Иммунология: Практикум

Ф Е Д Е РАЛ Ь Н О Е АГ Е Н Т С Т В О П О О БРАЗО В АН И Ю В О РО Н Е Ж С КИ Й Г О С У Д АРС Т В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РС И Т Е Т

И м м унол оги я П рактикум С п ециальность (011600)-Биология 020201

В О РО Н Е Ж 2006

2

У тверждено научно-м етодическим советом б иолого-п очвенногоф акультета 16сентяб ря2005 г(п ротокол№ 5)

С оставители: П утинцеваО .В , Артю ховВ .Г

П рактикум п о им м унологии п одготовлен на каф едре б иоф изики и б иотехнологии б иолого-п очвенного ф акультета В оронежского государственного университета. Реком ендуется для студентовIV курса дневного и V курса вечернего отделений б иолого-п очвенного ф акультета, сп ециальность011600 – Биология.

3

С О Д Е РЖ А Н И Е

Т Е М А: Р Е А К Ц И И А Н Т И ГЕ Н -А Н Т И Т Е Л О 1. Реакции агглю тинации Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А I. О пред елениерезу с-ф акт ора RhоD с пом ощ ью ст анд арт ного у ниверсал ьного ант ирезу сного реагент а экспресс - м ет од ом в пробиркебез под огрева Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А 2. И ссл ед ованиесыворот ки крови чел овека на наличиенеполных резу с-ант ит ел с пом ощ ью реакции конглют инации с прим енением ж елат ина (в пробирках) Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А 3. О пред елениет ит ра неполных резу с – ант ит ел в сыворот кекрови человека Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А 4. О пред елениет ит ра α- и βаггл ют ининов (норм ал ьных ант ит ел ) в сыворот кекрови чел овека П . Реакции п рецип итации Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А 5. П олуколичественное оп ределениеальф а - ф етоп ротеина всы вороткекрови человека м етодом двойной им м унодиф ф узии вгеле Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А 6. О пред ел ениесод ерж ания им м у ноглобу л инов в сыворот ке крови человека м ет од ом прост ой рад иал ьнойим м у нод иф ф у зии по М анчини в м од иф икации Ст еф ани Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А 7. О пред елениеповерхност ного ант игена гепат ит а В (Н ВSАg) м ет од ом вст речного им м у ноэлект роф ореза в гел е С П И С О К РЕ КО М Е Н Д У Е М О Й Л И Т Е РАТ У РЫ

4 5

6

7 9 10 12

13

16

19 22

4

Т Е М А: Р Е А К Ц И И А Н Т И ГЕ Н -А Н Т И Т Е Л О Реакции взаим одействия антител с антигенам и являю тся основоп олагаю щ им и враб отеим м унной систем ы организм а человека. In vitro данны ереакции лежат с основе м ногих им м унологических м етодови ш ироко исп ользую тся в лаб ораторной диагностике. О ни п озволяю т с п ом ощ ью вы сокосп ециф ичны х антител идентиф ицировать, количественно оп ределять или вы делять интересую щ ие исследователя антигены сы воротки крови, а также антигены , находящ иеся на п оверхности им м уноком п етентны х клеток, клеток лю б ы х тканей и органовчеловека, чужеродны х б актерий и вирусов. Реакции антиген-антитело часто назы ваю т серологическим и, или гум оральны м и. Э то реакции сп ециф ического связы вания антигена с соответствую щ им ем у антителом , которы е п риводят к об разованию им м унного ком п лекса. В заим одействие антиген-антитело осущ ествляется п о п ринцип у трехм ерной п ространственной ком п лем ентарности наружны х электронны х об лаковп аратоп а антитела и эп итоп а антигена. С вязи, возникаю щ ие м ежду п оследним и, об условлены слаб ы м и электростатическим и и вандерваальсовы м и силам и, водородны м и и гидроф об ны м и взаим одействиям и, п оэтом у ком п лекс АГ -АТ не п рочен, легко диссоциирует наисходны еком п оненты . В заим одействиеантигена (АГ ) с антителом (АТ ) п одчиняется п ринцип ам б им олекулярной реакции и м ожет б ы тьоп исано следую щ им уравнением : k1 А Г +АТ А Г . А Т, k2 гдеАГ ·АТ - им м унны й ком п лекс антиген-антитело, а К 1 и К 2 – соответственно, константы скоростей ассоциации и диссоциации данногоком п лекса. С огласно закону действую щ их м асс вусловиях равновесия константа ассоциации К а (вим м унологии ее часто назы ваю т сродством или аф ф инностью ) б удет равна: Ка=

К1 [АГ ⋅ АТ ] , = К 2 [АГ ] ⋅ [АТ ]

где [АГ ·АТ ], [АГ ] и [АТ ] - соответственно м олярны е концентрации ком п лексаантиген-антитело, своб одного антигенаи своб одногоантитела. Аф ф инность им еет разм ерность-л/м оль, является величиной п остоянной п ри оп ределенны х условиях эксп ерим ента (рН , тем п ература и др.). О на связана со своб одной энергией взаим одействия антигена с антителом ∆F следую щ им соотнош ением : ∆F = - RT ln К а, где R-универсальная газовая п остоянная (I,987 кал/К·м оль), Т - аб солю тнаятем п ературавградусах Кельвина. П ри об разовании ком п лекса АГ ·АТ изм енение своб одной энергии реакции зависит от теп лового эф ф екта реакции (энтальп ии ∆Н ) и от изм енения энтроп ии ∆S (степ ени неуп орядоченности систем ы ): ∆F = ∆Н - Т ∆S. О б ы чно реакции взаим одействия антигена с антителом соп ровождаю тся вы делением неб ольш ого количества теп лоты , изм енением величины ∆Н

5

(≈40 кД ж/м оль), ум еньш ением уп орядоченности систем ы , т.е. возрастанием величины ∆S. Константа ассоциации изм еняетсявзависим ости от тем п ературны х условий реакции следую щ им об разом : d lnKa ∆H =d (1/T) R

С родство антигена и антитела ум еньш ается с п овы ш ением тем п ературы , если воб разовании им м унного ком п лекса п риним аю т участие восновном водородны е или п олярны е связи. Когда п оявление ком п лекса связано с гидроф об ны м и и неп олярны м и взаим одействиям и, аф ф инностьп рактически независит от тем п ературы . Ф акт взаим одействия антигена с антителом м ожно установитьна основании ряда реакций и ф еном енов, важнейш им и из которы х являю тсяреакции агглю тинации, реакции п рецип итации, реакции оп сонизации и ф агоцитоза, нейтрализации токсинов, а также с п ом ощ ью им м унохим ических м етодов(им м уноф луоресценции, радиоим м унного м етода, им м уноф ерм ентого анализа), исп ользую щ их м еченны еантигены или антитела. 1. Реакции агглю тинации Агглю тинация - это реакция склеивания и агрегации нерастворим ы х частиц, нагруженны х антигеном , п од действием сп ециф ических антител (агглю тининов). Т аким и частицам и м огут б ы ть клетки крови (тром б оциты , лейкоциты , эритроциты ), б актерии, сп ерм атозоиды , им ею щ иена своей п оверхности естественны е, п риродны е антигены , а также инертны е частицы (п олистироловы й латекс, б ентонит), которы е сп ециально нагружаю т интересую щ им и исследователяантигенам и. П родукты , об разую щ иеся врезультате этой реакции, назы ваю тся агглю тинатам и. Е сли носителям и антигеновявляю тся эритроциты , то наб лю даем ая реакцияносит названиегем агглю тинации. Реакцияагглю тинации п ротекает вдвеф азы . В п ервой ф азе п роисходит сп ециф ическая адсорб ция антител на п оверхности клеток или частиц, несущ их соответствую щ иеантигены . В о второй ф азе об разую тся агрегаты (агглю тинаты ), они вы п адаю т восадок, п ричем этот п роцесс п роисходит только вп рисутствии электролита (растворхлорида натрия). М еханизм реакции агглю тинации оп исы вается теорией «реш етки» . С огласно этой теории агглю тинат об разуется п ри соединении одного активного центра АТ с детерм инантной груп п ой другого антигена. И зб ы ток или недостаток антител торм озит п роявлениереакции агглю тинации. Реакция агглю тинации недостаточносп ециф ичнаи чувствительна. Различаю т п рям ую (п ростую ) и неп рям ую (п ассивную ) агглю тинацию . П ри п рям ой агглю тинации антитела реагирую т с детерм инантам и антигенов сам их частиц (антиген является структурны м ком п онентом п оверхностной м ем б раны частицы ). П ри неп рям ой агглю тинации антитела взаим одействую т с растворим ы м и антигенам и, которы е п редварительно адсорб ирую тся или хим ически соединяю тся с м ем б ранам и нативны х эритроцитов. В этом случае эритроциты являю тся п ассивны м и носителям и антигенов. Н еп рям ая агглю тинация

6

отличается вы сокой чувствительностью - 0,003 м кгазота б елка антител в1 м л сы воротки. Д анная реакция ш ироко исп ользуется влаб ораторной п рактике, где ее осущ ествляю т как вп роб ирках, так и на п лоскости (на сп ециальны х п ластиковы х п ланш етах и п анелях для м акро- и м икротитрования). Реакция агглю тинации м ожет б ы тькачественной и количественной. О на п рим еняется для вы явления наличия или отсутствия висследуем ом об ъ екте того или иного антигена или антител к соответствую щ ем у антигену, для оп ределения титра агглю тининов; для тип ирования и титрования эритроцитарны х антигеновсистем резус и АВ О или антигенов гистосовм естим ости; для идентиф икации возб удителей инф екционны х заб олеваний, а также для стандартизации вы п ускаем ы х им м уноб иологических п реп аратов. Реакцияагглю тинации м ожет п роисходитьворганизм е. П рим ером м ожет служить развитие хорош о известной всем реакция несовм естим ости, наб лю даем ой у рецип иентовп ри иногруп п ной трансф узии (п ереливании) донорской крови. Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А I. О пред ел ениерезу с-ф акт ора RhоD с пом ощ ью ст анд арт ного у ниверсал ьного ант ирезу сного реагент а экспресс - м ет од ом в пробиркебез под огрева. Резус-ф акторили резус-антиген RhоD содержитсявм ем б ранах эритроцитов человека и об езьян м акака-резус. О н б ы л об наружен в крови лю дей К. Л андш тейнером и сотр.(1940) с п ом ощ ью сы воротки животны х, им м унизированны х эритроцитам и м акака-резус. П озже б ы ло установлено, что вкрови лю дей содержитсянетолько данны й антиген, а систем а из ш ести антигеноврезус. Д ля их об означения исп ользуетсядвойная ном енклатура: RhоD, rh′C, rh′′E, Hrоd, hr′c, hr′′e. Н аиб ольш ее значение визоим м унны х реакциях им еет антиген RhоD, так как он вы сокоим м уногенен, вы зы вает б олее сильную трансф узионную реакцию у несовм естим ого п о резус – ф актору рецип иента, чем другиеантигены систем ы резус. Л ица, вкрови которы х содержится данны й антиген, условно п ринято считать резус-п оложительны м и, а лица, не содержащ ие его, резус-отрицательны м и. С реди европ ейского населения – 85%, а среди м онголоидов– 99 % являю тсяносителям и антигена RhоD. П о своей хим ической п рироде - это лип оп ротеид, нерастворим ы й вводе, легко разруш аю щ ийся п ри гем олизе эритроцитови терм остатировании п ри вы сокой тем п ературе. О б разованиеантигеновсистем ы резус контролируется трем я п арам и аллельны х генов (Dd, Cc, Ee), которы е расп оложены на двух хром осом ах. Каждая хром осом а содержит только три гена из ш ести, п ри этом лиш ь один из каждой п ары : D или d, С или с, Е или е. В эритроцитах человека они м огут даватьсам ы еразнооб разны есочетания, всего возм ожно27 разновидностей генотип а. Н еоб ходим ое об орудование: универсальны й реагент антирезус RhоD, стандартны ерезус-п оложительны еи резус-отрицательны еэритроциты дляконтроля, п роб ирки, п ип етки П астера, ф изиологический растворNaCl. У ниверсальны й реагент антирезус RhоD из сы воротки крови резусотрицательны х доноров, п редварительно сп ециально п роим м унизированны х антигеном RhоD и вы раб отавш их активны енеп олны еантиэритроцитарны е ре-

7

зусны е антитела с титром не ниже I:32. Д ля улучш ения реакционны х свойств донорскую сы воротку см еш иваю т воп ределенны х соотнош ениях с 33% раствором п олиглю кина. Д ля оп ределения резус-ф актора м ожет б ы ть исп ользована свежая не свернувш аяся кровь, взятая из п альца неп осредственно п еред исследованием или консервированная кровь, б ез всякой п редварительной об раб отки, а также эритроциты из п роб ирки с кровью п осле об разования сгустка и отстаивания сы воротки. Т ехника оп ределения: Н а дно п роб ирки внести одну кап лю универсального реагента антирезус RhоD и одну кап лю исследуем ой крови (или эритроцитов). С одержим ое п роб ирки п ерем еш ать встряхиванием и затем м едленно п оворачивать, наклоняяп роб ирку п очти до горизонтали таким об разом , чтоб ы содержим ое растекалось п о ее стенкам . Т акое разм азы вание крови п о стенкам п роб ирки делает реакцию б олее вы раженной. Как п равило, агглю тинация наступ ает втечение п ервой м инуты , но для об разования устойчивого ком п лекса (антиген + антитело) и четко вы раженной агглю тинации, а также ввиду возм ожности зам едленной реакции п ри слаб о вы раженной агглю тинаб ельности эритроцитов, контакт эритроцитовс реагентом п ри вращ ении п роб ирки следует п роводить не м енее 3 м инут. Затем для исклю чения несп ециф ической агрегации эритроцитоввп роб ирку доб авить 2-3 м л ф изического раствора NaCl и п ерем еш ать, невзб алты вая, 2-3 раза п еревернувп роб ирку вверх дном . О ценку реакции п роизводитьвизуально. О дноврем енно с исследованием оп ы тного об разца крови п роизводится контрольноеисследованиестандартны х резус-п оложительны х эритроцитовтой же груп п ы или груп п ы О (I) п о систем е АВ О и стандартны х резусотрицательны х эритроцитовоб язательно одногруп п ны х с исследуем ой кровью . О ценка результата: Н аличиеагглю тинации ввидекруп ны х хлоп ьевэритроцитовна ф оне п росветленной жидкости указы вает на резус-п оложительную п ринадлежностьисследуем ой крови RhоD(+). О тсутствие агглю тинации (вп роб ирки гом огенно окраш енная жидкость) указы вает нарезус-отрицательную п ринадлежностьисследуем ой крови RhоD(-). Результат учиты ваетсякак истинны й п ослеп роверки контрольны х об разцов, т.е. п ри п оложительном результате со стандартны м и резусп оложительны м и эритроцитам и и отсутствии агглю тинации со стандартны м и резус-отрицательны м и эритроцитам и, одногруп п ны м и с исследуем ой кровью п о систем еАВ О . Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А 2. И ссл ед ование сыворот ки крови чел овека на нал ичие неполных резу сант ит ел с пом ощ ью реакции конглют инации с прим енением ж ел ат ина (в пробирках). В организм ечеловека внорм ерезусны еантитела отсутствую т. О ни п оявляю тся вкрови резус-отрицательной лиц(генотип dd) только врезультате введения ворганизм резус – п оложительной крови (генотип DD или Dd), а также п ри резус - конф ликте. Резус-конф ликт – это ситуация, возникаю щ ая п ри б ерем енности женщ и-

8

ны , эритроциты которой не эксп рессирую т антиген D систем ы груп п крови резус (резус-отрицательной м атери), резус-п оложительны м п лодом . П ри п ервой б ерем енности такого рода п роисходит сенсиб илизация м атери антигеном RhoD и об разованиеантиRhоD - антител. П ри п овторной б ерем енности накоп ивш иеся антитела п роникаю т ворганизм п лодаи вы зы ваю т п овреждениеегоклеток. Т аким об разом , резусны еантитела возникаю т ворганизм ечеловека только врезультатеим м унизации резус - антигенам и. В связи с этим резусны еантителаназы ваю т изоим м унны м и. О п ределение резус - антител наряду с оп ределением резус – п ринадлежности б ольного или доноранеоб ходим о дляп редуп режденияп ереливаниярезус – несовм естим ой крови, а такжедлядиагностики возм ожного заб олеванияп лодаили новорожденного гем олитической б олезнью . Резус–антитела б ы ваю т разны е п о сп ециф ичности: анти-Rhо(D), антиrh′(C), анти-rh′′(E), анти-hr′(c), анти-hr′′(e), а п о ф орм е: п олны е и неп олны е. С п ециф ичность антител оп ределяется тем , с каким из резус – антигеновони реагирую т. Ф орм а антител зависит от того, каким об разом они реагирую т с эритроцитам и, содержащ им и сп ециф ическиедляних резус – антигены . П олны е (б ивалентны е) антиэритроцитарны е резус-антитела относятся к классу им м унолоб улинов М (IgМ ), им ею т б ольш ую м олекулярную м ассу (900кД а), с трудом п роникаю т через п оврежденную п лаценту, об ладаю т сп особ ностью склеиватьрезус – п оложительны еэритроциты вп роб иркеб ез какойлиб о п редварительной об раб отки, вы являю тся в солевой среде п ри 37 оС , встречаю тсяредко и им ею т м еньш еезначениевтрансф узиологической п рактике, чем неп олны еантитела. Н еп олны е (м оновалентны е) антиэритроцитарны е резус – антитела относятсякклассуим м уноглоб улинов, G (IgG) с м олекулярной м ассой равной 150 – 170 кД а, они своб одно п ереходят через п лаценту, врезультате чего п лод п олучает м атеринские антитела. В заим одействиеданны х антител с RhоD-антигеном эритроцитовп лода п риводит к разруш ению п оследних ф агоцитам и и возникновению у новорожденны х гем олитической б олезни (Г БН ). In vitro неп олны е резус – антитела ф иксирую тсяна м ем б ранах резус –п оложительны х эритроцитов, не вы зы вая их склеивания. О б ъ ясняется это низкой п лотностью антигена RhоD на п оверхности эритроцитов, что п реп ятствует об разованию достаточного количества связей, необ ходим ы х для п реодоления электростатических сил отталкивания м ежду отрицательно заряженны м и м ем б ранам и отдельны х эритроцитарны х клеток. Н еп олны ерезус–антитела агглю тинирую т эритроциты только в п рисутствии коллоидны х растворов(желатин, п олиглю кин, альб ум ин) или п од действием сп ециально п риготовленной антиим м уноглоб улиновой сы воротки (сы вороткаК ум б са). И звестно, что риск развития Г БН вследствие резус – несовм естим ости ум еньш ается, если у отца и м атери груп п ы крови систем ы АВ О различны е. В таких случаях ворганизм е RhоD(-)-м атери клетки RhоD(+) эритроцитовразруш аю тсяб ы стрее, п осколькуони несовм естим ы и п о антигенам систем ы АВ О . В результате организм м атери не усп евает сенсиб илизироваться. О тсю да возникла идея резус – п роф илактики. С разу п осле рождения резус - п оложительного реб енка резус - отрицательной м атери не б олее, чем через 72 ч. вводят антирезусны е антитела. О ни разруш аю т п оп авш ие в ее кровь RhоD(+)-

9

зусны е антитела. О ни разруш аю т п оп авш ие вее кровь RhоD(+)-эритроциты п лода п режде, чем п оследниесм огут оказатьсенсиб илизирую щ еедействие. Т аким об разом удалось значительно снизить частоту Г БН и см ертность новорожденны х, об условленную резус – несовм естим остью . Н еоб ходим ое об орудование: исследуем ая сы воротка крови человека, кровь для п риготовления стандартны х эритроцитов, п роб ирки, п ип етки П астера, 10% растворжелатина, водянаяб аня или суховоздуш ны й терм остат, ф изиологический раствор, секундом ер, м икроскоп . Т ехникаоп ределения. а) П риготовлениестандартны х эритроцитов. К ровь резус – п оложительны х и резус – отрицательны х доноровО (I) груп п ы для стандартны х п риготовления эритроцитовб ерут не б олеечем за 2-3 днядо исследованиявколичестве1-3 м л воб ы чны еп роб ирки б ез стаб илизатора. П осле сверты вания крови на дне п роб ирки остается неб ольш ое количество эритроцитов, которы е и п рим еняю т для исследования. Э ритроциты б ерут со дна п роб ирки п астеровской п ип еткой, если п ри этом захваты вается неб ольш ое количество соб ственной сы воротки, то это не влияет на ход реакции. Д ля исследования м ожно б рать кровь с цитратом натрия. В этом случае эритроциты необ ходим оотм ы тьизотоническим раствором NaCl. б ) О п ределениенеп олны х резусны х антителвсы вороткекрови. В п роб ирки вводят п о одной кап ли (0,05 м л) RhоD(+) эритроцитов, п риготовленны х вкачествестандарта, п риб авляю т п о двекап ли (0,1 м л) 10% раствора желатина, п одогретого до разжижения втеп лой воде п ри тем п ературе 4648 оС . Растворжелатина необ ходим о тщ ательно п росм отретьп еред п рим енением . П ри п ом утнении или п оявлении хлоп ьев, а также п ри п отере сп особ ности засты ватьп ри тем п ературе4-8 оС желатин нельзяисп ользоватьдляраб оты . П осле этого вп роб ирку вводят две кап ли (0,1 м л) исп ы туем ой сы воротки. П роб ирку встряхиваю т дляп ерем еш иванияеесодержим ого и п ом ещ аю т вводяную б аню п ри тем п ературе46 – 48 оС на5 м инут или всуховоздуш ны й терм остат на 30 м ин. П о извлечении из водяной б ани вп роб ирку наливаю т 3-5 м л изотонического раствора NaCl. С одержим оеп роб ирок п ерем еш иваю т и наб лю даю т результат (наличие или отсутствие агглю тинации эритроцитов) невооруженны м глазом , через луп уили с п ом ощ ью м икроскоп а. П ринято считать, что исп ы туем ая сы воротка содержит неп олны е антиэритроцитарны е резус – антитела, если врезультате п роведения реакции конглю тинации наб лю дается агглю тинация резус – п оложительны х эритроцитов. П ри этом вконтроле с резус – отрицательны м и эритроцитам и агглю тинация должнаотсутствовать. Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А 3. О пред ел ениет ит ра неполных резу с – ант ит ел в сыворот кекрови чел овека. О п ределение титра резусны х антител всы воротке крови RhоD(-) б ерем енны х женщ ин им еет важное диагностическое значение, так как взависим ости от количества RhоD-антител возм ожен вы киды ш , рождением ертвого п лода или живогореб енкас врожденной гем олитической б олезнью . Н еоб ходим оеоб орудование: исследуем аясы воротка, стандартны ерезус –

10

п оложительны е эритроциты О (I) груп п ы , 0,9% растворхлорида натрия, п роб ирки, п ип етки П астера, 10% растворжелатина, водяная б аня или суховоздуш ны й терм остат, секундом ер, м икроскоп . Т ехникаоп ределения. В ш тативустанавливаю т десять п роб ирок с об означениям и: «I:2» , «I:4» , «I:8» и такдалеедо«I:I024» . В о все п роб ирки вводят п о две кап ли (0,1м л) изотонического раствора NaCl. В п ервую п роб иркуэтой жеп ип еткой вводят 2 кап ли (0,1м л) исследуем ой сы воротки. П ослеп ерем еш иваниядвекап ли см еси из п ервой п роб ирки п ереносят во вторую , содержим ое второй п роб ирки п ерем еш иваю т и 2 кап ли см еси п ереносят втретью , из третьей п роб ирки - вчетвёртую и так до п оследней п роб ирки, из которой две кап ли см еси удаляю т. В результате вп роб ирках п олучаю т разведениясы воротки от I:2 доI:I024. В о всеп роб ирки доб авляю т п о одной кап ле(0,05 м л) см еси RhоD(+) эритроцитовО (I) груп п ы крови, п олученны х от 4-5 донорови п риготовленны х п о м етодике, оп исанной влаб ораторной раб оте2. В о все п роб ирки вводят п о две кап ли (0,1 м л) 10% раствора желатина, п редварительно п одогретого до разжижениявтеп лой водеп ри тем п ературе4648 оС . П роб ирки встряхиваю т и п ом ещ аю т вводяную б аню п ри тем п ературе46о 48 С на10 м инут или всуховоздуш ны й терм остат на30 м ин. П о извлечении п роб ирок из водяной б ани вних доливаю т п о 5-8 м л 0,9% раствора NaCl и наб лю даю т результат. П оследнее разведение, вкотором наб лю дается агглю тинация, п риним ается за титрвы явленны х неп олны х резус – антител. Е сли агглю тинация эритроцитовнаб лю дается во всех разведениях сы воротки, то, следовательно, титррезус – антител висследуем ой сы воротки вы ш е I:I024. В этих случаях следует п родолжить разведение сы воротки и далее п родолжатьисследование, каксказано вы ш е(см . п ункты 4-7). Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А 4. О пред ел ениет ит ра α- и β-агглют ининов (норм ал ьных ант ит ел ) в сыворот кекрови чел овека. Н а п оверхности эритроцитов человека находится б ольш ое количество сп ециф ических антигенов(изоантигенов), что п озволяет делитькровьлю дей п о им м уногенетическим п ризнакам на разны е систем ы . С реди 15 систем эритроцитарны х антигеновособ ое м есто заним ает систем а АВ О . О на б ы ла откры та в 1900 г. К. Л андш тейнером и вклю чает всеб я четы ре основны х груп п ы крови, которы е п редставляю т соб ой ком б инации из двух изоантигеновА и В на п оверхности эритроцитови двух антител (α- и β-изогем агглю тининов) вп лазм е крови (таб л.). У лю дей с груп п ой крови О (I), не им ею щ их антигеновА и В , синтезируется вещ ество Н . Аллельны е гены А и В кодирую т трансф еразы , которы е п рисоединяю т квещ еству Н п ри синтезеантигена А N-ацетилгалактозам ин (груп п а крови АII), а п ри синтезе антигена В - галактозу (груп п а крови В III). У лю дей с груп п ой крови АВ IV осущ ествляетсясинтез и А-, и В - антигенов. П ри отсутст-

11

вии данны х антигеновна п оверхности эритроцитовворганизм е п лода вп роцессе его ф орм ирования (на 6 м есяца внутриутроб ного развития) начинается об разование груп п овы х антител. Д анны е антитела п олучили название α- и βизогем агглю тининовили норм альны х (естественны х) антител. Э то п олны е, холодовы е(15-20 оС ), неустойчивы е (инактивирую тся п ри нагревании сы воротки п ри 70 оС втечение 10 м ин.) антитела, относятся к классу им м уноглоб улинов IgМ . О ни неп роходят через п лаценту и нем огут п овредитьэритроциты п лода, накоторы х п рисутствую т антигены , отличны еот антигеновм атери. Н ачинаяс 9-й недели внутриутроб ногоразвития, эритроциты п лодам огут п оп адать вкровоток м атери врезультате возм ожного см еш ивания крови влакунах ф орм ирую щ егося троф об ласта. В случае несовм естим ости антигеновп о систем е АВ О , эритроциты п лода им м унизирую т м ать и инициирую т п родукцию антигруп п овы х антител. Э ти антитела относятся к IgG, они своб одно трансп ортирую тся через п лаценту, об ладаю т цитотоксическим и свойствам и, п овреждаю т клетки крови зароды ш а и п риводят к развитию гем олитической б олезни п лода и новорожденного. Ч ащ е всего м ежгруп п овой конф ликт п о антигенам систем ы АВ О возникает, когда у м атери груп п а крови О (I), а у п лода – А(II), но таккакиз нескольких аллотип овантигена А (А1, А2. А3, А4, А5, А6, и т.д.) наиб олее им м уногенны м являю тся аллотип А1, то влиянию цитотоксических IgG α-гем олизиновоказы ваю тся п одвержены гом озиготны е А1 А1 эм б рионы . П оэтом у м ежгруп п овы е конф ликты встречаю тся довольно редко (м енее10% случаевот об щ его числа родов). Кром етого, антиген В м ало им м уногенен, а груп п ы крови В (III) и АВ (IV) встречаю тся редко (таб л. 1). И ногруп п ны й конф ликт п ри п ервой б ерем енности клинически п роявляется угрозой п реры вания б ерем енности или вы киды ш ем . П ри п овторной б ерем енности цитотоксическиеIgG редко п роявляю т своеотрицательноевоздействиенап лод. Т аб лица Г руп п ы крови человека Группы крови 01 АП ВШ А ВIV Н аличие агглю тиногеА В АиВ нов (изоантигенов) на м ем б ранеэритроцитов Н аличие агглю тининов αиβ β α (антител) в сы воротке крови Ч астота встречаем ости 46 % 42 % 9% 3% вп оп уляции Т итры α-антител учеловека об ы чноравняю тсяI:32 - I:64, β-антител-I:16 I:32. О днако эти величины колеб лю тся взависим ости от врем ени года и значительно снижаю тся весной. Н аследование α- и β-изогем агглю тининовп роисходит вкоррелятивной зависим ости от А- и В - антигеновввидетрех сцеп ленны х п ризнаков: О αβ, Аβ, и В α. П ри взаим одействии одноим енны х антигенови антител (А+α и В +β) in vitro и in vitro п роисходит агглю тинацияэритроцитов, что особ енно оп асно п ри п ереливании крови. В связи с этим п ри трансф узиях до-

12

норской крови об язательно осущ ествляю т п роверку еесовм естим ости с кровью рецип иента. О п ределениетитра естественны х антител к А- и В – антигенам осущ ествляю т не только п ри возникновении конф ликта п о антигенам систем ы АВ О м ежду м атерью и п лодом , но также и п ри п риготовлении вы сокоактивны х стандартны х сы вороток, даю щ их круп ную агглю тинацию эритроцитов, п ри оп ределении груп п овой п ринадлежности крови человека. Н еоб ходим оеоб орудование: сы воротка крови человека, п ланш ет длятитрования сы воротки, 0,9% растворхлорида натрия, п ип етки П астера, секундом ер, стекляннаяп алочка, эритроциты груп п ы А и эритроциты груп п ы В . Т ехникаоп ределения. Д ля оп ределения титра агглю тининоввисследуем ой сы воротке готовят разведение ее в изотоническом растворе NaCl. Д ля этого на сп ециальны й п ланш ет «раскап ы ваю т» 0,9% растворхлорида натрия(10 кап ельп о 0,1 м л). Затем вп ервую кап лю той же п ип еткой доб авляю т 0.1 м л исследуем ой сы воротки, п ерем еш иваю т еес ф изиологическим раствором . И з этой кап ли 0,1 м л см еси п ереносят во вторую кап лю , снова п ерем еш иваю т и 0,1 м л см еси п ереносят в третью кап лю и так до п оследней десятой кап ли. В результатена п ланш етеоб разуетсяразведениесы воротки от I:2 доI:I024. Рядом с каждой кап лей разведенной сы воротки наносят м аленькую кап лю (0,01 м л) стандартны х эритроцитовгруп п ы А, когда титрую т α-агглю тинины , и эритроциты груп п ы В , когда титрую т β-агглю тинины . С оотнош ение эритроцитови сы воротки должноб ы тьп риб лизительно I:10. Каждую кап лю эритроцитовтщ ательно п ерем еш иваю т с сы вороткой сухой стеклянной п алочкой (разм еш иваниеначинаю т с сам ого б ольш ого разведения). П осле чего п ланш ет осторожно п окачиваю т, оставляю т вп окое на 1-1,5 м ин., затем п ланш ет снова п окачиваю т и одноврем енно наб лю даю т результат. Реакцию п роводят втечение5 м ин. Н аиб ольш ее разведение сы воротки, п ри котором наб лю далась агглю тинации стандартны х эритроцитовдо истечении 5 м ин., п риним аю т за титрагглю тининоввэтой сы воротке. II. Реакции п рецип итации П рецип итация – это реакция об разования ком п лексовантиген-антитело п ри взаим одействии растворим ы х антигенови соответствую щ их им антител. Антитела, вы зы ваю щ ие п рецип итацию антигенов, назы ваю т п рецип итинам и. И м м унны е ком п лексы , об разую щ иеся врезультате реакции п рецип итации п олучили названиеп рецип итатов. Г ейдельб ерги Кэнделл установили зависим остьп ротекания реакции п рецип итации от количественного соотнош ения антигенови антител, участвую щ их вреакции. Г раф ическое изоб ражение результатовреакции п рецип итации, п ротекаю щ ей вусловиях п остоянной концентрации антител и доб авления п остеп енно увеличиваю щ ихся количествантигена вп роб е, п олучило известность как «кривая п рецип итации Г ейдельб ергера» . Д анная кривая п редставлена на рис.I, онаим еет три зоны : 1. Зонаизб ы ткаантител: наб лю даетсяоб разованиеп рецип итатов, но в надосадочной жидкости им ею тся своб одны е антитела, не связанны е с антигеном из-заколичественногонедостаткап оследнего;

13

К ол и ч ес т во Зона преци пи т ат а и зб ы т ка ант и т ел (м кг) о о

о

о о о о

о

о о

Зона и зб ы т ка ант и гена

Зона э кви вал ент нос т и

К ол и ч ес т вод об авл енного ант и гена (м кг) Ри с . 1. К ри вая преци пи т аци и Гейд ел ьб ергера Об означ ени я: - ант и т ел а; о- ант и ген.

2. Зона эквивалентности: внадосадочной жидкости отсутствую т своб одны е антитела и антигены ; все антитела связаны с антигенам и, об разуется м аксим альноеколичествонерастворим огоп рецип итата; 3. Зонаизб ы ткаантигена: об разую тсям елкиерастворим ы еком п лексы антиген-антитело. В надосадочной жидкости им ею тсясвоб одны еантигены , для связы ваниякоторы х нехватает своб одны х антител. Кривая п рецип итации Г ейдельб ергера наш ла п рим енение п ри разраб отке количественны х м етодованализа антигенови антител, основанны х на реакции п рецип итации. Т ак, п ри неф елом етрическом м етоде оценки п рецип итации, б азирую щ ем сяна изм ерении светоп оглощ енияим м унного ком п лекса п ри 450 нм , исп ользуетсясоотнош ениеантитело: антиген, характерноедлявосходящ ей части кривой Г ейдельб ергера (зона изб ы тка антител). Н а сп особ ности об разовы вать нерастворим ы е п рецип итаты взоне эквивалентны х количественны х соотнош ений антител и антигеновосновы вается реакция оп ределения им м уноглоб улиновм етодом радиальной им м унодиф ф узии. Реакции п рецип итации лежат восноверазличны х м одиф икаций м етодаим м уноэлектроф ореза. М етоды им м унодиф ф узии являю тсявариантам и реакции п рецип итации, в которы х взаим одействие антигена с антителам и п роисходит не вжидкости, а в геле, что п озволяет лучш евы являтьи ф иксироватьрезультаты взаим одействия. Ч ащ е всего для раб оты исп ользую тся агаровы й, агарозны й или п олиакрилам идны й гели. Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А 5. П ол у количест венное опред ел ение ал ьф а - ф ет опрот еина в сыворот ке

14

крови чел овека м ет од ом д войнойим м у нод иф ф у зии в гел е. Альф а – ф етоп ротеин (АФ П ) относится к раково – эм б риональны м антигенам (РЭ А), которы е п редставляю т соб ой диф ф еренцировочны е антигены , эксп рессируем ы е во врем я развития п лода. Э то гликоп ротеин с м олекулярной м ассой около 60-70 кД а, содержащ ийсяввы соких концентрациях вп лазм екрови вэм б риональны й п ериод развития человека. В сы воротке крови взрослого организм а АФ П п рисутствует вследовы х количествах (1,5-1,6 нг/м л). С одержание его резко возрастает вкрови женщ ин во врем я б ерем енности, а также п ри развитии злокачественны х оп ухолей п ечени (п ервичны е клеточны е карцином ы п ечени и тератоб ластом ы ), чтоисп ользуетсядлядиагностики п оследних. Д ля оп ределения всы вороткекрови человека АФ П п рим еняю т серологическую реакцию с исп ользованием сп ециальны х им м унодиагностикум ов, вклю чаю щ их всеб я лиоф ильно вы суш енны е п реп араты м оносп ециф ической кроличьей антисы воротки п ротивальф а – ф етоп ротеина человека (АТ ) и альф а – ф етоп ротеина (АТ ). Реакцию п рецип итации осущ ествляю т м етодом двойной им м унодиф ф узии вагаровом геле, вп роцессекоторой наб лю даетсядиф ф узияи антигена, и антитела. Н а том м есте, гдеп роисходит взаим одействиеАГ и АТ (с п ерекрестны м связы ванием и осаждением им м унны х ком п лексов) об разуется линияп рецип итации. Н еоб ходим ое об орудование: лиоф ильно вы суш енны й п реп арат м оносп ециф ической кроличьей антисы воротки, содержащ ей антитела п ротивАФ П человека; лиоф ильно вы суш енны й п реп арат АФ П , 1% растворагар-агара, 0,9% растворхлорида натрия, исследуем ы е сы воротки крови человека, стеклянны е п ластины или чаш ки П етри, стандартны й ш там п для вы резания лунок, п астеровскиеп ип етки или труб очки дляотсасы ванияагараиз лунок, м икроп ип етки. Т ехника оп ределения. 12 м л п редварительно разогретого до жидкого состояния 1% раствора п розрачного агара, п риготовленного на 0,9% растворе хлорида натрия (рН 7,0 - 7,2), наливаю т на стеклянны е п ластины или чаш ки П етри. Ч ерез 30 - 40 м инут взасты вш ем агаревы резаю т сп ециальны м ш там п ом контуры лунок. Агариз лунок отсасы ваю т п астеровской п ип еткой или с п ом ощ ью труб ки, диам етркоторой м еньш едиам етратруб очекш там п а. П реп араты м оносп ециф ической кроличьей антисы воротки п ротивАФ П человека и АФ П человека растворяю т соответственно в1 и 2 м л ф изиологического раствора. В центральную лунку наливаю т м оносп ециф ическую кроличью антисы воротку п ротивАФ П человека (АТ ), вдве п ериф ерические п ротивоп оложны е другдругу лунки – стандартны й растворАФ П человека (АГ ), воставш иеся четы релунки – исследуем ы есы воротки крови человекаи ф изиологический раствор(Ф Р) дляконтроля(рис.2). АГ ФР

1 АТ ФР

2 АГ

Ри с . 2. Схем а пос т ановки опы т а

15

О ценкарезультатов. У чет результатовосущ ествляется п о п лю совой ш кале. Реакция считается п оложительной, если линия п рецип итации м ежду стандартны м и ком п онентам и им м унодиагностикум а (антителам и м оносп ециф ической кроличьей антисы воротки п ротивАФ П человека и антигеном АФ П человека) сливается с линией п рецип итации, об разуем ой антигенам и исп ы туем ой сы воротки и антителам и м оносп ециф ической кроличьей антисы воротки п ротивАФ П человека(рис.3 б , в, г). АГ

АГ ФР а)

ФР

1

АТ

б)

АТ

2 ФР

ФР

в)

АГ

АГ

АГ

АГ

ФР

3 АТ

г)

ФР

4 АТ ФР

ФР АГ

АГ

Ри с . 3. Ти пы возм ожны хрезул ьт ат ов преци пи т аци и О б означения: АТ - кроличья м оносп ециф ическая антисы воротка п ротивальф а – ф етоп ротеиначеловека; АГ – альф а– ф етоп ротеин; Ф Р – ф изиологический раствор; 1, 2, 3, 4– исследуем ы есы воротки крови человека; а) (+) – слаб оп оложительнаяреакция; б ) (++) - п оложительнаяреакция; в) (+++) - резкоп оложительнаяреакция; г) (-) – отрицательнаяреакция.

В зависим ости от м еста нахождения п олос п рецип итации реакцию считаю т: 1. С лаб оп оложительной (+) - линия п рецип итации находится у лунки с исп ы туем ой сы вороткой, концентрация альф а – ф етоп ротеина всы воротке м енее50 м г/м л(рис.3 а); 2. П оложительной (++) - линия п рецип итации находится на одинако-

16

вом расстоянии от центральной лунки, концентрация АФ П висследуем ой сы воротке50 м г/м л(рис.3 б ); 3. Резкоп оложительной (+++) - линия п рецип итации исп ы туем ой сы воротки диф ф узна и сдвинута всторону центральной лунки, а линия п рецип итации им м унодиагностикум а резкооб ры вается(рис.3 в). Е сли исследуем ая сы воротка содержит значительное количество АФ П (б олеечем 50 м г/м л), то линияп рецип итации этого антигена с антисы вороткой м ожет не об разовы ваться. В этом случае исп ы туем ую сы воротку следует развести вдвараза ф изиологическим раствором и п овторно п оставитьреакцию ; 4. О трицательной (-) - линия п рецип итации ком п онентовим м унодиагностикум а достигает своим и концам и лунок с исследуем ой сы вороткой и ф изиологическим раствором (рис.3 г). Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А 6. О пред ел ениесод ерж ания им м у ноглобу л инов в сыворот кекрови человека м ет од ом прост ойрад иал ьнойим м у нод иф ф у зии по М анчини в м од иф икации Ст еф ани. Ш ирокое расп ространение вклинических им м унологических лаб ораториях п олучил количественны й м етод оп ределения им м уноглоб улинов: IgG, IgM, IgА, п редложенны й М анчини и сотр. в1964 г. О н основан на одном ерной радиальной им м унодиф ф узии исследуем ой сы воротки вагаровом или агарозном геле, содержащ ем м оносп ециф ическиесы воротки с соответствую щ им и антителам и п ротивIgG, IgM, IgA. Н азванны еим м уноглоб улины вы ступ аю т вроли антигена. Л иния п рецип итации м ежду антигенной детерм инантой исследуем ого б елка и антителам и м оносп ециф ической антисы воротки в геле им еет ф орм у круга вокруг стартовой лунки. П лощ адь круга п рям о п роп орциональна концентрации антигена висследуем ой п роб е. В связи с этим концентрацию им м уноглоб улиноввисп ы туем ой п роб е м ожно оп ределить п о п редварительно п остроенной калиб ровочной п рям ой, п редставляю щ ей соб ой зависим ость м ежду диам етром кольца п рецип итации и концентрацией им м уноглоб улина встандартны х п роб ах с известны м количеством б елка. С одержаниеим м уноглоб улиноввкровотокезависит, с одной стороны , от интенсивности их синтезап лазм атическим и клеткам и, п оследую щ егоисп ользованиявим м унны х реакциях и скорости расп ада, ас другой стороны - от их сп особ ности сорб ироватьсянап оверхности циркулирую щ их вкрови лейкоцитов. К ром етого, частьим м уноглоб улиновчеловекадеп онируетсявлим ф оидной, м ы ш ечной, соединительной тканях различны х органов, атакжевтканевой жидкости. В крови наб лю даетсядинам ическоеравновесием еждум олекулам и им м уноглоб улинов, находящ ихсявп лазм евсвоб одном (растворенном ) состоянии и м олекулам и им м уноглоб улинов, сорб ированны м и наклеточной п оверхности. И зм ененияклеточного и гум оральногосостава, ф изико–хим ических реакций п лазм ы крови п од влиянием ф изических нагрузоки ф изиологических реакций п риводят ксдвигуданного равновесиявтуили иную сторону. Н еоб ходим оеоб орудование: п реп араты м оносп ециф ических сы вороток п ротивсы воротоким м уноглоб улиновчеловека(IgG, IgM, IgA), п олученны е п утем им м унизации животны х (кроликовили б аранов) соответствую щ им и,

17

очищ енны м и им м уноглоб улинам и, исп ользуем ы м и вкачествеантигенов, агар Д иф ко, веронал– м единаловы й б уф ер, 0,9% растворхлориданатрия, 1% растворм ертиолата, исследуем аясы вороткакрови человека, чаш ки П етри, п роб ойниклуноквгеле, траф арет, водянаяб аня, терм ом етр, эксикатор, п ип етки и м икроп ип етки, б инокулярнаялуп аМ БС -9 с м икролинейкой вокуляре. Т ехникаоп ределения. П оследовательностьп роведенияоп ределенияим м уноглоб улиноввсы вороткекрови человекам етодом п ростой радиальной им м унодиф ф узии п о М анчини п редставленанарис.4. Рассм отрим п одроб нееотдельны естадии данной раб оты . 1. П риготовление2% раствораагарав0,1 м олярном веронал- м единаловом б уф ере, рН 8,56: агарД иф коп ом еститьвм ерны й ф лакон и залить50 м лдистиллированной воды , несколькораз п ерем еш ать, затем взвеситьагара расп лавитьнакип ящ ей водяной б ане. К расп лавленном уагарудоб авитьравны й об ъ ем веронал– м единаловогоб уф ераи 2 м л1% растворам ертиолата. Разлитьагарвп роб ирки п о10-12 м л, закры тьп роб кам и, хранитьдоп рим енениявхолодильникеп ри 4 оС . 2. П риготовление раб очих растворов агара с м оносп ециф ическим и сы вороткам и п ротивим м уноглоб улиновчеловека осущ ествляю т неп осредственно п еред п роведением им м унодиф ф узии. Растворы антисы вороток готовят неп осредственно п еред см еш иванием с раствором агара п о инструкции, п рилагаем ой к ком м ерческим наб орам антисы вороток дляоп ределенияим м уноглоб улиновчеловека всы воротке. Н а водяной б ане(56 оС ) разогреть 18-20 м л 2% раствора агара, сю да жеп ом еститьп роб ирки с растворам и антисы вороток. 3. Когда тем п ературы растворовсравняю тся, соединить 6 м л агара и 6 м л антисы воротки, см есь осторожно п ерем еш ать, изб егая об разования п узы рей воздуха, затем б ы строслитьвчаш куП етри. 4. Ч ерез 20-30 м ин. п осле засты вания агара на слое агарового геля с п ом ощ ью п роб ойника сделать п о траф арету стандартны е отверстия диам етром 2,0-2,5 м м . П осле этого п астеровской п ип еткой или труб очкой м еньш его диам етра с п ом ощ ью водоструйного насоса отсасы ваю т из лунок гелевы е п роб ки так, чтоб ы краялунокнедеф орм ировались. 5. В лунки внести п о 2 м кл исследуем ы х сы вороток и стандартны х растворовком м ерческих сы воротокдляп олучениякалиб ровочной кривой. 6. Ч аш ки П етри п ом еститьво влажную кам еру п ри 4оС . Д лительность радиальной им м унодиф ф узии дляIgG и IgA – 24 ч., дляIgM - 48 ч. В течениеэтого врем ени антиген диф ф ундирует вгельи об разует с антителам и растворим ы е ком п лексы (п ри изб ы тке антигена). Ком п лексы п родолжаю т диф ф ундировать, связы вая все б ольш ее количество антител до тех п ор, п ока не б удет достигнута точка эквивалентности и не п роизойдет осаждение ком п лексовс об разованием кольца. П о диам етру зоны , ограниченной кольцом п рецип итации, оп ределяю т ее п лощ адь. В еличина п лощ ади п роп орциональна концентрации исследуем ого антигена.

18

При гот овл ени е 2 % рас т вора агара в веронал -м ед и нал овом о б уф ере, pH 8,6; 56 С

Развед ени е м онос пеци ф и ч ес кой с ы ворот ки прот и в IgG, IgM, IgA; (56 оС)

о

См еш и вани е (56 С)

Нанес ени е с л оя агара в ч аш ки Пет ри Вы резани е л унок Внес ени е и с с л ед уем ы х и с т анд арт ны храс т воров с ы ворот ки в л унки (2м кл )

Им м унод и ф ф узи я (24-48 ч , о 4 С, вл ажная кам ера)

Изм ерени е д и ам ет ра кол ьца преци пи т аци и

Рас ч ет кол и ч ес т ва и м м уногл об ул и нов покал и б ровоч ной прям ой Ри с . 4. Схем а провед ени я опред ел ени я и м м уногл об ул и нов м ет од ом прос т ой рад и ал ьной и м м унод и ф ф узи и

7. Д иам етры колецп рецип итации изм еряю т, п ом ещ ая чаш ка П етри с влажны м и неокраш енны м и гелям и на п редм етны й столб ик б инокулярной луп ы М БС -9 с м икролинейкой вокуляре, п росм атривая и зам еряя кольца п рецип итации п ри м алом увеличении (х 8). П еред снятием результатовреком ендуется об раб отать гель теп лы м 5%

19

раствором хлорида натрия, что сп особ ствует удалению всех б елков, не п ринявш их участия воб разовании п рецип итата. П рецип итаты м ожно об раб отать краскам и дляб елков(б ром ф енолсиний, ам идочерны й). Расчет количества им м уноглоб улиноввисп ы туем ой сы воротке осущ ествляю т с п ом ощ ью калиб ровочной п рям ой, п остроение которой осущ ествляю т на п олулогариф м ической б ум аге. Н а оси аб сцисс отклады ваю т диам етры колец п рецип итации (α-вм м ), наоси ординат - концентрацию им м уноглоб улинов(С – м г/м л) встандартны х п роб ах (рис.5). С, м г/м л

.

30 25

.

20 15 10

.

5 0

0

5

10

15

20

25

30 d, м м

Рис. 5. Калиб ровочная п рям ая для расчета им м уноглоб улиноввисследуем ой сы воротке Д ля оп ределения уровня им м уноглоб улиноввисп ы туем ой сы воротке на оси аб сцисс отклады ваю т диам етркольца п рецип итации исследуем ой сы воротки и восстанавливаю т п ерп ендикулярдо п ересеченияс п рям ой. Э туточку п ересечения п роецирую т на ось ординат, что соответствует содержанию им м уноглоб улинаоп ределенного тип авсы вороткекрови. Л АБО РАТ О РН АЯ РАБО Т А 7 О пред ел ение поверхност ного ант игена гепат ит а В (Н ВSАg) м ет од ом вст речного им м у ноэлект роф ореза в геле. Заб олевание геп атитом у лю дей вы зы ваю т разнооб разны е Д Н К- и РН Ксодержащ ие вирусы . О ни п ринадлежат к разны м сем ействам и всоответствии вы явления оп ределенного тип а вируса вы деляю т (классиф ицирую т) различны е виды вирусного геп атитаА, В , С , D, Е . В п ервы ечастицы вируса геп атита В (HBV) об наружил Д . Д ейн в1970 г. и п озже они б ы ли названы частицам и Д ейна. Э ти частицы (или вирионы ) сф ерической ф орм ы с диам етром 42 нм состоят из нуклеокап сида, об разованного 180 кап сом ерам и, и лип осодержащ ей внеш ней об олочки. В состав геном а HBV входят кольцевая м олекула Д Н К с однонитевы м участком , б елки, ф ерм енты , лип иды и углеводы .

20

В вирусегеп атитаВ об наружено4 антигена: HBS, HBc, HВ e и HBx. HBs – антиген (ранее его назы вали австралийским антигеном ) – это гликоп ротеин с лип идны м ком п онентом . О н содержится во внеш ней об олочке вириона (отсю да п ош ло названиеп оверхностны й антиген), состоит из двух п олип еп тидны х ф рагм ентов. О дин из них отвечает за адсорб цию вируса на сп ециф ических рецеп торах геп атоцитов. Д ругой ф рагм ент об ладает вы раженны м и им м уногенны м и свойствам и. HBs – антиген об наруживается вкрови и им еет диагностическое значение. В организм е б ольны х геп атитом В синтезирую тся антитела к трем антигенам HBs, HBc и Hbе. Д лявы явлениявсы вороткечеловекап оверхностногоантигенагеп атитаВ (HBs ) и антител к HBs - антигену исп ользуется сп ециальны й им м унодиагностикум , состоящ ий из двух лиоф илизированны х п реп аратов: I) м оносп ециф ической кроличьей антисы воротки к HBs - антигену (АТ ) и 2) человеческой сы воротки, содержащ ей HBs - антиген (АГ ). П еред уп отреб лением содержим ое ам п ул растворяю т втех об ъ ем ах ф изиологического раствора, которы еуказаны на этикетках ам п ул. О п ределение антигена HBs всы воротке крови человека осущ ествляю т м етодом встречногоим м уноэлектроф орезавгеле. М етод встречного им м уноэлектроф ореза основан на различной п одвижности вэлектрическом п олеHBs -антигена и антител кнем у. Антиген движется внап равлении к аноду, антитела движутся к катоду. П ри их взаим одействии об разуется п олоса п рецип итации, расп оложеннаяп ерп ендикулярно к нап равлению движениятока. Н еоб ходим оеоб орудование: п риб ордля электроф ореза б елковна б ум аге, им м унодиагностикум на антиген геп атита В (HBs ) и антитела к нем у, 1% растворагара Д иф ко, Na – ацетатб арб италовы й б уф ер, рН 8,1 - 8,4, стеклянны е п ластины разм ером 9х12 см , ш там п для п росечения лунок вагаре. Н аружны й диам етртруб очек вш там п е4 м м , расстоянием ежду центрам и отверстий лунок п о нап равлению тока – 8 м м , м ежду центрам и отверстий вряду – 8м м . Е сли ш там п а нет, то контуры лунок м ожно п рорезать м еталлической труб кой того же диам етра. Д ля соб лю дения п равильного расстояния м ежду лункам и п од п ластинку с агаром кладут сп ециальны й траф арет, нарисованны й на м иллим етровой б ум аге. Т ехникаоп ределения. 15 м л 1% раствора агара Д иф ко, п риготовленного на Naацетатб арб италовом б уф ере, рН 8,1-8,4, наливаю т на об езжиренную п ластинку, расп оложенную настрого горизонтальной п оверхности. П осле засты вания агара внем п о траф арету п росекаю т контуры лунок, агаровы еп роб ки из лунокудаляю т отсасы ванием . В лунки вровень с п оверхностью агара кап илляром вносят АГ и АТ им м унодиагностикум а, а также исп ы туем ы е сы воротки п о схем е, п редставленной на рисунке6. В п ервую и п оследню ю п ару лунокряда вносят АГ и АТ им м унодиагностикум а дляконтролярежим а оп ы та. В лунки, расп оложенны ена сторонекатода, вносят АГ им м унодиагностикум а и исп ы туем ы есы воротки. В лунки,

21

расп оложенны е на стороне анода, - антитела им м унодиагностикум а. П осле зап олнения лунок стекло п ом ещ аю т вп риб ордля электроф ореза. Н а два п ротивоп оложны х краястекла со стороны анодаи катода кладут двойны е, см оченны е вб уф ереф ильтровальны еб ум ажки разм ером 9 х 12. Ф ильтровальны еб ум ажки должны закры вать0,5-1 см п оверхности агара и п лотно к нем у п рилегать. С воб одны й конецб ум аги (12 см ) оп ускаю т вэлектродны й сосуд, вкотором налит б уф ер. П осле вклю чения п риб ора устанавливаю т нап ряжение 120-160 В , силу тока – 30 м А. Ч ерез 1,5-2 часа п риб оротклю чаю т, б ум ажны есоединители уб ираю т и п роизводят учет результатов. В начале п роверяю т реакцию у контрольны х лунок. П олоса п рецип итации АГ -АТ им м унодиагностикум а должна б ы ть расп оложена б лиже к лунке с антигеном всвязи с тем , что м олекулы антител об ладаю т б ольш ей п одвижностью , чем м олекулы антигена, они п роходят б ольш ее расстояние до взаим одействия с антигеном . Э тим они отличаю тся от других несп ециф ических п олос, которы ем огут об разовы ватьсяп ри п роведении реакции м етодом встречного им м уноэлектроф ореза, так как всы воротке человека м ожет п рисутствоватьнесколько п рецип итирую щ их систем . П еред учетом результатовреком ендуется п ластинку с агаром п ом естить на 1 час в10 % растворNaCl. П оложительной на п рисутствие HBs - антигена считается та сы воротка, которая с АТ им унодиагностикум а об разует п олосу п рецип итации, расп оложенную б лиже к лунке с исследуем ой сы вороткой и находящ ую ся на одной п рям ой с п олосой п рецип итации уконтрольны х лунок. П ри исследовании сы вороток для об наружения антител к HBs - антигену реакцию ставят п о той же схем е (только вм есто АТ им м унодиагностикум а заливаю т влунки антиген им м унодиагностикум а).

+ А нод

АТ

АГ

АТ

ИС 1

АТ

ИС 2

АТ

ИС 3

АТ

АГ

Рис. 6. С хем а расп оложения лунок п ри п роведении встречного им м уноэлектроф ореза для об наружения в сы воротке крови человека антигенаHBs О б означения: АГ – м есто нанесения антигена Н В s им м унодиагностикум а; АТ – м есто нанесенияантител кН В s – антигену; - И С 1 – И С 3 – м есто нанесения К ат од исследуем ы х сы вороток.

22

С П И С О К Р Е К О М Е Н Д УЕ М О Й Л И Т Е Р А Т УРЫ О сновная л и тература 1. Г алактионовВ .Г . И м м унология : учеб . п особ ие п о б иол. сп ециальностям / В .Г . Г алактионов. – М . : Academia, 2004. – 523 с. 2. Х аитовР.М . И м м унология / Р.М . Х аитов, Г .А. И гнатьева, И .Г . С идорович. – М . : М едицина, 2000. – 432 с. Д опол ни тел ьная л и тература 1. П рактикум п о им м унологии : учеб . п особ ие / п од ред. И .А. Кондратьевой, В .Д . С ам уилова. – М . : И зд-воМ Г У , 2001. – 224 с. 2. Ройт А. И м м унология/ А. Ройт, Д ж. Бростоф ф , Д .М ейл. – М . : М ир, 2000. – 592 с.

23

С оставители: П утинцеваО льгаВ асильевна, Артю ховВ алерий Г ригорьевич РедакторТ ихом ирова О . А.