Санитарно-бактериологический контроль и микробиологические методы исследования: Практическое пособие

М И Н И СТ Е РСТ В О О БРА ЗО В А Н И Я РО ССИ Й СК О Й Ф Е Д Е РА Ц И И В О РО Н Е Ж СК И Й ГО СУ Д А РСТ В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РСИ Т Е Т

Санитарно-б актериологический контроль и мик роб иологическиеметоды исследования

Практическоеп особ иедлясту дентов Сп ециальность «Ф армация» (011600)

В оронеж 2003

2

У тверж дено научно-методическим ф аку льтета, п ротокол№ 7 от14.05.2003

советом

ф армацевтического

Составители: СеменихинаА .В . РахмановаТ .И . Н ехаеваГ.И . Поп оваТ .Н . Н аучный редактор доц. Граб ович М .Ю . Практическое п особ ие п одготовлено на каф едре аналитической и медицинской б иохимии и микроб иологии б иолого-п очвенного ф аку льтета В оронеж ского госу дарственного у ниверситета. Рекоменду ется для сту дентовI и II ку рсаотделения средне-сп ециального об разованияи II ку рсаотделениявысш егооб разованияф армацевтического ф аку льтета.

3

С О Д ЕР Ж А Н И Е В В ЕД ЕН И Е… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 Т ем а 1. М И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Е Л А БО РА Т О РИ И И И Х О БО РУ Д О В А Н И Е … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..4 Т ем а 2. М И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Е М Е Т О Д Ы И ССЛ Е Д О В А Н И Я М О РФ О Л О ГИ И М И К РО О РГА Н И ЗМ О В … … … … … … … … … … … … … … 9 Т ем а 3. М И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Е М Е Т О Д Ы И ССЛ Е Д О В А Н И Я … … ..17 Т ем а 4. М Е Т О Д Ы В Ы Д Е Л Е Н И Я , К У Л ЬТ И В И РО В А Н И Я И И Д Е Н Т И Ф И К А Ц И И Ч И СТ Ы Х К У Л ЬТ У Р БА К Т Е РИ Й … … … … … … … ..23 Т ема4.1. ПО Л У Ч Е Н И Е Ч И СТ Ы Х К У Л ЬТ У Р БА К Т Е РИ Й … … … ...23 Т ема4.2. И Д Е Н Т И Ф И К А Ц И Я К У Л ЬТ У Р БА К Т Е РИ Й … … … … … .24 Т ем а 5. М Е Т О Д Ы И ЗУ Ч Е Н И Я А Н Т И М И К РО БН О ГО Д Е Й СТ В И Я А Н Т И БИ О Т И К О В … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 31 Т ем а 6. М И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Й К О Н Т РО Л Ь А Н Т И СЕ ПТ И К О В , Д Е ЗИ Н Ф Е К Т А Н Т О В , М Е Т О Д О В СТ Е РИ Л И ЗА Ц И И … … … … .… … ..… ..35 Т ема6.1. СТ Е РИ Л И ЗА Ц И Я … … … … … … … … … … … … … … … … ...35 Т ема6.2. Д Е ЗИ Н Ф Е К Ц И Я … … … … … … … … … … … … … … … … … .37 Т ема6.3. А СЕ ПТ И К А И А Н Т И СЕ ПТ И К А … … … … … … … … … … ..38 Т ем а 7. СА Н И Т А РН А Я М И К РО БИ О Л О ГИ Я … … … … … … … ...… … … … 40 Т ема7.1. М И К РО Ф Л О РА В О Д Ы … … … … … … … … … … … … … … ..43 Т ема7.2. М И К РО Ф Л О РА В О ЗД У Х А … … … … … … … … ..… … … … 48 Т ема7.3. М И К РО Ф Л О РА ПО Ч В Ы … … … … … … … … … … … … ...… 50 Т ема7.4. М И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Й К О Н Т РО Л Ь В А ПТ Е К А Х ...52 Т ем а 8. М Е Т О Д Ы В Ы Я В Л Е Н И Я И Т И Т РО В А Н И Я СПЕ Ц И Ф И Ч Е СК И Х А Н Т И Т Е Л (СЕ РО Д И А ГН О СТ И К А )… … … … … … … … … … … … … … … ..55 О С Н О В Н А Я Л И Т ЕР А Т У Р А … … … … … … … … … … … … … … … … … … .62

4

В В ЕД ЕН И Е М икроб иология(греч. micros – малый, bios – ж изнь и logos – у чение) – наукао мельчайш их организмах, которыеп о п редлож ению итальянского у ченого Седильо п ринято называть микроорганизмами. О на изу чает морф ологию , цитологию , экологию , генетику , ф изиологию и б иохимию микроорганизмов. В оп росы и задания, п редставленные в данном методическом п особ ии, нап равлены на овладение сту дентами п рактических навыков в отнош ении микроб иологических методов исследования, методовоценки санитарно-эп идемиологического состояния внеш ней среды, методов оп ределения антимикроб ного действия антиб иотиков. О соб ое внимание у деляю тся воп росам, имею щ им б ольш ое п рикладное значение в п роизводственной деятельности ф армацевта: методам стерилизации и дезинф екции, организации асеп тических у словий п ри изготовлении лекарств, п равильности хранения медицинских б иологических п реп аратов, п роведению микроб иологического контроля в ап теках и п р. Т ем а 1. М И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Е Л А БО РА Т О РИ И И И Х О БО РУ Д О В А Н И Е Б а кт ер ио л о г ическа я л а бо р а т о р ия В сю раб оту с микроб ами п роводят в лаб ораториях, которые в зависимости от основных задач могу т б ыть научно-исследовательскими, диагностическими или п роизводственными. В настоящ ее время лаб оратории, как п равило, сп ециализированы и раб отаю т с той или иной гру п п ой микроб ов: б актериальные (б актериологические), виру сные, гриб ковые, п ротозойные, хламидийные, риккетсиозные и дру гие. Сп ециализированный характер п риоб ретаю т и б актериологические лаб оратории, вкоторых раб отаконцентриру ется на оп ределенных гру п п ах б актерий (нап ример, риккетсиозные, ту б ерку лезные, леп тосп ирозные, анаэроб ные и др.). И мму нологические исследованияп роводятвимму нологических лаб ораториях, хотяотдельные виды исследований могу т вып олняться и в микроб иологических лаб ораториях (нап ример, серодиагностикаинф екционных б олезней). Раб оту с п атогенными микроб ами п роводят в сп ециально об ору дованных лаб ораториях, об есп ечиваю щ их такие реж им раб оты и технику б езоп асности, которые исклю чаю т возмож ность зараж ения п ерсоналаи «у течку » микроб овзап ределы лаб оратории. Н еоб ходимость четкой регламентации у словий раб оты с микроб ами, в различной степ ени оп асными для сотру дников лаб ораторий и окру ж аю щ его населения, об у словиларазраб отку классиф икации микроб ов - они разделены на4 гру п п ы п о степ ени их б иологической оп асности. В России в соответствии с рекомендациями В О З п атогенные микроб ы делятна4 гру п п ы: l-ягру п п а- возб у дители особ о оп асных инф екций;

5

2-ягру п п а- возб у дители высококонтагиозных эп идемических заб олеваний человека; З-я гру п п а -возб у дители инф екционных б олезней, выделяемые в самостоятельныенозологическиегру п п ы; 4-я гру п п а у словно-п атогенные микроб ы возб у дители оп п орту нистических инф екций. Безоп асность раб от влаб ораториях всех категорий об есп ечивается вып олнением расп орядкаи п равил раб оты влаб оратории, вып олнением треб ований к лаб ораторным п омещ ениям и их оснащ ению , оснащ ением лаб ораторий соответствую щ им об ору дованием, медицинским наб лю дением засостоянием здоровья сотру дников, об у чением п ерсонала техникеб езоп асности. П р а вил а р а бо т ы и по вед ения в л а бо р а т о р ии О соб енностью б актериологических раб от является п остоянное соп рикосновение сотру дников лаб оратории с заразным материалом ку льту рами п атогенных микроб ов, зараж енными ж ивотными, кровью и выделениями б ольного организма. Поэтому все сотру дники (врачи, лаб оранты, п реп араторы, технический п ерсонал) об язяны соб лю дать п равила раб оты, которые об есп ечиваю т стерильность в раб оте и п реду п реж даю т возмож ность возникновения вну трилаб ораторных зараж ений. О сновные п равила раб оты и п оведения для раб отников б актериологических лаб ораторий заклю чаю тсявследу ю щ ем: 1. Без сп ециальной одеж ды - халатаи головного у б ора- нельзя входить в п омещ ениеб актериологической лаб оратории. 2. При исследовании зараж енного материала и раб оте с п атогенными ку льту рами микроб ов необ ходимо строго соб лю дать об щ еп ринятые в б актериологической п рактике технические п риемы, исклю чаю щ ие возмож ность соп рикосновенияру к с заразным материалом. 3. В п омещ ении б актериологической лаб оратории категорически зап рещ аетсяку рить, п ринимать п ищ у , хранить п роду кты п итания. 4. О траб отанные ку льту ры и зараж енный материал п одлеж ат об язательному у ничтож ению , п о возмож ности в тот ж е день. И нстру менты, исп ользованныевраб отес заразным материалом, тотчас ж е п осле их у п отреб ления п одвергаю т дезинф екции, как и п оверхность раб очего места. 5. Переливаниеж идкостей, содерж ащ их п атогенных микроб ов, п роизводят над сосу дом, нап олненным дезинф ициру ю щ им раствором. 6. При расп аковке п рисланного заразного материала необ ходимо соб лю дать осторож ность: б анки, содерж ащ ие материалдля исследования, п ри п олу чении об тираю т снару ж и дезинф ициру ю щ им раствором и ставят неп рямо настол, анап односы или вкю веты. 7. О слу чаях аварии с п осу дой, содерж ащ ей заразный материал, или п роливания ж идкого заразного материаланадо немедленно доводить до сведениязаведу ю щ еголаб ораторией или егозаместителя. М ероп риятияп о

6

об еззараж иванию загрязненного п атогенным материалом п латья, п редметовраб очего инвентаря, раб очего местаи частей тела, накоторые п оп ал заразный материал, осу щ ествляю тся в п рису тствии врачаб актериолога. 8. При вып олнении б актериологических раб от ну ж но строго следить за чистотой ру к: п о окончании раб оты с заразным материалом п одвергать их дезинф екции; раб очееместо вконцедняп риводить вп орядок и тщ ательно дезинф ицировать, а заразный материал и ку льту ры микроб ов, необ ходимые для дальнейш ей раб оты, ставить на хранение в зап ираю щ ийсяреф риж ератор или сейф . 9. Раб отники б актериологических лаб ораторий п одлеж ат об язательной вакцинации п ротив тех инф екционных б олезней, возб у дители которых могу твстретитьсявисследу емых об ъ ектах. Oбopyд oвaниe микpoбиoл oг ичecкиx л aбopaт opий Л aб opaтopии cнaб ж eны cлeдyю щ ими п pиб opaми и aп п apaтaми: б иoлoгичecкими иммepcиoнными микpocкoп aми c дoп oлнитeльными п pиcп ocoб лeниями (ocвeтитeль, ф aзoвo-кoнтpacтнoe ycтpoйcтвo, тeмнoп oльный кoндeнcop и дp.), лю минecцeнтным микpocкoп oм, тepмocтaтaми, aп п apaтypoй для cтepилизaцни, pH-мeтpaми, aп п apaтoм для п oлyчения диcтиллиpoвaннoй вoды (диcтиллятop), цeнтpиф yraми, тexничecкими и aнaлитичecкими вecaми, aп п apaтypoй для ф ильтpoвaния (ф ильтp Зeйтцa и дp.), вoдяными б aнями, xoлoдильникaми, нaб opoм инcтpyмeнтoв(б aктepиoлoгичecкиe п eтли. ш п aтeли, иглы, п инцeты и дp.), лaб opaтopнoй п ocyдoй (п poб иpки, кoлб ы, чaш ки Пeтpи, мaтpaцы, ф лaкoны. aмп yлы, п acтepoвcкиe и гpaдyиpoвaнныe nип eтки) и дp. B лaб opaтopии выдeлeнo мecтo для oкpacки микpocкoп ичecкиx п peп apaтoв, гдe нaxoдятcя pacтвopы cп eциaльныx кpacитeлeй, cп иpт, киcлoты, ф ильтpoвaльнaя б yмaгa и дp. Kaж дoe paб oчee мecтo cнaб ж eнo гaзoвoй гopeлкoй или cп иpтoвкoй и б aнкoй c дeзинф ициpyю щ им pacтвopoм. Д ля п oвceднeвнoй paб oты лaб opaтopия дoлж нa pacп oлaгaть нeoб xoдимыми п итaтeльными cpeдaми, xимичecкими peaктивaми, диaгнocтичecкими п peп apaтaми и дpyгими лaб opaтopными мaтepиaлaми. B кpyп ныx лaб opaтopияx имeю тcя тepмocтaтныe кoмнaты для мaccoвoгo выpaщ ивaниямикpoоpгaнизмoв, п ocтaнoвки cepoлoгичecкиx peaкций. Д ля выpaщ ивaния, xpaнeния кyльтyp, cтepилизaции лaб opaтopнoй п ocyды и дpyгиx цeлeй иcп oльзyeтcяcлeдyю щ aяaп п apaтypa: 1. Tepмocт aт . Aп п apaт, в кoтopoм п oддepж ивaeтcя п ocтoяннaя тeмп epaтypa. Oп тимaльнaя тeмп epaтypa для paзмнoж eния мнoгиx микpoopгaнизмoв37 °C. Tepмocтaты б ывaю твoздyш ными и вoдяными. 2. Л а мина р бо кс. С п омощ ью б оксов(настольных, ламинарных) создаю т ф изическиеб арьеры дляп редотвращ ениявозмож ных контактовп ерсонала с инф екционным материалом. 3. Xoл oд ил ьники. И cп oльзyю тcя вмикpoб иoлoгичecкиx лaб opaтopияx для xpaнeния кyльтyp микpoopгaнизмoв, п итaтeльныx cpeд, кpoви, вaкцин, cывopoтoк и п poчиx б иoлoгичecки aктивныx п peп apaтoвп pи темп epaтypе

7

oкoлo 4°C. Д ля xpaнeния п peп apaтoвиcп oльзyю тcя низкoтeмп epaтypныe xoлoдильники, вкoтopыx п oддepж ивaeтcятeмп epaтypa - 20 °C и ниж e. 4. Ц eнт pифyг и. Пpимeняю тcя для ocaж дeния микpoopгaнизмoв, эpитpoцитoви дpyгиx клeтoк, для paздeлeния нeoднopoдныx ж идкocтeй (эмyльcии, cycп eнзии). B лaб opaтopияx иcп oльзyю т цeнтpиф yги c paзличными peж имaми paб oты. 5. Cyшил ьнo-cт epил изaциoнны й шкaф (пeчьП acт epa). Пpeдназначен для возду ш ной стерилизации лаб ораторной п осу ды и дру гих материалов. 6. Cт epил изaт op пapoвoй (aвт oкл aв). Пpeднaзнaчeн для cтepилизaции п apoм п oд дaвлeниeм. B микpoб иoлoгичecкиx лaб opaтopияx иcп oльзyю тcя aвтoклaвы paзныx мoдeлeй (вepтикaльныe, гopизoнтaльныe, cтaциoнapныe, п epeнocныe). Mикpocкoпы и микpocкoпичecкaя т exникa Д лямикpоб иoлoгичecкиx иccлeдoвaний иcп oльзyю тнecкoлькo тип oв микpocкoп oв (б иoлoгичecкий, лю минecцeнтный, элeктpoнный) и cп eциaльныe мeтoды микpocкoп ии (ф aзoвo-кoнтpacтный, тeмнoп oльный). Oни п peднaзнaчeны для изyчeния ф opмы, cтpyктypы, paзмepoв и дpyгиx п pизнaкoв paзличныx микpoopгaнизмoв, вeличинa кoтopыx нe мeнee 0,2-0,3 мкм. Пpeдeльнaя paзpeш aю щ aя cп ocoб нocть иммepcиoннoгo микpocкoп a - 0,2 мкм. Oб щ ee yвeличeниe микpocкoп a oп peдeляeтcя п poизвeдeниeм yвeличeния oб ъ eктивa нa yвeличeниe oкyляpa. Haп pимep, yвeличeниe микpocкoп a c иммepcиoнным oб ъ eктивoм 90 и oкyляpoм 10 cocтaвляeт: 90x10=900 кpaт. Teмнoпoл ьнaя микpocкoпия. Mикpocкoп ия в тeмнoм п oлe зpeния ocнoвaнa нa явлeнии диф paкции cвeтa п pи cильнoм б oкoвoм ocвeщ eнии взвeш eнныx вж идкocти мeльчaйш иx чacтиц (эф ф eкт Tиндaля). Э ф ф eкт дocтигaeтcя c п oмoщ ью п apaб oлoид- или кapдиoид-кoвдeнcopa, кoтopыe зaмeняю тoб ычный кoндeнcop вб иoлoгичecкoм микpocкoп e. Ф aзoвo-кoнт pacт нaя микpocкoпия. Ф aзoвo-кoнтpacтнoe п pиcп ocoб лeниe дaeт вoзмoж нocть yвидeть в микpocкoп п poзpaчныe oб ъ eкты. Oни п pиoб peтaю т выcoкyю кoнтpacтнocть изoб paж eния, кoтоpaя мoж eтб ыть п oзитивнoй или нeгaтивнoй. Пoзитивным ф aзoвым кoнтpacтoм нaзывaю ттeмнoe изoб paж eниe oб ъ eктa вcвeтлoм п oлe зpeния, нeгaтивным - cвeтлoe изoб paж eниe oб ъ eктa нa тeмнoм ф oнe. Л юминecцeнт нaя (ил и фл юopecцeнт нaя) микpocкoпия. Ocнoвaнa нa явлeнии ф oтoлю минecцeнции. Л ю минecцeнция - cвeчeниe вeщ ecтв, вoзникaю щ ee п ocлe вoздeйcтвия нa ниx кaкиx-либ o иcтoчникoвэнepгии: cвeтoвыx, элeктpoнныx лyчeй, иoнизиpyю щ eгo излyчeния. Ф oтoлю минecцeнция - лю минecцeнция oб ъ eктa п oд влияниeм cвeтa. Ecли ocвeщ aть лю минecциpyю щ ий oб ъ eкт cиним cвeтoм, тo oн иcп ycкaeт лyчи кpacнoгo, opaнж eвoгo, ж eлтoгo или зeлeнoгo цвeтa. B peзyльтaтe вoзникaeт цвeтнoe изoб paж eниe oб ъ eктa. Д линa вoлны излyчaeмoгo cвeтa (цвeт лю минecцeнции) зaвиcит oт ф изикo-xимичecкoй cтpyктypы лю минecциpyю щ eгo вeщ ecтвa. Пepвичнaя (coб cтвeннaя) лю минecцeнция

8

нaб лю дaeтcя б eз п peдвapитeльнoгo oкpaш ивaния oб ъ eктa, втopичнaя (нaвeдeннaя) - вoзникaeт п ocлe oб paб oтки п peп apaтoв cп eциaльными лю минecциpyю щ ими кpacитeлями - ф лю opoxpoмaми. Л ю минecцeнтнaя микpocкoп ия п o cpaвнeнию c oб ычными мeтoдaми oб лaдaeт pядoм п peимyщ ecтв: вoзмoж нocтью иccлeдoвaть ж ивыe микpoopгaнизмы и oб нapyж ивaть иx виccлeдyeмoм мaтepиaлe внeб oльш иx кoнцeнтpaцияx вcлeдcтвиe выcoкoй cтeп eни кoнтpacтнocти. B лaб opaтopнoй п paктикe лю минecцeнтнaя микpocкoп ия ш иpoкo п pимeняeтcядлявыявлeнияи изyчeп иямнoгиx микpoopгaнизмoв. Эл eкт poннaя микpocкoпия. Пoзвoляeт нaб лю дaть oб ъ eкты, paзмepы кoтopыx лeж aт зa п peдeлaми paзpeш aю щ eй cп ocoб нocти cветoвoгo микpocкoп a (0,2 мкм). Э лeктpoнный микpocкoп п pимeняeтcя для изyчeния виpycoв, тoнкoгo cтpoeния paзличныx микpoopгaнизмoв, мaкpoмoлeкyляpныx cтpyктyp и дpyгиx cyб микpocкoп ичecкиx oб ъ eктoв. Cвeтoвыe лyчи втaкиx микpocкoп ax зaмeняeтп oтoк элeктpoнoв, имeю щ ий п pи oп peдeлeнныx ycкopeнияx длинy вoлны oкoлo 0,005 нм, т. e. п oчти в 100 000 paз мeньш e длины вoлны видимoгo cвeтa. Bыcoкaя paзpeш aю щ aя cп ocoб нocть элeктpoннoгo микpocкoп a, п paктичecки cocтaвляю щ aя 0,1-0,2 9 нм, п oзвoляeтп oлyчить oб щ ee п oлeзнoe yвeличeниe дo l0 кpaт. Hapядy c п pиб opaми «п pocвeчивaю щ eгo» тип a иcп oльзyю т cкaниpyю щ иe элeктpoнныe микpocкoп ы, oб ecп eчивaю щ иe peльeф нoe изoб paж eниe п oвepxнocти oб ъ eктa. Paзpeш aю щ aя cп ocoб нocть этих п риб оров значительно ниж е, чем y электронных микроскоп ов «п росвечиваю щ его» тип а. П р инципы микр о био л о г ическо й д иа г но ст ики инфекцио нны х бо л езней Л а бо р а mо р на я д uа г но сmuка б олезней человека основана на об нару ж ении в организме б ольного микроб а, вызвавш его б олезнь, микроб ных комп онентов (антигенов) или п роду ктовж изнедеятельности (токсинови др.) либ о изменений вп оказателях гомеостазап од действием этого микроб а(нап ример, ф орму лы крови, б иохимического составакрови и др.). М атериалом для исследования в медицинской микроб иологии слу ж атразличныеб иологическиеж идкости и дру гиематериалы, взятыеиз макроорганизма(кровь, гной, моча, мокрота, ликвор, кал, рвотные массы, п ромывные воды и т.п .), и ткань, п олу ченная методом б иоп сии отж ивого или аутоп сии от тру п а. В некоторых слу чаях на исследование б еру т об ъ екты окру ж аю щ ей среды: возду х, воду , п ищ евые п роду кты, смывы и т.п . М икроб иологическая диагностика вклю чает в себ я 5 методов: микроскоп ический, ку льту ральный, б иологический, серологический и аллергический. М uкр о ско nuческuй меmо д заклю чается в п риготовлении микроскоп ических п реп аратов(нативных или окраш енных п ростыми или слож ными сп особ ами) из исследу емого материалаи их микроскоп ии с п рименением различных видов микроскоп ической техники (световая,

9

темноп ольная, ф азово-контрастная, лю минесцентная, электроннаяи др.). В б актериологии микроскоп ический метод п олу чил название б актериоскоп ическоrо, ввиру сологии - виру соскоп ического. Кул ьmур а л ьны й меmо д заклю чается в п осеве исследу емого материала на иску сственные п итательные среды с целью выделения и идентиф икации чистой ку льту ры возб у дителя. Б uо л о г uческuй меmо д (эксп ериментальный, или б иоп роб а) заклю чается в зараж ении исследу емым материалом чу вствительных лаб ораторных ж ивотных. Е го исп ользу ю тдля выделениячистой ку льту ры возб у дителя, оп ределения тип а токсина и активности антимикроб ных химиотерап евтических п реп аратови т.д. Сер о л о г uческuй меmо д заклю чается в оп ределении титра сп ециф ических антителвсыворотке крови б ольного, реж е воб нару ж ении микроб ного антигенависследу емом материале. С этой целью исп ользу ю т реакции имму нитета. Ал л ер г о л о г uческuй меmо д заклю чается ввыявлении инф екционной аллергии (ГЗТ ) надиагностический микроб ный п реп арат-аллерген. С этой целью ставят кож ные аллергические п роб ы с соответствую щ ими аллергенами. О чевидно, что диагностическая ценность п еречисленных методов неравнозначна. В еду щ ий метод микроб иологической диагностики ку льту ральный, так как он п озволяет выделять и идентиф ицировать возб у дитель, т.е. оп ределять п ервоп ричину б олезни. О стальные методы менее инф ормативны, п оскольку с их п омощ ью оцениваю т изменения в организме, об у словленные наличием в нем микроб а. В торое место п о значимости занимает серологический метод, так как взаимодействие антигенаи антителахарактеризу ется высокой степ енью сп ециф ичности. И нф ормативность трех остальных методов невысокая, и их об ычно п рименяю ткак доп олнениек ку льту ральному и серологическому методам. О соб ое значение п риоб ретаю т методы эксnр есс-д uа г но сmuкu, которые п озволяю т п оставить микроб иологический диагноз в течение короткого п ромеж у тка времени (от нескольких мину т до нескольких часов) с моментадоставки исследу емого материалавлаб ораторию . К этим методам относятсяРИ Ф , И Ф А , РИ А , ПЦ Р, газоваяхроматограф ияи др. Т ем а 2. М И К РО СК О ПИ Ч Е СК И Е М Е Т О Д Ы И ССЛ Е Д О В А Н И Я М О РФ О Л О ГИ И М И К РО О РГА Н И ЗМ О В М о р фо л о г ия ба кт ер ий Бактерии имею т разнооб разну ю ф орму и довольно слож ну ю стру кту ру , оп ределяю щ у ю многооб разие их ф у нкциональной деятельности. Д ля б актерий характерны четыре основные ф ормы: сф ерическая (ш аровидная), цилиндрическая (п алочковидная), извитая и нитевидная. Размеры б актерий колеб лю тся от 0,1 до 10 мкм. В состав б актериальной клетки входят кап су ла, клеточная стенка,

10

цитоп лазматическая мемб рана и цитоп лазма, в которой содерж атся ну клеоид, риб осомы и вклю чения. Н екоторые б актерии снаб ж ены ж гу тиками и ворсинками. Ряд б актерий об разу ю т сп оры, которые расп олагаю тся терминально, су б терминально или центрально; п ревыш ая п оп еречный размер клетки, сп оры п ридаю тей веретенооб разну ю ф орму . Размеры б актерий измеряю тся в микрометрах (мкм). О дин микрометр равен 1000 нанометров(нм). В нанометрах выраж аю тразмеры отдельных комп онентовб актерий. 1. Ко кко вид ны еба кт ер ии (ко кки) - ш аровидныеклетки размером 0,51,0 мкм, которые взависимости от взаимного расп олож ения делятся на микрококки, дип лококки, стреп тококки, тетракокки, сарцины и стаф илококки. М икр о ко кки п редставляю тсоб ой отдельно расп олож енныеклетки. Дипл о ко кки, или п арные кокки, расп олагаю тся п арами (п невмококк, гонококк, менингококк), так как клетки п оследелениянерасходятся. Ст р епт о ко кки (от греч. strер tos - цеп очка) - клетки окру глой или вытяну той ф ормы, составляю щ ие цеп очку вследствие деления клеток в одной п лоскости и сохранениясвязи меж ду ними вместеделения. Са р цины (отлат. sа rсiпа - связка, тю к) расп олагаю тсяввидеп акетов из 8 и б олее кокков, так как они об разу ю тся п ри делении клетки втрех взаимно п ерп ендику лярных п лоскостях. Ст а фил о ко кки (отгреч. stа р hуlе- винограднаягроздь) п редставляю т соб ой кокки, расп олож енныеввидегрозди виноградаврезу льтатеделения вразных п лоскостях. 2. П а л о чко вид ны е ба кт ер ии (п алочки) различаю тся п о размерам, ф орме концовклетки и взаимному расп олож ению клеток. Д линаклеток варьиру ет от 1,0 до 8,0 мкм, толщ ина- от 0,5 до 2,0 мкм. Палочки могу т б ыть п равильной (киш ечная п алочка и др.) и неп равильной (коринеб актерии и др.) ф ормы, в том числе ветвящ иеся, нап ример у актиномицетов. К наиб олее мелким п алочковидным б актериям относятся риккетсии. Слегка изогну тые п алочки называю тся вибр ио на ми (холерный виб рион). Больш инство п алочковидных б актерий расп олагается б есп орядочно, так как п осле деления клетки расходятся. Е сли п осле деления клетки остаю тся связанными об щ ими ф рагментами клеточной стенки и не расходятся, то они расп олагаю тся п од у глом дру г к дру гу (коринеб актерии диф терии) или об разу ю т цеп очку (сиб иреязвенная б ацилла). 3. И звит ы е фо р мы - сп иралевидные б актерии, нап ример спир ил л ы , имею щ ие вид ш топ орооб разно извитых клеток. К п атогенным сп ириллам относится возб у дитель содоку (б олезнь у ку са крыс). К извитым такж е относятся камп илоб актеры, имею щ ие изгиб ы как у крылалетящ ей чайки; б лизки к ним и такиеб актерии, как сп ирохеты. Спир о х ет ы - тонкие, длинные, извитые (сп иралевидной ф ормы) б актерии, отличаю щ иеся от сп ирилл п одвиж ностью , об у словленной

11

сгиб ательными изменениями клеток. Под клеточной стенкой сп ирохет находится аксиальная нить (аксистиль), которая как б ы закру чивается вокру г п ротоп лазматического цилиндра сп ирохеты, п ридавая ей винтооб разну ю ф орму (п ервичные завитки сп ирохет). А ксиальная нить состоит из ф иб рилл- аналоговж гу тиковб актерий и п редставляет соб ой сократительный б елок ф лагеллин. Ф иб риллы у частвую т вп ередвиж ении сп ирохет, п ридаваяклеткам вращ ательное, сгиб ательноеи п осту п ательное движ ение. При этом сп ирохеты об разу ю тп етли, завитки, изгиб ы, которые названы вторичными завитками. Сп ирохеты п лохо восп ринимаю т красители. О б ычно их окраш иваю т п о методу Романовского-Гимзы или сереб рением. В ж ивом видеих исследу ю тс п омощ ью ф азово-контрастной или темноп ольной микроскоп ии. Сп ирохеты п редставлены 3 родами, п атогенными для человека: Тrер о пет а , Во rrеliа , Lер tо sр irа . Патогенными п редставителями рода Тrер о пет а являю тся Т.р а llidит - возб у дитель сиф илиса и Т.р еrtепие возб у дитель троп ической б олезни - ф рамб езии. И мею тся и сап роф иты об итатели п олости ртаи илаводоемов. В озб у дитель возвратного тиф а В.rесиrrепti является п атогенным п редставителем рода Во rrеliа . Патогенный п редставитель L.iпtеrrо gа пs вызывает леп тосп ироз. Патогенные леп тосп иры п оп адаю т ворганизм с водой или п ищ ей, п риводя к развитию кровоизлияний и ж елту хи. Сап роф итныеп редставители об итаю твводе. 4. Р иккет сии - мелкие грамотрицательные п алочковидные б актерии размером 0,35 - 2,0 мкм, об лигатныевну триклеточныеп аразиты. О б итаю т в членистоногих, которые являю тся их хозяевами или п ереносчиками. Свое название риккетсии п олу чили вчесть Х .Т .Риккетса- американского у ченого, вп ервые оп исавш его одного из возб у дителей (п ятнистая лихорадка Скалистых гор). Ф орма и размер риккетсии могу т меняться (клетки неп равильной ф ормы, нитевидные) в зависимости от у словий роста. Риккетсии, как и б ольш инство б актерий, размнож аю тся б инарным делением. Стру кту ра риккетсии не отличается от таковой грамотрицательных б актерий. Больш инство риккетсий не мож ет развиваться вне ж ивой клетки, их выращ иваю т в ж елточных меш ках ку риного эмб риона, п ереж иваю щ их ку льту рах клеток и тканях ж ивотного. Риккетсии об ладаю т независимым от клетки хозяина метаб олизмом, однако, возмож но, они п олу чаю т от клетки-хозяина макроэргические соединениядлясвоего размнож ения. В мазках и тканях их окраш иваю тп о методу Романовского-Гимзы или п о Здродовскому . У человекариккетсии вызываю т эп идемический сып ной тиф , К у -лихорадку , клещ евой риккетсиоз, лихорадкv цу цу гаму ш и, п ятнисту ю лихорадку Скалистых гор и др. 5. Х л а мид ии, или гальп ровии, относятся к об лигатным вну триклеточным кокковидным грамотрицательным б актериям. Геном хламидий содерж итв4 разаменьш егенетической инф ормации, чем геном киш ечной п алочки. Х ламидии размнож аю тся только вж ивых клетках: их

12

рассматриваю т как энергетических п аразитов. По-видимому , у хламидий отсу тствует система регенерации А Т Ф . В не клеток хламидии имею т сф ерическу ю ф орму (0,3 мкм), являясь элементарными тельцами. В ну три клеток они п ревращ аю тся в делящ иеся ретику лярные тельца, об разу я скоп ления (вклю чения). У человека хламидии вызываю т такие заб олевания, как трахому , орнитоз, п невмонии, п ораж ения у рогенитального трактаи др. 6. М ико пл а змы - мелкие б актерии, окру ж енные цитоп лазматической мемб раной и не имею щ ие клеточной стенки. О ни относятся к отделу тенерику тов, классу М о lliсиtеs («мягкокож ие» ). И з-за отсу тствия клеточной стенки микоп лазмы осмотически чу вствительны и имею т разнооб разну ю ф орму : кокковидну ю , нитевидну ю , колб овидну ю . Э ти ф ормы видны п ри ф азово-контрастной микроскоп ии чистых ку льту р микоп лазм. Н ап лотной п итательной средемикоп лазмы об разу ю тколонии, нап оминаю щ ие яичницу -глазу нью : неп розрачная центральная часть, п огру ж енная в среду , и п росвечиваю щ ая п ериф ерия в виде кру га. Патогенные микоп лазмы вызываю т хронические инф екции, нап ример, М усо р lа sт а р пеит о пiа евызываету человеказаб олевание, п ротекаю щ ееп о тип у острой респ ираторной инф екции. М икоп лазмы вызываю т заб олевания не только у ж ивотных, но и растений. Д остаточно ш ироко расп ространены и неп атогенныеп редставители. 7. Акт ино мицет ы - ветвящ иеся грамп олож ительные б актерии. А ктиномицеты, как и гриб ы, об разу ю т мицел ий - нитевидные п ереп летаю щ иеся клетки (гиф ы). О б щ у ю ф илогенетическу ю ветвь с актиномицетами об разу ю т так называемые но ка р д ио по д о бны е (нокардиоф ормные) актиномицеты соб ирательная гру п п а п алочковидных, неп равильной ф ормы б актерий. И х отдельные п редставители об разу ю т ветвящ иеся ф ормы. К ним относят б актерии родовСо rупеbа сtеriит , М усо bа сtеriит , Nо са rdiа и др. Н окардиоп одоб ные актиномицеты отличаю тся наличием в клеточной стенке сахаров араб инозы, галактозы, атакж е миколовых кислот и б ольш их количеств ж ирных кислот. М иколовые кислоты и лип иды клеточных стенок об у словливаю т кислотоу стойчивость б актерий, в частности п атогенных микоб актерий. Патогенные актиномицеты вызываю т актиномикоз, нокардии - нокардиоз, микоб актерии - ту б ерку лез, коринеб актерии диф терию . Сап роф итные ф ормы актиномицетов и нокардиеп одоб ных актиномицетовш ироко расп ространены вп очве, многие из них являю тся п роду центами антиб иотиков. За д а нuя д л я вы nо л ненuя л а бо р а т о р но й р а бо т ы 1. О п ределить ф орму клеток неизвестной б актериальной ку льту ры, исп ользу яп ростой метод окраски. 2. О п ределить ф орму клеток и отнош ениек окраскеп о Граму разных б актерий, содерж ащ ихсявисследу емой смеси б актериальных ку льту р.

13

3. О п ределить наличиесп ор, зерен волю тинаи кислотоу стойчивость исследу емой б актериальной ку льту ры, исп ользу я соответствую щ ие методы окраски. 4. Составить п ротокол и сделать заклю чение п о резу льтатам п роведенных исследований (таб л. 1). Т аблица 1. Х арактеристика ку льту ры п о морф ологическим и тинкториальным п ризнакам (ф ормап ротокола) Ф орма О краска Н аличие К ислотоПодвиж ность клеток п о у ст о йч ив о ст ь сп ор кап су л зерен Граму волю тина М ет о д ическиеука за ния Д ля изу чения морф ологии б актерий из ниx готовят нативные (п риж изненные) п реп араты и ф иксированныемазки, которыеокраш иваю т анилиновыми красителями. В основе окраски леж ат слож ные xимические и ф изико-xимические реакции. Ц итоп лазма б актерий, особ енно в ф иксированныx мазкаx, об ладает сродством к основным красителям, вследствие чего окраску п роводят метиленовым синим, кристаллическим ф иолетовым, везу вином и др. Д ля выявления различныx стру кту р б актериальной клетки п рименяю тнейтральныеи кислыекрасители. Различаю т п ростые и слож ные методы окраски. Простые заклю чаю тся вокраскеп реп аратаодним красителем; слож ныеметоды (п о Граму , Ц илю -Н ильсену и др.) вклю чаю т п оследовательное исп ользование несколькиx красителей и имею т диф ф еренциально-диагностическое значение. О тнош ение микроорганизмов к красителям расцениваю т как тинкториальные свойства. Су щ ествую т сп ециальные методы окраски, которые исп ользу ю т для выявления ж гу тиков, клеточной стенки, ну клеоидаи разныx цитоп лазматическиx вклю чений. П р иг о т о вл ениепр епа р а т о в д л я микр о ско пическо г о иссл ед о ва ния Д ля п риготовления п реп арата исследу емый материал б еру т из п роб ирки, колб ы или чаш ки Петри б актериологический п етлей или стерильной п ип еткой. В некоторыx слу чаяx исп ользу ю т для этой цели п реп аровальныеиглы. П р иг о т о вл ение пр епа р а т о в д л я изучения микр о р г а низмо в в на т ивно м вид е М ет о д « висячей» ка пл и. Преп арат готовят нап окровном стекле, в центр которого наносят одну кап лю б актериальной ку льту ры, затем п редметно стекло с лу нкой, края которой п редварительно смазываю т вазелином, п риж имаю т к п окровному стеклу так, чтоб ы кап ля находилась вцентрелу нки. Быстрым движ ением п ереворачиваю тп реп аратп окровным стеклом вверх. В п равильно п риготовленном п реп арате кап ля долж на своб одно висеть над лу нкой, некасаясь ееднаили края. Д лямикроскоп ии вначалеисп ользу ю тмалый су xой об ъ ектив8X, п од у величением которого наxодят край кап ли, азатем у станавливаю т об ъ ектив40X и исследу ю т п реп арат.

14

М ет о д « р а зд а вл енно й» ка пл и. Н а п оверхность об езж иренного п редметного стекла наносят кап лю исследу емого материала или су сп еп зию б актерий и п окрываю т ее п окровным стеклом. К ап ля долж на б ыть неб ольш ой, не выходящ ей за край п окровного стекла. М икроскоп иру ю тп реп аратс об ъ ективом 40X. П р иж изненна я (вит а л ьна я) о кр а ска . В звесь микроорганизмоввносят вкап лю 0,001% раствораметиленовогосинегоили нейтральногокрасного. Затем готовят п реп арат «висячая» или «раздавленная» кап ля и микроскоп иру ю т. После микроскоп ии п реп араты «раздавленной» или «висячей» кап ли оп у скаю твдезинф ициру ю щ ий раствор. П р иг о т о вл ениефиксир о ва нны x пр епа р а т о в-ма зко в Д ля п риготовления п реп аратанаоб езж иренное п редметное стекло наносят кап лю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в котору ю п етлей вносят исследу емый материали расп ределяю т его таким об разом, чтоб ы п олу чить тонкий и равномерный мазок. При таком расп ределении материала в мазке п ри микроскоп ии мож но у видеть изолированные б актериальные клетки. Е сли исследу емый материал содерж ится вж идкой среде, то его неп осредственно наносят п етлей на п редметное стекло и готовят мазок. М азки высу ш иваю т навозду хе или в стру етеп лого возду ханад п ламенем горелки, недаваякап лезакип ать. Д ля ф иксации мазкап редметное стекло (мазком вверх) медленно п роводят 3 раза через п ламя горелки. М икроорганизмы п ри ф иксации п огиб аю т, п лотно п рикреп ляясь к п оверхности стекла, и несмываю тсяп ри дальнейш ей об раб отке. Прогретыемикроорганизмы б олеевосп риимчивы к красителю , но б олее длительное нагревание мож ет вызвать деф ормации клеточных стру кту р. М азки крови, мазки-отп ечатки органови тканей и в некоторых слу чаях мазки из ку льту р микроорганизмов ф иксиру ю т п огру ж ением на 5 - 20 мин. в метиловый или этиловый сп ирт, смесь Н икиф орова, су лемовый сп иртили дру гиеф иксиру ю щ иеж идкости. М ет о д ы о кр а ски ма зко в П р о ст о й мет о д . Ф иксированный мазок окрасить каким-либ о одним красителем, нап ример ф у ксином водным (1 - 2 мин.) или метиленовым синим (3 - 5 мин.), п ромыть водой, высу ш ить и микроскоп ировать. Сл о ж ны е мет о д ы . Последовательно нанести на п реп арат оп ределенныекрасители, различаю щ иесяп о химическому составу и цвету , п ротравы, сп ирты, кислоту и др. Э то п озволяет выявить оп ределенные стру кту ры клеток и диф ф еренцировать одни виды микроорганизмовот дру гих. О кр а ска по мет о д у Г р а ма 1. Н а ф иксированный мазок нанести карб олово-сп иртовой раствор генцианового ф иолетовогочерез п олоску ф ильтровальной б у маги. Ч ерез 12 мин. ееснять, акраситель слить. 2. Н анести раствор Л ю голяна1-2 мин. 3. О б есцветить этиловым сп иртом втечение 30-60 сек. до п рекращ ения отхож денияф иолетовыx стру ек красителя.

15

4. Промыть водой. 5. Д окрасить водным раствором ф у ксина в течение 1-2 мин., п ромыть водой, высу ш ить и микроскоп ировать. Грамп олож ительные б актерии окраш иваю тся в темно-ф иолетовый цвет, грамотрицательные- вкрасный. О тнош ение б актерий к окраске п о Граму оп ределяется их сп особ ностью у держ ивать об разовавш ийся вп роцессе окраски комп лекс генцианового-ф иолетового с йодом. Э то зависит от различий в химическом составе и п роницаемости клеточной стенки грамп олож ительныx и грамотрицательных б актерий. У грамп олож ительных б актерий п еп тидогликан многослоен, с ним связаны тейхоевые кислоты. У грамотрицательных б актерий п еп тидогликан однослоен, имеется нару ж ная мемб рана, в состав которой входят ф осф олип иды, лип оп ротеиды, б елки и слож ный лип оп олисахарид (Л ПС). В сю нару ж ну ю мемб рану п ронизываю т б елки-п орины, об есп ечиваю щ ие диф ф у зию различных соединений. Т аким об разом, у грамп олож ительных б актерий создаю тся оп тимальные у словия для п рочной ф иксации красителяи резистентности к об есцвечиванию сп иртом. О краскап о Граму имеет важ ное диф ф еренциально-диагностическое значениеи ш ироко исп ользу етсявмикроб иологии. К грамп олож ительным б актериям относятся стаф илококки, стреп тококки, коринеб актерии диф терии, микоб актерии ту б ерку леза и др., к грамотрицательным гонококки, менингококки, киш ечная п алочка и др. Н екоторые виды б актерий могу т окраш иваться п о Граму вариаб ельно в зависимости от возраста, особ енностей ку льтивирования и дру гих ф акторов, воздействую щ их настру кту ру клеточной стенки. О сновная ош иб ка, доп у скаемая п ри окраске п о Граму , состоит в «п ереоб есцвечивании» мазка этиловым сп иртом. Грамп олож ительные б актерии п ри этом могу т у трачивать п ервоначальну ю окраску генциановым ф иолетовым и п риоб ретать красный цвет (характерный для грамотрицательных б актерий) врезу льтате п оследу ю щ ей докраски мазка ф у ксином. Грамотрицательные б актерии всвою очередь могу т сохранять сине-ф иолетовый цвет генцианового ф иолетового. Д ля п равильной окраски следу етстрого соб лю дать технику об есцвечивания. О кр а ска кисл о т о уст о йчивы х ба кт ер ий по мет о д у Ц ил я - Н ил ьсена 1. Н аф иксированный мазок нанести карб оловый раствор ф у ксиначерез п олоску ф ильтровальной б у маги и п одогреть до п оявленияп ароввтечение 3-5 мин. 2. Снять б у магу , п ромыть мазок водой. 3. Н анести 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси сп иртас хлороводородной кислотой на1 - 2 мин. дляоб есцвечивания. 4. Промыть водой. 5. Д окрасить мазок водным раствором метиленового синего втечение3 - 5 мин. 6. Промыть водой, высу ш ить и микроскоп ировать.

16

К ислотоу стойчивость об у словленаналичием вклеточной стенке и цитоп лазме б актерий п овыш енного количества лип идов, воска и оксикислот, вчастности миколовой кислоты. Раствор карб оловой кислоты разрыхляет клеточну ю стенку и тем самым п овыш ает ее тинкториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в п роцессе окраски у силиваю т реакцию взаимодействия красителя с б актериальными клетками, которыеокраш иваю тсяп ри этом вкрасный цвет. При об раб отке п реп арата серной кислотой некислотоу стойчивые б актерии об есцвечиваю тся и окраш иваю тся метиленовым синим вголу б ой цвет, а кислотоу стойчивыеб актерии остаю тсяокраш енными ф у ксином вкрасный цвет. О кр а ска зер ен во л ют ина по мет о д у Н ейссер а 1. Н аф иксированный мазок нанести ацетатсиньки Н ейссерана2 - 3 мин. 2. Д об авить раствор Л ю голяна10 – 30 сек. 3. Промыть п реп аратводой. 4. М азок докрасить водным раствором везу винаили хрезоидинавтечение 0,5 - l мин. 5. Промыть п реп аратводой, высу ш ить и микроскоп ировать. Зерна волю тина п редставляю т соб ой соединения, имею щ ие в отличие от цитоп лазмы щ елочну ю реакцию , и п оэтому изб ирательно восп ринимаю т ацетат синьки, окраш иваясь в темно-синий цвет. Ц итоп лазма клетки, об ладаю щ ая кислой реакцией, восп ринимает щ елочной краситель везу вин и окраш иваетсявж елтый цвет. О бна р уж ениека псул по мет о д у Б ур р и-Г инса 1. Смеш ать кап лю взвеси микроб ных клеток с кап лей ту ш и и п ри п омощ и стекласо ш лиф овальным краем сделать мазок таким ж еоб разом, как мазок из крови, высу ш ить и ф иксировать. 2. Н амазок нанести водный раствор ф у ксинана1 - 2 мин. 3. Промыть водой, высу ш ить навозду хе и микроскоп ировать. Бактерии окраш иваю тся в красный цвет, а неокраш енные кап су лы контрастно выделяю тсяначерно-розовом ф оне. О кр а ска спо р микр о бо в Плотная об олочкасп ор, неп роницаемая для воды, окраш ивается с б ольш им тру дом, п оэтому п ри об ычных методах окраски сп оры имею твид неокраш енных п у стот вну три клетки. Д ля окраски сп ор п ользу ю тся сп ециальными методами с п рименением п ротрав(кислоты или щ елочи). Протравы разрыхляю т об олочку сп оры, об легчая п роникновение в нее красителя. О красивш иеся сп оры об ладаю т кислотоу стойчивостью в отличие от вегетативного теламикроб ной клетки, об есцвечиваю щ егося п од действием кислоты. Поэтому п ринцип окраски сп ор и кислотоу стойчивых б актерий одинаков: п реп арат окраш иваю т основным красителем, затем об есцвечиваю ткислотой и докраш иваю тдоп олнительно вкакой-ниб у дь контрастный цвет.

17

О кр а ска спо р по мет о д у О ж ешки 1. Н анеф иксированный мазок нанести 0,5 % раствор соляной кислоты (Н Сl) и п одогреть нап ламени втечение2 - 3 мин. 2. К ислоту слить, п реп арат п ромыть водой, п росу ш ить и ф иксировать над п ламенем. Затем окрасить п о методу Ц иля-Н ильсена. Сп оры б актерий п риоб ретаю ткрасный цвет, авегетативныеф ормы – синий. О кр а ска спо р по мет о д у Ш еффер а и Ф ул т о на 1. Н аф иксированный мазок нанести 5 % раствор малахитового зеленого и 3 - 4 разанагреть до п оявленияп аров. 2. Промыть водой. 3. Д окрасить 0,5 % саф ранинавтечение30 сек. 4. Промыть водой. Сп оры б актерий окраш иваю тсявзеленый цвет, вегетативныеклетки – вкрасный. Т ем а 3. М И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Е М Е Т О Д Ы И ССЛ Е Д О В А Н И Я ПИ Т А Т Е Л ЬН Ы Е СРЕ Д Ы Питательной средой вмикроб иологии называю тсреды, содерж ащ ие различные соединения слож ного или п ростого состава, которые п рименяю тся для размнож ения б актерий или дру гих микроорганизмовв лаб ораторных или п ромыш ленных у словиях. Л ю б аяп итательнаясредадолж наотвечать следу ю щ им треб ованиям: содерж ать все необ ходимые для размнож ения микроорганизмоввещ ества в легкоу свояемой ф орме, иметь оп тимальные влаж ность, вязкость, рН , б ыть изотоничной и п о возмож ности п розрачной. К аж ду ю п итательну ю среду стерилизу ю топ ределенным сп особ ом взависимости отеесостава. Среды различаю тся: по ко нсист енции - п лотные, п олу ж идкиеи ж идкие; О сновой п лотной п итательной среды являю тся гелеоб разные вещ ества: агар-агар (2 - 3%), ж елатин (10 - 15%), которые доб авляю т к ж идким п итательным средам, нап ример, к мясоп еп тонному б у льону (М ПБ), п олу чаятаким об разом мясоп еп тонный агар (М ПА ). по со ст а ву - п ростые, слож ные; Простые п итательные среды п рименяю т для выращ ивания многих б актерий. Э то гидролизаты мясных, рыб ных п роду ктов, крови ж ивотных или казеина, из которых готовят ж идку ю п итательну ю среду – п итательный б у льон, и п лотну ю – п итательный агар. Слож ные п итательные среды вклю чаю т доп олнительные комп оненты - сыворотку крови (сывороточный агар), кровь (кровяной агар), сахар (сахарный б у льон). Н ап ример, на кровяном агаре б актерии, п роду циру ю щ ие гемолизин, об разу ю тколонии с зоной гемолиза. по ист о чнику – естественные, синтетические (иску сственные) и п олу синтетические;

18

по на зна чению – об щ егоназначения(у ниверсальные) и сп ециальные. Ср ед ы о бщ ег о на зна чения исп ользу ю т для выращ ивания многих п атогенных микроб ови п рименяю т вкачестве основы для п риготовления сп ециальных сред, доб авляя к ним кровь, сахара, молоко, сыворотку и дру гиеингредиенты, необ ходимыедляростатогоили иноговидамикроб а. К ним относятся мясоп еп тонные среды: агар, б у льон, п итательный ж елатин. Г р уппа специа л ьны х ср ед вклю чает: элективные, ингиб иторные, диф ф еренциально-диагностическиеп итательныесреды. Эл ект ивны е (избир а т ел ьны е) и инг ибит о р ны е ср ед ы содерж ат в своем составе вещ ества, об есп ечиваю щ ие наиб олее б лагоп риятные у словия для выращ ивания одного или нескольких видовмикроб ов. При п осевенаних материала, содерж ащ егосмесь различных микроорганизмов, раньш евсего б у детп роявлятьсяросттого вида, длякоторого даннаясреда б у детэлективной. При создании элективных п итательных сред исходятиз б иологических особ енностей, которые отличаю т данные микроорганизмы от б ольш инства дру гих. Н ап ример, изб ирательный рост стаф илококков наб лю дается п ри п овыш енной концентрации хлориданатрия, холерного виб риона- вщ елочной среде и т. д. И нгиб иторные п итательные среды наш ли ш ирокое п рименение п ри б актериологическом исследовании материалов, содерж ащ их об ильну ю и разнооб разну ю микроф лору , нап ример, п ри исследовании об ъ ектов внеш ней среды (п очвы, воды, возду ха), п ри исследовании кала на содерж ание в нем возб у дителей киш ечных инф екций. Приготовление ингиб иторных сред основано на п рименении ж изненно необ ходимых вещ еств, ассимилиру емых только выращ иваемым видом микроорганизма, или вещ еств, изб ирательно п одавляю щ их развитиесоп у тствую щ ей микроф лоры. Диффер енциа л ьно -д иа г но ст ические пит а т ел ьны е ср ед ы п рименяю тся для разграничения отдельных видов (или гру п п ) микроорганизмов. Принцип п остроения этих сред основан на том, что разные виды б актерий различаю тся меж ду соб ой п о б иохимической активности вследствиенеодинаковогонаб ораф ерментов. Ростб актерий на диф ф еренциально-диагностических средах соп ровож дается изменением цвета колоний, п роисходящ им п од действием ф ерментов микроб ной клетки. По своему назначению диф ф еренциально-диагностические п итательныесреды мож но разделить наследу ю щ иегру п п ы: 1. Среды для выявления п ротеолитической сп особ ности микроб ов, содерж ащ ие всвоем составе б елковые вещ ества: кровь, молоко, ж елатин, сверну ту ю кровяну ю сыворотку и т. д. 2. Среды с сахарами, многоатомными сп иртами для об нару ж ения соответствую щ их ф ерментов, расщ еп ляю щ их эти сахараи сп ирты. 3. Среды для оп ределения реду циру ю щ ей сп особ ности микроб ов, содерж ащ ие в своем составе химические вещ ества, изменяю щ иеся в окраске б лагодаря окислительному или восстановительному действию

19

б актерий. Т акими красками являю тся: нейтральная красная, метиленовая синь, лакму совая настойка, кислый ф у ксин, б ромтимолб лау, водная голу б аяи розоловаякислота(В Р). 4. Среды с индиф ф ерентными химическими вещ ествами, которые слу ж ат источником п итаниядляодних видовмикроб ови неу сваиваю тсядру гими видами. Н ап ример, среды с солями лимонной кислоты для выявления разновидности киш ечной п алочки, сп особ ной у сваивать у глерод из молеку ллимонной кислоты. Д иф ф еренциально-диагностические среды ш ироко исп ользу ю тся в лаб ораторных микроб иологических диагностических исследованиях для диф ф еренциации и идентиф икации б актерий. ПРИ ГО Т О В Л Е Н И Е ПИ Т А Т Е Л ЬН Ы Х СРЕ Д О сно вны еср ед ы П ит а т ел ьны й бул ьо н. В ып у скается всу хом виде и содерж ит, г/л, гидролизат кильки - 10,05; натрия хлорид - 4,95. Н авеску п орош ка, у казанну ю наэтикетке(нап ример, 15 г), тщ ательно размеш иваю твколб ес 1 лдистиллированной воды. К ип ятят 1 - 2 мин., не доп у ская п ригорания, ф ильтру ю т через б у маж ный ф ильтр и разливаю т вп роб ирки или колб ы. Стерилизу ю тп ри темп ерату ре120 °С втечение20 мин. П ит а т ел ьны й а г а р . Состав, г/л: ф ерментативный гидролизат кормовых дрож ж ей - 12,0; агар - 12,5; натрия хлорид - 5,5; рН 7,34. 30 г п орош каразмеш иваю т в1 лдистиллированной воды, кип ятят до п олного расп лавления агара (2 - 3 мин.), ф ильтру ю т через ватный ф ильтр и стерилизу ю т п ри темп ерату ре 120 °С втечение 20 мин. Затем разливаю т п итательный агар в стерильные чаш ки Петри. Д ля п риготовления скош енного п итательного агарап роб ирки с разлитым агаром оставляю т застывать внаклонном п олож ении настоле. Кр о вяны е, сы во р о т о чны еи а сцит ическиеср ед ы . К расп лавленному и осту ж енному до45 - 50 °С п итательному агару асеп тически доб авляю т510 % деф иб ринированной крови или такое ж е количество сыворотки крови, или 25 % асцитической ж идкости, хорош о п еремеш иваю т и сразу ж еразливаю твчаш ки Петри, п роб ирки или дру гу ю лаб ораторну ю п осу ду . Д ля п риготовления ж идкой среды такие ж е количествасыворотки или асцитической ж идкости доб авляю тк п итательному б у льону . Ср ед ы с уг л ево д а ми. К п итательному агару или б у льону доб авляю т 0,5 - 1 % глю козы или дру гого у глевода. Стерилизацию п роизводят теку чим п аром или п аром п од давлением 0,5 атм. Эл ект ивны епит а т ел ьны еср ед ы П епт о нна я во д а 1 %, рН 8,0. И зб ирательнадляхолерного виб риона, который размнож ается б ыстро, оп ереж ая рост дру гих микроорганизмов. Щ елочная реакция среды не п реп ятствует росту холерных виб рионов, тормозитростдру гих микроорганизмов. Щ ел о чно й а г а р (п лотная среда): п итательный агар, рН 7,8, аналогично п редыду щ ей средеэлективен дляхолерного виб риона.

20

Ср ед а Л еффл ер а . Смесь 1 части лош адиной сыворотки и 3 частей сахарного б у льона. Среда элективна для коринеб актерий диф терии. Быстрый рост этих микроорганизмов(4 - 6 ч) об есп ечивает элективность среды. Ж ел т о чно -со л ево й а га р (Ж СА). Содерж ит п овыш енные концентрации хлорида натрия (8 - 10 %), которые не п реп ятствую т размнож ению стаф илококков, что об есп ечивает элективность этой среды для данных микроорганизмов. В качестве основы исп ользу ю т солевой агар. По п роп иси, у казанной наэтикетке, готовят 1,8 - 2 % агар, рН 7,2 7,4. К расп лавленному и охлаж денному до 40 - 50 °С агару , соб лю дая п равила асеп тики, доб авляю т 20 % ж елточной взвеси (асеп тически извлеченной из яйца ж елток взб алтываю т с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия). Смеш иваю т тщ ательно агар с ж елточной взвесью , разливаю т п о 20 мл в чаш ки Петри. Среда такж е п озволяет диф ф еренцировать стаф илококки, п роду циру ю щ ие лецитиназу , от стаф илококков, не выделяю щ их этот ф ермент, п о об разованию зон п ому тнения с п ерламу тровым оттенком вокру г колоний лецитиназоп олож ительных видов(ф ермент расщ еп ляет лецитин ку риного ж елтка). Диффер енциа л ьно -д иа г но ст ическиеср ед ы Ср ед а Р ессел я. Применяется п ри изу чении б иохимических свойств энтероб актерий (ш игелл, сальмонелл). Содерж ит п итательный агар, лактозу , глю козу и индикатор б ромтимоловый синий. Ц вет п риготовленнои среды травянисто-зеленый. Ср ед а Энд о . В ып у скается в виде п орош ка, который состоит из высу ш енного п итательного агара, содерж ит 1 % лактозу и индикатор основной ф у ксин, об есцвеченный су льф итом натрия. Свеж еп риготовленнаясредаб есцветнаили имеетб ледно-розовую окраску . При росте лактозоп олож ительных б актерий их колонии окраш иваю тся в темно-красный цвет с металлическим б леском; лактозоотрицательные б актерии об разу ю тб есцветныеколонии. Ср ед а П л о скир ева (ба кт о а г а р Ж ). В ып у скается в су хом виде и содерж ит п итательный агар с лактозой, б риллиантовым зеленым, солями ж елчных кислот, минеральными солями и индикатором (нейтральный красный). Э та среда является не только диф ф еренциальнодиагностической, но и селективной, так как п одавляет рост многих микроорганизмов(киш ечная п алочкаи др.) и сп особ ствуетлу чш ему росту некоторых п атогенных б актерий (возб у дители б рю ш ного тиф а, п аратиф ов, дизентерий). Л актозоотрицательные б актерии об разу ю т на этой среде б есцветныеколонии, алактозоп олож ительные- красные. Висмут -сул ьфит а г а р . Среда п редназначена для выделения сальмонелл из инф ицированного материала. В ып у скается всу хом виде; содерж иттрип тический гидролизаткильки, глю козу , неорганическиесоли, б риллиантовый зеленый, агар. Д иф ф еренциру ю щ ие свойства среды

21

основаны насп особ ности микроорганизмовп роду цировать Н 2S, который всту п ает вреакцию с лимоннокислым висму том и об разу ет соединение черного цвета - сернистый висму т. Среда резко у гнетает рост соп у тствую щ ей микроф лоры за счет ингиб иру ю щ его действия б риллиантового зеленого и су льф итанатрия. Подготовленные к у п отреб лению п итательные среды п роверяю т на стерильность. Д ля этого их ставят в термостат п ри 37 °С. Среды, п ростерилизованные в автоклаве, выдерж иваю т в термостате 1 су тки, п ростерилизованные теку чим п аром - 3 су ток. Проросш ие среды б раку ю тся и отп равляю тся вмойку , аостальные б еру тся враб оту или оставляю тся нахранение. Н екоторые п итательные среды мож но готовить вп рок на2 - 3 недели. Создавать зап асы наб олее п родолж ительное время нецелесооб разно, так как врезу льтатедолгогохранениясреды высыхаю ти изменяю тсвойства. Х ранить п итательные среды лу чш е всего вхолодильниках, однако хранениеих возмож но и п ри комнатной темп ерату ревш каф ах с секциями. В каж дое отделение со средой вкладываю т об язательно листок б у маги с названием п итательной среды и даты ее п риготовления. Помещ ение, в котором хранятся среды, долж но б ыть п рохладное, защ ищ енное от света, су хое. Поверх п роб ок наф лаконы и колб ы надеваю т б у маж ные колп ачки или п араф иновые«ш ап очки» . За д а нuед л я вы по л ненuя л а бо р а т о р но й р а бо т ы О своить технику п осевап етлей натвердые и ж идкие п итательные среды. М ет о д ическиеука за ния Т Е Х Н И КА ПО СЕ В О В И ПЕ РЕ СЕ В О В К У Л ЬТ У Р М И К РО О РГА Н И ЗМ О В У ниверсальным инстру ментом для п роизводствап осевовявляется б актериальная п етля. К роме нее, для п осева у колом п рименяю т сп ециальну ю б актериальну ю иглу , а для п осевов на чаш ках Петри металлические или стеклянные ш п атели. Д ля п осевовж идких материалов наряду с п етлей исп ользу ю тп астеровски и граду ированныеп ип етки. П о сев в ча шки П ет р и с пл о т но й пит а т ел ьно й ср ед о й П о сев пет л ей: п осевной материал втираю т п етлей в п оверхность среды у края чаш ки, изб ыток снимаю т, п роколов п етлей агар, а оставш ийсяматериалрассеиваю тп араллельными ш трихами п остерильной п оверхности среды. Э то наиб олеерасп ространенный сп особ п осева. П о сев шпа т ел ем: материал наносят нап оверхность среды п етлей или п ип еткой, а затем стеклянным или металлическим ш п ателем тщ ательно втираю т его п о всей п оверхности агара. При этом левой ру кой п ридерж иваю г слегка п риоткрыту ю крыш ку и одновременно вращ аю т чаш ку . После п осева металлический ш п атель п рокаливаю т в п ламени горелки, астеклянный п омещ аю твдезинф ициру ю щ ий раствор.

22

П о сев т а мпо но м: тамп он с исследу емым материалом вносятвчаш ку и кру говыми движ ениями втираю т его содерж имое вп оверхность среды, одновременно вращ аятамп он и чаш ку . П о сев на сект о р ы : дно чаш ки расчерчиваю т на секторы, п осев п роизводят зигзагооб разными движ ениями от края чаш ки к центру так, чтоб ы ш трихи с одного неп ереходили надру гой. П о сев г а зо но м: 1 мл исследу емого материала (ж идкая б у льонная ку льту ра или взвесь микроб ов в ф изиологическом растворе) наносят п ип еткой нап оверхность среды и тщ ательно расп ределяю т ж идкость п о всей ее п оверхности. И зб ыток материалаотсасываю тп ип еткой и вместе с ней п омещ аю т в дезинф ициру ю щ ий раствор. После п осева чаш ки закрываю ти п ереворачиваю тих вверх дном. Н адп иси начаш ках делаю тсо стороны дна, анап роб ирках - вверхней части. П о сев иссл ед уемо г о ма т ер иа л а в т о л щ у пл о т но й пит а т ел ьно й ср ед ы . М атериал, засеваемый втолщ у п итательной среды, долж ен б ыть в ж идком состоянии. Д ля этого из материала, п одлеж ащ его п осеву, готовят взвесь (в стерильной водоп роводной воде или в ф изиологическом растворе), наб ираю теевп ип етку воб ъ еме0,1; 0,5 или 1 млвзависимости от п редп олагаемого микроб ного загрязнения и выливаю т в п у сту ю стерильну ю чаш ку Петри. В след заэтим чаш ки заливаю т15 - 20 млМ ПА , расп лавленным и осту ж енным до 40 – 45 °С (п ри такой темп ерату ре, если п рилож ить п роб ирку со средой к щ еке, онанедолж навызывать ощ у щ ения ож ога). Д ля равномерного расп ределения исследу емого материала в п итательной средечаш ку с содерж имым б еру твру ки и слегкап окачиваю т вразныестороны. П о сев на пл о т ны еи ж ид киепит а т ел ьны й ср ед ы в пр о бир ка х При п осеве иноку лята из п роб ирки в п роб ирку об е п роб ирки (с п осевным материалом и со средой) держ ат слегканаклонно влевой ру ке меж ду б ольш им и у казателыным п альцами так, чтоб ы краяп роб ирок б ыли наодном у ровне. Бактериальну ю п етлю держ ат как п исчее п еро. Петлю вертикально п рокаливаю т в п ламени горелки. Проб ки из п роб ирок вынимаю т п равой ру кой, заж имая их меж ду мизинцем и ладонью . В ыну в п роб ки, края п роб ирок об ж игаю твп ламени горелок. Прокаленну ю п етлю вводят через п ламя горелки в п роб ирку с п осевным материалом, охлаж даю т и неб ольш ое количество п осевного материала осторож но п ереносятвп роб ирку со средой. 1. При п осевенаж идку ю среду п етлю слегкап огру ж аю твж идкость и растираю т п осевной материалнастенке п роб ирки, п осле чего смываю т его средой. Д ля п осева ж идкого материала мож но исп ользовать стерильныеп ип етки (п астеровскиеили граду ированные). 2. При п осеве на скош енный агар материал наносят ш трихооб разными движ ениями снизу вверх, начиная с конденсационной воды, аесли агар или ж елатин разлит вп роб ирки столб иком, то п осев п роизводяту колом, п рокалываяп етлей с п осевным материалом столб ик до

23

дна. После п осевап етлю извлекаю т из п роб ирки, п роб ирку закрываю т, п редварительноп роведяеекраячерез п ламягорелки. Петлю п рокаливаю т. Посевы инку б иру ю тсявтермостатеп ри 37 °С втечение18 - 24 ч. За это время из отдельных микроб ных клеток ф ормиру ю тся изолированные колонии. Т ем а 4. М Е Т О Д Ы В Ы Д Е Л Е Н И Я , К У Л ЬТ И В И РО В А Н И Я И Д Е Н Т И Ф И К А Ц И И Ч И СТ Ы Х К У Л ЬТ У Р БА К Т Е РИ Й

И

Т ема4.1. ПО Л У Ч Е Н И Е Ч И СТ Ы Х К У Л ЬТ У Р БА К Т Е РИ Й Ч истой ку льту рой называю т п оп у ляцию микроорганизмов, п ринадлеж ащ их к одному виду . Примером чистой ку льту ры мож ет слу ж ить колония, состоящ аяиз микроб ных клеток одного и того ж евида. Полу чение чистых ку льту р необ ходимо для изу чения морф ологических, ку льту ральных и б иологических свойстввыделенного микроорганизмав целях оп ределения его видовой п ринадлеж ности. Д ля выделения чистых ку льту р п ользу ю тся методом рассева в глу б ине п итательной среды и методом п осеванап оверхность п итательной среды (метод Д ригальского). П о л учение чист о й кул ьт ур ы мет о д о м р а ссева в г л убине ср ед ы . Содерж имое 3 - 5 п роб ирок, в которых находится п о 10 - 15 мл п итательного ж елатина или М ПА , расп лавляю т в водяной б ане. Расп лавленну ю среду осту ж аю т до 43 - 45 °С и ставят втеп лу ю воду , чтоб ы п реду п редить ее засту дневание. В одну из п роб ирок вносят исследу емый материал. Затем п ип еткой или п етлей содерж имоеиз п ервой п роб ирки п ереносят во втору ю , из второй - в третью . Д ля лу чш его п еремеш ивания материаласо средой засеянные п роб ирки, заж авмеж ду ладонями, вращ аю т несколько раз в одну и затем в дру гу ю сторону . Приготовленныетаким об разом разведениямикроорганизмоввыливаю тиз п роб ирок в чаш ки Петри, об означенные номерами, соответствую щ ими номерам п роб ирок. Послезасту дневаниясреды с исследу емым материалом чаш ки п омещ аю т в термостат. К оличество колоний в чаш ках с п итательной средой у меньш аетсяп о мереразведенияматериала. Вы д ел ение чист о й кул ьт ур ы по спо со бу Др иг а л ьско г о . Расп лавленну ю п итательну ю среду с толщ иной слоя не менее 0,5 см разливаю т в3 чаш ки Петри. Застывш у ю среду об язательно п одсу ш иваю т. В п ервую чаш ку вносят неб ольш ое количество исследу емого материалаи ш п ателем Д ригальского или ш п ателем, сделанным из п астеровской п ип етки, втираю т его в п оверхность п итательной среды. Д алее, не п рож игаяи ненаб ираяновогоматериала, ш п атель п ереносятвовтору ю и в третью чаш ки, втираявп оверхность п итательных сред оставш ийсянанем материал. М етод рассева п о п оверхности, п редлож енный Д ригальским, является наиб олее у п отреб ительным для п олу чения чистой ку льту ры микроорганизмов. В место ш п ателя мож но п ользоваться п етлей. М атериал

24

нап итательной средерасп ределяю тгу стыми п араллельными ш трихами п о всей чаш ке водном нап равлении. Затем, п оверну вчаш ку на180°, той ж е п етлей п роводят ш трихи в нап равлении, п ерп ендику лярном п ервым ш трихам. В резу льтате нап оверхности п итательной среды вычерчивается гу стаясетка. При таком сп особ еп осеваматериал, содерж ащ ийсянап етле, расходу ется п остеп енно, и п о линиям сетки, нанесенным вконце п осева, вырастаю тизолированныеколонии микроб ов. В ыделение чистой ку льту ры методом рассева в глу б ине и на п оверхности п итательной среды основано намеханическом разъ единении микроорганизмов, находящ ихся в исследу емом материале, с целью п олу чения изолированных колоний на п лотной п итательной среде. К оличество микроорганизмов, содерж ащ ееся в исследу емом материале, п реду гадать заранее тру дно, п оэтому для п осевап ользу ю тся не одной, а двумя или тремя чаш ками. При очень б ольш ой б актериальной загрязненности материала рост микроб ов на п ервой чаш ке б ывает настолько гу стым, что п олу чить материал из отдельной колонии для выделения чистой ку льту ры невозмож но. Т огда для выб ора изолированных колоний п ользу ю тся второй чаш кой. Е сли ж е и наней колонии расп олож ены б лизко дру г к дру гу , б еру т чаш ку с третьим разведением. Д лявыделениячистой ку льту ры п атогенных микроорганизмовчасто п ользу ю тся п осевом исследу емого материала на элективные и ингиб иторныеп итательныесреды. За д а ниед л я вы по л нения л а бо р а т о р но й р а бо т ы 1. Рассмотреть нараздаточном материале характер ростаразличных б актериальных ку льту р на п лотных и ж идких п итательных средах, различные тип ы колоний, «п естрые» ряды б актерий с разной ф ерментативной активностью . 2. О характеризовать выделенну ю ку льту ру (стаф илококка, киш ечной п алочки) п о морф ологическим, ку льту ральным и б иохимическим свойствам. О ф ормить п ротокол. Т ема4.2. И Д Е Н Т И Ф И К А Ц И Я К У Л ЬТ У Р БА К Т Е РИ Й И дентиф икацию выделенных б актериальных ку льту р п роводят п у тем изу чения морф ологии б актерий, их ку льту ральных, б иохимических и дру гих п ризнаков, п рису щ их каж дому виду . Кул ьт ур а л ьны е пр изна ки. К у льту ральные свойствахарактерны для каж дого вида микроорганизма и п отому являю тся важ ным диагностическим п ризнаком. Свойства ку льту ры изменяю тся с ее возрастом, п оэтому возраст ку льту ры необ ходимо у читывать и отмечать вп ротоколе исследования. В озраст ку льту ры, наиб олее б лагоп риятный для изу чения ее свойств, зависит от видовой п ринадлеж ности микроорганизма, так как для п оявления выраж енных п ризнаков роста различным микроорганизмам необ ходимо разноевремя. Н ап ример, колонии чу мной п алочки могу тб ыть

25

об нару ж ены и п одвергну ты изу чению через 10 - 12 часов, колонии б актерий ту б ерку леза- только через несколько недель отмоментап осева. К данным п ризнакам относятся морф ологические особ енности колоний б актерий, характер ростанап лотных и вж идких п итательных средах. К олонии различаю тся п о величине, ф орме, цвету , консистенции, конту ру края, стру кту ре и характеру п оверхности. По величине колонии могу тб ыть кру п ные(диаметр б олее4 - 5 мм), средние(2 - 4 мм) и малые(1 - 2 мм), п о ф орме - кру глые, розеткооб разные, листовидные и т. д. Ц вет колонии зависитотвыраб отки оп ределенного п игмента- б елого, ж елтого, красного и др. К олонии неп игментиру ю щ их б актерий б есцветны. По консистенции различаю тся су хие, влаж ные, сочные или слизистые колонии. Поверхность колонии б ывает гладкой, морщ инистой, исчерченной, п лоской, вып у клой, вдавленной. К рай колонии мож ет б ыть ровным, волнистым, б ахромчатым. К олонии могу т иметь аморф ну ю , зернисту ю , волокнисту ю вну тренню ю стру кту ру . Х арактер роста б актерий в чистой ку льту ре, выращ енной на скош енном п итательном агаре, мож ет б ыть су хим, влаж ным, «п олзу чим» , складчатым, п игментированным. В ж идкой п итательной среде одни б актериальные ку льту ры даю т диф ф у зное п ому тнение, дру гие характеризу ю тся п ридонным, п ристеночным ростом; некоторые ку льту ры об разу ю тп ленки нап оверхности среды, дру гие- осадок наднеп роб ирки. Б ио х имические пр изна ки. Биохимическу ю активность микроб ов изу чаю т п о характеру и количеству тех ф ерментов, которые микроб ная клеткап роду циру ет и выделяет во внеш ню ю среду . В ж изнедеятельности микроб овф ерменты играю т б ольш у ю роль. О ни являю тся об язательными у частниками разнооб разных б иохимических реакций, леж ащ их воснове ф у нкций п итания, дыхания. К аж дый вид микроорганизмовп роду циру ет п остоянный длянего п о количеству и качеству наб ор ф ерментов. Поэтому исследование б иохимических свойств микроорганизма является об язательным п ри оп ределении их видовой п ринадлеж ности. Д ля диагностики микроб ов наиб ольш ее значение имеет оп ределение сахаролитических и п ротеолитических ф ерментов, активиру ю щ их соответственно расщ еп лениеу глеводови б елков. 1. Са х а р о л ит ические фер мент ы микр о о р г а низмо в. Свойство расщ еп лять у глеводы и высокоатомные сп ирты, которые п ринято об ъ единять в одну гру п п у , имену ему ю сахарами, п рису щ е многим п атогенным микроб ам. Под действием сахаролитических ф ерментов б актерий «сахара» расщ еп ляю тся на альдегиды и кислоты. К онечными п роду ктами их расщ еп ления являю тся газооб разные вещ ества: СО 2 и Н 2. О тнош ение микроорганизмов к различным у глеводам сп ециф ично и п оэтому ш ироко п рименяется в б актериологической п рактике для диф ф еренциации различных видови разновидностей б актерий. Д ля об нару ж ения сахаролитических ф ерментов исследу ему ю ку льту ру б актерий засеваю т в п итательные среды Гисса, называемые

26

такж е «п естрым» рядом. Последний п редставляет соб ой ряд п роб ирок с п еп тонной водой, «сахаром» и индикатором (реактивА ндреде или В Р). К ороткий «п естрый» ряд Гиссасодерж итоб ычно 5 п роб ирок: с глю козой, лактозой, маннитом, мальтозой и сахарозой. При некоторых исследованиях для б олее у глу б ленного изу чения б иохимических свойств выделенногомикроорганизмаисп ользу ю тдлинный «п естрый» рядГисса, в составкоторого наряду с п еречисленными у глеводами входят и дру гие «сахара»: ду льцит, сорб ит, ксилоза, араб иноза, крахмал, ину лин, гликоген и др. Н азвание «п естрый» ряд об у словлено тем, что п од действием ф ерментоврасту щ его микроб аодни у глеводы остаю тся неизменными и, следовательно, цвет п итательной среды не изменяется, в то время как дру гие сахарарасщ еп ляю тся, об разу я кислые п роду кты расп ада, которые изменяю тцветиндикатораи соответственно цветп итательной среды. Среды Гисса б ываю т ж идкими и п олу ж идкими. В п роб ирки с ж идкими средами Гиссадля об нару ж ения газов, являю щ ихся конечными п роду ктами расп адасахаров, оп у скаю т«п оп лавок» , который п редставляет соб ой тру б очку диаметром 0,5 - 0,7 см, зап аянну ю с одного конца. Поп лавок оп у скаю т зап аянным концом кверху , п ри стерилизации он п олностью зап олняется п итательной средой. При об разовании в среде газооб разных п роду ктовп оследние вытесняю т часть находящ ейся внем ж идкости, вследствие чего у зап аянной верху ш ки п оп лавка об разу ется возду ш ный п у зырек различной величины. В п олу ж идких средах Гисса газооб разованиеоп ределяю тп о наличию мелких п у зырьковвтолщ есреды и стойкой п ены наееп оверхности. Т аким об разом, п ри изу чении сахаролитических ф ерментов; выделяемых микроорганизмами, у читываю т не только явление расщ еп ления тех или иных сахаровп о кислотооб разованию , но и глу б ину ф ерментативного п роцесса п о наличию в п итательной среде конечных газооб разных п роду ктоврасщ еп ления. Проб ирки с наб ором сред Гиссаставят вш тативводин ряд. Н а каж дой п роб ирке надп исываю т название сахара, содерж ащ егося всреде. Н а1-й п роб ирке каж дого ряда, кроме названия сахара, у казываю т номер или вид исп ыту емой микроб ной ку льту ры. К у льту ру б еру т на кончик п етли в очень неб ольш ом количестве и засеваю т п о об щ еп ринятой методике. При п ереносе п етли из п роб ирки с одной сахарной средой в дру гу ю п етлю об язательно п рож игаю т, а исп ыту ему ю ку льту ру б еру т заново. Ш тативс засеянными средами Гиссаставятвтермостатп ри 37 или 43 °С взависимости от исследу емого материалаи цели исследования. После инку б ации в термостате у читываю т резу льтаты ф ерментации сахаров. И зменение цветап итательной среды вп роб ирке об означаю т б у квой К , что соответствует об разованию в среде кислых п роду ктов расп ада сахара. К ислотооб разование, соп ровож даю щ ееся п оявлением п у зырьков газавп оп лавке или втолщ е п олу ж идкой среды, об означаю т вп ротоколе

27

оп ыта б у квами К Г, где б у ква Г у казывает на расщ еп ление сахара с об разованием конечных газооб разных п роду ктовего расп ада. 2. П р о т ео л ит ические фер мент ы микр о о р г а низмо в. Н екоторые микроорганизмы п роду циру ю т и выделяю т во внеш ню ю среду п ротеолитические ф ерменты - п ротеазы, катализиру ю щ ие расщ еп ление б елков. В резу льтате расщ еп ления молеку лы б елка об разу ю тся высокомолеку лярные п ромеж у точные п роду кты расп ада - п еп тоны, химическая п рирода которых изу чена недостаточно. Под действием п еп толитических ф ерментовп еп тоны всвою очередь расщ еп ляю тся на п олип еп тиды (соединениядвух или нескольких аминокислот) и отдельные аминокислоты. Д ля выявления п ротеолитических ф ерментовисследу ему ю ку льту ру засеваю т вп итательну ю среду , содерж ащ у ю тот или иной б елок. Ч ащ е всего для этой цели п рименяю т ж елатин, реж е - сверну ту ю лош адину ю сыворотку , коагу лированный яичный б елок, молоко или ку сочки вареного мяса. Протеолитическая активность одного и того ж е микроб а п ри оп ределении ее на различных п итательных средах б у дет п роявляться неодинаково, что об у словливается сп ециф ичностью ф ерментов. Поэтому для разных видовмикроб оврекоменду ю т п итательные среды различного состава. 2.1. О пр ед ел ениепр о т ео л ит ическо й а кт ивно ст и микр о бо в на ж ел а т ине. М ясо-п еп тонный ж елатин разливаю т вп роб ирки столб иком п о 5 - 6 мл. Посев п роизводят у колом, п огру ж ая п етлю с исследу емой ку льту рой в глу б ь п итательной среды до днап роб ирки. М икроб ы, сп особ ныерасти п ри низкой темп ерату ре, оставляю тстоять вкомнатеп ри 20 - 22 °С. О стальные п осевы инку б иру ю т в термостате п ри 37 °С. В месте с оп ытными п роб ирками втермостат ставят одну или две п роб ирки с незасеянным ж елатином для контроля. При темп ерату ре 37 °С ж елатин п лавится, п оэтому п осле инку б ации п роб ирки, выну тые из термостата, оп у скаю т на 30 - 60 мин. в холодну ю воду или ставят в холодильник. После засту дневания ж елатина в контрольных п роб ирках п ристу п аю т к п росмотру роста и у чету изменений в п итательной среде оп ытных п роб ирок. Т ам, где п од действием ф ермента ж елатиназы п роизош ло расщ еп ление б елков ж елатина, отмечается разж иж ение п итательной среды. Проб ирки, в которых п осле су точного инку б ирования среда остается б ез изменения, оставляю т на 6 - 7 дней для еж едневного п росмотра. В п ротоколе исследования об язательно отмечаю т день п оявления п ризнаков разж иж ения среды. При регистрации резу льтатов у читываю тинтенсивность ростаи ф орму разж иж енияж елатиновой среды. Разж иж ениеж елатинау разных видовмикроб овп роисходитнеодинаково. Т ак, нап ример, различаю т п ослойное разж иж ение ж елатина, п ри котором п оследовательно разж иж ается один горизонтальный слой за дру гим в нап равлении сверху вниз. У некоторых видов б актерий отмечаю т

28

разж иж ениекратерооб разноес вогну тостью п оверхности вф ормечайного б лю дца, воронкооб разное. Ш таммы, об ладаю щ ие высокой активностью ф ерментаж елатиназы, разж иж аю т весь столб ик ж елатина, находящ ийся в п роб ирке. Н екоторые виды п атогенных микроб ов с выраж енной п ротеолитической активностью об ладаю тсп особ ностью расщ еп лять б елок и п еп тон до п роду ктов глу б окого расп ада: индола, сероводорода, мочевины и аммиака. При оп ределении видов и диф ф еренциации разновидностей п атогенных микроб ов наиб ольш ее значение имеет выявление двух п ервых п роду ктов: индола и сероводорода. И ндол об разу ется из слож ной гетероциклической аминокислоты - трип тоф ана. Сероводород является конечным п роду ктом расщ еп ления аминокислот: цистина, цистеинаи метионина, содерж ащ их всвоем составесеру . 2.2. О пр ед ел ение инд о л а в кул ьт ур е (П о М о р ел ю). Д ля выявления индолооб разования засеваю т п етлю исследу емой ку льту ры микроб а в М ПБ, п риготовленный на п ереваре Х оттингера, содерж ащ ем б ольш ое количество своб одного трип тоф ана. Т отчас ж е п осле п осева п олоску индикаторной б у маги, п роп итанну ю раствором щ авелевой кислоты, оп у скаю т вп роб ирку так, чтоб ы онане у п алавп итательну ю среду и не касалась б ы ее п оверхности. Д ля этого верхню ю треть б у маж ной п олоски п ринимаю т п роб кой к горлыш ку п роб ирки. Посевы инку б иру ю т в термостате 24 - 48 часов п ри 37 °С. О б разование индола в б у льоне соп ровож дается окраш иванием ниж него конца индикаторной б у маги в слаб о розовый цвет, б олее заметный в п роходящ ем свете. Более чу вствительным индикатором на индол является реактив Э рлиха (сп иртовой раствор п арадиметиламидоб ензальдегидас хлороводородной кислотой). О п ределение п роводят следу ю щ им об разом: в п роб ирку с ку льту рой б актерий п риб авляю т 2 - 3 мл эф ира, содерж имое энергично п еремеш иваю т и доб авляю т несколько кап ель реактива Э рлиха. О краш ивание эф ирного слоя вмалиново-красный цвет свидетельствует о п олож ительной реакции наиндол. 2.3. О пр ед ел ение сер о во д о р о д а . Петлю исследу емой ку льту ры микроб ов засеваю т вп роб ирку с М ПБ или б у льоном Х оттингера. Т отчас ж е п осле п осева в п роб ирку вносят п роп итанну ю у ксу снокислым свинцом индикаторну ю б у магу на оп ределение сероводорода. В п олож ительных слу чаях об разу ю щ ийся вку льту ре сероводород всту п ает всоединение с б есцветным у ксу снокислым свинцом, п ревращ аясь всернокислый свинец, который п ридает индикаторной б у маге черно-б у рое окраш ивание. О б разованиесероводородаи индолавку льту реоп ределяю тодновременно. С этой целью вп роб ирку с засеянным б у льоном вносятодновременно две индикаторные б у маги: на индол и сероводород. Д ля того чтоб ы индикаторные б у маги не у п али вп итательну ю среду и не касались б ы ее п оверхности, верхню ю треть б у маж ных п олосок п лотно п риж имаю т к стенке п роб ирки п роб кой. О кончательный у чет резу льтатов на об разование индолаи сероводородап роизводят на7 - 10-й день п осле

29

п роизведенного п осева, так как п роцесс ф ерментативного расщ еп ления б елкаи об разования конечных п роду ктоврасп адап роисходит иногдав течениедлительного времени. 3. О кисл ит ел ьно -во сст а но вит ел ьны е фер мент ы . В ку льту ре микроорганизмов могу т б ыть об нару ж ены окислительновосстановительные ф ерменты, связанные главным об разом с дыхательной ф у нкцией. 3.1. Дл я вы явл ения фер мент о в д ег ид р а з и о пр ед ел ения их а кт ивно ст и в п рактике микроб иологических исследований п редлож ен метод, основанный на введении в п итательну ю среду органической краски, вып олняю щ ей роль акцеп тора водорода. В резу льтате п рисоединения водорода краситель восстанавливается, п ревращ аясь в б есцветное соединение, называемое лейкоб азой. Последнее п ри об ильном досту п е кислородамож етвновь окислитьсяи п риоб рести свой п реж ний цвет. В качестве акцеп тора водорода исп ользу ю т метиленовую синь, лакму совую настойку , малахитовую зелень, индигокармин, нейтральрот и др. Д ля выявления реду циру ю щ их свойствмикроб ау казанные красители доб авляю тк об ычным п итательным средам: М ПБ, М ПА , молоку . О дин и тотж евид микроб аведетсеб янеодинаково п о отнош ению к краскам разного состава. Э то свойство микроб а исп ользовано в микроб иологической п рактике вкачестве диф ф еренциального п ризнака. Бактерии б рю ш ного тиф а реду циру ю т метиленовую синь, но не реду циру ю т лакму са и не изменяю т нейтральрот в п ротивоп олож ность киш ечной п алочке, которая остается нейтральной в отнош ении метиленовой сини, но восстанавливаетлакму с и нейтральрот. 3.2. О пр ед ел ение фер мент а ка т а л а зы . Н екоторые микроорганизмы, п ринадлеж ащ ие к гру п п е аэроб ов, вп роцессе дыхания об разу ю т п ерекись водорода, являю щ у ю ся клеточным ядом. К оличество п ерекиси водородав ку льту ре никогдане достигает высоких концентраций, так как п о мере об разования п ерекись разлагается наводу и молеку лярный кислород п ри у частии ф ерментакаталазы. О п ределением наличия каталазы наряду с изу чением дру гих б иохимических п ризнаков п ользу ю тся п ри оп ределении вида и диф ф еренциации разновидностей п атогенных микроб ов, выделенных из организма б ольного и об ъ ектоввнеш ней среды. Н ап редметное стекло наносяткап лю 1 - 3 % растворап ероксидаводородаи вносятвнееп етлю с б актериальной ку льту рой. К аталаза разлагает п ероксид водорода на кислород и воду . В ыделение п у зырьковО 2 свидетельствует о наличии у данного видаб актерий ф ерментакаталазы. В б актериологической п рактике иногдаограничиваю тся изу чением сахаролитических и п ротеолитических п ризнаковисследу емых б актерий, если это является достаточным для их идентиф икации. В необ ходимых слу чаях п роводят изу чение дру гих п ризнаков, нап ример сп особ ности к восстановлению нитратов, карб оксилированию аминокислот, об разованию оксидазы, п лазмокоагу лазы, ф иб ринолизинаи дру гих ф ерментов, атакж е

30

оп ределение антигенной стру кту ры, чу вствительности к ф агам, виру лентности и т. д. В се этап ы выделения и идентиф икации чистой ку льту ры б актерии мож но п редставить ввидесхемы:

1. 2. 3. 4.

Iэт а п И ссл ед уемы й ма т ер иа л М икроскоп иямазковили нативных п реп аратов. Посевначаш ки Петри с п итательным агаром. Посевнаэлективну ю среду . Посевнадиф ф еренциально-диагностическу ю среду .

II эт а п Х а р а кт ер ист ика изо л ир о ва нны х ко л о ний 1. М азок-окраскап о Граму или дру гим методом дляизу ченияморф ологии клеток и их тинкториальных свойств. 2. Посевнаскош енный п итательный агар или дру гиесреды длянакоп лениячистой ку льту ры.

III эт а п Х а р а кт ер ист ика р о ст а кул ьт ур ы 1. М азок-окраскап о Граму или дру гими методами дляп роверки однородности ку льту ры. 2. Пересевнасреды «п естрого» ряда длявыявленияб иохимических п ризнаков. 3. Серологическиереакции дляизу чения антигенных свойств. 4. Зараж ениеи вскрытиелаб ораторных ж ивотных дляоп ределениявиру лентности. П р имеча ния. 1. И сследу емый материал п еред п осевом с целью освоб ож дения от соп у тствую щ ей микроф лоры иногда п одвергаю т нагреванию до 80 °С для выделения сп орооб разу ю щ их б актерий, об раб откекислотой – длявыделениякислотоу стойчивых б актерий и т.п . 2. У словия инку б ации п осевовзависят от ф изиологических особ енностей б актериальной ку льту ры, п оэтому аэроб ные б актерии выращ иваю т в п рису тствии кислородавозду ха, анаэроб ные б актерии – б ескислородной среде: некоторые б актерии лу чш е расту т п ри п овыш енном содерж ании СО 2.

31

вид Род и ку льту ры

ж елатина

индола

маннита

маннозы

сахарозы

лактозы

Биохимическиесвойства ф ерментация об разо -вание глю козы

агаре

б у льоне

Х арактер роста ку льту ры на п итательном колонии

О краскап о Граму и др. методами

М орф ология клеток б актерий

Резу льтаты раб от п о идентиф икации выделенной ку льту ры п ротоколиру ю т(таб л. 2). Т аблица 2. Х арактеристика ку льту ры п о морф ологическим и ф изиологическим п ризнакам (ф ормап ротокола)

Т ем а 5. М Е Т О Д Ы И ЗУ Ч Е Н И Я А Н Т И М И К РО БН О ГО Д Е Й СТ В И Я А Н Т И БИ О Т И К О В А нтиб иотики занимаю тведу щ ееместо среди химиотерап евтических п реп аратов, исп ользу емых для лечения различных б актериальных инф екций. В зависимости от п роисхож дения, химического строения, механизмаантиб актериального действия и числачу вствительных к ним б актерий (сп ектр антиб актериального действия) антиб иотики п одразделяю т на ряд гру п п . Н аряду с антиб иотиками у зкого сп ектра (п енициллины, цеф алосп орины) ш ироко п рименяю тся антиб иотики ш ирокого сп ектрадействия (тетрациклины, левомицетин и др.). В связи с расп ространением антиб иотикорезистентных б актерий выб ор п реп арата для лечения оп ределенного б ольного зависит п реж де всего от чу вствительности к данному антиб иотику выделенного возб у дителя. Т аблица 3. М еханизмы ингиб иру ю щ его действия важ нейш их гру п п антиб иотиковнамикроб ну ю клетку Н азваниекласса Н екоторыеп редставители Бензилп енициллин, β-лактамы аминоп енициллины Пенициллины (амоксициллин, амп ициллин), оксациллин, Ц еф алосп орины метициллин. Д елятся на п реп араты 1 (цеп орин, цеф алотин, цеф алексин), 2 (цеф азолин), 3 (цеф отаксим), 4 (цеф еп им, цеф п иром) п околений. М акролиды и Э ритромицин, линкозамины рокситромицин. Л инкомицин, клиндамицин.

М еханизм действия И нгиб ирование синтеза клеточной стенки

В ызываю т нару ш ение синтезаб елка.

32

А миногликозиды Т етрациклины

Полип еп тиды

Стреп томицин, гентамицин, канамицин, амикацин, нетилмицин Т етрациклин, окситетрациклин/клиними цин, метациклин, доксициклин. Грамицидин, п олимиксин М и В , б ацитрацин.

-» -«-

-«-» -

Н ару ш ение ф у нкций цитоп лазматической мемб раны Полиены А мф отерицин В , нистатин, И зменяю т п роницаемость леворин. клеточной мемб раны гриб ов, б локиру я стироиды, входящ ие вих состав. Риф амицины Риф амп ицин И нгиб итор синтеза ну клеиновых кислот (РН К ) Д оп олнительная Л евомицитин И нгиб ирование синтеза гру п п а Гризеоф у львин б елканариб осомах О сновные классы синтетических антиб иотиков Х инолоны и Н алидиксовая кислота: Н ару ш ение отдельных ф торхинолоны невиграмон, неграм. этап ов (реп ликации, Производные хинолонов: транскрип ции, реп арации) оксолиниевая кислота, синтеза Д Н К микроб ной нитроксалин (5-Н О К ). клетки. Ф торхинолоны: цип роф локсацин (циф ран, цип роб ай, цип ролет). Су льф аниламиды Производные Близки п о стру кту ре к су льф аниловой кислоты: п арааминоб ензой-ной су льф аметоксазол, кислоте, нару ш аю т синтез су льф ацетамицид ф олиевой кислоты, а (альб у цид), через него – синтез Д Н К , су льф одиметаксин т.е. являю тся (п реп арат антиметаб олитами. п ролонгированного действия). Н итроф у раны Ф у рацилин, ф у рагин, И нгиб иторы ряда ф у разолидон и др. ф ерментов микроб ной клетки. И мидазолы М етронидазол -«-» -

33

За д а ниед л я вы по л нения л а бо р а т о р но й р а бо т ы 1. Поставить оп ыт п о оп ределению чу вствительности б актерий к различным антиб иотикам методом дисков. М ет о д ическиеука за ния О пр ед ел ение чувст вит ел ьно ст и ба кт ер ий к а нт ибио т ика м мет о д о м д иско в И сследу ему ю б актериальну ю ку льту ру засеваю т газоном на п итательный агар или среду А ГВ вчаш кеПетри. Ср ед а АГ В: су хой п итательный рыб ный б у льон, агар-агар, натрий ф осф ат двузамещ енный. Среду готовят из су хого п орош кавсоответствии с инстру кцией. Н а засеянну ю п оверхность п инцетом п омещ аю т на одинаковом расстоянии дру г от дру га б у маж ные диски, содерж ащ ие оп ределенные дозы разных антиб иотиков. Посевы инку б иру ю тп ри 37 °С до следу ю щ его дня. По диаметру зон задерж ки роста исследу емой ку льту ры б актерий су дято еечу вствительности к антиб иотикам. Д ля п олу чения достоверных резу льтатов необ ходимо п рименять стандартные диски и п итательные среды, для контроля которых исп ользу ю тся эталонные ш таммы соответствую щ их микроорганизмов. М етод дисков не дает надеж ных данных п ри оп ределении чу вствительности микроорганизмов к п лохо диф ф у ндиру ю щ им в агар п олип еп тидным антиб иотикам (нап ример, п олимиксин, ристомицин). Е сли эти антиб иотики п редп олагаетсяисп ользовать длялечения, рекоменду ется оп ределять чу вствительность микроорганизмов методом серийных разведений. О пр ед ел ение чувст вит ел ьно ст и ба кт ер ий к а нт ибио т ика м мет о д о м сер ийны х р а звед ений Д анным методом оп ределяю т минимальну ю концентрацию антиб иотика, ингиб иру ю щ у ю рост исследу емой ку льту ры б актерий. В начале готовят основной раствор, содерж ащ ий оп ределенну ю концентрацию антиб иотика (мкг/мл или Е Д /мл) в сп ециальном растворителе или б у ф ерном растворе. И з него готовят все п оследу ю щ ие разведения вб у льоне (воб ъ еме 1 мл), п осле чего к каж дому разведению 6 доб авляю т0,1 млисследу емой б актериальной су сп ензии, содерж ащ ей 10 7 10 б актериальных клеток в1 мл. В п оследню ю п роб ирку вносят 1 мл б у льона и 0,1 мл су сп ензии б актерий (контроль ку льту ры). Посевы инку б иру ю т п ри 37 °С до следу ю щ его дня, п осле чего отмечаю т резу льтаты оп ыта п о п ому тнению п итательной среды, сравнивая с контролем ку льту ры. Последняя п роб ирка с п розрачной п итательной средой у казывает назадерж ку ростаисследу емой ку льту ры б актерий п од влиянием содерж ащ ейсявней минимальной ингиб иру ю щ ей концентрации (М И К ) антиб иотика(таб л. 4).

34

Т аблица 4. О п ределение чу вствительности б актериальной ку льту ры к антиб иотнку методом серийных разведений Н омер Разведение п роб ирки антиб иотика

1 2 3 4 5 6 7

К онцентрация И сследу емая Рост антиб иотика, ку льту ра, мл б актерий мкг/мл (п ому тнение среды) 1:100 100 0,1 1:200 50 0,1 1:400 25 0,1 1:800 12,5 0,1 1:1600 6,25 0,1 + 1:3200 3,12 0,1 + 1млб у льонаб ез антиб иотика 0,1 + (контроль)

О ценку резу льтатов оп ределения чу вствительности микроорганизмовк антиб иотикам п роводятп о таб лице, которая содерж ит п ограничные значения диаметровзон задерж ки ростаД ля у стойчивых, у меренно у стойчивых и чу вствительных ш таммов, атакж е значения М И К антиб иотиковдляу стойчивых и чу вствительных ш таммов. К чу вствительным относятся ш таммы микроорганизмов, рост которых п одавляется п ри концентрациях п реп арата, об нару ж иваемых в сывороткекрови б ольного п ри исп ользовании об ычных доз антиб иотиков. К у меренноу стойчивым относятсяш таммы, дляп одавленияростакоторых треб у ю тся концентрации, создаю щ иеся всыворотке крови п ри введении максимальных доз п реп арата. У стойчивыми являю тся микроорганизмы, рост которых неп одавляется п реп аратом вконцентрациях, создаваемых в организмеп ри исп ользовании максимально доп у стимых доз. О пр ед ел ениеспо со бно ст и S. а urеus пр о д уцир о ва т ьбет а -л а кт а ма зы В колб у с 0,5 мл су точной б у льонной ку льту ры стандартного ш тамма- стаф илококка, чу вствительного к п енициллину , вносят 20 мл расп лавленного и охлаж денного до 45 °С п итательного агара, п еремеш иваю т и выливаю т в чаш ку Петри. После застывания агара в центр чаш ки на п оверхность среды п омещ аю т диск, содерж ащ ий п енициллин. По радиу сам дискап етлей засеваю т исследу емые ку льту ры. Посевы инку б иру ю т п ри 37 °С до следу ю щ его дня, п осле чего отмечаю т резу льтаты оп ыта. О сп особ ности исследу емых б актерий п роду цировать б ета-лактамазы су дят п о наличию роста стандартного ш тамма стаф илококка вокру г той или дру гой исследу емой ку льту ры (вокру г диска).

35

Т ем а 6. М И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Й К О Н Т РО Л Ь А Н Т И СЕ ПТ И К О В , Д Е ЗИ Н Ф Е К Т А Н Т О В , М Е Т О Д О В СТ Е РИ Л И ЗА Ц И И Т ема6.1. СТ Е РИ Л И ЗА Ц И Я Д ля у ничтож ения микроорганизмов на различных п редметах, исп ользу емых вмедицине и б ыту , п рименяю т двасп особ а: стерилизацию и дезинф екцию . Ст ер ил иза ция п редп олагает п олну ю инактивацию микроб ов на п редметах, п одвергаю щ ихся об раб отке. Су щ ествую ттри основных метода стерилизации: теп ловая, лу чевая, химическая. Тепл о ва я ст ер ил иза ция основананачу вствительности микроб овк высокой темп ерату ре. При 60 °С и наличии воды п роисходитденату рация б елков, в том числе ф ерментов, вследствие чего вегетативные ф ормы микроб овп огиб аю т. Сп оры, содерж ащ ие неб ольш ое количество воды в связанном состоянии и об ладаю щ ие п лотными об олочками, инактивиру ю тся п ри 60 °С. Д ля теп ловой стерилизации п рименяю т в основном су хой ж ар и п ар п од давлением. Стерилизацию сух им ж а р о м п роизводят всу хож аровых ш каф ах, или п ечах Пастера. О б еззараж ивание материала в нем п роисходит п ри 160-170 °С в течение 60-120 мин. Н едостатком этого методаявляется то, что столь высоку ю темп ерату ру выдерж иваю т только некоторые стерилизу емые п редметы, нап ример, лаб ораторное стекло. Н аиб олее у ниверсальным методом стерилизации является об раб отка па р о м по д д а вл ением в автоклавах, в которых стерилизу ю т п еревязочный материал, б елье, многие инстру менты, п итательные среды, растворы, инф екционный материал. Продолж ительность стерилизации вавтоклавеп ри 120 °С составляет15-20 мин., п ри 115 °С – 20-30 мин; материал, загрязненный сп орами микроб ов, стерилизу ю т до 2 часов п ри 120 °С. Ст ер ил иза ция т екучим па р о м п роизводитсявап п аратеК оха, называемом теку чеп аровым ап п аратом, или вавтоклаве п ри не завинченной крыш ке и открытом вып у скном кране. Стерилизация втеку чеп аровом ап п арате длится от 30 мин. до 1 часав зависимости от характера и п редп олагаемой загрязненности стерилизу емого об ъ екта. В теку чеп аровом ап п арате стерилизу ю т главным об разом п итательные среды, у которых изменяю тся их свойства п ри темп ерату ревыш е100 °С. Стерилизациятеку чим п аром всегдап роводится п овторно, так как однократное п рогревание п ри темп ерату ре 100 °С не об есп ечивает п олного об есп лож ивания. Т акой метод стерилизации п олу чил название д р о бно й ст ер ил иза ции: об раб отку стерилизу емого материалатеку чим п аром п роводят п о 15-20 мин. еж едневно втечение 3 дней. В п ромеж у тках меж ду стерилизациями материалвыдерж иваетсяп ри комнатной темп ерату ре. В о времяп ервого п рогреванияп роисходитгиб ель содерж ащ ихся вматериале вегетативных ф орм б актерий, вто время как сп оры сохраняю т ж изнесп особ ность. В п оследу ю щ ие су тки, во время

36

выдерж ивания стерилизу емого материала п ри комнатной темп ерату ре, часть сп ор п рорастаети п ревращ аетсяввегетативныеф ормы, п огиб аю щ ие п ри п овторных п рогреваниях. Тинд а л иза ция - дроб ная стерилизация с п рименением низкой темп ерату ры. Прогревание стерилизу емого материалап роизводитсявводяной б ане, снаб ж енной терморегу лятором, 56 дней п одряд п ри 56 - 58 °С втечение2 часоввп ервый день и п о 1 часу в п оследу ю щ ие 4-5 дней. В п ромеж у тках меж ду п рогреваниями об раб атываемый материалвыдерж иваетсяп ри комнатной темп ерату редля п рорастания сп ор в вегетативные ф ормы, которые у б иваю тся п оследу ю щ им нагреванием. Т индализацией п ользу ю тся для об есп лож иванияматериалов, свойствакоторых изменяю тсяп од действием б олее высокой темп ерату ры, нап ример ж идкости, содерж ащ ей в своем составеб елок. Т еп ловая стерилизация - наиб олее надеж ный, экологически б езоп асный, деш евый и хорош о контролиру емый метод, однако его невозмож но п рименять в тех слу чаях, когда п редметы и вещ ества п овреж даю тсяотдействиявысокой темп ерату ры. Г а зо ва я ст ер ил иза ция п редп олагаетисп ользование восновном двух токсичных газов: окиси этиленаи ф ормальдегида. Стерилизация газами осу щ ествляетсявп рису тствии п арап ри 60 - 80 °С всп ециальных камерах. Л учева я ст ер ил иза ция являетсяальтернативой газовой стерилизации и осу щ ествляется с п омощ ью гамма-излу чения, либ о у скоренных электронов. О на п озволяет об раб атывать об ъ екты, не выдерж иваю щ ие высокой темп ерату ры вб ольш их количествах вп ромыш ленных у словиях (нап ример, одноразовыеш п рицы, системы дляп ереливаниякрови). Е щ е одним сп особ ом стерилизации является фил ьт р о ва ние с п омощ ью различных ф ильтров(керамических, асб естовых, стеклянных) и особ енно мемб ранных, которое п озволяет освоб одить ж идкости (сыворотку крови, лекарства, б иоп реп араты) от б актерий, гриб ов, п ростейш их и даж евиру сов. Ко нт р о л ь ст ер ил иза ции. К онтроль об ъ ектов, п одвергш ихся стерилизации, как п равило, заменяю тконтролем раб оты стерилизаторовс п омощ ью ф изических, химических и б иологических сп особ ов. Ф изические мет о д ы п реду сматриваю т контроль раб оты п риб оров, характеризу ю щ их темп ерату ру , время, давление, п озволяю щ их строго соб лю дать у становленный реж им стерилизации, который об есп ечивает гиб ель микроб ов. Н ап ример, вп роб ирку насып аю т какое-либ о вещ ество, п лавящ ееся п ри темп ерату ре около 120 °С - сера, б ензойная кислота. Н едостаток этого сп особ а контроля состоит в том, что регистриру ется только то, что п орош ок расп лавился и, значит, необ ходимая темп ерату ра достигну та, но нельзяб ыть у веренным, что онаб ылатакой нап ротяж ении всего времени эксп озиции. Х имический ко нт р о л ь осу щ ествляется косвенно п о изменению окраски химических индикаторов (индикаторных б у маж ек, п орош ков,

37

ж идкостей - б ензойной кислоты, мочевины, зап аянных вамп у лы), которые п омещ аю тся нап оверхности и вглу б ине стерилизу емого об ъ екта. М етод имееттотж енедостаток, что и ф изический. Б ио л о г ический ко нт р о л ь п роводится п у тем п омещ ения вну трь стерилизу емых п редметов б иотестов, п риготовленных из термоу стойчивых сп орооб разу ю щ их б актерий. Д ля п роведения микроб иологического контроля об ъ ектов, п одвергш ихся стерилизации, п роизводят п осевы ку сочков материала, смывов с п редметов на п итательные среды, п озволяю щ ие об нару ж ить аэроб ные и анаэроб ные б актерии и гриб ы. О тсу тствие роста п осле 48 часов инку б ации в термостатесвидетельствуето стерильности п редмета. Н едостаток методав том, что ответ п олу чаем только сп у стя 48 часов, аматериал считается стерильным п осле автоклавирования вб иксе втечение 48 часов. Значит, материалисп ользу ю тся ещ е до п олу чения ответаиз б актериологической лаб оратории. Т ема6.2. Д Е ЗИ Н Ф Е К Ц И Я . Дезинфекция - у ничтож ениевегетативных ф орм микроорганизмовна об ъ ектах внеш ней среды. Д езинф ициру ю тп редметы, которыеневозмож но п одвергну ть стерилизации, нап ример, оп ерационный стол, стены оп ерационной, ру ки хиру рга или оп тиволоконну ю ап п арату ру . Д ля дезинф екции и стерилизации исп ользу ю т одни и те ж е методы, которые различаю тся качественно и количественно. В ыб ор метода зависит от дезинф ициру емого материала. Тепл о ва я д езинфекция вклю чает воздействие горячей водой и насыщ енным п аром: п ри 80 °С - 10 мин; п ри 85 °С - 3 мин; п ри 90 °С - 1 мин. При этом реж име п огиб аю т все вегетативные ф ормы б актерий и б ольш инство виру сов. При доб авлении в воду 2 % раствора гидрокарб оната натрия (NаН СО з) п огиб аю т и сп оры б актерий. М едицинский инстру ментарий и дру гие п редметы часто п одвергаю тся п редстерилизационной дезинф екции. И сп ользу ю т такж е и детергенты, которые растворяю т б елки и ж иры на п оверхности п редмета, у лу чш ая качество дезинф екции. Разновидностью теп ловой дезинф екции является па ст ер иза ция, п редлож енная ф ранцу зским у ченым Л .Пастером (1822 - 1895 гг) и п рименяемая для об раб отки восновном молока, атакж е соков, винаи п ива. При исп ользу емом реж име60 - 70 °С втечение20 - 30 мин. п огиб ает б ольш инство вегетативных ф орм б актерий. Х имическую д езинфекцию п роводят с п омощ ью различных дезинф ициру ю щ их вещ еств. Н аиб олее расп ространенными дезинф ициру ю щ ими средствами являю тся хлорсодерж ащ ие, ф енольные, четвертичные аммониевые и п ерекисные соединения. К неорганическим хлорсодерж ащ им соединениям относят хлорну ю известь, б елильну ю известь, гип охлорид кальция, гип охлорид натрия; к органическим

38

хлорсодерж ащ им соединениям - хлорамин Б, дезам, дихлор-l, су льф охлорантин, хлорцин, хлордезин; к ф енольным соединениям - лизоли хлор-Рнаф тол, гексахлороф ен. Персп ективну ю гру п п у дезинф ициру ю щ их соединений составляю т п оверхностно-активные вещ ества, относящ иеся к четвертичным аммониевым соединениям и амф олитам и об ладаю щ ие б актерицидными, мою щ ими свойствами и низкой токсичностью (ниртан, амф олан и др.). К п ерекисным соединениям п ринадлеж атп ергидроль (З%ый водный раствор п ерекиси водорода) и дезоксон-l. Д ля дезинф екции п рименяю тсятакж екислоты, альдегиды (ф ормальдегид, глю таральдегид и др.). Примером химической дезинф екции является хлорирование воды. Д ля дезинф екции п омещ ений, а такж е об ору дования и ап п арату ры исп ользу ю т газовую смесь из оксида этилена с метилб ромидом. Д езинф екцию п роводят вгерметичных у словиях. А ктивность каж дого из дезинф ектантовнеодинаковадляразличных микроорганизмови зависитот темп ерату ры, рН и дру гих у словий. Ул ьт р а ф ио л ет о во е о бл учение п роизводят с п омощ ью сп ециальных б актерицидных ламп (настенных, п отолочных, п ередвиж ных) для об еззараж ивания возду ха, различных п оверхностей в оп ерационных, п еревязочных, микроб иологических лаб ораториях, на п редп риятиях п ищ евой п ромыш ленности. Т ема6.3. А СЕ ПТ И К А И А Н Т И СЕ ПТ И К А Д ля п роф илактики вну триб ольничных и особ енно хиру ргических инф екций п рименяю т асеп тику и антисеп тику . Д о введения методов асеп тики и антисеп тики п ослеоп ерационная смертность достигала80 %: б ольные у мирали от гнойных, гнилостных и гангренозных п роцессов. О ткрытая в 1863 г. Л у и Пастером п рирода гниения и б рож ения, став стиму лом развития микроб иологии и п рактической хиру ргии, п озволила у тверж дать, что п ричиной многих раневых ослож нений такж е являю тся микроорганизмы. О сновоп олож ником а септ ики является английский хиру ргД .Л истер (1827-1912 гг), который ввелее вхиру ргическу ю п рактику как комп лекс мер, нап равленных нап реду п реж дениеп оп аданиявозб у дителяинф екции в рану и органы б ольного п ри оп ерациях, лечеб ных и диагностических п роцеду рах. Э ти мероп риятия вклю чаю т стерилизацию и сохранение стерильности инстру ментов, п еревязочноrо материала, оп ерационного б елья, п ерчаток и всего, что п риходит в соп рикосновение с раной: дезинф екцию ру к хиру рга, оп ерационного п оля, ап п арату ры, оп ерационной и дру гих п омещ ений, п рименение сп ециальной одеж ды, масок. М етоды асеп тики такж е п рименяю т на микроб иологических и ф армацевтических п роизводствах, п редп риятиях п ищ евой п ромыш ленности. Ант исепт ика - совоку п ность мер, нап равленных на у ничтож ение микроб ов в ране, п атологическом очаге или организме в целом, на п реду п реж дениеили ликвидацию восп алительного п роцесса. Е еп ринцип ы

39

введены вмедицину в1846 г. венгерским аку ш ером И . Земмельвейсом. В ыделяю т ф изическу ю , механическу ю , химическу ю и б иологическу ю антисеп тику . При физическо й а нт исепт ике об есп ечиваю т отток из раны инф ицированного содерж имого и тем самым ее очищ ение от микроб ов, токсинов и п роду ктов расп ада тканей. Д остигается это п рименением тамп онов из марли, дренаж ей из резины, стекла, п ластмассы. Гигроскоп ические свойства марли значительно у силиваю тся п ри смачивании ее гип ертоническими растворами (5 - 10 % раствор NaCl, 20 40 % раствор сахараи др.). Применяю тоткрытыеметоды лечения ран б ез налож енияп овязки, что ведетк высу ш иванию раны возду хом и созданию , таким об разом, неб лагоп риятных у словий для развития микроб ов. К ф изической антисеп тике относится такж е исп ользование у льтразвука, лу чей лазера, ф изиотерап евтических п роцеду р. М ех а ническо й а нт исепт ико й являю тсяп риемы п о у далению из раны инф ицированных и неж изнесп особ ных тканей, слу ж ащ их основной п итательной средой для микроорганизмов. Э то оп ерации, п олу чивш ие название активной хиру ргической об раб отки раны, атакж е ту алет раны, имею тб ольш оезначениедляп роф илактики развитияраневой инф екции. Х имическа я а нт исепт ика п реду сматривает вещ ества с б актерицидным или б актериостатическим действием, оказываю щ ие гу б ительное воздействие на микроф лору . Противомикроб ные вещ ества, называемыеа нт исепт ика ми резко сниж аю тчисленность микроб оввране, нап оверхности организма. Похимическому составу различаю тследу ю щ ие антисеп тики: • галоиды - п реп араты йода(сп иртовой раствор йода, раствор Л ю голя, йодоф орм, иодинол, иодоп ирин), хлора(хлорамины, хлориты); • п ерекись водорода, калия п ерманганат, об ладаю щ ие, как и галоиды, окислительными свойствами; • кислоты и их соли (б орная, салициловая, тетраб орат натрия), щ елочи (аммиак и его соли, б у ра), сп ирты (70 - 80 % этанол), альдегиды (ф ормальдеrид, гексаметилентетрамин, З-п роп иолак-тон); • детергенты (декамин, мирамистин, хлоргексидин, этоний и др.); • п роизводные S-оксихинолина(хинозол, интестоп ан, нитро- s ксолин), хинолона(оксолиноваякислота), хиноксолина(хинооксидин,диоксидин); • п роизводныенитроф у рана(ф у рацилин, ф у рагин, ф у разолидон); • ф енол и его п роизводные (ф енол, трикрезол, ф енилрезорцин, ф енилсалицилат), дегти (деготь б ерезовый, ихтиоли др.); • красители (б риллиантовый зеленый, метиленовый синий, этакридина лактат); • соединения тяж елых металлов(дихлорид и оксицианид рту ти, нитрат сереб ра, колларгол, п ротаргол, су льф атцинка). Б ио л о г ическа я а нт исепт ика составляетб ольш у ю гру п п у п реп аратов и методик, действие которых нап равлено неп осредственно п ротив микроб ной клетки и ее токсинов, и гру п п у вещ еств, действую щ их

40

оп осредованно через организм человека. Т ак, п реиму щ ественно на микроорганизм или его токсины действую т: 1) антиб иотики - вещ ествас выраж енными б актериостатическими или б актерицидными свойствами; 2) б актериоф аги; 3) антитоксины, вводимые, как п равило, в виде сывороток (п ротивостолб нячная, п ротиводиф терийнаяи др.). О п осредованно через организм, п овыш ая его имму нитет и, тем самым, у силивая защ итные свойства, действую т вакцины, анатоксины, п ереливаниекрови и п лазмы, введениеимму нных глоб у линов, п реп аратов метилтиоу рацилаи др. Протеолитические ф ерменты лизиру ю т мертвые и неж изнесп особ ные ткани, сп особ ствую т б ыстрому очищ ению ран и лиш аю т микроб ные клетки п итательных вещ еств. По наб лю дениям эти ф ерменты, меняясреду об итаниямикроб ови разру ш аяих об олочку , могу т делать микроб ну ю клетку б олеечу вствительной к антиб иотикам. А сеп тика и антисеп тика п редставляю т соб ой единый комп лекс мероп риятий, их нельзяразделить. За д а нuед л я вы nо л ненuя л а бо р а т о р но й р а бо т ы 1. О п ределить антимикроб ное действие антисеп тических и дезинф ициру ю щ их вещ еств. М ет о д ическиеука за ния Д иски из ф ильтровальной б у маги смочить растворами исследу емых вещ естви п оместить нап оверхность п итательного агаравчаш ке Петри, засеянной (газоном) тест-ку льту рой стаф илококкаили киш ечной п алочки. Ч аш ку инку б ировать втечение су ток п ри 37 °С. О б антиб актериальном действии исследу емых вещ ествсу дят п о зонам задерж ки ростаб актерий, об разу ю щ имсявокру гдисков. Т ем а 7. СА Н И Т А РН А Я М И К РО БИ О Л О ГИ Я Са нит а р на я микр о био л о г ия – это отдельное нап равление медицинской микроб иологии, которое изу чает микроф лору окру ж аю щ ей среды и ее влияние наздоровье человека. Г л а вна я за д а ча са нит а р но й микр о био л о г ии - раннееоб нару ж ениеп атогенной микроф лоры во внеш ней среде. О сновным резервуаром возб у дителя является человек (б ольной или б актерионоситель), атакж е п тицы, млекоп итаю щ ие. Подавляю щ ее число возб у дителей п ередается возду ш но-кап ельным и ф екально-оральным п у тем. Санитарная микроб иология изу чает микроф лору воды, возду ха, п очвы, п ищ евых п роду ктови дру гих об ъ ектоввнеш ней среды, оп ределяя их санитарно-эп идемиологическое б лагоп олу чие. Су щ ествую т оп ределенные пр инципы пр о вед ения са нит а р но -микр о био л о г ических иссл ед о ва ний: 1) п равильность отб орап роб , 2) серийность п роводимых анализов, 3) п овторность отб орап роб . О сно вны ена пр а вл ения са нит а р но ба кт ер ио л о г ические мет о д о в иссл ед о ва ния: 1) оп ределение об щ ей микроб ной об семененности (О М Ч ), 2) оп ределение санитарноп оказательных микроорганизмов, 3) выявление п атогенных микроорганизмов и их токсинов, 4) оп ределение степ ени

41

недоб рокачественности изу чаемых об ъ ектов или п роду ктов, об у словленной микроорганизмами. Перечисленные исследования вып олняю тся б актериологическими лаб ораториями санитарноэп идемиологических станций вп лановом п орядке и п о эп идемическим п оказаниям. Санитарная микроб иология исп ользу етдваосновных методаоценки санитарно-эп идемиологического состояниявнеш ней среды: 1. М етод п рямого об нару ж ения возб у дителя. Н аиб олее точный и надеж ный критерий оценки эп идемиологической оп асности внеш ней среды. О днако неп осредственное об нару ж ение п атогенных микроб ов в об ъ ектах внеш ней среды, как п равило, соп ряж ено с б ольш ими тру дностями, иб о встречаю тся они неп остоянно, главным об разом в п ериод эп идемических всп ыш ек и в окру ж ении б актерионосителей, п редставляя ничтож но малу ю величину п о сравнению с п остоянной, неп атогенной микроф лорой исследу емого об ъ екта. 2. М етод косвенного оп ределения возмож ного п рису тствия возб у дителя во внеш ней среде. С этой целью оп ределяю т микроб ну ю об семененность об ъ екта и п роводят об нару ж ение в нем санитарноп оказательных микроорганизмов. О микроб ной об семененности су дят п о микр о бно му числ у – это об щ ее количество микроорганизмов, содерж ащ ееся вединицеоб ъ емаили 3 3 массы исследу емого об ъ екта (в1 см воды, 1 г п очвы, 1 м возду ха). Содерж ание санитарно-п оказательных б актерий оценивается п о двум п оказателям - титру и индексу . Тит р о м называется тот минимальный об ъ ем или масса, вкоторых об нару ж иваю тсяданныеб актерии; инд ексо м количество санитарно-п оказательных б актерий, содерж ащ ихся в 1 л 3 ж идкости, 1 гп лотных вещ еств, 1 м возду ха. К санитарно-п оказательным б актериям относятся п редставители об лигатной микроф лоры организмачеловекаи теп локровных ж ивотных, для которых средой об итания являю тся киш ечник или возду ш нодыхательныеп у ти (таб л.5). Т аблица 5. Санитарно-п оказательныеб актерии окру ж аю щ ей среды О б ъ ект В ода Почва

В озду х

Х арактер загрязнения Ф екальное

Санитарно-п оказательныеб актерии

Бактерии гру п п ы киш ечной п алочки (БГК П): Escherichia coli, Citrobacter freundii, Streptococcus faecalis Ф екальное БГК П, клостридии ( Clostridium perfringrns, Cl. sporogenes и др.), термоф ильные б актерии, Proteus vulgaris. О рально-кап ельное Staphylococcus aureus, S. pyogenes

42

Санитарно-п оказательные б актерии об ладаю т следу ю щ ими свойствами: 1) п остоянно выделяю тся вб ольш ом количестве с калом или кап ельками слизи из возду ш но-дыхательных п у тей; 2) не имею т дру гих мест об итания; 3) сп особ ны сохраняться вокру ж аю щ ей среде втечение тех ж е сроков, что и п атогенные б актерии, п аразитиру ю щ ие вкиш ечнике или возду ш но-дыхательных п у тях; 4) не сп особ ны интенсивно размнож аться накаких-либ о об ъ ектах вне организмахозяинаи изменять свои свойства. Санитарно-п оказательные б актерии гру п п ы киш ечных п алочек (БГК П) п ринадлеж ат к разным родам семейства энтероб актерий. И х диф ф еренциру ю т п о различным п ризнакам. О б щ им является то, что все п редставители гру п п ы киш ечной п алочки - мелкие, тонкие б актерии, с закру гленными концами, неокраш иваю щ иеся п о Граму и сб раж иваю щ иес об разованием кислоты и газа лактозу , глю козу , маннит, мальтозу и в некоторых слу чаях сахарозу . О б нару ж ение Е . со li в разных об ъ ектах окру ж аю щ ей среды, п ищ евых п роду ктах считаетсянаиб олеедостоверным п оказателем свеж его ф екального загрязнения. Н аличие в этих ж е об ъ ектах б актерий родов Сitrо bа сtеr и Е ntеrо bа сtеr у казывает наотносительно давнее ф екальное загрязнение. Прису тствие Сl. р еrfringеns, Сl. sр о rо gеnеs и дру гих клостридий вп очве свидетельствует о ее ф екальном загрязнении, п ричем как свеж ем, так и давнем, п оскольку эти б актерии об разу ю т сп оры, что п озволяет им длительно п ереж ивать вокру ж аю щ ей среде (вчастности, в п очве). Т ермоф ильные б актерии вклю чаю т гру п п у разных б актерий (Lа сtо bа сillus lа сtis, Stг ер tо со ссus thег mо р hilus и др.), размнож аю щ ихсяп ри темп ерату ре 60 °С и выш е. О ни не являю тся п остоянными об итателями киш ечника человека и не слу ж ат критериями ф екального загрязнения окру ж аю щ ей среды. Резкое у величение количества этих б актерий в саморазогреваю щ емся навозе и комп остах мож ет свидетельствовать о загрязнении п очвы разлагаю щ имисяотб росами. Бактерии, п ринадлеж ащ иек роду Р г о tеus (Р . vulgа ris и др.) семейства Е ntег о bа сtег iа сеа е, ш ироко расп ространены вп рироде. Э ти гнилостные б актерии вб ольш ом количестве встречаю тся наразлагаю щ ихся останках ж ивотных и растений. О б нару ж ениеэтих б актерий вкаких-либ о п ищ евых п роду ктах свидетельствуето гнилостном расп аде. О б нару ж ение воб ъ ектах окру ж аю щ ей среды Strер tо со ссus fа еса lis свидетельствует об их ф екальном загрязнении. Гемолитические стреп тококки (S. р уо gеnes), являясь транзитными об итателями носоглотки и зева, выделяю тся с кап ельками слизи орально-кап ельным п у тем. Сроки выж ивания гемолитических стреп тококков в окру ж аю щ ей среде п рактически не отличаю тся от сроков, характерных для б ольш инства дру гих возб у дителей возду ш но-кап ельных инф екций. О б нару ж ение гемолитических стреп тококков в возду хе п омещ ений у казывает на возмож ное его загрязнение микроорганизмами, содерж ащ имися в зеве,

43

носоглотке, верхних дыхательных п у тях человека и являю щ имися возб у дителями возду ш но-кап ельных инф екций. Stа р hуlо со ссus а urеus является ф аку льтативным об итателем носоглотки, зева, атакж е кож ных п окрововчеловека. Е го п рису тствие в возду хе п омещ ений или на находящ ихся там п редметах является п оказателем орально-кап ельного загрязнения. О дновременное об нару ж ение золотистого стаф илококка и гемолитических стреп тококков свидетельствует о высокой степ ени загрязнениявозду ха. Т ема7.1. М И К РО Ф Л О РА В О Д Ы В ода является естественной средой об итания разнооб разных микроорганизмов. По характеру п ользования выделяю т: п итьевую воду , воду п лавательных б ассейнов, сточные воды. М икроб иологические исследования п итьевой воды п роводят в соответствии с СанПиН (санитарные нормы и п равила) 2.1.4.10.74-01 «Питьевая вода гигиеническая. Т реб ования качества воды централизованных систем п итьевого водоснаб ж ения. К онтроль качества». Безоп асность п итьевой воды вэп идемиологическом отнош ении оп ределяется ее соответствием нормативам п о микроб иологическим п оказателя(таб л. 6). Т аблица 6. Н ормативы микроб иологических п оказателей п итьевой воды Показатели Т ермотолерантные колиф ормные б актерии (Т К Б) О б щ ие колиф ормные б актерии (О К Б) О б щ ее микроб ное число (О М Ч ) К олиф аги Сп оры су льф итреду циру ю щ их клостридий

Е диницы измерения Ч исло б актерий в100 мл

Н ормативы О тсу тствие

Ч исло б актерий в100 мл

О тсу тствие

Ч исло б актерий, об разу ю щ их Н еб олее50 колонии в1 мл Ч исло б ляш кооб разу ю щ их О тсу тствие единиц в100 мл Ч исло сп ор в20 мл О тсу тствие

Превыш ение нормативовне доп у скается в95 п роб ах, отб ираемых в течение12 месяцевп ри об щ ем количественеменее100. При об нару ж ении вп роб ах Т К Б и О К Б п роводитсяих оп ределениевп овторных п роб ах. При п овторном об нару ж ении п роводитсяисследованиенаналичиеп атогенных б актерий киш ечной гру п п ы и энтерококков. Сп оры клостридий оп ределяю т п ри оценке эф ф ективности технологии об раб отки воды. К олиф аги оп ределяю т в системах водоснаб ж ения и с п оверхностных источниковп еред п одачей врасп ределительну ю сеть.

44

За д а ниед л я вы по л нения л а бо р а т о р но й р а бо т ы О су щ ествить заб ор п роб ы воды из водоп роводного крана. Провести оп ределение об щ его числа микроорганизмов, об разу ю щ их колонии на п итательном агаре. Провести п осев п роб с целью количественного оп ределенияО К Б и Т К Б титрационным методом. М ет о д ическиеука за ния Санитарно-микроб иологический анализ п роводится согласно методическим у казаниям М У К 4.2.10.18-01. О т бо р , х р а нениеи т р а нспо р т ир о ва ниепр о б О тб ор п роб п роизводит сп ециально об у ченный сотру дник. Проб ы отб ираю т встерильные ф лаконы с резиновыми п роб ками и б у маж ными колп ачками. При отб ореп роб водной и той ж еточкедляразличных цеп ей п ервыми отб ираю т п роб ы для б актериологических исследований. Е сли отб ираю т воду п осле об еззараж ивания химическими реагентами (нап ример, хлорированну ю воду ), то для нейтрализации остаточного количествадезинф ектантавемкость, п редназначенну ю для отб орап роб , вносятдо стерилизации натрий серноватисто-кислый ввидекристалловиз расчета 10 мг на 500 мл воды. При исследовании воды из расп ределительных сетей отб ор п роб из крана п роизводят п осле п редварительной его стерилизации об ж иганием и п оследу ю щ его сп у ска воды не менее 10 мин п ри п олностью открытом кране. При отб оре п роб ы нап ор воды долж ен б ыть у меньш ен. При отб оре из кранас п остоянным п отоком воды об ж иг кранане п роводят, нап ор не меняю т. Проб ки п ри трансп ортировке не долж ны смачиваться водой. В соп роводительном доку менте отмечаю т место, дату и время заб ора, Ф .И .О . сп ециалистаи цель исследования. Д оставку п роб осу щ ествляю т в контейнерах-холодильниках п ри темп ерату ре(4 - 10) °С. В холодный п ериод годаконтейнеры долж ны б ыть снаб ж ены термоизолиру ю щ ими п рокладками, об есп ечиваю щ ими п редохранение п роб от п ромерзания. В ремя доставки не долж но п ревыш ать 6 часов. Е сли п роб ы нельзя охладить, то анализ следу ет п ровести в течение 2 часов п осле заб ора. Е сли не соб лю дено время доставки п роб ы и темп ерату рахранения, то анализ п роб ы п роводить не следу ет. П о д г о т о вка по суд ы Посу ду стерилизу ю т су хим ж аром п ри 160 °С 2 часа, п ри 180 °С 1 час. Срок хранения стерильной п осу ды не б олее 10 дней. После вып олнения анализа всю исп ользованну ю п осу ду автоклавиру ю т п ри 126°С втечение1 часа. О пр ед ел ение о бщ ег о числ а микр о о р г а низмо в, о бр а зующ их ко л о нии на пит а т ел ьно м а г а р е М етод оп ределяет в п итьевой воде об щ ее число мезоф ильных аэроб ных и ф аку льтативно анаэроб ных микроорганизмов (О М Ч ),

45

сп особ ных об разовывать колонии нап итательном агаре п ри темп ерату ре 37 °С втечение24 ч, видимыес у величением в2 раза. И з каж дой п роб ы делаю т п осевне менее двух об ъ емовп о 1 мл. После тщ ательного п еремеш ивания п роб ы воды вносят п о 1 мл в стерильные чаш ки Петри, слегкап риоткрывая крыш ки. После внесения воды вкаж ду ю чаш ку вливаю т (8 – 12) мл(начаш ку диаметром 90 - 100 мм) расп лавленного и осту ж енного до (45 – 49) °С п итательного агара. Затем б ыстро смеш иваю т содерж имое чаш ек, равномерно расп ределяя п о всему дну , изб егая об разования п у зырьковвозду ха, п оп адания агарана края и крыш ку чаш ки. Э ту п роцеду ру п роизводят на горизонтальной п оверхности, гдечаш ки оставляю тдо застыванияагара. Послезастывания агарачаш ки с п осевами п омещ аю т втермостат вверх дном и инку б иру ю т п ри темп ерату ре(37 ± 1) °С втечение(24 ± 2) ч. Учет р езул ьт а т о в Подсчитываю т все выросш ие начаш ке колонии, наб лю даемые п ри у величении в2 раза. У читываю ттолько те чаш ки, накоторых выросло не б олее 300 изолированных колоний. К оличество колоний наоб еих чаш ках су ммиру ю т и делят на два. Резу льтат выраж аю т числом колониеоб разу ю щ их единиц (К О Е ) в1 млисследу емой п роб ы воды. Е сли на одной из 2 чаш ек п одсчет невозмож ен, резу льтат выдаю т на основании у четаколоний наодной чаш ке. Е сли надвух чаш ках имеет место рост расп лывчатых колоний, не расп ространяю щ ийся на всю п оверхность чаш ки, или выросло б олее 300 колоний и анализ нельзя п овторить, п одсчитываю т сектор чаш ки с п оследу ю щ им п ересчетом на всю п оверхность. В этих слу чаях вп ротоколеотмечаю т«число К О Е / млориентировочно» . Е сли п одсчет колоний на чаш ках невозмож ен, то в п ротоколе отмечаю т«сп лош ной рост» . О пр ед ел ениео бщ их и т ер мо т о л ер а нт ны х ко л ифо р мны х ба кт ер ий О бщ ие ко л ифо р мны е ба кт ер ии (О КБ ) - грамотрицательные, оксидазоотрицательные, необ разу ю щ иесп ор п ап очки, сп особ ныерасти на диф ф еренциальных лактозных средах, ф ерментиру ю щ ие лактозу до кислоты, альдегидаи газап ри темп ерату ре(37 ± 1) °С втечение(24- 48) ч. Тер мо т о л ер а нт ны е ко л иф о р мны е ба кт ер ии (ТКБ ) входят вчисло об щ их колиф ормных б актерий, об ладаю т всеми их п ризнаками и, кроме того, сп особ ны ф ерментировать лактозу до кислоты, альдегидаи газап ри темп ерату ре(44 ± 0,5) °С втечение24 ч. Д ляоп ределенияО К Б и Т К Б исп ользу ю тдваметода: 1. М ет о д о м мембр а нно й фил ьт р а ции (о сно вно й мет о д ) М етод основан наф ильтрации у становленного об ъ емаводы через мемб ранные ф ильтры, выращ ивании п осевов на диф ф еренциальной п итательной среде с лактозой и п оследу ю щ ей идентиф икации колоний п о ку льту ральным и б иохимическим свойствам.

46

2. О пр ед ел ениеО КБ и ТКБ т ит р а цио нны м мет о д о м Д анный метод исп ользу ю т: • п ри отсу тствии материалов и об ору дования, необ ходимых для вып олненияанализаметодом мемб ранной ф ильтрации; • п ри анализеводы с б ольш им содерж анием взвеш енных вещ еств; • в слу чае п реоб ладания в воде п осторонней микроф лоры, п реп ятствую щ ей п олу чению наф ильтрах изолированных колоний об щ их колиф ормных б актерий. П р инцип мет о д а М етод основан на накоп лении б актерий п осле п осева у становленного об ъ ема воды в ж идку ю п итательну ю среду , с п оследу ю щ им п ересевом на диф ф еренциальну ю п лотну ю п итательну ю среду с лактозой и идентиф икации колоний п о ку льту ральным и б иохимическим тестам. Вы по л нениеа на л иза При исследовании п итьевой воды ка чест венны м мет о д о м (теку щ ий санэп иднадзор, п роизводственный контроль) засеваю т3 об ъ емап о 100 мл. При исследованиях воды с целью ко л ичест венно г о о пр ед ел ения О К Б и Т К Б п ри п овторном анализе п роизводят п осев: 3 об ъ емовп о 100 мл, 3 об ъ емовп о10 мл, 3 об ъ емовп о1 мл. К аж дый об ъ ем исследу емой воды засеваю т в лактозо-п еп тонну ю среду . Посев 100 мл и 10 мл воды п роизводят в 10 и 1 мл концентрированной лактозо-п еп тонной среды, п осев1 млп роб ы п роводят в10 млсреды об ычной концентрации. Посевы инку б иру ю тп ри (37 ± 1) °С втечение48 ч. Н еранее24 часа инку б ации п роводят п редварительну ю оценку п осевов. И з емкостей, где отмечено наличие роста (п ому тнение) и об разование газа, п роизводят высевб актериологической п етлей насекторасреды Э ндо для п олу чения изолированных колоний. Е мкости б ез наличия ростаи об разования газа оставляю твтермостатеи окончательно п росматриваю тчерез 48 ч. Посевы б ез п ризнаков роста считаю т отрицательными и дальнейш ему исследованию они не п одлеж ат. И з емкостей, где отмечено п ому тнение и об разование газаили только п ому тнение, делаю т высевнасекторасреды Э ндо. Посевы насреде Э ндо инку б иру ю т п ри темп ерату ре (37 ± 1) °С в течение(18-20) ч. При об разовании п ому тнения и газавсреденакоп ления и росте на среде Э ндо колоний, тип ичных для лактозоп олож ительных б актерий: темно-красных или красных, с металлическим б леском или б ез него, вып у клых с красным центром и отп ечатком нап итательной среде, даю тп олож ительный ответнап рису тствиеоб щ их колиф ормных б актерий вданном об ъ емеп роб ы. Н аличие О К Б треб у ется п одтвердить, если в среде накоп ления отмечено только п ому тнение и/или если п ринадлеж ность к лактозоп олож ительным колониям вызывает сомнение у исследователя.

47

В этих слу чаях: 1) п роверяю т наличие отп ечатканасреде Э ндо п осле снятияп етлей п одозрительной колонии; 2) вып олняю токсидазный тест; 3) п одтверж даю т п ринадлеж ность к Граму ; 4) п одтверж даю т сп особ ность к газооб разованию п ри п осевеизолированных 1 - 2 колоний каж дого тип ас каж дого секторанасреду с лактозой с п оследу ю щ ей инку б ацией п осевов п ри темп ерату ре(37 ± 1) °С втечение(24 - 48) ч. При отсу тствии изолированных колоний п роводят рассевнасреду Э ндо об щ еп ринятыми б актериологическими методами. О трицательный ответдаю т, если: • всреденакоп лениянетп ризнаковроста; • насекторах среды Э ндо нетроста; • на секторах среды Э ндо выросли не характерные для колиф ормных б актерий колонии (п розрачныес неровными краями, расп лывчатыеи т. п .); • всеколонии оказались оксидазоп олож ительными; всеколонии оказались грамп олож ительными; • если в п одтверж даю щ ем тесте на среде с у глеводом не отмечено газооб разования. Д ля оп ределения т ер мо т о л ер а нт ны х ко л ифо р мны х ба кт ер ий раб отаю т с секторами среды Э ндо, где выросли тип ичные лактозоп олож ительные колонии. Д елаю т п осев 2 - 3 изолированных колоний каж дого тип ас каж дого секторавп роб ирки с лю б ой из лактозных сред. Среду п еред п осевом нагреваю тнаводяной б анеили втермостатедо 44 °С. Н емедленно п осле п осева п роб ирки п омещ аю т в термостат и инку б иру ю т п ри темп ерату ре (44 ± 0,5) °С втечение 24 ч. Д оп у скается п росмотр п осевовчерез (4 - 6) ч. При об разовании газа в среде накоп ления, росте на среде Э ндо лактозоп олож ительных б актерий и выявлении сп особ ности этих б актерий ф ерментировать лактозу до кислоты и газавтечение24 ч п ри темп ерату ре 44 °С даю т п олож ительный ответ наналичие вэтом об ъ еме п роб ы воды Т К Б. В о всех остальных слу чаях даю тотрицательный ответ. Д оп у стимо для у скорения выдачи ответа на п рису тствие Т К Б п роизводить высев 1 мл из об ъ емов среды накоп ления, где отмечено п ому тнение и газооб разование вп роб ирке с лактозо-п еп тонной средой с п оп лавком и п рогретой п редварительно до темп ерату ры 44 °С. Посевы выдерж иваю т втермостате п ри темп ерату ре (44 ± 0,5) °С втечение 24 ч. При об нару ж ении кислоты и газадаю тп олож ительный ответ. Учет р езул ьт а т о в При исследовании 3 об ъ емовп о 100 мл резу льтаты оцениваю тся качественно и п ри об нару ж ении О К Б и Т К Б хотяб ы водном из 3 об ъ емов, делаетсязап ись вп ротоколе«об нару ж ены в100 мл» . При отрицательном ответе на наличие OKБ и Т К Б во всех исследованных об ъ емах выдаю тзаклю чение вп ротоколе«не об нару ж ены в100 мл» .

48

П о ст а но вка о ксид а зно г о т ест а Полоску ф ильтровальной б у маги п омещ аю т в чаш ку Петри, смоченной реактивом для оксидазного теста. Ч асть колоний п етлей наносят ш трихом нап олоску . Реакция считается п олож ительной, если в течение 1 мин. п оявляется ф иолетово-коричневое или синее окраш ивание ш триха. При отрицательной реакции цвет вместе нанесения ку льту ры не меняется. При п олож ительном резу льтате эту колонию из дальнейш их исследований исклю чаю т. Т ема7.2. М И К РО Ф Л О РА В О ЗД У Х А В озду х является средой, вкоторой микроорганизмы не сп особ ны размнож аться, что об у словлено отсу тствием п итательных вещ еств, недостатком влаги. Ж изнесп особ ность микроорганизмов в возду хе об есп ечиваю т взвеш енные частички воды, п ыли, п очвы. М икроф лора возду ха п остоянно меняется, об новляется п од воздействием солнечных лу чей, темп ерату ры, атмосф ерных осадкови т.п . А тмосф ерный возду х и возду х закрытых п омещ ений значительно различается п о качественному и количественному составу микроф лоры. Бакоб семененность ж илых п омещ ений значительно выш еоб семененности атмосф ерного возду ха. В атмосф ерном возду хе содерж ится б ольш ое количество микроб ов-сап роф итов, п оп адаю щ их ввозду х из п очвы. Среди них находятсясп орооб разу ю щ иеп алочки, п игментныеб актерии, гриб ки и дрож ж и. В возду хе закрытых п омещ ений наряду с б езвредными сап роф итами об нару ж иваю тся п атогенные микроорганизмы, вызываю щ ие п атологические п роцессы наслизистых об олочках п олости ртаи верхних дыхательных п у тей, нап ример б актерии диф терии, коклю ш а, ту б ерку леза. Патогенные микроб ы выделяю тся б ольным человеком или б актерионосителем с мельчайш ими частицами слю ны и слизи во время каш ля, чихания, смехаи разговора. М икроб иологический анализ возду ха на п атогенну ю микроф лору п роизводят только п о эп идемическим п оказаниям. Д ля п овседневной санитарно-гигиенической оценки возду хаоп ределяю т. 3 1. О б щ ееколичество микроб ов, находящ ихсяв1 м возду ха. 2. К оличество в том ж е об ъ еме возду ха санитарно-п оказательных α-зеленящ их микроб ов (β-гемолитических, стреп тококков и гемолитических стаф илококков). По концентрации этих микроб ов оп ределяю т степ ень загрязнения возду ш ной среды, аналогично тому , как п о титру киш ечной п алочки оцениваю ткачество п итьевой воды. О б нару ж ение в возду хе закрытых п омещ ений β-гемолитического стреп тококка и стаф илококка, об ладаю щ его п ризнаками п атогенности, являетсяп оказателем эп идемического неб лагоп олу чияданного об ъ екта. Л аб оратории санитарно-эп идемиологических станций в п лановом п орядке п одвергаю т б актериологическому об следованию возду х различных об ъ ектов: ясель, детских садов, ш кол, б ольниц, кинотеатров.

49

При исследовании возду ха закрытых п омещ ений реш аю щ ее значение имеет сп особ выделения микроорганизмов из возду ха. В зависимости от п ринцип а у лавливания б актерий микроб иологические методы исследования возду ха п одразделяю тся на седиментационные и асп ирационные. При п омощ и седиментационных методовмож но п олу чить об щ ее п редставление о встречаю щ ихся в возду хе микроорганизмах. А сп ирационные методы даю т возмож ность оп ределить не только качественное, но и количественное содерж ание б актерий воп ределенном об ъ емевозду ха. За д а нuед л я вы nо л ненuя л а бо р а т о р но й р а бо т ы Провести исследованиевозду хаседиментационным методом с целью оп ределенияО М Ч . М ет о д ическиеука за ния О т бо р пр о б во зд ух а сед имент а цио нны м мет о д о м Седиментационный метод основан нап ринцип е оседания микроб ов из возду хап од действием силы тяж ести нагоризонтальну ю п оверхность. При отб оре п роб возду ха седиментационным методом открытые чаш ки Петри, зап олненныеп лотной п итательной средой, у станавливаю тв нескольких точках п омещ ения, нагоризонтальной п оверхности п олаили стола. Д ля оп ределения об щ ей микроб ной об семененности возду ха п ользу ю тся М ПА . Д ля качественного анализа микроф лоры возду ха п рименяю т элективные п итательные среды, нап ример, для выделения стаф илококков- Ж СА , для гемолитических стреп тококков- среду Гарро, дляб актерий диф терии - сверну ту ю сыворотку (среду Л еф ф лераили Ру ). В зависимости от п редп олагаемой степ ени б актериального загрязнения возду хаэксп озиция чаш ек п родолж ается от 5 мин. до 1 часа. Н ап ример, чаш ки с М ПА эксп ониру ю тся15 мин., ас Ж СА - 40-60 мин. По истечении намеченного времени чаш ки закрываю т и п омещ аю т на24 - 48 часовв термостат п ри 37 °С. Н а следу ю щ ий день п одсчитываю т количество колоний, выросш их наМ ПА . Ч аш ечный метод не п озволяет оп ределить об ъ ем возду ха, из которого осели микроорганизмы, выросш ие на п оверхности п итательной среды. Поэтому резу льтат анализа выраж аю т средним числом колоний, выросш их нап оверхности п итательной среды в чаш ках Петри, с у казанием времени их эксп озиции. В настоящ ее время чаш ечным методом п ользу ю тся для ориентировочного оп ределения б актериальной загрязненности возду ха. Е сли выросло менее 250 колоний, то возду х считается чистым, если 250 -500 колоний – загрязненный в средней степ ени, б олее500 колоний – загрязненный. При п росмотре чаш ек Петри с элективными п итательными средами об ращ аю т внимание наколонии, характерные для микроб а, выделяемого наданной п итательной среде. Н ап ример, наЖ СА выявляю т колонии с п ризнаками, тип ичными длястаф илококка. И з колоний, п одозрительных натот или иной вид микроб а, готовят мазки, окраш иваю т их п о Граму и микроскоп иру ю т, азатем выделяю т

50

чисту ю ку льту ру для изу чения ее свойств и оп ределения видовой п ринадлеж ности, п ользу ясь дляэтой цели об щ еп ринятыми методами. О т бо р пр о б во зд ух а а спир а цио нны м мет о д о м Более точный количественный метод оп ределения микроб ного числа возду ха. Посев возду ха осу щ ествляется с п омощ ью п риб оров (нап ример, «SAS SUPER 90» ф ирмы SIMAS), констру кция которых основана на п ринцип е у дарного действия стру и возду ха. В озду х всасывается с оп ределенной скоростью через крыш ку с отверстием оп ределенной конф игу рации. Поток возду ханап равляется нап оверхность п итательной среды. Затем чаш ку с п итательной средой инку б иру ю т24 - 48 часов в термостате п ри 37 °С. В ыросш ие колонии п одсчитываю т п о 3 сп ециальной ф орму ле, оп ределяю тО М Ч в1 м возду ха. Д ля оп ределения О М Ч исп ользу ю т М ПА , для оп ределения золотистого стаф илококка– Ж СА , для β-гемолитического стреп тококка– кровяной агар. Т ема7.3. М И К РО Ф Л О РА ПО Ч В Ы Почваявляется резервуаром и естественной средой об итания ряда микроорганизмов. В состав п очвенной микроф лоры входят сп орооб разу ю щ иеб актерии, актиномицеты, сп ирохеты, п ростейш ие, синезеленыеводоросли, гриб ы, виру сы. Патогенные микроорганизмы п оп адаю т вп очву с исп раж нениями, мочой, гноем, мокротой, слю ной и дру гими выделениями, с тру п ами лю дей и ж ивотных, п огиб ш их от инф екционных заб олеваний. Поп адая в п очву, значительная часть п атогенных микроорганизмов, не об разу ю щ их сп ор, рано или п оздно п огиб ает. Сроки выж ивания вп очве возб у дителей киш ечных инф екций (дизентерии, б рю ш ного тиф а, холеры), чу мы, б ру целлеза, ту ляремии, ту б ерку лезаш ироко варьиру ю т и составляю т от нескольких часовдо нескольких месяцев. О тмираниеп атогенных б актерий вп очве зависит от рядап ричин: высу ш ивания; отсу тствия необ ходимых п итательных су б стратов; действия антиб иотических вещ еств, выраб атываемых п очвенными б актериями и гриб ами; солнечных лу чей; б актериоф агов и т. п . Значительно дольш е в п очве сохраняю тся сп орооб разу ю щ ие п атогенные б актерии - аэроб ные (сп оры В. anthracis сохраняю тсявп очвесвыш е15 лет) и анаэроб ные- возб у дители столб няка, газовой гангрены, б оту лизма(их сп оры такж есохраняю тсявп очвемногие годы, а п ри б лагоп риятных у словиях п рорастаю т и б актерии размнож аю тся, п оддерж ивая тем самым свое су щ ествование в п очве). Поэтому п очваиграетосновну ю роль вэп идемиологии столб няка, газовой гангрены (особ енно в военных у словиях) и б оту лизма, она является основным резервуаром возб у дителей этих заб олеваний. При санитарно-микроб иологическом анализе п очвы оп ределяю т об щ ее микроб ное число, коли-титр, п ерф рингенс-титр и титр термоф ильных б актерий. В необ ходимых слу чаях исследу ю т состав

51

нитриф ициру ю щ их и аммониф ициру ю щ их б актерий, актиномицетов, гриб ов, целлю лозных и дру гих микроорганизмов. За д а ния д л я вы по л нения л а бо р а т о р но й р а бо т ы 1. О п ределить микроб ноечисло п очвы, сделать заклю чение. 2. Провести оценку санитарно-б актериолоrическогосостоянияп очвы п о резу льтатам оп ределения коли-титра, п ерф рингрнс-титра и титра термоф ильных б актерий. М ет о д ическиеука за ния О пр ед ел ениемикр о бно г о числ а по чвы Почву б еру тнаглу б ине10-15 см стерильным нож ом (из разных мест исследу емой территории не менее 10 п роб ) и п омещ аю т встерильну ю б анку . И з п роб готовятнавеску (30 г), котору ю вносятвколб у с водой (270 мл) и тщ ательно встряхиваю т. И з п олу ченной су сп ензии готовят -3 -4 -5 разведения l0 , l0 , 10 . И з двух п оследних разведений б еру т 0,1 мли смеш иваю т с 40 мл 0,7 % расп лавленного и осту ж енного до 45 °С п итательного агара, п осле чего выливаю т вторым слоем вчаш ки Петри с 2% п итательным агаром. Посевы инку б иру ю т п ри 37 °С. Затем п одсчитываю т количество выросш их колоний и оп ределяю т микроб ное число. О пр ед ел ение ко л и-т ит р а , пер фр инг енс-т ит р а и т ит р а т ер мо фил ьны х ба кт ер ий по чвы Различные разведения п очвенной су сп ензии засеваю т п о 1 мл в п роб ирки со средой К есслераи инку б иру ю т п ри 43 °С втечение 48 ч. В дальнейш ем анализ п роводят п о схеме, п рименяемой п ри оп ределении коли-титраводы. Д ля оп ределения п ерф рингенс-титра различные разведения п очвенной су сп ензии п о 1 мл засеваю т в п роб ирки со стерильным об езж иренным молоком или ж елезосу льф итной средой В ильсона-Блера. Посевы инку б иру ю тп ри 43 °С втечение24 - 48 ч., п ослечего у читываю т резу льтаты п о свертыванию молокаили п о об разованию черных колоний Сlо stridium р еrfringеns в агаровом столб ике среды В ильсона-Блера. И з колоний делаю т мазки, окраш иваю т п о Граму , микроскоп иру ю т и вычисляю тп ерф рингенс-титр. Со ст а в ср ед . Среда К есслера: 1 % п еп тона, 5 % ж елчи, 0,25 % лактозы, генциановый ф иолетовый для п одавления роста грамп олож ительных б актерий. Ж елезосу льф итная средаВ ильсона-Блера: 3 % п итательного агара, 1 % глю козы, 2 % су льф итанатрия, 0,08 % хлоридаж елеза. Д ля оп ределения титра термоф ильных б актерий разведения п очвенной су сп ензии п о 1 мл вносят в чаш ки Петри, заливаю т расп лавленным и охлаж денным п итательным агаром. Посевы инку б иру ю т втечение су ток п ри 60 °С, а затем п одсчитываю т количество выросш их колоний и п ересчитываю тна1 гп очвы.

52

Санитарно-микроб иологическу ю оценку п очвы п роизводят п о комп лексу п оказателей, из которых наиб олее важ ным является у становлениестеп ени ф екального загрязнения(таб л. 7). Т аблица 7. О ценка санитарного состояния п очвы п о основным микроб иологическим п оказателям Х арактеристика К оли-титр Перф рингенсК оличество п очвы титр термоф ильных б актерий в1 гп очвы 2 3 Ч истая 1,0 и выш е 0,01 и выш е 10 -10 3 4 Загрязненная 0,9-0,01 0,009-0,0001 О т10 до 10 Сильно 0,009 и ниж е0,00009 и ниж е О т105 до 4х106 загрязненная Т ема7.4. М И К РО БИ О Л О ГИ Ч Е СК И Й К О Н Т РО Л Ь В А ПТ Е К А Х За д а ниед л я вы по л нения л а бо р а т о р но й р а бо т ы Провести микроб иологическое исследование смывов с раб очей п оверхности до и п осле п роведения дезинф екции. Провести оценку резу льтатов. М ет о д ическиеука за ния О б ъ ектами б иологических исследований являю тся: 1. В одадистиллированная. 2. И нъ екционныерастворы до стерилизации. 3. И нъ екционныерастворы п ослестерилизации. 4. Глазные кап ли, п риготовленные настерильных растворах и п осле стерилизации. 5. Су хие лекарственные вещ ества, исп ользу емые для п риготовления инъ екционных растворов. 6. А п течная п осу да, п роб ки, п рокладки, п рочие всп омогательные материалы. 7. И нвентарь, об ору дование, ру ки и санитарнаяодеж дап ерсонала. В озду ш наясреда. О тб ор п роб для исследования п роводят сотру дники санитарноэп идемиологических станций или раб отники б актериологической лаб оратории. К ратность об следований с отб ором п роб составляетнеменее 2-х раз вквартал. 1. И ссл ед о ва ниед ист ил л ир о ва нно й во д ы : а ) О пр ед ел ение ко л ичест ва мезо фил ьны х а эр о бны х и фа кул ьт а т ивны х 3 а на эр о бны х ба кт ер ий в 1 см д ист ил л ир о ва нно й во д ы . 3 И сследу ему ю воду вносятп о 1 см вдвеп араллельныечаш ки Петри, которые затем заливаю т п итательным агаром и выдерж иваю т24 часап ри темп ерату ре 37 °С и 24 часап ри комнатной темп ерату ре. После этого п одп итываю т число выросш их колоний как нап оверхности, так и вну три п итательного агара. При вычислении резу льтатованализавыводятсреднее ариф метическоеиз числаколоний, выросш их наоб еих чаш ках.

53 3

б) Дл я вы явл ения пл есневы х и д р о ж ж евы х г р ибо в засеваю т п о 0,5 см исследу емой воды нап оверхность двух чаш ек Петри со средой Саб у ро и инку б иру ю т п ри темп ерату ре 20 - 22 °С втечение 3 - 4 су ток. Затем п одсчитываю т число колоний п лесневых и дрож ж евых гриб овнаоб еих чаш ках. Резу льтаты оцениваю т п о об щ ему количеству неп атогонных микроорганизмов, п у тем су ммирования числа б актерий выросш их на чаш ках с п итательным агаром и насредеСаб у ро (Приказ М инздраваСССР № 573 от30.11.62, п рилож ение№ 1). О п ределение титраб актерий гру п п ы киш ечной п алочки (М етодика действую щ его Госстандарта18963-73 «В одап итьевая, М етоды санитарноб актериологического анализа». 2. И ссл ед о ва ние д ист ил л ир о ва нно й во д ы д л я пр иг о т о вл ения инъекцио нны х р а ст во р о в и г л а зны х ка пел ь, инъекцио нны х р а ст во р о в д о ст ер ил иза ции г л а зны х ка пел ь, пр иг о т о вл енны х в а септ ических усл о виях на ст ер ил ьны х о сно ва х а ) О пр ед ел ение ко л ичест ва мезо фил ьны х а эр о бо в и фа кул ьт а т ивны х а на эр о бо в п роизводятвсоответствии с п у нктом 1а. 3 б) О пр ед ел ение на л ичия ба кт ер ий г р уппы кишечны х па л о чек в 1,0 см . 3 3 Л екарственные средства засеваю т в количестве 1 г (см ) на 9 см разведенной глю козо-п еп тонной среды, среды К есслер и К ода. Посевы выращ иваю тп ри темп ерату ре37 °С втечение18 - 24 часовс дальнейш им высеном секторами на среду Э ндо, п оследню ю инку б иру ю т п ри темп ерату ре 37 °С 18 - 24 часа и п роводят п росмотр п осевов. И з п одозрительных колоний делаю т мазки, красят п о Граму и микроскоп иру ю т. При наличии грамотрицатедьных п алочек, оставш у ю ся часть колоний п ересеваю т на глю козо-п еп тонну ю среду с п оп лавком, инку б иру ю тп ри37 °С втечение 18 - 24 часов. Н аличие кислоты и газана глю козо-п еп тонной среде об у словливает содерж ание б актерии гру п п ы киш ечных п алочек. в) Ко л ичест венно е о пр ед ел ение ба кт ер ии г р уппы кишечны х па л о чек. 1 г 3 (см ) лекарственных средствзасеваю т начаш ку и заливаю т средой Э ндо, т.е. п рименяю т глу б инный метод п осева. После инку б ации п осевовп ри темп ерату ре 37 °С втечение 18 - 24 часову читываю т колонии тип ичные дляб актерий гру п п ы киш ечной п алочки. 3. И ссл ед о ва ние сух их л ека р ст венны х вещ ест в, испо л ьзуемы х д л я пр иг о т о вл ения инъекцио нны х р а ст во р о в и г л а зны х ка пел ь Резу льтаты п олу ченные п ри исследовании су хих лекарственных вещ еств слу ж ат одним из оснований для выб ора п артии п ри п риготовлении инъ екционных растворов. Су хие лекарственные вещ ества разводят стерильной дистиллированной водой с целью создания соответствую щ их концентраций инъ екционным растворам и глазным кап лям изготовляемым

54

вап теках. О б ъ ем и методикаисследованияп риготовленных растворовсм. п у нкт2. Резу льтаты п олу ченные п ри исследовании су хих вещ еств в растворах долж ны соответствовать треб ованиям п рилож ения п риказа№ 573, такие ж е треб ования п редъ являю тся к глазным кап лям, п риготовленных васеп тических у словиях настерильной основе. 4. Иссл ед о ва ния а пт ечно й по суд ы , пр о бо к, пр о кл а д о к, во р о но к, цил инд р о в Т ри одноименных ф лакона, доставленные в лаб ораторию , 3 п оследовательно оп оласкиваю тв10 см стерильной водоп роводной воды. В оду из ф лаконаво ф лакон п ереливаю тнад п ламенем горелки, тщ ательно сп оласкиваякаж дый ф лакон. В б анки или ш ирокогорлые колб ы с доставленными п роб ками и 3 п рокладками наливаю т 10 см стерильной водоп роводной воды и тщ ательно сп оласкиваю т. В смы вно й ж ид ко ст и пр о во д ят о пр ед ел ение: а ) ко л ичест ва мезо фил ьны х а эр о бны х и фа кул ьт а т ивно а на эр о бны х 3 ба кт ер ий (см. п у нкт 1а). Ч исло колоний, у становленное в1 см смывной ж идкости, у множ аю т на10, что соответствует содерж анию б актерий на всей смывш и п оверхности 3-х одноименных п редметов; 3 б) о пр ед ел ение на л ичия ба кт ер ий г р уппы кишечны х па л о чек 8 см 3 оставш ейся смывной ж идкости засеваю т в 1 мл концентрированной глю козо-п еп тонной среды и инку б иру ю тп ри темп ерату ре37 °С втечение 18 - 24 часов. Д альнейш ий ход исследования и идентиф икацию б актерий гру п п ы киш ечных п алочек п роводятп о п у нкту 2б . И нт ер пр ет а ция р езул ьт а т о в ба кт ер ио л о г ических иссл ед о ва ний: - количество мезоф ильных аэроб ов и ф аку льтативных анаэроб ов не долж но п ревыш ать 150 колоний с 3-х ф лаконов, 5-ти п роб ок, 5-ти 3 п рокладок (т. е. в10 см смывной ж идкости); - б актерии гру п п ы киш ечной п алочки недоп у скаю тся. 5. М ет о д ика иссл ед о ва ния во зд ух а Д оставленные чаш ки с п осевами на п итательном агаре и Ж СА инку б иру ю т втермостате п ри 37 °С втечение 24 часов, п осевы наЖ СА доп олнительно выдерж иваю тещ е24 часап ри комнатной темп ерату ре. Посевы насредеСаб у ро инку б иру ю тп ри темп ерату ре22 - 28 °С - 4 су ток. Д ля оп ределения об щ ей б актериальной об семененности через 48 часов п осевы п росматриваю т, п одсчитываю т количество выросш их колоний и 3 п роизводятп ересчетна1 м . Д ля оп ределения количественного содерж ання золотистого стаф илококкап росматриваю т п осевы на п осле 48-ми часов инку б ации, колонии п одозрительные на стаф илококк п одсчитываю т и п роводят идентиф икацию . После идентиф икации п роизводят п ересчет п олу ченных

55 3

резу льтатовна1 м возду ха(Прилож ение№ 2 к п риказу М инздраваСССР № 720 от31. 07. 78 г.) Д ля количественного оп ределения п лесневых и дрож ж евых гриб ов п осле96 часовой инку б ации п одсчитываю тколичество выросш их колоний 3 п лесневых и дрож ж евых гриб овп роизводятп ересчетна1 м . 6. И ссл ед о ва ниесмы во в О риентировочный п еречень об ъ ектов, п одлеж ащ их контролю методом смывов: 1. Раб очееместо деф ектара. 2. Столдляп риготовленияинъ екционных растворов. 3. Столдляп риготовленияглазных кап ель. 4. В есы длявзвеш иваниясу хих вещ еству деф ектара. 5. Т арадля хранения п рокладок и п роб ок, исп ользу емых для у ку п орки инъ екционных растворови глазных кап ель. 6. Сту п ки. 7. Пластинки п ластмассовые. 8. В есы роговые. 9. К ран водоп роводный вассистентской. 10. Ру ки п ерсонала. 11. Полотенце. 12. Санодеж да. О бъем иссл ед о ва ния: а) оп ределениеб актерий гру п п ы киш ечных п алочек. Т амп он со стеклянной п алочкой п омещ аю т всреду К есслераили К ода. Д альнейш ий ход исследования и идентиф икацию п роводят п о об щ еп ринятой методикеисследованиясм. п у нкт1б , в. б ) оп ределение п атогенных (золотистых) стаф илококков(п о п оказаниям) 3 осу щ ествляю т п у тем п осевасмывовж идкости вп роб ирку с 5 см 6,5% солевого б у льона. Д альнейш ий ход исследования п роводят согласно п рилож ению № 2 к п риказу № 720 от31.07.78 г. И нт ер пр ет а ция р езул ьт а т о в: Бактерии гру п п ы киш ечной п алочки и п атогенные стаф илококки в смывах недоп у скаю тся. Т ем а 8. М ЕТ О Д Ы В Ы ЯВ Л Е Н И Я И Т И Т РО В А Н И Я СПЕ Ц И Ф И Ч Е СК И Х А Н Т И Т Е Л (СЕ РО Д И А ГН О СТ И К А ) За д а ния д л я вы по л нения л а бо р а т о р но й р а бо т ы 1. Поставить ориентировочну ю реакцию агглю тинации настекле с целью идентиф икации изу чаемых чистых ку льту р б актерий. Сделать заклю чениеп о резу льтатам реакции. 2. Протоколировать и оценить резу льтаты реакции неп рямой гемагглю тинации (РИ ГА ), п оставленной с целью серодиагностики. Сделать заклю чениеп о резу льтатам реакции.

56

В сеимму номикроб иологическиеметоды (И М ) мож но разделить на3 гру п п ы: И М , основанные п ап рямом взаимодействии антигенас антителом (ф еномены агглю тинации, п рецип итации, гемагглю тинации, иммоб илизации и др.); И М , основанные на оп осредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции неп рямой гемагглю тинации, коагглю тинации, латексагглю тинации, у гольной аггломерации, б ентонит-агглю тинации, связываниякомп лементаи др.); И М с исп ользованием меченых антител или антигенов (метод ф лю оресциру ю щ их антител, имму ноф ерментный и радиоимму нный анализы, сп инимму нологический и дру гиеметоды). Р еа кция а г г л ют ина ции (Р А) Реакция основана п а взаимодействии п оверхностных антигенов б актерий и дру гих корп у ску лярных частиц с антителами и п ротекаетвдве ф азы: 1) сп ециф ическая ф аза - связывание детерминап тной гру п п ы (эп итоп а) антигена с п аратоп ом - активным центром имму ноглоб у лина (невидимая ф аза); 2) несп ециф ическая (видимая) ф аза - об разу ю щ ийся комп лекс (А Г+А Т ) у трачивает растворимость и вып адает восадок ввиде хлоп ьев. О днако это явление возмож но лиш ь в электролитной среде, нап ример в0,85 % растворенатрияхлорида. РА мож но п рименять для об нару ж ения сп ециф ических антител в сывороткекрови и, наоб орот, п ри п омощ и стандартной агглю тиниру ю щ ей сыворотки мож но идентиф ицировать выделенныемикроб ы. О р иент ир о во чна я Р А д л я ид ент ифика ции микр о ба Реакция слу ж ит для п редварительного оп ределения видамикроб а. Н ап редметное стекло наносят кап лю у зкосп ециф ичной адсорб ированной сыворотки (т.е. сыворотку , содерж ащ у ю только сп ециф ические антитела). Сыворотку наносят вразведении 1:10 и рядом кап лю ф изиологического раствора(контроль). И сследу ему ю ку льту ру микроб ап етлей вносят воб е кап ли и размеш иваю т. Ч ерез 2 - 4 мин. у читываю т резу льтат. При п олож ительной реакции (соответствие исследу емой ку льту ры диагностической сыворотке) наб лю дается ску чивание б актерий в виде хлоп ьевнаф онеп розрачной ж идкости. В контроле- равномернаяму ть. К роме сп ециф ической агглю тинации б актерий, вызванной антителами, возмож насп онтанная агглю тинация (вотсу тствие имму нной сыворотки). Сп онтанну ю агглю тинацию даю т R-ф ормы б актерий, не об разу ю щ ие гомогенной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия и осаж даю щ иеся ввиде клеточных агрегатов. При кислой реакции среды в резу льтате снятия одноименного заряда с п оверхности б актериальных клеток визоэлектрической зоне такж е п роисходит склеивание - насту п ает «кислотная» агглю тинация. Ч тоб ы исклю чить возмож ность у чета лож ноп олож ительных резу льтатов сп онтанной агглю тинации, всегда ставятконтрольну ю п роб у с изотоническим раствором хлориданатрия.

57

Р еа кция непр ямо й г ема г г л ют ина ции РН ГА является своеоб разной модиф икацией РА . Су щ ность реакции состоит в том, что молеку лы антигена адсорб иру ю тся на п оверхности эритроцитов. Т акие "нагру ж енные" антигенами эритроциты п риоб ретаю т сп особ ность агглю тинироваться имму нной сывороткой, сп ециф ичной для данного антигена. Э ритроциты склеиваю тсяи вып адаю твосадок, об разу я на дне п роб ирки гемагглю тинат. В п оследнее время РИ ГА п олу чила ш ирокое расп ространение б лагодаря высокой чу вствительности, эксп рессивности и п ростотеп остановки. В лу нках п олистироловых п ланш етовготовятряд п оследовательных двукратных разведений сыворотки. В п редп оследню ю лу нку вносят - 0,5 мл заведомо п олож ительной сыворотки и в п оследню ю 0,5 мл ф изиологического раствора(контроль). Затем во все лу нки доб авляю т п о 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностику ма, встряхиваю т и п омещ аю т в термостат на 2 ч. В п олож ительном слу чае эритроциты оседаю т на дне лу нки ввиде ровного слоя клеток со складчатым или зазу б ренным краем (п ереверну тый зонтик), вотрицательном - оседаю т в видеп у говки или колечка(таб л. 8). Т аблица 8. Постановкареакции неп рямой гемагглю тинации И нгридиенты 1-я 0,5

Н омералу нок п анели 2-я 3-я 4-я 5-я 0,5 0,5 0,5 0,5

И зотонический раствор натрия хлорида, мл И сследу емая 0,5→ 0,5→ 0,5→ 0,5→ 0,5↑ сыворотка в разведении 1:25, мл Полу ченное 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 разведение сыворотки Э ритроцитарный 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 диагностику м, мл И нку б ацияп ри 37 °С втечение2ч. втермостате

К онтроли 1-й -

2-й 0,5

И мму нный диагностику м 0,5

0,1

0,1

Т итр сыворотки 1:100 Н а эритроцитах мож но адсорб ировать не только антигены, но и антитела. В данном слу чае РН ГА мож но п рименять для индикации п атогенных микроб ов во внеш ней среде. Д ля этого IgG сыворотки ф иксиру ю т п а п оверхности б араньих эритроцитов. Разреш аю щ ая сп особ ность эксп ресс-индикации антигеновсоставляет несколько тысяч микроб ных телв1 мл.

58

Р еа кция пр еципит а ции в г ел е И мму нодиф ф у зия вагаровом геле растворовантигенови антител, залитых вразные лу нки, навстречу дру г дру гу вслу чаях соответствия их сп ециф ичности п риводит к об разованию сп ециф ического п рецип итатав видеп олосок и ду гвместах встречи реагентов. К ак п равило, вцентральну ю лу нку заливаю т стандартный раствор антигена, а в п ериф ерические - исп ыту емые сыворотки. В одну из п ериф ерических лу нок заливается стандартная имму нная сыворотка соответствую щ ей сп ециф ичности, авдру гу ю - нормальная сывороткадля контроля. Проводится инку б ация во влаж ной камере п ри 37 °С втечение 24 ч. У читываю т количество и ш ирину п олос п рецип итации меж ду центральной лу нкой с раствором антигена и лу нками с исследу емыми сыворотками. Р еа кция л изиса . Р еа кция связы ва ния ко мпл емент а Д ля п остановки реакции лизисаи реакции связывания комп лемента (РСК ) исп ользу ю т комп лемент, который содерж ится всыворотке крови морских свинок. Гемолитическая активность комп лементатермолаб ильна и п олностью у трачивается п ри п рогревании сыворотки втечение 30 мин. п ри 56 °С. При адсорб ции комп лементанакомп лексе антиген - антитело его действие п роявляется реакцией лизиса антигена, если антиген корп у ску лярный, или не соп ровож дается никакими видимыми изменениями, если это мелкодисп ерсныеили растворимыеантигены. Д ляу четарезу льтатовРСК вводятвсп омогательну ю (индикаторну ю ) гемолитическу ю систему . О на состоит из взвеси эритроцитовб аранав изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки кролика, п олу ченной п у тем его имму низации у п омяну тыми эритроцитами. Полож ительная РСК характеризу ется задерж кой гемолиза вследствие адсорб ции комп лементасистемой антиген - антитело. О трицательнаяРСК характеризу ется наличием гемолиза, п оскольку своб одный комп лемент связывается с системой эритроциты б арана- гемолитическая сыворотка кролика. РСК об ладает высокой чу вствительностью и сп ециф ичностью , что п озволяетисп ользовать еедлясеродиагностики многих заб олеваний. Д ля п остановки РСК треб у ется точноеоп ределениеколичественных соотнош ений всех ингредиентов, у частвую щ их вреакции: исследу емой сыворотки, антигена, комп лемента, гемолитической сыворотки кроликаи эритроцитовб арана. Поэтому п остановке основного оп ытап редш ествует титрование гемолитической сыворотки и выб ор ее раб очего разведения, титрованиедру гих ингредиентов. П р иг о т о вл ениеи т ит р о ва ниеинг р ед иент о в д л я Р СК Тит р о ва ние ко мпл емент а . Д ля оп ределения титраи раб очей дозы п роизводят титрование комп лемента с п омощ ью реакции имму нного гемолиза. Д ля этого свеж у ю сыворотку морской свинки разводят изотоническим раствором хлорида натрия от 1:10 до 1:40. К 0,2 мл каж дого разведения комп лементадоб авляю т п о 0,4 мл гемолитической

59

смеси (смеси равных об ъ емов3 % су сп ензии эритроцитоввизотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки в разведении, соответствую щ ем ее тройному титру ). Проб ирки выдерж иваю т п ри 37 °С и через 30 мин. оп ределяю т титр комп лемента- наиб ольш ее разведение комп лемента, котороевызываетп олный лизис эритроцитоввп рису тствии гемолитической сыворотки. Раб очу ю дозу комп лемента рассчитываю т, исходя из его титра. Раб очая дозакомп лементадолж наб ыть выш е титра на25 %. Т ак, нап ример, п ри титре комп лемента1:20 вкачестве раб очей дозы б еру тего п редыду щ ееразведение1:10. Ант иг ены изготавливаю тся из взвесей у б итых микроорганизмов, их лизатов, п олных антигенов, гап тенов, экстрактовтканевых лип идов. Взвесьэр ит р о цит о в б аранап олу чаю тиз деф иб ринированной крови б арана, отмываяэритроциты изотоническим раствором хлориданатриядо п олу ченияп олной б есцветности и п розрачности надосадочной ж идкости и готовятиз них 3 % взвесь визотоническом растворехлориданатрия. Г емо л ит ическа я сы во р о т ка готовится п у тем 3-4-кратной вну тривенной имму низации кролика50 % взвесью б араньих эритроцитов и инактивиру ется п ри 56 °С (разру ш ен комп лемент). Н аэтикетке амп у лс сывороткой об означен ее титр - максимальное разведение данной сыворотки, которое об есп ечивает п олный лизис 3 % взвеси эритроцитов б аранавп рису тствии комп лементап ри 37 °С втечение часа. Д ля РСК б еру тгемолитическу ю сыворотку втройном титре. П о ст а но вка о сно вно г о о пы т а Р СК После у становления титраи раб очих доз всех ингредиентовставят основной оп ыт РСК . И сп ыту ему ю и контрольные сыворотки п редварительно инактивиру ю т нагреванием п ри 56 °С втечение 30 мин. Стандартная схемап остановки РСК п реду сматривает п роведение п ервой ф азы инку б ации смеси антигенаисп ыту емой сыворотки и комп лемента п ри 37 °С втечение 30 мин. При п остановке РСК нахолоде эту ф азу п роводятп ри 0 - 4 °С втечение18 - 20 ч., что п овыш аетчу вствительность реакции. После доб авления вкаж ду ю п роб ирку п о 0,4 мл гемолитической системы п роб ирки встряхиваю т и выдерж иваю т 20 - 30 мин. п ри 37 °С. Резу льтаты оп ытаоцениваю т, отмечаяналичиеили отсу тствиегемолизаво всех п роб ирках. Реакцию считаю т п олож ительной п ри п олной задерж ке гемолиза, когда ж идкость в п роб ирке б есцветна и эритроциты оседаю т на дно, отрицательной - п ри п олном лизисе эритроцитов, когда ж идкость интенсивно окраш ена («лаковая кровь» ). Степ ень задерж ки гемолиза оцениваю твзависимости отинтенсивности окраски ж идкости и величины осадкаэритроцитовнадне( + + + + , + + + , +). В качестве контроля (2-я и 3-я п роб ирки) у читываю т реакцию с заведомо п олож ительной и заведомо отрицательной сыворотками; 4-я и

60

5-я п роб ирки слу ж ат для п роверки антикомп лементарных свойств сыворотки и антигена; в6-й и 7-й п роб ирках контролиру ю тсяраб очаядоза комп лементаи качество гемолитической системы. Р еа кция Кумбса Слож ность выявления неп олных (моновалентных) антителсвязанас тем, что эти антитела, связываясь с эп итоп ами сп ециф ического антигена, не об разу ю т стру кту ру реш етки и реакция меж ду антигенами и антителами не выявляется ни агглю тинацией, ни п рецип итацией, ни дру гими тестами. Д ля выявления об разовавш ихся комп лексовантиген антитело п риходится исп ользовать доп олнительные тест-системы. Д ля выявления неп олных антител, нап ример к резу с-антигену эритроцитовв сывороткекрови б еременной ж енщ ины, реакция ставится вдваэтап а: I) к двукратным разведениям исп ыту емой сыворотки доб авляю т эритроциты, содерж ащ иерезу с-антиген, и выдерж иваю тп ри 37 °С втечениечаса; 2) к тщ ательно отмытым п осле п ервого: этап а эритроцитам доб авляю т кроличью античеловеческу ю антиглоб у линовую сыворотку (в заранее оттитрованном раб очем разведении). После инку б ации втечение 30 мин. п ри 37 °С резу льтаты оцениваю т п о наличию гемагглю тинации (п олож ительная реакция). Н еоб ходимо ставить контроль ингредиентов реакции: 1) антиглоб у линовая сыворотка + заведомо сенсиб илизированные сп ециф ическими антителами эритроциты; 2) об раб отанные нормальной сывороткой эритроциты -f- антиглоб у линовая сыворотка; 3) об раб отанные исследу емой сывороткой резу сотрицательныеэритроциты + антиглоб у линоваясыворотка. И ммуно фер мент ны й а на л из О дним из наиб олее чу вствительных методов выявления антител считается имму ноф ерментный анализ (И Ф А ), который не у сту п ает п о чу вствительности радиоимму нному анализу (РИ А ) и в то ж е время отличается от него б ольш ей досту п ностью для об ычных диагностических лаб ораторий. Сп ециф ический антиген адсорб иру ю тнап оверхности лу нок в п ластинах из п олистирола (п оливинилхлорида). Ф иксированный на п ластине антиген инку б иру ю т с исп ыту емыми человеческими сыворотками. После отмывания от несвязавш ихся б елков связанные иммоб илизованными антигенами имму ноглоб у лины выявляю тс п омощ ью антивидовой (античеловеческой) антиимму ноглоб у линовой сыворотки, к антителам которой ковалентно п рикреп лен ф ермент -п ероксидаза. После инку б ации с су б стратом (п ероксидом водорода) и индикатором (диаминоб ензидином) оцениваю т ф ерментативну ю активность п о интенсивности окраски. И нтенсивность окраски, п роп орциональну ю количеству сорб ированных наантигенеантител, мож но оценить визу ально или с п омощ ью сп ектроф отометра. В данной модиф икации у доб на у ниверсальность меченого реагента, который п озволяетвыявлять антитела к разным антигенам.

61

Р еа кция фл о ккул яции В резу льтате взаимодействия токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой вып адаю т хлоп ья ф локку лята. Н аиб олее интенсивная и ранняя («инициальная» ) ф локку ляция п роисходит в п роб ирке, где антиген и антитело содерж атся в эквивалентных соотнош ениях. Реакцию ставят в два этап а. Сначала п о стандартной сыворотке у станавливаю тп ороговую величину ф локку ляции (Limes flocculationis) в1 мл токсина. Lf токсина оп ределяется его минимальным количеством, которое дает «инициальну ю » ф локку ляцию с 1 меж ду народной единицей (ME) сыворотки. У становив силу токсина, п ристу п аю т к титрованию антитоксической сыворотки. И звестной силы токсин и исп ыту ему ю антитоксическу ю сыворотку разливаю т в п роб ирки в оп ределенном об ъ еме. Проб ирки выдерж иваю т вводяной б ане п ри 45 °С втечение 30 мин. до вып аденияхлоп ьевводной из них. «И нициальная» ф локку ляция п роявляется в той п роб ирке, где количество токсина соответствует количеству меж ду народных единиц сыворотки. Н ап ример, ф локку ляция п роизош лав3-й п роб ирке, значит, в 0,4 мл сыворотки находится 40 ME. Следовательно, 1 мл сыворотки содерж ит40:0,4 - 100 ME. Ант ист р епт о л изино ва я р еа кция Реакция основана на ф еномене нейтрализации гемолитического действия микроб ного токсина (О -стреп толизина) антитоксическими антителами имму нной сыворотки. Д ля п остановки реакции п редварительно оп ределяю т минимальну ю гемолитическу ю дозу токсина(О -стреп толизина), т. е. то наименьш ее его количество, которое вызывает гемолиз 0,2 мл 5 % взвеси эритроцитов кролика. Затем оп ределяю т раб очу ю дозу О -стреп толизина, т. е. наиб ольш ее количество токсина, которое в смеси с 1/2 А Е (антитоксической единицы) стандартной антитоксической сыворотки п олностью нейтрализу ется и не вызывает гемолиза эритроцитов. Д ля п остановки основного оп ытаготовят разведения исследу емой сыворотки, к каж дому из которых доб авляю т раб очу ю дозу токсина, инку б иру ю т 45 мин. п ри 37 °С и доб авляю т равный об ъ ем взвеси эритроцитов, инку б иру ю т ещ е 1 ч. п ри 37 °С и 18 ч. п ри комнатной темп ерату ре. О б язательным является контроль навозмож ность сп онтанного гемолиза эритроцитов. В качестве п олож ительной у читывается реакция, где отсу тствую т гемолиз и оседание эритроцитов на дно. С у четом максимального разведения сыворотки, п ри котором наб лю дается п олная задерж ка гемолиза, рассчитываю т содерж ание А Е в I мл исп ыту емой сыворотки. Р еа кция т о р мо ж ения г ема г г л ют ина ции Реакциятормож ениягемагглю тинации (РТ ГА ) основананатом, что п ри взаимодействии виру сных антигенов (гемагглю тининов) со

62

сп ециф ическими антителами имму нной сыворотки п роисходит б локирование(нейтрализация) гемагглю тиниру ю щ ей сп особ ности виру са, т. е. тормож ениегемагглю тинации. Разверну тая РТ ГА п роводится в лу нках п ластмассовых п ластин. Предварительно оп ределяю т титр виру сного антигена в РГА с целью выб орараб очей дозы. Раб очее разведениеб еру тв16 раз меньш етитра. В лу нках готовят 2-кратные разведения исследу емой сыворотки воб ъ еме 0,25 мл, доб авляю т п о 0,25 мл взвеси виру савраб очем разведении и инку б иру ю т 2 ч. п ри 37 °С. Затем доб авляю т п о 0,5 мл 1 % взвеси ку риных эритроцитов, инку б иру ю т ещ е 2 ч. и оцениваю т резу льтат п о ф еномену гем агглю тинации. При п олож ительной РТ ГА об разу ется п лотный осадок эритроцитовнадне лу нки ввиде дискаили кольцас ровными краями. Т итр антител оп ределяю т п о п оследней лу нке с п олож ительной РТ ГА . О С Н О В Н А Я Л И Т ЕР А Т У Р А Борисов Л .Б. М едицинская микроб иология, виру сология, имму нология / Л . Б.Борисов.-2-е изд. доп и п ерераб .-М .: М ед. инф орм. агенство, 2001.-734 с. М едицинскаямикроб иология/ А . З. Байчу рина, Г. Х . Гильманова, В . Е . Григорьеви др.; Гл. ред.: В . И . Покровский, О . К . Поздеев.-М .: ГЭ О Т А Р М Е Д И Ц И Н А , 1999.-1183,[1]с. БорисовЛ .Б. Ру ководство к п рактическим занятиям п о медицинской микроб иологии, виру сологии и имму нологии / Л .Б. Борисов, Б.Н .К озьминСоколов, И .С.Ф рейдлин -М .: М едицина, 1994. – 240 с. О сновы микроб иологии, виру сологии и имму нологии: У чеб ник для сту дентовмед. у чилищ / Под ред. А . А . В ороб ьева, Ю . С. К ривош еина. М .: Б.и., 2001.-223,[1] с.

63

Составители: СеменихинаА настасияВ ладимировна РахмановаТ атьянаИ вановна Н ехаеваГалинаИ вановна Поп оваТ атьянаН иколаевна Редактор Т ихомироваО .А .