Методические указания к самостоятельной работе и лабораторному практикуму по физической химии ''Хроматографические методы анализа''

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВОСТОЧНО-СИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Методические указания к самостоятельной работе и лабораторному практикуму по физической химии «Хроматографические методы анализа» для студентов технологических специальностей дневного и заочного обучения

Разработали: Цыренова С.Б., Балдынова Ф.П., Карпенко Л.В.

Улан-Удэ, 2001 г.

Методические указания к самостоятельной работе и лабораторному практикуму по физической химии «Хроматографические методы анализа» для студентов технологических специальностей дневной и заочной формы обучения. Рассмотрено и одобрено на заседании кафедры «Биотехнология» «_29___»_июня__2001 г., протокол № 5 .

ВВЕДЕНИЕ Хроматографический метод всегда связан с движением газообразной или жидкой среды, содержащей смесь разделяемых веществ, через неподвижный слой сорбента, состоящий из отдельных зернышек или волокон. Разделение веществ возникает вследствие разницы в адсорбируемости и кинетике сорбции отдельных компонентов смеси. Эти элементарные акты сорбции и десорбции в лабораторных колонках повторяются десятки тысяч раз. Разрешающая сила и чувствительность метода при качественных определениях необычайно велика в рационально подобранных условиях. Особенно это относится к окрашенным колоночным и бумажным хроматограммам при визуальном исследовании пятен. При открытии и исследовании новых элементов периодической системы его чувствительность превышает чувствительность масс-спектографа. Актуально комбинирование хроматографических колонок с аналитическими приборами. Например, в случае газовой хроматографии продукты вытеснения, содержащиеся в обособленных зонах, могут поступать непосредственно в масс-спектограф. Для жидкостной хроматографии на выходе хроматографической колонки можно установить полярографический прибор, позволяющий сразу обнаружить присутствие компонентов смеси, заранее сконцентрированных в колонке. Сочетание объективных методов физико - химического исследования с хроматографическим способом разделения или накапливания вещества позволяет получать и количественные результаты. К ним относятся колориметрические, рефрактометрические, радиометрические и другие способы анализа жидкости, вытекающей из колонки, прямые радиометрические и спектрометрические измерения плотности окраски пятен на бумаге. 1. СУЩНОСТЬ МЕТОДА И ЕГО ПРЕИМУЩЕСТВА Хроматографический метод - один из наиболее эффективных физико-химических методов разделения и анализа сложных смесей. Он применяется к жидким и парообразным системам. Разделение компонентов смеси нескольких веществ основано на каком-либо различии в их свойствах, например: различная адсорбционная способность компонентов смеси; различная растворимость образующихся осадков; различное распределение компонентов смеси между двумя несмешивающимися жидкостями. Для хроматографического разделения смесей можно использовать любой механизм сорбции. Наибольшее распространение получили виды хроматографии, основанные на применении твердых сорбентов, такие как адсорбционная (молекулярная), распределительная, ионообменная, осадочная. По сравнению с другими методами разделения, такими как осаждение, перегонка, экстракция хроматографический метод обладает рядом преимуществ: 1) возможность разделения газообразных и жидких веществ любой природы; 2) для разделения можно использовать как большие так и малые количества анализируемой смеси; 3) хроматографический анализ применим для разделения смесей веществ, очень близких по своему составу, строению и свойствам;

4) высокая степень разделения, которая значительно выше, чем в методах дробной кристаллизации и перегонки; 5) простота выполнения и применение простой аппаратуры, доступной для любой лаборатории. Хроматографический метод анализа имеет большое значение и находит широкое применение, как в лабораторной практике, так и в промышленности. Наиболее быстро развивается промышленное применение колоночной - молекулярной и ионообменной хроматографии. Адсорбция паров летучих растворителей, гиперсорбция и сорбция в кипящем слое находят все большее и большее применение в промышленности. Гиперсорбцией называется метод, в котором применяется шихта, непрерывно движущаяся вдоль колонки, навстречу газовому потоку. Проходя внизу колонки зону регенерации, очищенный сорбент вновь поступает в верхнюю часть колонки. При этом возможно осуществление непрерывности сорбционного процесса. Ионный обмен применяется в пищевой, фармацевтической, медицинской и других отраслях промышленности главным образом для торможения солесодержания растворов органических веществ. Иониты играют активную роль при поглощении веществ, имеющих кислотные или основные свойства – антибиотиков, витаминов, алкалоидов и т.д. Распределительная колоночная хроматография, т.е. газожидкостная хроматография, получила широкое развитие как аналитический метод контроля производства, при разделении газовых смесей, преимущественно в технике переработки угля и нефти. Распределительная хроматография на бумаге перспективна при работе с ультрамалыми количествами веществ. 2. МЕТОДЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Хроматография развивается в нескольких направлениях, которые принято различать по механизму образования хроматограмм. Сюда относятся адсорбционная, ионообменная, распределительная и осадочная хроматографии. 2.1. Адсорбционная (молекулярная) хроматография. В основе адсорбционной хроматографии лежит поглощение разделяемых веществ на твердой поверхности выбранного адсорбента. Необходимая для этого энергия поглощения обусловлена вандерваальсовыми силами межмолекулярного взаимодействия адсорбант - адсорбент. Адсорбционная способность является свойством не только твердого тела, но и любой поверхности раздела двух фаз. На границе между раствором и адсорбентом устанавливается адсорбционное равновесие, определяемое равенством скоростей адсорбции и десорбции. В качестве адсорбента может быть использовано любое твердое вещество при соответствующем измельчении и активизации, однако применяется ограниченное число адсорбентов, дающих наиболее эффективные результаты хроматографического разделения. Из органических адсорбентов пригодными для молекулярной хроматографии являются сахароза, инсулин, лактоза, целлюлоза, крахмал. Из неорганических адсорбентов наиболее употребляемые: окись алюминия, карбонат кальция, окись кальция, силикагель, окись цинка, окись магния, активированный уголь, а также некоторые природные материалы, главным образом различные сорта глин. Адсорбенты для молекулярной хроматографии должны удовлетворять следующим требованиям: 1) быть химически инертными по отношению к компонентам раствора и к растворителю; 2) иметь достаточную адсорбционную способность (активность и емкость поглощения в значительной степени определяется способом приготовления); 3) быть однородными,

легко измельчаться до нужной величины зерна, но в то же время не подвергаться дальнейшему диспергированию в колонке, когда через нее фильтруют жидкость. 2.2. Ионообменная хроматография. Образование ионообменных хроматограмм основано на обмене ионов между растворенным веществом и адсорбентом. Сорбент для ионного обмена должен представлять собой твердое нерастворимое вещество, содержащее в своей структуре ионогенные группы, способные к реакции ионного обмена. Сорбируемое вещество должно находиться в растворе и быть в диссоциированном состоянии. Для осуществления катионного обмена сорбент должен содержать в своей структуре кислотные группы, ион водорода, которое легко обменивает на катион электролита, находящийся в растворе (катионообменный сорбент или катионит). В случае анионообменной сорбции сорбент должен содержать в своей структуре группы, обладающие свойствами оснований, т.е. гидроксида; ион этих групп должен обмениваться на анионы электролита, находящихся в растворе (анионообменный сорбент или анионит). Таким образом, ионообменные сорбенты представляют собой своеобразную группу электролитов, которые должны содержать в своей структуре ионы, способные к диссоциации и в то же время быть нерастворимыми. Сочетание этих свойств достигается соединением ионных групп или атомов ковалентными связями, в результате чего образуется высокомолекулярное соединение пространственной или сетчатой структуры. По своему химическому составу иониты можно разделить на 2 группы: 1) ионообменные сорбенты минерального происхождения; 2) ионообменные сорбенты органического происхождения. Сорбенты минерального происхождения представляют собой слабокислотные катионы или слабоосновные аниониты. К ним относятся для катионообменной адсорбции: окись алюминия, силикагель, фосфат циркония и другие природные алюмосиликаты; для анионообменной сорбции можно использовать окись алюминия или гидрат окиси циркония. Алюмоионогенная окись алюминия может быть использована как катионит и анионит. В первом случае подвижные ионы натрия замещаются на другие металлы: (Al2 O3)m AlO2 =(NA+MeAu → (Al2O3)m ALO2 -|Me++ NaAu Способность замены одного металла на другой определяется адсорбционным рядом, характерным для каждого ионита. Адсорбционный ряд для окиси алюминия: H+>As3+>Sb3+>Be3+=Fe3+=Hg2+ >Pb2+>Al3+>Cu2+>Hg22+> >Zn2+>Co2+=Ni2+=Cd2+=Fe2+>Fe3+>Mn2+ Во втором случае ионный обмен протекает по следующей реакции: (Al2O3)mAlO+|NО3-+MeAu=(Al2O3)mAlO+|Au-+MeNO3 Ионообменные сорбенты органического происхождения являются продуктами химической переработки угля или лигнина. Их получают синтетическим путем методом поликонденсации или полимеризации органических веществ. Сорбционные свойства ионообменных смол могут быть до известной степени заданы в процессе их изготовления. Ионогенные группы либо вводятся в исходное вещество до процесса смолообразования, либо присоединяются к макромолекуле смолы. Наибольшее распространение получили смолы: фенолформальдегид и полистирольные катиониты: аминоформальдегидные, полиаминовые и полистирольные аниониты. Ионообменная сорбция определяется характером ионогенных групп, присутствующих в сорбенте, и структурой сорбента.

Реакции ионного обмена протекают по следующим уравнениям: SO3-|H+ Z SO3-|H+ SO3-| Z SO3-|

SO3-| +CuSO4 → Z SO3-| SO3-|H+ Cu2+ +2HCl → Z SO3-|H+

Cu2++2H++SO42-;

+ Cu2++2Cl-

Смолы, содержащие аминогруппы (-NH2, -N(CH3)2 и т.д.), обладают теми же свойствами, что и сульфированные смолы, с той лишь разницей, что на них происходит обмен анионов, а не катионов. Состав смолы, содержащей аминогруппу, можно выразить символом [R2-NH2]+ Cl-. По степени ионизации смоляные иониты подразделяются: на сильнокислотные и слабокислотные катиониты; сильноосновные и слабоосновные аниониты. Основные качества ионита определяются сорбционной емкостью, физическими свойствами и химической стойкостью. Сорбционная емкость сорбентов характеризуется количеством растворенного электролита, которое было поглощено единицей веса или объема сорбента. К показателям физических свойств ионообменных сорбентов относят величины насыщенного веса, влагосодержание в воздушно-сухом состоянии, стойкость к растворителям, набухаемость, теплостойкость и механическую прочность. Мерой химической стойкости сорбента служит степень потери веса сорбента и степень потери емкости. 2.3. Осадочная хроматография. Осадочная хроматография используется для разделения веществ c различной растворяемостью осадков. Колонки для осадочной хроматографии состоят из смеси носителя и осадителя. В качестве носителя применяются высокодисперсные вещества, обеспечивающие хорошую фильтруемость раствора через их слой и индиферентные к осадителю и хроматографируемому раствору. Осадителями служат вещества, способные реагировать с анализируемым раствором с образованием осадков различной растворяемости. Носитель механически растирают с осадителем, затем пропитывают раствором осадителя и высушивают (сухие колонки) или пропитывают раствором осадителя, не высушивая (влажные колонки). Если через колонку пропустить смесь двух веществ AX и BX, которые реагируют с осадителем MZ, то процесс образования осадочной хроматографии можно выразить следующими уравнениями: MZ+AX= AZ ↓+MX MZ+BX=BZ ↓+MX Образовавшиеся в результате реакции соединения AZ, BZ подчиняются закону растворимости труднорастворимых веществ. Порядок расположения осадков определяется их растворимостью. Выделение одного или нескольких компонентов из смеси можно получить, применяя растворитель, который хорошо растворяет одни осадки и не растворяет другие. Носителями для осадочной хроматографии могут служить: силикагель, окись алюминия, гидроокись алюминия, сернокислый барий, крахмал, песок. Целесообразность применения того или другого носителя в каждом отдельном случае определяется характером веществ, участвующих в процессе. 2.4. Распределительная хроматография. Распределительная хроматография основывается на различных величинах коэффициентов распределения отдельных компонентов раствора между двумя несмешивающимися растворителями. При распределительной хроматографии носитель пропитывается одним

из растворителей (“неподвижный растворитель”), а другой растворитель (“подвижный растворитель”) пропускают через колонку носителя. В качестве неподвижного растворителя чаще всего берут воду или другие полярные жидкости (серную кислоту, метиловый спирт и т.д.); в качестве подвижного растворителя – менее полярные жидкости, не смешивающиеся с первыми во всех соотношениях. Порцию исследуемой смеси веществ, растворенную в подвижном растворителе, вводят в колонку и после того, как раствор впитается верхней частью колонки, начинают промывание колонки чистым подвижным растворителем. В процессе промывания происходит непрерывное перераспределение веществ смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами. Так как разные компоненты смеси имеют различные коэффициенты распределения, скорость передвижения отдельных компонентов различная. Наибольшей скоростью движения будет обладать тот компонент смеси, который имеет наибольший коэффициент распределения: C K = подв. Cнеподв. т.е. отношение концентраций растворенного вещества в подвижной фазе к его концентрации в неподвижной фазе. Одним из основных условий получения четкого разделения смеси методом распределительной хроматографии является практическое отсутствие какого-либо взаимодействия компонентов смеси непосредственно с носителем. Если это условие соблюдается, то при промывании колонки происходит полное разделение смеси. Число носителей, пригодных для распределительной хроматографии, крайне ограничено. Более или менее удовлетворительными качествами обладают такие носители, как особым образом, приготовленный силикагель, очищенный крахмал, целлюлоза. Особое место в качестве носителя занимает фильтровальная бумага; получение бумажных хроматограмм в распределительной хроматографии называется бумажной хроматографией. Применение дополнительных химических или физических средств для более эффективного разделения смесей дают новые виды хроматографического анализа. К химическим средствам относится пропускание через колонку раствора комплексообразователя. Такой прием носит название комплексообразующего вытеснения в хроматографии. Применение электрического поля, действующего на хроматографическую колонку, называется электрохроматографией, а нагревание колонки при хроматографическом разделении компонентов смеси – термохроматографией. Разделение смесей газов в хроматографической колонке, содержащей неподвижный растворитель, носит название газожидкостной хроматорграфии (ГЖХ), которая получила наибольшее применение в исследованиях и контроле химико-технологических процессов. В основе газожидкостной распределительной хроматографии лежит различие растворимости разделяемых веществ на выбранном неподвижном растворителе в хроматографической колонке. Ограничения в применении метода возникают из-за заметной летучести подавляющего большинства неподвижных жидких фаз. Однако ГЖХ имеют ряд преимуществ: 1) симметричность пиков на хроматограмме, обусловленная линейностью изотерм распределения разделяемых веществ в широком диапазоне концентраций; 2) большая универсальность в смысле разнообразия веществ, которые поддаются разделению с одновременным их аналитическим определением; 3) сравнительно низкий коэффициент распределения и, следовательно, малое время удерживания, что позволяет разделять быстро даже высококипящие соединения при хорошем качестве разделения. 3. ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Проведение хроматографического анализа смеси веществ можно условно разделить на несколько операций: 1) подготовка аппаратуры и реактивов; 2) получение хроматограмм; 3) анализ хроматограмм. В зависимости от применяемого сорбента в хроматографическом анализе рассматриваются несколько видов хроматограмм, из которых наибольшее распространение получили колоночные и бумажные хроматограммы. Основным прибором для получения колоночной хроматограммы является хроматографическая колонка, которая состоит из стеклянного или металлического цилиндра, запаянного порошкообразным или волоконным материалом, сорбентом или носителем. Размер колонки зависит от качества исходных веществ, подлежащих хроматографированию. Для микроанализа используются хроматографические колонки диаметром (1-2) мм и высотой несколько сантиметров. Для промышленных целей сооружаются хроматографические колонки высотой несколько метров и диаметром до одного метра. Заполнение колонки пористым материалом является важной операцией. От величины зерен сорбента или носителя и плотности его упаковки зависит скорость фильтрации и степень поглощения анализируемой смеси в колонке. Для заполнения хроматографических колонок используется сорбент определенного гранулометрического состава. Более крупные зерна сорбента измельчаются, мелкая фракция удаляется путем просеивания сорбента через набор сит. Колонку можно дополнять порошкообразным материалом в сухом виде или в виде суспензии в какой-либо жидкости. Способ заполнения трубки сухим пористым материалом имеет ряд недостатков. Так, например, при фильтрации жидкости через сухой материал в его порах остается значительное количество пузырьков воздуха, которые снижают “рабочую поверхность” пористого материала и нарушают режим потока жидкости. Существенным недостатком сухого метода является то, что многие применяемые в хроматографическом анализе сорбенты и носители имеют способность к набуханию, что приводит к постоянному изменению многих параметров, характеризующих режим работы колонки. Иногда набухший материал настолько плотно заполняет все поры, что фильтрация жидкости прекращается. В некоторых случаях развивается чрезвычайно сильное набухание, приводящее к разрыву колонки. Чтобы устранить эти недостатки, колонку заполняют сорбентом в виде суспензии. Для удаления пузырьков воздуха суспензию нагревают до 70-800С. При работе с набухающими материалами приготовленную суспензию необходимо выдержать в растворе в течении 1-2 суток, прежде чем вносить ее в колонку, так как процесс набухания происходит иногда очень медленно. Применяемые в хроматографическом анализе иониты требуют предварительной обработки. Полученные синтетическим путем они могут быть загрязнены продуктами реакционной среды, различного рода ионами и растворимыми низкомолекулярными компонентами. Промывание зерен ионита производят раствором соляной кислоты (1:1) до полного удаления ионов железа, затем водой до нейтральной среды. Отмывание сорбента удобнее производить динамическим методом в адсорбционных колонках при минимальной скорости движения промывного раствора. Очищенный таким образом ионит переводят в определенную ионогенную форму, например, в H+ - форму для катионов (а) в OH- -форму для анионитов. Для перевода в H+ - форму катионит в той же колонке промывают 5-6%-ным раствором соляной кислоты до прекращения изменения кислотности фильтрата, а затем дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод. Получение хроматограммы. При фильтрации через хроматографическую колонку смеси веществ в результате различной адсорбционной способности компонентов смеси в колонке будет происходить образование зон. Однако при этом не произойдет полного разделения смеси, т.к. только первая – самая нижняя зона - будет содержать в чистом виде один наименее адсорбируемый компо-

нент, вторая зона уже будет состоять из смеси двух компонентов, третья из трех и т.д. Последняя самая верхняя зона - будет содержать смесь всех компонентов. Таким образом, при получении первичной хроматограммы можно получить в чистом виде лишь часть одного из веществ смеси. Однако уже первичная хроматограмма может дать ценные сведения о качественном и количественном составе анализируемой смеси. Собирая последовательно в отдельные приемники одинаковые порции фильтрата, вытекающего из колонки, получают хроматограмму, Собранные порции фильтрата подвергают количественному анализу обычными химическими или физико-химическими методами. Промывание первичной хроматограммы чистым растворителем может привести к разделению зон. Разделение зон может быть полное и неполное. При неполном разделении имеет место перекрывание зон. В молекулярной хроматографии возможно полное разделение смеси при промывании компонентов с достаточно различной адсорбционной способностью. Промывание в ионообменной хроматографии приводит только к расширению зон. Особенность осадочной хроматограммы – получение чистых зон уже в первичной хроматограмме. В распределительной хроматографии для разделения смеси веществ используется только процедура промывания. Вытеснение. Для того, чтобы осуществить полное разделение компонентов смеси, необходимо применить операцию вытеснения (элюция). Она заключается в том, что после получения первичной или промытой хроматограммы в колонку вводится растворитель или раствор вещества, способный вытеснять все или некоторые адсорбированные компоненты смеси. При пропускании через колонку растворителя компоненты смеси, вытесняя друг друга, располагаются в колонке в виде отдельных чистых зон в соответствии с адсорбируемостью. Продолжительное пропускание растворителя через хроматографическую колонку приводит к последовательному вытеснению из колонки компонентов смеси. Газожидкостная хроматография. Процесс так же как и в газовой хромотографии, ведут в колонке, которую заполняют шихтой - пористыми телами, например, силикагелем, углем или пемзой. Но в этом процессе шихта не служит сорбентом газов или паров, а является носителем неподвижной жидкой фазы, которая и абсорбирует газы. Чем больше поверхность, смоченная жидкостью, тем активнее будет идти процесс, но поверхность эта должна оставаться легкодоступной для разделяемой газообразной смеси. Поэтому не следует применять носитель с тонкопористой структурой – мелкие поры, заполненные жидкостью, не принимают участия в сорбции. Жидкость должна хорошо смачивать и прочно удерживаться поверхностью носителя. Она должна обладать более низким давлением пара, не испаряться с поверхности сорбента во время продолжительного опыта. Такой жидкостью является, например, дибутилфталат, давление пара которого при обычных условиях составляет около 0,00007 мм. рт. ст. При выборе жидкости надо учитывать не только физические константы, но возможность растворять компоненты смеси. Так как методика ГЖХ позволяет вести процесс при довольно высоких температурах, неподвижными жидкостями могут служить вещества, являющиеся при обычной температуре твердыми телами (парафин, вакуумные смазки) Эти вещества в виде раствора в подходящем органическом растворителе наносятся на пористую основу, которую затем сушат, удаляя с нее растворитель. При 100-2000С твердые вещества плавятся и образуют неподвижную жидкую фазу. Процесс разделения смеси парообразных веществ на такой колонке ведут следующим образом. В верхнюю часть колонки через дозирующее устройство (например, микрошприц) вводят небольшое количество жидкой или газообразной смеси компонентов. Затем в колонку впускают ток газоносителя: водорода, аргона, гелия или азота. Процесс, происходящий в колонке, напоминает фракционную перегонку. Парообразные вещества распределяются между газом - носителем и жидкой фазой, находящейся на пористой основе. Газ – носитель, проходя над зернами основы, обогащается менее растворимыми компонентами, эта смесь абсорбируется следующими зернами, от которых уходит

фракция, еще более обогащенная легколетучими составными частями. Подобный процесс сорбции и десорбции с постоянным отставанием хорошо растворяемых компонентов происходит десятки тысяч раз по мере прохождения газа – носителя по всей длине колонки. Смесь распределяется по колонке отдельными зонами, содержащими чистые компоненты. В таком порядке они движутся вдоль шихты и выходят из колонки. Далее они регистрируются приборами – котарометрами ГЖХ – очень гибкий процесс, имеющий много вариантов. Здесь можно менять и сорбент и неподвижные жидкости, газ – носитель, длину и форму колонки. В основу количественного определения состава анализируемой смеси, по дифференциальным хроматограммам можно положить высоту пика (Н), площадь пика (П) или же произведение высоты пика (Н) на величину (L), пропорциональную (Vr) – удерживаемому объему (т.е. объему газа – носителя, который следует пропустить через слой сорбента в колонке от момента ввоза пробы до момента регистрации на выходе из колонки максимальной концентрации вымываемого вещества) (рис. 1). Величину (L) измеряют по хроматограммам как расстояние от момента выхода несорбирующегося вещества (точка О) до проекции точки максимальной концентрации на нулевую линию (точка G). Наиболее простым является измерение высоты пика. Однако для пиков размытых и не имеющих острой вершины измерения высоты может привести к значительным погрешностям. Для симметричных пиков целесообразно измерять площадь как произведение высоты на половину ширины. За высоту следует принимать (H), а за ширину – отрезок (А1-В1), H A1 ⋅ B1 П≈ . 2

(

)

Рис.1. Типичная выходная кривая проявительного метода Бумажная хроматография. Для получения бумажной распределительной хроматограммы берется полоса фильтровальной бумаги длиной 30-50 см и шириной 1,5 см. На один из концов этой полосы на некотором расстоянии от края наносится капля смеси анализируемых веществ. Затем этот конец бумаги опускается в ванночку, содержащую органический растворитель, насыщенный водой. При медленном продвижении растворителя через поры бумаги происходит непрерывное перераспределение веществ смеси между двумя жидкими фазами. Если разные компоненты смеси имеют различные коэффициенты распределения, то скорость продвижения отдельных компонентов смеси будет различной. Движение подвижного растворителя по бумаге может быть как нисходящим, так и восходящим. После того, как хроматографирование заканчивается, полосу бумаги высушивают и затем проявляют реактивом, дающим цветную реакцию с анализируемыми соединениями. Полученная хроматограмма представляет собой совокупность цветных пятен, расположенных в определенном порядке вдоль полосы бумаги. Анализ хроматограммы.

Заключительной стадией хроматографического анализа смеси веществ является качественный и количественный анализы полученной хроматограммы. Хроматограмма, полученная на адсорбенте белого цвета, представляет собой серию цветных зон, расположенных в определенном порядке. Визуальное исследование такой хроматограммы дает ориентировочное представление о составе исследуемой смеси. Если разделяемые вещества флюоресцируют в ультрафиолетовом свете, расположение зон в колонке можно определить при помощи облучения ее УФ- лучами. Выявление зон бесцветных веществ осуществляются методом проявления хроматограмм. Для этого через хроматографическую колонку пропускают раствор, который дает окрашивание зон, или перед началом хроматографии адсорбент обрабатывается соответствующим индикатором, который изменяет свою окраску в зависимости от среды образовавшейся зоны. Количественный анализ хроматограммы целесообразно проводить лишь в том случае, когда осуществлено полное разделение смеси и хроматограмма состоит из серии отдельных непрерывающихся зон. Количественный анализ результатов разделения сводится к определению количества вещества, содержащегося в каждой обнаруженной зоне. Ориентировочные данные можно получить, измеряя ширину полосы при стандартном сорбенте, откалиброванном по данному веществу при постоянных условиях. Для этой цели может быть использовано измерение диэлектрической постоянной по длине колонки или применение метода счета импульсов при работе с радиоактивными изотопами. Наибольшее распространение имеет метод фронтального анализа. При рациональном подборе вытеснителя обеспечивается последовательность появления отдельных компонентов смеси в фильтрате. В простейшем случае производится количественный и качественный анализ отдельных порций фильтрата. Метод отбора проб позволяет не только констатировать разделение, но и количественно выделять вымываемые из колонны вещества. Качественный анализ бумажных хроматограмм производится в основном такими же методами, что и анализ колоночных хроматограмм. Простым и убедительным способом анализа бумажных хроматограмм является способ свидетелей. Согласно этому способу на одной и той же полосе бумаги хроматографируют исследуемую смесь веществ и отдельно набор веществ, присутствие которых в исследуемой смеси предполагается. Растворы наносят на бумагу в один раз. После окончания хроматографирования и проявления зон производится визуальное сопоставление положения пятен известных веществ с положением пятен неизвестных веществ. Для бумажной хроматографии используют специальные сорта фильтровальной бумаги. В этом случае неподвижной фазой является вода, адсорбированная бумагой, или органическая жидкость, которой бумага пропитана. Иногда бумагу модифицируют, например, обрабатывают уксусным ангидридом. При этом гидроксильные группы целлюлозы превращаются в сложноэфирные, что приводит к изменению сорбционных свойств бумаги. Поток элюента может перемещаться вверх по полоске бумаги, благодаря капиллярным силам (восходящая хроматография) или вниз самотеком (нисходящая хроматография). Зоны отдельных компонентов проявляются в виде пятен. При работе с неокрашенными веществами приходится “проявлять” хроматограмму обработкой соответствующим реактивом, дающим цветную реакцию с компонентом смеси. В случае люминесцирующих веществ, зоны можно наблюдать, освещая хроматограмму ультрафиолетовым светом. Положение пятна каждого компонента характеризуется фактором замедления Rf, величина которого зависит от методики разделения, элюента и природы вещества. Фактор замедления рассчитывается по формуле: a Rf = , b где а- расстояние от линии нанесения веществ (линия старта) до центра пятна, обнаруженного на хроматограмме;

в- расстояние от линии старта до линии фронта элюента. 4. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В БИОЛОГИЧЕСКИХ И МЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ В настоящее время хроматография - один из наиболее распространенных методов анализа и выделения витаминов, антибиотиков, белков, гормонов, аминокислот и других природных соединений. Для анализа и разделения применяются разнообразные хроматографические методы. Начиная с работ М.С. Цвета, открывшего (табл.2) элютивную жидкостноадсорбционную хроматографию, её развитие сопровождалось ростом числа приложений в области биологии и медицины. Разработка А.Мартином и Р.Синджем (1941) жидкостной распределительной хроматографии значительно расширила возможности хроматографических методов. Преимуществами распределительной хроматографии является возможность работы в области линейной изотермы сорбции, что позволяет избавиться от деформации хроматографических полос. Кроме того, использование органических жидкостей в качестве неподвижной фазы улучшает возможность набора необходимого сорбента. Она с успехом применяется для анализа и разделения лекарственных препаратов, гормонов, пестицидов, антибиотиков. Основным недостатком классической жидкостной хроматографии является длительность процесса, достигающая суток. А. Джеймс и А.Мартин (1952) для разделения жирных кислот в качестве подвижной фазы использовали газ, положив начало газовой хроматографии в газожидкостном варианте. В связи с тем, что вязкость газа в 100 раз меньше вязкости жидкости, диффузионные процессы протекают в нем очень быстро, и скорость движения газовой фазы можно повысить. Процесс разделения с помощью газовой хроматографии обычно не превышает 0,5ч. Однако газовая хроматография не может быть использована для веществ, не переводимых в летучее состояние (соединений с молекулярной массой, превышающий 300, солей, термически нестойких соединений). С середины 60-х годов появился новый вариант жидкостной хроматографии, сочетающий быстроту газовой хроматографии с возможностью разделять нелетучие соединения. В этом варианте, называемом высокоскоростной жидкостной хроматографией, используются так называемые поверхностно-пористые насадки (сорбенты) в виде твердых частиц, не имеющих глубоких пор и застойных областей жидкости. Ниже приводятся данные, характеризующие различие методов жидкостной хроматографии: Таблица 1 Диаметр колонки, мм Размер частиц сорбента, мкм Линейная скорость элюента, м/с Градиент давления

Классическая хроматография

Высокоскоростная хроматография

10 - 12

1-3

100 - 200

< 40

10-5 - 10-4

1,5 - 3,5

Под действием собственного веса жидкости

до 10 Мпа/м

И. Парат и Р. Флодин (1959) обнаружили явление разделения белков по молекулярной массе при фильтровании через слои набухших зерен крахмала и агара. Оказалось, что низкомолекулярные соединения достаточно глубоко диффундируют в объем геля и по этой причине трудно вымываются подвижной фазой. Высокомолекулярные соединения или совсем не протекают в поры или, имея меньшую диффундирующую способность, протекают только в наиболее крупные поры. Парат и Флодин показали, что гель - проникающая хроматография может быть использована для удаления солей из водных растворов белков и для их концентрирования. В последние годы для гель - протекающей хроматографии предложено большое число насадок. В зависимости от степени набухания различают: - мягкие гели, имеющие небольшое число поперечных связей и увеличивающих свой объем при набухании в несколько раз; - полужесткие гели, набухающие в 1,1-1,8 раз; - жесткие гели, ненабухающие в растворителях. В качестве примеров мягких гелей можно привести крахмал, агарозу, полиакриламид, полиэектролиты для водных сред, а также полистирол, смешанный с дивинилбензолом, каучуки - для органических сред. Жесткими гелями являются пористые стекла и силикагели.

Сорбционные методы удаления токсических веществ из организма. С 60-х годов сорбционные методы используются для прижизненного удаления токсических веществ из биологических жидкостей. С этой целью через слой сорбента пропускают кровь, плазму и лимфу. Соответственно эти процессы называют гемо-, плазмо - и лимфоперфузией или - сорбцией. Гемосорбция была первым методом, использованным для лечения отравлений. Техника этой процедуры достаточно проста: цельную кровь, взятую из артериальной системы организма, пропускают через колонку с адсорбентом, после чего вновь возвращают в организм. Недостатком гемосорбции является прямой контакт адсорбента с клеточными частицами крови (эритроцитами, тромбоцитами, лейкоцитами), в результате чего некоторые виды адсорбентов (активные угли) могут вызвать травму клеток. для устранения этого недостатка было предложено заключать частицы угля в полупроницаемые мембраны. Такой вариант представляет собой комбинацию мембранных и сорбционного методов очистки. При его использовании проявляются недостатки гемодиализа: трудность извлечения веществ со средней молекулярной массой и гидрофобных соединений. Чисто сорбционный характер очистки сохраняется, если через сорбент пропускать не цельную кровь, а бесклеточную среду- плазму. Таблица 2 Классификация методов хроматографии Признак 1 Тип сорбционного процесса

Вид хроматографии 2 Адсорбционная Распределительная Экстракционная Ионнообменная

Особенности 3 Основан на различии изотерм адсорбции разделяемых веществ Основан на различии растворимости веществ в подвижной и неподвижной фазах Основан на различии экстракции разделяемых веществ в неподвижной фазе, содержащей комплексообразователь Основан на различии констант ионного обмена, разделяемых веществ

Гельпроникающая (эксклюзивная) Агрегат- Жидкостноное адсорбционная состояЖидкостноние жидкостная подвижГазоадсорбционной и не- ная подвижГазожидкостная ной фаз Способ Колоночная хроразмеще- матография ния сор- Капиллярная хробента матография Хроматография на бумаге Хроматография в тонком слое

Основан на различии способности молекул вещества проникать в поры геля Неподвижная фаза - твердое вещество, подвижная - жидкость Обе фазы - жидкости Неподвижная фаза - твердое вещество, подвижная - газ Неподвижная фаза - жидкость, подвижная газ Н из сорбента помещена в колонку Сорбент нанесен на поверхность капилляра Открыт сорбент - бумага Открыт сорбент - тонкий слой порошкообразного материала

5. ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ Работа 1. Определение магния и цинка в растворе Цель работы. Разделение и количественное определение ионов магния и цинка. Сущность работы. Ион Zn2+, содержащийся в анализируемом растворе, образует комплексный анион при достаточно высокой концентрации хлорид-ионов: Zn2+ + 4Cl- ⇔ [ZnCl4]2-. Магний при этом остается в виде катиона Mg2+. Для разделения этих ионов используется анионит ЭДЭ-10П. После промывания раствором соляной кислоты анионит диссоциирует по схеме RCl ⇔ R+ + Cl-, + где, R - высокомолекулярный катион. При пропускании раствора, содержащего ионы [ZnCl4]2- и Mg2+ через колонку с анионитом, происходит реакция ионного обмена по схеме 2RCl + [ZnCl4]2 ⇔ R2[ZnCl4] + 2Cl-. При этом цинк задерживается анионитом, а выходящий из колонки раствор содержит только магний. Промывание колонки водой приводит к понижению концентрации хлоридионов, что вызывает диссоциацию комплексных ионов R2[ZnCl4] ↔ 2R+ + [ZnCl4]2-, [ZnCl4] ↔ Zn2+ + 4Cl-, 2 R + + 2Cl ↔ 2 RCl . R2 [ ZnCl4 ] ↔ 2 RCl + Zn 2 + + 2Cl − В результате анионит переходит в первоначальную форму, а катионы Zn2+ оказываются в растворе, вытекающем из колонки. Определение ионов цинка и магния заканчивается объемным комплесонометрическим методом. Титрование основано на применении комплексона III, трилона Б (двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) NaOOC-CH2 HOOC-CH2

CH2COONa -

N-CH2-CH2-N -

CH2COOH

или, сокращенно, Na2H2An, где An – кислотный остаток этилендиаминтетраацетата. Диссоциация соли в водном растворе выражается уравнением Na2H2An ↔ 2 Na+ + H2An2-, причем H2An2- - диссоциирует слабо. Реакция взаимодействия с металлами выражается в общем виде уравнениями Ме2+ + H2An2- → МеAn2- + 2Н+, Ме3+ + H2An2- → МеAn- + 2Н+, Ме4+ + H2An2- → МеAn + 2Н+, показывающими, что один моль комплексона III реагирует с одним молем металла, независимо от природы и валентности иона металла. При титровании комплексоном III, к раствору, содержащему ионы определяемого металла, приливают буферный раствор, обеспечивающий необходимую величину рН, и вводят индикатор. Индикатор образует цветное комплексное соединение с ионами металла, окрашенное иначе, чем сам индикатор и менее прочное, чем соединение металла с титрантом. При введении эквивалентного количества комплексона III индикатор выделяется в свободном виде и наблюдается изменение окраски раствора. Выполнение работы. Подготовка анионита: 6г воздушно-сухого анионита ЭДЭ-10П в виде зерен размером 0,2-0,5мм предварительно выдерживают для набухания в течение суток в насыщенном растворе хлорида натрия, затем в течение суток в 2М растворе соляной кислоты и помещают в колонку (рис.2). Анионит в колонке промывают поочередно дистиллированной водой и 2 М раствором соляной кислоты, после чего колонка готова для работы. Обменная емкость анионита – 10ммоль/г.

Рис.2. Общий вид хроматографической колонки с ионитом. При работе с колонкой не следует допускать обнажения поверхности анионита, так как попадание воздуха в слой анионита нарушает работу колонки. Выполнение работы следует начать с промывания колонок дистиллированной водой. Для ускорения работы студентам выдают по две колонки. Промывание ведется порциями, очередная порция добавляется лишь после прекращения вытекания предыдущей (над анионитом всегда должен оставаться слой жидкости 0,5-1см). Израсходовав по 50 мл воды, колонки промывают 2М раствором соляной кислоты. Расход 2М раствора НСl cоставляет 70 мл на каждую колонку. В мерную колбу с отобранным вариантом задачи добавляют дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают. Приготовленный раствор 1 содержит ионы Zn2+ Mg2+ . Пипетку на 20 мл, соизмеренную с колбой, промывают этим раствором. Затем отбирают по 20 мл раствора 1 и переносят в два стаканчика вместимостью 50 мл. В стаканчики добавляют 8-10 мл (по две мерки) 6М раствора HCl. Полученный таким образом раствор, содержащий

ионы [ZnCl4]2-, Mg2+ и 2 моль/л HCl, пропускают через подготовленные колонки. Стаканчики промывают 2М раствором HCl и этот раствор тоже пропускают через колонку. Ионы [ZnCl4]2- - связываются анионитом, раствор, выходящий из колонки, содержит ионы Mg2+ и не содержит цинка. Чтобы удалить полностью ионы Mg2+, колонки промывают 70мл 2М раствора HCl. Полученные растворы, не содержащие ионов цинка, отбрасывают. Для извлечения ионов цинка через каждую колонку пропускают 100 мл дистиллированной воды. При этом ионы [ZnCl4]2- диссоциируют с образованием катионов Zn2+. Вытекающий из каждой колонки раствор 2, содержащий ионы Zn2+ , собирают в конические колбы для титрования. Добавив 1-2 капли индикаторы метилового оранжевого, раствор нейтрализуют, приливая из пипетки 6М раствор аммиака по каплям, до перехода розовой окраски в желтую. В результате внесения некоторого избытка аммиака раствор должен содержать NH4Cl и NH4OH. Затем добавляют 4-5 капель индикатора хромоген черного и титруют комплексоном III до перехода окраски в синюю (или в зеленовато-синюю из-за присутствия желтой формы метилового оранжевого) без фиолетового оттенка. После этого титруют исходный раствор задачи, содержащий ионы Zn2+ и Mg2+ (раствор 1). Из мерной колбы пипеткой отбирают два аликвота (по 20 мл) раствора 1 и вносят в две конические колбы, добавляют в каждую до 100мл дистиллированной воды, по 1 мм (одну мерку) буферного раствора (смесь NH4Cl и NH4OH), 4-5 капель индикатора хромоген черного и медленно титруют раствор комплексоном III до перехода окраски в синюю без фиолетового оттенка. Расчет результатов анализа. Если на титрование раствора, содержащего ионы Mg2+ и Zn2+ (раствор 1), затрачено v1 мл, а на титрование раствора, содержащего ионы Zn2+ (раствор 2), пошло v2 мл раствора комплексона III, то разность этих объемов отвечает содержанию магния, следовательно: m

Mg

2+

= 5 ⋅ ( v 1 − v 2 ) CM

Mg

2+

, мг ;

m Zn 2 + = 5 ⋅ v 2 CM Zn 2 + , мг , где С – молярная концентрация раствора комплексона III, ммоль/мл; М – молярные массы: M Mg 2 + = 24,32 мг/моль; M Zn 2 + = 65,38 мг/моль. Работа 2. Качественный и количественный анализ смеси углеводородов на газовом хроматографе Цель работы. Качественное и количественное определение разделяемых компонентов смеси углеводородов методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Сущность работы. Качественный и количественный анализ смеси различных углеводородов выполняется методом ГЖХ на газовом хроматографе. Подвижная фаза (газноситель) из баллона через камеры высокого и низкого давления редуктора поступает в блок подготовки газов 1, а затем термостатируемый блок колонок 2, совмещенный с дозатором – испарителем и детектором по теплопроводности. Температура детектора и термостата задается с помощью блока измерения и термостатирования 3. Сигнал детектора фиксируется регистрирующим прибором 4 компенсационного типа, условная схема которого изображена на рис. 5. Усилительная схема 1 с помощью двигателя М перемещает подвижной контакт К реохорда R до тех пор, пока напряжение V2 на реохорде не уравновесит входной сигнал детектора V1. Перемещение контакта R передается перу самописца. Спиральный хроматографические колонки общей длиной 1,0 м и внутренним диаметром 4 мм заполнены твердым носителем Хроматон N – AW (0,100 – 0,125), на который нанесена неподвижная фаза (НФ) 15% Карбовакс 20М. В качестве подвижной фазы используется азот или гелий. Поскольку НФ слабополярна, разделяемые углеводороды должны выходить из колонки в соответствии с их температурами кипения. Газовый хроматограф снабжен детектором по теплопроводности - катарометром – с ячейкой проточного типа, изображенным на рис 6. В качестве чувствительных элементов ячейки используют тонкие вольфрамовые нити, нагреваемые до высокой температуры по-

стоянным током. Стенки ячейки имеют более низкую температуру (температуру термостата). В условиях постоянства скорости подвижной фазы осуществляется непрерывный отвод тепла от нитей за счет теплопроводности и теплоемкости газа-носителя, и система в целом находится в состоянии теплового баланса.

Рис. 3. Схема регистрирующего прибора компенсационного типа КСП-4 Нити рабочей и сравнительной ячеек включены в схему моста Уинстона (рис.5). При попадании в рабочую ячейку одного из компонентов анализируемой смеси, разделяемой на хроматографической колонке, нарушаются условия отвода тепла от нити вследствие разницы в теплопроводностях (или теплоемкостях) газа-носителя и данного компонента; изменяется температура нити, а, следовательно, и её сопротивление, что приводит к возникновению сигнала детектора V1. Установка нуля

Рис. 4. Схема детектора по Рис.5. Схема моста Уистона теплопроводности: а – рабочая ячейка; б – ячейка сравнения Величину этого сигнала можно ориентировочно оценить, исходя из выражения γ −γк V 1 = kI 2 R α г ( Т н − Т б ), γг где k – константа, зависящая от геометрии ячейки; I – сила тока моста; R – сопротивление нити (обычно, 10÷20 Ом); α - температурный коэффициент (для вольфрама α = 4⋅10-3); λГ и λК – теплопроводности газа-носителя и анализируемого компонента; Тн и Тб – температуры нити и блока. Из данного выражения следует, что увеличение тока моста приводит к резкому росту сигнала, поскольку V1 ∼ I2, и кроме того, повышается и Тн. Такие детекторы могут работать при Тб - 60÷400°С, така как при токе моста 50-200 мА (с азотом в качестве газа-носителя) температура нитей достигает 700÷800°С. В последнее время в качестве чувствительных элементов катарометра используют термисторы (полупроводниковые термосопротивления). Эти элементы имеют большие со-

противления (до 1 МОм), большой (хотя и отрицательный) температурный коэффициент αтерм = -4⋅10-2, небольшие размеры (1÷2мм); и позволяют работать при низких токах моста (5÷10мА). Катарометр с термисторами менее инерционен (мала ячейка) и почти на порядок чувствительнее детектора с нитями, однако, из-за отрицательного температурного коэффициента Тб не должна быть выше 100°С. Газовый хроматограф должен быть предварительно подготовлен для выполнения анализа. В соответствии с характером анализируемой пробы выбирают и устанавливают необходимую температуру термостата (колонки и детектора) и испарителя; ток детектора и скорость потока газа-носителя. Подготовка хроматографа к работе

1. Специальным ключом открыть, вентиль баллона с газом-носителем. Вентилем тонкой регулировки установить давление на рабочем манометре (вторичная камера) 4 атм. 2. На блоке управления 3 установить потенциометром «темп. колонки» рабочую температуру: 125°С для азота или 90°С для гелия. Переключатель «множитель» поставить на отметку «0» (вправо до упора). 3. Поднять верхнюю крышку блока 2. Установить потенциометром «испаритель» температуру испарителя 125°С. включить тумблер «сеть». При этом на лицевой панели блока должны загореться индикаторные лампочки. 4. Включить тумблеры «сеть» и «питание детектора» на блоке управления 2. Потенциометром питания детектора установить ток детектора по микроамперметру 60÷70мА для азота или 90÷100мА для гелия. Включить тумблер «прибор» на самописце 4. 5. После 30 мин прогрева прибора подсоединить шланг пенного расходометра к выходу из колонки и, поворачивая вентиль тонкой регулировки соответствующей колонки блока подготовки газов 1, установить требуемый расход газа-носителя 20 см3/мин. 6. Переключить тумблер «множитель» на блоке управления 3 на отметку 100. Проверить дрейф нулевой линии, для чего включить тумблер «диаграмма» на самописце. Тумблерами установки нуля – «грубо» и «точно» на блоке управления 3 вывести перо самописца приблизительно на середину. Подождать пока перо самописца не начнет выписывать прямую линию, что указывает на стабилизацию температуры в термостате, после чего выключить тумблер «диаграмма» на самописце. Хроматограф готов к работе. Проверка режима работы хроматографа

1. Переключить тумблер «множитель» на блоке управления 3 в положение 10. 2. Включить тумблер «диаграмма» на самописце 4. Ручками «установка нуля», «грубо» и «точно» на блоке управления 3 установить перо самописца на нулевую отметку шкалы. В процессе выполнения анализа допустим небольшой дрейф (0,1мВ/ч) нулевой линии. 3. Записать в журнал (табл.1) температуру колонки, температуру испарителя, ток детектора и множитель шкалы. 4. C целью экономии диаграммной ленты отключить тумблер «диаграмма» самописца.

Дата

Температура испарителя, °С

Температура колонки, °С

Ток детектора, мА

1

2

3

4

Таблица 1 Шкала регистратора (деления) 5

Калибровка хроматографа Для выполнения качественного анализа смеси следует снять хроматограммы стандартных веществ, которые могут содержаться в задаче. Для этого необходимо определить объем вводимой пробы и время выхода (время удерживания - tR) индивидуальных компонентов. Результаты записать в журнал в виде табл.2

Таблица 2 Данные калибровки хроматографа Дата 1

Объем пробы (деления) 2

Номер пика

Время выхода, tR

Вещество

Примечание

3

4

5

6

Отбор и введение жидких проб производится при помощи микрошприца (рис. 6). Он состоит из корпуса 1, барабана 2, поршня со штоком 3, иглы 4. Работая со шприцем следует соблюдать следующий порядок. 1. Промыть шприц той жидкостью, которую необходимо дозировать. Для этого барабан шприца установить на нулевое деление шкалы корпуса, перемещая его по направлению к игле, и нажав на шток, поставить поршень в исходное положение. После чего, опустив иглу в раствор, медленно оттянуть шток до отказа, при этом камера шприца заполнится жидкостью. Нажатием на шток вывести жидкость из шприца в стаканчик для сбора отходов. Повторить промывание шприца не менее трех раз. 2. Заполнить шприц анализируемой жидкостью, оттянув шток до отказа. 3. Установить шприц иглой вверх и, осторожно постукивая пальцем по корпусу, добиться перемещения пузырьков воздуха вверх. 4 Вращая барабан против часовой стрелки, установить его на делении шкалы 10÷15. 5. Нажатием на поршень удалить воздух и избыток жидкости из камеры шприца.

Рис. 6. Микрошприц для дозировки жидких проб: 1 – корпус; 2- барабан; 3 – поршень со штоком; 4 - игла 6. Сделать 1-2 полных оборота барабана по часовой стрелке. 7. Включить тумблер «диаграмма» на самописце КСП-4. 8. Повернуть шприц иглой вниз, поднести его к головке испарителя и, проколов иглой резиновую мембрану, резко нажать до упора. При проколе мембраны игла должна входить в дозатор полностью и без усилий. Перемещение иглы должно осуществляться вертикально, иначе она может коснуться стенок и сломаться. Нельзя нажимать на поршень постепенно, так как жидкость в этом случае будет поступать в испаритель отдельными порциями, что и будет зафиксировано детектором в виде нескольких пиков (вместо одного). Во время нажа-

тия на шток, пером регистратора сделать отметку на диаграммной ленте -–это момент ввода пробы. 9. После выхода пика замерить по горизонтали расстояние от линии «ввода пробы» до максимума пика – это расстояние (в мм) при постоянстве скорости газа-носителя и движения диаграммной ленты пропорционально времени удерживания компонента – tR. Если пик не укладывается по высоте на диаграмме, то объем вводимой пробы следует уменьшить, если пик слишком мал -–увеличить. Если при объемом пробы – 1 оборот пик компонента выходит за пределы шкалы, переключить тумблер «множитель» блока 3 на отметку 30. 10. Каждую новую порцию жидкости следует вводить только после выхода предыдущей и после стабилизации нулевой линии. По мере передвижения диаграммной ленты следует непосредственно на ней записать номер пика, объемом пробы и время удержания. 11. все пробы должны быть введены при помощи одной и той же иглы. Если игла сломается, то обломки следует удалить, а введение всех проб повторить, пользуясь новой иглой. Выполнение качественного и количественного анализа смеси При выполнении работы следует придерживаться следующей последовательности операций: 1. Промыть шприц 3-4 раза исследуемой пробой. 2. Заполнить шприц исследуемой жидкостью. 3. Установить необходимый объем вводимой пробы- обычно в 1,5 раза больше объема индивидуальных компонентов. 4. Ввести пробу в хроматограф и выждать время, соответствующее выходу наиболее высококипящего компонента (одного из изомеров ксилола). 5. После выхода всех компонентов (обычно 2-3) получить у преподавателя диаграммную ленту и результаты записать в рабочий журнал (табл.3). 6. Сравнивая времена удержания стандартных веществ и отдельных компонентов задачи, определить её качественный состав. 7. Определить количественный состав пробы. Расчет может быть проведен различными способами, однако наиболее простым и точным при работе с катарометром является метод нормировки. Таблица 3 Результаты Объем проВремя Вариант качественДата бы (делеНомер пика удерживазадачи ного аналиния) ния, tR за 1 2 3 4 5 6

Вычисляют для каждого компонента произведение высоты его пика hi на время удерживания - hi t R , полученные произведения суммируют. Содержание компонента qi в задаче i

рассчитывают по формуле qi =

hi t Ri i =n

∑h t i =1

i Ri

Способ измерения высоты пика зависит от его формы. В случае пика идеальной формы (рис.7а) высота измеряется по перпендикуляру из вершины пика на нулевую линию. При значительном смещении нулевой линии (рис.7б) через обе нулевые линии проводят параллельные прямые, расстояние между которыми делят пополам. Высота пика в таком случае измеряется от его вершины до середины этого расстояния. При неполном разделении

измеряется от его вершины до середины этого расстояния. При неполном разделении двух компонентов (рис.7в) экстраполируют (пунктир) очертания пиков. Из рисунка видно, что большой пик повлиял на высоту малого. Поэтому высоту последнего следует найти как показано на рис.7в. Результаты работы записывают в табл.4. Таблица 4 НаименоваВремя удерСодержание ПроизведеВысота пика живания ние компоt Ri , Номер пика компонента, ние hi t R hi, мм i нента задачи % мм 1 2 3 4 5 6 Для одного из компонентов смеси рассчитать эффективность колонки N:  tR  Т = 16  ,  µ0  где µ0 - ширина основания пика, мм (см. рис.7 а).

Рис. Форма хроматограммы и способы замера высоты пика: а - идеальная хроматограмма; б - хроматограмма со смещенной линией нуля; в - неполностью разделенные пики По окончании работы шприц следует сдать дежурному. Работа 3. Построение изотермы адсорбции на основе хроматографических измерений. Цель работы. Построить изотерму адсорбции спиртов по хроматографическим кривым проявления и рассчитать адсорбцию. Сущность работы. Изотерма адсорбции иллюстрирует зависимость адсорбции а от равновесной концентрации С. Чтобы построить эту изотерму, надо определить а при разных значениях С. Концентрация исследуемого газа или пара, соответствующая данной точке хроматографической кривой, пропорциональна отклонению пара регистрирующего прибора: С = Кh, (1) где К – постоянная прибора, ммоль/мл⋅см; h – отклонение пара самописца, см. Чтобы знать К, надо провести калибровочный опыт с тем же веществом. Для этого ввести в дозатор определенное количество q вещества и измерить площадь пика на хроматограмме. Из нескольких опытов определить средний результат. Все количество этого вещества выйдет из колонки с образованием пика на диаграммной ленте самописца и может быть выражено интегралом, т.е. площадью пика. Объем прошедшего через колонку газа-носителя

l , (2) u где αS – объемная скорость потока газа-носителя, мл/мин; l - расстояние на ленте самописца от начала опыта, см; u – скорость движения ленты самописца, см/мин. Тогда V = αSt = αS

v2

Kα s 2 Kα s q = ∫ cdV = ∫ Kh dl = hdl = S, ∫ u u l1 u l1 v1 l2

αS

l

(3)

где S – площадь кривой проявления (интегрирование производится по всей кривой проявления), см2. Отсюда qu К= . (4) αS S калибровку производить при той же температуре, что и опыты с целью построения изотермы адсорбции. Уравнения для вычисления измотерм адсорбции выводят из уравнения материального баланса хроматографического процесса:

ω=

αS

 ∂Са  vc +   Va  ∂С  Χ

,

(5)

где vс – объем пространства в колонке, занимаемый подвижной, на единицу длины колонки; ω - линейная скорость перемещения зоны компонента по длине колонки; V – объем пространства в колонке, занимаемой неподвижной жидкой фазой на единицу длины колонки; Са – концентрация введенного компонента в колонку в неподвижной фазе; С– концентрация компонента в подвижной фазе; va – объем пространства в колонке, занимаемый неподвижной фазой, на единицу длины колонки. Если в последнем уравнении заменить (∂Са/∂С) на da/dc, то оно приобретет вид

ω=

αs

(6) . da vc + va dc Это уравнение справедливо для любого вида изотермы адсорбции. Каждой концентрации на кривой проявления соответствует при данной скорости потока газа – носителя αs определенное время удерживания tr. Поэтому преобразование данного уравнения дает da α S t αS = Vc + Va = , (7) ω dc L L поскольку ω = (L – длина слоя адсорбента в колонке). t В результате дальнейших преобразований получим, da α S t Vc α S t − Vc L = − = . (8) dc Va L Va Va L Так как αSt равно объему удерживания десорбирующегося из колонки вещества – адсорбента V при данной выходной концентрации, Vc L равно объему удерживания газа- носителя V0, равного объему промежутков между зернами адсорбента, VaL равно объему Va, занимаемому адсорбентом (без объема промежутков между зернами), то da v − v0 = . (9) dc va Интегрируя это уравнение, получим выражения, связывающее адсорбцию аi c равновесной концентрацией сi:

c

1 i (vi − v0 )dc (10) Va ∫0 Графически аi равно площади (V0V2 Ci Ci) поделенной на объем адсорбента в колонке Va, как это показано на рис.8. Значения С может быть выражено через пропорциональное ему показание детектора h по уравнению (1), а V – через пропорциональное значение l. Тогда (10) примет вид αKh αK (11) ai = f (ci ) = s ∫ (l i − l 0 )dh = s S , Vau 0 Vau где ai – адсорбция (в ммоль/см3), S – площадь пика (в см2), заштрихованная на рис. 2 и соответствующая интегралу в (11). ai =

v2

Рис. 8. График зависимости площади хроматографического пика

S = ∫ cdV v1

от количества введенного в колонку вещества q и способ графического расчета адсорбции согласно уравнению 8 В отличие от случая калибровки, когда задача состоит в определении соотношения между количеством дозированного в колонку вещества q и площадью соответствующего этому количеству пика V1 Сmax V2, решая задачу построения изотерму адсорбции, измеряют площадь V0V2CiCi; интегрируют в пределах высоты, а не ширины пика, как показано на рис. 8. Таким образом, расчет изотерм, адсорбции следует производить по графику на рис. 9 и формулами (11), (1): αK a1 = s S 1; S 1 = Oh1 c1 l 2 − Oh1 c 0′ l 0 ; c1 = Kh1 ; uVa αK a2 = s S 2; S 2 = Oh2 c2 l 2 − Oh2 c0′′l 0 ; c2 = Kh2 ; uVa αK a3 = s S 3; S 3 = Oh3 c3 l 2 − Oh3 c0′′′l 0 ; c3 = Kh3 ; (12) uVa αK '''' a4 = s S4 ; S 4 = Oh4 c4 l 2 − Oh4 c0 l 0 ; c4 = Kh4 ; uVa αK i ai = s Si ; S i = Ohi ci l 2 − Ohi c0 l 0 ; ai = Khi ; uVa αK amax = s S max ; S max = Ohmax cmax l 2 − Ohmax c0max l 0 ; amax = Khmax ; uVa

Рис. 9. График для расчета адсорбции по (12), (11) и (1) Выполнение работы. Адсорбенты: силикогель с удельной поверхностью 76м2/г (силохром - 3) или трепел Зикеевского карьера Т3К-М (зернение 0,25-0,5мм). Длина колонки 100-200см, внутренний диаметр 0,3см, температура 600С. Скорость потока газа –носителя (азот) 40мл/мин. Скорость диаграммной ленты самописца 1440мм/с. Объем вводимой пробы бензола в колонку (микрошприцем) 0,006мл. Рассчитать адсорбцию и равновесную концентрацию по (12). Свободный объем колонки V определить по объему удерживания водорода. Результаты расчета представить графически в координатах ai (ммоль/см3) – сi (ммоль/см3) и свести в таблицу по форме

ai, ммоль/см3

Сi, ммоль/см3

Работа 4. Определение теплоты и энтропии адсорбции или растворение на основе хроматографических измерений. Цель. Снять хроматограммы жирных спиртов при температуре колонки 20, 40, 60, 80 С. Вычислить теплоту, энтропию и свободную энергию растворения. Сущность работы. Коэффициент адсорбции Г и коэффициент распределения К – термодинамические константы фазового равновесия. Поэтому для них справедливы уравнения ∆Ga = − RT ln Г , (1) ∆G S = − RT ln K , (1а) ∆Ga = ∆H a − T∆ S a , (2) ∆G S = ∆H S − T∆ S S , (2а) В этих условиях ∆Ga и ∆G S - свободная энергии адсорбции и растворения соответственно, т.е. свободные энергии перехода вещества из одной фазы (подвижной) в другую фазу (неподвижную) и наоборот; R и T – газовая постоянная и абсолютная температура хроматографической колонки, при которой измерена Г и К, ∆Ha и ∆Hs – энтальпии адсорбции и растворения соответственно, численно равна теплотам адсорбции и растворения, но с обратным знаком, т.е. - Qa и -QS; ∆Sa и ∆SS – энтропии адсорбции и растворения соответственно. Приравниваем правые части уравнений (1) и (2), а также (1а) и (2а). После преобразований получим ∆H a ∆S a lg Γ = − , (3) + 2,3RT 2,3R 0

lg Κ = −

∆H s ∆S s , + 2,3RT 2,3R

(3а)

При этом - ∆На = Qa и - ∆НS = QS. (3а/) Уравнения (3) и (3а) можно рассматривать как уравнения прямой у = Ах тВ со следующими параметрами: ∆H ∆S 1 y = lg Γ (или lgK), x = , A = − ;B= (4) T 2,3R 2,3R Если нанести на график величины lgK или lgГ относительно обратных температур 1/Т хроматографической колонки, при которых измеряется Г и К, то экспериментальные точки должны лечь на прямую. Из углового коэффициента прямой можно вычислить теплоту адсорбции Qa или теплоту растворения QS, а по отрезку В и его численному значению соответствующую энтропию адсорбции или энтропию растворения, т.е. ∆Sa или ∆SS.

Рис. 10. График зависимости логарифма коэффициента адсорбции Г или коэффициента распределения К от обратной температуры хроматографической колонки (1/Т) Угловой коэффициент прямой равен: ∆ lg(Γ, K ) Q A= = . (5) 2,3R ∆(1 / T ) Следовательно, ∆ lg Γ Qa = 2,3R (дляГАХ ) (6) ∆(1 / T ) ∆ lg K QS = 2,3R (дляГЖХ ) (6а) ∆(1 / T ) Таким образом, теплота адсорбции и теплота растворения определяются из ряда хроматографических опытов, проведенных при различных температурах колонки в изотермическом режиме. Величины ∆lgГ и ∆lgK представляют собой соответственно разности логарифмов коэффициентов адсорбции и коэффициентов распределения, измеренных при двух температурах хроматографической колонки: Т1 и Т2. Величина ∆ (1/Т) с разность обратных температур Т1 и Т2. Величины Г и К рассчитать из объемов удерживания по формулам: Г=

V − VΓ ( o ) V −V d S t r Vc L или Г = Γ и K = Γ Γ (o) , − Va LVa Va L VL

(3б)

где Vr = αstr – объем удерживания исследуемого вещества; VcL – объем пространства между зернами сорбента, равный объему подвижной фазы по всей длине колонки, а также равный объему удерживания несорбирующегося вещества Vr(0), если таковое вести в колонку; VaL=Va – объем, занимаемый неподвижной фазой. VL=VL⋅L – объем жидкой фазы в колонке. При точных измерениях следует вносить поправку на период давления в колонке f1, температурную поправку f2 и поправку на упругость пара манометрической жидкости в ремометре f3, а истинный объем удерживания вносить для каждой температуры колонки.

V r ( ист ) = (t r − t r ( 0) )α 3изм

2 3 ( ρ / ρ 0 ) − 1 Т кол ρ 0 − ρ H 2O ⋅ ⋅ ⋅ 2 ( ρ / ρ 0 ) 3 − 1 Т реом ρ0

(3в)

где ρ - давление газа-носителя на входе в колонку; ρ0 – давление газа-носителя на выходе из колонки; ρ Н 0О - упругость водяных паров при температуре реометра. Треом – абсолютная температура реометра; Ткол – абсолютная температура хроматографической колонки. Попровку f1, f2, f3 и ρ 0 − ρ Н 2О Tкол 3 (ρ / ρ0 )2 −1 f1 = ; ; f = . f = 3 2 2 (ρ / ρ 0 )3 − 1 ρ0 Т реом В этом случае Vr ( шт ) Vr ( шт ) , К= (7) Г= Va VL После вычисления теплоты адсорбции (6) или теплоты растворения (6а), исходя из значений А можно вычислить энтропию адсорбции ∆Sа или энтропия растворения ∆SS, исходя из значений В, т.е. отрезков, отсекаемых прямой графика функции lg(Г,К) = f (1/T) на оси ординат (рис 10, формула 4). В этом случае ∆S = 2,3RB. Такой способ расчета энтропии ненадежен, т.к. ненадежно графическое определение константа В. Более точно энтропию рассчитывают по формуле (2 и 2а), после того, как графически определена теплота, а по (1 и 1а) рассчитывают свободную энергию. Таким образом ∆H a − ∆Ga ∆H S − ∆G S ∆S a = , ∆S s = (8) T T Поскольку величина 1/Т << 1, то для графического расчета удобнее на график нанести не 1/Т, а 1000/Т, но расчет производить по 1/Т. Пересчет температуры колонки t0C d 1000/T0K, приведен в табл.1 (см. приложение). Если обратиться к уравнениям (3б), припев при этом, что - ∆Н=Q, то уравнения (3 и 3а) примут вид: Qa ∆S a lg Vr ( испр ) = + + lg Va (9) 2,3RT 2,3R QS ∆S S lg Vr (испр ) = + + lg VL (9а) 2,3RT 2,3R Пользуясь этими уравнениями, можно графически вычислить теплоту адсорбции, теплоту растворения и энтропийные константы (график lgVr(испр) – 1/Т), они равны

Ва′ =

∆S a + lg Va ; 2,3R

ВS′ =

∆S S + lg Vn ; 2,3R

(10)

Измеряемые величины имеют следующие размерности: Vr-в см3; Т – в 0К; R – в кал/моль⋅град; ∆Н и Q – в кал/моль; ∆G – в кал/моль; ∆S – в кал/моль⋅град, Г и К всегда безразмерны. Под термином «свободная энергия», «энтальпия» и «энтропия» подразумеваются стандартные изменения парциональных мольных величин свободной энергии, энтальпии и энтропии. На основе уравнений (9) и (9а) можно написать обобщенное уравнение, справедливое как для ГАХ, так и для ГЖХ: Q lg Vr ( испр ) = + B′ (11) 2,3RT

Такое уравнение можно написать для каждого из разделяемых веществ и каждое уравнение даст на графике lgVr(испр) = f(1/T) прямую (рис.11). Если вычесть одно уравнение из другого, принять постоянной температуру колонки Т, то получим Vr′′( испр ) ∆Q lg = + ∆B ′. (12) Vr′( испр ) 2,3RT Отношение объемов удерживания Vr′′(испр ) / Vr′(испр ) -основная характеристика полноты

разделения.

Рис. 11. Температурная зависимость объема удерживания двух разделяемых веществ при одновременном влиянии на полноту разделений разницы теплот и энтропий адсорбции или растворения ∆Q ≠ 0, ∆S ≠ 0 Это отношение числено равно отношению коэффициентов адсорбции или коэффициентов распределения разделяемых веществ. Оно одновременно зависит от разности теплот ∆Q адсорбции или растворения и от разности энтропийных констант ∆В/ этих процессов, а следовательно, от разности энтропий ∆S ′′ − ∆S ′. Правило Траубе. Из (11) и (12) вытекает: различие в сорбции, или, различие в объеме удерживания в гомологическом ряду, обусловлено разницей теплот сорбции. Для предельных углеводородов, согласно правилу Траубе, Qn = Q1 + (n − 1)∆Q, (13) где Qn – теплота сорбции n-ного члена ряда; ∆Q – теплота сорбции группы СН2 (гомологическая разность); Q1 – теплота сорбции метана.

Рис. 12. График уравнения (13) (Правило Траубе)

Правило Траубе графически изображается прямой, представленной на рис. 12. На рисунке видно, что разница теплот сорбции между соседними членами гомологического ряда постоянна. Выполнение работы. Длина колонки 120 см, её диаметр 0,4см. Газ – носитель азот, скорость его потока 20мл/мин. Твердая фаза – ИНЗ – 600 или сферохром – 1, или другой носитель аналогичной химической природы. Жидкая фаза – 10% полиэтилен гликоля от массы носителя. Скорость диаграммной ленты 24 мм/мин. Объем пробы 0,0006мл. При каждой указанной температуре опыта измерить время удерживания бензола tr и несорбирующегося газа tr(0) (водорода), рассчитать соответствующие коэффициенты распределения К по (7) и исправленные объемы удерживания Vr(испр) по (3в), вводя поправки f1, f2 и f3 . Результаты измерений и расчетов представить в виде таблицы: T0C

T,0K

100 Т

αs, мл/м ин

tr, мин

tr(0), мин

К

lgK

Vr(испр LgVr( ) мл испр)

по результатам измерений и расчетов построить график уравнения (3а), используя соотношения (3а/) и (4), т.е. в координатах lgК – 1000/Т или построить график уравнения (11) в координатах lgVr(испр) – 1000/Т. По полученным графикам рассчитать угловой коэффициент пользуясь (5) или аналогичной формулой ∆ lg Vr ( испр ) Q А= S = . (14) ∆(1 / Т ) 2,3R Отсюда ∆ lg Vr (испр ) кол/моль (15) QS = 2,3R ∆( 1 ) Т Далее по (1а) вычислить свободную энергию растворения бензола в полиэтиленгликоле при указанных четырех температурах и соответсвующих значениях коэффициента распределения (К). Полученные значения свободной энергии ∆GS, энтальпии ∆НS, численно равные измеренной теплоте растворения – Q, абсолютную температуру колонки Т подставить в (8а) и вычислить энтропию растворения. Расчет произвести для четырех указанных температур и ввести средний результат. Работа 5. Разделение и количественное определение органических кислот методом распределительной колоночной хроматографии. Цель работы. Разделить и количественно определить органические кислоты методом распределительной хроматографии на колонке силикагеля. Материалы и реактивы: соляная кислота (уд. вес 1, 19); серная кислота 5н; серная кислота разбавленная 1:1; сернокислый натрий безводный; раствор тимолового синего (0,1г тимолового синего в 100 мл воды с добавлением 2 мл 0,1н NaOH); раствор бромкрезола зеленого (0,25-бромкрезола зеленого в 100мл воды с добавлением 1,5мл 0,1нNaOH); 1%-ный раствор бутилового спирта в хлороформе 100мл; 5%-ный раствор бутилового спирта в хлорофиле; индикаторная бумага «като»; аммиак 20%-ный; титрованный раствор NaOH 0,05н; силикагель для распределительной хроматографии: хроматографическая колонка. Смесь кислот (для проведения лабораторной работы смесь кислот может быть приготовлена искусственно, при смешивании в различных сочетаниях и отношениях 0,1н растворов уксусной, муравьиной, пропионовой и масляной кислот).

Выполнение работы. 3г силикагеля растирается в ступке с 0,5мл водного раствора бромкрезол-зеленого до получения однородной желтой окраски. Затем добавляется 1 капля 20%-ного раствора аммиака и вновь осторожно растирается, при этом окраска геля меняется с желтой на темно-голубую. Если при добавлении индикатора силикагель сразу окрашивается в голубой цвет, то добавление аммиака излишне. Полученная масса заливается 10-15 мл 1%-ного раствора бутилового спирта в хлороформе и переносится через воронку в хроматографическую колонку. Адсорбционный слой уплотняется или путем постукивания или путем нагнетания в колонку воздуха, при этом поверхность силикагеля в колонке обязательно должна быть покрыта жидкостью. Смесь кислот-муравьинной, уксусной, пропионовой и масляной в количестве 8-10мл – нейтрализуется 0,1н раствором щелочи по фенолфталеину и выпаривается на водяной бане досуха. Выпаренный остаток обрабатывается 2 каплями серной кислоты (1:1) до растворения солей, добавляется 0,1г безводного сернокислого натрия и из полученной смеси органические кислоты извлекаются 1%-ным раствором бутилового спирта в хлороформе 5-кратно так, чтобы общее количество полученного раствора составляло 5мл. Раствор органических кислот в хлороформе заливается в хроматографическую колонку. Под давлением, создаваемым при помощи резиновой груши, раствор передвигается вниз по колонке, в результате чего происходит разделение кислот, и определенные часы колонки приобретают соответствующую окраску. Так, например, уксусная кислота проявляется в виде канареечно – или оранжево-желтой полосы, масляная кислота – в виде светло-зеленой полосы, муравьиная кислота – в виде белой с желтоватым оттенком. Когда уровень раствора над колонкой силикагеля почти достигает начала колонки, прибавляется чистая порция 1%ного бутилового спирта в хлороформе, и эта операция повторяется до тех пор, пока слой содержащий масляную кислоту, не достигает нижнего конца колонки. При продолжении промывания этим же раствором из колонки вымывается масляная кислота и собирается в отдельный приемник, затем производится промывание колонки 5%-ным раствором бутилового спирта в хлороформе. При этом вымывается сначала пропионовая кислота, затем уксусная кислота, которые также собираются в отдельные приемники. Таким образом, кислоты вымываются из колонки в определенном порядке, а именно: масляная, пропионовая, затем уксусная. В самой верхней части колонки остается муравьиная кислота. Элюированные кислоты, собранные в отдельные колбы титруются 0,05н раствором NaOH в присутствии фенол-фталеина. Белое кольцо муравьиной кислоты, находящееся в самой верхней части колонки, не элюируется. Поэтому слой силикагеля, содержащий муравьиную кислоту, механически отделяется от колонки, помещается в колбе, куда добавляется 30 мл воды. Содержимое тщательно перемешивается и титруется NaOH в присутствии фенолфталеина. Рассчитывается содержание каждой кислоты процент выхода от взятого количества. Определение фракций молочных белков методом гель-хроматографии (по К. Буткусу и В. Буткене)

Метод основан на разделении белков, элюируемых через гель декстрана (сефадекс). Сухой дефадекс суспензируют в дистиллированной воде или в соответствующем буфере в течение 48-72 ч. Мельчайшие частицы геля декантируют. Колонку укрепляют в строго вертикальном положении. В основание колонки вставляют перфорированный диск из плексигласа пористостью № 1, на него насыпают песок слоем 0,5 см и на песок кладут диск из фильтрованной бумаги. Над колонкой укрепляют стеклянную воронку, помещая в нее стеклянную палочку таким образом, чтобы ее кончик частично закрывал выход из воронки, и заполняют ее разведенным раствором сефадекса. Стеклянная палочка должна настолько прикрывать выход из воронки, чтобы суспензия сефадекса могла просачиваться в колонку тонкой струйкой. После того как слой сефрадекса осядет в колонке на высоту 2-5 см, открывают кран колонки для медленного истечения жидкости, колонку продолжают наполнять се-

фадексом. Критерием правильного наполнения является наличие совершенно горизонтальной поверхности сефадекса. После того как все частицы осели, на гель помещают диск фильтровальной бумаги. Колонку промывают буферным раствором. При работе с колонками следует помнить, что нельзя допускать подсыхания верхнего слоя геля. При аккуратной работе колонка с сефрадексом может быть использована многократно. Иногда со временем уменьшается скорость фильтрования жидкости через колонку, что может быть вызвано значительным измельчением части геля и накоплением загрязнений. Следует заново наполнить колонку, обмыв (путем декантации) бывший в употреблении препарат сефадекса от мельчайших частиц и загрязнений. После пропуска через колонку одного белка ее промывают буферным раствором (2-3 объема колонки), после чего она может быть использована для другого опыта. При помощи перестального насоса в колонку вводят 20 м3 исследуемого (обезжиренного) молока. Элюация проводится ацетатным буфером (pH 6,25) по 60см3/ч. Компоненты белка в элюате постоянно определяются при длине волны 280 м. Результаты регистрируются самописцем. Отдельные компоненты на графике отделяют перпендикулярами и измеряют площади под пиками. По относительной массе определяют количество отдельных компонентов в процентах. Определение содержания свободных летучих жирных кислот методом газожидкостной хроматографии (по С. Урбене и В. Завецкене)

Метод основан на выделении свободных летучих жирных кислот (СЛЖК) при дистилляции водным паром, разделении их на хроматографе. Для анализа берут 75 см3 молока, 50 см3 кислых молочных продуктов, 75 г масла, 25 г созревшего сыра, до 50 г сыра из-под пресса. Нужное количество исследуемого продукта переносят в термостойкую колбу, наливают до 150 см3 дистиллированной воды, добавляют 0,5-1 см3 концентрированной Н2SO4 и 1 см3 стандартного раствора энантовой кислоты (реактив 1). Полученный раствор перегоняют с водяным паром. Процесс кипения регулируют так, чтобы уровень жидкости в колбе сохранялся постоянным. Следует набрать 250 см3 дистиллята. Время дистилляции - около 55 мин. Дистиллят нейтрализуют 0,1 н. раствором гидроксида натрия для образования солей летучих кислот. Общее количество СЛЖК можно выразить объемом (см3) 0,1 н. гидроксида натрия, который необходим для нейтрализации кислот, выделенных из 100 г продукта. Дистиллят испаряют в водяной бане при температуре 60 град. С. Оставшееся минимальное количество дистиллята из колбы объемом 250 см3 переносят в бутылочку от пенициллина и подвергают полному испарению. Для хроматографического разделения соли необходимо перевести в кислотное состояние. Для этого к соли добавляют по 2 капли ортофосфорной кислоты и ацетона (растворитель). Анализ проводят на газовом хроматографе "Хром-5" с пламенно-ионизационным детектором, на колонке из нержавеющей стали. В качестве твердого носителя используют хроматон NAW-HMDS 0,200-0,250 мм. Жидкая фаза - 10% диэтиленгликольадипинат-Lac - 22446 с добавлением 2% ортофосфарной кислоты (d=1,87). 1-10 см3 готового раствора свободных жирных кислот (реактив 2) вводят в хроматограф с помощью микрошприца. Условия хроматографирования: температура колонки 100-150 град. С, инжектора 170 град. С; давление азота 0,1 МПа; скорость водорода 30см3/мин, воздуха 500 см3/мин. Режим программирования температуры - I: 100-124 град. С (4 град. С/мин); II: 124-150 град. С (6 град. с/мин); III: 150 град. С const 4 мин.; охлаждение - 2 мин.

Для установления абсолютного количества вещества в пробе удобно пользоваться методом внутреннего стандарта. Метод не требует точной дозировки и основан на сравнении площадей пиков вещества - метки (в нашем случае - энантовая кислота) и определяемого компонента. В приготовленный стандартный раствор добавляют точно отмеренное количество раствора энантовой кислоты. По хроматограммам стандартного раствора с энантовой кислотой определяют градуировочную константу К для каждой кислоты по формуле

К=

S эVх S хVэ

где Sэ - площадь пика энанта, мм2; Sх - площадь пика кислоты, мм"; Vэ - концентрация энанта, мг%; Vх - концентрация кислоты,мг%. В анализируемую смесь необходимо добавить такое же количество стандартного раствора. Зная градуированные константы для каждой кислоты, можно подсчитать массу любой кислоты. Приготовление реактивов. Реактив 1 (стандартный раствор энантовой кислоты). Взвешивают около 100 см3 энантовой кислоты, растворяют в ацетоне и разбавляют в мерной колбе до 100 см3 дистиллированной водой. Реактив 2 (стандартный раствор жидких кислот). Состав и концентрация этого раствора должны быть близкими составу СЛЖК исследуемого продукта. Взвешивают нужное количество кислот, добавляют небольшое количество ацетона для полного растворения кислот и доливают дистиллированной водой до 100 см3. Определение содержания витамина А методом жидкостно-адсорбционной хроматографии

Метод основан на щелочном гидролизе жиров, гидролизе витамина А до свободной формы, экстакции диэтиловым эфиром неомыляемого остатка, выпаривании эфира, растворении остатка в растворителе, используемом в качестве основного компонента подвижной фазы (элюента) и определении витамина А методом ВЭЖХ. Так как жирорастворимые витамины легко разрушаются под действием света, кислорода воздуха и других факторов, во время анализа необходимо соблюдать специальные меры предосторожности, защищающие витамины от воздействия этих факторов: определение проводят, предохраняя от света, в присутствии антиоксиданта, все операции от взятия навески продукта до получения результата выполняют в течение рабочего дня. Выполнение работы. Навеску молока или молочных продуктов (20 г), взятую с точностью до 0,01 г, помещают в круглодонную колбу, соединенную шлифом с обратным холодильником, добавляют 40-60 см3 этилового спирта и 0,2 г аскорбиновой кислоты. Затем в колбу вносят 5-7 см3 50%-ного раствора гидроксида калия. Для продуктов (масло сливочное и др.) с высоким содержанием жира (более 40%) на навеску образца 3-5 г берут 4-8 см3 щелочи. После добавления щелочи смесь кипятят 30 мин. на водяной бане с обратным водяным холодильником, охлаждают, переливают в делительную воронку и добавляют воду до окончательной концентрации спирта около 30-35%. Признак полного омыления - прозрачная смесь после добавления воды. При образовании мути необходимо повторить омыление с новой навеской, увеличив объем щелочи для омыления. Затем смесь экстрагируют эфиром 4 раза: сначала объемом, равным объему добавленной воды, а затем объемами на 20% меньшими. Колбу после омыления ополаскивают эфиром. Объединенный эфирный экстракт отмывают от щелочи водой, контролируя рH по фенолфталеину. К экстракту добавляют 8-10 г безводного сульфата натрия, выдерживают 20-30 мин. в темном месте и медленно фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу, промывая сульфат натрия и фильтр эфиром. Затем эфир полностью отго-

няют под вакуумом на роторном испарителе при температуре не выше 25-30 град. С. Сухой неомыляемый осадок немедленно растворяют в объеме растворителя так, чтобы концентрация витамина А была в пределах 3-5 мкг/см3. В колонку хроматографа вводят последовательно равные объемы (0,01-0,1 см3) испытуемого раствора, полученного выше описанным методом, и стандартного. Пик витамина на хроматограмме испытуемого раствора индентифицируют с пиком витамина на хроматограмме стандартного раствора. Содержание витамина определяют по результатам двух хроматографических анализов. Содержание витамина А в продукте (мг/100г) рассчитывают по формуле Н С V ⋅ 100 Х = ис ст 1 Н стV2 а ⋅ 100 где Нис - средняя высота (или площадь) пика витамина А на хроматограмме пробы испытуемого раствора, мм (или мм2); Нст - средняя высота (или площадь) пика витамина А на хроматограмме стандартного раствора, мм или мм2; Сст - масса витамина А в стандартном растворе, введенном в колонку, мкг; V1 - общий объем испытуемого раствора, см3; V2 - объем испытуемого раствора, вводимый в колонку хроматографа, см3; а - навеска образца продукта, г; 100 - пересчет на 100 г продукта; 1000 - пересчет на мг. При использовании в качестве стандарта ретинола ацетата в формуле будут те же обозначения, кроме Нст =Нис + ст - Нмс, где Нис + ст - средняя высота (или площадь) пика витамина А в образце с внесенным ретинола ацетатом; Сст - масса витамина А в стандартном растворе с внесенным ретинола ацетатом (мкг), введенного в колонку. Результаты определений рассчитываются до третьей значащей цифры. За результат измерений принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений. Приготовление реактива (стандартного раствора). Взвешивают 0,02 г витамина А или 0.025 г ретинола ацетата с точность до 0,0001 г, растворяют в этиловом спирте и доводят объем в мерной колбе до 100 см3 (основной стандартный раствор). 2 см3 раствора переносят в мерную колбу на 100 см3 и доводят объем этиловым спиртом (рабочий стандартный раствор). Содержание витамина А в рабочем стандартном растворе в пересчете на ретинол приблизительно 4-4,5 мкг/см3 (13-15 МЕ/см3). При использовании в качестве стандартного раствора ретинола ацетата в масле навеску препарата рассчитывают, исходя из требуемой концентрации рабочего раствора. Стандартный раствор хранят при 4 град. С в течение 10 дней. В день использования определяют концентрацию в рабочем стандартном растворе, измеряя оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 325 нм в кювете толщиной 1 см и проверяя чистоту стандартного раствора хроматографически (на хроматограмме должен присутствовать один пик витамина, помимо пиков, не удерживаемых на колонке примесей, содержащихся в растворителе). Содержание витамина А (мкг/см3) рассчитывают по формуле D ⋅ 10000 ХА = Е где D - оптическая плотность испытуемого раствора при длине волны 325 нм против этилового спирта; 10000 - содержание витамина А в 1 см3 1%-ного раствора, мкг; Е - 1830 для витамина А при использовании кюветы толщиной 1 см. При использовании в качестве стандарта ретинола ацетата содержание в растворе пересчитывают на витамин А (ретинол) по формуле D ⋅ 10000 ⋅ 0.87 ХА = Е где Е - 1550 для ретинола ацетата при использовании кюветы толщиной 1 см; 0,87 коэффициент пересчета на витамин А.

При использовании в качестве стандарта ретинола ацетата к навеске образца продукта добавляют точный объем рабочего стандартного раствора ретинола ацетата (навеска образца должна быть равна навеске образца без добавления рабочего стандартного раствора). Затем навеску образца с добавленным рабочим стандартным раствором подвергают щелочному гидролизу и проводят экстракцию так же, как описано выше для навески испытуемого образца. Сухой неомыленный остаток растворяют в том же объеме растворителя. В этом случае навеску образца, объем рабочего стандартного раствора, добавляемого к навеске, объем растворителя рассчитывают, исходя из того, что приблизительная концентрация витамина в испытуемом растворе должна быть около 3 мкг/см3, в растворе исследуемого образца с добавленным рабочим стандартным раствором около 5 мкг/см3. Определение содержания хлорида натрия в сырах, брынзе, соленых творожных изделиях, сливочном масле методом ионообменной хроматографии с катионитом

Метод основан на выделении хлорида натрия из молочных продуктов и определении его в катинообменной колонке. 15 г катионита КУ-2 (в пересчете на безводный катионит), взвешенного с погрешностью не более 0,1 г, помещают на 5 ч. в химический стакан с дистиллированной водой. Набухший катионит переносят в стеклянную трубку длиной 700-800 мм с внутренним диаметром 12-15 мм или в бюретку вместимостью 50 см3, на дно которых кладут стеклянную вату или другой пористый материал. Через колонку пропускают, регулируя с помощью крана, 100 см3 раствора соляной кислоты (70 г/дм3) со скоростью 2-3 капли в секунду. Затем катионит промывают с той же скоростью дистиллированной водой до нейтральной реакции по метиловому оранжевому. Каждую последующую порцию жидкости необходимо приливать, как только уровень ее в колонке достигнет верхнего края катионита. Необходимо следить, чтобы мениск жидкости никогда не опускался ниже верхнего края катионита. Ионообменную колонку регенирируют пропусканием через нее 50 см3 раствора соляной кислоты (50 г/дм3) со скоростью 2-3 капли в секунду, с последующим промыванием дистиллированной водой с той же скоростью до нейтральной реакции по метиловому оранжевому. Между двумя процессами регенерации допускается исследовать 20 проб сыра, брынзы, творожных изделий или 100 проб сливочного масла. В случае меньшего числа определений колонку следует регенерировать ежедневно. Пригодность катионита для проведения анализа проверяют периодически, пропуская через катионообменную колонку 5 см3 раствора хлорида натрия, с последующим промыванием катионита дистиллированной водой в количестве 50 см3. Фильтр вместе с промывными водами титруют раствором гидроксида натрия. Объем гидроксида натрия пошедший на титрование, может отличаться не более чем на 0,2 см3 от взятых 5 см3 раствора хлорида натрия. Взвешивают 2 г сыра, брынзы или творожных изделий с погрешностью не более 0,01 г в фарфоровом тигле, предварительно высушенном. Тигель с продуктом высушивают в сушильном шкафу при постепенном повышении температуры до 120-140 град. С. Высушенную массу осторожно обугливают при постоянном повышении температуры. По окончании выделения дыма нагревание усиливают и обугливание продолжают до получения остатка темно-синего цвета. Обугленную массу осторожно измельчают стеклянной палочкой и обрабатывают 4-5 порциями дистиллированной воды температурой 80-90 град. С. Жидкую часть осторожно переводят по стеклянной палочке на бумажный фильтр и фильтруют в коническую колбу. Остаток в тигле и на фильтре промывают дистиллированной водой температурой 70-80 град. С до прекращения реакции последних порций фильтрата с нитратом серебра. Для этого небольшую порцию фильтрата в пробирке подкисляют 1-2 каплями азотной кислоты и прибавляют 1-2 каплями раствора нитрата серебра.

Вытяжку переносят в подготовленную катинообменную колонку и пропускають со скоростью 3-4 капли в секунду. После этого колонку промывают 50 см3 дистиллированной воды. Фильтрат вместе с промывными водами титруют раствором гидроксида натрия в присутствии 2-3 капель метилового оранжевого до получения соломенно-желтого окрашивания. Для выделения хлорида натрия взвешивают 5 г сливочного масла с погрешностью не более 0,01 г в стакане вместимостью 100 см3. Затем пипеткой прибавляют в стакан 50 см3 дистиллированной воды. Содержимое стакана нагревают до расплавления сливочного масла, тщательно перемешивают и оставляют в покое до поднятия жира наверх и его застывания. При необходимости охлаждения, стакан после поднятия наверх слоя жира помещают в холодную дистиллированную воду. Стеклянной палочкой делают в слое сливочного масла отверстие, через которое пипеткой отбирают 10 см3 вытяжки и переносят в колонку, фильтруют со скоростью 3-4 капли в секунду. С той же скоростью колонку промывают 50 см3 дистиллированной воды. Фильтр вместе с промывными водами титруют раствором гидроксида натрия в присутствии 2-3 капель метилового оранжевого до получения соломенно-желтого цвета. Массовую долю хлорида натрия (5) вычисляют по формуле в сыре, брынзе и соленых творожных изделиях: Х=V х 0,292; в масле: Х=V х 0,585, где V - объем раствора гидроксида натрия, израсходованный на титрование, см3; 0.292 и 0,585 - титр раствора гидроксида натрия, пересчитанный на хлорид натрия, умноженный на 100 и деленный на величину массы навески продукта. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не должны превышать 0,2% для сыра, брынзы, творожных изделий и 0,1% - для сливочного масла. ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1 Обратная температура T, 0C 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

1000/Т 0К 3,663 3,597 3,533 3,472 3,413 3,356 3,300 3,247 3,195 3,145 3,096 3,049 3,003 2,959 2,916 2,874

T, 0C 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175

1000/Т 0К 2,681 2,646 2,611 2,577 2,545 2,513 2,481 1,451 2,421 1,392 2,364 2,336 2,309 2,283 2,257 2,232

T, 0C 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 275

1000/Т 0К 2,114 2,092 2,070 2,049 2,028 2,008 1,998 1,969 1,949 1,931 1,912 1,894 1,876 1,859 1,842 1,825

80 85 90 95 100

2,833 2,793 2,755 2,717 2,268

180 185 190 195 200

2,208 2,184 2,160 1,137 2,114

280 285 290 295 300

1,808 1,792 1,776 1,761 1,745

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Д.А. Вихрев, А.Ф. Шушунова. Руководство по газовой хроматографии. М.”Высшая школа”,1975. 2. В.Ф. Баровский, С.М. Горелик, Т.Б. Городенцева. Практикум по физикохимическим методам анализа. М.”Высшая школа”,1963. 3. Б.А. Айвазоа. Основы газовой хроматографии. М.”Высшая школа”,1977. 4. Практические работы по хроматографии. Л. ЛТИ, 1985. СОДЕРЖАНИЕ Введение 1. Сущность метода и его преимущества 2. Методы хроматографического анализа 3. Техника проведения хроматографического анализа 4. Хроматографические методы, применяемые в биологических и медицинских исследованиях 5. Лабораторные работы

Работа 1. Определение магния и цинка в растворе. Работа 2. Качественный и количественный анализ смеси углеводородов на газовом хроматографе АХМ-8 МД Работа 3. Построение изотермы адсорбции на основе хромотагрофических измерений. Работа 4. Определение теплоты и энтропии адсорбции или растворения на основе хроматографических измерений. Приложение Список использованных источников