Картирование генома и обратная генетика. Избранные лекции по курсу ''Генетика с основами селекции'': Учебное пособие

Ф е де рал ь ное аге нс тво по образованию В О Р О Н Е Ж СКИ Й ГО СУД А Р СТВ Е Н Н Ы Й УН И В Е СИ ТЕ Т

А .К. Буторина, О .С. М аш кина К А Р ТИ Р О В А Н И Е Г Е Н О М А И О Б РА ТН А Я Г Е Н Е ТИ К А И З Б РАН Н Ы Е Л Е К Ц И И п о курсу “ Г енетикас основами селекц ии” У Ч Е Б НО Е П О С О Б И Е 020201 ( 011600) – Б иология

В ороне ж 2005

2

Утве ржде но научно-ме тодичес ким с ове том биол ого-почве нного факул ь те та3 ию ня 2005 года, протокол № 4

А вторы : БуторинаА .К. М аш кинаО .С.

Учебное пос обие подготовл е но на кафе дре ге не тики, с е л е кц ии и те ории эвол ю ц ии биол ого-почве нного факул ь те та В ороне жс кого гос ударс тве нного униве рс ите та Р е коме ндуе тс я дл я с туде нтов биол ого-почве нного факул ь те та дне вной и ве черне й формы обучения

3

СО Д Е Р Ж А Н И Е В В Е Д Е Н ИЕ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1. КА Р ТИ Р О В А Н И Е ГЕ Н О М А . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1. Ц итол огичес кие карты хромос ом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.1. Гибридизац ия in situ: ISH - и FISH-гибридизац ия . . . . . . . . . . 1.1.2. Х ромос омны й пе й нтинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.3. Гибридизац ия с оматичес ких кл е ток. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. Ге не тичес кое картирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3. М ол е кул ярны е марке ры Д Н К и их ис пол ь зование дл я ге не тичес кого картирования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.1. П Д Р Ф -марке ры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.2. М ол е кул ярны е марке ры , ос нованны е напол име разной ц е пной ре акц ии (П Ц Р -марке ры ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.3. М икрос ате л л иты и минис ате л л иты какмол е кул ярны е марке ры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4. Ф изичес кое картирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.1. Создание ре с трикц ионны х карт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.2. Создание упорядоченны х библ иоте ккл онов. Карты контиг. П роц е дура“П рогул капо хромос оме ” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4.3. Страте гии пос троения физичес кой карты вы с окого разре ш е ния . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5. О пре де л е ние нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти ге нома (с е кве нирование ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6. Базы данны х нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й . Компь ю те рная ге не тика(биоинформатика). И с с л е дования in silico . 1.7. Кандидатное картирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2. ГЕ Н О М И КА , П Р О ТЕ О М И КА И “О БР А ТН А Я ГЕ Н Е ТИ КА ” . . . . . . . 2.1. Ге номика. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2. О ртол огичны е и парал огичны е ге ны . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3. “О братная ге не тика” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4. П роте ом и проте омика. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5. Д Н К-микрочипы (Д Н К-пол я) и приме ры их ис пол ь зования дл я изучения ге номов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6. Н е которы е итоги с равните л ь ного анал изаге номов разл ичны х организмов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3. О БЛА СТИ П Р И М Е Н Е Н И Я Р Е ЗУЛЬТА ТО В КА Р ТИ Р О В А Н И Я ГЕ Н О М А . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1. Ге номная ме диц ина. Д Н К-диагнос тика. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2. О бнаруже ние мутац ий при нас л е дс тве нны х забол е ваниях чел ове ка. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3. Ге не тичес кий пас порт и е го значение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . СЛО В А Р Ь ТЕ Р М И Н О В . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Р Е КО М Е Н Д УЕ М А Я ЛИ ТЕ Р А ТУР А . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4 5 6 8 9 11 11 14 15 16 25 27 28 30 30 34 37 39 40 40 42 43 44 45 48 51 51 55 59 60 59

4

ВВЕ ДЕ Н И Е Картирование ге номов разл ичны х видов, т.е . ус тановл е ние пол оже ния конкре тны х ге нов относ ите л ь но других ге нов в хромос омах и изучение их нукл е отидного с ос тава явл яе тс я фундаме нтал ь ны м направл е ние м с овре ме нной ге не тики, пос кол ь ку о с те пе ни ге не тичес кой изученнос ти видов с удят по “нас ы щ е ннос ти” ге нами их хромос ом. Ус тановл е ние пол оже ния и природы ге нов откры вае т возможнос ти дл я манипул ирования ими. Э то ис кл ю чите л ь но важно дл я с е л е кц ии с е л ь с кохозяй с тве нны х рас те ний и животны х, так как обе с пе чивае т возможнос ть дл я направл е нного подбора пар при гибридизац ии с ц е л ь ю пол учения гибридов, обл адаю щ их же л ае мы ми признаками. Э то не обходимо и дл я ис с л е дований по ге нной инже не рии, в ходе которы х инте ре с ую щ ий нас ге н л ибо вы де л яю т из организма с помощ ь ю с пе ц иал ь ны х прие мов, л ибо с инте зирую т, зная е го нукл е отидны й с ос тав. Как отме чае т А .И . М ирош ников (2004), “П о мне нию ве дущ их мировы х экс пе ртов, ге нная инже не рия буде т ш ироко ис пол ь зовать с я чел ове чес твом дл я ре ш е ния с воих гл обал ь ны х пробл е м в XXI ве ке , и по мас ш табам приме не ния будут с равнима с информац ионны ми те хнол огиями, а также те хнол огиями, приме няе мы ми дл я производс твановы х мате риал ов и эне ргии… В с оотве тс твии с прогнозами аме риканс ких экономис тов тол ь ко ге не тичес кие подходы обе с пе чат экономике СШ А к 2025 г. 20% прирос т вал ового нац ионал ь ного продукта, что с ос тавит окол о 2 трил л ионов дол л аров чис той прибы л и” . В обл ас ти ме диц ины картирование ге нов, отве тс тве нны х за нас л е дс тве нны е забол е вания чел ове ка, позвол яе т разрабаты вать ме тоды их ранне й диагнос тики и ге ноте рапии наос нове ге нно-инже не рны х подходов. В ажнос ть и с л ожнос ть пробл е мы картирования ге нома и в то же вре мя не дос таточное ос ве щ е ние е е в име ю щ ихс я учебниках по ге не тике обус л овил о не обходимос ть напис ания данного учебного пос обия с привл е чение м мате риал ов нове й ш е й пе риодичес кой л ите ратуры . М ы с очл и также ц е л е с ообразны м познакомить с туде нтов с с амы ми с овре ме нны ми направл е ниями мол е кул ярной ге не тики – ге номикой и проте омикой , ме тодол огичес кими подходами “обратной ге не тики” дл я ус тановл е ния функц ии ге нов и с ис пол ь зование м Д Н К-микрочипов (биочипов) дл я изучения ге номов. В учебном пос обии рас с матриваю тс я также пробл е мы ге не тики in silico – компь ю те рной ге не тики ил и биоинформатики, которая позвол яе т ис пол ь зовать и инте рпре тировать обш ирную информац ию , пол учае мую в мол е кул ярно-ге не тичес ких ис с л е дованиях, ос обе нно при анал изе пе рвичной с труктуры ц е л ы х ге номов вы с ш их организмов, а также гл обал ь ны х профил е й экс пре с с ии ге нов с приме не ние м биочипов. О граниченнос ть вре ме ни, отве де нного на чте ние л е кц ий по курс у “Ге не тика с ос новами с е л е кц ии” , не позвол яе т, к с ожал е нию , ос ве тить в л е кц иях вс е вопрос ы , кас аю щ ие с я гл авны х направл е ний с овре ме нной ге не тики. П оэтому, нанаш взгл яд, данное учебное пос обие може т пре дс тавл ять инте ре с дл я с туде нтов вс ех форм обучения, бакал авров, магис тров,

5

ас пирантов и пре подавате л е й -биол огов, а также химиков, физиков, мате матиков и других с пе ц иал ис тов, инте ре с ую щ ихс я пробл е мами с овре ме нной ге не тики. 1. К А Р ТИ РО В А Н И Е Г Е Н О М А Г еном – это с овокупнос ть кодирую щ их и не кодирую щ их пос л е довате л ь нос те й (с уммарная ге не тичес кая информац ия) кл е тки и организма. Н априме р, ге ном вирус ов, ге ном бакте рий – это вс я их (тотал ь ная) Д Н К (ил и Р Н К у вирус ов), а говоря о геноме дипл оидны х организмов, наприме р, пш е ниц ы ил и чел ове ка, име ю т в виду с овокупнос ть ге нов их гапл оидного (гаме тичес кого) набора. Э то ус ре дне нное , общ е е с трое ние Д Н К – разме ры и ос обеннос ти организац ии, пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов и др. П оэтому ге ном - это характе рис тикавидав отл ичие от ге нотипа– характе рис тики каждого индивида. Соматичес кие кл е тки чел ове кас оде ржат 2n=46 хромос ом, из них 44 аутос омы - одинаковы е у обоих пол ов (22 пары гомол огичны х хромос ом) и две пол овы е хромос омы (гонос омы ). У л иц же нс кого пол ас оде ржитс я пара гомол огичны х пол овы х хромос ом (Х Х ), а у л иц мужс кого пол а – две ге те рол огичны е хромос омы (Х У). Ге ном чел ове кавкл ю чае т 23 хромос омы (22 аутос омы и одну из двух пол овую хромос ому – Х ил и У), 32 ты с . с труктурны х ге нов и пре дс тавл е н 3,2 мл рд нукл е отидны х пос л едовате л ь нос те й (пн). О с те пе ни ге не тичес кой изученнос ти вида с удят по пл относ ти (ил и нас ы щ е ннос ти) ге не тичес ких карт е го хромос ом. К артирование генома – это ус тановл е ние пол оже ния конкре тны х ге нов (ил и фрагме нтов Д Н К) на опре де л е нны х хромос омах относ ите л ь но других ге нов (ил и фрагме нтов Д Н К). О но базируе тс я на ис пол ь зовании тре х ос новны х ме тодов (ил и подходов): ге не тичес кого, ц итол огичес кого и физичес кого. Карты ге нома, как и ге ографичес кие карты , можно с троить в разном мас ш табе , т.е . с разны м уровне м разре ш е ния. П риме ром с амой ме л комас ш табной карты явл яе тс я идиограмма дифференц иально окрашенных хромосом, с амой крупномас ш табной картой ге нома явл яе тс я пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов в мол е кул е Д Н К, входящ е й в с ос тав каждой хромос омы . Сл е довате л ь но, один нукл е отид явл яе тс я пре де л ь но возможны м уровне м разре ш е ния накарте ге нома. Таким образом, информац ия о с труктуре ге номаможе т бы ть пол учена в ре зул ь тате пос трое ния ге не тичес ких, ц итол огичес ких, физичес ких и ре с трикц ионны х карт хромос ом. Р ас с мотрим картирование ге номанаприме ре чел ове ка. Задача изучения ге нома чел ове ка приобре л а ос обую значимос ть в с вязи с ос ознание м учены ми не пос ре дс тве нной с вязи бол ь ш инс твабол е зне й чел ове кас повре жде ние м е го ге нома. П оэтому в 1987 г. по иниц иативе проф. Гарвардс кого униве рс ите та л ауре ата Н обе л е вс кой пре мии Уол те ра

6

Гил бе рта бы л а разработана ме ждународная программа “Ге ном чел ове ка” , объе динивш ая ус ил ия учены х 50 разны х с тран, в том чис л е и Р ос с ии. Ц е л ь ю этой очень дорогос тоящ е й программы бы л о: 1) ус тановл е ние групп с ц е пл е ния и л окал изац ия ге нов нахромос омах; 2) прочте ние (ил и с е кве нирование ) вс е х 3,2 мл рд пн в с ос таве ге нома чел ове ка и с ос тавл е ние подробной ге не тичес кой карты е го хромос ом; 3) изучение функц ии ге нов; 4) разработка ме тодов ге ноте рапии, т.е . ис правл е ние де фе ктов ге нов, отве тс тве нны х за нас л е дс тве нны е бол е зни чел ове ка. П ри ус пе ш ном вы пол не нии данной программы у чел ове чес твапоявятс я пе рс пе ктивы понять ме ханизмы функц ионирования каждого из е го ге нов, принц ипы развития организма, ге не тичес кие причины многих нас л е дс тве нны х бол е зней и ме ханизмы с таре ния. К конц у XX с тол е тия бы л и пол нос ть ю рас ш ифрованы нукл е отидны е пос л е довате л ь нос ти, входящ ие в ге ном чел ове ка. П ос л е того как бы л и опре де л е ны нукл е отидны е пос л е довате л ь нос ти двух с амы х ме л ких хромос ом – 21 и 22-ой (2000г.), проц е дура с е кве нирования бы л а нас тол ь ко отработана, что с тал а, по с ущ е с тву, рутинной . О с тал ис ь до конц ане ре ш е нны ми такие задачи программы , как пол ное ге не тичес кое картирование , изучение функц ий вс е х 32 ты с ячге нов, ус тановл е нны х в геноме чел ове ка, и ге ноте рапии многих нас л е дс твенны х забол е ваний . Таким образом, ос новны ми ме тодами изучения ге нома явл яю тс я картирование и с е кве нирование . 1.I. Ц и т ологи ческ и е к арт ы хромосом П одробны е ц итол огичес кие карты хромос ом с озданы по чел ове ку с ис пол ь зование м ме тода диффе ре нц иал ь ного окраш ивания, которы й в отл ичие от прос той (монохромной = с пл ош ной ) окрас ки хромос ом, позвол яе т иде нтифиц ировать каждую хромос ому, вы явл ять их с труктурную разнороднос ть по дл ине , что вы ражае тс я в виде чере дования с ве тл ы х и те мны х пол ос . Чис л о и протяже ннос ть вы явл яе мы х при диффе ре нц иал ь ном окраш ивании пол ос характе ризую тс я пос тоянс твом и с пе ц ифичнос ть ю дл я каждой хромос омы (рис унок 1). К этим пол ос ам каждой хромос омы привязы ваю т ме с топол оже ние конкре тного ге на. В пе рвы е ме тод диффе ре нц иал ь ного окраш ивания хромос ом с помощ ь ю фл уоре с ц е нтны х крас ите л е й (Q-окрас ка) бы л пре дл оже н в 1968 г. Кас пе рс с оном с с отрудниками. П озже появил ис ь другие ме тоды окрас ки – G -, R -, C – и Т- окрас ка. О с обе нно подробно у чел ове каизученаХ -хромос ома, в час тнос ти, те е е учас тки, которы е находятс я в ге мизиготном с ос тоянии (рис унок2). П л е чи вс е х хромос ом, в том чис л е и Х -хромос омы , p – короткие и q дл инны е подразде л е ны нарай оны (у Х -хромос омы их два), в пре де л ах которы х с ве тл ы е и те мны е пол ос ы (бэнды = с е гме нты , ил и учас тки) пронуме рованы . Р ай оны и бэнды нуме рую тс я арабс кими ц ифрами от ц е нтроме ры к те л оме ре , отде л ь но дл я каждого пл е ча. Запис ь пол оже ния ге на на карте вкл ю чае т номе р хромос омы , пл е чо, номе р рай она и бэнда. Н априме р, пол оже ние гена GGPD указы вае тс я как Х q28, что означае т, что ге н

7

рас пол оже н в вос ь мом бэнде второго рай она дл инного пл е ча Х хромос омы .

Р ис унок 1. Схе матичес кое изображе ние гапл оидного набора хромос ом чел ове капри диффе ре нц иал ь ной окрас ке (G-ме тод) [Захаров, 1982].

8

Запис ь 7p11 означае т, что ге н л окал изован в первом бэнде первого рай онакороткого пл е чахромос омы 7. П одобная запис ь позвол яе т л окал изовать ге н с точнос ть ю до одного бэндаи даже е го с убъе диниц ы .

Р ис унок 2. Д иффере нц иал ь но окраш енная Х -хромос ома чел ове ка [Захаров, 1982]. П ри ц итологическом картировании изучение диффе ре нц иал ь но окраш енны х хромос ом позвол яе т обнаружить крупны е хромос омны е пе ре с трой ки путе м с равне ния ис с л е дуе мого образц ас контрол ь ны м. П риме ните л ь но к чел ове ку дл я ц итол огичес кого картирования ис пол ь зую т кл е тки пац ие нтов с хромос омны ми бол е знями. Е с л и у бол ь ного обнаруже наде л е ц ия опре де л енного учас ткаконкре тной хромос омы и в то же вре мя ус тановл е но наруш е ние функц ии какого-л ибо ге на, то очевидно, что ге н находитс я в этом учас тке . П ри ш ироком изучении хромос омны х бол е зне й появил ас ь возможнос ть пол учения набора кл е ток с де л е ц иями разной дл ины , т.е . возможнос ть с оздания п анелей клеток дляразных хромосом. 1.1.1. Г ибр идизация in situ: ISH- и FISH- гибр идизация П рямы м ме тодом картирования ге нов нахромос оме явл яе тс я ме тод гибридизац ии нукл е иновы х кис л от. В ариац ии ме тода(гибридизац ия in situ – на ме с те ): ISH (in situ hybridization) и FISH (fluorescence in situ hybridization) ис пол ь зую тс я в те х с л учаях, когдаиме ю тс я пробы , ил и зонды с изве с тны ми (с е кве нированны ми) нукл е отидны ми пос л е довате л ь нос тями. З онды – это ис кус с тве нно с инте зированны е ме чены е : радиоактивны ми изотопами (при ISH – гибридизац ии) ил и фл уоре с ц е нтны ми крас ите л ями – химичес ки (при FISH- гибридизац ии) не бол ь ш ие (10-30 нукл е о-

9

тидов) с е гме нты одноц е почечной Д Н К (ил и Р Н К), компл е ме нтарны е ис комому ге ну. Э ти короткие ол игонукл е отиды с ое диняю тс я тол ь ко с те м учас тком Д Н К, которы й с оде ржит пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов, с трого с оотве тс твую щ ую (компл е ме нтарную ) пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов зонда. Сл е довате л ь но, нал ичие с вязавш е й с я с Д Н К ме тки с вы с окой точнос ть ю с виде те л ь с твуе т о прис утс твии в анал изируе мом образц е ис комы х пос л е довате л ь нос те й нукл е отидов. Локус ы ге нов, компл е ме нтарны е зондам, могут бы ть картированы не пос ре дс тве нно на хромос оме путе м ре гис трац ии радиоактивной ме тки (при ISH-гибридизац ии) ил и рис унку окраш е нны х фл уоре с ц е нтны м крас ите л е м пол ос (при FISH-гибридизац ии). Таким образом, гибридизац ияin situ – это ме тод вы явл е ния (картирования) опреде л е нны х учас тков мол е кул ы Д Н К напре паратах хромос ом, где пос л е де натурац ии Д Н К (путе м нагре вания ил и обработки щ е л очью ) ос ущ е с твл яе тс я е е отжиг с одноц е почечны ми компл е ме нтарны ми зондами. О тж иг – это проц е с с вос с тановл е ния (ре натурац ии) двухц е почечной мол е кул ы Д Н К из однонитчаты х пол инукл е отидны х ц е пе й путе м пос те пе нного охл ажде ния. О бразование гибридны х дупл е кс ов проис ходит тол ь ко при ус л овии компл е ме нтарнос ти ос нований ис с л е дуе мой мол е кул ы Д Н К и мол е кул ы зонда, что можно ус тановить с помощ ь ю ме тодаавторадиографии (в с л учае ISH-гибридизац ии) ил и приме не ния фл уоре с ц е нтного микрос копа(при FISH-гибридизац ии). В ы ш е названны е ме тоды ис пол ь зую тс я не тол ь ко дл я картирования хромос ом чел ове ка, но и многих животны х, а также рас те ний (наприме р, пш е ниц ы ). Какова разре ш аю щ ая с пос обнос ть данного ме тода? П ри рутинной (обы чной ) окрас ке хромос ом с амы й мал е нь кий наруш е нны й учас ток хромос омы в виде де л е ц ий ил и дупл икац ий , которы й можно разл ичить под с ве товы м микрос копом, с оде ржит 30⋅106 нукл е отидов. П риме не ние ме тодов диффе ре нц иал ь ной окрас ки хромос ом уве л ичивае т такую возможнос ть до (7… 10)⋅106 нукл е отидов. Д л я вс е х хромос ом чел ове ка пос трое ны ме л комас ш табны е ге не тичес кие карты с рас с тояние м ме жду с ос е дними марке рами 7-10 мл н. пар нукл е отидов ил и 7-10 М б (ме габаз; 1 М б=1 мл н пн). Совре ме нны е ме тоды гибридизац ии in situ с ис пол ь зование м ме тафазны х хромос ом, гл авны м образом, ме тод FISH, л окал изую т ге не тичес кие марке ры в пре де л ах 2–5 мл н пн. Бол е е того, при гибридизац ии in situ с инте рфазны ми хромос омами, в которы х ге не тичес кий мате риал находитс я в ме не е компактной форме , разре ш аю щ ая с пос обнос ть хромос омны х карт прибл ижае тс я к 100 тпн. Совре ме нны е с ве де ния о ге не тичес ких картах чел ове кас оде ржат информац ию о бол е е чем 50000 марке ров. 1.1.2. Хр омосомный пейнтинг В ц итоге не тике конц а90-х годов 20 ве капоявил ис ь новы е мощ ны е ме тоды , в ос нове которы х л е жит фл уоре с ц е нтная гибридизац ия нукл е иновы х кис л от in situ (FISH-гибридизац ия). Э то с вязано с приме не ние м новы х, бол е е эффе ктивны х фл уорохромов и нового оборудования дл я анал иза

10

микрос копичес ких изображе ний – ц ифровы х фотоаппаратов, с ое дине нны х с микрос копом и компь ю те ром (CCD-каме р) вме с то фотокаме р. О дним из наибол е е разре ш аю щ их ме тодов явл яе тс я многоц ветнаяфлуоресц ентная гибридизац ия ил и хромосомный п ейнтинг (хромос омная живопис ь ). Д л я пол учения многоц ве тны х изображе ний ис пол ь зую т разл ичны е фл уорохромы , которы ми ме тят разны е зонды Д Н К. И нформац ия об инте нс ивнос ти с ве чения каждого фл уорохромазапис ы вае тс я накомпь ю те ре отде л ь но и каждому из таких изображе ний прис ваивае тс я с вой с обс тве нны й пс е вдоц ве т. О дновре ме нное ис пол ь зование не с кол ь ких фл уорохромов позвол яе т пол учить не с кол ь ко пс е вдоц ве тов. Н априме р, е с л и фрагме нт хромос омы , окраш е нны й фл уорохромом а, буде т давать один пс е вдоц ве т, фрагме нт, окраш е нны й фл уорохромом b - другой , то фрагме нт, окраш е нны й a и b одновре ме нно, буде т давать тре тий пс е вдоц ве т. И с пол ь зование n фл уорохромов позвол яе т одновре ме нно опре де л ить л окал изац ию 2n-1 фрагме нтов Д Н К. Н априме р, приме не ние пяти фл уорохромов дае т возможнос ть анал изировать ре зул ь таты одновре ме нной гибридизац ии in situ 31 фрагме нта Д Н К. Н овая приборная базапозвол яе т ре гис трировать с ве рхс л абы е с ве товы е с игнал ы , не дос тупны е гл азу чел ове ка и с ве товы е с игнал ы с дл иной вол ны , вы ходящ ими запре де л ы видимого с ве та. П ри ис пол ь зовании тре х фл уорохромов каждую хромос ому чел ове каможно окрас ить в с вой с обс тве нны й пс е вдоц ве т. О крас ка хромос омы бол е е чем одним ц ве том с виде те л ь с твуе т о нал ичии транс л окац ии. Е с л и с де л ать библ иоте ку фрагме нтов Д Н К не из ц е л ой хромос омы , а из отде л ь ны х учас тков индивидуал ь ны х хромос ом, то можно идентифиц ировать пол оже ние этих учас тков. В нас тоящ е е вре мя в ряде диагнос тичес ких ц е нтров не которы е варианты многоц ве тной FISH ис пол ь зую тс я в качес тве рутинны х ме тодов при анал изе хромос омны х пе ре с трое к у чел ове ка. В пос л е дние годы дл я с равните л ь ного изучения ге номов разны х видов ис пол ь зуе тс я е щ е ц е л ы й ряд новы х ме тодов по пе ре кре с тной гибридизац ии Д Н К одного видас кариотипом другого. К их чис л у относ итс я ме тод Zoo-FISH (пре дл оже нны й в 1990 году). Так, с ис пол ь зование м такого ме тода у нас в с тране бы л и вы явл е ны зоны гомол огии ме жду хромос омами чел ове каи бурундука. П о с ос тоянию на1998 год в мире проводил и подобны е с опос тавл е ния набол е е чем 200 видах мл е копитаю щ их. В ре зул ь тате такой работы бы л о ус тановл е но, наприме р, что 17 хромос омачел ове каявл яе тс я дос таточно конс е рвативной и име е т пол ную гомол огию с с оотве тс твую щ ими ц е л ы ми хромос омами с винь и, бы ка, л ош ади, кош ки ил и с ц е л ы ми пл е чами хромос ом норки и тю л е ня, с отде л ь ны ми с е гме нтами хромос ом ол е ня мунжака, овц ы , ш импанзе , макаки, кита-финвал а. Д л я оц е нки ге номного дис бал анс ав кл е тках разл ичны х организмов в нас тоящ е е вре мя ш ирокое рас прос тране ние пол учил мол е кул ярноц итоге не тичес кий ме тод – CGH (Comparative Gemomic Hybridization = с равните л ь ная ге номная гибридизац ия), впе рвы е опис анны й в 1992 Кал л ионие ми с с оавторами. Е го приме няю т дл я иде нтификац ии и характе ри-

11

с тики чис л овы х и с труктурны х хромос омны х наруш е ний в кл е тках разны х ткане й при разл ичны х патол огичес ких с ос тояниях у чел ове ка, ос обе нно при ис с л е довании раковы х забол е ваний . 1.1.3. Г ибр идизация соматических клеток П ри ц итол огичес ком картировании ис пол ь зуе тс я также гибридизац ия соматических клеток. В ус л овиях кул ь туры можно пол учить с оматичес кие гибриды кл е ток чел ове каи разл ичны х гры зунов: чел ове к – мы ш ь , чел ове к – кры с а, чел ове к – хомяк. Э ти животны е л учш е изучены в ге не тичес ком отнош е нии. Так, к 2002 году бы л пол нос ть ю изучен ге ном мы ш и. О казал ос ь , что многие ге ны в геноме мы ш и гомол огичны по с труктуре ге нам чел ове ка. Н аос новании этого удал ос ь ус тановить функц ию 1200 ге нов чел ове ка. У мы ш и и других упомянуты х животны х в нас тоящ е е вре мя дос тупно значите л ь ное чис л о марке ров по ге нам, контрол ирую щ им пути ме табол изма. Такие отдал е нны е гибриды характе ризую тс я не с табил ь нос ть ю их ге номаи при размноже нии гибридны х кл е ток те ряю тс я хромос омы чел ове ка(как име ю щ ие бол е е ме дл е нны й те мп размноже ния). П оте ря хромос ом нос ит с л учай ны й характе р, и образую щ ие с я кл оны кл е ток с оде ржат ос тавш ие с я хромос омы в разны х с очетаниях. Так пол учаю т пане л и гибридны х кл е точны х кл онов, с оде ржащ их вс е го одну-две хромос омы чел ове каи пол ны й набор хромос ом другого вида. П ричем, хромос омы чел ове ка л е гко иде нтифиц ирую тс я с помощ ь ю ц итоге не тичес ких ме тодов. Э то позвол яе т ве с ти парал л е л ь ны е ис с л е дования какого-л ибо биохимичес кого признакаи хромос омного набора. Е с л и ис чезнове ние какого-л ибо признака с овпадае т с ис чезнове ние м опре де л е нной хромос омы , можно с де л ать вы вод о том, что ге н, контрол ирую щ ий этот признак, л окал изован в ис чезнувш е й хромос оме чел ове ка. Так, впе рвы е удал ос ь л окал изовать ге н тимидинкиназы в 17 хромосоме человека. Д ругой приме р. Инс ул ин чел ове ка с инте зирую т тол ь ко те гибридны е кл е тки, которы е с оде ржат 11-ую хромос ому. Сл е довате л ь но, ге н, кодирую щ ий инс ул ин, находитс я име нно в этой хромос оме . Таким образом, данны й ме тод позвол яе т ус танавл ивать группы с ц е пл е ния у чел ове ка, ис пол ь зуя же не хватки и транс л окац ии, можно вы яс нять и пос л е довате л ь нос ть рас пол оже ния ге нов, т.е . с троить ге не тичес кие карты хромос ом чел ове ка. М е тод явл яе тс я разновиднос ть ю кл ас с ичес кого ге не тичес кого анал иза. Е го ограничение – можно картировать тол ь ко биохимичес кие признаки. 1.2. Генет и ческ ое к арт и ровани е Г енетические карты – это карты -с хе мы взаимного рас пол оже ния ге нов (ил и ге не тичес ких марке ров) на индивидуал ь ны х хромос омах, т.е. находящ ихс я в одной группе с ц е пл е ния. Таким образом, пе рвоначал ь ны й этап картирования – это пос трое ние ге не тичес ких карт с ц е пл е ния. И х с троят наос нове данны х о час тоте с овме с тного нас л е дования двух ил и бол е е признаков организма, которы е и с л ужат генетическими маркерами.

12

П од ге не тичес ким маркером понимаю т л ю бой нас л е дуе мы й фе нотипичес кий признак, дос тупны й дл я иде нтификац ии те м ил и ины м с пос обом (ге н, мутац ия, учас ток Д Н К с не опре де л е нной функц ие й , точкарас щ епл е ния Д Н К фе рме нтами – ре с триктазами, не транс крибируе мы е повторяю щ ие с я пос л е довате л ь нос ти разл ичной дл ины , мобил ь ны е ге не тичес кие эл е ме нты и т.д.). Ус тановл е ние л окал изац ии какого-л ибо марке рапозвол яе т ис пол ь зовать е го дл я опре де л е ния пол оже ния другого марке ра. М арке ры , вы бранны е дл я картирования, дол жны бы ть п олиморфными, т.е . дол жны с ущ е с твовать ал ь те рнативны е формы признака, которы е можно бы л о бы л е гко отл ичить и опис ать у отде л ь ны х ос обе й . Д вамарке ра, рас пол оже нны е наодной хромос оме вбл изи друг друга, име ю т те нде нц ию пе ре давать с я от родите л е й потомкам с овме с тно. Соотве тс тве нно с овме с тно пе ре даю тс я и контрол ируе мы е такими марке рны ми ге нами признаки. Че м бл иже рас пол оже ны марке ры друг к другу, те м “те с не е ” они с ц е пл е ны , те м ме не е ве роятно, что проц е с с крос с ингове ра разде л ит их. О нал ичии групп с ц е пл е ния те х ил и ины х ге нов (ил и ге не тичес ких марке ров) у рас те ний и животны х с удят по ре зул ь татам гибридизац ии организмов: час тоте с овме с тного нас л е дования марке ров. Е с л и два марке ра нас л е дую тс я вме с те , то они относ ятс я к одной группе с ц е пл е ния. О рас с тоянии ме жду ге нами в той ил и иной группе с ц е пл е ния – по ве л ичине крос с ингове ра. Е диниц е й рас с тояния ме жду ге нами с л ужит 1% крос с ингове ра(ил и 1с М – с антиморган). Когдачас тотаре комбинац ии ме жду двумя ге нами (ил и марке рами) равна 1%, это значит, что они находятс я на рас с тоянии 1с М . Ге не тичес кое рас с тояние в 1с М приме рно равно физичес кой протяже ннос ти в 1 мл н. пн – 1 М б (ме габазе ). О бщ ая дл инаге номачел ове кав этих е диниц ах с ос тавл яе т окол о 3200 с М . П ринц ипы ге не тичес кого картирования бы л и впе рвы е разработаны Т. М органом. И м же бы л а с ос тавл е на пе рвая ге не тичес кая карта Х хромос омы дрозофил ы , ос нованная научете час тоты образования крос с ове рны х и не крос с ове рны х гаме т у с амок, ге те розиготны х по ре ц е с с ивны м мутац иям, л окал изованны м в Х -хромос оме . Так, в ме й озе ге те розиготны х с амок крос с ингове р ме жду ге нами y (же л тое те л о) и w (бе л ы е гл аза) проис ходил в 1,5% с л учае в, ме жду ге нами w и m (миниатю рны е кры л ь я) – 34,5%, аме жду ге нами y и m – 36% с л учае в. Э то показал о, что данны е ге ны относ ятс я к одной группе с ц е пл е ния и рас пол агаю тс я в порядке y - w – m (рис унок3). Ге не тичес кие карты с ц е пл е ния правил ь но отражаю т порядок рас пол оже ния ге нов (ил и ге не тичес ких марке ров) на хромос омах, однако рас с тояния ме жду ними име ю т относ ите л ь ны е значения, т.е . не с оотве тс твую т ре ал ь ны м физичес ким рас с тояниям. Э то с вязано с те м, что час тота крос с ингове раможе т ме нять с я от ус л овий с ре ды : те мпе ратуры , радиац ии, возрас та, питания. Э ффе ктивнос ть ре комбинац ии подавл енав ге те рохроматиновы х учас тках хромос ом. С другой с тороны , в хромос омах час то вс тре чаю тс я "горячие точки" ре комбинац ии. И с пол ь зование час тот ре комбина-

13

ц ии дл я пос трое ния физичес ких ге не тичес ких карт бе з учетаэтих факторов буде т приводить к ис каже ниям (с оотве тс тве нно заниже нию ил и завы ш е нию ) ре ал ь ны х рас с тояний ме жду ге не тичес кими марке рами. Таким образом, ге не тичес кие карты с ц е пл е ния явл яю тс я наиме не е точны ми из вс е х име ю щ ихс я типов ге не тичес ких карт, и их можно рас с матривать тол ь ко в качес тве пе рвого прибл иже ния к ре ал ь ны м физичес ким картам. Те м не ме не е , напрактике име нно они и тол ь ко они позвол яю т л окал изовать с л ожны е ге не тичес кие марке ры (наприме р, ас с оц иированны е с с имптомами забол е вания) на пе рвы х этапах ис с л е дования и даю т возможнос ть их дал ь не й ш е го изучения. y 0,0

w

m

1,5 1,5%

36,0 34,5% 36%

Р ис унок 3. Лине й ное рас пол оже ние ге нов в Х -хромос оме дрозофил ы , ус тановл е нное Т. М органом с помощ ь ю крос с ингове ра [Д убинин, 1985]: y – же л тое те л о, w – бе л ы е гл аза, m – мал е нь кие кры л ь я Кл ас с ичес кие ме тоды изучения групп с ц епл е ния, разработанны е на дрозофил е , не приме нимы дл я чел ове ка из-за не возможнос ти прове де ния прямы х с кре щ иваний . П оэтому до начал а70-х гг. XX ве кау чел ове кабы л и изве с тны л иш ь три аутос омны е и Х -хромос омная группы с ц е пл е ния. П е рвы й ге н чел ове ка(ге н ц ве товой с л е поты ) бы л картирован наХ -хромос оме в 1911 году, апе рвы й аутос омны й ге н – тол ь ко в 1968 г. Ге не тичес кие карты хромос ом чел ове кас троят наос новании изучения родос л овны х. В ме с то гибридол огичес кого ме тода (ме тода с кре щ иваний ) в данном с л учае дл я изучения нас л е дования признаков у чел ове каис пол ь зую т ге не ал огичес кий ме тод (ме тод родос л овны х). К 1973 г. нахромос омах чел ове кабы л о картировано 64 ге на, к1994г. – 5000 с труктурны х ге нов и с вы ш е 60 000 марке рны х Д Н Кпос л е довате л ь нос те й . Стол ь с тре мите л ь ны й прогре с с с картирование м ге нов чел ове ка с вязан с появл е ние м новы х те хнол огий в ц итоге не тике , в кл е точны х кул ь турах и ос обе нно в мол е кул ярной ге нетике . П о данны м В .А . М аккь ю с ика, до конц а1990 г. дл я пос трое ния ге не тичес ких карт с ц е пл е ния чел ове канаибол е е час то ис пол ь зовал ис ь ме тоды : гибридизац ия с оматичес ких кл е ток (1148 картированны х л окус ов), гибридизац ия in situ (687 л окус ов) и с е ме й ны й ге не тичес кий анал из с ц е пл е ния (466 л окус ов). В пос л е дне м с л учае вы явл яе тс я с вязь (с ц е пл е ние ) ме жду с имптомами забол е вания, вы зы вае мого мутац ие й в не изве с тном ге не , и другими ге не тичес кими марке рами.

14

Традиц ионно с ос тавл е ние карт с ц е пл е ния ге нов завис е л о от иде нтификац ии мутац ий по их эффе ктам на признаки, такие как ц ве т гл аз, ц ве т вол ос , форманос а, уш е й , группы крови и др. Гл авное при этом – нал ичие л е гко вы явл яе мы х ме жиндивидуал ь ны х разл ичий рас с матривае мы х марке ров. О днако таких морфол огичес ких марке ров с равните л ь но не много, бол ь ш ая час ть из них опре де л яе мы х многими ге нны ми л окус ами и с вязь ме жду ними и важны ми дл я ме диц ины признаками, такими как нас л е дс тве нны е забол е вания чел ове каил и хозяй с тве нно ц е нны е признаки у рас те ний и животны х прос л е живае тс я с л або. П оэтому пос л е дние де с ятил е тия значите л ь ное рас прос тране ние пол учил и так назы вае мы е молекулярные маркеры. Так, изве с тно окол о 50 бе л ковы х (изозимны х) марке ров, с помощ ь ю которы х у рядаобъе ктов удал ос ь с оздать карты с ц е пл е ния ге нов. Н о поис тине не ограниченны е возможнос ти дл я картирования ге номов появил ис ь с ис пол ь зование м молекулярных маркеров Д Н К , позвол яю щ ие изучать е с те с тве нны й пол иморфизм науровне пос л е довате л ь нос те й Д Н К. 1.3. М олек улярные марк еры ДНК и и х и спользовани е для генет и ческ ого к арт и ровани я В чем же ос новны е пре имущ е с тва ис пол ь зования мол е кул ярны х марке ров Д Н К? 1. В озможнос ть ис с л е дования вс е го ге нома (с уммарной ге не тичес кой информац ии), а не тол ь ко кодирую щ е й Д Н К (бе л окс инте зирую щ ие пос л е довате л ь нос ти), с ос тавл яю щ е й у рас те ний и мл е копитаю щ их не бол е е 5-10% от вс е го разме ра ге нома. Т.е . марке рами могут бы ть как экс пре с с ируе мы е учас тки Д Н К (ге ны ), так и не кодирую щ ие пос л е довате л ь нос ти, нас л е дование которы х можно прос л е дить . 2. П ол иморфизм Д Н К можно опре де л ить нал ю бой с тадии онтоге не за, в л ю бы х час тях рас те ния (пос кол ь ку проявл е ние мол е кул ярны х марке ров не явл яе тс я ткане с пе ц ифичны м). 3. П роявл е ние бол ь ш инс тва мол е кул ярны х марке ров не й трал ь но по отнош е нию к фе нотипу; многие из ис пол ь зуе мы х в нас тоящ е е вре мя марке ров име ю т кодоминантное нас л е дование (это позвол яе т разл ичать гомо[А А ] и ге те розиготы [А а], рас познавать родите л ь с кие формы ) и с табил ь но с охраняю тс я в потомс тве , что дае т возможнос ть отне с ти их к чис л у наде жны х ге не тичес ких марке ров. 4. О с новны м с вой с твом мол е кул ярны х марке ров Д Н К явл яе тс я их с трогая видо- и ге нос пе ц ифичнос ть , что позвол яе т проводить иде нтификац ию отде л ь ны х видов, с ортов, кл онов. П оявл е ние мол е кул ярны х марке ров Д Н К дал о мощ ны й с тимул дл я картирования ге не тичес ких л окус ов, отве тс тве нны х запрос ты е менде л е вс кие признаки, в час тнос ти, приме ните л ь но к ге не тике чел ове казаН ЗЧ. К нас тоящ е му вре ме ни уже картировано не с кол ь ко с от Н ЗЧ, нас л е дуе мы х по ме нде л е вс кой с хеме .

15

1.3.1. ПД РФ –мар кер ы ПД Р Ф (полимор физм длин р естр икционных фр агментов Д Н К , restriction fragments length polymorphism – RFLP). Бы л о ус тановл е но, что ге не тичес ким марке ром може т бы ть л ю бое ме с то в ге номе , где произош л о изме не ние в пос л е довате л ь нос ти Д Н К, которое обнаруживае тс я как внутре нне е разл ичие ме жду индивидами в попул яц ии, но никаких вне ш них (фе нотипичес ких) разл ичий ме жду ними при этом не набл ю дае тс я. У бакте рий ус тановл е н и вы де л е н ц е л ы й ряд фе рме нтов – рестриктаз, которы е узнаю т с пе ц ифичес кие пос л е довате л ь нос ти в мол е кул е Д Н К (обы чно с ос тавл яю щ ие 4-6 нукл е отидов) и разре заю т двой ную с пирал ь внутри ил и вбл изи с ай таузнавания, в ре зул ь тате чего образую тс я ре с трикц ионны е фрагме нты , ил и ре с трикты . О тс утс твие с ай таузнавания може т бы ть с вязано с де л е ц ие й , инс е рц ие й ил и заме ной нукл е отидов. Сл е довате л ь но, л ю бая мутац ия, изме няю щ ая пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов с ай та ре с трикц ии, уничтожае т этот с ай т (рис унок4). сайты р естр икции му тация в сайте р естр икции

обр азу ется 3 фр агмента

обр азу ется 2 фр агмента Р ис унок4. М утац ия в с ай те ре с трикц ии приводит кизме не нию чис л а и дл ины ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К П ол ное рас щ е пл е ние анал изируе мой ге номной Д Н К отде л ь ны ми ре с триктазами приводит к образованию опре де л е нного набора фрагме нтов Д Н К, чис л о и разме ры которы х с оотве тс твую т рас пол оже нию с ай тов ре с трикц ии. Гибридизац ия по Саузе рну позвол яе т опре де л ять разме ры и взаимное рас пол оже ние ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К пос л е их эл е ктрофоре тичес кого разде л е ния. П ри нал ичии мутац ии в одном из с ай тов ре с трикц ии этот с ай т ос тае тс я не рас щ е пл е нны м пос л е заве рш е ния ре с трикц ии, что приводит к с л иянию с ос е дних ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К, разде л яе мы х мутантны м с ай том, и образованию фрагме нта Д Н К бол ь ш е го разме ра (рис унок 4). В ре зул ь тате дл ина ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К, с оде ржащ их мутантны е с ай ты , може т ме нять с я (с тановитс я пол иморфной ), что четко вы явл яе тс я при с равне нии Д Н К из разны х ис точников ме тодом П Д Р Ф .

16

Е с л и какой -л ибо нормал ь ны й ге н отл ичае тс я от повре жде нного тол ь ко по отс утс твию ил и нал ичию с ай та узнавания, то такие разл ичия можно обнаружить по дл ине ре с трикц ионны х фрагме нтов. Т.е . л ю бы е изме не ния (и/ил и разл ичия) в нукл е отидном с ос таве в точках, которы е “узнаю тс я” ре с триктазами, приводящ ие к ис чезновению одних и образованию других с ай тов-ре с трикц ии, проявятс я в виде изме не ния дл ины ре с трикц ионного фрагме нта Д Н К. Э то с разу вы явл яе тс я при эл е ктрофоре зе по изме не нию пол оже ния фрагме нтаД Н К (по с равне нию с контрол е м ил и другим ге нотипом), е го ис чезнове нию ил и появл е нию нового. М е тод бы л де тал ь но опис ан Ботш те й ном с с оавт. в 1980 г. Р азл ичия по дл ине ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К пол учил и название п олиморфизм длины рестрикц ионных фрагментов (П Д РФ ил и RLFP). Такие учас тки можно привязать к хромос оме , как ге ны , ос обе нно в те х с л учаях, когда изве с тны е гены с ц е пл е ны с ними, т.е . най ти ме с топол оже ние таких фрагме нтов нахромос оме . М е тод П Д Р Ф ш ироко ис пол ь зуе тс я в ге не тичес ких ис с л е дованиях попул яц ий , пос кол ь ку нал ичие в ге номе ис с л е дуе мого организмаре с трикц ионного фрагме нтаД Н К опре де л е нной дл ины явл яе тс я пре крас ны м ге не тичес ким марке ром и одновре ме нно фе нотипичес ким признаком, те с но с вязанны м с ге нотипом организма. Э то позвол яе т л е гко с л е дить зарас прос тране ние м такого марке рав попул яц иях, запе ре дачей е го от родите л е й к потомс тву при с кре щ иваниях и ис пол ь зовать дл я пос трое ния ге не тичес ких карт ис с л е дуе мы х организмов, в том чис л е чел ове ка. Д л я анал иза бе рут пробы крови у чл е нов не с кол ь ких с е ме й , пре дс тавл е нны х 2-3 покол е ниями, л ибо у чл е нов одной бол ь ш ой с е мь и, пре дс тавл е нной не с кол ь кими покол е ниями, с данны м ге не тичес ким забол е вание м. С помощ ь ю П Д Р Ф марке ров бы л и картированы ге ны таких забол е ваний , как миодис трофия Д ю ш е на, муковис ц идоз и др. М е тод П Д Р Ф ис пол ь зую т дл я пре натал ь ной диагнос тики и вы явл е ния ге не тичес ких де фе ктов у л ю де й . Н априме р, в с л учае с е рповиднокл е точной ане мии проис ходит заме на А Т на ТА в ш е с той паре нукл е отидов ге на, кодирую щ е го β-ц е пь ге могл обина чел ове ка. Заме на проис ходит в с ай те (CTNAG), чувс твите л ь ном к ре с триктазе DdeI (рис унок 5). Ф рагме нты Д Н К, возникаю щ ие под де й с твие м DdeI у здорового чел ове каи бол ь ного с ерповиднокл е точной ане мие й в этом учас тке ге на разл ичаю тс я. Их можно с равнивать с помощ ь ю ме тодагибридизац ии по Саузе рну, ис пол ь зуя в качес тве зонда радиоактивно меченую Д Н К ге на β-гл обина. Таким с пос обом можно опре де л ить прис утс твие мутантного ге на в ге номе эмбрионазане с кол ь ко ме с яц е в до рожде ния. 1.3.2. М олеку ляр ныемар кер ы, основанныена полимер азной цепной р еакции (ПЦ Р -мар кер ы) В пос л е дние годы , однако, дл я ге номны х анал изов с тал и ис пол ь зовать пре имущ е с тве нно мол е кул ярны е марке ры Д Н К, ос нованны е нап олимеразной ц еп ной реакц ии (П Ц Р = PCR – polymerase chain reaction). Д л я них

17

дос таточно мал ого кол ичес тваис ходного мате риал а, и в отл ичие от П Д Р Ф не тре буе тс я ни кл онирования, ни с е кве нирования. Т.е . те хникаанал изов, ос нованны х наП Ц Р , прощ е и пригоднадл я автоматизац ии, авы явл яе мы й пол иморфизм значите л ь не е . A. Н ормал ь ная и мутантная пос л е довате л ь нос ть аминокис л от (кодоны 5,6 и 7) и с оотве тс твую щ ие им пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов в Д Н К Н ормал ь ная β-ц е пь

Pro – Glu – Glu CCT GAG GAG GGA CTC CTC

Се рповидноКл е точная β-ц е пь

Pro – Val – Glu CCT GTG GAG GGA CAC CTC

Сай т ре с трикц ии DdeI подчеркнут

Б. Локал изац ия DdeI – с ай тов наре с трикц ионной карте учас ткаге наβц е пи ге могл обиначел ове ка: нормал ь ного (β) и мутантного ( β ) 175 201 88 β

89

β

89

S

S

376

88

В . Р азме ры DdeI –ре с триктов Д Н К из нормал ь ны х кл е ток(ββ) и кл е ток, S S гомозиготны х по мутац ии с е рповиднокл е точной ане мии ( β β ), опре де л е нны е с помощ ь ю радиоактивного зонда S S ββ β β

376

201 175

Р ис унок5. И с с л е дование мутац ии с е рповиднокл е точной ане мии наос нове анал изадл ины ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К (П Д Р Ф ) [А й ал а, 1987].

18

Пр инципы метода ПЦ Р . Те хникаампл ификац ии фрагме нтов Д Н К с помощ ь ю пол име разной ц епной ре акц ии, которая ре вол ю ц ионизировал а с ущ е с твую щ ие ме тоды мол е кул ярного анал изаге номов, бы л апре дл оже на в 1985 г. Кэри М ю л л ис ом, заразработку которой в 1993г. е му бы л априс ужде наН обе л е вс кая пре мия. П ол име разная ц е пная ре акц ия имитируе т природны й проц е с с вос произве де ния (удвое ния) Д Н К – ре пл икац ию , проис ходящ ую на матричной ос нове (по принц ипу компл е ме нтарнос ти) с учас тие м фе рме нтаД Н К-пол име разы . Н о е с л и во вре мя ре пл икац ии удваивае тс я вс я Д Н К, то при П Ц Р – проис ходит многократное копирование (вос произве де ние , ампл ификац ия) л иш ь инте ре с ую щ е го ис с л е довате л я с пе ц ифичес кого, не бол ь ш ого фрагме нта, рас пол оже нного ме жду двумя прай ме рами. Компл е ме нтарное дос траивание ните й начинае тс я в опре де л е нны х с тартовы х точках, пол оже ние которы х опре де л яе тс я затравками = прай ме рами. П раймеры – с инте тичес кие ол игонукл е отиды , вкл ю чаю щ ие окол о 20 нукл е отидов, кажды й из которы х компл е ме нтаре н и буде т гибридизировать с я с одной из двух ц е пе й на противопол ожны х конц ах подл е жащ е го ампл ификац ии фрагме нтаД Н К. П рай ме ры орие нтированы таким образом, что с инте з Д Н К проис ходит тол ь ко ме жду ними, т.к. затравки компл е ме нтарны пос л е довате л ь нос тям Д Н К на л е вой и правой границ е ампл ифиц ируе мого фрагме нта. 3’-конц ы прай ме ров направл е ны навс тре чу друг другу на ампл ифиц ируе мы й учас ток (Д Н К-миш е нь ). Т.е . прай ме ры как бы “запираю т” с двух с торон фрагме нт, которы й дол же н бы ть многократно удвое н (рис унок6). О ткры тие те рмос табил ь ной Д Н К-пол име разы (Taq - пол име разы ) у обитаю щ их в горячих ис точниках бакте рий Thermis aquaticus, позвол ил и с де л ать проц е с с ампл ификац ии Д Н К ц икл ичес ким и ис пол ь зовать е го дл я работы in vitro. Э тот проц е с с автоматизирован и ос ущ е с твл яе тс я с помощ ь ю с пе ц иал ь ного прибора (те рмоц икл е ра =ампл ификатора), которы й по заданной экс пе риме нтатором программе проводит с е рию многократно повторяю щ ихс я ц икл ов (20-30 ц икл ов) и ос ущ е с твл яе т бы с трую с ме ну те мпе ратур. Кажды й ц икл П Ц Р вкл ю чае т три кратковре ме нны х этапа, проте каю щ их в разл ичны х те мпе ратурны х ре жимах (рис унок6). 1 этап. Д е натурац ия Д Н К. Кратковре ме нное нагре вание нативной Д Н К приводит к изме не нию е е физико-химичес ких с вой с тв, в час тнос ти, вязкос ти, проис ходит разруш е ние водородны х с вязе й , с ое диняю щ их компл е ме нтарны е ц е пи, и разъе дине ние ц е пе й ис ходной мол е кул ы Д Н К. В таком с ос тоянии каждая ц е почка може т с л ужить матриц е й дл я ре пл икац ии. П роте кае т при 93-950С в те чение 30-40 с е к. 2 этап. П рис ое дине ние прай ме ров (отжиг) при охл ажде нии ре акц ионной с ме с и. П рис ое дине ние прай ме ров проис ходит компл е ме нтарно к с оотве тс твую щ им пос л е довате л ь нос тям на противопол ожны х ц е пях Д Н К награниц ах с пе ц ифичес кого учас тка. Д л я каждой пары прай ме ров с ущ е с т-

19

вуе т с воя те мпе ратураотжига, значения которой рас пол агаю тс я в инте рвал е 50 - 650С. В ре мя отжига20-60 с е к.

Р ис унок6. Схе мапол име разной ц е пной ре акц ии [М ю л л ис , 1990] 3 этап. Синте з Д Н К (эл онгац ия). С учас тие м термос табил ь ной Д Н Кпол име разы (Taq-пол име раза) проис ходит избирате л ь ны й с инте з (копирование ) учас тка Д Н К, рас пол оже нного ме жду двумя прай ме рами. А мпл ификац ия проис ходит в том с л учае , е с л и рас с тояние ме жду прай ме рами находитс я в пре де л ах 50-4000 ос нований . Синте з Д Н К иде т от 5’ к 3’-е му конц у в обоих направл е ниях, начиная с учас тков прис ое дине ния прай ме ров. Т.е . наращ ивание прай ме ров проис ходит навс тре чу друг другу. М ате риал ом дл я с инте за новы х ц е пе й Д Н К с л ужит добавл яе мая в буфе рны й рас твор с ме с ь четы ре х де зокс ирибонукл е отидтрифос фатов (дН ТФ ). П ро-

20

ц е с с проис ходит при те мпературе 70-720С. В ре мя проте кания с инте за– 2040 с е к. (рис унок6). Р ас твор с пол ученны ми копиями Д Н К с новаподогре ваю т дл я начал а нового ц икл а ампл ификац ии, при котором тол ь ко что с инте зированны е фрагме нты Д Н К (ампл иконы ) с л ужат матриц е й дл я с инте зановы х ц е пе й . Т.е . в каждом ц икл е чис л о ампл ифиц ируе мы х фрагме нтов Д Н К удваивае тс я. О бщ е е их кол ичес тво може т бы ть вы чис л е но по формул е 2n, где n – чис л о ц икл ов ампл ификац ии. П оэтому, даже е с л и в ис ходном рас творе пе рвоначал ь но находил ас ь тол ь ко однадвухц е почечная мол е кул аД Н К, то за 30-40 ц икл ов ампл ификац ии с инте зируе тс я окол о 1 мл рд. (108) копий фрагме нтов = ампл иконов, что по вре ме ни занимае т 3-4 час а. Т.е . ис пол ь зуя очень не бол ь ш ое , с л е довое кол ичес тво матричной Д Н К (не с кол ь ко нанограммов), можно пол учить мил л ионы копий не обходимой Д Н К, что де л ае т возможны м визуал ь ны й учет ре зул ь татов пос л е ге л ь -эл е ктрофоре за и не тре буе т гибридизац ии с радиоактивны м зондом. П Ц Р позвол яе т ампл ифиц ировать л ю бы е инте ре с ую щ ие учас тки ге нома (дл иной до 4 ты с . п.н.) с ис пол ь зование м с пе ц ифичны х ил и произвол ь ны х (с л учай ны х) прай ме ров. П Ц Р -марке ры разл ичаю тс я дл иной ампл ифиц ированной пос л е довате л ь нос ти. Д л я опре де л е ния разме ра пол ученны х П Ц Р -фрагме нтов (П Ц Р -продуктов) их разде л яю т с помощ ь ю ге л ь эл е ктрофоре за. О пол иморфизме Д Н К организмов с удят по прис утс твию ил и отс утс твию пол ос ы в каждом п аттерне (рис унке рас пол оже ния пол ос ) при эл е ктрофоре тичес ком разде л е нии фрагме нтов Д Н К, их окрас ке и фотографировании в УФ с ве те . Такие разл ичия в патте рне могут бы ть с вязаны с де л е ц иями ил и инс е рц иями в ампл ифиц ируе мом фрагме нте . Бл агодаря бол ь ш ой информативнос ти и экономичнос ти, возможнос ти дос таточно бы с трого изучения многочис л е нны х вы борок и л окус ов (100-1000 л окус ов против 10-20 л окус ов ал л озимов), ме тод П Ц Р -анал изас приме не ние м разл ичны х мол е кул ярны х Д Н К-марке ров в нас тоящ е е вре мя ш ироко ис пол ь зую тс я в ге не тичес ких ис с л е дованиях. М е тод П Ц Р л е жит в ос нове картирования разл ичны х ге номов, Д Н К-иде нтификац ии л ичнос ти, ус тановл е ния родс тва л ю де й , в с уде бной ме диц ине (пос кол ь ку позвол яе т проводить ге не тичес кую “дактил ос копию ” по одной е динс тве нной кл е тке , диагнос тики нас л е дс тве нны х (вы явл е ние мутантны х ге нов), а также инфе кц ионны х забол е ваний бакте риал ь ной и вирус ной природы (обнаруже ние ге не тичес кого мате риал апатоге нны х микроорганизмов в кл иничес ких образц ах). Н априме р, данны й ме тод ис пол ь зуе тс я дл я диагнос тики бе с с имптомного нос ите л ь с твавозбудите л е й инфе кц ионного забол е вания - вирус а иммуноде фиц ита чел ове ка (В И Ч), которы е в л ате нтной с тадии инфе кц ии могут прис утс твовать в организме чел ове ка л иш ь в не бол ь ш ом чис л е копий . Д ругой приме р. С.А . Бул атом (одним из пе рвы х приме нивш их в наш е й с тране ме тод П Ц Р дл я иде нтификац ии грибов и анал изаих ге не тичес кой изме нчивос ти) бы л и с конс труированы ге нос пе ц ифичны е прай ме ры

21

(обозначенны е как Cs5), ампл ифиц ирую щ ие тол ь ко фрагме нты Д Н К, с пе ц ифичны е дл я патоге нного гриба ячме ня и пш е ниц ы Cochliobolus sativus, что позвол яе т вы явл ять ус той чивы е кданному грибу рас те ния (рис унок7).

Р ис унок 7. И л л ю с трац ия приме не ния П Ц Р -анал иза с о с пе ц ифичны ми прай ме рами дл я диагнос тики патоге нного дл я ячме ня и пш е ниц ы гриба Cochliobolus sativus [Бул ат, 1996]: А мпл ифиц ированны й фрагме нт с трого с пе ц ифичен дл я C. sativus. Ш е с ть пе рвы х дороже к - в ис с л е дуе мы х образц ах прис утс твуе т Д Н К патоге на, четы ре пус ты х дорожки – ус той чивы е к данному патоге ну рас те ния. П о краям (М ) – марке р мол е кул ярны х мас с (эл е ктрофоре з марке рны х макромол е кул с изве с тны ми мол е кул ярны ми мас с ами: Д Н К фагал ямбда, рас щ е пл е нная Hind III, и Д Н К пл азмиды pBR322, рас щ е пл е нная Alu I).

Н арис унке 8 приве де н приме р ис пол ь зования ме тодаП Ц Р -анал изаи анал изадл ины ре с трикц ионны х фрагме нтов (П Д Р Ф ) в криминал ис тике . О бл ас тями ис пол ь зования мол е кул ярны х марке ров Д Н К в прикл адной ге не тике , с е л е кц ии и с еме новодс тве с е л ь с кохозяй с тве нны х рас те ний явл яю тс я: оц е нка ге не тичес кого разнообразия кул ь турны х рас те ний и их дикорас тущ их с ородичей , пас портизац ия и комме рчес кая с е ртификац ия ц е нны х ге нотипов, ре конс трукц ия родос л овны х, ре ш е ние с порны х вопрос ов такс ономии, подбор родите л ь с ких пар и оц е нкапотомс тваи др. В завис имос ти от природы прай мера(с пе ц ифичны й , пол ус пе ц ифичны й , произвол ь ны й =с л учай ны й ) и с пос оба иде нтификац ии продуктов ампл ификац ии разл ичаю т не с кол ь ко ме тодов и марке ров П Ц Р - анал иза. О с тановимс я намол е кул ярны х марке рах, которы е наибол е е ш ироко ис пол ь зую тс я дл я вы явл е ния ге не тичес кого пол иморфизмаи картирования ге номаживотны х, чел ове ка, рас те ний и микроорганизмов.

22

Р ис унок 8. П риме не ние ме тодаП Ц Р -анал изаи анал изадл ины ре с трикц ионны х фрагме нтов (П Д Р Ф ) в криминал ис тике [Кол ь ман, 2004]: Д л я пол учения “ге не тичес кого отпе чатка” : 1)Д Н К-фрагме нт, вы де л е нны й из кл е тки подозре вае мого и с оде ржащ ий ис с л е дуе мую пос л е довате л ь нос ть ампл ифиц ирую т с помощ ь ю П Ц Р , 2) разре заю т подходящ е й ре с триктазой , 3) фрагме нты разде л яю т ге л ь -эл е ктрофоре зом, 4) с пе ц ифичес кий фрагме нт вы явл яю т с помощ ь ю зонда. Р е с трикц ионная карта образц а Д Н К, вы де л е нной из ткани, най де нной на ме с те пре с тупл е ния, четко с овпадае т с пробой , взятой у подозре вае мого 2, ане у подозре вае мого 1.

К чис л у таких марке ров, ос нованны х на П Ц Р , относ ятс я RAPD марке ры и микрос ате л л иты . RAPD-мар кер ы – РА ПИ Д (random amplified polymorphic DNA= RAPD-PCR - с л учай но ампл ифиц ированная пол иморфная Д Н К). П ри не обходимос ти ампл ификац ии ге на, ил и фрагме нта Д Н К с изве с тной нукл е отидной пос л е довате л ь нос ть ю ис пол ь зую т два ге нос пе ц ифичны х прай ме ра, фл анкирую щ их (ограничиваю щ их) нужную пос л е довате л ь нос ть . В этом с л учае прямой прай ме р с оотве тс твуе т по нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти начал у нужного ге на, а обратны й компл е ме нтаре н второй ц е пи в конц е этого ге на. Таким образом можно ис с л е довать пол и-

23

морфизм конкре тны х л окус ов, дл я которы х хотя бы час тично изве с тная нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть . И с пол ь зование таких марке ров бы л о рас с мотре но вы ш е (рис . 6-8). М е тодикаП Ц Р позвол яе т ампл ифиц ировать Д Н К из л ю бого учас тка ге нома, в том чис л е фрагме нты Д Н К с не изве с тной (анонимной ) нукл е отидной пос л е довате л ь нос ть ю (при ис пол ь зовании RAPD-марке ров). П ри RAPD-ме тоде ис пол ь зую т с тандартны е наборы прай ме ров – с л учай ны е (произвол ь ны е ) прай ме ры . И с пол ь зование ол игонукл е отидны х прай ме ров произвол ь ной с труктуры ос новано натом, что в бол ь ш их ге номах дл я них име ю тс я множе с тве нны е с ай ты пос адки, а с л е довате л ь но, и иниц иац ии П Ц Р . В этом с л учае ис пол ь зуе тс я, как правил о, тол ь ко один прай ме р и ампл ифиц ирую тс я учас тки ме жду этим прай ме ром и е го обратной (инве ртированной ) пос л е довате л ь нос ть ю . П рай ме р с вязы вае тс я с ге номной Д Н К в двух разл ичны х учас тках – инве ртированны х повторов (ип). И нвертированны е повторы – это учас тки мол е кул ы Д Н К, двас е гме нтакоторы х име ю т одинаковую нукл е отидную пос л е довате л ь нос ть , но противопол ожную е е орие нтац ию . C A G G A C A G A ... A G A             C T G T C C T G T C T ... T О бы чно ис пол ь зую тс я произвол ь ны е прай ме ры из 10 нукл е отидов, с оде ржащ ие не ме не е 50% GC. ТаккакпараG-C с оде ржит три водородны х с вязи, апараA-T – тол ь ко две , гибрид “Д Н К-прай ме р” , с оде ржащ ий ме не е 50% GC, пл авитс я до того, как пол име раза начинае т пол име ризац ию и продукты ампл ификац ии в этом с л учае не образую тс я. П родукты RAPDП Ц Р пре дс тавл яю т с обой анонимную пос л е довате л ь нос ть Д Н К, закл ю ченную ме жду двумя инве ртированны ми повторами, разной дл ины . Их вы явл яю т ге л ь -эл е ктрофоре зом (как прис утс твие ил и отс утс твие отде л ь ной RAPD-пол ос ы ). RAPD-марке ры явл яю тс я вы с окоинформативной характе рис тикой дл я оц е нки ге не тичес кого разнообразия и родс тва. Типичная с хе маме тодаRAPD-П Ц Р пре дс тавл е нанарис унке (рис унок9). Н а рис унке 10 пре дс тавл е н приме р эл е ктрофоре граммы продуктов П Ц Р с ис пол ь зование м униве рс ал ь ного (произвол ь ного) прай ме ра. Д л я не которы х RAPD-марке ров ус тановл е нас вязь с ге нами ус той чивос ти к забол е ваниям. Н а с е л ь с кохозяй с тве нны х рас те ниях показана возможнос ть ис пол ь зования RAPD-марке ров в с е л е кц ии наге те розис : дл я оц е нки ге не тичес кого разнообразия ис ходны х инбре дны х л иний и подбора родите л ь с ких пар дл я с оздания вы с окоге те розис ны х гибридов и др. О дним из не дос татков RAPD-марке ров явл яе тс я их доминантное (а не кодоминантное ) нас л е дование . Считаю т, что в F2 доминантны е маркеры даю т в 2 раза ме нь ш е информац ии, чем кодоминантны е . Э ти не дос татки RAPDмарке ров пре одол е ваю т с помощ ь ю ме тодов, занимаю щ их проме жуточное пол оже ние ме жду П Д Р Ф - П Ц Р - анал изом. Сре ди них ос обы й инте ре с пре дс тавл яю т AFLP-марке ры .

24

Р ис унок9. Схе маRAPD – П Ц Р [Weising, 1995].

25

П ри AFLP-ме тоде ампл ификац ии подве ргаю т заране е вы бранны е пос л е довате л ь нос ти ге нома, наприме р, ре с трикц ионны е фрагме нты ге номас опре де л е нной нукл е отидной пос л е довате л ь нос ть ю .

Р ис унок 10. И л л ю с трац ия приме не ния П Ц Р -анал иза с униве рс ал ь ны м (произвол ь ны м) прай ме ром А А 2 дл я идентификац ии микроорганизмов: П Ц Р -профил и разны х видов грибов родаCochliobolus [Бул ат, 1996]: П Ц Р - продукты , будучи разде л е нны ми ге л ь -эл е ктрофоре зом в виде с пе ктров-патте рнов ампл ифиц ированной Д Н К, с пе ц ифичны дл я каждого вида организма. Каждая дорожка пре дс тавл яе т отде л ь ны й вид гриба. Д орожки по краям ге л я (М ) – марке ры мол е кул ярны х мас с (Д Н К фагал ямбда, рас щ е пл е нная Pst1).

Н овы е возможнос ти дл я картирования ге номавозникл и с откры тие м пол иморфизмав с трое нии мол чащ их учас тков Д Н К, которы е в ге номе чел ове ка, наприме р, с ос тавл яю т бол е е 90%. Э то так назы вае мая с ате л л итная Д Н К. 1.3.3. М икр осателлиты и минисателлиты как молеку ляр ныемар кер ы Р азновиднос тями с атД Н К явл яю тс я микросателлиты (М К С , или п ростые п овторяю щ иеся п оследовательности - П П П ) и минисателлиты (М Н С ). М инимал ь ная повторяю щ аяс я е диниц а (КО Р ) микрос ате л л итов вкл ю чае т от 1 до 10 пар нукл е отидов, минис ате л л итов – 15 –70 пн. И х рас пол оже ние в ге номе и чис л о повторений коровы х е диниц с пе ц ифичны дл я каждого организма.

26

И з-за ш ирокой вариабе л ь нос ти М КС и М Н С с ай ты их л окал изац ии нахромос омах названы локусами варьирую щ его числа тандемных п овторов (VNTR-л окус ы ). О ни повс е ме с тно вс тре чаю тс я не тол ь ко в яде рном ге номе эукариот (с час тотой 104-105 наге ном), но и в ц итопл азматичес кой Д Н К (хпД Н К и мтД Н К). В ге номе чел ове ка76% М КС приходитс я надол ю 5 типов повторов дл иной бол е е 20 нукл е отидов (A)n, (AC)n, (AAAN)n, (AAN), где N- л ю бой из тре х ос тавш ихс я нукл е отидов и (AG)n. П ри эл е ктрофоре зе П Ц Р - ампл ифиц ированной микрос ате л л итной Д Н К вы явл яе тс я разл ичная картина по чис л у, л окал изац ии и инте нс ивнос ти пол ос . П ри этом ул авл иваю тс я разл ичия в один нукл е отидны й повтор. М арке ры проявл яю т кодоминантнос ть и с е л е ктивно не й трал ь ное пове де ние (т.е . отс утс твие пл е й отропного эффе кта). В ы с окий пол иморфизм М КС и М Н С (что с вязы ваю т с их бол ь ш е й эвол ю ц ионной подвижнос ть ю по с равне нию с ос тал ь ной Д Н К), их обил ие и повс е ме с тное рас прос тране ние в ге номе с де л ал о их пе рс пе ктивны ми дл я ис пол ь зования в качес тве мол е кул ярны х маркеров Д Н К. Э то четкие ге не тичес кие марке ры , набор которы х уникал е н дл я конкре тного индивидуума. П рис утс твие М КС и М Н С в мтД Н К обе с пе чивае т возможнос ть ис пол ь зовать их дл я ц е л е й иде нтификац ии л ичнос ти по кос тны м ос танкам, как это бы л о с де л ано при иде нтификац ии чл е нов с е мь и пос л е дне го рус с кого ц аря и как это де л ае тс я в пе чал ь но изве с тной Р ос товс кой л аборатории. Н априме р, дл я идентификац ии ос танков ц арс кой с е мь и бы л ис пол ь зован один из коротких танде мны х повторов (Short Tandem Repeat – STR) мтД Н К, аиме нно ТН 01, с оде ржащ ий многократно повторяю щ ую с я пос л е довате л ь нос ть CA (от 6 до 10 копий ). Р азл ичия по дл ине ре с трикц ионны х фрагме нтов, обус л овл е нны е пол иморфизмом М Н С и М КС, также нас л е дую тс я по ме нде л е вс кой с хе ме , т.е . могут бы ть ис пол ь зованы дл я ге не тичес кого картирования И сторияоткрытияминисателлитов такова. В 1985 г. группаангл ий с ких учены х во гл аве с А . Д же ффрис ом ис с л е довал аге н мы ш е чного миогл обинаи вы явил ав е го с ос таве не обы чны й учас ток, названны й ими минис ате л л итная Д Н К. В ос нове е е с трое ния л е жит бл ок из 16 нуклеотидов, рас пол оже нны х в опре де л е нной пос л е довате л ь нос ти. В с я этапос л е довате л ь нос ть бы л ас инте зирована, поме ченарадиоизотопом и ис пол ь зованав качес тве зонда(ил и пробы ) дл я вы явл е ния пол иморфизмапо минис ате л л итной Д Н К в ге номе чел ове ка. Такие пос л е довате л ь нос ти в ге номе чел ове карас пол ожены в разны х хромос омах и их чис л о кол е бл е тс я от двух до не с кол ь ких де с ятков, т.е . нал иц о оказал с я очень варь ирую щ ий признак – набор минис ате л л итны х Д Н К, разл ичаю щ ихс я по дл ине . Э ти учас тки Д Н К с тал и име новать гипе рвариабе л ь ны ми, а так как дл я каждого чел ове ка такой набор с угубо индивидуал е н, то по анал огии с отпе чатками пал ь ц е в ме тод вы явл е ния “п робы Д ж еффриса” пол учил название “генной дактилоскоп ии” ил и “фингерп ринтинга” - генных отп ечатков п альц ев.

27

Суть ме тодав с л е дую щ е м. И з биол огичес кого мате риал а(капл и крови, с пе рмы , не с кол ь ких л уковиц вол ос ) вы де л яю т Д Н К, ампл ифиц ирую т и разре заю т ре с триктазами. Ф рагме нты Д Н К де натурирую т (де л аю т одноните вы ми) и подве ргаю т эл е ктрофоре зу в пол иакрил амидном (П А А Г) ил и агарозном ге л е , где они разде л яю тс я по дл ине . В эл е ктричес ком пол е фрагме нты Д Н К движутс я от отриц ате л ь ного к пол ожите л ь ному пол ю с у с о с корос ть ю , завис ящ е й от дл ины (мас с ы ) фрагме нта. Че м ме нь ш е разме р фрагме нтов, те м бы с тре е они движутс я и дал ь ш е продвигаю тс я вниз по ге л ю . В ре зул ь тате эл е ктрофоре зав ге л е образуе тс я ряд пол ос , рас пол оже нны х однапод другой . В е рхние пол ос ы с оотве тс твую т фрагме нтам, име ю щ им бол е е крупны е разме ры , а нижние – фрагме нтам с бол е е ме л кими разме рами. П о окончании эл е ктрофоре за на ге л ь накл ады ваю т нитроц е л л ю л озны й фил ь тр, накоторы й мол е кул ы Д Н К пе ре нос ятс я и там закрепл яю тс я (иммобил изирую тс я) в той же пос л е довате л ь нос ти, что они бы л и рас пол оже ны в ге л е . Н атаком фил ь тре проводитс я гибридизац ия Д Н К с поме ченны м радиоактивно зондом Д же ффрис а (гибридизац ия in situ). Н аре нтге новс кой пл е нке , нал оже нной нанитроц е л л ю л озны й фил ь тр, радиоактивно ме ченая Д Н К буде т зас ве чивать эмул ь с ию в ме с тах, где произош л а гибридизац ия Д Н К с зондом. В итоге на эл е ктрофоре грамме пол учитс я рис унок из нес кол ь ких де с ятков те мны х пол ос , наразном рас с тоянии от начал адвиже ния. Каждая из таких пол ос с оотве тс твуе т отде л ь ному учас тку мини-с атД Н К, аих чис л о, разме щ е ние и инте нс ивнос ть с ос тавл яю т рис унок сугубо индивидуальный длякаж дого человека. П одс читано, что ве роятнос ть е го повторе ния у двух не родс тве нны х индивидов 1 на1 мл рд., кроме однояй ц е вы х бл изне ц ов. Н е которое , но дал е ко не пол ное с овпаде ние набл ю дае тс я также у кровны х родс тве нников. Ге нная дактил ос копия по Д же ффрис у ис пол ь зуе тс я в криминал ис тике и с уде бной ме диц ине . 1.4. Ф и зи ческ ое к арт и ровани е В отл ичие от рас с мотре нны х вы ш е ге не тичес ких карт с ц е пл е ния фи зи ческ и е к арт ы ге номаотражаю т ре ал ь ное рас с тояние ме жду ге нами (ил и марке рами), вы ражае мое чис л ом пар нукл е отидов. Физическое кар тир ование ос новано на п рямом анализе молекул Д Н К , составляю щ их каж дую хромосому (бе з анал иза ре зул ь татов с кре щ ивания). Е го коне чная ц е л ь – опре де л е ние пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов в каждой хромос оме . Ф изичес ки картировать какой -л ибо ге н ил и фрагме нт на хромос оме означае т опре де л ить е го пол оже ние наэтой хромос оме в физичес ких е диниц ах - парах нукл е отидов. В озможнос ть физичес кого картирования ге номов появил ас ь в с вязи с развитие м те хники мол е кул ярны х марке ров Д Н К. Ф изическое картирование вклю чает создание рестрикц ионных карт и уп орядоченных библиотек клонов геномной Д Н К . В ажную рол ь при этом с ы грал о откры тие ре с триктаз.

28

1.4.1. С озданиер естр икционных кар т Рестрикц ионное картирование основано на установлении точек действияразличных рестриктаз. Р асп ределение сайтов рестрикц ии п редставляет собой своеобразный п асп орт каж дого фрагмента Д Н К и мож ет исп ользоватьсядляего идентификац ии. О бработка образц а Д Н К опре де л е нной ре с триктазой вс е гда дае т один и тот же набор фрагментов. Д л я пос трое ния ре с трикц ионной карты опре де л е нного рай онахромос омы ис пол ь зую т не с кол ь ко фе рме нтов ре с трикц ии и с начал аобрабаты ваю т (рас щ е пл яю т) Д Н К каждой из ре с триктаз в отде л ь нос ти, а зате м их комбинац иями. О пре де л ив разме р пол ученны х фрагме нтов с помощ ь ю ге л ь -эл е ктрофоре за, можно ус тановить порядок с л е дования с ай тов ре с трикц ии вдол ь анал изируе мой мол екул ы Д Н К. Т.е . мол е кул у Д Н К пос те пе нно рас щ е пл яю т на вс е ме нь ш ие и ме нь ш ие фрагме нты , пол учая пе ре кры ваю щ ие с я фрагме нты (име ю щ ие общ ие конц ы ) и зате м ус тановл иваю т пос л е довате л ь нос ть с амих фрагме нтов относ ите л ь но друг другав ге номе. Н аре с трикц ионной карте будут показаны ме с таре с трикц ии каждой нукл е азы по отнош е нию к ме с там ре с трикц ии других нукл е аз (рис унок11). 5,0 0,5

4,5

Eco RI 3,0

Bam HI Eco RI

Eco RI + Bam HI 0

0,5

2,0 Bam HI

3,0

5,0

Р ис унок 11. П риме р пос трое ния ре с трикц ионной карты по с ай там ре с трикц ии Eco RI и Bam HI [Ж имул е в, 2002]: Чис л а– рас с тояние ме жду с ай тами узнавания с оотве тс твую щ их фе рме нтов (тпн)

Н априме р, кл онирован фрагме нт Д Н К дл иной 5 тпн. О дну партию (ал иквоту) Д Н К обрабаты ваю т ре с триктазой EcoRI, другую – Bam HI, тре ть ю – с ме с ь ю обе их ре с триктаз. П ос л е ге л ь -эл е ктрофоре за опреде л яю т разме ры фрагме нтов, с опос тавл яя их с разме рами марке рны х макромол е кул с изве с тны ми мол е кул ярны ми мас с ами. П ри гидрол изе Д Н К ре с триктазой EcoRI образую тс я двафрагме нтаразмером 4,5 и 0,5 тпн. Э то с виде те л ь с твуе т о нал ичии тол ь ко одного с ай таре с трикц ии и этот с ай т находитс я на рас с тоянии 0,5 тпн от одного из конц ов ис ходного фрагме нта. П о этой же л огике е с ть тол ь ко один с ай т узнавания при гидрол изе ре с триктазой Bam HI, удал е нны й на3 тпн от одного из конц ов (рис унок 11). П ри с о-

29

вме с тном гидрол изе двумя ре с триктазами пол учаю тс я 3 фрагме нта: 2,5; 2,0 и 0,5 тпн, наос новании чего с троитс я ре с трикц ионная карта. В ре ал ь ны х экс пе риме нтах пос трое ние ре с трикц ионны х карт - гораздо бол е е с л ожны й проц е с с . П ос трое ние ре с трикц ионны х карт хромос ом – обязате л ь ны й пре дварите л ь ны й этап с е кве нирования (опре де л е ния пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов). Зная взаимное рас пол оже ние пе ре кры ваю щ ихс я фрагме нтов Д Н К, можно вос с тановить пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов в бол е е крупны х фрагме нтах, азате м во вс е й хромос оме и в ге номе в ц е л ом. П е рвая ре с трикц ионная картабы л апол ученадл я вирус аSV-40 (онкоге нны й обе зь яний вирус ), зате м – бакте риофагаλ. Б анк генов. Д л я ре с трикц ионного картирования фрагме нты Д Н К, пол ученны е с помощ ь ю опре де л е нны х ре с триктаз ил и при возде й с твии на не е ул ь тразвуком (так назы вае мы м ме тодом дробовикаил и ш от-ган ме тодом), ис пол ь зую т дл я с оздавая геномых библиотек разных видов, или банков генов. Д л я этого фрагме нты Д Н К организма прис ое диняю т к ве кторны м мол е кул ам, т.е . мол е кул ам-пе ре нос чикам чуже родны х ге нов. В качес тве ве кторов ис пол ь зую т пл азмиды бакте рий , фаги (вирус ы , инфиц ирую щ ие бакте рии), кос миды (гибридны е мол е кул ы , пол ученны е из Д Н К фага λ и бакте риал ь ной пл азмиды ; бл агодаря нал ичию cos-учас ткафагаλ, которы й обе с пе чивае т замы кание е го л ине й ной Д Н К в кол ь ц о, кос мидная Д Н К, вкл ю чивш ая чуже родны е ге ны , може т бы ть упакована в гол овку бакте риофага). В качес тве ве кторов ис пол ь зую т также ис кус с тве нны е хромос омы дрожже й YAK – (Я К) и бакте рий BAC – (БА К) хромос омы . В е кторны е мол е кул ы с вкл ю ченны ми в них фрагме нтами чуже родной Д Н К, т.е . ре комбинантны е Д Н К (ре кД Н К) вводят в ре ц ипие нтны е бакте рии, где они ре пл иц ирую тс я автономно ил и вме с те с Д Н К бакте риире ц ипие нтапос л е инте грац ии с е е ге номом (хромос омой ). Кл онирование (многократную ре пл икац ию ) фрагме нтов Д Н К проводят с ц е л ь ю пол учения бол ь ш ого чис л а копий фрагме нтов, иде нтичны х ис ходному. Д л я кл онирования не бол ь ш их фрагме нтов Д Н К ис пол ь зую т пл азмиды , фаговы е Д Н К, адл я крупны х - кос миды и ис кус с тве нны е хромос омы . И с кус с тве нны е хромос омы дрожже й (YAK-хромос омы ) позвол яю т кл онировать фрагме нты Д Н К чел ове каразме ром до 1М б. А нал огичны е кол л е кц ии, пол ученны е из индивидуал ь ны х хромос ом ил и их час те й , назы ваю т хромосомными библиотеками. Создаю т также библ иоте ки кД Н К , т.е . копий Д Н К, компл е ме нтарны х мР Н К. П ос кол ь ку компл е ме нтарную Д Н К пол учаю т из зре л ы х мол е кул мР Н К, пре те рпе вш их проц е с с инг, мол е кул ы кД Н К не с оде ржат интронов. Библ иоте какД Н К отражае т с пе ктр ге нной активнос ти в кл е тках, из которы х онабы л авы де л е на. Создание таких библ иоте к пол е зно при с равне нии ге нной активнос ти в кл е тках разны х ткане й . Е е также ис пол ь зую т дл я ре с трикц ионного картирования и опре де л е ния нукл е отидны х пос л едовате л ь нос те й фрагме нтов Д Н К.

30

1.4.2. С озданиеу пор ядоченных библиотек клонов. К ар ты контиг. Пр оцеду р а “ Пр огу лка по хр омосоме” Чтобы ус тановить порядок рас пол оже ния кл онов (т.е . кл онированны х фрагме нтов Д Н К) на хромос оме (по е е дл ине ), не обходимо вы явить учас тки их час тичного пе ре кры вания. Э то можно с де л ать путе м гибридизац ии нукл е иновы х кис л от, е с л и изве с тна нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть хотя бы одного фрагме нта. Е го ме тят радиоактивно ил и фл уорохромом и ис пол ь зую т в качес тве зонда дл я с оздания уп орядоченных библиотек клонов. К упорядоченны м библ иоте кам кл онов относ ят карты контиг. Д л я их с оздания не обходимо пол учить и кл онировать не бол ь ш ие учас тки Д Н К и опре де л ить их нукл е отидны е пос л е довате л ь нос ти. Э то так назы вае мы й STS (sequence tagget site) – Д Н К-маркирую щ ий с ай т – уникал ь ная дл я данного л окус апос л е довате л ь нос ть . Зате м STS упорядочиваю т, с оздавая протяже нны е учас тки Д Н К. Э то и е с ть контиги – груп п ы клонов, охватываю щ ие п ерекрываю щ иесяучастки генома. Упорядочение рас пол оже ния кл онов ос ущ е с твл яю т с помощ ь ю проц е дуры , изве с тной как “п рогулка п о хромосоме” , пре дл оже нной в 1979 г. Б. Бе нде ром, П . Спире ром и Д . Х огне с с ом. “П рогулк а по хромосоме” (ск ользящ ее зонди ровани е). Д л я упорядочивания кл онов ис пол ь зую т две разны е библ иоте ки ге номной Д Н К, пол ученны е из Д Н К одного и того же организма, но разде л е нны е двумя разны ми ре с триктазами. Е с л и один из ге нов (ил и кл онов) в пе рвой библ иоте ке удал ос ь картировать и кл онировать (т.е . пол учить из не го Д Н Кмаркирую щ ий с ай т – STS), он зате м може т бы ть ис пол ь зован в качес тве зонда дл я вы явл е ния пе ре кры ваю щ е гос я кл она во второй библ иоте ке . А изученны й кл он второй библ иоте ки може т ис пол ь зовать с я как зонд дл я другого пе ре кры ваю щ е гос я фрагме нтапе рвой библ иоте ки и т.д. Так, оты с кивая кл он закл оном, можно пе редвигать с я по хромос оме ш агами дл иной до 30000 пн (рис унок12). Т аким образом устанавливается п орядок расп олож ения клонов на хромосоме. 1.4.3. С тр атегии постр оения физической кар ты высокого р азр еш ения Ф изичес кие карты разл ичаю тс я по с те пе ни их разре ш е ния, т.е . по те м де тал ям с труктуры ге нома, которы е на них пре дс тавл е ны . И с черпы ваю щ ая физичес кая картаге номачел ове камакс имал ь ного разре ш е ния буде т с оде ржать пол ную нукл е отидную пос л е довате л ь нос ть вс е х е го хромос ом. Н адругом пол ю с е физичес ких карт с минимал ь ны м разре ш е ние м находятс я хромосомные (ц итогенетические) карты ге нома. П ринц ип их пос трое ния бы л рас с мотре н в разде л е 1.1.

31

библиотека геномной Д Н К , полу ченная 1-ой р естр иктазой

F

M

L

N

P

O

R

библиотека геномной Д Н К , полу ченная 2-ой р естр иктазой К лоны библиотеки 1

A B

F

К лоны библиотеки 2

L

L

M

N

C

M

X

N

O

Y

P

R

Z

P

O

Ге н F картирован наге не тичес кой карте , кл онирован и ус тановл е на е го нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть . Э то позвол яе т иде нтифиц ировать в библ иоте ке ге номной Д Н К кл оны , с оотве тс твую щ ие с ос е дним ге нам с помощ ь ю ме тодики “прогул капо хромос оме ” . Кл он А (из 1-ой библ иоте ки), ис пол ь зуе мы й как зонд при изучении 2ой библ иоте ки, в проц е с с е бл оттингапо Саузе рну, иде нтифиц ипуе т кл он Х за с чет нал ичия у них пе ре кре щ иваю щ е гос я учас тка L ; кл он Х (из 2-ой библ иоте ки), ис пол ь зуе мы й как зонд при изучении 1-ой библ иоте ки в проц е с с е бл оттингапо Саузе рну, иде нтифиц ируе т кл он В зас чет нал ичия у них пе ре кры ваю щ е гос я учас тка М ; кл он В как зонд иде нтифиц ируе т кл он Y (пе ре кры ваю щ ий с я учас ток N ) и т.д.

F

L

к л он А

L

M M

к л он Х N

к л он В

N

O

к л он Y

O

P

к л он С

к л он Z

P

R

И с пол ь зование пе ре кры ваю щ ихс я фрагме нтов позвол яе т опре де л ить порядок рас пол оже ния ге нов на ис с л е дуе мом учас тке хромос омы , т.е . пос троить карту контиг.

Р ис унок12. Схе мапроц е дуры “прогул капо хромос оме ”

32

К физичес ким картам низкого разрешенияотнос ятс я карты кД Н К . К ар ты кД Н К . Карты кД Н К отражаю т пол оже ние экс пре с с ирую щ ихс я учас тков Д Н К (экзонов) относ ите л ь но изве с тны х ц итоге не тичес ких марке ров (бэндов) наме тафазны х хромос омах. П ос кол ь ку такие карты даю т пре дс тавл е ние о л окал изац ии транс крибирую щ ихс я учас тков ге нома, в том чис л е и генов с не изве с тны ми функц иями, они могут бы ть ис пол ь зованы дл я поис кановы х ге нов. Э тот подход ос обе нно пол е зе н при поис ке ге нов, повре жде ния которы х вы зы ваю т забол е вания чел ове ка, в том с л учае е с л и прибл изите л ь ная л окал изац ия таких учас тков хромос ом уже пре дварите л ь но прове де нанаге не тичес ких картах с ц е пл е ния. К ар ты высокого р азр еш ения. Д л я пос трое ния карт ге номачел ове ка вы с окого разре ш е ния экс пе риме нтал ь но ре ал изую тс я два ал ь те рнативны х подхода: картирование сверху вниз(top-down mapping) и картированиеснизу вверх (bottom-up mapping), рис унок13. П ри картировании сверху вниз(рис унок 13А ) ис ходны м в анал изе явл яе тс я пре парат Д Н К индивидуал ь ной хромос омы чел ове ка. Д Н К разре зае тс я крупнощ е пящ ими ре с триктазами (наприме р NotI) надл инны е фрагме нты , которы е пос л е разде л е ния эл е ктрофоре зом в пул ь с ирую щ е м пол е (пул ь с -эл е ктрофоре з), подве ргаю тс я дал ь не й ш е й обработке другими ре с триктазами. М е тодом эл е ктрофоре запод де й с твие м однонаправл е нного пос тоянного пол я в агарозном ил и пол иакрил амидном (П А А Г) ге л ях удае тс я разде л ить фрагме нты Д Н К разме ром не бол е е 30-50 тпн. Э тот ме тод ус пе ш но ис пол ь зуе тс я дл я картирования мал ы х ге номов. П родвиже ние бол ь ш их фрагме нтов Д Н К в ге л е при пул ь с ирую щ е м изме не нии направл е ния эл е ктричес кого пол я проис ходит за с чет конформац ионны х изме не ний , обус л овл е нны х с кручивание м и рас кручивание м мол е кул Д Н К в моме нт пе ре кл ю чения направл е ния пол я. В этом с л учае удае тс я разде л ить мол е кул ы Д Н К разме ром от 50 тпн до 10 мл н пн). В ре зул ь тате пол учаю т макрорестрикц ионную карту, на которой дос таточно пол но предс тавл е ны вс е пос л е довате л ь нос ти ис с л е дуе мой хромос омы ил и е е час ти, однако е е разре ш е ние не вы с око. Н атакой карте очень трудно л окал изовать индивидуал ь ны е ге ны . К тому же каждая индивидуал ь ная картаре дко охваты вае т протяже нны е с е гменты Д Н К (как правил о, не бол е е 1–10 мл н пн). Д л я картирования ге номачел ове каснизу вверх (рис унок 13А ) индивидуал ь ную хромос ому разре заю т на множе с тво не бол ь ш их с л учай ны х фрагме нтов (разме ром 10–1000 тпн), час ть из которы х пе ре кры вае тс я друг с другом. Зате м их кл онирую т и упорядочиваю т. В качес тве ве ктора дл я кл онирования в этом с л учае час то ис пол ь зую т ис кус с тве нны е минихромос омы бакте рий (BAC) ил и дрожже й (YAC). П орядокрас пол оже ния кл онов, с оде ржащ их час тично пе ре кры ваю щ ие с я учас тки, опре де л яю т с помощ ь ю проц е дуры “прогул ка по хромос оме ” . Кажды й раз отобранны й фрагме нт ис пол ь зуе тс я в качес тве Д Н К-зондадл я пос л е дую щ е го поис ка. В ре -

33

Р ис унок 13. Страте гия физичес кого картирования ге нома(А ) и типы карт ге нома[П атруш е в, 2000]: А . 1.Страте гия "с ве рху вниз": Д Н К ц е л ой хромос омы рас щ е пл яе тс я ре с триктазами, дл я каждого из индивидуал ь ны х фрагме нтов Д Н К с троитс я ре с трикц ионная карта; 2 – с трате гия "с низу вве рх", индивидуал ь ны е YAC-кл оны пос л е иде нтификац ии объе диняю тс я в контиги. Б . 1 – ге не тичес кая картас ц е пл е ния, 2 – физичес кая ре с трикц ионная карта, пробе л ы обозначаю т ме с та рас щ е пл е ния Д Н К ре с триктазами, 3 – упорядоченная библ иоте ка кл онов (физичес кая карта контигов), показаны пе ре кры ваю щ ие с я кл оны Д Н К, пол ученны е с помощ ь ю YAC-ве кторов, 4 – ис черпы ваю щ ая физичес кая картав виде пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов Д Н К. Н авс е х картах пре дс тавл е н один и тот же учас токхромос омы .

зул ь тате пол учаю т набор час тично пе ре кры ваю щ ихс я фрагме нтов Д Н К, образую щ их не пре ры вную с ос ты кованную (contiguous) пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов Д Н К (пол учивш их название “контиг” = от англ . contig), пол нос ть ю пе ре кры ваю щ их ис с л е дуе мы й учас ток хромос омы . Э тас трате гия впе рвы е бы л аус пе ш но приме не надл я изучения 3-й хромос омы дрозофил ы . К ограничениям ме тода относ итс я труднос ть прохожде ния бол е е

34

200-300 тпн в одном направл е нии из-занал ичия в ге номе повторяю щ ихс я и трудно кл онируе мы х пос л е довате л ь нос те й Д Н К. Д л я их пре одол е ния и ус коре ния проц е с с апоис каге нны х пос л е довате л ь нос те й Ф . Кол л инз пре дл ожил ме тод “пры жков” по хромос оме , позвол яю щ ий изол ировать фрагме нты Д Н К, отс тоящ ие в ге номе друг от друганас отни ты с ячпар нукл е отидов (дл инапры жка), не вы де л яя при этом вс е проме жуточны е пос л е довате л ь нос ти Д Н К. П равил ь нос ть пол ученны х контигов подтве рждаю т обы чно гибридизац ие й in situ (FISH) с одновре ме нной их привязкой к опре де л е нны м учас ткам ис с л е дуе мы х хромос ом. Карты , ос нованны е на контигах, пре дс тавл яю т пол ную информац ию о с труктуре отде л ь ны х с е гме нтов хромос ом и позвол яю т л окал изовать отде л ь ны е ге ны . О днако такие карты трудно приме нять дл я ре конс трукц ии ц е л ы х хромос ом ил и протяже нны х их учас тков из-заотс утс твия с оотве тс твую щ их кл онов в име ю щ ихс я кл оноте ках ге нов. 1.5. О пределени е нук леот и дной последоват ельност и генома (сек вени ровани е) И с черпы ваю щ ая физичес кая картаге номачел ове ка(и л ю бого другого организма) дол жна пре дс тавл ять с обой пол ную пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов Д Н К вс е х е го хромос ом. В 2001 году бы л о объявл е но о заве рш е нии с е кве нирования ге нома чел ове ка – прочте нии вс е го ге не тичес кого те кс та. К ре ш е нию такой грандиозной по объе му задачи бы л и привл е чены многие хорош о финанс ируе мы е л аборатории в разны х с транах мира, ос нащ е нны е автоматичес кими вы с окопроизводите л ь ны ми с е кве наторами. О дна из причин труднос ти с е кве нирования – дл инны е мол е кул ы Д Н К. Так, ге ном E. coli с ос тавл яе т почти 5 мл н пн. Таковаже дл инаД Н К с амой мал е нь кой Y хромос омы чел ове ка. Д л ина же Д Н К с амой бол ь ш ой хромос омы 1 с ос тавл яе т 300 мл н пн (300М б). П одс читано, что е с л и бы с е кве нированную Д Н К тол ь ко одной пол овой кл е тки чел ове ка, образованную 3 мл рд. пн и име ю щ ую с овокупную дл ину мол е кул в 1,8м, с ос тавить в книги, то это бы л о бы эквивал е нтно 200 томам по 1000 с траниц кажды й (вме щ аю щ их по 2500 пе чатны х знаков – A, G, T ил и C). Н апрочте ние таких книг чел ове ку потре бовал ос ь бы не ме не е тре ти жизни. Д л я с равне ния: ге ном бакте рии E. coli може т бы ть запис ан вс е го в двух подобны х томах. В 1977 г. бы л и разработаны две ме тодики с е кве нирования: 1) ме тод А . М акс амаи У. Гил бе рта- химичес кой де градац ии Д Н К; 2) ме тод Ф . Се нге ра– фе рме нтативны й с пос об. В торой с пос об ис пол ь зуе тс я чащ е . П риме не ние этих ме тодов с де л ал о проц е с с с е кве нирования дос тупны м л ю бой биохимичес кой л аборатории и значите л ь но ус корил о опре де л е ние пе рвичной с труктуры ге нов.

35

П ос л е довате л ь нос ть нукл е отидов опре де л яю т в одноц е почечны х фрагме нтах Д Н К, с ос тоящ их из 100-300 нукл е отидов, которы е образую тс я при рас щ е пл е нии Д Н К ре с триктазами. Р е зул ь таты с е кве нирования объе диняю тс я зате м в дл инны е ц е почки нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й на хромос оме . О баме тодас е кве нирования с водятс я к тому, чтобы пол учить с е рию одноц е почечны х мол е кул Д Н К, разл ичаю щ ихс я по размеру на один нукл е отид. Д л я этого ис пол ь зую т дваподхода: в одном с л учае Д Н К химичес ки рас щ е пл яю т (разруш аю т и укорачиваю т по одному ос нованию – химичес кая де градац ия); в другом с л учае (фе рме нтативны й с пос об) ос ущ е с твл яю т удл ине ние ц е пи Д Н К наодно ос нование , ис пол ь зуя дл я этого те риминаторы с инте за. П ол ученны е мол е кул ы можно разде л ить с помощ ь ю эл е ктрофоре за, аре зул ь таты прочитать “с л ис та” . Р ас с мотрим бол е е подробно ферментативный сп особ с е кве нирования. Е го е щ е назы ваю т метод обрыва ц еп и (от англ . chain termination method), рис унок14. Се кве нирование начинае тс я с кл онирования не бол ь ш их ре с трикц ионны х фрагме нтов Д Н К, образуе мы х в ре зул ь тате ре с трикц ии пре дварите л ь но кл онированны х бол е е крупны х фрагме нтов. Ф рагме нт Д Н К, подл е жащ ий с е кве нированию , де натурирую т до однонитчатого с ос тояния щ е л очной обработкой ил и нагре вание м. Зате м с одной из нитей проводят гибридизац ию (отжиг) с коротким ол игонукл е отидны м прай ме ром, которы й с вязы вае тс я с 3′-конц ом одноните вой Д Н К. О л игонукл е отид (которы й с л ужит прай ме ром дл я дос траивания ц е пи Д Н Кпол име разой ) с инте зируе тс я таким образом, чтобы е го 3′-коне ц бы л пос л е дним пе ре д с е кве нируе мой пос л е довате л ь нос ть ю . Д л я каждого экс пе риме нта по с е кве нированию с тавят 4 ре акц ии с однонитчатой Д Н К и прикре пл е нны м к не й прай ме ром. Каждая ре акц ионная с ме с ь с оде ржит четы ре нормал ь ны х пре дш е с тве нника Д Н К – четы ре дезоксирибонуклеозидтрифосфата dNTP: dATP, dGTP, dTTP и dCTP, а также Д Н К-пол име разу. П ре дш е с тве нники ме тятс я радиоактивно изотопами 32Р , 33Р ил и 35S ил и не радиоактивно. Кроме этого, в ре акц ионную с ме с ь добавл яю т один из четы ре х модифиц ированны х пре дш е с тве нников Д Н К – дидезоксинуклеозидтрифосфаты ddNTP (в с оотнош е нии 100 dNTP : 1 ddNTP), которы е с л ужат те рминаторами с инте за: ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP. У этих нукл е отидов в 3′ пол оже нии находитс я -Н , ане -О Н (как у де зокс инукл е отидов). Так как пре дш е с тве нники (нукл е отиды ) модифиц ированы , то можно прис ое динить тол ь ко одно ос нование и рос т ц е пи пре кращ ае тс я (фос фодиэфирная с вязь не образуе тс я, т.к. –О Н отс утс твуе т). Зате м с помощ ь ю Д Н К-пол име разы ве дут синтез второй комп лементарной ц еп и Д Н К. О с тановкас инте за(обры в ц е пи) буде т проис ходить вс який раз, когдавме с то dNTP в рас тущ ую ц е пь Д Н К буде т вс траивать с я с оотве тс твую щ ий е му ddNTP. П оэтому с ре ди продуктов ре акц ии буде т множе с тво фрагме нтов, разл ичаю щ ихс я по дл ине , так как с инте з их начинае тс я с фикс ированной точки (от прай ме ра), акончае тс я в пол оже нии од-

36

ного из нукл е отидов, с оотве тс твую щ их диде зокс инукл е отиду. Н арис унке 14 это проде монс трировано на приме ре ddGTP. В данном с л учае образую тс я фрагме нты , которы е вкл ю чаю т прай ме р пл ю с 3, 6, 8, 13 ил и 14 других нукл е отидов.

Р ис унок 14. Схе мас е кве нирования Д Н К (фе рме нтативны й с пос об = ме тод обры вац е пи) [Кол ь ман, 2004]. Зате м вс е четы ре пробы внос ят в с ос е дние л унки пл ас тины ге л я и проводят ге л ь -эл е ктрофоре з, где они разде л яю тс я. Н укл е отидную пос л е довате л ь нос ть можно прочес ть прямо в ге л е (чте ние “с л ис та” ) с низу по направл ению к с тарту в с оотве тс твие с очере днос ть ю , в которой фрагме нты рас пол агаю тс я наотде л ь ны х “дорожках” (рис унок14).

37

Сре дняя с корос ть с е кве нирования к конц у 1998 г. с ос тавл ял а90 М б. Се й час анал изу чащ е подве ргаю т продукты П Ц Р , а не кл онированны е фрагме нты Д Н К. Спе ц иал ь но с конс труированны е ге номотроны (с е кве наторы -роботы ) производят до 105 пол име разны х ц е пны х ре акц ий в час и с е кве нирую т не с кол ь ко мил л ионов нукл е отидов в не де л ю . А втоматизац ия проц е с с ас е кве нирования с ущ е с тве нно ус корил аэтот проц е с с и позвол ил аос ущ е с твить с е кве нирование кл е точны х ге номов, дл я которы х пре дварите л ь но с ос тавл яю т физичес кие карты . П ос л е разработки нове й ш их те хнол огий прочте ние ге не тичес кого те кс та с тал о рутинной проц е дурой . 1.6. Б азы данных нук леот и дных последоват ельност ей. Компью т ерная генет и к а (б и ои нформат и к а). И сследовани я in silico Б азы данных ну клеотидных последовательностей. Сущ е с тве нную рол ь в развитии ге номны х подходов с ы грал и базы (ил и банки) данны х нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й . Д овол ь но бы с тро с тал о понятно, что не возможно с опос тавл ять пос л е довате л ь нос ти, с равнивая вручную дл инны е ряды букв, приводимы х нарис унках кс тать ям. Уже в 1979 г. бы л о начато обс ужде ние того, как хранить пос л е довате л ь нос ти Д Н К и Р Н К и как обе с пе чивать дос туп к ним. П е рвы е базы данны х нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й GenBank (СШ А ) и EMBL (Е вропа) появил ис ь в 1982 г., и уже в с л е дую щ е м году одним из пе рвы х важны х ре зул ь татов, пол ученны х при помощ и анал изапос л е довате л ь нос те й , бы л о обнаруже ние с ходс твавирус ного онкоге на v-sis и нормал ь ного ге на фактора рос та тромбоц итов, что приве л о к значите л ь ному прогре с с у в понимании ме ханизма рака. С те х пор с равне ние новой пос л е довате л ь нос ти с пос л е довате л ь нос тями из банка данны х с тал о рутинны м эл е ме нтом работы с л ю бы м ге ном, а поме щ ение каждой новой пос л е довате л ь нос ти в банк - не обходимы м ус л овие м журнал ь ной публ икац ии. В 1996 г. бы л и с формул ированы "Бе рмудс кие принц ипы " (названы по ме с ту прове де ния конфе ре нц ии), с огл ас но которы м даже не бол ь ш ие фрагме нты ге номов, пол ученны е в рамках прое кта "Ге ном чел ове ка" и анал огичны х программ, с разу же поме щ ал ис ь в банки данны х и могл и бы ть ис пол ь зованы вс е ми же л аю щ ими. То е с ть важной ос обе ннос ть ю с бораи хране ния информац ии о с е кве нированны х нукл е отидны х пос л е довате л ь нос тях в базах данны х явл яе тс я е е дос тупнос ть дл я ис с л е довате л е й . В с е опе рац ии по с равне нию нукл е отидны х пос л едовате л ь нос те й разл ичны х ге номов вы пол няю тс я с помощ ь ю компь ю те ра(это компь ю те рная проц е дура). Р аботаос ущ е с твл яе тс я в с л е дую щ е м порядке : с е кве нирование → базаданны х → вы явл е ние ге нов (откры ты е рамки с читы вания) → опре де л е ние их функц ии. Крупне й ш е й базой данны х по с труктуре ге нома чел ове ка в нас тоящ е е вре мя явл яе тс я GDB (Genome Data Base), с озданная и подде рживае мая в униве рс ите те Д ж. Гопкинс а(Бал тимор, СШ А ). Кроме изве с тны х пос л е -

38

довате л ь нос те й нукл е отидов ге номачел ове кав не й хранитс я вс я пол ученная информац ия о ге не тичес ких марке рах, зондах и контигах, ас с оц иированны х с ге не тичес кими забол е ваниями. Че ты ре других базы данны х хранят вс е изве с тны е пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов, вкл ю чая пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов ге нома чел ове ка: GenBank и Genome Sequence Data Base (GSDB) в СШ А ; European Molecular Biology Laboratory (EMBL) в Е вропе , International Nucleotide Sequense Database (INSD) в В е л икообритании; DNA Data Bank of Japan (DDBJ) в Я понии. В Р ос с ии И нс титутом мол е кул ярной биол огии им. В .А . Э нге л ь гардтаподде рживае тс я анал огичная базаданны х по ге ному чел ове ка (Hugene). Банки пос тоянно обме ниваю тс я данны ми и в этом с мы с л е , практичес ки равноц е нны . В этих базах данны х в 1996 году хранил ос ь ∼200 мл н.пн, пре дос тавл е нны х как с амими авторами, так и вводимы х из с тате й , опубл икованны х в пе риодичес ких изданиях. О с новной ме ждународной базой данны х по пос л е довате л ь нос тям аминокис л от явл яе тс я Protein Identification Resource (Ш ве й ц ария). К омпью тер ная генетика (биоинфор матика). И сследования in silico. А втоматизац ия проц е с с а с е кве нирования, л авинообразное нарас тание объе маданны х ре зул ь татов с е кве нирования пос л ужил о тол чком рожде ния мол одой науки – биоинформатики (вычислительной биологии), она же комп ью тернаягенетика. Э танаукавозникл ав 1976-1978 годах, окончате л ь но оформил ас ь в 1980 году с о с пе ц иал ь ны м вы пус ком журнал а «Nucleic Acid Research» (NAR), пос вящ е нного биоинформатике . Зате м бы л и пре дл оже ны не которы е ал горитмы вы равнивания пос л е довате л ь нос те й (т.е . с пос обанапис ания не с кол ь ких пос л е довате л ь нос те й друг под другом дл я их дал ь не й ш е го с равне ния). В 1987 году появил с я GeneBank (кол л е кц ия нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й ) и т.д. Биоинформатикавозникл а на с ты ке мол е кул ярной биол огии и ге не тики, мате матики (с татис тики и те ории ве роятнос ти) и информатики. Каждая пол ученная пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов пре дс тавл яе т инте ре с дл я ц е л е й ге нной инже не рии и биоте хнол огии, с равне ния с нукл е отидны ми пос л е довате л ь нос тями других организмов. Компь ю терны й анал из с тановитс я ос новны м ме тодом с равне ния и изучения ге нов разл ичны х организмов, пре дс казания функц ии ге нов по нукл е отидной и аминокис л отной пос л е довате л ь нос ти и др. Биоинформатика с тал а чре звы чай но модной обл ас ть ю науки, с прос нас пе ц иал ис тов в которой очень ве л ик. Биоинформатикаре ш ае т с л е дую щ ие задачи: 1. Статис тичес кий анал из пос л е довате л ь нос те й Д Н К; 2. П ре дс казание функц ии по пос л е довате л ь нос ти (рас познавание ге нов в пос л е довате л ь нос ти Д Н К, поис к ре гул яторны х с игнал ов, пре дс казание функц ий бе л ков). 3. А нал из прос транс тве нной с труктуры бе л ков и нукл е иновы х кис л от, в том чис л е пре дс казание с труктуры бе л капо пос л е довате л ь нос ти; 4. Те ория мол е кул ярной эвол ю ц ии и с ис те матика.

39

А нал из in silico (в компь ю те ре ) – с равне ние име ю щ ихс я в базах данны х ге номны х и EST п оследовательностей (Expressed sequence tags = марке рны е экс пре с с ируе мы е пос л е довате л ь нос ти). EST, по с ути, явл яю тс я пос л е довате л ь нос тями разной дл ины (в с ре дне м окол о 500 пн), пол ученны ми путе м обратной транс крипц ии с 3’ конц амР Н К. Э то короткие марке рны е пос л е довате л ь нос ти, характе рны е дл я каждого экс пре с с ируе мого ге на чел ове ка. П озвол яю т изучать разме ры , разнообразие и транс крипц ионную активнос ть экс пре с с ирую щ ихс я ге нов чел ове ка. То е с ть ос новны м инс труме нтом биоинформатики, ос обе нно той е е час ти, которая занимае тс я пре дс казание м функц ий , явл яе тс я с равните л ь ны й анал из, которы й , наприме р, позвол яе т по изве с тны м функц иям ге нов мухи дрозофил ы , червя не матоды и других организмов пре дс казы вать функц ии ге нов чел ове ка. Э то задачапоис кас ходс твапос л е довате л ь нос те й у разны х организмов. 1.7. Канди дат ное к арт и ровани е Д о пос л е дне го вре ме ни при картировании ге нома доминировал функц иональный п одход. П ри этом ме с то ге нанакарте ус танавл иваю т по ре зул ь татам с ц е пл е ния признака, наприме р, нас л е дс тве нной бол е зни с уже картированны ми ге не тичес кими марке рами. О днако с пис ок забол е ваний , дл я которы х функц ионал ь ная информац ия о биол огичес ком де фе кте , л е жащ е м в ос нове того ил и иного забол е вания, явл яе тс я дос таточно пол ной (наприме р, не дос таточнос ть пе ченочного фе рме нта фе нил ал анингидрокс ил азы при фе нил ке тонурии), в нас тоящ е е время практичес ки ис черпан. Бол ь ш инс тво ге нов, функц ия которы х бы л аизве с тна, уже с е кве нированы , кл онированы и картированы . Бл изко к функц ионал ь ному и так назы вае мое кандидатное картирование. В пос л е дне м с л учае информац ия о функц ии ге нане дос таточно пол ная, чтобы точно указать ге н, но дос таточная дл я того, чтобы бол е е ил и ме не е обос нованно предпол ожить о возможны х кандидатах. В обоих с л учаях клонирование гена предш е с твуе т е го точной л окал изац ии в ге номе , т.е . картированию . В рамках этих подходов картировать ген означало п ройти п уть от его функц ии к локализац ии нахромосоме(п озиц ии). П оявл е ние в 80-х гг. XX ве камноже с тва вы с окопол иморфны х марке ров Д Н К позвол ил о пой ти в обратном направл е нии – от хромос омной карты кфункц ии. П ри рас ш ифровке пос л е довате л ь нос те й нукл е отидов ге номов прос то ус трое нны х бакте рий и вирус ов ге не тикам с точнос ть ю до одного нукл е отида удал ос ь опре де л ить их пос л е довате л ь нос ть в Д Н К. П рочте ние же нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й в ге номе эукариот оказал ос ь затрудните л ь ны м в с вязи с прис утс твие м у них бол ь ш ого кол ичес тваповторяю щ ихс я пос л е довате л ь нос те й (с вы ш е 90%). П ри наработке копий этих уча-

40

с тков с помощ ь ю П Ц Р они образовы вал и ш пил ь ки ил и изл омы , не рас познавае мы е ил и не правил ь но читае мы е Д Н К- пол име разами – фе рме нтами, удваиваю щ ими (ампл ифиц ирую щ ими) эти учас тки. К тому же повторяю щ ие с я учас тки, оказал ос ь , не возможно размножить в бактериал ь ны х кл е тках. М ногие труднос ти, однако, при изучении ге номов разны х организмов удал ос ь пре одол е ть бл агодаря разработке в ходе ос ущ е с твл е ния ме ждународной программы ге нома чел ове ка принц ипиал ь но новы х физичес ких, химичес ких и мате матичес ких ме тодов, вне дре нии роботов в анал из пос л е довате л ь нос те й нукл е отидов Д Н К, развитие с амы х мощ ны х из име ю щ ихс я в мире компь ю те рны х программ. Э тому в значите л ь ной с те пе ни с пос обс твовал о крупное финанс овое обе с пе чение намного пре вы с ивш е е в ме ждународны х мас ш табах с тартовую ц е ну программы 3,2 мл рд. дол л аров, привл е чение к работе крупне й ш их с пе ц иал ис тов из вс е х с тран: ге не тиков, физиков, химиков, ме диков, мате матиков, компь ю те рщ иков, с ил ь не й ш ая конкуре нц ия ме жду учены ми и в то же вре мя с отрудничес тво в пл ане публ икац ий , обс ужде ния ре зул ь татов проработки программы на ме ждународны х с ове щ аниях. И с с л е дования ге нома с тал и аре ной не тол ь ко научного, но также экономичес кого и даже пол итичес кого с оре внования на гос ударс тве нном уровне . Так, пре дпринимал ис ь попы тки запате нтовать ус тановл е нны е ге ны нас л е дс тве нны х забол е ваний чел ове ка, не пол учивш ие подде ржки мирового научного с ообщ е с тва, а гл авы СШ А и В е л икообритании – гос ударс тв, вне с ш их ос обо крупны й вкл ад в изучение ге номачел ове ка, в канун нас тупл е ния XXI ве капубл ично заявил и, что име нно учены е их с тран добил ис ь крупне й ш их дос тиже ний в науке . 2. Г Е Н О М И К А , ПР О ТЕ О М И К А И “ О Б Р А ТН А Я Г Е Н Е ТИ К А ” 2.1. Геноми к а В нас тоящ е е вре мя парал л е л ь но с изучение м ге нома чел ове ка рас ш ифрованы пос л е довате л ь нос ти Д Н К и изучены функц ии ге нов у многих видов бакте рий и вирус ов, однокл е точны х эукариотичес ких организмов: дрожже й и многокл е точны х: кругл ого червя не матоды , нас е комого - пл одовой муш ки дрозофил ы и рас те ния арабидопс ис а. В 2002 г. рас ш ифрован ге ном мы ш и, ус пе ш но развиваю тс я ис с л е дования ге номов пш е ниц ы , рис а и других однодол ь ны х. Э то с оздал о предпос ы л ки дл я с равне ния ге номов организмов разны х такс ономичес ких кате горий . То е с ть ре зул ь таты ис с л е дований ге номов разны х организмов зал ожил и ос новы новой науки – геномика. Э то наукао ге номах. Те рмин “ге номика” появил с я тол ь ко в 1985 году и относ итс я к науке , занимаю щ е й с я картирование м и с е кве нирование м ге номов. Какие ос новны е задачи ре ш ае т ге номика?

41

1. Се кве нирование ге номов разл ичны х организмов, вы явл е ние ране е не изве с тны х ге нов, изучение л окал изац ии и с трое ния ге нов и других учас тков ге нома. Н априме р, у чел ове ка с обс тве нно ге ны с ос тавл яю т ме не е 10% вс е го ге нома(≈3%). 2. В ы явл е ние функц ий каждого ге на, изучение ме ханизмов ре гул яц ии работы ге номов. 3. И зучение вопрос ов проис хожде ния видов, биоразнообразия, с охране ния и ис пол ь зования биол огичес ких ре с урс ов пл ане ты . Р азл ичаю т структурную и функц иональную геномику. Ц е л ь ю с труктурной ге номики явл яе тс я вы яс не ние пос л е довате л ь нос ти ос нований в мол е кул ах Д Н К у организмов разл ичны х видов. Ф ункц ионал ь ная ге номика– это учение о функц иях ге нов. О дним из ос новны х экс пе риме нтал ь ны х подходов при изучении с труктурно-функц ионал ь ной организац ии ге номаи ме ханизмов ге нной экс пре с с ии, атакже дл я дигнос тики нас л е дс твенны х и инфе кц ионны х забол е ваний в ме диц ине , ве те ринарии и рас те ние водс тве явл яе тс я ме тод мол е кул ярной гибридизац ии нукл е иновы х кис л от. П е рвы е ус пе хи ге номики с вязаны с рас ш ифровкой ге номов вирус ов, бакте рий (пре дс тавл яю щ их инте ре с дл я ме диц ины , промы ш л е ннос ти и фундаме нтал ь ной биол огичес кой науки) и кл е точны х органе л л . В 1955 году бы л а опре де л е на пол ная нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть не бол ь ш их ге номов патоге нны х бакте рий – микопл азмы и ге мофил ь ной пал очки, ав 1996-98 гг. бы л и рас ш ифрованы ге номы е щ е 15 бакте рий , в том чис л е рикке тс ии (возбудите л я тифа), микобакте рии (причины тубе ркул е за), ге л иобакте ра– не давно откры той бакте рии, которая явл яе тс я ис точником гас тритов и язвы же л удка. И зучение ге номов этих бакте рий позвол ил о вы яс нить ге не тичес кую природу их патоге ннос ти, иде нтифиц ировать с оотве тс твую щ ие ге ны . Н априме р, у бол ь ного ге мофил ие й най де но 115 ге нов, которы х не т у не патоге нны х бакте рий , из них бол е е 80 отве чаю т завзаимоде й с твие бакте рии с кл е ткой хозяинаи с те пе нь бол е зне творнос ти. У кл ас с ичес кого моде л ь ного объе ктаге не тики – киш е чной пал очки (E.coli), ге ном которой с ос тавл яе т ≈4,6 мл н пн, обнаруже но ≈ 4 ты с . ге нов, из них у 40% функц ии е щ е не изве с тны . Ге ном прос те й ш их эукариотичес ких организмов – дрожже й с ос тоит из 12 мл н. пн и приме рно 6 ты с . ге нов, однако функц ии 2 ты с . ге нов до с их пор не изве с тны . П оэтому с е й час ос обое внимание учены х с конц е нтрировано навы яс не ние функц ий разны х ге нов. Кл ю чевой пробл емой , которую не обходимо ре ш ить в с вязи с пол учение м бол ь ш ого кол ичес тва новой информац ии, явл яе тс я с оотне с е ние пе рвичны х с труктур откры вае мы х новы х ге нов с функц иями кодируе мы х этими ге нами бе л ков и нукл е иновы х кис л от. Структурно-функц ионал ь ны й анал из ге нома чел ове ка ос обе нно важе н дл я кл иничес кой ме диц ины , с тавящ е й пе ред с обой задачи не тол ь ко диагнос тики нас л е дс тве нны х бол е зне й , но и л е чения – ге ноте рапии. Бл агодаря ге номике возникл о новое понимание мол е кул ярны х ме ханизмов забол е ваний , ис пол ь зую тс я новы е подходы в с оздании л е карс тв, новы е диагно-

42

с тичес кие те с ты . П оявил ас ь фармакоге номика– наука, явл яю щ аяс я одновре ме нно ос новой пре одол е ния л е карс тве нной ре зис те нтнос ти и ос новой индивидуал ь ной фармакоте рапии. Н аконе ц , ге номика пол ожил а начал о пол учению транс ге нны х животны х и рас те ний ме диц инс кого назначения. 2.2. О рт ологи чные и паралоги чные гены Сравне ние ге номов организмов разны х видов (про- и эукариот) показал о, что с ущ е с твуе т фундаме нтал ь ны й набор ге нов, общ ий дл я вс е х организмов, бе л ковы е продукты которы х л е гко рас познаю тс я у вс е х них. Э то подтве рждае т гипоте зу об общ е м пре дш е с тве ннике дл я вс е х организмов. Такие ге ны пол учил и название ортологичные гены (ил и ортологи). Ге ны – ортол оги произош л и от одного ге на в общ е м пре дковом организме и с охранил и одну и ту же функц ию в проц е с с е эвол ю ц ии. О ни кодирую т с трое ние кл ю чевы х макромол е кул кл е тки, учас твую щ их в проц е с с ах ре пл икац ии, транс крипц ии, транс л яц ии и ре парац ии ге не тичес кого мате риал а. О чевидно, что такие ос новопол агаю щ ие ме ханизмы биол огичес кой организац ии, с л оживш ие с я мил л ионы л е т назад, уже не могут бы ть изме не ны в нас тоящ е е время так же , как не могут бы ть изме не ны ге не тичес кий код, с трое ние рибос ом, нукл е ос ом и многие другие с ис те мы многоуровне вой биол огичес кой организац ии. П оэтому мутац ии ортол огов, как правил о, л е тал ь ны . Таким образом, ортологи – это гомологичныегены в геномах разных организмов, которые п роизошли от одного гена в общ ем п редковом организме и сохранили одну и ту ж е функц ию в п роц ессе эволю ц ии. Н е подве ргаю тс я изме не ниям в нас тоящ е е вре мя и ре гул яторны е эл е ме нты , контрол ирую щ ие кл ю чевы е этапы онтоге не завы с ш их рас те ний и животны х. Типичны й приме р ортол огичны х ге нов – гис тоновы е ге ны , кодирую щ ие бе л ки гис тоны (H1, H2A, H2B и H3), учас твую щ ие в образовании нукл е ос ом при пе рвом уровне компактизац ии Д Н К в с ос таве хромос ом. Сущ е с твование ортол огичны х ге нов позвол яе т припис ы вать базовы е биохимичес кие функц ии пос л е довате л ь нос тям одного организманаос новании их гомол огии с пос л е довате л ь нос тями другого (п озиц ионное клонирование). О с обе нно час то такой подход ис пол ь зую т дл я “припис ы вания” функц ий ге нам, вовл е ченны м в возникнове ние нас л е дс тве нны х забол е ваний чел ове ка. Так, с труктура кл онированны х и с е кве нированны х ге нов чел ове ка MSH2 и MLH1, отве тс тве нны х занас л е дс тве нную пре драс пол оже ннос ть к не пол ипозному раку тол с той киш ки, оказал ас ь гомол огичной дрожже вы м и бакте риал ь ны м ге нам, вовл е ченны м в ре парац ию . В отл ичие от ортол огов п аралогичныегены, ил и п аралоги, возникаю т путе м внутриге номны х дупл икац ий и могут эвол ю ц ионировать с приобре те ние м новы х функц ий . П арал огичны е ге ны обе с пе чиваю т видам адаптац ию кме няю щ имс я ус л овиям окружаю щ е й с ре ды . И де нтификац ия ортол огов и парал огов очень важна дл я функц ионал ь ны х вы водов набазе с равне ния ге номов.

43

И с с л е довать функц ии ге нов бол е е прос ты х организмов л е гче, чем бол е е с л ожны х, апо гомол огии пос л е довате л ь нос тей ге нов можно с удить и об анал огии их функц ий . 2.3. “О б рат ная генет и к а” Г еномика ис пол ь зуе т ме тоды так назы вае мой “обратной генетики” , которая в отл ичие от кл ас с ичес кой ге не тики, изучаю щ е й вначал е признаки, азате м контрол ирую щ ие их ге ны (признак→ге н), иде т в обратном направл е нии - от иде нтификац ии ге напри отс утс твии вс якой информац ии о не м к изучению е го функц ии (ге н→признак). О братнаягенетика пол учил аразвитие в проц е с с е разработки ме ждународной программы “Ге ном чел ове ка” . Традиц ионно работы по изучению функц ий ге нов проводил ис ь так. И с кус с тве нно пол учал и ил и в природны х попул яц иях находил и мутантны е организмы , в которы х какая-то функц ия (признак) бы л анаруш е на, наприме р, мух с наруш е ниями пигме нтац ии гл аз, микроорганизмов с с е рие й биохимичес ких мутац ий , и с помощ ь ю кл ас с ичес ких ге не тичес ких экс пе риме нтов пы тал ис ь опре де л ить , какой ге н “отве чае т” заданную функц ию . Такой подход назы ваю т п рямой генетикой. Как уже отме чал ос ь вы ш е , с е годня рас ш ифрована пол ная нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть многих ге нов разл ичны х организмов, однако функц ия бол ь ш инс тва из них не изве с тна. “О братная ге не тика” пы тае тс я вы явить функц ии ге на, ис ходя из изве с тной нукл е отидной пос л едовате л ь нос ти. Н априме р, е с л и какой -то ге н с не извес тной функц ие й гомол огичен уже изве с тному ге ну другого организма, то можно с казать , что функц ии этих ге нов с ходны . Н о что же де л ать , е с л и с равне ние пос л е довате л ь нос ти изучае мого ге на не вы явл яе т гомол огии с уже изве с тны ми ге нами? О дин из возможны х с пос обов ре ш е ния этой пробл е мы – ис пол ь зование не давно откры того дл я рас те ний и не которы х животны х фе номе на – Р Н К -интерференц ии. Суть е го закл ю чае тс я в с л е дую щ е м. П ри вве де нии ис кус с тве нно с инте зированной двухц е почечной Р Н К, гомол огичной изучае мому ге ну, проис ходит “вы кл ю чение ” е го работы , организмы с тановятс я мутантны ми по данному ге ну, т.е . наруш ае тс я функц ия с оотве тс твую щ е го ге на. Н априме р, вве де ние в не матоду Caenorhabditis elegans двуц е почечной Р Н К, гомол огичной ге ну rol, зас тавл яе т червяков с ворачивать с я в кол ь ц а, так как у них наруш ае тс я с инте з с пе ц иал ь ны х мы ш е чны х бе л ков – актинов. О с обе нно много подобны х работ проводят на кл ас с ичес ких объе ктах ге не тики муш ке дрозофил е и не матоде . Страте гия “обратной генетики” приме ните л ь но к поис ку ге нов пол учил а вопл ощ е ние в п озиц ионном клонировании, которое подразуме вае т л окал изац ию ге напри отс утс твии вс якой информац ии о е го функц ии, т.е . о кодируе мом ге ном бе л ке . П ре дварите л ь но ме с то ге нанахромос омной карте ус танавл иваю т по е го с ц е пл е нию с изве с тны м ге не тичес ким марке ром,

44

наприме р, с ус тановл е нны м ге ном, отве тс тве нны м заопреде л е ние нас л е дс тве нного забол е вания. П ос л е этого ос ущ е с твл яю т позиц ионное кл онирование и с е кве нирование ге на, функц ия которого не изве с тна. П роц е дурас е кве нирования, как уже бы л о с казано вы ш е , с е й час пол нос ть ю автоматизирована, как и с равне ние ге номов, и они пре дс тавл яю т с обой “компь ю те рое мкие ” и “инте л л е ктуал ь ное мкие ” проц е дуры . 2.4. П рот еом и прот еоми к а О дним из не обходимы х ус л овий функц ионал ь ного анал иза ге нома явл яе тс я также познание е го п ротеома. Те рмин “п ротеом” появил с я уже в 1994 году дляоп исаниясовокуп ности белков, эксп рессируемых геномом на п ротяж ении ж изни клетки. П ол ное познание проте ома– одно из не обходимы х ус л овий функц ионал ь ного анал изаге нома. Н аукао наборах бе л ков в кл е тках при разны х физиол огичес ких с ос тояниях и функц иях этих бе л ков пол учил а название п ротеомика. Задачапроте омики нане с кол ь ко порядков с л ожне е , чем у ге номики – инве нтарзац ия бе л ков, т.е . ре ал ь но работаю щ их ге нов в кл е тке . С ущ ественнаяразниц а меж ду геномикой и п ротеомикой, обусловлена тем, что геном данного вида, как п равило, достаточно стабилен, в то времякак п ротеом индивидуален не только дляразных клеток одного индивида, но и дляодной клетки в зависимости от ее состояния(деление, п окой, дифференц ировка и т.д.). Т.е . проте ом – понятие динамичное (в отл ичие от ге нома). Э то с вязано с те м, что в кл е тках про- и эукариот никогда не проис ходит экс пре с с ия вс е х име ю щ ихс я в нал ичии ге нов, ал иш ь час ти из них. Бе л ки ил и проте ины (отс ю дапроте ом) – продукты ге нной активнос ти, вы пол няю т в кл е тке и многокл е точном организме с амы е разнообразны е биол огичес кие функц ии (ферме нты , рос товы е гормоны , ре ц е пторны е и ре гул яторны е бе л ки и т.д.). П ри этом общ ий с ос тав кл е точны х бе л ков пос тоянно ме няе тс я в завис имос ти от фазы ц икл акл е точного де л е ния, ткане вой принадл е жнос ти и с тадии диффе ре нц ировки у многокл е точны х организмов, вне ш них возде й с твий и т.д. Кроме того, помимо набора, ме няе тс я е щ е и кол ичес тво бе л ков: от не с кол ь ких мол е кул до не с кол ь ких ты с яч накл е тку. О с новной задачей проте омики явл яе тс я пре дс казание функц ионал ь ной рол и отде л ь ны х бе л ков путе м экс пе риментал ь ного с опос тавл е ния их качес тве нного и кол ичес тве нного с ос тава в кл е тке наразны х с тадиях и в разны х с ос тояниях е е развития. П омимо этого, в задачу проте омики входит ус тановл е ние взаимос вязи ме жду с труктурой бе л каи е го функц иями, что впл отную с бл ижае т это направл е ние с функц ионал ь ной ге номикой . В ажной задачей явл яе тс я понимание ме ханизмов фол динга бе л ков, т.е . с кл ады вания пол ипе птидной ц е пи в функц ионал ь но активную тре хме рную с труктуру. О т прос транс тве нного (тре хме рного) с трое ния бе л ков завис ит их биол огичес кая функц ия. П онимание ме ханизмов фол дингатакже важно дл я биоте хнол огии и развития бе л ковой инже не рии. Кроме того, возник-

45

нове ние многих не й роде ге не ративны х забол е ваний у чел ове каи животны х (наибол е е яркий приме р – коровь е бе ш е нс тво) с вязано с нал ичие м в их организме прионов – бе л ков с не нормал ь ны м фол дингом. В проте омике с разу бы л взят ме диц инс кий укл он: в пе рвую очере дь с тал и изучать те бел ки, которы е важны дл я понимания ме ханизмазабол е вания и диагнос тики. П роте ом чел ове ка с оде ржит ≈ 250 ты с . разл ичны х бе л ков, в то вре мя как чис л о бе л ок-кодирую щ их ге нов вс е го ≈ 32 ты с . Такое оказал ос ь возможны м бл агодаря ал ь те рнативному с пл ай с ингу и с виде те л ь с твуе т о том, что в ге номе ос ущ е с твл яе тс я принц ип экономии генетического материала (комп актная зап ись), а с другой с тороны , бл агодаря ре гул ируе мой комбинаторике экзонов дос тигае тс я бол ь ш ой вы бор ге нны х продуктов – бе л ков. 2.5. ДНК-ми к рочи пы (ДНК-поля) и при меры и х и спользовани я для и зучени я геномов Н овы м дос тиже ние м изучения ге номов явл яе тс я с оздание Д Н Кмикрочипов – Д Н К-анал изирую щ их матриц . М икрочип пре дс тавл яе т с обой с те кл янную подл ожку разме ром не с кол ь ко с антиме тров, накоторую робот нанос ит (иммобил изуе т = химичес ки приш ивае т с помощ ь ю ул ь трафиол е та) дл инны е фрагме нты ге нов (Д Н К-пробы дл иной до 1000 нукл е отидов) ил и кД Н К (чащ е ). П е ре д нане с е ние м на чип мол е кул ы Д Н К ампл ифиц ирую тс я (умножаю тс я) с помощ ь ю П Ц Р . Ул ь трафиол е т с тимул ируе т образование химичес ких с вязе й ме жду с те кл ом и Д Н К. М атриц ас ос тоит из с оте н и ты с ячячее к. П л относ ть ячее к-пол е й с ос тавл яе т 1 мл н. точекна1 с м2, где каждая точка– отде л ь ная проба. Н атакой биочип (разме ром вс е го не с кол ь ко с м) можно “пол ожить ” с разу ве с ь ге ном той ил и иной живой с ис те мы . В каждой из этих ячее к закре пл е н маркированны й фрагме нт, пол ученны й в ре зул ь тате разре зания ис ходной мол е кул ы Д Н К наогромное чис л о фрагме нтов. Д л инафрагме нтов во вс е х ячей ках одинаковая, отл ичаю тс я они л иш ь пос л е довате л ь нос ть ю нукл е отидов. Совре ме нны е Д Н К-пол я уже с е й час с оде ржат до 10 ты с . ге нов наодин чип. Э ффе ктивнос ть микрочипов обус л овл е навозможнос ть ю парал л е л ь ного прове де ния огромного кол ичес тва с пе ц ифичес ких ре акц ий и взаимодей с твий мол екул биопол име ров. Н а рис унке 15 показан принц ип де й с твия ячей ки Д Н К микрочипа, ос нованного накомпл е ме нтарны х взаимоде й с твиях A с T и G с C в двух нитях Д Н К. Ф рагме нт одноц е почечной Д Н К фикс ирован в одной из ячее к микрочипаи избирате л ь но с вязы вае т из многих добавл е нны х к микрочипу фл уоре с ц е нтно ме чены х фрагме нтов Д Н К (наприме р, ге нома чел ове ка) тол ь ко компл е ме нтарны й . Т.е . е с л и пос л е довате л ь нос ть ос нований в одной нити Д Н К (ил и ол игонукл е отида) пол нос ть ю компл е ме нтарна пос л е довате л ь нос ти другой нити, то образуе тс я с табил ь ная двухнитчатая с пирал ь – дупл е кс . В ре зул ь тате тол ь ко этот эл е ме нт микрочипаначинае т с ве тить с я. П рис утс твие не компл е ме нтарной пары , наприме р G-G, пре дотвращ ае т об-

46

разование дупл е кс аи ос тавл яе т эл е ме нт микрочипате мны м. Таким образом, один эл е ме нт микрочипапроизводит одну вы борку приме рно из трил л ионавозможны х вариантов.

Р ис унок 15. Схе маобразования двой ной с пирал и Д Н К намикрочипе [М ирзабе ков, 2003]. С помощ ь ю микрочипов можно пол учить данны е о с ос тоянии вс е х ге нов организма, т.е . оц е нить , какие ге ны ре ал ь но работаю т (экс пре с с ирую тс я) в кл е тке в данны й моме нт вре ме ни. Ге н функц ионируе т, когдас не го с читы вае тс я информац ия и с инте зируе тс я Р Н К. И з кл е тки вы де л яю т с ме с ь продуктов разл ичны х ге нов (т.е . мР Н К разл ичны х типов), производимы х в данны й моме нт индивидуал ь ного развития. Р Н К (вы с тупаю щ ую в качес тве зонда) ме тят фл уоре с ц е нтны ми крас ите л ями и нанос ят намикрочип, с оде ржащ ий Д Н К дл я гибридизац ии Д Н К-Р Н К. В с ю работу вы пол няю т роботы . М е с тагибридизац ии Д Н КР Н К вы явл яю тс я путе м с канирования микрочипал азе ром. Н ос ите л е м информац ии явл яю тс я инте нс ивнос ть и ц ве т изл учения. Ге ны нас те кл е даю т с игнал ы разл ичной инте нс ивнос ти, которы е обрабаты ваю тс я с помощ ь ю компь ю те ров (рис унок16). И зготовл е ние одного микрочипа занимае т от тре х до ш е с ти не де л ь (при ус л овии, что в рас поряже нии ис с л е довате л я е с ть ге не тичес кий мате риал дл я нане с е ния начип). Сам экс периме нт (гибридизац ия и с нятие данны х) занимае т 1-2 дня. П ри традиц ионной же те хнол огии потре бовал ис ь бы годы на пос л е довате л ь ное прове де ние вс е х экс пе риме нтов, вкл ю ченны х в один биочип. В пе рвы е работу по изучению экс пре с с ии бол ь ш ого чис л а ге нов на уровне ц е л ого ге номавы пол нил и М . Ш е н с с отрудниками в 1995 г., с оздав микрочип наос нове ампл ифиц ированны х в П Ц Р фрагме нтов кД Н К дл я 48 ге нов рас те ния Arabidopsis thaliana. И з л ис ть е в и корне й рас те ний вы де л ял и с уммарную мР Н К, фл уоре с ц е нтно ме тил и в ре акц ии обратной транс -

47

крипц ии и гибридизировал и с с озданны м микрочипом. Р е зул ь таты анал иза проде монс трировал и, что экс пре с с ия изученны х ге нов в л ис ть ях и корнях одного и того же рас те ния разл ичаю тс я.

Р ис унок 16. Схе ма, ил л ю с трирую щ ая принц ип работы микрочипа(Григорян, 2001).

Д Н К-

Час то с оздаю т с пе ц иал изированны е микроматриц ы дл я анал изаэкс пре с с ии опре де л е нны х типов ге нов: контрол ирую щ их кл е точны й ц икл , апоптоз, с пл ай с инг, транс л яц ию , с инте з ц икл инов, факторов с ве рты вания крови, факторов транс крипц ии и др. Н априме р, Т. Ш е нк с с отрудниками (1998 г.), ис пол ь зуя четы ре микрочипа, с оде ржащ их в с умме фрагме нты кД Н К дл я 6600 ге нов чел ове ка, изучил и напе рвичной кул ь туре фибробл ас тов кожи чел ове ка, как инфиц ирование ц итоме гал овирус ом чел ове ка вл ияе т наэкс пре с с ию этих ге нов. О казал ос ь , что данная вирус ная инфе кц ия дос тове рно изме няе т (уве л ичивае т ил и уме нь ш ае т) экс пре с с ию 258 ге нов. Д ругая группаучены х наос нове данны х с е кве нирования Д Н К ц итоме гал овирус а чел ове ка с оздал а в 1998 году микрочип нукл е отиды , с оотве тс твую щ ие вс е м те оре тичес ки пре дс казанны м откры ты м рамкам транс л яц ии (О Р Т). Д л я 151 О Р Т бы л адоказанапродукц ия с пе ц ифичес ких мР Н К и вы явл е но вре мя их биос инте зав проц е с с е инфе кц ии. А . В ант-В оут с с оавторами (2003) ис с л е довал и экс пре с с ию 271 ге на кл е ток чел ове кав ус л овиях инфиц ирования их вирус ом гриппатипаА , вирус ом иммунодефиц итачел ове ка, атакже под де й с твие м инте рфе ронаил и те пл ового ш ока. О казал ос ь , что каждое возде й с твие по-разному отражае тс я наэкс пре с с ию данны х ге нов. В то же вре мя обнаруже но с ходс тво в ре гул яц ии экс пре с с ии рядаге нов при инфе кц ии кл е токвирус ом гриппаи под

48

вл ияние м инте рфе рона, что указы вае т важнос ть инте рфе ронового отве та при зараже нии данны м вирус ом. И с пол ь зуя микрочипы , можно диагнос тировать не тол ь ко врожде нны е забол е вания, но и бол е зни, явл яю щ ие с я ре зул ь татом прижизненны х мутац ий в ге не тичес ком коде . Так, в ге номе чел ове кае с ть дваге на, которы е в норме рас пол оже ны дос таточно дал е ко друг от друга. В ре зул ь тате патол огичес ких пе ре с трое к в Д Н К они могут оказать с я по с ос е дс тву. Э тот факт с л ужит дос тове рны м с виде те л ь с твом начал а л е й коза (рака крови). Н априме р, таким с пос обом л е й коз вы явл яе тс я на не с кол ь ко л е т рань ш е , не же л и с тандартны м путе м. И многих л ю де й можно бы л о бы с пас ти, прой дя они вовре мя подобную прове рку. С помощ ь ю микрочипов можно диагнос тировать и разл ичны е подкл ас с ы ос трого л е й коза. Д л я этого ис пол ь зуе тс я микрочип, с оде ржащ ий 50 ге нов, с ил ь ное разл ичие экс пре с с ии которы х позвол яе т однозначно опре де л ить тип опухол и и вы брать нужны й курс те рапии. Сущ е с тве нную помощ ь микрочипы могут оказать и при пе ре с адке органов, ос новной пробл е мой которой явл яе тс я отторже ние импл антированны х ткане й иммунной с ис те мой чел ове ка. Чтобы избе жать отторже ния, не обходимо, чтобы бе л ки-марке ры гис тос овме с тимос ти на импл антированной ткани как можно ме нь ш е отл ичал ис ь от бе л ков-марке ров пац ие нта. П одходящ е го донора(в качес тве которого може т вы с тупать не тол ь ко чел ове к, но и кл онированное животное , например, с винь я), пе ре с адка органов от которого вы звал абы минимал ь ны й иммунны й отве т, можно подобрать с помощ ь ю микрочипов. О л игонукл е отидны е микрочипы ис пол ь зую т дл я с е квенирования (с е кве нирование гибридизац ие й ). Э то е щ е один (новы й ) подход, пре дл оже нны й в 1988 г. группой рос с ий с ких учены х И нс титута мол е кул ярной биол огии им. В .А . Э нге л ь гардтаР А Н под руководс твом А .Д . М ирзабе кова. Суть ме тодазакл ю чае тс я в с е кве нировании коротких фрагме нтов Д Н К путе м гибридизац ии с ол игонукл е отидами изве с тной пос л е довате л ь нос ти, которы е иммобил изованы намикрочипе в с трого опре де л е нном порядке . 2.6. Нек от орые и т оги сравни т ельного анали за геномов разли чных органи змов Кос не мс я л иш ь не которы х итогов с равните л ь ного анал иза пол ны х ге номов разл ичны х организмов. П о данны м с е кве нирования ге номачел ове кас уммарное чис л о ге нов, кодирую щ их бе л ки, с ос тавл яе т окол о 32 ты с яч. П ре жние оц е нки (80-100 ты с яч) бы л и завы ш е ны , так как характе ризовал и не чис л о с амих ге нов, а разнообразие транс крибируе мы х с них мол е кул Р Н К. Э кс пе риме нтал ь но (по функц ии продукта, нал ичию мутац ий , разме ру транс крипта, ткане с пе ц ифичнос ти и т.д.) охаракте ризовано покаокол о 6500 ге нов чел ове ка, то е с ть приме рно однаш е с тая час ть . Н аос нове гомол огии с изве с тны ми ге нами других организмов в ге номном с икве нс е чел о-

49

ве кавы явл е но е щ е окол о 11 ты с ячге нов. Кажды й из этих ге нов нане с е н на карту. Д л я 40% аннотированны х ге нов чел ове кафункц ия покане изве с тна. П о с равне нию с ге номами других эукариотичес ких организмов у чел ове ка бол ь ш е е рас прос тране ние пол учил и ге ны , учас твую щ ие в обе с пе чении иммунной защ иты , в развитии не рвной с ис те мы и др. У чел ове ка значите л ь но бол ь ш е е кол ичес тво ге нов учас твуе т в транс крипц ии и транс л яц ии. Сравне ние с труктур ге нов с е кве нированны х к нас тоящ е му вре ме ни ге номов чел ове ка, дрозофил ы , не матоды , дрожже й и бакте рий приводит к вы воду, что вс е живы е с ущ е с тва де й с твите л ь но произош л и от общ е го пре дш е с тве нника в ре зул ь тате дупл икац ий , модификац ий и разл ичного рода пе ре тас овок ге не тичес кого мате риал а. Р одс тве нны е ге ны -ортол оги л е гко иде нтифиц ирую тс я в ге номах вс е х вы ш е пе ре чис л е нны х организмов. О днако с ущ е с твую т также ге ны , кодирую щ ие продукты , с пе ц ифичны е дл я отде л ь ны х видов. В ге номе чел ове каучены е нас читал и 223 ге на, которы е с ходны с ге нами киш е чной пал очки. Киш е чная пал очка возникл а приме рно 3 мл рд. л е т назад. Зачем нам такие «дре вние » ге ны ? В идимо, с овре ме нны е организмы унас л е довал и от пре дков какие -то фундаме нтал ь ны е с труктурны е с вой с твакл е ток и биохимичес кие ре акц ии, дл я которы х не обходимы с оотве тс твую щ ие бе л ки. Н е т поэтому ничего удивите л ь ного и в том, что пол овинабе л ков мл е копитаю щ их име ю т с ходс тво аминокис л отны х пос л е довате л ь нос те й с бе л ками мухи дрозофил ы . Р е зул ь таты с равне ния ге номов показал и, что с мы ш ь ю мы име е м бол е е 80% общ их ге нов, ас ш импанзе – окол о 99%. В то же вре мя вы явл е но, что у 52% ге нов чел ове кае с ть такие экзоны , которы х не т у мы ш и. Как уже вы ш е отме чал ос ь , проте ом чел ове кас оде ржит почти в 8 раз бол ь ш е бе л ков (приме рно 250 ты с разл ичны х бе л ков) по с равне нию с чис л ом бе л ок-кодирую щ их ге нов (вс е го окол о 32 ты с . генов). Э то возможно бл агодаря ал ь те рнативному с пл ай с ингу, когда один ге н кодируе т в с вое й с трукте ре бол е е одного бе л ка(т.е . разны е бе л ки кодирую тс я разны ми с очетаниями экзонов одного и того же ге на). Д о 1998 г. с читал ос ь , что тол ь ко окол о 6% ге нов чел ове каиме ю т ал ь те рнативны й с пл ай с инг. Се й час изве с тно, что не ме не е 50% ге нов чел ове каал ь те рнативно с пл ай с ируе тс я. Самое явс тве нное разл ичие ме жду чел ове ком и мы ш ь ю и другими организмами с с е кве нированны ми ге номами с ос тоит в том, что бе л ки чел ове кас оде ржат бол ь ш е доме нов набе л ок и новы е комбинац ии доме нов. У чел ове ка име е тс я бол ь ш ое чис л о новы х бе л ков. Сущ е с твуе т пре дпол оже ние , что H. sapiens не “изобре л ” новы е ге ны , аис пол ь зовал с ущ е с твую щ ие с труктурны е доме ны , с обирая из них новы е бе л ки с новы ми функц иями. Ге ном чел ове какодируе т бол ь ш е парал огов и многодоме нны х бе л ков с бол ь ш им разнообразие м функц ий и архите ктуры доме нов по с равне нию с ге номами других эукариот. Е щ е один вы вод: число генов не коррелирует со слож ностью организма. В рас с читанном с уммарном разме ре ге нома – 3,2 мл рд пн – бол е е

50

пол овины Д Н К занимаю т разны е виды повторяю щ ихс я пос л е довате л ь нос те й , ав ос тавш е й с я пол овине 1,1% ге номас ос тавл яю т экзоны , 24% - интроны , 75% - ме жге нная Д Н К. П ричем, чис л о с труктурны х (бе л оккодирую щ их) ге нов у чел ове кас ос тавл яе т вс е го л иш ь 3-5%, а95% приходитс я надол ю так назы вае мой избы точной (час то повторяю щ е й с я) Д Н К. Такого ге номного “мус ора” не т ни у бакте рий , ни у прос те й ш их однокл е точны х эукариотичес ких микроорганизмов – дрожже й . Чис л о ге нов, кодирую щ их бе л ки, в ге номе чел ове кал иш ь в дваразабол ь ш е , чем у червя C. elegans (32 ты с ячи 19 ты с ячс оотве тс тве нно) и приме рно равно чис л у кодирую щ их ге нов в ге номе Arabidopsis taliana (26 ты с яч) и ры бы фугу. То е с ть по чис л у ге нов мы уш л и с овс е м не дал е ко от прос те й ш их многокл е точны х организмов, хотя с читае м с е бя “ц арями природы ” и “ве нц ом эвол ю ц ии” . Бол е е того, ге ном такого с л ожного с ущ е с тва, как пл одовой муш ки D. melanogaster, с оде ржит в с е бе даже ме нь ш е ге нов (окол о 13 ты с яч), чем ге ном довол ь но примитивного червя (19 ты с яч). Н е трудно увиде ть огромное разл ичие в с л ожнос ти C. elegans и H. sapiens. Каким образом с кромное разл ичие в чис л е ге нов дае т разры в в с л ожнос ти организмов? Д ире ктор Инс титутамол е кул ярной ге не тики Р А Н , акаде мик Е .Д . Све рдл ов с читае т, что наибол е е ве роятны ми факторами такого разл ичия явл яю тс я с л е дую щ ие : 1. Сил ь ное уве л ичение функц ионал ь ной нагрузки наодин ге н в проц е с с е эвол ю ц ии; в ре зул ь тате один ге н чел ове ка вы пол няе т с ущ е с тве нно бол ь ш е функц ий , чем один ге н чел ове ка. 2. Р е зкое возрас тание комбинаторны х с очетаний продуктов, вовл е ченны х в вы пол не ние одной функц ии, поэтому однафункц ия вы пол няе тс я множе с твом ге нов, кажды й из которы х вы пол няе т также и другие функц ии. В озникаю т с л ожны е с е ти ге нны х взаимоде й с твий ; в ре зул ь тате почти вс е многообразие признаков пре дс тавл яю т с обой с л ожны е признаки, чре звы чай но трудно поддаю щ ие с я традиц ионному ге не тичес кому анал изу. 3. В озрас тание комбинаторны х с очетаний с опровождае тс я ус л ожне ние м с ис те мы регул яц ии экс пре с с ии ге нов, которая позвол яе т одному и тому же ге ну экс пре с с ировать с я в разное вре мя развития организма и в разны х диффе ре нц ированны х кл е тках. 4. М ноже с тво ге нов не кодирую т никаких бе л ков и вы пол няю т с вои функц ии в виде Р Н К. Е щ е одним отл ичие м с труктуры ге нома, с вязанны м с ре гул яц ие й ге нной активнос ти, явл яе тс я то, что у чел ове каэкзоны намного короче по с равне нию с другими изученны ми организмами, аинтроны – дл инне е . Кроме ус тановл е ния пол ной нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти ге номачел ове ка, ве дутс я ис с л е дования по с равне нию ге номов разны х л ю де й дл я вы явл е ния их индивидуал ь ны х ос обе ннос те й . Э ти ис с л е дования привл е каю т внимание в с вязи с те м, что наос нове данны х о разнообразии ге нома ре конс труируе тс я ис тория проис хожде ния чел ове ка как биол огичес кого вида и ис тория формирования народов. И с с л е дования важны и дл я ме диц ины , так как разл ичны е попул яц ии характе ризую тс я с воим с пе ктром

51

бол е зне творны х мутац ий , и знание этих ос обе ннос те й с ущ е с тве нно дл я разработки с трате гий мол е кул ярной диагнос тики забол е ваний . В ге номе чел ове канай де но бол е е двух мил л ионов позиц ий , в которы х у разны х л ю де й находятс я разл ичаю щ ие с я нукл е отиды (так назы вае мы е однонукл е отидны е пол иморфизмы , Single Nucleotide Polymorfisms, с окращ енно SNP). М е не е 1% этих SNP приводят к изме не нию пос л е довате л ь нос ти бе л ков. С кажды м годом обнаруживае тс я вс е бол ь ш е ге нов, мутац ии по которы м проводят к опре де л е нны м забол е ваниям чел ове ка. В нас тоящ е е вре мя их вы явл е но бол е е 1,4 ты с . Такие ис с л е дования могут ре вол ю ц ионизировать ме диц инс кую науку. Сравне ние ге номов дал о возможнос ть оц е нить минимал ь ное кол ичес тво ге нов (минимал ь ны й разме р ге нома) однокл е точны х организмов, не обходимое дл я подде ржания кл е точной жизни. Р е ш е ние данного вопрос а не обходимо дл я понимания проис хожде ния жизни наЗе мл е , атакже путе й и ме ханизмов с овме с тного эвол ю ц ионирования ге нов, объе дине нны х в конкре тны е ге номы , ас л е довате л ь но, и ме ханизмов возникнове ния ге номов как таковы х. В качес тве моде л и минимал ь ной живой кл е тки бы л и взяты два бл изкородс тве нны х вида микопл азмы , име ю щ их с амы е мал е нь кие ге номы из изве с тны х и явл яю щ ие с я паразитами. О ни пол учаю т многие не обходимы е продукты от хозяе в. Mycoplasma genitalium с оде ржит 517 ге нов. П уте м мутац ий с ис те матичес ки уничтожаю т ге н заге ном дл я того, чтобы вы явить тот минимум, которы й явл яе тс я дос таточны м дл я обе с пе чения жизне де яте л ь нос ти бакте рии. Ус тановл е но, что тол ь ко 265-350 ге нов из 480 ге нов бакте рии, кодирую щ их бе л ок, абс ол ю тно не обходимы дл я с ущ е с твования с вободноживущ их кл е ток (в л абораторны х ус л овиях). К ним относ ятс я: почти пол ны й набор ге нов с ис те мы транс л яц ии; почти пол ны й набор ге нов с ис те мы ре пл икац ии; ге ны рудиме нтарной с ис те мы ре парац ии и ре комбинац ии; ге ны аппарататранс крипц ии, в котором отс утс твую т почти пол нос ть ю ге ны ре гул яц ии транс крипц ии; бол ь ш ой набор ге нов, кодирую щ их бе л ки, гомол огичны е ш аперонам; ге ны , контрол ирую щ ие анаэробны й ме табол изм, вкл ю чая ге ны гл икол иза и фос форил ирования с убс тратов; ге ны биос инте за л ипидов; вос е мь ге нов, кодирую щ их фе рме нты , которы е ис пол ь зую т с л ожны е кофакторы ; ге ны с ис те мы транс порта бе л ков; ограниченны й набор ге нов, обе с пе чиваю щ ий транс порт ме табол итов; пол ны й набор ге нов утил изац ии нукл е отидов de novo и ге ны их биос инте за; ге ны биос инте зааминокис л от не вкл ю чены (пос кол ь ку пре дпол агае тс я паразитичес кий образ жизни). 3. О Б Л А С ТИ ПРИ М Е Н Е Н И Я Р Е З У Л Ь ТА ТО В К А РТИ Р О В А Н И Я ГЕ Н О М А 3.1. Геномная меди ц и на. ДНК-ди агност и к а Традиц ионная диагнос тика нас л е дс твенны х и инфе кц ионны х забол е ваний с троитс я наде тал ь ном изучении с имптомов и прове де нии много-

52

чис л е нны х биохимичес ких анал изов, вкл ю чая кул ь тивирование патоге нны х микроорганизмов нас л ожны х питате л ь ны х с ре дах. П ри этом вы явл е ние бе с с имптомного нос ите л ь с тва вре дны х ал л е л е й и микроорганизмоввозбудите л е й пре вращ ае тс я в чре звы чай но трудое мкую задачу. В час тнос ти, традиц ионны ми ц итоге не тичес кими ме тодами можно вы явить в ге номе чел ове ка л иш ь не которы е крупны е хромос омны е пе ре с трой ки: протяже нны е де л е ц ии и транс л окац ии ге не тичес кого мате риал а, поте рю ил и приобре те ние ц е л ы х хромос ом. П ри этом ме л кие де л е ц ии, транс л окац ии и вс тавки, а также точковы е мутац ии, которы е явл яю тс я наибол е е час то вс тре чаю щ имис я изме не ниями ге не тичес кого материал а, ос таю тс я не обнаруже нны ми. То же име е т ме с то и при диагнос тике бе с с имптомного нос ите л ь с твавозбудите л е й инфе кц ионны х забол е ваний бакте риал ь ной и вирус ной природы , наприме р вирус а иммуноде фиц ита чел ове ка, которы е в л ате нтной с тадии инфе кц ии могут прис утс твовать в организме чел ове ка л иш ь в не бол ь ш ом чис л е копий . Р ас ш ифровкас труктуры ге номачел ове ка, атакже разработкановы х ме тодов мол е кул ярной биол огии, и ос обе нно ме тод П Ц Р , откры л и не дос тупны е ране е возможнос ти дл я понимания мол е кул ярны х ос нов нас л е дс тве нны х бол е зне й и разработки новы х с трате гий диагнос тики и л е чения (нас л е дс тве нны х и инфе кц ионны х забол е ваний ). П ри этом мутац ии вы явл яю тс я в Д Н К кл иничес ких образц ов, а бе с с имптомное прис утс твие возбудите л е й обнаруживаю т по нал ичию ге номны х Д Н К ил и Р Н К с оотве тс твую щ их вирус ов ил и бакте рий . В с е го изве с тно 5 ты с . нас л е дс тве нны х забол е ваний чел ове ка(Н ЗЧ), из них 2 ты с . – тяже л ы х рас с трой с тв, приводящ их к инвал иднос ти. Н аибол е е пол но изучены моноге нны е забол е вания, возникаю щ ие в ре зул ь тате наруш е ния работы одного ге на. И х изве с тно уже бол е е ты с ячи. Э то, наприме р, фе нил ке тонурия, ге мофил ия, пигме нтная кс е роде рмаи др. О днако бол ь ш инс тво нас л е дс тве нны х бол е зне й с вязано с одновре ме нны м наруш е ние м работы не с кол ь ких ге нов нафоне возде й с твия опре де л е нны х факторов вне ш не й с ре ды . Э то так назы вае мы е мул ь тификториал ь ны е (многофакторны е ) бол е зни. В той ил и иной с те пе ни нас л е дс тве нны е ос обе ннос ти опре де л яю т вос приимчивос ть ил и ус той чивос ть к бол ь ш инс тву забол е ваний , в том чис л е и кинфе кц ионны м. Ге номны е ис с л е дования позвол яю т вы явить пре драс пол оже ннос ть к ряду патол огий нал ю бой с тадии развития организма. Э то рас ш иряе т возможнос ти пре с имптоматичес кой (проявл е ние бол е зни е щ е не набл ю дае тс я – “бол е зне нны й ” ге н проявит с е бя в бол е е поздне м возрас те ), дородовой и пре импл антац ионной (пре дш е с твую щ е й вне дре нию зароды ш а в матку) диагнос тики. В пос л е дне м с л учае ряд яй ц е кл е ток мате ри опл одотворяю тс я in vitro (в пробирке ), зате м не с кол ь ко зароды ш е й развиваю тс я до с тадии 8 кл е ток, и 1-2 кл е тки зароды ш аанал изирую тс я нанал ичие повре жде нного ге на. Зароды ш , не с оде ржащ ий повре жде нного ге на, импл антируе тс я в матку. В бол ь ш инс тве с л учае в проводитс я анал из Д Н К, пол ученной обы чно из крови ил и других биол огичес ких образц ов индивида. Гл авное пре -

53

имущ е с тво Д Н К-диагнос тики – это возможнос ть ус тановить пе рвопричину патол огии, т.е . наруш е ния с труктуры ге на. С помощ ь ю Д Н К-диагнос тики с е й час вы явл яю т уже бол е е 500 Н ЗЧ, в том чис л е 50 наибол е е рас прос тране нны х вы явл яю т в Р ос с ии. М ол е кул ярно-ге не тичес кие ме тоды , т.е . ме тоды Д Н К-диагнос тики прочно вош л и в медико-ге не тичес кую практику с 70-80х годов XX ве ка. В с е они ос нованы навы явл е нии и изучении мутац ий и могут бы ть подразде л е ны нап рямыеи косвенные. П рямые ме тоды Д Н К-диагнос тики возможны л иш ь при ус л овии, что ге н забол е вания кл онирован, изве с тнае го экзон - интронная организац ия ил и нукл е отидная пос л едовате л ь нос ть е го кД Н К. П ос кол ь ку пре дме том анал изапри этом явл яю тс я мутац ии гена, эффе ктивнос ть прямой диагнос тики с ос тавл яе т 100%. О днако ге ны бол ь ш инс тванас л е дс тве нны х забол е ваний е щ е не кл онированы ил и забол е вание може т бы ть обус л овл е но повре жде ние м не с кол ь ких ге нов. В таких с л учаях приме няю т косвенные ме тоды Д Н К-диагнос тики, ос нованны е на ис пол ь зовании с ц е пл е нны х с ге ном пол иморфны х марке ров. П оэтому не обходимы м ус л овие м ис пол ь зования кос ве нны х ме тодов Д Н К-диагнос тики явл яе тс я обязате л ь ное пре дварите л ь ное изучение ге нотипа (гапл отипа) хотя бы одного пораже нного родс тве нника. Сре ди ос новны х ме тодов Д Н К-диагнос тики вы де л яю т: - разл ичны е ме тоды мол е кул ярной гибридизац ии нукл е иновы х кис л от: гибридизац ия in situ (ISH- и FISH- гибридизац ия), дот-гибридизац ия, дозовы й бл от-гибридизац ионны й анал из и др., час ть из которы х бы л и рас с мотре ны вы ш е ; - анал из пол иморфизмадл ин ре с трикц ионны х фрагме нтов (П Д Р Ф ); - пол имеразная ц е пная ре акц ия (П Ц Р ); - анал из пол иморфизмамикрос ате л л итны х пос л е довате л ь нос те й . Д от-гибр идизация. П ри диагнос тике инфе кц ионны х забол е ваний час то ис пол ь зую т ме тод дот-гибридизац ии (от англ . dot – точка). Э тот ме тод явл яе тс я модификац ие й ме тодамол е кул ярной гибридизац ии и приме няе тс я, когдане обходимо ус тановить факт нал ичия опре де л е нной нукл е отидной пос л довате л ь нос ти в ис с л е дуе мы х образц ах и оц е нить е е кол ичес тво. И з подходящ е й ткани (крови, амниотичес кой жидкос ти, пл ац е нты , удал е нной опухол и ил и с пе рмы чел ове ка; пе чени ил и хвос та мы ш и; л ис ть е в рас те ния и т.д.) вы де л яю т с уммарную Д Н К. О бразц ы Д Н К нанос ят на микропорис ты й (нитроц е л л ю л озны й ил и капроновы й ) фил ь тр, де натурирую т и иммобил изую т обл учение м ул ь трафиол е том, пос л е чего инкубирую т с ме чены м зондом. П ри этом на один фил ь тр могут бы ть нане с е ны де с ятки образц ов нукл е иновы х кис л от, вы де л е нны х из биол огичес ких жидкос те й разны х пац ие нтов. М е чены е зонды , ис пол ь зуе мы е в диагнос тике , компл е ме нтарны какой -л ибо пос л е довате л ь нос ти Д Н К ил и Р Н К (в с л учае зараже ния Р Н К-с оде ржащ ими вирус ами), с пе ц ифичной дл я возбудите л я забол е вания. За не с кол ь ко час ов можно пол учить отве т, инфиц ирован л и пац ие нт опре де л е нны м вирус ом ил и микроорганизмом и как много чу-

54

же родной нукл е иновой кис л оты прис утс твуе т в образц е . О т ре зул ь татов такого анал изазавис ит тактикал е чения бол ь ного. Б лот-гибр идизация. В том с л учае , когдатре буе тс я бол е е де тал ь ная информац ия о рас пол оже нии вы явл яе мой с пе ц ифичес кой нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти в ге номе , приме няе тс я другая модификац ия ме тода мол е кул ярной гибридизац ии - блот-гибридизац ия(от англ . to blot – промакать фил ь тровал ь ной бумагой ), пре дл оже нной е щ е в 1975 г. Э таме тодикаявл яе тс я униве рс ал ь ной те хнол огичес кой ос новой . Сущ нос ть ме тодики закл ю чае тс я в с л е дую щ е м: Д Н К, вы де л е нная из ткани л ю бого органа, кл е ток крови ил и кл е ток, кул ь тивируе мы х вне организма, подве ргае тс я рас щ е пл е нию ре с трикц ионны ми нукл е азами (ре с триктазами), которы е “узнаю т” в не й с трого опре де л е нную пос л едовате л ь нос ть нукл е отидов. Р е с триктазы назы ваю т “биол огичес кими ножниц ами” (их изве с тно уже бол е е 500). Н абор фрагме нтов Д Н К, пол ученны й при разре зании опре де л е нной ре с триктазой , с пе ц ифичен дл я каждого организма. Чтобы из множе с тва наре занны х ре с триктазой фрагме нтов (от не с кол ь ких ты с ячдо де с ятков мил л ионов) най ти один ил и не с кол ь ко с опре де л е нной нукл е отидной пос л е довате л ь нос ть ю и охаракте ризовать эти фрагме нты , пол ученную с ме с ь Д Н К подве ргаю т эл е ктрофоре зу. П ри этом фрагме нты разде л яю тс я по разме ру (ме л кие в ге л е мигрирую т бы с тре е бол ь ш их). Р азде л е нны е фрагме нты “пе ре пе чаты ваю т” на фил ь тр (с пе ц иал ь ны м образом обработанную бумагу, нитроц е л л ю л озу ил и не й л он), фикс ирую т (иммобил изую т) на не м и подве ргаю т гибридизац ии с зондом (ол игонукл е отидом), ме ченны м радиоактивны м изотопом ил и фл ю оре с ц е нтной ме ткой . Зонд явл яе тс я кл ю чевы м эл е ме нтом диагнос тичес кой с хе мы . З онд – это ол игонукл е отид (короткий : 10-30 нукл е отидов, ме чены й те м ил и ины м с пос обом с е гме нт одноц е почечной Д Н К, ил и Р Н К, ил и е е Д Н К-копии), ис пол ь зую щ ий с я дл я вы явл е ния компл е ме нтарны х пос л е довате л ь нос те й с помощ ь ю гибридизац ии. З онд – это кл онированная ге нноинже не рны ми ме тодами нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть конкре тного ге на, подл е жащ е го ис с л е дованию , ил и пос л е довате л ь нос ть , с инте зированная ис кус с тве нно. Зонд вы явл яе т не обходимы й фрагме нт, е с л и он прис утс твуе т с ре ди ис с л е дуе мого множе с тва фрагме нтов. Э то проис ходит путе м с пе ц ифичес кого с вязы вания пос л е довате л ь нос те й зондас комл е ме нтарны ми е му пос л е довате л ь нос тями фрагме нта, зафикс ированны ми нафил ь тре . Узнать об этом можно по проявл яю щ е й с я в таком с л учае радиоактивной ил и фл уоре с ц е нтной ме тке . Е с л и в зонде с оде ржитс я радиоактивная ме тка, фил ь тр в те мноте накры ваю т ре нтге новс кой пл е нкой , а по прош е с твии опре де л е нного вре ме ни (от не с кол ь ких час ов до не с кол ь ких с уток) е е проявл яю т и по зас ве ченны м пол ос ам опре де л яю т, в фрагме нтах какой дл ины находитс я компл е ме нтарная зонду нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть . Е с л и зонд не с е т фл уоре с ц е нтную ме тку, фил ь тр фотографирую т в ул ь трафиол е товом

55

с ве те . Зонды ис пол ь зую т и дл я поис ка мутантного ге на не пос ре дс тве нно на хромос оме . М утантны й ге н при этом можно также обнаружить л ибо при ис пол ь зовании радиоактивно ме ченого зонда(ISH- ме тод), л ибо зонда, ме ченого фл уоре с ц е нтны м крас ите л е м (FISH- ме тод). FISH- ме тод име е т опре де л е нны е пре имущ е с тва пе ре д ISH-ме тодом потому, что при этом проис ходит бол е е точная л окал изац ия гибридизац ионного с игнал анахромос оме . Кроме того, не радиоактивная ме тка бе зопас на дл я здоровь я обс л уживаю щ е го пе рс онал а. В озможно приме не ние не одного, ане с кол ь ких Д Н К-зондов с разл ичной ц ве товой окрас кой . Пр именение ПЦ Р . Д л я вы явл е ния точковы х мутац ий , не бол ь ш их де л е ц ий и инс е рц ий в ис с л е дуе мы х ге нах, атакже ис комой нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти (прис утс твую щ е й в не дос таточном дл я обнаруже ния кол ичес тве ) ис пол ь зую т разл ичны е подходы , ос нованны е наме тоде П Ц Р , бл агодаря которому можно многократно уве л ичить (ампл ифиц ировать ) уникал ь ную пос л е довате л ь нос ть Д Н К, а зате м проанал изировать дл я вы явл е ния мутац ий ил и с пе ц ифичес кой пос л е довате л ь нос ти. Н е дос таточны м може т бы ть и с амо кол ичес тво ткани, дос тупной дл я прове де ния анал иза. В о вс е х этих с л учаях пе ре д нане с е ние м образц а на фил ь тр к ампл ификац ии (умноже нии) нукл е отидного мате риал ас помощ ь ю П Ц Р . А мпл ификац ия ничтожны х кол ичес тв ис ходного биол огичес кого мате риал ав с очетании с мол е кул ярной гибридизац ие й позвол яе т обнаружить одну кл е тку, инфиц ированную В И Ч с ре ди 105 не инфиц ированны х кл е ток нос ите л я СП И Д а. П риме не ние П Ц Р де л ае т возможны м однозначное ус тановл е ние л ичнос ти пре с тупникапо одному вол ос у, зас охш е й капл е с пе рмы , с л ю ны ил и крови с ис пол ь зование м ме тода “ге номной дактил ос копии” , также ос нованного напринц ипах мол е кул ярной гибридизац ии. 3.2. О б наруж ени е мут ац и й при наследст венных заб олевани ях человек а С еквенир ование Д Н К как способ обнар у ж ения му таций. П рямое секвенирование п родуктов П Ц Р явл яе тс я очень эффе ктивны м и чувс твите л ь ны м ме тодом вы явл е ния мутац ий . П ринято с читать , что с помощ ь ю прямого с е кве нирования одноц е почечны х и двухц е почечны х продуктов П Ц Р с тандартны ми ме тодами можно обнаруживать до 99% мутац ий . М е тод позвол яе т не тол ь ко точно л окал изовать мутац ию в ис с л е дуе мой пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов, но и опре де л ить е е тип и возможны й ме ханизм возникнове ния с учетом конте кс таокружаю щ их е е нукл е отидов. Лю бы е типы мутац ий могут бы ть обнаруже ны ме тодом прямого с е кве нирования мутантной кД Н К ил и отде л ь ны х экзонов. Как ос новной , этот ме тод приме няе тс я дл я с канирования мутац ий в ге нах, име ю щ их мал ы е разме ры (наприме р, в ге не фактораIX с ве рты вания крови, отве тс тве нного заге мофил ию В ). О днако с е кве нирование пол норазме рной кД Н К (т.е . вс е х экзонов) у пац ие нтов дл я опре де л е ния мутац ий дос таточно трудое мко, дорого и тре буе т бол ь ш их затрат вре ме ни. П оэтому напрактике чащ е проводят пре дварите л ь ны й отбор дл я ампл ификац ии фрагме нтов Д Н К, пре дпо-

56

л ожите л ь но с оде ржащ их мутац ии, азате м с е кве нирую т тол ь ко эти учас тки Д Н К. М е тоды поис кафрагме нтов Д Н К, с оде ржащ их мутац ии, ос нованы на с равните л ь ном анал изе мутантны х и нормал ь ны х пос л е довате л ь нос те й по ц е л ому ряду физичес ких и химичес ких характе рис тик, которы е в значите л ь ной с те пе ни варь ирую т от типамутац ионного повре жде ния. Н о не завис имо от ме тода вы явл е ния мутац ий , точны е мол е кул ярны е характе рис тики мутац ий могут бы ть пол учены путе м прямого с е кве нирования. М утац ии, изме няю щ ие дл ину ампл ифиц ированны х фрагме нтов, вы явл яю тс я л е гко при эл е ктрофоре зе . Такое , в час тнос ти, буде т име ть ме с то при микроде л е ц иях ил и вс тавках. Н о при мутац иях ге нов, пре дс тавл яю щ их с обой заме ну одного ил и не с кол ь ких нукл е отидов, дл ины ампл ифиц ированны х фрагме нтов ос таю тс я пос тоянны ми. В ыявление генных му таций пу тем оценки конфор мационного полимор физма однонитевой Д Н К (SSCP). О днако не которы е физикохимичес кие с вой с тва мутантны х мол е кул ме няю тс я. С учетом этих ос обе ннос те й разработаны разл ичны е ме тоды поис камутантны х фрагме нтов. Н априме р, ме тодами анал изаконформац ионного пол иморфизмаодноните вой Д Н К (SSCP – Single Strand Conformational Polymorfism). О н ос нован на ре гис трац ии разл ичий в эл е ктрофоре тичес кой подвижнос ти одноните вы х Д Н К, одинаковы х по ве л ичине , но разл ичаю щ ихс я вс л едс твие нукл е отидны х заме н по прос транс тве нной организац ии мол е кул . Конформац ия не бол ь ш их одноните вы х Д Н К завис ит от нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти, поэтому заме на даже одного нукл е отида приводит к изме не нию их прос транс твенной с труктуры . М е тод вкл ю чае т ампл ификац ию фрагме нтов Д Н К (экзонов ис с л е дуе мого ге на), де натурац ию продуктов П Ц Р и эл е ктрофоре з в П А А Г. В качес тве матриц ы дл я П Ц Р ис пол ь зую т Д Н К бол ь ны х и здоровы х (контрол ь ) индивидов. Каждая пара прай ме ров вы бирае тс я из пос л е довате л ь нос те й , фл анкирую щ их экзон, ил и из е го конц е вы х учас тков. В с л е дс твие компл е ме нтарнос ти две ц е пи одной мол е кул ы Д Н К име ю т разную нукл е отидную пос л е довате л ь нос ть , а поэтому принимаю т разную тре хме рную конфигурац ию и мигрирую т при ге л ь -эл е ктрофоре зе с разной с корос ть ю . В ре зул ь тате пос л е разде л е ния в ге л е набл ю даю тс я 2 пол ос ы , отве чаю щ ие разны м компл е ме нтарны м ц е пям. Е с л и две мол е кул ы , пре дс тавл яю щ ие один и тот же учас ток гена, но пол ученны е из разны х ис точников, разл ичаю тс я одной парой нукл е отидов, то конформац ия одиночны х ните й ткаих мол е кул Д Н К буде т разл ичать с я, т.е . каждая из четы ре х ц е пе й буде т пе ре ме щ ать с я при ге л ь -эл е ктрофоре зе с о с вое й с корос ть ю (рис унок 17). С помощ ь ю SSCP можно л окал изовать нукл е отидны е изме не ния в опре де л е нном экзоне ил и с пе ц ифичес кой обл ас ти ге на, аопре де л ить природу мутац ии може т л иш ь с е кве нирование . М е тод оц е нки конформац ионного пол иморфизмаодноц е почечны х фрагме нтов Д Н К прос т в пос тановке и позвол яе т вы явл ять до 80% мутац ий . Поиск му таций пу тем анализа гетер оду плексов (Heteroduplex analysis, HA). Е щ е одним прямы м новы м ме тодом Д Н К-диагнос тики явл я-

57

е тс я ге те родупл е кс ны й анал из (HA), которы й позвол яе т вы явл ять мутац ии, находящ ие с я в ге терозиготном с ос тоянии, а также инс е рц ии и де л е ц ии. П ринц ип этого ме тода закл ю чае тс я в с л е дую щ е м. П ри ампл ификац ии фрагме нтов ге нов ге те розигот, пос л е дую щ е й де натурац ии и ме дл е нной ре натурац ии пол ученны х продуктов П Ц Р в ампл ифиц ированной с ме с и наряду с двумя типами ге те родупл е с ов образую тс я ге те родупл е кс ы ме жду нормал ь ной и мутантной ц е пями Д Н К. Такие ге те родупл е кс ны е мол е кул ы отл ичаю тс я по эл е ктрофоре тичес кой подвижнос ти от гомодупл е кс ов за с чет конформац ионны х ос обе ннос те й в ме с тах не с овпаде ния нукл е отидов, пос кол ь ку эл е ктрофоре тичес кая подвижнос ть ге те родупл е кс ов значите л ь но ниже , чем гомодупл е с ов. Э ти разл ичия обнаруживаю тс я при эл е ктрофоре зе в П А А Г. Д анны й ме тод также позвол яе т находить до 80% мутац ий .

Р ис унок 17. А нал из конформац ионного пол иморфизма одноц е почечной Д Н К (SSCP) [Гл ик, 2002]: П ре параты Д Н К, разл ичаю щ ие с я одной парой нукл е отидов (A:T↔G:C), ампл ифиц ирую т П Ц Р -ме тодом с ис пол ь зование м одинаковы х прай ме ров (П 1, П 2). П Ц Р -продукты де натурирую т и разде л яю т с помощ ь ю ге л ь -эл е ктрофоре за на двух дорожках (1 и 2). Р ас с тояние , на которое пе ре ме щ аю тс я одноц е почечны е мол е кул ы Д Н К, завис ит от конформац ии, а пос дняя, в с вою очере дь , - от нукл е отидной пос л е довате л ь нос ти. П Ц Р -продукты образую т в ге л е не две , ачеты ре пол ос ы .

58

В нас тоящ е е вре мя наибол е е рас прос тране нны м с пос обом с крининга мутац ий явл яе тс я комбинац ия анал изаге те родупл е кс ов и ме тодаодноните вого конформац ионного пол иморфизма, позвол яю щ ая вы явить точковы е мутац ии почти в 100% с л учае в и не тре бую щ их бол ь ш их затрат вре ме ни. М етод “ тр ансляции белкового пр оду кта”. П рямы м ме тодом Д Н Кдиагнос тики явл яе тс я также ме тод “транс л яц ии бе л кового продукта” . О н ис пол ь зуе тс я дл я диагнос тики мутац ий , пре ры ваю щ их с инте з бе л кового продукта, в ре зул ь тате чего образую тс я укороченны е пол ипе птидны е ц е пи, функц ионал ь но не значимы е . Э тот ме тод проводитс я в с ис те ме in vitro на ос нове пол ученной с пе ц ифичес кой мР Н К с добавл е ние м л изатаре тикул оц итов, в котором с оде ржатс я вс е не обходимы е компоне нты дл я с инте за бе л ка. В этой с ис те ме с инте зируе тс я бе л ковы й продукт с оотве тс твую щ е го ге на. П родукт транс крипц ии анал изируе тс я с помощ ь ю эл е ктрофоре за. И зме не ние эл е ктрофоре тичес кой подвижнос ти бе л ка с виде те л ь с твуе т о нал ичии мутац ии (нонс е нс -мутац ия, наруш е ние с пл ай с инга Р Н К, с двиг рамки с читы вания), пре ры ваю щ е й с инте з пол ипе птидной ц е пи. В с е ме тоды , опис анны е вы ш е , приобре л и ос обую значимос ть с развитие м ме тодаП Ц Р , которы й дос таточно прос то позвол яе т ампл ифиц ировать конкре тны е учас тки ге номной Д Н К, пол учать пре паративны е кол ичес твагомоге нной по разме рам двухц е почечной Д Н К и бы с тро с оздавать ге те родупл е кс ы . П ри косвенной Д Н К-диагнос тике ис пол ь зую тс я те же те хничес кие прие мы , что и при прямой (пол учение Д Н К, ре с трикц ия, эл е ктрофоре з), а также не обходим мате матичес кий анал из с ц е пл ения признаков. И с пол ь зование кос ве нны х ме тодов Д Н К-диагнос тики оказал ос ь возможны м бл агодаря прис утс твию в ге номе пол иморфны х учас тков (л окус ов) Д Н К. Н укл е отидны е заме ны не ре дко вс тре чаю тс я в не кодирую щ их учас тках Д Н К. Значите л ь ное чис л о нукл е отидны х заме н приводит к изме не нию ме с т ре с трикц ии. Э ти изме не ния можно вы явить с помощ ь ю бл отгибридизац ии по Саузе рну, пос кол ь ку изме няе тс я дл ина ре с трикц ионны х фрагме нтов. Э та разновиднос ть пол иморфизма Д Н К пол учил а название пол иморфизмапо дл ине ре с трикц ионны х фрагме нтов (П Д Р Ф ). Р ас пол оже нны й вбл изи изучае мого ге на ил и внутри е го пол иморфны й с ай т може т с л ужить марке ром ал л ел ь ны х вариантов этого ге на, в том чис л е марке ром патол огичес ких мутац ий . Таким образом, кос ве нная Д Н К-диагнос тикас водитс я к анал изу пол иморфны х ге не тичес ких марке ров у бол ь ны х и здоровы х чл е нов с е мь и. М арке ры дол жны бы ть рас пол оже ны в том же хромос омном рай оне , что и ге н бол е зни, т.е . они дол жны бы ть с ц е пл е ны . О днако пол иморфизм, обус л овл е нны й нукл е отидны ми заменами ил и де л е ц иями, как правил о, диал л е л е н, с л е довате л ь но, е го информац ионная ц е ннос ть ограничена. Бол е е информативны ми явл яю тс я кл ас те ры танде мны х повторов, которы е обус л овл иваю т пол иморфизм по кол ичес тву копий (VNTR-variable

59

number of tandem repeats), так назы вае мы й пол иморфизм мини- и микрос ате л л итны х пос л е довате л ь нос те й . Кос ве нны е ме тоды Д Н К-диагнос тики не тре бую т знаний ге наи мутац ии в не м. О ни информативны дл я бол ь ш инс твас е ме й , но тре бую т абс ол ю тной уве ре ннос ти в кл иничес ком диагнозе , приме нимы тол ь ко дл я монол окус ны х забол е ваний и при обязате л ь ном с е ме й ном анал изе . В озможнос ть пре с имптоматичес кой , пре натал ь ной и даже пре импл антац ионной диагнос тики в пе рвом триме с тре бе ре ме ннос ти обе с пе чивае тс я с табил ь нос ть ю Д Н К напротяже нии вс е й жизни индивида. Д Н К-диагнос тика помогае т вы явить , наприме р, такие бол е зни как ге мофил ия А и В , миодис трофия Д ю ш е нна и Бе ке ра, муковис ц идоз, с пинал ь ная амиотрофия, фе нил ке тонурия, с е рповиднокл е точная ане мия и др. В с л учае адре но-генитал ь ного с индрома можно проводить профил актичес кое дородовое л е чение , с ущ е с тве нно с нижаю щ е е тяже с ть бол е зне й пос л е рожде ния ре бе нка. Д ородовое л е чение возможно и при с вое вре ме нной пре с имптоматичес кой диагнос тике бол е зни В ил ь с она-Коновал ова. В с л учае хоре и Ге нтингтона пре с имптоматичес кая диагнос тика име е т ре ш аю щ е е значение дл я пл анирования с е мь и. 3.3. Генет и ческ и й паспорт и его значени е В с е го в нас тоящ е е вре мя, гл авны м образом за с чет ис пол ь зования мол е кул ярно-ге не тичес ких ме тодов, удал ос ь картировать бол е е 10 ты с яч ге нов в ге номе чел ове ка (из 32 ты с с труктурны х ге нов), но те хничес ки дос тупе н индивидуал ь ны й анал из л иш ь по не с кол ь ким де с яткам ге нов. О днако это ге ны , отве тс тве нны е за важне й ш ие нас л е дс тве нны е забол е вания чел ове ка. П оэтому же л аю щ ие знать с вои ге не тичес кие характе рис тики могут пол учить ге не тичес кий пас порт, в котором буде т с оде ржать с я информац ия о нал ичии мутантны х ге нов, отве тс тве нны х за нас л е дс тве нны е бол е зни (моноге нны е ил и мул ь тифакториал ь ны е ). В не которы х западны х с транах ге не тичес кое те с тирование проводят по ме диц инс ким показаниям ил и в качес тве пл атной ус л уги. Све де ния, запис анны е в ге не тичес ком пас порте , - такая же врачебная тай на, как и ре зул ь таты л ю бы х других ме диц инс ких ис с л е дований . Д л я мол одого чел ове катакой пас порт важе н, чтобы знать какие бол е зни могут ожидать е го в будущ е м и как пре дотвратить их развитие . П ре жде чем прис тупить к с ос тавл е нию пас порта, не обходимо с ос тавить родос л овную и пос мотре ть , чем бол е л и е го родс тве нники. Н ос ите л ь с тво мутац ий , с вязанны х с моноге нны ми бол е знями (фе нил ке тонурие й , муковис ц идозом) можно опре де л ять , е с л и в с е мь е име ю тс я подобны е бол ь ны е ил и же забол е вания вс тре чаю тс я с вы с окой час тотой в той ме с тнос ти, где проживае т обс л е дуе мы й . Е с л и с ре ди родс тве нников бол ь ного име е тс я бол е е одного чел ове ка с одинаковой мул ь тифакториал ь ной патол огие й , не обходимо анал изировать ге ны пре драс пол оже ннос ти к е е развитию . П ри нал ичии факторов рис ка, с вязанны х с профе с с ие й ил и ус л овиями

60

с ре ды , нужно те с тировать ге ны , име ю щ ие отнош е ние к бол е зням, провоц ируе мы м этими факторами. Знание информац ии о с обс тве нны х гене тичес ких ос обе ннос тях дл я каждого чел ове кадае т возможнос ть е щ е до рожде ния пре дс казать , к каким нас л е дс тве нны м забол е ваниям буде т пре драс пол оже н чел ове к, какие меры профил актики и л е чения могут бы ть приняты . Ге не тичес кий пас порт може т бы ть макс имал ь но пол е зе н, е с л и ре зул ь таты те с тирования анал изирую тс я вы с ококвал ифиц ированны ми с пе ц иал ис тами вме с те с с е ме й ны м врачом. Р аботы по ге не тичес кой пас портизац ии профодятс я в Ирл андии, Ф инл яндии, СШ А . П равите л ь с тво Э с тонии вы де л ил о бол ь ш ие с ре дс твана ге не тичес кое те с тирование де те й с 7-л е тне го возрас та. Такие работы проводятс я и в Р ос с ий с кой Ф е де рац ии: в М ос кве , Санкт-П е те рбурге , Томс ке , Н овос ибирс ке , Уфе . СЛО В А Р Ь ТЕ Р М И Н О В Б анк генов, ил и клонотека (геномнаябиблиотека) – это кол л е кц ия кл онов Д Н К, вкл ю чаю щ ая вс е фрагме нты , входящ ие в с ос тав ге номаданного вида; набор фрагме нтов Д Н К, вс трое нны х в ве ктор. Б иблиотека кД Н К – кол л е кц ия кл онов кД Н К, с инте зируе мы х in vitro на матриц е мР Н К, проис ходящ их из одной ткани ил и кл е точной попул яц ии. Б лоттинг – пе ре нос разде л е нны х фрагме нтов из одной с ре ды (наприме р, ге л я) натве рды й нос ите л ь (бумагу, нитроц е л л ю л озны й фил ь тр). В екторы – это мол е кул ы Д Н К, с пос обны е пе ре нос ить вкл ю ченны е в них чуже родны е ге ны в кл е тку, где эти мол е кул ы ре пл иц ирую тс я автономно ил и пос л е инте грац ии с ге номом (хромос омой ). В е кторы ис пол ь зую тс я в ге нной инже не рии дл я пе ре нос а транс ге на от организма-донора в организм-ре ц ипие нт, атакже дл я кл онирования ге нов. Г ен – транс крибируе мы й учас ток хромос омы , кодирую щ ий функц ионал ь ны й пол ипе птид, л ибо тР Н К ил и рР Н К. Ге н – функц ионал ь но не де л имая е диниц а нас л едс тве нной информац ии, пре дс тавл яю щ ая с обой учас ток мол е кул ы Д Н К (ре же Р Н К у вирус ов) с опре де л е нной пос л е довате л ь нос ть ю нукл е отидов, кодирую щ ий с инте з пол ипе птида, тР Н К, л ибо рР Н К. Г ен-мишень – ге н, подве ргае мы й с пе ц ифичес кому возде й с твию . Ге н, инте ре с ую щ ий ис с л е довате л я. Г еном – это с овокупнос ть кодирую щ их и не кодирую щ их пос л е довате л ь нос те й (с уммарная ге не тичес кая информац ия) кл е тки и организма. Ге ном – с овокупнос ть ге нов гапл оидного наборахромос ом данного вида. Г еномика – наукао ге номах (о с труктуре и функц иях). Структурная ге номика вы явл яе т пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов в мол е кул ах Д Н К у организмов разл ичны х видов. Ф ункц ионал ь ная ге номика – это учение о функц иях генов.

61

Г енотип - с овокупнос ть ге нов отде л ь ного организма(индивидуума), находящ ихс я ме жду с обой в разл ичного рода взаимоде й с твиях. Т.е . генотип – это не прос тая с умма ге нов, а с ис те ма взаимоде й с твую щ их ге нов. Э то ге не тичес кая конс титуц ия организма(набор вс е х е го ал л е л е й ), име ю щ ая фенотипичес кое проявл е ние . Г ибридизац ияД Н К – с паривание двух однонитчаты х мол е кул Д Н К, час то из разны х ис точников, бл агодаря образованию водородны х с вязе й ме жду компл е ме нтарны ми нукл е отидами. И с пол ь зуе тс я дл я вы явл е ния с пе ц ифичес ких нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й в пре парате Д Н К. Д енатурац ия– рас хожде ние ц е пе й двухц е почечной мол е кул ы Д Н К ил и Р Н К. Э то наруш е ние нативной конформац ии биол огичес ких макромол е кул в ре зул ь тате разруш е ния водородны х с вязе й . Д Н К -маркирую щ ий сайт, STS (Sequence tagget site). Уникал ь ны й дл я данного л окус а ол игонукл е отид, которы й може т ис пол ь зовать с я дл я е го иде нтификац ии ме тодом П Ц Р . Д Н К -фингерп ринтинг (“отпе чаток пал ь ц е в” ) – набор ре с трикц ионны х фрагментов Д Н К, характе рны й дл я данного индивидуума. Д л я пол учения “отпе чатка” ис пол ь зую т л ибо ге л ь -эл е ктрофоре з как таковой , л ибо в с очетании с П Ц Р -ампл ификац ие й . Д Н К -п олимераза – фе рме нт, катал изирую щ ий с инте з пол инукл е отидной ц е пи из отде л ь ны х нукл е отидов с ис пол ь зование м другой ц е пи в качес тве матриц ы и Д Н К-затравки (прай ме ра) с о с вободной 3′-О Н группой . Д Н К -п олимераза Taq – те рмос табил ь ная Д Н К-пол име раза(с охраняе т активнос ть при 950С) бакте рии Thermus aquaficus. Час то приме няе тс я в ме тоде П Ц Р . Д омен – учас ток пол ипе птидной ц е пи, вы пол няю щ ий опре де л е нную функц ию (наприме р, ц итопл азматичес кий доме н, транс ме мбранны й доме н и т.д.). П о мне нию не которы х ге не тиков, кажды й доме н кодируе тс я учас тком гена, рас пол оже нны м ме жду с ос е дними интронами (т.е . одним экзоном). Д . - дис кре тны й учас ток хромос омы , с пирал изую щ ий с я не завис имо от с ос е дних учас тков (доме нов), ил и обл адаю щ ий повы ш е нной чувс твите л ь нос ть ю кД Н Казе . З онды – это ис кус с тве нно с инте зированны е ме чены е (изотопами ил и фл уоре с ц е нтны ми крас ите л ями – химичес ки) не бол ь ш ие (10-30 нукл е отидов) с е гме нты одноц е почечной Д Н К (ил и Р Н К, ил и е е Д Н К-копии), компл е ме нтарны е ис комому ге ну. Зонд – это с инте тичес кий ол игонукл е отид (короткий с е гме нт одноц е почечной Д Н К) с изве с тной нукл е отидной пос л е довате л ь нос ть ю , которы й ис пол ь зуе тс я дл я вы явл е ния компл е ме нтарны х пос л е довате л ь нос те й с помощ ь ю гибридизац ии. И скусственные хромосомы дрож ж ей - YAK (Yeast Artificial Chromosomes) – ве ктор, приме няе мы й дл я кл онирования очень бол ь ш их (до 400Кб) фрагме нтов Д Н К.

62

кД Н К – Д Н К, компл е ме нтарная мР Н К, пол ученная путе м обратной транс крипц ии; ис пол ь зуе тс я как мол е кул ярны й зонд вы с окой избирате л ь нос ти. К андидатное картирование – с трате гия иде нтификац ии ге на конкре тного забол е вания, ос нованная на данны х о возможном продукте данного ге на. К арта рестрикц ионная- диаграммарас пол оже ния намол е кул е Д Н К с ай тов узнавания ре с триктазами. К арта сц еп ления(мул ь тил окус ная ге не тичес кая карта) – с хе ма взаимного рас пол оже ния л окус ов нахромос омах данного организма. К артирование генома – это ус тановл е ние пол оже ния конкре тны х ге нов (ил и фрагме нтов Д Н К) на опре де л е нны х хромос омах относ ите л ь но других ге нов (ил и фрагме нтов Д Н К). О но базируе тс я на ис пол ь зовании тре х ос новны х ме тодов (ил и подходов): ге не тичес кого, ц итол огичес кого и физичес кого. К артирование рестрикц ионное – картирование , ос нованное наус тановл е нии точекде й с твия разл ичны х ре с триктаз. К артирование физическое – картирование , ос нованное на прямом анал изе мол е кул Д Н К, с ос тавл яю щ их каждую хромос ому (бе з анал изаре зул ь татов с кре щ ивания). Е го коне чная ц е л ь – опре де л е ние пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов в каждой хромос оме . К арты генетические - это с хе мы взаимного рас пол оже ния ге нов (ил и ге не тичес ких марке ров) на индивидуал ь ны х хромос омах, т.е . находящ ихс я в одной группе с ц е пл е ния. К арты физические – карты ге нома(в отл ичие от ге не тичес ких карт с ц е пл е ния) отражаю т ре ал ь ное рас с тояние ме жду ге нами (ил и марке рами), вы ражае мое чис л ом пар нукл е отидов. К лон – попул яц ия кл е ток ил и мол е кул , иде нтичны х одной родоначал ь ной кл е тке ил и мол е кул е . К лонирование – с овокупнос ть проц е дур, ис пол ь зую щ ихс я дл я пол учения кл онов. Кл онирование ге нов вкл ю чае т: вы де л е ние нужного ге наиз какого-л ибо организма, вс траивание е го в ве ктор, вве де ние в кл е тку организма-хозяина, многократная ре пл икац ия. К лонирую щ ий вектор – мол е кул а Д Н К (пл азмидная ил и вирус ная Д Н К), пре дназначенная дл я кл онирования Д Н К-миш е ни. К онтиги – не пре ры вны й набор кл онов, охваты ваю щ их данную обл ас ть хромос омы ил и вс ю хромос ому. К онформац ионный п олиморфизм одноц еп очечной Д Н К , SSCP (Single Strand Conformational Polymorfism) – разл ичие в конформац ии одноц е почечны х Д Н К, отл ичаю щ ихс я одна от другой вс е го одним нукл е отидом. А нал изируе мы е Д Н К подве ргаю т де натурац ии. Д е натурированны е ц е пи принимаю т разную конформац ию и при ге л ь -эл е ктрофоре зе мигрирую т с разной с корос ть ю .

63

К осмида – ве ктор, объе диняю щ ий с вой с тва пл азмидного ве ктора и ве кторанаос нове фага λ. Име е т cos-с ай ты . П озвол яе т кл онировать бол ь ш ие (до 45Кб) по с равне нию с пл азмидами фрагменты Д Н К. Л окус – ме с то нахромос оме , где находитс я с пе ц ифичес кий ге н. М аркерные эксп рессируемые п оследовательности, EST (Expressed sequence tag) – короткие марке рны е пос л е довате л ь нос ти, характе рны е дл я каждого экс пре с с ируе мого ге на чел ове ка. П озвол яю т изучать разме ры , разнообразие и транс крипц ионную активнос ть экс пре с с ирую щ ихс я ге нов чел ове ка. М аркерный ген – ге н с изве с тной хромос омной л окал изац ие й , име ю щ ий четкое фе нотипичес кое проявл е ние (мутантны й фе нотип, фе рме нтативная активнос ть и др.). Час то ис пол ь зуе тс я при прове де нии картирования других ге нов. “О братная” генетика – в отл ичие от кл ас с ичес кой ге не тики, изучаю щ е й вначал е признаки, а зате м контрол ирую щ ие их ге ны (признак→ге н), иде т в обратном направл е нии - от иде нтификац ии ге напри отс утс твии вс якой информац ии о не м к изучению е го функц ии (ге н→признак). О лигонуклеотид – короткий (6-10 нукл е отидов) с е гме нт одноц е почечной Д Н К. О бы чно пол учаю т химичес ким путе м. О ртологичные гены (ортологи) – это гомол огичны е ге ны в ге номах разны х организмов, которы е произош л и от одного ге на в общ е м пре дковом организме и с охранил и одну и ту же функц ию в проц е с с е эвол ю ц ии. О тж иг – проц е с с образования двухц е почечны х мол е кул (Д Н К-Д Н К ил и Д Н К-Р Н К) из одиночны х пол инукл е отидны х компл е ме нтарны х ц е пе й . Э то проц е с с вос с тановл е ния (ре натурац ии) двухц е почечны х мол е кул . П аралогичные гены (п аралоги) – в отл ичие от ортол огов п аралогичные гены возникаю т путе м внутриге номны х дупл икац ий и могут эвол ю ц ионировать с приобре те ние м новы х функц ий . П озиц ионное картирование – однаиз с трате гий иде нтификац ии ге на забол е вания в отс утс твие данны х о продукте этого ге на и каких-л ибо ге нов-кандидатов. Сначал а опре де л яю т хромос омную л окал изац ию (позиц ию ) ге на. Зате м пол учаю т ге номны е кл оны , охваты ваю щ ие картированны й с ай т (ис пол ь зуя с оотве тс твую щ ие марке ры ), иде нтифиц ирую т и анал изирую т прис утс твую щ ие в них экзоны . И с пол ь зуя ц е л ы й ряд ме тодов опре де л яю т, какой име нно ге н отве тс тве не н заданное забол е вание . П олимеразнаяц еп аяреакц ия(П Ц Р = PCR – polymerase chain reaction) - ме тод ампл ификац ии с пе ц ифичес кого фрагме нтаД Н К с помощ ь ю те рмос табил ь ной Д Н К-пол име разы , с ис пол ь зование м ол игонукл е отидны х Д Н Кзатравок, компл е ме нтарны х пос л е довате л ь нос тям противопол ожны х ц е пе й Д Н К на границ ах ампл ифиц ируе мого учас тка. П роц е с с с ос тоит из с е рии ц икл ичес ких повторяю щ ихс я ре акц ий : де натурац ии Д Н К, отжига зондов, с инте заД Н К. П олиморфизм длины рестрикц ионных фрагментов, П Д Р Ф (restriction fragment length polymorphism, RFLP) И зме нчивос ть дл ины фрагме нтов

64

Д Н К, образую щ ихс я при е е рас щ е пл е нии ре с триктазами. О бус л овл е намутац ионны м измене ние м с ай тов ре с трикц ии ил и появл е ние м новы х с ай тов. О бнаруживае тс я при разде л е нии фрагме нтов с помощ ь ю ге л ь эл е ктрофоре за. П раймеры – короткий ол игонукл е отид, которы й гибридизуе тс я с матриц е й и с л ужит затравкой при е е копировании (ампл ификац ии). “П рогулка п о хромосоме” (chromosome walking) - ме тод вы де л е ния и анал иза нукл е отидны х пос л е довате л ь нос те й (новы х ге нов), фл анкирую щ их изве с тны е ге ны , дл я которы х име ю тс я ол игонукл е отидны е зонды . Ф л анкирую щ ие пос л е довате л ь нос ти ис пол ь зую тс я зате м в качес тве зондов иде нтификац ии прил е гаю щ их кним пос л е довате л ь нос те й и т.д. П ротеом – пол ны й набор бе л ков в кл е тке в конкре тны й моме нт. П ротеомика - наукао наборах бе л ков в кл е тках при разны х физиол огичес ких с ос тояниях и функц иях этих бе л ков. Сущ е с тве нная разниц а ме жду ге номикой и проте омикой обус л овл е нате м, что ге ном данного вида, как правил о, дос таточно с табил е н, в то вре мя как проте ом индивидуал е н не тол ь ко дл я разны х кл е токодного индивида, но и дл я одной кл е тки в завис имос ти от е е с ос тояния (де л е ние , покой , диффе ренц ировка и т.д.). Т.е . проте ом – понятие динамичное . “П рыж ки п о хромосоме” (chromosome jumping) - один из вариантов ме тода“прогул ок по хромос оме ” , отл ичаю щ ий с я те м, что в ре зул ь тате какой -л ибо мутац ии марке рны й ге н, ис пол ь зуе мы й дл я с кринингабибл иоте ки, пе ре ме щ ае тс я по ге ному (пры гае т нату же ил и другую хромос ому), что позвол яе т вы де л ять новы е с ц е пл е нны е с ним ге ны . Расстояние на генетической карте – рас с тояние ме жду двумя ге нами, опре де л яе мое по час тоте ре комбинац ий наанал изируе мом учас тке . За е диниц у картирования принимаю т рас с тояние ме жду ге нами, ве роятнос ть ре комбинац ии ме жду которы ми равна1% (одной с антиморганиде ). Ренатурац ия – вос с ое дине ние ц епе й двухц е почечной Д Н К, разош е дш ихс я при де натурац ии. Рестриктаза – бакте риал ь ны й фе рме нт, рас щ е пл яю щ ий двухц е почечную Д Н К в с пе ц ифичес ких с ай тах. С еквенирование – опре де л е ние пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов Д Н К. С еквенатор – прибор дл я опре де л е ния пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов Д Н К. С ц еп ление генов – с овме с тное нас л е дование разл ичны х генов, л окал изованны х в одной и той же хромос оме . Э лектрофорез– ме тод разде л е ния заряже нны х мол е кул (Д Н К, Р Н К ил и бе л ков), ос нованны й наразной с корос ти их пе ре ме щ е ния в эл е ктричес ком пол е .

65

1. 2. 3. 4. 5.

О СН О В Н А Я ЛИ ТЕ Р А ТУР А Гл ик Б. М ол е кул ярная биоте хнол огия: П ринц ипы и приме не ние . / Б. Гл ик, Д ж. П ас те рнак. - М . : М ир, 2002. - 589с . Ж имул е в И .Ф . О бщ ая и мол е кул ярная ге не тика / И .Ф . Ж имул е в. Н овос ибирс к: И зд-во Н овос иб. ун-та, 2002. - 458 с . П атруш е в Л.И . Э кс пре с с ия ге нов / Л.И . П атруш е в. – М . : Н аука, 2000. – 466с . Синге р М . Ге ны и ге номы : в 2-х т. / М . Синге р, П . Берг. - М . : М ир, 1998. Щ е л кунов С.Н . Ге не тичес кая инже не рия / С.Н . Щ е л кунов. – Н овос ибирс к: Сиб. унив. изд-во, 2004. – 496с .

Д О П О ЛН И ТЕ ЛЬН А Я ЛИ ТЕ Р А ТУР А 1. А й ал аФ . Совре ме нная гене тика: в 3-х т. / Ф . А й ал а, Д ж. Кай ге р. – М .: М ир, 1987. 2. Бочков Н .П . Кл иничес кая ге не тика/ Н .П . Бочков.- М . : М е диц ина, 1997. - 288с . 3. Бул ат С.А . И де нтификац ия грибов и анал из их ге не тичес кой изме нчивос ти ме тодом пол име разной ц е пной ре акц ии (П Ц Р ) с ге нос пец ифичны ми и не с пе ц ифичны ми прай ме рами / С.А . Бул ат, Н .В . М ироне нко // Ге не тика. – 1996. – Т.32, № 2. – С. 165-183. 4. БуторинаА .К. М ол е кул ярны е ме ханизмы ге не тичес ких проц е с с ов.- И збранны е л е кц ии по курс у “Ге не тикас ос новами с е л е кц ии” . Учебное пос обие / А .К. Буторина, О .С. М аш кина. - В ороне ж : В ороне ж. гос . ун-т, 2004. - 75с . 5. Ге л ь фанд М . Биол огия in silico / М . Ге л ь фанд // Компь ю те рра. Биоинформатика. – 2001. - № 36 (413). – С.20-22. 6. Ге л ь фанд М .С. Биоинформатика: от экс пе риме нта к компь ю те рному анал изу и с нова к экс пе риме нту / М .С. Ге л ь фанд, В .А . Лю бе ц кий // В е с тникР А Н . – 2003. – Т.73, № 11. – С.987-994. 7. Гос тимс кий С.А . И с пол ь зование мол е кул ярны х марке ров дл я анал иза ге номарас те ний / С.А . Гос тимс кий , З.Г. Кокае ва, В .К. Боброва// Ге не тика. - 1999. - Т.35, № 11. - С.1538-1549. 8. Григорян И . Биочипы как приме р индус триал ь ной биол огии / И . Григорян, В . М аке е в // Компь ю те рра. Биоинформатика. – 2001. - № 36 (413). – С. 30-32. 9. Д ы мш иц Г.М . Н е радиоактивно ме чены е ол иго- и пол инукл е отидны е зонды – инс труме нт изучения с труктуры ге нома и диагнос тики / Г.М . Д ы мш иц // Сорос овс кий образовате л ь ны й журнал . – 2001. – Т.7, № 9. – С. 30-36. 10.Кол ь ман Я . Н агл ядная биохимия / Я . Кол ь ман, К.-Г. Р е м. – М . : М ир, 2004. – 469с . 11.Коничев А .С. М ол е кул ярная биол огия / А .С. Коничев, Г.А . Се вас ть янова. - М . : И здате л ь с кий ц е нтр “А каде мия” . - 2003. - 400с .

66

12.М аш кинаО .С. Ге не тичес кая инже не рия и биобе зопас нос ть - И збранны е л е кц ии по курс у “Ге не тика с ос новами с е л е кц ии” . Учебное пос обие / О .С. М аш кина, А .К. Буторина. - В ороне ж : В ороне ж. гос . ун-т, 2005. 71с . 13.М аш кина О .С. К ис пол ь зованию мол е кул ярны х марке ров Д Н К в ге не тико-с е л е кц ионны х ис с л е дованиях л е с ны х дре ве с ны х рас те ний / О .С. М аш кина, Ю .Н . И с аков // Ге не тичес кая оц е нкаис ходного мате риал ав л е с ной с е л е кц ии. – В ороне ж : Н ИИ ЛГиС, 2000. - С. 4-18. 14.М ирзабе ков А .Д . Биочипы в биол огии и ме диц ине XXI ве ка/ А .Д . М ирзабе ков // В е с тникР А Н . – 2003. – Т.73, № 5. – С. 412-424. 15.М ол е кул ярная биол огия кл е тки: в 3-х т. / Б. А л бе ртс [и др.]. - М . : М ир, 1994. 16.М утовин Г.Р . О с новы кл иничес кой ге не тики / Г.Р . М утовин. - М . : В ы с ш . ш к., 2001. - 234 с . 17.М ю л л ис К.Б. Н е обы чай ная ис тория о том, как родил ас ь пол име разная ц е пная ре акц ия / К.Б. М ю л л ис // Н аучная А ме рика. – 1990. - № 5. – С.2634. 18.О с трове рхова Н .В . Сравните л ь ная ге номная гибридизац ия как ме тод оц е нки ге номного дис бал анс а/ О с трове рховаН .В ., Н азаре нко С.А ., Че ре мны х А .Д . // Ге не тика. – 2002. - Т. 38, № 2. – С. 149-160. 19.П атруш е в Л.И . И с кус с тве нны е ге не тичес кие с ис те мы . Т.1: Ге нная и бе л ковая инже не рия / Л.И . П атруш е в. – М . : Н аука, 2004. – 526с . 20.П узы ре в В .П . Ге номны е ис с л е дования и бол е зни чел ове ка/ В .П . П узы ре в // Сорос овс кий образовате л ь ны й журнал . – 1996. - № 5. – С.19-27. 21.Р убц ов Н .Б. М ногоц ве тие с овре ме нной ц итоге не тики, ил и multicolor fish today / Н .Б. Р убц ов, Т.В . Карамы ш е ва // В е с тн. В О ГиС. – 2000. № 11. - С. 11-15. 22.Сивол ап Ю .М . И с с л е дования мол е кул ярно-ге не тичес кого разнообразия инбре дны х л иний и уровня ге те розис а у гибридов подс ол не чника / Ю .М . Сивол ап, А .Е . Сол оде нко, В .В . Бурл ов // Ц итол огия и ге не тика. 1998. - Т.32, N6. - С.5-10. 23.Све рдл ов Е .Д . В е л икое откры тие : ре вол ю ц ия, канонизац ия, догмы и е ре с ь / Е .Д . Све рдл ов // В е с тникР А Н . – 2003. – Т.73, № 6. – С.496-513. 24.Х авкин Э .Е . М ол е кул ярны е марке ры в рас те ние водс тве / Э .Е . Х авкин // Се л ь с кохозяй с тве нная биол огия. – 1997. - № 5. - С. 3-21. 25.Х ромос омы чел ове ка. А тл ас / А .Ф . Захаров [и др.]. - М . : М е диц ина, 1982. - 205с . 26.Х ус нутдинова Э .К. Ге номная ме диц ина – ме диц ина XXI ве ка / Э .К. Х ус нутдинова, С.А . Боринс кая // П рирода. – 2002. - № 12. – С.3-8. 27.Я нковс кий Н .К. Ге ном чел ове ка: научны е и практичес кие дос тиже ния и пе рс пе ктивы / Н .К. Я нковс кий , С.А . Боринс кая // В е с тник Р Ф Ф И . – 2003. - № 2. – С.3-21. 28.Chowdhary B.P. Einerging patterns of comparative genome organization in some mammalian species as revealed by Zoo-FISH / B.P. Chowdhary, T. Raudsepp, L. Fronicke // Genome research. – 1998. – Vol.8. – P. 577-589.

67

29.DNA fingerprinting in plants and fungi / Weising K. [et all.]. - Boca Raton: CRC Press. - 1995. - P.3-35. 30.McKusick A. Mendelian Inheritance in Man / A. McKusick. – Baltimor and London: Jons Hopkins University. – 1992. – 199p.

А вторы : А нас тас ия Конс тантиновнаБуторина, О л ь гаСе рге е внаМ аш кина Р е дактор О .А . Тихомирова