Медицинская биохимия: Лабораторный практикум

Федеральное агентство по образованию Омский государственный университет им. Ф.М. Достоевского

УДК 557.1 ББК 28.072 М422 Рекомендовано к изданию редакционно-издательским советом ОмГУ М422 Медицинская биохимия: Лабораторный практикум (для студентов III курса специальности «Медицинская физика») / сост.: Е.В. Бескровная, Е.Ю. Мосур, В.И. Ямковой / под ред. проф. Н.А. Семиколеновой. – Омск: Изд-во ОмГУ, 2005. – 76 с. ISBN 5-7779-0598-6 УДК 557.1 ББК 28.072

МЕДИЦИНСКАЯ БИОХИМИЯ Лабораторный практикум (для студентов III курса специальности «Медицинская физика»)

ISBN 5-7779-0598-6 Изд-во ОмГУ

Омск 2005

© Омский госуниверситет, 2005

I. ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОХИМИИ

Лабораторная работа №1 Определение константы ионизации цитидина спектрофотометрическим методом

Представляет собой длинные иглоподобные кристаллы или белый кристаллический порошок. Цитидин хорошо растворим в воде, гигроскопичен; молекулярная масса 243,2 г/моль. В водных растворах цитидин ионизируется по схеме: Ka BH + ←⎯→ B+H+.

(1) Термодинамическая константа диссоциации Ka по определению равна

aH + aB

Цель работы: изучение процесса ионизации цитидина при помощи спектрофотометрического метода.

Ka =

Приборы, принадлежности и реактивы: спектрофотометр СФ-56, кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см, pH-метр Mettler Toledo MP2220, дозирующие диспенсеры Biohit Proline, мерные колбы на 50 мл, химические стаканы на 50 мл, пробирки, раствор цитидина 6,6⋅10-5 М, раствор NaOH 0,2 М, раствор HCOOH 0,4 М, раствор HCl 0,1 М, дистиллированная вода.

где aH + , a B , a BH + – активности H+, B, BH+, соответственно.

Ионизация цитидина Цитидин (цитозинрибозид) – один из нуклеозидов, входящий в состав рибонуклеиновых кислот. Он состоит из гетероциклического основания – цитозина, соединенного N-гликозидной связью с углеводным остатком рибозы (рис. 1).

N N

О

OH

OH

O

Рис. 1. Структурная формула цитидина

3

,

(2)

Способность нуклеозидов к ионизации определяет их химические и физические свойства, в частности, реакционную способность. Ионизация оснований влияет также на вторичную структуру нуклеиновых кислот и полинуклеотидов. В настоящей работе ионизация цитидина изучается спектрофотометрическим методом, позволяющим работать с малыми концентрациями изучаемого вещества. В случае достаточно разбавленных растворов константа ионизации связана со степенью диссоциации α, pH раствора и средним коэффициентом активности ионов в этом растворе формулой: 1−α (3) pK a = pH + lg − lg γ ± ,

α

NH2

HOCH2

a BH +

где pKa=–lgKa. Для одновалентных ионов при 200C принимается следующее соотношение: lg γ ± = −

0,505 µ 1 + 1,6 µ

.

Ионная сила раствора µ определяется по формуле: 1 µ = ∑ mi zi2 , 2 i 4

(4)

(5)

где mi – концентрация i-го иона (моль/л); zi – заряд i-го иона в электронных единицах.

ванного и неионизированного цитидина при длине волны λ; mBH + ,

mB – соответствующие концентрации.

Определение степени диссоциации цитидина Анализ кислотно-основных равновесий представляет одну из наиболее важных областей приложения спектрофотометрии. Количественная спектрофотометрия основана на уравнении Фирордта:

Aλ = ε λ m l ,

λ λ где ε BH + , ε B – миллимолярные показатели поглощения ионизиро-

(6)

Концентрации BH+ и B связаны соотношением:

mBH + + mB = m0 , где m0 – исходная концентрация цитидина. Степень диссоциации цитидина определяется по формуле:

α=

где Aλ – оптическая плотность исследуемого раствора при длине волны λ; ε λ – миллимолярный показатель поглощения анализируемого вещества при длине волны λ; m – концентрация анализируемого вещества в растворе; l – толщина светопоглощающего слоя. В соответствии с принципом аддитивности Фирордта оптическая плотность смеси n химических соединений, подчиняющихся закону Ламберта–Бугера–Бера и не вступающих в химическое взаимодействие, равна сумме парциальных оптических плотностей, отвечающих поглощению света каждым из соединений:

Aλ = ε 1λ m1l + ε 2λ m2 l + ... + ε nλ mn l = l ∑ ε iλ mi .

(7)

λ

λ

λ

A = ε BH + mBH + l + ε B mB l ,

(8)

mB . m0

Для нахождения искомого соотношения

mB из (9) выражаем m0

λ λ Aλ = ε BH + (m0 − m B )l + ε B m B l .

(11)

λ Неизвестные миллимолярные показатели поглощения ε BH + ,

ε Bλ найдем, используя однокомпонентные растворы, каждый с общей концентрацией m0 . Оптическая плотность данных растворов: λ λ Aкисл = ε BH + m0 l ,

(12)

λ Aщел = ε Bλ m0l .

(13)

λ λ Выражая из (12) и (13) ε BH + и ε B , после подстановки в (11)

получаем:

Aλ =

λ λ mB (m0 − mB ) + Aщел Aкисл . m0 m0

(14)

С учетом формулы (10) выражение (14) принимает вид: λ λ (1 − α ) + Aщел Aλ = Aкисл α.

5

(10)

mBH + и подставляем в (8):

i

Вода и водные растворы некоторых сильных минеральных кислот и щелочей не поглощают свет в видимой и УФ-областях спектра. Это обстоятельство значительно упрощает применение спектрофотометрии к анализу кислотно-основных равновесий. Поэтому смесь BH+, B, H+ можно считать двухкомпонентной и ее оптическая плотность Aλ при длине волны λ будет выражаться следующим образом:

(9)

6

(15)

Из (15) выражаем степень диссоциации путем несложных алгебраических операций:

α=

λ Aкисл − Aλ . λ Aкисл − Aщелλ

(16)

Таким образом, значения α находят посредством измерений оптической плотности буферных растворов с известным значением pH. Определив для одного и того же раствора значения α и µ , мы можем рассчитать значения pKa по формуле (3). Методика измерений Для приготовления трех буферных растворов (HCOONaHCOOH) с одинаковой концентрацией формиата натрия (0,1 М) и pH, равным соответственно 4,0, 4,2, 4,4, необходимо в три стакана на 50 мл налить по 25 мл 0,2 М раствора NaOH, затем оттитровать каждый 0,4 М муравьиной кислотой до соответствующего pH, после чего общий объем каждого раствора довести в мерной колбе до 50 мл дистиллированной водой. Анализируемые растворы могут быть подготовлены следующим образом. К исходному раствору цитидина 6,6⋅10-5 М добавляем растворы, указанные в нижеследующей таблице. Номер раствора

Характеристика раствора

Объем раствора цитидина, мл

Добавляемый раствор

1

кислый

9

1 мл 0,1 М HCl

2

щелочной

9

1 мл 0,1 М NaOH

3

буферный

9

4

буферный

9

5

буферный

9

7

1 мл буфера pH=4,0 1 мл буфера pH=4,2 1 мл буфера pH=4,4

Растворы сравнения готовятся аналогично, только вместо раствора цитидина необходимо использовать такое же количество дистиллированной воды. Контроль значений pH осуществляется с помощью pH-метра Mettler Toledo MP2220. Измерение оптической плотности исследуемых растворов производится посредством автоматического спектрофотометра СФ56 в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. Порядок выполнения работы 1. Ознакомиться с устройством и принципом работы спектрофотометра СФ-56. 2. Приготовить буферные растворы. 3. Приготовить анализируемые растворы и растворы сравнения. 4. Измерить спектры поглощения всех анализируемых растворов относительно соответствующих растворов сравнения в оптическом диапазоне 240÷310 нм с шагом 1 нм. Результаты измерения представить в следующем виде: Длина волны, нм

Оптическая плотность растворов 1 2 3 4 5

5. По спектрам поглощения растворов № 1–5 определить характеристическую и изобестическую (точка пересечения всех спектральных кривых) длины волн. 6. Вычислить степень диссоциации (значения оптической плотности следует брать при характеристической длине волны) и ионную силу для растворов № 3–5. Затем рассчитать среднее значение pKa и Ka. Результаты оформить в виде таблицы:

8

Номер рас- pH твора 3

4,0

4

4,2

5

4,4

µ lgγ±

λ λ Aщел Aкисл

A

α

lg((1α)/α)

pKa pKa сред- Ka нее

λ λ где Aкисл , Aщел – оптическая плотность при характеристической

длине волны растворов № 1–2, соответственно.

ным.

7. Полученное значение pKa цитидина сравнить с литератур-

Рекомендуемый библиографический список 1. Ямковой В.И. Практикум по биохимии: Учебное пособие. Часть I. Методы физической химии в биохимии. Новосибирск: НГПУ, 2002. 2. Ямковой В.И. Курс лекций по биохимии: Учебное пособие: В 2 ч. Омск: ОмГУ, 2003. 3. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1992. 4. Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии. Л.: Химия, 1986.

Лабораторная работа №2 Определение констант ионизации трис-оксиметиламинометана и уксуснокислого натрия методом потенциометрического титрования Цель работы: изучение основ потенциометрии и метода потенциометрического титрования; определение констант ионизации исследуемых веществ. Приборы, принадлежности и реактивы: pH-метр Mettler Toledo MP2220, дозирующие диспенсеры Biohit Proline, магнитная мешалка, химические стаканы на 50, 100, 250 мл, колба на 1 л, воронка, боек, стандартные буферные растворы, раствор титранта – 0,1 M HCl, дистиллированная вода, трис-оксиметиламинометан («трис»), уксуснокислый натрий безводный. Потенциометрия Потенциометрический метод анализа основан на измерении электродного потенциала и нахождении зависимости между его величиной и концентрацией, точнее, активностью потенциалопределяющего компонента в растворе. Возникновение электродного потенциала связано с электрохимическим процессом, происходящим на границе раздела металл/раствор. При погружении, например, индифферентного электрода из благородного металла в раствор, содержащий окислительно-восстановительную (редокс) систему (пару), устанавливается динамическое равновесие, которое может быть выражено следующим уравнением: Ок + ne ⇔ Вос , а электрод приобретает так называемый равновесный потенциал (Eр). Математическое выражение его зависимости от активности

9

10

компонентов рассматриваемой редокс-системы дается уравнением Нернста: 0 E р = E Ок/Вос +

ϑ n

lg

aОк , aВос

0 E р = E Ок/Вос +

где E0 – стандартный потенциал редокс-системы, равный Eр, когда активности всех участвующих в электрохимической реакции компонентов равны единице; n – число электронов, принимающих участие в данной электрохимической реакции; ϑ =(RT/F)2,303=0,0001983T=0,0591±0,0002 (t=250С); R – газовая постоянная (8,31 Дж/(К•моль)); F – постоянная Фарадея (~96500 Кл). В общем случае, когда электрохимическая реакция выражена равновесием aA + bB + cC + ... + e ⇔ m M + pP + qQ + ... ,

уравнение можно изобразить в виде 0 E р = E А, В,С/М, Р, Q +

a a a b a c ... RT ln mA Bp Cq . nF aM aP aQ ...

(*)

Компонентами, участвующими в реакции, могут быть ионы окислителя, восстановителя, водорода и др., молекулы растворителя (например, воды), твердая фаза (металл, оксид металла или малорастворимый электролит) и газообразные вещества (например, H2, O2, Cl2, и пр.). При этом в уравнении (*) не фигурируют те компоненты, активность которых постоянна или равна единице. К таким компонентам относятся твердая фаза, газообразное вещество, если раствор насыщен им при давлении 1 атм, а также растворитель вследствие большой его концентрации и тем самым малых изменений его активности в процессе реакции. Учитывая, что aОк=γОк[Ок]; aВос=γВос[Вос] и [Ок]=αОксОк; [Вос] = αВос сВос, где γОк и γВос – коэффициенты активности, зависящие только от ионной силы раствора и отражающие электростатическое взаимодействие всех присутствующих в растворе ионов; αОк и αВос – коэффициенты «побочных» реакций; [Ок] и [Вос] – равновесные концентрации потенциалопределяющих компонентов; сОк и 11

сВос – их общие концентрации, можно записать уравнение (*) в следующем виде:

ϑ n

lg

г Ок ϑ α Ок ϑ сОк ϑ с + lg + lg = E ф + lg Ок , г Вос n α Вос n сВос n сВос

где Eф – реальный или формальный потенциал, измеренный при сОк=сВос и являющийся постоянной величиной только в конкретных условиях. Практически невозможно измерять потенциалы отдельного электрода. Поэтому необходимо составить гальванический элемент (электролитическую ячейку) из двух электродов, между которыми возникает разность потенциалов, при этом потенциал одного электрода постоянен и заранее известен. Такие электроды, относительно которых определяют потенциал индикаторного электрода, носят название электродов сравнения. По международному соглашению в качестве стандартного электрода сравнения принят стандартный водородный электрод (с. в. э.). Но так как водородный электрод малопригоден в обычных условиях работы (трудоемкость его приготовления), то на практике используют другие электроды сравнения, например насыщенный каломельный электрод (нас. к. э.) или хлорсеребряный (х. с. э.). ЭДС, возникшую между индикаторным электродом и электродом сравнения, можно измерить различными способами. Наиболее распространенным и надежным способом измерения ЭДС гальванических элементов является компенсационный метод Поггендорфа. Определение констант ионизации кислот и оснований Одной из наиболее важных задач потенциометрии является определение концентрации и активности ионов водорода, а также потенциометрическое титрование – наиболее удобный и быстрый метод определения констант ионизации кислот и оснований. Рассмотрим процесс ионизации. Для кислот он может быть представлен в следующем виде: T

Ka HA ←⎯ ⎯→ H + + A − ,

12

(1)

где

K aT =

aH + a A −

(2)

a HA

Учитывая (9), уравнения (6) и (7) можно написать в следующем виде:

pK aT = pH + lg

есть константа ионизации кислоты НА. Для оснований состояние ионного равновесия также можно описать кислотной константой ионизации: +

K Ta

+

BH ←⎯ ⎯→ H + B , где

K aT =

aH + aB a BH +

есть константа ионизации сопряженной с основанием В кислоты ВH+. Константы ионизации – величины малые, и поэтому удобнее пользоваться их отрицательными логарифмами

pK aT = −lgK aT .

(5)

pK aT = pH + lg

кислот – и оснований – где

pK aT

pK aT = pH + lg

aBH aB

pH = −lg a H + .

+

(6)

− lg γ n =

(7) (8)

Далее перейдем от активностей к концентрациям, приняв во внимание, что активности неионизированных кислот НА и оснований В в разбавленных растворах практически равны их концентрациям, а зависимость активности любого иона от его концентрации выражается уравнением an=mnγn, (9) где γn – коэффициент активности иона, а mn – его молярная концентрация.

13

m BH + mB

+ lgγ BH + .

0,505Z n2 µ

(11)

1 + 1,6 µ

,

(12)

где µ – ионная сила раствора, вычисляемая по формуле

µ=

1 m n Z n2 . ∑ 2

(13)

Для однозарядного иона уравнение (12) можно написать в виде

− lg γ n = ,

(10)

Согласно теории Дебая-Гюккеля, коэффициент активности иона с зарядом Zn определяется формулой

Прологарифмировав выражения (2), (4) и поменяв знаки на обратные, получим следующие уравнения для pK aT :

a = pH + lg HA aA−

-

−

(3) (4)

mHA - lgγ A , mA

0,505 µ 1 + 1,6 µ

,

(14)

а для растворов 0,01 М и более разбавленных знаменателем в уравнении (14) можно пренебречь, и в этом случае оно еще более упрощается:

− lg γ n = 0,505 µ .

(15)

Таким образом, для разбавленных водных растворов одновалентных кислот и оснований можно написать следующие уравнения для определения pK aT :

pK aT = pH + lg

mHA + 0,505 µ , mA −

14

(16)

pK aT = pH + lg

m BH + mB

- 0,505 µ .

(17)

Константы ионизации, полученные из этих уравнений, являются истинными или термодинамическими, не зависящими от концентраций кислот и оснований. При определении констант ионизации методом потенциометрического титрования часто пренебрегают поправкой на коэффициент активности и получают так называемые смешанные константы ионизации:

pK aC = pH + lg

mHA , mA

(18)

mBH . mB

(19)

В связи с тем, что все соли в растворе полностью ионизированы, величина m K + равна В, т. е. концентрации КОН с учетом разбавления ее раствором. Исходную концентрацию кислоты можно определить через концентрацию оставшейся кислоты и концентрацию образовавшейся соли (концентрацию аниона A − ):

a = m HA + m A − .

В любой момент титрования раствор должен быть электронейтральным, т. е. сумма концентраций отрицательных ионов должна быть равна сумме концентрации положительных ионов:

−

pK aC = pH + lg

+

Смешанные константы ионизации незначительно отличаются от термодинамических при условии, что концентрации кислот и оснований не превышают 0,01 М. Однако, если решено внести термодинамическую поправку в эти величины, то достаточно близкое приближение можно получить с помощью уравнений: для кислот –

pK aT = pK aC + 0,505 µ ,

(20)

для оснований –

pK aT = pK aC − 0,505 µ ,

(21)

где µ – ионная сила раствора в средней точке титрования; а K

C a

–

(23)

откуда

m A − + m OH − = m K + + m H + ,

(24)

m A − = m K + − m OH − + m H + = B − m OH − + m H + .

(25)

Решая совместно уравнения (23) и (25), получим

m HA = a − B + m OH − − m H + .

(26)

Разделив почленно (26) на (25), получим следующее отношение:

m HA a − B + m OH − − m H + . = m A− B − m OH − + m H +

(27)

Уравнение (27) совместно с уравнением (16) позволяет рассчитывать pK aT слабой одноосновной кислоты, титруемой КОН.

среднее значение pK из серии результатов, полученных в одном эксперименте. В качестве примера рассмотрим процесс титрования слабой одноосновной кислоты НА раствором сильного однокислотного основания КОН:

Если результаты титрования лежат в области pH=4÷10, то поправкой на ионы водорода и гидроксила можно пренебречь, а уравнение (27) в этом случае можно записать в виде

HA + KOH → KA + H2O.

В кислой и щелочной областях уравнение (27) запишется соответственно

C a

(22)

Обозначим: a – исходная концентрация кислоты (моль/л), B – количество добавленной щелочи в пересчете на концентрацию в получившемся растворе (моль/л). 15

m HA a − B при 4
16

(28)

m HA a − B − m H + при pH≤4, = m A− B + mH +

(29)

m HA a − B + m OH − = при pH ≥10. m A− B − m OH −

(30)

В некоторых случаях константу ионизации слабой одноосновной кислоты определяют путем титрования ее соли сильной ки-

m слотой HCl. Отношение HA в этом случае находят из уравнений: m A−

при pH≤4,

(31)

mB m BH + mB

=

=

D − mH + C − D + mH +

17

при pH≤4,

(32)

C − D − m OH −

при pH ≥10,

m BH + mB

следую-

щие:

m BH + mB

mB

D при 4
D + m OH −

нований сильной щелочью (КОН) уравнения для

m BH +

где С – исходная концентрация соли слабой одноосновной кислоты (моль/л); D – количество добавленной HCl в пересчете на концентрацию в получившемся растворе (моль/л). Расчет констант ионизации слабых однокислотных оснований при титровании их сильной кислотой (HCl) проводится подобным же образом, исходя из уравнения (17) и уравнений, аналогичных таковым для кислот:

=

где С – исходная концентрация основания (моль/л); D – количество добавленной сильной кислоты в пересчете на концентрацию в получившемся растворе (моль/л). При обратном титровании солей слабых однокислотных ос-

mB

D + m OH − m HA = при pH ≥10, m A − C − D − m OH −

m BH +

mB

m BH +

m HA D = при 4
m BH +

=

a−B B

=

=

при 4
a − B − mH + B + mH +

a − B + m OH − B − m OH −

при pH≤4,

(33)

при pH ≥10,

где a – исходная концентрация соли слабого однокислотного основания (моль/л); В – количество добавленной щелочи в пересчете на концентрацию в получившемся растворе (моль/л). Ниже приведены две задачи на определение констант ионизации методом потенциометрического титрования. Лучше всего титровать вещество концентрации 0,01 М. При этой концентрации эффект активности мал, а точность результатов достаточно высока. В качестве титрантов используют 0,1 М растворы HCl и КОН. Применение титранта в десять раз более концентрированного, чем титруемый раствор, позволяет не учитывать разбавление титрантом раствора исследуемого вещества, если расчеты базируются на концентрации, которая достигается в средней точке титрования.

18

Методика измерений Титрант 0,1 М HCl готовится следующим образом: в колбу объемом 1 л вставляют воронку диаметром 9–10 см. В торце ампулы стандарт-титра пробивают отверстие с помощью стеклянного бойка. Перевернув ампулу, содержимое переводится в колбу через воронку. Затем ампулу тщательно промывают изнутри дистиллированной водой в количестве шестикратного объема ампулы. Объем жидкости доводят до 1000 мл и тщательно перемешивают. Титруемые растворы трис-оксиметиламинометана (раствор A) и уксуснокислого натрия (раствор B) с концентрациями 0,01 М готовятся в точке полунейтрализации, для чего навески 60,6 мг «триса» и 41 мг уксуснокислого натрия необходимо растворить в 47,5 мл прокипяченной дистиллированной воды каждую. Титрование производится десятью порциями раствора титранта, каждая из которых равна одной десятой эквивалента, т. е. 0,5 мл 0,1 М HCl. Титровать при перемешивании магнитной мешалкой. Значения pH измерять после каждого добавления порции титранта, при этом мешалку выключать и дожидаться установления равновесия. Измерение значений pH производится с помощью pH-метра Mettler Toledo MP2220.

Рис. 1. Установка для титрирования: 1 – дозирующий диспенсер; 2– стакан для титрования; 3 – стеклянный электрод; 4 – хлорсеребряный электрод; 5 – магнитная мешалка; 6 – рН-метр; 7 – магнит; 8 – термометр

Таблица A

Порядок выполнения работы 1. Собрать установку по схеме, указанной на рис. 1. 2. Проверить показания pH-метра по стандартным буферным растворам. 3. Приготовить титруемый раствор A. 4. Измерить температуру титруемого раствора. 5. Определить значение рН титруемого раствора. 6. Провести титрование. 7. Приготовить титруемый раствор B и повторить п. 4–6. 8. Рассчитать pK aC и K aC в каждой точке титрования. Заполнить табл. А и Б.

19

V, мл 0,1М HCl

pH

m BH +

m BH +

mB

mB

lg

m BH + mB

pK aC

K aC

Таблица B V, мл 0,1М HCl

pH

m HA

m HA m A−

m A−

20

lg

m HA m A−

pK aC

K aC

Усреднив полученную серию результатов, найти K aC и p K aC =–lg K aC .Окончательный

результат

представить

в

виде

C

p K aC ±∆p K aC , где ∆p K a – наибольшее отклонение в серии значеC

ний p K a от средней величины. Внеся поправки на коэффициенты T

активности, определить p K a и термодинамические константы ионизации трис-оксиметиламинометана и уксуснокислого натрия. Полученные величины сравнить с литературными данными. Рекомендуемый библиографический список 1. Богачев В.С., Райт В.К., Ямковой В.И. Методические указания по физической химии и кинетике. Новосибирск: НГУ, 1984. 2. Практическое руководство по физико-химическим методам анализа / Под ред. И.П. Алимарина и др. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1987. 3. Ямковой В.И. Курс лекций по биохимии: Учебное пособие: В 2 ч. Омск: ОмГУ, 2003. 4. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1992.

Лабораторная работа №3 Определение кинетических параметров реакции гидролиза сахарозы поляриметрическим методом Цель работы: исследование реакции гидролиза сахарозы в присутствии катализатора (соляная кислота); определение кинетических параметров данной реакции. Приборы, принадлежности и реактивы: круговой поляриметр СМ-3, термостат WB-1, секундомер, дозирующие диспенсеры Biohit Proline, колбы на 50 мл, стандарт-титр HCl, сахароза. Гидролиз сахарозы Сахароза, относящаяся к дисахаридам, состоит из глюкозы и фруктозы, соединенных между собой гликозидной связью. Структурная формула молекулы сахарозы представлена на рис. 1:

CH2O

HO

O

HOCH O

OH OH

O

H

CH2O

OH

Рис. 1. α-Д-глюкопиранозил-(1→2)-β-Д-фруктофуранозид Гликозидная связь в водных нейтральных растворах достаточно устойчива. При добавлении в раствор сахарозы в качестве катализатора сильной (хорошо диссоциирующей) кислоты скорость гидролиза гликозидной связи значительно возрастает – сахароза распадается на две составляющие (глюкозу и фруктозу): +

С12Н22О11+Н2О ⎯H⎯→ С6Н12О6+С6Н12О6.

21

22

Оптическая активность Большинство сложных молекул, содержащих более чем три атома, не имеет плоскости и центра симметрии. Такие молекулы называют хиральными. Термин «хиральность» означает несовпадение некоторой структуры с ее зеркальным отражением. Хиральные вещества могут существовать в двух конфигурациях – правой (Dформа) и левой (L-форма). Эти две конфигурации нельзя совместить никаким поворотом системы как целого в пространстве, они относятся друг к другу как левая и правая руки. Хиральные вещества различаются взаимодействием с поляризованным светом, они способны поворачивать плоскость поляризации проходящего света в разные стороны (оптическая активность). Оптическая активность есть результат кругового двулучепреломления, т.е. разных скоростей распространения в среде света, поляризованного по кругу вправо и влево. В правой волне вектор напряженности электриче-

G ского поля E в луче, идущем в глаз наблюдателя, вращается по ча-

совой стрелке, в левой – против часовой стрелки. Линейно поляризованную волну можно разложить на правую и левую волны, поля-

G ризованные по кругу – вектор E , колеблющийся вдоль одного на-

правления, есть сумма двух векторов, вращающихся по кругу в разных направлениях (рис. 2а). Если одна из этих волн распространяется быстрее другой, то суммарный вектор поворачивается на угол, тем больший, чем больше разность скоростей (рис. 2б), т. е. показателей преломления. При прохождения луча через слой вещества толщиной l плоскость поляризации поворачивается на угол

α=

π (n L − n D ) l , λ

где λ – длина волны света; nL и nD – показатели преломления для левой и правой волн.

ϕL

ϕD

а

б

Рис. 2. Разложение плоскополяризованной волны на волны, поляризованные по кругу вправо и влево (а), и поворот плоскости поляризации в результате кругового двулучепреломления (б) Экспериментально установлено, что для растворов угол поворота плоскости поляризации α прямо пропорционален толщине d слоя раствора и концентрации c активного вещества: α=[α]dc, где [α] – вращательная способность раствора (постоянная вращения). В мире биомолекул чаще всего приходится встречаться с хиральностью, определяемой так называемым ассиметрическим атомом углерода. Хиральность свойственна и белкам, и углеводам, и нуклеиновым кислотам, и ряду низкомолекулярных соединений в клетке. Углеводы в ДНК и РНК всегда фигурируют в D-форме. Азотистые основания имеют плоское строение и, следовательно, лишены хиральности. В процессах метаболизма, происходящих без рацемизации (превращения зеркальных антиподов друг в друга), клетка усваивает лишь те из них, которым отвечают структуры ее биологических молекул. Организм усваивает L-аминокислоты. Определение кинетических параметров реакции гидролиза сахарозы В данной работе методом исследования является поляриметрия, так как все три (исходное и конечные продукты реакции) ве-

23

24

щества имеют в своем составе ассиметрические атомы углерода и являются оптически активными. По мepe течения реакции правое вращение поляризации водного раствора сахарозы будет сменяться левым, поскольку суммарное вращение эквимолярной смеси глюкозы и фруктозы имеет знак «–» и соответствует левому вращению. Получение экспериментальной зависимости уменьшения угла вращения плоскости поляризации реакционной смесью (пропорциональное уменьшению концентрации сахарозы в растворе) от времени реакции достаточно для расчета всех кинетических параметров данной реакции. 1. Определение константы скорости реакции. а) Интегральный метод. В этом методе константа скорости реакции К вычисляется следующим способом: n

K=

∑ i =1

2,3 б 0 − б ∞ lg б ti − б ∞ ti

n

,

где n – число измерений при одной температуре; α0 – угол вращения реакционной смеси в нулевой момент времени реакции, практически не зависящий от температуры, который определяется из б соотношения б t =0 = (так как в реакционной смеси раствор раз2 бавлен точно вдвое, α – угол вращения исходного раствора сахарозы); α∞=–6,50 – угол вращения реакционной смеси при полном гидролизе сахарозы. б) Графический способ. Для определения константы скорости реакции К необходимо б − б∞ построить зависимость величины lg 0 от времени. После этобt − б∞ го следует определить β – угол наклона прямой к оси абсцисс. Константа скорости реакции выражается через β: К = 2,3 tgβ.

25

2. Определение энергии активации. Энергию активации определяют также графически. Строят зависимость вида lg K = lg K(1/T). Затем находят угол наклона данной прямой ξ. Энергия активации E выражается следующим образом: E = 2,3 R tgξ, где R=8,31 Дж/(К·моль) – универсальная газовая постоянная. Методика измерений Для приготовления 30 %-го раствора сахарозы необходимо в мерной колбе на 100 мл растворить навеску сахарозы массой 30 граммов в 75 мл дистиллированной воды. В качестве катализатора использовать стандарт-титр соляной кислоты, который готовят следующим образом: в мерный цилиндр вставляют воронку диаметром 9–10 см. В торце ампулы стандарт-титра пробивают отверстие с помощью стеклянного бойка. Перевернув ампулу, содержимое переносят в колбу через воронку. Затем ампулу тщательно промывают изнутри дистиллированной водой в количестве шестикратного объема ампулы. Объем жидкости доводят до 250 мл и тщательно перемешивают. После этого по 20 мл приготовленных растворов с помощью пипетки вносят в колбы. Термостатирование растворов проводят в термостате WB-1. Измерение углов вращения плоскости поляризации производят на поляриметре СМ-3 в поляриметрической трубке длиной 2 дм. Устройство поляриметра позволяет вести реакцию гидролиза непосредственно в кюветной камере поляриметра. Порядок выполнения работы 1. Ознакомиться с устройством и принципом измерений поляриметра СМ-3. 2. Приготовить 30 %-й раствор сахарозы и катализатор. 3. С помощью поляриметра определить угол вращения плоскости поляризации исходным раствором сахарозы и рассчитать точную концентрацию сахарозы в растворе по формуле 26

C [% ] =

бом найти относительную ошибку; рассчитать энергию активации; заполнить таблицу:

б 100 % , [ б]l

где α – найденный угол вращения для раствора сахарозы; для сахарозы [α]=66,55°; l – длина трубки в дециметрах. 4. Установить температуру термостата 40°С. 5. Поместить в термостат поляриметрическую трубку и две колбы с 20 мл 30 %-го раствора сахарозы и катализатора. 6. Через 10 минут содержимое колб смешать, переливая растворы из одной колбы в другую; одновременно запустить секундомер, отсчитывающий время реакции; реакционную смесь на 5 минут снова поместить в термостат. 7. Заполнить трубку реакционной смесью и поместить ее в поляриметр; найти угол вращения (определять угол вращения следует по возможности оперативно, чтобы избежать охлаждения реакционной смеси в трубке ниже температуры опыта), при этом синхронно фиксируя время; после измерения вернуть трубку в термостат. 8. Результаты записать в таблицу: Температура опыта, К

Время реакции, с

T, K t, c

αt αt–α∞

б 0 −б ∞ б t −б ∞

2,3/t lg

2,3 б 0 − б ∞ lg t бt − б∞

K

Рекомендуемый библиографический список 1. Ямковой В.И. Курс лекций по биохимии: Учебное пособие: В 2 ч. Омск: ОмГУ, 2003. 2. Волькенштейн М.В. Биофизика. М.: Наука, 1988. 3. Богачев В.С., Райт В.К., Ямковой В.И. Методические указания по физической химии и кинетике. Новосибирск: НГУ, 1984.

Угол вращения, 0

9. Следующее измерение угла вращения провести через 3–4 мин., всего 10 измерений до значительного изменения угла вращения. 10. Ополоснуть поляриметрическую трубку раствором сахарозы и повторить п. 5–9 для температур термостата 50°С, 60°С (учесть, что с повышением температуры скорость реакции и соответственно изменение угла вращения будут возрастать, поэтому интервалы времени между измерениями следует уменьшить). 11. Построить кинетическую кривую α=α(t); определить константы скорости реакции для данных температур по интегральному методу (для реакции псевдопервого порядка) и графическим спосо-

27

б 0 −б ∞ б t −б ∞

28

Лабораторная работа №4 Идентификация нуклеозидов в смеси с помощью метода тонкослойной хроматографии Цель работы: изучение метода тонкослойной хроматографии; разделение смеси нуклеозидов и определение подвижности хроматографических зон. Приборы, принадлежности и реактивы: камера для хроматографирования, листы силуфола УФ-254 15х5 см, ультрафиолетовая лампа для обнаружения УФ-поглощающих пятен, капилляры для нанесения растворов веществ, 1%-й водный раствор смеси нуклеозидов, 1%-е водные растворы уридина (U), тимидина (T), цитидина (C), аденозина (A), система растворителей: хлороформметанол-вода (4:4:1), карандаш, линейка. Основы хроматографии Хроматография – физический метод анализа и исследования веществ и их смесей, основанный на разделении компонентов за счет распределения их при перемещении через слой неподвижной фазы потоком подвижной фазы. В основе хроматографических процессов лежат явления сорбции и десорбции, многократное повторение актов которых в этих средах при перемещении через слой неподвижной фазы приводит к разделению компонентов за счет разницы в константах распределения индивидуальных веществ между двумя фазами, перемещающимися друг относительно друга. На разделяемые системы могут накладываться те или иные поля, например электрические, гравитационные или другие, происходить изменения условий во взаимодействующих фазах, что создает большое число возможных вариантов хроматографии. Наиболее важным признаком хроматографии является динамический характер процесса, при котором возникают градиенты в распределении концентраций молекул или частиц. 29

К числу несомненных достоинств хроматографических методов исследования и анализа относится возможность одновременной реализации большого числа параметров, характеризующих разделение, идентификацию, количественную оценку компонентов исследуемой смеси и физико-химические свойства сорбатов и сорбентов. Вследствие этого хроматография является многоканальным источником информации. Важным является возможность осуществить в ходе этих процессов большое число взаимодействий – от чисто физических (ситовые эффекты) до межмолекулярных и хемисорбционных, что позволяет реализовать многообразные механизмы, приводящие к разделению компонентов систем практически любой сложности. Основы метода тонкослойной хроматографии Тонкослойная хроматографая (ТСХ) является планарной разновидностью жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза движется в пористой среде слоя адсорбента. Основной количественной характеристикой ТСХ служит скорость перемещения разделяемых веществ по пластине. Она определяется как отношение времени движения в токе элюента (растворителя) ко времени удерживания за счет сорбции. При этом каждая молекула вещества участвует в многочисленных актах сорбции и десорбции. В конце процесса хроматографирования каждая зона проходит характерное расстояние, определяемое положением центра хроматографической зоны, которая размывается за счет флуктуации средней скорости индивидуальных молекул при движении по слою на пластине. ТСХ широко используется в химии природных соединений как весьма удобный и эффективный метод разделения. Главное ее преимущество перед другими методами – быстрота разделения (20– 30 мин. в сравнении с 12–16 часами при бумажной хроматографии) при хорошем его качестве. Метод ТСХ заключается в следующем: на стеклянную пластинку (или металлическую фольгу) наносят тонкий слой какого-либо сорбента. На линию старта наносят каплю раствора вещества, высушивают, нижний край пластинки помещают в систему растворителей. За счет сил капиллярного смачивания жидкость быстро продвигается по пластинке, при этом происходит 30

разделение веществ в соответствии с их коэффициентами распределения α. Термин ТСХ объединяет несколько методов. В зависимости от природы применяемого тонкого слоя и, как следствие, механизма взаимодействия хроматографируемого вещества с неподвижной фазой различают следующие виды ТСХ: 1) Адсорбционная хроматография. Тонкий слой, чаще всего: силикагель, окись алюминия, кизельгур. Механизм распределения: адсорбция растворенного вещества на поверхности твердой фазы. 2) Распределительная хроматография. Тонкий слой – слабоактивные сорбенты: целлюлоза, гипс, целит, силикагель, пропитанный водой. Механизм распределения: распределение между неподвижной жидкой фазой, закрепленной на сорбенте, и подвижной фазой. 3) Ионообменная хроматография. Тонкий слой – ионообменные смолы: ДЭАЭ-целлюлоза, ДЭАЭ-сефадексы, дауэксы и др. Механизм распределения: ионный обмен между растворенным веществом и заряженными группами неподвижной фазы. В каждом конкретном случае могут иметь место различные сочетания этих вариантов. Например, адсорбционная хроматография на силикагеле может сопровождаться или распределительной (силикагель всегда содержит адсорбированную воду, которая, если ее много, может служить неподвижной фазой), или ионообменной хроматографией (силикагель – высушенный гель слабодиссоциированной кремневой кислоты – при хроматографии оснований проявляет свойства катионообменника). Вместе с тем распределительная и ионообменная хроматография сопровождается адсорбцией на поверхности неподвижной твердой фазы. Адсорбционная хроматография Из рассмотренных вариантов ТСХ чаще всего применяют адсорбционную хроматографию, которая лучше освоена, проста по выполнению и, кроме того, для этого метода налажено промышленное производство пластинок с закрепленным слоем силикагеля 31

(например, силуфол УФ-254). Это существенно упрощает технику хроматографирования, обеспечивает стандартность операций и воспроизводимость результатов. Адсорбционная ТСХ основана на адсорбции растворенного вещества поверхностью сорбента. Адсорбция встречается довольно часто, но особенно проявляется только для фаз с большой поверхностью. В состоянии адсорбционного равновесия (равенство скоростей сорбции и десорбции при постоянной температуре) количество адсорбированного на единице поверхности вещества n следующим образом зависит от концентрации вещества в растворе с (изотерма адсорбции Фрейндлиха): n = асb, (1) где a и b – константы для данной системы адсорбент-веществорастворитель. Графиком этого уравнения является кривая, изображенная на рис. 1.

n

c Рис. 1. Изотерма адсорбции из раствора При этом отношение концентраций вещества в двух фазах ⎛ c ⎞ не является постоянной величиной, оно увеличивается с рос⎜ ⎟ ⎝n⎠ том концентрации. Поэтому пятна веществ при адсорбционной хроматографии четко очерчены сверху и размыты снизу в виде хвостов. Для уменьшения этого эффекта стараются работать в области небольших концентраций веществ, где функция разделения близка к линейной.

32

Способность веществ к адсорбции зависит от нескольких факторов. 1) Строение вещества. Введение в насыщенные углеводороды двойных связей и особенно различных функциональных групп увеличивает их способность адсорбироваться. Адсорбционная способность функциональных групп увеличивается в следующем ряду: СН=СН<ОСН3<СООR
неполярный неполярные

полярные

Заштрихованный треугольник вращается вокруг центра. Один угол устанавливается на разделяемое вещество (допустим, неполярное), тогда два других угла укажут нам, что надо взять неполярный растворитель и активный сорбент (активность сорбента легко регулируется добавками воды). 33

Для выбора растворителя нужной полярности пользуются элюотропными рядами, где растворители расположены в порядке увеличения их элюирующей способности (полярности), например: гексан<гептан
центра зоны (пятна), и расстояния L, пройденного элюентом от точки нанесения пробы до фронта элюента: Rf =X/L. (3) Диапазон изменения Rf – от 0 до 1. При Rf =0 вещество не движется, остается в точке нанесения (на старте), при Rf =1 вещество не задерживается неподвижной фазой и движется с фронтом растворителя.

Разделение методом ТСХ на силикагеле смеси четырех нуклеозидов (аденозин, цитидин, уридин, тимидин) и их идентификация путем сравнения со свидетелями (растворами чистых компонентов). Особенности в строении этих веществ приводят к различной адсорбции их поверхностью силикагеля и, следовательно, к различной скорости движения при хроматографии. В порядке увеличения скорости движения (увеличения Rf) эти вещества располагаются в следующем порядке: С<А<
35

H 3C

N-H HOCH2

О

OH

Методика измерений

O

O

N

HOCH2

O

OH

N- H N

О

OH Тимидин (T)

Уридин (U)

NH2 N HOCH2

N

О

OH

O

N HOCH2 O

O

OH

OH

N

NH2 N N

OH

Аденозин (A)

Цитидин (C)

При выборе растворителя для хроматографии нуклеозидов воспользуемся схемой Шталя (см. выше). Так как вещества полярные, а сорбент высокоактивный, то нужен полярный растворитель. Этому требованию удовлетворяет система хлороформ-метанолвода (4:4:1). В работе будем пользоваться следующими стандартными условиями для ТСХ: 1. Линия старта располагается в 15 мм от нижнего края пластинки. 2. Расстояние между пятнами (и от боковой стороны) ≈10 мм. 3. Размер пятен ≈2 мм. 36

4. Глубина погружения пластинки в растворитель 5 мм, а уровень жидкости не касается линии старта. 5. Пробег растворителя ≈10–12 см. 6. Насыщенность атмосферы камеры – парами растворителя. Порядок выполнения работы

2. Богачев В.С., Райт В.К., Ямковой В.И. Методические указания по физической химии и кинетике. Новосибирск: НГУ, 1984. 3. Ямковой В.И. Курс лекций по биохимии: Учебное пособие: В 2 ч. Омск: ОмГУ, 2003. 4. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1992.

1. Пластинку размечают в соответствии со схемой и вышеперечисленными правилами, пользуясь карандашом и линейкой. 2. При помощи капилляров наносят растворы веществ (1–2 мкл). 3. В камеру наливают систему растворителей, смачивая при этом бумажную обкладку стенок, осторожно помещают туда пластинку и плотно закрывают камеру. линия фронта смесь

8 мм

U 50 мм

T C A 15 мм

4. После окончания хроматографии вынимают пластинку; отмечают карандашом линию фронта растворителя и затем обнаруживают пятна веществ по поглощению в УФ-свете, обводят их карандашом и рассчитывают Rf каждого пятна. 5. По полученной хроматограмме идентифицируют нуклеозиды, присутствовавшие в исследуемой смеси, рассчитывают Rf нуклеозидов и свидетелей. Рекомендуемый библиографический список 1. Сакодынский К.И. и др. Аналитическая хроматография. М.: Химия, 1993. 37

38

Лабораторная работа №5 Разделение смеси хромата калия, цитохрома C и голубого декстрана посредством гель-хроматографии Цель работы: изучение метода гель-хроматографии; определение количественных характеристик разделения (V0, Ve, Kav, ВЭТТ). Приборы, принадлежности и реактивы: коллектор фракций СФ-62, спектрофотометр СФ-56, колонка с Сефадексом Г-75, шприц на 2 мл с полиэтиленовым капилляром, пробирки, раствор элюента (NaCl, 9 г/л), растворы: а) голубого декстрана (18 мг/мл), б) цитохрома С (30 мг/мл), в) хромата калия (10 мг/мл). Основы теории гель-хроматографии Гель-хроматография является одним из методов разделения и анализа соединений с различными молекулярными весами, геометрическими размерами молекул. Сравнительно несложная техника эксперимента, простота оборудования и анализа экспериментальных данных в сочетании с мягкими условиями разделения, воспроизводимостью и достаточная экспрессивность метода обеспечили его широкое применение в различных областях химии, биохимии, физической химии биополимеров. В качестве классического метода разделения смеси веществ широко известен пример разделения этих веществ распределением их между фазами – в простейшем случае между двумя фазами. Такое распределение определяется энергиями взаимодействия между соединениями и фазами. При установлении равновесия достигается равенство химических потенциалов вещества в фазах и в определенных случаях обогащение одной из фаз каким-либо компонентом смеси. Рассмотрим распределение смеси веществ между фазами, одна из которых представляет собой гель, диспергированный в рас39

творителе, представляющем вторую фазу. Пусть гель характеризуется размером пор, сравнимым с размером молекул одного из компонентов смеси, находящейся в растворителе. Не встречая стерических препятствий, такой компонент может свободно диффундировать в гель, а более крупный компонент останется в фазе растворителя. Таким образом, перенося растворитель со смесью веществ от одной порции геля к другой, можно достичь полного отделения от смеси низкомолекулярного фрагмента. Отметим, что скорость установления диффузионного равновесия зависит от поверхности контакта фаз и что практическое разделение описанным способом будет трудоемким и долгим. Большая эффективность достигается за счет гранулирования геля – при этом увеличивается поверхность взаимодействия и диффузионное равновесие будет устанавливаться быстрее. Если таким гелем заполнить вертикальную хроматографическую колонку и пропустить через нее смесь веществ, то компоненты разделяемой смеси будут двигаться по колонке с разной скоростью: крупные с большей скоростью (верхний предел – скорость подвижной фазы), а меньшие – с меньшей, поскольку их продвижение по колонке 6yдет тормозиться диффузией в неподвижную фазу. В конечном итоге компоненты смеси выходят из колонки, наполненной гранулами геля, в порядке уменьшения их молекулярного веса и в соответствии со степенью торможения их неподвижной фазой геля, вызванной диффузией. Очевидно, что колоночный вариант легко автоматизировать. Определение количественных характеристик разделения В настоящее время поведение веществ при хроматографии в геле теоретически объяснено неполностью, хотя систематическое изучение этого процесса уже определило основные положения метода и эмпирические количественные соотношения между различными параметрами геля и разделяемых веществ. В качестве характеристик, позволяющих количественно оценить результаты разделения, выступают объемные соотношения в геле.

40

Общий объем геля, упакованного в колонку Vt, складывается из трех величин: 1) V0 – внешний объем, объем между гранулами; 2) Vi – внутренний объем, объем растворителя внутри гранул; 3) Vm – объем матрицы, объем сухого геля. Vt= V0+ Vi+ Vm. (1) Vt легко определить, измерив ту часть объема колонки, в которой упакован гель. V0 определяют, хроматографируя на колонке высокомолекулярное вещество, неспособное проникать в гель. Он равен объему элюента, сошедшего с колонки от момента нанесения такого вещества до момента его появления в элюате. Vi зависит от пористости геля. Для его определения нужно знать емкость геля по растворителю Sr.

Vi =

aS r

ρ

,

(2)

где a – вес сухого геля; ρ – плотность растворителя. Vi можно рассчитать по формуле (1), заменив Vm плотностью геля в набухшем состоянии d, определяемой в свою очередь пикнометром:

Vi =

Sr d

ρ (S r ρ + 1)

(Vt − V0 ) .

V e −V 0 Vi

где Ve – объем элюирования.

41

2

⎛ 4V ⎞ N =⎜ e ⎟ . ⎝ ω ⎠

(3)

Vm рассчитывается на основании данных об удельном объеме сухого полимера, образующего гель. Кроме того, значением Vm для сильно набухающих гелей можно пренебречь. В известных пределах можно пользоваться объемными параметрами гелей, определенными фирмами-изготовителями гелей. В общем случае для веществ, которые способны проникать в гранулы геля с некоторыми затруднениями, можно рассчитать доступную часть внутреннего объема гранул Kd, которая не зависит от размеров колонки, но зависит от типа геля и размера молекул:

Kd =

В связи со сложностью определения Vi вместо Kd чаще расV −V 0 считывают K av = e , заменяя Vi общим объемом геля Vg= Vt – V t −V 0 V0= Vi + Vm. Очевидно, что различие между Kd и Kav тем меньше, чем пористей гель. Kav не зависит от геометрии и плотности заполнения колонки, все объемы измеряются легко; наибольшая точность достигается при больших Ve. Kav очень полезна при выборе параметров колонки для практического разделения, так как позволяет подобрать наиболее удовлетворительный объем разделения, равный разности объемов выхода разделяемых веществ: VS = Ve' – Ve'' = (Kav' – Kav'')(Vt – V0). (5) Используя Ve, можно также рассчитать ВЭТТ, оценивающую эффективность гельфильтрации на конкретной колонке. Для этого рисуют диаграмму элюирования (см. рисунок), проводят касательные и определяют ширину пика ω и объем элюирования Ve (обе величины в мл). Затем рассчитывают число тарелок на колонке:

(4)

c

(6)

Ve

ω

V,

Высота одной тарелки: h(ВЭТТ) = h(слоя геля в колонке)/N. Чем меньше ВЭТТ, тем выше эффективность колонки. На значение ВЭТТ влияют следующие факторы: скорость достижения диффузионного равновесия и диффузия в продольном направлении (при этом ширина кривой элюирования ω определяется главным обра42

зом величиной зерен геля и реже скоростью подвижной фазы). Неправильное, неоднородное заполнение колонки гелем также приводит к увеличению ВЭТТ. Методика измерений Для выбранного типа геля (Сефадекс Г-75) и размеров колонки (2,5х60см) оптимальная скорость элюции – около двух миллилитров в минуту. В качестве элюента используется раствор хлористого натрия 9 г/л. Фракции рекомендуется отбирать по 5 мл. Из исходных растворов декстрана синего 2000 (18 мг/мл), цитохромa С (30 мг/мл) и хромата калия (10 мг/мл) готовится смесь отбором по 0,5 мл каждого компонента; смесь перемешивается и осторожно подслаивается под элюент над гелем шприцом на 2 мл с присоединенным к нему полиэтиленовым капилляром. Очень важно при этом не нарушить ровную поверхность геля. После нанесения смеси колонка закрывается пробкой со шлангом, идущим от колбы емкостью 250 мл, закрепленной на высоте 20 см от верхнего конца колонки. Оптическая плотность фракций определяется посредством СФ-56 в кювете с оптической длиной пути 1 см, контрольным раствором служит раствор элюента. Выход с колонки декстрана синего регистрируется при работе с фильтром № 8, а выход цитохрома С и хромата калия – при работе с фильтром № 3. При определении объема фракции в мерный цилиндр переносится содержание 10–15 фракций, измеряется и рассчитывается объем одной фракции, Vфр. Высота столба геля в колонке, необходимая при расчете ВЭТТ, измеряется линейкой. Из графика оптической плотности определяются номера фракций, соответствующих максимальному значению оптической плотности для каждого из трех пиков. Порядок выполнения работы 1. Ознакомиться с методикой измерений оптической плотности при помощи спектрофотометра СФ-56. 2. Подготовить экспериментальную смесь. 3. Заполнить ячейки штатива пробирками. 43

4. Внести приготовленную смесь в колонку. 5. Время сбора элюата в пробирку ~4 минуты. 6. После выхода последней фракции измерить оптическую плотность в каждой пробирке. 7. Построить профиль элюции, откладывая на оси абсцисс номер фракции, а на оси ординат – оптическую плотность. 8. Рассчитать значение Vфр. 9. Определить высоту геля в колонке. 10. Рассчитать Ve для каждого вещества. 11. Заполнить табл. 1. 12. Вычислить величины Kav для цитохрома С и хромата калия и занести в табл. 2. 13. Определить ВЭТТ для компонентов разделяемой смеси; результаты записать в табл. 3. Таблица 1 Тип геля Элюент Скорость элюции Время отбора одной фракции Объем одной фракции V0=Ve декстрана синего Ve цитохрома С Ve хромата калия Vt объем геля в колонке Vt – V0

Сефадекс Г-75 Раствор NaCl, 9 г/л

Таблица 2 Компонент

Ve, мл

Ve – V0, мл

Декстран Цитохром С Хромат

44

V e −V 0 , мл V t −V 0

Kav

Таблица 3 Компонент Декстран Цитохром С Хромат

Ve, мл

ω, мл

N

hВЭТТ

II. БИОХИМИЯ ОРГАНИЗМА

Лабораторная работа №6 Определение содержания общего белка в плазме крови биуретовым методом

Рекомендуемый библиографический список 1. Сакодынский К.И. и др. Аналитическая хроматография. М.: Химия, 1993. 2. Богачев В.С., Райт В.К., Ямковой В.И. Методические указания по физической химии и кинетике. Новосибирск: НГУ, 1984. 3. Ямковой В.И. Курс лекций по биохимии: Учебное пособие: В 2 ч. Омск: ОмГУ, 2003. 4. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1992.

Цель работы: определение содержания общего белка в плазме крови биуретовым методом, построение калибровочной кривой. Приборы, принадлежности и реактивы: спектрофотометр СФ-56, кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см, центрифуга Cole-Palmer P-17307-05, центрифужные пробирки, дозирующие диспенсеры Biohit Proline, биуретовый реактив, раствор с известной концентрацией альбумина, цельная гепаринизированная кровь. Общий белок Общий белок является интегральным лабораторным показателем, отражающим состояние гомеостаза. Белки плазмы крови играют очень важную и многообразную роль. Благодаря им поддерживается вязкость и текучесть крови и формируется ее объем в сосудистом русле, а концентрация белка обеспечивает плотность плазмы крови, что позволяет форменным элементам удерживаться во взвешенном состоянии. Белки плазмы крови осуществляют транспортные (связывание гормонов, минеральных компонентов, липидов, пигментов и т. п.) и защитные (иммуноглобулины, опсонины, белки острой фазы и др.) функции, участвуют в регуляции кислотно-щелочного состояния организма, являются регуляторами свертываемости крови и антителами. Поэтому общее содержание белка (как и распределение его по фракциям) является очень важным диагностическим параметром при целом ряде заболеваний, особенно связанных с выраженными нарушениями метаболизма.

45

46

Нормальное содержание общего белка плазмы крови 65÷85 г/л, такой уровень белка носит название нормопротеинемия. В патологических состояниях общий белок плазмы крови может быть выше или ниже нормальных цифр, первое состояние принято называть гиперпротоинемия, второе – гипопротеинемия. Гипер- и гипопротеинемия могут быть абсолютными (за счет истинного увеличения или уменьшения общего количества растворенных в плазме крови белков) или относительными (связанными с изменением вязкости крови из-за нарушений водно-солевого обмена). Абсолютная гиперпротеинемия встречается при заболеваниях из группы так называемых парапротеинемических ретикулезов – миеломной болезни и макроглобулинемии Вальденстрема; при этом уровень общего белка иногда превышает норму в 2 раза и более (до 180 г/л). Менее выраженная гиперпротеинемия, обычно до 100 г/л, встречается при некоторых хронических заболеваниях печени, коллагенозах, изредка при лимфогранулематозе и др. заболеваниях. Относительная гиперпротеинемия – явление редкое, встречается при больших потерях жидкости. Абсолютная гипопротеинемия наблюдается при белковом голодании экзо- и эндогенного характеров (хронические энтериты, следствие оперативного удаления значительных участков тонкого кишечника) или как результат потери белков с лимфой (при разрывах крупных лимфатических сосудов, при ожогах), при нефрозах различного происхождения. При этом гипопротеинемия может достигать 25÷30 г/л. Методы определения Среди методов определения концентрации общего белка можно выделить несколько основных групп: 1) азотометрические, основанные на определении количества белкового азота, образующегося при разрушении входящих во все белки аминокислот; 2) гравиметрические (весовые), основанные на прямом и косвенном определении плотности сыворотки (плазмы) крови; 47

3) оптические (нефелометрические), основанные на измерении рассеиваемого света; 4) спектрофотометрические, основанные на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой области; 5) колориметрические, основанные на цветных реакциях белков с хромоген-образующими реактивами или на неспецифическом связывании красителя. Кроме перечисленных выше разработаны также другие методы, например, флюориметрические, поляриметрические, а также методы атомно-абсорбционной спектрофотометрии и аминокислотного анализа белка. Азотометрические методы, а также гравиметрическое и рефрактометрическое определение белка трудоемки плохо поддаются стандартизации, кроме того, на результаты определения оказывает воздействие ряд дополнительных факторов. Колориметрические методы достаточно просты и недороги, хотя большинство из них неприменимо к исследованию какого-нибудь отдельного (т.н. специфического) белка. Нефелометрические и поляриметрические методы практически не используются в клинической лабораторной практике, во-первых, из-за необходимости закупки специального оборудования, а во-вторых, из-за того, что траты на проведение анализа практически не дают преимуществ в специфичности, точности и чувствительности перед распространенными колориметрическими методами. Спектрофотометрические методы (определение поглощения в УФ-диапазоне) достаточно быстры и удобны, однако их постановка осложняется тем, что большинство нуклеиновых кислот также имеет максимум поглощения в ультрафиолетовом диапазоне, что может значительно исказить результаты анализа. Модификации метода позволили нивелировать этот эффект, однако даже при использовании коэффициентов пересчета спектрофотометрическое определение дает достоверные результаты, если содержание нуклеиновых кислот не превышает 20 % от концентрации белка. Флюориметрические и другие современные методы (например, полярографический микрометод или атомно-абсорбционый анализ) обладают высокой чувствительностью и специфичностью, однако необходимость ввода специальной аппаратуры, 48

а иногда и специальной квалификации аналитика наряду с достаточно высокой стоимостью определения делает этот метод достоянием научно-исследовательских учреждений и значительно ограничивает его использование в клинической лаборатории. Среди колориметрических методов определения концентрации общего белка наиболее распространенным считается биуретовый метод, основанный на так называемой «цветной биуретовой реакции», которая происходит по схеме: Белок + Сu+ + ОН– → комплекс фиолетового цвета. Каждый ион меди образует комплекс с 5 или 6 пептидными связями. Определение концентрации вещества в окрашенном растворе по оптической плотности можно осуществить при помощи построения калибровочной кривой. В этом случае готовят несколько растворов определяемого вещества с известными концентрациями и измеряют оптические плотности этих растворов. Полученные результаты представляют графически (по оси абсцисс откладывают значения концентрации белка, а по оси ординат – соответствующие значения оптической плотности). Определив оптическую плотность анализируемого раствора, находят по калибровочной кривой содержание в нем вещества. Методика измерений В настоящей работе используется плазма крови, полученная центрифугированием цельной гепаринизированной венозной крови в течение 15 минут. Для спектрофотометрического анализа необходимо приготовить анализируемый, калибровочные растворы и раствор сравнения. Для приготовления анализируемого раствора в пробирку с помощью дозирующих диспенсеров наливают 40 мкл плазмы и 2,0 мл рабочего раствора. Для приготовления растворов с концентрациями 50 г⁄л, 60 г⁄л, 70 г⁄л, 80 г⁄л и 90 г⁄л в пробирки наливают 40 мкл раствора с известной концентрацией альбумина и 2,40 мл, 2,00 мл, 1,71 мл, 1,50 мл и 1,33 мл рабочего раствора, соответственно.

49

Раствор сравнения готовится следующим образом: в пробирку наливают 40 мкл дистиллированной воды и 2,0 мл рабочего раствора. Приготовленные растворы тщательно перемешивают, избегая пенообразования, и оставляют инкубировать в течение 30 минут при температуре 18−25°С. Оптическая плотность растворов измеряется при помощи спектрофотометра СФ-56 в кюветах с длиной оптического пути 1 см. Порядок выполнения работы 1. Ознакомиться с принципом работы спектрофотометра СФ56. 2. Приготовить растворы белка с концентрацией 50 г⁄л, 60 г⁄л, 70 г⁄л, 80 г⁄л, 90 г⁄л, анализируемый раствор и раствор сравнения. 3. Измерить оптические плотности растворов с различной концентрацией белка, анализируемого растворов относительно раствора сравнения в кювете с оптической длиной 1 см при длине волны 540 нм. 4. Построить калибровочную кривую: зависимость оптической плотности от концентрации. Аппроксимировать калибровочную кривую зависимостью вида A=kc, где A – оптическая плотность вещества, k – постоянный коэффициент, c – концентрация вещества. 5. Определить концентрацию общего белка в анализируемом растворе по калибровочной кривой. Сравнить с физиологической нормой. Рекомендуемый библиографический список 1. Практикум по биохимии. Омск: ОГМА, 2001. 2. Справочник по функциональной диагностике / Под ред. И.А. Кассирского. М.: Медицина, 1980.

50

Углеводами называют соединения с общей формулой (CH2O)n, где n в живых организмах принимает значение от 3 до 9. Углевод, который нельзя превратить гидролизом в более простое соединение, называется моносахаридом. Моносахариды классифицируют по числу углеродных атомов в молекуле и присутствию альдегидной группы. Молекулы моносахаридов хиральны, т. е. не имеют плоскости и центра симметрии. Важнейшим из моносахаридов является глюкоза С6Н12О6 (альдогексоза). Глюкоза, как хиральное вещество, может существовать в двух конфигурациях, называемых D-форма и L-форма (рис. 1).

H - C - OH

HO -3 C - H 4

HO - C - H

5

HO - C - H

H - C - OH

Цель работы: оценка уровня гликемии по концентрации глюкозы в плазме крови.

Глюкоза, структура, функции

HO - C - H

H -2 C - OH

Определение концентрации глюкозы в плазме крови ферментативным методом

Приборы, принадлежности и реактивы: спектрофотометр Spectro 2000 RS, кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см, центрифуга Cole-Palmer P-17307-05, колба объемом 100 мл, дозирующий диспенсер Biohit Proline, таблетка «ферментыхромогены», раствор с известной концентрацией глюкозы, венозная кровь, дистиллированная вода.

CHO

1 CHO

Лабораторная работа №7

H - C - OH

CH2OH

6 CH2OH

L-глюкоза

D-глюкоза

Рис. 1. D-глюкоза и L-глюкоза в проекциях Фишера В D-глюкозе гидроксильная группа при пятом атоме углерода расположена справа, а в неприродной L-форме – слева. В водных растворах глюкоза находится в трех равновесных формах – двух циклических и одной линейной (рис. 2). 1 CHO

H - C - OH H - C - OH HO - C - H H - C - OH H-C

2

H - C - OH O

HO -3 C - H H -4 C - OH 5

H - C - OH

HO - C - H H - C - OH HO - C - H

O

H - C - OH H-C

CH2OH 6 CH2OH CH2OH D-глюкоза β - D - глюкоα - D - глюкопираноза пираноза Рис. 2. Равновесные формы глюкозы в проекциях Фишера

α и β-формы различаются пространственным расположением гликозидной гидроксильной группы у первого углеродного атома. Для изображения циклических форм лучше всего пользоваться проекциями Хеуорса, как плоскими, так и изогнутыми (рис. 3). 51

52

6

CH2OH

H 4

HO

5

О

H OH 3

H 2

H

OH

H 1

OH полуацеталь-

α - D - глюкопираноза ный гидроксил (проекция Хеуорса)

Рис. 3. Проекция Хеуорса для α-D-глюкопиранозы При переходе от проекции Фишера к проекции Хеуорса левый заместитель при атоме углерода становится верхним (при С5 – исключение). Глюкоза – один из ключевых продуктов обмена веществ. При окислении глюкозы в тканях освобождается энергия, необходимая для нормальной жизнедеятельности организма. Процесс окисления протекает ступенчато, поэтому реакцию окисления обычно выражают суммарным уравнением:

Сахарный диабет 1-го типа обусловлен абсолютным дефицитом инсулина вследствие прекращения его выработки поджелудочной железой, что приводит к стойкой гипергликемии и развитию осложнений. Заболевание 2-го типа вызвано преимущественной инсулинорезистентностью (невосприимчивостью к инсулину) и относительной инсулиновой недостаточностью. Методы определения концентрации глюкозы в крови разделяются на несколько групп: редуктометрические, колорометрические, поляризационные, ферментативные. В настоящей работе для количественного анализа глюкозы используется ферментативный метод. Ферментативный метод

Концентрация глюкозы в крови определяется скоростями процессов образования глюкозы из гликогена или других источников, всасывания ее из желудочно-кишечного тракта и утилизации тканями. Нарушения углеводного обмена сопровождаются снижением или повышением концентрации глюкозы в крови (гипо- и гипергликемии). Гипогликемия – состояние, характеризующееся концентрацией глюкозы в плазме крови менее 4,0 ммоль/л, гипергликемия – более 6,1 ммоль/л. Сахарный диабет – группа хронических метаболических (обменных) заболеваний, характеризующихся гипергликемией, возникающей в результате дефектов секреции инсулина, действия инсулина или обоих этих факторов. Сахарный диабет бывает двух типов.

Фермент глюкозооксидаза катализирует перенос двух водородных атомов с первого углеродного атома глюкозы на кислород, растворенный в жидком реагенте. При этом в ходе реакции образуется в эквимолярном количестве перекись водорода, т. е. концентрация образовавшейся перекиси водорода точно равна определяемой концентрации глюкозы. Следовательно, использование глюкозооксидазной реакции трансформирует задачу определения концентрации глюкозы в задачу определения концентрации перекиси водорода. Наибольшее распространение получил фотометрический биохимический метод, в котором молекулы перекиси водорода под действием фермента пероксидазы расщепляются с образованием активной формы кислорода – супероксид анион-радикала – О2-, который в свою очередь окисляет хромоген, что приводит к значительному изменению спектра поглощения хромогена. Максимум поглощения реакционной смеси – (реактив + глюкоза) находится в области 500 нм. Соответственно, изменение оптической плотности конечной реакции на длине волны 500 нм пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в анализируемом образце. Схема реакций ферментативного метода: глюкоза + О2 ⎯глюкозоокс ⎯ ⎯ ⎯идаза ⎯ ⎯→ глюконовая кислота + Н2О2 пероксидаза Н2О2 + хромоген ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯→ Н2О + окисленный окрашенный хромоген

53

54

C6 H 12 O6 + 6O2 → 6CO2 + 6 H 2 O .

Расчет концентрации глюкозы в исследуемых образцах производится по формуле: A C= Cк , Aк

(1)

где C – концентрация глюкозы в исследуемом растворе, ммоль/л; A – оптическая плотность исследуемого раствора; Aк – оптическая плотность калибровочного раствора; Cк – концентрация глюкозы в калибровочном растворе (10 ммоль/л). Погрешность этого метода составляет ±0,7 ммоль/л в диапазоне от 2–20 ммоль/л. Методика измерений Для приготовления рабочего раствора необходимо растворить одну таблетку «ферменты-хромогены» в 100 мл дистиллированной воды. Одновременно с этим производится центрифугирование 1 мл крови при 1000 об/мин в течение 15 мин для получения плазмы. Надосадочная жидкость переносится в чистую пробирку и используется для приготовления анализируемых растворов. Для этого необходимо смешать 2 мл рабочего раствора и 0,02 мл плазмы. Для проведения измерений необходимы калибровочный раствор и раствор сравнения. Приготовление калибровочного раствора осуществляется путем смешивания 2 мл рабочего раствора и 0,02 мл раствора с известной концентрацией глюкозы. Раствор сравнения готовится из рабочего раствора и дистиллированной воды (пропорции те же). После приготовления все растворы тщательно перемешивают и инкубируют 25 мин при температуре 18–25°C. После окончания инкубации измеряется величина оптической плотности анализируемого и калибровочного растворов относительно раствора сравнения посредством спектрофотометра Spectro 2000 RS в кюветах с длиной оптического пути 1 см при длине волны 500 нм.

55

Порядок выполнения работы 1. Ознакомиться с устройством и принципом работы спектрофотометра Spectro 2000 RS. 2. Приготовить рабочий раствор. 3. Приготовить анализируемый, калибровочный растворы и раствор сравнения. 4. Измерить оптическую плотность анализируемого и калибровочного растворов относительно раствора сравнения при 500 нм. 5. По формуле (1) вычислить концентрацию глюкозы в анализируемом растворе. По рассчитанному значению определить уровень гликемии (гипогликемия, нормальный уровень, гипергликемия). Рекомендуемый библиографический список 1. Ямковой В.И. Курс лекций по биохимии: Учебное пособие: В 2 ч. Омск: ОмГУ, 2003. 2. Справочник по функциональной диагностике / Под ред. И.А. Кассирского. М.: Медицина, 1980. 3. Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии. Л.: Химия, 1986.

56

Лабораторная работа №8 Определение содержания гликозилированного гемоглобина методом микроколоночной хроматографии Цель работы: оценка уровня гликемии по содержанию гликозилированного гемоглобина в крови. Приборы, принадлежности и реактивы: автоматический спектрофотометр СФ-56, кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см, хроматографическая микроколонка, дозирующие диспенсеры Biohit Proline, термостат WB-1, колбы мерные объемом 500 и 1000 мл, пробирки стеклянные и пластиковые, штатив для пробирок, буферные растворы № 1 и 2, растворы № 1 и 2, венозная кровь, дистиллированная вода. Гемоглобин, его свойства и функции. Гликозилированный гемоглобин Гемоглобин (Hb) – красный железосодержащий пигмент крови человека, позвоночных и некоторых беспозвоночных животных; в организме выполняет функцию переноса кислорода (O2) из органов дыхания к тканям; играет также важную роль в переносе углекислого газа от тканей в органы дыхания. Объемная формула гемоглобина представлена на рис. 1. Гемоглобин находится в крас-

Рис. 1. Объемная формула гемоглобина 57

ных кровяных клетках – эритроцитах. По химической природе гемоглобин – сложный белок – хромопротеид, состоящий из белка глобина и железопорфирина – гема. Глобин состоит из четырех субъединиц: двух α и двух β – и соответственно содержит четыре полипептидные цепочки двух видов. Каждая α-цепочка содержит 141, а β-цепочка – 146 аминокислотных остатков. Таким образом, вся молекула включает 573 аминокислоты. Каждая субъединица гемоглобина содержит одну небелковую группу – гем. Гем представляет собой комплекс Fe(II) с протопорфирином. Поскольку одна молекула гемоглобина содержит четыре субъединицы и, следовательно четыре гема, каждый из которых может обратимо присоединять одну молекулу кислорода, реакцию оксигенации можно разделить на четыре стадии. Без кислорода молекулы гемоглобина обладают низким сродством к кислороду, однако при достаточно высоком парциальном давлении последнего происходит соединение одного гема с одной молекулой кислорода, что влияет на присоединение кислорода к другому гему и меняет кислотно-основные свойства гемоглобина. Поэтому в тканях, где значительная часть гемоглобина теряет кислород и становится более сильным основанием, гемоглобин связывает образующуюся в ходе метаболических внутриклеточных процессов углекислоту. В альвеолах легких дезоксигемоглобин снова превращается в оксигемоглобин, становится более сильной кислотой и способствует отщеплению CO2. Установлено, что в крови человека наряду с основной фракцией гемоглобина (HbA) содержится незначительное количество других фракций, названных «минорными»: HbA1а (образован фруктозой), HbA1b (образован глюкозой-6-фосфатом), HbA1c (образуется при участии глюкозы). У здоровых взрослых людей на долю HbA приходится 90%, НbА1a – 1,6%; НbА1b – 0,8%, HbA1c – 3,6%; НbА2 – 2,5% и НbF – 0,5%. Гликозилированный гемоглобин – это гемоглобин, в котором молекула глюкозы конденсируется с β-концевым валином β-цепи молекулы НbА. Этот неферментативный процесс протекает медленно, в течение всей жизни красных кровяных телец (около 120 дней). Установлено, что гликозилирование осуществляется через стадию образования альдимина, сравнительно неустойчивого соединения. Далее альдимин посредством химического преоб58

разования превращается в относительно устойчивое соединение – кетоамин. Образовавшийся кетоамин остается присоединенным к белку на весь период его жизни. Гликозилированию подвергаются многие белки организма (белки крови, хрусталика, почек, нервов, сосудов и др.). Скорость гликозилирования и количество гликозилированных белков зависит от величины и длительности гипергликемии и не зависит от уровня инсулина. Таким образом, если измерение концентрации глюкозы в крови дает представление о показателях уровня гликемии в момент проведения теста, то измерение гликозилированного гемоглобина дает более обширную картину – среднюю концентрацию глюкозы за последние два–три месяца. У здорового человека содержание гликозилированного гемоглобина изменяется в диапазоне 4,5÷7 %. Для количественного анализа гликозилированного гемоглобина разработано множество методов: хроматографические, колориметрические и электрофорез. В данной работе для определения содержания гликозилированного гемоглобина применяется метод микроколоночной хроматографии.

Хроматография – метод разделения веществ и определения их физико-химических характеристик, основанный на различии скоростей движения и размывания концентрационных зон исследуемых компонентов, которые движутся в потоке подвижной фазы, причем исследуемые вещества находятся в обеих фазах. Необходимым условием разделения является различие между подвижной и неподвижной фазой в равновесном распределении или кинетике его установления для анализируемых соединений. Чаще всего для определения гликозилированного гемоглобина используется аффинная хроматография. Она основана на установлении обратимых молекулярных взаимодействий, присущих биологически активным веществам, в частности гемоглобину. Аффинная хроматография – разновидность адсорбционной, при которой связывание происходит в соответствии со специфическими свойствами двух молекул. Взаимодействие происходит за

счет разных сил: ионных, водородных, гидрофобных и других в зависимости от конформации и размера молекул. В аффинной хроматографии используется нерастворимый носитель, на котором иммобилизуется соединение, называемое лигандом; он особым образом связывает подлежащий очистке продукт, находящийся в подвижной, обычно жидкой фазе. Лиганд удерживается за счет ковалентных связей, иногда пользуются ионным обменом, адсорбцией и др. Раствор, в котором находятся молекулы, вступает в контакт с неподвижным лигандом. Из всех веществ удерживаются те, чьи молекулы способны соединяться с лигандом. Разрыв связей может происходить за счет действия агента, связывающегося с молекулой вместо лиганда, или агента, способного связываться с лигандом вместо молекулы. В методе микроколоночной хроматографии используется цельная стабилизированная кровь. Гемолизат цельной крови, нанесенный на хроматографическую микроколонку, элюируется фосфатным буфером с низкой ионной силой. При этом НbA1c задерживается катионообменной смолой, а НbA1a, НbA1b и липиды вымываются. Последующее элюирование буфером с более высокой ионной силой позволяет собрать фракцию, содержащую НbA1c, и определить ее оптическую плотность. Измерение оптической плотности неэлюированного гемолизата, величина которой соответствует общей концентрации гемоглобина, позволяет рассчитать уровень НbA1c в процентах от общей концентрации гемоглобина. Метод определения содержания гликозилированного гемоглобина, использующийся в данной работе, основан на аффинной хроматографии. Заполняющий микроколонки сорбент обеспечивает на первой стадии специфическое связывание гликозилированного гемоглобина (фракция Б) и его отделение от негликозилированной фракции (фракция А). На второй стадии происходит полное вытеснение гликозилированной фракции за счет вымывания из сорбента растворителем. По измеренным оптическим плотностям обеих фракций при длине волны 414 нм можно вычислить содержание гликозилированного гемоглобина [ HbA1c ] в анализируемом образце крови:

59

60

Метод микроколоночной хроматографии

[ HbA1c ] =

AБ 100% , AБ + 2,04 AА

где AА – оптическая плотность фракции А; AБ – оптическая плотность фракции Б; 2,04 – коэффициент пересчета, зависящий от объема фракций А и Б. Методика измерений Для количественного анализа гликозилированного гемоглобина используется венозная кровь. В пластиковую пробирку поместить 0,05 мл (одна капля) раствора 1 и 0,5 мл крови. Перемешать, отобрать 0,02 мл, перенести в пробирку, содержащую 0,2 мл раствора 2 и перемешать в течение 1–2 мин. Нагреть водопроводную воду до температуры 250C в термостате. Поместить в термостат колбу с буферным раствором 1 и выдержать в течение 15 мин при периодическом перемешивании. Промаркировать две стеклянные пробирки буквами А и Б. Установить пробирки в штатив. Подготовка микроколонки к анализу: снять верхнюю крышку, затем нижний колпачок и слить консервирующий раствор. Вставить микроколонку в пробирку А и выдержать в течение 15–20 мин при комнатной температуре. В микроколонку внести по 5,0 мл буферного раствора №1 и дать жидкости стечь. После полного стекания жидкости в микроколонку нанести на верхний фильтр 0,1 мл исследуемого гемолизата, выдержать 1–2 мин, затем в микроколонку внести 0,1 мл буферного раствора № 1 и выдержать 3–5 мин. Затем внести в микроколонку 10,0 мл буферного раствора № 1 и дать жидкости стечь. Микроколонку переместить таким образом, чтобы она находилась в пробирке Б. В микроколонку внести 5,0 мл буферного раствора № 2 и дать жидкости стечь. Затем извлечь микроколонку из пробирки. Измерение оптической плотности фракций А и Б производится с помощью спектрофотометра СФ–56.

61

Порядок выполнения работы

(1)

1. Подготовить образцы крови для анализа. 2. Осуществить хроматографическое разделение фракций А и Б. 3. Разделенные фракции А и Б поместить в кварцевые кюветы, затем определить оптическую плотность данных растворов относительно раствора сравнения (дистиллированная вода) при 414 нм. 4. По формуле (1) вычислить содержание гликозилированного гемоглобина в анализируемом образце крови. Используя нижеследующую таблицу соответствия, определить уровень гликемии (гипогликемия, нормальный уровень, гипергликемия). Среднесуточная концентрация глюкозы, ммоль/л 0,8 1,7 2,6 3,6 4,4 5,4 6,3 7,2 8,2 9,1 10,0 11,0 11,9 12,8 13,7 14,7 15,6

Содержание гликозилированного гемоглобина, % 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,6 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0 62

Рекомендуемый библиографический список 1. Волькенштейн М.В. Биофизика. М.: Наука, 1988. 2. Сакодынский К.И. и др. Аналитическая хроматография. М.: Химия, 1993. 3. Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии. Л.: Химия, 1986.

Лабораторная работа №9 Определение концентрации общего и связанного билирубина в плазме крови Цель работы: определение содержания билирубина в крови методом Ендрашика-Грофа. Приборы, принадлежности и реактивы: спектрофотометр Spectro 2000 RS, кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см, центрифуга Cole-Palmer P-17307-05, дозирующий диспенсер Biohit Proline, центрифужные пробирки, кофеиновый реактив, диазореактив, 10%-й раствор NaCl, раствор с известной концентрацией билирубина, сыворотка крови. Билирубин Билирубин (структурная формула представлена на рис. 1) – оранжево-коричневый пигмент крови, образующийся в результате многоэтапного разложения гемоглобина, присутствующий в плазме крови здоровых людей в свободном и связанном состоянии. Билирубин обладает фотосенсибилизирующим воздействием, а также участвует в процессе свободнорадикального окисления липидов. Клинико-диагностическое значение определения этого параметра связано с тем, что по содержанию билирубина и соотношению его свободных и связанных форм можно проводить дифференциальную диагностику различных классов патологий.

63

64

CH2 H 2C

CH

H 2C

COOH

COOH

│

│

CH2

CH2

│

│

CH2

CH2

CH2 CH2

H 2C

CH

HO

OH N

CH

NH

CH2

NH

CH

N

Рис. 1. Структурная формула билирубина Билирубин образуется в результате сложного химического превращения продуктов распада гемоглобина – биливердина и вердоглобина. При распаде 1 г гемоглобина образуется 34 мг билирубина. При высоких концентрациях билирубин обладает выраженной токсичностью, так как он легко проникает через плазматическую мембрану нервных клеток, нарушает процессы окислительного фосфорилирования и приводит к повреждениям нервной системы. Свободный билирубин – нерастворимое в воде вещество, которое переносится в плазме крови альбумином. Установлено, что каждая молекула альбумина реагирует с 2–3 молекулами билирубина, причем одна из молекул связана с альбумином более прочно, чем остальные. В физиологических условиях 1 г альбумина содержит в себе 17 мг билирубина. Комплекс альбумина и билирубина транспортируется током крови в печень, где диссоциирует на альбумин и свободный билирубин на поверхности плазматической мембраны. Свободный билирубин ассоциирует с липидами плазматической мембраны и перемещается в клетку при участии двух белков переносчиков – лигандина и протеина Z. В клетках печени под влиянием фермента глюкуронилтрансферазы билирубин образует билирубинмоно- и билирубиндиглюкурониды, при этом присущая билирубину токсичность в значительной мере теряется. Эти производные достаточно хорошо растворимы в воде и выводятся из печени по желчевыводящим путям.

65

Результатом избыточного накопления билирубина в крови (более 35÷43 мкмоль/л) и его отложения в тканях является желтое окрашивание кожи, слизистых оболочек. Желтуха является характерным симптомом заболеваний печени, желчных путей, а также болезней, протекающих с массивным гемолизом. В настоящее время под свободным билирубином принято понимать неконъюгированный с глюкуроновой кислотой билирубин. Билирубин-глюкурониды именуют связанным билирубином. В клинической лабораторной практике нашло применение количественное определение обеих фракций: как связанного билирубина, так и общего билирубина (суммарного содержания свободного билирубина и билирубинглюкуронидов). Нормальное содержание общего билирубина 7,5÷20,5 мкмоль/л, связанного билирубина – 1,6÷6,2 мкмоль/л. Методы определения Для определения содержания билирубина в сыворотке (плазме) крови используют химические и физико-химические методы исследования: колориметрические, спектрофотометрические, хроматографические. Большинство методов базируется на реакции билирубина с диазофенилсульфоновой кислотой, в ходе которой в щелочной среде образуется синяя, а в кислой – розовая окраска. Метод Ван ден Берга заключается в использовании диазотирования диазофенилсульфоновой кислотой двух дипирроловых производных билирубина, образующихся вследствие разрыва тетрапирроловой цепи молекулы билирубина при предварительной инкубации образца с соляной кислотой. Этот метод позволяет по скорости реакции определять различные фракции билирубина. Из модифицированных методов, использующих диазореакцию, наибольшее распространение в клинико-лабораторной практике приобрел метод Ендрашика-Грофа, в котором в качестве акселераторов (ускорителей) протекания реакции со свободным билирубином используются кофеин и бензоат натрия. Метод заключается в том, что при добавлении к сыворотке кофеинового реактива свободный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние и, вступая в реакцию со смесью диазореактивов, образу66

ет комплекс красного цвета. По оптической плотности полученного раствора определяют концентрацию общего билирубина, а по разнице между содержанием общего и конъюгированного билирубина (определяемого по той же реакции, но без добавления кофеина) устанавливают концентрацию свободного билирубина. Этот метод удобен тем, что на одной и той же реагентной базе можно проводить определение как прямого, так и свободного билирубина. Для определения концентрации билирубина измеряют спектры поглощения анализируемого раствора и раствора с известной концентрацией. Основным уравнением количественного спектрофотометрического анализа является уравнение Фирорда: (1) A л = е л cl , λ где A – оптическая плотность вещества при длине волны λ; ελ – показатель поглощения соответствующий длине волны λ; c – концентрация исследуемого вещества; l – толщина светопоглощающего слоя. Решение уравнений Фирорда для анализируемого и калибровочного растворов:

A л = е л cl ,

(2)

Aкл = е л cк l ,

(3)

где А л – оптическая плотность анализируемого раствора; Акл – оптическая плотность раствора с известной концентрацией вещества; ск – концентрация в калибровочном растворе, позволяющая определить концентрацию анализируемого раствора:

c=

Aл . c Aкл к

(4)

Методика измерений

Для приготовления раствора №1 (для определения общего билирубина) в пробирку с помощью дозирующих диспенсеров наливают 0,25 мл сыворотки крови, 2,0 мл кофеинового реактива и 0,25 мл диазореактива. Для приготовления раствора №2 (для определения связанного билирубина) в пробирку наливают 0,25 мл сыворотки крови, 2,0 мл 10 %-го раствора NaCl и 0,25 мл диазореактива. Раствор сравнения получается при смешивании в пробирке 0,25 мл сыворотки крови и 2,25 мл 10 %-го раствора NaCl. Подготовленные растворы осторожно перемешивают, избегая пенообразования, и оставляют инкубировать при температуре 20– 25°С. Время инкубации для определения концентрации связанного билирубина 10 мин., для общего билирубина – 20 мин. Оптическая плотность растворов измеряется при помощи спектрофотометра Spectro 2000 RS в кюветах с длиной оптического пути 1 см. Порядок выполнения работы 1. Ознакомиться с принципом работы спектрофотометра Spectro 2000 RS. 2. Приготовить анализируемые, калибровочный растворы и раствор сравнения. 3. Измерить оптические плотности анализируемых и калибровочного растворов относительно раствора сравнения в кюветах с оптической длиной 1 см при длине волны λ=540 нм. 4. Вычислить концентрации связанного и общего билирубина в сыворотке крови по формуле (4), где cк=51 мкмоль/л. Сравнить полученные значения с физиологической нормой. Рекомендуемый библиографический список 1. Практикум по биохимии. Омск: ОГМА, 2001. 2. Справочник по функциональной диагностике / Под ред. И.А. Кассирского. М.: Изд-во «Медицина», 1980.

В настоящей работе используют сыворотку негепаринизированной венозной крови. 67

68

Лабораторная работа №10 Определение концентрации холестерина в плазме крови энзиматическим колориметрическим методом Цель работы: определение содержания холестерина в плазме крови. Приборы, принадлежности и реактивы: спектрофотометр Spectro 2000 RS, кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см, центрифуга Cole-Palmer P-17307-05, центрифужные пробирки, дозирующие диспенсеры Biohit Proline, буферный раствор, раствор с известной концентрацией холестерина, цельная гепаринизированная кровь. Холестерин Холестерин – вторичный одноатомный циклический спирт, органическое соединение из класса стероидов. В чистом виде холестерин – это белое кристаллическое воскоподобное вещество без вкуса и запаха, нерастворимое в воде и хорошо растворимое в неполярных органических растворителях. Холестерин впервые был выделен из желчных камней (отсюда название: греч. chole – желчь, sterol – жирный). Химическая формула холестерина C27H42O + H2O, структурная формула холестерина представлена на рис. 1. H3C

CH3

H3C CH3 H3C

HO

Рис. 1. Структурная формула холестерина 69

Характерное химическое свойство холестерина – способность к образованию молекулярных комплексов со многими солями, кислотами, аминами, белками и такими нейтральными соединениями, как сапонины, витамин D3 (холекальциферол) и др. Холестерин есть практически во всех живых организмах, включая бактерии и сине-зелёные водоросли. Холестерин содержится в желчи, крови, мозге, ланолине и др. В крови обязательно должно присутствовать определенное количество жиров и холестерина, так как он входит в состав клеточных мембран. Холестерин является важнейшим показателем липидного обмена и необходим для протекания многих процессов. Можно выделить три аспекта использования холестерина в организме человека. 1) Холестерин является важной составной частью биологических мембран. В теле здорового взрослого человека содержится примерно 140 г холестерина, около 120 г которого приходится на клеточные мембраны. Так, мембраны центральной и периферической нервных систем содержат 10 % холестерина по массе. 2) Холестерин регулирует проницаемость клеточных мембран и активность мембранных ферментов. 3) Холестерин является исходным веществом некоторых биологически активных веществ. Из холестерина синтезируются стероидные гормоны, кортикостероиды, желчные кислоты и витамин D. Например, адренокортикоидные гормоны регулируют усвоение организмом углеводов, уменьшают воспалительные процессы, вовлекаются в процессы, вызванные стрессом. Другая их разновидность – минералокортикоидные гормоны. Они регулируют объем и давление крови, стимулируют адсорбцию почками ионов Na+, Сl– и HCO3. До 80 % холестерина синтезируется в печени, значительные его количества образуются в надпочечниках, коже и других органах, а остальная часть поступает в организм с продуктами животного происхождения. Удаление избытка холестерина происходит с помощью липопротеинов высокой плотности. Они переносят холестерин в печень, далее он превращается в желчные кислоты, кото70

рые выделяются с желчью в кишечник. Холестерин сам по себе не вреден. Но, когда уровень холестерина в крови превышает определенное значение, артерии загрязняются. Поток крови становится насыщенным частицами холестерина, которые оседают на стенках артерий и засоряют их. Это способствует закупорке желчных протоков, жировой инфильтрации печени, образованию желчных камней и отложению в стенках кровеносных сосудов, содержащих холестерин, атеросклеротических бляшек. Высокая концентрация холестерина в крови свидетельствует о повышенном риске сердечнососудистых заболеваний. В крови и тканях организма холестерин содержится в свободной и этерифицированной формах. Свободный холестерин – компонент клеточных плазматических мембран, а также мембран митохондрий и эндоплазматической сети (в меньшем количестве). В сыворотке крови преобладают эфиры холестерина. Транспорт холестерина между тканями и органами происходит за счет образования липопротеидных комплексов. Выделяют фракции холестерина липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), различающиеся по составу и функциям. Липопротеины состоят из липидов (жиров) и белков, но различаются удельным весом. Высокий уровень холестерина в составе ЛПНП повышает вероятность сосудистой недостаточности, тогда как при высоком содержании в крови связанного с ЛПВП холестерина риск сосудистой недостаточности, напротив, снижен, так как холестерин в составе ЛПВП эффективнее выводится из организма. Уровень холестерина при рождении ниже 3,0 ммоль/л. С возрастом его уровень в крови увеличивается, появляются половые различия в концентрации. Нормальные концентрации холестерина в плазме крови в соответствии с возрастом и полом представлены в табл. 1.

Таблица 1 Нормальное содержание холестерина в плазме крови Возраст > 4 лет 5–10 лет 10–15 лет 15–20 лет 20–25 лет 25–30 лет 30–35 лет 35–40 лет 40–45 лет 45–50 лет 50–55 лет 55–60 лет 60–65 лет 65–70 лет > 70 лет

71

Концентрация холестерина, ммоль/л 2,95 ÷ 5,25 2,90 ÷ 5,18 3,13 ÷ 5,25 2,26 ÷ 5,30 3,08 ÷ 5,23 3,21 ÷ 5,20 2,93 ÷ 5,10 3,08 ÷ 5,18 3,21 ÷ 5,64 3,16 ÷ 5,59 3,44 ÷ 6,32 3,32 ÷ 5,75 3,57 ÷ 6,58 3,37 ÷ 5,96 3,37 ÷ 5,96 3,37 ÷ 5,96 3,91 ÷ 6,94 3,81 ÷ 6,53 4,09 ÷ 7,15 3,94 ÷ 6,86 4,09 ÷ 7,17 4,20 ÷ 7,38 4,04 ÷ 7,15 4,45 ÷ 7,77 4,12 ÷ 7,15 4,45 ÷ 7,69 4,09 ÷ 7,10 4,43 ÷ 7,85 3,73 ÷ 6,86 4,48 ÷ 7,25

Пол Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина Мужчина Женщина 72

Повышение уровня холестерина (гиперхолестеринемия) наблюдается при атеросклерозе, ишемической болезни сердца, инфаркте миокарда, болезнях печени и почек, хроническом панкреатите и злокачественных опухолях поджелудочной железы, сахарном диабете, подагре, диете, богатой углеводами и жирами. Снижение уровня холестерина (гипохолестеринемия) наблюдается при голодании, обширных ожогах, тяжелых острых заболеваниях и инфекциях, хронической сердечной недостаточности, при приеме некоторых лекарственных препаратов. Энзиматический метод определения холестерина Находящийся в тканях холестерин входит в состав клеточных мембран. Переходя в плазму крови, он этерифицируется, образуя сложные эфиры с жирными кислотами. Реакция этерификации катализируется плазмоспецифическим ферментом – лецитинхолестеролацилтрансферазой печени (ЛХАТ). При заболеваниях печени нарушена выработка фермента, и количество эфиров холестерина в плазме крови уменьшается. В эритроцитах содержится лишь свободный холестерин, количество которого значительно отличается от его содержания в плазме. Поэтому для практического исследования пригодны только плазма или сыворотка крови. Энзиматический колориметрический метод определения общего холестерина в плазме крови основан на использовании сопряженных ферментативных реакций: 1) гидролиз эфиров холестерина до свободного холестерина, катализируемый холестеролэстеразой: холестеролэстераза Эфиры холестерина + H2O ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯⎯→ холестерин + жирные кислоты;

2) превращение холестерина в холестенон с образованием перекиси водорода, катализируемое холестериноксидазой: холестерин оксидаза Холестерин + О2 ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯⎯→ холестенон + Н2О2;

3) окисление перекисью водорода 4-аминоантипирина (4ААП) и фенола с образованием окрашенного продукта розово-

73

малинового цвета – хинонимина с максимумом поглощения при 500 нм: пероксидаз а 2Н2О2 + 4-ААП + фенол ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯⎯→ химиноминовый краситель + 4 H2O.

Для определения концентрации холестерина измеряют спектры поглощения анализируемого раствора и раствора с известной концентрацией и вычисляют концентрацию холестерина по формуле:

A500 , с = 500 ск Aк

(1)

где A500 – оптическая плотность анализируемого раствора; Aк500 – оптическая плотность раствора с известной концентрацией холестерина; ск – концентрация холестерина в калибровочном растворе. Методика приготовления растворов В настоящей работе используется плазма крови, полученная центрифугированием цельной гепаринизированной венозной крови в течение 15 мин. Для спектрофотометрического анализа необходимо приготовить анализируемый, калибровочный растворы и раствор сравнения. Для приготовления анализируемого раствора в пробирку с помощью дозирующих диспенсеров наливают 20 мкл плазмы и 2,0 мл буферного раствора. Для приготовления калибровочного раствора в пробирку наливают 20 мкл раствора с известной концентрацией холестерина и 2,0 мл буферного раствора. Раствор сравнения получается при смешивании в пробирке 20 мкл дистиллированной воды и 2,0 мл буферного раствора. Приготовленные растворы тщательно перемешивают, избегая пенообразования, и оставляют инкубировать в течение 15–20 мин. при температуре 20–25°С. Оптическая плотность растворов измеряется при помощи спектрофотометра Spectro 2000 RS в кюветах с длиной оптического пути 1 см. 74

Порядок выполнения работы 1. Ознакомиться с принципом работы спектрофотометра Spectro 2000 RS. 2. Приготовить анализируемый, калибровочный растворы и раствор сравнения. 3. Измерить оптические плотности анализируемого и калибровочного растворов относительно раствора сравнения в кювете с оптической длиной 1 см при длине волны 500 нм. 4. Вычислить концентрацию холестерина в плазме крови по формуле (1), при ск = 5,17 ммоль/л. Сравнить с физиологической нормой концентрации холестерина в плазме в соответствии с возрастом и полом донора. Рекомендуемый библиографический список 1. Практикум по биохимии. Омск: ОГМА, 2001. 2. Справочник по функциональной диагностике / Под ред. И.А. Кассирского. М.: Медицина, 1980.

Содержание I. Физические методы исследования в биохимии Лабораторная работа №1. Определение константы ионизации цитидина спектрофотометрическим методом ................ 3 Лабораторная работа №2. Определение констант ионизации трис-оксиметиламинометана и уксуснокислого натрия методом потенциометрического титрования............................................................................................ 10 Лабораторная работа №3. Определение кинетических параметров реакции гидролиза сахарозы поляриметрическим методом ............................................................. 22 Лабораторная работа №4. Идентификация нуклеозидов в смеси с помощью метода тонкослойной хроматографии..................................................................................... 29 Лабораторная работа №5. Разделение смеси хромата калия, цитохрома C и голубого декстрана посредством гель-хроматографии ............................................................................ 39 II. Биохимия организма Лабораторная работа №6. Определение содержания общего белка в плазме крови биуретовым методом ....................... 46 Лабораторная работа №7. Определение концентрации глюкозы в плазме крови ферментативным методом....................... 51 Лабораторная работа №8. Определение содержания гликозилированного гемоглобина методом микроколоночной хроматографии.................................................... 57 Лабораторная работа №9.Определение концентрации общего и связанного билирубина в плазме крови........................... 64 Лабораторная работа №10. Определение концентрации холестерина в плазме крови энзиматическим колориметрическим методом ............................... 69

75

76

Технический редактор Е.В. Лозовая Редактор Л.Ф. Платоненко Подписано в печать 23.05.05. Формат бумаги 60х84 1/16. Печ. л. 4,8. Уч.-изд. л. 3,7. Тираж 100 экз. Заказ 225. Издательство ОмГУ 644077, г. Омск, пр. Мира, 55а, госуниверситет