Методические указания к лабораторному практикуму по биологии почв для студентов II курса отделения почвоведения

Министерство образования Российской Федерации Ростовский государственный университет Биолого-почвенный факультет

Полякова А.В. Велигонова Н.В. Патрушева Е.В.

Методические указания к лабораторному практикуму по биологии почв для студентов II курса отделения почвоведения

Ростов-на-Дону 2001

2

Печатается по решению кафедры биохимии и микробиологии. Протокол № 9 от 4 апреля 2001 г.

3

СОДЕРЖАНИЕ

С.

Занятие 1. Правила работы и техника безопасности в микробиологической лаборатории. Микроскоп. Основные правила микроскопирования. Методы микроскопического исследования микроорганизмов.

4

Занятие 2. Знакомство с морфологией бактерий, актиномицетов, грибов. Препараты «раздавленная капля», «висячая капля», «отпечаток»

8

Занятие 3. Окраска. Фиксированный препарат. Окраска по Граму. Питательные среды. Принципы их составления. Способы стерилизации питательных сред, посуды, инструментария.

12

Занятие 4. Выделение почвенных микроорганизмов на питательных средах.

23

Занятие 5. Количественный учет микроорганизмов в почве. Получение накопительных культур азотфиксирующих микроорганизмов

24

Занятие 6. Превращение микроорганизмами азотсодержащих соединений. 26 Микроскопия свободноживущих азотфиксаторов. Занятие 7. Превращение микроорганизмами азотсодержащих соединений. 28 Аммонификация белковых веществ и мочевины. Занятие 8. Микроскопия микроорганизмов, разрушающих целлюлозу.

29

Список литературы Приложение. Схема посева

30 31

4

ЗАНЯТИЕ I Тема: 1. Правила работы и техника безопасности в микробиологической лаборатории. 2. Микроскоп. Основные правила микроскопирования. микроскопического исследования

Методы

микроорганизмов.

1. Правила работы и техника безопасности в микробиологической лаборатории. При работе в микробиологической лаборатории необходимо соблюдать определенные

правила

поведения.

Занятие

начинают

со

знакомства

с

инструкцией по технике безопасности. В лабораторию запрещается входить в верхней одежде и класть на столы сумки, портфели и другие личные вещи. В микробиологической лаборатории разрешается работать только в халатах и косынках (шапочках), которые защищают одежду и волосы от контаминации микроорганизмами, а также препятствуют их распространению за пределы лаборатории. За

каждым

студентом

закрепляется

постоянное

рабочее

место

и

микроскоп. Рабочее место во время занятий должно поддерживаться в полном порядке. На

всех

пробирках

и

чашках

обязательно

пишется

название

микроорганизма, дата его посева, фамилия студента, номер группы. В ходе работы бактериологические петли и иглы обеззараживаются прокаливанием в пламени горелки до и после отбора микроорганизмов. Приготавливая препарат или производя пересев культур микроорганизмов, выросших в жидкой среде, пользуются не петлей, а пипеткой, в верхний конец которой должен быть вложен кусочек ваты, чтобы не допустить случайного соприкосновения микробного материала с полостью рта. Использованные шпатели, пипетки помещаются в фарфоровые стаканы с дезинфицирующими растворами

(1%

раствор

хлорамина,

3%

раствор

фенола),

спички,

фильтровальную бумагу, отработанные препараты помещают в кристаллизатор. Класть на стол названные предметы категорически запрещается. Все препараты готовят на специальных стеклянных мостиках над кристаллизатором. В

случае

попадания

исследуемого

материала

или

культуры

микроорганизмов на руки, стол, халат или обувь необходимо сообщить об этом

5

преподавателю и под его руководством провести дезинфекцию. В лаборатории категорически запрещается принимать пищу. После

окончания

занятия

рабочее

место

дезинфицируется,

использованный материал и другие предметы сдаются лаборанту, моются с мылом руки, помещение проветривают (30-60 мин), облучают УФ-лампами. Результаты исследований протоколируются. 2. Микроскоп. Основные правила микроскопирования. Методы микроскопического исследования микроорганизмов. Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величины которых измеряются микрометрами

(1 мкм = 0,001 мм), нанометрами (1 нм =

0,001 мкм), ангстремами (1 А° = 0,1 нм), возможно только с помощью микроскопов. Наиболее

распространены

и

удобны

для

микробиологических

исследований прозрачных объектов в проходящем свете микроскопы МБИ-1, МБР1, БИОЛАМ 70Р (рабочий), С (студенческий), Д (дорожный). Микроскоп имеет механическую и оптическую части. Механическая часть микроскопа включает штатив с предметным столиком, тубус,

макро-

и

микрометрические

винты.

Верхняя

часть

штатива

-

тубусодержатель - может перемещаться на 50 мм с помощью механизма, приводимого в действие вращением макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и тонкой фокусировки препарата. При вращении

этих

винтов

по

часовой

стрелке

тубусодержатель

микроскопа

опускается, при вращении против часовой стрелки - поднимается. В верхней части тубусодержателя находится револьвер, в отверстия которого ввинчиваются объективы и тубус. Оптическая часть микроскопа состоит из осветительного аппарата, объектива и окуляра. Осветительный аппарат состоит из зеркала и конденсора. Зеркало отражает падающий на него свет и направляет его в конденсор. Одна сторона зеркала плоская, и ее используют при любом источнике света и при любом увеличении. Другую, вогнутую, сторону зеркала употребляют при искусственном освещении и

малых увеличениях без конденсора. Конденсор, состоящий из

нескольких линз, собирает отраженный от зеркала свет в пучок, направляемый непосредственно на плоскость препарата. Под конденсором имеется ирисовая

6

диафрагма (служит для задержания лишних лучей света) и откидная оправа для светофильтра. Объектив представляет собой наиболее важную часть микроскопа. Он состоит из системы линз, заключенных в металлическую оправу, которые дают действительное увеличенное обратное изображение. В микроскопах МБР-1, БИОЛАМ используются объективы, дающие увеличение в 8, 40 и 90 раз. Увеличение объектива зависит от фокусного расстояния фронтальной линзы и, следовательно, от ее кривизны. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива. Поэтому, чем большее увеличение дает объектив, тем ниже его следует опускать над плоскостью препарата. При 8х объективе расстояние между фронтальной линзой объектива и исследуемым объектом равно 8,53 мм, при 40х - 0,4 мм, при 90х- 0,1 мм. Изображение, получаемое при помощи линз, обладает рядом недостатков аберраций. Наиболее существенные - сферическая (каждая точка объекта имеет вид кружочка, а не точки, изображение не резкое, размытое) и хроматическая (получаемое изображение приобретает окраску, которую не имеет объект) аберрации. Объективы, у которых аберрации скоррегированы не полностью, называются ахроматами. Они содержат до шести линз и дают изображение наиболее резкое в центре. Более совершенные объективы - апохроматы - могут состоять из 10-12 линз, хроматическая погрешность в них в 10 раз меньше, чем у ахроматов. Планохроматы полностью устраняют искривление поля зрения, их применяют при микрофотографировании. Окуляр служит для рассмотрения изображения объекта, увеличенного с помощью объектива, и содержит две линзы: глазную (верхнюю) и собирательную (нижнюю). Окуляры могут давать увеличение в 5, 7, 10, 12, 15 и 20 раз, что указано на их оправе. Увеличение, увеличения

которое

объектива

на

дает

микроскоп,

увеличение

определяется

окуляра.

произведением

Бинокуляры

имеют

дополнительное увеличение насадки (она предназначена для наблюдения объекта одновременно двумя глазами). Однако общее увеличение еще не характеризует всех возможностей микроскопа. Увеличенное изображение может оказаться как четким, так и нечетким. Отчетливость получаемого изображения определяется

разрешающей

способностью

микроскопа

-

минимальным

7

расстоянием между двумя точками, когда они еще не сливаются в одну. Чем больше разрешающая способность микроскопа, тем меньшей величины объект можно увидеть. Повысить ее можно двумя путями: либо освещая объект короткими лучами света, например УФ, либо увеличивая показатель преломления среды (n), граничащей с линзой, с тем, чтобы приблизить его к показателю преломления стекла, на котором находится объект (n стекла = 1,5). В целом микроскопический объект может рассматриваться в трех типах системы: сухой между линзой объектива и объектом находится воздух (n = 1); водной - между линзой объектива и объектом находится капля воды (n = 1,3) - водная иммерсия; масляной - линза объектива погружается в каплю иммерсионного масла кедрового, касторового, вазелинового (n = 1,52) - масляная иммерсия. При микроскопии в дневное время можно пользоваться естественным светом, однако, чаще прибегают к источникам искусственного света, которые обеспечивают интенсивное регулируемое освещение (осветители типа ОИ-19, ОИ35). При установке света конденсор должен быть поднят до упора, ирисовая диафрагма открыта; настройка освещения производится с объективом малого увеличения (8х). Объектив опускают на расстояние около 0,8 см от предметного стекла и, вращая зеркало, добиваются равномерного и яркого освещения. Яркость освещения следует регулировать только изменением накала лампы осветителя или применением светофильтров. Положение зеркала, конденсора и диафрагмы осветителя больше не изменять! Диафрагмой конденсора можно пользоваться только для изменения контрастности изображения. На предметный столик помещают препарат, закрепляют его боковыми зажимами и изучают сначала с объективом 8х. Для детального изучения препарата

пользуются

объективом

40х,

осуществляя

фокусировку

только

микровинтом! После просмотра препарата переводят револьвер на увеличение 8х и только после этого снимают препарат с предметного столика. Микроскоп в нерабочем состоянии должен находиться на увеличении 8х! ХОД РАБОТЫ 1.

Изучить

инструкции

по

технике

безопасности

для

студентов,

работающих в лаборатории микробиологии, правила работы при выполнении микробиологического практикума. 2. Познакомиться с оборудованием микробиологической лаборатории.

8

3. Ознакомиться с устройством биологического микроскопа и правилами обращения с ним. ЗАНЯТИЕ II Тема: Знакомство с морфологией бактерий, актиномицетов, грибов. Препараты живых клеток («раздавленная капля», «висячая капля», «отпечаток»). Знакомство с морфологией бактерий, актиномицетов, грибов. Препараты «раздавленная капля», «висячая капля», «отпечаток» Морфология бактерий. Бактерии

по

форме

делятся

на

несколько

групп:

сферические,

цилиндрические, спиральные, необычной формы и нитчатые. Сферические бактерии, или кокки (гр. κοκκοs - ягода, зерно), имеют округлую форму. В зависимости от расположения клеток после их деления подразделяются на группы: Микро- (или моно-) кокки Диплококки Стрептококки Тетракокки Сарцины Стафилококки

Кроме круглой формы кокки могут быть ланцетовидными, овальными, удлиненными, чечевицеобразными и др.

Большинство кокков неподвижны и не

образуют эндоспор. Цилиндрическая форма (гр. Bacteria – палочка, лат. Bacillum – палочка) характерна для большинства бактерий. Палочковидные бактерии подразделяются на образующие и не образующие эндоспор.

9

Палочки, образующие споры, называют бациллами. Спорообразование у бактерий – способ перенесения неблагоприятных внешних воздействий. В клетке образуется только одна спора. Различают три вида спорообразования: Бациллярный Клостридиальный Плектридиальный Среди палочковидных бактерий есть подвижные и неподвижные формы. Подвижные имеют жгутики: Перитрих

Лофотрих Амфитрих

Монотрих Спиральной формы бактерии различаются количеством и характером завитков, длиной и толщиной клеток. Их можно разделить на не гнущиеся (вибрионы – изгиб не превышает ¼ оборота спирали, спириллы – имеют один или несколько правильных витков) и изгибающиеся (спирохеты – имеют много витков, напоминают штопор). Необычные тороидальные,

формы

бактерий

звездообразные,

морфологически

канатоподобные,

разнообразны: тубероидальные,

червеобразные и др. Нитчатые формы бактерий – это в большинстве случаев палочковидные

10

клетки, которые соединяются в длинные цепочки, объединяемые слизью, чехлами или общей оболочкой. Для определения формы бактерий, способности их к спорообразованию, подвижности достаточно исследовать их в живом состоянии на препаратах «раздавленная» и «висячая капля». Препарат «раздавленная капля» На чистое предметное стекло наносится небольшая капля водопроводной воды; дистиллированную воду брать не рекомендуется, так как в ней отсутствуют необходимая для микробов концентрация солей, что может вызвать изменение формы клеток, потерю ими подвижности и т. д. В каплю воды бактериологической петлей, прокаленной в пламене горелки и охлажденной, помещают исследуемый материал. Им могут служить настои мяса, рыбы, белка яйца, навоза, сена, картофеля, гороха и прочие, а также чистые культуры микроорганизмов. Препарат накрывают покровным стеклом, помещают на предметный столик микроскопа и исследуют в сухой системе. В препарате можно найти микро-, дипло-, стрептококки, бактерии, бациллы. По характеру их движения можно предположить тип жгутикования (сами жгутики в живом препарате увидеть не удается): перитрих – кувыркающиеся движения, монотрих, лофотрих – направленное, стремительное. Споры в водном препарате отличаются от микрококков резкой очерченностью, сильно преломляют свет и кажутся блестящими или темными. Препарат «раздавленная капля» быстро готовится, и позволяет установить форму клеток микроорганизмов, их размеры, способ спорообразования, а также наличие или отсутствие подвижности, но, к сожалению, является недолговечным. Препарат «висячая капля» «Висячей каплей» удобнее пользоваться для наблюдения подвижности микробов, их развития, размножения, прорастанием спор. Для

приготовления

препарата

небольшую

каплю

суспензии

микроорганизмов наносят на покровное стекло, переворачивают его каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением в центре. (рис. 1). Края

лунки

предварительно

смазывают

вазелином.

Капля

оказывается

герметически заключенной во влажной камере, что допускает многодневное наблюдение за объектом.

11

Препарат «висячая капля» 2

3

1

Условные обозначения: 1- предметное стекло с углублением в центре, 2 – покровное стекло, 3 – капля суспензии микроорганизмов.

Рис. 1 Морфология актиномицетов Общим признаком актиномицетов, или ветвящихся бактерий, является способность образовывать при развитии в питательной среде мицелий толщиной 0,6 – 1,4 мкм. У одних актиномицетов мицелий хорошо развит, у других способность к его образованию выражена лишь в тенденции клеток к ветвлению и проявляется в строго определенных условиях. По строению клетки и ее химическому составу актиномицеты во многом напоминают бактерии, а по способности образовывать мицелий и строению органов плодоношения – грибы. Колонии

актиномицетов

представляют

собой

сложную

систему

несептированных гиф, часть которых при росте на агаризованной среде проникают в субстрат – субстратный мицелий, а другая часть свободно ветвится в воздухе и образует на поверхности колонии пушистый, бархатистый или мучнистый налет, состоящий из гиф воздушного мицелия. Размножаются

актиномицеты

обрывками

мицелия

или

спорами,

образующимися бесполым путем и располагающимися одиночно, парами, цепочками или в спорангиях. Морфология плесневых грибов Под

названием

«плесневые

грибы»

объединяют

представителей

различных классов грибов. Вегетативное тело грибов организовано в виде мицелия. На плотных средах плесени образуют пушистый паутинообразный налет различной

окраски.

Воздушный

мицелий

состоит

преимущественно

из

спороносной части гриба, вегетативное тело проникает в субстрат. Плесени

12

размножаются спорами и участками мицелия. Мицелий Фикомицетов (Mucor, Rhizopus)

несептированный,

на

отдельных

его

веточках

образуются

спорангиеносцы с шаровидными спорангиями, наполненными эндоспорами. Мицелий

Аскомицетов

(Penicillium,

Aspergillus)

септирован,

они

образуют

преимущественно конидиальные спороношения. Строение колоний и мицелия, его ветвление, строение и расположение спороносцев можно изучать, просматривая колонии актиномицетов и грибов, выросшие на плотной питательной среде в чашках Петри при малом увеличении микроскопа. Препарат «отпечаток» Для знакомства с формой спор и мицелия актиномицетов и грибов делают препарат

«отпечаток».

Чистое

покровное

стекло

накладывают

на

газон

микроорганизма, слегка надавливают на него пинцетом, и тотчас же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды на предметное стекло и рассматривают под микроскопом в сухой системе. Этот препарат также удобен для изучения естественного расположения клеток в колониях микроорганизмов. ХОД РАБОТЫ 1. Приготовить препарат «раздавленная капля» настоя гороха или картофеля и исследовать в сухой системе при увеличении 40х. Изучить формы бактерий,

обратить

внимание

на

характер

спорообразования,

движения

палочковидных форм. Сделать зарисовки в тетради. 2.

Просмотреть

колонии

актиномицетов

или

плесневых

грибов,

выращенных на плотной питательной среде в чашках Петри, при малом увеличении микроскопа, а также приготовить «препарат отпечаток» и изучить строение мицелия и споронсцев со спорами. Зарисовать и обозначить их. ЗАНЯТИЕ III Тема: 1. Окраска. Фиксированный препарат. Окраска по Граму. 2.

Питательные

среды.

Принципы

их

составления.

стерилизации питательных сред, посуды, инструментария. 1. Окраска. Фиксированный препарат. Окраска по Граму

Способы

13

Окраска микроорганизмов – сложный физико-химический процесс, в котором играют роль явления электроадсорбции, капилярности, химического сродства между красителем и объектом. Некоторые красители характеризуются избирательным сродством к отдельным компонентам клетки (ядерному веществу, включениям) и применяются для их выделения. Для

окраски

микроорганизмов

используют

анилиновые

красители

(основные, кислые и нейтральные). К кислым красителям относят те, у которых ион, придающий окраску (хромофор), - анион. У основных красителей хромофором является катион. Наибольшее применение имеют основные красители: основной фуксин, сафранин (красные), генцианвиолет (фиолетовый), метиленовая синь, малахитовая зелень. Из кислых красок широкое применение находят кислый фуксин, эритрозин (красные), конго, пикриновая кислота (желтые), нигрозин (черная). Пользуясь комбинацией кислых и основных красок, можно произвести дифференциацию структурных частей клетки (ядра, протоплазмы и т. д.). Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. Прижизненной окраской следует считать лишь такую, при которой окрашенные микроорганизмы остаются длительное время живыми и способными к размножению. Для прижизненной окраски применяют красители в очень сильных разведениях – от 0,001 до 0,0001 %. Фиксированный препарат Фиксированный

препарат

готовят

для

выявления

некоторых

морфологических особенностей и количественного учета, проверки чистоты культуры и ряда других целей. Такие препараты могут храниться длительное время, имеют высокую контрастность, позволяют дифференцировано выявлять клеточные структуры, кроме того, работа с ними безопасна. Приготовление

фиксированных

окрашенных

препаратов

включает

следующие этапы: 1. Приготовление мазка. На обезжиренное предметное cтекло наносят маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество

исследуемого

материала.

Полученную

суспензию

равномерно

распределяют петлей на площади 1 – 2 кв. см возможно более тонким слоем. 2. Высушивание. Препарат высушивают при комнатной температуре на воздухе или в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло

14

мазком вверх, не перегревая, иначе клетки микроорганизмов деформируются. 3. Фиксация. Преследует следующие цели: 1) убить микробов, 2) обеспечить лучшее прилипание мазка к стеклу, 3) сделать мазок более восприимчивым к окраске. Для фиксации сухой препарат несколько раз проводят через пламя горелки (до легкого ожога руки от прикосновения к стеклу). Для изучения строения бактериальной клетки термическая фиксация не годится, тогда используют химическую фиксацию: 1) этиловым спиртом 960 в течение 5 –20 мин, 2) смесью равных объемов этилового спирта и эфира (жидкость Никифорова) до испарения смеси, 3) жидкостью Карнуа (960 этиловый спирт + хлороформ + ледяная уксусная кислота в соотношении 6:3:1) и др. 4. Окраска. Фиксированный препарат покрывают раствором какого-либо красителя. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на фильтровальную бумагу, покрывающую препарат. Следят, чтобы во время окрашивания раствор красителя на мазке не подсыхал. Через 1 – 3 мин мазок промывают слабой струей воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной.

Препарат

осторожно

промокают

фильтровальной

бумагой

и

просматривают под микроскопом. При простых методах окраски используют один краситель, при этом окрашивается вся клетка и хорошо видны ее формы и размеры. Сложные методы заключаются

в

последовательном

окрашивании

двумя

или

несколькими

красителями, при этом окрашивается не вся клетка, а лишь определенные ее структуры, например, ядерный аппарат. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения остается светлым и чистым, а окрашенными оказываются только клетки микроорганизмов или их структуры. Окраска по Граму Впервые предложена в 1884 г. датским ученым Х. Грамом для выявления бактерий в гистологических срезах. Сущность метода заключается в том, что при обработке генцианвиолетом и йодом в клетках одних микроорганизмов образуется относительно устойчивый и нерастворимый в спирте комплекс, который удерживается ими при обработке спиртом. Эти микроорганизмы относят к грамположительным, они остаются окрашенными

в

сине-фиолетовый

цвет.

Грамотрицательные

бактерии

обесцвечиваются спиртом, и их выявляют, дополнительно окрашивая контрастной

15

краской (водным фуксином). В основе механизма окраски по Граму лежат особенности химического состава и строения клеточных стенок бактерий. Для окраски берут клетки молодых 18 - 24 ч. культур бактерий, так как с возрастом в бактериальной популяции увеличивается количество мертвых клеток, которые всегда грамотрицательные, а некоторые грамположительные бактерии становятся грамотрицательными (например, Lactobacillus). Окраску по Граму проводят следующим образом: 1. Готовят мазок культуры исследуемого микроорганизма на предметном стекле, который высушивают на воздухе, фиксируют жаром. 2. На препарат помещают фильтровальную бумагу и наносят раствор генцианвиолета. Экспозиция 2 мин. 3. Не смывая краски, добавляют раствор Люголя (I2 в KI) на 2 мин. (до почернения мазка). 4. Сливают растворы красок и препарат обесцвечивают 960 этиловым спиртом в течение 60 сек. 5. Препарат быстро, чтобы не увеличить экспозицию спирта, промывают водой. 6. Дополнительно контрастно окрашивают водным раствором основного фуксина. Экспозиция 2 мин. 7. Препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют. В поле зрения микроскопа грамположительные бактерии сине-фиолетового цвета, грамотрицательные – красные. Определение

принадлежности

бактерий

к

грамположительным

или

грамотрицательным можно проводить с помощью экспресс-анализа с 3% раствором KOH. Для этого на предметное стекло помещают каплю раствора щелочи, в которую вносят бактериологической петлей исследуемую культуру и перемешивают в течение 60 сек. Если суспензия микроорганизмов в щелочи становиться

вязкой

или

желеобразной,

то

культура

относится

к

грамотрицательным, в противном случае – к грамположительным. 2.

Питательные

среды.

Принципы

их

составления.

Способы

стерилизации питательных сред, посуды, инструментария Для

накопления,

выделения,

культивирования

и

сохранения

16

микроорганизмов пользуются питательными средами, которые не только содержат питательные вещества, но и являются средой обитания микроорганизмов. Поэтому при составлении сред учитывают как потребности микроорганизмов в веществах, необходимых для их жизни, так и физико-химические условия, в которых микроорганизмы могут осуществлять обмен между клеткой и средой. Требования, предъявляемые к питательным средам •

Среды

источники

должны

питания.

содержать Недостаток

все или

необходимые избыток

для

микроорганизмов

питательных

элементов

неблагоприятны для роста микроорганизмов. Специфичность питательных сред определяется набором соединений, поставляющих клеткам углерод и азот. Минеральный фон сред для многих микроорганизмов бывает очень близок по составу, так как микроорганизмы по потребностям в минеральных веществах менее разнообразны. По мере необходимости в среды добавляют факторы роста (витамины, гормоны) в незначительных концентрациях. •

Среды должны содержать отдельные ингредиенты в определенных

соотношениях, примерно соответствующих соотношению их в клетке. Для большинства гетеротрофов применяют среды, содержащие 0,8 – 1,2 г/л аминного азота (в составе NH2), 2,5 – 3,0 г/л общего азота, 1% пептона и 0,5 % хлоридов (NaCl). Соотношение углерода и азота должно составлять 20:1. •

Среды

должны

иметь

достаточную

влажность,

обеспечивающую

возможность диффузии питательных веществ, в клетку. •

Важным

фактором

является

кислотность

среды.

Большинство

микроорганизмов развиваются при нейтральной или слабощелочной реакции среды. Грибы обычно развиваются в более кислой среде, чем бактерии. Есть среди

бактерий

кислотоустойчивые

(молочнокислые,

уксуснокислые),

ацидофильные (Acetobacter acidophillus), щелочеустойчивые (уробактерии). В процессе стерилизации

сред и культивирования микроорганизмов рН может

изменяться. Чтобы избежать этого, в среду добавляют буферные системы (фосфатные буферы) или мел. •

Среды должны обладать определенным окислительно-восстановительным

потенциалом, определяющим насыщение их кислородом (rH2). По шкале от 0 до 41 этим индексом можно обозначит любую степень аэробности: насыщенный

17

кислородом раствор обозначают rH2=41, насыщенный водородом – rH2=0. Анаэробы размножаются при rH2<5, аэробы – при rH2>10. •

Среды

должны

быть

изотоничными

для

микробной

клетки,

т.

е.

осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Большинство бактерий могут расти на средах с 0,1 – 10 % NaCl. •

Среды должны быть стерильными, чтобы обеспечить рост чистых культур

микроорганизмов. Классификации питательных сред По происхождению питательные среды можно разделить на натуральные, синтетические, полусинтетические. Натуральными обычно называются среды, которые состоят из продуктов животного

или

растительного

происхождения,

имеющие

неопределенный

химический состав. Основой таких сред являются злаки, травы, овощи, фрукты, молоко, животные ткани, кровь, сыворотка, мясо, почва, вода морей, озер и минеральных

источников,

яйца,

шерсть,

дрожжи.

Большинство

из

них

используется в виде экстрактов, отваров, настоев. Примеры таких сред – мясопептонный бульон (МПБ) для гетеротрофов, неохмеленное пивное сусло для дрожжей, почвенная вытяжка для почвенных микроорганизмов. Натуральные среды

используются,

главным

образом,

для

поддержания

культур

микроорганизмов, накопления их биомассы и для диагностических целей. Компонентами полусинтетических сред наряду с соединениями известного состава (углеводы, фосфаты, нитраты и др.) являются натуральные продукты неопределенного состава (мясной отвар, пивное сусло). Такие среды находят широкое применение в промышленной микробиологии. Синтетические среды – это такие среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях.

Эти

среды

готовят

только

на

дистиллированной

воде.

Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. По назначению среды делят на: 1.

Универсальные

(МПА,

МПБ

и

др.).

На

них

растут

многие

микроорганизмы. 2.

Специальные. Эти среды применяют для выращивания микробов, не

18

размножающихся на универсальных средах. Среди специальных сред различают элективные и дифференциально-диагностические. Элективные (избирательные) среды подобраны таким образом, чтобы обеспечить наиболее благоприятные условия для выращивания определенных микроорганизмов. Их применяют для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания или для получения накопительных культур. К таким средам относятся среда Эшби для Azotobacter,

среда

Виноградского

для

Clostridium.

Дифференциально-

диагностические среды используют для дифференциации определенных видов бактерий по их культуральным и биохимическим свойствам. К таким средам относят среды с молоком, желатином, на которых определяют протеолитические свойства микробов. В состав дифференциально-диагностических сред могут входить индикаторы (феноловый красный, метиленовый синий и т.д.), которые изменяя окраску при различных значениях рН, указывают на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления вводимого в среду субстрата. Примером таких сред является среда Эндо, применяемая для выделения и определения бактерий кишечной группы, на которой колонии кишечной палочки окрашиваются в красный цвет с металлическим блеском. По физическому состоянию среды разделяются на жидкие, плотные, сыпучие.

Для

выяснения

физиолого-биохимических

особенностей

микроорганизмов, а также для накопления их биомассы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие среды. Плотные среды используют для выделения

чистых

культур,

в

диагностических

целях,

для

хранения

и

количественного учета микроорганизмов и в ряде других случаев. Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатин и кремнекислый гель. Агар-агар – сложный полисахарид, получаемый из бурых водорослей, который образует гель с точкой плавления 96-100 40

0

0

С и температурой застывания

С. Плотные питательные среды получают, добавляя к жидким 1,5 – 2 % агар-

агара. Желатин – вещество белковой природы, которое получают из костей и хрящей животных при их вываривании. Его добавляют к средам в количестве 10 – 20 %. Образуемый желатином гель плавится при 23 –25 0 С и застывает при 20 0 С, а также разжижается под действием протеолитических ферментов многих микроорганизмов, в связи с чем используется ограниченно.

19

Кремнекислый гель (силикагель) образуется из силикатов калия или натрия и соляной кислоты. Хорошо промытые и стерильные гелевые пластинки в чашках Петри пропитывают стерильной питательной средой. Преимуществом силикагеля является то, что он представляет собой минеральное соединение и пригоден для культивирования автотрофов (например, нитрифицирующих бактерий). Способы стерилизации питательных сред, посуды, инструментария При

выделении

микроорганизмов

и

сохранении

чистых

культур

необходимо, чтобы среда не содержала никаких посторонних микробов, что достигается обеспложиванием или стерилизацией. Стерилизуют как среды, так и материалы, инструменты, аппараты, которыми пользуются при работе. Стерилизация бывает: - физическая - химическая - биологическая Физическая стерилизация подразделяется на термическую и холодную. Термическая стерилизация - стерилизация под действием высоких температур,

вызывающих

денатурацию

клеточных

белков,

разрушающих

осмотический барьер клеток, нарушающих равновесие ферментативных реакций, что приводит к гибели клетки. Термическая стерилизация осуществляется различными способами: 1.

Прокаливание в пламене горелки. Так стерилизуют бактериальные

петли, иглы, кончики пинцетов, горлышки колб и пробирок, ватные пробки (кратковременно). 2.

Кипячение. Производят в стерилизаторе. Стерилизуют шприцы,

ножницы, скальпели, пинцеты, резиновые перчатки и резиновые пробки. 3.

Стерилизация сухим жаром. Осуществляется в сушильных шкафах

при температуре 160

0

С – 2 ч., 165

0

С – 1 ч., 180

0

С – 40 мин. Горячим воздухом

чаще всего стерилизуют стеклянную посуду. 4.

Стерилизация влажным жаром (текучим паром). Производится в

аппарате Коха или в автоклаве при открытом выпускном кране. Таким образом стерилизуют питательные среды, свойства которых изменяются при температурах выше 100

0

С. Обработку материала текучим паром используют для проведения

дробной стерилизации (тиндализации) – трехкратной обработки питательной

20 0

среды влажным жаром в течение одного часа при температуре 70 – 80 интервалами

24

ч.,

во

время

которых

поддерживается

С с

температура,

благоприятная для прорастания спор. Проросшие из спор вегетативные клетки быстро погибают при очередном нагревании. 5. Наиболее

Стерилизация влажным жаром под давлением (автоклавирование). надежный

и

чаще

всего

применяемый

способ

стерилизации

питательных сред. Основан на нагревании материала насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного. Время стерилизации 10 – 45 мин. Температура пара возрастает при повышении его давления: Температура пара ( С 0 )

Давление (атм.)

112

0,5

121

1

128

1,5

132

2

6.

Неполная стерилизация (пастеризация). Достигается выдерживанием

материала при 60

0

0

С в течение 30 мин, при 75

С –15 мин, при 90

0

С без

выдержки. Широко применяется для частичной стерилизации легко портящихся пищевых

продуктов

(молоко,

соки,

сиропы).

В

почвенной

микробиологии

пастеризуют суспензии почв, чтобы освободить их от вегетативных клеток, но сохранить споры бактерий. Методы холодной стерилизации применяют в тех случаях, когда среды не выдерживают нагревание. Холодная стерилизация включает в себя: 1.

Фильтрацию, которая заключается в пропускании жидкостей через

специальные

фильтры,

имеющие

мелкопористые

перегородки

и

поэтому

задерживающие клетки микроорганизмов. Причем здесь имеет место не только механическая

задержка,

но

и

адсорбция

микроорганизмов

на

стенках,

ограничивающих поры, вследствие того, что большинство микроорганизмов в водных суспензиях несет на своей поверхности отрицательный заряд, а фильтры изготавливаются

из

положительно

заряженных

материалов.

Диаметр

пор

определяет область применения фильтров (фильтрующее и стерилизующее

21

действие). Используют следующие типы фильтров: •

Мембранные фильтры (пористые диски из целлюлозы, коллодия,

ацетата, толщиной около 0, 1 мм с диаметром пор от 0, 35 до 1, 2 мкм). •

Фильтры Зейтца (диски из смеси асбеста с целлюлозой). С

увеличением содержания целлюлозы пористость фильтра возрастает. •

Мелкопористые стеклянные фильтры (диски из фрагментов стекла,

получаемые путем его сплавливания). •

Фарфоровые фильтры в виде полых свечей из каолина с примесью

кварцевого песка (свечи Шамберлана), из инфузорной земли (свечи Беркефельда) и других материалов. Фильтр, представляющий собой диск, закрепляется в специальном держателе (стеклянном, металлическом), который вставляется в приемник фильтрата (колба Бунзена). Свечи вставляют непосредственно в резиновую пробку приемника. Перед употреблением фильтры, их держатели и приемник фильтрата должны быть простерилизованы. Обычно фильтрование ускоряется путем создания на фильтре перепада давления, достигаемого либо приложением повышенного давления к находящейся над фильтром жидкости, либо откачиванием воздуха с помощью вакуумного насоса, присоединенного к приемнику фильтрата. Мембранные использование.

и

Свечи

асбестовые после

фильтры

специальной

рассчитаны

обработки

на

одноразовое

можно

использовать

повторно. 2.

Стерилизацию облучением, основанную на летальном эффекте,

которое оказывают на клетки микроорганизмов ультрафиолетовые, рентгеновские, γ -,

α -,

β - лучи и нейтроны. В лабораторных условиях обычно используют

ультрафиолетовые бактерицидные

лучи,

лампы.

источником

Излучателем

которых в

них

являются

служит

специальные

электрическая

дуга,

возникающая в парах ртути низкого давления и испускающая линейчатый спектр в ультрафиолетовой области с длиной волны 260 нм. Бактерицидные лампы используют для частичной стерилизации открытых поверхностей и воздуха. Применение

ультрафиолета

ограничено

из-за

его

малой

проникающей

способности. Вегетативные формы бактерий более чувствительны

к УФ-

22

облучению, чем споры. 3.

Стерилизацию ультразвуком, создаваемым в жидкостях при помощи

вибрирующих никелевых или кварцевых дисков. Разрушение клеток при ультразвуковом воздействии обусловлено возникновением вторичных явлений – кавитации. В результате действия звуковой волны высокой частоты образуются разрывы в жидкости, которые затем образуют пузырьки. При их захлопывании идет сильная гидравлическая волна, достигающая 10 атм., что приводит к механическому разрушению клеток. Бактерицидный эффект ультразвука снижается, если подавляется кавитация (разрыв жидкости), что происходит при дегазации, погружении объекта в гель или другую вязкую среду.

Бактерицидный

насыщении

эффект

озвучиваемой

ультразвука

эмульсии

напротив

углекислотой,

усиливается

азотом,

при

кислородом,

воздухом, так как это усиливает кавитацию. К ультразвуку чувствительны все микроорганизмы, в том числе и споровые. Но по степени чувствительности они значительно отличаются. Химическая разрушение поверхностях,

стерилизация

микроорганизмов, с

помощью

представляет

находящихся

химических

на

собой неживых

агентов,

удаление

или

объектах

или

получивших

название

дезинфицирующих веществ. В качестве дезинфицирующих агентов применят галогены и их производные (гипохлорид натрия, хлорамины, спиртовой раствор йода), фенольные соединения, спирты, микробоцидные газы (формальдегид, окись этилена). Для консервации питательных сред, вакцин и сывороток используют хлороформ, толуол, эфир, формалин и др. Биологическая стерилизация основана на применении антибиотиков. ХОД РАБОТЫ 1.

Приготовить фиксированный препарат, окрасить его по методу Грама,

промикроскопировать при увеличении объектива 40х. Дополнительно провести экспресс-анализ с 3 % раствором КОН. Результаты наблюдения занести в тетрадь. 2.

Ознакомиться с различными видами питательных сред, методами их

стерилизации и оборудованием для стерилизации. 3.

Подготовить посуду (пипетки, шпатели, чашки Петри) к стерилизации,

завернув их в бумагу.

23

ЗАНЯТИЕ IV Тема: Выделение почвенных микроорганизмов на питательных средах. Выделение почвенных микроорганизмов на питательных средах Почва представляет собой природную среду, где имеются все условия для нормального развития микроорганизмов. Она снабжена достаточным количеством органических и минеральных веществ, имеет подходящую реакцию и влажность, снабжена кислородом и защищена от губительного влияния прямых солнечных лучей. Почва обильно заселена микробами и является основным источником их распространения. Одним из видов количественного учета микроорганизмов почвы является посев на жидкие и плотные питательные среды. Предложено много способов посева и огромное количество питательных сред. Одним из таких методов является высев на плотные питательные среды (чашечный метод). Сущность метода заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний. Работа этим методом включает три этапа: 1.

Приготовление разведений. Чтобы получить изолированные колонии,

почву разводят в стерильной водопроводной воде, пользуясь постоянным коэффициентом разведения 10. Таким образом, получают серию разведений, в которой концентрации клеток образуют геометрическую прогрессию. Разведения производят следующим образом: 10 г почвы вносят в 100 мл стерильной воды в колбе и размешивают в течение 3 мин. Полученная суспензия представляет собой разведение 1:10 (1 разведение). После отстаивания почвенной болтушки в течение 1 мин стерильной пипеткой берут 1 мл этой почвенной суспензии и вносят в 10 мл стерильной воды в пробирку № 1, получая при этом разведение исходного субстрата 1:100 (2 разведение). После размешивания (барботации) берут 1 мл почвенной суспензии из пробирки № 1 и вносят в пробирку № 2. Далее аналогичным образом готовят необходимое количество разведений. Пипетку меняют при каждой новой концентрации почвенной суспензии. 2.

Посев в чашки. Высевать суспензию можно поверхностным и

глубинным способами. Перед посевом суспензии поверхностным способом в стерильные чашки Петри разливают расплавленную агаризованную среду (по 20

24

мл). Чашки оставляют на горизонтальной поверхности пока среда не застынет. Далее на поверхность среды стерильной пипеткой наносят одну каплю (0,05 мл) соответствующего

разведения.

Этот

объем

распределяют

стерильным

стеклянным шпателем по поверхности питательной среды. Высевы на плотную среду обычно производят из 4 – 5 разведений в 2 – 4 повторностях. Засеянные чашки Петри помещают в термостат крышками вниз. При глубинном способе посева 1 мл разведенной суспензии вносят стерильной пипеткой в стерильную чашку Петри. Затем, осторожно приоткрыв под углом крышку, заливают дно чашки 20 мл расплавленной и охлажденной до 45

0

С агаризованной среды. Крышку

чашки закрывают и тщательно перемешивают питательную среду с посевным материалом, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания агара. Засеянные чашки Петри помещают в термостат крышками вниз. 3.

Подсчет выросших колоний.

Для подсчета количества микроорганизмов, которые плохо или совсем не развиваются на плотных питательных средах, применяют метод высева в жидкие среды (метод предельных разведений). Сущность метода состоит в следующем. В пробирки с жидкой средой вносят строго измеренный объем из различных разведений исследуемой почвенной суспензии. После инкубации исходя из числа пробирок в которых наблюдался или отсутствовал рост, расчитивают число клеток, содержащихся в одном грамме исходного субстрата. Для выявления и учета бактерий посевы делают чаще всего на МПА. Актиномицеты учитывают на крахмало-аммиачном агаре (КАА), грибы – на агаризованной среде Чапека. На жидкой среде Виноградского учитывают свободно живущих азотфиксаторов р. Clostridium. ХОД РАБОТЫ Произвести посев образца почвы на МПА, КАА, среду Чапека (приложение 1). При посеве учитывать, что бактерии высевают глубинно, а актиномицеты и грибы – поверхностно из 3, 4, 5 разведения. После посева чашки и пробирки подписать с указанием степени разведения, группы, фамилии студента, а также даты посева. ЗАНЯТИЕ V Тема: 1. Количественный учет микроорганизмов в почве.

25

2. Получение накопительных культур азотфиксирующих бактерий. 1.

Количественный учет микроорганизмов в почве

Количество микроорганизмов на плотных средах определяют подсчетом развившихся колоний в чашках Петри. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суспензии суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из данного разведения. Колонии подсчитывают, не открывая чашек, и для удобства отмечают просчитанные колонии точками на наружной стороне дна чашки, пользуясь карандашом по стеклу. Лучшим разведением следует считать то, при высеве из которого вырастает от 50 до 100 колоний на одной чашке. Количество клеток в 1 г почвы определяют по формуле: a х 10n M = -------------------, где V M – количество клеток в 1 г почвы, a – среднее количество колоний на чашке, 10n – разведение, из которого сделан посев, V – объем суспензии, взятый для посева, в мл. Пример расчета При поверхностном посеве из 4 разведения в трех повторностях на чашках выросло 60, 70 и 80 колоний (a = 70). Число колоний нужно умножить на 20, т. к. было посеяно 0,05 мл суспензии. Следовательно, количество микроорганизмов в 1 г почвы будет равно M = 70 х 10000 х 20 = 14 000 000 = 1,4 х 10 7 кл/г. При глубинном посеве число колоний подсчитывают также, но не умножают на 20, т. к. при высеве используют 1 мл суспензии. М =70 х 10000 = 700 000 = 7 х 10 5 кл/г. 2.

Получение накопительных культур азотфиксирующих бактерий

Азотфиксация – это процесс связывания и перевода в органические соединения молекулярного азота воздуха и главное звено в цикле азота, так как именно этот процесс лимитирует все остальные звенья превращения азота. Его

26

проводят

микроорганизмы,

составляющие

физиологическую

группу

азотфиксаторов. К бактериальным микроорганизмам, обладающим высокой азотсвязывающей

способностью,

относятся

как

симбиотические,

так

и

свободноживущие бактерии. Последними являются аэробный азотфиксатор Azotobacter и анаэробный Clostridium. Их выявление проводят на элективных безазотистых средах – среде Эшби для азотобактера и среде Виноградского для клостридий. Существует несколько методов выделения азотобактера из почвы. Одним из них является метод почвенных комочков, когда увлаженную почву комочками раскладывают на поверхность питательной среды Эшби в чашки Петри. Навеску почвы увлажняют стерильной водопроводной водой до пастообразного состояния и микробиологической петлей или тонкой стеклянной палочкой раскладывают комочки правильными рядами (по трафарету) - 50 комочков на каждую чашку. Чашки помещают в термотат во влажной камере при 28 – 30 0 С на 5 – 7 суток. Для получения накопительной культуры клостридий в целях освобождения от сопутствующих аэробных бесспоровых бактерий среду Виноградского наливают в пробирки высоким слоем, засевают комочком исследуемой почвы и пастеризуют. Температура культивирования 28 –30 0 С, продолжительность 7 – 10 суток. ХОД РАБОТЫ 1.

Произвести

количественный

учет

микроорганизмов

(бактерий,

актиномицетов, грибов) на жидких и плотных питательных средах. 2.

Произвести посев почвы на среды Эшби и Виноградского для

получения культур свободноживущих азотфиксаторов. ЗАНЯТИЕ VI Тема: Превращение микроорганизмами азотсодержащих соединений. Микроскопия свободноживущих азотфиксаторов. Микроскопия свободноживущих азотфиксаторов О наличии азотобактера в исследуемом материале судят по образованию через 4 – 6 суток вокруг комочков почвы его характерных колоний. Эти колонии слизистые, растекающиеся, сначала бесцветные, затем могут становиться бурыми. Клетки азотобактера в начальной стадии развития – палочковидные, с закругленными концами, подвижные перитрихи. С возрастом

они теряют

27

подвижность, становятся кокковидными, на поверхности появляется толстая слизистая

капсула.

Для

обнаружения

капсул

проводят

негативное

контрастирование живых препаратов тушью. При этом небольшое количество культуры смешивают на предметном стекле с тушью и накрывают препарат покровным стеклом. При микроскопии на черном фоне заметны бесцветные капсулы и заключенные в них клетки азотобактера. Наиболее

существенные

признаки

развития

клостридий

на

среде

Виноградского – характерный запах масляной кислоты, усиливающийся при встряхивании культуры. Через 2 – 3 суток после посева среда мутнеет, из нее начинают выделяться пузырьки газа в результате развития клостридий. Клетки клостридий

легко

обнаруживаются

при

микроскопировании

осадка.

Они

представляют собой крупные палочки, подвижные благодаря перитрихальному жгутикованию, образующие споры по клостридиальному или плектридиальному типу. На стадии спорообразования в клетке накапливается много запасного вещества гранулезы, для которой характерно окрашивание раствором Люголя (гранулезная реакция с йодом). Для проведения данной реакции каплю жидкости, содержащую клостридий, помещают на предметное стекло, добавляют каплю раствора Люголя и накрывают покровным стеклом. При микроскопировании препарата видны клетки с потемневшим (синим) содержимым. Спора в клетке при этом остается неокрашенной и хорошо различима. ХОД РАБОТЫ 1.

Рассмотреть и зарисовать в тетради колонии азотобактера на среде

Эшби. Приготовить микроскопический препарат «раздавленная капля» с окраской тушью, зарисовать клетки азотобактера, капсулы. 2.

Рассмотреть и зарисовать в тетради пробирки с клостридиями на

среде Виноградского. Приготовить микроскопический препарат «раздавленная капля» с окраской раствором Люголя на гликоген и гранулезу. Зарисовать клетки клостридий со спорами и гранулезой.

28

ЗАНЯТИЕ VII Тема: Превращение микроорганизмами азотсодержащих соединений. Аммонификация белковых веществ и мочевины. Аммонификация белковых веществ и мочевины Аммонификацией

называется

процесс

разложения

азотсодержащих

органических веществ с выделением аммиака. Разложение белковых веществ ведут многие микроорганизмы из разных групп: бактерии, актиномицеты, грибы. Разложение белков в анаэробных условиях сопровождается образованием восстановленных продуктов: сероводорода и тиоспиртов меркаптанов, которые образуются из белков, содержащих серу, а так же индола, скатола, метана, водорода. Для выявления аммонификаторов пользуются мясо-пептонными средами, которые разливают в колбы и засевают почвой. Колбы закрывают ватными пробками и под них подвешивают влажную красную лакмусовую бумажку для обнаружения аммиака и фильтровальную бумагу, смоченную уксуснокислым свинцом для обнаружения сероводорода. После 2 – 3 дней инкубации при 25 – 30 выделяющегося

аммиака,

а

бумажка

с

0

С лакмусовая бумажка синеет от уксуснокислым

свинцом

темнеет

вследствие образования сульфида свинца, если она покрывается серебристым налетом, значить, наряду с сероводородом выделяются еще и меркаптаны. Накопление аммиака в субстрате устанавливают также с помощью реактива Несслера. На фарфоровые пластинки с лунками помещают каплю реактива, затем каплю субстрата. При большом количестве аммиака появляется коричневый или буроватый осадок, при небольшом – оранжевая или желтая окраска. Микроскопию

аммонификаторов

проводят,

приготавливая

препарат

«раздавленная капля» с прижизненной окраской основным фуксином или без нее. Типичными аммонификаторами являются споровые (в основном представители рода Bacillus) и неспороносные (p. Pseudomonas, p. Proteus) бактерии. Разложение мочевины происходит под влиянием уреазы уробактерий, мочевина при этом превращается в аммиак и углекислоту. Для накопления данной группы

бактерий

пользуются

средами,

содержащими

мочевину,

которые

разливают в колбы. Под ватную пробку подвешивают влажную красную лакмусовую бумажку для обнаружения аммиака.

29

При микроскопическом изучения материала из колбы можно познакомиться с представителями группы уробактерий, постоянно встречающимися в почве. Для этого готовят препарат «раздавленная капля» без окраски. ХОД РАБОТЫ 1.

Рассмотреть колбы с опытом по аммонификации белков и мочевины.

По посинению красного лакмуса и пробе с реактивом Несслера убедиться в накоплении аммиака. 2.

Приготовить

и

рассмотреть

препараты

«раздавленная

капля»

аммонификаторов. Результаты занести в тетрадь. ЗАНЯТИЕ VIII Тема: Микроскопия микроорганизмов, разрушающих целлюлозу. Микроскопия микроорганизмов, разрушающих целлюлозу Разложение целлюлозы – это основной процесс в круговороте углерода на земной поверхности. Полисахарид целлюлоза, или клетчатка, является одной их главных составных частей оболочек растительных клеток, которые в огромном количестве попадают в почву, где подвергаются разложению в аэробных и анаэробных условиях под действием бактерий, актиномицетов, грибов. Для выделения целлюлозоразлагающих микроорганизмов существует ряд методов, в большинстве случаев основанных на применении элективных сред. При обнаружении аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов жидкую среду наливают тонким слоем в колбочки, анаэробных – в пробирки высоким слоем. В качестве единственного источника углерода в среду помещают фильтровальную бумагу: в колбочки опускают складчатый фильтр, в пробирки полоску бумаги. После стерилизации колбы и пробирки засевают почвой. Через несколько недель (срок варьирует в зависимости от особенностей почвы) определяют степень разложения бумаги и микроскопируют микроорганизмы, вызывающие ее распад. Для микроскопического исследования готовят препараты «раздавленная капля» с поверхности распадающейся фильтровальной бумаги. Аэробные бактерии на уровне жидкости на бумаге образуют налет желтого или оранжевого цвета (миксобактерии). Когда бактерии хорошо разовьются, они нарушают целостность бумаги, фильтр постепенно оседает и на нем образуется

30

слизь. Кроме того, в разрушении клетчатки в аэробных условиях активно участвуют грибы и актиномицеты. При

анаэробном

микроорганизмов

процессе

сопровождается

развитие интенсивным

целлюлозоразлагающих помутнением

среды,

пенообразованием и изменением клетчатки. Фильтровальная бумага желтеет и постепенно разрушается бактериями (преимущественно, p. Clostridium). При микроскопировании в оставшихся волокнах бумаги обнаруживаются тонкие, длинные, слегка изогнутые клетки с круглой спорой на конце. ХОД РАБОТЫ 1.

Внимательно рассмотреть, сравнить и зарисовать колбы и пробирки с

опытами по разложению целлюлозы, заложенными в разные сроки (3 недели, 2 недели, 1 неделя, контроль). 2.

Приготовить и рассмотреть в микроскоп препараты раздавленная

капля разрушителей целлюлозы. Список литературы 1. Бабьева И. П., Агре Н. С. Практическое руководство по биологии почв.М.: Изд-во МГУ.- 1971.- 140 с. 2. Бранцевич Л. Г., Лысенко Л. И., Овод В.В., Гурбик А. В. Микробиология: практикум. - К.: Вища школа. - 1987.- 200 с. 3. Методы почвенной микробиологии и биохимии / под ред. проф. Д. Г. Звягинцева. – М.: Изд-во МГУ. - 1991. - 304 с. 4. Практикум по микробиологии / под ред. проф. Н.С. Егорова. – М.: Изд-во МГУ. - 1976. -307с.

Схема посева 1 мл

Приложение 1 1 мл

1 мл

1 мл

10 г почвы

1:10 1 разведение

1:100 2 разведение

1:1000 3 разведение

1:10000 4 разведение

1:100000 5 разведение

31

1

2

3 1

Условные обозначения: 1 – МПА (вносят 1 мл почвенной суспензии); 2 – среда Чапека (вносят 0,05 мл почвенной суспензии); 3 – КАА (вносят 0,05 мл почвенной суспензии).

1

2

3

2

3