М И Н И СТ Е РСТ В О О БРА ЗО В А Н И Я И Н А У К И РО ССИ Й СК О Й Ф Е Д Е РА Ц И И В О РО Н Е Ж СК И Й ГО СУ Д А РСТ В...
31 downloads
185 Views
1MB Size
Report
This content was uploaded by our users and we assume good faith they have the permission to share this book. If you own the copyright to this book and it is wrongfully on our website, we offer a simple DMCA procedure to remove your content from our site. Start by pressing the button below!
Report copyright / DMCA form
М И Н И СТ Е РСТ В О О БРА ЗО В А Н И Я И Н А У К И РО ССИ Й СК О Й Ф Е Д Е РА Ц И И В О РО Н Е Ж СК И Й ГО СУ Д А РСТ В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РСИ Т Е Т
М икробиологич еская диагностикараневых, гнойно-воспалительных, киш еч ных ивоз ду ш но-капельныхинф екц ий
П рактич еское пособие по спец иальностям «Ф арм ац ия» (060108) «Биология» (020201)
В оронеж 2004
2
У тверж дено нау ч но-м етодич еским советом ф арм ац евтич еского ф аку льтета, протокол № 1 от 20.01.2004; биолого-поч венного ф аку льтета, протокол № 20 от 11.06.2004
Составители: Рахм ановаТ .И . Сем енихинаА .В . Н ехаеваГ.И . П оповаТ .Н . Н ау ч ный редактор: доц . Грабович М .Ю . П рактич еское пособие подготовлено на каф едре аналитич еской и м едиц инской биохим ии и м икробиологии биолого-поч венного ф аку льтета В оронеж ского госу дарственного у ниверситета. Реком енду ется для сту дентов I ку рсаотделения средне-спец иального образ ования и II ку рса отделения высш его образ ования ф арм ац евтич еского ф аку льтета, сту дентов III иIV ку рсов биолого-поч венного ф аку льтета.
3
С О Д ЕР Ж А Н И Е В В ЕД ЕН И Е М ЕТ О Д Ы К Л И Н И К О -Д И А Г Н О С Т И Ч ЕС К И Х М И К Р О БИ О Л О Г И Ч ЕС К И Х И С С Л ЕД О В А Н И Й … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 4 В О ЗБУД И Т ЕЛ И Г Н О Й Н О -В О С ПА Л И Т ЕЛ ЬН Ы Х И Р А Н ЕВ Ы Х И Н Ф ЕК ЦИ Й … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 11 Л абораторная диагностика гнойно-воспалительных з аболеваний, выз ванных аэробным ибактериям и… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...11 Л абораторная диагностикаанаэробных инф екц ий… … … … … … … … … … … ..20 В О ЗБУД И Т ЕЛ И БА К Т ЕР И А Л ЬН Ы Х К И Ш ЕЧ Н Ы Х И Н Ф ЕК ЦИ Й … … … ...26 Л абораторная диагностикаэш ерихиоз ов идизентерии… … … … … … … … … ..26 Л абораторная диагностика брюш ного тиф а, паратиф ов и сальм онелез ов. Д исбактериоз … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 31 Л абораторная диагностикахолеры… … … … … … … … … … … … … … … … … … 39 Л абораторная диагностика пищ евых токсикоинф екц ий, интоксикац ий бактериальной природы… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..43 В О ЗБУД И Т ЕЛ И БА К Т ЕР И А Л ЬН Ы Х Р ЕС ПИ Р А Т О Р Н Ы Х И Д Р УГ И Х В О ЗД УШ Н О -К А ПЕЛ ЬН Ы Х И Н Ф ЕК ЦИ Й … … … … … … … … … … … … … … ...45 Л абораторная диагностикам енингококковой инф екц ии, коклюш аи диф терии… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...47 Л абораторная диагностикату берку лез а… … … … … … … … … … … … … … … … 56 О С Н О В Н А Я Л И Т ЕР А Т УР А … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .62 В В ЕД ЕН И Е В данном пособии излож ена лабораторная диагностика бактериальных инф екц ий, проводим ая для у становления этиологич еской и патогенетич еской роливыделяем ых из организм абольного м икроорганизм ов, выбораэф ф ективных им м у нологич ескихихим иотерапевтич ескихпрепаратов. П ри изу ч ении ч астной м икробиологии отдельных з аболеваний особое з нач ение им еют правильный выбор м атериалов для лабораторного исследования, сроки исследования, прим енение адекватных м етодов, оц енка полу ч енных рез у льтатов, выбор м етодов леч ения и спец иф ич еской проф илактики. П ри анализе рез у льтатов лабораторных исследований для постановкиоконч ательного диагноз а з аболеваний необходим о, преж де всего, определить воз м ож ну ю роль патогенных м икроорганизм ов, оц енить роль у словно-патогенной м икроф лоры и определить ч у вствительность м икроорганизм ов к антибиотикам . Рез у льтаты исследований использ у ются для проведения эпидем иологич еского анализа з аболеваем ости с ц елью у становления источ ника инф екц ии, пу тей ее передач и, выявления м икробоносителей идр. Рассм атриваем ые в данном пособии м икроорганизм ы сгру ппированы с у ч етом патогенетич еских и эпидем иологич еских признаков выз ываем ых им и инф екц ий: раневых, гнойных, киш еч ных ивоз ду ш но-капельных.
4
М ЕТ О Д Ы К Л И Н И К О -Д И А Г Н О С Т И Ч ЕС К И Х М И К Р О БИ О Л О Г И Ч ЕС К И Х И С С Л ЕД О В А Н И Й О сновной з адач ей клинико-диагностич еских м икробиологич еских исследований является у становление этиологич еского агента инф екц ионного з аболевания - м икроорганизм а-воз бу дителя. Д ля реш ения этой з адач ииспольз у ют раз лич ные диагностич еские м етоды, которые м ож но подраз делить на две гру ппы в з ависим остиот подхода к определению воз бу дителя. П ервая гру ппа включ ает м етоды, направленные на обнару ж ение прису тствия в м атериале от больного сам ого воз бу дителя, а такж е его антигенов, ну клеиновых кислот (Н К ), характерных проду ктов его ж изнедеятельности или органич еских соединений, входящ их в его состав. В торая гру ппа диагностич еских м етодов основана на выявлении спец иф ич еской им м у нной реакц ии на данного воз бу дителя со стороны м акроорганизм а: гу м оральной - антител против воз бу дителя (серодиагностика) иликлеточ ной - аллергодиагностика. Су щ еству ющ ие м етоды диагностики отлич аются дру г от дру га тру доем костью, срокам и проведения исследований, ч у вствительностью и спец иф ич ностью, а такж е инф орм ативностью полу ч енных данных. В ыбор м етодов исследования з ависит от предварительного клинич еского диагноз а з аболевания, его сроков и определяется биологич еским и свойствам и м икроорганизм а-воз бу дителя и особенностям и его вз аим одействия с м акроорганизм ом в ходе инф екц ионногопроц есса. З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. О з наком иться с основным и правилам и выбора, вз ятия и транспортировки исследу ем ого м атериала. Заполнить типовые бланки для направления м атериалав лабораторию. 2. И з у ч ить схем ы и м етоды м икробиологич еской диагностики основных гру пп м икроорганизм ов. П ри оц енке рез у льтатов лабораторных исследований определить патогенные и у словно-патогенные м икроорганизм ы. М е т о диче с кие ука за ния О сновные правила взятия и направления м атериала в к линик од иагностическ у ю м ик робиологическ у ю лабораторию Рез у льтаты м икробиологич еских исследований во м ногом з ависят от правильного выбора м атериала для исследования, соблюдения всех правил его полу ч ения и направления в лабораторию. В ыбор м атериала определяется клинич еской картиной з аболевания, предполагаем ой локализац ией воз бу дителя в организм е на данном этапе инф екц ионного проц есса ипу тям иего выделения в окру ж ающ у ю среду . 1. М атериал беру т в ранние срокиз аболевания, до нач ала антим икробной терапии. Э то повыш ает вероятность выделения воз бу дителя. Следу ет исключ ить
5
попадание в образ ец антибиотиков, антисептиков, дез инф ектантов, а такж е ч астиц ваты, содерж ащ ей свободные ж ирные кислоты. В аж ным у словием является достаточ ное колич ество м атериала для исследования (наприм ер, не м енее 5-10 м л крови, 3-5 м лм оч иит.д.). 2. Л юбой клинич еский м атериал для м икробиологич еских исследований рассм атривается как потенц иально опасный для ч еловека. П оэтом у при полу ч ении, хранении и транспортировке м атериала в лабораторию строго соблюдают правилатехникибактериологич еской без опасности. 3. М атериал собирают, соблюдая правила асептики, для преду преж дения его воз м ож ной контам инац ии норм альной м икроф лорой организм а больного и м икроорганизм ам и окру ж ающ ей среды. П осле вз ятия м атериала его в м аксим ально короткие срокидоставляют в лабораторию. П риотсу тствиитакой воз м ож ности м атериал сохраняют непродолж ительное врем я, соблюдая определенные правила. Способ сохранения м атериала определяется свойствам и предполагаем ого воз бу дителя и сам ого м атериала. В больш инстве слу ч аев воз м ож но непродолж ительное хранение в холодильнике при тем перату ре 4 °С. П ри необходим ости длительного хранения м атериал м ож но подвергну ть глу боком у з ам ораж иванию притем перату ре -20 °С иниж е. Е слипредполагаем ый м икробвоз бу дитель ч у вствителен к действию низких тем перату р, м атериал необходим о сохранять в терм остате при37 °С. Д ля подавления раз м нож ения сопу тству ющ ей м икроф лоры м ож но использ овать антим икробные препараты. 4. М атериал транспортиру ют в спец иальных биксах, пеналах или м еталлич еских контейнерах, которые после использ ования подвергают дез инф екц ии. 5. Д ля серологич еского исследования у больного натощ ак беру т кровь в колич естве 5-6 м л из локтевой вены при соблюдении правил асептики. К ровь ставят в терм остат на 30-60 м ин; образ овавш ийся кровяной сгу сток отделяют от стенкистерильной стеклянной палоч кой иоставляют м атериал в холодильнике на 18-20 ч . О тстоявш у юся сыворотку осторож но сливают в стерильну ю пробирку ; в слу ч ае прим есиэритроц итов ее ц ентриф у гиру ют. Сыворотка м ож ет храниться в стерильных у словиях в холодильнике до 1 м ес. Д ля более длительного хранения ее з ам ораж ивают притем перату ре от -20 до-70 °С. 6. В м икробиологич еской лаборатории все остатки патологич еского м атериалаподлеж ат у нич тож ению (пу тем автоклавирования). 7. В се м атериалы, направленные в лабораторию, долж ны им еть сопроводительный доку м ент - направление на спец иальном бланке, где у каз аны ф ам илия, им я, отч ество больного, воз раст, вид м атериала, дата вз ятия, предполагаем ый клинич еский диагноз идру гие сведения. М етод ы к линик о-д иагностическ их м ик робиологическ их исслед ований М е т о ды о бна руже ния в о збудит е л я в ма т е риа л е о т бо л ьно го М икро с ко пиче с кие ме т о ды . М икроскопич еские м етоды прим еняют для обнару ж ения воз бу дителей непосредственнов исследу ем ом м атериале.
6
Д ля выявления бактерий (бактериоскопич еские исследования), а такж е грибов и простейш их прим еняют световые м етоды м икроскопии окраш енных или нативных препаратов, приготовленных из м атериала, полу ч енного от больного. П реим у щ ество м икроскопич еских исследований состоит в быстроте (осу щ ествление требу ет не более 30-60 м ин), простоте идеш евизне. О сновным недостатком м етода является низкая спец иф ич ность - невоз м ож ность видовой идентиф икац ии обнару ж енных м икроорганизм ов, а в ряде слу ч аев - их диф ф еренц иац ии м еж ду собой (наприм ер, эш ерихий, сальм онелл и ш игелл). Ч у вствительность такж е невысока: м икроскопич еский м етод поз воляет 6 обнару ж ить воз бу дителя приего конц ентрац иине м енее 10 м икробных клеток в 1 м лили1 гисследу ем огом атериала. В больш инстве слу ч аев м икроскопич еский м етод им еет ориентировоч ное з нач ение и поз воляет полу ч ить предварительные данные о м икробах, прису тству ющ их в м атериале, инам етить пу тидальнейш их исследований. В м есте с тем при некоторых инф екц иях диагностич еская ц енность м икроскопич еского исследования весьм а велика и является основанием для постановки оконч ательного диагноз а з аболевания, наприм ер, воз вратного тиф а, гонореи, дерм атом икоз ов идр. Н еобходим о пом нить, ч то некоторые бактерии (хлам идии, м икоплаз м ы) им еют м алые раз м еры, леж ащ ие з а пределам и раз реш ающ ей способности световой м икроскопии, ине м огу т быть выявлены с пом ощ ью этихм етодов. В иру соскопич еские исследования осу щ ествляют с использ ованием электронной м икроскопии, ч то в соч етаниис ком пьютерным исистем ам ианализа изображ ений поз воляет осу щ ествлять предварительну ю идентиф икац ию виру сов по м орф ологии. Д остоинство м етода: воз м ож ность обнару ж ения ранее неизвестных виру сов. Ч у вствительность аналогич набактериоскопич еском у . М икро био ло гиче с кие ме т о ды . О снованы на выделении ч истой ку льту ры воз бу дителя из м атериала, полу ч енного от больного, и ее последу ющ ей идентиф икац ии. М икробиологич еские м етоды отлич аются высокой ч у вствительностью и спец иф ич ностью. Располагая ч истой ку льту рой воз бу дителя, м ож но определить его родову ю и видову ю принадлеж ность и осу щ ествить вну тривидовое типирование, обнару ж ить ф акторы виру лентности, а такж е определить ч у вствительность к антибиотикам , ч то необходим о для рац ионального выбораэтиотропной терапии. Д ля эпидем иологич еского анализа вспыш ек инф екц ионных з аболеваний проводят типирование ку льту р воз бу дителей, выделенных от раз ных больных и из внеш них объ ектов - вероятных источ ников з араж ения (вода, пищ евые проду кты и т.д.), т.е. определение их биовара: серовара (серотипирование), ф аговара(ф аготипирование) ит.д. К ром е того, м икробиологич еские исследования проводят для выявления носительства патогенных м икробов среди детей и вз рослых. Бактериологич еское исследование является веду щ им в диагностике больш инства бактериальных инф екц ий. Т ру дностим етода м огу т быть связ аны с низкой скоростью раз м нож ения бактерий-воз бу дителей, слож ным и ростовым и
7
потребностям и и требовательностью к у словиям ку льтивирования. О днако только выделение ч истой ку льту ры воз бу дителя из м атериала от больного при исключ енииконтам инац ииим еет абсолютное диагностич еское з нач ение. М икологич еские исследования осу щ ествляют реж е, ч ем бактериологич еские, поскольку м икроскопич еская диагностика м икоз ов достаточ но надеж на. М икологич еские исследования являются обяз ательным ипри диагностике кандидоз ов, атакж е глу боких м икоз ов. В иру сологич еский м етод является наиболее достоверным для диагностики виру сных инф екц ий. О днако его прим енение огранич ивается тру доем костью. О собое з нач ение виру сологич еский м етод приобретает в слу ч ае необходим ости оц енки ч у вствительности воз бу дителя к противовиру сным препаратам . В ряде слу ч аев виру сологич еский м етод использ у ют для ретроспективной диагностики виру сных инф екц ий. В се м икробиологич еские м етоды им еют определяющ ее з нач ение в лабораторной диагностике инф екц ионных з аболеваний, являются наиболее инф орм ативным и и достоверным и. К ч ислу недостатков м ож но отнести длительность и отсу тствие м етодов ку льтивирования некоторых м икробов (наприм ер, воз бу дителей сиф илисаилепры). Био л о гиче с кие ме т о ды (био про бы ). Биопробу осу щ ествляют пу тем з араж ения лабораторных ж ивотных м атериалом , полу ч енным от больного. Э тот м етод прим еняют для выделения ч истой ку льту ры воз бу дителя в тех слу ч аях, когда м икроорганизм ы не расту т или плохо ку льтивиру ются, когда м икробиологич еские м етоды не дают одноз нач но полож ительного рез у льтата, а такж е для диф ф еренц иац ии патогенных м икроорганизм ов и определения их виру лентности. Д иф ф еренц иац ия воз бу дителей основана на неодинаковой ч у вствительности раз ных лабораторных ж ивотных к определенным м икроорганизм ам . В настоящ ее врем я биопробы прим еняют только в слу ч ае крайней необходим ости, ч то определяется в перву ю оч ередь гу м анным отнош ением к ж ивотным , а такж е связ ано с повыш енным риском з араж ения персоналадиагностич еской лаборатории. И м м унох и м и че с ки е м е т оды ди агнос т и ки : (м е т оды обнаруж е ни я ант и ге нов возбуди т е ля в м ат е ри але от больного) М е т о д иммуно флюо ре с це нции (ИФ ). Д ает воз м ож ность обнару ж ить в м атериале от больного антигены м икроба с пом ощ ью спец иф ич еских антител, м еч енных ф люорохром ам и. Э тот м етод поз воляет выявлять иидентиф иц ировать по антигенной стру кту ре воз бу дителей в м атериале, содерж ащ ем раз нообраз ну ю м икроф лору (наприм ер, в испраж нениях), а такж е обнару ж ивать виру сные антигены в з араж енных клетках. В настоящ ее врем я им м у ноф люоресц ентный м етод ш ироко прим еняют для обнару ж ения раз нообраз ных м икроорганизм ов в патологич еском м атериале. Иммуно эле кт ро нна я микро с ко пия (ИЭМ ). П оз воляет з нач ительно повысить ч у вствительность и спец иф ич ность виру соскопич еского м етода. И сследу ем ый м атериал, содерж ащ ий свободные виру сные ч астиц ы, обрабатывают спец иф ич еским и антителам и. О браз овавш иеся им м у нные ком плексы осаж дают
8
высокоскоростным ц ентриф у гированием и агрегаты виру сных ч астиц выявляют с пом ощ ью электронной м икроскопии. Су щ еству ют такж е твердоф аз ные м етоды И Э М : спец иф ич еские антитела ф иксиру ют на спец иальных сетках для электронной м икроскопии, которые з атем обрабатывают исследу ем ым м атериалом . В иру сные ч астиц ы спец иф ич ески связ ываются с антителам и, после ч его их выявляют с пом ощ ью электронной м икроскопии. В ряде слу ч аев прим еняют антитела, м еч енные ч астиц ам из олота. Другие с е ро ло гиче с кие ре а кции. Растворим ые антигены раз лич ных воз бу дителей м огу т быть обнару ж ены в раз лич ных биологич еских ж идкостях больного с пом ощ ью серологич еских реакц ий. Н аиболее ч асто прим еняют им м у ноф ерм ентный (И Ф А ) ирадиоим м у нный (РИ А ) анализ в связ ис их высокой ч у вствительностью, реж е использ у ют м етоды прец ипитац ии в геле и непрям ой агглютинац ии. Би ох и м и че с ки е и м оле кулярно-би ологи че с ки е м е т оды ди агнос т и ки М е т о д га зо жидко с т но й хро ма т о гра фии (ГЖ Х). П оз воляет раз делять слож ные см еси органич еских соединений. М етод использ у ют для обнару ж ения проду ктов ж изнедеятельности м икроорганизм ов в исследу ем ом м атериале. П ринц ип м етода основан на раз лич ной скорости движ ения соединений, растворенных в инертном газ е (подвиж ной ф аз е), ч ерез раз огрету ю колонку , з аполненну ю ж идким исм олам и(неподвиж ная ф аз а). Н авыходе колонкиим еется детектор, регистриру ющ ий прису тствие соединения. И дентиф икац ию вещ еств производят пу тем сравнения со стандартам и. М е т о ды о бна руже ния нукл е ино в ы х кис ло т во збудит е л я . Н у клеиновые кислоты (Н К ) воз бу дителя м ож но обнару ж ить в исследу ем ом м атериале от больного с пом ощ ью м етодов гибридизац ии Н К (Д Н К -з ондов) и полим ераз ной ц епной реакц ии - П Ц Р. Э ти м етоды прим еняют преим у щ ественно для обнару ж ения плохо- или неку льтивиру ем ых воз бу дителей, прису тству ющ их в м атериале в м алых колич ествах (В И Ч , виру с гепатита В , М .tuberculosus идр.) в связ и с их высокой ч у вствительностью: м етод ну клеиновых "з ондов" поз воляет -10 обнару ж ивать Н К воз бу дителя в конц ентрац ии 10 г/м л; П Ц Р теоретич ески поз воляет обнару ж ить единич ные копии Н К . М етод "з ондов" является высокоспец иф ич ным . П рииспольз ованииП Ц Р су щ еству ет высокая вероятность полу ч ения лож нополож ительной реакц ии, ч то требу ет квалиф иц ированной интерпретац ии полу ч енных рез у льтатов. Н еобходим о такж е пом нить о воз м ож ности контам инац ии м атериала посторонним и Н К . П Ц Р рац ионально использ овать в кач естве экспресс-м етода для постановки предварительного диагноз а, ну ж дающ егося в обяз ательном подтверж дениис пом ощ ью дру гих более достоверныхдиагностич еских исследований. Се роди агнос т и ка и алле ргоди агнос т и ка С е ро диа гно с т ика . М етод основан на обнару ж ении антител в сыворотке кровибольного иопределениидинам икиих нарастания в ходе з аболевания. Д ля серодиагностики прим еняют раз лич ные им м у нологич еские реакц ии (агглютинац ии, связ ывания ком плем ента, непрям ой гем агглютинац ии и др.). В
9
кач естве стандартных антигенов использ у ют ж ивые ку льту ры м икроорганизм ов или диагностику м ы - у битые вз веси м икроорганизм ов или экстракты из них, полу ч енные хим ич еским пу тем . Серодиагностич еские исследования ч асто проводят и для эпидем иологич еского анализаинф екц ионной з аболеваем ости, атакж е для оц енки эф ф ективностивакц инопроф илактики. П ри серодиагностич еских исследованиях необходим о у ч итывать диагностич еский титр обнару ж енных антител, т.е. такое раз ведение исследу ем ой сыворотки, нач иная с которого полож ительная реакц ия им еет диагностич еское з нач ение. Более высоку ю инф орм ативность дают серологич еские исследования парных сывороток крови больного, вз ятых в нач але болез ни и ч ерез раз ные пром еж у тки врем ени в ходе ее раз вития. Д иагностич еское з нач ение им еет нарастание титрав 4 раз аиболее в динам ике з аболевания. Ал л е рго диа гно с т ика . К ож но-аллергич еские пробы прим еняют для выявления гиперч у вствительностик раз лич ного родаантигенам (аллергенам ) при диагностике ряда инф екц ионных з аболеваний (ту берку лез , бру ц еллез , ту лярем ия идр.), атакж е атопий идру гих неинф екц ионныхаллергич еских состояний. Правила биологическ ой безопасности при работеспатогенным и м ик робам и В з ависим ости от степени патогенности и контагиоз ности воз бу дителей принято выделять ч етыре у ровня биологич еской опасности и соответству ющ их м ероприятий, необходим ыхдля преду преж дения з араж ения в лаборатории. П ервый у ровень (работас непатогенным им икроорганизм ам и). Н еобходим о соблюдение стандартных правил. В торой у ровень (работас низковиру лентным им икроорганизм ам и). К ч ислу дополнительных правил и м ероприятий относятся использ ование лабораторной одеж ды из ащ итных перч аток; обяз ательное обез з араж ивание всех з агряз ненных отходов; огранич ение досту па в лабораторию. Д ля предотвращ ения попадания м икробов в воз ду х рабоч его пом ещ ения выполнение м еханич еских м анипу ляц ий, сопряж енных с высокой вероятностью распыления м икроорганизм ов, необходим о осу щ ествлять в спец иализированных з акрытых легкодез инф иц иру ем ых настольныхбоксах. Т ретий у ровень (работа с высоковиру лентным и м икроорганизм ам и). К ч ислу дополнительных правил и м ероприятий относятся использ ование спец иальной з ащ итной лабораторной одеж ды; контроль досту па в лабораторию. В се м анипу ляц ии с патологич еским м атериалом необходим о осу щ ествлять в спец иализированныхбоксах. Ч етвертый у ровень (работа с воз бу дителям и особо опасных инф екц ий (О О И ). Раз реш ена исключ ительно в спец иализированных реж им ных лабораториях, им еющ их обору дование, необходим ое для эф ф ективной з ащ иты от патогенных м икробов, их контроля и у нич тож ения. К ч ислу дополнительных правил и м ероприятий относятся налич ие отдельных пом ещ ений для см ены лабораторной одеж ды и ду ш евых, обяз ательное обез з араж ивание всех отходов лаборатории. В се м анипу ляц ии с патологич еским м атериалом необходим о
10
осу щ ествлять в спец иализированных настольных систем ам истерилизац иивоз ду ха.
боксах,
снабж енных
О ценк а резу льтатовк линик о-д иагностическ их исслед ований О бна руже ние па т о ге нны х микро о рга низмо в, являющ ихся воз бу дителям и з аболеваний (наприм ер, м икобактерии ту берку лез а, гонококки и др.), им еет реш ающ ее з нач ение для постановкидиагноз а. Вы я в л е ние ро ли ус л о вно -па т о ге нны х микро о рга низмо в в этиологии и патогенез е з аболеваний долж но быть основано на строгой аргу м ентац ии. О бяз ательным у словием является клинич еское, эпидем иологич еское, м икробиологич еское исерологич еское исключ ение воз бу дителей инф екц ионных болез ней (наприм ер, воз бу дителей киш еч ных инф екц ий, венерич еских болез ней и др.). Д ля оц енкиролиу словно-патогенных м икроорганизм ов в патологиим огу т быть использ ованы следу ющ ие критерии. 1. В ыделение м икроорганизм ов из крови, спинном оз говой ж идкостиилидру гих ж идкостей организм а, которые в норм е у з доровыхлюдей являются стерильным и. 2. О бнару ж ение в исследу ем ом м атериале, особенно при дисбактериоз ах, у словно-патогенных м икроорганизм ов в достаточ но больш их колич ествах 5 7 (наприм ер, 10 -10 м икробных клетокв 1 м л). Д ля этого проводят колич ественное определение м икроорганизм ов по ч ислу колониеобраз у ющ их единиц (К О Е ) в 1 г или 1 м л испыту ем ого образ ц а. Э ти колич ественные показ атели м огу т варьировать в з ависим ости от вида м икроорганизм ов, типа исследу ем ого м атериала, характераистадииз аболевания. 3. П овторное, м ногократное (в теч ение су токилич ерез су тки) выделение одногои того ж е м икроорганизм аиз одного итого ж е м атериалаот больного (наприм ер, из кровиприсепсисе ит.д.). 4. О бнару ж ение идентич ных у словно-патогенных м икроорганизм ов в раз ных образ ц ах м атериала (наприм ер, припищ евых токсикоинф екц иях - в пром ывных водах ж елу дка, рвотныхм ассах, испраж нениях, пищ евыхпроду ктах). 5. Н арастание титраантител в 4 раз аиболее в парных сыворотках кровибольного в отнош енииу словно-патогенного м икроорганизм а, который предполагается как воз бу дитель данного патологич еского проц есса. В ряде слу ч аев реком енду ется использ овать в кач естве антигенов ау тош там м ы м икроорганизм ов, выделенные от больных. 6. П олож ительные кож но-аллергич еские реакц ии у больных с аллергенам и, приготовленным ииз у словно-патогенных м икроорганизм ов. 7. В слу ч ае вну трибольнич ных (ноз оком иальных) инф екц ий - выделение идентич ныхку льту р м икроорганизм ов от гру ппы больных. 8. Совпадение данных лабораторного определения ч у вствительности м икроорганизм ов к антибиотикам с эф ф ективностью антим икробной терапии в клинич еских у словиях, подтверж даем ое у лу ч ш ением состояния больного и у м еньш ением колич естваилиэлим инац ией соответству ющ их м икроорганизм ов. У словно-патогенные м икроорганизм ы (синоним : оппорту нистич еские) представляют собой больш у ю гру ппу м икроорганизм ов, з аним ающ их раз лич ное систем атич еское полож ение. О ни встреч аются среди аэробных и анаэробных
11
бактерий, грибов, простейш их. В клинич еской м икробиологии наиболее ч асто встреч аются оппорту нистич еские м икроорганизм ы, относящ иеся к родам Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Proteus, Enterobacter, Citrobacter, Pseudomonas, Candida идр. О ф орм лениерезу льтатовлабораторных м ик робиологическ их исслед ований Рез у льтаты лабораторных исследований оф орм ляют на спец иальных бланках, которые передают леч ащ ем у врач у . 1. В ответе преж де всего у каз ывают налич ие патогенных, а такж е у словнопатогенных м икроорганизм ов, обнару ж енных при м икробиологич еском исследовании. Сообщ ают такж е данные лабораторного определения ч у вствительностим икроорганизм ов кантибиотикам . 2. П риобнару ж ении м икробных ассоц иац ий переч исляют все м икроорганизм ы, у каз ывают дом иниру ющ ие виды иколич ественные показ атели. 3. В соответствиис правилам им еж ду народной ном енклату ры в ответах приводят видовые наз вания м икроорганизм ов, наприм ер: Staphylococcus aureus ит.д. 4. С ц елью у скорения лабораторных исследований в ряде слу ч аев привыделении у словно-патогенных м икроорганизм ов вполне допу стим о в ответе огранич иться у каз анием только родовой принадлеж ности обнару ж енных м икроорганизм ов, наприм ер, Р го teus spp., Candida spp. ит.д. В О ЗБУД И Т ЕЛ И Г Н О Й Н О -В О С ПА Л И Т ЕЛ ЬН Ы Х И Р А Н ЕВ Ы Х И Н Ф ЕК ЦИ Й Раневые и нераневые гнойные инф екц ии ч асто встреч аются в хиру ргич еской, аку ш ерско-гинекологич еской, терапевтич еской и дру гих клиниках. Н ередко они носят характер вну трибольнич ной инф екц ии. В оз бу дителям и инф екц ии являются раз лич ные бактерии, которые относятся к раз ным сем ействам , родам и видам . Бактерии, переч исленные в таблиц е 1, выз ывают гнойно-воспалительные проц ессы раз лич ной локализац ии, в том ч исле ангины, ф у ру нку лы, ц иститы и пиелиты, плевриты, перикардиты, сепсис и др. М ногие из этих воз бу дителей встреч аются в норм альной м икроф лоре ч еловека и проявляют свою патогенность толькопринару ш ениинорм альной экологии. Н екоторые из бактерий являются воз бу дителям итаких ф орм з аболеваний, которые не сопровож даются выраж енным гнойно-воспалительный проц ессом . Н априм ер, стрептококкивыз ывают скарлатину , рож истое воспаление; С . tetani – столбняк. Стаф илококки, стрептококки, протей, киш еч ная палоч ка ианаэробные бактериинередко выз ывают см еш анну ю инф екц ию в раз нообраз ных соч етаниях какм еж ду собой, такис дру гим им икроорганизм ам и– виру сам и, грибам и. Л абораторная д иагностик а гной но-воспалительных заболеваний , вызванных аэ робным и бак териям и Гнойну ю инф екц ию ч ащ е всего выз ывают стаф илококки (сем . М iс rо со с с а с е а е ), которые относятся квиду S. aureus, реж е квидам S. epidermidis и
12
S. saprophyticus; стрептококки (сем . Streptoс о с с а с е а е ) Streptococcus pyogenes, реж е S. pneumoniae. Н аряду с ним и важ ная роль принадлеж ит Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus spp. и дру гим у словнопатогенным м икроорганизм ам . К ром е того, пристом атологич еских з аболеваниях встреч аются Streptococcus sanguis, S. mutans, S. mitis идр. Т аблица 1. В оз бу дителираневой инф екц ииигнойно-воспалительных проц ессов А эробные бактерии А наэробные бактерии Г рам полож ительныебак терии С порообразу ю щие Chryseobacterium indologenes грам полож ительныеанаэ робы Chryseobacterium meningosepticum Clostridium perfringenes Enterococcus faecalis и дру гие виды C. oedermatiens и дру гие воз бу дители энтерококков раневой анаэробной инф екц ии(газ овой Staphylococcus aureus и дру гие виды гангрены) стаф илококков С . tetani – воз бу дитель столбняка Streptococcus pyogenes S. faecalis Н еспорообразу ю щие S. agalactiae грам полож ительныеанаэ робы Peptococcus spp Peptostreptococcus spp. Г рам отрицательныебак терии Citrobacter koseri Propionibacterium acnes Enterobacter spp. Escherichia coli Н еспорообразу ю щие Haemophilus influenzae грам отрицательныеанаэ робы Klebsiella spp. Bacteroides spp. Moraxella catarrhalis Prevotella spp. Proteus spp. Porphiromonas spp. Pseudomonas aeruginosa Fusobacterium spp. Salmonella enterica Veilonella spp. З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы ЗА Н Я Т И Е 1 М ик робиологическ ое исслед ование гноя при под озрении на стаф илок ок к ову ю или стрепток ок к ову ю инф ек цию . М атериал - гной из раны (раневое отделяем ое). Д ля выявления источ ника стаф илококковой вну трибольнич ной инф екц ииисследу ют м атериал, вз ятый там поном из з ева исо слизистой оболоч ки носа з доровых людей: больнич ного персонала, а такж е работников детских у ч реж дений. 1. Бактериоскопич еское исследование: приготовить м аз кииз ч истых ку льту р воз бу дителей гнойных инф екц ий, атакж е из гноя ислизистого отделяем ого з ева. О красить их по Грам у , м икроскопировать и з арисовать. Сделать з аключ ение инам етить план дальнейш его анализа. 2. О з наком иться с питательным и средам и, прим еняем ым и при м икробиологич еской диагностике гнойных и раневых инф екц ий. У каз ать наз нач ение отдельныхпитательныхсред.
13
3. Бактериологич еское исследование: у ч есть рез у льтаты готовых посевов и м аз ков из слизистого отделяем ого з ева на ч аш ки с кровяным агаром : а) описать колониииотм етить налич ие илиотсу тствие гем олиза; б) приготовить м аз ки из колоний, окрасить их по Грам у и м икроскопировать; в) пересеять колонию стаф илококка в пробирку со скош енным питательным агаром и колонию стрептококка - на скош енный кровяной агар исахарный бу льон для полу ч ения соответству ющ их ч истыхку льту р. ЗА Н Я Т И Е 2 1. П родолж ение бактериологич еского исследования гноя и м аз ков из з ева и носабактерионосителей: а) отм етить характер роста ку льту ры (налич ие з олотистого пигм ента) в пробирке с питательным агаром . Сделать м аз ок, окрасить по Грам у и м икроскопировать; б) отм етить налич ие или отсу тствие гем олиза на кровяном агаре и пом у тнение илиосадок на сахарном бу льоне. Сделать м аз ок, окрасить по Грам у им икроскопировать. 2. В слу ч ае выделения з олотистого стаф илококка: а) определить его способность проду ц ировать плаз м окоагу лаз у , лец итиназ у ; б) у становить ф аготипы стаф илококков, выделенных из раз ных источ ников - больныхибактерионосителей поготовым пробам . 3. О тм етить по готовым посевам ч у вствительность выделенных стаф илококков кантибиотикам . 4. Д ать кратку ю характеристику дем онстриру ем ым антим икробным , диагностич еским илеч ебно-проф илактич еским препаратам . Сделать оконч ательное з аключ ение на основании анализа собственных, дем онстрац ионных и полу ч енных из лаборатории данных о видах выделенных ку льту р стаф илококкаистрептококкаиоб их патогенных свойствах. О пределить источ ник госпитальной инф екц ии на основании ф аготипов, выделенных от больныхиносителей стаф илококковой инф екц ии. М е т о диче с кие ука за ния М а т е риа л дл я ис с л е до в а ния : гной, экссу дат, раневое отделяем ое, перевяз оч ный м атериал, м аз ки слизи из носоглотки и з ева, кровь - при подоз рениинасепсис. М ик робиологическ ая д иагностик а стаф илок ок к овых инф ек ций Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е (схем а1 ). И з исследу ем ого м атериала (з а исключ ением крови) готовят м аз ки для первич ной бактериоскопии, окраш ивают по Грам у и м икроскопиру ют. Н алич ие в препаратах грам полож ительных гроз девидных кокков, располагающ ихся в виде скоплений, поз воляет поставить предварительный диагноз стаф илококковой инф екц ии.
14
и с с ле довани е . И сследу ем ый м атериал Бакт е ри ологи че с кое з асевают петлей на ч аш ки с кровяным и ж елточ но-солевым агаром (Ж СА ) для полу ч ения изолированных колоний. П осевы инку биру ют при 37 °С в теч ение су ток. Н а следу ющ ий день исследу ют выросш ие колонии на обеих средах. Н а кровяном агаре отм еч ают налич ие илиотсу тствие гем олиза. Н а Ж СА S. aureus образ у ет з олотистые кру глые выпу клые непроз рач ные колонии. В окру г колоний стаф илококков, обладающ их лец итиназ ной активностью, образ у ются з оны пом у тнения с перлам у тровым оттенком . Д ля оконч ательного у становления вида стаф илококка 2 - 3 колониипересевают в пробиркисо скош енным питательным агаром для полу ч ения ч истых ку льту р с последу ющ им определением их диф ф еренц иальныхпризнаков (табл. 2). Т аблица 2. Д иф ф еренц иальные признакистаф илококков П ризнак В ид S. aureus S. epidermidis О браз ование: плаз м окоагу лаз ы + лец итиназ ы + + α-токсина Ф ерм ентац ия: глюкоз ы + + м аннитав анаэробных у словиях + Ч у вствительность кновобиоц ину S S
S. saprophyticus + R
У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) - налич ие признака; (-) - отсу тствие признака; (S) ч у вствительный; (R) - рез истентный.
П о с т а но в ка ре а кции на пл а змо ко а гула зу. Раз веденну ю в 2 раз а плаз м у крови раз ливают по 0,4 м л в пробирки, вносят ту да по одной петле каж дой исследу ем ой ку льту ры стаф илококкаипом ещ ают в терм остат при37 °С. Ч ерез 2, 4 и24 ч отм еч ают рез у льтаты опыта. П риналич ииплаз м окоагу лаз ы образ у ется сгу сток. В некоторых слу ч аях наряду с плаз м окоагу лаз ой и лец итиназ ой определяют ф ибринолизин, гиалу ронидаз у , Д Н К аз у , а такж е ставят дерм онекротич еску ю пробу накролике. Д ля у становления источ ника госпитальной инф екц ии выделяют ч истые ку льту ры стаф илококкаот больных ибактерионосителей, после ч его проводят их ф аготипирование с пом ощ ью набора типовых стаф илоф агов. Ф аги раз водят до титра, у каз анного на этикетке. К аж ду ю из исследу ем ых ку льту р з асевают на питательный агар в ч аш ку П етри газ оном , высу ш ивают, а з атем петлей каплю соответству ющ его ф агананосят наквадраты (по ч ислу ф агов, входящ их в набор), предварительно раз м еч енные карандаш ом на дне ч аш ки П етри. П осевы инку биру ют при37 °С. Рез у льтаты оц енивают на следу ющ ий день по налич ию лизиса ку льту ры. П роводят определение ч у вствительности стаф илококка к антибиотикам .
С хем а 1. М ик робиологическ оеисслед ованиепри стаф илок ок к овых инф ек циях
15
16
Экс пре с с м е т оды ди агнос т и ки Иммуно химиче с кие ис с л е до ва ния основаны на обнару ж ении антигенов воз бу дителя в м атериале от больного с пом ощ ью ч у вствительных серологич еских реакц ий. Био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с ле до в а ния . И сследу ем ый м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью П Ц Р. М ик робиологическ ая д иагностик а стрепток ок к овых инф ек ций Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е (схем а 2). М аз ки для первич ной бактериоскопииготовят из патологич еского м атериала, окраш ивают по Грам у и м икроскопиру ют. П ри полож ительном рез у льтате обнару ж ивают ц епоч ки грам полож ительных кокков. Следу ет им еть в виду , ч то в патологич еском м атериале стрептококки редко образ у ют типич ные скопления, ч ащ е располагаются поодиноке илинебольш им игру ппам ипо2 – 3 бактерии. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . И сследу ем ый м атериал з асевают на кровяной агар в ч аш ку П етри. П осле инку бац ии при 37 °С в теч ение 24 ч отм еч ают характер колоний и налич ие вокру г них з он гем олиза. И з ч асти м атериала, вз ятого из колоний, готовят м аз ок, окраш ивают по Грам у и м икроскопиру ют. Д ля полу ч ения ч истой ку льту ры 1 - 3 подоз рительные колонии пересевают в пробиркисо скош енным кровяным агаром исахарным бу льоном . Н а кровяном агаре Streptococcus pyogenes образ у ет м елкие, велич иной с бу лавоч ну ю головку , м у тноватые кру глые колонии. В бу льоне стрептококк в отлич ие от стаф илококка дает придонно-пристеноч ный рост в виде хлопьев или з ерен, оставляя среду проз рач ной. П о характеру гем олиза на кровяном агаре стрептококки делятся на три гру ппы: 1) негем олитич еские; 2) α1-гем олитич еские, илиз еленящ ие, образ у ющ ие з еленовату ю з ону ч астич ного гем олиза; 3) β-гем олитич еские, образ у ющ ие вокру г колонииполностью проз рач ну ю з ону гем олиза. Заключ ительным этапом бактериологич еского исследования является идентиф икац ия выделенной ку льту ры по антигенным свойствам . П о данном у признаку все стрептококкиделят насерологич еские гру ппы (А , В , С, D ит.д.). Серогру ппу стрептококков определяют в реакц ии прец ипитац ии с полисахаридным прец ипитиногеном С, выделенным из исследу ем ой ку льту ры, и сывороткам и(обыч но 4 наиболее распространенные серогру ппы - А , В , С иD). Больш инство патогенных для ч еловека β-гем олитич еских стрептококков относится к серологич еской гру ппе А . П о содерж анию типоспец иф ич еских антигенов протеиновой природы β-гем олитич еские стрептококкиподраз деляются на серовары, из которых 47 относятся к гру ппе А . Серовары стрептококков определяют в реакц ииагглютинац ии. Раз верну тое серологич еское исследование и типирование стрептококков проводят главным образ ом для эпидем иологич еского обследования. В ыделенну ю ку льту ру стрептококка проверяют на ч у вствительность к антибиотикам м етодом дисков. П ри подоз рении на сепсис делают посевы из кровибольного.
С хем а 2. М ик робиологическ оеисслед ованиепри стрепток ок к овых инф ек циях
17
18
Экс пре с с м е т оды ди агнос т и ки Иммуно химиче с кие ис с л е до ва ния . П ри отдельных ноз ологич еских ф орм ах стрептококковой инф екц ии у станавливают налич ие спец иф ич еских антигенов в кровибольногос пом ощ ью РСК , реакц иипрец ипитац ииидр. Био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с ле до ва ния . И сследу ем ый м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью П Ц Р. В слу ч ае обнару ж ения соответству ющ их м олеку л м ож нопоставить предварительный диагноз . Се роди агнос т и ка. П ри отдельных ноз ологич еских ф орм ах стрептококковой инф екц ии у станавливают налич ие спец иф ич еских антигенов в крови больного с пом ощ ью РСК или реакц ии прец ипитац ии. А нтитела к О стрептолизину определяют главным образ ом для подтверж дения диагноз а ревм атизм а. Реакц ия основана на подавлении способности О -стрептолизина растворять эритроц иты приналич иив кровибольного соответству ющ их антител. Реакц ию ставят со стандартным су хим О -стрептолизином . М ик робиологическ ая д иагностик а гной но-воспалительных заболеваний , вызванных грам отрицательным и аэ робным и бак териям и Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е . И з исследу ем ого м атериала (гной, раневое отделяем ое, у ч асткиож оговой тканиидр.) готовят м аз ки, окраш ивают по Грам у и м икроскопиру ют. О бнару ж ение в м аз ках грам отриц ательных бактерий илидру гой м икроф лоры поз воляет сделать предварительное з аключ ение. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . Д ля выделения ку льту ры бактерий Р seudomonas aeruginosa (синегнойная палоч ка) исследу ем ый м атериал з асевают в ч аш ки П етри на питательный агар или на Ц П Х -агар, содерж ащ ий Nц итилпиридиний-хлорид (Ц П Х ), который у гнетает рост 24 видов м икроорганизм ов, воз м ож ных ассоц иатов псевдом онад в клинич еском м атериале. П осевы инку биру ют при37 °С в теч ение су ток. Синегнойная палоч ка образ у ет кру глые плоские слизистые колонии, окраш ивая среду характерным синез еленым пигм ентом . П рибактериоскопиинативных препаратов в «раз давленной» или«висяч ей» капле, приготовленных из колоний, обнару ж иваются подвиж ные и слегкаизогну тые палоч ки; в м аз ках, окраш енных по Грам у , - грам отриц ательные палоч ки. Ч истые ку льту ры Р . aeruginosa идентиф иц иру ют по биохим ич еским признакам иобраз ованию пигм ента. П атогенные ш там м ы Р . aeruginosa образ у ют белковые экз отоксины: гистотоксин, обладающ ий ц итотоксич еским свойством , и лейкоц идин, лизиру ющ ий лейкоц иты ч еловека. Э ти токсины м огу т быть обнару ж ены пу тем биопробы. Д ля эпидем иологич еского анализа госпитальных инф екц ий определяют серовары в реакц ииагглютинац ии, пиоц иновары иф аговары. Д ля выделения энтеробактерий исследу ем ый м атериал з асевают на одну из диф ф еренц иально-диагностич ескихсред, наприм ер насреду Э ндо. Д ля выделения бактерий родаР rо teus использ у ют м етод Ш у кевич а. Экс пре с с м е т оды ди агнос т и ки Иммуно химиче с кие ис с л е до ва ния . П атогенные ш там м ы Р . aeruginosa выделяют раз лич ные растворим ые белковые (экз отоксины и экз оф ерм енты) и
19
небелковые (экстрац еллюлярная слизь) антигены, которые м огу т быть обнару ж ены в м атериале от пац иента (из оч ага, в кровиили м оч е) с пом ощ ью ч у вствительных серологич ескихреакц ий. Био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с ле до ва ния . И сследу ем ый м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью полим ераз ной ц епной реакц ии (П Ц Р). В слу ч ае обнару ж ения соответству ющ их м олеку л м ож но поставить предварительный диагноз . М ик робиологическ иеисслед ования при сепсисе М а т е риа л дл я ис с л е до ва ния : м икробиологич еское исследование крови является веду щ им при лабораторной диагностике сепсиса. К ром е того, при септикопием иях исследу ют м атериал из первич ных ивторич ных м естных оч агов инф екц ии. К ровь беру т в период подъ ем а тем перату ры до нач ала антибиотикотерапиииз локтевой вены в колич естве не м енее 10 м л у вз рослых и5 м л у детей, таккакм икроорганизм ы находятся в кровив сравнительно небольш их колич ествах. П осевы делают у постелибольного в колбы с 50-100 м л питательной среды. Сравнительно больш ие объ ем ы питательной среды (в 10 раз превыш ающ ие колич ество крови) необходим ы для у странения бактериц идного действия сывороточ ных белков. В слу ч ае транспортировкикровикней добавляют антикоагу лянты: ц итрат илиоксалат натрия, декстран су льф ат, гепарин. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . Я вляется веду щ им при лабораторной диагностике сепсиса. П осевы производят наж идкие среды обогащ ения: сахарный бу льон идр.; приподоз рениинаанаэробну ю ф лору - натиогликолеву ю среду или среду К итта-Т ароц ц и и инку биру ют их при 37 °С в теч ение 10 дней при еж едневном контроле. В слу ч ае отсу тствия роста м икроорганизм ов дают отриц ательный ответ. П риналич иироста делают м аз ки, которые окраш ивают по Грам у . В ыделенну ю ч исту ю ку льту ру м икроорганизм ов идентиф иц иру ют и определяют ее ч у вствительность кантибиотикам . П ри оц енке рез у льтатов необходим о исходить из того, ч то сепсис является тяж елым общ им инф екц ионным з аболеванием , раз вивающ им ся в у словиях рез кого у гнетения всех основных м еханизм ов им м у нитета. В оз бу дителям и сепсисаявляются раз лич ные патогенные иу словно-патогенные м икроорганизм ы. О днократный посев крови при сепсисе не всегда приводит к выделению ку льту ры. Более инф орм ативным является трехкратный посев кровис су точ ным интервалом . Н а ф оне антибиотикотерапии кровь у больных для посева следу ет брать 5 - 6 раз . Д иагностическ ие, проф илак тическ иеи лечебныепрепараты Ст афи лококковы й анат окс и н (очи щ е нны й и адс орби рованны й). П олу ч ают из нативного анатоксина пу тем его осаж дения трихлору ксу сной кислотой с дополнительной оч исткой этиловым спиртом иадсорбц ией нагидрате оксидаалюм иния. О бладает высоким иим м у ногенным исвойствам и. П рим еняется для активной им м у низац иис ц елью проф илактикистаф илококковых инф екц ий и для леч ения стаф илококковых з аболеваний.
20
коагу лаз ополож ительных Ст афи лококковая вакци на. В з весь з олотистых стаф илококков, инактивированных нагреванием . П рим еняется с ц елью леч ения при длительно и вяло теку щ их стаф илококковых з аболеваниях. Ч ащ е использ у ют ау товакц ину . И м м уноглобули н че лове че с ки й прот и вос т афи лококковы й. Гам м аглобу линовая ф ракц ия сыворотки крови, содерж ащ ая стаф илококковый антитоксин. Готовят из ч еловеч еской крови, содерж ащ ей высокие титры антител, или крови доноров, им м у низированных стаф илококковым адсорбированным анатоксином . П рим еняется для спец иф ич еского леч ения при стаф илококковых з аболеваниях. Ст афи лококковы й(с т ре пт ококковы й) бакт е ри офаг (ж и дки й). Ф ильтрат ф аголизата стаф илококков (стрептококков). П рим еняется нару ж но, вну трикож но, вну трим ыш еч но для леч ения при стаф илококковых (стрептококковых) з аболеваниях. Ди агнос т и че с ки е с т афи лококковы е фаги . Н абор типоспец иф ич еских ф агов для ф аготипирования стаф илококков. О -с т ре пт оли зи н с ух ой. Л иоф ильно высу ш енный ф ильтрат бу льонной ку льту ры стрептококка - активного проду ц ента О -стрептолизина. П рим еняется для постановки серологич еских реакц ий - определения анти-О -стрептолизина в сывороткахкровибольных стрептококковым иинф екц иям и(ч ащ е ревм атизм ом ). Ант и би от и ки . Гра мо т рица т е льны е ба кт е рии - β-лактам ы, спектр действия которых сдвину т в сторону грам отриц ательных м икроорганизм ов, хлорам ф еникол, ам иногликоз иды, тетрац иклины, су льф анилам иды, ф торхинолоны идр. Гра мпо л о жит е л ьны е ба кт е рии- β-лактам ные антибиотики, ванком иц ин, тетрац иклины, ам иногликоз иды, м акролиды, линком иц ины, су льф анилам иды, ф торхинолоны идр. Л абораторная д иагностик а анаэ робных инф ек ций А наэробные и см еш анные (анаэробно-аэробные) инф екц ии представляют одну из сам ых з нач ительных категорий гнойно-воспалительных з аболеваний у ч еловека. О сновная м асса инф екц ий, протекающ их с у ч астием анаэробов, им еет, как правило, эндогенное происхож дение. В оз бу дители анаэробных инф екц ий: пептококки, петострептококки, бактериоды, ф у з обактерии, эу бактерии, клостридииидр., являются представителям инорм альной м икроф лоры ч еловека. Раз витию инф екц ии способству ют травм ы, ож оги, оперативное вм еш ательство, м естное нару ш ение кровообращ ения, стресс, голодание, переу том ление, хронич еские з аболевания, прим енение лекарственных препаратов: им м у нодепресантов, ц итостатиков, антибиотиков, глюкокортикоидов идр. О сновное з нач ение в лабораторной диагностике з аболеваний, выз ванных данной гру ппой м икроорганизм ов, им еет бактериологич еское исследование, проводим ое в строго анаэробных у словиях, так как даж е нез нач ительное колич ество кислородавоз ду харез ко торм оз ит раз м нож ение бактерий - анаэробов. Д ля соз дания анаэробных у словий использ у ют спец иальные м етоды вз ятия м атериала, элективные питательные среды и спец иальну ю аппарату ру для ку льтивирования анаэробов. Бактериоскопия дает воз м ож ность распоз нать
21
см еш анну ю инф екц ию и сделать предполож ение о ее воз бу дителях. Серодиагностика данных инф екц ий практич ески не проводится в связ и с тру дностью выбора антигенов и низким титром антител. М ногие анаэробные бактерии вырабатывают экз отоксины, поэтом у важ ное з нач ение в м икробиологич еской диагностике им еют биопробы налабораторныхж ивотных. З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. П риготовить м аз ки из гноя, окрасить их по Грам у и м икроскопировать. Сделать предварительное з аключ ение инам етить ходдальнейш его анализа. 2. Сделать оконч ательное з аключ ение о воз бу дителе или воз бу дителях раневой инф екц ии на основании данных, полу ч енных из бактериологич еской лаборатории. М е т о диче с кие ука за ния М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : гной, раневое отделяем ое, отеч ная ж идкость, ку соч ким ыш еч ной ткани, перевяз оч ный м атериал, кетгу т. К ровь – присепсисе. П риподоз рениина столбняк у ж енщ ин после родов илиаборта - выделения из м атки, у новорож денных - выделения из пу пка. Реком енду ется брать м атериал из раз ных у ч астков оч ага пораж ения, особенно из глу боких слоев. Д ля обеспеч ения бескислородных у словий вз ятие м атериала производят ш приц ем с хорош о притертым порш нем до полного его з аполнения и вытеснения воз ду ха. Затем ш приц надевают на иглу , вставленну ю ч ерез рез инову ю пробку в пробирку со см есью инертных газ ов (N2 + Н 2) иСO2, ивводят в нее исследу ем ый м атериал, который изу ч ают в м икробиологич еской лаборатории. И спольз у ют такж е раз лич ные спец иальные транспортные среды, в которые пом ещ ают м атериал, вз ятый у больных. М ик робиологическ ая д иагностик а гной но-воспалительных заболеваний , вызванных неспорообразу ю щим и анаэ робным и бак териям и В оз бу дителям игнойно-воспалительных проц ессов довольно ч асто являются неспорообраз у ющ ие анаэробные бактерии, принадлеж ащ ие к родам Bacteroides, Veillonella, Peptococcus,Peptostreptococcus. О нивыз ывают как м оноинф екц ии, так и см еш анные инф екц ии во всевоз м ож ных соч етаниях дру г с дру гом и с аэробным и бактериям и – Р seudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, E. coli, коккам и. Бакт е ри ологи че с кое и бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани я. П осевы производят в пробирку с предварительно прокипяч енной средой К итта-Т ароц ц ии в пробирку с полу ж идким тиогликолевым агаром и инку биру ют при 37 °С в теч ение 24-48 ч . П осле просм отравыросш ей ку льту ры делают м аз ки, окраш ивают их по Грам у и м икроскопиру ют. Бактериоскопия дает воз м ож ность у становить однородность или неоднородность ку льту ры, а по м орф ологии клеток и отнош ению к окраске по Грам у ориентировоч но отнести ее к определенном у роду . Д ля полу ч ения ч истой ку льту ры делают пересевы на сахарный кровяной агар в ч аш ки П етри, которые инку биру ют в анаэробных у словиях 3-4 су т до ф орм ирования изолированных колоний. П осле изу ч ения колоний их пересевают
22
на среду К итта-Т ароц ц и. И дентиф икац ию выделенной ч истой ку льту ры производят на основаниипрису щ их им диф ф еренц иальных признаков, которые определяют в техж е строгоанаэробных у словиях (табл. 3). Экс пре с с м е т оды ди агнос т и ки . А наэробные бактерии вырабатывают спец иф ич еские м етаболиты, включ ая лету ч ие ж ирные кислоты с короткой ц епью инелету ч ие органич еские кислоты. Д ля их обнару ж ения в м атериале использ у ют ГЖ Х . Т аблица 3. Д иф ф еренц иальные спорообраз у ющ их анаэробныхбактерий
признаки
неспорообраз у ющ их
и
Peptostreptococc us Veilonella
Bacteroides
Cl. perfringenes
Cl. novy
Cl. septicum
Cl. sordelli
Cl. histolyticum
К ороткие ц епоч ки кокков
М елкие палоч ки
К ру пные палоч ки
К ру пные палоч ки
Т онкие палоч ки
М елкие палоч ки
М елкие палоч ки
П одвиж ность Споры О краскапо Грам у Ф ерм ентац ия у глеводов Свертывание/ пептонизац ия м олока О браз ование H2S О браз ование индола Раз ж иж ение ж елатина В осстановление нитратов Гем олиз эритроц итов О браз ование токсина
Ц епоч ки кокков
Ф орм аи располож ение клеток
Peptococcus
П ризнак
О диноч ные кокки
Бактерии
+
+
-
-+ -
+ +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
с
+
-
+
+
с
+
с
-
-
-
+
+
+
X
-
+
+
+
-
+
-+
-
-
-
X
X
-+
-
-
-+
-
-
-
-
-
-
-
-
-+
+
+
+
+
+
-+
-
+
+-
X
X
X
-
-
-+
-
-
+-
X
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) – налич ие признака; (-) – отсу тствие признака; (X) – непостоянный признак; (- +) – отсу тствие признака у больш инства ш там м ов; (+ -) – налич ие признакау больш инстваш там м ов; (с) – слабая ф ерм ентац ия.
23
М ик робиологическ ая д иагностик а раневой анаэ робной к лострид иальной инф ек ции (газовая гангрена) В оз бу дителям иявляются бактериирода Clо stridium (схем а 3). Ч ащ е всего воз бу дителем газ овой гангрены является С l. perfringens. Зараж ение происходит при попадании в рану поч вы или пыли, з агряз ненной спорам и клостридий. В анаэробных у словиях (в глу бине раны) они прорастают в вегетативные клетки, проду ц иру ющ ие раз нообраз ные токсины, которые выз ывают распад и некротизац ию м ыш еч ной ткани. В этом проц ессе м огу т у ч аствовать стаф илококки, синегнойная палоч ка, протей и дру гие бактерии, в з нач ительной м ере ослож няющ ие теч ение з аболевания. Л абораторну ю диагностику проводят в дву х направлениях с ц елью обнару ж ения воз бу дителя в некротич еских тканях и экз отоксинав отеч ной ж идкости. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е . П роводится пу тем м икроскопии м аз ков, приготовленных из отеч ной ж идкости или некротизированной ткани. Н алич ие в препаратах кру пных (1-1,5 × 3-10 м км ) грам полож ительных палоч ек, ч асть из которых (С l. рerfringens) образ у ют капсу лу , поз воляет поставить предварительный диагноз . Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . И сследу ем ый м атериал вносят в несколько пробирок со средой К итта-Т ароц ц и, ж елез осу льф итным агаром (среда В ильсона-Блера) им олоком . Ч асть пробирок прогревают при80 °С в теч ение 30 м ин для у нич тож ения неспорообраз у ющ их бактерий. П осевы инку биру ют в обыч ном терм остате при37 °С. С l. рerfringens растет в глу бине среды. В м олоке у ж е ч ерез 3-4 ч после посева образ у ется гу бкообраз ный сгу сток, содерж ащ ий пу з ырьки газ а и отделивш у юся проз рач ну ю ж идкость. Н а следу ющ ие су тки на среде К итта-Т ароц ц и отм еч ается пом у тнение и газ ообраз ование, а на ж елез осу льф итном агаре несколько поз днее появляются ч ерные колонии в глу бине агарового столбика. Д ля полу ч ения ч истой ку льту ры делают пересевы на сахарный кровяной агар в ч аш ки П етри, которые инку биру ют в строго анаэробных у словиях при 37 °С в теч ение 3-4 дней. В ыросш ие колонии пересевают в пробирки со средой К итта-Т ароц ц и. И дентиф икац ию ч истой ку льту ры производят наоснованиипризнаков, переч исленных в табл.3. Экс пре с с м е т оды ди агнос т и ки Био про ба . Д ля определения токсигенности исследу ем у ю ку льту ру , выращ енну ю на среде К итта-Т ароц ц и, ц ентриф у гиру ют и надосадоч ну ю ж идкость вводят м орской свинке, которая при полож ительном рез у льтате погибает. В следствие того, ч то токсины раз ных видов клостридий раз лич аются по своим антигенным свойствам , их серологич еску ю идентиф икац ию проводят в реакц ии нейтрализац ии на лабораторных ж ивотных. С этой ц елью см есь исследу ем ого токсинас антитоксич еской сывороткой (С l. рerfringens илиС l. novy) вводят подкож но м орской свинке. В слу ч ае нейтрализац ии токсина ж ивотное остается ж ивым ; приотриц ательной реакц иим орская свинка погибает ч ерез 30 м ин – 4 ч после инъ екц ии.
С хем а 3. М ик робиологическ оеисслед ованиепри газовой гангрене
24
25
Иммуно химиче с кие ис с л е до ва ния . Д ля быстрого обнару ж ения токсина С l. рerfringens в раневом отделяем ом определяют его лец итиназ ну ю активность. П олож ительная реакц ия на лец итиназ у выявляется пом у тнением ж идкости в пробирке. П ри отриц ательной реакц ии, характеризу ющ ейся нейтрализац ией ф ерм ентасоответству ющ ей антисывороткой, ж идкость остается проз рач ной. М ик робиологическ ая д иагностик а столбняк а В оз бу дитель столбняка С 1. tetani проникает в организм ч еловека ч ерез повреж денные кож ные покровы притравм ах иранениях, у ж енщ ин ч ерез родовые пу типриродах иабортах, у новорож денныхч ерез пу поч ну ю рану . Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . М атериал з асевают в среду К иттаТ ароц ц и и инку биру ют в анаэробных у словиях при 37 °С в теч ение 3-4 су т, наблюдая придонный рост бактерий. Затем делают посевы на сахарный агар в ч аш киП етри, в столбик сахарного питательного агара в пробирке. П осевы такж е инку биру ют в анаэробных у словиях. Н а поверхностикровяного агара С 1. tetani образ у ет неж ные проз рач ные колонии, окру ж енные м алоз ам етной з оной гем олиза. Д ля полу ч ения ч истой ку льту ры подоз рительные колониипересевают в пробиркисо средой К итта-Т ароц ц иисохраняют их под слоем ваз елинового м асла или в эксикаторе, з аполненном см есью инертных газ ов. Д ля определения способностивыделенной ч истой ку льту ры к образ ованию столбняч ного токсина (токсигенности) использ у ют серологич еские реакц ии с антителам и к тетаноспаз м ину . Бактериологич еский м етод использ у ют в кач естве дополнительного м етода для подтверж дения диагноз а, поскольку он не дает своеврем енного рез у льтата. Экс пре с с м е т оды ди агнос т и ки Био про ба . П роводится для обнару ж ения столбняч ного токсина в исследу ем ом м атериале. С этой ц елью м атериал растирают в стерильной сту пке с песком , з аливают изотонич еским раствором хлорида натрия для экстрагирования токсина и ф ильтру ют ч ерез бу м аж ный ф ильтр. Ч асть ф ильтрата см еш ивают с антитоксич еской сывороткой и вну трим ыш еч но вводят белым м ыш ам (контрольная гру ппа), подопытным ж ивотным вводят один ф ильтрат. Ч ерез 1-2 су т у м ыш ей появляется ригидность м ыш ц хвоста и з адних конеч ностей. В рез у льтате рез кого сокращ ения хвостовых м ыш ц хвост подним ается в виде ду ги. Затем подопытные ж ивотные погибают. У ж ивотных в контрольной гру ппе признаки интоксикац ии отсу тству ют вследствие нейтрализац ии токсина антисывороткой. Д ля определения токсигенности выделенной ку льту ры белым м ыш ам вводят надосадоч ну ю ж идкость, полу ч енну ю при ц ентриф у гировании этой ку льту ры, выращ енной на ж идкой питательной среде. В настоящ ее врем я биопробапрактич ескине прим еняется. Иммуно химиче с кие ис с л е до в а ния . Т оксин в м атериале м ож ет быть обнару ж ен с пом ощ ью серологич еских реакц ий in vitro. М етод поз воляет полу ч ить ответ в теч ение нескольких ч асов и обеспеч ивает своеврем енну ю диагностику з аболевания.
26
Проф илак тическ ие и лечебные препараты Ант и т окс и че с ки е с ы ворот ки - ант и пе рфри нге нс , ант и эде м ат и е нс (ант и нови ), ант и с е пт и кум . В ыпу скаются в ж идком ису хом виде после оч истки и конц ентрац ии м етодом ф ерм ентативного гидролиза (диаф ерм -3) антитоксич еских сывороток, полу ч енных при им м у низац ии лош адей соответству ющ им ианатоксинам и. П рим еняются для экстренной проф илактикии спец иф ич еской терапиираневой анаэробной инф екц ии(газ овой гангрены). Адс орби рованны й с т олбнячны й анат окс и н. П олу ч ен пу тем обез вреж ивания ф орм алином столбняч ного токсинас последу ющ ей его оч исткой, конц ентрац ией и адсорбц ией на гидрате оксида алюм иния. В ходит в состав ассоц иированной коклюш но-диф терийно-столбняч ной вакц ины и дру гих препаратов. П рим еняется для активной им м у низац иипротив столбняка. Прот и вос т олбнячная с ы ворот ка. П олу ч ена из крови лош адей, гиперим м у низированных столбняч ным анатоксином . О ч ищ ена и конц ентрирована м етодом диаф ерм -3. А ктивность изм еряется в м еж ду народных единиц ах. П рим еняется для проф илактикиилеч ения столбняка. И м м уноглобули н че лове че с ки й прот и вос т олбнячны й. П олу ч ен из гам м аглобу линовой ф ракц ии крови людей-доноров, ревакц инированных оч ищ енным сорбированным столбняч ным анатоксином . П рим еняется для пассивной экстренной проф илактики столбняка в соч етании со столбняч ным анатоксином при повреж дениях кож ных покровов, а такж е для леч ения нач авш егося з аболевания. В О ЗБУД И Т ЕЛ И БА К Т ЕР И А Л ЬН Ы Х К И Ш ЕЧ Н Ы Х И Н Ф ЕК ЦИ Й К иш еч ные инф екц ии выз ывают: а) энтеробактерии родов Escherichia, Salmonella, Shigella и др.; б) холерные вибрионы; в) анаэробные грам отриц ательные неспоровые бактерии Ва с teroides и Veilonella. П ищ евые отравления (токсикоинф екц иииинтоксикац ии) выз ывают сальм онеллы, протеии м икроорганизм ы, проду ц иру ющ ие белковые токсины – Staphilococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum. О бнару ж ение воз бу дителей киш еч ных инф екц ий и пищ евых отравлений им еет больш ое диагностич еское иэпидем иологич еское з нач ение. О но поз воляет подтвердить клинич еский диагноз . Л абораторная д иагностик а э ш ерихиозови д изентерии З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. М икроскопировать и з арисовать м аз ки из ч истых ку льту р воз бу дителей киш еч ныхинф екц ий. 2. Бактериологич еская диагностикаэш ерихиоз ов: а) выбрать м атериал для исследования; б) у ч есть рез у льтаты первич ного посеваисследу ем ого м атериаланасреду Э ндо. О писать и з арисовать колонии, выросш ие на среде Э ндо, и обосновать выбор подоз рительных колоний для дальнейш его исследования;
27
в) провести серологич еску ю идентиф икац ию ч истой ку льту ры, полу ч енной из подоз рительных колоний, в ориентировоч ной реакц ии агглютинац ии на стекле с агглютиниру ющ им и О В -коли-сывороткам и (серотипирование). Сделать выводинам етить план дальнейш егоанализа. 3. Бактериологич еская диагностикадизентерии: а) выбрать м атериал для исследования; б) у ч есть рез у льтаты первич ного посеваисследу ем ого м атериаланасреду Э ндо. О писать и з арисовать колонии, выросш ие на среде Э ндо, и обосновать выбор подоз рительных колоний для дальнейш его исследования; в) у ч есть рез у льтаты пересеваподоз рительных колоний насреду Ресселя; г) провестиидентиф икац ию ч истой ку льту ры: • побиохим ич еским свойствам , • по антигенным свойствам в ориентировоч ной реакц ииагглютинац иина стекле с агглютиниру ющ им и сывороткам и для идентиф икац ии ш игелл. Сделать вывод инам етить план дополнительныхисследований. 4. О з наком иться с диагностич еским и и леч ебно-проф илактич еским и препаратам и. М е т о диче с кие ука за ния М а т е риа л дл я ис с л е до ва ния : ф екалии, ректальные м аз ки, соскобы со слизистой оболоч ки. М ик робиологическ ая д иагностик а эш ерихиозов Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е (схем а 4). Я вляется веду щ им в диагностике эш ерихиоз ов. Ф екалии з асевают на ч аш ки со средой Э ндо для полу ч ения изолированных колоний. П атогенные E. coli по основным биологич еским свойствам (м орф ологии, ку льту ральным и биохим ич еским признакам ) не отлич аются от непатогенных эш ерихий - представителей норм альной м икроф лоры киш еч ника. Д ля отбора подоз рительных колоний прим еняют м етод серотипирования. М атериал из лактоз ополож ительных колоний использ у ют для постановки реакц ии агглютинац ии на стекле со см есью О В сывороток, содерж ащ их антитела против наиболее распространенных сероваров патогенных эш ерихий. О быч но проверяют на агглютинабельность не м енее 10 колоний с каж дой ч аш ки. П ри полож ительном рез у льтате ставят реакц ию с м оноспец иф ич еским исывороткам и: О 26:В 6, О 55:В 5, О 111:В 4, О 124: В 17 идр., после ч его делают предварительное з аключ ение. Затем пересевают несколько агглютинабельных колоний на скош енный питательный агар для полу ч ения ч истых ку льту р. Н а 3-й день проверяют агглютинабельность ч истых ку льту р в реакц ии на стекле с О В -сывороткам и. П ри полож ительном рез у льтате ставят раз верну ту ю реакц ию агглютинац иис соответству ющ ей О В -сывороткой. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки : иммуно химиче с кие , био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с л е до ва ния . П ри м олеку лярно-биологич еских исследованиях м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью П Ц Р.
С хем а 4. Б ак териологическ оеисслед ованиепри э ш ерихиозах
28
29
М ик робиологическ ая д иагностик а д изентерии Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е (схем а 5). Ф екалиибольного з асевают на диф ф еренц иально-диагностич еские среды (агар Э ндо, П лоскирева идр.). П ри налич ии в исследу ем ых испраж нениях гнойных или слизисто-кровянистых ком оч ков их выбирают петлей, пром ывают в изотонич еском растворе хлорида натрия и наносят на поверхность питательной среды, после ч его растирают ш пателем . Н а 2-й день лактоз оотриц ательные (проз рач ные бесц ветные) колонии пересевают на среду Ресселя или на короткий "пестрый ряд" с лактоз ой и глюкоз ой. С ре да Р е с с е л я : питательный агар, 1 % раствор лактоз ы, 0,1 % раствор глюкоз ы и индикатор бром тим оловый синий. Среду готовят таким образ ом , ч тобы внизу она была в виде столбика, а верхняя ч асть им ела скош енну ю поверхность. И сследу ем у ю ку льту ру з асевают у колом в столбикинаповерхность среды. П риф ерм ентац ииу глеводов происходит изм енение ц вета среды (ж елтая окраска); раз рывы столбикасвидетельству ют о газ ообраз овании. И з м енение ц вета во всем объ ем е среды наблюдается приф ерм ентац иилактоз ы, только столбика приф ерм ентац ииглюкоз ы, так как содерж ание ее в среде в 10 раз м еньш е, ч ем лактоз ы. В м есто среды Ресселя м ож но использ овать трехсахарну ю среду (в ее состав входят глюкоз а, лактоз а, сахароз а, м оч евина, некоторые солиииндикатор ф еноловый красный) или дру гие диф ф еренц иально-диагностич еские среды, поз воляющ ие раз лич ать бактерии по способности ф ерм ентировать лактоз у и глюкоз у . О ставш у юся ч асть колоний использ у ют для постановки ориентировоч ной реакц ии агглютинац ии на стекле со см есью дизентерийных сывороток и см есью сывороток против сальм онелл (для исключ ения брюш ного тиф а или сальм онеллез а). О конч ательное з аключ ение дают на 4-й день по рез у льтатам ф ерм ентативных тестов (табл. 4) и реакц ии агглютинац ии. В ыделенну ю ч исту ю ку льту ру использ у ют для определения ч у вствительности воз бу дителя кантим икробным препаратам .
S. dysenteriae S. flexneri S. boydii S. sonnei
-
[+]
+ + +
[+]
К силоз ы
Д у льц ита
М аннита
Л актоз ы
Глюкоз ы с газ ообраз ованием
Т аблица 4. Биохим ич еские признакибактерий родаShigella О браз оФ ерм ентац ия вание Гру ппа индола
В В
В В В -
Д екарбоксилирование орнитина
+
У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) - полож ительная реакц ия; (-) - отриц ательная реакц ия; [+] поз дняя реакц ия; В - вариабельная реакц ия.
С хем а 5. М ик робиологическ оеисслед ованиепри д изентерии
30
31
Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки . П ри биохим ич еских и м олеку лярнобиологич еских исследованиях м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью П Ц Р. Се роди агнос т и ка. П рим еняют для ретроспективного обоснования диагноз а дизентерии при стертых и хронич еских ф орм ах. Ставят раз верну ту ю реакц ию агглютинац ии по типу реакц ии В идаля и РП ГА с эритроц итарным и диагностику м ам иФ лекснера иЗонне. Д иагностич еским титром придизентерии, выз ванной ш игеллам иФ лекснера, сч итают раз ведение 1:200, аш игеллам иЗонне 1:100. Д иагностическ ие, проф илак тическ иеи лечебныепрепараты Агглют и ни рующ и е О В -с ы ворот ки прот и в пат оге нны х ки ш е чны х палоче к: О В -коли-сыворотка О 26:В 6, О В -коли-сыворотка О 111:В 4, О В -колисыворотка О 55:В 5 и др. П олу ч ают пу тем им м у низац ии кроликов вз весью эш ерихий соответству ющ его серовара иприм еняют в реакц ииагглютинац иидля идентиф икац иипатогенных эш ерихий. Адс орби рованны е агглют и ни рующ и е с ы ворот ки для и де нт и фи каци и ш и ге лл. Раз лич ают гру пповые и м оновалентные сыворотки. П олу ч ают пу тем им м у низац ии кроликов определенным и видам и и сероварам и S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii иS. sonnei с последу ющ ей адсорбц ией м еж гру пповых идру гих лиш нихантител. Поли вале нт ны й ди зе нт е ри йны й бакт е ри офаг. Содерж ит ф аги, лизиру ющ ие ш игеллы Ф лекснера и Зонне. В ыпу скается в виде таблеток с кислотоу стойч ивым покрытием . П рим еняют для экстренной проф илактики и леч ения. Ди зе нт е ри йная вакци на с пи рт овая, с ух ая. Содерж ит ш игеллы Ф лекснера иЗонне. П рим еняют для леч ения хронич ескихф орм дизентерии. Пре парат ы эуби от и ков - коли -бакт е ри н, би фи дум бакт е ри н, би фи кол, лакт обакт е ри н. П рим еняют с леч ебно-проф илактич еским иц елям и. Ант и би от и ки : полу синтетич еские пениц иллины, ц еф алоспорины 2-4-го поколений, хлорам ф еникол, тетрац иклины, ф торхинолины, су льф анилам иды, полим иксин идр. Л абораторная д иагностик а брю ш ного тиф а, паратиф ов и сальм онелезов. Д исбак териоз Совре м е нная клас с и фи каци я бакт е ри й рода Salmonella. Род Salmonella включ ает 2 вида: S. е пtе riс а (2307 сероваров) иS. bongori (17 сероваров). В ид S. е пtе riс а включ ает 5 подвидов: е пtе riс а (I), sа 1а т а е (II), а rizо па е (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV), indica (V), которые выделены на основании м олеку лярногенетич еских признаков (гибридизац ионного анализа Д Н К ) и ф енотипич ески раз лич аются по биохим ич еским свойствам . В ну три подвидов сальм онеллы подраз деляются на серовары по O-и Н -антигенам согласно классиф икац ии К ау ф м ана-У айта. Н еобходим о пом нить, ч то представители раз ных подвидов м огу т им еть общ ие или идентич ные антигены. А бсолютное больш инство сероваров (1367) относятся к подвиду е пtе riс а . Согласно ранее су щ ествовавш ей
32
классиф икац ии, сальм онеллы - представители раз лич ных сероваров рассм атривались как сам остоятельные виды и им ели собственные видовые наз вания. В настоящ ее врем я старые видовые наз вания использ у ют для обоз нач ения биоваров (сероваров), наприм ер S. е пtе riс а подвидае пtе riс а серовара tyrhimurium соответству ет S. tyrhimurium, серовара tyrhi - S. tурhi, серовара ра ratyphi A – S. ра ratyphi A ит.д. П риродным рез ерву аром бактерий S. е пtе riс а подвида е пtе riс а являются теплокровные ж ивотные, для остальных холоднокровные ж ивотные и окру ж ающ ая среда. В оз бу дители з аболеваний ч еловекаотносятся кподвиду е пtе riс а . С эпидем иологич еской точ ки з рения сальм онеллы, выз ывающ ие з аболевания ч еловека, относят к трем основным гру ппам . П ервая гру ппа включ ает 3 биовара: typhi, ра ratyphi А и С, которые являются воз бу дителям и строгих антропоноз ов (инф иц иру ют только ч еловека ипередаются от ч еловека к ч еловеку прям о илиопосредованно - ч ерез пищ у , воду ). В торая гру ппа включ ает серовары, которые адаптировались к определенном у виду ж ивотных. Н екоторые из этих сероваров патогенны для ч еловека (dublin, gallinarum, schotmulleri идр.). К третьей гру ппе относятся больш инство сероваров, не им еющ их спец иф ич еских хоз яев испособных инф иц ировать какч еловека, такиж ивотных. П о клинич еской классиф икац ии сальм онеллы подраз деляют на воз бу дителей брюш ного тиф а (биовар typhi) ипаратиф ов (биовары ра ratyphi А , С иschotmulleri) ивоз бу дителей сальм онеллез ов, включ ающ их все остальные биовары сальм онелл, патогенных для ч еловека. Больш инство воз бу дителей сальм онеллез ов относится к третьей гру ппе поэпидем иологич еской классиф икац ии. З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. М икроскопировать и з арисовать м аз ки из ч истых ку льту р воз бу дителей киш еч ныхинф екц ий. 2. Д иагностикабрюш ного тиф аипаратиф ов. 2.1. Бактериологич еская диагностика: а) выбрать м атериал для исследования; б) у ч есть рез у льтаты первич ного посеваисследу ем ого м атериаланасреду Раппопорт; в) у ч есть рез у льтаты пересева бактерий со среды Раппопорт на среду Э ндо. О писать и з арисовать колонии, выросш ие на среде Э ндо, и обосновать выбор подоз рительных колоний для дальнейш его исследования; г) у ч есть рез у льтаты пересеваподоз рительных колоний со среды Э ндо на среду Ресселя; д) у ч есть рез у льтаты идентиф икац ии выделенной ч истой ку льту ры по биохим ич еским свойствам ; е) сделать вывод инам етить план дальнейш его исследования. 2.2. Серодиагностика. П роанализировать рез у льтаты реакц ииВ идаля. 3. Бактериологич еская диагностикасальм онеллез ов: а) выбрать м атериал для исследования;
33
б) у ч есть рез у льтаты первич ного посева исследу ем ого м атериала на висм у т-су льф ит агар. О писать и з арисовать колонии и обосновать выбор подоз рительных колоний для дальнейш его исследования; в) у ч есть рез у льтаты пересеваподоз рительных колоний насреду Ресселя; г) у ч есть рез у льтаты идентиф икац ии выделенной ч истой ку льту ры по биохим ич еским свойствам ; д) сделать вывод инам етить план дальнейш его исследования. 4. О з наком иться с диагностич еским и и леч ебно-проф илактич еским и препаратам и. М е т о диче с кие ука за ния М ик робиологическ ая д иагностик а брю ш ноготиф а и паратиф ов М а т е риа л дл я ис с л е до ва ния : исходя из особенностей патогенез а брюш ного тиф а, на 1-й неделе з аболевания, в период бактерием ии, воз бу дителей выделяют из крови(полу ч ение гем оку льту ры), со 2-й неделиз аболевания - из испраж нений (полу ч ение копроку льту ры), м оч и или ж елч и. А нтитела в сыворотке накапливаются прибрюш ном тиф е в конц е 1-й неделиз аболевания. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е (схем а6). П о л уче ние ге мо кул ьт уры . В 1-й день из локтевой вены больного беру т 5-10 м л крови и з асевают в колбу с 50-100 м л селективной среды Раппопорт, содерж ащ ей ж елч ный бу льон (для подавления роста дру гих бактерий), глюкоз у , индикатор А ндреде и поплавок для обнару ж ения газ а. У каз анные соотнош ения крови и среды необходим ы для подавления бактериц идного действия белков крови. П осевы инку биру ют при37 °С в теч ение 18-20 ч . Н а 2-й день приросте сальм онелл наблюдается пом у тнение и изм енение ц вета среды. П ри росте паратиф оз ных бактерий (биовары ра ratyphi А , С и schotmulleri) наряду с у каз анным иизм енениям ипоявляются пу з ырькигаз а в поплавке. Д ля у скорения ответа из среды Раппопорт делают м аз ки и препараты "висяч ая" капля. П ри налич ии ч истой ку льту ры грам отриц ательных подвиж ных палоч ек иизм енении ц вета среды (или налич ии газ а) дают первый предварительный ответ. Затем ку льту ру из среды Раппопорт пересевают в пробирку со средой Ресселя, полагая приэтом , ч то из кровивыделенач истая ку льту ра им ож но сраз у присту пить к ее идентиф икац ии. О дноврем енно со среды Раппопорт делают посевы насреду Э ндо для полу ч ения изолированных колоний с ц елью проверки ч истоты выделенной ку льту ры. Н а 3-й день отм еч ают ф ерм ентац ию глюкоз ы на среде Ресселя и ставят ориентировоч ну ю реакц ию агглютинац ии на стекле. Н а основании полу ч енных данных дают второй предварительный ответ. Д ля дальнейш его исследования отбирают несколько бесц ветных колоний со среды Э ндо ипересевают их в среду Ресселя или скош енный питательный агар (для контроля полу ч енных рез у льтатов). Ч исту ю ку льту ру пересевают на среды "пестрого" ряда и серотипиру ют в реакц ии агглютинац ии на стекле со см есью гру пповых сывороток, а з атем с адсорбированным и м онорец епторным и О - и Н -
34
сальм онеллез ным и сывороткам и. О конч ательный диагноз у станавливают на основании биохим ич еских (табл. 5) и антигенных свойств. Биохим ич еские признаки (раз верну тый "пестрый" ряд) поз воляют диф ф еренц ировать сальм онеллы от схож ихс ним иэнтеробактерий: Citrobacter, Hafnia (табл. 6). В ыделенну ю ч исту ю ку льту ру бактерий использ у ют для определения ч у вствительностикантим икробным препаратам . Ф а го т ипиро ва ние . С пом ощ ью наборастандартных Vi-ф агов определяют до 78 ф аготипов S. enterica биовараtурhi. П риэтом необходим ым у словием является налич ие в ку льту ре Vi-антигена. К у льту ры S. enterica биовара ра ratyphi В (schotmulleri) диф ф еренц иру ются на11 ф аготипов иподтипов. Т аблица 5. Биохим ич еские свойства сальм онелл - воз бу дителей брюш ного тиф аипаратиф ов Биовар Ф ерм ентац ия О браз ование S. е пtе riс а лактоз ы глюкоз ы м альтоз ы сахароз ы м аннита H2S NH3 индола typhi К К К + ра ratyphi А КГ КГ КГ schotmulleri КГ КГ КГ + + У с л о в ны е о бо зна че ния : (К ) - образ ование кислоты; (К Г) - образ ование кислоты игаз а; (+) - обнару ж ение признака; (-) - отсу тствие признака.
Т аблица 6. Д иф ф еренц иац ия сальм онелл и дру гих энтеробактерий по биохим ич еским признакам Л изинФ ерм ентац ия у глеводов βдекар- ду льсорксирам сали4% ГалакРод бокси- ц ита бита лоз ы ноз ы ц ина лактоз ы тоз илаз а даз а Salmonella Citrobacter Hafnia
++
К (-) К (-) -
К К -
К К К
К К К
К (+-) К (+-)
К (+-) -
К К
У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) - полож ительная реакц ия; (-) - отриц ательная реакц ия; (+-) вариабельная реакц ия; К - образ ование кислоты; К (-) - образ ование кислоты (редко); К (+-) - образ ование кислоты (вариабельно).
П о л уче ние ко про кул ьт уры . И спраж нения з асевают на одну из диф ф еренц иально-диагностич еских сред (Э ндо или Л евина) или элективные среды обогащ ения (М юллера, селенитовая иливисм у т-су льф ит агар). Д ля посева петлю ф екалий вносят в пробирку с изотонич еским раствором хлорида натрия и готовят су спенз ию. П осле оседания кру пных ком оч ков су спенз ию петлей наносят на поверхность агаровой среды - на одну половину ч аш ки. М атериал тщ ательно растирают ш пателем по одной, а з атем по дру гой половине ч аш кидля полу ч ения изолированных колоний. П осевы инку биру ют при37 °С в теч ение 18-20 ч . Н а2-й день из у ч ают характер колоний, выросш их нач аш ках, пересевают 2-3 бесц ветные колонии(со среды Э ндо илиЛ евина) иликолониич ерного ц вета(висм у т-су льф ит
35
агар) на среду Ресселя ив пробиркисо скош енным питательным агаром . П ри отсу тствии подоз рительных колоний на ч аш ках делают высевы из среды М юллера или селенитовой среды на ч аш ки со средой Э ндо для полу ч ения изолированных колоний. Д ля у скорения ответаставят ориентировоч ну ю реакц ию агглютинац ии на стекле с м атериалом , вз ятым из бесц ветной колонии. Д алее посту пают такж е, какиприидентиф икац иигем оку льту ры. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки . М атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, в м олеку лярно-биологич еских исследованиях использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью П Ц Р. Се роди агнос т и ка. В лабораторной практике ш ироко прим еняют раз верну ту ю реакц ию агглютинац ии В идаля, основанну ю на обнару ж ении в сыворотке кровилюдей антител - агглютининов, которые появляются в конц е 1-й - нач але 2-й недели з аболевания. Реакц ию ставят одноврем енно с ч етырьм я антигенам и: О и Н -брюш нотиф оз ным и, Аи В -паратиф оз ным и диагностику м ам и. Брюш нотиф оз ные м онодиагностику м ы прим еняют для у становления стадии болез ни, так как содерж ание О - и Н -антител в раз ные ее периоды неодинаково, О -антитела появляются на 1-й неделе, накапливаются в раз гар з аболевания иисч ез ают к м ом енту выз доровления. Н -антителапоявляются в раз гар з аболевания, накапливаются к конц у з аболевания и сохраняются у переболевш их в теч ение длительного врем ени. У людей, вакц инированных против брюш ного тиф а ипаратиф ов, такж е наблюдается полож ительная реакц ия В идаля, прич ем в довольно высоком титре, поэтом у "инф екц ионный В идаль" у дается отлич ить от "прививоч ного" только по нарастанию титраагглютининов у больных в проц ессе з аболевания. Реакц ию В идаля ставят в ч етырех рядах пробирок по 7 пробирок в каж дом ряду , из которых 5 опытных и2 контрольные. Д ля контроля каж дого диагностику м а в пробиркивносят по 1 м л изотонич еского раствора хлорида натрия, в который добавляют 2 капли диагностику м а. В контрольной пробирке с 1 м л сыворотки (без диагностику м а) не долж но быть хлопьев. П ри спонтанной агглютинац ии реакц ия не у ч итывается. Д иагностич еский титр реакц ии В идаля равен 1:200. Д ля серологич еского исследования реконвалесц ентов и выявления бактерионосителей ш ироко использ у ют реакц ию непрям ой Vi-гем агглютинац ии, с пом ощ ью которой в сыворотке крови людей определяют прису тствие антител к Vi -антигену . В кач естве антигена использ у ют эритроц итарный Vi-диагностику м , представляющ ий собой вз весь эритроц итов ч еловека I(0) гру ппы, обработанных ф орм алином и сенсибилизированных Vi-антигеном S. enterica биовара typhi. Готовят раз ведения испыту ем ой сывороткиот 1:10 до1:1280. П риполож ительной реакц ии эритроц иты покрывают дно пробирки в виде диска с з аз у бренным и краям и, а надосадоч ная ж идкость остается проз рач ной. П ри отриц ательной реакц ии, так ж е как и в контроле, эритроц иты осаж даются на дно пробирки и им еют вид дискас ровным икраям и("пу говки"). Д иагностич еское з нач ение им еет титр пассивной Vi-гем агглютинац ии, нач иная с 1:40 ивыш е. В сех лиц , сыворотка крови у которых дает полож ительный рез у льтат в РН ГА с эритроц итарным Viдиагностику м ом , рассм атривают как подоз рительных на носительство S. enterica биовараtyphi иподвергают м ногократном у бактериологич еском у обследованию.
С хем а 6. М ик робиологическ оеисслед ованиепри брю ш ном тиф еи паратиф е
36
37
М ик робиологическ ая д иагностик а сальм онеллезов М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : испраж нения, пригенерализованной ф орм е - кровь. М икробиологич еская диагностика сальм онеллез ов принц ипиально не отлич ается от диагностики брюш ного тиф а и паратиф ов. Серодиагностика не прим еняется по прич ине больш ого ч исла сероваров воз бу дителей. В аж нейш ие биохим ич еские признакирядасальм онелл представлены в таблиц е 7.
В С D E
S.typhimurium S.derby S.heiderberg S.choleraesuis S.newport S.enteritidis S.anatum
+ + + + + + +
-
+ + + + + + +
++ + + + + +
+-
+ + + ++ ++
рам ноз ы
О браз ование
ду льц ита
сахароз ы
ксилоз ы
м аннита
лактоз ы
Гру ппа
глюкоз ы
Т аблица 7. Биохим ич еские свойствасальм онелл Ф ерм ентац ия В ид
++ + + + + +
индола H2S
+-
+ + + ++ + +
У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) - полож ительная реакц ия; (-) - отриц ательная реакц ия; (+-) – больш ее ч исло ш там м ов дает полож ительну ю реакц ию.
М ик робиологическ ая д иагностик а к иш ечногод исбак териоза М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : ф екалии. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е . И м еет ориентировоч ное з нач ение. П ри рез ко выраж енном дисбактериоз е в м аз ках преобладают м икроорганизм ы определенных видов (наприм ер, дрож ж еподобные грибы, стаф илококкиидр.) на ф оне су щ ественного у м еньш ения грам отриц ательной м икроф лоры. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . П роводится колич ественное исследование состава м икроф лоры киш еч ника. Д ля этого из исследу ем ого -2 -4 -6 м атериала готовят раз ведения 10 , 10 , 10 ит.д. П ервич ные посевы по 0,1 м л каж дого раз ведения производят параллельно на несколько питательных сред (Э ндо, кровяной агар, Ж СА , агар Сабу ро и др.) и инку биру ют при 37 °С. П одсч итывают ч исло выросш их колоний и определяют ч исло К О Е в 1г м атериала. П роводят отсев 2-3 колоний каж дого вида для выделения и идентиф икац иич истых ку льту р м икроорганизм ов. Д ля обнару ж ения анаэробных Bifidobacterium spp. делают м ерные посевы -7 м атериала в раз ведениях 10 ивыш е в пробиркис 13-15 м л м одиф иц ированной среды Блау рокка, в состав которой входит печ еноч ный бу льон, пептон - 1%, лактоз а - 1%, хлорид натрия - 0,5%, ц истин - 0,01%, агар-агар - 0,75%, твин-80 0,1%. П риросте Bifidobacterium spp. ч ерез 24-48 ч происходит пом у тнение всей среды с образ ованием тяж ей или отдельных колоний. Готовят м аз ки и
38
окраш ивают по м етоду Грам а. В ыделение ч истых ку льту р Bifidobacterium spp. является весьм а тру доем ким ипрактич ескинеобяз ательным . П ри необходим ости идентиф икац ию представителей рода осу щ ествляют по биохим ич еским свойствам . Д ля оц енки рез у льтатов бактериологич еского исследования сопоставляют полу ч енные данные с колич ественным содерж анием м икроорганизм ов в норм е. О риентировоч ные критерии норм альной м икроф лоры толстой киш ки представлены в табл. 8. Т аблица 8. К ритериинорм ы киш еч ной ф лоры М икроорганизм ы П атогенные м икробы сем . Enterobacteriaceae О бщ ее колич ествоЕ .с о li, м лн/г Е .с о li со слабовыраж енным иф ерм ентативным исвойствам и, % Е .с о li с гем олитич еским исвойствам и, % Э нтеробактерии (лактоз оотриц ательные и лактоз ополож ительные): Hafnia, Aerobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia К окковые ф орм ы, % Гем олитич еский стаф илококк по отнош ению ко всем кокковым ф орм ам , % Bifidobacterium spp. (рост припосеве раз ведения) БактерииродаProteus Грибы родаCandida
Н орм а 0 300-400 Д о10 Н ет Д о5 Д о25 Н ет 10 ивыш е Н ет Н ет
П ри киш еч ном дисбактериоз е происходит з нач ительное сниж ение облигатной анаэробной м икроф лоры, ив перву ю оч ередь Bifidobacterium spp., а такж е у велич ение аэробных видов, в ч астностиЕ.с о li, содерж ание которых м ож ет 11 превыш ать 10 м икробных клеток в 1 г испраж нений. У велич ивается ч астота обнару ж ения ш там м ов Е.с о li со слабой ф ерм ентац ией лактоз ы и им еющ их гем олитич еские свойства (до 30-40%), гем олитич еских и негем олитич еских стаф илококков, бактерий родаProteus, грибов родаCandida (до 15-16%). У лиц с дисбактериоз ам и более ч асто обнару ж ивают лактоз оотриц ательные и лактоз ополож ительные энтеробактерии, относящ иеся к родам Hafnia, Aerobacter, Citrobacter. Д ля м икроорганизм ов, в норм е отсу тству ющ их в испраж нениях или им еющ ихся в небольш ом колич естве, показ ателем дисбактериоз а бу дет 5 6 содерж ание их 10 -10 и выш е К О Е в 1 г м атериала. Д ля оконч ательного з аключ ения о киш еч ном дисбактериоз е важ ное з нач ение им еет повторное его выявление в динам ике обследования больного. Д иагностическ ие, проф илак тическ иеи лечебныепрепараты Сальм оне лле зны е групповы е , адс орби рованны е и м оноре це пт орны е О - и Н -агглют и ни рующ и е ди агнос т и че с ки е с ы ворот ки . П олу ч ают так ж е, как и дру гие диагностич еские сыворотки. П рим еняют для серотипирования сальм онелл в реакц ииагглютинац ии.
39
П редставляют Сальм оне лле зны е О- и Н - м оноди агнос т и кум ы . собой вз веси сальм онелл, у битых нагреванием (О -диагностику м ы) или обработкой ф орм алином (Н -диагностику м ы). П рим еняют для серодиагностики брюш ного тиф ав реакц ииВ идаля. Ти повы е с альм оне лле зны е бакт е ри офаги . П рим еняют для ф аготипирования сальм онелл. Брюш нот и фозная м оновакци на и брюш нот и фозная с пи рт овая вакци на, обогащ е нная Vi-ант и ге ном . П рим еняют для спец иф ич еской активной проф илактикибрюш ного тиф а. Поли вале нт ны й брюш нот и фозны й бакт е ри офаг. В ыпу скается в виде таблеток с кислотоу стойч ивым покрытием . П рим еняют для экстренной проф илактикибрюш ного тиф а. Коли -бакт е ри н. Содерж ит лиоф ильно высу ш енные ж ивые клетки Е .с о li ш там м а М 17, обладающ его выраж енным и антагонистич еским и свойствам и в отнош енииряда патогенных киш еч ных бактерий. П рим еняют для норм ализац ии киш еч ной м икроф лоры придисбактериоз е илеч ениидизентерииу детей. Би фи дум бакт е ри н. Содерж ит лиоф ильно высу ш енну ю вз весь ж ивых клеток В. bifidum. П рим еняют для леч ения хронич еских киш еч ных инф екц ий невыясненной этиологииу детей идизентерии. Би фи кол. Содерж ит см есь высу ш енныхж ивыхбактерий Е .с о li ш там м аМ 17 иВ. bifidum. П оказ ания кприм енению те ж е. Л акт обакт е ри н. В ыпу скается в виде таблеток и содерж ит проду кты ж изнедеятельностилактобактерий. П рим еняют для леч ения дисбактериоз ов. Ант и би от и ки : су льф анилам иды, полу синтетич еские пениц иллины, ц еф алоспорины 2-4-го поколения, хлорам ф еникол, тетрац иклины, ф торхинолоны, полим иксин. Л абораторная д иагностик а холеры З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. У каз ать м атериалдля исследования. 2. Бактериологич еская диагностикахолеры. а) изу ч ить м орф ологич еские и тинкториальные свойства: м икроскопировать готовые м аз кииз исследу ем ой ку льту ры больного; б) изу ч ить антигенные свойства: отм етить рез у льтаты раз верну той реакц ииагглютинац иис диагностич еской O1-сывороткой; в) отм етить налич ие или отсу тствие роста исследу ем ой ку льту ры на среде с полим иксином ирез у льтаты гексам инового теста. Д ать з аключ ение попроведенным исследованиям . М е т о диче с кие ука за ния М а т е риа л для ис с ле до ва ния : испраж нения больного, рвотные м ассы, вода, пищ евые проду кты; при постм ортальной диагностике: отрез ки тонкой киш ки и ж елч ный пу з ырь с ч астью печ ени. П ри необходим ости хранения м атериал пом ещ ают в транспортну ю среду (бу ф ерный солевой раствор с глиц ерином ). Д ля
40
длительного сохранения реком енду ется полоску ф ильтровальной бу м аги, см оч енну ю в ж идких испраж нениях, пом естить в герм етич ески з акрытый пластиковый контейнер - для предохранения от высыхания. Т аким образ ом воз бу дитель сохраняется в м атериале до 5 нед. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е . И з исследу ем ого м атериала готовят м аз ки, окраш ивают их по м етоду Грам а и водным ф у ксином . К ром е того, из нативного м атериала готовят препарат "висяч ая" капля, в котором определяют налич ие подвиж ных вибрионов при тем нопольной или ф аз ово-контрастной м икроскопии. О бнару ж ение в м аз ках больш ого колич ества грам отриц ательных, слегка изогну тых палоч ек (длиной от 1,5 до 3 м км ) и активно-подвиж ных вибрионов в препарате "висяч ая" капля поз воляет дать первый предварительный полож ительный ответ. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . М атериал з асевают в раз лич ные ж идкие и плотные элективные среды, в ч астности во ф лаконы со щ елоч ной пептонной водой (1% с теллу ритом ) и на ч аш ки со щ елоч ным питательным агаром . П осевы на пептонной воде инку биру ют при 37 °С в теч ение 5-6 ч , на ч аш ках – 10-12 ч . И з голу боватой пленки, образ у ющ ейся на пептонной воде, или из ее поверхностного слоя делают м аз киипрепараты "раз давленная" и"висяч ая" капля. Э тот ж е м атериал использ у ют для постановкиреакц ииагглютинац иина стекле со спец иф ич еской противохолерной О 1-сывороткой. Ч асть пептонной воды переносят в дру гу ю пробирку для постановкинитроз оиндоловой пробы. Д ля этого добавляют ту да ж е несколько капель серной кислоты. В полож ительном слу ч ае появляется роз овое окраш ивание вследствие образ ования нитроз оиндола под влиянием холерного вибриона. Н ез ависим о от рез у льтатов исследования делают пересев на втору ю пептонну ю воду . Н алич ие грам отриц ательных вибрионов, агглютини-ру ющ ихся О 1-сывороткой, поз воляет дать второй предварительный ответ. Н ез ависим о от полу ч енных рез у льтатов продолж ают исследование, какпоказ анонасхем е 7. В ыделение ч истой ку льту ры и ее идентиф икац ию проводят по 5-6 однотипным колониям , выросш им на щ елоч ном агаре. Д ля у скорения хода анализа ставят раз верну ту ю реакц ию агглютинац иис бактериальной су спенз ией, приготовленной из колоний. Д ля этого агглютиниру ющ у ю О 1-сыворотку раз водят в пробирках до титра пептонной водой (в объ ем е 0,5 м л). Затем в каж ду ю пробирку вносят 1-2 капли су спенз ии бактерий. Рез у льтат реакц ии агглютинац ииу ч итывают после 3-4-ч асовой инку бац иипри37 °С. Р е а кция Ф о ге с а -П ро с ка уэра : вибрионы выращ ивают в глюкоз оф осф атном бу льоне, з атем добавляют реактив альф а-наф тол в растворе щ елоч и; приналич ии ац етилм етилкарбиноланаблюдается ру биново-красное окраш ивание среды. Ге кс а мино в ы й т е с т : ку льту ру выращ ивают на бу льоне с глюкоз ой, гексам ином (у ротропином ) и индикатором бром тим оловым синим . В полож ительном слу ч ае ч ерез 6-8 ч наблюдается изм енение з еленого ц ветасреды в ж елтый. Т аким образ ом , идентиф икац ию ку льту р проводят в три этапа: 1) у станавливают их принадлеж ность к роду Vibrio; 2) диф ф еренц иру ют их от холероподобных вибрионов в реакц ии агглютинац ии с O1-сывороткой, по
41
ч у вствительности к спец иф ич еском у ф агу идру гим итестам и; 3) определяют видовые признаки ку льту р. О конч ательное з аключ ение о выделении и диф ф еренц ировании холерных вибрионов дают ч ерез 36-48 ч на основании ком плексногоизу ч ения основныхбиологич еских признаков воз бу дителя. Т ру дности при оц енке рез у льтатов бактериологич еского исследования встреч аются привыделенииатипич ных холерных вибрионов ив перву ю оч ередь не агтлютиниру ющ ихся холерной O1-сывороткой (Н А Г-вибрионы). Н А Гвибрионы м огу т лизироваться одним из спец иф ич еских холерных ф агов и обладать дру гим исвойствам и, сходным ис холерным ивибрионам и. И дентиф икац ию ку льту ры проводят на основании определения ч у вствительности вибрионов к холерном у ф агу , агглютинабельности противохолерной О 1-сывороткой и типовым и агглютиниру ющ им и сывороткам и И наба и О гава, их гем олитич еских и биохим ич еских свойств (оксидаз ная активность декарбоксилаз ы ам инокислот, ф ерм ентац ия у глеводов, образ ование ац етилм етилкарбинолаидр.). Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки : иммо бил иза ция вибрио но в хо л е рны ми с ы в о ро т ка миит ипо в ы михо л е рны мифа га ми. К аплииспраж нений илим атериала с поверхности пептонной воды обрабатывают холерной O1-сывороткой, типовым исывороткам иО гаваиИ набаилитиповым ихолерным иф агам и. Готовят из них препараты "раз давленная" капля, которые исследу ют с пом ощ ью тем нопольной и ф аз ово-контрастной м икроскопии. В полож ительном слу ч ае ч ерез 3-5 м ин движ ение вибрионов прекращ ается. Иммуно химиче с кие ис с л е до ва ния . П рим еняют м етод прям ой И Ф . М аз кииз исследу ем ого м атериала обрабатывают ф люоресц иру ющ ей противохолерной сывороткой и исследу ют в люм инесц ентном м икроскопе. П олож ительным рез у льтатом сч итается обнару ж ение в препарате даж е единич ных вибрионов с ярким ж елто-з еленым свеч ением в виде блестящ его ободкапо периф ерииклетки. П олож ительный рез у льтат м ож но полу ч ить ч ерез 1-2 ч после нач ала 6 исследования приконц ентрац иивибрионов не м енее 10 клеток в 1 м л, поэтом у реком енду ется предварительное подращ ивание м атериаланапитательных средах. Био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с л е до в а ния . В слу ч ае обнару ж ения соответству ющ их м олеку л Д Н К в исследу ем ом м атериале в ходе в рез у льтате проведения П Ц Р-анализам ож но поставить предварительный диагноз . Се роди агнос т и ка. В ыявление антител к воз бу дителю является вспом огательным и прим еняется для ретроспективной диагностики холеры, выявления вибрионосителей и оц енки напряж енности постинф екц ионного и поствакц инального им м у нитета. Д ля этого обыч но ставят реакц ию агглютинац ии или РН ГА , диагностич еский титр антител в этих реакц иях 1:80-1:320, а такж е определяют вибриоц идные антителав реакц иилизиса. Ди агнос т и ка нос и т е льс т ва В о врем я вспыш ки холеры проводят м ассовое обследование на носительство V.cholerae. М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : ректальные м аз ки(ф екалии, вз ятые там поном из прям ой киш ки).
42
и с с ле довани е . П осев м атериала от 10 Бакт е ри ологи че с кое обследу ем ых на обогатительну ю среду с О 1-агглютиниру ющ ей диагностич еской сывороткой. В полож ительных слу ч аях ч ерез 3-4 ч нач инается выпадение хлопьев в рез у льтате агглютинац ии раз м нож ивш ихся вибрионов. П ри обнару ж ении в осадке грам отриц ательных подвиж ных вибрионов каж дый из 10 пац иентов обследу ется индивиду ально. С хем а 7. М ик робиологическ оеисслед ованиепри холере
43
Л абораторная д иагностик а пищевых ток сик оинф ек ций , бак териальной природ ы
инток сик аций
З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. М икроскопировать и з арисовать м аз ки из ч истых ку льту р воз бу дителей киш еч ных инф екц ий. О писать характер колоний, выросш их на ч аш ках с диф ф еренц иально-диагностич еской средой после посева испраж нений больного и остатков пищ и – воз м ож ных источ ников пищ евой токсоинф екц ии. 2. О тм етить рез у льтаты изу ч ения биохим ич еских свойств исследу ем ой ку льту ры сальм онелл по ранее з асеяном у «пестром у » ряду . Сделать з аключ ение наоснованииполу ч енныхданных. 3. Д иагностикаботу лизм а: а) у каз ать м атериалдля исследования; б) проанализировать рез у льтаты РН ГА для обнару ж ения боту лотоксина в сыворотке кровибольного (реакц ия Бойдена). Д ать з аключ ение. М е т о диче с кие ука за ния М ик робиологическ ая д иагностик а пищевых ток сик оинф ек ций , вызванных Е scherichia spp., Salmonella spp., Proteus spp. М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : ф екалии, рвотные м ассы, пром ывные воды ж елу дка больного, остатки пищ евых проду ктов - воз м ож ные источ ники и ф акторы передач иинф екц ии. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . П роизводят пу тем посевам атериалана диф ф еренц иально-диагностич еские и элективные среды (Э ндо, висм у т-су льф ит агар и др.) для выделения ч истой ку льту ры сальм онелл иэш ерихий, а такж е в конденсац ионну ю воду в пробирке со скош енным питательным агаром для выявления бактерий рода Р roteus. П осле инку бац иипосевов при37 °С в теч ение 20-24 ч отм еч ают ц вет колоний нач аш ках с диф ф еренц иальной средой иналич ие "полз у ч его" роста, характерного для Р roteus spp., в пробирке со скош енным питательным агаром . П одоз рительные колонии пересевают на скош енный питательный агар для полу ч ения ч истых ку льту р иодноврем енно ставят с ним и ориентировоч ну ю реакц ию агглютинац ии на стекле, использ у я см еси диагностич еских сывороток. Н а следу ющ ий день с ч истой ку льту рой ставят раз верну ту ю реакц ию агглютинац ии с соответству ющ ей м онорец епторной сывороткой иделают посев на среды "пестрого" ряда. П ривыделенииодного и того ж е серовара сальм онелл или эш ерихий из организм а больных людей и пищ евого проду кта делают оконч ательное з аключ ение об этиологии пищ евой токсикоинф екц ии - источ нике з аболевания. П ри налич ии "полз у ч его" роста на скош енном питательном агаре из конденсац ионной воды петлей беру т м атериал для приготовления препарата"висяч ая" капля с ц елью у становления подвиж ности и для м аз ка, который окраш ивают по м етоду Грам а и м икроскопиру ют. Затем выделяют ч исту ю ку льту ру , определяют биохим ич еские и дру гие признаки и у станавливают вид: Р .vulgaris, P.mirabilis, P.morganii иP.rettgeri.
44
О ц енка ролиу словно-патогенных м икроорганизм ов в этиологиипищ евых токсикоинф екц ий долж на быть строго аргу м ентирована: а) бактериологич еским , серологич еским , эпидем иологич еским и клинич еским исключ ением сальм онеллез ов, дизентерии, холеры; б) выделением идентич ных ш там м ов у словно-патогенных бактерий из рвотных м асс, пром ывных вод ж елу дка, испраж нений, проду ктов. М ик робиологическ ая д иагностик а стаф илок ок к овых пищевых инток сик аций М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : рвотные м ассы, пром ывные воды ж елу дка, подоз рительные пищ евые проду кты. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки : иммуно химиче с кие , био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие исс л е до ва ния . И м м у нохим ич еская диагностика основананаобнару ж енииэнтеротоксинав исследу ем ом м атериале. Э нтеротоксин Staphylococcus spp. экстрагиру ют изотонич еским раствором хлориданатрия, з атем определяют его прису тствие и серологич еску ю спец иф ич ность реакц ией прец ипитац ии в геле с им м у нным и антитоксич еским и сывороткам и А , В , С. И спольз у ют такж е латекс-агглютинац ию, И Ф А , РИ А идр. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . С ц елью выделения ч истой ку льту ры стаф илококкаисследу ем ый м атериал, который м ож ет содерж ать ж изнеспособные бактерии, з асевают в ч аш ки с Ж СА . П олу ч енные по схем е ч истые ку льту ры проверяют на способность проду ц ировать энтеротоксины. Д ля эпидем иологич еского анализа м ассовых стаф илококковых интоксикац ий проводят ф аготипирование выделенных ку льту р с пом ощ ью набора стаф илококковыхф агов. Би опроба. Д ля обнару ж ения энтеротоксинам ож но использ овать биопробу скорм ить изу ч аем ый м атериал котятам -сосу нкам , у которых стаф илококковый энтеротоксин выз ывает рвоту ипонос ч ерез 30-60 м ин после скарм ливания. М ик робиологическ ая д иагностик а боту лизм а М а т е риа л для ис с л е до в а ния : сыворотка крови, м оч а, испраж нения, пром ывные воды ж елу дка, остаткипищ иилиподоз реваем ые проду кты (колбасы, м ясные, рыбные, ф ру ктовые, овощ ные консервы идр.). Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки : иммуно химиче с кие , био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие исс л е до ва ния . И м м у нохим ич еская диагностика основананаобнару ж енииботу лотоксинав исследу ем ом м атериале. С этой ц елью ставят реакц ию Бойдена- РИ ГА с эритроц итам и, нагру ж енным им оновалентным и антитоксич еским и противоботу линич еским и сывороткам и типов А , В , Е . В кач естве контроля использ у ют норм альну ю сыворотку крови. Д ля выявления боту лотоксина м огу т быть использ ованы такж е И Ф А и дру гие ч у вствительные серологич еские реакц ии. Би опроба. Д ля обнару ж ения боту лотоксина в пищ евых проду ктах и определения токсигенностиС .botulinum м ож но провестиреакц ию нейтрализац ии токсина на белых м ыш ах. Д ля определения серотипа токсина реакц ию ставят с
45
м оновалентным исывороткам итипов А , В , Е . П ри нейтрализац ии токсина гем олитич еской антитоксич еской сывороткой м ыш иостаются ж ивым и. Д иагностическ ие, проф илак тическ иеи лечебныепрепараты Ст афи лококковы е бакт е ри офаги (м еж ду народный набор). П рим еняют для ф аготипирования стаф илококков с ц елью эпидем иологич еского анализа пищ евой интоксикац ии. Прот и вобот ули ни че с ки е с ы ворот ки . П олу ч ены из крови лош адей, гиперим м у низированных боту линич еским и анатоксинам и. О ч ищ ены и конц ентрированы м етодом диаф ерм -3. Д ля леч ебно-проф илактич еских ц елей готовят противоботу линич еские сыворотки ч етырех типов: А , В , Е , F. М оновалентные сывороткипереч исленных типов использ у ют в диагностич еских ц елях для определения серотипатоксинав исследу ем ом м атериале. Бот ули ни че с ки й т ри анат окс и н адс орби рованны й очи щ е нны й. Э кз отоксины С .botulinum (серотипы А , В иЕ ) обез вреж ивают ф орм алином при нагревании, а з атем оч ищ ают от балластных вещ еств, конц ентриру ют и адсорбиру ют на гидрате оксида алюм иния. П рим еняют для проведения плановой активной им м у низац ии против боту лизм а юнош ей допризывного воз раста (16 лет). Прот и вох оле рная агглют и ни рующ ая O-с ы ворот ка, т и повы е с ы ворот ки О гава и И наба. П олу ч ены из крови кроликов, им м у низированных холерным и вибрионам и. П рим еняют для серологич еской идентиф икац ии и типирования холерных вибрионов в реакц ииагглютинац ии. Холе рны е фаги . Т иповые холерные ф агиприм еняют для идентиф икац иии типирования холерных вибрионов. П оливалентный холерный бактериоф аг использ у ют для леч ебно-проф илактич еских ц елей. Холе рная вакци на. В з весь у битых холерных вибрионов прим еняют для активной им м у низац иипротив холеры. Готовится из ч истых ку льту р V.cholerae O1 биоваров Е1-tor иasiatici серо-типов И набаиО гава. Холе роге н-анат окс и н. О без вреж енный холерный токсин. П рим еняют для спец иф ич еской проф илактики холеры (соз дание активного спец иф ич еского антитоксич ескогоим м у нитета). Ант и би от и ки . М огу т быть использ ованы все препараты, действу ющ ие на соответству ющ ие бактерии. В м есте с тем надо у ч итывать, ч то средивоз бу дителей достаточ но ш ироко распространены у стойч ивые варианты. Д ля больш инства грам отриц ательных воз бу дителей киш еч ных инф екц ий ш ироко использ у ют тетрац иклины, ам пиц иллин, ц еф алоспорины 2-4-го поколений, хлорам ф еникол, ф торхинолоны. В О ЗБУД И Т ЕЛ И БА К Т ЕР И А Л ЬН Ы Х Р ЕС ПИ Р А Т О Р Н Ы Х В О ЗД УШ Н О -К А ПЕЛ ЬН Ы Х И Н Ф ЕК ЦИ Й
И
Д Р УГ И Х
В оз бу дители инф екц ий, передающ ихся воз ду ш но-капельным пу тем (табл. 9), относятся к раз ным сем ействам , родам и видам , которые су щ ественно отлич аются дру г от дру га по м орф ологии, ку льту ральным и биохим ич еским
46
свойствам , антигенной стру кту ре. Респираторные инф екц ии раз ной этиологииклинич ескидиагностиру ются как острые респираторные з аболевания (О РЗ) илипневм онии. И х воз бу дителим огу т быть идентиф иц ированы только с пом ощ ью м икробиологич еского исследования. В этиологии О РЗ и пневм оний важ ну ю роль играют слож ные м икробные ассоц иац ии, преим у щ ественно бактериальные ивиру сно-бактериальные. Т аблица 9. В оз бу дителибактериальных воз ду ш но-капельныхинф екц ий Н аим енование воз бу дителя Заболевание илисиндром Staphylococcus aureus (+) А П невм ония Streptococcus pneumonia (+) А Т ож е S. pyogenes (+) А -//Klebsiella pneumonia (-) А -//Mycoplasma pneumonia А -//Chlamydia psittaci -//Coxiella burnetii Q-лихорадка(пневм ония) Escherichia coli (-) А П невм ония (аспирац ионная) Enterobacter spp. (-) А Т ож е Proteus spp. (-) А -//Bacteroides spp. (-) А н П невм ония, абсц есс легких Peptococcus spp. (+) А н Т ож е Vellonella spp. (-) А н П невм ония, сину сит, отит Haemophilus influenzae (-) А П невм ония, бронхит Bordetella pertussis (-) А К оклюш Bordetella parapertussis (-) А П аракоклюш Corynebacterium diphtheriae (+) А Д иф терия Mycobacterium tuberculosis (к/у ) А Т у берку лез легких Actinomyces bovis (+) А н А ктином икоз легких Neisseria meningitides (-) А М енингококковая инф екц ия У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) – грам полож ительные, (-) – грам отриц ательные, (к/у ) – кислотоу стойч ивые, А – аэробы, А н – анаэробы.
Д ру гие бактериивыз ывают более избирательные пораж ения. Т ак, Вordetella pertussis, как правило, локализу ется в эпителии дыхательных пу тей. С о rynebacterium diphteriae выз ывают патологич еский проц есс главным образ ом в з еве, кром е того, воз никают систем ные пораж ения, связ анные с токсинем ией. М енингококкилокализу ются в носоглотке ивыз ывают ф арингиты, наз оф агиты, а проникая в м оз говые оболоч ки и кровь, - м енингит и сепсис. К бактериям , выз ывающ им спец иф ич еские пораж ения респираторного тракта, относятся воз бу дителиту берку лез а иактином икоз а. В м есте с тем этибактериипораж ают такж е и дру гие органы (киш еч ник, печ ень, кости, су ставы и др.). В ыз ванные всем и у пом яну тым и бактериям и з аболевания су щ ественно раз лич аются по клинич еской картине ипатогенез у . Д ля выявления бактерионосителей использ у ют главным образ ом бактериоскопич еский ибактериологич еский м етоды, иногдабиопробы. Э кспресс-
47
диагностика осу щ ествляется им м у ноф люоресц ентным м етодом . М икробиологич еская диагностика респираторных з аболеваний, выз ванных стаф илококкам и, стрептококкам и, а такж е анаэробным ибактериям ипроводится м етодам и, которые излагаются в предыду щ их тем ах. Л абораторная д иагностик а м енингок ок к овой д иф терии
инф ек ции,
к ок лю ш а и
З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. У каз ать приспособления (виды там понов) для вз ятия м атериала при м енингококковой инф екц ии, коклюш е идиф терии. 2. М икробиологич еское исследование при м енингококковой инф екц ии, коклюш е ипаракоклюш е: а) у каз ать м атериал, подлеж ащ ий исследованию; б) бактериоскопич еский м етод: м икроскопировать готовые м аз ки из спинном оз говой ж идкостииносоглотки, сделать з аключ ение инам етить план дальнейш его исследования; в) бактериологич еское исследование иим м у нохим ич еский м етод; г) порез у льтатам , полу ч енным из лаборатории, сделать з аключ ение. 3. М икробиологич еское исследование придиф терии: а) у каз ать м атериал, подлеж ащ ий исследованию; б) бактериоскопич еский м етод: м икроскопировать м аз ки из м атериала, вз ятого из з ева лиц с подоз рением на диф терию или бактерионосительство, сделать предварительное з аключ ение и нам етить ход дальнейш его исследования для подтверж дения бактериоскопич еского диагноз а; в) бактериологич еский м етод: описать рост ку льту ры, полу ч енной на сверну той сыворотке, иколоний на теллу ритовой среде, отм етить рез у льтаты готовых посевов исследу ем ых ку льту р на средах "пестрого" ряда, в слу ч ае обнару ж ения С.diphtheriae определить ее токсигенность. Сопоставить данные бактериоскопич еского и бактериологич еского исследований с ц елью идентиф икац ии выделенной ку льту ры и поставить оконч ательный м икробиологич еский диагноз . 4. Д ать кратку ю характеристику диагностич еским , проф илактич еским и леч ебным препаратам . М е т о диче с кие ука за ния М ик робиологическ ая д иагностик а м енингок ок к овой инф ек ции М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : спинном оз говая ж идкость, кровь, м аз ки со слизистой оболоч ки верхних отделов носоглотки, аспират из высыпных элем ентов. П ри обследовании на носительство м атериал из верхних отделов носоглоткиберу т спец иальным носоглоточ ным там поном (который на 3/4 длины сгибают под у глом 45°). П ри доставке в лабораторию его предохраняют от охлаж дения и высу ш ивания, поскольку м енингококк оч ень ч у вствителен к воз действию этихф акторов.
48
Спинном оз гову ю ж идкость беру т в колич естве 2-5 м л и делят на две ч асти: одну ц ентриф у гиру ют и исследу ют осадок, к дру гой добавляют полу ж идку ю питательну ю среду и выдерж ивают при 37 °С для накопления бактерий. И з исследу ем ого м атериалаготовят м аз киипроизводят посевы. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е (схем а 8). М аз ки из осадка спинном оз говой ж идкостиокраш ивают по м етоду Грам аим икроскопиру ют. П ри налич ии гноя в больш инстве слу ч аев обнару ж иваются типич ные грам отриц ательные диплококки, им еющ ие характерное располож ение вну три лейкоц итов, ч то поз воляет сделать оконч ательное з аключ ение о м енингококковой инф екц ии. П рим икроскопиим аз ков из носоглоткибактерионосителей наряду с м енингококком обнару ж иваются грам полож ительные стаф илококки и стрептококки, а такж е непатогенные нейссерии (Moraxella spp. и др.). Д иф ф еренц ировать ихпо м орф ологич еским признакам з атру днительно. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . И сследу ем ый м атериал з асевают петлей нач аш кис питательным агаром , содерж ащ им кровь, сыворотку кровиили асц итич еску ю ж идкость. В среды добавляют антибиотик ристом иц ин (150 Е Д /м л), который з адерж ивает раз м нож ение грам полож ительных кокков, содерж ащ ихся в исследу ем ом м атериале, итем сам ым способству ет выделению ч истой ку льту ры м енингококка. О браз ование колоний м енингококка на этих средах наблюдается ч ерез 48 ч после инку бац иипосевов при37 °С в атм осф ере с повыш енным содерж анием СО 2 (3-10 %) ивысокой влаж ностью. В отлич ие от дру гих кокков колонии м енингококка велич иной с бу лавоч ну ю головку проз рач ны, им еют голу боватый оттенок и ровные края. Т акие колонии пересевают в пробирку со скош енным агаром для полу ч ения ч истой ку льту ры. И дентиф икац ию ч истой ку льту ры, диф ф еренц иац ию от сапроф итных нейссерии, обитающ их в носоглотке, проводят по ряду ку льту ральных и биохим ич еских признаков. Т ак, м енингококк растет только в прису тствии нативного белка, в то врем я как дру гие нейссерии раз м нож аются на простых средах и образ у ют пигм ент; на средах Гисса с добавлением сыворотки крови м енингококк ф ерм ентиру ет глюкоз у и м альтоз у до кислоты. Ф аготипирование м енингококкапроводят для эпидем иологич еского анализа. О пределение серовара производят в реакц ииагглютинац иив пробирках. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки . Иммуно химиче с кие ис с л е до в а ния . Д ля выявления антигенов м енингококков в м аз ках из исследу ем ого м атериала использ у ют м етод встреч ного им м у ноэлектроф орез а. А нтигены воз бу дителя такж е м огу т быть обнару ж ены в м атериале от больного в реакц иях непрям ой латекс-агглютинац ии, РН ГА идр. Био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с ле до ва ния . И сследу ем ый м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения Д Н К воз бу дителя с пом ощ ью П Ц Р. Се роди агнос т и ка. Д ля ретроспективного подтверж дения диагноз а использ у ют РН ГА с парным исывороткам и.
С хем а 8. М ик робиологическ оеисслед ованиепри м енингок ок к овой инф ек ции и бак терионосительстве
49
50
М ик робиологическ ая д иагностик а к ок лю ш а и парак ок лю ш а М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : м окрота, слизь из носоглотки. М атериал беру т стерильным ватным там поном из носоглотки больного ребенка. Д ля вз ятия м атериала у м аленьких детей там пон, приготовленный на тонкой эластич ной проволоке, вводят ч ерез нос. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е (схем а9). Бактериоскопич еский м етод как таковой при диагностике коклюш а не прим еняется. Д ля быстрого обнару ж ения и идентиф икац ии Bordetella pertussis использ у ют им м у ноф люоресц ентный м етод. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . О сновной м етод лабораторной диагностики коклюш а. М атериал для посева беру т с пом ощ ью носоглоточ ного там пона или м етодом "каш левых пластинок". Д ля этого в м ом ент появления каш ля открыту ю ч аш ку П етрис питательной средой подносят ко рту ребенка и держ ат в теч ение 6-8 каш левых толч ков. П равильное ираннее вз ятие м атериала поз воляет выделить воз бу дителя в нач альном периоде болез ни от 80-90 % больных. М атериал з асевают накам енноК У А иликровяные среды - картоф ельноглиц ериновый кровяной агар (среда Борде-Ж ангу ) и м олоч но-кровяной агар. В питательные среды добавляют пениц иллин для у гнетения роста посторонней м икроф лоры. К олонииB.pertussis на у каз анных средах обыч но появляются ч ерез 48-72 ч ку льтивирования. B.parapertussis - несколько раньш е: ч ерез 24-72 ч . Бордетеллы образ у ют м елкие (диам етром около 1 м м ) выпу клые влаж ные блестящ ие колонии. Н а К У А колонииим еют серовато-крем овый ц вет, а на среде Борде-Ж ангу приобретают ж ем ч у ж ный или рту тный блеск. К олонии B.parapertussis более кру пные. Н а среде Борде-Ж ангу им олоч но-кровяном агаре они образ у ют огранич енну ю з ону гем олиза. И з колоний, выросш их на ч аш ках, готовят м аз ки, окраш ивают их по м етоду Грам аим икроскопиру ют. П риналич ии в м аз ках овоидных грам отриц ательных палоч екставят ориентировоч ну ю реакц ию агглютинац ии с коклюш ной и паракоклюш ной сывороткам и. Затем подоз рительные колонии пересевают в пробирки для дальнейш его изу ч ения ч истыхку льту р. И дентиф икац ию выделенной ку льту ры производят на основании ком плексного изу ч ения м орф ологич еских, ку льту ральных, биохим ич еских и серологич еских свойств (табл. 10). В отлич ие от дру гих бордетелл B.pertussis не растет на простом питательном агаре и не изм еняет ц вета спец иальных питательныхсред. Д ля определения у реаз ы в агглютинац ионные пробирки вносят 0,3 м л 2 % раствора м оч евины, 0,3 м л гу стой су спенз иииспыту ем ой ку льту ры и2-3 капли 0,1 % спиртового раствора ф енолф талеина. В полож ительном слу ч ае ч ерез 20-30 м ин появляется м алиновое окраш ивание, у каз ывающ ее нарасщ епление м оч евины у реаз ой. Серологич еску ю идентиф икац ию бордетелл, диф ф еренц иац ию видов и определение сероваров (серотипирование) проводят в реакц ии агглютинац ии с адсорбированным и ф акторным и сывороткам и. П ри этом исходят из того, ч то
51
антиген (ф актор) 7 является родовым , а антиген (ф актор) 1 прису щ B.pertussis, 14 - B.parapertussis и12 - B.bronchisepticas. Т аблица 10. Д иф ф еренц иальные признакиBordetella spp. П ризнак B.pertussis B.parapertussis Рост: наагаре (простом ) + (корич невая окраска) наагаре с тироз ином + (ярко-корич невая окраска) И з м енение окраски: КУА Бу ро-корич невая аровяного агара П отем нение О браз ование у реаз ы + + Н алич ие антигенов: родового 7 7 видового 1 14
только
B.bronchisepticas + +
+ 7 12
У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) - налич ие признака; (-) - отсу тствие признака; ц иф рам и обоз нач ены ном ераантигенов.
П ри бактериологич еской диагностике коклюш а м ож ет воз никну ть необходим ость диф ф еренц иац ии бордетелл от Н а е т о philus influenzae, который ч асто встреч ается на слизистой оболоч ке дыхательных пу тей и выз ывает пневм онииидру гие воспалительные з аболевания дыхательных пу тей. В отлич ие от бордетелл Н .influenzae растет только на кровяных питательных средах кровяном агаре, "ш околадном " агаре Л евинталя, содерж ащ их гем ин и коэнз им дегидрогеназ ы. Бактериологич еское исследование продолж ается не м енее 5 дней. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки Иммуно химиче с кие ис с л е до ва ния . М етод И Ф : там поном делают два м аз ка, высу ш ивают их на воз ду хе иф иксиру ют на плам ени. О дин м аз ок обрабатывают ф люоресц иру ющ им и противококлюш ным и антителам и, дру гой паракоклюш ным и антителам и. П репараты м икроскопиру ют в люм инесц ентном м икроскопе, просм атривая не м енее 50 полей з рения. О полож ительном рез у льтате свидетельству ет обнару ж ение тем ных бактериальных клеток с ч етким светящ им ся венч иком . Био химиче с кие и мо л е кул я рно -био ло гиче с кие ис с л е до в а ния проводят м етодом П Ц Р. Се роди агнос т и ка. Реакц ии агглютинац ии и РСК прим еняют в основном для ретроспективного подтверж дения диагноз аидиф ф еренц иальной диагностики атипич ных ф орм коклюш а. А гглютинины в кровибольных появляются на 3-4-й неделе з аболевания в титрах 1:20 ивыш е. В у словиях м ассовой вакц инац иидетей против коклюш а диагностич еское з нач ение им еет нарастание титра антител в динам ике болез ни, поэтом у реакц ию ставят повторноч ерез 4-5 дней.
С хем а 9. М ик робиологическ оеисслед ованиепри к ок лю ш еи парак ок лю ш е
52
53
М ик робиологическ ая д иагностик а д иф терии М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : м аз ки со слизистой оболоч ки з ева и носа, пленки с поверхности м индалин и носоглотки. М атериал беру т дву м я ватным и стерильным итам понам и, один из которых использ у ют для приготовления м аз ков, дру гой - для посева. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е (схем а 10). М аз ки окраш ивают по м етоду Грам а, м етиленовым синим по Л еф ф леру , по Н ейссеру . Д ля Corynebacterium diphtheriae характерно налич ие полярно располож енных з ерен волютинаирасполож ение в виде бу квы "V". Corynebacterium pseudodiphtheriae и диф тероиды не им еют з ерен волютинаилисодерж ат их не на конц ах, а по длине палоч ки. К ром е того, сам ибактериирасполагаются в виде ч астокола. П рим енение люм инесц ентной м икроскопиипоз воляет повысить эф ф ективность исследования. П ри этом C.diphtheriae м ож но отлич ить от дру гих коринебактерий по корич нево-красном у свеч ению з ерен волютина, которое ониприобретают после окраскиф люорохром ом кориф осф ином . Ц итоплаз м а этих бактерий дает з еленое илиж елтое свеч ение. О днако C.diphtheriae ч асто изм еняют свою м орф ологию, в ч астности, при санац ии з ева антибиотикам и. В настоящ ее врем я бактериоскопич еское исследование придиф териипрактич ескине использ у ют в связ и с его низкой надеж ностью (высокой ч астотой лож нополож ительных и лож ноотриц ательныхрез у льтатов). Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . Я вляется веду щ им м етодом диагностики диф терии. М атериал з асевают на кровяной агар и элективные питательные среды, содерж ащ ие теллу рит: среда К лау берга (питательный агар с теллу ритом натрия, глиц ерином идеф ибринированной кровью) идр. Н а средах с теллу ритом з адерж ивается рост кокков и дру гой м икроф лоры з ева, ч то способству ет раз м нож ению воз бу дителя диф терии. Н а теллу ритовой среде C.diphtheriae образ у ет ч ерные колонииз а сч ет восстановления теллу рита (биовар gravis ф орм иру ет колониисеровато-ч ерного ц ветас радиальной исч ерч енностью поверхности, напом инающ ие ц ветокм аргаритки, биовар mitis - кру глые выпу клые колонии ч ерного ц вета). Т ипич ные колонии, представленные грам полож ительным и палоч кам и бу лавовидной ф орм ы с характерным располож ением , содерж ащ им из ерна волютина, пересевают на кровяной агар для полу ч ения ч истой ку льту ры. Д ля подтверж дения диагноз а диф терии в перву ю оч ередь необходим о у становить токсигенность выделенной ку льту ры. Н алич ие токсина определяют с пом ощ ью раз лич ных серологич еских реакц ий. П рим еняют такж е м етод П Ц Р, поз воляющ ий обнару ж ить прису тствие у выделенных бактерий tо х-гена, контролиру ющ его синтез диф терийного токсина. О бщ епринятым м етодом определения токсигенности являлась реакц ия прец ипитац ии в агаре с антитоксич еской противодиф терийной сывороткой. М етоды И Ф А и П Ц Р, раз работанные в последние годы, являются более ч у вствительным иипоз воляют полу ч ить рез у льтат в теч ение 3-5 ч .
С хем а 10. М ик робиологическ оеисслед ованиепри д иф терии
54
55
О пределение токсигенности в реакц ии прец ипитац ии: в ч аш ку П етри с питательным агаром , содерж ащ им 15-20 % лош адиной сыворотки, 0,3 % м альтоз ы и 0,03 % ц истина, кладу т полоску ф ильтровальной бу м аги, пропитанну ю антитоксич еской противодиф терийной сывороткой, содерж ащ ей 5000 А Е /м л. Ч аш ку подсу ш ивают при 37 °С в теч ение 30 м ин и з асевают исследу ем ые ку льту ры в виде перпендику лярных к бу м аге ш трихов на расстоянии0,6-0,8 см от края бу м аги. В кач естве контроля использ у ют з аведом о токсигенну ю ку льту ру . П осевы инку биру ют при37 °С до следу ющ его дня. П ри раз м нож ении токсигенной ку льту ры в м есте соединения токсина с антитоксич еским и антителам и в плотной питательной среде образ у ется прец ипитат в виде белыхлиний - "у сов". В ыделенну ю ку льту ру идентиф иц иру ют и диф ф еренц иру ют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по м орф ологич еским особенностям , ку льту ральным и биохим ич еским признакам : пробы на ц истиназ у , у реаз у , ф ерм ентац ия у глеводов идр. (табл. 11).
+ + + -
+ -
++-
+ + +-
+
А гглютинац ия противодиф терийной сыворотки
крахм ала
+ -
У реаз а
глюкоз ы
+ -
Ц истиназ а
сахароз ы
+ + ++-
Т оксигенность
Гем олиз
C.diphtheriae биовар gravis биовар mitis C.xerosis C.pseudodiphtheriticum
Зерна волютина
Т аблица 11. СвойстваC.diphtheriae исходныхс ней коринебактерий В ид Ф ерм ентац ия
+ + -
У с л о в ны е о бо зна че ния : (+) – налич ие признака у 85-100 % ш там м ов; (-) – отсу тствие признака; (+ -) – налич ие признакау 16-84 % ш там м ов.
В слу ч ае выделения нетоксигенной ку льту ры ставят дополнительну ю реакц ию агглютинац ии с противодиф терийной сывороткой с ц елью выявления видоспец иф ич еского антигенаC.diphtheriae. Д ля определения ц истиназ ы (проба П изу ) в столбик питательного агара с ц истином у колом з асевают исследу ем у ю ку льту ру . П осевы инку биру ют при37 °С до следу ющ его дня. C.diphtheriae выз ывают поч ернение среды по ходу посева (в рез у льтате образ ования су льф ида свинц а), вокру г которого появляется з она корич невого ц вета, а на глу бине 1 см от поверхностиагара в среде образ у ется корич невое "облач ко". Д ля определения у реаз ы (пробаЗакса) готовят спиртовой раствор м оч евины и раствор индикатора - ф енолового красного, которые перед у потреблением см еш ивают в соотнош ении 1:9 и раз ливают по 1-2 м л в агглютинац ионные
56
пробирки. Затем исследу ем ые бактерии петлей вносят и растирают по стенке пробирки. П осле 20-30-м ину тной инку бац иипри37 °С наблюдают расщ епление м оч евины у реаз ой, в рез у льтате ч его средаприобретает красный ц вет. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки . И сследу ем ый м атериал, полу ч енный из оч ага инф екц ии, использ у ют для обнару ж ения tox-генаC.diphtheriae с пом ощ ью П Ц Р. Д иагностическ ие, проф илак тическ иеи лечебныепрепараты Пре ци пи т и рующ и е ант и м е ни нгококковы е с ы ворот ки . П рим еняют с диагностич еской ц елью для обнару ж ения м енингококкового антигена в спинном оз говой ж идкости(м етодом встреч ногоим м у ноэлектроф орез а). Эри т роци т арны е ант и т е льны е м е ни нгококковы е ди агнос т и кум ы . П рим еняют для обнару ж ения антигенов N.meningitidis в спинном оз говой ж идкостив РН ГА . Коклюш ная вакци на. Содерж ит вз весь В.ре rtussis, у битых ф орм алином . П рим еняют для обяз ательной активной спец иф ич еской проф илактикикоклюш а. В ходит в состав А К Д С (адсорбированная коклюш но-диф терийно-столбняч ная вакц ина), которая включ ает такж е оч ищ енные конц ентрированные диф терийный истолбняч ный анатоксины, адсорбированные нагидрате оксидаалюм иния. И м м уноглобули н норм альны й че лове че с ки й. П олу ч ен из плац ентарной или веноз ной крови ч еловека. Содерж ит спец иф ич еские антитела против воз бу дителей м ногих инф екц ионных з аболеваний, в том ч исле воз бу дителя коклюш а. П рим еняют для соз дания пассивного им м у нитета с ц елью проф илактикиилеч ения коклюш а. Агглют и ни рующ и е адс орби рованны е (факт орны е ) с ы ворот ки . П рим еняют для серологич еской диф ф еренц иац иивоз бу дителей коклюш а. Прот и води фт е ри йная ант и т окс и че с кая с ы ворот ка. П олу ч ена из крови лош адей, гиперим м у низированных диф терийным анатоксином , оч ищ ена и конц ентрирована м етодом диаф ерм -3. А ктивность сыворотки изм еняется в м еж ду народных единиц ах. П рим еняют для экстренной проф илактикиилеч ения диф терииз асч ет соз дания пассивного им м у нитета. Агглют и ни рующ ая прот и води фт е ри йная с ы ворот ка (поливалентная и типовые). П рим еняют для диф ф еренц иац ииC.diphtheriae.от диф тероидов. Ант и м и кробны е пре парат ы : пениц иллин и дру гие β-лактам ы, хлорам ф еникол, риф ам пиц ин, су льф анилам иды, тетрац иклин, эритром иц ин. Л абораторная д иагностик а ту берк у леза З а да ния дл я в ы по лне ния л а бо ра т о рно й ра бо т ы 1. У каз ать м атериал, подлеж ащ ий исследованию; 2. Бактериоскопич еский м етод: окрасить по м етоду Ц иля-Н ильсена приготовленные из м окроты м аз ки и провести м икроскопич еское исследование. Сделать з аключ ение инам етить ход дальнейш его исследования для подтверж дения бактериоскопич еского диагноз а; 3. Бактериологич еский м етод:
57
а) отм етить характер роста исследу ем ой ку льту ры на среде Л евенш тейна-Й енсена, б) отм етить рез у льтаты ниац иновой пробы, в) определить ч у вствительность м икобактерий к антим икробным препаратам : отм етить налич ие илиотсу тствие ростам икобактерий насреде Л евенш тейна-Й енсена с раз ным и конц ентрац иям и противоту берку лез ных препаратов и сопоставить полу ч енные данные с клинич еским и границ ам и у стойч ивости м икобактерий. Д ать оконч ательное з аключ ение по проведенным исследованиям . М е т о диче с кие ука за ния М а т е риа л дл я ис с ле до ва ния : при легоч ном ту берку лез е м атериалом для исследования являются м окрота, пром ывные воды бронхов, бронхоальвеолярная ж идкость, плевральный экссу дат, пром ывные воды ж елу дка. О браз ц ы м окроты необходим о собирать в теч ение 3-6 дней. П ривнелегоч ном ту берку лез е м атериал для исследования выбирают в з ависим остиот локализац иипораж ений. Э то м ож ет быть кровь, спинном оз говая ж идкость, м оч а, синовиальная ж идкость, тканевые биоптаты (лим ф атич еских у з лов, костного м оз га, печ ени, кож и и подкож ной ж ировой клетч атки и др.), испраж нения. Н естерильный м атериал, контам инированный норм альной м икроф лорой, для предотвращ ения раз м нож ения посторонних бактерий сраз у после отбора долж ен быть пом ещ ен в холодильникихраниться до исследования притем перату ре 4-8 °С. Пе рви чная обработ ка кли ни че с кого м ат е ри ала. Н естерильный м атериал ну ж дается в предварительной деконтам инац ии. Д ля исследования вяз кого и негом огенного м атериала, содерж ащ его тканевой детрит (м окрота, бронхоальвеолярная ж идкость и др.), требу ется такж е произвести проц еду ру раз ж иж ения игом огенизац ии. П оскольку клинич еские образ ц ы обыч но содерж ат м алое колич ество м икобактерий, ж елательно производить обогащ ение исследу ем ого м атериала. О быч но с ц елью гом огенизац ии/деконтам инац ии м атериал обрабатывают м у колитич еским и (N-ац етил-L-ц истеин) и антибактериальным иагентам и(10 % Nа3РO4, 1-2 % NаО Н идр.). Д алее бактерии конц ентриру ют пу тем осаж дения в ходе ц ентриф у гирования. П риэтом клеточ ный детрит ипогибш ие посторонние м икроорганизм ы у даляются в виде су пернатанта. О садок ресу спендиру ют в м иним альном объ ем е стерильной воды или изотонич еского раствора NaCl и использ у ют для дальнейш его исследования. Т каневые биоптаты перед исследованием необходим огом огенизировать. Бакт е ри ос копи че с кое и с с ле довани е (схем а 11). Бактериоскопич еская диагностика ту берку лез аоснована на выявлениив м атериале кислотоу стойч ивых бактерий с пом ощ ью спец иальных слож ных м етодов окраски. В ыявление м икобактерий классич еским м етодом Ц иля-Н ильсенаявляется весьм атру доем кой проц еду рой. К ислотоу стойч ивые бактерии окраш иваются в ярко-красный ц вет, располагаются поодиноч ке или небольш им и скоплениям и. П репараты из м оч и обяз ательно обесц веч ивают не только кислотой, но и спиртом для диф ф еренц иац ииМ .tuberculosis от М .smegmatis, которые м огу т находиться в м оч е з доровых людей. В отлич ие от М .tuberculosis ониобесц веч иваются спиртом .
58
М аз ок исследу ют им м ерсионным м етодом при у велич ении 900х-1000х, просм атривая до 300 полей з рения. Рез у льтат сч итается полож ительным при обнару ж ении 1 или более кислотоу стойч ивых бактерий на 100 полей з рения. О тсу тствие кислотоу стойч ивых бактерий при просм отре 300 полей з рения следу ет трактовать как отриц ательный рез у льтат. О краску по м етоду Ц иляН ильсена прим еняют преим у щ ественно для изу ч ения выделенных ч истых ку льту р. В кач естве основного м етода выявления м икобактерий в м атериале от больного прим еняют люм инесц ентну ю м икроскопию м аз ков, окраш енных ф люорохром ом ау рам ином О по м етоду Боя (последу ющ ая обработка 3 % раствором Н С1 в абсолютном этаноле обеспеч ивает обесц веч ивание некислотоу стойч ивых бактерий). Э тот м етод облегч ает исследование, поскольку поз воляет использ овать м еньш ее у велич ение (250х или 450х) и просм атривать м еньш ее ч исло полей з рения (30-70 в з ависим остиот у велич ения). Н ез ависим о от м етода окраски бактериоскопич еское исследование поз воляет обнару ж ить бактерии при их конц ентрац ии не м енее 5000-10 000 в 1 м л образ ц а, поэтом у отриц ательный рез у льтат не поз воляет исключ ить з аболевание. М икроскопич еское исследование является ориентировоч ным и дает воз м ож ность су дить лиш ь о налич иив м атериале кислотоу стойч ивых бактерий без определения их видовой принадлеж ности. М етод не поз воляет диф ф еренц ировать м икобактерии м еж ду собой и от дру гих кислотоу стойч ивых м икроорганизм ов. Л егоч ные ивнелегоч ные пораж ения в перву ю оч ередь у лиц с им м у нодеф иц итом раз лич ной этиологии м огу т быть выз ваны не только бактериям и ком плекса М .tuberculosis (М Т С ), но такж е и нету берку лез ным и м икобактериям и: бактериям и ком плекса М .а vium (М АС ), М .kansassii, реж е дру гим и представителям и рода М ус о bacterium. П оскольку нету берку лез ные м икобактерииявляются обитателям иокру ж ающ ей среды, з агряз няющ им иводу , проду кты, оним огу т такж е прису тствовать в образ ц е какконтам инанты. Бактериоскопич еское исследование сч итается оптим альным м етодом ориентировоч ной экспресс-диагностикиту берку лез а. Бакт е ри ологи че с кое и с с ле довани е . Сч итается веду щ им м етодом диагностики ту берку лез а. Дл я в ы де л е ния чис т о й кул ьт уры мико ба кт е рии производят посев исследу ем ого м атериала на спец иальные ж идкие илиплотные питательные среды. Д ля выделения м икобактерии из нестерильного м атериала ж елательно использ овать селективные среды, содерж ащ ие антим икробные препараты, подавляющ ие рост посторонних м икробов. Д ля ку льтивирования м икобактерии прим еняют плотные яич ные (среда Л евенш тейна-Й енсена) и агаровые среды, а такж е ряд синтетич еских ж идких питательных сред. Реком енду ется осу щ ествлять посев одноврем енно на плотну ю иж идку ю среду . П осевы необходим о инку бировать в атм осф ере с повыш енным содерж анием СО 2 (5-10 %). М иним альный срок инку бац ии составляет не м енее 8 нед. П осевы первый раз просм атривают на3-5-й день после внесения м атериала, далее - 2 раз а в неделю. Н ач иная с 5-й недели ку льтивирования - 1 раз в неделю. К у льту ры М .tuberculosis им еют вид сероватого или светло-крем ового м орщ инистого или крош кообраз ного су хогоналета.
С хем а 11. М ик робиологическ оеисслед ованиепри ту берк у лезе
59
60
Е щ е до появления видим ых невоору ж енным глаз ом м акроскопич еских колоний на плотных средах с пом ощ ью м икроскопии м огу т быть обнару ж ены м икроколонии. О тсу тствие м икробного роста ч ерез 8 нед. ку льтивирования следу ет расц енивать какотриц ательный рез у льтат. В последнее врем я ш ирокое прим енение наш ли раз лич ные ком м ерч еские систем ы ку льтивирования м икобактерии, использ у ющ ие как ж идкие, так и плотные питательные среды, а такж е раз лич ные высокоч у вствительные способы автом атизированного контроля роста бактерий на основанииих м етаболич еской активности- по потреблению ком понентов питательной среды и/илиобраз ованию проду ктов ж изнедеятельности. Э то поз воляет обнару ж ить прису тствие бактерий з нач ительно раньш е появления видим ых признаков роста. И спольз ование у каз анных м етодов контроля ростапоз воляет в больш инстве слу ч аев су щ ественно у скорить проц есс выделения ч истой ку льту ры м икобактерии. П олож ительный рез у льтат м ож ет быть полу ч ен у ж е ч ерез 3-5 дней, средний срок составляет 7-14 дней. О днако, у ч итывая вероятну ю низку ю конц ентрац ию воз бу дителя в исследу ем ом м атериале, м аксим альный срок инку бац ии достаточ но велик рез у льтат бактериологич еского исследования сч итается отриц ательным при отсу тствии признаков роста в теч ение 40 дней. В слу ч ае регистрац ии полож ительного рез у льтата ку льтивирование продолж ают до тех пор, когда колич ество бактерий в среде достигает определенной конц ентрац ии, необходим ой для проведения дальнейш его изу ч ения выделенной ч истой ку льту ры идентиф икац ии иопределения ч у вствительности к антим икробным препаратам . Среднее врем я ку льтивирования составляет 9-20 дней. Бактериологич еский м етод дает полож ительный рез у льтат приналич иине м енее 10-30 ж изнеспособных м икобактериив 1 м л исследу ем ого м атериалапосле обогащ ения. О триц ательный рез у льтат в ряде слу ч аев м ож ет быть обу словлен оч ень низким содерж анием воз бу дителя в клинич еском образ ц е. Иде нт ифика ция чис т о й кул ьт уры . В ыделенные ч истые ку льту ры м икобактерий обыч но идентиф иц иру ют до вида. Т радиц ионные м етоды идентиф икац ии основаны на изу ч ении достаточ но больш ого ч исла признаков, включ ая скорость роста, м орф ологию колоний, способность к пигм ентробраз ованию, проду кц ии никотиновой кислоты, восстановлению нитратов ителлу ритакалия, гидролиз у твина-80, м оч евины (у реаз ная активность), пираз инам ида до пираз иновой кислоты (пираз инам идаз ная активность), перекиси водородаприповыш енной тем перату ре (терм оу стойч ивая каталаз ная активность) и некоторых дру гих. Н а основании этих признаков м ож но одноз нач но идентиф иц ировать представителей основных видов М ус о bacterium spp, выз ывающ их з аболевания ч еловека. П роц еду ра идентиф икац ии по ф енотипич еским признакам м ож ет з аним ать до 3 нед. Спец иф ич ность м етода доставляет 100%. Способность исследу ем ой ку льту ры синтез ировать никотинову ю кислоту (ниа цино ва я про ба К о нно ) является одним из важ ных признаков, с пом ощ ью которого у дается отлич ить М .tuberculosis, хорош о синтез иру ющ ие никотинову ю кислоту , от М .bovis, образ у ющ их ее в м иним альных колич ествах. Д ля
61
определения ниац ина к ку льту ре м икобактерий в ж идкой питательной среде добавляют 1 м л раствораК CN и1 м л 5 % растворахлорам ина. П риналич ии ниац ина ч ерез несколько м ину т появляется ярко-ж елтая окраска. Д ля нейтрализац ииК CN после у ч ета рез у льтатов реакц иив пробиркидобавляют 3-5 м л10 % растворагидрокарбонатанатрия. П ри выращ ивании м икобактерий на предм етных стеклах (ме т о д микро кул ьт ур П ра йс а ) виру лентные ш там м ы характеризу ются ростом в виде ж гу тов или кос з а сч ет образ ования корд-ф актора. Н а нескольких предм етных стеклах делают толстые м аз ки, высу ш ивают, обрабатывают несколько м ину т 2-6 % серной кислотой и нейтрализу ют. Затем стекла опу скают во ф лаконы с гем олизированной ц итратной кровью в раз ведении1:4-1:8 иставят в терм остат. Ч ерез 7-14 дней извлекают стекла, ф иксиру ют препарат, окраш ивают по м етоду Ц иля-Н ильсенаим икроскопиру ют. М е т о д гибридиза ции ДН К ("ДН К -зо ндо в ") прим еняют для быстрой идентиф икац ии ч истой ку льту ры м икобактерий. И спольз ование Д Н К -з ондов поз воляет полу ч ить оконч ательный ответ в теч ение су ток после з аверш ения ку льтивирования. Н асегодня су щ еству ют Д Н К -з онды для идентиф икац иитолько наиболее клинич ески з нач им ых и ш ироко распространенных м икобактерий, выз ывающ их з аболевания ч еловека. И дентиф икац ия м икобактерий по липидном у составу (хе мо иде нт ифика ция ) с пом ощ ью газ ож идкостной или ж идкостной хром атограф ии. М етод поз воляет осу щ ествить идентиф икац ию любого из известных 50 видов м икобактерий в теч ение 4 ч . О сновным иф акторам и, огранич ивающ им иего ш ирокое прим енение, являются необходим ость использ ования дорогостоящ его обору дования и технич еская слож ность интерпретац иирез у льтатов. О пре де л е ние чувс т в ит е л ьно с т и во збудит е л я к а нт ибио т ика м является обяз ательным этапом диагностикиту берку лез а иосновой наз нач ения адекватной терапии. Т радиц ионно определение ч у вствительности м икобактерий осу щ ествляют м етодом серийных раз ведений препарата в питательной среде. И сследование м ож ет з аним ать более 3 нед. (до 3 м ес.), ч то обу словлено ч рез выч айнонизкой скоростью ростарез истентныхвариантов. П рим енение соврем енных м олеку лярно-генетич еские м етодов определения ч у вствительности м икобактерий к антим икробным препаратам поз воляют обнару ж ить налич ие у воз бу дителя генов, контролиру ющ их рез истентность к определенном у препарату . У ж е раз работаны тест-систем ы на основе П Ц Р для определения рез истентностикпрепаратам гру ппы риф ам пиц инов. Би опроба. П рим енялиранее для диагностикиту берку лез а: ч исту ю ку льту ру М .tuberculosis выделяли из органов ж ивотного, з араж енного исследу ем ым м атериалом . В настоящ ее врем я м етодпрактич ескине прим еняется. Экс пре с с -м е т оды ди агнос т и ки . Био химиче с кие и мо л е кул я рно био л о гиче с кие ис сл е до ва ния . М етод П Ц Р поз воляет обнару ж ить налич ие видоспец иф ич еских ну клеиновых кислот м икобактерий непосредственно в клинич еском образ ц е после обогащ ения. И сследование з аним ает около 4 ч . Су щ еству ющ ие ком м ерч еские тест-систем ы поз воляют выявить в образ ц е прису тствие М Т С - бактерий ком плекса М .tuberculosis (М .tuberculosis,
62
М .bovis/BCG, М .africanum) и надеж но диф ф еренц ировать их от нету берку лез ных м икобактерий. Рез у льтаты П Ц Р-диагностики реком енду ется интерпретировать в з ависим остиот данных бактериоскопич еского исследования. П олу ч ение полож ительного ответа бактериоскопич еским м етодом и П Ц Р поз воляет диагностировать ту берку лез иреком ендовать нем едленное наз нач ение противоту берку лез ных препаратов по классич еской схем е. О триц ательный рез у льтат П Ц Р приналич иикислотоу стойч ивыхм икобактерий в м аз кахпоз воляет исключ ить прису тствие М Т С и реком ендовать наз нач ение антим икробных препаратов, активных в отнош ениинету берку лез ныхм икобактерий. Се роди агнос т и ка. А нтитела к антигенам воз бу дителя в крови пац иентов м ож но обнару ж ить с пом ощ ью РСК , РН ГА и дру гих серологич еских реакц ий. Н еобходим о им еть в виду , ч то полож ительные рез у льтаты отм еч аются не только приактивном ту берку лез ном проц ессе в организм е, но такж е приинф иц ировании М .tuberculosis ивакц инац ии, поэтом у диагностич еского з нач ения не им еют. Кож но-алле рги че с кая проба. Ставится с ту берку лином - оч ищ енной белковой ф ракц ией, полу ч енной из ф ильтратабу льонной ку льту ры М .tuberculosis. И спольз у ется для оц енки теч ения ту берку лез ного проц есса, определения эф ф ективности вакц инац ии и отбора контингентов для ревакц инац ии против ту берку лез а. Т у берку лин вводят вну трикож но в строго определенной доз ировке (реакц ия М анту ). Рез у льтаты у ч итывают ч ерез 24-48 ч . Д иагностическ ие, проф илак тическ иеи лечебныепрепараты Тубе ркули н с ух ой очи щ е нны й (Р Р D). П олу ч ен из ф ильтрата бу льонной ку льту ры м икобактерии пу тем добавления хим ич еских вещ еств, осаж дающ их белок, с последу ющ ей оч исткой и лиоф илизац ией. П рим еняют для постановки кож но-аллергич еской пробы. В акци на ВСG. Ж ивая лиоф ильно высу ш енная ку льту ра авиру лентного ш там м а М .bovis BCG. П рим еняется вну трикож но для активной спец иф ич еской проф илактикиту берку лез а. Ант и би от и ки . Д ля леч ения ту берку лез а обыч но использ у ют ком бинац ии препаратов (не м енее трех препаратов раз лич ных гру пп) с у ч етом ч у вствительностиМ .tuberculosis иклинич еской характеристикиз аболевания. О С Н О В Н А Я Л И Т ЕР А Т УР А Борисов Л .Б. М едиц инская м икробиология, виру сология, им м у нология / Л .Б. Борисов. – 2-е изд. доп. иперераб. – М .: М ед.инф орм . агенство, 2001. – 734 с. Борисов Л .Б. Ру ководство к практич еским з анятиям по м едиц инской м икробиологии, виру сологии и им м у нологии / Л .Б. Борисов, Б.Н . К оз ьм инСоколов, И .С. Ф рейдлин - М .: М едиц ина, 1994. – 240 c. Ру ководство к практич еским з анятиям по м едиц инской м икробиологии, виру сологиииим м у нологии/ под ред. В .В . Т ец а. – И з д. 2-е, перераб. идоп. – М .: М едиц ина, 2002. – 352 с. Эл е кт ро нны й ка т а ло гН а учно й библ ио т е киВГУ – (http://www.lib.vsu.ru)
63
Составители: Рахм ановаТ атьянаИ вановна Сем енихинаА настасия В ладим ировна Н ехаеваГалинаИ вановна П оповаТ атьянаН иколаевна Редактор Т ихом ироваО .А .
64