Нейротрансмиттеры - биомедиаторы и регуляторы растений: Учебное пособие

Институт биофизики клетки РАН

В.В.Рощина

Автор пособия – Рощина Виктория Владимировна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Института биофизики клетки РАН, работает в области химической сигнализации и хемокоммуникации клеток. Основные исследования, посвященные нейротрансмиттерам и активным формам кислорода (в том числе роли озона), в растительных клетках, представлены в 6 моногра-фиях на русском и английском языках.

Электронная версия учебного пособия «Нейротрансмиттеры – биомедиаторы и регуляторы растений» подготовлена в Электронном издательстве «Аналитическая микроскопия» под редакцией проф. А.Ю.Буданцева. Техническая поддержка – ред. 1 кат. Шатурная Н.В. (рег. Свидетельство Эл № 77- 6072 Министерства РФ по делам печати, телерадиовещания и средств массовой информации от 4 февраля 2002 г.) Администратор Сервера http://cam.psn.ru : А.Б.Петров © Электронное издательство “Аналитическая микроскопия”

Рецензенты: Кондрашова М.Н., Заслуженный деятель науки, профессор Пущинского госуниверситета, доктор биологических наук, главный научный сотрудник Учреждения Российской Академии Наук Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Головкин Б.Н.., профессор, доктор биологических наук, главный научный сотрудник Учреждения Российской Академии Наук Главного ботанического сада РАН, Москва Шмуклер Ю.Б., доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, зав. группой эмбриофизиологии Учреждения Института биологии развития РАН им. Н.К. Кольцова

Аннотация В последнее десятилетие 20 века сформированы новые представления о нейротрансмиттерных веществах - ацетилхолине и биогенных аминах, как всеобщих агентах раздражимости, свойственных любой живой клетке. Исторически функции нейротрансмиттеров рассматривались только у животных, обладающих нервной системой. Их первоначальная роль связывалась с передачей нервного импульса. Оказалось, однако, что нейротрансмиттеры - ацетилхолин, дофамин, норадреналин, адреналин, серотонин, гистамин - найдены и у растений, грибов, микроорганизмов, что позволяет говорить об их универсальности в живом мире. Их функции для

организмов,

рассматривать

эти

не

обладающих

соединения

и

нервной под

системой,

другим

позволяют

названием

–

как

биомедиаторы и регуляторы в ненервной системе. Множественность функциональных характеристик веществ, первоначально названных нейротрансмиттерами, заставляет по-иному взглянуть на их роль в эволюции. Токсины, опасные для нервной системы животных, оказались столь же опасны и для растительных организмов. Присутствие таких соединений

у

растений

открывает

новые

возможности

в

фитофармакологии, когда можно направленно применять растительные экстракты и препараты из них. Роли нейротрансмиттеров (биомедиаторов) в растениях была посвящена монография, вышедшая на русском и

английском языках, но популяризации данного вопроса внимания до сих пор не уделялось. Ввиду этого возникла необходимость создания специального курса для преподавателей,

студентов,

аспирантов

и

магистрантов,

чтобы

познакомить широкий круг биологов – биофизиков, биохимиков, физиологов с этими новыми веяниями в науке о живой природе. В данном учебном

пособии

нейротрансмиттеров

приведена (биомедиаторов),

информация а

также

о

присутствии

холинергической

и

аминергической систем регуляции в растениях. Рассматриваются реакции растений на эти соединения, механизмы их действия в растениях, возможные пути эволюции холинергической и аминергической систем.

CОДЕРЖАНИЕ Для вызова разделов Содержания используйте гиперссылку

Введение Глава 1. Синтез и катаболизм ацетилхолина и биогенных моноаминов в растительной клетке Глава 2. Реакции растений на ацетилхолин и биогенные моноамины Глава 3. Системы регуляции с участием ацетилхолина и биогенных аминов Глава 4. Функции ацетилхолина и биогенных аминов в растениях Заключение Рекомендуемая литература Приложение 1. История открытия нейротрансмиттеров

1

ВВЕДЕНИЕ

В середине XIX века известный физиолог животных Клод Бернар, рассматривая явление раздражимости, как одно из главных свойств всего живого, предположил существование общих механизмов восприятия и быстрой реакции организма на внешние воздействия. В своей книге “Жизненные явления общие животным и растениям” он писал: “Способность, составляющая существенное условие всех явлений жизни у растений, как и животного, существует в самой простейшей степени. Эта способность есть раздражимость”. Основанием для такого заключения послужили опыты по влиянию анестетиков на быстрое закрывание листьев мимозы при механическом раздражении. Он установил, что у растений наблюдается такая же блокада анестетиками проведения импульса возбуждения, как и у животных. Однако молекулярный механизм раздражимости, включающий восприятие внешнего стимула, передачу информации о нем и ответные реакции начали изучаться лишь в XX столетии. Индийский естествоиспытатель и врач Яхавендра Бос в 1926 году высказал гипотезу о существовании аналога нервной системы и у растений. Выяснилось, что в основе

проведения

импульса

возбуждения

у

животных

и

растений

лежат

электрические явления в виде изменений электрического потенциала. Практические потребности медицины, связанные с необходимостью поиска обезболивающих

и

успокаивающих

лекарственных

средств,

стимулировали

дальнейшие научные исследования. Это привело к открытию механизма химической передачи возбуждения от клетки к клетке с помощью низкомолекулярных посредников - медиаторов: холинового эфира — ацетилхолина, биогенных аминов — дофамина, норадреналина, адреналина, серотонина, гистамина и др. соединений. В нервной клетке эти соединения содержатся в специальных секреторных пузырьках и освобождаются при возбуждении в очень узкое пространство (1 нм) между контактирующими

клетками

–

синаптическую

щель.

Свободный

медиатор

связывается с белками-рецепторами соседней клетки, в результате чего открываются ионные каналы в плазматической мембране, и ионы устремляются по градиенту концентрации, возникает изменение электрического потенциала клетки. При этом химическая информация преобразуется в электрическую. Взаимодействие медиатора с рецептором может реализоваться и по другому механизму — через включение систем внутриклеточных вторичных посредников, которые регулируют активность ферментов в клетке. Помимо специализированной медиаторной функции в организмах, обладающих нервной системой, ацетилхолину и биогенным аминам свойственна и другая роль.

2

Видный специалист по эволюционной физиологии животных профессор X. С. Коштоянц в 60-е годы обосновал положение о том, что физиологические и биохимические регуляторные процессы сходны у всех представителей зоомира от одноклеточных

и

примитивных

многоклеточных

до

высших

позвоночных.

Экспериментальное обоснование эта гипотеза получила позже в работах профессора Г. А. Бузникова с сотрудниками в Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова АН СССР, которые показали, что медиаторы синтезируются и выполняют важные функции регуляторов развития у зародышей и организмов, не обладающих нервной системой.

Почти одновременно с исследованиями на животных в начале двадцатого века (Исторический экскурс см. приложение 1) ацетилхолин был обнаружен в грибах спорыньи Эвинсом и Дэйлом [Ewins, 1914;Dale, 1914], а затем и у высших растений Эммелином и Фельдбергом [Emmelin, Feldberg, 1947]. В грибах спорыньи ранее также был открыт гистамин [Barger, Dale, 1990; Kutscher, 1910]. Позднее и в высших растениях обнаружили биогенные амины – гистамин [Holtz und Janisch, 1937], дофамин и норадреналин [Buelow and Gisvold, 1944; Waalkes et al., 1958], адреналин

3

[Askar et al., 1972], серотонин [Collier et al., 1956]. Общебиологическая роль веществ, являющихся химическими передатчиками возбуждения у высших животных, становится очевидной только к концу 20 века. В 70-е годы в лабораториях Джаффе (Jaffe) и Флака (Fluck) в США, Хартмана (Hartmann) в ФРГ, Оаты и Хошино (Oata, Hoshino) в Японии и др. были начаты систематические исследования роли ацетилхолина в растительных объектах. Вначале основное внимание уделялось этому соединению в связи с возможной регуляцией им роста и фотоморфогенеза. Позднее усилия исследователей сосредоточились на методических вопросах обнаружения и идентификации ацетилхолина, ферментов его синтеза и гидролиза. Кроме упомянутых выше, на этом этапе исследований заметный вклад в разработку проблемы внесли сотрудники лабораторий Кутачека (Kutacek) в Чехии, Кастури (Kasturi) и Гупта (Gupta) в Индии, Третина (Tretyn) и Беднарски (Bednarska) в Польше, Смолмен (Smallman) в Великобритании, Мадхавана (Madhavan) в США, Момоноки (Momonoki) в Японии. В России роль медиаторов в растениях исследовалась в Институте биофизики клетки РАН (Рощина В.В.) и Институте физиологии растений РАН (Жолкевич В.Н.). Результаты мировых исследований по данной проблеме обобщены в монографии Рощиной В.В., опубликованной в 1991 году на русском языке, а затем в расширенном варианте в 2001 году - на английском языке. На основе этой монографии в Белорусском госуниверситете создан курс лекций. В 21 веке следует особо вспомнить о пионерах в области исследования роли нейромедиаторных веществ в растениях, тех, кто проложил дорогу для понимания всеобщего механизма раздражимости. Недавно ушедший от нас профессор Марк Джаффе и ныне здравствующий профессор Ричард Флак. в семидесятые годы

Марк Джаффе (Mark Jaffe) в США– пионер в области исследования роли ацетилхолина в растениях.

Ричард Флак (Richard Fluck) в США - пионер в области исследования ацетилхолина и холинэстеразы в растениях.

двадцатого века опубликовали ряд ключевых работ (в том числе первый обзор), ставший основой для всех дальнейших исследований роли ацетилхолина в растениях.

4

американские исследователи ацетилхолина в растительных клетках. (Автор пособия благодарит профессора Флака и вдову профессора Джаффе за предоставленные для данной публикации фотографии). Настоящее учебное пособие составлено на основе монографий автора, вышедших в 1991 и 2001 годах. В нем обобщены основные сведения об ацетилхолине и биогенных аминах в растениях. Учитывая общебиологическую роль этих соединений, в данном пособии, использован термин “биомедиаторы, наряду с первоначально возникшими в физиологии

высшей

нервной

деятельности

“нейромедиаторы (нейротрансмиттеры)”.

названиями

“медиаторы”

или

1

Глава 1. СИНТЕЗ И КАТАБОЛИЗМ АЦЕТИЛХОЛИНА И БИОГЕННЫХ АМИНОВ В РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКЕ Ацетилхолин

и

биогенные

амины

(дофамин,

норадреналин,

адреналин,

серотонин, гистамин) известны под названием “нейромедиаторы”, так как участвуют в распространении возбуждения в виде электрического сигнала, играя роль химических посредников между клетками в синапсах животных. В связи с их обнаружением в растениях и микроорганизмах стало понятно, что указанные соединения образуются на всех ступенях эволюционной лестницы, в том числе у организмов, лишенных развитой нервной системы, и выполняют определенные функции в любой клетке. Например, они выступают как модуляторы, поскольку способны регулировать метаболические и энергетические процессы, способствуя адаптации организма к изменениям окружающей среды. Адреналин, норадреналин и серотонин могут выступать также в качестве гормонов и активных компонентов азотного обмена. Поэтому был предложен новый термин “ биомедиаторы” для этой группы веществ, который мы будем использовать в дальнейшем. 1.1.Ацетилхолин Холиновый

эфир

уксусной

кислоты

ацетилхолин

(окисленное

кислородом

производное четвертичных аминов), как указывалось во введении, был открыт,

экстрагирован, изолирован и идентифицирован в препаратах гриба спорыньи Claviceps purpurea Эвинсом (Ewins)и Дэйлом (Dale) в Англии в 1914 году. Другие исследователи не смогли повторить эту работу, и результаты этих опытов были объяснены бактериальным загрязнением. В 20-е годы того же столетия уже в экспериментах на сердце амфибии Леви и Навратил (Loewi and Navratil) открыли ацетилхолин и гидролизующий его фермент, позднее названный холинэстеразой (см. приложение 1). Оказалось, что в основе синаптической передачи нервного возбуждения у животных лежит механизм, включающий в себя синтез ацетилхолина в нервных клетках, его взаимодействие с возбудимыми мембранами и последующий гидролиз холинэстеразами. Это фундаментальное открытие XX века привело к интенсивному изучению роли ацетилхолина как нейромедиатора в организме

2

животных. Спустя почти 30 лет после открытия Эвинса и Дале появились работы Эммелина и Фельдберга, проведенные на растениях. Они обнаружили, что волоски и ткани листьев крапивы содержат большое количество ацетилхолина. К настоящему времени ацетилхолин обнаружен в более чем 78 видах из 42 семейств многоклеточных растений, некоторых видов мхов и грибов, сине-зеленых бактериях. Содержание в растениях. Содержание ацетилхолина в органах и тканях растений колеблется у разных видов от 0,1 до 547 мкг/г сырой массы (примеры в табл.1-1.). Распределение ацетилхолина по растению неравномерно. Стебли отличаются Таблица 1. Содержание ацетилхолина (мкг г-1 сырой массы) у разных видов растений Семейство и вид Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus L. (подсолнечник)

Часть растения стебли, побеги 1.29, корни 0.57

Brassicaceae Raphanus sativus L.( редис)

листья 18.28-53.68,черешки 38.67-88.92 , корни 53.36-83.22

Convolvulaceae Ipomaea abutiloides (Carnea) (ипомея)

стебли 2.28, семена 13.87

Fabaceae Pisum sativum L. (горох)

листья 0.36,стебли 1.34, корни 0.23

Rosaceae Crataegus oxyacantha L.(боярышник)

листья, цветки, плоды 16.32-163.17

Urticaceae Urtica urens L (крапива).

листья, стебли, корни 19.58-29.37

более низким содержанием ацетилхолина 55 нмоль-г-1 сырой массы, напротив, жилки листа и семена содержат в 30-700 раз больше ацетилхолина, чем стебли. В таблице 1-2 сравнивается содержание этого соединения у животных и растений. Так в мозге крысы и жалящих клетках пчелы ацетилхолин присутствует в количествах, вполне сравнимых с его содержанием в клетках растений. Больше Таблица 1-2. Содержание ацетилхолина в растениях и животных Объект

Ацетилхолин (нмоль г-1 сырой массы)

Растения в целом

0.5 - 3000

Жгучие волоски крапивы и лапортеи

120-180

Мозг крысы

3.4-3400

Жалящие клетки пчелы

До 300

всего ацетилхолина содержится в секреторных клетках жгучих волосков крапивы и лапортеи. У крапивы концентрация в таких волосках достигает10-2 M (отметим, что в процессе передачи электрического сигнала от моторного нерва к мышце животных концентрация ацетилхолина может быть около 10-3М). Вместе с присутствующим в составе секрета гистамином ацетилхолин может вызывать болевую реакцию и образование волдырей при контакте с кожей человека. Особенно сильные ожоги

3

вызывают жгучие волоски австралийского вида лапортеи Laportea moroides. Следует отметить,

что

содержание

ацетилхолина

в растениях

подвержено

сильным

колебаниям и зависит от возраста, фазы развития и условий выращивания растений. Локализация в клетке. Ряд данных показывает, что ацетилхолин в растительной клетке, как и у животных, хранится в секреторных пузырьках, отделяемых от аппарата Гольджи. Иногда пузырьки покрыты особым белком клатрином. Джаффе [Jaffe, 1976] предположил, что местом синтеза и первоначальной локализации ацетилхолина в клетках

растений

являются

мембраны

эндоплазматического

ретикулума.

Показательно, однако, что на свету его образуется больше, чем в темноте. Этот эффект связывали как с фотоморфогенезом, так и непосредственно с фотосинтезом. Позднее присутствие ацетилхолина было обнаружено в изолированных хлоропластах (Табл.1-3). Поскольку ацетилхолин обнаружен в этих органеллах, а его образование Таблица 1-3. Содержание ацетилхолина в листьях и хлоропластах, нмоль г-1 сырой массы листьев (Рощина, 1989, 1991) Ацетилхолин Растение В листьях В хлоропластах Pisum sativum L. 2.2 0,069-8,2 Phaseolus aureus Roxb. 0,32-17,7 0,1-49 Zea mays L. 6.0 0-2.3 Urtica dioica L. 12-100 2,0

стимулируется светом, можно предполагать, что биосинтез данного холинового эфира зависит

от

функционирования

фотосинтезирующих

мембран.

(У

животных

значительное количество ацетилхолина найдено также во фракциях митохондрий). 1.1.1.Синтез ацетилхолина. Предшественниками ацетилхолина в растениях так же, как и у животных является ацетил-КоА(CH3CO-KoA) и холин. Реакции синтеза протекают согласно схеме (Рис.11) из холина и ацетил-КоА. Холин, как предшественник, синтезируется двумя

Рис.1-1. Биосинтез ацетилхолина

4

путями: из аминокислоты серина или фосфатидилхолина мембран. Другой предшественник ацетилхолина, ацетил-КоА, образуется из ацетата с участием ацетилКоА–синтетазы или из пирувата с помощью пируватдегидрогеназного комплекса. Синтез собственно ацетилхолина осуществляется на свету с участием фермента холинацетилтрансферазы (она найдена внутри секреторных везикул) в мембранах эндоплазматического

ретикулума.

Подробнее

об этом

ферменте,

как

части

регуляторной системы с участием ацетилхолина, описано в главе 3, раздел 3.1.2. Синтез

ацетилхолина

зависит

от

внешних

факторов.

Свет

может

непосредственно влиять на уровень ацетилхолина в тканях, регулируя активность ферментов его синтеза и распада. При непрерывном освещении белым светом листьев Phaseolus aureus содержание ацетилхолина в них по сравнению с темнотой увеличивается в два раза, в стеблях резко (в три раза) снижается, а в корнях практически не изменяется. Наблюдаемое явление отмечено для целого ряда растений. Подтверждена важная роль света, как необходимого фактора для синтеза ацетилхолина, поскольку уровень эндогенного ацетилхолина в 2-3 раза повышается по мере зеленения этиолированных проростков. Имеются сведения, что накопление ацетилхолина в тканях зависит от длины волны света, которым облучается растение. В целом отмечается положительное влияние красного света с длиной волны < 730 нм, но дальний красный свет (>730 нм) может вызывать уменьшение уровня ацетилхолина. 1.1.2.Катаболизм и превращения ацетилхолина. Катаболизм ацетилхолина включает его гидролиз и превращения в другие холиновые эфиры, как например, на схеме (рис.1-2):

Рис.1-2. Схема катаболизма ацетилхолина Гидролиз ацетилхолина до холина и уксусной кислоты осуществляется ферментом холинэстеразой. Этот фермент играет ключевую роль в катаболизме ацетилхолина. Холинэстераза является маркером присутствия ацетилхолина в растениях и ее активность является важной частью регуляторной системы

5

аккумуляции этого холинового эфира в растениях (см. Главу 3, раздел 3.1.3) Кроме специализированного фермента способностью гидролизовать ацетилхолин, хотя и с более низкими скоростями (в 1000 раз), могут другие эстеразы растений пектинэстеразы, аллилэстеразы , синапинэстеразы. Продукт распада ацетилхолина холин может вновь вступать в реакции. В растениях холин является субстратом не только для синтеза ацетилхолина, но и ряда других холиновых эфиров пропионилхолина, бутирилхолина, синапина и др. Холин также является источником бетаина (или глицинбетаина), предохраняющего растения от солевого стресса. Образование бетаина идет в хлоропластах ряда растений, растущих в районах с засушливым климатом, например, в ячмене, или солеросах, а также у представителей семейства Chenopodiaceae, (свекла, шпинат). Реакции идут с участием фермента пиридиннуклеотид зависимой бетаинальдегиддегидрогеназы, активность которого растет с увеличением засоления. Утилизация ацетилхолина в растениях ведет к повышению пула холина, легко переходящего в бетаин или этерифицирующегося в другие эфиры. Другой

продукт

гидролиза

ацетилхолина

уксусная

кислота

легко

метаболизируется в ацетил-КоА, активно участвующий в разнообразных синтезах от органических кислот в цикле Кальвина до терпеноидов. 1.2. Биогенные амины К биогенным аминам - нейротрансмиттерам относят катехоламины (дофамин, норадреналин, адреналин), серотонин и гистамин. Их присутствие в растениях показано для многих видов растений (Табл.1-4). Содержание этой группы Таблица 1-4. Содержание биогенных аминов-нейротрансмиттеров в растениях Трансмиттер Дофамин Норадреналин Адреналин Серотонин Гистамин

Число содержащих видов 18 17 5 37 48

Число содержащих семейств 13 8 4 17 26

Содержание, мкг/г сырой массы 1-4000 0.1-6760 0.22-3833 0.0017-4000 1-3473

трансмиттеров значительно колеблется у разных видов от 30-700 в норме и до 3000 нмоль-г-1 сырой массы и выше в стрессовых условиях. В таблице 1-5 приведены наиболее заметные примеры. Катехоламины.

Катехоламины

–

группа

производных

фенольных

содержащих аминогруппу - включает дофамин, норадреналин и адреналин.

спиртов,

6

Впервые они были найдены в растениях при изучении механизмов терапевтического эффекта плодов банана Musa sp. Оказалось, что действующим началом экстрактов из мякоти и кожуры этих плодов являются дофамин и норадреналин. К настоящему Таблица 1-5. Содержание биогенных аминов (мкг/г сырой массы) у различных растений Дофамин Cactaceae гигантский кактус Carnegiae gigantea Надземная часть 30004000 Lauraceae Персик Persea плоды 4-5

Норадреналин Fabaceae (Leguminosae) бобы Phaseolus aureus листья 0.490.6

Адреналин Fabaceae (Leguminosae) горох Pisum sativum листья 34.2

Серотонин Bromeliaceae ананас Ananas comosus плод 19

Гистамин Chenopodiaceae свекла Beta vulgaris листья 5.2

Mimosaceae мимоза Mimosa pudica первичные подушечки 3.5, черешки 0.6

Fabaceae (Leguminosae) бобы Phaseolus aureus листья 0.22-284

Solanaceae Lycopersicon esculentum стебли 0.5, плод 3.75

Fabaceae (Leguminosae) клевер Trifolium pratense листья 3-4.5

Musaceae банан Musa плод (кожура – 700, мякоть – 8)

Musaceae банан Musa плод (кожура – 122, мякоть – 2)

Graminae кукуруза Zea mays листья 3833

Musaceae банан Musa плод (кожура – 40-150, мякоть – 19-28

Urticaceae крапива Urtica dioica листья 11-43

времени катехоламины найдены в 40 видах растений из 25 семейств. Особенно много дофамина в цветках и плодах различных видов (Табл.1-5). Предполагается, что он накапливается именно при цветении и плодоношении. Содержание дофамина, у многих растений находится в пределах 1-20 мкг/г сырой массы, но у некоторых объектов, таких как у плода банана Musa – 700, у кактусов Carnegiea gigantea достигает 3000-4000 мкг/г сырой массы. В последние годы появились данные о том, что Тихоокеанская водоросль Ulvaria obscura содержит дофамина до 4 % своего сырого веса, что может быть защитным механизмом, предотвращающим поедание морскими животными. Норадреналин найден у большинства исследованных видов в количестве 0.1- 3.0 мкг/г сырой массы. Но у крапивы, портулака и банана в листьях и плодах его

7

накапливается до 100-2500 мкг/г сырой массы. Адреналин в больших количествах (более 3000 мкг/г сырой массы) содержится в листьях кукурузы. В норме содержание катехоламинов обычно увеличивается в генеративных органах в период цветения и плодоношения. Однако накопление катехоламинов может быть также связано со стрессовой ситуацией, окислительными процессами при созревании плодов, а также движением листьев и черешков в ответ на механическое раздражение. Последняя реакция особенно ярко выражена у таких растений, как Albizia julibrissin и Mimosa pudica. Места субклеточной локализации биогенных аминов в растительной клетке мало изучены. У животных основная масса катехоламинов хранится в секреторных пузырьках, одетых белком клатрином. Такие пузырьки были найдены и в растительных клетках. У растений дофамин найден в вакуолях латекса мака Papaver bracteatum и Papaver somniferum. Норадреналин и адреналин идентифицированы в изолированных хлоропластах растений из семейств Fabaceae и Urticaceae. Cеротонин.

Серотонин

(5-окситриптамин)

является

производным

индола

и

обнаружен в 37 видах растений из 17 семейств. Количество серотонина варьирует в зависимости от таксономического положения растения и особенно велико у представителей семейств Juglandaceae, Leguminosae (Fabaceae), Lygophyllaceae (и вполне сравнимо с содержанием его у животных, например у моллюсков). Отчетливо наблюдается неравномерное распределение серотонина между органами растений. В

плодах и семенах многих растений содержится в 100-1000 раз больше серотонина, чем в вегетативных органах(Табл.1-5). Например, в зародышах грецкого ореха Juglans regia обнаружено его большое количество 0,4-0,6 мг г-1 сырой массы, тогда как в других частях растения он отсутствует. Возможно, серотонин играет определенную роль в репродукции растений, что отражается на годичной динамике его содержания. весной наблюдается наименьшее содержание амина, а к осени в период репродукции оно резко повышается, особенно в плодах. В тканях плода распределение серотонина также неравномерно. Наибольшее количество сосредоточено в наружной части кожуры. Внутренняя же часть кожуры и мякоть плода, как правило, содержат значительно меньше серотонина. В репродуктивный период (март) у бобового растения, произрастающего в Африке, Griffonia simplicifolia в листьях накапливается до 1,2-1,3 мкмоль- г-1 сырой массы, тогда как в вегетативный период (ноябрь—январь)

8

- всего до 0,3 мкмоль г-1 сырой массы. Аналогичное явление отмечено для растения умеренных широт ореха грецкого Juglans regia, где весной наблюдается наименьшее содержание амина, а к осени в период репродукции оно резко повышается, особенно в плодах. В тканях плода распределение серотонина также неравномерно. Наибольшее количество сосредоточено в наружной части кожуры. Внутренняя часть кожуры и мякоть плода, как правило, содержат значительно меньше серотонина. Особая роль выполняет серотонин, накапливающийся в жгучих волосках крапивы или бархатных бобов Mucuna pruriens. Он предохраняет от поедания растений травоядными животными. В ряде случаев, например у риса, синтез серотонина стимулируется в ответ на инфицирование патогенами, что может также служить защитным механизмом. Внутриклеточная локализация серотонина у растений точно не показана. Обычно он запасается в белковых тельцах семядолей развивающихся зародышей семян, в которых еще нет вакуолей, тогда как в клетках стрекательных волосков у рода Urtica серотонин, как предполагают, локализуется именно в вакуолях. У животных до 40% серотонина содержится в микросомах и 49—60% - в митохондриях нервных окончаний, в ядрах- всего 14%. В нейронах серотонин локализован в клатриновых секреторных пузырьках. Поскольку покрытые клатрином секреторные пузырьки встречаются у растений, то можно допустить нахождение серотонина в подобных структурах. Гистамин.

Гистамин

-пятичленный

гетероциклический

амин

–впервые

был

обнаружен у гриба спорыньи Claviceps purpurea в начале двадцатого века, а затем в довольно значительных количествах ( 5 - 40 мкг г-1 сырой массы) и у многих высших растений. К настоящему времени он найден у более 50 видов растений из 28 семейств.

В листьях его содержание составляет 2-3 , а в цветках до 10 мкмоль-г-1 сырой массы. Примерно такие же концентрации амина в норме найдены и у животных. Более высокие концентрации гистамина обнаружены в стрекательных волосках крапивы Urtica dioica (Табл.1-5) наряду с ацетилхолином и серотонином. Этот механизм служит, по-видимому, для отпугивания животных, поскольку гистамин вызывает болевые и аллергические реакции. При стрессах, особенно при засолении почв, засухе, а также заражении паразитами, содержание гистамина увеличивается многократно (Подобная реакция на любой стресс характерна и для животных).

9

Локализация гистамина в растительной клетке, как и для серотонина , точно не установлена. По аналогии с клетками животных предполагается его концентрация в секреторных клетках, ядрах, митохондриях, а также микросомах. 1. 2.1. Метаболизм биогенных аминов Метаболизм

биогенных

аминов

составляет

часть

общей

системы

азотного

метаболизма растений. Он важен не только для физиологии и биохимии растений. но и для фармакологии, поскольку в их метаболических путях образуются важнейшие лекарственные соединения. Все биогенные амины происходят из соответствующих аминокислот. Общие для животных и растений ферментные системы трансфераз, декарбоксилаз и оксидаз (аминооксидаз) в метаболизме этих соединений. 1.2.1.1. Метаболизм катехоламинов Синтез катехоламииов. Моноамины дофамин, норадреналин и адреналин - часть общей системы азотного метаболизма растений. Катехоламины происходят из аминокислоты

фенилаланина

(рис.1-3),

которая

путем

гидроксилирования

превращается вначале в тирозин, затем в диоксифенилаланин (ДОФА). Эти процессы

Рис. 1-3. Образование катехоламинов из фенилаланина

катализируются

ферментом

фенилаланингидроксилазой

или

иначе

фенилаланинмонооксидазой (I) и тирозингидроксилазой или иначе тирозин-3монооксидазой (II). Дофамин - непосредственный предшественник норадреналина и адреналина образуется путем декарбоксилирования ДОФА с помощью фермента декарбоксилазы ароматических кислот (III). Возможен и другой путь превращения тирозина

в

дофамин

последовательно

декарбоксилированием

с

помощью

декарбоксилазы ароматических кислот (III) до тирамина, а затем в катехоламин с помощью тирамингидроксилазы (IV). Далее дофамин окисляется до норадреналина с помощью фермента дофамин-р-монооксидазы (V) в присутствии кислорода. Затем из

10

норадреналина при участии фенилэтаноламин метилтрансферазы (VI) происходит образование адреналина. Места синтеза катехоламинов в растительной клетке точно не установлены. Предполагается, что, как и у животных, образование этих веществ идет в цистернах аппарата Гольджи. Катаболизм катехоламинов. Распад и превращения катехоламинов в растениях в общих чертах происходят так же, как в тканях животных. Катехоламины окисляются, дезаминируются и метилируются до физиологически неактивных производных или превращаются в другие токсичные метаболиты. Существует несколько путей катаболизма катехоламинов: 1. Окислительное дезаминирование согласно общему уравнению:

Реакция

дезаминирования

протекает

с

участием

моноаминооксндаз

или

диаминооксндаз - медьсодержащих ферментов. 2. O-метилирование

Реакция о-метилирования протекает с участием катехоламин-о-метилтрансфераз. 3. Коньюгация с фенольными соединениями. Катехоламин + кумарин (или другие фенолы) ——> Кумароилкатехоламин Часто катехоламины способны коньюгироваться с фенолами, например кумарином или его производными, образуя кумароилкатехоламин. Подобные соединения, повидимому, служат защитой от патогенных грибов (как кумароиладреналин у томатов) или же это - путь детоксикации биологически активных катехоламинов. Превращение в алкалоиды. Катехоламины способны превращаться в алкалоиды, токсичные

продукты,

часто

видоспецифические

и

широко

применяемые

в

фармакологии, как лекарственные препараты. Формулы некоторых из них приведены на рис.1-4.

11

Рис. 1-4. Формулы алкалоидов, образующихся из катехоламинов

Алкалоиды папаверин, морфин и другие производные дофамина часто находят в латексе маков Papaver somniferum и Papaver bracteatum. Другая группа алкалоидов типа берберина и берберастина образуется из катехоламинов у растения желтокорень Hydrastis canadensis и часто встречается в семействах Berberidaceae, Ranunculaceae, Menispermaceae, Rutaceae и др. Метилированием дофамина образуются такие алкалоиды, как мескалин , ангаламин, которые встречаются в мексиканских кактусах Lophophora williamsii и Trichocereus pachanoi (сем. Cactaceae). Мескалин является галлюциногенным ядом. Растение рода Ephedra также путем простого метилирования адреналина производит известный агонист ацетилхолина (лекарственный препарат) алкалоид эфедрин. Из продуктов катаболизма катехоламинов ванилина и ванилиновой кислоты образуются алкалоиды капсаицин, d-тубокурарин, и возможно атропин. dТубокурарин и атропин являются блокаторами соответственно никотиновых и мускариновых холинорецепторов животных (глава 4) и оказывают антимедиаторное действие

на

постсинаптическую

мембрану.

Конденсация

дофамина

с

дигидроциннамовым (дигидрокоричным) альдегидом ведет к образованию целого ряда сложных по структуре алкалоидов, среди которых – колхицин, известный ингибитор полимеризации сократительных белков (тубулина) микротрубочек, а также отомналин и о-метиландроцимбин. Помимо

вышеуказанных

путей

метаболизма,

катехоламины

окисляются

кислородом воздуха с образованием красных пигментов аминохромов и бурых или черных пигментов меланинов. Это окисление может быть неэнзиматическим (спонтанным в растворах) и энзиматическим (в присутствии полифенолоксидаз).

12

1.2.2. Синтез и катаболизм серотонина. Синтез

серотонина.

Синтез

серотонина

осуществляется

из

триптофана,

образованного в шикиматном пути, локализованном в пластидах (рис.1-5). Первой стадией биосинтеза является декарбоксилирование триптофана, превращающегося в растениях в триптамин с помощью фермента триптофандекарбоксилазы или декарбоксилазы (II) ароматических аминокислот. Далее триптамин превращается в серотонин путем гидроксилирования с помощью триптамин-5-гидроксилазы (I) или Lтриптофан-5-гидроксилазы. Характерен и другой путь превращения триптофана, как у растений, так и у животных. Гидроксилирование (I) триптофана приводит к образованиюс5-окситриптофана

при

1.14.16.4).

этапе

На

следующем

участии 5

триптофан-5-гидроксилазы

окситриптофан

(КФ

декарбоксилируется

декарбоксилазой ароматических кислот (II), превращаясь в серотонин. У растений фитогормон индолил-3-уксусная кислота образуется из той же аминокислоты триптофана через индолилпируват и индолилацетальдегид. Мелатонин, регулятор фотоморфогенеза растений, возникает уже из самого серотонина.

Рис.1-5. Образование серотонина, индолилуксусной кислоты и мелатонина из общего предшественника – аминокислоты триптофана

Место синтеза серотонина в растительной клетке, как и других медиаторов, точно не установлено. Предполагается, что, как и у животных, этот биогенный амин синтезируется в аппарате Гольджи. Катаболизм серотонина. Катаболизм серотонина в растениях (Рис.1-6) направлен либо на метилирование с помощью триптофанметилтрансферазы, либо на окислительное

дезаминирование

амина

с

участием

моноаминооксидазы

или

диаминооксидаз, подобно тому, как это происходит с катехоламинами. Конечным продуктом

подобного

пути

катаболизма

серотонина

может

быть

5-

13

гидроксииндолилиуксусная

кислота.

Кроме

того,

серотонин

может

быть

предшественником многих алкалоидов. Метилированные производные серотонина

Рис.1-6. Конечные продукты катаболизма серотонина

лизергиновая кислота, алкалоиды буфотенин (у гриба поганки Аmаnita mарра), буфотенидин, псилоцин, псилоцибин (в грибах мексиканских прерий) известны, как сильные галлюциногены и токсиканты. Помимо этих процессов, происходит конденсация изопентильной группы с индольным ядром серотонина, что может приводить к синтезу алкалоидов группы резерпина, иохимбана, иохимбина, винбластина (рис.1-6). 1.2.1.3.Синтез и катаболизм гистамина. Гистамин

образуется

непосредственно

гистидиндекарбоксилазой,

находящейся

при в

декарбоксилировании

митохондриальной

и

гистидина

микросомной

фракциях (рис.1-7). Это самый простой путь образования биогенного амина.

Рис.1-7. Синтез и превращения гистамина в растениях. ДО – диаминоксидаза, МАО – моноаминооксидаза. Ме – метильная группа

Образованный гистамин легко подвержен окислительному дезаминированию, что

14

является распространенным способом инактивации этого токсичного вещества (Рис.1-7).

Чаще

всего

образуется

имидазолуксусная

кислота,

а

затем

ее

метилированные и ацетилированные производные. У ряда растений гистамин является

предшественником

запотидина и глохидина.

видоспецифичных

алкалоидов

–

долихотелина,

1

Глава 2. РЕАКЦИИ РАСТЕНИЙ НА АЦЕТИЛХОЛИН И БИОГЕННЫЕ АМИНЫ Физиологическая роль ацетилхолина и биогенных аминов в растениях может быть оценена по отдельным реакциям в процессах роста и развития, движения, а также в метаболических

и

энергетических

превращениях.

Чувствительность

к

этим

соединениям и их агонистам (имитаторам), а также избирательность самих реакций определяет существование рецепторов и в целом связанных с ними систем регуляции, подобно известным для животных организмов. 2.1. Рост и развитие В настоящее время установлены ростовые реакции чувствительные к ацетилхолину и биогенным аминам, как это показано на схеме:

Рост. Физиологическая роль ацетилхолина в растениях была впервые рассмотрена Джаффе (Jaffe, 1970), который установил действие этого вещества на ростовые реакции растений, управляемые фитохромом. Чаще всего под влиянием ацетилхолина наблюдается стимуляция элонгации колеоптилей и гипокотилей зеленеющих проростков злаков. У этиолированных проростков такого эффекта не наблюдается. В относительно низких концентрациях (10-6-10-5 М) ацетилхолин вызывает заметную стимуляцию элонгации протонемы мха Athyrium filix-femina и развертывания листьев у этиолированных проростков мягкой озимой пшеницы Triticum aestivum. При этом действие трансмиттера аналогично эффекту красного света, который, как известно, регулирует активность фитохрома – одного из фоторецепторов. Однако ацетилхолин

2

вызывает не только стимулирующие эффекты, но может и ингибировать рост верхушек корней и вторичных корней или образование вторичных корней. В зависимости от концентрации ацетилхолин регулирует и элонгацию пыльцевой трубки при прорастании пыльцы, вызывая ее стимуляцию при низких концентрациях, и угнетая – при высоких. Эффекты биогенных аминов на рост растений исследованы в основном на каллусной ткани. Дофамин в концентрациях, превышающих 5 мг/л (3,2 х 10-5 М), ингибирует рост каллюсной ткани банана Musa acuminate, а в концентрации 50 мг/л полностью блокирует ростовой процесс. Однако, в присутствии ауксина или гиббереллина катехоламины в микромолярных концентрациях стимулируют рост культуры ткани картофеля Solanum tuberosum, табака Nicotiana tabacum и корневых волосков Acmella oppositifolia Серотонин является одним из самых активных регуляторов роста и развития, как у животных, так и растений. На основании экспериментов, в которых на колеоптилях овса серотонин вызывал ростовой изгиб, было высказано предположение, что это соединение, близкое по строению индолилуксусной кислоте, обладает аналогичной функцией стимулятора роста. Ауксиноподобный эффект был обнаружен позднее и на гипокотилях люпина Lupinus albus. Установлено также, что серотонин стимулирует образование корней в культуре ткани листа Populus tremuloides x P. tremula, даже в большей мере, чем индолилуксусная кислота. Кроме того, серотонин ингибирует образование ризосферы на корнях тополя, и в то же время стимулирует рост вторичных корней. У семян ячменя этот трансмиттер вызывает повышение митотического индекса, ускорение роста корня, увеличение корневой массы и семядолей. Установлено также, что серотонин ингибирует образование и рост галловых опухолей на дисках клубней картофеля. Прорастание семян, пыльцы и вегетативных спор. Ацетилхолин оказывает в основном стимулирующее действие на прорастание семян, спор, грибов и пыльцы растений. Однако есть сомнения, что стимуляция ацетилхолином прорастания семян имеет всеобщий характер, поскольку действуют только очень высокие концентрации (>10-3 М), и процент стимуляции невелик. Наряду с этим в литературе описываются опыты, в которых повышение количества проросших семян было значительным. Так, ацетилхолин и его аналог карбамаилхолин в концентрации 10-3 М на свету стимулировали прорастание семян Rumex obtusifolius на 25-50%. Более того, в опытах польских исследователей (Tretyn et al.) ацетилхолин ускорял прорастание семян Echinochloa crusgalli в три paзa, Chenopodium album в 4 раза, Setaria viridis в 8 раз по сравнению с контролем, а семена Brassica sp. и Agropyron repens вообще не

3

прорастали без обработки ацетилхолином. В экспериментах с редисом Raphanus sativus ацетилхолин, напротив, особого влияния не оказал, но катехоламины, серотонин и гистамин стимулировали прорастание семян в концентрациях 10-7–10-4М (рис.2-1). Однако в концентрации 0,24 х 10-3 М гистамин снижал количество

Рис. 2-1. Влияние нейротрансмиттеров на прорастание семян редиса Raphanus sativum. Д – дофамин, НА – норадреналин, А – адреналин (Рощина, 1992)

проросших семян салата по сравнению с контролем на 50%, а в более высоких концентрациях полностью подавлял этот процесс. Возможно, гистамин является регулятором прорастания семян, как и другие производные гистидина. Прорастание генеративных (пыльца – мужской гаметофит размножающихся семенами

голосеменных

и

покрытосеменных

растений)

и

вегетативных

(у

размножающихся спорами растений) микроспор также весьма чувствительно к биогенным аминам. В качестве удобных моделей для исследований были использованы

пыльца

гиппеаструма

Hippeastrum

hybridum

и

вегетативные

микроспоры хвоща полевого Equisetum arvense (Рис.2-2). Прорастание пыльцы оценивали по образованию пыльцевой трубки, а развитие вегетативных микроспор по нарастанию хлорофилла и сбрасыванию жесткой оболочки. Развивающиеся вегетативные

микроспоры

флуоресцируют

(это

облегчает

наблюдение)

в

ультрафиолетовом свете микроскопа, становясь ярко красными от образующегося хлорофилла, сброшенная ими оболочка светится голубым светом. В диапазоне концентраций 10

–7

- 10

–5

М дофамин и серотонин стимулировали развитие обоих

видов микроспор, а норадреналин – только вегетативных микроспор. При концентрациях 10-6-10-4 M норадреналин часто ингибировал прорастание пыльцы

4

Рис.2-2.Концентрационная зависимость действия биогенных аминов на прорастание пыльцы гиппеаструма Hippeastrum hybridum - генеративных микроспор - (А) и вегетативных микроспор хвоща полевого Equisetum arvense (Б) спустя 120 мин после смачивания сухих микроспор. Контроль – для пыльцы сахароза (10 %) или для вегетативных микроспор вода (100%). Адаптировано из работ Roshchina, 2004; Рощина, 2006). 1. Дофамин, 2. Норадреналин, 3. Серотонин

Hippeastrum hybridum, тогда как дофамин и серотонин, напротив, при этих концентрациях всегда стимулировали процесс. В опытах с гистамином отмечена лишь небольшая стимуляция, чаще в пределах ошибки опыта. В целом, развитие микроспор растений является процессом, чувствительным к биогенным аминам. Передача сигнала от этих соединений с поверхности внутрь клетки от плазмалеммы к ядру, возможно, инициирует деление ядра, а затем и последующее прорастание микроспор. Развитие растений. В 1972-1974 гг. было установлено, что в условиях постоянного освещения ацетилхолин препятствует цветению растений длинного дня ряски Lemna gibba, но в том же самом световом режиме ускоряет цветение короткодневного другого вида Lemna perpusilla. По сравнению с ацетилхолином а, катехоламины проявляют еще большую активность в регуляции процессов развития и морфогенеза. В одних случаях они подавляют цветение у Lemna gibba G-3, в других - могут стимулировать цветение этого же вида, а также и другого вида Lemna paucicostata. Катехоламины активно включаются в морфогенез in vitro. Так экзогенный дофамин (100-500 мкмоль/л) в культуральной среде вызывает стимуляцию роста культуры ткани

картофеля

Solanum

tuberosum

L.

При

культивировании

тканей

с

индолилуксусной кислотой в среде норадреналин также стимулирует соматический эмбриогенез листьев, например у ежи сборной Dactylis glomerata L. Предполагается, что общий регуляторный эффект катехоламинов на рост связан с окислением ауксина. Например, дофамин может ингибировать оксидазу ИУК, сберегая тем самым ауксин, и эта реакция высокоспецифична.

5

Серотонин также влияет на морфогенез, стимулируя цветение растений, как предшественник мелатонина, который собственно является триггером цветения. Зависимость эффектов от факторов внешней среды. Эффекты трансмиттеров на рост и развитие растений могут зависеть от факторов внешней среды. Достоверные сведения по данному вопросу пока получены лишь для ацетилхолина, тогда как для биогенных аминов экспериментальные данных мало, и они противоречивы. Свет не только мощный регулятор синтеза ацетилхолина в растениях. Он также играет важную роль и в эффектах, вызываемых холиновыми эфирами. Содержание ацетилхолина регулируется фоторецептором, связанным с продолжительностью светового дня, по разным данным – фитохромом. Например, обнаружена зависимость ингибирования ацетилхолином образования вторичных корней у Pisum sativum от экспонирования проростков на свету. Польские исследователи (Tretyn et al., 1985) наблюдали на свету резкую (до 50% от контроля) стимуляцию ацетилхолином прорастания семян Rumex obtusifolius. В ряде случаев эффекты ацетилхолина на свету (ингибирование образования вторичных корней Phaseolus aureus, стимуляция споруляции у гриба Trichoderma viride, стимуляция прорастания семян различных растений ингибирование роста гипокотилей и стимулирование роста эпикотилей Vigna sesquipedalis) были аналогичны тем, что вызывал красный свет с длиной волны <680 нм. Кроме того, синий свет или ацетилхолин в одинаковой мере стимулировали образования конидий у мицелия гриба Trichoderma viride, выросшего в темноте. Эти факты легли в основу дискуссии о механизме действия света различного качественного состава. Предполагалось, что механизм действия красного света опосредован ацетилхолином. Однако однозначно решить, этот вопрос не удалось. Существует зависимость эффектов ацетилхолина и от рН среды. Показано, например, что ацетилхолин в концентрациях 10-3-10-2 М стимулирует рост проростков Triticum vulgare только при рН 7,5. Анализируя эффекты экзогенных ацетилхолина и катехоламинов на рост и развитие растений, следует отметить, что существуют определенные трудности использования этих веществ в опытах на целом растении или его интактных органах. Прежде всего, это касается ацетилхолина, который может на 90% разрушаться холинэстеразой, локализованной в плазмалемме и клеточной стенке поверхностных клеток. Трудно интерпретировать эффекты высоких (>10~3 М) концентраций веществ, так как они могут вызывать неспецифические реакции, и в силу этого действовать как ретарданты или вызывать десенсибилизацию поверхностных рецепторов, что блокирует ответные реакции растений. Механизм действия на рост и развитие. Механизм действия ацетилхолина и

6

биогенных аминов на рост и развитие растений в полной мере не изучен. Он может заключаться в активации белков, участвующих в ростовых реакциях (в том числе ферментов синтеза фитогормонов). Но, кроме фитохрома, пока не известно, какие еще рост-регулирующие белки активируются ацетилхолином (см. предыдущий раздел) или биогенными аминами. Одно из наиболее обсуждаемых предположений связывает

взаимодействие

экспериментальные

медиаторов

подтверждения.

с

Прежде

фитогормонами, всего

и

показано,

этому

что

есть

некоторые

фитогормоны и биомедиаторы синтезируются по сходному пути из одного и того же предшественника. Например, серотонин и индолилуксусная кислота происходят из триптофана (глава 1, Рис.1-5). В других случаях фитогормоны и медиаторы могут иметь разных предшественников, однако синтезироваться параллельно и проявлять сходную активность. Например, в плодах и каллусе банана Musa acuminate наряду с цитокининами обнаружен дофамин. Дофамин проявляет себя как ингибитор роста каллуса сои в концентрации >5 мг/л и полностью блокирует процесс при содержании 50 мг/л, действуя подобно цитокинину зеатину. Другая возможность возможность взаимосвязи между биомедиаторами и фитогормонами может заключаться в синергизме действия этих веществ. В концентрации 10-7-10-6 М катехоламины адреналин, норадреналин и дофамин ускоряют элонгацию гипокотилей салата Lactuca sativa, вызванную гиббереллином. Производные катехоламинов (метанефрин, норметанефрин, З-метокси-4-гидроманделевая кислота) или их предшественник ДОФА (диоксифенилаланин) не вызывают этого эффекта. Известно также, что у ежи сборной адреналин в молярных и миллимолярных концентрациях, подавляющих эмбриогенез, вызывает образование этилена, гормона старения, что демонстрирует определенный синергизм аминоергической и гормональной систем. Между

биомедиаторами

и

фитогормонами

возможны

и

конкурентные

взаимодействия. Примером может быть ингибирование ацетилхолином выделения гормона этилена этиолированными проростками Phaseolus vulgaris и листовыми дисками сои Glycine max. В низких концентрациях этилен вызывает стимуляцию элонгации клеток мха Athyrium filix-femina, а добавление ацетилхолина (10-5 М) ингибирует процесс в1,5-2 раза. Холин (0.1-500 мкМ) снижает уровень стимуляции роста проростков пшеницы, предварительно обработанных индолилуксусной кислотой. По данным японского автора Хошино (Hoshino, 1979) обработка растения ряски Lemna gibba G-3 индолилуксусной кислотой на 30% снижает содержание ацетилхолина, а антагонист ацетилхолина атропин (>10-6 М) нивелирует эффект ауксина на рост, а также сокращает количество цветков на растениях по сравнению с вариантами опытов, в которых использовалась только индолилуксусная кислота. На

7

этом основании предположили, что ауксин и холиновый эфир связываются с рецептором в одном и том же месте мембраны или независимо, но близко друг к другу. Есть доказательства и конкурентных отношений с гиббереллином, другим растительным гормоном. По данным индийских исследователей (Beri and Gupta 2007) ацетилхолин и антитела против ацетилхолинэстеразы могут ингибировать биосинтез гибберелловой

кислоты.

Ацетилхолинэстераза

как

фермент,

гидролизующий

ацетилхолин, может быть включена во взаимоотношения холин-ауксин, что в конечном итоге также влияет на ростовой процесс. Проявление эффектов катехоламинов на ростовые процессы ингибирует транс-циннамовая кислота, которая

тоже

конкурирует

за

место

связывания

(рецептор)

не

только

с

катехоламинами, но и их структурным аналогом дигидроконифериловым спиртом. Следует отметить, что существует несомненное сходство химических структур катехоламинов и таких метаболитов как циннамовая кислота, конифериловый спирт, синаповая кислота, а серотонина - с индолилуксусной кислотой и алкалоидом грамином. Рассмотренные эффекты на рост и развитие представляют интерес не только с позиций внутриклеточного и межклеточного действия биомедиаторов в организме. Следует учесть, что ацетилхолин, гистамин, серотонин являются распространенными продуктами выделений растений и могут, как экзогенные продукты, оказывать аллелопатическое (химическое взаимодействие между организмами) влияние в фитоценозе. Очевидно, что это явление имеет важное экологическое значение. 2.2.Двигательные реакции растений. Как известно, нейромедиаторы участвуют в двигательных реакциях животных, контролируемых

холинэргической

и

адренергической

системами.

Движения

свойственны и растительным видам (перемещения внутриклеточных элементов в клетке, а также настические движения и тропизмы целых растений или отдельных их частей). В живых клетках ряда растений наблюдается движение цитоплазмы, обнаруживающей сходство с мышечным сокращением. Это явление (особенно непрерывное

круговое

движение

цитоплазмы,

называемое

циклозом)

часто

наблюдается в харовых водорослях, у высших растений в листьях элодеи и чешуе лука, а также в пыльцевых трубка прорастающей пыльцы разных видов. В растениях и даже микроорганизмах сократительные элементы клетки также чувствительны к медиаторам, особенно в реакциях подвижности, указанных на схеме:

8

По данным советских исследователей (Ониани с сотрудниками 1975, 1977) в клетках Nitella наблюдается замедление движения цитоплазмы при содержании ацетилхолина в среде 10-7-10-6 М, и оно полностью прекращается при более высоких концентрациях. Это явление обратимо и, если отмыть клетки от действующего вещества, скорость движения возвращается к своему исходному уровню. Адреналин и норадреналин примерно в тех же концентрациях замедляют циклоз в клетках этой же

харовой

водоросли.

При

более

высоких

концентрациях

наблюдаются

необратимые изменения, приводящие клетки к гибели. Связь этих явлений с действием биомедиаторов на сократительные белки подтверждается опытами японского

ученого

Ториямы

(Тоriyama,

1975,

1978),

который

исследовал

сократительные свойства протопластов отдельных клеток корней Phaseolus aureus и показал, что они чувствительны к экзогенному ацетилхолину. Протопласты клеток перицикла корневых верхушек были также способны к сокращению под влиянием ацетилхолина. В связи с этим было высказано предположение, что в чувствительных к ацетилхолину клетках растений протоплазматическая мембрана включает сократительные белки. Польскими исследователями (Tretyn et al., 1990) показано, что ацетилхолин также индуцирует Са2+-зависимое набухание (поглощение жидкости) протопластов мезофилла листа этиолированных проростков пшеницы Triticum aestivum. Набухание протопластов у проростков пшеницы может быть вызвано ацетилхолином

и

также

другими

гормональными

веществами

путем

их

взаимодействия с рецепторами плазматической мембраны, связанными с ионными K+/Na+ каналами и чувствительным к ГТФ-регулируемому Ca2+ каналу. Связь сократительных систем клетки с работой ионных каналов хорошо прослеживается в движении замыкающих клеток устьиц, регулирующих открываниезакрывание устьичной щели (открывание и закрывание за счет тургора замыкающих клеток) стеблей и листьев. В опытах работах американских (Madhavan et al., 1996) и китайских ученых (Liu et al., 1998; 2004) было установлено, что движения устьиц контролируются работой калиевых каналов, управляемых ацетилхолином. Например,

9

в устьицах Vicia faba K+- ток внутрь клеток увеличивается при добавлении во внешнюю среду 0, 1 мкМ ацетилхолина на 45 %, тогда как при более высоких концентрациях медиатора (1 или 5 мкМ) – падает соответственно на 42 или даже 67 %. Сократительные белки, по-видимому, играют определенную роль также в передаче и распространении хемосигналов с поверхности внутрь клетки. На одноклеточных системах (вегетативные микроспоры хвоща полевого Equisetum arvense и генеративные микроспоры − пыльца гиппеаструма Hippeastrum hybridum) было изучено (Рощина, 2005, 2006) участие контрактильных компонентов в передаче хемосигнала с поверхности клетки к органеллам. В частности рассматривался путь сигнала к ядру с поверхности клетки по контрактильным белкам. В качестве хемосигналов использовали нейротрансмиттеры дофамин и серотонин, которые стимулировали прорастание микроспор. Если до добавления в среду трансмиттеров клетки обрабатывали цитохалазином В (ингибитор полимеризации актина в микрофиламентах), колхицином и винбластином (ингибиторы полимеризации тубулина в микротрубочках), то у обоих типов микроспор наблюдали ингибирование развития. На основании этих данных выдвинуто предположение, что передача сигнала от нейротрансмиттеров с поверхности внутрь клетки проходит с участием сократительных белков. Котрактильные системы проводящих тканей растений также чувствительны к нейротрансмиттерам. Профессор Жолкевич с соавторами (1979, 1989) обнаружили значительную (на 40-50% от контроля) стимуляцию ацетилхолином (5 х 10-5—10-3 М) корневого давления у подсолнечника Не1ianthus annuus и экссудации ксилемного сока проростками кукурузы Zea mays. Норадреналин, адреналин и серотонин также стимулировали экссудацию ксилемного сока корней этих растений. Наблюдаемые эффекты

эти

контрактильные

авторы белки

объясняют (особенно

с

воздействием актином)

нейротрансмиттеров

сосудов

растений.

на

Недавним

подтверждением этому стали эксперименты китайских исследователей (Yung et al., 2007), в которых показано, что ацетилхолин ускорял транспорт ассимилятов, управляемый актиновыми филаментами флоэмной сосудистой системы у проростков редиса Raphanus sativus. В исследованиях влияния нейротрансмиттеров – биомедиаторов на двинательные реакции растений особое внимание привлекают растения, реагирующие быстрыми движениями на разнообразные внешние факторы, в том числе и химические вещества. У некоторых видов семейства бобовых (Albizzia julibrissin. Mimosa pudica, Samanea saman) происходит быстрое складывание листьев в результате изменения

10

тургорного давления в особых моторных клетках (органах движения). Такие специальные моторные клетки с тонкой кутикулой найдены в особых расширениях, называемых подушечками, которые располагаются у основания черешка или мелких черешочков листьев бобовых растений (Рис.2-3 и 2-4). Благодаря изменению тургорного давления (связано с приливом и отливом воды) в этих клетках, расположенных

на

разных

сторонах

подушечек,

осуществляется

быстрое

складывание и опускание листьев при механическом прикосновении к растению.

Рис.2-3. Развернутые (A)и сложенные (Б) дваждыперистые листья у Mimosa pudica (сем. Musaceae (Fabaceae). Стрелками показаны органы движения – подушечки (утолщения) в основании черешков и черешочков

С подушечками связывают передачу электрического сигнала по растению в виде потенциала действия, который возникает при участии медиаторов. Специально проведенные опыты показали, однако, что концентрация эндогенного ацетилхолина в листьях и листовых подушечках у мимозы Mimosa pudica оказалась примерно одинаковой, да и добавленный извне ацетилхолин в концентрациях 10-5- 10-7 М не вызывал листовых движений. Есть основания полагать, что в движениях таких растений принимает участие не ацетилхолин, а норадреналин, поскольку его содержание в подушечках и осях больше, чем в листовых пластинках. Вместе с тем, функции ацетилхолина и гидролизующего его фермента ацетилхолинэстеразы ассоциируются с подвижностью листьев в некоторых других видах бобовых растений, чувствительных к механическому раздражению или тепловому стрессу. Так у фасоли темнопурпурной Macroptilium atropurpureum японские исследователи (Momonoki and Momonoki,1993) обнаружили, что количество ацетилхолина во вторичных подушечках (черешочек - утолщение тройчатых листьев) этого вида обычно выше, чем в листе, а в первичных подушечках (черешок у места ветвления листовых побегов) – ниже (рис.2-4). Причем активность ацетилхолинэстеразы в

11

первичных подушечках была в 4-12 раз выше, чем в листьях, черешках, стебле и

Рис. 2-4. Первичные и вторичные подушечки черешков листьев Macroptilium atrop Sessé ex DC. (Fabaceae) управляют складыванием и развертыванием листовых п тонких срезах обнаружена ацетилхолинэстеразная активность.

корнях. Содержание ацетилхолина в листе падало в два раза после теплового воздействия (30 оС в течение 3 мин вместо 20-22оС), но в такой же степени возрастало в первичных и падало во вторичных подушечках. Тепловой стресс вызывал увеличение активности ацетилхолинэстеразы (возможно вследствие возрастания количества ацетилхолина) в первичных подушечках в 4 раза, а во вторичных - в 2 раза. Это сопровождалось пониканием листьев и закручиванием черешков при тепловом раздражении (Рис.2-5). Погружение отделенных поникших побегов в

Рис.2-5. Вторичные подушечки (показано стрелками) листьев Macroptilium atropurpureum (Fabaceae) управляют складыванием и развертыванием листовых пластинок. А. – без воздействий, Б – после 3 минутной экспозиции при 30оС.

раствор ацетилхолина ускоряло восстановление обычного вида растения. Считалось, что ацетилхолин может действовать только внутри организма. Однако показано его участие и во взаимоотношениях между организмами. Ацетилхолин может играть важную роль в поддержании симбиоза клубеньковые бактерии бобовое растение, так как он регулирует подвижность клубеньковых бактерий (Rhizobium)

в

почвенном

растворе.

В

клубеньках

найден

фермент

ацетилхолинэстераза, гидролизующий ацетилхолин. Кроме того, установлено, что ацетилхолин вымывается из листовых волосков крапивы, где он содержится в

12

значительных количествах. Таким образом, при дожде, тумане и росе почва, на которой произрастает крапива, может быть обогащена холиновыми эфирами, что оказывает влияние на сопутствующие организмы. Известна также роль ацетилхолина в подавлении у бактерий хемотаксиса, например у Pseudomonas fluorescens, что может рассматриваться как результат активности соединений, экскретируемых некоторыми видами растений. Действие ацетилхолина может быть очень заметным. Так при концентрации 1,5 х 10-3 М он на 30% ингибирует подвижность фотосинтезирующих бактерий Rhodospirillum rubrum и Thiospirillum jenenese. Катехоламины и серотонин также проявляют активность при хемотаксисе бактерий, что подтверждает их влияние на сократительные белки. 2.3. Мембранные процессы. Основной механизм действия медиаторов в животных клетках состоит в изменении транспортных характеристик мембран. Аналогичные явления наблюдаются и в растениях. В растительных клетках биомедиаторы изменяют проницаемость мембран, мембранный потенциал и связанные с ним процессы, как показано на схеме:

Модификация мембранных характеристик под влиянием ацетилхолина и биогенных аминов наблюдается как на целых клетках, так и в изолированных органеллах. 2.3.1. Ионная проницаемость, ионные каналы и мембранный потенциал целых растительных клеток Ацетилхолин. Первой работой, в которой, показано, что ацетилхолин способен увеличивать ионную проницаемость растительных мембран и вызывать изменения мембранного потенциала, было исследование, проведенное Джаффе (Jaffe, 1970). Он установил, что под влиянием ацетилхолина, также как и красного света, протоны выходят из клеток корней растений в наружную среду, в результате чего возникает положительный биоэлектрический потенциал. Это же подтверждено экспериментами японского автора Танады (Tanada, 1972), показавшего, что на красном свету

13

корневые окончания этиолированных проростков Phaseolus aureus прилипают к отрицательно заряженной стеклянной поверхности (эффект Танада), и такой же эффект

деполяризации

вызывает

ацетилхолин.

В

таблице

2-1

приведены

современные данные о влиянии ацетилхолина на мембранный потенциал и ионную проницаемость у разных растений. Чаще всего под влиянием ацетилхолина (10-6-10-4 M) происходит деполяризация - снижение мембранного потенциала покоя и изменение К+ проницаемости клеток. Проницаемость плазмалеммы целых клеток проростков и водорослей хары и нителлы обычно увеличивается для ионов K+, Са2+, Сl-, и часто

сопровождается секрецией

Таблица 2-1. Изменения мембранного потенциала и ионной проницаемости растительных клеток под действием ацетилхолина. Растение Avena spp.

Орган Колеоптили

снижается Степень деполяризации увеличивается клетки снижается Nitella (деполяризация) корни снижается Phaseolus (деполяризация) aureus Гипокотили снижается Phaseolus этиолирированных (на слабом синем vulgaris проростков свету) корни снижается Pisum sativum (деполяризация) хлоропласты снижается Pisum sativum (деполяризация) Сhara carolina

Вакуоль Клетки

Мембранный потенциал снижается

Ионная проницаемость Ca+2 и H+ проницаемость увеличивается СI - - проницаемость увеличивается K + проницаемость увеличивается H+ проницаемость увеличивается K+ проницаемость увеличивается K+ проницаемость увеличивается Na+/K+ проницаемость увеличивается

протонов в окружающую среду. При этом мембранный потенциал снижается примерно с - 136 до - 123 мВ. Снижение мембранного потенциала ацетилхолином наблюдается и в других опытах. Например, разность потенциалов между верхушкой и местом среза этиолированного гипокотиля фасоли Phaseolus vulgaris,обычно составляет около -30 мВ, а на синем свету с длиной волны 430 нм до - 37 мВ, т.е происходит гиперполяризация. Добавление ацетилхолина может подавить эффект, вызвав снижение мембранного потенциала. Изменения проницаемости плазмалеммы под влиянием экзогенного ацетилхолина напоминают явления, происходящие в синапсах животных клеток, где ацетилхолин, вступая в контакт с постсинаптической мембраной, вызывает увеличение проницаемости для ионов Na+ и К+, и тем самым генерируют потенциал действия, распространяющийся по организму. Сложные двигательные и ростовые реакции также зависимы от регуляции ацетилхолином работы ионных каналов. Благодаря исследованиям американских (Madhavan et al., 1995) и китайских исследователей (Wang et al. 1998; Meng et al..

14

2004) установлено, что роль ацетилхолина в открывании и закрывании устьиц связана с участием в регуляции K+ и Ca2+ - каналов, а также Ca-регулирующих систем. Например, K+ поток внутрь замыкающих клеток устьиц стимулируется при низких (< 10-6М) концентрациях ацетилхолина, и ингибируется – при более высоких. В двигающихся под влиянием изменения тургора замыкающих клетках обнаружено и присутствие

ацетилхолинэстеразы.

В

связи

с

этим

предположили,

что

холинэргическая регуляторная система участвует в двигательных реакциях устьиц, причем особая роль отведена ацетилхолину как регулятору открывания K+- каналов. Эффекты экзогенного ацетилхолина при добавлении солей калия или кальция на вторичные подушечки листьев фасоли темнопурпурной Macroptilium atropurpureum, закрывающихся при механическом или тепловом раздражении (Рис.2-4 и 2-5) исследовались

японскими

учеными

(Momonoki

and

Momonoki,1992).

Они

обнаружили, что погружение отделенных от растения поникших побегов в раствор ацетилхолин (0,1-1 мкМ) в присутствии солей калия или кальция значительно ускоряет восстановление обычного вида растения. Возможно, что ацетилхолин контролирует ионные или гормональные потоки, вызывающие открывание ионных каналов вторичных подушечек листьев. Биогенные амины. Подобно ацетилхолину биогенные амины также способны изменять проницаемость мембран и мембранный потенциал растительных клеток. В таблице 2-2 сравниваются эффекты дофамина, норадреналина, серотонина и гистамина на ионную проницаемость клеток. В дисках из корнеплодов красной свеклы, дофамин достоверно уменьшал выход из клеток Ca2+ и Mg2+, а норадреналин увеличивал выход ионов Na+ . Серотонин и гистамин угнетали активный транспорт Na+ через плазмалемму. Гистамин, кроме того, снижал и Mg2+ поток наружу. Помимо Таблица 2-2. Действие биогенных аминов (10-6 M) на проницаемость мембран (выход ионов из и бетацианина из мембран спустя час после начала опыта) клеток корнеплода красной свеклы Beta vulgaris var. rubra на (Roshchina 2001) Нейротрансмиттер

Контроль Дофамин Норадреналин Серотонин Гистамин

Ионы , мкг/л Na+ 3.47±0.03 0.95±0.08* 3.38± 0.02 1.03± 0.10 0.77± 0.005

K+ 5.30±0.01 4.8± 0.5 5.30± 0.5 4.80± 0.05 4.30±0.04

Бетацианин (A 540 nm) Ca2+ 6.51±0.03 3.35±0.02 6.61± 0.05 1.60 ± 0.07 3.95± 0.3

Mg2+ 5.80± 0.02 5.8± 0.01 4.8± 0.5 5.30± 0.5 4.80± 0.05

Нет эффекта Нет эффекта Нет эффекта стимулирует стимулирует

эффектов на плазмалемму, под действием серотонина и гистамина наблюдался выход из вакуолей в наружную среду красного пигмента бетацианина, что указывает и на повышение проницаемости тонопласта вакуоли. В заключение отметим, что

15

биогенные амины чаще стимулируют проницаемость для Са2+ , тогда как ацетилхолин - для Na+ и К+. 2.3.2. Ионная проницаемость и мембранный потенциал органелл. В отличие от животных, у растений передача сигнала от клетки к клетке идет не по щелевым синаптическим контактам с участием биомедиаторов, а через непрерывные тяжи цитоплазмы (симпласт). Следовательно, в растительных клетках ацетилхолин и другие медиаторы участвуют в передаче сигнала по плазматическим тяжам внутри клеток. Поскольку медиаторы присутствуют и в одноклеточных организмах, можно полагать, что у них существует передача сигнала с помощью биомедиаторов от плазмалеммы к органеллам и между органеллами. В связи с предположением о роли медиаторов во внутриклеточной сигнализации были выполнены работы по изучению влияния ацетилхолина и биогенных аминов на отдельные органеллы. Ацетилхолин. Первые исследования влияния медиаторов на изолированные органеллы были выполнены на митохондриях, выделенных из различных органов животных. При обработке митохондрий ацетилхолином (10-3 М) отмечено торможение их набухания. Российскими исследователями (Roshchina, Mukhin, 1985) обнаружено аналогичное явление на изолированных хлоропластах гороха. Так ацетилхолин (10-4-10-3 М) тормозил набухание хлоропластов в изотонической среде, причем на свету в большей мере, чем в темноте. Набухание, как известно, связано с поступлением воды внутрь органеллы по градиенту, где выше концентрация ионов по сравнению с цитоплазмой. Поскольку высокие концентрации ацетилхолина (10-3 М) тормозят процесс, то следует предположить, что медиатор увеличивает проницаемость мембран хлоропластов для ионов. Об этом свидетельствуют и данные по изменению мембранного потенциала пластид, косвенным показателем которого является светоиндуцированное изменение адсорбции при 520 нм. В проведенных опытах рост содержания ацетилхолина в среде приводил к уменьшению величины А520

нм

на 40%. Этот эффект можно рассматривать как снижение мембранного

потенциала . Чтобы

установить,

выделением

каких

ионов

можно

объяснить

падение

мембранного потенциала пластид при действии ацетилхолина, были поставлены специальные опыты с интактными хлоропластами гороха. При добавлении к ним ацетилхолина происходил выход из пластид ионов Na+ и К+ (Рис. 2-6). При этом

16

Рис.2-6. Концентрационная зависимость действия ацетилхолина бромида на выделение ионов Na+ и К+ интактнымн хлоропластами гороха (Roshchinа, 1987; Рощина, Мухин, 1987)

концентрация ионов в среде соответственно увеличивалась. Концентрационные кривые выходили на плато при концентрации ацетилхолина 10-6- 10-5 М. Возможно, это свидетельствует о том, что места связывания ацетилхолина в мембранах хлоропластов имеют ограниченную емкость. Реакция была одинаковой независимо от того, были ли пластиды освещены или находились в темноте. Концентрация Na+ в окружающем растворе, вследствие выхода ионов из пластид, увеличивалась в 15 раз по сравнению с исходной, а содержание К+- в два раза. Выход ионов Na+ и К+ сопровождался

поглощением

ионов

водорода

в

темноте

как

интактными

хлоропластами, так и тилакоидами. Ацетилхолин может регулировать движение молекул через мембраны за счет взаимодействия с липидной фракцией мембран. Это вероятно, поскольку установлено, что при низких концентрациях (10-8 М) ацетилхолин ингибирует включение радиоактивного фосфора в фосфолипиды, которые контролируют транспорт веществ в клетках животных. Изменения мембранного потенциала и проницаемости для некоторых ионов происходят под влиянием ацетилхолина также в вакуолях. Например, в присутствии ацетилхолина (0.1- 4 мМ) отмечается зависимая от хлорных каналов деполяризация как плазмалеммы и тонопласта харовой водоросли Chara corallina. В дисках корнеплода красной свеклы ацетилхолин стимулировал выход ионов кальция из плазмалеммы, и напротив снижал натриевый поток наружу. При этом эффект затрагивал и тонопласт, поскольку наблюдалось усиление экссудации красного пигмента бетацианина, локализованного в вакуолях. Биогенные амины. В отличие от ацетилхолина, норадреналнн, адреналин и серотонин не влияют на выход К+ и Na+ из хлоропластов, но стимулируют выделение ионов Ca2+ и Mg2+ . В хлоропластах найдены кальциевые каналы и кальций-регулирующий белок кальмодулин. Возможно, что это - главная мишень для биогенных аминов в пластидах.

17

2.4. Энергетические и метаболические реакции Действие медиаторов на рост может быть опосредовано стимуляцией или ингибированием реакций обмена веществ и энергии, оцениваемым по скорости электронного транспорта и сопряженного фосфорилирования, флуоресценции, разнообразным процессам окисления-восстановления и т.д., как показано на схеме:

2.4.1. Энергетические процессы Электронный транспорт и сопряженное фосфорилирование. В 70е годы целым рядом исследователей было установлено, что даже небольшие количества ацетилхолина (10 нМ) вызывают 70% падение уровня эндогенного АТФ как в изолированных митохондриях корней бобов Phaseolus aureus так и в стеблях фасоли Phaseolus vulgaris. В проявлении эффектов ацетилхолина большую роль играет свет. Красный свет сам по себе значительно увеличивает уровень АТФ в этиолированных зародышевых почках фасоли, а ацетилхолин почти наполовину снижает его. Снижение уровня аденозинтрифосфата отмечали и в изолированных митохондриях вторичных корней фасоли, при этом ацетилхолин стимулирует поглощение кислорода этими органеллами. В изолированных хлоропластах гороха Pisum sativum низкие концентрации ацетилхолина (<10-5 М), увеличивают скорость фотофосфорилирования по сравнению с контролем в два раза, а в более высоких – угнетают, при этом не влияя на электронный транспорт (Рис. 2-7). Предполагают, что стимуляция синтеза АТФ на свету в хлоропластах обусловлена действием на АТФ-синтетазу, поскольку ацетилхолин снижает Mg2+-зависимую светоиндуцируемую АТФазную активность этого фермента (Рис.2-7).

18

Рис. 2-7. Концентрационная зависимость действия ацетилхолина на фотовосстановление НАДФ+ (I) , сопряженное фотофосфорилирование (2) и активность Mg2-зависимой светоиндуцированной АТФазы хлоропластов гороха (3) (Poщина, Мухин, 1987; Roshchina, 2001)

Влияние биогенных аминов на изолированные клеточные органеллы мало изучено. Известно лишь, что в низких концентрациях адреналин стимулирует окислительное фосфорилирование в митохондриях печени крысы на 23-30%. Серотонин в концентрации 7,2 х 10-4 М ингибирует поглощение кислорода клетками дрожжей Sachcharomyces cerevisiae. Действие биогенных аминов на энергетические реакции митохондрий растений пока не исследовано. Более детально изучены эффекты биогенных

аминов на

фотохимическую

активность

хлоропластов.

Дофамин,

адреналин, норадреналин, серотонин и гистамин не влияли на фотовосстановление НАДФ+, но в низких концентрациях (<10-5 М) все эти соединения, исключая серотонин, стимулировали сопряженное фотофосфорилирование. Максимальная стимуляция синтеза АТФ (в два раза) наблюдалась при концентрациях катехоламинов 10--8

-10--7

М.

Примерно

в

тех

же

концентрациях

повышал

скорость

фотофосфорилирования и ацетилхолин. Реакции окисления-восстановления. Дофамин, адреналин и норадреналин как соединения, имеющие двойные связи и гидроксильные группы, могут вступать в окислительно-восстановительные реакции присоединения и отдачи электронов и протонов. Простейшая реакция автоокислення катехоламинов происходит при переносе электронов на молекулярный кислород воздуха, с возможным образованием перекиси. Этот процесс значительно ускоряется в присутствии ионов металлов Fe2+, Fe3+, Сu2+, которые образуют комплексы с катехоламинами (К-Ме) и реагируют с кислородом (перекисью водорода) согласно уравнению Фентона

19

В бескислородной среде медь и железо образуют комплекс с катехоламинами в соотношении 1:2, например с адреналином, который на воздухе легко превращается в адренохром, а затем в щелочной среде в присутствии аскорбата - в адренолютин. Адренохром легко образуется в присутствии ионов Fe3+и Сu2+и с еще большей скоростью (в 2-3 раза) - железосодержащих белков - ферритина, метгемоглобина, окисленного цитохрома С. Это окисленное производное адреналина является токсичным продуктом для тканей животных и в ряде случаев служит причиной различных заболеваний при накоплении катехоламинов организмом в стрессовых условиях. Эксперименты с изолированными переносчиками электронов хлоропластов: ферредоксином, ферредоксин-НАДФ-редуктазой, пластоцианином из гороха, а также цитохромом f (С553) из хлореллы показали, что в присутствии кислорода воздуха в высоких концентрациях (>-10-5 М) дофамин, норадреналин и адреналин могут вступать в окислительно-восстановительные реакции с переносчиками электронов, расположенными между фотосистемами 2 и 1. Способность катехоламинов быть донорами электронов в ЭТЦ проверялась и подтвердилась на изолированных хлоропластах. Показано также, что экзогенный дофамин, как оксидант, может участвовать в механизме разложения воды при освещении гран хлоропластов шпината. Кислород, образуемый хлоропластами, может также окислять адреналин до красного продукта адренохрома, и это окисление происходит на уровне фотосистемы 2. Флуоресценция интактных клеток и отдельных клеточных компонентов. Флуоресценция служит важным показателем сопряжения энергетических процессов в клетке. Ацетилхолин и биогенные амины оказывают влияние на флуоресценцию изолированных пигментов и интактных клеток. Например, в ряде экспериментов обнаружено значительное тушение флуоресценции изолированного фикоэритрина водорослей адреналином, норадреналином, дофамином , серотонином и гистамином. В

работах

сотрудников

Института

биофизики

клетки

РАН

показано,

что

автофлуоресценция клеток поверхности рыльца пестика гиппеаструма Hippeastrum hybridum резко изменяется при добавлении ацетилхолина или гистамина (Рис.2-8).

20

Рис. 2-8. Спектры автофлуоресценции рыльца пестика гиппеаструма Hippeastrum hybridum в присутствии нейротрансмиттеров 10-5 М и пыльцы (Roshchina, 2001)

При этом изменяется форма спектров флуоресценции и увеличивается интенсивность эмиссии. Пыльца собственного вида (которая содержит ацетилхолин), добавленная к необработанному пестику вызывает такие же изменения в спектре флуоресценции клеток, как и ацетилхолин. Поскольку пыльца ряда видов содержит и выделяет ацетилхолин и гистамин, по-видимому, именно эти медиаторы вызывают характерные изменения свечения. 2.4.2. Метаболические процессы Ацетилхолин и биогенные амины могут влиять на метаболизм растительных клеток путем регуляции активности ферментов и(или) включения в отдельные реакции в качестве субстратов. Эти реакции показаны на схеме:

Регуляция активности ферментов биомедиаторами демонстрируется рядом примеров. Ацетилхолин в концентрациях 10-4- 10-3 М стимулирует пероксидазную активность растительных тканей, а в более высоких – угнетает (ингибирование достигает 50%). У ячменя Hordeum vulgare он также ингибирует активность фенилаланинаммоний лиазы, ключевого фермента синтеза фенолов. Имеются данные об ингибировании ацетилхолином, адреналином и норадреналином активности

21

светоиндуцируемой Мg2+-зависимой АТФазы хлоропластов гороха. Известна также способность гистамина подавлять лизоцимную активность латекса Asclepias syriaca. Ацетилхолин и биогенные амины могут включаться в метаболизм клетки и как субстраты-предшественники для образования различных метаболитов. Ацетилхолин служит предшественником холина при образовании других холиновых эфиров, катехоламины - предшественники ванилиновой кислоты и алкалоидов, а серотонин предшественник как алкалоидов, так и 5-гидроксииндолилуксусной кислоты. Ацетилхолин может также включаться в метаболический путь биосинтеза этилена на уровне

1-амино-циклопропан-1-карбоновой

кислоты,

ингибируя

тем

самым

образование этого газа. Существенно отметить, что при окислении катехоламинов образуются их свободные радикалы и супероксид анион радикал, которые весьма токсичны и могут окислять различные соединения. Благодаря этому окислительному механизму многие растения способны противостоять инфекциям, а у ряда водорослей присутствие , например. Дофамина, помогает в конкуренции за жизненное пространство против поедания морскими животными. Общую

схему

реакций,

которые

чувствительны

к

нейротрансмиттерам

(биомедиаторам) можно представить следующей cхемой:

В заключение отметим, что нейротрансмиттерные вещества участвуют в распространении возбуждения в виде электрического сигнала и выполняют функцию

22

химических посредников между клетками, а также между органеллами внутри клетки. При этом происходят изменения мембранного потенциала вследствие изменений ионной проницаемости мембран, сдвиги в сопряжении электронного транспорта и фосфорилирования в хлоропластах и митохондриях, многочисленные окислительновосстановительные реакции, в том числе с образованием активных форм кислорода. Биомедиаторы-нейротрансмиттеры регулируют метаболические и энергетические процессы, способствуя адаптации организма к изменениям окружающей среды как модуляторы. Адреналин, норадреналин и серотонин могут выступать в качестве гормонов и активных компонентов азотного обмена. В конечном итоге, наблюдаемые двигательные

реакции,

нейротрансмиттеров

изменения

свидетельствуют

раздражимости растений.

роста об

их

и

развития

важнейшей

под роли

влиянием в

явлениях

1

ГЛАВА 3. СИСТЕМЫ РЕГУЛЯЦИИ С УЧАСТИЕМ АЦЕТИЛХОЛИНА И БИОГЕННЫХ АМИНОВ В

тканях

животных

холинергическая,

функционируют

адренергическая,

сложные

серотонинергическая,

системы

регуляции

-

дофаминергическая

и

гистаминергическая. В состав компонентов каждой из систем регуляции включен низкомолекулярный медиатор, ферменты его синтеза и катаболизма, чувствительный к нему рецептор. Они участвуют в оперативном восприятии и передаче внешнего возбуждения по организму и реализации быстрой ответной реакции. Направленная передача сигнала осуществляется в особых контактах - синапсах, состоящих из двух клеток, разделенных узкой синаптической щелью с помощью диффундирующих ацетилхолина и биогенных аминов. Медиатор синтезируется в аппарате Гольджи пресинаптической клетки и хранится в секреторных пузырьках, из которых при возбуждении экскретируется в сннаптическую

щель,

постсинаптической

и

клетки

затем -

диффундирует

приемнику

к

сигнала.

плазматической Соединяясь

с

мембране рецептором

плазматической мембраны, медиатор передает информацию (Рис.3-1). При этом возбужденный рецептор претерпевает конформационные изменения, в

Рис.3-1 . Последовательность передачи информации в клетке с участием нейромедиаторов как хемосигналов.

2

результате чего происходит: 1. Изменение проницаемости этой мембраны путем открывания ионных каналов или 2. С участием G-белков (белков трансдуцинов) производится включение системы синтеза вторичных внутриклеточных посредников регуляторов (циклических АМФ и ГМФ, ионов Са2+, инозит фосфата. диацилглицерола и др.). И в том, и в другом случае формируется быстрая ответная реакция клетки на раздражение. Последовательность регуляции с участием вторичных мессенджеров показана на рис. 3-1. В отличие от животных, в растениях нет нервной системы и синапсов, а, следовательно, специализированной передачи нервного импульса. Однако в них присутствуют соединения, которые являются медиаторами у животных и могут вызвать заметные физиологические изменения в растительных клетках (глава 2). Аналогичное явление характерно и для низкоорганизованных животных организмов, не обладающих нервной системой, и эмбрионов. Это дало основание предполагать присутствие компонентов

холинергической,

адренергической,

дофаминергической

и

серотонинергической систем в любой живой клетке. В основе механизма чувствительности и узнавания нейротрансмиттера лежит его

рецепция

специальным

белком

рецептором.

Рецептор

связывает

лиганд,

соединение, которое может быть самим нейротрансмиттером, а также его агонистом (имитатором, вызывающим такой же эффект, как и трансмиттер) или антагонистом (веществом,

блокирующим

проявление

эффекта

трансмиттера).

Например,

холинорецептор животных представляет собой гликопротеид, имеющий сродство к ацетилхолину

и

определенным

фармакологическим

агентам,

которые

могут

блокировать физиологическое действие ацетилхолина (антагонисты) или наоборот имитировать его (агонисты). В физиологии животных обычно исследуются изменения мембранных потенциалов, потенциалов действия, Na+ -K+ обмена. Хотя представления о рецепции сложились в физиологии животных, но в настоящее время они распространены и на анализ действия гормонов и медиаторов в других живых системах. Одним из основных отличий рецепторного связывания от нерецепторного является быстрый физиологический ответ на медиаторный или гормональный эффектор и соответствующие величины констант связывания (для животных >10-9 М и ниже). Для изучения свойств изолированного или связанного в мембране рецептора используются два метода: фармакологический и метод радиоактивных меченых лигандов или их комбинации. Лиганды - соединения, связывающиеся с рецептором, причем

одни

из

них

являются

агонистами,

а

другие

антагонистами.

3

Фармакологический метод состоит в получении концентрационных кривых действия нейротрансмиттера (биомедиатора), его агонистов и антагонистов на отдельные реакции исследуемого органа, ткани, клетки, органеллы, управляемых рецепторами. Метод радиоактивных лигандов заключается обычно в выделении рецепторов или обогащении ими препаратов с последующим изучением кинетических характеристик их связывания с лигандом. Методы молекулярной биологии, такие как клонирование, используются далее для подтверждения существования рецепторов на уровне генов. Характерными признаками присутствия рецепторов для медиаторов и гормонов в мембранах животных и растений считаются следующие: 1. Рецептор должен проявлять высокую избирательность (различать его по структуре) и специфичность в отношении исследуемого лиганда (соединения). 2. Эффект должен вызываться низкими концентрациями (10-10- 10-7 М) трансмиттера или его агониста и быть избирательно чувствителен именно к этим соединениям. 3. Кинетика связывания лиганда должна описываться кривой с насыщением - условие, свидетельствующее о том, что число рецепторных молекул в мембране или клетке ограничено. 4. Антагонисты агента-эффектора, связываясь с рецептором, должны препятствовать проявлению индуцированной эффектором реакции. Изучение мембранных рецепторов к любому физиологически активному соединению основывается на анализе концентрационных кривых “доза- эффект” в присутствии

агонистов

и

антагонистов.

Сродство

вещества

к

возможному

мембранному рецептору анализируют по константам связывания лиганда (медиатора, агониста, антагониста) с рецептором (КС) и диссоциации комплекса “рецепторлиганд” (KD). У животных, обладающих нервной системой, с помощью меченых лигандов и генетического клонирования выделены типы и подтипы отдельных рецепторов (указания на них есть в специальной литературе). Для растений чаще используется термин “функциональные аналоги рецепторов животных”, поскольку это – пока слабо изученная проблема. 3.1. Холинергическая система регуляции Холинергическая система регуляции животных включает в себя четыре компонента ацетилхолин,

холинорецептор,

фермент

синтеза

ацетилхолина

холинацетилтрансферазу и фермент его гидролиза холинэстеразу 3.1.1. Холинорецепция Ацетилхолиновый рецептор был впервые выделен в начале 70-х годов из электрического ската Torpedo с помощью полипептидных нейротоксинов из яда змей

4

французскими исследователями (Changeux et al., 1984; Changeux, Revah, 1987), При взаимодействии

с

ацетилхолином

рецептор

претерпевает

конформационные

изменения, ведущие к образованию трансмембранного ионного канала, или управлению работой уже существующих ионных каналов. По чувствительности к некоторым агонистам ацетилхолина никотину или мускарину (Рис.3-2) различают никотиновые и мускариновые холинорецепторы. Эти два типа холинорецептора блокируются разными антагонистами ацетилхолина: никотиновые - d-тубокурарином и α-бунгаротоксином, а мускариновые – атропином и хинуклидинилбензилатом.

Рис. 3-2. Агонисты и антагонисты ацетилхолина

Никотиновый холинорецептор, полученный из тканей животных, представляет собой сложный белок с молекулярной массой 250-300 кДа и состоит из 5-6 субъединиц 2α,β, γ, σ, с смолекулярной массой примерно 40, 48, 58 и 66,5 кДа, которые образуют ионный канал (Рис. 3-3).

Рис.3-3. Схема расположения никотинового холчнорецептора в мембране животных клеток. Отдельные субъединицы рецептора образуют натриевый канал IQberthur et at. 1987].

5

Действие рецептора можно представить себе в виде двуступенчатого процесса связывания лиганда и инициации сигнала действия. При возбуждении нервной клетки а-субъединица

холинорецептора

связывает

ацетилхолин,

происходят

конформационные изменения белка, и канал открывается. В отличие от никотинового рецептора, мускариновый холинорецептор управляет работой ионного канала, но сам его

не

образует.

Холинорецептор

имеет

два

активных

центра

связывания

ацетилхолина. Первый - отрицательно заряженный анионный центр, в который входят карбоксильные группы глутамата или аспартата. Этот участок рецептора вступает во взаимодействие с положительно заряженной катионной “головкой” молекулы ацетилхолина. Второй - эстерофильный положительно заряженный центр взаимодействует с карбоксильной группой и кислородом эфирной связи молекулы биомедиатора. Реализация второй ступени, т.е. инициация сигнала, может осуществляться двумя различными путями. Первый путь заключается в том, что рецептор действует, как ионофор, открывая ионный канал. Это ведет к импульсному поступлению Na+ в клетку и выходу из нее К+. При этом мембранный потенциал резко снижается. Когда деполяризация мембраны достигает определенного значения, возникает потенциал действия, вызывающий спонтанное открывание потенциал-зависимых ионных каналов. Таким образом, потенциал действия распространяется в виде электрического импульса

по

мембране.

Продолжительность

импульсов

лежит

в

пределах

миллисекунд. Советские исследователи Гунар и Синюхин (1958-1960 гг.) показали также образование потенциала действия и у растений. Описанный путь инициации сигнала характерен для никотинового типа холинорецепторов. Другой путь инициации сигнала с участием рецептора (чаще мускаринового типа) состоит в том, что он включает пусковые механизмы систем синтеза вторичных посредников (мессенджеров). При этом происходит активация аденилатциклазы, катализирующей образование вторичного мессенджера цАМФ на внутренней стороне плазмалеммы, что, в свою очередь, вызывает целый каскад реакций внутри клетки (см. Рис. 3-16). Скорость ответной реакции в этом случае ниже, чем ионофорного механизма и составляет от десятых долей секунд до нескольких секунд. Так наряду с возможным открыванием ионных каналов, связывание ацетилхолина с мускариновым рецептором сопровождается увеличением концентрации циклических нуклеотидов цАМФ и цГМФ и образуемых при гидролизе фосфатидилинозитол фосфата диацилглицерола

и

инозитолфосфата.

Взаимодействие

рецепторами приводит только к открыванию ионных каналов.

же

с

никотиновыми

6

Холинорецепция в растениях. Обнаружение ацетилхолина, ферментов его синтеза и

гидролиза

в

холинорецепторов

растениях в

инициировали

растительных

объектах.

и

исследования

возможных

Целенаправленные

поиски

холинорецептора у растений с использованием фармакологического метода были сделаны впервые Джаффе и Тома [Jaffe, Thoma, 1973]. В таблице 3-1 представлены основные реакции растений, чувствительные к ацетилхолину, его агонистам и Таблица 3-1. Реакции растений, чувствительные к ацетилхолину, его агонистам и антагонистам. Реакция чувствительная к ацетилхолину Подвижность одноклеточных фотосинтезирующих организмов Поглощение C14- ацетата Поглощение воды клетками

Агонист или антагонист, влияющий на эту реакцию Агонист Антагонист ацетилхолин атропин

Корневое давление Выделение этилена Рост зародышей (эмбрионов) Прорастание вегетативных микроспор

ацетилхолин ацетилхолин никотин ацетилхолин ,мускарин

Открывание и закрывание устьиц Na+ выход из интактных хлоропластов

мускарин

K+ выход из интактных хлоропластов Фотофосфорилирование в хлоропластах

ацетилхолин, ареколин, мускарин ацетилхолин, ареколин, мускарин, карбамоилхолин

Развертывание листьев из почек Автофлуоресценция рыльца пестика Оплодотворение после обработки рыльца пестика

ацетилхолин, никотин ацетилхолин,

Поглощение воды сухой пыльцой Сокращение протопластов клеток Экссудация ксилемного сока из сосудов корней

ацетилхолин ацетилхолин

ацетилхолин, ацетилхолин ацетилхолин

α-бунгаротоксин, d-тубокурарин d-тубокурарин

ацетилхолин, ареколин, мускарин, карбамоилхолин

ацетилхолин,

d-тубокурарин атропин, d-тубокурарин d-тубокурарин атропин

мускарин,

атропин, d-тубокурарин, α-бунгаротоксин Тетраэтиламмоний, атропин, d-тубокурарин, атропин, d-тубокурарин, α-бунгаротоксин, хинуклидинил бензилат атропин, d-тубокурарин атропин, d-тубокурарин, атропин, d-тубокурарин, α-бунгаротоксин атропин, d-тубокурарин, атропин атропин

антагонистам которые могут быть связаны с холинорецепторами. Это – поглощение воды и различных метаболитов, изменение проницаемости мембран для ионов, двигательные реакции, а также реакции энергетического обмена и ростовые процессы. Экспериментальные данные, суммированные в таблице, свидетельствуют в пользу присутствия рецептора ацетилхолина в растительных клетках. Связанной с рецептором является любая реакция, где агонист стимулирует, там антагонист

7

блокирует процесс, и наоборот, что указывает на связывание агониста и антагониста в одном и том же участке мембраны-рецепторе. Например, ацетилхолин ингибирует выделение этилена как гормона старения дисками листьев сои, тогда как его антагонист атропин - стимулирует. Китайскими учеными (Wang et al. 2003a, Meng et al. 2004) было также показано участие мускариновых и никотиновых холинорецепторов в регуляции K+ и Ca2+ - каналов, а также Ca-регулирующих систем при открывании и закрывании устьиц на основании противоположных эффектов агониста мускарина и антагониста d-тубокурарина. Природа возможных холинорецепторов у растений пока неясна. Предполагалось, что у растений рецептором ацетилхолина может быть хромопротеид фитохром, поскольку в ряде опытов было установлено, что ацетилхолин имитирует действие красного света на управляемые фитохромом процессы. Это тем более вероятно, поскольку

светочувствительный

белок

фитохром

может

управлять

ионной

проницаемостью. Польскими исследователями (Tretyn et al., 1990, 1992) показано, что развертывание

листьев

этиолированными

проростками

пшеницы

(реакция,

управляемая фитохромом) стимулируется как ацетилхолином, так и его агонистами мускарином и никотином (1 мкМ) в присутствии ионов Са2+и Na+, а антагонисты атропин и d-тубокурарин (10 мкМ) блокируют этот процесс. На основании этих данных предполагается, что развертывание листьев контролируется фитохромом и двумя типами холинорецептора - мускариновым и никотиновым. Ряд исследователей все же отрицают прямое действие ацетилхолина на фитохром, так как не обнаружили его эффектов на другие управляемые фитохромом процессы, такие как синтез антоциана и никтинастические движения листьев у чувствительных к механическому раздражению видов, например у мимозы Mimosa pudica. Сократительные системы, чувствительные к ацетилхолину, также могут быть связаны с функционированием рецепторов. Например, сокращение протопластов, индуцированное

ацетилхолином,

ингибируется

его

антагонистом

атропином.

Агонисты ацетилхолина мускарин и никотин подобно ацетилхолину стимулируют Ca2+ - и K+/Na+- зависимое набухание протопластов и развертывание этиолированных проростков пшеницы, тогда как антагонисты ацетилхолина атропин и d-тубокурарин останавливают эти процессы. Участие холинорецепторов в процессах оплодотворения и роста растений проводилось сотрудниками Института биофизики клетки РАН (Рощина, Вихлянцев, 2009.).

Было

показано,

что

регуляция

оплодотворения

у

осуществляется

холинэргической системой. Если перед опылением гиппеаструма Hippeastrum hybridum рыльце его пестика обработать антагонистами ацетилхолина атропином, d-

8

тубокурарином, или α-бунгаротоксином, блокируется нормальное созревание плодов и семян. Пыльца также весьма чувствительна к ацетилхолину и его антагонистам. Так ацетилхолин (10-5М) стимулировал в два раза набухание сухой пыльцы в воде по сравнению с контролем, и этот процесс блокировался атропином или dтубокурарином. Другим примером участия холинорецепции в ростовых процессах может служить блокирование атропином, d-тубокурарином, или α-бунгаротоксином прорастания одноклеточных вегетативных микроспор хвоща полевого Equisetum arvense и дальнейшего появления из них многоклеточного гаметофита (таллуса) . В этих

опытах

агонисты

ацетилхолина

мускарин

и

ареколин

стимулировали

прорастание вегетативных микроспор, по-видимому, связываясь в том же месте мембраны, где находится предполагаемый рецептор. В опытах российских (Roshchina, 2005) и китайских аисследователей (Meng et al, 2001) cочетание флуоресцентного анализа с использованием агонистов и

Рис.3-4. Флуоресценция вегетативных микроспор хвоща полевого Equisetum arvense (А и Б) и замыкающих клеток устьиц конских бобов Vicia faba (С) после обработки флуоресцирующим агонистом или антагонистом ацетилхолина (10-5М). Обработка агонистом мускарином (А и Б) или антагонистом Bodipy FL- ABT (С). А и С–вид флуоресцирующих клеток под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом (бар =5 мкм), Б – спектры флуоресценции. 1. раствор мускарина, 2- необработанные споры хвоща, 3 – споры после обработки мускарином, 4 – споры выдерживали в растворе ацетилхолина перед добавлением мускарина

антагонистов ацетилхолина дало возможность увидеть места связывания этих веществ в клетке (Рис.3-4). Агонист мускарин и антагонист Bodipy FL-ABT при возбуждении светом лазера длиной волны 488 нм флуоресцировали зеленым светом на поверхности вегетативных микроспор хвоща и замыкающих клеток устьиц конских бобов. Эти флуоресцирующие соединения связывались в плазмалемме, как показано стрелками (Рис.3-4 А, С). В спектре флуоресценции микроспор хвоща (Рис.3-4 Б) мускарин вызывал появление характерных для него максимумов 450 и 550 нм (кривая 3) при возбуждении ультрафиолетовым светом (360-380 нм). Максимумы, однако, не

9

появлялись, если перед добавлением мускарина споры обрабатывали ацетилхолином. Таким образом, ацетилхолин и мускарин конкурировали за одно и то же место связывания в плазмалемме клеток. На основании этих экспериментов предположили, что

в

плазмалемме

исследованных

клеток

локализованы

холинорецепторы

никотинового или мускаринового типа. На одноклеточных системах вегетативных микроспор хвоща полевого Equisetum arvense и пыльце гиппеаструма Hippeastrum hybridum была сделана попытка исследовать передачу хемосигнала с поверхности клетки к органеллам с участием рецепторов и связанных с ними ионных каналов и вторичных мессенджеров. У обоих объектов после обработки ацетилхолином и его агонистами, а также форсколином и теофиллином (агентов, повышающих уровень внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата), отмечена стимуляция прорастания, тогда как антагонисты ацетилхолина и блокаторы Na+/K+ионных каналов d-тубокурарин, или α-бунгаротоксин угнетали этот процесс. Стимулирующие эффекты ацетилхолина и его агонистов также не наблюдали, если к клеткам предварительно добавляли указанные

антагонисты.

Таким

образом,

можно

предполагать

участие

холинорецепторов никотинового типа и регулируемых ими ионных каналов в передаче хемосигнала с поверхности клетки к ядру. Есть также данные, что механизм этой передачи связан и с сократительными белками актином и тубулином, имеющих общие домены (белковые участки) с ионными каналами и рецепторами. Отмеченные выше реакции связаны, в основном, c предполагаемыми рецепторами, находящимися в плазмалемме. Однако есть основания полагать, что освобождаемые из везикул внутри клетки нейротрансмиттеры также могут взаимодействовать с мембранными рецепторами органелл. Присутствие ацетилхолина в хлоропластах и его эффекты на некоторые реакции фотосинтезирующих мембран послужили основанием для поиска в хлоропластах рецептора ацетилхолина. Физиологическими ответами на воздействие ацетилхолина служили две чувствительные к нему реакции — выход ионов Na+ и К+ из хлоропластов (Рис.2-6) и фотофосфорилирование (Рис. 2-7). Измеряли

скорости

этих

реакций

и

вычисляли

константы

связывания

Кс

ацетилхолина или его агонистов. Показано, что, подобно ацетилхолину, агонисты мускарин и ареколин стимулируют выход ионов Na+ и К+ из интактных хлоропластов гороха и поглощение тилакоидами ионов водорода. Действие их проявлялось в низких концентрациях (10-10 - 10-7 М), и концентрационные кривые имели насыщение, что может свидетельствовать в пользу существования функциональных аналогов холинорецепторов в оболочке интактных пластид. Было исследовано также влияние антагонистов ацетилхолина, связывающихся с

10

мускариновым

типом

никотиновым

типом

рецептора

(атропин,

(d-тубокурарин,

хинуклидинилбензилат)

α-бунгаротоксин)

или

с

холинорецептора

млекопитающих, а также с холинорецептором моллюсков (тетраэтиламмоний), было исследовано

также

влияние

мускариновым

типом

никотиновым

типом

антагонистов

рецептора

ацетилхолина,

(атропин,

(d-тубокурарин,

связывающихся

хинуклидинилбензилат)

α-бунгаротоксин)

или

с с

холинорецептора

млекопитающих, а также с холинорецептором моллюсков (тетраэтиламмоний) на выход ионов Na+ и К+ из интактных хлоропластов. Антагонисты атропин и dтубокурарин снижали выход ионов Na+ из пластид (Рис. 3-5). Аналогично действовал и α-бунгаротоксин.

Рис.3-5. Влияние антагонистов ацетилхолина на выход ионов Na+ из хлоропластов гороха, предварительно обработанных ацетилхолином. А. 1 - без блокаторов; 2 - атропин l0-6М; 3 — d-тубокурарин l0-6М. (Roshchina. 1987. 1989, 1990с).

Другим физиологическим

ответом на обработку

ацетилхолином, его

агонистами и антагонистами изолированных тилакоидов было изменение скорости фотофосфорилирования (Рис. 3-6). Агонист ацетилхолина ареколин имитировал стимулирующий эффект биомедиатора на синтез АТФ на свету (Рис.3-6 А).

Рис.3-6. Фотофосфорилирование а хлоропластах гороха в присутствии агониста (А) и антагониста (Б) ацетилхолина. А. Концентрационная кривая действия ареколина. Б. Концентрационные кривые “доза—эффект” действия ацетилхолина без атропина (I) и в его присутствии в концентрациях 10-8 М (2), 10-7 М (3). 10-6 М (4) (Roshchina, 1990)

11

Доказательством связывания антагонистов и ацетилхолина в одном и том же участке холинорецептора служат параллельные концентрационные кривые “доза-эффект”, полученные в опытах с последовательной обработкой пластид вначале антагонистом, а затем медиатором (Рис. 3-6 Б). Без атропина в среде ацетилхолин стимулирует фотофосфорилирование, концентрационные

а

кривые

добавление зависимости

антагониста скорости

атропина

сдвигает

фотофосфорилирования

от

ацетилхолина в сторону более высоких концентраций. Это указывает на вытеснение антагониста из места связывания рецептором более высокими концентрациями медиатора. Данные, полученные по изучению влияния ацетилхолина, его агонистов и антагонистов на мембранные реакции хлоропластов, сведены в табл. 3-2. Все Таблица 3-2. Характеристика холинорецепторных свойств мембран хлоропластов. Минимальная концентрация агониста, вызывающая эффект, M

Реакция

AХ

M

АР

Антагонист, блокирующий эффект, вызванный ацетилхолином

Насыщение концентрационной кривой для ацетилхолина

КХ

есть Na+ поток из (++) (++) (++) (+) Атропин, интактных 10-9 10-9 10-9 10-9 d - тубокурарин, хлоропластов α -бунгаротоксин (++) Фотофосфорили(-) (++) (+) Атропин, есть 10-9 рование 10-10 10-9 α -бунгаротоксин, хинуклидинилбензилат (H2O→НAДФ+) в тилакоидах АХ - ацетилхолин, М — мускарнн, АР - ареколнн, КХ - карбамоилхолин, ++ и +- сильная и слабая стимуляция, (-) - иигибирование.

использованные в экспериментах агонисты действуют в концентрациях 10-10 - 10-9 М, столь же низких, как и у животных, а их эффекты блокируются антагонистами, действующими,

в

основном,

на

никотиновый

тип

холинорецепторов.

В

концентрационных кривых есть насыщение, указывающее на ограниченную емкость рецепторов. Ацетилхолин и его агонисты вызывают в растениях изменения К+/Na+ проницаемости и падение мембранного потенциала плазмалеммы или наружной оболочки

хлоропласта,

что

напоминает

реакции

с

участием

никотинового

холинорецептора животных. Вполне возможно, что в растительных клетках работает и механизм вторичных мессенджеров цАМФ и цГМФ, включаемый мускариновым холинорецептором. цАМФ и аденилатциклаза обнаружены у растений и даже в хлоропластах. Можно предполагать присутствие одного из функциональных аналогов холинорецептора в наружной оболочке пластид, который может регулировать ионные потоки Na+ и К+, а другого холинорецептора - в тилакоидах, связанного с регуляцией фотофосфорилирования.

12

3.1.2. Холинацетилтрансфераза Синтез собственно ацетилхолина осуществляется на свету с участием фермента холинацетилтрансферазы (она найдена внутри секреторных везикул) в мембранах эндоплазматического ретикулума. Холинацетилтрансфераза впервые была обнаружена в листьях крапивы Urtica dioica и даже в ее отдельном жгучем волоске. Холинацетилтрансферазная активность была найдена также в экстрактах зародышей гороха, и капусты Brassica oleracea и гипокотилях бобов, в семенах Allium altaicum. Скорость образования ацетилхолина была максимальной у крапивы Urtica dioica и вполне сравнима с тем, что наблюдается у домашней мухи Musca domestica. В целом же активность фермента холинацетилтрансферазы. как и содержание ацетилхолина значительно выше в тканях животных. Однако у некоторых групп растений, как, например, у крапивы, активность его столь же велика. Как и в клетках животных, холинацетилтрансфераза растений локализована в цитоплазме и легко ассоциируется с клеточными мембранами в средах с низкой ионной силой. Холинацетилтрансфераза была выделена из некоторых растений, и препараты этого фермента отличались в сотни и тысячи раз более низкими скоростями по сравнению с аналогичным ферментом мозга крысы (4000 нмоль ацетилхолина мин-1• мг-1 белка) или свиньи (135000 нмоль мин-1мг-1 белка). Холинацетилтрансфераза, изолированная из проростков Phaseolus vulgaris, имела молекулярную массу около 80 кДа, что сравнимо с аналогичными белками из животных объектов - 66 - 68 кДа. 3.1.3. Холинэстераза Ключевую роль в катаболизме ацетилхолина играет фермент холинэстераза. Способность гидролизовать ацетилхолин, как известно, была впервые установлена Леви и Навратилом на сердце амфибии еще в начале 20 - го века (позднее Леви назвал осуществляющий этот гидролиз фермент холинэстеразой). Затем холинэстеразная активность была обнаружена у грибов и бактерий. Начало систематическим исследованиям холинэстераз растений было положено в 60-е годы двадцатого века. Холинэстеразная активность была впервые обнаружена у низших растений - в экстрактах харовой водоросли нителлы (Dettbarn, 1962). В серии работ Флака, Джаффе, Риова Миуры и Гупты (Fluck, Jaffe, Riov, Miura, Gupta) затем показано, что эта активность присуща и многим растениям - от водорослей до покрытосеменных видов. Особенно часто холинэстеразная активность обнаруживается у представителей семейства бобовых Fabaceae. Наиболее высокая скорость гидролиза субстрата характерна для семейства Brassicaceae (Cruciferae), а самая низкая - у голосеменных растений семейств Gingoaсеае и Тахасеае.

13

Характеристика фермента. Критерием холинэстеразной активности является способность ткани с высокой скоростью гидролизовать ацетилхолин и другие холиновые эфиры, а также подавляться специфическими ингибиторами прозерином и эзерином. Характер взаимодействия холинэстераз с их субстратами холиновыми эфирами показан на рис. 3-7.

Рис.3-7. Схема взаимодействия холинэстеразы с ацетилхолином.

Субстрат ацетилхолин обычно связывается с двумя участками холинэстеразы. Карбо группа холинового эфира присоединяется водородными связями к эстеразному центру фермента, выполняющему собственно гидролизующую функцию, а

группа ацетилхолина (катионная головка) соединяется с анионным

(отрицательно заряженным) центром холинэстеразы, который выполняет лишь функцию правильной ориентации субстрата. Ингибиторы холинэстеразы могут присоединяться либо к эстеразному центру фермента (фосфорорганические вещества) либо к анионному центру (четвертичные аммонийные соединения), препятствуя тем самым связыванию с ацетилхолином (см. ниже раздел “Чувствительность к ингибиторам”).

В

составе

эстеразного

центра

холинэстеразы

присутствует

аминокислотный остаток серина. Как серин-содержащий белок, холинэстераза угнетается

многими

фосфорорганическими

соединениями,

в

том

числе

инсектицидами. Методы обнаружения фермента в клетке основаны либо на определении продуктов гидролиза ацетилхолина - уксусной кислоты и холина, либо - окрашенного продукта реакции тиохолина (если в качестве субстрата использовался ацетилтиохолин) с 5,5дитио-ди-2-нитробензойной кислотой (реактив Эллмана) или его красный аналог. Субстратная специфичность холинэстераз. Для животных изначально было принято различать два типа холинэстераз. Фермент, специфичный к ацетилхолину, называют истинной холинэстеразой, или ацетилхолинэстеразой (КФ 3.1.1.7). В отличие от него, фермент, гидролизующий с высокой скоростью не только ацетилхолин, но и другие холиновые эфиры - бутирилхолин, пропионилхолин и т.д.,

14

называют псевдохолинэстеразой, или просто холинэстеразой (КФ 3.1.1.8). В растениях содержатся холинэстеразы обоих типов, а также промежуточные формы фермента

(Рис.3-8).

Активность

истинных

холинэстераз

в

отличие

от

псевдохолинэстераз ингибируется высокими концентрациями субстрата (> 10-3 М). Кривая гидролиза ацетилхолина ацетилхолинэстеразой имеет колоколообразную форму с выраженным максимумом при определенной оптимальной концентрации субстрата. Кроме того, антитела против ацетилхолинэстеразы не связываются с

Рис.3-8.Концентрационные кривые гидролиза ацетилтиохолина (темные кружки) или бутирилтиохолина (светлые кружки) экстрактами из пыльника вьюнка полевого Convolvulus arvensis и пыльцы чубушника Philadelphus grandiflorus, каштана конского Aesculus hippocastanum, лука Allium cepa и петунии Petunia hybrida. Адаптировано из работ (Roshchina and Semenova, 1995; Roshchina, 2001)

псевдохолинэстеразой. Таким образом, холинэстеразы различаются по субстратной специфичности, чувствительности к ингибиторам и концентрационным кривым гидролиза субстратов. Российскими исследователями (Рощина, Семенова и др. 1993-1995) установлено присутствие этого фермента в экстрактах пестика гиппеаструма гибридного Hippeastrum hybridum и в пыльце многих других видов растений. Полагают, что фермент

экскретируется

рыльцем

пестика

и

поверхностью

пыльцы.

Концентрационные кривые экстрактов пыльника и пыльцы показывают разнообразие типов

холинэстераз,

присущих

растениям

(Рис.3-8).

В

пыльниках

вьюнка

присутствует истинная холинэстераза или ацетилхолинэстераза, поскольку скорость гидролиза ацетилтиохолина много выше, чем бутирилтиохолина, и высокие концентрации субстрата угнетают активность фермента (колоколообразные кривые), как и у каштана конского. Для пыльцы же лука и петунии – характерны

15

противоположные характеристики, и кривые имеют насыщение, что позволяет их относить

к

ложным

холинэстеразам

или

псевдохолинэстеразам.

У

других

исследованных объектов, например у чубушника, по-видимому, встречаются промежуточные типы фермента по отношению к субстрату – у них или нет угнетения субстратом или скорость гидролиза разных холиновых эфиров одинакова. Распределение холинэстеразной активности в тканях и локализация в клетке. Способностью гидролизовать холиновые эфиры обладают все части растений: листья, корни, семена, цветки. Эта способность возникает на самых ранних стадиях развития растений - у эмбрионов и в алейроновом слое семени. Холинэстеразная активность отмечена на стадии дифференцировки корней и стеблей, в эпидермисе, флоэме, камбии

и

апикальных

меристемах

этих

растений.

Она

найдена

также

в

пищеварительных железистых волосках насекомоядного растения дрозеры Drosera capensis L., выделениях пестика и пыльцы целого ряда растений. Относительно локализации холинэстераз в клетке мы располагаем рядом сведений.

Методами

электронно-микроскопической

гистохимии

и

обычной

микроскопии с помощью специальных красителей было показано, что холинэстераза содержится в плазмалемме, клеточной стенке (также экзине пыльцы), ядре, хлоропластах и частично в цитоплазме растительных клеток. На рис.3-9 приведены некоторые примеры локализации фермента в клетке.

Рис.3-9. Локализация холинэстеразы в растительных клетках. 1 и 2 обработка красным аналогом реактива Эллмана пыльцы эпифиллюма Epiphillum hybridum (cнимки Рощиной В.В). Видно в экзине (1 и 2))снаружи синее окрашивание, которое присутствует и в выделившемся секрете пыльцы (показано стрелками). 3-4. Холинэстераза корней Phaseolus vulgaris,выявленная гистохимическим методом Келле в сочетании с электронной микроскопией (Fluck, Jaffe, 1974). Черные пятна продукта гистохимической реакции на холинэстеразу на разных срезах показаны двойными стрелками во внутреннем пространстве между плазмалеммой и клеточной стенкой и одной стрелкой в плазмалемме

Холинэстераза также была исследована В.В. Рощиной в изолированных хлоропластах, где ее активность обнаружена в наружных мембранах органелл и

16

тилакоидах. При этом активность фермента в тилакоидах была в 7 раз выше, чем в оболочке хлоропластов. Способность к гидролизу ацетилхолина в этих органеллах подавлялась ингибиторами холинэстераз эзерином и прозерином. Холинэстераза хлоропластов с большей скоростью гидролизует ацетилхолин, чем бутирилхолин и что

избыток

классификации,

субстрата принятой

угнетает для

ее

активность.

животных,

ее

Следовательно,

можно

отнести

к

согласно истинным

холинэстеразам или ацетилхолинэстеразам. Отметим, что у животных, обладающих нервной системой, ацетилхолинэстераза находится преимущественно в плазмалемме, а также в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи нейронов, в ядрах и микросомах, митохондриях клеток мозга. Характеристика изолированных холинэстераз. В настоящее время проделана большая работа по выделению и очистке холинэстераз растений. В основном, холинэстеразы выделяли из корней и листьев, однако, есть сообщения о подобных белках, выделенных из семян, стеблей и латекса. Холинэстераза выделена также из интактных хлоропластов 6 видов высших растений - гороха, бобов, белой акации, кукурузы, вьюнка, а также из этиопластов гороха. В этиолированных пластидах содержание холинэстераз было в 3 раза меньше, чем в нормальных зеленых хлоропластах, а их активность в 5 раз ниже. Таким образом, становление фотосинтетического процесса после зеленения этиопластов на свету сопровождается, по-видимому, бурным синтезом фермента. Сравнение молекулярных масс (Mr) показало, что выделенные из растений белки высокомолекулярные агрегаты с очень большими молекулярными массами от 330 до 2600 кДа. Они отличались высоким содержанием остатков аспарагина, треонина, серина,

глютамина,

пролина

и

глицина,

причем

наблюдалось

сходство

с

ацетилхолинэстеразой, выделенной из электрического ската Torpedo californica. Отличия были, главным образом, в минорных остатках аминокислот. В основной массе холинэстеразы являются кислыми белками с изоэлектрической точкой 5,0 -5,4. и, кроме способности гидролизовать холиновые эфиры, обладают и пептидазной активностью. Выделенные к настоящему времени холинэстеразы растений представляют собой, в основном, истинные холинэстеразы или ацетилхолинэстеразы. Они гидролизовали ацетилхолин и ацетилтиохолин с более высокой скоростью, чем другие холиновые эфиры. Активность холинэстераз ингибировалась избытком субстрата, и кривая зависимости скорости гидролиза холиновых эфиров имела колоколобразную форму, как, например, показано на рис. 3-10. Однако, в семенах, наряду с истинной

17

холинэстеразой, присутствует и псевдохолинэстераза. У некоторых растений различия между типами холинэстераз сделать довольно трудно. Так ферменты, выделенные из корней Cicer arietinum и Phaseolus vulgaris, имеют более высокую специфичность к ацетилхолину по сравнению с бутирилхолином или пропионилхолином

Рис.3-10. Гидролиз ацетилтиохолина препаратами холинэстеразы из листьев гороха (Рощина. 1986). 1 – кинетика процесса с разными субстратами (10-3М), оцениваемая по поглощению при 412 нм (A412) желтого продукта реакции с реактивом Эллмана, 2 – зависимость скорости реакции от концентрации субстрата. АТХ или БТХ – соответственно ацетилтиохолин или бутирилтиохолин.

(как у истинных холинэстераз), но при этом не наблюдается ингибирования высокими концентрациями субстрата (как и для псевдохолинэстераз). Другой пример ферменты из корней Solanum tuberosum, которые с более высокой скоростью гидролизуют бутирилтиохолин, чем ацетилтиохолин. Как и холинэстеразы некоторых беспозвоночных, обладающих такими же особенностями, они занимают, повидимому, промежуточное положение между холинэстеразами обоих типов. Существование таких “промежуточных” ферментов, возможно, служит отражением филогенетической эволюции холинэстераз. Чувствительность холинэстераз к ингибиторам. Карбаматы и фосфорорганические соединения (ФОС) являются мощными пестицидами, в основном, инсектицидами, а четвертичные соединения – регуляторами роста, ретардантами (хлорхолинхлорид и производные лимонена Q80 и Q76) также действуют на холинэстеразу растений (Рис. 311). Их применение связано с подавлением холинэстераз вредителей культурных растений. При обработке инсектицидами обычно не учитывается ингибирование холинэстераз у растений, хотя это могло быть одной из важных причин ухудшения роста. Поэтому испытания новых веществ пестицидов и регуляторов роста на холинэстеразную активность растений могут иметь большое значение для практики сельского хозяйства и природоохранных мероприятий. Схема на рис. 3-11 позволяет понять высокую чувствительность фермента к

18

Рис.3-11. Формулы ингибиторов холинэстераз

четвертичным аммонийным и фосфорорганическим соединениям. Четвертичные аммонийные соединения, в частности соли карбаминовой кислоты - прозерин (неостигмин) и эзерин (физостигмин) в низких концентрациях (10-5- 10-6 М) угнетают активность ферментов гидролиза холиновых эфиров. Аминогруппа ингибитора, находящаяся рядом с карбонильной группой, связывается с анионным центром холинэстеразы, не затрагивая эстеразный центр. Ингибирование носит конкурентный характер и может быть обратимым. В отличие от карбаминовых ингибиторов, фосфорорганические соединения присоединяются группировкой:

к серину эстеразного центра холинэстеразы. Такие вещества (инсектициды дихлорофос, фосфон и д.) действуют как конкурентные ингибиторы, и в большинстве случаев их эффекты необратимы. Другие функции холинэстеразы. Помимо основных функций холинэстеразы как катализатора реакции гидролиза ацетилхолина, предполагается еще ряд функций этого белка, как показано на схеме:

19

Дополнительные функции можно разделить по механизму действия: 1. эффекты продуктов

гидролиза

ацетилхолина

(в

первую

очередь

уксусной

кислоты)

холинэстеразой, 2. белковая адгезия свободно связанной формы холинэстеразы , 3. эффекты,

вызванные

протеазной

активностью

холинэстеразы.

Российскими

исслндователями (Ковалева, Рощина,1997) показано, что присутствие холинэстеразы необходимо для нормального оплодотворения растений – стерильность или самонесовместимость пыльцы коррелируют с блокадой или снижением активности фермента. Высокая активность холинэстеразы коррелирует с контрактильными реакциями

–

движениями

замыкающих

клеток

устьиц,

стимулируемым

ацетилхолином корневым давлением и др. В 1990 г. исследователь из МГУ Бородюк выдвинула

гипотезу

о

том,

что

холинэстераза

участвует

в

появлении

и

преобразовании дополнительного ∆µН (градиента протонов) для трансформации энергии в таких процессах как мышечное сокращение и фотосинтез. Согласно этой гипотезе,

регуляция

ионных

потоков

и

активности

сократительных

систем

холинэстеразой связана с дополнительно возникающими при гидролизе ацетилхолина протонами уксусной кислоты, так как активные перемещения требуют затрат энергии. Эти же явления, вероятны и для регуляции самосовместимости пыльцы при оплодотворении. Другая некатализная функция холинэстеразы определяется в связывании (заякоривании) других белков и гликолипидов, поскольку холинэстераза находится на поверхности

клеток.

Более

того,

внутри

клеток

холинэстераза

может

взаимодействовать с редокс-белками – цитохромами и пластоцианином, а также с рибулезо-бис-фосфат

карбоксилазой,

основными

белковыми

системами

при

фотосинтезе, и регулировать их активность. Показано, что рибулезо-бис-фосфат карбоксилаза в свою очередь, регулирует активность самой холинэстеразы. Холинэстераза также ингибирует излишнюю продукцию хинонов из дофамина, регулируя образование активных форм кислорода в клетке в присутствии катехоламинов. Третья функция холинэстеразы определяется ее протеазной активностью. Важная роль этого фермента отмечена в защитных реакциях клетки, поскольку он присутствует в клеточных выделениях и гидролизует пептиды в качестве протеазы. Кроме того, холинэстераза найдена в составе пищеварительного сока желез насекомоядных растений и таким образом тоже участвует в обменных процессах как пептидаза.

20

3.2. Cистемы регуляции c участием биогенных аминов Катехоламины, серотонин, гистамин, так же как и ацетилхолин, входят в состав сложных систем регуляции у животных. Составляющие элементы этих систем представлены на рис. 3-12. Биогенные амины взаимодействуют с мембранами клеток путем связывания со специфическими рецепторами. 3.2.1. Рецепция катехоламинов, серотонина, гистамина В мембранах клеток животных имеются особые рецепторы дофамина (Д1 и Д2 дофаминовые рецепторы), адреналина и норадреналина (α- и β-адренорецепторы), серотонина (серотониновые рецепторы до 7 семейств с 15-16 подтипами - 5-НТ1, 5НТ2, 5-НТ3, 5-НТ4, 5-НТ5, 5-НТ6 и 5-НТ7), H1, H2 , Н3- гистаминовые рецепторы и их подтипы. У каждой группы рецепторов есть агонисты и антагонисты (табл.3-3).

Рис.3-12. Системы регуляции с участием биогенных аминов.

Биогенные амины взаимодействуют с мембранами клеток путем связывания со специфическими рецепторами. Как видно из таблицы 3-3, агонисты дофамина представлены аналогами фенольной

21

Таблица 3-3. Агонисты и антагонисты биогенных аминов (обведены замещаемые группы в молекулах агонистов) Биогенный амин Дофамин

Агонист Природа и Примеры формул названия Производные фенилаланина – аналоги фенольной природы (метилированные и сульфониевые производные дофамина)

Норадреналин Производные адреналин фенилаланина – аналоги фенольной природы (адреналин), алкалоиды эфедрин, изадрин и др. Серотонин Производные триптофана – аналоги индольной природы (мексамин) и алкалоиды (буфотенин) Гистамин Аналоги имидазольной природы (метилгистамин, диметилгистамин, бетазол)

Антагонист Природа и названия Хлорпромазин и его производные, сульпиридин и его производные

Примеры формул

Лабеталол, иохимбин, празозин, пропранолол

Кюр-14, хлорпромазин, лизергиновая кислота, бенперидол, инмекарб

(5-метил-2-β-диметиламиноэтил-3-β-этилиндол -

Тавегил, перилимин, буримаид, метиамид

природы, исходно происходящие из фенилаланина, тогда как их антагонисты производные хлорпромазина или сульпирида. Агонистами норадреналина и адреналина являются окисленные метилированные производные катехоламинов, среди которых и природный алкалоид эфедрин. Антагонисты представлены сложными фенольными производными, среди которых алкалоид иохимбин. Агонистами серотонина являются, в основном, производные триптофана (табл.33), в том числе продукт метилирования серотонина буфотенин, а в качестве антагонистов выступают фенолы с присоединенными азотными группами (Кюр-14), хлорпромазин и его производные, а также фторированные перидолы. К антагонистам серотонина и относится и природный продукт лизергиновая кислота - сильный галлюциногенный яд. В качестве агонистов гистамина (табл.3-3) выступают его метилированные

22

метаболиты, а в качестве антагонистов H1-группы - дифенолы, Н2-группы - амиды, присоединенные к NH2-rpynne гистамина, а также имидазольные производные. С помощью аффинной хроматографии и применения агонистов и антагонистов из тканей животных выделены Д2 –дофаминовый рецептор с молекулярной массой 92 кДа, а также β-адренорецепторы с молекулярными массами 62-67 или 76 кДа. Все типы рецепторов биогенных аминов располагаются на поверхности плазматических мембран. Присутствие рецепторов биогенных аминов в растительных мембранах также предполагается на основании ряда экспериментов с использованием агонистов и антагонистов катехоламинов. Ониани с сотрудниками (1974, 1977) показали, что в клетках зеленой водоросли Nitella скорость движения цитоплазмы и мембранный потенциал клеток изменяется в присутствии катехоламинов и адреноблокаторов изадрина и индерола. Хотя данные этих экспериментов были не однозначны и применялись высокие (>10-5 М) концентрации адреноблокаторов, тем не менее, эти авторы впервые подошли к экспериментальному поиску адренорецепторов у растений. Дальнейшие исследования в этом направлении были связаны с испытанием агонистов и антагонистов катехоламинов и серотонина на различные реакции, чувствительные

к

этим

медиаторам.

Среди

этих

реакций

(табл.

3-4)

–

фотоморфогенез, автофлуоресценция целых клеток, прорастание семян, пыльцы и вегетативных микроспор, фотофосфорилирование в хлоропластах. Исследования проводились на целых клетках и изолированных органеллах. Целые клетки. К катехоламинам наиболее чувствителен морфогенез растений. Интактные клетки растений четко реагируют на воздействие агонистами и антагонистами трансмиттеров (Табл.3-4). Норадреналин, адреналин (10-6-10-4 М) и их агонист L-изопротеренол ускоряют цветение ряски Lemna paucicostata при фотопериодическом режиме 8 ч свет и 16 ч темнота. Пропранолол (антагонист катехоламинов,

блокатор

β-адренорецептора)

частично

подавляет

цветение,

вызванное катехоламинами. Другие

биогенные

амины,

в

частности

норадреналин

и

серотонин

стимулируют, а их антагонисты угнетают прорастание семян редиса. Например, антагонист норадреналина иохимбин, снижает этот процесс на 30-40 % , а стимулируемое

серотонином

прорастание

семян

редиса

ингибируется

его

антагонистом Кюр-14 (10-7-10-5 М) на 50-60% от контроля. Приведенные данные могут свидетельствовать о возможном присутствии рецепторов биогенных аминов в растительных клетках.

23

Таблица 3-4. Реакции растений, чувствительные к биогенным аминам, их агонистам и антагонистам. Реакция чувствительная к Агонист или антагонист, влияющий на эту реакцию биогенному амину Агонист Антагонист Фотоморфогенез Пропранолол Норадреналин, адреналин, L-изопротеренол (ускорение цветения) Прорастание вегетативных Норадреналин, адреналин, 6,7-diOHATN* Иохимбин микроспор -//Серотонин Кюр-14*, инмекарб Прорастание пыльцы Норадреналин, адреналин, 6,7-diOHATN Прорастание семян Норадреналин, адреналин, 6,7-diOHATN иохимбин -//Серотонин Кюр-14, инмекарб -//Гистамин, 4-метилгистидин Автофлуоресценция Bodipy – дофамин вегетативных и генеративных микроспор -//Иохимбин -//Bodipy - серотонин, 6,7-diOHATN Кюр -14 Оплодотворение после Иохимбин обработки рыльца пестика -//Тавегил Движение цитоплазмы Норадреналин, адреналин, изадрин, индерол Мембранный потенциал Норадреналин, адреналин, изадрин, индерол K+ и Mg2+ выход из клеток Норадреналин, адреналин, Иохимбин Са2+ и Mg2+выход из Норадреналин, адренали Иохимбин интактных хлоропластов Фотофосфорилирование в Дофамин, норадреналин, адреналин, 6,7Иохимбин хлоропластах diOHATN * 6,7-diOHATN - название агониста 2-амино-6,7-ди-гидрокси-1,2,3,4-тетрагидронафтален гидробромида; Kюр-14 - название антагониста 5- метил -2-β- диметиламиноэтил-3-β-этилиндола

С помощью флуоресцирующих агонистов и антагонистов дофамина и серотонина российскими исследователями (Рощина и др., 2003; Roshchina, 2008) было показано, что рецепция биогенных аминов происходит на поверхности интактных клеток и изолированных ядер. В качестве примера на рис. 3-13 видна флуоресценция пыльцы подорожника и изолированных из лепестков чубушника ядер, окрашенных агонистом дофамина Bodipy-ДА. Зеленая эмиссия наблюдается на поверхности этих объектов, что указывает на локализацию дофаминовых рецепторов. Зеленая эмиссия, характерная для Bodipy-ДА, не наблюдается, если, клетки предварительно перед добавлением агониста, омывали раствором обычного дофамина, который связывал рецепторы. Опыты по установлению локализации рецепторов в клетках проводились и с флуоресцирующими антагонистами биогенных аминов. Свечение в голубой или зеленой области спектра также появлялось на поверхности клеток, например спор хвоща, после обработки соответственно - антагонистом норадреналина иохимбином или антагонистом серотонина Кюр-14 . В интактных клетках связывание с рецептором происходит в плазмалемме, а в ядрах – в наружной ядерной мембране.

24

Рис.3-13. Вид под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом (Возбуждение лазером 488 нм) пыльцы подорожника Plantago lanceolatum (А) и изолированных ядер лепестков чубушника Philadelphus grandiflorus (Б), окрашенных флуоресцирующим аналогом дофамина Bodipy-DA (Roshchina, 2008).

Изолированные

органеллы.

Медиаторная

функция

трансмиттеров

осуществляется не только в плазмалемме, но и внутри клеток. При этом соответствующие рецепторы биогенных аминов располагаются в мембранах органелл. К настоящему времени экспериментальные данные об управляемых рецепторами реакциях получены для изолированных хлоропластов. Установлено, что низкие (<105

М) концентрации дофамина, норадреналина, а также адреналина, стимулируют

Ca2+/Mg2+-проницаемость мембран и фотофосфорилирование в хлоропластах гороха. Селективный агонист дофамина 6,7-diOHATN (2-амино-6,7-ди-гидрокси-1,2,3,4тетрагидронафтален гидробромид) в концентрациях 10-8-10-7 М также вызывал стимуляцию синтеза АТФ (Рис.3-14). Его действие имитировало

25

Рис. 3-14. Действие агониста дофамина 2-амино- 6,7-дигидрокси-1.2,3,4-тетрагидронафталена гидробромида на фотофосфорилировамие с НАДФ+ и ферредоксином а изолированных хлоропластах гороха (Roshchina, 1990).

эффект, вызываемый катехоламинами в тех же концентрациях. Константы связывания Кс соответственно дофамина и его агониста равны 10-9 М и 2 х10-9 М . Антагонист катехоламинов - адреноблокатор иохимбин в концентрациях 10-10 -10-9 М не ингибирует синтез АТФ. Торможение этого процесса выявлялось в более высоких концентрациях.

Концентрационная

фотофосфорилирование

в

кривая

обработанных

действия его

норадреналина

антагонистом

на

иохимбином

хлоропластах (рис.3-15) показывает, что максимум реакции (стимуляция синтеза АТФ на свету) смещается в сторону более высоких концентраций норадреналина. При концентрации иохимбина 10-5 М пул предполагаемых рецепторов полностью заполнен, в результате чего величина максимума стимуляции практически не изменяется. Константы связывания норадреналина, его агониста адреналина и антагониста иохимбина с хлоропластами соответственно равны в М 10-8, 5 х 10-9, 1,1 х 10-9. В состав адренорецепторов хлоропластов, вероятно, входят или связаны с ним и

сократительные

актомиозиновых

элементы филаментов

(актиноподобные цитохалазин

белки), В

поскольку

препятствует

блокатор

стимуляции

фотофосфорилирования норадреналином, а блокатор микротрубочек - колхицин не оказывает подобного действия.

26

Рис. 3-15. Действие антагониста норадреналина иохимбина на фотофосфорилирование с НАДФ+ и ферредоксином в изолированных хлоропластах гороха (Roshchina, 1990).1 - без иохимбина. 2-4 - на фоне иохимбина соответственно 10-8,10-7, 10-6 М.

Специфичность

действия

катехоламинов

и

их

агонистов

в

низких

концентрациях, вызывающих эффект, насыщение мест связывания и блокирование физиологической реакции (энергетических процессов, например фосфорилирования) антагонистами может указывать на присутствие адренорецепторов в клеточных органеллах. 3.2.2.Ферменты биосинтеза биогенных аминов. В реакциях синтеза биогенных аминов принимают участие гидроксилазы и декарбоксилазы, а также некоторые метилтрансферазы (Табл. 3-6). Их участие в метаболических путях показано в главе 1 (Рис.1-3). Гидроксилазы превращают тирозин в ДОФА и триптофан в 5-гидрокситриптофан. Первый фермент тирозингидроксилаза имеет молекулярную массу от 32 до 220 кДа и гидроксилирует тирозин в присутствии тетрагидробиоптерина и кислорода. Активность этого

фермента

стимулируется

ионами

двухвалентного

железа.

Триптофан-5-

гидроксилазы с молекулярной массой нативной формы 220 кДа гидроксилируют Таблица 3-6. Ферменты, участвующие в синтезе биогенных аминов Фермент

Гидроксилазы тирозингидроксилаза, триптофангидроксилаза, дофамин-β-гидроксилаза

Декарбоксилазы дигидроксифенилаланин декарбоксилаза, декарбоксилаза ароматических аминоксилот, гистидиндекарбоксилаза

Метилазы фенилэтаноламин-Nметилтрансфераза

Реакция Гидроксилирование

Путь биосинтеза биогенного амина

тирозина, триптофана, фенилэтиламинов, тирамина Декарбоксилирование

катехоламинов (начиная с дофамина), серотонина, катехоламинов (начиная с дофамина), катехоламинов (начиная с дофамина)

дигидроксифенилаланина в катехоламинов (начиная с дофамина), 5-окситриптофана,

серотонина

гистидина Метилирование

гистамина

норадреналина

адреналина

27

триптофан сходным образом - с непременным участием тетрагидробиоптерина и кислорода. Общий ход гидроксилирования сейчас представляют следующим образом:

Возможно, что промежуточной стадией реакции является образование перекиси водорода. Предполагается, что тирозингидроксилаза и триптофангидроксилаза активируются фосфорилированием с участием циклических нуклеотидов. Помимо тирозин- и триптофангидроксилаз существует третий тип гидроксилаз - дофамин-βгидроксилаза,

превращающая

фенилэтиламины

(в

том

числе

дофамин)

в

норадреналин :

Для этой реакции необходимы аскорбат и кислород. Дофамин-β-гидроксилаза имеет молекулярную массу 290 кДа, а субъединицы денатурированного белка - около 75 кДа. Фермент содержит медь в простетической группе. Другой фермент, гидроксилирующий тирамин до дофамина (найденный в плодах банана Musa sapientum), по своим характеристикам и ходу реакции гидроксилирования он напоминает дофамин-β-гидроксилазу. Группа декарбоксилаз включает в себя дигидроксифенилаланин декарбоксилазу, превращающую

дигидроксифенилаланин

катализирующую

образование

в

дофамин,

серотонина

из

декарбоксилазу, 5-окситриптофана,

гистидиндекарбоксилазу, декарбоксилирующую гистидин с образованием гистамина. В биосинтетическом пути синтеза серотонина из триптофана принимают участие два основных фермента - декарбоксилаза ароматических кислот, превращающая 5окситриптофан триптофан

в

в

серотонин

триптамин.

или

триптофандекарбоксилаза,

Гистидиндекарбоксилаза

участвует

превращающая в

образовании

гистамина. В

синтезе

адреналина

из

норадреналина

принимает

участие

фермент

фенилэтаноламин-N-метилтрансфераза. Реакция протекает по уравнению: норадреналин + S-аденозил-L-метионин = адреналин + S-аденозил-L гомоцистеин

3.2.3. Ферменты катаболизма биогенных аминов Катаболизм биогенных аминов происходит с участием двух основных ферментов аминооксидаз

и

метилтрансфераз

(Табл.3-7).

Реакции

окислительного

28

дезаминирования протекают с участием диаминооксидаз или моноаминооксидаз, медь-содержащих белков. Они способны окислять катехоламины до физиологически неактивных

продуктов

-

ванилиновой

кислоты,

серотонин

до

гидроксииндолилуксусной кислоты, а гистамин - до имидазол-амнноуксусной кислоты

(см.

главу

1).

В

состав

ферментов

входит

медь,

соединенная

сульфгидрильными группами с белком. Полагают, что медь необходима для активации реакционного центра, в который входят две сульфгидрильные группы, Таблица 3-7. Ферменты, участвующие в утилизации биогенных аминов Фермент

Реакция

Аминооксидазы

Дезаминирование

Диаминооксидазы

катехоламинов, серотонина, гистамина триптамина гистамина Перенос метильной группы (Метилирование) дофамина метокситирамина норадреналина адреналина гистамина

Моноаминооксидазы

Метилтрансферазы Катехоламин-о-метилтрансфераза

Гистамин-о-метилтрансфераза

Путь катаболизма катехоламинов, серотонина, гистамина серотонина, гистамина

катехоламинов

гистамина

два гистидиновых остатка и один ковалентно связанный флавин- адениндинуклеотид. В растениях фермент, участвующий в реакции окислительного дезаминирования, был впервые обнаружен в проростках разных растений и идентифицирован как диаминооксидаза. Экстракты из Trifolium pratense и Т. repens были способны в качестве субстратов использовать норадреналин и другие моноамины. В дальнейшем было показано, что не все диаминооксидазы способны утилизировать биогенные моноамины. Они преимущественно окисляют гистамин и диамины путресцин, кадаверин, спермидин. Диаминооксидазы катализируют окислительное дезаминирование гистамина и катехоламинов. Этот фермент был впервые выделен и очищен из проростков гороха Pisum sativum в Германии (Mann, 1955,1961). Его активность ингибировалась цианидом,

семикарбазидом,

диэтилдитиокарбаматом,

гидроксиламином,

3-

оксихинолином, о-фенантролином. В спектре поглощения выделенного белка розового цвета имеется характерный максимум при 500 нм, обусловленный присутствием 0,08-0,09% меди. Медь активирует фермент, но не входит в активный центр. При взаимодействии с субстратом диаминооксидаза образует желтый комплекс в анаэробных условиях, по-видимому, за счет образования хелатов меди. При оксигенировании розовая окраска фермента восстанавливается. Активный центр у

диаминооксидаз

представлен

или

флавинадениндинуклеотидом

или

29

пиридоксальфосфатом. У животных окисление гистамина осуществляет похожий на диаминооксидазу фермент гистаминаза, который содержит в активном центре оба указанных кофермента. Гомогенный препарат диаминооксидазы из этиолированных проростков гороха с молекулярной массой 185 кДа имел две полосы, одна из которых обладала

способностью

к

окислительному

дезаминированию.

Присутствие

моноаминооксидазы у растений установлено еще 50 лет назад, но исследованию ее реакций с биогенными аминами до сих пор уделено мало внимания. Известно лишь, что предшественник серотонина триптамин окисляется и дезаминируется этим ферментом до индолилуксусной кислоты. 3.3. Системы вторичных посредников (мессенджеров), связанные с нейротрансмиттерами Конформационные изменения рецепторов, вызванные взаимодействием с медиаторами, реализуются в клетке двумя путями: включением синтеза вторичных посредников - циклического З',5'-аденозинмонофосфата (цАМФ) и циклического гуанозин-3',5'-монофосфата (цГМФ), инозитолтрифосфата (инозиттрифосфата), а также инозиттрифосфата, или изменением ионной проницаемости мембран, например для ионов Са2+, которые также могут выполнять функцию вторичных посредников. Хотя первоначально представления о вторичных мессенджерах возникли на основании экспериментов на животных клетках, но они полностью применимы и для растительных клеток, поскольку все из перечисленных систем вторичных посредников обнаружены в растениях. Синтез вторичных посредников. Синтез цАМФ или цГМФ из АТФ и ГТФ осуществляется в клетке с помощью ферментов циклаз - соответственно, аденилатциклазы. или гуанилатциклазы. Для того, чтобы циклические нуклеотиды могли служить внутриклеточными медиаторами, их концентрация в клетке (обычно 10-6

М)

должна

строго

контролироваться.

Чрезмерное

накопление

их

предотвращается с помощью фосфодиэстераз, которые гидролизуют циклические нуклеотиды до нециклических продуктов, например цАМФ до аденозин-5'монофосфата. Синтез и гидролиз цАМФ показаны на рис. 3-16. Аналогичным образом происходят реакции образования циклического ГМФ из ГТФ с участием гуанилатциклазы и гидролизу ГМФ фосфодиэстеразой.

30

Рис.3-16. Пути образования вторичных мессенджеров в процессе метаболизма клетки.

Синтез цАМФ в растениях тесно связан с фотофосфорилированием и окислительным фосфорилированием, в процессе которых образуется необходимый субстрат - АТФ. Фермент синтеза цАМФ - аденилатциклаза найдена не только у животных, но и у у растений. Этот мембраносвязанный фермент (липопротеид с молекулярной массой 84 кДа) активируется ионами Mg2+ и Са2+, а также кальмодулином. В клетках аденилатциклаза присутствует в плазматической мембране, фракциях хлоропластов, ядер, митохондрий, микросом, тонопласте. В растениях также найден фермент синтеза цГМФ – гуанилатциклаза. Избыток цАМФ или цГМФ разрушается фосфодиэстеразой (молекулярная масса 350 кДа) до соответственно нециклических АМФ и ГМФ. Этот фермент присутствует в цитозоле и во фракциях многих органелл и плазмалеммы. Другим

вторичным

мессенджером

является

инозиттрифосфат

или

инозитолтрифосфат, который образуется в присутствии фермента фосфолипазы С путем отщепления от фосфатидилинозит бифосфата (рис.3-16). В результате образуется и другой вторичный мессенджер – диацилглицерол. В растениях были обнаружены компоненты инозитол-фосфатной системы вторичных посредников — фосфатидилинозитол

фосфодиэстераза

или

просто

фосфолипаза

С,

которая

гидролизует фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат с образованием диацилглицерола, и инозит(ол)трифосфатов.

31

Сопряжение рецептора с вторичными мессенджерами. Механизм сопряжения рецептора с синтезом вторичных посредников лучше всего изучен для циклических нуклеотидов с участием аденилатциклазной и гуанилатциклазной систем. Этот процесс

представляется

сигнальные

молекулы

следующим (медиаторы),

образом.

Рецептор,

располагается

на

воспринимающий внешней

стороне

плазматической мембраны, а аденилатциклаза или гуанилатциклаза - на ее внутренней стороне. Такое расположение создает условия для передачи внешнего сигнала внутрь клетки, где при участии вторичных посредников осуществляется регуляция внутриклеточных процессов. Передача информации к этим ферментам (аденилатциклазе мембранного

или

белка

гуанилатциклазе) трансдуцина,

осуществляется

называемого

G-

через

белком

посредство (G

-белок).

Аденилатциклаза активируется через разнообразные рецепторы не менее чем шестью медиаторами, в том числе адреналином, норадреналином, дофамином, серотонином и гистамином (ацетилхолин активирует не только аденилатциклазу, но и гуанилатциклазу). Активация

аденилатциклазы

или

гуанилатциклазы

осуществляется

черезцелую цепь биохимических реакций, начиная с конформационных изменений рецептора, который в результате взаимодействия с медиатором приобретает способность взаимодействовать с регуляторным белком (G-белком). G-белки играют центральную роль в механизмах передачи сигнала с поверхности внутрь клеток. Взаимодействие медиатора с рецептором (при участии в плазматической мембране G-белков) индуцирует сопряжение, например в аденилатциклазной системе, в результате чего в клетках изменяется содержание цАМФ - универсального вторичного посредника. Вторичные посредники не только способствуют передачу информации от внешнего сигнала внутрь клетки, но и обеспечивают усиление этого сигнала. Это можно иллюстрировать на примере аденилатциклазной системы следующим образом. Каждая молекула рецептора, присоединившая сигнальную молекулу, активирует много молекул аденилатциклазы, которая, в свою очередь, катализирует образование множества молекул цАМФ. В итоге, по всей цепи от рецептора до данной клеточной реакции происходит усиление сигнала в 107-108 раз. Так несколько сигнальных

молекул

медиаторов

могут

изменить

функциональную

или

метаболическую активность всей клетки. Аналогичным образом осуществляется функционирование и гуанилатциклазной системы синтеза цГМФ. Действие циклических нуклеотидов, как вторичных посредников основано на активации специфических ферментов цАМФ- или цГМФ-зависимых протеинкиназ,

32

которые фосфорилируют многие белки (в частности белки рибосом, ряд ферментов, транспортные мембранные белки и др). Фосфорилирование белков есть способ их активации, поскольку основные процессы в клетке идут, когда белки находятся в фосфорилированном

(активном)

состоянии.

В

неактивное

состояние

они

возвращаются путем дефосфорилирования с помощью фосфопротеинфосфатазы согласно схеме: цАМФ (цГМФ) → Протеинкиназа→ Белок + Р → Белок-Р →Фосфопротеинфосфатаза → Белок + Р

Избыток циклических нуклеотидов регулируется превращением в нециклические монофосфаты при участии фосфодиэстеразы . Циклические АМФ и ГМФ регулируют внутриклеточные реакции всех изученных прокариотических и эукариотических клеток. цАМФ в концентрации 10-5-10-6 М участвует

в

эндогенном

фотофосфорилировании

белков.

Для

некоторыхнейротрансмиттеров животных вторичным посредником чаще является циклический гуанозин-3'-5'-монофосфат (цГМФ). Его концентрация в клетке в 10 раз меньше, чем цАМФ. Теперь присутствие циклических нуклеотидов показано также в растительных клетках и отдельных органеллах. Вторичными мессенджерами, образование которых может индуцироваться адреналином и серотонином, являются диацилглицерол и инозитолфосфаты. Они образуются при гидролизе фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата как у животных, так и у растений (рис.3-16). Кроме того, для очень многих медиаторов вторичным посредником служат ионы кальция. Механизм действия данной группы вторичных посредников различен. Диацилглицерол активирует протеинкиназу С, которая фосфорилирует белки, Диацилглицерол→ протеинкиназа С →Белок + Р →Белок-Р

тогда как инозитолфосфаты стимулируют выход ионов Са2+ из компартментов клетки в цитоплазму: Инозитолтрифосфат→ Са2+- компартмент → протеинкиназа →Белок + Р →Белок-Р

Изменение

же

концентрации

активность

многих

ферментов,

кальция в

том

непосредственно числе

может

протеинкиназ,

регулировать

которые

затем

фосфорилируют белки Са2+→ → протеинкиназа →Белок + Р →Белок-Р

Ионы Са2+ сами по себе являются признанными вторичными мессенджерами. В нестимулированной

клетке

их

концентрация

составляет

10-8-10-7

М.

При

взаимодействии сигнальной молекулы с рецептором концентрация Са2+ возрастает в

33

десятки раз. В результате активируются или ингибируются ряд биохимических процессов в клетке. В большинстве случаев Са2+оказывает влияние на внутриклеточные процессы через кальций-связывающий белок кальмодулин (полипептид, состоящий из 148 аминокислот), который имеется во всех растительных и животных клетках. Присоединяя Са2+, кальмодулин претерпевает конформационные изменения и активирует кальмодулинзависимые белки -НАД-киназу, фосфодиэстеразу и другие ферменты. Кальмодулин тоже можно считать частью вторичных систем регуляции. Са2+ и кальмодулин контролируют мембранную деполяризацию, секрецию материалов клеточной стенки, движение хлоропластов в токе цитоплазмы и фототаксис, настические движения, рост, индуцированный гормонами, а главное - активность ферментов, принимающих участие в фоторазложении воды при фотосинтезе. С какими конкретными системами внутриклеточных вторичных мессенджеров связана передача хемосигнала от нейротрансмиттеров (биомедиаторов) снаружи внутрь клетки показано в ряде экспериментов на растениях (табл.3-8) с применением агентов, Таблица 3-8. Сопряжение передачи сигнала от биомедиатора к вторичному мессенджеру Медиатор

Сопряженный вторичный посредник

Ацетилхолин Ацетилхолин

Адреналин Серотонин Гистамин

цАМФ

Чувствительный к медиатору компонент вторичных посредников фосфодиэстераза

Са2+

Са2+

Циклические нуклеотиды цАМФ

Протеинкиназы фосфодиэстераза

цАМФ

фосфодиэстераза

Физиологический ответ

Прорастание пыльцы гиппеаструма Движения замыкающих клеток устьиц конских бобов Экссудация корней Прорастание пыльцы гиппеаструма Прорастание пыльцы гиппеаструма

блокирующих или стимулирующих активность ферментов синтеза и катаболизма вторичных посредников, или специальных флуоресцирующих красителей. Так участие системы

цАМФ

при

прорастании

пыльцы,

стимулированной

ацетилхолином,

серотонином и гистамином, показано российскими исследователями (Рощина и др. 1998). Стимулирующие эффекты этих медиаторов не наблюдаются, если пыльцу гиппеаструма

предварительно

обрабатывали

ингибиторами

фосфодиэстераз

теофиллином или изобутилметилксантином (образуется избыток цАМФ, что, в свою очередь,

блокирует

активность

аденилатциклазы).

С

помощью

ингибитора

протеинкиназ стауроспорина и ингибитора протеинфосфатаз окадаевой кислоты

34

недавно в лаборатории профессора Жолкевича (Жуковская и др. 2007, 2008) показано участие этих ферментов в трансдукции хемосигнала от адреналина (стимулирующего экссудацию) внутрь клеток корней кукурузы. В серии экспериментов китайских исследователей (Meng et al., 2004) установлено, что ацетилхолин стимулирует накопление ионов кальция (определяли по флуоресценции специального красителя Fluo-3) в замыкающих клетках устьиц. В результате открывается устьичная щель. Эти данные, наряду с информацией о присутствии в растениях широкого круга внутриклеточных вторичных мессенджеров для передачи внешних сигналов, дают основание предполагать, что механизм хемосигнализации с участием биомедиаторов от плазмалеммы внутрь клетки может осуществляться с помощью систем вторичных посредников.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Присутствие в растениях классических нейромедиаторов синаптической передачи возбуждения - ацетилхолина, катехоламинов, серотонина и гистамина, их заметная физиологическая

активность,

обнаружение

компонентов

холинэргической

и

адренэргической систем регуляции в растительных клетках, делает вполне реальной идею об

универсальных

принципах

сигнализации

и

передачи

информации

в

виде

электрического и химического сигналов у всех живых организмов. Различия отмечаются, в основном, в частных механизмах межклеточной сигнализации у многоклеточных животных и растений, обусловленных специализацией, структурной организацией, особенностями энергетического и метаболического обмена. Участие химических соединений типа медиаторов как генераторов изменений мембранного потенциала и их возможная роль в возникновении потенциалов действия у растений пока лишь постулируется на основе представлений, установленных для синаптической передачи животных. На уровне клетки (как у одноклеточных, так и у многоклеточных организмов, не имеющих синаптических контактов) присутствие ацетилхолина и биогенных аминов может объясняться их двойной ролью: как регуляторов внутриклеточного метаболитического обмена и как локальных внутриклеточных медиаторов, взаимодействующих с органеллами в ответ на внешний сигнал, полученный плазмалеммой из окружающей среды. Реакции на ацетилхолин и биогенные амины состоят в изменении проницаемости мембран для Na+, K+ и Са2+ и (или) индукции синтеза вторичных посредников. Присутствие в растительной клетке и ее органеллах вторичных мессенджеров цАМФ. цГМФ, Са2+ ионов, а также фермента аденилатциклазы подтверждают возможность локальной медиации, которую можно представить в виде схемы (рис. 1(закл.) Последовательность

указанных

событий

представляется

вероятной

для

митохондрий и хлоропластов, которые на начальном эволюционном этапе развития были самостоятельными организмами и сохранили характерные принципы структурной организации. Передача информации с помощью ацетилхолина и биогенных аминов от плазмалеммы к органеллам или между органеллами напоминает классический принцип межклеточной передачи возбуждения в синапсе. Это подтверждается тем, что медиаторную и регуляторную роль ацетилхолин и биогенные амины могут проявлять в низких концентрациях (10-9-10-7М).

Рис.1-закл. Пути передачи внешнего сигнала от плазмалеммы к органеллам и физиологический ответ клетки. Высокие концентрации ацетилхолина и биогенных аминов в растениях выполняют иную роль. Прежде всего, это связано со стрессовой ситуацией. Аккумуляция катехоламинов ведет к окислительно-восстановительным реакциям с образованием ядовитых продуктов их окисления (адренохрома) или синтезу на их основе токсиновалкалоидов (d-тубокурарина, берберастина и т.д.). Рост содержания ацетилхолина угнетает активность ферментов и, в частности, холинэстераз. При неблагоприятных воздействиях внешней среды возрастает протекторная роль биогенных аминов. Однако аккумуляция биомедиаторов не всегда показатель стресса. Она может быть таксономическим признаком, например, для семейства Urticaceae. В растениях этого семейства аккумуляция медиаторов в стрекательных волосках служит средством защиты от механического повреждения животными. Таким образом, роль ацетилхолина и биогенных аминов в растениях многообразна, и наряду с общебиологическими (регуляторной, сигнальной, медиаторной) им свойственны и специфические функции. Несмотря на то, что фундаментальные исследования механизмов сенсорных реакций растений находятся еще в начале пути, возникают вопросы практического применения уже полученных сведений. Холинэстеразная активность и рецепторные системы растений могут быть использованы для разработки лабораторных тестов на присутствие пестицидов и испытания новых средств защиты растений. Простота и доступность для анализа растительного материала делают отдельные органы, клетки и

органеллы

удобными

моделями

для

разработки

биосенсоров

в

биохимической

диагностике. Данные о метаболизме биомедиаторов в растениях имеют практическое значение для медицины и фармакологии как основа для получения новых лекарственных препаратов растительного происхождения. БЛАГОДАРНОСТИ Автор пособия глубоко благодарна преподавателям и специалистам в различных областях биофизики, физиологии, фармакологии и медицины, работающих с нейротрансмиттерами – Марии Николаевне Кондрашовой, Борису Николаевичу Головкину, Юрию Борисовичу Шмуклеру, Аркадию Юстиановичу Буданцеву. Они взяли на себя труд помочь в издании и редактировании данного пособия. Автор пособия также признательна профессору Флаку и вдове профессора Джаффе (США) за предоставленные для данной публикации фотографии ученых - пионеров в исследовании нейротрансмиттеров у растений.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА Монографии Бузников Г.А. Нейротрансмиттеры в эмбриогенезе. М.: Наука, 1987. 282 c. Рощина В.В. Биомедиаторы в растениях. Ацетилхолин и биогенные амины. Пущино: Биологический Центр АН СССР. 1991. 192 с. Roshchina V.V. Neurotransmitters in plant life. Enfield, Plymouth: Science Publ., 2001. 283 p. Обзоры Рощина В.В., Мухин Е.Н. (1986) Ацетилхолин в жизнедеятельности растений // Успехи современной биологии Т.101. № 2. С. 265-274. Рощина В.В. (1991) Нейротрансмиттеры катехоламины и серотонин в растениях. // Успехи современной биологии Т.111. № 4. С. 631-645. Рощина В.В. Функции нейромедиаторных веществ у растений//Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 2000. Т.86, №10б С.1300-1307 Рощина В.В., Семенова М.Н. (1990) Холинэстеразы растений: активность и субстратноингибиторная спцифичность..//Журнал эволюционной биохимии и физиологии. Т.26.№ 5 . С. 644—651. Fluck, R.A. and Jaffe, M.J. (1976). The acetylcholine system in plants. In: Commentaries in Plant Science. (Ed., H.Smith). pp. 119-136. Oxford: Pergamon Press. Fluck, R.A., Jaffe, M.J. (1974a). The acetylcholine system in plants. In: Current Advances in Plant Sciences. ( Ed., E.Smith). Vol. 5. pp. 1-22. Oxford: Science Engineering, Medical and Data Ltd. Hartmann , E. and Gupta, R. ( 1989) Acetylcholine as a signaling systems in plants. In: Second Messengers in Plant Growth and Development. (Eds., W.F.Boss and D.I.Morve). pp. 257-287. New York: Allan Liss. Kulma, A. and Szopa, J. 2007. Catecholamines are active compounds in plant. Plant Sci. 172: 433-440. Lyte, M. 1992. The role of microbial endocrinology in infection disease. J. Endocrinology 137: 343-345. Tretyn, A. , Kendrick, R.E. Acetylcholine in plants: presence, metabolism and mechanism of action. Botanical Review. 57(1): 33-73.1991 Wessler, I., Kilbinger, H., Bittinger, and Kirkpatrick, C.J. 2001. The non-neuronal cholinergic system: the biological role of non-neuronal acetylcholine in plants and humans. Japan J Pharmacology 85: 2-10 Дополнительная литература о нейротрансмиттерах животных Бузников Г. А., Шмуклер Ю.Б., Лаудер Дж. М. Изменение физиологической роли нейротрансмиттеров в течение индивидуального развития //Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова.. 1997. Т. 10 . С. 1-16. Бузников Г. А. Донервные трансмиттеры как регуляторы эмбриогенеза. Современное состояние проблемы //Онтогенез. 2007. Т. 38.№ 4. С.262-270. Шмуклер Ю.Б., Тости Э, Силвестре Ф. Эффект локальной микроапликации серотонинергических веществ на мембранные токи ранних зародышей Paracentrotus lividus //Онтогенез. 2007. Т. 38.№ 4. С.254-261 Шепперд Г. Нейробиология. М., 1987. Т.1 Интернет: www.ncbi.nlm.nih.gov,http://pharmacop.ru/category/antiserotoninovye-preparaty, http://nature.web.ru, http://www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2009,

1

Приложение 1. История открытия нейротрансмиттеров (Открытие нейротрансмиттеров в живых организмах из различных царств) Нейротрансмиттер Ацетилхолин

Дофамин

Норадреналин

В микроорганизмах В препаратах из гриба спорыньи Claviceps purpurea в 1914 году английскими учеными Эвинсом и Дэйлом (Ewins and Dale) и у бактерии Pseudomonas fluorescens Четом с сотрудниками (Chet et al.1973). В 1985 году у инфузории Tetrahymena pyriformis Гундерсеном и Томпсоном (Gundersen and Thompson) в Англии, а в 2000 году российскими исследователями Цавкеловой с сотрудниками в бактериях и грибах В 2000 году российскими исследователями Цавкеловой с сотрудниками в бактериях и грибах

Адреналин

Серотонин

Гистамин

.

В 1986 году в Японии китайцем Хсу с соавторами (Hsu with co-workers) во многих бактериях аскарид , затем у ряда грибов и бактерий советскими учеными Страховской и Фрайкиным и исследователем из США Марком Лайте (Lyte) в 19911993 годах, а также российским ученым Олескиным с сотрудниками в 1998 году. У гриба спорыньи Claviceps purpurea в 1910 году Баргером, Дэйлом и Кутчером (Barger, Dale and Kutscher), в 1947-1948 гг. у многих бактерий немецкими исследователями Верле и Раубом (Werle and Raub)

В растениях В стрекательных волосках листьев крапивы фармакологами Эммелином и Фельдбергом (Emmelin и Feldberg) в 1947 году в Великобритании

У животных В 1921-1926 годах в Германии Леви и Навратилом (Loewi and Navratil) у амфибий. (Но еще в 1906 году в адренальных железах млекопитающих студентом Хантом (Reid Hunt), работавший в лаборатории Джона Абеля (John J. Abel) в США.

Найден в 1944 году у Hermidium alipes Буэллоу и Гисвольдом (Buelow and Gisvold).

В бананах в 1950-1952 годах шведскими фармакологами Карлсоном, Хиларпом и Эулером (Arvid Carlsson, NilsÅke Hillarp and von Euler )

В 1956-1958 годах в плодах банана Ваалкесом и Юденфрендом (Waalkes and Udenfriend ) в шведских лабораториях В 1972 году в листьях банана Musa sapientum Аскаром, Рубахом и Шормуллером (Askar,, Rubach , Schormüller) в Германии В 1954 году в плодах банана (Musa) Боуденом с сотрудниками (Bowden et al. ) в Англии.

Изолирован из адренальных желез млекопитающих в 1897– 1898 годах в США Джоном Абелем (John J. Abel)

У многих растений немецкими исследователями Верле и Раубом (Werle and Raub) в 1948 году

В адренальных железах млекопитающих в 1895 году польским физиологом Наполеоном Цыбульским (Napoleon Cybulski) и в 1897 году американцем Джоном Абелем (John J. Abel) У разных типов и классов животных итальянским исследователем Эрспамером (Erspamer) в 1937-1940 годах и американцем Раппопортом с сотрудниками (Rapport with coworkers )в 1948 году

В1919 году американцем Джоном Абелем (John J. Abel) John Jacob Abel Джоном Абелем (John J. Abel) из различных экстрактов животных тканей