, 270f motilidad, 220, 220r - - presuntiva, características, 206,207f, Protocolo 6, Lámina en color 6 - - producción de fenilalanina desaminasa, 219, Protocolo 6, Lámina en co lor 6 - - producción de indol, 216. Protocolo 6, Lámina en color 6 producción de sulfuro de hidrógeno, 219, 219c, 220r - - producción de ureasa, 218, Protocolo 6. Lámina en color 6 - - prueba de rojo de metilo, 217, Protocolo 6, Lámina en color 6 prueba de utilización de citrato, 217, Protocolo 6, Lámina en color 6 - - prueba de Voges-Proskauer, 217, Protocolo 6, Lámina en color 6 - - reducción de nitrato, 209, Protocolo 6, Lámina en color 6 - - sistema de autoidentificación de gramne­ gativos Sensititre, 280 - - sistema OmniLog ID, 280 sistema Phoenix, 280 - - sistema Vitek, 279 - - sistemas automatizados, 279 - - sistemas clásicos, 271, 272f - - sistemas de codificación numéricay 273, 273c, 275c sistemas en equipos comerciales, 274, 276, 277c, Veáse también Sistemas empaquetados - - sistemas semiautomatizados, 279 - - utilización de hidratos de carbono, 206, 207f - - Walkaway, 279 - más nuevas. 263, 264c - - características diferenciadoras, 266c - - características de identificación, 263, 263c - - importancia clínica, 263, 263c - reacciones bioquímicas, 228c - recuperación - - caldos de enriquecimiento, 215, 216c medios de aislamiento Lámina en color 6-1C, Lámina en color 6-2A-D, Lámina en color 6-3A-F, 211, 212c, 213c, 214r, 216c, 216r - - muestras gastrointestinales, medios selec­ tivos, 213c, 214 - resistentes a los antibióticos, 205 - taxonomía, 220 Enterobiasis, 1224r Enterobius vermicularis, 1223 Enterococo, 639 - ß-lactamasas, inducción, 952 - clasificación, 64Ir - descritos, 640 - factores de virulencia, 667 - identificación, sistemas comerciales, 708 - métodos de evaluación. 954c - miembros, 667, 668r - taxonomía, 667 EnteroScreen4, 271 Enterotube II, 277 Enterovirus - detección molecular, 1339 - efecto citopático, 1332f -

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ÍNDICE ANALÍTICO

Enzima - diana, modificación, 912 - D N A girasa, 174 - modificadoras de antibióticos, 915, 916c, 917c - neuraminidasa, S. pneumoniae, 656 - reconocedora de penicilina, activa en membra­ na celular, 910. 912, 914f. 916c, 917c, 918r - S. aureus, 60Ir Enzimoinmunoanálisis (E IA ) - detección de anticuerpos, 116, 117f, 119f - detección de antígenos. 120, 122, 122f - método de captura de anticuerpos, detección de IgM , 120, 121f Epicoccum, especies, 1159, 1160f Epidemiólogos, interacciones, ciclo diagnóstico, 44 Epidermophyton, especies, E. floccosum, identifi­ cación, 1142, 1143f Epiglotis, especies de Haemophilus y, 41 Ir Epiglotitis, 73 - especies de Haemophilus y, 416 EPOC. Véase Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (E P O C ) Equinococosis, 1261, 1262f, Lámina en color 22 Equipamiento, de laboratorio, monitorización, control de calidad, 59, 61c Equipo de prueba A'e/sjería-Kwik, identificación de especies de Neisseria, 566 Equipo para recolección de orina B-D, 82 Equipos comerciales, identificación de no fer­ mentadores, 342, 345, 350, 355r, 356 Eremococcus, especies, 675 Erisipelas, 736 - estreptococos y, 646 Eritromicina, 5. pyogenes resistentes, 968 Erupción(es) - maculopapular, infecciones virales y, 1312c - petequiales, infecciones virales y, 1312c - vesiculares, infecciones virales y, 1312c Erwineae (tribu), 262 Erysipelothrix, especies, 736 - características, 730c - E. rhusiopathiae factores de virulencia, 737 - - importancia clínica, 737 - taxonomía. 736, 736c Escabiosis, 1372 Escherichia, especies - características de identificación, 226c - E. abertii - - descritas, 239 - - reacciones bioquímicas, 230c - E. adecarboxylata, descrita, 240 - E. blattae - - descritas, 240 - - reacciones bioquímicas, 230c - E. co li, 225, 241, 241c, 24Ir, 244c - - diarreicogénica, características, 238c - - difusamente adherente, características, 238c - - enteroagregante, características, 238c - - reacciones bioquímicas, 230c - E. fergusonii - - descritas, 240 reacciones bioquímicas, 230c - E. hermanii - - descritas, 240 - - reacciones bioquímicas, 230c - E. vulneris - - descritas, 240 - - reacciones bioquímicas, 230c - enterohemorrágica - características, 238c - detección, 239 - epidemiología, 237 - fisiopatología, 227,240

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enteroinvasiva, características, 238c enteropatógena, características, 238c enterotoxigénica, características, 238c estructura de peptidoglicanos, 179f estructura de unidad repetitiva de peptidoglicano, 178, 178f - - gastroenteritis, 227,242c - - meningitis, 90 - especies, diferenciación, 241r - reacciones bioquímicas, 228c Escherichieae, tribu, 221c, 225, 240, 242c, 243r, 244c, 245c, 245r - características de identificación, 226c Escotocromógeno(s), 1047 Esfingobacteriaceae, 332, 333c Esfingobacterias, 172r Esfingomonadales, 318 ESP Culture System II, detección de micobacte­ rias, 1034 Espacio periplasmático. 180 Esparganosis, 1261 Especies bacterianas - definidas, 163 - designaciones alfanuméricas de los CDC, 295c - nitrato-positivas asacarolíticas, 879 - “ similares a Rothia", 793, 794c Espectometría de masa, diagnóstico de tuberculo­ sis, 1020 Espirilos, definidos, 172, 174f Espiroqueta(s), 171r - cultivo, 1081, 1081c - transmisión, 1079c Espora(s) - definidas, 1106 - microsporidios, heces y aspirados duodenales, tinción de Weber en detección, 1219, 1220r Esporangioespora(s), 1107r Esporangiola, 1120. 1122f Esporangios, 1107r Esporodoquia, 1159 Esporotricosis, 1152, 1154f, 1155f, 1155r Esporulación basipetalo, 1107r Esputo - examen directo, diagnóstico de enfermedades infecciosas, 22c - expectorado, dignóstico de infecciones del aparato respiratorio inferior, recolección, 75 Esquema de clasificación functional de BushJacoby-Madeiros, ?-lactamasas, 915, 916c Esquema de clasificación de Runyon, 1042, 1042r Esquema de clasificación de Woods y Washington, 1043, 1043r Esquema de identificación de Gilardi, identifica­ ción de no fermentadores, 341 Esquema de identificación de Pickett, identifica­ ción de no fermentadores, 341 Esquema de identificación de Weyant, identifica­ ción de no fermentadores, 341 Esquemas computarizados, identificación de no fermentadores, 342 Esquistosoma(s), 1234, 1235f, 1236r Estafilococos, 593 - aislamiento, 611, 613c, Protocolo 12, Lámina en color 12 - - morfología de las colonias, 611 - - muestras clínicas, 611 - - prueba de catalasa, 612 - aumento al máximo de detección de resisten­ cia a meticilina, 962r - coagulasa-negativa, 606, 607r - - identificación, 617 - actividad de la pirrolidonil arilamidasa, 618, 620 - A P I Staph, 624

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A P I Staph-IDENT, 624 clave dicotómica, 620f ID32 Staph, 624 métodos convencionales, 617,618r, 620f, 621c - métodos de tipificación, 626, 629 - - molecular, 626,629 - Panel MicroScan Pos ID, 625 - Panel MicroScan Rapid Pos Combo, 625 - - producción de acetoína, 623 - - producción de fosfatos, 618 - - producción de ureasa, 623 - prueba ODC, 620, 623 - pruebas fenotípicas y genotípicas, 617, 618r, 619c, 621c - Rapidez Staph, 624 - sensibilidad a polimixina B, 620 - sensibilidad, desfreoxamina, 623 - Sistema de identificación G Crystal, 625 Sistema de identificación microbiano, 626 - Sistema de identificación en microplacas Biolog, 626 - - sistemas comerciales, 624 - - Staf-System 18-R, 626 - Staphy-Zym, 626 - tarjeta Vitek GPI, 625 - coagulasa-positivos, diferenciación, 617 - definidos, 172, 174f - diferenciación preliminar, 611,613c - identificación, enfoque de laboratorio, 629 - importancia clínica, 594, 596r, 607r - micrococos versus, 612, 613c, Protocolo 12, Lámina en color 12 - taxonomía, 593 Esterasa leucocitaria (LE ), 86 Esterilización, tipos, 49c Estibogluconato de sodio, infecciones parasita­ rias, 1265c Estreptocinasa(s), factor de virulencia estreptocócico, 645 Estreptococos, 639, Veáse también Streptococcus, especies - aislamiento, 675, Protocolo 13, Lámina en color 13, Lámina en co lor 13 - P-hemolíticos - - agrupables, identificación, características bioquímicas, 686, 687c - - p-hemolíticos - grupo A, 641, 644f, 646 - - - muestras faríngeas para técnicas de detección directa sin cultivo, 677 - grupo B, 649, 651, 653r, 678 - - importancia clínica, 650,653r - - grupo C, 654 - - grupo D, 663 - - grupo E 655 - - grupo G, 654 - - identificación - características fenotípicas, 687c - - serológicas, 685 - características generales, 641 - caracterización preliminar, 680, 681c - clasificación, 64Ir - definidos, 172, 174f - descritos, 640 - grupo anginoso, 662 - identificación, 676, 679, Protocolo 13, Lámina en color 13, Lámina en co lor 13 - - coaglutinación, 685 - - extendidos directos teñidos con Gram, 676 - - hemolisis en agar sangre, 676, 677f, 677r - - hidrólisis de hipurato de sodio, 682 - - medios de cultivo, 676

ÍNDICE ANALÍTICO

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presuntiva, 680, 683c, 1388, 1408, 1412, Protocolo 1 - - comercial, 685, Protocolo 13 - - criterios fenotípicos, 680,683c - - producción de pigmento, 682 - - prueba de bilis-esculina, 684, Protocolo 13, Lámina en color 13 - - prueba C A M , 682 - - prueba de catalasa, 679 prueba LAP, 684 - - prueba de precipitinas capilares, 685 - - prueba PYR, 684, Protocolo 1, Lámina en color 13 - - prueba de solubilidad en bilis, 684, Protocolo 1 - - prueba de tolerancia a la sal, 684, Protocolo 3, Lámina en color 13 - - sensibilidad al SXT, 682, 688c, Protocolo 13, Lámina en color 13 - - sensibilidad a la bacitracina, 680, Protocolo 13, Lámina en co lor 13 - - sensibilidad a optoquina, 684, Protocolo 13, Lámina en color 13 - - sistemas comerciales, 706 - otros, 666 - reconocimiento, 680, 681c - 5. agalactiae, 649, 653r - viridans. 660 - - aislados en animales, 666 diagrama de flujo, 691f grupo S. anginosus, 688, 692c - - grupo S. bovis, 693, 694c - - grupo S. mitis, 686, 689c - - grupo S. mutans, 686, 689c grupo S. salivaris, 686, 689c - - diferenciación fenotípica, 688c - - identificación, 686, 688c, 689c, 691f, 692c, 694c - - tratamiento antibiótico, resistencia, 968 Estreptogramina(s), especies de Staphylococcus resistentes, 960 Estreptolisina O. factor de virulencia estreptocócico, 645 Estreptolisina S. factor de virulencia estreptocócico, 645 Estreptomiceto, 823 Estrongiloidiasis, 1225f, 1226, 1237f Estudios de microbiología ambiental, especies de Legionella, 534, 536c Etest, evaluación de la actividad inhibidora de los agentes antibióticos, 946, 957f, 958r, Protocolo 17 Eubacterium, especies, 886, 887c, 888c Eucarionte, definición, 1105 Ewingella, especies - E. americana, 264c - - reacciones bioquímicas, 230c - más nuevas, características diferenciadoras, 263, 266c Examen en campo oscuro, examen microscópico de muestras, 18c Examen de oxiuros, preparado con cinta de celu­ losa, 1473 Exiguobacterium, especies. 790, 791c, 792 Exophiala jeanselmei, 1163, 1163f Exotoxina(s) - bacterianas, 199 - factores de virulencia, 199 - pirógenas estreptocócicas, factor de virulencia del estreptococo, 645 Exposición ocupacional a sangre, manejo, 1296, 1299r Exposición a sangre por pinchazos de aguja, riesgos ulteriores de contraer infecciones virales de transmisión sanguínea, 52, 55c Exserohilum, especies, 1159, 1161f

Extendidos de heces, técnica de tinción tricrómi­ ca, 1468 F Facklamia, especies, 675 - identificación, 706, 707c Factor cordón, 183, 183f Factor de opacidad, como factor de virulencia del estreptococo, 644 Factores de crecimiento, crecimiento y metabolis­ mo bacteriano, 190 Factores R. 199 Factores de virulencia, 5, 5c - microorganismos, 197 Faehifomicosis, 1105, 1166r - agentes, 1157 Familia(s), definida(s), 163 Faringitis, 70 - aguda, especies de Haemophilus y, 41 Ir - Arcanobacterium haemolyticum, 71 - causas, infecciosas, 71 - cultivo, 72, 72f - estreptocócica, 70, 646 - gonocócica, 71 - infecciones virales y, 1311c - viral, 70 Fármaco(s), parasitosis, 1264c. 1266 Fasciola hepatica, 1234, 1237f, 1238r Fascioliasis, 1238f, 1238r Fasciolopsiasis, 1238r Fasciolopsis buski, 1234, 1238r Fenilalanina desaminasa, 1401, 1401f Fermentación - ácido mixta, 193 - ácido propiónico, 194 - anaerobia, piruvato formado, destino, 193, 195f - bacteriana, 189, 191, 192f - butanediol, 194 - butanol, 194 - definición, 206 - glucosa - - ausencia de evidencia, identificación de no fermentadores, 297 - - diferenciación de micrococos y estafiloco­ cos, 612 - heteroláctica, 193 - hidrato de carbono, deteción - - medios de cultivo, 209f, 210, 210r, 21 Ir - - principios bioquímicos Lámina en color 61E, Lámina en co lor 6-4A-C, Lámina en color 7-1A, 209f, 210, 21 Ir - homoláctica, 193 - manitol, identificación de S. aureus, 616 - principios básicos, 206, 207f - utilización de hidratos de carbono, 206 Fermentadores oxidasa-positivos, 387 Fiálido(s), 1107r, 1123, 1125f Fibrosis quística, neumonía, 75 Ficomicosis, definida, 1105 Fiebre - dengue, manifestaciones clínicas, 1291 - entérica, causas, 79c - por mordedura de rata, 1097 - de Oroya, B. baciliformis y, 476 - Pontiac, 525, 525c - purpúrica brasilera, especies de Haemophilus y, 41 Ir, 419 - recurrente - - características, 1085, 1085c - - diagnóstico de laboratorio, 1086 especies de Borrelia y, 1085 - - presentación clínica, 1086 - recurrente, especies de Borrelia y, 1086 - reumática aguda, estreptococos y, 647 - tifoidea, diagnóstico, cultivo y serología, 10, lOf

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- de las trincheras, B. quintana y, 477 Fijador de Schaudinn, fórmulas, 1475 Filariasis, 1248, 1251r, 1252f Filoviridae, especies, descritas, 1279c Filovirus, manifestaciones clínicas, 1290 Fimbrias (pili) - bacterianas, 184 - Moraxella catarrhalis, 558r - N. gonorrhoeae, 547r - N. meningitidis, 545r Fimbrilina, 185 Flagelado(s), intestinales, 1210, 1211 f , 1215f Flagelina, 185 Flagelos - bacterianos, 184, 185f - disposiciones, 301 - morfología, identificación de no fermentadores, 301 - peritricosos, microorganismos móviles, 324 - polares, microorganismos móviles, 301 Flaviviridae, especies, descritas, 1283c Flavobacteriaceae, 329, 329r, 330c Flavobacterias, 172r Flavobacterium, especies, 293c Fleming, A., descubrimiento de la penicilina, 903, 903f Flexispira rappini, 379c, 383, 383c “ Flexispira” , características. 374c Flora - colonizante, 4 - cutánea, contaminación, recolección de hemocultivos, 98, 99f - endógena, aparato respiratorio superior, 67 Fluorescencia-desnitrificación, 1405 Fluroquinolonas - especies de Staphylococcus, resistentes, 962 - S. pyogenes resistente, 968 Foliculitis, S. aureus y, 603r Folículos pilosos, 1372 Fonsecaea pedrosoi, 1162 Forúnculo(s), S. aureus y, 603r Fosfatidilinositol, manósidos, 183 Fosfato, producción, identificación de S. epider­ midis, 618 Fosforilación a nivel de sustrato, 193 Fotocromógeno(s), 1045 Fotorreactividad, micobacterias, evaluación, 1437 Fragmentos de uñas, examen directo, diagnóstico de enfermedades infecciosas, 23c Francisella tularensis, 467. Véase también Tularemia - aislamiento, 469, 471c - características del cultivo, 470, 473c - descrita, 468 - identificación, características bioquímicas, 473c - reseña, 468 - taxonomía, 468 - virulencia, 468 Frasco Mycotrim Triphasic, 1000 Frotis - ácido-alcohol resistente, recuperación de micobacterias, 1031 - de heces, técnica de tinción tricrómica, 1468 - recolección de muestras, 13 - sanguíneos - gota fina, 1469 - - gota gruesa, 1470 Fructosiltransferasa, 184 FTA-ABS, Véase Prueba de absorción de anti­ cuerpos treponémicos fluorescentes (FTAABS) Furazolidona, sensibilidad, diferenciación de micrococos y estafilococos, 613, Protocolo 12, Lámina en color 12 Fusarium, especies, grupos de conidios produci­ dos, 1132, 1133f

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ÍNDICE ANALÍTICO

G Gabinetes de seguridad biológica, comparación, 52c, 53f Gangrena gaseosa, clostridios, 889, 892 Garantía de calidad - evaluación de actividad inhibidora de los agentes antibióticos, 932 - laboratorio de microbiología, 58 Gardnerella, especies, G. vaginalis, 795, 798c - aislamiento, 796, 797c - descritas, 795 - factores de virulencia, 796 - identificación, 797, 798c - importancia clínica, 796 - morfología celular, 793 - sensibilidad a los antibióticos, 799 - taxonomía, 795 Garrapata(s), C Lámina en color A l-B , Lámina en color A-2A-D,E-H, 1363, 1363c, 1366c, 1366f, 1370c, Veáse también Ixodida, espe­ cies - descritas, 1363 - distribución geográfica, 1365, 1365c - duras - - características diagnósticas, 1370c - - identificación, C, 1366, 1366f - identificación, C, 1366, 1366f - Ixodes ricinos, 1086 - rangos geográficos, 1365 Gastroenteritis - B. cereus y, 741 - E. coli y, 225, 230c - evaluación, consideraciones epidemiológicas, 80c, 81 - V. cholerae y, fisiopatología, 389, 389r, 390f - viral, manifestaciones clínicas, 1293, 1293c Gastroenteritis viral, manifestaciones clínicas, 1293, 1293c Gemella, especies, 673 - identificación, 701, 704c Gen-Probe A M TD , identificación de micobacte­ rias, 1059 Géneros, definidos, 163 Genitales, flora comensal y agentes patológicos, 85c Genoma, 172 Giardia, especies, G. Lamblia, 1210, 121 lf, 1212r - ciclo vital, 1210, 121 l f - detección de antígenos, 1212 Giardiasis, 1212r Gingivitis, 71 Gingivoestomatitis ulcerosa, necrosante, 71 Gliocladium, especies, grupos de conidios produ­ cidos, 1133, 1134f Globicatella, especies, 675 - identificación, 703, 706, 707c Glomerulonefritis aguda, estreptococos y, 647 Glucocáliz, 184 Glucosa, fermentación - diferenciación de micrococos y estafilococos, 612 - falta de pruebas, identificación de no fermen­ tadores Glucosiltransferasa(s), 184 Gnathostoma spinigerum, 1260 Gonorrea, antecedentes históricos, 540 Gordonia, especies, 822 Gram, Véase Tinción(es), de Gram Granulicatella, especies, 671 - identificación, 693, 698c Gránulo(s), metacromático(s), 176 Granuloma, 7 - inguinal, 87 Granulos metacromáticos, 176 Grupo acidovorans de commonadaceae, 315 Grupo alcaligenes de Pseudomonas, 304, 307c Grupo amarillo de agrobacterias, 323

Grupo de bacilos 1 de Gilardi, 335c, 336 Grupo facilis-delafieldii de Comamonadaceae, 316 Grupo nocardioforme, 819 Grupo rRNA de caulobacterias, 316 Grupo rRNA I, 301, 301r, 303c, 304r, 305c, 305r, Véase también Pseudomonas, especies Grupo rR N A II, 306, 308c, 309r, 312c, 313r, 314c Grupo rR N A de xantomonadas, 317, 317c Grupo Stutzeri de Pseudomonas, 304, 304c Grupos bacterianos de los CDC - EF-4A, 456, 457c - EF-4B, 456, 457c - grupo 1c, 323 - grupo 4, 792, 794c - grupo EF-4b, 336 - grupo EO-5, 337c, 338 - grupo NO-1, 337c, 338 - grupo NO-2, 337c, 338 - grupo WO-1, 323 - grupos O -l,0-2 y 0-3, 323 - identificación, características bioquímicas, 466c - de oxidantes eugónicos (EO ) de los CDC, 334, 334c, 336 H Hábitat, bacterias anaerobias, 839, 839r Haemophilus, especies, 409 - (3-lactamasas, inducción, 952 - enfermedades infecciosas causadas por, 41 Ir, 415,416 - H. aphrophilus, infecciones causadas, 421 - //. ducreyi - - diagnóstico de laboratorio, 427, 427f - - infecciones causadas por, 421 - - sensibilidad a los antibióticos, 429 - H. influenzae, 410, 410r, 41 Ir, 412f, 413r - - bacteriemia debida a, 41 Ir, 418 - - bacteriemia posparto debida a, 41 Ir, 419 - - biotipificación, 426,426r - - bronquitis debida a, 41 Ir, 417 - - celulitis debida a, 420 - - conjuntivitis debida a, 41 Ir, 419 - - endocarditis debida a, 41 Ir, 418 - - epigiotitis debida a, 41 Ir, 416 - - EPOC debida a, 417 - - factores de virulencia, 413r - - fiebre purpúrica brasilera debida a, 41 Ir, 419 - - infecciones causadas por, 41 Ir, 415, 416 - - infecciones oculares debidas a, 41 Ir, 419 - - infecciones del tracto genital debidas a, 41 Ir, 419 - - meningitis debida a, 41 Ir, 415, 416 - - neumonía debida a, 41 Ir, 418 - - otitis media debida a, 41 Ir, 416 - - sensibilidad a los antibióticos. 428 - - sepsis neonatal debida a, 41 Ir, 418 - - serotipificación, 425 - - sinusitis debida a, 41 Ir, 417 - - uretritis debida a, 41 Ir, 419 - H. influenzae tipo b. vacunas, 410, 412, 415r - H. parainfluenzae - - biotipificación, 426.426r - - infecciones causadas por, 420 - H. paraphrophilus, infecciones causadas por, 421 - infecciones causadas por - - diagnóstico de laboratorio, 422, 424c, 426r, 427f - agar para aislamiento de Haemophilus, 423 - agar chocolate, 422 - características bioquímicas, 423,424c - características de identificación, 419, 420

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cultivo, 422 detección de antígeno capsular tipo b, 422 - métodos bioquímicos y equipos, 427, 433c - - tinción de Gram para identificación, 423, 424c, 426r, Protocolo 9, Lámina en color 9 - métodos de evaluación, 955c - miembros, 409, 410, 410r - sensibilidad a los antibióticos, 428 - taxonomía. 408, 409r, 410c - tratamiento antibiótico, resistencia, 962 - - cefalosporinas, 963 - - cloranfenicol, 963 - - penicilina, 962 - - timetoprim-sulfametoxazol, 963 Hafnia, especies, 255 - características de identificación, 226c - H. alvei, 255 - reacciones bioquímicas, 230c Halomonadaceae, 321, 321c Halomonas venusta, 321, 321c Hansenula anómala, 1176, 1176f Hantavirus, manifestaciones clínicas, 1291, 1291c HBV, Véase Hepatitis, B Heces, examen directo, diagnóstico de enferme­ dad infecciosa, 23c Helcococcus, especies, 672 - identificación, 693, 697, 701c Helicobacter, especies, 379c, 382, 383c - características, 374c - H. cinaedi, 379c, 383, 383c - H. fennelliae, 379c, 383, 383c - H. heilmannii, 383, 383c - H. pylori, 379c, 383, 383c - - antecedentes históricos, 373 - - cultivo y aislamiento, 385, 385c - - identificación, 385 detección de antígenos, 387 - método de la ureasa, 386 - - métodos serológicos, 387 - - precisión de las pruebas invasivas y no invasivas, 386 - - prueba de ureasa en biopsia, 386 - - recuperación de muestras, 385 - no humanas, 384 Hemaglutinación - detección e identificación provisional de infecciones virales, 1324, 1325, 1333f, Protocolo 23 - pasiva - - identificación de S. aureus, 615 - - prueba, 115 Hemaglutinina(s), Moraxella catarrhalis, 558r Hemocultivos - diagnóstico de tuberculosis, 1022 - recolección, infecciones de transmisión san­ guínea, 98, 99f, lO lr - - medios, 100, 101 r - - número de cultivos, 100 - - oportunidad. 100 - - pautas, lO lr - sistemas de procesamiento, infecciones de transmisión sanguínea, 101 - - estudios comparativos, 103 - - sistema de cultivo T R E K ESP II, 103 - - sistema de hemocultivo BacT/Alert, 102 - - sistema de hemocultivo BACTEC 9240/9120, 102 - - sistema de hemocultivo BBL Septi-Chek, 101 sistema de hemocultivo de lisis-centrifugación, 101 - - sistema de señales de oxoides, 101 - - Sistema Wampole Isostat/Isolator Microbial, 101

ÍNDICE ANALÍTICO

sistemas de hemocultivo automatizados y computarizados, 102 - - sistemas de hemocultivo manuales, 101 Hemoflagelado(s), 1238. 1245f, 1246r, 1247f, 1248r Hemolisina II, 741 Hemolisina III, 741 Hemolisina(s), de S. aureus, 601r Hemolisis, identificación, 677, 677r Hendra, 1288 - hepatitis, 1308, 1308c, Veáse también Hepatitis Hepadnaviridae, especies de, descritas, 1287c Hepatitis - A diagnóstico serológico, 1343 - - manifestaciones clínicas, 1307, 1308c - B, 1287c, 1287r - - detección molecular, 1338 - - diagnóstico serológico, 1341, 1343f - - manifestaciones clínicas, 1307, 1308c - C - - detección molecular, 1337 diagnóstico serológico, 1343 - - manifestaciones clínicas, 1307, 1308c - causas, 1308, 1308c - D, manifestaciones clínicas, 1308c, 1309 - E, manifestaciones clínicas, 1308c, 1309 - infecciones virales y, 1312c - manifestaciones clínicas, 1305, 1305c Hepatoesplenomegalia, 1194 Herbaspirillum, especies, 320, 320c Herpesviridae, especies, descritas, 1285c Heterorresistencia, 605 HHV-6, Véase Virus herpes humano 6 (HHV-6) HHV-7, Véase Virus herpes humano 7 (HHV-7) HHV-8, Véase Virus herpes humano 8 (HHV-8) Hialofomicosis, 1105, 1121, 1137r Hialohifomicetos, conidios producidos en forma aislada, 1134, 1134f, 1137r Hialuronidasa - factor de virulencia del estreptococo, 643, 645 - de S. pneumoniae, 656 Hibridación, 136, 137f - D NA-D NA. 163 - identificación de micobacterias, 1058 - in situ - - cromógena, 136 - - por fluorescencia, 132, 136, 137f - - identificación de micobacterias, 1059 - inversa - - análisis posamplificación, 144, 144f - - identificación de micobacterias, 1061, 1061f Hidatidosis, 1261, 1262f Hidradenitis supurada, S. aureus y, 603r Hidrato de carbono - CTA, convencionales, identificación de espe­ cies de Neisseria, 565 - metabolismo oxidativo, 295 Hidrólisis - esculina, identificación de no fermentadores, 300, Protocolo 7, Lámina en color 1 - Tween 80, identificación de micobacterias, 1037. Protocolo 19,Lámina en color 19 - Tween-80, 1447, Protocolo 19,Lámina en color 19 - de urea, identificación de no fermentadores, 299, Protocolo 6, Lámina en co lor 7 Hidróxido de potasio (KO H ), examen microscó­ pico de muestras, 18c Hifas, 1107r - especies no productoras, 1170, 1173f, 1174f, 1175r - especies productoras, 1170, 1170f, 1173r Himenolepiasis, 1233r Hipoxantina, hidrólisis, 1418

Hipurato de sodio, hidrólisis, identificación de estreptococos, 682 Hirudo medicinales, especies de Aeromonas, 398 Hisopado(s) - pus aspirado versus, 11, 1l f - rectal, medio, 215, 216r Histoplasma, especies, H. capsulatum, 1148, 1151 f , 1153r - descrito, 1148 - diagnóstico con el uso de técnicas sin cultivo, 1151, 1153r - presentación de laboratorio, 1149, 115l f Histoplasmosis, 1148, 1151 f , 1153r HIV, sistema de clasificación revisado, 1295, 1296c, 1297c Hongos, 1157 - cultivo, recomendaciones de la American Thoracic Society para la recolección de muestras, 1109, 1110c, 111 Ir - dematiáceos, 1157 - descripción, 3 - dimorfos, 1143, 1145 - - descritos, 1148 - - observaciones preliminares sugestivas, 1187 - filamentosos dematiáceos, observaciones pre­ liminares sugestivas, 1188 - filamentosos hialinos, 1121 - - características de las colonias, 1129 - - conidios en cadenas producidos, 1129, 1129f, 1132f - identificación preliminar, 38 - de importancia médica, identificación, 1117c - observaciones preliminares de identificación presuntiva, 1185, 1186 - observaciones preliminares sugestivas, sobre la base del examen microscópico directo de material de muestras clínicas, 1118c - oportunistas. 1104 - terminología relacionada, 1107r - conidios en grupos producidos, 1132, 1133f - de crecimiento rápido, 1129 - descritos, 1121 - diagnóstico, técnicas sin cultivo, 1126, 1130r - especies de Aspergillus, 1121, Véase también Aspergillus, especies - histopatología, 1125, 1128f, 1130r - observaciones preliminares sugestivas, 1186 HPLC. Véase Cromatografía líquida de alto ren­ dimiento (H P L C ) HPLC-FL. Véase Cromatografía líquida de alto rendimiento, p o r fluorescencia (H P L C -F L ) HPV, Véase Virus del papiloma humano (H P V ) HSV, Véase Virus herpes simple (HSV) Huella genética, identificación de micobacterias, 1063 Hueso(s), infecciones, 89 Huésped(es) - agentes infecciosos y, interacciones, 4, 4c - infectado, virulencia y, 6 Hymenolepis, especies, 1232, 1233f, 1233r - H. diminuta, 1232, 1233f I IATA, Véase International A ir Transpon Association (Asociación de transporte aéreo internacional) (IATA) ID32 Staph, identificación de estafilococos coagulasa-negativos, 624 Identificación de laboratorio, optimización, enfo­ ques, 42c IgM , Véase Inmunoglobulina(s) Ignavigranum, especies, 675 - identificación, 706, 707c Impétigo, S. aureus y, 603r, 646 Inclusión, C. trachomatis, detección morfológica, 1347

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Incubación, recuperación de micobacterias, 1031, 1032f Indol. producción, identificación de enterobacte­ rias, 216, 217f, Protocolo 1 Infección por duelas (Fasciola hepatica), 1234 Infección por especies de Salmonella, 244, 245r Infección de huesos y articulaciones, 89 Infección iatrogénica, definición, 6r Infección intravascular, 96 Infección oportunista, definición. 6r Infección subclínica. definición, 6r Infección por virus herpes simple (H SV), 72, 86, 1285c - detección inmunológica, 1336 - detección molecular, 1342 - - diagnóstico serológico, 1341 - manifestaciones clínicas, 1299 Infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (H IV ), 1283c - detección molecular, 1336 - diagnóstico serológico, 1340, 1340c, 1341f - epidemia global, 1294, 1295c, 1298c, 1299r, 1300c - M. Tuberculosis, impacto, 1018 - secuencia de D NA, 145, 145f - sistema de clasificación revisado entre adoles­ centes y adultos positivos, 1295. 1296c, 1297c - tipo 1 (HIV-1) - - manifestaciones clínicas, 1295, 1295c, 1297 - - procedimientos de Western blot, 118, 119f - tratamiento, apoyo de laboratorio, 1300c - úlceras genitales y, interacciones, 87 - vigilancia, definiciones de casos revisadas, 1298c Infecciones del aparato genital, 69c, 85c, 86, 90f - causas, 85c, 86 - complicaciones sistémicas, 87 - diagnóstico, 87, 90f - enfermedades de transmisión sexual, 86 - especies de Haemophilus y, 41 Ir, 418 - superiores, infecciones, 87 - transmisión, no sexual, 86 Infecciones asociadas con catéteres de diálisis peritoneal, S. epidermidis y, 608r Infecciones bacterianas, relacionadas con el sitio, diagnóstico, 68c Infecciones por bolas micóticas, 1130r Infecciones de catéteres venosos, S. epidermidis y, 607r Infecciones cutáneas, S. epidermidis y, 608r Infecciones dentales, 73 Infecciones por espiroquetas, 1076 - especies de Borrelia, 1085 - especies de Leptospira, 1094 - especies de Treponema, 1077 - Spirillum minor, 1097 - taxonomía, 1076, 1076c Infecciones hemáticas, 69c, 96 - bacteriemia, 96, 97c - consideraciones especiales, 103 - intravascular, 96 - patogenia, 96, 97c - presentación clínica, 95 - recolección de hemocultivos, 98, 99f, lOlr, Véase también Hemocultivos, recolec­ ción, infecciones relacionadas con la sangre Infecciones de heridas, 69c, 94 - diagnóstico, 92 - presentación clínica, 94 - S. aureus y, 603r Infecciones hospitalarias - definición, 6r - especies de Bacillus y, 742 Infecciones humanas, bacterias anaerobias y, 840, 847f, 848c, 848r

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ÍNDICE ANALÍTICO

Infecciones de injertos vasculares, S. epidermidis y, 607r Infecciones por micoplasmas - hemotróficas, animales, diagnóstico y trata­ miento, 1007 - sensibilidad a los antibióticos, 1004 - tratamiento, 1004 Infecciones micóticas - de asiento profundo, 1104 - categorización clínica, 1104 - diagnóstico, enfoque de laboratorio, 1106 - - examen directo, 1110, 1113f, 1113r, 1114r, 1116c medios de cultivo, selección e inoculación. 1111, 1115f - - preparación para estudio, 1110, 111 Ir, 1113f, 1113r, 1114r - - procesamiento de muestras, 1110, 1112c - - rechazo de muestras, criterios, 111 Ir - - recolección y transporte de muestras, 1109, 1110c, 111 Ir - pacientes en riesgo, 1104 - signos y síntomas, 1104, 1105c - superficial, 1104 Infecciones musculoesqueléticas, especies de Bacillus y, 743 Infecciones oculares, 69c, 95 - conjuntivitis, 95 - cultivos, 95 - diagnóstico, 95 - endoftalmitis, 95 - especies de Bacillus y, 742 - especies de Haemophilus y, 410r, 419 - examen microscópico, 95 - presentación clínica, 94 - queratitis, 95 - recolección de muestras, 96 - S. epidermidis y, 607r - uveítis, 95 - por “ oxiuros” , 1223 - por protozoos titulares, 1253, 1255f, 1256f, 1256r Infecciones en pediatría, S. epidermidis y, 608r Infecciones respiratorias, 67 - altas, 67, 69c. 72f angina Vincent - - epiglotitis, 73 - - faringitis, 70 - - infecciones dentales, 73 - - laringitis, 73 nasofaríngeas, 72 - - otitis media, 73 - - sinusitis, 73 - bajas, 69c, 73, 77r, 78c - - bronquiolitis, 74 - - diagnóstico, recolección de muestras, 75 - - neumonía, 74 - - traqueobronquitis, 73 - diagnóstico, 68c - pulmonares y S. aureus, 603r Infecciones del sistema nervioso central (SNC), 69c, 90 - abceso encefálico, 92 - de derivaciones de líquido cefalorraquídeo (LCR ), S. epidermidis y, 607r - diagnóstico, 91, 92f - - por cultivo, 92 - - detección de antígeno y ácido nucleico, 92 - - serológico, 93 - - técnicas microscópicas, 92 - encefalitis, 91 - meningitis, 91, 91c, 411c, 415, 416, 603r, 1171r, 1311c - recolección de muestras, 92, 93f - respuesta inflamatoria, evaluación, 92 Infecciones de transmisión sexual, 86 - cervicitis, 86, 88 - enfermedad ulcerosa genital, 86

- HPV, 87 - HSV. 86 - infección por HIV, 87 - uretritis, 86, 88 - vaginitis, 86 - vaginosis, 87 - verrugas venéreas, 87 Infecciones del tubo digestivo, 77, 79c, 80c - alto, 80 - - recolección de muestras, 79 - - síntomas clínicos, 80 - bajo, 69c, 77, 79c, 80c - - causas, 7 9 ,80c - - recolección de muestras de heces, 79 - - síntomas clínicos, 77, 79c - diagnóstico, 68c - “ Gastropirillum hominis", 383c, 384 Infecciones del aparato urinario, 69c, 81, 81c, 82f, 83r, 84f - diagnóstico, 68c - factores del huésped, 81 - pruebas de cribado, 84 - recolección de muestras de orina, 81, 81c - S. epidermidis y, 607r - signos y síntomas, 68c, 80 Infecciones virales. Véase también Virus - aislamiento, cultivo, 1316 - clasificación clínica, 1309, 1311c - detección, 1323 - diagnóstico, 1304, 1312 - - aislados, identificación definitiva, 1331 - - artificios, 1310, 1312 - - asilamiento de virus en cultivo, 1316 asociación celular, 1329 - - cambios no inducidos por el virus, 1329 - - cultivos celulares - aspectos técnicos, 1320, 1322f, 1322r - contaminación, 1318, 132 l f - inoculación e incubación, 1323, 1324f - preparación y mantenimiento, 1316, 1324f - selección, 1321 - - detección de antígenos virales, 1329 - - diferenciación bioquímica, 1329 - - efecto citopático, 1323f, 1324, 1325c, 1326c, 1327f, Veáse también Efecto citopático, detección e identificación provisional de infecciones virales - - hemadsorción, 1324, 1325, 1333f, Protocolo 23 - - hemaglutinación, 1324, 1325, 1333f, Protocolo 23 - - métodos, 1313c - - microscopía electrónica, 1329 - - microscopía óptica, 1329, Protocolo 23 muestras - almacenamiento, 1312, 1315, 1315c, 1316 - recolección, 1312, 1315, 1315c, 1316 - tipos, 1315c - transporte, 1316 - diagnóstico serológico, 1337, 1340, 1340f, 1345c - - anticuerpos contra-IgM, 1345 - - CMV, 1344 - - coronavirus SARS, 1345 - - EBV, 1342, 1343f - - HAV, 1344 - - HBV, 1342, 1343f - - HCV, 1344 - - HIV, 1340, 1340c, 1341f - - HSV, 1342 - - infecciones por parvovirus, 1344 - - pruebas de sensibilidad a los antivirales, 1345 - - rubéola, 1345 - - virus del Nilo Occidental, 1345

por VZV, Véase Virus varicela-zoster ( VZV) - especies de Anaplasma, 1351, 1351c - especies de Chlamydia y, 1346, 1348 - especies de Coxiella, 1349 - especies de Ehrlichia, 1351, 1351c - especies de Rickettsia, 1349 - manifestaciones clínicas, 1277, 1283 - nomenclatura relacionada, 1274, 1274r, 1275f, 1276f, 1278c - síndromes clínicos asociados, 1311c - taxonomía relacionada, 1274, 1274r, 1275f, 1276f, 1278c Infectividad, definida, 195 Inflamación, 6 - atópica, 7 - granulomatosa, 7 - linfohistiocítica, 7 - supurada aguda, 7 - tipos, 7 Informe, resultados de cultivos de microbiología, 43, 43c Inhibición del crecimiento de la hidracida del ácido tiofeno-2-carboxílico (T2H), identifi­ cación de micobacterias, 1039, Protocolo 19, Lámina en co lor 19 - inhibición, 1441 Inhibidores de la (3-lactamasa, 917 Inmunidad celular - adaptativa, 7 Inmunidad humoral - adaptativa, 8 - innata, 6 Inmunodepresión e infecciones por Bacillus, 742 Inmunodepresión y neumonía, 75 Inmunoelectroforesis a contracorriente, 112 Inmunoensayo(s) - definición, 117 - enzimático, detección de anticuerpos, 117, 117f, 119f - en fase sólida, métodos, 117, 117f, 119f, 121f, 122f - - métodos de captura de anticuerpos EIA, 120, 121f - - métodos de detección de anticuerpos EIA, 117f, 118, 119f Inmunofluorescencia - descrita. 123 - directa (IFD), 123, 123f, 124f - - examen de especies de Legionella, 530 - indirecta (IFI), 123, 124f - técnicas, 123, 123f - - detección de anticuerpos, 123, 124f, 125f - - detección de antígenos, 123, 123f, 124f Inmunoglobulina(s) - clases, 110, 11 l f - definición, 110 - IgM , detección, método de captura de anti­ cuerpos EIA, 120, 12 l f Inoculo - evaluación de la actividad inhibidora de los agentes antibióticos, 932 - tratamiento antibiótico, 920f, 921 Inquilinus limosus, 312c, 315 Insectos, 1373 - chinches, 1364 - - reduvídeas (vinchuca), 1364r - moscas, 1373 - mosquitos, 1374 - piojos, 1375 - pulgas, 1375 Intercambio genético, bacterias, 186, 187f Intermedilisina, 662 Intemalina, 198 - factor de virulencia para L. monocytogenes, 730

INDICE ANALÍTICO

International A ir Transport Association (Asociación de transporte aéreo internacio­ nal) (IATS), 56 Intoxicación alimentaria estafilocócica, S. aureus y, 604r Intoxicación alimentaria, estafilocócica, S. aureus y, 604r Intoxicación, alimenticia, S. aureus y, 604r lodamoeaba bütschlii, 1209 Isospora belli, 1218 - ciclo vital, 1216f Isosporiasis, 1218 Ivermectina, infecciones parasitarias, 1264c Ixodida, especies, 1363, Veáse también Garrapata(s) - características diagnósticas, 1370c - /. cookei - - distribución geográfica, 1366, 1366c identificación, 1368, 1371c - I. marxi - - distribución geográfica, 1365, 1366c - - identificación, 1368, 1371c - I. scopularis distribución geográfica, 1365, 1366c - - identificación, 1366, 1366f, 1368f, 1370c - relación con la enfermedad. 1365

K Kala-azar, 1246r Kerstersia, especies, 325c, 328 Kingella, especies, 449 - características de los cultivos, 445c, 449 - identificación, 445, 450 - - características bioquímicas, 448c - importancia clínica, 449 - sensibilidad a los antibióticos, 451 - taxonomía. 449 Klebsiella, especies - cambios taxonómicos, 250, 252c - características de identificación, 226c - descritas, 250, 253 - especies, diferenciación, 252c - Grupo Klebsiella-Enterobacter-HafniaSerratia, 207, 208f, 218 - K. granulomatis, 250 - K. oxytoca, reacciones bioquímicas, 230c - K. ozaenae, 250 - K. pneumoniae, 250 - - reacciones bioquímicas, 230c - K. rhinoscleromatis, 250 Klebsielleae (tribu), 222c, 250, 251c, 252c, 253c, 256c - características de identificación, 226c - especies, diferenciación, 251c Kluyvera, especies - más nuevas, 264c - - características de diferenciación, 263, 266c - reacciones bioquímicas, 230c Koneman, E.W., 2 KosereUa trabulsii, características de diferencia­ ción, 268c, 269 L Laboratorio de microbiología - acreditación e inspección, 46 - aseguramiento de calidad, 58 - aspectos administrativos, 45 - bioterrorismo, 58, 59c, 60c - calificaciones personales, 47 - confidencialidad en relación con los pacientes, 47 - control de calidad, 59, Véase también Control de calidad, laboratorio de microbiología - evaluación de eficiencia, 47 - laboratorios de referencia o derivación, 47 - manejo de riesgos, 47

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manuales de procedimiento, 47 papel, 1 regulación estatal, 45, 45r, 46c requerimientos de espacio, 47 seguridad, 47, Veáse también Seguridad, labo­ ratorio de microbiología Lactobacillus, especies, 799 - aislamiento, 800 - características, 730c - epidemiología, 799 - identificación, 800, 885 - importancia clínica, 799 - taxonomía, 799 Lactococcus, especies, 675 - identificación, 706, 708c Lactofenol. 21c Lactrodectus mactans, 1372 Laribacter hongkongensis, 320c, 323 Laringitis, 73 - estridulosa, 1311c Laringotraqueobronquitis, especies de Haemophilus y, 41 Ir Larva migrans - cutánea, 1259 - visceral, 1258 Larvas, de moscas, y miasis, 1373 Lautropia mirabilis, 315 Lavado broncoalveolar, diagnóstico de infeccio­ nes del aparato respiratorio, 22c, 76 Lavado rectal, medio, 215, 216r LCR, Véase Líquido cefalorraquídeo (L C R ) LE, Véase Leucocito esterasa (L E ) LeClercia, especies, L. adecarboxylata, 264c - reacciones bioquímicas, 232c LeClercia, especies, más nuevas, características diferenciadoras, 263, 267c Legioneláceas, en medioambiente, 527 Legionella, especies, 523, Véase también Legionelosis - ácidos grasos celulares, 533c, 534c - aislamiento - - aspirados de líquidos pleurales y transtraqueales, 531 - - del esputo y otras muestras contaminadas, 531 - - hemocultivos, 532 - - muestras ambientales, 534 - - muestras clínicas, 531, 53Ir - - tejidos, 531 - características, 524, 524c, 532, 533c - diagnóstico molecular, 534 - estudios de microbiología ambiental. 534, 535c - hábitats acuáticos elaborados por el hombre (artificiales), 527 - hábitats naturales, 527 - identificación, 532, 532c, 533c - manifestaciones clínicas, 525, 525c - medioambiente, 526 - prueba de IFA indirecta en suero, 532 - sensibilidad a los antibióticos, 531, 532 - taxonomía, 524, 524c - tipificación, 535, 536c Legionelosis, Véase también Legionella, especies - aspectos ecológicos, 527 - brotes hospitalarios, 528 - diagnóstico de laboratorio, 529 - - muestras clínicas aislamiento de especies de Legionella, 531, 53Ir - detección de antígeno en orina y líquidos corporales, 530 - detección molecular de ácidos nucleicos, 531, 53 Ir, 533c, 534 - examen director, 530 - examen microscópico, 530 - procedimiento IFA, 530

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selección, recolección y transporte, 529 - epidemiología, 527 - espectro clínico, 525, 525c - factores predisponentes, 526 - incidencia, 527 - patogenia, 526 - patología, 526 - tratamiento, 531, 532 - en viajeros, 528 Leifsonia, especies, 790, 791c Leishmania, especies, 1244, 1246r - ciclo vital, 1245f - identificación de laboratorio, 1244 Leishmaniasis, 1194, 1244, 1245r, 1246r - cutánea, 1244 - - primaria, 1246r - diseminada, 1246r Leminorella, especies - más nuevas - - características diferenciadoras, 265, 267c - reacciones bioquímicas, 232c Leptospira, especies, 1094 - descritas, 1094, 1094f, 1095c - genomoespecies. 1095c - leptospirosis debida, 1094 - serogrupos, 1095c Leptospirosis, 1094 - causas, 1094 - diagnóstico de laboratorio, 1096 - epidemiología, 1094 - manifestaciones clínicas, 1095 Lesiones genitales, microscopía de campo oscu­ ro, 1453 Leuconostoc, especies, 673 Levaduras - negras, identificación de laboratorio, 1176, 1177f - - definidas, 1106 - - descripción, 3 - - identificación de laboratorio, 1164, 1165 - preparados de agar harina de maíz, 1165, 1168f, 1168r, 1169f - tubo germinal, 1164, 1165, 1165f, 1165r, 1168f - - identificación, abreviada, 40c - - no formadora de hifas, 1174, 1176f - - observaciones preliminares sugestivas, 1190 - productoras de artroconidios, 1173r Ley de transferibilidad y responsabilidad del seguro de salud de 1996, 47 Lincosamida - especies de Staphylococcus resistentes, 960 - S. pneumoniae resistente, 964 Líneas celulares - mantenimiento, procedimiento, 1322r - orígenes, 1315, 1318c Lípidos, definidos, 181 Lipoarabinomanano, 183 Lipooligosacáridos, 182 - Moraxella catarrhalis, 558r - N. gonorrhoeae, 547r - N. meningitidis, 545r Lipopolisacáridos (LPS), 181, 18l f Lipoproteínas de mureína, 181 Líquido cefalorraquídeo (LC R ) - examen directo, diagnóstico de enfermedades infecciosas, 22c - meningitis, 22c, 90 Líquidos corporales, detección de parásitos, 1201 Lisina, descarboxilación, identificación de ente­ robacterias, 218, Protocolo 6, Lámina en color 6 Lisostafina, sensibilidad, diferenciación de micrococos y estafilococos, 612

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ÍNDICE ANALÍTICO

Listeria, especies, 729 - características, 730c - E. rhusiopathiae - - aislamiento, 738 - - identificación, 737 - - sensibilidad a los antibióticos, 738 - identificación, 733, 734c - L. monocytogenes, 728 aislamiento, muestras clínicas, 733 - - epidemiología, 731 - - factores de virulencia, 730 - - identificación, 733,734c - - importancia clínica, 731 - - meningitis debida a, 90 - - tratamiento antibiótico, resistencia, 968 - métodos de evaluación, 956c - patogenia, 736 - sensibilidad a los antibióticos, 736 - taxonomía, 728, 729c, 729r - tratamiento, 736 Listeriolisina O, 198 - factor de virulencia para L. monocytogenes, 730 Listonella, especies, 397 Loxosceles recluso, 1372 LPS, Véase Lipopolisacárido (L P S ) LV-PVA, formulaciones, 1475

M Macroconidio, 1107r, 1132, 1133f, 1140, 1143f - con tabiques transversos, 1158, 1159f - con tabiques transversos y longitudinales, 1158, 1158f, 1159f - de transmisión aislada o a través de conidiación especial, 1159, 1161f Macrólido(s) - especies de Staphylococcus resistentes, 960 - S. pneumoniae resistente, 964 Maduromiceto(s), 822, 822c Magnetosoma(s), composición, 176 Malassezia furfur, 1176 Mannheimia, especies, 437r, 444 - actualmente reconocido, 437r - identificación, características bioquímicas, 440c - M. haemolytica, 437r, 444 Manósido(s), fosfatidilinositol, 183 Massilia, especies, 318, 319c Mastitis, S. aureus y, 603r Material peligroso, manipulación, precauciones de seguridad, 50 Materiales infecciosos, limpieza de derrames, 53, 55 Matriz en damero, identificación de enterobacte­ rias, 271 Matriz de glucano insoluble, 184 Mebendazol. para infecciones parasitarias, 1264c Medio de transporte de Sutar, 14, 14r Medio(s) de cultivo - de Barbnour-Stoenner-Kelly para cultivo de B. burgdorferi, 1091, 1092r - con base de agar, diagnóstico de tuberculosis, 1019 - de Blazer, aislamiento de C. jejuni, 376c - diferenciales, cambios, 35r - Eh, 838 - evaluación de la actividad inhibidora de los agentes antibióticos, 930 - evaluación de muestras, 26, 28c - libre de sangre para Campylobacter de Preston, aislamiento de C. jejuni, 376c - de Loeffler, 1416 - monitorización, control de calidad, 61, 62c - recuperación y caracterización de especies de Salmonella, 245, 246c, 248f - recuperación de enterobacterias Lámina en color 6-1C, Lámina en color 6-2A-D, Lámina en color 6-3 A-F, 210, 212c, 213c, 214r, 216c, 216r

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medios de aislamiento selectivo Lámina en color 6-1C, Lámina en color 62A-D, Lámina en co lor 6-3A-F, 246c, 248f - - medios de enriquecimiento, 215, 216c - - sustancias químicas y compuestos, 212. 214r - selectivo de Butzler, aislamiento de C. jejuni, 376c - para viriones de Butzler, aislamiento de C. jejuni, 376c Medioambiente - enfermedades infecciosas, 2 - especies de Legionella, 526 - virulencia y, 5, 6c, 6r Medios cromógenos, recuperación y caracteriza­ ción de especies de Salmonella, 246c, 247, 248f Melarsoprol, para infecciones parasitarias, 1264c Melioidosis, 308, 308c, 309r Melissococcus, especies, 671 Membrana celular - antibióticos activos, 910, 912, 914f, 916c, 917c, 918r - bacterias gramnegativas, componentes, 91 l f - enzimas activas reconocedoras de la penicili­ na, 910, 912, 914f, 916c, 917c, 918r - transporte de los agentes antibióticos, 906, 909f Membrana citoplasmàtica, células bacterianas. 176 Membrana externa, 180 Membrana nuclear, 173 Meningitis, 91, 91c - aséptica, infecciones virales y, 1311c - Candida, 117 Ir - causas, patógenos, 90 - especies de Haemophilus y, 41 Ir, 413,416 - LC R en pacientes, 91c, 92 - S. aureus y, 603r - sepsis neonatal, especies de Haemophilus y, 41 Ir - signos y síntomas, 90 Mesosoma(s), 177 Metabolismo, no fermentadores, 291, Véase tam­ bién N o fermentador, metabolismo Metaneumovirus humano, 1288 Metapneumovirus humano, 1288 Methylobacterium, especies, 321, 322c - M. mesophilicum, 293c Metilobacterias, 321, 322c Método de tinción de Leifson, identificación de no fermentadores, 300, 300r, Protocolo 7.2 Método de tinción de Ryu, identificación de no fermentadores, 300, Protocolo 7 Métodos de amplificación de señales, 132, 135f - D N A ramificado, 135 - FISH, 132, 136, 137f - hibridación in situ, 136, 137f - Hybrid Capture, 134, 135f - identificación de micobacterias, 1058 - sondas de ácidos nucleicos, 133 Métodos inmunológicos, 112 Metronidazol, infecciones parasitarias, 1265c Micelio, 1107r, 1108f - aéreo, 1107r - de reproducción, 1107r - vegetativo, 1107r Micetoma - agentes, 1160 - causas, 822, 823c Micobacterias, 1016, Veáse también Mycobacterium, especies - aislamiento - - cultivo de muestras, 1029, 1030c, 1031c, 1032f - - frotiss ácido-alcohol resistentes, sensibili­ dad, 1031

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- GLC, 1032 - HPLC, 1032 - HPLC-FL, 1032 - incubación, 1030, 1032f - medio de cultivo en caldo, 1032 - medios de Cohén y Middlebrook, 1030 - medios de cultivo, 1029, 1030c - medios de cultivo no selectivos, 1029 - medios selectivos, 1029. 1030c - métodos rápidos, 1031 características diferenciales, 1038c clasificación, 1042 - reseña, 1042, 1043r detección - BACTEC MYCO/F Lytic, 1035 - sistema BACTEC AFB, 1036, Protocolo 9 - sistema de detección manual, 1035 - sistema de detección de micobacterias MB/BacT, 1034 - sistema MGIT, 1033 - sistema M G IT 960, 1034 - sistema Septi-Chek AFB, 1035 - sistemas de detección automatizados, 1032 diagnóstico, recuperación e identificación de tuberculosis, 1023, 1024f, 1025c, 1026c, 1028c, 1029c, 1030c, Veáse también Tuberculosis, diagnóstico de laborato­ rio, recuperación e identificación de micobacterias fotorreactividad, evaluación, 1437 identificación, 1042, 1044c actividad de arilsulfatasa, 1037, 1040c, Protocolo 19, Lámina en color 19 - actividad de catalasa, 1037, Protocolo 19, Lámina en color 19 - actividad de ureasa, 1037, 1038c, Protocolo 19, Lámina en co lor 19 - acumulación de niacina, 1037, Protocolo 19, Lámina en co lor 19 - captación de hierro, 1039, Protocolo 19 - crecimiento en agar de MacConkey, 1042, Protocolo 19 - crecimiento en cloruro de sodio, 1042, Protocolo 9 - hidrólisis de Tween 80, 1037, Protocolo 19, Lámina en co lor 19 - huellas genéticas, 1063 - inhibición del crecimiento por T2H, 1039, Protocolo 19, Lámina en color 19 - métodos convencionales, 1036, 1040c, Protocolo 19 - métodos moleculares, 1056, 1062f análisis posamplificación, 1061, 1061 f ensayo para M. tuberculosis BD ProbeTec, 1060 - ensayo para M. tuberculosis Abbott LCx, 1060 - ensayos de PCR, 1060 Gen-Probe A M TD , 1059 hibridación in situ, 1059 hibridación inversa, 1061, 1061 f métodos de amplificación de ácidos nucleicos, 1059 métodos de amplificación de señales, 1058 prueba para Mycobacterium Tuberculosis Roche Amplificor, 1060 - secuenciación de D NA, 1062 sondas de ácidos nucleicos, 1058 - pirazinamidasa, 1038, Protocolo 19, Lámina en color 19 - producción de pigmento. 1037, Protocolo 19, Lámina en co lor 19

ÍNDICE ANALÍTICO

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reducción de nitratos a nitritos, 1037, 1038c, Protocolo 19, Lámina en color 19 - - sondas de D NA, 1449 - - tipificación de cepas, 1063 - identificación preliminar, 38 - M. shimoidei, 1054 - nomenclatura, 1040C - reducción de nitratos, 1444, 1444f - tinciones de fluorocromo, 25 - tolerancia al cloruro de sodio, 1446 - ureasa, 1448 Micologia, 1102 - terminología relacionada, 1105 Micoplasma(s), 975 - aislamiento - - medios de cultivo de rutina, 1000 seres humanos, 978r - central, aislamiento, medio, 1427 - cultivo - - medios, 993, Protocolo 18 - - medios de transporte, 993 muestras clínicas, 993, 996f, Protocolo 18 - - recolección de muestras, 994 - descritos, 976 - detección, tinción de Diene, 1423 - genitales - - aislamiento e identificación, 997, 999f, 1427, Protocolo 18, Lámina en color 18 - - detección sin cultivo, 997 - - pruebas serológicas, 1003 - origen animal, infecciones humanas debidas a, 992 - taxonomía, 976, 976r, 978c. 978r Micosis - extrapulmonar. signos, síntomas y agentes probables, 1106c - pulmonares, signos y síntomas, 1105c Micro-ID, 278 Microaerófilo, 837 Microbact Staphylococcal 12S, identificación de estafilococos coagulasa-negativos, 626 Microbacterium, especies, 791c, 792 Microbiología, introducción. 1 Microbios, olores. 33, 35c Micrococcus, especies, 610 - descritas, 595 - especies de Staphylococcus versus, 612, 613c, Protocolo 12, Lámina en color 12 - identificación, características fenotípicas, 627c, 629 Microconidios, 1107r, 1132, 1140 Micròmetro ocular, calibración, 1471, 1472f Microorganismos, 197 - Microorganismos autotróficos, 191 - caracterización, métodos, 164r - inmóviles oxidasa-negativos, 337, 337c - - oxidasa-positivos, 329 - microaerófilos, 189 - procariontes, replicación, transcripción y tra­ ducción de códigos genéticos, 177f - prototróficos, 191 Microplaca Biolog GN2, 278 Microscopia de campo oscuro, de lesiones geni­ tales, 1453 Microscopia electrónica - detección directa de virus en muestras clíni­ cas, 1335 - detección e identificación provisoria de infec­ ciones virales, 1329 - inmunitaria, 117 Microscopia óptica - detección directa de virus en muestras clíni­ cas. 1334, Protocolo 23 - detección e identificación provisional de infecciones virales, 1329. Protocolo 23

Miocarditis/pericarditis, infecciones virales y, 1312c Mionecrosis, clostridios, 889, 892 Mixovirus, efecto citopático, 1327f Molécula 16S rRNA, 163 Monitorización de insumos, control de calidad. 61,62c Monofosfatos de nucleótidos, D NA, 130, 13 l f Moraxelas, 333, 335c - clasificación, especies, 541, 541r - taxonomía, 541, 54Ir Morfotipos bacterianos, en cultivos mixtos, sepa­ ración, 35, 37c Morganella, especies, 257, 257c - características de identificación, 226c - M. morganii, reacciones bioquímicas, 232c Mosca(s) - Dermatobia hominis (larva de la mosca huma­ na), 1373 - tumbu, 1373 Mosquitos, 1374 - flebótomos, 1374 Motilidad bacteriana, identificación de enterobac­ terias. 220, 220r, Lámina en color 6 mRNA, Véase RNA mensajero (mRNA) Mucor, especies, identificación, 1120, 1123f Mucormicosis, 1105 Muestra(s), Véase también Recolección de mues­ tras - anaerobias, recipientes para transporte. 12, 12c, 13. 13f - de biopsia, recuperación e identificación de micobacterias, 1026 - cultivo - - aislamiento de micobacterias, 1029, 1030c, 1031c, 1032f técnicas, 26, 27, 30f - de esputo, evaluación de la calidad, 1201 sistema de graduación de Bartlett, 17, 17r - - sistema de graduación de Murray y Washington, 17. 17r - diagnóstico de infecciones virales almacenamiento, 1316 - - tipos, 1315c - - transporte, 1316 - ectoparásitos, remisión al laboratorio, 1362 - enfermedades parasitarias, 1194, Veáse tam­ bién Enfermedad parasitaria, muestras - examen microscópico, 15, 17, 17r, 18f, 24r, 95, Veáse también Examen microscópico de muestras - genitales, 88. 89f - de heces diagnóstico de tuberculosis, 1022 - - enfermedades parasitarias, 1194 - - medio, 216,216r ooquistes de Cryptosporidium, técnica de flotación de Sheather en recupera­ ción, 1217r - - parásitos, incidencia. 1192, 1193r - - recolección, 79 - líquidas, recuperación e identificación de micobacterias. 1026 - manipulación, precauciones de seguridad. 50 - de médula ósea, recuperación e identificación de micobacterias, 1026 - de orina de chorro medio, 82, 82f, 82r - - cultivo, 83 - - detección de parásitos, 1201 - - diagnóstico de infecciones del aparato uri­ nario, 82f, 83r - - diagnóstico de infecciones del tracto uri­ nario, 81 - - evacuada, 83 - - examen directo, diagnóstico de enferme­ dades infecciosas, 22c

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instrucciones de obtención al acecho, lim­ pias, 81, 82f, 83r - procesamiento, 26, 28c, 29 - - relacionado con enfermedad parasitaria, 1194 - recepción y observaciones preliminares. 14 - rechazo, criterios, 14, 15r - respiratorias, diagnóstico de tuberculosis, 1021 - de sangre, detección de parásitos, 1202, Protocolo 22 - selección de medios de cultivo primarios, 27, 28c - técnica de transferencia, 27 - transporte, 10, 12, 12c, 14c, 14r - - precauciones de seguridad, 55, 56f, 57f recipientes, 12, 12c, 13, 13f relacionado con enfermedad parasitaria, 1194 Multiceps, especies, 1261 Muriforme, 1107r Mutualismo, 4 Mycobacterium, especies, Véase también Micobacterias - complejo M. tuberculosis, 1046, Diagrama 19, Lámina en color 19 - de crecimiento rápido, 1055, 1057r - escotocromógenos, 1047 - fotocromógenos, 1045 - M. abscessus, 1055, 1057r - M. asiaticum, 1047 - M. avium-intracellulare, 1051 - M. bovis, 1044 - M. celatum, 1049 - M. fortuitum, 1055, 1057r - M. gastri, 1053 - M. genavense, 1056 - M. gordonae, 1050, 1050r - M. haemophilum, 1054. 1054r - M. kansasii, 1045, 1048r - M. malmoense, 1054, 1054r - M. marinum, 1045, 1049r - M. paratuberculosis, 1052 - M. scrofulaceum, 1047 - M. simiae, 1047, 1049r - M. szulgai, 1048, 1050r - M. terrae, 1053, 1053r - M. thermoresistible, 1056 - M. triviale, 1053, 1053r - M. tuberculosis, 1056, Protocolo 19, Lámina en color 19 detección, instrumentación radiomètrica, 1451 - - evaluación de sensibilidad. 1064, 1065f evaluación de sensibilidad a drogas, ins­ trumentación radiomètrica, 1451 - - HIV, 1018 identificación, instrumentación radiomètri­ ca, 1451 - - meningitis debida, 91 - - tratamiento a corto plazo, 1067, 1067r - M. ulcerans, 1056, 1056r - M. xenopi, 1049, 1049r - no fotocromógenos, 1051 - nomenclatura, 1040c - orden de presentación, 1045r - revisión, 1043 Mycoplasma, especies - factores de virulencia, 979 - hemotróficas, 992 - identificación, características, 978r - importancia clínica, 980 - M. fermentans, importancia clínica, 987 - M. genitalum, importancia clínica, 986 - M. hominis, importancia clínica, 981 - M. penetrans, importancia clínica, 989 - M. pirum, importancia clínica, 991

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ÍNDICE ANALÍTICO

Mycoplasma, especies (Cont.) - M. pneumoniae - - aislamiento, 994, 996f, 1426, Protocolo 18, Lámina en co lor 18 - medio, 1425 - - detección sin cultivo, 995 - - identificación, 994, 996f, 1424, Protocolo 18, Lámina en co lor 18 - presuntiva, prueba de reducción de tetrazolio, 1428 - - prueba de hemadsorción, 1424 - - importancia clínica, 980 - - infecciones debidas a, diagnóstico, prue­ bas serológicas, 1001 - M. primatum, importancia clínica, 991 - M. spermatophilum, importancia clínica, 992 Myroides, especies, 293c, 332, 333c N N-acetil-L-cisteína-hidróxido de sodio (N A L C ), 1429 Af-acetilglucosamina, 178, 180f Naegleria, especies, N. fow leri, meningitis. 91 N A LC , Véase N-acetil-L-cisteína-hidróxido de sodio (N A LC ) NAP, Véase p-Nitro-acetilamino-hnidroxipropiofenona (N A P ) Naranja de acridina, examen microscópico de muestras, 24, 26r NASBA, Véase Amplificación basada sobre secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) Nasofaringe - cultivos, 72 - infecciones, 72 National Type Culture Collection (N T C C ) (Recolección de cultivos de tipo nacional), 162 Natostomiasis, 1260 Necrosis, 7 Neisseria, especies, 293c, 335c, 336, 539 - aislamiento, 559, 561c, 561r, 563r - atípicas, características de cultivos, 572c - características, 542, 543r, 545f - características del cultivo, 571, 572c - clasificación. 541, 54Ir - identificación, 564, 567c - - BatiCard, 567 - - características, 572c diferenciación de otros microorganismos sobre medios selectivos, 565 - - ’’falsas” , características, 572c - - morfología de las colonias, 564 - - prueba de oxidasa, 564 - - prueba rápida de utilización de hidratos de carbono, 1410 - - prueba de superoxol, 564 - - pruebas de coaglutinación, 568 - - pruebas confirmatorias, 564 - - pruebas de sustrato de enzimas cromogénicas, 566, 567c - - pruebas de utilización de hidratos de car­ bono, 565 - - sistemas de identificación multiprueba, 568 - - tinción de Gram, 564 - importancia clínica, 542, 546, 546f, 547f - N. cinerea, 556 - - características del cultivo, 572c, 574 - N. elongata - - subespecie elongata, características del cultivo, 572c, 576 - - subespecie glycolitica, características del cultivo, 572c, 576 - N. flavescens, características del cultivo, 572c, 575 - N. gonorrhoeae - - aislamiento, 559, 560c, 561c, 561r

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extendidos directos teñidos con Gram, 559 - - medios de cultivo selectivos, inocula­ ción e incubación, 560c, 561 - recolección de muestras, 560, 560c, 561r - transporte de muestras, 560 - - antecedentes históricos, 540 - - antígenos, asociados con virulencia, 544r - - p-lactamasas, inducción, 952 - - características del cultivo, 571, 571c - - confirmación del cultivo - - métodos epidemiológicos, 567 - prueba de sonda de D NA, 569 - - epidemiología, 546,546r - - evaluación de métodos, 955c - factores de virulencia, 544r - - identificación - - criterios presuntivos, 565 - - prueba de IFD, 567 - - pruebas de hibridación y amplifica­ ción de ácidos nucleicos, 569 - - importancia clínica, 542, 546r, 547f - - infeccionesa causadas por, 547, 548, 548f, 549f - - sensibilidad a los antibióticos, 577 - - subespecie kochii, características del culti­ vo, 572c, 576 - - tratamiento antibiótico, resistencia, 965 - N. lactamica, 556 - - características del cultivo, 572c, 574 - N. meningitidis - - aislamiento - - aislamiento e incubación, 562 - - extendidos directos teñidos con Gram, 563 - - pruebas de antígeno capsular directo, 563 - - recolección y transporte de muestras, 563 - - seguridad de laboratorio, 562 - - antecedentes históricos, 540 antígenos, asociados con virulencia, 545r - - características del cultivo, 572c, 573 - - epidemiología, 550 - - evaluación de métodos, 955c - - factores de virulencia, 545r - - identificación, métodos moleculares, 571 - - infecciones causadas, 552 - - meningitis debida a, 91 - - sensibilidad a los antibióticos, 578 - - tratamiento antibiótico, resistencia, 966 - N. polysaccharea, características del cultivo, 572c, 575 - N. sicca, 556 - N. subflava, 556 - no humanas, características del cultivo, 572c, 576 - no patogénicas, identificación, 572c, 575 - sensibilidad a los antibióticos, 577 - taxonomía, 541, 54Ir Nematodos, 1220 - Ascaris lumbricoides, 1221, 1221f, 1223r - Capillaria philippinensis, 1226 - descritos, 1220 - Enterobius vermicularis, 1223, 1223f - por filarías, 1248, 1252f, 1252r - Strongyloides stercoralis, 1225, 1225f, Í227r - Trichostrongylus, especies, 1226 - Trichuris trichuria, 1222, 1223f, 1224r - uncinarias, 1222, 1225, 1225f Neumolisina, S. pneumoniae, 656 Neumonía(s), 73 - aguda, 74 - en ancianos, 75 - por aspiración, 73

- atípica, 74 - crónica, 74 - diagnóstico de laboratorio, 76, 76r, 78c - especies de Haemophilus y, 41 Ir, 418 - manifestaciones clínicas, 131 le - pacientes con fibrosis quística, 74 - pacientes inmunosuprimidos, 74 - poblaciones especiales, 75 Neurorretinitis, especies de Bartonella y, 481 Niacina, acumulación, 1442 - identificación de micobacterias, 1036 Niclosamida, infecciones parasitarias, 1265c Nigrospora, especies, 1160, 1161 f Ninfa(s), 1365 Niños - abuso sexual, infección por C. trachomatis, 1348 - Chilomastix mesnili, 1213 - infecciones, S. epidermidis y, 608r Nitrato(s) - desnitrificación, identificación de no fermenta­ dores, 299, Protocolo 7, Lámina en color 1 - identificación de no fermentadores, 299, Protocolo 7, Lámina en co lor 7 - a nitritos, identificación de micobacterias, 1038c, Protocolo 19, Lámina en color 19 Nitrito(s), nitratos, identificación de micobacte­ rias, 1037, 1038c, Protocolo 19, Lámina en co lor 19 Nitrógeno - asimilación y metabolismo, 190, 190f - crecimiento y metabolismo bacterianos, 189, 190f Nocardia, especies, 818 - células bacterianas, 821 - descritas, 821 - diferenciación, 825, 826c, 829c, 829r, 831c, Protocolo 15, Lámina en color 15 - - pruebas claves, 829c - enfermedad clínica, 819 - identificación - - bandas A P I 20C AU X, 830c - - prueba de lisozima, 826, 826r tinción ácido-alcohol resistente modifica­ da, 829, 829r - N. asteroides, 819 - - aislados, perfiles de sensibilidad a los anti­ bióticos, 819,821c - N. brasiliensis, 820 - N. otitidiscaviarum, 820 - sensibilidad in vitro, 832c, 833 - taxonomía, 818 - utilización de hidratos de carbono, patrones, pruebas suplementarias en resolución, 831c Nocardiopsis, especies, 823 Nocardiosis, 820 Nomenclatura - definida, 1273 - relacionada con infecciones virales, 1273, 1274r, 1276f, 1278c Novobiocina, sensibilidad, identificación de S. saprophyticus, 623 Novobiocina-verde brillante-agar glucosa (NBG ), recuperación y caracterización de especies de Salmonella, 246c Novobiocina-verde brillante-glicerol-agar lactosa (N B G L), recuperación y caracterización de Salmonella, 246c Nucleoide, 172 Nuclisens HIV-1 QT, 140 Números de biotipo, 274 O o-Nitrofenil-p-D-galactopiranosida (ONPG), 1391, 1391f

ÍNDICE ANALÍTICO

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identificación de enterobacterias, 208, Protocolo 6, Lámina en color 6 Obesumbacterium, especies - más nuevas, características diferenciadoras, 267c - O. proteus, 264c reacciones bioquímicas, 232c Objetos de vidrio, precauciones de seguridad, 49 Oceanopiriláceas, 318, 319c Ochrobactrum, especies, 326c, 329 - Ochrobactrum anthropi, 293c Oerskovia, especies, 789c, 790, 824 OFBA-1, 323 Ojo(s), examen directo, diagnóstico de enferme­ dad infecciosa, 23c Oligella, especies, 293c, 328 Olores, microbios, 33, 35c Onchocerca volvulus, 1250, 1253f - ciclo vital, 1253f Oncocerciasis, 1250, 1253f ONPG, Véase o-Nitrofenil-?-D-galactopiranosida (O N P G ) Ooquistes de Cryptosporidium, muestras fecales, técnica de flotación de Sheather para recu­ peración, 1217r Oospora(s), 1109f, 1109r Optoquina, sensibilidad, identificación de estrep­ tococos, 684, Protocolo 13, Lámina en color 13 Orgánulos, locomotores, 185 Omithodoros, especies - distribución geográfica, 1369 - identificación, 1369 Ornitina, descarboxilación, identificación de enterobacterias, 218, Protocolo 6, Lámina en color 6 Orthomyxoviridae, especies, descritas, 1278c Ortomixovirus, manifestaciones clínicas, 1277, 1284 Ortopoxvirus, manifestaciones clínicas, 1304 Osteomielitis - diagnóstico, 89 - S. aureus y, 603r - S. epidermidis y, 607r - síntomas, 89 Otitis media, 72 - especies de Haemophilus y, 41 Ir, 417 Oxalobacterias, 318, 319c Oxígeno - crecimiento y metabolismo bacterianos, 189 - relaciones de las bacterias, 837

P p-Nitro-a-acetilamino-/}-hidroxipropiofenona. 1434 í>-Nitro-acetilamino-hidroxipropiofenona (N A P), diagnóstico de tuberculosis, 1020 Paecilomyces, especies, cadenas de conidios pro­ ducidos, 1131, 1132f Paludismo, 1239, 1242f, 1242r - descrito, 1239 - identificación de laboratorio, 1241, 1244 Pamoato de pirantelo, infecciones parasitarias, 1265c Pandoraea, especies, 293c, 312c, 315 Panel Combo MicroScan Rapid POS, identifica­ ción de estafilococos coagulasa-negativos, 625 Panel MicroScan POS ID, identificación de esta­ filococos coagulasa-negativos, 625 Paneles de identificación MicroScan, identifica­ ción de estreptococos, enterococos y bacte­ rias “ similares a Streptococcus” selecciona­ das, 710 Pantoea, especies, 254 - características de identificación, 226c - reacciones bioquímicas, 232c Papovaviridae, especies, descritas, 1286c

Papovavirus, manifestaciones clínicas, 1305, 1306c, 1306f, 1307c Paracoccidioides, especies, P. immitis, 1152, 1155f, 1156f. 1157r Paracoccidioidomicosis, 1152, 1153r, 1157f, 1157r Paracoccus yeei, 336, 336c Paragonimus westermani, 1238, 1240f, 1241r Parálisis por garrapatas, 1365 Paramyxoviridae, especies, 1278c Parasitismo, 4 Parasitología, 1191 Parásitos, 4 - cestodos, 1228 - descripción, 3 - diferenciación, 1202, 1204f, Protocolo 2, Lámina en color 22 - humanos, ciclos vitales. 1203, 1204f - identificación, 1202, 1204f - imaginarios, 1192 - intestinales - - muestras de materia fecal, incidencia, 1192, 1193r - - recuperación, técnicas de concentración de heces, 1465 - nematodos, 1220 - - filarías, 1248, 125 Ir, 1252f - - identificación preliminar, 39 - prevalencia, 1192, 1193r - protozoos, 1191. 1203, 1205 - - intestinales, 1205, Véase también Protozoos intestinales - reseña, 1192 - sanguíneos, 1195, 1238 - tipos, 1192 - tisulares, 1238 - tremátodos, 1234 Pared celular - de actinomicetos aerobios, 818, 819c - agentes antibióticos que no ejercen efecto, 918 - bacteriana, formación, antibióticos que inter­ fieren, 910, 912, 914f, 916c, 917c, 918r - de bacterias “ ácido-alcohol resistentes” , 182, 183f - de bacterias gramnegativas, 179, 180f, 18 l f - de bacterias grampositivas, 178, 180f - - componentes, 91 Of - de endosporas bacterianas, 183 - estructura, 176, 178f, 183f - formación, antibióticos que interfieren, 910, 912, 914f, 916c, 917c, 918r - transporte de agentes antibióticos, 906, 909f Parotiditis - infecciones virales y, 1312c - infecciosa, 1284 Parotiditis infecciosa, 1284 Parvoviridae, especies, descritas, 1286c Parvovirus - B19, detección molecular, 1339 - detección molecular, 1338 - diagnóstico serológico, 1344 - manifestaciones clínicas, 1305 Pasteureláceas, diferenciación de miembros, características, 410c Pasteurella, especies, 434 - características, 410c - características del cultivo, 44Ir - descritas, 434, 437r, 438c - identificación, 441r - - características bioquímicas, 438c - P. aerogenes, 436r, 437, 438c - P. bettyae, 436r, 438c. 443 - - características del cultivo, 441r - - identificación, 441r - - características bioquímicas, 438c - - importancia clínica, 436, 437, 441r

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infecciones debidas a, espectro clínico, 434, 44Ir - P. caballi, 436r, 438c, 444 - P. canis, 437r, 438c, 443 - P. dagmatis, 437, 437r, 438c - P. gallinarum, 437r, 438c, 444 - P. multocida, 153, 153f - P. pneumotropica, 436r, 437, 438c - P. stomatis, 437r, 438c, 443 - reconocidas actualmente, 437r - sensibilidad a los antibióticos, 437 - taxonomía, 434 Patogenicidad - definida, 195 - virulencia bacteriana y, 197 Patógeno(s), 4 - definidos, 195 - potencial, 4 - potenciales, 4 PCR, Véase Reacción en cadena de la polimerasa (P C R ) - de amplio espectro, 141 - anidada, 143 - múltiple, 142 - PCR-RFLP, 152 Pediculus, especies - P. capitis, 1375 - P. humanus, 1375 Pediococcus, especies, 673 - identificación, 701, 703f Pedobacter. especies, 332, 333c Peligros no biológicos, precauciones de seguri­ dad, 56 Peliosis, B. henselae y, 477 Penicilina - descubrimiento, 903, 903f - S. pneumoniae resistente, 963. 964f - S. pyogenes resistente, 968 Penicillium, especies, cadenas de conidios produ­ cidas, 1129, 113 lf, 1132f Peptidasa C5a, 650 - factor de virulencia del estreptococo, 645 Peptidoglucano, 178. 910, 912, 914f - S. aureus, 600r Pericarditis, S. aureus y, 603r Periodontitis juvenil localizada, 430 Permeasas, 177 Peste, 258, 259f, 259r - bubónica, 260r, 264c - clasificación, fenotípica, 304r - definida, 258 - diagnóstico, 259f, 259r - - de laboratorio, 259 - epidemiología, 258. 258f, 258r - especies de Yersinia y, 258, 259f, 260r, 261r - hallazgos clínicos, 265c - informe, 26Ir - neumónica, 260r - número de casos, 259f - pandemia, 260r - prevención, 26 Ir - pruebas de laboratorio, 261r - reseña, 260r - septicémica, 260r - tipos, 260r - Y. enterocolitica, infecciones causadas por. 260 - Y. frederiksenii, 262 PH - evaluación de la actividad inhibidora de los agentes antibióticos, 930 - tratamiento antibiótico, 922 Phaeoannellomyces wemeckii, 1177, 1177f Phialophora, especies - P. richardsiae, 1162, 1164f - P. verrucosa, 1162 Phoma, especies, 1160, 1161f Photobacterium, especies, 397

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ÍNDICE ANALÍTICO

Photorhabdus, especies, 269 - más nuevas, 265c - reacciones bioquímicas, 232c Phthirus pubis, 1376 Picnidios, 1160 Picornaviridae, especies, descritas, 1281c Picornavirus, manifestaciones clínicas, 1288 Pigmentación, identificación de micobacterias, 1037, Protocolo 19, Lámina en color 19 Pili - bacterianos, 184 - Moraxella catarrhalis, 558r - N. gonorrhoeae, 547r - N. meningitidis. 545r Pilina. 185 Piojos, 1375f Piomiositis, S. aureus y, 604r Pirazinamidasa, 1445 - identificación de micobacterias, 1037, Protocolo 19, Lámina en color 19 Pirosecuenciación, 145; 146f Piruvato, utilización, efectos bacterianos, 193, 195f, 196f Piuría, pruebas de cribado, 84 Placa de agar, 30f, 33, 33f, 34f Placa de agar sangre-agar de MacConkey, 31f Placa UNI-N/F Tek, identificación de no f ermentadores, 350 Placas Presumpto, diferenciación de bacterias anaerobias, 860, 861c, 862r Placas de sensibilidad a antibióticos, diferenciación de bacterias anaerobias, 862 Plagia fontium. 265c Plásmido, 176 - de conjugación, 176 - F, 187 - N. gonorrhoeae, 547r - N. meningitidis, 545r Plasmodium, especies - P. falciparum, 1241, 1243 - P. malariae - - ciclo vital, 1242f - - identificación, 1241 - P. vivax, 1241 Plesiomonas, especies, 395c, 399, 400c - aislamiento de laboratorio e identificación, 399, 400c - P. shigelloides, 395c, 399, 400c Pleurodinia, infecciones virales y, 1311c Pneumocystis, especies, P. carinii, 1257 Pneumovirinae, especies, 1284 Polibetahidroxibutirato, 176 Polimixina B, sensibilidad, identificación de estafilococos coagulasa-negativos, 620 Polinucleótido(s), 173, 175f - estructura molecular, 175f Poliomavirus. manifestaciones clínicas, 1306 Poliovirus 1, 1281c, 1281f Polirribosoma(s), definido, 174 Polisacárido(s), capsulares - N. meningitidis, 545r - S. aureus, 600r Polisoma(s), 174 Porphyromonas, especies - identificación, características, 878c, 878r - productos metabólicos, 877c Potencial de oxidorreducción (Eh), medio de cultivo, 838 Poxiviridae, especies, 1287c Poxvirus, manifestaciones clínicas, 1305 Pragia fontium - reacciones bioquímicas, 232c Praziquantel, infecciones parasitarias, 1265c Preparación con cinta adhesiva transparente, 1114f Preparación con solución fisiológica, examen microscópico de muestras. 18c

Preparado de cinta adhesiva de celulosa, examen de oxiuros, 1473 Preparado con yodo, examen microscópico de muestras, 18c Preparado con tinta china, examen microscópico de muestras, 18c Preservativos de heces, de uso frecuente, fórmu­ las, 1475 Prevalencia, 1241 Prevotella, especies - características, 876c - identificación, características, 878c - P. oralis, 879 - productos metabólicos, 877c - tipos, 879 Primaquina, infecciones parasitarias, 1265c Prión(es), 4 - enfermedades y manifestaciones clínicas, 1309, 1309c Procedimiento de digestión-descontaminación, 1023, 1025c, 1025r, Protocolo 19 - agentes utilizados, 1023, 1025c Procedimiento de gota gruesa, examen microscó­ pico de muestras, 18c Procedimiento de Western blot, para anticuerpos anti-HI V -1, 118, 119f Producción de acetoína, identificación de estafi­ lococos coagulasa-negativos, 623 Producción de pigmento, identificación de estrep­ tococos, 682 Productos bacterianos, pruebas, 84 Productos MicroScan, evaluación de la actividad inhibidora de los agentes antibióticos, 945 Programa de control de calidad, componentes, 60 Propionibacterium, especies - identificación, 882 - R propionicum, identificación, 885 Proteasa - características de identificación, 226c - Ig A l, 657 - N. gonorrhoeae, 544r - N. meningitidis, 546r - - Proteeae (tribu), 224c, 255, 256c Proteína(s) - A, S. aureus, 600r - CD, Moraxella catarrhalis, 558r - CopB, Moraxella catarrhalis, 559r - E, Moraxella catarrhalis, 557r - H.8, N. gonorrhoeae, 544r - LpbA, Moraxella catarrhalis, 558r - LpbB, Moraxella catarrhalis, 558r - M, factor de virulencia estreptocócico, 645 - de la membrana externa, 182 - - asociadas con lípidos, 1003 - - Moraxella catarrhalis, 558r - - N. gonorrhoeae, 543r - N. meningitidis, 546r - Opa - - N. gonorrhoeae, 544r - - N. meningitidis, 546r - Opc, N. meningitidis, 546r - periféricas, 182 - PorA, N. meningiditis, 546r - PorB, N. meningitidis, 546r - porinas, 182 - - transporte de agentes antibióticos a través de la membrana celular, 906, 91 lf, 912f - Rmp, N. gonorrhoeae, 544r - superficie extracelular, factor de virulencia en especies de Enterococcus, 661, 669 - TbpA, Moraxella catarrhalis, 558r - TbpB, Moraxella catarrhalis, 558r - transmembrana, 182 - de unión a peniciilna, 178 - - de la superficie celular, 650 - de unión a vancomicina, 911, 912, 912c

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de unión al hierro/adquisición, N. meningitidis, 546r - UspA, Moraxella catarrhalis, 558r Proteobacterias, 166r Proteus, especies, 255, 256c - características de identificación, 226c - P. mirabilis, 255, 256c - P. penneri, 255, 256c - P. vulgaris, 255, 256c - reacciones bioquímicas, 232c Protocolos, 1382 Protozoos, intestinales, 1205 ' - amebas,B, 1205, 1206r, 1207f - Balantidium coli, 1214, 1215f - Blastocystis hominis, 1209 - C. parvum, 1214, 1216f, 1217f, 1217r - C'hilomastix mesnili, 1213 - ciliados, 1214, 1215f - coccidios, 1214, 1216f, 1217f, 1217r - Cyclospora cayetanensis, 1217 - Dientamoeba fragilis, 1213 - E. histolytica, B, 1205, 1205f, 1205r - Endolimas nana, 1209 - especies de Microsporidium, 1219, 1220r - especies de Sarcocystis, 1218 - flagelados, 1210, 1211f, 1212r, 1215f - G. lamblia, 1210, 1212f, 1212r - Iodamoeba biitschlii, 1209 - Isospora belli, 1218 - Tricomonas hominis, 1214 Providencia, especies, 257, 258r - características de identificación, 226c - reacciones bioquímicas, 232c Prueba(s) - de la (3-galactosidasa, identificación de enterobacterias, 208, Protocolo 6, Lámina en co lor 6 - de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-ABS), 1084, 1461, Protocolo 20 - de aerotolerancia, 858, 858f - AFD, Véase Prueba de anticuerpos fluores­ centes directos (DFA) - de aglutinación de látex, identificación de S. Aureus, 615 - de amplificación, identificación de N. gonorrheae, 569 - de Bauer-Kirby, 922 - de identificación de estreptococos, 684, Protocolo 13, Lámina en color 13 - de CAMP, 1408, 1408f - - para diferenciación de bacterias anaero­ bias, 863 - - para identificación de estreptococos. 682 - del caprilato de 4-metilumbeliferilo (M U C A P), recuperación y caracteriza­ ción de especies de Salmonella, 248, 249 - de captura de híbridos digenes, identificación de N. gonorrhoeae, 569 - de la catalasa, 38, Protocolo 1 - - de aislamiento y diferenciación preliminar de especies de Staphylococcus, 612 - - de identificación de estreptococos, 679 - de la citocromo oxidasa, 1387, 1387f, Protocolo 1 - de la citocromooxidasa, 38, Protocolo 1 - CLO, identificación de H. pylori, 386 - de cloruro manganoso-urea, identificación de U. urealyticum, 1424 - de coaglutinación, identificación de especies de Neisseria, 568 - de coagulasa en portaobjetos, 38, 1384, Protocolo 1 - - identificación de 5. aureus, 612, Protocolo 1, Lámina en color 2 - de coagulasa en tubo, identificación de S. aureus, 614

ÍNDICE ANALÍTICO

de confirmación de cultivo de Neisseria gonorrhoeae AccuProbe, identificación de N. gonorrhoeae, 569 cromógenas de enzima -sustrato, identifica­ ción de especies de Neisseria, 566. 567c de la desoxirribonucleasa (S), identificación de S. aureus, 616 directa de indol en punto. 38, Protocolo 1 del disco de penicilina, identificación de N. gonorrhoeae, 565 de la DNAsa, Véase Prueba de desoxirribonu­ cleasa (DNAsa) de endonucleasa termoestable, identificación de 5. aureus, 616 del epsilómetro (Etest), evaluación de la acti­ vidad inhibidora de los agentes antibióti­ cos, 946, 957f, 958r, Protocolo 17 FAM A, Véase Prueba de inmunofluorescencia contra antígenos de membrana de fijación del complemento (FC), 114, 115f, 1388, Diagrama 3 de la furazolidona con disco, 1411 Gen-Probe, 997 Gonochek II. identificación de especies de Neisseria, 566 GonoGen II, identificación de especies de Neisseria, 568 de gradiente de difusión, sensibilidad bacteria­ na, 1422 de hemadsorción (H A D ), 1474 de detección e identificación provisional de infecciones virales, 1324, 1325, 1333f, Protocolo 23 - de identificación de M. pneumoniae, 1424 de hibridación de ácidos nucleicos, identifica­ ción de N. gonorrhoeae, 569 por métodos moleculares, 1058 - con sondas de ácidos nucleicos, 133 de la hidrólisis de esculina, 1406, 1407f de hinchazón capsular (Quellung). 184 de inhibición de la hemaglutinación (IH A ), 114, 116f, 1390, Protocolo 3 de inmunofluorescencia indirecta (IF I) en suero, examen de especies de Legionella, 532 de inmunofluorescencia anticomplemento (IFAC), 125, 125f de inmunofluorescencia contra antígeno de membrana, 126 de anticuerpos inmunofluorescencia directa (IFD ) - detección de especies de Bordetella, 495 - identificación de N. gonorrhoeae, 567 de la leucinaaminotransferasa (L A P ), identifi­ cación de estreptococos, 684 de motilidad - de identificación de no fermentadores. 298, 299f - medio, 219, 219r MUCAP, recuperación y caracterización de especies de Salmonella, 248, 249 M UG, 38 para Mycobacterium Tuberculosis de Roche Amplicor, identificación de micobacte­ rias, 1060 de Nagler, diferenciación de bacterias anaero­ bias, 863 NAP, 1434 de la novobiocina, 1411 ODC. Véase Prueba de la ornitina descarboxilasa (O D C ) oxidofermentadora, 854f, 855 de la pirrolidonil arilamidasa (P Y R ), 38, 1388, Protocolo 1 - identificación de estafilococos coagulasanegativos, 620

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identificación de estreptococos, 684, Protocolo 1, Lámina en color 13 de precipitinas capilares, identificación de estreptococos, 685 de producción de indol, 1385, 1386f - de identificación de no fermentadores, 300, Protocolo 1, Lámina en color 1 de producción de pigmento, identificación de no fermentadores, 298 de bilis-esculina, 1413 rápida de utilización de hidratos de carbono, identificación de especies de Neisseria, 566, 1410 de reaginas plasmáticas rápidas (RPR), 1457 - para sífilis, 1082, 1083f, Protocolo 20 de reducción de nitratos, identificación de no fermentadores, 299, Protocolo 6 de reducción de tetrazolio, identificación pre­ suntiva de M. pneumoniae, 1428, Protocolo 6 de RIM-Neisseria, identificación de especies de Neisseria, 566 del rojo de metilo, 1393, 1393f - de identificación de enterobacterias, 217, Protocolo 6, Lámina en color 6 RPR, Véase Prueba de reaginas plasmáticas rápidas (R PR ) de sensibilidad a antibióticos, 90, Veáse tam­ bién Agentes antibióticos - para bacterias anaerobias, 896 - para p-lactamasas, 949, 952 directas, 969 - formatos de resúmenes, recomendaciones, 937 - para infecciones por micoplasmas, 1004 problemas especiales. 945, 949 - reseña histórica, 902, 902f, 905c de sensibilidad a antimicóticos, 1178, 1178f de sensibilidad a antivirales, en diagnóstico serológico de infecciones virales, 1345 de sensibilidad a la bacitracina, 1412 de sensibilidad a la colistina, identificación de N. cinerea, 575 de sensibilidad por difusión con discos para bacterias sin requerimientos nutricionales especiales, 1420 - examen de la actividad inhibitoria de los agentes antibióticos, 937, 938, 945f, 945r, 946f, 947c control de calidad. 942, 947c difusión con disco estandarizada, 940c, 945r interpretación de resultados, 939, 942, 946f - limitaciones, 942 de sensibilidad por dilución en agar, evalua­ ción de la actividad inhibidora de los agentes antibióticos, 937, 944f de sensibilidad directas, 969 de sensibilidad a fármacos, M. tuberculosis, instrumentación radiométrica, 1451 de sensibilidad por microdilución en caldo para bacterias con requerimientos nutricionales especiales, rendimiento, 1421 evaluación de la actividad inhibidora de los agentes antibióticos, 942, 944, 949f, 950c, 952f, 953c de sensibilidad a la optoquina, 1414 de sensibilidad a SXT, 1412 serológicas, diagnóstico de infecciones vira­ les, 1332f, 1340, 1341f, 1348, Véase también Infecciones virales, diagnóstico serológico de solubilidad en bilis, 38, 1383. Protocolo 1 para identificación de estreptococos, 684, Protocolo 1 de la sonda de DNA, identificación de N. gonorrhoeae, 569

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de superoxol, identificación de N. gonorrhoe­ ae, 565 - de tolerancia a la sal, 1414 - - para identificación de estreptococos, 684, Protocolo 3, Lámina en color 13 - TPI, Véase Treponema, especies, prueba de inmovilización de T. pallidum (T P I) - tubo germinal, 1167r - de utilización de citrato, identificación de enterobacterias, 217, Protocolo 6, Lámina en color 6 - de utilización de glucosa, identificación de no fermentadores, 297, 298f, Protocolo 7, Lámina en color 1 - de utilización de hidratos de carbono, identifi­ cación de especies de Neisseria, 565 - VDRL, Véase Prueba Venereal Disease Research Laboratory ( VDRL) - de Voges-Proskauer. 194, 1394, 1395f - - de identificación de enterobacterias, 217, Protocolo 6, Lámina en color 6 “ Prurito del nadador” , 1236r Pseudomonadaceae, 301, 301r, 302r, 303c, 305c, 305r, Veáse también Pseudomonas, especies - características - - características. 303c Pseudomonadales, fluorescente. 301. 305c, 305r Pseudomonas, 301 - alcalinas, 307c - características, 303c - curvas, 320c - especies, 293c - fluorescentes, 301, 305c, 305r - grupo alcalígenes, 304, 307c - grupo fluorescente, 294r, 301, 305r - grupo Stutzeri, 306, 306c - halofílicas-positivas, 321c - P. aeruginosa, 301,305r - - características, 305c - - factores de virulencia, 301, 305r - - identificación, 339, Protocolo 6, Lámina en co lor 6 - requerimientos mínimos, 301, 305r - P. fluorescens, 304, 305c - P. luteola, 306 - P. oryzihabitans, 306, 319c - P. putida, 304, 305c - pigmentadas de amarillo, características, 306, 309r - rR N A grupo 1, 301, 301r, 303c, 304r. 305c, 305r - - grupo de pigmento amarillo, 306, 319c - - grupo stutzeri, 304. 304c - sulfuro de hidrógeno-positivas, 321c PspA, g A l, 657 Psychrobacter, especies, 334, 336c - P. immobilis, 336, 336c - P. phenylpyruvicus, 294c, 334, 335c Pulga(s), 1375 Punción y biopsia pulmonar, diagnóstico de infecciones del aparato respiratorio inferior, 76 Punción lumbar, técnica, 92, 93f Punción suprapúbica, 83, 83f Púrpura fulminante, N. meningiditis y, 553 Pus, aspirado, muestras de hisopado, 11. 1l f Q Queratitis - y conjuntivitis por infecciones virales y, 1312c - presentación clínica, 95 Quimiolitótrofo(s), 291 Quimioorganótrofo(s), 291 R Radioinmunmunoanálisis (R IA ), 118

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ÍNDICE ANALÍTICO

Rahnella, especies - más nuevas, 265c - - características diferenciadoras, 268c, 269 - R. aquatilis, reacciones bioquímicas, 232c Ralstonia, especies, 294c, 311, 313r, 314c Raoultella, especies, reacciones bioquímicas. 230c RAPD RapID CB plus, 750 Rapid ID 32 Strep. identificación de estreptoco­ cos, enterococos y “ bacterias similares a Streptococcus” seleccionadas, 709 Rapidec Staph, identificación de estafilococos coagulasa-negativos, 624 Raspados coméanos, detección de parásitos, 1201 Raspados cutáneos, examen directo, diagnóstico de enfermedades infecciosas, 23c Reacción(es) - antígeno-anticuerpo. serología diagnóstica - - fijación del complemento, 114, 115f, Protocolo 3 - - prueba IHA, 114, 116f, Protocolo 3 - - reacciones de precipitina, 112, 114 - - tipos, 112, 114, 115f, 116f - en cadena de la ligasa, 140 - en cadena de la polimerasa (PCR) - - de amplio espectro, 141 - - anidada, 143 - - aplicaciones clínicas, 139 - - definición, 137 - - métodos, 137 - - modificaciones, 141 - - múltiple, 142 - - principios básicos, 137, 138f, 139f - - transcriptasa reversa, 140 - de citocromooxidasa, positiva, identificación de no fermentadores, 297, Protocolo 1, Lámina en co lor 7 - cromogénica, 248, 248f - de hinchazón capsular de Neufeld, examen microscópico de muestras, 19c - de precipitinas, 112, 114 - a la tinción de Gram, 182 Reactivos, monitorización, control de calidad, 61, 62c Recolección de muestras Recolección de muestras, 9f, 10. 12c - abscesos, 92 - aparato gastrointestinal superior, 80 - cantidades necesarias, 11 - de catéteres, 83 - celulitis, 94 - diagnóstico de infecciones del aparato respira­ torio inferior, 75 - diagnóstico de infecciones virales, 1312, 1313, 1314c, 1315 - diagnóstico de tuberculosis, 1022 - dispositivos, 11, 11f, 12c - especies de Coxiella, 1351 - especies de Rickettsia, 1350 - frotis, 13 - genitales, 88, 89f - infecciones de heridas, 94 - infecciones oculares, 95 - infecciones relacionadas con C. trachomatis, 1347 - infecciones del SNC, 91, 93f - de materia fecal, recolección, 79 - oportunidad, 10, lOf, 13 - de orina. 82f, 83r - relaciones costo-eficacia, 15, 16c - rotulación, 13 - sitios, 10 Recombinación genética, bacterias, 186, 187f Reducción de nitrato(s), 1392 - asimilatoria, 190 - disimilatoria, 190

-

identificación de enterobacterias, 209, Protocolo 6, Lámina en color 6 - por micobacterias, 1444, 1444f Registradores de códigos numéricos, lectura, 274 Reglamentación estatal, laboratorio de microbio­ logía, 45, 45r, 46c Reoviridae, especies, descritas, 1282c Rep-PCR. 154, 154f Replicación, definida. 174, 177f Requerimientos de factor V. 1409. 1409f Requerimientos de factor X, 1409, 1409f Reservorio de infección, 1362 Reservorio de infección, definido. 1362 Resistencia bacteriana - a agentes antibióticos, 904, Véase también Agentes antibióticos, resistencia bacte­ riana - expresión y transferencia, variables, 906c - a la meticilina en S. aureus, detección, 616 Respuesta inflamatoria, infecciones del SNC, evaluación, 92 Retroviridae, especies, descritas, 1283c Retrovirus, manifestaciones clínicas, 1294, 1295c, 1298c, 1299r, 1300c Rhabdoviridae, especies, descritas, 1279c Rhabdovirus, manifestaciones clínicas, 1289 Rhizobium, especies, 326c, 328 - R. radiobacter, 294c Rhizopus, especies, identificación, 1119, 1119f, 1120 Rhodococcus, especies, 822 - anatomía patológica, 822 - enfermedad clínica debida a, 822 - epidemiología, 822 - patogenia, 822 Rhodotorula, especies, 1174 R IA, Véase Radioinmunoanálisis (R IA ) Ribosoma(s), definido(s), 173 Rickettsia, especies - aislamiento en cultivos, 1351 - características clínicas, 1349 - detección directa de antígenos y ácido nuclei­ co en muestras clínicas, 1351 - epidemiología, 1349 - infección, 1349 - - diagnóstico serológico, 1351 - recolección de muestras, 1350 - tipos, 1349, 1350c Riesgo(s) biológico(s), niveles de bioseguridad. 52c Riesgos, manejo en el laboratorio de microbiolo­ gía, 47 Rizobiáceas, 326c, 328 Rizoide(s), 1119 R N A, Véase también Ácido ribonucleico (RNA) - mensajero (m R NA), 173 - ribosómico (rR N A), 173 - de transferencia (tR NA), 173 Roseomonas, especies, 294c, 322 Rotavirus - humanos, 1282, 1282c - - detección inmunológica, 1336 - manifestaciones clínicas, 1293, 1293c Rothia, especies, 595, 793, 794c - R. musilaginosa, 611 - - identificación, características fenotípicas, 629, 629c Rotulación, muestras, 13 S Saccharomyces, especies, 1174, 1176 Sacocystis, especies, 1218 SAF, fórmulas, 1475 Salmonella, especies - aislamiento y caracterización, nuevos méto­ dos, 245, 246c, 248f - características de diferenciación, 244c - características de identificación, 226c

-

multirresistentes, surgimiento, 244 reacciones bioquímicas, 234c S. arizone - infecciones debidas, 245, 245r reacciones bioquímicas, 234c - S. enterica - - infecciones debidas a, 245, 245r - - reacciones bioquímicas, 234c - S. typhi - - identificación, 245 - - reacciones bioquímicas, 234c - taxonomía, 243, 243r Salmonelleae (tribu), 221c, 241 - características de identificación, 226c - clasificación, 242, 242r, 244c - nomenclatura asociada, 241, 243r Samonelosis - fuentes, 242, 244, 245r - incidencia, 242, 243, 245r Sangre - examen directo, diagnóstico de enfermedades infecciosas, 23c - exposición a pinchazos de agujas, riesgos de contraer infecciones virales de transmi­ sión sanguínea, 52, 55c - exposiciones ocupacionales, manejo, 1296, 1299r Sanguijuelas medicinales, especies de Aeromonas, 398 Saprofito, 4 Sarcoptes scabiei, 1372 - distribución geográfica, 1369 - identificación, 1369 Scedosporium. especies. Lámina en color 2122G,1185,1185f, 1186f Scopulariopsis, especies, cadenas de conidios producido. 1131, 1132f Secreción vaginal, purulenta, examen directo, diagnóstico de enfermedades infecciosas, 23c Secreción uretral purulenta, examen directo, diagnóstico de enfermedad infecciosa. 22c Secreción vaginal purulenta, examen directo, diagnóstico de enfermedad infecciosa. 23c Secuenciación de D N A - análisis de micromatrices, 146 - análisis posamplificación, 145, 145f, 146f - descrita, 145 - del HIV. 145, 145f - identificación de micobacterias, 1062 - prosecuenciación, 145, 146f - síntesis, 145, 146f - tradicional, 145, 145f Secuencias de inserción, definida, 176, 188 Seguridad - eléctrica, 49 - del laboratorio (de microbiología), 47 - - agentes biológicos, 50, 51c, 52c, 53f - - agujas, 49 - - centrifugación, 48 - - eléctrica, 49 - - elementos de vidrio, 49 - - elevación, 49 - - envío de muestras y agentes etiológicos, 53, 56f, 57f - - fuego, 58 - - limpieza de derrames de materiales infec­ ciosos, 53, 55 - - manipulación de desechos y materiales peligrosos, 50 en la manipulación de micobacterias, 1020 - - manipulación de muestras y derrames, 50 - - peligros no biológicos, 56 - - precauciones con los corredores, 49 - - precauciones de rutina, 48 - - precauciones universales, 52, 55, 55c - - reglas y normas generales, 48, 49c - - sustancias químicas, 56

“.D ICE ANALÌTICO

Sensibilidad bacteriana, prueba del gradiente de difusión, 1422 Sensititre AutoReader, 280 Sepedonium, especies, condios producidos en forma aislada, 1135f, 1136 Sepsis - asociada con catéteres, 98 - - consideraciones especiales, 103 - neonatal, especies de Haemophilus y, 41 Ir, 419 - puerperal, estreptococos y, 646 Serratia, especies, 254, 254c - características de identificación, 226c - especies, diferenciación, 256c - reacciones bioquímicas, 234c - S. marcescens, 256, 256c - S. rubidaea, 255, 256c Seudomembrana diftérica, 766 Shewanella, especies, 291c, 320, 325c, 397 Shigella, especies - características de identificación, 226c - especies, diferenciación, 242c - infecciones por, 24 Ir - - fuentes, 240 - - incidencia, 240 - reacciones bioquímicas, 234c - subgrupos, 240, 242c Shock endotóxico - bacterias gramnegativas y; 205 - diagnóstico, ensayo de lisado de límulus, 205 Sideróforo(s), 199 Sífilis - cardiovascular, 1078 - congènita, 1079 - diagnóstico de laboratorio. 1081, 1081c, 1083f. Protocolo 20. Lámina en color 20 - epidemiología, 1079, 1079c - prueba FTA-ABS, 1084, Protocolo 20 - prueba RPR. 1082, 1082f, Protocolo 20.3 - prueba TPI, 1083 - prueba V D R L. 1082, 1082f, Protocolo 20.2 - pruebas no treponémicas, 1082, 1082f - pruebas provisionales y experimentales, 1084 - pruebas serológicas, 1082, 1082c, 1082f - pruebas treponémicas, 1083 - T. pallidum subespecie paltidum y, 1077, 1080c - “ benigna” tardía, 1079 Simbiosis, 4 Simonsiella, especies, 456 Sinanamorfo, 1178 Síndrome(s) - de Fitz-Hugh-Curtis, 87 - de gastroenteritis, causas, 78, 79c - gripal, 1277, 1284 - de Katayama, 1236r - de la piel escaldada estafilocócica, S. aureus y, 604r - respiratorio agudo grave (SRAG ), manifesta­ ciones clínicas, 1294 - del shock tóxico estafilocócico - - definición de caso, 605r - - S. aureus y, 604r - similar al shock tóxico, estreptococos del grupo A, 648 - urémico-hemolítico, 227 Síntesis de polisacáridos. identificación de N. gonorrhoeae, 575 Sinusitis, 72 - aguda, especies de Haemophilus y, 41 Ir, 417 Sistema(s) - aislante, 89 - anaerobio GasPak, 854, 854f - A P I 20NE, identificación de no fermentadores, 345, 355r - Autoscan-4, identificación de no fermentadores, 358 - BACTEC, 1001

BACTEC ABF, detección de micobacterias, 1036, Protocolo 9 BACTEC TB. identificación de micobacterias. 1058 BD ProbeTEc ET. identificación de N. gonorrhoeae, 570 Biolog, identificación de no fermentadores, 357 de codificación e identificación computarizados (CCIS), 278 de códigos numéricos, 273, 273c, 275c cálculo de probabilidad, 274, 275c - de códigos octales, lectura, 274 - frecuencia estimada de aparición, 274 - resolución de discrepancias, 274 comerciales, 274, 276, 277c - A P I 20E, 276, 277c, Lámina en color 6 - Enterotube II, 277 - de evaluación de actividad inhibidora de agentes antibióticos, 945 - Micro-ID, 278 - microplaca Biolog GN2, 278 - sistema de identificación BBL cristal E/NF, 276 - MicroScan, 278 - RapID onE, 277 Sensititre, 279 Crystal Enteric/Nonfermenter, identificación de no fermentadores. 356 de cultivo de micoplasmas, comerciales, 1000 de cultivo T RE K ESP, procesamiento de hemocultivo, 103 de detección de micobacterias MB/BAT. detección de micobacterias, 1034 de difusión simple, 112 de graduación de Bartlett, evaluación de espu­ to, 17, 17r de graduación de Murray y Washington, eva­ luación de esputo, 17, 17r para hemocultivo BacT/Alert, en procesamien­ to de hemocultivos, 102 para hemocultivo BACTEC 9240/9120, proce­ samiento de hemocultivos, 102 de hemocultivo por lisis-centrifugación, proce­ samiento de hemocultivos, 101 de hemocultivos Septi-Chek BBL, procesa­ miento de hemocultivos, 101 ID no fermentadores entéricos BBL Crystal, 276 de identificación A P I 20E, 276, 277c - para no fermentadores, 345, 355r de identificación para grampositivos BBL Crystal, identificación de estafilococos coagulasa-negativos, 625 de identificación para grampositivos Crystal, identificación de estreptococos, enterococos y bacterias “ similares a Streptococcus” seleccionadas, 709 de identificación de levaduras, empaquetados, 1178, 1179r de identificación de microbios, identificación de estafilococos coagulasa-negativos, 626 de lectura e incubación automatizado Sensititre (A R IS ), 280 LightCycler, 1061 M GIT, Véase Mycobacterium Growth Indicador Tube (M G IT ) System (Sistema del tubo indicador de crecimiento de micobacterias) M G IT 960, detección de micobacterias, 1034 Microbiano Wampole Isostat/siolator, procesa­ miento de hemocultivos, 101 de microbiología automatizado Phoenix, 280 para identificación de no fermentadores, 359 MicroScan, 278

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para identiñcacióe de rao i - n m i Y w 358 - Mycotrim GL\ 1000 - Mycotrim RS. 1000 - OmniLog ID, 280 - PACE 2, 569 - - identificación de N. gonorrhoeae. 569 - RapID N F Plus, identificación ¿e - : :e— re ­ tadores, 356, 357r - RapID onE, 276 - RapID SS/u, 270 - RapID STR, identificación de estreptococos. enterococos y bacterias similares a Streptococcus seleccionadas, 710 - Remel N/F. identificación de no fermentadores, 350, 356, 356r - de rotación-estría, 856 - Sensititre, 279 - Sensitre AP80, identificación de no fermenta­ dores, 359 - Septi-Chek AFB, detección de micobacterias, 1036 - de transporte de hisopos, 13, 13f - de transporte de hisopos no nutritivos, aisla­ miento de N. gonorrhoeae, 560 - de transporte de medios de cultivo, aislamien­ to de N. gonorrhoeae, 561 - del tubo indicador de crecimiento de micobac­ terias (M G IT), detección de micobacte­ rias, 1033 - Vitek 2, identificación de no fermentadores, 358 - Vitek Legacy, 271 - - Vitek, 279 Sonda(s), 59, 147 - DNA, identificación de micobacterias, 1449 - FRET, amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real, 147, 149, 149f, 150f - de hibridación - - amplificación de ácidos nucleicos en tiem­ po real, 147, 148f - - balizas moleculares, 150, 151f - - FRET, 147, 148, 149f, 150f - - de hidrólisis, 147, 148f - - TaqMan, 147 - hidrólisis, amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real, 147, 148f - Taqman. 147 - de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, amplificación de ácido nucleico en tiempo real, 148, 149f, 150 Southern blot, análisis posamplificación. 144 Sphingobacterium, especies, 291c, 332, 333c Sphingomonas, especies, 291c, 318 Spirillum minor, 1097 Spirometra mansonoides, 1261 Sporothrlx, especies, S. schenckii, 1152, 1154f. 1155f, 1156r SRAG, Véase Síndrome respiratorio agudo grave (SRAG) Staf-System 18-R, identificación de estafilococos coagulasa-negativos, 626 Staph-Zymm, identificación de estafilococos coagulasa-negativos, 626 Staphylococcus, especies, 593, Veáse también Estafilococos - aislamiento, 611, 613c, Protocolo 12, Lámina en co lor 12 - - morfología de las colonias, 611 - - muestras clínicas, 611 - - prueba de catalasa, 612 - ambiental, 599r - animales, 598r - |3-lactamasas, inducción, 949 - diferenciación de micrococos y estafilococos, hemaglutinación pasiva, 615 - diferenciación preliminar, 611, 613c

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ÌNDICE ANALÌTICO

Staphylococcus, especies ( Cont.) - identificación, características fenotípicas, 618r, 619c, 621c - importancia clínica, 594, 596r, 607r - métodos de evaluación, 954c - primates humanos y no humanos, 596r - resistencia a antibióticos, mecanismos, 908c - S. arlene, medioambiente, 599r - S. aureus - - estructura de peptidoglucano, 179f - - factores de virulencia, 595, 600r - ácidos teicoicos, 600r - enzimas, 60Ir - hemolisinas, 60Ir - peptidoglicanos, 600r - polisacáridos capsulares, 600r - proteína A. 600r superantígenos, 602r - - toxinas, 602r - - identificación, 612 - aglutinación del látex, 614 - fermentación de manitol, 616 - prueba de coagulasa en portaobjetos, 612, Protocolo 1, Lámina en co lor 2 - prueba de coagulasa en tubo, 614, Protocolo 1, Lámina en color 12 - prueba de DNasa, 616 - - prueba de endonucleasa termoestable, 616 - - impétigo debido, 646 - - importancia clínica, 595, 596r infecciones asociadas, 595, 603r - - resistencia a la meticilina, detección, 616 - 5. auricularis, primates humanos y no huma­ nos, 597r - 5. capitis, primates humanos y no humanos, 597r - S. caprae. primates humanos y no humanos, 597r - S. carnosus, medioambiente, 599r - S. chromogenes, animales, 598r - S. cohnii, primates humanos y no humanos, 597r - S. condimenti, medioambiente, 599r - S. delphini, animales, 595r - S. epidermidis, 606, 607r identificación, producción de fosfatasa, 618 - - infecciones asociadas, 606, 607r - S. equorum, animales, 598r - S. felis, animales, 595r - S. fleurettii, medioambiente. 599r - S. gallinarum, animales, 598r - S. haemolyticus, primates humanos y no humanos, 596r - S. hominis, primates humanos y no humanos, 596r - S. hyicus, animales, 598r - S. intermedius, animales, 598r - S. kloosii, medioambiente, 599r - S. lentus, animales, 598r - S. lugdunensis, primates humanos y no huma­ nos, 596r - 5. lutrae, animales, 598r - S. muscae, animales, 598r - S. pasteuri, primates humanos y no humanos, 597r - S. piscifermentans, medioambiente, 599r - 5. saccharolyticus, primates humanos y no humanos, 597r - S. saprophyticus - - identificación, sensibilidad a novobiocina, 623 subespecie saprophyticus, 609 - 5. simulans, primates humanos y no humanos, 596r

-

S. succinis, medioambiente, 599r S. vitulinus, animales, 598r 5. wameri, primates humanos y no humanos, 596r - S. xylosus, primates humanos y no humanos, 597r - taxonomía, 593 - tratamiento antibiótico, resistencia - - P-lactámicos, 957, 961f, 962r, 963f - - estreptograminas, 960 - - lincosamidas, 960 - - macrólidos, 960 - - vancomicina, 9 59,964r Stemphylium, especies, 1158, 1159f Stenotrophomonas, especies, 317, 317c - S. maltophilia, 317, 317c - - identificación, 340 Stomatococcus mucilaginosus, 595 Streptobacillus monilifoimis, 456, 459c - características del cultivo, 458, 458c - identificación, 456, 459c - importancia clínica, 457 - sensibilidad a los antibióticos, 459 - taxonomía, 456 Streptococcus, especies, 639, Veáse también Estreptococos - aislamiento, 675, Protocolo 13, Lámina en co lor 13, Lámina en color 13 - bacterias “ similares al Streptococcus", 644f - bacterias “ similares a Streptococcus", 639, 671 - P-hemolítico, grupo B, enfermedad de inicio temprano debida, 651 - caracterización preliminar, 680, 681c - clasificación, 64Ir - descritas, 640 - especies de Abiotrophia, 671 - especies de Aerococcus, 671 - especies de Alloiococcus, 674 - especies de Dolosicoccus, 675 - especies de Dolosigranulum, 675 - especies de Eremococcus, 675 - especies de Facklamia, 675 - especies de Gemella, 673 - especies de Globicatella, 675 - especies de Granulicatella, 671 - especies de Helcoccus, 672 - especies de Ignavigranum, 675 - especies de Lactococcus, 675 - especies de Leuconostoc, 672 - especies de Pediococcus, 673 - especies de Tetragenococcus, 673 - especies de Vagococcus, 614 - grupo S. anginosus, identificación. 688, 691, 692c, 694c - grupo S. mitis, identificación, 686, 689c - grupo S. mutans, identificación, 686, 689c - grupo S. salivaris, identificación, 686, 689c - grupo S. sanguis, identificación. 686, 689c - grupo(s), sobre base de análisis de secuencia de rR N A de subunidades pequeñas, 642r - identificación, 676, Protocolo 13, Lámina en co lor 13, Lámina en color 13 - - sistemas comerciales, 706 - métodos de evaluación, 956c - 5. agalactiae - - enfermedad de inicio tardío debida, 651 - - enfermedad de inicio temprano debida a, 651 - - evaluación, recolección y procesamiento de muestras clínicas, 653r - - factores de virulencia, 649 - - importancia clínica, 650, 653r - - meningitis debida a, 91 - - tratamiento antibiótico, resistencia, 968 - S. anginosus, 662 - 5. constellatus, 662 - S. intermedius, 661 - S. pneumoniae, 656

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factores de virulencia, 656 identificación, serológica, 685 importancia clínica, 658 meningitis debida a, 91 métodos de evaluación, 955c resistencia a los antibióticos, mecanismos, 908c - - tratamiento antibiótico, resistencia, 963,965f - - vacunas antineumocócicas, 657 - S. pyogenes, 641, 643f - - factores de virulencia, 641, 644f - - importancia clínica, 646 - - proteína M, 645 - - tratamiento antibiótico, resistencia, 968 - S. suis, 665 - - identificación, 693,695c Streptomyces, especies, 823 Strongyloides stercolaris, 1225f, 1226, 1228r - ciclo vital, 1227f Suero - evaluación de la actividad inhibidora de los agentes antibióticos, 930 - VD R L, prueba en portaobjetos, 1454 Sulfuro de hidrógeno, producción, identificación de enterobacterias, 219c, 220r Superantígeno(s) - bacteriano, 200 - factor de virulencia del estreptococo, 645 - S. aureus, 60Ir Superóxido dismutasa, 198 Suramina, infecciones parasitarias, 1265c Sustancia(s) química(s) - potencial para el terrorismo, 58, 59c - precauciones de seguridad, 57 Sustancias de agregación, 188 - factor de virulencia en especies de Enterococcus, 667 Suttonella, especies, 449 - identificación. 448c, 450 - - características bioquímicas, 448c - importancia clínica, 449 - S. wadworthensis, 384 - sensibilidad a los antibióticos, 451 - taxonomía, 449 Svedberg, unidad, 174 Syncephalastrum, especies, identificación, 1119, 1121f T T2H, Véase Hidrazida del ácido tiopeno-2-carboxílico (T2H ) Tabiques, 1107r Taenia, especies - T. saginata, 1229, 1230 - T. solium, 1229, 1229f, 1230r - - ciclo vital, 1229f Talosfera(s), 1107r Tambor giratorio, cultivos virales, 1323, 1323f Tarjeta de identificación para grampositivos Vitek - identificación de estafilococos coagulasanegativos, 625 - identificación de estreptococos, enterococos y bacterias “ similares a Streptococcus" seleccionadas, 710 Tatumella, especies - más nuevas, características diferenciadoras, 268c, 269 - T. pytseos, 265c - - reacciones bioquímicas, 236c Taxonomía - bacterias, 162, 162r, 166r - definida, 1273 - relacionada con infecciones virales, 1274, 1274r, 1276f, 1278c Técnica de cultivo endometrial, 90, 90f Técnica de la estría de Staphylococcus, diagnósti­ co de infección por especies de Haemophilus, 423

ÌNDICE ANALÌTICO Técnica de filtro de membrana de Steele y McDermott, 375, 377r Técnica de flotación de Sheather, para recupera­ ción de ooquistes de Cryptosporidium en muestras de materia fecal, 1217r Técnica del montaje húmedo, identificación de no fermentadores, 300, Protocolo 7 Técnica de tinción de tricomonas, extendidos de heces, 1468 Técnicas de AFD. Véase Técnicas de anticuerpos fluorescentes directos (A F D ) Técnicas de concentración de heces, recuperación de parásitos intestinales, 1465 Tecnología del inmunoensayo enzimático, análi­ sis posamplificación, 143, 144f Tegenaria agrestis, 1373 Tejido(s), para cultivo, manipulación, 104 Teleomorfo, 1108r - definido, 1105 Temperatura, evaluación de actividad inhibidora de agentes antibióticos, 931 Teniasis, 1230r Termonospora(s), 822, 823c Terrorismo, agentes biológicos y químicos con potencial, 58, 59c Tétanos, 896 - causas, 199 Tetragenococcus, especies, identificación, 700. 703c Tiabendazol, infecciones parasitarias, 1265c Tichuris trichiura, 1222, 1223f Timetoprim-sulfametoxazol, especies de Haemophilus resistentes, 963 Tiña - de la barba, 1144r - de la cabeza, 1144r - crural, 1144r - del cuerpo, 1144r - de los pies, 1144r - ungular, 1144r Tinción(es) - del ácido peryódico de Schiff, examen micros­ cópico de muestras. 26 - ácido-alcohol resistente, 24 - - antígenos asociados con virulencia, 558r - - factores de virulencia, 558r - - interpretación de los cultivos, 33, 33f, 34f. 35c, 35r, 37f - - naranja de acridina, 24, 26r - - relaciones costo-eficaces, 39, 40c - - con blanco de calcoflúor, 26 - - de Gram, 21, 22c, 22r - - directas, 19 - - fluorescentes, 25 - - con fluorocromo, 25 - - directas, 20c - - de Ziehl-Nielsen, 20c - azul de metileno, 26 - - de Loeffler, 1415 - azul de toluidina, 26 - biológicas, 19, 20c - blanco de calcoflúor, 26 - carbol fucsina, 1431 - de Diene, detección de micoplasmas, 1423 - directas, 19, 20c - examen microscópico de muestras, 17, 20c. Lámina en color 1 - para flagelos, 1403 - flagelos, identificación de no fermentadores, 300, 300r, Protocolo 7.2 - fluorescentes, 25, 1432 - con fluorocromo, 20c - - examen microscópico de muestras, 20c - - micobacterias, 25, Lámina en color 1 - de Gram - - aislamiento de especies de Bartonella, 481 diagnóstico de infección por especies de Haemophilus, 422

examen de cultivo, 36, 37f examen microscópico de muestras Lámina en color 1-1, Lámina en color 1-3, Lámina en color 1-4, 16c, 17, 20c, 21, 24c, 24r - interpretación, errores, 24, 24c - técnica, 2 1 ,24r - impregnación argéntica, 26 - de impregnación argéntica, examen microscó­ pico de muestras, 26 - naranja de acridina, 24, 25r - Papanicolaou, 1305, 1306f - periódico de Schiff, 26 - de Weber, detección de esporas de microsporidias en heces y aspirados duodenales, 1219, 1220r - de Weber, detección de esporas de microspori­ dios en heces y aspirados duodenales, 1219, 1220r - de Wright-Giemsa, 21c, 26 Tipificación microbiana, 151, 153f, 154f - aplicaciones clínicas, 154 - basada sobre amplificación, 153, 154f - identificación de micobacterias, 1062 - no basada sobre amplificaciones, 152, 153f - PCR-RFLP, 152 - Rep-PCR, 154, 154f Tironsina, hidrólisis, 1418 Togaviridae, especies, descritas, 1282c Togavirus, manifestaciones clínicas, 1291 Tolerancia al cloruro de sodio, micobacterias, 1446 Tolerancia al oxígeno, de anaerobios, 838 Tos ferina, Veáse también Bordetella, especies - diagnóstico, pruebas serológicas, 498 - epidemiología, 489 - estadios, 489 - tratamiento, 498 - vacunas, 490 Toxina(s) - bipartita, 199 - bipartitas, 199 - citolítica, 199 - citolíticas, 199 - edema, 740 - letal, 740 - S. aureus, 601r - toxina-1 del síndrome del shock tóxico, 602r Toxocara canis, 1259 Toxoplasma, especies, T. gondii, 1253, 1255f - ciclo vital, 1255f Toxoplasmosis, 1256r - diagnóstico de laboratorio, 1254, 1257f, 1257r - síndromes clínicos, resultados serológicos, 1256r Trabajadores de laboratorio, brucelosis, 460 Trabulsiella, especies - más nuevas, características diferenciadoras. 268c, 269 - T. guamensis, 265c - - reacciones bioquímicas, 236c Traducción, 174, 175f - mensaje genético, 133, 133f Transcripción, 173, 175f - mensaje genético, 133, 133f - R N A polimerasa dependiente de DNA, 173 Transcriptasa inversa (RT)-PCR. 140 Transducción - definida, 187, 187f - especializada, 188 - generalizada, 188 - de señales, de dos componentes, 197 Transformación, definida, 186 Transporte de muestras, 10, 12, 12c, 14, 14r - precauciones de seguridad, 56, 57f - recipientes, 12, 12c, 14, 14f Transposón(es), definido, 176, 188 Traqueobronquitis, 73 -

-

1-25

Tratamiento antibiótico - cationes, 923 - farmacología clínica, 923 - guía, 922, 922c - guía de laboratorio, 919, 922, 922c, 922r, 923r - inoculo, 920f, 92l f - pH, 923 Trematodo(s), 1234 - Clonorchis sinensis, 1236, 1239f, 1239r - descritos, 1234 - esquistosomas, 1234, 1235f, 1236r - Fasciola hepatica, 1234, 1237f, 1240r - Fasciolopsis buski, 1234, 1238r - Paragonimus westermani, 1238, 1240f, 1241r Treponema, especies, 1077 - prueba de inmovilización de T. pallidum (TPI). para sífilsis, 1084 - T. carateum, 1077c, 1079c, 1081 - T. pallidum - - subespecie endemicum, 1077c, 1079c, 1080 - - subespecie pallidum, 1077, 1077c, 1079c - descritas, 1077 - inmunidad, 1080 - sífilis, 1077 - - subespecie pertenue, 1077c, 1080, 1080c Tribu(s), clasificación de enterobacterias, 220, 221c Trichinella spiralis, ciclo vital, 1257f Trichoderma , especies, grupos de conidios pro­ ducidos, 1133, 1134f Trichophyton, especies - identificación, 1139, 1140f - T. mentagrophytes, identificación, 1140, 1141f - T. rubrum, identificación, 1141 - T. tonsurans, identificación, 1141 - T. verrucosum, identificación, 1142, 1142f Trichuriasis, 1222, 1223f, 1224r Tricocèfalo, 1222, 1223f, 1224r Tricomonas hominis, 1214 Trimetoprim-sulfametoxazol, sensibilidad. 682, Protocolo 13, Lámina en co lor 13 Tripanosomiasis, 1244, 1248f, 1248r - africana, 1248r - americana. 1249f - sudamericana. 1247 Tripsina, EDTA y, diagnóstico de infecciones virales, 1320 Triquinosis, 1257, 1258f, 1259r tRNA. Véase RNA de transferencia (tRNA) Tropheryma whipplei, 824 - identificación, 829 Trypanosoma, especies - T. brucei gambiense, ciclo vital. 1247f - T. cruzi, ciclo vital, 1249f Tsukamurella, especies, 822 Tuberculosis - clínica, tendencias, 1017 - control, 1019 - diagnóstico de laboratorio, 1019 - - cromatografía gas-líquido, 1020 - - cromatografía líquida de alto rendimiento. 1020 - - espectrometría de masa, 1020 inoculación de muestras clínicas en medios de cultivo con base de agar, 1019 - - instrumentos automatizados, 1019 - - medios de cultivo en caldo, 1019 - - NAP. 1020 - - optimización de la detección e identifica­ ción de micobacterias, 1020 - - recolección de muestras, 1021 - hemocultivos, 1021 - muestras de heces, 1021 - muestras respiratorias, 1021 - muestras “ estériles” , 1022

1-26

ÍNDICE ANALÍTICO

Tuberculosis (Cont.) - - recuperación e identificación de micobac­ terias, 1023, 1024f, 1025c, 1026c, 1028c, 1029c, 1030c - - centrifugación, 1026, 1026c - muestras líquidas, 1026 - muestras de médula ósea, 1026 - preparación de muestras, 1023 - procedimiento de descontaminación, 1025c, 1025r, Protocolo 19 - tinción para bacilos ácido-alcohol resistentes, 1027, 1028c, 1029c, Protocolo 19, Lámina en color 19 - - seguridad del laboratorio, 1020 - - técnicas moleculares, 1019 - - tubo de hemocultivo por sistema de lisiscentrifugación, 1020 - incidencia, aumento mundial, 1017 - personas en riesgo, 1018 - prevención, 1068. 1068r - rápidamente progresiva, 1018 - tratamiento, 1066, 1067r - - recomendaciones de la American Thoracic Society, 1068, 1068r Tubo germinal - definido, 1165, 1167f - identificación de levaduras, 1164, 1165, 1165f, 1165r Tubo de hemocultivo por sistema de lisis-centrifugación, en diagnóstico de tuberculosis, 1020 Tubo Oxi/Ferm, procesamiento de hemocultivos, 101 Tularemia, Véase también Francisella tularensis - aislamiento, 465. 469 - características del cultivo, 467, 469 - descrita, 468 - diagnóstico serológico, 472 - epidemiología, 467 - espectro clínico, 469 - ganglionar, 470 - neumónica, 470 - oculoganglionar, 470 - orofaríngea, 470 - reseña, 468 - taxonomía, 468 - tifoidea, 470 - tratamiento, 471, 472 - ulceroganglionar, 470 Turicella, especies, 793, 795c u Ulcera(s) - genital, 86 - - infección por H IV y, interacciones, 87 - - muestras, recolección, 89 - orofaríngea, examen directo, diagnóstico de enfermedades infecciosas, 22c - peniana, examen directo, diagnóstico de enfer­ medades infecciosas, 23c - vulvar, examen directo, diagnóstico de enfer­ medades infecciosas, 23c Ulocladium, especies, 1158, 1159f Uncinaria(s), 1222, 1225, 1225f - ciclo vital, 1225f Uncinariasis, 1226r Unidad Svedberg, 174 Urea, hidrólisis, identificación de no fermentadores, 299, Protocolo 6, Lámina en color 1 Ureaplasma, 975 - aislados de seres humanos, 978r - especies - factores de virulencia, 979 - identificación, características, 978r - taxonomía, 976, 976r, 978c, 978r - U. urealyticum - - identificación, prueba de cloruro manganoso-urea, 1424

- - importancia clínica, 981 Ureasa - actividad, identificación de micobacterias, 1037, 1038c, Protocolo 19, Lámina en co lor 19 - convencional, 1397, 1398f - micobacterias. 1448 - producción - - identificación de enterobacterias, 218, Protocolo 6, Lámina en color 6 - - identificación de estafilococos coagulasanegativos, 623, Protocolo 6, Lámina en color 6 Uretritis, 86 - diagnóstico, 87 - especies de Haemophilus y, 41 Ir, 418 Utilización de citrato, 1396, 1396f Utilización de hidratos de carbono - fermentación, 206 - identificación de enterobacterias, 206, 207f Uveítis, presentación clínica, 95 V Vacuna(s) - enfermedad meningocócica, 553 - H. influenzae tipo B, 409, 412, 414r - polisacárido neumocócico, S. pneumoiae, 657 - tos convulsa, 490 - contra la tos ferina, 490 Vaginitis, 86 - diagnóstico, 86 Vaginosis, 87 - bacteriana, 86, 795 - - identificación, 886 Vagococcus, especies, 674 - identificación, 701, 703, 705c Vancomicina - especies de Enterococcus resistentes, 966 - especies de Staphylococcus resistentes, 960, 964r Variación de antígeno, 185 Variación de fase, 185 Variantes de colonias pequeñas, 611 Verde SYBR, amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real, 147, 148f Verruga peruana, B. bacilliformis y, 476 Verrugas venéreas, 87 - diagnóstico, 88 Vesículas gaseosas, 176 Vía aeróbica, 295, 296f Vía de Embden-Meyerhof, 206, 207f Vía de Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP), 192, 192f, 193, 294, 296f Vía de Entner-Doudoroff (ED), 193, 193f, 295, 296f Vía fermentativa, 291, 295f Vía glucolítica, 192, 192f Vía de hexosas monofosfato de WarburgDickens, 296, 296f Vía de las pentosas fosfato, 193, 194f Viajero(s), legionelosis, 528 Vibrio, especies, 387, 387c, 389r, 390f, 391c, 395c - aislamiento de laboratorio, métodos, 393 - antecedentes históricos, 387 - caracterización bioquímica, 394, 394c - descritas, 387, 387c, 389r, 390f - identificación de laboratorio, 394. 394c - identificación presuntiva, 393 - no cólera, 390, 391c - pruebas diferenciales, 396c - taxonomía, 387 - V. alginolyticus, 390, 391c - V. carchariae, 392 - V cholerae, 388, 388c, 391f, 391r - - biotipos, diferenciación, 394, 395c - - características, 388, 388c

-

-

cepas, 387 cólera, 388, 388c, 389r gastroenteritis, 389, 39Ir infecciones, tratamiento y prevención, 389 - - métodos de evaluación, 956c - - toxigénico, 388, 388c - V. cincinnatiensis, 392 - V. damsela, 391c, 392 - V. fluvialis, 391c, 392 - V.furnissii, 391c, 392 - V. hollisae, 391c, 392 - V. metschnikovii, 391c, 392 - V. mimicus, 391c, 393 - V. parahaemolyticus, 392, 392c - V. vulnificus, 392, 392c Vibrionáceas, filogenia, 387, 388c, 389r, 390f, 391c, 395c Vibriones, definidos, 172, 174f “ Vientre de Delhi” , 79 Vinchuca, 1374, Véase también Chinche(s), reduvídeas Virulencia bacteriana - factores que afectan, 195 - patogenicidad, requerimientos, 197 Virulencia, definición, 4 Virus. Veáse también Infecciones virales - adenovirus, 1304, 1304c - adenovirus entéricos, 1293, 1293c - arenavirus, 1290, 1290c - astrovirus, 1293, 1293c - B , 1303 - bunyavirus, 1291, 1291c - calicivirus, 1293, 1293c - CMV, 1301, 1335, 1339 - coltivirus, 1294 - construcción, 1275, 1275f - coronavirus, 1293c, 1294 - denominación, 1274, 1274r - descritos, 1274, 1275f - diagnóstico, 1271 - DNA, 1285c - DNA, clasificación, 1285c - Ébola, 1279c, 1279f, 1290 - - manifestaciones clínicas, 1290 - EBV, 1302 - - diagnóstico serológico, 1342, 1343f - encefalitis de California, 1291 - de la encefalitis de California, manifestaciones clínicas, 1291 - de Epstein-Barr (E BV), 5 - - manifestaciones clínicas, 1302 - de la estomatitis vesicular, 1279c, 1279f - de la estomatitis, vesicular, 1279c - del exantema porcino, 1281c, 1281f - filovirus, 1290 - gastroenteritis humana, 1293, 1293f - de la gastroenteritis humana, manifestaciones clínicas, 1293, 1293c - de la gastroenteritis, humana, manifestaciones clínicas, 1293, 1293c - de la gripe, 1277, 1283 - H -l, 1286c, 1286f - Hendra, 1288 - de hepatitis, 1308, 1308c, Véase también hepatitis - de la hepatitis B, manifestaciones clínicas, 1303 - herpes. Véase también Virus herpes humanos - - humano 6 (HHV-6), manifestaciones clíni­ cas, 1303 - - humano 7 (HHV-7), manifestaciones clíni­ cas, 1303 - - humano 8 (HHV-8), manifestaciones clíni­ cas, 1303 - - manifestaciones clínicas, 1299 - HHV-6, 1303 - HHV-7, 1303 - HHV-8, 1303

ÍNDICE ANALÍTICO HIV. Véase Infección p o r el virus de la inmunodeficiencia humana (H IV ) HPV, 1305, 1305c, 1307c, 1307f HSV, Véase Infección p or el virus herpes sim­ ple (HSV) influenza (de la gripe) - A, 1278c, 1278f - manifestaciones clínicas, 1277, 1283 LaCrosse, 1280c, 1280f del molusco contagioso, 1305 muestras clínicas, detección directa, 1334 - CMV, 1335, 1339 - coronavirus SARS, 1339 - enterovirus, 1339 - HBV, 1338 - HCV, 1338 - HIV, 1337 - HPV, 1339 - HSV, 1335, 1338 - inmunológico, 1336 - microscopía electrónica, 1335 - microscopio de luz, 1334 - parvovirus B19, 1339 - pruebas diagnósticas rápidas, 1340 rotavirus humano, 1336 - técnicas moleculares, 1336 - VAB, 1336 - del N ilo Occidental, 1339 del Nilo Occidental - detección molecular, 1339 - diagnóstico serológico, 1345 - manifestaciones clínicas, 1291 N’ ipah. 1288 ortomixovirus, 1277 papovavinis. 1305, 1305c del papiloma humano (H PV ), 87 - detección molecular, 1338 - manifestaciones clínicas, 1305, 1305c, 1306f, 1307c piiiinfluenza. 1278c, 1284 paramixovirus, 1284 de la Darotiditis, manifestaciones clínicas, 1284

-

parvovirus, 1305 picomavirus, 1288 del polioma humano, manifestaciones clínicas, 1306 - respiratorios - - detección inmunológica, 1336 - - efecto citopático, 1328f - - efectos citopáticos, 1328f - retrovirus, 1298c, 1299r, 1300c - rhabdovirus, 1289 - RNA, clasificación, 1278c - rotavirus, 1293 - de la rubéola, 1282c, 1282f, 1289 - - diagnóstico serológico, 1345 - del sarampión, manifestaciones clínicas, 1284 - similares al Norwalk, manifestaciones clíni­ cas, 1294 - similares al Sapporo, manifestaciones clínicas, 1294 - sincitial respiratorio (R SV). manifestaciones clínicas, 1288 - Tanapox, manifestaciones clínicas, 1304 - togavirus, 1291 - ultraestructura, 1274, 1276f - de la vacuna, 1287c, 1287f - varicela-zoster (V Z V ) detección inmunológica, 1336 - - diagnóstico serológico, 1344 - - manifestaciones clínicas, 1303 - - diagnóstico serológico, 1342, 1343f - de la verruga humana, 1286c - de la coriomeningitis linfocitaria, 1284c Vitek, evaluación de la actividad inhibidora de los agentes antibióticos, 945 Volutina, 176 W Walkaway-40, identificación de no fermentadores, 358 Walkaway-96, identificación de no fermentadores, 358 Walkway, 279 Wee-Tabs OM P y NGP, 270 Weeksella, especies, 331c, 332

1-27

- W. virosa, 294c Wolinella, especies, 384 - características, 374c - W. succinogenes, 384 Wuchereria, especies de, W. hancrofti, 1248, 125 Ir, 1252f - ciclo vital, 1252f

X Xantina, hidrólisis, 1418 Xantomonadáceas, 317, 317c - grupo rRNA, 316, 317c Xenorhabdus, especies - más nuevas, 263c - X. nematophilus, reacciones bioquímicas, 236c Xilosa-lisina-tergitol 4 (XLT4), recuperación y caracterización de especies de Salmonella, 246c

Y Yersinia, especies, 258, 258r, 259c - características de identificación, 226c - especies, diferenciación, 259c - reacciones bioquímicas, 236c Yersiniae (tribu), 224c, 258, 259c, 259f, 260r, 261r - características de identificación, 226c Yokenella, especies - más nuevas, características diferenciadoras, 268c, 269 - Y. regensburgei, 265c reacciones bioquímicas, 236c

Z Zigomiceto(s) - histopatología, infecciones, 1120, 1124r Zigomicosis, 1124r - definida, 1105 - identificación, 1119f Zygomycete, especies, identificación. 1118, 1119f

1 —

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u n « c ia n c la ; ü ii t a r e a e s e n c i a l e s

m a c r o s e o p ie a

p ru eb a s

m ás

c a fa c tfifís tic a

a p r o p ia d a s d é

d o

lo a

r e c o n o c í*

m ic r o o r g a n is ­

Id e n t ific a d 6 n

fíe

c-a d a u n a

la s c iip p s .

El o t ijt íiiv Q

(Jé? K o n & m m i D i a g n ó s t i c a

m c r a lu o f ú g ic o . T e x to v A tla s e n c o lo r e s

p r a fu r c io ita r

1.1 I n r o i m a c f ó n c i e n t í f i c a n e c e s a r i o p a r a e ó r n p r e , n d o r l a s m a n í t a l u d a n a s « u r u e t t i f a l i » ló g ic a s , p a t o g é n ic a s y c lín ic a a d e p a u la s y

P rovee

m ic r o o r g a n js im ü t q u o

causan

p io o flr fiir iin n t ü s p a r e úI d i a g n o s t i c o d o I a b o r a t o n o d e

S u s a s p e c to s m a s *

lo s

fis io ­

y p re s e n ta r

e s ta s a ^ t e m s w la d e fl.

d e s ta c a d o s s o ir

o n lo q u e é ; d e t a lla d o s

e o d ir m e n to s

In fe c c io n e s

p a re

su

s o tu o

la r e c o l e c c i ó n

p r o c e s a m ie n to

y

v

el tra n s p o rto

t a i p r u e b a s . U t iliz a d a s

rfts I s s m u e n t r a s , l o s p r o *

p a ra

la

id e n tifitíd o n

d e

In s

mteroqfgpqpvnos. * In te r c a la g r á fic o s , c u a d r o s y *

in c lu y e

una

ex ten s a

»a c c ió n

r e c u a d r o s q u e d e s la c e n da

lá m in a s c o n

627

lo s m ic r o o r g a n is m o s y f o le a r a fia s d e c o lo n ia s e n s i m o r fo lo g ía * P r é s e n la

p u n to s c la v e s d e l lé a lo .

F ig u r a s e n

c o lo r

d e

m ic r o fa t o a r a lía s d e

m e d io s s ó lid o s q u e a y u d a n a r e c o n o c e r

c a r a c te r ís tic a ,

fn íís m v fie ió n

d ia g n ó s t ic o

lo s

a m p lia d a

m ic r o b io ló g ic o q u e

sob re

g e re n e ip m i e n t o

t& llü ja (a r e a l i d a d

y

r e g u la d a n e s

d e l e je r c ic io m é d ic o

del

la b o r a lo r io

du

m o d ern o

* F le a f ia a u n a n á t i s i s e x h a u s i i v o d o l o s p r h r iW p ío a d o io s . m é t o d o n i n m u n o l ó g i c o s v d e I n s t ñ c -

S50N 378 E60DG D095 <

n lc a s m o le c u la r e s . c o y a

* C o r / c lac l o n a

la

c lin r e a

im p o r ta n c ia d ia g n o s t ic a o s rtp

la s

a n fe r m o d iid e - s

cada v

in fe c c io s a s

« con

m a yor, ls

p r á c tic a

d el

is b a r a t o r i o

m ic fo b io lo g tc o E s to c lá s ic o e s

la g u i a a c t u a l m a s a x t o n s a

d e b a s o r u n s e x ig e n c ia

sob ra

el

-ii a g n ó s t i c o

m lc r o tiio ld g ic g

p a r a lo s e s tu d ia n te s d n m ic r o b io lo g ía y d a

y

sg

le c tu r a

m e d ic in a , a s i c o m o

p a ra

lo s m é d ic o s a s p a d a lle ta s u n e n f e r m e d a d e s i n f e c d o s i s , lo s m i c r o b ió lo g o s c lín ic o s , lo s p o t ó * lo g a s

y l o s a ¡ « i l l a r e s t í a l a b o r ¡a I d f i o .

E D IT O H IA L M E D F C A e ^

p a n a m e r ic a n a

igma