Инактивация ферментов ультрафиолетовым облучением

БИОЛОГИЯ ИНАКТИВАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ Ю. А. ВЛАДИМИРОВ Российский государственный медицинский университет, Москва

ВВЕДЕНИЕ

ENZYME INACTIVATION BY UV IRRADIATION Yu. A. VLADIMIROV

In living cells, UV radiation is absorbed mostly by proteins and nucleic acids. In proteins, the primary photochemical reaction is either photoionization of aromatic aminoacids, or photodissociation of -S-S- bridges in cystine. Free radicals thus produced initiate a cascade of reactions, which lead to disruption of the structure and loss of enzyme activity.

© Владимиров Ю.А., 2001

Ультрафиолетовое излучение поглощается в живых клетках в основном белками и нуклеиновыми кислотами. В белках первичной фотохимической реакцией является фотоионизация ароматических аминокислот или фотодиссоциация –S–S-связи цистина. При этом образуются свободные радикалы и запускается каскад реакций, заканчивающихся нарушением структуры и инактивацией фермента.

20

Ультрафиолетовое (УФ) излучение Солнца действует на живые организма с момента зарождения жизни на Земле, оказывая благотворное или повреждающее действие. УФ-облучение кожи используется в физиотерапии, поскольку приводит к фотосинтезу витамина D и оказывает бактерицидное и стимулирующее действие. В больших дозах УФ-излучение вызывает покраснение кожи (эритему) и может вызвать ожоги и развитие раковых опухолей. В экспериментальных исследованиях УФ-облучение клеток и внутриклеточных структур применяют, чтобы вызвать мутации или окисление липидов мембран, избирательно разрушить определенные клеточные структуры. Основной закон фотохимии и фотобиологии гласит, что действует только тот свет, который поглощается. В живых клетках, не содержащих хлорофилл, УФ-излучение поглощается в основном нуклеиновыми кислотами и белками, в меньшей степени коферментами, гормонами и пигментами. Поглощение света нуклеиновыми кислотами лежит в основе мутагенного и бактерицидного действия УФ-излучения. Вместе с тем слабо делящиеся клетки повреждаются УФ-излучением главным образом из-за денатурации белков и повреждения биологических мембран. Инактивация ферментов под действием ультрафиолетового излучения не только очень важный, но и относительно простой фотобиологический процесс, гораздо более простой, чем фотосинтез или зрение. На его примере можно познакомиться с общими принципами и методами современной фотобиологии [1]. НЕМНОГО О СВЕТЕ И ВЕЩЕСТВЕ

www.issep.rssi.ru

Исаак Ньютон представлял себе луч света как поток частиц (1704 год). Христиан Гюйгенс предположил, что свет – это волны (1790 год). Сейчас мы знаем, что оба были правы. Свет – это электромагнитные волны и одновременно частицы, которые мы называем квантами света или фотонами. Фотоны могут взаимодействовать

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 2 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ с молекулами вещества, при этом фотоны исчезают, передавая свою энергию молекулам. Энергия фотона E пропорциональна частоте электромагнитного колебания ν и обратно пропорциональна длине световой волны λ:

Энергия молекулы

Незанятые (вакантные) уровни

Занятые (заполненные) уровни

Рис. 1. Энергетические электронные уровни в молекулах

ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ВОЗБУЖДЕННЫХ МОЛЕКУЛАХ Рассмотрим судьбу энергии, поглощенной молекулой в виде фотона, на примере аминокислоты триптофан (рис. 2). Два максимума поглощения триптофана (220 и 280 нм) соответствуют электронным переходам на первый и второй нижние свободные энергетические уров-

S0

Поглощение > 600 нм

330 нм

Фосфоресценция 435 нм

Процессы при поглощении фотона связаны с электронными переходами в молекуле. Электроны в молекуле могут иметь лишь определенные значения энергии, которые принято изображать в виде энергетических уровней (рис. 1). На этих уровнях, как на полках шкафа, располагаются, начиная с нижнего уровня, все наличные электроны, по паре на каждой полке. При поглощении кванта света электрон с верхнего заполненного уровня переходит на один из свободных уровней, обычно на самый нижний, реже на второй снизу. Такая молекула, поглотившая фотон, называется электронновозбужденной. Поглощенная энергия может дать начало фотохимическим реакциям и фотобиологическим процессам.

Флуоресценция

В молекулярном масштабе эта энергия фотонов довольно значительна: так, энергия кванта видимого света с длиной волны 500 нм равна 2,48 эВ, что в десять раз превышает энергию гидролиза АТФ. Энергия ультрафиолетового кванта еще больше.

T1 280 нм 220 нм

где h – постоянная Планка, а c – скорость света.

S1

Поглощение

(1)

Возбужденное состояние Энергия молекулы триптофана

hc E = hν = ------ , λ

S2

Сольватированный электрон

Основное состояние

Рис. 2. Электронные переходы в аминокислоте триптофане

ни. За короткий промежуток времени (порядка 10−11 с) происходят растрата части поглощенной энергии и переход электрона на самый низкий энергетический уровень возбужденного состояния молекулы (S1 на рис. 2). На этом уровне, называемом синглетным, электрон задерживается на срок порядка 10− 8 с, и именно в этот момент решается вопрос, что произойдет дальше. В зависимости от ситуации энергия электронного возбуждения может быть израсходована одним из трех способов: 1) передача энергии окружающим молекулам (чаще всего растрата энергии в тепло); 2) высвечивание фотона (люминесценция); 3) химическая реакция с окружающими молекулами (фотохимическая реакция). В первом случае переход электрона на исходный уровень (S0 на рис. 2) сопровождается расходованием энергии возбуждения на тепловые движения молекул окружающей среды. Во втором случае такой переход сопровождается высвечиванием фотона, это явление называется флуоресценцией. Энергия высвечиваемого кванта, как правило, меньше энергии поглощенного кванта, а следовательно, длина волны света флуоресценции больше длины волны поглощенного кванта (см. уравнение 1 и рис. 2). Альтернативой флуоресценции может быть переход на энергетический уровень, лежащий чуть ниже чем S1 и называемый триплетным, в результате обращения спина электрона (то есть направления его собственного магнитного момента). Электронный переход с триплетного уровня на основной (S0 на рис. 2) может сопровождаться высвечиванием фотона, этот процесс называется фосфоресценцией.

В Л А Д И М И Р О В Ю . А . И Н А К Т И В А Ц И Я Ф Е Р М Е Н Т О В УЛ Ь Т РА Ф И О Л Е Т О В Ы М О Б Л У Ч Е Н И Е М

21

БИОЛОГИЯ

1

A

3

A;

3

A + 3O2

A + 1O2 .

Молекула фотосенсибилизатора (A), поглотив фотон, переходит сначала в синглетное возбужденное (1A), а затем в триплетное состояние (3A). Последнее при взаимодействии с молекулой кислорода (3O2) переводит ее из обычного для кислорода триплетного состояния в возбужденное синглетное (1O2). Синглетный кислород (1O2) – чрезвычайно активное химическое соединение. Вступая в реакции с белками, липидами и нуклеиновыми кислотами, он разрушает клеточные структуры. По счастью, раковые клетки накапливают гораздо большие количества сенсибилизатора, чем ок-

22

S2

Поглощение 275 304 Флуоресценция Фосфоресценция (при 77 К) 378

S1 S1

S0

T1 306 кДж/моль

A + hν

Интенсивность 217

Фосфоресценция

где AH – молекула аминокислоты в основном состоянии, 1AH – молекула в синглетном возбужденном состоянии, •AH+ – катион-радикал, (e−)s – сольватированный (захваченный средой) электрон. Эта реакция идет через синглетное возбужденное состояние аминокислоты. По другому механизму идут, например, реакции с участием фотосенсибилизаторов, к которым относятся, в частности, производные гематопорфирина, используемые при так называемой фотодинамической терапии [1] раковых заболеваний:

375 кДж/моль

AH

Флуоресценция

•AH+ + (e−)s ,

1

545 кДж/моль 427 кДж/моль

AH + hν

Электронные переходы в молекулах при поглощении света изучают измеряя спектры поглощения и люминесценцию растворов соответствующих соединений. На рис. 3 показано, как на основании измерения спектров поглощения, флуоресценции и фосфоресценции можно построить схему электронных энергетических уровней. При расчетах энергий электронных уровней (по сравнению с энергией основного состояния, принимаемой за нуль) используют уравнение (1). В то же время измерение квантовых выходов флуоресценции и фосфоресценции позволяет оценить вероятности излучательных электронных переходов между уровнями. Напомним, что квантовый выход люминесценции равен отношению числа высвеченных квантов к числу поглощенных. Это отношение равно вероятности излучательных переходов S1 S0 для флуоресценции и T1 S0 для фосфоресценции (см. рис. 2), то есть отношению числа переходов, сопровождающихся излучением, к числу всех переходов из возбужденного в основное состояние молекул. Образование и превращения первичных продуктов фотохимических реакций также изучаются преимущественно методами спектроскопии, поскольку такие частицы, как свободные радикалы, синглетный кислород и даже сольватированный электрон, обладают характерными спектрами поглощения, а зачастую и люминесценции. Радикалы и сольватированный электрон – весьма активные частицы, время жизни которых при комнатной температуре измеряется микросекундами.

Поглощение

Электронно-возбужденные молекулы, обладая избытком энергии, охотно вступают в химическое взаимодействие с другими молекулами (фотохимические реакции), при этом вероятность вступить в реакцию с синглетного и триплетного уровней различна по двум причинам. С одной стороны, энергия молекулы в синглетном состоянии выше. Но, с другой стороны, в синглетном состоянии молекула живет 10− 8–10− 9 с, а в триплетном – 10− 5–10− 4 с (при комнатной температуре), то есть в тысячи раз дольше. Таким образом, в триплетном состоянии энергии меньше, но выше вероятность столкнуться с подходящей молекулой и вступить с ней в реакцию. В итоге в различных ситуациях преобладают реакции с участием либо синглетного, либо триплетного возбужденного состояния возбужденных молекул. Так, например, ароматические аминокислоты белков тирозин и триптофан под действием ультрафиолетового облучения отдают электрон молекулам окружающей их воды, который некоторое время может существовать в окружении диполей молекул H2O:

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ НАЧАЛЬНЫХ СТАДИЙ ФОТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

Энергия молекулы тирозина

ПЕРВИЧНЫЕ СТАДИИ ФОТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ

ружающие нормальные клетки, и при освещении опухоли после приема пациентом сенсибилизатора разрушаются преимущественно эти клетки.

Длина волны, нм

Энергия кванта фосфоресценции меньше энергии кванта флуоресценции, а следовательно, фосфоресценция наблюдается в более длинноволновом диапазоне по сравнению с флуоресценцией. Флуоресценция и фосфоресценция объединяются термином “люминесценция”.

Основное состояние

Рис. 3. Построение схемы электронных уровней и переходов по данным спектральных измерений

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 2 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ Для изучения их свойств используют либо быструю регистрацию спектров поглощения после импульсного освещения объекта, либо замораживание растворов до температуры жидкого азота, при которой прекращаются химические превращения первичных фотопродуктов. На рис. 2 показан энергетический уровень сольватированного электрона, куда электрон попадает в результате ионизации электронно-возбужденной молекулы. При температуре жидкого азота (77 К) это состояние устойчиво, и можно измерить поглощение сольватированных электронов, которое лежит в красной области спектра. При постепенном нагревании электроны возвращаются на триплетный уровень молекулы, что сопровождается высвечиванием кванта фосфоресценции. Под действием красного света сольватированные электроны переходят в свое возбужденное состояние, а затем на синглетный уровень возбужденного состояния родительской молекулы, что сопровождается высвечиванием квантов ее флуоресценции. При температуре жидкого азота радикалы аминокислот, образующиеся под действием УФ-облучения, также довольно устойчивы. Это делает возможным изучать их структуру измеряя спектры поглощения, флуоресценции и сигналы ЭПР замороженных жидким азотом и затем облученных растворов. ПРЕВРАЩЕНИЕ ПРОДУКТОВ ПЕРВИЧНЫХ ФОТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ В УСТОЙЧИВЫЕ ХИМИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ Судьба продуктов первичных фотохимических реакций в основном определяется их ближайшим окружением. Так, например, в растворах аминокислот тирозина, триптофана и фенилаланина, содержащих кислород, происходят реакции обоих продуктов фотохимического процесса: сольватированного электрона и свободных радикалов с молекулярным кислородом. В результате образуются супероксид-радикал ( •O −2 ) и диоксидрадикалы аминокислот (AOO•): (e−)s + O2 •AH+ •A + O2

•O −2 , •A + H+, AOO•

Появление диоксид–радикалов, по-видимому, служит началом цепного окисления, которое заканчивается образованием устойчивых продуктов окисления аминокислоты. Ниже приведены формулы радикалов тирозина и триптофана, а также устойчивых продуктов фотоокисления этих аминокислот.

CH2 •O

CH NH3+

COO− + O2

Радикал тирозина

CH2 HO HO

N

CH NH3+

COO−

Диоксифенилаланин

− • CH2 CH COO + O2 NH3+

Радикал триптофана

O C

CH2

CH

NH3+ COO−

N CH H O Формилкинуренин Надо отметить, что продукты окисления тирозина и триптофана обладают определенной физиологической активностью. Если те же аминокислоты встроены в полипептидную цепь белка, судьба первичных фотопродуктов (радикалов) резко изменяется. Вместо кислорода они реагируют с окружающими аминокислотами, и это приводит к образованию внутри- или межмолекулярных сшивок между полипептидными цепями. При этом снижается растворимость белков, а в случае ферментов происходит их инактивация. СВЯЗЬ МЕЖДУ ФОТОХИМИЧЕСКИМИ И ФОТОБИОЛОГИЧЕСКИМИ ПРОЦЕССАМИ. СПЕКТРЫ ДЕЙСТВИЯ Читатель вправе спросить, все ли фотохимические реакции биохимических составляющих наших клеток и тканей важны для конечного биологического действия света на эти клетки, ткани и организм в целом. УФ-лучи поглощаются белками, нуклеиновыми кислотами, стероидными гормонами, тироксином, пиридиннуклеотидами, коэнзимом Q и многими другими биологически важными соединениями. Гемоглобин, цитохромы, каталаза, пероксидазы, флавопротеины, каротиноиды поглощают свет в видимой области спектра и могут вступать в различные фотохимические реакции. Но как узнать, какая именно из рассматриваемых реакций приводит к конечному фотобиологическому эффекту. Одна из фундаментальных концепций фотобиологии – это понятие о молекулах-мишенях света и действующих фотонах. Согласно этой концепции, конечный

В Л А Д И М И Р О В Ю . А . И Н А К Т И В А Ц И Я Ф Е Р М Е Н Т О В УЛ Ь Т РА Ф И О Л Е Т О В Ы М О Б Л У Ч Е Н И Е М

23

БИОЛОГИЯ фотобиологический эффект определяется не тем, каким светом освещается биологический объект, и даже не тем, сколько и каких квантов поглотилось, а исключительно тем, сколько поглотилось действующих фотонов молекулами-мишенями. Рассмотрим это непростое понятие на относительно простом примере – инактивации ферментов под действием ультрафиолетового излучения. Такие ферменты, как трипсин или пепсин, представляют собой свернутые полипептидные цепи, которые в числе прочих содержат аминокислоты, поглощающие УФ-лучи: ароматические (тирозин, триптофан, фенилаланин), гистидин и серосодержащие (цистеин, метионин, цистин). Суммарный спектр поглощения трипсина показан на рис. 4. Относительный вклад различных аминокислот в общее поглощение белка различен в разных областях спектра. Так, в области 200–230 и 270–300 нм поглощение белка обусловлено в основном ароматическими аминокислотами, а в области 240–250 нм – сульфгидрильными (–SH) и дисульфидными (–SS–) группами цистеина и цистина. На рис. 4 показана эффективность света разных длин волн в отношении инактивации фермента. В целом зависимость эффективности света от длины волны (такая зависимость называется спектром фотохимического действия или спектром действия) по форме похожа на спектр поглощения, но эффективность в области σ Действие 100 s

–SH и – SS– группы Ароматические аминокислоты

10 Поглощение 1

0,1

0,01 180 200 220 240 260 280 300 320 Длина волны, нм Рис. 4. Спектры поглощения трипсина (внизу) и спектры действия инактивации трипсина под действием УФ-облучения (вверху). В области 220 и 280 нм поглощение белка обусловлено в основном поглощением ароматических аминокислот. В области 240–250 нм – сульфгидрильных (–SH) и дисульфидных (–SS–) групп цистеина и цистина

24

поглощения –SH и –SS– групп относительно несколько выше. Интуитивно мы понимаем, что это значит: фотоны, поглощаемые ароматическими и серосодержащими аминокислотами, участвуют в инактивации фермента, но эффективность последних несколько выше. Наука, однако, в том и заключается, чтобы интуитивные ощущения заменить точными знаниями. Поэтому придется немного потрудиться, чтобы понять, что именно означает понятие “эффективность” действующего света и как измеряют спектры фотохимического действия. ТЕОРИЯ МИШЕНЕЙ В ФОТОБИОЛОГИИ Теория мишеней была разработана для объяснения поражающего действия ионизирующей радиации на клетки. В первоначальном виде она оказалась непродуктивной, поскольку главной мишенью для ионизирующих частиц оказались не клеточные структуры, а молекулы воды, кроме того, конечный эффект зависел от активности системы репарации повреждений. Но в случае инактивации ферментов под действием квантов УФ-излучения теория мишеней вполне себя оправдывает. Суть ее сводится к трем положениям. 1. В ферментах имеется чувствительный к свету участок молекулы, который будем называть мишенью. Поглощение фотона мишенью приводит к инактивации фермента с некоторой вероятностью Q, называемой квантовым выходом инактивации. Таким образом, квантовый выход, по определению, Число инактивированных молекул фермента Q = -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- . Число поглощенных фотонов 2. Вероятность поглощения фотона мишенью пропорциональна величине, имеющей размерность квадратный сантиметр (или квадратный метр) и называемой поперечным сечением поглощения. Надо подчеркнуть, что величина поперечного сечения поглощения (обозначим ее буквой s) не имеет никакого отношения к реальным размерам поглощающей свет молекулы и изменяется с изменением длины волны поглощаемого излучения. Тем не менее она позволяет наглядно представить себе акт поглощения света. Представьте себе, что вы стреляете из ружья наугад в направлении пруда с надеждой попасть в утку. Вероятность того, что вы попадете, зависит от размеров утки, а точнее, от площади поперечного сечения утки в плоскости, перпендикулярной направлению выстрела. Так же и вероятность поглощения фотона пропорциональна поперечному сечению молекулы-хромофора. 3. Вероятность поражения мишени, то есть инактивации фермента, пропорциональна поперечному сечению поглощения, умноженному на квантовый выход инактивации. Это произведение также выражается в

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 2 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ квадратных сантиметрах (или в квадратных метрах) и называется поперечным сечением инактивации, обычно оно обозначается буквой σ. Итак σ = Q ⋅ s.

(2)

Возвращаясь к примеру о стрельбе по уткам, попробуем понять смысл величины “поперечное сечение инактивации”. Не всякая пуля, попавшая в утку, ее убьет. Нужно попасть в жизненно важные органы, такие, как сердце или мозг. Вероятность поражения утки равна отношению поперечного сечения этих органов к поперечному сечению всей утки. Отношение этих сечений равно вероятности поражения утки попавшей пулей и эквивалентно квантовому выходу инактивации для случая обстрела фермента ультрафиолетовыми фотонами. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗМЕРЕНИЕ ПОПЕРЕЧНЫХ СЕЧЕНИЙ ПОГЛОЩЕНИЯ И ИНАКТИВАЦИИ Эти две величины определяются в опытах совершенно разными методами. Поперечное сечение поглощения измеряют с помощью оптических приборов – фотометров, в которых измеряют интенсивность света, падающего на кювету с раствором изучаемого вещества (обозначим ее I0), и интенсивность света, прошедшего через кювету и, следовательно, не поглощенную изучаемым веществом (обозначим ее I ). Отношение T = I / I0 , называемое коэффициентом пропускания, зависит от концентрации вещества n (в числе молекул на 1 м3) и длины кюветы l (в м) согласно уравнению I – snl T = ---- = e , I0

(3)

где s и есть то самое поперечное сечение поглощения. (С целью экономии места мы не приводим вывода этого уравнения.) Таким образом, измерив пропускание образца T, легко рассчитать поперечное сечение поглощения при любой длине волны падающего света. Поперечное сечение инактивации измеряют в опытах, где оценивают снижение активности фермента по мере его облучения. Степень инактивации, как оказалось, в данном случае зависит от произведения интенсивности света (выраженной в числе фотонов, падающих на единицу площади в единицу времени, скажем, на 1 м2 за 1 с) на время облучения в секундах. Эта величина называется дозой облучения (обозначим ее как Д) и в нашем случае выражается числом фотонов, упавших на 1 м2 поверхности изучаемого раствора фермента. Активность фермента A снижается по мере облучения согласно уравнению (4), вывод которого мы также не приводим:

A ----- = e –σД , A0

(4)

где A0 – активность фермента до облучения, а σ – поперечное сечение инактивации фермента. Измерив зависимость активности фермента от дозы облучения, строят график зависимости ln(A/A0) от Д и по тангенсу угла наклона полученной прямой к оси абсцисс находят величину σ. ФОТОХИМИЧЕСКИЙ СПЕКТР ДЕЙСТВИЯ Как и все другие вещества, белки поглощают с различной вероятностью излучение с разной длиной волны. Поэтому поперечное сечение поглощения и поперечное сечение инактивации изменяются с изменением длины волны падающего света. Зависимость s от длины волны падающего на объект излучения назовем спектром поглощения данного объекта (в нашем случае раствора фермента). Зависимость σ от длины волны излучения назовем спектром действия. Именно эти величины отложены по оси ординат на рис. 4. Многочисленными исследованиями показано, что квантовый выход фотохимических реакций в простых молекулах, таких, как те же ароматические аминокислоты в растворах, не зависит от длины волны падающего излучения. Причина этого станет понятной, если еще раз рассмотрим схему электронных переходов после поглощения света молекулой (см. рис. 2). Поглощение может происходить на разные уровни возбужденного состояния молекулы (S1 и S2 на рис. 2), но за очень короткое время (порядка 10−11 с) все электроны с этих уровней переходят на самый нижний уровень возбужденного состояния, где они задерживаются на относительно долгий срок (порядка 10−8 с). Таким образом, независимо от длины волны падающего излучения все возбужденные молекулы оказываются в совершенно одинаковом состоянии. После этого все они имеют некий шанс (одинаковый для всех и равный квантовому выходу Q) вступить в фотохимическую реакцию. По этой причине квантовый выход Q не зависит от длины волны падающего излучения (от того, на какой именно уровень возбужденного состояния попадет молекула при поглощении фотона). Таким образом, из уравнения (2) следует, что поперечные сечения поглощения и инактивации пропорциональны друг другу при всех длинах волн, а следовательно, спектры поглощения и инактивации имеют одинаковую форму (то есть различаются только масштабом ординаты). СКОЛЬКО МИШЕНЕЙ В МОЛЕКУЛЕ БЕЛКА Жизненно важных органов у утки несколько, поражение любого из них приведет к гибели птицы. В молекуле фермента обычно бывает несколько ароматических

В Л А Д И М И Р О В Ю . А . И Н А К Т И В А Ц И Я Ф Е Р М Е Н Т О В УЛ Ь Т РА Ф И О Л Е Т О В Ы М О Б Л У Ч Е Н И Е М

25

БИОЛОГИЯ Нативный белок Ароматические группы (АН)

–SH и –SS– группы

hν 280 нм •

AOO

AH+ + es

•

A + H+

•

Рекомбинация радикалов и хемилюминесценция ДОФА, формилкинуренин

hν 254 нм S–S связи

−SH Радикалы цистина Поперечные сшивки между участками полипептидной цепи

Фотолиз S–S или С–S связи

Изменение конформации или разрушение активного центра Инактивация Рис. 5. Схема первичных фотохимических реакций при действии ультрафиолетовых лучей на белки. Сокращения: •AH+ – катион-радикал ароматической аминокислоты; es – сольватированный (захваченный растворителем) электрон; •A – нейтральный радикал аминокислоты; AOO• – пероксидный радикал ароматической аминокислоты; ДОФА – диоксифенилаланин

аминокислот, дисульфидных (–SS–) связей и сульфгидрильных групп (–SH), но разрушение только некоторых из этих группировок (а не любой) приводит к инактивации фермента. Так, например, было показано, что в пепсине разрушение только одного остатка триптофана приводит к инактивации фермента, а остальные несущественны для сохранения его активности. В трипсине существенными оказались один остаток триптофана и одна дисульфидная связь из соответственно четырех и шести имеющихся остатков. При этом эффективность света (Q), поглощаемого –SS– группами, существенно выше эффективности при поглощении ароматических аминокислот, в результате чего в спектре действия инактивации трипсина в области 240–260 нм (где поглощается цистин) минимум сглажен по сравнению со спектром поглощения (см. рис. 4). ВСЕГДА ЛИ ИНАКТИВАЦИЯ ВЫЗВАНА РАЗРУШЕНИЕМ МИШЕНЕЙ На рис. 5 суммированы наши знания о процессах, протекающих в белках при УФ-облучении. Рассматривая приведенную схему, можно обнаружить любопытные вещи. Фотохимическое разрушение триптофана (звенья этой цепи событий выделены лиловым цветом), равно как и фотолиз –SS– связей (желтый цвет), приводит к инактивации фермента. В данном случае повреждение чувствительных мишеней приводит к поражению белка. Но это не единственная возможность. Сольватирован-

26

ные электроны, образующиеся в реакции фотоионизации тирозина или триптофана, атакуют дисульфидные связи, что приводит к их разрушению и инактивации фермента [2]. Получается, что биологический эффект может быть связан с разрушением не той группы, которая поглотила свет, а той, которая вступила в реакцию с первичными фотопродуктами. Этот пример далеко не исключение, когда речь идет о более сложных системах, чем такие сравнительно простые белки, как пепсин или трипсин. При УФоблучении мембранных структур клетки, например внутриклеточных мембран мышечных клеток, наблюдается перекисное окисление липидов, которое вызвано фотонами, поглощаемыми мембранными белками. Повреждение мембран ведет к повреждению клетки в целом [2]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Коротковолновое ультрафиолетовое излучение Солнца и искусственных источников, таких, как кварцевые лампы (220–300 нм), поглощается в живых клетках в основном белками и нуклеиновыми кислотами. После поглощение кванта света (фотона) молекула переходит в возбужденное электронное состояние. Избыток энергии, который приобрела такая молекула, может быть либо растрачен на тепловые движения окружающих молекул, либо высветиться в виде кванта люминесценции (флуоресценции или фосфоресценции), либо, наконец, использоваться для запуска химических реак-

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 2 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ ций, которые в темноте практически не идут. При УФоблучении белков первичными фотохимическими реакциями оказались фотоионизация ароматических аминокислот или фотодиссоциация –S–S– связи цистина. И в том и в другом случае образуются свободные радикалы, которые дают начало каскаду реакций, заканчивающихся нарушением природной структуры белка и инактивацией фермента. Если молекула белка была встроена в липидный слой биологической мембраны, то могут запускаться цепные реакции в липидной фазе. Фотохимические реакции в белках играют важную роль в действии УФ-излучения на живые существа. Изучение механизма действия УФ-лучей на такие простые системы, как аминокислоты и белки, позволяет лучше понять механизм более сложных фотобиологических процессов, таких, как эритема (покраснение кожи), зрение или фотосинтез. ЛИТЕРАТУРА 1. Миронов А.Ф. Фотодинамическая терапия рака – новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 12. С. 32–40.

2. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Там же. 2000. № 12. С. 13–19. 3. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: Высш. шк., 1989. 200 с. 4. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в первичных фотобиологических процессах // Биол. мембраны. 1998. Т. 15, вып. 5. С. 517–529.

Рецензент статьи А.Я. Потапенко *** Юрий Андреевич Владимиров, профессор, зав. кафедрой биофизики Российского государственного медицинского университета и зав. кафедрой физикохимических основ медицины МГУ, академик РАМН, руководитель отдела биофизики Института физикохимической медицины МЗ РФ, лауреат Государственной премии СССР. Автор 400 научных работ, включая 11 монографий и учебников.

В Л А Д И М И Р О В Ю . А . И Н А К Т И В А Ц И Я Ф Е Р М Е Н Т О В УЛ Ь Т РА Ф И О Л Е Т О В Ы М О Б Л У Ч Е Н И Е М

27