Вирус натуральной оспы - источник новых медицинских препаратов

S

U

M

M

A

R

Y

ÂÈÐÓÑ ÍÀÒÓÐÀËÜÍÎÉ ÎÑÏÛ — ÈÑÒÎ×ÍÈÊ ÍÎÂÛÕ ÌÅÄÈÖÈÍÑÊÈÕ ÏÐÅÏÀÐÀÒΠС.Н.ЩЕЛКУНОВ Новосибирский государственный университет

© Щелкунов С.Н., 1995

Показана принципиальная возможность создания новой группы медицинских препаратов на основе элементов генома вируса натуральной оспы. Индивидуальные белки данного вируса, полученные методами генной инженерии, могут быть эффективны при лечении целого ряда патологических состояний — аутоиммунных, воспалительных, септических и др. The possibility of the creation of new group medical preparations based on the elements of the genome of the natural smallpox virus is shown. Individual proteins of the given virus, produced by methods of genome engineering, may be effective upon the curing of a wide range of pathological conditions — autoimmune, inflammatory, sepsis, and other diseases.

Оспа (натуральная оспа) — одно из древнейших и наиболее опасных эпидемических заболеваний человека. С незапамятных времен она встречалась в Египте, а китайские летописи сообщают о существовании оспы в XII веке до н.э. Болезнь, по клиническим признакам соответствующая оспе, описана в одном из наиболее ранних источников индийской медицинской письменности (IX век до н.э.). С периода Крестовых Походов эпидемии этой опустошительной болезни не прекращались на европейском материке. Они были описаны в VI—VII веках во Франции, Италии, Испании и других странах. Первые описания тяжелых эпидемий оспы в России относятся к XV веку. К XVI веку в Европе оспа стала настолько обычным явлением, что о ней упоминали только в случаях чрезвычайно широкого распространения. В начале XVI века оспу завезли из Европы в Америку, в результате чего там из-за эпидемий погибали целые племена. Есть сообщения о том, что только в течение 1520 года в Мексике оспа унесла до 3,5 млн жизней. Оспа не только приводила к гибели огромного числа людей, но и оставляла после себя инвалидов — ослепших. В прошлом веке у половины слепых потеря зрения была связана с этой болезнью. Оспа представляет собой генерализованную инфекцию с характерным высыпанием на теле больного (рис.1). Показатели летальности (смертности) при этом заболевании колеблются в широком диапазоне — от 0,2% до почти 30% пораженных (табл. 1). Важная особенность натуральной оспы состоит в том, что она — антропонозная инфекция, то есть она передается только от человека к человеку и отсутствует природный резервуар возбудителя этого заболевания. Многие другие инфекции, например чума, — зоонозные болезни, когда возбудитель персистирует в организме диких животных и от них может передаваться человеку. Полагают, что оспа произошла от возбудителя зоонозной инфекции, но в процессе эволюционных изменений возбудитель оспы утратил способность эффективно передаваться и размножаться в организме большинства бывших природных хозяев, максимально адаптировавшись при этом лишь к организму человека. В этом плане данный возбудитель — вирус натуральной оспы — яркий пример тупика эволюции вируса. Активная борьба с оспой началась почти 200 лет назад — после того, как в 1796 году английский врач Эдвард Дженнер доказал возможность эффективной защиты человека от данного заболевания в результате прививки схожего, но гораздо менее тяжелого заболевания, известного под названием “оспа коров”. Такая процедура получила название вакцинация (по-латыни корова — “вакка”). С тех пор всякие прививки, предохраняющие человека от патогенных микроорганизмов, называют вакцинацией.

Соросовский Образовательный Журнал, №1, 1995

Рис.1. Карточка Всемирной организации здравоохранения с фотографией типичного случая натуральной оспы для распознавания случаев заболевания, которая использовалась при осуществлении эпиднадзора по оспе.

Постепенно методы получения вакцин против оспы и способы их применения совершенствовались, что позволяло осуществлять вакцинацию против данного заболевания во все более широких масштабах и в различных климатических зонах. К середине нашего столетия многие страны добились ликвидации оспы на своих территориях. Однако противооспенные мероприятия неудовлетворительно проводились на территориях колоний и в экономически слабо развитых странах. Поэтому данная болезнь оставалась эндемичной в ряде стран Азии, Африки и Южной Америки. В 1958 году на сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения по предложению делегации СССР была принята резолюция о проведении мероприятий, обеспечивающих ликвидацию оспы на земном шаре. Огромные усилия мирового сообщества увенчались успехом: в 1977 году зарегистрирован последний случай заболевания оспой (табл. 2), и с тех пор случаи натуральной оспы более отмечены не были. Таким образом, оспа — это первое и пока Таблица 1 Показатели летальности при оспе (данные ВОЗ) Страна

Год

Число случаев заболевания

Число Летальсмертельных ность исходов (%)

Индия

1974−75

2 826

575

Бангладеш Пакистан Индонезия Танзания Уганда Судан Эфиопия Бразилия Сомали Ботcвана

1975 1971 1969 1967−70 1966−70 1970−72 1972−74 1969 1977 1972

1 127 1 674 11 966 2 232 1 045 2 979 21 250 6 795 3 229 1 059

207 249 950 167 54 35 243 37 12 2

20,3 (6,2/26,5)* 18,4 14,9 7,9 7,5 5,2 1,2 1,1 0,5 0,4 0,2

Приведены суммарные данные для заболевших, как ранее вакцинированных, так и невакцинированных против оспы. *Данные для вакцинированных/невакцинированных.

единственное инфекционное заболевание, которое удалось искоренить. После объявления в 1980 году о полной ликвидации оспы во всем мире прекращена массовая вакцинация против данного заболевания. В то же время до сих пор существуют зоонозные инфекции человека, вызываемые вирусами оспы обезьян и оспы коров. Причем вирус оспы обезьян может обусловливать оспоподобное заболевание человека, которое в высоком проценте случаев завершается летальным исходом. Что касается оспы коров, то к ее возбудителю чувствителен очень широкий круг животных. Этот вирус также патогенен для человека и иногда может приводить к генерализованной инфекции, завершающейся летальными исходами. Основное отличие вирусов оспы обезьян и оспы коров от вируса натуральной оспы состоит в том, что первые два не вызывают эпидемических вспышек среди людей. Однако не исключено, что в процессе эволюционных изменений они смогут приобрести и такие свойства. Подробное изучение вирусов натуральной оспы, оспы обезьян и оспы коров, проведенное в последние годы, показало, что эти возбудители — близкие родственники; они объединены в один род ортопоксвирусов (Orthopoxvirus). Начиная с 1991 года под эгидой Всемирной организации здравоохранения осуществляется международная программа по молекулярно-биологическому изучению разных изолятов вируса натуральной оспы (ВНО). В настоящее время в мире существует только две коллекции штаммов ВНО. Эти коллекции находятся в России и США — поэтому основной объем исследований ВНО выполняется учеными этих стран (Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор”, п. Кольцово и Центр инфекционных заболеваний, г. Атланта). Таблица 2 Ликвидация оспы на Земном шаре 1948 г. — Решение I сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения (ВАЗ) о создании исследовательской группы по оспе. 1958 г. — Резолюция XI сессии ВАЗ о проведении мероприятий, обеспечивающих ликвидацию оспы во всем мире. 1966 г. — Решение XIX сессии ВАЗ о необходимости интенсификации программы ликвидации оспы. 1967 г. — Оспа эпидемична в 33 странах с общим населением 1200 млн человек. За год зафиксировано 10−15 млн случаев оспы и умерло около 2 млн человек. 1977 г. — Последний случай заболевания человека оспой (Сомали). 1980 г. — Декларация XXXIII сессии ВАЗ о глобальной ликвидации оспы.

Щелкунов С.Н. Вирус натуральной оспы – источник новых медицинских препаратов

29

Таблица 3 Генетическая организация вируса натуральной оспы

Рис.2. Схематическое изображение в одном масштабе трех типов патогенных микроорганизмов.

Следует сказать, что ортопоксвирусы и, в частности, ВНО относятся к крупнейшим по размерам вирусам животных. На рис.2 в одном масштабе изображены вирионы ВНО и одного из самых мелких вирусов — полиовируса (возбудителя полиомиелита — детского паралича), а также цепочка очень мелких шарообразных клеток пневмококка (возбудителя пневмонии человека). При таком сравнении ВНО выглядит гигантом. В 1992 году нами расшифрована полная последовательность нуклеотидов ДНК ВНО штамма Индия-1967. Американские коллеги в 1993 году завершили анализ своего штамма Бангладеш-1975. В 1994 году совместными усилиями было проведено сравнение полученных данных. Геном ВНО представлен крупной двухцепочечной линейной молекулой ДНК, концы которой ковалентно замкнуты (как теломеры эукариотических хромосом). ВНО кодирует около 200 белков. Много это или мало? Для вируса, размножающегося в клетке и использующего для этого многочисленные ее компоненты, — очень много. Так, онкогенному ретровирусу достаточно четырех генов для своего размножения и индукции злокачественного роста (рака) в организме хозяина. Однако в отличие от ретровируса и большинства других вирусов, размножающихся в ядре клетки, жизненный цикл поксвирусов полностью проходит в цитоплазме клетки. Известно, что ядро клетки содержит множество ферментов, необходимых для синтеза и модификации молекул РНК и ДНК, — поэтому ядерные вирусы используют этот сложный биосинтетический аппарат клетки-хозяина. А вот в цитоплазме клетки многие из данных ферментов отсутствуют, в силу чего цитоплазматические вирусы вынуждены сами синтезировать такие ферменты и, более того, часть из них упаковывать в вирусную частицу и “носить” их с собой. В настоящее время уже идентифицировано большинство генов, обеспечивающих биосинтез молекул ДНК и РНК поксвирусов. Также выявлено множество генов, кодирующих белки, которые необходимы для постройки вирусных частиц. Однако главный вопрос заключается в следующем: что обусловливает патогенность вируса натуральной оспы? Для того чтобы ответить на этот вопрос, прежде всего надо знать, сколько генов ответственны за патогенные свойства ВНО. Один, два, три? До недавнего времени так и думали. Однако выяснилось, что проявление свойств патогенности поксвирусов регулируется относительно большим набором разных

30

Размер ДНК — 186 тыс. пар нуклеотидов. — 196 потенциальных генов. Идентифицировано более 30 генов, обеспечивающих биосинтез молекул ДНК и РНК вируса. Выявлено около 50 генов, белковые продукты которых входят в состав вирионов. Доказано, что не менее 20 генов важны для проявления свойств патогенности вируса.

вирусных белков — факторов вирулентности (см. табл.3). Для ученых и медиков именно эти молекулярные факторы вирулентности ВНО представляют особый интерес. К настоящему времени эти факторы подразделяют на три группы (табл. 4). Причем для целей медицины наиболее важными могут быть ингибиторы воспалительных реакций, белки, контролирующие систему комплемента (см. ниже) и модуляторы иммунного ответа хозяина. Известно, что организм человека обладает целым рядом защитных реакций, направленных против инфекционных агентов. Первые (немедленные) защитные реакции — это реакции неспецифические, то есть они универсально направлены против любых чужеродных клеток, вирусов, крупных молекул. Вторичные защитные реакции — уже высокоспецифичные, и осуществляются они иммунной системой организма. На запуск этой системы необходимо некоторое время. Одной из первых линий защиты организма от вирусной инфекции служат воспалительные процессы, которые — пока не сформировался полноценный иммунный ответ — быстро индуцируются для ограничения распространения вируса в первые часы и дни после инфицирования. Ключевую роль в индукции воспалительных реакций играют такие цитокины (молекулярные сигналы), как фактор некроза опухоли (ФНО) и интерлейкин-1β (ИЛ-1β). Другие неспецифические защитные реакции осуществляет система комплемента. Согласно современным представлениям комплемент — это многокомпонентная система белков (более 20), которые циркулируют в кровяном русле. Основные функции комплемента — распознавание, разрушение и удаление из организма генетически чужеродного материала. Кроме того, комплемент играет важную роль и в регуляции воспалительных и иммунологических реакций организма. Фактор некроза опухоли и гамма-интерферон (γ-ИФН) относятся к важнейшим регуляторам иммунной системы организма. Проявляют они также и прямую антивирусную активность. Исследования последних двух-трех лет позволили сделать вывод, что ВНО способен синтезировать белки, которые, секретируясь из зараженной клетки, могут связывать (инактивировать) такие важнейшие цитокины, как фактор некроза, γ-ИФН, а также белки системы комплемента. Более того, ВНО предотвращает секрецию из зараженной клетки цитокина ИЛ-1β (синтез и секреция ИЛ-1β представляет собой общую реакцию клетки в ответ на заражение любым

Соросовский Образовательный Журнал, №1, 1995

Таблица 4 Молекулярные факторы вирулентности вируса натуральной оспы 1. Модуляторы защитных механизмов хозяина — Ингибиторы воспалительных реакций. — Белки, контролирующие систему комплемента. — Модуляторы иммунного ответа хозяина. — Ингибиторы действия интерферона. — Модуляторы системных эффектов вирусной инфекции на организм. 2. Белковые факторы, необходимые для эффективного распространения вируса в организме. 3. Белки, обеспечивающие эффективную репликацию вируса в организме.

вирусом, направленную на индукцию воспалительных и иммунных реакций организма). Результат такой “круговой молекулярной обороны” ВНО (рис. 3) проявляется в том, что подавляется развитие неспецифических и специфических защитных реакций организма. Это и позволяет вирусу активно размножаться и разноситься по зараженному организму. В результате развивается острое генерализованное заболевание. На примере других поксвирусов (в частности, вируса миксомы кроликов) показано, что вирусные белки, связывающие цитокины, проявляют ярко выраженную видовую специфичность по отношению к цитокинам их природного хозяина (в котором они размножаются). ВНО в процессе своей эволюции сузил круг хозяев практически до одного вида — человека. Это, мы полагаем, привело к тому, что соответствующие белки ВНО с высокой эффективностью взаимодействуют с фактором некроза опухоли, γ-ИФН, белками комплемента человека и обеспечивают вирусу возможность эффективного преодоления защитных барьеров организма. Такие вирусные белки могут быть полезны в медицине, так как в случае многих патологических состояний у человека наблюдается повышенное содержание либо фактора некроза опухоли, либо γ-ИФН, либо белков системы комплемента. Используя узконаправленные вирусные белки-инактиваторы, можно добиться лечения целого ряда таких патологий за счет связывания упомянутых выше факторов. γ - ИФН

ИЛ-1β

Таблица 5 Потенциальное использование ФНО-связывающего белка вируса натуральной оспы в терапии — Септический (эндотоксический) шок. — Ревматоидный артрит. — Церебральная малярия. — Цитомегаловирусная инфекция пациентов, получающих препараты иммуносупрессоров.

Таблица 6 Возможные области применения комплемент-связывающего белка вируса натуральной оспы — Снижение повышенной свертываемости крови, наблюдаемой у пациентов после удаления вилочковой железы (тимуса). — Противовоспалительное действие. — Снятие гетеротрансфузионного шока, возникающего при переливании крови.

Учитывая эти предположения, мы начали работы по получению методами генетической инженерии бактериальных штаммов-продуцентов индивидуальных белков вируса натуральной оспы, связывающих фактор некроза, γ-ИФН и белки системы комплемента. Уже создан вариант кишечной палочки Escherichia coli, продуцирующий в большом количестве γ-ИФН-связывающий белок ВНО. Показано, что такой белок эффективно взаимодействует с гамма-интерфероном человека и подавляет его биологическую активность. Таким образом, на примере вируса натуральной оспы мы пытаемся реализовать подход, который в принципе использован при применении змеиного яда. При “природном” способе попадания в организм человека — через укус змеи — змеиный яд часто приводит к смертельному исходу. Однако вводя тот же самый яд (или его компоненты) в очень малом количестве в определенные препараты, можно добиться в ряде случаев высокого лечебного эффекта. Также и с вирусом натуральной оспы: обычное заражение им людей в большом проценте случаев приводит к заболеваниям со смертельным исходом, в отличие от чего использование определенных индивидуальных белков этого вируса может быть эффективным при лечении различных, в том числе тяжелых патологических состояний человека (табл.5—6), тех, для которых пока не найдено методов лечения или которые поддаются лечению с большим трудом. ЛИТЕРАТУРА

Рис.3. Схема преодоления вирусом натуральной оспы антивирусной активности цитокинов и системы комплемента зараженного организма.

Ладный И.Д. Ликвидация оспы и предупреждение ее возврата. — М.: Медицина, 1985. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: Учеб. пособие: ч. 2. — Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 1995.

Щелкунов С.Н. Вирус натуральной оспы – источник новых медицинских препаратов

31