Физико-химические и физиологические аспекты реакции оседания эритроцитов

1

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

В. Л. Воейков ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕАКЦИИ ОСЕДАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Резюме. Несмотря на широкое применение в клинической диагностике определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ), до сих пор не существует единой теории механизма оседания красной крови. Проведен анализ агрегационной модели оседания эритроцитов, объясняющей этот процесс образованием агрегатов эритроцитов при адсорбции на них макромолекул, способствующих их адгезии, и оседанием агрегатов в соответствии с законом Стокса. Приведены данные, полученные при изучении динамики оседания красной крови, при непосредственном наблюдении за ассоциацией эритроцитов и диссоциацией образованных ими структур, которые противоречат агрегационной модели СОЭ. Рассмотрена предложенная С.Д. Балаховским модель оседания красной крови (1928 г.), в соответствии с которой эритроциты быстро формируют в условиях определения СОЭ разветвленные сети “монетных столбиков”, а оседание красной крови отражает уплотнение этой структуры, имеющее кооперативный характер. Нами предложена модель ассоциации-диссоциации эритроцитов, основанная на явлении выделения фаз в водных растворах полимеров. Показано, что в совокупности две эти модели хорошо согласуются с имеющимся массивом экспериментальных данных, включающих и данные о роли метаболической активности клеток в процессах ассоциации-диссоциации эритроцитов и оседания красной крови. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА СОЭ. Определение СОЭ -- скорости оседания эритроцитов в цельной крови -- один из самых распространенных в лабораторной клинической практике тестов. Еще в 1894 г. польский врач Эдмунд Биернаки заметил, что расслоение крови на клеточную и жидкую фракцию значительно ускоряется при различных заболеваниях [21]. Однако лишь с начала 20-х годов, после того, как Альф Вестергрен предложил удобный способ измерения скорости оседания эритроцитов в цельной крови в вертикально установленной колонке длиной 200 мм и диаметром 2.5 мм [102], метод стали широко применять в клинике. Венозную кровь стабилизируют против коагуляции цитратом натрия. Через 1 час после заполнения колонки кровью измеряют высоту столбика чистой плазмы над столбиком оседающей красной крови и регистрируют значение СОЭ в мм/час. В других вариантах этого метода, например, в методе Панченкова [12] для определения СОЭ используют пипетки внутренним диаметром 1 мм, которые заполняют до высоты 100 мм стабилизированной капиллярной кровью [14]. Нормальные значения СОЭ для лиц моложе 50 лет лежат в диапазоне от 1 до 10 мм/час (мужчины) и от 2 до 12 мм/час (женщины). Значения СОЭ превышают эти границы при острых воспалительных процессах, беременности, анемии, инфаркте миокарда, при заболеваниях щитовидной железы, при наличии злокачественных опухолей [1]. При серповидноклеточной анемии и других видах гемоглобинопатий, полицитемии СОЭ может быть резко понижена [92; 1

2

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

100]. Однако “нормальные” значения СОЭ иногда могут наблюдаться в терминальных стадиях заболевания, а при, казалось бы, легких заболеваниях СОЭ может быть весьма высокой. Поэтому несмотря на широкое применение тест на СОЭ обычно считается имеющим ограниченное диагностическое значение [106] . С другой стороны, в литературе имеются указания на то, что диагностические возможности этого метода используются далеко не полностью. В ряде работ сообщается о высокой прогностической значимости показателей СОЭ при многих заболеваниях. Так, анализ данных, полученных на большой группе перенесших инфаркт больных, выявил высокую корреляцию между значениями СОЭ, но не других гематологических тестов и вероятностью скорых неблагоприятных последствий [25]. Систематически повышенное значение СОЭ свидетельствует о высоком риске быстрой смерти при немелкоклеточном раке легких [36], хронической лимфоцитарной лейкемии [45]. Сравнение значений СОЭ у пациентов с болезнью Ходжкина до и после начала терапевтических процедур позволяет с большой степенью достоверности предсказать возможность рецидивов [46]. Повышенное СОЭ при карциноме почки также связывают с неблагоприятным прогнозом [44]. Более того, у 70% больных, которым поставлен диагноз карциномы почки, повышенные значения СОЭ наблюдались в течение нескольких лет до вынесения окончательного диагноза [78]. Утверждается, что при раке предстательной железы показатели СОЭ более надежны для прогноза, чем другие гематологические тесты [47]. Анализ СОЭ у 300 больных с диагнозом рака предстательной железы выявил высокую корреляцию между риском смерти от рака, если значения СОЭ у больного были систематически выше 20 мм/час. Дополнительные исследования выявили нелинейность зависимости между СОЭ и риском смерти. Последний снижался, если значения СОЭ лежали в диапазоне от 40 до 50 мм/час и резко возрастал при более высоких значениях [50]. Авторы отмечают, что СОЭ отражает какие-то аспекты взаимодействия опухоли и "хозяина" и считают, что показатели СОЭ свидетельствуют о состоянии защитных сил организма. Таким образом, определение СОЭ позволяет в ряде случаев вырабатывать стратегию лечения. Нет сомнения, что если бы удалось понять почему скорость оседания красной крови так зависит от состояния здоровья индивидуума, диагностическая ценность метода стала бы значительно выше. ПРОЦЕСС ОСЕДАНИЯ КРАСНОЙ КРОВИ. Как ни странно, несмотря на длительную историю использования метода, на его кажущуюся простоту, до сих пор не существует единой теории механизма оседания красной крови. А.Л. Чижевский, много лет посвятивший изучению этого явления, констатировал: “... теоретические основы механизма оседания эритроцитов не только не разработаны, но даже и не высказаны в той мере, которая необходима для элементарного понимания явления. ...В то же 2

3

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

время есть достаточные основания считать, что оценка СОЭ таит в себе большие потенциальные возможности, умение пользоваться которыми будет зависеть от глубины экспериментально-теоретического анализа этой сложной и интересной проблемы” [16, с. 4]. В современных работах также отмечается, что “несмотря на интенсивные исследования, суть процессов, протекающих в ходе оседания клеток крови, пока не находит однозначного объяснения” [62]. Для объяснения механизма оседания красной крови часто привлекают закон Стокса для оседания частиц в вязкой среде, по которому частица, плотность которой превышает плотность среды, оседает под действием силы тяжести с постоянной скоростью. Cкорость оседания пропорциональна квадрату радиуса частицы, разнице ее плотности и плотности среды, и обратно пропорциональна вязкости среды. Отсюда различия в СОЭ крови объясняют разной вязкостью плазмы, различиями в размерах оседающих частиц и их агрегатов и в их плотности. Постепенное замедление скорости оседания эритроцитов, наблюдаемое при длительном проведении опыта, объясняют увеличением вязкости и плотности суспензии в нижней части пипетки [31, 67, 69]. На основании подобных моделей некоторые авторы предлагают ускорить определение СОЭ и проводить его не за 1 час, а за более короткий период времени, экстраполируя полученные значения скорости к принятому стандарту (мм/ч) [94], либо измерять скорость осаждения эритроцитов в процессе мягкого центрифугирования [33]. Однако реальный ход оседания границы между красной кровью и чистой плазмой не согласуется с моделями этого типа. Уже с самого начала скорость движения границы между столбиком клеток и чистой плазмой непостоянна. Если измерения положения границы между плазмой и столбиком клеток проводить каждые 10-15 мин, то выясняется, что сначала скорость ее движения возрастает, а затем снижается [79]. В крови здоровых людей максимальная скорость движения границы приходится на первую половину второго часа, а при патологических процессах она достигает максимума намного быстрее [3, 9, 17]. Сообщалось, что на основании хода кривой зависимости скорости оседания от времени можно судить, например, о характере туберкулезного процесса [10]. Этот метод получил название “фракционная реакция оседания эритроцитов” [13], однако не нашел распространения, возможно, из-за своей трудоемкости. В последнее время стали появляться исследования, в которых вновь обращается внимание на существенную немонотонность процесса оседания красной крови [37, 55, 104]. Куо и соавт. использовали для записи динамики процесса оседания эритроцитов автоматизированную систему и обнаружили, что помимо начального ускорения оседания границы плазма—красная кровь на кривой зависимости скорости от времени наблюдаются кратковременные периоды резкого ускорения — замедления ее движения [56]. Авторы отмечают, что такое поведение 3

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

4

системы не может быть объяснено в рамках моделей оседания эритроцитов, основанных на законе Стокса. Мы также проанализировали динамику оседания границы между чистой плазмой и красной кровью. С использованием бинокулярного микроскопа измеряли последовательные временные интервалы, за которые граница опускалась на каждые 0.5 мм и обнаружили, что в ходе оседания крови наблюдаются периоды резкого ускорения и замедления скорости движения границы между клетками и чистой плазмой [7]. Кроме того мы обратили внимание, что столбик красной крови отрывается от мениска, разделяющего кровь и воздух, не сразу, а после латентного периода, продолжительностью в ряде случаев в десятки минут. Более подробные исследования

динамики

оседания

эритроцитов

были

проведены

с

использованием

автоматического компьютеризированного прибора, позволяющего с высокой точностью регистрировать положение границы каждые 30 сек. [6]. На Рис. 1 представлены типичные графики динамики оседания красной крови (ДОК) для крови здорового донора и больного ИБС. На кривых ДОК выделяется несколько характерных макроскопических этапов процесса, а также видны многочисленные колебания скорости оседания границы. В течение длительного времени (τ1) после установки капилляра с кровью здорового донора в измерительную систему (А) прибор не регистрирует отрыва границы плазма/клетки от мениска, разделяющего кровь и воздух. Затем, после формирования границы она начинает двигаться со скоростью, варьирующей относительно низкого среднего значения (период τ2), далее средняя скорость возрастает (период τ3), после чего достигает максимальной величины и начинает постепенно уменьшаться (период τ4). Размах колебаний скорости в последний период увеличивается. На кривой ДОК больного с диагнозом “ишемическая болезнь сердца” (Б), представленном в том же масштабе, что и график ДОК здорового донора, выявляются те же этапы процесса, но их длительность у больного короче, а средние скорости и отклонения от средних скоростей выше, чем у здорового донора. Особенно заметно увеличение максимальной скорости при переходе от третьего этапа к четвертому. 40

Скорость оседания, мм/час

35

τ4

30

Б

25 20

τ3

А

15 τ2

10 5 τ1 0 -5

τ1 0

τ2 30

τ4

τ3 60

90

120

150

180

Время от установки капилляра, мин

4

5

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

Рисунок 1. Типичные графики динамики оседания крови здорового донора (А) и больного ишемической болезнью сердца (Б). Стрелками выделены моменты перехода от одного макроскопического этапа оседания к следующему. Мы обнаружили, что предварительные воздействия на кровь заметно сказываются на динамике ее оседания. Так, например, введение в кровь специфических активаторов нейтрофилов – замозана или форболового эфира приводят к значительному удлинению фазы τ1, периоду времени, когда отрыва столбика крови от мениска не происходит [6]. В литературе также имеются интересные факты, говорящие о том, что целый ряд воздействий на кровь непосредственно перед анализом СОЭ может специфически влиять на этот процесс. Так, А.Л. Чижевский поставил более 1000 экспериментов по изучению действия обогащенного отрицательно заряженными ионами кислорода (аэроионами) воздуха. Оказалось, что контакт образцов крови в течение 4-8 мин с таким воздухом существенно снижает СОЭ крови больных туберкулезом, острым гепатитом, бруцеллезом, с диагнозом “экссудативный плеврит” и несколько снижает СОЭ в крови большинства здоровых доноров. При некоторых других заболеваниях (абсцесс легких, пиелонефрит) в крови, обработанной ионизированным воздухом, СОЭ возрастает. В особую группу Чижевский выделил кровь онкологических больных, на значения СОЭ в которой такая обработка крови не влияет или влияет много слабее, чем на кровь здоровых доноров и больных без злокачественных новообразований. [16, с. 139-152]. Интересно отметить, что отмеченное нами замедление оседания крови после добавления к ней активаторов нейтрофилов согласуется с данными Чижевского, поскольку активированные нейтрофилы начинают сами продуцировать отрицательные ионы кислорода (супероксиданион-радикалы). В обзоре Подрабинека приводится большое число данных о влиянии введения специфических антигенов даже в весьма высоких разведениях на значения СОЭ в крови сенсибилизированных к ним индивидуумов [13]. Изменение функциональной активности эритроцитов также сказывается на СОЭ. Так, ингибитор анионного транспорта 4,4’диизоцианатостилбен-2,2’-сульфонат замедляет СОЭ, тогда как ингибитор транспорта катионов оубаин не влияет на нее [37]. Неоднозначные результаты получены при исследовании влияния температуры на СОЭ. Если тест проводить при повышенной температуре, СОЭ увеличивается, если же кровь инкубировать при той же температуре до набора ее в пипетку, столбик крови оседает медленнее, чем в контроле [5]. Таким образом, характер оседания красной крови отличается от того, который наблюдается при оседании частиц в простых коллоидных и мелкодисперсных физикохимических системах. Необходимо объяснить целый ряд особенностей поведения крови. Почему в течение определенного, часто длительного времени после заполнения капилляра оседания красной крови вообще не происходит? Почему сначала наблюдается ускорение, а 5

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

6

затем замедление оседания красной крови? Почему в ходе оседания крови скорость движения границы

многократно

ускоряется

и

замедляется?

Почему

агенты,

влияющие

на

функциональную активность как эритроцитов, так и, что более неожиданно — лейкоцитов, составляющих около 0.1% клеток крови, оказывают влияние на динамику оседания красной крови? ЯВЛЕНИЕ АССОЦИАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ И “АДГЕЗИОННАЯ” МОДЕЛЬ ИХ ОСЕДАНИЯ. Для объяснения начального ускорения оседания столбика клеток за счет агрегации эритроцитов предложено несколько моделей. Все они основаны на явлении, которое в литературе называют агрегацией эритроцитов. Это явление принципиально отличается от агглютинации крови за счет ее свертывания. Еще в 1859 г. Джозеф Листер наблюдал, что в капле крови человека, помещенной между стеклянными пластинками эритроциты образуют структуры характерной формы — “монетные столбики” — стопки, в которых клетки прилегают друг к другу своими плоскими поверхностями[59] (в западной литературе эти структуры обычно называют rouleaux – рулоны). В большинстве современных моделей, описывающих механизм оседания эритроцитов, начальное ускорение оседания столбика красной крови объясняют тем, что сразу после набора крови в капилляр эритроциты представлены в виде отдельных клеток, которые оседают в вязкой среде плазмы медленно. Но клетки постепенно агрегируют, и по мере роста размеров агрегатов скорость их оседания увеличивается и возрастает скорость оседания красной крови в целом. Через какое-то время за счет уплотнения клеточной массы СОЭ замедляется. Действительно, есть много указаний на то, что существует высокая корреляция между способностью эритроцитов к ассоциации и скоростью оседания красной крови. При многих патологических состояниях, когда эритроциты легко агрегируют, значения СОЭ, как правило, повышаются. Существенные различия значений СОЭ у разных видов животных хорошо коррелируют со способностью их эритроцитов образовывать “монетные столбики”. В частности, эритроциты быка в обычных условиях не образуют комплексов [51], и значения СОЭ крови быка составляют 0,6-0,7 мм/ч [15]. Напротив, эритроциты лошади и антилопы легко объединяются в “монетные столбики”, и значения их СОЭ достигают в норме 45-64 мм/ч [68]. Однако далеко не всегда повышенная способность эритроцитов к ассоциации коррелирует с увеличением значений СОЭ. Так, при серповидноклеточной анемии значения СОЭ резко понижены – красная кровь не оседает в течение длительного времени [100]. В то же время отмытые эритроциты этих больных, помещенные в плазму здоровых людей или в растворы декстрана проявляют в 3 раза более высокую склонность к ассоциации, чем эритроциты здоровых индивидуумов [66].

6

7

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

Изучение кинетики процесса ассоциации эритроцитов также показывает, что между ассоциацией эритроцитов и оседанием красной крови взаимосвязь далеко не непосредственная. Кинетику ассоциации эритроцитов исследуют обычно в камере, представляющей собой цилиндр с прозрачными стенками, внутрь которого коаксиально помещен другой цилиндр. Кровь заливают в щель между цилиндрами. Цилиндры приводят во вращение друг относительно друга с фиксированными скоростями и быстро останавливают. При определенных скоростях вращения все ассоциаты эритроцитов распадаются на отдельные клетки, а при остановке вращения начинается образование “монетных столбиков”, их сетей или агрегатов, за которым можно следить по изменениям светорассеяния или по эхоскопии. С использованием такого подхода, а также цайтрайферной киносъемки было установлено, что в крови здоровых доноров ассоциация эритроцитов в “монетные столбики” начинается практически сразу после остановки потока и завершается по одним данным в течение 8-10 сек [80], по другим –за нескольких десятков секунд [32, 43, 53]. Почти столь же быстро ассоциируют отмытые эритроциты, перенесенные затем либо в собственную плазму [58], либо в растворы декстранов [87], которые также способствуют их ассоциации (см. ниже). Итак, скорость, с которой эритроциты образуют “монетные столбики”, а затем и более объемные структуры (сети, агрегаты) несопоставима с длительностью этапов оседания красной крови, особенно с продолжительностью первого этапа (см. Рис. 1.), когда оседание вообще отсутствует. Таким образом, хотя до самого последнего времени в работах, посвященных СОЭ, чаще всего исходят из постулата о непосредственной связи между скоростью ассоциации (агрегации) эритроцитов и скоростью оседания красной крови, целый ряд наблюдений ставит столь однозначную связь этих двух явлений под сомнение. Тем не менее, как мы увидим далее, ассоциация эритроцитов в “монетные столбики” и в структуры более высокого порядка, является ключевым фактором в процессе оседания столбика клеток в заполненном кровью капилляре. Явление ассоциации клеток далеко не тривиально и выяснение его тонких механизмов необходимо не только для объяснения механизма оседания красной крови, но и для понимания многих особенностей физиологии крови. Ассоциация и диссоциация эритроцитов происходит и в циркулирующей крови человека. При ассоциации эритроцитов в “монетные столбики” вязкость крови снижается [80], что особенно важно для ее циркуляции в микрососудистой сети [22, 38]. Когда в крови, текущей в микрососудах при низких скоростях, а, значит, малых сдвиговых усилиях эритроциты собираются в “монетные столбики”, происходит расслоение плазмы и клеток. При этом стержень, образованный “монетным столбиком”, скользит в центре сосуда по слою плазмы, разделяющей стенки сосуда и клетки [20, 29]. Для обеспечения нормального кровотока и тканевого дыхания эритроциты должны в нужный момент легко 7

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

8

ассоциировать, а при необходимости ассоциаты должны быстро распадаться на отдельные клетки [28]. При остановке кровотока (стазис) “монетные столбики” в нормальной крови образуют разветвленные структуры, которые могут “сворачиваться” образуя радиальнокольцевые системы веретенообразной формы [16, с. 18-21] и быстро распадаются на отдельные клетки при повышении скорости тока крови [71]. При многих патологических состояниях эритроциты, напротив, бессистемно объединяются в конгломераты, имеющие неправильную форму, и распадающиеся на отдельные клетки при гораздо более высоких сдвиговых усилиях [89]. Повышенная агрегируемость эритроцитов в крови при диабете, инфаркте миокарда, при пост-травматических

осложнениях

приводит

к

серьезным

нарушениям

капиллярного

кровообращения [54]. Почему же эритроциты собираются в достаточно устойчивые структуры, хотя они заряжены отрицательно и должны отталкиваться друг от друга? Некоторые авторы считали, что в экстравазированной крови заряд эритроцитов постепенно снижается из-за “стекания” его носителей с поверхности клеток [16, с. 115-130]. Такая точка зрения была основана на предположении, что поверхность клеток заряжена отрицательно за счет адсорбированных ионов. Однако в настоящее время известно, что отрицательный заряд клеточной поверхности обусловлен кислотными группировками липидов и белков -- интегральных компонентов клеточной мембраны. Заряд поверхности эритроцитов определяется высоким содержанием Nацетил

нейраминовой

кислоты

в

составе

гликофорина

—

главного

гликопротеина

плазматических мембран эритроцитов [88]. Электрофоретическая подвижность эритроцитов, отражающая нескомпенсированный заряд их поверхности в физиологическом растворе, значительно снижается после инкубации клеток с нейраминидазой [27, 95]. Поэтому предположение о “стекании” заряда с поверхности клеток приходится отвергнуть. В

соответствии

с

наиболее

широко

распространенным

в

настоящее

время

предположением, ассоциация эритроцитов обеспечивается макромолекулярными “мостиками” между ними. Согласно этой концепции агрегация эритроцитов происходит, когда силы сцепления между клетками, возникающие за счет адсорбции на них макромолекул, преодолевают электростатическое отталкивание и механические сдвиговые усилия [27, 86]. Гипотеза о “склеивании” отрицательно заряженных эритроцитов фибриногеном и гаммаглобулинами была выдвинута еще в 20-е годы, поскольку было замечено, что при высоком содержании фибриногена в плазме ассоциация эритроцитов происходит быстрее, а значения СОЭ в такой крови резко повышены [39]. Тогда считалось, что фибриноген заряжен положительно и поэтому может способствовать адгезии эритроцитов [103]. Однако позднее выяснилось, что изоэлектрическая точка фибриногена человека составляет 5,8 [70], и в плазме крови, рН которой варьирует в узких пределах вблизи значения 7,37 [11], он заряжен 8

9

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

отрицательно. Гамма-глобулины – слабоосновные белки (pI=7,3) и при рН крови они практически электронейтральны. Поэтому и их действие на агрегацию эритроцитов нельзя объяснить нейтрализацией ими зарядов на клеточной мембране эритроцитов. Более того, при увеличении рН среды, когда электроотрицательность как самих клеток, так и любых сывороточных белков должна увеличиваться, скорость ассоциации эритроцитов возрастает и образуются более крупные и прочные ассоциаты [60]. Тем не менее, старое объяснение механизма “склеивания” эритроцитов белками плазмы крови, образующими между ними солевые мостики, встречается в литературе [напр., 16, с. 13; 15]. На ассоциацию эритроцитов влияют и водорастворимые незаряженные полимеры, такие как декстран и поливинилпирролидон (ПВП). Декстраны (линейные полимеры глюкозы) со средними молекулярными массами (40 кД и ниже) улучшают реологические свойства крови за счет дезагрегирующего действия на эритроциты [57, 77]. Декстраны с молекулярными массами 70 кД и выше стимулируют ассоциацию эритроцитов [26, 93]. В большинстве публикаций, посвященных изучению влияния декстранов на ассоциацию эритроцитов, постулируется, что они адсорбируются на клеточной поверхности, обеспечивая адгезию соседних эритроцитов [напр., 65, 84, 85]. Поскольку ионные взаимодействия не могут играть существенной роли в процессах с участием незаряженных декстранов, ассоциацию эритроцитов в их присутствии пытаются объяснить образованием водородных связей. В обоснование этой гипотезы приводят данные экспериментов, в которых было показано что 6 М мочевина препятствует индуцированной декстраном агрегации фиксированных глутаральдегидом эритроцитов [49]. Даже если в столь искусственной модельной системе водородные связи и играют какую-то роль в агрегации эритроцитов, то объяснить “склеивание” эритроцитов водородными связями в присутствии ПВП намного труднее. Последний в отличие от декстрана не может образовывать значительного числа водородных связей, и тем не менее вызывает агрегацию эритроцитов даже в более низких концентрациях, чем декстран [83]. Еще труднее в рамках постулата об адгезии объяснить, каким образом “склеивают” эритроциты отрицательно заряженные полимеры, например, полиглутаминовая кислота с молекулярной массой 50-66 кД [61] или гепарин даже в терапевтических концентрациях [52]. Ассоциирующий эффект гепарина, представляющего собой интенсивно сульфатированный полисахарид, пытаются объяснить тем, что он “связывается

с сиаловой кислотой на поверхности эритроцита (!?) и обеспечивает

электростатическое притяжение между заряженными молекулами того же знака, но имеющими разную плотность заряда” [48]. Но такое объяснение не кажется убедительным. Другие макромолекулы также влияют на ассоциацию эритроцитов. Так, сывороточный альбумин ослабляет тенденцию эритроцитов к ассоциации [76]. В частности, добавление альбумина к нормальной или гипоальбуминемической плазме снижает скорость оседания в них 9

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

10

эритроцитов. Напротив, добавление альбумина к буферному раствору, содержащему фибриноген и иммуноглобулины, приводит к увеличению СОЭ, что указывает на сложное взаимодействие всех трех типов макромолекул [73]. С другой стороны, полимеры альбумина, образующиеся при нагревании плазмы до 62

0

С, стимулируют образование “монетных

столбиков” [41]. Такой же активностью обладают олигомеры альбумина, образующиеся при его гликировании. Содержание этих форм альбумина повышено в крови больных диабетом [24]. При исследовании влияния на кровь кровезаменителей на основе гемоглобинов показало, что сам гемоглобин почти не влияет на СОЭ, а его полимеры, полученные путем обработки глутаральдегидом, увеличивают значения СОЭ более чем в 50 раз. При этом эффект резко зависит от молекулярной массы полимеров [91]. Оценка расстояния между клетками, входящими в состав “монетных столбиков”, также дала неожиданные результаты. В присутствии декстрана 72 кД в изотоническом растворе (145 мМ) растворе NaCl минимальное расстояние между эритроцитами, образовавшими “монетные столбики”, составляет 0,78 мкм, а при снижении ионной силы раствора до 90 мМ NaCl (при сохранении

его

изотоничности),

когда увеличивается

электрокинетический потенциал

клеточной поверхности, оно возрастает до 1,4 мкм [90]. Эти расстояния несопоставимы с размерами молекул декстрана, которые в соответствии с адгезионными моделями должны выступать в роли “молекулярного клея”. Существуют и другие факты, которые почти невозможно объяснить в рамках агрегационной модели. Так, если один и тот же полимер способен адсорбироваться на поверхности эритроцитов разных видов животных, способствуя адгезии клеток, то следует ожидать, что в смеси эритроцитов разных видов в его присутствии образуются смешанные агрегаты. Прямые эксперименты с эритроцитами человека, кошки, собаки, крысы, мыши, кролика и морской свинки показали, что в смешанных популяциях эритроцитов в присутствии ПВП образуются “монетные столбики”, в состав которых предпочтительно входят эритроциты одного вида. Лишь эритроциты крысы и мыши объединялись в смешанные “монетные столбики”, возможно за счет того, что они принадлежали к близким видам животных [82]. Аналогичные результаты были получены другой группой исследователей, которые метили эритроциты одного вида животных флуоресцеинизотиоцианатом и смешивали с немечеными эритроцитами другого вида. После индукции образования “монетных столбиков” полимерами альбумина эритроциты двух видов полностью разделялись, хотя меченые и немеченые эритроциты одного вида образовывали смешанные “монетные столбики” [40]. Авторы делают вывод, что либо “мостиковая” гипотеза о механизме ассоциации эритроцитов неверна, либо возможность “склеивания” эритроцитов полимерами определяют какие-то дополнительные видовоспецифические факторы. 10

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

11

Ассоциация эритроцитов друг с другом зависит не только от состава среды, в которой они суспендированы, но и от свойств самих клеток. Если считать, что главную роль в ассоциации эритроцитов должен играть заряд их поверхности, то следует ожидать, что снижение плотности заряда на клеточной поверхности должно непременно способствовать агрегации клеток. Выше, однако, уже упоминалось, что с повышением рН среды тенденция к образованию ассоциатов эритроцитов не снижается, а возрастает [60]. Неоднозначные результаты получают и при обработке клеток нейраминидазой и другими ферментами. Так, после инкубации эритроцитов с нейраминидазой щель между клетками, ассоциировавшими в присутствии декстрана несколько сужалась. Но минимальных размеров (0,7 мкм)

ширина щели достигала после инкубации

клеток с проназой, хотя заряд их поверхности снижался так же, как после обработки нейраминидазой

[18].

Интересные

результаты

были

получены

при

модификации

нейраминидазой и трипсином эритроцитов быка. Ассоциации эритроцитов в крови быка в норме не происходит. Эта их особенность не связана со степенью их электронегативности: электрофоретическая подвижность эритроцитов быка даже ниже, чем эритроцитов человека или лошади, которые при остановке тока крови быстро и интенсивно ассоциируют. Эритроциты быка имеют такие же размеры, как эритроциты лошади. Концентрация фибриногена, гаммаглобулинов и общая концентрация белков в плазме крови быка, лошади и человека также мало отличается. Однако если концентрацию фибриногена в среде повысить до 10 раз по сравнению с нормой, то эритроциты быка подобно эритроцитам человека и лошади объединяются в “монетные столбики”. Особо примечательным оказалось то, что обработка эритроцитов быка нейраминидазой не способствовала их ассоциации, тогда как после обработки трипсином они легко ассоциировали даже в собственной плазме [51]. Следовательно, заряд эритроцитов не служит определяющим фактором для их ассоциации. Зависимость ассоциации эритроцитов от более тонких свойств клеток и их мембран, непосредственно не связанных с зарядом на их поверхности, следует из результатов опытов, в которых отмытые физиологическим раствором эритроциты прогревали в течение 4 мин при температуре 48,4 0С, а затем переносили в собственную плазму. После нагревания скорость ассоциации эритроцитов замедляется, но когда она завершается, количество клеток, входящих в состав “монетных столбиков”, и размеры столбиков не отличаются от контроля [58]. Аналогичные результаты были получены, когда прогретые эритроциты помещали в среду, содержащую декстран 70 кД или 173 кД [87]. При температуре выше 48,4 0С нарушаются свойства актина и спектрина, отвечающих за эластомеханические свойства клеток, и возрастает жесткость мембраны эритроцитов. Именно с этим обстоятельством, по-видимому, связано замедление ассоциации. Если же клетки прогревать в течение короткого времени при температуре 47,5 0С, или обрабатывать глутаральдегидом в концентрациях ниже 0,1 %, то 11

12

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

скорость их к ассоциации даже возрастает [74]. Мы также наблюдали заметное изменение средней скорости и особенно динамики оседания красной крови после ее прогревания при 45 0С в течение 1-2 мин: среднее значение СОЭ падает, а колебания скорости относительно среднего значения почти исчезают [7]. Способность эритроцитов к ассоциации и скорость оседания красной крови зависят и от формы эритроцитов. Так, резкое снижение СОЭ и подавление ассоциации эритроцитов наблюдается при эхиноцитозе. Наиболее высокие значения СОЭ наблюдаются, когда в суспензии эритроцитов примерно одна треть клеток представлена стоматоцитами, но при повышении степени стоматоцитоза значения СОЭ снижаются [75]. В совокупности все эти результаты свидетельствуют, что зависимость явлений ассоциации эритроцитов и оседания красной крови как от факторов среды, так и от клеточных факторов не столь проста и механистична, как она трактуется в общепринятых теориях СОЭ, непосредственно связывающих динамику этого процесса с динамикой агрегации эритроцитов, а само образование многоклеточных комплексов объясняют “склеиванием” эритроцитов друг с другом присутствующими в среде макромолекулами. Существуют, однако и другие представления как о механизме СОЭ, так и о механизме ассоциации эритроцитов, которые позволяют, с нашей точки зрения, дать более удовлетворительное объяснение этим процессам, нежели то, что дается в рамках рассмотренных выше моделей. “ГЕМОТОНИЯ” И ЕЕ РОЛЬ В ОСЕДАНИИ КРАСНОЙ КРОВИ (МОДЕЛЬ С.Д. БАЛАХОВСКОГО). Первые тщательные исследования процессов структурообразования в цитратной крови выполнил еще в 20-е годы отечественный исследователь С.Д. Балаховский [4]. Его наблюдения не только предварили многие работы, выполненные в последние годы с использованием новейшей техники, но и заставляют пересмотреть многие сложившиеся представления. Балаховский помещал кровь в вертикально установленную плоскопараллельную стеклянную камеру (высота 10-15 см, ширина 1 мм, глубина 0,1-1,0 мм) и с помощью горизонтального микроскопа изучал строение крови на разной высоте от ее верхнего края. Он обнаружил, что почти сразу после заполнения камеры в крови возникает трехмерная клеточная сеть. Она образована длинными “монетными столбиками”, которые разветвляются за счет прикрепления торцов одних столбиков к боковым поверхностям других или же за счет нарушения в отдельных участках столбика упаковки эритроцитов и выхода из таких “дефектных” участков еще одного или нескольких новых столбиков. В крови здоровых доноров сразу после образования сети боковые контакты между отдельными “нитями” относительно редки. Оседание столбика крови здорового донора главным образом обусловлено “проседанием петель” и сближением их друг с 12

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

13

другом, а не седиментацией отдельных клеток и их ассоциатов. Балаховский отметил, что скорость движения мениска между красной кровью и плазмой определяется прочностью клеточного остова, для оценки степени которой он ввел специальный термин — “гемотония”. Балаховский наблюдал, что общая масса кровяного остова проседает вначале значительно медленнее, чем отдельные эритроциты, что эритроциты в плазме не обладают броуновским движением и не отталкиваются друг от друга. Оседание красной крови останавливалось значительно раньше, чем объем общей массы эритроцитов достигал своего минимума. Как отмечалось выше, распространенные сейчас модели оседания эритроцитов основаны на

предпосылке,

согласно

которой

скорость

оседания

красной

крови

определяется

седиментационными свойствами агрегатов эритроцитов. Предполагается, что чем быстрее формируются агрегаты и чем больше их размеры, тем выше СОЭ. Балаховский, напротив, утверждал, что сама по себе агрегация эритроцитов, точнее, образование пространственной сети из “монетных столбиков” и оседание красной крови — это разные явления. Он писал: “Теория и опыт подсказывают, что агрегация ускоряет оседание истинной суспензии. Если же мы встречаемся с системой, в которой агрегация не ускоряет оседания, то приходится предположить, что эта система во многих отношениях отличается от тех, что называют взвесями” [4, с. 34]. Представления Балаховского позволяют объяснить многие описанные выше явления, кажущиеся парадоксальными с точки зрения седиментационных моделей. В частности, ярким подтверждением представлений Балаховского служат результаты, полученные с кровью больных серповидноклеточной анемией: несмотря на повышенную способность клеток к образованию ассоциатов, значения СОЭ в этой крови очень низки. Разрешается противоречие между высокой скоростью образования ассоциатов из отдельных эритроцитов после прекращения перемешивания крови (секунды – десятки секунд) и началом оседания красной крови (минуты – десятки минут). Длительность этого периода определяется гемотонией – прочностью пространственной сети, образованной разветвленными “монетными столбиками”, ее сопротивлению силе тяжести. В рамках седиментационных моделей трудно объяснить колебания скорости движения границы между красной кровью и плазмой, наблюдаемые при анализе динамики оседания крови с высоким разрешением (Рис. 1). Если же движение границы определяется проседанием кровяного остова, то последнее должно обладать кооперативностью и вполне может представлять собой немонотонно протекающий процесс. “Проседание” лишь одной петли может повлечь за собой каскад “проседаний” других, связанных с первой через узлы сети. После проседания наиболее неустойчивой в данный момент части сети вся система на какое-то время стабилизируется в новом состоянии неустойчивого равновесия, за которым следует новый каскад проседания остова. В рамках этой модели можно удовлетворительно 13

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

14

объяснить различия между динамикой оседания красной крови в норме и при патологических состояниях. Выше отмечалось, что в нормальной крови образуются “монетные столбики” правильной формы с высокой степенью разветвленности, тогда как в патологической крови образуются гораздо менее организованные клеточные структуры. Очевидно, что в этом случае устойчивость сети к проседанию будет значительно ниже. При слишком высокой скорости ассоциации эритроцитов разветвленная сеть может вообще не возникнуть, а красная кровь разобьется на отдельные плотные агрегаты, которые будут оседать в соответствии с законами седиментации. То же должно происходить и при патологически низких значениях гематокрита или в модельных системах, где изучают ассоциацию эритроцитов и оседание ассоциатов в разбавленных суспензиях клеток. Таким образом, модель механизма оседания красной крови, основанная на концепции С.Д.

Балаховского

о

гемотонии,

позволяет

объяснить

многие

факты,

кажущиеся

парадоксальными в рамках моделей, рассматривающих осаждение красной крови лишь как суммарный результат седиментации отдельных, не взаимодействующих друг с другом агрегатов клеток. Однако эта модель не затрагивает вопросов о том, почему эритроциты вообще ассоциируют, и какие факторы обеспечивают гемотонию. ФАЗОВАЯ МОДЕЛЬ АССОЦИАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ Выше была приведена сводка экспериментальных данных, которые не согласуются с общепринятой

теорией

о

механизме

ассоциации

эритроцитов

за

счет

их

адгезии,

опосредованной молекулярными “клеями”. Одна из главных проблем адгезионной теории ассоциации эритроцитов — необходимость изыскивать каждый раз особые объяснения причинам, по которым разные по химической природе и физико-химическим свойствам водорастворимые полимеры стимулируют структурообразование в суспензиях эритроцитов. Активность полимеров определяется в основном их молекулярной массой и зависит от их концентрации, причем эта зависимость носит нелинейный, часто критический характер. Особенно заметна критичность при изучении времени, требуемого для ассоциации двух эритроцитов, помещенных в водный раствор полимера -- образования их дублетов. Так, два эритроцита формируют дублет в 1% растворе декстрана 70 кД в среднем за 85 сек, в 2% растворе – всего за 4,4 сек, а в 2% растворе декстрана 173 кД дублет образуется за 0,72 сек. Эритроциты, прогретые до 48,4 0С, в 1% растворе декстрана 70 кД образуют дублет за 1000 сек, а в 2% растворе – за 10 сек. [87]. Интересно отметить, что время, за которое в цельной крови завершается образование сети из “монетных столбиков” по порядку величины мало отличается от времени, за которое происходит ассоциация двух клеток. Зависимость ассоциации эритроцитов от концентрации декстрана также носит пороговый характер [18, 72]. Зависимость СОЭ от концентрации фибриногена также не линейна, а описывается экспоненциальной 14

15

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

функцией, характерной для кооперативных процессов, к которым относятся и фазовые переходы [105]. Предлагаемая модель ассоциации эритроцитов, учитывающая эти важные особенности, основана на аналогии с открытым еще в 30-е годы явлением коацервации [23]. Коацервация представляет собой выделение из гомогенного раствора высокомолекулярных соединений капель, обогащенных растворенным веществом, и разделение гомогенной системы на две или более фазы. Каждая из них является водной, но растворенные вещества по-разному распределяются между ними. Явление разделения фаз как общее для водных растворов бинарных или многокомпонентных смесей практически любых водорастворимых полимеров (декстранов и их производных, полиэтиленгликолей (ПЭГ), водорастворимых производных целлюлозы, фиколла, ПВП, а также белков и нуклеиновых кислот) при повышении концентрации любого из растворенных веществ выше некой критической было наиболее подробно изучено Пер-Оке Альбертсоном [2].. Например, если концентрация декстрана 68 кД в воде составляет 4%, а ПЭГ 6 кД – 3,5%, раствор гомогенен, но если повысить концентрацию любого из полимеров на доли процента, то раствор разделяется на две фазы, одна из которых обогащена декстраном, а другая – ПЭГ [2, с. 43]. В многокомпонентных смесях может выделяться более десятка фаз. Чем выше молекулярные веса полимеров, тем ниже критические концентрации, необходимые для разделения фаз. Предложенные Альбертсоном двухфазные системы водорастворимых полимеров широко используются для разделения и очистки белков, нуклеиновых кислот, а также вирусов, бактерий и клеток крови, включая эритроциты. Если в смесь, например, декстрана и ПЭГ при отношении их концентраций выше критического внести какие-либо частицы, то после разделения фаз внесенное в систему вещество распределится между фазами неравномерно. В связи с проблемой механизма ассоциации эритроцитов особый интерес приобретает анализ закономерностей, выявленных при изучении поведения эритроцитов в двухфазных системах. Так, макроскопические частицы, к которым относятся эритроциты, часто не просто неравномерно распределяются между двумя жидкими фазами, а собираются на границе между ними – в интерфазе. Тенденция к уходу эритроцитов из жидких фаз в интерфазу тем сильнее, чем более отличается состав фаз от критического, т. е. чем выше концентрации полимеров и чем больше их молекулярный вес. Например, если в системах ПЭГ 6кД - декстран 19 кД или 24 кД эритроциты собираются предпочтительно в обогащенной декстранами нижней фазе, то когда используют декстраны с молекулярной массой 48 или 68 кД они уходят в интерфазу. В системе 5% декстран 48 кД - 3,5% ПЭГ 6 кД в интерфазе накапливается менее 20% эритроцитов, но при повышении концентрации декстрана до 7% там собирается более 80% эритроцитов (остальные эритроциты оказываются в верхней фазе, обогащенной полиэтиленгликолем) [2, c. 91-97; 98]. 15

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

16

Напомним, что и ассоциация эритроцитов в растворах декстранов сильно зависит от молекулярной массы последних: в растворах декстранов с молекулярными массами ниже 40 кД она затруднена, а в растворах высокомолекулярных декстранов протекает быстрее. Распределение эритроцитов в двухфазных системах зависит и от свойств самих эритроцитов. Различия в коэффициентах распределения эритроцитов различных видов животных в двухфазных системах позволяют путем многократной экстракции (метод противоточного распределения) разделять их смеси на индивидуальные популяции [99]. При этом

обнаруживается

корреляция

между

коэффициентом

распределения

эритроцитов

различных животных в двухфазных системах и способностью эритроцитов к ассоциации. Так, в системе декстран 500 кД - ПЭГ 6 кД эритроциты человека почти полностью переходят в интерфазу и верхнюю фазу, тогда как 70% эритроцитов овцы, которые в норме не ассоциируют в “монетные столбики” [101], концентрируется в нижней, обогащенной декстраном фазе [2, c. 229]. Выше отмечалось, что после обработки эритроцитов глутаральдегидом в концентрациях ниже 0,1 %, скорость их ассоциации возрастает, а эритроциты, обработанные более концентрированным глутаральдегидом, ассоциируют медленнее [74]. Низкие и высокие концентрации глутаральдегида оказывали противоположное действие и на коэффициент распределения эритроцитов в двухфазных системах [96]. Мы уже упоминали, что абсолютное значение плотности фиксированных зарядов на поверхности эритроцитов не определяет их способность к ассоциации. Оказалось, что полное удаление сиаловых кислот с поверхности эритроцитов человека также мало сказывается на коэффициентах их распределения в различных двухфазных системах. Коэффициенты распределения эритроцитов гораздо сильнее зависят от других свойств клеток, например, от отношения насыщенных к полиненасыщенным жирным кислотам в составе их мембран [97]. Липидный состав мембран влияет на вязкоэластичные свойства клеток, а последние, как отмечалось выше, играют важную роль при ассоциации эритроцитов. Что может произойти, если эритроциты поместить в раствор, соответствующий по своему составу той фазе двухфазной системы, из которой эритроциты вытесняются? Если вторая фаза отсутствует и “вытесняться” эритроцитам некуда, то необходимость снижения свободной энергии системы приведет к тому, что они с необходимостью образуют собственную фазу, что внешне будет напоминать их агрегацию или слипание друг с другом. Аналогичное явление наблюдается при смешивании, например, раствора альбумина с концентрированным раствором высокомолекулярного ПЭГ. При этом белок как бы выпадает в осадок, который, по существу, представляет собой высоко концентрированный водный раствор альбумина, то есть одну из фаз двухфазной системы [2, c. 165]. Действительно, для системы сывороточный альбумин - ПЭГ Н2О была описана фазовая диаграмма [35]. Предположим, что ассоциат или агрегат эритроцитов 16

17

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

в растворе, скажем, декстрана представляет собой своеобразную водную фазу. Содержание воды в ней, то есть в ближайшем окружении эритроцитов, достаточно высоко, что следует из приведенных выше данных о значительном расстоянии между клетками в “монетных столбиках”. Если это так, то концентрация декстрана в этой воде должна быть ниже, чем в растворе, из которого эритроциты вытеснены. Действительно, недавно были получены данные о том, что в слое воды, непосредственно прилегающем к гликокаликсу эритроцитов, помещенных в раствор декстрана 70 кД, концентрация декстрана составляет всего 10 % от его концентрации в самом

растворе [19]. Cледовательно, эритроциты не адсорбируют декстран, как

предполагается в адгезионных моделях их агрегации, а, напротив, “вытесняют” полимер, что и следует ожидать, если ассоциаты эритроцитов – отдельная фаза в их суспензии в водном растворе полимеров. Таким образом, фазовая гипотеза ассоциации эритроцитов утверждает, что в условиях, когда концентрация полимерных молекул в среде, в которой суспендированы эритроциты, превышает некоторое критическое значение, определяемое свойствами полимеров, свойствами низкомолекулярных компонентов раствора, а также свойствами эритроцитов, происходит расслоение фаз. Одна из двух новых фаз представляет коллоидный раствор, точнее, раствор высокомолекулярных полимеров, в той или иной степени обедненный эритроцитами, другая — ассоциаты эритроцитов, обедненные компонентами среды. Обе эти фазы представляют собой по-разному структурированные водные системы. Структура “эритроцитарной фазы” более или менее известна: в зависимости от условий системы возникают “монетные столбики”, их сети или же агрегаты эритроцитов. Как структурирована более “жидкая” фаза, пока неясно, хотя из химии высокомолекулярных соединений известно, что в достаточно концентрированных водных растворах полимеры также могут формировать сетеподобные ассоциаты [8]. Предложенная гипотеза позволяет ответить на много трудных для “адгезионной” модели вопросов. Так, если ассоциация эритроцитов представляет собой фазовый переход, то он будет зависеть в первую очередь от молекулярной массы и концентрации водорастворимого полимера, образующего вторую фазу, и уже в меньшей степени от его химической природы, поверхностного заряда и других его свойств. Учитывая, что разделение фаз — это критический переход, то вблизи критических условий ассоциация-диссоциация эритроцитов должна нелинейно зависеть от многих параметров системы. Такая нелинейность зависимости ассоциации эритроцитов и СОЭ от концентрации в среде полимеров, как указано выше, действительно, наблюдается. Чем выше молекулярные веса полимеров, тем легче осуществляются фазовые переходы в их растворах. Для тех белков плазмы крови, которые способствуют ассоциации эритроцитов характерны высокие молекулярные веса: 340 кД у фибриногена, от 150 до более 900 кД у 17

18

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

иммуноглобулинов и иммунных комплексов. Напротив, альбумин, который ослабляет тенденцию эритроцитов к ассоциации, имеет молекулярный вес всего 69 кД, хотя его олигомеры, как указывалось выше, оказывают противоположное действие. Если ассоциация эритроцитов представляет собой фазовый переход, то и другие параметры системы помимо концентрации м молекулярной массы основных фазообразующих частиц, а именно, рН среды, ее ионный состав, могут влиять на точку фазового перехода. Выше уже отмечалось, что при повышении рН среды скорость ассоциации эритроцитов в плазме возрастает [60]. То же самое происходит и при подкислении как плазмы, так и растворов декстрана, в которых суспендированы эритроциты [66]. Поведение эритроцитов в двухфазных системах водорастворимых полимеров также служит хорошей моделью для выявления таких зависимостей. Например, в системе Фиколл - декстран 40 кД эритроциты могут концентрироваться в верхней или нижней фазе в зависимости от ионного состава системы [64]. До сих пор мы рассматривали фазообразование в системах, находящихся в покое. Если ассоциация эритроцитов в текущей крови также представляет собой критический переход, то как он зависит от течения жидкости? С использованием эритро-агрегометра, работающего по принципу двух коаксиальных цилиндров, было показано, что для диссоциации “монетных столбиков” скорость вращения одного цилиндра относительно другого должна превысить некоторое критическое значение [32]. Интересно, что “обращение” фазового разделения происходит при механическом перемешивании и двухфазных систем водорастворимых полимеров. При перемешивании двухфазной системы, она превращается в эмульсию, но при достижении определенной критической скорости становится гомогенной. При прекращении перемешивания фазы формируются вновь [2, c 49]. Таким образом, фазовая модель ассоциации эритроцитов в водных растворах полимеров, к которым, безусловно, относится и плазма крови позволяет непротиворечиво объяснить многие факты, касающиеся ассоциации эритроцитов и связанные с ними особенности осаждения красной крови. Она помогает также подойти с новых позиций к более общим проблемам реологии крови. Очевидно, что для нормального обеспечения кислородом клеток и тканей в широком диапазоне нагрузок необходимо поддержание оптимальной динамики ассоциациидиссоциации эритроцитов. Из фазовой модели следует существование определенного оптимального “фазового пространства” критических параметров, в котором в зависимости от потребностей организма как быстрая ассоциация эритроцитов, как и их диссоциация происходит при небольших изменениях критических условий. Выход того или иного параметра или их сочетания за пределы данного “фазового пространства” может сопровождаться либо затрудненной ассоциацией эритроцитов, что должно сопровождаться повышением вязкости

18

19

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

крови и увеличением нагрузки на сердечно-сосудистую систему, либо к их повышенной агрегируемости, повышающей риск закупорки микрососудистой и капиллярной сети. Нарушения оптимальных условий ассоциации-диссоциации эритроцитов должны в той или иной степени сказываться на динамике оседания красной крови. Конкретная форма их проявления в тесте СОЭ должна зависеть от гемотонии. Можно предположить, что гемотония, в свою очередь, определяется не только чисто физико-химическими условиями системы (относительные и абсолютные концентрации в плазме крови белков, значение гематокрита, вязкоэластичные свойства эритроцитов), но и, как следует из ряда косвенных данных, зависит от метаболической активности форменных элементов крови. Об этом свидетельствуют замедление скорости оседания красной крови после добавления к ней глюкозы или активации в крови нейтрофилов и ускорение скорости ее оседания после хранения в течение нескольких часов после отбора из организма [6]. На это же указывают интересные наблюдения, говорящие о том, что эритроциты, суспендированные в растворе ПВП, сближаются друг с другом со скоростями, которые существенно превышают скорости их броуновского движения в физиологическом растворе. Аномальные скорости движения наблюдались, лишь если эритроциты были метаболически активными [42]. Против пассивной адгезии клеток друг с другом свидетельствуют и видеозаписи процесса образования дублетов эритроцитов как в их собственной плазме [34], так и в присутствии полимеров, способствующих их ассоциации [63]. После сближения друг с другом ободками две клетки сжимаются, а затем одна из них начинает наползать на другую с увеличивающейся скоростью. Клетки, образовавшие дублет, могут вращаться друг относительно друга. Если исходить из того, что распределение эритроцитов в двухфазных системах полимеров также отражает способность эритроцитов к ассоциации, то интересно отметить, что их предварительная инкубация в течение 5 мин с 1 нМ эстрадиола, но не его изомеров или другими стероидными гормонами приводит к обратимому изменению коэффициента распределения эритроцитов между двумя фазами. Это действие эстрадиола связывают с его влиянием на активность (Na, K)-АТФ-азы. [30]. Следует, однако, отметить, что этими наблюдениями почти исчерпывается список работ, в которых были сделаны попытки проанализировать вклад метаболических и физиологических факторов в процессы ассоциации-диссоциации эритроцитов, оседания красной крови, распределения клеток в двухфазных системах. В современной литературе почти не принимается во внимание, что кровь -- это не просто сложная коллоидная система, а живая ткань. После взятия крови в капилляр для измерения СОЭ на нее начинает действовать внешняя температура, свет, громадная часть ее поверхности соприкасается со стенками капилляра. Она оказывается в условиях глубокой гипоксии. Кровь не может не реагировать на все эти факторы, и возможно поэтому явление оседания клеток в крови долго именовалось "реакцией оседания эритроцитов" 19

20

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

(РОЭ). Биологические процессы, включающие и реакции биологических систем на внешние раздражители, часто носят колебательный характер. Как было показано выше, и процесс оседания границы между столбиком клеток и чистой плазмой является колебательным, что, возможно, отражает реакцию живой крови на условия, в которых она оказалась. Частота, амплитуда, продолжительность колебаний любого параметра определяется совокупностью всех свойств целостной системы, поэтому динамика процесса оседания столбика клеток в цельной крови должна отражать ее свойства значительно полнее и тоньше, чем единственное среднее значение скорости, измеренное через 1 час после начала оседания. Мы полагаем, что в совокупности

с

анализом

динамических

процессов,

происходящих

при

ассоциации-

диссоциации эритроцитов анализ динамики оседания крови может быть использован не только как существенно более информативный диагностический тест, нежели общепринятый тест на СОЭ, но позволит глубже разобраться как в физико-химических, так и в физиологических процессах, протекающих в крови вне организма.

Настоящая работа была поддержана Государственным органом сертификации "МИНРЕСУРСЭКСПЕРТИЗА" и ЗАО Центр "Анализ веществ". СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Алмазов В.А. Оседание эритроцитов. Большая медицинская энциклопедия. Москва: Советская энциклопедия. 1981. Т. 17. С. 1306-1311. 2. Альбертсон П.-О. Разделение клеточных частиц и макромолекул. 1974. М.: “Мир”, 381 с. 3. Бабицкая М.С., Мартынова Е.Я. Реакция оседания эритроцитов при круппозном воспалении легких. //Клинич. медицина. 1935. Т. 13. № 12. С. 15-18. 4. Балаховский С.Д. Реакция оседания эритроцитов. М.-Л.: ГИЗ. 1928. 149 с. 5. Бурчинский Г.И. Реакция оседания эритроцитов. Киев: Госмедизат УССР, 1962. С. 49. 6. Воейков В.Л., Гурфинкель Ю.И., Дмитриев А.Ю., Кондаков С.Э. Немонотонные изменения скорости оседания эритроцитов в цельной крови. Доклады РАН. Т. 359, N 5, с.1-5. 7. Воейков В.Л., Дмитриев А.Ю., Пирогов А.В. О биофизических механизмах реакции оседания эритроцитов. //Четвертый Международный Пущинский симпозиум “Связь биологических и физикохимических процессов с космическими и гелио-геофизическими факторами”. Тезисы докладов. Пущино. 1996. С. 129-130. 8. Воюцкий С.С. Курс коллоидной химии. Москва: Химия. 1975. С. 432-438. 9. Егоров А. Оседание эритроцитов у здоровых. //Клинич. медицина. 1932. Т. 10. № 3-4, 60-65. 10. Ляхович Я.Ф., Козлова А.М. Реакция оседания эритроцитов.//Вопр. туберкулеза. 1926. Т. 4. № 6. С. 59. 11. Навратил М., Кадлец К., Даум С. Патофизиология дыхания. М.: Медицина. 1967. С. 215. 12. Панченков Т.П. Определение оседания эритроцитов при помощи микрокапилляра. //Врач. дело. 1924. № 16-17. С. 695-697. 13. Подрабинек П.А. Современные представления о механизме РОЭ. //Успехи совр. биологии. Т. 48. В. 1 С.75-87 1959. 14. Справочник. Лабораторные методы исследования в клинике. Под ред. проф. В.В.Меньшикова, М.: Медицина, 1987. С. 122. 15. Физиология сельскохозяйственных животных. П/р. А.Н. Голикова. М: ВО “Агропромиздат”. 1991. С. 15. 16. Чижевский А.Л., Биофизические механизмы реакции оседания эритроцитов. Новосибирск: Наука. 1980.173 с. 17. Эпштейн Л.Я. Оседание эритроцитов при туберкулезе легких. //Вопр. туберкулеза. 1925.Т. 3. № 3. С. 20-23. 20

21

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

18. Baker A.J., Coakley W.T., Gallez D. Influence of polymer concentration and molecular weight and of enzymic glycocalyx modification on erythrocyte interaction in dextran solutions. //Eur. Biophys. J. 1993. V. 22. N 1. P. 53-62. 19. Baumler H., Donath E., Krabi A., et al. Electrophoresis of human red blood cells and platelets. Evidence for depletion of dextran. //Biorheology. 1996. V. 33. N 4-5. P. 333-351. 20. Bayliss L.H. Axial drift of red cells when blood flows in narrow tube. //J. Physiol. 1959. V. 149. P. 593-613. 21. Biernacki E. Uber die Bezienhung des Plasmas zu den roten Blutkorperchen und uber den Werth verschiendener Metodein der Blutkorperchenvolumbestimmung. //Z. f. physiolog. Chem. 1894. Bd.19. S. 179. 22. Braasch D. The missing negative effect of red cell aggregation upon blood flow in small capillaries at low shear forces. //Biorheology (Suppl. 1). 1984. V. 21. P. 227-230. 23. Bundenberg de Jung H.G., Kruyt H. Koazervation (Entmischung in kolloidien Systemen). //Koll.-Ztschr. 1930. Bd. 50. Nr. 1. S. 39. 24. Candiloros H., Muller S., Ziegler O., et al. Role of albumin glycation on the erythrocyte aggregation: an in vitro study. //Diabet Med. 1996. V. 13. N 7. P. 646-650. 25. Chamorro A., Vila N , Ascaso C., et al. Early prediction of stroke severity. Role of the erythrocyte sedimentation rate. //Stroke. 1995. V. 26. N 4. P. 573-576. 26. Chen S., Gavish B., Zhang S., et al. Monitoring of erythrocyte aggregate morphology under flow by computerized image analysis. //Biorheology. 1995. V. 32. N 4. P. 487-496. 27. Chien S., Sung LA., Simchon S., et al. Energy balance in red cell interactions. //Ann. N Y. Acad. Sci. 1983. V. 416. P. 190-206. 28. Cokelet G.R., Goldsmith H.L. Decreased hydrodynamic resistance in the two-phase flow of blood through small vertical tubes at low flow rates. //Circ. Res. 1991. V. 68. N 1. P. 1-17. 29. Copley A.L., Stapale P.H. Hemorheological studies on the plasmatic zone of microcirculation of the cheek pouch of chicken and syrian hamsters. //Biorheology. 1962. V. 1. P. 3-14. 30. Degani D., Bellini T., Bergamini C.M., et al. Effect of 17 beta-estradiol on partition behavior of human erythrocytes in dextran-poly(ethylene glycol) aqueous phases //Biochem. Int. 1989. V. 19. N 4. P. 687-693 31. Dobashi T., Goto H., Sakanishi A., Oka S. Erythrocyte sedimentation rate. I. Volume fraction dependence in saline solution.//Biorheology. 1987. V. 24. № 2. Р. 153-162. 32. Donner M., Saidat M., Stoltz J.F. Erythrocyte aggregation: approach by light scattering determination. //Biorheology. 1988. V. 25. P. 367-375. 33. Dschietzig T., Lerche D., Dunker N Sedimentation analyser--calibration and testing of a newly developed device for recording separation behavior of blood and other dispersed systems. //Biomed. Tech. (Berlin). 1994. V. 39. N 1-2. P. 8-12. 34. Dunlop M.J., Lee M.M., Canham P.B., Taylor C.P. Kinetics of adhesive interaction in vitro of human erythrocytes in plasma. //Microvasc. Res. 1984. V. 28. N 1. P. 62-74. 35. Edmond E., Ogston A.G. An approach to the study of phase separation in ternary aqueous systems. //Biochem. J. 1968. V. 109. N 4. P. 569-576. 36. Engan T., Hannisdal E. Blood analyses as prognostic factors in primary lung cancer. //Acta Oncol. 1990. V. 29. N 2. P. 151-154. 37. Fabry T.L. Mechanism of erythrocyte aggregation and sedimentation. //Blood. 1987. V. 70. N 5. P. 15721576. 38. Fahraeus R. Influence of rouleau formation of erythrocytes on rheology of blood. //Acta Med. Scand. 1958. V. 161. P. 151-165. 39. Fahrаeus R. The suspension stability of blood. //Physiol. Rev. 1929. V. 9. P. 241-274. 40. Forsdyke D.R., Ford P.M. Segregation into separate rouleaux of erythrocytes from different species. Evidence against the agglomerin hypothesis of rouleaux formation. //Biochem J. 1983. V. 214. N 1. P. 257260. 41. Forsdyke D.R., Palfree R.G., Takeda A. Formation of erythrocyte rouleaux in preheated normal serum: roles of albumin polymers and lysophosphatidylcholine. //Can. J. Biochem. 1982. V. 60. N 7. P. 705-711. 42. Fritz O.G., Jr. Anomalous diffusion of erythrocytes in the presence of polyvinylpyrrolidone. //Biophys. J. 1984.V. 46. N 2. P. 219-227. 43. Gaspar-Rosas A., Thurston G.B. Erythrocyte aggregation rheology by transmitted and reflected light. //Biorheology. 1988. V. 25. P. 471-487. 44. Hannisdal E., Bostad L., Gruttum K.A., Langmark F. Erythrocyte sedimentation rate as a prognostic factor in renal cell carcinoma. //Eur. J. Surg. Oncol. 1989. V. 15. N 4. P. 333-336. 45. Hannisdal E., Grшttum KA., Langmark F Erythrocyte sedimentation rate as a prognostic factor in chronic lymphocytic leukaemia. //Scand. J. Haematol. 1986. V. 36. N 3. P. 253-257. 21

22

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

46. Henry-Amar M., Friedman S., Hayat M., et al Erythrocyte sedimentation rate predicts early relapse and survival in early-stage Hodgkin disease. //Ann. Intern. Med. 1991. V. 114. N 5. P. 361-365. 47. Imai K., Suzuki T., Kobayashi M., et al. The significance of erythrocyte sedimentation rate as a prognostic factor for patients with prostate cancer: Gunma Urological Oncology Study Group investigation. //Jpn. J. Cancer Res. 1990. V. 81. N 10. P. 971-974. 48. Jan K. M. Electrochemical basis of heparin-induced red blood cell aggregation. In: Advances in Chemistry, Series, No. 188. Bioelectrochemistry: Ions? Surfaces, Membranes. M. Blank, Ed. American Chemical Society. 1980. P. 143-149. 49. Jan K.M. Role of hydrogen bonding in red cell aggregation. //J. Cell Physiol. 1979. V. 101. N 1 P. 49-55. 50. Johansson J.E., Sigurdsson T., Holmberg L., Bergstrum R. Erythrocyte sedimentation rate as a tumor marker in human prostatic cancer. An analysis of prognostic factors in 300 population-based consecutive cases. //Cancer. 1992. V. 70. N 6. P. 1556-1563. 51. Kaibara M. Rheological behaviors of bovine blood forming artificial rouleaux. //Biorheology. 1983. V. 20. N 5. P. 583-92. 52. Kameneva M.V., Antaki J.F., Watach M.J., et al. Heparin effect on red blood cell aggregation. //Biorheology. 1994. V. 31. P. 297-304. 53. Kim S.Y., Miller I.F., Sigel B., et al. Ultrasonic evaluation of erythrocyte sedimentation dynamics. //Biorheology. 1989. V. 26. P. 723-736. 54. Knisely M.H., Bloch E.H., Shiga T. Sludged blood. //Science. 1947. V. 106. P. 431-441. 55. Kuo C.D, Bai J.J,, Chien S. Erythrocyte sedimentation realizable in terms of population dynamics. //Biorheology. 1989. V. 26. N 6. P. 1003-1010. 56. Kuo C.D., Bai J.J., Chang I.T., et al. Continuous monitoring of erythrocyte sedimentation process: a new possible mechanism of erythrocyte sedimentation. //J. Biomech. Eng. 1988. V. 110. N 4. P. 392-395. 57. Lal H.B, Caroli R.K, Sen Gupta D., et al. The dispersing effect of low molecular weight dextran on human erythrocytes. An in-vitro study. //J. Assoc. Physicians. India. 1967. V. 7. P. 335-337. 58. Lerche D., Bаumler H. Moderate heat treatment of only red blood cells (RBC) slows down the rate of RBCRBC aggregation in plasma. //Biorheology. 1984. V. 21. N 3. P. 393-403. 59. Lister J. On the early stages of inflammation. //Phil. Trans. Roy. Soc. London. 1859. V. 148. P. 645-702. 60. Maeda N , Seike M., Suzuki Y., Shiga T. Effect of pH on the velocity of erythrocytes aggregation. //Biorheology. 1988. V. 25. P. 25-30. 61. Maeda N , Shiga T. Inhibition and acceleration of erythrocyte aggregation induced by small macromolecules. //Biochim Biophys Acta. V. 843. 1-2. 1985 Nov 22. 128-36. 62. Mayer J., Pospesil Z. Mechanisms of erythrocyte sedimentation. Do we know more today than Robin Fahraeus? //Vnitr. Lek. 1993. V. 39. N 6. P. 604-12. 63. McMillan D.E., Utterback N G., Lee M.M. Red cells slide as they form doublets and deform in rouleaux. //Biorheology. 1989. V. 26. N 5. P. 899-906. 64. Miheeva L.M, Zaslavsky B.Y., Rogozhin S.V. Choice of an aqueous polymer two-phase system for cell partition. / Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 542. N 1. P. 101-106. 65. Murata T., Secomb T.W. Effects of shear rate on rouleau formation in simple shear flow. //Biorheology. 1988. V. 25. N 1-2. P. 113-22. 66. Obiefuna P.C., Photiades D.P. Sickle discocytes form more rouleaux in vitro than normal erythrocytes. //J. Trop. Med. Hyg. 1990. V. 93. N 3. P. 210-214. 67. Oka S. A note on a theoretical study of erythrocyte sedimentation rate.//Biorheology. 1983. V. 20. P. 579581. 68. Popel A.S., Johnson P.C., Kameneva M.V., Wild M.A. Capacity for red blood cell aggregation is higher in athletic mammalian species than in sedentary species. //J. Appl. Physiol. 1994. V. 77. N 4. P. 1790-1704. 69. Pucchini I., Stasiw D.M., Cerny L.C. The erythrocyte sedimentation curve: a semi-empirical approach. //Biorheology. 1977. V. 14. P. 43-49. 70. Putnam F.M. Structure and function of plasma proteins. In: The Proteins. Composition, Structure and Function. Second Edition. Ed.: Hans Neurath. Academic Press. New York and London. 1965. P. 154-267. 71. Quemada D. Blood rheology and its implication in flow of blood. In: Artheries and Artherial Blood Flow. C.M. Rodkeiwcz (Ed.). Wien and New York: Springer Verlag. 1983. P. 1-127. 72. Rampling M.W., Whittingstall P. A comparison of five methods for estimating red cell aggregation. //Klin Wochenschr. 1986. V. 64. N 20. P. 1084-1088. 73. Reinhart W.H, Nagy C. Albumin affects erythrocyte aggregation and sedimentation. //Eur. J. Clin. Invest. 1995. V. 7. P. 523-528. 74. Reinhart W.H., Singh A. Erythrocyte aggregation: the roles of cell deformability and geometry. //Eur. J. Clin. Invest. 1990. V. 20. N 4. P. 458-462. 22

23

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

75. Reinhart WH., Singh A., Straub P.W. Red blood cell aggregation and sedimentation: the role of the cell shape. //Br. J. Haematol. 1989. V. 73. N 4. P. 551-556. 76. Reinke W, Gaehtgens P, Johnson P.C. Blood viscosity in small tubes: effect of shear rate, aggregation, and sedimentation. //Am. J. Physiol. 1987. V. 253. N 3. Pt. 2. P. H540-547. 77. Richter W. Normalizing effect of low molecular weight dextran fractions on the reduced suspension stability of human erythrocytes in vitro. //Acta Chir. Scand. 1966. V. 131. N 1. P. 1-8. 78. Roger M, Solberg H.E, Wetteland P. Rising erythrocyte sedimentation rate during several years before diagnosis can be a predictive factor in 70% of renal cell carcinoma patients. The benefitof knowing subjectbased reference values. //J. Intern. Med. 1996. V. 240. N 3 P. 133-141. 79. Rourke M.D., Ernstene A. C. A method for correcting the erythrocyte sedimentation rate for variation in the cell volume percentage of blood. //J. Clin. Invest. 1930. V. 8. P. 549-559. 80. Schmid-Schonbein H, Kline KA, Heinich L, et al. Microrheology and light transmission of blood. III. The velocity of red cell aggregate formation. Pflugers Arch 1975 354:4 299-317 81. Schmid-Schonbein H., Gaethgens P., Hirsh H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. //J. Clin. Invest. 1968. V. 47. P. 1447-1454. 82. Sewchand L., Canham P.B. Induced rouleaux formation in interspecies populations of red cells. //Can. J. Physiol. Pharmacol.1976. V. 54. N 4. P. 437-442. 83. Sewchand L.S., Canham P.B. Modes of rouleaux formation of human red blood cells in polyvinylpyrrolidone and dextran solutions. //Can. J. Physiol. Pharmacol. 1979. V. 57. N 11. P. 1213-1222. 84. Singh M, Joseph K.P. Erythrocytes sedimentation profiles under gravitational field as determined by He-Ne laser. VII. Influence of dextrans, albumin and saline on cellular aggregation and sedimentation rate. //Biorheology. 1987. V. 24. N 1. P. 53-61. 85. Skalak R. Aggregation and disaggregation of red blood cells. //Biorheology. 1984. V. 21. N 4. P. 463-476. 86. Skalak R., Zarda P.R., Jan K.M., Chien S. Mechanics of rouleau formation.// Biophys. J. 1981. V. 35. N 3. P. 771-781. 87. Snabre P., Baumler H., Mills P. Aggregation of human red blood cells after moderate heat treatment. //Biorheology. 1985. V. 22. N 3. P. 185-15. 88. Steck T.L., Dawson G. Topographical distribution of complex carbohydrates in the erythrocyte membrane. //J. Biol. Chem. 1974.V. 249. P. 2135-2142. 89. Talstad I., Scheie P., Dalen H., Roli J. Influence of plasma proteins on erythrocyte morphology and sedimentation. //Scand. J. Haematol. 1983. V. 31. P. 478-484. 90. Thomas N E., Coakley W.T. Localized contact formation by erythrocyte membranes: electrostatic effects.// Biophys. J. 1995. V. 69:N 4. P. 1387-1401. 91. Tsai S.P, Wong J.T. Enhancement of erythrocyte sedimentation rate by polymerized hemoglobin. //Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 1996. V. 24. N 5 P. 513-523. 92. Vinceneux P., Pouchot J., Gaudin H Relation of fever and the erythrocyte sedimentation rate. //] Presse Med. 1990. V. 19. N 24. P. 1147-1149. 93. Volger E, Schmid-Schonbein H, Gosen Jv, et al. Microrheology and light transmission of blood. IV. The kinetics of artificial red cell aggregation induced by Dextran. //Pflugers Arch. 1975. V. 354. N 4. P. 319-337 94. Wagner H., Mirzaie M., Kurz H. Description and assessment of a rapid new method for measuring erythrocyte sedimentation rate. //Med. Klin. 1989. V. 84. N 1. P. 15-22. 95. Walter H, Krob E.J. Partitioning behavior of erythrocytes in aqueous two-phase systems containing hydroxypropyl starch and polyethylene glycol. //J. Chromatogr. 1988. V. 441. N 2. P. 261-273. 96. Walter H., Krob E.J. Fixation with even small quantities of glutaraldehyde affects red blood cell surface properties in a cell- and species-dependent manner. Studies by cell partitioning. //Biosci. Rep. 1989. V. 9. N 6. P. 727-735. 97. Walter H., Krob E.J., Brooks D.E. Membrane surface properties other than charge involved in cell separation by partition in polymer, aqueous two-phase systems. //Biochemistry. 1976. V. 15. N 14. P. 2959-2964. 98. Walter H., Raymond F.D., Fisher D. J. Erythrocyte partitioning in dextran-poly(ethylene glycol) aqueous phase systems. Events in phase and cell separation. //Chromatogr. 1992 .V. 609. N 1-2. P. 219-227. 99. Walter H., Widen K.E. Cell partitioning in two-polymer aqueous phase systems and cell electrophoresis in aqueous polymer solutions. Red blood cells from different species. //J. Chromatogr. A. 1994. V. 668. N 1. P. 185-190. 100.Webber D., Nunan T.O., O'Doherty M.J. The effect of varying type and volume of sedimenting agents on leukocyte harvesting and labelling in sickle cell patients. //Nucl. Med. Commun. 1994. V. 15. N 9. P. 735741.

23

24

Успехи физиологических наук, т. 29, N 4, с. 55-73, 1998.

101.Weng X., Cloutier G., Pibarot P., Durand L.G. Comparison and simulation of different levels of erythrocyte aggregation with pig, horse, sheep, calf, and normal human blood. // Biorheology. 1996. V. 33. N 4. P. 365377. 102.Westergren A. Studies on the suspension stability of the blood in pulmonary tuberculosis. //Acta Med. Scand. 1921.V. 54. P. 247-281. 103.Wohlisch E., Bohnen P. Microscopische Untersuchungen ann Schwangerenblut.//Klin. Wschr. 1924. S. 472. 104.Woodland N B., Cordatos K., Hung W.T., et al. Erythrocyte sedimentation in columns and the significance of ESR. //Biorheology. 1996. V. 33. N 6. P. 477-488 105.Zhao T.X., Jacobson B. Quantitative correlations among fibrinogen concentration, sedimentation rate and electrical impedance of blood. //Med. Biol. Eng. Comput. 1997. V. 35. N 3. P. 181-185. 106.Zlonis M. The mystique of the erythrocyte sedimentation rate. A reappraisal of one of the oldest laboratory tests still in use. //Clin Lab Med. 1993. V. 13. P. 787-800.

24