Молекулярный и генетический анализ некоторых семейств микроорганизмов

На правах рукописи

НАУМОВ ДАНИИЛ ГЕННАДИЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ СЕМЕЙСТВ ГЛИКОЗИЛ-ГИДРОЛАЗ МИКРООРГАНИЗМОВ

Специальность 03.00.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА – 2001

Работа

выполнена

в

лабораториях

генетики

бактерий,

генетики

молочнокислых бактерий и генетики, таксономии и экологии дрожжей Государственного

научно-исследовательского

института

генетики

и

селекции промышленных микроорганизмов (ГУП ГосНИИгенетика)

Научный руководитель: кандидат биологических наук В.А. Лившиц Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Г.И. Наумов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор М.Д. Тер-Аванесян кандидат биологических наук А.Б. Шевелёв Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН Защита диссертации состоится « 29 » мая 2001 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1ый Дорожный проезд, д.1. С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГосНИИгенетика

Автореферат разослан « 27 » апреля 2001 года

Учёный секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

В.И. Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Трисахарид раффиноза и его компоненты: дисахариды сахароза и мелибиоза синтезируются многими высшими растениями. Для полного гидролиза

раффинозы

необходимо

наличие

двух

гликозил-гидролазных

активностей: β-фруктозидазной и α-галактозидазной. Молочнокислые бактерии родов Lactobacillus и Pediococcus имеют важное промышленное значение, играя основную роль в ферментации молочнокислых и мясных продуктов и растительных материалов. Для бактерий рода Lactobacillus характерна способность сбраживать сахарозу. Однако молекулярные детерминанты этого признака остаются совершенно не изученным. Штаммы бактерий рода Pediococcus, как правило, не способны сбраживать сахарозу. Лишь редкие природные изоляты имеют плазмиды, детерминирующие ферментацию сахарозы, мелибиозы и раффинозы. "Излечивание" штаммов Pediococcus, используемых в ферментации мясных продуктов, от сахарозной плазмиды являлось предметом патентования, поскольку обеспечивает лучшие вкусовые качества пищевых продуктов. Дрожжи-сахаромицеты

являются

важными

промышленными

микроорганизмами. Способность сбраживать мелибиозу не характерна для дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Известны лишь редкие Mel+-штаммы этого вида. Они обычно выделяются из специфических экологических ниш – желудочно-кишечного тракта млекопитающих и отходов производства оливкового масла. Там часто обнаруживают изоляты, в которых накапливаются полимерные α-галактозидазные гены MEL ферментации мелибиозы. За исключением MEL1, остальные гены ферментации мелибиозы остаются мало изученными. Однако они представляют интерес не только для молекулярно-генетических исследований, но и для селекционной работы с пекарскими и спиртовыми штаммами Saccharomyces. Фермент α-галактозидаза позволяет дрожжам наиболее полно усваивать дешёвый источник углерода – мелассу, содержащую α-галактозид раффинозу. В последние годы возрос также интерес к продуцентам α-галактозидаз в связи с использованием

этого фермента для обработки пищевых продуктов растительного происхождения. Таким путём разрушают не утилизируемые α-галактозиды (раффинозу, стахиозу и др.), способствующие жизнедеятельности вредных микроорганизмов в кишечнике человека и животных. Исследование новых генов α-галактозидаз обеспечивает расширение возможностей для селекционной работы с дрожжами Saccharomyces. Хорошо известно о наличии гомологии аминокислотных последовательностей многих гликозил-гидролаз, имеющих разные энзиматические активности. Однако β-фруктозидазы принято относить к двум различным семействам гликозил-гидролаз (GH32 и GH68) вследствие отсутствия у них сходства аминокислотных последовательностей.

Получение

данных

о

структурном

сходстве

между

β-фруктозидазами, относящихся к разным семействам, а так же об их гомологии с другими

гликозидазами

позволит

экстраполировать

имеющиеся

данные

о

пространственной структуре отдельных гликозидаз и о каталитически важных аминокислотных остатках на большее число ферментов. С целью дальнейшего исследования генов и ферментов микроорганизмов, ответственных за гидролиз раффинозы, сахарозы и мелибиозы в представляемой диссертационной работе были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1. Исследовать молекулярную структуру локуса утилизации сахарозы типового штамма Lactobacillus plantarum и сравнить её с ранее известной структурой того же локуса у Pediococcus pentosaceus. 2. Определить положение на генетической карте дрожжей Saccharomyces cerevisiae новых полимерных генов MEL ферментации мелибиозы. 3. Исследовать

структурное

сходство

аминокислотных

последовательностей

β-фруктозидаз, принадлежащих семействам GH32 и GH68. Провести скрининг полной базы данных аминокислотных последовательностей для выявления возможных гомологов β-фруктозидаз. Научная новизна. Впервые определена молекулярная структура локуса утилизации сахарозы у молочнокислых бактерий рода Lactobacillus. Этот хромосомный локус состоит, по крайней мере, из четырёх генов и имеет очень высокую степень сходства с гомологичным плазмидным локусом Pediococcus

pentosaceus. Осуществлено генетическое картирование девяти ранее известных генов MEL2-MEL10 и впервые обнаружено и картировано три гена MEL12-MEL14, представляющих новое дивергентное семейство α-галактозидазных генов дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Проведено сравнительное исследование аминокислотных последовательностей ряда семейств гликозил-гидролаз. Полученные результаты позволили объединить четыре семейства гликозидаз в суперсемейство на основании наличия у их представителей α- или β-фуранозидазных активностей и статистически достоверного

сходства

наиболее

консервативных

участков

аминокислотных

последовательностей. К этому суперсемейству также отнесено новое семейство гипотетических белков, представленных, главным образом, у термофильных бактерий и, вероятно, обладающих гликозидазными активностями. Апробация работы. Результаты исследований докладывались: на IV (1996) и V (1997) научных конференциях «ГосНИИгенетика» (Москва); на конференции, посвящённой 30-летию журнала «Молекулярная биология» (1997, Москва); на совместном семинаре «ГосНИИгенетика» и исследовательских лабораторий «Cultor Technology Center» (1998, Хельсинки, Финляндия); на II съезде Вавиловского общества

генетиков

и

селекционеров

(2000,

Санкт-Петербург);

на

IV

международном симпозиуме по фруктанам (2000, Аролла, Швейцария) и на конференции «Биосфера и человечество» (2000, Обнинск). Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 статей и 7 тезисов. Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (364 литературных источника). Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 13 таблиц. Обзор

литературы

классификации

содержит

гликозил-гидролаз,

три

главы,

посвящённые

принципам

системам

утилизации

сахарозы

грамположительных бактерий и генам ферментации мелибиозы дрожжей. Раздел «Материалы и методы» посвящён описанию разнообразных методов молекулярной биологии, генетики и микробиологии, используемых в работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Клонирование и секвенирование фрагмента гена scrB из Lactobacillus plantarum На основе консервативных участков генов сахараз 5 видов молочнокислых бактерий

сконструированы

вырожденные

праймеры

DG-1

и

DG-2.

Амплифицированный с помощью этих праймеров в процессе ПЦР фрагмент генома типового штамма L. plantarum NRRL B-4496 клонирован в векторе pUC19. Секвенированная по двум цепям вставка имела длину 693 п.н. и на 98.6% идентична 5′-концевой части гена scrB плазмиды pSRQ1 из штамма Pediococcus pentosaceus NRRL

B-11465

(GenBank

последовательности

access.

отличаются

num.

10

L32093).

заменами

Эти

две

(четыре

нуклеотидные

замены

на

уровне

аминокислотной последовательности), а также вставкой и делецией одного нуклеотида.

Структура

L. plantarum:

участка,

соответствующего

вставке

и

делеции,

у

517-CCAAATCTGGTCTGGATCGATCAACAGCCCGTCTTATTGTTCTGTCCCCAA-567.

У

P. pentosaceus вместо трёх аденозинов – четыре, а вместо четырёх цитидинов – три (подчёркнуты). Это приводит к локальному сдвигу открытой рамки считывания на участке,

соответствующем

15

аминокислотным

остаткам.

Секвенированная

последовательность L. plantarum идентична на 50-52% генам сахараз Lactococcus lactis, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus и Staphylococcus xylosus, на 48-50% – генам сахараз бактерий родов Vibrio и Bacillus. Секвенирование аминокислотную

фрагмента

генома

последовательность

L. plantarum

позволило

соответствующего

белка

определить из

231

аминокислотного остатка на 92.2% идентичного N-концевой части сахаразы ScrB из P. pentosaceus. Сходство этих двух последовательностей достигает 98.3%, если исправить локальный сдвиг рамки считывания, обнаруженный в гене scrB P. pentosaceus, и позволяет рассматривать эту гипотетическую аминокислотную последовательность сахаразам

и

как фрагмент

других

аминокислотных

сахаразы L. plantarum. Она гомологична

грамположительных

остатков

с белками

бактерий:

представителей

41-48%

идентичных

родов

Lactococcus,

фруктаназа FruA Streptococcus mutans ОРС YveB Bacillus subtilis фруктозилтрансфераза Arthrobacter nicotinovorans сахараза Aspergillus niger фруктозилтрансфераза Aspergillus niger ОРС FruB Streptococcus mutans

c

эндо-инулиназа Pseudomonas mucidolens фруктозилтрансфераза Bacillus circulans инулиназа Arthrobacter sp. фруктозилтрансфераза Cynara scolymus фруктозилтрансфераза Cichorium intybus сахараза Tulipa gesneriana сахараза Vigna radiata фруктозилтрансфераза Hordeum vulgare фруктозилтрансфераза Allium cepa сахараза Triticum aestivum сахараза Daucus carota

0.1

леваназа Bacillus sp. леваназа Paenibacillus polymyxa леваназа Bacillus subtilis экзо-инулиназа Pseudomonas mucidolens леваназа Bacteroides fragilis сахараза Tritrichomonas foetus сахараза Schizosaccharomyces pombe сахараза Saccharomyces cerevisiae сахараза Debaryomyces occidentalis инулиназа Aspergillus ficuum инулиназа Penicillium purporogenum фруктозилтрансфераза Aspergillus foetidus леваназа Actinomyces naeslundii

d

ОРС3 Leishmania major ОРС2 Leishmania major ОРС1 Leishmania major сахараза RafD Escherichia coli сахараза CscA Escherichia coli сахараза Zymomonas mobilis

b

a

инулиназа/сахараза Thermotoga maritima сахараза Vibrio cholerae

сахараза Clostridium beijerinckii сахараза Lactobacillus plantarum сахараза Lactococcus lactis сахараза Streptococcus sobrinus сахараза Streptococcus mutans сахараза Staphylococcus xylosus сахараза Vibrio alginolyticus сахараза Clostridium acetobutylicum сахараза Bacillus stearothermophilus сахараза Bacillus subtilis сахараза Klebsiella pneumoniae сахараза Salmonella typhimurium

Рисунок 1. Филогенетическое древо β-фруктозидаз семейства GH32, построенное на основе анализа N-концевых фрагментов последовательностей, гомологичных вычисленной последовательности сахаразы L. plantarum. Буквами («a», «b», «c» и «d») отмечены кластеры ветвей древа, соответствующие последовательностям β-фруктозидаз подсемейств 32a-d.

Streptococcus и Staphylococcus; 36-38% – Clostridium; 35-36% – Bacillus. Более низкое сходство выявлено с сахаразами грамотрицательных бактерий и эукариот (Рис. 1). Рестриктазное картирование локуса утилизации сахарозы L. plantarum Праймеры DG-3 и DG-4, гомологичные участкам секвенированного ПЦРпродукта, использовали для амплификации фланкирующих его областей ДНК в процессе обращённой ПЦР. Такая ПЦР с расходящимися праймерами на кольцевых лигированных фрагментах хромосомной ДНК L. plantarum приводила к синтезу продуктов при использовании рестриктаз AluI (0.3 т.п.н.), BsuRI (0.3), MlsI (1.0), Tru1I (0.4), Ecl136II/EheI (1.3) и HincII/SspI (1.5). Полученные результаты позволили построить рестриктазную карту фрагмента генома L. plantarum длиной около 2.3 т.п.н. Она совпадает с расположением сайтов рестрикции в соответствующем участке плазмиды pSRQ1 P. pentosaceus, содержащем гены scrA и scrB. Хромосомную

ДНК

L. plantarum,

гидролизованную

рестриктазами,

гибридизировали с клонированным ПЦР-продуктом. Зонд гибридизуется с Ecl136II-фрагментом длиной 4.1 т.п.н., Ecl136II/DraI – 3.0, DraI – 5.1, Eco32I – 7, Eco32I/BamHI – 7, Eco32I/HindIII – 7, EcoRI – 5, HincII – 2.0, SalI – 7.5, SalI/XbaI – Рисунок 2. Саузерн-гибридизация клонированного ПЦР-продукта, соответствующего 5'-концевой части гена scrB из L. plantarum, с разделёнными электрофорезом образцами геномной ДНК этого организма, рестрицированными эндонуклеазами: 1 – Ecl136II, 2 – DraI и Ecl136II, 3 – DraI, 4 – HincII, 5 – PaeI, 6 – BamHI, 7 – Eco32I, 8 – HindIII, 9 – BamHI и Eco32I, 10 – BamHI и HindIII, 11 – Eco32I и HindIII, 12 – SalI, 13 – XbaI, 14 – SalI и XbaI, 15 – PstI и 16 – EcoRI. M – маркер SmartLadder (Eurogentec, Belgium) молекулярных весов фрагментов ДНК (в т.п.н.).

7.5, (Рис. 2); BglI – 2.2, Cfr9I – 4.6, EheI – 3.0, Kpn2I – 4.7 и 6.8, NheI – 3.2, PstI/Eco32I – 4.1, PstI/HindIII – 4.4 и PvuII – 2.8 (данные не приведены), а также с BamHI-, BamHI/HindIII-, HindIII-, PstI- и XbaI-фрагментами размером более 10 т.п.н. (Рис. 2). Полученные данные позволяют построить рестриктазную карту участка генома L. plantarum длиной около 10 т.п.н. (Рис. 3). Этот участок состоит из двух частей: 3′-концевой (на Рис. 3 справа), гомологичной фрагменту плазмиды pSRQ1, содержащему

гены

сахарозо-специфичного

EII

ФТС

scrA,

сахаразы

scrB,

α-глюкозидазы agl и регуляторного белка scrR; и 5′-концевой (около 4 т.п.н.), рестриктазная карта которой не совпадает с рестриктазной картой фрагмента pSRQ1, содержащего ген α-галактозидазы agaS. На этом основании можно предположить, что гомолог гена agaS у L. plantarum отсутствует. Полученные результаты указывают на то, что в геноме типового штамма L. plantarum имеется локус утилизации сахарозы, содержащий гены scrA, scrB, scrR и agl. Возможно, что этот локус также включает в себя, подобно плазмиде pSRQ1, и ген фруктокиназы scrK. Следует обратить внимание на то, что предполагаемая организация

центральной

части

локуса

утилизации

сахарозы

L. plantarum,

состоящей из двух расходящихся оперонов, scrAK и scrBR, полностью повторяет структуру этого локуса Lactococcus lactis. Сходная структура локуса утилизации сахарозы обнаружена и у стрептококков: четыре гена утилизации сахарозы S. mutans расположены аналогичным образом, однако гены scrB и scrR не образуют общего оперона; у S. sobrinus секвенирован только фрагмент сахарозного локуса, содержащий противоположно направленные гены scrA и scrB. Обнаруженный только у Pediococcus и Lactobacillus периферийный ген agl (Рис. 3) не является необходимым для утилизации сахарозы, так как он функционально дублирует ген scrB.

Появление

в

сахарозном

локусе

плазмиды

pSRQ1

P. pentosaceus

дополнительного гена agaS можно объяснить присутствием в ней также локуса утилизации раффинозы и мелибиозы, который состоит из генов пермеазы раффинозы rafP, α-галактозидазы agaR и регуляторного белка rafR. Можно предположить, что второй ген α-галактозидазы, agaS, был компонентом этого же локуса, а затем переместился и встроился в локус утилизации сахарозы между

Рисунок 3. Структура локуса утилизации сахарозы Pediococcus pentosaceus и Lactobacillus plantarum. В верхней части рисунка представлена ранее известная генная структура локуса P. pentosaceus. Чёрные стрелки соответствуют генам гликозил-гидролаз (agaS – ген α-галактозидазы, scrB - β-фруктозидазы, agl – α-глюкозидазы); заштрихованные стрелки – генам гипотетических белков, гомологичных транспозазам IS30 и IS3 E. coli; серые стрелки – другим генам (scrK – ген фруктокиназы, scrA – сахарозо-специфичного фермента II фосфотрансферазной системы, scrR - регуляторного белка). Стрелки показывают направление транскрипции генов. В нижней части рисунка представлена комбинированная рестриктазная карта локусов P. pentosaceus и L. plantarum. Вертикальными штрихами отмечены сайты рестрикции P. pentosaceus, обнаруженные в ходе настоящей работы также у L. plantarum. Подчёркнуты названия сайтов (PstI и SalI), которые не были картированы у L. plantarum, но расположение которых у P. pentosaceus было учтено при построении карты L. plantarum. Над картой стрелками вниз указаны сайты P. pentosaceus, отсутствующие у L. plantarum; а под картой жирными стрелками вверх – примерное расположение сайтов рестрикции, обнаруженных у L. plantarum, но отсутствующих у P. pentosaceus. Треугольниками и цифрами над картой отмечены участки последовательности, гомологичные праймерам DG-1, DG-3, DG-4 и DG-2 соответственно. Условные обозначения сайтов узнавания рестриктаз: B – Bsh1236I, C – BclI, D – DdeI, P – Bsp143I, R – RsaI и S – BseNI. Справа указан масштаб для двух фрагментов рестриктазной карты.

генами scrK и scrA. В пользу общего происхождения локусов утилизации сахарозы Lactobacillus, Lactococcus, Pediococcus и Streptococcus свидетельствует как их структурное сходство, так и высокая гомология образующих их генов. Принимая во внимание более высокую гомологию генов scrB L. plantarum и P. pentosaceus (98.6%), чем генов 16S рРНК этих организмов (94.4%), можно сделать предположение о недавнем горизонтальном переносе локуса утилизации сахарозы Lactobacillus в штаммы P. pentosaceus. Подобное предположение согласуется с плазмидной локализацией детерминантов утилизации сахарозы у Pediococcus. Генетическое картирование α-галактозидазных генов семейства MEL1-MEL11 в теломерах дрожжей Saccharomyces cerevisiae Материалом для картирования генов MEL2-MEL10 служили гаплоидные линии, содержащие по одному различному гену MEL и маркеры: MATa, ura3, ade2 и lys2. Рекомбинационная маркировка моногенных линий MEL2-MEL10 ауксотрофными мутациями проведена с помощью штамма YP1, обладающего соответствующими мутациями. Для локализации генов MEL использовали теломерные тестеры, у которых была мутация ura3, а маркер URA3 интегрирован в разных штаммах во все концы хромосом. Результаты картирования приведены в Таблице I. Они подтверждают ранее известные данные (Turakainen et al. 1993) о том, что гены MEL расположены в концевых районах хромосом и тесно сцеплены с теломерами. В тех случаях, когда маркеры MEL и URA3 были на одном и том же конце хромосомы все тетрады были родительского дитипа: 2Mel+Ura-:2Mel-Ura+. Если гибрид содержал маркеры MEL и URA3 в разных плечах одной хромосомы, все три типа асков (родительского и неродительского дитипов и тетратипа) обнаруживались в соотношении близком к 1:1:4 соответственно. Результаты работы доказывают, что гены MEL этого семейства располагаются как в левых (L), так и в правых (R) плечах в разных хромосомах: ген MEL2 картирован в VII L, MEL3 – в XVI L, MEL4 – в XI L, MEL5 – в IV L, MEL6 – в XIII R, MEL7 – в VI R, MEL8 – в XV R, MEL9 – в X R и MEL10 – в XII R. Известно, что ген

Таблица I. Мейотическая сегрегация генов MEL2-MEL10 и MEL12-MEL14 с маркером URA3, интегрированным ((TG1-3)::URA3) в правые и левые теломеры различных хромосом дрожжей Saccharomyces cerevisiae Анализируемые генотипы гибридов Число тетрад типа PD ND T ura3 VII L::URA3 mel2/MEL2 ura3 25 0 0 ura3 XVI L::URA3 mel3/MEL3 ura3 25 0 0 ura3 XI L::URA3 mel4/MEL4 ura3 23 0 0 ura3 IV L::URA3 mel5/MEL5 ura3 22 0 0 ura3 XIII R::URA3 mel6/MEL6 ura3 27 0 0 ura3 VI R::URA3 mel7/MEL7 ura3 24 0 0 ura3 XV R::URA3 mel8/MEL8 ura3 23 0 0 ura3 X R::URA3 mel9/MEL9 ura3 23 0 0 ura3 XII R::URA3 mel10/MEL10 ura3 22 0 0 ura3 IX L::URA3 mel12/MEL12 ura3 105 0 0 ura3 XV L::URA3 mel13/MEL13 ura3 113 0 0 ura3 X L::URA3 mel14/MEL14 ura3 110 0 0

Анализируемые генотипы гибридов Число тетрад типа PD ND T ura3 VII R::URA3 mel2/MEL2 ura3 6 5 14 ura3 XVI R::URA3 mel3/MEL3 ura3 5 3 14 ura3 XI R::URA3 mel4/MEL4 ura3 6 3 18 ura3 IV R::URA3 mel5/MEL5 ura3 4 2 17 ura3 XIII L::URA3 mel6/MEL6 ura3 4 1 15 ura3 VI L::URA3 mel7/MEL7 ura3 2 3 20 ura3 XV L::URA3 mel8/MEL8 ura3 4 4 19 ura3 X L::URA3 mel9/MEL9 ura3 8 3 15 ura3 XII L::URA3 mel10/MEL10 ura3 3 6 11 ura3 IX R::URA3 mel12/MEL12 ura3 6 1 15 ura3 XV R::URA3 mel13/MEL13 ura3 4 4 13 ura3 X R::URA3 mel14/MEL14 ura3 12 4 41

Примечание. PD, ND и T – тетрады родительского дитипа (2Mel+Ura-:2Mel-Ura+), неродительского дитипа (2Mel+Ura+:2Mel-Ura-) и тетратипа (1Mel+Ura+:1Mel+Ura-:1Mel-Ura+-:1Mel-Ura-) соответственно. Римскими цифрами обозначены стандартные номера хромосом. L и R – левые и правые теломеры. Таблица II. Идентификация полимерных генов MEL12-MEL14 у дрожжей Saccharomyces cerevisiae CBS 2888 Гибрид

Происхождение гибридов Mel+

CR0 CR1 CR2 CR3 CR4 CR5 CR6 CR7

CBS 2888 x X2180-1A CR0-1A x X2180-1A CR0-1B x S288C CR0-1C x S288C CR1-7B x CR3-2B CR2-19A x X2180-1A CR1-7B x CR2-19A CR2-19A x CR3-3A

Мейотическое расщепление Mel+:MelЧисло тетрад типа Случайная выборка спор у низкофертильных 4:0 3:1 2:2 гибридов 6 6 1 0 0 21 59:34 23:23 61:17 56:58 76:28 2 11 4

Генотип (MEL)3/mel MEL12/mel (MEL)2/mel MEL14/mel MEL12/MEL14 MEL13/mel MEL12/MEL13 MEL13/MEL14

MEL1 расположен в левом плече хромосомы II (Vollrath et al. 1988), а ген MEL11 – в левом плече хромосомы I (Naumov G.I. et al. 1996). Обнаружение и картирование нового семейства α-галактозидазных генов MEL12-MEL14 у Saccharomyces cerevisiae Молекулярное кариотипирование и последующая Саузерн-гибридизация зонда MEL1 с хромосомной ДНК показали наличие у штамма CBS 2888, по меньшей мере, трёх генов MEL (Рис. 4А и 4B, дорожка 4). Сопоставление интенсивностей гибридизационных полос позволило сделать вывод о сравнительно низком уровне гомологии этих трёх генов MEL с зондом MEL1 по сравнению с ранее известным семейством высокогомологичных генов MEL1-MEL11. На Рисунке 4B (дорожки 2 и 3) для сравнения представлены результаты гибридизации генов MEL2, MEL3, MEL4, 1

A XII IV VII, XV XVI XIII II XIV X XI

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11

B MEL13 MEL3 MEL6 MEL2

MELj

MEL4 MEL14

MELp

V VIII IX

MEL12

III VI I

MEL7 MEL11

Рисунок 4. Сравнительный анализ нового семейства генов MEL12-MEL14 у штамма Saccharomyces cerevisiae CBS 2888 на основе пульс-электрофореза хромосомных ДНК (A) и Саузерн-гибридизации с зондом MEL1 (B). Штаммы: 1 – YNN 295, 2 – ВКМ Y-1830, 3 – CBS 3081, 4 – CBS 2888, 5 – CR0-1A, 6 – CR0-1B, 7 – CR0-1C, 8 – CR2-19A, 9 – IFO 1815, 10 – IFO 1816, 11 – 61-248. Нумерация хромосом римскими цифрами дана для штамма YNN 295 («Bio-Rad»).

MEL6, MEL7 и MEL11. Уровень дивергенции этих двух семейств примерно соответствует генетическому различию между семейством генов MEL1-MEL11 дрожжей S. cerevisiae и генами MEL двух других видов-двойников: S. paradoxus и S. mikatae (Рис. 4B, дорожки 9-11). Это позволяет предположить, что штамм CBS 2888 обладает тремя новыми генами ферментации мелибиозы MEL12-MEL14. Для однозначной идентификации генов MEL12-MEL14 было необходимо получить рекомбинантные штаммы, содержащие по одному изолированному гену MEL. С этой целью штамм CBS 2888 был скрещен с Mel--тестером X2180-1A генотипа mel12 mel13 mel14. Соответствующий гибрид CR0, как и ожидалось, давал полимерное расщепление по ферментации мелибиозы (Табл. II). Для дальнейшего анализа были взяты три сегреганта из одной тетрады (CR0-1). Представленные на Рисунке 4B (дорожки 5-7) результаты Саузерн-гибридизации свидетельствуют, что сегреганты CR0-1A, CR0-1B и CR0-1C, вероятно, имеют соответственно генотипы MEL12 mel13 mel14, mel12 MEL13 MEL14 и mel12 mel13 MEL14. Эти генотипы подтверждены результатами генетического анализа. Возвратные скрещивания показали, что сегреганты CR0-1A и CR0-1C действительно имеют по одному гену MEL, тогда как сегрегант CR0-1B – два гена MEL (Табл. II, гибриды CR1, CR2 и CR3). Гены MEL у сегрегантов CR0-1A и CR0-1C различны, так как у гибрида генотипа

MEL12 mel13 mel14 / mel12 mel13 MEL14

наблюдается

выщепление

сегрегантов Mel- (Табл. II; гибрид CR4). Третий ген (MEL13) был изолирован по данным Саузерн-гибридизации у одного из сегрегантов гибрида CR2 – CR2-19A (Рис. 4B, дорожка 8). Моногенное расщепление гибрида CR2-19A x X2180-1A подтвердило наличие у сегреганта CR2-19A только одного гена MEL (Табл. II, гибрид CR5). Рекомбинационный анализ гибридов CR6 и CR7 (Табл. II) однозначно показал различную локализацию генов MEL12, MEL13 и MEL14. Таким образом, доказано, что сегреганты CR0-1A, CR0-1B и CR0-1C имеют соответственно генотипы MEL12 mel13 mel14, mel12 MEL13 MEL14 и mel12 mel13 MEL14. Отсюда следует, что гибрид CR0 обладает генотипом MEL12 MEL13 MEL14 / mel12 mel13 mel14, а штамм CBS 2888 имеет все эти три гена MEL.

Для картирования новых генов MEL12-MEL14 штаммы, содержащие по одному гену ферментации мелибиозы и мутацию ura3, были скрещены с тестерами, несущими ген URA3 только в определённых теломерных районах. Результаты тетрадного рекомбинационного анализа представлены в Таблице I. Они позволили картировать новые гены MEL в левых плечах хромосом: MEL12 в хромосоме IX, MEL13 – в XV и MEL14 – в X. Возможно, что дивергенция между новым семейством генов MEL12-MEL14 и семейством высоко гомологичных генов MEL1-MEL11 связана с экологогеографическими особенностями штамма CBS 2888. Эти дрожжи были выделены из необычного для S. cerevisiae субстрата – почвы, к тому же из географически удаленной южно-африканской популяции. Помимо S. cerevisiae гены MEL были обнаружены у S. bayanus, S. mikatae и S. paradoxus, а также у гибридного таксона S. pastorianus. Было показано, что гены видов-двойников в комплексе Saccharomyces sensu stricto имеют сходство на уровне 75-81% (Naumova et al, 1996). Как мы указывали, судя по интенсивности гибридизации с зондом MEL1 (Рис. 4B), примерно такой же уровень гомологии имеет место и между семействами MEL12-MEL14 и MEL1-MEL11. Логично предположить, что у штамма CBS 2888 произошла интрогрессия чужеродных для вида S. cerevisiae генов MEL. Результаты настоящего исследования указывают, что гены утилизации мелибиозы

семейств

MEL1-MEL11

и

MEL12-MEL14,

подобно

семействам

полимерных генов ферментации других сахаров – мальтозы, сахарозы и, возможно, α-метилглюкозида и растворимого крахмала (MAL, SUC, MGL, STA) – никогда не находятся

на противоположных концах одной хромосомы дрожжей. Вероятно,

противоположные концы каждой хромосомы дифференцированы специфическими последовательностями,

участвующими

в

межхромосомных

теломерных

перемещениях генов ферментации сахаров соответствующего семейства.

Анализ аминокислотных последовательностей β-фруктозидаз Существующая классификация гликозил-гидролаз объединяет ферменты с β-фруктозидазной активностью на основании гомологии их аминокислотных последовательностей

в

два

семейства:

GH32

и

GH68

(http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/db.html). Семейство GH68 включает в себя исключительно бактериальные белки, главным образом левансахаразы. Семейство GH32 объединяет прокариотические и эукариотические ферменты, имеющие разную субстратную специфичность и характер катализируемой реакции (сахаразы, фруктаназы и фруктозилтрансферазы). Сходство химических реакций, катализируемых ферментами семейств GH32 и GH68 (перенос β-D-фруктофуранозидазного остатка или его производного с молекулы донора на молекулу акцептора), позволило нам предположить общность их эволюционного происхождения. С помощью программы MACAW было Рисунок 5. Схемы расположения консервативных участков в β-фруктозидазах семейства GH68: литературные данные (схемы 1-5) и данные, полученные в настоящей работе (схемы 6-8). Деления шкалы соответствуют аминокислотным остаткам последовательности левансахаразы Gluconacetobacter diazotrophicus. 1 – Расположение высоко консервативных остатков. Заглавные буквы соответствуют предполагаемым компонентам активного центра. Процессированная форма фермента изображена прямоугольником. Скоба соответствует дисульфидной связи. 2 – Участки, консервативные в левансахаразах протеобактерий (Arrieta et al. 1996). 3 – Участки, консервативные в левансахаразах (Arrieta et al. 1996). 4 – Консервативные мотивы, содержащие кислые аминокислотные остатки (Batista et al. 1999). 5 – Участки, консервативные в левансахаразах (Kurimoto et al. 1999). 6 – Консервативные сегменты (L1–L20), обнаруженные в последовательностях β-фруктозидаз семейства GH68. 7 – Консервативные сегменты (D1-D9), обнаруженные в β-фруктозидазах семейств GH32 и GH68. 8 – Консервативные сегменты (N1-N6), обнаруженные в гликозил-гидролазах семейств GH43 и GH68.

проведено множественное выравнивание участков последовательностей гликозидаз семейства GH32, входящих в состав известных консервативных блоков, с аминокислотными

последовательностями

ферментов

семейства

GH68.

В

последовательностях β-фруктозидаз обоих семейств удалось обнаружить девять участков локального сходства (консервативные сегменты D1-D9; Рис. 5, строка 7), что позволило объединить их в β-фуранозидазное суперсемейство. Скрининг полной базы данных аминокислотных последовательностей с помощью

программы

PSI-BLAST

подтвердил

наличие

сходства

у

последовательностей гликозил-гидролаз семейств GH32 и GH68. При использовании последовательностей представителей семейства GH68 в качестве исходных для анализа, уже после первой итерации выявляется сходство с белками семейства GH32. Анализ порядка появления последовательностей семейства GH68 в зависимости от выбора исходной последовательности позволил сгруппировать всех известных представителей этого семейства в два чётко обособленных подсемейства. При этом наблюдается закономерность: подсемейство 68a включает исключительно белки

грамположительных

бактерий,

а

подсемейство

68b

–

белки

грамотрицательных бактерий (протеобактерий), к подсемейству 68b также относится фруктозилтрансфераза Actinomyces naeslundii. Анализ порядка появления последовательностей семейства GH32 (при скрининге базы данных с помощью программы PSI-BLAST) в зависимости от выбора исходной последовательности этого семейства, позволил подразделить его на четыре подсемейства. Подсемейство 32a включает все бактериальные сахаразы, β-фруктозидазу Thermotoga maritima, а также два гипотетических белка простейшего Leishmania major. Подсемейство 32b объединяет главным образом бактериальные фруктаназы и β-фруктозидазы дрожжей и мицелиальных грибов. Исключение составляют три необычных фермента Aspergillus niger и A. sydowii, образующих подсемейство 32c. К подсемейству 32b также относятся две гипотетические инвертазы простейшего Tritrichomonas foetus и фруктозилтрансферазы Aspergillus foetidus, Microbacterium sp. и двух видов бактерий рода Arthrobacter. Подсемейство 32d включает инвертазы и фруктозилтрансферазы высших растений. К этому

подсемейству также относятся некоторые бактериальные β-фруктозидазы и один из гипотетических белков L. major. Число идентичных аминокислотных остатков в последовательностях одного и того же подсемейства, как правило, превышает 30%, а в последовательностях разных подсемейств семейства GH32 составляет около 25%. Выделенные в семействе GH32 подсемейства хорошо согласуются с кластеризацией ветвей на филогенетическом древе этого семейства, построенном с помощью программы ClustalW (Рис. 1). α-L-Арабиназы и β-D-ксилозидазы – гомологи β-фруктозидаз Анализ консервативных участков каждого из семейств β-фруктозидаз показал, что наиболее протяжённым из них является сегмент L13 семейства GH68 (содержит сегмент D7, консервативный у β-фруктозидаз обоих семейств; Рис. 5, строки 6 и 7). Использование «усреднённой структуры» участка L13 всех гликозидаз семейства GH68 для скрининга базы данных аминокислотных последовательностей с помощью программы PSI-BLAST уже после первого раунда позволило нам показать наличие у него статистически достоверного сходства с последовательностями ряда β-ксилозидаз и α-L-арабинофуранозидаз, относящихся к семейству GH43 гликозидаз. Для

дальнейшего

исследования

сходства

последовательностей

гликозил-гидролаз семейства GH43 и β-фруктозидаз была применена программа PSI-BLAST. При использовании последовательностей представителей семейства GH43 в качестве исходных для анализа, после первого раунда и двух итераций, как правило, удавалось получить в качестве белков-гомологов всех представителей этого семейства. Анализ порядка появления последовательностей семейства GH43 в зависимости от выбора исходной последовательности, позволил различить в этом семействе семь подсемейств (43a-g). Как видно на филогенетическом древе семейства GH43 (Рис. 6), все выделенные нами подсемейства имеют примерно одинаковый иерархический статус (пунктирной линией на рисунке отмечен уровень сходства, соответствующий критерию подсемейства).

При использовании последовательностей белков семейства GH43 в качестве исходных для анализа с помощью программы PSI-BLAST вслед за гликозидазами этого семейства в качестве белков-гомологов в базе данных GenPept выявляются представители семейств GH32, GH62 и GH68. Также обнаружено сходство этих гликозидаз с рядом неохарактеризованных гипотетических белков эубактерий и архебактерий. Использование последовательностей каждого из них для анализа с помощью программы PSI-BLAST показало, что все они образуют семейство белков-гомологов. Для него нами предложено название «семейство GHLP» (Glycoside Hydrolase Like Protein family) и высказано предположение о возможном наличии гликозил-гидролазных активностей у его представителей. Следует отметить, что все белки этого семейства обладают гомологией только с C-концевой

0.1

BAA02527 AAC67554 AAB08024 CAA89208 AAB87371C AAB95326 CAA40378 CAB13699 CAA71485 BAA20372 CAB92901 AAA32682 AAG27441 BAA06646 BAB05597 CAB61805 CAC16457 BAA90772 CAB89837 BAB05586 AAB87371N AAD20247 AAB08692 AAB97967 CAA29235 AAB41091 AAC27699 BAB07402 AAF66622 AAA63610 CAB52932 AAB03089 CAA63265 CAB66926 BAB08462

43a 43d

43b

43g

43c

43e 43f

Рисунок 6. Филогенетическое древо гликозидаз семейства GH43. Справа указаны номера последовательностей в GenPept и их распределение по подсемействам. Ветви AAB87371N и AAB87371C соответствуют N- и C-концевым доменам белка.

частью последовательностей гликозидаз семейств GH32, GH43, GH62 и GH68. Сравнение

с

помощью

программы

MACAW

последовательностей,

представляющих гликозидазы семейств GH43 и GH68, показало наличие у них шести общих консервативных участков (консервативные сегменты N1-N6). Эти сегменты в первичной структуре сгруппированы попарно в три кластера (Рис. 5, строка 8). Гомологичные им участки также оказались консервативными в остальных трёх семействах: GH32, GH62 и GHLP. В качестве примера на Рисунке 7 представлена структура участков последовательностей гликозидаз пяти семейств, соответствующих консервативным сегментам N5 и N6. В состав сегмента N5 входит высоко консервативный остаток Glu и кластер гидрофобных аминокислотных остатков, вероятно соответствующий β-слою во вторичной структуре. В случае сахаразы S. cerevisiae было показано, что этот остаток Glu является донором протона в активном центре фермента, а примыкающий к нему у гликозидаз семейства GH32 остаток Cys также существенен для энзиматической активности фермента (Reddy & Maley, 1996). Полученные нами данные о гомологии с β-фруктозидазами семейств GH32 и GH68, а также наличие α-фуранозидазной активности у гликозидаз семейств GH43 и GH62

позволяют

включить

эти

семейства

в

состав

β-фруктозидазного

суперсемейства. Это суперсемейство становится первым суперсемейством гликозилгидролаз, содержащим ферменты гидролизующие гликозидную связь как с сохранением (GH32 и GH68), так и с обращением (GH43) оптической конфигурации субстрата. Семейство GHLP гипотетических гликозидаз термофильных бактерий также относится к этому суперсемейству на основе гомологии аминокислотных последовательностей. Подпись к Рисунку 7. Множественное выравнивание последовательностей гликозидаз. Слева указаны номера последовательностей в GenPept, справа – их принадлежность к семействам. На чёрном фоне указаны консервативные аминокислотные остатки (сверху – консервативный мотив), на сером фоне – кластер гидрофобных аминокислотных остатков. В нижней части рисунка звёздочками отмечены консервативные сегменты N5 и N6, стрелочкой – остаток Glu, входящий в состав активного центра сахараз.

Рисунок 7 &&EoPz &&z&bb &&&&& o & ozz & GP@z TERRFFEASW-MHKYNG--------KYYFSYSTG< 4 >LCYATGDN-PYGPFTYQ STRRFFEGPS-LNKVGN--------LYVLQYSTG< 4 >VEIATATK-PDGPYYWK DPHRFFEASW-MHKYNG--------KYYFSYSTG< 4 >LCYAVGDN-PYGPFTYQ EGHEFFEAPS-IRKKGE--------TYYFITSSV< 4 >LCYATSKHPTKG-FKYG AGSAQIEAPF-ILRKGD--------YYYLFASWG<11>LVVGRSKQ-VTGPYLDK NNGGALEAPT-LTYQNG--------YYYLMVSFD<11>IAYGRSKS-ITGPYLDK NNNGALEAPT-LTYQNG--------YYYLMVSFD<11>IAYGRSKS-ITGPYLDK SGTHAEEGSY-MFQYGD--------YYYLFYSAG<17>IKVCRSTS-PTGDFVDS GNHSRIEGPYVLYNPDT-------QYYYLYLSYG< 9 >IRVARSKK-PDGPYYDA TDIKLTEAPH-LYHIGD--------YYYLLTAEG< 7 >ATIARSKH-IEGPYEIH TPIKLTEAPH-LYHIGD--------NYYLLTAEG< 7 >ATIARSSH-IEGPYEVH TDIAYTEGPH-LYYIND--------MYYLMTAEG< 7 >ETIARSKT-IHGPYEIQ TPLCYTEGAH-LYRHAG--------WYYLMAAEG< 7 >VVVLRSKN-IDGPYELH KDVIWPEGPH-LYKKDG--------YYYLLHAEA< 7 >ISVARSKE-LFKWFEGC SGLKYPEAPH-LYRIGD--------WWYLLIAEG< 7 >VSVARSRS-PRGPWQGA TNVKLVEGPH-LYQIND--------YYYLFAAQG< 7 >EVVARSKT-LDTLSFEA YEGPIAEGTK-FMKRNG--------WYYLIIPEG< 6 >QTVLRARN-IYGPYERR KIDGLEEGSH-AYKING--------KYYITTIRW< 7 >ECVYRADK-IDGPYEGR PAPFMFEDSG-INKIGN--------TYYYSYCTN<15>IAYMTSKS-PMGPWEYK PAPYMFEDSG-INKIGN--------TYYYSYCTN<13>IAYMTGKS-PVGPWEYR DAPYLFEDSG-IHKYNG--------KYYYSYCIN<13>IGYMVSDN-PMGPFTYK DAPFMFEDSG-LHKYNG--------TYYYSYCIN<13>IGYMTSSS-PMGPFTYR EGIQGVEGPT-AFKFNK-DDVEEDTWCVLLDHFG--------------------GVIGANEGPTGFVDNQD----ASKTW-LYVDEYN--------------------MVGQHREAPA-IFKHQN--------TYYMITSGC< 7 >ALAHAAES-IMGPWETL AIADDIEGPY-HRCPANPVTNSGHETCVWRYGD------GIAAMLT-TDGPERNT

GH43

697 355 208 208 497

TTKNLFEAPQ-VYKVQG-----QNQYFMIVEARG< TKANLFEGVQ-VYKVQG-----QNQYLMIVEAMG< TKENLFEAVQ-VYTVDG-----QNKYLMIVEAMG< ARNDLFEAVQ-VYTVDG--GEGDTKYLMIVEAIG< GNSYLFEAAN-VYKLDG-----QNRYLLMVEAYI<

GH62

AAD36914 BAA30206 CAB50037 AAD36300 AAD35864 AAC07180 BAA79294 CAB02016

79 75 75 99 108 110 123 204

DELYGVEDPR-ITKIGD-------EYYMVYTAYS<30>DAALFPEK-INGKYVMF WEKKGIEDPR-VVKLGK-------RYVMTYTGYD<39>SGAILPQK-INGEYIMY CEIMGVEDPR-IVKIGK-------DYLMTYTGYD<39>SGAILPEK-VSGEYVMY FQPSYAYDPR-VVKIED-------TYYITFCTDD<28>NGVLFPRK-INGKYVML QEFLGCEDPR-VFFRNS-------RFELLYTAKG<28>KRYISIKS-TLGEYVPV YDLWGVEDPR-VYEIDG-------KLFMTYTGRT<45>NAFLVKTD-KLMLYHRL IDFWGAEDPR-YTSVNS-------HDVLTYTGRT<35>DEAPLATS-IKNAFILS SDNSAACRPY-VVRDAG-------VYRMWFCARG<34>DMIEYPCV-FDHRGQRF

AAD36485 AAA27562 AAA25568 CAA68542 BAA24915 AAB51115 CAA24618 BAA12320 CAA04131 S33920 BAA24360 CAA21433 AAA03516 BAA01107

184 217 216 217 226 286 217 227 235 265 1015 238 249 302

ETTKEIECPD-LVRIGEKD------ILIYSITST< 2 >VLFSMGEL-KEGK-LNV DLGYMWECPD-FFEINGQS------VMLFSPQGV< 8 >KNIYSVAY-IVGDQLNL ARGYMIECPn-lvwidqqp------vllfcpQGL< 7 >QNIYPNMY-LVADQLNL SHGGVWECPD-LFELPVDGNPNQKKWVMQVSVGN< 3 >SGGSGMQY-FVGDFDGT HALGGIECPD-LFEMTAGDGTRH--WVFGASMDA< 3 >GLPMTFAY-WTGSWNGT CHDGVWECPA-VLKVDGK-------WVILLNINP< 3 >FGGSATQY-FVGEFDGH FLGYQYECPG-LIEVPTEQDPSKSYWVMFISINP< 3 >AGGSFNQY-FVGSFNGT SSVTGWEVPD-MFQLPIQGTNETT-WVIIFTPAQ< 3 >AGGNGVVA-LTGSFDGE AQGGVWECPG-LFKLPLDGGSSTK-WVITSGLNP< 5 >TVGSGTQY-FVGEFDGT RWAFNFETGN-VFSLDEYGYNPHGQIFSTIGTEG< 9 >TSIHDMLW-VSGNVSRN ELGTVWELPV-LLPLGTDSTGKKKHIFIINPHEK<10>QRDVEVYY-WIGTWDRD DLDHMFECPD-FFTLKQGGEH----YLKVSTMPS-------HRDYI-IYGSYQLN ANTGMWECPD-FFPVSLKGLNG------------<18>DLTRYEYY-TVGTYLTD PGTGMWECVD-FFPVSKKNGNG------------<18>DDDRHDYY-AIGTYDDN

CAB08015 CAB39327 AAA88584 AAA71925 AAB36606 AAC36458 AAC36056 AAA27702 AAC36942

336 348 495 541 395 281 281 272 270

TVTDEIERAN-VFKMNG--------KWYLFTDSR<15>MLGYVSNS-LTGPYKPL LVTDEIERAN-VFKMNG--------LWYLFTSTR<15>MLGYVSTS-LTGPYKPL MVSDELERPN-VVKLGD--------KYYLFTASR<22>MLGYVSDQLTNG-YKPL MVTDEVERPS-VVKMGG--------KYYLFTASR<22>MLGFVSDS-LRGKYRPL CVNDQTERPQ-VYLHNG--------KYYIFTISH<13>VYGFVGDG-IRSDFQPM GVNDQTERPH-FVFQDG--------KYYLFTISH<13>VYGFLSDN-LTGPYSPM GVNDQTERPH-YVFQDG--------KYYLFTISH<13>VYGFVGEH-LFGPYRPM GVNDQTERPH-VVFQNG--------LTYLFTISH<13>VYGFVSENGIFGPYEPL GVNDQMERPH-VIFQNG--------LTYLFTISH<13>LYGFVSENGIFGPYEPL ***⇑************************** ************ N5 N6

AAB08024 AAC67554 CAA89208 JQ1936 CAA71485 CAA99586 BAA20372 AAA32682 BAA06646 AAC27699 AAC97375 AAB97967 AAB08692 AAA63610 CAB52932 AAD20253 BAA78558 AAB87371 AAB87371 AAB95326 CAA40378 CAB13699 AAB03089 CAA63265 CAB66926 CAB61805

218 219 216 203 215 209 210 194 218 180 180 180 180 179 168 182 >131 220 1082 1516 242 245 674 278 322 234

AAD32559 AAC26524 BAA85252 CAB01408 CAA38390

6 >FRSFTATS-LNGPWTPQ 5 >FRSFTASS-LSGSWTPQ 5 >FRSFTADS-LDGEWTVQ 6 >FRSFTASS-LGGEWTAQ 1 >GRAFSAPG-QRPAWMAH

GHLP

GH32

GH68

ВЫВОДЫ 1. У молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum NRRL B-4496 и Pediococcus pentosaceus NRRL B-11465 обнаружена сходная структура локуса утилизации сахарозы: дивергентно расположенные ген scrA, кодирующий сахарозоспецифичный второй фермент фосфотрансферазной системы, и гены scrB, scrR и agl, кодирующие β-фруктозидазу, регуляторный белок и α-глюкозидазу соответственно. Сходство 5′-концевых частей генов scrB у L. plantarum и P. pentosaceus достигает 98.6%. 2. Проведено картирование в субтеломерных районах хромосом Saccharomyces cerevisiae девяти полимерных генов ферментации мелибиозы: ген MEL2 локализован в левом плече седьмой хромосомы (VII L), MEL3 – в XVI L, MEL4 – в XI L, MEL5 – в IV L, MEL6 – в XIII R, MEL7 – в VI R, MEL8 – в XV R, MEL9 – в X R и MEL10 – в XII R. 3. У штамма S. cerevisiae CBS 2888 обнаружено три гена ферментации мелибиозы MEL12-MEL14, представляющие новое дивергентное семейство α-галактозидазных генов. Проведено картирование этих генов в субтеломерных районах левых плечей хромосом S. cerevisiae: MEL12 в – IX, MEL13 – в XV и MEL14 – в X. 4. Обнаружена закономерность локализации полимерных генов семейств утилизации углеводов у S. cerevisiae. Гены ферментации сахарозы, мальтозы и мелибиозы, принадлежащие одному семейству (SUC, MAL, MEL1-MEL11 или MEL12-MEL14), никогда не находятся в противоположных концах одной и той же хромосомы (даже в разных штаммах). 5. Обнаружена гомология аминокислотных последовательностей β-фруктозидаз, принадлежащих двум разным семействам гликозил-гидролаз: GH32 и GH68. Эти два семейства объединены в β-фруктозидазное суперсемейство. 6. Обнаружена

гомология

белков

β-фруктозидазного

суперсемейства

с

β-D-ксилозидазами и α-L-арабинофуранозидазами семейств GH43 и GH62 гликозил-гидролаз. Оба семейства включены в состав β-фруктозидазного суперсемейства. В состав этого суперсемейства также включена группа гипотетических белков, вероятно, кодирующих гликозидазы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи: 1. Naumoff D.G. β-fructosidase superfamily: homology with some α-L-arabinases and β-D-xylosidases // Proteins: Structure, Function, and Genetics, 2001, V. 42, P. 66-76. 2. Наумов Д.Г. и Лившиц В.А. Молекулярная структура локуса утилизации сахарозы Lactobacillus plantarum: сравнение с Pediococcus pentosaceus // Молекулярная биология, 2001, т. 35, No1, стр. 19-27. 3. Naumoff D.G. Conserved sequence motifs in levansucrases and bifunctional β-xylosidases and α-L-arabinases // FEBS Letters, 1999, V. 448, P. 177-179. 4. Наумов Д.Г. Гомологичный локус геномов Bacillus subtilis и Bacillus stearothermophilus, содержащий гены левансахаразы и леваназы // Молекулярная биология, 1999, т. 33, Nо2, стр. 207-210. 5. Naumoff D.G. Levanase gene sequence from strain Bacillus sp. L7 (letter) // FEMS Microbiology Letters, 1998, V. 164, P. 227-228. 6. Наумов Д.Г. и Дорошенко В.Г. β-фруктозидазы: новое суперсемейство гликозил-гидролаз // Молекулярная биология, 1998, т. 32, Nо5, стр. 902-907. 7. Наумов Г.И. и Наумов Д.Г. Генетическое картирование нового дивергентного семейства α-галактозидазных генов MEL у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Биотехнология, 1997, Nо1, стр. 26-28. 8. Наумов Г.И. и Наумов Д.Г. Суперсемейство α-галактозидазных генов MEL у дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Доклады АН, 1997, т. 353, Nо3, стр. 426-429. 9. Наумов Г.И., Наумов Д.Г. и Луис Э.Д. Локализация семейства α-галактозидазных генов MEL в правых и левых теломерах дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Доклады АН, 1995, т. 341, Nо1, стр. 134-136.

Тезисы конференций: 10. Наумов Д.Г. Новое суперсемейство гликозил-гидролаз: β-фруктозидазы гомологичны β-ксилозидазам и α-L-арабиназам // Материалы конференции “Биосфера и человечество”, 20-21 сентября 2000, Обнинск, стр. 116-122. 11. Naumoff D.G. Enzymes of fructan synthesis and degradation: sequence analysis and classification // Abstracts of 4th International Fructan Symposium “Fructan 2000”, August 16-20, 2000, Arolla, Switzerland, P. 1.4. 12. Наумов Д.Г. и Лившиц В.А. Сравнительный анализ систем утилизации сахарозы молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum и Pediococcus pentosaceus // Тезисы школы-конференции “Горизонты физико-химической биологии”, 28 мая – 2 июня 2000, Пущино, т. 2, стр. 130. 13. Наумов Д.Г. Новое суперсемейство гликозил-гидролаз: β-фруктозидазы генетически родственны β-ксилозидазам и α-L-арабиназам // Тезисы докладов II съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. 1-5 февраля 2000, Санкт-Петербург, т. 2, стр. 231-232. 14. Наумов Д.Г., Дорошенко В.Г. и Лившиц В.А. Секвенирование фрагмента гена сахаразы из Lactobacillus plantarum (Тезисы стендовых сообщений конференции, посвящённой 30-летию журнала “Молекулярная биология”, 17-19 декабря 1997, Москва) // Молекулярная биология, 1998, т. 32, Nо2, стр. 373. 15. Наумов Д.Г., Дорошенко В.Г. и Лившиц В.А. Секвенирование гена сахаразы из Lactobacillus plantarum // Тезисы V научной конференции ГосНИИгенетика, 28-31 октября 1997, стр. 23. 16. Наумов Д.Г. Генетическое картирование суперсемейства α-галактозидазных генов MEL дрожжей Saccharomyces cerevisiae в теломерах // Тезисы IV научной конференции ГосНИИгенетика, 22-26 апреля 1996, стр. 21.