Иммунорективность рекомбинантных белков ВИЧ

ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ ФЕДЕРАЛЬНОГО УПРАВЛЕНИЯ «МЕДБИОЭКСТРЕМ» ПРИ МИНЗДРАВЕ РОССИИ На правах рукописи

КОРОБОВА Светлана Вячеславовна

ИММУНОРЕАКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ВИЧ

14.00.36 – аллергология и иммунология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Доктор биологических наук И.А. Николаева Кандидат биологических наук Э.В. Карамов

Москва 2002 г. 1

СОДЕРЖАНИЕ Введение

5

Литературный обзор

9

Введение

9

1.1.

Иммунный ответ против ВИЧ

17

1.1.1.

Гуморальный ответ

17

1.1.2.

Основные нейтрализующие эпитопы

17

1.1.3.

Клеточный ответ

20

1.2.

Вакцины против ВИЧ/СПИД

24

1.2.1.

Вакцины на основе рекомбинантных векторов

24

1.2.2.

Вакцины на основе живого аттенуированного вируса

27

1.2.3.

ДНК вакцины и стратегия прайм/буст

28

1.2.4.

Вакцины на основе рекомбинантных белков и субъединичных

29

1.

антигенов 1.3.

Модели ВИЧ – инфекции/СПИД

33

1.4.

Клинические испытания кандидатных вакцин против вич/спид

35

1.4.1.

Гуморальный ответ на вакцинацию людей против ВИЧ/СПИД

35

1.4.2.

Основные результаты клинических испытаний:

36

1.4.3.

Клеточный ответ на вакцинацию людей против ВИЧ/СПИД

38

1.4.4.

Основные результаты клинических испытаний:

38

2.

Материалы и методы

40

2.1.

Рекомбинантные белки и их конъюгаты с

2.2.

Методика изучения иммуногенных свойств

Полиоксидонием.

40 46

рекомбинантных белков ВИЧ1. 2.2.1.

Иммунизация мышей.

46

2.2.2.

Твердофазный непрямой иммунофементный анализ.

46

2.2.3.

Иммунометрический ( «сэндвич») метод ИФА.

47

2.2.4.

Иммунизация кроликов.

48

2.2.5.

Постановка твердофазного иммуноферментного анализа.

48

2.2.6.

Постановка иммунометрического «сэндвич» метода ИФА.

49

2.3.

Методика изучения иммуногенности белка rec(24-41) при введении

49

высоких и низких доз препарата.

2

2.4.

Методика изучения иммуногенности конъюгата химерного

49

рекомбинантного белка rec (24-41) c полиоксидонием rec (24-41) – ПО. 2.5.

Проведение иммуноблота с сыворотками животных,

50

иммунизированных rec(24-41). 2.6.

Проведение ИФА c сыворотками животных, иммунизированных

51

rec(24-41) с использованием антигенов коммерческих тест-систем. 2.7.

Проведение теста нейтрализации.

52

2.7.1.

Иммунизация животных.

52

2.7.2.

Постановка реакции нейтрализации.

52

2.8.

Проведение реакции бластной трансформации лимфоцитов.

53

2.9.

Проведение ИФА и иммуноблота для изучения специфической

54

активности rec(24-41). 2.9.1.

Проведение ИФА с сыворотками людей, инфицированных ВИЧ1.

54

2.9.2.

Проведение ИФА с поликлональными антителами барана против

55

вирусного белка р24 из коммерческого набора GENETIC SYSTEMS HIV-1 AG EIA . 2.9.3.

Проведение иммуноблота с сыворотками людей инфицированных

56

ВИЧ1. 2.9.3.1. Проведение электрофореза в полиакриламидном геле.

56

2.9.3.2. Постановка иммуноблота.

57

3.

Результаты и обсуждение

59

3.1.

Изучение иммуногенных свойств рекомбинантных белков ВИЧ1.

59

3.2.

Изучение специфической активности rec(24-41).

63

3.2.1.

Изучение специфической активности rec(24-41) в ИФА.

64

3.2.2.

Изучение специфической активности rec(24-41) в иммуноблоте.

69

3.3.

Изучение специфической активности сывороток мышей,

71

иммунизированных rec (24-41). 3.4.

Изучение иммунногенности рекомбинантных белков ВИЧ при

73

введении высоких и низких доз антигенов. 3.5.

Изучение иммуногенных свойств конъюгата рекомбинантного белка rec (24-41) с полиоксидонием. 3

75

3.6.

Исследование нейтрализующей активности сывороток мышей,

78

иммунизированных rec (24-41). 3.7.

Изучение пролиферативной активности клеток, животных

80

иммунизированных rec (24-41). Заключение

82

Выводы

84

Список сокращений

85

Список литературы

86

4

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Эпидемия синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), который является заключительной фазой инфекции ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), приняла характер пандемии. К настоящему времени от СПИДа умерло более 20 миллионов человек, а инфицировано более 60 миллионов. Россия занимает одно из лидирующих мест по темпам роста инфицирования. Вирус поражает молодое трудоспособное население. Инфекция ВИЧ предается половым путем, с кровью или ее препараты, от инфицированной матери к ребенку во время родов, при грудном вскармливании или во время беременности. В борьбе с ВИЧ-инфекцией достигнут определенный прогресс, связанный с разработкой эффективной лабораторной диагностики, позволяющей в большинстве случаев определять инфекцию уже через месяц после заражения и, таким образом, предотвращать распространение вируса через банки крови и своевременно начинать антиретровирусную терапию. Исследованы молекулярная структура вируса, его жизненный цикл, используемые им клеточные рецепторы и корецепторы. Однако, не смотря на все принимаемые меры, эпидемия продолжает распространяться. В России это связано, прежде всего, с тем, что в настоящее время распространение вируса идет среди внутривенных наркоманов и их половых партнеров. Терапия не способна излечивать инфицированных людей, т.е. удалять вирус из организма, а стоимость годового курса лечения достигает 10 000 и больше долларов. Кроме того, показано образование штаммов вируса, устойчивых к лекарственным препаратам. В связи с этим особое значение приобретает комплекс превентивных мер, частью которых является безопасная и эффективная вакцина. Более 30 кандидатных вакцин проходят или прошли I или II фазу клинических испытаний. В ходе этой работы исследуется широкий спектр вакцинирующих препаратов (профилактических и терапевтических), различные схемы иммунизации и адъюванты. В последнее время возрос интерес к терапевтическим вакцинам в связи с внедрением в клиническую практику активной многокомпонентной специфической антиретровирусной терапии (HAART) [156]. Предполагается, что при перерыве в HAART следует назначать терапевтическую вакцину, чтобы иммунная система оставалась активной и сдерживала всплеск размножения вируса. Другой причиной 5

активизации интереса к терапевтической вакцине является возможность с ее помощью смягчить остроту инфекционного процесса, снизить концентрацию вируса в организме и биологических жидкостях и тем самым снизить риск заражения людей, контактирующих с ВИЧ - инфицированными. Разработка вакцины особенно важна для нашей страны, где темпы ежегодного прироста числа новых случаев одни из самых высоких в мире. По данным Российского Федерального научно-методического Центра по профилактике и борьбы со СПИДом, в России в 2002 году зарегистрировано 200 000 ВИЧ – инфицированных. Характерной особенностью ВИЧ является его высокая вариабельность. В связи с этим одним из исследуемых подходов является разработка так называемых «региональных» вакцин, в которых используются антигены, соответствующие субтипу ВИЧ, циркулирующему в данном географическом регионе. Прежде всего, это относится к вакцинам, основанным на белках оболочки ВИЧ, кодируемых геном env. Однако внутренние белки ВИЧ, в частности антигены, кодируемые геном gag, значительно более консервативны, следовательно, можно ожидать, что иммунный ответ против них может быть направлен против различных субтипов ВИЧ [35]. Поэтому в настоящее время особое внимание уделяется разработке вакцин на основе целых внутренних белков ВИЧ или их фрагментов. Одними

из

перспективных

являются

вакцинные

препараты

на

основе

рекомбинантных белков. Они безопасны, имеют невысокую себестоимость, методика их получения и очистки хорошо отработана. В результате иммунизации рекомбинантными белками можно вызвать образование нейтрализующих антител и активацию СD4+ клеток, играющих важную роль в контролировании ВИЧ [7,139,187,188,189,21]. В связи с этим целью работы было исследование иммунореактивности рекомбинантных белков, содержащих копии фрагментов и полноразмерных белков сердцевины и/или оболочки ВИЧ1 для их последующего применения в составе кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД. В ходе исследования были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать иммуногенные свойства рекомбинантных белков, повторяющие антигенные детерминанты ВИЧ1. 2. Провести сравнительный анализ сходства антигенных детерминант рекомбинантных белков с таковыми вирусного прототипа. 6

3. Провести сравнительный анализ иммунного ответа, вызываемого рекомбинантными белками, повторяющими антигенные детерминанты ВИЧ1, с иммунным ответом на вирус. 4. Исследовать иммуногенные свойства рекомбинантных белков при введении высоких и низких доз препарата. 5. Исследовать иммуногенные свойства конъюгата рекомбинантных белков с Полиоксидонием. 6. Провести анализ нейтрализующей активности сывороток животных, иммунизированных рекомбинантными белками, повторяющими антигенные детерминанты ВИЧ1. 7. Исследовать лимфопролиферативный ответ, вызываемый рекомбинантными белками, повторяющие антигенные детерминанты ВИЧ1. Научная новизна работы. Впервые исследованы иммуногенные свойства нового экспрессируемого в Е.coli

химерного

рекомбинантного

белка

rec(24-41),

повторяющего

последовательность консервативного полноразмерного внутреннего белка ВИЧ1 р24 и фрагмента трансмембранного белка ВИЧ1 – gp41. Впервые

показано,

что

иммунизация

лабораторных

животных

рекомбинантным химерным белком приводит к образованию высоких титров антител на обе его составляющие – р24 и gp41- у разных видов животных (мышей и кроликов). Впервые показано, что рекомбинантный химерный белок вызывает сильный лимфопролиферативный ответ клеток селезенки и лимфатических узлов мыши. Впервые показано, что рекомбинантный химерный белок индуцирует у животных образование вирус - нейтрализующих антител. Впервые исследованы иммуногенные свойства конъюгата белка иммуномодулятором Полиоксидонием. Показано, что конъюгация

rec(24-41) с белка с

Полиоксидонием позволяет достичь высокого иммунного ответа при введении низких доз антигена, и не приводит к изменению его антигенных детерминант.

7

Научно-практичесое значение работы. На основании полученных данных создан кандидатный вакцинный препарат «ВИЧРЕПОЛ», представляющий собой конъюгат химерного рекомбинантного белка rec(24-41)

с Полиоксидонием. В настоящее время препарат проходит

доклиническое исследование в ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Положения, выносимые на защиту. 1. Химерный рекомбинантный белок rec(24-41) является высокоактивным иммуногеном: он вызывает образование антител на оба своих участка – р24 и gp41 при иммунизации как высокими, так и низкими дозами препарата и антигенспецифическую пролиферацию клеток лимфатических узлов и селезенки у лабораторных животных. 2. Антигенные детерминанты рекомбинантного химерного белка rec(24-41), повторяющего внутренний белок р24 и часть трансмембранного белка gp41 ВИЧ1, схожи с антигенными детерминантами вирусного прототипа. 3. Химерный рекомбинантный белок rec(24-41) индуцирует у лабораторных животных иммунный ответ, специфичность которого схожа со специфичностью иммунного ответа на вирус. 4. Конъюгация рекомбинантного химерного белка с Полиоксидонием увеличивает иммуногенность rec(24-41) при иммунизации низкими дозами. 5. Иммунизация лабораторных животных рекомбинантным вирусным белком rec(24-41) вызывает образование антител, нейтрализующих лабораторный штамм ВИЧ1.

8

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ВВЕДЕНИЕ Вакцина является одним из средств, которые могли бы остановить эпидемию ВИЧ. Желательно, чтобы полученная вакцина соответствовала следующим критериям: 1. Вызывала образование антител, способных нейтрализовать все субтипы вируса. 2. Активировала вирус - специфические ЦТЛ. 3. Индуцировала сильный ответ на слизистых. Разрабатываемые

вакцины

против

ВИЧ/СПИД

могут

быть

как

терапевтическими, так и профилактическими, т.е. вызывать иммунный ответ, который полностью или частично контролировать ВИЧ-инфекцию [76]: 1. Стерильный

Заражение не происходит, т.е. клетки не содержат

иммунитет

интегрированного провируса (вирус не обнаруживается

(наиболее

в крови, в лимфатических узлах или в месте

предпочтительный).

инфицирования при использовании самых

(профилактические чувствительных методов ПЦР). Отсутствие вакцины)

сероконверсии к белкам ВИЧ, которые не представлены в вакцине. Не детектируются ЦТЛ к белкам ВИЧ, которые не представлены в вакцине.

2. Временная

Низкий уровень вируса, определяющийся только в

инфекция.

первое время после заражения (вирус не обнаруживается

(профилактические в крови, в лимфатических узлах или в месте вакцины)

инфицирования при использовании самых чувствительных методов ПЦР через 6 месяцев и все последующее время). Отсутствие или временная сероконверсия к белкам ВИЧ, которые не представлены в вакцине. Временно или не детектируются ЦТЛ к белкам ВИЧ, которые не представлены в вакцине.

3. Контролируемая

Снижается уровень вируса и остается низким (< 1000

инфекция.

копий РНК/мл). Сероконверсия к белкам ВИЧ, которые

(терапевтические

не представлены в вакцине. ЦТЛ к белкам, не 9

вакцины)

представленных в вакцинном препарате.

4.Отсутствие

Уровень вируса в крови и секретах недостаточно

инфицирования

высокий для инфицирования.

других. (терапевтические вакцины) При разработке вакцины против ВИЧ/СПИД исследователи столкнулись с серьезными трудностями: - Отсутствие случаев самопроизвольного выздоравливания инфицированных; - Не установлено, какие механизмы определяют иммунную защиту против вируса; - Вирус встраивается в геном хозяина; - Желание достигнуть стерильного иммунитета; - Генетическая вариабельность вируса; - Нет адекватной животной модели; - Передача вируса посредством клеток; Однако в настоящее время накоплены факты, позволяющие надеяться на создание эффективной вакцины: 1. Иммунная система некоторое время (достаточно долго) способна контролировать ВИЧ-инфекцию после заражения. 2. Показан ВИЧ - специфический иммунный ответ у людей, имеющих частые половые контакты с ВИЧ инфицированными, но остающимися незараженными. 3. У приматов удается индуцировать вакцинами иммунный ответ против родственного ВИЧ вируса иммунодефицита обезьян. 4. ВИЧ2 обеспечивает частичную защиту против ВИЧ1 инфекции [89]. 5. ВИЧ1 малоинфекционный. 6. В последнее время разработаны новые подходы к созданию вакцинных препаратов (например, вакцины на основе рекомбинантных векторов, ДНКвакцины, стратегия прайм-буст). 10

Геном ВИЧ отличается сложностью, на ряду с генами кодирующими структурные белки, в него входят гены регуляторных элементов. Ниже перечислены структурные элементы ВИЧ их функции, а также гены и их продукты [91]. Генные структурные элементы ВИЧ LTR

Длинный

концевой

фланкирующая важные

повтор.

Последовательность

ДНК,

геном интегрированного провируса. Содержит

регуляторные

области

для

начала

транскрипции

и

полиаденилирования. TAR

Участок связывания для белка tat и клеточных белков. Состоит приблизительно из первых 45 нуклеотидов вирусной мРНК у ВИЧ1 (или первых 100 нуклеотидов ВИЧ2 и ВИО). РНК tar образует шпильку с боковой петлей, для связывания и функционирования белка tat.

RRE

Элемент РНК, кодирующийся в области env. Состоит приблизительно из 200 нуклеотидов (7327-7530 от начала транскрипции ВИЧ1, соединяет края gp120 и gp41). Необходим для действия гена rev. Содержит высоко аффинный сайт для белка rev. rre образует комплекс вторичных структур, необходимых для специфического связывания белка.

CRS

Ингибирует экспрессию структурных белков в отсутствие rev.

INS

Находится

среди

структурных

посттранскрипционную экспрессию.

генов

ВИЧ1.

Ингибирует

Мутации в этой области

приводят к инактивации INS и повышенной экспрессии генов.

11

Гены и их продукты GAG

Область гена, кодирующая капсидные белки (антигены групповой специфичности). Предшественником является миристилирированный белок р55, который процессируется (нарезается) вирусной протеазой на

р17

(Матриксный),

р24

(Капсидный),

р7

(НуклеоКапсидный) и р6. gag соединяется с цитоплазматической

БЕЛКИ СТРУКТУРНЫЕ

белки:

мембраной,

где

происходит

сборка

вирусного

вириона.

Предшественник gag 55 kDa белок называется ассемблин, что отражает его роль в сборке вириона (assembly). POL

Область

гена,

транскриптазу

кодирующая и

интегразу.

ферменты Продукт

протеазу,

обратную

экспрессируется

как

предшественник gag-pol полипротеин, который затем процессируется вирусными протеазами. ENV Продукт гена – гликопротеин gp160, который процессируется на два нековалентно связанных белка: наружный gp120 и трансмембранный gp41. Зрелые gp120- gp41 образуют тримеры на поверхности вируса. На gp120 находится сайт связывания с СD4 и хемокиновыми рецепторами (корецепторами ВИЧ1).

РЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ

TAT

Трансактиватор экспрессии генов ВИЧ. Известно две его формы: tаt 1 exon (минорная форма, состоит из 72 аминокислот) и Таt 2 exon (мажорная форма, состоит из 86 аминокислот). Его действие основано на связывании с TAR элементом РНК, что приводит к активации начала и элонгации транскриппции от LTR промотора.

REV Регуляторный

фактор

вирусной

экспрессии.

Фосфопротеин

с

молекулярной массой 19 kD, находится в ядреклетки, связываясь с RRE, обеспечивает переход репликации вируса из ранней стадии экспрессии

регуляторных

генов

экспрессии структурных генов ВИЧ.

12

в

стадию

крупномасштабной

VIF

Фактор вирусной инфекционности. Основный протеин, 23 kD. Способствует инфекционности вируса, но не продукции вирусных частиц. В отсутствие vif образуются неполноценные вирусные частицы, но путь передачи вируса через клетку не нарушается. vif – цитоплазматический белок, существующий как в растворимой, так и в связанной с мембраной форме.

VPR

Вирусный белок R, состоит из 96 аминокислот (14 kD), располагается

ДОБАВОЧНЫЕ БЕЛКИ

в ядре клетки. Взаимодействует с белком gag р6. Основная функция – трансактивация

клеточных

генов, импорт преинтегрированных

комплексов и активация дифференцировки клетки. VPU

Вирусный белок U, состоит из 81 аминокислоты (16 kD), встроен в мембрану. Разрушает CD4 в эндоплазматическом ретикулеме и усиливает высвобождение вирионов из плазматической мембраны ВИЧ - инфицированных клеток. Vpu способствует созреванию белка env.

NEF

Многофункциональный

миристилированный белок 27 kD.

В

основном располагается в цитоплазме и связан с цитоплазматической мембраной. Это один из первых вирусных белков, который продуцируется в инфицированной ВИЧ клетке. Высоко иммуногенен. Необходим для распространения вируса и развития болезни. nef снижает уровень CD4 и МНС1 молекул на поверхности клетки. Взаимодействие nef с компонентами пути сигнальной клеточной трансдукции, приводит к увеличению инфекционность вируса. VPX

Белок ВИЧ2, 12 kD. Является гомологом vpr ВИЧ1.

13

Белки ВИЧ БЕЛОК РАЗМЕР ФУНКЦИЯ GAG МА р17 связывание с мембраной; взаимодействие с env; транспорт сердцевины вируса в ядро КА р24 внутренний капсид НК р7 нуклекапсид; связывание РНК р6 связывание vpr Протеаза р15 нарезание и созревание gag/pol Обратная р66 обратная транскрипция транскриптаза вирусной РНК РНКаза Н активность РНКаза Н Интеграза р51 интеграция ДНК провируса в геном клетки ENV gp120 наружные вирусные белки, gp41 связываются с CD4 и корецепторами ТАТ р16/р14 трансактиватор вирусной транскрипции REV р19 транспорт РНК, стабилизирующий фактор (фосфопротеин) VIF р23 способствует созреванию и инфекционности вириона VPR p10-15 способствует локализации в ядре преинтегрального комплекса, ингибирует клеточное деление, задерживает инфекционные клетки в фазе G2/М VPU р16 способствует высвобождению вирусных частиц, разрушает CD4 в ЭПР NEF р27-р25 Понижает экспрессию СD4 и МНС1 молекул VPX р12-16 Белок ВИЧ2, гомолог vpr ВИЧ1

14

РАСПОЛОЖЕНИЕ вирион

вирион вирион вирион вирион вирион вирион вирион плазматическая мембрана, оболочка вириона ядро ядро, перемещается между ядром и цитоплазмой цитоплазма (цитозоль, мембраны), вирион вирион, ядро

встроен в клеточную оболочку плазматическая мембрана, цитоплазма вирион

gp41

обратная транскриптаза

РНК

протеаза

РНК рецептор

Хемокиновый рецептор рецептор лимфоцит Рисунок 1.1. Строение вириона ВИЧ1.

Vpr

Vpu

5562 5853

6070 6302

Tat1

Gag 793

2295

5’ LTR 1

Vif

636

Tat2

5834 6048

8368 8458

Rev1

Rev2

5044 5622 5973 6048

Pol 2088

Рисунок 1.2. Строение генома ВИЧ1

8368 8663

Nef 3’ LTR

Env 5099

6230

8805

8807

9431

1.1. ИММУННЫЙ ОТВЕТ ПРОТИВ ВИЧ 1.1.1. Гуморальный ответ Антитела - единственный компонент адаптивного иммунного ответа, способный предотвратить проникновение вируса в клетку. Обычно эффективность используемых современных вакцин определяется по уровню антител, который они взывают у иммунизированных. Следует сказать, что ВИЧ хорошо защищен от иммунного ответа хозяина. Вирусный оболочечный белок gp120 имеет ряд особенностей, которые ограничивают способность антител связываться с ним. Он сильно гликозилирован и представлен в олигомерной форме. Поэтому, несмотря на то, что ВИЧ вызывает образование, у инфицированных высоких титров антител, они,

как

правило,

не

способны

нейтрализовать

его

[19].

Механизм

нейтрализующего действия антител остается спорным. Существуют две основные точки зрения, объясняющие его. Одна из них – наличие на белках оболочки вируса эпитопов,

связывание

с

которыми

специфическими

(нейтрализующими)

антителами приводит к нейтрализации вируса [62,158,161,141,122], согласно другой,

нейтрализующий

эффект

возникает,

когда

плотность

антител,

покрывающих поверхность вириона, достигает определенного уровня [20]. Нейтрализующие антитела впервые обнаруживаются между 2 и 6 месяцем после острой первичной инфекции [90,117]. Нейтрализующие эпитопы вируса были выявлены при изучении моноклональных антител (МАТ), полученных на различные области белков gp120 и gp41. 1.1.2. Основные нейтрализующие эпитопы V3. Третья вариабельная петля (V3) gp120 была определена как основной нейтрализующий эпитоп при изучении нейтрализации культурального вируса сыворотками ВИЧ-инфицированных и иммунизированных gp120 людей [164,153]. Механизм нейтрализации основан на ингибировани антителами связывание комплекса gp120-CD4 с корецептором [178,160,72] , однако, полученные к нему МАТ не обладали нейтрализующей активностью по отношению к первичным изолятам [17]. 17

CD4bd. Большинство антител у инфицированных ВИЧ людей распознают непрерывные или конформационные эпитопы, иммунодоминантным является домен связывания с СD4 [115]. Полученное к нему МАТ b12, распознающее домен связывания CD4 и часть V2 петли, обладает нейтрализующей активностью по отношению не только к культуральному вирусу, но и к большинству первичных изолятов [18,141]. V2. МАТ к ножке петли V1/V2 распознают конформационные эпитопы, расположенные в центральной области V2 петли [118]. Два МАТ специфически связывающиеся с

V2 петлей, нейтрализуют ряд первичных изолятов вируса

[58,168]. 2G12. Эпитоп расположен в основании V3 и V4 петли и, возможно, включает углеводные структуры в С2 , С3, С4 и V4 доменов gp120. Полученное к нему МАТ 2G12 нейтрализует первичные изоляты вируса[161]. 2F5: единственный нейтрализующий эпитоп, МАТ (2F5)

к которому

нейтрализовало первичные изоляты [122,123,33,19]. Он расположен на мембране проксимальной части

эктодомена (662-667 ак.) и имеет линейную структуру

ELDKWA. Таким образом, в составе белков оболочки было выявлено три основных нейтрализующих эпитопа: два – конформационных расположены на gp120, третий находится на gp41, и имеет линейное строение. Антитела к ним выявляются лишь у небольшого количества инфицированных ВИЧ, что свидетельствует об их невысокой

иммуногенности.

Возможно,

это

объясняется

тем,

что

при

инфицировании большинство антител образуется на белок – предшественник gp120 и gp41 - gp160, т.е. он является иммунодоминантным, поэтому ответ на зрелые белки,

имеющие

моноклональные

более

низкую

антитела

могут

концентрацию, послужить

подавляется. основой

Полученные

для

создания

терапевтического вакцинного препарата. Это было показано в следующем эксперименте. Обезьяны были разбиты на четыре группы. Первой группе, (n=4, nколичество обезьян) ввели моноклональные антитела 2G12, 15 мг/кг, второй (n=5) – смесь 2G12

и 2F5, 15 мг/кг, третьей (n=5) - смесь из ВИЧ-специфических

иммуноглобулинов (Ig) и моноклональных антител- 2G12

и 2F5 400 мг/кг,

четвертая, контрольная получила ВИЧ специфический иммуноглобулин 400 мг/кг. 18

Через 24 часа их инфицировали ВИОЧ. У всех обезьян из контрольной группы было отмечено снижение уровня CD4+ клеток и высокий уровень вируса в крови. У 8 из 14 иммунизированных обезьян вирус не обнаруживался как в культуре ПМНК, так и в ПЦР в клетках лимфатических узлов, т.е. полностью защищенными оказались 4 из 5 обезьян третьей группы, 2 из 5 второй группы и 2 из 4 первой группы. Пассивное введение обезьянам 2F5 МАТ, хотя и не защищало их от инфицирования

первичными

изолятами

вируса,

но

способствовало

более

медленному течению болезни и сниженному уровню РНК вируса в крови [173]. Смесь трех МАТ нейтрализует большинство первичных изолятов in vitro. Однако, иммунизация пептидами и белками, содержащими последовательность для 2F5 эпитопа, не вызывала образование нейтрализующих антител. Не было выявлено закономерностей между нейтрализующими серотипами, генетическими субтипами

и биологическими свойствами (тропностью) вируса

[119]. Так, при изучении нейтрализующей активности сывороток крови людей, инфицированных вирусами, относящихся к субтипу А, B, C, D в тесте нейтрализации, оказалось, что все они нейтрализуют вирус, относящийся к субтипу В. Все сыворотки нейтрализовали его в разведении 1:64. При этом, были нейтрализованы как М-тропные так и Т-тропные штаммы вируса [173]. Ряд опытов in vitro показал, что некоторые антитела, не имеющие специфической активности против вирусных белков, так же могут нейтрализовать вирус. Большинство из них направлены на белки клеточной мембраны, такие как ICAM-1 (CD54), LFA-1 (CD11a/CD18), HLA-DR, β2-микроглобулин, МНС1 [56,140,3]. Другой мишенью для антител, могут быть регуляторные белки, например, tat, высвобождение, которого из инфицированных клеток [45,175,26], приводит к активации репликации вируса в соседних клетках [54]. tat вызывает активацию экспрессии ко-рецепторов ВИЧ и способствует проникновению вируса в клетку [98,75]. Оказалось, что антитела против tat ингибировали HIV-1IIIB in vitro и изх наличие коррелировало с отсутствием развития СПИДа in vivo [136,184]. Нейтрализующая активность сывороток

редко обнаруживается во время

острой инфекции. Таким образом, нейтрализующие антитела не играют обычно существенной роли в контролировании ВИЧ инфекции. 19

Помимо нейтрализации, антитела принимают участие в другом механизме борьбы с ВИЧ – антителозависимой клеточной цитотоксичностью (АЗКЦ). Он основан на том, что антитела, с одной стороны, связываются с белками вируса на поверхности инфицированной клетки (клетка мишень) а с другой стороны с эффекторной

клеткой,

имеющей

рецептор

для

Fc

конца

антитела.

Это

взаимодействие приводит к лизису или апоптозу клетки – мишени [51]. Connick et al. обнаружили антитела, обусловливающие АЗКЦ у ряда инфицированных ВИЧ людей, в то время как CD8+ ответ у них не определялся [35]. Также было показано, что уровень

АЗКЦ, определенный хромовым методом, обратно коррелирует с

уровнем вирусной нагрузки [50]. Антитела, определяющие АЗКЦ, относятся к изотипу G1[100]. Другой способ защиты обусловлен тем, что натуральные киллеры (НК) при стимуляции их Fc рецептора выделяют β-хемокины, которые в свою очередь блокирую ко-рецепторы ВИЧ, лигандами для которых они являются [71]. При

анализе

распределения

антител

против

антигенов

ВИЧ

по

принадлежности к субклассам была выявлена следующая закономерность: большая часть образующихся антител принадлежит к субклассу G1. Эти антитела имеют анти-env специфичность [86,108,85,107]. Такую же специфичность имеют и IgG2 антитела. IgG3 направлены на gag и особенно на матриксный белок р17 [86,108,85]. IgG3 чаще выявляются на ранних стадиях инфекции [100]. Рестриктность гуморального ответа на гены gag и env отражает различные пути регуляторных механизмов иммунного ответа против этих белков. Это объясняет, почему титр анти gag антител понижается раньше, чем чем анти env в процессе ВИЧ инфекции [92,61,172,15]. Антитела изотипа IgG4 направлен также против gag, но встречается в основном у гемофиликов, зараженных путем переливания крови. Обнаружено, что наличие антител против внутренних белков вируса имеет обратную корреляцию с уровнем антигена в крови [87]. 1.1.3. Клеточный ответ СD8+ цитотоксические Т лимфоциты распознают вирусные

белки в виде

коротких пептидов состоящих из 8-11 аминокислот в ассоциации с молекулами главного комплекса гистосовместимости первого типа (МНС1) на поверхности 20

инфицированной клетки [159]. Распознавание комплекса МНС1 и вирусного пептида происходит Т клеточным рецептором (ТКР) совместно с

СD8

корецептором, что приводит к функциональной активации ЦТЛ [171,174,134]. Прямой лизис инфицированной клетки обусловлен высвобождением перфорина и протеаз из литических гранул ЦТЛ в кальций - зависимом процессе. Интеграция перфорина в клеточную мембрану клетки-мишени приводит к образованию пор диаметром 16 нм и осмотической гибели клетки [78]. Протеазы, проникая в клетку,

вызывают

ее

апоптоз

[155].

Кальций-независимая

клеточная

цитотоксичность опосредована специфическими лигандами, такими как Fasлиганды, которые при взаимодействии с ТКР запускают апоптоз клетки-мишени [79,88,124]. Клеточный ответ играет главную роль в патогенезе ВИЧ-инфекции [185]. Это было показано при исследовании людей, хронически инфицированных вирусом, но не развившим клиническую картину болезни, имевшим нормальный уровень CD4+ клеток и низкий или недетектируемый уровень вирусной РНК, в отсутствие специфической большинства

из

них

антиретровирусной терапии. Оказалось, что у развивался

сильный

антиген-зависимый

лимфопролиферативный ответ к внутреннему белку вируса р24 или высокая специфическая цитотоксическая активность [143]. Анализ линейной регрессии показал значительную негативную корреляцию (r=-0,8,P<0,006) между вирусной нагрузкой и CD4+ лимфопролиферативным ответом к р24 [143]. Важная роль СD8+ ЦТЛ была подтверждена в следующем опыте: при удалении вирус - специфических CD8+ клеток с помощью цитотоксических моноклональных анти CD8+

антител, у инфицированных ВИОЧ обезьян

происходило увеличение вирусной нагрузки, и развивалась

иммуносупрессия

[146,77]. У

серонегативных гамбийских проституток, имеющих множественные

половые контакты с инфицированными ВИЧ партнерами, но остающихся незараженными, у них была отмечена специфическая ВИЧ ЦТЛ активность в ПМК [95, 52,144]. Вирус - специфические CD8+ и CD4+ клетки обнаруживаются практически на всех стадиях ВИЧ – инфекции. Во время острой стадии их количество составляет 21

2-10% и 1-2% при хронической инфекции, в терминальной стадии они практически не обнаруживаются [112]. Снижение функциональной активности специфических ЦТЛ происходит по разным причинам. Прежде всего, сами CD4+ являются клетками-мишенями для вируса, при этом вирус - специфические CD4+ Th клетки подвергаются клональной делеции на ранних стадиях инфекции, т.к. именно они активируются в ответ на стимуляцию вирусом, что способствует их заражению. Этот процесс идет настолько быстро, что не успевают образоваться вирус специфические клетки-памяти. Было также показано, что ВИЧ-специфические Т клетки памяти содержат большее количество провирусной ДНК, по сравнению с другими клетками на всех стадиях болезни [42]. Инфицированные клетки разрушаются за счет прямого цитопатического действия вируса и ЦТЛ [27]. Значительная часть CD4+ клеток погибает за счет апоптоза. Существуют и другие механизмы, с помощью которых вирусу удается избежать иммунного ответа. Так, оболочечные белки вируса вызывают анергию CD4+ клеток. Все это приводит к тому, что ЦТЛ не получают дополнительной активации со стороны Th клеток и не могут нормально функционировать. У инфицированных ВИЧ отмечено снижение уровня перфорина у ЦТЛ. Кроме того, высокая генетическая изменчивость вируса предотвращает

распознавание инфицированных клеток специфическими ЦТЛ.

Вирусные мутации ведут к делеции эпитопов, снижению связывания вирусных пептидов с МНС1, неэффективному процессингу вирусных белков и сниженному распознаванию ТКР [112]. Вирусный белок nef повышает экспрессию FasL (CD95L), индуцирующих апоптоз ВИЧ - специфических ЦТЛ [180]. nef также снижает экспрессию молекул MHC1 [130, 145, 32] на поверхности зараженной клетки, что затрудняет распознавание их натуральными киллерами. Этот процесс имеет аллельную специфичность и не включает HLA C и Е. Однако, опосредованный натуральными киллерами лизис инфицированных клеток ингибируется у людей имеющих HLA C и Е. [162,163,183,93]. У некоторых натуральных киллеров имеется рецептор NKB1, специфичный для Bw4 популяции HLA B клеток. Инфицированные ВИЧ люди, относящиеся к этой популяции, характеризуются медленным развитием болезни [68,69,114].

22

Было

показано,

определяется HLA

что

эффективность

клеточного

иммунного

ответа

генотипом хозяина [80, 82, 154 , 104, 24]. Отмечено, что

болезнь развивается быстрее у людей, имеющих гаплотип HLA B35

и HLA

A1/B8/DR3, а медленнее у HLA B27 и HLA B57, это продукты МНС1 и HLA DRB1* 13-DQB1* 06, продукты МНС II [80, 81, 111, 24]. Оказалось, что фрагмент gag (251-270 а.к.) имеет высокую аффиность к DRB1* 13. Этот пептид распознается клонами Т-клеток, выделенных из пациентов с высоким Т клеточным ответом. Высокоаффинное связывание коррелирует с увеличенной плотностью комплексов МНС-пептид на антиген - представляющей клетке, что приводит к увеличению плотности сигнальных ТКР и развитию Th1 ответа [133,84,63]. Вирусный белок tat ингибирует 20S протеосому и ее регулятор 11S, что приводит неэффективному представлению некоторых вирусных эпитопов [147, 149]. Нецитолитический контроль инфекции ВИЧ включает

СС хемокин-

опосредованную блокаду вируса через конкуренцию лиганда к корецептору с V3 доменом оболочечного гликопротеина gp120 и супрессию репликации в CD4+ клетках на уровне транскрипции плохо охарактеризованным растворимым агентом, называемым CD8+ Т клеточным антивирусным фактором [30, 31, 96, 181]. Для анализа иммунного ответа на ВИЧ-инфекцию и при оценке вакцин используются методы, представленные в таблице 1.1.

23

Таблица 1.1. Лабораторные методы оценки иммунного ответа Тип ответа

Методы

Гуморальный

Связывание антител

ИФА

иммунный ответ

Вестерн блот Нейтрализации вируса в культуре Опосредованное антителами ингибирование слияния Антитело – зависимая клеточная цитотоксичность

Клеточный

Пролиферация к

иммунный ответ

растворимому антигену (в

РБТЛ

основном CD4+) Цитотоксичность

Определение активность ЦТЛ по выделению хрома из клетки – мишени

Определение антиген

Tetramer binding

специфических Т клеток Определение цитокин -

ELISPOT

продуцирующих клеток

1.2. ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИЧ/СПИД 1.2.1. Вакцины на основе рекомбинантных векторов Используя генно-инженерные методы, можно создать бактерии и вирусы, содержащие в своем геноме гены ВИЧ или их фрагменты. Это приведет к тому, что они начнут экспрессировать, помимо своих белков, белки ВИЧ. Заражение экспериментальных животных и людей такими рекомбинантными бактериями и вирусами вызывает образование иммунного ответа, как на собственные белки, так и на белки ВИЧ. 24

В последние года исследования модели ВИЧ на основе ВИО и ВИОЧ показали роль цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ), активированных вирусными векторами, при защите от вируса. Если до инфицирования обезьян ВИО вакцинировали

вектором

на

основе

модифицированного

или ВИОЧ, их вируса

Анкара,

содержащим гены внутреннего белка ВИО – gag и регуляторного – pol, то у животных

наблюдалось

снижение

уровня

виремии,

сохранялся

уровень

периферических CD4+ лимфоцитов, были выявлены специфические ЦТЛ, обезьяны чувствовали себя намного лучше по сравнению с неиммунизированными животными. Уровень снижения виремии коррелировал с шириной вызванного вектором специфического иммунного ответа [148,127]. В настоящее время на основе живых аттенуированных вирусов и вирусов с незавершенным циклом репликации разработаны и используются при создании вакцины против ВИЧ/СПИД векторы

новые вирусные векторы. Наиболее популярные

созданы на основе поксвирусов (вирус осповакцины ), альфавирусов

(вирус Синдбис, вирус венесуэльского энцефалита лошадей), аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, полиовируса, вируса простого герпеса, вируса бешенства и вируса везикулярного стоматита [25,14]. Наиболее хорошо изучены, и чаще всего используются векторы на основе поксвирусов. Самые первые исследования, в которых использовался в качестве модели вирус иммунодефицита обезьян (ВИО), показали, что, если при первой иммунизации

обезьян

использовался

экспрессирующий белки оболочки

рекомбинантный

вирус

оспы,

ВИЧ – env, а при второй растворимый

рекомбинантный белок ВИЧ, не происходило заражение некоторыми патогенными штаммами ВИО [74]. Однако

при дальнейшем исследовании выяснилось, что

векторы на основе поксвирусов не защищают полностью от инфицирования. Полной защиты можно было достигнуть только в том случае, если вектор был создан на основе вируса, гомологичному тому, что использовался при заражении, протективную

роль

в

данном

случае

играли

образовавшиеся

штамм

-

специфические антитела [37]. Перспективными считаются векторы, созданные на основе поксвирусов со сниженной вирулентностью или с незавершенным циклом репликации в человеке, что приводит, в свою очередь, к снижению негативного действия вируса. Один из 25

них – модифицированный штамм вируса Анкара. Это вакцинный штамм вируса, прошедший много пассажей in vitro и потерявший свою патогенность в результате делеции ряда генов [109]. Другой – вирус оспы канареек, имеющий незавершенный цикл репликации в клетках человека [105]. На

основе

доклинических

испытаниях

рекомбинантные

векторы

поксовирусов начали исследоваться на людях. На первой стадии клинических испытаний было показано, что векторы на основе вакцинного вируса оспы и оспы канареек безопасны, и вызывают активацию специфических CD8+ и СD4+ клеток. У большинства вакцинированных добровольцев развился антиген – специфический лимфопролиферативный ответ, а у трети – ЦТЛ специфический иммунный ответ (определяли по лизису клеток – мишеней при стимуляции in vitro) [60, 157, 166]. Однако значительная часть населения мира иммунизирована против оспы, т.о., вектор будет быстро удаляться из организма, кроме того, вирус осповакцины сам по себе вызывает поствакцинальные осложнения, что снижает эффективность использования данного вектора. В доклинических испытаниях было исследовано несколько векторов на основе альфавирусов. При введении в их геном структурных генов ВИЧ или при использовании дупликата субгеномного mРНК промотора, чтобы управлять экспрессией чужеродного антигена, был достигнут высокий уровень репликации альфа вирусов. Достоинством векторов на основе альфавирусов является то, что клетками-мишенями для них являются антиген представляющие клетки. Для векторов на основе вируса Синдбис и вируса венесуэльского энцефалита лошадей было показано их нацеливание на некоторые популяции человеческих дендритных клеток in vitro [102,55]. Иммунизация обезьян рекомбинантным вирусом венесуэльского энцефалита лошадей вызывала как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ и способствовала частичной защите от инфицирования ВИО [39]. Антиген представляющие клетки являются мишенями и для аденовирусов. Кроме того, полученные на их основе векторы вызывали сильный иммунный ответ у

макак.

Интраназальная

иммунизация

обезьян

аденовирусным

вектором

вызывала как системный, так и иммунный ответ на слизистых оболочках [101,22]. Другие

вирусные

векторы

(полиовирус,

вирус

простого

герпеса,

аденоассоциированные вирусы), содержащие гены ВИЧ, также были исследованы 26

на приматах. Было показано, что они вызывают как системный, так и ответ на слизистых. ВИЧ - специфические антитела обнаруживались в течение нескольких месяцев после иммунизации [131, 29]. Вирус

оспы

канареек,

венесуэльского

энцефалита

лошадей

и

модифицированный вирус Анкара не персистируют в организме человека, и для достижения высокого иммунного ответа необходимо несколько иммуннизаций. В противоположность им, вирусы герпеса и аденоассоциированные вирусы устанавливают иммунизации

персистирующую обезьян

инфекцию

в

адено–ассоциированным

организме вирусом,

хозяина.

иммунный

При ответ

определялся в течение года после единственной иммунизации. Однако у людей, иммунизированных персистирующими вирусными векторами, могут возникнуть поствацинальные осложнения [120]. В качестве векторных систем, поимо вирусов, могут быть использованы бактериальные клетки. Наиболее привлекательной из-за своей безопасности является бацилла Calmette-Guerin (BCG). Вектор, созданный на основе этой бактерии, вызывал при иммунизации ВИЧ - специфический клеточный ответ у экспериментальных животных [128, 48]. Доклинические исследования проходят бактериальные векторы на основе бактерий семейств Salmonella, Listeria и Shigella [99, 165]. Преимуществом аттенуированного штамма Salmonella typhi являются: возможность орального введения, легкость приготовления, внутриклеточное расположение антигена, бактерия, размножаясь на слизистых, индуцирует образование специфического гуморального (sIgA, IgG) и клеточного ответа слизистых [182]. 1.2.2. Вакцины на основе живого аттенуированного вируса Вакцины, созданные на основе живого, генетически модифицированного или аттенуированного

вируса,

обладают

рядом

преимуществ.

Они

вызывают

образование как гуморального, так и клеточного иммунного ответа, антигенные детерминанты представлены у них в неизменном виде. Аттенуированные вирусы кори, полиомиелита, оспы широко используются как вакцинирующие препараты. При введении обезьянам ВИЧ с генетически поврежденным регуляторным белком nef, они в последующем не инфицировались патогенными штаммами вируса. Были 27

проведены исследования механизмов защиты. Оказалось, что пассивное введение иммуноглобулинов, полученных из сыворотки обезьян, иммунизированных аттенуированным

вирусом,

неиммунным

животным

не

защитило

их

от

инфицирования патогенными штаммами вируса. Однако при исследовании иммунизированных животных у них был выявлен вирус специфический Тклеточный

ответ.

Кроме

того,

иммунизированные

животные

оказались

защищенными от ВИОЧ (рекомбинантный вирус, оболочка которого состоит из белков ВИЧ, а внутренние белки из ВИО). Полученные данные свидетельствую о важной роли Т клеточного ответа в контролировании инфекции [37, 150]. Кроме того, оказалось, что люди инфицированные ВИЧ с поврежденным геном nef (так называемая, Сиднейская когорта) не развивали СПИД, и уровень CD4+ клеток у них оставался в пределах нормы в течение 20 лет после заражения [38, 43]. Несмотря на ряд преимуществ вакцины данного типа, работы по этому направлению

сдерживаются по соображениям безопасности. Оказалось, что у

обезьян зараженных вирусом с делецией в 12 нуклеотидных пар в гене nef через какое-то время произошло полное восстановление поврежденного участка, т.е. вирус снова приобрел вирулентные свойства [176]. 1.2.3. ДНК вакцины и стратегия прайм/буст Одним из перспективных способов активации клеточного ответа может быть введение плазмидной ДНК, кодирующей вирусные белки [41]. Возможность ДНКиммунизации была продемонстрирована в некоторых модельных системах. Этот способ имеет ряд преимуществ: низкая стоимость, стабильность ДНК-конструкций. Кроме того, методы получения рекомбинантных плазмид хорошо отработаны. Иммунизация ДНК вызывает сильную активацию как клеточного, так и гуморального иммунного ответа у грызунов, однако такой же уровень не был достигнут при ее введении приматам [167, 135, 170, 57]. Иммунный ответ на внутримышечное введение добровольцам ДНК плазмиды, кодирующей гены rev и env, в дозе 100 или 300 мкг, был слабым и наблюдалcя не у всех испытуемых [16]. Для усиления иммуногенных свойств рекомбинантной ДНК, бала разработана 28

стратегия прайм/буст [177]. В этом случае при первой иммунизации (прайм) вводится ДНК, а при второй (буст) – рекомбинантный вирусный белок или вирусный вектор, но не наоборот. Введение в конструкцию генов, кодирующих цитокины, может также повысить иммунные свойства конструкции. Это было показано на примере двух групп иммунизированных обезьян. Уровень иммунного ответа был намного выше в той группе, где рекомбинантная плазмида, помимо вирусных

белков,

кодировала

IL2-Ig.

Кроме

того,

при

последующем

инфицировании животных ВИОЧ, в этой группе наблюдался более низкий уровень виремии, и животные чувствовали себе лучше [5, 6]. Используя в качестве модели ВИОЧ, Robinson et al. иммунизировали обезьян ДНК вакциной (кодирующей несколько белков ВИО и ВИЧ1 env штамма 89,6) дважды - на 0 и 8 неделю внутримышечно или подкожно, а третью иммунизацию проводили рекомбинантным вирусом Анкара, кодирующим gag и pol ВИО и env ВИЧ1(на 24 неделе внутримышечно) [142]. Оба способа введения ДНК вызывали слабую активацию CD8+ Т клеточного ответа, который усиливался при введении рекомбинантного вируса Анкара (МВА). Однако титр антител против оболочечных белков вируса был очень низким даже после введения МВА. Через 7 месяцев животных заразили ректально ВИОЧ. Все они контролировали развитие инфекции. Эти результаты показывают, что в обоих случаях

(IL-2-Ig, ДНК/МВА),

образовывались клетки памяти, способные понижать уровень виремии ВИО. Поскольку при использовании этих методов не было получено высокого уровня антитела, было высказано предположение, что главную роль в контролировании инфекции играют ВИЧ/ВИО специфические Т клетки [5, 2, 142, 12, 13]. Ряд авторов показал, что для индуцирования сильного гуморального иммунного ответа вторую иммунизацию (буст) необходимо проводить белковыми антигенами [129]. 1.2.4. Вакцины на основе рекомбинантных белков и субъединичных антигенов К настоящему времени хорошо отработана технология получения генноинженерных, или рекомбинантных, белков. Несомненное их преимущество - это дешевизна получения и возможность высокой степени очистки. Рекомбинантные

29

белки получают в бактериальных и дрожжевых клетках, в перевиваемых опухолевых клетках, в клетках насекомых. Иммуногены на основе оболочечного вирусного белка gp120 вызывают образование высоких титров антител у экспериментальных животных

и

безопасны в применении. Однако индуцируемые ими нейтрализующие антитела имеют ограниченную силу и широту. Поэтому в настоящее время разрабатываются новые иммуногены – рекомбинантные белки, строение которых максимально приближено к

вирусным оболочечным гликопротеинам или лучше всего

представляющие

нейтрализующие

эпитопы

вируса.

Было

показано,

что

иммунизация рекомбинантными белками защищала шимпанзе от внутривенного заражения ВИЧ-1 [9]. Однако эти исследования были проведены с культуральным вирусом, который плохо реплицируется в организме обезьян. Кроме того, антитела, образованные в организме животных в ответ на иммунизацию, не могли нейтрализовать

первичные

вирусные

изоляты

in

vitro.

Иммунизация

рекомбинантными белками не приводит к индукции CD8+ ответа, который играет основную роль в контролировании ВИЧ – инфекции [106]. Помимо оболочечных белков, в качестве кандидатных вакцинных препаратов могут быть использованы неструктурные белки, такие как tat и rev. У макак, иммунизированных биологически активным tat, инактивированным токсоидом tat или рекомбинантным вектором, экспрессирующим tat и rev, после их заражения ВИО или ВИОЧ наблюдалось снижение виремии и увеличение СD4+ Т клеточного уровня по сравнению с неимунными животными [138, 152, 103, 7]. При

изучении

иммуногенности

пептидов

с

применением

различных

адъювантов оказалось, что они могут вызывать слабый специфический CD8+ ответ у

различных

экспериментальных

животных.

Кроме

того,

большинство

нейтрализующих эпитопов ВИЧ имеют конформационное строение, которое невозможно воспроизвести у иммуногенов на основе пептидов.

30

Таблица 1.2. Варианты вакцин против ВИЧ/СПИД. Вакцина

Примеры

ДНК Живые вирусы

Плазмиды ДНК Адено-ассоциированный вирус Вирус герпеса Вирус осповакцины Вирус оспы канареек Модифицированный вирус Анкара Вирус желтой лихорадки Альфавирусы

Репликоны (вирусы с незавершенным циклом репликации у человека)

Полиовирусы Salmonella

Бактерии

Полностью инактивированный вирус Живые аттенуированные Рекомбинантные-субъединичные Повторяющие значимые эпитопы Псевдовирионы/ вирусоподобные частицы

Listeria Shigella BCG ВИЧ ВИЧ с поврежденными генами Белки - оболочки Регуляторные белки Пептиды Полиэпитопная вакцина Ту р55gag

31

Таблица 1.3. Недостатки разрабатываемых вакцин против ВИЧ/СПИД Вакцины

Недостатки

Живой аттенуированный вирус

Возможность возврата к дикому типу Не вызывают образования

Субъединичные вакцины

нейтрализующих антител против первичных изолятов, не вызывают активации CD8+- лимфоцитов. Не вызывают образования

Рекомбинантные белки

нейтрализующих антител против первичных изолятов. Не вызывают нейтрализующих антител

Вакцины на основе рекомбинантных векторов и бактерий

против первичных изолятов, иммуногенность, уровень репликации in vivo и патогенность вектора тесно связаны; слабая активация CD8 клеток.

ДНК плазмиды

Недостаточно исследованы, мало опыта работы

32

1.3. МОДЕЛИ ВИЧ - ИНФЕКЦИИ/СПИД Для оценки эффективности и безопасности разрабатываемых вакцин требуется

модель

исследуемой

инфекции

и

заболевания

у

животных.

Единственные животные, которые восприимчивы к инфицированию ВИЧ-1 – человекообразные обезьяны, из них наиболее изученны инфицированные ВИЧ-1 шимпанзе. Однако инфицирование их первичными изолятами ВИЧ-1 не приводит к такому же уровню репликации вируса, как у людей. У многих хронически инфицированных животных вирусная РНК не определяется в плазме крови. Инфицирование шимпанзе ВИЧ-1 не приводит к развитию у них СПИДа [94]. При пассировании в шимпанзе изоляты ВИЧ-1 приобретают вирулентные свойства: у них возрастает уровень репликации вируса, снижается количество CD4+ и развивается СПИД – подобный синдром, но разработка модели на основе шимпанзе сдерживается высокой стоимостью животных [125]. Естественным близким к ВИЧ инфекционным агентом для обезьян, обитающих в Африке, является

вирус иммунодефицита обезьян (ВИО), но, в

отличие от ВИЧ, он не является для них патогенным. Однако при инфицировании некоторыми изолятами ВИО азиатских обезьян, они развивали СПИД, и у них происходило снижение уровня CD4+ клеток [73]. ВИЧ и ВИО - генетически достаточно близкие вирусы. Наибольшее различие имеют гены, кодирующие

оболочечные белки вирусов, что не позволяет

использовать ВИО, как модель ВИЧ. Поэтому был сконструирован химерный вирус, экспрессирующий оболочечные белки ВИЧ и внутренние белки ВИО – так называемый ВИОЧ, после нескольких пассажей через обезьян его патогенные свойства стали похожи на свойства ВИЧ [110, 97]. К настоящему времени не разработана универсальная схема использования ВИОЧ. Большинство заражений в естественных происходит половым путем через слизистые оболочки, но для исследования эффективности вакцин подопытных животных заражают через внутривенное введение вируса. Кроме того, чтобы добиться эффективного заражения, вводимая доза во много раз превышает дозу вируса при естественном инфицировании. Во многих случаях заражение людей происходит через инфицированные клетки, однако этот путь не используется при 33

заражении подопытных животных. В результате, зараженные экспериментальным путем обезьяны погибают быстрее, чем ВИЧ - инфицированные люди [94,137]. Таким образом, существующие на сегодняшний день модели не отражают в полной мере патогенетическую картину ВИЧ-инфекции и СПИД.

Таблица 1.5. Модели приматов для оценки вакцин Вид и вирус

Ограничения использования

Шимпанзе

Убой животных; дороговизна;

ВИЧ-1

Ограниченная репликация вируса и отсутствие болезни при инфицировании первичными изолятами.

Макаки ВИО

Не соответствие нуклеотидной последовательности и нейтрализующих эпитопов ВИЧ;

ВИОЧ

Отличие в кинетике снижения СD4+ клеток по сравнению с индуцированной ВИЧ.

34

1.4. Клинические испытания кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД К настоящему времени проведена оценка эффективности и безопасности многих кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД. Были исследованы следующие варианты иммуногенов: 1) рекомбинантные белки вируса gp160 и gp120, полученные в дрожжевых клетках, клетках насекомых и млекопитающих (основанные на лабораторном культуральном вирусе субтипа В); 2) пептиды, повторяющие фрагменты V3 петли оболочечного белка env и внутреннего белка gag. Они были представлены в виде липопептидов или Ту частиц (конъюгат пептида с дрожжевым белком Ту), их вводили внутримышечно, ректально или орально; 3) живые рекомбинантные векторы, включавшие векторы на основе вируса осповакцины, оспы канареек и сальмонеллы; 4) ДНК-вакцины. Векторы экспрессировали как один, так и несколько вирусных антигенов. Кроме того, были исследованы различные схемы введения и комбинации препаратов. 1.4.1. Гуморальный ответ на вакцинацию людей против ВИЧ/СПИД При иммунизации рекомбинантными белками оболочки вируса отдельно или в комбинации с рекомбинантным поксвирусом были получены нейтрализующие антитела. Гуморальный ответ против рекомбинантного gp120 был максимальным после третьей или четвертой иммунизации и был дозозависимым. Специфические сывороточные антитела обнаруживались в течение непродолжительного времени после введения иммуногена. Повторное введение иммуногена не увеличивало продолжительность иммунного ответа. Рекомбинантные

белки могут быть

использованы как бустирующий иммуноген при иммунизации рекомбинантными векторными или ДНК-вакцинами [65]. Первые рекомбинантные белки повторяли последовательность белков культурального Х4 вируса субтипа В. Новейшие продукты, такие как вакцина

VaxGen B/B, повторяет последовательность

первичных R5 изолятов (MN и GNE) [8].

35

1.4.2. Основные результаты клинических испытаний: 1) Полученные при иммунизации антитела нейтрализовали только культуральный вирус или некоторые штаммы первичных R5 вирусов [106]. 2) Полученные в результате антитела связывали олигомерные формы вирусных белков, представленные на поверхности инфицированных клеток, таким образом, используемые образование

при

иммунизации

антител,

которые

мономерные

распознают

формы

белков,

олигомерные

вызывают

структуры,

хотя

аффиность и специфичность полученных антител не достаточна для нейтрализации вируса [49]. 3) Рекомбинантные антигены, полученные из клеток млекопитающих, вызывали образование более высоких титров антител, нейтрализующих культуральный вирус, по сравнению с иммуногенами полученными в бакуловирусах и дрожжевых клетках [40, 83, 64, 10]. 4) Рекомбинантный белок gp120 вызывал образование антител, имеющих более высокую нейтрализующую активность, по сравнению с антителами, полученными после иммунизации рекомбинантным gp160 [11б40, 83, 64]. 5) Иммунный ответ был более эффективным, если интервал между второй, третьей и четвертой иммунизацией составлял не менее 3-4 месяцев[40, 83]. 6) «Быстрая», или ежемесячная иммунизация оболочечными белками приводила к ослаблению иммунного ответа после четвертого введения[40]. 7) Четвертая иммунизация рекомбинантным gp120, независимо от количества времени, прошедшего между иммунизациями, не увеличивала титр антител,по сравнению с уровнем, достигнутым после третьей иммунизации. 8) Продолжительность времени, в течение которого определялись специфические антитела, при иммунизации

рекомбинантным gp120 составила 3 месяца и не

зависела от числа доз. Она была более длительной у иммунизированных gp160 или в том случае, когда при первой иммунизации использовался

рекомбинантый

поксвирус. Факторы, определяющие продолжительность иммунного ответа не были определены. 9) Применение адъювантов способствовало снижению дозы иммуногена. Так, например, использование адъюванта QS21 позволило снизить дозу 36

в 10-100 раз,

при этом продолжительность иммунного ответа осталась прежней [46] 10) Как правило, пептиды были слабыми иммуногенами. Единственный препарат из этой группы, вызывающим сильный иммунный ответ, состоял из смеси различных иммуногенов: пептида, повторяющего последовательность Th эпитопа из С4 домена gp120 и эпитопов для нейтрализующих антител и СTLв из V3 петли, при внутримышечном введении комбинации пептидов из четырех штаммов вируса в неполном адъюванте Фрейнда. Нейтрализующая активность была показана у 75 вакцинированных,

после

второго

введения.

Однако

исследования

были

приостановлены из-за образования после иммунизации стерильного абсцесса. 11) Иммунизация рекомбинантным gp160 вызывала у людей медленное развитие иммунного

ответа

к

оболочечным

белкам

вируса,

часто

антитела

не

обнаруживались в течение 100 дней после введения[66]. 12) Специфичность гуморального ответа у людей, иммунизированных сначала рекомбинантным вирусным вектором, а затем рекомбинантным белком оболочки вируса, определялась прежде всего антигенами, используемыми при первой иммунизации (вирусный вектор) [67,36]. 13) Уровень антител к белкам ВИЧ, полученных при иммунизации вирусным вектором, повышался в несколько раз, если проводилась вторая иммунизация рекомбинантными белками [28, 47]. 15) У людей, которым при первой иммунизации вводился рекомбинантный вакцинный вирус оспы, содержащий гены gp160 HIV1-LAI, а при второй рекомбинантный белок gp160 HIV1-LAI, полученный в бакуловирусах, вместе с окисью алюминия, основная часть антител образовалась участок на gp41 (720-740 аминокислоты),

который

не

является

доминантным

эпитопом

у

людей

инфицированных HIV1-LAI [132]. 16)

Уровень

антител,

иммунизированных

людей,

нейтрализующих был

в

инфицированными ВИЧ [116, 113, 131].

37

5-10

культуральные раз

ниже,

по

вирусы

у

сравнению

с

1.4.3. Клеточный ответ на вакцинацию людей против ВИЧ/СПИД Для образования CD8 + клеточного ответа необходимо, чтобы антиген проник в цитоплазму клетки и представлялся совместно с МНС1. Это достигается при использовании вирусных векторов и ДНК-вакцин. Использование рекомбинантных белков и полностью инактивированного вируса не приводит к активации CD8+ клеток, в этом случае представление антигена идет по эндоцитозному пути через МНС II. CD4+ необходимы для полноценного функционирования как В, так ЦТЛ лимфоцитов. Активировать CD8 лимфоциты можно также

при иммунизации

пептидами, т. к. они могут связываться напрямую с молекулой МНС1, находящейся на поверхности клетки, без проникновения внутрь нее. Вакцины на основе рекомбинантных векторов начали разрабатываться в начале 80-х годов, и в середине 90-х начались их клинические испытания. 1.4.4. Основные результаты клинических испытаний: 1) У людей, иммунизированных рекомбинантным вирусом оспы, индуцировался продолжительный ВИЧ – специфический клеточный ответ [34, 36,70, 44]. 2) ВИЧ-специфическая активность

CD8+ клеток

определялась в течение 18

месяцев у людей, иммунизированных рекомбинантными поксвирусами. ВИЧ специфические CD8+ клетки, индуцированные рекомбинанатным вирусом оспы канареек, лизировали клетки-мишени, зараженные первичными R5 вирусными изолятами различных субтипов [49].

У вакцинированных рекомбинантными

вирусными векторами была показана нецитолитическая CD8+-опосредованная супрессия репликации вируса [36]. 3) ВИЧ – специфический ЦТЛ ответ наблюдался у 1/3/-1/2 части добровольцев при введении им рекомбинантного вируса оспы канареек. 4) Клеточный ответ был показан у 2/3 добровольцев

при иммунизации их

липопептидами, содержащими белки env, gag, nef. Иммунизация пептидами не вызывала иммунного ответа.

38

5) Иммунизация добровольцев ДНК вакцинами, кодирующими гены env и gag-pol в дозе 3 мг/человека, не давала побочных эффектов. Однако сильного иммунного ответа получено не было [16]. Таблица 1.6. Рекомбинантные вирусные векторы, прошедшие 1 фазу клинических исследований ВИРУС Вакцинный

НАЗВАНИЕ БЕЛКИ ВИЧ вирус HIV Ac

gp160

оспы TCB-IIIB

gp120, gag.pol

Poly Env1

gp140 ( 23 клона)

Вирус оспы канареек vCP125

gp160

vCP205

gag, Pro, gp120/TM*

vCP300

gag, Pro, gp120/TM, 5 Pol/Nef эпитопов

vCP1433

gag, Pro, gp120/TM, 5 Pol/Nef эпитопов

vCP1452

gag, Pro,gp120/TM, 5 Pol/Nef эпитопов,vvE3L, vvK3L

vCP1521

gag, Pro,gp120/TM, 5 Pol/Nef эпитопов,vvE3L, ccK3L

*

трансмембранная часть gp41

39

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Рекомбинантные белки и их конъюгаты с Полиоксидонием В работе были использованы рекомбинантные белки, содержащие фрагменты внутренних и поверхностных белков ВИЧ1. Rec p24

Копирует полноразмерный внутренний белок р24 ВИЧ1 (аа.133-387).

Rec trx p24

Копирует полноразмерный внутренний белок р24 ВИЧ1(аа. 133-387), содержит белок вектора тиоредоксин.

Rec trx gp41

Копирует N – концевой участок gp41 ВИЧ1 (аа.578-609), содержит белок вектора тиоредоксин.

Rec (24-41)

Содержит полноразмерный внутренний белок р24 ВИЧ1 и N – концевой участок gp41 ВИЧ1.

Все рекомбинантные белки были любезно предоставлены сотрудниками Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН А.Ф. Шевалье и Т.А.Алексеевым. На рисунке 2.1. представлена схема вектора экспрессии

рекомбинантного

белка

rec(24-41).

На

рисунке

2.2.

приведена

аминокислотная последовательность рекомбинатного белка rec(24-41).

Чистоту

продукта проверяли электрофорезом в ПААГ. Доля основного вещества в исследуемых препаратах составляла не менее 99 %. На рисунке 2.3. электрофореза

приведена картина

очищенного рекомбинантного белка rec(24-41). На рисунке 2.5.

приведен UV спектр поглощения очищенного белка rec(24-41). На рисунке приведен 2.4. профиль элюции очищенного химерного рекомбинатного белка rec(24-41). Конъюгаты белка rec(24-41) с Полиоксидонием были любезно предоставлены сотрудником Института иммунологии И.В.Савиновой. На рисунке 2.6. приведена схема строения участка связывания Полиоксидония с rec(24-41).

40

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His ATG GGC AGC AGC CAT CAT CAT CAT CAT CAC AGC AGC GGC CTG GTG CCG CGC GGC AGC CAT p24→ 147 133 Met Leu Glu Asp Pro Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile ATG CTC GAG GAT CCT CCT ATA GTG CAG AAC ATC CAG GGG CAA ATG GTA CAT CAG GCC ATA 148 167 Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu TCA CCT AGA ACT TTA AAT GCA TGG GTA AAA GTA GTA GAA GAG AAG GCT TTC AGC CCA GAA 168 187 Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met GTA ATA CCC ATG TTT TCA GCA TTA TCA GAA GGA GCC ACC CCA CAA GAT TTA AAC ACC ATG 208 217 Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu CTA AAC ACA GTG GGG GGA CAT CAA GCA GCC ATG CAA ATG TTA AAA GAG ACC ATC AAT GAG 218 237 Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln GAA GCT GCA GAA TGG GAT AGA GTA CAT CCA GTG CAT GCA GGG CCT ATT GCA CCA GGC CAG 238 257 Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile ATG AGA GAA CCA AGG GGA AGT GAC ATA GCA GGA ACT ACT AGT ACC CTT CAG GAA CAA ATA 258 277 Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile GGA TGG ATG ACA AAT AAT CCA CCT ATC CCA GTA GGA GAA ATT TAT AAA AGA TGG ATA ATC 278 297 Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln CTG GGA TTA AAT AAA ATA GTA AGA ATG TAT AGC CCT ACC AGC ATT CTG GAC ATA AGA CAA Рисунок 2.2. Аминокислотная и нуклеотидная последовательность белка rec (24-41)

298 317 Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu GGA CCA AAA GAA CCT TTT AGA GAC TAT GTA GAC CGG TTC TAT AAA ACT CTA AGA GCC GAG 318 337 Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn CAA GCT TCA CAG GAG GTA AAA AAT TGG ATG ACA GAA ACC TTG TTG GTC CAA AAT GCG AAC 338 357 Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met CCA GAT TGT AAG ACT ATT TTA AAA GCA TTG GGA CCA GCG GCT ACA CTA GAA GAA ATG ATG 358 377 Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met ACA GCA TGT CAG GGA GTA GGA GGA CCC GGC CAT AAG GCA AGA GTT TTG GCT GAA GCA ATG 378

387 ←p24 Ser Gln Val Thr Asn Thr Ala Thr Ile Met Leu Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys AGC CAA GTA ACA AAT ACA GCT ACC ATA ATG TTG GAT CTG GGT ACC GAC GAC GAC GAC AAG 575 584 gp41→ Ala Met Ala Ile Ser Asp Leu Gln Asp Ser Leu Gln Ala Arg Ile Leu Asn Val Glu Arg GCC ATG GCG ATA TCG GAT CTG CAG GAT TCA CGT GTT CTG GCT ATC GAA CGT TAC CTG CGT 585 604 Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr GAC CAG AAA CTG CTG GGT ATG TGG GGT TGC TCT GGT AAA CTT CAA GCC CTG ATC TGC ACC 685

616 gp41 Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys ACC GCT GTT CCG TGG AAT GCA TCA TGG TCA GCT AAG Рисунок 2.2. Аминокислотная и нуклеотидная последовательность белка rec (24-41) (продолжение)

EcoR1 (8350) Cla I (24)

PstI (7600)

KanR AmpR

Hind III (1520)

rec(24-41) 8375 b.p. pET 15 b

Bam H I (2134) Pst I (2210)

T7 promoter

Hind III (2430)

Pst I (2730) XbaI (3070)

REC (24- 41)

Bam HI (2960)

Рисунок 2.1. Строение вектора экспрессии рекомбинатного химерного белка rec(24-41).

димерные формы белка rec(24-41) Mwr 69 кДа

мономерные формы белка rec(24-41) Mwr 32-33 кДа

1

2

Рисунок 2.3. Результаты электрофореза в PAAG-SDS рекомбинантного химерного белка rec(24-41. 1 - маркеры молекулярного веса , 2 - очищенный белок rec(24-41). 43

200

0,20

180 0,15

115 mM

OD

0,10

NaСl, mM

226

160

140

0,05

120

100

0,00 0

5

10

15

20

25

V, ml

Стартовый буфер: 8M мочевина, 20 mM tris-HCl (8.8), 100 mM NaCl Финальный буфер: 8M мочевина, 20 mM tris-HCl (8.8), 200 mM NaCl Рисунок 2.4. Профиль элюции очищенного белка rec(24-41) с колонки с Qсефарозой.

OД 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

нм 240 24

260

280

300

320

340

Рисунок 2.5. UV спектр поглощения очищенного белка rec(24-41)

44

N

N

CH2

Br -+ … N

CH2

O

N

CH2

CH2

CH2 CO

n

NH rec (24-41)

C

N

O

H

Рисунок 2.6. Строение участка связывания Полиоксидония с rec (24-41)

m

2.2.

Методика изучения иммуногенных свойств

рекомбинантных белков

ВИЧ1. 2.2.1. Иммунизация мышей. Использовали мышей самок линии (CBA x C57 B1/6) F1 весом 16-18 г. Для иммунизации были использованы следующие антигены: rec p24, rec trx gp41, rec (24-41). Животным вводили препарат очищенных белков в физиологическом растворе или в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) в дозе 100 мкг/антигена на животное в 0,5 мл раствора. Мыши были разделены на группы в соответствии с составом препарата, по 15 мышей в группе. Антиген вводили внутрибрюшинно. Вторую иммунизацию проводили через 1 месяц после первой. Кровь забирали из яремной вены через 7 дней после второй иммунизации. Сыворотки животных одной группы объединяли и определяли титр с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), используя в качестве антигена сорбированные на твердой фазе рекомбинантные белки и планшет из коммерческого набора «Пептоскрин-2», с сорбированными синтетическими пептидами ВИЧ. Контрольную сыворотку получали от неиммунизированных животных. 2.2.2. Твердофазный непрямой иммунофементный анализ. Антигены rec p24, rec trx gp41, rec (24-41) и rec trx p24 в концентрации 8 мкг/мл сорбировали по отдельности на полистироловых планшетах фирмы «Greiner» в 0,05 М растворе карбонантно - бикарбонантного буфера рН 9,5, внося по 100 мкл раствора антигена в лунку. Выдерживали

48 часов при комнатной температуре во влажной

камере. После окончания инкубации содержимое лунок стряхивали. Планшеты подсушивали, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаги. Готовили ряд последовательных двоичных разведений сывороток иммунизированных животных на 0,01 М фосфатно-солевом буфере (0,45М NaCl) pH 7,2, содержащем 0,05% раствора Твин-20 (ФСБ-Т) и 0,02% бычьего сывороточного альбумина (ФСБАТ). Образцы вносили по 100 мкл в лунку в трех параллелях для каждого разведения, и выдерживали 60 мин при 37° С. По окончании инкубации, лунки пятикратно отмывали 46

ФСБ-Т для удаления несвязавшихся антител, внося в каждую лунку не менее 350 мкл отмывающего раствора. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат пероксидазы хрена (ПХ)

с антителами кролика против иммуноглобулинов мыши,

любезно предоставленный сотрудником Института иммунологии Г.А. Игнатьевой. Конъюгат в рабочем разведении на ФСБ-АТ вносили по 100 мкл в лунку. Инкубировали 60 мин при 37° С. После этого лунки вновь промывали пятикратно ФСБ-Т, реакцию проявляли внесением в каждую лунку 0,2 % раствора ортофенилендиамина в субстратном буфере рН 5,1 (11,13 г 5,5 водного цитрата натрия, 3,46 г лимонной кислоты, 0,93 г пербората натрия растворяли в 0,5 литров дистиллированной воды). Развитие цветной ферментативной

реакции останавливали после 15-минутной

инкубации в темноте, внося в каждую лунку 50 мкл 10% раствора серной кислоты. Учет реакции производили с помощью спектрофотометра «Reader 530» (Organon Teknika) при длине волны 492 нм. Результат считали положительным, если среднее значение оптической плотности по трем параллелям на 25% превышало оптическую плотность негативного контроля в разведении 1:100. ИФА на наборе «Пептоскрин-2» ставили согласно инструкции приложенной к набору. Были использованы растворы из набора. В качестве детектирующего агента использовался конъюгат пероксидазы хрена (ПХ) с антителами кролика против иммуноглобулинов мыши, любезно предоставленные сотрудником Института иммунологии Г.А. Игнатьевой. 2.2.3. Иммунометрический ( «сэндвич») метод ИФА. Антигены rec p24, rec trx gp41 и rec (24-41) в концентрации 2 мкг/мл сорбировали по отдельности на полистироловых планшетах фирмы «Greiner» в 0,05 М растворе карбонантно - бикарбонантного буфера, рН 9,5, внося по 100 мкл в лунку, и выдерживали 48 часов при комнатной температуре во влажной камере. После окончания инкубации содержимое лунок стряхивали. Планшеты подсушивали, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаги. Готовили ряд последовательных двоичных разведений сывороток иммунизированных животных на растворе для разведения образцов (0,05 М. Tris HCl, pH 7,2-7,4, 0,8 М NaCl, 10% фетальная сыворотка). Образцы вносили по 100 мкл в лунку, по три параллели для 47

каждого разведения и инкубировали в течение 60 мин при 37 °С.

По окончании

инкубации лунки пятикратно отмывали ФСБ-Т для удаления несвязавшихся антител, внося в каждую лунку не менее 350 мкл отмывающего раствора. Связывание специфических антител с антигенным сорбентом определяли с помощью конъюгата антигена с пероксидазой хрена (ПХ) (rec (24-41)-ПХ), любезно предоставленного сотрудником ИЭК ВКНПК Е.Е. Ефремовым. Конъюгат в рабочем разведении на растворе для разведения конъюгата (0,05 М. TrisHCl, pH 7,2-7,4, 0,8М NaCl, 0,125% казеина), вносили по 100 мкл в лунки и инкубировали в течение 60 мин при 37° С. Лунки отмывали пятикратно раствором ФСБ-Т от несвязавшегося конъюгата. Реакцию проявляли внесением в каждую лунку 0,2 % раствора ортофенилендиамина в субстратном буфере. Развитие цветной ферментативной реакции останавливали после 15 минутной инкубации в темноте, внося в каждую лунку 50 мкл 10% раствора серной кислоты. Учет реакции производили с помощью спектрофотометра «Reader 530» (Organon Teknika) при длине волны 492 нм. Результат считали положительным, если среднее значение оптической плотности параллели на 25% превышало оптическую плотность негативного контроля в разведении 1:100. 2.2.4. Иммунизация кроликов. Кроликов породы Шиншилла, весом 2 кг иммунизировали дважды подкожно антигеном rec(24-41) в физиологическом растворе (1 мг антигена на животное). Повторную иммунизацию производили через 4 недели после первой. Кровь брали из ушной вены через 9 дней после второй иммунизации. 2.2.5. Постановка твердофазного иммуноферментного анализа. Анализ проводили так же, как описано в пп. 2.2.2. В качестве детектирующего агента использовался конъюгат А-белка золотистого стафилококка с пероксидазой хрена в рабочем разведении.

48

2.2.6. Постановка иммунометрического «сэндвич» метода ИФА. Анализ проводили так же, как описано в пп 2.2.3. 2.3. Методика изучения иммуногенности белка rec(24-41) при введении высоких и низких доз препарата. Мышей самок линии (CBA x C57 B1/6) F1 весом 16-18 г разбивали на группы и иммунизировали внутрибрюшинно очищенным препаратом белка rec (24-41) и р24 в физиологическом растворе в дозе 10 и 100 мкг антигена на животное. Вторую иммунизацию проводили через месяц после первой, третью через два месяца после второй. Кровь собирали из яремной вены через 14 дней после первой иммунизации и через 7 дней после второй и третьей. Сыворотки получали как обычно. Титр антител в сыворотке каждого животного определяли с помощью ИФА. ИФА проводили как описано в пп.2.2.2. 2.4.

Методика

изучения

иммуногенности

конъюгата

химерного

рекомбинантного белка rec (24-41) c Полиоксидонием rec (24-41) – ПО. Мышей самок линии (CBA x C57 B1/6) F1 весом 16-18 г иммунизировали внутрибрюшинно следующими препаратами: очищенным белком rec (24-41) физиологическом растворе, его конъюгатом

в

с Полиоксидонием в физиологическом

растворе, белком, прошедшим стадии конъюгации, но без добавления Полиоксидония в реакционную смесь в физиологическом растворе и белком в ПАФ в дозе 10 мкг и 100 мкг антигена (по белку) на животное в 0,5 мл раствора. В каждой группе было по 15 мышей. Вторую иммунизацию проводили через 1 месяц после первой. Кровь забирали из яремной вены на 14 день после первой иммунизации и на 7 день после второй иммунизации. Сыворотки получали как обычно. Титр антител в сыворотке каждого животного определяли с помощью ИФА. ИФА проводили как описано в пп.2.2.2.

49

2.5. Проведение иммуноблота с сыворотками животных, иммунизированных rec(24-41). Специфическую активность сывороток мышей после второй иммунизации rec (24-41) (см.пп. 2.1.)

определяли методом иммуноблота, используя полоски

нитроцеллюлелозы из коммерческого набора New Lav Blot1 (Sanofi Pasteur, Франция, cat. №72251), где в качестве антигена используются белки культурального вируса ВИЧ. Полоски нитроцеллюлозы помещали в лунку планшета для иммуноблота из набора New LAV Blot1, добавляли 2 мл раствора ФСБ-АТ и выдерживали 5 минут при покачивании на

шейкере.

В

лунки

добавляли

по

0,02

мл

объединенных

сывороток

иммунизированных белком rec (24-41) и неиммунизированных животных (в качестве негативного контроля) и выдерживали в течение 2 часов при покачивании при температуре 18-25° С. По окончании инкубации полоски промывали три раза от несвязавшихся антител, внося в лунку по 2 мл ФСБ-Т, каждый раз выдерживая в течение 5 минут при покачивании. Далее в лунки добавляли по 2 мл раствора конъюгата: конъюгат козьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена (Sigma, cat. № А 4416). Конъюгат вносили в рабочем разведении на ФСБ-АТ и выдерживали

течение 1 часа при покачивании при температуре 18-25 ° С. Лунки

промывали три раза раствором ФСБ-Т. Реакцию проявляли, внося в каждую лунку 2 мл субстратного буферного раствора (К 19 мл цитратно – фосфатного буферного раствора добавляли 0,1 мл 10% раствора Твин 20 добавляли 1 мл 1% раствора 4 хлор нафтола на 96%этиловом спирте и 0,1 мл 3% раствора гидроперита). Выдерживали 10-15 мин при температуре 18-25° С при покачивании. Реакцию останавливали, промывая

5 раз

дистиллированной водой, каждый раз внося в лунку 2 мл воды. В качестве положительного и отрицательного контроля использовали соответствующие сыворотки людей из набора New LAV Blot. Реакцию проводили, используя

реактивы

коммерческого набора. Реакцию оценивали визуально, сравнивая картину иммуноблота сыворотки иммунизированного животного с

фотографией картины иммуноблота

сыворотки инфицированного ВИЧ человека приложенной к набору.

50

2.6. Проведение ИФА c сыворотками животных, иммунизированных rec(24-41) с использованием антигенов коммерческих теcт-систем. Мышей самок линии (CBA x C57 B1/6) F1 весом 16-18 г иммунизировали внут рибрюшинно очищенным препаратом белка rec (24-41) в физиологическом растворе в дозе 50 мкг антигена на животное. Вторую иммунизацию проводили через месяц после первой. Кровь собирали из яремной вены через 14 дней после первой иммунизации и через 7 дней после второй и третьей. Сыворотки получали как обычно. Титр антител в сыворотке каждого животного определяли в ИФА. В работе были использованы планшеты следующих тест-систем: Диагностикум

Антиген на твердой фазе

ИФА-АНТИ-ВИЧ-

Рекомбинантные белки gp160, gp 120, gp41 (env ВИЧ1), р17, р24 и р15 (gag ВИЧ1),

УНИФ

gp120 и gp41 (env-ВИЧ1 группы 0), р17 и р24 (gag ВИЧ1 группы 0), gp40 и gp38 env ВИЧ2 Комби Бест антиВИЧ-1+2

Рекомбинантные белки р24, gp41 ВИЧ1 и gp32 ВИЧ2

Пептоскрин 2

Пептиды gp41, gp120 ВИЧ1 и gp32 ВИЧ2

Рекомби Бест

Рекомбинантные белки Gag1, Env-1, Env-2 : p15,p17, p24, gp120 ВИЧ1 и gp38 ВИЧ2

анти-ВИЧ-1+2 Авиценна

Пептиды gp41,gp120, p24 ВИЧ1, gp36 ВИЧ2

Планшеты готовили к работе согласно инструкциям, приложенным к наборам. Готовили серийные разведения сывороток мышей на рабочем растворе для разведения проб и конъюгата. ИФА проводили согласно пп 2.2.2.

51

2.7. Проведение теста нейтрализации. 2.7.1. Иммунизация животных. Мышей самок линии (CBA x C57 B1/6) F1 весом 16-18 г иммунизировали четыре раза rec (24-41), иммунизирующая доза составила 100 мкг антигена на животное. При первой иммунизации антиген вводили в ПАФ подкожно, при второй – в неполном адъюванте Фрейнда подкожно, при третьей и четвертой антиген вводили в физиологическом растворе внутрибрюшинно. Интервалы между первой, второй и третьей иммунизацией были по 1 месяцу, между третьей и четвертой – 2 месяца. В группе было 10 мышей. Кровь собирали из яремной вены на 7 день после четвертой иммунизации в стерильных условиях. Сыворотку получали как обычно Полученную сыворотку объединяли. В качестве негативного контроля использовали объединенную сыворотку неиммунных мышей, также полученную в стерильных условиях. 2.7.2. Постановка реакции нейтрализации. Нейтрализующую активность сывороток определяли в тесте нейтрализации на модели острой инфекции лимфобластоидных клеток МТ4 ВИЧ-1, при этом использовался референс-штамм ВИЧ-1 IIIВ, активно реплицирующийся в Тлимфобластоидных клеточных линиях. Сыворотку мышей подвергали тепловой обработке при 56 °С в течении 30 минут для инактивации белков системы комплемента. В лунку 24-луночного планшета одновременно вносили сыворотку и вирус-содержащую жидкость (100 TCID50) в культуру клеток МТ4 (300 тыс. клеток на лунку) и доводили объем до 1 мл ростовой средой (RPMI 1640 (Sigma), 10 % фетальной сыворотки (Sigma), 2 мМ L - глютамин (Sigma)). Каждое разведение сыворотки анализировали в трех параллелях. Планшеты инкубировали 18 часов при 37 °С в 5% СО2 , а затем отмывали путем низкоскоростного центрифугирования 7 минут при 1100 об/мин. Удаляли надосадочную жидкость, осадок клеток ресуспендировали в 1 мл свежей ростовой среды. Планшеты инкубировали при 37 °С в 5 % СО2. На третьи сутки из лунок отбирали 0,5 мл ростовой среды для определения концентрации вирусного антигена р24. Концентрацию вирусного антигена 52

р24 определяли с помощью коммерческого набора Innogenetics согласно приложенной инструкции. Индекс нейтрализации рассчитывали по формуле

NI=

ODNegSer –ODTestSer ---------------------------- *100% ODNegSer – ODCellControl

Где: ODNegSer – средняя оптическая плотность по трем параллелям контроля с негативной сывороткой в ИФА ODTestSer– средняя оптическая плотность образца по трем параллелям в ИФА ODCellControl– средняя оптическая плотность контроля клеток без вируса по трем параллелям в ИФА. 2.8. Проведение реакции бластной трансформации лимфоцитов. Мышей самок линии (CBA x C57 B1/6) F1 весом 16-18 г иммунизировали rec(2441) в ПАФ, подкожно, в дозе 50 мкг антигена на животное. Через 30 дней мышам вводили внутрибрюшинно 500 мкг антигена в физиологическом растворе. Через 48 и 72 часов после второй иммунизации из животных выделяли клетки селезенки и лимфатических узлов. Клетки культивировали в 24 луночных планшетах с плотностью культуры 5х106 клеток на лунку в ростовой среде (DMEM с 20% FCS) и 3Н-тимидином (50 мкл/лунку раствора 3Н-тимидином с активностью 100 мкКю/мл) 12 часов при 37°С в 5% СО2 в трех параллелях. По завершении инкубации клетки переносили в круглодонные планшеты 96-луночного планшета с плотностью культуры 1х106 клеток, оттуда на харвестер. Включение 3Н- тимидина считали на β-счетчике в толуоловом сцинтилляторе.

53

2.9. Проведение

ИФА и иммуноблота для изучения специфической

активности rec(24-41). 2.9.1. Проведение ИФА с сыворотками людей, инфицированных ВИЧ1. В работе были использованы сыворотки содержащими антитела к ВИЧ1 (стандартная панель сывороток производства Медико-биологического союза и нативные сыворотки людей, инфицированных ВИЧ1, из коллекции Института иммунологии). Отрицательным контролем служили сыворотки, не содержащие антитела ВИЧ1 (стандартная панель сывороток производства Медико-биологического союза). Раствор, содержащий антиген rec(24-41) в концентрации 16 мкг/мл в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,5 вносили в лунки планшетов и выдерживали 40 часов. Раствор удаляли, и планшеты высушивали в течение 2 часов при комнатной температуре. В лунки вносили сыворотки ВИЧ–инфицированных или сыворотки неинфицированных людей, разведенные 1:10 в растворе для разведения проб в объеме 100 мкл в трех параллелях и выдерживали в течение 1 часа при температуре 37°С. Далее лунки промывали 4 раза ФСБ-Т. Затем в лунки

вносили

по 100 мкл конъюгата

пероксидазы хрена с антителами против γ-цепи иммуноглобулина человека (Sigma, cat. № А 8775) в рабочем разведении 1:5000 на растворе для разведения конъюгата и выдерживали в течение 1 часа при температуре 37 °С. Далее лунки промывали 4 раза ФСБ-Т.

Реакцию

проявляли

внесением

в

каждую

лунку

0,2%

раствора

ортофенилендиамина в субстратном буфере рН 5,0 (11,13 г 5,5 водного цитрата натрия, 3,46 г лимонной кислоты, 0,93 г пербората натрия растворяли в 0,5 литров дистиллированной воды). Развитие цветной ферментативной реакции останавливали после 15 минутной инкубации в темноте, внося в каждую лунку 50 мкл 10% раствора серной кислоты. Учет реакции производили с помощью спектрофотометра «Reader 530» (Organon Teknika) при длине волны 492 нм. Результат считали положительным, если среднее значение оптической плотности параллели в разведении 1:10 превышало значение ОП критической (ОП крит). ОП крит рассчитывали по формуле: ОП крит.= ОП нег.+0,250 .

54

Раствор для разведения проб, рН 8,0. 300 г мочевины, 15 г. Tris, 58,5 г хлорида натрия, 50 мл 500мМ ЭДТА, 12,5 мл 10 % раствора Triton X-100, 5 мл Kathon CG, 5г бычьего сывороточного альбумина, 187,5 мл 10 % раствора коллоидного казеина в 2,5 л дистиллированной воды. Раствор для разведения конъюгата, рН 7,0 4,33 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, 2,45 г натрия фосфорнокислого

однозамещенного 2-водного,73,13 г хлорида натрия, 25 мл 10%

раствора Triton X-100, 5 мл Kathon CG, 27,5 мг гексацианоферрата калия, 625 мг бычьего сывороточного альбумина, 31,25 мл 10% раствора коллоидного казеина в 2,5 л дистиллированной воды. 2.9.2. Проведение ИФА

с поликлональными антителами барана против

вирусного белка р24 из коммерческого набора Genetic Systems HIV-1 Ag EIA . Антиген rec (24-41) в концентрации от 10 мкг/мл до 0,63 нг/мл сорбировали на полистироловых планшетах фирмы «Greiner» в 0,05 М растворе карбонантно бикарбонантного буфера, рН 9,5, внося по 100 мкл раствора в лунку в трех параллелях, выдерживая 48 часов при комнатной температуре во влажной камере. После окончания инкубации содержимое лунок стряхивали, планшеты подсушивали, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге. Далее вносили по 100 мкл в лунку конъюгата 1 из набора Genetic Systems HIV-1 Ag EIA (биотинилированные антитела барана против р24) в рабочем разведении на растворе из набора. Выдерживали 30 мин при температуре 37°С. Планшеты отмывали 5 раз отмывающим раствором из этого набора в рабочем разведении. Затем вносили конъюгат 2 (конъюгат авидина с пероксидазой хрена) по 100 мкл в лунку в рабочем разведении на растворе из коммерческого набора и выдерживали 30 минут при температуре 37°С. Планшеты отмывали 5 раз отмывающим раствором из набора в рабочем разведении. Реакцию проявляли внесением тетраметилбензидина в субстратном буфере из набора. Развитие цветной ферментативной

реакции останавливали после 15 минутной инкубации в

темноте, внося в каждую лунку 50 мкл 10% раствора серной кислоты. Учет реакции производили с помощью спектрофотометра «Reader 530» (Organon Teknika) при длине волны 450 нм. 55

2.9.3. Проведение иммуноблота с сыворотками людей инфицированных ВИЧ1. 2.9.3.1. Проведение электрофореза в полиакриламидном геле. Электрофорез проводили в денатурирующих условиях по методу U.K. Laemmly (1970).

Для

разделения

использовали

disk-электрофорез,

с

концентрацией

фокусирующего геля 4% и разделяющего геля 12%. Толщина геля составляла 0,75 мм. Белок вносили из расчета 170 мкг на лунку геля шириной 68 мм. При подготовке проб использовали 5-кратный диссоциирующий буфер. Растворы антигенов смешивали с диссоциирующим буфером в соотношении 4:1 и прогревали 20 мин. на кипящей водяной бане

Диссоциирующий буфер 5х: SDS - 2г Меркаптоэтанол - 300 мкл 1М Tris HCl рH 6,8 – 1 мл Глицерин – 2 мл 0,5 М ЭДТА – 200 мкл БФС – 5мг

Полиакриаламидный гель Фокусирующий гель, 4%* Разделяющий гель, 12%*

*

Мономеры

0,65 мл

4 мл

Разделяющий буфер

-

2 мл

Фокусирующий буфер

0,4 мл

-

10% SDS

40 мкл

150 мкл

Н2О дистиллированная 2,9 мл

4 мл

10% APS

14 мкл

50 мкл

TEMED

5 мкл

8 мкл

готовили по методике, описанной в Laboratory Manual LKB (1984)

56

Электродный буфер для электофореза: Tris – 3,03 г Глицин – 14,42 г SDS –1 г Н2О дистиллированная – 800 мл Электрофорез вели 1 час при 150 В. Далее белки переносили из геля на нитроцеллюлозу.

Электроперенос Буфер для электропереноса: Tris HCl 25 мМ Глицин 200 мМ Этанол 20% по объему РН 8,4 Перенос вели 45 мин при 200 мА После переноса нитроцеллюлозу выдерживали 12 часов при +4°С в 1% растворе бычьего сыворотчного альбумина. 2.9.3.2. Постановка иммуноблота. Нитроцеллюлозную пластину нарезали на стрипы. Стрипы помещали в лунки планшета для иммуноблота. В каждую лунку добавляли 2 мл раствора ФСБ-АТ и выдерживали 5 минут при покачивании на шейкере. В лунки добавляли по 0,02 мл сыворотки человека инфицированного или неинфицированного ВИЧ1, выдерживали в течение 2 часов при покачивании при температуре 18-25° С. По окончании инкубации стрипы промывали три раза от несвязавшихся антител, внося в лунку по 2 мл ФСБ-Т, каждый раз выдерживая в течение 5 минут при покачивании. Далее в лунки добавляли по 2 мл раствора конъюгата пероксидазы хрена с антителами против γ-цепи иммуноглобулина человека (Sigma, cat. № А 8775). Конъюгаты вносили в рабочем разведении на ФСБ-АТ и выдерживали

течение 1 часа при покачивании при

температуре 18-25 ° С. Лунки промывали три раза раствором ФСБ-Т. Реакцию оявляли, 57

ся в каждую лунку 2 мл субстратного буферного раствора

(к 19 мл цитратно –

фосфатного буферного раствора добавляли 0,1 мл 10% раствора Твин 20, 1 мл 1% раствора 4 хлор нафтола на 96% - ном этиловом спирте и 0,1 мл 3 % раствора гидроперита). Выдерживали 10-15 мин при температуре 18-25 °С при покачивании до появления видимых полос. Реакцию останавливали, промывая 5 раз дистиллированной водой, внося в лунку 2 мл воды.

58

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантных белков ВИЧ1. Нейтрализующие антитела играют важную роль в контролировании ВИЧ инфекции, поскольку предотвращают проникновение вируса в клетку. Основные нейтрализующие

эпитопы

расположены

Нейтрализующие

антитела

могут

быть

на

белках

индуцированы

оболочки при

вируса.

иммунизации

рекомбинантными белками. Отмечено, что эффективность нейтрализации вируса зависит

от

количества

антител

к

нейтрализующему

эпитопу.

Поэтому

потенциальный вакцинный препарат должен не только содержать нейтрализующие эпитопы, но и вызывать образование высоких титров антител, т.е. быть хорошим иммуногеном. Основной целью этого этапа работы был отбор рекомбинантных белков, индуцирующих образование высоких титров специфических антител, которые в дальнейшем могли бы использоваться в качестве потенциального вакцинирующего препарата. В качестве иммунизирующих антигенов были

использованы

следующие рекомбинантные полипептиды, копирующие фрагменты и целые белки ВИЧ1:

rec (24-41)*

Содержит иммунодоминантный фрагмент gp41 и полноразмерный белок р24.

rec p24

Содержит полноразмерный белок р24.

rec trx gp41*

Содержит иммунодоминантный фрагмент gp41 и векторный белок тиоредоксин.

Иммуногенность рекомбинантных белков ВИЧ1 оценивалась по результатам иммунизации лабораторных животных (мышей). В работе были использованы 59

самки мышей линии (CBA x C57 B1/6) F1.

Титр полученных сывороток

определяли в ИФА. Отрицательным контролем служили сыворотки неиммунных животных. Поскольку антиген rec trx gp41 содержал в своем составе, кроме фрагмента белка ВИЧ1 gp41, белок тиоредоксин, то для того, чтобы узнать, не образовались ли антитела на тиоредоксиновую часть белка, при проведении иммуноферментного анализа на твердой фазе помимо рекомбинантных белков, которыми были иммунизированы мыши, был использован рекомбинантный белок rec trx p24, состоящий из полноразмерного белка р24 ВИЧ1 и векторного белка тиоредоксина. Таким образом, белок тиоредоксин входил в состав двух рекомбинантных белков – rec trx gp41 и rec trx р24. Для группы мышей иммунизированных rec(24-41), была проведена оценка иммунного ответа на каждый фрагмент химерного белка (p24 и gp41). Иммунореактивность сывороток мышей, иммунизированных rec (24-41) и rec trx gp41, была проверена также на планшете коммерческого набора «Пептоскрин-2», где в качестве сорбированного на твердой фазе

антигена

используется синтетический пептид sp-35, повторяющий тот же фрагмент gp 41, который содержится в рекомбинантных полипептидах rec (24-41) и rec trx gp41. Результаты определения иммуногенности исследуемых препаратов представлены в таблице 3.1. Таблица 3.1. Титры антител∗ в сыворотках мышей после второй иммунизации рекомбинантными антигенами (иммунизирующая доза 100 мкг антигена на мышь), определенные непрямым ИФА. Иммунизирующий антиген. Антиген на твердой фазе

rec trx gp41

rec p24

rec (24-41)

чистый

антиген

чистый

антиген

чистый

антиген

антиген

+ПАФ

антиген

+ПАФ

антиген

+ПАФ

8000

250 000

-

-

6 400

32 000

rec p24

-

-

25 000

100 000

200 000

500 000

rec (24-41)

-

-

25 000

100 000

200 000

500 000

rec trx p24

8000

250 000

25 000

100 000

200 000

500 000

sp35

200

10 000

-

-

400

-

rec trx gp41

∗

по 15 животных в группе, приведены средние значения 60

Как видно из таблицы, все белки обладали высокой иммуногенностью. Титры иммунных сывороток определенные в ИФА, когда в качестве антигена на твердой фазе использовался rec trx p24, содержавший также векторный белок тиоредоксин, и rec trx gp41 были одинаковыми, следовательно, при иммунизации rec trx gp41 антитела образовались в основном на тиоредоксиновую часть белка. Вероятно, это связано с тем, что тиоредоксиновая часть белка rec trx gp41 имеет большую молекулярную массу, сравнению с фрагментом, повторяющим фрагмент gp41 ВИЧ1, т.е. он является иммунодоминантным. Антиген rec(24-41) вызывал образование высоких титров антител на оба своих фрагмента. Однако титр антител на фрагмент, повторяющий белок р24 и часть gp41 ВИЧ1 был различным (на р24 часть больше). Это связано с тем, что фрагмент р24 имеет большую молекулярную массу по сравнению с фрагментом gp41, что, повидимому, приводит к различию в иммуногенности этих фрагментов. Применение полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) увеличивало титр антител в 2-4 раза в группах животных, иммунизированных белками rec p24 и rec (24-41) и примерно в 40 раз в группе животных, иммунизированной rec trx gp41. Однако в группе животных, иммунизированных rec(24-41) с ПАФ соотношение ответа на gp41 и р24 было такми же (примерно 1:10), как и в случае иммунизации чистым антигеном. Более низкий титр антител к gp41, в случае анализа в ИФА на основе синтетического пептида, по сравнению с рекомбинантным антигеном объясняется стерическими препятствиями – менее выгодными для взаимодействия с антителами формой представления антигенной детерминанты олигопептида на полистироле. Титры антител в сыворотках мышей после второй иммунизации rec(24-41) были определены также иммунометреческим, или «сэндвич», методом ИФА, где в качестве проявляющего агента использовался конъюгированный с пероксидазой хрена рекомбинантный антиген rec(24-41). Результаты исследования представлены в таблице 3.2.

61

Таблица 3.2. Титры антител∗ в сыворотках мышей после второй иммунизации рекомбинантным антигеном rec(24-41) (иммунизирующая доза 100 мкг антигена на мышь), определенные иммунометрическим («сэндвич»)-методом ИФА. Конъюгат - меченный пероксидазой хрена rec(24-41). Антиген на твердой фазе

Титр антител

rec trx gp41

3200

rec p24

1600

rec(24-41)

1600

∗

по 15 животных в группе, приведены средние значения

Иммуногенность рекомбинантного белка rec(24-41) была исследована на кроликах. Кроликов породы «Шиншилла» иммунизировали дважды c интервалом 1 месяц. Иммуногенные свойства препарата анализировали как непрямым, так и иммунометрическим («сэндвич») ИФА. Как и в случае иммунизации мышей, определяли ответ как на целый белок, так и на оба его фрагмента. Результаты приведены в таблицах 3.3 и 3.4. Таблица 3.3. Титры антител в сыворотках кроликов после второй иммунизации

rec(24-41), определенные в твердофазном непрямом ИФА.

Иммунизирующая доза 1 мг антигена на 1 кг веса животного. Антиген на твердой фазе

Титр антител

rec trx gp41

6 400

rec p24

25 000

rec(24-41)

25 000

62

Таблица 3.4. Титр антител в сыворотках кроликов после второй иммунизации rec(24-41), определенные иммунометрическим ИФА. Конъюгат - меченный пероксидазой хрена rec (24-41). Иммунизирующая доза 1 мг антигена на 1 кг веса животного. Антиген на твердой фазе

Титры антител

rec trx gp41

12 800

rec p24

400

rec(24-41)

12 800

Как видно из таблиц 3.3 и 3.4, при иммунизации кроликов белком rec(24-41) были также получены сыворотки с антителами к обеим частям антигена. Как и при иммунизации мышей, уровень антител, определенных непрямым методом ИФА, на фрагмент gp41 и р24 различается. Различия в титрах антител против фрагментов химерного белка, определенных непрямым и иммунометрическим методом ИФА, объясняется, по-видимому, разными условиями представления антигена на твердой фазе и в составе конъюгата и связанной с этим разной доступностью антигенных детерминант. Таким

образом,

полученные

данные

свидетельствуют

о

том,

что

рекомбинантный белок rec(24-41) является высоко активным иммуногеном: он вызывает образование высоких титров антител у разных видов животных на оба своих фрагмента. Кроме того, достоинством этого белка является то, что в нем одновременно присутствуют нейтрализующий эпитоп (часть трансмембранного белка gp41)[184] и эпитопы для CD4+ клеток (на р24) [91]. 3.2. Изучение специфической активности rec(24-41) При создании вакцинных препаратов важно, чтобы строение антигенных детерминат рекомбинантного белка максимально соответствовало вирусному прототипу, т.к. даже небольшие различия могут привести к неэффективному иммунному ответу. В связи с этим мы провели исследование специфической активности

антигена

rec(24-41),

т.е.

63

схожести

строения

его

антигенных

детерминант

с таковыми вирусного прототипа. Исследование проводили,

используя метод твердофазного ИФА и иммуноблота. 3.2.1

Изучение специфической активности rec(24-41) в ИФА.

Специфическую активность рекомбинантного белка rec(24-41) определяли в твердофазном

непрямом

ИФА

по

его

взаимодействию

с

сыворотками,

содержащими антитела к ВИЧ1 (стандартная панель сывороток ОСО 42 28-212-93 производства Медико-биологического союза и сыворотки людей, инфицированных ВИЧ1, из коллекции Института иммунологии) и поликлональными антителами барана к внутреннему белку р24 из коммерческого набора фирмы Bio-Rad. Отрицательным контролем служили сыворотки, не содержащие антитела ВИЧ1 (стандартная панель сывороток ОСО 42 28-214-94 производства Медикобиологического союза). Результаты исследования представлены в таблицах 3.6., 3.7.

64

3.5,

Таблица

3.5.

Иммунореактивность

rec

(24-41)

с

сыворотками,

содержащими антитела к ВИЧ1 из стандартной панели ОСО 42 28-212-93 в твердофазном ИФА (концентрация антигена при сорбции на планшете 10 мкг/мл). № сыворотки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 ОП крит∗∗∗ 1)

ОП среднее в ИФА∗ 0,667 0,458 0,555 0,460 0,939 0,742 0,541 0,692 0,788 0,654 0,456 0,392 0,865 0,600 0,941 0,460 0,381

ОП среднее/ОП критическое 1,7 1,2 1,46 1,2 2,46 1,95 1,42 1,82 2,07 1,72 1,2 1,03 2,27 1,58 2,47 1,21

Результат∗∗ положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный

∗

Среднее значение оптической плотности (ОП) образца в ИФА по двум

параллелям; 2)

∗∗

Результат считается положительным, если отношение оптической плотности

образца к оптической плотности критической >1,0 , а отрицательным - <1,0; 3)∗∗∗∗ Оптическая плотность критическая (ОП крит.) рассчитывается по формуле: ОПнег+0,25

65

Таблица

3.6.

Иммунореактивность

rec(24-41)

с

сыворотками,

не

содержащими антитела к ВИЧ1, из стандартной панели ОСО 42 28-214-94 в твердофазном ИФА (концентрация антигена при сорбции на планшете 10 мкг/мл). № сыворотки ОП среднее в ИФА∗ ОП среднее/ОП критическое 1 0,128 0,33 2 0,118 0,31 3 0,160 0,42 4 0,159 0,42 5 0,128 0,34 6 0,119 0,31 7 0,162 0,43 8 0,133 0,35 9 0,110 0,29 10 0,156 0,41 11 0,116 0,30 12 0,092 0,24 13 0,101 0,27 14 0,133 0,35 15 0,123 0,32 16 0,127 0,33 17 0,113 0,30 18 0,152 0,4 19 0,133 0,35 20 0,205 0,54 ∗∗∗ 0,381 ОП крит

Результат∗∗ отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный отрицательный

1)∗Среднее значение оптической плотности (ОП) образца в ИФА по двум параллелям; 2)∗∗Результат считается положительным, если отношение оптической плотности образца к оптической плотности критической >1,0 , а отрицательным - <1,0; 3)∗∗∗∗ Оптическая плотность критическая (ОП крит.) рассчитывается по формуле: ОПнег+0,25

66

Таблица 3.7. Иммунореактивность rec (24-41) с сыворотками, содержащими антитела к ВИЧ1, из коллекции Института иммунологии в твердофазном ИФА. (концентрация антигена при сорбции на планшете 10 мкг/мл) № сыворотки ОП среднее в ИФА∗ ОП среднее/ОП критическое 1 >3,0 >7,0 2 >3,0 >7,0 3 >3,0 >7,0 4 >3,0 >7,0 5 >3,0 >7,0 6 >3,0 >7,0 7 >3,0 >7,0 8 >3,0 >7,0 9 >3,0 >7,0 10 >3,0 >7,0 11 >3,0 >7,0 12 >3,0 >7,0 13 >3,0 >7,0 14 >3,0 >7,0 15 >3,0 >7,0 16 >3,0 >7,0 17 >3,0 >7,0 18 >3,0 >7,0 19 >3,0 >7,0 20 >3,0 >7,0 ∗∗∗ 0,428 ОП крит

Результат∗∗ положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный положительный

1)∗Среднее значение оптической плотности (ОП) образца в ИФА по двум параллелям; 2)∗∗Результат считается положительным, если отношение оптической плотности образца к оптической плотности критической >1,0 , а отрицательным - <1,0; 3)∗∗∗∗ Оптическая плотность критическая (ОП крит.) рассчитывается по формуле: ОПнег+0,25

67

Как видно из таблиц, белок rec (24-41) специфически взаимодействовал со всеми сыворотками людей, инфицированных ВИЧ1 из коллекции Института иммунологии и со всеми ВИЧ - позитивными образцами стандартной панели ОСО 42 28-212-93. Ни одна из негативных сывороток панели ОСО 42 28-214-94 не прореагировала с rec (24-41), что свидетельствует о специфичности реакции. Коммерческий набор

фирмы Bio-Rad (Genetic SystemsTM HIV-1 Ag EIA)

предназначен для количественного

определения вирусного антигена р24 в

сыворотке, плазме и в культуральном супернатанте с помощью ИФА. В качестве детектирующего реагента в этом наборе используются биотинилированные поликлональные антитела барана к внутреннему белку ВИЧ1 р24 и как проявляющий

агент – конъюгат авидина с пероксидазой хрена. Схема

эксперимента выглядела следующим образом: на твердую фазу полистироловых планшетов сорбировали антиген reс(24-41)

в различных концентрациях. Затем

добавляли поликлональные антивирусные антитела барана, а после инкубации и удаления несвязавшихся антител для детекции этого комплекса вносили второй конъюгат. Реакцию проявляли внесением субстратного буфера. Результаты этого исследования представлены в таблице 3.8. Таблица 3.8. Иммунореактивность химерного рекомбинантного белка rec(24-41) c поликлональными антителами барана к внутреннему белку ВИЧ1 р24. 0,19 Концентрация антигена при 10 5 2,5 1,5 0,75 0,375 мкг/мл сорбции на мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл 190 твердой фазе нг/мл Оптическая >3,000 >3,000 >3,000 >3,000 >3,000 2,796 1,815 Плотность Концентрация антигена при сорбции на твердой фазе Оптическая Плотность

95 нг/мл

1,122

48 нг/мл

24 нг/мл

12 нг/мл

6 нг/мл

3 нг/мл

1,5 нг/мл

1,25 нг/мл

0,63 нг/мл

0,676

0,325

0,193

0,139

0,139

0,094

0,087

0,092

68

Таким образом, поликлональные антитела барана к внутреннему белку р24 ВИЧ1 специфически распознавали р24 в составе рекомбинантного химерного белка rec(24-41) при различных концентрациях антигена на твердой фазе, минимальная определяемая концентрация антигена, сорбированного на твердой фазе, составила 24 нг/мл. Следовательно, белок rec(24-41) специфически взаимодействует с антителами инфицированных ВИЧ1 людей и поликлональными антителами барана к внутреннему белку р24 ВИЧ1 в ИФА. 3.2.2. Изучение специфической активности rec(24-41) в иммуноблоте. Специфическая активность рекомбинантного химерного белка rec(24-41) была изучена в иммуноблоте с сыворотками инфицированных ВИЧ1 людей. Опыт проводили по следующей схеме: проводили электрофорез белка rec(2441) в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и переносили его на нитроцеллюлозу. Нитроцеллюлозу нарезали на стрипы и обрабатывали сывороткой инфицированного

ВИЧ1 человека. Как контроль использовали сыворотку, не

содержащую антитела к ВИЧ1. Реакцию проявляли моноклональными антителами к иммуноглобулину G человека, конъюгированными с пероксидазой хрена. Результаты иммуноблота представлены на рисунке. Как

видно

из

рисунка

3.1.,

иммуноблот

с

сыворотками

людей,

инфицированных ВИЧ1 выявляет две основные фракции антигена: мажорную, представленная мономерами и минорную, представленная димерными формами, образующимися в процессе фолдинга белка. Эти фракции имеют одинаковую иммунореактивность, но различные относительные молекулярные массы. На контрольном стрипе, обработанным сывороткой неинфицированного ВИЧ1 человека, окрашенные полосы не наблюдаются. Следовательно, рекомбинантный антиген специфически распознается антителами людей, инфицированных ВИЧ1 в иммуноблоте. Результаты

проведенных

исследований

свидетельствуют

о

том,

что

антигенные детерминанты химерного рекомбинантного белка rec(24-41) похожи на детерминанты вирусного прототипа, т.к. антитела людей, инфицированных ВИЧ1, 69

специфически взаимодействуют с рекмбинантным белком rec(24-41) в ИФА и иммуноблоте, а поликлональные антитела барана против вирусного р24 специфически взаимодействуют с rec(24-41) в ИФА.

димеры rec(24-41)

мономеры rec (24-41)

2

1

Рисунок 3.1. Взаимодействие антител из сыворотки инфицированного ВИЧ 1 человека с химерным рекомбинантным белком rec(24-41) в иммуноблоте. 1. Стрип обработан сывороткой, не содержащей антитела к ВИЧ1 2. Стрип обработан сывороткой инфицированного ВИЧ1 человека. 70

3.3.

Изучение

специфической

активности

сывороток

мышей,

иммунизированных rec (24-41). Иммунизация рекомбинантными антигенами должна вызывать образование иммунного ответа, специфичность которого была бы максимально похожа на специфичность ответа, вызываемого вирусом. Специфическую активность сывороток мышей, иммунизированных rec(24-41) анализировали в иммуноблоте и ИФА. При проведении иммуноблота использовали нитроцеллюлозные стрипы из коммерческого набора New LavBlot (Sanofi Pasteur), на которые после электрофоретического разделения в SDS-PAAG перенесены белки культурального ВИЧ1. В качестве положительного контроля использовалась сыворотка инфицированного

ВИЧ1 человека, отрицательными контролями

служили сыворотки неинфицированного ВИЧ1 человека и неиммунных мышей. Результаты иммуноблота

приведены на рисунке 3.2. Как видно из рисунка,

антитела, индуцированные у животных в ответ на иммунизацию rec (24-41), узнают белки gp41 и р24 культурального вируса, а также предшественник белка p24 – р55, что подтверждает сходство строения рекомбинантного белка с вирусным прототипом. Таким образом, антитела, индуцированные rec(24-41), распознают

белки

культурального вируса в иммуноблоте, что свидетельствует о том, что химерный рекомбинантный белок вызывает образование антител той же специфичности, что и его вирусный прототип. Иммунореактивность сывороток иммунизированных животных была изучена методом ИФА с использованием планшетов коммерческих диагностических наборов, где в качестве сорбированных антигенов используются рекомбинантные белки и пептиды ВИЧ1, повторяющие фрагменты вирусных белков. Результаты исследований представлены в таблице 3.9.

71

gp160 gp120

p55

p55 gp41

gp41

p34 p24

p24

1

2

3

4

Рисунок 3.2. Результаты иммуноблота сывороток мышей, иммунизированных rec (24-41). Стрип 1 - обработан сывороткой иммунизированного животного. Стрип 2 - негативный контроль (обработан сывороткой неиммунизированного животного). Стрип 3 - позитивный контроль (обработан сывороткой ВИЧ-инфицированного человека). Стрип 4 - негативный контроль (обработан сывороткой ВИЧ-негативного человека).

Таблица

3.9.

Результаты

взаимодействия

антител

в

сыворотках

мышей,

иммунизированных rec (24-41), с рекомбинантными белками и пептидами ВИЧ1, сорбированными на твердой фазе (планшетах) коммерческих диагностических наборов. Диагностикум

Антиген на твердой фазе

ИФА-АНТИ-ВИЧРекомбинантные белки: УНИФ gp160, gp 120, gp41 (env ВИЧ1), р17, р24 и р15 (ЗАО (gag ВИЧ1), gp120 и gp41 (env-ВИЧ1 группы 0), «Диагностические р17 и р24 (gag ВИЧ1 группы 0), gp40 и gp38 env системы», ВИЧ2 Нижний Новгород) Пептоскрин 2 Пептиды: (ЗАО «Амеркард», gp41, gp120 ВИЧ1 и gp32 ВИЧ2 Москва) Рекомби Бест Рекомбинантные белки: анти-ВИЧ-1+2 Gag1, Env-1, Env-2: p15, p17, p24, gp120 ВИЧ1 и (ЗАО «Вектор-Бест», gp38 ВИЧ2 Новосибирск) Авиценна Пептиды: (МЦ «Авиценна», gp41, gp120, p24 ВИЧ1, gp36 ВИЧ2 Москва) ∗ по 10 животных в группе, приведены средние значения

Титр антител в ИФА∗

1: 640

1:10

1:320 1:10

Из приведенной таблицы видно, что антитела, индуцированные rec(24-41), распознавали антигены коммерческих диагностиумов. Титр антител был выше в тех диагностикумах, где в качестве антигена используются рекомбинантные белки ВИЧ (ИФА-АНТИ-ВИЧ-УНИФ и Рекомби Бест анти-ВИЧ-1+2). Разница в титрах в диагностикумах на основе рекомбинантных белков и пептидов объясняется, вероятно, тем, что пептиды короче и представляют не все антигенные детерминанты, по сравнению с рекомбинантными белками. 3.4. Изучение иммунногенности рекомбинантных белков ВИЧ при введении высоких и низких доз антигенов. Отмечено, что при введении больших доз антигена возрастает вероятность развития нежелательных реакции (токсических, анафилактических и.т.д.). Поэтому 73

предпочтительно, чтобы антиген индуцировал образование высоких титров антител

при введении низких доз. В связи с этим была исследована

иммуногенность низких доз рекомбинантных белков. Помимо рекомбинантного белка rec(24-41), был изучен рекомбинантный белок rec р24. Лабораторные животные (мыши) были разбиты на две группы. Первой группе вводили низкие дозы антигена (10 мкг на мышь), второй – высокие (100 мкг на мышь). Животных иммунизировали трижды rec(24-41)

и дважды -

rec р24.

Интервал между первой и второй иммунизацией составил 1 месяц, между второй и третьей 2 месяца. Титр антител в сыворотке крови определяли после каждой иммунизации в непрямом ИФА. Результаты исследований приведены в таблицах 3.10, 3.11. Таблица 3.10. Титры антител* в сыворотках мышей, иммунизированных rec р24, в непрямом ИФА. (иммунизирующие дозы 10 мкг и 100 мкг антигена на животное). Первый ответ Антиген на твердой фазе

Второй ответ

Иммунизирующая доза 10 мкг

100 мкг

10 мкг

100 мкг

rec p24

10

800

400

100 000

rec (24-41)

10

800

400

100 000

∗

по 15 животных в группе, приведены средние значения

Таблица 3.11. Титры антител∗ в сыворотках мышей, иммунизированных rec(24-41), в непрямом ИФА.

(иммунизирующие дозы 10 мкг и 100 мкг антигена на

животное). Первый ответ Антиген на твердой фазе

Второй ответ

Третий ответ

Иммунизирующая доза 10 мкг

100 мкг

10 мкг

100 мкг

10 мкг

100 мкг

rec trx gp41

10

400

200

6 400

100

16 000

rec p24

100

1600

6400

200 000

8 000

250 000

rec (24-41)

100

1600

6400

200 000

8 000

250 000

∗

по 15 животных в группе, приведены средние значения

74

Как видно из таблицы, иммунизация рекомбинантным белком rec(24-41) вызывала образование высоких титров антител при введении как высокой, так и низкой дозы антигена. Уже при второй иммунизации достигался максимальный ответ, третья иммунизация не давала значительного прироста титра антител, по сравнению со второй: титр антител на часть р24 не изменился, а на gp41 вырос примерно в 3 раза в группе животных, иммунизированных дозой 100 мкг. При введении животным низких доз рекомбинантного белка rec р24, полученный титр антител был примерно в 10 раз меньше, по сравнению с rec(24-41). Разница в титрах вызываемых введением низких доз антигенов р24 и rec(24-41) объясняется наличием гидрофобной части на N-конце rec(24-41), что приводит к образованию мономерных и димерных форм белка, что, в свою очередь,

способствует

увеличению его иммуногенности. Таким образом, rec(24-41) является лучшим иммуногеном по сравнению с rec р24. 3.5. Изучение иммуногенных свойств конъюгата рекомбинантного белка rec (24-41) с Полиоксидонием. Полиоксидоний является высокомолекулярным физиологически активным соединением обладающим выраженной иммунотропностью. По химической структуре это сополимер N-окиси-1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1б4этиленпиперазиния бромида. Мишенями для Полиоксидония являются клетки фагоцитарной системы: моноциты и фагоциты. Взаимодействие Полиоксидония с нейтрофилами и моноцитами ведет к изменению к их функциональной активности, проявляющееся в усилении синтеза цитокинов и фагоцитоза. Клетками-мишенями для Полиоксидония in vitro являются прежде всего факторы естественной резистентности: моноциты/макрофаги, нейтрофилы и НК-клетки, факторы ранней защиты организма от инфекции. Так как развитие любого иммунного ответа начинается с клеток моноцитарно - макрофогальной системы, и так как цитокины, продуцируемые моноцитами/макрофагами, обладают плейтропным эффектом, то усиление под влиянием Полиоксидония их функциональной активности ведет к активации и клеточного и гуморального иммунитета. При введение Полиоксидония

75

совместно с низкими дозами антигена происходит усиление синтеза антител к этому антигену в 5-10 раз по сравнению с контролем [1]. Иммуногенные свойства конъюгата Полиоксидония белком rec(24-41)

с рекомбинантным

были исследованы на лабораторных животных. Животные

(мыши) были разбиты на две группы. Первой группе вводили 10 мкг (в расчете на белок) конъюгированного с Полиоксидонием антигена, второй – 100 мкг. Животных иммунизировали дважды. Интервал между иммунизациями составил 1 месяц. В качестве контролей использовались: белок, прошедший все стадии конъюгации, но без добавления Полиоксидония в реакционную смесь (для того, чтобы проверить - не модифицируется ли белок карбодиимидом в процессе конъюгации [rec (24-41) обр.]);

антиген

в ПАФ и нативный белок в тех же

иммунизирующих дозах. Результаты этих экспериментов приведены в таблицах 3.12, 3.13, 3.14.. Таблица 3.12. Титры антител∗ в сыворотках мышей после первой иммунизации чистым rec(24-41), его конъюгатом с Полиоксидонием [rec(24-41)-ПО], белком, прошедшим все стадии конъюгации, но без добавления Полиоксидония в реакционную смесь [rec(24-41) обр.] и нативного белка в ПАФ, определенные непрямым ИФА. Иммунизирующие дозы -10 мкг антигена на животное. Антиген на твердой фазе

Иммунизирующий антиген rec (24-41)

rec (24-41)-ПО

rec (24-41) обр.

rec (24-41) в ПАФ

rec trx gp41

10

10

10

100

rec p24

100

400

100

1600

rec (24-41) 100 400 100 1600 ∗ по 15 животных в группе, приведены средние значения по трем сериям опытов

76

Таблица 3.13. Титры антител∗ в сыворотках мышей после второй иммунизации чистым rec(24-41), его конъюгатом с Полиоксидонием [rec(24-41)-ПО], белком, прошедшим все стадии конъюгации, но без добавления Полиоксидония в реакционную смесь [rec(24-41) обр.] и нативного белка в ПАФ, определенные непрямым ИФА. Иммунизирующие дозы -10 мкг антигена на животное. Антиген на твердой фазе

Иммунизирующий антиген rec(24-41)

rec(24-41)-ПО

rec(24-41) обр.

rec(24-41) в ПАФ

rec trx gp41

200

1600

100

6 400

rec p24

6400

50 000

12 800

200 000

rec (24-41) 6400 50 000 12 800 200 000 ∗ по 15 животных в группе, приведены средние значения по трем сериям опытов Сравнение результатов, приведенных в таблицах 3.12 и 3.13, показывает, что применение

Полиоксидония

способствовало

повышению

иммуногенности

препарата при иммунизации животных низкими дозами. Так, титр сывороток в ИФА, в группе животных после второй иммунизации низкими дозами конъюгата с Полиоксидонием был примерно в 10 раз выше, по сравнению с группой, иммунизированной

нативным белком и белком, прошедшим все стадии

конъюгации, но без добавления Полиоксидония в реакционную смесь. Во всех группах сохраняется соотношение титров антител на gp41 и р24 часть (1:30). Это свидетельствует о том, что конъюгация рекомбинантного белка c Полиоксидонием способствует росту титров антител, т.е. увеличивает иммуногенность препарата. Кроме того, нами была изучена иммуногенность конъюгата

белка с

Полиоксидонием при введении высоких доз препаратов. Использовались те же контроли, что и при введении низких доз. Результаты экспериментов представлены в таблице.

77

Таблица 3.14. Титры антител∗ в сыворотках мышей после второй иммунизации чистым rec(24-41), его конъюгатом с Полиоксидонием [rec(24-41)-ПО], белком, прошедшим все стадии конъюгации, но без добавления Полиоксидония в реакционную смесь [rec(24-41) обр.] и нативного белка в ПАФ, определенные непрямым ИФА. Иммунизирующие дозы -100 мкг антигена на животное. Антиген на твердой фазе rec trx gp41 Rec p24

Иммунизирующий антиген rec(24-41)

re (24-41)-ПО

rec(24-41) обр*

rec(24-41) в ПАФ

6 400

3 200

3 200

3 200

200 000

100 000

100 000

500 000

rec(24-41) 200 000 100 000 100 000 500 000 ∗ по 15 животных в группе, приведены средние значения по трем сериям опытов Как видно из таблицы при введении высоких доз антигена не наблюдалось значительной разницы между титрами

антител в группах, которым вводился

нативный антиген, его конъюгат с Полиоксидонием или белок, прошедший все стадии конъюгации, но без добавления Полиоксидония в реакционную смесь. Применение ПАФ способствует лишь незначительному приросту титра антител на р24 часть белка. Вероятно, эти результаты объясняются тем, что белок rec(24-41) является хорошим иммуногеном сам по себе и введение высоких доз вызывает максимальную

активацию

иммунной

системы,

и

поэтому

применение

иммуностимуляторов не дает заметного прироста иммунного ответа. Во всех группах иммунизированных животных (опытных и контрольных), при введении высоких и низких доз антигенов, наблюдается различия в титрах антител в ответ на фрагменты р24 и gp41. Таким

образом,

применение

Полиоксидония

в

составе

конъюгата

способствует увеличению иммуногенности антигена при иммунизации низкими дозами, что позволяет снизить иммунизирующую дозу препарата. 3.6. Исследование нейтрализующей активности сывороток мышей, иммунизированных rec (24-41). Нейтрализующие антитела играют важную роль в контролировании инфекции ВИЧ. Отмечено, что у людей с высокой нейтрализующей активностью сывороток 78

наблюдается медленное развитие болезни и хорошее самочувствие. У нативного вируса нейтрализующие эпитопы, как правило, являются слабыми иммуногенами, что

позволяет

Предполагается,

вирусу что

избежать применение

действия

иммунного

рекомбинантных

ответа

белков,

хозяина.

в

которых

нейтрализующие эпитопы были бы представлены в иммунодоминантной форме, позволило бы индуцировать образование нейтрализующих антител. [ 173 ] В связи с этим мы исследовали нейтрализующую активность сывороток мышей, иммунизированных rec(24-41). Нейтрализующую активность определяли в тесте нейтрализации на модели острой инфекции лимфобластоидных клеток МТ4. При этом использовался референс - штамм ВИЧ1 III B, который активно реплицируется в Т лимфобластоидных клеточных линиях in vitro. Сыворотки с нейтрализующей активностью подавляют размножение вируса в клетках, в результате в присутствии сывороток снижается концентрация ВИЧ1 в культуре, о чем можно судить по снижению концентрации антигена р24 в культуральной среде. Сыворотки

иммунных

мышей

инкубировали

совместно

с

вирусом.

Нейтрализующую активность определяли по снижению концентрации вирусного белка р24 в тех лунках, где вирус инкубировался совместно с иммунными сыворотками, по сравнению с лунками, в которых была сыворотка неиммунных мышей.

В

качестве

позитивного

контроля

использовали

сыворотки

инфицированных ВИЧ1 людей, имеющие сильную нейтрализующую активность. Концентрацию вирусного белка р24 определяли на третьи сутки после начала инкубации методом ИФА анализа с применением набора Innogenetics. При этом ожидали, что оптическая плотность (ОП) в ИФА сывороток с нейтрализующей активностью окажется ниже, по сравнению с ОП сывороток, не обладающих ею. Результаты экспериментов приведены в таблице 3.15.

79

Таблица 3.15. Нейтрализующая активность гипериммунных сывороток мышей, иммунизированных rec(24-41) и инфицированного ВИЧ1 человека.

разведение сыворотки

∗

ОП в ИФА индекс нейтрализации ∗

Иммунная мышь

Интактная мышь

Инфицированный ВИЧ1 человек

Неинфицированный ВИЧ1 человек

1:50

1:10

1:10

1:10

0,871

1,453

0,569

1,616

54,9%

-

81,7%

-

среднее значение по трем параллелям

Как видно из таблицы, ОП в ИФА сывороток иммунных мышей была ниже по сравнению с сыворотками интактных мышей. т.е. иммунные сыворотки обладали нейтрализующей активностью. Таким образом, иммуннизация rec(24-41) вызывает у животных образование антител, нейтрализующих

ВИЧ1.

При разведении

сыворотки 1:50 индекс нейтрализации равнялся 54,9%. 3.7.

Изучение

пролиферативной

активности

клеток,

животных

иммунизированных rec (24-41) Показано, что у инфицированных ВИЧ людей уровень пролиферации лимфоцитов к внутреннему белку вируса р24 обратно коррелирует с уровнем вируса в крови. Кроме того, уровень активации CD8+ лимфоцитов зависит от уровня активации CD4+ лимфоцитов. В связи с этим, в этой части работы был изучен лимфопролиферативный ответ, вызываемый рекомбинантным белком rec(24-41). Опыт проводился по следующей схеме: мышей иммунизировали rec(24-41) в ПАФ подкожно в дозе 50 мкг антигена на животное. Через 30 дней мышам вводили внутрибрюшинно 500 мкг антигена в физиологическом растворе. Через 48 и 72 часов после повторного введения антигена из животных выделяли в культуру клетки селезенки и лимфатических узлов. Пролиферативную активность клеток определяли по включению 3Н-тимидина и визуально по образованию бластов в культуре клеток с помощью инвертируемого микроскопа. Негативным контролем служили неиммунные мыши. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 3.16 .

80

Таблица 3.16 Включение

3

Н-тимидина через 48 часов после иммунизации

животных.

∗

Экспериментальная группа

cpm на 106 клеток ∗

Клетки селезенки иммунных мышей

10 000± 300

Клетки селезенки интактных мышей

1000 ±50

Клетки лимфоузлов иммунных мышей

5000±100

Клетки лимфоузлов интактных мышей

600±100

среднее по трем параллелям

Таблица 3.17. Включение

3

Н-тимидина через 72 часов после иммунизации

животных.

∗

Экспериментальная группа

cpm на 106 клеток∗

Клетки селезенки иммунных мышей

2200±200

Клетки селезенки интактных мышей

2200±500

Клетки лимфоузлов иммунных мышей

1800±150

Клетки лимфоузлов интактных мышей

1500±50

среднее по трем параллелям Как видно из таблиц, сигнал клеток иммунных животных был в 10 раз выше

по сравнению с сигналом клеток неимунных животных через 48 часов после введения антигена. Через 72 часа после введения антигена разница в сигналах не наблюдалась, т.к. S-фаза митоза миновала.

Визуально в обеих группах

у

иммунных мышей наблюдалось образование бластов, тогда как в культурах лимфоцитов

интактных

мышей

бласты

отсутствовали.

Таким

образом,

иммунизация рекомбинантным антигеном вызывает антиген - специфическую пролиферацию у животных.

81

Заключение Основная трудность, которая возникает при разработке вакцины против ВИЧ/СПИД – то, что, несмотря на детально изученный патогенез инфекции ВИЧ, неизвестны иммунные корреляты защиты против вируса. До сих пор не найдены достоверные случаи излечивания инфицированных ВИЧ. Однако показано, что в некоторых случая иммунная система способна контролировать инфекцию ВИЧ, посредством

клеточного

(ВИЧ–специфические

ЦТЛ)

и

гуморального

(нейтрализующие антитела) иммунного ответа [19,76]. Кроме того, обнаружены генетические факторы устойчивости к ВИЧ-инфекции, такие как мутации в генах, кодирующих ко-рецепторы, кроме того люди с определенными аллелями главного комплекса гистосовместимости I и II типа более устойчивы к заражению ВИЧ [24]. Показаны также неспецифические факторы защиты против ВИЧ, например CD8 антивирусный фактор (CAF) [4, 185]. Все это позволяет надеяться на возможность разработки терапевтической и профилактической вакцины против вируса. Создание терапевтической вакцины

позволило бы понизить уровень вирусной

нагрузки, контролировать инфекцию при отмене или перерыве химиотерапии, привело бы к удешевлению стоимости курса терапии, сократило бы число случаев передачи инфекции половым путем, от матери к ребенку. Вакцина против ВИЧ/СПИД должна индуцировать обе ветви иммунного ответа – гуморальной и клеточной. Вакцина на основе живого аттенуированного вируса была бы идеальной. Однако разработка этого направления сдерживается соображениями безопасности. Поэтому в настоящее время наиболее перспективной считается («прайм-буст») стратегия вакцинации. В этом случае при первой вакцинации («прайм») вводится рекомбинатная плазмида, содержащая некоторые гены вируса, а при второй («буст») – рекомбинантные белки ВИЧ. Это позволяет одновременно индуцировать, как гуморальный, так и клеточный ответ. В ходе нашей работы были изучены и отобраны рекомбинантные белки вируса, копирующие внутреннего и трансмембранного белка ВИЧ1: rec (24-41), rec p24, rec trx gp41. Проведенные исследования показали, что белок rec(24-41) обладает наилучшими свойствами: он оказался лучшим иммуногеном, в его состав одновременно входят как полноразмерный внутренний белок ВИЧ1 р24, в котором 82

находятся эпитопы для СD4+ лимфоцитов, так и нейтрализующий эпитоп (участок gp41). Химерный полипептид rec(24-41) индуцировал образование высоких титров антител на оба своих фрагмента, при введении как высоких, так и низких доз. При исследовании специфической активности белка было показано, что его антигенные детерминанты похожи на антигенные детерминанты вирусного прототипа. Это было показано в следующих опытах: во-первых белок специфически распознается антителами людей, инфицированных ВИЧ1, во-вторых с ним специфически взаимодействуют антитела барана, иммунизированного белками ВИЧ1.

Кроме

того, рекомбинантный белок вызывает образование антител, специфичность которых, близка специфичности антител, образующихся у инфицированных ВИЧ людей, это

подтверждается, тем, что сыворотки иммунных животных

нейтрализуют культуральный штамм ВИЧ1 in vitro и распознают белки культурального вируса в иммуноблоте. Иммунизация белком вызывает сильный лимфопролиферативный ответ in vivo у лабораторных животных. Таким образом, рекомбинантный белок rec(24-41) является перспективным иммуногеном сам по себе, а также может быть использован при второй иммунизации по схеме «прайм-буст».

83

ВЫВОДЫ. 1. Показано,

что

рекомбинантный

химерный

белок

ВИЧ1

rec(24-41)

индуцирует сильный иммунный ответ на оба свои участка (р24 и gp41) при иммунизации как высокими, так и низкими дозами. 2. Антитела, индуцированные у животных рекомбинантным антигеном rec(2441),

специфически

взаимодействуют

с

прототипными

белками

культурального вируса. 3. Рекомбинантный

химерный

белок

ВИЧ1

rec(24-41)

индуцирует

у

иммунизированных животных сильный лимфопролиферативный ответ

и

образование антител нейтрализующих ВИЧ1 in vitro. 4. Конъюгация белка с Полиоксидонием позволяет увеличить иммуногенность и снизить дозу вакцинирующего препарата.

84

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИФА -

Иммуноферментный анализ

ВИЧ -

Вирус иммунодефицита человека

ВИО -

Вирус иммунодефицита обезьян

ВИОЧ -

Вирус иммунодефицита обезьян/ человека

ПМНК -

Периферические мононуклеары крови

СПИД -

Синдром приобретенного иммунодефицита

85

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. 2. 3.

4 5

6

7 8

9

10

11. 12 13

Пинегин. Б.В. Полиолксидоний-новое поколение иммуномодуляторов с известной структурой и механизмом действия. г. Москва. 2000 Amara RR, Villinger F, Altman JD et al. Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine. Science 2001 Apr 6;292(5514):69-74 Arthur L. O., Bess J. W. J., Sowder R. C., Benveniste R. E., Mann D. L., Chermann J. C.,Henderson L. E. Cellular proteins bound to immunodeficiency viruses: implications for pathogenesis and vaccines. Science-1992-V. 258-P.1935-1938. Barker E. CD8+ cell-derived anti-human immunodeficiency virus inhibitory factor. J Infect Dis 1999 May;179 Suppl 3:S485-8 Barouch DH, Santra S, Schmitz JE, Kuroda MJ, Fu TM, Wagner W et al. Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokine-augmented DNA vaccination. Science 2000 Oct 20;290(5491):48692 Barouch DH, Craiu A, Kuroda MJ, Schmitz JE, Zheng XX, Santra S,Frost JD, Krivulka GR, Lifton MA, Crabbs CL et al.: Augmentation of immune responses to HIV-1 and simian immunodeficiency virus DNA vaccines by IL-2/Ig plasmid administration in rhesus monkeys. Proc Nat/ Acad Sci USA 2000-V. 97-P.4192-4197. Betts MR, Yusim K, Koup RA. Optimal Antigens for HIV Vaccines Based on CD8+ T Response, Protein Length, and Sequence Variability. DNA Cell Biol. 2002 Sep;21(9):665-70 Berman PW, Huang W, Riddle L, Gray AM, Wrin T, Vennari J, Johnson A, Klaussen M, Prashad H, Kohne C, deWit C, Gregory TJ. Development of bivalent (B/E) vaccines able to neutralize CCR5-dependent viruses from the United States and Thailand. Virology 1999-V. 265-P.1-9. Berman PW, Groopman JE, Gregory T, Clapham PR, Weiss RA, Ferriani R, Riddle L, Shimasaki C, Lucas C, Lasky LA, et al. Human immunodeficiency virus type 1 challenge of chimpanzees immunized with recombinant envelope glycoprotein gp120. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988 Jul;85(14):5200-4 Belshe RB, Graham BS, Keefer MC, et al. Neutralizing antibodies to HIV-1 in seronegative volunteers immunized with recombinant gp120 from the MN strain of HIV-1. NIAID AIDS Vaccine Clinical Trials Network. JAMA 1994V.272-P.475480. Belshe RB, Clements ML, Dolin R, et al. Safety and immunogenicity of a fully glycosylated recombinant gp160 human immunodeficiency virus type 1 vaccine in subjects at low risk of infection. J Infect Dis 1993; 168:1387-95. Belyakov I. M. et al., paper presented at AIDS Vaccines 2001, Foundation for AIDS Vaccine Research and Development, Philadelphia, PA, 5-8 September 2001, Abstract 29. Belyakov I. M et al., paper presented at AIDS Vaccines in the New Millennium, Keystone Symposia, Keystone, CO, 28 March to 3 April 2001, Abstract 402. 86

14 15 16

17

18

19 20 21 22

23

24 25

26

27

Bende S, Johnston MI. Immunization. Update: search for an AIDS vaccine. AIDS Read. 2000 Sep;10(9):526-32, 534-8. Review. Binley J, Klasse PJ, Cao Y, Jones I, Markowitz M, Ho DD and Moore JP. Differential regulation of the antibody responses to Gag and Env proteins of human immunodeficiency virus type 1. Submitted to J Virol, 1996 Boyer JD, Cohen AD, Voght S, Schumann K, Nath B, Ahn L, Lacy K, Bagarazzi ML, Higgins YJ, Baine Y et al. Vaccination of seronegative volunteers with a of human immunodeficiency virus type 1 env/rev DNA vaccine induces antigen-specific proliferation and lymphocyte production of beta-chemokines. J Infect Dis 2000-V.181-P.476-483. Bou-Habib D.C., Roderiques G., Oravecz T., Berman P.W., Lusso P., Norcross M.A. Cryptic nature of envelope V3 region epitopes protects primary monocytotrpopic human immunodeficiency virus type 1 from antibody neutralization. . J. Virol. – 1994. – V.68. – P.6006- 6013. Burton D. R., Pyati J., Koduri R., Sharp S. J., Thornton G. B., Parren P. W. H. I., Sawyer L. S., Hendry R. M., Dunlop N., Nara,P. L.. Efficient neutralization of primary isolates of HIV-1 by a recombinant human monoclonal antibody. Science-1994-V. 266-P.1024-1027. Burton D. R. A vaccine for HIV type 1: the antibody perspective. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A.-1997-V. 94-P.10018-10023. Burton DR, Williamson RA, Parren PW. Antibody and virus: binding and neutralization. Virology 2000; 270:1-3. Burton DR, Saphire EO, Parren PW. A model for neutralization of viruses based on antibody coating of the virion surface. Curr Top Microbiol Immunol. 2001;260:109-43. Review Buge SL, Murty L, Arora K, Kalyanaraman VS, Markham PD, Richardson ES, Aldrich K, Patterson LJ, Miller CJ, Cheng SM et al.: Factors associated with slow disease progression in macaques immunized with an adenovirussimian immunodeficiency virus (SIV) envelope priming-gp120 boosting regimen and challenged vaginally with SIVmac251. J Virol 1999-V.73P.7430-7440. Buseyne F, Fevrier M, Garcia S, Gougeon ML, Riviere Y. Dual function of a human immunodeficiency virus (HIV)-specific cytotoxic T-lymphocyte clone: inhibition of HIV replication by noncytolytic mechanisms and lysis of HIV-infected CD4+ cells. Virology. 1996 Nov 1;225(1):248-53. Carrington M, Nelson G, Martin M et al. HLA and HIV-1: heterozygote advantage and B*35-Cw*04 disadvantage. Science 1999-V.283-P.17481752. Caley IJ, Betts MR, Irlbeck DM, et al. Humoral, mucosal, and cellular immunity in response to a human immunodeficiency virus type 1 immunogen expressed by a Venezuelan equine encephalitis virus vaccine vector. J Virol. 1997;71:3031-3038. Chang H. C., Samaniego F., Nair B. C., Buonaguro L.,Ensoli B. (1997). HIV1 Tat protein exits from cells via a leaderless secretory pathway and binds to extracellular matrix-associated heparan sulfate proteoglycans through its basic region. AIDS-1997-V. 11-P.1421-1431. Cicala C, Arthos J, Rubbert A et al. HIV-1 envelope induces activation of 87

28 29 30 31 32 33

34

35 36 37

38

39

caspase-3 and cleavage of focal adhesion kinase in primary human CD4+ T cells. Proc Natl Acad Sci USA 2000-V.97-P.1187-1193. Clements-Mann ML, Matthews TJ, Weinhold K, et al. HIV-1 immune responses induced by canarypox (ALVAC)-gp160 MN, SF-2 rgp120, or both vaccines in seronegative adults. J Infect Dis 1998-V.177-P.1230-1246. Clark KR, Sferra TJ, Johnson PR: Recombinant adeno-associated viral vectors mediate long-term transgene expression in muscle.Hum Gene Ther 1997-V.8-P.659-669. Cocchi F, de Vico A, Garzino-Demo A et al. The V3 domain of the HIV-1 gp120 envelope glycoprotein is critical for chemokine-mediated blockade of infection. Nat Med 1996-V.2-P.1244-1247 Cocchi F, de Vico A, Garzino-Demo A et al. Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1 beta as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+ T cells. Science 1995-V.270-1811-1815 Collins K, Chen B, Kalams S et al. HIV-1 Nef protein protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes. Nature 1998V.391-P.397-401. Conley A. J., Kessler J. A., Boots L. J., Tung J. S., Arnold B. A., Keller P. M., Shaw A. R., Emini E. A. Neutralization of divergent human immunodeficiency virus type 1 variants and primary isolates by IAM-41-2F5, an anti-gp41 human monoclonal antibody. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. – 1994- V.91-P.3348-3352. Cooney EL, McElrath MJ, Corey L, et al. Enhanced immunity to human immunodeficiency virus (HIV) envelope elicited by a combined vaccine regimen consisting of priming with a vaccinia recombinant expressing HIV envelope and boosting with gp160 protein. Proc Natl Acad Sci USA 1993V.90-P.1882-1886. Connick E., Marr D.G., Zhang X.Q., Clark S.J., Saag M.S., Sholley R.T. HIV –specific cellular and humoral immune responses in primary HIV infection. AIDS Res Hum Retroviruses-1996-V.124-P.1129-1140.. Corey L, McElrath MJ, Weinhold K, et al. Cytotoxic T cell and neutralizing antibody responses to HIV-1 envelope with a combination vaccine regimen. J Infect Dis 1998-V.177-P.301-309. Cranage MP, Whatmore AM, Sharpe SA, Cook N, Polyanskaya N, Leech S, Smith JD, Rud EW, Dennis MJ, Hall GA. Macaques infected with live attenuated SIVmac are protected against superinfection via the rectal mucosa. Virology. 1997 Mar 3;229(1):143-54. Deacon NJ, Tsykin A, Solomon A, Smith K, Ludford-Menting M, Hooker DJ, McPhee DA, Greenway AL, Ellett A, Chatfield C, et al. Genomic structure of an attenuated quasi species of HIV-1 from a blood transfusion donor and recipients. Science. 1995 Nov 10;270(5238):988-91. Devis NL.Caley IJ, Brown KW, Betts MR, Irlbeck DM, McGrath KM, Connell MJ, Montefori DC, Frelinger JA, Swanstrom R et al. Vaccination of macaques against pathogenic simian immunodeficiency virus with Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles. J Virol 2000 –V.74P.371-378. 88

40

41 42

43

44

45

46

47

48

49 50 51

Dolin R, Graham BS, Greenberg SB, et al. The safety and immunogenicity of a human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) recombinant gp160 candidate vaccine in humans. NIAID AIDS Vaccine Clinical Trials Network.Ann Intern Med 1991-V.114-P.119-127. Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW, Liu MA. DNA vaccines. Annu Rev Immunol. 1997;15:617-48. Review. Douek DC, Brenchley JM, Betts MR, Ambrozak DR, Hill BJ, Okamoto Y, Casazza JP, Kuruppu J, Kunstman K, Wolinsky S, Grossman Z, Dybul M, Oxenius A, Price DA, Connors M, Koup RA.HIV preferentially infects HIVspecific CD4+ T cells.Nature. 2002 May 2;417(6884):95-8. Dyer WB, Ogg GS, Demoitie MA, Jin X, Geczy AF, Rowland-Jones SL, McMichael AJ, Nixon DF, Sullivan JS.Strong human immunodeficiency virus (HIV)-specific cytotoxic T-lymphocyte activity in Sydney Blood Bank Cohort patients infected with nef-defective HIV type 1. J Virol. 1999 Jan;73(1):436-43 El-Daher N, Keefer MC, Reichman RC, Dolin R, Roberts NJ. Persisting human immunodeficiency virus type 1 gp160-specific human T lymphocyte responses including CD8+ cytotoxic activity after receipt of envelope vaccines. J Infect Dis 1993-V.168-P.306-313. Ensoli B., Buonaguro L., Barillari G., Fiorelli V., Gendelman R., Morgan R. A., Wingfield P., Gallo, R. C. Release, uptake, and effects of extracellular human immunodeficiency virus type 1 Tat protein on cell growth and viral transactivation. J. Virol.-1993-V. 67-P.277-287. Evans TG, McElrath MJ, Matthews TJ, Montefiori DC, Wolff M, Keefer MC, Kallas EG, Corey L, Gorse GJ, Belshe RB, Graham BS, Spearman PW, Schwartz D, Clements ML, Mulligan MJ, Goepfert P, Fast PE, Francis D, and the NIAID AIDS Vaccine Evaluation Group. QS-21 promotes an antigen dose-sparing adjuvant effect during HIV-1 envelope subunit immunization in humans. Vaccine 2001; (in press). Evans TG, Keefer MC, Weinhold KJ, Wolff M, Montefiori DM, Gorse GJ, Graham BS, McElrath MJ, Clements-Mann ML, Mulligan M, Fast PL, Walker MC, Excler JL, Duliege AM, Tartaglia J, and the NIAID AIDS Vaccine Evaluation Group. A canarypox vaccine expressing multiple HIV-1 genes given alone or with rgp120 elicits broad and durable CD8+ CTL responses in seronegative volunteers. J Infect Dis 1999-V.180-P.290-298. Falk LA, Goldenthal KL, Esparza J, Aguado MT, Osmanov S, Ballou WR, Beddows S, Bhamarapravati N, Biberfeld G, Ferrari G, Hoft D, Honda M, Jackson A, Lu Y, Marchal G, McKinney J, Yamazaki S. Recombinant bacillus Calmette-Guerin as a potential vector for preventive HIV type 1 vaccines.AIDS Res Hum Retroviruses. 2000 Jan 20;16(2):91-8. Ferrari G, Humphrey W, McElrath MJ, et al. Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers. Proc Natl Acad Sci USA 1997-V.94-P.1396-1401. Forthal D.N., Landucci G., Keenan. The relonship between antibody – dependent cellular cytotoxicity , plasma HIV-1 PHA, and CD4+ lymphocyte count. AIDS Res Hum Retroviruses-2001-V.17-P.553-561. Forthal D.N., Landucci G., Daar E.S. Antibody from patients with acute HIV 89

52 54 55

56 57

58

49

60

61

62 63 64

65

infection inhibits primary strains of HIV type1 in the presence of naturalkiller effector cells. J. Virol.-2001-V. 75-P.6953-6961. Fowke KR, Nagelkerke NJ, Kimani J, et al. Resistance to HIV-1 infection among persistently seronegative prostitutes in Nairobi, Kenya. Lancet 1996V. 348-P.1347-1351. Frankel A. D. and Pabo C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell –1988-V.55-P.1189-1193. Gadner JP, Frolov I, Perri S,Ji Y, MacKichan ML, zur Megede J, Chen M, Beli BA, Driver DA, Sherrill S et al. Infection of human dendritic cells by sindbis virus replicon vector is determined by a single amino acid substitution in the E2 glicoprotein. J Virol 2000 –V.74-P.11849-11857. Gomez M. B. and Hildreth J. E. Antibody to adhesion molecule LFA-1 enhances plasma neutralization of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol.-1995-V. 69-P.4628-4632. Gorelick RJ, Benveniste RE, Lifson JD, Yovandich JL, Morion WR, Kuller L, Flynn BM, Fisher BA, Rossio JL, Piatak M ef a/.: Protection of Macaca nemestrina from disease following pathogenic simian immunodeficiency virus (SIV) challenge: utilization of SIV nucleocapsid mutant DNA vaccines with and without an SIV protein boost. J Virol 2000V.74-P.11935-11949. Gorny M. K., Moore J. P., Conley A. J., Karwowska S., Sodroski J., Williams C., Burda S., Boots L. J., Zolla-Pazner S. Human anti-V2 monoclonal antibody that neutralizes primary but not laboratory isolates of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol.-1994-V. 68-P.8312-8320. Gorse GJ, Patel GB, Newman FK, et al. Antibody to native human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoproteins induced by IIIB and MN recombinant gp120 vaccines. Clin Diag Lab Immunol 1996-V.3-P.378386. Gorse GJ, Patel GB, Mandava MD, Arbuckle JA, Doyle TM, Belshe RB: Cytokine responses to human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induced by immunization with live recombinant canarypox virus vaccine expressing HIV-1 genes boosted by HIV-1(SF-2) recombinant GP120. Vaccine 2001-V.19-P.1806-1819. Goudsmit J, Lange JM, Paul DA and Dawson GJ. Antigenemia and antibody titers to core and envelope antigens in AIDS, AIDS-related complex, and subclinical human immunodeficiency virus infection. J Infect Dis-1987-V. 155-V.558-560. Goudsmit J, Boucher CA, Meloen RH, Epstein LG, Smit L, van der Hoek L, Bakker M. Human antibody response to a strain-specific HIV-1 gp120 epitope associated with cell fusion inhibition. AIDS –1988-V.2-P.157-164. Goulder PJ, Brander C, Tang Y, Tremblay C, Colbert RA, Addo MM, Rosenberg ES et al. Evolution and transmission of stable CTL escape mutations in HIV infection. Nature 2001 Jul 19;412(6844):334-8 Graham BS, Keefer MC, McElrath MJ, et al. Safety and immunogenicity of a candidate HIV-1 vaccine in healthy adults: Recombinant glycoprotein (rgp) 120- A randomized, double-blind trial.Ann Intern Med 1996-V.125-P.270279. Graham BS, Matthews TJ, Belshe RB, et al. Augmentation of human 90

66

67

68

69

70

71

72

73 74

75

76

immunodeficiency virus type1 neutralizing antibody by priming with gp160 recombinant vaccinia and boosting with rgp160 in vaccinia-naive adults. The NIAID AIDS Vaccine Clinical Trials Network. J Infect Dis 1993-V.167P.533-537. Graham BS, Belshe RB, Clements ML, et al. Vaccination of vaccinia-naive adults with human immunodeficiency virus type 1 gp160 recombinant vaccinia virus in a blinded, controlled, randomized clinical trial. The AIDS Vaccine Clinical Trials Network. J Infect Dis 1992-V.166-P.244-252. Graham BS, Gorse GJ, Schwartz DH, et al. Determinants of antibody response after recombinant gp160 boosting in vaccinia-naive volunteers primed with gp160-recombinant vaccinia virus. J Infect Dis 1994-V.170P.782-786. Gumperz J, Barber L, Valiante N et al. Conserved and variable residues within the Bw4 motif of HLA-B make separable contributions to recognition by the NKB1 killer cell-inhibitory receptor. J Immunol 1997-V.158-P.52375241. Gumperz J, Valiante N, Parham P et al. Heterogeneous phenotypes of expression of the NKB1 natural killer cell class I receptor among individuals of different human histocompatibility leukocyte antigens types appear genetically regulated, but not linked to major histocompatibility complex haplotype. J Exp Med 1996-V.183-P.1817-1827. Hammond SA, Bollinger RC, Stanhope PE, Quinn TC, Schwartz D, Clements ML, Siliciano RF. Comparative clonal analysis of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-specific CD4+ and CD8+ cytolytic T lymphocytes isolated from seronegative humans immunized with candidate HIV-1 vaccines. J Exp Med 1992-V.176-P.1531-1542. Heeney JL, Teeuwsen VJ, van Gils M, et al. Beta-chemokines and neutralizing antibody titers correlate with sterilizing immunity generated in HIV-1 vaccinated macaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95:1080310808 Hill C.M., Deng H., Unutmaz D., Kewalramani V.N., Bastiani L., Gorny M., Zolla-Pazner S., Littman D.R. Envelope glycoproteins from human immunodeficiency virus types 1 and 2 and simian immunodeficiency virus can use human CCR5 as a coreceptor for viral entry and make direct CD4dependent interactions with this chemokine receptor. J. Virol. – 1997 – V.71.-P.6296-6304/ Hirsch V. M. and. Johnson P. R, Pathogenic diversity of simian immunodeficiency viruses.Virus Res. 1994 May;32(2):183-203. Review Hu SL, Abrams K, Barber GN, Moran P, Zarling JM, Langlois AJ, Kuller L, Morton WR, Benveniste RE. Protection of macaques against SIV infection by subunit vaccines of SIV envelope glycoprotein gp160. Science. 1992 Jan 24;255(5043):456-9. Huang L., Bosch I., Hofmann W., Sodroski J., and Pardee A. B.. Tat protein induces human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) coreceptors and promotes infection with both macrophage-tropic and T- lymphotropic HIV-1 strains. J. Virol.-1998-V. 72-P.8952-8960 Johnston MI, Flores J. Progress in HIV vaccine development. Curr. Opin. 91

77 78 79 80 81

82

83

84

85 86 87 88 89 90 91 92

Pharmac.-2001-V.1- P.504-510. Jin X, Bauer DE, Tuttleton SE, et al. Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Exp Med. 1999;189:991-998. Kagi D, Ledermann B, Burki K et al. Cytotoxicity mediated by T cells and natural killer cells is greatly impaired in perforin-deficient mice. Nature 1994-V.369-P.31-37. Kagi D, Vignaux F, Ledermann B et al. Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell-mediated cytotoxicity. Science 1994-V.265-P.528-530. Kaslow R, Carrington M, Apple R et al. Influence of combinations of human major histocompatibility complex genes on the course of HIV-1 infection. Nat Med 1996-V.2-P.405-411. Kaslow RA, Duquesnoy R, VanRaden M, et al. Combinations of A1, Cw7, B8, DR3 HLA antigens associated with rapid decline of T-helper lymphocytes in HIV-1 infected homosexual men: a report from the Multicenter AIDS Cohort Study. Lancet. 1990;335:927-930 Kaslow R, Duquesnoy R, van Raden M et al. A1, Cw7, B8, DR3 HLA antigen combination associated with rapid decline of T-helper lymphocytes in HIV-1 infection. A report from the Multicenter AIDS Cohort Study. Lancet 1990-V.335-P.927-930. Keefer MC, Graham BS, McElrath MJ, et al. Safety and immunogenicity of Env 2-3, a human immunodeficiency virus type 1 candidate vaccine, in combination with a novel adjuvant, MTP- PE/MF59. AIDS Res Hum Retrovir 1996-V.12-P.683-693. Kelleher AD, Long C, Holmes EC, Allen RL, Wilson J, Conlon C et al. Clustered mutations in HIV-1 gag are consistently required for escape from HLA-B27-restricted cytotoxic T lymphocyte responses. J Exp Med 2001 Feb 5;193(3):375-86 Khalife J, Guy B, Capron M, Kieny MP, Ameisen JC, Montagnier L, Lecocq JP and Capron A. Isotypic restriction of the antibody-response to human immunodeficiency virus. AIDS Res Hum Retroviruses-1988-V. 4-P.3-9. Klasse PJ and Blomberg J. Patterns of antibodies to human immunodeficiency virus proteins in different subclasses of IgG. Journal Of Infectious Diseases-1987-V.156-P.1026-1030. Klasse PJ, Berntorp E and Hansson BG. An aberrant subclass pattern of HIVspecific immunoglobulin-G in sera from hemophiliacs. AIDS –1988-V.2-P. 311-313. Kojima H, Shinohara N, Hanaoka S et al. Two distinct pathways of specific killing revealed by perforin mutant cytotoxic T lymphocytes. Immunity 1994-V.1-P.357-364 Kokkotou EG, Sankale JL, Mani I, Gueye-Ndiaye A, Schwartz D, Essex ME, Mboup S, Kanki PJ. In vitro correlates of HIV-2 mediated HIV-1 protection. Proc Natl Acad Sci USA 2000 –V.97-P.6797-6802. Koup RA, Safrit JT, Cao Y, et al. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol 1994-V.68-P.4650-4655. Landmarks of the genome.HIV Sequence Compendium 2001. P.v-viii. Lange JM, Coutinho RA, Krone WJ, Verdonck LF, Danner SA, van der 92

Noorda J and Goudsmit J. Distinct IgG recognition patterns during progression of subclinical and clinical infection with lymphadenopathy associated virus/human T lymphotropic virus. Br Med J –1986-V.292-P.228230. 93 Lanier L. Follow the leader: NK cell receptors for classical and nonclassical MHC class I. Cell 1998-V.92-P.705-707. 94 Letvin NL. Progress in the Development of an HIV-1 Vaccine. Science 1998V.280-P.1875-1880 95 Letvin N, Walker B. HIV versus immune system: another apparent victory for the virus. Journal of Clinical Investigation-2001-V.107-P.273-275 96 Levy J, Mackewicz C, Barker E. Controlling HIV pathogenesis: the role of the noncytotoxic anti-HIV response of CD8+ T cells. Immunol Today 1996V.17-P.217-224 97 Li J, Lord CI, Haseltine W, Letvin NL, Sodroski J. Infection of cynomolgus monkeys with a chimeric HIV-1/SIVmac virus that expresses the HIV-1 envelope glycoproteins. J Acquir Immune Defic Syndr. 1992;5(7):639-46. 98 Li C. J., Ueda Y., Shi B., Borodyansky L., Huang L., Li Y. Z., Pardee A. B. Tat protein induces self-perpetuating permissivity for productive HIV-1 infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.-1997-V. 94-P.8116-8120. 99 Lieberman J, Frankel FR. Engineered Listeria monocytogenes as an AIDS vaccine. Vaccine. 2002 May 6;20(15):2007-10. 100 Ljunggren K, Broliden PA, Morfeldtmanson L, Jondal M and Wahren B. IgG subclass response to HIV in relation to antibody-dependent cellular cytotoxicity at different clinical stages. Clinical And Experimental Immunology-1988-V. 73-P. 343-347. 101. Lubeck MD, Natuk R, Myagkikh M, Kalyan N, Aldrich K, Sinangil F, Alipanah S, Murthy SC, Chanda PK, Nigida SM e t al.: Long-term protection of chimpanzees against high-dose HIV-1 challenge induced by immunization. Nat Med 1997-V.3-P.651-658. 102. MacDonakd GH, Johnston RE. Role of dendritic cell targeting in Venezuelan equine encephalitis virus pathogenesis. J Virol 2000-V.74-P.914-922. 103. MacGregor RR, Ginsberg R, Ugen KE, Baine Y, Kang CU, Tu XM, Higgins T, Weiner DB, Boyer JD. T-cell responses induced in normal volunteers immunized with a DNA-based vaccine containing HIV-1 env and rev. AIDS. 2002 Nov 8;16(16):2137-2143. 104 Magierowska M, Theodorou I, Debre P et al. Combined genotypes of CCR5, CCR2, SDF1, and HLA genes can predict the long-term nonprogressor status in human immunodeficiency virus-1-infected individuals. Blood 1999-V.93P.936-941. 105 Marovich MA, Mascola JR, Eller MA, Louder MK, Caudrelier PA, El-Habib R, Ratto-Kim S, Cox JH, Currier JR, Levine BL, June CH, Bernstein WB, Robb ML, Schuler-Thurner B, Steinman RM, Birx DL, Schlesinger-Frankel S. Preparation of clinical-grade recombinant canarypox-human immunodeficiency virus vaccine-loaded human dendritic cells.J Infect Dis. 2002 Nov 1;186(9):1242-52. 93

106

Mascola JR, Snyder SW, Weislow OS, et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratoryadapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Infect Dis 1996-V.173-P.340-348. 107 Mathiesen T, Broliden PA, Rosen J and Wahren B. Mapping of IgG subclass and T-cell epitopes on HIV proteins by synthetic peptides. Immunology1989-V. 67-P. 453-459. 108 McDougal JS, Kennedy MS, Nicholson J, Spira TJ, Jaffe HW, Kaplan JE, Fishbein DB, Omalley P, Aloisio CH, Black CM, Hubbard M and Reimer CB. Antibody-response to human immunodeficiency virus in homosexual men - relation of antibody specificity, titer, and isotype to clinical status, severity of immunodeficiency, and disease progression. Journal of Clinical Investigation-1987-V. 80-P.316-324. 109 Meyer H, Sutter G, Mayr A. Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence. J Gen Virol. 1991 May;72 ( Pt 5):1031-8. 110 G. Meyers, B. Korber, S. Wain-Hobson, R. F. Smith, Ed., Human Retroviruses and AIDS 1993 111. Migueles SA, Sabbaghian MS, Shupert W, et al. HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:2709-2714 112 Mitsuyasy R.T. Cellular immunity in HIV: the beat goes on. 7th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. Day 4 – February 2, 2000. Medscape. 113 Moog C., Fleury H.J., Pellegrin I., Kirn A., Aubertin A.M. Autologous and hetrologous neutralizing antibody responses following initial seroconversion in human immunodeficiency virus type 1-infected individuals. J. Virol. – 1997 – V.71 – P.3734-3741. 114 Moore CB, John M, James IR, Christiansen FT, Witt CS, Mallal SA. Evidence of HIV-1 adaptation to HLA-restricted immune responses at a population level. Science. 2002 May 24;296(5572):1439-43. 115 Moore J. P. and Ho, D. D. Antibodies to discontinuous or conformationally sensitive epitopes on the gp120 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 are highly prevalent in sera of infected humans. J. Virol. –1993V. 67 – P.863-875. 116 Moore, J.P., Cao Y., Leu J., Qing L., Korber B., Ho D. Inter and intraclade neutralization of human immunodeficiency virus type 1: genetic clades do not correspond to neutralization serotypes but partially correspond to gp120 antigenic serotypes. J. Virol. – 1996. – V.70. – P.427- 444. 117 Moore JP, Cao Y, Ho DD, et al. Development of the anti-gp120 antibody response during seroconversion to human immunodeficiency virus type. J Virol 1994-V.68-P.5142-5155. 118 Moore J. P., Sattentau Q. J., Yoshiyama H., Thali M., Charles M., Sullivan N., Poon S. W., Fung M. S., Traincard F., Pinkus M. Probing the structure of the V2 domain of human immunodeficiency virus type 1 surface glycoprotein gp120 with a panel of eight monoclonal antibodies: human immune response 94

119 120 121

122 123

124 125

126

127

128 129 130 131

132 133

to the V1 and V2 domains. J. Virol.- 1993-V. 67-P.6136-6151. Moore JP, Parren PW, Burton DR. Genetic subtypes, humoral immunity, and human immunodeficiency virus type 1 vaccine developmentJ Virol. 2001 Jul;75(13):5721-9 Moss B, Flexner C. Vaccinia virus expression vectors. Ann Rev Immunol 1987;5:305-324. Murphy CG, Lucas WT, Means RE, Czajak S, Hale CL, Lifson JD, Kaur A, Johnson RP, Knipe DM, Desrosiers RC: Vaccine protection against simian immunodeficiency virus by recombinant strains of herpes simplex virus. J Virol 2000-V.74-P.7745-7754. Muster T., Steindl F., Purtscher M., Trkola A., Klima A., Himmler G., Ruker F., Katinger H. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol.-1993-V. 67-P.6642-6647. Muster T., Guinea R., Trkola A., Purtscher M., Klima A., Steindl F., Palese P., Katinger H. Cross-neutralizing activity against divergent human immunodeficiency virus type 1 isolates induced by the gp41 sequence ELDKWAS. J. Virol.-1994-V. 68-P.4031-4034. Nagata S, Golstein P. The Fas death factor. Science 1995-V.267-P.1449-1456 Novembre FJ, Saucier M, Anderson DC, Klumpp SA, O'Neil SP, Brown CR 2nd, Hart CE, Guenthner PC, Swenson RB, McClure HM. Development of AIDS in a chimpanzee infected with human immunodeficiency virus type 1.J Virol. 1997 May;71(5):4086-91. Ourmanov I, Bilska M, Hirsch VM, Montefiori DC. Recombinant modified vaccinia virus ankara expressing the surface gp120 of simian immunodeficiency virus (SIV) primes for a rapid neutralizing antibody response to SIV infection in macaques. J Virol. 2000 Mar;74(6):2960-5. Ourmanov I, Brown CR, Moss B, Carroll M, Wyatt L, Pletneva L, Goldstein S, Venzon D, Hirsch VM, Comparative efficacy of recombinant modified vaccinia virus Ankara expressing simian immunodeficiency virus (SIV) GagPol and/or Env in macaques challenged with pathogenic SIV. J Virol 2000 – V.74-P.2740-2751. Palese P, Zavala F, Muster T, et al. Development of novel influenza virus vaccines and vectors. [Review] [16 refs]. J Infect Dis 1997;176:S45-S49. Peiperl L. Progress toward an AIDS vaccine: Prospects for protective immunity. AIDScience Vol. 1, No. 13, October 2001 Piguet V, Chen Y, Mangasarian A et al. Mechanism of Nef-induced CD4 endocytosis: Nef connects CD4 with the mu chain of adaptor complexes. EMBO J 1998-V.17-P.2472-2481 Pilgrim A.K., Pantaleo G., Cohen O.J., Fink L.M., Zhou J.Y., Zhou J.T, Bolognesi D.P., Fauci A.S., Montefiori D.C. Neutralizing antibody responses to human immunodeficiency virus type1 in primary infection and long-termnonprogressive infection. . J. Infect.Dis. – 1997 – V.176 – P.924-932. Pincus SH, Messer KG, Cole R, et al. Vaccine-specific antibody responses induced by HIV-1 envelope subunit vaccines. J Immunol 1997-V.158P.3511-3520. Price DA, Goulder PJ, Klenerman P, Sewell AK, Easterbrook PJ, Troop M, Bangham CR, Phillips RE. Positive selection of HIV-1 cytotoxic T 95

134 135

136

137

138

139

140 141

142 143 144 145

lymphocyte escape variants during primary infection. Proc Natl Acad Sci U S A 1997 Mar 4;94(5):1890-5 Purbhoo M, Sewell AK, Klenerman P et al. Copresentation of natural HIV-1 agonist and antagonist ligands fails to induce the T cell receptor signaling cascade. Proc Natl Acad Sci USA 1998-V.95-P.4527-4532. Putkonen P, Quesada-Rolander M, Leandersson AC, Schwartz S, Thorstensson R, Okuda K, Wahren B, Hinkula J: Immune responses but no protection against SHIV by gene-gun delivery of HIV-1 DNA followed by recombinant subunit protein boosts. Virology 1998-V.250-P.293-301. Re M. C., Furlini G., Vignoli M., Ramazzotti E., Roderigo G., De Rosa V., Zauli G., Lolli S., Capitani S.,La Placa M.Effect of antibody to HIV-1 Tat protein on viral replication in vitro and progression of HIV-1 disease in vivo. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol.-1995-V.10-P.408-416. Reimann KA, Li JT, Veazey R, Halloran M, Park IW, Karlsson GB, Sodroski J, Letvin NL. A chimeric simian/human immunodeficiency virus expressing a primary patient human immunodeficiency virus type 1 isolate env causes an AIDSlike disease after in vivo passage in rhesus monkeys. J Virol. 1996 Oct;70(10):6922-8. Richardson MW, Mirchandani J, Silvera P, Regulier EG, Capini C, Bojczuk PM, Hu J, Gracely EJ, Boyer JD, Khalili K, Zagury JF, Lewis MG, Rappaport J. Immunogenicity of HIV-1 IIIB and SHIV 89.6P Tat and Tat Toxoids in Rhesus Macaques: Induction of Humoral and Cellular Immune Responses.DNA Cell Biol. 2002 Sep;21(9):637-51. Rasmussen RA, Hofmann-Lehmann R, Li PL, Vlasak J, Schmitz JE, Reimann KA, Kuroda MJ, Letvin NL, Montefiori DC, McClure HM, Ruprecht RM. Neutralizing antibodies as a potential secondary protective mechanism during chronic SHIV infection in CD8+ T-cell-depleted macaques. AIDS. 2002 Apr 12;16(6):829-38. Rizzuto C. D. and Sodroski J. G. Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization. J. Virol.1997-V. 71-P.4847-4851. Roben P., Moore J. P., Thali M., Sodroski J., Barbas C. F., Burton D. R. (1994). Recognition properties of a panel of human recombinant Fab fragments to the CD4 binding site of gp120 that show differing abilities to neutralize human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. -1994- V.68P.4821-4828. Robinson H. L., paper presented at AIDS Vaccines 2001, Foundation for AIDS Vaccine Research and Development, Philadelphia, PA, 5-8 September 2001, Abstract 44. Rosenberg ES, Billingsley JM, Caliendo AV et al. Vigorous HIV-1-specific CD4+ T cell responses associated with control of viremia. Science 1997V.278-P.1447-1450. Rowland-Jones S, Sutton J, Ariyoshi K, et al. HIV-specific cytotoxic T-cells in HIV-exposed but uninfected Gambian women. Nat Med 1995-V.1-P.5964. Schwartz O, Marechal V, Le Gall S et al. Endocytosis of major 96

146 147 148

149 150

151

152

153

154 155 156

157 158

histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-1 Nef protein. Nat Med 1996-V.2-P.338-342. Schmitz JE, Kuroda MJ, Santra S, et al. Control of viremia in simian immunodeficiency virus infection by CD8+ lymphocytes. Science. 1999;283:857-860. Seeger M, Ferrell K, Frank R et al. HIV-1 tat inhibits the 20 S proteasome and its 11 S regulator-mediated activation. J Biol Chem 1997-V.272-P.81458148. Seth A., Ourmanov I, Schmitz JE, Kuroda MJ, Lifton MA, Nickerson CE, Wyatt L, Caroll M.Moss B, Venzon D et al. Immunization with modified vaccinia virus expressing simian immunodeficiency virus (SIV) Gag-Pol primes for an anamnestic Gag-specific cytotoxic T lymphocyte response and is associated with reduction of viremia after SIV challenge. J Virol 2000 – V.74-P.2502-2509. Sewell AK, Price DA, Teisserenc H et al. IFN-gamma exposes a cryptic cytotoxic T lymphocyte epitope in HIV-1 reverse transcriptase. J Immunol 1999-V.162-P.7075-7079. Shibata R, Siemon C, Czajak SC, Desrosiers RC, Martin MA. Live, attenuated simian immunodeficiency virus vaccines elicit potent resistance against a challenge with a human immunodeficiency virus type 1 chimeric virus. J Virol. 1997 Nov;71(11):8141-8. Shiver JW, Fu TM, Chen L, Casimiro DR, Davies ME, Evans RK, et al. Replication-incompetent adenoviral vaccine vector elicits effective antiimmunodeficiency-virus immunity. Nature. 2002 Jan 17;415(6869):331-5. Silvera P, Richardson MW, Greenhouse J, Yalley-Ogunro J, Shaw N, Mirchandani J, Khalili K, Zagury JF, Lewis MG, Rappaport J.Outcome of simian-human immunodeficiency virus strain 89.6p challenge following vaccination of rhesus macaques with human immunodeficiency virus Tat protein.J Virol. 2002 Apr;76(8):3800-9. Spenlehauer C., Saragosti S., Fleury H.J., Kirn A., Aubertin A.M., Moog C. Study of the V3 loop as target epitope for antibodies involved in the neutralization of primary isolates versus T-cell-line-adapted strains of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. – 1998. – V.72. – P.9855- 9864. Steel C, Ludlam C, Beatson D et al. HLA haplotype A1 B8 DR3 as a risk factor for HIV-related disease. Lancet 1988-V.i-P.1185-1188. Su B, Bochan M, Hanna W et al. Human granzyme B is essential for DNA fragmentation of susceptible target cells. Eur J Immunol 1994-V.24-P.20732080. Taffe P, Rickenbach M, Hirschel B, Opravil M, Furrer H, Janin P, Bugnon F, Ledergerber B, Wagels T, Sudre P. Impact of occasional short interruptions of HAART on the progression of HIV infection: results from a cohort study. AIDS. 2002 Mar 29;16(5):747-55. Team TAVEGP: Cellular and humoral immune responses to a canarypox vaccine containing human immunodeficiency virus type 1 Env, Gag, and Pro in combination with RGP120. J Infect Dis 2001-V.18-P.563-570. Thali M, Moore JP, Furman C, Charles M, Ho DD, Robinson J, Sodroski J. 97

159 160

161

162 163 164

165

166

167

168

169

170

Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J Virol 1993V.67-3P.978-88. Townsend A, Bodmer H. Antigen recognition by class 1-restricted T lymphocytes. Annu. Rev. Immunol.-1989-V.7-P. 601-624. Trkola A., Dragic T., Arthos J., Binley J.M., Oslon W.C., Allaway G.P., Cheng-Mayer C., Robinson J., Maddon P.J., Moore J.P. CD4-dependent, Antibody-sensitive interactions between HIV-1 and its coreceptor CCR-5 . Nature. – 1996. – V.384. – P.184- 187. Trkola A., Purtscher M., Muster T., Ballaun C., Buchacher A., Sullivan N., Srinivasan K., Sodroski J., Moore J. P., Katinger H. Human monoclonal antibody 2G12 defines a distinctive neutralization epitope on the gp120 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol.-1996-V. 70P.1100-1108. Uhrberg M, Valiante N, Shum B et al. Human diversity in killer cell inhibitory receptor genes. Immunity 1997-V.7-P.753-763. Valiante N, Uhrberg M, Shilling H et al. Functionally and structurally distinct NK cell receptor repertoires in the peripheral blood of two human donors. Immunity 1997-V.7-P.739-751. Van Cott T.C., Polonis V.R., Loomis L.D., Michael N.L., Nara P.L., Brix D.L. Differential role of V3 –specific antibodies in neutralization assays involving primary and laboratory –adapted isolates of HIV type 1. AIDS Res. Hum.Retroviruses. – 1995 – V.11 – P.1379-1391. Vecino WH, Morin PM, Agha R, Jacobs WR, Fennelly GJ. Mucosal DNA vaccination with highly attenuated Shigella is superior to attenuated Salmonella and comparable to intramuscular DNA vaccination for T cells against HIV. Immunol Lett. 2002 Jul 3;82(3):197-204 Verrier F, Burda S, Belshe R, Duliege AM, Excler JL, Klein M,Zolla-Pazner S: A human immunodeficiency virus prime-boost immunization regimen in humans induces antibodies that show interclade cross-reactivity and neutralize several X4-, R5-, and dual-tropic clade B and C primary isolates. J Virol 2000-V.74-P.10025-10033. Verschoor EJ, Mooij P, Oostermeijer H, van der Kolk M, ten Haaft P, Verstrepen B, Sun Y, Morein B, Akerblom L, Fuller DH et al.Comparison of immunity generated by nucleic acid-, MF59-, and ISCOM-formulated human immunodeficiency virus type 1 vaccines in Rhesus macaques: evidence for viral clearance. J Virol 1999-73:3292-3300. Vijh-Warrier S., Pinter A., Honnen W. J.,Tilley S. A. Synergistic neutralization of human immunodeficiency virus type 1 by a chimpanzee monoclonal antibody against the V2 domain of gp120 in combination with monoclonal antibodies against the V3 loop and the CD4- binding site. J. Virol.-1996-V. 70.-P.4466-4473. Wasik TJ, Bratosiewicz J, Wierzbicki A, Whiteman VE, Rutstein RR, Starr SE, Douglas SD, Kaufman D, Sison AV, Polansky M, Lischner HW, Kozbor D. Protective role of beta-chemokines associated with HIV-specific Th responses against perinatal HIV transmission. J Immunol. 1999 Apr 1;162(7):4355-64. Wang SW, Kozlowski PA, Schmelz G, Manson K, Wyand MS, 98

171 172

173 174 175 176

177

178

179 180 181 182

183 184

Glickman R, Montefiori D, Lifson JD, Johnson RP, Neutra MR ef a/.: Effective induction of simian immunodeficiency virus-specific systemic and mucosal immune responses in primates by vaccination with proviral DNA producing intact but noninfectious virions. J Virol 2000-V.74-P.1051410522. Wange R, Samelson L. Complex complexes: signaling at the TCR. Immunity 1996-V.5-V.197-205 Weber JN, Clapham PR, Weiss RA, Parker D, Roberts C, Duncan J, Weller I, Carne C, Tedder RS, Pinching AJ and et al. Human immunodeficiency virus infection in two cohorts of homosexual men: neutralising sera and association of anti-gag antibody with prognosis. Lancet-1987-V. 1-P. 119-122. Weber J, Fenyo E.-M., Zolla-Pazner S., et al. Humoral anti-HIV responses as potential mechanism of protection against HIV/AIDS. AIDS 2001-V.15-W.125 Weiss A, Littman D. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 1994-V.76-P.263-274 Westendorp M. O., Frank R., Ochsenbauer C., Stricker K., Dhein J., Walczak H., Debatin K. M., Krammer P. H. Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by HIV-1 Tat and gp120. Nature-1995-V. 375-P.-497-500. Whatmore AM, Cook N, Hall GA, Sharpe S, Rud EW, Cranage MP. Repair and evolution of nef in vivo modulates simian immunodeficiency virus virulence. J Virol. 1995 Aug;69(8):5117-23. Wierzbicki A, Kiszka I, Kaneko H, Kmieciak D, Wasik TJ, Gzyl J, Kaneko Y, Kozbor D. Immunization strategies to augment oral vaccination with DNA and viral vectors expressing HIV envelope glycoprotein.Vaccine. 2002 Jan 31;20(9-10):1295-307 Wu L., Gerard N.P., Wyatt R., Parolin C., Ruffing N., Borsetti A., Cardoso A.A., Deajardin E., Newman W., Gerard C., Sodorski J. CD-4 induced interaction of primary HIV-1 gp120 glycoproteins with the chemokine receptor CCR-5. Nature. – 1996. – V.384. – P.179- 183. Xiao Y, Liao M, Lu Y, Dierich MP, Chen YH. Epitope-vaccines: a new strategy to induce high levels of neutralizing antibodies against HIV-1. Immunobiology. 2000 Jan;201(3-4):323-31. Xu X, Laffert B, Screaton G et al. Induction of Fas ligand expression by HIV involves the interaction of Nef with the T cell receptor zeta chain. J Exp Med 1999-V.189-P.1489-1496. Yang O, Walker B. CD8+ cells in human immunodeficiency virus type I pathogenesis: cytolytic and noncytolytic inhibition of viral replication. Adv Immunol 1997-V.66-P.273-311. Yasutomi Y, Koenig S, Haun SS, Stover CK, Jackson RK, Conard P, Conley AJ, Emini EA, Fuerst TR, Letvin NL. Immunization with recombinant BCG-SIV elicits SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in rhesus monkeys. J Immunol. 1993 Apr 1;150(7):3101-7. Yokoyama W. Natural killer cell receptors. Curr Opin Immunol 1998-V.10P.298-305. Zagury J. F., Sill A., Blattner W., Lachgar A., Le Buanec H., Richardson M., 99

Rappaport J., Hendel H., Bizzini B., Gringeri A., Carcagno M., Criscuolo M., Burny A., Gallo R. C., Zagury D. (1998). Antibodies to the HIV-1 Tat protein correlated with nonprogression to AIDS: a rationale for the use of Tat toxoid as an HIV-1 vaccine. J Hum Virol-1998-V.282-P.92. 185 Zinkernagel RM, Doherty PC. MHC-restricted cytotoxic T cells: Studies of the biological role of polymorphic major transplantation antigens determining T cell restriction specificity, function, and responsiveness. Adv Immunol 1979-V.27-P.51-177. 186 Zhang L, Yu W, He T, Yu J, Caffrey RE, Dalmasso EA, Fu S, Pham T, Mei J, Ho JJ, Zhang W, Lopez P, Ho DD. Contribution of human alpha-defensin 1, 2, and 3 to the anti-HIV-1 activity of CD8 antiviral factor.Science. 2002 Nov 1;298(5595):995-1000. 187 Zwick MB, Wang M, Poignard P, Stiegler G, Katinger H, Burton DR, Parren PW. Neutralization synergy of human immunodeficiency virus type 1 primary isolates by cocktails of broadly neutralizing antibodies. J Virol. 2001 Dec;75(24):12198-208. 188 Zwick MB, Labrijn AF, Wang M, Spenlehauer C, Saphire EO, Binley JM, Moore JP, Stiegler G, Katinger H, Burton DR, Parren PW.Broadly neutralizing antibodies targeted to the membrane-proximal external region of human immunodeficiency virus type 1 glycoprotein gp41. J Virol. 2001 Nov;75(22):10892-905. 189 Zwick MB, Bonnycastle LL, Menendez A, Irving MB, Barbas CF 3rd, Parren PW, Burton DR, Scott JK. Identification and characterization of a peptide that specifically binds the human, broadly neutralizing anti-human immunodeficiency virus type 1 antibody b12. 190. Clinical Trials of HIV Vaccines, Barney Graham, Vaccine Research Center, NIAID, NIH. Annual Review of Medicine 2002, 53:207-21.

100