分子生物学常用实验技术

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目 第一章

录

基因克隆

1. 操作流程---------------------------------------------------- 1 2. 方法-------------------------------------------------------- 1 2.1 设计引物 ------------------------------------------- 1 2.2 PCR------------------------------------------------- 1 2.3 割胶回收目的片段------------------------------------ 2 2.4 连接------------------------------------------------ 3 2.5 感受态细胞制备及转化-------------------------------- 3 2.6 接菌------------------------------------------------ 4 2.7 阳性克隆鉴定---------------------------------------- 5 2.8 质粒抽提-------------------------------------------- 5 2.9 测序------------------------------------------------ 6 3. 基因克隆的编码---------------------------------------------- 6

第二章

酵母双杂交筛选

1. 操作流程---------------------------------------------------- 7 2. 方法-------------------------------------------------------- 7 2.1 诱饵基因转化筛库宿主菌 Y190------------------------- 7 2.2 含 Bait 基因质粒的 Y190 保种 ------------------------- 8 2.3 Bait 基因的自激活检测 ------------------------------ 9 2.4 诱饵基因筛库--------------------------------------- 10 2.5 抽提酵母质粒--------------------------------------- 13 2.6 酵母质粒的扩增------------------------------------- 14 2.7 Prey 质粒与 Bait 质粒共转 Y190----------------------- 16

第三章

细胞培养和转染

1. 细胞培养--------------------------------------------------- 17 2. 细胞转染--------------------------------------------------- 17 2.1 脂质体介导的贴壁细胞转染法------------------------- 17 2.2 磷酸钙介导的贴壁细胞转染法------------------------- 18 3. 相关试剂--------------------------------------------------- 19

第四章

免疫共沉淀

1. 操作流程--------------------------------------------------- 20 2. 方法------------------------------------------------------- 20 2.1 收获细胞------------------------------------------- 20 2.2 Protein G beads 悬液的制备------------------------- 20 2.3 Preclear ------------------------------------------ 21 2.4 免疫共沉淀----------------------------------------- 21 3.试剂------------------------------------------------------- 22 生命经纬网站 http://www.biox.cn/ —— 关注生命科学与交叉学科研究 1

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第五章

Western Blot

1. 操作流程--------------------------------------------------- 23 2. 方法------------------------------------------------------- 23 2.1 电泳----------------------------------------------- 23 2.2 转膜----------------------------------------------- 23 2.3 杂交----------------------------------------------- 24 2.4 显色----------------------------------------------- 24 2.5 膜的 strip----------------------------------------- 24 3. 试剂------------------------------------------------------- 25

第六章

报告基因检测系统

1. NF-kB 报告基因检测系统------------------------------------- 26 1.1 细胞培养------------------------------------------- 26 1.2 转染----------------------------------------------- 27 1.3 细胞收获及处理------------------------------------- 28 1.4 luciferase 分析------------------------------------ 28 1.5 Western-blot 检测待检基因的表达情况----------------- 28 2. p53 报告基因检测系统---------------------------------------- 29 2.1 细胞培养及铺板------------------------------------- 29 2.2 转染----------------------------------------------- 29 2.3 细胞收获及处理------------------------------------- 30 2.4 luciferase 分析------------------------------------ 30 2.5 Western-blot 检测待检基因的表达情况----------------- 31 3. NFAT 报告基因检测系统--------------------------------------- 31 3.1 细胞培养------------------------------------------- 31 3.2 电击转化------------------------------------------- 31 3.3 铺板加药------------------------------------------- 32 3.4 细胞收获及处理------------------------------------- 33 3.5 Luciferase 检测------------------------------------ 33 3.6 Western-blot 检测待检基因的表达情况----------------- 33 4. Western-blot----------------------------------------------- 33 5. 注释------------------------------------------------------- 35 5.1 几种药物的储存浓度和应用浓度----------------------- 35 5.2 各系统的 control------------------------------------ 36 5.3 Lumat LB P507 仪器操作步骤-------------------------- 36

第七章

流式细胞分析分选术

1. 96 孔板样本处理--------------------------------------------- 41 1.1 操作流程------------------------------------------- 41 1.2 方法----------------------------------------------- 41 1.3 注释----------------------------------------------- 28 2. Cell Cycle Assay------------------------------------------- 42 2.1 细胞培养及铺板------------------------------------- 42

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2.2 转染----------------------------------------------- 43 2.3 细胞分板------------------------------------------- 43 2.4 加药刺激------------------------------------------- 43 2.5 细胞收获及处理------------------------------------- 44 2.6 上机样本制备--------------------------------------- 44 2.7 上机----------------------------------------------- 44 2.8 相关试剂的配制------------------------------------- 44 3. FACS analysis on Apoptosis -------------------------------- 45 3.1 细胞培养及铺板------------------------------------- 45 3.2 转染----------------------------------------------- 46 3.3 细胞收获------------------------------------------- 47 3.4 上机样本制备--------------------------------------- 47 3.5 上机----------------------------------------------- 47 4. CD69 检测-------------------------------------------------- 48 4.1 细胞培养------------------------------------------- 48 4.2 电击转化------------------------------------------- 48 4.3 铺板加药------------------------------------------- 49 4.4 细胞收获及处理------------------------------------- 49 4.5 样本制备------------------------------------------- 50 4.6 上机----------------------------------------------- 51 4.7 几种药物的储存浓度和应用浓度----------------------- 51 5. 细胞分选--------------------------------------------------- 52 5.1 分选细胞样本处理----------------------------------- 52 5.2 分选细胞的上机操作程序----------------------------- 53 5.3 相关试剂的配制------------------------------------- 53

第八章

siRNA 技术

1. 方法------------------------------------------------------- 54 2. 注释------------------------------------------------------- 54 2.1 不同培养体积贴壁细胞用 RNAfect 转染时的初始条件---- 55 2.2 在 24 孔平板中优化 RNAfect 转染效果的方法------------ 55 2.3 在 24 孔平板中优化 RNAfect 转染效果的方法------------ 55

第九章

杆状病毒表达系统

1. 操作流程--------------------------------------------------- 56 2. 方法------------------------------------------------------- 56 2.1 共转染--------------------------------------------- 56 2.2 病毒扩增------------------------------------------- 57 2.3 滴度与 plaque 纯化---------------------------------- 58 2.4 小规模表达带有 His 标签的目的基因------------------ 59 3. 昆虫细胞 Sf9 的培养条件------------------------------------- 59 3.1 培养基--------------------------------------------- 59 3.2 培养方式------------------------------------------- 60 2.3 细胞的冻存和解冻----------------------------------- 60

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2.4

第十章

无血清适应----------------------------------------- 61

蛋白的表达和纯化

1. 基因表达载体构建------------------------------------------- 62 1.1 操作流程------------------------------------------- 62 1.2 方法----------------------------------------------- 62 2. 蛋白纯化--------------------------------------------------- 64 2.1 重组蛋白的提取------------------------------------- 64 2.2 金属鳌合层析(IMAC)--------------------------------- 65 2.3 谷胱苷肽配体亲合层析(GAF)-------------------------- 66 2.4 离子交换层析(IEC)---------------------------------- 66 2.5 凝胶过滤(GF)--------------------------------------- 67 3. 蛋白浓度测定----------------------------------------------- 68

第十一章

RNA 技术

1. 组织 Total RNA 提取------------------------------------------69 1.1 组织取材和保存------------------------------------- 69 1.2 组织的破碎和匀浆----------------------------------- 69 1.3 总 RNA 的抽提--------------------------------------- 70 2. 荧光定量 PCR (Q-PCR)---------------------------------------- 71 2.1 Q－PCR 反应体系------------------------------------- 71 2.2 Q－PCR 反应程序------------------------------------- 71

第十二章

抗体的制备和纯化

1. 多克隆抗体的制备------------------------------------------- 72 2. 单克隆抗体的制备------------------------------------------- 72 2.1 免疫动物------------------------------------------- 72 2.2 细胞融合------------------------------------------- 73 2.3 细胞筛选------------------------------------------- 74 2.4 细胞克隆------------------------------------------- 75 2.5 细胞扩增------------------------------------------- 75 2.6 细胞冻存------------------------------------------- 75 2.7 腹水制备------------------------------------------- 76 2.8 腹水的纯化----------------------------------------- 76 2.9 杂交瘤鉴定----------------------------------------- 76 3. Peptide-KLH 的偶联及-SH 偶联率测定方法---------------------- 76 3.1 Peptide-KLH 偶联------------------------------------ 76 3.2 -SH 偶联率测定------------------------------------- 77 3.3 Cys 标准曲线制作----------------------------------- 77 3.4 -SH 偶联率换算公式--------------------------------- 78 3.5 透析及分装保存-------------------------------------- 78

第十三章

病理实验基本技术

1. 基本技术--------------------------------------------------- 79

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2. 常规制片--------------------------------------------------2.1 操作流程------------------------------------------2.2 方 法---------------------------------------------3. 免疫组织化学----------------------------------------------4. 免疫细胞化学----------------------------------------------5. 组织微阵列------------------------------------------------6. 常规溶液配制-----------------------------------------------

79 79 79 81 82 82 82

第一章

第一章

基因克隆

基因克隆

1. 操作流程 收集基因信息——>设计引物——>PCR ——>回收目的片段——>与载体 连接，取得连接产物 ——> 用感受态细胞做转化 ——>接菌——>阳性克隆鉴 定(酶切法或 PCR)——>质粒抽提——>质粒测序——>测序结果分析——>克隆 信息输入数据库——>质粒实物保存

2. 方法 2.1 设计引物 引物设计要求：引物长度为 25bp-35bp.forward primer 和 reverse primer 的 Tm 为 70℃(±4℃)，且两条引物的 Tm 相差不超过 4℃。引物之间及引物本身避免形 成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板不能有任何错配。 forward primer 5’加:GGCCAATCCGGCC reverse primer 5’加:GGCCTCTAAGGCC

2.2 2.2.1

PCR

PCR 反应体系

模扳(100ng/ul 质粒)

2.00μl

4dNTP(10mM)

1.00μl

10×PCR Buffer

5.00μl

MgCl2(25mM)

5.00μl

5’Primer (10-12uM)

4.00μl

3’Primer (10-12uM)

4.00μl

5M 甜菜碱

10.00μl

Pfu (5U/ul)

0.50μl

ddH20

18.50μl

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第一章

基因克隆

50.00μl

总计

2.2.2

PCR 反应程序

1)从 cDNA 文库克隆基因 Stage1

Stage2

1 Cycle

Stage3

30Cycle

1 Cycle

95℃

94℃

60℃

68℃

68℃

4℃

2min

30sec

30 sec

Xmin(2

10min

1min

min/Kb) 注：Pfu 酶最适延伸温度为 68℃。 2)从含目的基因质粒中克隆 Stage1

Stage2

1 Cycle

Stage3

22Cycle

95℃

94℃

60℃

2min

30sec

30 sec

1 Cycle 68℃ Xmin(2 min/Kb)

68℃

4℃

10min

1min

2.3 割胶回收目的片段 (QIAGEN QIAquickGel Extraction Kit) 1) 1%Agarose 胶电泳将目的 DNA 片段用干净的手术刀割下，放入 1.5ml 离心管 2) 称重后，在 1.5ml 离心管中加入 3 倍胶体积的 buffer QG(100mg 加 300ul) 3) 50℃水浴中放置 10min(至胶完全溶解)，每 2-3 分钟混匀一次(溶胶液应于 buffer QG 颜色相同) 4) 加入 1 倍胶体积的异丙醇然后充分混匀，静置片刻。 5) 将样品转移入柱子中(柱子的最大容量为 800uL)，然后 13000rpm*1min 离心 6) 取下柱子，弃流出液，将柱子放回到刚才那个收集管中

第一章

基因克隆

7) 加入 0.75mL buffer PE 至柱子，室温放置 2-5min，然后 13000rpm*1min 离心 8) 取下柱子，弃流出液，再次 13000rpm*1min 离心 9) 将柱子放置在一支新的 1.5mL 离心管中，加入 50uL EB buffer (或无菌 H2O) 至膜中央，静置片刻，然后 13000rpm*1min 离心，然后测定浓度

2.4 在连接反应中通常要求：

连 接

(目的基因分子数：载体分子数=3：1) 连接反应体系 sample

+

-

10*T4 buffer

1.00μl

1.00μl

1.00μl

PGEM-T (50ng/ul)

1.00μl

1.00μl

1.00μl

目的基因(150ng/ul)

1.00μl

1.00μl

/

T4 连接酶

0.50μl

0.50μl

0.50μl

补水

6.50μl

6.50μl

7.50μl

于 16℃连接过夜。或室温(25℃)1 小时以上。

2.5

感受态细胞制备及转化

2.5.1 CaCl2 制备感受态细胞(DH5α 、DH10B、TOP10 )

1） 接过夜菌 在 15ml 试管中加入 3ml LB 培养基，从平板上挑取一单克隆接 种，37℃，260rpm，培养过夜，约 16 小时。 2） 接菌 取 2ml 过夜菌接入 200ml 新鲜的 LB 培养基， 37℃，260rpm，培 养，直至 OD600=0.4-0.5(一般约 2 小时),然后将菌液冰浴 30-60 分钟。 3） 收菌 4℃，5000rpm×5min，弃上清。 4） CaCl2 悬浮

若 50ml 菌液收菌，用 10ml 0.1M 的 CaCl2 轻轻吹打，充分悬

浮，冰浴 10min。 5）离心 4℃，5000rpm×5min，弃上清。

第一章

基因克隆

6）CaCl2 悬浮 以 2ml 0.1M 的 CaCl2 轻轻吹打，充分悬浮，冰浴 30min 即感 受态制备完成。 此时感受态可直接使用或冰浴过夜第二天使用或加入 10%的灭菌甘油，混匀后 -80℃冻存，以后使用(一般可存 1 个月)。 注： 制备感受态细胞要求严格控制温度，制备过程在冰上操作。

2.5.2

转化(PGEM-T vector)

1)

准备 1.5ml 的离心管，冰浴预冷。

2)

取 100ul 感受态细胞，加入 5ul 连接液，冰浴 45-60min。

3)

42℃热刺激 90sec。(此关键步骤，一定注意温度及时间)

4)

冰浴 2min。

5)

加 LB 培养基 900ul，37℃，150rpm 培养 45-60min。

6)

4000rpm×3min 离心。

7)

留 100ul 上清，弃多余部分，混匀，涂布到含氨苄青霉素的 LB 板(预先涂 布 X-gal 和 IPTG)。

8)

37℃ 培养箱倒置培养过夜，约 16 小时。

2.6 接菌 1） 转化得到蓝白菌落筛选板 (因为我们一般用的是 PGEM-T 做连接，经 X-gal 处理后，有插入片段的显白色；载体自连的显蓝色，因此得到筛选。) 2） 挑取白色的菌落接到含氨苄青霉素的 LB 培养基。 3） 37℃，260rpm 培养。 4） 培养 5-6 小时后挑取 2ul 菌液为模板做 PCR 鉴定。 5） 以 PCR 结果，将有目的片段插入的样品以 5ml LB 培养基再次接菌，37℃， 260rpm 培养过夜，约 16 小时。

2.7

阳性克隆鉴定 (PCR 鉴定) 2.7.1PCR 鉴定体系

第一章

10X Taq buffer

3

4X dNTP (10mM) Taq DNA polymerase(5U/ul) 10uM 引物 (双向) 50%DMSO(which is optional)

30cycle

ul 0.5 ul

0.2ul(1U) 各 1ul 1ul

模板：过夜菌液 / 挑单克隆

2ul

加灭菌水至

30ul

2.7.2 94℃

5min

94℃

30s

基因克隆

PCR 鉴定程序：

55℃ 30s 72℃

3min

72℃

10min

4℃

+∞

30ul 上样，走电泳(以 100bp plus marker 为对照)→核对片断大小

2.8

质粒抽提 (质粒小量抽提试剂盒)

1) 收菌 以 10000 rpm ×1 min 离心收菌。(一般抽提一份用 3-4ml 菌液) 2) 弃上清。 3) 加 100ul 冰浴 Solution I(含 Rnase A)，涡旋振荡，使菌体充分悬浮。 4) 加 200ul Solution II，温和混匀 6 次。(此过程不超过 5min) 5) 加 280ul Solution III，温和混匀 6 次。 6) 以 14000 rpm×10 min 离心。 7) 取上清，过吸附柱，以 10000 rpm×1 min，弃滤液。 8)

吸附柱内加 450ul Buffer2，10000 rpm×1 min，弃滤液。

9)

反复步骤 8)一次。

第一章

基因克隆

10) 14000 rpm×1 min 离心。 11) 将吸附柱旋转 180 度后再 14000 rpm×1 min 离心。 12) 加 40ul 50℃预热的 ddH2O(或 EB buffer)于吸附柱的膜中央，室温静置 2min。 13) 14000 rpm×1 min 离心并收集洗脱液，即质粒 DNA。

2.9

测

序

1) ABI377 测序仪测序。 2) 测序结果分析：用软件 Vector NTI Suite 6 分析测序结果。每个克隆相应的测 序结果，分析结果，存储信息分类输入数据库 http://192.168.0.2/index.htm。 克隆信息管理系统。将测序完成的克隆编号入库。

3. 基因克隆的编码 根据实验基因引物的号码相对应编制。 如：基因引物编号： 1000_f 1000_r 克隆编号： 1000A1 or 100092 (注：号码倒数第二位为日期编号： 1—9 为阿拉伯数字 10=A,11=B,12=C… 最后一位为克隆数编号，一般为 1—3)

第二章

第二章

酵母双杂交筛选

酵母双杂交筛选 1. 操作流程

诱饵基因转化筛库宿主菌 Y190——>含诱饵基因的 Y190 保种——>诱饵基因的 自激活检测——>筛库(组织库或者小文库)——>挑选鉴定阳性克隆——>抽提阳 性克隆中 PREY 质粒并在细菌中扩增——>猎物(Prey)质粒与诱饵(Bait)质粒共 同转化 Y190，验证其相互作用

2. 方 法 2. 1

诱饵基因转化筛库宿主菌 Y190

1） 3 个 1mm 克隆接种于 3mlYPD 液体培养基 30℃振荡培养 20 小时(过夜)， OD600 达到 1.2 左右。 2） 将此 3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPD 中培养 4 小时左右，使 培养液 OD600 达到 0.6。 3） 50ml 离心管收集菌液(Falcon, BD)，Eppendorf Centrifuge 5810R, 700g (1， 865rpm)，5 分钟离心收集菌体，弃上清。 4） 20ml ddH2O 重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R，700g，5 分钟离心收 集菌体，弃上清。 5） 20ml 1XTE/LiAc*重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R ，700g，5 分钟离 心收集菌体，弃上清。 6） 根据每个转化需要 50μl 菌液的量加入 1XTE/LiAc 重悬菌体，分装到 Eppendorf 管中，每管 50μl 菌液。 7） 每管加约 100ng Bait 基因质粒，5μl 预变性的 Carrier DNA*，500μl 1X TE/LiAc/PEG*。 8） 放置于 30℃培养箱或者水浴中孵育 30 分钟,15 分钟时混匀一次。 9） 30 分钟后，每管加入 15μl DMSO(DIMETHYL SULFOXIDE)，轻轻上下颠 7

第二章

酵母双杂交筛选

倒混匀。 10） 42℃水浴热激 20 分钟，每 10 分钟上下颠倒混匀一次。 11） 冰浴 5 分钟。 12） 700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。 13） ddH2O 洗涤一次菌体。 14） 利用残余液体重悬菌体，涂布于 SD/-Trp 平板上。 15） 30℃培养箱培养。第 2 天即可观察到克隆长出，第 3 天克隆即长到所需大 小。

Carrier DNA: Herring Testes Carrier DNA,Denatured. Clontech. 10mg/ml. 未使用过的 Carrier DNA 先 100℃变性 10 分钟，立即置于冰浴 2 分钟,然后 再 100℃变性 10 分钟，之后置于冰浴上备用。已经使用过的 Carrier DNA 只 需要 100℃变性一次即可。 1XTE/LiAc:

V10XTE:V10XLiAc:VH2O=1:1:8

1XTE/LiAc/PEG: V10XTE:V10XLiAc:V50%PEG=1:1:8 50%PEG： 50%为质量体积比。PEG3350 溶于 ddH20 中一般需要加热溶解 10XTE：

0.1 M Tris-HCl, 10mM EDTA, pH7.5

10XLiAc： 1M LiAc, pH7.5

2.2

含 Bait 基因质粒的 Y190 保种

Bait 基因长出克隆后，一般用诱饵基因特异性引物直接在酵母菌落中 PCR 鉴定是否转入正确的 Bait 基因的质粒，然后把经鉴定正确的克隆进行保种。 2.2.1

酵母菌落 PCR

1) 用含 Bait 基因的质粒作为阳性对照，用宿主菌 Y190 作为阴性对照 2) 按照下列反应体系进行 PCR ExTaq Premix(Takara) 5’Primer 3’Primer 8

10μl (2X ) 0.5μl (10μM) 0.5μl (10μM)

第二章

ddH20 菌

酵母双杂交筛选

8.9μl 0.1μl

3)按照下列反应条件进行 PCR 95℃

5 分钟

94℃

30 秒

58℃

30 秒

72℃

2 分钟

72℃

5 分钟

35cycles

72℃延伸 2 分钟是针对小于 2Kb 的 Bait 基因,对于长于 2Kb 的 Bait 基因要相 应延长时间。 4）PCR 产物进行电泳检测 2.2.2

阳性克隆保种

1） 将阳性克隆接种到 3ml 相应液体培养基中，30℃振荡培养 2-3 天。 2） 700g,5 分钟,离心收集菌体。 3） 加入 1：1 的液体培养基和 Sterile Glycerol Solution*混合溶液。 4） 充分悬浮菌体，放于-80℃保存。 Sterile Glycerol Solution: 65%(V/V) glycerol, 0.1M MgSO4, 0.5mM Tris-HCl, pH7.4

2.3

Bait 基因的自激活检测

一般采用膜检的方法，检测 LacZ 基因的表达情况。膜检方法如下: 1) 将阳性克隆菌落影印于滤纸上。 2) 将滤纸完全浸于液氮中，时间长于 30 秒，取出后晾干。 3) 培养皿加入适量显色液*(新鲜配制)，垫一层滤纸，让其完全湿润，将冻溶 后的滤纸铺在上面，使显色液渗透到表层。9cm 培养皿加 2ml 显色液，15cm 培养皿加 5ml 显色液。 4) 盖上皿盖，放置在 37℃培养箱中，避光放置。 5) 20 分钟后开始观察有无变蓝的阳性结果并记录，一般以 3 小时为准，特殊情 况下可以看过夜是否变蓝。 6)反应过后打开皿盖，将滤纸烘干，保存并记录。 9

第二章

酵母双杂交筛选

显色液: 100ml Z buffer,0.27ml β–mercaptoethanol,1.67ml X-gal Z buffer: 16.1g/L Na2HPO4·7H20, 5.50g/L NaH2PO4·H2O, 0.75g/L KCl, 0.246g/L MgSO4·7H2O,pH7.0。室温可以存放一年。 X-gal:

X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-D-galactopyranoside) 溶 于

DMF

(N,N-dimethylformamide)中，终浓度为 20mg/ml。

2.4

诱饵基因筛库

2.4.1 转化法筛选组织库

1)

5-10 个 2mm 克隆接种于 1ml SD/-Trp 液体培养基中，混匀后转入 150ml SD/-Trp 振荡培养 20 小时(过夜)，至 OD600=1.2 左右。

2) 150ml 培养液转入 1000ml YPDA(YPD+Adenine)中混匀，此时 OD600=0.2~0.3。 3) 培养约 4~5 小时至 OD600>0.6。 4) 500ml 离心管收集菌液。Beckman Coulter Centrifuge Avanti J-25(以下步骤均使 用此离心机),700g,5 分钟,RT(室温)。同时将 2000μl Carrier DNA 预变性两次。 5) 500ml ddH2O 洗涤一次，700g, 5 分钟,RT，收集菌体。 6) 30ml 1X TE/LiAC 洗涤菌体(预先配制 50ml 1X TE/LiAC), 转入 100ml 离心管。 7)

700g, 5 分钟, RT。(预先配制 50ml 1XTE/LiAC/PEG)。

8)

加入 12ml 1X TE/LiAc 重悬菌体。

9) 加入 100~500μg 文库 DNA, 2000μl 预变性的 Carrier DNA，轻轻混匀。 10)加入 50 ml 1XTE/LiAc/PEG, 剧烈涡旋混匀。 11)30℃孵育 45 分钟，每 15 分钟混匀一次. 12)加入 3.2ml DMSO, 轻轻混匀. 13)42℃热激 20 分钟,每 10 分钟混匀一次. 14)冰浴 5 分钟. 15）700g,5 分钟，收集菌体. 16）加入 1000ml YPDA,30℃振荡培养 60 分钟. 17）700g, 5 分钟，收集菌体. 10

第二章

18) 加入 2ml 0.9％ NaCl 悬浮菌体，终体积约 5ml 左右。取 20μl

酵母双杂交筛选

菌液做滴度测

定 ， 其 余 菌 液 200μl/ 块 ， 涂 布 于 15cm SD/-Trp/-Leu/-His/+30mM 3-AT(3-amino-1,2,4-triazole)平板上。第三天起要注意观察平板酵母克隆生长 状态。 19) 滴度(转库效率)测定：

20μl +180μl NaCl(0.9％) 1:10 ； 20μl +180μl NaCl(0.9％) 1:100； 20μl +180μl NaCl(0.9％)1:1000； 20μl +180μl NaCl(0.9％) 1:10000 20μl +180μl NaCl(0.9％) 1:100000

1:1000; 1:10000；1:100000 三种浓度各取 100μl 涂布 SD/-Trp/-Leu 平板 20) 转库效率的计算：对生长在 SD/-Trp/-Leu 平板上的克隆计数，挑选克隆数在 30-300 之间稀释度计算转库效率 克隆数(cfu)X 总悬浮体积 涂板体积 X 稀释度 X 文库用量(μg)

=cfu/μg DNA

转库效率计算实例： ¾ 在 1：10000 转库效率计数平板上长出 100 个克隆(稀释度=0.0001) ¾ 总悬浮体积= 5ml ¾ 文库质粒用量=100μg 100cfu X (5mlX103μl/ml)

转库效率 =

100μl X 0.0001 X 100μg

= 5 X 105cfu/μg

21)筛库完成，菌在 SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT 平板上生长 7-14 天后，会有阳 性克隆生长出来，阳性克隆一般大于 3mm。挑取少量菌做膜检(方法见 3)。 从膜检变蓝的酵母菌中抽提 prey 质粒与 Bait 质粒做共转验证。

2.4.2 筛选小文库 2.4.2.1

转化法

1)5~10 个 2mm 克隆接种于 2ml SD/-Trp 液体培养基中，摇 20 小时(过夜)，至 OD600=1.2 左右。 2) 2ml 培养液转入 20ml YPDA 中，此时 OD600=0.2~0.3。 11

第二章

酵母双杂交筛选

3) 培养约 4~5 小时至 OD600>0.6。 4) 用 50ml 离心管收集菌液，Eppendorf Centrifuge 5810R(以下步骤均使用此离心 机),700g,5 分钟,RT。同时将 Carrier DNA 预变性两次。 5)10ml ddH2O 洗涤一次，700g, 5 分钟,RT，收集菌体。 6)

10ml 1X TE/LiAc 洗涤菌体(预先配制 1X TE/LiAc)700g, 5 分钟, RT。(预先配 制 1XTE/LiAC/PEG)。

7)

加入 600μl 1X TE/LiAc 重悬菌体。

8） 加入 2μg 小文库 DNA，20μl 预变性 Carrier DNA，轻轻混匀。 9） 加入 2.5 ml 1XTE/LiAc/PEG, 剧烈涡旋混匀。 10) 30℃孵育 45 分钟，每 15 分钟混匀一次。 11) 加入 160μl DMSO, 轻轻混匀。 12) 42℃，热激 20 分钟,每 10 分钟混匀一次。 13) 冰浴 5 分钟。 14) 700g,5 分钟,收集菌体。 15) 加入 20mlYPDA,30℃摇 60 分钟。 16) 700g,5 分钟，收集菌体。 17) 加入 200μl 0.9％NaCl 悬浮菌体,取 20μl 菌液做滴度测定，其余菌液涂布于一 块 15cm SD/-Trp/-Leu/-His/+30mM 3-AT 平板上。第三天起要注意观察平板酵 母克隆生长状态。 18) 滴度测定：方法同筛选组织文库。 19)筛库完成，菌在 SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT 平板上生长 7-14 天后，会有阳 性克隆生长出来。阳性克隆一般大于 3mm。挑取少量菌做膜检(方法见 3)。 从膜检变蓝的酵母菌中抽提 prey 质粒与 Bait 质粒做共转验证。 2.4.2.2

Mating 法

1)将带有小文库基因的质粒分别转入 Y187 中(方法见 1)，保存甘油菌(方法见 2.2)。将甘油菌扩增并保存到 96 孔板(Corning Incorporated costar 3599)中，每 个孔对应一条小文库基因，-80℃冻存备用。 2) 将 Y190 菌液(携带 pGB-诱饵基因质粒)平铺在 15cm 培养皿中, 用 96 孔

12

第二章

酵母双杂交筛选

replicator(sigma)影印到 15cm SD/-Trp 平板上。 将 Y187 菌(携带 pACT2-小文库基因质粒)用 96 孔 replicator 从 96 孔板中影印 到 15cm SD/-Leu 平板上。 3)生长 48-72 小时，观察菌落生长情况，每个菌落长至 3-5mm，分别印至绒布上。 再从绒布上影印到 15cm 2xYPD 平板上。Y190 菌(携带 PGB-X 诱饵质粒)的 96 个克隆和 Y187 菌(携带 pACT2-小文库基因质粒)的 96 个克隆一一对齐， 影印到一起，使其发生 Mating。30℃培养 20~24 小时。 4)Mating

完 成 ， 再 用 绒 布 把 菌 落 从

2xYPD

平 板 影 印 至

SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT 平板上。 5)30℃培养 5~14 天，在 SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT 平板生长出来的克隆做膜检 (方法见 3)。 6)对膜检显蓝色的菌落做 PCR 鉴定(方法见 2.1)是否为对应的小文库基因，并用 此基因的 prey 质粒与 Bait 质粒做共转验证。 2.4.3

注意事项

1) 2XYPD 平板培养基应该稍微薄一些，这样培养基比较透明容易观察，可以尽 量保证 Y 190 菌和 Y187 菌克隆对齐。 2) 因为 Y190 为 Adenine 缺陷菌株，所以菌落为红色。而 Y187 非 Adenine 缺陷 菌株。所以菌落为白色。为了便于操作，一般先把 Y187 菌影印到 2XYPD 平板，然后再影印 Y190 菌。 3)Mating 时应该设置阳性对照，以便监测 Mating 情况是否良好。

2．5． 抽提酵母质粒 1） 膜检变蓝的阳性克隆用牙签涂布在 SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT 平板上，约 2cm2，然后放置于 30℃培养箱中培养 3~4 天。 2) 取一 Eppendorf 管，加入 30μl 5u/μl Lyticase。 把菌用牙签刮到 lyticase 中，Vortex 充分悬浮。37℃孵育 30 分钟。 3)

加 入 170μl Lysis Buffer 使 终 体 积 为 200μl 。 再 加 入 200 μ l 玻 璃 珠 (425-600microns)，200μl 酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，vortex 剧烈振荡 5 分钟。 13

第二章

4)

酵母双杂交筛选

12,000rpm 离心 10 分钟，将上清转入一干净 Eppfendorf 管中。注意，不要 把蛋白转移过去。

5) 加入 8μl 10M NH4Ac 和 500μl 无水乙醇，混匀，-80℃放置 1 小时。 6) 12,000rpm 离心 10 分钟，去上清。 7) 加入 500μl 70%乙醇洗涤沉淀，12,000rpm 离心 5 分钟。 8) 弃上清，真空抽干沉淀。 9) 将沉淀重悬于 10μl ddH2O 中，一般取 2~3μl 转化大肠杆菌。

Lyticase: 将 Lyticase 干粉溶解在 1XTE 中，终浓度为 5u/μl。 Lysis Buffer: 50mM Tris-HCl(pH8.0), 0.1% Triton X-100 , 0.5% SDS

2.6

酵母质粒的扩增

一般用电转的方法，把从筛库所得的阳性克隆中抽提的 Prey 质粒在大肠杆 菌中扩增。 2.6.1 大肠杆菌电转感受态制备

1) 挑一单克隆接入 3ml LB 培养基，摇培 14~16 小时至 OD600=1.0~1.2 2) 将摇培后的菌液转接 1L LB 培养基, 摇培 4~5 小时至 OD600=0.7-0.8 3) 离心收菌，10ml 冰水溶解 4) 5000g，2oC 离心 10 分钟收菌，400ml 冰水将菌重悬，冰浴 10 分钟 5) 5000g，2oC 离心 10 分钟收菌，40ml 预冷 10%甘油重悬，冰浴 10 分钟 6) 5000g，2oC 离心 10 分钟收菌，加 1ml 10%甘油重悬 7) 用枪测量重悬后的菌液体积，加入与菌液等体积的 10%甘油(注：等体积 10% 甘油指重悬后的菌液体积减去 1ml。例：加入 1ml10%甘油后重悬菌液体积为 4ml，则加入 10%甘油量为 3ml) 8) 分装到 Eppendorf 管中，每管 100μl，冰上操作。 9) -80oC 冰箱保存。 14

第二章

酵母双杂交筛选

10) 取出两管做阴性、阳性对照。

LB：10g/L 蛋白冻,10g/L NaCl；5g/L 酵母提取物。121oC，20 分钟灭菌。 10%甘油：V 甘油：V 水=1：9。 2.6.2

电 转

1)从-80oC 冰箱取出感受态，至冰上溶解。同时，将电转杯至冰上冷却，打开电 转仪准备 30 分钟。 2)感受态溶解后，将要转化的质粒(或连接产物或其他要转化的物质)加入感受态， 用枪吹打均匀(注意，不要产生气泡)。电转时有必要进行阴性对照、阳性对 照，以检验感受态是否被污染及感受态是否正常，有利于在出现问题时寻找 原因。 3)将混合后的感受态加入预冷的电转杯(Eppendorf,CAT.No.4307000569)。(注意， 不要产生气泡) 4) 擦干电转杯上电极两边的壁。 5)

将电转杯放入电转仪，启动电极。

6)

电击后，用 1ml SOC*将感受态洗出，37oC 孵育 45 分钟。

7)

6,000rpm，3 分钟离心收菌。

8)

涂板。

不同电转杯的最适电压各不相同，经实验： 1mm 电转杯的最适电压为 1900-2200V 4mm 电转杯的最适电压为 2300-2500V 8mm 电转杯的最适电压为 2500-2700V SOC: 20g/L 蛋白胨，5g/L 酵母提取物，0.5g/L NaCl，2.5mM KCl，pH7.0。121oC， 20 分钟灭菌。冷却至 60 oC 以下时，每升加入 20ml 灭菌的 1M 葡萄糖溶 液。该溶液使用前每升加入 5ml 灭菌的 2M MgCl2。

2.7

Prey 质粒与 Bait 质粒共转 Y190(参考 1)

1) 3 个 1mm 克隆接种于 3mlYPD 液体培养基 30℃振荡培养 20 小时(过夜)， 15

第二章

酵母双杂交筛选

OD600 达到 1.2 左右。 2) 将这 3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数确定)YPD 中培养 4 小时左右，使 培养液 OD600>0.6。 3) 50ml 离心管收集菌液，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。 4) 20ml ddH2O 重悬菌体，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。 5) 20ml 1XTE/LiAc 重悬菌体，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。 6) 根据每个转化需要 50μl 菌液的量加入 1XTE/LiAc 重悬菌体，分装到 Eppendorf 管中，每管加 50μl 菌液。 7) Prey 质粒分别与 Bait 质粒和 pGB 质粒(无 Bait 基因)共转，每种质粒都加入约 300ng；另外再加入 5μl 预变性的 Carrier DNA，500μl 1XTE/LiAc/PEG。 8) 放置于 30℃培养箱或者水浴中孵育 30 分钟,15 分钟时混匀一次。 9) 每管加入 15μl DMSO，轻轻上下颠倒混匀 10) 42℃水浴热激 20 分钟，每 10 分钟上下颠倒混匀一次。 11) 冰浴 5 分钟。 12) 700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。 13) ddH2O 洗涤一次菌体。 14) 利用残余液体重悬菌体，涂布于 SD/-Trp/-Leu 平板上。 15) 30℃培养箱培养。第 2 天即可观察到克隆长出，第 3 天克隆即长到所需大小。 16) 用滤纸印大约十几个克隆进行膜检(方法见 3)。

16

第三章

第三章

细胞培养和转染

细胞培养和转染

1. 细胞培养(HEK293T) 1) 显微镜下观察细胞，细胞生长状态良好，去上清； 2) 加入预热的 PBS 3ml, 温柔地清洗细胞,弃去 PBS； 3) 用胰蛋白酶消化细胞，通常 75cm2 培养瓶的贴壁细胞用 3ml 胰蛋白酶于 37oC 处理 5min； 4) 待细胞脱落后，加入 5ml DMEM 培养液(含 10%FBS)以终止消化反应，并将 细胞悬液转移入 15ml 或 50ml 离心管中； 5) 1000rpm 离心 5min，去除上清； 6) 加入 10ml DMEM 培养液(含 10%FBS)，重新悬浮细胞，使细胞充分打散； 7) 进行细胞计数,(4 个大方格细胞数的均值×104 个为每 ml 所含细胞数)； 8) 根据细胞计数结果，将适当数量的细胞悬液转接入含有新鲜培养液的培养瓶 或皿中；(第二天做转染，A.Fugene6 法--细胞总量应达 4-5×106 /10cm 培养 皿; B. 磷酸钙法: 细胞总量应达 3×106 / 10cm 培养皿)； 9) 置于 37 ℃ 5％CO2 的培养箱中培养 (注意培养箱应有足够的水分)。 注：以上所使用的胰蛋白酶、培养液等在使用前都置于 37℃水浴中预热，以减 小对细胞的刺激。

2. 细胞转染 2.1

脂质体介导的贴壁细胞转染法

以下针对 293T 细胞、10cm 培养皿 目前主要使用试剂盒为 Roche 公司的 FuGENETM6 Transfection Reagent 1) 转染前 24 小时以 4-5×106 /10cm 培养皿的细胞总量铺板，当细胞生长状态 17

第三章

细胞培养和转染

良好且贴壁细胞密度达到 50~80%时即可进行转染； 2) 在 1.5ml 离心管中加入需要共转的 2 种质粒 DNA 各 5μg，混匀。 3) 将 50μl FuGENE6 脂质体加入 500μl DMEM(serum free)培养液(注意不要 将 FuGENE6 脂质体沾到管壁)，加入前述 DNA，轻轻混匀，RT 培养 30 分 钟； 4) 将含有 DNA 和脂质体的液体小心加入到培养皿中，分散均匀，置于 37 ℃ 5 ％CO2 的培养箱中培养 24－48 小时。

2.2 磷酸钙介导的贴壁细胞转染法 以下针对 293T 细胞、10cm 培养皿(参照《分子克隆实验指南(第三版)》) 1)转染前 24 小时以 3×106/10cm 培养皿的细胞数量铺板； 2) 转染前 1h 换液； 3) 在 1.5ml 离心管中混和 50μl

2.5M CaCl2 和 12.5μg 质粒 DNA (溶于 0.1×

TE)，并用 0.1×TE 将体积补至 500μl； 4) 加入 500μl 2×HEPES 盐缓冲液，迅速弹敲试管侧壁混匀溶液，室温下静 置 1 分钟； 5) 立即将磷酸钙－DNA 悬液加入到单层细胞的细胞培养基中(每 1ml 培养基加 0.1ml 悬液)，轻轻摇动平皿混匀培养基，培养基会变成混浊的橘红色； 6) 置于 37 ℃ 5％CO2 的培养箱中培养，2－6 小时后吸去培养基和 DNA 沉淀； 7)(此步可以省略) 用 PBS 将细胞层洗 1 次，加入 3ml 15％甘油 1×HEPES 盐缓 冲液，置于 37 ℃ 5％CO2 的培养箱中 0.5－3 分钟，吸去甘油，用 PBS 将 细胞层洗 1 次； 8) 加入 10ml 预热的新鲜培养液，继续置于 37 ℃ 5％CO2 的培养箱中培养培养 24－48 小时。

18

第三章

3. 相关试剂 1) 2×HEPES 盐缓冲液： 140mM NaCl 1.5mM Na2HPO4•2H2O 50mM HEPES 用 0.5N NaOH 将 pH 值调至 7.05 2) 0.1×TE(pH7.6)： 1mM Tris-Cl(pH7.6) a、 1mM EDTA(pH7.6) 3) 2.5M CaCl2 4) 15％甘油：用 1×HEPES 盐缓冲液配制

19

细胞培养和转染

第四章

免疫共沉淀

第四章 免疫共沉淀 (co-immunoprecipitaion) 1. 操作流程 ※

所有操作在冰上进行

收获细胞——>制备 protein G beads 悬液——>Preclear ——> 免疫共沉淀

2. 方

法

2.1 收获细胞 1) 转染过夜后，在荧光显微镜下确认转染效率； 2) 转染 24-48h 后收获细胞：小心吸干细胞培养液，用预冷 PBS 或 TBS 润洗贴 壁细胞 1 次； 3) 向每个 10cm 平皿中加入 1ml 裂解液(lysis buffer),并置于 4℃振荡 30min(裂解 液用量根据培养细胞数量进行适当调整)； 4)4℃ 12,000rpm 15min 离心，吸取上清； 5)吸取部分细胞裂解上清，加入适量的 6×SDS loading buffer，100℃ 变性 5min 后进行 western blot，用以检测被转染质粒在宿主细胞中的表达情况。当表 达结果理想时，进行免疫共沉淀实验。 注：其余所得上清若需保存，则应该加入甘油(终浓度为 10％)冻存于－80℃

2.2

Protein G beads 悬液的制备

(以下以一个样品为例: 一般用量为 10μl /500μl 反应) 1) 将 protein G beads 原液在 4℃ 13,000rpm 30sec 离心弃上清； 2) 加入 1ml 预冷裂解液(不含蛋白酶抑制剂)混匀，4℃ 13,000rpm 30sec 离心弃 20

第四章

免疫共沉淀

上清，共如此清洗 3 次； 3) 弃上清，加入裂解液，制成 50％ protein G beads 悬液备用。

2.3

Preclear

1)向收获得到的细胞蛋白裂解产物中加入 15μl 的 50％ protein G beads 悬液和 1 μl IgG(与 IP 所使用的抗体同源，约 1μg)，混匀后置于 4℃振荡 1 hr； 2)4℃ 2,000rpm 2min 离心，将上清转移至一个干净的 1.5ml 离心管中；

2.4

免疫共沉淀

1) 向约 500μl preclear 上清中加入一抗(为需要免疫沉淀的蛋白的相应抗体)2μ g，混匀后置于 4℃振荡 1hr ； 2) 加入 20μl 的 50％ protein G beads 悬液，混匀后置于 4℃振荡过夜； 3) 4℃ 2,000rpm 2 min 离心，将上清转移至一个干净的 1.5ml 离心管中，上清 即为 output； 4) 加入 1ml 预冷低盐(150mM)裂解液(含蛋白酶抑制剂) 混匀，4℃ 2,000rpm

2

min 离心弃上清，共如此清洗 3 次； 5) 如需用高盐洗涤时，加入 1ml 预冷高盐(350mM－500mM)裂解液(含蛋白酶抑 制剂) 混匀，4℃ 2,000rpm 2 min 离心弃上清，共如此清洗 2 次(洗涤 beads 步骤可视蛋白相互作用强弱而变化)； 6) 加入 1ml 预冷 TBS，4℃ 2,000rpm 2 min 离心弃上清，共如此清洗 2 次； 弃上清，加入 10μl 2×蛋白上样缓冲液(2×SDS loading buffer),100℃变性 5min； 7) 4℃ 10,000rpm 30s 离心，取上清上样进行电泳，进行 western blot。

21

第四章

免疫共沉淀

3. 试 剂 1） 1×TBS 2)低盐裂解液(150mM NaCl)：

1×TBS 5mM EDTA 1% NP-40 1mM DTT 1×蛋白酶抑制剂

3)高盐裂解液(500mM NaCl)：

1×TBS 5mM EDTA 1% NP-40 1mM DTT 1×蛋白酶抑制剂 350mM NaCl

4)贮存液： 5)5×TBS：Tris base 60.57g, NaCl 45g, 加浓 HCl 约 34ml 将 pH 值调至 8.0, 加水 定容至 1000ml 6)1M DTT(二硫苏糖醇)：3.09g DTT in 20ml 0.01 M NaAc(pH5.2) 注：DTT 不能进行高压处理 7)10% NP-40(Nonidet P-40) 8)100×蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)： PMSF(苯甲基磺酰氟)

5mg/ml

Aprotinin

100μg/ml

Leupeptin

100μg/ml

Pepstatin

100μg/ml

用无水乙醇定容，保存于－20℃ 另有 Roche 生产的蛋白酶抑制剂--Protease Inhibitor Cocktail Tablets(complete, EDTA-free)，使用时每 50ml lysis buffer 加入 1 片 (Roche 生产，货号 10418000) 注意：处理含 His-tag 的蛋白时不能使用含 EDTA 的 buffer

22

第五章

第五章

Western Blot

Western Blot 1. 操作流程

电 泳——>转 膜——>杂 交——>显 色

2. 方 法 2.1 电

泳

根据所要分离的蛋白质分子量大小，配制适当浓度的 SDS-PAGE 胶，常用 浓度为 10％-20％

2.2 转

膜

2.2.1 湿转 1) 在一适当容器中加入转移缓冲液，将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和 2 张 普通滤纸浸泡约 10min(若用 PVDF 膜，则首先要将 PVDF 膜置于甲醇中浸 透 10min，然后和硝酸纤维素膜同样使用)； 2) 依次将 1 张滤纸、SDS-PAGE 胶、膜、1 张滤纸叠放在一起，对齐并赶出其 中的气泡； 3) 将膜靠近阳极装入转膜电泳槽中(胶在阴极)； 4) 接通电源，在 4℃冰浴中进行转膜，恒流 300 毫安(或恒压 100 伏)转膜>1hr， 或恒压 30 伏转膜过夜。 2.2.2 半干转 1) 在一适当容器中加入转移缓冲液，将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和 2 张 约 3mm 厚滤纸浸泡约 10min； 2) 依次将 1 张滤纸、SDS-PAGE 胶、膜、1 张滤纸叠放在一起，对齐并赶出其 中的气泡； 3) 将膜靠近阳极(底部)装入转膜仪中(膜在下，胶在上)； 4) 接通电源，恒流 0.8 毫安/cm2 膜, 转膜 1.5hrs。 23

第五章

2.3

杂

Western Blot

交

※ 以下各步均置于摇床上进行 1) 将转好的膜浸于 5％脱脂奶中封闭 30min； 2) 用 TBST 将膜冲洗干净； 3) 将膜浸于含有一抗(终浓度为 1μg/ml)的 TBST 中室温 1hr； 4) 用 TBST 将膜浸洗 10 次，3-5min/次； 5) 将膜浸于含有二抗的 TBST 中室温 30min； 6) 用 TBST 将膜浸洗 10 次，3-5min/次，膜即可用于显色反应。 注：若使用偶联酶标抗体(例如：anti-flag-HRP)，则在牛奶封闭后, 将膜浸于含 有抗体的 TBST 中 1hr，然后用 TBST 将膜浸洗 3 次，10min/次，膜即可用于显 色反应。

2.4

显

色

目前主要使用 PIERCE 试剂盒显色 1) 将膜表面的液体略微沥干，置于干净的保鲜膜上； 2) 将等体积的底物 1 和底物 2 混合(通常用量为 10μl / cm× cm 膜)后，均匀覆 盖于膜的表面，避光放置 3-5min； 3) 将膜表面的液体略微沥干后，用干净的保鲜膜包裹，固定于暗盒中即可压 X 光片，压片时间可适当调节； 4) 显影，定影，分析结果。

2.5 膜的 strip 膜经 Strip 后可继续用于另一次 western blot 实验 1) 将膜浸于 stripping buffer 中，50℃放置 30min；(最好放在通风柜中) 2) 用 TBST 浸洗膜 2 次，每次置于摇床上 10min；

24

第五章

Western Blot

3) 5% 脱脂奶粉封闭 30 分钟。

3. 试 剂 1) 5×SDS-PAGE 电泳缓冲液：Tris 碱 15.1g, 甘氨酸 94g, SDS 5g，加水定容至 1000ml 2) 转膜缓冲液：Tris 碱 4.55g, 甘氨酸 21.625g, 甲醇 200ml， 加水定容至 1000ml 3) TBST：1×TBS，0.1% Tween-20 4) Stripping buffer 100ml

β-巯基乙醇，

700ul

2%SDS,

2g

62.5mM Tris HCl, 0.76g, pH6.7 5)2×SDS gel-loading buffer：

0.1M Tris-HCl (pH6.8) 20% 甘油 10％

β－巯基乙醇(B-ME)

4％

SDS

0.001% 溴酚蓝 6)6×SDS gel-loading buffer：

0.28M

Tris-HCl (pH6.8)

30%

甘油

0.5M

DTT

1％

SDS

0.0012%

溴酚蓝

25

第六章 报告基因检测系统

第六章 报告基因检测系统 公司现已发展的有三种报告基因检测系统：NF-Kb，p53，NFAT。根据待检 基因对其作用的原理，及在药物、抗体等作用下，产生的不同效果，这三种报告 基因系统又具体可以分为：NF-kB 刺激系统和 NF-kB 抑制系统；p53 刺激系统 和 p53 抑制系统；NFAT 刺激系统和 NFAT 抑制系统。

1. NF-kB 报告基因检测系统 (NF-kB 刺激系统；NF-kB 抑制系统) 1．1 细胞培养 1)细胞株及材料 细胞株：

293-T 细胞

培养基：

DMEM(10%FBS GBICO)，DMEM(无血清)

培养器皿：T75(75cm2)培养瓶(以下相同)，24 孔细胞培养板 2)细胞培养及铺板 a) 传代：用 DMEM(10%FBS) 培养基接种 293T 至 75 cm2 培养瓶，细胞长 满后铺板并传代。 注：一般一瓶细胞总数可以达到 3×107 个，可以按 1：8 分瓶。 b) 铺板： 细胞消化：将培养好的 293 T 细胞，倾去培养基，加入 1-2ml1×胰酶 轻轻摇晃以覆盖整瓶细胞，37℃培养箱放置 2-3min，观察 细胞从瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁)，显微镜下 观测到细胞成单个，或是只有 2-3 个细胞聚团，即可以加 入含有血清的 DMEM(10%FBS) 10ml 左右，终止胰酶的 消化作用，随后从中取少量细胞计数。 细胞计数：如果细胞密度较大，可按一定倍数稀释后计数，细胞密度 的计算按照公式： 细胞密度(单位：个/ml)=(4 个大方格的细胞总数/4)×104 ×稀释倍数 铺板： 24 孔板按照每孔 1.0×105(NF-kB 刺激系统)或 0.8×105(NF-kB 抑 26

第六章 报告基因检测系统

制系统)，接种体积为 500μL 来铺板。 细胞加入后将 24 孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃 动(勿转动)，使细胞能够均匀分布，放置细胞培养箱生长。

1. 2

转染

1)试剂及材料： 转染试剂：Lipofectamin 2000 质粒：

a:对照质粒：pEF-BOS TRAF6(NF-kB 刺激系统) Dominant negative TRAF6 (NF-kB 抑制系统) b:NF-　B-luc report plasmid c:目的基因质粒，构建在 pEF-FN 载体上

2)转染： 铺板后 24 小时转染，每个样品须作 3 个重复孔，目的是为消除实验误差， 并且在 24 孔板上相应位置做好标记。 在 A，B 两个 eppendorf 管中分别加入： A：0.1μg NF　B-luc reporter gene+0.4μg interest gene+ serum free DMEM 至终 体积 50μl/孔。 B：1.5μL lipofectamine 2000+48.5μL serum free DMEM 体积为 50μl /孔，室温 放置 5min A，B 二者混合，室温放置 20-30min 后将混合液缓慢而均匀的加到 24 孔板细 胞液中，每孔为 100μL，轻轻摇晃，使 DNA 分布均匀，培养 24hr。 NF-kB 刺激系统：negative cotrol： pEF-BOS positive control：TRAF6， NF-kB 抑制系统：negative cotrol： pEF-BOS positive control：Dominant negative TRAF6(TRAF6 DN)。 (进一步具体转染方法可以参照 Lipofectamin2000 的说明书。)

27

第六章 报告基因检测系统

1.3

细胞收获及处理

刺激因子：TNF(肿瘤坏死因子)，母液浓度 2μg/Ml，使用浓度 20ng/ml Buffer：

5×PBL 裂解液 (Tricine：pH7.8，40 mM； NaCL： 50 mM； EDTA： 2 mM； MaSO4： 1 mM； DTT：

5 mM；

Triton X-100：1% ) 1) NF-kB 刺激系统： 转染后 24 小时先通过荧光显微镜观察 GFP 表达的强弱以判断转染效率，处 理细胞。 2)NF-kB 抑制系统： A) 转染后 24 小时先通过荧光显微镜观察 GFP 表达的强弱以判断转染效率 B) 加药刺激：TNF 用 DMEM 培养基稀释后，200μl/孔换液。 C) 加药刺激 12-16 小时后收细胞。 3)细胞处理：吸干培养液，24 孔板中每孔加入 1×PBL buffer，在摇床上振荡 10-15 分钟。置于冰上后，取出 5μl 裂解液，加入发光管中，可以马上上 机检测，可以马上上机，或放入-80°C 保存。

1.4 luciferase 分析 参 见 promega 公 司 的 TECHNICAL MANUAL 上机操作方法附在后面。

1.5 Western-blot 检测待检基因的表达情况 见后。

28

第六章 报告基因检测系统

2. p53 报告基因检测系统(P53 抑制系统) p53 刺激系统仍在优化之中，因此主要介绍 p53 抑制系统的操作步骤。

2.1 细胞培养及铺板 1)细胞株及材料： 细胞株： Saos(p53-/-)，细胞骨肉瘤细胞(Osteosarcoma cell)，缺失 p53 基因。 DMEM(10%FBS GBICO)，DMEM(无血清)

培养基：

培养器皿：75cm2 培养瓶，24 孔细胞培养板 2)细胞培养及铺板： a)传代：用 DMEM(10%FBS) 培养基接种 Saos 至 75cm2 培养瓶，细胞长满 后铺板并传代。一瓶 75cm2 的细胞长满约为 1×107 个。 b) 铺板： 细胞消化：将培养好的 Saos 细胞(75cm2 培养瓶)，倾去培养基，加入 2ml 胰酶轻轻摇晃以覆盖整瓶细胞，37℃培养箱放置 2-3min。观察 细胞从瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁)，显微镜下观测 到细胞成单个，或是只有 2-3 个细胞聚团，即可以加入含有血 清的 DMEM(10%FBS)10 ml 左右，终止胰酶的消化作用。 细胞计数：如果细胞密度较大，可按一定倍数稀释后计数。 细胞密度(单位：个/ml)=(4 个大方格的细胞总数/4)×104×稀释 倍数 铺板：24 孔板的细胞接种量为每孔 1.0×105 个，接种体积为 500μl 来铺板。 细胞加入后将 24 孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(勿转 动)，使细胞能够均匀分布，放置细胞培养箱生长。

转染

2．2 1)试剂及材料： 转染试剂：Lipofectamin 2000 质粒：

a:对照质粒：pEF-BOS;

P53 wild type plasmid

b:P53-luc report plasmid c:目的基因质粒，构建在 pEF-FN 载体上 2)转染：

29

第六章 报告基因检测系统

铺板后 24 小时转染，每个样品须作 3 个重复孔，目的是为消除实验误差， 并且在 24 孔板上相应位置做好标记。在 a，b 两个 eppendorf 管中分别加入： a：0.1μg P53-luc reporter gene+0.4μg interest gene+ 25ng P53 wild type plasmid +serum free DMEM 至终体积 50μl/孔。(negative cotrol 不加 P53 wild type plasmid) b：1.5μL lipofectamine 2000+48.5μL serum free DMEM 体积为 50μl /孔，室温 放置 5min a，b 二者混合，室温放置 20-30min 后将混合液缓慢而均匀的加到 24 孔板细胞 液中，每孔为 100μl，轻轻摇晃，使 DNA 分布均匀，培养 24hr。 P53 抑制系统：negative cotrol： pEF-BOS positive control：pEF-BOS+P53 wild type plasmid (进一步具体转染方法可以参照 Lipofectamin2000 的说明书。)

2.3 细胞收获及处理 Buffer：

5×PBL 裂解液 (Tricine：pH7.8，40 mM； NaCL： 50 mM； EDTA： 2 mM； MaSO4： 1 mM； DTT：

5 mM；

Triton X-100：1% ) 1) 转染后 24 小时先通过荧光显微镜观察 GFP 表达的强弱以判断转染效率。 2) 细胞处理：吸干培养液，24 孔板中每孔加入 1×PBL buffer，室温下摇床上振 荡 10-15 分钟。置于冰上，取出 5μL 裂解液，加入发光管中，可 以马上上机检测，或放入-80°C 保存。

2.4 luciferase 分析 上机操作方法附在后面。

2.5 Western-blot 检测待检基因的表达情况 操作附在后面。 30

第六章 报告基因检测系统

3. NFAT 报告基因检测系统 (NFAT 刺激系统；NFAT 抑制系统) 3.1 细胞培养 1)细胞株及材料： 细胞株：Jurkat-T 细胞 培养基：RPMI 1640(10%FBS GBICO；1%双抗)，RPMI 1640(无血清) 培养器皿：75cm2 培养瓶;175cm2 培养瓶;25 cm2 培养瓶;96 孔细胞培养板 2)Jurkat-T 细胞的培养： Jurkat-T 细胞为悬浮细胞，细胞活力好时，镜检多为 10-20 个细胞聚团， 少游离的单个细胞，细胞圆而透亮。一般培养按密度来计算，起始培养密度 不要低于 1×105 个/ ml，24hr 后细胞密度即可达到 2×105 个/ ml，以此类推在 第五天上即可以达到 1.6×106 个/ ml，根据这个来调整接种密度及传代天数。 最好细胞的密度高不能超过 1.6×106 个/ ml。 例如，起始培养密度 2×105 个/ ml，体积 30 ml，在第三天时, 细胞密度 达到 8×105 个/ ml，细胞总数达到 2.4×107 个，因为检测一个待检基因的电击 所需细胞数量为 1×107，所以，此培养的细胞数只能做 2.4 个样品，因此，根 据实验所需要检测的样品数目来调整培养细胞的体积(象 175cm2 的培养瓶可 以培养 200-250ml，细胞总数可以达到 16-20×107，这样就可以电击 16-20 个 样品)。

3.2 电击转化 细胞总数达到检测样品所需则可转染。 转染用品：电击仪，400mm 电击杯(Biorad #1652088) 质粒： a:对照质粒：NFAT 刺激系统：negative control:pEF-BOS posivie control: SYC plasmid NFAT 抑制系统: negative control:pEF-BOS posivie control: SLIM plasmid b: NFAT-luc report plasmid c:目的基因质粒，构建在 pEF-FN 载体上 31

第六章 报告基因检测系统

试剂：

台盼蓝(0.4%)用于活细胞计数。

1)将 Jurkat-T 细胞转到 50ml 离心管中，细胞计数(细胞密度最好在 1×106 左右)。 2) 1000rpm 离心， 用无血清的 RPMI1640 培养液收集细胞， 调整浓度为 2.5×107/ml, 每个电极杯中加入 400μl 细胞液(细胞数为 1×107 个)。 3)依次加入 10μg NFAT-luc reporter gene 和 20ug interest gene(体积控制在 20μl 以 内)，使质粒和细胞混匀(尽量不要有 bubble)。NFAT-luc reporter gene 是每个电 击杯都必须加的可以先在加到电击杯之前预先和细胞混好。 4)电击条件 250V，950μF。电击前轻轻弹击电击杯，将杯底的细胞重悬起来，注 意不要产生气泡。电击时观察一下 time constant(约为 24ms)。 5)电击完后立即弹击电击杯的侧壁数次，室温下放置 30min。 6)将电极杯中的细胞加到 10ml RPMI1640 培养液中(含 serum)24cm2 培养瓶，培 养 40hr(即培养到第三天上午)。

3.3 铺板，加药 C305：1∶60 稀释使用 PMA: 储存浓度为 0.5mg/ml，应用浓度为 50ng/ml(稀释 10000 倍)) Ionomycin: 储存浓度为 1mM，应用浓度为 1μM(稀释 1000 倍))；详见附 1。 1) 将转染培养 40hr 后的细胞转到 15ml 离心管中，进行活细胞计数(台盼蓝染色)， 离心收细胞，调整细胞浓度为 2×106 个/ml。 2) 在 96 孔板中，每孔加 50μl 细胞(细胞数为 1×105 个)，每个样品还是要做 3 个 复孔。NFAT 刺激系统，NFAT 抑制系统可以同时进行，前者无需加药刺激， 后者需要做 C305 抗体刺激和 PMA+ Ionomycin 刺激，因此，一个样品需要做 9 个复孔。按顺序在 96 孔板中加入细胞，并相应做好标记。 3) 对于 NFAT 刺激系统， 直接在每孔中补加 50μl 新鲜培养基， 使终体积为 100μl； 对于 NFAT 抑制系统分别加入 50μl C305(anti-TCR, 60 倍稀释)；或 50μl PMA(50ng/ml)+Ionomycin(1μM)，刺激 8-12 小时。

3.4 细胞收获及处理 试剂：5×PBL 裂解液(同前)。 32

第六章 报告基因检测系统

将刺激 8-12 小时后的细胞取出，每孔加入 25μL 5×PBL buffer，将细胞置于 -80°C 保存，准备第二天检测。

3.5 Luciferase 检测 将细胞培养板取出，37°C 放置 10-15min，将裂解液融化，显微镜下确认细 胞已完全裂解，取出 5μL 裂解液置于发光管中，上机检测。

3.6．Western-blot 检测待检基因的表达情况 见下。

4．Western-blot 试剂：Flag-antibody(1:4000) goat anti-mouse-HRP Pierces 显色底物。 1) 取剩余细胞裂解液加入 SDS Loading buffer。 z 裂解液与 SDS Loading buffer 比例视蛋白浓度而定。一般 293 T 细胞 裂解液按 1：1 加入 2×SDS Loading buffer，Jurkat T 和 Saos 细胞裂解 液按 6：1 加入 6× SDS Loading buffer。 2) 100℃加热变性 5-10 分钟，上样。聚丙烯酰胺蛋白胶浓度为 10%，75V/125V。 一般 Jurkat T 和 Saos 细胞上样量为 20μl，293 T 细胞为 8μl。 3) 电泳：根据所要分离的蛋白质分子量大小，配制适当浓度的 SDS-PAGE 胶， 常用浓度为 10％-20％ 4) 转膜 湿转 a) 在一适当容器中加入转移缓冲液，将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和 4 张普通滤纸浸泡约 10min(若用 PVDF 膜，则首先要将 PVDF 膜置于甲 醇中浸透 10min，然后和硝酸纤维素膜同样使用); b) 依次将 2 张滤纸、SDS-PAGE 胶、膜、2 张滤纸叠放在一起，对齐并赶 出其中的气泡; c) 将膜靠近阳极装入转膜电泳槽中(胶在阴极); 33

第六章 报告基因检测系统

d) 接通电源，在 4℃冰浴中进行转膜，恒流 300 毫安(或恒压 100 伏)转膜 >1hr，或恒压 30 伏转膜过夜。 B、半干转 a) 在一适当容器中加入转移缓冲液，将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和 2 张约 3mm 厚滤纸浸泡约 10min； b) 依次将 1 张滤纸、SDS-PAGE 胶、膜、1 张滤纸叠放在一起，对齐并赶 出其中的气泡； c) 将膜靠近阳极(底部)装入转膜仪中(膜在下，胶在上)； d) 接通电源，恒流 0.8 毫安/cm2 膜, 转膜 1.5hrs； 5) 杂交(以下各步均置于摇床上进行) a) 将转好的膜浸于 5％脱脂奶中封闭 30min； b)

将膜浸于含有一抗(终浓度为 1μg/ml)的 TBST 中室温 1hr；

c) 用 TBST 将膜浸洗 3 次，至少 10min/次； d)

将膜浸于含有二抗的 TBST 中室温 30min；

e) 用 TBST 将膜浸洗 3 次，>10min/次，膜即可用于显色反应。 z 若使用偶联酶标抗体(例如：anti-flag-HRP)，则在牛奶封闭后, 将膜浸 于含有抗体的 TBST 中 1hr，然后用 TBST 将膜浸洗 3 次，10min/次， 膜即可用于显色反应。 6) 显色 a) 目前主要使用 PIERCE 试剂盒显色 b) 将膜表面的液体略微沥干，置于干净的保鲜膜上； c) 将等体积的底物 1 和底物 2 混合(通常用量为 10μl / cm× cm 膜)后，均 匀覆盖于膜的表面，避光放置 3-5min； d) 将膜表面的液体略微沥干后，用干净的保鲜膜包裹，固定于暗盒中即可 压 X 光片，压片时间可适当调节； e) 显影，定影，分析结果。 7) 膜的 strip--膜经 Strip 后可继续用于另一次 western blot 实验 a) 将膜浸于 stripping buffer 中，50℃放置 30min；(最好放在通风柜中) b) 用 TBST 浸洗膜 2 次，每次置于摇床上 10min；

34

第六章 报告基因检测系统

c) 5% 脱脂奶粉封闭 30 分钟。 相关试剂： A) 5×SDS-PAGE 电泳缓冲液：Tris 碱 15.1g, 甘氨酸 94g, SDS 5g，加水定容至 1000ml。 B) 转膜缓冲液：Tris 碱 4.55g, 甘氨酸 21.625g, 甲醇 200ml，加水定容至 1000ml。 C) TBST：1×TBS，0.1% Tween-20。 D) Stripping buffer 100ml

β-巯基乙醇：

700ul

2%SDS：

2g

62.5mM Tris HCl： 0.76g, pH6.7

5. 注释 5.1 几种药物的储存浓度和应用浓度 TNF 1×106U/瓶 1mg=4×107U, 1×106U=25μg 溶于 12.5ml PBS 中，浓度为 2μg/ml。 储存浓度：2μg/ml，100μl 分装，存于-40℃ 应用浓度：20ng/ml(稀释 100 倍) C305 60 倍稀释使用。C305 原液分装存于－80℃，稀释后存于-20℃，短期(不超 于一周)可放置 4℃，并加入少量 NaN3，无菌操作。 PMA and Ionomycin(dissolved in DMSO) PMA:1 支 1mg 溶于 2ml DMSO 即 0.5mg/ml 储存浓度：0.5mg/ml，3μl 分装(储存于-80°C) 应用浓度：50ng/ml(稀释 10000 倍) Ionomycin: 1mg/747.1(MW)=1.33×10-3mmol 溶于 1.33ml,浓度为 1mM。(储存于 -80°C) 储存浓度：1mM，6μl 分装。 应用浓度：1μM(稀释 1000 倍) 35

第六章 报告基因检测系统

5.2

各系统的 control

1) NF-kB 刺激系统： TRAF6 与 NFkB reporter gene 共转染, 作为 positive control. 2) NF-kB 抑制系统：Dominant negative TRAF6 与 NFkB reporter gene 共转染， 抑制 TNF 诱导的 NFkB 活性。 3) p53 抑制系统：wt-P53 与 p53-luc 共转染，作为 positive control. 4) NFAT 刺激系统：SYK 与 NFAT-luc 共转染，作为 positive control. 5) NFAT 抑制系统：SLIM 与 NFAT-luc 共转染，抑制 C305 诱导的 NFAT 活性， 作为 positive control.

5.3

Lumat LB P507 仪器操作步骤

1、开机，和注入反应底物。 a.开机后，仪器的液晶屏出现： REA D Y M EA SU RE

PRO TO CO L

-O TH ERS-

b.选择 -OTHERS- 选项，进入子菜单： READY

Deleted:

OPER.FUNCT. TURN ONCE

-OTHERS-

Deleted:

c.选择 OPER.FUNCT.选项，进入菜单： OPERATOR FUNCTIONS REAGENT

PERF.TEST

d.选择 REAGENT 选项，进入菜单： REAGENT

Deleted:

Deleted: Deleted:

PRIME

REFRESH

-OTHERS-

36

第六章 报告基因检测系统

e.选择 PRIME 选项，进入菜单： PRIME INJECT 1

INJECT 2

f.选择 INJECT 1 选项，进入菜单： INSERT TUBE…

Deleted:

g.取一只干净的上样管插入到检测槽中，显示屏上立即显示：

START

h.选择 START 选项，检测槽开始旋转，显示屏上显示： INJECT 1

3 FOLD

i.当没有加入底物的情况下，此时是将导管内的残留水分抽出，确定导管内 的水分全部抽干后，将底物瓶换上，此时屏幕显示程序返回到“e”。重 复 e-h 步骤将底物充满整个导管。 j.当界面回到“e”时，按“EXIT”键返回到界面“a” 。 2、上样检测： a. Deleted: READY Deleted: MEASURE PROTOCOL

-OTHERS- 37

第六章 报告基因检测系统

b.选择“MEASURE”，进入界面： SELECT TYPE OF MEASUEMENT? PROTOCOLS DIRECT ENTRY

Deleted:

RATEMEETER

c.选择“PROTOCOLS”，可以打开一个事先储存的程序，进入界面： ENTER PROTOCOL NO.

3

Deleted:

PRINT LIST

根据提示键入数字 3，并按“enter”键，进入程序 3。 d.选择“PRINT LIST”选项，可以打印出程序 3 的各项检测参数： 03: PROTOCOL LUC-1 YES

OK ?

Deleted:

NO

e.选择：“YES”进入界面： COMMENT

f.键入“enter”键，进入界面：

SAMPLE 1

REPL. #1

TUBE#1

INSERT TUBE…

38

第六章 报告基因检测系统

g.按提示将样品管插入到检测槽中并按“START”键，开始检测：

SAMPLE-RLU

133

REMOVE TUBE…

h.第一个样品的第一个复孔读值出来后，仪器屏幕会自动提示加入第一个 样品的第二个复孔样品管： SAMPLE 1

REPL.#2

TUBE#2

INSERT TUBE…

与步骤“g”相同，略，屏幕出现加入第三个复孔样品管： SAMPLE 1

REPL.#3

TUBE#3

INSERT TUBE…

第三个复孔读值出来后，仪器自动计算“MEAN”值，并打印在纸上。 i. 屏幕出现下一样品检测命令： SAMPLE 2

REPL.#1

TUBE#1

INSERT TUBE…

以后操作与 f-h 相同。 3、检测完仪器的清理 a. 所有样品检测完毕后，按“exit”键回到仪器开始状态，并将底物瓶换成 空瓶： READY MEASURE PROTOCOL

Deleted: -OTHERS39

第六章 报告基因检测系统

选择“OTHERS”选项，与“1 开机加底物”步骤中的 b-d 相同，进入： REAGENT PRIME

REFRESH

-OTHERS-

b. 选择“OTHERS”选项，进入界面： REAGENT

Deleted:

WASH MANUAL LOAD

-OTHERS-

c.选择“WASH”选项，进入界面：

WASH INJECT 1

INJECT2

c. 选择“INJECT 1”，与“1 开机加底物”步骤中的 f-g 相同根据提示选择 “START”键，进入界面： INJECT 1

8 FOLD

将残留在导管中的底物全部吸出后(可回收再用)，将空瓶换成水瓶后重复 上述操作洗涤 1-2 遍，直至收集管中无底物颜色为止，再将水瓶换成空瓶后抽干 导管中的残留水分，即可按“EXIT”键退回仪器初始菜单，关机。 注：双报告基因系统的检测程序为 6 号程序。

40

第七章 流式细胞分析分选术

第七章

流式细胞分析分选术

1. 96 孔板样本处理 1.1 接种细胞：3×104 /孔

操作流程 一般作用 24 小时，上机

药物刺激

1.2

方法

在 cellquest 环境下，利用 control 细胞标定上样条件，并在已设好的文件 夹(INS 文件及 SET 文件)下，保存好需要的上样文件 打开 MPM 软件

关闭 cellqest 软件，

在 MPM 软件下进行一系列设定(首先在 Autosample 下，

进行 SettingInitial 及 FinalWashing 操作，清洗整个管路

管路清洗完毕进行

上样条件设定(主要设定上样体积(一般 100ul)，混合体积(一般 100ul)，混合次数， 清洗次数等，在 Acquisition 菜单下设定 current plate(现在使用的板号是 353263)， DateStorageFolder( 即 数 据 储 存 文 件 夹 ) ， AcquisitionDocument InstrumentSettingsFile(上样条件从保存好的 INS 及 SET 文件中选定) 条件设定完毕，选定 96 孔板的上样范围 上样

及 上样

在 Acquisition 下选择 Acquire,

上样完毕，退出上样板，使用次氯酸钠及水，清洗管路(将次氯酸钠

及水加在 96 孔板上，以上样的方式清洗管路) *须知：如果使用 PBS 作为上样鞘液，上样完毕后，换用水作为鞘液，并反复冲 洗管路，防止 PBS 盐结晶堵塞管路。

1.3

注释

1) 必需的 control：应准备一管对于检测指标为阴性的细胞(例如：若要检测 Jurkat-NF-KB-GFP 经药物刺激样本，就需要准备一管 Jurkat 细胞(GFP 为阴 性))，用于标定机器的上样条件。细胞量为 1×106 个/ml，1ml。 2) 上机前，应对样本进行混合，以使样本均一(注意使用排枪吹打，勿产生气泡)。 3) 以上 protocol 仅针对于悬浮细胞。 4)

药物刺激浓度需先做梯度检测。

41

第七章 流式细胞分析分选术

2.

Cell Cycle Assay

常用的实验细胞株包括：293(T)，MCF7，U2OS，Saos，Hela 等 以 U2OS 细胞为例

2.1

细胞培养及铺板

1) 细胞株及材料： a) 细胞株：

U2OS 细胞

b) 培养基：

DMEM(10%FBS，GBICO)，DMEM(无血清)

c) 培养器皿：75cm2 培养瓶,6cm 培养皿 2) 细胞培养及铺板： a) 传代：用 DMEM(10%FBS) 培养基接种 U2OS 至 75cm2 培养瓶，细胞长 满后铺板并传代。 注：一般一瓶细胞总数可以达到 1×107 个 b)

铺板： 细胞消化：将培养好的 U2OS 细胞，倾去培养基，加入 2ml 1×胰酶轻轻 摇晃以覆盖整瓶细胞，37℃培养箱放置 2-3min，观察细胞从 瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁)，显微镜下观测到细胞 成单个，或是只有 2-3 个细胞聚团，即可以加入 5ml 含有血清 的 DMEM(10%FBS)，终止胰酶的消化作用。 细胞计数：如果细胞密度较大，可按一定倍数稀释后计数。 细胞密度(单位：个/ml)=(4 个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数 铺板：

6cm 培养皿按照每孔 6×105 个细胞(即 1.5×105/ml，4ml) 细胞加入后将 6cm 培养皿沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动 (手势一定要轻柔,防止培养液泼出)，使细胞能够均匀分布，放置细 胞培养箱生长。

注：计算铺板量时，应将 control 板，药物阳性对照板及质粒对照板考虑在内。

42

第七章 流式细胞分析分选术

转染

2.2 1） 试剂及材料： a)

转染试剂：Lipofectamin 2000

b)

质粒：对照质粒：pEF-BOS p21(阳性对照) p16(阳性对照) GFP-spectin 目的基因质粒，构建在 pEF-FN 载体上

注：若目的基因载体不是 pEF-FN,则对应的空载体要相应变化。 2） 转染：细胞密度为 50%-60%时，进行转染 A：0.3μg GFP-spectin+3μg interest gene+ serum free DMEM 至终体积 500μl/ 孔。 B：9.9μL lipofectamine 2000+490.1μL serum free DMEM 体积为 500μl /孔，室 温放置 5min A，B 二者混合，室温放置 20-30min 后将混合液缓慢而均匀的加到 6cm 板 细胞液中，每板为 1000μL，轻轻摇晃，使 DNA 分布均匀，转染 5 小时后， 换置培养液(10%FBS+DMEM)。

2.3

细胞分板

细胞分板：转染 12-16 小时后, 根据细胞密度按 1：3 或 1：2 分板，使分 板后细胞密度为 30%左右,37℃继续培养 30h。

2.4

加药刺激

除了利用转染质粒作为阳性对照，也可使用药物处理细胞作为阳性对照样本 细胞铺板 24 小时后，加药刺激： G1，S-arrest ：L-mimosine: 0.5mM 5-fluorourcil: 10mM G2/M arrest : nocodazole: 50ng/ml

43

第七章 流式细胞分析分选术

加药后，继续培养 24 小时 附注：作为阳性对照的基因及药物的具体使用情况见附表 1。

2.5

细胞收获及处理

分别收集培养液，在每个 6cm 板中加入 1ml 胰酶消化(细胞消化的方法同上)。 消化完毕，加入已收集的培养液(注意一一对应，防止弄错)中和胰酶。离心(300g， 5min)收集细胞，弃上清，加入 2-3ml 75%乙醇(细胞量较多，可酌量多加)，votex， 充分混匀，放入-20oC 冰箱，保存。

2.6

上机样本制备

从-20oC 取出细胞样本(至少已在-20oC 放置 4 小时)，离心(300g，5min)收集细 胞，弃上清。1×PBS 清洗两遍，加入 100ul 1×PBS，votex 混匀，加入 10ulPI(终 浓度 100ug/ml)，10ulRnase(终浓度 50ug/ml)，置于 37oC 水浴锅，避光处理 30min。 注：细胞量较多时，PI 及 RNase 量应酌量增加。

2.7 上机 在 cellquest 环境下，选择 FL-1(GFP)及 FL-3(PI)作为研究对象，先上 control 样本标定上样条件，进而上其他样本。

2.8

相关试剂的配制

1．1×PBS：采用 GIBCO 1×10L D’PBS(Cat.No21600-069)配制。 2．PI：以水为溶剂，母液浓度为 1mg/ml，配制完毕后，4oC 避光保存 3．Rnase：以水为溶剂，母液浓度为 0.5mg/ml，配制完毕后，分装冻存于-20oC 4．L-mimosine： 以无血清培养液为溶剂，母液浓度为 100mM，配制完毕后， 4oC 避光保存 5．5-fluorourcil：以 DMSO 为溶剂，母液浓度为 549mM，配制完毕后，4oC 保 存 6．Nocodazole：以 DMSO 为溶剂，母液浓度为 5mg/ml，配制完毕后，4oC 保存 44

第七章 流式细胞分析分选术

附表 1：阳性对照基因及药物

G0/G1

基因

药物

P21,P16

L-mimosine: 0.5mM

S

5-fluorourcil: 10mM

G2/M

nocodazole:

50ng/ml

3.FACS analysis on Apoptosis 可用于凋亡检测的细胞，多为对细胞凋亡较为敏感的细胞，例如：MCF7, Hela 以 Hela 细胞为例

3.1

细胞培养及铺板

1) 细胞株及材料： i.

细胞株：

Hela 细胞

ii.

培养基：

DMEM(10%FBS GBICO)，DMEM(无血清)

iii.

培养器皿：75cm2 培养瓶,6cm 培养皿

2) 细胞培养及铺板： a) 传代：用 DMEM(10%FBS) 培养基接种 hela 细胞至 75cm2 培养瓶，细胞 长满后铺板并传代。 注：一般一瓶细胞总数可以达到 3×107 个 b) 铺板： i.细胞消化：将培养好的 Hela 细胞，倾去培养基，加入 2ml 1×胰酶轻 轻摇晃以覆盖整瓶细胞，37℃培养箱放置 2-3min，观察细 胞从瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁)，显微镜下观测 45

第七章 流式细胞分析分选术

到细胞成单个，或是只有 2-3 个细胞聚团，即可以加入 5ml 含有血清的 DMEM(10%FBS)，终止胰酶的消化作用。 ii.细胞计数：如果细胞密度较大，可按一定倍数稀释后计数。 细胞密度(单位：个/ml)=(4 个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数 iii.铺板： 6cm 培养皿按照每孔 3×105 个细胞(即 0.75×105/ml，4ml)接种， 细胞加入后将 6cm 板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(手势一定 要轻柔,防止培养液泼出)，使细胞能够均匀分布，放置细胞培养箱生长。 注：计算铺板量时，应将 control 板，药物阳性对照板及质粒对照板考虑在内。

转染

3.2

1)试剂及材料： 转染试剂：Lipofectamin 2000 质粒：

a:对照质粒：pEF-BOS RIP(阳性对照) b:GFP-spectin c:目的基因质粒，构建在 pEF-FN 载体上

注：若目的基因载体不是 pEF-FN,则对应的空载体要相应变化。 2)转染：细胞密度为 50%-60%时，进行转染 A：0.15μg GFP-spectin+3μg interest gene+ serum free DMEM 至终体积 500μl/孔。 B：9.45μL lipofectamine 2000+490.55μL serum free DMEM 体积为 500μl /孔，室 温放置 5min A， B 二者混合，室温放置 20-30min 后将混合液缓慢而均匀的加到 6cm 培养皿 中，每孔为 1000μL，轻轻摇晃，使 DNA 分布均匀，转染 5 小时后,换置培养 液(10%FBS+DMEM)。继续培养

3.3

细胞收获 46

第七章 流式细胞分析分选术

转染 24 小时后，一旦观察到经 RIP 转染的细胞明显死亡，即可收获细胞。 每板分别收集培养液，在每个 6cm 板中加入 1ml 胰酶(细胞消化的方法同上)， 消化完毕，加入已收集的培养液(注意一一对应，防止弄错)中和胰酶，离心(300g， 5min)收集细胞。

3.4

上机样本制备

收集细胞液(包括上清) 分别取一点 没有转染的细胞 作为 control 及转染的细胞 作为 GFP 单染样本

同时准备 56℃水浴处理细胞

PBS 洗 染 AnnexinV Ab-PE 染 7-AAD 室温避光 15min

PE-mouse IgG 室温避光染色 15min

1╳binding buffer 洗两次

染 7-AAD，室温避光 15min

AnnexinV Ab-PE/ 7-AAD 染色， 室温避光 15min

3.5

上机

在 cellquest 环境下，选择 FL-1(GFP)，FL-2(PE)及 FL-3(7-AAD)作为研究对 象，先上 control 样本标定电压，域值，再用单染 GFP 的细胞样本及水浴处理后 单染 PE,7-AAD 的样本，调节补偿，最终确立上样条件，进而上其他样本。 注：A:用 GFP 单染样本以及水浴处理的单标 Annexin V-PE 样本调节 FL1-H 及 FL2-H 的补偿； B:水浴处理的单标 Annexin V-PE 以及水浴处理的单标 7-AAD 样本调节 FL2-H 及 FL3-H 的补偿。

4.

CD69 检测 47

第七章 流式细胞分析分选术

(或其他类似的免疫荧光检测) 4.1

细胞培养

1)细胞株及材料： 细胞株：Jurkat-T 细胞或 Jurkat 细胞 培养基：RPMI 1640(10%FBS GBICO；1%双抗)，RPMI 1640(无血清) 培养器皿：75cm2 培养瓶;175cm2 培养瓶;25 cm2 培养瓶;96 孔细胞培养板 2)Jurkat-T 细胞的培养： Jurkat-T 细胞为悬浮细胞，细胞活力好时，镜检多为 10 个左右细胞聚团， 及少量游离的单个细胞，细胞圆而透亮。一般培养按密度来计算，起始培养 密度不要低于 1×105 个/ml，24hr 后细胞密度即可达到 2×105 个/ml，以此类推 在第五天上即可以达到 1.6×106 个/ml，根据这个来调整接种密度及传代天数。 最好细胞的密度高不能超过 1.6×106 个/ml。 例如，起始培养密度 2×105 个/ml，体积 30 ml，在第三天时, 细胞密度 达到 8×105 个/ml，细胞总数达到 2.4×107 个，因为检测一个待检基因的电击 所需细胞数量为 1×107 个，所以，此培养的细胞数只能做 2.4 个样品，因此， 根据实验所需要检测的样品数目来调整培养细胞的体积(象 175cm2 的培养瓶 可以培养 200-300ml 细胞悬液，细胞总数可以达到 16-24×107，这样就可以做 16-24 个样品)。

4.2

电击转化

细胞总数达到检测样品所需则可转染(细胞密度最好在 1×106/ml 左右)。 转染用品：电击仪，400mm 电击杯 质粒：

a:对照质粒：NFAT 刺激系统：negative control:pEF-BOS positive control: SYC plasmid NFAT 抑制系统: negative control:pEF-BOS positive control: SLIM plasmid b: NFAT-luc report plasmid c:目的基因质粒，构建在 pEF-FN 载体上

试剂：

台盼蓝(0.4%)

1)将 Jurkat-T 细胞转到 50ml 离心管中，细胞计数(细胞密度最好在 1×106 左右)。 48

第七章 流式细胞分析分选术

2)1000rpm 离心， 用无血清的 RPMI1640 培养液收集细胞，调整浓度为 2.5×107/mL, 每个电极杯中加入 400μl 细胞液(细胞总数为 1×107 个)。 3)依次加入 10μg NFAT-luc reporter gene 和 20ug interest gene(体积控制在 20μl 以 内)，使质粒和细胞混匀(尽量不要产生气泡)。 4)电击条件 250V，950μF。电击前轻轻弹击电击杯，将杯底的细胞重悬起来，注 意不要产生气泡。电击时观察一下 time constant(约为 24ms)。 5)电击完后立即弹击电击杯的侧壁使细胞混匀，室温下放置 30min。 6)将电极杯中的细胞加到 10mL RPMI1640 培养液中(含 serum)24cm2 培养瓶，培 养 40hr(即培养到第三天上午)。

4.3

铺板，加药

C305：1∶60 稀释使用 PMA: 储存浓度为 0.5mg/ml，应用浓度为 50ng/ml(稀释 10000 倍)) Ionomycin: 储存浓度为 1mM，应用浓度为 1μM(稀释 1000 倍))； 1)将转染培养 40hr 后的细胞转到 15ml 离心管中，进行活细胞计数(台盼蓝染色)， 离心收细胞，调整细胞浓度为 2×106/ml。 2)在 96 孔板中，每孔加 50μL 细胞(细胞数为 1×105)，每个样品还是要做 3 个复 孔。NFAT 刺激系统，NFAT 抑制系统可以同时进行，前者无需加药刺激，后 者需要做 C305 抗体刺激和 PMA+ Ionomycin 刺激，因此，一个样品需要做 9 个复孔。按顺序在 96 孔板中加入细胞，并相应做好标记。 3) 对于 NFAT 刺激系统， 直接在每孔中补加 50μl 新鲜培养基， 使终体积为 100μl； 对于 NFAT 抑制系统分别加入 50μL C305(anti-TCR, 60 倍稀释)；或 50μl PMA(50ng/mL)+Ionomycin(1μM)，刺激 8-12 小时。

4.4

细胞收获及处理

将刺激 8-12 小时后的细胞取出，离心收集细胞

4.5 样本制备

49

第七章 流式细胞分析分选术

A:CD69 间标法 Cells harvested

1 × PBS 清洗两遍

Cells were suspended in 1ml 1×binding buffer (1% BSA) (cell 浓度约 1×106/ml)

取其中的 100µl

5µl pure-Mouse IgG1 5µl Mouse anti-human CD69 (或其它一抗) (非特异性染色) 4ºC 或冰上放置， 30min

1×binding buffer (1% BSA) 清洗两遍(每次 4ml)

5µl PE goat anti-mouse IgG 及 5µl 7-AAD 4ºC 或冰上，避光放置 15min

1×PBS 清洗两遍(每次 2ml)

上机

B:CD69 检测直标法 操 作 步 骤 基 本 同 间 标 法 ， 只 是 作 非 特 意 性 对 照 的 样 本 ， 直 接 用 Mouse anti-human IgG-pe 直接标记

上机

4.6 50

第七章 流式细胞分析分选术

在 cellquest 环境下，选择 FL-1(GFP)，FL-2(PE)及 FL-3(7-AAD)作为研究对 象，先上 control 样本标定电压，阈值，并调节补偿，最终确立上样条件，进而 上其他样本。

4.7

几种药物的储存浓度和应用浓度

TNF 1×106U/瓶 1mg=4×107U, 1×106U=25μg 溶 于 12.5mL PBS 中， 浓 度 为 2μg/mL。 储存浓度：2μg/mL 应用浓度：20ng/mL(稀释 100 倍) C305 60 倍稀释使用。

PMA and Ionomycin(dissolved in DMSO) PMA:1 支 1mg 溶于 2ml DMSO 即 0.5mg/mL(储存于-80°C) 储存浓度：0.5mg/ml 应用浓度：50ng/ml(稀释 10000 倍) Ionomycin: 1mg/747.1(MW)=1.33×10-3mmol 溶于 1.33ml,浓度为 1mM。(储存与 -80°C) 储存浓度：1mM 应用浓度：1μM(稀释 1000 倍)

5. 细胞分选 5.1 分选细胞样本处理 51

第七章 流式细胞分析分选术

贴壁细胞培养：一个细胞样本 至少需要一个 10cm 细胞板 (细胞总数大于 1×107 )

悬浮细胞培养：一个细胞样本 细胞总数应大于 1×107

收集细胞 去除培养液

胰酶消化(一般加入 2ml 胰酶， 37 ºC 充分消化，大约 3 分钟, 消化至细胞轻拍脱壁)

加入 5ml 培养液中和，充分 分散细胞(尽量使之呈单 细胞悬液,可通过显微镜观察判断)

取 100ul 细胞上机，测定转染效率，剩余细胞记数，离心

根据转染效率，分选模式(一般选用 exclusion 模式)，调节细胞浓度，达到 上样速率 1000-3000 个/秒，目的细胞 300 个/秒(细胞浓度(个/ul)=300/目的 细胞百分率) 上机，分选

分选后细胞，1500 转/秒，5min,离心收集细胞 1) 若所要分选的是悬浮细胞，要求细胞总数大于 1×107，直接收集细胞液 2) 必需的 control：举例说明，如果需要筛选的是 GFP 阳性的细胞，必须提供没 有转染的同种细胞。 3) 如果分选后的细胞还需要继续培养，需要预先用无菌的 4%BSA 包埋收集管 (在无菌收集管中，加满 4%BSA ，并放置于 4℃至少 1 小时，使用前倒除包 埋液)。 4) 如果分选后的细胞还需要继续培养，所有用到的试剂，包括鞘液，都必须无 菌处理；在分选前及分选过程中，必须进行严格无菌操作，机器需要经过酒 精冲洗，无菌 PBS 冲洗的过程。

5.2

分选细胞的上机操作程序 5.2.1 上机分选前准备 52

第七章 流式细胞分析分选术

1)无菌分选 分选前夜 FACS 仪器间需紫外照射过夜，收集管预先用 4%BSA 包埋(4 ℃至少 1 小时)

分选前冲洗机器程序：1. 将上样管换成 75%酒精，鞘液

桶中换成 3L 75%酒精冲洗，至 3L 酒精完全跑完； 2. 倒去鞘液桶中残余的酒精， 用无菌 PBS 冲洗鞘液桶使酒精彻底去除，加无菌 PBS 至鞘液桶满，同时上样管 中换成无菌 PBS，冲洗，使每个收集管收集液体约 20ml 左右,即可上机分选。 2)非无菌分选 如果不需要无菌分选，可仅用少量酒精冲洗，再用 PBS 冲洗至每管收集约 20ml 后即可上机分选。

5.2.2 上机分选步骤 打开 cellquest 软件，先上 control 样本，确定细胞获取条件，并划定需要获 取的细胞范围；在 Acquire menu 菜单下，选择 SortSetup，并设定 SortSetup 下的 一系列参数，设定完毕，Acquire,上样分选。 注：SortSetup 下主要的参数设定如下： SortGate 选择分选门，SortCount 选择 0(连续分选)， SortMode 选择分选模式(一般使用 exclusion) *须知：分选完毕后，用水冲洗，使每个收集管收集液体约 20ml 左右后可停止(防 止分选管道中形成盐结晶)。继而用常规冲洗方法冲洗上样管。

5.3

相关试剂的配制

1．4%BSA 溶液:使用 1×PBS 作为溶剂,每 100ml 1×PBS 中加入 4gBSA,充分溶 解. 2．1×PBS 溶液:采用 GIBCO 1×10L D’PBS(Cat.No21600-069)配制。

53

第八章

第八章 QIAGEN

siRNA 技术

siRNA 技术

RNAfect 试剂转染 siRNA

(贴壁细胞)

稀释 siRNA: 1OD=33ug

加入 50ul 水相当于 100uM

合成 dsRNA 双链：

100ul 体系

100uM

sense RNA

20ul

100uM

Anti-sense RNA

5 × Annealing buffer

20ul 20ul

H2O 90°C 1min

40ul then 37°C 1.5h

20uM siRNA 相当于 0.26ug/ul 1 nmol siRNA 的质量相当于 13.4ug

1. 方 法 1) 在转染前 24 小时铺板，细胞密度为 50~80%，对 24 孔板：4 ~ 8×104 cell/ 孔，生长速度快的细胞可铺 2×104 cell/孔。 2) 转染当天在 100 ul 培养液中稀释 1ug 的 siRNA，vortex 混匀，加入 6 ul 的 RNAfect 试剂，用枪上下混匀 5 次或 vortex 混 10 秒。(对于某些特殊细胞 系，可使用试剂盒中 ECR 缓冲液代替培养液) 3) 室温下静止 10~15 分钟 (15~25°C)。 4) 全部更换培养液，将转染复合物直接加到细胞上。 5) 继续培养，在 24~72 小时之间取样检测基因沉默效果。 a) 如果观测到细胞毒性，可在转染后 6~24 h 之内更换培养液。 b) 如要观察 siRNA-Fluorescein，须在转染后 4~8 小時内观察。

54

第八章

siRNA 技术

2. 注 释 2.1 不同培养体积的贴壁细胞用 RNAfect 转染时的初始条件 siRNA

siRNA 稀释后的

RNAfect 转染试

培养基用量

( ug )

终体积( ul )

剂量( ul )

( ul )

24 孔板

1

100

6

300

12 孔板

2

100

12

600

6 孔板

5

100

15

1900

培养体积

2.2 在 24 孔平板中优化 RNAfect 转染效果的方法 siRNA 与 RNAfect 试剂的比例 (ug/ul) 1:3

1:6

1:9

siRNA 用量

0.5ug

0.5ug

0.5ug

RNAfect 试剂用量

1.5ul

3ul

siRNA 用量

1.0ug

1.0ug

1.0ug

3ul

6ul

9 ul

siRNA 用量

1.5ug

1.5ug

1.5ug

RNAfect 试剂用量

4.5ul

9ul

13.5ul

RNAfect 试剂用量

2.3 在 24 孔平板中优化 RNAfect 转染效果的方法 推荐使用的贴壁细胞量 (转染前 24 小时) 24 孔板

4.0 ~ 8.0 × 104

12 孔板

0.8 ~ 2.0 × 105

6 孔板

1.5 ~ 4.0 × 105

55

4.5ul

第九章

第九章

杆状病毒表达系统

杆状病毒表达系统 1. 操作流程

共转染——>病毒扩增——>滴度与 plaque 纯化——>小规模表达带有 His 标签 的目的基因

2. 方 法 2.1

共 转 染

2.1.1 使用 Invitrogen 的 Cellfectin 1) 于六孔板的每孔接种 1E6 Sf9。等待 30～60min 直至细胞贴附。 2) 在 15ml 的 falcon 管中混合 0.5μg BaculoGold 线性 DNA 和 2μg 转移载体(含有 目的基因)，室温孵育 5min(温和混匀， 勿 vortex)， 在 DNA 混合物中加入 100ul Sf-900 II SFM。 3)

在 eppendorf 管加入 100ul SFM，然后加入 6ul Cellfectin(使用 Cellfectin 之前 混匀)。

4) 将“操作 3 溶液”加入操作 2 的管中。 5) 室温孵育混合物 15－45min，然后加入 1ml SFM。 6) 用 SFM 洗涤六孔板中的细胞，吸除培养基，加入 1ml 的“操作 5 溶液”。 7) 27 度孵育细胞 5h。 8) 移去转染混合物，加入 2ml 含有 50μg/ml 庆大霉素的 SFM。 9) 27 度孵育 5 天。

2.1.2 使用 BD BaculoGold 转染试剂盒 注意：共转染过程中使用的培养基即为平时培养 Sf9 细胞所用的培养基，BD 公 司的 protocol 使用 TNM－FH 培养基(含有 10％FCS)培养并共转染 Sf9。

56

第九章

杆状病毒表达系统

1) 接种 2E6 Sf9 于 60mm 组织培养皿，初始细胞密度应在 50－70％铺满。 2) 使细胞牢固贴壁(大约 15min)。 3) 除去培养基，加入 1ml 转染缓冲液 A。确认培养皿的所有区域被转染缓冲液 A 覆盖，以防止细胞干燥死亡。 4) 于一无菌 15ml 离心管中混合 0.5μg BaculoGoldTM 线性 DNA 和 2μg 重组转 移载体质粒(含有目的基因)。 5) 混合物静置 5min 后加入 1ml 转染缓冲液 B，混合均匀。 6) 逐滴将 1ml 转染缓冲液 B/DNA 溶液加入组织培养皿，每加入 2 到 3 滴便温 和地晃动培养皿以使起其与转染缓冲液 A 混匀。在此过程期间，应该可以见 到形成的沉淀使得溶液呈现轻微乳状。 7) 27 度培养 4 小时。 8) 4 小时以后，除去转染溶液，并加入 3ml TNM-FH。温和晃动培养皿，然后 除去培养基。加入 3ml 新鲜 TNM-FH，27 度培养 4－5 天。 9) 4－5 天后，收集上清，用其感染更多细胞以扩增病毒。 阳性对照： 第 4 步按照以下操作(其余步骤同上)： 于 一 无 菌 15ml 离 心 管 中 混 合 0.5 μ g BaculoGoldTM 线 性 DNA 和 2 μ g pVL1392-XylE 对照质粒。 注：XylE 为 Pseudomonas putrida gene。被重组杆状病毒感染的昆虫细胞表达 XylE 后，在 500 mM catechol(儿茶酚;焦性儿茶酚;邻苯 二酚)和 50 mM sodium bisulfate(硫酸氢钠)存在下，5min 后细胞变为黄色。 阴性对照： 1.接种 2E6 Sf9 于 60mm 组织培养皿，初始细胞密度应在 50－70％铺满。 2.使细胞牢固贴壁(大约 15min)。 3.除去培养基，加入 3ml TNM-FH。

2.2 2.2.1

病毒扩增

P1 扩增(使用含 2％血清的 SFM)

注意：扩增病毒时，病毒 MOI(平均每个细胞所感染的病毒数)应该小于 1。

57

第九章

杆状病毒表达系统

1) 收获 P0 细胞。离心混合物移取得上清(sup)作为 P0。 2) P1：使用 0.1ml virus/15ml 培养基(于一个 T75 flask 中的贴壁细胞大约 1-1.2E7)。 3) 感染三天后收获 P1 细胞。离心混合物移取得上清(sup)作为 P1。

2.2.2

P2 扩增(使用含 2％血清的 SFM)

注意：扩增病毒时，病毒 MOI 应该小于 1。 4) 收获 P1 细胞。离心混合物移取得上清(sup)作为 P1。 5) P2：使用 0.1ml virus/50ml(2E6/ml)细胞(于一个 250ml flask 中的悬浮细胞)。 5） 三天后收获 P2 细胞。离心混合物移取得上清(sup)作为 P2。

2.3 滴度与 plaque 纯化 注意：对于 BD 公司的 BaculoGold 杆状病毒表达系统不需要 plaque 纯化(99％以 上的病毒是携带目的基因的重组病毒)。 1) 室温，于六孔板的每孔接种 1E6 Sf9。等待 30min 直至细胞贴附。 2) 于 1ml SFM 中稀释病毒。 3) 加“操作 2 溶液”于“操作 1 细胞”中，室温孵育 1h。 4) 准备 1％琼脂糖溶液：10ml 4％Agarose(Invitrogen)＋30ml 1.3×SFM，42 度 孵育混合物。 5) 移去细胞上的病毒混合物，覆盖以 2ml 1％琼脂糖溶液，室温 10min。 6) 27 度孵育 6～10 天。 7) 目视观察 plaque。 备注：或者中性红染色观察 plaque：10ml 4％Agarose＋30ml SFM＋1.3ml 3.3g/L 中性红(终浓度 0.01%)。

2.4

小规模表达带有 His 标签的目的基因 58

第九章

杆状病毒表达系统

注意：生产目的蛋白时，病毒 MOI 应该在 3－10。 1) 分配 5ml Sf9(Invitrogen’s Sf9 细胞，比 Gibco’s Sf9 细胞大)(1E6/ml)于 50ml falcon 管中。 2) 用 10ul(低)，50ul(中)，0.25ml(高)P2 病毒。27 度，于混匀器(shaker)中 165rpm。 3) 于第一、二、三天各取 1ml 样品。 4) 14Krpm，2min，4 度离心细胞，沉淀储存于－20 度。 5) 在 第 三 天 ， 裂 解 所 有 细 胞 沉 淀 于 400ul 裂 解 缓 冲 液 ： 10mM Tris-HCl,pH7.5,200mM Nacl,1%Triton X-100,10mM NaF/10mM Sodium Pyrophosphate/10mM Sodium phosphate,1×photease inhibitor cocktail. 6) 14Krpm,10min,4 度离心裂解液。 7) 收集上清，加咪唑至终浓度为 10mM。每管加入 20ul Ni－NTA 琼脂胶(我稀 释 Ni－NTA 三次，然后每管加 60ul 稀释的琼脂胶)。将管在 cold room 中振 荡 1h。 8) 用 PBS＋20mM 咪唑洗涤 Ni－NTA 琼脂胶。 9) 重悬琼脂胶于 2×SDS sample buffer。80 度，5min 变性蛋白。 10) 上样 20ul 于 10－15％SDS－PAGE gel。

3. 昆虫细胞 Sf9 的培养条件 3.1 培养基 使用 BD 公司 TNM-FH(含有 10％FCS)或者 Invitrogen 公司的 Sf-900 II SFM 或者其他公司的含有或者不含有血清的培养基都支持 Sf9 的生长。但是,在病毒 扩增和蛋白生产的时候推荐使用 SFM(Serum-Free Medium)。

3.2

培养方式

3. 2．1 单层(贴壁)培养 59

第九章

杆状病毒表达系统

不同目的的实验，对细胞密度的要求不同 ：

细胞传代：初始接种密度要求在 30－40％,大约在 2－3 天后细胞铺满时传代。

3. 2．2

悬浮培养

初 始 接 种 密 度 在 要 >5E5 cells/ml( 一 般 是 6E5 cells/ml), 细 胞 密 度 <5E6 cells/ml(一般是 2E6 cells/ml)进行传代(大约二到三天一次；一周两到三次)。 现在我们使用 100ml flask, 20-25ml 细胞悬浮培养基, 120 rpm 悬浮培养。 记作：20－25ml/100 ml flask，120 rpm. 备注，已知的悬浮培养其他条件(尚未使用过)： A．800mL/2.8L Fernbach flask，65 rpm. B．400mL/2L flask，125 rpm.

3．3

细胞的冻存和解冻

3.3.1

按照 ATCC 的方法冻存

culture medium 95%; DMSO, 5%. (ATCC Number: CRL-1711) 3.3.2

按照 BD 公司的方法冻存

TNM-FH 92.5%;DMSO,7.5%

3.3.3 解

冻

解冻后的细胞培养所使用的培养基(TNM-FH 或是 Sf-900 II)和培养方式(贴 60

第九章

杆状病毒表达系统

壁或悬浮)应该与冻存前的细胞一致。

3.4 无血清适应 3.4.1．贴壁 Sf9 从含血清培养基向无血清培养基适应时，应在每次传代时逐步增加无血清培 养基的比例。逐步用 SFM：TNM-FH ＝1：2、SFM：TNM-FH ＝1：1、SFM： TNM-FH ＝2：1，直到全部用 SFM。 3.4.2

悬浮 Sf9

从含血清培养基向无血清培养基适应时，应在每次传代时逐步增加无血清培 养基的比例。每次传代(当细胞密度达到 2E6 cells/ml 时)都在 1Vol 的细胞悬浮液 中加入 2Vol 的 SFM,直到最后全部替代成 SFM。 注：Sf9 大约每 2－3 天传代一次、每周传代 2－3 次。四次传代后(大约需要 10 －12 天)完成对无血清培养基的适应。

61

第十章

第十章

蛋白表达和纯化

蛋白表达和纯化

1、基因表达载体构建 1.1

操作规程

主要步骤

操作

1. 用限制性酶消化,去磷酸化 2. 胶纯化

制备载体

1. 质粒纯化或 PCR 2. 限制性酶消化 3. 胶纯化

制备插入 DNA

1. 插入片段与载体连接 2. 转化非表达型宿主菌 3. 筛选阳性克隆:菌落 PCR,酶切,制备质 粒 DNA,通过测序确定阅读框

将插入片段克隆到载体上

1.2 方法 1.2.1 构建的准备工作 1)选择合适的载体,载体选择的考虑因素主要有. a. 对目的基因的表达有利,包括表达量和表达后的纯度 b. 方便目的蛋白的纯化 c. 应便于构建操作 d. 从经济角度考虑, 主要是选择酶切位点时选用较经济的酶 2)目的基因的获得 a. 已有的目的基因 b. 从载体上酶切或通过 PCR 扩增获得

62

第十章

蛋白表达和纯化

1.2.2 构建 1)载体：制备载体,采用限制性酶及对应的缓冲液和反应条件,许多酶可以共用一 种缓冲液和反应体系. 2)制备插入片段： 限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法.请注意,从其它与载体有 一致筛选标记的载体亚克隆(即使是 PCR 法),需要胶纯化目的片段去除原载体, 以便得到很高的转化效率.10pg 左右的超螺旋质粒污染都会造成大量假阳性克 隆,而非希望得到的亚克隆. 采用 PCR 方法插入片段有引入突变的风险.注意以下要点可以最大限度地 降低发生错误的几率： ♦ 采用高保真酶. ♦ 尽量减少 PCR 循环数. ♦ 增加模板 DNA 浓度. ♦ 增加引物浓度.

3)在载体中插入片段 a. 连接反应: 以插入片段为 2-4 个碱基粘性末端的典型连接反应为例,在 20uL 的反应体系中,载体为 50-100ng(0.015-0.03pmol), 0.2pmol(500bp 的 插入片段为 50ng)插入片段,2uL 的 10Xbuffer, 0.2uL 连接酶,用水补足到 20uL. b. 转化: 最初的克隆需要在 recAˉ菌柱中操作,这类菌柱有利于增加质粒 单体产量,达到测序要求,并且将目的基因的表达和克隆分离. 4) 重组子分析 如果亚克隆成功的话,由连接反应产生的克隆数通常远大于阴性对照. 然而 有时即使两个平板中的菌落数大致相同,克隆也有可能成功。 有多种方法检验转化子,包括菌落 PCR,质粒抽提及酶切分析,测序等。 a. 菌落 PCR 挑菌落克隆放在 50uL 的液体培养基中培养,并以培养出的菌液作为 模板做 PCR 鉴定.选取引物是可分别选取一条载体引物和一条目的基因 的自身引物.鉴定出阳性后,培养,抽质粒

63

第十章

蛋白表达和纯化

b. 酶切分析 用双酶切法再次鉴定阳性,以确保准确率. 酶切后的样品在琼脂糖 凝胶电泳中可以分离出一条目的基因大小的条带,说明阳性正确. c. 测序

用载体的引物测序,以此鉴定目的基因是否有突变

1.2.3 诱导表达分析 1) 把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的 LB 平板上培养过夜 2) 分别挑两个单克隆于 3ml 含抗生素的 LB 培养基中培养过夜 3) 按 2%接种过夜培养的菌液于 4ml 含抗生素 LB 培养基中 37 度培养 2-3 小时 4) 加入终浓度为 0.1mM 的 IPTG 诱导表达 3 个小时左右，取样做蛋白电泳分 析目标蛋白的表达情况。

2. 蛋白纯化 2.1 重组蛋白的提取 (Harvesting and extraction of recombinant proteins) 2.1.1

提取缓冲液

PBS(pH 7.4) 或者其他推荐使用的缓冲体系。如需溶解难溶蛋白或者包涵体 还可加入8 M urea 或 6 M guanidine hydrochloride 。 Note: 处理(His)6 融合蛋白时可以加入 5–50 mM imidazole 以减少上柱时的非 特异性吸附。

2.1.2 方法 1) 发酵液离心收集菌体 (at 7 000–8 000 g for 10 minutes or 1 000–1 500 g for 30 minutes at +4 °C)。 2) 弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。 3) 每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液混悬菌体。 64

第十章

蛋白表达和纯化

4) 冰浴中超声裂解菌体(超声10秒，停止10秒)，之后取样进行SDS-PAGE电泳 分析。 Note:超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。还应避 免产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。

5) 离心使细胞碎片沉降(at 12 000 g for 10 minutes at +4 °C)。 6) 小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDS-PAGE电泳分析。 Note:含有8 M urea的样品可以直接电泳上样，但含有6 M guanidine hydrochloride的 样品必须换成8 M urea才可上样。

7) 样品上样前必须完全溶解并用稀释或换液的方法调整缓冲液。 8) 如样品暂时不使用应存于-20 °C。

2.2 金属鳌合层析(IMAC) HiTrap Chelating (Ni2+ )纯化(His)6 融合蛋白 (Purification of a (His)6-tagged recombinant protein) 1)缓冲液： a、 Start buffer: 0.02 M sodium phospate, 0.5 M NaCl 5-50 mM imidazole pH 7.4 b、Elution buffer: pH 7.4

0.02 M sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 0.5 M imidazole

Note: 如recombinant (His)6-tagged protein 表达成包涵体还需加入6 M guanidine hydrochloride or 8 M urea 。 ＋

2)层析柱准备：用0.1 M NiSO4 对层析柱充Ni2 ，然后用超纯水冲洗至少5个柱 体积。 3)样品纯化： a. 用start buffer平衡5-10柱体积； b. 上样； c. 用start buffer洗涤5-10柱体积； d. 用Elute buffer洗脱10-20柱体积；

65

第十章

蛋白表达和纯化

4) 层析柱清洗 (CIP)：2 M NaCl反向清洗0.5个柱体积，洗15分钟；1 M NaOH 以 1ml/mim反向洗40min。

2.3

谷胱苷肽配体亲合层析(GAF)

Glutathione Sepharose纯化GST融合蛋白 (Purification of a GST fusion protein) 1) 缓冲液： a、 Start buffer: PBS pH 7.4 b、Elution buffer:

50mM Tris HCl，10mM reduced glutathione pH 8.0

2) 样品纯化： a、 用start buffer平衡5-10柱体积； b、上样； c、 用start buffer洗涤5-10柱体积； d、用Elute buffer洗脱10-20柱体积； 3) 层析柱清洗 (CIP)： 6 M guanidine hydrochloride清洗2个柱体积。

2.4

离子交换层析(IEC)

HiTrap IEX Selection Kit 1) 缓冲液： a、 Start buffer: See Table 1 b、Elution buffer:

Start buffer + 1 M NaCl

Table 1. Suggested buffer for various pH intervals Counter ion Concentration pKa, 25 oC Buffers for cation exchangers (SP, CM) Citrate Na+ 20 mM 3.1, 4.8, 6.4 Acetate Na+ 50 mM 4.8 + Phosphate Na 50 mM 2.1, 7.2, 12.3 Buffers for anion exchangers (Q, DEAE,) Tris Cl20 mM 8.1 66

第十章

蛋白表达和纯化

2) 样品准备：样品需用脱盐柱换成start buffer。 3) 样品纯化： a、 用start buffer以1 ml/min洗涤5ml； b、用elution buffer以1 ml/min洗涤5ml； c、 用start buffer 5 - 10 ml平衡层析柱； d、上样； e、 用start buffer 5 - 10 ml洗涤层析柱； f、 用elution buffer以0-100%的阶段或连续梯度洗脱20ml以上。 4) 层析柱清洗 (CIP)： 2 M NaCl以1ml/mim反向清洗10个柱体积；1 M NaOH 以1ml/mim反向洗 40min。

2.5 HiLoad

Superdex

凝胶过滤(GF)

30,75,200

XK26/60 prep grade Columns

Characteristics of HiLoad Superdex prep grade. Separation range (Mr) <10 000 3 000–70 000 10 000–600 000

(Superdex 30 pg) (Superdex 75 pg) (Superdex 200 pg)

Column volume

319–330 ml

Sample volume

Up to 13 ml

Recommended flow rate

2.5ml/min

Max. flow rate

4.25ml/min

Maximum pressure

0.5 MPa, 5 bar, 73 psi

pH stability long term and working range 3–12 short term 1–14 67

第十章

蛋白表达和纯化

Solutions in which the media is stable 1 M acetic acid 1 M sodium hydroxide 8 M urea 6 M guanidine hydrochloride 30% isopropanol 30% acetonitrile 70% ethanol Storage 20% ethanol 1) 缓冲液： 根据需要使用相应的缓冲体系。通常为了减少非特异性吸附缓冲液一般需加 入至少0.15 M NaCl。PBS(pH7.4)是常用的缓冲液。 2) 层析柱准备：上样前用2柱体积elution buffer平衡。 3) 层析柱清洗 (CIP)：0.5 M NaOH以0.5ml/min反向清洗1-2 hours 。

3. 蛋白浓度测定 1) 将各样品及空白对照取 10ul 分别与 500ul 考马斯亮蓝混合； 2) 打开分光光度计电源，选择到 Bradford 操作界面； 3) 将分光光度杯以蒸馏水洗净后加入空白对照，选择 Blank 读数为零； 4) 将分光光度杯以蒸馏水洗净后方可加入各样品，选择 Sample 并读数； 未经稀释过的样品读数即为样品中的蛋白浓度，稀释过的样品按照稀释度处理数 据后即可得出样品中的蛋白浓度。

68

第十一章 RNA 技术

第十一章

RNA 技术

1． 组织 Total RNA 提取 1.1

组织取材和保存

所有组织取回后应立即保存于冻存管中，管外应标明姓名、组织部位、组织 性质，统一存放于冻存盒后入液氮罐中冷冻保存，并记录下冻存盒号及冻存盒内 存放位置！

1.2

组织的破碎和匀浆 1.2.1 准备工作

每次抽提组织 RNA 进行取材时速度要快，应事先准备好冰盒、盛有 Trizol 的 50ml 离心管置于冰上，并准备好锡箔纸、天平、匀浆器、镊子剪刀及液氮等！

1.2.2 组织破碎 组织从液氮罐中取出后，立即用锡箔纸包裹后用力锤击，使大块组织破碎， 再称取所需重量组织并立即入液氮冰冻，余下组织则立即放回原位保存。将称重 后的所需组织块用 3—5 层铝箔纸包裹后锤击成<2mm 的小块组织, 期间加入液 氮数次以防止组织冻融 RNA 降解，迅速将组织碎片转入盛有 Trizol 的离心管中。 注意：务必使组织在破碎过程中保持低温。

1.2.3

匀浆

1) Trizol 量的确定：一般以 1mlTrizol/100mg 组织的比例加入，同时也要据不同 的器官进行调整，如：肝.胰等组织的酶类丰富，RNA 含量也较高，应以 20mlTrizol/克组织或更高的比例添加。心肌，骨骼肌等组织，结缔组织较多， 不易匀浆，加 Trizol 时，也应考虑一倍的量。乳腺组织 RNA 含量较少，加 Trizol 时应用 0.5ml/100mg 组织的比例。 69

第十一章 RNA 技术

2) 匀浆：用组织匀浆机将组织彻底破碎成肉眼几乎不见的细小颗粒。匀浆过程 要尽量快，尽量在冰上操作，避免一次匀浆时间过长使产生过多热量导致 RNA 降解；一个组织匀浆完毕后应立即将匀浆器冲洗干净，并将其外套管 卸下将外套管内外及匀浆轴完全清洗干净后用氯仿冲洗后再继续下一个组 织的匀浆，以防止交叉污染！

1.3

总 RNA 的抽提

1) 匀浆结束后，冰上放置 2－3 分钟以保证组织充分裂解后于 40C，4000rpm 离 心 5min； 2) 将组织上清夜转入 Rnase-free 的 1.5ml 离心管中，1ml/管； 3) 以 200ul 氯仿/1mlTrizol 比例加入氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温静置 2min 后于 13000rpm，4℃，15min 离心； 4) 将上清液转至另一 Rnase-free 的 1.5ml 离心管中(此步操作小心，勿吸动中间 相蛋白层！)； 5) 以 0.5ml 异丙醇/1mlTrizol 比例加入异丙醇， 混匀，室温静置 10min， 12000rpm， 4℃10min 离心； 6) 吸去上清，此时可见试管底部有白色块状沉淀，加入 75%乙醇洗涤 RNA 沉 淀，7500rpm，4℃，5min 离心； 7) 用 75%乙醇重复洗涤沉淀一次并离心；(此步如同一样品有数管可予并管) 8) 吸去上清，并尽量吸尽残存液体，真空干燥 1-2min；(注意不能过分干燥导 致 RNA 难以溶解) 9) 用适量 Rnase-free H2O 完全溶解 RNA 沉淀；(视 RNA 沉淀的多少决定水量) 10) 测定 OD 值(eppendorf 分光光度计)； 11) 分装 1ugRNA 留做电泳鉴定，余-80 度冰箱保存。

70

第十一章 RNA 技术

2. 荧光定量 PCR (Q-PCR) 2.1

Q－PCR 反应体系

反应成分

Volume (ul)

H2O

9.4

10*PCR buffer

2.5

MgCl2(25mM)

2.5

dNTPs (各 2.5mM)

2

primer-F(10uM)

1.2

primer-R(10uM)

1.2

probe(10uM)

1

TaKaRa TaqE

0.2

Total

20

cDNA or plasmid

5

Total

25

2.2

Q－PCR 反应程序

Stage1

Stage2

1 Cycle

Stage3

40 Cycles

1 Cycle

94℃

94℃

60℃

72℃

20℃

3min

15sec

15 sec

20 sec

2min

71

第十二章

第十二章

抗体的制备和纯化

抗体的制备和纯化

1. 多克隆抗体的制备 1)

0 天

抗原 10ug－50ug/只， 0.25ml 抗原＋0.25ml 完全福氏佐剂/只， 搅拌机 6000 转/分 10 分钟，充分混匀， 皮下多点注射，2 只 兔子/抗原

2) 28－30 天

抗原 10ug－50ug/只， 0.25ml 抗原＋0.25ml 不完全福氏佐剂/ 只，搅拌机 6000 转/分 10 分钟，充分混匀， 皮下多点注射， 2 只兔子/抗原

3)

58－60 天

抗原 10ug－50ug/只， 0.25ml 抗原＋0.25ml 不完全福氏佐剂/ 只，搅拌机 6000 转/分 10 分钟，充分混匀， 皮下多点注射， 2 只兔子/抗原

4) 70 天

试血 测定效价

5) 88－90 天

抗原 10ug－50ug/只， 0.25ml 抗原＋0.25ml 不完全福氏佐剂/ 只，搅拌机 6000 转/分 10 分钟，充分混匀， 皮下多点注射， 2 只兔子/抗原，或兔子耳静脉注射 10－20ug/只

6) 100 天

颈动脉放血

7) 用 ELISA 测定其效价

2. 单克隆抗体的制备 2.1 免疫动物 1) 0 天

抗原 5ug－50ug/只， 0.25ml 抗原＋0.25ml 完全福氏佐剂/只，搅 拌机 6000 转/分 10 分钟，充分混匀， 皮下多点注射，5 只小鼠 /抗原

2) 28－30 天 抗原 5ug－50ug/只， 0.25ml 抗原＋0.25ml 不完全福氏佐剂/只， 72

第十二章

抗体的制备和纯化

搅拌机 6000 转/分 10 分钟，充分混匀， 皮下多点注射，5 只小 鼠/抗原 3) 58－60 天

抗原 5ug－50ug/只， 0.25ml 抗原＋0.25ml 不完全福氏佐剂/ 只，搅拌机 6000 转/分 10 分钟，充分混匀， 皮下多点注射， 5 只小鼠/抗原

4) 88－90 天

抗原 5ug－50ug/只， 0.25ml 抗原＋0.25ml 不完全福氏佐剂/只， 搅拌机 6000 转/分 10 分钟，充分混匀， 皮下多点注射，5 只 小鼠/抗原

5) 融合前 4 天 腹腔注射抗原 10－30ug/只

2.2

细胞融合

2.2.1 骨髓瘤细胞的准备 1) 细胞的复苏：将冻存在液氮中的细胞管取出，放入 37℃水浴中，使迅速融化 将细胞转移入 10ml 离心管内，加入 10mlDMEM 含 15％胎牛血清，离心 1000rpm/分 10 分钟, 弃上清，加入 5ml 的 DMEM 含 15％胎牛血清，转移 入 75cm 的培养瓶中培养 2) 在细胞融合前一周，复苏骨髓瘤细胞 sp2/0，(同 2.1.1)并扩增传代，保持良 好的细胞活力，用 0.5%苔肦蓝染色，用显微镜计数，透亮不着色的活细胞 应在 90％以上。 2.2.2 饲养细胞的制备

1) 取 BALB/C 小鼠 3－5 只，用颈椎脱位处死后，浸泡在 75％酒精或 1：1000 新洁而灭溶液中 5 分钟。 2) 取出小鼠固定在蜡板上，使腹部朝上，用无菌剪刀在小鼠腹部皮肤剪一小口， 注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外溢。进而玻璃腹部皮肤，暴露腹膜，用灭 菌注射器将 DMEM 培养液 5ml 注入腹腔中，右手固定注射器，使针头留置 在腹腔内，另一手轻轻按摩腹腔约 1－2 分钟。 3) 用原注射器抽取腹腔内液体，每只约可得 4－4.5ml，注入 50ml 离心管中。 73

第十二章

抗体的制备和纯化

用含 1％HAT 15％胎牛血清的 DMEM 补满至 100ml(2 管)。摇匀，放入 96 孔细胞板中 ，每孔 100ul 37℃， 5％CO2 培养箱中培养。

2.2.3 免疫小鼠脾脏的制备

1) 免疫小鼠眼眶放血，脱颈处死，放入 75％的酒精中消毒， 2) 无菌的条件下，分离脾脏，制备脾脏细胞，约 1×108 个。

2.2.4 细胞融合

1) 取 sp2/0 细胞 1×107 个放入 50ml 离心管中 离心 1000rpm/分 10 分钟, 弃上 清，加入 5ml DMEM。 2) 脾脏细胞，约 1×108 个放入 50ml 离心管中 离心 1000rpm/分 10 分钟，弃 上清，加入 5ml DMEM。 3) 用移液管分别加入 sp2/0 细胞和脾脏细胞，放入 50ml 离心管中充分混合， 离心 1000rpm/分 10 分钟，弃上清。 4) 加入融合剂 PEG 0.7ml 一分钟加完，静止 90 秒，加入 DMEM 40ml 离心 1000rpm/分 10 分钟，弃上清。 5) 加入 DMEM 含 15％牛血清 1％HAT 的培养基 100ml 混合均匀 6) 放入 96 孔细胞板中(含饲养细胞) ，每孔 100ul 37℃， 5％CO2 培养箱中培 养。

2.3 细胞筛选 用间接 ELISA 法筛选融合细胞。 1) 用 PH9.6 的碳酸盐缓冲液稀释抗原至 10ug/ml，加入酶标板中，每孔 100ul， 置入 4℃冰箱过夜。 2) 用 PH7.2－7.4 的 PBS(含 0.05％吐温 20)洗涤 5 次，拍干,加入 5％的脱脂奶粉 溶液(PBS 配制)每孔 200ul。放入 37℃烘箱 2 小时。

74

第十二章

抗体的制备和纯化

3) 拍干。加入样品每孔 100ul，放入 37℃烘箱 1 小时。 4) 用 PH7.2－7.4 的 PBS(含 0.05％吐温 20)洗涤 5 次，拍干。 5) 加入酶标记抗体每孔 100ul，放入 37℃烘箱 1 小时。 6) 用 PH7.2－7.4 的 PBS(含 0.05％吐温 20)洗涤 5 次，拍干。 7) 加入底物 TMB 显色，每孔 100ul。室温放置 5min。 8) 加入 2mol/L 的硫酸每孔 50ul 终止。 9) 酶标仪 450nm/630nm 双波长读数。 10) 取强阳性孔进行克隆

2.4 细胞克隆 1)先制备饲养细胞方法同 2.2.2 2)用 100ul 移液枪将待克隆化细胞孔中的细胞轻轻吹起，用显微镜计数 3)将待克隆的细胞根据计数稀释为 10 个/ml，共稀释 10ml，加入已制备饲养细 胞的 96 孔细胞板中，每孔 100ul 4)第一次克隆用含 15％胎牛血清 1％HT 的 DMEM 稀释细胞 5)筛选出的阳性孔连续克隆 3 次，第二第三次用含 15％胎牛血清的 DMEM 稀 释细胞

2.5 细胞扩增 1) 将扩增的细胞用 100ul 的移液枪轻轻吹起，移入 24 孔的细胞培养板扩增 2) 24 孔细胞培养板长满后移至 25cm2 的细胞培养瓶中 3) 25cm2 细胞培养瓶长满后移至 75cm2 的细胞培养瓶中

2.6 细胞冻存 1) 收取生长旺盛，形态良好的细胞，加入 50ml 离心管中，1000rpm/分钟 10 分 钟，弃上清 75

第十二章

抗体的制备和纯化

2) 沉淀用 90％牛血清 10％DMSO 的冻存液将细胞调整为 106/ml 3) 将细胞悬液放入冻存管内，每管 1ml，放入塑料泡沫盒中－80℃过夜 4) 把－80℃细胞放入液氮中，同时记录放置位置及只数。

2.7 腹水制备 1) 小鼠预处理：接种杂交瘤细胞前 10 天小鼠腹腔注射液体石蜡油 0.5ml/只 2) 每只小鼠腹腔注射 106 个杂交瘤细胞 3) 接种杂交瘤细胞后约 8－10 天小鼠腹部明显胀大。 4) 脱颈处死小鼠，取腹水，1000rmp 离心 30min，取上清，分装-20℃保存

2.8 腹水的纯化 用商品化 ProteinA 纯化，操作方法参照其使用说明

2.9 杂交瘤鉴定 1) 上清效价的鉴定：用间接 ELISA 法 ，方法同 2.3 2) 腹水的鉴定：用间接 ELISA 法 ，方法同 2.3 3) 杂交瘤亚型的鉴定：购买商品化试剂盒操作方法参见试剂盒说明书。

3. Peptide-KLH 的偶联及-SH 偶联率测定方法 3.1

Peptide-KLH 偶联

1) 精密称取 Peptide 2mg 一份，供偶联使用；1mg 一份，供测定使用。 2) 将 2mg 分装之 Peptide 用 200ul PBS－EDTA(PH7.0-8.0)溶解，即 10mg/ml。 3) 将 10mgKLH 用 1ml 纯水溶解，即 10mg/ml。

76

第十二章

抗体的制备和纯化

4) 取 10mg/ml Peptide 0.2ml 与 10mg/ml KLH 0.2ml 等体积混合。(一般肽分 子量在 2000 左右，混合时与 KLH 的摩尔浓度比>10:1) 5)

混合液室温 27℃放置 2 小时。2 小时后取 20ul 作为样品 2。

3.2 -SH 偶联率测定 1) 取 1mg Ellmans’s Reagent 用 1ml PBS－EDTA(PH7.0-8.0)溶解，即 1mg/ml。 2) 将 1mg 分装之 Peptide 用 200ul PBS－EDTA(PH7.0-8.0)溶解，即 5mg/ml。 3) 取 5mg/ml Peptide 20ul 分装入 4℃保存(样品 1)。另取 20ul 置入室温 27℃放 置 2 小时(样品 3)。 4) 2 小时后将样品 1，样品 2，样品 3 分别加入 400ul PBS－EDTA(PH7.0-8.0)， 20ul 1mg/ml Ellman’s Reagent，室温 27℃放置 15 分钟。 5)

用分光光度计在 412 波长下读取各个样品的 OD 值。

Cys 标准曲线制作

3.3

1) 取分子量为 121.15 的 Cys 1.8mg，用 PBS－EDTA(PH7.0-8.0)稀释至 10ml 作 为母液。取 7 个 1.5ml 试管按下表配置各浓度混合溶液。

管号

PBS-EDTA(ml)

母液(ml)

摩尔浓度(mM/ml)

1

0

0.3

1.5

2

0.05

0.25

1.25

3

0.1

0.2

1.0

4

0.15

0.15

0.75

5

0.2

0.1

0.5

6

0.25

0.05

0.25

7

0.3

0

0.0 (Blank)

77

第十二章

抗体的制备和纯化

2) 混合均匀后每管各取样 20ul，分别加入 400ul PBS－EDTA(PH7.0-8.0)，40ul 1mg/ml Ellman’s Reagent，室温 27℃放置 15 分钟。 3) 用分光光度计在 412 波长下读取各个浓度 Cys 的 OD 值。 4) 以摩尔浓度为横坐标 X，OD412 值为纵坐标 Y，通过所测 7 点做 Cys –SH 浓 度标准曲线。并据图推得一阶回归方程。

3.4

-SH 偶联率换算公式

1) 将步骤 2 中样品 1，样品 2，样品 3 所测 OD412 值代入标准曲线回归方程 内，保证其 OD412 值在可推算范围内(即在 7 个标准点范围内)，求得样品 1， 样品 2，样品 3 中所含-SH 基团的 mol 浓度。 2) 偶联率换算公式如下： 3) 样品 1 含量：4℃保存的 Peptide 原溶液中-SH 摩尔浓度 4) 样品 2 含量：Peptide-KLH 室温 27℃偶联 2 小时后溶液中-SH 摩尔浓度 5) 样品 3 含量：Peptide 原溶液经过室温 27℃放置 2 小时后溶液中-SH 摩尔浓 度 6) 偶联率=[(样品 1 含量-样品 2 含量)-(样品 1 含量-样品 3 含量)]/样品 1 含量 *100% 7) 简化后得 8) 偶联率=(样品 3 含量-样品 2 含量)/样品 1 含量*100%

3.5

透析及分装保存

1) 将5g Pierce™ Purification Buffer Salts (Prod. No. 77159) 用纯水稀释至60ml作 为透析液，将偶联后得到之Peptide－KLH溶液透析过夜。 2) 取1ul透析后Peptide－KLH溶液用PBS或者透析液1：10稀释至10ul，测其蛋 白浓度，空白对照相应为PBS或者透析液。 3) 根据所测得蛋白浓度计算，按照200ug/管进行分装，置入－40℃保存。

78

第十三章

第十三章

病理实验基本技术

病理实验基本技术 1. 基本技术

— 常规制片 (石蜡包埋组织，冰冻组织) — 免疫组织化学 — 免疫细胞化学 — 组织微阵列

2.常规制片 2.1 操作流程 以下为石蜡包埋组织制作流程,冰冻组织暂无。 查验核对收集及送检样本——>取材——>固定——>脱水——>包埋——>切片、 漂片、烤片——>染色

2. 2 方 法 1)查验核对收集及送检样本：所有标本编号，核对相应资料及标本(有无),入数据 库 2)取材： 对于较大肿瘤标本，从最大切面切开，尽量取与周围正常组织交界处(即： 一块组织内含有正常及肿瘤组织)，每块组织厚小于 2 毫米；消化道组织，每块 组织尽量包括所取器官全层，如：胃正常组织，应包括粘膜层，粘膜下层，肌层 及桨膜层。 对于小标本，由于组织较小，需用纱布或薄纸包裹，以防脱水时组织漏出包 埋筐。 每例标本取材时要记录: 大小、颜色、质地及所取组织块数等。 3)固定：新鲜 10％中性缓冲福尔马林 24 小时 4)脱水：以人正常大小组织为例，程序如下： 80％乙醇 95％(一)

60 分钟 60 分钟 79

第十三章

95％(二)

60 分钟

95％(三)

60 分钟

无水乙醇 (一)

60 分钟

无水乙醇 (二)

60 分钟

无水乙醇 (三)

60 分钟

二甲苯(一)

45 分钟

二甲苯(一)

30 分钟

二甲苯(一)

30 分钟

病理实验基本技术

注：具体时间视组织种类及组织大小调整 5)包埋：组织需要观察的面向下放入包埋金属模中，石蜡加热融化后，倒入金属 模，加包埋筐，冷却凝固取出蜡块。 6)切片、漂片、烤片(60 度，1 小时，以不脱片为准) 7)染色(HE 染色) a) 二甲苯(一)10 分钟 b) 二甲苯(二)10 分钟 c) 二甲苯(三)5 分钟 d) 无水乙醇(一)1 分钟 e) 无水乙醇(二) 1 分钟 f)

95％乙醇

1 分钟

g) 90％乙醇

1 分钟

h) 85％乙醇

1 分钟

i)

自来水洗

2 分钟

j)

苏木素染色

1 分钟至 5 分钟

k) 自来水洗 l)

1 分钟

1％盐酸乙醇分化 20 秒

m) 自来水洗

1 分钟

n) 温水返蓝 o) 伊红

20 秒至 5 分钟

p) 自来水洗

30 秒

q) 85％乙醇

20 秒

r)

90％乙醇

30 秒

s)

95％乙醇(一)1 分钟

t)

95％乙醇(二)1 分钟

u) 无水乙醇(一)2 分钟 80

第十三章

病理实验基本技术

v) 无水乙醇(二)2 分钟 w) 石炭酸二甲苯 1 分钟 x) 二甲苯(一) 2 分钟 y) 二甲苯(二) 2 分钟 z) 二甲苯(三) 2 分钟 aa) 中性树胶封片 阅片 出报告 切片及蜡块归档

3.免疫组织化学 以下为石蜡包埋组织制作流程,冰冻组织暂无。 1） 切片(3～5 微米)，烤片(低于 60 摄氏度)，2 小时或过夜 2） 脱蜡，水化(见 HE 染色 1～9) 3） 0.01M，PH6.0 柠檬酸缓冲液抗原修复：微波炉高火 2X5M 分钟 4） 合适稀释度一抗 1 小时(室温)，或 4 度冰箱过夜 5） PBS 洗 3X5 分钟(PH7.4) 6） 酶标二抗 30 分钟(室温) 7） PBS 洗 3X5 分钟() 8） DAB 显色，显微镜下观察，合适时终止 9） 苏木素复染 1 分钟 10） 脱水 (见 HE 染色 17～22) 11） 透明(见 HE 染色 23～25) 12） 封片

4.免疫细胞化学 1) 收集标本离心，PBS 洗 2～3 次，离心，PBS 洗 2) 取沉淀涂片，晾干 81

第十三章

3) 其余同上述(4～12)

5.组织微阵列 1） 设计微阵列图 2） 挑选组织(从切片至蜡块) 3） 重新切片、染色(HE) 4） 观察切片，定位，标记 5） 空蜡块打孔 6） 取样，放样 7） 制作完成后切片 8） 根据不同需求继续操作

6.常规溶液配制 1)10XPBS(PH7.28-7.40)

80g

Nacl 11.5g

Na2HPO4

2.0g

KCl

2.0g

KH2PO4

1000ml ddH20 2)0.01mol/L 柠檬酸盐缓冲液(PH6.0) 柠檬酸三钠

3)DAB 显色液(液体)：

3G

柠檬酸

0.4G

ddH2O

1000ml

具体见使用说明书

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病理实验基本技术