Методические указания к лабораторному практикуму по микробиологии для студентов 3 курса ОЗО

Министерство образования Российской Федерации Ростовский государственный университет Биолого-почвенный факультет Кафедра биохимии и микробиологии

Полякова А.В. Велигонова Н.В. Патрушева Е.В.

Методические указания к лабораторному практикуму по микробиологии для студентов 3 курса ОЗО

Ростов-на-Дону 2001

2

Печатается по решению кафедры биохимии и микробиологии. Протокол № 9 от 4 апреля 2001 г.

3 ЗАНЯТИЕ I Тема: 1. Правила работы при выполнении микробиологического

практикума.

Техника безопасности в микробиологической лаборатории. 2. Микроскоп. Основные правила микроскопирования. микроскопического исследования 3.

Знакомство

с

Методы

микроорганизмов.

морфологией

бактерий,

актиномицетов,

грибов.

Препараты «раздавленной капли», «висячей капли», «отпечаток». 4.

Прижизненная

окраска

внутриклеточных

органелл

(цитоплазма

дрожжей). 1.

Правила

работы

при

выполнении

микробиологического

практикума. Техника безопасности в микробиологической лаборатории. При работе в микробиологической лаборатории необходимо соблюдать определенные правила поведения. Занятие начинают со знакомства с инструкцией по технике безопасности. В лабораторию запрещается входить в верхней одежде и класть на столы сумки, портфели и другие личные вещи. В микробиологической лаборатории разрешается работать только в халатах и косынках (шапочках), которые защищают одежду и волосы от контаминации микроорганизмами, а также препятствуют их распространению за пределы лаборатории. За каждым студентом закрепляется постоянное рабочее место и микроскоп. Рабочее место во время занятий должно поддерживаться в полном порядке. На

всех

пробирках

и

чашках

обязательно

пишется

название

микроорганизма, дата его посева, фамилия студента, номер группы. В ходе работы бактериологические петли и иглы обеззараживаются прокаливанием в пламени горелки до и после отбора микроорганизмов. Приготавливая препарат или производя пересев культур микроорганизмов, выросших в жидкой среде, пользуются не петлей, а пипеткой, в верхний конец которой должен быть вложен кусочек ваты, чтобы не допустить случайного соприкосновения микробного материала с полостью рта. Использованные шпатели, пипетки помещаются в фарфоровые стаканы с дезинфицирующими растворами

(1%

фильтровальную кристаллизатор.

раствор бумагу, Класть

на

хлорамина,

3%

отработанные стол

раствор

фенола),

препараты

названные

предметы

спички,

помещают

в

категорически

запрещается. Все препараты готовят на специальных стеклянных мостиках над

4 кристаллизатором. В

случае

попадания

исследуемого

материала

или

культуры

микроорганизмов на руки, стол, халат или обувь необходимо сообщить об этом преподавателю и под его руководством провести дезинфекцию. В лаборатории категорически запрещается принимать пищу. После

окончания

занятия

рабочее

место

дезинфицируется,

использованный материал и другие предметы сдаются лаборанту, моются с мылом руки, помещение проветривают (30-60 мин), облучают УФ - лампами. Результаты исследований протоколируются. ХОД РАБОТЫ 1. Изучить инструкции по технике безопасности для студентов, работающих в лаборатории микробиологии, правила работы при выполнении микробиологического практикума. 2. Познакомиться с оборудованием микробиологической лаборатории. 2. Микроскоп. Основные правила микроскопирования. Методы микроскопического исследования микроорганизмов. Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величины которых измеряются микрометрами

(1 мкм = 0,001 мм), нанометрами (1 нм =

0,001 мкм), ангстремами (1 А° = 0,1 нм), возможно только с помощью микроскопов. Наиболее

распространены

и

удобны

для

микробиологических

исследований прозрачных объектов в проходящем свете микроскопы МБИ-1, МБР-1, БИОЛАМ 70Р (рабочий), С (студенческий), Д (дорожный). Микроскоп имеет механическую и оптическую части. Механическая часть микроскопа включает штатив с предметным столиком, тубус, макро- и микрометрические винты. Верхняя часть штатива тубусодержатель - может перемещаться на 50 мм с помощью механизма, приводимого в действие вращением макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и тонкой фокусировки препарата. При вращении этих винтов по часовой стрелке тубусодержатель микроскопа опускается, при вращении против часовой стрелки - поднимается. В верхней части

тубусодержателя

находится

револьвер,

в

отверстия

которого

ввинчиваются объективы и тубус. Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата, объектива и окуляра.

5 Осветительный аппарат состоит из зеркала и конденсора. Зеркало отражает падающий на него свет и направляет его в конденсор. Одна сторона зеркала плоская, и ее используют при любом источнике света и при любом увеличении. Другую, вогнутую, сторону зеркала употребляют при малых увеличениях без конденсора. Конденсор, состоящий из нескольких линз, собирает отраженный от зеркала свет в пучок, направляемый непосредственно на плоскость препарата. Под конденсором имеется ирисовая диафрагма и откидная оправа для светофильтра. Ирисовая диафрагма служит для задержания лишних лучей света и позволяет при необходимости уменьшить аппертуру конденсора (аппертура - это “охват” линзы, она характеризуется количеством лучей, попадающих в линзу). Объектив представляет собой наиболее важную часть микроскопа. Он состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу, которые дают действительное увеличенное обратное изображение. В микроскопах МБР-1, БИОЛАМ используются объективы, дающие увеличение в 8, 40 и 90 раз. Увеличение объектива зависит от фокусного расстояния фронтальной линзы и, следовательно, от ее кривизны. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива. Поэтому, чем большее увеличение дает объектив, тем ниже его следует опускать над плоскостью препарата. При 8х объективе расстояние между фронтальной линзой объектива и исследуемым объектом равно 8,53 мм, при 40х - 0,4 мм, при 90х- 0,1 мм. Изображение, получаемое при помощи линз, обладает рядом недостатков - аберраций. Наиболее существенные - сферическая (каждая точка объекта имеет вид кружочка, а не точки, изображение не резкое, размытое) и хроматическая (получаемое изображение приобретает окраску, которую не имеет объект) аберрации. Объективы, у которых аберрации скоррегированы не полностью, называются ахроматами. Они содержат до шести линз и дают изображение наиболее резкое в центре. Более совершенные объективы апохроматы - могут состоять из 10-12 линз, хроматическая погрешность в них в 10 раз меньше, чем у ахроматов. Планохроматы полностью устраняют искривление поля зрения, их применяют при микрофотографировании. Окуляр служит для рассмотрения изображения объекта, увеличенного с помощью

объектива,

и

содержит

две

линзы:

глазную

(верхнюю)

и

собирательную (нижнюю). Окуляры могут давать увеличение в 5, 7, 10, 12, 15 и 20 раз, что указано на их оправе.

6 Увеличение, которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения

объектива

на

увеличение

окуляра.

Бинокуляры

имеют

дополнительное увеличение насадки (она предназначена для наблюдения объекта одновременно двумя глазами). Однако общее увеличение еще не характеризует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изображение может оказаться как четким, так и нечетким. Отчетливость получаемого изображения

определяется

разрешающей

способностью

микроскопа

-

минимальным расстоянием между двумя точками, когда они еще не сливаются в одну. Чем больше разрешающая способность микроскопа, тем меньшей величины объект можно увидеть. Повысить ее можно двумя путями: либо освещая объект короткими лучами света, например УФ, либо увеличивая показатель преломления среды (n), граничащей с линзой, с тем, чтобы приблизить его к показателю преломления стекла, на котором находится объект

(n

стекла

=

1,5).

В

целом

микроскопический

объект

может

рассматриваться в трех типах системы: сухой - между линзой объектива и объектом находится воздух (n = 1); водной - между линзой объектива и объектом находится капля воды (n = 1,3) - водная иммерсия; масляной - линза объектива погружается в каплю иммерсионного масла - кедрового, касторового, вазелинового (n = 1,52) - масляная иммерсия. При микроскопии в дневное время можно пользоваться естественным светом, однако, чаще прибегают к источникам искусственного света, которые обеспечивают интенсивное регулируемое освещение (осветители типа ОИ - 19, ОИ - 35). При установки света конденсор должен быть поднят до упора, ирисовая

диафрагма

открыта;

настройка

освещения

производится

с

объективом малого увеличения (8х). Объектив опускают на расстояние около 0,8 см от предметного стекла и, вращая зеркало, добиваются равномерного и яркого

освещения.

Яркость

освещения

следует

регулировать

только

изменением накала лампы осветителя или применением светофильтров. Положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не изменять! Диафрагмой

конденсора

можно

пользоваться

только

для

изменения

контрастности изображения. На предметный столик помещают препарат, закрепляют его боковыми зажимами и изучают сначала с объективом 8х. Для детального изучения препарата пользуются объективом 40х, осуществляя фокусировку только микровинтом! После просмотра препарата переводят револьвер на увеличение

7 8х и только после этого снимают препарат с предметного столика. Микроскоп в нерабочем состоянии должен находиться на увеличении 8х! ХОД РАБОТЫ 1. Ознакомиться с устройством биологического микроскопа и правилами обращения с ним. 3. Знакомство с морфологией бактерий, актиномицетов, грибов. Препараты «раздавленная капля», «висячая капля», «отпечаток» Морфология бактерий. Бактерии по форме делятся на несколько групп: сферические, цилиндрические, спиральные, необычной формы и нитчатые. Сферические бактерии, или кокки (гр. κοκκοs - ягода, зерно), имеют округлую форму. В зависимости от расположения клеток после их деления подразделяются на группы: Микро- (или моно-) кокки Диплококки Стрептококки Тетракокки Сарцины Стафилококки

Кроме круглой формы кокки могут быть ланцетовидными, овальными, удлиненными, чечевицеобразными и др. Большинство кокков неподвижны и не образуют эндоспор. Цилиндрическая форма (гр. Bacteria – палочка, лат. Bacillum – палочка) характерна

для

большинства

бактерий.

Палочковидные

бактерии

подразделяются на образующие и не образующие эндоспор. Палочки, образующие споры, называют бациллами. Спорообразование у бактерий – способ перенесения неблагоприятных внешних воздействий. В клетке образуется только одна спора. Различают три вида спорообразования:

8

Бациллярный Клостридиальный Плектридиальный Среди палочковидных бактерий есть подвижные и неподвижные формы. Подвижные имеют жгутики: Перитрих

Лофотрих Амфитрих

Монотрих Спиральной формы бактерии различаются количеством и характером завитков, длиной и толщиной клеток. Их можно разделить на не гнущиеся (вибрионы – изгиб не превышает ¼ оборота спирали, спириллы – имеют один или несколько правильных витков) и изгибающиеся (спирохеты – имеют много витков, напоминают штопор). Необычные тороидальные,

формы

бактерий

звездообразные,

морфологически

канатоподобные,

разнообразны: тубероидальные,

червеобразные и др. Нитчатые формы бактерий – это в большинстве случаев палочковидные клетки, которые соединяются в длинные цепочки, объединяемые слизью, чехлами или общей оболочкой. Для

определения

формы

бактерий,

способности

их

к

спорообразованию, подвижности достаточно исследовать их в живом состоянии

9 на препаратах «раздавленная» и «висячая капля». Препарат «раздавленная капля» На

чистое

предметное

стекло

наносится

небольшая

капля

водопроводной воды; дистиллированную воду брать не рекомендуется, так как в ней отсутствуют необходимая для микробов концентрация солей, что может вызвать изменение формы клеток, потерю ими подвижности и т. д. В каплю воды

бактериологической

петлей,

прокаленной

в

пламене

горелки

и

охлажденной, помещают исследуемый материал. Им могут служить настои мяса, рыбы, белка яйца, навоза, сена, картофеля, гороха и прочие, а также чистые культуры микроорганизмов. Препарат накрывают покровным стеклом, помещают на предметный столик микроскопа и исследуют в сухой системе. В препарате можно найти микро-, дипло-, стрептококки, бактерии, бациллы. По характеру их движения можно предположить тип жгутикования (сами

жгутики

кувыркающиеся

в

живом

препарате

движения,

увидеть

монотрих,

не

удается):

лофотрих

–

перитрих

–

направленное,

стремительное. Споры в водном препарате отличаются от микрококков резкой очерченностью, сильно преломляют свет и кажутся блестящими или темными. Препарат «раздавленная капля» быстро готовится, и позволяет установить

форму

клеток

микроорганизмов,

их

размеры,

способ

спорообразования, а также наличие или отсутствие подвижности, но, к сожалению, является недолговечным. Препарат «висячая капля» «Висячей каплей» удобнее пользоваться для наблюдения подвижности микробов, их развития, размножения, прорастанием спор. Для

приготовления

препарата

небольшую

каплю

суспензии

микроорганизмов наносят на покровное стекло, переворачивают

его каплей

вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением в центре. (рис. 1).

10 Препарат «висячая капля» 2

3

1

Условные обозначения: 1- предметное стекло с углублением в центре, 2 – покровное стекло, 3 – капля суспензии микроорганизмаов.

Рис. 1 Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметически заключенной во влажной камере, что допускает многодневное наблюдение за объектом. Морфология актиномицетов Общим признаком актиномицетов, или ветвящихся бактерий, является способность образовывать при развитии в питательной среде мицелий толщиной 0,6 – 1,4 мкм. У одних актиномицетов мицелий хорошо развит, у других способность к его образованию выражена лишь в тенденции клеток к ветвлению и проявляется в строго определенных условиях. По строению клетки и ее химическому составу актиномицеты во многом напоминают бактерии, а по способности образовывать мицелий и строению органов плодоношения – грибы. Колонии

актиномицетов

представляют

собой

сложную

систему

несептированных гиф, часть которых при росте на агаризованной среде проникают в субстрат – субстратный мицелий, а другая часть свободно ветвится в воздухе и образует на поверхности колонии пушистый, бархатистый или мучнистый налет, состоящий из гиф воздушного мицелия. Размножаются

актиномицеты

обрывками

мицелия

или

спорами,

образующимися бесполым путем и располагающимися одиночно, парами, цепочками или в спорангиях. Морфология плесневых грибов Под

названием

«плесневые

грибы»

объединяют

представителей

различных классов грибов. Вегетативное тело грибов организовано в виде мицелия. На плотных средах плесени образуют пушистый паутинообразный налет различной окраски. Воздушный мицелий состоит преимущественно из

11 спороносной части гриба, вегетативное тело проникает в субстрат. Плесени размножаются спорами и участками мицелия. Мицелий Фикомицетов (Mucor, Rhizopus)

несептированный,

на

отдельных

его

веточках

образуются

спорангиеносцы с шаровидными спорангиями, наполненными эндоспорами. Мицелий Аскомицетов (Penicillium, Aspergillus) септирован, они образуют преимущественно конидиальные спороношения. Строение колоний и мицелия, его ветвление, строение и расположение спороносцев можно изучать, просматривая колонии актиномицетов и грибов, выросшие на плотной питательной среде в чашках Петри при малом увеличении микроскопа. Препарат «отпечаток» Для знакомства с формой спор

и мицелия актиномицетов и грибов

делают препарат «отпечаток». Чистое покровное стекло накладывают на газон микроорганизма, слегка надавливают на него пинцетом, и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды, на предметное стекло и рассматривают под микроскопом в сухой системе. Этот препарат также удобен для изучения естественного расположения клеток в колониях микроорганизмов. ХОД РАБОТЫ 1. Приготовить препарат «раздавленная капля» настоя гороха или картофеля и изучить формы бактерий. Обратить внимание на характер спорообразования, движения палочковидных форм. Сделать зарисовки в тетради. 2.

Просмотреть

колонии

актиномицетов

или

плесневых

грибов,

выращенных на плотной питательной среде в чашках Петри, при малом увеличении микроскопа, а также приготовить препараты «отпечатки» и изучить строение мицелия и споронсцев со спорами. Зарисовать и обозначить их. 4. Прижизненная окраска внутриклеточных органелл Окраска микроорганизмов – сложный физико-химический процесс, в котором играют роль явления электроадсорбции, капиллярности, химического сродства между красителем и объектом. Некоторые красители характеризуются избирательным сродством к отдельным компонентам клетки (ядерному веществу, включениям) и применяются для их выделения. Для окраски микроорганизмов используют анилиновые красители

12 (основные, кислые и нейтральные). К кислым красителям относят те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), - анион. У основных красителей хромофором является катион. Наибольшее применение имеют основные красители:

основной

фуксин,

сафранин

(красные),

генцианвиолет

(фиолетовый), метиленовая синь, малахитовая зелень. Из кислых красок широкое применение находят кислый фуксин, эритрозин (красные), конго, пикриновая кислота (желтые), нигрозин (черная). Пользуясь комбинацией кислых и основных красок, можно произвести дифференциацию структурных частей клетки (ядра, протоплазмы и т. д.). Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. Прижизненной окраской следует считать лишь такую, при которой окрашенные

микроорганизмы

остаются

длительное

время

живыми

и

способными к размножению. Для прижизненной окраски применяют красители в очень сильных разведениях – от 0,001 до 0,0001 %. Морфология дрожжей Термин «дрожжи» не имеет таксономического значения. К дрожжам относят все грибы, которые вегетативно размножаются в одноклеточной форме независимо от того, имеют или не имеют они мицелиальную фазу. Дрожжевая клетка может иметь круглую, овальную, лимоновидную, бутылевидную, треугольную или серповидную форму. Размеры клеток от 2 – 3 мкм до 25 – 50 мкм в длину, ширина не превышает 10 мкм. Некоторые почвенные дрожжи (Lipomyces, Cryptococcus) способны образовывать капсулы. Наиболее обычным способом вегетативного размножения является почкование. Дрожжам свойственен и половой процесс. Образование спор у дрожжей

–

одновременно

и

процесс

формирования

устойчивых

к

неблагоприятным воздействиям форм. Наблюдение за строением и размножением дрожжевых клеток с помощью микроскопа проводят на живых культурах, приготавливая нативные и окрашенные препараты «раздавленной» и «висячей капли». Прижизненная окраска цитоплазмы дрожжей К суспензии дрожжей на предметном стекле добавляют каплю раствора метиленового синего (1:100), накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Подобным

образом

дифференцируют

живые

и

мертвые

клетки

дрожжей. Мертвые клетки окрашиваются быстрее и ярче за счет повышения

13 проницаемости клеточной оболочки. ХОД РАБОТЫ 1.

Приготовить

и

рассмотреть

окрашенный

метиленовой

синью

препарат дрожжей. Найти мертвые, живые, почкующиеся клетки. Зарисовать, сделать необходимые обозначения. ЗАНЯТИЕ II Тема:

1.

Питательные

среды.

Принципы

их

составления.

Способы

стерилизации питательных сред, посуды, инструментария. 2. Исследование микрофлоры воздуха. 3.

Особенности

роста

микроорганизмов

на

плотных

средах

(культуральные признаки). 4. Фиксированный препарат. Окраска по Граму. 5. Влияние ультрафиолетовых лучей на микроорганизмы. 6. Действие антибиотиков на микроорганизмы. 1. Питательные среды. Принципы их составления. Способы стерилизации питательных сред, посуды, инструментария Для

накопления,

выделения,

культивирования

и

сохранения

микроорганизмов пользуются питательными средами, которые не только содержат

питательные

вещества,

но

и

являются

средой

обитания

микроорганизмов. Поэтому при составлении сред учитывают как потребности микроорганизмов в веществах, необходимых для их жизни, так и физикохимические условия, в которых микроорганизмы могут осуществлять обмен между клеткой и средой. Требования, предъявляемые к питательным средам •

Среды должны содержать все необходимые для микроорганизмов

источники

питания.

Недостаток

или

избыток

питательных

элементов

неблагоприятны для роста микроорганизмов. Специфичность питательных сред определяется набором соединений, поставляющих клеткам углерод и азот. Минеральный фон сред для многих микроорганизмов бывает очень близок по составу, так как микроорганизмы по потребностям в минеральных веществах менее разнообразны. По мере необходимости в среды добавляют факторы роста (витамины, гормоны) в незначительных концентрациях. •

Среды должны содержать отдельные ингредиенты в определенных

соотношениях, примерно соответствующих соотношению их в клетке. Для

14 большинства гетеротрофов применяют среды, содержащие 0,8 – 1,2 г/л аминного азота (в составе NH2), 2,5 – 3,0 г/л общего азота, 1% пептона и 0,5 % хлоридов (NaCl). Соотношение углерода и азота должно составлять 20:1. •

Среды

должны

иметь

достаточную

влажность,

обеспечивающую

возможность диффузии питательных веществ в клетку. •

Важным

фактором

является

кислотность

среды.

Большинство

микроорганизмов развиваются при нейтральной или слабо-щелочной реакции среды. Грибы обычно развиваются в более кислой среде, чем бактерии. Есть среди

бактерий

кислотоустойчивые

(молочнокислые,

уксуснокислые),

ацидофильные (Acetobacter acidophillus) и щелочеустойчивые (уробактерии). В процессе стерилизации сред и культивирования микроорганизмов рН может изменяться. Чтобы избежать этого, в среду добавляют буферные системы (фосфатные буферы) или мел. •

Среды

должны

обладать

определенным

окислительно-

восстановительным потенциалом, определяющим насыщение их кислородом (rH2). По шкале от 0 до 41 этим индексом можно обозначит любую степень аэробности: насыщенный кислородом раствор обозначают rH2=41, насыщенный водородом – rH2=0. Анаэробы размножаются при rH2<5, аэробы – при rH2>10. •

Среды должны быть изотоничными для микробной клетки, т. е.

осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Большинство бактерий могут расти на средах с 0,1 – 10 % NaCl. •

Среды должны быть стерильными, чтобы обеспечить рост чистых

культур микроорганизмов. Классификации питательных сред По

происхождению

питательные

среды

можно

разделить

на

натуральные, синтетические, полусинтетические. Натуральными продуктов

животного

обычно

называются

или

растительного

среды,

которые

происхождения,

состоят

из

имеющие

неопределенный химический состав. Основой таких сред являются злаки, травы, овощи, фрукты, молоко, животные ткани, кровь, сыворотка, мясо, почва, вода морей, озер и минеральных источников, яйца, шерсть, дрожжи. Большинство из них используется в виде экстрактов, отваров, настоев. Примеры таких сред – мясо-пептонный бульон (МПБ) для гетеротрофов, неохмеленное пивное сусло для дрожжей, почвенная выдержка для почвенных микроорганизмов. Натуральные среды используются главным образом для

15 поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и для диагностических целей. Компонентами

полусинтетических

сред

наряду

с

соединениями

известного состава (углеводы, фосфаты, нитраты и др.) являются натуральные продукты неопределенного состава (мясной отвар, пивное сусло). Такие среды находят широкое применение в промышленной микробиологии. Синтетические среды – это такие среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Эти среды готовят только на дистиллированной воде. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. По назначению среды делят на: 1.

Универсальные (МПА, МПБ и др.). На них растут многие

микроорганизмы. 2.

Специальные. Эти среды применяют для выращивания бактерий,

не размножающихся на универсальных средах. Среди специальных сред различают элективные и дифференциально-диагностические. Элективные (избирательные) среды подобраны таким образом, чтобы обеспечить наиболее благоприятные условия для выращивания определенных микроорганизмов. Их применяют для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания или для получения накопительных культур. К таким средам относятся среда

Эшби

для

Azotobacter,

среда

Виноградского

для

Clostridium.

Дифференциально-диагностические среды используют для дифференциации определенных видов бактерий по их культуральным и биохимическим свойствам. К таким средам относят среды с молоком, желатином, на которых определяют протеолитические свойства микробов. В состав дефференциальнодиагностических

сред

могут

входить

индикаторы

(феноловый

красный,

метиленовый синий и т.д.), которые изменяя окраску при различных значениях рН, указывают на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления вводимого в среду субстрата. Примером таких сред является среда Эндо, применяемая для выделения и определения бактерий кишечной группы, на которой колонии кишечной палочки окрашиваются в красный цвет с металлическим блеском. По физическому состоянию среды разделяются на жидкие, плотные, сыпучие.

Для

выяснения

физиолого-биохимических

особенностей

16 микроорганизмов, а также для накопления их биомассы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие среды. Плотные среды используют для выделения чистых культур, в диагностических целях, для хранения и количественного учета микроорганизмов и в ряде других случаев. Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатин и кремнекислый гель. Агар-агар – сложный полисахарид, получаемый из бурых водорослей, который образует гель с точкой плавления 96-100 застывания 40

0

0

С и температурой

С. Плотные питательные среды получают, добавляя к жидким

1,5 – 2 % агар-агара. Желатин – вещество белковой природы, которое получают из костей и хрящей животных при их вываривании. Его добавляют к средам в количестве 10 – 20 %. Образуемый желатином гель плавится при 23 –25 при 20

0

0

С и застывает

С, а также разжижается под действием протеолитических ферментов

многих микроорганизмов, в связи с чем используется ограниченно. Кремнекислый гель (силикагель) образуется из силикатов калия или натрия и соляной кислоты. Хорошо промытые и стерильные гелевые пластинки в чашках Петри пропитывают стерильной питательной средой Преимуществом силикагеля является то, что он представляет собой минеральное соединение и пригоден для культивирования автотрофов (например нитрифицирующих бактерий). Способы стерилизации питательных сред, посуды, инструментария При

выделении

микроорганизмов

и

сохранении

чистых

культур

необходимо, чтобы среда не содержала никаких посторонних микробов, что достигается обеспложиванием или стерилизацией. Стерилизуют как среды, так и материалы, инструменты, аппараты, которыми пользуются при работе. Стерилизация бывает: - физическая - химическая - биологическая Физическая стерилизация подразделяется на термическую и холодную. Термическая стерилизация- стерилизация под действием высоких температур, вызывающих денатурацию клеточных белков, разрушающих осмотический

барьер

клеток,

нарушающих

равновесие

ферментативных

реакций, что приводит к гибели клетки. Термическая стерилизация осуществляется различными способами:

17 1.

Прокаливание в пламене горелки. Так стерилизуют бактериальные

петли, иглы, кончики пинцетов, горлышки колб и пробирок, ватные пробки (кратковременно). 2.

Кипячение. Производят в стерилизаторе. Стерилизуют шприцы,

ножницы, скальпели, пинцеты, резиновые перчатки и резиновые пробки. 3.

Стерилизация сухим жаром. Осуществляется в сушильных шкафах

при температуре 160

0

С – 2 ч., 165

0

С – 1 ч., 180

0

С – 40 мин. Горячим

воздухом чаще всего стерилизуют стеклянную посуду. 4.

Стерилизация влажным жаром (текучим паром). Производится в

аппарате Коха или в автоклаве при открытом выпускном кране. Таким образом стерилизуют

питательные

температурах выше 100 для

проведения

0

среды,

свойства

которых

изменяются

при

С. Обработку материала текучим паром используют

дробной

стерилизации

(тиндализации)

–

трехкратной

обработки питательной среды влажным жаром в течение одного часа при температуре 70 – 80 поддерживается

0

С с интервалами 24 ч., во время которых

температура,

благоприятная

для

прорастания

спор.

Проросшие из спор вегетативные клетки быстро погибают при очередном нагревании. 5.

Стерилизация

влажным

жаром

под

давлением

(автоклавирование). Наиболее надежный и чаще всего применяемый способ стерилизации

питательных

сред.

Основан

на

нагревании

материала

насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного. Время стерилизации 10 –45 мин. Температура пара возрастает при повышении его давления: Температура пара ( С 0 )

Давление (атм.)

112

0,5

121

1

128

1,5

132

2

6.

Неполная

стерилизация

(пастеризация).

Достигается

выдерживанием материала при 60 0 С в течение 30 мин, при 75 0 С –15 мин, при 90

0

С без выдержки. Широко применяется для частичной стерилизации легко

портящихся

пищевых

продуктов

(молоко,

соки,

сиропы).

В

почвенной

18 микробиологии

пастеризуют

суспензии

почв,

чтобы

освободить

их

от

вегетативных клеток, но сохранить споры бактерий. Методы холодной стерилизации применяют в тех случаях, когда среды не выдерживают нагревание. Холодная стерилизация включает в себя: 1.

Фильтрацию, которая заключается в пропускании жидкостей через

специальные фильтры, имеющие мелкопористые перегородки и поэтому задерживающие клетки микроорганизмов. Причем здесь имеет место не только механическая задержка, но и адсорбция микроорганизмов на стенках, ограничивающих поры, вследствие того, что большинство микроорганизмов в водных суспензиях несет на свой поверхности отрицательный заряд, а фильтры изготавливаются из положительно заряженных материалов. Диаметр пор

определяет

область

применения

фильтров

(фильтрующее

и

стерилизующее действие). Используют следующие типы фильтров: •

Мембранные фильтры (пористые диски из целлюлозы, коллодия,

ацетата, толщиной около 0, 1 мм с диаметром пор от 0, 35 до 1, 2 мкм). •

Фильтры Зейтца (диски из смеси асбеста с целлюлозой). С

увеличением содержания целлюлозы пористость фильтра возрастает. •

Мелкопористые стеклянные фильтры (диски из фрагментов стекла

получаемые путем его сплавливания). • кварцевого

Фарфоровые фильтры в виде полых свечей из каолина с примесью песка

(свечи

Шамберлана),

из

инфузорной

земли

(свечи

Беркефельда) и других материалов. Фильтр, представляющий собой диск, закрепляется в специальном держателе (стеклянном, металлическом), который вставляется в приемник фильтрата (колба Бунзена). Свечи вставляют непосредственно в резиновую пробку приемника. Перед употреблением фильтры, их держатели и приемник фильтрата должны быть простерилизованы. Обычно

фильтрование

ускоряется

путем

создания

на

фильтре

перепада давления, достигаемого либо приложением повышенного давления к находящейся над фильтром жидкости, либо откачиванием воздуха с помощью вакуумного насоса, присоединенного к приемнику фильтрата. Мембранные и асбестовые фильтры рассчитаны на одноразовое использование. Свечи после специальной обработки можно использовать повторно.

19 2. которое

Стерилизацию облучением, основанную на летальном эффекте, оказывают

на

клетки

микроорганизмов

ультрафиолетовые,

рентгеновские, γ -, α -, β - лучи и нейтроны. В лабораторных условиях обычно используют

ультрафиолетовые

лучи,

источником

которых

являются

специальные бактерицидные лампы. Излучателем в них служит электрическая дуга, возникающая в парах ртути низкого давления и испускающая линейчатый спектр в ультрафиолетовой области с длиной волны 260 нм. Бактерицидные лампы используют для частичной стерилизации открытых поверхностей и воздуха. Применение ультрафиолета ограничено из-за его малой проникающей способности. Вегетативные формы бактерий более чувствительны к УФоблучению, чем споры. 3.

Стерилизацию ультразвуком, создаваемым в жидкостях при

помощи вибрирующих никелевых или кварцевых дисков. Разрушение клеток при ультразвуковом воздействии обусловлено возникновением вторичных явлений – кавитации. В результате действия звуковой волны высокой частоты образуются разрывы в жидкости, которые затем образуют пузырьки. При их захлопывании идет сильная гидравлическая волна, достигающая 10 атм., что приводит к механическому разрушению клеток. Бактерицидный эффект ультразвука снижается, если подавляется кавитация (разрыв жидкости), что происходит при дегазации, погружении объекта в гель или другую вязкую среду. Бактерицидный эффект ультразвука напротив усиливается при насыщении озвучиваемой эмульсии угликислотой, азотом, кислородом, воздухом, так как это усиливает кавитацию. К ультразвуку чувствительны все микроорганизмы, в том числе и споровые. Но по степени чувствительности они значительно отличаются. Химическая

стерилизация

представляет

собой

удаление

или

разрушение микроорганизмов, находящихся на неживых объектах или поверхностях, с помощью химических агентов, получивших название дезинфицирующих

веществ.

В

качестве

дезинфицирующих

агентов

применяют галогены и их производные (гипохлорид натрия, хлорамины, спиртовой раствор йода), фенольные соединения, спирты, микробоцидные газы (формальдегид, окись этилена). Для консервации питательных сред, вакцин и сывороток используют хлороформ, толуол, эфир, формалин и др. Биологическая стерилизация основана на применении антибиотиков. ХОД РАБОТЫ

20 1.

Ознакомиться с различными видами питательных сред, методами

их стерилизации и оборудованием для стерилизации. 2. Исследование микрофлоры воздуха Воздух, как и вода, и почва, является основным местом обитания микроорганизмов. Бактерии в огромных количествах попадают туда вместе с поднимающейся с пылью, и их численность зависит от микрофлоры почвы. В воздухе микроорганизмы находят для себя достаточное количество пищи, но подвержены губительному действию солнечных лучей. Микрофлора воздуха меняется в зависимости от климатических условий, расположения населенных пунктов, сезона, времени года и суток. Сырая, дождливая погода очищает от пыли воздух и осаждает микробы. При подъеме вверх воздух более чист, чем у поверхности почвы. Большое количество микроорганизмов содержится в воздухе общественных помещений, и чем больше скопление в них людей, тем сильнее он загрязнен микроорганизмами. В зависимости от задач исследования применяют различные методы учета воздушной микрофлоры. Для определения загрязненности воздуха в помещении используется метод осаждения по Коху. Для суждения о степени загрязненности воздуха по методу Коха чашки Петри со стерильным МПА

в горизонтальном положении на расстоянии не

менее 1 м от пола оставляют в анализируемом помещении на 5 минут открытыми. После экспозиции чашки закрывают и ставят в термостат при 28 0 С для проращивания. После 2 – 3 дневной инкубации проводят количественный учет микрофлоры воздуха. Среди сапрофитов воздуха

помещений, развивающихся на МПА,

постоянно встречаются различные кокковые формы, в частности Sarcina flava, спороносные палочки и различные плесени. Пример расчета количества микроорганизмов в 1 м3 воздуха Известно, что за 5 минут при спокойном состоянии воздуха на площадь в 100 см2 оседает такое количество микробных клеток, которое соответствует содержанию бактерий в 10 литрах воздуха. 1) Подсчитывают общее количество колоний в чашке Петри. 2) Определяют площадь питательной среды в чашке Петри S = PR2, где R = 5 см; S = 78,5 см2.

21 3) Вычисляют количество колоний, соответствующее 1 дм2 25 колоний – 78,5 см2 - 100,0 см2

Х

25 х 100 Х = ------------------------- = 32 колонии 78,5 4) Пересчитывают количество бактерий на 1 м3 воздуха, который равен 1000 л. 32 колоний – 10 л Х

- 1000 л 32 х 1000

Х = ------------------------- = 3200 бактериальных клеток 10 ХОД РАБОТЫ 1.

Рассмотреть чашки с посевами воздуха различных помещений, расчитать количество микроорганизмов в 1 м

3

воздуха. Провести

сравнительный анализ загрязненности воздуха микроорганизмами в данных помещениях. 3.

Особенности

роста

микроорганизмов

на

плотных

средах

(культуральные признаки) Признаки, выявляемые при развитии культур микроорганизмов на питательных средах, носят название культуральных. К ним относятся : характер роста на различных (твердых, жидких) питательных средах, тип колонии, способность к разжижению желатина и некоторые другие. Из культуральных признаков микроорганизмов наиболее существенным является строение колоний. Колонии – это видимые простым глазом на поверхности

субстрата

скопления

огромного

количества

клеток

микроорганизмов одного и того же вида. Споры или отдельные клетки микробов, попадая при посеве на определенное место плотного субстрата, не могут как в жидкости рассеиваться по всей среде, а прорастают и размножаются на одном и том же месте, образуя колонии.

22 При учете посевов принято описывать выросшие на чашках колонии. Это описание ведется по определенной схеме. Так, колонии бактерий описывают, отмечая следующие признаки: 1.

Размер (колония крупная - больше 10 мм в диаметре, средняя – 1

–10 мм, мелкая, точечная – меньше 1 мм). 2.

Профиль (выпуклый, конусовидный, плоский, кратерообразный и

3.

Край (ровный, лопастной, волнистый, зубчатый, бахромчатый,

т. д.). фестончатый). 4.

Поверхность (гладкая, бугристая, складчатая, морщинистая, с

концентрическими кругами, радиально исчерченная). 5.

Цвет.

6.

Блеск и прозрачность.

7.

Консистенция (тестообразная, густая, слизистая, тягучая, жидкая,

клейкая). Определяют, прикасаясь к колонии петлей. ХОД РАБОТЫ 1.

На МПА выбрать одну бактериальную колонию и описать ее

культуральные признаки. 4. Фиксированный препарат. Окраска по Граму Фиксированный препарат Фиксированный

препарат

готовят

для

выявления

некоторых

морфологических особенностей и количественного учета, проверки чистоты культуры и ряда других целей. Такие препараты могут храниться длительное время, имеют высокую контрастность, позволяют дифференцировано выявлять клеточные структуры, кроме того, работа с ними безопасна. Приготовление

фиксированных

окрашенных

препаратов

включает

следующие этапы: 1. Приготовление мазка. На обезжиренное предметное cтекло наносят маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала. Полученную суспензию равномерно распределяют петлей на площади 1 – 2 кв. см возможно более тонким слоем. 2. Высушивание. Препарат высушивают при комнатной температуре на воздухе или в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло

мазком

деформируются.

вверх,

не

перегревая,

иначе

клетки

микроорганизмов

23 3. Фиксация. Преследует следующие цели: 1) убить микробов, 2) обеспечить лучшее прилипание мазка к стеклу, 3) сделать мазок более восприимчивым к окраске. Для фиксации сухой препарат несколько раз проводят через пламя горелки (до легкого ожога руки от прикосновения к стеклу). Для изучения строения бактериальной клетки термическая фиксация не годится, тогда используют химическую фиксацию: 1) этиловым спиртом 960 в течение 5 –20 мин, 2) смесью равных объемов этилового спирта и эфира (жидкость Никифорова) до испарения смеси, 3) жидкостью Карнуа (960 этиловый спирт + хлороформ + ледяная уксусная кислота в соотношении 6:3:1) и др. 4. Окраска. Фиксированный препарат покрывают раствором какого-либо красителя. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на фильтровальную бумагу, покрывающую препарат. Следят, чтобы во время окрашивания раствор красителя на мазке не подсыхал. Через 1 – 3 мин мазок промывают слабой струей воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Препарат осторожно промокают фильтровальной бумагой и просматривают под микроскопом. При простых методах окраски используют один краситель, при этом окрашивается вся клетка и хорошо видны ее формы и размеры. Сложные методы заключаются в последовательном окрашивании двумя или несколькими красителями, при этом окрашивается не вся клетка, а лишь определенные ее структуры, например ядерный аппарат. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными оказываются только клетки микроорганизмов или их структуры. Окраска по Граму Впервые предложена в 1884 г. датским ученым Х. Грамом для выявления бактерий в гистологических срезах. Сущность

метода

заключается

в

том,

что

при

обработке

генцианвиолетом и йодом в клетках одних микроорганизмов образуется относительно устойчивый и нерастворимый в спирте комплекс, который удерживается ими при обработке спиртом. Эти микроорганизмы относят к грамположительным, они остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом, и их выявляют, дополнительно окрашивая контрастной краской (водным фуксином). В основе механизма окраски по Граму лежат особенности химического состава и

24 строения клеточных стенок бактерий. Для окраски берут клетки молодых 18 - 24 ч. культур бактерий, так как с возрастом в бактериальной популяции увеличивается количество мертвых клеток, которые всегда грамотрицательные, а некоторые грамположительные бактерии становятся грамотрицательными (например, Lactobacillus). Окраску по Граму проводят следующим образом: 1.

Готовят

мазок

культуры

исследуемого

микроорганизма

на

предметном стекле, который высушивают на воздухе, фиксируют жаром. 2. На препарат помещают фильтровальную бумагу и наносят раствор генцианвиолета. Экспозиция 2 мин. 3. Не смывая краски, добавляют раствор Люголя (I в KI) на 2 мин. (до почернения мазка). 4. Сливают растворы красок и препарат обесцвечивают 960 этиловым спиртом в течение 60 сек. 5. Препарат быстро, чтобы не увеличить экспозицию спирта, промывают водой. 6. Дополнительно контрастно окрашивают водным раствором основного фуксина. Экспозиция 2 мин. 7. Препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют. В

поле

зрения

микроскопа

грамположительные

бактерии

сине-

фиолетового цвета, грамотрицательные – красные. Определение принадлежности бактерий к грамположительным или грамотрицательным можно проводить с помощью экспресс-анализа с 3% KOH. Для этого на предметное стекло помещают каплю раствора щелочи в которую вносят бактериологической петлей исследуемую культуру и перемешивают в течение 60 сек. Если суспензия микроорганизмов в щелочи становиться вязкой или желеобразной, то культура относится к грамотрицательным, в противном случае – к грамположительным. ХОД РАБОТЫ 1. Приготовить фиксированный препарат, окрасить его по методу Грама, промикроскопировать при увеличении объектива 40х. Дополнительно провести экспресс-анализ с 3 % КОН. Результаты наблюдения занести в тетрадь.

25 5. Влияние ультрафиолетовых лучей на микроорганизмы Энергия, распространяющаяся в пространстве в виде электромагнитных волн, называется лучистой энергией. Различные ее спектры оказывают на микроорганизмы

неодинаковое

воздействие.

Радиоволны

не

оказывают

биологического действия, инфракрасные – при адсорбции их организмом вызывают нагревание. Видимый свет действует на фотосинтезирующие микроорганизмы благоприятно, являясь основным источником энергии. Все остальные бактерии лучше развиваются в темноте. Даже рассеянный свет задерживает их размножение. А видимый свет значительной интенсивности может вызывать повреждение и гибель клеток. От губительного действия видимого света микроорганизмы предохраняет способность образовывать пигменты. Наиболее активно на бактерии действует ультрафиолетовая часть спектра,

оказывающая

либо

летальное,

либо

мутагенное

действие

в

лучей

на

зависимости от природы микроба и дозы облучения. Лабораторный

опыт

по

влиянию

ультрафиолетовых

жизнедеятельность микроорганизмов закладывается следующим образом. В стерильную чашку Петри с МПА вносят каплю суспензии бактерий, которую равномерно распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского. Затем на центральную часть сплошного газона микроорганизмов помещают стерильный трафарет, и, открыв чашку, ставят ее под облучатель кварцевой лампы на 20 – 30 мин на расстоянии от источника излучения 10 – 20 см. Затем трафарет убирают, чашки закрывают и инкубируют при 28

0

С. Результаты

опыта наблюдают через 5 – 7 дней. Рост микроорганизмов виден лишь на том участке агара, который был закрыт трафаретом от действия ультрафиолетовых лучей. Остальная часть среды стерильна. Губительное действие лучей зависит от

расстояния,

времени

экспозиции

и

вида

микроорганизма,

который

подвергался облучению. ХОД РАБОТЫ 1.

Изучить чашку Петри, подвергнутую облучению УФЛ. Результаты

наблюдения занести в тетрадь и сделать рисунок. 7.

Действие антибиотиков на микроорганизмы

Антибиотики – это специфические вещества, образуемые клеткой в процессе жизнедеятельности, а также их производные и синтетические

26 аналоги, обладающие способностью подавлять развитие микроорганизмов или задерживать развитие злокачественных новообразований. Антибиотики отличаются от неспецифических метаболитов (кислоты, спирты),

высокой

биоактивностью

в

отношении

чувствительных

микроорганизмов. Их действующие концентрации выражаются в микрограммах или даже десятых и сотых долях мкг/мл. Антибиотики обладают избирательностью биологического действия. Не все микроорганизмы, находясь в контакте с антибиотиком, чувствительны к нему, и поэтому делятся на чувствительные и резистентные (устойчивые). Одни

антибиотики

микроорганизмов

и

подавляют

являются

рост

небольшого

антибиотиками

узкого

числа

спектра

видов

действия

(бензилпенициллин, новобиоцин, гризеофульвин), другие угнетают рост многих микроорганизмов – антибиотики широкого спектра действия (тетрациклины, хлорамфеникол). Антибиотики

могут

подавлять

развитие

микроорганизмов

(бактериостатическое действие), убивать их (бактерицидное действие) и растворять (бактериолитическое действие). Для доказательства антибиотической активности и избирательности действия антибиотиков на микроорганизмы ставится следующий опыт. В чашку Петри засевают сплошным газоном культуру микроорганизма и накладывают стерильным

пинцетом

кружки

фильтровальной

бумаги,

различными антибиотиками. Посевы инкубируют при 28

0

пропитанной

С. После чего по

образованию зон отсутствия роста делают вывод о действии антибиотиков на данный микроорганизм. Может быть установлено три результата: антибиотик не действует на микроорганизм (зона отсутствует), антибиотик действует слабо (диаметр зоны < 15 мм), среднее действие антибиотика (диаметр зоны от 15 до 25 мм) антибиотик оказывает сильное действие (диаметр >25 мм). ХОД РАБОТЫ 1. Рассмотреть и зарисовать чашки с опытом по определению действия антибиотиков на микроорганизмы. Замерить зоны отсутствия роста микробов вокруг дисков с антибиотиками. Сделать вывод. ЗАНЯТИЕ III Тема: Превращение микроорганизмами органических веществ. 1. Спиртовое брожение.

27 2.

Молочно кислое брожение.

3.

Разложение пектиновых веществ.

4.

Разложение клетчатки.

5.

Уксуснокислое брожение.

6.

Аммонификация белков и мочевины.

Имеющиеся в природе органические углеродсодержащие вещества растительного и животного происхождения подвергаются микробиологическим превращениям с образованием или промежуточных веществ, или простых соединений. Для изучения настоящей группы микроорганизмов в большинстве случаев пользуются элективными средами. 1. Спиртовое брожение Спиртовое

брожение

–

это

процесс

анаэробного

превращения

углеводов с образованием этилового спирта, углекислого газа и выделением небольшого количества энергии. Этот

вид

брожения

вызывается

различными

микроорганизмами:

дрожжами р Saccharomyces, грибами рода Oidium, Monilia, Mucor, а также бактериями

Sarcina ventriculi,

некоторыми видами Enterobacteriaceae и

Clostridium. Для большинства перечисленных выше микроорганизмов спирт является побочным продуктом и только для дрожжей р. Saccharomyces он – главный конечный продукт брожения. Ряд отраслей промышленности основан на жизнедеятельности дрожжей (виноделие, производство спирта, пивоварение, хлебопекарное производство). Для наблюдения за ходом спиртового брожения в трубку Дунбара или сосуд Эйнгорна наливают 20 % раствор сахарозы так, чтобы заполнить запаянный конец трубки или сосуда . Вносят 2 – 3 г прессованных пекарских дрожжей, закрывают отверстие трубки или сосуда ватномарлевой пробкой и ставят в термостат с температурой 30

0

С. Через 1 – 1,5 часа у запаянного

конца трубки или сосуда происходит вытеснение жидкости выделившимся в процессе спиртового брожения углекислым газом. Об интенсивности брожения судят по количеству выделившигося СО2. Наличие этилового спирта в бродящей жидкости можно определить пробой на получение йодоформа. К 10 мл бродящей жидкости прибавляют 10 мл 20% раствора Na2CO3 и около 0,1 г металлического I2. Смесь нагревают до полного растворения йода и его обесцвечивания. При охлаждении выпадают желтые кристаллы йодоформа с характерным запахом.

28 ХОД РАБОТЫ Внимательно рассмотреть и зарисовать в тетради трубку Дунбара или сосуд

Эйнгорна

с

опытом

по

спиртовому

брожению

По

количеству

выделевшегося СО2 сделать вывод об интенсивности брожения. Поставить пробу на получение йодоформа и убедиться в наличии спирта в бродящей жидкости. 2. Молочнокислое брожение Основным

свойством

молочнокислых

бактерий,

по

которому

их

объединяют в отдельную обширную группу микроорганизмов, является их способность образовывать в качестве главного продукта брожения молочную кислоту. В группу молочнокислых бактерий объединены различные по систематическому положению микроорганизмы. Известны два типа молочнокислого брожения: гомоферментативное и гетероферментативное.

Они

отличаются

друг

от

друга

возбудителями,

субстратами брожения, механизмом превращения углеводов и конечными продуктами (табл. 1). Таблица 1 Характеристика молочнокислого брожения Тип брожения

Путь превращения углеводов

Гомофер ментатив ное

Гликолиз (путь ЭмбденаМейергофаПарнаса)

Гетерофе рментати вное

Гексозомнонфосфат ный (пентозофосфатный окислительный, путь Варбурга-ДиккенсаХорекера)

Основные конечные продукты Молочная кислота

Молочная кислота, уксусная кислота, этиловый спирт, СО2, диацетил, ацетоин

Возбудители p. Streptococcus (S. faecalis), p. Lactococcus (L. lactis) p.Pediococcus (P.cerevisiae) p.Lactobacillus n/p Thermobacterium n/p Streptobacterium (L.delbruckii, L.bulgaricus, L. lactis, L. plantarum, L.casei p.Leuconostoc (L. mesenteroides, L. lactis) p. Lactobacillus n/p Betabacterium (L.fermentum, L. brevis, L. buchneri)

29

Отличительной чертой молочнокислых бактерий являются выраженные антагонистические свойства, которые используются в практике с глубокой древности

для

квашения

овощей,

силосования

кормов,

изготовления

кисломолочных продуктов. Для ознакомления с морфологией молочнокислых бактерий готовят их фиксированные препараты из заквасок или рассола. Проводят обезжиривание их смесью равных объемов этилового спирта и эфира (смесь Никифорова), для чего заливают ею мазок и дают смеси испариться. Препараты окрашивают метиленовой синью в течение 5 мин, промывают водой, микроскопируют. Присутствие в исследуемом продукте (простокваша, кефир, рассол) молочной кислоты можно обнаружить, проведя пробу с фенолом. Проба с фенолом: К исследуемому продукту приливают реактив, приготовленный путем смешивания 5% растворов карболовой кислоты и хлорного железа в соотношении 1:2 (растворы разбавляют двойным количеством воды). В присутствии

молочной

кислоты

первоначальный

аметистовосиний

цвет

переходит в соломенно-желтый, который дает молочнокислое железо. ХОД РАБОТЫ 1.

Приготовить фиксированный препарат молочнокислых бактерий, после

микроскопии

зарисовать,

отмечая

морфологические

особенности культуры. 2.

Поставить пробу с фенолом и убедиться в наличии молочной кислоты в исследуемом продукте.

3.

Разложение пектиновых веществ

Пектины – это межклеточные вещества растительных тканей. Имеется три типа пектиновых веществ: протопектин, пектин, пектиновая кислота, которые

подвергаются

окислению

или

сбраживанию

разнообразными

микроорганизмами. При анаэробиозе они сбраживаются маслянокислыми бактериями Clostridium pectinovorum, C. felsineum с образованием масляной кислоты, уксусной кислоты, водорода, углекислого газа. Пектиновое

брожение

наблюдается

при

мочке

лубоволокнистых

растений (льна, конопли), которая необходима для отделения от пектина целлюлозных волокон этих растений, имеющих промышленное значение.

30 При водной (анаэробной) мочке после погружения стеблей льна в воду они набухают. При этом экстрагируются водо-растворимые вещества (сахара, гликозиды,

пигменты)

и

начинают

развиваться

бактерии.

Сначала

размножаются аэробы (вода содержит кислород). После поглощения ими кислорода

создаются

анаэробные

факультативно-анаэробные

условия,

бесспоровые

и

бактерии,

начинают близкие

развиваться к

E.

сoli.

Отделение волокон происходит во время основной стадии брожения. C. pectinovorum расщепляет пектин, при этом накапливаются органические кислоты, и его сменяет более кислотоустойчивый C. felsineum. В росяной (аэробной) мочке льна учавствуют в основном плесневые грибы. В лабораторных условиях анаэробное разложение пектина можно воспроизвести следующим образом: снопики льна, соломы вываривают 7 – 10 мин в кипящей воде для удаления экстрактивных веществ, которые могут помешать истиному пектиновому брожению. После чего снопики помещают в пробирки с чистой водопроводной водой и кипятят еще несколько минут. Затем пробирки заражают кусочком соломы. Посевы инкубируют 7 дней при температуре 350 С. Чтобы убедиться в присутствии в тканях растения пектинразлагающих бактерий, следует приготовить препарат для микроскопирования. Для этого на предметное стекло наносять каплю раствора Люголя на гликоген и гранулезу, затем туда же с вымокшего стебля растения отжимают каплю бродящей жидкости или вносят небольшой отрезок лубяной ткани. Препарат накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Клетки пектинразлагающих бактерий отчетливо видны благодаря темнобурому или фиолетовому окрашиванию гранулезы. ХОД РАБОТЫ 1.

Приготовить препарат раздавленная капля с окраской раствором

Люголя, внимательно рассмотреть его при большом увеличении микроскопа, найти клетки клостридий, сделать рисунок в тетради. 4. Разложение клетчатки Разложение клетчатки (целлюлозы) – это основной процесс, в круговороте углерода на Земле. Полисахарид целлюлоза является одной из главных составных частей оболочек растительных клеток, которые в огромном

31 количестве попадают в почву, где подвергаются разложению в аэробных и анаэробных условиях под действием бактерий, актиномицетов, грибов. Для выделения целлюлозоразлагающих микроорганизмов существует ряд методов, в большинстве случаев основанных на применении элективных сред. Для обнаружения аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов жидкую среду наливают в колбочки, анаэробных – в пробирки высоким слоем. В качестве

единственного

источника

углерода

в

среду

помещают

фильтровальную бумагу: в колбочки опускают складчатый фильтр, в пробирки полоску бумаги. После стерилизации колбы и пробирки засевают почвой. Через несколько недель (срок варьирует в зависимости от особенностей почвы) определяют степень разложения бумаги и микроскопируют микроорганизмы, вызывающие ее распад. Для микроскопического исследования готовят препараты раздавленная капля с поверхности распадающейся фильтровальной бумаги. Аэробные бактерии на уровне жидкости на бумаге образуют налет желтого или оранжевого цвета (миксобактерии). Когда бактерии хорошо разовьются, они нарушают целостность бумаги, фильтр постепенно оседает и на нем образуется слизь. Кроме того, в разрушении клетчатки в аэробных условиях активно участвуют грибы и актиномицеты. При

анаэробном

микроорганизмов

процессе

сопровождается

развитие интенсивным

целлюлозоразлагающих помутнением

среды,

пенообразованием и изменением клетчатки. Фильтровальная бумага желтеет и постепенно разрушается бактериями (преимущественно p Clostridium). При микроскопировании в оставшихся волокнах бумаги обнаруживаются тонкие, длинные, слегка изогнутые клетки с круглой спорой на конце. ХОД РАБОТЫ 1.

Внимательно рассмотреть, сравнить и зарисовать колбы и

пробирки с опытами по разложению целлюлозы, заложенными в разные сроки (3 недели, 2 недели, 1 неделя, контроль). 2.

Приготовить и рассмотреть в микроскоп препараты «раздавленная

капля» разрушителей целлюлозы. 5. Уксуснокислое брожение

32 Возбудители уксуснокислого брожения широко распространены в природе. Они встречаются в почве, на поверхности зрелых ягод, в закисшем пиве и вине. Уксуснокислое брожение вызывается представителями pp. Acetobacter, Gluconobacter, получающими энергию, осуществляя неполное окисление органических соединений. Для наблюдения за ходом уксуснокислого брожения в колбу низким слоем наливают 50 мл пива, слегка подкисленного уксусной кислотой, и оставляют стоять при 25 – 30

0

С. Через 5 - 7 суток на поверхности пива

появляется серовато-белая пленка уксуснокислых бактерий – Acetobacter rancens, A. pasteurianum. При более низкой температуре 20 – 22 развиваются представители других видов –

0

С

A. aceti, A. xylinum.

Для микроскопического исследования в каплю раствора Люголя на гликоген

и

гранулезу

уксуснокислых

на

бактерий,

предметном

стекле

накрывают

вносят

препарат

кусочек

покровным

пленки стеклом,

микроскопируют. У A. pasteurianum и A. kutzingianum оболочка клетка синеет от действия на них йода. Другие бактерии A. rancens и A. aceti посинение не дают и окрашиваются йодом в желтый цвет. Качественной реакцией на уксусную кислоту является образование грушевой

эссенции

(уксусноэтилового

эфира)

при

нагревании

40

мл

исследуемого раствора с 2 мл 96 0 этилового спирта и 2 мл концентрированной серной кислоты. ХОД РАБОТЫ 1.

Рассмотреть пленку на поверхности пива, внести результаты

наблюдений в тетрадь. 2.

Приготовить

раствором

Люголя

препарат

«раздавленная

кусочка

пленки

капля»

с

уксуснокислых

окраской бактерий.

Промикроскопировать и зарисовать в тетради. 3.

Поставить качественную реакцию на уксусную кислоту и убедиться

в ее присутствии в исследуемом продукте. 6. Аммонификация белков и мочевины. Аммонификацией называется процесс разложения азотсодержащих органических веществ с выделением аммиака. Разложение белковых веществ ведут многие микроорганизмы из разных

групп:

бактерии,

актиномицеты,

грибы.

Разложение

белков

в

33 анаэробных

условиях

сопровождается

образованием

восстановленных

продуктов: сероводорода и тиоспиртов меркаптанов, которые образуются из белков, содержащих серу, а так же индола, скатола, метана, водорода. Для выявления аммонификаторов пользуются мясо-пептонными средами, которые разливают в колбы и засевают почвой. Колбы закрывают ватными пробками и под них подвешивают влажную красную лакмусовую бумажку для обнаружения аммиака и фильтровальную бумагу, смоченную уксуснокислым свинцом для обнаружения сероводорода. После 2 – 3 дней инкубации при 25 – 30

0

С

лакмусовая бумажка синеет от выделяющегося аммиака, а бумажка с уксуснокислым свинцом темнеет вследствие образования сульфида свинца, если она покрывается серебристым налетом, значит, наряду с сероводородом выделяются еще и меркаптаны. Накопление аммиака в субстрате устанавливают также с помощью реактива Несслера. На фарфоровые пластинки с лунками помещают каплю реактива,

затем

каплю

субстрата.

При

большом

количестве

аммиака

появляется коричневый или буроватый осадок, при небольшом – оранжевая или желтая окраска. Микроскопию аммонификаторов проводят, приготавливая препарат «раздавленная капля» с прижизненной окраской основным фуксином или без нее.

Типичными

аммонификаторами

являются

споровые

(в

основном

представители рода Bacillus) и неспороносные (p. Pseudomonas, p. Proteus) бактерии. Разложение мочевины происходит под влиянием уреазы уробактерий, мочевина при этом превращается в аммиак и углекислоту. Для накопления данной группы бактерий пользуются средами, содержащими мочевину, которые разливают в колбы. Под ватную пробку подвешивают влажную красную лакмусовую бумажку для обнаружения аммиака. При

микроскопическом

познакомиться

с

изучении

представителями

материала

группы

из

колбы

уробактерий,

можно

постоянно

встречающимися в почве. Для этого готовят препарат «раздавленная капля» без окраски. ХОД РАБОТЫ 1. Рассмотреть колбы с опытом по аммонификации белков и мочевины. По посинению красного лакмуса и пробе с реактивом Несслера убедиться в накоплении аммиака.

34 2. Приготовить

и

рассмотреть

препараты

«раздавленная

капля»

аммонификаторов. Результаты занести в тетрадь. Список литературы 1. Бранцевич Л. Г., Лысенко Л. И., Овод В.В., Гурбик А. В. Микробиология: практикум. - К.: Вища школа. - 1987.- 200 с. 2. Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. проф. Д. Г. Звягинцева. - Изд-во МГУ. - 1991. - 304 с. 3. Практикум по микробиологии / под ред. проф. Н.С. Егорова. - Изд-во МГУ. - 1976. -307с.