Большой практикум по физиологии человека и животных. Техника гистологических исследований: Практикум по специальности 020201 (011600) - ''Биология''

Ф Е Д Е РАЛ Ь Н О Е АГ Е Н Т С Т В О П О О БРАЗО В АН И Ю Г О С У Д АРС Т В Е Н Н О Е О БРАЗО В АТ Е Л Ь Н О Е У ЧРЕ Ж Д Е Н И Е П РО Ф Е С С И О Н АЛ Ь Н О Г О О БРАЗО В АН И Я «В О РО Н Е Ж С КИ Й Г О С У Д АРС Т В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РС И Т Е Т »

Больш ой практикум по физ иологии челов екаи ж ив отны х

Т Е Х НИ К А Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х И С С Л Е Д О В А НИ Й П ракт и кум С пеци альност ь 020201 (011600) «Би ологи я»

В оронеж 2005

2 У тв ерж дено научно-методическим факультета3 ию ня 2005 г., протокол№ 4

сов етом

биолого-почв енного

С остав итель П оляков а-С еменов аН .Д .

«Больш ой практикум по физ иологии челов ека и ж ив отны х . Т ех ника гистологических исследов аний » подготов лен на кафедре физ иологии челов ека и ж ив отны х биолого-почв енного факультета В оронеж ского государств енного унив ерситета. Рекомендуется для студентов IV курса биолого-почв енного факультета, обучаю щ их ся по спец иальности 020201 (011600) «Биология»

3 С О Д Е РЖ АН И Е В в едение… … … … … … ..… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 4 Т ема1. Ф иксац ия тканей … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … . 4 1.1 .О бщ ие прав илафиксац ии… … … … … … … … … … … … … … … … 5 1.2 . Ф иксирую щ ие средств аи их применение… … … … … … … … … 5 1.3 . П рактическое з адание I … … … … … … … … … … … … … … ......... 7 Т ема2. П ромы в ание и обез в ож ив ание … … … … … … … … … … … … … … ... 7 2.1. П ромы в ание гистологического материала. .… … … … … … … … 7 2.2. О без в ож ив ание гистологического материала… … … … … … … ... 8 2.3. П рактическое з адание II … … … … … … … … … … … … … … … … .. 8 Т ема3. Залив каматериалав плотны е среды . П риготов ление гистологических красителей … … … … … … … … … … … … … … … .. 9 3.1. Залив кав парафин .… … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 9 3.2. П риготов ление блоков … … … … … … … … … … … … … … … … .. 10 3.3. П рактическое з адание III ...… … … … … … … … … … … … … … … 10 Т ема4. П риготов ление гистологических срез ов … … … … … … … … … … . 11 4.1. П риготов ление срез ов изгистологических блоков .… … … … ... 11 4.2. Ф иксац ия срез ов напредметном стекле .… … … … … … … … … . 11 4.3. П рактическое з адание IV … … … … … … … … … … … … … … … ...11 Т ема5. О краш ив ание и з аклю чение гистологических срез ов … … … … ... 12 5.1. П риготов ление красителей и окраш ив ание … ..… … … … … … .. 12 5.2. Заклю чение срез ов в смолы … … … … … … … … … … … … … … ...13 5.3. П рактическое з адание V … … … … … … … … … … … … … … … ..14 Т ема6. Анализгистологических препаратов … … … … … … … … … … … … ..14 6.1. П рактическое з адание VI … … … … … … … … … … … … … … .....14 П рилож ение 1 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ... 15 П рилож ение 2 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .15 Л итература… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 15

4 ВВЕ ДЕ Н И Е П рактикум по тех нике гистологических исследов аний для студентов , спец иализ ирую щ их ся на кафедре физ иологии челов ека и ж ив отны х , посв ящ ен осв оению методик морфологических исследов аний . О н представ лен ш естью темами, в каж дой изкоторы х рассматрив аю тся теоретические обоснов ания раз делов и конкретны е з адания. Д анны й раз дел Больш ого практикума расш иряет теоретические и практические з нания студентов , полученны е ими при из учение общ его курса«Г истология». Работа с методической раз работкой помож ет студентам в ы работать нав ы ки самостоятельного приготов ления гистологических препаратов и сделать перв ичны й анализц итоморфологических структур раз личны х в идов тканей . П еред началом работ по гистологической тех нике студенты прох одят инструктаж у преподав ателя по т ехнике безопасност и нарабочем месте. Д ля поз нания з акономерностей раз в ития, строения, обмена в ещ еств и функц ий клеток и тканей в сов ременной гистологии ш ироко применяю тся методы исследов аний микроструктур на молекулярном, субклеточном, клеточном и тканев ом уров нях с помощ ью микроскопиров ания. Д ля микроскопического из учения исследуемы й объ ект долж ен удов летв орятьдв ум основ ны м услов иям: 1) он долж ен бы тьпроз рачны м; 2) его структуры долж ны бы ть контрастны , то есть отличаться одна от другой по показ ателям преломления или поглощ ения св ета. Больш инств о ж ив отны х тканей не удов летв оряетэтим требов аниям, поэтому их необх одимо подв ергать спец иальной обработке с ц елью приготов ления гистологического препаратадля микроскопического из учения. О снов ны м методом в гистологических исследов аниях яв ляется из учение окраш енны х срез ов раз личны х тканей и органов . Т радиц ионны й способ подготов ки материала для получения постоянного гистологического препарата в клю чает фи кс аци ю м ат ери ала, проводку (обезвож и вани е), зали вку (уплот нени е), при гот овлени е ги с т ологи чес ки х с резов, окраши вани е с резов, заключени е с резоввс вет оопт и чес ки е с реды . Т Е М А 1. Ф И К С А Ц И Я Т К А НЕ Й ной , пинц еты - глаз ной , О борудов ание и реактив ы : скальпель средний и глаз анатомический и х ирургический средний , нож ниц ы средние и больш ие, дв е чаш ки П етри, лез в ие, стеклянны е бю ксы в местимостью 20-50 мл (15 ш тук), флаконы для реактив ов и стаканчики в местимостью 50-100 мл, ш ирокогорлы е банки, перев яз очны е материалы . П икринов ая кислота, ледяная уксусная кислота, формалин (40% раств ор формальдегида), х лороформ, этилов ы й спирт, дистиллиров анная в ода, этилов ы й эфир, парафин.

5 1.1. О бщ ие прав илафиксац ии О бяз ательны м услов ием микроскопической тех ники яв ляется предупреж дение и з адерж ка посмертны х из менений в тканях . Э то достигается путем фиксац ии в з ятого для исследов ания материала. В основ е дей ств ия фиксаторов леж ат физ ико-х имические проц ессы , и, в перв ую очередь, проц есс коагуляц ии белков . Ф иксирую щ ая ж идкость долж на отв ечать дв ум основ ны м требов аниям: перв ое – бы стро проникатьв ткани и в торое – дей ств ов ать«мягко», не в ы з ы в ая грубы х наруш ений тканев ы х структур (сморщ ив ания, чрез мерного уплотнения и т. д.). Н еобх одимо придерж ив аться определенны х прав илфиксац ии. 1. Раз мер исследуемы х кусочков ткани долж ен бы ть таким, чтобы произ ош ло бы строе его пропиты в ание. В среднем для больш инств а фиксаторов беруткусочки толщ иной 0,5 – 5 мм. 2. Количеств о фиксирую щ ей ж идкости долж но не менее чем в 20 раз прев ы ш атьобъ ем исследуемого материала. 3. Ф иксируемы й объ ект нуж но помещ ать так, чтобы обеспечить однов ременно его пропиты в ание со в сех сторон. 4. Н еобх одимо соблю дать в ремя фиксац ии, которое з ав исит от св ой ств а фиксирую щ ей ж идкости, исследуемого материала и толщ ины в з ятого кусочка. В больш инств е случаев фиксац ию произ в одят при комнатной температуре. О днако для некоторы х спец иальны х исследов аний (особенно гистох имических и электронно-микроскопических ) применяю т фиксац ию ох лаж денны ми ж идкостями при температуре +4оС и ниж е. Ф иксац ию мож но считать з ав ерш енной после того, как ж идкость полностью пропитала фиксируемы й объ ект. Рав номерны й ц в ет и одинаков ая консистенц ия тканей на пов ерх ности раз рез а св идетельств ую т о том, что проц есс фиксац ии з ав ерш ен. 1.2. Ф иксирую щ ие средств аи их применение С фиксирующ ими смесями следует обращ ат ься сост орожност ью! Ф иксаторы раз деляю тнадв е основ ны е группы – просты е и слож ны е. К просты м фиксаторам относятся формалин, этилов ы й спирт, ац етон, дих лорид ртути ( сулема), соли тяж елы х металлов ( кобальт, платина, уран и т. д. ) и кислоты ( уксусная, трих лоруксусная, пикринов ая, осмиев ая, х ромов ая и др. ). Н аиболее распространенны ми фиксаторами яв ляю тся этилов ы й спирт и формалин. Эт анол осущ еств ляетбы струю фиксац ию , не требую щ ую обез в ож ив ания тканей перед з алив кой в парафин и ц еллоидин. Е го фиксирую щ ее дей ств ие осущ еств ляется з а счет обез в ож ив ания тканей и коагуляц ии белков , при этом происх одитобез ж ирив ание и сущ еств енное уплотнение тканей .

6 И спольз ую т 96 % и абсолю тны й этилов ы й спирт. В ремя фиксац ии з ав исит от материала: для тонких кусочков ткани толщ иной 0,5 – 2 мм оно состав ляет 15 – 30 минут, для кусочков в 3 – 4 мм соотв етств енно ув еличив ается до 2 – 3 часов . П риг от овление раст вора формалина. Раств ор формалина (40% раств ор формальдегида) раз в одят в одопров одной в одой (дистиллиров анная в ы з ы в ает набух ание тканей ) в соотнош ении: 1 частьформальдегидаи 10 частей в оды . П риготов ленны й раств ор формалина необх одимо ней трализ ов ать. В банку насы паю ткарбонаткальц ия (или магния), чтобы надне образ ов ался слой толщ иной 1,5 – 2 см. Затем налив аю т формалин, несколько разэнергично в стрях ив аю ти остав ляю тотстаив аться на2 суток. В ремя фиксац ии тканей в раств оре формалина от 24 – 48 часов до нескольких суток. В гистологической практике часто использ ую тся слож ны е фиксаторы . Ж идкост ь Б уэна. Э тот фиксатор яв ляется одним излучш их фиксаторов , так как бы стро проникает в ткани, в ы з ы в ая нез начительное их сж атие, и поз в оляет х орош о окраш ив ать тканев ы е структуры . Е го применяю т для приготов ления обз орны х препаратов , для фиксац ии тканей эмбрионов . Ж идкостьБуэнаготов ится непосредств енно перед фиксац ией . С остав : Раств ор пикринов ой кислоты (насы щ енны й ) 75 мл Ф ормалин 25 мл Л едяная уксусная кислота 5 мл П икринов ая кислота плох о раств оряется в в оде. Е е насы щ енны й раств ор необх одимо приготов ить з аранее. В сосуд насы паю т 25-30 г кристаллической кислоты и з алив аю т1 л горячей дистиллиров анной в оды . И з бы ток кислоты при ох лаж дении в ы падает в осадок и мож ет бы ть использ ов ан при приготов лении нов ой порц ии раств ора. Раств ор мож но х ранить неограниченны й период в ремени. П родолж ительностьфиксац ии материалав ж идкости Буэнасостав ляетот 2 до 24 часов в з ав исимости от в еличины объ екта. Д лительное (до нескольких суток) пребы в ание кусочков ткани в фиксаторе не ух удш аеткачеств о фиксац ии и их последую щ ей обработки. П осле фиксац ии материалпереносятв 70 – 80 % спирт, которы й меняю т2 – 3 раз ас интерв алом 30 – 60 минут(для удаления пикринов ой кислоты ). П римеч ание. О бъ ект, фиксиров анны й в ж идкости Буэна, з алив ается только парафином. Ж идкост ь К арнуа. С месь Карнуа яв ляется х орош им фиксатором, как для гистологических исследов аний , так и для гистох имических методик. Н едостатком яв ляется легкое сморщ ив ание тканей . Ж идкостьКарнуаприготав лив аю тнепосредств енно перед фиксац ией . С остав : Абсолю тны й (или 96 %) этилов ы й спирт 60 мл

7 Х лороформ 30 мл Л едяная уксусная кислота 10 мл Кусочки толщ иной до 5 мм фиксирую тв течение от30 минутдо 1 часа(в з ав исимости от толщ ины объ екта). П осле фиксац ии кусочки сраз у переносят в абсолю тны й спирт. Е сли фиксатор бы л приготов лен на96 % спирте, то кусочки следует ополоснуть 2 – 3 раз а в спирте той ж е конц ентрац ии; в случае необх одимости материалмож но остав итьв спирте на2 – 3 часа. П римеч ание. Н еобх одимо, чтобы материал нах одился в фиксаторе не дольш е, чем это нуж но для его пропиты в ания, так как удлинение фиксац ии усилив аетсж атие и уплотнение объ екта. 1.3. П ракт ич еское задание I Ц елью работы яв ляется ов ладение методикой з абора тканей у ж ив отны х , фиксац ия кусочков материалав раз личны х фиксирую щ их ж идкостях . 1. П риготов ить фиксаторы : ж идкость Буэна, Карнуа, 10 % формалин в объ еме по 50 мл. Каж ды й фиксатор раз литьв 5 бю ксов по 10 мл 2. П од эфирны м наркоз ом произ в ести декапитац ию ж ив отного и из в лечь голов ной моз г. И ссечь кусочки коры моз га издв игательной з оны и коры моз ж ечка, отделитьгипофиз . М атериалпогруз итьв бю ксы с фиксатором Буэна. 3. П осле в скры тия брю ш ной полости ж ив отного в з ять печень, надпочечники и семенники. И зкаж дого органав ы рез атьпо несколько кусочков и поместить их в бю ксы с фиксирую щ ими ж идкостями (Буэна, Карнуа, формалин). Записать в ремя начала фиксац ии. Через 40 минут (соблюд ат ь т оч но) материал изж идкости Карнуа перенести в диоксан. Через30 минут слить раств ор, наполнить бю кс св еж ей порц ией диоксана и остав ить в нем материал ещ е на30 минут. Затем з афиксиров анны е кусочки тканей погруз итьв расплав ленны й парафин (приготов итьз аранее в термостате). Т Е М А 2. П РО М Ы В А НИ Е И О Б Е З В О Ж И В А НИ Е О борудов ание и реактив ы : термостат, стеклянны е бю ксы и стаканчики, пинц еты , стеклянны е или фарфоров ы е сита, марля, нитки, этанол, диоксан. 2.1. П ромы в ание гистологического материала С пособ промы в ания з ав исит от методики фиксац ии. Н апример, после фиксирую щ их смесей , содерж ащ их пикринов ую кислоту, дих лорид ртути, трих лоруксусную кислоту, для их удаления применяю тэтилов ы й спиртраз ной конц ентрац ии. П осле фиксац ии в формалине, в ж идкостях , содерж ащ их х ром, осмиев ую кислоту, обы чно употребляю т в оду. В больш инств е случаев промы в ку кусочков тканей произ в одят в проточной в одопров одной в оде. Н аиболее удобно это делать, помещ ая объ ект в стеклянны е или фарфоров ы е сита, которы е з акры в аю т пробкой с отв ерстиями и опускаю т в сосуд с проточной в одой . П робка обеспечив ает плав учесть, а отв ерстия – постоянную ц иркуляц ию в оды . Е сли кусочек не прош ит ниткой , то этикетку тож е помещ аю т в сито. П ри отсутств ии сита кусочек з ав орачив аю т в марлю и

8 подв еш ив аю т з а нитку в сосуд, наполненны й в одой . В ерх сосуда з акры в аю т марлей и проделы в аю т в ней небольш ое отв ерстие. К в одопров одному крану присоединяю т рез инов ы й ш ланг или прив яз ы в аю т ш нур (полоску бинта), св ободны й конец которого пропускаю тчерезмарлю в сосуд и пускаю тпо нему не сильную струю в оды . П ри небольш ом количеств е материалакаж ды й кусочек промы в аю тв отдельной посуде. С реднее в ремя промы в ания 20 – 24 часа. 2.2. О без в ож ив ание гистологического материала Д ля приготов ления качеств енны х гистологических препаратов необх одимо, начиная с момента обез в ож ив ания, соблю дать прав ила постепенного в оз дей ств ия применяемы х в ещ еств на исследуемы е ткани. П осле промы в ания кусочки подв ергаю т дальней ш ему уплотнению путем обез в ож ив ания в спиртах ув еличив аю щ ей ся конц ентрац ии (50, 60, 70, 80, 96 и 100%). О без в ож ив ание материала произ в одится в стеклянны х бю ксах или стаканчиках с притерты ми кры ш ками. П осуду этикетирую т и з алив аю т спиртами (100 % спирт в дв ух стаканчиках ). Т акой последов ательны й ряд сосудов получил наз в ание гистологической батареи. С пирты необх одимой конц ентрац ии приготав лив аю т з аранее согласно таблиц е раз в едения (см. прилож ение 2). Е сли препарат промы в али в в оде, то обез в ож ив ание начинаю т с 50% спирта, если ж е в спиртах , то объ ектпомещ аю тв спиртпоследую щ ей крепости (из70% в 80% и т. д.). П ри необх одимости обез в ож ив ание начинаю т с 10 – 20% спирта. В ремя пребы в ания кусочков в отдельны х спиртах определяется их в еличиной и св ой ств ами. О бъ екты толщ иной 5 мм достаточно держ ать в спиртах меньш ей конц ентрац ии (до 60%) по 2 – 4 часа, а в более конц ентриров анны х раств орах спирта – от 12 до 24 часов . М елкие и более тонкие объ екты мож но пров одитьчерезгистологическую батарею бы стрее. С ледует помнит ь, что длительное пребы в ание объ екта в спиртах низ кой конц ентрац ии прив одит к мац ерац ии тканей , а з адерж ка в спиртах в ы сокой конц ентрац ии чрез мерно уплотняет их . П ри необх одимости прерв ать проц есс обез в ож ив ания, материал мож но остав ить (на 1-2 суток) в «индифферентном» спирте, крепостькоторого состав ляет70 – 80%. П осле фиксац ии гистологического материала в ж идкости Карнуа в оз мож но исклю чение этапапров одки по спиртам в осх одящ их конц ентрац ий и помещ ение кусочков тканей непосредств енно в диоксан, где происх одит удаление (з амещ ение) остаточной в оды . 2.3. П ракт ич еское задание II Ц ель работы – приготов ление этанола раз личной конц ентрац ии и абсолю тного (100 %) спирта(см. прилож ение 1). О св оение тех ники промы в ки и обез в ож ив ания гистологического материала. П ри необх одимости работа в ы полняется в течение дв ух дней подряд. 1. П риготов ить раств оры для промы в ания и обез в ож ив ания материала. П одготов ить«батарею »спиртов , в том числе 100% этанол.

9 2. О сущ еств итьпромы в ку тканей с ц елью удаления фиксаторов . Кусочки з ав ернуть в марлю , в лож ить этикетки и промы ть проточной в одопров одной в одой . 3. П ров ести обез в ож ив ание тканей в спиртах в оз растаю щ ей конц ентрац ии. 4. П оместить поочередно материал в диоксан I и II (дв а стакана обоз начить– “I” и “II”, в них налитьдиоксан, экспоз иц ия – 30 минутв каж дом). П осле из в лечения кусочков из диоксана II погруз ить их в расплав ленны й парафин. П арафин необх одимо растопить в термостате з аранее при о температуре 56 – 58 С . Д иоксан I и II мож етиспольз ов аться многократно. Т Е М А 3. З А Л И В К А М А Т Е РИ А Л А В П Л О Т НЫ Е С РЕД Ы П РИ Г О Т О В Л Е НИ Е Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х К РА С И Т Е Л Е Й О борудов ание и реактив ы : термостат, скальпель, пинц ет, ш патель, бумаж ны е фильтры , спец иальны е дерев янны е блоки, фарфоров ы е круж ки с носиком, спец иальны е формочки, предметны е стекла, стеклянны е емкости для красителей , мерны е ц илиндры , стеклянны е в оронки, парафин, в оск, эфир, этанол, гематоксилин, эоз ин, х лоралгидрат, глиц ерин, й одат натрия (NaJO3), лимонная кислота, калий ны е кв асц ы , ледяная уксусная кислота, тимол, формалин, куриное яй ц о. 3.1. Залив кав парафин Д ля приготов ления в ы сококачеств енны х гистологических препаратов необх одимы рав номерно тонкие срез ы с исследуемого объ екта. Д ля их получения кусочки тканей надо пропитать и з алить такой средой , которая прев ратила бы их в х орош о реж ущ ую ся массу. Н аиболее употребительны ми для этих ц елей материалами яв ляю тся парафин, ц еллоидин и ж елатин. П арафин при комнатной температуре – тв ердое гомогенное в ещ еств о, он плав ится при 54 – 56оС . Д ля эластичности к нему следует прибав ить чисты й пчелины й в оск в количеств е 2 – 5%. Залив кав парафин требуетсоблю дение дв ух основ ны х услов ий : перв ое – материал долж ен бы тьполностью обез в ож ен, в торое – он не долж ен содерж ать спирт. П ерв ое услов ие обеспечив ается в проц ессе обез в ож ив ания и уплотнения в батарее спиртов пов ы ш енной конц ентрац ии. Д ля удаления спиртаи подготов ки к пропиты в анию парафином материал обрабаты в аю т одним израств орителей парафина, обладаю щ им способностью в ы теснять спирт. К таким в ещ еств ам относятся х лороформ, бенз ол, толуол, ксилол, диоксан, сероуглерод и др. Чащ е использ ую т диоксан, х лороформ и бенз ол. Т олуоли ксилолделаю ткусочки ткани более тв ерды ми. В тех случаях , когда по услов иям работы необх одимо сократить в ремя приготов ления парафинов ы х блоков , мож но применять ускоренную з алив ку. П ри этом кусочки ткани толщ иной 1,5 – 2 мм помещ аю т в абсолю тны й (или 96%) спирт, ац етон или диоксан для фиксац ии и обез в ож ив ания на1 – 2 часаи произ в одится однократная сменафиксатора.

10 П осле окончального пропиты в ания объ екта его з алив аю т расплав ленны м парафином (с 5 % пчелиного в оска). П арафин предв арительно подогрев аю т в термостате при 58оС и в расплав ленном в иде налив аю т в приготов ленную формочку, з аполняю т ее до самы х краев , из бегая образ ов ания пуз ы рьков в оз дух а(использ ую тв ы сокую фарфоров ую круж ку с ручкой и носиком). Затем подогрев аю т пинц ет или металлический ш патель, бы стро переносят подготов ленны й к з алив ке объ ект в формочку с парафином и ориентирую т в необх одимом полож ении. П осле этого формочку ох лаж даю тв одой (10 – 18оС ). 3.2. П риготов ление блоков И зз атв ердев ш его парафина скальпелем в ы рез аю т четы рех угольны й блок таким образ ом, чтобы объ ект со в сех сторон бы л окруж ен слоем парафина толщ иной 1 – 3 мм. Н аклей ку блоков произ в одят на дерев янны е кубики. Н а дерев янны й кубик наносятнебольш ой кусочек тв ердого парафина, расплав ляю т его горячим металлическим ш пателем (или скальпелем), пров одят этим ж е ш пателем по ниж ней пов ерх ности парафинов ого блокаи бы стро придав лив аю т его к кубику. 3.3. П ракт ич еское занят ие III Ц ельработы – осв оение тех ники з алив ки ткани в парафин и из готов ления гистологических блоков . 1. Расплав ить в термостате парафин при 56оС с кусочками тканей (см. практическое з адание II). С делатьперед з алив кой этикетиров ку материала. 2. В термостатпостав итьтри баночки с парафином, обоз начитьих 1, 2, 3. В четв ертую банку поместитьз алив очную смесь(парафин + в оск). П ерелож ить исследуемую ткань в баночку 1. П оочередно через 40 минут переносить кусочки тканей в термостате изпарафинаI в парафин II и, далее, в парафин III. П осле в ы полнения этой проц едуры кусочки тканей осторож но в ы нуть из парафинаIII, аккуратно улож итьв формочку и з алитьз алив очной смесью . 3. П риготов ить предметны е и покров ны е стекла к следую щ ему з анятию . П редметны е стекла тщ ательно помы ть в мы льном раств оре, промы ть в проточной в одопров одной в оде и дистиллиров анной в оде, тщ ательно в ы суш ить из алить смесью Н икифоров а (1 часть эфира + 1 часть 96о этанола). Х ранить предметны е стеклав темной стеклянной банке с притертой пробкой . 4. П риготов итькрасители – гематоксилин и эоз ин (см. тему 5) 5. С делатьбелков ы й раств ор для фиксац ии тканей напредметном стекле. П риг от овление раст вора. К белку изсв еж его куриного яй ц а добав ляю т рав ной по объ ему количеств о х имически чистого глиц ерина и х орош о вз балты в аю т (или в з бив аю т). Раств ор фильтрую т черезв лаж ны й складчаты й бумаж ны й фильтр в чисты й флакончик. В о из беж ание гниения белкак фильтру добав ляю т2 – 3 маленьких кусочка(с пш еничное з ерно) тимолаили формалин (1:100).

11 Т Е М А 4. П РИ Г О Т А В Л Е НИ Е Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х С РЕ З О В О борудов ание и реактив ы : термостат, микротом, электростолик для суш ки парафинов ы х срез ов , чаш ки П етри, кисточки, препаров альны е иглы . Д ля приготов ления гистологических срез ов определенной толщ ины использ ую тспец иальное мех аническое устрой ств о – микротом. В нимание! С ост ры м ножом микрот ома обращ ат ься с ост орожност ью. 4.1. П риготов ление срез ов изпарафинов ы х блоков Н аклеенны й на дерев янную колодку парафинов ы й блок прочно з акрепляю тв з аж име микротома, располож ив длинной осью параллельно длине микротома. П осле установ ки необх одимого угла рез ания и угла наклона нож а, его прочно з акрепляю тв интов ы ми з аж имами и располагаю тнад блоком. Затем, регулируя в интами мех аниз м подачи, блок устанав лив аю т таким образ ом, чтобы в ерх няя его плоскость нах одилась в гориз онтальном полож ении и не дох одиладо лез в ия нож а0,5 – 1 мм. П осле предв арительной подгонки блока к нож у устанав лив аю т микрометрическую ш калу на получение толсты х срез ов (25 – 30 мкм) и дв иж ением нож ев ы х салаз ок начинаю т подав ать блок в в ерх до получения с него перв ы х полны х срез ов . Затем произ в одят моделиров ание блока: срез аю т скальпелем из бы точны й парафин, остав ляя в округ з алитого объ екта слой не более 2 – 3 мм, и придаю т блоку прямоугольную форму. П осле этого устанав лив аю т микрометрическую ш калу на нуж ную толщ ину срез а (4 – 10 мкм) и приступаю тк окончательной рез ке материала. С ледует помнить, что перемещ ение нож ев ы х салаз ок в доль рельсов ого пути нуж но произ в одитьплав но и безлиш них усилий . Д в иж ение микротомны м нож ом в момент прох ож дения над блоком надо произ в одить бы стро и рав номерно. Г отов ы й срез осторож но снимаю т с нож а в лаж ной кисточкой (в направ лении от спинки к лез в ию ) и переносят на подготов ленное предметное стекло (см. 4.2), расправ ляя его препаров альной иглой ; при необх одимости срез переносят в чаш ку с теплой (35 – 400С ) дистиллиров анной в одой . П риготов ленны е препараты в ы суш ив аю т на электростолике при температуре 30 – 400С . 4.2. Ф иксац ия срез ов напредметном стекле Н аклеить парафинов ы е срез ы на предметное стекло в расправ ленном полож ении при помощ и белка с глиц ерином. Д ля этого пов ерх ность предметного стекла предв арительно покры в аю т тонким слоем белков ого раств ора, в ы суш ив аю т, з атем наносят1 – 2 капли дистиллиров анной в оды . 4.3. П ракт ич еское задание IV Ц ель работы – научиться тех нике приготов ления гистологических срез ов .

12 1. Н аклеить с помощ ью расплав ленного парафина кусочки тканей , ранее з алиты х в парафин, на дерев янны е блоки (необх одимо пров ести маркиров ку блоков ). 2. Закрепить блоки в держ ателе санного микротома и приготов ить гистологические срез ы толщ иной 5 – 8 мкм. 3. Н аклеить срез ы на предметны е стекла с помощ ью белка с глиц ерином (раств ор долж ен бы ть приготов лен на преды дущ ем з анятии), пров ести маркиров ку стекол. Т Е М А 5. О К РА Ш И В А НИ Е И З А К Л Ю Ч Е НИ Е Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х С РЕ З О В О борудов ание и реактив ы : термостат, пинц еты , колбы , стеклянны е стаканы , мерны е ц илиндры , в оронки, «батарея» спиртов , ксилол, толуол, готов ы е красители – гематоксилин и эоз ин (долж ны бы ть приготов лены на з анятии № 3), канадский бальз ам. В основ е окраш ив ания тканев ы х микроструктур леж ат физ икох имические проц ессы . Красители подраз деляю тся на3 группы . 1. О снов ны е – гематоксилин, метилов ы й з елены й и др. Э ти красители применяю тся для окраш ив ания баз офильны х в ещ еств и структур клеток. 2. Кислотны е – эоз ин, кислы й фуксин и др. О ни окраш ив аю т оксифильны е в ещ еств а, например, гранулы эоз инофильны х лей коц итов , ц итоплаз му клеток; 3. Н ей тральны е – судан III и др., использ ую тся для окраш ив ания ней трофильны х компонентов клеток, например, липидов . 5.1. П риготов ление красителей и окраш ив ание К ислы й г емат оксилин Эрлиха. В 100 мл 96 % спирта раств орить 2 г гематоксилина, прибав ить 100 мл дистиллиров анной в оды , з атем 100 мл чистого глиц ерина, 3 гкалий ны х кв асц ов (х имически чисты х ) и 10 мл ледяной уксусной кислоты , в з болтатьи остав итьнасв ету «соз рев ать» в течение 14 дней , периодически в з балты в ая. Д ля того чтобы обеспечить постоянны й доступ в оз дух а (проц есс окисления гематоксилина), следует брать ш ирокогорлы й сосуд и накры в ать в х одное отв ерстие несколькими слоями марли. В проц ессе «соз рев ания» раств ор изсв етло– красного станов ится темно– красны м. В плотно з акры том сосуде красительсох раняетсв ой ств адлительное в ремя. К ислы й г емалаун М айера. В 1 литре дистиллиров анной в оды раств орить 1 г гематоксилина, добав ить 0,2 г й одата натрия (NaJO3), 50 г калий ны х кв асц ов (х имически чисты х ) и, непреры в но помеш ив ая, дож даться их полного раств орения (при этом ж идкость приобретает фиолетов о – синю ю окраску). Затем добав ляю т50 гх лоралгидратаи 1 гкристаллической лимонной кислоты , в рез ультате чего раств ор станов ится фиолетов о – красны м. В х орош о з акры том сосуде изх имически чистого стекла краситель х ранится длительное в ремя.

13 П реимущ еств о данного метода – бы строе окисление гематоксилина й одатом натрия, благодаря чему раств ор не требует«соз рев ания»и сраз у мож ет использ ов аться для окраш ив ания. П ри окраш ив ании гематоксилин – эоз ином фиксац ия мож етбы тьлю бая. П еред окраш ив анием парафинов ы е срез ы подв ергаю т депарафинированию – проц ессу, обратному тому, которы й осущ еств ляю тпри подготов ки объ екта к з алив ке в парафин, то есть срез ы последов ательно пров одят черезраств оритель парафина, спирты нисх одящ ей конц ентрац ии и помещ аю т в в оду. Д анны й проц есс в ы полняю т по следую щ ей непреры в ной сх еме: 1. Ксилол(толуол) – дв е смены по 2 – 4 минуты 2. С пирт96 % - дв е смены по 2 – 3 минуты 3. С пирт70 % - один раз– 2 – 3 минуты 4. В одадистиллиров анная – 1 раз– 2 – 3 минуты и более Т ех никапров едения окраш ив ания. П ри окраске в одны ми красителями срез ы переносятиздистиллиров анной в оды , а при окраски спиртов ы ми – изспирта соотв етств ую щ ей конц ентрац ии, непосредств енно в красящ ий раств ор (прямое окраш ив ание) или сначала в ж идкость для протрав ки (непрямое окраш ив ание). П осле приобретения препаратом необх одимой интенсив ности окраски, его промы в аю т в в оде (или спирте) для удаления из бы ткакрасителя, аз атем, если нуж но, дифференц ирую т в соотв етств ую щ ей ж идкости. И з лиш ний красительотмы в аю тдо тех пор, пока он не перестанетперех одитьизсрез ав отмы в аю щ ую ж идкость. О краш ив ание срез ов , наклеенны х на стекла, мож но пров одить как путем помещ ения их в красящ ий раств ор, так и каплями красителя. П еред нанесением на гистологические срез ы красящ ие раств оры следует отфильтров ать. П родолж ительность окраш ив ания состав ляет 2 – 6 минут. П осле окраш ив ания срез ов гематоксилином из лиш ки красителя отмы в аю т в течение 3 – 5 минут в дистиллиров анной в оде, з атем помещ аю т препараты в в одопров одную в оду на 10 – 15 минут. П осле этого препарат в нов ь помещ аю т на 3 – 5 минут в дистиллиров анную в оду. Д ополнительно окраш ив аю тсрез ы эоз ином в течение 0,2 – 3 минут, после чего препаратпомещ аю тв дистиллиров анную в оду на3 – 5 минут. 5.2. Заклю чение срез ов в смолы 1. О без в ож ив ание срез ов осущ еств ляется погруж ением препаратов в спирты в оз растаю щ ей конц ентрац ии (60, 80, 96, 100%) на3 – 5 минут. 2. П росв етление срез ов пров одят поочередны м погруж ением препаратов на3 – 5 минутв три смены ксилола(или толуола). 3. Заклю чение срез ов . Д ля обез в ож енны х и просв етленны х препаратов наиболее часто применяемой средой з аклю чения яв ляется канадский бальз ам, представ ляю щ ий собой проз рачную древ есную смолу ж елтов атого ц в ета. Бальз ам обладает консерв ирую щ ими св ой ств ами, сох раняет проз рачность препарата и имеет показ атель преломления, близ кий к показ ателям

14 преломления стекла. Д ля з аклю чения срез ов использ ую т канадский или пих тов ы й бальз ам, раств оренны й в ксилоле до консистенц ии ж идкого меда. В ы нув стекло со срез ом изксилола, бы стро в ы тираю т ты льную сторону и, полож ив в гориз онтальном полож ении на стол, наносят несколько капель бальз ама. Затем берут приготов ленное чистое покров ное стекло (чисты м пинц етом или, осторож но, дв умя пальц ами з а боков ы е грани, чтобы не з агряз нить пов ерх ность), став ят его на предметное стекло рядом с препаратором под углом 45о и, как только бальз ам растечется по краю покров ного стекла, осторож но опускаю т, при этом в оз дух постепенно в ы тесняется и бальз ам покры в аетпрепараттонким, рав номерны м слоем. 5.3. П ракт ич еское задание V Ц ель работы – осв оить методику окраски гистологических срез ов и з аклю чения их в бальз ам. 1. П риготов ить «батарею » спиртов для депарафиниров ания гистологических срез ов и з аклю чения их в бальз ам. 2. О тфильтров ать гематоксилинов ы й краситель, приготов ленны й ранее. П роиз в ести депарафиниз ац ию и окраш ив ание гистологических срез ов , приготов ленны х на преды дущ ем з анятии, гематоксилинов ы м красителем с дополнительной окраской раств ором эоз ина. 3. П роиз в ести обез в ож ив ание и просв етление полученны х препаратов и з аклю читьих в бальз ам. Т Е М А 6. А НА Л И З Г И С Т О Л О Г И Ч Е С К И Х П РЕ П А РА Т О В О борудов ание и реактив ы : микроскопы , готов ы е гистологические препараты , иммерсионное масло. Д анная тема яв ляется итогов ой , определяется качеств о гистологических препаратов . С туденту необх одимо использ ов ать з нания, полученны е на лабораторны х з анятиях по курсу «Г истология». 6.1. П ракт ич еское задание VI Ц ель работы – анализприготов ленны х препаратов , определение в ида ткани, дифференц иров каклеточны х структур. 1. С использ ов анием св етов ого микроскопа идентифиц иров ать клетки на препаратах , окраш енны х гематоксилином – эоз ином (окуляр Х 15, объ ектив Х 20 и Х 40). 2. В ы яв ить ц итоморфологические особенности клеточны х структур – ядро, х роматин, Э П С , аппаратГ ольдж и в клетках раз ны х тканей (объ ектив Х 90, иммерсионное масло). 3. Зарисов атьклетки и их структуры . О формитьпротоколы з анятий .

15 П РИ Л О Ж Е НИ Е 1. С пособприг от овления абсолют ног о спирт а. Д ля получения абсолю тного спирта изнего необх одимо из в лечь в оду. Н асы пать порош ок обез в ож енного медного купороса (примерно 10 гна100 мл спирта) в чистую сух ую стеклянную буты лку с притертой пробкой и з алить960 этанолом. Буты лку периодически в стрях ив ать в течение 1 – 2– х дней . О без в ож енны й спирт отфильтров ать в чистую сух ую посуду с притертой стеклянной пробкой . П РИ Л О Ж Е НИ Е 2. П риг от овление спирт ов различ нойконцент рации. Д ля получения 96% в оды 100 мл спирта спирта 40% 42 58 45% 47 53 50% 52 48 60% 63 37 70% 73 27 80% 83 17 90% 94 6

Н еобх одимы й объ ем, мл 90% в оды 80% в оды спирта спирта 44 50 56 67 78 89 -

56 50 44 33 22 11 -

50 56 63 75 88 -

50 44 37 25 12 -

70% в оды спирта 57 64 71 86 -

43 36 29 14 -

Л И Т Е РАТ У РА 1. Бы ков В .Л . Ц итология и общ ая гистология / В .Л .Бы ков . – С П б.:С О Т И С , 2001.- 520 с. 2. Л абораторны е з анятия по курсу гистологии, ц итологии и эмбриологии / П од ред. Ю .И . Афанасьев а. – М . : В ы сш ая ш кола, 1990. – 398 с. 3. Рябов К.В . Г истология с основ ами эмбриологии / К.В .Рябов . – М инск : Беларусь, 1990.- 238 с.

С остав ительП оляков а– С еменов аН инаД митриев на. Редактор Т их омиров аО .А.

__________________________________________________________________ Заказ№ … .. от… … … 2005 г. Т ираж 50 экз . Л аборатория оператив ной полиграфии В Г У .