Микробиологическая диагностика раневых, гнойно-воспалительных, кишечных и воздушно-капельных инфекций: Практическое пособие

М И Н И СТ Е РСТ В О О БРА ЗО В А Н И Я И Н А У К И РО ССИ Й СК О Й Ф Е Д Е РА Ц И И В О РО Н Е Ж СК И Й ГО СУ Д А РСТ В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РСИ Т Е Т

М икробиологич еская диагностикараневых, гнойно-воспалительных, киш еч ных ивоз ду ш но-капельныхинф екц ий

П рактич еское пособие по спец иальностям «Ф арм ац ия» (060108) «Биология» (020201)

В оронеж 2004

2

У тверж дено нау ч но-м етодич еским советом ф арм ац евтич еского ф аку льтета, протокол № 1 от 20.01.2004; биолого-поч венного ф аку льтета, протокол № 20 от 11.06.2004

Составители: Рахм ановаТ .И . Сем енихинаА .В . Н ехаеваГ.И . П оповаТ .Н . Н ау ч ный редактор: доц . Грабович М .Ю . П рактич еское пособие подготовлено на каф едре аналитич еской и м едиц инской биохим ии и м икробиологии биолого-поч венного ф аку льтета В оронеж ского госу дарственного у ниверситета. Реком енду ется для сту дентов I ку рсаотделения средне-спец иального образ ования и II ку рса отделения высш его образ ования ф арм ац евтич еского ф аку льтета, сту дентов III иIV ку рсов биолого-поч венного ф аку льтета.

3

С О Д ЕР Ж А Н И Е В В ЕД ЕН И Е М ЕТ О Д Ы К Л И Н И К О -Д И А Г Н О С Т И Ч ЕС К И Х М И К Р О БИ О Л О Г И Ч ЕС К И Х И С С Л ЕД О В А Н И Й … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 4 В О ЗБУД И Т ЕЛ И Г Н О Й Н О -В О С ПА Л И Т ЕЛ ЬН Ы Х И Р А Н ЕВ Ы Х И Н Ф ЕК ЦИ Й … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 11 Л абораторная диагностика гнойно-воспалительных з аболеваний, выз ванных аэробным ибактериям и… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...11 Л абораторная диагностикаанаэробных инф екц ий… … … … … … … … … … … ..20 В О ЗБУД И Т ЕЛ И БА К Т ЕР И А Л ЬН Ы Х К И Ш ЕЧ Н Ы Х И Н Ф ЕК ЦИ Й … … … ...26 Л абораторная диагностикаэш ерихиоз ов идизентерии… … … … … … … … … ..26 Л абораторная диагностика брюш ного тиф а, паратиф ов и сальм онелез ов. Д исбактериоз … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 31 Л абораторная диагностикахолеры… … … … … … … … … … … … … … … … … … 39 Л абораторная диагностика пищ евых токсикоинф екц ий, интоксикац ий бактериальной природы… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..43 В О ЗБУД И Т ЕЛ И БА К Т ЕР И А Л ЬН Ы Х Р ЕС ПИ Р А Т О Р Н Ы Х И Д Р УГ И Х В О ЗД УШ Н О -К А ПЕЛ ЬН Ы Х И Н Ф ЕК ЦИ Й … … … … … … … … … … … … … … ...45 Л абораторная диагностикам енингококковой инф екц ии, коклюш аи диф терии… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...47 Л абораторная диагностикату берку лез а… … … … … … … … … … … … … … … … 56 О С Н О В Н А Я Л И Т ЕР А Т УР А … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .62 В В ЕД ЕН И Е В данном пособии излож ена лабораторная диагностика бактериальных инф екц ий, проводим ая для у становления этиологич еской и патогенетич еской роливыделяем ых из организм абольного м икроорганизм ов, выбораэф ф ективных им м у нологич ескихихим иотерапевтич ескихпрепаратов. П ри изу ч ении ч астной м икробиологии отдельных з аболеваний особое з нач ение им еют правильный выбор м атериалов для лабораторного исследования, сроки исследования, прим енение адекватных м етодов, оц енка полу ч енных рез у льтатов, выбор м етодов леч ения и спец иф ич еской проф илактики. П ри анализе рез у льтатов лабораторных исследований для постановкиоконч ательного диагноз а з аболеваний необходим о, преж де всего, определить воз м ож ну ю роль патогенных м икроорганизм ов, оц енить роль у словно-патогенной м икроф лоры и определить ч у вствительность м икроорганизм ов к антибиотикам . Рез у льтаты исследований использ у ются для проведения эпидем иологич еского анализа з аболеваем ости с ц елью у становления источ ника инф екц ии, пу тей ее передач и, выявления м икробоносителей идр. Рассм атриваем ые в данном пособии м икроорганизм ы сгру ппированы с у ч етом патогенетич еских и эпидем иологич еских признаков выз ываем ых им и инф екц ий: раневых, гнойных, киш еч ных ивоз ду ш но-капельных.

4

М ЕТ О Д Ы К Л И Н И К О -Д И А Г Н О С Т И Ч ЕС К И Х М И К Р О БИ О Л О Г И Ч ЕС К И Х И С С Л ЕД О В А Н И Й О сновной з адач ей клинико-диагностич еских м икробиологич еских исследований является у становление этиологич еского агента инф екц ионного з аболевания - м икроорганизм а-воз бу дителя. Д ля реш ения этой з адач ииспольз у ют раз лич ные диагностич еские м етоды, которые м ож но подраз делить на две гру ппы в з ависим остиот подхода к определению воз бу дителя. П ервая гру ппа включ ает м етоды, направленные на обнару ж ение прису тствия в м атериале от больного сам ого воз бу дителя, а такж е его антигенов, ну клеиновых кислот (Н К ), характерных проду ктов его ж изнедеятельности или органич еских соединений, входящ их в его состав. В торая гру ппа диагностич еских м етодов основана на выявлении спец иф ич еской им м у нной реакц ии на данного воз бу дителя со стороны м акроорганизм а: гу м оральной - антител против воз бу дителя (серодиагностика) иликлеточ ной - аллергодиагностика. Су щ еству ющ ие м етоды диагностики отлич аются дру г от дру га тру доем костью, срокам и проведения исследований, ч у вствительностью и спец иф ич ностью, а такж е инф орм ативностью полу ч енных данных. В ыбор м етодов исследования з ависит от предварительного клинич еского диагноз а з аболевания, его сроков и определяется биологич еским и свойствам и м икроорганизм а-воз бу дителя и особенностям и его вз аим одействия с м акроорганизм ом в ходе инф екц ионногопроц есса. З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. О з наком иться с основным и правилам и выбора, вз ятия и транспортировки исследу ем ого м атериала. Заполнить типовые бланки для направления м атериалав лабораторию. 2. И з у ч ить схем ы и м етоды м икробиологич еской диагностики основных гру пп м икроорганизм ов. П ри оц енке рез у льтатов лабораторных исследований определить патогенные и у словно-патогенные м икроорганизм ы. М е т о диче с кие ука за ния О сновные правила взятия и направления м атериала в к линик од иагностическ у ю м ик робиологическ у ю лабораторию Рез у льтаты м икробиологич еских исследований во м ногом з ависят от правильного выбора м атериала для исследования, соблюдения всех правил его полу ч ения и направления в лабораторию. В ыбор м атериала определяется клинич еской картиной з аболевания, предполагаем ой локализац ией воз бу дителя в организм е на данном этапе инф екц ионного проц есса ипу тям иего выделения в окру ж ающ у ю среду . 1. М атериал беру т в ранние срокиз аболевания, до нач ала антим икробной терапии. Э то повыш ает вероятность выделения воз бу дителя. Следу ет исключ ить

5

попадание в образ ец антибиотиков, антисептиков, дез инф ектантов, а такж е ч астиц ваты, содерж ащ ей свободные ж ирные кислоты. В аж ным у словием является достаточ ное колич ество м атериала для исследования (наприм ер, не м енее 5-10 м л крови, 3-5 м лм оч иит.д.). 2. Л юбой клинич еский м атериал для м икробиологич еских исследований рассм атривается как потенц иально опасный для ч еловека. П оэтом у при полу ч ении, хранении и транспортировке м атериала в лабораторию строго соблюдают правилатехникибактериологич еской без опасности. 3. М атериал собирают, соблюдая правила асептики, для преду преж дения его воз м ож ной контам инац ии норм альной м икроф лорой организм а больного и м икроорганизм ам и окру ж ающ ей среды. П осле вз ятия м атериала его в м аксим ально короткие срокидоставляют в лабораторию. П риотсу тствиитакой воз м ож ности м атериал сохраняют непродолж ительное врем я, соблюдая определенные правила. Способ сохранения м атериала определяется свойствам и предполагаем ого воз бу дителя и сам ого м атериала. В больш инстве слу ч аев воз м ож но непродолж ительное хранение в холодильнике при тем перату ре 4 °С. П ри необходим ости длительного хранения м атериал м ож но подвергну ть глу боком у з ам ораж иванию притем перату ре -20 °С иниж е. Е слипредполагаем ый м икробвоз бу дитель ч у вствителен к действию низких тем перату р, м атериал необходим о сохранять в терм остате при37 °С. Д ля подавления раз м нож ения сопу тству ющ ей м икроф лоры м ож но использ овать антим икробные препараты. 4. М атериал транспортиру ют в спец иальных биксах, пеналах или м еталлич еских контейнерах, которые после использ ования подвергают дез инф екц ии. 5. Д ля серологич еского исследования у больного натощ ак беру т кровь в колич естве 5-6 м л из локтевой вены при соблюдении правил асептики. К ровь ставят в терм остат на 30-60 м ин; образ овавш ийся кровяной сгу сток отделяют от стенкистерильной стеклянной палоч кой иоставляют м атериал в холодильнике на 18-20 ч . О тстоявш у юся сыворотку осторож но сливают в стерильну ю пробирку ; в слу ч ае прим есиэритроц итов ее ц ентриф у гиру ют. Сыворотка м ож ет храниться в стерильных у словиях в холодильнике до 1 м ес. Д ля более длительного хранения ее з ам ораж ивают притем перату ре от -20 до-70 °С. 6. В м икробиологич еской лаборатории все остатки патологич еского м атериалаподлеж ат у нич тож ению (пу тем автоклавирования). 7. В се м атериалы, направленные в лабораторию, долж ны им еть сопроводительный доку м ент - направление на спец иальном бланке, где у каз аны ф ам илия, им я, отч ество больного, воз раст, вид м атериала, дата вз ятия, предполагаем ый клинич еский диагноз идру гие сведения. М етод ы к линик о-д иагностическ их м ик робиологическ их исслед ований М е т о ды о бна руже ния в о збудит е л я в ма т е риа л е о т бо л ьно го М икро с ко пиче с кие ме т о ды . М икроскопич еские м етоды прим еняют для обнару ж ения воз бу дителей непосредственнов исследу ем ом м атериале.

6

Д ля выявления бактерий (бактериоскопич еские исследования), а такж е грибов и простейш их прим еняют световые м етоды м икроскопии окраш енных или нативных препаратов, приготовленных из м атериала, полу ч енного от больного. П реим у щ ество м икроскопич еских исследований состоит в быстроте (осу щ ествление требу ет не более 30-60 м ин), простоте идеш евизне. О сновным недостатком м етода является низкая спец иф ич ность - невоз м ож ность видовой идентиф икац ии обнару ж енных м икроорганизм ов, а в ряде слу ч аев - их диф ф еренц иац ии м еж ду собой (наприм ер, эш ерихий, сальм онелл и ш игелл). Ч у вствительность такж е невысока: м икроскопич еский м етод поз воляет 6 обнару ж ить воз бу дителя приего конц ентрац иине м енее 10 м икробных клеток в 1 м лили1 гисследу ем огом атериала. В больш инстве слу ч аев м икроскопич еский м етод им еет ориентировоч ное з нач ение и поз воляет полу ч ить предварительные данные о м икробах, прису тству ющ их в м атериале, инам етить пу тидальнейш их исследований. В м есте с тем при некоторых инф екц иях диагностич еская ц енность м икроскопич еского исследования весьм а велика и является основанием для постановки оконч ательного диагноз а з аболевания, наприм ер, воз вратного тиф а, гонореи, дерм атом икоз ов идр. Н еобходим о пом нить, ч то некоторые бактерии (хлам идии, м икоплаз м ы) им еют м алые раз м еры, леж ащ ие з а пределам и раз реш ающ ей способности световой м икроскопии, ине м огу т быть выявлены с пом ощ ью этихм етодов. В иру соскопич еские исследования осу щ ествляют с использ ованием электронной м икроскопии, ч то в соч етаниис ком пьютерным исистем ам ианализа изображ ений поз воляет осу щ ествлять предварительну ю идентиф икац ию виру сов по м орф ологии. Д остоинство м етода: воз м ож ность обнару ж ения ранее неизвестных виру сов. Ч у вствительность аналогич набактериоскопич еском у . М икро био ло гиче с кие ме т о ды . О снованы на выделении ч истой ку льту ры воз бу дителя из м атериала, полу ч енного от больного, и ее последу ющ ей идентиф икац ии. М икробиологич еские м етоды отлич аются высокой ч у вствительностью и спец иф ич ностью. Располагая ч истой ку льту рой воз бу дителя, м ож но определить его родову ю и видову ю принадлеж ность и осу щ ествить вну тривидовое типирование, обнару ж ить ф акторы виру лентности, а такж е определить ч у вствительность к антибиотикам , ч то необходим о для рац ионального выбораэтиотропной терапии. Д ля эпидем иологич еского анализа вспыш ек инф екц ионных з аболеваний проводят типирование ку льту р воз бу дителей, выделенных от раз ных больных и из внеш них объ ектов - вероятных источ ников з араж ения (вода, пищ евые проду кты и т.д.), т.е. определение их биовара: серовара (серотипирование), ф аговара(ф аготипирование) ит.д. К ром е того, м икробиологич еские исследования проводят для выявления носительства патогенных м икробов среди детей и вз рослых. Бактериологич еское исследование является веду щ им в диагностике больш инства бактериальных инф екц ий. Т ру дностим етода м огу т быть связ аны с низкой скоростью раз м нож ения бактерий-воз бу дителей, слож ным и ростовым и

7

потребностям и и требовательностью к у словиям ку льтивирования. О днако только выделение ч истой ку льту ры воз бу дителя из м атериала от больного при исключ енииконтам инац ииим еет абсолютное диагностич еское з нач ение. М икологич еские исследования осу щ ествляют реж е, ч ем бактериологич еские, поскольку м икроскопич еская диагностика м икоз ов достаточ но надеж на. М икологич еские исследования являются обяз ательным ипри диагностике кандидоз ов, атакж е глу боких м икоз ов. В иру сологич еский м етод является наиболее достоверным для диагностики виру сных инф екц ий. О днако его прим енение огранич ивается тру доем костью. О собое з нач ение виру сологич еский м етод приобретает в слу ч ае необходим ости оц енки ч у вствительности воз бу дителя к противовиру сным препаратам . В ряде слу ч аев виру сологич еский м етод использ у ют для ретроспективной диагностики виру сных инф екц ий. В се м икробиологич еские м етоды им еют определяющ ее з нач ение в лабораторной диагностике инф екц ионных з аболеваний, являются наиболее инф орм ативным и и достоверным и. К ч ислу недостатков м ож но отнести длительность и отсу тствие м етодов ку льтивирования некоторых м икробов (наприм ер, воз бу дителей сиф илисаилепры). Био л о гиче с кие ме т о ды (био про бы ). Биопробу осу щ ествляют пу тем з араж ения лабораторных ж ивотных м атериалом , полу ч енным от больного. Э тот м етод прим еняют для выделения ч истой ку льту ры воз бу дителя в тех слу ч аях, когда м икроорганизм ы не расту т или плохо ку льтивиру ются, когда м икробиологич еские м етоды не дают одноз нач но полож ительного рез у льтата, а такж е для диф ф еренц иац ии патогенных м икроорганизм ов и определения их виру лентности. Д иф ф еренц иац ия воз бу дителей основана на неодинаковой ч у вствительности раз ных лабораторных ж ивотных к определенным м икроорганизм ам . В настоящ ее врем я биопробы прим еняют только в слу ч ае крайней необходим ости, ч то определяется в перву ю оч ередь гу м анным отнош ением к ж ивотным , а такж е связ ано с повыш енным риском з араж ения персоналадиагностич еской лаборатории. И м м унох и м и че с ки е м е т оды ди агнос т и ки : (м е т оды обнаруж е ни я ант и ге нов возбуди т е ля в м ат е ри але от больного) М е т о д иммуно флюо ре с це нции (ИФ ). Д ает воз м ож ность обнару ж ить в м атериале от больного антигены м икроба с пом ощ ью спец иф ич еских антител, м еч енных ф люорохром ам и. Э тот м етод поз воляет выявлять иидентиф иц ировать по антигенной стру кту ре воз бу дителей в м атериале, содерж ащ ем раз нообраз ну ю м икроф лору (наприм ер, в испраж нениях), а такж е обнару ж ивать виру сные антигены в з араж енных клетках. В настоящ ее врем я им м у ноф люоресц ентный м етод ш ироко прим еняют для обнару ж ения раз нообраз ных м икроорганизм ов в патологич еском м атериале. Иммуно эле кт ро нна я микро с ко пия (ИЭМ ). П оз воляет з нач ительно повысить ч у вствительность и спец иф ич ность виру соскопич еского м етода. И сследу ем ый м атериал, содерж ащ ий свободные виру сные ч астиц ы, обрабатывают спец иф ич еским и антителам и. О браз овавш иеся им м у нные ком плексы осаж дают

8

высокоскоростным ц ентриф у гированием и агрегаты виру сных ч астиц выявляют с пом ощ ью электронной м икроскопии. Су щ еству ют такж е твердоф аз ные м етоды И Э М : спец иф ич еские антитела ф иксиру ют на спец иальных сетках для электронной м икроскопии, которые з атем обрабатывают исследу ем ым м атериалом . В иру сные ч астиц ы спец иф ич ески связ ываются с антителам и, после ч его их выявляют с пом ощ ью электронной м икроскопии. В ряде слу ч аев прим еняют антитела, м еч енные ч астиц ам из олота. Другие с е ро ло гиче с кие ре а кции. Растворим ые антигены раз лич ных воз бу дителей м огу т быть обнару ж ены в раз лич ных биологич еских ж идкостях больного с пом ощ ью серологич еских реакц ий. Н аиболее ч асто прим еняют им м у ноф ерм ентный (И Ф А ) ирадиоим м у нный (РИ А ) анализ в связ ис их высокой ч у вствительностью, реж е использ у ют м етоды прец ипитац ии в геле и непрям ой агглютинац ии. Би ох и м и че с ки е и м оле кулярно-би ологи че с ки е м е т оды ди агнос т и ки М е т о д га зо жидко с т но й хро ма т о гра фии (ГЖ Х). П оз воляет раз делять слож ные см еси органич еских соединений. М етод использ у ют для обнару ж ения проду ктов ж изнедеятельности м икроорганизм ов в исследу ем ом м атериале. П ринц ип м етода основан на раз лич ной скорости движ ения соединений, растворенных в инертном газ е (подвиж ной ф аз е), ч ерез раз огрету ю колонку , з аполненну ю ж идким исм олам и(неподвиж ная ф аз а). Н авыходе колонкиим еется детектор, регистриру ющ ий прису тствие соединения. И дентиф икац ию вещ еств производят пу тем сравнения со стандартам и. М е т о ды о бна руже ния нукл е ино в ы х кис ло т во збудит е л я . Н у клеиновые кислоты (Н К ) воз бу дителя м ож но обнару ж ить в исследу ем ом м атериале от больного с пом ощ ью м етодов гибридизац ии Н К (Д Н К -з ондов) и полим ераз ной ц епной реакц ии - П Ц Р. Э ти м етоды прим еняют преим у щ ественно для обнару ж ения плохо- или неку льтивиру ем ых воз бу дителей, прису тству ющ их в м атериале в м алых колич ествах (В И Ч , виру с гепатита В , М .tuberculosus идр.) в связ и с их высокой ч у вствительностью: м етод ну клеиновых "з ондов" поз воляет -10 обнару ж ивать Н К воз бу дителя в конц ентрац ии 10 г/м л; П Ц Р теоретич ески поз воляет обнару ж ить единич ные копии Н К . М етод "з ондов" является высокоспец иф ич ным . П рииспольз ованииП Ц Р су щ еству ет высокая вероятность полу ч ения лож нополож ительной реакц ии, ч то требу ет квалиф иц ированной интерпретац ии полу ч енных рез у льтатов. Н еобходим о такж е пом нить о воз м ож ности контам инац ии м атериала посторонним и Н К . П Ц Р рац ионально использ овать в кач естве экспресс-м етода для постановки предварительного диагноз а, ну ж дающ егося в обяз ательном подтверж дениис пом ощ ью дру гих более достоверныхдиагностич еских исследований. Се роди агнос т и ка и алле ргоди агнос т и ка С е ро диа гно с т ика . М етод основан на обнару ж ении антител в сыворотке кровибольного иопределениидинам икиих нарастания в ходе з аболевания. Д ля серодиагностики прим еняют раз лич ные им м у нологич еские реакц ии (агглютинац ии, связ ывания ком плем ента, непрям ой гем агглютинац ии и др.). В

9

кач естве стандартных антигенов использ у ют ж ивые ку льту ры м икроорганизм ов или диагностику м ы - у битые вз веси м икроорганизм ов или экстракты из них, полу ч енные хим ич еским пу тем . Серодиагностич еские исследования ч асто проводят и для эпидем иологич еского анализаинф екц ионной з аболеваем ости, атакж е для оц енки эф ф ективностивакц инопроф илактики. П ри серодиагностич еских исследованиях необходим о у ч итывать диагностич еский титр обнару ж енных антител, т.е. такое раз ведение исследу ем ой сыворотки, нач иная с которого полож ительная реакц ия им еет диагностич еское з нач ение. Более высоку ю инф орм ативность дают серологич еские исследования парных сывороток крови больного, вз ятых в нач але болез ни и ч ерез раз ные пром еж у тки врем ени в ходе ее раз вития. Д иагностич еское з нач ение им еет нарастание титрав 4 раз аиболее в динам ике з аболевания. Ал л е рго диа гно с т ика . К ож но-аллергич еские пробы прим еняют для выявления гиперч у вствительностик раз лич ного родаантигенам (аллергенам ) при диагностике ряда инф екц ионных з аболеваний (ту берку лез , бру ц еллез , ту лярем ия идр.), атакж е атопий идру гих неинф екц ионныхаллергич еских состояний. Правила биологическ ой безопасности при работеспатогенным и м ик робам и В з ависим ости от степени патогенности и контагиоз ности воз бу дителей принято выделять ч етыре у ровня биологич еской опасности и соответству ющ их м ероприятий, необходим ыхдля преду преж дения з араж ения в лаборатории. П ервый у ровень (работас непатогенным им икроорганизм ам и). Н еобходим о соблюдение стандартных правил. В торой у ровень (работас низковиру лентным им икроорганизм ам и). К ч ислу дополнительных правил и м ероприятий относятся использ ование лабораторной одеж ды из ащ итных перч аток; обяз ательное обез з араж ивание всех з агряз ненных отходов; огранич ение досту па в лабораторию. Д ля предотвращ ения попадания м икробов в воз ду х рабоч его пом ещ ения выполнение м еханич еских м анипу ляц ий, сопряж енных с высокой вероятностью распыления м икроорганизм ов, необходим о осу щ ествлять в спец иализированных з акрытых легкодез инф иц иру ем ых настольныхбоксах. Т ретий у ровень (работа с высоковиру лентным и м икроорганизм ам и). К ч ислу дополнительных правил и м ероприятий относятся использ ование спец иальной з ащ итной лабораторной одеж ды; контроль досту па в лабораторию. В се м анипу ляц ии с патологич еским м атериалом необходим о осу щ ествлять в спец иализированныхбоксах. Ч етвертый у ровень (работа с воз бу дителям и особо опасных инф екц ий (О О И ). Раз реш ена исключ ительно в спец иализированных реж им ных лабораториях, им еющ их обору дование, необходим ое для эф ф ективной з ащ иты от патогенных м икробов, их контроля и у нич тож ения. К ч ислу дополнительных правил и м ероприятий относятся налич ие отдельных пом ещ ений для см ены лабораторной одеж ды и ду ш евых, обяз ательное обез з араж ивание всех отходов лаборатории. В се м анипу ляц ии с патологич еским м атериалом необходим о

10

осу щ ествлять в спец иализированных настольных систем ам истерилизац иивоз ду ха.

боксах,

снабж енных

О ценк а резу льтатовк линик о-д иагностическ их исслед ований О бна руже ние па т о ге нны х микро о рга низмо в, являющ ихся воз бу дителям и з аболеваний (наприм ер, м икобактерии ту берку лез а, гонококки и др.), им еет реш ающ ее з нач ение для постановкидиагноз а. Вы я в л е ние ро ли ус л о вно -па т о ге нны х микро о рга низмо в в этиологии и патогенез е з аболеваний долж но быть основано на строгой аргу м ентац ии. О бяз ательным у словием является клинич еское, эпидем иологич еское, м икробиологич еское исерологич еское исключ ение воз бу дителей инф екц ионных болез ней (наприм ер, воз бу дителей киш еч ных инф екц ий, венерич еских болез ней и др.). Д ля оц енкиролиу словно-патогенных м икроорганизм ов в патологиим огу т быть использ ованы следу ющ ие критерии. 1. В ыделение м икроорганизм ов из крови, спинном оз говой ж идкостиилидру гих ж идкостей организм а, которые в норм е у з доровыхлюдей являются стерильным и. 2. О бнару ж ение в исследу ем ом м атериале, особенно при дисбактериоз ах, у словно-патогенных м икроорганизм ов в достаточ но больш их колич ествах 5 7 (наприм ер, 10 -10 м икробных клетокв 1 м л). Д ля этого проводят колич ественное определение м икроорганизм ов по ч ислу колониеобраз у ющ их единиц (К О Е ) в 1 г или 1 м л испыту ем ого образ ц а. Э ти колич ественные показ атели м огу т варьировать в з ависим ости от вида м икроорганизм ов, типа исследу ем ого м атериала, характераистадииз аболевания. 3. П овторное, м ногократное (в теч ение су токилич ерез су тки) выделение одногои того ж е м икроорганизм аиз одного итого ж е м атериалаот больного (наприм ер, из кровиприсепсисе ит.д.). 4. О бнару ж ение идентич ных у словно-патогенных м икроорганизм ов в раз ных образ ц ах м атериала (наприм ер, припищ евых токсикоинф екц иях - в пром ывных водах ж елу дка, рвотныхм ассах, испраж нениях, пищ евыхпроду ктах). 5. Н арастание титраантител в 4 раз аиболее в парных сыворотках кровибольного в отнош енииу словно-патогенного м икроорганизм а, который предполагается как воз бу дитель данного патологич еского проц есса. В ряде слу ч аев реком енду ется использ овать в кач естве антигенов ау тош там м ы м икроорганизм ов, выделенные от больных. 6. П олож ительные кож но-аллергич еские реакц ии у больных с аллергенам и, приготовленным ииз у словно-патогенных м икроорганизм ов. 7. В слу ч ае вну трибольнич ных (ноз оком иальных) инф екц ий - выделение идентич ныхку льту р м икроорганизм ов от гру ппы больных. 8. Совпадение данных лабораторного определения ч у вствительности м икроорганизм ов к антибиотикам с эф ф ективностью антим икробной терапии в клинич еских у словиях, подтверж даем ое у лу ч ш ением состояния больного и у м еньш ением колич естваилиэлим инац ией соответству ющ их м икроорганизм ов. У словно-патогенные м икроорганизм ы (синоним : оппорту нистич еские) представляют собой больш у ю гру ппу м икроорганизм ов, з аним ающ их раз лич ное систем атич еское полож ение. О ни встреч аются среди аэробных и анаэробных

11

бактерий, грибов, простейш их. В клинич еской м икробиологии наиболее ч асто встреч аются оппорту нистич еские м икроорганизм ы, относящ иеся к родам Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Proteus, Enterobacter, Citrobacter, Pseudomonas, Candida идр. О ф орм лениерезу льтатовлабораторных м ик робиологическ их исслед ований Рез у льтаты лабораторных исследований оф орм ляют на спец иальных бланках, которые передают леч ащ ем у врач у . 1. В ответе преж де всего у каз ывают налич ие патогенных, а такж е у словнопатогенных м икроорганизм ов, обнару ж енных при м икробиологич еском исследовании. Сообщ ают такж е данные лабораторного определения ч у вствительностим икроорганизм ов кантибиотикам . 2. П риобнару ж ении м икробных ассоц иац ий переч исляют все м икроорганизм ы, у каз ывают дом иниру ющ ие виды иколич ественные показ атели. 3. В соответствиис правилам им еж ду народной ном енклату ры в ответах приводят видовые наз вания м икроорганизм ов, наприм ер: Staphylococcus aureus ит.д. 4. С ц елью у скорения лабораторных исследований в ряде слу ч аев привыделении у словно-патогенных м икроорганизм ов вполне допу стим о в ответе огранич иться у каз анием только родовой принадлеж ности обнару ж енных м икроорганизм ов, наприм ер, Р го teus spp., Candida spp. ит.д. В О ЗБУД И Т ЕЛ И Г Н О Й Н О -В О С ПА Л И Т ЕЛ ЬН Ы Х И Р А Н ЕВ Ы Х И Н Ф ЕК ЦИ Й Раневые и нераневые гнойные инф екц ии ч асто встреч аются в хиру ргич еской, аку ш ерско-гинекологич еской, терапевтич еской и дру гих клиниках. Н ередко они носят характер вну трибольнич ной инф екц ии. В оз бу дителям и инф екц ии являются раз лич ные бактерии, которые относятся к раз ным сем ействам , родам и видам . Бактерии, переч исленные в таблиц е 1, выз ывают гнойно-воспалительные проц ессы раз лич ной локализац ии, в том ч исле ангины, ф у ру нку лы, ц иститы и пиелиты, плевриты, перикардиты, сепсис и др. М ногие из этих воз бу дителей встреч аются в норм альной м икроф лоре ч еловека и проявляют свою патогенность толькопринару ш ениинорм альной экологии. Н екоторые из бактерий являются воз бу дителям итаких ф орм з аболеваний, которые не сопровож даются выраж енным гнойно-воспалительный проц ессом . Н априм ер, стрептококкивыз ывают скарлатину , рож истое воспаление; С . tetani – столбняк. Стаф илококки, стрептококки, протей, киш еч ная палоч ка ианаэробные бактериинередко выз ывают см еш анну ю инф екц ию в раз нообраз ных соч етаниях какм еж ду собой, такис дру гим им икроорганизм ам и– виру сам и, грибам и. Л абораторная д иагностик а гной но-воспалительных заболеваний , вызванных аэ робным и бак териям и Гнойну ю инф екц ию ч ащ е всего выз ывают стаф илококки (сем . М iс rо со с с а с е а е ), которые относятся квиду S. aureus, реж е квидам S. epidermidis и

12

S. saprophyticus; стрептококки (сем . Streptoс о с с а с е а е ) Streptococcus pyogenes, реж е S. pneumoniae. Н аряду с ним и важ ная роль принадлеж ит Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus spp. и дру гим у словнопатогенным м икроорганизм ам . К ром е того, пристом атологич еских з аболеваниях встреч аются Streptococcus sanguis, S. mutans, S. mitis идр. Т аблица 1. В оз бу дителираневой инф екц ииигнойно-воспалительных проц ессов А эробные бактерии А наэробные бактерии Г рам полож ительныебак терии С порообразу ю щие Chryseobacterium indologenes грам полож ительныеанаэ робы Chryseobacterium meningosepticum Clostridium perfringenes Enterococcus faecalis и дру гие виды C. oedermatiens и дру гие воз бу дители энтерококков раневой анаэробной инф екц ии(газ овой Staphylococcus aureus и дру гие виды гангрены) стаф илококков С . tetani – воз бу дитель столбняка Streptococcus pyogenes S. faecalis Н еспорообразу ю щие S. agalactiae грам полож ительныеанаэ робы Peptococcus spp Peptostreptococcus spp. Г рам отрицательныебак терии Citrobacter koseri Propionibacterium acnes Enterobacter spp. Escherichia coli Н еспорообразу ю щие Haemophilus influenzae грам отрицательныеанаэ робы Klebsiella spp. Bacteroides spp. Moraxella catarrhalis Prevotella spp. Proteus spp. Porphiromonas spp. Pseudomonas aeruginosa Fusobacterium spp. Salmonella enterica Veilonella spp. З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы ЗА Н Я Т И Е 1 М ик робиологическ ое исслед ование гноя при под озрении на стаф илок ок к ову ю или стрепток ок к ову ю инф ек цию . М атериал - гной из раны (раневое отделяем ое). Д ля выявления источ ника стаф илококковой вну трибольнич ной инф екц ииисследу ют м атериал, вз ятый там поном из з ева исо слизистой оболоч ки носа з доровых людей: больнич ного персонала, а такж е работников детских у ч реж дений. 1. Бактериоскопич еское исследование: приготовить м аз кииз ч истых ку льту р воз бу дителей гнойных инф екц ий, атакж е из гноя ислизистого отделяем ого з ева. О красить их по Грам у , м икроскопировать и з арисовать. Сделать з аключ ение инам етить план дальнейш его анализа. 2. О з наком иться с питательным и средам и, прим еняем ым и при м икробиологич еской диагностике гнойных и раневых инф екц ий. У каз ать наз нач ение отдельныхпитательныхсред.

13

3. Бактериологич еское исследование: у ч есть рез у льтаты готовых посевов и м аз ков из слизистого отделяем ого з ева на ч аш ки с кровяным агаром : а) описать колониииотм етить налич ие илиотсу тствие гем олиза; б) приготовить м аз ки из колоний, окрасить их по Грам у и м икроскопировать; в) пересеять колонию стаф илококка в пробирку со скош енным питательным агаром и колонию стрептококка - на скош енный кровяной агар исахарный бу льон для полу ч ения соответству ющ их ч истыхку льту р. ЗА Н Я Т И Е 2 1. П родолж ение бактериологич еского исследования гноя и м аз ков из з ева и носабактерионосителей: а) отм етить характер роста ку льту ры (налич ие з олотистого пигм ента) в пробирке с питательным агаром . Сделать м аз ок, окрасить по Грам у и м икроскопировать; б) отм етить налич ие или отсу тствие гем олиза на кровяном агаре и пом у тнение илиосадок на сахарном бу льоне. Сделать м аз ок, окрасить по Грам у им икроскопировать. 2. В слу ч ае выделения з олотистого стаф илококка: а) определить его способность проду ц ировать плаз м окоагу лаз у , лец итиназ у ; б) у становить ф аготипы стаф илококков, выделенных из раз ных источ ников - больныхибактерионосителей поготовым пробам . 3. О тм етить по готовым посевам ч у вствительность выделенных стаф илококков кантибиотикам . 4. Д ать кратку ю характеристику дем онстриру ем ым антим икробным , диагностич еским илеч ебно-проф илактич еским препаратам . Сделать оконч ательное з аключ ение на основании анализа собственных, дем онстрац ионных и полу ч енных из лаборатории данных о видах выделенных ку льту р стаф илококкаистрептококкаиоб их патогенных свойствах. О пределить источ ник госпитальной инф екц ии на основании ф аготипов, выделенных от больныхиносителей стаф илококковой инф екц ии. М е т о диче с кие ука за ния М а т е риа л дл я ис с л е до в а ния : гной, экссу дат, раневое отделяем ое, перевяз оч ный м атериал, м аз ки слизи из носоглотки и з ева, кровь - при подоз рениинасепсис. М ик робиологическ ая д иагностик а стаф илок ок к овых инф ек ций Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е (схем а1 ). И з исследу ем ого м атериала (з а исключ ением крови) готовят м аз ки для первич ной бактериоскопии, окраш ивают по Грам у и м икроскопиру ют. Н алич ие в препаратах грам полож ительных гроз девидных кокков, располагающ ихся в виде скоплений, поз воляет поставить предварительный диагноз стаф илококковой инф екц ии.

14

и с с ле довани е . И сследу ем ый м атериал Бакт е ри ологи че с кое з асевают петлей на ч аш ки с кровяным и ж елточ но-солевым агаром (Ж СА ) для полу ч ения изолированных колоний. П осевы инку биру ют при 37 °С в теч ение су ток. Н а следу ющ ий день исследу ют выросш ие колонии на обеих средах. Н а кровяном агаре отм еч ают налич ие илиотсу тствие гем олиза. Н а Ж СА S. aureus образ у ет з олотистые кру глые выпу клые непроз рач ные колонии. В окру г колоний стаф илококков, обладающ их лец итиназ ной активностью, образ у ются з оны пом у тнения с перлам у тровым оттенком . Д ля оконч ательного у становления вида стаф илококка 2 - 3 колониипересевают в пробиркисо скош енным питательным агаром для полу ч ения ч истых ку льту р с последу ющ им определением их диф ф еренц иальныхпризнаков (табл. 2). Т аблица 2. Д иф ф еренц иальные признакистаф илококков П ризнак В ид S. aureus S. epidermidis О браз ование: плаз м окоагу лаз ы + лец итиназ ы + + α-токсина Ф ерм ентац ия: глюкоз ы + + м аннитав анаэробных у словиях + Ч у вствительность кновобиоц ину S S

S. saprophyticus + R

У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) - налич ие признака; (-) - отсу тствие признака; (S) ч у вствительный; (R) - рез истентный.

П о с т а но в ка ре а кции на пл а змо ко а гула зу. Раз веденну ю в 2 раз а плаз м у крови раз ливают по 0,4 м л в пробирки, вносят ту да по одной петле каж дой исследу ем ой ку льту ры стаф илококкаипом ещ ают в терм остат при37 °С. Ч ерез 2, 4 и24 ч отм еч ают рез у льтаты опыта. П риналич ииплаз м окоагу лаз ы образ у ется сгу сток. В некоторых слу ч аях наряду с плаз м окоагу лаз ой и лец итиназ ой определяют ф ибринолизин, гиалу ронидаз у , Д Н К аз у , а такж е ставят дерм онекротич еску ю пробу накролике. Д ля у становления источ ника госпитальной инф екц ии выделяют ч истые ку льту ры стаф илококкаот больных ибактерионосителей, после ч его проводят их ф аготипирование с пом ощ ью набора типовых стаф илоф агов. Ф аги раз водят до титра, у каз анного на этикетке. К аж ду ю из исследу ем ых ку льту р з асевают на питательный агар в ч аш ку П етри газ оном , высу ш ивают, а з атем петлей каплю соответству ющ его ф агананосят наквадраты (по ч ислу ф агов, входящ их в набор), предварительно раз м еч енные карандаш ом на дне ч аш ки П етри. П осевы инку биру ют при37 °С. Рез у льтаты оц енивают на следу ющ ий день по налич ию лизиса ку льту ры. П роводят определение ч у вствительности стаф илококка к антибиотикам .

С хем а 1. М ик робиологическ оеисслед ованиепри стаф илок ок к овых инф ек циях

15

16

Экс пре с с м е т оды ди агнос т и ки Иммуно химиче с кие ис с л е до ва ния основаны на обнару ж ении антигенов воз бу дителя в м атериале от больного с пом ощ ью ч у вствительных серологич еских реакц ий. Био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с ле до в а ния . И сследу ем ый м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью П Ц Р. М ик робиологическ ая д иагностик а стрепток ок к овых инф ек ций Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е (схем а 2). М аз ки для первич ной бактериоскопииготовят из патологич еского м атериала, окраш ивают по Грам у и м икроскопиру ют. П ри полож ительном рез у льтате обнару ж ивают ц епоч ки грам полож ительных кокков. Следу ет им еть в виду , ч то в патологич еском м атериале стрептококки редко образ у ют типич ные скопления, ч ащ е располагаются поодиноке илинебольш им игру ппам ипо2 – 3 бактерии. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . И сследу ем ый м атериал з асевают на кровяной агар в ч аш ку П етри. П осле инку бац ии при 37 °С в теч ение 24 ч отм еч ают характер колоний и налич ие вокру г них з он гем олиза. И з ч асти м атериала, вз ятого из колоний, готовят м аз ок, окраш ивают по Грам у и м икроскопиру ют. Д ля полу ч ения ч истой ку льту ры 1 - 3 подоз рительные колонии пересевают в пробиркисо скош енным кровяным агаром исахарным бу льоном . Н а кровяном агаре Streptococcus pyogenes образ у ет м елкие, велич иной с бу лавоч ну ю головку , м у тноватые кру глые колонии. В бу льоне стрептококк в отлич ие от стаф илококка дает придонно-пристеноч ный рост в виде хлопьев или з ерен, оставляя среду проз рач ной. П о характеру гем олиза на кровяном агаре стрептококки делятся на три гру ппы: 1) негем олитич еские; 2) α1-гем олитич еские, илиз еленящ ие, образ у ющ ие з еленовату ю з ону ч астич ного гем олиза; 3) β-гем олитич еские, образ у ющ ие вокру г колонииполностью проз рач ну ю з ону гем олиза. Заключ ительным этапом бактериологич еского исследования является идентиф икац ия выделенной ку льту ры по антигенным свойствам . П о данном у признаку все стрептококкиделят насерологич еские гру ппы (А , В , С, D ит.д.). Серогру ппу стрептококков определяют в реакц ии прец ипитац ии с полисахаридным прец ипитиногеном С, выделенным из исследу ем ой ку льту ры, и сывороткам и(обыч но 4 наиболее распространенные серогру ппы - А , В , С иD). Больш инство патогенных для ч еловека β-гем олитич еских стрептококков относится к серологич еской гру ппе А . П о содерж анию типоспец иф ич еских антигенов протеиновой природы β-гем олитич еские стрептококкиподраз деляются на серовары, из которых 47 относятся к гру ппе А . Серовары стрептококков определяют в реакц ииагглютинац ии. Раз верну тое серологич еское исследование и типирование стрептококков проводят главным образ ом для эпидем иологич еского обследования. В ыделенну ю ку льту ру стрептококка проверяют на ч у вствительность к антибиотикам м етодом дисков. П ри подоз рении на сепсис делают посевы из кровибольного.

С хем а 2. М ик робиологическ оеисслед ованиепри стрепток ок к овых инф ек циях

17

18

Экс пре с с м е т оды ди агнос т и ки Иммуно химиче с кие ис с л е до ва ния . П ри отдельных ноз ологич еских ф орм ах стрептококковой инф екц ии у станавливают налич ие спец иф ич еских антигенов в кровибольногос пом ощ ью РСК , реакц иипрец ипитац ииидр. Био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с ле до ва ния . И сследу ем ый м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью П Ц Р. В слу ч ае обнару ж ения соответству ющ их м олеку л м ож нопоставить предварительный диагноз . Се роди агнос т и ка. П ри отдельных ноз ологич еских ф орм ах стрептококковой инф екц ии у станавливают налич ие спец иф ич еских антигенов в крови больного с пом ощ ью РСК или реакц ии прец ипитац ии. А нтитела к О стрептолизину определяют главным образ ом для подтверж дения диагноз а ревм атизм а. Реакц ия основана на подавлении способности О -стрептолизина растворять эритроц иты приналич иив кровибольного соответству ющ их антител. Реакц ию ставят со стандартным су хим О -стрептолизином . М ик робиологическ ая д иагностик а гной но-воспалительных заболеваний , вызванных грам отрицательным и аэ робным и бак териям и Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е . И з исследу ем ого м атериала (гной, раневое отделяем ое, у ч асткиож оговой тканиидр.) готовят м аз ки, окраш ивают по Грам у и м икроскопиру ют. О бнару ж ение в м аз ках грам отриц ательных бактерий илидру гой м икроф лоры поз воляет сделать предварительное з аключ ение. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . Д ля выделения ку льту ры бактерий Р seudomonas aeruginosa (синегнойная палоч ка) исследу ем ый м атериал з асевают в ч аш ки П етри на питательный агар или на Ц П Х -агар, содерж ащ ий Nц итилпиридиний-хлорид (Ц П Х ), который у гнетает рост 24 видов м икроорганизм ов, воз м ож ных ассоц иатов псевдом онад в клинич еском м атериале. П осевы инку биру ют при37 °С в теч ение су ток. Синегнойная палоч ка образ у ет кру глые плоские слизистые колонии, окраш ивая среду характерным синез еленым пигм ентом . П рибактериоскопиинативных препаратов в «раз давленной» или«висяч ей» капле, приготовленных из колоний, обнару ж иваются подвиж ные и слегкаизогну тые палоч ки; в м аз ках, окраш енных по Грам у , - грам отриц ательные палоч ки. Ч истые ку льту ры Р . aeruginosa идентиф иц иру ют по биохим ич еским признакам иобраз ованию пигм ента. П атогенные ш там м ы Р . aeruginosa образ у ют белковые экз отоксины: гистотоксин, обладающ ий ц итотоксич еским свойством , и лейкоц идин, лизиру ющ ий лейкоц иты ч еловека. Э ти токсины м огу т быть обнару ж ены пу тем биопробы. Д ля эпидем иологич еского анализа госпитальных инф екц ий определяют серовары в реакц ииагглютинац ии, пиоц иновары иф аговары. Д ля выделения энтеробактерий исследу ем ый м атериал з асевают на одну из диф ф еренц иально-диагностич ескихсред, наприм ер насреду Э ндо. Д ля выделения бактерий родаР rо teus использ у ют м етод Ш у кевич а. Экс пре с с м е т оды ди агнос т и ки Иммуно химиче с кие ис с л е до ва ния . П атогенные ш там м ы Р . aeruginosa выделяют раз лич ные растворим ые белковые (экз отоксины и экз оф ерм енты) и

19

небелковые (экстрац еллюлярная слизь) антигены, которые м огу т быть обнару ж ены в м атериале от пац иента (из оч ага, в кровиили м оч е) с пом ощ ью ч у вствительных серологич ескихреакц ий. Био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с ле до ва ния . И сследу ем ый м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью полим ераз ной ц епной реакц ии (П Ц Р). В слу ч ае обнару ж ения соответству ющ их м олеку л м ож но поставить предварительный диагноз . М ик робиологическ иеисслед ования при сепсисе М а т е риа л дл я ис с л е до ва ния : м икробиологич еское исследование крови является веду щ им при лабораторной диагностике сепсиса. К ром е того, при септикопием иях исследу ют м атериал из первич ных ивторич ных м естных оч агов инф екц ии. К ровь беру т в период подъ ем а тем перату ры до нач ала антибиотикотерапиииз локтевой вены в колич естве не м енее 10 м л у вз рослых и5 м л у детей, таккакм икроорганизм ы находятся в кровив сравнительно небольш их колич ествах. П осевы делают у постелибольного в колбы с 50-100 м л питательной среды. Сравнительно больш ие объ ем ы питательной среды (в 10 раз превыш ающ ие колич ество крови) необходим ы для у странения бактериц идного действия сывороточ ных белков. В слу ч ае транспортировкикровикней добавляют антикоагу лянты: ц итрат илиоксалат натрия, декстран су льф ат, гепарин. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . Я вляется веду щ им при лабораторной диагностике сепсиса. П осевы производят наж идкие среды обогащ ения: сахарный бу льон идр.; приподоз рениинаанаэробну ю ф лору - натиогликолеву ю среду или среду К итта-Т ароц ц и и инку биру ют их при 37 °С в теч ение 10 дней при еж едневном контроле. В слу ч ае отсу тствия роста м икроорганизм ов дают отриц ательный ответ. П риналич иироста делают м аз ки, которые окраш ивают по Грам у . В ыделенну ю ч исту ю ку льту ру м икроорганизм ов идентиф иц иру ют и определяют ее ч у вствительность кантибиотикам . П ри оц енке рез у льтатов необходим о исходить из того, ч то сепсис является тяж елым общ им инф екц ионным з аболеванием , раз вивающ им ся в у словиях рез кого у гнетения всех основных м еханизм ов им м у нитета. В оз бу дителям и сепсисаявляются раз лич ные патогенные иу словно-патогенные м икроорганизм ы. О днократный посев крови при сепсисе не всегда приводит к выделению ку льту ры. Более инф орм ативным является трехкратный посев кровис су точ ным интервалом . Н а ф оне антибиотикотерапии кровь у больных для посева следу ет брать 5 - 6 раз . Д иагностическ ие, проф илак тическ иеи лечебныепрепараты Ст афи лококковы й анат окс и н (очи щ е нны й и адс орби рованны й). П олу ч ают из нативного анатоксина пу тем его осаж дения трихлору ксу сной кислотой с дополнительной оч исткой этиловым спиртом иадсорбц ией нагидрате оксидаалюм иния. О бладает высоким иим м у ногенным исвойствам и. П рим еняется для активной им м у низац иис ц елью проф илактикистаф илококковых инф екц ий и для леч ения стаф илококковых з аболеваний.

20

коагу лаз ополож ительных Ст афи лококковая вакци на. В з весь з олотистых стаф илококков, инактивированных нагреванием . П рим еняется с ц елью леч ения при длительно и вяло теку щ их стаф илококковых з аболеваниях. Ч ащ е использ у ют ау товакц ину . И м м уноглобули н че лове че с ки й прот и вос т афи лококковы й. Гам м аглобу линовая ф ракц ия сыворотки крови, содерж ащ ая стаф илококковый антитоксин. Готовят из ч еловеч еской крови, содерж ащ ей высокие титры антител, или крови доноров, им м у низированных стаф илококковым адсорбированным анатоксином . П рим еняется для спец иф ич еского леч ения при стаф илококковых з аболеваниях. Ст афи лококковы й(с т ре пт ококковы й) бакт е ри офаг (ж и дки й). Ф ильтрат ф аголизата стаф илококков (стрептококков). П рим еняется нару ж но, вну трикож но, вну трим ыш еч но для леч ения при стаф илококковых (стрептококковых) з аболеваниях. Ди агнос т и че с ки е с т афи лококковы е фаги . Н абор типоспец иф ич еских ф агов для ф аготипирования стаф илококков. О -с т ре пт оли зи н с ух ой. Л иоф ильно высу ш енный ф ильтрат бу льонной ку льту ры стрептококка - активного проду ц ента О -стрептолизина. П рим еняется для постановки серологич еских реакц ий - определения анти-О -стрептолизина в сывороткахкровибольных стрептококковым иинф екц иям и(ч ащ е ревм атизм ом ). Ант и би от и ки . Гра мо т рица т е льны е ба кт е рии - β-лактам ы, спектр действия которых сдвину т в сторону грам отриц ательных м икроорганизм ов, хлорам ф еникол, ам иногликоз иды, тетрац иклины, су льф анилам иды, ф торхинолоны идр. Гра мпо л о жит е л ьны е ба кт е рии- β-лактам ные антибиотики, ванком иц ин, тетрац иклины, ам иногликоз иды, м акролиды, линком иц ины, су льф анилам иды, ф торхинолоны идр. Л абораторная д иагностик а анаэ робных инф ек ций А наэробные и см еш анные (анаэробно-аэробные) инф екц ии представляют одну из сам ых з нач ительных категорий гнойно-воспалительных з аболеваний у ч еловека. О сновная м асса инф екц ий, протекающ их с у ч астием анаэробов, им еет, как правило, эндогенное происхож дение. В оз бу дители анаэробных инф екц ий: пептококки, петострептококки, бактериоды, ф у з обактерии, эу бактерии, клостридииидр., являются представителям инорм альной м икроф лоры ч еловека. Раз витию инф екц ии способству ют травм ы, ож оги, оперативное вм еш ательство, м естное нару ш ение кровообращ ения, стресс, голодание, переу том ление, хронич еские з аболевания, прим енение лекарственных препаратов: им м у нодепресантов, ц итостатиков, антибиотиков, глюкокортикоидов идр. О сновное з нач ение в лабораторной диагностике з аболеваний, выз ванных данной гру ппой м икроорганизм ов, им еет бактериологич еское исследование, проводим ое в строго анаэробных у словиях, так как даж е нез нач ительное колич ество кислородавоз ду харез ко торм оз ит раз м нож ение бактерий - анаэробов. Д ля соз дания анаэробных у словий использ у ют спец иальные м етоды вз ятия м атериала, элективные питательные среды и спец иальну ю аппарату ру для ку льтивирования анаэробов. Бактериоскопия дает воз м ож ность распоз нать

21

см еш анну ю инф екц ию и сделать предполож ение о ее воз бу дителях. Серодиагностика данных инф екц ий практич ески не проводится в связ и с тру дностью выбора антигенов и низким титром антител. М ногие анаэробные бактерии вырабатывают экз отоксины, поэтом у важ ное з нач ение в м икробиологич еской диагностике им еют биопробы налабораторныхж ивотных. З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. П риготовить м аз ки из гноя, окрасить их по Грам у и м икроскопировать. Сделать предварительное з аключ ение инам етить ходдальнейш его анализа. 2. Сделать оконч ательное з аключ ение о воз бу дителе или воз бу дителях раневой инф екц ии на основании данных, полу ч енных из бактериологич еской лаборатории. М е т о диче с кие ука за ния М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : гной, раневое отделяем ое, отеч ная ж идкость, ку соч ким ыш еч ной ткани, перевяз оч ный м атериал, кетгу т. К ровь – присепсисе. П риподоз рениина столбняк у ж енщ ин после родов илиаборта - выделения из м атки, у новорож денных - выделения из пу пка. Реком енду ется брать м атериал из раз ных у ч астков оч ага пораж ения, особенно из глу боких слоев. Д ля обеспеч ения бескислородных у словий вз ятие м атериала производят ш приц ем с хорош о притертым порш нем до полного его з аполнения и вытеснения воз ду ха. Затем ш приц надевают на иглу , вставленну ю ч ерез рез инову ю пробку в пробирку со см есью инертных газ ов (N2 + Н 2) иСO2, ивводят в нее исследу ем ый м атериал, который изу ч ают в м икробиологич еской лаборатории. И спольз у ют такж е раз лич ные спец иальные транспортные среды, в которые пом ещ ают м атериал, вз ятый у больных. М ик робиологическ ая д иагностик а гной но-воспалительных заболеваний , вызванных неспорообразу ю щим и анаэ робным и бак териям и В оз бу дителям игнойно-воспалительных проц ессов довольно ч асто являются неспорообраз у ющ ие анаэробные бактерии, принадлеж ащ ие к родам Bacteroides, Veillonella, Peptococcus,Peptostreptococcus. О нивыз ывают как м оноинф екц ии, так и см еш анные инф екц ии во всевоз м ож ных соч етаниях дру г с дру гом и с аэробным и бактериям и – Р seudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, E. coli, коккам и. Бакт е ри ологи че с кое и бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани я. П осевы производят в пробирку с предварительно прокипяч енной средой К итта-Т ароц ц ии в пробирку с полу ж идким тиогликолевым агаром и инку биру ют при 37 °С в теч ение 24-48 ч . П осле просм отравыросш ей ку льту ры делают м аз ки, окраш ивают их по Грам у и м икроскопиру ют. Бактериоскопия дает воз м ож ность у становить однородность или неоднородность ку льту ры, а по м орф ологии клеток и отнош ению к окраске по Грам у ориентировоч но отнести ее к определенном у роду . Д ля полу ч ения ч истой ку льту ры делают пересевы на сахарный кровяной агар в ч аш ки П етри, которые инку биру ют в анаэробных у словиях 3-4 су т до ф орм ирования изолированных колоний. П осле изу ч ения колоний их пересевают

22

на среду К итта-Т ароц ц и. И дентиф икац ию выделенной ч истой ку льту ры производят на основаниипрису щ их им диф ф еренц иальных признаков, которые определяют в техж е строгоанаэробных у словиях (табл. 3). Экс пре с с м е т оды ди агнос т и ки . А наэробные бактерии вырабатывают спец иф ич еские м етаболиты, включ ая лету ч ие ж ирные кислоты с короткой ц епью инелету ч ие органич еские кислоты. Д ля их обнару ж ения в м атериале использ у ют ГЖ Х . Т аблица 3. Д иф ф еренц иальные спорообраз у ющ их анаэробныхбактерий

признаки

неспорообраз у ющ их

и

Peptostreptococc us Veilonella

Bacteroides

Cl. perfringenes

Cl. novy

Cl. septicum

Cl. sordelli

Cl. histolyticum

К ороткие ц епоч ки кокков

М елкие палоч ки

К ру пные палоч ки

К ру пные палоч ки

Т онкие палоч ки

М елкие палоч ки

М елкие палоч ки

П одвиж ность Споры О краскапо Грам у Ф ерм ентац ия у глеводов Свертывание/ пептонизац ия м олока О браз ование H2S О браз ование индола Раз ж иж ение ж елатина В осстановление нитратов Гем олиз эритроц итов О браз ование токсина

Ц епоч ки кокков

Ф орм аи располож ение клеток

Peptococcus

П ризнак

О диноч ные кокки

Бактерии

+

+

-

-+ -

+ +

+ + +

+ + +

+ + +

+ + +

с

+

-

+

+

с

+

с

-

-

-

+

+

+

X

-

+

+

+

-

+

-+

-

-

-

X

X

-+

-

-

-+

-

-

-

-

-

-

-

-

-+

+

+

+

+

+

-+

-

+

+-

X

X

X

-

-

-+

-

-

+-

X

+

+

+

+

-

-

-

-

+

+

+

+

+

У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) – налич ие признака; (-) – отсу тствие признака; (X) – непостоянный признак; (- +) – отсу тствие признака у больш инства ш там м ов; (+ -) – налич ие признакау больш инстваш там м ов; (с) – слабая ф ерм ентац ия.

23

М ик робиологическ ая д иагностик а раневой анаэ робной к лострид иальной инф ек ции (газовая гангрена) В оз бу дителям иявляются бактериирода Clо stridium (схем а 3). Ч ащ е всего воз бу дителем газ овой гангрены является С l. perfringens. Зараж ение происходит при попадании в рану поч вы или пыли, з агряз ненной спорам и клостридий. В анаэробных у словиях (в глу бине раны) они прорастают в вегетативные клетки, проду ц иру ющ ие раз нообраз ные токсины, которые выз ывают распад и некротизац ию м ыш еч ной ткани. В этом проц ессе м огу т у ч аствовать стаф илококки, синегнойная палоч ка, протей и дру гие бактерии, в з нач ительной м ере ослож няющ ие теч ение з аболевания. Л абораторну ю диагностику проводят в дву х направлениях с ц елью обнару ж ения воз бу дителя в некротич еских тканях и экз отоксинав отеч ной ж идкости. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е . П роводится пу тем м икроскопии м аз ков, приготовленных из отеч ной ж идкости или некротизированной ткани. Н алич ие в препаратах кру пных (1-1,5 × 3-10 м км ) грам полож ительных палоч ек, ч асть из которых (С l. рerfringens) образ у ют капсу лу , поз воляет поставить предварительный диагноз . Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . И сследу ем ый м атериал вносят в несколько пробирок со средой К итта-Т ароц ц и, ж елез осу льф итным агаром (среда В ильсона-Блера) им олоком . Ч асть пробирок прогревают при80 °С в теч ение 30 м ин для у нич тож ения неспорообраз у ющ их бактерий. П осевы инку биру ют в обыч ном терм остате при37 °С. С l. рerfringens растет в глу бине среды. В м олоке у ж е ч ерез 3-4 ч после посева образ у ется гу бкообраз ный сгу сток, содерж ащ ий пу з ырьки газ а и отделивш у юся проз рач ну ю ж идкость. Н а следу ющ ие су тки на среде К итта-Т ароц ц и отм еч ается пом у тнение и газ ообраз ование, а на ж елез осу льф итном агаре несколько поз днее появляются ч ерные колонии в глу бине агарового столбика. Д ля полу ч ения ч истой ку льту ры делают пересевы на сахарный кровяной агар в ч аш ки П етри, которые инку биру ют в строго анаэробных у словиях при 37 °С в теч ение 3-4 дней. В ыросш ие колонии пересевают в пробирки со средой К итта-Т ароц ц и. И дентиф икац ию ч истой ку льту ры производят наоснованиипризнаков, переч исленных в табл.3. Экс пре с с м е т оды ди агнос т и ки Био про ба . Д ля определения токсигенности исследу ем у ю ку льту ру , выращ енну ю на среде К итта-Т ароц ц и, ц ентриф у гиру ют и надосадоч ну ю ж идкость вводят м орской свинке, которая при полож ительном рез у льтате погибает. В следствие того, ч то токсины раз ных видов клостридий раз лич аются по своим антигенным свойствам , их серологич еску ю идентиф икац ию проводят в реакц ии нейтрализац ии на лабораторных ж ивотных. С этой ц елью см есь исследу ем ого токсинас антитоксич еской сывороткой (С l. рerfringens илиС l. novy) вводят подкож но м орской свинке. В слу ч ае нейтрализац ии токсина ж ивотное остается ж ивым ; приотриц ательной реакц иим орская свинка погибает ч ерез 30 м ин – 4 ч после инъ екц ии.

С хем а 3. М ик робиологическ оеисслед ованиепри газовой гангрене

24

25

Иммуно химиче с кие ис с л е до ва ния . Д ля быстрого обнару ж ения токсина С l. рerfringens в раневом отделяем ом определяют его лец итиназ ну ю активность. П олож ительная реакц ия на лец итиназ у выявляется пом у тнением ж идкости в пробирке. П ри отриц ательной реакц ии, характеризу ющ ейся нейтрализац ией ф ерм ентасоответству ющ ей антисывороткой, ж идкость остается проз рач ной. М ик робиологическ ая д иагностик а столбняк а В оз бу дитель столбняка С 1. tetani проникает в организм ч еловека ч ерез повреж денные кож ные покровы притравм ах иранениях, у ж енщ ин ч ерез родовые пу типриродах иабортах, у новорож денныхч ерез пу поч ну ю рану . Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . М атериал з асевают в среду К иттаТ ароц ц и и инку биру ют в анаэробных у словиях при 37 °С в теч ение 3-4 су т, наблюдая придонный рост бактерий. Затем делают посевы на сахарный агар в ч аш киП етри, в столбик сахарного питательного агара в пробирке. П осевы такж е инку биру ют в анаэробных у словиях. Н а поверхностикровяного агара С 1. tetani образ у ет неж ные проз рач ные колонии, окру ж енные м алоз ам етной з оной гем олиза. Д ля полу ч ения ч истой ку льту ры подоз рительные колониипересевают в пробиркисо средой К итта-Т ароц ц иисохраняют их под слоем ваз елинового м асла или в эксикаторе, з аполненном см есью инертных газ ов. Д ля определения способностивыделенной ч истой ку льту ры к образ ованию столбняч ного токсина (токсигенности) использ у ют серологич еские реакц ии с антителам и к тетаноспаз м ину . Бактериологич еский м етод использ у ют в кач естве дополнительного м етода для подтверж дения диагноз а, поскольку он не дает своеврем енного рез у льтата. Экс пре с с м е т оды ди агнос т и ки Био про ба . П роводится для обнару ж ения столбняч ного токсина в исследу ем ом м атериале. С этой ц елью м атериал растирают в стерильной сту пке с песком , з аливают изотонич еским раствором хлорида натрия для экстрагирования токсина и ф ильтру ют ч ерез бу м аж ный ф ильтр. Ч асть ф ильтрата см еш ивают с антитоксич еской сывороткой и вну трим ыш еч но вводят белым м ыш ам (контрольная гру ппа), подопытным ж ивотным вводят один ф ильтрат. Ч ерез 1-2 су т у м ыш ей появляется ригидность м ыш ц хвоста и з адних конеч ностей. В рез у льтате рез кого сокращ ения хвостовых м ыш ц хвост подним ается в виде ду ги. Затем подопытные ж ивотные погибают. У ж ивотных в контрольной гру ппе признаки интоксикац ии отсу тству ют вследствие нейтрализац ии токсина антисывороткой. Д ля определения токсигенности выделенной ку льту ры белым м ыш ам вводят надосадоч ну ю ж идкость, полу ч енну ю при ц ентриф у гировании этой ку льту ры, выращ енной на ж идкой питательной среде. В настоящ ее врем я биопробапрактич ескине прим еняется. Иммуно химиче с кие ис с л е до в а ния . Т оксин в м атериале м ож ет быть обнару ж ен с пом ощ ью серологич еских реакц ий in vitro. М етод поз воляет полу ч ить ответ в теч ение нескольких ч асов и обеспеч ивает своеврем енну ю диагностику з аболевания.

26

Проф илак тическ ие и лечебные препараты Ант и т окс и че с ки е с ы ворот ки - ант и пе рфри нге нс , ант и эде м ат и е нс (ант и нови ), ант и с е пт и кум . В ыпу скаются в ж идком ису хом виде после оч истки и конц ентрац ии м етодом ф ерм ентативного гидролиза (диаф ерм -3) антитоксич еских сывороток, полу ч енных при им м у низац ии лош адей соответству ющ им ианатоксинам и. П рим еняются для экстренной проф илактикии спец иф ич еской терапиираневой анаэробной инф екц ии(газ овой гангрены). Адс орби рованны й с т олбнячны й анат окс и н. П олу ч ен пу тем обез вреж ивания ф орм алином столбняч ного токсинас последу ющ ей его оч исткой, конц ентрац ией и адсорбц ией на гидрате оксида алюм иния. В ходит в состав ассоц иированной коклюш но-диф терийно-столбняч ной вакц ины и дру гих препаратов. П рим еняется для активной им м у низац иипротив столбняка. Прот и вос т олбнячная с ы ворот ка. П олу ч ена из крови лош адей, гиперим м у низированных столбняч ным анатоксином . О ч ищ ена и конц ентрирована м етодом диаф ерм -3. А ктивность изм еряется в м еж ду народных единиц ах. П рим еняется для проф илактикиилеч ения столбняка. И м м уноглобули н че лове че с ки й прот и вос т олбнячны й. П олу ч ен из гам м аглобу линовой ф ракц ии крови людей-доноров, ревакц инированных оч ищ енным сорбированным столбняч ным анатоксином . П рим еняется для пассивной экстренной проф илактики столбняка в соч етании со столбняч ным анатоксином при повреж дениях кож ных покровов, а такж е для леч ения нач авш егося з аболевания. В О ЗБУД И Т ЕЛ И БА К Т ЕР И А Л ЬН Ы Х К И Ш ЕЧ Н Ы Х И Н Ф ЕК ЦИ Й К иш еч ные инф екц ии выз ывают: а) энтеробактерии родов Escherichia, Salmonella, Shigella и др.; б) холерные вибрионы; в) анаэробные грам отриц ательные неспоровые бактерии Ва с teroides и Veilonella. П ищ евые отравления (токсикоинф екц иииинтоксикац ии) выз ывают сальм онеллы, протеии м икроорганизм ы, проду ц иру ющ ие белковые токсины – Staphilococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum. О бнару ж ение воз бу дителей киш еч ных инф екц ий и пищ евых отравлений им еет больш ое диагностич еское иэпидем иологич еское з нач ение. О но поз воляет подтвердить клинич еский диагноз . Л абораторная д иагностик а э ш ерихиозови д изентерии З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. М икроскопировать и з арисовать м аз ки из ч истых ку льту р воз бу дителей киш еч ныхинф екц ий. 2. Бактериологич еская диагностикаэш ерихиоз ов: а) выбрать м атериал для исследования; б) у ч есть рез у льтаты первич ного посеваисследу ем ого м атериаланасреду Э ндо. О писать и з арисовать колонии, выросш ие на среде Э ндо, и обосновать выбор подоз рительных колоний для дальнейш его исследования;

27

в) провести серологич еску ю идентиф икац ию ч истой ку льту ры, полу ч енной из подоз рительных колоний, в ориентировоч ной реакц ии агглютинац ии на стекле с агглютиниру ющ им и О В -коли-сывороткам и (серотипирование). Сделать выводинам етить план дальнейш егоанализа. 3. Бактериологич еская диагностикадизентерии: а) выбрать м атериал для исследования; б) у ч есть рез у льтаты первич ного посеваисследу ем ого м атериаланасреду Э ндо. О писать и з арисовать колонии, выросш ие на среде Э ндо, и обосновать выбор подоз рительных колоний для дальнейш его исследования; в) у ч есть рез у льтаты пересеваподоз рительных колоний насреду Ресселя; г) провестиидентиф икац ию ч истой ку льту ры: • побиохим ич еским свойствам , • по антигенным свойствам в ориентировоч ной реакц ииагглютинац иина стекле с агглютиниру ющ им и сывороткам и для идентиф икац ии ш игелл. Сделать вывод инам етить план дополнительныхисследований. 4. О з наком иться с диагностич еским и и леч ебно-проф илактич еским и препаратам и. М е т о диче с кие ука за ния М а т е риа л дл я ис с л е до ва ния : ф екалии, ректальные м аз ки, соскобы со слизистой оболоч ки. М ик робиологическ ая д иагностик а эш ерихиозов Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е (схем а 4). Я вляется веду щ им в диагностике эш ерихиоз ов. Ф екалии з асевают на ч аш ки со средой Э ндо для полу ч ения изолированных колоний. П атогенные E. coli по основным биологич еским свойствам (м орф ологии, ку льту ральным и биохим ич еским признакам ) не отлич аются от непатогенных эш ерихий - представителей норм альной м икроф лоры киш еч ника. Д ля отбора подоз рительных колоний прим еняют м етод серотипирования. М атериал из лактоз ополож ительных колоний использ у ют для постановки реакц ии агглютинац ии на стекле со см есью О В сывороток, содерж ащ их антитела против наиболее распространенных сероваров патогенных эш ерихий. О быч но проверяют на агглютинабельность не м енее 10 колоний с каж дой ч аш ки. П ри полож ительном рез у льтате ставят реакц ию с м оноспец иф ич еским исывороткам и: О 26:В 6, О 55:В 5, О 111:В 4, О 124: В 17 идр., после ч его делают предварительное з аключ ение. Затем пересевают несколько агглютинабельных колоний на скош енный питательный агар для полу ч ения ч истых ку льту р. Н а 3-й день проверяют агглютинабельность ч истых ку льту р в реакц ии на стекле с О В -сывороткам и. П ри полож ительном рез у льтате ставят раз верну ту ю реакц ию агглютинац иис соответству ющ ей О В -сывороткой. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки : иммуно химиче с кие , био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с л е до ва ния . П ри м олеку лярно-биологич еских исследованиях м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью П Ц Р.

С хем а 4. Б ак териологическ оеисслед ованиепри э ш ерихиозах

28

29

М ик робиологическ ая д иагностик а д изентерии Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е (схем а 5). Ф екалиибольного з асевают на диф ф еренц иально-диагностич еские среды (агар Э ндо, П лоскирева идр.). П ри налич ии в исследу ем ых испраж нениях гнойных или слизисто-кровянистых ком оч ков их выбирают петлей, пром ывают в изотонич еском растворе хлорида натрия и наносят на поверхность питательной среды, после ч его растирают ш пателем . Н а 2-й день лактоз оотриц ательные (проз рач ные бесц ветные) колонии пересевают на среду Ресселя или на короткий "пестрый ряд" с лактоз ой и глюкоз ой. С ре да Р е с с е л я : питательный агар, 1 % раствор лактоз ы, 0,1 % раствор глюкоз ы и индикатор бром тим оловый синий. Среду готовят таким образ ом , ч тобы внизу она была в виде столбика, а верхняя ч асть им ела скош енну ю поверхность. И сследу ем у ю ку льту ру з асевают у колом в столбикинаповерхность среды. П риф ерм ентац ииу глеводов происходит изм енение ц вета среды (ж елтая окраска); раз рывы столбикасвидетельству ют о газ ообраз овании. И з м енение ц вета во всем объ ем е среды наблюдается приф ерм ентац иилактоз ы, только столбика приф ерм ентац ииглюкоз ы, так как содерж ание ее в среде в 10 раз м еньш е, ч ем лактоз ы. В м есто среды Ресселя м ож но использ овать трехсахарну ю среду (в ее состав входят глюкоз а, лактоз а, сахароз а, м оч евина, некоторые солиииндикатор ф еноловый красный) или дру гие диф ф еренц иально-диагностич еские среды, поз воляющ ие раз лич ать бактерии по способности ф ерм ентировать лактоз у и глюкоз у . О ставш у юся ч асть колоний использ у ют для постановки ориентировоч ной реакц ии агглютинац ии на стекле со см есью дизентерийных сывороток и см есью сывороток против сальм онелл (для исключ ения брюш ного тиф а или сальм онеллез а). О конч ательное з аключ ение дают на 4-й день по рез у льтатам ф ерм ентативных тестов (табл. 4) и реакц ии агглютинац ии. В ыделенну ю ч исту ю ку льту ру использ у ют для определения ч у вствительности воз бу дителя кантим икробным препаратам .

S. dysenteriae S. flexneri S. boydii S. sonnei

-

[+]

+ + +

[+]

К силоз ы

Д у льц ита

М аннита

Л актоз ы

Глюкоз ы с газ ообраз ованием

Т аблица 4. Биохим ич еские признакибактерий родаShigella О браз оФ ерм ентац ия вание Гру ппа индола

В В

В В В -

Д екарбоксилирование орнитина

+

У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) - полож ительная реакц ия; (-) - отриц ательная реакц ия; [+] поз дняя реакц ия; В - вариабельная реакц ия.

С хем а 5. М ик робиологическ оеисслед ованиепри д изентерии

30

31

Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки . П ри биохим ич еских и м олеку лярнобиологич еских исследованиях м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью П Ц Р. Се роди агнос т и ка. П рим еняют для ретроспективного обоснования диагноз а дизентерии при стертых и хронич еских ф орм ах. Ставят раз верну ту ю реакц ию агглютинац ии по типу реакц ии В идаля и РП ГА с эритроц итарным и диагностику м ам иФ лекснера иЗонне. Д иагностич еским титром придизентерии, выз ванной ш игеллам иФ лекснера, сч итают раз ведение 1:200, аш игеллам иЗонне 1:100. Д иагностическ ие, проф илак тическ иеи лечебныепрепараты Агглют и ни рующ и е О В -с ы ворот ки прот и в пат оге нны х ки ш е чны х палоче к: О В -коли-сыворотка О 26:В 6, О В -коли-сыворотка О 111:В 4, О В -колисыворотка О 55:В 5 и др. П олу ч ают пу тем им м у низац ии кроликов вз весью эш ерихий соответству ющ его серовара иприм еняют в реакц ииагглютинац иидля идентиф икац иипатогенных эш ерихий. Адс орби рованны е агглют и ни рующ и е с ы ворот ки для и де нт и фи каци и ш и ге лл. Раз лич ают гру пповые и м оновалентные сыворотки. П олу ч ают пу тем им м у низац ии кроликов определенным и видам и и сероварам и S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii иS. sonnei с последу ющ ей адсорбц ией м еж гру пповых идру гих лиш нихантител. Поли вале нт ны й ди зе нт е ри йны й бакт е ри офаг. Содерж ит ф аги, лизиру ющ ие ш игеллы Ф лекснера и Зонне. В ыпу скается в виде таблеток с кислотоу стойч ивым покрытием . П рим еняют для экстренной проф илактики и леч ения. Ди зе нт е ри йная вакци на с пи рт овая, с ух ая. Содерж ит ш игеллы Ф лекснера иЗонне. П рим еняют для леч ения хронич ескихф орм дизентерии. Пре парат ы эуби от и ков - коли -бакт е ри н, би фи дум бакт е ри н, би фи кол, лакт обакт е ри н. П рим еняют с леч ебно-проф илактич еским иц елям и. Ант и би от и ки : полу синтетич еские пениц иллины, ц еф алоспорины 2-4-го поколений, хлорам ф еникол, тетрац иклины, ф торхинолины, су льф анилам иды, полим иксин идр. Л абораторная д иагностик а брю ш ного тиф а, паратиф ов и сальм онелезов. Д исбак териоз Совре м е нная клас с и фи каци я бакт е ри й рода Salmonella. Род Salmonella включ ает 2 вида: S. е пtе riс а (2307 сероваров) иS. bongori (17 сероваров). В ид S. е пtе riс а включ ает 5 подвидов: е пtе riс а (I), sа 1а т а е (II), а rizо па е (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV), indica (V), которые выделены на основании м олеку лярногенетич еских признаков (гибридизац ионного анализа Д Н К ) и ф енотипич ески раз лич аются по биохим ич еским свойствам . В ну три подвидов сальм онеллы подраз деляются на серовары по O-и Н -антигенам согласно классиф икац ии К ау ф м ана-У айта. Н еобходим о пом нить, ч то представители раз ных подвидов м огу т им еть общ ие или идентич ные антигены. А бсолютное больш инство сероваров (1367) относятся к подвиду е пtе riс а . Согласно ранее су щ ествовавш ей

32

классиф икац ии, сальм онеллы - представители раз лич ных сероваров рассм атривались как сам остоятельные виды и им ели собственные видовые наз вания. В настоящ ее врем я старые видовые наз вания использ у ют для обоз нач ения биоваров (сероваров), наприм ер S. е пtе riс а подвидае пtе riс а серовара tyrhimurium соответству ет S. tyrhimurium, серовара tyrhi - S. tурhi, серовара ра ratyphi A – S. ра ratyphi A ит.д. П риродным рез ерву аром бактерий S. е пtе riс а подвида е пtе riс а являются теплокровные ж ивотные, для остальных холоднокровные ж ивотные и окру ж ающ ая среда. В оз бу дители з аболеваний ч еловекаотносятся кподвиду е пtе riс а . С эпидем иологич еской точ ки з рения сальм онеллы, выз ывающ ие з аболевания ч еловека, относят к трем основным гру ппам . П ервая гру ппа включ ает 3 биовара: typhi, ра ratyphi А и С, которые являются воз бу дителям и строгих антропоноз ов (инф иц иру ют только ч еловека ипередаются от ч еловека к ч еловеку прям о илиопосредованно - ч ерез пищ у , воду ). В торая гру ппа включ ает серовары, которые адаптировались к определенном у виду ж ивотных. Н екоторые из этих сероваров патогенны для ч еловека (dublin, gallinarum, schotmulleri идр.). К третьей гру ппе относятся больш инство сероваров, не им еющ их спец иф ич еских хоз яев испособных инф иц ировать какч еловека, такиж ивотных. П о клинич еской классиф икац ии сальм онеллы подраз деляют на воз бу дителей брюш ного тиф а (биовар typhi) ипаратиф ов (биовары ра ratyphi А , С иschotmulleri) ивоз бу дителей сальм онеллез ов, включ ающ их все остальные биовары сальм онелл, патогенных для ч еловека. Больш инство воз бу дителей сальм онеллез ов относится к третьей гру ппе поэпидем иологич еской классиф икац ии. З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. М икроскопировать и з арисовать м аз ки из ч истых ку льту р воз бу дителей киш еч ныхинф екц ий. 2. Д иагностикабрюш ного тиф аипаратиф ов. 2.1. Бактериологич еская диагностика: а) выбрать м атериал для исследования; б) у ч есть рез у льтаты первич ного посеваисследу ем ого м атериаланасреду Раппопорт; в) у ч есть рез у льтаты пересева бактерий со среды Раппопорт на среду Э ндо. О писать и з арисовать колонии, выросш ие на среде Э ндо, и обосновать выбор подоз рительных колоний для дальнейш его исследования; г) у ч есть рез у льтаты пересеваподоз рительных колоний со среды Э ндо на среду Ресселя; д) у ч есть рез у льтаты идентиф икац ии выделенной ч истой ку льту ры по биохим ич еским свойствам ; е) сделать вывод инам етить план дальнейш его исследования. 2.2. Серодиагностика. П роанализировать рез у льтаты реакц ииВ идаля. 3. Бактериологич еская диагностикасальм онеллез ов: а) выбрать м атериал для исследования;

33

б) у ч есть рез у льтаты первич ного посева исследу ем ого м атериала на висм у т-су льф ит агар. О писать и з арисовать колонии и обосновать выбор подоз рительных колоний для дальнейш его исследования; в) у ч есть рез у льтаты пересеваподоз рительных колоний насреду Ресселя; г) у ч есть рез у льтаты идентиф икац ии выделенной ч истой ку льту ры по биохим ич еским свойствам ; д) сделать вывод инам етить план дальнейш его исследования. 4. О з наком иться с диагностич еским и и леч ебно-проф илактич еским и препаратам и. М е т о диче с кие ука за ния М ик робиологическ ая д иагностик а брю ш ноготиф а и паратиф ов М а т е риа л дл я ис с л е до ва ния : исходя из особенностей патогенез а брюш ного тиф а, на 1-й неделе з аболевания, в период бактерием ии, воз бу дителей выделяют из крови(полу ч ение гем оку льту ры), со 2-й неделиз аболевания - из испраж нений (полу ч ение копроку льту ры), м оч и или ж елч и. А нтитела в сыворотке накапливаются прибрюш ном тиф е в конц е 1-й неделиз аболевания. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е (схем а6). П о л уче ние ге мо кул ьт уры . В 1-й день из локтевой вены больного беру т 5-10 м л крови и з асевают в колбу с 50-100 м л селективной среды Раппопорт, содерж ащ ей ж елч ный бу льон (для подавления роста дру гих бактерий), глюкоз у , индикатор А ндреде и поплавок для обнару ж ения газ а. У каз анные соотнош ения крови и среды необходим ы для подавления бактериц идного действия белков крови. П осевы инку биру ют при37 °С в теч ение 18-20 ч . Н а 2-й день приросте сальм онелл наблюдается пом у тнение и изм енение ц вета среды. П ри росте паратиф оз ных бактерий (биовары ра ratyphi А , С и schotmulleri) наряду с у каз анным иизм енениям ипоявляются пу з ырькигаз а в поплавке. Д ля у скорения ответа из среды Раппопорт делают м аз ки и препараты "висяч ая" капля. П ри налич ии ч истой ку льту ры грам отриц ательных подвиж ных палоч ек иизм енении ц вета среды (или налич ии газ а) дают первый предварительный ответ. Затем ку льту ру из среды Раппопорт пересевают в пробирку со средой Ресселя, полагая приэтом , ч то из кровивыделенач истая ку льту ра им ож но сраз у присту пить к ее идентиф икац ии. О дноврем енно со среды Раппопорт делают посевы насреду Э ндо для полу ч ения изолированных колоний с ц елью проверки ч истоты выделенной ку льту ры. Н а 3-й день отм еч ают ф ерм ентац ию глюкоз ы на среде Ресселя и ставят ориентировоч ну ю реакц ию агглютинац ии на стекле. Н а основании полу ч енных данных дают второй предварительный ответ. Д ля дальнейш его исследования отбирают несколько бесц ветных колоний со среды Э ндо ипересевают их в среду Ресселя или скош енный питательный агар (для контроля полу ч енных рез у льтатов). Ч исту ю ку льту ру пересевают на среды "пестрого" ряда и серотипиру ют в реакц ии агглютинац ии на стекле со см есью гру пповых сывороток, а з атем с адсорбированным и м онорец епторным и О - и Н -

34

сальм онеллез ным и сывороткам и. О конч ательный диагноз у станавливают на основании биохим ич еских (табл. 5) и антигенных свойств. Биохим ич еские признаки (раз верну тый "пестрый" ряд) поз воляют диф ф еренц ировать сальм онеллы от схож ихс ним иэнтеробактерий: Citrobacter, Hafnia (табл. 6). В ыделенну ю ч исту ю ку льту ру бактерий использ у ют для определения ч у вствительностикантим икробным препаратам . Ф а го т ипиро ва ние . С пом ощ ью наборастандартных Vi-ф агов определяют до 78 ф аготипов S. enterica биовараtурhi. П риэтом необходим ым у словием является налич ие в ку льту ре Vi-антигена. К у льту ры S. enterica биовара ра ratyphi В (schotmulleri) диф ф еренц иру ются на11 ф аготипов иподтипов. Т аблица 5. Биохим ич еские свойства сальм онелл - воз бу дителей брюш ного тиф аипаратиф ов Биовар Ф ерм ентац ия О браз ование S. е пtе riс а лактоз ы глюкоз ы м альтоз ы сахароз ы м аннита H2S NH3 индола typhi К К К + ра ratyphi А КГ КГ КГ schotmulleri КГ КГ КГ + + У с л о в ны е о бо зна че ния : (К ) - образ ование кислоты; (К Г) - образ ование кислоты игаз а; (+) - обнару ж ение признака; (-) - отсу тствие признака.

Т аблица 6. Д иф ф еренц иац ия сальм онелл и дру гих энтеробактерий по биохим ич еским признакам Л изинФ ерм ентац ия у глеводов βдекар- ду льсорксирам сали4% ГалакРод бокси- ц ита бита лоз ы ноз ы ц ина лактоз ы тоз илаз а даз а Salmonella Citrobacter Hafnia

++

К (-) К (-) -

К К -

К К К

К К К

К (+-) К (+-)

К (+-) -

К К

У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) - полож ительная реакц ия; (-) - отриц ательная реакц ия; (+-) вариабельная реакц ия; К - образ ование кислоты; К (-) - образ ование кислоты (редко); К (+-) - образ ование кислоты (вариабельно).

П о л уче ние ко про кул ьт уры . И спраж нения з асевают на одну из диф ф еренц иально-диагностич еских сред (Э ндо или Л евина) или элективные среды обогащ ения (М юллера, селенитовая иливисм у т-су льф ит агар). Д ля посева петлю ф екалий вносят в пробирку с изотонич еским раствором хлорида натрия и готовят су спенз ию. П осле оседания кру пных ком оч ков су спенз ию петлей наносят на поверхность агаровой среды - на одну половину ч аш ки. М атериал тщ ательно растирают ш пателем по одной, а з атем по дру гой половине ч аш кидля полу ч ения изолированных колоний. П осевы инку биру ют при37 °С в теч ение 18-20 ч . Н а2-й день из у ч ают характер колоний, выросш их нач аш ках, пересевают 2-3 бесц ветные колонии(со среды Э ндо илиЛ евина) иликолониич ерного ц вета(висм у т-су льф ит

35

агар) на среду Ресселя ив пробиркисо скош енным питательным агаром . П ри отсу тствии подоз рительных колоний на ч аш ках делают высевы из среды М юллера или селенитовой среды на ч аш ки со средой Э ндо для полу ч ения изолированных колоний. Д ля у скорения ответаставят ориентировоч ну ю реакц ию агглютинац ии на стекле с м атериалом , вз ятым из бесц ветной колонии. Д алее посту пают такж е, какиприидентиф икац иигем оку льту ры. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки . М атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, в м олеку лярно-биологич еских исследованиях использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью П Ц Р. Се роди агнос т и ка. В лабораторной практике ш ироко прим еняют раз верну ту ю реакц ию агглютинац ии В идаля, основанну ю на обнару ж ении в сыворотке кровилюдей антител - агглютининов, которые появляются в конц е 1-й - нач але 2-й недели з аболевания. Реакц ию ставят одноврем енно с ч етырьм я антигенам и: О и Н -брюш нотиф оз ным и, Аи В -паратиф оз ным и диагностику м ам и. Брюш нотиф оз ные м онодиагностику м ы прим еняют для у становления стадии болез ни, так как содерж ание О - и Н -антител в раз ные ее периоды неодинаково, О -антитела появляются на 1-й неделе, накапливаются в раз гар з аболевания иисч ез ают к м ом енту выз доровления. Н -антителапоявляются в раз гар з аболевания, накапливаются к конц у з аболевания и сохраняются у переболевш их в теч ение длительного врем ени. У людей, вакц инированных против брюш ного тиф а ипаратиф ов, такж е наблюдается полож ительная реакц ия В идаля, прич ем в довольно высоком титре, поэтом у "инф екц ионный В идаль" у дается отлич ить от "прививоч ного" только по нарастанию титраагглютининов у больных в проц ессе з аболевания. Реакц ию В идаля ставят в ч етырех рядах пробирок по 7 пробирок в каж дом ряду , из которых 5 опытных и2 контрольные. Д ля контроля каж дого диагностику м а в пробиркивносят по 1 м л изотонич еского раствора хлорида натрия, в который добавляют 2 капли диагностику м а. В контрольной пробирке с 1 м л сыворотки (без диагностику м а) не долж но быть хлопьев. П ри спонтанной агглютинац ии реакц ия не у ч итывается. Д иагностич еский титр реакц ии В идаля равен 1:200. Д ля серологич еского исследования реконвалесц ентов и выявления бактерионосителей ш ироко использ у ют реакц ию непрям ой Vi-гем агглютинац ии, с пом ощ ью которой в сыворотке крови людей определяют прису тствие антител к Vi -антигену . В кач естве антигена использ у ют эритроц итарный Vi-диагностику м , представляющ ий собой вз весь эритроц итов ч еловека I(0) гру ппы, обработанных ф орм алином и сенсибилизированных Vi-антигеном S. enterica биовара typhi. Готовят раз ведения испыту ем ой сывороткиот 1:10 до1:1280. П риполож ительной реакц ии эритроц иты покрывают дно пробирки в виде диска с з аз у бренным и краям и, а надосадоч ная ж идкость остается проз рач ной. П ри отриц ательной реакц ии, так ж е как и в контроле, эритроц иты осаж даются на дно пробирки и им еют вид дискас ровным икраям и("пу говки"). Д иагностич еское з нач ение им еет титр пассивной Vi-гем агглютинац ии, нач иная с 1:40 ивыш е. В сех лиц , сыворотка крови у которых дает полож ительный рез у льтат в РН ГА с эритроц итарным Viдиагностику м ом , рассм атривают как подоз рительных на носительство S. enterica биовараtyphi иподвергают м ногократном у бактериологич еском у обследованию.

С хем а 6. М ик робиологическ оеисслед ованиепри брю ш ном тиф еи паратиф е

36

37

М ик робиологическ ая д иагностик а сальм онеллезов М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : испраж нения, пригенерализованной ф орм е - кровь. М икробиологич еская диагностика сальм онеллез ов принц ипиально не отлич ается от диагностики брюш ного тиф а и паратиф ов. Серодиагностика не прим еняется по прич ине больш ого ч исла сероваров воз бу дителей. В аж нейш ие биохим ич еские признакирядасальм онелл представлены в таблиц е 7.

В С D E

S.typhimurium S.derby S.heiderberg S.choleraesuis S.newport S.enteritidis S.anatum

+ + + + + + +

-

+ + + + + + +

++ + + + + +

+-

+ + + ++ ++

рам ноз ы

О браз ование

ду льц ита

сахароз ы

ксилоз ы

м аннита

лактоз ы

Гру ппа

глюкоз ы

Т аблица 7. Биохим ич еские свойствасальм онелл Ф ерм ентац ия В ид

++ + + + + +

индола H2S

+-

+ + + ++ + +

У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) - полож ительная реакц ия; (-) - отриц ательная реакц ия; (+-) – больш ее ч исло ш там м ов дает полож ительну ю реакц ию.

М ик робиологическ ая д иагностик а к иш ечногод исбак териоза М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : ф екалии. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е . И м еет ориентировоч ное з нач ение. П ри рез ко выраж енном дисбактериоз е в м аз ках преобладают м икроорганизм ы определенных видов (наприм ер, дрож ж еподобные грибы, стаф илококкиидр.) на ф оне су щ ественного у м еньш ения грам отриц ательной м икроф лоры. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . П роводится колич ественное исследование состава м икроф лоры киш еч ника. Д ля этого из исследу ем ого -2 -4 -6 м атериала готовят раз ведения 10 , 10 , 10 ит.д. П ервич ные посевы по 0,1 м л каж дого раз ведения производят параллельно на несколько питательных сред (Э ндо, кровяной агар, Ж СА , агар Сабу ро и др.) и инку биру ют при 37 °С. П одсч итывают ч исло выросш их колоний и определяют ч исло К О Е в 1г м атериала. П роводят отсев 2-3 колоний каж дого вида для выделения и идентиф икац иич истых ку льту р м икроорганизм ов. Д ля обнару ж ения анаэробных Bifidobacterium spp. делают м ерные посевы -7 м атериала в раз ведениях 10 ивыш е в пробиркис 13-15 м л м одиф иц ированной среды Блау рокка, в состав которой входит печ еноч ный бу льон, пептон - 1%, лактоз а - 1%, хлорид натрия - 0,5%, ц истин - 0,01%, агар-агар - 0,75%, твин-80 0,1%. П риросте Bifidobacterium spp. ч ерез 24-48 ч происходит пом у тнение всей среды с образ ованием тяж ей или отдельных колоний. Готовят м аз ки и

38

окраш ивают по м етоду Грам а. В ыделение ч истых ку льту р Bifidobacterium spp. является весьм а тру доем ким ипрактич ескинеобяз ательным . П ри необходим ости идентиф икац ию представителей рода осу щ ествляют по биохим ич еским свойствам . Д ля оц енки рез у льтатов бактериологич еского исследования сопоставляют полу ч енные данные с колич ественным содерж анием м икроорганизм ов в норм е. О риентировоч ные критерии норм альной м икроф лоры толстой киш ки представлены в табл. 8. Т аблица 8. К ритериинорм ы киш еч ной ф лоры М икроорганизм ы П атогенные м икробы сем . Enterobacteriaceae О бщ ее колич ествоЕ .с о li, м лн/г Е .с о li со слабовыраж енным иф ерм ентативным исвойствам и, % Е .с о li с гем олитич еским исвойствам и, % Э нтеробактерии (лактоз оотриц ательные и лактоз ополож ительные): Hafnia, Aerobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia К окковые ф орм ы, % Гем олитич еский стаф илококк по отнош ению ко всем кокковым ф орм ам , % Bifidobacterium spp. (рост припосеве раз ведения) БактерииродаProteus Грибы родаCandida

Н орм а 0 300-400 Д о10 Н ет Д о5 Д о25 Н ет 10 ивыш е Н ет Н ет

П ри киш еч ном дисбактериоз е происходит з нач ительное сниж ение облигатной анаэробной м икроф лоры, ив перву ю оч ередь Bifidobacterium spp., а такж е у велич ение аэробных видов, в ч астностиЕ.с о li, содерж ание которых м ож ет 11 превыш ать 10 м икробных клеток в 1 г испраж нений. У велич ивается ч астота обнару ж ения ш там м ов Е.с о li со слабой ф ерм ентац ией лактоз ы и им еющ их гем олитич еские свойства (до 30-40%), гем олитич еских и негем олитич еских стаф илококков, бактерий родаProteus, грибов родаCandida (до 15-16%). У лиц с дисбактериоз ам и более ч асто обнару ж ивают лактоз оотриц ательные и лактоз ополож ительные энтеробактерии, относящ иеся к родам Hafnia, Aerobacter, Citrobacter. Д ля м икроорганизм ов, в норм е отсу тству ющ их в испраж нениях или им еющ ихся в небольш ом колич естве, показ ателем дисбактериоз а бу дет 5 6 содерж ание их 10 -10 и выш е К О Е в 1 г м атериала. Д ля оконч ательного з аключ ения о киш еч ном дисбактериоз е важ ное з нач ение им еет повторное его выявление в динам ике обследования больного. Д иагностическ ие, проф илак тическ иеи лечебныепрепараты Сальм оне лле зны е групповы е , адс орби рованны е и м оноре це пт орны е О - и Н -агглют и ни рующ и е ди агнос т и че с ки е с ы ворот ки . П олу ч ают так ж е, как и дру гие диагностич еские сыворотки. П рим еняют для серотипирования сальм онелл в реакц ииагглютинац ии.

39

П редставляют Сальм оне лле зны е О- и Н - м оноди агнос т и кум ы . собой вз веси сальм онелл, у битых нагреванием (О -диагностику м ы) или обработкой ф орм алином (Н -диагностику м ы). П рим еняют для серодиагностики брюш ного тиф ав реакц ииВ идаля. Ти повы е с альм оне лле зны е бакт е ри офаги . П рим еняют для ф аготипирования сальм онелл. Брюш нот и фозная м оновакци на и брюш нот и фозная с пи рт овая вакци на, обогащ е нная Vi-ант и ге ном . П рим еняют для спец иф ич еской активной проф илактикибрюш ного тиф а. Поли вале нт ны й брюш нот и фозны й бакт е ри офаг. В ыпу скается в виде таблеток с кислотоу стойч ивым покрытием . П рим еняют для экстренной проф илактикибрюш ного тиф а. Коли -бакт е ри н. Содерж ит лиоф ильно высу ш енные ж ивые клетки Е .с о li ш там м а М 17, обладающ его выраж енным и антагонистич еским и свойствам и в отнош енииряда патогенных киш еч ных бактерий. П рим еняют для норм ализац ии киш еч ной м икроф лоры придисбактериоз е илеч ениидизентерииу детей. Би фи дум бакт е ри н. Содерж ит лиоф ильно высу ш енну ю вз весь ж ивых клеток В. bifidum. П рим еняют для леч ения хронич еских киш еч ных инф екц ий невыясненной этиологииу детей идизентерии. Би фи кол. Содерж ит см есь высу ш енныхж ивыхбактерий Е .с о li ш там м аМ 17 иВ. bifidum. П оказ ания кприм енению те ж е. Л акт обакт е ри н. В ыпу скается в виде таблеток и содерж ит проду кты ж изнедеятельностилактобактерий. П рим еняют для леч ения дисбактериоз ов. Ант и би от и ки : су льф анилам иды, полу синтетич еские пениц иллины, ц еф алоспорины 2-4-го поколения, хлорам ф еникол, тетрац иклины, ф торхинолоны, полим иксин. Л абораторная д иагностик а холеры З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. У каз ать м атериалдля исследования. 2. Бактериологич еская диагностикахолеры. а) изу ч ить м орф ологич еские и тинкториальные свойства: м икроскопировать готовые м аз кииз исследу ем ой ку льту ры больного; б) изу ч ить антигенные свойства: отм етить рез у льтаты раз верну той реакц ииагглютинац иис диагностич еской O1-сывороткой; в) отм етить налич ие или отсу тствие роста исследу ем ой ку льту ры на среде с полим иксином ирез у льтаты гексам инового теста. Д ать з аключ ение попроведенным исследованиям . М е т о диче с кие ука за ния М а т е риа л для ис с ле до ва ния : испраж нения больного, рвотные м ассы, вода, пищ евые проду кты; при постм ортальной диагностике: отрез ки тонкой киш ки и ж елч ный пу з ырь с ч астью печ ени. П ри необходим ости хранения м атериал пом ещ ают в транспортну ю среду (бу ф ерный солевой раствор с глиц ерином ). Д ля

40

длительного сохранения реком енду ется полоску ф ильтровальной бу м аги, см оч енну ю в ж идких испраж нениях, пом естить в герм етич ески з акрытый пластиковый контейнер - для предохранения от высыхания. Т аким образ ом воз бу дитель сохраняется в м атериале до 5 нед. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е . И з исследу ем ого м атериала готовят м аз ки, окраш ивают их по м етоду Грам а и водным ф у ксином . К ром е того, из нативного м атериала готовят препарат "висяч ая" капля, в котором определяют налич ие подвиж ных вибрионов при тем нопольной или ф аз ово-контрастной м икроскопии. О бнару ж ение в м аз ках больш ого колич ества грам отриц ательных, слегка изогну тых палоч ек (длиной от 1,5 до 3 м км ) и активно-подвиж ных вибрионов в препарате "висяч ая" капля поз воляет дать первый предварительный полож ительный ответ. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . М атериал з асевают в раз лич ные ж идкие и плотные элективные среды, в ч астности во ф лаконы со щ елоч ной пептонной водой (1% с теллу ритом ) и на ч аш ки со щ елоч ным питательным агаром . П осевы на пептонной воде инку биру ют при 37 °С в теч ение 5-6 ч , на ч аш ках – 10-12 ч . И з голу боватой пленки, образ у ющ ейся на пептонной воде, или из ее поверхностного слоя делают м аз киипрепараты "раз давленная" и"висяч ая" капля. Э тот ж е м атериал использ у ют для постановкиреакц ииагглютинац иина стекле со спец иф ич еской противохолерной О 1-сывороткой. Ч асть пептонной воды переносят в дру гу ю пробирку для постановкинитроз оиндоловой пробы. Д ля этого добавляют ту да ж е несколько капель серной кислоты. В полож ительном слу ч ае появляется роз овое окраш ивание вследствие образ ования нитроз оиндола под влиянием холерного вибриона. Н ез ависим о от рез у льтатов исследования делают пересев на втору ю пептонну ю воду . Н алич ие грам отриц ательных вибрионов, агглютини-ру ющ ихся О 1-сывороткой, поз воляет дать второй предварительный ответ. Н ез ависим о от полу ч енных рез у льтатов продолж ают исследование, какпоказ анонасхем е 7. В ыделение ч истой ку льту ры и ее идентиф икац ию проводят по 5-6 однотипным колониям , выросш им на щ елоч ном агаре. Д ля у скорения хода анализа ставят раз верну ту ю реакц ию агглютинац иис бактериальной су спенз ией, приготовленной из колоний. Д ля этого агглютиниру ющ у ю О 1-сыворотку раз водят в пробирках до титра пептонной водой (в объ ем е 0,5 м л). Затем в каж ду ю пробирку вносят 1-2 капли су спенз ии бактерий. Рез у льтат реакц ии агглютинац ииу ч итывают после 3-4-ч асовой инку бац иипри37 °С. Р е а кция Ф о ге с а -П ро с ка уэра : вибрионы выращ ивают в глюкоз оф осф атном бу льоне, з атем добавляют реактив альф а-наф тол в растворе щ елоч и; приналич ии ац етилм етилкарбиноланаблюдается ру биново-красное окраш ивание среды. Ге кс а мино в ы й т е с т : ку льту ру выращ ивают на бу льоне с глюкоз ой, гексам ином (у ротропином ) и индикатором бром тим оловым синим . В полож ительном слу ч ае ч ерез 6-8 ч наблюдается изм енение з еленого ц ветасреды в ж елтый. Т аким образ ом , идентиф икац ию ку льту р проводят в три этапа: 1) у станавливают их принадлеж ность к роду Vibrio; 2) диф ф еренц иру ют их от холероподобных вибрионов в реакц ии агглютинац ии с O1-сывороткой, по

41

ч у вствительности к спец иф ич еском у ф агу идру гим итестам и; 3) определяют видовые признаки ку льту р. О конч ательное з аключ ение о выделении и диф ф еренц ировании холерных вибрионов дают ч ерез 36-48 ч на основании ком плексногоизу ч ения основныхбиологич еских признаков воз бу дителя. Т ру дности при оц енке рез у льтатов бактериологич еского исследования встреч аются привыделенииатипич ных холерных вибрионов ив перву ю оч ередь не агтлютиниру ющ ихся холерной O1-сывороткой (Н А Г-вибрионы). Н А Гвибрионы м огу т лизироваться одним из спец иф ич еских холерных ф агов и обладать дру гим исвойствам и, сходным ис холерным ивибрионам и. И дентиф икац ию ку льту ры проводят на основании определения ч у вствительности вибрионов к холерном у ф агу , агглютинабельности противохолерной О 1-сывороткой и типовым и агглютиниру ющ им и сывороткам и И наба и О гава, их гем олитич еских и биохим ич еских свойств (оксидаз ная активность декарбоксилаз ы ам инокислот, ф ерм ентац ия у глеводов, образ ование ац етилм етилкарбинолаидр.). Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки : иммо бил иза ция вибрио но в хо л е рны ми с ы в о ро т ка миит ипо в ы михо л е рны мифа га ми. К аплииспраж нений илим атериала с поверхности пептонной воды обрабатывают холерной O1-сывороткой, типовым исывороткам иО гаваиИ набаилитиповым ихолерным иф агам и. Готовят из них препараты "раз давленная" капля, которые исследу ют с пом ощ ью тем нопольной и ф аз ово-контрастной м икроскопии. В полож ительном слу ч ае ч ерез 3-5 м ин движ ение вибрионов прекращ ается. Иммуно химиче с кие ис с л е до ва ния . П рим еняют м етод прям ой И Ф . М аз кииз исследу ем ого м атериала обрабатывают ф люоресц иру ющ ей противохолерной сывороткой и исследу ют в люм инесц ентном м икроскопе. П олож ительным рез у льтатом сч итается обнару ж ение в препарате даж е единич ных вибрионов с ярким ж елто-з еленым свеч ением в виде блестящ его ободкапо периф ерииклетки. П олож ительный рез у льтат м ож но полу ч ить ч ерез 1-2 ч после нач ала 6 исследования приконц ентрац иивибрионов не м енее 10 клеток в 1 м л, поэтом у реком енду ется предварительное подращ ивание м атериаланапитательных средах. Био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с л е до в а ния . В слу ч ае обнару ж ения соответству ющ их м олеку л Д Н К в исследу ем ом м атериале в ходе в рез у льтате проведения П Ц Р-анализам ож но поставить предварительный диагноз . Се роди агнос т и ка. В ыявление антител к воз бу дителю является вспом огательным и прим еняется для ретроспективной диагностики холеры, выявления вибрионосителей и оц енки напряж енности постинф екц ионного и поствакц инального им м у нитета. Д ля этого обыч но ставят реакц ию агглютинац ии или РН ГА , диагностич еский титр антител в этих реакц иях 1:80-1:320, а такж е определяют вибриоц идные антителав реакц иилизиса. Ди агнос т и ка нос и т е льс т ва В о врем я вспыш ки холеры проводят м ассовое обследование на носительство V.cholerae. М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : ректальные м аз ки(ф екалии, вз ятые там поном из прям ой киш ки).

42

и с с ле довани е . П осев м атериала от 10 Бакт е ри ологи че с кое обследу ем ых на обогатительну ю среду с О 1-агглютиниру ющ ей диагностич еской сывороткой. В полож ительных слу ч аях ч ерез 3-4 ч нач инается выпадение хлопьев в рез у льтате агглютинац ии раз м нож ивш ихся вибрионов. П ри обнару ж ении в осадке грам отриц ательных подвиж ных вибрионов каж дый из 10 пац иентов обследу ется индивиду ально. С хем а 7. М ик робиологическ оеисслед ованиепри холере

43

Л абораторная д иагностик а пищевых ток сик оинф ек ций , бак териальной природ ы

инток сик аций

З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. М икроскопировать и з арисовать м аз ки из ч истых ку льту р воз бу дителей киш еч ных инф екц ий. О писать характер колоний, выросш их на ч аш ках с диф ф еренц иально-диагностич еской средой после посева испраж нений больного и остатков пищ и – воз м ож ных источ ников пищ евой токсоинф екц ии. 2. О тм етить рез у льтаты изу ч ения биохим ич еских свойств исследу ем ой ку льту ры сальм онелл по ранее з асеяном у «пестром у » ряду . Сделать з аключ ение наоснованииполу ч енныхданных. 3. Д иагностикаботу лизм а: а) у каз ать м атериалдля исследования; б) проанализировать рез у льтаты РН ГА для обнару ж ения боту лотоксина в сыворотке кровибольного (реакц ия Бойдена). Д ать з аключ ение. М е т о диче с кие ука за ния М ик робиологическ ая д иагностик а пищевых ток сик оинф ек ций , вызванных Е scherichia spp., Salmonella spp., Proteus spp. М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : ф екалии, рвотные м ассы, пром ывные воды ж елу дка больного, остатки пищ евых проду ктов - воз м ож ные источ ники и ф акторы передач иинф екц ии. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . П роизводят пу тем посевам атериалана диф ф еренц иально-диагностич еские и элективные среды (Э ндо, висм у т-су льф ит агар и др.) для выделения ч истой ку льту ры сальм онелл иэш ерихий, а такж е в конденсац ионну ю воду в пробирке со скош енным питательным агаром для выявления бактерий рода Р roteus. П осле инку бац иипосевов при37 °С в теч ение 20-24 ч отм еч ают ц вет колоний нач аш ках с диф ф еренц иальной средой иналич ие "полз у ч его" роста, характерного для Р roteus spp., в пробирке со скош енным питательным агаром . П одоз рительные колонии пересевают на скош енный питательный агар для полу ч ения ч истых ку льту р иодноврем енно ставят с ним и ориентировоч ну ю реакц ию агглютинац ии на стекле, использ у я см еси диагностич еских сывороток. Н а следу ющ ий день с ч истой ку льту рой ставят раз верну ту ю реакц ию агглютинац ии с соответству ющ ей м онорец епторной сывороткой иделают посев на среды "пестрого" ряда. П ривыделенииодного и того ж е серовара сальм онелл или эш ерихий из организм а больных людей и пищ евого проду кта делают оконч ательное з аключ ение об этиологии пищ евой токсикоинф екц ии - источ нике з аболевания. П ри налич ии "полз у ч его" роста на скош енном питательном агаре из конденсац ионной воды петлей беру т м атериал для приготовления препарата"висяч ая" капля с ц елью у становления подвиж ности и для м аз ка, который окраш ивают по м етоду Грам а и м икроскопиру ют. Затем выделяют ч исту ю ку льту ру , определяют биохим ич еские и дру гие признаки и у станавливают вид: Р .vulgaris, P.mirabilis, P.morganii иP.rettgeri.

44

О ц енка ролиу словно-патогенных м икроорганизм ов в этиологиипищ евых токсикоинф екц ий долж на быть строго аргу м ентирована: а) бактериологич еским , серологич еским , эпидем иологич еским и клинич еским исключ ением сальм онеллез ов, дизентерии, холеры; б) выделением идентич ных ш там м ов у словно-патогенных бактерий из рвотных м асс, пром ывных вод ж елу дка, испраж нений, проду ктов. М ик робиологическ ая д иагностик а стаф илок ок к овых пищевых инток сик аций М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : рвотные м ассы, пром ывные воды ж елу дка, подоз рительные пищ евые проду кты. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки : иммуно химиче с кие , био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие исс л е до ва ния . И м м у нохим ич еская диагностика основананаобнару ж енииэнтеротоксинав исследу ем ом м атериале. Э нтеротоксин Staphylococcus spp. экстрагиру ют изотонич еским раствором хлориданатрия, з атем определяют его прису тствие и серологич еску ю спец иф ич ность реакц ией прец ипитац ии в геле с им м у нным и антитоксич еским и сывороткам и А , В , С. И спольз у ют такж е латекс-агглютинац ию, И Ф А , РИ А идр. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . С ц елью выделения ч истой ку льту ры стаф илококкаисследу ем ый м атериал, который м ож ет содерж ать ж изнеспособные бактерии, з асевают в ч аш ки с Ж СА . П олу ч енные по схем е ч истые ку льту ры проверяют на способность проду ц ировать энтеротоксины. Д ля эпидем иологич еского анализа м ассовых стаф илококковых интоксикац ий проводят ф аготипирование выделенных ку льту р с пом ощ ью набора стаф илококковыхф агов. Би опроба. Д ля обнару ж ения энтеротоксинам ож но использ овать биопробу скорм ить изу ч аем ый м атериал котятам -сосу нкам , у которых стаф илококковый энтеротоксин выз ывает рвоту ипонос ч ерез 30-60 м ин после скарм ливания. М ик робиологическ ая д иагностик а боту лизм а М а т е риа л для ис с л е до в а ния : сыворотка крови, м оч а, испраж нения, пром ывные воды ж елу дка, остаткипищ иилиподоз реваем ые проду кты (колбасы, м ясные, рыбные, ф ру ктовые, овощ ные консервы идр.). Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки : иммуно химиче с кие , био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие исс л е до ва ния . И м м у нохим ич еская диагностика основананаобнару ж енииботу лотоксинав исследу ем ом м атериале. С этой ц елью ставят реакц ию Бойдена- РИ ГА с эритроц итам и, нагру ж енным им оновалентным и антитоксич еским и противоботу линич еским и сывороткам и типов А , В , Е . В кач естве контроля использ у ют норм альну ю сыворотку крови. Д ля выявления боту лотоксина м огу т быть использ ованы такж е И Ф А и дру гие ч у вствительные серологич еские реакц ии. Би опроба. Д ля обнару ж ения боту лотоксина в пищ евых проду ктах и определения токсигенностиС .botulinum м ож но провестиреакц ию нейтрализац ии токсина на белых м ыш ах. Д ля определения серотипа токсина реакц ию ставят с

45

м оновалентным исывороткам итипов А , В , Е . П ри нейтрализац ии токсина гем олитич еской антитоксич еской сывороткой м ыш иостаются ж ивым и. Д иагностическ ие, проф илак тическ иеи лечебныепрепараты Ст афи лококковы е бакт е ри офаги (м еж ду народный набор). П рим еняют для ф аготипирования стаф илококков с ц елью эпидем иологич еского анализа пищ евой интоксикац ии. Прот и вобот ули ни че с ки е с ы ворот ки . П олу ч ены из крови лош адей, гиперим м у низированных боту линич еским и анатоксинам и. О ч ищ ены и конц ентрированы м етодом диаф ерм -3. Д ля леч ебно-проф илактич еских ц елей готовят противоботу линич еские сыворотки ч етырех типов: А , В , Е , F. М оновалентные сывороткипереч исленных типов использ у ют в диагностич еских ц елях для определения серотипатоксинав исследу ем ом м атериале. Бот ули ни че с ки й т ри анат окс и н адс орби рованны й очи щ е нны й. Э кз отоксины С .botulinum (серотипы А , В иЕ ) обез вреж ивают ф орм алином при нагревании, а з атем оч ищ ают от балластных вещ еств, конц ентриру ют и адсорбиру ют на гидрате оксида алюм иния. П рим еняют для проведения плановой активной им м у низац ии против боту лизм а юнош ей допризывного воз раста (16 лет). Прот и вох оле рная агглют и ни рующ ая O-с ы ворот ка, т и повы е с ы ворот ки О гава и И наба. П олу ч ены из крови кроликов, им м у низированных холерным и вибрионам и. П рим еняют для серологич еской идентиф икац ии и типирования холерных вибрионов в реакц ииагглютинац ии. Холе рны е фаги . Т иповые холерные ф агиприм еняют для идентиф икац иии типирования холерных вибрионов. П оливалентный холерный бактериоф аг использ у ют для леч ебно-проф илактич еских ц елей. Холе рная вакци на. В з весь у битых холерных вибрионов прим еняют для активной им м у низац иипротив холеры. Готовится из ч истых ку льту р V.cholerae O1 биоваров Е1-tor иasiatici серо-типов И набаиО гава. Холе роге н-анат окс и н. О без вреж енный холерный токсин. П рим еняют для спец иф ич еской проф илактики холеры (соз дание активного спец иф ич еского антитоксич ескогоим м у нитета). Ант и би от и ки . М огу т быть использ ованы все препараты, действу ющ ие на соответству ющ ие бактерии. В м есте с тем надо у ч итывать, ч то средивоз бу дителей достаточ но ш ироко распространены у стойч ивые варианты. Д ля больш инства грам отриц ательных воз бу дителей киш еч ных инф екц ий ш ироко использ у ют тетрац иклины, ам пиц иллин, ц еф алоспорины 2-4-го поколений, хлорам ф еникол, ф торхинолоны. В О ЗБУД И Т ЕЛ И БА К Т ЕР И А Л ЬН Ы Х Р ЕС ПИ Р А Т О Р Н Ы Х В О ЗД УШ Н О -К А ПЕЛ ЬН Ы Х И Н Ф ЕК ЦИ Й

И

Д Р УГ И Х

В оз бу дители инф екц ий, передающ ихся воз ду ш но-капельным пу тем (табл. 9), относятся к раз ным сем ействам , родам и видам , которые су щ ественно отлич аются дру г от дру га по м орф ологии, ку льту ральным и биохим ич еским

46

свойствам , антигенной стру кту ре. Респираторные инф екц ии раз ной этиологииклинич ескидиагностиру ются как острые респираторные з аболевания (О РЗ) илипневм онии. И х воз бу дителим огу т быть идентиф иц ированы только с пом ощ ью м икробиологич еского исследования. В этиологии О РЗ и пневм оний важ ну ю роль играют слож ные м икробные ассоц иац ии, преим у щ ественно бактериальные ивиру сно-бактериальные. Т аблица 9. В оз бу дителибактериальных воз ду ш но-капельныхинф екц ий Н аим енование воз бу дителя Заболевание илисиндром Staphylococcus aureus (+) А П невм ония Streptococcus pneumonia (+) А Т ож е S. pyogenes (+) А -//Klebsiella pneumonia (-) А -//Mycoplasma pneumonia А -//Chlamydia psittaci -//Coxiella burnetii Q-лихорадка(пневм ония) Escherichia coli (-) А П невм ония (аспирац ионная) Enterobacter spp. (-) А Т ож е Proteus spp. (-) А -//Bacteroides spp. (-) А н П невм ония, абсц есс легких Peptococcus spp. (+) А н Т ож е Vellonella spp. (-) А н П невм ония, сину сит, отит Haemophilus influenzae (-) А П невм ония, бронхит Bordetella pertussis (-) А К оклюш Bordetella parapertussis (-) А П аракоклюш Corynebacterium diphtheriae (+) А Д иф терия Mycobacterium tuberculosis (к/у ) А Т у берку лез легких Actinomyces bovis (+) А н А ктином икоз легких Neisseria meningitides (-) А М енингококковая инф екц ия У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) – грам полож ительные, (-) – грам отриц ательные, (к/у ) – кислотоу стойч ивые, А – аэробы, А н – анаэробы.

Д ру гие бактериивыз ывают более избирательные пораж ения. Т ак, Вordetella pertussis, как правило, локализу ется в эпителии дыхательных пу тей. С о rynebacterium diphteriae выз ывают патологич еский проц есс главным образ ом в з еве, кром е того, воз никают систем ные пораж ения, связ анные с токсинем ией. М енингококкилокализу ются в носоглотке ивыз ывают ф арингиты, наз оф агиты, а проникая в м оз говые оболоч ки и кровь, - м енингит и сепсис. К бактериям , выз ывающ им спец иф ич еские пораж ения респираторного тракта, относятся воз бу дителиту берку лез а иактином икоз а. В м есте с тем этибактериипораж ают такж е и дру гие органы (киш еч ник, печ ень, кости, су ставы и др.). В ыз ванные всем и у пом яну тым и бактериям и з аболевания су щ ественно раз лич аются по клинич еской картине ипатогенез у . Д ля выявления бактерионосителей использ у ют главным образ ом бактериоскопич еский ибактериологич еский м етоды, иногдабиопробы. Э кспресс-

47

диагностика осу щ ествляется им м у ноф люоресц ентным м етодом . М икробиологич еская диагностика респираторных з аболеваний, выз ванных стаф илококкам и, стрептококкам и, а такж е анаэробным ибактериям ипроводится м етодам и, которые излагаются в предыду щ их тем ах. Л абораторная д иагностик а м енингок ок к овой д иф терии

инф ек ции,

к ок лю ш а и

З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. У каз ать приспособления (виды там понов) для вз ятия м атериала при м енингококковой инф екц ии, коклюш е идиф терии. 2. М икробиологич еское исследование при м енингококковой инф екц ии, коклюш е ипаракоклюш е: а) у каз ать м атериал, подлеж ащ ий исследованию; б) бактериоскопич еский м етод: м икроскопировать готовые м аз ки из спинном оз говой ж идкостииносоглотки, сделать з аключ ение инам етить план дальнейш его исследования; в) бактериологич еское исследование иим м у нохим ич еский м етод; г) порез у льтатам , полу ч енным из лаборатории, сделать з аключ ение. 3. М икробиологич еское исследование придиф терии: а) у каз ать м атериал, подлеж ащ ий исследованию; б) бактериоскопич еский м етод: м икроскопировать м аз ки из м атериала, вз ятого из з ева лиц с подоз рением на диф терию или бактерионосительство, сделать предварительное з аключ ение и нам етить ход дальнейш его исследования для подтверж дения бактериоскопич еского диагноз а; в) бактериологич еский м етод: описать рост ку льту ры, полу ч енной на сверну той сыворотке, иколоний на теллу ритовой среде, отм етить рез у льтаты готовых посевов исследу ем ых ку льту р на средах "пестрого" ряда, в слу ч ае обнару ж ения С.diphtheriae определить ее токсигенность. Сопоставить данные бактериоскопич еского и бактериологич еского исследований с ц елью идентиф икац ии выделенной ку льту ры и поставить оконч ательный м икробиологич еский диагноз . 4. Д ать кратку ю характеристику диагностич еским , проф илактич еским и леч ебным препаратам . М е т о диче с кие ука за ния М ик робиологическ ая д иагностик а м енингок ок к овой инф ек ции М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : спинном оз говая ж идкость, кровь, м аз ки со слизистой оболоч ки верхних отделов носоглотки, аспират из высыпных элем ентов. П ри обследовании на носительство м атериал из верхних отделов носоглоткиберу т спец иальным носоглоточ ным там поном (который на 3/4 длины сгибают под у глом 45°). П ри доставке в лабораторию его предохраняют от охлаж дения и высу ш ивания, поскольку м енингококк оч ень ч у вствителен к воз действию этихф акторов.

48

Спинном оз гову ю ж идкость беру т в колич естве 2-5 м л и делят на две ч асти: одну ц ентриф у гиру ют и исследу ют осадок, к дру гой добавляют полу ж идку ю питательну ю среду и выдерж ивают при 37 °С для накопления бактерий. И з исследу ем ого м атериалаготовят м аз киипроизводят посевы. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е (схем а 8). М аз ки из осадка спинном оз говой ж идкостиокраш ивают по м етоду Грам аим икроскопиру ют. П ри налич ии гноя в больш инстве слу ч аев обнару ж иваются типич ные грам отриц ательные диплококки, им еющ ие характерное располож ение вну три лейкоц итов, ч то поз воляет сделать оконч ательное з аключ ение о м енингококковой инф екц ии. П рим икроскопиим аз ков из носоглоткибактерионосителей наряду с м енингококком обнару ж иваются грам полож ительные стаф илококки и стрептококки, а такж е непатогенные нейссерии (Moraxella spp. и др.). Д иф ф еренц ировать ихпо м орф ологич еским признакам з атру днительно. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . И сследу ем ый м атериал з асевают петлей нач аш кис питательным агаром , содерж ащ им кровь, сыворотку кровиили асц итич еску ю ж идкость. В среды добавляют антибиотик ристом иц ин (150 Е Д /м л), который з адерж ивает раз м нож ение грам полож ительных кокков, содерж ащ ихся в исследу ем ом м атериале, итем сам ым способству ет выделению ч истой ку льту ры м енингококка. О браз ование колоний м енингококка на этих средах наблюдается ч ерез 48 ч после инку бац иипосевов при37 °С в атм осф ере с повыш енным содерж анием СО 2 (3-10 %) ивысокой влаж ностью. В отлич ие от дру гих кокков колонии м енингококка велич иной с бу лавоч ну ю головку проз рач ны, им еют голу боватый оттенок и ровные края. Т акие колонии пересевают в пробирку со скош енным агаром для полу ч ения ч истой ку льту ры. И дентиф икац ию ч истой ку льту ры, диф ф еренц иац ию от сапроф итных нейссерии, обитающ их в носоглотке, проводят по ряду ку льту ральных и биохим ич еских признаков. Т ак, м енингококк растет только в прису тствии нативного белка, в то врем я как дру гие нейссерии раз м нож аются на простых средах и образ у ют пигм ент; на средах Гисса с добавлением сыворотки крови м енингококк ф ерм ентиру ет глюкоз у и м альтоз у до кислоты. Ф аготипирование м енингококкапроводят для эпидем иологич еского анализа. О пределение серовара производят в реакц ииагглютинац иив пробирках. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки . Иммуно химиче с кие ис с л е до в а ния . Д ля выявления антигенов м енингококков в м аз ках из исследу ем ого м атериала использ у ют м етод встреч ного им м у ноэлектроф орез а. А нтигены воз бу дителя такж е м огу т быть обнару ж ены в м атериале от больного в реакц иях непрям ой латекс-агглютинац ии, РН ГА идр. Био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с ле до ва ния . И сследу ем ый м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью П Ц Р. Се роди агнос т и ка. Д ля ретроспективного подтверж дения диагноз а использ у ют РН ГА с парным исывороткам и.

С хем а 8. М ик робиологическ оеисслед ованиепри м енингок ок к овой инф ек ции и бак терионосительстве

49

50

М ик робиологическ ая д иагностик а к ок лю ш а и парак ок лю ш а М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : м окрота, слизь из носоглотки. М атериал беру т стерильным ватным там поном из носоглотки больного ребенка. Д ля вз ятия м атериала у м аленьких детей там пон, приготовленный на тонкой эластич ной проволоке, вводят ч ерез нос. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е (схем а9). Бактериоскопич еский м етод как таковой при диагностике коклюш а не прим еняется. Д ля быстрого обнару ж ения и идентиф икац ии Bordetella pertussis использ у ют им м у ноф люоресц ентный м етод. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . О сновной м етод лабораторной диагностики коклюш а. М атериал для посева беру т с пом ощ ью носоглоточ ного там пона или м етодом "каш левых пластинок". Д ля этого в м ом ент появления каш ля открыту ю ч аш ку П етрис питательной средой подносят ко рту ребенка и держ ат в теч ение 6-8 каш левых толч ков. П равильное ираннее вз ятие м атериала поз воляет выделить воз бу дителя в нач альном периоде болез ни от 80-90 % больных. М атериал з асевают накам енноК У А иликровяные среды - картоф ельноглиц ериновый кровяной агар (среда Борде-Ж ангу ) и м олоч но-кровяной агар. В питательные среды добавляют пениц иллин для у гнетения роста посторонней м икроф лоры. К олонииB.pertussis на у каз анных средах обыч но появляются ч ерез 48-72 ч ку льтивирования. B.parapertussis - несколько раньш е: ч ерез 24-72 ч . Бордетеллы образ у ют м елкие (диам етром около 1 м м ) выпу клые влаж ные блестящ ие колонии. Н а К У А колонииим еют серовато-крем овый ц вет, а на среде Борде-Ж ангу приобретают ж ем ч у ж ный или рту тный блеск. К олонии B.parapertussis более кру пные. Н а среде Борде-Ж ангу им олоч но-кровяном агаре они образ у ют огранич енну ю з ону гем олиза. И з колоний, выросш их на ч аш ках, готовят м аз ки, окраш ивают их по м етоду Грам аим икроскопиру ют. П риналич ии в м аз ках овоидных грам отриц ательных палоч екставят ориентировоч ну ю реакц ию агглютинац ии с коклюш ной и паракоклюш ной сывороткам и. Затем подоз рительные колонии пересевают в пробирки для дальнейш его изу ч ения ч истыхку льту р. И дентиф икац ию выделенной ку льту ры производят на основании ком плексного изу ч ения м орф ологич еских, ку льту ральных, биохим ич еских и серологич еских свойств (табл. 10). В отлич ие от дру гих бордетелл B.pertussis не растет на простом питательном агаре и не изм еняет ц вета спец иальных питательныхсред. Д ля определения у реаз ы в агглютинац ионные пробирки вносят 0,3 м л 2 % раствора м оч евины, 0,3 м л гу стой су спенз иииспыту ем ой ку льту ры и2-3 капли 0,1 % спиртового раствора ф енолф талеина. В полож ительном слу ч ае ч ерез 20-30 м ин появляется м алиновое окраш ивание, у каз ывающ ее нарасщ епление м оч евины у реаз ой. Серологич еску ю идентиф икац ию бордетелл, диф ф еренц иац ию видов и определение сероваров (серотипирование) проводят в реакц ии агглютинац ии с адсорбированным и ф акторным и сывороткам и. П ри этом исходят из того, ч то

51

антиген (ф актор) 7 является родовым , а антиген (ф актор) 1 прису щ B.pertussis, 14 - B.parapertussis и12 - B.bronchisepticas. Т аблица 10. Д иф ф еренц иальные признакиBordetella spp. П ризнак B.pertussis B.parapertussis Рост: наагаре (простом ) + (корич невая окраска) наагаре с тироз ином + (ярко-корич невая окраска) И з м енение окраски: КУА Бу ро-корич невая аровяного агара П отем нение О браз ование у реаз ы + + Н алич ие антигенов: родового 7 7 видового 1 14

только

B.bronchisepticas + +

+ 7 12

У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) - налич ие признака; (-) - отсу тствие признака; ц иф рам и обоз нач ены ном ераантигенов.

П ри бактериологич еской диагностике коклюш а м ож ет воз никну ть необходим ость диф ф еренц иац ии бордетелл от Н а е т о philus influenzae, который ч асто встреч ается на слизистой оболоч ке дыхательных пу тей и выз ывает пневм онииидру гие воспалительные з аболевания дыхательных пу тей. В отлич ие от бордетелл Н .influenzae растет только на кровяных питательных средах кровяном агаре, "ш околадном " агаре Л евинталя, содерж ащ их гем ин и коэнз им дегидрогеназ ы. Бактериологич еское исследование продолж ается не м енее 5 дней. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки Иммуно химиче с кие ис с л е до ва ния . М етод И Ф : там поном делают два м аз ка, высу ш ивают их на воз ду хе иф иксиру ют на плам ени. О дин м аз ок обрабатывают ф люоресц иру ющ им и противококлюш ным и антителам и, дру гой паракоклюш ным и антителам и. П репараты м икроскопиру ют в люм инесц ентном м икроскопе, просм атривая не м енее 50 полей з рения. О полож ительном рез у льтате свидетельству ет обнару ж ение тем ных бактериальных клеток с ч етким светящ им ся венч иком . Био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с л е до в а ния проводят м етодом П Ц Р. Се роди агнос т и ка. Реакц ии агглютинац ии и РСК прим еняют в основном для ретроспективного подтверж дения диагноз аидиф ф еренц иальной диагностики атипич ных ф орм коклюш а. А гглютинины в кровибольных появляются на 3-4-й неделе з аболевания в титрах 1:20 ивыш е. В у словиях м ассовой вакц инац иидетей против коклюш а диагностич еское з нач ение им еет нарастание титра антител в динам ике болез ни, поэтом у реакц ию ставят повторноч ерез 4-5 дней.

С хем а 9. М ик робиологическ оеисслед ованиепри к ок лю ш еи парак ок лю ш е

52

53

М ик робиологическ ая д иагностик а д иф терии М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : м аз ки со слизистой оболоч ки з ева и носа, пленки с поверхности м индалин и носоглотки. М атериал беру т дву м я ватным и стерильным итам понам и, один из которых использ у ют для приготовления м аз ков, дру гой - для посева. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е (схем а 10). М аз ки окраш ивают по м етоду Грам а, м етиленовым синим по Л еф ф леру , по Н ейссеру . Д ля Corynebacterium diphtheriae характерно налич ие полярно располож енных з ерен волютинаирасполож ение в виде бу квы "V". Corynebacterium pseudodiphtheriae и диф тероиды не им еют з ерен волютинаилисодерж ат их не на конц ах, а по длине палоч ки. К ром е того, сам ибактериирасполагаются в виде ч астокола. П рим енение люм инесц ентной м икроскопиипоз воляет повысить эф ф ективность исследования. П ри этом C.diphtheriae м ож но отлич ить от дру гих коринебактерий по корич нево-красном у свеч ению з ерен волютина, которое ониприобретают после окраскиф люорохром ом кориф осф ином . Ц итоплаз м а этих бактерий дает з еленое илиж елтое свеч ение. О днако C.diphtheriae ч асто изм еняют свою м орф ологию, в ч астности, при санац ии з ева антибиотикам и. В настоящ ее врем я бактериоскопич еское исследование придиф териипрактич ескине использ у ют в связ и с его низкой надеж ностью (высокой ч астотой лож нополож ительных и лож ноотриц ательныхрез у льтатов). Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . Я вляется веду щ им м етодом диагностики диф терии. М атериал з асевают на кровяной агар и элективные питательные среды, содерж ащ ие теллу рит: среда К лау берга (питательный агар с теллу ритом натрия, глиц ерином идеф ибринированной кровью) идр. Н а средах с теллу ритом з адерж ивается рост кокков и дру гой м икроф лоры з ева, ч то способству ет раз м нож ению воз бу дителя диф терии. Н а теллу ритовой среде C.diphtheriae образ у ет ч ерные колонииз а сч ет восстановления теллу рита (биовар gravis ф орм иру ет колониисеровато-ч ерного ц ветас радиальной исч ерч енностью поверхности, напом инающ ие ц ветокм аргаритки, биовар mitis - кру глые выпу клые колонии ч ерного ц вета). Т ипич ные колонии, представленные грам полож ительным и палоч кам и бу лавовидной ф орм ы с характерным располож ением , содерж ащ им из ерна волютина, пересевают на кровяной агар для полу ч ения ч истой ку льту ры. Д ля подтверж дения диагноз а диф терии в перву ю оч ередь необходим о у становить токсигенность выделенной ку льту ры. Н алич ие токсина определяют с пом ощ ью раз лич ных серологич еских реакц ий. П рим еняют такж е м етод П Ц Р, поз воляющ ий обнару ж ить прису тствие у выделенных бактерий tо х-гена, контролиру ющ его синтез диф терийного токсина. О бщ епринятым м етодом определения токсигенности являлась реакц ия прец ипитац ии в агаре с антитоксич еской противодиф терийной сывороткой. М етоды И Ф А и П Ц Р, раз работанные в последние годы, являются более ч у вствительным иипоз воляют полу ч ить рез у льтат в теч ение 3-5 ч .

С хем а 10. М ик робиологическ оеисслед ованиепри д иф терии

54

55

О пределение токсигенности в реакц ии прец ипитац ии: в ч аш ку П етри с питательным агаром , содерж ащ им 15-20 % лош адиной сыворотки, 0,3 % м альтоз ы и 0,03 % ц истина, кладу т полоску ф ильтровальной бу м аги, пропитанну ю антитоксич еской противодиф терийной сывороткой, содерж ащ ей 5000 А Е /м л. Ч аш ку подсу ш ивают при 37 °С в теч ение 30 м ин и з асевают исследу ем ые ку льту ры в виде перпендику лярных к бу м аге ш трихов на расстоянии0,6-0,8 см от края бу м аги. В кач естве контроля использ у ют з аведом о токсигенну ю ку льту ру . П осевы инку биру ют при37 °С до следу ющ его дня. П ри раз м нож ении токсигенной ку льту ры в м есте соединения токсина с антитоксич еским и антителам и в плотной питательной среде образ у ется прец ипитат в виде белыхлиний - "у сов". В ыделенну ю ку льту ру идентиф иц иру ют и диф ф еренц иру ют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по м орф ологич еским особенностям , ку льту ральным и биохим ич еским признакам : пробы на ц истиназ у , у реаз у , ф ерм ентац ия у глеводов идр. (табл. 11).

+ + + -

+ -

++-

+ + +-

+

А гглютинац ия противодиф терийной сыворотки

крахм ала

+ -

У реаз а

глюкоз ы

+ -

Ц истиназ а

сахароз ы

+ + ++-

Т оксигенность

Гем олиз

C.diphtheriae биовар gravis биовар mitis C.xerosis C.pseudodiphtheriticum

Зерна волютина

Т аблица 11. СвойстваC.diphtheriae исходныхс ней коринебактерий В ид Ф ерм ентац ия

+ + -

У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) – налич ие признака у 85-100 % ш там м ов; (-) – отсу тствие признака; (+ -) – налич ие признакау 16-84 % ш там м ов.

В слу ч ае выделения нетоксигенной ку льту ры ставят дополнительну ю реакц ию агглютинац ии с противодиф терийной сывороткой с ц елью выявления видоспец иф ич еского антигенаC.diphtheriae. Д ля определения ц истиназ ы (проба П изу ) в столбик питательного агара с ц истином у колом з асевают исследу ем у ю ку льту ру . П осевы инку биру ют при37 °С до следу ющ его дня. C.diphtheriae выз ывают поч ернение среды по ходу посева (в рез у льтате образ ования су льф ида свинц а), вокру г которого появляется з она корич невого ц вета, а на глу бине 1 см от поверхностиагара в среде образ у ется корич невое "облач ко". Д ля определения у реаз ы (пробаЗакса) готовят спиртовой раствор м оч евины и раствор индикатора - ф енолового красного, которые перед у потреблением см еш ивают в соотнош ении 1:9 и раз ливают по 1-2 м л в агглютинац ионные

56

пробирки. Затем исследу ем ые бактерии петлей вносят и растирают по стенке пробирки. П осле 20-30-м ину тной инку бац иипри37 °С наблюдают расщ епление м оч евины у реаз ой, в рез у льтате ч его средаприобретает красный ц вет. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки . И сследу ем ый м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения tox-генаC.diphtheriae с пом ощ ью П Ц Р. Д иагностическ ие, проф илак тическ иеи лечебныепрепараты Пре ци пи т и рующ и е ант и м е ни нгококковы е с ы ворот ки . П рим еняют с диагностич еской ц елью для обнару ж ения м енингококкового антигена в спинном оз говой ж идкости(м етодом встреч ногоим м у ноэлектроф орез а). Эри т роци т арны е ант и т е льны е м е ни нгококковы е ди агнос т и кум ы . П рим еняют для обнару ж ения антигенов N.meningitidis в спинном оз говой ж идкостив РН ГА . Коклюш ная вакци на. Содерж ит вз весь В.ре rtussis, у битых ф орм алином . П рим еняют для обяз ательной активной спец иф ич еской проф илактикикоклюш а. В ходит в состав А К Д С (адсорбированная коклюш но-диф терийно-столбняч ная вакц ина), которая включ ает такж е оч ищ енные конц ентрированные диф терийный истолбняч ный анатоксины, адсорбированные нагидрате оксидаалюм иния. И м м уноглобули н норм альны й че лове че с ки й. П олу ч ен из плац ентарной или веноз ной крови ч еловека. Содерж ит спец иф ич еские антитела против воз бу дителей м ногих инф екц ионных з аболеваний, в том ч исле воз бу дителя коклюш а. П рим еняют для соз дания пассивного им м у нитета с ц елью проф илактикиилеч ения коклюш а. Агглют и ни рующ и е адс орби рованны е (факт орны е ) с ы ворот ки . П рим еняют для серологич еской диф ф еренц иац иивоз бу дителей коклюш а. Прот и води фт е ри йная ант и т окс и че с кая с ы ворот ка. П олу ч ена из крови лош адей, гиперим м у низированных диф терийным анатоксином , оч ищ ена и конц ентрирована м етодом диаф ерм -3. А ктивность сыворотки изм еняется в м еж ду народных единиц ах. П рим еняют для экстренной проф илактикиилеч ения диф терииз асч ет соз дания пассивного им м у нитета. Агглют и ни рующ ая прот и води фт е ри йная с ы ворот ка (поливалентная и типовые). П рим еняют для диф ф еренц иац ииC.diphtheriae.от диф тероидов. Ант и м и кробны е пре парат ы : пениц иллин и дру гие β-лактам ы, хлорам ф еникол, риф ам пиц ин, су льф анилам иды, тетрац иклин, эритром иц ин. Л абораторная д иагностик а ту берк у леза З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. У каз ать м атериал, подлеж ащ ий исследованию; 2. Бактериоскопич еский м етод: окрасить по м етоду Ц иля-Н ильсена приготовленные из м окроты м аз ки и провести м икроскопич еское исследование. Сделать з аключ ение инам етить ход дальнейш его исследования для подтверж дения бактериоскопич еского диагноз а; 3. Бактериологич еский м етод:

57

а) отм етить характер роста исследу ем ой ку льту ры на среде Л евенш тейна-Й енсена, б) отм етить рез у льтаты ниац иновой пробы, в) определить ч у вствительность м икобактерий к антим икробным препаратам : отм етить налич ие илиотсу тствие ростам икобактерий насреде Л евенш тейна-Й енсена с раз ным и конц ентрац иям и противоту берку лез ных препаратов и сопоставить полу ч енные данные с клинич еским и границ ам и у стойч ивости м икобактерий. Д ать оконч ательное з аключ ение по проведенным исследованиям . М е т о диче с кие ука за ния М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : при легоч ном ту берку лез е м атериалом для исследования являются м окрота, пром ывные воды бронхов, бронхоальвеолярная ж идкость, плевральный экссу дат, пром ывные воды ж елу дка. О браз ц ы м окроты необходим о собирать в теч ение 3-6 дней. П ривнелегоч ном ту берку лез е м атериал для исследования выбирают в з ависим остиот локализац иипораж ений. Э то м ож ет быть кровь, спинном оз говая ж идкость, м оч а, синовиальная ж идкость, тканевые биоптаты (лим ф атич еских у з лов, костного м оз га, печ ени, кож и и подкож ной ж ировой клетч атки и др.), испраж нения. Н естерильный м атериал, контам инированный норм альной м икроф лорой, для предотвращ ения раз м нож ения посторонних бактерий сраз у после отбора долж ен быть пом ещ ен в холодильникихраниться до исследования притем перату ре 4-8 °С. Пе рви чная обработ ка кли ни че с кого м ат е ри ала. Н естерильный м атериал ну ж дается в предварительной деконтам инац ии. Д ля исследования вяз кого и негом огенного м атериала, содерж ащ его тканевой детрит (м окрота, бронхоальвеолярная ж идкость и др.), требу ется такж е произвести проц еду ру раз ж иж ения игом огенизац ии. П оскольку клинич еские образ ц ы обыч но содерж ат м алое колич ество м икобактерий, ж елательно производить обогащ ение исследу ем ого м атериала. О быч но с ц елью гом огенизац ии/деконтам инац ии м атериал обрабатывают м у колитич еским и (N-ац етил-L-ц истеин) и антибактериальным иагентам и(10 % Nа3РO4, 1-2 % NаО Н идр.). Д алее бактерии конц ентриру ют пу тем осаж дения в ходе ц ентриф у гирования. П риэтом клеточ ный детрит ипогибш ие посторонние м икроорганизм ы у даляются в виде су пернатанта. О садок ресу спендиру ют в м иним альном объ ем е стерильной воды или изотонич еского раствора NaCl и использ у ют для дальнейш его исследования. Т каневые биоптаты перед исследованием необходим огом огенизировать. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е (схем а 11). Бактериоскопич еская диагностика ту берку лез аоснована на выявлениив м атериале кислотоу стойч ивых бактерий с пом ощ ью спец иальных слож ных м етодов окраски. В ыявление м икобактерий классич еским м етодом Ц иля-Н ильсенаявляется весьм атру доем кой проц еду рой. К ислотоу стойч ивые бактерии окраш иваются в ярко-красный ц вет, располагаются поодиноч ке или небольш им и скоплениям и. П репараты из м оч и обяз ательно обесц веч ивают не только кислотой, но и спиртом для диф ф еренц иац ииМ .tuberculosis от М .smegmatis, которые м огу т находиться в м оч е з доровых людей. В отлич ие от М .tuberculosis ониобесц веч иваются спиртом .

58

М аз ок исследу ют им м ерсионным м етодом при у велич ении 900х-1000х, просм атривая до 300 полей з рения. Рез у льтат сч итается полож ительным при обнару ж ении 1 или более кислотоу стойч ивых бактерий на 100 полей з рения. О тсу тствие кислотоу стойч ивых бактерий при просм отре 300 полей з рения следу ет трактовать как отриц ательный рез у льтат. О краску по м етоду Ц иляН ильсена прим еняют преим у щ ественно для изу ч ения выделенных ч истых ку льту р. В кач естве основного м етода выявления м икобактерий в м атериале от больного прим еняют люм инесц ентну ю м икроскопию м аз ков, окраш енных ф люорохром ом ау рам ином О по м етоду Боя (последу ющ ая обработка 3 % раствором Н С1 в абсолютном этаноле обеспеч ивает обесц веч ивание некислотоу стойч ивых бактерий). Э тот м етод облегч ает исследование, поскольку поз воляет использ овать м еньш ее у велич ение (250х или 450х) и просм атривать м еньш ее ч исло полей з рения (30-70 в з ависим остиот у велич ения). Н ез ависим о от м етода окраски бактериоскопич еское исследование поз воляет обнару ж ить бактерии при их конц ентрац ии не м енее 5000-10 000 в 1 м л образ ц а, поэтом у отриц ательный рез у льтат не поз воляет исключ ить з аболевание. М икроскопич еское исследование является ориентировоч ным и дает воз м ож ность су дить лиш ь о налич иив м атериале кислотоу стойч ивых бактерий без определения их видовой принадлеж ности. М етод не поз воляет диф ф еренц ировать м икобактерии м еж ду собой и от дру гих кислотоу стойч ивых м икроорганизм ов. Л егоч ные ивнелегоч ные пораж ения в перву ю оч ередь у лиц с им м у нодеф иц итом раз лич ной этиологии м огу т быть выз ваны не только бактериям и ком плекса М .tuberculosis (М Т С ), но такж е и нету берку лез ным и м икобактериям и: бактериям и ком плекса М .а vium (М АС ), М .kansassii, реж е дру гим и представителям и рода М ус о bacterium. П оскольку нету берку лез ные м икобактерииявляются обитателям иокру ж ающ ей среды, з агряз няющ им иводу , проду кты, оним огу т такж е прису тствовать в образ ц е какконтам инанты. Бактериоскопич еское исследование сч итается оптим альным м етодом ориентировоч ной экспресс-диагностикиту берку лез а. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . Сч итается веду щ им м етодом диагностики ту берку лез а. Дл я в ы де л е ния чис т о й кул ьт уры мико ба кт е рии производят посев исследу ем ого м атериала на спец иальные ж идкие илиплотные питательные среды. Д ля выделения м икобактерии из нестерильного м атериала ж елательно использ овать селективные среды, содерж ащ ие антим икробные препараты, подавляющ ие рост посторонних м икробов. Д ля ку льтивирования м икобактерии прим еняют плотные яич ные (среда Л евенш тейна-Й енсена) и агаровые среды, а такж е ряд синтетич еских ж идких питательных сред. Реком енду ется осу щ ествлять посев одноврем енно на плотну ю иж идку ю среду . П осевы необходим о инку бировать в атм осф ере с повыш енным содерж анием СО 2 (5-10 %). М иним альный срок инку бац ии составляет не м енее 8 нед. П осевы первый раз просм атривают на3-5-й день после внесения м атериала, далее - 2 раз а в неделю. Н ач иная с 5-й недели ку льтивирования - 1 раз в неделю. К у льту ры М .tuberculosis им еют вид сероватого или светло-крем ового м орщ инистого или крош кообраз ного су хогоналета.

С хем а 11. М ик робиологическ оеисслед ованиепри ту берк у лезе

59

60

Е щ е до появления видим ых невоору ж енным глаз ом м акроскопич еских колоний на плотных средах с пом ощ ью м икроскопии м огу т быть обнару ж ены м икроколонии. О тсу тствие м икробного роста ч ерез 8 нед. ку льтивирования следу ет расц енивать какотриц ательный рез у льтат. В последнее врем я ш ирокое прим енение наш ли раз лич ные ком м ерч еские систем ы ку льтивирования м икобактерии, использ у ющ ие как ж идкие, так и плотные питательные среды, а такж е раз лич ные высокоч у вствительные способы автом атизированного контроля роста бактерий на основанииих м етаболич еской активности- по потреблению ком понентов питательной среды и/илиобраз ованию проду ктов ж изнедеятельности. Э то поз воляет обнару ж ить прису тствие бактерий з нач ительно раньш е появления видим ых признаков роста. И спольз ование у каз анных м етодов контроля ростапоз воляет в больш инстве слу ч аев су щ ественно у скорить проц есс выделения ч истой ку льту ры м икобактерии. П олож ительный рез у льтат м ож ет быть полу ч ен у ж е ч ерез 3-5 дней, средний срок составляет 7-14 дней. О днако, у ч итывая вероятну ю низку ю конц ентрац ию воз бу дителя в исследу ем ом м атериале, м аксим альный срок инку бац ии достаточ но велик рез у льтат бактериологич еского исследования сч итается отриц ательным при отсу тствии признаков роста в теч ение 40 дней. В слу ч ае регистрац ии полож ительного рез у льтата ку льтивирование продолж ают до тех пор, когда колич ество бактерий в среде достигает определенной конц ентрац ии, необходим ой для проведения дальнейш его изу ч ения выделенной ч истой ку льту ры идентиф икац ии иопределения ч у вствительности к антим икробным препаратам . Среднее врем я ку льтивирования составляет 9-20 дней. Бактериологич еский м етод дает полож ительный рез у льтат приналич иине м енее 10-30 ж изнеспособных м икобактериив 1 м л исследу ем ого м атериалапосле обогащ ения. О триц ательный рез у льтат в ряде слу ч аев м ож ет быть обу словлен оч ень низким содерж анием воз бу дителя в клинич еском образ ц е. Иде нт ифика ция чис т о й кул ьт уры . В ыделенные ч истые ку льту ры м икобактерий обыч но идентиф иц иру ют до вида. Т радиц ионные м етоды идентиф икац ии основаны на изу ч ении достаточ но больш ого ч исла признаков, включ ая скорость роста, м орф ологию колоний, способность к пигм ентробраз ованию, проду кц ии никотиновой кислоты, восстановлению нитратов ителлу ритакалия, гидролиз у твина-80, м оч евины (у реаз ная активность), пираз инам ида до пираз иновой кислоты (пираз инам идаз ная активность), перекиси водородаприповыш енной тем перату ре (терм оу стойч ивая каталаз ная активность) и некоторых дру гих. Н а основании этих признаков м ож но одноз нач но идентиф иц ировать представителей основных видов М ус о bacterium spp, выз ывающ их з аболевания ч еловека. П роц еду ра идентиф икац ии по ф енотипич еским признакам м ож ет з аним ать до 3 нед. Спец иф ич ность м етода доставляет 100%. Способность исследу ем ой ку льту ры синтез ировать никотинову ю кислоту (ниа цино ва я про ба К о нно ) является одним из важ ных признаков, с пом ощ ью которого у дается отлич ить М .tuberculosis, хорош о синтез иру ющ ие никотинову ю кислоту , от М .bovis, образ у ющ их ее в м иним альных колич ествах. Д ля

61

определения ниац ина к ку льту ре м икобактерий в ж идкой питательной среде добавляют 1 м л раствораК CN и1 м л 5 % растворахлорам ина. П риналич ии ниац ина ч ерез несколько м ину т появляется ярко-ж елтая окраска. Д ля нейтрализац ииК CN после у ч ета рез у льтатов реакц иив пробиркидобавляют 3-5 м л10 % растворагидрокарбонатанатрия. П ри выращ ивании м икобактерий на предм етных стеклах (ме т о д микро кул ьт ур П ра йс а ) виру лентные ш там м ы характеризу ются ростом в виде ж гу тов или кос з а сч ет образ ования корд-ф актора. Н а нескольких предм етных стеклах делают толстые м аз ки, высу ш ивают, обрабатывают несколько м ину т 2-6 % серной кислотой и нейтрализу ют. Затем стекла опу скают во ф лаконы с гем олизированной ц итратной кровью в раз ведении1:4-1:8 иставят в терм остат. Ч ерез 7-14 дней извлекают стекла, ф иксиру ют препарат, окраш ивают по м етоду Ц иля-Н ильсенаим икроскопиру ют. М е т о д гибридиза ции ДН К ("ДН К -зо ндо в ") прим еняют для быстрой идентиф икац ии ч истой ку льту ры м икобактерий. И спольз ование Д Н К -з ондов поз воляет полу ч ить оконч ательный ответ в теч ение су ток после з аверш ения ку льтивирования. Н асегодня су щ еству ют Д Н К -з онды для идентиф икац иитолько наиболее клинич ески з нач им ых и ш ироко распространенных м икобактерий, выз ывающ их з аболевания ч еловека. И дентиф икац ия м икобактерий по липидном у составу (хе мо иде нт ифика ция ) с пом ощ ью газ ож идкостной или ж идкостной хром атограф ии. М етод поз воляет осу щ ествить идентиф икац ию любого из известных 50 видов м икобактерий в теч ение 4 ч . О сновным иф акторам и, огранич ивающ им иего ш ирокое прим енение, являются необходим ость использ ования дорогостоящ его обору дования и технич еская слож ность интерпретац иирез у льтатов. О пре де л е ние чувс т в ит е л ьно с т и во збудит е л я к а нт ибио т ика м является обяз ательным этапом диагностикиту берку лез а иосновой наз нач ения адекватной терапии. Т радиц ионно определение ч у вствительности м икобактерий осу щ ествляют м етодом серийных раз ведений препарата в питательной среде. И сследование м ож ет з аним ать более 3 нед. (до 3 м ес.), ч то обу словлено ч рез выч айнонизкой скоростью ростарез истентныхвариантов. П рим енение соврем енных м олеку лярно-генетич еские м етодов определения ч у вствительности м икобактерий к антим икробным препаратам поз воляют обнару ж ить налич ие у воз бу дителя генов, контролиру ющ их рез истентность к определенном у препарату . У ж е раз работаны тест-систем ы на основе П Ц Р для определения рез истентностикпрепаратам гру ппы риф ам пиц инов. Би опроба. П рим енялиранее для диагностикиту берку лез а: ч исту ю ку льту ру М .tuberculosis выделяли из органов ж ивотного, з араж енного исследу ем ым м атериалом . В настоящ ее врем я м етодпрактич ескине прим еняется. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки . Био химиче с кие и мо л е кул я рно био л о гиче с кие ис сл е до ва ния . М етод П Ц Р поз воляет обнару ж ить налич ие видоспец иф ич еских ну клеиновых кислот м икобактерий непосредственно в клинич еском образ ц е после обогащ ения. И сследование з аним ает около 4 ч . Су щ еству ющ ие ком м ерч еские тест-систем ы поз воляют выявить в образ ц е прису тствие М Т С - бактерий ком плекса М .tuberculosis (М .tuberculosis,

62

М .bovis/BCG, М .africanum) и надеж но диф ф еренц ировать их от нету берку лез ных м икобактерий. Рез у льтаты П Ц Р-диагностики реком енду ется интерпретировать в з ависим остиот данных бактериоскопич еского исследования. П олу ч ение полож ительного ответа бактериоскопич еским м етодом и П Ц Р поз воляет диагностировать ту берку лез иреком ендовать нем едленное наз нач ение противоту берку лез ных препаратов по классич еской схем е. О триц ательный рез у льтат П Ц Р приналич иикислотоу стойч ивыхм икобактерий в м аз кахпоз воляет исключ ить прису тствие М Т С и реком ендовать наз нач ение антим икробных препаратов, активных в отнош ениинету берку лез ныхм икобактерий. Се роди агнос т и ка. А нтитела к антигенам воз бу дителя в крови пац иентов м ож но обнару ж ить с пом ощ ью РСК , РН ГА и дру гих серологич еских реакц ий. Н еобходим о им еть в виду , ч то полож ительные рез у льтаты отм еч аются не только приактивном ту берку лез ном проц ессе в организм е, но такж е приинф иц ировании М .tuberculosis ивакц инац ии, поэтом у диагностич еского з нач ения не им еют. Кож но-алле рги че с кая проба. Ставится с ту берку лином - оч ищ енной белковой ф ракц ией, полу ч енной из ф ильтратабу льонной ку льту ры М .tuberculosis. И спольз у ется для оц енки теч ения ту берку лез ного проц есса, определения эф ф ективности вакц инац ии и отбора контингентов для ревакц инац ии против ту берку лез а. Т у берку лин вводят вну трикож но в строго определенной доз ировке (реакц ия М анту ). Рез у льтаты у ч итывают ч ерез 24-48 ч . Д иагностическ ие, проф илак тическ иеи лечебныепрепараты Тубе ркули н с ух ой очи щ е нны й (Р Р D). П олу ч ен из ф ильтрата бу льонной ку льту ры м икобактерии пу тем добавления хим ич еских вещ еств, осаж дающ их белок, с последу ющ ей оч исткой и лиоф илизац ией. П рим еняют для постановки кож но-аллергич еской пробы. В акци на ВСG. Ж ивая лиоф ильно высу ш енная ку льту ра авиру лентного ш там м а М .bovis BCG. П рим еняется вну трикож но для активной спец иф ич еской проф илактикиту берку лез а. Ант и би от и ки . Д ля леч ения ту берку лез а обыч но использ у ют ком бинац ии препаратов (не м енее трех препаратов раз лич ных гру пп) с у ч етом ч у вствительностиМ .tuberculosis иклинич еской характеристикиз аболевания. О С Н О В Н А Я Л И Т ЕР А Т УР А Борисов Л .Б. М едиц инская м икробиология, виру сология, им м у нология / Л .Б. Борисов. – 2-е изд. доп. иперераб. – М .: М ед.инф орм . агенство, 2001. – 734 с. Борисов Л .Б. Ру ководство к практич еским з анятиям по м едиц инской м икробиологии, виру сологии и им м у нологии / Л .Б. Борисов, Б.Н . К оз ьм инСоколов, И .С. Ф рейдлин - М .: М едиц ина, 1994. – 240 c. Ру ководство к практич еским з анятиям по м едиц инской м икробиологии, виру сологиииим м у нологии/ под ред. В .В . Т ец а. – И з д. 2-е, перераб. идоп. – М .: М едиц ина, 2002. – 352 с. Эл е кт ро нны й ка т а ло гН а учно й библ ио т е киВГУ – (http://www.lib.vsu.ru)

63

Составители: Рахм ановаТ атьянаИ вановна Сем енихинаА настасия В ладим ировна Н ехаеваГалинаИ вановна П оповаТ атьянаН иколаевна Редактор Т ихом ироваО .А .

64