Цитологическое изучение растительных и животных клеток: Учебное пособие по курсу ''Цитология''

Ф е де рал ь ное аге нс тво по образованию В О Р О Н Е Ж СКИ Й ГО СУД А Р СТВ Е Н Н Ы Й УН И В Е СИ ТЕ Т

М аш кин а О .С ., Л ав л ин с кий А .В . Ц И Т О Л О Г И Ч ЕС К О Е И ЗУЧ ЕН И Е РА С Т И Т ЕЛ ЬН Ы Х И Ж И В О Т Н Ы Х К Л ЕТ О К У Ч Е Б НО Е П О С О Б И Е ПО К УРС У “Ц И Т О Л О Г И Я” С пеци а ль н о ст ь 020201(011600) – Би о ло ги я

В ороне ж 2005

2

Утве ржде но научно-ме тодиче с ким с ове том биол ого-почве нного факул ь те та8 де кабря2005 года, протокол № 7

А вторы: М аш кинаО .С. Л авл инс кий А .В .

Уче бное пос обие подготовл е но на кафе дре ге не тики, с е л е кции и те ории эвол ю ции биол ого-почве нного факул ь те та В ороне жс кого гос ударс тве нного униве рс ите та Р е коме ндуе тс я дл я с туде нтов биол ого-почве нного факул ь те та дне вной и ве че рне й формы обуче ния

3

СО Д Е Р Ж А Н И Е В В Е Д Е Н ИЕ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4

Те ма1. И зуче ние рас тите л ь ных и животных кл е ток с помощ ь ю с ве товой микрос копии. Спос обы изготовл е ния микропре паратов в завис имос ти от це л е й ис с л е дования. . . . . .

5

Те ма2. Э л е ктроннаямикрос копиякак ме тод цитол огиче с ких ис с л е до ваний . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

15

Те ма3. Ул ь трас труктурная(с убкл е точная) организациякл е тки . . . . . . .

23

Те ма4. Я дро инте рфазной кл е тки. Структурамитотиче с ких хромос ом. П онятие о кариотипе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

32

Те ма5. М е тоды хромос омного анал иза. Кариограмма, идиограмма. М е тоды изуче ниякариотипачел ове ка. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

40

Те ма6. М итотиче с кое де л е ние кл е тки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

49

Те ма7. Кл е точный цикл и формы е го проявл е ния. О пре де л е ние мито тиче с кой активнос ти . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

54

Те ма8. М е й оз . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

64

Те ма9. Спороге не з, гаме тоге не з и проце с с опл одотворе нияу рас те ний

73

Р Е КО М Е Н Д УЕ М А Я Л И ТЕ Р А ТУР А . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

78

4

В В Е ДЕН И Е Ц итол огия– наукао с труктуре и функциях кл е ток. П ознание кл е тки (как эл е ме нтарной е диницы с трое ния, функционирования, развития и вос произве де ния вс е х живых организмов) име е т важное значе ние дл я развития ге не тики, мол е кул ярной биол огии, физиол огии и других биол огиче с ких наук. Н е обходимос ть напис ания данного уче бного пос обия вызвана те м, что запос л е дние годы накопил ос ь множе с тво новых с ве де ний о кл е тке нас амых разных уровнях, начиная с о с ве тооптиче с кого и кончая мол е кул ярным. П оэтому в наш у задачу входил о ознакомить с туде нтов с ос новными пол ожениями и вопрос ами с овре ме нной цитол огии по отде л ь ным те мам, вкл ю чая пос л е дние дос тиже ния науки о ме тодах изуче ния хромос ом, кл е точном цикл е и е го ре гул яции и др. Сл е дуе т также отме тить , что на данную дис ципл ину отводитс я с ущ е с тве нно ме нь ш е кол иче с тво час ов (18 час ов л е кционных и 18 час ов л абораторных занятий ) по с равне нию с объ е мом час ов, отводимых дл я данного курс а в ве дущ их униве рс ите тах с траны – М ос ковс ком, Санкт-П е те рбургс ком, Н овос ибирс ком. Д анное уче бное пос обие позвол ит с туде нтам с амос тояте л ь но ос воить ряд ос новопол агаю щ их те м, атакже ис пол ь зовать е го дл яподготовки к л абораторным и заче тным занятиям. Уче бное пос обие вкл ю чае т и ме тодиче с кие указаниядл япрове де ния вс е х запл анированных к данному курс у л абораторных занятий , пе ре д которыми в краткой форме изл агаю тс я ос новные те оре тиче с кие пол оже ния. М е тодиче с кие указания к л абораторным занятиям по курс у “О бщ ая цитол огия” накафе дре ге не тики, с е л е кции и те ории эвол ю ции В ГУ не издавал ис ь много л е т (Н азарова, 1987). Кроме того, в нас тоящ е е вре мя уче бная программа по курс у “Ц итол огия” в В ороне жс ком гос ударс тве нном униве рс ите те пре дус матривае т 9 (ане 7 как рань ш е ) л абораторных занятий . Н а л абораторных занятиях с туде нт дол же н овл аде ть навыками работы с о с ве товым микрос копом, приготовл е ниямикропре паратов и их цитол огиче с кого анал иза; ознакомить с я с принципами работы эл е ктронного микрос копа, рас с мотре ть ул ь трас труктурную организацию кл е тки; ознакомить с я с с овре ме нными ме тодами изуче ниякариотипа; кл е точным цикл ом и формами е го проявл е ния; ос новными типами де л е ния кл е тки рас те ний и животных; рас с мотре ть ос обе ннос ти с пороге не заи гаме тоге не зау животных и рас те ний из разл ичных с ис те матиче с ких групп. Каждая из 9 те м, с оотве тс твую щ ая одному л абораторному занятию продол жите л ь нос ть ю 2 уче бных час а, с оде ржит с л е дую щ ие разде л ы: це л ь занятия, ос новные те оре тиче с кие пол оже ния, мате риал ы и оборудование , ход работы (задания дл я выпол не ния л абораторной работы), а также вопрос ы дл яс амопрове рки и контрол я, которые помогут с туде нтам прове с ти оце нку с воих знаний при подготовке мате риал аи л учш е е го ус воить . В начал е каждого л абораторного занятия проводитс я контрол ь знаний с туде нтами те оре тиче с кого мате риал а.

5

Уче бное пос обие пре дназначе но дл я с туде нтов дне вной и ве че рне й форм обуче ния. В завис имос ти от объ е ма час ов, отве денного на л абораторные занятия, пре подавате л е м выборочно пре дл агае тс я те ма занятия и пе ре чень заданий дл явыпол не ниял абораторной работы. Т ем а 1. И ЗУЧ ЕН И Е РА С Т И Т ЕЛ ЬН Ы Х И Ж И В О Т Н Ы Х К Л ЕТ О К С ПО М О Щ ЬЮ С В ЕТ О В О Й М И К РО С К О ПИ И . С ПО С О БЫ И ЗГ О Т О В Л ЕН И ЯМ И К РО ПРЕПА РА Т О В В ЗА В И С И М О С Т И О Т Ц ЕЛ ЕЙ И С С Л Е ДО В А Н И Я Ц ел ь зан ят ия: 1. О знакомл е ние с ус трой с твом, типами и ос новными характе рис тиками оптиче с кой с ис те мы с ве топол ь ных с ве товых микрос копов (“Биол ам”, М БР -3, М БИ -6, М икме д-2 и др.). 2. О пре де л е ние разре ш аю щ е й с пос обнос ти микрос копапри ис пол ь зовании разл ичных объ е ктивов и разном ос ве щ е нии объ е ктов. 3. О знакомл е ние с правил ами работы с о с ве товым микрос копом. 4. Знакомс тво с ос новными этапами приготовл е ния пос тоянных микротомных пре паратов. 5. О с вое ние ме тода приготовл е ния давл е ных (пос тоянных ил и вре ме нных) микропре паратов. П рос мотр микропре паратов под с ве товым микрос копом и зарис овкаобщ е й с труктуры рас тите л ь ной и животной кл е тки. 6. И зуче ние ос обе ннос те й с трое ния рас тите л ь ной и животной кл е ток. О с н овн ы е т еорет и чес ки е полож ен и я. Ус т р ойс т в о и п р ин цип р абот ы с в ет ов ого м икр ос коп а п р ос в еч ив аю щ его т ип а. Д иаме тр типичной кл е тки животных с ос тавл яе т 10-20 микроме тров (мкм), что в 5 раз ме нь ш е ме л ь чай ш е й видимой час тицы (пре де л разре ш аю щ е й с пос обнос ти гл аза– 100 мкм ил и 0,1 мм). Н иже разре ш аю щ е й с пос обнос ти гл азаиме ю т также разме ры кл е ток рас те ний . Будучи чре звычай но мал ыми по разме рам, животные и рас тите л ь ные кл е тки к тому же бе с цве тны и прозрачны. П оэтому изуче ние их морфол огии и с труктуры возможно л иш ь с помощ ь ю микрос копа. О дин из ос новных ме тодов цитол огиче с ких ис с л е дований – ме тод с ве топол ь ной с ве товой микрос копии (набл ю де ние изображе ния пре паратов в проходящ е м с ве те в с ве тл ом пол е ). Д л я цитол огиче с ких ис с л е дований ис пол ь зую т разл ичные марки оте че с тве нных микрос копов: М БИ -3, М БР -3, М БИ -6, М БИ -11, “Биол ам”, атакже новая с е рия М икме д-2. Н е с мотря набол ь ш ое разнообразие моде л е й с ве товых микрос копов, принцип их ус трой с тва и работы с ходе н. Све товой микрос коп пре дс тавл яе т с обой оптиче с кую с ис те му, с ос тоящ ую из конде нс ора, объ е ктива и окул яра, которые ис пол ь зую тс я дл я рас с матривания объ е кта и уве л иче ния е го изображе ния (рис унок 1 и 2). П учок с ве таот ис точникаос ве щ е ния с обирае тс я в конде нс оре и направл яе тс янаобъ е кт. П роходяче ре з объ е кт, л учи с ве тапопадаю т в с ис те му л инз объ е ктива; они с троят пе рвичное изображе ние , которое уве л ичивае тс я с помощ ь ю л инз окул яра.

6

Гл авная оптиче с кая час ть микрос копа, опре де л яю щ ая е го ос новные возможнос ти - объ е ктив. О бъ е ктивы и окул яры в с овре ме нных микрос копах с ме нные , что позвол яе т изучать кл е тки при разных увели ч ен и ях. Ко н ден со р– с пе циал ь ный ос ве тите л ь , рас пол оже нный под пре дме тным (объ е ктным) с тол иком микрос копа. О н с ос тоит из двух ил и тре х л инз, с обираю щ их от зе ркал ас ве т в пучок, направл яе мый в пл ос кос ть пре парата. И ме е т с уживаю щ ую с я апе ртурную диафрагму. Н а каче с тво изображе ния вл ияе т ме с топол оже ние конде нс ора(пе ре ме щ ая конде нс ор, можно изме нить каче с тво изображе ния), с те пе нь открытия диафрагмы (открывая и закрываяе е можно изме нить гл убину ре зкос ти, ос ве щ е ннос ть ). Р ис унок 1. Ус трой с тво микрос копа “Биол ам Р ” с зе ркал ом: 1- ос нование ; 2- коробка с ме ханизмом микроме триче с кой фокус ировки; 3- рукояткамикроме триче с кой фокус ировки; 4рукоятка макроме триче с кой фокус ировки; 5- с топорный винт; 6- це нтрировочный винт; 7- тубус оде ржате л ь ; 8- гол овка; 9- монокул ярная нас адка; 10- винт кре пл е ния нас адки; 11- винт ре вол ь ве ра; 12- ре вол ь ве р; 13- пре дме тный с тол ик; 14- винт конде нс ора; 15-16- корпус конде нс ора; 17- откидная л инзав оправе ; 18- рукояткаконде нс ора; 19- зе ркал о.

Зерка ло (рас пол оже нное под конде нс ором) отражае т падаю щ ий на не го с ве т и направл яе т е го в конде нс ор дл я ос ве щ е ния пре парата. Зе ркал о име е т две пове рхнос ти – пл ос кую (е ю пол ь зую тс я при л ю бом ис точнике с ве та и при л ю бом уве л иче нии) и вогнутую (ис пол ь зуе мую при ис кус с тве нном ос ве щ е нии). Д л я л учш е го ос ве щ е ния объ е кта в биол огиче с ких микрос копах вме с то зе ркал аис пол ь зую т как выне с е нные пе ре д микрос копом (О И -19), так и вс трое нные в микрос коп ос ве тите л и (у микрос копов М БИ -6, М БИ -11, М икме д 2, рис унок 2). Объект и в ы – многол инзовые с ис те мы, одна из наибол е е важных час те й микрос копа, опре де л яю щ ая е го ос новные возможнос ти. О бъ е ктивы бываю т с ухие и имме рс ионные . Сухие объ е ктивы (7х, 9х, 20х, 40х) приме няю тс яобычно при не бол ь ш их уве л иче ниях (от 56 до 600 раз). В этом с л учае ме жду объ е ктивом и пре паратом находитс я с л ой воздуха (показате л ь пре л омл е ния е го 1). И з-заразницы показате л е й пре л омл е ния пре дме тного с те кл а и воздуха час ть с ве товых л уче й откл оняе тс я и не попадае т в гл аз набл ю дате л я. П оэтому с ухие объ е ктивы не позвол яю т рас с матривать с л иш ком ме л кие объ е кты, дл я этого ис пол ь зую т имме рс ионные объ е ктивы, даю щ ие уве л иче ние в 900-1350 раз. П ре имущ е с тво имме рс ионной с ис те мы закл ю чае тс яв том, что ме жду объ е ктом напре дме тном с те кл е и объ -

7

е ктивом находитс я с ре да с одинаковым показате л е м пре л омл е ния (ке дровое мас л о име е т показате л ь пре л омл е ния1,515; вода– 1,33). Бл агодарятому, что л учи не пре л омл яю тс я и попадаю т в объ е ктив, дос тигае тс я наил учш е е ос ве щ е ние и хорош аявидимос ть ме л ь чай ш е го объ е кта. Р ис унок 2. Ус трой с тво микрос копа М икме д 2 с о вс трое нным ос ве тите л е м: 1- ос нование ; 2- кол ь цо пол е вой диафрагмы; 3- винт кре пл е нияконде нс ора; 4- откидная оправа; 5- винты, це нтрирую щ ие конде нс ор; 6- конде нс ор; 7- винт кре пл е ния пре дме тного с тол ика; 8- пре дме тный с тол ик; 9объ е ктивы; 10- ре вол ь ве рное ус трой с тво; 11- рифл е ное кол ь цо ре вол ь ве рного ус трой с тва; 12- окул яры; 13- бинокул ярная нас адка; 14- винт кре пл е ния бинокул ярной нас адки; 15- ш татив; 16- рукояткагрубой (макроме триче с кой ) фокус ировки; 17- рукоятка тонкой (микроме триче с кой ) фокус ировки; 18- фонарь ; 19- кронш те й н с тол ика; 20- рукоятка пе ре ме щ е ния конде нс ора; 21- кронш те й н.

Н аоправе имме рс ионных объ е ктивов име ю тс я канавки разного цве тав завис имос ти от видаприме няе мой имме рс ии. Н аобъ е ктиве мас л яноимме рс ионном (“М И ” наоправе ) канавкаокраш е нав че рный цве т. В каче с тве имме рс ии ис пол ь зую т вазе л иновое , ке дровое ил и другое мас л о. Н а объ е ктиве водно-имме рс ионном (“В И ”) канавкабе л ая. Э тот объ е ктив удобе н дл яизуче нияобъ е ктов, закл ю че нных в воду. Н аобъ е ктиве гл ице риново-имме рс ионном (“ГИ ”) канавкаокраш е нав же л тый цве т. Уве л иче ние объ е ктива указано на оправе . Н априме р, у микрос копа М БР -1 объ е ктивы могут име ть уве л иче ние 9х, 20х, 40х, 90х и апе ртуру с оотве тс тве нно 0,20; 0,40; 0,65; 1,25 (ил и 1,4). А перт ура (А ) = нуме риче с каяапе ртура(NA) – это ве л ичина, опре де л яю щ аяс пос обнос ть оптиче с кой с ис те мы вос принимать то ил и иное кол иче с тво с ве та (т.е . характе ризуе т с ве тос обираю щ ую с пос обнос ть объ е ктива). О наопре де л яе тс япо формул е : A = n ⋅ sin α , где α - пол овинаугл ал инзы объ е ктива, т.е . угл аме жду л учами, идущ ими от объ е ктак краям объ е ктива, аn – показате л ь пре л омл е ния с ре ды ме жду покровным с те кл ом пре парата и объ е ктивом. Е с л и ме жду пре паратом и объ е ктивом находитс я воздух, то значе ние n ⋅ sin α може т дос тигать 0,94-0,95. В е л ичинануме риче с кой апе ртуры явл яе тс япос тоянной дл якаждого отде л ь ного объ е ктиваи указана на е го оправе . И мме рс ионные объ е ктивы име ю т бол е е выс окие значе ния апе ртуры, че м с ухие , так как показате л ь пре л омл е ния жидкос ти >1. Так, с ухой обе ктив с уве л иче ние м 40х име е т А =0,65, аводноимме рс ионный объ е ктив с те м же уве л иче ние м – А =0,75. Н аибол е е выс окая апе ртура– у мас л яноимме рс ионных объ е ктивов (до 1,4).

8

А пе ртурой характе ризую тс я не тол ь ко объ е ктивы, но и конде нс ор микрос копа. Их ве л ичины указываю тс я наоправе объ е ктивов и конде нс ораи дол жны с овпадать (принцип Ке л е ра). В противном с л учае возможнос ти объ е ктиваре ал изую тс яне пол нос ть ю . Гл авной характе рис тикой микрос копа как оптиче с кой с ис те мы, опре де л яю щ е й е е каче с тво, явл яе тс я ра зреш а юща я спо со бн о ст ь . П од ра зреш а ющей спо со бн о ст ь ю объ е ктивамикрос копа(d) понимаю т тот наиме нь ш ий диаме тр час тицы, которую мы може м увиде ть в микрос коп. Р азре ш аю щ ая с пос обнос ть не вооруже нного гл аза че л ове ка равна приме рно 0,1-0,2 мм ил и 100-200 мкм (1 мм = 1000 мкм). П ри помощ и с ил ь ной л упы можно рас с матривать объ е кты ве л ичиной до 0,01 мм (10 мкм). Све товой микрос коп може т повыс ить (к не вооруже нному гл азу че л ове ка) разре ш аю щ ую с пос обнос ть в 1000 раз. О бычно макс имал ь ная разре ш аю щ ая с пос обнос ть микрос копане выш е 0,2-0,35 мкм ил и 200-350 нм (1 мкм=1000 нм - наноме тров), т.е . в с ве товом микрос копе можно виде ть час тицы разме ром 0,2-0,35 мкм. Р азре ш аю щ ая с пос обнос ть объ ектива завис ит от дл ины вол ны (че м онаме нь ш е , те м ме нь ш е го разме раде тал ь мы може м увиде ть ) и от нуме риче с кой апе ртуры объ е ктива– А (че м онавыш е , те м выш е разре ш е ние ) и λ ⋅ 0,61 , где d – разре ш аю щ ая с пос обнос ть вычис л яе тс я по формул е : d = A объ е ктива; λ - дл ина вол ны ис пол ь зуе мого ис точника с ве та, мкм; А - чис л овая апе ртура. Так, при ис пол ь зовании объ е ктива мас л яноимме рс ионного с уве л иче ние м 90х и апе ртурой (А ) =1,4, при ос ве щ е нии обычным с ве том λ=0,55 мкм, наиме нь ш ий диаме тр видимых час тиц с о0,55 мкм ⋅ 0,61 с тавл яе т d = = 0,24 мкм. Уме нь ш ая дл ину вол ны с ве та (ис 1,4 пол ь зуя, наприме р, с иние с ве тофил ь тры - λ=0,47 мкм ил и коротковол новый ул ь трафиол е товый с ве т - λ=0,26-0,28 мкм) можно увиде ть и изучить бол е е ме л кие с труктуры и де тал и с трое ния, че м при ос ве щ е нии обычным бе л ым с ве том. Каждый объ е ктив характе ризуе тс я опре де л е нной ве л ичиной ра бо ч его ра сст о ян и я. О бъ е ктивы мал ого уве л иче ния име ю т макс имал ь ное рабоче е рас с тояние от объ е ктивадо пре паратаи наибол ь ш е е пол е зре ния, поэтому с них начинаю т ис с л е дования, а зате м пе ре ходят на объ е ктивы с бол ь ш им уве л иче ние м. П ри работе с микрос копом важное значе ние име е т тол щ инапокровного и пре дме тного с те кол . Каче с тве нное изображе ние набл ю дае тс япри тол щ ине покровного с те кл а0,17 мм, пре дме тного – 1,2 мм. Окулярус трое н значите л ь но прощ е объ е ктива. Н е ре дко он с ос тоит вс е го из двух л инз. Уве л иче ние окул ярау микрос копаобычно с ос тавл яе т 7х, 10х, 15х. Ц ифровые виде оокул яры, ш ироко ис пол ь зуе мые в пос л е дние годы, позвол яю т выве с ти изображе ние на экран монитораи прове с ти е го компь ю те рную обработку, пол учить фотографии выс окого каче с тва.

9

Общее ув ели ч ен и е ми кро ско па опре де л яе тс я как произве де ние уве л иче ния объ е ктива(Vоб) науве л иче ние окул яра(Vок): V = Vоб · Vок. Е с л и объ е ктив име е т уве л иче ние 90х, а окул яр 15х, то общ е е уве л иче ние равно 1350. В те х с л учаях, когдамикрос коп с набже н бинокул ярной нас адкой А У-12, име ю щ е й с вое с обс тве нное уве л иче ние (Vн), равное 1,5х, уве л иче ние микрос копаопре де л яю т по формул е : V= Vоб ·Vок · Vн. В ыбор окул яра в микрос копе дол же н производить с я так, чтобы общ е е уве л иче ние микрос копа не пре выш ал о ве л ичину 1000А , т.е . предель н ую вели ч и н у по лезн о го ув ели ч ен и я ми кро ско па . Н априме р, при объ е ктиве 90х с апе ртурой 1,35 пол е зное уве л иче ние микрос копа буде т равно 1350 раз (1000 ⋅ 1,35) и поэтому не ре коме ндуе тс я приме нять окул яры с уве л иче ние м бол ь ш е 15х (1350 : 90 = 15). Е с л и наруш ить это правил о и приме нить окул яры 20х и бол е е с ил ь ные , то в рас с матривае мых с труктурах мы не увидим допол ните л ь ных де тал е й , наоборот, наконтурах эл е ме нтов объ е кта из-за явл е ния дифракции будут заме тны с ве товые окай мл е ния, что ухудш ит изображе ние и даже може т приве с ти к оптиче с ким ош ибкам. Пр ав ил а обр ащ ен ия с м икр ос коп ом . Р аботаяс микрос копом, нужно приде рживать с яс л е дую щ их пра ви л. 1. М икрос коп не обходимо с оде ржать в чис тоте , пре дохранять от пыл и и с ырос ти, тол чков и царапин, с оприкос нове ния с кис л отами, щ е л очами, рас творите л ями, приме няе мыми при изготовл е нии микропре паратов. В не рабоче м с ос тоянии микрос коп дол же н быть накрыт че хл ом. 2. О с обое внимание надо обращ ать начис тоту объ е ктивов и других оптиче с ких де тал е й . Н е л ь зя кас ать с я пал ь цами пове рхнос те й л инз. О птиче с кие пове рхнос ти окул яров, объ е ктивов и конде нс оров нужно пе риодиче с ки протирать марл е й ил и мягкой с ал фе ткой ; чис той ватой , с моче нной с пе циал ь ной жидкос ть ю дл ячис тки оптиче с ких де тал е й . 3. П ри работе с объ е ктивом бо ль ш о го ув ели ч ен и я тубус пе ре двигать вначал е макровинтом; окончате л ь ная фокус ировка производитс я микровинтом. М икровинт во избе жание порчи винтовой наре зки поворачивать не бол е е , че м наодин оборот в ту ил и другую с торону. П ри работе с объ е ктивом ма ло го ув ели ч ен и я тубус пе ре двигать тол ь ко ма кро ви н т о м. 4. Н е ос тавл ять микрос коп пос л е работы наобъ ективе бол ь ш ого уве л иче ния; ре вол ь ве р с л е дуе т пе ре ве с ти намал ое уве л иче ние . 5. Н е ос тавл ять тубус микрос копаоткрытым, т.е . бе з окул яра, так как это приводит к накапл иванию в не м пыл и и загрязне нию объ е ктива. 6. П е ре нос микрос копаос ущ е с твл яе тс я с л е дую щ им образом: правой рукой захватываю т тубус оде ржате л ь , а ножку ш татива с тавят на л адонь л е вой руки. В Н И М А Н ИЕ ! Запре щ ае тс я с амим разбирать объ е ктивы, окул яры, конде нс ор. Подбор м ат ер иал а дл я ис с л едов ан ия и его ф иксация. С п ос обы изгот ов л ен ия м икр оп р еп ар ат ов . Сущ е с твую т разл ичные с пос обы изготовл е ния пре паратов. М икропре парат може т пре дс тавл ять с обой мазок,

10

с ре з разл ичных ткане й и кл е ток, може т быть тотал ь ным, давл е ным. Ц итол огиче с кие микропре параты могут быть вре менными ил и пос тоянными. С помощ ь ю микрос копа можно изучать как живые , так и фикс ированные (ме ртвые ) кл е тки. Д л я при ж и зн ен н о го (витал ь ного) изуче ния кл е тки рас те ний , животных, че л ове каил и с вободноживущ ие однокл е точные микроорганизмы л ибо поме щ аю т прямо в жидкую с ре ду напре дме тное с те кл о, л ибо пре дварите л ь но кул ь тивирую т в ус л овиях, бл агоприятных дл я их жизне де яте л ь нос ти и размноже ния. Н априме р, дл я кул ь тивирования кл е ток че л ове ка ис пол ь зую т л имфоциты (кл е тки крови), фибробл ас ты кожи (кл е тки с ое дините л ь ной ткани), миобл ас ты (мол одые однояде рные мыш е чные кл е тки), эпите л иал ь ные кл е тки и др. Д л я изуче ния не окраш е нных кл е ток ис пол ь зую т разл ичные ме тоды ко н т ра ст и ро в а н и я: фазово-контрас тную , те мнопол ь ную , фл уоре с це нтную микрос копию . Э то разл ичные “прие мы” с помощ ь ю которых не видимые дл я гл аза оптиче с кие эффе кты пре образую тс я в вос принимае мые гл азом изме не ния. Д ругая возможнос ть их изуче ния – ис пол ь зование в и т а ль н ых кра си т елей, т.е . крас ите л е й в бол ь ш ом разве де нии (1:10 000 – 1:50 000) с це л ь ю с ниже нияих токс ичнос ти. Н е с мотря наважнос ть и дос таточную прос тоту витал ь ных набл ю де ний , бол ь ш ая час ть с ве де ний о с труктуре и с вой с твах кл е ток пол уче нана фи кси ро в а н н о м мате риал е . Д л я этого ткань фи кси руют (т.е . быс тро убиваю т, поме щ ая в фикс атор), ис пол ь зуя разл ичные с мес и ре аге нтов: ал ь де гиды, с пирты и др. с пос л е дую щ им о кра ш и в а н и ем кл е ток. В завис имос ти от це л е й ис с л е дованияизготавл иваю т времен н ые (тре бую щ ие не ме дл е нного изуче ния) ил и по ст о ян н ые (хранящ ие с ядл ите л ь ное вре мя) ми кро препа ра т ы с пос л е дую щ им их изуче ние м с помощ ь ю с ве тового микрос копа. Р ас с мотрим при н ци пы и зго т о в лен и я да в лен ых и ми кро т о мн ых пре паратов дл яцитол огиче с кого изуче ниярас тите л ь ных кл е ток. Д л я подс че та чис л а, изуче ния с труктуры и морфол огии хромос ом; изуче ния характе раде л е ния кл е тки (митоза, ме й за) в норме и при разл ичных патол огиях; подс че такол иче с тваядрыш е к и опре де л е нияих разме ров и др. изготавл иваю т вре ме нные ил и вре ме нно-пос тоянные да влен ые препа ра т ы. Д л я изуче ния с труктуры и рас пол оже ния кл е ток в разл ичных типах ткане й , изуче ния проце с с а опл одотворе ния, развития зародыш а, эндос пе рма и др. изготавл иваю т по ст о ян н ые ми кро т о мн ые препа ра т ы. В обоих с л учаях работу начинаю т с фикс ации выбранного дл я ис с л е дования мате риал а(коре ш ков пророс тков, мол одых л ис ть е в из рас пус каю щ ихс яве ге тативных поче к, ге не ративных поче к и др). Н априме р, де л е ние с оматиче с ких кл е ток – митоз можно набл ю дать в ме рис те мах корне й пророс ш их с е мян, в конус ах нарас тания с те бл я, в ме рис те ме л ис ть е в рас пус каю щ ихс я ве ге тативных поче к. Д л ямногих рас те ний митозы идут наибол е е активно в утре нние и ве черние час ы. Так, у с ос ны обыкнове нной набл ю дае тс я два пика митоза – в 9-11 час ов и 20-23 час а. П оэтому при проращ ивании с е мян, коре ш ок, дос тигш ий 0,5-1,5 с м, фикс ирую т име нно в это вре мя.

11

Д л я изуче ния ме й озапри микрос пороге не зе фикс ирую т бутоны, мол одые кол ос ь я зане с кол ь ко не де л ь (ил и дне й ) до рас пус кания, выкол аш ивания. О пл одотворе ние и разл ичные этапы эмбриоге не за набл ю даю т в опыл е нных цве тках че ре з опре де л е нные проме жутки вре ме ни пос л е нане с е нияпыл ь цы нарыл ь це пе с тика. Ф и кса т о р(ко н серви рующа я ж и дко ст ь ) – это с ме с ь разл ичных ре активов: с пирта, укс ус ной кис л оты, ал ь де гидов и др., которая быс тро проникае т в ткань , кл е тки и фикс ируе т (убивае т) их. В ажно выбрать такой фикс атор, который , убивая кл е тку, макс имал ь но с охраняе т прижизне нную с труктуру е е компоне нтов, подл е жащ их изуче нию . П ри фикс ации кол л оиды кл е ток пе ре ходят в не рас творимое с ос тояние и приобре таю т с пос обнос ть окраш ивать с якрас ите л ями. Ф икс аторы подразде л яю т натри группы: 1) фикс ирую щ ие ядро, ил и яде рные фикс аторы (фикс аторы Н аваш ина, Карнуа, М одил е вс кого и др.); 2) фикс ирую щ ие цитопл азму (фикс аторы Ф л е мминга, Ге рмана и др.); 3) фикс ирую щ ие органоиды кл е тки (фикс аторы Л е витс кого, Р е го и др.). В каче с тве компоне нтов яде рных фикс аторов обычно ис пол ь зую т с л е дую щ ие ве щ е с тва: с пирт, укс ус ную кис л оту, хромовую кис л оту, формал ин, ос мие вую кис л оту, пропионовую кис л оту и др. Укс ус ная кис л ота, наприме р, в конце нтрации 98% (л е дяная укс ус ная кис л ота– Л УК) хорош о ос аждае т нукл е иновые кис л оты, хорош о с охраняе т форму хромос ом, но разруш ае т митохондрии и аппарат Гол ь джи. Спирты вызываю т не обратимую де натурацию бе л ков, ос ажде ние нукл е иновых кис л от и пол ис ахаридов. А л ь де гиды (наприме р, формал ь де гид) хорош о с вязывае тс я с бе л ками, вызываяих де натурацию , нукл е иновыми кис л отами, л ипидами. В с е рас творы фикс аторов готовят на с пирту (наприме р, фикс атор Карнуа) ил и надис тил л ированной воде (наприме р, фикс аторы Н аваш инаи М одил е вс кого). Спиртовые фикс аторы быс тро проникаю т в ткани, мате риал в них выде рживаю т от 30 минут до 24 час ов. В одные фикс аторы проникаю т в ткань ме дл е нне е , поэтому продол жите л ь нос ть фикс ации от с уток до не с кол ь ких (в завис имос ти от разме ров фикс ируе мого мате риал а). П риме ром наибол е е прос того яде рного фикс атора явл яе тс я “У ксусн ый а лко го ль ”, име ю щ ий с ос тав 3:1: 3 час ти 96% этил ового с пирта и 1 час ть л е дяной укс ус ной кис л ота(98%). Ф икс ацию ос ущ е с твл яю т путе м погруже ния живого, с ве же го мате риал а(коре ш ки, бутоны и др.) в разл ичные ядовитые жидкос ти нас рок от не с кол ь ких час ов до не с кол ь ких с уток. П родол жите л ь нос ть фикс ации завис ит от объ е мафис ируе мого мате риал аи типафикс атора. В с ре дне м с ос тавл яе т от двух час ов до с уток. О бъ е м фикс ирую щ е й жидкос ти дол жен значите л ь но (не ме не е че м в 50 раз) пре выш ать объ е м фикс ируе мого мате риал а. П ос л е фикс ации мате риал промываю т водой дл я удал е ния фикс ирую щ их ве щ е с тв ил и продуктов их разл оже ния (при фикс ации водными фикс аторами) ил и с пиртом (при ис пол ь зовании с пиртовых фикс аторов). В пос л е дне м с л учае зафикс ированный мате риал промываю т в тре х с ме нах

12

80%-го с пиртаи при не обходимос ти хранят в 70 %-ном с пирте в с те кл янных фл аконах при пониже нной те мпе ратуре . О бщ ие п р ин цип ы изгот ов л ен ия п ос т оян н ы х м икр от ом н ы х п р еп ар ат ов . 1. Ф икс ациярас тите л ь ного мате риал а. 2. П ос те пе нное обе звоживание (дл яизбе жанияс морщ ивания) зафикс ированного мате риал а в с пиртах возрас таю щ е й конце нтрации: 20% → 40% → 60% → 80% → 96% → 100% - абс ол ю тный с пирт. 3. П ропитывание мате риал а рас творите л ями парафина: хл ороформом, кс ил ол ом, тол уол ом ил и бе нзол ом (пос кол ь ку парафин не с ме ш ивае тс яни с водой , ни с о с пиртом). 4. Закл ю че ние мате риал ав парафин (пос л е че го он с тановитс я пл ас тичным и из не го можно изготавл ивать тонкие с ре зы), наре зканамикротоме с помощ ь ю с тал ь ного ножа. Тол щ ина микротомных с ре зов – 5-10 мкм. Н акл е ивание парафиновых с ре зов напре дме тное с те кл о. 5. Удал е ние парафинаи окраш ивание с ре зов. Д л я того, чтобы с ре зы можно был о прокрас ить , проводят удал е ние парафина рас творите л ями (пос кол ь ку парафин пре пятс твуе т окрас ке ), который в с вою оче ре дь заме щ аю тс яс пиртом, азате м водой . 7. О краш ивание с ре зов. В завис имос ти от це л и ис с л е дованияис пол ь зую т разл ичные с пос обы окрас ки. П о проис хожде нию крас ите л и де л ят на три группы: рас тите л ь ные (ге матокс ил ин, орс е ин), животные (кармин) и с инте тиче с кие (анил иновые , ал изариновые и др.). П о характе ру де й с твия крас ите л и де л ят на две группы: цитопл азматиче с кие (в ос новном кис л ые крас ите л и – эозин и др.) и яде рные (гл авным образом, ос новные : ме тил е новый с иний , атакже ге матокс ил ин и кармин). 8. Закл ю че ние с ре зов в канадс кий бал ь зам под покровное с те кл о. Бал ь зам пре дс тавл яе т с обой рас творе нную в кс ил ол е с мол у не которых видов пихты. И зготовл е нные таким образом микротомные пос тоянные пре параты дос тупны дл ите л ь ному хране нию (в те че ние не с кол ь ких л е т). И зуче ние митоза, ме й оза, кариотипа л учш е проводить на давл е ных микропре паратах, т.к. намикротомных с ре зах не ре дко можно увиде ть разруш е нные митозы, нал оже нные однанадругую хромос омы -– кл убки хромос ом, пл охо поддаю щ ие с яанал изу. И згот ов л ен иедав л ен ы х п р еп ар ат ов . Р ас с мотрим порядок изготовл е нияда влен ых ми кро препа ра т о в из корне вой ме рис те мы пророс тков рас те ний . 1. Пр ор ащ ив ан ие с ем ян . Се ме на прорас тить в чаш ках П е три на вл ажной фил ь тровал ь ной бумаге в те рмос тате при те мпе ратуре 25-260С. 2. Ф иксация. Коре ш ки ил и ме л кие пророс тки с е мян с коре ш ками, дос тигш ими дл ины 0,5-2 с м (в завис имос ти от объ е кта), зафикс ировать в “укс ус ном ал когол е ”: 3 час ти 96%-ного этил ового с пиртаи 1 час ть л е дяной укс ус ной кис л оты. Ф икс ацию прове с ти в с те кл янных пе ницил л иновых пузырь ках, выде рживая мате риал в комнатных ус л овиях в те че ние от 2-3 час ов до с уток, азате м поме с тить в хол одил ь ник. П ри не обходимос ти дл ите л ь ного хране ниямате риал пе ре ве с ти в 70% этил овый с пирт.

13

3. Пр едобр абот ка п ер ед ф иксацией. М ате риал , пре дназначе нный дл я подс че та чис л а и изуче ния морфол огии хромос ом пре добрабатываю т пе ре д фикс ацие й ве щ е с твами, ул учш аю щ ими разброс и конде нс ацию хромос ом (кол хицином, 8-окс ихинол ином, парадихл орбе нзол ом, хол одом и др.), зате м промываю т дис тил л ированной водой и фикс ирую т. Так, дл я объ е ктов с крупными хромос омами (наприме р, с ос ны обыкнове нной , л ис тве нницы) мате риал поме щ аю т в 1% -ный рас твор кол хицинаи выде рживаю т в те че ние 5-6 час ов при комнатной те мпе ратуре . Д л яобъ е ктов с ме л кими хромос омами (например, виш ни, че ре ш ни, бе ре зы, топол я) мате риал выде рживаю т в 0,002 М рас творе 8-окс ихинол инапри те мпе ратуре 10-140С в те че ние 3-4 час ов. 4. М ацер ация (л ат. maceratio – размягче ние , рас пад ткани на отде л ь ные кл е тки). Зафикс ированные коре ш ки (ил и це л ые пророс тки) поме с тить в фарфоровый тиге л ь , нал ить 18% рас твор с ол яной кис л оты и ос торожно подогре ть до те мпе ратуры приме рно 600С. 5. П ромыть коре ш ки (ил и пророс тки) в не с кол ь ких с ме нах дис тил л ированной воды, с пол ос нуть один раз в 45 % рас твором укс ус ной кис л оты и поме с тить в с ве жую порцию кис л оты на5-15 минут. О бработкамате риал а с ол яной и укс ус ной кис л отой не обходима дл я е го мацерации (размягче ния в ре зул ь тате рас творе ния кл е точных с те нок и разъ е дине ния кл е ток) и л учш е го раздавл ивания (л учш е го рас пре де л е ния кл е ток) при изготовл е нии микропре паратов. 6. О кр аш ив ан ие. Д л я окраш ивания пре паратов давл е ной ткани в каче с тве крас ите л е й в ос новном ис пол ь зую т ге матокс ил ин, орс е ин, кармин, ре актив Ш иффа(фукс инс е рнис тую кис л оту). Р ас с мотрим окраш ивание мате риал ааце то-же л е зо-ге матокс ил ином, приготовл е нным из экс трактакампе ш е вого де ре ва. П омес тить коре ш ки (ил и це л ые пророс тки) в крас ите л ь аце то-же л е зо-ге матокс ил ин на30-60 минут (дл я с ос ны обыкнове нной , л укаи др.) при комнатной те мпе ратуре . П родол жите л ь нос ть окраш ивания ге матокс ил ином у разных объ е ктов с ос тавл яе т от не с кол ь ких минут до 24 час ов при комнатной те мпе ратуре . О пе рации 5 и 6 проводят в фарфоровых тигл ях, закрытых крыш ками. 7. Тщ ате л ь но промыть окраш е нный мате риал в дис тил л ированной воде . В с л учае не обходимос ти мате риал може т ос тавать с яв воде в ус л овиях хол одил ь никав те че ние 2-х – 3-х с уток. 8. Д л яизвл е че нияизбыткакрас ки коре ш ок поме с тить напре дме тное с те кл о в капл ю 45% укс ус ной кис л оты ил и с ме с ь 45% укс ус ной кис л оты и 80% хл орал гидрата. 9. Раздав л ив ан иеобъект а. О тде л ить кончик коре ш капророс тка(не бол е е 1,5-2 мм) пре паровал ь ной игл ой (ил и л е звие м). П оме с тить е го на пре дме тное с те кл о в капл ю жидкос ти Гой е ра(прос ве тл яю щ е й и конс е рвирую щ е й , в с ос тав которой входит гуммиарабик=виш не вый кл е й , гл ице рин, хл орал гидрат и дис тил л ированная вода), накрыть покровным с те кл ом. Л е гким надавл ивание м ручкой пре паровал ь ной игл ы рас пре де л яю т кл е тки в один с л ой . Зате м покровное с те кл о накрываю т пол ос кой фил ь тровал ь ной

14

бумаги и надавл иваю т бол ь ш им пал ь це м руки, че м дос тигае тс я рас пол оже ние хромос ом в одной пл ос кос ти. В с л учае пол уче нияпре паратас о с куче нным рас пол оже ние м хромос ом, препарат с л е дуе т подогре ть над пл аме не м с пиртовки (не доводядо закипания!) и повторить раздавл ивание . Э тим же дос тигае тс я допол ните л ь ное ос ве тл е ние чре зме рно окраш е нной цитопл азмы. И зготовл е нный таким образом препарат явл яе тс ядавл е но - пос тоянным и хранитс я продол жите л ь ное вре мя. Д л я изготовл е ния давл еного вре ме нного пре паратараздавл ивание объ е ктаос ущ е с твл яе тс я в капл е 45% укс ус ной кис л оты. М ат ери алы и оборудован и е. Р азл ичные марки с ве товых микрос копов (“Биол ам”, М БР -3, М БИ -6, М икме д-2 и др.), ос ве тите л и, зафикс ированные корни (с ос ны обыкнове нной , е л и, бе ре зы, л ука), крас ите л ь аце тоже л е зо-ге матокс ил ин, 45% укс ус ная кис л ота, 18% рас твор с ол яной кис л оты, дис тил л ированнаявода, жидкос ть Гой е ра, пипе тки, пинце ты, пре паровал ь ные игл ы, фарфоровые тигл и, пре дме тные и покровные с те кл а, пол ос ки фил ь тровал ь ной бумаги, с пиртовки, с пички, пос тоянные микротомные пре параты (корне вой ме рис те мы л ука, бобов, кукурузы; кожицы л ука; кл е ток эритроцитов крови че л ове ка и л ягуш ки, кл е ток пе че ни мыш и и акс ол отл я, яй це кл е тки л ош адиной ас кариды). Ход работ ы . Задан ие1. О знакомить с я с ус трой с твом, типами и ос новными характе рис тиками оптиче с кой с ис те мы с ве товых микрос копов (“Биол ам”, М БР -3, М БИ-6, М икме д-2). Задан ие 2. В ычис л ить значе ние разре ш аю щ е й с пос обнос ти микрос копапри ис пол ь зовании низкоапе ртурных и выс окоапе ртурных объ е ктивов и ос ве щ е нии объ е ктал учами с дл иной вол ны 0,55 мкм и 0,47 мкм. Задан ие3. Ус тановить микрос коп в рабоче е пол оже ние . О пре де л ить общ е е уве л иче ние микрос копа, ис пол ь зуя комбинацию из объ е ктивов и окул яров с разным уве л иче ние м. Задан ие4. О знакомить с я с ос новными этапами изготовл е ния пос тоянных микротомных пре паратов из рас тите л ь ных ткане й . Запис ать в те традь пос л е довате л ь нос ть изготовл е ния пре паратов. Р ас с мотре ть готовые пос тоянные микротомные пре параты кл е ток рас тите л ь ной и животной ткани под с ве товым микрос копом, изучить их разнообразие и ос обе ннос ти с трое ния. Указать че рты с ходс тваи разл ичия. Задан ие 5. И зготовить давл е ные микропре параты из зафикс ированных коре ш ков разных видов рас те ний по выш е опис анной ме тодике (пункты 4-9). П рос мотреть микропре параты под с ве товым микрос копом. Сравнить как выгл ядит корне вая ме рис те ма л ука на микротомном и давл е ном микропре парате . Задан ие 6. И с пол ь зуя изготовл е нные на занятии давл е ные микропре параты и готовые микротомные пре параты, зарис овать при бол ь ш ом уве л иче нии общ ую с труктуру рас тите л ь ной и животной кл е тки. В оп р ос ы дл я с ам оп р ов ер киикон т р ол я: 1. В че м с ос тоит ос новной принцип работы с ве тового микрос копа?

15

2. П е ре чис л ите и охаракте ризуй те ос новные с ос тавл яю щ ие с ве тового микрос копа. 3. Как отл ичить имме рс ионные объ е ктивы от с ухих? В че м пре имущ е с тво их ис пол ь зования? 4. Ч то такое разре ш аю щ ая с пос обнос ть микрос копа? О т че го оназавис ит? Как е е ул учш ить (повыс ить )? 5. Как опре де л ить общ е е уве л иче ние микрос копа? Сформул ируй те правил о подбораокул яров у с ве тового микрос копа. 6. Ч то такое фикс атор? Какие с ущ е с твую т типы фикс аторов? Каков ме ханизм их де й с твия? 7. Д л яче го проводитс япре добработкамате риал апе ре д фикс ацие й ? 8. Какие крас ите л и ис пол ь зую т в цитол огиче с ких ис с л е дованиях? 9. Ч е м отл ичаю тс я давл е ные от микротомных пре паратов? В каких с л учаях их приме няю т? 10. Каковы ос новные этапы изготовл е ния пос тоянных микротомных пре паратов? В каких с л учаях их приме няю т? 11. О пиш ите кратко ос новные этапы изготовл е ния давл е ных пре паратов дл яцитол огиче с ких ис с л е дований . В каких с л учаях их приме няю т? 12. П е ре чис л ите ос новные разл ичия в с трое нии кл е ток рас те ний и животных. Т ем а 2. Э Л Е К Т РО Н Н А ЯМ И К РО С К О ПИ Я К А К М ЕТ О Д Ц И Т О Л О Г И Ч ЕС К И Х И С С Л ЕДО В А Н И Й Ц ел ь зан ят ия: 1. О знакомл е ние с ус трой с твом, принципом работы, типами и возможнос тями эл е ктронного микрос копа. 2. О знакомл е ние с ос новными этапами изготовл е ния ул ь тратонких с ре зов дл я их изуче ния с помощ ь ю эл е ктронного микрос копа. 3. В ыде л ить принципиал ь ные отл ичия эл е ктронного микрос копаот с ве тового, ме тодов изготовл е ния микропре паратов дл я с ве товой и эл е ктронной микрос копии (с равните л ь ный анал из). О с н овн ы е т еорет и чес ки е полож ен и я. Как уже отме чал ос ь выш е , один из ос новных ме тодов цитол огиче с ких ис с л едований – ме тод с ве тл опол ь ной с ве товой микрос копии, разре ш аю щ ая с пос обнос ть которого при ис пол ь зовании видимой обл ас ти с ве та с ос тавл яе т 0,2-0,3 мкм. Р азл ичные ме тоды контрас тирования, ис пол ь зуе мые в с ве товой микрос копии, позвол яю т увиде ть час тицы, име ю щ ие ве л ичину ме не е 0,2 мкм. К ним относ итс я те мнопол ь ная, фазово-контрас тная, фл уоре с це нтная микрос копияи другие ме тоды. М ет од «т ем н ого п ол я». В этом с л учае с ве т от ос ве тите л яне попадае т в объ е ктив. О с ве щ е ние ос ущ е с твл яе тс якос ыми л учами, что дос тигае тс я с помощ ь ю конденс орате много пол я, вс тавл яе мого намес то обычного. В объ е ктив попадае т с ве т, отраже нный от объ е кта. Ул ь трамикрос копиче с кие объ е кты (разме ром ме нь ш е 0,2 мкм), не видимые при ме тоде с ве тл ого по-

16

л я, можно увиде ть как с ве тящ ие с я нате мном фоне . М е тод ус пе ш но приме няе тс япри изуче нии живых кл е ток. М ет од ф азов о-кон т р ас т н ой м икр ос коп ии также ш ироко ис пол ь зуе тс ядл янабл ю де ний заживыми не окраш е нными кл е тками. О н ос нован на том, что отде л ь ные учас тки хотя и прозрачной кл е тки, могут отл ичать с я друг от друга по пл относ ти и по с ве топре л омл е нию . П роходя че ре з них, с ве т изме няе т с вою фазу, однако, такое изме не ние фазы с ве товой вол ны наш гл аз не ул авл ивае т, так как он чувс твите л е н тол ь ко к изме не нию инте нс ивнос ти с ве та. П ос л е дняя завис ит от ве л ичины ампл итуды с ве товой вол ны. Д л я пол уче ния изображе ния объ е кта в объ е ктив фазовоконтрас тного микрос копа вмонтирована с пе циал ь ная пл ас тинка, которая фазовые изме не ния пре образуе т в ампл итудные . В ре зул ь тате проис ходит с ме щ ение фаз, приводящ е е к изме не нию яркос ти и контрас тнос ти изображе ния. О бъ е кты и их де тал и, не видимые в микрос копе при обычном проходящ е м с ве те , с тановятс явидимыми. П ри изуче нии живых кл е ток ш ироко ис пол ь зую т фл уоре с цирую щ ие крас ите л и (фл ю орохромы) и м ет од ф л уор ес цен т н ой м икр ос коп ии. Суть е го закл ю чае тс яв том, что це л ый ряд ве щ е с тв обл адае т с пос обнос ть ю с ве тить с я (фл уоре с цировать , л ю мине с цировать ) при ос ве щ е нии не видимыми коротковол новыми л учами (ул ь трафиол е та, ре нтге новс кими и др.). Э тот принцип ис пол ь зую т во фл уоре с це нтной микрос копии: рас с матривание фл уоре с цирую щ их объ е ктов в зоне коротких дл ин вол н. О бычно в таких микрос копах приме няю тс я фил ь тры, даю щ ие ос ве щ е ние в с ине фиол е товой обл ас ти. В пос л е дне е вре мя дл я изуче ния живых кл е ток ил и их компоне нтов начинае т ш ироко приме нять с яс оче тание с ве товой микрос копии (ос обе нно фазово-контрас тной ) с элект ро н н о -ко мпь ют ерн о й о бра бо т ко й и зо бра ж ен и я. П риме не ние таких с ис те м не тол ь ко заме няе т кино- и фотос ъ е мку, вме с то которой ис пол ь зуе тс я цифровая виде озапис ь , но и позвол яе т проводить компь ю те рную обработку изображе ния: с ве де ния о пл относ ти с труктур, их параметрах, чис л е и тре хме рной организации. Э л ект р он н ая м икр ос коп ия. Создание эл е ктронных микрос копов с вязано с открытие м эл е ктронов и изуче ние м с вой с тв и явл е ний , которые име ю т ме с то при их движе нии. Е щ е в 1924 году был о изве с тно, что эл е ктронам прис ущ и вол новые с вой с тваи что дл инавол ны эл е ктронаобратно пропорционал ь на е го с корос ти (Л . де Брой л ). В 1926 году Г. Буш с оздал пе рвую магнитную л инзу и ус тановил , что эл е ктронный л уч можно фокус ировать , пропус кая че ре з магнитное пол е . Э ти двас вой с тваэл е ктронного л уча пос л ужил и ос новой дл я с оздания в апре л е 1931 года не ме цким уче ным М . Кнол е м и Э . Р ус ка пе рвого эл е ктронного микрос копа. В наш ей с тране пе рвый эл е ктронный микрос коп был с оздан в 1940 году в Гос ударс тве нном оптиче с ком инс титуте в л аборатории А .А . Л е бе де ва. В нас тоящ е е вре мявыпус ком Э М в СН Г занимае тс яСумс кое П О “Э л е ктрон” (Ук – раина).

17

Т ип ы э л ект р он н ы х м икр ос коп ов . О бычно, когда ре чь иде т об эл е ктронном микрос копе (Э М ), то имею т в виду микрос коп прос ве чиваю щ е го типа, в котором пучок эл е ктронов проходит че ре з ис с л е дуе мый образе ц. П оздне е был и с конс труированы другие типы эл е ктронных микрос копов: с канирую щ ие , выс оковол ь тные , низковол ь тные и др. Р ас с мотрим бол е е де тал ь но ус трой с тво и принцип работы эл е ктронного микрос копапрос ве чиваю щ е го типа(транс мис с ионный Э М ), так как он явл яе тс я одним из с амых рас прос тране нных и обл адае т наивыс ш е й разре ш аю щ е й с пос обнос ть ю . Ус т р ойс т в о и п р ин цип р абот ы эл ект р он н ого м икр ос коп а п р ос в еч ив аю щ его т ип а. В конс трукции л ю бого эл е ктронного микрос копа можно выде л ить 3 ос новные с ис те мы: 1) эл е ктронно-оптиче с кую ; 2) вакуумную ; 3) эл е ктропитания(рис унок 3 и 4). Э л е ктронно-оптиче с кая с ис те ма, ил и кол онна Э М , явл яе тс я ос новной и с л ужит дл я пол уче нияуве л иче нных изображе ний объ е кта. Д виже ние эл е ктронов ос ущ е с твл яе тс яв вакууме . В акуумнаяс ис те ма обе с пе чивае т с оздания выс окого вакуума в двухме тровой кол онне , чтобы поток эл е ктронов не рас с е ивал с яот возде й с твиямол е кул воздуха. Сис те маэл е ктропитанияобе с пе чивае т работу вс е х с ис те м Э М . О с новное отл ичие Э М от с ве тового закл ю чае тс я в том, что в не м вме с то с ве та(потокафотонов) ис пол ь зуе тс я поток эл е ктронов (дл инавол ны которых приме рно равна1Å = 0,1 нм), арол ь с те кл янных л инз выпол няю т эл е ктромагнитные пол я. П ри уве л иче нии напряже ния дл ина вол ны эл е ктрона уме нь ш ае тс я. Так, эл е ктроны, ус коре нные напряже ние м 100 вол ь т, име ю т дл ину вол ны 1,23 Å , при 50000 вол ь т – вс е го 0,05 Å (т.е приме рно в 100000 раз ме нь ш е , че м у видимого с ве та). П оэтому, ис пол ь зуя эл е ктроны, име ю щ ие короткую дл ину вол ны, можно ре зко повыш ать разре ш аю щ ую с пос обнос ть Э М . Р ас с тояние ме жду 2 атомами в мол е кул е окол о 1 Å , с л е довате л ь но, при ис с л е довании кл е тки на мол е кул ярном уровне можно ис пол ь зовать тол ь ко Э М , ане с ве товые микрос копы в с ил у не дос таточной разре ш аю щ е й с пос обнос ти пос л е дних. Ул ь тратонкие с ре зы рас с матриваю тс я в проходящ е м пучке эл е ктронов, но вме с то гл аза эл е ктроны попадаю т на л ю мине с цирую щ ий экран (пос кол ь ку гл аз че л ове кане ре агируе т наэл е ктроны) ил и нафотопл ас тинку (дл я пол уче ния с нимка). С помощ ь ю эл е ктронного микрос копа можно пол учить уве л иче ние до 500 - 800 тыс раз. Р азре ш е ние с овре ме нного эл е ктронного микрос копа с ос тавл яе т 0,1 нм (1Å ), т.е . може т повыс ить по отнош е нию к не вооруже нному гл азу че л ове каразре ш аю щ ую с пос обнос ть в 106 раз. П ол е зное (рабоче е ) уве л иче ние Э М с ос тавл яе т 0,2-0,3 нм (2-3Å ). Э то позвол яе т изучать с труктуру объ е ктов нас убкл е точном и макромол е кул ярном уровне . В ыс окая разре ш аю щ ая с пос обнос ть эл е ктронного микрос копа дал а возможнос ть изучить ул ь трас труктурную (с убкл е точную ) организацию ,

18

Р ис унок 3. В не ш ний вид с овре ме нного прос ве чиваю щ е го эл е ктронного микрос копа

Р ис унок 4. Схе матиче с кое изображе ние кол онны прос ве чиваю щ е го эл е ктронного микрос копа: 1- воздуховоз к вакуумному нас ос у; 2- вакуумная трубка; 3- питание нити накал а катода; 4- нить (катод); 5- анод; 6- зазе мл е ние ; 7- эл е ктронный л уч (ход эл е ктронных л уче й изображе н в виде пре рывис той л инии); 8конде нс орная л инза; 9- объ е кт; 10 — объ е ктивная л инза; 11- уве л иче нное изображе ние объ е кта; 12- прое кционная л инза; 13- л ю мине с це нтный экран; 14- фотографиче с кая пл ас тинка; 15- подводка к ис точнику питаниял инз.

т.е . открыть и изучить те с труктуры кл е тки, которые л е жат за пре де л ами разре ш аю щ е й с пос обнос ти с ве тового микрос копа. В понятие “ул ь трас труктура” входят как де тал и с трое ниякл е точных органе л л (ядер, пл ас тид, митохондрий ), которые видны в с ве товой микрос коп, так и це л ые органе л л ы (рибос омы, Э П Р и др.) и их с ос тавные час ти (граны, тил акоиды пл ас тид, крис ты митохондрий , разл ичные ме мбраны), видимые тол ь ко в эл е ктронный микрос коп. При н ци п ра бо т ы ЭМ . И с точник изл уче ния – вол ь фрамовая нить Vобразной формы (катод) под де й с твие м проходящ е го токас ил ь но нагре вае тс я и ис пус кае т обл ачко эл е ктронов. М е жду пол ю с ами (катодом и ано-

19

дом) с оздае тс я оче нь выс окое напряже ние (от 50 тыс вол ь т и выш е ), что с л ужит причиной ус коре ния эл е ктронов и с оздания из обл ачканаправл е нного и оче нь мощ ного их потока. Биол огиче с кий объ е кт (с пе циал ь ным образом подготовл е нный ) поме щ ае тс я на пути движе ния эл е ктронов. Э л е ктронный л уч проходит че ре з объ е кт, азате м че ре з с ис те му эл е ктромагнитных л инз, функция которых – с оздать изображение и с корре ктировать е го (фокус ировать пучок эл е ктронов), чтобы оно не откл онял ос ь , апопал о на экран. Э л е ктроны, попадаянаобъ е кт, взаимоде й с твую т с ним (откл оняю тс я, рас с е иваю тс я, погл ощ аю тс я ил и проходят бе з изме не ния). В низу кол онны рас пол оже н экран, покрытый л ю минес центным ве щ е с твом, с ве тящ имс я при попадании нане го эл е ктронов. Когдаэл е ктроны ударяю тс я об экран, пол учаю тс я с ве тящ ие с я точки, атам, где они рас с е яны, формируе тс я изображе ние . В ме с то л ю минис це нтного экрана изображе ние можно с фокус ировать на фотопл ас тинку и пол учить с нимок, а также выве с ти с помощ ь ю цифровой каме ры наэкран монитора. Пр ин цип ы изгот ов л ен ия п р еп ар ат ов дл я э л ект р он н ого м икр ос коп а п р ос в ецив аю щ его т ип а. С помощ ь ю прос ве чиваю щ е го эл е ктронного микрос копаможно изучать тол ь ко фи кси ро ва н н ые кл е тки. Кроме того, мате риал дл я эл е ктронной микрос копии дол же н име ть такие с вой с тва, которые позвол ил и бы изготовить из не го с ре зы намного бол е е тонкие , че м приме няе мые в с ве товой микрос копии (уль т ра т о н ки е срезы тол щ иной до 0,1 мкм). В ме с те с те м дол жны быть ис кл ю че ны возможные ме ханиче с кие повре жде ния и де формации мате риал а. Д л я взятия кус очкаткани не обходимо ис пол ь зовать ножи выс ш е го каче с тва (с те кл янные , ал мазные ), т. к. при этом ме ханиче с кие повре жде ниябудут с ве де ны к минимуму. Р ас с мотрим общ ие принципы и ос новные этапы изготовл е ния пре паратов дл я эл е ктронного микрос копа. П роце дура их изготовл е ния в принципе с ходна с той , что ис пол ь зуе тс я в с ве товой микрос копии, хотя име ю тс яи с ущ е с тве нные разл ичия. 1. Ф икс ация мате риал а. Ж ивую ткань пос л е изме л ь че ния накус очки до 1 мм 3 с начал а обрабатываю т глют а ро в ым а ль деги до м, который оче нь быс тро проникае т и фикс ируе т ткань , не ис кажаяприжизне нной с труктуры кл е ток. Зате м проводитс я допол ните л ь ная фикс ация рас твором че тыре хокис и о сми я ( OS O4 ). П риче м, ос мий (как тяже л ый ме тал л ) де й с твуе т не тол ь ко как фикс атор, но и как ве щ е с тво, контрас тирую щ е е кл е точные с труктуры (ос ущ е с твл яе т пре дварите л ь ное окраш ивание ). 2. П ос те пе нное обе звоживание (дл яизбе жанияс морщ ивания) зафикс ированного мате риал а в с пиртах возрас таю щ е й конце нтрации, вкл ю чая абс ол ю тный (100%) с пирт, зате м пропитывание мате риал а100% аце тоном - рас творите л е м эпокс идной с мол ы (пос кол ь ку эпокс идная с мол а хуже с ме ш ивае тс яс о с пиртом). 3. Зал ивка мате риал а в эпо кси дн ые смо лы (ил и другие пл ас тики) и пол име ризации бл оков. Д л язал ивки мате риал аис пол ь зуе тс яне парафин, а чащ е вс е го эпокс идные с мол ы. Бл оки, пол уче нные из них, бол е е тве рдые ,

20

однородные и эл ас тичные , позвол яю т пол учить оче нь тонкие с ре зы, которые не рас пл авл яю тс я(не рвутс я) под де й с твие м пучкаэл е ктронов. 4. И зготовл е ние уль т ра т о н ки х срезо в . Д л я того чтобы эл е ктронный л уч прош е л че ре з с ре з ткани, тол щ инас ре зане дол жнапре выш ать 1000 Å (100 нм = 0,1 мкм, против 5-10 мкм дл я парафиновых с ре зов, пре дназначе нных дл я прос мотра с помощ ь ю с ве тового микрос копа). Такие с ре зы можно пол учить тол ь ко науль т ра ми кро т о ме, с ое дине нным с бинокул ярной л упой , что позвол яе т набл ю дать запроце с с ом ре зания. Д л я ре зки ис пол ь зую т пре имущ е с тве нно с те кл янные ножи (с кол ы с те кл а), что с вязано с е го тве рдос ть ю и хрупкос ть ю (рис унок 5). Сте кл янные ножи обл адаю т иде ал ь но ос трой , бе з зазубрин ре жущ е й пове рхнос ть ю . Н о они не дол гове чны и ис пол ь зую тс я тол ь ко один раз. Р е же приме няю т ал мазные ножи, которые могут с л ужить в те че ние не с кол ь ких л е т. Р ис унок 5. Схе ма изготовл е ния и ис пол ь зования с те кл янного ножа дл я ул ь трамикротомии (Ч е нцов, 2004): 1 - на с те кл е де л ае тс я нас е чка; 2 - пос л е разл ома образуе тс я ре жущ ая кромка (показано с тре л кой ); 3 проце с с ре зки мате риал а (а), закл ю че нного в эпокс идную с мол у (б): образую щ ие с я с ре зы (в) попадаю т напове рхнос ть жидкос ти над ре жущ им ножом (г).

5. О краш ивание с ре зов. О бразую щ ие с я с ре зы (л е нту с ре зов) поме щ аю т нас пе циал ь ную ме л кояче ис тую ме тал л иче с кую с е тку (ане нас текл о), азате м окраш иваю т с ол ями тяже л ых ме тал л ов (с винца, урана). И оны тяже л ых ме тал л ов вс траиваю тс я во вс е ме мбранные с труктуры кл е тки, ус ил иваяи выде л яяих контуры. 6. П рос мотр ул ь тратонких с ре зов с помощ ь ю эл е ктронного микрос копа. Те хника изготовл е ния ул ь тратонких с ре зов открыл а огромные возможнос ти дл я приме не ния эл е ктронной микрос копии буквал ь но во вс ех обл ас тях биол огии и ме дицины. М ет оды кр иоул ьт р ам икр от ом ии. В пос л е дние годы вс е бол ь ш е е приме не ние пол учаю т ме тоды приготовл е ния ул ь тратонких с ре зов бе з фикс ации и зал ивки кл е ток в тве рдые пл ас тмас с ы. К ним относ ятс яме тоды кри о уль т ра ми кро т о ми и , т.е . пол уче ние с ре зов с замороже нных ткане й , моме нтал ь но охл ажде нных до те мпе ратуры жидкого азота(-196 °С). М ет од зам ор аж ив ан ия-с кал ы в ан ия ис пол ь зуе тс я дл я изуче ния с труктуры разл ичных ме мбранных компоне нтов кл е тки. О н закл ю чае тс я в том, что объ е кт с начал абыс тро замораживаю т жидким азотом, азате м при той же те мпе ратуре пе ре нос ят в с пе циал ь ную вакуумную ус тановку. Там

21

замороже нный объ е кт ме ханиче с ким с пос обом с кал ывае тс я охл ажде нным ножом. П ри этом обнажаю тс я внутре нние зоны замороже нных кл е ток. В вакууме час ть воды, пе ре ш е дш е й в с те кл овидную форму, возгоняе тс я («травл е ние »), а пове рхнос ть с кол а пос л е довате л ь но покрывае тс я тонким с л ое м ис паре нного угл е рода, а зате м ме тал л а. Таким образом с замороже нного и с охраняю щ е го прижизне нную с труктуру мате риал а пол учаю т ре пл ику с е го с кол а(рис унок 6). Зате м уже в ус л овиях комнатной те мпе ратуры ткань ил и кл е тки рас творяю т в кис л отах, но пл е нка-ре пл икапри этом ос тае тс яце л а, ее изучаю т в эл е ктронном микрос копе . Р ис унок 6. Схе ма ме тода замораживания-с кал ывания: а - с кал ывание замороже нного объ е кта; б— напыл е ние с л оя ме тал л аи угл е родана пове рхнос ть с кол а; в — рас творе ние объ е кта и пол уче ние ре пл ики с пове рхнос ти с кол аобъ е кта. 1— нож.

Др угиет ип ы э л ект р он н ы х м икр ос коп ов . В ы с оков ол ьт н ы й (м егав ол ьт н ы й) эл ект р он н ы й м икр ос коп . П роникаю щ ая с пос обнос ть эл е ктронов уве л ичивае тс я в ре зул ь тате уве л иче ния их с корос ти под де й с твие м оче нь выс окого напряже ния. (от 1 до 3 мл н вол ь т). Сконс труированные на этой ос нове приборы явл яю тс я оче нь крупногабаритными и дорогос тоящ ими, что с де рживае т их ш ирокое приме не ние . П ре имущ е с тво выс оковол ь тных эл е ктронных микрос копов с ос тоит не в том, что наних можно пол учить бол е е выс окое разре ш е ние (при бол е е короткой дл ине вол ны эл е ктронов), ав том, что при выс окой эне ргии эл е ктронов, которые ме нь ш е погл ощ аю тс я объ е ктом, можно прос матривать образцы бол ь ш ой тол щ ины (1-10 мкм против 0,1 мкм обычным эл е ктронным микрос копом). Д опол ните л ь ное ис пол ь зование с те ре ос копиче с кой с ъ е мки позвол яе т пол учить информацию о тре хме рной организации внутрикл е точных с труктур с выс оким их разре ш е ние м (окол о 0,5 нм). С кан ир ую щ ий (р ас т р ов ы й) э л ект р он н ы й м икр ос коп . Как с ве товой , так и эл е ктронный транс мис с ионный микрос коп даю т двуме рное (пл ос кое ) изображе ние . Сканирую щ ий эл е ктронный микрос коп позвол яе т изучать тре хме рную (объ е мную ) картину пове рхнос ти кл е тки. П ри с канирую щ е й эл е ктронной микрос копии пучок эл е ктронов отражае тс яот образца, а не проникае т че ре з не го. С помощ ь ю данного ме тода изучаю т пове рхнос ть объ е кта (наприме р, пове рхнос ть пыл ь це вых зе ре н). Ф икс ированный и с пе циал ь ным образом выс уш е нный объ е кт покрывае тс я тонким с л ое м ис паре нного ме тал л а(зол ота, пл атины, ал ю миния), отражаяс ь от которого эл е ктроны попадаю т в прие мное ус трой с тво, пе ре даю щ е е с игнал на

22

эл е ктронно-л уче вую трубку. Р азре ш аю щ ая с пос обнос ть этого типа приборов не с кол ь ко ниже , че м у прос ве чиваю щ их эл е ктронных микрос копов, но уже с е й час выпус каю тс яприборы с разре ш е ние м 3-5 нм. М ат ери алы и оборудован и е. Э л е ктронный микрос коп, ул ь трамикротом, с те кл янные ножи, готовые бл оки, с хе мы, микрофотографии. Х о д ра бо т ы. Задан ие 1. О знакомить с я с типами, ус трой с твом и принципом работы эл е ктронного микрос копа. Задан ие 2. Н арис овать с хе му кол онны прос ве чиваю щ е го эл е ктронного микрос копа. Задан ие 3. Указать (запол нив табл ицу) принципиал ь ные отл ичия эл е ктронного микрос копа от с ве тового. Сравне ние прове с ти по с л е дую щ им показате л ям: ис точник изл уче ния, ис пол ь зуе мые л инзы, разре ш аю щ аяс пос обнос ть , возможнос ти микрос копадл яизуче ниякл е тки. Сравнивае мые признаки

Све товой микрос коп

Э л е ктронный микрос коп

Задан ие4. О знакомить с я с принципами и ос новными этапами изготовл е ния ул ь тратонких с ре зов дл я эл е ктронного микрос копа прос ве чиваю щ е го типа. Запис ать в те традь пос л е довате л ь нос ть изготовл е ния пре паратов. Указать принципиал ь ные отл ичияизготовл е ния микропре паратов дл я с ве товой и эл е ктронной микрос копии. Д анные зане с ти в табл ицу. Сравне ние прове с ти по с л е дую щ им показате л ям: фикс аторы, ос обе ннос ти проводки, зал ивочный мате риал , ножи, тол щ инас ре зов, крас ите л и. Сравнивае мые при- И зготовл е ние микротомных микропре паратов дл я знаки с ве товой микрос копии эл е ктронной микрос копии Задан ие5. П ознакомить с я с ус трой с твом и принципом работы ул ь трамикротома. В оп р ос ы дл я с ам оп р ов ер киикон т р ол я: 1. Какова разре ш аю щ ая с пос обнос ть с ве тового микрос копа? Какие ме тоды контрас тирования позвол яю т изучить c помощ ь ю с ве тового микрос копас труктуры разме ром ме нь ш е 0,2 мкм? В че м их с уть ? 2. Каковаразре щ аю щ ая с пос обнос ть эл е ктронного микрос копапрос ве чиваю щ е го типа? О т че го оназавис ит? 3. Каков ос новной принцип работы эл е ктронного микрос копа? 4. П е ре чис л ите и охаракте ризуй те ос новные с ос тавл яю щ ие (с ис те мы) эл е ктронного микрос копа. 5. Н азовите принципиал ь ные отл ичия эл е ктронного микрос копа от с ве тового.

23

6. В каких с л учаях ис пол ь зую т эл е ктронный микрос коп, каковы е го возможнос ти? 7. Э л е ктронная микрос копия прос ве чиваю щ е го и с канирую щ е го типов: в че м разл ичияи в каких с л учаях их приме няю т? 8. Каковы пре имущ е с тва выс оковол ь тного (ме гавол ь тного) эл е ктронного микрос копа? 9. О пиш ите кратко этапы изготовл е ния ул ь тратонких с ре зов дл я эл е ктронного микрос копапрос ве чиваю щ е го типа. В че м принципиал ь ные отл ичия изготовл е ния микропре паратов дл я с ве товой и эл е ктронной микрос копии?. 10. П оче му зал ивку мате риал а, пре дназначе нного дл яизуче нияс помощ ь ю эл е ктронного микрос копа, не л ь зяпроизводить в парафиновые бл оки? Какие крас ите л и ис пол ь зую т дл яокраш иванияул ь тратонких с ре зов? Т ем а 3. УЛ ЬТ РА С Т РУК Т УРН А Я(С УБК Л ЕТ О Ч Н А Я) О РГ А Н И ЗА Ц И ЯК Л ЕТ К И Ц ел ь зан ят ия: 1. О знакомл е ние с ул ь трас труктурной организацие й кл е тки. 2. Знать кл ас с ификацию органе л л , их с труктуру и функционал ь ную значимос ть . 3. Н аучить с я иде нтифицировать органе л л ы наэл е ктронно-микрос копиче с ких фотографиях. 4. Зарис овать с труктуру органе л л , пре дс тавл е нных наэл е ктронно-микрос копиче с ких фотографиях и с хе мах. О с н овн ы е т еорет и чес ки е полож ен и я. Кл е тки животных и рас те ний (как однокл е точных, так и многокл е точных) в принципе с ходны по с вое му с трое нию . О с новными эл е ме нтами кл е тки явл яю тс я ядро, цитопл азма и с ве рху – пове рхнос тный аппарат кл е тки, куда входит цитопл азматиче с кая ме мбрана - пл азмал е мма (отде л яю щ аяцитопл азму от вне ш не й с ре ды), атакже надме мбранные образования: кл е точная обол очка (у рас те ний ) ил и гл икокал икс и кортикал ь ный с л ой (у животных). Ц итопл азмас ос тоит из гиал опл азмы и находящ ихс я в не й органе л л и вкл ю че ний . Орга н еллы (о рга н о и ды) – обязате л ь ные дл я л ю бой эукариотиче с кой кл е тки компоне нты, бе з которых кл е ткане може т подде рживать с вое с ущ е с твование . О ргане л л ы разде л яю т на две группы – мембра н н ые (образованные ме мбранами) и н емембра н н ые. Кл е точные ме мбраны ограничиваю т с оде ржимое кл е тки от вне ш не й с ре ды, образую т с те нки ме мбранных органоидов и обол очку ядра. В с е кл е точные ме мбраны пос трое ны по общ е му принципу: это тонкие л ипопроте идные пл е нки, с ос тоящ ие из бил ипидного с л оя, в который вкл ю че ны мол е кул ы бе л ка. М ембра н н ые органе л л ы пре дс тавл е ны двумя типами – о дн о мембра н н ыми и дв умембра н н ыми . К о дн о мембра н н ым относ ятс я органе л л ы вакуол ярной с ис те мы: эндопл азматиче с кий ре тикул ум (Э П Р ), компл е кс Гол ь джи (КГ), л изос омы, пе рокс ис омы и другие с пе циал изированные вакуол и, атакже пл азмал е мма. К дв умембра н н ым органе л л ам относ ятс ями –

24

тохондри и пл ас тиды. К н емембра н н ым органе л л ам принадл е жат рибос омы (макромол е кул ярные час тицы), цитос ке л е т (опорно-двигате л ь ная с ис те ма кл е тки, с ос тоящ ая из с е ти бе л ковых вол окон), а также кл е точный це нтр животных кл еток. С помощ ь ю с ве товой микрос копии можно рас с мотре ть отде л ь ные (крупные ) органе л л ы кл е тки, изучить их форму, подс читать кол иче с тво, однако их де тал ь ное внутре нне е (ул ь трас труктурное ) с трое ние можно изучить тол ь ко с помощ ь ю эл е ктронного микрос копа. Р ас с мотрим ул ь трас труктуру и функцию отде л ь ных мембра н н ых органе л л кл е тки. Э н доп л азм ат ич ес кий р ет икул ум (от л ат reticulum – с е ть ) – ЭП Р, ил и эндопл азматиче с кая с е ть (ЭП С ) – с е тчатая с труктуракл е тки, которая образована ме мбранами. Н а е е дол ю приходитс я бол е е 50% вс ех кл е точных ме мбран. В пе рвые эта одноме мбранная с труктура был а открыта К. П орте ром с с отрудниками в 1945 году при изуче нии фибробл ас тацыпл е нка. В с тре чае тс я практиче с ки у вс е х эукариотиче с ких кл е ток рас те ний и животных. Э то с е те видно разве твл е нная с ис те ма канал ов, трубоче к, цис те рн (пл ос ких ме ш ков), принизываю щ их вс ю гиал опл азму кл е тки в разл ичных направл е ниях и ограниче нных одной мембраной . Д иаме тр канал ов и пузырь ков Э П Р кол е бл е тс я в пре де л ах 10-100 нм. Э П Р не изол ирован от других компоне нтов кл е тки, а с ое дине н с пл азмал е ммой и яде рной ме мбраной , компл е кс ом Гол ь джи. Н е с мотря на то, что ме мбрана Э П Р име е т многочис л е нные с кл адки и изгибы, онаобразуе т не пре рывную с е ть . Ф ун кци я Э ПР – с инте з, накопл е ние и транс порт бе л ков, л ипидов, угл е водов, учас тие в с борке кл е точных ме мбран. Э П Р – это “фабрика” дл я производс твабе л ковых и л ипидных компоне нтов многих органе л л . Р азл ичаю т дватипаЭ П Р : ш еро хо ва т ый (гра н улярн ый, ил и эрга ст о пла зма ) и гла дки й(агранул ярный ). Ш еро хо ва т ый ЭПР . Со с тороны гиал опл азмы ме мбранная с е ть покрытарибос омами, накоторых иде т с инте з бе л ков. Ф ун кци я ш е роховатого Э П Р – с инте з, накопл е ние и транс порт бе л ков; учас тие в с борке ме мбран. Н арибос омах Э П Р с инте зирую тс я вс е ме мбранные бе л ки, а также бе л ки, пре дназначе нные дл я экс порта и не обходимые дл я работы других кл е ток ил и дл я выпол не ния общ е организме нных функций . Ш е роховатый Э П Р ос обе нно хорош о развит в с пе циал изированных (активных в отнош е нии бе л кового с инте за) кл е тках. Н априме р, кл е тки пе че ни с инте зирую т ал ь бумины крови, кл е тки мол очной же л е зы – казе ин, с л ю нной же л е зы – пищ е варите л ь ные фе рме нты амил азу и Р Н Казу. Гла дки й ЭПР – не с оде ржит рибос ом. П ре дс тавл е н ме мбранами, образую щ ими трубки, канал ь цы, которые могут ве твить с я, с л ивать с я друг с другом. Н абл ю дае тс я непре рывный пе ре ход ме жду ш е роховатым и гл адким Э П Р . Так, цис те рна ш е роховатого Э П Р , те ряя на с вое й пове рхнос ти рибос омы, начинае т ве твить с я и пе ре ходит в гл адкий Э П Р . Ф ун кци я гл адкого Э П Р – с инте з л ипидов, угл е водов (который проис ходит с учас тие м фе рме нтов, л окал изованных на ме мбранах), транс порт ве щ е с тв. Гл адкий

25

Э П Р развит в кл е тках, с инте зирую щ их с тероидные гормоны (наприме р, коранадпоче чников). О бавидаЭ П С кл е ток пе че ни учас твую т в проце с с ах де токс икациявре дных ве щ е с тв. К ом п л екс (ап п ар ат ) Г ол ьдж и – КГ (А Г) – одноме мбранная органе л л а. В ыявл яе тс яс помощ ь ю с ве тового микрос копав животных кл е тках в виде с л ожной с е ти, рас пол оже нной вокруг ядра (с е тчатый компл е кс ). В пе рвые опис ан К. Гол ь джи в 1898 году в не рвных животных кл е тках. В рас тите л ь ных кл е тках был обнаруже н с помощ ь ю выс оковол ь тного эл е ктронного микрос копаБю ваи П орте ром в 1957 году. КГ пре дс тавл е н с овокупнос ть ю ди кт и о со м с е рповидной ил и пал очковидной формы. Д иктиос ома = с е тчатое те л о (от гре ч. dictyon – с е ть и soma – те л о). Д е тал ь ное с трое ние КГ удал ос ь изучить тол ь ко с помощ ь ю эл е ктронного микрос копа. КГ пре дс тавл яе т с обой с топку пл отно ул оже нных пл ос ких цис те рн (диктиос ому) с рас ш ире ниями наконцах. О т них отщ е пл яе тс я мас с аме л ких пузырь ков, которые , с л иваяс ь , образую т с е кре торные вакуол и, что ос обе нно характе рно дл яс е кре тирую щ их кл е ток (рис унок 7). О тде л ь ная Р ис унок 7. Схе ма с трое ния диктиос омы (Ч е нцов, 2004): П - прокс имал ь ная (цис -час ть ); Д – дис тал ь ная (транс -час ть ); В – вакуол и; Ц – пл ос кие ме мбранные цис те рны; А – ампул ярные рас ш ире нияцис те рн.

цис те рна запол не на с е кре том и име е т диаме тр окол о 1 мкм. Р ас с тояние ме жду цис те рнами в с топке 20-25 нм. Каждаядиктиос омас оде ржит от 4 до 10 цис те рн. Д л я КГ характе рно нал ичие с труктурной и биохимиче с кой пол ярнос ти. Р азл ичаю т выпукл ую (цис -час ть , ил и прокс имал ь ную час ть ) и вогнутую (транс -час ть , ил и дис тал ь ную час ть ). В цис -час ти (формирую щ е мс я учас тке ) возникаю т новые цис те рны, проис ходит с инте з гормонов, пол ис ахаридов и др. Ц ис -учас ток находитс я в те с ном контакте с Э П Р . В транс -час ти (с е кре тирую щ е м, зре л ом учас ток) проис ходит фрагме нтация цис те рн и образование пузырь ков и вакуол е й (упаковка и выне с е ние из кл е тки готового продукта). Н абл ю дае тс я пос те пе нное пе ре ме щ ение цис те рн от цис -учас ткак транс -учас тку. О тде л ивш ие с я от транс -учас ткас е кре торные вакуол и, начинаю т двигать с я к пове рхнос ти кл е тки и выводятс я из не е с помощ ь ю экзоцитоза. П узырь ки, с оде ржащ ие гидрол итиче с кие фе рме нты, с тановятс я л изос омами. Д виже ние вакуол е й ос ущ е с твл яе тс я компоне нтами цитос ке л е такл е тки. КГ наибол е е выраже н в зре л ой , активно функционирую щ е й кл е тке , апри е е с таре нии он пос те пе нно атрофируе тс я. У не активных диктиос ом пол ярнос ть (цис -транс ) час то не выраже на. Ф ун кци и КГ: 1) гл авная функция – с е кре торная. Зде с ь проис ходит химиче с кая пе ре работка(модификация) и накопл е ние продуктов, с инте зированных в Э П Р , выве де ние с е кре та(упаковкав пузырь ки); 2) с инте з ве -

26

щ е с тв, в том чис л е не которых пол ис ахаридов (угл е водов), наприме р, матрикс акл е точной с те нки: ге мице л л ю л озы и пе ктиновых ве щ е с тв; 3) с борка и рос т кл е точных ме мбран. П ри этом проис ходит образование компл е кс а бе л ков и угл е водов (гл икопроте ины), бе л ков и л ипидов (л ипопроте ины); 4) образование л изос ом. Л изос ом ы (от гре ч. л ице о – рас творяю , с ома– те л о). Э то органе л л а кл е ток животных, рас те ний и грибов, пре дс тавл яю щ ая с обой ме л кие вакуол и разме ром 0,3-1,5 мкм, ограниче нные одной ме мбраной , с одержащ ие набор гидрол итиче с ких фе рме нтов (окол о 40): проте азы, нукл е азы, гл икозидазы, л ипазы и другие . О с новная фун кци я л изос ом – ос ущ е с твл е ние внутрикл е точного пе ре варивания макромол е кул (рас щ е пл е ние бе л ков, жиров, нукл е иновых кис л от, угл е водов), а также це л ых с труктур (органе л л , микробных час тиц и др.). Кол иче с тво гидрол аз в л изос омах так ве л ико, что при ос вобожде нии они с пос обны разруш ить вс ю кл е тку – “органе л л ы с амоубий с тва”. Л изос омы был и открыты биохимиками (Д е Д ю в с с отрудниками) в 1955 году ме тодом диффе ре нцированного це нтрифугирования при изуче нии кл е ток пе че ни крыс ы. Л изос омы образую тс яв КГ. Л изос омы – ге те роге нные органе л л ы. Р азл ичаю т 4 типа л изос ом. 1. Перви ч н ые ли зо со мы – ме л кие ме мбранные пузырь ки (окол о 0,1 мкм), запол не нные однородным с труктурным ве щ е с твом, с оде ржащ им активную кис л ую фос фатазу – марке рный дл я л изос ом фе рме нт. 2. В т о ри ч н ые ли зо со мы (эн до ли зо со мы) – образую тс я в ре зул ь тате с л ияния пе рвичных л изос ом с эндос омой . 3. Т ело ли зо со мы (о ст а т о ч н ые т ель ца ) образую тс я в с л учае не пол ного рас щ е пл е ния макромол е кул внутри л изос ом, в ре зул ь тате че го в них проис ходит накопл е ние и упл отне ние не пе ре варе нных продуктов. О с таточные те л ь цал ибо выводятс я, л ибо накапл иваю тс я, что указывае т нас таре ние кл е тки. 4. А ут о ли зо со мы (ил и а ут о фа го со мы, ил и а в т о фа ги рующа я ва куо ль ) – пос тоянно вс тре чаю тс я в кл е тках рас те ний и животных. О бразую тс я в ре зул ь тате выс траивания пе рвичных л изос ом вокруг кл е точной органе л л ы и с л иянияих друг с другом. В их с ос таве вс тре чаю тс я фрагме нты ил и даже це л ые цитопл азматиче с кие с труктуры, такие как митохондрии, пл ас тиды, эл е менты Э П Р , рибос омы и др. В этом с л учае они выпол няю т рол ь внутрикл е точных чис тил ь щ иков (с анитаров). У че л ове ка с ущ е с твуе т ряд врожде нных забол е ваний (ге не тиче с ких забол е ваний - бол е знь П омпе , бол е знь Гош е и др.), которые называю т л изос омными “бол е знями накопл е ния”, возникнове ние которых с вязано с мутацие й с оотве тс твую щ е го ге на, приводящ е й к де фициту ил и поте ре активнос ти отде л ь ных фе рме нтов л изос ом. И х отл ичите л ь наяче рта- множе с тво вакуол е й в кл е тке , видимых под с ве товым микрос копом. Дв ум ем бр ан н ы екл е точные органе л л ы – ми т о хо н дри и и пла ст и ды. М итохондрии и пл ас тиды име ю т це л ый ряд о бщи х че рт. 1. Гл авная фун кци я митохондрий и пл ас тид – эне ргообе с пе че ние кл е ток: с инте з униве рс ал ь ного ис точникаэне ргии А ТФ (аде нозинтрифос фата), не обходимого дл я ос ущ е с твл е ния проце с с ов жизне де яте л ь нос ти кл е ток и це л ого организма. Э то эне рге тиче с кие с танции кл е тки. У митохондрий с инте з А ТФ

27

ос ущ е с твл яе тс язас че т эне ргии, дос тавл яе мой дыхание м, ау хл оропл ас тов – зас че т эне ргии с ве та(работаю т на“с ол не чных батаре ях”). В хл оропл ас тах рас те ний , кроме этого, проис ходит важне й ш ий биол огиче с кий проце с с – фотос инте з (с вязывание угл е кис л оты, выде л е нию кис л ородаи с инте з с инте з угл е водов). 2. О т гиал опл азмы они отде л е ны дв умя ме мбранами – вне ш не й и внутре нне й . У них разл ичаю т две пол ос ти: ме жме мбранную (ме жду внутре нне й и вне ш не й ме мбранами) и ос новную (матрикс у митохондрий ил и с трому у хл оропл ас тов), ограниче нную внутре нне й ме мбраной . 3. В н ут рен н яя мембра н а о бра зует скла дки , гл убокие впячивания, гре бни, направл е нные внутрь матрикс а(ил и с тромы) – крис ты (у митохондрий ) и тил акоидную с ис те му (у хл оропл ас тов). Н аних л окал изую тс я пол ифе рме нтные компл е кс ы, катал изирую щ ие внутрикл е точные ре акции, опре де л яю щ ие выпол нение ос новных физиол огиче с ких функций . М ногочис л е нные с кл адки внутре нне й ме мбраны уве л ичиваю т общ ую пове рхнос ть ме мбраны. Д л я выпол не ния органе л л ами с пе цифиче с ких функций ме мбранные с кл адки дол жны быть це л ос тными. Так, е с л и наруш е натил акоиднаяс ис те ма, не проис ходит проце с с фотос инте за(пигме нт хл орофил л , учас твую щ ий в фотос инте зе , рас пол агае тс я на ме мбранах тил акоидов). 4. М итохондрии и пл ас тиды име ю т с обс тве нный ген ет и ч ески й ма т ери а л (Д Н К) и бе л окс инте зирую щ ий аппарат (Р Н К, рибос омы, фе рме нты), что с тавит их в пол оже ние относ ите л ь ной не завис имос ти от ядраи позвол яе т ос ущ е с твл ять с инте з с обс тве нных бе л ков. В то же вре мяэто по луа в т о н о мн ые с труктуры, имею щ ие “с ме ш анное ” хозяй с тво. О ни с пос обные с инте зировать тол ь ко час ть с обс тве нных бе л ков. Так, на рибос омах митохондрий образуе тс я окол о 5% от вс е х бе л ков, входящ их в е е с ос тав. Бол ь ш ая же час ть бе л ков этих органоидов находитс я под ге не тиче с ким контрол е м кл е точного ядра, с инте зируе тс янарибос омах в цитопл азме кл е тки, азате м транс портируе тс я в митохондии и пл ас тиды. П риче м, в отл ичие от яде рной , Д Н К митохондрий и пл ас тид не с вязанас гис тонами. В тоже вре мя ме жду митохондриями и пл ас тидами име ю тс яс ущ е с тве нные ра зли ч и я. М ит ох он др ии, ил и х он др иос ом а (от гре ч. mitos – нить , chondrion – зе рно, soma – те л о). Э то гранул ярные ил и ните видные органе л л ы эукариотиче с кой кл е тки, прис утс твую щ ие в гиал опл азме прос те й ш их, рас те ний , животных и грибов. О ни могут быть нас тол ь ко ве л ики, что их можно увиде ть в обычный с ве товой микрос коп. М итохондрии был и впе рвые обнаруже ны в 1882 году В . Ф л е ммингом и в 1894 году Р . А л ь таманом в кл е тках животных. Р . А л ь тман их называл «биобл ас тами». Те рмин “митохондрии” был пре дл оже н К. Бе ндав 1897 г., подробно опис авш им эти с труктуры. У рас те ний митохондрии был и впе рвые обнаруже ны Ф . М е ве с ом в 1904 году в тапе тал ь ных кл е тках пыл ь ников кувш инки. Р азме ры митохондрий , как и их форма, оче нь не пос тоянны у разных видов. В с тре чаю тс я митохондрии ш аровидной , цил индриче с кой , почковидной , ните видной , атакже с ил ь но разве твл е нной формы. Д аже в одной кл е тке они могут быть не одинаковы. У бол ь ш инс твакл е ток тол щ инаэтих

28

с труктур относ ите л ь но пос тоянна (окол о 0,5 мкм), а дл ина кол е бл е тс я, дос тигаяу нитчатых форм до 7- 60 мкм. Кол иче с тво митохондрий в кл е тке кол е бл е тс я от не с кол ь ких ш тук до дес ятков тыс яч. Так, кл е тки не которых водорос л е й с оде ржат по одной митохондрии, с пе рматозоиды разл ичных видов животных – от 20 до 72. В кл е тках пе че ни их окол о 200. Бол ь ш е вс е го их у гигантс кой аме бы Chaos chaos (до 500 тыс .). П родол жите л ь нос ть жизни митохондрий не ве л ика: в кл е тках пе че ни – 9-10 дне й , поче к – 12 дне й . Уве л иче ние чис л а митохондрий проис ходит путе м бинарного де л е ния (т.е . как у бакте рии путе м образования пе ре тяжки) с ущ е с твую щ их в кл е тке митохондрий . Ч ис л о митохондрий уве л ичивае тс я при де л е нии кл е тки ил и при уве л иче нии е е функционал ь ной нагрузки. Кроме того, митохондрии могут с л ивать с я друг с другом. В кл е тках зе л е ных рас те ний чис л о митохондрий ме нь ш е , че м в кл е тках животных, так как их функцию могут выпол нять хл оропл ас ты. О бычно митохондрии с капл иваю тс явбл изи те х учас тков цитопл азмы, где возникае т потре бнос ть в А ТФ . Совокупнос ть вс е х митохондрий в одной кл е тке называе тс яхо н дри о мо м. Н е завис имо от ве л ичины ил и формы митохондрии име ю т униве рс ал ь ное с трое ние , их ул ь трас труктураоднообразна(рис унок 8). М итохондрии ограниче ны двумяме мбранами. Н аружнаяме мбранаотде л яе т е е Р ис унок 8. Схе ма с трое ния митохондрии: А - продол ь ный с ре з; Б- с хе ма тре хме рной с труктуры митохондрии; 1- Н аружная ме мбрана, 2- внутре нняя ме мбрана, 3матрикс , 4- ме жме мбранное прос транс тво, 5- гранул а, 6- Д Н К, 7рибос ома.

от гиал опл азмы. О бычно онаиме е т ровные контуры, не образуе т впячиваний ил и с кл адок. Н ане е приходитс яокол о 7% от пл ощ ади вс е х кл е точных ме мбран. Тол щ инаэтой ме мбраны окол о 7 нм, онане бывае т с вязанани с какими другими ме мбранами цитопл азмы и замкнутас аманас е бя, так что пре дс тавл яе т с обой ме мбранный ме ш ок. Н аружную ме мбрану от внутре нне й отде л яе т ме жме мбранное прос транс тво ш ириной окол о 10 - 20 нм. В нутре нняя ме мбрана (тол щ иной окол о 7 нм) ограничивае т с обс тве нно внутре нне е с оде ржимое митохондрии, е е ма т ри кс, ил и ми т о пла зму и образуе т многочис л енные впячивания внутрь (с кл адки) – кри ст ы. Н а крис тах л окал изую тс якомпл е кс ы фе рме нтов дыхате л ь ной це пи, учас твую щ ие в пре образовании эне ргии химиче с ких с вязе й окис л яе мых питате л ь ных ве щ е с тв в эне ргию мол е кул А ТФ (“грибовидные ” те л а). О рие нтация крис т по отнош е нию к дл инной ос и митохондрии разл ичнадл яразных кл е ток, в с вязи с че м выде л яю т их разл ичные типы: пе р-

29

пе ндикул ярная орие нтация крис т (кл е тки пе че ни, поче к), продол ь ное рас пол оже ние крис т (кл е тки с е рде чной мыш цы), ве твящ ие с якрис ты бе з выраже нной орие нтации. У прос те й ш их, однокл е точных водорос л е й , в не которых кл е тках выс ш их рас те ний и животных вырос ты внутре нне й ме мбраны име ю т вид трубок (трубчатые крис ты). М атрикс митохондрий име е т тонкозе рнис тое гомоге нное с трое ние . В не м с оде ржатс я двухнитчатые мол е кул ы Д Н К (от одной до 50), которые в отл ичие от яде рной , име ю т, как правил о, кол ь це вую форму. Зде с ь же с оде ржатс я рибос омы, Р Н К, фе рме нты и разл ичные вкл ю че ния - крупные (20-40 нм) пл отные гранул ы - ме с таотл ожения с ол е й магния и кал ь ция. С де фе ктами мтД Н К с вязано появл е ние ряда ге не тиче с ких митохондриал ь ных забол е ваний у че л ове ка (изве с тно окол о 18 забол е ваний ): гл ухота, с л е пота, бе с пл одие , с е рде чно-с ос удис тые и другие забол е вания. Гене тиче с кие изме не нияв мтД Н К – однаиз причин с таре нияорганизма. Кл е точный эне рге тиче с кий кризис ве де т к гибе л и кл е тки – апоптозу. М итохондрии ос ущ е с твл яю т с инте з А ТФ , проис ходящ ий в ре зул ь тате проце с с ов окис л е ния органиче с ких с убс тратов и фос форил ирования А Д Ф . В кл е тках окис л е ние и выде л е ние эне ргии, ос вобождаю щ е й с я в ре зул ь тате этого проце с с а, проходят в не с кол ь ко взаимос вязанных этапов. В итоге при рас щ е пл е нии одной мол е кул ы гл ю козы образуе тс я 38 мол е кул А ТФ . Пл ас т иды (от гре ч. plastos – выл е пл е нный и eidos – подобный ) – органе л л ы, которые име ю т тол ь ко рас тите л ь ные кл е тки (их не т у грибов и животных). П одобно митохондриям пл ас тиды покрыты двумя ме мбранами, в их с троме име е тс я с обс тве нный ге не тиче с кий мате риал – хпД Н К (рис унок 9). У выс ш их рас те ний выде л яю т разл ичные типы пл ас тид, которые с пос обны к взаимному пре вращ ению одного типа пл ас тид в другой : хл оропл ас ты, л е й копл ас ты и хромопл ас ты. Х ло ро пла ст ы – зе л е ные пл ас тиды, в ос новном с оде ржащ ие пигме нт хл орофил л . Э то ос новная с труктура, ос ущ е с твл яю щ ая проце с с фотос инте за. О бычно это с труктуры удл ине нной овал ь ной формы с ш ириной 2 - 4 мкм и протяже ннос ть ю 5 - 10 мкм. У зе л е ных водорос л е й вс тре чаю тс я гигантс кие хл оропл ас ты (хроматофоры), дос тигаю щ ие дл ины 50 мкм. Кол иче с тво хл оропл ас тов в кл е тках разных рас те ний не одинаково. Так, у зе л е ных водорос л е й може т быть по одному крупному хл оропл ас ту в кл е тке . О бычно накл е тку выс ш их рас те ний приходитс я в с ре дне м 10 - 30 хл оропл ас тов. Х л оропл ас ты пре дс тавл яю т с обой с труктуры, ограниче нные двумя ме мбранами - внутре нне й и вне ш не й , каждая из которых име е т тол щ ину окол о 7 мкм. М е мбраны отде л е ны друг от друга ме жме мбранным прос транс твом окол о 20 - 30 нм. В с троме зре л ого хл оропл ас тавыс ш их рас те ний внутре нняя ме мбранаобразуе т хорош о развитую т и ла ко и дн ую си ст ему, с ос тоящ ую из двух типов ме мбран: образую щ ие пл ос кие , протяже нные ла меллы с тромы, и ме мбраны т и ла ко и до в - пл ос кие дис ковидные замкнутые ме мбранные ме ш ки, ил и вакуол и (рис унок 9).

30

Р ис унок 9. Схе ма с трое ния хл оропл ас та -А , л е й копл ас та - Б и хромопл ас та- В (Ч е нцов, 2004): 1- вне ш няяме мбрана, 2- внутре нняяме мбрана, 3с трома, 4- л аме л л ы с тромы, 5- грана, 6- тил акоид, 7- Д Н К, 8- крахмал ь ное зе рно, 9- л ипиднаякапл яс пигме нтами (ос миофил ь наягл обул а), 10- рибос омы..

М е мбранные т и ла ко и ды могут рас пол агать с я поодиночке ил и с обирать с я в с топку (наподобие с тол бика моне т), образуя гра н ы. Ч ис л о тил акоидов наодну грану варь ируе т: от не с кол ь ких ш тук до 50 и бол е е . Р азме р таких с топок може т дос тигать 0,5 мкм и их можно увиде ть под с ве товым микрос копом. Кол иче с тво гран в хл оропл ас тах выс ш их рас те ний може т дос тигать 40-60. В с ос тав граны помимо тил акоидов могут входить и л аме л л ы с тромы. Л а меллы ст ро мы (тол щ иной окол о 20 мкм) пре дс тавл яю т с обой пл ос кие пол ые ме ш ки ил и же име ю т вид с е ти из разве твл е нных и с вязанных друг с другом канал ов, рас пол агаю щ ихс яв одной пл ос кос ти. В с троме хл оропл ас тов обнаруживаю тс я мол е кул ы Д Н К, рибос омы. Там же проис ходит пе рвичное отл оже ние запас ного пол ис ахарида- крахмал а, в виде крахмал ь ных зе ре н. Н а эл е ктронных микрофотографиях хорош о видно нал ичие л ипидных вкл ю че ний – пл ас тогл обул . В хл оропл ас тах (как и в митохондриях) с инте зируе тс я А ТФ , идущ ая нанужды фотос инте за. Кроме того, в хл оропл ас тах ос ущ е с твл яю тс я фотос инте тиче с кие проце с с ы, приводящ ие в коне чном итоге к с вязыванию угл е кис л оты, к выде л е нию кис л ородаи с инте зу с ахаров. Ф отос инте з – с л ожный многос тупе нчатый проце с с , с ос тоящ ий из двух с тадий – с ве товой и те мновой . Све товаяфазапроте кае т тол ь ко нас ве ту наме мбранах тил акоидов с учас тие м с веточувс твите л ь ного зе л е ного пигме нта – хл орофил л а, рас пол оже нного в ме мбранах тил акоидов. Суммарнаяре акцияфотос инте за може т быть выраже нав общ е м виде : hν nCO2 + nH2O −−−−−−−−−→ (CH2O)n + O2 хл орофил л Л ейко пла ст ы – бе с цве тные пл ас тиды, с оде ржащ ие с яв кл е тках не окраш енных час те й рас те ний – корнях, кл убнях и др. О тл ичаю тс я от хл оро-

31

пл ас тов отс утс твие м развитой тил акоидной с ис те мы (рис унок 9), но с пос обны к е е образованию и к приобре те нию зе л е ной окрас ки под вл ияние м с ве та. Р азл ичаю т не с кол ь ко типов л е й копл ас тов: а ми ло пла ст ы (накапл иваю щ ие крахмал ), о лео пла ст ы (накапл иваю щ ие мас л а), про т еи н о пла ст ы (накапл иваю щ ие бе л ок). Х ро мо пла ст ы – окраш е нные пл ас тиды (крас ного, же л того ил и оранже вого цве та), возникаю щ ие в ре зул ь тате накопл е ния разл ичных пигме нтов каротиноидов. О бразую тс я из хл оропл ас тов и значите л ь но ре же из л е й копл ас тов (например, в корне моркови). В проце с с е рос та и развития отде л ь ные органы рас те ний (л е пе с тки, л ис ть я, пл оды) ме няю т с вой цве т. Э ти проце с с ы с опряже ны с уме нь ш е ние м чис л а ме мбран в пл ас тиде , ис че знове ние м хл орофил л аи крахмал а. М ат ери алы и оборудован и е. Све товые микрос копы, пос тоянные микротомные пре параты с разл ичными органе л л ами, набор эл е ктронномикрос копиче с ких фотографии (эл е ктроннограмм), с хе мы. Х о д ра бо т ы. Задан ие 1. Р ас с мотре ть готовые пос тоянные микротомные пре параты кл е ток животной ткани под с ве товым микрос копом. О братить внимание на морфол огию разл ичных органе л л под с ве товым микрос копом: компл е кс Гол ь джи (не рвные кл е тки с пинал ь ного гангл ия котенка), митохондрии (кл е тки пе че ни акс ол отл я). Задан ие2. И с пол ь зуя эл е ктронно-микрос копиче с кие фотографии и с хе мы изучить ос обе ннос ти с трое ниягл адкого и ш е роховатого Э П Р . Зарис овать ул ь трас труктуру разных типов Э П Р . Задан ие3. И зучить наэл е ктронно-микрос копиче с ких фотографиях морфол огию и ул ь трас труктуру компл е кс а Гол ь джи. И с пол ь зуя фотографии и с хе мы, зарис овать с трое ние диктиос омы. Задан ие4. Н ай ти и изучить наэл е ктронно-микрос копиче с ких фотографиях разл ичные типы л изос ом. Каковаих функция? Задан ие 5. И с пол ь зуя эл е ктронно-микрос копиче с кие фотографии и с хе мы, изучить морфол огию и ул ь трас труктуру митохондрий . Зарис овать с трое ние митохондрии. Задан ие 6. И с пол ь зуя эл е ктронно-микрос копиче с кие фотографии и с хе мы, изучить типы, морфол огию и ул ь трас труктуру пл ас тид. Зарис овать с трое ние хл оропл ас та, л е й копл ас таи хромопл ас та. В оп р ос ы дл я с ам оп р ов ер киикон т р ол я: 1. Ч то такое органе л л ы (органоиды) кл е тки. Какова их кл ас с ификация? 2. Какие органе л л ы относ ятс я к одноме мбранным, акакие к двуме мбранным? П оче му их так называю т? 3. Ч е м отл ичае тс я гл адкий эндопл азматиче с кий ре тикул ум от ш е роховатого (по с труктуре и функции)? 4. Д л я КГ характе рно нал ичие с труктурной и биохимиче с кой пол ярнос ти. В че м это проявл яе тс я?

32

5. Где образую тс я л изос омы? Какие с ущ е с твую т типы л изос ом? Каковаих функция? 6. Какие органе л л ы называю т “с ил овыми с танциями кл е тки” и поче му? Ч то общ е го и каковы разл ичияме жду этими органе л л ами? 7. Н азовите органе л л ы, в которых с оде ржитс яД Н К. 8. П оче му митохондрии и хл оропл ас ты называю т “пол уавтономными” органе л л ами? 9. С учас тие м каких органе л л проис ходит с инте з бе л ка? 10. П ри эл е ктронно-микрос копиче с ком изуче нии кл е тки выявл е ны разл ичные по форме бе с цве тные с труктуры, покрытые двумя ме мбранами: наружной гл адкой и внутре нне й , образую щ е й с л або развитые , не многочис л е нные тил акоиды. В с троме выявл яю тс я разл ичные вкл ю че ния – крахмал , мас л а и др. Д л я какой органе л л ы характе рна опис анная выш е ул ь трас труктура? 11. П ри эл е ктронно-микрос копиче с ком изуче нии кл е тки обнаруже ны с топки пл ос ких цис те рн с рас ш ире ниями наконцах. О т них отщ е пл яю тс я пузырь ки и вакуол и. И зве с тно, что в этих с труктурах накапл иваю тс яве щ е с тва, с инте зированные в других органе л л ах, обе с пе чивае тс я с озре вание , транс порт, упаковка ве щ е с тв в с е кре торные пузырь ки, удал е ние их из кл е тки. Д л якакой органе л л ы характе рнатакаяул ь трас труктура? Т ем а 4. ЯДРО И НТ ЕРФ А ЗН О Й К Л ЕТ К И . С Т РУК Т УРА М И Т О Т И Ч ЕС К И Х ХРО М О С О М . ПО Н ЯТ И Е О К А РИ О Т И ПЕ Ц ел ь зан ят ия: 1. Р ас с мотре ние с труктуры и функции инте рфазного ядра. 2. Уяс нить , что хромос омы – пос тоянные компоне нты кл е тки, име ю щ ие двас труктурно-функционал ь ных с ос тояния: инте рфазные и митотиче с кие (ме тафазные ) хромос омы. 3. О знакомл е ние с типами ме тафазных хромос ом, их с труктурой . 4. О знакомл е ние с понятие м кариотип. П роанал изировать пол иморфизм чис л а, морфол огии, с труктуры митотиче с ких хромос ом у разных видов рас те ний и животных. О с н овн ы е т еорет и чес ки е полож ен и я. К л ет оч н оеядр о. Ж изне нный цикл л ю бой кл е тки, как правил о, с л агае тс я из двух фаз: пе риода покоя (инте рфазы) и пе риода де л е ния, в ре зул ь тате которого образуе тс ядве доче рние кл е тки. Ядро – обязате л ь ный компоне нт эукариотиче с кой кл е тки. О с новная функция кл е точного ядра– хране ние , вос производс тво и ре ал изация ге не тиче с кой (нас л е дс тве нной ) информации. О но ре гул ируе т обме нные проце с с ы и размноже ние кл е тки; с де яте л ь нос ть ю ядрас вязанапе ре дачаге не тиче с кой информации. Э то це нтр управл е нияжизне де яте л ь нос ть ю кл е тки. В ядре с оде ржитс я ос новная час ть ге не тиче с кой информации кл е тки, запис анная в виде пос л е довате л ь нос те й нукл е отидов Д Н К. Д Н К, с ое диняяс ь с бе л ками, образуе т хроматин, с ос тавл яю щ ий ос нову каждой хромос омы эукариотиче с кого организма.

33

И нте рфазное ядро име е т с фе риче с кую форму разме ром от 5 до 30 мкм, занимае т от 5 до 20% объ е макл е тки и с ос тоит из яде рной обол очки (кариоте ки), кариол имфы (яде рного с ока, ил и нукл е опл азмы, ил и кариопл азмы, ил и яде рного бе л кового матрикс а), хроматина, ядрыш ка (ил и ядрыш е к) (рис унок 10).

Р ис унок 10. Схе мас трое ниякл е точного ядра(А ) и яде рной поры (Б): А . 1- яде рная обол очка = кариоте ка (внутре нняя и вне ш няя ме мбраны и пе ринукл е арное прос транс тво); 2- яде рная пора; 3- яде рная л амина; 4- ге те рохроматин (конде нс ированный хроматин); 5- эухроматин (де конде нс ированный хроматин); 6- ядрыш ко (гранул ярный и фибрил л ярный компоне нты, в це нтрал ь ных с ве тл ых зонах находитс ярД Н К); 7- Р Н П ; 8- яде рный с ок (кариопл азма); 9- рибос омы; 10- Э П Р . Б. 1- пе ринукл е арное прос транс тво; 2- внутре нняя яде рная ме мбрана; 3- вне ш няя яде рная ме мбрана; 4- пе рифе риче с кие с убъ е диницы; 5- це нтрал ь наягранул а; 6- диафрагма.

Ядерн а я о бо ло ч ка (ка ри о т ека ) отде л яе т ядро от цитопл азмы. О бразованадвумя эл е ме нтарными ме мбранами (наружной и внутре нне й ), ме жду которыми находитс я пе ринукл е арное прос транс тво. Со с тороны цитопл азмы наружнаяме мбранане ре дко покрытарибос омами и може т пе ре ходить в с те нки канал ов эндопл азматиче с кой с е ти. В нутре нняя ме мбрана яде рной обол очки с вязанас яде рной л аминой - бе л ковым с л ое м (тол щ иной 25-100 нм), с ос тоящ им из эл е ме нтов цитос ке л е та (проме жуточных фил аме нтов). Я де рнаял аминавыпол няе т функцию с ке л е та(играягл авную рол ь в подде ржании формы ядра), а также заякоривае т хроматин отде л ь ными учас тками на внутре нне й яде рной ме мбране . В о вре мя митоза яде рная обол очкаразруш ае тс я, пре вращ аяс ь в мал е нь кие пузырь ки, ал аминадис с оциируе т на бе л ковые с убъ е диницы. В поздне й те л офазе эти с труктуры вос с танавл иваю тс я. Ядерн ые по ры. По ро в ый ко мплекс. В ме мбранах ядраиме ю тс я поры (с квозные отве рс тиядиаме тром окол о 90 – 100 нм), которые образую тс яза с че т с л ияния двух яде рных ме мбран. Ч е ре з них идут обме нные проце с с ы

34

ме жду ядром и цитопл азмой , ре гул яция которых и явл яе тс я ос новной функцие й яде рной обол очки. Я де рные поры запол нены с л ожноорганизованными гл обул ярными и фибрил л ярными бе л ковыми с труктурами, образую щ ими по ро в ый ко мплекс. П оровый компл е кс с ос тоит из двух рядов с вязанных ме жду с обой бе л ковых гранул , каждая из которых с оде ржит по 8 перифе риче с ких гранул , рас пол оже нных на равном рас с тоянии друг от друга по обе с тороны яде рной ме мбраны. Э ти гранул ы по разме рам пре вос ходят рибос омы. П е рифе риче с кие гранул ы с помощ ь ю фибрил л ярных вырос тов (“с пиц”) с вязаны с це нтрал ь ной гранул ой (рис унок 10). Ч ис л о яде рных пор завис ит от ме табол иче с кой активнос ти кл е ток: че м выш е с инте тиче с кие проце с с ы в кл е тках, те м бол ь ш е пор на е диницу пове рхнос ти кл е точного ядра. Ка ри о ли мфа пре дс тавл яе т с обой однородную мас с у, запол няю щ ую прос транс тво ме жду с труктурами ядра (хроматином и ядрыш ками). О на с оде ржит бе л ки, нукл е отиды, А ТФ и разл ичные виды Р Н К, ос ущ е с твл яя взаимос вязь яде рных с труктур и обме н с цитопл азмой кл е тки. Х ро ма т и н (от гре ч. сhroma – крас ка). Э то с ил ь но окраш иваю щ е е с я ос новными крас ите л ями ве щ е с тво. П ре дс тавл яе т с обой дезо кси ри бо н уклео про т еи н (Д Н П ) – компл е кс Д Н К и гис тоновых бе л ков в отнош е нии 1:1. Д Н П (хроматин) - ос нова каждой хромос омы эукариотиче с кой кл е тки. Кроме того, в хромос оме обнаруживае тс я Р Н К, явл яю щ аяс я продуктом транс крипции. Сое диняяс ь с бе л ками, Р Н К образуе т ри бо н уклео про т еи н (Р Н П ). В инте рфазном ядре хроматин – это де с пирал изованные хромос омы. Х роматин занимае т ос новную час ть объ е ма ядра. В завис имос ти от с те пени конде нс ации разл ичаю т два типа хроматина – гет еро хро ма т и н (пл отный , конденс ированный ) и эухро ма т и н (рас с е янный , макс имал ь но де конде нс ированный ). Ге те рохроматин инте нс ивно окраш ивае тс я крас ите л ями. В с ве товом микрос копе выявл яе тс я в виде гл ыбок и гранул . Сте пе нь де конде нс ации хроматина отражае т е го функционал ь ное с ос тояние . Ге те рохроматиновые учас тки функционал ь но ме не е активны, че м эухроматиновые , в которых л окал изованабол ь ш ая час ть ге нов. Ге те рохроматин рас пол оже н, гл авным образом, напе рифе рии ядра, контактируяс л аминой , и вокруг ядрыш ка. Э ухроматин (с ве тл ые зоны) находитс я ме жду с копл е ниями ге те рохроматина. В пе риод де л е ния хроматин конде нс ируе тс я, образуя л е гко иде нтифицируе мые под с ве товым микрос копом, инте нс ивно окраш иваю щ ие с яхромос омы. Ядрыш ки – с амая пл отная с труктураядра, обычно ш аровидной формы (одно ил и не с кол ь ко), не окруже ны ме мбраной и с оде ржат бе л ки и Р Н К (в с оотнош е нии приме рно 1:1), л ипиды, фе рме нты. Р азме ры кол е бл ю тс я от 1 до 10 мкм и бол е е . О бразование ядрыш е к с вязано с учас тками вторичных пе ре тяже к хромос ом (ядрыш ко в ыми о рга н и за т о ра ми – Я О ), т.е . ядрыш ко – это не отде л ь наяот хроматинас труктура, ае го производная (рис унок 11). Э то активно функционирую щ ий в инте рфазе л окус хромос омы. В обл ас ти вторичных пере тяже к л окал изованы ге ны, кодирую щ ие с инте з рибос омал ь ной Р Н К (рР Н К), ав с амих ядрыш ках проис ходит с ин-

35

те з рР Н К и формирование с убъ е диниц рибос ом (пре дс тавл яю щ их с обой компл е кс рР Н К+рибос омал ь ные бе л ки), которые зате м выходят в цитопл азму че ре з поры в яде рной обол очке и принимаю т учас тие в транс л яции (с инте зе бе л ка). П оэтому ядрыш ки – обязате л ь ные компоне нты кл е точного ядра. Я дрыш ки – не пос тоянные образования. О ни ис че заю т в начал е де л е ния кл е ток (что с овпадае т с пре кращ е ние м с инте тиче с ких проце с с ов) и вновь появл яю тс япос л е е го окончания. Кол иче с тво ядрыш е к завис ит от кол иче с тва ядрыш кообразую щ их хромос ом. Так, у че л ове камакс имал ь ное кол иче с тво ядрыш е к в с оматиче с ких кл е тках равно 10, т.к. име е тс я пять пар ядрыш кообразую щ их хромос ом (13, 14, 15, 21 и 22-я). Кол иче с тво ядрыш е к и их разме ры могут ме нять с я, отражая функционал ь ную активнос ть кл е тки: инте нс ивнос ть с инте зав не й рР Н К и бе л ков, общ е е ме табол иче с кое с ос тояние . Э тот показате л ь ис пол ь зую т (наряду с другими) в цитол огиче с ком мониторинге окружаю щ е й с ре ды – при опре де л е нии вл ияния антропоге нных факторов на кл е тку. Так, кол иче с тво ядрыш е к и их разме ры могут возрас ти при антропоге нной нагрузке . С т р укт ур а м ет аф азн ы х (м ит от ич ес ких ) х р ом ос ом . Х ро мо со мы (от гре ч. сhroma – крас ка, цве т; с ома– те л о, т.е . хромос ома– те л о, которое с ил ь но окраш ивае тс я ос новными крас ите л ями) – пос тоянные компоне нты кл е тки, важная с ос тавная час ть ядра. И м принадл е жит ве дущ ая рол ь в явл е ниях нас л е дс тве ннос ти. Э то нукл е опроте иновые те л а(Д Н П ), в которых хранитс я, пе ре дае тс я потомс тву и ре ал изуе тс я нас л е дс тве ннаяинформация. Х ромос омы – мате риал ь нае нос ите л и нас л е дс тве нной информации – ге нов. В с ве те с овре ме нных пре дс тавл е ний хромос ома– это урове нь организации нас л е дс тве нного мате риал ав виде нукл е опроте инового компл е кс а. Х ромос омы име ю т инте рфазную и митотиче с кую (характе рную дл я де л ящ е й с я кл е тки) формы организации, которые в кл е точном цикл е взаимно пе ре ходят друг в друга. О ни могут находить с я в двух с труктурнофункционал ь ных с ос тояниях: а) в рабоче м (час тично ил и пол нос ть ю де конде нс ированном), при учас тии которых в инте рфазном ядре проис ходят проце с с ы ре пл икации (удвое ния Д Н К) и транс крипции (с инте замР Н К на матрице Д Н К); б) в с ос тоянии ме табол иче с кого покоя (при макс имал ь ной их конде нс ации), когдаони выпол няю т функцию рас пре де л е ния и пе ре нос аге не тиче с кого мате риал ав доче рние кл е тки. М орфол огию , чис л о хромос ом л учш е вс е го изучать во вре мя де л е ния кл е тки, в моме нт их наибол ь ш е й конде нс ации, т.е . намитотиче с ких = ме тафазных хромос омах, когдаони хорош о видны в с ве товой микрос коп. Х ромос омы вс е х эукариотиче с ких организмов пос трое ны по одному пл ану. Р ас с мотрим обобщ е нную с хе му с трое ния ме тафазной хромос омы (рис унок 11). М орфол огиче с ки хромос омы животных и рас те ний име ю т ните видную ил и пал очкообразную форму. М е тафазнаяхромос омаиме е т две хроматиды (Д Н П ), с ое дине нные в обл ас ти пе рвичной пе ре тяжки = цен т ро меры. О бе хроматиды каждой

36

хромос омы иде нтичны друг другу по ге нному с ос таву. Каждая хроматида с ос тоит из одной двухце поче чной мол е кул ы Д Н К, с ое дине нной с яде рными бе л ками (гис тонами и не гис тоновыми бе л ками). Ц е нтроме раиграе т ос новную рол ь в пе ре ме щ е нии хромос ом при де л е нии ядра. В обл ас ти пе рвичной пе ре тяжки находитс я ки н ет о хо р (от гре ч. kineo подвижный и choreo – иду впе ре д), к которому подс ое диняю тс я нити ве ре те на де л е ния (пучки микротрубоче к), рас тас киваю щ ие хромос омы к пол ю с ам (рис унок 11). Кине тохор – бе л ковое , тре хс л ой ное образование . В конце митозакине тохор, как с пе циал изированнаяс труктура, ис че зае т. Ц е нтроме ранакаждой из хромос ом занимае т с трого опре де л е нное ме с то. Как правил о, у каждой хромос омы име е тс я тол ь ко одна це нтроме ра (моноце нтриче с кие хромос омы).

Р ис унок 11. Структураме тафазных хромос ом: А - обобщ е нная с хе ма с трое ния ме тафазной хромос омы, Б- кине тохор в обл ас ти пе рвичной пе ре тяжки; В - ядрыш ки в обл ас ти вторичных пе ре тяже к у проме тафазных хромос ом [Muratova, 1997]: 1- те л оме ры, 2- хроматиды, 3- пе рвичная пе ре тяжка (це нтроме ра), 4- вторичнаяпе ре тяжка(ядрыш ковый организатор), 5- с путник, 6кине тохор, 7- пучок микротрубоче к ве ре те наде л е ния.

В завис имос ти от рас пол оже ния первичной пе ре тяжки разл ичаю т не с кол ь ко типов хромос ом (рис унок 12). 1. М е таце нтриче с кие (прибл изите л ь но равнопл е чие ); 2. Субме таце нтриче с кие (пл е чи разной дл ины); 3. А кроце нтриче с кие (ре зко не равнопл е чие ; центроме рарас пол оже навбл изи одного из пл е ч); 4. Те л оце нтриче с кие (однопл е чие ) – второе пл е чо практиче с ки отс утс твуе т. Н е которые хромос омы могут име ть вт о ри ч н ую перет яж ку, называе мую ядрыш ко в ым о рга н и за т о ра м (Я О ), т.к. в этом учас тке в инте рфазе обычно проис ходит образование ядрыш ка, которое ис че зае т в начал е митоза. Х ромос омы, име ю щ ие вторичную пе ре тяжку, называю т ядрыш ко о бра зующи ми . В торичная пе ре тяжка, как правил о, рас пол агае тс я у дис тал ь ного (рас пол оже нного вдал и от це нтроме ры) концахромос омы и отде л яе т

37

не бол ь ш ой учас ток хромос омы, пол учивш е й название спут н и к. Х ромос ому, име ю щ ую с путник, называю т спут н и ч н о й. Ф ормаи разме ры с путника пос тоянны дл яданной хромос омы. В торичные пе ре тяжки явл яю тс якариотакс ономиче с ким признаком, т.к. их чис л о и пол оже ние нахромос оме явл яе тс яс пе цифичным дл явида.

Р ис унок 12. Типы ме тафазных хромос ом в завис имос ти от пол оже ния це нтроме ры [П ухал ь с кий , 2004]: Сл е ванаправо – ме таце нтриче с кая, с убме таце нтриче с кая, акроце нтриче с кая, те л оце нтриче с кая

Р ис унок 13. Кариотип че л ове ка (мужчины), 2n=46 [Све нс он, 1980]: М ал е нь кая хромос ома (указана с тре л кой ) – Y-хромос ома; Х -хромос ому, име ю щ ую с ре дние разме ры, трудно иде нтифицировать .

Т ело меры (конце вые учас тки) ограничиваю т хромос ому с концов. У вс е х организмов те л оме ры выпол няю т униве рс ал ь ную функцию . О ни защ ищ аю т концы хромос ом от де градации и пре дотвращ аю т е е укорачивание в проце с с е многократной ре пл икации, пре пятс твую т с ое дине нию конце вых учас тков одной хромос омы с другой . Л иш е нные те л оме р (наприме р, в ре зул ь тате их разрыва и поте ри) хромос омы начинаю т с л ивать с я, что може т приве с ти к с ерь е зным ге не тиче с ким аномал иям. Соматиче с ким кл е ткам (т.е . вс е м кл е ткам организма, кроме пол овых) каждого видарас те ний и животных с вой с тве нно с трого опре де л е нное чис л о хромос ом, обозначае мое как 2n. Так обозначае тс я пол ный (с оматиче с кий ) набор хромос ом кл е тки. Ч ис л о хромос ом не завис ит от уровня организации животных и рас те ний . О но кол е бл е тс я от 2 до 1200. П риме ры с оматиче с кого чис л а хромос ом (2n) разных видов организмов приве де ны в табл ице 1. В пол овых кл е тках чис л о хромос ом уме нь ш е но в двараза(га пло и дн о е = одинарное чис л о) и обозначае тс яn. Р азме ры хромос ом у разных организмов также варь ирую т в ш ироких пре де л ах, но пос тоянны дл я каждого вида. В с ре дне м дл ина хромос ом у разл ичных организмов може т с ос тавл ять от 0,2 до 50 мкм. У че л ове ка, наприме р, разме р хромос ом находитс я в пре де л ах 1,5 - 10 мкм. У с ос ны обыкнове нной хромос омы крупне е и ме нь ш е варь ирую т по разме ру – 9-17 мкм. Х ромос омы ржи име ю т дл ину 7-12 мкм.

38

Ка ри о т и п – чис л о, форма, ос обеннос ти с трое нияи разме р хромос ом с оматиче с ких кл е ток, прис ущ ие данному виду. Т.е кариотип – это с пе цифиче с кий дл я данного виданабор хромос ом. Кариотип – это как бы л ицо (пас порт) вида. П онятие кариотип вве л Г.А . Л е витс кий в 1924 г. Табл ица1. Х ромос омный набор с оматиче с ких кл е ток у разных групп организмов В ид организма(*-животный , è-рас тите л ь ный )

Ч ис л о хромос ом (2n) *Л ош адинаяас карида, мал ярий ный пл азмодий 2 *Л ош адинаяас карида(другаярас а) è- гапл опаппус 4 *П л одоваямуш кадрозофил а 8 *Тл я è-арабидопс ис 10 *Щ ука è-с ве кл а, капус та 18 è- Сос наобыкнове нная, дуб, рис , томат, л ил ия 24 *А ме риканс каяноркаè- л е н 30 *Зе мл яной че рвь , тю л е нь è- виш ня 32 *Д омаш няя кош ка, домаш няя с винь я, ящ е рица 38 прыткаяè- виноград, топол ь , с оя *Д омоваямыш ь è- л ю пин узкол ис тный 40 *Се раякрыс аè- пш е ницамягкая, ове с пос е вной 42 *Ч е л ове к è- яс е нь обыкнове нный 46 *Горил л а, ш импанзе è-картофе л ь , с л ивадомаш няя 48 *Р е чной рак 196 è-Тутовое де ре во 308 Х ромос омы, по которым отл ичаю тс я ос оби разного пол а, пол учил и название по ло в ых хро мо со м (гет еро хро мо со м, го н о со м), а вс е ос тал ь ные хромос омы (одинаковые у обоих пол ов) – а ут о со мы (А ), ил и н епо ло в ые хро мо со мы. Н априме р, нормал ь ный кариотип че л ове кас оде ржит 22 пары аутос ом (22А ) и две пол овые хромос омы: Х Х у же нщ ины и Х У - мужчины (рис унок 13). Соотве тс тве нно, формул а кариотипа запис ывае тс я с л е дую щ им образом: 44, Х Х (же нс кий ) и 44, Х У (мужс кой ). Э то дипл оидное (двой ное ) чис л о хромос ом, 2n=46. Гапл оидное (одинарное ) – n=23. В ажне й ш им признаком кариотипас л ужит нал ичие пар го мо ло ги ч н ых хромос ом, иде нтичных по разме рам, форме , ос обе ннос тям с трое ния и нас л е дс тве нной информации (порядку рас пол оже ния ге нов). Т.е . парагомол огичных хромос ом име е т индивидуал ь ные ос обе ннос ти, отл ичаю щ ие их от других хромос ом кариотипа данного вида. Гомол огичные хромос омы разл ичны по проис хожде нию , так как однаиз них унас л е дованаот отца, а другая– от мате ри. Х ромос омы из разных пар называю т н его мо ло ги ч н ыми . О ни име ю т разный ге нный набор и разное с трое ние .

39

Н ормал ь ная дл инакаждой хромос омы и с уммарная дл инавс е х хромос ом кариотипа пос тоянны. Графиче с кое изображе ние кариотипа, показываю щ е е е го с труктурные ос обе ннос ти, называе тс яи ди о гра ммо й. Д л я оце нки разл ичных патол огий необходимо хорош о знать кариотип в норме . Сравните л ь ный анал из кариотипаш ироко ис пол ь зуе тс я в кариос ис те матике , пре натал ь ной (дородовой ) диагнос тике хромос омных бол е зне й че л ове ка (с вязанных с чис л овыми и с труктурными изме не ниями хромос ом), диагнос тике онкол огиче с ких забол е ваний (т.к. при 85% опухол е й набл ю даю тс яаномал ии хромос омного набора), с е л е кции новых с ортов рас те ний и пород животных, картировании хромос ом (т.е . ус тановл е ние пол оже нияконкре тных ге нов наопре де л е нных хромос омах) и др. М ат ери алы и оборудован и е. Све товые микрос копы, готовые микропре параты (давл е ные и пос тоянные ) с ос ны, е л и, топол я, бе ре зы, л ука, бобов, фас ол и, л ош адиной ас кариды, мыш и, че л ове ка; микрофотографии, с хе мы Х о д ра бо т ы. Задан ие1. И с пол ь зуя микропре параты и микрофотографии (с ве товые и эл е ктронномикрос копиче с кие ), рас с мотре ть и зарис овать с труктуру инте рфазного ядра. П од с ве товым микрос копом рас с мотре ть пос тоянные пре параты кл е ток пе че ни. Н а пре паратах хорош о выявл яю тс я: округл ые ядра, ядрыш ки, гл ыбки хроматина. Задан ие 2. Р ас с мотре ть на эл е ктронных микрофотографиях и зарис овать с труктуру ядрыш е к. О братите внимание , что ядрыш ки не окруже ны ме мбраной . Р ас с мотрите давл е ные пре параты с оматиче с ких кл е ток разл ичных объ е ктов (рас тите л ь ного и животного проис хожде ния), подс читай те кол иче с тво вс тре чаю щ ихс я у них ядрыш е к и с де л ай те выводы о возможном кол иче с тве ядрыш кообразую щ их хромос ом у проанал изированных объ е ктов. Задан ие3. Зарис овать в те тради общ ую с труктуру и типы ме тафазных хромос ом. Р ас с мотре ть как выгл ядят ме тафазные хромос омы надавл е ных микропре паратах из корне вой ме рис те мы с пре добработкой и бе з пре добработки пророс тков кол хицином пе ре д фикс ацие й . О бос нуй те не обходимос ть приме не ниякол хицинадл яанал изакариотипа. Задан ие 4. И с п ол ьзуя готовые давл е ные и микротомные микропре параты, атакже микрофотографии ознакомь те с ь с кариотипами разл ичных видов. П ри бол ь ш ом уве л иче нии (ил и на микрофотографии) подс читай те чис л о хромос ом в с оматиче с ких кл е тках у разных видов рас те ний и животных. Зане с ите данные в табл ицу: В ид организма

Н оме р ме тафазной пл ас тинки

Ч ис л о хромос ом (2n)

В оп р ос ы дл я с ам оп р ов ер киикон т р ол я: 1. Н азовите ос новные с труктурные эл е ме нты кл е точного ядра? П оче му ядро называю т “це нтром управл е нияжизне де яте л ь нос ти кл е тки”?

40

2. Ч то пре дс тавл яе т с обой хроматин (в химиче с ком отнош е нии)? Какие с ущ е с твую т типы хроматина, каковы их цитол огиче с кие ос обе ннос ти? 3. Ч то пре дс тавл яю т с обой хромос омы? Ч е м отл ичаю тс я (по с труктуре и функциям) инте рфазные и митотиче с кие хромос омы? Какое кол иче с тво мол е кул Д Н К входит в с ос тав инте рфазной и митотиче с кой (ме тафазной ) хромос омы? 4. Зарис уй те общ ую с хе му с трое ния митотиче с кой хромос омы. П одпиш ите вс е е е с ос тавл яю щ ие . 5. Какие выде л яю т типы митотиче с ких хромос ом в завис имос ти от рас пол оже нияпе рвичной пе ре тяжки? 6. Каковы функции пе рвичной и вторичной пе ре тяжки хромос омы? Как их е щ е называю т? 7. В какой зоне хромос омы проис ходит образование ядрыш ка? Каковафункцияядрыш ка? О т че го завис ит кол иче с тво ядрыш е к в инте рфазном ядре ? 8. Ч то такое кариотип (каковы е го ос новные признаки)? 9. Д ай те опре де л е ние с л е дую щ им те рминам: хромос ома, хроматида, хроматин, кариотип. 10. Каковы ос обе ннос ти фикс ации мате риал а, пре дназначе нного дл я изуче ниякариотипа? 11. Я дро кл е тки обработал и пре паратами, разруш аю щ ими бе л кигис тоны. Какаяс труктурапри этом пос традае т в пе рвую оче ре дь ? Т ем а 5. М ЕТ О ДЫ ХРО М О С О М Н О Г О А Н А Л И ЗА . К А РИ О Г РА М М А , И ДИ О Г РА М М А . М Е Т О ДЫ И ЗУЧ ЕН И ЯК А РИ О Т И ПА Ч ЕЛ О В ЕК А Ц ел ь зан ят ия: 1. О знакомл е ние с с овре ме нными ме тодами изуче ния хромос ом: морфоме триче с кий ме тод с ис пол ь зование м с пл ош ного (рутинного) окраш ивания хромос ом, ме тод диффе ре нциал ь ного окраш ивания, ме тод цитол огиче с кой гибридизации in situ: ISH- и FISH- гибридизация. Р ас с мотре ть возможнос ти изуче ния кариотипапри ис пол ь зовании разных ме тодов. 2. О знакомл е ние с принципами с ос тавл е ния кариограммы и идиограммы. 3. О пре де л е ние ос новных параме тром хромос ом при рутинной окрас ке и с ос тавл е ние идиограммы изучае мого вида. П онятие це нтроме рный и пл е че вой инде кс . 4. Сос тавл е ние кариограммы с ис пол ь зование м микрофотографий диффе ре нциал ь но окраш е нных хромос ом. 5. О знакомл е ние с принципами кл ас с ификации хромос ом че л ове ка, ос обе ннос тями приготовл е ниямикропре паратов, ме тодами изуче ниякариотипа. О с н овн ы е т еорет и чес ки е полож ен и я. М ет оды х р ом ос ом н ого ан ал иза. Сущ е с твую т разл ичные ме тоды изуче нияи иде нтификации хромос ом. 1. М о рфо мет ри ч ески й мет о д с ис пол ь зование м с пл ош ного (равноме рного, рутинного) окраш ивания хромос ом. Э то ме тод, вкл ю чаю щ ий оп-

41

ре де л е ние чис л ахромос ом, с равне ние их разме ров и морфол огии (це нтроме рный инде кс , нал ичие и пол оже ние вторичных пе ре тяже к). Р е зул ь таты анал изакариотипапредс тавл яю т в виде кариограммы и идиограммы. Ка ри о гра мма – “рас кл адка” вс е х хромос ом, входящ их в кариотип те с тируе мого объ е ктанабумаге путе м подборагомол огичных пар и рас пре де л е ния по типам (в завис имос ти от пол оже ния це нтроме ры). Е е с троят, группируя хромос омы попарно и рас пол агая це нтроме ры по одной л инии в порядке убывания их дл ины. Короткие пл е чи хромос ом направл яю т вве рх, а дл инные – вниз. Д л я с ос тавл е ния кариограммы ме тафазную пл ас тинку с хромос омами фотографирую т. Н ожницами хромос омы разде л ь но выре заю тс я из микрофотографии, разбиваю тс я напары гомол огов и в ранжированном порядке накл е иваю тс янал ис т бумаги. И ди о гра мма - графиче с кое изображе ние кариотипас указание м разме ров хромос ом и ос обе ннос те й их с трое ния (с ис те матизированный кариотип). Е е с ос тавл е ние ос новано наизме ре нии каждой хромос омы, уче те дл ин пл е ч, пол оже ния це нтроме р, вторичных пе ре тяже к, с путников. Н а идиограмме пре дс тавл яю т относ ите л ь ные разме ры вс е х типов хромос ом, а также ос обе ннос ти рас пол оже ния первичных и вторичных пе ре тяже к, с путников, что позвол яе т бол е е точно иде нтифицировать хромос омы. Н а идиограмме принято изображать по одной из каждой пары гомол огичных хромос ом (т.е . гапл оидный набор), рис унок 14.

А Б Р ис унок 14. Кариотип (А ) и идиограмма (Б) с ос ны обыкнове нной , 2n=2х=24 (Muratova, 1997). В ажне й ш ие показате л и, которыми пол ь зую тс я при иде нтификации хромос ом, с л е дую щ ие : абс ол ю тная дл ина хромос омы, мкм; общ ая дл ина вс е х хромос ом, мкм; относ ите л ь ная дл инахромос омы (дл инаданной хромос омы от общ е й дл ины вс е х хромос ом гапл оидного набора), %; пл е че вой инде кс (отнош е ние дл инного пл е ча к короткому); це нтроме рный инде кс (отнош е ние дл ины короткого пл е чак дл ине вс ей хромос омы, т.е . с уммарной дл ине короткого и дл инного пл е ча), %. В 1960 г. в Д енве ре (СШ А ) был а принята пе рвая М е ждународная кл ас с ификация хромос ом че л ове ка, ос нованная на уче те разме ров хромо-

42

с ом и пол оже ния це нтроме ры. Согл ас но этой кл ас с ификации, вс е 46 хромос ом че л овекапри с пл ош ном ме тоде окрас ки по форме разде л е ны наме таце нтриче с кие , с убме таце нтриче с каие и акроце нтриче с кие и подразде л е ны на7 групп: А , B, C, D, E, F, G. В с е пары аутос ом, рас пол оже нные в порядке уме нь ш е ния их дл ины, пронуме рованы арабс кими цифрами от 1 до 22. П ол овые хромос омы обозначе ны л атинс кими буквами Х ил и У и поме щ е ны в конце рас кл адки (рис унок 15). Самые ме л кие хромос омы (21-ая и 22-ая) име ю т разме р 1,5 мкм, ас амая крупная (1-ая) – 10 мкм. В ажным крите рие м принадл е жнос ти хромос омы к той ил и иной группе явл яе тс я е е це нтроме рный инде кс (табл ица2). П ри таком с пос обе окрас ки можно прове с ти подс че т чис л ахромос ом и выявить их чис л е нные аномал ии, опре де л ить разме ры хромос ом, л е гко отл ичить крупные ме таце нтриче с кие хромос омы в группе А (1-ая и 2-ая) от ме л ких ме таце нтриче с ких в группе F (19-ая и 20-ая); ме таце нтриче с кие от акроце нтриче с ких. О днако, во многих с л учаях не возможно прове с ти иде нтификацию отде л ь ных хромос ом в пре де л ах одной группы. Так, в группе С 6-ая и 7-ая хромос омы с хожи ме жду с обой также , как и с Х хромос омой . Ч е тко отл ичить эти хромос омы друг от другапозвол яе т другой ме тод – диффе ре нциал ь ного окраш ивания хромос ом, разработанный в 70-ые годы XX ве ка(рис унок 16). И з вс е х 46 хромос ом че л ове кас помощ ь ю с пл ош ного окраш ивания можно иде нтифицировать тол ь ко хромос омы 1, 2, 3 (три пары ме таце нтриче с ких хромос ом группы А ), 16 (группаЕ ) и У. В с е хромос омы групп В , С, D, F и G при с пл ош ном окраш ивании не иде нтифицирую тс я. Табл ица2. Кл ас с ификацияи общ аяхаракте рис тикахромос ом че л ове ка Группа

А

B С D E F G Х – хромос ома Y- хромос ома

Н оме ра хромос омных пар в группе 1 2

Ц е нтроме рный инде кс , %

Х аракте рис тикахромос ом

48 – 49 38 – 40

3 4, 5 6 – 12 13, 14, 15 16, 17, 18 19, 20 21, 22 23

45 – 48 24 – 30 27 – 42 14 – 24 28 – 43 36 – 46 13 - 33 38 – 42

Самые крупные ме таце нтриче с кие Самые крупные с убме таце нтриче с кие Крупные ме таце нтриче с кие Крупные с убме тацентриче с кие Сре дние с убме таце нтриче с кие Сре дние акроце нтриче с кие М е л кие с убме таце нтриче с кие М е л кие ме таце нтриче с кие М е л кие акроце нтриче с кие Сре дняяс убме таце нтриче с кая

23

0 – 26

М е л каяакроце нтриче с кая

43

Р ис унок 15. Кариотип мужчины. Х ромос омы обозначе ны с огл ас но Д е нве рс кой кл ас с ификации . И де нтификация хромос ом на ос нове опре де л е ния разме ров хромос ом и с оотнош е ния пл е ч трудно приме нимаи к разл ичным рас тите л ь ным объ е ктам, наприме р, к разным видам пш е ницы. В о многих с л учаях тол ь ко с путничные хромос омы могут быть иде нтифицированы бл агодаря нал ичию вторичной пе ре тяжки. 2. М ет о д ди фферен ци а ль н о го о кра ш и ва н и я хро мо со м (хромос омный бэндинг) – это компл е кс ме тодов окрас ки хромос ом, ос нованный на разл ичном окраш ивании химиче с ки разл ичаю щ ихс я учас тков хромос ом, что позвол яе т выявить их с труктурную разнороднос ть по дл ине . Х ромос омы в этом с л учае выгл ядят попе ре чно ис че рче нными (с че ре дую щ имис я те мными и с ве тл ыми зонами). П риче м, “рис унок” (кол иче с тво, рас пол оже ние и тол щ инапол ос =с е гме нтов) с трого с пе цифиче н дл я каждой пары хромос омы. Ч е ре дование с е гме нтов характе ризуе тс я пос тоянс твом, что може т быть ис пол ь зовано дл я маркировки и иде нтификации каждой хромос омы, картирования(привязки к этим учас ткам ге нов). М е тод диффе ре нциал ь ного окраш ивания был пол оже н в ос нову П арижс кой кл ас с ификации хромос ом че л ове ка (1971), позвол ил уточнить и допол нить Д е нве рс кую кл ас с ификацию , точно иде нтифицировать каждую хромос ому че л ове каи с ос тавить идиограмму, фрагме нт которой приве де н нарис унке 16. П л е чи хромос ом с тал и обозначать л атинс кими буквами: p короткое и q- дл инное . П л е чи разде л е ны на рай оны, а те – на с е гме нты. В с е они пронуме рованы арабс кими цифрами от це нтроме ры к те л оме ре , отде л ь но дл я каждого пл е ча. Н априме р, запис ь 5р13 означае т: короткое пл е чо хромос омы 5, рай он 1, с е гме нт 3. Сущ е с твую т 4 ос новных ме тода диффе ре нциал ь ного окраш ивания хромос ом. 1) Q-мет о д (quinacrine, акрихин) - это фл уоре с це нтное окраш ивание , ос ущ е с твл яе мое с помощ ь ю фл уорохромов (наприме р, акрихин-ипритом), а прос мотр пре паратов с помощ ь ю фл уоре с це нтного

44

ипритом), апрос мотр пре паратов с помощ ь ю фл уоре с це нтного микрос копа. М е тод впе рвые пре дл ожил в 1968 г. Т. Кас пе рс с он (Ш ве ция). В микрос копе видны попере чные с ве тящ ие с я(фл уоре с цирую щ ие ) пол ос ы (бэнды), рас пол оже ние которых характе рно дл якаждой хромос омы.

Р ис унок 16. Д иффе ре нциал ь но окраш е нные (G-мет о до м – с л е ваи Rмет о до м – с права) 6-я, 7-я и Х -хромос омы че л овека, трудно иде нтифицируе мые при с пл ош ном окраш ивании. Х ромос омы обозначе ны с огл ас но П арижс кой кл ас с ификации. П озже был о выявл е но, что диффе ре нциал ь ное окраш ивание можно ос ущ е с твл ять бе з фл уоре с це нтных крас ите л ей , а пре параты изучать под обычным с ве товым микрос копом. 2) G-мет о д (Giemza, окраш ивание с помощ ь ю крас ите л яГимзав с оче тании с допол ните л ь ными процедурами, с пос обс твую щ ими адс орбции крас ите л я на опре де л е нных учас тках). G-мет о д наибол е е час то приме няе тс ядл ямаркировки и иде нтификации хромос ом (рис унок 16). К разновиднос тям диффе ре нциал ь ного окраш ивания по ме тоду Гимзы относ ятс я R-окрас ка и C-окрас ка. В этом с л учае изме няе тс я вре мя и ус л овияинкубации препаратов, окраш е нных по ме тоду Гимзы. 3) R-мет о д (reverse, оборотные ) – с е гме нтация хромос ом обратная G-с е гме нтации. С помощ ь ю этого с пос обаокраш ивания удае тс я че тко опре де л ять те л оме рные рай оны хромос ом. 4) С -мет о д (constitutive heterochromatin, ил и centromeric heterochromatin). П риме няе тс я дл я ус тановл е ния л окал изации учас тков ге те рохроматина, в час тнос ти, в це нтроме рных и окол оце нтроме рных учас тках. П озвол яе т выявл ять с труктурный (конс титутивный , т.е . пос тоянно конде нс ированный ) ге те рохроматин, что дае т возможнос ть оце нить хромос омный пол иморфизм, т.е . индивидуал ь ные отл ичия по отде л ь ным хромос омам. С помощ ь ю C-ме тода опис аны кариотипы ос новных хл е бных зл аков (пш е ница, рожь , ячме нь и др.). О н был ис пол ь зован дл я иде нтификации и анал изахромос ом родс тве нных ге номов пш е ницы и дикорас тущ их с ородиче й , с помощ ь ю не го выявл е но проис хожде ние кул ь турной мягкой пш е ницы (рис унок 17). Сопос тавл е ние ме тодов диффе ре нциал ь ного окраш ивания показал о, что вс е они выявл яю т в принципе одни и те же с труктуры, но каждый из них с пе цифиче н в отнош е нии опре де л е нных хромос омных с е гме нтов.

45

Точное пос тоянс тво чис л а хромос ом, их индивидуал ь нос ть и с л ожнос ть с трое нияс виде те л ь с твую т о важнос ти выпол няе мой ими функции.

Р ис унок 17. Кариотип диффе ре нциал ь но окраш е нных (С-ме тод) хромос ом эгил опс а (Aegilops speltoides, 2n=2x=14) – одного из пре дков кул ь турной пш е ницы [Бадае ва, 2001]. К ограниче ниям ме тодов диффе ре нциал ь ного окраш ивания хромос ом относ итс я возможнос ть е го приме не ния л иш ь к дос таточно крупным хромос омам, богатым ге те рохроматином. 3. М ет о д ци т о ло ги ч еско й ги бри ди за ци и = ги бри ди за ци я in situ (на ме с те ). ISH- и FISH- ги бри ди за ци я. Э то прямой ме тод л окал изации в хромос омах опре де л е нных учас тков мол е кул ы Д Н К (ил и ге нов). Э то принципиал ь но новый ме тод изуче ния хромос ом, относ ящ е й с я к обл ас ти мол е кул ярной кариол огии, задачакоторой – изуче ние мол е кул ярной организации и функционирования хромос ом. П риче м, он приме ним как дл я крупных, так и ме л ких хромос ом животных и рас тите л ь ных объ е ктов. П риме не ние данного ме тода с тал о возможным бл агодаря тому, что кл онирован це л ый ряд ге нов че л ове ка, животных, рас тений (отве чаю щ их за проявл е ние нас л е дс тве нных де фе ктов, рос т, продуктивнос ть и другие признаки), а также рас ш ифрована их нукл е отидная пос л е довате л ь нос ть . Д л я е го ос ущ е с твл е ния ис пол ь зую т зо н ды. Зо н ды – это не бол ь ш ие (20-30 нукл е отидов) ис кус с тве нно с инте зированные ме че ные одноце поче чные учас тки Д Н К (ил и Р Н К), компл е ме нтарные ис комому ге ну (ил и учас тку мол е кул ы Д Н К). Компл е ме нтарнос ть – это взаимодопол няе мос ть (взаимное с оотве тс твие ) азотис тых ос нований в мол е кул е Д Н К, ме жду которыми образую тс я водородные с вязи: аде нинаи тимина(A – T), гуанинаи цитозина(G – C). Д вухце поче чную Д Н К, входящ ую в с ос тав каждой хромос омы, прямо нацитол огиче с ком пре парате де натурирую т с помощ ь ю щ е л очи ил и те мпе ратурной обработки (т.е . удал яю т бе л ки, разруш аю т водородные с вязи и размыкаю т це пи Д Н К). Зате м напре парат нанос ят фрагме нт ме че ной Д Н К и проводят Д Н К-Д Н К гибридизацию . Зонды с ое диняю тс ятол ь ко с те м учас тком Д Н К, который с оде ржит пос л е довате л ь нос ть нукл е отидов, с трого с оотве тс твую щ ую (компл е ме нтарную ) пос л е довате л ь нос ти нукл е отидов зонда, в ре зул ь тате че го в этом ме с те Д Н К вновь с тановитс ядвухце поче чной . П ри ISH-гибридизации (in situ hybridization) зонды ме тят радиоактивными ме тками, а ме с та гибридизациии выявл яю т ме тодом авторадиографии. П ри FISH-гибридизации (fluorescent in situ hybridization) зонды ме тят химиче с ки, ис пол ь зуя фл уоре с це нтные крас ите л и, биотин, дигокс иге -

46

нин (рис унок 18). М е с та гибридизации выявл яю т с помощ ь ю фл уоре с це нтного ил и обычного с ве тового микрос копа. Ч ащ е ис пол ь зуе тс я второй с пос об как бол е е дос тупный и бе звре дный . Р ис унок 18. Гибридизация in situ на хромос омах эгил опс а (Ae. squarrosa, 2n=2x=14) – одного из пре дков кул ь турной пш е ницы [Бадае ва, 2001]. Стре л ками указаны ме с та гибридизации с митотиче с кими хромос омами 1 и 5.

П риме не ние данного ме тодапозвол яе т пол учить с ве де нияо нал ичии ил и отс утс твии того ил и иного ге на(наприме р, де фе ктного, вызываю щ е го нас л е дс тве нное забол е вание у че л ове ка ил и наоборот ге на, кодирую щ е го хозяй с тве нно-це нные признаки у рас те ний ), нал ичие Д Н К вирус а, разл ичных хромос омных пе ре с трое к и др. 4. Х ро мо со мн ый пэйн т и н г = “хро мо со мн а я ж и в о пи сь ” = мн о го цв ет н а я флуо ресцен т н а я ги бри ди за ци я. В 1990 –х гг. появил ис ь новые мощ ные ме тоды, в ос нове которых л е жит фл уоре с це нтная гибридизация нукл е иновых кис л от in situ (FISHгибридизация). Э то с вязано с приме не ние м новых, бол е е эффе ктивных фл уорохромов и нового оборудования дл я анал изамикрос копиче с ких изображений – цифровых фотоаппаратов, с ое диненных с микрос копом и компь ю те ром (CCD-каме р) вме с то фотокаме р. О дним из наибол е е разре ш аю щ их ме тодов явл яе тс я мн о го цвет н а я флуо ресцен т н а я ги бри ди за ци я ил и хро мо со мн ый пейн т и н г (хромос омнаяживопис ь ). Д л я пол уче ния многоцве тных изображе ний ис пол ь зую т разл ичные фл уорохромы, которыми ме тят разные зонды Д Н К. И нформацияоб инте нс ивнос ти с ве че ния каждого фл уорохромазапис ывае тс я накомпь ю те ре отде л ь но, и каждому из таких изображе ний прис ваивае тс яс вой с обс тве нный пс е вдоцве т. О дновре ме нное ис пол ь зование не с кол ь ких фл уорохромов позвол яе т пол учить не с кол ь ко пс е вдоцве тов. Н априме р, е с л и фрагме нт хромос омы, окраш е нный фл уорохромом а , буде т давать один пс е вдоцве т, фрагме нт, окраш е нный фл уорохромом b - другой , то фрагме нт, окраш е нный a и b одновре ме нно, буде т давать тре тий пс е вдоцве т. И с пол ь зование n фл уорохромов позвол яе т одновре ме нно опре де л ить л окал изацию 2n-1 фрагме нтов Д Н К. Н априме р, приме не ние пяти фл уорохромов дае т возможнос ть анал изировать ре зул ь таты одновре ме нной гибридизации in situ 31 фрагме нтаД Н К. Н оваяприборнаябазапозвол яе т ре гис трировать с ве рхс л абые с ве товые с игнал ы, не дос тупные гл азу че л ове каи с ве товые с игнал ы с дл иной вол ны, выходящ ими за пре де л ы видимого с ве та. П ри ис пол ь зовании тре х фл уорохромов каждую хромос ому че л ове каможно окрас ить в

47

с вой с обс тве нный пс е вдоцве т. Н априме р, окрас ка хромос омы бол е е че м одним цве том с виде те л ь с твуе т о нал ичии транс л окации (обме не ме жду не гомол огичными учас тками хромос ом). В нас тоящ е е вре мяв ряде диагнос тиче с ких це нтров не которые варианты многоцве тной FISH ис пол ь зую тс я в каче с тве рутинных ме тодов при анал изе хромос омных пе ре с трое к у че л ове ка. М ат ери алы и оборудован и е. М икрофотографии (ил и кс е рокопии) кариотипов с ос ны обыкнове нной , пш е ницы, эгил опс а, че л ове ка. М ил л име троваябумага, л ине й ка, ножницы, кл е й , карандаш . Х о д ра бо т ы. Задан ие1. О знакомить с яс ме тодами изуче нияи иде нтификации хромос ом: морфоме триче с ким с ис пол ь зование м с пл ош ного окраш ивания хромос ом, ме тодами диффе ре нциал ь ного окраш ивания, ме тодом цитол огиче с кой гибридизации in situ: ISH- и FISH- гибридизация, хромос омным пэй нтингом. Р ас с мотре ть возможнос ти изуче ния кариотипа при ис пол ь зовании данных ме тодов, их дос тоинс тваи не дос татки. Р е зул ь таты с равните л ь ного анал изазане с ти в табл ицу: М е тоды изуче нияи иде нСуть и краткаяхаВ озможнос ти ме тода, тификации хромос ом ракте рис тикаме тода обл ас ти приме не ния Задан ие2. О знакомить с я с принципами с ос тавл е ния кариограммы и идиограммы. И с пол ь зуя микрофотографии ме тафазных пл ас тинок с ос ны обыкнове нной с о с пл ош ным окраш ивание м хромос ом опре де л ить ос новные параме тры каждой хромос омы. Сос тавить идиограмму изучае мого вида. Д л я этого с микрофотографии выре зать каждую хромос ому. П о визуал ь ному набл ю де нию подбор гомол огичных хромос ом затрудните л е н, поэтому с начал а проме ряю т каждую хромос ому, а зате м уже подбираю т е й парную . О пре де л ить : абс ол ю тную дл ину каждой хромос омы и каждого е е пл е чав мм, атакже их ис тинный разме р в мкм. В ычис л ить ос новные показате л и: относ ите л ь ную дл ину каждой хромос омы, пл е че вой инде кс , це нтроме рный индекс . Р е зул ь таты прове де нных ис с л е дований зане с ти в табл ицу: № Д л ина, мм (ил и мкм) О тнос и- П л е че вой Ц е нтрохромо абс о- Д л инно- Коротко- те л ь ная инде кс ме рный инс омы л ю тная го пл е ча го пл е ча дл ина, % де кс , %

П одобрать пары гомол огичных хромос ом, накл е ить их на бумагу. Сос тавить идиограмму. Д л я этого на мил л име тровой бумаге нарис овать одну из пар хромос ом. Р ас пол агать це нтроме ры по одной прямой , короткое пл е чо – вве рху, дл инное внизу. Задан ие 3. Сос тавить кариограмму с ис пол ь зование м микрофотографий диффе ре нциал ь но окраш е нных хромос ом эгил опс а. Д л я этого вы-

48

ре зать каждую хромос ому эгил опс а, подобрать гомол огичные хромос омы на ос нове с опос тавл е ния их “рис унка” (ис че рче ннос ти), накл е ить парные хромос омы в те традь , рас пол агая це нтроме ры по одной прямой в порядке уме нь ш е ния разме ров хромос ом. Короткие пл е чи рас пол агаю т наве рху, дл инные – внизу. Задан ие 4. О знакомить с я с принципами кл ас с ификации хромос ом че л ове ка, ос обе ннос тями приготовл е ния микропрепаратов, ме тодами изуче ния кариотипа. П е ре рис овать в те традь табл ицу 2 (кл ас с ификация и общ аяхаракте рис тикахромос ом че л ове ка). Задан ие 5. И с пол ь зуя кс е рокопию диффе ре нциал ь но окраш е нных хромос ом, най дите и зарис уй те (выде рживая мас ш таб разме ров хромос ом) ме таце нтриче с кую , с убме таце нтриче с кую и акроце нтриче с кую хромос ому. Укажите номе ра зарис ованных хромос ом. В ыявите морфол огиче с кие отл ичия ме жду отде л ь ными хромос омами и группами хромос ом. Д л я этого дл якаждой группы хромос ом (А , B, C, D, E, F, G, X/Y) опре де л ить двапараме тра: общ ий разме р и це нтроме рный инде кс . О бщ ий разме р вычис л яю т как с умму дл ин двух пл е че й , наприме р, 18+20=38 (мм), а це нтроме рный инде кс раве н (18:38) ⋅ 100 = 47,4. И зме ре ния и вычис л е ния не обходимо с де л ать дл я каждой хромос омы в группе . Зате м най ти с ре дне е арифме ти че с кое дл якаждой из вос ь ми групп. И тоговые ре зул ь таты оформите в виде табл ицы: Группа № хромос омы хромов группе с ом 1 А 2 и т.д. Сре дне е B и т.д.

Д л ина, мм (ил и мкм) Д л инного короткого вс е й хропл е ча пл е ча мос омы

Ц е нтроме рный инде кс , %

Сде л ай те с хе матиче с кий рис унок “ус ре дне нной ” хромос омы, входящ е й в с ос тав каждой группы. Р ис унки хромос ом разных групп выпол няю т в мас ш табе друг относ ите л ь но друга. В Н И М А Н ИЕ ! Задания 1 и 4 выпол няю тс я каждым с туде нтом. И з тре х ос тал ь ных заданий (2,3,5) с туде нтом по выбору выпол няе тс я тол ь ко одно. В оп р ос ы дл я с ам оп р ов ер киикон т р ол я: 1. Ч то такое кариотип, кариограмма, идиограмма? Каковы принципы с ос тавл е ниякариограммы и идиограммы? 2. Какие с ущ е с твую т ме тоды изуче ния и иде нтификации хромос ом? В че м их с уть и какие возможнос ти у каждого ме тодадл яизуче ниякариотипа? 3. Ч то с обой пре дс тавл яе т кариотип че л ове кав норме ? Н апиш ите формул у. Д ай те характе рис тику нормал ь ного кариотипа в с оотве тс твии с Д е н-

49

ве рс кой кл ас с ификацие й . Ч то пол оже но в ос нову П арижс кой кл ас с ификации? 4. О пиш ите ме тоды диффе ре нциал ь ной окрас ки хромос ом. Какие новые возможнос ти появил ис ь в изуче нии кариотипа при их ис пол ь зовании? Т ем а 6. М И Т О Т И Ч ЕС К О Е ДЕ Л Е Н И Е К Л Е Т К И Ц ел ь зан ят ия: 1. О знакомл е ние с ос новным с пос обом де л е нияс оматиче с ких кл е ток – митозом. 2. Н аучить с я иде нтифицировать фазы митоза. 3. О знакомл е ние с ос обе ннос тями проте кания кариокине за и цитокине за (цитотомии) у рас тите л ь ных и животных кл е ток. 4. О знакомить с я с прямым де л е ние м кл е тки – амитозом как откл оне ние м от типичного ходамитоза. 6. П рове с ти с равните л ь ную характе рис тику митозаи амитоза. О с н овн ы е т еорет и чес ки е полож ен и я. М ит оз(от гре ч. mitos - нити) – ос новной , униве рс ал ь ный с пос об де л е ния эукариотиче с ких с оматиче с ких кл е ток, в ре зул ь тате которого из одной с оматиче с кой кл е тки (2n) образую тс я две доче рние ге не тиче с ки равнозначные кл е тки, име ю щ ие то же чис л о хромос ом, какое был о у родите л ь с кой кл е тки. М итоз (ил и кариокине з) – не прямое де л ение ядра с оматиче с кой кл е тки. Э то ос новаве ге тативного (бе с пол ого) размноже ния. М итоз был открыт с помощ ь ю с ве тового микрос копа в 1874 году рус с ким уче ным И .Д . Ч ис тяковым в рас тите л ь ных кл е тках. В 1878 г. В . Ф л е мминг и рус с кий уче ный П .И . П е ре ме жко обнаружил и этот проце с с в животных кл е тках. Д е тал ь ное опис ание с тадий митоза дано Э . Страс бурге ром наматериал е рас тите л ь ных кл е ток (1876-1879 гг.) и В . Ф л е ммингом накл е тках животных. Ф л е мминг пре дл ожил те рмин “митоз”, что означае т де л е ние , при котором образую тс яните видные с труктуры – хромос омы. В митозе выде л яю т двавзаимос вязанных проце с с а– кариокине з (де л е ние ядра) и цитокине з = цитотомия(де л е ние цитопл азмы). Д е л е ние кл е тки начинае тс я с де л е ния ядра. Кариокине з с ос тоит из че тыре х с тадий : профазы, ме тафазы, анафазы и те л офазы (рис унок 19). Про фа за . Х ромос омы конде нс ирую тс я, укорачиваю тс я и утол щ аю тс я, бл агодаря че му к концу профазы с тановятс я отче тл иво видимыми в с ве товой микрос коп. Каждая хромос ома с ос тоит из двух хроматид (с е с тринс ких хроматид), уде рживае мых вме с те це нтроме рой . Конде нс ация хромос ом с овпадае т с ре зким уме нь ш е ние м с инте тиче с ких проце с с ов в кл е тке , проис ходит инактивацияге нов в обл ас ти ядрыш кового организатора, бол ь ш ая час ть бе л ков ядрыш ка дис с оциируе т. К концу профазы ядрыш ко ис че зае т, яде рная обол очка рас падае тс я на ме л кие вакуол и (фрагме нтируе тс я), поровые компл е кс ы ис че заю т и хромос омы оказываю тс я в цитопл азме . В профазе проис ходит образование с пе циал ь ного аппарата кл е точного де л е ния - в ерет ен а делен и я, в с ос тав которого входят с ос тоящ ие из бе л ка тубул ина одиночные микротрубочки (у дрожже й ) ил и их пучки (у

50

выс ш их организмов 20-40 микротрубоче к на одну хромос ому). Ц е нтром образованияве ре те наде л е нияу животных кл е ток явл яе тс якл е точный

Р ис унок 19. Схе мамитозаживотной кл е тки: 1- ядрыш ко, 2- хромос ома, 3- пол ярные те л ь ца, 4- яде рная ме мбрана, 5- пол ю с ные микротрубочки (ве ре те но де л е ния), 6- кине тохоные микротрубочки.

це нтр = пол ярные те л ь ца (ил и це нтрос омы). Как правил о, в образовании ве ре те наде л е нияучас твую т две це нтрос омы, которые в профазе рас ходятс я к разным пол ю с ам кл е тки, от которых и начинае тс я рос т (пол име ризация) микротрубоче к. В ыде л яю т три типамикротрубоче к – ки н ет о хо рн ые, по люсн ые (меж по лярн ые) и а ст ра ль н ые. Ки н ет о хо рн ые микротрубочки тянутс я от пол ю с ов к с е с тринс ким хроматидам и с ое диняю тс я с ними в обл ас ти кине тохора, отве тс тве нного за пе ре ме щ е ние хромос ом при де л е нии. Кине тохорные микротрубочки движут хромос омы во вре мя профазы (пос те пе нно пе ре ме щ аяих в с е ре дину кл е тки, что приводит к образованию в ме тафазе экваториал ь ной пл ас тинки = упорядоче нному рас пол ожению хромос ом) и анафазы. По люсн ые (меж по лярн ые) микротрубочки тянутс я от одного пол ю с ак другому, минуя хромос ому. М икротрубочки, л е жащ ие вне ве ре те наи ис ходящ ие из це нтрос ом в противопол ожную от хромос омы с торону, называю т а ст ра ль н ыми . О ни ос ущ е с твл яю т движе ние це нтрос ом. У выс ш их рас те ний , низш их грибов и не которых прос те й ш их це нтрос омы отс утс твую т. В кл е тках выс ш их рас те ний пол име ризация микротрубоче к проис ходит в цитопл азме по пе рифе рии кл е точного ядравне с вязи с о с пе циал ь ными зонами ил и с труктурами (рис унок 20). М ет а фа за . П роце с с конде нс ации хромос ом продол жае тс я до ме тафазы, при которой укороче ние хромос ом дос тигае т макс имума. Кине тохорные микротрубочки в конце концов приводят каждую хромос ому в эк-

51

ваториал ь ную пл ос кос ть , образуе тс я мет а фа зн а я пла ст и н ка . Ц е нтроме ры вс е х хромос ом рас пол оже ны по экватору, акине тохоры (с прикре пл е нными к ним нитями ве ре те наде л е ния) обращ е ны к противопол ожным пол ю с ам кл е тки. О тче тл иво видны нити ве ре те на. Ч ис л о и форма ме тафазных хромос ом – характе рный признак организма, е го пас порт. Н апомним, что име нно в ме тафазе митозаопре де л яю т кариотип.

Р ис унок 20. Схе ма митоза рас тите л ь ной кл е тки (Све нс он, 1980): 1 – инте рфаза, 2 и 3 – профаза, 4 – ме тафаза, 5 –7 – анафаза, 8 – те л офаза, 9 цитокине з

А н а фа за . Э то с амая короткая с тадия митоза. В анафазе проис ходит важней ш ий биол огиче с кий проце с с , кл ю че вое с обытие митоза – с е гре гацияхромос ом и рас пре де л е ние ге не тиче с кого мате риал аме жду доче рними кл е тками. Ц е нтроме ры, уде рживаю щ ие обе хроматиды каждой хромос омы, де л ятс я попол ам и начинаю т оттал кивать с я однаот другой , направл яяс ь к противопол ожным пол ю с ам кл е тки. Ц е нтроме ра увл е кае т за с обой хроматиду, которая в этом ме с те пе ре гибае тс я, приобре тая V-образную форму. Се с тринс кие хроматиды (пол овинки каждой хромос омы) с тановятс я с амос тояте л ь ными хромос омами. Х ромос омы двигаю тс я к пол ю с ам за с че т укорачивания (де пол име ризации=разборки) микротрубоче к у кине тохоров. Э то так называе маяанафазаА , в которой проис ходит точное рас хожде ние хромос ом к противопол ожным пол ю с ам кл е тки. В о вре мя анафазы В проис ходит удл ине ние пол ярных микротрубоче к и пол ю с ы ве ре те нае щ е дал ь ш е отодвигаю тс я друг от друга(рас хожде ние пол ю с ов вытягивание м ве ре те на). У мл е копитаю щ их с тадии А и В проте каю т практиче с ки одновре ме нно. В рас тите л ь ных кл е тках с тадияВ отс утс твуе т. Каждаяхромати-

52

да, отош е дш ая к пол ю с у, с тановитс я доче рне й хромос омой . Ч ис л о хромос ом у каждого пол ю с аиде нтично чис л у хромос ом ис ходной родите л ь с кой кл е тки. В конце анафазы проис ходит де с пирал изацияхромос омных ните й . Т ело фа за (от гре ч. telos – коне ц). Х ромос омы де конде нс ирую тс я (их уже не л ь зяразл ичить в с ве товой микрос коп), образуе тс яяде рнаяобол очка, вновь появл яю тс яядрыш ки. В те л офазе начинае тс яи заве рш ае тс япроце с с разруш е нияве ре те наде л е ния. Ц и т о ки н ез (ци т о т о ми я). П роис ходит разде л е ние цитопл азмы и образование двух доче рних кл е ток из одной ис ходной . У рас те ний де л е ние кл е тки проис ходит путе м образования кл е точной пе ре городки внутри кл е тки (рис унок 20), ау животных – путе м пе ре тяжки, впячиванияпл азматиче с кой ме мбраны внутрь кл е тки (рис унок 19) за с че т образования под цитопл азматиче с кой ме мбраной с ократимого кол ь ца, с ос тоящ е го из эл е ме нтов цитос ке л е та– актиновых и миозиновых фил аме нтов, которое рас падае тс япос л е разде л е ниякл е тки. У рас те ний в це нтре кл е тки с капл иваю тс я ме л кие вакуол и, с оде ржащ ие пе ктиновые ве щ е с тва, произош е дш ие от вакуол е й Компл е кс а Гол ь джи. В акуол и с л иваю тс ядруг с другом и образую т наэкваторе кл е тки пл ос кую вакуол ь – ф ра гмо пла ст , который разрас тае тс як пе рифе рии кл е тки, а зате м с л ивае тс я с пл азматиче с кой ме мбраной . Так образуе тс я пе рвичная кл е точнаяс те нка, в ре зул ь тате че го кл е ткаде л итс янадве . Биол огич ес кий с м ы с л (зн ач ен ие) м ит оза. 1. Точное рас пре де л е ние ге не тиче с кого мате риал аме жду доче рними кл е тками. В ре зул ь тате митозаобразую тс я дваядра, с одержащ ие одинаковый (ис ходный ) набор хромос ом и одни и те же ге ны. Т.е . обе доче рние кл е тки гене тиче с ки иде нтичны мате ринс кой . М итоз обе с пе чивае т пре е мс тве ннос ть нас л е дс тве нных с вой с тв в ряду кл е точных покол е ний . 2. В ре зул ь тате митоза проис ходит уве л иче ние чис л а кл е ток эукариотиче с кого организма, е го рос т. М итоз – ос новабе с пол ого размноже ния (у однокл е точных организмов) и заме щ е ния кл е ток. М итоз л е жит в ос нове ве ге тативного размноже ниярас те ний . А м ит оз– п р ям оедел ен иекл ет ки. П ри амитозе кл е тканаходитс я в инте рфазном с ос тоянии. Я дро де л итс я путе м пе ре тяжки бе з конде нс ации хроматинаи образования ве ре те наде л е ния, разруш е нияяде рной обол очки и ядрыш е к. Затем проис ходит разде л е ние цитопл азмы и образование кл е точной пе ре городки. Строго равноце нного рас пре де л е ния яде рного (ге не тиче с кого) мате риал аме жду доче рними кл е тками не проис ходит. В с л учае отс утс твия цитокине за образую тс я двуяде рные ил и многояде рные кл е тки (с ядрами разной ве л ичины). В отде л ь ных с л учаях проис ходит фрагме нтацияядра(разде л е ние надва, три и бол е е фрагме нтов). П ос л е амитозакл е ткане с пос обнавс тупать в нормал ь ный кл е точный (митотиче с кий ) цикл . Р ань ш е амитоз опис ывал с я как с амос тояте л ь ный , относ ите л ь но ре дкий тип де л е нияс оматиче с ких кл е ток эукариот. В нас тоящ е е вре мяряд ис с л е довате л е й рас с матривае т е го как откл онение от типичного ходамитоза, как не пол ноце нное де л е ние кл е ток, утративш их с пос обнос ть к митозу.

53

А митоз дос тове рно опис ан при де л е нии пол ипл оидных макронукл е ус ов инфузорий . И х микронукл е ус ы де л ятс я тол ь ко митотиче с ким путе м. А митоз с вой с тве не н тканям вре ме нного характе ра: нуце л л ус у, эндос пе рму, паре нхиме ; де ге не рирую щ им и патол огиче с ки изме не нным (раковым) кл е ткам. А .К. Буториной с с отр. опис аны с л учаи амитозау с ос ны обыкнове нной , произрас таю щ е й в Брянс кой обл ас ти, подве ргш е й с я пос л е дс твиям аварии Ч е рнобыл ь с кой А Э С (рис . 21).

Р ис унок 21. А митоз у с ос ны обыкнове нной (Butorina, 1996). М ат ери алы и оборудован и е. Све товые микрос копы, готовые микропре параты (давл е ные и пос тоянные ), микрофотографии и с хе мы с митозом и амитозом рас тите л ь ных и животных кл е ток. Х о д ра бо т ы. Задан ие1. И зучить под с ве товым микрос копом готовые микропре параты (коре нь л ука, пш е ницы, с ос ны обыкнове нной , яй цо ас кариды, пе че нь акс ол отл я), микрофотографии и с хе мы. Зарис овать с хе му митоза рас тите л ь ной (ил и животной ) кл е тки, с оде ржащ е й 4 хромос омы. Д ать краткую характе рис тику ос новных фаз митоза. Задан ие2. О знакомить с яс ос обе ннос тями проте канияцитокине зау рас тите л ь ных и животных кл е ток. Зарис овать с хе матично цитокине з (цитотомию ) у рас тите л ь ных и животных кл е ток. Задан ие 3. И с пол ь зуя готовые микропре параты (эпите л ия моче вого пузыря мыш и), микрофотографии и с хе мы, ознакомить с я с амитозом. Зарис овать с хе му амитоза. П рове с ти с равните л ь ную характе рис тику митоза и амитоза. В оп р ос ы дл я с ам оп р ов ер киикон т р ол я: 1. Д ать краткую характе рис тику ос новных фаз митоза. 2. Каков биол огиче с кий с мыс л митоза? 3. В че м с ходс тво и отл ичия митоза(кариокине заи цитокине за) рас тите л ь ной и животной кл е тки? 4. Ч то такое амитоз? Каковы е го цитол огиче с кие ос обеннос ти? 5. В че м отл ичиямитозаи амитоза?

54

Т ем а 7. К Л ЕТ О Ч Н Ы Й Ц И К Л И Ф О РМ Ы ЕГ О ПРО ЯВ Л Е Н И Я. О ПРЕ ДЕЛ ЕН И Е М И Т О Т И Ч Е С К О Й А К Т И В Н О С Т И Ц ел ь зан ят ия: 1. О знакомл е ние с разл ичными пе риодами и ре гул яцие й кл е точного цикл а в норме . 2. Уяс нить , что в проце с с е кл е точного цикл а в кл е тке проис ходит изме не ние кол иче с тва Д Н К при с охране нии дипл оидного (с оматиче с кого) набора хромос ом. 3. И зуче ние цитол огиче с ких ос обе ннос тей и пос л е дс твий а) эндомитоза как ре зул ь тата “с бое в” кл е точного цикл апри пе ре ходе кл е тки от с тадии G2 к профазе митоза, б) пол ипл оидии и ане упл оидии как ре зул ь татанаруш е ния рас хожде ния хромос ом в анафазе митоза, в) многояде рных кл е ток как ре зул ь тата многократного выпаде ния проце с с а цитокине за. 4. П ол учить навыки оце нки прохожде ния митозав норме и при разл ичных патол огиях. 5. О знакомл е ние с морфол огиче с кими ос обе ннос тями пол ите нных (многонитчатых) хромос ом как ре зул ь татом многократных цикл ов ре пл икации (с инте за) Д Н К бе з пе ре хода кл е тки к митозу. 5. О пре де л ить митотиче с кую активнос ть кл е ток в зоне де л е ниякорняу разных видов рас те ний . О с н овн ы е т еорет и чес ки е полож ен и я. К л ет оч н ы й (м ит от ич ес кий) цикл – это пе риод с ущ е с твования кл е тки от одного де л е ниядо пос л е дую щ е го. О н с кл адывае тс яиз двух фаз: и н т ерфа зы (подготовки кл е тки к де л е нию ) и ми т о за (М , пе риода де л е ния). И н т ерфа за у бол ь ш инс тва с оматиче с ких кл е ток выс ш их эукариот с ос тоит из тре х пе риодов: преси н т ет и ч еско го (G1, от англ . gap – проме жуток, пропус к), си н т ет и ч еско го = пе риода с инте за Д Н К (S) и по ст си н т ет и ч еско го (G2), рис унок 22. Зате м нас тупае т ми т о з (М ). Гл авными с обытиями цикл аявл яю тс яре пл икация(удвое ние ) Д Н К и с е грегация дупл ицированного набора материнс ких хромос ом на два иде нтичных доче рних набора.

Р ис унок 22. Схе макл е точного цикл а: пре с инте тиче с кий G1пе риод, S- с инте тиче с кий пе риод, G2- пос тс инте тиче с кий пе риод, Go – пе риод покоя; П - профаза, М - ме тафаза, А - анафаза, Т- те л офаза

55

Преси н т ет и ч ески й пери о д G1 нас тупае т с разу пос л е де л е ниякл е тки. Э то пе риод подготовки к с инте зу Д Н К, в котором каждаяиз гомол огичных хромос ом пре дс тавл е наодной хроматидой (одной копие й ) и вкл ю чае т по одной мол е кул е Д Н К. В G1 кл е тки име ю т дипл оидное с оде ржание Д Н К на ядро (2с ) и дипл оидное (с оматиче с кое ) чис л о хромос ом (2n). Н абор хромос ом, т.е формул а кл е тки 2n2c. В этот пе риод проис ходит инте нс ивный рос т и функционирование кл е тки: иде т пе ре пис ывание ге не тиче с кой информации, запис анной в Д Н К и с инте з разл ичных типов Р Н К – мР Н К, рР Н К, тР Н К (транс крипция), с инте з с пе цифиче с ких бе л ков (транс л яция). Э то наибол е е с ил ь но варь ирую щ ий по продол жите л ь нос ти пе риод кл е точного цикл а. О н може т практиче с ки отс утс твовать в активно де л ящ ихс я кл е тках эукариот ил и продол жать с я от 10 час ов до не с кол ь ких с уток и бол ее. С и н т ет и ч ески й пери о д (S), в который проис ходит ре пл икация = удвое ние Д Н К каждой хромос омы (с инте з с е с тринс ких хроматид). Суммарное кол иче с тво Д Н К в ядре кл е тки уве л ичивае тс я вдвое . Каждая хромос омате пе рь с ос тоит из двух хроматид (двух мол е кул Д Н К). Ф ормул акл е тки приобре тае т вид 2n4c. П родол жае тс я с инте з Р Н К и бе л ков. Так, с инте зируе мые наэтой с тадии бе л ки гис тоны с разу же с ое диняю тс яс вновь с инте зированной мол е кул ой Д Н К, образуя хроматин. S-пе риод продол жае тс я не с кол ь ко час ов, обычно 6-10 час ов. По ст си н т ет и ч ески й пери о д (G2), ил и пе риод подготовки к кл е точному де л е нию . Каждая хромос омапре дс тавл е надвумя с е с тринс кими хроматидами. Ф ормул а кл е тки 2n4c. Инте нс ивно проходят биос инте тиче с кие проце с с ы: с инте зирую тс я бе л ки ве ре те на де л е ния, иде т накопл е ние эне ргии дл я митоза(в виде А ТФ ) и др. К концу G2-пе риодав кл е тке затухаю т вс е с инте тиче с кие проце с с ы, начинаю тс я проце с с ы конде нс ации хромос ом, хромос омы пос те пе нно пе ре ходят в ме табол иче с ки не активное с ос тояние . П родол жите л ь нос ть ме нь ш е , че м у G1- и S- пе риодов и обычно с ос тавл яе т 3-6 час ов. В о вре мя ми т о за (М -фаза) проис ходит с е гре гация хромос ом (рас хожде ние с е с тринс ких хроматид каждой хромос омы к пол ю с ам), кол иче с тво Д Н К вновь уме нь ш ае тс я в 2 раза. Ч ис л о же хромос ом в те че ние вс е го кл е точного цикл ане изме няе тс я. Ф ормул адоче рне й кл е тки вновь с тановитс я 2n2c. Кл е ткаопять вс тупае т в G1 – пе риод. Кл е точный цикл - однонаправл е нный проце с с , где кл е ткапос л е довате л ь но проходит разные е го пе риоды, бе з их пропус каи возвратак пос л е дую щ им с тадиям. П родол жите л ь нос ть кл е точного цикл ас ил ь но варь ируе т в завис имос ти от типакл е ток и ткани, видаорганизмаи вне ш них ус л овий (те мпе ратуры, питате л ь ных ве щ е с тв и др.). Е го дл ите л ь нос ть може т быть ме нь ш е час а(в кл е тках ранне го эмбрионал ягуш ки) ил и бол е е года(в кл е тках пе че ни взрос л ого че л ове ка). К активно де л ящ имс я кл е ткам взрос л ых организмов относ ятс я крове творные , базал ь ные кл е тки эпиде рмис а и тонкой киш ки. О ни могут входить в кл е точный цикл каждые 12-36 час ов.

56

Н амитоз приходитс я1/7-1/10 час ть вс е го кл е точного цикл а. М итоз в кл е тках животных дл итс я30-60 минут, в рас тите л ь ных – 2-3 час а. О тнош е ние де л ящ ихс якл е ток к общ е му чис л у кл е точных попул яций пол учил о название про ли фера т и вн о го пула . У многокл е точных зре л ых организмов бол ь ш ая час ть диффе ре нцированных (с пе циал изированных) кл е ток пе ре с тае т де л ить с я и находитс я в G0-пери о де (пе риоде покоя = “вне цикл а”). Э то, наприме р, не рвные и мыш е чные кл е тки, пе ре с тавш ие де л ить с я пос л е заве рш е ния эмбрионал ь ного пе риода развития и функционирую щ ие на протяже нии жизни организма. О бычно кл е тки пе ре ходят к с пе циал изации (G0-пе риоду) из фазы G1, поэтому в G0-пе риоде каждая хромос омапре дс тавл е наодной хроматидой , а формул акл е тки - 2n2c. П ри опре де л енных ус л овиях: при с тимул яции рос товыми факторами, повре жде нии органов (наприме р, пос л е час тичного удал е ния пе че ни животного) покоящ ие с я кл е тки могут с новаде диффе ре нцировать с я (поте рять с пе циал изацию ) и из G0-пе риодавс тупить в кл е точный цикл – вновь ве рнуть с яв с ос тояние , с вой с тве нное пе риоду G1 и пос л е прохожде нияпе риодов S и G2 прис тупить к де л е нию . Регул яция кл ет оч н ого цикл а. В нас тоящ е е вре мя ус тановл е но, что прохожде ние кл е тки по вс е м пе риодам кл е точного цикл ас трого гене тиче с ки контрол ируе тс я. Н обе л е вс кая пре мия по физиол огии и ме дицине за2001г. прис ужде натре м уче ным: Л . Х артве л л у (СШ А ), Т. Х анту и П . Н е рс у (А нгл ия) заис с л е дования в изуче нии ре гул яции кл е точного цикл а, которые они выпол нил и на моде л ь ном объ е кте – дрожжах (однокл е точных прос то ус трое нных эукариотиче с ких организмах). Так как кл ю че вые бе л ки кл е точного цикл апочти не изме нил ис ь в проце с с е эвол ю ции (они с ходны у дрожже й и че л ове ка, т.е . дос таточно униве рс ал ь ны), то ре зул ь таты, пол уче нные на дрожжах, с ущ е с тве нны дл я вс е х эукариот. Уче ными был и открыты ге ны, продукты которых учас твую т в ре гул яции кл е точного цикл аи ус тановл е но, что кл ю че выми бе л ками, вовл е че нными в ре гул яторные с обытия, явл яю тс я цикл ины (cyclins) и цикл ин-завис имые киназы – проте инкиназы (cdk – cyclin dependent kinases). Ц и кли н -за ви си мые ки н а зы (с ущ е с твуе т не с кол ь ко разновиднос те й бе л ков-фе рме нтов) прис утс твую т в кл е тке пос тоянно и их конце нтрация ос тае тс я практиче с ки не изме нной . Н априме р, cdk28 отве чае т за “с тарт” многих с обытий – запус кае т ре пл икацию Д Н К, формирование митотиче с кого ве ре те наи др. О днако они находятс я в кл е тке в не активном с ос тоянии и не могут с амос тояте л ь но ре гул ировать прохожде ние кл е тки по пе риодам кл е точного цикл а. А ктивация с оотве тс твую щ е й cdk проис ходит пос л е е е взаимоде й с твия с о с пе цифиче с ким цикл ином, которые пос л е образования компл е кс а cyc/cdk начинаю т фос форил ировать с вои бе л кимиш е ни, что, в с вою оче ре дь , активируе т ге ны, продукты которых не обходимы нас л е дую щ е й фазе цикл а. О бразование же компл е кс аcyc/cdk с тановитс я возможным тол ь ко пос л е дос тиже ния цикл ином критиче с кой конце нтрации. Ц икл ины пол учил и с вое название от того, что их внутрикл е -

57

точная конце нтрация пе риодиче с ки изме няе тс я по ме ре прохожде ния кл е ток че ре з кл е точных цикл , дос тигая макс имумана е го опре де л е нных с тадиях. Т.е . цикл ины прис утс твую т в кл е тке не пос тоянно. Синте з с пе цифиче с кого цикл ина проис ходит в с трого опреде л е нный пе риод кл е точного цикл ав отве т навне ш ние с тимул ы (которые называю т ми т о ген н ые с тимул ы). В отве т на уме нь ш е ние внутрикл е точной концентрации конкре тного цикл инапроис ходит обратимаяинактивацияс оотве тс твую щ е й cdk. Кл е тка с новас тановитс ячувс твите л ь нак с игнал ам, ре гул ирую щ им де л е ние . Р азнообразные с оче тания цикл инов и цикл инзавис имых киназ ре гул ирую т пе ре ход кл е тки от одного пе риодакл е точного цикл ак другому и запус к разл ичных с обытий : митоза, начал о проце с с а транс крипции в G1пе риоде , ре пл икацию Д Н К в S-пе риоде и др. Так, одним из кл ю че вых бе л ков, ре гул ирую щ им вс тупл е ние кл е тки в митоз (G2/M-пе ре ход), явл яе тс я с пе цифиче с каяс е рин/тре онин проте инкиназа, котораянос ит название фактор с озре вания(Ф С=MPF, от англ . maturation promoting factor). О н с ос тоит из цикл инаВ и продуктаге наcdk2. В активной форме фе рме нт катал изируе т фос форил ирование многих бе л ков, принимаю щ их учас тие в митозе , таких, наприме р, как входящ ий в с ос тав хроматинагис тон H1, бе л ки митотиче с кого ве ре те на, ряд фе рме нтов и др. Ф ос форил ирование этих бе л ков запус кае т проце с с митоза. MPF-фактор име е т бол ь ш ое значе ние и в обе с пе че нии пе ре ходак ме й отиче с кому де л е нию . И зве с тно окол о 100 ге нов, продукты которых вовл е че ны в ре гул яцию митозау дрозофил ы, мыш и, че л ове каи дрожже й , что с ос тавл яе т 1/6 вс е х ге нов кл е точного цикл а. Кроме того, ус тановл е но, что в кл е точном цикл е е с ть не с кол ь ко точе к контрол я = точе к прове рки (check-points), в которых обе с пе чивае тс я контрол ь при пе ре ходе кл е тки G1→S, G2→M и от ме тафазы к анафазе митоза. В этих пунктах де й с твую т так называе мые “пол ице й с кие ге ны” (вс е они пол учил и имя rad, к которому добавл яе тс я порядковый номе р, наприме р, rad51), продукты которых (rad-бе л ки) организую т тщ ате л ь ную прове рку це л ос тнос ти ге не тиче с кого мате риал а и готовнос ть к пе ре ходу в с л е дую щ ую с тадию цикл а. Н апример, в точке контрол я М -А (ме тафазаанафаза– пе ре ход) ос ущ е с твл яе тс я прове ркаправил ь нос ти с борки ве ре те наи правил ь нос ть прикре пл е ния хромос ом к ве ре те ну, с ос тояние кине тохоров, что обе с пе чивае т правил ь ную с е гре гацию хромос ом. Се гре гация хромос ом у вс е х эукариот заде рживае тс я под де й с твие м аге нтов, наруш аю щ их формирование ве ре те на(наприме р, при де й с твии кол хицина). Е с л и в кл е тке повре жде наД Н К и с инте зирую тс я не те бе л ки, которые дол жны с инте зировать с я на данном этапе , в кл е тку пос тупае т с игнал , бл окирую щ ий е е пе ре ход в с л е дую щ ую фазу. П ри обнаруже нии с л абых де фе ктов (“ош ибок”) вкл ю чае тс я с ис те мал иквидации повре жде ний Д Н К и вос с тановл е ния е е ис ходной с труктуры. Е с л и же повре жде ния Д Н К значите л ь ны и их ис правл е ние не проис ходит, кл е ткал ибо с амоуничтожае тс я с помощ ь ю проце с с аапоптоза(ге не тиче с ки программируе мой с ме рти кл е тки), л ибо вс тупае т дал е е в абе ррантное де л е ние . Т.е . “точки контрол я” кл е -

58

точного цикл а пре дс тавл яю т с обой ме ханизм, который пре дохраняе т де л ящ ие с якл е тки от л е тал ь ного митоза. Считаю т, что эти открытиябудут приме нять с япри диагнос тике опухол е й и приве дут к разработке новых с пос обов борь бы с раком, т.к. у бол ь ш инс тва изве с тных типов опухол е вых кл е ток наруш е но ре гул яция кл е точного цикл а. П риче м, в каждой опухол и по-с вое му. Так, в одних кл е тках с л иш ком много цикл инов, поэтому они де л ятс ябыс тре е обычного, у других – откл ю че ны ге ны группы rad “пол ице й с кие ге ны”, в ре зул ь тате че го выходят из с троя “точки контрол я” и кл е тка, игнорируя накопивш ие с япатол огии, вс тупае т в митоз и др. Ф ор м ы п р ояв л ен ия (от кл он ен ия от т ип ич н ого х ода) кл ет оч н ого цикл а. - Н екот ор ы еп ат ол огии м ит оза. Е с л и де л ящ ие с я дипл оидные кл е тки (2n = 2x) нане которое вре мя охл адить ил и обработать ве щ е с твом, разруш аю щ им микротрубочки ве ре те на де л е ния (наприме р, кол хицином), то произой де т разруш е ние (бл окада) ве ре те наде л е ния, в ре зул ь тате че го с е с тринс кие хроматиды не разой дутс я к пол ю с ам в анафазе митозаи вс е попадут в одно ядро. Ч ис л о хромос ом удвоитс я. О бразуе тс я по ли пло и дн а я кл е ткас одним те трапл оидным (2n = 4x) ядром (рис унок 23). Е с л и де й с т -

Р ис унок 23. П атол огии митоза, приводящ ие к изме не нию чис л ахромос ом у доче рних кл е ток [М ю нцинг, 1967]: А - нормал ь ный митоз в с оматиче с кой кл е тке с 4 хромос омами (2n=2x=4); Б- ве ре те но де л е ния не образуе тс я, хроматиды не рас ходятс я к пол ю с ам, возникае т одна пол ипл оидная доче рняя кл е тка с 8 хромос омами (2n=4x=8); В - в с л учае рас хожде ния обоих хроматид одной хромос омы (с амой мал е нь кой на рис унке ) к одному пол ю с у, возникаю т две ане упл оидные доче рние кл е тки: с тре мя хромос омами (2n-1)- ве рхняя и с пять ю (2n+1) – нижняя.

59

вие кол хицинапродол жае тс яи кл е ткапос л е прохожде нияпе риодов G1, S и G2 вс тупае т в новое митотиче с кое де л е ние , то чис л о хромос ом е щ е раз удвоитс я, образуе тс я октопл оидная (2n = 8x) кл е тка и т.д. По ли пло и ди я (от гре ч. poly- много и ploos- с кл адывать ) – кратное уве л иче ние по отнош е нию к дипл оидному набору чис л ахромос ом в ре зул ь тате пол ного не рас хожде ния хромос ом (с е с тринс ких хроматид) в анафазе митоза, (т.е . выпадения с тадии анафазы). Се л е кционе ры час то ис пол ь зую т такой прие м дл япол уче нияпол ипл оидных рас те ний , не редко обл адаю щ их повыш е нной продуктивнос ть ю , урожай нос ть ю , адаптивнос ть ю по с равне нию с ис ходными дипл оидными экзе мпл ярами. П рактиче с ки пол овинавозде л ывае мых че л ове ком кул ь турных рас те ний явл яю тс я пол ипл оидами. П ри этом, чис л о хромос ом разных видов одного родакратно одному общ е му чис л у, пол учивш е му название о сн о в н о е ч и сло хромос ом и обозначае мое как х. Н априме р, виды родаTriticum L. име ю т ос новное чис л о хромос ом, равное 7. П оэтому T. monococcum (2n=2x=14), пш е ницаоднозе рнянка- дипл оидная; T. durum (2n=4x=28), тве рдаяпш е ница- те трапл оидная; T. aestivum (2n=6x=42), мягкая пш еница – с амая продуктивная и наибол е е рас прос тране нная (> 4/5 вс е й пос е вной пл ощ ади этой кул ь туры), ос новной хл е бный зл ак наЗе мл е ге кс апл оидная. П ол ипл оидия у животных ме не е рас прос тране на, че м у рас те ний . Э то с вязано с те м, что у животных изме не ние уровня ге нного бал анс аме жду пол овыми хромос омами и аутос омами заме тно вл ияе т на жизне с пос обнос ть ос оби. П ол ипл оидные ос оби обнаруже ны с ре ди че рве й , нас е комых, ракообразных, рыб, амфибий и др. О ткл оне ние от дипл оидного уровня у животных час то вызывае т с те рил ь нос ть , ау че л ове ка– л е тал ь ный ис ход (пол ипл оидия) ил и разл ичные по с вое й тяже с ти хромос омные бол е зни (ане упл оидия). И зме не ние чис л а хромос ом (уве л иче ние ил и уме нь ш е ние ), не кратное ос новному чис л у хромос ом вида, возникаю щ е е в ре зул ь тате не правил ь ного рас хождения одной ил и не с кол ь ких хромос ом в анафазе митоза приводит к а н еупло и ди и . Так, в с л учае поте ри одной хромос омы у дипл оидных организмов возникаю т мо н о со ми ки (2n-1), пары гомол огичных хромос ом – н улли со ми ки (2n-2), которые явл яю тс я с л або- ил и не жизне с пос обными. П ри добавл е нии одной л иш не й хромос омы возникаю т т ри со ми ки (2n+1), двух – т ет ра со ми ки (2n+2). В с тре чаю тс яи бол е е с л ожные варианты. - М ногократное де л е ние ядра (кариокине з) бе з пос л е дую щ е го де л е ниякл е тки (цитокине з) може т приве с ти к появл е нию многояде рных кл е ток с иде нтичными по ге не тиче с кому с ос таву и разме ру ядрами. М ногояде рные кл е тки с оче нь бол ь ш им чис л ом яде р называю тс я си мпла ст а ми (с инцитиями). - Э н дом ит оз (внутре нний митоз) – однократное ил и многократное удвое ние чис л ахромос ом в ядре кл е тки бе з образованияве ре те наде л е ния, разруш е ния яде рной обол очки и пос л е дую щ е го де л е ния ядра и с амой кл е тки. Ч ащ е вс е го проис ходит в диффе ре нцированных кл е тках. Э ндоми-

60

тоз – ре зул ь тат “с бое в” кл е точного цикл а при пе ре ходе кл е тки от с тадии G2 к профазе митоза. В озникае т вс л е дс твие наруш е ния проце с с а митоза при не наруш е нной ре пл икации хромос ом. П ри эндомитозе хромос омы проходят те же с тадии, что и при нормал ь ном митозе . П риче м, митотиче с кая конде нс ация хромос ом, обос обл е ние хроматид бе з пос л е дую щ е го их рас хожде ния к пол ю с ам проис ходят внутри ядра, что приводит к однократному удвое нию чис л ахромос ом. П ос л е оче ре дной ре пл икации Д Н К в S-пе риоде , кл е ткавновь вс тупае т в эндомитоз, проис ходит двукратное удвое ние чис л ахромос ом в ядре и уве л иче ние разме ров с амого ядраи т.д. В пе рвые явл е ние эндомитоза был о изуче но в кл е тках разл ичных ткане й водяного кл опаге ррии. У рас те ний амитоз впе рвые был опис ан дл я кл е ток тапе тумаш пината. В с тре чае тс яв кл е тках кл убнякартофе л яв пе риод крахмал ообразования. - Пол ит ен ия (от гре ч. poly – много, tenia - нить ) – многонитчатое с ос тояние хромос ом. Э то ре зул ь тат многократных цикл ов ре пл икации (с инте за) Д Н К бе з пос л е дую щ е й с е гре гации хромос ом (т.е . рас хожде ния доче рних хроматид) в митозе . М е ханизм де л е ния ядра и кл е тки пол нос ть ю бл окирован. Кл е точный цикл с ос тоит тол ь ко из двух пе риодов – S (с инте з Д Н К) и G (ме жс инте тиче с кий ), что приводит к прогре с с ивному уве л иче нию кол иче с тваД Н К в ядре (рис унок 25). Кл е тканаходитс яв инте рфазном с ос тоянии. Я де рная обол очка и ядрыш ко пос тоянно прис утс твую т в ходе с л е дую щ их один задругими цикл ов ре пл икации Д Н К. П ол ите ния приводит к уве л иче нию чис л а хроматид в хромос оме (чис л о которых може т пре выш ать тыс ячу) и образованию ги га н т ски х (по ли т ен н ых) хромос ом (рис унок 24). В пе рвые пол ите нные хромос омы был и обнаруже ны Е . Бал ь биани в 1881 г. в кл е тках с л ю нных же л е з л ичинки комараChironomus plumosus, апозже был и опис аны в ядрах эндос пе рма, с ине ргид и антипод разл ичных с е ме й с тв рас те ний . У дрозофил ы, наприме р, в кл е тках с л ю нной же л е зы може т произой ти до 6-8 цикл ов ре пл икации, в ре зул ь тате че го с те пе нь пол ите нии (n – отнош е ние кол иче с тваД Н К в ядрах с пол ите нными хромос омами к с оде ржанию Д Н К в обычном дипл оидном ядре ) дос тигае т 1024 – 4096n. У не которых хирономид (их л ичинку называю т мотыл е м) с те пе нь пол ите нии дос тигае т 8000 – 32000n. В кл е тках пол ите нные хромос омы с тановятс я видны пос л е дос тижения с те пе ни пол ите нии в 62-128n. П ол ите ния возникае т и дос тигае т выс оких с те пе ней в тканях и органах, вовл е че нных в проце с с ы инте нс ивной с е кре ции, ос ущ е с твл яе мые на фоне быс трого рос таоргана. Таковы питаю щ ие кл е тки ооцитов, ш е л коотде л ите л ь ные , с л ю нные же л е зы, антиподы, с ус пе нзор, эндос пе рм. Ч ис л о пол ите нных хромос ом в ядре чащ е вс е го гапл оидное , так как гомол огичные хромос омы каждой пары объ е диняю тс я и находятс я в с ос тоянии с оматиче с кой конъ ю гации, в ре зул ь тате че го общ е е чис л о хромос ом уме нь ш ае тс явдвое . Так, в кл е тках с л ю нных же л е з л ичинки дрозофил ы 4 пары пол ите нных хромос ом те с но конъ ю гирую т друг с другом (рис унок

61

24). Н а рис унке видны рай оны, где две хромос омы л е жат с вободно (ас инапс ис ).

Р ис унок 24. П ол ите нные хромос омы с л ю нных же л е з дрозофил ы [Ге рш е нзон, 1979]. Справа при таком же уве л иче нии ме тафазные хромос омы с оматиче с кой кл е тки. Стре л ками указаны пуфы.

Р ис унок 25. Схе ма с трое ния пол ите нной хромос омы (А ) и е е учас тков (Б) [Ч е н-цов, 2004]: а- нить инте рфазной хромос омы с учас тками конде нс ированного хроматина, б- две нити пос л е одного цикл а ре пл икации, в- вос е мь ните й пос л е тре х цикл ов ре пл икации; 1- дис ки, 2ме ждис ковые учас тки, 3- пуф, образовавш ий с я зас че т де конде нс ации хроматинадис ка.

П ол ите нные хромос омы отл ичаю тс я от митотиче с ких це л ым рядом ос обе ннос те й . 1. Э то моде л ь интерфазных хромос ом: они макс имал ь но де конде нс ированы и находятс я в с ос тоянии, когда ге ны име ю т макс имал ь ные возможнос ти дл я работы, т.е . это активно функционирую щ ие хромос омы. 2. Э ти хромос омы име ю т гигантс кие разме ры, так как с ос тоят из тыс яч прил е гаю щ их друг к другу де конде нс ированных хроматид. П ол ите нные хромос омы дос тигаю т 100-250 мкм в дл ину и 15-25 мкм в ш ирину, тогда как с ре дняя дл ина обычных (ме тафазных) хромос ом разл ичных организмов може т с ос тавл ять от 0,2 до 50 мкм. Так, общ ая дл иначе тыре х пар пол ите нных хромос ом в с л ю нных же л е зах л ичинки дрозофил ы с ос тавл яе т 2000 мкм (2 мм), а в обычных с оматиче с ких кл е тках разме ры митотиче с ких (ме тафазных) хромос ом в с умме с ос тавл яю т 7,5 мкм (рис унок 24). 3. П ол ите нные хромос омы с труктурно не однородны по дл ине и име ю т характе рный рис унок попе ре чной ис че рче ннос ти. О ни с ос тоят из ди ско в , меж ди ско вых уч а ст ко в и пуфо в. Д и ски (окраш е нные те мные пол ос ы, хромоме ры) пре дс тавл яю т с обой учас тки конде нс ированного хроматинаи с оотве тс твую т ме с топол оже нию одного ил и не с кол ь ких ге нов. У дрозофил ы, наприме р, име е тс я окол о 3,5 тыс . дис ков. Д ис ки разде л е ны ме ж-

62

дис ковыми прос транс твами (с ве тл ые зоны, ме хромоме ры), с ос тоящ ими из рыхл о упакованного хроматина. Кол иче с тво Д Н К, приходящ е е с я на вс е ме ждис ки с ос тавл яе т 3-5% от е е общ е го кол иче с твав пол ите нных хромос омах. Р азме ры, кол иче с тво и ме с топол оже ние дис ков с трого индивидуал ь ны дл я каждой хромос омы (но одинаковы дл я гомол огичных хромос ом). Пуфы (вздутия) – вре ме нные образования на хромос омах. О ни возникаю т в ре зул ь тате де конденс ации и разрыхл е ния отде л ь ных дис ков. В пуфах выявл яе тс я Р Н К, которая там же и с инте зируе тс я, т.е . пуф явл яе тс я ме с том транс крипции Д Н К и с оотве тс твуе т учас ткам хромос омы, где ге ны активно функционирую т. Т.е . пуфы явл яю тс яцитол огиче с ки видимым выраже ние м ге нной активнос ти нахромос омном уровне . П риче м, наразных с тадиях развития л ичинки рас пол оже ние пуфов ме няе тс я, так как ге ны вс тупаю т в работу в разное вре мяи разных с оотнош е ниях в ре зул ь тате че го наразных этапах развитияс инте зирую тс яразл ичные бе л ки. М ат ери алы и оборудован и е. Све товые микрос копы, готовые микропре параты (давл е ные и пос тоянные ), микрофотографии и с хе мы с митозом (нормаи патол огии) рас тите л ь ных и животных кл е ток. Ход работ ы . Задан ие 1. И с пол ь зуя готовые микропре параты, рас с мотре ть разл ичные пе риоды кл е точного цикл а у рас тите л ь ных и животных кл е ток (коре нь с ос ны, л ука, яй цо ас кариды). Н арис овать с хе му кл е точного цикл акл е ток, с оде ржащ их 6 хромос ом, подпис ать вс е е го пе риоды. Указать чис л о хромос ом (n), чис л о хроматид и относ ите л ь ное с оде ржание Д Н К (c) дл я вс е х пе риодов кл е точного цикл а. Сде л ать вывод как изме няе тс я чис л о хромос ом и кол иче с тво Д Н К в ходе кл е точного цикл а. Задан ие 2. О пре де л ить митотиче с кую активнос ть кл е ток в зоне де л е ниякорняу разных видов рас те ний . М и т о т и ч еска я а кт и вн о ст ь – это относ ите л ь ное чис л о кл е ток, находящ ихс я в митозе . П оказате л е м, характе ризую щ им митотиче с кую активнос ть ткани, явл яе тс я ми т о т и ч ески й и н декс (М И ) – отнош е ние чис л а де л ящ ихс я кл е ток (т.е . находящ ихс я в митозе ) к общ е му чис л у прос мотре нных кл е ток, выражае мый в проце нтах и рас с читывае мый по формул е : П+ М + А +Т ⋅ 100% , где И – чис л о кл е ток в инте рфазе , П – МИ И + П+ М + А +Т чис л о кл е ток в профазе , А – чис л о кл е ток в анафазе , Т – чис л о кл е ток в те л офазе . И ногдамитотиче с кий инде кс выражаю т в промил л е ( 000 ), т.е . чис л ом митозов на1000 кл е ток ис с л е дуе мого учас ткаткани. В этом с л учае пол уче нную ве л ичину умножаю т не на100, ана1000. О пре де л ить митотиче с кий инде кс у разных видов рас те ний , подс читав общ е е чис л о кл е ток в пол е зре ния, в том чис л е находящ ихс янаразных с тадиях митоза, не ме не е че м в 10 пол ях зре ния. Д анные зане с ти в табл ицу. П о ре зул ь татам ис с л е дований с де л ать с оотве тс твую щ ие выводы.

63

М итотиче с кий инде кс в зоне де л е ниякорняу разных видов рас те ний П ол е О бщ е е чис л о зре ния прос мотре нных кл е ток в пол е зре ния

И з них де л ящ ихс якл е ток М итотиче с кий вс е го по с тадиям митоза инде кс , % (с ре дне е из 10 П М А Т пол е й зрения)

Задан ие3. И с пол ь зуяготовые микропре параты, микрофотографии и с хе мы, рас с мотре ть разл ичные типы откл оне ния кл е точного цикл а. Зарис овать в виде с хе мы как проис ходит образование : пол ипл оидной , ане упл оидной и многояде рной кл е ток. Указать с какими наруш е ниями кл е точного цикл ас вязано их возникнове ние ? Задан ие4. И с пол ь зуяготовые микропре параты, рас с мотре ть морфол огию пол ите нных хромос ом хирономус а. Зарис овать пол ите нные хромос омы, указав на рис унке дис ки, ме ждис ковые учас тки и пуфы. П рове с ти с равните л ь ную характрис тику ос обе ннос те й с трое ния митотиче с ких и пол ите нных хромос ом. Д анные оформить в виде табл ицы. В оп р ос ы дл я с ам оп р ов ер киикон т р ол я: 1. Н азовите ос новные пе риоды кл е точного цикл аи охаракте ризуй те проце с с ы, проис ходящ ие в них. Как изме няе тс я морфол огия хромос ом и формул акл е тки (набор хромос ом) в проце с с е кл е точного цикл а? 2. Как ос ущ е с твл яе тс яре гул яциякл е точного цикл а? 3. С какими наруш е ниями кл е точного цикл ас вязаны с л е дую щ ие явл е ния: пол ипл оидия, ане упл оидия, эндомитоз, пол ите ния? Каковы цитол огиче с кие причины возникнове нияпол ипл оидных кл е ток? 4. Ч е м пол ите нияотл ичае тс яот пол ипл оидии? 5. Н акл е тку поде й с твовал и кол хицином, бл окирую щ им с борку бе л ков – тубул инов, входящ их в с ос тав ве ре те наде л е ния. Какие с тадии митозабудут наруш е ны? 6. К че му приве де т: а) пол ное не рас хожде ние вс е х хроматид к пол ю с ам в анафазе митоза? б) не рас хожде ние отде л ь ных хромос ом к пол ю с ам в анафазе ? в) многократное де л е ние ядра (кариокине з) бе з пос л е дую щ е го де л е ниякл е тки (цитокине з). 7. О преде л ить урове нь пл оиднос ти разл ичных видов картофе л я, име ю щ их ос новное чис л о хромос ом, равное 12. а) Solanum gibberuloseum Jus. et Bik, 2n=24; б) S. maglia Schlecht, 2n=36; в) S. tuberosum L. (кул ь турный ), 2n=48; г) S. demissum Lind. L., 2n=72. 8. О с новное чис л о хромос ом в роде Beta (с ве кл а) равно 9. Какое чис л о хромос ом име ю т дипл оидные , трипл оидные и те трапл оидные рас те ния? 9. В с оматиче с ких кл е тках пш е ницы с оде ржитс я 42 хромос омы. Какое чис л о хромос ом будут име ть кл е тки трис омика, монос омикаи нул л ис омика? 10. В с оматиче с ких кл е тках с орго с оде ржитс я 20 хромос ом. Какое чис л о хромос ом будут име ть кл е тки трис омикаи монос омика?

64

11. В че м отл ичие пол ите нных хромос ом (по с трое нию и функциям) от митотиче с ких (ме тафазных)? Т ем а 8. М ЕЙО З Ц ел ь зан ят ия: 1. О знакомл е ние с ме й озом – с пос обом де л е ниякл е тки, обе с пе чиваю щ им ре дукцию чис л а хромос ом и образование ге не тиче с ки не равнозначных гапл оидных кл е ток. 2. Н аучить с я иде нтифицировать фазы и с тадии ме й озав норме , ознакомить с я с ос обе ннос тями проте кания ме й озау рас тите л ь ных и животных организмов. 3. О знакомл е ние с типами образования те трад у однол ь ных и двудол ь ных рас те ний . 4. П рове с ти с равните л ь ную характе рис тику митозаи ме й оза. О с н овн ы е т еорет и чес ки е полож ен и я. М ейо з(от гре ч. meiosis - уме нь ш е ние ) – ос обый тип де л е ния кл е тки, при котором проис ходит кратное уме нь ш е ние (ре дукция) наборахромос ом и пе ре ход кл е ток из дипл оидного с ос тояния в гапл оидное . Э то один из этапов, пре дш е с твую щ их проце с с у пол ового размноже ния эукариотиче с ких организмов и л е жащ их в ос нове формирования пол овых кл е ток (гаме т). М е й оз был впе рвые опис ан не ме цким гис тол огом В . Ф л е ммингом у животных в 1882 году и пол ь с ким ботаником Э . Страс бурге ром у рас те ний в 1888 году. Сущ е с твуе т не с кол ь ко разновиднос те й (типов) ме й озав завис имос ти от того, накаком этапе жизне нного цикл аорганизмапроис ходит ме й оз. 1 т и п мейо за - зигот н ы й (ил и начал ь ный ) характе рен дл я многих грибов (ас комице тов, базидиомице тов), не которых водорос л е й . М ей оз нас тупае т с разу пос л е с л ияния гаме т (с ингамии), при пе рвом же де л е нии зиготы. В этом с л учае в жизне нном цикл е организмапре обл адае т гапл оидная фаза, адипл оиднаяфазас ве де нак с ущ е с твованию одной кл е тки – зиготы. 2 т и п мейо за - гам ет н ы й (ил и коне чный ) характе ре н дл я вс е х многокл е точных животных, че л ове ка, прос те й ш их, не которых низш их рас те ний . П роис ходит в дипл оидных гаме тообразую щ их кл е тках. В этом с л учае в жизне нном цикл е пре обл адае т дипл оиднаяфаза. Гапл офазаже пре де л ь но ре дуцированаи пре дс тавл енагапл оидными кл е тками – с пе рматозоидами и яй це кл е ткой . Так, ме й оз у че л ове капроис ходит в первичных дипл оидных пол овых кл е тках: с пе рматогониях у мужчин ил и оогониях у же нщ ин (рис унок 26). М ужс кие пол овые кл е тки (с пе рматозоиды) образую тс я в ходе сперма т о ген еза , идущ е го в три с тадии: размноже ние путе м митоза в с е ме нниках дипл оидных кл е ток с пе рматоге нной ткани, в ре зул ь тате которого образую тс я с пе рматоциты (2n); рос т (уве л иче ние разме ров) с пе рматоцитов, с опровождаю щ ий с я с инте зом Д Н К и дос траивание м второй хроматиды; с озре вание с пе рматоцитов, которые затем де л ятс яме й озом с образование м гапл оидных (n) с пе рматид, пре вращ аю щ ихс я в с пе рматозоиды бе з дал ь не й ш е го де л е ния ядра. Ж е нс кие пол овые кл е тки (яй це кл е тки) образую тс яв ходе о о ген еза , идущ е го в яичниках тоже в три с тадии: размноже ние

65

дипл оидных кл е ток ооге нной ткани, в ре зул ь тате которого образую тс я ооциты (2n); рос т ооцитов, с опровождаю щ ий с я с инте зом Д Н К и пос трое ние м второй хроматиды хромос ом; с озре вание ооцитов и их де л е ние ме й озом.

Р ис унок 26. Гаме тный тип ме й оза. Схе маос новных этапов с пе рматоге не заи ооге не зау че л ове ка[Бочков, 2002]. 3 т и п мейо за – с п ор ов ы й (ил и проме жуточный ) характе ре н дл я выс ш их рас те ний , рядаводорос л е й , мхов. У выс ш их рас тений ме й оз проис ходит в дипл оидных кл е тках с пороге нной ткани (материнс ких кл е тках с пор) и заканчивае тс я образование м гапл оидных с пор (а не гаме т), которые е щ е не с кол ь ко раз де л ятс я митотиче с ки, в ре зул ь тате че го формирую тс яже нс кие (яй це кл е тка) и мужс кие (с пе рмии) гаме ты. Д л явс е х тре х типов ход ме й озаодинаков (униве рс ал е н). В ре зул ь тате ме й оза из одной ис ходной дипл оидной кл е тки образую тс я че тыре гапл оидные доче рние кл е тки. М е й оз с ос тоит из двух с л е дую щ их друг задругом де л е ний , которым пре дш е с твуе т о дн о кра т н о е удвое ние м Д Н К: редукци о н н о го (мейо зI) и экв а ци о н н о го (мейо з II). В каждом де л е нии выде л яю тс я: профаза, ме тафаза, анафаза и те л офаза (рис унок 27). П ре ме й отиче с кая интерфаза (инте рфаза

66

I) анал огична митотиче с кой инте рфазе . Удвое ние Д Н К (с инте з с е с тринс ких хроматид) проис ходит в S-пе риоде кл е точного цикл а. П оэтому хромос омы, вс тупаю щ ие в проце с с ме й отиче с кого де л е ния, также как и в с л учае митоза, с ос тоят из двух с е с тринс ких хроматид.

Р ис унок 27. Схе мапос л е довате л ь ных с тадий ме й оза[А й ал а, Кай ге р, 1987]. Пер в ое дел ен ие м ейоза (м ейоз I, р едукцион н ое дел ен ие), в котором проис ходит уме нь ш е ние ис ходного чис л ахромос ом в дваразаи пе ре комбинация (обме н) ге не тиче с кого мате риал а ме жду мате ринс кими и отцовс кими хромос омами. Про фа за I (наибол е е продол жите л ь ная фазаме й оза) подразде л яе тс я на5 с тадий . 1. Л епт о т ен а (с тадия тонких ните й ) – начал о с пирал изации и упл отне ния хромос ом, которые с тановятс я разл ичимыми в ядре , приобре тая ните видную форму. 2. Зи го т ен а . О с новное с обытие – ко н ъюга ци я (си н а пси с) гомол огичных отцовс ких и мате ринс ких хромос ом и образование би в а лен т о в. Гомол огичные хромос омы попарно с ое диняю тс я вме с те , образуя бивал е нты, но они е щ е не разл ичимы микрос копиче с ки. В с ос таве каждого бивал е нта хромос омы уде рживаю тс я с помощ ь ю с пе циал ь ной с труктуры - си н а пт о н емн о го ко мплекса – СК (от гре ч. synapsis – с вязь , с ое дине ние ). Так как каждая хромос ома предс тавл е на двумя хроматидами, пары конъ ю гирую щ их хромос ом (бивал е нты) с ос тоят из че тырех хроматид и в с умме из че тыре х мол е кул Д Н К (рис унок 27). Ч ис л о бивал е нтов наядро равно гапл оидному чис л у хромос ом. Н априме р, е с л и в кл е тке чис л о хромос ом равно 24 (2n=24), то образуе тс я12 бивал е нтов (12 II). В зиготе не ме й озас инте зируе тс я не бол ь ш ое кол иче с тво (0,3% от вс е й Д Н К кл е тки) так называе мой zД Н К = зиготе нной Д Н К (так как онаре пл ицируе тс янас тадии зиготе ны, а

67

не в S-пе риоде инте рфазы). П ри обычном митотиче с ком цикл е zД Н К с инте зируе тс я с ос новной мас с ой Д Н К в S-пе риоде инте рфазы, но при ме й озе – тол ь ко нас тадии зиготе ны. Был о ус тановл е но, что е с л и нас тадии зиготе ны подавить с помощ ь ю ингибиторов с инте з zД Н К, то конъ ю гация хромос ом не проис ходит. ZД Н К рас пол агае тс я не бол ь ш ими учас тками по дл ине хромос омы, с пос обс твуя тому, что гомол огичные хромос омы "узнаю т" друг другаи навре мяобразую т с вязи, уде рживаю щ их их однавдол ь другой . Зате м хромос омы с ое диняю тс я с помощ ь ю си н а пт о н емн о го ко мплекса (рис унок 28), который пре дс тавл яе т с обой бе л ковое образование , входящ е е в с ос тав бивал е нта и име ю щ е е вид тре хс л ой ной л е нты, с ос тоящ е й из двух боковых компоне нтов – тяже й и це нтрал ь ного ос е вого эл е ме нта. О с е вые эл е ме нты с ое диняю тс я тонкими попе ре чными с вязками. Синаптоне мный компл е кс формируе тс я ме жду конъ ю гирую щ ими хромос омами пос те пе нно по принципу зас те жки “мол нии” на протяже нии вс е й с тадии зиготе ны. СК компл е кс выпол няе т две функции: не позвол яе т конъ ю гирую щ им хромос омам не обратимо с л ипнуть с я (с охраняя их индивидуал ь нос ть ) и закре пл яе т рас пол оже ние гомол огичных учас тков хромос ом точно друг против друга, т.е . с табил изируе т с вязь ме жду хромос омами, что не обходимо дл я пос л е дую щ е го крос с ингове ра. О дновре ме нно с этим продол жае тс япроце с с конде нс ации хромос ом. 3. Па хи т ен а . О с новное с обытие этой фазы – крос с ингове р (от англ crossing-over – пе ре кре с т): пе ре кре с т и взаимный обме н гомол огичными учас тками гомол огичных хромос ом (от отцовс кой к мате ринс кой и наоборот). П роис ходит нас тадии че тыре х хроматид. О бме н ме жду хромос омами проис ходит с помощ ь ю ме ханизма“разрыв и вос с ое дине ние ” в ходе которых две не с е с тринс кие хроматиды рвутс яи зате м вос с ое диняю тс яв новом с оче тании. П риводит к пе ре комбинации ге не тиче с кого мате риал а ме жду гомол огичными хромос омами (обме ну, пе ре тас овке отцовс ких и мате ринс ких ге нов) и появл е нию в потомс тве новых комбинаций признаков, отл ичаю щ ихс я от родите л ь с ких. Крос с ингове р може т одновре ме нной проис ходить не в одной , а в не с кол ь ких точках (множе с тве нный крос с ингове р), обе с пе чивая бол е е выс окую с те пе нь ре комбинации нас л е дс тве нной информации в пол овых кл е тках (гаме тах). П риче м, крос с ингове р – это с л учай ное с обытие , которое с той ил и иной ве роятнос ть ю може т возникнуть нал ю бом учас тке гомол огичных хромос ом. Н арис унке 29 приве де наупрощ е ннаяс хе мане которых возможных вариантов одиночного ил и двой ного крос с ингове рас учас тие м двух хроматид из пары гомол огичных хромос ом. Крос с ингове р име е т ге не тиче с кий с мыс л , когда проис ходит ме жду не с е с тринс кими хроматидами гомол огичных хромос ом, и не име е т, когда проис ходит ме жду с е с тринс кими хроматидами (входящ ими в с ос тав одной хромос омы), пос кол ь ку они иде нтичны друг другу по с ос таву нукл е отидов, так как образовал ис ь в ре зул ь тате ре пл икации (вос произве де ния, копирования) мол е кул ы Д Н К каждой хроматиды. П ахите нахаракте ризуе тс я продол жаю щ е й с яконде нс ацие й и утол щ е ние м хромос ом в ре зул ь тате че го

68

с е с тринс кие хроматиды каждой хромос омы уже хорош о видны в с ве товой микрос коп.

Р ис унок 28. Синаптоне мный компл е кс (СК): А - вид в эл е ктронном микпрс копе ; Бс хе ма; В - моде л ь [Ч е нцов, 2004]: 1- хроматин, 2- ос е вой эл е ме нт, 3- боковые эл е ме нты.

Р ис унок 29. Р азл ичные варианты крос с ингове ра с учас тие м двух не с е с тринс ких хроматид [Щ ипков, 2003]: 1- ис ходные хроматиды и вариант бе з крос с ингове ра, 2 и 3 - одиночный крос с ингове р научас тке А -В (2) и В -С (3) и крос с ове рные хроматиды, 3- двой ной крос с ингове р и крос с ове рные хроматиды.

4. Д и пло т ен а – начал о оттал кивания гомол огичных хромос ом друг от другав с ос таве каждого бивал е нта, которое начинае тс я в зоне це нтроме р. П ри этом в точках пе ре кре с та (крос с ингове ра) видны хи а змы (зоны пе ре кре с та хроматид). Х иазмы с виде те л ь с твую т об обме не в бивал е нте учас тками гомол огичных хромос ом. Тол ь ко в этих ме с тах с охраняе тс яСК. В разош е дш ихс я ме с тах он ис че зае т. Конде нс ация хромос ом наэтой с тадии продол жае тс я. 5. Д и а ки н ез - проис ходит макс имал ь ная конде нс ация хромос ом, их укорачивание и утол щ е ние , хиазмы пе ре ме щ аю тс я от це нтроме р к концам хромос ом (те рминал изация хиазм). Гомол огичные хромос омы уде рживаю тс я в с ос таве бивал е нтов бл агодаря хиазмам. К концу диакине за разруш ае тс я яде рная обол очка, ис че заю т ядрыш ки, образуе тс я ве ре те но де л е ния. М ет а фа за I (М I) – бивал е нты рас пол агаю тс я в пл ос кос ти экватора, образуя ме тафазную пл ас тинку. В отл ичие от митоза, нити ве ре те напри-

69

кре пл яю тс я к центроме ре (кине тохору) каждой из пары гомол огичных хромос ом л иш ь с одной с тороны (с о с тороны пол ю с а). Связь ме жду гомол огичными хромос омами с помощ ь ю хиазм продол жае т с охранять с я. А н а фа за I (AI). В отл ичие от митозаце нтроме ры не де л ятс я. Сое дине нные ране е хиазмами концы гомол огичных хромос ом рас ходятс я. К противопол ожным пол ю с ам рас ходятс я гомол огичные хромос омы, входящ ие в с ос тав каждого бивал е нта(но не с е с тринс кие хроматиды, как в митозе ). Каждая хромос ома по-пре жне му с ос тоит из двух хроматид. П роис ходит ре дукция (уме нь ш е ние ) чис л ахромос ом в двараза(n) по с равне нию с родите л ь с кой кл е ткой (2n). П риче м, каждая мате ринс кая и отцовс кая хромос омаиме ю т равнове роятные возможнос ти отой ти к тому ил и иному пол ю с у. В е роятнос ть того, что к одному пол ю с у отой дут мате ринс кие хромос омы, ак другому тол ь ко отцовс кие , чре звычай намал а. П оэтому проис ходит не завис имое (с вободное , с л учай ное ) рас хожде ние гомол огов каждого бивал е нтаи разл ичное их с оче тание с хромос омами из разных пар. Э то (наряду с крос с ингове ром) приводит к допол ните л ь ной пе ре комбинации ге не тиче с кого мате риал аи явл яе тс яе щ е одной из причин ге не тиче с кого разнообразияформирую щ ихс ягаме т. Т ело фа за I (ТI). П роис ходит окончате л ь ное рас хожде ние хромос ом к пол ю с ам. Х ромос омы де конде нс ирую тс я, удл иняю тс я и вновь с тановятс я не разл ичимыми, вокруг них формируе тс я яде рная обол очка, образую тс я ядрыш ки. Н ити ве ре те наде л е нияис че заю т. В кл е тке формируе тс ядвагапл оидных ядра, которые могут разл ичать с я ге нотипиче с ки. У мл е копитаю щ их (в том чис л е и че л ове ка), однодол ь ных рас те ний (рожь , пш е ница) проис ходит цитокине з и образуе тс я две кл е тки, с оде ржащ ие гапл оидный (пол овинный ) набор хромос ом. Каждая хромос ома с ос тоит из двух с е с тринс ких хроматид. У бол ь ш инс тва двудол ь ных цитокине з отс утс твуе т и кл е ткаос тае тс ядвуяде рной . И н т еркен ез (инте рфаза ме жду ме й озом I и ме й озом II) проис ходит быс тро ил и отс утс твуе т вовс е . В отл ичие от инте рфазы ме й озаI и митоза наэтой с тадии н е про и схо ди т с инте зановой Д Н К. В т ор ое дел ен ие м ейоза (м ейоз II, э кв ацион н ое дел ен ие) – проис ходит по типу митоза, но при гапл оидном наборе хромос ом. Про фа за II – час то проходит оче нь быс тро. Х ромос омы компактизую тс я, ядрыш ки и яде рная обол очкаразруш аю тс я, формируе тс я ве ре те но де л е ния. М ет а фа за II – Х ромос омы (с ос тоящ ие из двух хроматид) выс траиваю тс я в пл ос кос ти экватора. Н ити ве ре те на прикре пл яю тс я к центроме рам (кине тохору). О бразуе тс яме тафазнаяпл ас тинка. А н а фа за II. Ц е нтроме ракаждой хромос омы продол ь но де л итс я и с е с тринс кие хроматиды (с тав те пе рь с амос тояте л ь ными однохроматидными хромос омами, с оде ржащ ими по одной мол е кул е Д Н К) рас ходятс як противопол ожным пол ю с ам. Х роматиды могут быть не иде нтичными в ре зул ь тате произош е дш е го в пе рвом де л е нии крос с ингове ра. Ч ис л о же хромос ом у каждого пол ю с аос тае тс япре жним – гапл оидным.

70

Т ело фа за II – О днохроматидные хромос омы де конде нс ирую тс я, появл яю тс я ядрыш ки и яде рная обол очка, формируе тс я че тыре гапл оидных ядра, которые могут разл ичать с я ге нотипиче с ки. В кл е тке проис ходит цитокине з. Заканчивае тс я ме й оз образование м че тыре х доче рних гапл оидных кл е ток (из каждой дипл оидной мате ринс кой ) с разл ичным с оче тание м отцовс ких и материнс ких хромос ом. Э то обе с пе чивае т формирование у одного организмапол овых кл е ток (гаме т) с равным по чис л у, но разл ичным по с ос таву набором хромос ом, что приводит к ге не тиче с кому разнообразию в потомс тве . М е й оз у животных и рас тений в це л ом проте кае т с ходным образом. В тоже вре мяиме ю тс яи не которые ос обе ннос ти. У животных кл е ток цитокине з проис ходит дважды: как в конце пе рвого, так и второго де л е ния ме й оза. Д оче рние кл е тки с разу те ряю т с вязь с друг другом и с тановятс я не завис имыми. П риче м, в с л учае о о ген еза (развитияже нс ких пол овых кл е ток) у мл е копитаю щ их, в том чис л е и че л ове ка в проце с с е ме й озапроис ходит не равноме рное рас пре де л е ние цитопл азмы ис ходной мате ринс кой кл е тки (оогония) ме жду че тырь мя гапл оидными доче рними кл е тками: формируе тс я однабол ь ш ая по разме рам яй це кл е тка и три не бол ь ш их по разме ру пол ярных те л ь ца(кл е ток с оче нь не бол ь ш им кол иче с твом цитопл азмы, рис унок 26). В дал ь не й ш е м проис ходит де ге не рация пол ярных те л е ц и с озре вание яй це кл е тки, с оде ржащ е й бол ь ш ое кол иче с тво цитопл азмы, не обходимое дл я развития будущ е го эмбриона. В с л учае сперма т о ген еза (образования мужс ких пол овых кл е ток) набл ю дае тс я равноме рное рас пре де л е ние цитопл азмы ме жду доче рними кл е тками, приводящ е е к образованию че тыре х (из одной ис ходной - с пе рматогония) гапл оидных с перматозоидов с одинаковым и не бол ь ш им с оде ржание м цитопл азматиче с ких компоне нтов. У не которых рас те ний , наприме р, однодол ь ных (пш е ница, рожь ) при формировании микрос пор (мужс ких с пор) цитокине з, проис ходящ ий пос л е пе рвого де л е ния мей оза, приводит к формированию ди а ды - двух с вязанных с друг другом гапл оидных кл е ток, апос л е второго де л е ния ме й оза– т ет ра ды, в которой че тыре гапл оидные кл е тки окруже ны общ е й обол очкой (рис унок 30). Такой тип образования те трад называе тс я сукцесси вн ым ил и по следо ва т ель н ым. У гол ос е ме нных (с ос на, е л ь ), двудол ь ных (виш ня, че ре ш ня) рас те ний кл е точные с те нки закл адываю тс я пе рпе ндикул ярно друг другу в конце второго де л е ния ме й оза– си муль т а н н ый ил и о дн о времен н ый тип образования те трад (рис унок 30). П ри про меж ут о ч н о м типе пос л е ме й озаI закл адывае тс яне пол наяпе ре городкаме жду ядрами. П ол ное же разде л е ние мате ринс кой кл е тки нате траду проис ходит при заве рш е нии второго де л е ния. Х аракте рным признаком те трады макрос пор (ме гас пор) явл яе тс я л ине й ное рас пол оже ние макрос пор, опре де л яю щ е е с я рас пол оже ние м ве ре те наде л е нияпри пе рвом и втором де л е ниях (рис унок 33).

71

Р ис унок 30. Типы развитияте трад микрос пор у рас те ний [А табе кова, 1971]: А - пос л е довате л ь ный (с укце с с ивный ) тип; Б- проме жуточный тип; В - одновре ме нный (с имул ь танный ) тип. П ояс не нияв те кс те .

Би о ло ги ч ески й смысл(зн а ч ен и е) мейо за : 1. П одде ржание видового пос тоянс твачис л ахромос ом при пол овом размноже нии (с охране ние с вой с тве нного видам кариотипа). У организмов, размножаю щ ихс я пол овым путе м, в ре зул ь тате ме й озаиз одной ис ходной дипл оидной кл е тки (2n) образую тс яче тыре доче рние с гапл оидным (n) набором хромос ом, из которых развиваю тс я пол овые кл е тки (гаме ты). П ри опл одотворе нии гаме ты с л иваю тс я, образуя зиготу, в которой вос с танавл ивае тс я дипл оидный набор хромос ом, с вой с тве нный данному виду. Е с л и бы не был о ме ханизма, обе с пе чиваю щ е го уме нь ш е ние чис л а хромос ом в двараза, то в каждом пос л е дую щ е м покол е нии дипл оидный набор возрас тал бы вдвое . 2. П родуцирование ге не тиче с ки разнообразных (не равнозначных) гаме т и с оздание ге не тиче с кого разнообразия в потомс тве . Т.е . ме й оз – ос нова нас л е дс тве нной (комбинативной ) изме нчивос ти. Э то обус л овл е но с л е дую щ им: а) в проце с с е крос с ингове ра проис ходит пе ре рас пре де л е ние (ре комбинация) ге не тиче с кого мате риал аме жду гомол огичными хромос омами; б) в анафазе I проис ходит не завис имое рас хожде ние хромос ом, входящ их в бивал е нты (мате ринс ких и отцовс ких), т.е . и в AI проис ходит пе ре комбинация ге не тиче с кого мате риал а. Сл учай ное и разл ичное с оче тание мужс ких и же нс ких гаме т при опл одотворе нии также обе с пе чивае т допол ните л ь ную комбинативную изме нчивос ть . М ат ери алы и оборудован и е. Све товые микрос копы, готовые микропре параты (давл е ные и пос тоянные ), микрофотографии и с хе мы с ме й озом рас тите л ь ных и животных кл е ток. Х о д ра бо т ы. Задан ие1. И зучить под с ве товым микрос копом готовые микропре параты с ме й озом у разл ичных рас тите л ь ных объ е ктов (микрос пороге не з у с ос ны, л ис тве нницы, топол я и др.), микрофотографии

72

(ме й оз у ржи, виш ни, че ре ш ни) и с хе мы. О пре де л ить вс е фазы и с тадии ме й оза. Зарис овать с хе му пе рвого и второго де л е ния ме й оза кл е тки, с оде ржащ е й 4 хромос омы. Д ать краткую характе рис тику ос новных с тадий ме й оза. Сде л ать вывод на каком этапе ме й оза проис ходит цитокине з у проанал изированных рас тите л ь ных объ е ктов, каков у них тип образования те трад? Задан ие 2. Р ас с мотре ть на с хе мах, микрофотографиях и микропре паратах ме й оз при ооге не зе и с пе рматоге не зе у многокл е точных животных. Каковы ос обе ннос ти ме й озау животных организмов? Задан ие3. П рове с ти с равните л ь ную характе рис тику митозаи ме й оза. Н азовите че рты с ходс тваи принципиал ь ные отл ичия по с тадиям. Д анные зане с ти в табл ицу. Сравните л ь наяхаракте рис тикамитозаи ме й оза Стадия

М итоз

М е й оз

В оп р ос ы дл я с ам оп р ов ер киикон т р ол я: 1. Ч то такое зиготный , гаме тный и с поровый тип ме й оза? Каковы их ос обе ннос ти и у каких организмов они вс тре чаю тс я? 2. П е ре чис л ить ос новные фазы ме й озаи дать им краткую характе рис тику. 3. Ч е м отл ичае тс я профаза митоза от профазы I ме й оза? П ояс ните это наприме ре . 4. Ч то такое крос с ингове р, накакой с тадии ме й озаон проис ходит и каково е го биол огиче с кое значе ние ? 5. Ч е м отл ичае тс я ме тафаза пе рвого де л е ния ме й оза от ме тафазы второго де л е ния ме й оза? И зобразите с хе матично дл я кл е тки, име ю щ е й в начал е де л ения8 хромос ом. 6. Ч е м отл ичае тс я анафаза пе рвого де л е ния мей оза от анафазы второго де л е ния ме й оза? И зобразите с хе матично дл я кл е тки, име ю щ е й в начал е де л е ния16 хромос ом. 7. Скол ь ко хромос ом отой де т к каждому пол ю с у в анафазе I и в анафазе II ме й озау а) мыш и, име ю щ е й в с оматиче с ких кл е тках 40 хромос ом; б) ре чного рака, име ю щ е го в с оматиче с ких кл е тках 116 хромос ом; в) л ука, име ю щ е го в с оматиче с ких кл е тках 16 хромос ом; г) картофе л я, име ю щ е го в с оматиче с ких кл е тках 48 хромос ом? Скол ь ко хроматид входит в с ос тав каждой хромос омы пос л е анафазы I и анафазы II? 8. Каков биол огиче с кий с мыс л (значе ние ) ме й оза? 9. П оче му пос л е ме й озаобразую тс я ге не тиче с ки не равнозначные гапл оидные кл е тки? 10. В че м с ходс тво и отл ичия митозаи ме й оза. П ояс нить это наприме ре пш еницы, име ю щ е й 42 хромос омы.

73

Т ем а 9. С ПО РО Г ЕН ЕЗ, Г А М ЕТ О Г ЕН Е ЗИ ПРО Ц Е С С О ПЛ О ДО Т В О РЕНИ ЯУ РА С Т ЕН И Й Ц ел ь зан ят ия: 1. Уяс нить , что ме й оз у рас те ний заканчивае тс я формирование м те трады с пор (а не гаме т); дл я образования пол овых кл е ток (гаме т) не обходимо прохожде ние двух проце с с ов: с пороге не за (ме й оза) и гаме тоге не за (ряда митотиче с ких де л е ний ). 2. О знакомл е ние с ос обе ннос тями развития мужс кого и же нс кого гаме тофитов (цитол огиче с кими ос обе ннос тями микро- и макрогаме тоге не за) у гол ос е ме нных рас те ний (на приме ре хвой ных – с ос ны). 3. И зуче ние этапов образования мужс кого и же нс кого гаме тофитов у разл ичных пре дс тавите л е й цве тковых (покрытос е ме нных) рас те ний . 4. П оказать , что набл ю даю тс я с ущ е с тве нные разл ичияпроте канияпроце с с а: а) микро- и макрогаме тоге не зау рас те ний ; б) гаме тогене за у гол ос е ме нных (на приме ре хвой ных) и покрытос е ме нных рас те ний . 5. О знакомл е ние с цитол огиче с кими ос обе ннос тями проце с с а опл одотворе ния у гол ос е ме нных (на приме ре с ос ны) и покрытос е менных рас те ний (с равните л ь ный анал из). О с н овн ы е т еорет и чес ки е полож ен и я. О бразование пол овых кл е ток у выс ш их рас те ний проис ходит в два этапа- спо ро ген еза и га мет о ген еза . С по ро ген ез– проце с с образованиягапл оидных с пор, в ос нове которого л е жит ме й оз, проис ходящ ий в це л ом схо дн ым образом у рас те ний , относ ящ ихс я к разным с ис те матичес ким группам. М е й оз проис ходит в дипл оидных кл е тках с пороге нной ткани (мате ринс ких кл е тках с пор) е щ е до цве те ния и заканчивае тс я образование м с пор (ане гаме т, как у животных), которые е щ е не с кол ь ко раз де л ятс я митотиче с ки (га мет о ген ез), в ре зул ь тате че го формирую тс я же нс кие (яй це кл е тка) и мужс кие (с пе рмии) гаме ты. П рохожде ние проце с с агаме тоге не за с ущ е с тве нно разл ичае тс яу рас те ний разл ичных с ис те матиче с ких групп. Г ол ос ем ен н ы ер ас т ен ия (н а п р им ер ех в ойн ы х : с ос н а). М икр ос п ор оген ези р азв ит ием уж с кого гам ет оф ит а (м икр огам ет оген ез). М и кро спо ро ген ез – проце с с образования микрос пор в микрос порангиях. У гол ос е ме нных рас те ний , в час тнос ти хвой ных (с ос ны, е л и, л ис тве нницы), в микрос порангиях мужс ких ге не ративных поче к (микрос тробил ах) образую тс я мужс кие а рхеспо ри а ль н ые дипл оидные кл е тки, пол учивш ие название ма т ери н ски х клет о к ми кро спо р(ил и ми кро спо ро ци т ы), которые де л ятс я путе м ме й оза(ми кро спо ро ген еза ). В ходе ме й озаиз каждой мате ринс кой кл е тки микрос пор с имул ь танно образуе тс я т ет ра да ми кро спо р, в которой че тыре гапл оидные с поры окруже ны общ е й обол очкой (рис унок 31). П ос л е рас пада те трад каждая микрос пора формируе т с обс тве нные обол очки – экзину и интину, пре образуяс ь в однояде рное пыл ь це вое зе рно. У пыл ь це вых зе ре н хвой ных экзина образуе т два ш аровидных вздутия – “крыл ь я”. В здутия напол не ны воздухом и обл е гчаю т пол е т пыл ь цы. В оз-

74

душ ные ме ш ки рас пол агаю тс я по бокам пыл ь це вого зе рнаил и час то с двинуты к наружной е го час ти.

Р ис унок 31. Ф ормирование мужс кого гаме тофита у с ос ны: 1- те трада

Р ис унок 32. Ж е нс кий гаме тофит у с ос ны (Комаров, 1949): 1- архе -

с пор, 2- однояде рное пыл ь це вое зе рно, 3-7- пос л е довате л ь ные этапы гаме тоге не за: аи б- протал л иал ь ные кл е тки, ванте ридиал ь ная кл е тка, г- ве ге тативное ядро, д- кл е тка-ножка, е - ге не ративная кл е тка.

гонии с яй це кл е тками, 2- ш е й ковая кл е тка, 3- эндос пе рм, 4- нуце л л ус (“ядро” с е мяпочки), 5- инте гуме нт (покров с е мяпочки), 6- микропил е (пыл ь це вход), 7- пыл ь це ваякаме ра, 8- пророс ш е е пыл ь це вое зе рно, 9с пе рмии.

У хвой ных мужс кой гаме тофит формируе тс я в проце с с е пяти де л е ний (пяти гапл оидных митозов, т.к. они проходят нагапл оидном уровне ). П е рвые дваде л е ния заве рш аю тс я образование м двух мал е нь ких про т а лли а ль н ых (зародыш е вых) кл е ток, которые пре дс тавл яю т с обой рудиме нтарный зарос ток. О ни отте с няю тс я к одной из с те нок микрос поры и там разруш аю тс я. Тре ть е де л е ние ядра микрос поры, проис ходящ е е за1-2 дня до выл е та пыл ь цы, приводит к образованию двух не равных по ве л ичине кл е ток – а н т ери ди а ль н о й кл е тки, с двигаю щ е й с я к с те нке микрос поры и в егет а т и вн о й (бол е е крупной ) кл е тки, даю щ е й поздне е пыл ь це вую трубку (рис унок 31). В таком с ос тоянии ве с ною пе рвого года пыл ь це вые зе рна выс ыпаю тс я из с порангие в и разнос ятс я ве тром. Д ал ь не й ш е е развитие мужс кого гаме тофита проис ходит уже пос л е опыл е ния пыл ь цой с е мязачатков в же нс ких ш иш ках, т.е . наткани нуце л л ус а. П ыл ь ца, попадаянапове рхнос ть апикал ь ной час ти нуце л л ус а, дае т тол с тую ве твящ ую с я трубку, которая, дос тигнув у с ос ны дл ины окол о 200 мкм, ос танавл ивае тс яв рос те . М икрогаме тоге не з у с ос ны заве рш ае тс я на с л е дую щ ий год пос л е с поронош е ния(“цве те ния”), когдатрубкас воим концом дос тигае т а рхего н и ев . В ре зул ь тате че тве ртого де л е ния в мужс ком гаме тофите из а н т ери ди а ль н о й кл е тки образую тс я ген ера т и вн а я и ст ебель ко ва я (кл е тка-ножка анте ри-

75

дия) кл е тки. Я дро с те бе л ь ковой кл е тки опус кае тс я в пыл ь це вую трубку, те ряя при этом цитопл азму. Ге не ративная кл е тка де л итс я (пятое де л е ние мужс кого гаме тофита) и образуе тс ядва сперми я - гаме ты. О дин с пермий в дал ь не й ш е м опл одотворяе т яй це кл е тку, а второй отмирае т. В ре зул ь тате формируе тс я дипл оидный зародыш и гапл оидный эндос пе рм. Таким образом, ве с ь цикл развитиямужс ких гаме т из с пороге нной ткани с моме нтае е зал оже ниядл итс яокол о двух л е т. М акр ос п ор ген ез (м егас п ор оген ез) и р азв ит ие ж ен с кого гам ет оф ит а (м акр огам ет оген ез = м егагам ет оген ез). Ж е нс кие пол овые кл е тки (яй це кл е тки) у по крыт о семен н ых рас те ний с озре ваю т в с е мяпочке , развиваю щ е й с я в завязи. У го ло семен н ых рас те ний завязь не образуе тс я и с е мяпочкал е жит с вободно. В с убэпиде рмал ь ном с л ое н уцеллуса (те л о с е мяпочки) закл адывае тс я крупная дипл оидная же нс кая а рхеспо ри а ль н а я кл е тка, пол учивш ая название ма т ери н ско й клет ки ма кро спо р (ма кро спо ро ци т , мега спо ро ци т ), которая де л итс я путе м ме й оза(ма кро спо ро ген еза = мега спо ро ген еза ), в ре зул ь тате че го образуе тс я т ет ра да ма кро спо р(мега спо р), три из которых в дал ь не й ш е м де ге не рирую т. Судь баче тве ртой макрос поры разл ичнау по крыт о семен н ыхи го ло семен н ыхрас те ний . У го ло семен н ых, в час тнос ти, хвой ных рас те ний ос тавш аяс яиз че тыре х макрос пора разрас тае тс я, инте нс ивно де л итс я митотиче с ки, образуя многокл е точный га пло и дн ый эн до сперм, с оде ржащ ий запас ные питате л ь ные ве щ е с твадл я будущ е го зародыш а. Т.е . у хвой ных эндос пе рм возникае т до опл одотворе нияи не завис имо от не го. Н аве рхне й час ти эндос пе рма, обращ е нной к пыл ь це входу (микропил е ), из е го пове рхнос тных кл е ток образую тс я а рхего н и и (от одного до че тырех, чащ е два). Каждый архе гоний име е т по одной крупной яй це кл е тке , над которой рас пол агаю тс я однанад другой в виде розе ток че тыре мал е нь кие кл е тки, с охранивш ие с я как рудиме нт ш е й ки архе гония (ш ейко в ые кл е тки). Таким образом, же нс кий гаме тофит у хвой ных пре дс тавл е н гапл оидным эндос пе рмом с рас пол оже нными в не м архе гониями, с оде ржащ ими яй це кл е тки (в каждом архе гонии по одной яй це кл е тке ). Покр ы т ос ем ен н ы е(цв ет ков ы е) р ас т ен ия. М икр ос п ор оген ези р азв ит ием уж с кого гам ет оф ит а (м икр огам ет оген ез). М икрос пороге не з проис ходит в микрос порангиях (которыми явл яю тс я гне зда пыль н и ко в ) с ходным с гол ос е ме нными рас те ниями с пос обом. В итоге из каждого микрос пороцита (мате ринс кой кл е тки пыл ь цы) образуе тс я те традамикрос пор, в которой че тыре гапл оидные с поры окруже ны общ е й обол очкой (рис унок 33). Зате м начинае тс я проце с с образования пыл ь цы (муж ско го га мет о фи т а ), ил и ми кро га мет о ген ез (рис унок 33). О бол очка, окружаю щ ая те траду микрос пор, рас падае тс я. В округ каждой микрос поры пос те пе нно образуе тс я две обол очки – экзи н а (наружная) и и н т и н а (внутре нняя). Так выгл ядит мол одое однояде рное пыл ь це вое зе рно. Зате м ядро пе ре ходит от це нтрак пе рифе рии кл е тки, де л итс япо типу митоза(пе рвый гапл оидный ас с име тричный митоз), в ре зул ь тате которого образую тс ядве кл е тки: в егет а т и вн а я (бол ь ш ая) и ген ера т и вн а я (ма-

76

л ая). Д ал е е проис ходит де л е ние по типу митоза (второй гапл оидный митоз) ядраге не ративной кл е тки – сперми о ген ез и образуе тс я двасперми я = муж ски е га мет ы. Н а этом заканчивае тс я образование муж ско го га мет о фи т а – зре л ого пыл ь це вого зе рна, с ос тоящ е го из ве ге тативной кл е тки и двух с пе рмие в. Т.е . в отл ичие от хвой ных мужс кой гаме тофит у покрытос е ме нных рас те ний формируе тс я в проце с с е двух (ане пяти ) де л е ний . В отл ичие от с пе рматозоидов, образую щ ихс яу животных, с пе рмии покрытос е ме нных и рас с матривае мых хвой ных рас те ний те ряю т с пос обнос ть к с амос тояте л ь ному пе ре движе нию и пе ре нос ятс я к яй це кл е тке пыл ь це вой трубкой . У одних рас те ний (ас тры, гре чиха, л е н) с пермиоге не з проис ходит в пыл ь никах (до выл е тапыл ь цы), у других (л ил ия, томат, виш ня, топол ь и др.) – в пыл ь це вой трубке при прорас тании пыл ь цы.

Р ис унок 33. Р азвитие мужс кого и же нс кого гаме тофитов у покрытос е ме нных рас тений . М акр ос п ор ген ез (м егас п ор оген ез) и р азв ит ие ж ен с кого гам ет оф ит а (м акр огам ет оген ез = м егагам ет оген ез). Как уже отме чал ос ь , же нс кие пол овые кл е тки (яй це кл е тки) у покрытос е ме нных рас те ний с озре ваю т в семяпо ч ке, развиваю щ е й с я в завязи. М а т ери н ска я клет ка ма кро спо р (ма кро спо ро ци т , мега спо ро ци т ) де л итс я путе м ме й оза, в ре зул ь тате че го образуе тс я т ет ра да с л ине й ным рас пол оже ние м ма кро спо р(мега спо р). В дал ь не й ш е м (как и у хвой ных) проис ходит де ге не рация тре х макрос пор. Я дро че тве ртой макрос поры пре те рпе вае т три пос л е довате л ь ных ми т о т и ч ески х де л е ния (три га пло и дн ых ми т о за ), не с опровождаю щ ие с я цитокине зом, в ре зул ь тате че го формируе тс я вос ь мияде рный за ро дыш ев ый меш о к. В вос ь мияде рном зародыш е вом ме ш ке у каждого пол ю с а, т.е . у ми кро пи лярн о м (у пыл ь це входа) и ха ла за ль н о м (напротивопол ожном) концах зародыш е вого ме ш ка рас пол агае тс я по 4 гапл оидных ядра. Зате м от каж-

77

дого пол ю с а по одному ядру отходит к це нтру зародыш е вого ме ш ка, где они обычно с л иваю тс я, образуя дипл оидное (2n) це нтрал ь ное ядро. Зате м проис ходит образование кл е ток напротивопол ожных концах зародыш е вого ме ш ка. У ми кро пи ле формируе тс я яй це вой аппарат: яйцеклет ка (же нс кая гаме та) и две си н ерги ды, ау хал азал ь ного конца– три а н т и по ды. Я й це кл е ткапо ве л ичине значите л ь но крупне е с ине ргид и име е т груш е видную форму. Н аэтом заканчивае тс я формирование зародыш е вого ме ш ка– ж ен ско го га мет о фи т а . П одобный тип формирования зародыш е вого ме ш ка называе тс янормал ь ный ил и Polygonum-т и п – наибол е е рас прос тране нный у покрытос е ме нных рас те ний (до 85% вс е х видов). Сущ е с твую т и другие типы развития зародыш е вых ме ш ков у покрытос е ме нных рас те ний – 4яде рный (тип Plumbagella) и 16-яде рный (тип Drusa). В образовании разных типов зародыш е вых ме ш ков учас твуе т разное чис л о макрос пор – одна (монос пориче с кий тип – с амый рас прос тране нный ), две (бис пориче с кий ) и че тыре (те трас пориче с кий ). Дв ойн оеоп л одот в ор ен иеу п окр ы т ос ем ен н ы х р ас т ен ий. П роце с с опл одотворе ния у покрытос е ме нных рас те ний отл ичае тс я от вс е х других организмов нал ичие м у них двой ного опл одотворе ния, открытого в 1898 г. С.Г. Н аваш иным. П ыл ь це вое зе рно, попав на рыл ь це пе с тика, прорас тае т зас че т ве ге тативной кл е тки, образуя пыл ь це вую трубку, в которых находятс я два с пе рмия. П роникая в зародыш е вый ме ш ок че ре з микропил е , один с пе рмий опл одотворяе т яй це кл е тку с образование м зиготы, которая путе м митотиче с ких де л е ний пре вращ ае тс я в зародыш с е ме ни, вс е кл е тки которого име ю т дипл оидный набор хромос ом (2n). Ц е нтрал ь ное ядро (2n) с л ивае тс яс другим с пе рмие м (n). О бразуе тс явтораязигота, из которой буде т развивать с яэндос пе рм (питаю щ аяткань зародыш а) с трой ным (3n) набором хромос ом. Трипл оиднос ть эндос пе рмапокрытос е ме нных – однаиз причин их с овре ме нного гос подс тваназе мном ш аре . М ат ери алы и оборудован и е. Све товые микрос копы, готовые микропре параты (давл е ные и пос тоянные ), микрофотографии и с хе мы проце с с ов микро- и макрос пороге не за, гаме тоге не за у хвой ных (с ос на, л ис тве нница) и покрытос е ме нных (виш ня, топол ь , рожь ) рас те ний . Ход работ ы . Задан ие1. И с пол ь зуя готовые микропре параты, микрофотографии и с хе мы, изучить ос обе ннос ти проце с с а формирования мужс кого гаме тофита (микрогаме тоге не за) у хвой ных рас те ний (с ос на) и разл ичных пре дс тавите л е й цве тковых (топол ь , виш ня). Зарис овать разные с тадии микрогаме тоге не зау изуче нных хвой ных и цве тковых рас те ний . Задан ие 2. И с пол ь зуя микрофотографии и с хе мы, ознакомить с я с ос обе ннос тями формированияже нс кого гаме тофита(макрогаме тоге не за) у хвой ных и покрытос е ме нных рас те ний , типами зародыш е вых ме ш ков у цве тковых рас те ний . Зарис овать этапы формирования же нс кого гаме тофитау изуче нных рас те ний . Задан ие3. П рове с ти с равните л ь ный анал из проце с с ов с пороге не заи гаме тоге не зау хвой ных и цве тковых рас те ний . П е ре чис л ить принципиал ь -

78

ные отл ичия и че рты с ходс тва. Р е зул ь таты можно оформить в виде табл ицы. Задан ие4. И с пол ь зуя с хе мы, ознакомить с я с цитол огиче с кими ос обе ннос тями проце с с аопл одотворе ния у гол ос е ме нных (наприме ре с ос ны) и покрытос е менных рас те ний . П рове с ти с равните л ь ный анал из и пе ре чис л ить принципиал ь ные разл ичия. В оп р ос ы дл я с ам оп р ов ер киикон т р ол я: 1. И з каких этапов с ос тоит проце с с образованияпол овых кл е ток (гаме т) у рас те ний ? 2. Ч то такое микрос пороге не з и микрогаме тоге не з, макрос пороге не з и макрогаме тоге не з. Где проис ходят эти проце с с ы у гол ос е ме нных (в час тнос ти у хвой ных) и покрытос е ме нных рас те ний ? 3. Ч то с обой пре дс тавл яе т мужс кой (ил и же нс кий ) гаме тофит у гол ос е ме нных (хвой ных) и покрытос е ме нных рас те ний ? 4. В че м с ходс тва и принципиал ь ные разл ичия проце с с а микро- и макрогаме тоге не зау хвой ных и покрытос е менных рас те ний ? 5. Скол ь ко митотиче с ких де л ений пре те рпе вае т пыл ь це вое зе рно при формировании мужс ких гаме т у хвой ных и покрытос е ме нных рас те ний ? 6. В че м с ходс тваи разл ичия проце с с аопл одотворе ния у хвой ных и покрытос е ме нных рас те ний ? 7. Какие из ниже пе ре чис л е нных кл е ток относ ятс я к гаме там рас те ний ? М икрос пора, макрос пора, яй це кл е тка, с пе рматозоид, ооцит, с пе рматоцит, с пе рмии.

1. 2. 3. 4.

О СН О В Н А Я Л И ТЕ Р А ТУР А М итоз. Р е гул яция и организация де л е ния кл е точного ядра / Л .И. Л е бе де ва[и др.] // Ге не тика. – 2004. – Т. 40, № 12. – С. 1589 – 1608. О с новные с обытиякл е точного цикл а, их ре гул яцияи организация/ Л .В . О ме л ь янчук [и др.] // Ге не тика. – 2004. – Т. 40, № 3. – С. 293 – 310. Ч е нцов Ю .С. В ве де ние в кл е точную биол огию / Ю .С. Ч е нцов. – М . : И КЦ “А каде мкнига”, 2004. – 495 с . Справочник по ботаниче с кой микроте хнике . О с новы и ме тоды / Р .П . Барыкина[и др.]. – М . : И зд-во М ГУ, 2004. – 312 с .

Д О П О Л Н И ТЕ Л Ь Н А Я Л И ТЕ Р А ТУР А 1. Бадае ваЕ .Д . Х ромос омный анал из при ис с л е довании проис хожде нияBи G- ге номов пол ипл оидных пш е ниц / Е .Д . Бадае ва // Биол огиче с кие ме мбраны. - 2001. - Т. 18, № 3. - С. 216 - 229. 2. Бил ич Г. Ц итол огия / Г. Бил ич, Г.С. Катинас , Л .В . Н азарова. – СП б. : Д е ан, 2001. – 112 с . 3. Заварзин А .А . Биол огия кл е тки. О бщ аяцитол огия / А .А . Заварзин, А .Д . Х аразова, М .Н . М ол итвин. – СП б : И зд-во СП бГУ, 1992. - 239 с . 4. Зощ ук Н .В . И с тория хромос омного анал иза/ Н .В . Зощ ук, Е .Д . Бадае ва, А .В . Зе л е нин // Биол огиче с кие ме мбраны. - 2001. - Т. 18, № 3. - С. 164172.

79

5. Козубов Г.М . Совре ме нные гол ос е ме нные / Г.М . Козубов, Е .Н . М уратова. – Л . : Н аука, 1986. – 192 с . 6. М ол е кул ярная биол огия кл е тки : в 3-х т. / Б. А л ь бе ртс [и др.]. - М . : М ир, 1994. 7. М е тодиче с кие указанияк прове де нию л абораторных занятий по “общ е й цитол огии” дл я с туде нтов – биол огов вс е х форм обуче ния / с ос т. М .Н . Н азарова, Н .А . Багрянс кая. – В ороне ж, 1987. - 16 с . 8. П ауш е ваЗ.П . П рактикум по цитол огии рас те ний / З.П . П ауш е ва. – М . : В О А гропромиздат, 1988. – 271 с . 9. П ухал ь с кий В .А . Ц итол огия и цитоге не тика рас те ний / В .А . П ухал ь с кий , А .А . Сол овь е в, В .Н . Ю рце в. – М . : И зд-во М СХ А , 2004. – 118 с . 10.Р ол ан Ж .-К. А тл ас по биол огии кл е тки / Ж .-К. Р ол ан, А . Се л ош и, Д . Се л ош и. - М . : М ир, 1978. – 118 с . 11.Р убцов Н .Б. М ногоцве тие с овре ме нной цитоге не тики ил и multicolor FISH today / Н .Б. Р убцов, Т.В . Карамыш е ва// В е с тник В О ГиС. – 2000. №11. - С. 11 - 15. 12.Сравните л ь ный хромос омный пэй нтинг / Е .З. А л кал ае ва[и др.] // Ге не тика. - 2002. - Т. 38, №8. - С. 1034 - 1042. 13.Ц итол огияи ге не тикаме й оза/ под ре д. В .В . Х вос товой , Ю .Ф . Богданова. – М . : Н аука, 1975. – 432 с .

А вторы: О л ь гаСе рге е внаМ аш кина, А л е кс андр В икторович Л авл инс кий Р е дактор О .А . Тихомирова