Биофизика: Практикум

М И Н И СТ Е РСТ В О О БРА ЗО В А Н И Я РО ССИ Й СК О Й Ф Е Д Е РА Ц И И В О РО Н Е Ж СК И Й ГО СУ Д А РСТ В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РСИ Т Е Т

Б И О Ф И ЗИ КА практикум длястудентов Специальность«Провизор» 040500 (Е н.Ф .03)

В О РО Н Е Ж 2003

2

У тверж дено научно-м етодическим советом биолого-почвенного ф акультета сентября2003 г. (протокол № ).

Составители: А ртю ховВ .Г., Баш арина О .В .

Практикум по биоф изике подготовлен на каф едре биоф изики и биотехнологии биолого-почвенного ф акультета В оронеж ского государственного ф акультета. Реком ендуетсядлястудентов 2-го курса дневного и вечернего отделений ф арм ацевтического ф акультета, обучаю щ ихсяпо специальности «Провизор» .

3

СО Д Е РЖ А Н И Е В В ЕД ЕНИ Е Т Е М А 1.С П Е КТ РА Л Ь Н Ы Е М Е Т О Д Ы И С С Л Е Д О В А Н И Я 1.1.Законом ерности поглощ ениясвета вещ еством 1.2. К олорим етр ф отоэ лектрический KF-77 1.3. Спектроф отом етр СФ -46 1.4. Э ксперим ентальнаячасть Лабораторнаяработа № 1. О пред ел ениек о нцент рации иссл ед уем о го в ещест ва в раст в о ре Лабораторнаяработа № 2. Иссл ед о в аниев л ияния т ем перат уры на о пт ическ иесв о йст в а раст в о ро в о к сигем о гл о бина Лабораторнаяработа № 3. О пред ел ениеуд ел ьно го к о эф фициент а по гл о щения фурад о нина Лабораторнаяработа № 4. Исслед о в аниеспек т рал ьны х св о йст в нек о т о ры х л ек арст в енны х вещест в Т Е М А 2. РЕ Ф РА КТ О М Е Т РИ Ч Е С КИ Й М Е Т О Д А Н А Л И ЗА 2.1.Прелом ление света и реф рактом етрические свойства растворов 2.2.Реф рактом етр RL-1, устройство и принципдействия 2.3. Э ксперим ентальнаячасть Лабораторнаяработа № 1. О пред ел ениепо к азат ел я прел о м л ения нек о т о ры х в ещест в и био л о гическ их сист ем Т Е М А 3. И С П О Л Ь ЗО В А Н И Е М Е Т О Д А В И С КО ЗИ М Е Т РИ И Д Л Я О П РЕ Д Е Л Е Н И Я В Я ЗКО С Т И РА ЗЛ И Ч Н Ы Х Ж И Д КО С Т Е Й 3.1. Понятие вязкости, характеристика видоввязкости 3.2. В язкостькрови 3.2. У стройство капиллярного вискозим етра 3.4. М едицинский вискозим етр 3.5. Э ксперим ентальнаячасть Лабораторнаяработа № 1. О пред ел ениев язк о ст и раст в о ро в нео рганическ их со л ей Лабораторнаяработа № 2. О пред ел ениев язк о ст и раст в о ро в сахаро зы Лабораторнаяработа № 3. О пред ел ениео т но сит ел ьно й в язк о ст и пл азм ы и сы в о ро т к и к ро в и чел о в ек а Т Е М А 4. И С П О Л Ь ЗО В А Н И Е РА Д И О М Е Т РИ Ч Е С КО ГО М Е Т О Д А Д Л Я О П РЕ Д Е Л Е Н И Я А КТ И В Н О С Т И РА Д И О Н УКЛ И Д О В 4.1. Радиоактивность. В заим одействие ионизирую щ его излученияс вещ еством 4.2. И спользование радионуклидови ионизирую щ их излучений в м едицине и биологии 4.3. Д етекторы ионизирую щ их излучений 4.4. Работа со счетной установкой типа Б-3 4.5. Э ксперим ентальнаячасть Лабораторнаяработа № 1 О пред ел ениеβ-рад ио ак т ив но ст и препарат а с зад анно й ст епенью т о чно ст и

5 7 7 11 11 11 12 13 13 14 17 17 19 20 20 23 23 25 26 28 28 28 29 30 32 32 35 36 37 38 39

4

Лабораторнаяработа № 2. Изм ерениеак т ив но ст и рад ио ак т ив но го препарат а в зав исим о ст и о т гео м ет рическ их усл о в ий счет а Лабораторнаяработа № 3. Иссл ед о в аниепро ник аю щей спо со бно ст и β-част иц Т Е М А 5. Ф И ЗИ КО -ХИ М И Ч Е С КИ Е О С Н О В Ы Б И О ЭЛ Е КТ РО ГЕ Н Е ЗА И И ЗМ Е РЕ Н И Е РА ЗН О С Т И П О Т Е Н ЦИ А Л О В 5.1. М еханизм э лектрогенеза вклетках 5.2. М етоды регистрации разности потенциалов 5.4. Э ксперим ентальнаячасть Лабораторнаяработа № 1. Изм ерениек о нцент рацио нно й разно ст и по т енциал о в м еж д у д в ум я раст в о рам и серно к исл о й м ед и П РИ Л О Ж Е Н И Е

40 40 42 42 44 46 47 49

5

В В ЕД ЕНИ Е Биоф изика - важ нейш ий раздел соврем енной биологии, представляю щ ий собой неотъем лем ую часть проф ессиональной подготовки студентов биологических, м едицинских, ф арм ацевтических и других специальностей вузов. О на изучает э лем ентарны е взаим одействия и превращ ения ионов и м олекул, леж ащ ие воснове биологических процессови явлений. О сновны м и разделам и биоф изики являю тся: - квантовая биоф изика, которая рассм атривает э лектронную структуру биом олекул, м еханизм ы поглощ ения квантов света атом ам и и м олекулам и, м играцию э нергии, ф отохим ические реакции, леж ащ ие в основе ф отобиологических процессов; - м олекулярная биоф изика, изучаю щ ая структурную организацию и м еханизм ы ф ункционированиябиом акром олекул и их ком плексов; - биоф изика клеточны х процессов, изучаю щ аяф изико-хим ические основы процессов, протекаю щ их в отдельны х клеточны х систем ах, в том числе ф орм ирование э лектрических потенциалов, м еханизм транспортны х процессов, законом ерности взаим одействиялигандовсклеточны м и рецепторам и; - биоф изика слож ны х систем , вклю чаю щ ая важ нейш ие разделы биоф изической науки, втом числе терм одинам икуи кинетикубиопроцессов; - радиационная биоф изика, исследую щ ая процессы взаим одействия ионизирую щ его излучения с биосистем ам и, развитие лучевого пораж ения на м олекулярном , клеточном и организм енном уровнях; - прикладная биоф изика, которая рассм атривает вопросы , связанны е с практическим прилож ением полож ений, понятий, законов, м оделей и м етодов биоф изической науки. Д ля подготовки квалиф ицированны х провизоров, обладаю щ их вы соким интеллектуальны м уровнем творческого характера в реш ении проф ессиональны х задач, необходим о постоянное соверш енствование учебного процесса на основе ф ундам ентализации знаний. С другой стороны , знания, ум ения и навы ки по ф ундам ентальны м дисциплинам представляю т собой ценность для будущ его специалиста только тогда, когда они вписы ваю тсякак э лем ент в систем у знаний по данной специальности. И м енно для реш ения названной проблем ы нам представлялось необходим ы м издание «Практикум а по биоф изике» , переработанного и дополненного сучетом проф ессиональной направленности для студентовф арм ацевтического ф акультета. В настоящ ее врем я биоф изика как ком плексная сам остоятельная дисциплина изучается на ф арм ацевтическом ф акультете В ГУ на II курсе (3 сем естр): учебны м планом предусм отрены лекции (38 часов) и лабораторны е занятия в таком ж е объем е. Практикум вклю чает пятьтем , в каж дой из них содерж итсятеоретическаячасть, подробное описание ф изико-хим ических основ м етодованализа, устройство приборови правила их э ксплуатации, цели, задачи и э тапы вы полнения лабораторны х работ (от 1 до 4), контрольны е вопросы и задачи, список реком ендуем ой литературы . Лабораторны е занятияпредназначены для расш ирения и закрепления теоретических знаний, углубленного изучения практического аспекта учебного м атериала, приобретениянавы коввобращ ении с

6

биоф изическим и приборам и, прим еняем ы м и для качественного и количественного анализа биологических и хим ических систем , ум енияставитьи реш ать ф арм ако-биологические и биоф изические задачи. В «Практикум е по биоф изике» отрабаты ваю тся необходим ы е теоретические полож ения, усваиваю тся расчетны е ф орм улы , правила работы с оборудованием в биоф изической лаборатории. О ценка знаний студентов осущ ествляется при прием е работ спом ощ ью контрольны х вопросови реш ениязадач. Ч астьлабораторны х работ э того учебно-м етодического пособиянаправлена не только на освоение того или иного биоф изического м етода анализа, но и на реш ение определенны х исследовательских задач, вы явление взаим освязи м еж ду изм енениям и структуры и ф ункций биообъекта, установление причинноследственны х связей рассм атриваем ы х явлений. Т акаяпостановка цели и задач исследования отраж ает основны е (общ ие) направления развития соврем енной биоф изики.

7

Т Е М А 1.С П Е КТ РА Л Ь Н Ы Е М Е Т О Д Ы И С С Л Е Д О В А Н И Я 1.1.За кономерностипоглощ ения св ета в ещ еств ом Ф отом етрическим и назы ваю т способы анализа, основанны е на избирательном поглощ ении э лектром агнитного излучения анализируем ы м вещ еством . В ф арм ацевтическом анализе они использую тся для установления структуры , идентиф икации, оценки чистоты , количественного определения лекарственны х вещ естввиндивидуальном виде и влекарственны х ф орм ах. Сущ ествую щ аяв настоящ ее врем яаппаратура позволяет использоватьдля аналитических целей следую щ ие диапазоны длин волн: ультраф иолетовы й (190 – 400 нм ), видим ы й (400 – 750 нм ), инф ракрасны й (750 – 40 000 нм ). Поглощ ение света проявляется в ослаблении светового потока после прохож денияего через исследуем ы й объект. Д лям онохром атического света э та законом ерностьвы раж аетсязаконом Бугера – Лам берта – Бера: Е сли интенсивностьпадаю щ его светового потокаравнаI0, то интенсивность света после поглощ енияслоем вещ ества будет равняться I = I010-εсl, (1) где ε - м олярны й коэ ф ф ициент э кстинкции (поглощ ения); с- концентрация вещ ества(м оль/л); l - длина оптического пути (толщ ина слояобразца). К оэ ф ф ициент э кстинкции характеризует способность м олекул вещ ества поглощ ать свет определенной длины волны и определяется структурны м и особенностям и м олекул данного вещ ества; он соответствует величине оптической плотности 1 м оль/л раствора при длине оптического пути 1 см . Закон Бугера-Лам берта-Бера вы веден для достаточно разбавленны х растворов при использовании м онохром атического света. Значительны е отклоненияот закона м огут бы тьобусловлены : - свойствам и анализируем ого образца - способностью м олекул вещ ества при больш их концентрациях образовы вать агрегаты , что приводит к росту светорассеянияи каж ущ ем усяповы ш ению его оптической плотности; - конструкцией прибора - использование нем онохром атического пучка света; работа вобласти, где погреш ностьприбора м аксим альна. Д ляхарактеристики поглощ аю щ ей способности вещ естваиспользую т такие величины , как оптическаяплотность, светопропускание и светопоглощ ение. О птическая плотность (D) - э то десятичны й логариф м отнош ения интенсивности света, падаю щ его на образец (Io), к интенсивности света, вы ходящ его из образца(I): D = lgI0/I. (2) О птическаяплотностьвещ ества являетсябезразм ерной величиной. Светопропускание (Т ) - отнош ение интенсивности света, вы ш едш его из образца, к интенсивности света, падаю щ его на него: Т = I/I0. (3) Светопропускание изм еряетсявпроцентах. Светопоглощ ение - величина, равная 1-Т ; изм еряется в долях или в процентах.

8

В аж нейш им следствием из закона Бугера-Лам берта-Бера является следую щ ее полож ение: оптическая плотность прям о пропорциональна концентрации данного вещ ества: D = εсl. (4) Спектр поглощ ения–э то граф ик зависим ости оптической плотности (или коэ ф ф ициента э кстинкции) от длины волны . При э том по оси ординат отклады ваю т D (или ε), а по оси абсцисс– длинуволны изм ерения(λ, нм ). λmax - длина волны , при которой на кривой светопоглощ ения опы тного образца появляетсяпик. Спектр поглощ ениям ож ет им етьнесколько м аксим ум ов поглощ ения. Полуш ирина полосы поглощ енияравна расстоянию м еж ду двум яточкам и полосы , находящ им ися на вы соте, равной половине м аксим альной. О на изм еряетсявнм . Т аким образом , при интерпретации спектров поглощ ения необходим о указы ватьполож ение полоспоглощ ения, их интенсивностьи полуш ирину. Поглощ ение света осущ ествляетсяне всей м олекулой, а определенны м и ее участкам и. Х ром оф оры - э то отдельны е группы атом ов в м олекуле вещ ества, поглощ аю щ ие кванты света в У Ф - и видим ой областях спектра. О сновны м и хром оф орам и в белках являю тся пептидны е группы , аром атические ам инокислоты (тирозин, триптоф ан, ф енилаланин) и цистин. У казанны е хром оф оры поглощ аю т в У Ф -области спектра. В нуклеиновы х кислотах хром оф оры - пуриновы е и пирим идиновы е азотисты е основания(аденин, гуанин, тим ин, цитозин и урацил). Х ром оф орам и слож ны х белков, в частности гем опротеидов, в видим ой области являю тся гем ы . Т ак, благодаря ж елезопорф ирину в составе гем белка, раствор оксигем оглобина обнаруж ивает несколько м аксим ум ов поглощ ения в э той области спектра: сам ы й интенсивны й в области 412-414 нм (полоса Соре) и м аксим ум ы м еньш ей интенсивности при 542 и 578 нм . О дноком понентны е неокраш енны е белки (сы вороточны й и яичны й альбум ины , трипсин, пепсин, глобулины и др.) не поглощ аю т свет сдлинам и волн 400-700 нм . Поглощ ение видим ого и У Ф -света происходит главны м образом сучастием π- и n-э лектронов (π-π* - и n-π* -переходы ). Ч ем длиннее систем а сопряж енны х связей в м олекуле, тем при больш ей длине волны располагаетсядлинноволновой м аксим ум поглощ ения. Спектры поглощ ения прим еняю тся для качественного (установления структуры , подлинности, чистоты ) и количественного (вы бораналитических длин волн) анализа лекарственны х средств. И дентиф икацию (установление подлинности) лекарственны х вещ еств в субстанции или одноком понентны х лекарственны х ф орм ах осущ ествляю т: - путем сравнения спектров поглощ ения испы туем ого и стандартного (ГСО ) образцов, полученны х в одних и тех ж е условиях (А Т Ф , рибоксин и др.) - по известны м парам етрам спектровпоглощ ения:

9

по полож ению м аксим ум ов поглощ ения при определенны х длинах волн (рутин, цианкобалам ин,хингам ин и др.). Э тот способ наиболее прост, но недостаточно достоверен, поэ том у прим еняется в качестве дополнительного критерия; по полож ению м аксим ум ов и м иним ум ов на спектрах поглощ ения, полученны х изм ерением кислотны х растворов относительно щ елочны х или наоборот (сульф анилам идны е препараты ); - по величине удельного показателя поглощ ения в м аксим ум е поглощ ения (токоф ерола ацетат, дигитоксин, левом ицетин и др.), прим еняетсянаиболее часто; - по величине отнош енияоптических плотностей при двух или более длинах волн (кислота ф олиевая, м етициллина натриеваясольи др.). При качественном анализе некоторы х лекарственны х вещ еств перечисленны е способы прим еняю тсявразны х ком бинациях. Э ти ж е характеристики м огут служ итьдляоценки чистоты лекарственного вещ ества, т.к. наличие прим есей м ож ет вы зы вать см ещ ение м аксим ум ов, появление дополнительны х полоспоглощ ения, изм енение величин коэ ф ф ициента поглощ ения. Ч истоту ряда лекарственны х вещ еств определяю т по величине отнош енияоптических плотностей вм аксим ум ах поглощ енияпри двух или более длинах волн (цианкобалам ин, ретинола ацетат, рутин и др.). Спектральны е м етоды анализа использую тся такж е для количественного определениявещ еств с пом ощ ью калибровочной прям ой или с использованием ф орм улы (4). В озм ож ен спектроф отом етрический анализ двух- и трехком понентны х систем . О бязательны м условием является соблю дение принципа аддитивности (сум м ирования), сф орм улированного К .Ф ирордтом . О н заклю чаетсяв том , что оптическая плотность см еси соединений, подчиняю щ ихся закону БугераЛам берта-Бэ ра и не вступаю щ их в хим ическое взаим одействие друг с другом , равна сум м е оптических плотностей каж дого ингредиента. Д ляопределениясодерж анияингредиентов двухком понентны х порош ков использую т диф ф еренциальны й м етод ф отом етрии: готовят растворы равной концентрации анализируем ого порош ка и каж дого ингредиента. И зм еряю т оптическую плотностьиспы туем ого раствора относительно раствора первого (D1) и второго (D2) ком понента при длине волны , при которой значения диф ф еренциальной оптической плотности м аксим альны . Содерж ание ингредиентоврассчиты ваю т по ф орм улам : g1=D2P/(D1+D2), g2=P-g1, (5) где g1 и g2 –содерж ание первого и второго ингредиентовпорош ков, г, Р – м асса порош ка по прописи, г. 1.2. Колориметр ф отоэлектрический KF-77 В биологических исследованиях чащ е всего использую тся спектроф отом етры (СФ ) и ф отоэ лектроколорим етры (Ф Э К ). Д ля вы деления участка спектра или отдельны х длин волн в ф отоколорим етрах использую т, как

10

правило, светоф ильтры ; в спектроф отом етрах свет разлагается в спектр с пом ощ ью призм ы или диф ракционной реш етки, а затем на объект направляется луч света определенной длины волны . Принцип действия колорим етра основан на поочередном изм ерении интенсивности света, прош едш его через контрольны й раствор (растворитель), и интенсивности света, прош едш его через исследуем ы й образец. При э том оптическую плотность контроля приним аю т равной нулю . К онтроль, а затем опы тны й образец поочередно устанавливаю т на пути светового потока. Световы е потоки светоприем никам и преобразую тся в э лектрические сигналы , которы е представлены на ш кале, откалиброванной в единицах оптической плотности и светопоглощ ения. Принципиальнаясхем а соврем енны х ф отоэ лектроколорим етроввклю чает в себяпоследовательно следую щ ие блоки: 1) источник света, даю щ ий излучение в видим ой области спектра - лам па накаливания; 2) оптическаясистем а; 3) светоф ильтр; 4) кю ветное отделение; 5) ф отоэ лем ент (чащ е всего используется селеновы й ф отоэ лем ент), преобразую щ ий э нергию светового потока вэ лектрическую э нергию ; 6) блок усилителяф ототока; 7) регистрирую щ ее устройство (вы сокочувствительны й м икроам перм етр или циф ровой вольтм етр; в соврем енны х Ф Э К - вы числительны й блок с м икропроцессорной систем ой). К олорим етр KF-77 предназначен дляизм еренияоптической плотности и светопропускания в отдельны х участках диапазона длин волн 390÷680 нм , вы деляем ы х светоф ильтрам и. Н орм альны м и условиям и работы колорим етра являю тся: напряж ение сети 220 ± 20 В , тем пература окруж аю щ ей среды 20 ± 5 °С, относительнаявлаж ность воздуха 45-80 %. О тносительная ош ибка изм ерения различна при работе на разны х участках ш калы прибора, она м иним альна при значениях оптической плотности винтервале 0,05-0,7. П ра в ила ра боты на KF-77 следу ю щ ие: В кю ветное отделение ставят кю веты с растворителем (контроль) и исследуем ы м раствором , устанавливаю т нуж ны й светоф ильтр. С пом ощ ью рукоятки кю ветного отделенияна пути светового потока устанавливаю т кю ветус растворителем . Стрелка изм ерительного прибора вы водитсяна нольоптической плотности (верхняяш кала) с пом ощ ью рукояток грубой и тонкой регулировки, располож енны х под ш калой. Затем рукояткой кю ветного отделенияв световой поток вводитсякю вета с исследуем ы м раствором , и сним аетсяотсчет показаний по ш кале оптической плотности или светопропускания. 1.3. С пектроф отометр С Ф -46

11

Спектроф отом етр СФ -46 предназначается для изм ерения коэ ф ф ициентов пропусканияи оптической плотности ж идких и тверды х прозрачны х вещ еств в области спектра от 190 до 1100 нм . Э тот прибор предназначен для работы в лабораторны х пом ещ ениях без повы ш енной опасности пораж енияэ лектрическим током . ПринципдействияСФ -46 основан наизм ерении отнош енияинтенсивности двух световы х потоков: прош едш его через исследуем ы й образец (I) и падаю щ его на него (Iо). Структурная схем а спектроф отом етра вклю чает следую щ ие основны е блоки: - осветитель (дейтериевая лам па предназначена для работы в области спектра 190 – 350 нм , лам па накаливания– дляработы в области 340 – 1100 нм ; - м онохром атор (построен по автоколлим ационной схем е), - кю ветное отделение; - прием но-усилительны й блок (ф отоэ лем ент (сурьм яно-цезиевы й дляизм ерений в области спектра 190 – 700 нм и кислородно-цезиевы й – дляработы при 600 – 1100 нм ), резистор, усилительпостоянного тока); - м икропроцессорнаясистем а. Световой пучок из осветителя попадает в м онохром атор через входную щ ельи разлагается диф ракционной реш еткой в спектр. В м онохром атический пучок излучения, поступаю щ ий из вы ходной щ ели в кю ветное отделение, поочередно вводятсяконтрольны й и опы тны й образцы . И злучение, прош едш ее через образец, попадает на ф отоэ лем ент в прием но-усилительном блоке. Э лектрический ток, проходящ ий через резистор, подклю ченны й к ф отоэ лем енту, создает на резисторе падение напряж ения, пропорциональное потоку излучения, падаю щ ем у на ф отокатод. У силительпостоянного тока обеспечивает передачу сигналов на вход м икропроцессорной систем ы (М ПС). М ПС по ком анде оператора (студента) поочередно изм еряет и запом инает напряж енияUт, Uо и U, соответствую щ ие тем новом у току ф отоэ лем ента, интенсивности света, падаю щ его на образец, и интенсивности света, прош едш его через образец. Значение изм еренной величины вы свечивается на циф ровом ф отом етрическом табло М ПС. 1.4. Эксперимента ль на я ча сть М ат ериал ы и о бо руд о в ание: ф отоэ лектроколорим етр К F-77 (или спектроф отом етр СФ -46), терм остат, терм ом етр, секундом ер, водны е растворы гем оглобина донорской крови, ф урадонин, пробирки, пипетки, м ерны е колбы , ф ильтровальнаябум ага. Л а бора торна я ра бота № 1. О пред ел ениек о нцент рации иссл ед уем о го в ещ ест в а в раст в о ре Цел ь рабо т ы : определить концентрацию гем оглобина в растворе с пом ощ ью градуировочной прям ой Хо д рабо т ы

12

Приготовитьраствороксигем оглобиначеловекавконцентрации 10-4 м оль/л. И зм еритьоптическую плотностьопы тного раствора при различны х длинах волн (используяприлагаю щ иесясветоф ильтры ); данны е занести втабл. 1.1. Т аблица1.1 Зависим остьоптической плотности раствора оксигем оглобина от длины волны № п/п

λ, нм

D

Построитьспектр поглощ енияраствора оксигем оглобина. Д ля дальнейш их исследований вы брать тот светоф ильтр, при котором оптическаяплотностьобразца им еет наибольш ую величину, так как изм ерения необходим о проводитьвобласти м аксим ум а поглощ енияисследуем ого образца. Разбавитьисходны й раствор оксигем оглобина в2, 4, 8, 10 и 20 раз, получив растворы гем белкасконцентрациям и 5⋅10-5; 2,5⋅10-5; 1,25⋅10-5;1⋅10-5 и 5⋅10-6 м оль/л соответственно. И зм ерить оптическую плотность приготовленны х растворов, данны е занести втабл.1.2. Т аблица1.2 Зависим ость оптической плотности растворов оксигем оглобина от их концентрации № п/п с, моль /л D

Построитькалибровочную прям ую , отклады ваяпо оси абсцисс значения концентрации э талонны х растворов, а по оси ординат - оптической плотности. По калибровочной прям ой находят концентрацию белка, соответствую щ ую изм еренном у значению оптической плотности. Д анны й граф ик позволяет установить, в каких концентрациях исследуем ого вещ ества соблю дается закон Бугера-Лам берта-Бера. И зм ерить оптическую плотность раствора гем белка с неизвестной концентрацией. О пределить концентрацию оксигем оглобина с пом ощ ью калибровочной прям ой. Сделатьвы воды о спектральны х свойствах раствора оксигем оглобина; о возм ож ности прим енения закона Бугера-Лам берта-Бера для определения концентрации вещ ества врастворе. Л а бора торна я ра бота № 2. И ссл ед о в ание в л ияния т ем перат уры на о пт ическ иесв о йст в а раст в о ро в о к сигем о гл о бина

13

Цел ь рабо т ы : изучитьоптические свойства растворовоксигем оглобина, м одиф ицированного воздействием различны х тем ператур. Хо д рабо т ы Приготовитьраствор оксигем оглобина вконцентрации 1⋅10-5 м оль/л. И зм еритьоптическую плотностьисследуем ого образца при длине волны , вы бранной длявы полнениялабораторной работы № 1. Н астроить терм остат на необходим ую тем пературу и пом естить в него растворы гем оглобина (варианты терм остатированиясм . ниж е). И зм еритьоптическую плотностьтерм ом одиф ицированны х растворовбелка. Сделать вы воды об оптических свойствах растворов гем оглобина, м одиф ицированны х воздействием различны х тем ператур; о связи оптических свойстви структуры м олекулы биополим ера. Вариант 1. Растворы белкатерм остатироватьпри 35; 45 и 55оС втечение 20 м ин. Вариант 2. Растворы белка нагреватьпри 40оС втечение 10; 15; 30; 45 м ин. Вариант 3. Растворы белка нагреватьпри 50оС втечение 5; 10; 15; 20 м ин. Л а бора торна я ра бота № по гл о щ ения фурад о нина

3. О пред ел ение уд ел ьно го

к о эффициент а

Цел ь рабо т ы : рассчитатьзначение удельного коэ ф ф ициента поглощ ения ф урадонина. Хо д рабо т ы Приготовитьстандартны й раствор ф урадонина, дляэ того точную навеску м ассой 100 м г внести в м ерную колбу объем ом 100 м л, добавить2,5 м л 1м оль/л NaOH и после полного растворенияф урадонинадовести содерж ание колбы водой до м етки. В м ерны е колбы объем ом 100 м л внести 0,6 м л стандартного раствора и довести водой до м етки. Приготовить таким образом не м енее 6 опы тны х растворов. И зм еритьоптическую плотностьопы тны х растворов на ф отоколорим етре или спектроф отом етре при длине волны 445 нм (м аксим ум поглощ енияраствора ф урадонина) в кю вете столщ иной слоя1,0 см . В качестве контрольного раствора использоватьводу. Рассчитать процентную концентрацию анализируем ого раствора, воспользовавш исьследую щ ей схем ой: а (0,100 г) → W1(100 мл) → V (0,6 мл) → W2 (100 мл) с= (aV/W1W2).100%, (6) где а – м асса вещ ества, W1 – общ ий объем стандартного раствора, V – объем стандартного раствора, взяты й на анализ, W2 – общ ий объем вторичного стандартного раствора (после разведения). Д анны е внести втаблицу1.3:

14

Т аблица1.3 О пределение удельного показателяпоглощ енияф урадонина D

ε%

ε% ср.

ε% - удельны й коэ ф ф ициент поглощ ения, соответствую щ ий величине оптической плотности 1 % раствора, пом ещ енного в кю вету с толщ иной слоя1 см . Расчет ε% провести по ф орм уле: ε% = D/сl, (7) где с– концентрациявещ ества, %, l – длина оптического пути, D – оптическаяплотностьобразца. Сделать вы вод о величине удельного коэ ф ф ициента поглощ ения ф урадонина. Л а бора торна я ра бота № 4. И ссл ед о в ание спек т рал ьны х св о йст в нек о т о ры х л ек арст в енны х в ещ ест в Цел ь рабо т ы : изучить спектральны е свойсва некоторы х лекарственны х вещ естввУ Ф - и видим ом диапазонах длин волн. Хо д рабо т ы Приготовить водны е растворы исследуем ы х вещ еств в определенной концентрации: а) раствор рибоф лавина – 1.10-5 м оль/л (м олекулярнаям асса рибоф лавина – 470 а.е.м .); б) раствор одноком понентного белка – ф ерм ента трипсина - 1.10-5 м оль/л (м олекулярнаям асса трипсина ≈ 24 кД а); в) раствор слож ного гем опротеида – ф ерм ента пероксидазы хрена - 5.10-6 м оль/л (м олекулярнаям асса пероксидазы хрена ≈ 44,1 кД а); г) раствор адреналина гидротартрата – 10 %. И зм еритьоптическую плотностьопы тны х образцов при различны х длинах волн – от 250 до 700 нм – на спектроф отом етре СФ -46. О птическую плотность изм ерятьчерез каж ды е 10 нм , в области м аксим ум ов поглощ ения вещ ества – через 2 нм . (В ним ание! При работе в У Ф -области спектр (250 – 400 нм ) использовать только кварцевы е кю веты , т.к. стекло поглощ ает лучи в э той спектральной области.) Построитьспектры поглощ енияопы тны х образцов. Сделатьвы вод о спектральны х свойствах исследуем ы х вещ еств, объяснить природувы явленны х полоспоглощ ения. Растворы белков (трипсина, пероксидазы ) нагреть (варианты терм остатированиясм . вработе № 2), изм еритьих оптическую плотностьвУ Ф - и видим ом диапазонах длин волн. Построить спектры поглощ ения терм ом одиф ицированны х белковы х растворов.

15

Сделатьвы вод о характере изм енений спектральны х свойств и структуры белковы х м олекул при действии на их растворы повы ш енны х тем ператур. 1.5. Контроль ны е в опросы 1. О сновны е характеристики оптического излучения. 2. Понятие об оптической плотности, светопропускании, светопоглощ ении; взаим освязьм еж дуданны м и парам етрам и. 3. Законом ерности поглощ ениясвета вещ еством . 4. Закон Бугера-Лам берта-Бера, причины отклоненияот него. 5. Прим енение спектральны х м етодоввбиологии и м едицине. 6. Принципустройства соврем енны х ф отоэ лектроколорим етров. 7. Принципустройства соврем енны х спектроф отом етров. 8. Связь оптических характеристик и структурного состояния биополим еров. 1.6. Реш ение з а да ч 1.О птическаяплотностьраствора равна 0,08. Н айдите его светопоглощ ение и светопропускание. 2. И нтенсивностьсвета, прош едш его через раствор, ум еньш иласьв 10 раз. И звестно, что данное вещ ество им еет м олярны й коэ ф ф ициент поглощ енияпри тестируем ой длине волны , равны й 500 м оль-1см -1. Т олщ ина кю веты сраствором 1 см . Н айдите концентрацию вещ ества врастворе. 3. Ч ем у равен м олярны й коэ ф ф ициент поглощ ения вещ ества при длине волны 400 нм , если при прохож дении света через раствор с концентрацией 0,5 м оль/л интенсивностьсвета ум еньш иласьв5 раз? Т олщ ина кю веты равна 0,3 см . 4. Рассчитайте содерж ание коф еина и бензоата натрияв коф еин-бензоате натрия, если точны е навески составляю щ их вещ естви их см еси м ассой по 0,050 г растворили в 50 м л воды (W1). По 0,1 м л (V) каж дого раствора довели до м етки в м ерной колбе объем ом 50 м л (W2) 0,1 м оль/л раствором хлороводородной кислоты . О птическаяплотностьраствора коф еин-бензоата натрия, изм ереннаяна спектроф отом етре при 273 нм относительно коф еина – 0,488, относительно натриябензоата – 0,320. 5. Рассчитайте содерж ание кортизона ацетата в таблетках, если навеску порош ка растерты х таблеток м ассой 0,1157 г растворили в 100 м л э танола, отф ильтровали от таблеточной м ассы . 5,0 м л полученного раствора довели э танолом до 100 м л. О птическаяплотностьполученного раствора при 238 нм равна 0,520. У дельны й показательпоглощ ениястандартного образца кортизона ацетата втех ж е условиях равен 390,0. Средняям асса одной таблетки – 0,2140 г. 6. Рассчитайте содерж ание адреналина гидротартрата в растворе для инъекций, если 5,0 м л препарата довели водой до 100 м л. О птическаяплотность полученного раствора составила при 530 нм 0,420. О птическая плотность стандартного образца, содерж ащ его 0,091 м г/м л, равна0,432.

16

СПИ СО К РЕ К О М Е Н Д У Е М О Й ЛИ Т Е РА Т У РЫ 1. А ртю хов В .Г. Биоф изика./ В .Г. А ртю хов, Т .А .К овалева, В .П.Ш м елев. В оронеж : И зд-во В оронеж . ун-та, 1994. - 336 с. 2. В ладим иров Ю .А . Ф изико-хим ические основы ф отобиологических процессов./ Ю .А .В ладим иров, А .Я .Потапенко. - М .: В ы сш . ш к., 1989. - 199 с. 3. К оневС.В . Ф отобиология./ С.В .К онев, И .Д .В олотовский.- М инск:: И зд-во БГУ , 1979. - 379 с. 4. А ртю хов В .Г. Гем опротеиды : законом ерности ф отохим ических превращ ений в условиях различного м икроокруж ения./ В .Г.А ртю хов - В оронеж : И зд-во В оронж . ун-та, 1995. - 280 с. 5. А ртю хов В .Г. О птические м етоды анализа интактны х и м одиф ицированны х биологических систем ./ В .Г.А ртю хов, О .В .Путинцева. В оронеж : И зд-во В оронеж . ун-та, 1996. - 240 с. 6. О лигом ерны е белки: структурно-ф ункциональны е м одиф икации и роль субъединичны х контактов./ В .Г.А ртю хов, О .В .Баш арина, Г.А .В аш анов, М .А .Н аквасина, О .В .Путинцева- В оронеж : И зд-во В оронеж . ун-та, 1997. - 264 с. 7. У э йн Р. О сновы и прим ененияф отохим ии./ Р.У э йн. - М .: М ир, 1991.- 304 с.

17

Т Е М А 2. РЕ Ф РА КТ О М Е Т РИ Ч Е С КИ Й М Е Т О Д А Н А Л И ЗА 2.1.П реломление св ета иреф ра ктометрические св ойств а ра ств оров Реф рактом етрический м етод анализа вещ еств и биосистем основан на изм ерении показателя прелом ления света (n) исследуем ы м вещ еством или раствором вещ ества. Понятие реф ракции - светопрелом ляю щ ей способности вещ ества - ввел в оптику И .Н ью тон. Реф ракция- э то м ера э лектронной поляризуем ости вещ ества, его внутрим олекулярнаяхарактеристика. При переходе света через границу раздела двух сред, скорость распространениясвета в которы х различна, происходит изм енение направления луча света. А бсолю тны й показатель прелом ления среды (nабс) определяется как отнош ение скорости распространения света в вакуум е (C) к скорости света в данной среде (V): nа бс = С /V. (1) О тносительны й показатель прелом ления (n)– э то величина, которую определяю т как отнош ение синусов угла паденияα1 и угла прелом ленияα2 или как отнош ение скоростей распространениясвета вдвух средах: n = sinα1/sinα2=V1/V2 . (2) В лабораторной практике чащ е определяю т не абсолю тны й, а относительны й показатель прелом ления. Поскольку величина абсолю тного показателя прелом ления воздуха при ком натной тем пературе и атм осф ерном давлении равняется1,00027, то дляполучениязначений абсолю тного показателя прелом лениявещ ества использую т ф орм улу: nа бс= 1,00027 n. (3) Показательпрелом ленияраствора зависит от: - природы вещ ества и растворителя, - тем пературы , - концентрации растворенного вещ ества, - длины волны света. Н аиболее часто для определения показателя прелом ления ж идкостей и изотропны х тверды х вещ ествиспользую т реф рактом етры , позволяю щ ие вы делять с пом ощ ью призм из естественного или э лектрического света длину волны , соответствую щ ую ж елтой линии D спектра испусканияиона натрия(589,3 нм ). Зависим ость показателя прелом ления от концентрации устанавливается опы тны м путем для каж дого индивидуального вещ ества и вы раж ается следую щ им и ф орм улам и: n=n0 + Fс; (4) F=F0 + Kс, (5) где n – показательпрелом ленияраствора; n0 – показательпрелом лениярастворителя(воды ) при той ж е тем пературе (длядистиллированной воды при ком натной тем пературе n0= 1,33299); с– концентрацияраствора, %;

18

F- ф актор, равны й величине прироста показателя прелом ления при увеличении концентрации на 1 % (определяетсяэ ксперим ентально длякаж дого вещ ества), его разм ерность- %-1; F0 – начальны й ф актор или ф актор, равны й величине прироста показателя прелом ления при переходе от показателя прелом ления воды к 1 % раствору данного вещ ества( %-1); К – постоянная величина, характеризую щ ая изм енение F-ф актора от изм ененияконцентрации (втораяпроизводная). Показательпрелом лениявещ естввозрастает сувеличением их плотности. Реф рактом етрический м етод им еет перед другим и м етодам и количественного анализа ряд преим ущ еств: простота и бы строта вы полнения, достаточная для практических целей точность, затраты небольш их количеств анализируем ы х препаратов. Н аиболее точны е результаты при количественном определении вещ еств реф рактом етрическим м етодом достигаю тся при концентрации определяем ого ком понента в пределах 5 – 10 % (допустим ы й ниж ний предел концентрации его при анализе см есей – 3 %). М етод реф рактом етрии ш ироко прим еняетсяво внутриаптечном контроле для анализа концентратов, полуф абрикатов, лекарственны х ф орм индивидуального изготовления, содерж ащ их один или несколько ком понентов. Д ля количественного определения лекарственны х вещ еств в см есях м етодом реф рактом етрии важ но, чтобы соблю дался принцип аддитивности (сум м ирования) показателей прелом ления ингредиентов, входящ их в состав анализируем ой см еси. Э то условие соблю дается при отсутствии хим ического взаим одействия м еж ду ком понентам и см еси. Поскольку случаи абсолю тно индиф ф ерентного отнош ения лекарственны х вещ еств и наполнителей друг к другу чрезвы чайно редки, следует говорить о соблю дении принципа аддитивности стой или иной степенью приближ ения. Д ля определения содерж ания действую щ их вещ еств в лекарственны х см есях на реф рактом етре изм еряю т показатель прелом ления раствора и растворителя. К онцентрацию исследуем ого вещ ества в растворе (с, %)рассчиты ваю т по показателю прелом ленияпо ф орм уле: с=(n –n0)/F. (6) К ром е того, содерж ание действую щ их вещ еств рассчиты ваю т м етодом э кстраполяции, пользуясьзначениям и показателей прелом ления, приведенны м и в реф рактом етрических таблицах. Е сли оба ингредиента достаточно хорош о растворяю тся в используем ом растворителе, то использую т диф ф еренциальную реф рактом етрию . Д ля э того готовят три раствора одинаковой концентрации (в %) – лекарственной ф орм ы и каж дого ком понента, входящ его в ее состав. И зм еряю т показатели прелом ления растворов анализируем ой см еси (n) и каж дого ком понента (n1 и n2 соответственно). Содерж ание ком понентоврассчиты ваю т по ф орм уле: g1=(n –n2)P/(n1 –n2), g2=P –g1, (7) где g1 и g2 – содерж ание первого и второго ком понентовпорош ков, г; Р- м асса порош ка по прописи, г.

19

2.2.Реф ра ктометр RL-1, у стройств о ипринцип действ ия В основе действия реф рактом етра RL-1 (Польш а) леж ит м етод, базирую щ ийся на изм ерении предельного угла прелом ленияили угла полного внутреннего отраж енияпри переходе луча света из среды сбольш им показателем прелом лениявсредусм еньш им показателем прелом ления(n1 >n2). Лабораторны й реф рактом етрRL-1 предназначен дляизм еренияпоказателей прелом ления и средней дисперсии ж идкостей и тверды х тел, а такж е для определениясодерж аниясахара вводны х растворах. Реф рактом етр RL-1 им еет две изм ерительны е ш калы , верхняяслуж ит для изм еренияпоказателяпрелом лениявещ еств в пределах величин от 1,3 до 1,7. Т очностьприбора в пределах n от 1,3 до 1,42 составляет 0,0004; при n от 1,42 до 1,7 – 0,0002. По ниж ней ш кале определяетсяпроцентное содерж ание сахара в водном растворе; точностьизм еренияв диапазоне от 0 до 50 % составляет 0,2 %, до 95 % сахара – 0,1 %. И сследуем ы й образец пом ещ ается на изм ерительную (реф рактом етрическую ) призм у. О на изготовлена из м атериала с известны м показателем прелом ления (чащ е всего э то тяж елы й ф линт) и им еет угол прелом ления, равны й 60 о. Н а входной грани изм ерительной призм ы происходит прелом ление света и наблю дается полное внутреннее отраж ение. Ж идкий анализируем ы й образец не стекает с входной грани, благодаря ее горизонтальном у располож ению . Призм а пом ещ ается в антикоррозийную м еталлическую полую кам еру, которая м ож ет бы ть подклю чена к ультратерм остату. Перед проведением изм ерений кам ера реф рактом етра и анализируем ы й раствор долж ны бы тьнагреты до определенной (одинаковой) тем пературы . Н ад изм ерительной призм ой располож ена вспом огательнаяприкры ваю щ ая (осветительная) призм а, пом ещ енная в оправу, закрепленную ш арнирно. О на позволяет использовать для изм ерений дневной свет или искусственное освещ ение. М еж ду граням и обеих призм пом ещ аетсяоченьтонкий слой ж идкости (0,1 – 0,2 м м ), так что лучи света, скользящ ие по входной грани реф рактом етрической призм ы , в пределах необходим ой точности соответствую т предельном у лучу полного внутреннего отраж ения. О кно в оправе прикры ваю щ ей призм ы предназначено для освещ ения прозрачны х вещ еств, исследуем ы х впроходящ ем свете. Н а реф рактом етре м ож но изм ерятьпоказатели прелом ленияполупрозрачны х и тем ноокраш енны х образцов. Д ля э того использую т отраж енны й свет, получаем ы й с пом ощ ью зеркала, ш арнирно закрепленного на оправе реф рактом етрической призм ы . В о врем я изм ерения пучок световы х лучей направляется на призм у зеркалом или освещ аю щ им окном , прелом ляется на изм ерительной плоскости призм ы и попадает внутрь корпуса реф рактом етра. Лучи света после прохож дениячерез направляю щ ую призм у попадаю т на систем у призм А м ичи. В ращ ение призм А м ичи расщ епляет белы й свет, что позволяет удалитьокраску

20

граничной линии, э то осущ ествляетсяс пом ощ ью головки снакаткой на корпусе реф рактом етра. Н а головке нанесены деления, указы ваю щ ие уровеньдисперсии. Затем пучок лучей света падает на объектив и ф окусируетсявверхнем окне полязренияокуляра – граничнаялиниядолж на находитьсяв центре верхнего поля, при э том в ниж ней части поля зрения окуляра видна ш кала показателя прелом ления и процентного содерж ания сахара; риска на ш кале показы вает изм еряем ое значение. Перем ещ ение граничной линии и ш калы показателей прелом ления в поле зрения окуляра осущ ествляется с пом ощ ью головки на корпусе реф рактом етра (см . инструкцию к прибору). О куляр передвигается в пределах 5 диоптрий. 2.3. Эксперимента ль на я ча сть М ат ериал ы и о бо руд о в ание: реф рактом етр RL-1, растворы альбум ина и гем оглобина донорской крови, сы воротка донорской крови, э тиловы й спирт, ф урадонин, растворы неорганических солей, дистиллированнаявода, пробирки, пипетки, ф ильтровальнаябум ага. Л а бора торна я ра бота № 1. О пред ел ение по к азат ел я прел о м л ения нек о т о ры х в ещ ест в и био л о гическ их сист ем Цел ь рабо т ы : определить показатели прелом ления предлож енны х преподавателем вещ естви биообъектов. Х од работы альбум ина и оксигем оглобина человека в

Приготовить растворы концентрации 5 . 10-5 м оль/л. О пред ел ит ь по к азат ел и прел о м л ения д ист ил л иро в анно й во д ы , эт ил о в о го

спирт а, раст в о ро в NaCl, CuSO4 (1 м о л ь/л), приго т о в л енны х белк о в ы х раст в о ро в , сы в о ро т к и к ро в и чел о в ек а. Каж д о еизм ерениепро в ест и нем енеечет ы рех раз. Полученны е величины показателей прелом ления исследуем ы х вещ еств и биобъектовзанести втабл.2.1. Т аблица2.1 Значенияпоказателей прелом ления некоторы х вещ естви биологических систем А нализируем ое вещ ество, биообъект

1

В еличина показателяпрелом ления О пределение Среднее значение 2 3 4

21

Н а основании полученны х данны х сделатьвы вод о зависим ости величины показателя прелом ления от структуры и ф изических свойств исследуем ого вещ ества. 2.4. Контроль ны е в опросы 1. Сф орм улируйте основны е законы отраж енияи прелом лениясвета. 2. Ч то такое абсолю тны й и относительны й показатели прелом ления вещ ества, от каких парам етровони зависят? 3. Понятие реф ракции. 4. О пиш ите устройство и принципдействияреф рактом етра RL-1. 5. К ак определить концентрацию раствора, зная его показатель прелом ления? 6. С какой целью прим еняю т реф рактом етрический анализ в м едикобиологических исследованиях? 2.5. Реш ение з а да ч 1. Рассчитайте содерж ание ингредиентов в лекарственной ф орм е состава: м етионина и глю козы по 0,25 г, показательпрелом ленияраствора анализируем ой см еси, приготовленной растворением в2,0 м л воды навески порош кам ассой 0,1 г, равен 1,3410, апоказатели прелом лениярастворовм етионинаи глю козы такой ж е концентрации равны соответственно 1,3420 и 1,3400. 2. Рассчитайте содерж ание ингредиентов в лекарственной ф орм е состава: м етионина и глю козы по 0,25 г, если показатель прелом ления раствора анализируем ой см еси, приготовленной растворением в 2,0 м л воды навески порош ка м ассой 0,1 г, равен 1,3413, а показатели прелом ления растворов м етионина и глю козы такой ж е концентрации равны соответственно 1,3422 и 1,3398. 3. Рассчитайте содерж ание глю козы (г) в лекарственной ф орм е: раствора Рингера 20,0 м л; глю козы 10,0 м г; воды до 100 м л; если показательпрелом ления анализируем ого раствора - 1,3492, а показатель прелом ления точно приготовленного раствора Рингера, 2,0 м л которого довели водой до 10 м л 1,3346. Ф актор показателяпрелом ленияглю козы - 0,00142. 4. Рассчитайте содерж ание ингредиентов в лекарственной ф орм е: папаверина гидрохлорида 0,02 г, глю козы 0,2 г, если показательпрелом ления10 % водного раствора см еси равен 1,3474, а показатели прелом ления растворов папаверина гидрохлорида и глю козы , приготовленны е растворением в 2,0 м л воды навесок м ассой по 0,2 г, равны соответственно 1,3490 и 1,3472. 5. Рассчитайте содерж ание ингредиентов в лекарственной ф орм е состава: дим едрола 0,005 г, глю козы 0,1 г, если показательпрелом ления10 % водного раствора см еси равен 1,3475, а показатели прелом лениярастворов дим едрола и глю козы , приготовленны е растворением в 2,0 м л воды навесок м ассой по 0,2 г, равны соответственно 1,3532 и 1,3472.

22

6. Н а анализ получен раствор кальцияхлорида 10 % в ам пулах по 10 м л. Н айдите концентрацию данного раствора при условии, что его показатель прелом ленияпри 20 0С равен 1,3448 (F = 0,00115 %-1). 7. Н а анализ получен раствор глю козы 10 % во ф лаконах по 100 м л. Н айдите содерж ание глю козы в г/м л при условии, что показательпрелом ления исследуем ого раствора, изм еренны й при 23 0С, равен 1,3466, а показатель прелом лениядистиллированной воды , изм еренны й при той ж е тем пературе, равен 1,3327 (F = 0,00142 % -1). СПИ СО К РЕ К О М Е Н Д У Е М О Й ЛИ Т Е РА Т У РЫ 1. Сауш кина А .С. Руководство по реш ению практических задач ф арм ацевтического анализа./ А .С.Сауш кина. – Пятигорск: И зд-во Пятигорск. ф арм . академ ии, 1996.- 194 с. 7. А ртю хов В .Г. О птические м етоды анализа интактны х и м одиф ицированны х биологических систем ./ В .Г.А ртю хов, О .В .Путинцева. В оронеж : И зд-во В оронеж . ун-та, 1996. - 240 с. 3. И оф ф е Б.Ф . Реф рактом етрические м етоды хим ии./ Б.Ф .И оф ф е.- Л.: Х им ия, 1983.- 349 с. 4. Э ссаулова И .А . Руководство к лабораторны м работам по м едицинской и биологической ф изике / И .А .Э ссаулова, М .Е .Блохина, Л.Д .Гонцов; под ред. И .А .Рем изова.- М .: В ы сш . ш к., 1987.- 271 с.

23

Т ема 3. И С П О Л Ь ЗО В А Н И Е М Е Т О Д А В И С КО ЗИ М Е Т РИ И О П РЕ Д Е Л Е Н И Я В Я ЗКО С Т И РА ЗЛ И Ч Н Ы Х Ж И Д КО С Т Е Й

ДЛ Я

3.1. П оня тие в я з кости, ха ра ктеристика в идов в я з кости Р ео л о гия - э то наука, изучаю щ аязаконом ерности деф орм ации и текучести различны х м атериалов. О дним из ее разделов являетсяв иск о зим ет рия, которая исследует важ нейш ую гидродинам ическую характеристикувещ ества- вязкость. Вязк о ст ь (внутреннее трение) ж идкости - свойство ж идкости оказы вать сопротивление перем ещ ению отдельны х ее слоев относительно друг друга; она обусловлена м еж м олекулярны м и взаим одействиям и, ограничиваю щ им и подвиж ность м олекул. В язкость представляет собой коэ ф ф ициент пропорциональности м еж ду напряж ением сдвига τ и градиентом скорости движ енияж идкости (закон Н ью тона): τ = η.du/dx, (1) где η - вязкость, du/dx – градиент скорости движ енияж идкости, назы ваем ы й такж е скоростью деф орм ации сдвига. Н апряж ение сдвига – сила, действую щ ая на единицу площ ади слоя в направлении его движ ения: τ = F/s. (2) В систем е СИ за единицу динам ической вязкости (η) принят 1 Па/с. Э то динам ическаявязкостьсреды , вкоторой при лам инарном течении на каж ды й 1 м 2 движ ущ егосяслоядействует силатрения1 Н при условии, что разностьскоростей слоев, находящ ихсяна расстоянии 1 м друг от друга, равна1 м /с. В систем е СГС единицей вязкости является1 пуаз (П). 1 Па/с = 10 П = 103 сП. В язкостьводы при 20 оС равна 1,002 сП (м Па.с) с ош ибкой до ± 0,1%. В язкостькакого-либо раствора по величине м ож ет сущ ественно отличатьсяот вязкости чистого растворителя, т.к. м олекулы растворенного вещ ества будут наруш атьоднородностьпотока. О т но сит ел ьная вязк о ст ь – э то величина, определяем ая отнош ением вязкости вещ ества(η) к вязкости растворителя(ηо): ηотн.=

η . (3) η0

О бы чно величина относительной вязкости больш инства вещ еств превы ш ает 1. Т ак, относительнаявязкостьэ тилового спирта при 20оС равна 1,192; уксусной кислоты - 1,219; хлорида натрия- 1,084; касторового м асла - 1,250; глицерина 1,490. Уд ел ьная в язк о ст ь – э то величина, определяем аядолей изм енениявязкости, вы званной добавлением растворенного вещ ества: ηу д =

η−η

ο = η -1=η -1. (4) отн. η η ο ο

24

У дельнаявязкостьпропорциональна доле объем а, заним аем ого м олекулам и вещ ества. По степени различий величин вязкости растворенного вещ ества и вязкости растворителясудят о гидродинам ических свойствах данного вещ ества. Показательудельной вязкости зависит от концентрации вещ ества, поэ том у бы ло введено понятие прив ед енно й в язк о ст и: ηпр.= ηу д /с, (5) где с- концентрациявещ ества вграм м ах на1 или 100 м л. Д ляневзаим одействую щ их м еж ду собой м олекул удельнаявязкостьпрям о пропорциональна концентрации. Д ля биологических м акром олекул нельзя пренебрегать м еж м олекулярны м и взаим одействиям и, которы е усиливаю тся с ростом их концентрации. Приведенная вязкостьне одинакова при различны х концентрациях вещ естви им еет см ы сл характеристической константы только при м алы х концентрациях. Э кстраполируявы раж ение

η— Љ к нулевой концентрации, получаю т величину, c

назы ваем ую в нут ренней ил и харак т ерист ическ о й в язк о ст ью ([η]): [η]=lim

η— Љ ≅ aV, (6) c

где а – константа, определяем аяф орм ой м олекулы , V – удельны й объем м олекулы . Гибкие полим ерны е биом олекулы в растворе приним аю т ф орм у гауссова клубка, т.е. асим м етричного клубка, которы й м ож но представить в виде э ллипсоида вращ ения. Т акая м олекула вращ ается вм есте с ж идкостью , пронизы ваю щ ей данны й клубок, следовательно, ж идкостьчерез нее не протекает. Х арактеристическаявязкостьбиом олекулы зависит от константы а, определяем ой ф орм ой м олекул, и от удельного объем а.; она представляет собой важ нейш ую характеристику м олекул биополим еров, тесно связанную с их разм ером , ф орм ой и степенью ж есткости. Д ляопределенияэ того вида вязкости находят значения удельной вязкости растворов исследуем ого вещ ества с нескольким и заранее известны м и концентрациям и. Затем строят кривую зависим ости величины ηпр от концентрации и э кстраполирую т значение приведенной вязкости к точке с = 0 (нулевой концентрации), а затем по оси ординат находят величину характеристической вязкости. Х арактеристическая вязкость является показателем , э квивалентны м м олекулярной м ассе биополим еров. Г.Ш таудингер предлож ил уравнение: [η] = KМ а , (7) где К и а- э м пирические коэ ф ф ициенты ; М - м олекулярнаям асса биополим ера. Э м пирические коэ ф ф ициенты находят по калибровочной прям ой следую щ им образом . О пределяю т [η] растворов биополим еров с заранее известны м и м олекулярны м и м ассам и. Строят граф ик, где по оси абсцисс отклады ваю т натуральны е логариф м ы м олекулярны х м асс м олекул-м етчиков, а по оси ординат - найденны е величины их характеристической вязкости. Е сли нанесенны е на граф ик точки леж ат на одной прям ой, то величина lnК будет

25

равнятьсядлине отрезка, отсекаем ого калибровочной прям ой от оси ординат, а коэ ф ф ициент а- соответствоватьтангенсуугла наклона э той прям ой. У становлено, что коэ ф ф ициент а для сф ерических частиц равен 0, для беспорядочно свернуты х клубков (гауссовы х клубков) - 0,5 - 0,8; для клубкообразны х полим ерны х м олекул, сквозь которы е свободно протекает растворитель, - 0,5; дляж естких клубков и гибких стерж ней - 1,1; дляж естких стерж ней - 1,8. 3.2. В я з кость кров и Ж идкости, течение которы х подчиняется уравнению (1), назы ваю тся нью тоновским и. Д ля м ногих ж идкостей, в частности крови, уравнение (1) не соблю дается, э то ненью тоновские ж идкости. Д ействительно, вязкостькрови резко падает с увеличением градиента скорости. При вы соких величинах напряж ения сдвига (а значит и при вы соких градиентах скорости) кровь ведет себя как нью тоновскаяж идкость. Э ти свойства крови обусловлены тем , что при низких скоростях сдвига вней им ею тсяагрегаты э ритроцитов. Э ти агрегаты распадаю тся по м ере увеличения скорости сдвига, и поэ том у вязкостькрови сниж ается и приближ ается постепенно к определенном у пределу. При больш ой скорости сдвига кровьм ож но рассм атриватьпросто как суспензию клеток и изучатьее м еханические свойства на м оделях: суспензиях э ритроцитов в ф изиологическом растворе и суспензиях других частиц. Э то справедливо для крови, текущ ей в крупны х артериях. Т ечение крови по таким сосудам зависит от концентрации и ф изических свойств э ритроцитов. О днако зависим остьвязкости от напряж ения сдвига для норм альны х э ритроцитов зам етно отличается от кривой для сф ерических частиц или «ж естких» э ритроцитов. При э том вязкостьсуспензии э ритроцитовпри значении гем атокрита, соответствую щ ем норм альной крови, т.е. около 40 %, почти вдвое ниж е вязкости ж естких сф ерических частиц. Благодаря дисковидной ф орм е клеток и э ластичности оболочки суспензия э ритроцитов обладает относительно низкой вязкостью , что важ но дляум еньш ениянагрузки на сердце, которое прокачивает кровь по кровеносны м сосудам . У величение ж есткости стенок э ритроцитов при патологических процессах приводит к возрастанию вязкости и ухудш ению кровообращ ения. М еханическое напряж ение стенки кровеносного сосуда(σ): σ = pr/h, (8) где р – давление крови, r – радиуспросвета сосуда, h – толщ ина стенки сосуда. Скоростьраспространенияпульсовой волны вкрупны х сосудах: v=

Eh , 2rρ

(9),

где ρ - плотностьвещ ества сосуда. Связьобъем ной (Q) и линейной скорости (v) кровотока всосуде Q = vS, (10)

26

где S – площ адьпросвета сосуда. Н а вязкостькрови влияет ряд ф акторов: - скорость кровотока (поэ том у вязкость вы ш е в капиллярах и ниж е в артериях); - концентрацияэ ритроцитов; - э ластичностьм ем бран клеток крови; - концентрациябелковплазм ы ; - тем пература. 3.2. Устройств о ка пилля рного в искоз иметра Д ля протекания ж идкости через трубку (капилляр) требуется некоторая разностьдавлений. Зависим остьм еж ду объем ом ж идкости (V), протекаю щ ей за врем я t через трубку длиной l, и разностью давлений ∆p на концах трубки вы раж аетсяф орм улой Пуазейля: V = πr4∆pt/(8ηl), (11) где r – радиуструбки. Д ля определения вязкости по ф орм уле (11) необходим о, чтобы течение ж идкости бы ло лам инарны м , т.е. таким , при котором слои ж идкости текут параллельно, не перем еш иваясь. Д лявихревого (турбулентного) теченияф орм ула Пуазейля неприм еним а. Ч тобы при обы чны х скоростях вихри не появились, трубка долж на бы тьдостаточно тонкой. И зм ерение вязкости ж идкостей при пом ощ и стеклянны х капиллярны х вискозим етров основано на законе Пузейля. И сходяиз ф орм улы (11), вязкость ж идкости равна: η = πr4∆pt/(8lV). (12) Е сли ввести дляданного прибора постоянную k: k = πr4/(8ηl), (13) то вязкостьм ож но вы разитьследую щ им уравнением : η = k∆pt. (14). К онстанта k определяетсяпри калибровке прибора. К апиллярны й вискозим етр представляет собой стеклянны й калибровочны й капилляр, соединенны й с изм ерительны м резервуаром . В ы ш е и ниж е изм ерительного резервуара располагаю тсям етки, по которы м отсчиты ваю т врем я прохож дениям ениска исследуем ого раствора. В искозим етр терм оизолирован от окруж аю щ ей среды терм ически закры ты м кварцевы м или стеклянны м кож ухом , заполненны м дистиллированной водой, и соединен с ультратерм остатом . В искозим етр закрепляетсявш тативе встрого вертикальном полож ении. И сследуем ую ж идкостьналиваю т в стаканчик, погруж аю т в него ниж ний конец капилляра и засасы ваю т раствор в вискозим етр с пом ощ ью резинового баллона так, чтобы уровеньвещ ества бы л вы ш е верхней м етки изм ерительного резервуара. Затем сним аю т резиновы й баллон и даю т ж идкости возм ож ность свободно вы текатьобратно через капилляр. При э том секундом ером изм еряю т

27

врем явы теканияисследуем ого вещ ества от верхней до ниж ней изм ерительной м етки. И стечение ж идкости из капиллярапроисходит при перем енном давлении, т.к. вы сота столба ж идкости ум еньш аетсяпо м ере ее вы текания. И зм енение давления (∆p) равно: ∆p = ρg∆h, (15) где ρ - плотностьж идкости, ∆h – разностьуровней ж идкости. Следовательно, исходяиз ф орм ул (3), (14) и (15), относительную вязкость раствора вещ ества, вы текаю щ его из вискозим етра, м ож но рассчитатьпо ф орм уле: ηотн.=

ρ1 t 1 ρ0 t 0

,

(16)

где ρ1 – плотностьисследуем ого раствора вещ ества, ρ0 – плотностьрастворителя, t1 – врем яистечениякалибровочного объем а исследуем ого раствора, t0 – врем яистечениякалибровочного объем а растворителя. В случае, когда плотности исследуем ого раствора и растворителяблизки по величине, значение относительной вязкости м ож но определятьтолько по врем ени истечениярастворителяи исследуем ого раствора по ф орм уле: ηотн.≈

t1 . to

(17).

О ш ибки, возникаю щ ие при определении вязкости ж идкостей с пом ощ ью стеклянны х капиллярны х вискозим етров, весьм а м ногочисленны и разнообразны , поэ том у точность изм ерения вязкости с использованием э того вида вискозим етров не м ож ет превы сить± 1%. Ч астьош ибок связана сособенностям и конструкции приборов и гидродинам ических свойств ж идкостей (отклонение геом етрической ф орм ы от кругового цилиндра; действие капиллярны х сил; различное поверхностное натяж ение для разны х исследуем ы х ж идкостей; влияние кинетической э нергии м олекул вещ ества, движ ущ ихсяпо капилляру). М ногие ош ибки носят м еханический характер: отсутствие тщ ательного терм остатированиявискозим етров; недостаточнаячистота капилляра и изм ерительного резервуара; присутствие инородны х частиц висследуем ом растворе; установка вискозим етра не в строго вертикальном полож ении; неточны й отсчет врем ени м ом ента начала и конца истечения. Н еобходим о старатьсяизбеж атьэ тих ош ибок при работе. В настоящ ее врем я созданы новы е виды капиллярны х вискозим етров и приспособлений к ним , позволяю щ ие избавиться частично от возм ож ности появления вы ш еперечисленны х ош ибок. Среди них следует отм етить использование вы сокоточны х терм остатов, введение э лектрических и ф отоэ лектрических регистрирую щ их устройств, автом атизацию изм ерений с дальнейш ей передачей изм еряем ы х величин на Э В М и програм м ирование обработки э ксперим ентальны х данны х. В се э то пом огло снизить величину ош ибки изм ерений ≈ в10 раз (т.е. до 0,1 %.

28

3.4. М едицинский в искоз иметр М едицинский вискозим етр используетсядляопределениявязкости крови. Принцип его действия основан на том , что скорости продвиж ения различны х ж идкостей в капиллярах с одинаковы м и сечениям и при равны х тем пературах и давлениях зависят от вязкости э тих ж идкостей. И з ф орм улы Пуазейля(11) следует, что объем ы ж идкостей, протекаю щ их за равны е пром еж утки врем ени по одинаковы м капиллярам , обратно пропорциональны вязкостям э тих ж идкостей. Следовательно, V0/V = l0/l = η0/η, (18) где l0 и l – перем ещ ение ж идкостей вкапилляре за одинаковое врем я. М едицинский вискозим етр состоит из двух одинаковы х градуированны х капилляров, сообщ аю щ ихся м еж ду собой. В один из капилляров набираю т определенны й объем дистиллированной воды , в другой – исследуем ую ж идкость (кровьили плазм у). При вы текании ж идкостей их перем ещ ение l за одно и то ж е врем ябудет обратно пропорционально их вязкости (18). Е сли вязкость воды считать равной единице, а путь, пройденны й ею , составляет одно деление вискозим етра,. то на основании (18) вязкостьж идкости численно равна пути, пройденном упри э том данной ж идкостью . 3.5. Эксперимента ль на я ча сть М ат ериал ы и о бо руд о в ание: стеклянны й капиллярны й вискозим етр, секундом ер, водны е растворы неорганических солей, водны е растворы сахарозы , пробирки, пипетки, м ерны е колбы , ф ильтровальнаябум ага. Л а бора торна я ра бота нео рганическ их со л ей

№

1.

О пред ел ение в язк о ст и

раст в о ро в

Цел ь рабо т ы : определитьвеличины относительной, удельной и приведенной вязкости исследуем ы х растворов. Хо д рабо т ы Приготовить растворы хлорида натрия, хлорида ам м ония, гидроф осф ата натрия, сульф ата м еди вконцентрации 1 м оль/л. О пред ел ит ь в рем я ист ечения д ист ил л иро в анно й в о д ы (раст в о рит ел ь) и иссл ед уем ы х раст в о ро в в к апил л ярев иск о зим ет ра. Каж д о еизм ерениепро в ест и нем енеечет ы рех раз. Полученны е величины врем ени истеченияисследуем ы х вещ еств занести в табл.3.1. Т аблица3.1 Значениявязкости растворовнеорганических солей

29

А нализируем ое вещ ество

1

В рем яистечения, с О пределение 2 3

4

Среднее значение

Н а основании полученны х данны х сделатьвы вод о зависим ости величины вязкости от концентрации (%) и ф изических свойствисследуем ого вещ ества. Л а бора торна я ра бота № 2. О пред ел ениев язк о ст и раст в о ро в сахаро зы Цел ь рабо т ы : определитьвеличины относительной, удельной, приведенной и характеристической вязкости растворовсахарозы . Хо д рабо т ы Приготовитьрастворы сахарозы вконцентрации 1; 5; 10; 15 и 20 %. О пред ел ит ь в рем я ист ечения д ист ил л иро в анно й во д ы (раст в о рит ел ь) и иссл ед уем ы х раст в о ро в. Каж д о еизм ерениепро в ест и нем енеечет ы рех раз. Полученны е величины врем ени истечения опы тны х растворов занести в табл.3.2. Т аблица3.1 Значениявязкости растворовсахарозы К онцентрация раствора

1

В рем яистечения, с О пределение 2 3

4

Среднее значение

Рассчитать величины относительной, удельной и приведенной вязкости растворов сахарозы . Х арактеристическую вязкостьсахарозы найти граф ически, дляэ того построитьграф ик зависим ости приведенной вязкости (по оси ординат) от концентрации углевода (по оси абсцисс). В еличина отрезка, отсекаем ого полученной прям ой на оси ординат, соответствует характеристической вязкости э того вещ ества. Сделатьвы вод о зависим ости вязкости от концентрации раствора сахарозы . Л а бора торна я ра бота № 3. О пред ел ениео т но сит ел ьно й в язк о ст и пл азм ы и сы в о ро т к и к ро в и чел о в ек а Цел ь рабо т ы : исследовать относительную вязкость плазм ы и сы воротки крови человека. Хо д рабо т ы По врем ени истечениясы воротки и плазм ы крови доноров определитьих относительную вязкость. В рем яистеченияопы тны х образцовизм ерятьне м енее 5 раз. О ценитьвеличины ηотн. дляплазм ы и сы воротки.

30

3.5. Контроль ны е в опросы 1. Ч то представляет собой вязкость? К аковы единицы ее изм ерения? 2. О характеризуйте различны е виды вязкости, напиш ите ф орм улы для их определения. 3. В чем состоит сущ ностьзакона Н ью тона? 4. О пиш ите сутьразличны х м етодовопределениявязкости. 5. В чем состоят различия м еж ду нью тоновским и и ненью тоновским и ж идкостям и? 6. К акие парам етры структурного состояния биом олекул позволяет определитьм етод вискозим етрии? 7. К акие ф акторы оказы ваю т влияние на вязкостькрови? 8. К акое значение им ею т биореологические исследования в биологии и м едицине? 9. К аковы принципы , леж ащ ие воснове м етодики определениявязкости при пом ощ и капиллярны х вискозим етров? 3.6. Реш ение з а да ч 1. О пределите давление в стенке капилляра диам етром 20 м км , если толщ ина стенки сосуда2 м км , а м еханическое напряж ение стенки составляет 8.105 Па. 2. Н айдите объем ную скоростькровотока в аорте, если радиус просвета аорты равен 1,75 см , а линейнаяскоростькрови вней составляет 0,5 м /c. 3. В ряде случаев лекарство дозирую т каплям и. Н а сколько процентов изм енитсядоза водного раствора лекарства при изм енении тем пературы от t1 = 25 о С до t2 = 10 оС? Э тим тем пературам соответствую т поверхностны е натяж енияσ1 = 71,78 м Н /м и σ2 = 74,01 м Н /м . Д ополнительное давление под сф ерической поверхностью ж идкости ∆р= 2σ/r, где r – радиуссф ерической поверхности. 4. При использовании м едицинского вискозим етра10 м л дистиллированной воды вы текаю т из капилляра за 35 с. И звестно, что относительнаявязкостькрови ум уж чин составляет около 5 (4,3 – 5,3), а уж енщ ин – 4,5 (3,9 – 4,9). Рассчитайте, за какое врем я из данного вискозим етра будет вы текатьтот ж е объем крови? О бъясните, чем обусловлена разнаявязкостькрови ум уж чин и ж енщ ин. 5. При ум еньш ении тем пературы от 37 оС до 17 оС вязкость крови возрастает на 10 %. Н а сколько процентов изм енится врем я вы текания калибровочного объем а крови? С П И С О К РЕ КО М Е Н Д УЕ М О Й Л И Т Е РА Т УРЫ 1. А нтоновВ .Ф . Биоф изика./ В .Ф .А нтонов.- М .: В ЛА Д О С, 1999. - 288 с. 2. Биоф изика./ Ю .А .В ладим иров, Д .И .Рощ упкин, А .Я .Потапенко, А .М .Д еев. - М .: М едицина, 1983. -272 с.

31

3. Э ссаулова И .А . Руководство к лабораторны м работам по м едицинской и биологической ф изике / И .А .Э ссаулова, М .Е .Блохина, Л.Д .Гонцов; под ред. И .А .Рем изова.- М .: В ы сш . ш к., 1987.- 271 с. 4. Захарченко В .Н . К оллоиднаяхим ия./ В .Н .Захарченко.-М .: В ы сш .ш к., 1989. - 238 с.

32

Т Е М А 4. И С П О Л Ь ЗО В А Н И Е РА Д И О М Е Т РИ Ч Е С КО ГО М Е Т О Д А Д Л Я О П РЕ Д Е Л Е Н И Я А КТ И В Н О С Т И РА Д И О Н УКЛ И Д О В 4.1. Ра диоа ктив ность . В з а имодейств ие ионизиру ю щ его излу чения с в ещ еств ом О дним из распространенны х источников ионизирую щ его излучения являетсярадиоактивны й распад атом ны х ядер. И з отопы - э то атом ы э лем ента, заним аю щ ие в периодической систем е э лем ентов Д .И . М енделеева одно и то ж е м есто, но им ею щ ие разны е м ассовы е числа, т.е. содерж ащ ие в ядре разное число нейтронов. По способности ядра атом а к распаду изотопы делят на стабильны е и радиоактивны е. Стабильны е изотопы им ею т э лем енты с зарядом ядра м еньш е 83. Я дра атом ов стабильны х изотопов устойчивы . Радиоактивны е изотопы сам опроизвольно превращ аю тсяв другие ядра, э тот процессчасто сопровож даетсяэ лектром агнитны м излучением . Ра диоа ктив ность ю назы ваю т сам опроизвольны й распад неустойчивы х ядер с образованием других ядер или э лем ентарны х частиц. Х арактерны м признаком , отличаю щ им ее от других видов ядерны х превращ ений, является спонтанностьданного процесса. Заряж енны е частицы и γ-кванты , распространяясь в вещ естве, взаим одействую т с ним , в результате наблю дается изм енение состояния как вещ ества, так и частиц. О сновны м м еханизм ом потери э нергии заряж енной частицы при прохож дении через вещ ество являетсяионизационное торм ож ение. При э том ее кинетическая э нергия расходуется на возбуж дение и ионизацию атом овсреды . Радиоактивны й распад - э то статистическое явление. Д ля больш ой совокупности радиоактивны х ядер м ож но получить статистический закон, вы раж аю щ ий зависим ость числа нераспавш ихся ядер от врем ени. Закон радиоактивного распада м ож но вы разитьследую щ ей ф орм улой: Nt = N0e-λt ,(1) где Nt - число радиоактивны х атом ов в м ом ент врем ени t; N0 первоначальное число таких атом ов; λ - коэ ф ф ициент пропорциональности, характеризую щ ий вероятность распада изотопа. О н равняется доле атом ов, распадаю щ ихсявединицуврем ени. Д ругой важ ной характеристикой процесса распада радионуклидов является период полураспада T1/2 - врем я, за которое количество радиоактивны х атом ов ум еньш ается вдвое. Е сли подставить Nt = 1/2N0 в уравнение (1) и прологориф м ироватьего, то получим ln1/2 = -λT1/2, (2) следовательно: T1/2 = 0,693 . 1/λ. (3) Период полураспада - постоянная величина, не зависящ ая от числа радиоактивны х атом ов в образце. В еличины периодов полураспада изотопов приводятсяв специальны х справочниках, они изм еняю тсяот нескольких секунд до сотен лет. Знание величины T1/2 пом огает подобратьболее удобны й дляработы

33

изотоп, позволяет внести поправки наизм енение скорости распадаядервданны й м ом ент врем ени. Т аким образом , активность препарата тем вы ш е, чем больш е радиоактивны х ядер и чем м еньш е их период полураспада. Е диница радиоактивности - беккерель (Бк). 1 Беккерель соответствует одном у ядерном у превращ ению в секунду. В несистем ной единицей активности радиоизотопа являетсякю ри (Ku). 1 К ю ри соответствует радиоактивности такого препарата, вкотором в1 спроисходит столько ж е распадов, сколько в1 г радия: 1 Ku = 3,7⋅1010 Бк. Рассм отрим основны е типы радиоактивного распада. А ль ф а -ра спа д заклю чается в сам опроизвольном превращ ении ядра с испусканием α-частицы . Схем уα-распада записы ваю т вследую щ ем виде: А → AZ−−42 Y + 42 α , ZX где Х и Y - сим волы исходного и образовавш егосяядер соответственно; А м асса, Z - заряд ядра. Следовательно, α-частицы представляю т собой ядра атом а гелия. При α-распаде дочернее ядро м ож ет образоватьсяне только в норм альном , но и в возбуж денны х состояниях. Т ак как они приним аю т дискретны е значения, то и значенияэ нергии α-частиц, вы летаю щ их из разны х ядер одного и того ж е радиоактивного вещ ества, дискретны . Э нергиявозбуж дениядочернего ядра чащ е всего вы деляется в виде γ-квантов, им енно поэ том у α-распад, как правило, сопровож даетсяγ-излучением . Средний линейны й пробег α-частицы зависит от ее э нергии (Е =(6-16)⋅10-11 Д ж ) и составляет в воздухе несколько сантим етров, а в воде и в тканях ж ивы х организм ов - 10 - 100 м км . К огда α-частица полностью теряет свою э нергию на столкновения с атом ам и вещ ества, она присоединяет два э лектрона и превращ аетсяв стабильны й атом гелия, которы й не взаим одействует с другим и атом ам и. И онизация и возбуж дение являю тся первичны м и процессам и радиоактивного распада. В торичны м и его процессам и м огут бы тьувеличение скорости м олекулярно-теплового движ ения, характеристическое рентгеновское излучение, радиолю м инесценция, хим ические процессы . Б ета -ра спа д заклю чается во внутриядерном взаим ном превращ ении нейтрона и протона. β-лучи - э то поток отрицательно (э лектроны ) или полож ительно (позитроны ) заряж енны х частиц. Различаю т три вида β-распада. 1. Э лектронны й, или β -распад, которы й сопровож даетсявы летом из ядра β -частицы (э лектрона). В 1932 г. В .Паули вы сказал предполож ение о том , что одноврем енно с β--частицей из ядра вы летает ещ е и другая, нейтральная, сочень м алой м ассой. По предлож ению Э .Ф ерм и э та частица бы ла названа нейтрино. Позж е бы ло установлено, что нейтрино возникает при β+-распаде, а при β-распаде образуетсяантинейтрино. Схем а β--распада сучетом правила см ещ ения: ~ A А → Z+1 Y + −10 β + ν , ZX где ~ ν - обозначение антинейтрино.

34

При β--распаде э лектрон образуется в результате внутриядерного превращ ениянейтрона впротон: ~ 1 1 0 0 n → 1 p + −1 e + ν . 2. Позитронны й, или β+-распад. Схем а β+-распада: А → Z A−1Y + +10 β + ν, ZX где ν - обозначение нейтрино. При β+-распаде позитрон образуется в результате внутриядерного превращ енияпротона внейтрон: 1 1 0 1 p → 0 n + +1 e + ν. 3. Э лектронны й, или е-захват. Э тот вид радиоактивности заклю чается в захвате ядром одного из внутренних э лектронов атом а, в результате чего протон ядра превращ ается внейтрон: 1 0 1 1 p + − 1 e → 0 n + ν. Схем а э лектронного захвата: А + −10 β → Z A−1Y + ν. ZX В зависим ости от того, с какой внутренней оболочки захваты вается э лектрон, иногда различаю т К -захват, L-захват и т.д. При э лектронном захвате освобож даю тся м еста в э лектронной оболочке, поэ том у данны й вид радиоактивности сопровож дается характеристическим рентгеновским излучением . Э нергии β-частиц изм еняю тся в ш ироких пределах, достигая значений порядка 1,6⋅10-17 Д ж . В отличие от α-лучей сдискретны м (линейчаты м спектром ), β-лучи им ею т сплош ной спектр э нергии. К ром е ионизации и возбуж дения, βчастицы м огут вы зы ватьи другие процессы . Т ак, наприм ер, при торм ож ении э лектронов возникает торм озное рентгеновское излучение. Бета-частицы рассеиваю тсяв вещ естве, и их пути сильно искривляю тся. При попадании β+частицы ввещ ество сбольш ой вероятностью наблю даетсяаннигиляция. А ннигиляция - э то такое взаим одействие β+-частицы с э лектроном , в результате которого вм есто пары э лектрон - позитрон образую тсядваγ-ф отона(γкванта). Н есм отря на разнообразие процессов, приводящ их к ослаблению βизлучения, м ож но приближ енно считать, что интенсивностьего изм еняетсяпо э кспоненциальном узакону. В качестве одной из характеристик поглощ ения β-излучения вещ еством использую т слой половинного поглощ ения, при прохож дении через которы й интенсивностьизлученияум еньш аетсявдвое. Путьпробега β-частиц до полной потери э нергии в воздухе составляет десятки сантим етров, в ткани организм а βчастицы проникаю т на глубину 10-15 м м . Защ итой от β-излученияслуж ат тонкие алю м иниевы е, плексигласовы е и другие э краны . Т ак, наприм ер, слой алю м иния толщ иной 0,4 м м или воды толщ иной 1,1 м м ум еньш ает вдвое интенсивностьβизлученияот ф осф ора 3215 P . γ-лу чи им ею т э лектром агнитную природу, э то излучение ядерного происхож дения, которое отличается от других э лектром агнитны х излучений больш ой э нергией кванта и м алой длиной волны . Д лина волны γ-квантовлеж ит в

35

пределах от 0,0005 до 0,04 нм . В процессе взаим одействиясвещ еством γ-кванты характеризую тсякак волновы м и, так и корпускулярны м и свойствам и. В воздухе γ-лучи проходят десятки и даж е сотни килом етров, в воде - десятки м етров. В результате различны х процессов под действием γ-излучения образую тся заряж енны е частицы , следовательно, γ-лучи являю тся такж е ионизирую щ им и. К ром е того, при попадании γ-излученияввещ ество наблю даю тсятакие процессы , как когерентное рассеяние, э ф ф ект К ом птона, ф отоэ ф ф ект, образование пары э лектрон-позитрон, происходящ ее при э нергии γ-кванта, не м еньш ей сум м арной э нергии покоя позитрона и э лектрона (1,02 М э В ) и др. О слабление пучка γизлученияввещ естве обы чно описы ваю т э кспоненциальны м законом . О сновны е процессы взаим одействияγ-квантов с вещ еством происходят с разной вероятностью , котораязависит от э нергии γ-ф отона: при м алы х э нергиях основную роль играет ф отоэ ф ф ект, при средних - К ом птон-э ф ф ект и при э нергиях, больш их 10 М э В , - процессобразованияпары э лектрон-позитрон. Э кспоненциальны й закон ослабления пучка γ-ф отонов вы полняется приближ енно, особенно при больш их э нергиях. Э то обусловлено вторичны м и процессам и, возникаю щ им и при попадании γ-квантов в среду. Т ак, наприм ер, э лектроны и позитроны , образовавш иеся при действии γ-лучей, обладаю т э нергией, достаточной дляобразованияновы х γ-квантовврезультате торм ож ения и аннигиляции. Рассм атривая первичны е ф изико-хим ические процессы в организм е при действии ионизирую щ их излучений, следует учиты вать две принципиально разны е возм ож ности взаим одействия: см олекулам и органических соединений и с м олекулам и воды . Радиолиз - э то хим ические превращ ения вещ ества под действием радиоактивного излучения. В результате радиолиза воды м огут образовы ватьсявозбуж денны е м олекулы , ионы , радикалы и пероксиды , которы е м огут инициироватьцепны е реакции. 4.2. И спользование радионуклидови ионизирую щ их излучений вм едицине и биологии Радиоактивны е изотопы ш ироко использую тся в биологии, м едицине и ф арм акологии. Д ля исследовательских целей в биологии и в диагностике использую т радиоактивны е индикаторы (м ечены е атом ы ). С пом ощ ью таких м етодов м ож но изучать обм ен вещ еств, его изм енения при действии различны х ф акторов окруж аю щ ей среды . В качестве изотопны х индикаторов использую т радионуклиды , стабильны е изотопы которы х входят в состав организм а и приним аю т активное участие в процессах м етаболизм а - 3Н , 14С, 42К , 22Na, 32Р, 45 Са, 47Са, 59Fe, 131I, 132I. У становлены хим ическая идентичностьи одинаковое поведение в биологических процессах стабильны х и радиоактивны х изотопов. При вы боре изотопа учиты ваю т величину периода полураспада, типи э нергию излучения, подбираю т безопасны е дляздоровьячеловека дозы радионуклида.

36

М етод м ечены х атом ов заклю чается в том , что в организм вводят радиоактивны е м етки и затем определяю т их м естонахож дение и активностьв органах и тканях. Т ак, наприм ер, длядиагностированиязаболеваниящ итовидной ж елезы ворганизм вводят радиоактивны й йод и спом ощ ью счетчика определяю т накопление йода вэ той ж елезе. Д ля обнаруж ения радионуклидов использую т гам м а-топограф (cцинтиграф ). Э тот прибор дает сравнительно грубое описание распределения радиоактивны х м еток в организм е. Более детальны е сведениям ож но получить м етодом авторадиограф ии. В ж ивой организм радионуклиды вводятсяв таком небольш ом количестве, что ни они, ни продукты их распада не причиняю т вреда организм у. Д ругаягруппа м етодов основана на прим енении радиоактивного излучения в лечебны х целях. В терапии прим еняется в основном γ-излучение (гам м атерапия). Прим енение γ-лучей вы сокой э нергии позволяет разруш атьопухоли, при э том здоровы е органы и ткани подвергаю тсям еньш ем увоздействию . Т ерапевтическое прим енение им ею т и α-частицы , особенно при раковы х заболеваниях. О ни им ею т небольш ой линейны й пробег в воздухе, поэ том у использование α-распада вм едицине возм ож но при непосредственном контакте с организм ом или при введении радионуклидов внутрь. Х арактерны м прим ером 222 является радоновая терапия: м инеральны е воды , содерж ащ ие 86 Rn , использую тсядлявоздействияна кож у, органы ды ханияи пищ еварения. И ногда радиоактивны й препарат вводят непосредственно вбольной орган. В диагностике и онкологии такж е ш ироко прим еняется рентгеновское излучение (э то излучение с длиной волны от 80 до 10-5нм ). Д линноволновое рентгеновское излучение перекры ваетсявакуум ны м У Ф -светом , коротковолновое - длинноволновы м γ-излучением . 4.3. Д етекторы ионизиру ю щ их излу чений Д етекторам и ионизирую щ их излучений назы ваю т приборы , регистрирую щ ие α-, β- и γ-излучения. Д етекторы использую т такж е для изм еренияэ нергии частиц, изученияпроцессових взаим одействия, распада и т.п. Д етекторы делят на три группы : следовы е (трековы е) детекторы , интегральны е приборы и счетчики. К лассиф икацияэ таусловна. Т ак, наприм ер, от регистрации частиц счетчиком м ож но перейти к интегральной оценке потока ионизирую щ его излучения. Следовы е детекторы позволяю т наблю дать траекторию частицы . К ним относят кам еру В ильсона, диф ф узионную и искровую кам еры , толстослойны е ф отопластины . В о всех э тих устройствах наблю даем ая частица ионизирует м олекулы или атом ы вещ ества на своем пути, образовавш иесяионы проявляю тся по вторичны м э ф ф ектам . К интегральны м детекторам м ож но отнести ф отопленки (ф иксируется степеньпочерненияее после проявления), ионизационны е кам еры непреры вного действияи др.

37

К счетчикам относят газоразрядны е устройства (им пульсны е ионизационны е кам еры , счетчики Гейгера-М ю ллера), а такж е лю м инесцентны е, полупроводниковы е и др. приборы . 4.4. Ра бота со счетной у ста нов кой типа Б -3 У становка Б-3 предназначена для счета и регистрации им пульсов от газовы х низковольтны х счетчиков, атакж е длясчетапериодических им пульсов. В состав установки входят: а) счетнаятрубка, б) блок газовы х счетчиков БГС-3, в) пересчетны й прибор ПС-20, г) кабель, соединяю щ ий блок БГС-3 с пересчетны м прибором ПС-20. 1. Д лясчета β-частиц сэ нергией 0,5 ÷ 0,7 М э В использована счетнаятрубка - цилиндрический тонкостенны й счетчик типа СТ С-6 (СТ - стальной, С сам огасящ ийсякатод, 6 - серийны й ном ер). Д ляж есткости конструкции счетчик им еет ребристы е стенки. Счетнаятрубка вклю чаетсям еж ду корпусом прибора (“зем лей”) и вы сокоом ны м сопротивлением , через которое подаетсянапряж ение ≈ 390 В . В ы сокоом ное сопротивление им еет величину2 М О м длятрубок Т ростаи 1000 М О м длятрубок Гейгера. При попадании в счетную трубку радиоактивны х частиц в инертном газе, которы м заполнен счетчик, возникаю т им пульсы (разряд). 2. Блок БГС является вы носны м и объединен с держ ателем газовы х счетчиков. В озникаю щ ие при попадании в газовы й счетчик радиоактивны х частиц им пульсы через конденсатор подаю тсяна лам пу, усиливаю тсяэ той лам пой и по гибком укабелю подаю тсяна вход пересчетного прибора ПС-20. 3. Пересчетны й прибор ПС-20 вклю чает в себя входное устройство, пересчетны й блок и блок питания. В ходное устройство пересчетного прибора ПС-20 служ ит для преобразования входны х отрицательны х и полож ительны х им пульсов в стандартны е по ам плитуде полож ительны е им пульсы . Ч увствительность пересчетного прибораПС-20 к им пульсам отрицательной полярности не ниж е 6 В при ф ронте входны х им пульсовне м енее 5 м кси средней скорости счетадо 10000 им п/с. Сф орм ированны е им пульсы с входного устройства поступаю т на пересчетны й блок, собранны й на ш ести газоразрядны х счетны х лам пах (декатронах). В схем е прим еняю тсядва типа декатронов: О Г-3 и О Г-4. Первы м после входного устройства прим енен декатрон О Г-3, им ею щ ий м аксим альную скорость счета около 20000 им п/с, последую щ ие пять декатронов - с м аксим альной скоростью 2000 им п/с. Блок питаниявклю чает в себя: стабилизированны й вы прям ительанодного напряж ения - 300 В , 30 м А ; стабилизированны й вы прям ительотрицательного напряж ения - 150 В , 30 м А и общ ий трансф орм атор, питаю щ ий стабилизированны е вы прям ители и накалы всех лам п. Пересчетны й прибор ПС-20 с входящ им и в него блокам и заклю чен в м еталлический перф орированны й кож ух. Н а лицевой панели располож ены блок декатронов, переклю чательрода работ и переклю чательзнака входного сигнала.

38

Переклю чательрода работ им еет пятьполож ений (пятькнопок). При наж атии кнопки “В ы кл.” прибор вы клю чается из сети; при наж атии кнопки “Сброс” происходит сброс показаний всех декатронов; при наж атии кнопки “Проверка” перем енное напряж ение подается на вход прибора, т.е. проверяется работоспособностьсхем ы ; при наж атии кнопки “Пуск” приборсчитает им пульсы , поступаю щ ие на его вход; при наж атии кнопки “Стоп” прибор из сети не вы клю чается, в э том случае происходит остановка счета им пульсов и ф иксирую тсяпоказаниядекатронов. Н а задней панели прибора ПС-20 располож ены вход для подклю чения блока БГС-3, вход напряж ения(390 ± 20 В ) дляпитаниянизковольтны х газовы х счетчиков, сетевой ш ланг, переклю чательнапряж ениясети спредохранителем . Подготовка установки к работе Подклю читьблок БГС-3 к пересчетном у прибору ПС-20. В ставитьгазовы й счетчик в держ атель(соблю даяполярность).Н аж атьлю бую кнопкуна кнопочном переклю чателе, при э том установка долж на вклю читься в сеть. Прибору необходим о прогреться в течение 15-20 м ин. Переклю чатель знака входного сигнала на приборе ПС-20 поставитьв полож ение “+”. Н аж атькнопку “Сброс” показаниядекатроновдолж ны установитьсяна0. Приборготовк работе. 4.5. Эксперимента ль на я ча сть М ат ериал ы и о бо руд о в ание: радиом етр Б-3, радиоактивны й препарат, секундом ер, линейка. Л а бора торна я ра бота № 1 О пред ел ениеβ-рад ио ак т ив но ст и препарат а с зад анно й ст епенью т о чно ст и Цел ь рабо т ы : определитьрадиоактивностьпрепарата сзаданной степенью точности. Ход ра боты Переклю чательполярности пересчетного прибора поставитьв полож ение “+”. В клю читьустановку в сеть, установка долж на прогретьсяв течение 15-20 м ин. Перед началом работы показаниядекатронов долж ны равнятьсянулю , для э того нуж но наж атькнопку“Сброс”. Д ля того чтобы определить радиоактивность препарата с заданной точностью , надо пользоватьсятаблицей Бэ лла(см . “Прилож ение”). Д ляэ того: 1. Н еобходим о узнатьколичество им пульсов препарата с ф оном (n) и ф она (nô ) за1 м ин. И зм ерения проводить не м енее трех раз. О пределить значение коэ ф ф ициента К по ф орм уле: K = n / n ; (4) 2. Пользуясь таблицей Бэ лла, определить, какое количество им пульсов нуж но подсчитать для препарата с ф оном (Nn) и ф она (Nф ) при данном коэ ф ф ициенте К . Степень точности, с которой нуж но определить активность препарата, задаетсяпреподавателем . 3. Рассчитатьнеобходим ое врем ясчета им пульсовот препарата и ф она: ф

39

t n = N / n , (5) t = N ф / n ф . (6) В рем яокруглятьдо м инут всторонуувеличения. 4. С пом ощ ью счетчика радиоактивны х частиц определить количество им пульсов от препарата (N′n) и ф она (N′ф ) в течение врем ени tn и tф соответственно. В се результаты занести втаблицу4.1: Т аблица4.1 К оличество им пульсовот ф она и препарата вм есте сф оном n

n

ф

№ п/п По к азт ел ь

И зм ерение (им п.) 2 3

1 1

nn

2

nф

3

N′n

4

N′ф

средн.

1. 2. 3. 4. В ы числитьактивностьпрепарата(А n) и ф она(А ф ) по ф орм улам : A n = N ′n / t n - N ′ф / t ф , (7) A ф = N ′ф / t ф . (8) В ы разить активность препарата и радиоактивного ф она в беккерелях и м ккю ри. После окончанияэ ксперим ентов проверить, с какой степенью точности ∆′ бы ли проведены подсчеты . В еличину∆′ определяю т по ф орм уле: ∆′ =

N ф′ N′ + tn tф nn − nф

⋅ 100% . (9)

Сделать вы вод о радиоактивности ф она и препарата, о корректности реш ения поставленной преподавателем задачи, о техническом состоянии установки типа Б-3. Л а бора торна я ра бота № 2. И зм ерение ак т ив но ст и рад ио ак т ив но го препарат а в зав исим о ст и о т гео м ет рическ их усл о в ий счет а Цел ь рабо т ы : установить зависим ость радиоактивности препарата от расстоянияего до счетной трубки.

40

Ход ра боты Пом еститьрадиоактивны й препарат на расстоянии 1; 2, 5; 10; 15; 20 и 30 см от оси счетной трубки. О сущ ествитьподсчет им пульсов от препарата с ф оном в течение врем ени tn, найденного вработе № 1. Рассчитатьактивность(А , Бк) радиоактивного препарата по ф орм уле (7). Д анны е занести втаблицу4.2. Т аблица4.2 Зависим остьрадиоактивности препарата от расстояниядо оси счетной трубки l, см

N′n

A, Бк

Построить граф ик зависим ости величины активности радиоактивного препарата от расстояниядо счетной трубки. Сделатьвы воды о зависим ости активности препарата от геом етрических условий счета. Л а бора торна я ра бота № 3. И ссл ед о в ание про ник аю щ ей спо со бно ст и βчаст иц Цел ь рабо т ы : исследовать способность β-частиц проникать через различны е м атериалы . Ход ра боты М еж ду препаратом и счетной трубкой последовательно пом естить: лист бум аги, стекло, слой воды толщ иной 1 см (в чаш ке Петри). О пределить количество им пульсовза врем яtn, найденное вработе № 1. Рассчитатьактивностьрадиоактивного препарата (Бк). Сделать вы вод о проникаю щ ей способности β-частиц через различны е м атериалы . 4.6. Контроль ны е в опросы 1.Понятие о радиоактивном распаде э лем ентов. 2. В иды радиоактивного распада и их характеристика. 3. Закон радиоактивного распада. 4. Д етекторы ионизирую щ их излучений. 5. Принципдействияи технические характеристики счетной установки типа Б-3. 6. Прим енение радиоактивны х изотоповвбиологии и м едицине. 4.7. Реш ение з а да ч 1.В ы числите число ядер130 павш ихся в течение первы х суток, если 53 I , рас 22 первоначальное число ядер Nо=10 . 2. К аким образом искусственная β-радиоактивность приводит к образованию 1430 Si из алю м иния2713 Al ? 3. К ак получитьиз ртути золото ?

41

4. Сколько ядер урана 238 палосьв течение года, если первоначальная 92 U рас м асса уранаm=1 г? 5. В озраст древних деревянны х предм етовм ож но приближ енно определить по удельной м ассовой активности изотопа 146 C вних. Сколько лет том уназад бы ло срублено дерево, которое пош ло на изготовление предм ета, если удельная м ассоваяактивностьуглерода внем составляет 3/4 от удельной м ассы активности растущ его дерева? СПИ СО К РЕ К О М Е Н Д У Е М О Й ЛИ Т Е РА Т У РЫ 1. А ртю хов В .Г. Биоф изика./ В .Г. А ртю хов, Т .А .К овалева, В .П.Ш м елев. В оронеж : И зд-во В оронеж . ун-та, 1994. - 336 с. 2. Рем изов А .Н . М едицинскаяи биологическаяф изика./ А .Н .Рем изов.- М .: В ы сш . ш к., 1996. - 608 с. 3. Э йдусЛ.Х . Ф изико-хим ические основы радиобиологических процессови защ иты от излучения./ Х .Л.Э йдус. - М .: М ир, 1979. - 270 с. 4. К удряш ов Ю .Б. О сновы радиационной биоф изики./ Ю .Б.К удряш ов, Б.С.Беренф ельд.- М .: И зд-во М ГУ , 1982. - 304 с. 5.Я рм оненко С.П. Радиобиологиячеловека и ж ивотны х./ С.П.Я рм оненко.М .: В ы сш . ш к., 1988. - 424 с. 6. О лигом ерны е белки: структурно-ф ункциональны е м одиф икации и роль субъединичны х контактов./ В .Г.А ртю хов, О .В .Баш арина, Г.А .В аш анов, М .А .Н аквасина, О .В .Путинцева- В оронеж : И зд-во В оронеж . ун-та, 1997. - 264 с.

42

Т Е М А 5. Ф И ЗИ КО -ХИ М И Ч Е С КИ Е О С Н О В Ы Б И О ЭЛ Е КТ РО ГЕ Н Е ЗА И И ЗМ Е РЕ Н И Е РА ЗН О С Т И П О Т Е Н ЦИ А Л О В 5.1. М еха низм электрогенез а в клетка х Генерация и распространение э лектрических потенциалов – важ нейш ее ф изическое явление в ж ивы х клетках и тканях, которое леж ит в основе возбудим ости клеток, регуляции внутриклеточны х процессов, работы нервной систем ы , регуляции м ы ш ечного сокращ ения. Н аруш ение э лектрических характеристик отдельны х клеток, нервны х волокон и целы х тканей, наприм ер сердечной ткани, приводит к ряду серьезны х заболеваний. И спользование результатов э лектроф изиологических исследований в сочетании с ф изическим и м атем атическим м оделированием м ем бранны х транспортны х процессов леж ит в основе соврем енны х теорий э лектрогенеза в клетках. Различаю т следую щ ие основны е виды м ем бранны х биопотенциалов: 1. Потенциал покоя – разность э лектрических потенциалов м еж ду внутренней и наруж ной поверхностью м ем браны норм ально ф ункционирую щ ей клетки вневозбуж денном состоянии. 2. Потенциал действия(возбуж дения) – разностьпотенциаловнам ем бране, регистрируем ая в м ом ент возбуж дения м еж ду возбуж денны м и и невозбуж денны м и участкам и м ем браны . 3. Потенциал повреж дения – регистрируется м еж ду повреж денны м и и неповреж денны м и участкам и клетки, ткани, органа. К нем ем бранны м биопотенциалам относятсям етаболические потенциалы , которы е регистрирую тсям еж ду участкам и с различной скоростью м етаболизм а внутри клетки, ткани или органа. Равновесие – э то такое состояние систем ы , при котором каж даячастица м ож ет переходитьиз некоторого состояния1 в некоторое состояние 2 и обратно, но в целом долясостояний 1 и 2 в систем е не изм еняется. В равновесии м огут находиться субстраты и продукты биохим ических реакций или ионы по обе стороны м ем браны . Д оннановское равновесие устанавливаетсям еж ду клеткой и окруж аю щ ей средой, если клеточнаям ем брана хорош о проницаем а длянеорганических ионов, но непроницаем а для белков, нуклеиновы х кислот и других крупны х органических ионов. В озникновение м ем бранны х потенциалов связано с неравенством концентрации ионов внутри клетки и в окруж аю щ ей среде и неодинаковой проницаем остью клеточной м ем браны дляразны х ионов. В 1902 г. Бернш тейн вы двинул гипотезу, согласно которой потенциал покоя обусловлен тем , что цитоплазм атическаям ем бранапроницаем адляионовК +, и на ней создается потенциал, описы ваем ы й уравнением Н ернста (равновесны й потенциал): E=

RT c 1 ln , (1) nF c 2

43

где Е – равновесны й потенциал, определяем ы й как разностьпотенциаловпо обе стороны м ем браны ; R – универсальнаягазоваяпостоянная; T – абсолю тнаятем пература(К ); n – заряд иона; F – постояннаяФ арадея; с1 и с2 – концентрации потенциалопределяю щ их ионов по обе стороны м ем браны . Д иф ф узияионов через м ем брану, при которой вещ ества транспортирую тся по концентрационном у градиенту, создает разностьэ лектрических потенциалов. Д виж ение ионов по концентрационном у градиенту обусловлено силой, им ею щ ей хим ическую природу. Х им ическаяработа (А х), необходим аядляпредотвращ ения переноса ионовкалияиз клетки, будет равна: A x = 2,3RTlg

[K + ]out [K + ]in

. (2)

По м ере диф ф узии ионов К + из клетки ионы хлора проникаю т в клетку по своем уконцентрационном уградиенту. Противополож ны е заряды притягиваю тся, поэ том у э лектрическаясила заставляет ионы калиястрем итсяв клетку за ионам и хлора. Н а преодоление э той э лектрической силы требуетсяэ лектрическаяработа (А э ): А э = nFE. (3) К огда в систем е устанавливаетсяравновесие и сум м арны й поток вещ ества равен нулю , хим ическая работа будет уравновеш ена противополож но направленной э лектрической: А х = А э, (4) Следовательно, уравнение для равновесного калиевого потенциала им еет вид: E = 2,3

+ RT [K ]out lg . (5) F [K + ] in

Д ля более точного вы числения величины м ем бранного потенциала необходим о учиты вать диф ф узию ионов К +, Na+ и Cl-. В связи с э тим для определениям ем бранного потенциала использую т уравнение Гольдм ана: + + − RT Pк[K ]out + Р Na [Na ]out + PCl [Cl ] in E м = 2,3 lg , (6) F Р к[K + ] in + PNa [Na + ]in + Pcl [Cl − ]out

где Е м – м ем бранны й потенциал, Рк, РNa, PCl – коэ ф ф ициенты проницаем ости длясоответствую щ их ионов внутри (in) и снаруж и (out) клетки. Д ляаксона кальм ара, наприм ер, Рк: РNa:PCl = 1 : 0,04 : 0,45. У равненияН ернста и Гольдм ана не учиты ваю т активного транспорта ионов через м ем брану, наличие в м ем бране ионны х насосов. В цитоплазм атической м ем бране ф ункционирую т м олекулы Na+ ,К +- А Т Ф азы , перекачиваю щ ие калий внутрьклетки, а натрий из клетки (т.е. против концентрационного градиента). С учетом работы э лектрогенны х ионны х насосов для м ем бранны х потенциалов использую т уравнение Т ом аса:

44

E м = 2,3

+ + RT mPк[K ]out + Р Na [Na ]out lg , (7) F mР к[K + ]in + PNa [Na + ] in

где m – отнош ение количества ионов натрия к ионам калия, перекачиваем ы х ионны м и насосам и через м ем брану. Ч ащ е всего Na+ ,К +- А Т Ф аза работает вреж им е, когдаm = 3/2. Следует пом нить, что цитоплазм а клетки в состоянии покоявсегда им еет отрицательны й потенциал по отнош ению к м еж клеточной ж идкости. При развитии потенциала действия (ПД ) наряду с изм енением проницаем ости происходит кратковрем енное увеличение э лектропроводности м ем браны . Т ак, сопротивление м ем браны аксонакальм араизм еняетсяот 1000 О м /см 2 в состоянии покоя до 25 О м /см 2 в м ом ент возбуж дения. Повы ш ение э лектропроводности м ем браны при возбуж дении объясняется увеличением ее проницаем ости для ионов. Происходит деполяризация м ем браны - падение уровня м ем бранного потенциала, а затем см ена знака, когда наруж ная поверхность м ем браны несет отрицательны й заряд, а внутренняя полож ительны й. А м плитуда потенциала действиядостигает значений 100 - 120 мВ . В первой ф азе ПД - ф азе деполяризации - усиленны й поток ионов Nа+, направленны й внутрь клетки, уравновеш ивает концентрационны й градиент, и поступление в клетку натрияпрекращ ается. В нутренняяповерхностьм ем браны заряж ается полож ительно по отнош ению к наруж ной. В э то врем яотнош ение коэ ф ф ициентов проницаем ости м ем браны аксона кальм ара составляет: РК :РNа:РСl=1:20:0,45, т. е. проницаем остьм ем браны дляNa+ увеличиваетсяв 500 раз за0,5 - 1 м с. Затем возрастает проницаем остьм ем браны для ионов К +, и усиливается диф ф узия э тих ионов из клетки. В результате происходит ум еньш ение м ем бранного потенциала, что, всвою очередь, сниж ает проницаем остьм ем браны дляNа+. Э то продолж аетсядо тех пор, пока потенциал покояне восстановится. После э того проницаем остьдляионов К + падает до исходного уровня. Ф аза, в течение которой м ем бранны й потенциал возвращ ается к уровню потенциала покоя, назы вается ф азой реполяризации. О на осущ ествляется не в результате обратного перем ещ енияионовNа+, авследствие вы ходаиз клетки э квивалентного количества ионов К +. Ф аза реполяризации всегда продолж ительнее ф азы деполяризации. Следовательно, ф орм ирование ПД обусловлено двум яионны м и потокам и через биом ем брану, которы е приблизительно равны по величине, но сдвинуты во врем ени. 5.2. М етоды регистра циира з ностипотенциа лов И зучение м еханизм а возникновения клеточны х биопотенциалов стало возм ож ны м благодаря развитию м етодов клеточной э лектроф изиологии. В их развитии важ ную рольсы грали: - м икроэ лектроднаятехника;

45

- создание усилителей биопотенциалов, обладаю щ их вы соким входны м сопротивлением (до 1010 О м ), м алой постоянной врем ени (от 10 м с) и вы сокой чувствительностью (токи до 10-12 А ); - вы бор удачны х объектов исследования, начинаяот гигантского аксона кальм ара и гигантских нейронов пресноводны х м оллю сков и заканчивая различны м и м одельны м и м ем бранам и. Н еобходим о подчеркнуть, что изм ерение величины биопотенциалов использую т в качестве теста для оценки состояния отдельной клетки, органа, организм а. Регистрируем аяразностьпотенциалов всегда м еньш е Э Д С за счет падения потенциала на внутреннем сопротивлении источника Э Д С и в результате ш унтирую щ его влияния раствора, находящ егося м еж ду э лектродам и. Первы й ф актор сказы ваетсянезначительно в том случае, если внутреннее сопротивление изм ерительного прибора велико. Т огда ток, протекаю щ ий в цепи, оченьм ал, падение напряж ения на внутреннем сопротивлении объекта м ало и им м ож но пренебречь. Ш унтирую щ ее влияние раствора, ом ы ваю щ его биологический объект, трудно учестьполностью . При регистрации постоянны х и м едленно изм еняю щ ихся потенциалов использую т следую щ ие основны е м етодические прием ы : 1) непосредственная регистрация силы тока в цепи, источником Э Д С в которой служ ит биообъект. О днако определение э тим путем истинного значения Э Д С представляется слож ны м из-за трудностей, связанны х с регистрацией величины сопротивленияж ивого объекта; 2) ком пенсационны й м етод определенияЭ Д С биообъектов; 3) регистрация потенциалов при пом ощ и усилителя постоянного тока и осциллограф а. Д ляизм ерениядиф ф узионны х, концентрационны х, м ем бранны х и ф азовы х потенциалов в м одельны х э ксперим ентах использую т ком пенсационную изм ерительную схем у. И зм ерение разности потенциалов производят при пом ощ и прибора или установки, внутреннее сопротивление которы х прим ерно на два порядка вы ш е, чем сопротивление изм еряем ого источника Э Д С. В э том случае изм еряем аяразностьпотенциаловпрактически не отличаетсяот истинной Э Д С. В качестве вольтм етра с вы соким внутренним сопротивлением использую т лам повы е потенциом етры типа ЛПУ -01, ПМ -60, ЛП-58 и др. П ринцип к о м пенсацио нно го м ет о д а изм ерения разности потенциалов состоит в том , что в исследуем ой цепи с неизвестной Э Д С ток ком пенсируется при пом ощ и внеш него источникаЭ Д С, величинакоторой м ож ет бы тьизм ерена. В м ом ент ком пенсации ток через изучаем ы й объект не течет, падение напряж ения на его внутреннем сопротивлении отсутствует (или пренебреж им о м ало), т.е. при э том условии изм еряется истинное значение Э Д С неизвестного источника напряж ения, вкачестве которого м ож ет вы ступатьбиологический объект (клетка, ткань, орган, целы й организм ). Т очность м етода определяется точностью градуировки делителянапряж ения(Д Н ) и стабильностью источника Э Д С. При э том индикатор (гальваном етр) долж ен обладать вы сокой чувствительностью , чтобы точнее определитьм ом ент ком пенсации.

46

В работе использую тсяпотенциом етры постоянного тока типа Р-307 или ППТ В -1, обладаю щ ие вы соким входны м сопротивлением . Д ля относительно вы сокой точности изм ерения необходим о использоватьвы сокочувствительны е гальваном етры типа М -95 и другие счувствительностью порядка10-7- 10-8 А . Д ля калибровки источника основного напряж ения (Е изв.) (1,5-3,0 В ) прим еняетсянорм альны й э лем ент (Е нэ ), Э Д С которого оченьм ало изм еняетсяв течение длительного врем ени (годы ). Э Д С норм ального э лем ента слабо зависит от тем пературы . И зм ерение потенциалов покоя и повреж дения необходим о производить неполяризую щ им ися э лектродам и, которы е не изм еняю т скачка потенциала м еж ду м еталлом и ом ы ваю щ им его раствором при прохож дении э лектрического тока. Постоянство скачка потенциала у э лектрода (потенциал э лектрода) будет наблю даться только при постоянстве концентрации ионов у поверхности э лектродов даж е в случае прохож дения э лектрического тока. Т акое явление наблю даетсяпри условии, если м еталл находитсяв насы щ енном растворе своих ионов (Hg+/HgCl, Ag+/AgCl, Cu2+/CuSO4, Zn2+/ZnSO4). К таким э лектродам относятся соответственно калом ельны е, хлорсеребряны е, м едны е, цинковы е. Н аиболее часто в биологических исследованиях прим еняю тся калом ельны е и хлорсеребряны е э лектроды , которы е для предотвращ ения повреж дения биообъекта соединяю тся с ним при пом ощ и полы х м остиков или сиф онов, заполненны х раствором хлорида калия. Подвиж ность ионов калия и хлора прим ерно одинакова, что исклю чает появление диф ф узионной разности потенциалов. 5.3. Эксперимента ль на я ча сть К онцентрационная разность потенциалов м ож ет бы ть изм ерена при наличии в систем е ионов, одинаковы х с ионам и или атом ам и э лектрода. О на возникает вследствие зависим ости скачка потенциала (э лектродного потенциала) от концентрации (активности) ионовраствора, вкотором находитсяэ лектрод. Т ак как скачок потенциала на э лектроде зависит от концентрации раствора э лектролита, то систем а, состоящ ая из м еталла и его соли, м ож ет служ ить источником Э Д С, к которой для вы числения разности потенциалов м ож но прим енитьуравнение Н ернста: E = 2,3

RT a 2 lg , (8) zF a 1

подставляявнего а= γ ⋅ с, получаем : E = 2,3

RT c 2 γ 2 lg , (9) zF c 1 γ1

где а1 и а2 - активности ионовврастворах 1 и 2 соответственно; γ1 и γ2 - коэ ф ф ициенты активности потенциалопределяю щ их ионов (в использованны х растворах); z - валентностьиона.

47

М ат ериал ы и о бо руд о в ание: Потенциом етр Р-307 или ППТ В -1; батареяна 1,5-3,0 В ; гальваном етр типа М -95; норм альны й э лем ент В естона (э лем ент сравнения); м едны е э лектроды ; 1 м оль/л растворСuSO4; соединительны е провода; стаканчики; м остики (сиф оны ), заполненны е агар-агаром или насы щ енны м раствором К Сl. Л а бора торна я ра бота № 1. И зм ерение к о нцент рацио нно й разно ст и по т енциал о в м еж д у д в ум я раст в о рам и серно к исл о й м ед и Цел ьрабо т ы : изм еритьвеличины концентрационной разности потенциалов м еж ду растворам и СuSО 4 разной концентрации при пом ощ и ком пенсационного м етода. Хо д рабо т ы Проверить правильность подклю чения к потенциом етру (к соответствую щ им клем м ам ) гальваном етра, норм ального э лем ента, батареи. Н астроить установку по норм альном у э лем енту. Д ля э того установить ручку переклю чателя потенциом етра в полож ение “Н Э ” (цепьзам кнута через норм альны й э лем ент); ручкам и грубой, а затем точной регулировки добиться того, чтобы ток вцепи не протекал, т.е. показаниягальваном етраравнялисьнулю . М еж дуэ лектродам и м ож ет бы тьнебольш аяразностьпотенциалов(порядка нескольких м илливольт), которая обусловлена неодинаковы м хим ическим составом и состоянием поверхности э лектрода. Е е необходим о учиты вать в дальнейш ем при изм ерении Э Д С м еж ду растворам и с разны м и концентрациям и СuSO4. Поэ том у нуж но определить асим м етрию э лектродов. Д ля э той цели опуститьоба м едны х э лектрода в 0,01 м оль/л раствор CuSO4 и изм еритьразность потенциалов м еж ду ним и. При э том ручка переклю чателядолж на находитьсяв полож ении Х 1 (или Х 2). Н еобходим о строго следить за тем , чтобы область спая с отводящ им проводом бы ла хорош о изолирована и не соприкасалась с раствором . При невозм ож ности ком пенсации необходим о изм енитьполярностьприсоединения э лектродовк клем м ам потенциом етра Х 1 ( Х 2). Приготовитьрастворы CuSO4 с концентрациям и: 1; 0,1; 0,01; 0,001 м оль/л. Н алитьв два стаканчика растворы CuSO4 с разной концентрацией, цепьм еж ду ним и зам кнутьагаровы м или солевы м м остиком . И зм еритьконцентрационную разностьпотенциалов 4-5 раз. Составитьвсе возм ож ны е концентрационны е пары растворовсульф ата м еди и изм еритьразностьпотенциаловм еж дуним и. Д анны е занести втаблицу5.1. Т аблица5.1 Вел ичины к о нцент рацио нно й разно ст и по т енциал о в м еж дурастворам и CuSO4 К онцентрации растворовCuSO4, м оль/л

В еличина разности потенциалов, мВ

48

С1

С2

ксперим ентальная

Тео рет иче ск ая

В о врем яработы необходим о использоватьсвеж ие агаровы е м остики или солевы е м остики, заполненны е К Сl, так как при пом ещ ении их враствор CuSO4 в кончик м остика за счет диф ф узии попадаю т ионы Cu2+ и SO42-. В следствие разной подвиж ности э тих ионов ф орм ируетсядиф ф узионны й потенциал, искаж аю щ ий результаты изм еренияконцентрационной разности потенциалов. Д ля изм ерения величины диф ф узионного потенциала необходим о пом еститьсолевой м остик в два раствора одинаковой концентрации и провести изм ерение Э Д С м еж ду опущ енны м и в них э лектродам и. В еличина диф ф узионного потенциала не долж на превы ш ать величины потенциала асим м етрии. При необходим ости нуж но зам енитьсолевой м остик на новы й и провести серию требуем ы х изм ерений. После проведения каж дой серии э ксперим ентов надо вновь определять асим м етрию э лектродов. Е сли онаотличаетсяот первоначальной, то э то означает, что происходила поляризацияэ лектродов под влиянием тока, протекаю щ его в цепи. Т акие э лектроды использоватьнеж елательно. По уравнению (9) определить теоретическое значение разности потенциалов, используя табл. “Прилож ения”, в которой приведены коэ ф ф ициенты активности длянекоторы х э лектролитов. Сравнитьэ ксперим ентальны е и теоретические величины Э Д С, объяснить возм ож ны е причины их расхож дения. Е сли э ти отличия значительны е (превы ш аю т 5-6%), необходим о повторитьизм ерения. 5.4. Контроль ны е в опросы 1. К аковы причины возникновениябиопотенциалов? 2. О пиш ите м еханизм ы возникновения потенциала покоя и потенциала действия. 3. В результате какого вида транспорта ионов (активного или пассивного) создаетсям ем браннаяразностьпотенциалов? Поясните э то. 4. По какой причине дляопределениям ем бранного потенциала использую т уравненияГольдм ана или Т ом аса, а не уравнение Н ернста? 5. К акие м етодические подходы использую т для регистрации биопотенциалов? 6. В чем состоит принцип ком пенсационного м етода изм ерения разности потенциалов? 5.5. Реш ение з а да ч

49

1. О пределите равновесны й м ем бранны й потенциал на м ем бране при отнош ении концентраций натрияснаруж и и внутри клетки: а) 1 : 1; б) 10 : 1; в) 100 : 1. 2. Потенциал покоя нерва конечности краба равен 89 м В . Ч ем у равна концентрация ионов калия внутри нерва, если снаруж и она составляет 12 м м оль/л? Т ем пература равна20оС. 3. И спользуя табл 4 ”Прилож ения”, рассчитайте величину м ем бранного потенциала для: а) аксона кальм ара; б) м ы ш ечного волокна позвоночны х. 4. 50% ионов калия внутри гигантского аксона кальм ара бы ло зам енено натрием . Рассчитайте величинум ем бранного потенциала при 25оС. 5. В ы числите потенциал покоягигантского аксона кальм ара, если известно, что концентрацияионов натрияснаруж и равна 440 м м оль/л, а внутри его - 49 м м оль/л (тем пература равна20оС). С писок рекоменду емой литера ту ры 1. Рубин А .Б. Биоф изика./ Б.А .Рубин: В 2-х кн.- М .: В ы сш . ш к., 1987. - К н.2: Биоф изика клеточны х процессов.- 303 с. 2. Ревин В .В . Ф изиологияи биоф изика м ем бранны х процессов./ В .В .Ревин, Г.В .М аксим ов, О .Р.К ольс. - Саранск: И зд-во М ордов. ун-та, 1995. - 96 с. 3. Х одоровБ.И . О бщ аяф изиологиявозбудим ы х м ем бран./ Б.И .Х одоров. - М .: Н аука, 1975. - 406 с. 4. Рощ упкин Д .И . Биоф изика органов./ Д .И .Рощ упкин, Е .Е .Ф есенко, В .И .Н овоселов.- М .: Н аука, 2000. - 255 с. 5. Практикум по биоф изике./ В .Г.А ртю хов, М .А .Н аквасина, С.Г.Резван, О .В .Баш арина, Г.А .В аш анов. - В оронеж : И зд-во В оронеж . ун-та, 2001.- 224 с. П РИ Л О Ж Е Н И Е Табл ица 1 П ериоды полу ра спа да некоторы х ра диоа ктив ны х я дер 3

Н С 60 Со 130 I 131 I 238 U 14

12,262 года 5730 лет 5,263 года 12,3 часа 8,05 суток 4,51⋅109 лет

50

Т а блица 2 Табл ица Бэл л а ∆ = 1% К Nф N 1,3 240000 350000 1,5 89000 163500 1,7 47000 105000 2,0 24000 68000 3,0 11500 46000 5,0 2000 23000 10,0 500 16000 20,0 150 13000 50,0 34 11000 100,0 11 11200 10000

∆ = 2% Nф N 60000 90000 22000 41000 12000 26000 6000 17000 3000 11000 500 5700 130 4000 40 3700 9 3000 3 2800 2500

∆ = 3% Nф N 27000 40000 10000 18000 5000 12000 2700 7600 1300 5100 200 2600 60 1800 20 1500 4 1300 1200 1100

∆ = 5% Nф N 9500 14000 3600 6500 2000 4000 1000 2700 450 1800 80 900 20 650 6 540 (1,3) 480 (0,4) 450 400

∆ = 10% Nф N 2400 3500 900 1600 470 1000 240 710 115 450 20 230 5 160 (1,5) 130 (0,34) 120 112 100

Т аблица3 К оэ ф ф ициент активности (γ) сильны х э лектролитовпри 25 °С Э л ек т ро К онцентрация, м оль/1000 г воды Лит 0,001 0,005 0,01 0,02 0,05 0,1 1,0 СuSO4 0,74 0,573 0,438 0,371 0,271 0,154 0,043 HCl 0,965 0,928 0,904 0,875 0,830 0,796 0,809 KCl 0,965 0,927 0,902 0,869 0,816 0,770 0,604 KOH 0,824 0,798 0,756 Т аблица4 С одерж а ние ионов в а ксоне ка ль ма ра имы ш ечном в олокне поз в оночного ж ив отного (Aidley, 1970) М ы ш ечны е волокна (а такж е А ксон кальм ара(м м оль/л) нейроны ) позвоночного (м м оль/л) И оны В неклеточная В неклеточная В нутриклеточсреда В нутриклеточ- среда(интернаясреда (м орская наясреда стициальная вода, кровь) ж идкость) К атионы K+ 400 10 124 2 Na 50 460 10 125 + Ca 2+

0,4

10

5

2

Mg2+

10

14

1

ClHClО Прочие

20-150 -

54 А нионы 560 -

2 12 65

77 27 13

51

Составители: А ртю ховВ алерий Григорьевич, Баш арина О льга В ладим ировна. Редактор Т ихом ирова О .А .