Модулирующее действие алиментарных факторов на метаболизм вомитоксина

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ На правах рукописи

ОБОЛЬСКИЙ ОЛЕГ ЛЬВОВИЧ

МОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ АЛИМЕНТАРНЫХ ФАКТОРОВ НА МЕТАБОЛИЗМ ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА (ВОМИТОКСИНА) У КРЫС

03.00.04. - Биохимия

Д И С С Е Р Т А Ц И Я на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор медицинских наук, академик РАМН, профессор В.А. ТУТЕЛЬЯН

Москва - 2001

ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................

1

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................................

6

1.1. ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛ И ДРУГИЕ ТРИХОТЕЦЕНОВЫЕ МИКОТОКСИНЫ

6

1.1.1. физико-химические свойства трихотеценовых микотоксинов......

6

1.1.2. Распространенность ДОН и других фузариотоксинов в природе..

8

1.1.3. Токсическое действие трихотеценовых микотоксинов....................

12

1.2. ОСНОВНЫЕ ПУТИ БИОТРАНСФОРМАЦИИ И ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ..................................................................................................

15

1.2.1. Общие сведения........................................................................................

15

1.2.2. Основные пути биотрансформации и детоксикации трихотеценовых микотоксинов............................................................

20

1.2.2.1. Биотрансформация дезоксиниваленола......................................

22

1.3. ВЛИЯНИЕ АЛИМЕНТАРНЫХ ФАКТОРОВ НА МЕТАБОЛИЗМ И ТОКСИЧНОСТЬ КСЕНОБИОТИКОВ..................................................................................................

25

1.3.1. Селен...........................................................................................................

25

1.3.2. Пищевые волокна....................................................................................

30

1.3.3. Пробиотики...............................................................................................

35

1.3.4. Биотрансформация и детоксикация чужеродных соединений при их комбинированном поступлении..............................................

37

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.............................................................................

40

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................................

40

2.1.1. Животные и их содержание...................................................................

40

2.1.1.1. Экспериментальные рационы......................................................

40

2.1.1.2 Условия эксперимента по изучению метаболизма ДОН............

44

2.1.2. Реактивы и материалы, используемые в работе...............................

45

2.1.3. Физико-химические методы исследования........................................

46

2.1.3.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография..................

46

2.1.3.2. Масс- и хроматомасс-спектрометрия.......................................

47

2.1.4. Метод определения ДОН и его метаболитов в моче крыс...............

47

2.1.5. Статистическая обработка результатов..............................................

48

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................................................

49

2.2.1. Модификация метода количественного определения ДОН и его метаболитов в моче и кале крыс................................................

49

2.2.1.1. Подбор системы для элюирования ДОН и ДОМ-1 с адсорбционной колонки..............................................................

49

2.2.1.2. Определение формы нанесения экстракта образца на колонку............................................................................................

50

2.2.1.3. Определение сульфатных конъюгатов ДОН и ДОМ-1..............

51

2.2.1.4. Модифицированный метод анализа ДОН и его метаболитов в экскретах крыс...................................................

54

2.2.2. Изучение распределения экскретируемых метаболитов ДОН в моче и кале крыс Вистар........................................................................

58

2.2.3. Влияние индукторов ферментов метаболизма ксенобиотиков на метаболизм ДОН у крыс...................................................................

60

2.2.4. Влияние уровня селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс........

68

2.2.4.1. Влияние обогащения рациона селеном на метаболизм ДОН у крыс..............................................................................................

68

2.2.4.2. Влияние дефицита селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс..............................................................................................

74

2.2.5. Влияние обогащения рациона пектином на метаболизм ДОН у крыс.........................................................................................................

80

2.2.6. Влияние пробиотиков на метаболизм ДОН у крыс..........................

86

2.2.7. Изучение комбинированного действия ДОН и зеараленона на метаболизм ДОН у крыс.........................................................................

93

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................................

100

4. ВЫВОДЫ............................................................................................................................

105

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................

106

-1ВВЕДЕНИЕ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ К природным контаминантам продовольственного сырья и пищевых продуктов, представляющих реальную опасность для здоровья человека, относятся микотоксины, что связано с их высокой токсичностью, наличием у большинства из них иммунодепрессивных свойств и у многих — мутагенных, канцерогенных или коканцерогенных свойств [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; IARC, 1993; Miller J.D., 1998]. Микотоксины являются продуктами жизнедеятельности повсеместно распространенных микроскопических (плесневых) грибов, способных поражать продовольствие на всех этапах его производства, переработки и хранения. Полагают, что не менее 25% всех продовольственных ресурсов подвержены загрязнению микотоксинами или повреждающему действию плесневых грибов [Pohland A.E., 1998]. Исследования, проведенные как за рубежом, так и в нашей стране, показали, что наиболее часто обнаруживаемыми микотоксинами являются микотоксины, продуцируемые грибами рода Fusarium — трихотеценовые микотоксины (ТТМТ), зеараленон и фумонизины [Саркисов А.Х., 1954; Scott P.M., 1990; Miller J.D., 1995 a; Bhat R., 1999]. В отличие от других микотоксинов, накопление которых в пищевых продуктах является, главным образом, результатом нарушений условий хранения или технологических условий производства продукта, фузариотоксины накапливаются в зерне в процессе его созревания, и интенсивность их синтеза в клетках мицелия зависит в значительной степени от климатических и погодных условий. Необходимо отметить, что проблема загрязнения продовольствия фузариотоксинами имеет выраженную тенденцию к нарастанию по степени риска для здоровья человека. Это определяется отсутствием устойчивости зерновых культур к поражению грибами рода Fusarium, отсутствием перспектив создания сортов, устойчивых к этим видам грибов и отсутствием в настоящее время достаточно эффективных в отношении грибов Fusarium фунгицидов [Львова Л.С. и др., 1992, 1994; Riley R.T., Norred W.R., 1999; Edwards S.G. et al., 2001]. Среди фузариотоксинов широкой распространенностью выделяются дезоксиниваленол (вомитоксин) и зеараленон, а своими выраженными токсическими свойствами — Т-2 токсин [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; IARC, 1993]. Дезоксиниваленол (ДОН) в настоящее время, несомненно, является наиболее часто обнаруживаемым в мире микотоксином. ДОН выявляют в качестве контаминанта зерновых культур и, в первую очередь, пшеницы в большинстве регионов мира. Частота обнаруже-

-2ния ДОН в пшенице в разные годы в Канаде, США, в большинстве стран Европы и ряде стран Азии, Африки и Южной Америки достигает 50–100% [Ueno Y., Tanaka T., 1987; Scott P.M., 1989, 1990, 1997; Tutelyan V.A. et al., 1990]. Результаты наших предыдущих исследований [Соболев В.С. и др., 1990; Захарова Л.П. и др., 1994, 1995; Кравченко Л.В. и др., 1998; Tutelyan V.A., 1998] показали, что в период 1986–1999 гг. в некоторых регионах России, относящихся к основным производителям зерна, ежегодная частота контаминации ДОН заготавливаемого зерна пшеницы варьирует от 60 до 100%. Имеются сообщения о высокой частоте (до 41–50 случаев) обнаружения Т-2 токсина в отдельные годы в зерне пшеницы, ячменя и овса в европейских странах — Польше, Германии, Финляндии [Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; Müller H.M., Schwadore K., 1993; Müller H.M. et al., 1998; Grabarkiewicz-Szczesna J. et al., 2001]. Результаты эпидемиологических наблюдений свидетельствуют, что алиментарные микотоксикозы и, в первую очередь, фузариотоксикозы как у людей, так и у сельскохозяйственных животных, являются обычно следствием поступления с пищей (кормом) нескольких микотоксинов, среди которых один или два являются доминирующими. Так, в описанных в последние годы случаях массовых отравлений в Индии [Bhat R.V. et al., 1989] в пшеничной муке были обнаружены наряду с ДОН еще три трихотеценовых микотоксина — Т-2 токсин, ниваленол и ацетил-ДОН. В Китае, в 35 случаях массовых отравлений, связанных с контаминацией зерна пшеницы и кукурузы микотоксинами, в качестве загрязнителей были обнаружены ДОН и зеараленон [Luo X.Y., 1988]. Практически во всех странах Европы, в Северной и Южной Америке, в ряде стран Азии неоднократно выявляли ДОН вместе с зеараленоном в пшенице, ячмене, овсе [Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; Yoshizawa T., Jin Y.Z., 1995; Müller H.M. et al., 1998]. Результаты исследований, проведенных в НИИ питания РАМН, показали возможность накопления двух фузариотоксинов — ДОН и зеараленона — в зерне из ареала фузариоза (Краснодарский край) [Львова Л.С. и др., 1994; Кравченко Л.В. и др., 1998]. В связи с тем, что практически невозможно полностью предотвратить заражение сельскохозяйственной продукции микроскопическими грибами и загрязнение их микотоксинами, основной мерой защиты организма от неблагоприятного воздействия этих токсинов является гигиеническое регламентирование их содержания в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Как показали результаты наших предыдущих исследований, даже при наличии в достаточной степени налаженной системы

-3контроля за безопасностью продовольственного зерна и пищевых продуктов, сохраняется вероятность постоянного поступления с пищей микотоксинов (главным образом ДОН) в количествах, которые в настоящее время нельзя считать абсолютно безопасными для здоровья человека [Захарова Л.П., 1994, 1995; Кравченко Л.В. и др., 1998]. В связи с этим, наряду с мероприятиями, направленными на предотвращение попадания микотоксинов в организм, важное значение приобретает изыскание путей снижения токсичности поступивших в организм токсинов. К числу наиболее перспективных направлений относится использование пищи и ее компонентов как мощного фактора регуляции процессов токсикокинетики чужеродных соединений, включая этапы всасывания, печеночно-кишечной циркуляции, биотрансформации и детоксикации [Тутельян В.А. и др., 1987; Galvano F. et al., 2001]. Особое внимание привлекают биологически активные компоненты пищи, которые находят широкое применение не только для коррекции структуры питания населения, но и в профилактических целях, для повышения резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Большинство ферментов, занимающих ключевое место в процессах биотрансформации и детоксикации ксенобиотиков и в том числе ТТМТ, являются компонентами мембран, и их активность определяется в значительной степени функциональным состоянием мембран. Кроме того, в единичных исследованиях in vitro показана возможность восстановления эпоксидного кольца трихотеценовых микотоксинов ферментами микрофлоры желудочно-кишечного тракта. В связи с этим особый интерес представляют компоненты пищи, способные оказывать стабилизирующее влияние на мембраны (антиоксиданты) и улучшающие микробиологический баланс кишечника (пробиотики, пищевые волокна). Цель работы состояла в изучении влияния на основные пути биотрансформации и детоксикации ДОН у крыс алиментарных факторов — биологически активных компонентов пищи. Были поставлены следующие задачи: − изучить распределение свободных и конъюгированных форм экскретируемых метаболитов ДОН; − изучить роль микросомальных UDP-глюкуронозилтрансфераз в детоксикации ДОН; − изучить влияние различных уровней селена в рационе на метаболизм ДОН; − изучить влияние обогащения рациона пектином на метаболизм ДОН; − изучить влияние пробиотиков на метаболизм ДОН;

-4− изучить метаболизм ДОН при одновременном поступлении с кормом двух фузариотоксинов — ДОН и зеараленона. НАУЧНАЯ НОВИЗНА − Получены новые данные, подтверждающие, что основными путями детоксикации ДОН у крыс является образование его деэпоксида — ДОМ-1 и конъюгатов ДОН и ДОМ-1. − Впервые показана возможность образования у крыс наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфоконъюгатов ДОН и ДОМ-1. − Впервые получены данные об участии в образовании глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы, относящихся к семействам 1А и 2В. − Показано, что как дефицит селена в рационе, так и обогащение рациона селеном приводит к усилению образования и выведения глюкуроновых конъюгатов ДОН, которое

сопровождается

возрастанием

активности

микросомальной

UDP-

глюкуронозилтрансферазы в печени крыс. − Показано, что обогащение рациона крыс пектином усиливает не только экскрецию ДОН, но и образование и выведение его глюкуроновых конъюгатов, что коррелирует с возрастанием в печени крыс активности UDP-глюкуронозилтрансферазы. − Впервые показано, что in vivo пробиотики могут влиять на токсикокинетику ксенобиотиков. − Установлено, что длительное поступление с кормом двух фузариотоксинов — ДОН и зеараленона — в дозах, близких к недействующим для крыс, не оказывает какого-либо влияния на метаболизм ДОН. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Данные об отсутствии изменения метаболизма ДОН у крыс при длительном поступлении с кормом двух фузариотоксинов — зеараленона и ДОН — в дозах, близких к недействующим для крыс, свидетельствуют, что одновременное присутствие в пище двух фузариотоксинов в пределах установленных регламентов не представляет дополнительную опасность для здоровья человека и не требует изменения гигиенических регламентов. Получены новые данные по научному обоснованию использования биологически активных добавок к пище (БАД), содержащих микронутриенты, пробиотики и

-5пищевые волокна, для повышения неспецифической резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, в частности таких приоритетных загрязнителей пищевых продуктов как микотоксины.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты диссертационной работы были представлены на Первом международном научном конгрессе «Традиционная медицина и питание: Теоретические и практические аспекты» (Москва, 1994), 1-м съезде токсикологов России (Москва, 1998), Международной конференции «Региональные проблемы профилактической медицины» (Великий Новгород, 1999). ПУБЛИКАЦИИ По результатам выполненных исследований опубликовано 6 печатных работ в научных журналах и сборниках научных трудов. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, двух глав экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу и 14 рисунков. Список литературы включает 294 источника, из которых 239 — иностранных авторов.

-61. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛ И ДРУГИЕ ТРИХОТЕЦЕНОВЫЕ МИКОТОКСИНЫ

Трихотеценовые микотоксины (ТТМТ) — группа близких по химической структуре соединений сесквитерпенового ряда, которые являются вторичными метаболитами микроскопических грибов рода Fusarium. Первым из ТТМТ, выделенным в чистом виде, был трихотецин, полученный из культуры Trichotecium roseum в 1948 г. В настоящее время известно более 40 представителей микотоксинов этой группы. ТТМТ являются наиболее широко распространенными в мире микотоксинами. Среди трихотеценов широкой распространенностью выделяется дезоксиниваленол (ДОН), а своими выраженными токсическими свойствами — Т-2 токсин. Основными грибамипродуцентами ДОН являются F. graminearum и F. culmorum, а Т-2 — F. sporotrichiella и F. poae. 1.1.1. физико-химические свойства трихотеценовых микотоксинов Большинство токсинов, продуцируемых микроскопическими грибами рода Fusarium, относится к производным 12,13-эпокситрихотец-9-ена. В основе структуры трихотеценовых микотоксинов лежит система сопряженных колец, называемое трихотеканом [Godtfredsen W.O., et al., 1967] (рис. 1). Природные трихотецены содержат двойную связь в положении С-9–С-10 и эпоксидную группу при 12 и 13 углеродных атомах [Bamburg J.R., Strong F.M., 1971].

Рис. 1. Структура трихотекана. По своей химической структуре трихотецены разделяются на 4 группы: A, B, C и D [Ueno Y., 1977]. В группу A входят соединения, содержащие при С-8 атом водорода, гидроксил либо сложноэфирную группу (основной представитель Т-2 токсин). Представители группы B имеют при С-8 кетогруппу (основной представитель ДОН).

-7Группа С включает макроциклические трихотецены. Дополнительный макроцикл образован при С-4 и С-15. Группа D представлена соединениями, содержащими вторую эпоксидную группу при С7-С8 (рис. 2).

A

B

C

D

Рис. 2. Структура различных групп трихотеценов. В чистом виде трихотецены представляют собой бесцветные вещества кристаллической природы, оптически активные, нелетучие при обычных условиях. Представители группы А наиболее хорошо растворимы в апротонных растворителях, таких как хлороформ, этилацетат, ацетон. ТТМТ группы В лучше растворяются в более полярных растворителях (спирты, ацетонитрил, вода). На растворимость оказывает влияние степень гидроксилирования молекулы вещества: с увеличением количества гидроксильных групп возрастает растворимость в полярных растворителях [Cole R.G., Cox R.H., 1981; Ueno Y., 1983]. Трихотецены, за исключением некоторых макроциклических соединений, не обладают собственной флуоресценцией и для их обнаружения методом тонкослойной хроматографии используют обработку пластин различными реагентами, образующие с ТТМТ окрашенные или флуоресцирующие комплексы [Scott P.M., 1982; Pohland A.E., et al., 1984; Pohland A.E., et al., 1986].

-8Трихотеценовые микотоксины отличаются высокой химической устойчивостью и термической стабильностью. В природных условиях на них практически не влияют естественные факторы окружающей среды [Львова Л.С., 1985]. Процессы обычной кулинарной и технологической обработки пищи также не приводят к разрушению ТТМТ [Wolf-Hall C.E. et al., 1999]. Такая устойчивость ТТМТ связана с высокой стабильностью эпоксида в структуре токсина, поэтому для раскрытия этого кольца, являющегося основным фактором токсичности, требуются жесткие условия [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Наиболее эффективными из способов детоксикации являются автоклавирование зерна при повышенном давлении в растворе бисульфита натрия [Young J.C., et al., 1987], обработка концентрированными кислотами и щелочами [Рухляда В.В., 1993]. Однако такие методы детоксикации исключают возможность дальнейшего использования продовольственного сырья. В молекуле всех трихотеценовых микотоксинов имеются две основные функциональные группы, ответственные за токсические свойства этого класса соединений: 12,13-эпоксигруппа и, в меньшей степени, двойная связь С-9 - С-10 [Grove J.F., Mortimer P.H., 1969]. Если восстановление двойной связи С-9 - С-10 приводит к незначительному снижению токсичности, то размыкание эпоксидного кольца и трансформация его в двойную связь С-12 - С-13 вызывает почти полную потерю биологической активности [Bamburg J.R., Strong F.M., 1971; Smalley E.B. et al., 1973; Bamburg J.R., 1976; Grove M.D. et al., 1984; Swanson S.P. et al., 1988]. Кроме того, важную роль в токсичности трихотеценов играет свободная 3α-ОН группа в молекуле ТТМТ групп А и В [Bergmann F. et al., 1988]. На токсичность ТТМТ влияют также боковые ацетильные группы в молекуле некоторых представителей групп А (Т-2 токсин, диацетоксискирпенол и др.) и В (фузаренон-Х, ацетилДОН), изовалериловый радикал при С-8 у Т-2 токсина и некоторых его гомологов (группа А) [Madhyastha M.S. et al., 1994] и наличие макроцикла между углеродными атомами С-4 и С-15 (ТТМТ группы С). ТТМТ групп А и В с гидроксильными группами более токсичны, чем их аналоги с атомом водорода в том же положении [Thompson W.L., Wannenmacher R.W., 1986]. 1.1.2. Распространенность ДОН и других фузариотоксинов в природе Накопленный за последние десятилетия фактический материал позволяет сделать вывод о повсеместном распространении как продуцентов ТТМТ, так и самих токсинов [Scott P.M., 1990; Miller J.D., 1995 a]. Наиболее часто грибы рода Fusarium по-

-9ражают злаковые сельскохозяйственные культуры в регионах с влажным и умеренно теплым климатом как в нашей стране, так и за рубежом. Вспышки фузариоза зерновых культур неоднократно отмечались в разных странах мира, в частности в Канаде, США, Японии, Китае, Индии, странах центральной Европы, а так же на территории бывшего СССР [Scott P.M., 1989, 1990; Левитин М.М., 1994; Фузариоз колоса..., 1992; Захарова Л.П. и др., 1994; Miller J.D., 1995 а]. ДОН является основным микотоксином, загрязняющим зерно, в России, США, Канаде, Австрии, Италии, Великобритании, Северной Африке и ряде других стран [Tutelyan V.A. et al., 1990; Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; Scott P.M., 1997; Hochsteiner W., Schuh M., 2001]. Чаще всего он обнаруживается в пшенице, реже — в ячмене, ржи и других злаковых культурах, пораженных фузариозом. По данным американских ученых, в некоторых странах мира концентрация ДОН в пшенице, пораженной F. graminearum, варьировала от 2,8 до 44 мг/кг [Bai G. et al., 1999]. В исследованиях Gereis M. et al. (1989) ДОН был обнаружен в 90% изученных образцов из 12 европейских стран, причем максимальный уровень токсина составил 43,8 мг/кг зерна. В Швеции в зерне пшеницы урожая 1984 г. обнаруживаемые концентрации ДОН находились в диапазоне 0,05-1,18 мг/кг, а в 1982 г. — 0,04-2,60 мг/кг [Pettersson H., et al., 1986]. При исследовании зерна пшеницы урожаев 1987-1988 гг. в Финляндии было показано, что более 90% образцов содержали ДОН в количестве от 0,007 до 0,03 мг/кг [Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991]. В пшенице из Венгрии, собранной в 1998 г., концентрация ДОН достигала 4,3 мг/кг [Fazekas B. et al., 2000]. В США и Канаде в отдельные годы уровни контаминации пшеницы этим токсином достигали 2,65-8,53 мг/кг при частоте выявления 47-100% [Wood G.E., Carter L., 1989; Scott P.M., 1990, 1997]. В 1991 г. в пшенице из США уровни ДОН достигали 9,33 мг/кг при среднем уровне контаминированных образцов 1,57 мг/кг [Fernandes C. et al., 1994]. В Аргентине 80% урожая 1993/94 гг. были контаминированы ДОН, уровни которого варьировались от 0,3 до 4,5 мг/кг [Dalcero A. et al., 1997]. 93,3% исследованных образцов аргентинской пшеницы содержали ДОН в количестве от 0,1 до 9,25 мг/кг [Pacin A.M. et al., 1997]. Имеются данные об обнаружении ДОН в ячмене Уругвая [Pineiro M.S. et al., 1995-96]. Уровень ДОН в пшенице Венесуэлы достигал 3,2 мг/кг [Contreras M.M.C. et al., 2000]. Широко распространены микромицеты рода Fusarium в странах ЮгоВосточной Азии. В северо-восточных провинциях Китая вспышки фузариоза пшени-

- 10 цы повторяются каждые 3-4 года. В образцах хлебных злаков обнаруживали ДОН в количестве 0,34-92,8 мг/кг зерна [Wei R.Y., 1986; Luo X.-Y., et al., 1987]. Сильное поражение микромицетами рода Fusarium продовольственной пшеницы наблюдалось в 1987 г. в Индии (Кашмир): содержание ДОН в некоторых образцах достигало уровня 8,38 мг/кг [Bhat R.V., et al., 1989]. Обнаруживался ДОН также в зерне из Индонезии (до 0,032 мг/кг) [Sardjono A.N. et al., 1998]. Особенностью продуцентов фузариотоксинов является их способность синтезировать одновременно несколько микотоксинов [Смирнов В.В. и др., 2000]. Наиболее часто наряду с ДОН в пораженном фузариозом зерне обнаруживается зеараленон, обладающий выраженными эстрогенными свойствами. О высокой частоте обнаружения ДОН и зеараленона в пшенице и кукурузе, пораженных F. graminearum, сообщают [Nesh G.A. et al., 1983]. Также сообщалось о совместном присутствии ДОН и зеараленона в кукурузе из Новой Зеландии [Lauren D.R., Ringrose M.A., 1997], Одновременное присутствие ДОН и зеараленона выявлено в зерновых, собранных в Аргентине [Gonzalez H.H. et al., 1999] и Индонезии [Sardjono A.N. et al., 1998]. Зеараленон определялся в контаминированном ДОН овсе из Германии урожаев 1987, 1989-1992 гг. [Müller H.M., Schwadore K., 1993; Müller H.M. et al., 1998]. Имеются сведения о совместном присутствии ДОН и зеараленона в пшенице и ячмене из Японии [Yoshizawa T., Jin Y.Z., 1995], ячмене из Уругвая [Pineiro M.S. et al., 1995-96], а также в пшенице из Польши [Perkowski J., et al., 1990] и Финляндии [Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991]. Также во многих странах наряду с ДОН в контаминированном зерне обнаруживали другие трихотецены: ацетилаты ДОН, ниваленол, Т-2 токсин, НТ-2 токсин [Teich A.H., et al., 1987; Tanaka T. et al., 1988; Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; Sardjono A.N. et al., 1998; Grabarkiewicz-Szczesna J. et al., 2001]. Показано, что 3ацетилДОН чаще встречается в Европе и Азии, в то время как 15-ацетилДОН преобладает в Северной и Южной Америке [Miller J.D., 1995 а]. В странах Юго-Восточной Азии (Япония, Китай, Корея, Тайвань) ниваленол, обнаруживаемый совместно с ДОН, иногда присутствует в бо´ льших количествах, чем ДОН [Yoshizawa T., 1984; Tanaka T., et al., 1986 б; Miller J.D., 1995 б]. Результаты эпидемиологических наблюдений свидетельствуют, что алиментарные микотоксикозы и, в первую очередь, фузариотоксикозы как у людей, так и у сельскохозяйственных животных, являются обычно следствием поступления с пищей (кормом) нескольких микотоксинов, среди которых один или два являются домини-

- 11 рующими. Так, в описанных в последние годы случаях массовых отравлений людей в Индии [Bhat R.V. et al., 1989] в пшеничной муке были обнаружены наряду с ДОН (в концентрации до 8,38 мг/кг) еще три трихотеценовых микотоксина — Т-2 токсин (в концентрации 0,55–0,8 мг/кг), ниваленол и ацетил-ДОН (в количестве до 2,4 мг/кг). В Китае, в 35 случаях массовых отравлений, связанных с контаминацией зерна пшеницы и кукурузы микотоксинами, в качестве загрязнителей были обнаружены ДОН (в концентрации до 92,8 мг/кг) и зеараленон (в количестве до 0,59 мг/кг) [Luo X.Y., 1988]. В России основным ареалом фузариоза является Северо-Кавказский регион [Львова Л.С. и др., 1992; Захарова Л.П. и др., 1994, 1995]. Результаты мониторинга содержания ДОН в свежеубранном зерне за последние 11 лет выявили постоянный высокий уровень загрязнения ДОН зерна пшеницы в этом регионе. Обращает на себя внимание высокий уровень контаминации ДОН пшеницы урожаев 1989, 1992 и 1993 гг., когда практически все изученные образцы пшеницы из Северо-Кавказского региона содержали ДОН [Tutelyan V.A., 1998]. В 1992 г. 92% всех исследованных партий зерна пшеницы содержали ДОН в количестве, превышающем ПДК*, а в 1993 г. уровень ДОН превышал ПДК в 69% исследованных образцов. В 1992 г. концентрация ДОН в зерне пшеницы достигала 8,05 мг/кг при среднем уровне контаминации 1,96 мг/кг зерна [Захарова Л.П. и др., 1994, 1995]. Во все годы прослеживается четкая корреляция между концентрацией ДОН в пшенице и уровнем поражения ее фузариозом [Львова Л.С. и др., 1994; Захарова Л.П. и др., 1994, 1995]. Частота обнаружения ДОН в продовольственном зерне пшеницы коррелировала с частотой контаминации заготавливаемого зерна и была наиболее высокой в 1989, 1992 и 1993 гг. — 26, 38 и 23% соответственно, причем количество образцов с содержанием ДОН выше ПДК варьировало от 9 до 20%. Анализ потребления контаминированного ДОН зерна пшеницы показал, что наибольшее количество содержащей ДОН пшеницы потребляется в СевероКавказском регионе. В 39% изученных образцов выявляли ДОН, причем 24% образцов содержали ДОН выше ПДК. Расчетная суточная нагрузка ДОН на человека в среднем по России в период 1989–1995 гг. различалась по годам и варьировала от 0,07 до 1,40 мкг/кг массы тела. В Северо-Кавказском регионе эти величины в течение всего периода наблюдения были выше, чем в других регионах, и в период с 1992 по 1995 гг. варьировали от 0,29 до 4,10 мкг/кг массы тела, превышая допустимую суточную дозу — 3 мкг/кг массы тела [Кравченко Л.В. и др., 1998].

- 12 В результате исследований, проведенных в НИИ питания РАМН, показана возможность накопления в отдельные годы в зерне пшеницы наряду с ДОН другого фузариотоксина — зеараленона. Так в 69% исследованных партий заготавливаемой пшеницы урожая 1992 г. обнаруживали зеараленон в концентрациях от 0,01 до 1,48 мг/кг. В 1993 г. из 154 исследованных партий пшеницы в 3-х случаях (2%) было установлено наличие зеараленона в количестве до 0,28 мг/кг [Львова Л.С. и др., 1994; Кравченко Л.В. и др., 1998]. В виду повсеместного распространения ДОН и отсутствия эффективных способов детоксикации в ряде стран установлены предельно-допустимые концентрации (ПДК) ДОН в зерне. В США ПДК ДОН составляет 1 мг/кг в продуктах переработки пшеницы. В Канаде допустимый уровень ДОН в неочищенной пшенице составляет 2 мг/кг. Установленная в Китае ПДК ДОН в пшенице равна 1 мг/кг зерна [FAO, 1996]. В России ПДК ДОН в пшенице установлена на уровне 0,7 мг/кг, а в ячмене — 1 мг/кг [СанПиН, 1997]. 1.1.3. Токсическое действие трихотеценовых микотоксинов Токсическое действие дезоксиниваленола, Т-2 токсина, ниваленола, как и большинства других ТТМТ, характеризуется поражением желудочно-кишечного тракта, кроветворных и иммунокомпетентных органов. Общим симптомом острого отравления являются рвота и понос, отказ от корма; при длительном воздействии ТТМТ развивается лейкопения. Т-2 токсин обладает дерматотоксическими свойствами. ТТМТ являются сильными иммунодепрессантами. Алиментарные микотоксикозы, вызванные пищевыми продуктами и кормами, пораженными микроскопическими грибами продуцентами ТТМТ, относятся к наиболее рано описанным микотоксикозам человека и сельскохозяйственных животных. Алиментарная токсическая алейкия (АТА) — заболевание, наблюдавшееся в отдельные годы, вплоть до 1955 г., на территории СССР и связанное с употреблением в пищу продуктов переработки перезимовавшего под снегом зерна проса, пшеницы, ячменя [Рубинштейн Ю.И., Лясс Л.С., 1948; Joffe A.Z., 1983]. Заболевание характеризовалось локализацией в сельской местности, выраженной очаговостью, сезонностью, неравномерностью вспышек в разные годы и бесспорным доказательством связи с *

До 1995 г. ПДК ДОН в пшенице сильных и твердых сортов составляла 1,0 мг/кг и во всех остальных сортах — 0,5 мг/кг.

- 13 употреблением в пищу зерна, пораженного микроскопическими грибами F. sporotrichiella [Саркисов А.Х., Квашнина Е.С., 1948; Билай В.И., 1977], в последствии идентифицированных как продуценты ТТМТ, главным образом Т-2 токсина [Билай В.И. и др., 1983; Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. В легких случаях заболевание протекало по типу гингивита, стоматита, глоссита, реже — по типу гастроэнтерита, с тошнотой, рвотой, головной болью, головокружением и длилось 3-5 дней. При длительном потреблении загрязненных продуктов доминирующим симптомам становилась прогрессирующая лейкопения, переходящая в особо тяжелых случаях в алейкию и сопровождающаяся геморрагическими диатезами, носовыми кровотечениями, кровотечениями из десен, некрозами зева и глотки (ангинозный синдром) [Саркисов А.Х., Квашнина Е.С., 1948; Билай В.И., Пидопличко Н.М., 1970]. Синдром «пьяного хлеба» — заболевание человека и животных, связанное с употреблением зерновых продуктов, пораженных грибами F. graminearum, известных в настоящее время как продуценты ДОН, ниваленола, зеараленона. Впервые это заболевание наблюдали на Дальнем Востоке в 1882 г. [Саркисов А.Х., 1954; Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Случаи отравления отмечались также в Италии, Германии, Швеции, Финляндии и Франции [Matossian M.K., 1989]. У людей симптомы отравления появлялись вскоре после приема в пищу продуктов (главным образом хлеба) из пораженного («пьяного») зерна: через 30-60мин появлялась рвота, боли в области живота, понос, возникало чувство слабости, тяжести в конечностях, скованность походки. Через день наступало состояние, похожее на состояние после тяжелого опьянения: сильные головные боли, головокружение. При длительном потреблении «пьяного хлеба» у людей наблюдалось истощение, потеря зрения, явления нарушения психики. У заболевших домашних животных характерными симптомами явились отказ от корма и рвота [Саркисов А.Х., 1985]. Известны случаи массовых отравлений в Китае [Luo X.Y., 1988] и Индии [Bhat R.V. et al., 1989] заплесневелой пшеницей и кукурузой с высоким содержанием ДОН. Симптомы отравления — тошнота, рвота, боли в животе, понос, головокружение и головная боль, появлялись через 5-30 мин после приема пищи. В случаях присутствия наряду с ДОН Т-2 токсина у большинства заболевших были жалобы на першение в горле. Акакаби-токсикоз, или болезнь, вызванная пораженным красной плесенью зерном, начиная с 1890 г. периодически отмечается у людей и сельскохозяйственных

- 14 животных в Японии и Корее. Вспышки заболевания наблюдаются в годы с обильными дождями в период цветения, созревания и сбора урожая зерновых и связаны с поражением зерна некоторыми штаммами F. graminearum — продуцентами ДОН, ниваленола и фузаренона-Х. У людей заболевание протекает по типу пищевого отравления — вскоре после приема пищи появляются тошнота, рвота, боли в животе, реже — понос, головная боль, озноб [Kuiper-Goodman T., 1994]. Нередко одновременно болеют домашние животные, у которых основными симптомами являются отказ от корма, рвота, понос [Ueno Y., 1986; Kubena L.F. et al., 1997; Hughes D.M. et al., 1999]. Основными органами-мишенями действия ТТМТ являются кроветворные и иммунокомпетентные органы. Внутрибрюшинное или per os введение ДОН или Т-2 токсина мышам вызывало дозозависимую атрофию тимуса и селезенки, связанную с гибелью клеток вследствие апоптоза [Ihara T., et al., 1997; Islam Z. et al., 1998; Zhou H.-R. et al., 2000]. В экспериментах, проведенных в НИИ питания РАМН, также отмечалось дозозависимое снижение относительной массы тимуса при введении крысам Т-2 токсина или ДОН per os [Кравченко Л.В. и др., 2000]. Дегенеративные и некротические изменения иммунокомпетентных и кроветворных органов сопровождаются проявлением иммуносупрессорной активности ТТМТ [Борисов В.А., 1988 б; Pariza M.W.,1996; Bondy G.S., Pestka J.J., 2000] и гематологическими изменениями (лейкоцитопения, анемия, тромбоцитопения и др.) [Lutsky I., Mor N, 1981; Rotter B.A. et al., 1994, 1996]. По своему механизму ТТМТ относятся к ингибиторам синтеза белка. Некоторые трихотецены (Т-2 токсин, НТ-2 токсин, неосоланиол, ниваленол, диацетоксискирпенол, фузаренон-Х и др.) ингибируют процесс инициации трансляции, включаясь на этапе перед образованием комплекса между рибосомой, информационной РНК, метионил-тРНК. Другие ТТМТ, такие как трихотецин, трихотеколон, веррукарол, дезоксиниваленол подавляют процесс элонгации и терминации, т.е. ингибируют процесс связывания тРНК с рибосомами, а также процессы транслокации, или препятствуют освобождению пептидов от рибосом. ТТМТ, подавляющие инициацию трансляции, обладают более выраженными токсическими свойствами, чем токсины, влияющие на более поздние стадии синтеза белка на рибосомах [Ueno Y., 1983; Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Также получены данные, показывающие, что наряду с блокированием синтеза белка некоторые ТТМТ (Т-2 токсин, ниваленол, дезоксиниваленол, диацетоксискирпенол)

обладают

способностью

ингибировать

синтез

ДНК

- 15 [Cundlife E. et al., 1974; Тутельян В.А., 1985; Thompson W.L., Wannemacher R.W., 1990; Atroshi F. et al., 1995]. Важным компонентом биологической активности ТТМТ является их повреждающее воздействие на мембраны субклеточных структур [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985]. Одним из механизмов токсичности ТТМТ может являться индукция процесса образования свободных радикалов и инициация реакции перекисного окисления липидов. Показано, что Т-2 токсин индуцирует перекисное окисление липидов в печени и в тканях других органов [Khachatourians G.G., 1990; Mezes M. et al., 1999]. Однократное введение крысам per os ДОН и Т-2 токсина приводило к усилению процессов перекисного окисления липидов на 21 и 268% соответственно [Rizzo A.F. et al., 1994]. Во многих случаях продукция свободных радикалов может служить дополнительным механизмом токсичности, более существенным, чем прямое повреждение клеток [Atroshi F. et al., 2000]. 1.2. ОСНОВНЫЕ ПУТИ БИОТРАНСФОРМАЦИИ И ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ

1.2.1. Общие сведения Многочисленные ферменты метаболизма ксенобиотиков с различными, но частично перекрывающимися каталитическими свойствами играют ключевую роль в процессе биотрансформации и детоксикации чужеродных веществ в организме. Эти ферменты сформировались в процессе эволюции и позволили различным видам выжить и прогрессировать в сложных условиях окружающей среды [Lang M., Pelkonen O., 1999]. Биотрансформация чужеродных соединений в организме происходит по двум главным направлениям (фазам метаболизма). Реакции I фазы обусловливают специфическую перестройку в молекуле субстрата с образованием функциональных групп. Эти реакции обычно предшествуют реакциям второй фазы, хотя иногда сразу имеют место последние. Кроме того, в некоторых случаях продукты реакций I фазы могут выводиться из организма, минуя дальнейшие превращения. Реакции II фазы приводят к образованию конъюгатов чужеродных соединений с высокополярными эндогенными субстратами. В результате этих метаболических процессов образуются более полярные и водорастворимые производные чужеродных веществ, которые могут с

- 16 большей легкостью выводиться из организма. Как правило, биотрансформация также ведет к образованию менее токсичных соединений [Meydani M., 1987; Sitkiewicz D., 2000]. Оба этих процесса осуществляются под воздействием ферментных систем печени и других органов (желудочно-кишечного тракта, почек, легких, крови и др.). Существенную роль в биотрансформации играют также ферментные системы микрофлоры желудочно-кишечного тракта [Sheline R.R., 1968]. Биохимические превращения первой фазы метаболизма по видам реакций можно разделить на окислительные, восстановительные и гидролитические. Продукты этой фазы в дальнейшем могут подвергаться конъюгации с последующим выделением, но могут выводиться без дальнейших изменений [Парк Д.В., 1973]. Окислительные реакции протекают под влиянием микросомальных монооксигеназ. Эти ферменты играют ключевую роль в биотрансформации и детоксикации большого

числа

различных

ксенобиотиков,

катализируя

реакции

их

С-

гидроксилирования в алифатической цепи, в ароматическом и ациклических кольцах и в

алкильных

боковых

цепях,

N-гидроксилирования,

О-дезалкилирования,

S-

дезалкилирования, N-дезалкилирования, окислительного дезамидирования и дезаминирования, десульфирования и эпоксидирования [Belinsky S.A. et al., 1987]. Важнейшим компонентом микросомальной монооксигеназной системы, ответственным за активацию молекулярного кислорода и связывание субстрата является цитохром Р-450. В настоящее время известно более 700 изоформ цитохрома Р-450 [Archakov A.I., Degtyarenko K.N., 1993; Omiecinski C.J. et al., 1999]. Многообразием изоформ определяется субстратная специфичность цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ. Реакции восстановления катализируются микросомальными ферментами печени — редуктазами, коферментами которых являются NADH или NADPH. Эти реакции обратимы и приводят к восстановлению кетонов в соответствующие спирты и ароматических нитро- и азозоединений в амины. Реакции гидролиза приводят к разрушению сложноэфирной связи в молекуле чужеродных эфиров и амидов. Эти реакции катализируются рядом гидролитических ферментов — эстераз, — локализующихся как в печени, так и в плазме крови. Некоторые из этих ферментов локализуются в микросомах печени [Krisch K., 1963]. В результате отщепления боковых заместителей ксенобиотики приобретают реактивные группы OH, NH2, COOH, SH. Образующиеся таким путем метаболиты легко вступают

- 17 в реакции конъюгации с образованием малотоксичных высокополярных соединений, которые выводятся из организма с мочой, желчью и калом [Голиков С.Н. и др., 1986]. Важную роль в гидролитической биотрансформации ксенобиотиков, содержащих эфирные и амидные связи, играет карбоксилэстераза (КФ 3.1.1.1.). Карбоксилэстеразы млекопитающих представляют собой большую группу ферментов, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме клеток многих тканей (печени, почках, селезенке и др.) [Satoh T., Hosokawa M., 1998]. Другим ферментом, гидролизующим связь углерод–кислород в эпоксидном кольце, является эпоксидгидролаза (КФ 3.3.2.3). Она локализована в эндоплазматическом ретикулуме клеток печени, почек, легких и кишечника и является ключевым ферментом детоксикации высокотоксичных и реакционноспособных эпоксидсодержащих соединений как экзогенного, так и эндогенного происхождения [Oesch F. et al., 2000]. Реакции конъюгации составляют вторую фазу биотрансформации ксенобиотиков, которые в первой фазе при действии микросомальных монооксигеназ получили нуклеофильные группы. Химические соединения, изначально имеющие в своем составе реакционноспособные группы (OH, NH2, COOH, SH), могут вступать в реакции конъюгации без предварительных превращений с участием монооксигеназ печени. В организме животных и человека основными являются следующие реакции конъюгации: глюкуроновая, сульфатная, глутатионовая, глутаминовая, аминокислотная, метилирование, ацетилирование. Поскольку перечисленным реакциям может подвергаться большинство ксенобиотиков, а продукты их, как правило, нетоксичны и быстро экскретируются из организма [Принципы и методы оценки токсичности химических веществ, 1981], эти реакции рассматриваются как один из основных компонентов общих механизмов детоксикации. Конъюгация с глюкуроновой кислотой является доминирующим механизмом конъюгации и осуществляется у всех млекопитающих. Этот процесс происходит наиболее активно в печени, в меньшей степени в почках, желудочно-кишечном тракте и коже [Anthony Y. H. Lu., 1979; Stenlake J.B., 1979; Ritter J.K., 2000]. Ферментом, катализирующим процесс присоединения к молекуле ксенобиотика остатка глюкуроновой кислоты, является UDP-глюкуронозилтрансфераза (уридиндифосфатглюкуронозилтрансфераза, UDP-ГТ; КФ 2.4.1.17). UDP-глюкуронозилтрансфераза имеет гетерогенный характер, то есть представляет собой группу изоформ, объединенных в семейства 1А и 2В, каждая из которых катализирует взаимодействие с глюкуроновой кислотой определенных

- 18 соединений в зависимости от вариации их функциональных групп [Голиков С.Н. и др., 1986; Burchell B. et al., 1995; Radominska-Pandya A. et al., 1999; Strassburg C.P. et al., 1999]. Полиморфизм этого фермента и низкая специфичность отдельных изоформ к разным субстратам определяет способность UDP-глюкоронозилтрансферазы катализировать образование глюкуронидов широкого ряда соединений [Tephly T.R., Burchell B., 1990]. У человека известно 15 изоформ этого фермента [Tukey R.H., Strassburg C.P., 2000]. У крыс обнаружено 8 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы: 6 представителей семейства 1А и 2 представителя семейства 2В [Li Y.Q. et al., 1999; Grams B. et al., 2000]. Глюкурониды ксенобиотиков в организме животных образуются в несколько стадий. Сначала синтезируется активированный интермедиат UDP-глюкуроновая кислота (UDP-ГК): UDP-α-D-глюкоза + 2NAD + Н2О → UDP-α-D-глюкуроновая кислота + 2NADН2. Фермент, катализирующий эту реакцию, — UDP-глюкозодегидрогеназа (КФ 1.1.1.22) — локализован в растворимой фракции печени. Затем глюкуроновая кислота переносится от UDP-ГК на субстрат [Головенко Н.Я., Карасева Т.Л., 1983]: UDP-α-D-глюкуроновая кислота + R–OH → R–O–β-D-глюкуроновая кислота + UDP + Н2О. На реакцию конъюгации с глюкуроновой кислотой влияют различные факторы, такие как возраст [Gradinaru D. et al., 1999], пол, некоторые патологические состояния печени [Little J.M. et al., 1999], многие гормоны [Li Y.Q. et al., 1999]. У крыс-самцов образуется больше конъюгатов, чем у самок, возможно, потому, что тестостерон стимулирует образование глюкуронидов. Напротив, эстрадиол снижает экскрецию глюкуронидов

у

самцов

[Лакин К.М.,

Крылов Ю.Ф.,

1981].

Известно,

что

3-

метилхолантрен индуцирует преимущественно изоформы фермента, входящие в семейство 1А. Активирование проходит по механизму связывания индуктора с Ah-рецептором, контролирующим экспрессию некоторых ферментов метаболизма ксенобиотиков [Saarikoski S.T. et al., 1998]. У крыс основными изоформами, индуцируемыми 3-метилхолантреном, являются 1А1 и 1А6 [Emi Y. et al., 1996; Jemnitz K. et al., 2000]. Фенобарбитал является индуктором преимущественно изоформ семейства 2В UDPглюкоронозилтрансферазы [Oguri K. et al., 1996]. Показано, что у крыс Вистар основной индуцируемой фенобарбиталом изоформой является 2В1 [Ishii Y. et al., 1997].

- 19 Еще одним важным механизмом конъюгации чужеродных веществ является сульфатная конъюгация — связывание молекулы ксенобиотика с ацилсульфатом. Эта реакция катализируется сульфотрансферазой. Синтез сульфатов протекает в три стадии∗: АТФ + SO42+ ←→ АФС + P2O74– АФС + АТФ ←→ ФАФС + АДФ R–OH + ФАФС ←→ ROSO3 + АМФ Эти реакции катализируют соответственно аденозинтрифосфат-сульфурилаза (АТФ-сульфурилаза) (КФ 2.7.7.4), аденозинфосфосульфат-киназа (АФС-киназа) (КФ 2.7.1.25) и сульфотрансфераза (КФ 2.8.2.1), способствующая взаимодействию «активного сульфата» аденозин-3'-фосфат-5-фосфосульфата (ФАФС) с гидроксильной группой молекулы субстрата. АТФ-сульфурилаза и АФС-киназа локализованы в цитозоле клеток [Головенко Н.Я., Карасева Т.Л., 1983]. Сульфотрансфераза является цитозольным ферментом, обладающим полиморфизмом. У человека обнаружено 11 изоформ этого фермента, которые существенно различаются по распределению в различных тканях и субстратной специфичности [Glatt H., 2000]. Отмечено дозозависимое соотношение образования глюкуроновых и сульфатных конъюгатов в организме. При увеличении количества поступающего в организм ксенобиотика преобладает глюкуроновая конъюгация; при достаточно больших дозах конъюгация с сульфатом может прекратиться вовсе. Возможно, в организме существует конкуренция за арилгидроксилы между глюкуроновой и серной кислотами, и в силу того, что общий запас сульфатов в организме мал, при увеличении дозы ксенобиотика экскреция возрастает лишь за счет глюкуронида. Значительную роль в детоксикации ксенобиотиков играет их конъюгация с глутатионом. Эту реакцию катализирует фермент глутатионтрансфераза, обладающая, как и многие другие ферменты метаболизма ксенобиотиков, полиморфизмом. У млекопитающих можно выделить 4 семейства цитозольных и 2 семейства мембрансвязанных изоформ фермента, отличающихся селективностью к ряду субстратов. Глутатионовые конъюгаты могут экскретироваться с желчью или превращаться посредством дальнейших ферментативных реакций в меркаптуровые кислоты и выводиться из организма с мочой [Seidegard J., Ekstrom G., 1997].

- 20 В организме человека и животных β-глюкуроновые конъюгаты могут подвергаться гидролизу, катализируемому ферментом β-глюкуронидазой (КФ 3.2.1.31). Этот фермент обнаруживают в большинстве тканей животных, особенно в печени, почках, селезенке, кишечном тракте. Выделяемые в желчь глюкурониды могут гидролизоваться кишечной β-глюкуронидазой, а образовавшиеся в результате этого соединения реабсорбируются, что приводит к увеличению их печеночно-кишечной циркуляции. Как и конъюгаты с глюкуроновой кислотой, сульфаты гидролизуются специфической ферментной системой. Известно несколько типов специфических сульфатаз (стероидсульфатаза, арилсульфатаза), широко представленных в тканях животных различных видов. Наибольшее значение имеют арилсульфатазы (КФ 3.1.6.1), стеролсульфатазы (КФ 3.1.6.2), гликосульфатазы (КФ 3.1.6.3) и хондроитинсульфатазы (КФ 3.1.6.4). Арилсульфатаза I находится в микросомах печени человека и животных. Часто этот фермент называют сульфатазой С. Арилсульфатаза II представляет собой лизосомальный белок, делящийся на формы А и В [Головенко Н.Я., Карасева Т.Л., 1983]. Конъюгаты ксенобиотиков, в том числе глюкуроновые и сульфатные, могут выделяться с желчью в кишечник, подвергаться там дальнейшей биотрансформации, реабсорбироваться в кровь и вновь поступать в печень. Затем эти соединения выделяются с мочой или повторно поступают с желчью в кишечник и выделяются с калом. В такой процесс печеночно-кишечной циркуляции вовлекаются ксенобиотики, имеющие определенную молекулярную массу. Для крыс она составляет 325, а для человека — 500 Д [Голиков С.Н. и др., 1986]. В кишечнике животных и человека ксенобиотики также претерпевают метаболические превращения под воздействием ферментов микроорганизмов. К числу таких превращений относятся реакции гидролиза, восстановления и конъюгации, протекающие с участием бактериальных эстераз, редуктаз, ацетилтрансфераз, деацетилаз, деметилаз и других ферментов [Головенко Н.Я., Карасева Т.Л., 1983; Cheng Z. et al., 1999]. Гидролиз глюкуронидов — один из наиболее важных метаболических процессов, протекающих под влиянием кишечной микрофлоры. Опыты показывают, что у крыс гидролиз происходит в слепой и толстой кишках, но не в тощей. Глюкурониды гидролизуются главным образом анаэробными микроорганизмами. Определенное участие в этом процессе принимают E. coli в нижней части кишечника, также, воз∗

АТФ — аденозинтрифосфат; АДФ — аденозиндифосфат; АМФ — аденозинмонофосфат; ФАФС — аденозин-3'-фосфат-5-фосфосульфат; АФС — аденозинфосфосульфат.

- 21 можно, в проксимальной части тонкой кишки (в этом отношении обнаружены значительные различия у разных видов животных). 1.2.2. Основные пути биотрансформации и детоксикации трихотеценовых микотоксинов Процессы биотрансформации трихотеценов в настоящее время изучены очень слабо. Имеющиеся сведения касаются главным образом Т-2 токсина. Эти ферментативные реакции можно подразделить на гидролитические (деацилирование), окислительные (гидроксилирование), восстановительные (деэпоксидирование) и реакции конъюгации [Swanson S.P., Corley R.A., 1989]. Деацилирование представляет собой гидролиз ацетильных остатков. Этой реакции могут подвергаться молекулы трихотеценов, имеющие боковые ацетильные группы: 3-ацетилДОН, триацетилскирпентриол, Т-2 токсин, НТ-2 токсин и др. [Udell M.N., Dewick P.M., 1989; Ueno Y., 1986; Yagen B., Bialer M., 1993]. Установлено, что ферментом, катализирующим этот тип реакций, является микросомальная неспецифическая карбоксилэстераза [Ohta M. et al., 1977, 1978]. Т-2 токсин, введенный животным per os, подвергался реакции гидроксилирования атома С-3 3-метилбутирилоксигруппы. 3’-гидроксилированные метаболиты Т-2 токсина образовывались в микросомальной фракции в присутствии NADPH [Yoshizawa T. et al., 1984]. Аналогичный результат был получен в экспериментах in vitro, в которых Т-2 токсин подвергался воздействию печеночных ферментных систем животных [Yoshizawa T. et al., 1982; Yagen B., Bialer M., 1993]. Предполагается, что в реакции гидроксилирования Т-2 токсина принимают участие цитохром Р-450зависимые монооксигеназы. Третий метаболический путь трихотеценов — деэпоксидирование 12,13эпоксикольца. В результате этой реакции эпоксигруппа превращается в винильную связь. Деэпоксид ДОН был выявлен как при оральном введении ДОН крысам [Yoshizawa T., et al., 1983], так и при инкубировании ДОН in vitro с желудочной жидкостью коров [Cote L.-M., et al., 1986 a; Yoshizawa T., et al., 1986]. Деэпоксипроизводные Т-2 токсина и его метаболитов обнаруживались в экскрементах и тканях животных после введения им Т-2 токсина [Yagen B., Bialer M., 1993]. Имеется предположение, что деэпоксидирование катализируется ферментными системами кишечной микрофлоры.

- 22 Реакция конъюгации приводит к образованию глюкуронового конъюгата дезоксиниваленола, а также глюкуронидов Т-2 токсина и его метаболитов в организме животных [Ueno Y., 1986; Yagen B., Bialer M., 1993]. Ферментом, ответственным за образование глюкуронидов, является UDP-глюкуронозилтрансфераза. В результате таких метаболических превращений молекула токсина становится более полярной и гидрофильной, что ускоряет ее выведение из организма. Кроме того, в молекуле микотоксина появляются новые функциональные группы, что, как правило, приводит к потере токсических свойств: деэпоксидирование влечет за собой размыкание эпоксидного кольца, что приводит к практически полной потере токсичности, конъюгация ведет к блокированию таких функциональных групп, как –СООН и –ОН, что также дезактивирует молекулу [Тутельян В.А.,1985]. Исследования, проведенные с рядом ТТМТ показали, что эти токсины быстро всасываются из желудочно-кишечного тракта, обнаруживаясь через 30-60 мин. в максимальных концентрациях в крови, подвергаются метаболизму и в течение 24-72 часов практически полностью выводятся из организма [Beasley V.R. et al., 1986; Suneja S.K. et al., 1988; Lee R.C. et al., 1990]. 1.2.2.1. Биотрансформация дезоксиниваленола Для ДОН выделен только один структурный метаболит, впервые описанный в 1983 г. [Yoshizawa T., et al., 1983] (рис. 3). При введении ДОН внутрижелудочно крысам в моче, кале и в небольшом количестве в плазме крови и тканях печени было обнаружено его производное, в котором эпоксидное кольцо превращалось в винильную связь. Новый метаболит, 3α,7α,15-тригидрокситрихотец-9,12-диен-8-он, был назван ДОМ-1. Деэпоксидирование осуществляется, по-видимому, за счет ферментных систем микрофлоры желудочно-кишечного тракта. При инкубировании ДОН с содержимым рубца in vitro в реакционной смеси обнаруживался ДОМ-1 [King R.R., et al., 1984; Hedman R., Pettersson H., 1997]. Поскольку эпоксигруппа в эпокситрихотеценовых микотоксинах является одним из главных факторов их токсичности, очень вероятно, что такая реакция прямо связана с детоксикацией этих ксенобиотиков [King R.R., et al., 1984; Ueno Y., 1986]. Кроме того, в экскретах и тканях лабораторных животных, получивших ДОН, обнаруживали глюкуроновые конъюгаты как ДОН (рис. 4), так и ДОМ-1. Предполагается, что основным местом образования глюкуронидов является печень; ферментом, катализирующим процесс конъюгации с остатком глюкуроновой кислоты, является

- 23 UDP-глюкуронозилтрансфераза, представляющая собой группу изоформ [Kasper Ch., Henton D., 1980; Голиков С.Н. и др., 1986; Radominska-Pandya A. et al., 1999; Strassburg C.P. et al., 1999].

ДОН

ДОМ-1

Рис. 3. Структура ДОН и ДОМ-1.

Рис. 4. Структура глюкуронового конъюгата ДОН. Изучение метаболизма ДОН у крыс показало, что через 96 ч. после введения однократной оральной дозы ДОН с радиоактивной меткой (14С) 25% радиоактивности было экскретировано с мочой и 64% с калом. За 24 ч. с мочой выводилось 6,2% введенного токсина в виде свободного ДОН и 2,5-3,2% в виде свободного ДОМ-1; количество токсина, выводимого с калом за 24-48 ч. в виде свободных ДОН и ДОМ-1 было около 3% и 6,4-8,3% соответственно [Lake B.C., et al., 1987]. По другим данным у крыс за 72 ч. с мочой выводилось в виде свободного ДОН 4,5% орально введенной дозы и в виде свободного ДОМ-1 — 4,4%; с калом экскретировалось 0,3% в виде свободного ДОН и 5,6% в виде свободного ДОМ-1 [Yoshizawa T., et al., 1983]. Важно отметить, что при введении ДОН per os крысам, предварительно получавшим антибиотики, по-

- 24 давляющие их кишечную микрофлору, наблюдалось значительное снижение образования и экскреции ДОМ-1 как с калом, так и с мочой. В то же время инкубирование ДОН с анаэробным препаратом кишечного содержимого крыс приводило к образованию ДОМ-1, а при инкубировании ДОН с гомогенатом печени образования ДОМ-1 не наблюдали. Из этого можно заключить, что деэпоксидирование ДОН происходит под влиянием ферментных систем микроорганизмов желудочно-кишечного тракта [Worrell N.R. et al., 1989]. При введении ДОН свиньям per os в моче и кале наряду с неизмененным токсином обнаруживали его глюкуронид и деэпоксид [Bauer J., 1995]. Присутствие ДОН выявляли в плазме крови и спинномозговой жидкости [Prelusky D.B., et al., 1990]. Внутривенно введенный токсин исчезал из крови через 11-17 ч., а в моче переставал обнаруживаться через 20-30 ч. после введения. За 24 ч. с мочой выделялось от 28,1 до 57,2% дезоксиниваленола. [Coppock R.W., et al., 1985]. При введении ДОН овцам per os экскреция с мочой достигала максимума через 6-9 ч. и завершалась через 28-30 ч. после введения. Кроме исходного токсина (2,1% от введенной дозы) с мочой экскретировался конъюгированный ДОН (3,6%), ДОМ-1 (0,06%) и конъюгированный ДОМ-1 (1,2%). Еще 0,11% введенного ДОН выводилось с желчью, преимущественно в виде конъюгированного ДОМ-1, а также 54-75% экскретировалось с калом [Prelusky D.B., et al., 1986]. Токсин обнаруживался также в плазме крови. Причем лишь 14-37% от общего ДОН, выявленного в плазме, соответствовали свободному ДОН, 60-84% приходилось на глюкуроновый конъюгат ДОН и еще 1,82,8% — на ДОМ-1 [Prelusky D.B., et al., 1985]. При внутривенном введении ДОН овцам в крови обнаруживался глюкуроновый конъюгат ДОН в количестве 15-23% общего количества ДОН, выявленного в плазме. Доля ДОМ-1 составила 1,4-1,7% от общего ДОН в плазме [Prelusky D.B., et al., 1985]. С мочой выводилось 63% всего введенного ДОН в виде свободного ДОН (24,1%), глюкуронового конъюгата ДОН (21,2%), ДОМ-1 (0,5%) и глюкуронового конъюгата ДОМ-1 (17,2%). Кроме того, 3,5% введенного ДОН выделялось с желчью, почти полностью в виде глюкуронида ДОМ-1. Однако значительная часть введенного ДОН (33,5%) остается неучтенной, возможно, превращаясь в неидентифицированные метаболиты. [Prelusky D.B., et al., 1986]. Изучение метаболизма внутривенно введенного овцам ДОН с радиоактивной меткой (14С) показало, что 91% введенного токсина выводился с мочой, а 6% обнаруживалось в желчи; 67% всего экскретированного токси-

- 25 на выходило в виде глюкуронидов ДОН (54%) и ДОМ-1 (13%), доля неизмененного токсина составила 11% от введенной дозы; оставшаяся часть (18%) состояла из ДОМ1 (6%), сульфатных конъюгатов ДОН (2%) и трех неидентифицированных метаболитов, содержащих радиоактивную метку (10%) [Prelusky D.B. et al., 1987]. У коров, получавших ДОН с кормом в течение 5 дней, приблизительно 20% потребленного токсина было выведено с мочой и калом в несвязанных формах, таких как ДОН (4%) и ДОМ-1 (96%). При инкубировании образца мочи с β-глюкуронидазой концентрация ДОН увеличивалась в 1,6-3,0 раза, а ДОМ-1 — в 7-16 раз, т.е. основная часть токсинов выводится в виде глюкуроновых конъюгатов [Cote L.-M., et al., 1986a]. Таким образом, основными путями биотрансформации ДОН в организме являются его конъюгация с глюкуроновой кислотой и образование его деэпоксипроизводного, значительная часть которого также выводится в виде глюкуронида. Глюкуроновая конъюгация происходит при участии UDP-глюкуронозилтрансферазы, локализованной главным образом в печени, в то время как образование деэпоксипроизводного связано, по-видимому, с ферментными системами микрофлоры желудочно-кишечного тракта. 1.3. ВЛИЯНИЕ АЛИМЕНТАРНЫХ ФАКТОРОВ НА МЕТАБОЛИЗМ И ТОКСИЧНОСТЬ КСЕНОБИОТИКОВ

Влияние пищевых факторов на процессы биотрансформации чужеродных веществ можно рассматривать с нескольких основных позиций. Во-первых, пищевые вещества выполняют структурную функцию и непосредственно образуют или являются кофакторами ферментных систем метаболизма ксенобиотиков. Во-вторых, нутриенты и непищевые компоненты пищевых продуктов оказывают модифицирующее влияние на активность процессов метаболизма ксенобиотиков, индуцируя или ингибируя монооксигкназную систему и ферменты конъюгации. В третьих, пищевые вещества являются предшественниками эндогенных доноров-субстратов конъюгации, а также субстратами ПОЛ или, напротив, антиоксидантами [Anderson K.E. et al., 1982; Тутельян В.А. и др., 1987]. К настоящему времени накоплен большой фактический материал по влиянию отдельных компонентов пищи и их соотношения на токсикокинетику и ферментные реакции биотрансформации чужеродных веществ [Goldberg I., 1994]. Являясь модуляторами активности ферментных систем как собственно организма, так и микрофлоры же-

- 26 лудочно-кишечного тракта, макро- и микронутриенты играют важную роль в снижении токсических свойств поступающих в организм ксенобиотиков [Meydani M., 1987]. Следует также принимать во внимание, что компоненты пищи помимо биотрансформации влияют также и на другие этапы токсикокинетики ксенобиотиков: всасывание, мембранный транспорт, распределение, депонирование и экскрецию [Тутельян В.А. и др., 1987]. К числу интенсивно изучаемых природных модуляторов разных этапов токсикокинетики ксенобиотиков, и в том числе их биотрансформации и детоксикации, относятся селен, пищевые волокна и пробиотики [Galvano F. et al., 2001]. 1.3.1. Селен Селен представляет собой незаменимый в питании человека и животных микроэлемент, являющийся важным фактором для нормальных процессов жизнедеятельности. В организме человека и животных бо´ льшая часть селена находится в двух формах. Одна из них — селенометионин, который замещает метионин в различных белках; другая — селеноцистеин в селенопротеинах, таких как глутатионпероксидаза (GPX), йодтирониндейодиназа и селенопротеины Р и W. Селенометионин поступает с пищей, т.к. не способен синтезироваться в организме, не регулируется селеновым статусом и может рассматриваться как форма резервирования селена [Levander O.A., Burk R.F., 1996; Гореликова Г.А. и др., 1997]. Основная биологическая роль селена у человека и животных связана с ферментом глутатионпероксидазой (КФ 1.11.1.9), компонентом которой он является. Этот фермент катализирует распад перекиси водорода или разложение гидроперекисей липидов, стероидов, полиеновых жирных кислот и других, образующихся в клетке [Levander O.A., Burk R.F., 1996]. Известно несколько типов глутатионпероксидаз: GPX-I, II, III и IV. GPX-I представляет собой белок, образованный четырьмя одинаковыми субъединицами молекулярной массой 23 кД, организованными в комплекс квадратной формы. Каждая субъединица содержит 1 атом селена в составе селеноцистеина. Этот фермент катализирует разложение перекиси водорода в эритроцитах [Swanson C.A. et al., 1991]: H2O2 + 2GSH = GSSG + 2H2O

- 27 Другая форма — GPX-II — обезвреживает гидроперекиси липидов. Она представляет собой тканевый фермент, локализованный преимущественно в печени и сердце, имеет молекулярную массу 22 кД и в естественных условиях мономерна. GPX-II катализирует следующую реакцию [Гмошинский И.В. и др., 2000]: ROOH + 2GSH = GSSG + ROH + H2O GPX-III — фермент плазмы крови. По специфичности GPX-III сходна с GPX-I. Это тетрамер из 4 субъединиц по 23 кД, но в отличие от GPX-I является гликопротеином. GPX-IV по специфичности тождественна с GPX-II [Kelner M.J., Montoya M.A., 1998]. Результаты многочисленных исследований показали тесную зависимость между количеством поступающего с рационом селена и активностью глутатионпероксидазы в тканях лабораторных животных [Hafeman D.G. et al., 1974; Olsson U. et al., 1993; Гореликова Г.А. и др., 1997]. При крайне низких (ниже 0,02 мг/кг рациона) синтез глутатионпероксидазы практически полностью подавлен. У изначально нормально обеспеченных селеном крыс его прием на уровне 0,1 мг/кг рациона достаточен для поддержания активности фермента [Hill K.E. et al., 1987]. Литературные данные по влиянию обогащения рациона селеном на активность глутатионпероксидазы противоречивы. Активность фермента при обогащении селеном рациона лабораторных животных зависит от многих факторов, в частности от изначального селенового статуса животных, от источника селена и от вводимых доз селена [Селен, 1989; Кравченко Л.В. и др., 1991]. Отмечено, что у крыс количество селена в рационе, превышающее 1 мг/кг, вызывает возрастание активности глутатионпероксидазы в печени, однако при введении токсических доз селена (5 мг/кг рациона и более) активность фермента в печени снижается, одновременно наблюдаются повреждения печени [Julius A.D. et al., 1980]. Важным селеноэнзимом является 5’-йодтирониндейодиназа (КФ 1.11.1.8), ответственная за обмен тиреоидных гормонов. Роль селена в функционировании тканевых дейодиназ свидетельствует о наличии связи обмена этого элемента с обменом йода [Zinoni F. et al., 1987; Никитина Л.П. и др., 1995]. Селенопротеины P и W также выполняют функции антиоксидантов на тканевом уровне, но их механизм защиты организма от воздействия перекисей иной, нежели в случае глутатионпероксидазы [Hill K.E., Burk R.F., 1997; Yeh J.Y. et al., 1997; Sun Y. et al., 2001].

- 28 Защитное действие селена проявляется в снижении токсического действия многих контаминантов окружающей среды природного и антропогенного происхождения, в частности тяжелых металлов: способствует детоксикации метилртути, солей кадмия, висмута, таллия, серебра [Гореликова Г.А. и др., 1997]. Известна способность селена повышать устойчивость организма к ряду бактериальных и вирусных инфекций [Селен, 1989]. Кроме того, селен играет заметную роль в терапии ряда патологических состояний, связанных с накоплением гидроперекисей [Ip C., 1986; Combs G.F., Combs S.B., 1986; Parnham M.J., Graf E., 1987]. Показана ингибирующая активность селена на процессы канцерогенеза. Отмечено уменьшение частоты возникновения спонтанных и химически индуцируемых опухолей у лабораторных животных при введении селена, а также снижение уровня этого микроэлемента в организме онкологических больных. Установлена отрицательная корреляция между частотой поражения населения онкологическими заболеваниями и содержанием селена в продуктах питания, организме и среде [Гореликова Г.А. и др., 1997; McLeod R. et al., 1997]. Селен снижал частоту возникновения опухолей в печени крыс, вызванных 2ацетиламинофлуореном [Harr J.R. et al., 1972], 3-метил-4-диметиламиноазобензолом, диэтилнитрозамином, афлатоксинами, а также уменьшал вероятность возникновения рака других органов (кишечника, молочной железы), индуцированного различными химическими агентами [Shamberger R.J., 1984]. Показано, что введение в корм крыс обогащенного селеном чеснока оказывало защитное действие по отношению к раку молочной железы, индуцированного 7,12-диметилбенз[а]антраценом [Ip C. et al., 1992]. Селен также ингибировал развитие у крыс опухолей вирусного происхождения [Milner J.A.,1985]. Особого внимания заслуживает защитное действие селена от неблагоприятного воздействия на организм трихотеценовых микотоксинов. Принимая во внимание, что инициация свободнорадикального окисления липидов — один из возможных механизмов токсического действия ТТМТ, введение селена может играть значительную роль в ослаблении их токсических свойств. При однократном введении крысам Т-2 токсина per os наблюдалось снижение уровня белка в печени, а также достоверное повышение активности аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы и щелочной фосфатазы. Добавление в рацион селена и витамина Е снижало токсическое действие Т-2 токсина, что проявлялось в отсутствии столь резких изменений вышеупомянутых показателей [Atroshi F. et al., 2000]. Введение крысам ДОН или Т-2 ток-

- 29 сина после содержания на рационе с дефицитом селена и витаминов С и Е вызывало увеличение перекисного окисления липидов на 33 и 307% соответственно. При включении в диету антиоксидантов эти показатели составляли 21 и 268% [Rizzo A.F. et al., 1994]. Внутрижелудочное введение мышам селенита натрия снижало острую летальную токсичность Т-2 токсина [Yazdanpanah H. et al., 1997]. Было показано протекторное действие селена при фузарио- и Т-2 токсикозе у свиней с обеспечением 100%-й сохранности поголовья при летальности в группе без селенотерапии до 25% [Борисов В.А., 1988 а]. Под влиянием селена повышается уровень естественной резистентности животных, сниженный действием фузариотоксинов, к возбудителю сальмонеллеза [Борисов В.А., 1988 б]. Защитные эффекты селена связывают, во-первых, с его антиоксидантной активностью в качестве компонента глутатионпероксидазы, и, во-вторых, с его влиянием на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков. Дефицит потребления селена может приводить к резкому снижению уровня селенопротеинов и, как следствие — к оксидативному стрессу, что влечет за собой различные патологические состояния [McLeod R. et al., 1997; Sakaguchi S. et al., 2000; Reddi A.S., Bollineni J.S., 2001]. Полагают, что один из механизмов участия селена в регуляции активности ферментов метаболизма ксенобиотиков — обеспечение стабильности мембран эндоплазматической сети, что обеспечивает оптимальные условия для функционирования ферментов, участвующих в детоксикационных процессах [Meydani M., 1987; Schrauzer G.N.,1992], а также с влиянием этого элемента на гомеостаз печеночного гема [Correia M.A., Burk R.F., 1976; Mackinnon A.M., Simon F.R., 1976]. Один из механизмов противоракового действия селена основан на препятствии взаимодействия канцерогенов с макромолекулами, в частности с ДНК. Введение селена в корм снижало образование аддуктов афлатоксина В1 и ДНК у цыплят [Thompson H.J., 1984], но имело обратный эффект у крыс [Chen J. et al., 1982]. Другим механизмом антиканцерогенного действия селена может служить стимулирование активности ферментов, обеспечивающих детоксикацию канцерогенов [Martin S.E., Schillaci M., 1984]. Обнаружено, что селен усиливал гидроксилирование кольца, но подавлял гидроксилирование атома азота 2-ацетиламинофлуорена, способствуя детоксикации этого соединения и снижая его активность [Besbris H.J. et al., 1982]. Метаболиты N,N-диметилаланина, 7,12-диметилбенз[а]антрацена, 2-аминофлуорена, бенз[а]пирена, образующиеся ферментами печени крыс, потреблявших высокие дозы селена, про-

- 30 являли меньшую мутагенную активность, чем исходные соединения [Combs J.F., Combs S.B., 1986]. Противораковая активность селена может проявляться и благодаря его антиоксидантным свойствам, в силу которых селен препятствует окислительному повреждению клеточных мембран канцерогенами. Отмечено, что добавление селена в рацион препятствует подавлению активности глутатионпероксидазы, вызываемое некоторыми канцерогенами [Kauppila A. et al., 1984]. Показано, что уровень селена в рационе лабораторных животных в значительной степени влияет на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков. У крыс и мышей, получавших рацион с дефицитом селена, наблюдалось значительное возрастание активности изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы семейства 1А в микросомах печени [Chen J. et al., 1982; Reiter R., Wendel A., 1983]. Кроме того, сообщается о двукратном снижении активности сульфотрансферазы — фермента, ответственного за образование сульфоконъюгатов, — у мышей, содержащихся на рационе с дефицитом селена. Это может означать, что дефицит селена в рационе может способствовать снижению образования сульфоконъюгатов ксенобиотиков [Reiter R., Wendel A., 1983]. Дефицит селена в рационе крыс приводил к возрастанию активности некоторых изоформ важного фермента II фазы метаболизма ксенобиотиков — глутатионтрансферазы (2.5.1.18) [Combs J.F., Combs S.B., 1986; Olsson U. et al., 1993; McLeod R. et al., 1997]. Сходные результаты были получены в опытах на мышах [Reiter R., Wendel A., 1983]. Было установлено, что обогащение рациона крыс селеном в концентрациях, превышающих физиологические потребности, оказывает индуцирующее действие на активность ключевых ферментов метаболизма ксенобиотиков. Высокой чувствительностью

к

избытку

селена

отличались

микросомальные

рНФ-UDP-

глюкуронозилтрансфераза (семейство 1А) и эпоксидгидролаза. Показан дозозависимый эффект в изменении активности этих ферментов. В то же время обогащение рациона крыс селеном не оказывало значительного влияния на активность ГБФ-UDPглюкуронозилтрансферазы и цитозольной глутатионтрансферазы, а также на содержание цитохрома Р-450 в микросомах печени [Кравченко Л.В. и др., 1990; 1991]. В другом исследовании [Ip C., Lisk D.J., 1997] также обнаружено возрастание активности UDP-глюкуронозилтрансферазы в печени крыс при обогащении рациона селеном, но в этом случае отмечалось также увеличение активности глутатионтрансферазы. Было показано, что обогащенный селеном рацион снижает токсичность Т-2 токсина у крыс, что связано с усилением процесса конъюгации Т-2 токсина, и это в определенной сте-

- 31 пени коррелирует с изменением активности ферментов, участвующих в его метаболизме [Кравченко Л.В. и др., 1990; 1991]. 1.3.2. Пищевые волокна Пищевые волокна представляют собой комплекс биополимеров, включающий полисахариды (целлюлозу, гемицеллюлозы, пектиновые вещества), а также лигнин (высокомолекулярное соединение ароматической природы) и связанные с ними белковые вещества. Пищевые волокна формируют стенки растительных клеток и отличаются резистентностью к действию пищеварительных ферментов [Тутельян В.А. и др., 1987; Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 в]. Пищевые волокна можно разделить на однородные, т.е. сформированные из биополимеров одного вида (целлюлоза, лигнин, пектин и др.) и неоднородные, включающие биополимеры нескольких видов (холоцеллюлоза, целлолигнин, белково-полисахаридные комплексы и др). Одним из основных свойств пищевых волокон, определяющих их поведение в желудочно-кишечном тракте, является их растворимость в воде. К водорастворимым пищевым волокнам относятся пектин, альгиновые кислоты, камеди, слизи и др. Малорастворимые или нерастворимые — это целлюлоза, лигнин, некоторые виды гемицеллюлоз [Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 б]. Роль пищевых волокон в питании многообразна. Главными их функциями являются регуляция функциональной активности кишечника, адсорбция токсичных веществ, а также влияние на активность ферментов кишечной микрофлоры [Златкина А.Р., 1994; Prosky L., 2001]. Недостаток пищевых волокон в питании может способствовать развитию ряда заболеваний, таких как атеросклероз, гипертоническая болезнь, диабет и др. [Kritchevsky D., 1986]. Многие исследователи в качестве одного из факторов, способствующих развитию рака толстой кишки и некоторых других онкологических заболеваний, называют недостаточное потребление пищевых волокон [Higginson J., 1984; Ohta M., 1987]. Экспериментально было показано, что обогащение рациона пищевыми волокнами снижало токсическое действие полихлорированных бифенилов, нитрозаминов, полиэтиленгликоля, тяжелых металлов, некоторых микотоксинов и ряда других токсических и канцерогенных соединений экзогенного и эндогенного происхождения [Debethizy J.D., et al.,1985; Kritchevsky D., 1985; Тутельян В.А. и др., 1987;

- 32 Southgate D.A.T., et al.,1990; Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а]. Важно отметить защитное действие пищевых волокон при неблагоприятном влиянии на организм трихотеценовых микотоксинов. Эксперименты показали, что введение в рацион крыс лигносорба (препарат пищевых волокон типа лигнина, выделенный из подсолнечника) снижало токсическое действие Т-2 токсина [Тутельян В.А. и др., 1994]. Неоднократно показано, что введение пищевых волокон в пищу или корм лабораторных животных оказывало профилактический и лечебный эффект при различных патологических состояниях человека и животных. Пищевые волокна оказывали благоприятное влияние на клинические проявления желчнокаменной болезни [Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а], снижали уровень холестерина в крови, липопротеинов высокой плотности и триглицеридов [Hazan A., Madar Z., 1993; Groudeva J. et al., 1997; Bobek P. et al., 2000], способствовали профилактике и лечению атеросклероза [Оганов Р., Киселева Н., 1998] и сахарного диабета [Голубев В.Н., Шелухина Н.П., 1995; Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а]. Отмечаются антиканцерогенные [Ohkami H. et al., 1995; Reddy B.S., 1999; Bobek P. et al., 2000; Jenab M., Thompson L.U., 2000], радиопротекторные [Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а] свойства пищевых волокон, а также их способность восстанавливать нормальное состояние кишечника после химически индуцированного энтероколита [Mao Y. et al., 1996; Deng G.-Y. et al., 1999, 2000]. Действие пищевых волокон на процессы токсикокинетики ксенобиотиков реализуется посредством нескольких механизмов. Первый и самый очевидный из них заключается в усилении перистальтики кишечника, что вызывает ускорение прохождения содержимого кишечника и тем самым сокращает время контакта ксенобиотика со слизистой оболочкой кишечника [Конышев В.А. и др., 1984]. Другой механизм влияния пищевых волокон на токсикокинетику ксенобиотиков связан с их адсорбционными и катионообменными свойствами. Связывание токсинов переводит их в неабсорбируемую форму, снижает действующую концентрацию и ускоряет выведение с калом. В частности, предполагается, что противораковая активность пищевых волокон основана на их свойствах адсорбировать канцерогены [Ferguson L.R., Harris P.J., 1996], а также эстрогены, повышенный уровень которых является основной причиной рака некоторых органов эндокринной системы [Rao J.N., 1996]. Адсорбционная способность пищевых волокон зависит от их источника. Так на примере 1,2-диметилгидразина экспериментально показано, что наиболее эффективным

- 33 адсорбентом являются пшеничные отруби, а пектин цитрусовых обладает минимальной связывающей способностью [Smith-Barbaro P., et al., 1981]. При связывании фенола лигнин и целлолигнин из жмыха виноградных семян значительно превосходят целлюлозу. По способности связывать ионы свинца целлюлоза значительно уступает другим биополимерам жмыха виноградных семян [Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а]. Третий важный механизм состоит во влиянии пищевых волокон на ферментные системы как собственно организма, так и кишечной микрофлоры, которые принимают участие в биотрансформации ксенобиотиков. Была показана способность пищевых волокон изменять активность отдельных изоформ цитохрома Р-450 в печени, причем как снижать, так и повышать их активность. Добавление 20% пшеничных отрубей в корм крыс значительно повышало активность изоформы CYP3A2 цитохрома Р-450, но несколько снижало активность изоформ CYP1A1 и CYP1A2 [Helsby N.A. et al., 2000]. Пищевые волокна из какао-бобов существенно увеличивали количество изоформ CYP1А2, CYP2В1 и CYP2В2 цитохрома Р-450 и снижало образование изоформы CYP2С11 в печени крыс [Nugon-Baudon L. et al., 1996]. Было отмечено снижение активности глутатионтрансферазы и UDPглюкуронозилтрансферазы в печени крыс при введении в их корм большого количества пшеничных отрубей [Helsby N.A. et al., 2000]. По другим данным, введение пищевых волокон из какао-бобов в рацион крыс не влияло на активность печеночной глутатионтрансферазы и способствовало возрастанию активности UDP-глюкуронозилтрансферазы в печени [Nugon-Baudon L. et al., 1996]. Введение в рацион целлюлозы или волокон столовой свеклы индуцировало активность печеночных глутатионпероксидазы и глутатионтрансферазы [Bobek P. et al., 2000]. Показано, что введение пищевых волокон в рацион крыс снижало степень индукции цитохрома Р-450 и UDP-глюкуронозилтрансферазы в печени, вызванной глюкозинолатами [Roland N. et al., 1996]. Обнаружено, что обогащение рациона крыс лигносорбом приводило к возрастанию активности в слизистой тонкой кишки микросомальной карбоксилэстеразы — одного из ключевых ферментов биотрансформации микотоксина Т-2 токсина [Тутельян В.А. и др., 1994]. В ряде сообщений отмечают, что влияние пищевых волокон на ферменты метаболизма ксенобиотиков в кишечнике отличалось от такового в печени лабораторных животных. Пшеничные отруби значительно увеличивали активность глутатионтрансферазы в толстом кишечнике крыс, одновременно снижая активность этого фермента в печени [Helsby N.A. et al., 2000]. Введение пищевых волокон в рацион крыс не влия-

- 34 ло на активность UDP-глюкуронозилтрансферазы и глутатионтрансферазы в кишечнике, при том, что в печени активность UDP-глюкуронозилтрансферазы возрастала [Nugon-Baudon L. et al., 1996]. Отмечалось, что пшеничные отруби снижали уровень индукции цитохрома Р-450 CYP1А1 в слизистой толстой кишки, вызванной 3метилхолантреном [Kawata S. et al., 1992]. Пищевые волокна повышали индуцирующее влияние глюкозинолатов на активность глутатионтрансферазы в печени и толстом кишечнике, но не влияли на уровень индукции этого фермента в тонком кишечнике, а также не влияли на вызванное глюкозинолатами снижение активности цитохрома Р-450 и UDP-глюкуронозилтрансферазы в тонком кишечнике [Roland N. et al., 1996]. Влияние пищевых волокон на токсикокинетику ксенобиотиков проявляется также в изменении состава кишечной микрофлоры и активности микробных ферментов, участвующих в метаболизме чужеродных веществ или их конъюгатов. Известно, что некоторые виды пищевых волокон, являются субстратами для кишечной микрофлоры [Тутельян В.А. и др., 1987; Мухина Ю.Г., 1999]. Так при включении в рацион крыс целлюлозы, каррагинина, смолы гуара или пектина наблюдалось в разной степени выраженное ингибирование β-глюкуронидазы микрофлоры кишечника [Shiau S.-Y., Chang G.W., 1983; Ohkami H. et al., 1995; Manoj G. et al., 2001]. Ингибирующее действие на активность β-глюкуронидазы кишечной микрофлоры людей оказывали овсяные и пшеничные отруби [Reddy B.S. et al., 1992]. Введение в корм крыс каррагинана также приводило к снижению активности β-глюкуронидазы в кишечнике [Mallett A.K. et al., 1985]. Ингибирование активности β-глюкуронидазы кишечной микрофлоры препятствует гидролизу глюкуроновых конъюгатов ксенобиотиков, что выключает их из печеночно-кишечной рециркуляции и способствует скорейшему выведению из организма с калом. Однако, по другим сообщениям пектин способен активировать β-глюкуронидазу микрофлоры кишечника у людей [Ross J.K., et al., 1981] и экспериментальных животных [Bauer H.G., et al., 1979; Rowland I.R. et al., 1983]. При изучении влияния пищевых волокон на токсикокинетику ТТМТ обнаружено, что включение в рацион лигносорба приводит к значительному возрастанию суммарной экскреции метаболитов Т-2 токсина с калом при одновременном снижении их выведения с мочой. Также существенно менялся характер распределения свободных и конъюгированных форм экскретируемых метаболитов Т-2 токсина: возрастало общее количество выделяемого Т-2 токсина, в том числе его глюкуронидов — в 4 раза; экскреция Т-2 триола увеличивалась в 9 раз, а неосоланиола — в 10 раз. Уменьшалась

- 35 общая экскреция Т-2 тетраола, однако в кале количество свободного Т-2 тетраола возрастало. К числу наиболее вероятных механизмов обнаруженных изменений следует отнести связывание токсинов в просвете кишечника, подавление их печеночнокишечной циркуляции и ускорение выведения с калом [Тутельян В.А. и др., 1994]. Известно, что в состав комплекса пищевых волокон помимо биополимеров, определяющих непосредственно термин «пищевые волокна» (лигнин, целлюлоза, пектин, гемицеллюлозы) входят сопутствующие вещества, количество и соотношение которых в исходном сырье и выделенных препаратах пищевых волокон различно [Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а]. Эти естественные включения невозможно полностью удалить современными технологическими методами. Существует предположение, что некоторые эффекты, проявляющиеся при введении пищевых волокон в организм, вызываются именно этими дополнительными компонентами. Одним из таких компонентов является фитиновая (инозитгексафосфорная) кислота, обладающая хемопротекторными и антиоксидантными свойствами [Reddy B.S., 1999]. Эксперименты показывают, что свойство пшеничных отрубей уменьшать апоптоз клеток и подавлять процесс канцерогенеза в толстой кишке проявляется благодаря содержанию в них фитиновой кислоты [Jenab M., Thompson L.U., 2000]. Другими биологически активными соединениями в составе пектинов, влияющими на активность ферментов, являются лигнаны и биофлавоноиды. Таким образом, в результате совокупной реализации разных механизмов снижения токсичности ксенобиотиков, ведение в рацион пищевых волокон оказывается одним из наиболее перспективных естественных способов защиты организма от неблагоприятного воздействия токсикантов. 1.3.3. Пробиотики Данные последних лет убедительно продемонстрировали, что в процессе детоксикации различных соединений, попадающих извне или образующихся в пищеварительном тракте, наряду с печенью большое участие принимает микрофлора желудочно-кишечного тракта. Процессы детоксикации с участием микрофлоры идут по пути микробной биотрансформации химических соединений в нетоксические конечные продукты или в соединения, более легко и быстро разрушающиеся в печени или экскретирующиеся с калом из организма.

- 36 Микрофлора кишечника представляет собой сложный комплекс аэробных и анаэробных бактерий, взаимно влияющих друг на друга и на весь организм. Она выполняет ряд жизненно важных функций: синтез витаминов, аминокислот, ферментов, гормонов, ацетилхолина; ферменты микрофлоры участвуют в расщеплении пищевых веществ и в детоксикации чужеродных соединений; продукты жизнедеятельности бактерий оказывают положительное влияние на вегетативную нервную систему, а также стимулируют иммунную систему; в условиях нормально функционирующего кишечника они способны подавлять и уничтожать различные патогенные микробы [Richardson D., 1996]. В последние годы большое внимание уделяется разработке и созданию принципиально новых препаратов, получивших название «пробиотики» — это препараты на основе живых микроорганизмов, оказывающие при естественном способе введения благоприятное действие на гомеостаз посредством нормализации баланса микрофлоры в кишечнике. Наиболее изученными пробиотиками являются молочнокислые бактерии, особенно Lactobacillus sp. и Bifidobacterium sp. Кроме того, в качестве пробиотиков используются и другие микроорганизмы: Escherichia coli, Streptococcus sp., Enterococcus sp., Bacteroides sp., Bacillus sp., Propionibacterium sp. Некоторые препараты пробиотиков содержат смеси бактериальных штаммов [Kalantzopoulos G., 1997; Rolfe R.D., 2000]. Показано, что позитивные эффекты пробиотических микроорганизмов — прежде всего молочнокислых бактерий и бифидобактерий, связаны с их способностью поддерживать и восстанавливать нормальный баланс кишечной микрофлоры, с их стимулирующим действием на иммунную систему и способностью синтезировать витамины, ферменты и др. регуляторные факторы [Gibson G.R., Roberfroid M.B., 1995; Richardson D., 1996]. Благоприятный эффект пробиотиков проявляется в повышении устойчивости организма к воздействию потенциально вредных микроорганизмов и токсичных соединений [Шендеров Б.А., 1998 а, 1998 б; Macfarlane G.T., 1999]. Пробиотики способствуют нормализации повышенной или пониженной секреции соляной кислоты в желудке. Они повышают эффективность усвоения ряда микронутриентов, как кальций, цинк, железо, марганец, медь и фосфор [Мухина Ю.Г., 1999]. Пробиотики способствуют снижению уровня холестерина в крови, играют определенную роль в предупреждении остеопороза, снижают проявления печеночной энцефалопатии [Macfarlane G.T., 1999; Erickson K.L., Hubbard N.E., 2000], в том числе путем повыше-

- 37 ния в крови уровня гамма-интерферона, обладают антиаллергическим действием [Hunter B.T., 1993]. Пробиотики обладают антиканцерогенной активностью. Показано, что молочнокислые бактерии подавляли канцерогенез в толстом кишечнике мышей, индуцированный 1,2-диметилгидразином, а также ингибировали рост опухолей в печени и молочной железе крыс [Macfarlane G.T., 1999]. Обнаружено, что пробиотики ингибировали кишечные бактериальные ферменты, способствующие активации канцерогенов [Rolfe R.D., 2000]. Имеются сообщения об эффективности длительной терапии молочнокислыми бактериями при опухолях толстой кишки у людей [Hunter B.T., 1993]. Таким образом, лактобациллы являются значимым фактором детоксикации чужеродных веществ посредством детерминирования микробного состава пищеварительного тракта. В основе клинической эффективности молочнокислых бактерий может лежать продукция антибиотических веществ, подавляющих рост микроорганизмов — молочной кислоты, этилового спирта и лизоцима [Мухина Ю.Г., 1999]. Наряду с этим молочнокислые бактерии способны изменять активность ряда микробных ферментов, таких как β-глюкуронидаза, β-глюкозидаза, нитроредуктаза, уреаза [Goldin B.R., Gorbach S.L., 1984; Goldin B.R. et al., 1992; Ling W.H. et al., 1994; Morotomi M., 1996], что также влияет на метаболизм и выведение токсинов из организма. Еще около 20 лет тому назад было показано, что Lactobacillus acidophilus снижали активность βглюкуронидазы [Ayebo A.D. et al., 1980]. Этот факт был подтвержден более поздними исследованиями, которые показали, что Lactobacillus GG снижали активность βглюкуронидазы и нитроредуктазы в кишечнике [Ling W.H. et al., 1994]. У безмикробных крыс было отмечено снижение активности β-глюкозидазы и β-глюкуронидазы, индуцированное L. acidophilus. Такой эффект, однако, не вызывали бифидобактерии Bifidobacterium adolescentis [Cole C.B. et al., 1989]. Отмечается, что пробиотики могут воздействовать на микрофлору ЖКТ лишь при определенной их концентрации, которая находится в пределах между 106 и 108 клеток/г кишечного содержимого [Richardson D., 1996]. Эксперименты показывают, что введение пробиотических штаммов микроорганизмов в количестве 108–109 клеток приводит к значительным изменениям микрофлоры кишечника человека [Gmeiner M. et al., 2000]. Эти изменения касаются состава микрофлоры и ее влияния на различные биохимические процессы. Терапевтическая доза пробиотиков для мышей определена на уровне 5·108 клеток [Мальцев В.Н. и др., 1978; Коршунова В.М. и др., 1980].

- 38 -

1.3.4. Биотрансформация и детоксикация чужеродных соединений при их комбинированном поступлении Пища является носителем большого числа как природных, так и антропогенных токсикантов. Есть основания предполагать, что существует взаимодействие между поступающими в организм ксенобиотиками, влияющее на их биотрансформацию. Характер взаимодействия при комбинированном поступлении ксенобиотиков определяется структурной близостью ксенобиотиков, наличием близких (общих) путей метаболизма, общими (если имеются) органами-мишенями, одинаковыми путями выведения [Groten G.P. et al., 2000]. Для проявления возможного взаимодействия поступающие в организм дозы ксенобиотиков должны находиться в пределах диапазона возникновения реакции для каждого химического вещества [Feron V.J. et al., 1995]. Кроме того, важно, чтобы продолжительность и величина суммарного потребления были токсикологически значимыми [Principles for the safety..., 1987]. Возможными эффектами комбинированного действия ксенобиотиков на организм могут являться как усиление токсичности (суммирование эффектов или синергическое усиление), так и ослабление (антагонизм) [Casse F.R. et al., 1998]. Ферменты, ответственные за метаболизм ксенобиотиков, обычно характеризуются низкой специфичностью, но высоким потенциалом. Ксенобиотики, в биотрансформации которых участвует один и тот же фермент, могут взаимодействовать при конкуренции за фермент, но такая конкуренция может возникнуть лишь при поступлении в организм ксенобиотиков в достаточных количествах, насыщающих процесс взаимодействия с ферментом. При превышении этих количеств взаимодействие ксенобиотиков носит дозозависимый характер. Также может иметь место взаимодействие, при котором одно чужеродное соединение выступает ингибитором или индуктором ферментов биотрансформации другого соединения. Наиболее часто индукции или ингибированию ксенобиотиками подвергаются изоферменты цитохрома Р-450 и некоторые ферменты, ответственные за реакции конъюгации [Лакин К.М., Крылов Ю.Ф., 1981; Ренвик А.Г., 2000]. Установлено, что грибы-продуценты микотоксинов в природных условиях способны синтезировать одновременно несколько микотоксинов. Так, имеются многочисленные данные о совместном присутствии двух и более токсинов в контаминированном грибами Fusarium зерне. Наряду с ДОН часто обнаруживали другие трихо-

- 39 тецены — ацетилДОН, ниваленол, Т-2 токсин [Teich A.H., et al., 1987; Tanaka T., et al., 1986 a; Miller J.D., 1995 а], а также афлатоксины [Sardjono A.N. et al., 1998]. Наиболее часто обнаруживаемым наряду с ДОН фузариотоксином является зеараленон, выявленный во многих странах Европы [Perkowski J., et al., 1990; Hietaniemi V., Kumpulainen J., 1991; Müller H.M. et al., 1998], Северной и Южной Америки [Pineiro M.S. et al., 1995-96; Gonzalez H.H. et al., 1999], Новой Зеландии [Lauren D.R., Ringrose M.A., 1997], Японии [Yoshizawa T., Jin Y.Z., 1995] и др. В странах ЮгоВосточной Азии совместно с ДОН постоянно обнаруживается ниваленол, иногда в бо´ льших количествах, чем ДОН [Yoshizawa T., 1984; Tanaka T., et al., 1986 б; Miller J.D., 1995 б]. По результатам наших исследований в 1992 г. 69% проанализированных партий свежеубранного зерна пшеницы одновременно с ДОН содержали зеараленон [Львова Л.С. и др., 1994]. Имеющиеся данные о возможности высокой частоты загрязнения зерна двумя фузариотоксинами ставят вопрос о взаимоотношениях и возможном синергизме действия микотоксинов при их совместном поступлении с пищей. Сведения о таком взаимодействии фузариотоксинов практически отсутствуют, однако единичные исследования показывают, что в большинстве случаев загрязненное в природных условиях смесью микотоксинов продовольственное сырье оказывается более токсичным, чем можно было бы ожидать от действия индивидуальных микотоксинов [Trenholm H.L. et al., 1994; Smith T.K. et al., 1997]. Результаты эпидемиологических наблюдений свидетельствуют, что поступление с пищей (кормом) нескольких микотоксинов является причиной алиментарных микотоксикозов и, в первую очередь, фузариотоксикозов как у человека, так и у сельскохозяйственных животных. Описаны случаи массовых отравлений людей в Индии, где наряду с ДОН в пшеничной муке были обнаружены в высоких концентрациях Т-2 токсин, ниваленол и ацетил-ДОН [Bhat R.V. et al., 1989], и в Китае, где в качестве загрязнителей пшеницы и кукурузы микотоксинами одновременно присутствовали ДОН и зеараленон [Luo X.Y., 1988]. ДОН, поступая с кормом в организм свиней в составе естественно контаминированной микромицетами Fusarium пшеницы, оказывал более сильное воздействие на животных, чем введенное с кормом эквивалентное количество чистого препарата ДОН. [Trenholm H.L. et al., 1994]. Т-2 токсин усиливал неблагоприятное действие ДОН на свиней, выражающееся в снижении прироста массы тела и потребления корма

- 40 [Friend D.W., et al., 1992]. Естественно встречающиеся сочетания Т-2 токсин – диацетоксискирпенол,

диацетоксискирпенол – ДОН

и

диацетоксискирпенол –

фузаренон-Х демонстрировали синергическое усиление действия микотоксинов у лабораторных животных [Schiefer H.B., et al., 1986; Bhavanishankar T.N., et al., 1988]. Комбинированное действие ДОН и Т-2 токсина на крыс в дозах, превышающих неэффективные дозы, характеризуется дозозависимым усилением токсичности индивидуальных микотоксинов. Комбинированное действие ДОН и Т-2 токсина в неэффективных

дозах

характеризуется

отсутствием

каких-либо

проявлений

токсичности [Кравченко Л.В. и др., 2000]. Таким образом, первостепенное значение для проявления комбинированного действия фузариотоксинов имеет их доза, также как и при взаимодействии других поступающих в организм ксенобиотиков.

- 40 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.1. Животные и их содержание Исследования проводили на крысах линии Вистар — самцах и самках (в эксперименте по изучению комбинированного действия ДОН и зеараленона на метаболизм ДОН), выращенных в Питомнике лабораторных животных РАМН «Столбовая», с массой тела от 130 до 250 г в зависимости от эксперимента. В эксперименте по изучению влияния уровня селена в рационе на метаболизм ДОН использовали растущих крыс массой 50 г и крысят-отъемышей. Всего в работе было использовано 182 крысы. Животные получали соответствующие эксперименту рационы, а также воду без ограничений. Животных содержали в стандартных условиях вивария Института питания РАМН, в помещениях с температурой +20–24°С. 2.1.1.1. Экспериментальные рационы В зависимости от поставленных задач были использованы рационы, приведенные в табл. 1–8. 1. Общевиварный рацион, разработанный Институтом питания РАМН Таблица 1. Состав общевиварного рациона (на 1 крысу массой 130-240 г) Ингредиент Подсолнечник (семена) Овес Хлеб 2 сорта пшеничный Каша пшенная Творог нежирный Рыбная мука Мясо 2 к. Морковь Зелень (салат) Рыбий жир Дрожжи NaCl ИТОГО:

Масса, г

Белок, г

Жир, г

Углеводы, г

Ккал

3,700

0,760

1,900

0,114

22,100

10,300

1,030

0,630

4,900

25,800

4,000

0,340

0,050

1,830

9,320

2,500 2,000 0,500 4,000 8,000 8,000 0,100 0,100 0,150 43,350

0,270 0,360 0,230 0,800 0,104 0,120 0 0,050

0,340 0,012 0,027 0,390 0,008 0,016 0,099 0,010

1,560 0,036 0 0 0,670 0,250 0 0,083

10,500 1,760 1,170 6,720 2,400 1,360 0,900 0,085

4,060

3,480

9,440

82,120

- 41 2. Полусинтетический рацион, разработанный Институтом питания РАМН. Таблица 2. Состав полусинтетического рациона Продукты

Масса продуктов в г на

Масса крыс в граммах 40–60

60–90

90–120

24,0

2,400

3,150

3,580

4,800

5,100

1,0

0,100

0,130

0,150

0,200

0,210

58,8

5,880

7,750

8,770

11,760

12,500

5,0

0,500

0,650

0,740

1,000

1,000

Лярд

5,0

0,500

0,650

0,740

1,000

1,000

Солевая смесь (табл. 4)

4,0

0,400

0,520

0,590

0,800

0,800

Витамины ж/р (табл. 5)

0,2

0,020

0,020

0,024

0,030

0,036

Целлюлоза

2,0

0,200

0,200

0,200

0,200

0,200

100 г смеси Казеин Витаминная смесь (табл. 3) Крахмал Масло растительное

120–200 200–280

Таблица 3. Состав витаминной смеси для приготовления полусинтетического рациона Института питания РАМН (на 1000 г смеси) Витамины

Количество, мг

В1 (тиамин)

400

В2 (рибофлавин)

600

В6 (пиридоксин)

400

Никотинамид

1500

Пантотенат кальция

1500

Фолиевая кислота

200

Витамин К

100

Биотин

10

В12

3

Фитин Сахароза

5000 до 1000 г

- 42 Таблица 4. Состав солевой смеси для приготовления полусинтетического рациона Института питания РАМН Название солей

Формула

Количество, г

NaCl

58,500

KHPO4

163,300

Сернокислый магний

MgSO4 · 7H2O

24,100

Углекислый кальций

CaCO3

160,200

FeSO4 · H2O

11,100

KJ

0,322

Сернокислый марганец

MnSO4 · 2H2O

1,870

Сернокислый цинк

ZnSO4 · 7H2O

0,230

Сернокислая медь

CuSO4 · 5H2O

0,200

Хлористый кобальт

CoCl2 · 6H2O

0,010

Фтористый натрий

NaF

0,210

KAl(SO4)2 · 12H2O

0,047

Хлористый натрий Фосфорнокислый калий однозамещенный

Сернокислое железо (закисное) Йодистый калий

Алюмокалиевые квасцы ИТОГО:

420,089 Таблица 5.

Состав смеси жирорастворимых витаминов для приготовления полусинтетического рациона Института питания РАМН Витамины Е (токоферол)

на 1кг рациона 60 мг

А (ретинол)

800 МЕ

D (эргокальциферол)

700 МЕ

3. Полусинтетический рацион, дефицитный по селену. При проведении эксперимента по изучению влияния дефицита селена в рационе крыс на метаболизм ДОН готовили специальный полусинтетический безселеновый рацион. При создании модели селеновой недостаточности у крыс за основу был взят метод, предложенный Burk R.F. (1987), но вместо дрожжей Torula в качестве источника белка использовали дрожжи А/О «Алко» (Финляндия) с содержанием селена не более 0,04 мг/кг. Общее содержание селена в рационе составляло менее 0,02 мг/кг. В качестве источника углеводов использовали сахар и крахмал, не содержащие селен. Со-

- 43 левая и витаминная смеси были составлены с учетом химического состава использованных дрожжей и не содержали селен. Контрольный полусинтетический рацион включал дополнительно к «безселеновой» дрожжевой муке обогащенную селеном дрожжевую муку с содержанием селена (селенометионина) 450±8 мг/кг в количестве, обеспечивающем концентрацию селена не менее 0,5 мг/кг рациона. Для приготовления рациона и в качестве питьевой использовали дважды дистиллированную воду. Таблица 6. Состав полусинтетичекого рациона, дефицитного по селену Продукты

Количество (г/100 г рациона)

Дрожжевая мука*

30,0

Крахмал

26,5

Сахар

26,5

Масло растительное

5,0

Лярд

5,0

Солевая смесь (табл. 7)

4,0

Витаминная смесь

1,0

Метионин

0,3

Целлюлоза

2,0

Витамины ж/р

0,2 мл

* содержание белка в дрожжевой муке – 50%. Таблица 7. Состав солевой смеси для эксперимента с дефицитом селена Название солей

Формула

Количество, г

KCl

121,80

NaHPO4

286,40

Сернокислый магний

MgSO4 · 7H2O

71,40

Углекислый кальций

CaCO3

380,40

FeSO4 · H2O

26,40

KJ

0,77

Сернокислый марганец

MnSO4 · 2H2O

4,55

Сернокислая медь

CuSO4 · 5H2O

0,48

Фтористый натрий

NaF

0,21

Хлористый калий Фосфорнокислый натрий однозамещенный

Сернокислое железо (закисное) Йодистый калий

ИТОГО:

892,41

- 44 4. Полусинтетический рацион с включением контаминированного микотоксинами зерна Таблица 8. Состав полусинтетического рацион для изучения комбинированного действия ДОН и зеараленона на метаболизм ДОН Продукты Пшеничная крупа Казеин Крахмал Масло растительное Лярд Витаминная смесь* Солевая смесь** Витамины ж/р***

Количество (г/100 г рациона) 50,0 12,0 27,0 3,0 3,0 1,0 4,0 0,2 мл

*, **, *** — витаминную смесь, солевую смесь и смесь жирорастворимых витаминов использовали как в стандартном полусинтетическом рационе Института питания РАМН. 2.1.1.2. Условия экспериментов по изучению метаболизма ДОН В экспериментах по изучению метаболизма ДОН крысы содержались в индивидуальных металлических обменных клетках

Ô

с сетчатым дном. Каждая клетка оснащалась металлической воронкой для сбора экскрементов, под которой располагались стеклянная воронка и колба-приемник для мочи. Кал задерживался пластиковой сеточкой, размещенной в стеклянной воронке. Моча и кал собирались раздельно каждый час (за исключением ночного времени) в течение 48 часов. По окончании эксперимента клетка и металлическая воронка омывались 10-15 мл дистиллированной воды, смыв присоединялся к собранной моче. Мочу фильтровали и замеряли ее объем. Кал высушивали в термостате при температуре 63°С до постоянного веса и измельчали в фарфоровой ступке. Образцы мочи и кала хранились до проведения анализа при температуре -18°С.

В каждом конкретном эксперименте животные получали корм, соответствующий этому эксперименту.

- 45 2.1.2. Реактивы и материалы, используемые в работе Ацетонитрил («Криохром», Россия) для ВЭЖХ и приготовления стандартного раствора ДОН использовали квалификации “ос.ч.”, ацетонитрил («Криохром», Россия) для экстракции образцов и промывания адсорбционной колонки — “х.ч.”. Бензол (ПО «Азот», Россия) и этилацетат («Реактив», Украина) для приготовления стандартных растворов ДОН и ДОМ-1 использовали квалификации “х.ч.”. Растворители для приготовления стандартных растворов микотоксинов очищали перегонкой. Рабочие растворы ДОН и ДОМ-1 для ВЭЖХ готовили в метаноле “х.ч.” фирмы “MERCK” (Германия) Изопропанол (Шосткинский з-д химреактивов, Украина) для упаривания экстрактов и для приготовления подвижной фазы для ВЭЖХ соответствовал квалификации “ос.ч.”. Подвижную фазу для ВЭЖХ при идентификации и определении степени чистоты выделенных ДОН и ДОМ-1 готовили с использованием гексана (Новочеркасский з-д синтетических продуктов, Россия) квалификации “х.ч.”. Для приготовления растворов для экстракции токсинов, элюирования колонок и подвижной фазы ВЭЖХ использовали бидистиллированную воду. При очистке активированного угля применяли уксусную кислоту “х.ч.” (Ереванский з-д химреактивов, Армения), этиловый спирт-ректификат (ГОСТ 18300) и ацетон “ос.ч.” (ОАО «Синтез», Россия). Для гидролиза конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1 использовали препарат ферментов β-глюкуронидазы (7,8 ед./мл) и арилсульфатазы (12,1 ед./мл) (“Serva”, Германия). В эксперименте по изучению влияния индукторов ферментов метаболизма ксенобиотиков на метаболизм ДОН использовали фенобарбитал фирмы “Serva” (Германия), 3-метилхолантрен и транс-стильбеноксид фирмы “Sigma” (США). Активированный уголь, используемый для очистки экстракта, готовили по следующей схеме. 200 г нейтрального активированного угля БАУ (Россия) измельчали на лабораторной мельнице, помещали в цилиндрическую вакуумную воронку с бумажным фильтром и последовательно промывали под слабым вакуумом 2 л дистиллированной воды, 1 л 2% уксусной кислоты, 2 л дистиллированной воды, 1 л этилового спирта и 1 л ацетона. Промытый уголь переносили на металлический лоток и оставляли в сушильном шкафу при температуре 120 °С на 15 часов. Очистку образцов биологического материала методом препаративной ТСХ проводили на стеклянных хроматографических пластинках фирмы “MERCK” (Герма-

- 46 ния) размером 10 х 10 см с толщиной слоя силикагеля 0,2 мм и размером пор 6 нм. Визуальное наблюдение флуоресцирующих пятен токсинов проводили в УФ-боксе фирмы “Camag” (Швейцария) при длине волны 366 нм. Препараты микотоксинов Для введения крысам и приготовления стандартного раствора в эксперименте использовали коммерческий препарат ДОН фирмы “Sigma” (США), а также ДОН, полученный нами по методике [Тутельян В.А. и др., 1991]. Структуру выделенного токсина подтверждали методом масс-спектрометрии с использованием хроматомассспектрометра “Finnigan-3200F” (США)*. Идентификацию и степень чистоты проводили методами ТСХ, а также нормально- и обращеннофазной ВЭЖХ. Содержание ДОН в полученном препарате составило не менее 96-98%. ДОМ-1 был получен по методике [Cote L.-M. et al., 1986 б] при инкубации ДОН с содержимым рубца бычка с последующим выделением метаболита методом хроматографии на колонке с силикагелем и препаративной обращеннофазной ВЭЖХ**. Идентификацию и степень чистоты выделенного токсина проводили методами ТСХ и ВЭЖХ. Степень чистоты полученного препарата ДОМ-1 составляла 97%. Структура выделенного ДОМ-1 была подтверждена масс-спектрометрически на хроматомассспектрометре “Finnigan-3200F” (США)*. Для приготовления стандартных растворов навески токсинов растворяли в смеси бензол-ацетонитрил (98:2) (ДОН) и в этилацетате (ДОМ-1). Стандартные растворы токсинов хранили в стеклянной герметичной посуде при температуре -10 °С. Перед введением в хроматограф стандартные растворы упаривали в токе азота и перерастворяли в метаноле; рабочие растворы имели концентрации СДОН=9,715 нг/мкл и СДОМ-1=12,5 нг/мкл. 2.1.3. Физико-химические методы исследования 2.1.3.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография Определение содержания ДОН и ДОМ-1 в биологическом материале проводили методом ВЭЖХ на хроматографе “Altex” модель 110 А (США) с УФ-детектором *

Масс-спектрометрические исследования проводились совместно с Ф.А. Медведевым (НИИ питания РАМН), за что автор выражает ему искреннюю признательность. ** Получение ДОМ-1 проводилось В.С. Соболевым и Л.П. Захаровой (НИИ питания РАМН), за что автор выражает им глубокую благодарность.

- 47 “Kratos-757” (США) при длине волны 224 нм. Хроматографическая колонка “Силасорб SPH С18” 3 х 250 мм, размер частиц 6 мкм. В качестве подвижной фазы использовали 8% ацетонитрил. Расход подвижной фазы 0,7 мл/мин. Предел обнаружения метода для ДОН и ДОМ-1 в моче и кале крыс составил 50 нг/г, относительное стандартное отклонение — 0,05–0,1. Идентификацию и степень чистоты выделенных токсинов проводили методом нормально- и обращеннофазной ВЭЖХ на хроматографе “Altex-110A” (США) с УФдетектором “Kratos-757” (США) при длине волны 224 нм. В нормальнофазном варианте ВЭЖХ использовали колонку “Ultrasphere-Si” (“Beckman”, США) 4,6 х 250 мм с размером частиц 5 мкм, подвижная фаза гексан-изопропанол-вода (85:25:1,5), расход подвижной фазы 1,5 мл/мин. При обращеннофазной ВЭЖХ применяли колонку “Ultrasphere-ODS” (“Beckman”, США) 4,6 х 250 мм с размером частиц 5 мкм, в качестве подвижной фазы использовали 30% водный метанол, расход подвижной фазы 1,0 мл/мин. 2.1.3.2. Масс- и хроматомасс-спектрометрия Структуру выделенных токсинов подтверждали методом масс-спектрометрии*. Спектры исходных соединений и их ТМС-производных были сняты на хроматомассспектрометре “Finnigan-3200F” (США) при ионизирующем напряжении 70 э/в, температуре источника ионов 120°С, в диапазоне массовых чисел 39-520 а.е.м. Хроматографическое разделение ТМС-производных токсинов проводили на кварцевой капиллярной колонке с фазой SE-30 при температуре от 30°С до 290°С. Температура инжектора составляла 270°С. 2.1.4. Метод определения ДОН и его метаболитов в кале и моче крыс ДОН и его метаболиты в моче и кале крыс определяли по методу, разработанному в Институте питания РАМН [Тутельян В.А. и др., 1991], в нашей модификации. В полиэтиленовую колонку диаметром 9 мм с пористым тефлоновым фильтром последовательно помещали смесь 0,1 г нейтрального активированного угля и 0,15 г целита, 0,1 г нейтрального оксида алюминия (для хроматографии по Брокману II). Сверху помещали кусочек ваты. Колонку последовательно промывали 3–5 мл 2% водного раствора уксусной кислоты, 3–5 мл ацетонитрила, 5 мл воды в слабом вакууме водоструйного насоса. *

См. стр. 46.

- 48 1 мл мочи наносили на колонку, промывали 3 мл воды. ДОН и ДОМ-1 элюировали 3 мл смеси ацетонитрил-вода (4:1). Из элюата удаляли основную массу ацетонитрила упариванием в токе азота на водяной бане, к остатку (до 1 мл) добавляли 4–5 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия, токсины четырежды экстрагировали этилацетатом порциями по 5 мл. Объединенные экстракты упаривали на ротационном испарителе досуха. К образцу кала добавляли равную массу целита 545 и тщательно гомогенизировали в фарфоровой ступке; навеску гомогенной массы, соответствующую 3 г цельного кала, экстрагировали 20 мл смеси метанол-вода (1:1) в течение 1 ч, затем добавляли равный объем ацетона и фильтровали через складчатый бумажный фильтр, отбирали аликвоту 15 мл, упаривали в вакууме до объема 3–3,5 мл, наносили на колонку и элюировали, как это описано для мочи. Глюкуроновые конъюгаты ДОН и ДОМ-1 определяли, используя ферментную реакцию с β-глюкуронидазой. К 1 мл мочи добавляли 4 мл ацетатного буфера (рН 5,0) и 10 мг г β-глюкуронидазы (“Serva”, США) с активностью 51 ед/г (920000 ед. Фишмана/г), инкубировали в течение 16–18 ч при 37°С, наносили на колонку и элюировали, как описано выше. Для определения глюкуронидов в кале навеску смеси кала с целитом экстрагировали смесью метанол-вода (1:1) в течение 1 ч, фильтровали. Аликвоту фильтрата, соответствующую 0,7 г, упаривали в вакууме досуха, перерастворяли в 4 мл ацетатного буфера. Ферментную реакцию и последующую очистку на колонке проводили как описано для мочи. Сухие остатки растворяли в метаноле и анализировали методом ВЭЖХ. 2.1.5. Статистическая обработка результатов Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерных программ “Statgraphics” (США) и “Excel” (“Microsoft”, США). Достоверность отличия от контроля средних показателей опытных групп рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента. Полученные экспериментальные показатели представляли в виде M±m. Различия считали достоверными при P<0,05.

- 49 2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.2.1. Модификация метода количественного определения ДОН и его метаболитов в моче и кале крыс Для решения поставленных задач, с целью увеличения степени извлечения анализируемых соединений, представилось необходимым усовершенствовать метод определения ДОН и его метаболитов, разработанный в лаборатории энзимологии питания Института питания РАМН [Тутельян В.А. и др., 1991]. Основными этапами подготовки проб кала для анализа по данному методу являлись экстракция навески высушенного измельченного кала смесью ацетонитрил-вода (3:1), упаривание аликвоты экстракта с силикагелем, нанесение силикагеля с экстрактом на подготовленную определенным образом колонку с адсорбирующей смесью активированный уголь – целит (1:1,5), элюирование колонки смесью ацетонитрил-вода (4:1), высушивание элюата в токе азота для дальнейшего определения в нем токсинов методом ВЭЖХ. Аликвоту мочи наносили на колонку непосредственно. При определении общего содержания ДОН и ДОМ-1 в экскрементах образец инкубировали с β-глюкуронидазой в ацетатном буфере для ферментного гидролиза глюкуроновых конъюгатов токсинов. Метод обладает хорошими метрологическими характеристиками и достаточно низким пределом обнаружения ДОН и ДОМ-1. Однако ряд предварительных сравнительных экспериментов показал, что отдельные стадии пробоподготовки могут быть оптимизированы с целью повышения выхода токсинов на этих этапах и увеличения степени извлечения анализируемых соединений в целом по методу. 2.2.1.1. Подбор системы для элюирования ДОН и ДОМ-1 с адсорбционной колонки Исходный метод предписывает элюирование токсинов с колонки 4 мл системы ацетонитрил-вода (4:1). Однако на примере очистки образцов кала было показано, что при дополнительном промывании колонки 2 мл этой же смеси в элюате обнаруживаются токсины в количестве около 40% от найденного в первом элюате (4 мл). Таким образом, по исходному методу не происходит полного элюирования токсинов с колонки. Для смывания всего количества токсинов с адсорбента необходимо либо увеличить количество элюента до 8 мл, либо применить менее полярную элюирующую систему, которая бы ускоряла движение достаточно полярных ТТМТ по слою неполярного адсорбента. Проведенные предварительные исследования показали, что

- 50 несколько более предпочтительным вариантом является применение в качестве элюента системы ацетонитрил-вода (84:16). Такая система в количестве 6 мл обеспечивают полное элюирование токсинов с колонки. В табл. 9 приведены сравнительные результаты элюирования колонок согласно исходному методу и с применением системы, обогащенной ацетонитрилом. Таблица 9. Сравнительные результаты элюирования ДОН и ДОМ-1 с адсорбционных колонок водным ацетонитрилом с различным соотношением компонентов Суммарное количество токсина в образце (нг) ДОН

ДОМ-1

Концентрация токсина в кале (мкг/г) ДОН ДОМ-1

ацетонитрил-вода (4:1) 1779,3

4478,3

9,34

22,38

ацетонитрил-вода (84:16) 2864,1

7102,2

14,32

35,50

Примечание: представлены средние данные из 4 определений. Результаты показывают, что изменение количественного состава элюента позволяет увеличить выход ДОН и ДОМ-1 на данной стадии очистки на 60 и 54% соответственно. Суммарный выход ДОН и ДОМ-1, таким образом, повышается на 59%. 2.2.1.2. Определение формы нанесения экстракта образца на колонку Исходя из литературных данных, существует две формы нанесения экстракта биологического материала на колонку для адсорбционной очистки: в жидком виде и в сухом виде на силикагеле, с которым упаривается аликвота экстракта. При сравнении обоих способов нами было найдено, что выход токсинов с колонки был заметно выше в случае нанесения на колонку жидкого экстракта. Хроматографическая чистота очищенных экстрактов в обоих случаях была примерно одинаковой. Можно предположить, что во втором случае часть адсорбированных на силикагеле токсинов не смывается системой-элюентом. Результаты исследования выхода токсинов при различных формах нанесения экстракта на колонку отражены в табл. 10.

- 51 Таблица 10. Сравнительные результаты элюирования ДОН и ДОМ-1 с адсорбционных колонок при различных формах нанесения экстракта на колонку Объем элю-

Количество токсина Суммарное количест-

Концентрация

ента

в элюате

во токсина в образце

токсина в кале

(последова-

(нг)

(нг)

(мкг/г)

тельные порции)

ДОН

ДОМ-1

ДОН

ДОМ-1

ДОН

ДОМ-1

11,97

33,87

17,42

43,75

нанесение экстракта на силикагеле 6 мл

2150,7

6197,4

2 мл

244,2

575,8

2394,9

6773,2

нанесение экстракта в жидком виде 4 мл экстракта+2 мл элю-

3484,3

8749,1

3484,3

8749,1

ента Примечание: представлены средние данные из 4 определений. Таким образом, нанесение экстракта на колонку в жидком виде оказывается предпочтительным с точки зрения увеличения выхода анализируемых веществ на данной стадии: выход ДОН увеличивался на 45%, а ДОМ-1 — на 29%. Кроме того, в этом случае исключается операция упаривания экстракта с силикагелем, что сокращает время проведения анализа. 2.2.1.3. Определение сульфатных конъюгатов ДОН и ДОМ-1 Исходный метод предполагает определение лишь глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1. Действительно, в процессе биотрансформации ксенобиотиков в организме наибольшее количество образующихся конъюгатов представляет собой глюкурониды [Paulson G., 1979], однако доля других конъюгатов, и, прежде всего, сульфатных, может быть значительной [Голиков С.Н. и др., 1986]. Показано, что сульфатная конъюгация является важным механизмом конъюгации чужеродных веществ. Она представляет собой связывание молекулы ксенобиотика с ацилсульфатом. Эта реакция катализируется сульфотрансферазой, однако значи-

- 52 тельную роль в этом процессе играют и другие ферменты — АТФ-сульфурилаза, катализирующая образование ацилсульфата, и фосфокиназа (АФС-киназа), активирующая ацилсульфат [Лакин К.М., Крылов Ю.Ф., 1981]. Необходимо также принимать во внимание дозозависимое соотношение образования глюкуроновых и сульфатных конъюгатов в организме. При увеличении количества поступающего в организм ксенобиотика преобладает глюкуроновая конъюгация; при достаточно больших дозах конъюгация с сульфатом может прекратиться вовсе. Возможно, в организме существует конкуренция за арилгидроксилы между глюкуроновой и серной кислотами, и в силу того, что общий запас сульфатов в организме мал, при увеличении дозы ксенобиотика экскреция возрастает лишь за счет глюкуронида. Кроме того, следует учесть, что связывание ксенобиотиков с глюкуроновой кислотой зависит от степени их растворимости в липидах. По мере уменьшения липотропности соединений уменьшается их способность к образованию глюкуронидов [Голиков С.Н. и др., 1986]. Для определения возможного образования сульфатных конъюгатов ДОН и ДОМ-1, образующихся в организме крыс в процессе метаболизма ДОН, образцы мочи и кала животных, получавших внутрижелудочно ДОН в дозе 8 мг/кг, в одном случае инкубировали с β-глюкуронидазой, а в другом — с β-глюкуронидазой и арилсульфатазой. В первом случае использовали лиофилизированный препарат β-глюкуронидазы (“Serva”, Германия) с активностью фермента 56 ед./г, а во втором — раствор βглюкуронидазы (7,8 ед./мл) и арилсульфатазы (12,1 ед./мл) (“Serva”, Германия). В обоих случаях в реакционную смесь вводили 0,5 ед. β-глюкуронидазы (≈9000 ед. Фишмана∗), количество арилсульфатазы, используемой во втором случае, составляло 0,8 ед. (13500 ед. Фишмана∗∗). Во втором случае, таким образом, ферментному гидролизу подвергались также и сульфатные конъюгаты. После инкубации реакционные смеси очищали по основному методу. Исходя из найденного в обоих случаях количества токсинов рассчитывали количество сульфатных конъюгатов. Результаты приведены в табл. 11.

∗

1 ед. β-глюкуронидазы освобождает 1 мкг фенолфталеина из фенолфталеин-глюкуронида за 1 час при рН 5 и температуре 37°С. ∗∗ 1 ед. арилсульфатазы расщепляет 1 мкмоль р-нитрокатехол-сульфата за 1 час при рН 5 и температуре 37°С.

- 53 Таблица 11. Содержание конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1 в моче и кале крыс (в % от введенной дозы ДОН) ДОН

№ образца

глюкурониды

ДОМ-1 сульфаты

глюкурониды

сульфаты

моча 1

2,65

0,23

3,07

0,75

2

3,27

0,16

2,62

2,25

3

2,90

0,19

7,49

1,93

4

3,79

0,25

5,73

3,12

5

2,46

0,13

2,42

1,16

среднее

3,01±0,13

0,19±0,01

4,27±0,56

1,84±0,23

сумма

3,20±0,14

6,11±0,70 кал

1

0,10

0,06

0,26

0,05

2

0,39

0,03

0,64

0,08

3

0,17

0,02

0,13

0,04

4

0,37

0,02

0,22

0,04

5

0,41

0,03

0,34

0,06

среднее

0,29±0,06

0,03±0,004

0,32±0,05

0,050±0,004

сумма

0,32±0,03

0,37±0,05

Из данных таблицы видно, что сумма экскретированных сульфатных конъюгатов ДОН и ДОМ-1 в среднем составляет порядка 2% от введенной дозы ДОН, что согласуется с данными Prelusky D.B. et al., (1987 а), которые обнаружили, что 2% введенного внутривенно овцам ДОН выводились с мочой в виде сульфоконъюгатов ДОН. Доля сульфоконъюгатов ДОН от всех экскретированных с мочой конъюгатов ДОН составила 6%, а доля сульфоконъюгатов ДОМ-1 от суммы экскретированных с мочой конъюгатов ДОМ-1 — 30,1%; для кала эти показатели составили соответственно 9,4 и 13,5%. Таким образом, впервые показана возможность образования у крыс наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфоконъюгатов ДОН и ДОМ-1 при поступлении ДОН per os.

- 54 В процессе работы над методом были апробированы дополнительные стадии очистки образцов мочи и кала крыс — препаративная ТСХ и жидкость-жидкостная экстракция. Эти стадии значительно повышают степень очистки образцов, что облегчает дальнейшее хроматографическое определение содержания в них токсинов и обеспечивает получение более точных результатов. Однако введение в очистку дополнительных стадий одновременно приводит к значительным потерям анализируемых веществ. При препаративной ТСХ теряется 24,5% ДОН при анализе мочи и 17,3% при анализе кала. Переэкстракция токсинов в этилацетат вызывает потерю 12,3% ДОН при анализе мочи и 15,6% при анализе кала, для ДОМ-1 эти величины составили 12,3 и 21,7% соответственно. Ввиду значительного снижения выхода определяемых веществ, дополнительные стадии очистки не были использованы в дальнейшей работе. 2.2.1.4. Модифицированный метод анализа ДОН и его метаболитов в экскретах крыс Учитывая изменения некоторых стадий подготовки образцов мочи и кала для количественного определения ДОН и его метаболитов, модифицированный метод анализа выглядит следующим образом: Подготовка колонки для адсорбционной очистки мочи и экстракта кала крыс Полиэтиленовую колонку с внутренним диаметром 9 см с пористым тефлоновым фильтром заполняли 0,45 г смеси тонко измельченного активированного угля (БАУ, Россия) и целита 545 в соотношении 1:1,5. Смесь уплотняли, сверху помещали кусочек ваты. Набитую колонку последовательно промывали 3 мл 2% водного раствора уксусной кислоты, 6 мл дистиллированной воды, 6 мл ацетонитрила и 8 мл дистиллированной воды под вакуумом водоструйного насоса. Определение содержания свободных форм ДОН и ДОМ-1 в моче крыс 2 мл мочи наносили на колонку и элюировали под слабым вакуумом, давая моче полностью стечь. Промывали колонку 5 мл дистиллированной воды. Воду отбрасывали, токсины элюировали 4 мл смеси ацетонитрил-вода (84:16). Элюат упаривали в токе азота на водяной бане при t°=50°С досуха. Сухой остаток хранили при -18°С и перед проведением ВЭЖХ-анализа растворяли в 200 мкл метанола.

- 55 Определение общего содержания ДОН и ДОМ-1 в моче крыс Для гидролиза конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1 1 мл мочи добавляли к 4 мл ацетатного буфера (рН 5), содержащего 65 мкл препарата ферментов β-глюкуронидазы (9000 ед. Фишмана) и арилсульфатазы (13500 ед. Фишмана). Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 17 часов. Смесь переносили на колонку, элюировали под слабым вакуумом. Колонку промывали 4 мл дистиллированной воды. Воду отбрасывали, токсины элюировали 4 мл смеси ацетонитрил-вода (84:16). Элюат упаривали в токе азота на водяной бане при t°=50°С досуха. Сухой остаток хранили при -18°С и перед проведением ВЭЖХ-анализа растворяли в 200 мкл метанола. Определение содержания свободных форм ДОН и ДОМ-1 в кале крыс Кал высушивали в термостате при 63°С в течение 24 часов, затем измельчали в ступке. 0,5 г сухого измельченного кала экстрагировали 10 мл смеси ацетонитрил-вода (3:1) в течение 1 часа. Аликвоту экстракта (4 мл) наносили на колонку, элюировали под слабым вакуумом и дополнительно элюировали 2 мл смеси ацетонитрил-вода (84:16). Объединенные элюаты упаривали в токе азота на водяной бане при t°=50°С досуха. Сухой остаток хранили при -18°С и перед проведением ВЭЖХ-анализа растворяли в 200 мкл метанола. Определение общего содержания ДОН и ДОМ-1 в кале крыс 0,3 г высушенного измельченного кала помещали в 4 мл ацетатного буфера (рН 5), содержащего 65 мкл препарата ферментов β-глюкуронидазы и арилсульфатазы. Реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 17 часов. К смеси прибавляли 12 мл ацетонитрила. Встряхивали в течение 30 мин. 6 мл экстракта наносили на колонку, элюировали под слабым вакуумом и дополнительно элюировали 2 мл смеси ацетонитрил-вода (84:16). Объединенные элюаты упаривали в токе азота на водяной бане при t°=50°С досуха. Сухой остаток хранили при -18°С и перед проведением ВЭЖХ-анализа растворяли в 200 мкл метанола. Общая схема количественного определения ДОН и его метаболитов в моче и кале крыс представлена на рис. 5.

- 56 -

Высушенный кал

Аликвота мочи (экстракт кала)

Элюент ацетонитрил-вода (84:16)

Вода

Экстрагент ацетонитрил– вода (3:1)

Адсорбент активированный уголь–целит (1:1,5) 0,45 г

Сброс

¬

Сброс

Упаривание при 50°С

ВЭЖХ

Рис. 5. Схема количественного определения ДОН и его метаболитов в моче и кале крыс.

- 57 Определение степени извлечения ДОН и ДОМ-1 Кал К 0,5 г сухого измельченного кала добавляли 7,772 мкг ДОН (400 мкл стандартного раствора с концентрацией 19,43 нг/мкл) и 15,0 мкг ДОМ-1 (30 мкл стандартного раствора с концентрацией 500 нг/мкл). Образец тщательно перемешивали в фарфоровой ступке. Растворители удаляли током азота. Очистку образца проводили по модифицированному методу. Моча В колбочку помещали 500 мкл стандартного раствора ДОН с концентрацией 19,43 нг/мкл (9,715 мкг ДОН) и 50 мкл стандартного раствора ДОМ-1 с концентрацией 500 нг/мкл (25,0 мкг ДОМ-1). Растворы токсинов упаривали досуха в токе азота. Добавляли 10 мл мочи, растворяли токсины. Образец очищали по модифицированному методу. Результаты изучения степени извлечения токсинов из мочи и кала крыс представлены в табл. 12. Таблица 12. Степень извлечения (в %) добавленных к экскрементам крыс ДОН и ДОМ-1 Токсин

Моча

Кал

ДОН

94,6 ± 2,2

93,0 ± 2,5

ДОМ-1

97,3 ± 1,2

92,3 ± 2,8

Примечание: представлены средние данные из 4 определений. Таким образом, предложенная модификация метода определения ДОН и его метаболитов в моче и кале крыс позволяет: во-первых, увеличить выход анализируемых токсинов на стадии их элюирования с колонки, а также за счет изменения формы нанесения экстракта кала на колонку; общий выход добавленных в мочу и кал токсинов увеличился до 92-97%, в то время как в исходном методе он составлял 70-89%; во-вторых, сократить время анализа и количество расходуемых реактивов на этапе колоночной очистки образцов кала; в-третьих, определять наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфоконъюгаты ДОН и ДОМ-1.

- 58 2.2.2. Изучение распределения экскретируемых метаболитов ДОН у крыс Вистар Исследования проводили на 12 крысах-самцах Вистар с массой тела 225±4 г. Животных помещали в индивидуальные металлические обменные клетки на 24 часа, после чего крысам вводили однократно внутрижелудочно водный раствор ДОН в количестве 10 мг/кг массы тела. Мочу и кал собирали раздельно в течение 48 часов, образцы до проведения анализа хранили при температуре -18°С. За период наблюдения животные получали общевиварный рацион, разработанный Институтом питания РАМН, и воду без ограничения. Результаты исследования показали, что основными экскретируемыми метаболитами ДОН у крыс является неизмененный ДОН, его деэпоксипроизводное — ДОМ-1, конъюгаты ДОН и ДОМ-1 (рис. 6).

% от суммы метаболитов

80

Моча

Кал

60 40 20 0 ДОН

ДОМ-1

Свободная форма

Конъюгаты

ДОН

ДОМ-1

Общее количество

Рис. 6. Соотношение метаболитов ДОН в кале и моче крыс. За 100% принимается сумма метаболитов в кале или моче. Как видно из рис. 6, в моче преобладал неизмененный ДОН. При этом соотношение свободной и конъюгированной форм составляло примерно 50:50. Экскретированные с мочой метаболиты ДОН определяли преимущественно в конъюгированной форме — 62% от общего количества метаболитов в моче.

- 59 В кале количественно преобладал ДОМ-1, на долю которого приходилось 75% от всех экскретируемых с калом метаболитов ДОН. При этом свободные и конъюгированные формы ДОМ-1 определялись в равных соотношениях (50:50). Около 50% выводимого с калом неизмененного ДОН также выявляли в виде конъюгатов. Следует отметить, что более 50% всех экскретируемых у крыс метаболитов ДОН составляли конъюгаты. Общий выход ДОН и его метаболитов в наших экспериментах составлял 25– 38% от введенного количества ДОН. Причем экскреция свободных форм ДОН и ДОМ-1 с мочой составила 5,2 и 2,7% от введенной дозы, а с калом — соответственно 3,6 и 4,3%. Эти данные хорошо согласуются с приведенными в литературе, где через 24 ч. после введения крысам однократной дозы ДОН с мочой выводилось 6,2% введенного токсина в виде свободного ДОН и 2,5-3,2% в виде свободного ДОМ-1; количество токсина, выводимого с калом за 24-48 ч. в виде свободных ДОН и ДОМ-1 было около 3% и 6,4-8,3% соответственно [Lake B.C. et al., 1987]. По другим данным у крыс за 72 ч. с мочой выводилось в виде свободного ДОН 4,5% орально введенной дозы и в виде свободного ДОМ-1 — 4,4%; с калом экскретировалось 0,3% в виде свободного ДОН и 5,6% в виде свободного ДОМ-1 [Yoshizawa T. et al., 1983]. Сходные результаты были описаны в эксперименте на овцах. Так, при оральном введении ДОН овцам кроме исходного токсина (2,1% от введенной дозы) с мочой экскретировался конъюгированный ДОН (3,6%), ДОМ-1 (0,06%) и конъюгированный ДОМ-1 (1,2%). [Prelusky D.B. et al., 1986]. В то же время нельзя исключить вероятность существования и других, неидентифицированных метаболитов ДОН, о чем свидетельствуют единичные сообщения [Prelusky D.B. et al., 1986; 1987 а; Hedman R., Pettersson H., 1997]. Теоретически представляется возможным образование 3-ацетил ДОН по подобию с ацетилированием гидроксила в С-3 положении у Т-2 токсина и его ближайших аналогов. Не исключено, что две других гидроксильных группы (в С-7 и С-15 положениях) также могут присоединять ацетильный остаток. Нельзя также полностью исключать возможности гидроксилирования ДОН по С-4 положению. Хотя такая реакция представляется маловероятной в силу электрохимических закономерностей, но С4 положение наиболее выгодно для гидроксилирования с точки зрения стерической конфигурации молекулы ДОН. Подобные реакции гидроксилирования протекают в организме под действием монооксигеназ, локализованных в мембранах эндоплазмати-

- 60 ческого ретикулума [Арчаков А.И., 1975]. Также можно предположить возможное образование второго эпоксидного кольца между С-9 – С-10 атомами углерода. Еще один возможный путь биотрансформации ДОН — восстановление С-8 карбонильной группы до гидроксила. Такая реакция обратима и протекает под действием редуктаз, коферментами которых являются NADH или NADPH [Голиков С.Н. и др., 1986]:

О || С /\

NADPH NADH

НО Н \/ С /\

Сходные реакции неоднократно описаны для многих соединений, в частности для афлатоксинов, и протекают под действием NADPH-зависимых ферментов цитозоля печени некоторых видов животных и птиц [Shank R.C., 1977; Loveland P.M. et al., 1984]. Показано, что восстановление карбонильной группы зеараленона (с образованием α-зеараленола) осуществляется при участии 3α-гидроксистероид-дегидрогеназ, как микросомальной, так и цитозольной [Ueno Y., Tashiro F., 1983; Ueno Y., 1983]. Таким образом, проведенное исследование подтверждает то, что основными путями детоксикации ДОН у крыс является образование его деэпоксида — ДОМ-1 и конъюгатов ДОН и ДОМ-1. 2.2.3. Влияние индукторов ферментов метаболизма ксенобиотиков на метаболизм ДОН у крыс Специфические индукторы или ингибиторы ферментов широко используются в исследованиях по выяснению роли отдельных ферментов в биотрансформации ксенобиотиков. Цель данного эксперимента заключалась в изучении участия отдельных изоформ фермента UDP-глюкуронозилтрансферазы, ответственного за образование глюкуроновых конъюгатов ксенобиотиков в печени крыс. В настоящей работе в качестве индукторов UDP-глюкуронозилтрансферазы использовали фенобарбитал, 3-метилхолантрен и транс-стильбеноксид. Эти соединения являются классическими индукторами активности ферментов метаболизма ксенобиотиков [Bamburg J.R., Strong F.M., 1971; Bamburg J.R., 1976; Smalley E.B. et al., 1973; Grove M.D. et al., 1984]. По данным литературы 3-метилхолантрен является индуктором изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы семейства 1А, причем изоформа 1А1

- 61 является основной изоформой, индуцируемой 3-метилхолантреном в печени крыс [Emi Y. et al., 1996]. Также известно, что 3-метилхолантрен повышает активность изоформы 1А6 UDP-глюкуронозилтрансферазы [Jemnitz K. et al., 2000]. Фенобарбитал индуцирует преимущественно изоформы UDP-глюкуронозилтрансферазы семейства 2В [Oguri K. et al., 1996]. Показано, что у крыс Вистар основной индуцируемой фенобарбиталом изоформой является 2В1 [Ishii Y. et al., 1997]. Транс-стильбеноксид является неспецифическим индуктором UDP-глюкуронозилтрансферазы, одновременно активируя изоформы различных семейств этого фермента [Glatt H.R. et al., 1986]. Эксперимент проводили на 5 группах крыс-самцов линии Вистар с массой тела 253±4 г, по 6 животных в каждой группе. Все животные получали общевиварный рацион и воду без ограничения. Животные первой группы (контроль 1) получали внутрибрюшинно кукурузное масло в количестве 5 мл на 1 кг массы тела. Двум опытным группам животных (опыт-1 и опыт-2) вводили внутрибрюшинно соответственно 3-метилхолантрен (“Sigma”, США) в дозе 20 мг/кг и транс-стильбеноксид (“Sigma”, США) в дозе 400 мг/кг в виде растворов в кукурузном масле. Крысы четвертой группы (контроль-2) получали внутрибрюшинно физиологический раствор в количестве 5 мл/кг массы тела. Пятой группе (опыт-3) вводили внутрибрюшинно фенобарбитал (“Serva”, США) в физиологическом растворе в дозе 75 мг/кг. Введение кукурузного масла (контроль-1) и масляного раствора транс-стильбеноксида (опыт-2) проводили на протяжении 3 дней, а масляного раствора 3-метилхолантрена (опыт-1) — 2 дней. Физраствор (контроль-2) и раствор фенобарбитала (опыт-3) вводили в течение 5 дней. Через 24 часа после последнего введения (48 часов для второй и третьей групп) всех животных помещали в индивидуальные металлические обменные клетки с сетчатым дном и однократно вводили им внутрь ДОН в виде водного раствора в количестве 8 мг/кг массы тела. Мочу и кал животных собирали раздельно на протяжении 48 часов. До проведения анализа образцы хранили при температуре -18°С. Результаты проведенных исследований показали, что введение фенобарбитала вызывало снижение выведения свободных форм метаболитов, увеличивая в то же время образование и выведение конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1. Доля конъюгированных форм метаболитов возрастала с 39% в контрольной группе до 57% в опытной (рис. 7). Как видно из табл. 13, общее выводимое количество ДОН и его метаболитов с мочой оставалось неизменным, но количество конъюгатов увеличивалось при одновременном уменьшении в 1,5 раза доли свободной формы. Существенно усиливалось

- 62 -

Фенобарбитал

3-Метилхолантрен

70 60 50 40 30 20 10 0

К

ФБ

Свободная форма Конъюгаты

80 % от всех экскретированных метаболитов

80 % от всех экскретированных метаболитов

% от всех экскретированных метаболитов

80

Транс-стильбеноксид

70 60 50 40 30 20 10 0

К

МХ

Свободная форма Конъюгаты

70 60 50 40 30 20 10 0

К

ТСО

Свободная форма Конъюгаты

Рис. 7. Влияние индукторов ферментов метаболизма ксенобиотиков на соотношение свободных и конъюгированных форм метаболитов ДОН в моче и кале крыс.

- 63 Таблица 13. Экскреция ДОН и его метаболитов с мочой у крыс, получавших индукторы ферментов метаболизма ксенобиотиков Токсин Контроль-2

Опыт-3

Индуктор Контроль-1

Опыт-1

Опыт-2

282,8±40,9

276,0±26,8

306,6±51,5

261,0±48,6

374,0±18,0

(12,9±1,9)

(12,5±1,2)

(13,9±2,3)

(11,9±2,2)

(17,0±0,8)

104,4±15,0

69,0±7,6

92,8±6,9

89,0±15,2

22,0±3,1*

(4,8±0,7)

(3,1±0,3)

(4,2±0,3)

(4,0±0,7)

(1,0±0,1)

178,4±24,4

207,4±21,4

213,8±49,3

(8,1±1,1)

(9,4±1,0)

(9,7±2,2)

(7,8±1,9)

(16,0±0,8)

162,0±35,4

197,2±14,2

191,0±44,0

139±16

324±33*

(7,4±1,6)

(9,0±0,6)

(8,7±2,0)

(6,3±0,7)

(14,7±1,5)

78,2±23,0

67,2±8,1

68,4±13,7

52,4±11,4

22,5±2,9*

(3,6±1,0)

(3,1±0,4)

(3,1±0,6)

(2,4±0,5)

(1,0±0,1)

84,2±16,2

130,0±20,9

122,8±32,4

87,0±8,6

300,8±30,3*

(3,8±0,7)

(5,9±0,9)

(5,6±1,5)

(4,0±0,4)

(13,7±1,4)

120,0±20,0

79,0±18,1

115,0±22,8

122,6±22,9

52,0±16,4*

(5,5±0,9)

(3,6±0,8)

(5,2±1,0)

(5,6±1,0)

(2,4±0,7)

26,2±6,1

1,4±1,4*

24,4±4,6

37,4±3,4

0

(1,2±0,3)

(0,1±0,1)

(1,1±0,2)

(1,7±0,2)

(0)

93,8±28,2

77,6±31,2

91,0±15,1

84,8±22,5

52,0±16,4

(4,3±1,3)

(3,5±1,4)

(4,1±0,7)

(3,9±1,0)

(2,4±0,7)

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг общее количество свободная форма конъюгаты

172,0±42,0 352,0±18,1*

Масса неизмененного ДОН, мкг общее количество свободная форма конъюгаты Масса ДОМ-1, мкг общее количество свободная форма конъюгаты

Примечание: представлены средние данные (X±Sx) из 5 опытов. *) Р<0,05. В скобках указан % от введенной дозы ДОН.

- 64 выведение нативного ДОН за счет значительного возрастания (в1,5 раза) образования и выведения его конъюгатов. В моче наблюдалось снижение (в 1,5 раза) экскреции ДОМ-1 главным образом за счет резкого подавления образования и выведения конъюгированной формы ДОМ-1 (табл. 13). В кале наблюдалось снижение выведения общего количества ДОН и его метаболитов за счет уменьшения почти вдвое доли свободных форм. При этом относительное содержание в кале конъюгатов возрастало с 15% (в контроле) до 25% от общего количества метаболитов в кале. Обращает на себя внимание выраженное уменьшение образования и выведения свободного ДОМ-1 (в 3,3 раза). Однако при этом относительное содержание в кале конъюгатов ДОМ-1 возрастало с 9% (в контроле) до 24% от общего количества метаболитов в кале (табл. 14). Таким образом, фенобарбитал, являясь индуктором преимущественно изоформ семейства 2В UDP-глюкуронозилтрансферазы, не влиял существенно на общую экскрецию метаболитов ДОН, но вызывал выраженное перераспределение свободных и конъюгированных форм, выражающееся в усилении (в 1,5 раза) образования и выведения конъюгированных форм при одновременном снижении доли свободных метаболитов. Установлено также, что фенобарбитал подавляет образование и выведение свободного ДОМ-1, что приводит к возрастанию доли экскретируемых конъюгатов ДОМ-1 с 30 до 60%. 3-метилхолантрен в меньшей степени влиял как на общую экскрецию, так и на соотношение свободных и конъюгированных форм экскретируемых метаболитов ДОН (рис. 7). Как видно из табл. 13, в моче обнаружено лишь некоторое снижение свободных и конъюгированных форм нативного ДОН. Не выявлено какого-либо влияния 3метилхолантрена на количество экскретируемого с мочой ДОМ-1 и на соотношение его свободной и конъюгированной форм. В кале (табл. 14) наблюдается возрастание в 1,7 раза выведения конъюгированных форм метаболитов ДОН при одновременном уменьшении доли свободных форм (в 1,4 раза). Это перераспределение определяется, главным образом, значительным, в 4 раза, усилением образования и выведения конъюгатов ДОМ-1. Введение 3метилхолантрена сопровождалось уменьшением экскреции неметаболизированного ДОН и количества выводимых конъюгатов ДОН. Таким образом, 3-метилхолантрен, индуктор преимущественно изоформ семейства 1А UDP-глюкуронозилтрансферазы, в меньшей степени, чем фенобарбитал

- 65 Таблица 14. Экскреция ДОН и его метаболитов с калом у крыс, получавших индукторы ферментов метаболизма ксенобиотиков Токсин Контроль-2

Опыт-3

Индуктор Контроль-1

Опыт-1

Опыт-2

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг общее количество свободная форма конъюгаты

290,2±31,7 177,6±22,0* 364,2±45,1

327,2±16,2 126,8±10,6*

(13,2±1,4)

(16,6±2,1)

(14,9±0,7)

(5,8±0,5)

247,0±30,6 132,4±13,9* 306,0±35,3

225,4±20,8

83,8±18,3*

(11,2±1,4)

(6,0±0,6)

(13,9±1,6)

(10,2±0,9)

(3,8±0,8)

43,2±4,4

45,2±8,6

58,2±10,8

101,8±23,4

43,0±12,4

(2,0±0,2)

(2,1±0,4)

(2,6±0,5)

(4,6±1,1)

(2,0±0,6)

69,6±10,8

97,6±18,5

106,0±10,9

69,4±13,9

92,0±5,3

(3,2±0,5)

(4,4±0,8)

(4,8±0,5)

(3,2±0,6)

(4,2±0,2)

46,2±4,0

71,8±11,6

69,6±11,9

53,0±5,3

60,0±9,0

(2,1±0,2)

(3,3±0,5)

(3,2±0,5)

(2,4±0,2)

(2,7±0,4)

23,8±3,3

26,0±4,2

36,4±4,6

17,4±4,6*

32,3±9,0

(1,1±0,2)

(1,2±0,2)

(1,7±0,2)

(0,8±0,2)

(1,5±0,4)

220,2±18,1

80,0±1,5*

259,1±22,0

258,3±21,1

35,0±1,0*

(10,0±0,8)

(3,6±0,1)

(11,8±1,0)

(11,7±1,0)

(1,6±0,1)

200,8±17,9

60,6±5,3*

237,0±21,2

173,2±32,0

24,1±2,0*

(9,1±0,8)

(2,8±0,2)

(10,8±1,0)

(7,9±1,5)

(1,1±0,1)

19,6±2,2

19,2±4,5

21,9±4,1

85,0±8,0*

11,0±1,0*

(0,9±0,1)

(0,9±0,2)

(1,0±0,2)

(3,9±0,4)

(0,5±0,1)

(8,1±1,0)

Масса неизмененного ДОН, мкг общее количество свободная форма конъюгаты Масса ДОМ-1, мкг общее количество свободная форма конъюгаты

Примечание: см. табл. 13.

- 66 влиял на соотношение свободных и конъюгированных форм экскретируемых метаболитов ДОН. В отличие от фенобарбитала 3-метилхолантрен не влиял на образование и выведение свободных форм ДОМ-1 и существенно усиливал образование и выведение с калом конъюгатов ДОМ-1. У крыс, получавших транс-стильбеноксид, резко изменялось соотношение свободных и конъюгированных форм экскретируемых метаболитов ДОН (рис. 7). Как видно из рис. 7, доля свободных форм снижалась с 60 до 20%, в то время как 80% всех выводимых метаболитов ДОН определялись в виде конъюгатов (против 40% в контроле). Как видно из табл. 13, в моче наблюдалось некоторое увеличение экскреции суммы метаболитов ДОН, что явилось следствием достоверного, более чем в два раза, усиления образования и выведения конъюгатов; в то же время экскреция свободных форм метаболитов ДОН с мочой снижалась в 4 раза. В моче в 1,7 раза усиливалось выведение нативного ДОН за счет усиления образования и выведения конъюгатов ДОН почти в 2,5 раза при одновременном снижении выведения свободного ДОН почти в 3 раза. Подобно фенобарбиталу, трансстильбеноксид резко подавлял образование и выведение свободного ДОМ-1, но в меньшей степени влиял на образование и выведение конъюгатов ДОМ-1 (табл. 13). В кале происходило почти трехкратное снижение выведения суммарного количества метаболитов ДОН за счет уменьшения в 3,6 раза экскреции свободных форм. Транс-стильбеноксид не оказывал никакого влияния на суммарную экскрецию конъюгированных форм метаболитов ДОН с калом (табл. 14). Не было обнаружено влияния транс-стильбеноксида на выведение нативного ДОН в кале, но, как и при введении фенобарбитала, наблюдалось резкое подавление образования и выведения свободного ДОМ-1 (почти в 10 раз); в меньшей степени было выражено снижение образования и выведения конъюгатов ДОМ-1 (в 2 раза). Таким образом, транс-стильбеноксид проявляет себя как наиболее сильный индуктор процесса образования конъюгатов нативного ДОН, но не ДОМ-1. Кроме того, транс-стильбеноксид подавляет образование ДОМ-1. Обращает на себя внимание сходный характер изменений в соотношении экскретируемых

метаболитов

ДОН

при

воздействии

фенобарбитала

и

транс-

стильбеноксида, однако в количественном плане эти изменения гораздо более выражены при использовании транс-стильбеноксида. Основным общим эффектом, вызываемым введением фенобарбитала и транс-стильбеноксида per os, явилось значитель-

- 67 ное усиление экскреции глюкуронида ДОН с мочой (но не с калом). Наблюдаемые эффекты согласуются с данными литературы, согласно которым выход с мочой глюкуронидов ацетофена усиливался в 3 и 3,6 раза у крыс при введении фенобарбитала и транс-стильбеноксида; одновременно снижалась желчная экскреция конъюгированного токсина [Gregus Z. et al., 1990]. Таким образом, можно сделать предположение, что фенобарбитал и транс-стильбеноксид активируют одинаковые изоформы UDPглюкуронозилтрансферазы (семейства 2В), однако индуцирующее действие трансстильбеноксида либо сильнее, либо он воздействует также и на другие изоформы фермента. Так, в наших совместных исследованиях с Л.В. Кравченко [Кравченко Л.В. и др., 1998] было обнаружено, что активность как рНФ-UDP-глюкуронозилтрансферазы (семейство 1А), так и ГБФ-UDP-глюкуронозилтрансферазы (семейство 2В) возрастает более чем в 3 раза в микросомах печени и в 2 раза в микросомах тонкой кишки крыс, получавших транс-стильбеноксид. Ранее на примере другого трихотеценового токсина, структурного аналога ДОН, Т-2 токсина было показано, что индукторы ферментов метаболизма ксенобиотиков оказывают защитное действие при остром Т-2 токсикозе. При этом установлена коррелятивная зависимость между выраженностью защитного эффекта индуктора и степенью возрастания активности UDP-глюкуронозилтрансферазы: максимальной при введении фенобарбитала и минимальной в случае 3-метилхолантрена [Кравченко Л.В. и др., 1984]. Внутрижелудочное введение мышам цис-стильбеноксида также снижало острую летальную токсичность Т-2 токсина [Yazdanpanah H. et al., 1997]. Таким образом, проведенные исследования подтвердили, что образование глюкуроновых конъюгатов является одним из главных путей детоксикации ДОН в организме. Установлена прямая зависимость между усилением образования и выведения глюкуроновых конъюгатов ДОН и возрастанием активности микросомальной UDPглюкуронозилтрансферазы. Впервые получены данные об участии в образовании глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы, относящихся к семействам 1А и 2В.

- 68 2.2.4. Влияние уровня селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс В предыдущих исследованиях, проведенных в лаборатории энзимологии питания Института питания РАМН, было установлено, что селен в количествах, превышающих физиологические потребности, снижает токсичность трихотеценового микотоксина Т-2 токсина для крыс, что в определенной степени коррелирует с изменением активности ферментов, участвующих в его метаболизме [Кравченко Л.В. и др., 1990]. При этом высокой чувствительностью к повышенному содержанию селена в рационе отличалась микросомальная UDP-глюкуронозилтрансфераза, относящаяся к семейству 1А, активность которой возрастала почти вдвое [Кравченко Л.В. и др., 1991]. Как известно, этот фермент катализирует образование глюкуроновых конъюгатов и играет ключевую роль в детоксикации Т-2 токсина у крыс. Предполагается, что снижение острой токсичности Т-2 токсина у крыс, получавших обогащенный селеном рацион, связано с изменением соотношения различных путей биотрансформации токсина в пользу усиления процессов его конъюгации и выведения из организма [Кравченко Л.В. и др., 1990]. Целью настоящего раздела явилось изучение влияния обогащения рациона селеном, а также его дефицита в рационе крыс на метаболизм ДОН. 2.2.4.1. Влияние обогащения рациона селеном на метаболизм ДОН у крыс Исследования проводили на 3 группах крыс-самцов Вистар с исходной массой тела 50 г по 12 животных в каждой группе. Животные 1-й, контрольной группы, получали в течение 6 недель полноценный полусинтетический рацион с содержанием селена в количестве 0,2 мг/кг; животные 2-й и 3-й групп получали рацион с содержанием селена в концентрации 1 и 5 мг/кг. В качестве дополнительного источника селена в рацион включали селен-обогащенные дрожжи «Биоселен» с содержанием селена в количестве 460±40 мг/кг. Разные уровни селена в рационах получали за счет добавления в разных соотношениях селен-содержащих и бесселеновых дрожжей. Во всех случаях общее количество дрожжей в рационе составляло 1,1%. В конце экспериментального периода по 6 крыс из каждой группы помещали в обменные клетки, вводили им однократно внутрь водный раствор ДОН в дозе 8 мг/кг массы тела и в течение 48 ч собирали раздельно мочу и кал для определения метаболитов ДОН. Образцы мочи и кала до проведения анализа хранили при температуре -18°С.

- 69 Обогащение рациона крыс селеном в концентрации 1 мг/кг не влияло на суммарную экскрецию из организма метаболитов ДОН и на соотношение их свободных и конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1, экскретируемых с мочой и калом (табл. 15). Увеличение уровня селена в рационе до 5 мг/кг сопровождалось достоверным возрастанием выведения суммарного количества экскретируемых метаболитов ДОН (на 23%), преимущественно за счет усиления образования и выведения конъюгированных форм ДОН (в 1,7 раза) (табл. 15). У крыс этой группы количество конъюгатов составляло более 60% от всех экскретируемых метаболитов, в то время как у крыс контрольной группы на долю глюкуронидов приходилось 40%. Как видно из данных, представленных в табл. 16 и на рис. 8А, при концентрации селена 5 мг/кг рациона у крыс значительно усиливалось выведение с мочой как ДОН, так и ДОМ-1. Так общее количество экскретируемого с мочой ДОН возрастало в 1,5 раза, конъюгатов ДОН — в 2,5 раза, в то время как количество свободного ДОН практически не изменялось. У крыс этой же группы почти вдвое возрастало общее выводимое с мочой количество ДОМ-1 за счет усиления в 3 раза образования и экскреции конъюгатов ДОМ-1 при незначительном (на 30%) снижении доли свободной формы метаболита. Таким образом, при содержании селена в рационе 5 мг/кг суммарное количество метаболитов ДОН, выводимых с мочой, возрастало в 1,7 раза, образование и выведение конъюгированных форм — почти в 3 раза, а суммарный уровень свободных форм метаболитов не изменялся. Количество экскретируемых с калом ДОН и ДОМ-1, а также соотношение их свободных и конъюгированных форм не изменялись достоверно, независимо от изменения обеспечения рационов крыс селеном (табл. 17, рис. 8Б). Обнаруженное резкое усиление образования и экскреции конъюгированных форм (главным образом глюкуронидов) ДОН и ДОМ-1 при обогащении рациона селеном, коррелирует с обнаруженным в параллельном исследовании возрастанием в печени крыс активности обеих изученных изоформ UDP-глюкуронозилтрансфераз — pНФ-UDP-ГТ (семейство 1А) и ГБФ-UDP-ГТ (семейство 2В), при обогащении рационов крыс органическими формами селена. Причем при максимальном уровне селена в рационе крыс активность pНФ-UDP-глюкуронозилтрансферазы в печени превышала контрольный уровень более чем в два раза, в то время как возрастание активности ГБФ-UDP-глюкуронозилтрансферазы было умеренным (табл. 18).

- 70 Таблица 15. Суммарная экскреция ДОН и его метаболитов у крыс в зависимости от уровня селена в рационе. Токсин Контроль

Рацион Se, 1 мг/кг

Se, 5 мг/кг

общее количество

607 ± 29 (24,7 ± 0,9)

663 ± 51 (26,2 ± 2,4)

744 ± 19 * (32,6 ± 0,5)

свободная форма

360 ± 14 (14,7 ± 0,7)

382 ± 30 (15,1 ± 1,5)

321 ± 30 (14,7 ± 1,8)

конъюгаты

249 ± 27 (10,0 ± 1,0)

281 ± 26 (11,1 ± 1,2)

423 ± 51* (18,0 ± 1,7)

общее количество

276 ± 19 (11,3 ± 0,9)

302 ± 36 (11,9 ± 1,5)

343 ± 18* (15,6 ± 0,5)

свободная форма

177 ± 11 (7,3 ± 0,7)

195 ± 27 (7,7 ± 1,2)

175 ± 10 (8,1 ± 0,7)

конъюгаты

101 ± 15 (4,0 ± 0,6)

106 ± 16 (4,2 ± 0,7)

194 ± 40 (7,5 ± 0,9)

общее количество

331 ± 35 (13,4 ± 1,4)

362 ± 27 (14,3 ± 1,4)

374 ± 9 (17,1 ± 0,7)

свободная форма

184 ± 19 (7,5 ± 0,8)

187 ± 13 (7,4 ± 0,7)

145 ± 21 (6,7 ± 1,2)

конъюгаты

147 ± 19 (5,9 ± 0,7)

175 ± 14 (6,9 ± 0,7)

228 ± 24* (10,5 ± 1,2)

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг

Масса неизмененного ДОН, мкг

Масса ДОМ-1, мкг

Примечание: представлены средние данные (X±Sx) из 6 опытов. *) Р<0,05. В скобках указан % от введенной дозы ДОН.

- 71 Таблица 16. Экскреция ДОН и его метаболитов с мочой у крыс в зависимости от уровня селена в рационе. Токсин Контроль

Рацион Se, 1 мг/кг

Se, 5 мг/кг

308,5±25,8

371,3±26,9

513,8±41,4*

(12,5±1,0)

(14,7±1,1)

(23,6±1,9)

195,3±18,5

230,3±27,8

203,4±12,0

(7,9±0,8)

(9,1±1,1)

(9,3±0,6)

114,9±23,3

141,1±9,2

310,4±47,9*

(4,7±0,9)

(5,6±0,2)

(14,2±2,2)

190,1±9,9

216,5±18,8

288,3±18,1*

(7,7±0,4)

(8,6±0,7)

(13,2±0,8)

133,3±8,5

157,6±23,9

148,5±7,4

(5,4±0,3)

(6,2±0,9)

(6,8±0,3)

56,8±7,8

58,8±7,8

139,8±21,7*

(2,3±0,3)

(2,3±0,3)

(6,4±1,0)

118,4±18,2

154,9±13,3

225,5±31,9*

(4,8±0,7)

(6,1±0,5)

(10,3±1,5)

62,0±11,1

72,6±8,5

54,8±5,5

(2,5±0,5)

(2,9±0,3)

(2,5±0,3)

56,4±12,4

82,3±6,2

170,7±33,9*

(2,3±0,5)

(3,3±0,2)

(7,8±1,6)

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг общее количество свободная форма конъюгаты Масса неизмененного ДОН, мкг общее количество свободная форма конъюгаты Масса ДОМ-1, мкг общее количество свободная форма конъюгаты

Примечание: см. табл. 15.

- 72 -

*

14

ДОН

% от введенного количества ДОН

А

Контроль 1 мг/кг 5 мг/кг

ДОМ-1

12

*

10

* 8

*

6 4 2 0 а

б

в

10

% от введенного количества ДОН

ДОН

Б

9

а

б

ДОМ-1

в

Контроль 1 мг/кг 5 мг/кг

8 7 6 5 4 3 2 1 0 а

б

в

а

б

в

Рис. 8. Влияние обогащения рациона селеном на соотношение свободных и конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1, экскретируемых с мочой (А) и с калом (Б) у крыс. а — общее количество, б — свободная форма, в — конъюгаты. *) Р<0,05.

- 73 Таблица 17. Экскреция ДОН и его метаболитов с калом у крыс в зависимости от уровня селена в рационе. Токсин Контроль

Рацион Se, 1 мг/кг

Se, 5 мг/кг

298,8±25,8

291,9±52,5

202,5±35,3

(12,1±1,0)

(11,5±2,1)

(9,3±1,6)

165,1±17,0

151,5±24,7

117,3±21,7

(6,7±0,7)

(6,0±1,0)

(5,4±1,0)

133,8±9,4

139,8±30,0

112,3±28,8

(5,4±0,4)

(5,5±1,2)

(5,2±1,3)

86,2±20,8

85,2±28,7

54,3±9,6

(3,5±0,8)

(3,4±1,1)

(2,5±0,4)

43,5±10,7

37,1±9,4

26,9±5,2

(1,8±0,4)

(1,5±0,4)

(1,2±0,2)

42,7±10,3

47,5±18,9

27,4±4,8

(1,7±0,4)

(1,9±0,7)

(1,3±0,2)

212,7±27,4

206,7±34,9

148,1±26,8

(8,6±1,1)

(8,2±1,4)

(6,8±1,2)

121,6±17,0

114,4±19,7

90,4±17,3

(4,9±0,7)

(4,5±0,8)

(4,1±0,8)

91,5±10,7

92,3±16,1

57,7±12,1

(3,7±0,4)

(3,6±0,6)

(2,6±0,6)

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг общее количество свободная форма конъюгаты Масса неизмененного ДОН, мкг общее количество свободная форма конъюгаты Масса ДОМ-1, мкг общее количество свободная форма конъюгаты

Примечание: см. табл. 15.

- 74 Таблица 18. Активность UDP-глюкуронозилтрансфераз в микросомах печени крыс, получавших рацион, обогащенный селеном Фермент

Содержание селена в рационе, мг/кг 0,2 (контроль)

1

5

20,7±1,2

25,6±1,5

44,2±3,6*

4,26±0,21

4,17±0,25

5,72±0,83

рНФ-UDP-Глюкуронозилтрансфераза, нмоль/мин × мг белка ГБФ-UDP-Глюкуронозилтрансфераза, нмоль/мин × мг белка

Примечание: Данные Л.В. Кравченко. *) P<0,05. Полученные результаты свидетельствуют, что обогащение рациона крыс селеном оказывает дозозависимое влияние на токсикокинетику ДОН, ускоряя процессы его детоксикации преимущественно за счет усиления образования и выведения глюкуронидов. 2.2.4.2. Влияние дефицита селена в рационе на метаболизм ДОН у крыс Исследования проводили на крысах-самцах Вистар массой 40,7±1,3 г. Каждая экспериментальная группа включала 12 животных. Крысы опытной группы в течение 6 недель получали полусинтетический рацион с содержанием селена < 0,02 мг/кг; крысы контрольной группы — тот же рацион с добавлением селена в виде селен-обогащенных дрожжей в количестве, обеспечивающем концентрацию селена 0,5 мг/кг. В конце экспериментального периода по 6 крыс из каждой группы помещали в обменные клетки и вводили им однократно внутрь водный раствор ДОН в дозе 8 мг/кг массы тела. Мочу и кал для определения метаболитов собирали раздельно в течение 48 ч и хранили при -18°С до проведения анализа. В период содержания в обменных клетках животные получали соответствующие экспериментальные рационы. Результаты проведенных анализов показали, что у крыс как опытной, так и контрольной группы, единственными экскретируемыми метаболитами ДОН наряду с неизмененным микотоксином, являются его глюкурониды. ДОМ-1 как в свободной,

- 75 так и в конъюгированной форме не был обнаружен ни в одной из групп, что, возможно, является результатом специфического влияния дрожжей, составляющих почти 30% рациона, на микрофлору кишечника, ферментные системы которой, как полагают, осуществляют превращение ДОН в ДОМ-1 [Swanson S.P. et al., 1987; Worrell N.R. et al., 1989]. Как видно из данных, представленных в табл. 19 и на рис. 9, у крыс, получавших дефицитный по селену рацион, умеренно возрастало выведение общего количества ДОН, главным образом в конъюгированной форме. У крыс опытной группы доля экскретируемых глюкуронидов ДОН возрастала почти вдвое. Общее количество метаболитов ДОН, выводимых с мочой, возрастало в два раза у крыс на селен-дефицитном рационе (табл. 20, рис. 9А). При этом резко усиливалась экскреция ДОН как в свободной (в 3 раза), так и в конъюгированной форме (в 2 раза). Дефицит селена в рационе не оказывал существенного влияния на уровень экскреции ДОН с калом. Можно отметить некоторое уменьшение доли выводимого в свободной форме ДОН при одновременном умеренном (в 1,5 раза) увеличении доли глюкуронидов ДОН, выводимых с калом (табл. 21, рис. 9Б). Усиление выведения конъюгированного ДОН с мочой и калом коррелировало с резким возрастанием активности микросомальных UDP-глюкуронозилтрансфераз, обнаруженном в параллельном исследовании. Активность изоформы pНФ-UDP-ГТ (семейство 1А) возрастала почти вдвое, в то время как активность изоформы ГБФ-UDPГТ (семейство 2В) увеличивалась в 1,7 раза (табл. 22). Значительное возрастание активности рНФ-UDP-глюкуронозилтрансферазы (семейство 1А) в печени крыс и мышей с селеновой недостаточностью было обнаружено и в более ранних исследованиях [Chen J. et al, 1982; Reiter R., Wendel A., 1983]. В последней работе также сообщается о двукратном снижении активности сульфотрансферазы — фермента, ответственного за

образование

сульфоконъюгатов, — у мышей, содержащихся на рационе с дефицитом селена. Это может означать, что дефицит селена в рационе подавляет образование сульфоконъюгатов ДОН.

- 76 Таблица 19. Суммарная экскреция ДОН и его метаболитов у крыс, содержащихся на рационе с дефицитом селена. Токсин

Рацион Контроль

Опыт

500,4 ± 64,1

686,8 ± 62,0

(24,9 ± 2,0)

(36,8 ± 3,5)

290,8 ± 46,2

335,5 ± 24,9

(14,6 ± 2,3)

(17,9 ± 0,6)

203,6 ± 43,3

352,1 ± 61,8

(10,3 ± 1,6)

(19,0 ± 3,6)

Масса ДОН, мкг общее количество

свободная форма

конъюгаты

Примечание: представлены средние данные (X±Sx) из 4 опытов. В скобках указан % от введенной дозы ДОН.

% от введенного количества ДОН

20

А

*

Б

18 16

Контроль Опыт

14 12

*

10

*

8 6 4 2 0 а

б

в

а

б

в

Рис. 9. Влияние дефицита селена в рационе на соотношение свободных и конъюгированных форм ДОН, экскретируемых с мочой (А) и с калом (Б) у крыс. а — общее количество ДОН, б — свободная форма ДОН, в — конъюгаты ДОН. *) Р<0,05.

- 77 Таблица 20. Экскреция ДОН и его метаболитов с мочой у крыс, содержащихся на рационе с дефицитом селена. Токсин

Рацион Контроль

Опыт

224,16 ± 37,23

341,92 ± 28,16*

(11,2 ± 1,9)

(18,3 ± 1,5)

87,42 ± 11,14

145,91 ± 16,45*

(4,4 ± 0,6)

(7,8 ± 0,9)

118,76 ± 26,10

202,90 ± 19,94*

(6,0 ± 1,3)

(10,9 ± 1,1)

Масса ДОН, мкг общее количество

свободная форма

конъюгаты

Примечание: см. табл. 19. *) Р<0,05. Таблица 21. Экскреция ДОН и его метаболитов с калом у крыс, содержащихся на рационе с дефицитом селена. Токсин

Рацион Контроль

Опыт

276,27 ± 24,00

344,98 ± 46,51

(13,9 ± 1,2)

(18,5 ± 2,5)

203,38 ± 39,89

189,51 ± 40,67

(10,2 ± 2,0)

(10,2 ± 2,2)

85,12 ± 10,36

148,61 ± 30,28

(4,3 ± 0,5)

(8,0 ± 1,6)

Масса ДОН, мкг общее количество

свободная форма

конъюгаты

Примечание: см. табл. 19.

- 78 Таблица 22. Активность UDP-глюкуронозилтрансфераз в микросомах печени крыс, при дефиците селена в рационе Фермент

Содержание селена в рационе, мг/кг 0,5 (контроль)

< 0,02

15,0±2,3

29,5±1,8*

6,79±0,45

11,74±0,77*

рНФ-UDP-Глюкуронозилтрансфераза, нмоль/мин × мг белка ГБФ-UDP-Глюкуронозилтрансфераза, нмоль/мин × мг белка Примечание: Данные Л.В. Кравченко. *) P<0,05. Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют, что дефицит селена в рационе, приводящий к развитию умеренной селеновой недостаточности у крыс, оказывает значительное влияние на токсикокинетику трихотеценового микотоксина ДОН. Это проявляется в усилении экскреции ДОН как в неизмененном виде, так и в виде глюкуронидов, преимущественно с мочой. Усиление образования и выведения глюкуронидов коррелировало со значительным возрастанием активности микросомальных UDP-глюкуронозилтрансфераз в печени, обнаруженном в параллельных исследованиях. Полученные данные выявили определенное сходство в характере влияния обогащения рациона селеном и дефицита селена в рационе крыс на метаболизм ДОН. Как обогащение, так и снижение уровня селена приводило к возрастанию суммарного количества экскретируемых метаболитов, усилению выведения метаболитов с мочой и значительному увеличению доли конъюгированных форм метаболитов, т. е. усилению образования и экскреции глюкуронидов, которое коррелировало со значительным возрастанием активности микросомальных UDP-глюкуронозилтрансфераз. Необходимо отметить, что сходные результаты были получены в исследовании Chen J. et al., (1982), где обнаружено, что как дефицит селена, так и обогащение им рациона (6 мг/кг) оказывают одинаковое действие на токсикокинетику афлатоксина В1 у крыс — подавляют образование в печени аддуктов токсина с макромолекулами. И в этом случае, как повышение, так и снижение уровня селена в рационе приводило к возрастанию активности глюкуронозилтрансферазы.

- 79 Механизм обнаруженных изменений ферментной активности до сих пор остается невыясненным. Физиологические функции селена изучены недостаточно, фактически неоспоримо доказана только его связь с процессами антиоксидантной защиты, и, как следствие этого, — возможное стабилизирующее действие на биологические мембраны [Combs G.F., Combs S.B., 1986; Meydani M., 1987; Збаровская И.А., Банникова М.В., 1995]. В то же время большинство авторов подчеркивает отсутствие

причинно-следственной

связи

между

индуцированными

селеном

изменениями активности ферментов метаболизма ксенобиотиков и изменением активности селен-зависимой глутатионпероксидазы, являющейся частью системы антиоксидантной защиты [Burk R.F., Lane J.M., 1979; Reiter R., Wendel A., 1984; Combs G.F., 1997]. Однако было найдено, что изменение уровня селена в рационе крыс может оказывать непосредственное влияние на метаболизм некоторых эссенциальных жирных кислот [Кулакова С.Н. и др., 1994]. Это позволяет предположить, что возникающие нарушения соотношения полиненасыщенных жирных кислот в мембранах клеточных структур могут приводить к изменению физических свойств мембран и к изменению кинетических свойств и аллостерической регуляции мембраносвязанных ферментов. Сопоставляя результаты настоящей работы с данными литературы, можно заключить, что изменения уровня селена в рационе, выходящие за границы физиологических потребностей, способны изменять функциональное состояние ферментных систем, осуществляющих биотрансформацию и детоксикацию ксенобиотиков. Особой чувствительностью к изменению уровня селена в рационе выделяется UDPглюкуронозилтрансфераза, локализованная, как и большинство ферментов этих систем, в мембранах эндоплазматической сети.

- 80 2.2.5. Влияние обогащение рациона пектином на метаболизм ДОН у крыс Некоторые типы пищевых волокон, такие как пектин и гемицеллюлоза, являются субстратами для кишечной микрофлоры, в результате чего включение их в рацион может сопровождаться значительными изменениями характера кишечной микрофлоры и ее функциональной активности. Следствием этого может явиться изменение токсичности соединений, в метаболизме которых участвуют ферментные системы микрофлоры кишечника. Принимая во внимание предположение о том, что одним из основных путей биотрансформации и детоксикации ДОН — его деэпоксидирование — происходит при влиянии ферментных систем микрофлоры желудочно-кишечного тракта, целью настоящего раздела явилось изучение влияния пектина на метаболизм ДОН у крыс. Эксперименты проводили на 2 группах растущих крыс-самцов Вистар по 12 животных в каждой. Масса тела крыс варьировала от 190 до 205 г. Контрольная группа крыс получала полусинтетический рацион без дополнительного включения пектина; опытная группа получала такой же рацион, содержащий цитрусовый пектин (“Kopenhagen pektin fabrik”, Дания) в концентрации 5%. Продолжительность эксперимента составила 2 недели. По истечении этого времени по 5 крыс из каждой группы были помещены в индивидуальные металлические обменные клетки с сетчатым дном. Всем животным был введен однократно внутрижелудочно ДОН в виде водного раствора в дозе 10 мг/кг массы тела. Моча и кал животных собирались раздельно в течение 48 часов с момента введения ДОН. До проведения анализа образцы мочи и кала хранились при температуре -18°С. Результаты проведенных исследований показали, что у крыс, получавших рацион с пектином, существенно (в 1,5 раза) возрастало общее количество экскретируемых метаболитов ДОН, главным образом их конъюгатов — более чем в 1,5 раза. При этом отмечается преимущественное усиление выведения неизмененного ДОН (в 1,8 раз) в первую очередь за счет возрастания образования и выведения его конъюгатов (почти вдвое), а также усиление выведения свободного ДОН в 1,5 раза. Не обнаружено какого-либо влияния пектина на суммарное образование и выведение ДОМ-1 как в свободной, так и конъюгированной форме (табл. 23). Как видно из таблицы 24 и рисунка 10А, обогащение рациона крыс пектином приводило к усилению экскреции метаболитов ДОН с мочой как за счет возрастания

- 81 Таблица 23. Суммарная экскреция ДОН и его метаболитов у крыс, содержащихся на рационе, обогащенном пектином. Токсин

Рацион Контроль Опыт

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг общее количество

751,48±46,94 (37,86±2,36)

1079,73±56,68* (54,39±2,86)

свободная форма

281,18±9,71 (14,17±0,49)

349,91±27,92* (17,63±1,41)

конъюгаты

470,31±46,76 (23,69±2,36)

729,82±43,25* (36,77±2,18)

общее количество

416,51±22,76 (20,98±1,15)

735,99±49,34* (37,08±2,49)

свободная форма

121,03±3,70 (6,10±0,19)

188,06±13,10* (9,47±0,66)

конъюгаты

295,48±25,19 (14,89±1,27)

547,93±44,97* (27,60±2,27)

общее количество

334,97±30,56 (16,88±1,54)

343,74±9,73 (17,32±0,49)

свободная форма

160,14±7,70 (8,07±0,39)

161,85±16,68 (8,15±0,84)

конъюгаты

174,83±26,13 (8,81±1,32)

181,89±13,12 (9,16±0,66)

Масса неизмененного ДОН, мкг

Масса ДОМ-1, мкг

Примечание: представлены средние данные (X±Sx) из 5 опытов. *) (Р<0,05). В скобках указан % от введенной дозы ДОН.

- 82 Таблица 24. Экскреция ДОН и его метаболитов с мочой у крыс, содержащихся на рационе, обогащенном пектином. Токсин

Рацион Контроль Опыт

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг общее количество

338,65±43,09 (16,79±2,13)

446,09±23,69 (22,44±1,19)

свободная форма

113,20±15,20 (5,60±2,13)

164,22±15,25* (8,16±0,75)

конъюгаты

225,45±28,16 (11,19±1,39)

281,86±17,28 (14,28±0,36)

общее количество

113,94±6,65 (5,76±0,33)

209,44±10,82* (10,53±0,54)

свободная форма

38,13±3,54 (1,91±0,17)

57,49±2,67* (2,89±0,13)

конъюгаты

75,80±4,60 3,85±0,23)

151,95±11,30* (7,64±0,56)

общее количество

224,72±37,41 (11,03±1,83)

236,65±13,91 (11,91±0,70)

свободная форма

75,07±12,18 (3,69±0,59)

106,73±15,75 (5,27±0,77)

конъюгаты

149,65±26,09 (7,34±1,28)

129,92±13,05 (6,64±0,66)

Масса неизмененного ДОН, мкг

Масса ДОМ-1, мкг

Примечание: см. табл. 23.

- 83 -

12 *

ДОН

% от введенной дозы

10

ДОМ-1

Контроль Опыт

А

*

8 *

6

4

*

2

0

Общее количество

Свободная форма

Конъюгаты

Общее количество

Свободная форма

Конъюгаты

30 *

ДОН

ДОМ-1

Контроль Опыт

% от введенной дозы

25 *

Б

20

15

10

* *

5

0

Общее количество

Свободная форма

Конъюгаты

Общее количество

Свободная форма

*

Конъюгаты

Рис. 10. Влияние пектина на соотношение свободных и коньюгированных форм ДОН, экскретируемых с мочой (А) и калом (Б) у крыс. *) P<0,05.

- 84 выведения свободных, так и конъюгированных форм. Выведение неизмененного ДОН с мочой усиливалось в 1,8 раз, прежде всего за счет статистически достоверного возрастания в 2 раза образования и выведения конъюгатов ДОН. В меньшей степени пектин влиял на образование и экскрецию ДОМ-1: выведение с мочой свободной формы ДОМ-1 возрастало в 1,4 раза. В кале, как и в моче, обнаружено достоверное возрастание суммарного количества экскретируемых метаболитов (в 1,5 раза). При этом количество конъюгатов увеличивалось более чем в 1,8 раза. Обнаруженные изменения определялись, прежде всего, усилением выведения неизмененного ДОН — в 1,7 раза, как в свободной форме, так и в виде конъюгатов (табл. 25, рис. 10Б). Обращает на себя внимание двукратное увеличение образования и экскреции с калом конъюгатов ДОМ-1 при одновременном уменьшении доли экскретируемого в свободной форме ДОМ-1. Таким образом, обогащение рациона пектином приводит к существенному усилению метаболизма ДОН, что проявлялось как в увеличении количества выводимого неизмененного токсина, так и в усилении образования и выведения его конъюгатов. Эти результаты коррелируют с полученными в этом же эксперименте данными о значительном возрастании (почти в 2 раза) в печени крыс, получавших рацион с пектином, активности микросомальной UDP-глюкуронозилтрансферазы [Кравченко Л.В. и др., 1994]. Интересно отметить сообщение Ohkami H. et al. (1995) о способности пектинов подавлять активность β-глюкуронидазы — фермента, осуществляющего гидролитическое расщепление глюкуронидов различных токсикантов в кишечнике и способствующего их печеночно-кишечной рециркуляции. Нельзя исключать, что подавление пектином кишечной и бактериальной β-глюкуронидазы может вносить свой вклад в обнаруженное возрастание количества конъюгированных метаболитов ДОН. К возможным механизмам влияния рациона, содержащего пектин, на активность микросомальных ферментов можно отнести, во-первых, наличие в препарате пектина соединений, индуцирующих ферменты (например, биологически активные компоненты) [Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а; Reddy B.S., 1999], во-вторых, возможные изменения обмена холестерина [Groudeva J. et al., 1997; Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф., 1998 а], который в значительной мере определяет степень жидкостности мембран и может модулировать функциональное состояние мембраносвязанных ферментов.

- 85 Таблица 25. Влияние обогащения рациона пектином на характер распределения метаболитов ДОН, экскретируемых с калом у крыс. Токсин

Рацион Контроль Опыт

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг общее количество

412,82±18,09 (21,10±0,93)

633,65±47,81* (31,47±2,38)

свободная форма

167,97±13,76 (8,70±0,71)

185,69±16,31 (9,16±0,81)

конъюгаты

244,85±26,33 (12,39±1,33)

447,96±39,89* (22,31±1,98)

общее количество

302,58±21,47 (15,37±1,09)

526,56±45,64* 26,14±2,27)

свободная форма

82,90±6,05 (4,27±0,31)

130,57±12,54* (6,43±0,62)

219,68±26,36 (11,1±1,33)

395,99±39,63* (19,71±1,97)

общее количество

110,25±7,67 (5,73±0,39)

107,09±5,97 (5,33±0,29)

свободная форма

85,07±8,29 (4,43±0,43)

55,12±4,48* (2,73±0,22)

конъюгаты

25,18±2,21 (1,29±0,11)

51,97±2,22* (2,60±0,11)

Масса неизмененного ДОН, мкг

конъюгаты Масса ДОМ-1, мкг

Примечание: см. табл. 23. Таким образом, обогащение рациона крыс пектином оказывает существенное влияние на различные этапы токсикокинетики ДОН, что проявляется как в повышении скорости экскреции токсина за счет усиления адсорбирования и выведения, а также за счет его влияния на этап биотрансформации-детоксикации, осуществляемый ферментами печени и тонкого кишечника.

- 86 2.2.6. Влияние пробиотиков на метаболизм ДОН у крыс Установлено, что наряду с реакциями конъюгации, деэпоксидирование трихотеценовых микотоксинов является одним из важных путей их детоксикации в организме. Существует гипотеза, практически не подтвержденная экспериментальными доказательствами, согласно которой деэпоксидирование трихотеценовых микотоксинов происходит при участии редуктаз анаэробных микроорганизмов желудочнокишечного тракта. В связи с этим проведено сравнительное изучение возможного влияния на метаболизм ДОН терапевтических доз пробиотиков. Эксперименты проводили на 2 группах крыс-самцов Вистар по 10 животных в каждой группе. Животные содержались на общевиварном рационе. Крысам опытной группы в течение 8 дней вводили внутрь суспензию живых культур Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus и Streptococcus thermophilus в количестве 5 х 108 клеток. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду. Спустя 24 часа после последнего введения, 6-ти животным из каждой группы вводили однократно внутрижелудочно водный раствор ДОН в дозе 8 мг/кг массы тела и помещали в индивидуальные металлические обменные клетки с сетчатым дном. В течение 48 часов у крыс собирали раздельно мочу и кал и хранили образцы при -18°С до проведения анализа. Результаты изучения экскреции ДОН и его метаболитов — ДОМ-1, конъюгатов ДОН и ДОМ-1, у крыс, получавших молочнокислые бактерии представлены в табл. 26-28 и на рис. 11 и 12. Как видно из табл. 26, введение молочнокислых бактерий приводило к умеренному возрастанию суммарной экскреции ДОН и его метаболитов за счет достоверного усиления вдвое выведения свободных форм, но не влияло на количество экскретируемых конъюгированных форм. Анализ распределения экскретируемых метаболитов ДОН показал, что молочнокислые бактерии вызывают достоверное усиление экскреции нативного ДОН (в 1,7 раза) в основном за счет более чем двукратного увеличения выхода свободной формы ДОН. Общее количество экскретированного ДОМ-1 не претерпело изменений, хотя наблюдалось некоторое увеличение выведения свободной формы (в 1,6 раза) и снижение конъюгированной формы (в 1,3 раза) ДОМ-1. Молочнокислые бактерии вызывали перераспределение соотношения экскретируемых нативного ДОН и ДОМ-1, выражающееся в увеличении доли ДОН с

- 87 Таблица 26. Суммарная экскреция ДОН и его метаболитов у крыс, получавших молочнокислые бактерии Токсин

Рацион Контроль

Опыт

общее количество

284,8±23,4 (20,4±1,6)

373,2±43,7 (26,7±3,1)

свободная форма

114,7±14,2 (8,2±1,0)

220,8±32,3* (15,8±2,2)

конъюгаты

170,0±17,0 (12,2±1,2)

152,4±13,6 (10,9±0,9)

общее количество

113,2±10,6 (8,1±0,8)

196,0±24,6* (14,0±1,7)

свободная форма

55,0±4,5 (4,0±0,3)

124,8±14,0* (8,9±1,0)

конъюгаты

58,2±10,9 (4,1±0,8)

71,2±12,6 (5,1±0,9)

общее количество

171,8±17,0 (12,3±1,2)

177,8±29,5 (12,7±2,1)

свободная форма

59,6±10,1 (4,3±0,7)

96,0±20,6 (6,9±1,4)

конъюгаты

112,2±10,7 (8,0±0,7)

82,0±10,8 (5,9±0,7)

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг

Масса неизмененного ДОН, мкг

Масса ДОМ-1, мкг

Примечание: представлены средние данные (X±Sx) из 6 опытов. *) (Р<0,05). В скобках указан % от введенной дозы ДОН.

- 88 Таблица 27. Экскреция ДОН и его метаболитов с мочой у крыс, получавших молочнокислые бактерии Токсин

Рацион Контроль

Опыт

общее количество

120,4±22,6 (8,6±1,6)

183,6±9,9* (13,2±0,7)

свободная форма

44,2±6,7 (3,2±0,5)

100,8±4,8* (7,2±0,3)

конъюгаты

76,2±16,7 (5,4±1,1)

82,8±11,7 (6,0±0,8)

общее количество

79,2±11,8 (5,6±0,8)

124,0±11,3* (8,9±0,8)

свободная форма

34,1±4,3 (2,4±0,3)

83,4±2,3* (6,0±0,2)

конъюгаты

45,1±9,6 (3,2±0,7)

40,6±9,5 (2,9±0,7)

общее количество

41,2±12,3 (2,9±0,9)

59,4±2,9 (4,2±0,2)

свободная форма

10,2±2,6 (0,7±0,2)

17,4±4,4 (1,2±0,3)

конъюгаты

31,0±9,7 (2,2±0,7)

42,0±5,3 (3,0±0,4)

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг

Масса неизмененного ДОН, мкг

Масса ДОМ-1, мкг

Примечание: см. табл. 26.

- 89 Таблица 28. Экскреция ДОН и его метаболитов с калом у крыс, получавших молочнокислые бактерии Токсин

Рацион Контроль

Опыт

общее количество

164,4±11,7 (11,7±0,8)

189,6±44,3 (13,6±3,1)

свободная форма

70,5±9,4 (5,0±0,7)

120,0±28,9 (8,6±2,0)

конъюгаты

93,8±9,9 (6,7±0,7)

69,6±15,2 (5,0±1,1)

общее количество

33,6±1,6 (2,4±0,1)

71,9±19,5 (5,1±1,4)

свободная форма

20,8±2,8 (1,5±0,2)

41,5±12,5 (3,0±0,9)

конъюгаты

12,9±2,7 (1,0±0,2)

30,4±7,1 (2,2±0,5)

общее количество

130,4±11,9 (9,3±0,8)

118,3±28,7 (8,4±2,0)

свободная форма

49,3±8,1 (3,5±0,6)

78,7±18,0 (5,6±1,3)

конъюгаты

81,0±11,6 (5,8±0,8)

39,6±11,1* (2,8±0,8)

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг

Масса неизмененного ДОН, мкг

Масса ДОМ-1, мкг

Примечание: см. табл. 26.

- 90 -

% 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Контроль

Молочнокислые бактерии

ДОН

ДОМ-1

Рис. 11. Влияние молочнокислых бактерий на соотношение ДОН и ДОМ-1, экскретируемых у крыс (в процентах от общего количества экскретированных метаболитов).

- 91 10

*

А

ДОН

9

ДОМ-1

% от введенной дозы

8

*

7

Контроль Молочнокислые бактерии

6 5 4 3 2 1 0 Общее количество

Свободная форма

Конъюгаты

ДОН

Б

10 9

Общее количество

Свободная форма

Конъюгаты

ДОМ-1

% от введенной дозы

8 7

Контроль Молочнокислые бактерии

6 5 4

*

3 2 1 0 Общее количество

Свободная форма

Конъюгаты

Общее количество

Свободная форма

Конъюгаты

Рис. 12. Влияние молочнокислых бактерий на соотношение свободных и конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1, экскретируемых с мочой (А) и калом (Б) у крыс. *) P<0,05.

- 92 40% в контроле до 59% при одновременном снижении доли ДОМ-1 с 60% в контроле до 41% от суммарного количества экскретированных метаболитов ДОН (рис. 11). При этом установлено, что суммарная экскреция метаболитов ДОН с мочой статистически достоверно возрастала за счет усиления выведения свободных форм (табл. 27). Как видно из таблицы 27 и рисунка 12А, выявленные количественные изменения определялись статистически достоверным усилением более чем в 2,4 раза свободного неизмененного ДОН, в то время как количество образования и экскреции конъюгатов ДОН не изменялось сколько-нибудь существенно. Суммарная экскреция метаболитов токсина с калом не претерпела существенных изменений (табл. 28), хотя можно отметить определенное перераспределение свободных и конъюгированных форм — статистически недостоверное возрастание выведения свободных форм и уменьшение количества конъюгатов у животных, получавших пробиотики. При этом характерно усиление выведения нативного ДОН — в 2 раза в свободной и конъюгированной форме (табл. 28, рис. 12Б). В отличие от ДОН, количество образующегося и выводимого с калом ДОМ-1 не изменялось, но отмечалось перераспределение свободного и конъюгированного ДОМ-1 — возрастание в кале свободных форм — в 1,6 раза, но статистически недостоверное, при одновременном статистически достоверном уменьшении конъюгированных — в 2 раза (табл. 28, рис. 12Б). Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что использованные в эксперименте молочнокислые бактерии не оказывают существенного влияния на образование и выведение ДОМ-1, но усиливают выведение, главным образом, свободной формы неизмененного токсина как с мочой, так и с калом. В связи с полученными данными, представляют интерес сообщения о способности молочнокислых бактерий in vitro «связывать» микотоксин афлатоксин и некоторые другие канцерогены (Bolognani F. et al., 1997; El-Nezami H. et al., 1998), что позволяет предположить, что и в условиях in vivo молочнокислые бактерии могут проявлять свойства адсорбента и влиять на токсикокинетику ДОН.

- 93 2.2.7. Изучение комбинированного действия ДОН и зеараленона на метаболизм ДОН у крыс В эксперименте изучали влияние длительного комбинированного действия ДОН и зеараленона на метаболизм ДОН у крыс. Исследования проводили на 3 группах крыс-самок линии Вистар (по 12 крыс в каждой группе) с исходной массой тела 120±4 г. Животные получали в течение 90 дней полноценный полусинтетический рацион с включением здорового или фузариозного зерна, с содержанием ДОН в концентрации около 5 мг/кг (0,5–0,6 мг токсина/кг массы тела), или ДОН в том же количестве и зеараленона в концентрации 3 мг/кг рациона (0,3-0,4 мг/кг массы тела). При этом дозы микотоксинов были близки к дозам, недействующим для крыс и лежащим в основе установленных ПДК для ДОН и зеараленона. Для достижения необходимой концентрации токсинов в экспериментальных рационах комбинировали зерно из четырех партий, полученных из Краснодарского края — 1-я партия, не содержащая токсины, 2-я партия с содержанием ДОН 9,4 мг/кг и зеараленона 2,1 мг/кг, 3-я партия с содержанием ДОН 6,8 мг/кг и зеараленона 0,34 мг/кг и 4-я партия с содержанием ДОН 16,0 мг/кг. Зерно измельчали до консистенции мелкой крупки и включали в рацион в количестве 50 г на 100 г рациона вместо крахмала. Затем животных (по 6 крыс из каждой группы) помещали в индивидуальные обменные клетки и вводили однократно внутрь ДОН в виде водного раствора в количестве 8 мг/кг массы тела. Мочу и кал собирали раздельно в течение 48 часов. Образцы мочи и кала до проведения анализа хранили при температуре -18°С. В период содержания в обменных клетках животные получали соответствующие экспериментальные рационы. Результаты анализа показали, что длительное потребление рациона, содержащего наряду с ДОН зеараленон, не оказывало какого-либо влияния на общее количество экскретируемых метаболитов ДОН у крыс и на соотношение их свободных и конъюгированных форм (рис. 13). Как видно из табл. 29, не обнаружено существенного влияния рационов, содержащих ДОН или ДОН вместе с зеараленоном, на количество экскретируемого нативного ДОН и его деэпоксипроизводного — ДОМ-1, как в свободной форме, так и в виде конъюгатов. В моче крыс, получавших рацион с контаминированным ДОН зерном, не выявлено выраженных изменений суммарной экскреции метаболитов ДОН, а также достоверных изменений в соотношении их свободных и конъюгированных форм, но отмечалось умеренное, но достоверное усиление (в 1,4 раза) выведения свободного нативного

- 94 ДОН. У животных, получавших рацион с ДОН и зеараленоном, не обнаружено какоголибо отличия от контроля в распределении метаболитов ДОН в моче (табл. 30, рис. 14).

45 Контроль

40

ДОН ДОН + зеараленон

% от введенной дозы

35 30 25 20 15 10 5 0

Общее количество

Свободная форма

Конъюгаты

Рис. 13. Соотношение свободных и конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1, экскретируемых калом у крыс, получавших рационы, контаминированные ДОН или ДОН + зеараленон

- 95 Таблица 29. Экскреция ДОН и его метаболитов с мочой и калом у крыс, получавших рацион с ДОН и ДОН + зеараленон. Токсин

Контроль1)

Рацион ДОН2)

ДОН+ЗН3)

общее количество

699 ± 65 (39,0 ± 4,0)

754 ± 77 (43,1 ± 5,2)

718 ± 79 (36,4 ± 3,3)

свободная форма

320 ± 35 (17,2 ± 2,0)

338 ± 27 (18,6 ± 1,3)

296 ± 58 (17,7 ± 1,2)

конъюгаты

380 ± 68 (21,4 ± 4,0)

416 ± 89 (23,3 ± 5,7)

372 ± 78 (18,9 ± 3,6)

общее количество

429 ± 53 (24,0 ± 3,3)

466 ± 54 (25,8 ± 3,5)

421 ± 58 (21,2 ± 2,4)

свободная форма

191 ± 17 (10,1 ± 1,2)

248 ± 12* (13,7 ± 0,7)

175 ± 32 (10,8 ± 0,4)

конъюгаты

238 ± 53 (13,4 ± 3,1)

218 ± 64 (12,1 ± 3,9)

207 ± 50 (10,4 ± 2,3)

общее количество

271 ± 28 (14,9 ± 1,6)

288 ± 41 (17,3 ± 3,3)

297 ± 28 (15,2 ± 1,4)

свободная форма

128 ± 22 (7,1 ± 1,1)

90 ± 16 (4,9 ± 0,7)

131 ± 24 (6,8 ± 1,3)

конъюгаты

143 ± 22 (8,0 ± 1,3)

198 ± 37 (11,1 ± 2,4)

166 ± 30 (8,4 ± 1,4)

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг

Масса неизмененного ДОН, мкг

Масса ДОМ-1, мкг

Примечание: 1) представлены средние данные (X±Sx) из 5 опытов; 2) представлены средние данные (X±Sx) из 4 опытов; 3) представлены средние данные (X±Sx) из 6 опытов. *) Р<0,05. В скобках указан % от введенной дозы ДОН.

- 96 Таблица 30. Экскреция ДОН и его метаболитов с мочой у крыс, получавших рацион с ДОН и ДОН + зеараленон. Токсин

Контроль1)

Рацион ДОН2)

ДОН+ЗН3)

общее количество

585 ± 71 (32,7 ± 4,1)

680 ± 85 (37,9 ± 5,7)

575 ± 90 (27,4 ± 2,9)

свободная форма

212 ± 40 (11,8 ± 2,1)

282 ± 17,6 (15,1 ± 1,5)

222 ± 17 (11,3 ± 0,6)

конъюгаты

372 ± 65 (20,9 ± 3,8)

398 ± 92 (22,3 ± 5,8)

353 ± 80 (16,0 ± 3,3)

общее количество

390 ± 52 (21,9 ± 3,1)

441 ± 56 (24,5 ± 3,7)

383 ± 57 (19,3 ± 2,5)

свободная форма

156 ± 20 (8,7 ± 1,2)

228 ± 10* (12,6 ± 0,8)

183 ± 14 (9,2 ± 0,4)

конъюгаты

235 ± 51 (13,2 ± 2,9)

214 ± 65 (11,9 ± 4,0)

201 ± 50 (10,1 ± 2,3)

общее количество

194 ± 31 (10,8 ± 1,7)

239 ± 40 (13,4 ± 2,5)

192 ± 33 (9,7 ± 1,5)

свободная форма

57 ± 22 (3,1 ± 1,1)

54 ± 9 (3,0 ± 0,4)

39 ± 4 (2,0 ± 0,2)

конъюгаты

138 ± 21 (7,7 ± 1,2)

185 ± 37 (10,4 ± 2,4)

152 ± 31 (7,7 ± 1,4)

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг

Масса неизмененного ДОН, мкг

Масса ДОМ-1, мкг

Примечание: см. табл. 29.

- 97 -

30

Контроль

ДОН

% от введенной дозы

25

ДОН ДОН + зеараленон

20

15

10

5

0

Общее количество

Свободная форма

30

Конъюгаты

Контроль ДОН

ДОМ-1

% от введенной дозы

25

ДОН + зеараленон

20

15

10

5

0

Общее количество

Свободная форма

Конъюгаты

Рис. 14. Соотношение экскретируемых свободных и конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1 у крыс, получавших рационы, контаминированные ДОН или ДОН+зеараленон.

- 98 Таблица 31. Экскреция ДОН и его метаболитов с калом у крыс, получавших рацион с ДОН и ДОН + зеараленон. Токсин

Контроль1)

Рацион ДОН2)

ДОН+ЗН3)

общее количество

115 ± 9 (6,1 ± 0,5)

73,1 ± 15,9* (4,2 ± 0,9)

143 ± 28 (7,4 ± 1,6)

свободная форма

108 ± 12 (6,0 ± 0,7)

55,7 ± 10,5* (3,0 ± 0,5)

123 ± 25 (6,4 ± 1,3)

7,6 ± 4,6 (0,50 ± 0,32)

17,4 ± 5,8 (0,95 ± 0,31)

19,3 ± 7,5 (1,10 ± 0,45)

общее количество

37,4 ± 4,6 (2,2 ± 0,3)

24,4 ± 4,5 (1,3 ± 0,2)

37,2 ± 3,9 (1,9 ± 0,2)

свободная форма

35,9 ± 5,2 (2,0 ± 0,3)

20,6 ± 3,8 (1,1 ± 0,1)

31,7 ± 3,8 (1,6 ± 0,1)

2,7 ± 2,1 (0,23 ± 0,19)

4,0 ± 1,8 (0,22 ± 0,11)

6,0 ± 2,7 (0,34 ± 0,15)

общее количество

73,9 ± 4,4 (4,1 ± 0,2)

48,7 ± 11,8 (2,7 ± 0,6)

104,1 ± 26,7 (5,5 ± 1,4)

свободная форма

71,7 ± 8,4 (4,0 ± 0,4)

35,1 ± 7,8* (1,9 ± 0,4)

92,0 ± 24,1 (4,8 ± 1,3)

4,5 ± 2,6 (0,25 ± 0,15)

13,6 ± 4,0 (0,74 ± 0,21)

13,4 ± 5,0 (0,76 ± 0,30)

Суммарное количество ДОН и ДОМ-1, мкг

конъюгаты Масса неизмененного ДОН, мкг

конъюгаты Масса ДОМ-1, мкг

конъюгаты

Примечание: см. табл. 29.

- 99 В кале крыс, получавших рацион, содержащий только ДОН, обнаружено уменьшение суммарной экскреции метаболитов ДОН, связанное, в первую очередь, с достоверным снижением выведения свободных форм ДОМ-1 и, в меньшей степени, неизмененного ДОН (табл. 31, рис. 14). Важно подчеркнуть, что у животных на рационе, содержащем ДОН вместе с зеараленоном, не выявлено каких-либо отличий в количестве и соотношении экскретируемых с калом метаболитов ДОН (табл. 31). Полученные результаты позволяют заключить, что совместное длительное поступление в организм крыс зеараленона наряду с ДОН в дозах, близких к недействующим для крыс, не оказывает существенного влияния на метаболизм ДОН. Это согласуется с результатами параллельных исследований, которые показали, что низкие дозы ДОН и зеараленона при длительном совместном поступлении не влияют на токсичность ДОН для крыс. Кроме того, по имеющимся литературным данным низкие концентрации (0,5 мг/кг массы тела) поступающего в организм крыс ДОН не приводят к изменению активности основных ферментов метаболизма ксенобиотиков, в том числе UDP-глюкуронозилтрансферазы [Кравченко Л.В. и др., 2000]. Таким образом, результаты данного раздела исследований можно рассматривать в качестве дополнительного подтверждения сделанного ранее заключения [Кравченко Л.В. и др., 2000], что одновременное присутствие в пище двух фузариотоксинов в пределах установленных регламентов не представляет дополнительную опасность для здоровья человека и не требует изменения гигиенических регламентов.

- 100 3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Поиск путей снижения неблагоприятного воздействия на организм загрязнителей окружающей среды является особо актуальным для таких природных контаминантов продовольственного сырья как микотоксины. Микотоксины — вторичные метаболиты микроскопических (плесневых) грибов — являются одними из приоритетных загрязнителей продовольственного сырья и пищевых продуктов [Тутельян В.А., Кравченко Л.В., 1985; IARC, 1993; Miller J.D., 1998]. В виду повсеместной распространенности грибов-продуцентов и высокой частоты контаминации микотоксинами продовольственного сырья основной мерой по защите организма от неблагоприятного действия микотоксинов является гигиеническое регламентирование их содержания в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Однако такая мера не может полностью предотвратить попадание в организм малых количеств микотоксинов, которые нельзя считать абсолютно безопасными для здоровья [Захарова Л.П., 1994, 1995; Кравченко Л.В. и др., 1998, 2000]. В связи с этим, наряду с мероприятиями, направленными на предотвращение попадания микотоксинов в организм, важное значение приобретает изыскание путей снижения токсичности поступивших в организм токсинов. К числу наиболее перспективных направлений относится использование пищи и ее компонентов как мощного фактора регуляции процессов токсикокинетики чужеродных соединений, включая этапы всасывания, печеночно-кишечной рециркуляции, биотрансформации и детоксикации [Тутельян В.А. и др., 1987; Galvano F. et al., 2001]. Особое внимание привлекают биологически активные компоненты пищи, такие как витамины, микроэлементы, пищевые волокна и пробиотики, которые находят широкое применение не только для коррекции структуры питания населения, но и в профилактических целях для повышения резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Настоящее исследование посвящено изучению влияния некоторых биологически активных компонентов пищи на метаболизм у крыс одного из наиболее распространенных в мире и обладающего достаточно высокой токсичностью трихотеценового микотоксина — дезоксиниваленола (ДОН, вомитоксина). ДОН продуцируется некоторыми видами микроскопических грибов Fusarium и является основным загрязнителем зерновых культур, главным образом пшеницы, во многих странах мира, в том числе и в России [Ueno Y., Tanaka T., 1987; Scott P.M., 1989, 1990, 1997; Tutelyan V.A. et al., 1990, 1998].

- 101 Для ДОН в настоящее время известно 2 пути детоксикации в организме: деэпоксидирование и образование конъюгированных форм как исходного токсина, так и его деэпоксида (ДОМ-1). Выдвигаются предположения, что реакция деэпоксидирования протекает под действием ферментных систем микрофлоры желудочно-кишечного тракта [King R.R., et al., 1984; Hedman R., Pettersson H., 1997]. Необходимо иметь в виду, что эпоксигруппа является основным фактором токсичности трихотеценовых микотоксинов, и ее разрушение приводит к практически полной утрате токсических свойств [Grove M.D. et al., 1984; Swanson S.P. et al., 1988]. Глюкуроновая конъюгация катализируется ферментом UDP-глюкуронозилтрансферазой, представляющим собой группу изоформ, локализованным главным образом в печени [Radominska-Pandya A. et al., 1999; Strassburg C.P. et al., 1999]. Важным аспектом в изучении количества и соотношения метаболитов ДОН у крыс является эффективность методов определения ДОН и его метаболитов в моче и кале. В настоящем исследовании мы использовали метод, разработанный в Институте питания РАМН [Тутельян В.А. и др., 1991], однако с целью увеличения степени извлечения анализируемых соединений представилось необходимым провести модификацию метода. В результате внесенных изменений в некоторые стадии очистки образцов общий выход метаболитов ДОН повысился на 20%. Исходный метод предполагал определение только глюкуроновых конъюгатов ДОН как преобладающего вида образующихся в организме конъюгатов. Однако конъюгация ДОН с другим субстратом в организме также может происходить в существенной степени, в частности сульфатная конъюгация. Мы сделали попытку изучить возможность образования наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфоконьюгатов. Полученные результаты показывают, что около 2% всех метаболитов ДОН выводятся из организма в виде сульфоконъюгатов. Проведенный эксперимент по изучению распределения экскретируемых метаболитов ДОН у крыс Вистар показал, что ДОН выводится как в неизмененном виде, так и в виде деэпоксида — ДОМ-1; кроме того, в кале и моче крыс определяли конъюгированные формы ДОН и ДОМ-1, причем с мочой преимущественно выделялся ДОН, а с калом — ДОМ-1. Было обнаружено, что более половины всех экскретируемых метаболитов ДОН составляют конъюгаты. Таким образом, проведенные исследования подтверждают данные, что основными путями детоксикации ДОН у крыс является образование его конъюгатов и деэпоксида. С целью более детального выяснения роли UDP-глюкуронозилтрансферазы в образовании глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1 было изучено влияние некото-

- 102 рых индукторов ферментов метаболизма ксенобиотиков — фенобарбитала, 3метилхолантрена и транс-стильбеноксида — на метаболизм ДОН. Проведенные исследования подтвердили, что образование глюкуроновых конъюгатов является одним из главных путей детоксикации ДОН в организме. Установлена прямая зависимость между усилением образования и выведения глюкуроновых конъюгатов ДОН и возрастанием активности микросомальной UDP-глюкуронозилтрансферазы. Впервые получены данные об участии в образовании глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы, относящихся к семействам 1А и 2В. Одной из главных задач настоящей работы явилось изучение влияния биологически активных компонентов пищи на оба известных пути метаболизма ДОН: образование конъюгатов и деэпоксидирование. В качестве изучаемых алиментарных факторов были выбраны селен, пектин, а также пробиотики (молочнокислые бактерии). Выбор селена был обусловлен его доказанным протекторным действием против повреждающего влияния на организм ряда токсических агентов — загрязнителей окружающей среды [Гореликова Г.А. и др., 1997], в том числе трихотеценовых микотоксинов [Борисов В.А., 1988 а, 1988 б; Rizzo A.F. et al., 1994; Yazdanpanah H. et al., 1997; Atroshi F. et al., 2000], а также его способностью влиять на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков, в том числе UDP-глюкуронозилтрансферазы [Reiter R., Wendel A., 1983; Кравченко Л.В. и др., 1990; 1991; Ip C., Lisk D.J., 1997]. Наши предположения основывались на том, что селен, благодаря способности модулировать активность UDP-глюкуронозилтрансферазы, может влиять на метаболизм ДОН, в первую очередь на образование его конъюгированных метаболитов. Было проведено изучение влияния на метаболизм ДОН как обогащения рациона крыс селеном, так и дефицита его в рационе. В обоих случаях наблюдали одинаковый эффект: возрастание суммарного количества экскретируемых метаболитов ДОН за счет усиления образования и выведения с мочой конъюгированных форм ДОН и ДОМ-1, что коррелировало со значительным возрастанием активности UDP-глюкуронозилтрансферазы в печени крыс. Принимая во внимание предположение, что за реакцию деэпоксидирования ДОН в организме ответственны ферментные системы микрофлоры желудочнокишечного тракта, мы предположили, что введение в рацион биологически активных веществ, способных влиять на состав и тем самым на функциональную активность микрофлоры кишечника, может повлиять на деэпоксидирование ДОН. Одним из таких алиментарных факторов являются пищевые волокна, в частности пектин. Результаты

- 103 эксперимента по изучению влияния обогащения рациона крыс пектином на метаболизм ДОН показал, что против наших ожиданий пектин не оказывал существенного влияния на образование и выведение ДОМ-1 у крыс. В то же время наблюдался достоверный почти двукратный рост выведения нативного ДОН как с мочой, так и с калом, главным образом за счет образования и экскреции конъюгированных форм. Увеличение количества выводимых конъюгатов коррелировало с возрастанием активности микросомальных UDP-глюкуронозилтрансфераз в печени крыс. Пектин, таким образом, выступал как модулятор пути детоксикации ДОН, связанный с образованием его конъюгатов. Кроме того, усиление выведения свободной формы ДОН может указывать на адсорбционные свойства пектина. Другим фактором, влияющим на состав кишечной микрофлоры и активность микробных ферментов являются пробиотики. В настоящем исследовании введение молочнокислых бактерий крысам per os не оказывало существенного влияния на образование и выведение ДОМ-1, но усиливали выведение, главным образом, свободной формы неизмененного токсина, как с мочой, так и с калом. Обнаруженное усиление экскреции свободного ДОН позволяет предположить, что молочнокислые бактерии могут проявлять свойства адсорбента и влиять тем самым на токсикокинетику ДОН. Одной из актуальных задач современной концепции безопасного питания является изучение комбинированного влияния различных контаминантов продуктов питания при их совместном поступлении в организм. В виду того, что грибы-продуценты микотоксинов способны одновременно продуцировать несколько токсичных метаболитов, для прояснения вопроса о возможном синергическом токсическом эффекте этих соединений было проведено исследование комбинированного действия зеараленона и ДОН на метаболизм ДОН в дозах, близких к недействующим для крыс и лежащих в основе установленных ПДК для ДОН и зеараленона. Не было обнаружено существенного влияния на метаболизм ДОН введения в рацион крыс как ДОН, так и ДОН совместно с зеараленоном. Таким образом, полученные результаты подтверждают, что одновременное присутствие в пище двух фузариотоксинов в пределах установленных регламентов не представляет дополнительную опасность для здоровья человека и не требует изменения гигиенических регламентов. Таким образом, обсуждая результаты проведенных исследований, необходимо еще раз подчеркнуть, что с позиций современной науки о питании роль пищи не ограничивается обеспечением организма нутриентами и энергией в соответствии с физиологическими потребностями. Несомненно, пищу следует рассматривать и как важ-

- 104 нейший фактор, регулирующий и модулирующий различные функции организма и, тем самым, участвующий в обеспечении оптимального состояния здоровья и снижения риска многих заболеваний. Такой подход стимулирует интенсивное изучение физиологических эффектов и влияния на здоровье различных, в том числе и минорных биологически активных компонентов пищи, к которым относятся и изученные в настоящей работе селен, пищевые волокна, пробиотики. Позитивное влияние этих соединений на здоровье обусловлено в первую очередь возрастанием защитноадаптационного потенциала организма. Несмотря на то, что многие биологически активные соединения находят в настоящее время широкое применение в составе биологически активных добавок к пище или в качестве ингредиентов функциональной пищи, научное обоснование и доказательства их применения в большинстве случаев остаются недостаточными. В связи с этим результаты настоящей работы, раскрывающие некоторые из механизмов влияния изученных алиментарных факторов на процессы детоксикации ксенобиотиков (на примере микотоксина дезоксиниваленола), представляют определенный вклад в научное обоснование их использования для повышения резистентности организма к неблагоприятному воздействию факторов окружающей среды.

- 105 4. ВЫВОДЫ 1. Получены новые экспериментальные данные, подтверждающие, что основными путями детоксикации дезоксиниваленола у крыс является образование его деэпоксида — ДОМ-1 и конъюгатов дезоксиниваленола и ДОМ-1. Впервые показана возможность образования у крыс наряду с глюкуроновыми конъюгатами сульфоконъюгатов дезоксиниваленола и ДОМ-1. 2. Впервые получены доказательства участия в образовании глюкуроновых конъюгатов дезоксиниваленола и ДОМ-1 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы, относящихся к семействам 1А и 2В. 3. Установлено, что как избыток, так и дефицит селена в рационе крыс приводит к значительному усилению образования и выведения глюкуроновых конъюгатов ДОН и ДОМ-1 и сопровождается возрастанием активности микросомальных UDPглюкуронозилтрансфераз. 4. Обогащение рациона крыс пищевыми волокнами (пектином) оказывает существенное влияние на различные этапы токсикокинетики дезоксиниваленола, что проявляется как в повышении скорости экскреции свободных форм дезоксиниваленола и ДОМ-1, так и в усилении образования и выведения глюкуроновых конъюгатов дезоксиниваленола. 5. Впервые показана способность пробиотиков (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus в количестве 5 х 108 клеток) in vivo влиять на токсикокинетику ксенобиотиков: введение per os культур молочнокислых бактерий достоверно усиливало выведение у крыс неизмененного дезоксиниваленола как с калом, так и с мочой. 6. Длительное совместное поступление с кормом двух фузариотоксинов — зеараленона и дезоксиниваленола — в дозах, близких к недействующим для крыс, не оказывает существенного влияния на метаболизм дезоксиниваленола, что подтверждает отсутствие необходимости изменения установленных регламентов содержания дезоксиниваленола и зеараленона в пищевых продуктах при их совместном обнаружении. 7. Полученные данные являются дополнительным научным обоснованием целесообразности использования биологически активных добавок к пище (БАД), содержащих микронутриенты, пробиотики и пищевые волокна, для повышения неспецифической резистентности организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, в частности таких приоритетных загрязнителей пищевых продуктов как микотоксины.

- 106 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. – М.: Наука, 1975 – 327 с. 2. Билай В.И., Пидопличко Н.М. Токсинообразующие микроскопические грибы. – К.: Наук. думка,1970. – 287 с. 3. Билай В.И. Фузарии. – К.: Наук. думка, 1977. – 442 с. 4. Билай В.И., Тутельян В.А., Эланская И.А., Эллер К.И., Соболев В.С. Компонентный состав трихотеценов, продуцируемых Fusarium sporotrichiella Bilai // Микробиол. ж. – 1983. – Т.45. – № 5 – С.45–49. 5. Борисов В.А. Влияние селена на течение фузарио- и Т-2 токсикоза у свиней / Факторы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. Сб. науч. тр. – Омск, 1988 а. – С.60–67. 6. Борисов В.А. Формирование противосальмонеллезного иммунитета у больных фузарио- и Т-2 токсикозом свиней и возможность его повышения при помощи селена / Профилактика инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. Сб. науч. тр. – Омск, 1988 б. 7. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Вып. 6. Принципы и методы оценки токсичности химических веществ. – ВОЗ, Женева, 1981. – 312 с. 8. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Вып. 58. Селен. – ВОЗ, Женева, 1989. – 270 с. 9. Гмошинский И.В., Мазо В.К., Тутельян В.А., Хотимченко С.А. Микроэлемент селен: роль в процессах жизнедеятельности. – Экология моря. – 2000. – Вып. 54. – С.5–19. 10. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. – Л.: Медицина, 1986 – 280 с. 11. Головенко Н.Я., Карасева Т.Л. Сравнительная биохимия чужеродных соединений. – К.: Наук. думка, 1983. – 200 с. 12. Голубев В.Н., Шелухина Н.П. Пектин: химия, технология, применение. – М.: Изд. АТН РФ. – 1995. – 388 с. 13. Гореликова Г.А., Маюрникова Л.А., Позняковский В.М. Нутрицевтик селен: недостаточность в питании, меры профилактики // Вопр. питания. – 1997. – № 5. – С.18–21. 14. Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф. Пищевые волокна и новые продукты питания // Вопр. питания. – 1998 а. – № 5. – С.35–41. 15. Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф. Пищевые волокна — новый раздел химии и технологии пищи // Вопр. питания. – 1998 б. – № 3. – С.36–38. 16. Дудкин М.С., Щелкунов Л.Ф. Новые продукты питания. – М.: МАИК Наука, 1998 в. – 304с. 17. Захарова Л.П., Обольский О.Л., Львова Л.С., Кравченко Л.В. Проблема контаминации зерновых культур дезоксиниваленолом в России // Вопр. питания. – 1994. – № 3. – С.40–44. 18. Захарова Л.П., Обольский О.Л., Львова Л.С., Быстрякова З.К., Кравченко Л.В., Тутельян В.А. Фузариотоксины в зерновых культурах в России. Ситуация в 1993 и 1994 годах // Вопр. питания. – 1995. № 2. – С.26–29. 19. Збаровская И.А., Банникова М.В. Антиоксидантная система организма, ее значение в метаболизме. Клинические аспекты // Вестн. РАМН. – 1995. – № 6. – С.53–60.

- 107 20. Златкина А.Р. Лечение хронических болезней органов пищеварения. – М.: Медицина, 1994. – 336 c. 21. Конышев В.А., Смирнова М.Г., Стасенкова К.П. Влияние факторов питания на всасывание в кишечнике и токсичность химических элементов / Теоретические и клинические аспекты науки о питании. Т. V. Актуальные проблемы гигиены питания. Сб. науч. тр. – М., 1984. – С.169–177. 22. Коршунова В.М., Киссина Е.В., Иконникова Т.Б. Влияние препаратов из лактобацилл и бифидобактерий на микрофлору кишечника мышей, облученных гамма-квантами // Ж. микробиол. – 1980. – № 6. – С.47–54. 23. Кравченко Л.В., Кузьмина Е.Э., Авреньева Л.И., Тутельян В.А. Защитное действие селена при остром Т-2 микотоксикозе // Вопр. мед. химии. – 1990. – № 5. – С.36-38. 24. Кравченко Л.В., Кузьмина Е.Э., Авреньева Л.И., Поздняков А.Л. Влияние селена на ферменты метаболизма ксенобиотиков печени крыс //Вопр. питания. – 1991. – № 5. – С.73–75. 25. Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Обольский О.Л. Пищевые волокна и токсикология ксенобиотиков / Материалы Первого международного научного конгресса «Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты». – М., 1994. – С.467. 26. Кравченко Л.В., Захарова Л.П., Обольский О.Л. Фузариотоксины в зерне: результаты мониторинга // Гигиена и санитария. – 1998. – № 1. – С.3–5. 27. Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., Тутельян В.А. Оценка комбинированного действия микотоксинов дезоксиниваленола (вомитоксина) и Т-2 токсина на крыс // Токсикологический вестник. – 2000. – № 1. – С.2–8. 28. Кулакова С.Н., Карагодина З.В., Левачев М.М., Волгарев М.Н. Влияние обогащения рациона крыс селеном на эффективность метаболизма эссенциальной линолевой кислоты // Бюлл. эксп. биол. мед. – 1994. – № 10. – С.136–138. 29. Лакин К.М., Крылов Ю.Ф. Биотрансформация лекарственных веществ. – М.: Медицина, 1981. – 344 с. 30. Левитин М.М. Микотоксины // Защита растений. – 1994. – № 2. – С.12–13. 31. Львова Л.С. Влияние технологических приемов переработки пищевых продуктов на содержание в них микотоксинов / Оценка загрязнения пищевых продуктов микотоксинами. Т. 2. – М., 1985. – С.186–206. 32. Львова Л.С., Быстрякова З.К., Ремеле В.В., Орлова Н.Ю., Шатилова Т.И., Шульгина А.П. Распространение микотоксинов и токсигенных грибов в зерне разных культур / Защита от вредителей и санитарная охрана зернопродуктов. – М., 1992. – С.74–87. 33. Львова Л.С., Омельченко М.Д., Пименова В.В., Захарова Л.П., Обольский О.Л., Аристархова Т.В., Эллер К.И., Быстрякова З.К. Образование микотоксинов в фузариозной пшенице при неблагоприятных условиях уборки // Прикладная биохимия и микробиология. – 1994. – Т.30.– Вып. 5. – С.686–694. 34. Мальцев В.Н., Коршунова В.М., Стрельников В.А. Бактериотерапия острой лучевой болезни // Радиобиология. – 1978. – № 5. – С.757–760. 35. Мухина Ю.Г. Диагностика и коррекция дисбактериоза у детей // Русский медицинский журнал. – 1999. – Т. 7. – № 11. – С. 487–494.

- 108 36. Никитина Л.П., Иванов В.Н., Аникина Л.В. Физиологический эффект селена у человека и животных / Селен в жизни человека и животных / ред. Л.П. Никитина, В.Н. Иванов /. – М., 1995. – 242 с. 37. Оганов Р., Киселева Н. Кардиологи о роли пищевых добавок // Доктор Фом. – 1998. – № 36. – С.7. 38. Парк Д.В. Биохимия чужеродных соединений. – М.: Медицина, 1973 – 288 с. 39. Ренвик А.Г. Комбинационная токсикология и взаимодействия между добавками // Вопр. питания. – 2000. – № 3. – С.32–37. 40. Рубинштейн Ю.И., Лясс Л.С. Об этиологии алиментарно-токсической алейкии // Гигиена и санитария. – 1948. – № 7. – С.33–38. 41. Рухляда В.В. Эффективность детоксикации Т-2 токсина в корме физикохимическими методами // Ветеринария. – 1993. – № 5. – С.47–50. 42. Санитарные правила и нормы. СанПиН 2.3.2.560–96. Продовольственное сырье и пищевые продукты. – М., 1997. 43. Саркисов А.Х., Квашнина Е.С. Новые токсикобиологические свойства гриба Fusarium sporotrichioides. // Доклады АН СССР. – 1948. – Т. 8. – № 1. – С.77–79. 44. Саркисов А.Х. Микотоксикозы. – М.: Сельхозиздат, 1954. – 216 с. 45. Саркисов А.Х. Микотоксикозы человека и животных (эпидемиология, этиология, патогенез) / Оценка загрязнения пищевых продуктов микотоксинами. Т.1. – М., 1985. – С.105–118. 46. Смирнов В.В., Зайченко А.М., Рубежняк И.Г. Микотоксины: Фундаментальные и прикладные аспекты // Современные проблемы токсикологии. – 2000. – № 1. – С.28–42. 47. Соболев В.С., Эллер К.И., Пименова В.В., Захарова Л.П., Музыченко Н.И., Тутельян В.А. Изучение загрязнения пшеницы урожаев 1986–1988 гг. дезоксиниваленолом (вомитоксином) // Вопр. питания. – 1990. – № 1. – С.68–71. 48. Тутельян В.А. Биогенез и механизм действия микотоксинов / Оценка загрязнения пищевых продуктов микотоксинами. Т.2. – М., 1985. – С.29–48. 49. Тутельян В.А., Кравченко Л.В. Микотоксины (медицинские и биологические аспекты). – М.: Медицина, 1985. – 319 с. 50. Тутельян В.А., Бондарев Г.И., Мартинчик А.Н. Питание и процессы биотрансформации чужеродных веществ / Итоги науки и техники. Сер. Токсикология. Т. 15. – М.: Изд. ВИНИТИ, 1987. – 212 с. 51. Тутельян В.А., Соболев В.С., Катруш И.Р., Медведев Ф.А., Захарова Л.П. Метод определения дезоксиниваленола (вомитоксина) и его метаболитов // Вопр. питания. – 1991. – № 5. – С.66–69. 52. Тутельян В.А., Кравченко Л.В., Соболев В.С., Захарова Л.П., Авреньева Л.И., Кузьмина Е.Э., Левицкий А.П. Влияние пищевых волокон на токсичность и метаболизм трихотеценовых микотоксинов // Токсикологический вестник. – 1994. – № 1. – С.16–20. 53. Фузариоз колоса зерновых злаковых культур. – Краснодар, 1992. – С.3–4; 25–28. 54. Шендеров Б.А. / Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т.2. – М.: Изд-во ГРАНТ, 1998 а. – 416 с. 55. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопрроктологии. – 1998 б. – № 1. – С.61–65.

- 109 56. Anderson K.E., Coney A.N., Kappas A. nutritional influences on chemical biotransformation in humans // Nutr. Rev. – 1982. – V.40. – N 6. – P.161–171. 57. Anthony Y. H. Lu. Multiplicity of liver drug metabolizing enzymes // Drug. Metabol. Rev. – 1979. – V.10. – N 2. – P.187–208. 58. Archakov A.I., Degtyarenko K.N. Structural classification of the P450 superfamily based on consensus sequence comparison // Biochem. Mol. Biol. Int. – 1993. – V.31. – N 6. – P.1071–1080. 59. Atroshi F., Rizzo A., Biese I., Lindberg L.A., Saloniemi H. Effect of feeding T-2 toxin and deoxynivalenol on DNA and GSH content of brain and spleen of rats supplemented with vitamin E and C and selenium combination // J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. – 1995. – V.74. – P.157–154. 60. Atroshi F., Rizzo A., Sankari S., Biese I., Westermarck T., Veijalainen P. Liver enzyme activities of rats exposed to ochratoxin A and T-2 toxin with antioxidants // bull. Environ. Contam. Toxicol. – 2000. – V.64. – N 4. – P.586–592. 61. Ayebo A.D., Angelo I.A., Shahani K.M. Effect of ingesting Lactobacillus acidophilus milk upon fecal flora and enzyme activity in humans // Milchwiss. – 1980. – V.35. – P.730–733. 62. Beasley V.R., Swanson S.P., Corley R.A., Buck W.B., Kortitz G.D., Burmeister H.R. // Pharmacokinetics of the trichothecene mycotoxin, T-2 toxin, in swine and cattle // Toxicon. – 1986. – V.24. – N 1. – 13–23. 63. Bai G., Plattner R.D., Desjardins A.E., Kolb F. Deoxynivalenol production by Fusarium graminearum on wheat. – Internet publication. – 1999. 64. Bamburg J.R., Strong F.M. 12-13-epoxytrichothecenes. / Microbial toxins (ed. S. Kadis, A. Ciegler, S.J. Aje). – Acad. Press, New York, 1971. – V.7. – P.207–289. 65. Bamburg J.R. / Mycotoxins and other fungal related food problems. – Washington, D.C., 1976. – P.144–162. 66. Bauer H.G., Asp N.G., Oste R., Dahquist A., Fredlung P.E. Effect of dietary fiber on the induction of colorectal tumors and fecal beta-glucuronidase activity in the rat // Cancer Res. – 1979. – V.39. – N 9. – P.3752–3756. 67. Bauer J. the metabolism of trichothecenes in swine // Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. – 1995. – V.102. – N 1. – P.50–52. 68. Belinsky S.A., Kauffman F.C., Thurman R.G. Effect of nutrition on monooxigenation and conjugation in the liver. / Nutritional toxicology, V.II. (ed. J.N. Hathcock). – Ac. Press Inc., 1987. – P.41–63. 69. Bergmann F., Soffer D., Yagen B. Cerebral toxicity of the trichothecene toxin T-2, of the products of its hydrolysis and of some related toxins // Toxicon. – 1988. – V.26. – N 10. – P.923–930. 70. Besbris H.J., Wortzman M.S., Cohen A.M. Effect of dietary selenium on the metabolism and excretion of 2-acetylaminofluorene in the rat // J. Toxicol. Environ. Health. – 1982. – V.9. – P.63–76. 71. Bhat R.V., Beedu S.R., Ramakrishna Y., Munshi K.L. Outbreak of trichothecene mycotoxicosis associated with consumption of mold-damaged whea products in Kashmir Valley, India // Lancet. – 1989. – V.7. – P.35–37. 72. Bhat R. Mycotoxin contamination of foods and feeds. Working document FAO/WHO/UNEP Conference on mycotoxins. – Tunis, 1999.

- 110 73. Bhavanishankar T.N., Romesh H., Shantha T. Dermal toxicity of Fusarium toxins in combinations // Archs Toxic. – 1988. – V.61. – N 3. – P.241–244. 74. Bobek P., Galbavy S., Mariassyova M. The effect of red beet (Beta vulgaris var. rubra) fiber on alimentary hypercholesterolemia and chemically induced colon carcinogen in rats // Nahrung. – 2000. – V.44. – N 3. – P.184–187. 75. Bolognani F., Rumney C.J., Rowland I.R. Influence of carcinogen bindings by lactic acid-producing bacteria on tissue distribution and in vivo mutagenicity of dietary carcinogens // Food Chem. Toxicol. – 1997. – V.35. – N 6. – P.535–545. 76. Bondy G.S., Pestka J.J. Immunomodulation by fungal toxins // J. Toxicol. Environ. Health B. Crit. Rev. – 2000. – V.3. – N 2. – P.109–143. 77. Burchell B., Brierley C.H., Rance D. Specificity of human UDP-glucuronosyltransferases and xenobiotic glucuronidation // Life Sci. – 1995. – V.57. – N 20. – P.1819–1831. 78. Burk R.F., Lane J.M. Ethane production and liver necrosis in rats after administration of drugs and other chemicals // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 1979. – V.50. – N 3. – P.467–478. 79. Burk R.F. Production of selenium deficiency in the rat //Methods of Enzymology. – 1987. – V.143. – P.307–313. 80. Casse F.R., Groten J.R., van Bladeren P.J., Feron V.J. Toxicological evaluation and zisk assessment of chemical mixtures // Crit. Rev. Toxicol. – 1998. – V.28.– N 1. – P.73–101. 81. Chen J., Goetchius M.P., Campbell T.C., Combs G.F. ffects of dietary selenium and vitamin E on hepatic mixed-function oxidase activities and in vivo covalent binding of aflatoxin B1 in rats // J. Nutr. – 1982. – V.112. – N 2. – P.324–331. 82. Cheng Z., Radominska-Pandya A., Tephly T.R. Studies on the substrate specificity of human intestinal UDP-glucuronosyltransferases 1A8 and 1A10 // Drug. Metab. Dispos. – 1999. V.27. – N 10. – P.1165–1170. 83. Cole C.B., Fuller R., Carter M. Effect of probiotic supplements of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium adolescentis 2204 on β-glucosidase and β-glucuronidase activity in the lower gut of rats associated with a human faecal flora // Microbiol. Ecol. Health. Dis. – 1989. V.2. – P.223–225. 84. Cole R.J., Cox R.H. Handbook of toxic fungal metabolites. – Acad., N.Y., 1981. – P.937. 85. Combs G.F., Combs S.B. The role of selenium in nutrition. – Acad. Press, Inc., 1986. – 532 p. 86. Combs G.F. Antioxidants and disease prevention. – CRC Press, Boca Raton, N.Y., 1997. – P.97–113. 87. Contreras M.M.C., Yepez M.A.J., Mortinez R.R. Determination of deoxynivalenol (DON) in wheat, barley and corn and its relationship with the levels of total molds, Fusarium spp., colonization percentage and water activity // Arch. Latinoam. Nutr. – 2000. – V.50. – N 2. – P.183–186. 88. Coppock R.W., Swanson S.P., Gelberg H.B., Koritz G.D., Hoffman W.E., Buck W.B., Vesonder R.F. Preliminary study of the pharmacokinetics and toxicopathy of deoxynivalenol (vomitoxin) in swine // Am. J. Vet. Res. – 1985. – V.46. – N 1. – P.169–174. 89. Correia M.A., Burk R.F. Hepatic heme metabolism in selenium-deficient rats: effect of phenobarbital // Arch. Biochem. Biophys. – 1976. – V.177. – 642–644. 90. Cote L.-M., Dahlem A.M., Yoshizawa T., Swanson S.P., Buck W.B. Excretion of deoxynivalenol and its metabolite in milk, urine and feces of lacting dairy cows // J. Dairy Sci. – 1986 a. – V.69. – N 9. – P.2416–2423.

- 111 91. Cote L.-M., Nicoletti J., Swanson S.P., Buck W.B. Production of deepoxydeoxynivalenol (DOM-1), a metabolite of deoxynivalenol, in vitro rumen incubation // J. Agric Food Chem. – 1986 б. – V.34. – N 3. – P.458–460. 92. Cundlife E., Cannon M., Davies J.E. Mechanism of inhibition of eukaryotic protein synthesis by trichothecene fungal toxins // Proc. Natl. Acad. Sci., USA. – 1974. V.71. – N 1. – P.30–34. 93. Dalcero A., Torres A., Etcheverry M., Chulze S., Varsavsky E. Occurrence of deoxynivalenol and Fusarium graminearum in Argentinian wheat // Food Addit. Contam. – 1997. – V.14. – N 1. – P.11–14. 94. Debethizy J.D., Goldstein R.S. The influence of fermentable dietary fiber on the disposition and toxicity of xenobiotics. / Xenobiotic metabolism: nutritional effects. – ACS, Washington, 1985. – P.37–50. 95. Deng G.-Y., Liu Y.-W., He G.-Z., Jiang Z.-M. Effect of dietary fiber on intestinal barrier function of 5-Fu stressed rats // Res. Experim. Med. – 1999. – V.199. – N 2. – P.111–119. 96. Deng G.-Y., Liu Y.-W., He G.-Z., Jiang Z.-M. Dietary fiber protection on intestinal barrier function // Asian J. Surg. – 2000. – V.23. – N 1. – P.90–96. 97. Edwards S.G., Pirgozliev S.R., Hare M.C., Jenkinson P. Quantification of trichotheceneproducing Fusarium species in harvested grain by competitive PCR to determine efficacies of fungicides against Fusarium head blight of winter wheat // Appl. Environ. Microbiol. – 2001. – V.67. – N 4. – P.1575–1580. 98. El-Nezami H., Kakaanpaa P., Salminen S., Ahokas J. Ability of dairy strains of lactic acid bacteria to bind a common food carcinogen, aflatoxin B1 // Food Chem. Toxicol. – 1998. – V.36. – N 4. – P.321–326. 99. Emi Y., Ikushiro S., Iyanagi T. Xenobiotic responsive element-mediated transcriptional activation in the UDP-glucuronosyltransferase family 1 gene complex // J. Biol. Chem. – 1996. – V.271. – N 7. – P.3952–3958. 100. Erickson K.L., Hubbard N.E. Probiotic immunomodulation in health and disease // J. Nutr. – 2000. – V.130. – 2S Suppl. – P.403S–409S. 101. FAO. Worldwide regulations for mycotoxins. – FAO, Rome, 1996. 102. Fazekas B., Hajdu E.T., Tar A.K., Tanyi I. Natural deoxynivalenol (DON) contamination of wheat samples grown in 1998 as determined by high-performance liquid chromatography // Acta Vet. Hung. – 2000. – V.48. – N 2. – P.151–160. 103. Ferguson L.R., Harris P.J. Studies on the role of specific dietary fibers in protection against colorectal cancer // Mutat. Res. – 1996. – V.350. – N 1. – P.173–184. 104. Fernandes C., Stack M.E., Musser S.M. Determination of deoxynivalenol in 1991 U.S. winter and spring wheat by high-performance thin-layer chromatography // J. AOAC Int. – 1994. – V.77. – N 3. – P.628–630. 105. Feron V.J., Groten J.P., Jonker D., Casse F.R., van Bladeren P.J. Toxicology of chemical mixtures: challenges for today and the future // Toxicology. – 1995. – V.105. – N 2–3. – P.415–427. 106. Friend D.W., Thompson B.K., Trenholm H.L., Boermans H.J., Hartin K.E., Panich P.L. Toxicity of T-2 toxin and its interaction with deoxynivalenol when fed to young pigs // Can. J. Anim. Sci. – 1992. – V.72. – N 4. – P.703-711. 107. Galvano F., Piva A., Riteni A., Galvano G. Dietary strategies to counteract the effects of mycotoxins: a review // J. Food Prot. – 2001. – V.64. – N 1. – P.120–131.

- 112 108. Gereis M., Bauer J., Enders C., Gedek B. Contamination of cereals and feed with Fusarium mycotoxins in European countries. / Fusarium — mycotoxins, taxonomy and pathogenicity (ed. J. Chelcowski). – Elsevier, 1989. – P.441–472. 109. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics // J. Nutr. – 1995. – V.125. – N 6. – P.1401–1412. 110. Glatt H. Sulfotransferases in the bioactivation of xenobiotics // Chem. Biol. Interact. – 2000. – V.129. – N 1–2. – P.141–170. 111. Glatt H.R., Robertson L.W., Arand M., Rauch P., Schramm H., Setiabudi F., Pochlauer P., Muller E.P., Oesch F. Cis- and trans-1,2-diphenylaziridines: induction of xenobiotic-metabolizing enzymes in rat liver and mutagenicity in Salmonella typhimurium // Arch. Toxicol. – 1986. –V.59. – N 4. – P.242–248. 112. Gmeiner M., Kneifel W., Kulbe K.D., Wouters R., De Boever P., Nollet L., Verstraete W. Influence of a synbiotic mixture consisting of Lactobacillus acidophilus 74-2 and a fructooligosaccharide preparation on the microbial ecology sustained in a simulation of the human intestinal ecosystem (SHIME reaction) // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2000. – V.53. – N 2. – P.219–223. 113. Godtfredsen W.O., Grove J.F., Tamm Ch. On the nomenclature of a new class of sesquiterpens // Helv. Chim. Acta. – 1967. – V.50. – P.1666–1668. 114. Goldberg I. (ed.) Functional foods. – Chapman & Hall, N.Y., 1994. – 572 p. 115. Goldin B.R., Gorbach S.L. The effect of milk and lactobacillus feeding on human intestinal bacterial enzyme activity // Amer. J. Clin. Nutr. – 1984. – V.39. – N 5. – P.756–761. 116. Goldin B.R., Gorbach S.L., Saxelin M., Barakat S., Gualteri L., Salminen S. Sirvival lactobacillus species (strain GG) in the human gastrointestinal tract // Digestive Diseases and Sciences. – 1992. – V.37. – N 1. – P.121–128. 117. Gonzalez H.H., Martinez E.J., Pacin A.M., Resnik S.L., Sydenham E.W. Natural cooccurrence of fumonisins, deoxynivalenol, zearalenone and aflatoxins in field trial corn in Argentina // Food Addit. Contam. – 1999. – V.16. – N 12. – P.565–569. 118. Goon D., Klaassen C.D. Effect of microsomal enzyme inducers upon UDP-glucuronic acod concentration and UDP-glucuronosyltransferase activity in the rat intestine and liver // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 1992. – V.115. – N 2. – P.253–260. 119. Grabarkiewicz-Szczesna J., Kostecki M., Golinski P., Kiecana I. Fusariotixins in kernels of winter wheat cultivars field samples collected during 1993 in Poland // Nahrung. – 2001. – V.15. – N 1. – P.28–30. 120. Gradinaru D., Suleiman F.G., Leclerc S., Heydel J.M., Grillasca J.P., Magdalou J., Minn A. UDP-glucuronosyltransferase in the rat of factory bulb: idrntification of the UGT 1A6 isoform and age-related changes in 1-naphthol glucuronidation // Neurochem. Res. – 1999. – V.24. – N 8. – P.995–1000. 121. Gregus Z., Madhu C., Klaassen C.D. Effect of microsomal enzyme inducers on biliary and urinary excretion of acetaminophen metabolites in rats. Decreased hepatobiliary and increased hepatovascular transport of acetaminophen-glucuronide after microsomal enzyme induction //Drug. Metab. Dispos. – 1990. – V.18. – N 1. – P.10–19. 122. Grams B., Harms A., Braun S., Strassburg C.P., Manns M.P., Obermayer-Straub P. Distribution and inductibility by 3-methylcholantrene of family 1 UDP-glucuronosyltransferases in the rat gastrointestinal tract // Arch. Biochem. Biophys. – 2000. – V.377. – N 2. – P.255–265.

- 113 123. Groten G.P., Butler W., Feron V.J., Kozianowski G., Renwick A.G., Walker R. An analysis of the possibility for health implications of joint actions and interactions between food additives // Regul. Toxicol. Pharmacol. – 2000. – V.31. – P.77–91. 124. Groudeva J., Kratchanova M.G., Panchev I.N., Kratchanova C.G. Application of granulated apple pectin in the treatment of hyperlipoproteinaemia I. Deriving the regression equation to describe the changes // Zeitschrift fur Lebensmitteluntersuchung und-forschung A. – 1997. V.204. – N 5. – P.374–378. 125. Grove J.F., Mortimer P.H. The cytotoxicity of some transformation products of diacetoxyscirpenol // Biochem. Pharmacol. – 1969. – V.18. – N 16. – P.1473–1478. 126. Grove M.D., Burmeister H.R., Taylor S.L., Wesleder D., Plattner R.D. // J. Agric. Food Chem. – 1984. – V.32. – N 2. – P.541–558. 127. Hafeman D.G., Sunde R.A., Hoekstra W.G. Effect of dietary selenium on erythrocyte in the rats // J. Nutr. – 1974. – V. 104. – N 5. – P.580–587. 128. Harr J.R., Exon J.H., Whanger P.D., Westwig P.H. Effect of dietary selenium on N-2fluorenyl acetamide (FFA)-induced cancer in vitamin E-supplemented selenium-depleted rats // Clin. Toxicol. – 1972. – V.5. – N 2. – P.187–194. 129. Hazan A., Madar Z. Preparation of a dietary fiber mixture derived from different sources and its metabolic effects in rats // J. Amer. Coll. Nutr. – 1993. – V.12. – N 6. – P.661–668. 130. Hedman R., Pettersson H. Transformation of nivalenol by gastrointestinal microbes // Arch. Tierernahr. – 1997. – V.50. – N 4. – P.321–329. 131. Helsby N.A., Zhu S., Pearson A.E., Tingle M.D., Fergusson L.R. Antimutagenic effects of wheat bran diet throgh modification of xenobiotic metabolising enzymes // Mutat. Res. – 2000. – V.454. – N 1–2. – P.77–88. 132. Hietaniemi V., Kumpulainen J. Contents of Fusarium toxins in Finnish and imported grains and feeds // Food. Addit. Contam. – 1991. – V.8. – N 2. – P.171–182. 133. Higginson J. Existing risk for cancer / Reducing the carcinogenic risks in industry (ed. P.F. Deisler, Jr.). – N.Y., Marcel Dekker, Inc., 1984. – P.1–19. 134. Hill K.E., Burk R.F., Lane J.M. Effect of selenium depletion and repletion on plasma glutatione and glutatione-dependent enzymes in the rat // J. Nutr. – 1987. – V.117. – N 1. – P.99–104. 135. Hill K.E., Burk R.F. Selenoprotein P: recent studies in rats and in humans // Biomed. Environ. Sci. – 1997. V.10. – N 2–3. – P.198–208. 136. Hochsteiner W., Schuh M. Occurrence of the fusariotoxins deoxynivalenol and zearalenone in Austrian feedstuff in the period from 1995 to 1999 // Dtsch Tierarztl Wochenschr. – 2001. – V.108. – N 1. – P.19-23. 137. Hughes D.M., Gahl M.J., Graham C.H., Grieb S.L. Overt signs of toxicity to dogs and cats of dietary deoxynivalenol // J. Anim. Sci. – 1999. – V.77. – N 3. – P.693–700. 138. Hunter B.T. How “probiotics” fight food-borne illness // Consumers’ Research Magazine – 1993. – V.76. – N 12. – P.19–21. 139. IARC. Some naturally occuring substances: food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins / IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to human. – V.56. – Lyon, 1993. 140. Ihara T., Sugamata M., Sekijima M., Okumura H., Yoshino N., Ueno Y. Apoptotic cellular damage in mice after T-2 toxin-induced acute toxicosis // Nat. Toxins. – 1997. – V.5. – N 4. – P.141–145. 141. Ip C. Selenium and experimental cancer // Ann. Clin. Res. – 1986. – V.18. – N 1. – P.22–29.

- 114 142. Ip C., El-Bayoumy K., Upadhyaya P., Ganther H. Novel strategies in selenium cancer chemoprevention research / Selenium in biology and medicine: 5th Int. Symp. – 1992. – P.22. 143. Ip C., Lisk D.J. Modulation of phase I and phase II xenobiotic-metabolizing enzymes by selenium-enriched garlic in rats // Nutr. Cancer. – 1997. – V.28. – N 2. – P.184–188. 144. Ishii Y., Takami A., Tsuruda K., Kurogi A., Yamada H., Oguri K. Induction of two UDP-glucuronosyltransferase isoforms sensitive to phenobarbital that are involved in morphine glucuronidation: production of isoform-selective antipeptide antibodies toward UGT1.1r and UGT2B1 // Drug. Metab. Dispos. – 1997. – V.25. – N 2. – P.163–167. 145. Islam Z., Nagase M., Yoshizawa T., Yamauchi K., Sakato N. T-2 toxin inducers thymic apoptosis in vivo in mice // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 1998. – V.148. – N 2. – P.205– 214. 146. Jemnitz K., Veres Z., Monostory K., Vereczkey L. Glucuronidation of thyroxine in primary monolayer cultures of rat hepatocytes: in vitro induction of UDPglucuronosyltransferases by methylcholantrene, clofibrate, and dexametasone alone and in combination // Drug. Metab. Dispos. – 2000. – V.28. – N 1. – P.34–37. 147. Jenab M., Thompson L.U. Phytic acid in wheat bran affects colon morphology, cell differentiation and apoptosis // Carcinogenesis. – 2000. – V.21. – N 8. – P.1547–1552. 148. Joffe A.Z. Foodborne diseases: alimentary toxic aleukia / Handbook of foodborne diseases of biological origin (ed. M. Rechcigl). – CRC Press, Boca Raton, FL, 1983. 149. Julius A.D., Davies M.H., Birt D.F. Relationship between blood selenium and erethrocyte glutatione peroxidase activity with excess dietary selenium in Syrian golden hamsters // Fed. Proc. – 1980. – V.39. – N 3. – P. 555–561. 150. Kalantzopoulos G. Fermented products with probiotic qualities // Anaerobe. – 1997. – V.3. – N 2/3. – P.185–190. 151. Kasper Ch., Henton D. Glucuronidation / Enzymatic basis of detoxification (ed. W. Jakoby). – N.Y., London, Toronto, Sydney, San Francisco, 1980. – V.2 – P.3–36. 152. Kauppila A., Sundstrom H., Karpela H., Vinikka L., Yrjanheikki E. Serum selenium and gynecological cancer: effect of selenium supplementation on plasma malondialdehyde and serum glutatione peroxidase / Icosanoids and cancer (ed. H. Thaler-Dao et al.). – Raven Press, N.Y., 1984. – P.264–266. 153. Kawata S., Tamura s., Matsuda Y., Ito N., Matsuzawa Y. Effect of dietary fiber on cytochrome P 450IA1 induction in rat colonic mucosa // Carcinogenesis. – 1992. – V.13. – N 11. – P.2121–2125. 154. Khachatourians G.G. Metabolic effects of trichothecene T-2 toxin // Can. J. Physiol. Pharmacol. – 1990. – V.68. – N 7. – P.1004–1008. 155. Kelner M.J., Montoya M.A. Structural organisation of the human selenium-dependent phospholipid hydroperoxide glutatione peroxidase gene (GPX 4): chromosomal localisation to 19p13.3 //Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1998. – V.249. – N 1. – P.53–55. 156. King R.R., McQueen R.E., Levesque D., Greenhalgh R. Transformation of deoxynivalenol (vomitoxin) by rumen microorganisms // J. Agric. Food Chem. – 1984. – V.32. – N 5. – P.1181–1183. 157. Kritchevsky D. Influence of dietary fiber on xenobiotics / Xenobiotic metabolism: nutritional effects. – ACS, Washington, 1985. – P.51–60.

- 115 158. Kritchevsky D. The role of dietary fiber in health and disease // J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. – 1986. – V.6. – N 3–4. – P.273–284. 159. Krisch K. // Biochem Z. – 1963. – B.337. – S.531–545. 160. Kubena L.F., Edrington T.S., Harvey R.B., Buckley S.A., Phillips T.D., Rottinghaus G.E., Casper H.H. Individual and combined effects on fumonisin B1 present in Fusarium moniliforme culture material and T-2 toxin or deoxynivalenol in broiler chicks // Poult. Sci. – 1997. – V.76. – N 9. – P.1239–1247. 161. Kuiper-Goodman T. Prevention of human mycotoxicosis through risk assessment and risk management / Mycotoxins in grain: compounds other than aflatoxin (ed. J.D. Miller, H. Trenholm). – Eagan Press, Minnesota, 1994. – P.439–470. 162. Lake B.C., Phillips J.C., Walters D.J., Bayley D.L., Cook M.W., Thomas L.V., Gilbert J., Startin J.R., Baldwin N.C.P., Bycroft B.W., Dewick P.M. Studies on the metabolism of deoxynivalenol in the rat //Food Chem. Toxic. – 1987. – V.25. – N 8. – P.589–592. 163. Lang M., Pelkonen O. Chapter 3. Metabolism of xenobiotics and chemical carcinogenesis / IARC Sci. Publ. – N 148. – P.13–22. 1999. 164. Lauren D.R., Ringrose M.A. Determination of the fate of three Fusarium mycotoxins through wet-milling of maize using an improved HPLC analytical technique // Food Addit. Contam. – 1997. – V.14. – N 5. – P.435–443. 165. Lee R.C., Bunner D.L., Wannemacher R.W., Chu F.S. Immunochemical studies on the excretion of T-2 yoxin metabolites in rat and cynomolgus monkey urine // J. Agric. Food Chem. – 1990. – V.38. – N 2. – P.444–448. 166. Levander O.A., Burk R.F. Selenium / Present knowledge in nutrition. Seventh edition (ed. E.E. Ziegler, L.J. Filer). – ILSI Press, Washington, D.C., 1996. – P.320–328. 167. Li Y.Q., Prentice D.A., Howard M.L., Mashford M.L., Desmond P.V. The effect of hormones on the expression of five isoforms of UDP-glucuronosyltransferase in primary cultures of zat hepatocytes // Pharm. Res. – 1999. – V.16. – N 2. – P.191–197. 168. Ling W.H., Korpela R., Mykkanen H., Salminen S. Lactobacillus strain GG and fiber supplementation decreases colonic hydrolytic and reductive enzyme activities in healthy female subjects // J. Nutr. – 1994. – V.124. – N 1. – P.18–23. 169. Little J.M., Lester R., Kuipers F., Vonk R., Mackenzie P.I., Drake R.R., Frame L., Radominska-Pandya A. Variability of human hepatic UDP-glucuronosyltransferase activity // Acta Biochim. Pol. – 1999. – V.46. – N 46. – P.351–363. 170. Loveland P.M., Nixon J.E., Bailey G.S. Glucuronides in bile of rainbow trout (Salmo gairdneri) injected with [3H] aflatoxin B1 and the effects of dietary beta-naphtoflavone // Comp. Biochem. Physiol. – 1984. – V.78C. – N 1. – P.13–19.1984. 171. Luo X.-Y., Li Y.W., Wen X.Hu. Food poisoning associated with scabby wheat and determination of Fusarium toxins // J. Hygiene Res. – 1987. – V.16. – N 4. – P.33–37. 172. Luo X.-Y. Fusarium toxins contamination of cereals in China // Proc. Jap. Assoc. Mycotoxicology Suppl. – 1988. – N 1. – P.97–98. 173. Lutsky I., Mor N. Experimental alimentary toxic aleukia in cats // Lab. Anim. Sci. – 1981. – V.31. – N 1. – P.43–47. 174. Macfarlane G.T. Probiotics and prebiotics: Can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health? / British Medical Journal. – 1999. – V.318. – N 7189. – P.999– 1003.

- 116 175. Mackinnon A.M., Simon F.R. Impaired hepatic heme synthesis in the phenobarbitalstimulated selenium-dependent rat // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1976. – V.152. – P.568–572. 176. Madhyastha M.S., Marquardt R.R., Abramson D. Structure-activity relationships and interactions among trichothecene mycotoxins as assessed by yeast bioassay // Toxicon. – 1994. – V.32. – N 9. – P.1147–1152. 177. Mallett A.K., Rowland I.R., Bearne C.A., Nicklin S. Influence of dietary carrageenans on microbial biotransformation activities in the cecum of rodents and on gastrointestinal immune status in the rat // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 1985. – V.78. – N 3. – P.377–385. 178. Manoj G., Thampi B.S., Leelamma S., Menon P.V. Effect of dietary fiber on the activity of intestinal and fecal beta-glucuronidase activity during 1,2-dimethylhydrazine induced colon carcinogenesis // Plant. Foods. Hum. Nutr. – 2001. – V.56. – N 1. – P.13-21. 179. Mao Y., Kasravi B., Nobaek S., Wang L.Q., Adawi D., Roos G., Stenram U., Molin G., Bengmark S., Jeppsson B. Pectin-supplemented enteral diet reduces the severity of merhotrexate induced enterocolitis in rats // Scand. J. Gastroenterol. – 1996. – V.31. – N 6. – P.558–567. 180. Martin S.E., Schillaci M. Inhibitory effects of selenium on mutagenicity // J. Agric. Food Chem. – 1984. – V.32. – N 2. – P.426-433. 181. Matossian M.K. Poisons of the past. – Yale University Press, New Haven, CT., 1989. 182. McLeod R., Ellias E.M., Arthur J.R., Neal G.E., Judah D.J., Manson M.M., Hayes J.D. Protection conferred by selenium deficiency against aflatoxin B1 in the rat is associated with the hepatic expression of an aldo-keto reductase and glutatione S-transferase subunit that metabolise the mycotoxin // Cancer Research. – 1997. – V.57. – P.4257–4266. 183. Meydani M. Dietary effects on detoxification processes / Nutritional Toxicology (ed. J.H. Hathcock), V. II. – Acad. Press, 1987. – P.1-39. 184. Mezes M., Barta M., Nagy G. Comparative investigation on the effect of T-2 mycotoxin on lipid peroxidation and antioxidant status in different poultry species // Res. Vet. Sci. – 1999. – V.66. – N 1. – P.19–23. 185. Miller J.D. Fungi and mycotoxins in grain: Implications for stored product research // J. Stored Prod. Res. – 1995 a. – V.31 – N 1. – P.1–16. 186. Miller J.D. Mycotoxins in Asia: Policies for the future (workshop report) // ACTAR Postharvest Newsletter. – 1995 б. – N 32. – P.5–15. 187. Miller J.D. Global significance of mycotoxins / Mycotoxins and Phicotoxins — developments in chemistry, toxicology and food safety (ed. M. Miragila, H.P. van Egmond, C. Brera, J. Gilbert). – Alaken Inc., 1998. – P.3–15. 188. Milner J.A. Effect of selenium on virally induced and transplantable tumor models // Federation Proc. – 1985. – V.44. – N 9. – P.2568–2572. 189. Morotomi M. Propertis of Lactobacillus caseli Shiroda strain as probiotics // Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. – 1996. – V.5. – P.29–30. 190. Müller H.M., Schwadore K. A survey of the natural occurrence of fusarium toxins in wheat grown in a southwestern area of Germany // Mycopathologia. – 1993. – V.121. – N 2. – P.115–121. 191. Müller H.M., Reimann J., Schumacher U., Schwadore K. Natural occurrence of fusarium toxins in oats harvested during five years in an area of southwest Germany // Food Addit. Contam. – 1998. – V.15. – N 7. – P.801–806.

- 117 192. Nesh G.A., Farnworth E.R., Greenhalgh R. Observations on the occurrence of Fusarium species and their toxins in corn in eastern Ontario // Can. J. Pl. Path. – 1983. – V.5. – N 1. – P.11–16. 193. Nugon-Baudon L., Roland N., Flenois J.P., Beaune P. Hepatic cytochrome P-450 and UDP-glucuronosyl transferase are affected by five sources of dietary fiber in germ-free rats // J. Nutr. – 1996. – V.126. – N 2. – P.403–409. 194. Oesch F., Herrero M.E., Hengstler J.G., Lohmann M., Arand M. Metabolic detoxification: implications for thresholds // Toxicol. Pathol. – 2000. – V.28. – N 3. – P.382–387. 195. Oguri K., Kurogi A., Yamabe K., Tanaka M., Yoshisue K., Ishii Y., Yishimura H. Purification of a phenobarbital-inducible UDP-glucuronosyltransferase isofirm from dog liver which catalyzes morphine and testosterone glucuronidation // Arch. Biochem. Biophys. – 1996. – V.325. – N 2. – P.159–166. 196. Ohkami H., Tazawa K., Yamashita I., Shimuzu T., Murai K., Kobashi K., Fujimaki M. Effect of apple pectin on fecal bacterial enzymes in azoxymethane-induced rat colon carcinogenesis // Jpn. J. Cancer. Res. – 1995. – V.86. – N 6. – P.523–529. 197. Ohta M., Ishii K., Ueno Y. Metabolism of trichothecene mycotoxins. I. Microsomal deacetylation of T-2 toxin in animal tissues // J. Biochem. (Tokyo). – 1977. – V.82. – N 6. – P.1591–1598. 198. Ohta M., Matsumoto H., Ishii K., Ueno Y. Metabolism of trichothecene mycotoxins. II. Substrate specificity of microsomal deacetylation of trichothecenes // J. Biochem. (Tokyo). – 1978. – V.84. – N 3. – P.697–706. 199. Ohta M. An epidemiological study on relationship between intake of dietary fiber and colorectal cancer // J. Jpn. Soc. Colo-proctol. – 1987. – V.40. – N 6. – P.741–746. 200. Olsson U., Lundgren B., Segura-Aguilar J., Messing-Eriksson A., Andersson K., Becedas L., De Pierre J.W. Effects of selenium deficiency on xenobiotic-metabolising and other enzymes in rat liver // Int. Vitam. Nutr. Res. – 1993. – V.63. – N 1. – P.31–37. 201. Omiecinski C.J., Remmel R.P., Hosagahara V.R. Concise review of the cytochrome P450s and their roles on toxicology // Toxicol. Sci. – 1999. – V.48. – P.151–156. 202. Pacin A.M., Resnik S.L., Neira M.S., Molto G., Martinez E. // Natural occurrence of deoxynivalenol in wheat, wheat flour and bakery products in Argentina // Food Addit. Contam. – 1997. – V.14. – N 4. – P.327–331. 203. Pariza M.W. Tixic substances in food / Present knowledge in nutrition. seventh edition. – ILSI Press, Washington, DC, 1996. 204. Parnham M.J., Graf E. Seleno-organic compounds and the therapy of hydroperoxide-linked pathological conditions // Biochem. Pharmacol. – 1987. – V.36. – N 19. – P.3095–3102. 205. Paulson G. Conjugation of foreign chemicals by animals // Residue Rev. – 1979. V.70. – P.32–72. 206. Perkowski J., Wakulinski W., Chelkowski J. Natural occurrence of deoxynivalenol, 3acetyldeoxynivalenol and zearalenone in wheat in 1988 // Microbiol.-Aliment.-Nutr. – 1990. – V.8. – N 3. – P.241–247. 207. Pettersson H., Kiessling K.-H., Sandholm K. Occurrence of the trichothecene mycotoxin deoxynivalenol (vomitoxin) in Swedish-grown cereals // Swedish Journal of Agricultural Research. – 1986. – V.16. – 179–182. 208. Pineiro M.S., Scott P.M., Kanhere S.R. Mycotoxin producing potential of Fusarium graminearum isolates from Uruguayan barley // Mycopathologia. – 1995-96. – V.132. – N 3. – P.167–172.

- 118 209. Pohland A.E., Thorpe C., Spron J. The analytical chemistry of deoxynivalenol / Toxigenic fungi — their toxins and health hazard (ed. H. Kurata, Y. Ueno). – Kodansha, Tokyo, Elsevier, Amsterdam, 1984. 210. Pohland A.E., Thorpe C.W., Trucksess M.W., Eppley R.M. TLC and HPLC methods for analysis of trichothecenes in commodities / Diagnostic of mycotoxines (ed. M. Nihoff). – Dordreht, Nederland, 1986. 211. Pohland A.E. Overview of international mycotoxin and phycotoxin programs / Mycotoxins and Phicotoxins — developments in chemistry, toxicology and food safety (ed. M. Miragila, H.P. van Egmond, C. Brera, J. Gilbert). – Alaken Inc., 1998. – P.17–24. 212. Prelusky D.B., Veira D.M., Trenholm H.L. Plasma pharmacokinetics of the mycotoxin deoxynivalenol following oral and intravenous administration to sheep // J. Environ. Sci. Health. – 1985. – V.B20. – N 6. – P.603–624. 213. Prelusky D.B., Veira D.M., Trenholm H.L., Hartin K.E. Excretion profiles of the mycotoxin deoxynivalenol following oral and intravenous administration to sheep // Fund. Appl. Toxicol. – 1986. V.6. – N 6. – P.356–363. 214. Prelusky D.B., Veira D.M., Trenholm H.L., Foster B.C. Metabolic fate and elimination in milk, urine and bile of deoxynivalenol following administration to lactating sheep // J. Environ. Sci. Health [B]. – 1987. V.22. – N 2. – P.125–148. 215. Prelusky D.B., Hartin K.E., Trenholm H.L. Distribution of deoxynivalenol in cerebral spinal fluid following administration to swinw and sheep // J. Environ. Sci. Health. – 1990. – V.B25. – N 3. – P.395–413. 216. Prosky L. Dietary fiber // J. AOAC Int. – 2001. – V.84. – N 1. – P. 222–224. 217. Radominska-Pandya A., Czernik P.J., little J.M., Battaglia E., Mackenzie P.I. Structural and functional studies of UDP-glucuronosyltransferases // Drug. Metab. Rev. – 1999. – V.31. – N 4. – P.817–899. 218. Rao G.N. Influence of diet on tumors of hormonal tissues // Prog. Clin. Biol. Res. – 1996. – N 394. – P.41–56. 219. Reddi A.S., Bollineni J.S. Selenium-deficient diet induces renal oxidative stress and injury via TGF-beta1 in normal and diabetic rats // Kidney Int. – 2001. – V.59. – N 4. – P.1342–1353. 220. Reddy B.S., Engle A., Simi B., Goldman M. Effect of dietary fiber on colonic bacterial enzymes and bile acids in relation to colon cancer // Gastroenterology. – 1992. – V.102. – N 5. – P.1475–1482. 221. Reddy B.S. Preventionn of colon carcinogenesis by components of dietary fiber // Anticancer Res. – 1999. – V.19. – N 5A. – P.3681–3683. 222. Reiter R., Wendel A. Selenium and drug metabolism. – I. Multiple modulations of mouse liver enzymes //Biochem. Pharmacol. – 1983. – V.32. – N 20. – 3063–3067. 223. Reiter R., Wendel A. Selenium and drug metabolism. – II. Independence of glutatione peroxidase and reversibility of the hepatic enzyme modulations in deficient mice // Biochem. Pharmacol. – 1984. – V.33. – N 12. – P.1923–1928. 224. Richardson D. Probiotics and product innovation // Nutr. Food Sci. – 1996. N 4. – P.27–33. 225. Riley R.T., Norred W.R. Mycotoxin prevention and decontamination — a case study on maize // Food Nutr. Agric. – 1999. – V.23. – P.25–30. 226. Ritter J.K. Roles of glucuronidation and UDP-glucuronosyltransferases in xenobiotic bioactivation reactions // Chem. Biol. Interact. – 2000. – V.129. – N 1–2. – P.171–193.

- 119 227. Rizzo A.F., atroshi F., Ahotupa M., Sankari S., Elovaara E. Protective effect of antioxidants against free radical-mediated lipid peroxidation induced by DON or T-2 toxin // Zentralbl. Veterinarmed. [A]. – 1994. – V.41. – N 2. – P.81–90. 228. Roland N., Rabot S., Nugon-Baudon L. Modulation of the biological effects of glucosinolates by inulin and oat fibre in gnotobiotic rats inoculated with a human whole fecal flora // Food Chem. Toxicol. – 1996. – V.34. – N 8. – P.671–677. 229. Rolfe R.D. The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health // J. Nutr. – 2000. – V.130. – 2S suppl. – P.396S–402S. 230. Ross J.K., Leklem J.E. The effect of dietary citrus pectin on the excretion of human fecal neutral and acid steroids and the activity of alpha-dehydroxylase and betaglucuronidase // Amer. J. Clin. Nutr. – 1981. – V.34. – N 10. – P.2068–2077. 231. Rotter B.A., Thompson B.K., Lessard M., Trenholm H.L., Tryphonas H. Influence of low-level exposure to fusarium mycotoxins on selected immunological and hematological parameters in young swine // Fund. Appl. Toxicol. – 1994. – V.23. – N 1. – P.117–124. 232. Rotter B.A., Prelusky D.B., Pestka J.J. Toxicology of deoxynivalenol (vomitoxin) // J. Toxicol. Environ. Health (United States). – 1996. – V.48. – N 1. – P.1–34. 233. Rowland I.R., Mallett A.K., Wise A. A comparison of the actinity of five microbial enzymes in cecal content from rats, mice, and hamsters, and response to dietary pectin // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 1983. – V.69. – N 1. – P.143–148. 234. Saarikoski S.T., Ikonen T.S., Oinonen T., Lindros K.O., Ulmanen I., HusgaftenPursiainen K. Induction of UDP-glucuronosyltransferase family 1 genes in rat liver: different patterns of mRNA expression with two inducers, 3-methylcholantrene and betanaphthoflavone // Biochem. Pharmacol. – 1998. – V.56. – N 5. – P.569–575. 235. Sakaguchi S., Iizuka Y., Furusawa S., Tanaka Y., Takayanagi M., Takayanagi Y. Roles of selenium in endotoxin-induced lipid peroxidation in the rats liver and in nitric oxide production in J774A.1 cells // Toxicol. Lett. – 2000. – V.118. – N 1–2. – P.69–77. 236. Sardjono A.N., Yamashita a., Yoshizawa T. Natural co-occurrence of aflatoxins and fusarium mycotoxins (fumonisins, deoxynivalenol, nivalenol and zearalenone) in corn from Indonesia // Food Addit. Contam. – 1998. – V.15. – N 4. – P.377–384. 237. Satoh T., Hosokawa M. The mammalian carboxilesterases: from molecules to functions // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. – 1998. – V.38. – P.257–288. 238. Scheline R.R. drug metabolism by intestinal microorganisms // J. Pharm. Sci. – 1968. – V.57. – N 12. – P.2021–2037. 239. Schrauzer G.N. Selenium. Mechanistic aspects of anticarcinogenic action // Biol. Trace elem. Res. – 1992. – V.33. – P.51–62. 240. Scott P.M. assessment of quantitative methods for determination of trichothecenes in grains and grain products // J. Assoc. Off. Anal. Chem. – 1982. – V.65. – N 4. – P.876–883. 241. Scott P.M. The natural occurrence of tricothecenes / Tricothecene mycotoxicosis: Pathophysiologic effects (ed. V.R. Beasley). – CRC Press Inc., Boca Raton, FL, 1989. – V.I. – P.2–26. 242. Scott P.M. Thrichothecenes in grains // Cereal Foods World. – 1990. – V.35. – N 7. – P.661–666. 243. Scott P.M. Multi-year monitoring of Canadian grains and grain-based foods for trichothecenes and zearalenone // Food Addit. Contam. – 1997. – V.14. – N 4. – P.333– 339.

- 120 244. Seidegard J., Ekstrom G. The role of human glutathione transferases and epoxide hydrolases in the metabolism of xenobiotics // Environ Health Perspect. – 1997. – V.105. – Suppl. 4. – P.791–799. 245. Shamberger R.J. selenium in nutrition and cancer / Proceedings of the Third International Symposium on Industrial Uses of selenium and Tellurium. – 1984. – P.570–584. 246. Shank R.C. Metabolic activation of mycotoxins by animals and humans: an overview. // J. Toxicol. Environm. Health. – 1977. – V.2. – N 6. – P.1229–1244. 247. Shiau S.-Y., Chang G.W. effects of dietary fiber on fecal mucinase and betaglucuronidase activity in rats // J. Nutr. – 1983. – V.13. – N 1. – P.138–144. 248. Schiefer H.B., Hancock D.S., Bhatti A.R. Systemic effects of topically applied trichothecenes. I. comparative study of various trichothecenes in mice // J. Vet. Med. – 1986. – V.33A. – N 5. – P.373–383. 249. Sitkiewicz D. Mechanisms of drug metabolism — implication for drug interaction // Pol. Merkuriusz. Lek. – 2000. – V.9. – N 51. – P.595–597. 250. Smalley E.B., Strong F.M. / Mycotoxins (ed. I.F.H. Purchase). – Elsevier, Amsterdam, 1973. – P. 199. 251. Smith T.K., McMillan E.G., Castillo J.B. Effect of feeding blends of fusarium mycotoxin-contaminated grains containing deoxynivalenol and fusaric acid on growth and feed consumption of immature swine // J. Anim. sci. – 1997. – V.75. – N 8. – P.2184–2191. 252. Smith-Barbaro P., Hanson D., Reddy B.S. Carcinogen binding to various types of dietary fiber // J. Nat. Cancer. Inc. – 1981. – V.67. – N 2. – P.495–497. 253. Southgate D.A.T., Waldron K., Johnson I.T., Fenwick G.R. Dietary fibre: chemical and biological aspects. – RCS, Cambridge, 1990. 254. Stenlake J.B. Foundation of molecular pharmacology. – The Athlone Press of the University, London, 1979. – V.2. 255. Strassburg C.P., Strassburg A., Nguyen N., Li Q., Manns M.P., Tukey R.H. Regulation and function of family 2 UDP-glucuronosultransferase genes (UGT1A, UGT2B) in human oesophagus // Biohem. J. – 1999. – N 338. – Pt.2. – P.489–498. 256. Sun Y., Gu Q.P., Whanger P.D. Selenoprotein W in overexpressed and underexpressed rat glial cells in culture // J. Inorg. Biochem. – 2001. – V.84. – N 1-2. – P.151-156. 257. Suneja S.K., Wagle D.S., Monga D.P., Ram G.C. Mycology, biochemistry and toxicology of T-2 toxin // Indian J. Microbiol. – 1988. – V.28. – N 2. – P.1–18. 258. Swanson C.A., Patterson B.H., Levander O.A., Veillon C., Taylor P.R., Helzlsouer K., McAdam P.A., Zech L.A. Human [74Se] selenomethionine metabolism; a kinetic model // Amer. J. Clin. Nutr. – 1991. – V.54. – N 5. – P.917–926. 259. Swanson S.P., Rood H.D.Ir., Behrens J.C., Sanders P.E. Preparation and characterisation of the deepoxy trichothecenes: deepoxy HT-2, deepoxy T-2 triol, deepoxy T-2 tetraol, deepoxy 15-monoacetoxyscirpentriol, and deepoxy scyrpentriol // Appl. Environ. Microbiol. – 1987. – V.53. – N 12. – P.2821–2826. 260. Swanson S.P., Helaszek C., Buck W.B., Rood H.D.Ir., Haschek W.M. The role of intestinal microflora in the metabolism of trichothecene mycotoxins // Food Chem. Toxicol. – 1988. V.26. – N 10. – P.823–829. 261. Swanson S.P., Corley R.A. The distribution, metabolism, and excretion of trichothecene mycotoxins / Tricothecene mycotoxicosis: Pathophysiologic effects (ed. V.R. Beasley). – CRC Press Inc., Boca Raton, FL, 1989. – V.I. – P.37–61.

- 121 262. Tanaka T., Hasegawa A., Matsuki Y., Lee U.-S., Ueno Y. A limited survey of fusarium mycotoxins nivalenol, deoxynivalenol and zearalenone in 1984 UK harvested wheat and barley // Food Addit. Contam. – 1986 a. – V.3. – N 3. – P.247–250. 263. Tanaka T., Hasegawa A., Yamamoto S. Natural occurrence of fusarium mycotoxins in cereal harvested in various parts of the world (1) // Proc. Jpn. Assoc. Mycotoxicol. – 1986 б. – V.24. – N 1. – P.57–59. 264. Tanaka T., Hasegawa A., Yamamoto S., Lee U.-S., Sigiura Y., Ueno Y. Worldwide contamination of cereals by the fusarium mycotoxins nivalenol, deoxynivalenol and zearalenone // J. Agric. Food Chem. – 1988. – V.36. – N 2. – P.976–983. 265. Teich A.H., Shugar L., Smid A. Soft white winter wheat cultivar field-resistence to scab and deoxynivalenol accumulation // Cer. Res. Comn. – 1987. – V.15. – N 2. – P.109–114. 266. Tephly T.R., Burchell B. UDP-glucuronosultransferases: a family of detoxifying enzymes // Trends Pharmacol. Sci. – 1990. – V.11. – N 7. – P.276–279. 267. Thompson W.L., Wannenmacher R.W. Structure-function relationship of 12,13epoxytrichothecene mycotoxins in cell culture. Comparison to whole animal lethality // Toxicon. – 1986. – V.24. – N 10. – P.985–994. 268. Thompson W.L., Wannemacher R.W. In vivo effects of T-2 mycotoxin on synthesis of proteins and DNA in rat tissues // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 1990. – V.105. – N 3. – P.483–491. 269. Trenholm H.L. Foster B.C., Charmley L.L., Thompson B.K., Hartin K.E., Coppock R.W., Albassam M.A. Effects of feeding diets containing Fusarium (naturally) contaminated wheat or pure deoxynivalenol (DON) in growing pigs // Can. J. Anim. Sci. – 1994. – V.74. – N 3. – P.361–369. 270. Tukey R.H., Strassburg C.P. Human UDP-glucuronosyltransferases; metabolism, expression, and disease // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. – 2000. – V.40. – P.581–616. 271. Tutelyan V.A., Eller K.I., Sobolev V.S., Pimenova V.V., Zakharova L.P., Muzychenko N.I. A survey of the occurrence of deoxynivalenol in wheat from 1986– 1988 harvests in the USSR // Food Addit. Contam. – 1990. – V.7. – N.4. – P.521–525. 272. Tutelyan V.A. Occurrenxe of Fusarium mycotoxins in cereal in Russia / Mycotoxins and Phicotoxins — developments in chemistry, toxicology and food safety (ed. M. Miragila, H.P. van Egmond, C. Brera, J. Gilbert). – Alaken Inc., 1998. – P.99–104. 273. Udell M.N., Dewick P.M. Metabolic conversions of trichothecene mycotoxins: deesterification reactions using cell-free extracts of Fusarium // Z. Naturalforsch. – 1989. – V.44c. – N 7–8. – P.660–668. 274. Ueno Y. Trichothecenes: Overview address / Mycotoxins in human and animal health (ed. J.V. Rodrics, C.W. Hesseltine, M.A. Mehlman). – Park Forest South, IL, Pathotox, 1977. – P.189–207. 275. Ueno Y., Tashiro F., Kobayashi T. Species differences in zearalenone-reductase activity // Food Chem. Toxicol. – 1983. – V.21. – N 2. – P.167–173. 276. Ueno Y. (ed.). Trichothecenes. Chemical, biological and toxicological aspects. – Elsevier, Amsterdam, New York, 1983. – P. 313. 277. Ueno Y. Trichothecenes as environmental toxicants / Reviews in environmental toxicology (ed. E. Hodson). – Elsevier, Amsterdam, New York, Oxford, 1986. – V.2. – P.303–341. 278. Ueno Y., Tanaka T. Worldwide occurrence of Fusarium mycotoxins in cereal and foods / Joint FAO/WHO/UNEP Second International Conference on Mycotoxins. – Bangkok, Thailand, 1987. – P.1–8.

- 122 279. Wei R.Y. Thin layer chromatographic determination of deoxynivalenol in wheat and corn // J. Hygiene Res. – 1986. – V.15. – N 5. – P.40–43. 280. Environmental Health Criteria, 70. Principles for the safety assessment of food additives and contaminants in food. – WHO, Geneva, 1987. 281. Wolf-Hall C.E., Hanna M.A., Bullerman L.B. Stability of deoxynivalenol in heat-treated foods // J. Food Prot. – 1999. – V.62. – N 8. – P.962–964. 282. Wood G.E., Carter L. Limited survey of deoxynivalenol in wheat and corn in the United States // J. Assoc. Off. Anal. Chem. – 1989. – V.72. – N 1. – P.38–40. 283. Worrell N.R., Mallett A.K., Cook W.M., Baldwin N.C., Shepherd M.J. The role of gut micro-organisms in the metabolism of deoxynivalenol administered to rats // Xenobiotica. – 1989. – V.19. – N 1. – P.25–32. 284. Yagen B., Bialer M. Metabolism and pharmacokinetics of T02 toxin and related trichothecenes // Drug Metab. Rev. – 1993. – V.25. – N 3. – P.281–323. 285. Yazdanpanah H., Roshanzamir F., Shafaghi B., Faizi M., Elhami M., Rasekh H.R. Assessment of possible protective roles of selenium, zinc, and cis-stilbene oxide against acute T-2 toxin poisoning: a preliminary report // Nat. Toxins. – 1997. – V.5. – N 4. – P.133–135. 286. Yeh J.Y., Gu Q.P., Beilstein M.A., Forsberg N.E., Whanger P.D. Dietary selenium increases selenoprotein W levels in rat tissues // J. Nutr. – 1997. – V.127. – N 3. – P.394–402. 287. Young J.C., Trenholm H.L., Friend D.W., Prelusky D.B. Detoxification of deoxynivalenol with sodium bisulfite and evaluation of the effects when pure mycotoxin or contaminated corn was treated and given to pigs // J. Agric. Food Chem. – 1987. – V.35. – N 2. – P.259–261. 288. Yoshizawa T., Sakamoto T., Ayano Y., Mirocha C.J. 3’-hydroxy T-2 and 3’-hydroxy HT-2 toxins: new metabolites of T-2 toxin, a trichothecene mycotoxin, in animals // Agric. Biol. Chem. – 1982. – V.46. – N 11. – P.2613–2619. 289. Yoshizawa T., Takeda H., Ohi T. Structure of a novel metabolite from deoxynivalenol, a trichothecene mycotoxin, in animals // Agric. Biol. Chem. – 1983. – V.47. – N 9. – P.2133–2135. 290. Yoshizawa T. Natural occurrence of Fusarium toxins in Japan / Toxigenic fungi — their toxins and health hazard (ed. H. Kurata, Y. Ueno). – Elsevier, Amsterdam, 1984. – P.292–300. 291. Yoshizawa T., Cote L.-M., Swanson S.P., Buck W.B. Confirmation of DOM-1, a deepoxidation metabolite of deoxynivalenol, in biological fluids of lactating cows // Agric. Food Chem. – 1986. – V.50. – N 1. – P.227–229. 292. Yoshizawa T., Jin Y.Z. Natural occurrence of acetylated derivatives of deoxynivalenol and nivalenol in wheat and barley in Japan // Foof Addit. Contam. – 1995. – V.12. – N 5. – P.689–694. 293. Zhou H.-R., Harkema J.R., Hotchkiss J.A., Yan D., Roth R.A., Pestka J.J. Lipopolisaccharide and the trichothecene vomitoxin (deoxynivalenol) synergistically induce apoptosis in murine lymphoid organs // Toxicol. Sci. – 2000. – V.53. – N 2. – P.253–263. 294. Zinoni F., Birkmann A., Leinfelder W., Bock A. Nucleotide sequence and expression of the selenocysteine-containing polypeptide of formate dehydrogenase (formate-hydrogenlyase-linked) from Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1987. – V.84. – N. 10. – P.3156–3160.