Нейродегенеративные болезни и проблема правильного сворачивания белка

БИОЛОГИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ БОЛЕЗНИ И ПРОБЛЕМА ПРАВИЛЬНОГО СВОРАЧИВАНИЯ БЕЛКА Н. Б. ГУСЕВ Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

ВВЕДЕНИЕ

NEURODEGENERATIVE DISEASES AND THE PROBLEM OF PROTEIN MISFOLDING N. B. GUSEV

The prion structure is described and the data of literature concerning aggregation of misfolded prion are analyzed. Different forms of prion diseases and their mode of transmission are also described. The data on other neurodegenerative diseases induced by protein misfolding are presented and the probable ways of preventing and curing of these diseases are analyzed.

© Гусев Н.Б., 2004

Подробно описана структура прионов и приведены данные литературы об агрегации прионов, вызванной неправильным сворачиванием молекулы белка. Описаны различные формы прионных болезней и пути их передачи. Представлены данные о других нейродегенеративных заболеваниях, вызванных неправильным сворачиванием белка, и проанализированы возможные пути их предотвращения и лечения.

journal.issep.rssi.ru

В середине XVIII в. в литературе появились первые сведения о необычном заболевании овец, получившем название “скрепи” (scrapie) и состоявшем в том, что на ранних стадиях больные животные терлись головой о различные предметы, а на поздних стадиях нарушалась координация движений и наступала смерть. В 1898 г. было обнаружено, что в мозгу больных животных происходит массовая гибель клеток и формируются характерные вакуоли. В 1939 г. появилось первое сообщение о возможности экспериментального заражения овец скрепи. Предположение об инфекционном характере скрепи получило дополнительные подтверждения в 1961 г., когда было установлено, что скрепи может быть перевита не только овцам и козам, но и мышам. Таким образом, было обнаружено новое инфекционное заболевание, поражающее клетки головного мозга. В 1920–1921 гг. Крейцфельд (Creuzfeldt) и Якоб (Jacob) описали новое заболевание людей, проявлявшееся в прогрессирующем слабоумии (деменции) и ранней смерти. Последующие исследования показали, что болезнь Крейцфельда–Якоба может возникать спонтанно, может передаваться инфекционным путем (использование плохо стерилизованного хирургического инструмента, недостаточно очищенных препаратов гормона роста человека или с пищей), а также может передаваться по наследству. Болезнь Крейцфельда– Якоба сопровождалась гибелью клеток мозга и накоплением белковых агрегатов внутри и вне клеток. В исследованиях, проведенных в 1955–1957 гг. среди аборигенов Папуа-Новой Гвинеи, было выявлено новое эндемичное (характерное только для данного места обитания) заболевание, получившее название “куру”. Симптомы куру (или “смеющаяся смерть”) были сходны с симптомами болезни Крейцфельда–Якоба и состояли в прогрессирующей деменции, сопровождавшейся беспричинным смехом. При этом, так же как в случае скрепи или болезни Крейцфельда–Якоба, в мозгу заболевших происходила массовая гибель клеток,

Г УС Е В Н . Б . Н Е Й Р О Д Е Г Е Н Е РА Т И В Н Ы Е Б О Л Е З Н И И П Р О Б Л Е М А П РА В И Л Ь Н О ГО С В О РА Ч И В А Н И Я Б Е Л К А

15

БИОЛОГИЯ накапливались отложения агрегированных белков и образовывались вакуоли, вследствие чего мозг приобретал губчатую структуру. Как выяснилось позднее, куру было связано с каннибализмом и обусловлено употреблением в пищу мозга покойных родственников, больных этим заболеванием. При всех различиях скрепи, болезнь Крейцфельда– Якоба и куру имеют много общего. Эти болезни могут передаваться инфекционным путем и вызывают поражение головного мозга, который становится похожим на пористую губку. Поэтому все эти заболевания были отнесены в группу так называемых трансмиссивных губчатых энцефалопатий. Исследования последних лет показали, что причиной возникновения губчатых энцефалопатий и многих других нейродегенеративных заболеваний (таких, как болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и некоторые другие) является неправильное сворачивание определенных белков. Неправильная упаковка полипептидной цепи приводит к тому, что обычно мономерный цитозольный или мембранный белок начинает агрегировать и формировать устойчивые к протеолитическому расщеплению агрегаты, которые могут выпадать в осадок внутри или вне клетки, что приводит к гибели нейронов и тяжелым повреждениям головного мозга. В данной статье мы сначала проанализируем структуру и свойства прионов, белков, играющих решающую роль в возникновении губчатых энцефалопатий, а потом

вкратце опишем другие нейродегенеративные заболевания, возможные пути их возникновения и лечения. ТРАНСМИССИВНЫЕ ГУБЧАТЫЕ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ И ПРИОНЫ Нобелевские премии по медицине, присвоенные в 1976 г. Д.К. Гайдузеку (D.C. Gajdusek) и 1997 г. С.Б. Прузинеру (S.B. Prusiner), отметили особый вклад этих ученых в изучение куру и других губчатых энцефалопатий [1]. Работами этих ученых, а также их коллег было установлено, что многие казавшиеся ранее совершенно различными заболевания человека и животных (табл. 1) обусловлены изменениями в структуре всего лишь одного белка, получившего название прион (или PrР). Проанализируем структуру приона человека. Этот белок состоит из 253 аминокислотных остатков и содержит несколько функционально важных участков (рис. 1). Благодаря наличию специальной сигнальной последовательности сразу после синтеза прион попадает в просвет эндоплазматического ретикулума, где происходит удаление N-концевой последовательности. После этого происходят удаление С-концевой сигнальной последовательности и перенос на освободившийся С-конец гликоинозитол-фосфолипидного остатка. Этот сложно построенный остаток содержит в своем составе молекулу фосфолипида (фосфоинозитида), которая через цепочку остатков сахаров и этаноламин прикрепляется к С-концевой аминокислоте белка. За счет

Таблица 1. Прионные болезни, или губчатые энцефалопатии Заболевание и их обозначение

Виды, подверженные данному заболеванию

Куру (Kuru) Болезнь Крейцфельда–Якоба (CJD)

Человек Человек

Фатальная семейная бессонница (FFI)

Человек

Болезнь Герстманна–Штрусслера– Шейнкера (GSS) Скрепи (scrapie) Губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (“коровье бешенство”) (BSE)

Человек Овца Крупный рогатый скот, человек (?) Кошка Норка

Губчатая энцефалопатия кошек (FSE) Трансмиссивная энцефалопатия норок (TME) Экзотическая энцефалопатия копытных Антилопа, сернобык (EUE)

16

Механизм передачи Инфекционный (ритуальный каннибализм) 1. Инфекционный (использование загрязненного хирургического инструмента, недостаточно очищенные гормональные препараты, пищевой (алиментарный) 2. Спонтанный (спорадические соматические мутации или изменение структуры прионов) 3. Наследственный (мутации гена прионов) 1. Спонтанный (спорадические соматические мутации или изменение структуры прионов) 2. Наследственный (мутации гена прионов) Наследственный (мутации генов прионов) Инфекционный (пищевой) Инфекционный (пищевой) Инфекционный (пищевой) Инфекционный (пищевой) Инфекционный (пищевой)

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 8 , № 2 , 2 0 0 4

БИОЛОГИЯ Гликозилирование Asn

a 1

22

232 Повторы

H1

Pro Гидроксилирование

B1

б 5 R

1

?

4 R

CJD

CJD GSS

B2

H3

Дисульфидный мостик

102 117 129 PRO ALA MET

178 ASP

198 200 210 232 PHE GLU VAL MET

LEU VAL VAL

ASN

SER LYS ILE ARG

Гликоинозитолфосфолипидный якорь

в 253

9 R

CJD CJD

H2

253

10 R 11 R

GSS GSS

FFI CJD GSS CJD CJD CJD (129 (129 MET) VAL)

12 R 13 R

Рис. 1. Строение приона человека. Схема строения приона человека (а). N- и С-концевой сигнальные пептиды отмечены синим цветом, гидрофобная область отмечена голубым цветом. Обозначены α-спиральные (Н1–Н3) и β-складчатые (В1, В2) участки, а также пять повторяющихся аминокислотных фрагментов (повторы), участки гликозилирования (Asn-181, 197), гидроксилирования (Pro-44) и дисульфидный мостик, образованный остатками Cys-179 и 214. Цифрами обозначены номера аминокислотных остатков (по: van Rheede T., Smolenaars M.M.W., Madsen O., Jong W.W. de. Molecular evolution of the mammalian prion protein // Mol. Biol. Evol. 2003. Vol. 20. P. 111–121). Мутации приона, связанные с различными заболеваниями человека (б). Кодирующая область гена приона изображена на верхнем прямоугольнике. Синим цветом отмечены сигнальные N- и С-концевые последовательности, пять маленьких прямоугольников (5 × R) обозначают пять восьмичленных аминокислотных повтора. Уменьшение числа повторов с пяти до четырех (4 × R) или увеличение количества повторов с пяти до 9–13 (9–13 × R) было обнаружено у больных с наследственной формой болезни Крейцфельда–Якоба (CJD) или болезни Герстманна–Штрусслера–Шейнкера (GSS). Замена аминокислот, отмеченных над прямоугольником на аминокислоты под прямоугольником, приводит к возникновению наследственных форм болезни Крейцфельда–Якоба (CJD), болезни Герстманна–Штрусслера–Шейнкера (GSS) или фатальной семейной бессонницы (FFI). В зависимости от того, какой остаток располагается в положении 129, мутация Asp-178 в Asn приводит либо к возникновению фатальной семейной бессонницы (FFI), либо к возникновению болезни Крейцфельда–Якоба (CJD) (по: Weissmann C. Molecular genetics of transmissible spongiform encephalopathies // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 3–6). Структура полипептидного скелета С-концевого фрагмента (остатки 124–231) приона мыши (в). Красным цветом обозначена полипептидная цепь, синие шарики – полисахариды, ковалентно прикрепленные к полипептидной цепи приона, желтым цветом показан прикрепленный к С-концу приона гликоинозитол-фосфолипидный якорь, желтая перемычка в центре молекулы обозначает положение дисульфидного мостика (по: Jackson G.S., Collinge J. The molecular pathology of CJD: Old and new variants // J. Clin. Pathol.: Mol. Pathol. 2001. Vol. 54. P. 393–399)

остатков жирных кислот, входящих в состав фосфолипида, такой модифицированный белок может прикрепляться к мембране, а гидрофильная “ножка”, образованная остатками сахаров, обеспечивает пьедестал, отделяющий молекулы белка от поверхности мембраны. Любопытно, что прион может закрепляться в мембране как за счет своего гликоинозитол-фосфолипидного “якоря” (и тогда образуется так называемый

полностью секретированный прион secPrP), так и за счет встраивания в мембрану гидрофобного участка, находящегося в структуре белка (рис. 1, а), и тогда образуются так называемые трансмембранные варианты приона. Еще находясь в просвете ретикулума, прион может подвергаться гликолизированию, при этом на один или два остатка аспарагина (Asn 181, 197) переносится разветвленная цепочка полисахаридов (шарики

Г УС Е В Н . Б . Н Е Й Р О Д Е Г Е Н Е РА Т И В Н Ы Е Б О Л Е З Н И И П Р О Б Л Е М А П РА В И Л Ь Н О ГО С В О РА Ч И В А Н И Я Б Е Л К А

17

БИОЛОГИЯ голубого цвета на рис. 1, в). В дополнение ко всем описанным модификациям один из остатков пролина (Pro 44) может подвергаться гидроксилированию. Таким образом, уже после синтеза прион претерпевает серию различных так называемых посттрансляционных модификаций, после которых прион попадает в аппарат Гольджи, а из него на наружную мембрану клетки. Как это ни удивительно, но до сих пор не очень понятно, какую функцию выполняет прион в здоровом организме животных и человека. Для того чтобы ответить на вопрос, в чем состоит физиологическая роль прионов, были проведены опыты на мышах, лишенных соответствующего гена. Эти животные нормально развивались и лишь немного отличались по поведению от своих сородичей, имевших нормально функционирующий ген приона. Эти опыты как будто говорят о том, что прионы не играют сколько-нибудь важной роли в функционировании мозга. Однако хорошо известно, что организм обладает огромным резервом компенсаторных механизмов, которые включаются сразу после потери гена. Поэтому отсутствие каких-то существенных отклонений в развитии и поведении мышей, не содержащих гена приона, вовсе не означает, что этот белок лишний и неважен для нормального развития организма. Высказывается предположение, что прион может выполнять функции своеобразного рецептора, взаимодействующего либо с еще не установленным лигандом, либо с белками внеклеточного матрикса. Установлено, что пять повторов, каждый из которых состоит из восьми аминокислот (см. рис. 1), могут участвовать в связывании ионов меди. После связывания меди молекулы приона подвергаются эндоцитозу, а после освобождения меди благодаря экзоцитозу возвращаются на наружную поверхность клетки. Находящийся на поверхности клетки прион может подвергаться ограниченному протеолизу, в ходе которого происходит удаление малоупорядоченного N-концевого фрагмента, а в мембране остается прочно связанный С-концевой фрагмент приона (рис. 1, в). Вероятно, этот укороченный вариант приона тоже может выступать в качестве своеобразного рецептора и взаимодействовать с такими же (или иными) лигандами, с которыми взаимодействует и интактный прион. Любопытно отметить, что прионы синтезируются практически во всех клетках организма и что белки, закрепленные в мембране за счет своих гликоинозитол-фосфолипидных “якорей”, довольно свободно перемещаются между мембранами контактирующих между собой клеток. Прионы, синтезируемые в клетках здоровых людей и животных, содержат в своем составе довольно много α-спиральных участков (до 40% структуры белка) и практически не содержат β -складок (менее 3% структуры). Эти нормальные, по-

18

стоянно синтезируемые в клетке белки обозначают как PrРc (cellular prions). PrPc не склонны к агрегации, не образуют нерастворимых агрегатов и легко подвергаются протеолитическому расщеплению. Что же происходит при возникновении трансмиссивных губчатых энцефалопатий? Предполагается, что под действием различных факторов нарушается правильное сворачивание полипептидной цепи приона, и белок превращается в так называемый PrPsc, то есть в прион, характерный для болезни скрепи. Хотя до сих пор не удалось получить растворимую форму этого белка и подробно исследовать его структуру, считается, что в этом дефектном белке резко возрастает (с 3 до 40%) доля β-складчатой структуры и убывает (с 40 до 30%) доля α-спирали. Этот дефектный белок склонен к агрегации, а образующиеся агрегаты плохо растворимы и очень устойчивы к действию протеаз. Вероятно, изменение структуры или формирование нерастворимых агрегатов является причиной возникновения трансмиссивных губчатых нейропатий. Естественно задаться вопросом, почему происходит неправильное сворачивание структуры приона и как формируются нерастворимые агрегаты прионов. Высказываются две гипотезы [2, 3]. Согласно первой гипотезе, в нормальных условиях из-за высокого энергетического барьера PrPc никогда не может превратиться в PrPsc (рис. 2). Однако если в клетку тем или иным способом попадает неправильно свернутый прион (PrPsc), то он может выступать в качестве дурного шаблона или плохого лекала. Сначала PrPsc образует гетеродимер с нормальным PrPc. Затем под влиянием PrPsc нормальный прион PrPc приобретает неправильную структуру и превращается в PrPsc. Образовавшийся гомодимер может диссоциировать, и вновь образовавшиеся молекулы PrPsc портят все большие и большие количества PrPc. Накопление неправильно свернутых молекул приона влечет за собой формирование нерастворимого осадка, похожего по внешнему виду на полисахарид и поэтому называемому амилоидом (или β-амилоидом). Согласно второй гипотезе (см. рис. 2), в ходе сворачивания полипептидной цепи приона возможно образование двух разных структур. Вероятность формирования нормальной структуры PrPc много больше вероятности формирования неправильной структуры PrPsc. Однако существует возможность того, что образующиеся с малой вероятностью молекулы PrPsc всетаки встретятся друг с другом и при этом образуют устойчивую затравку (зародыш), который будет сорбировать на себе те редкие молекулы PrPsc, которые изредка образуются в клетке. Очевидно, что это приведет к сдвигу равновесия между PrPc и PrPsc в сторону неправильно упакованной молекулы белка и скоро практически весь

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 8 , № 2 , 2 0 0 4

БИОЛОГИЯ a PrPc Энергетический барьер предотвращает переход PrPsc

б

Гетеродимер

Гомодимер

Амилоид (не важен для репликации)

PrPc

Равновесие между двумя формами PrPsc

Образование Связывание затравок мономера PrPsc (очень (быстро) медленно)

Инфекционные затравки

Большие затравки (амилоиды)

Фрагментация и образование инфекционных затравок

Рис. 2. Модели превращения нормально свернутого в основном α-спирального приона (PrPc) в неправильно свернутый в основном β-складчатый PrPsc, а – модель плохого шаблона. PrPsc связывается с PrPc и навязывает ему неправильную структуру; б – модель затравок-зародышей. Редко образующаяся форма PrPsc может образовывать затравки-зародыши, которые связывают все образующиеся молекулы PrPsc и поэтому сдвигают равновесие между PrPc и PrPsc в сторону последней (по: Aguzzi A., Polymenidou M. Mammalian prion biology: One century of evolving concepts // Cell. 2004. Vol. 116. Р. 313–327)

прион примет неправильную структуру и перейдет в состояние больших амилоидных структур. Эти структуры могут диссоциировать с образованием особенно опасных “инфекционных” затравок-зародышей (см. рис. 2). В настоящее время трудно сделать однозначный выбор между этими двумя гипотезами. Возможно, истина лежит где-то посередине. Процесс сворачивания прионов исследован довольно подробно. Судя по всему, в нормальных условиях вероятность образования неправильно упакованной молекулы приона PrPsc крайне мала. В то же время в неблагоприятных условиях возможна частичная денатурация приона, следствием чего может стать образование PrPsc. Кроме того, известно огромное количество точечных мутаций гена приона (см. рис. 1, б ), часть из которых коррелирует с возникновением наследственных форм фатальной семейной бессонницы, болезни Крейцфельда–Якоба или болезни Герстманна–Штрусслера–Шейнкера. По всей видимости, некоторые мутации дестабилизируют структуру приона и делают более вероятным образование неправильно упакованных форм приона PrPsc. Наконец, спонтанные формы трансмиссивных губчатых энцефалопатий могут быть

обусловлены как точечными соматическими мутациями, так и спонтанным образованием неправильно свернутых форм приона в отдельных клетках. В этом случае заражение соседних клеток может происходить потому, что белки, закрепленные за счет гликоинозитол-фосфолипидного “якоря” снаружи плазматической мембраны, могут довольно легко мигрировать между соседними клетками. Значительно сложнее объяснить механизм инфекционной передачи трансмиссивных губчатых энцефалопатий. Как уже отмечалось, болезнь куру возникала у людей, употреблявших в пищу мозг своих больных соплеменников, а некоторые формы болезни Крейцфельда–Якоба регистрировались в областях, где в пищу употреблялся мозг мелкого рогатого скота, среди которого были животные, больные скрепи. Исходно предполагалось, что виновником заболевания являются неизвестные вирусы, и были предприняты попытки выделить из инфекционного материала нуклеиновую кислоту, принадлежащую данному вирусу. Эти попытки не увенчались успехом. Более того, было установлено, что обработка инфекционного материала жестким ионизирующим или ультрафиолетовым облучением,

Г УС Е В Н . Б . Н Е Й Р О Д Е Г Е Н Е РА Т И В Н Ы Е Б О Л Е З Н И И П Р О Б Л Е М А П РА В И Л Ь Н О ГО С В О РА Ч И В А Н И Я Б Е Л К А

19

БИОЛОГИЯ которые приводили бы к необратимому повреждению нуклеиновых кислот, не сопровождалась потерей инфекционности. Поэтому Гриффитом (J.S. Griffith), а позднее Прузинером (S.B. Prusiner) была высказана казавшаяся совершенной фантастической гипотеза о том, что единственным инфекционным началом при передаче губчатых энцефалопатий является неправильно свернутый белок. Сейчас эта гипотеза принимается многими исследователями, хотя многие важные вопросы остаются до сих пор непонятными. Попытаемся проследить пути проникновения неправильно свернутого приона внутрь организма. При приеме пищи, содержащей PrPsc, этот белок не подвергается полному гидролизу под действием протеаз желудочно-кишечного тракта, и в интактом или не полностью гидролизованном виде попадает в кровь. Далее, судя по всему, этот дефектный белок попадает в В-лимфоциты, где происходит не только его накопление, но и синтез новых молекул дефектного белка. При этом чужеродный белок, попавший в клетку хозяина, портит эндогенный белок и заставляет его принять несвойственную ему дефектную структуру (см. рис. 2). Этот процесс очень медленный и может продолжаться годами. После такого длительного инкубационного периода по не вполне понятному механизму дефектный белок попадает в головной мозг, где продолжаются синтез и накопление все большего количества неправильно упакованных белков. Следствием этого являются образование нерастворимых белковых комплексов (амилоидных структур), повреждение и гибель нервных клеток. Есть ли какие-то убедительные свидетельства в пользу этой гипотезы? Вероятно, самым сильным свидетельством является тот факт, что животные, не имеющие гена приона и не экспрессирующие собственного эндогенного приона, не могут быть заражены путем введения PrPsc. Действительно, в этом случае дефектный белок, введенный в организм, как бы не имеет субстрата и не может ничего испортить. Количество введенного дефектного белка слишком мало и при отсутствии эндогенного приона дефектный PrPsc не может образовать нерастворимых комплексов и вызвать фатальные повреждения клетки. Другое важное наблюдение состоит в том, что существуют межвидовые барьеры для распространения прионных болезней. Так, например, установлено, что введение PrPsc хомяка в организм мышей не сопровождается возникновением болезни. Этот факт может означать, что PrPsc способен взаимодействовать и портить структуру только такого нормального приона, первичная структура которого близка первичной структуре испорченного приона. Если же первичные структуры дефектного и нормального прио-

20

нов сильно отличаются друг от друга, то они просто не способны взаимодействовать друг с другом и поэтому становится невозможным инфекционный путь передачи заболевания. Судя по всему, точечные мутации в прионе хозяина могут уменьшать или вовсе стирать межвидовой барьер. Мутантные прионы, по всей видимости, обладают нестабильной структурой и поэтому могут подстраиваться и взаимодействовать с PrPsc, что неизбежно ведет к возникновению заболевания. Все эти факты следует учитывать при анализе возможности распространения так называемого коровьего бешенства, связанного с употреблением в пищу мяса или мозга крупного рогатого скота, больного губчатой энцефалопатией. На самом деле, из-за межвидового барьера вероятность передачи этого заболевания от крупного рогатого скота человеку представляется довольно малой. Однако в зависимости от того, какая из многочисленных генетических форм приона синтезируется у данного человека, вероятность его заболевания “коровьим бешенством” может быть как исчезающе малой (если структура приона данного человека сильно отличается от структуры приона быка), так и, наоборот, очень высокой (если в силу накопившихся мутаций прион человека окажется способным взаимодействовать с дефектным прионом быка). Однако в обоих случаях следует ожидать, что инкубационный период у такого заболевания будет очень продолжительным. Казалось бы, что из-за того, что все прионные болезни вызываются одним белком, эти заболевания должны быть очень похожими между собой. На самом деле это совсем не так, и, казалось бы, один и тот же прион может вызывать различные по тяжести заболевания, при этом очаги поражения головного мозга располагаются в разных областях, а скорость и течение заболевания оказываются тоже существенно различными. Более того, если перевивать прионную болезнь от одного животного другому, то окажется, что все эти свойства сохраняются. Другими словами, при прививке медленно созревающего приона заразившееся животное будет также иметь медленно развивающуюся форму прионной болезни и очаг будет располагаться в том же отделе головного мозга, что и в случае животного, от которого был получен инфекционный материал. Наоборот, если инфекционный материал был получен от животного, где развитие прионной болезни было быстрым, то и у животного-реципиента развитие прионной болезни будет быстрым и очаг поражения будет располагаться в том же месте, что и животного-донора. Поэтому в литературе введено понятие линий (strain) прионных болезней. Молекулярные механизмы возникновения таких линий остаются довольно загадочными, однако предполагается, что прионы различных линий отличаются по степени гликозилирования,

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 8 , № 2 , 2 0 0 4

БИОЛОГИЯ гидроксилирования остатков пролина или по своей пространственной структуре. Взаимодействуя с нормальными прионами, такие неправильно упакованные белки могут создать только свою зеркальную копию, и поэтому в зараженной клетке синтезируется только один из очень многих неправильно упакованных вариантов приона. Вероятно, именно по этой причине становится возможным возникновение многочисленных линий прионных болезней. Как уже отмечалось, неправильное сворачивание белка является причиной не только различных прионных болезней, но и лежит в основе большого количества иных нейродегенеративных заболеваний. Рассмотрим некоторые из них. НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ БОЛЕЗНИ, СВЯЗАННЫЕ С НАКОПЛЕНИЕМ НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТЫХ МОЛЕКУЛ БЕЛКА: ПРИЧИНЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ И ВОЗМОЖНЫЕ СПОСОБЫ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ В настоящее время описано несколько нейродегенеративных болезней, связанных с накоплением различных неправильно свернутых белков (табл. 2). В большинстве случаев неправильно свернутые белки взаимодействуют друг с другом за счет гидрофобных областей и образуют крупные агрегаты, построенные из множества мономеров, имеющих преимущественно β-складчатую структуру. В других случаях (болезнь Хантингтона и родственные ей спиноцеребральные атаксии) белки, склонные к агрегации, имеют длинные участки, обогащенные остатками глутамина, при этом вероятность агрегации коррелирует с длиной полиглутаминовых повторов. Глутамин склонен образовывать водородные связи, и полипептидные цепи, обогащенные глутамином, способны взаимодействовать друг с другом подобно тому, как это происходит при застеги-

вании молнии на куртке или пальто. Помимо таких “полярных молний” в стабилизации агрегатов хантингтина важная роль вновь отводится гидрофобным контактам. Таким образом, большинство нейродегенеративных болезней связано с накоплением неправильно свернутых белков и их агрегацией, ведущей к образованию β-амилоидных агрегатов. Что же является причиной гибели нервных клеток при различных формах всех этих заболеваний? К сожалению, до сих пор нет однозначного ответа на этот вопрос. Высказывается несколько гипотез [4]. Согласно первой гипотезе, неправильное сворачивание белка и его последующая агрегация приводят к истощению запасов нормально свернутого белка, который жизненно важен для нормального функционирования нейрона. Как уже упоминалось, предполагают, что прионы могут выступать в качестве своеобразных рецепторов и передают какой-то важный сигнал от до сих пор неизвестного гормона (или медиатора) внутрь клетки или могут участвовать в прикреплении клетки к различным элементам внеклеточного матрикса. Супероксиддисмутаза, агрегирующая при развитии амиотрофного латерального склероза (см. табл. 2), играет важную роль в разрушении опасной для клетки перекиси водорода. Именно поэтому агрегация и как бы выведение из игры этих белков могут драматически сказаться на жизнеспособности клеток. Вторая гипотеза состоит в том, что агрегаты неправильно свернутых белков приобретают свойства, нехарактерные для нормальных мономерных белковпредшественников. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что правильно свернутые прионы, α-синуклеин и белок-предшественник β-амилоидных структур предотвращают развитие процессов, ведущих к программируемой клеточной смерти (апоптозу). В то же время агрегаты неправильно свернутых белков могут взаимодействовать с определенными рецепторами

Таблица 2. Клинические и биохимические свойства различных нейродегенеративных заболеваний Болезнь

Способ передачи

Трансмиссивные губ- Спорадический 90% чатые энцефалопатии Наследственный 8% Инфекционный 2% Болезнь Альцгеймера Спорадический 95% Наследственный 5% Болезнь Паркинсона В основном спорадический, редко наследуемый Болезнь Хантингтона Наследственный (аутосомально доминантный) Амиотрофный Спорадический 90% латеральный склероз Наследственный 10%

Клиническое течение Слабоумие, атаксия, нарушение психики или бессонница Прогрессирующее слабоумие Нарушение движения

Пораженные области мозга

Различные области (в зависимости от заболевания) Гиппокамп, кора головного мозга Субстанция нигра, гипоталамус Слабоумие, нарушение Стриатум, кора психики и моторики головного мозга Нарушение движения Ствол головного мозга, моторный кортекс

Вовлеченные Клеточная локабелки лизация агрегатов Прионы

Вне клетки

β-Амилоид, Внутри и вне тау белки клетки α-Синуклеин Цитоплазма Хантингтин

Ядро

Супероксид- Цитоплазма дисмутаза

Г УС Е В Н . Б . Н Е Й Р О Д Е Г Е Н Е РА Т И В Н Ы Е Б О Л Е З Н И И П Р О Б Л Е М А П РА В И Л Ь Н О ГО С В О РА Ч И В А Н И Я Б Е Л К А

21

БИОЛОГИЯ на поверхности клетки и тем самым инициировать процессы программируемой смерти клетки (рис. 3). Агрегированные белки способны захватывать и удерживать в составе конгломератов важные для клетки факторы транскрипции, внутриклеточные протеолитические ферменты и цитоскелетные белки (см. рис. 3). Все это может приводить к необратимым повреждениям клетки. Клетка пытается избавиться от нерастворимых белковых агрегатов и с этой целью начинает усиленно синтезировать различные активные формы кислорода (супероксиданион, перекиси). Эти соединения вызывают окисление белков и липидов, повреждают мембраны митохондрий и клеток и таким образом также могут быть причиной гибели клеток. Наконец, неправильно свернутые белки могут встраиваться в мембраны (предполагается, что это может происходить с прионами) и образовывать каналы, по которым в клетку могут попадать ионы. Это приведет к нарушению ионного баланса, деполяризации мембраны и гибели клетки (см. рис. 3). Наконец, согласно третьей гипотезе, накопление нерастворимых агрегатов вне клетки ведет к развитию различных воспалительных реакций. В областях отложения белковых агрегатов наблюдается накопление специальных белков, факторов роста и цитокинов. Все эти процессы могут в определенной степени способствовать разрушению белковых агрегатов, но в то же время могут вызывать тяжелые поражения соседних клеток и приводить в конечном счете к их гибели. Если в основе развития различных патологических процессов, протекающих в мозге, действительно лежит накопление агрегатов неправильно свернутых белков, то возникает оправданное желание разработать методы, которые были бы применимы для лечения широкого круга нейродегенеративных болезней. Схематически эти подходы изображены на рис. 4. Первый подход (рис. 4, а ) может состоять в стабилизации нормального состояния белка. Этого можно достичь повысив в клетке уровень низкомолекулярных соединений, стабилизирующих нормальную структуру белка, или обеспечив в клетке синтез таких мутантов исследуемого белка, которые могли бы сворачиваться только правильным образом. Известно, что введение определенных мутаций делает невозможным неправильную упаковку белка и тем самым будет препятствовать накоплению белковых агрегатов. Очевидно, что такой подход довольно сложен и предполагает развитие методов генной терапии. Второй подход (рис. 4, б ) состоит в индукции в клетке синтеза специальных коротких пептидов, которые бы блокировали образование β-складчатой структуры и тем самым препятствовали бы агрегации исследуемого белка. Помимо пептидов некоторые химические соединения (такие, как тетрациклин, 4-иод-4-деоксидоксорубицин) препятствуют неправильного сворачиванию

22

Активация сигнальных путей

Окислительный стресс

Окисление белков и липидов

O2–•, H2O2, OH•, CNOO–•

Апоптоз нервных клеток

Связывание клеточных белков

Формирование ионных каналов

Рис. 3. Возможные модели нейротоксического действия агрегатов неправильно свернутых белков. Агрегированные белки могут активировать процессы, ведущие к программируемой клеточной смерти (апоптозу), захватывать и удерживать в составе агрегатов важные для клетки белки, индуцировать накопление активных форм кислорода, что ведет к окислению и повреждению белков и липидов, или, наконец, могут формировать в мембране каналы, по которым в клетку поступают ионы (по: Soto C. Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases // Nature Rev. Neurosci. 2003. Vol. 4. Р. 49–60)

белка и даже способствуют диссоциации уже сформировавшихся агрегатов. Третий подход состоит в синтезе соединений, которые бы конкурентным образом взаимодействовали либо с мономерным белком (рис. 4, в ), либо с концами формирующегося агрегата (рис. 4, г ). И в том и в другом случае эти соединения либо препятствовали бы встраиванию неправильно свернутого мономера в растущий полимер, либо блокировали бы рост уже сформировавшихся агрегатов. Известно, что некоторые красители (например, конго красный), а также некоторые белки (например, аполипопротеин Е или протеогликаны) специфически взаимодействуют с

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 8 , № 2 , 2 0 0 4

БИОЛОГИЯ

а) Стабилизация нормально свернутого белка

используя антитела, выработанные на агрегированные формы белка. К сожалению, и этот процесс небезопасен, потому что он может вызвать воспалительные реакции, следствием чего станет гибель соседствующих с очагом поражения здоровых клеток. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

б) Блокирование формирования β-складок

в) Конкурентное ингибирование агрегации мономеров

г) Конкурентное ингибирование роста полимера

д) Увеличение эффективности разборки полимера Рис. 4. Схема различных подходов для предотвращения неправильного сворачивания белка и его агрегации (подробности в тексте) (по: Soto C. Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases // Nature Rev. Neurosci. 2003. Vol. 4. Р. 49–60)

β-амилоидными структурами и могут препятствовать их росту. Использование таких соединений представляется довольно перспективным, однако следует выяснить, что является первопричиной образования агрегатов. Может оказаться так, что образующиеся при фрагментации длинных полимеров короткие агрегаты станут выступать в качестве своеобразных зародышейзатравок и тем самым будут способствовать, а не препятствовать развитию заболевания. Наконец, последний вариант (рис. 4, д ) состоит в том, что имеет смысл попробовать ускорить и улучшить процесс удаления уже образовавшихся агрегатов. Этого можно достичь

Исследования последних 10–15 лет показали, что многие нейродегенеративные болезни связаны с накоплением неправильно свернутых белков. Исходно предполагалось, что только некоторые специфические белки могут под действием неблагоприятных факторов принимать β-складчатую структуру, а впоследствии агрегировать с образованием β-амилоидных структур. Позднее оказалось, что практически все белки в определенных условиях склонны к образованию β-складчатых структур. В этой связи можно предположить, что не только нейродегенеративные, но и многие другие болезни могут быть связаны с неправильной упаковкой молекул различных белков. Нельзя исключить вероятность того, что каждый из белков может иметь две или несколько относительно стабильных “замороженных” структур, которые лишь с малой вероятностью переходят друг в друга. Если это предположение верно, то вполне возможно, что, находясь в одной структуре, данный белок будет участвовать в одних реакциях или выполнять одну функцию, а перейдя в другое структурное состояние, белок станет выполнять совершенно иные функции. Разработка методов, позволяющих сдвигать равновесие между разными структурными состояниями белка, представляется крайне важной как для лечения, так и для предотвращения многочисленных болезней человека. ЛИТЕРАТУРА 1. Ноздрачев А.Д., Марьянович А.Т., Поляков Е.Л. и др. Нобелевские премии по физиологии или медицине за 100 лет. СПб.: Гуманистика, 2002. 2. Aguzzi A., Polymenidou M. Mammalian prion biology: One century of evolving concepts // Cell. 2004. Vol. 116. P. 313–327. 3. Гривенников С.И., Стволинский С.Л. Прионные белки и нейродегенеративные заболевания // Нейрохимия. 1998. Т. 15. С. 343–349. 4. Soto C. Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases// Nature Rev. Neurosci. 2003. Vol. 4. P. 49–60.

Рецензент статьи В.А. Ткачук *** Николай Борисович Гусев, доктор биологических наук, профессор кафедры биохимии биологического факультета МГУ. Область научных интересов – структура белка, биохимия мышц. Автор более 90 научных работ.

Г УС Е В Н . Б . Н Е Й Р О Д Е Г Е Н Е РА Т И В Н Ы Е Б О Л Е З Н И И П Р О Б Л Е М А П РА В И Л Ь Н О ГО С В О РА Ч И В А Н И Я Б Е Л К А

23