Основы экотоксикологиии: Методические указания к выполнению лабораторного практикума и СРС

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Восточно-Сибирский государственный технологический университет» (ГОУ ВПО ВСГТУ)

Основы экотоксикологиии Методические указания к выполнению лабораторного практикума и СРС для студентов специальности 240901 «Биотехнология»

В методических указания приведены краткие теоретические основы экотоксикологии и эколого-гигиенической оценки биотехнологических производств и продуктов, лабораторные работы по определению влияния некоторых соединений на биообъекты. Методические указания ознакомят студентов с актуальными проблемами экотоксикологии как раздела экологии с учетом современных концепций и результатов исследований, позволят выработать у них теоретические и практические навыки, необходимые для распознавания и прогнозирования поведения, нормируемых токсикантов и их распределения в экосистемах. Даны параметры предельно допустимых токсичных выбросов и их предельно допустимых концентраций, влияющие на защитные свойства среды обитания и отдельные организмы. Приведена концепция повышения сопротивляемости биоты к неблагоприятным внешним воздействиям. Описания включают вопросы для самопроверки. Представлены задания на СРС – задачи и контрольная работа для студентов заочного обучения. Методические указания для студентов специальности 240901 «Биотехнология».

Ключевые слова: микроорганизмы, тест-культуры, токсины, ксенобиотики, отходы, экология, ПДК. Составители: Гомбоева С.В., Инешина Е.Г.

Улан-Удэ Издательство ВСГТУ 2006 2

Введение В настоящее время значительная часть человечества в той или иной мере подвержена действию различных химикатов. Человечеству известно около 10 миллионов химических соединений. Из них более 60 тысяч широко используются в быту, медицине, на производстве и в сельском хозяйстве. Это количество веществ продолжает из года в год увеличиваться (по некоторым данным примерно на 1000 наименований ежегодно). И большая их часть при определенных обстоятельствах может причинить "серьезный вред здоровью". Развитие промышленности неразрывно связано с расширением круга используемых химических веществ. Увеличение объемов применяемых пестицидов, удобрений и других химикатов - характерная черта современного сельского хозяйства и лесоводства. В этом объективная причина неуклонного усиления химической опасности для окружающей среды, таящейся в самой природе человеческой деятельности. Экотоксикология изучает развитие неблагоприятных эффектов, проявляющихся при действии загрязнителей на самые разнообразные виды живых организмов (от микроорганизмов до человека), как правило, на уровне популяций или экосистемы в целом, а также судьбу химического вещества в системе биогеоценоза. Существует большое количество физико-химических методов обнаружения токсичных соединений в объектах окружающей среды, однако наибольшей чувствительностью обладают живые организмы на разных стадиях организаций, а также биосенсоры, созданные на основе ферментов, полиферментных комплексов, клеточных органелл, клетки, тканей, рецепторов, антител, антигенов, которые специрфически взаимодействуют с регистрируемым агентом.

3

Токсическое действие веществ Действие веществ, приводящее к нарушению функций биологических систем, называется токсическим действием. В основе токсического действия лежит взаимодействие вещества с биологическим объектом на молекулярном уровне. Следствием токсического действия веществ на биологические системы является развитие токсического процесса. Токсичность проявляется и может быть изучена только в процессе взаимодействия химического вещества и биологических систем (клетки, изолированного органа, организма, популяции). Механизмы формирования и развития токсического процесса, его качественные и количественные характеристики, прежде всего, определяются строением вещества и его действующей дозой. Однако формы, в которых токсический процесс проявляется, несомненно, зависят также от вида биологического объекта, его свойств. Токсическое действие веществ, регистрируемое на популяционном и биогеоценологическом уровне, может быть обозначено как экотоксическое. Экотоксический процесс на уровне популяции проявляется: ростом заболеваемости, смертности, числа врожденных дефектов развития, уменьшением рождаемости; нарушением демографических характеристик популяции (соотношение возрастов, полов и т.д.); падением средней продолжительности жизни членов популяции, их культурной деградацией. Для экотоксикологии интерес представляют лишь молекулы, обладающие биодоступностью, т.е. способные взаимодействовать немеханическим путем с живыми организмами. Как правило, это соединения, находящиеся в газообразном или жидком состоянии, в форме водных рас4

творов, адсорбированные на частицах почвы и различных поверхностях, твердые вещества, но в виде мелко дисперсной пыли (размер частиц менее 50 мкм), наконец вещества, поступающие в организм с пищей. Часть биодоступных соединений утилизируется организмами, участвуя в процессах их пластического и энергетического обмена с окружающей средой, т.е. выступают в качестве ресурсов среды обитания. Другие же, поступая в организм животных и растений, не используются как источники энергии или пластический материал, но, действуя в достаточных дозах и концентрациях, способны существенно модифицировать течение нормальных физиологических процессов. Такие соединения называются чужеродными или ксенобиотиками (чуждые жизни). Одна из сложнейших практических задач экотоксикологии - определение количественных параметров, при которых экополлютант (загрязнитель) трансформируется в экотоксикант. Экотоксиканты К числу природных источников биодоступных ксенобиотиков, по данным ВОЗ (1992), относятся: переносимые ветром частицы пыли, аэрозоль морской соли, вулканическая деятельность, лесные пожары, биогенные частицы, биогенные летучие вещества. Другим источником ксенобиотиков в среде, значение которого неуклонно возрастает, является деятельность человека. Экотоксиканты накапливаются в окружающей среде из-за определенного отставания эволюционных процессов микроорганизмов, направленных на выработку у них способности к катаболизму, т.е. деградации этих соединений. Многочисленные абиотические (происходящие без участия живых организмов) и биотические (происходящие с участием живых организмов) процессы в окружающей среде направлены на элиминацию (удаление) экополлю5

тантов. Многие ксенобиотики, попав в воздух, почву, воду приносят минимальный вред экосистемам, поскольку время их воздействия ничтожно мало. Вещества, оказывающиеся резистентными к процессам разрушения, и, вследствие этого, длительно персистирующие в окружающей среде, как правило, являются потенциально опасными экотоксикантами. Подавляющее большинство веществ подвергаются в окружающей среде различным превращениям. Характер и скорость этих превращений определяют их стойкость. Если загрязнитель окружающей среды не может попасть внутрь организма, то, как правило, не представляет для существенной опасности. Однако, попав во внутренние среды, многие ксенобиотики способны накапливаться в тканях. Процесс, посредством которого организмы накапливают токсиканты, извлекая их из абиотической фазы (воды, почвы, воздуха) и из пищи (трофическая передача), называется биоаккумуляцией. Результатом биоаккумуляции являются пагубные последствия как для самого организма (достижение поражающей концентрации в критических тканях), так и для организмов, использующих данный биологический вид, в качестве пищи. К особо опасным экотоксикантам относят тяжелые металлы. Молекулярными мишенями, то есть объектами атаки ионов тяжелых металлов, служат: 1) гемсодержащие белки и ферменты; 2) системы перекисного и свободнорадикального окисления липидов и белков, а также системы антиоксидантной и антипероксидной защиты; 3) ферменты транспорта электронов и синтеза АТФ; 4) белки клеточных мембран и ионные каналы мембран. Органические экотоксиканты. Среди миллионов органических веществ, продуктов органического синтеза, отходов промышленного производства и применяемых в различных областях человеческой деятельности (от пестици6

дов до трансформаторных масел, от топлив до моющих средств) существует множество органических экотоксикантов. Ограничимся примером наиболее опасных хлорорганических экотоксикантов. Множественность клеточных мишеней для диоксинов и подобных веществ в различных биологических средах определяет широкий спектр токсических эффектов. В их числе: 1) эмбриотоксические и тератогенные (эффекты в отношении развития) - повышение числа спонтанных абортов, рождение потомства с аномалиями развития; 2) иммунотоксические, аналогичные действию вируса СПИД; 3) гистопатологические, вызывающие болезнь хлоракне (изменение клеток сальных желез кожи) и язвенную болезнь; 4) метаболические, связанные с модуляцией активности; 5) эндокринно-токсические, связанные с влиянием на метаболизм гормонов тироксина, эстрогенов, андрогенов (подавление синтеза тестостерона приводит к устойчивой феминизации потомства); 6) нейротоксические, проявляющиеся в повышенной нервозности, депрессивных состояниях, снижении уровня умственного развития, что объясняют влиянием полихлорированных диоксинов и дибензофуранов на метаболизм некоторых нейротрансмиттеров в клетках головного мозга; 7) канцерогенные, вызывающие образование злокачественных опухолей. Метод оценки токсичности Пути развития бурно прогрессирующей химической экотоксикологии заключаются в прослеживании всех возможных маршрутов аккумуляции, биотрансформации экотоксикантов, выяснении множественных связей экотоксикантов с теми или иными видами биот, предсказании экотоксикологических последствий. Особенно важны количественные характеристики, касающиеся устойчивости химикатов и образования продуктов их превращений в природных условиях, которые 7

получают либо в ходе мониторинга - отслеживания изменения концентраций отдельных химических соединений путем систематического анализа представительных проб воздуха, воды и почвы, либо в результате лабораторного моделирования. Таким образом, эти методы должны всесторонне совершенствоваться. Основные практические результаты в экотоксикологии получаются в настоящее время в ходе эмпирических исследований в реальных полевых условиях и лабораториях. В будущем необходимо продолжить работы, направленные на установление основных феноменов этой науки. Среди них следует отметить следующие направления: выявление видов живых организмов (прежде всего среди определяющих благополучие человеческой популяции), обладающих повышенной чувствительностью к наиболее опасным экополлютантам; изучение закономерностей взаимодействий ксенобиотиков с абиотическими элементами окружающей среды, приводящих к формированию экотоксических эффектов; раскрытие закономерностей формирования неблагоприятных эффектов при сочетанном действии веществ, составляющих ксенобиотический профиль среды, влияние на экотоксичность стрессоров нехимической природы; выявление молекулярных и клеточных маркеров, позволяющих выявлять токсическое действие ксенобиотиков на экосистемы, до их проявления на уровне популяций и т.д. Определение острой и хронической токсичности питьевых, грунтовых, поверхностных, сточных вод, а также водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов в лабораторных условиях используют тест-объекты. Методика основана на определении смертности тестобъектов при воздействии токсических веществ.

8

Острое токсическое действие исследуемой воды или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов на тест-объекты определяется по их смертности (летальности) за определенный период экспозиции. Критерием острой токсичности служит гибель 50% и более тест-объектов за 96 часов в исследуемой воде при условии, что в контрольном эксперименте гибель не превышает 10%. В экспериментах по определению острого токсического действия устанавливают: среднюю летальную концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель 50% и более тесторганизмов (ЛК50-96); безвредную (не вызывающую эффекта острой токсичности) концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель не более 10% тест-организмов (БК10-96, БКР10-96). Подготовка к проведению биотестирования Для проведения биотестирования необходимо предварительно подготовить посуду, пробоотборники, места хранения отобранных проб, а также рабочие места для обработки проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключать попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ из окружающих предметов или среды в исследуемую воду или в водные вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов. Под биотестированием (bioassay) обычно понимают процедуру становления токсичности среды с помощью тест-объектов, сигнализирующих об опасности, независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают 9

изменения жизненно важных функций у тест-объектов. Благодаря простоте, оперативности и доступности биотестирование получило широкое признание во всем мире и его все чаще используют наряду с методами аналитической химии. Биотестирование как метод оценки токсичности водной среды используется: при проведении токсикологической оценки промышленных, сточных бытовых, сельскохозяйственных, дренажных, загрязненных природных и прочих вод с целью выявления потенциальных источников загрязнения; в контроле аварийных сбросов высокотоксичных сточных вод; при оценке степени токсичности сточных вод на разных стадиях формирования при проектировании локальных очистных сооружений; в контроле токсичности сточных вод, подаваемых на очистные сооружения биологического типа с целью предупреждения проникновения опасных веществ для биоценозов активного ила; при определении уровня безопасного разбавления сточных вод ля гидробионтов с целью учета результатов биотестирования при корректировке и установлении предельно допустимых сбросов (ПДС) веществ, поступающих в водоемы со сточными водами; при проведении экологической экспертизы новых материалов, технологий очистки, проектов очистных сооружений и пр. Тест-объект (test organism) – организм, используемый при оценке токсичности химических веществ; природных и сточных вод; почв; донных отложений; кормов и др. Тестобъекты, по определению Л.П. Брагинского, «датчики» сигнальной информации о токсичности среды и заменители сложных химических анализов, позволяющие оператив10

но констатировать факт токсичности (ядовитости, вредности) водной среды («да», «нет»). Тест-объекты с известной степенью приближения дают количественную оценку уровня токсичности загрязнения водной среды – сточных, сбросных, циркуляционных и природных вод. Для биотестирования используются различные гидробионты – водоросли, микроорганизмы, беспозвоночные, рыбы. Наиболее популярные объекты – ювенальные формы планктонных ракообразных - фильтраторов Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis. Важное условие правильного проведения биотестирования – использование генетически однородных лабораторных культур, так как они проходят поверки чувствительности, содержатся в специальных, оговоренных стандартами, лабораторных условиях, обеспечивающих необходимую сходимость и воспроизводимость результатов исследований, а также максимальную чувствительность к токсическим веществам. Длительность биотестирования зависит от задачи, поставленной исследователем. Острые биотесты, выполняемые на различных тест-объектах по показателям выживаемости, длятся от нескольких минут до 24-96 ч. Краткосрочные хронические тесты длятся в течение 7 сут и заканчиваются, как правило, после получения первого поколения тест-объектов. Хронические тесты на общую плодовитость ракообразных, охватывающие 3 поколения, длятся до рождения молоди в третьем поколении. Степень токсичности оценивается методами биотестирования, а также по превышению ПДК в исследуемой среде. Для надежности контроля токсичности загрязнений неопределенного состава должно быть задействовано одновременно несколько тест-объектов.

11

Тест-объекты Daphnia magna Straus – относится к низшим ракообразным, отряду ветвистоусых. Дафнии обитают в планктоне стоячих и слабопроточных пресноводных водоемов, широко распространены на территории России. Тело дафний овальной формы сжато с боков, заключено в прозрачный панцирь. Тело нечетко сегментировано на головной, грудной и брюшной отделы (рис. 2). Голова покрыта щитом, передний край которого вытянут, образуя рострум. Под рострумом расположены две пары конечностей: антеннулы и антенны, последние сильно развиты, служат для скачкообразного перемещения в толще воды. Пять пар грудных конечностей сильно расчленены, снабжены щетинками, служат для фильтрации воды, питания, дыхания. Брюшной (абдоминальный) отдел туловища заканчивается постабдоменом, дорсальных край которого имеет выемку, характерную для дафний данного вида. Расположение внутренних органов представлено на рисунке 2. В головном отделе, не покрытом раковиной, расположен глаз: большой — сложный, маленький — простой. Под панцирем дафний легко различимы сердце, кишечник, выводковая камера, которая находится в спинной части туловища. В выводковой камере протекает эмбриональное развитие дафний. Оптимальное питание обеспечивает удвоение размеров рачков в промежутке между линьками. После наступления половой зрелости рост дафний замедляется, снижается и частота линек. Всего в течение жизни дафния может линять до 24 раз. Молодь имеет в длину 0,7-0,9 мм. Половозрелые самки – 2,2-2,4 мм, самцы –2,0-2,1 мм. Период созревания рачков при оптимальной температуре (+20±2 0С) и хорошем питании – 5-8 сут, длительность эмбрионального развития – 3-4 сут, при повышенной температуре до 250С – 46 ч. В лабораторных условиях при оптимальном режиме дафнии живут 3-4 месяца и более. 12

При температуре свыше 250С продолжительность жизни может сокращаться до 25 сут. Голодание увеличивает продолжительность жизни, но задерживает рост и наступление линек. По характеру питания относятся к фильтраторам, в природе дафнии питаются взвешенными в воде бактериями, одноклеточными водорослями, детритом, растворенными органическими веществами. В качестве тест-объекта используется Daphnia magna Straus. Относится к низшим ракообразным, отряду ветвистоусых. Дафнии обитают в планктоне стоячих и слабопроточных пресноводных водоемов, широко распространены на территории России. Белый энхитрей – один из видов беспозвоночных животных, поддающихся культивированию в относительно простых условиях. Культивируют энихитрея в почве, на битом кирпиче, шлаке, гальке, между листами фильтровальной бумаги, между полотнищами ткани, рогожи или мешковины, среди погибшей листвы водных растений. Культивируют некоторые виды энхитреид в чашках Петри на агаре, содержащем двухпроцентный почвенный экстракт. Поверхность агара покрывалась небольшим слоем 13

почвы, в котором жили черви, питаясь микрофлорой, развивающейся на агаре. Наиболее благоприятны для разведения червей следующие условия: температура – 17-180; влажность почвы с хорошей структурой – 23-25%; активная реакция среды – нейтральная или слабокислая. Культура развивается быстро, когда в грунт вносят достаточное количество червей, не менее 20 г на площадь 0.2 м2 в течение первых 30-40 дней черви осваивают новую среду, начинают размножаться, из яиц в сброшенных коконах вылупляется молодь, которая также подрастает. Пользование культурой следует начинать в период максимального прироста биомассы, т.е. через 45-50 дней с момента начала разведения. В качестве корма употребляют различные крупы, муку, овощи, зеленые травянистые растения, ягоды, плоды, дрожжи, главным образом гидролизатные (кормовые) в заваренном и измельченном виде. В незаверенном виде употребляют лишь кормовые дрожжи, предварительно разведенные теплой водой. Олигохеты – малощетинковые черви (Oligochaeta) – водные и почвенные (земляные), относительно многочисленный подкласс в классе поясковых (Clitellata) кольчатых червей (Annelida), которые широко распространены в пресных и морских водах, в почве. Черви с цилиндрическим телом длиной от десятых долей мм (субмикроскопической) до 20 см у водных и до 2,5 м у наземных олигохет. Тело червей сегментированное, состоит из колец-сегментов (сомитов), числом от 3-5 до нескольких сотен. На переднем конце червей имеется головная (предротовая) лопасть (простомиум) различной формы, рот (перистом) и первый сегмент - ротовой (перистомиум). Тело заканчивается пигидием различной формы. У некоторых олигохет – наидид может быть пара глаз по бокам головной лопасти. На сегментах, кроме первого и пигидия могут быть щетинки, собранные в пучки – 2 или 4 (брюшные и спинные) с разным 14

числом щетинок; щетинки брюшных и спинных пучков могут быть одинаковыми и различаться по числу и форме. Черви гермафродитные. Размножение преобладает (в норме) половое, но может быть бесполое (паратомическое – образование зооидов в одном теле – у наидид) и архитомическое (разрыв тела на несколько частей с последующей регенерацией переднего и заднего концов). При половом размножении черви откладывают коконы, в которых происходит развитие молоди. Олигохеты играют важную роль в трофоценотической структуре донных биоценозов, являясь активными деструкторами и минерализаторами органических веществ из донных отложений. Составляя в биоценозах до 70-90% показателей обилия, это сотни и тысячи экз./м2 и десятки и сотни гр/м2, олигохеты не способствуют значительному накоплению на дне органических осадков и, тем самым, сохранению у дна и в грунтах высокого содержания кислорода даже на максимальных глубинах. Олигохеты служат кормом многих рыб и хищных беспозвоночных – гаммарид (бокоплавов), пиявок и планарий. Преимущество Тетрахимена пириформис перед другими животными заключается в том, что введенный в жидкую среду, где обитает инфузория, корм воздействует на нее не только изнутри, вследствие его заглатывания и переваривания, но и снаружи, так как частично, в отличие от высших животных, она питается и путем всасывания через свои мембраны, покрытые многочисленными порами, простых пищевых веществ (аминокислот, солей, витаминов). На эти же оболочки действуют и вредные вещества, возможно присутствующие в исследуемом продукте. В результате не только резко сокращается время выявления токсического действия пищи, но и уменьшаются ее количества, потребные для таких целей, вплоть до минималь15

ных уровней, не улавливаемых организмом высших животных, имеющих более мощные механизмы защиты от многих вредных факторов внешней среды. Наиболее близко к инфузориям по этим свойствам стоят культура тканей и личинки насекомых. Инфузория Тетрахимена пириформис имеет удлиненную грушевидную форму с более плоским каудальным и слегка заостренным вентральным концом. Размер 20х50 нм, вес 1,5*10-9 г. Клетка покрыта двойным слоем мембраны с многочисленными порами: до 200 на 1 мкм2. Имеет ротовое отверстие с четырьмя мембранами, глотку, пищеварительные вакуоли, сократительную вакуоль. Штамм в лабораторных условиях микроядра не имеет. Размножается делением через каждые 2,5-6 ч. Тип пищеварения кислотно-щелочной. Оптимум рН для роста 6,5-7,0. В процессе размножения рН сдвигается в щелочную сторону, достигая 7,5-8,0. Пределы температуры жизни +13 – 280С – лизируется. При температуре ниже +180С рост резко замедляется, при температуре выше +300С инфузория гибнет, при +370С – лизируется. В лабораторных условиях хорошо культивируется при комнатной температуре +22 ±30С. Инфузория хорошо переносит 1% раствор NaCl, но гибнет на 2%-ном. Культурная стандартная среда: 2 г пептона бактериологического; 0,5 г глюкозы; 0,1 г дрожжевого экстракта; 0,1 г морской соли аптечной (или 0,1 г NaCl) на 100 мл дистиллированной воды. Среду подвергают автоклавированию при 0,5 атм 30 мин или в кипящей водяной бане 1 ч. Хранят в темном месте, т.к. на свету питательные компоненты разлагаются. Инфузория – аэроб, т.е. нуждается в кислороде, поэтому слой среды не должен превышать 1,5-2 см. Культуру поддерживают путем пересева каждые 7-10 сут. на новую среду.

16

В качестве тест-объектов широко используются также и микроорганизмы различных таксономических групп, однако и сами микроорганизмы способны вырабатывать соединения, токсичные как для высших организмов (растения, животные), так и в отношении других микроорганинизмов (в т.ч. микотоксины - плесневые грибы рода Fusarium, Stachybotrys, Dendrodochium, выделяющие афлатоксины, дендродохины, миротециум, фузариум и др. Пути развития бурно прогрессирующей химической экотоксикологии заключаются в прослеживании всех возможных маршрутов аккумуляции, биотрансформации экотоксикантов, выяснении множественных связей экотоксикантов с теми или иными видами биот, предсказании экотоксикологических последствий. Особенно важны количественные характеристики, касающиеся устойчивости химикатов и образования продуктов их превращений в природных условиях, которые получают либо в ходе мониторинга - отслеживания изменения концентраций отдельных химических соединений путем систематического анализа представительных проб воздуха, воды и почвы, либо в результате лабораторного моделирования. Таким образом, с развитием науки и техники методы обнаружения токсикантов в окружающей среде постоянно совершенствуются. Лабораторная работа № 1 Определение токсичности на инфузориях Цель: Научиться определять токсичность пробы кормов (продуктов) на инфузориях Тетрахимены пириформис. Токсичность характеризует собой угнетение процессов жизнедеятельности организма вплоть до его гибели. Токсичность продукта определяется по гибели инфузории. Предлагаемый метод также позволяет выявить отдаленные отрицательные последствия влияния продукта на организм 17

в течение ряда поколений. Инфузория в этом отношении представляет весьма удобный тест-объект, так как за сутки она дает 3-8 поколений. Для сравнения напомним, что для воспроизводства одного поколения у мухи необходимо 2545 дней, у мыши – 2-4, а у крысы 5-8 месяцев, у человека 25-30 лет. Ход работы: Взятые на анализ пробы кормов (продуктов) тщательно перемешивают и растирают в ступке. Берут ряд 3-5 навесок в количествах, обратно пропорциональных предполагаемой токсичности, но не более 300 мг в наибольшей по массе навеске. Навески вносят в пробирки и заливают по 2 мл чистой кипяченой водой, закрывают резиновыми пробками с вырезкой для доступа воздуха, что предотвращает выбрасывание пробок при нагревании пробирок. Прогревают в водяной бане (или стерилизаторе) 1520 мин при температуре 80-900С. После охлаждения до комнатной температуры в пробирки вносят по 0,05 мл культуры Тетрахимены пириформис, разведенной перед этим водой в 10 раз, затем помещают их в обычный шкаф (в затемненное место) при комнатной температуре на 1-4 сут. Наличие роста, его степень контролируют каждые сутки под микроскопом (лучше МБС-микробиологический стериоскопический). Это позволяет просматривать пробы прямо в пробирке, не беря их пипеткой, что является предварительным контролем, за которым следует просмотр в капле под МБИ. Каплю берут на предметное стекло пастеровской или стеклянной палочкой, просматривают весь объем, все слои. Контролем является водопроводная, дехлорированная путем кипячения вода, в которую одновременно опытом также засевают культуру инфузорий. Угнетение подвижности, наличие гибели, даже единичных особей или их деформации свидетельствует о токсичности или другой вредности исследуемого материала. 18

Определенную вредность продукта характеризует и замедление роста и размножения инфузорий. Для этого на 4 сутки производят количественный учет выросших особей в счетной камере Фукс-Розенталя или Горяева, но чаще всего капли среды в трехкратной повторяемости, наличием каких-либо отклонений в подвижности и внешнем виде инфузорий. В совокупности эти наблюдения позволяют сделать достаточные для практики выводы о степени токсичности исследуемого корма (продукта) и даже характеризовать ее в баллах: Балл 1 2 3 4 5

Оценка токсичности корма (продукта) нетоксичный слабо токсичный умеренно токсичный токсичный сильно токсичный

Эффекты на фоне контроля Рост Гибель клеДругие изток менения густой нет нет несколько нет возможны угнетен сильно угнет возможны нетен очень сильчасть повозможны но угнетен гибла полная гибель клеток

Целесообразно делать и подсчет выросших особей. Для этого во все пробирки вносят по 3 мл фиксирующего раствора, например, формалина, приготовленного по следующей прописи: 20 мл 33% формалина, 175 мг КН2РО4 и 440 мл дистиллированной воды. Количество инфузорий в каждой пробирке, соответствующей разведению (титру) корма или продукта, выражают в процентном отношении к контролю (засеянному на стандартную среду, разведенную водой в 10 раз) и выдержанному то же самое время, что и опыт. На основании полученных цифр проводят соответствующие расчеты угнетения роста и гибели по правилам общей токсикологии. При необходимости используют и полулогарифмическую 19

сетку пробит-анализа (пробит – по-английски вероятность, т.е. анализ, характеризующий математическую вероятность оцениваемого явления), приводимую во многих руководствах по токсикологии. Кроме того, пробы, не показавшие гибели или других патологических изменений Тетрахимены в течение 1-4 сут, оставляют на дальнейшую инкубацию до 7 сут для выявления возможной кумуляции, т.е. накопления токсического эффекта, характеризующегося замедлением развития, частичной гибелью и другими изменениями жизнедеятельности данного тест-объекта. Их наличие также выражают в баллах или в процентах от количества особей в опыте и по отношению к контролю. Лабораторная работа № 2 Определение токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов на дафниях Цель: Определить острую токсичность питьевых, грунтовых, поверхностных, сточных вод, а также водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов с использованием в качестве тест-объекта низших ракообразных дафний. Острое токсическое действие исследуемой воды или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов на дафний определяется по их смертности за определенный период экспозиции. Критерием острой токсичности служит гибель 50% и более дафний за 96 часов в исследуемой воде при условии, что в контрольном эксперименте гибель не превышает 10%. В экспериментах по определению острого токсического действия устанавливают: • среднюю летальную концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод или водной вытяжки из почв, 20

осадков сточных вод и отходов, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель 50% и более тест-организмов (ЛК50-96, ЛКР50-96); • безвредную (не вызывающую эффекта острой токсичности) концентрацию отдельных веществ (кратность разбавления вод или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод и отходов, содержащих смеси веществ), вызывающую гибель не более 10% тест-организмов (БК10-96, БКР10-96). Приготовление водной вытяжки из почв Отобранные на токсикологический анализ почвы сначала разрыхляют вручную металлическим шпателем и освобождают от материала, заведомо относящегося к инородным (случайным) механическим включениям (возможные промышленные, строительные бытовые отходы и т.п.), а также галечника, обломков камней, корневищ, веток. Решение об изъятии таких включений из подготавливаемой пробы принимают на основе изучения полевого описания конкретного места ее отбора; эти сведения должны являться обязательной частью сопроводительной документации к пробам, направленным на токсикологический анализ. Перед биотестированием пробы просеивают сквозь сито с размером ячей 1 мм и доводят до воздушно-сухого состояния. Для чего пробу подсушивают в вытяжном шкафу или в хорошо проветриваемом помещении, размещая ее (в зависимости от массы и естественной влажности в стеклянных кристаллизаторах подходящей вместимости, на стекле или на чистых листах из плотной бумаги. Размещенные таким образом пробы почвы выдерживают открытыми не менее 2-х ч при комнатной температуре и влажности воздуха (ГОСТ 5180-84 "Грунты. Методы лабораторного определения физических характеристик"). Подготовленную пробу распределяют на ровной поверхности слоем толщиной не более 1 см и отбирают ложкой или 21

шпателем из 5-ти точек методом конверта. Не допускается предназначенные для исследования на токсичность пробы почв подвергать тепловой обработке, поэтому гигроскопическая влажность почвы определяется в отдельном образце. Проба с массой приблизительно 400 г делится на две равные части: для биотестирования и для определения гигроскопической влажности после высушивания до постоянной массы, что необходимо для пересчета воздушно-сухой пробы на массу абсолютно-сухой по формуле: ∆Мвозд.сух. = ∆Мабс.сух./Кср, (1) где ∆Мвозд.сух — масса абсолютно-сухого образца, г; ∆Мвозд.сух — масса воздушно-сухого образца почвы, г; Кср — коэффициент пересчета массы воздушно-сухой пробы на массу абсолютно-сухой (среднее расчетное значение из трех измерений). Для определения массовой доли почвы в воздушносухой пробе необходимо: 1. Взвесить три пустых высушенных бюкса с крышками и зафиксировать их массы (Моi), затем взвесить эти же бюксы с навесками воздушно-сухой пробы (около 1 г) и зафиксировать их массы (Мвозд.сухi.). 2. Установить открытые бюксы с воздушно-сухими пробами в сушильный шкаф. После выдержать в сушильном шкафу в течение 3 ч при температуре от 105 до 115 °С. Закрыть бюксы притертыми крышками, перенести их в эксикатор и выдержать там до полного остывания (около 40 мин). Взвесить бюксы с навесками абсолютно-сухой пробы и зафиксировать их массы (Mа6c.cyx.i). После взвешивания пробы почвы следует повторно высушить в течение 2 ч, затем охладить в эксикаторе и снова взвесить. После первого и второго высушивания допустимое расхождение в массе не должно превышать 0,005 г. В противном случае

22

высушивание повторить. Точность взвешивания для всех экспериментов должна составлять 0,001 г. 3. Рассчитать значения коэффициента пересчета Кi для каждого эксперимента по формуле: Kt = (Mа6c.cyx.i - Моi) / (Mвозд.cyx.i - Моi), (2) где Кi — коэффициент пересчета в i-том измерении; Мабс.cyxi — масса бюксы с абсолютно сухим образцом в i-М измерении, г; Mвозд.cyx.i — масса бюксы с воздушно-сухим образцом в i -м измерении, г; Moi — масса пустой бюксы в i-м измерении, г. 4. Так как по результатам измерений получено три значения коэффициента, производят расчет его среднего значения (Кср) по формуле: Кср = (К1 + К2 + К3) / 3. (3) Далее среди трех величин Kt рассчитывают размах (R) полученных значений с учетом максимальной (Кмах) и минимальной (Kmin) величин по формуле: R = (Кмах – Kmin) / Кср * 100%. (4) Если полученное значение R > 10 %, то эксперимент повторяют, устранив причины удовлетворительных результатов. Водную вытяжку из почвы для биотестирования готовят в соотношении: 1 часть почвы (с учетом гигроскопической влажности) и 4 части культивационной воды (допускается использование дистиллированной воды). Вода не должна содержать СО2, так как в его присутствии растворяются карбонаты кальция и магния по причине образования растворимых бикарбонатов, которые увеличивают сухой остаток и общую щелочность водной вытяжки и тем самым искажают результаты биотестирования. Для приготовления водной вытяжки из почвы отвешивают 100—200 г пробы почвы в воздушно-сухом состоянии, пересчитав ее массу на массу абсолютно-сухой. Масса пробы на стадии перед приготовлением водной вы23

тяжки должна быть достаточной для получения необходимого объема экстракта при проведении биотестирования во всех предполагаемых разведений с учетом контрольных испытаний. Навеску почвы помещают в колбу емкостью 1000 см3 и приливают 4-кратное количество культивационной воды. Далее на аппарате для встряхивания жидкости полученную смесь в течение 2-х ч встряхивают, после чего отстаивают в течение 30 мин. Надосадочная жидкость сифонируется, а затем профильтровывается через бумажные обеззоленные фильтры («белая лента») или через мембранные фильтры с диаметром пор 3,5 мкм (фильтры предварительно промывают и кипятят в дистиллированной воде не менее 10 мин). Бумажный фильтр помещают в воронку Бюхнера диаметром 15—20 см. Перед тем как вылить вытяжку на фильтр, содержимое склянки или колбы встряхивают, чтобы взмутить присутствующие взвешенные частицы почвы. На фильтр стараются перенести всю взвесь. При выливании струю суспензии направляют на боковую двойную стенку бумажного фильтра, но не на дно фильтра, так как при выливании на дно, бумага может легко порваться. Фильтрация осуществляется с помощью вакуумного водяного или электрического насоса. Для фильтрации применяется слабый вакуум (не более 20 мм рт. ст.). Первые порций фильтрата часто бывают мутными, и их нужно несколько раз перефильтровать до прозрачного раствора. При повышенной мутности водной вытяжки из почв (гумусированные, дерновоподзолистые, торфяные и др. почвы) допускается отстаивание в холодильнике до 5 сут. Затем жидкость над осадком сифонируется. Вытяжка из почв должна иметь; величину рН в диапазоне 7,0-8,2. При необходимости вытяжку перед серийным разбавлением предварительно нейтрализуют. После нейтрализации пробы аэрируют 10—20 мин 24

для стабилизации рН. Непосредственно перед началом биотестирования пробы доводят до температуры 20 ± 2°С. Биотестируемая проба водной вытяжки из почв должна иметь концентрацию растворенного кислорода не ниже 6 мг/дм3, в противном случае пробу аэрируют. Приготовление разведений водной вытяжки для биотестирования проводят как при приготовлении разбавлений исследуемых вод для биотестирования. Приготовление водной вытяжки из осадков сточных вод, отходов Водная вытяжка из осадков сточных вод и отходов готовится из соотношения твердая фаза : жидкость, равного 1 : 10. В качестве жидкости используется культивационная вода (допускается использование дистиллированной воды). Твердые отходы и осадки сточных вод. Проба тщательно перемешивается перекатыванием на гладкой, гибкой и плотной подстилке, затем — совком. Для подготовки пробы отходов требуется 2,5 кг пробы осадков сточных вод — 1 кг. Общий объем отобранной пробы (5 кг отходов или 2 кг осадков) делится на представительные половины, одна из частей возвращается в сосуд для хранения, оставшаяся часть разрыхляется и тщательно просматривается. В случае обнаружения частиц более 10 мм их осторожно измельчают с помощью металлического шпателя до размера менее 10 мм. Не допустимо механически размалывать смесь. Затем проба высушивается до воздушно-сухого состояния. При плохом высыхании отхода экспозицию высушивания допускается увеличивать до 24 ч. После этого проба сокращается в 3-4 раза методом квадратирования. Тщательно перемешанную пробу разравнивают на гладкой ровной поверхности на крафт-бумаге, клеенке или полиэтиленовой пленке и с помощью линейки 25

или специальной решетки делят на равные квадраты. Затем из квадратов в шахматном порядке отбирают порции, обеспечивая захват всей толщины слоя, и, объединяя порции в пробу с минимальной абсолютно-сухой массой 200 г представительной пробы, которая делится на две части и предназначается для биотестирования и определение влажности. Влажность осадков и отходов определяется по п. «Приготовление водной вытяжки из почв». Измеренная характеристика влажности используется для расчета массы воздушно-сухой пробы, предназначенной для приготовления водной вытяжки. Обычно требуется 120-200 г воздушно-сухой массы пробы. После выщелачивания 100 г абсолютно-сухой массы пробы будет получено приблизительно 900 см3 водной вытяжки, учитывая это, следует рассчитать общее необходимое минимальное количество отбираемой порции с учетом процедуры сокращения пробы. Масса пробы на стадии перед приготовлением водной вытяжки должна быть достаточной для получения необходимого объема экстракта для проведения биотестирования во всех предполагаемых разведениях. Проба осадков, отходов в воздушно-сухом состоянии взвешивается так, чтобы абсолютно-сухая масса была 100 ± 1 г. Записывается масса и содержание влаги и помещается в сосуд для выщелачивания Шламы. Шламы с большим содержанием твердой фазы, не разделяющиеся самостоятельно, обрабатываются также как твердые отходы. Отдельно определяется содержание влаги. Масса шлама, эквивалентная 100 ± 1 г абсолютно-сухой массы используется для приготовления водной вытяжки. Шламы с большим содержанием жидкости (влажность более 70 %) обрабатываются следующим образом. Жидкость фильтруется через вакуумный фильтр (0,45 мкм) и собирается 300 г влажно-твердого материала. Если тако26

го количества пробы недостаточно для получения 200 г абсолютно-сухого вещества, собирается столько, сколько необходимо. Пробы высушиваются до воздушно-сухого состояния по п. «Приготовление водной вытяжки из почв». При плохом высушивании экспозицию допускается увеличить до 24 ч. Проба делится на две части, в одной определяется содержание влаги, а другая часть, составляющая 100 ± 1 г абсолютно-сухой массы, переносится в сосуд для выщелачивания. В тетради регистрируется масса остатка и содержание влаги в нем. Твердые шламы выщелачиваются культивационной водой в пропорции 1:10. Жидкие отходы. Отходы и осадки сточных вод, жидкие и содержащие менее 1 % взвешенного материала не подвергаются выщелачиванию, а испытываются прямо на экотоксичность методами биотестирования после фильтрации через фильтр "белая лента". Выполнение процедуры подготовки экстракта выщелачивания. В сосуд для выщелачивания, где находится взвешенная воздушно-сухая масса отхода или осадка сточных вод с абсолютно-сухой массой 100 ± 1 г, добавляется вода, используемая для культивирования (или дистиллированная вода). Вода добавляется в сосуд для выщелачивания в соотношении сухая масса: жидкость — 1 : 10. Обычно это 1000 см3 воды на 100 г абсолютно-сухой массы. Если используется меньшее количество пробы, уменьшается количество жидкости. Нельзя использовать для выщелачивания менее чем 20 г твердого вещества и 200 см3 воды. Объемы воды более 10 см3 измеряются мерным цилиндром, объемы меньше 10 см3 — мерной пипеткой. Смесь должна перемешиваться слабо на мешалке в течение 7-8 часов таким образом, чтобы твердое вещество находилось во взвешенном состоянии. Недопустимо измельчение частиц отходов или осадков при перемешива27

нии. Используется большая лопасть механической мешалки или магнитная мешалка, а скорость перемешивания должна быть наименьшей, при которой материал поддерживается во взвешенном состоянии (не более 70 об/мин). После окончания перемешивания раствор с осадком оставляют на ночь (12-18 ч) для отстаивания. Затем жидкость над осадком сифонируется. Если после отстаивания жидкость становится прозрачной, фильтрование не требуется; если же имеется какой-либо видимый взвешенный материал, то жидкость должна быть профильтрована. В случае применения фильтрования это отмечается в тетради. Фильтрация осуществляется через фильтр "белая лента" или на воронке Бюхнера. Для фильтрации применяется слабый вакуум (не более 20 мм рт. ст.) с помощью водяного или электрического насоса такой же мощности. Вакуум должен быть выключен немедленно после прохождения всей жидкости через фильтр, во избежание дегазации фильтрата. В исключительных случаях, при повышенной мутности водной вытяжки из отхода после фильтрации допускается ее отстаивание в холодильнике до 5 суток. Затем жидкость над осадком сифонируется. Полученный экстракт выщелачивания исследуют на токсичность. Процедуру биотестирования необходимо начать не позднее, чем через 6 ч после приготовления вытяжки из осадка, отхода. Если это невозможно, допускается хранение экстракта в холодильнике не более 48 ч при температуре 4 °С. Если осадки сточных вод или отходы были разделены на жидкую и твердую фракции, результаты исследования жидкой фракции и экстракта выщелачивания из твердой фракции должны быть указаны в отчете отдельно. Если одна из этих частей была признана экотоксичной, экотоксичным признается весь отход. 28

Установление острого токсического действия Для определения острого токсического действия проводится биотестирование исходной исследуемой воды или водной вытяжки из почв, осадков сточных вод, отходов и нескольких их разбавлений, приготовленных по п. «Приготовление разбавлений исследуемых вод для биотестирования». Определение токсичности каждой пробы без разбавления и каждого разбавления проводится в трех параллельных сериях. В качестве контроля используется три параллельные серии с культивационной водой. Биотестирование проводится в химических стаканах объемом 150—200 см3, которые заполняются 100 см3 исследуемой воды, в них помещают по десять дафний в возрасте 6-24 ч Чувствительность дафний к токсикантам зависит от возраста рачков, поэтому в протоколе отмечают возраст используемой молоди. Дафний отлавливают из культиваторов, которых выращивается синхронизированная культура. В отдельный химический стакан отсаживают одновозрастных рачков после фильтрации их через набор сит, а затем отлавливают по одному пипеткой (с отпиленным и оплавленным концом) объемом 2 см3 с резиновой грушей помещают рачков по одному на сачок, через который вода сливается в отдельный химически стакан, после чего дафний сачком вносят в стаканы с исследуемой водой. Посадку рачков начинают с контрольной серии. В исследуемые растворы дафний помещают, начиная с больших разбавлений (меньших концентраций загрязняющих веществ) меньшим разбавлениям. После каждой посадки в исследуемые растворы сачок тщательно промывается в сосуде объемом 2 дм3 с культивационной водой. Для работы с серией контроль должен быть отдельный сачок.

29

Дня каждой серии исследуемой воды используется 3 химических стакана. Общее количество стаканов, используемых в опытах, равно утроенной сумме всех разбавлений плюс 3 для исходной воды и 3 для контроля. В экспериментах по определению острой токсичности растворы не меняют. Учет смертности дафний в опыте и контроле проводят через каждый час до конца первого дня опыта, а затем 2 раза в сутки ежедневно до истечения 96 ч. Неподвижные особи считаются погибшими, если не начинают двигаться в течение 15 с после легкого покачивания стакана. Результаты наблюдений заносят в тетрадь. Если гибель дафний в контроле превышает 10 %, результаты не учитывают, и опыт должен быть повторен. После того, как результаты эксперимента учтены, все дафнии из стаканов выбрасывают и в каждом стакане проводят измерения рН, температуры, содержания раствореного кислорода с помощью оксиметра. Содержание растворенного кислорода в конце эксперимента должно быть не ниже 2 мг/дм3, рН - в диапазоне 7,0-8,2. Все отклонения от установленых норм, а также данные по каждой серии разбавлений, исходной воды и контролю также заносят в тетрадь и протокол результатов эксперимента. Острые токсикологические эксперименты

При определении острой токсичности питьевых, сточных, поверхностных, грунтовых вод, а также водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов и их разбавлений устанавливают: среднюю летальную кратность разбавления вод, водных вытяжек, вызывающую гибель 50 % тест-объектов за 96-часовую экспозицию (ЛКП50-96), безвредную кратность разбавления вод, водных вытяжек, вызывающую гибель не более 10 % тест-объектов за 96-часовую экспозицию (БКР10-96). 30

Для определения острой токсичности исследуемых вод, водной вытяжки рассчитывается процент погибших в тестируемой воде дафний (А, %) по сравнению с контролем: А = (Хк – Хт) / Хк *100%, (5) где Хк — количество выживших дафний в контроле; Хт—количество выживших дафний в тестируемой воде. При А ≤ 10 % тестируемая вода или водная вытяжка не оказывает острого токсического действия (безвредная кратность разбавления). При А ≥ 50 % тестируемая вода, водная вытяжка оказывает острое токсическое действие (средняя летальная кратность разбавления). Лабораторная работа № 3 Определение токсичности культур грибов Цель работы - определения токсичности грибов родов Fusarium, Stachybotrys, Dendrodochium, выделяемых при микологическом исследовании из различных органических субстратов (пищевые, кормовые продукты). Метод основан на подавлении роста чувствительного тест-организма Candida pseudotropicalis, шт.44 пк, токсическими метаболитами грибов указанных родов и позволяет определить степень токсичности гриба в течение суток. Реактивы, посуда, приборы. Ацетон, хлороформ, этилацетат, эфир диэтиловый, агар Чапека, сусло-агар или агар Сабуро, вода дистиллированная стерильная, чашки Петри, бактериологические пробирки, выпарительные чашки 6 см, воронки химические 4,5 см, пипетки на 1 и 10 мл, микропипетки на 0,1 мл, трубчатое сверло 8 мм, термостат, холодильник, диски из фильтровальной бумаги 8 мм, суточная культура Candida pseudotropicalis, шт. 44 пк.

31

Подготовка тест-культуры. 1. Тест-культуру Candida pseudotropicalis, шт. 44 пк, высевают штрихом на скошенный сусло-агар или агар Сабуро. Посевы помещают в термостат при 37°С на 1 сут. Выросшую культуру хранят в холодильнике, пересевая не реже 1 раза в 6 мес. 2. Для приготовления водной взвеси бактериологической петлей переносят из пробирки часть биомассы суточной тест-культуры в пробирку с 3—5 мл стерильной воды и тщательно смешивают. 3. Полученную взвесь тест-культуры вносят по 1— 2 мл в чашки с питательной средой, распределяя ее круговыми движениями по всей поверхности агара, после чего избыток взвеси отсасывают и оставляют чашки открытыми до испарения влаги. Ход определения. I вариант. Определение токсичности культур грибов методом бумажных дисков применяют для исследования чистых культур, выращенных в пробирках. Культуру исследуемого гриба в бактериологической пробирке на агаре Чапека или сусло-агаре заливают 8—10 мл одного из органических растворителей (ацетон, диэтиловый эфир, этилацетат, смесь хлороформ — ацетон 4 : 1) и оставляют на 1 ч, периодически встряхивая. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в выпарительную чашку, и растворитель упаривают досуха в токе воздуха или на водяной бане при температуре 40— 500С. Затем в выпарительную чашку вносят 0,1—0,2 мл ацетона и круговыми движениями обмывают ее поверхность. На диск из фильтровальной бумаги наносят 20 мкл экстракта и оставляют до испарения растворителя. Затем его накладывают на поверхность питательной среды и помещают в термостат при 37 °С. Через 18—24 ч 32

проводят учет результатов и при наличии зон задержки роста тест-культуры измеряют их диаметр, включая диаметр диска. В одну чашку одновременно можно помещать 4—5 дисков с испытуемыми экстрактами культур, а для контроля в центр чашки кладут диск, смоченный используемым растворителем. II вариант. Определение токсичности грибов с помощью агаровых блоков используют для установления токсичности колоний грибов, выросших в первичных посевах кормов. Агаровые блоки готовят с помощью трубчатого сверла из газона 5-дневных колоний грибов в чашках Петри. Блоки накладывают мицелием на высохшую поверхность питательной среды с тест-культурой (см. п. 3.) и дальше поступают, как и с дисками (см. I вариант). Для стимуляции токсинообразования грибов рода Fusarium чашки с выросшими культурами перед исследованием помещают на 2 дня в холодильник при 4—6°С. В дальнейшем с ними поступают, как указано выше. Оценка токсичности. Оценку токсичности грибов проводят на основании величины зон подавления роста тест-организма, вокруг дисков или блоков: Степень токсичности Токсичные Слаботоксичные Нетоксичные

Диаметр зон подавления роста тест-культуры, мм 16 мм и более 9—15 мм отсутствие зоны задержки

Обнаружение токсинообразующих грибов позволяет установить причину токсичности корма и решить вопрос об его использовании и обезвреживании в соответствии с санитарно-микологической оценкой и улучшением качества кормов. 33

Лабораторная работа № 4 Определение токсичности почвы Почва является не только аккумулятором полезных, но токсичных элементов, которые подавляют процессы самоочищение почвы (биологические, физико-химические и др.), а также потенциально могут влиять на различные звенья трофической цепи. Цель работы: Исследование почвы на токсичность микробиологическим методом. Реактивы, посуда, приборы: культуры микроорганизмов (E.Coli, Bas. Subtillis, дрожжи, грамположительные бактерии). Среды МПА, Эшби. Чашки Петри, шпатели, целлофан, пробирки, пипетки на 1 и 10 мл, микропипетки на 0,1 мл, трубчатое сверло 8 мм, термостат, холодильник, диски из фильтровальной бумаги 8 мм. Подбор тест-культур и выбор и приготовление питательных сред студенты самостоятельно выполняют к началу лабораторного занятия. Ход работы. Свежеприготовленную агаровую среду разливают в стерильные чашки Петри и после застывания среды покрывают стерильными пленками целлофана, которые тщательно расправляют на поверхности агара металлическим шпателем. Целлофан предварительно вырезают кружками с диметром, равным диаметру чашки Петри, смачивают водой и в таком состоянии стерилизуют в автоклаве. На поверхность целлофана в центр чашки Петри с агаром накладывают комочек испытуемой почвы диаметром 3 см, также увлажненной водой. Можно расположить не один, а 4 комочка на равном расстоянии друг от друга, тогда диаметр будет несколько меньше, около 1 см. После наложения комочков почвы на целлофан чашки выдерживают в термостате в течение суток. Через сутки целлофан с 34

почвой снимают с агара, а среду засевают суточной культурой. При наличии в почве токсичных веществ на газоне тест-культуры на поверхности агара образуются стерильные зоны. Количественной оценкой фитотоксичности служит диаметр образующейся стерильной зоны. Вариант образцов почвы 1 почва + токсикант 2 3

Зона просветления, мм

Лабораторная работа № 5 Определение фитотоксичности методом проростков Необходимость определения этого показателя особенно часто возникает при мониторинге химически загрязненных почв или при оценке возможности использования в качестве мелиорантов или удобрений различного рода отходов: осадков сточных вод, различного рода компостов, гидролизного лигнина и необходимости биоремедиации с использованием бакпрепаратов или биологических удобрений. Для выяснения относительной фитотоксичности используют метод рулонной культуры, выращивая проростки тест-растений на рулоне фильтровальной бумаги из семян, 35

замоченных в растворе с различными концентрациями тяжелых металлов. Принцип метода. Метод основан на реакции тесткультур при внесении в почву удобрений, меллиорантов, загрязняющих веществ и т.п. Этот метод позволяет выявлять токсичное (ингибирующее действие тех или иных веществ), и стимулирующее влияние, активизирующее развитие теств-культур. Семена тест-культур высеваются в вегетационные сосуды или лабораторные стаканы, заполненные почвой с добавками изучаемых веществ, или загрязненной или незагрязненной почвой. В ходе опыта фиксируют всхожесть, энергию прорастания, длины надземной и корневой систем, массу сухого вещества надземной и подземной части. Выбор тест-культур. Желательно иметь быстро прорастающие культуры, которые обычно выращиваются в хозяйствах изучаемого региона. Так, для изучения дерновоподзолистой почвы используют овес как представитель злаковых несимбиотрофных растений и горох – представитель бобовых, способных к азотфиксации. Для степных почв могут быть пшеница, люцерна, бобы, фасоль. Важно, чтобы были использованы одновременно азатфиксирующие и не фиксирующие азот растения. В качестве культуры можно использовать скороспелые сорта редиса. Условия опыта. Опыт проводится на световых стеллажах или в вегетационных домиках при поддержании постоянной влажности почвы. Принята влажность, равная 70% от полной влагоемкости (ПВ). С этой целью для изучаемых почв или смесей предварительно определяют полную влагоемкость стандартным методом, используя одинаковую подготовку проб (измельчение, растирание, перемешивание и пр.). Затем в начале опыта почву увлажняют расчетным объемом воды так, чтобы влажность была 70% ПВ. В ходе опыта влажность поддерживают постоянной, 36

для чего сосуды взвешивают после первого улажнения немедленно, а затем периодически повторяют взвешивание и потерю массы за счет эвапотранспирации компенсируют добавлением в сосуды недостающей воды. Ход анализа. Возможны три варианта опытов. В первом варианте к почве добавляют исследуемое на фитотоксичность вещество. Это могут быть буровой раствор, мелиорант (фосфогипс и пр.), лигнинный компост, осадки сточных вод. Добавленные дозы должны превышать в максимальных вариантах намечаемые для внесения в реальных условиях. Второй вариант: просто сравниваются две почвы или более, попарно – незагрязненная и загрязненная. Третий вариант: загрязненная почва добавляется к незагрязненной в возрастающих количествах (вплоть до 100%). Все опыты ставят не менее чем в трехкратной повторности. Смеси (если они используются) тщательно перемешиваются. В стеклянные стаканы помещают по 100 г субстрата (смеси или почвы), субстрат увлажняют до 70% от ПВ (и такую влажность поддерживают в течение всего опыта) и в каждый сосуд высевают по 13 семян тест-культуры. На 4-е сутки стаканы помещают на световой стеллаж с освещением в течение 14 ч в сутки (с 6 до 20 ч). В этих условиях тест-культуры выращиваются в течение двух недель. В процессе опыта ведут наблюдения по следующим показателям: записывают время появления всходов и их число на каждые сутки: оценивают общую всхожесть (к концу опыта); измеряют регулярно длину надземной массы (высоту растений); по окончании опыта растения осторожно отделяют от земли, просушивают, стряхивают остатки почвы и измеряют окончательную длину надземной части растений, длину корней; затем высушивают растения на 37

воздухе и отдельно взвешивают надземные части и корни (все результаты рассчитывают на сосуд, можно указывать «всего», можно сделать пересчет на одно растение). Сопоставление этих данных позволяет выявить факт фитотоксичности или стимулирующего действия. Следует также обратить внимание на окраску растений (раннее ожелтение), характер корней, например более короткие, но густые. Фитотоксический эффект может быть рассчитан по разным показателям. Если, например, опирается на массу растений, то фитотоксический эффект ФЭ (%) рассчитывают по формуле: ФЭ= (М0 - Мх) / М0 * 100, где М0 – масса контрольного растения (или всех растений на сосуд); Мх – масса растения (растений, выращенных на предположительно фитотоксичной среде). Лабораторная работа № 6 Определение антимикробного действия лекарственного средства Лекарственные препараты в большинстве являются ксенобиотиками, которые влияют на физиологичную микрофлору человека, животных, вызывая дисбактериозы. Поэтому при использовании различных лекарственных средств необходимо выявлять воздействие на представителей естественной микрофлоры организма. Ход работы. Во избежание неправильной оценки результатов анализа необходимо определить однократно для каждого наименования лекарственного средства, обладает ли оно антимикробным действием. Для этого в две пробирки с 10 мл тиогликолевой среды и в две — с 10 мл среды Сабуро добавляют соответствующее количество исследуемого лекарственного средства и вносят в каждую пробирку 38

по 0,1 мл микробной взвеси соответствующего тестштамма, содержащей 1000 клеток в 1 мл. Посевы в тиогликолевой среде инкубируют при температуре от 30 до 35 °С в течение 48 ч, а на среде Сабуро — при температуре от 20 до 25 °С в течение 72 ч. Контролем служат пробирки с питательными средами, в которые вместо данного лекарственного средства вносят аналогичное количество дистиллированной воды или соответствующего растворителя. Для проверки антибактериального действия лекарственных средств используют тест-микроорганизмы: Staphylococcus aureus АТСС 6538 Р, Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli К.17, а противогрибкового действия — Candida albicans ATCC 885-653. При отсутствии антимикробного действия лекарственного средства в контрольных и опытных пробирках (колбах) должен наблюдаться рост перечисленных тестмикроорганизмов. При наличии антимикробного действия лекарственных средств используют соответствующие инактиваторы, указанные в частных фармакопейных статьях: (например, пара-аминобензойная кислота для сульфаниламидов, пенициллиназа — для пенициллинов и цефалоспоринов и т.д.). При отсутствии инактиватора препарат разводят, изменяя соотношение объемов посевного материала и питательной среды. Первоначально, не изменяя количества посевного материала, увеличивают объем питательной среды до 250 мл. Если при этом сохраняется антимикробное действие лекарственного средства, уменьшают объем посевного материала до 1 мл. В случае неэффективности разведения лекарственного средства используют метод мембранной фильтрации. Посев лекарственных средств. Для контроля стерильности лекарственных средств применяют тиогликоле39

вую среду и жидкую среду Сабуро. При этом используют метод прямого посева на питательные среды или метод мембранной фильтрации. Метод прямого посева. Испытуемый препарат, если необходимо, растворяют в соответствующем растворителе и высевают в количествах, указанных в таблице 1. Таблица 1 Количество испытуемого препарата для посева в зависимости от объема содержимого единиц (ампул, флаконов и др.), составляющих серию Объем содержимого одной единицы, мл менее 1 1—4 5—19 20—100 Более 100*

Объем лекарственного средства для посева, мл весь объем 1 2 2—4 10

Объем питательной среды в 10 раз больше объема образца для посева

*Если объем содержимого единицы превышает 100 мл, предпочтительнее использовать метод мембранной фильтрации

При испытании лекарственных средств посевы в тиогликолевой среде инкубируют при температуре от 30 до 35 °С, а в среде Сабуро — от 20 до 25 °С. Продолжительность инкубации посевов в обеих питательных средах составляет 14 сут. В случае помутнения питательной среды после внесения в нее испытуемого препарата следует в интервале от 3 до 7 сут после посева сделать пересев на свежие аналогичные среды и инкубировать их при соответствующей температуре 14 сут от начала испытания. При испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах отбирают асептически по 0,1 г (мл) от каждой единицы и вносят в стерильную колбу вместимостью 250 мл, содержащую стеклянные бусы, 100 мл/мол фосфатного буферного раствора (рН 6,8—7,0) и эмульгатор. Перед проведением испытания содержимое колбы подог40

ревают до температуры (41 ± 1) 0С. Колбу с испытуемым образцом встряхивают не более 30 мин до получения однородной эмульсии. Полученную эмульсию в количестве 5 мл переносят в колбу с 40 мл тиогликолевой среды и 5 мл — в колбу с 40 мл среды Сабуро. Посевы инкубируют 14 сут при соответствующей температуре для каждой питательной среды. Примечания. 1. Выбор эмульгатора и его количество зависят от природы мази и растворов лекарственных средств в маслах. Наиболее часто применяют твин-80 в концентрации до 2,5 %, не оказывающей антимикробного действия. 2. При испытании мазей, легко эмульгируемых в воде, эмульгатор не вносят и буферный раствор. 3. При испытании мазей и растворов в маслах предпочтительнее использовать метод мембранной фильтрации. Задачи 1. Если разбился ртутный термометр, и шарики ртути остались на полу, превышена ли будет допустимая концентрация паров ртути в комнате? ПДКHg=0,0002 мг/м3, комната площадью 20 м2, высотой 2,5 м. Количество разлившейся и полностью испарившейся ртути 0,1 мл, ее плотность 13,5 г/мл. Какой способ сбора разлившейся ртути можете предложить? 2. ПДК (для H2S в воздухе) = 0,008 мг/м3. Рассчитать количество молекул этого загрязнителя в 1 л воздуха при заданных условиях. 3. В городах с 1 л дождевой воды может поступать до 40 мкг свинца. Посчитайте, на какой площади почвы распределится данное количество свинца в течение суток, если за это время выпало 20 мм осадков? Какое количество свинца будет содержать 1 см2 почвы при условии равномерного

41

распределения загрязнителя на глубину 10 см от поверхности? 4. При недостатке бора в почве у свеклы развивается гниль сердечка (почернение внутренней части корнеплода). Внесение 6,3 кг бора на 1 га способствует излечению растения от этой болезни. В каком количестве 1н раствора буры (Na2B4O7 * 10H2O) содержится требуемое количество бора. 5. Выброс в атмосферу газообразного нагретого загрязнителя в г.Чита производится через трубу с диаметром отверстия 0,5 м, высотой 100 м над уровнем земли. Скорость оседания загрязнителя принята равной 0. фоновая концентрация загрязнителя составляет 10-4 мг/м3. Рассчитайте ПДС этого загрязнителя, если ПДК принят 0,01 мг/м3. Принять следующие допущения: разность температур между выбросами и окружающей средой равна 600С, коэффициенты, учитывающие шероховатость местности и условия выхода загрязнителя равны 1, средняя скорость выхода загрязнителя в окружающую среду 10 м/с. 6. В 1 т навоза содержится 4 г бора, 45 г марганца, 0,4 г молибдена. Сколько вносится этих микроэлементов со средней дозой навоза 40 т/га? Рассчитать эквивалентное количество 1н растворов минеральных удобрений, необходимых для внесения на 1 га (в виде буры, марганцевокислого калия). 7. В 1 т навоза содержится 0,4 г молибдена, 19 г цинка. Сколько вносится этих микроэлементов со средней дозой навоза 40 т/га? Рассчитать эквивалентное количество 1н растворов минеральных удобрений. Необходимых для внесения на 1 га ( в виде молибденовокислого натрия, сульфата цинка). 8. Выброс в атмосферу метилмеркаптана, скорость оседания которого принята равной 0, производится через трубу с диаметром отверстия 0,3 м, высотой 120 м над уровнем 42

земли. Фоновая концентрация загрязнителя составляет 9*10-6 мг/м3. Рассчитайте ПДС этого загрязнителя, если ПДК принят 0,8 мг/м3. Принять следующие допущения: разность температур между выбросами и окружающей средой равна 600С, коэффициенты, учитывающие шероховатость местности и условия выхода загрязнителя равны 1, средняя скорость выхода загрязнителя в окружающую среду 10 м/с. 9. В 1 т навоза содержится 3 г меди, 0,25 г кобальта. Сколько вносится этих микроэлементов со средней дозой навоза 40 т/га? Рассчитать эквивалентное количество 1 н растворов минеральных удобрений, необходимых для внесения на 1 га (в виде сульфата меди 5-ти водного, любой соли кобальта). 10. Выброс в атмосферу диоксида серы, скорость оседания которого принята равной 0, производится через трубу с диаметром отверстия 0,3 м, высотой 100 м над уровнем земли. Фоновая концентрация загрязнителя составляет 0,001 мг/м3. Рассчитайте ПДС этого загрязнителя для районов Бурятии, если ПДК принят 0,5 мг/м3. Принять следующие допущения: коэффициенты, учитывающие шероховатость местности и условия выхода загрязнителя равны 1, средняя скорость выхода загрязнителя в окружающую среду - 20 м/с. 11. Выброс в атмосферу загрязнителя, скорость оседания которого принята равной 0, производится через трубу с диаметром отверстия 0,6 м, высотой 150 м над уровнем земли. Фоновая концентрация загрязнителя составляет 0,0001 мг/м3. Рассчитайте ПДС этого загрязнителя, если ПДК принят 0,075 мг/м3. Принять следующие допущения: коэффициенты, учитывающие шероховатость местности и условия выхода загрязнителя равны 1, средняя скорость выхода загрязнителя в окружающую среду 15 м/с.

43

12. Составьте примерный дневной рацион вегетарианцасыроеда весом 50 кг, если известно, что суточная доза потребления нитратов была им превышена в 5 раз при употреблении следующих овощей с содержанием нитратов: капусты – 500 мг/кг, огурцов – 400 мг/кг, томатов – 300 мг/кг, моркови – 400 мг/кг. 13. Рассчитать, какое количество свеклы с содержанием нитратов 1400 мг/кг было у человека весом 70 кг в рационе, если известно, что суточный предел потребления нитратов (3,8 мг на кг веса) был превышен в 3 раза. Допустить, что нитраты человек получил только со свеклой, причем употреблял ее в сыром виде. 14. В ранних сортах овощей содержание нитратов больше, чем в поздних. Какое количество свежей моркови можно употреблять человеку весом 55 кг в сутки, чтобы не превысить предел потребления нитратов (3,8 мг на кг веса)? Рассчитать отдельно для ранних сортов (ПДК = 400 мг/кг) и поздних (ПДК = 250 мг/кг). 15. Суточный предел потребления нитратов 3,8 мг на 1 кг веса. Рассчитать количество нитратов, полученных организмом человека весом 60 кг, употребившего за сутки 2 кг картофеля с содержание нитратов, в 2,5 раза превышающих ПДК (ПДК картофеля по нитратам 250 мг/кг). Потери нитратов при чистке и варке принять за 50%. Расчет необходимой степени очистки сточных вод на локальных очистных сооружениях В настоящее время проблема обеспечения водой отрасли народного хозяйства является актуальной. Сброс неочищенных производственных или бытовых сточных вод в водоем оказывает на него отрицательное воздействие. Загрязненная вода не может быть использована для водоснабжения бытового и хозяйственного назначения. Выпуск загрязненных стоков приводит к образованию шламовых 44

донных отложений, полному или частичному загниванию или изменению состава воды, сопровождающемуся деградацией или гибелью водной фауны и флоры, прекращению доступа воздуха из атмосферы и, следовательно, к общему ухудшению санитарного состояния водоема. Поэтому необходима очистка сточных вод (механическая, биологическая, обеззараживание) с последующим сбросом в водоемы. Для определения качества воды, поступающей в водоем, необходимо знать и уметь рассчитывать степень очистки сточных вод. Цель. Рассчитать необходимую степень очистки сточных вод на локальных очистных сооружениях и доочистки на общегородских сооружениях для повторной подачи очищенных жидкостей в общегородской промышленный водопровод. Используя данные по химическому составу сточных вод, вод естественного водоема и вод определенного назначения, приведенных в таблицах 1, 2, установить: • степень разбавления сточных вод в водоеме в заданном створе; • необходимую степень очистки от загрязнителей, определяющих БПКполн с учетом расчетной концентрации кислорода в сточных водах; • расчетное изменение реакции среды (рН) водоема при сбрасывании с него сточных подготовленных и неподготовленных вод; • мероприятия по снижению уровня теплового загрязнения водоема; • степень очистки загрязненных жидкостей от растворенных в них вредных веществ. Таблица 2 Химический состав сточных и природных вод для расчета необходимой степени очистки сточных вод на очистных сооружениях

45

Параметры сточных и природных вод Расход сточных вод, q (м3/с) Концентрация взвешенных веществ, Свзв ст (мг/с) Время протекания воды от места сброса, до расчетного створа, t сут Полная биохимическая потребность сточной воды в кислороде Lct (мг/л) Содержание кислоты в сточных водах. Ск (мг-экв/л) Температура сточных вод, tо С Содержание вредных веществ, (мг/л) Мышьяк Ртуть Селен Свинец Кадмий Цинк Фтор Аммиак (по азоту) Нитраты (по азоту) Нефть многосернистая

46

1 3

2

3

Вариант очистки 4 5

Сточные воды предприятия 2,5 3,5 4

6

7

4,5

10

15

180

220

210

200

215

165

195

0,3

1

0,7

0,8

1,2

1,5

2

89

130

220

400

250

420

600

78

350

56

35

21

70

27

38

30

27

32

31

40

39

0,06 0,05 0,03 0,5 2,1 1,5 2

0,07 0,01 0,04 0,2 1,5 2,1 -

3,06 0,02 0,03 1,02 1,2 2,6 3,5

0,04 0,01 1,8 2,4 6

0,01 1,2 0,05 2,1 1,7 4,0 1,2 20

0,02 1,6 0,04 3 1 5,0 2,8 5

0,8 0,3 1 1,5 3,0 2 -

13

12

10

15

16

10

9

0,07

0,09

0,2

3

0,5

1,5

2,5

Фенол Бензол Цианиды

2,6 2,2 3,5 2,7 0,6 0,4 Речная вода, куда сбрасываются сточные воды Расход воды, Q 36 70 102 87 150 (м3 /с) Коэффициент 0,3 0,25 0,35 0,25 0,4 смешивания, J Концентрация 6 10 12 4 7 взвешенных веществ до сброса сточных вод, Св (мг/л) Биохимическая 2,2 1,8 2,1 2,2 1,7 потребность в кислороде, Lb, или ОБПК (мг/л) Содержание 7,5 8 8,5 8 7,5 растворенного кислорода в речной воде до сброса сточных вод, Ов (мг/л) рН 7 7,2 6,9 7,8 6,8

0,05 1 -

0,5 2 0,06

280

520

0,5

0,6

11

13

2,5

2,4

8,2

7,2

8

8,2

3,5

3,2

5

3

7,3

6

3,3

Максимальная температура в наиболее теплый летний месяц до спуска сточных вод, tо Смах Содержание вредных веществ, (мг/л) Кадмий Ртуть Свинец Цинк Фтор Мышьяк Аммиак (по азоту)

19

17

16

22

18

15

20

0,001 0,005 0,02 1,2 -

0,005 0,8 0,02 0,01

0,03 0,001 0,5 0,5

0,001 0,001 0,05 0,4 -

0,002 0,005 0,01 0,8 0,05

0,4

3

1,5

1,8

3

-

0,2 -

4 -

0,05 -

0,001

0,03 0,01

-

0,01

-

-

-

5*10-4

-

-

-

Хозяйственное назначение водоема Номер варианта 1 2 3 4 5 6

Цель водопользования Хозяйственно-питьевое водоснабжение маслосырзавода Снабжение водой мясокомбината Культурно-бытовое водоснабжение мелькомбината Снабжение водой хлебозавода Хозяйственно-питьевое водоснабжение сельскохозяйственного предприятия Хозяйственно-питьевое водоснабжение рыбоконсервного комбината Снабжение водой спиртзавода

Таблица 4 ПДК некоторых вредных веществ в воде рыбохозяйственных водоемов

0,003 0,006 0,0 1,2 2

47

2

Таблица 3

7

Щелочность (мг/л)

0,06 0,002 0,001 0,05 0,7 0,3

Нитраты (по азоту) Бензол Нефть многосернистая Фенол

48

Вещество

Норматив ПДК, мг/л

Аммиак Аммония соли Кадмий Кобальт Магний Медь Мышьяк Никель Нефть и нефтепродукты Свинец Сероуглерод Фенолы Хлор свободный Цинк

0,1 5,0 0,002 0,01 50,0 0,01 0,05 0,01 0,05 0,1 1,0 0,001 Отсутствие 0,01

Анилин Бензол Бериллий Ванадий Вольфрам ДДТ (дуст) Кобальт Молибден Аммиак Кадмий Медь Никель Сульфиды Титан Хлор активный Мышьяк Нафтол Нитраты по азоту Роданиды Ртуть Свинец Селен

1,0 0,5 2,0 0,01 0,1 0,1 Отсутствие 0,1 Отсутствие 0,05 0,4 10,0 0,1 0,005 0,1 0,001

Вещество Стронций Сурьма Теллур Фтор (в соединениях) Хлорбензол Четыреххлористый углерод Цинк Барий Бензин Железо Керосин Нефть многосернистая Нефть прочная Пикриновая кислота Сероуглерод Толуол Фенол Хром(Cr+6) Хром(Cr+3) Этилен

Норматив ПДК, мг/л 2,0 0,05 0,01 1,5 0,02 0,3 1,0 4,0 0,1 0,5 0,1 0,1 0,3 0,5 1,0 0,5 0,001 0,1 0,5 0,5

Результаты расчета представить в виде развернутых расчетов по пунктам задания с подробными пояснениями. Затем полученные данные свести их в таблицу 6. Таблица 6 Результаты расчета степени очистки сточных вод на очистных сооружениях

49

Эвр, %

Сст/Св, мг/л

Эк, %

ЭБПК,%

Максимально допустимая температура

Норматив ПДК, мг/л 0,1 0,5 0,0002 0,1 0,1 0,1

ЭО, % содержания растворенного кислорода

Вещество

Эвзв, %

Таблица 5 ПДК вредных веществ в воде водоемов хозяйственнопитьевого и культурно-бытового водопользования

Степень разбавления

0,05

№ варианта

Цианиды

1. Расчёт степени разбавления сточных вод речной водой При определении возможности спуска сточных вод проектируемого предприятия в водоём прежде всего рассчитывают степень разбавления сточных вод речной водой. Разбавление сточных вод - это процесс снижения концентраций загрязняющих веществ в водотоках и водоёмах, протекающий вследствие перемешивания сточных вод с природными водами. Интенсивность, процесса разбавления количественно характеризуется степенью разбавления, которая определяется по формуле: n = (J * Q + q) / q , (1) где n - степень разбавления сточных вод под водой реки; Q - расход реки, мЗ/с; q - расчётный расход сточных вод мЗ/с; J - коэффициент смешения. Коэффициент смешения всегда меньше единицы. Так как влияние сточных вод оценивается у ближайшего пункта водопользования, у этого пункта и надо определять степень разбавления. При проектировании среднемесячный расход реки и коэффициент смешения берутся из данных гидрометеорологической службы, а расход сточных вод определяется расчётным путём или по аналогии с действующим предприятием подобного профиля. 50

После определения степени разбавления сточных вод нужно рассмотреть вопрос возможного ухудшения качества воды в реке или в другом водоёме в результате сброса туда сточных вод. 2. Расчёт степени очистки сточных вод от взвешенных веществ. Необходимая степень очистки сточных вод по содержанию взвешенных веществ определяется по формуле: Эвзв = (Сст – С0) / Сст * 100%, (2) где Эвзв - искомая степень очистки, %; Сст исходная концентрация взвешенных веществ в сточных водах до очистки, мг/л; С0 - расчётная концентрация взвешенных веществ в очищенных сточных водах перед сбросом в водоём, мг/л. Расчётную концентрацию взвешенных веществ в очищенных сточных водах перед сбросом их в водоём определяем по формуле: С0 = Св + n * Сдоп, (3) где Св - концентрация взвешенных веществ в воде реки до сброса сточных вод, мг/л; n - степень разбавления сточных вод в расчётном; Сдоп - допустимое увеличение содержания взвешенных веществ в реке после сброса сточных вод, мг/л; Сдоп - для водоёмов хозяйственно-питьевого водоснабжения и для водоснабжения пищевых предприятий - 0,25 мг/л, а для рыбохозяйственных водоёмов и водоёмов культурно-бытового пользования - 0,75 мг/л. 3. Расчёт необходимой степени очистки сточных вод по БПК смеси речной воды и сточных вод При поступлении сточных вод в реки и водоёмы снижение концентрации органических веществ, выраженное в БПК, происходит вследствие не только разбавления, но и самоочищения.

Концентрацию сточных вод, при которой БПК воды реки в ближайшем пункте водопользования ниже спуска сточных вод будет не больше принятых нормативов, находят по формуле: L0 = (n – 1 / 10-K1t) (Lдоп – Lв) + Lдоп/ 10-K1t, (4) где Lдоп = 4мг/л - предельно допустимое значение БПК смеси cточных вод и речной воды; Lв - БПК речной воды до сброса сточных вод, мг/л; К1 - константа скорости потребления кислорода сточными водами; t - время протекания воды от места сброса до расчётного створа, сут. При решении уравнения значения величины 10-ktl вычислить сложно, поэтому составлены таблицы 7, 8 в которых принятые пределы К1 и t - охватывают все случаи, имеющие практическое значение. Если расчётное значение Lo больше фактического значения БПК сточных вод, подлежащих спуску в реку, то биологическая очистка сточных вод не требуется.

Таблица 7 Значение К1 при различных температурах речной воды t0 C 26 28 30 32

t0 C 34 36 38 40

К1 0,16 0,17 0,18 0,19

Таблица 8 Значение величины 10 К1t при переменных К1 и Т K1

51

К1 0,12 0,13 0,14 0,15

52

T, сут

0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0,22 0,24 0,26 0,28 0,3 0,4 0,5

0,25 0,83 0,92 0,91 0,90 0.89 0,88 0,87 0,86 0,85 0,84 0,79 0,75

0,6 0,87 0,85 3,83 0,81 0,79 0,77 0,75 0,74 0,72 0,70 0,63 0,56

1 0,75 0,72 0,69 0,66 0,63 0,60 0,57 0,55 0.52 0,50 0,39 0,31

1,5 0,661 0,617 0,575 0,537 0,501 0,478 0,437 0,407 0,380 0,335 0,251 ,178

2 0,575 0,525 0,479 L0,437 0,393 0,363 0,331 0,302 0,275 0,251 [0,158 0,100

Если же Lo меньше БПК сточных вод, то биологическая очистка перед спуском в водоём обязательна до получения расчётного значения Lo. Необходимая степень очистки смеси сточных вод и речной воды БПК определяется в этом случае по формуле: ЭБПК = (Lст – L0) / Lст * 100%, (5) где Lст – полная биохимичечская потребность сточной воды в кислороде, мг/л. При расчёте кислородного режима водоёма исходят из поглощения сточными водами растворённого кислорода речной воды в месте их. Если количество содержащегося в речной воде растворённого кислорода не ниже 4 мг/л в течение первых двух суток, то снижения не производится и в дальнейшем. Формула для определения расчетной концентрации растворенного кислорода сточных вод имеет следующий вид: Ор = (n – 1) / 0,4 (Ов – 0,4 ОБПК – Одоп) – Одоп / 0,4, (6) где Ор - расчётная концентрация растворённого кислорода сточной воды, мг/л; n - степень разбавления; 53

Ов - содержание растворенного кислорода в речной воде до сброса сточных вод, мг/л: Овпк - биохимическая потребность речной воды в кислороде, мг/л; Одоп - предельно допустимая концентрация растворённого кислорода, которая должна быть в расчётном створе после сброса сточных вод; 0,4 - коэффицент для пересчёта полного потребления кислорода в двухсуточное. Если расчётная концентрация меньше той, которая характерна для проектируемых к спуску в водоём сточных вод, то они должны быть очищены. Тогда необходимую степень очистки определяют по формуле: ЭБПК = (LCT - Ор) / LCT * 100%, (7) где LCT - полная биохимическая потребность сточной воды в кислороде, мг/л; Ор - расчётная концентрация растворённого кислорода в сточных водах, мг/л. Расчёт кислородного режима сточных вод и необходимой степени очистки по содержанию растворённого кислорода выполняют для определения загрязнённости сточных вод органическими веществами. 4. Расчёт степени очистки сточных вод по изменению рН Согласно общим требованиям к составу и свойствам воды водоёмов у пунктов культурно-бытового водопользования, реакция (рН) не должна выходить за пределы 6,5 8,5. Допустимую концентрацию кислоты в сточных водах находят по формуле: С до п =(n -1) * х к , (8) где Хк - максимальное количество кислоты, которое может быть добавлено к 1 л речной воды, мг-экв/л (находят по графику Черкинского, рис. 1); n - степень разбавления сточных вод. 54

Xщ мл 1-норм р-ра кислоты

Xк мл 1-норм р-ра кислоты

6,5 6,75

7

7,25

7,5

7,75

8

8.25Н

Рис 2. График для определения максимального количества кислоты на 1 л речной воды, мг-экв/л (по С.Н. Черкинскому)

Пользоваться графиком надо следующим образом. Допустим, что вода имеет рН=7,25 при щелочности 3 мг/л. Восстановив перпендикуляр из точки 7,25 на оси абсцисс до пересечения с основной кривой, которая соответствует З (В-3) и опустив из точки пересечения перпендикуляр на правую ось Хк ординат, находим значение, равное 1,25. Это и есть максимальное количество кислоты в миллилитрах нормального раствора, которое может быть добавлено к 1 л воды водоёма по санитарным нормам (Хк). Необходимая степень очистки сточных вод от кислоты определяется по формуле: (9) Эк = (Ск - Сдоп) / Ск * 100%, где Ск - содержание кислоты в сточных водах, мг-экв/л.

5. Расчет температуры сточных вод перед сбросом в водоём. Расчет производится с учётом санитарных требований: летняя температура речной воды не должна повышаться в результате спуска сточных вод более чем на 3°С. Максимально допустимую температуру сточных вод определяют по формуле: tст = (j * Q / q + 1) * tдоп + tмах, (10) где j - коэффициент смешения; Q - расход реки, м3/с; q - расход сточных вод; tдоп - допустимое повышение температуры (3°С); tmax - максимальная температура речной воды в наиболее тёплый летний месяц до спуска сточных вод. Сравниваем полученную величину с температурой сточных вод. Если температура сточных вод меньше полученной расчётной, то специальных мер по снижению температуры сточных вод принимать не нужно. Если температура сточных вод больше расчётной, то требуется охлаждение сточных вод перед сбросом их в водоём. 6. Расчет степени очистки сточных вод от вредных веществ. Если в сточных водах содержится несколько вредных веществ, то все компоненты, имеющиеся в сточных водах, разбиваются на группы с одинаковыми ЛВП (табл. 4, 5). Например, в сточных водах содержатся мышьяк, ртуть, свинец, никель, цинк. По таблице 4 определяем, что мышьяк, ртуть и свинец относятся к группе веществ санитарно-токсикологического ЛВП, а никель и цинк - к группе веществ общесанитарного ЛПВ. Затем определяем сумму отношений концентраций веществ каждой группы в сточной воде к их предельно допустимым концентрациям: Сст1/ПДК1 + Сст2/ПДК2 + Сст3/ПДК3 +…+ Сстn/ПДКn .(11)

55

56

После этого подсчитываем сумму отношений концентрации этих веществ в воде водоема до спуска в него сточных вод к их ПДК Св1/ПДК1 + Св2/ПДК2 + Св3/ПДК3 +…+ Свn/ПДКn .

(12)

Определяем необходимую степень очистки по формуле: Эвр = (1 – (1 – (п – 1) / п) * Св / Сст / п) * 100%,

где п - степень разбавления сточных вод.

Варианты контрольной работы для студентов заочной формы обучения Вариант контрольной работы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Вопросы 1, 11, 21 2, 12, 22 3, 13, 23 4, 14, 24 5, 15, 25 6, 16, 26 7, 17, 27 8, 18, 28 9, 19, 29 10, 20, 30

1.Видовые различия чувствительности к ядам. Токсический эффект. 2.Особенности воздействия яда и токсический эффект. 3.Влияние некоторых факторов внешней среды на действие ядов. 4.Смертельные дозы и концентрации. 5.Пороговые дозы и концентрации. 6.Предельно допустимые дозы и концентрации. 7.Равновесное распределение неэлектролитов между окружающей средой и млекопитающими. 57

8.Роль активности при переходе веществ из внешних фаз в биофазы. 9.Зависимость физико-химических свойств, токсических концентраций, активностей от местоположения веществ в гомологических рядах. 10. Кумуляция ядов. Количественные оценки. 11. Количественная оценка токсического эффекта при комбинированном воздействии ядов. 12. Связь между строением веществ и их токсичностью. 13. Эвтрофикация водоемов. Биологические помехи в системах водоснабжения, вызываемые аллохтонными и автохтонными организмами. Биологические обрастания в системах оборотного водоснабжения и методы борьбы с ними. 14. Источники и характер загрязнения природных водоемов. Процесс самоочищение водоема и его отдельные компоненты: разбавление, механическая составляющая, химическая, физико-химическая и биохимическая очистка. 15. Роль высшей водной растительности, водных животных, насекомых и микроорганизмов в процессах самоочищения водоемов. 16. Оценка процесса аэробной биохимической очистки по результатам химико-биологического анализа и индикаторным микроорганизмам. 17. Компостирование осадков сточных вод, твердых бытовых, промышленных и сельскохозяйственных отходов органического происхождения. 18. Специфика и механизм токсического действия ароматических углеводородов на биообъекты. 19. Радиоактивные изотопы, влияние на экосистему. 20. Экотоксиклогические вещества животного и растительного происхождения.

58

21. Токсические вещества микробиологического происхождения. 22. Биотехнологические альтернативы в сельском хозяйстве. 23. Биосорбция металлов из растворов. 24. Катаболические плазмиды. 25. Биотехнологическая очистка окружающей среды от загрязнителей. 26. Влияние тяжелых металлов на экологию. 27. Оценка воздействия на окружающую среды (ОВОС). Государственная экологическая экспертиза. 28. Атмосферные загрязнители и их влияние на экосистему. 29. Биогидрометаллургия. Бактериальное выщелачивание. 30. Ликвидация токсичных и опасных отходов.

9. Макушкин Э.О., Цыренов В.Ж. Эколого-токсикологические исследования в низовьях р. Селенги. Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, 2005. 152 с. 10. Никаноров A.M., Хоружая Т.А. Экология.// Учебное пособие. - М.: Изд-во «Приор», 2000. 11. Оксигендлер Г.И. Яды и организм. Проблемы химической опасности. - СПб.: Наука, 1991. – 317 с. 12. Орлов Д.С., Садовникова Л.К., Лозанская И.Н. Экология и охрана биосферы при химическом загрязнении: учебное пособие. – М.: Высшая школа, 2002. 13. Приборы контроля окружающей среды / Манойлов В.Е. и др. / Под ред. В.Е. Манойлова. – М.: Атомиздат, 1980. – 213 с. 14. Фелленберг Г. Загрязнение природной среды. Введение в экологическую химию. - М.: Мир, 1997. 15. Ханхунов Ю.М., Хантургаев Г.А. Основы расчетов нормирования загрязняющих веществ в окружающей природной среде: учеб. пособие. – Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 1998. – 158 с. 16. Юрин В.М. Основы ксенобиологии: учеб. пособие – М.: Новое знание, 2002.-267 с.

Список рекомендуемой литературы 1. Барышников И.И., Лойт А.О., Савченков М.Ф. Экологическая токсикология. Ч. 1, Ч. 11 – Иркутск: Изд-во Иркутского университета, 1991. - 282 с. 2. Головко А.И., Куценко С.А., Ивницкий Ю.Ю. и др. Экотоксикология. - СПб.: НИИХВ СПбГУ, 1999. - 124с. 3. Грушко Я.М. Вредные неорганические соединения в промышленных выбросах в атмосферу: справочник. - Л.: Химия, 1987. - 191 с. 4. Исидоров В.А. Введение в курс химической экотоксикологии: учебное пособие. - СПб.: Изд-во СПб. Университета, 1997. - 88 с. 5. Каган Ю.С. Общая токсикология пестицидов. - Киев: Здоровье, 1981. - 174 с. 6. Коробкин В.И., Передельский Л.В. Экология. – Ростов-наДону: Изд-во «Феникс» - 2000. 7. Корте Ф., Бахадир М., Клайн В., Лай Я.П., Парлар Г., Шойнерт И. Экологическая химия / Под ред. Ф. Корте. - М.: Мир, 1997. 8. Кушнева В.С., Горшкова Р.Б. Справочник по токсикологии и гигиеническим нормативам (ПДК) потенциально опасных химических веществ. - М.: ИздАТ, 1999. – 272 с.

59

60

Подписано в печать 20.12.2006 г. Формат 60х84 1/16. Усл.п.л. 3,49. Тираж 50 экз. Заказ № 294. Издательство ВСГТУ. 670013. г. Улан-Удэ, ул Ключевская, 40, в. © ВСГТУ, 2006 г.

61