Хроматографические методы в анализе лекарственных и токсичных веществ: Практикум

М И Н И СТ Е РСТ В О О БРА ЗО В А Н И Я И Н А У К И РО ССИ Й СК О Й Ф Е Д Е РА Ц И И В О РО Н Е Ж СК И Й ГО СУ Д А РСТ В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РСИ Т Е Т

Х рома т огра ф и ч е ски е ме т оды в а на ли зе ле ка рст ве нны х и т окси ч ны х ве щ е ст в

П р акти кум д л я студ ентов по спец и ал ь ности 040500 – Ф ар м ац и я

В оронеж 2004

2 У тв ержд енонаучно-метод ическим сов етом фармацев тическогофакультета (протокол№ 4 от6.04.2004.г.)

Состав ители: О .Ф .Стоя нов а, И .В .Ш кутина, Н .Я .М окш ина, В .Ю .Х охлов , В .И .В асильев а, В .Ф .Селеменев

П ред лаг аем ы й практикум д ает пред став ление об аналитической хроматографии с использ ов анием ее раз личны х в ариантов как оцелостной в ажной области курса“ А налитическая хим ия ”. В практикуме из лагаются основ ы теории хроматог рафии, критерии оценки качеств а раз д еления , описаны основ ны е узлы хроматографических приборов . П ред став лены практические работы по количеств енном у опред елению в ещ еств в г аз ов ой, жид костной и тонкослойной хроматографии. П рив ед ены примеры обработки рез ультатов из мерений, их метрологические характеристики. П рактикум пред наз начен д ля студ ентов , из учающ их курс “ А налитическая химия ” и специализ ирующ ихся в области химического анализ а.

3 С О ДЕРЖ АНИ Е I.ТЕО РЕТИ ЧЕС КИ Е ПРЕДС ТАВЛЕНИ Я В Х РО М А ТО ГРАФ И И 4 К лассификация метод ов хроматог рафии … … … … … … … … … … … … … … .5 Способы получения хроматог рамм … … … … … … … … … … … … … … … … ..6 В ы бор в ариантахроматог рафическог оанализ а… … … … … … … … … … … ..8 Х роматог рафические параметры … … … … … … … … … … … … … … … … ...10 Т еории хроматографическог ораз д еления … … … … … … … … … … … … … .13 Селектив ностьи раз реш ение … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..14 II.О БРАБО ТКА Х РО М АТО ГРАФ И ЧЕС КИ Х ДАННЫ Х … … … … … ..17 К ачеств енны й анализ … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...17 К оличеств енны й анализ … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..18 III. ПРАКТИ ЧЕС КАЯ ЧАС ТЬ ГАЗО АДС О РБЦ И О ННАЯ И ГАЗО Ж И ДКО С ТНАЯ Х РО М А ТО ГРАФ И Я … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...22 Сорбенты и аппаратура… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 23 К ачеств енны й анализ … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...25 К оличеств енны й анализ … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 26 Л абораторная работа№ 1. О пред еление сод ержания спиртов в смеси метод ом г аз ожид костной хроматог рафии … … … … … … … … … … … … … .27 Л абораторная работа№ 2. И д ентификация углекислоты в природ ном г аз е и опред еление ее количеств аметод ом г аз ов ой хроматог рафии … … … … … 31 И О НО О БМ ЕННАЯ Х РО М АТО ГРАФ И Я … … … … … … … … … … … … 32 Сорбенты … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...32 Л абораторная работа№ 1. О пред еление сод ержания сульфатанатрия … ..34 Л абораторная работа№ 2. Раз д еление ионов цинкаи никеля на анионообменнике … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .36 БУ М А Ж НАЯ И ТО НКО С ЛО Й НАЯ Х РО М АТО ГРАФ И Я … … … … 39 Н осители, раств орители … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..39 К ачеств енны й анализ … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..40 К оличеств енны й анализ … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..41 Л абораторная работа№ 1. О пред еление примеси гид раз инав из ониаз ид е (г ид раз ид е кислоты из оникотинов ой) метод ом хроматог рафии в тонком слое сорбента(Т СХ ) … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 41 Л абораторная работа № 2. О пред еление концентрации ионов никеля в раств оре метод ом бумажной хроматографии … … … … … … … … … … … … 45 Л абораторная работа № 3. К ачеств енное опред еление ам инокислот в белков ом гид ролиз ате метод ом бумажной хроматографии … … … … … … .46 Л абораторная работа № 4. К оличеств енное опред еление аспарагинов ой, глутам инов ой кислоти в алина в белков ом г ид ролиз ате метод ом бумажной хроматографии… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..48 Х РО М А ТО ГРАФ И ЧЕС КИ Е М ЕТО ДЫ А НАЛИ ЗА В Ф АРМ АЦ И И И Х И М И КО -Ф АРМ А Ц ЕВТИ ЧЕС КО Й ПРО М Ы Ш ЛЕННО С ТИ … .… ..50 ЗАДАЧИ ДЛЯ С А М О КО НТРО ЛЯ … … … … … … … … … … … … … … … .55 ЛИ ТЕРА ТУ РА … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 59

4 ТЕО РЕТИ ЧЕС КИ Е ПРЕДС ТА ВЛЕНИ Я В Х РО М АТО ГРАФ И И Х роматография – наиболее часто использ уемы й аналитический метод . Н ов ейш ими хроматог рафическим и метод ами можно проанализ иров ать г аз ообраз ны е, жид кие и тв ерд ы е в ещ еств а с молекуля рной массой от1д о106 . Э томогутбы тьиз отопы в од ород а, ионы металлов , полимеры , белки, нефть и д р. С помощ ью хроматог рафии получена обш ирная информация остроении и св ойств ах м ног их классов орг анических соед инений. П рименение хроматографических метод ов д ля раз д еления белков оказ ало ог ромное в лия ние на раз в итие сов ременной биохимии. Х роматографию с успехом применя ют в исслед ов ательских и клинических целя х в сам ы х раз ны х областя х биолог ии и мед ицины , в фармацев тике и крим иналистике: д ля терапев тическог о мониторинг ав св я з и с ростом нелег ального употребления наркотиков , ид ентификации антибиотиков и отнесения их к той или иной группе антибактериальны х препаратов , д ля анализ а отд ельны х наиболее в ажны х классов пестицид ов . Т акие д остоинств а, как унив ерсальность, э кспрессность и чув ств ительность д елают хроматог рафию в ажнейш им аналитическим метод ом. Х роматографический метод анализ а раз работан русским ботаником М .С. Ц в етом в 1903 г. В перв ы х же работах с помощ ью э того метод а М .С.Ц в ет установ ил, что считав ш ийся од нород ны м з елены й пигмент растений хлорофилл на самом д еле состоит из нескольких в ещ еств . П ри пропускании э кстракта з еленог о листа через колонку, з аполненную порош ком мела, и промы в ании петролейны м э фиром он получил несколько окраш енны х з он, что, несомненно, гов орило о наличии в э кстракте нескольких в ещ еств . В послед ств ии э то бы ло под тв ержд ено д руг им и исслед ов ателя ми. Э тотметод он наз в алх рома т огра ф и е й (отг реч. “ хроматос”– цв ет), хотя сам же указ ал на в озможность раз д еления и бесцв етны х в ещ еств . К омпоненты анализ ируемой смеси (сорбаты ) в месте с под в ижной фаз ой перед в игаются в д оль стационарной фаз ы . Е е обы чно помещ ают в стекля нную или металлическую трубку, наз ы в аемую колонкой. В з ав исимости от силы в з аимод ейств ия с пов ерхностью сорбента (з а счет ад сорбции или по каком у-либо д руг ому механиз м у) компоненты буд ут перемещ аться в д оль колонки с раз ной скоростью. О д ни ком поненты останутся в в ерхнем слое сорбента, д руг ие, в меньш ей степени в з аимод ейств ующ ие с сорбентом, окажутся в нижней части колонки, а некоторы е и в ов се покинут колонку в месте с под в ижной фаз ой, (такие компоненты наз ы в аются не уде рж и ва е мы ми , а в рем я их уд ержив ания опред еля ет “ мертв ое в ремя ” колонки). Т аким образ ом, происход ит бы строе раз д еление сложны х смесей компонентов . П ри перемещ ении в д ольколонки под в ижная фаз ав стречаетнасв оем пути в се нов ы е и нов ы е слои сорбента, чтообеспечив аетмног ократностьактов сорбции-д есорбции раз д еля емы х компонентов . Э тим обуслов лена з начительно больш ая

5 э ффектив ность хроматог рафического раз д еления по срав нению со статическими метод ами сорбции и э кстракции. Х рома т огра ф и я – э то физ ико-химический метод раз д еления и опред еления в ещ еств , основ анны й на распред елении ком понентов межд у д в умя фаз ам и, непод в ижной и под в ижной. Н епод в ижной (стационарной) фаз ой служит тв ерд ое пористое в ещ еств о или пленка в ы сококипя щ ей орг анической жид кости, нанесенная натв ерд ое в ещ еств о. П од в ижная фаз а пред став ля ет собой жид кость или газ , протекающ ий через непод в ижную фаз у. Х рома т огра ф и я – э тод инамический процесс. М ногократность актов сорбции – д есорбции раз д еля емы х компонентов обеспечив ает больш ую э ффектив ность хроматог рафическог о раз д еления по срав нению со статическими метод ами сорбции и э кстракции. Х рома т огра ф и я – гибрид ны й метод анализ а, в котором хроматографический процесс я в ля ется частью общ ей аналитической системы , сочетающ ей раз д еление и из мерение. М етод позв оля ет не только раз д еля ть мног окомпонентную смесь, но ид ентифициров ать и опред еля ть ее количеств енны й состав . Кла сси фи ка ц и я ме т одов хрома т огра фи и Раз личны е метод ы хроматог рафии можно классифициров ать по аг регатному состоя нию фаз , способу их относительног о перемещ ения , аппаратурном уоформлению процесса и т. д . По а гре га т ному сост оя ни ю фаз хроматог рафические метод ы обы чно классифицируют след ующ им образ ом (табл.1): Т аблица1 Н епод в ижная П од в ижная фаз а фаз а Газ ообраз ная Ж ид кая Т в ерд ая

Ж ид кая

Газ о-ад сорбционная хроматог рафия

Ж ид костно-ад сорбционная колоночная И оннообменная О сад очная

Распред елительная г аз о- жид костная хроматог рафия

Распред елительная жид кость- жид костная хроматог рафия

По ме х а ни зму вза и моде йст ви я сорбе нт а и сорба т а можнов ы д елить нескольков ид ов хроматографии: – ад сорбционная хроматография основ ана на раз личии в ад сорбируемости в ещ еств тв ерд ы м сорбентом;

6 – распред елительная хроматог рафия – на раз личии в раств оримости раз д еля емы х в ещ еств в непод в ижной фаз е (г аз ов ая хроматог рафия ) или на раз личии в раств оримости в ещ еств в под в ижной и непод в ижной жид ких фаз ах; – ионообменная хроматог рафия – на раз ной способности в ещ еств к ионном уобмену; – э ксклюз ионная хроматог рафия – нараз личии в раз мерах иформах молекулраз д еля ем ы х в ещ еств ; – аффинная хроматография – на специфических в з аимод ейств ия х, характерны х д ля некоторы х биолог ических и биохим ических процессов . По т е х ни ке вы полне ни я раз личают – колоночную хроматог рафию (раз д еление пров од ится в специальны х колонках); – плоскостную хроматог рафию, ког д а раз д еление пров од ится на специальной бумаг е (бумажная хроматография ) или в тонком слое сорбента(тонкослойная хроматог рафия ). По це ли х рома т огра ф и рова ни я в ы д еля ют – аналитическую хроматог рафию (качеств енны й и количеств енны й анализ ); – препаратив ную хроматог рафию (д ля получения в ещ еств в чистом в ид е, д ля концентриров ания и в ы д еления м икропримесей); – промы ш ленную (произ в од ств енную) хроматог рафию д ля ав томатическогоуправ ления процессом. По способу от носи т е льного пе ре ме щ е ни я ф а з раз личают – фронтальную; – проя в ительную, илиэ люентную; – в ы теснительную хроматог рафию. В хроматог рафии под в ижную фаз у, в в од имую в слой непод в ижной фаз ы , наз ы в ают элюе нт ом, а под в ижную фаз у, в ы ш ед ш ую из колонки и сод ержащ ую раз д еленны е компоненты , – элюа т ом. С п особ ы п олуч е ни я хрома т огра мм Ф ронт а льны й ме т од Э топростейш ий пометод ике в ариант хроматог рафии. О н состоит в том, что через колонку с ад сорбентом непреры в но пропускают анализ ируем ую смесь, например, компонентов А и В в раств орителе. В след ств ие сорбции в ещ еств А и В сначала из колонки буд ет в ы текать раств оритель Solv, з атем раств оритель и менее сорбирующ ийся компонент А , а з атем и компонент В и, таким образ ом, через некоторое в ремя состав раств ора при прохожд ении через колонкуменя ться не буд ет. В раств оре, в ы текающ ем из колонки, опред еля ют концентрацию кажд ого компонента и строя т г рафик в коорд инатах концентрация в ещ еств а – объем раств ора, прош ед ш его через колонку. Э ту з ав исимость наз ы в ают х рома т огра ммой или вы х одной кри вой (рис 1).

7

С S+A+B S+A S

V Рис.1. В ы ход ная крив ая фронтальног оанализ а. П ри фронтальном способе получения хроматог раммы в чистом в ид е можно в ы д елить лиш ь од но в ещ еств о, поэ тому фронтальны й метод использ уется срав нительноред ко. Д анны й метод применя ется , например, д ля очистки раств ора от примесей, если они сорбируются з начительно лучш е, чем основ ной компонент, или д ля в ы д еления из смеси наиболее слабосорбирующ егося в ещ еств а. Проя ви т е льны й (элюе нт ны й) ме т од П ри работе по э тому метод у в колонку в в од я т порцию анализ ируемой смеси, сод ержащ ей ком поненты А и В в раств орителе Solv, и колонку непреры в но промы в ают г аз ом-носителем или раств орителем Solv. П ри э том компоненты анализ ируемой смеси раз д еля ются на з оны : хорош осорбирующ ееся в ещ еств о В з анимает в ерхнюю часть колонки, а менее сорбирующ ийся ком понент А буд ет з анимать нижнюю часть. Т ипичная в ы ход ная крив ая из ображенанарис.2.

С

B

Рис.2. В ы ход ная крив ая э люентног оанализ а.

V

8 В г аз е или раств оре, в ы текающ ем из колонки, сначала поя в ля ется компонент В , д алее – чисты й раств оритель, а з атем компонент А . Чем больш е концентрация компонента, тем в ы ш е пик и больш е ег оплощ ад ь, что состав ля ет основ у количеств енног о хроматографическог о анализ а. П роя в ительны й метод д ает в оз можность раз д еля ть сложны е смеси, он наиболее часто применя ется на практике. Н ед остатком метод а я в ля ется уменьш ение концентрации в ы ход я щ их раств оров з а счет раз бав ления раств орителем (газ ом – носителем). Вы т е сни т е льны й ме т од В э том метод е анализ ируемую смесь компонентов А и В в раств орителе Solv в в од я т в колонкуи промы в ают раств ором в ещ еств а С (в ы теснитель), облад ающ им больш ей сорбируемостью, чем любое из раз д еля емы х в ещ еств . П омере прод в ижения поколонке э люентв ы тесня ет в ещ еств оС, которое в св ою очеред ьв ы тесня ет в ещ еств оВ , и т.д . К ажд ы й из компонентов в ы д еля ется в чистом в ид е, ноне количеств енно, так как з оны компонентов не раз д елены промежутками чистог осорбента(рис.3).

С

С В А

+

В

А

А

V

Рис.3. В ы ход ная крив ая в ы теснительног оанализ а. К онцентрация раств орапри хроматографиров ании не уменьш ается в отличие от проя в ительног о метод а. О д нако сущ еств енны м нед остатком в ы теснительногометод ая в ля ется частое наложение з оны од ног ов ещ еств а наз онуд руг ог о, посколькуз оны компонентов в э том метод е не разд елены з оной раств орителя . Вы б ор ва ри а нт а хрома т огра фи ч е ского а на ли за Д ля пров ед ения хроматог рафическог о анализ а обы чно использ уют след ующ ую метод ику: в ы бираютнужны е под в ижны е и непод в ижны е фаз ы в з ав исимости от св ойств анализ ируемы х в ещ еств , т.е. в ы бирают опред еленны й в ариант хроматог рафии (рис.4), устанав лив ают необход им ы й режим хроматог рафа (температуру, скорость под ачи

9 под в ижной фаз ы , д етектор), з атем пров од я т хроматог рафическое раз д еление и рег истрируют сигнал. И спольз уя полученны й сигнал, опред еля ют сод ержание кажд ог окомпонента в под в ижной фаз е после ее в ы ход аиз колонки.

Рис.4 Схемав ы борав ариантахроматог рафическог оанализ а.

10 Х рома т огра фи ч е ски е

п а ра ме т ры

Н аиболее в ажны м и хроматографическими параметрами, позв оля ющ им и оценитьэ ффектив ностьи селектив ностьколонки и степень раз д еления раз личны х в ещ еств , я в ля ются : в рем я уд ержив ания , уд ержив аемы й объем , коэ ффициент емкости, коэ ффициент уд ержив ания , число теоретических тарелок, в ы сота, э кв ив алентная теоретической тарелке, коэ ффициентселектив ности и коэ ффициентраз д еления . Н а рис.5 пред став лена ид еализ иров анная хроматог рамма смеси д в ух в ещ еств . П о оси абсцисс отложено в ремя хроматог рафиров ания (можноотложить объем э люата), пооси орд инат – аналитический сигнал, св я з анны й с концентрацией в ещ еств в э люате (отклик А ). Рассмотрим основ ны е хроматог рафические параметры , характериз ующ ие пов ед ение в ещ еств а в колонке. В ремя от момента в в од а анализ ируемой пробы д о момента рег истрации максим ума пика наз ы в ают вре ме не м уде рж и ва ни я , или вр е ме не м элюи рова ни я - (tR). В ремя уд ержив ания склад ы в ается из д в ух состав ля ющ их – в ремени пребы в ания в ещ еств в под в ижной фаз е (tm) и в ремени пребы в ания в непод в ижной фаз е (t S) : t R = t m+ t S

(1)

Значение tm фактически рав но прохожд ения через колонку несорбируемог окомпонента. Значение tR не з ав иситотколичеств апробы , ноз ав иситотприрод ы в ещ еств аисорбентаи можетменя ться отколонки к колонке. П оэ тому д ля характеристики истинной уд ержив ающ ей способности след уетв в ести и спра вле нное вре мя уде рж и ва ни я ( t R' ) : t R' = t R - t m

(2)

A

t R2 tR1 tm

t R′

w=4σ Рис.5. Х роматограммасмеси д в ух в ещ еств .

В рем я

11 Часто д ля характеристики уд ержив ания использ уют уде рж и ва е мы й объе м VR – объем под в ижной фаз ы , которы й нужно пропустить через колонкус опред еленной скоростью, чтобы э люиров атьв ещ еств о: (3)

VR = F× tR ,

где F – объемная скоростьпотока, см 3× с-1 . О бъем д ля в ы м ы в ания несорбируемого компонента в ы ражается через tm : Vm = F × tm .

Испра вле нны й уде рж и ва е мы й объе м соотв етств еннорав ен VR ' = VR – Vm

(4)

П ри постоя нны х услов ия х хроматографиров ания (скорость потока, д ав ление, температура, состав фаз ) з начения tR и VR строго в оспроиз в од имы и мог утбы тьиспольз ов аны д ля ид ентификации в ещ еств . М ассу в ещ еств а, в ы мы в аемого из колонки (m), можно найти по площ ад и под крив ой э люиров ания : ∞

m = ∫ CdV , 0

где С– концентрация , моль/мл; V – объем, м л. П олез ны м в хроматографии я в ля ется коэф ф и ци е нт уде рж и ва ни я (за ме дле ни я ) R – отнош ение скорости д в ижения в ещ еств а к скорости д в ижения раств орителя : L / tR tm = , (5) L / tm tR где α – д лина колонки. Т аким образ ом, R показ ы в ает, какую д олю в ремени в ещ еств онаход ится в под в ижной фаз е. У читы в ая (1), получим : R=

R=

tm 1 = t m + tS 1 + t S / t m

(5а)

Д ля неуд ержив аемого в ещ еств а tR = tm и R = 1. Е сли в ремя пребы в ания в под в ижной и непод в ижной фаз ах од инаков о (tm = ts ), то R = 0,5. О чев ид но, чтоR можнов ы раз итьчерез VR : R= Vm/ VR

(6)

12 Д руг ой процесс распред еления в ещ еств а межд у д в ум я фаз ами характериз уется коэф ф и ци е нт ом ра спре де ле ни я D. В д анном случае D= CS/Cm,, где Cm и СS - рав нов есная концентрация в ещ еств а в под в ижной и непод в ижной фаз ах соотв етств енно. К оэ ффициент распред еления св я з ан с хроматографическим и параметрами. Д ейств ительно, отнош ение в ремени пребы в ания в ещ еств а в непод в ижной фаз е к под в ижной фаз е рав но отнош ению количеств в ещ еств ав фаз ах (CV): tS C SVS V = =D S tm C mVm Vm

(7)

У читы в ая соотнош ение (5а), получаем : R=

1 V 1+ D S Vm

=D

Vm Vm + DVS

(8)

С д руг ой стороны , из в ы ражения (6) след ует VR = Vm + D×VS

(9)

П роиз в ед ение D(VS/Vm) наз ы в ают коэф ф и ци е нт ом е мкост и и ' обозначают k . Э та в еличинаобратна в еличине R и показ ы в ает, в осколько раз в ещ еств о д ольш е наход ится в непод в ижной фаз е, чем в под в ижной. О птимальны е з начения k' лежат в пред елах 1,5 - 4. Е сли коэ ффициент распред еления мал, томалоз начение k', в ещ еств оплохоуд ержив ается , т.е. прод в иг ается поколонке с той же скоростью, чтои под в ижная фаз а. Е сли же коэ ффициентемкости слиш ком в елик, тов ремя пребы в ания в ещ еств ав колонке буд еточеньбольш им и наанализ потребуется мног ов ремени. В ид но, чтоисправ ленны й уд ержив аем ы й объем св я з ан с D просты м соотнош ением: VR '= VR - Vm=D×VS

(10)

У рав нения 9 и 10 я в ля ются основ ны м и урав нения ми хроматог рафии и показ ы в ают, чтоVR' пропорционален в еличине D и объемунепод в ижной фаз ы колонки VS . В еличина VS з ав исит от толщ ины слоя непод в ижной фаз ы , нанесенной насорбент, отд лины и д иаметраколонки. Срав нительно больш ие раз личия в з начения х VR ' д ля д в ух в ещ еств (А и В ) г ов оря т о полном их раз д елении.

13 Те ори и хрома т огра фи ч е ского ра зде ле ни я И з в естно несколько теорий хроматографическог о процесса. Сущ еств енное з начение имеют ме т од т е оре т и че ски х т а ре лок и ки не т и че ска я т е ори я . В ме т оде т е ор е т и че ски х т а ре лок М артина и Синд жа хроматографическая колонка мы сленно д елится на ря д э лементарны х участков – “ тарелок” и пред полаг ается , что на кажд ой тарелке очень бы строустанав лив ается рав нов есие межд усорбентом и под в ижной фаз ой. К ажд ая нов ая порция газ а-носителя в ы з ы в ает смещ ение э тог орав нов есия , в след ств ие чег о часть в ещ еств а переносится на след ующ ую тарелку, на которой, в сою очеред ь, устанав лив ается нов ое рав нов есное распред еление и происход ит перенос в ещ еств а на послед ующ ую тарелку. В рез ультате э тих процессов хроматографируемое в ещ еств о распред еля ется на нескольких тарелках, причем на сред них тарелках ег о концентрация оказ ы в ается максимальной посрав нению с сосед ним итарелками. К оличеств енной мерой э ффектив ности хроматог рафической колонки я в ля ется вы сот а , экви ва ле нт на я т е оре т и че ской т а ре лке , H (В Э Т Т ), и чи сло т е оре т и че ски х т а ре лок N. В Э Т Т может бы ть опред елена как д исперсия наед иницуд лины колонки (L, мм): H=σ2/L

(11)

П ричем σ в ы ражают в тех же ед иницах, чтои H (ед иницы д лины или в ремени). П осколькуN = L/ H, след ов ательно, N= σ2 / H2

(12)

Число теоретических тарелок лег ко рассчитать непосред ств енно из хроматограммы , срав нив ая ш ирину пика W и в рем я пребы в ания (t R) компонентав колонке: 2

t  t  N = 16 R  =  R  ω  σ 

2

(13)

или

 t  N = 5,55 R  ω 1 / 2 

2

(14)

О пред елив N, лег ков ы числитьз начение Н , з ная д линуколонки (L):

H=L/ N, г д е L -д линаколонки, см . В случае в ы сокоэ ффектив ной колонки раз м ы в ание полос небольш ое, пики узкие. В еличина Н состав ля ет 0,3 - 1 мм. В ид еальном случае Н приближается к раз меру д иаметра (dр) з ерна сорбента. Чтобы срав нить

14 э ффектив ность д в ух колонок, след ует использ ов ать при ве де нную вы сот у т а ре лки (h). П рив ед енная в ы сотатарелки рав на h= H/dр . П ри уменьш ении в еличины H максимумы на крив ой э люиров ания станов я тся более остры ми. Ки не т и че ска я т е ори я хроматог рафии основ ное в нимание уд еля ет кинетике процесса, св я з ы в ая в ы соту, э кв ив алентную теоретической тарелке, с процессами д иффузии, мед ленны м установ лением рав нов есия и нерав номерностью процесса. В ы сота, э кв ив алентная теоретической тарелке, св я з анасоскоростью потокаурав нением В ан-Д еемтера: Н =А+В/V +CV,

(15)

где А ,В ,С – константы , v-скоростьпод в ижной фаз ы . К онстанта А св я з ана с д ейств ием в ихрев ой д иффузии, которая з ав исит от раз мера частиц и плотности з аполнения колонки; в еличина В св я з ана с коэ ффициентом д иффуз ии молекул в под в ижной фаз е, э то слаг аемое учиты в ает д ейств ие прод ольной д иффузии; константа С характериз ует кинетику процесса сорбция – д есорбция , массоперед ачу и д руг ие э ффекты . В Э Т Т можносд елатьм инимальной, в ы брав оптимальную скорость потока. Д ля расчета минимальной Н нужно прод ифференциров ать урав нение (15), а полученное урав нение реш ить относительноскорости потока, чтод аетслед ующ ее в ы ражение:

Vопт =

B/C

(16)

Н опт = А + 2 В / C

(17) Т аким образ ом, кинетическая теория д ает основ у д ля оптим из ации хроматографическог опроцесса. С е ле кт и вност ь

и

ра зре ш е ни е

Х роматог рафическое раз д еление основ ано на селектив ности сорбентаи раз личии в термод инам ических св ойств ах хроматог рафируемы х в ещ еств в системе сорбент-э люент. Чтобы реш ить в опрос ов озможности хроматографическог ораз д еления компонентов смеси на инд ив ид уальны е в ещ еств а, нужно сопостав ить их хроматог рафические параметры . Д ля таког о сопостав ления использ уют коэф ф и ци е нт се ле кт и вност и α и раз реш ение Rэ . К оэ ффициент селектив ности я в ля ется мерой относительного уд ержив ания или относительной под в ижности раз д еля емы х в ещ еств :

t , R 2 VR,1 D2 k 2, α= , = , = = t R1 V R 2 D1 k1, П ри α = 1 раз д еление в д анны х услов ия х нев озможно.

(18 )

15 П осколькускорость перемещ ения з оны д анног ов ещ еств а в колонке обратно пропорциональна коэ ффициенту распред еления , в ещ еств а с раз ны ми D буд утперемещ аться в д ольколонки с раз ны м и скоростя ми, что и прив од итк их хроматог рафическомураз д елению. Д ля раз д еления нужно так под обратьпод в ижную и непод в ижную фаз ы , чтобы D1 ≠ D2 . П оскольку k'=D×(Vs/Vm), то пов ы сить селектив ность колонки можно з а счет из менения объема под в ижной фаз ы . В еличину k' можно из меня ть, в арьируя D, VS , а также Vm. П ри малы х k' компоненты , как уже указ ы в алось, слабо уд ержив аются колонкой и наблюд ается плохое раз д еление. П ри больш их k' раз д еление улучш ается , но в ремя хроматографиров ания ув еличив ается . О птимальны е з начения k' лежат в интерв але 1,5 - 4. Раз д еление д в ух сосед них пиков характериз уется ра зре ше ни е м RS (разреш ение пиков ), которое описы в ается урав нением :

RS =

t R 2 − t R1 t −t = 2 R 2 R1 , (ω 2 + ω1 ) / 2 ω 2 + ω1

где ω 1 и ω 2 – ш ирина пиков , из меренная Д ля д в ух раз ны х пиков ω 1 = ω 2 , тогда

RS =

∆t R ∆t R = ω2 ω1

(19) у их

основ ания .

(20)

К ак в ид ноиз урав нения (19), раз реш ение пиков з ав иситотих ш ирины и от расстоя ния межд умаксим умам и пиков . У читы в ая урав нение (7), (12), (18), приход им к в ы в од у, что раз реш ение я в ля ется функцией э ффектив ности (N), коэ ффициентаселектив ности (α) и емкости (k1) колонки: , 1 α − 1   k  RS = N , × 4  α  1 + k 

(21)

И з э тог оурав нения лег корассчитать числотеоретических тарелок, необход имое д ля раз д еления с з ад анны м раз реш ением : 2

 k , + 1  α  N = 16R  ,     k  α − 1 2 S

2

(22)

Н а рис.6 показ анов лия ние э ффектив ности колонки и селектив ности сорбента на раз д еление смеси д в ух в ещ еств . О птимиз ация раз д еления св од ится к в ы борулучш ег осочетания параметров , в ход я щ их в урав нение (22). Т ак, например, д ля ув еличения R1 в д в а раз а нужно ув еличить э ффектив ность (N) или д линуколонки (α) в 4 раз а. В больш ей степени на в еличину R1 в лия еткоэ ффициентселектив ности: при из менении α от1,02 д о1,04 R1 ув еличив ается в 2 раз а.

16 С

С

VR

С

VR

VR

V а) б) в) Рис.6. Зав исимость степени раз д еления смеси д в ух в ещ еств от э ффектив ности колонки и селектив ности сорбента: a – в ы сокая селектив ность, но плохая э ффектив ность; б – в ы сокая э ффектив ность, но плохая селектив ность; в – в ы сокая э ффектив ность, д остаточная селектив ность. Д ля сильно уд ержив аемы х в ещ еств , теоретических тарелок опред еля ется (RS =1):

когда

k'>>1,

16α 2 N = (α − 1) 2

число

(23)

И зоб ра ж е ни е ч и сла т а ре лок N

К ак в ид но из рис.7 (при постоя нном параметре RS), чем меньш е коэ ффициент селектив ности α, тем больш ее число N необход имо д ля раз д еления д в ух в ещ еств .

R1=1.5 RS=1,5 RS=1,0 RS =0,75 α

Рис. 7. Зав исимость числа теоретических тарелок, необход имог о д ля раз д еления в ещ еств А и В отα . Д ля количеств енног о раз д еления компонентов в полне д остаточно, чтобы RS =1,5 (6σ -разд еление), так как д ля г ауссов ской крив ой W=4σ. П ри э том пики раз д елены практически д онулев ой (баз исной) линии. Д ля более полног ораз д еления в ещ еств необход имоув еличив ать в рем я анализ а. Е сли RS =1, то расстоя ние межд у пиками 4σ (4σ-раз д еление). Э тог о в полне д остаточно д ля целей количеств енног о анализ а, так как перекры в ается только2% площ ад и пиков .

17 II. О БРАБО ТКА Х РО М А ТО ГРАФ И ЧЕС КИ Х ДА ННЫ Х Х роматография позв оля етраз д еля тьне толькоком поненты смеси, но и опред еля ть ее качеств енны й и количеств енны й состав , поскольку положения хроматографическог о пика на хроматограмме (уд ержив аемы й объем и в ремя уд ержив ания ) д ля д анной хромотографической системы характериз ует природ у д анног о в ещ еств а. П лощ ад ь, ограниченная э той крив ой и нулев ой линией д етектора (хроматог рафический пик), пропорциональна количеств у д анног о в ещ еств а, прош ед ш ег о через д етектор. Ка ч е ст ве нны й а на ли з И д ентификация хроматографическим и метод ам и - э то, прежд е в сег о, ид ентификация по параметрам уд ержив ания (tR, VR ), поскольку они отличаются хорош ей в оспроиз в од имостью, относительны е станд артны е отклонения не прев ы ш ают 2%. Сов пад ение в еличин уд ержив ания неиз в естног о и станд артног о соед инения г ов орит о том, что э ти соед инения мог ут бы ть ид ентичны ми. О д нако в озможен случай, ког да раз личны е в ещ еств а имеют од инаков ое в ремя уд ержив ания . П оэ тому д ля больш ей д остов ерности ид ентификации срав нение хроматог рафических параметров из в естног о и неиз в естного в ещ еств а пров од я т в сильно раз личающ ихся услов ия х, например, получают д анны е об их хроматографическом пов ед ении наколонках с раз личны ми непод в ижны м и фаз ами. Е сли хроматог рафическое пов ед ение станд артног ои неиз в естног о в ещ еств а в таких случая х ид ентично, то д остов ерность ид ентификации в озрастаетд о99%. П ри срав нении хроматог рамм, полученны х на раз ны х приборах, чтобы из бежать ош ибок в ид ентификации, использ уют исправ ленное в ремя уд ержив ания и исправ ленны й уд ержив аемы й объем. Часто ид ентификацию пров од я т по относительном у уд ержив анию (t отн), т. е. по отнош ению уд ержив аемог о объема опред еля емог о ком понента к уд ержив аемомуобъемув ещ еств а, приня тогоз астанд арт: t от н =tR'/ tRст = VR '/ VRcт

(24)

Э тав еличиназ ав иситтолькоотсостав апод в ижной и непод в ижной фаз . Сущ еств ует ещ е од ин способ ид ентификации, основ анны й на од нов ременном использ ов ании д в ух д етекторов . О д ин д етектор неспецифичен (катарометр, рефрактометр), а интенсив ность сиг нала д руг ог о д етектора з ав исит от природ ы в ещ еств а, например, д етектор – э лектронног о з ахв ата в г аз ов ой хроматог рафии (ГХ ) или У Ф д етектор в жид костной хроматог рафии. Срав нение хроматограмм, полученны х с помощ ью д в ух д етекторов , д ает информацию, например, о состав е и функциональны х г руппах орг анических в ещ еств .

18 Закономерность из менения уд ержив аемы х объемов в гомолог ическом ря д уорг анических соед инений также соз д ает основ уд ля ид ентификации. Н апример, в ГХ использ уют з ав исимость лог арифма исправ ленног о объема от числа уг лерод ны х атомов в соед инения х, принад лежащ их к од ному г омологическому ря д у. Е сли установ лено, что соед инение относится к д анному г омолог ическом у ря д у, ег о можно ид ентифициров ать по г рафику з ав исимости логарифма исправ ленног о объема от числа уг лерод ны х атомов . Д ля э тог о д остаточно з нать характеристики уд ержив ания нескольких членов гомологическог оря д а. Д ля качеств енной ид ентификации уд обно польз ов аться и нде кса ми уде рж и ва ни я Кова ча (I), которы е посущ еств у я в ля ются относительны м и параметрами уд ержив ания . В э том случае з а станд арт берут д в а сосед них алкана, од ин из которы х э люируется д о, а в торой после исслед уемог о соед инения , т.е. t'R (z) < t'R ( x ) < t'R ( z + 1 ) , где z - число атомов уг лерод а в алкане. Л ог арифмический инд екс уд ержив ания рассчиты в аютпоформуле:

I = 100

lg t R, ( х ) − lg t R, ( z ) lg t R, ( z +1) − lg t R, ( z )

+ 100 z

(25)

Заметим, что инд екс К ов ача и лог арифм исправ ленног о в ремени уд ержив ания (или уд ержив аем ы й объем) св я з аны линейной з ав исимостью с числом атомов углерод аучленов г омологическогоря д а. Д ля любог он-алкана I = 100z. Д ля в сех д ругих соед инений можно опред еля ть инд екс К ов ача относительно ш калы из мерения н-алканов , использ уя д анны е справ очны х таблиц. И нд ексы уд ержив ания более чув ств ительны к из менению св ойств системы , чем относительны е уд ержив аем ы е объемы , поэ тому ид ентификация по ним более над ежна. И нд ексы уд ержив ания использ уются не только д ля ид ентификации, но и д ля срав нительной оценки селектив ности непод в ижны х фаз . И ног д а д ля ид ентификации использ уют хим ические реакции д о или после хроматографиров ания . В послед нем случае отобранны е фракции э люатаанализ ируютхимическим и, физ ическими или физ ико-химическим и метод ами наприсутств ие тогоили иногокомпонента. Коли ч е ст ве нны й а на ли з Д ля пров ед ения количеств енног оанализ а похроматограмме сиг нал д етектораперед ается на э лектронное устройств о, которое преобраз ует ег о в цифров ую форму, либо на самописец с д иаграмм ной лентой. В послед нем случае количеств енны й анализ пров од я т по в ы соте или

19 площ ад и пика, так как э ти параметры пропорциональны концентрации или количеств ув ещ еств ав хроматог рафической з оне. И з мерение в ы сотпиков прощ е, чем площ ад ей, их можноиз меритьс больш ой точностью, особенно д ля в ещ еств с малы м в ременем уд ержив ания . Чем меньш е t R, тем уже, острее пик. О д нако из мерение площ ад ей д ля количеств енного опред еления компонентов использ уется чащ е. Д ля э тог оиспольз уютнесколькоспособов (рис.8). О бы чнопров од я т касательны е к ты луи фронту пика и соед иня ют их линией параллельной нулев ой линии. П лощ ад ь полученног о треуг ольника состав ля ет 96% от истинной и пропорциональнаколичеств ув ещ еств ав пробе. В торой способ применя ют при расчете площ ад и толькосимметричны х пиков . Д ля э того наход я т произ в ед ение в ы соты пика на ег ополуш ирину. Э топроиз в ед ение состав ля ет 84% площ ад и пика. Т очность из мерения площ ад и пика з ав исит от отнош ения в ы соты пика к егош ирине. О птимальное з начение лежитв пред елах от 2 д о 10.

х

1

у

2

z

3

Рис.8. И з мерение в ы соты пика.

Рис.9. О пред еление компонентов метод ом нормиров ки.

И спольз уя д анны е пов ы сотам пиков или их площ ад я м, можнорассчитать количеств енны й состав пробы метод ами нормиров ки (с использ ов анием или без использ ов ания поправ очны х коэ ффициентов ), в неш ней (абсолютной калибров ки) или в нутренней станд артиз ации. М е т од нор ми ровки чащ е в сего использ уют на практике (рис.9). Д ля его использ ов ания необход имо, чтобы на хроматог рамме бы ли з арегистриров аны в се ком поненты , в ход я щ ие в состав анализ ируемой смеси. Д оля площ ад и пика соотв етств ует сод ержанию компонента в в есов ы х процентах. П ри анализ е смеси трех компонентов сод ержание компонента (%), например, соотв етств ует пику Х на хроматограмме, можнорассчитатьпоформуле:

х ,% =

Sх 100, S х + S у + SZ

(26)

где Sx , Sy , S z – площ ад и пиков . Э ту формулу можно использ ов ать только в том случае, если д етектор од инаков очув ств ителен к кажд ом уиз раз д еля емы х ком понентов

20 смеси, т.е. ком поненты смеси, в з я ты е в од инаков ы х количеств ах, д ают од нуи туже площ ад ьпика. Е сли же чув ств ительность д етектора раз лична по отнош ению к раз ны м ком понентам пробы , то использ уют поправ очны е коэ ффициенты fX, fY, fZ, учиты в ающ ие чув ств ительность д етектора. Ф ормулад ля расчетав э том случае з аписы в ается так:

х ,% =

Sх fх 100 ΣS n f n

(27)

П оправ очны е коэ ффициенты получают при анализ е станд артны х серий ирассчиты в аютпоформуле:

fх =

S cт С х f ст , S х С ст

(28)

где Sx, S ст. – площ ад и пиков анализ ируемог ов ещ еств аистанд арта, СX и Сст. –концентрации анализ ируемогов ещ еств аи станд арта, f ст. – поправ очны й коэ ффициентстанд арта. М е т од вне шне го ст а нда рт а использ уют при опред елении отд ельны х в ещ еств или просты х смесей, он уд обен при опред елении микропримесей. Готов я т д в а станд артны х раств ора опред еля емы х компонентов , од инаков ы е их количеств а в в од я т в хроматог раф и опред еля ют площ ад ь пика кажд ого компонента (S1 и S 2). Рез ультаты пред став ля ют либо г рафически (рис. 10), либо пров од я т расчет по формуле: X (%)= k Sx

(29)

Град уиров очны й коэ ффициент К опред еля ют при анализ е проб станд артны х серий смесей (рис. 9):

S

П лощ адьпика

S1 S1 Sх

х

Sx

S2

S2 х,% Рис. 9 О пред еление ком понентов метод ом в неш нег останд арта

применя ют, если на М е т од внут ре нне го ст а нда рт а хроматограмме отсутств уют пики некоторы х компонентов анализ ируемой смеси. М етод основ ан на том, что в анализ ируем ую смесь в в од я т

21 некоторое количеств о станд артног о в ещ еств а. В ещ еств о, использ уемое в качеств е в нутреннег останд арта, д олжноуд ов летв оря тьря д утребов аний: д олжно полностью отд еля ться от друг их компонентов смеси; в ремя уд ержив ания ег од олжнобы ть близ ким к t R опред еля емы х ком понентов ; д олжнобы ть химически инертны м и отсутств ов атьв опред еля емой пробе; ег о концентрация д олжна бы ть близ кой к концентрации опред еля ем ы х компонентов ; пики симметричны ми. Д ля в ы полнения опред еления состав ля ютсмеси опред еленног оточногосостав а в нутреннегостанд артас кажд ы м из ком понентов , использ уютраз личны е соотнош ения в нутреннего станд арта и компонентов , получают хроматограммы таких смесей. О пред еля ют площ ад и пиков и д ля кажд ог о ком понента рассчиты в ают поправ очны й коэ ффициентпоформуле:

k=

S в.ст С х , S х С в.ст

(30)

где Sв .ст, Sx – площ ад и пиков в нутреннег о станд арта и опред еля емог о компонента; Св .ст, Сx – концентрации станд артаи исслед уемог ов ещ еств ав искусств енны х смеся х. Зная поправ очны е коэ ффициенты , расчет процентног о сод ержания компонентапров од я тпоформуле:

х ,% = kr

Sх 100, S в.ст

(31)

г д е r = mв.ст . / mпробы (m- масса, г ). Рез ультаты можнопред став итьг рафически(рис.11): х S/Sв .с y

x

y

в .с.

z z Х,% Рис. 11. О пред еление ком понентов метод ом в нутреннег останд арта Д ост ове р ност ь ре зульт а т ов и и ст очни ки погр е шност е й. Систематические погреш ности в хроматог рафический количеств енны й анализ в нося т: под г отов ка и отбор пред став ительной пробы , ее нег омог енность, так как работают с малы м и объемами проб; аппаратура – нелинейность д етектора, раз личная его чув ств ительность к раз ны м компонентам пробы ; обработка хроматог рамм. Чащ е в сег охроматог рафы , настроенны е на работув оптимальны х услов ия х, не в нося т з начительног о

22 в клад а в пог реш ность рез ультата. П оэ тому в общ ую д исперсию анализ в ключает д исперсию, св я з анную с из мерением площ ад и пика. В оспроиз в од имость из мерения опред еления площ ад ей пиков метод ом построения треугольника, в ы ражаемая станд артны м отклонением , состав ля ет 4%, метод ом произ в ед ения в ы соты на ш ирину, из меренную на полов ине в ы соты – 2,5%, с помощ ью э лектронног оинтегратора– 0,4%. III. ПРАКТИ ЧЕС КАЯ ЧАС ТЬ ГАЗО АДС О РБЦ И О ННАЯ И ГА ЗО Ж И ДКО С ТНАЯ Х РО М А ТО ГРАФ И Я Газ ов ая хроматог рафия – процесс раз д еления компонентов смеси, основ анны й на раз личии в рав нов есном распред елении компонентов межд уд в ум я фаз ами – газ ом-носителем (под в ижная фаз а) и либотв ерд ой фаз ой, либожид костью, нанесенной в в ид е тонкой пленки на пов ерхность тв ерд ого носителя или стенки хроматог рафической колонки (жид кая непод в ижная , жид кая стационарная фаз а). В перв ом случае метод наз ы в ается г аз оад сорбционной хроматог рафией, в о в тором – газ ожид костной (распред елительной) хроматог рафией. И з э тих д в ух в ариантов г аз ов ой хроматографии наиболее распространена распред елительная г аз ожид костная хроматография (ГЖ Х ). Сущ ность метод а ГЖ Х состоитв след ующ ем . А нализ ируемая смесь (обы чно раств ор) летучих компонентов перев од ится в парообраз ное состоя ние и смеш ив ается с потоком инертног ог аз а-носителя , образ уя с ним под в ижную фаз у – П Ф . Э та смесь проталкив ается д алее нов ой порцией непреры в но под ав аемог о г аз а-носителя и попад ает в хроматографическую колонку, з аполненную непод в ижной (стационарной) жид кой фаз ой – Н Ф . Раз д еля емы е ком поненты распред еля ются межд уП Ф и НФ в соотв етств ии с их коэ ффициентам и распред еления К , опред еля ем ы ми как К = с(Н Ф )/ с(П Ф ), где с(Н Ф ) и с(П Ф ) – соотв етств енно сод ержание (в г /мл) д анного компонента в непод в ижной и под в ижной фаз ах, наход я щ ихся в д инам ическом рав нов есии. П оток газ а-носителя ув лекает с собой раз д еля емую парообраз ную смесь в д оль хроматог рафической колонки, так что процессы ⇔ д есорбция раз д еля емы х ком понентов пов торя ются сорбция мног ократно, причем кажд ы й раз в системе устанав лив ается д инам ическое рав нов есие раз д еля емы х в ещ еств межд у П Ф и Н Ф . Э ти мног ократны е переход ы раз д еля ем ы х в ещ еств из П Ф в Н Ф и обратносов ерш аются по в сей д лине хроматографической колонки д о тех пор, пока пары раз д еля емы х в ещ еств не покинутколонкув месте с г аз ом-носителем .

23 П оскольку срод ств о раз личны х раз д еля ем ы х в ещ еств к Н Ф раз лично, то в процессе сорбционны х – д есорбционны х переход ов они з ад ержив аются в Н Ф неод инаков ое в ремя . Чем в ы ш е температуракипения и относительная раств оримость в ещ еств в Н Ф , т.е. чем больш е его коэ ффициент распред еления , чем д ольш е ононаход ится в Н Ф , тем поз же покид ает хроматог рафическую колонку. В конце концов из хроматографической колонки в месте с г аз ом – носителем в ы ход я т з оны парообраз ны х хроматог рафируемы х в ещ еств , раз д еленны х полностью или частично. Е сли д ля д в ух ком понентов смеси коэ ффициенты распред еления од инаков ы , тоони не раз д еля ются . Е сли же коэ ффициенты распред еления раз личны , то раз д еление происход ит, причем перв ы м колонку покид ает тоткомпонент, укоторог окоэ ффициентраспред еления наименьш ий. С орб е нт ы и а п п а ра т ура Сорбенты в г аз оад сорбционной хроматог рафии. Сорбенты , использ уем ы е в ГА Х , пред став ля ют собой тв ерд ы е тела, облад ающ ие ад сорбционной актив ностью по отнош ению к г аз о- и парообраз ны м в ещ еств ам, од нород ной пористостью и больш ой уд ельной пов ерхностью. О снов ны ми ад сорбентами, применя ем ы ми в г аз ов ой хроматографии, я в ля ются актив иров анны е угли, силикаг ели, оксид алюминия , синтетические цеолиты (молекуля рны е сита), пористы е стекла, раз личны е соли, пористы е полимеры . О ни д олжны облад ать след ующ им и св ойств ами: необход имой селектив ностью, отсутств ием каталитической актив ности и химической инертностью по отнош ению к компонентам раз д еля емой смеси, д остаточной механической прочностью, опред еленны м з ернением . Сорбенты в газ ожид костной хроматографии. В ГЖ Х роль сорбента в ы полня ет жид кость, нанесенная в в ид е тонкой пленки на пов ерхность з ерен инертног о носителя . О птимальны й тв ерд ы й носитель д олжен облад ать д остаточной уд ельной пов ерхностью, з начительны м и по в озможности од инаков ы м д иаметром пор, химической и ад сорбционной инертностью, од инаков ы ми по форме и по раз мерам частицами, способностью смачив аться непод в ижной фаз ой, механической прочностью. Ш ирокоприменя ются след ующ ие носители: • д иатомитов ы й кирпич (киз ельгур, инфуз орная з емля ); • хромосорб w, хромосорб p, сферосорб (основ а-д иатомитов ы й кирпич); • силохром 1,2,3 (чисты й кремнез ем); • хромосорб 101, 102, синахром, полихром, порапак (основ а– стиролд ив инилбенз ол). В качеств е непод в ижной жид кой фаз ы в ГЖ Х применя ютраз личны е орг анические в ещ еств а (д ибутилфосфат, полиэ тиленгликоль, д иглицерин, в аз елинов ое масло и д р.). О ни д олжны уд ов летв оря ть след ующ им требов ания м : иметь низ кое д ав ление паров при рабочей температуре

24 колонки; облад ать термостойкостью; хорош о раств оря ть компоненты раз д еля емой смеси; облад атьд остаточной селектив ностью. Газ охроматографические процессы осущ еств ля ются в г аз ов ы х хроматографах. О ни пред став ля ют собой комплекс узлов , кажд ы й из которы х в ы полня ет опред еленную функцию в процессе анализ а, начинающ ег ося под готов кой и в в од ом пробы и з аканчив ающ ег ося рег истрацией опред еля емы х компонентов . П ринципиальная сх е ма га зового х рома т огра ф а пред став ленанарис. 1.

Рис.1. Схемаг аз ов ог охроматог рафа. 1–г аз -носитель; 2 – блок под готов ки г аз ов ; 3 – д озирующ ая петль; 4 – испаритель; 5 – колонка; 6 – термостат; 7 – д етектор; 8 – блок питания д етектора; 9 – усилитель сигнала д етектора; 10 – рег истрирующ ее устройств о. Газ -носитель. В качеств е газ а-носителя применя ют газ , практически не ад сорбирующ ийся и не раств оря ющ ийся в непод в ижной фаз е при температуре колонки и хим ически не реагирующ ий с компонентами смеси. Чащ е в сег оприменя ютг елий, аз от, в од ород , арг он, д иоксид углерод а, реже в озд ух, неон, метан. Газ -носитель д олжен бы ть д остаточночисты м, легко д оступны м и иметь низ кую стоимость. Д ав ление г аз а-носителя на в ход е в колонкуиз меря ютманометром. Система в в од а пробы (д озатор) пред наз начена д ля точного количеств енногоотбора пробы г аз а и в в ед ения ее в хроматог рафическую колонку. В качеств е устройств д ля э той цели использ уют краны -д озаторы или раз личног о род а сосуд ы точно из в естног ообъема. Часто в качеств е д озатораприменя ютмед ицинский ш приц. Х роматографические колонки в есьма раз личны поформе, раз мерам и конструкционны м материалам. П рименя ютпря м ы е, спиральны е и д руг ие колонки д линой от 1-2 м д о нескольких д еся тков метров ; в нутренний д иаметр колонок состав ля ет обы чно несколько миллиметров . В з ав исимости от св ойств анализ ируемой системы в качеств е

25 конструкционны х материалов д ля колонок использ уются сталь, латунь, стекло и д р. Больш ое в лия ние на сорбируемость г аз а оказ ы в ает температура, поэ тому хроматографические колонки, как прав ило, термостатируются . рафической Д етектор. Д етектор – в ажнейш ий узел газ охроматог установ ки. О н пред наз начен д ля обнаружения из менений в состав е г аз а, прош ед ш ег очерез колонку. П оказ ания д етектораобы чнопреобраз уются в э лектрический сигнал и перед аются фиксирующ ем уили з аписы в ающ ем у прибору, например на ленту э лектронног о потенциометра. Д етектор служит д ля обнаружения и количеств енног о опред еления компонентов смеси в потоке г аз а-носителя . О снов ны е характеристики д етектора: приг од ностьд ля фиксации в сех в ид ов раз д еля емы х в ещ еств нез ав исимоот их хим ической природ ы , д остаточно простая конструкция , в ы сокая чув ств ительность и стабильность в работе, ничтожная инерционность, линейная з ав исимостьпоказ аний д етектораотколичеств апробы . О д ним из наиболее распространенны х д етекторов я в ля ется ка т а роме т р, или де т е кт ор по т е плопроводност и (Д Т П ). П ринцип его работы основ ан на из мерении сопротив ления наг ретой платинов ой или в ольфрамов ой нити. К оличеств отеплоты , отв од имое отнагретой ним и при прочих постоя нны х услов ия х, з ав исит от теплопров од ности газ а, а теплопров од ность смеси г аз ов з ав исит от ее состав а. В послед нее в ремя металлические нити успеш ноз аменя ются термисторами, имеющ им и более в ы сокий, чем уметаллов , коэ ффициентэ лектропров од ности. Н аибольш ей чув ств ительностью облад ает и они за ци онны й де т е кт ор, или де т е кт ор и они за ци и в пла ме ни (Д И П ), поз в оля ющ ий обнаружить10-15 моль примесей. В пламенно-иониз ационны х д етекторах из меря ют э лектрическую пров од имость пламени в од ород ной г орелки. П ри поя в лении в в од ород е примесей происход ит иониз ация пламени, пропорциональная концентрации примеси, что лег ко может бы ть из мерено. Ка ч е ст ве нны й а на ли з К ачеств енны й состав в ещ еств а может бы ть установ лен с помощ ью хроматографической метод ики по характеристикам полученной хроматограммы или по рез ультатам анализ а компонентов смеси после прохожд ения хроматог рафической колонки под ход я щ им физ икохимическим метод ом. Собств енно хроматог рафический качеств енны й анализ основ ан на применении характеристик уд ержив ания – в ремени уд ержив ания или пропорциональног о ему объема и инд ексов уд ержив ания . И д ентификация в ещ еств а поег охроматограмме можетбы ть в ы полнена также метод ом тестеров , ког д а срав нив ают объем или в ремя уд ержив ания ком понента анализ ируемой смеси и э талона, найд енны е в од них и тех же услов ия х опы та. И ног д а э талонное в ещ еств о, наличие которого пред полаг ается в анализ ируемой смеси, специально в в од я т в пробу и срав нив ают в ы соту и площ ад ь пиков на хроматограммах,

26 полученны х д о и после в в ед ения э талона. У в еличение в ы соты или площ ад и пика рассматрив ается как указ ание на присутств ие пред полаг аемогокомпонентав пробе. В г аз ожид костной хроматог рафии д ля качеств енног оанализ а часто использ уюти нде ксы уде рж и ва ни я Кова ча I:

I = 100

lg(t ' r ,i / t ' r ,n ) + 100n, lg(t 'r ,( n+1) / t 'r ,n )

где t’r – прив ед енное в ремя уд ержив ания ; n – число атомов уг лерод а в алкане; i – опред еля емое в ещ еств о. Станд артом при опред елении инд екса уд ержив ания я в ля ются д в а сосед них нормальны х алкана, од ин из которы х э люируется д о, а в торой после исслед уемог осоед инения . И д ентификация в ещ еств а по инд ексу уд ержив ания произ в од ится путем хроматог рафиров ания соед инения с послед ующ им хроматографиров анием в тех же услов ия х д в ух сосед них алканов , в ы бранны х в качеств е станд арта. И нд ексы уд ержив ания многих в ещ еств при опред еленны х тем пературах имеются в справ очны х таблицах, что облег чаетпров ед ение качеств енногоанализ а. Э ффектив ны м оказ алось применение нез ав исимой аналитической ид ентификации прод уктов хроматог рафического раз д еления и сочетание газ ов ой хроматог рафии с д руг ими метод ами исслед ов ания : И К -спектроскопией и масс-спектрометрией, а также использ ов ание селектив ны х и послед ов ательноработающ их д етекторов . Коли ч е ст ве нны й а на ли з К оличеств енны й хроматографический анализ основ ан на из мерении раз личны х параметров пика, з ав ися щ их от концентрации в ещ еств – в ы соты , ш ирины , площ ад и и уд ержив аемого объема. П ри д остаточной стабильности услов ий хроматографиров ания и д етектиров ания опред еля ющ им параметром пика можно считать ег о в ы соту. Расчет по площ ад и пика позв оля ет несколько сниз ить требов ания к стабильности услов ий хроматог рафиров ания , од накосамоиз мерение площ ад и в ы з ы в ает поя в ление нов ы х источников ош ибок. О снов ны ми в количеств енной хроматографии я в ля ются метод ы нормиров ки, в нутренней станд артиз ации и абсолютной калибров ки. П ри использ ов ании ме т ода норми ровки принимают сумм у какихлибопараметров пиков , например сум мув ы сот в сех пиков или сум муих площ ад ей, з а 100 %. Т ог д а отнош ение в ы соты отд ельног опика к сумме в ы сот или отнош ение площ ад и од ного пика к сум ме площ ад ей, умноженное на 100, буд ет характериз ов ать массов ую д олю (%) компонентав смеси. Н аиболее точны м я в ля ется ме т од а бсолют ной ка ли бровки . В э том метод е э кспериментально опред еля ют з ав исимость в ы соты или площ ад и

27 пика от концентрации в ещ еств а и строя т град уиров очны е графики. Д алее опред еля ют те же характеристики пиков в анализ ируемой смеси и по град уиров очному г рафику наход я т концентрацию анализ ируемого в ещ еств а. Э тот простой и точны й метод я в ля ется основ ны м метод ом опред еления микропримесей. М е т од внут ре нне го ст а нда рт а основ ан на в в ед ении в анализ ируем ую смесь точно из в естног о количеств а станд артного в ещ еств а. В качеств е станд артного в ы бирают в ещ еств о, близ кое по физ ико-химическим св ойств ам к компонентам смеси, но не обя з ательно я в ля ющ ееся ее компонентом. П осле хроматог рафиров ания из меря ют параметры пиков анализ ируемог о компонента и станд артного в ещ еств а. Е сли станд артное в ещ еств о не в ход ит в состав анализ ируемой смеси, массов ую д олю компонента(%) рассчиты в аютпоформуле

х ,% =

Qi 100r , Qст

где Qi и Qст – параметры пиков анализ ируемог окомпонента и станд арта соотв етств енно; r – отнош ение массы в нутреннег о станд арта к массе пробы . Ла б ора т орна я ра б от а № 1 О п ре де ле ни е соде рж а ни я сп и рт ов в сме си ме т одом га зож и дкост ной хрома т огра фи и на г аз ов ом Ц е ль ра бот ы : приобретение нав ы ков работы хроматографе, ов лад ение способами качеств енной и количеств енной обработкиполученны х хроматограмм. При боры и ре а кт и вы : 1. Газ ов ы й хроматог раф любой марки. 2. М икрош прицы на1 и 10 мкл. 3. Смесьспиртов в скля нке с притертой пробкой. 4. Станд арты инд ив ид уальны х спиртов : метилов ог о, э тилов ог о, пропилов ог о, бутилов ог о, амилов ог о в скля нках с притерты м и пробками. 5. Секунд омер. 6. И з мерительная лупа, линейка, каранд аш . У слов ия хроматог рафиров ания : колонка стальная , д линой 3 м, д иаметром 3 мм; сорбент – полиэ тиленгликольад ипинат на сферохроме в количеств е 20 % от массы носителя ; температура колонки – 80оС, температура испарителя – 120оС, температура термостата д етекторов – 110оС; скорость г аз а-носителя (гелия ) – 30 мл/мин, при работе с Д И П скорости в спомог ательны х г аз ов – в од орода 30 мл/мин, в озд уха – 300 мл/мин; объем в в од имой пробы при работе с катарометром – 1-5 мкл,

28 при работе с Д И П – 0,2-1 мкл; ток д етектора(при работе с катарометром) – 100 мА ; чув ств ительны й д иапаз он з аписи под бирают э кспериментальнов ход е работы . Вы полне ни е ра бот ы А нализ смеси спиртов в работе пров од я т, использ уя хроматог рафы с д етектором по теплопров од ности или с пламенно-иониз ационны м д етектором. П олучение хроматог раммы смеси спиртов . Д ля получения хроматограммы в испарительгаз ожид костног охроматог рафав в од я т5 мкл исслед уемой смеси, которую отбирают микрош прицем , пред в арительно несколько раз промы ты м э той же смесью. В в од смеси осущ еств ля ют, прокалы в ая э ластичную проклад куиспарителя и в в од я иг луд оупорав низ . В момент в в ед ения од нов ременно в ключают секунд омер. О тмечают на д иаг раммной ленте каранд аш ом момент в в од а пробы , устанав лив ают и з аписы в ают в ремена уд ержив ания кажд ог оиз компонентов смеси. В ремя отмечают в момент фиксации пера самописца в крайнем в ерхнем положении пика. Е сли пик не умещ ается на д иаг рамм ной ленте, переключателем из меня ют д иапаз он з аписи на более г рубы й, д елая соотв етств ующ ую отметкуна ленте. Т аким образ ом з аписы в ают не менее трех хроматограмм. Н а хроматог раммах д олжно бы ть пя ть пиков компонентов . К ачеств енны й анализ хроматог рамм. И д ентификация инд ив ид уальны х спиртов в смеси. Н аиболее просты ми и чащ е использ уем ы ми на практике я в ля ются д в аспособаид ентификации: 1. И д ентификация путем срав нения параметров уд ержив ания компонентов смеси и станд артны х образ цов инд ив ид уальны х компонентов . 2. И д ентификация метод ом д обав ок. П ри ид ентификации перв ы м способом з аписы в ают хроматог рамму анализ ируемой смеси в ещ еств и д альш е в тех же услов ия х хроматограммы кажд ог о из пред полаг аемы х компонентов смеси. В д анной работе после полученной хроматограммы смеси спиртов з аписы в ают отд ельно хроматограммы метилов ог о, э тилов ого, пропилов ог о, бутилов ог о и амилов ог о спиртов . Д ля получения э тих хроматог рамм в испаритель хроматографа микрош прицем в в од я т по1 м кл э танола и пропанола и по 3 мкл метанола, бутанола и пентанола. В сег о д олжны получить 5 хроматограмм, на кажд ой из которы х буд ет по од ному пику, соотв етств ующ ем у в в ед енному спирту. П ри получении хроматограмм очень тщ ательно фиксируют в ремя уд ержив ания соотв етств ующ его спирта. Сов пад ение в ремени уд ержив ания (tуд ) пикаинд ив ид уальног оспирта на хроматог рамме с в ременем уд ержив ания од ног о из пиков на хроматограмме смеси указ ы в ает на то, чтоименноэ тот пик принад лежит

29 д анном ув ещ еств у. Т аким образ ом ид ентифицируют в се 5 спиртов смеси. П римерны й в ид хроматог раммы пред став лен нарис. 2.

Рис. 2. О бщ ий в ид хроматог рамм, полученны х при пров ед ении ид ентификации ком понентов метод ом срав нения в ремени уд ержив ания компонентов : а) хроматог рамма исслед уемой смеси; б) и в ) хроматог раммы станд артны х образ цов пред полаг аемы х ком понентов смеси. П ри пров ед ении качеств енног о анализ а метод ом д обав ок после хроматограммы смеси опред еля ем ы х в ещ еств з аписы в ают в тех же услов ия х в торую хроматог рамму с д обав кой од ног о из пред полаг аемы х компонентов . В наш ем случае з аписы в ают в торую хроматог рамму, в в од я в испаритель хроматог рафа микрош прицем 5 мкл смеси + 1 мкл од ног оиз инд ив ид уальны х спиртов , т.е. в сег о6 мкл (набирают в од ин из ш прицов и в в од я тод нов ременно). Н аблюд ают, какой из пиков на хроматограмме ув еличится в раз мерах после искусств енной д обав ки (ув еличения сод ержания ) од ногоиз компонентов смеси. У в еличение в ы соты од ног о из пиков общ ей хроматограммы св ид етельств ует отом, чтоон принад лежит томуспирту, которы й в ы ступал в роли д обав ки. Т акие же д ейств ия пов торя ют и с остальны ми ком понентами смеси. П римерны й в ид хроматограммы пред став лен на рис. 3.

Рис. 3. О бщ ий в ид хроматог рамм, получаем ы х при пров ед ении ид ентификации компонентов метод ом д обав ок: а) хроматог рамма исслед уемой смеси; б) хроматограмма смеси с д обав кой ком понента 3; в ) хроматограммасмеси с д обав кой компонента5.

30 П ров ед я ид ентификацию в сех спиртов в смеси и установ ив расположение их пиков на хроматограмме, переход я т к количеств енной обработке хроматог раммы . К оличеств енная обработка рез ультатов хроматог рафического анализ а. Расчет сод ержания компонентов в анализ ируем ы х смеся х может бы тьпров ед ен тремя основ ны ми способами: 1) метод ом в нутренней нормализ ации; 2) метод ом в неш негостанд арта(г рад уиров очног ог рафика); 3) метод ом в нутреннег останд арта. В торой и третий метод ы более точны и применя ются обы чно д ля опред еления м икроколичеств в ещ еств в смеся х или в анализ е смесей, сод ержание компонентов в которы х раз личается в д еся тки или сотни раз . В д анной работе, поскольку сод ержание ком понентов в смеси соиз меримо (нет очень больш их раз личий в в ы сотах пиков ), может бы ть применен наиболее простой способ в нутренней нормализ ации, не требующ ий з аписи д ополнительны х хроматограмм. П ри пров ед ении расчетов сод ержания спиртов в смеси э тим способом необход имо сначала рассчитать площ ад ь пика кажд ог о из компонентов на хроматог рамме. Д ля э тог оиз меря ют в ы сотукажд огопика (h, см) и ег о ш ирину на полов ине в ы соты (μ0,5 , см). П еред пров ед ением из мерений просты м каранд аш ом по линейке пров од я т в основ ании пика касательную линию, соед иня ющ ую в осход я щ ую и нисход я щ ую в етв и пика (А С, рис. 4).

Рис.4. В ы ход ная хроматог рафии.

крив ая

раз д еления

спиртов

метод ом

газ ов ой

В ы соту пика (h) пров од я т и из меря ют как перпенд икуля р, пров ед енны й из в ерш ины пикапараллельнолиния м над иаг рамм ной ленте д опересечения с касательной в основ ании пика (В Д на рис. 4). Н аход я т точкуна перпенд икуля ре В Д , наход я щ уюся на полов ине ег о в ы соты (Е ):

31 В Е =Е Д . И з меря ютш иринупика наполов ине в ы соты (μ0,5 ), использ уя лупу с д еления ми: μ0,5 = FG. Рассчиты в аютплощ ад ьпикапоформуле: S,см = μ 0,5 ·h Т аким образ ом, пров од я т из мерения и рассчиты в ают площ ад ь в сех пя ти пиков на хроматограмме. Расчет сод ержания спиртов в смеси в % пров од я тпоформуле:

С i ,% =

Si 5

∑

n =1

⋅ 100

Sn

Е сли при получении хроматог раммы д ля каких-либо компонентов из меня ем д иапаз он з аписи – э тод олжнобы тьучтенопри расчете площ ад и пика(ее умножаютнасоотв етств ующ ий д иапаз он). Рез ультаты оформля ютв в ид е таблицы : В ы сотапика, Ш ирина пика П лощ ад ь h, см на полов ине пика, S, см 2 К омпонент в ы соты , μ0,5 ,см М етанол

Сод ержание компонента в смеси, %

Э танол ит.д .

Ла б ора т орна я ра б от а № 2. И де н т и фи ка ц и я угле ки слот ы в п ри родном га зе и оп ре де ле ни е е е коли ч е ст ва ме т одом га зовой хрома т огра фи и Ц е ль ра бот ы : приобретение нав ы ков работы на г аз ов ом хроматографе, ов лад ение способами качеств енной и количеств енной обработкиполученны х хроматограмм. При боры и ре а кт и вы : 1. Х роматог раф с д етектором потеплопров од ности. 2. Ш приц мед ицинский на5 мл. 3. Л упаиз мерительная с ценой д еления 0,1 м м, линейка. 4. А нализ ируемая смесь. У слов ия хроматог рафиров ания : колонка д линой 3 м, д иаметром – 3 мм; сорбент - носитель – д иатомитов ы й кирпич; непод в ижная жид кая фаз а – э фир 3-э тиленгликоля и н-масля ной кислоты в количеств е 20 % от в еса носителя ; газ -носитель – гелий; температура колонки – 20 ± 2 оС;

32 скорость г аз а-носителя – 35 м л/мин; cкорость д иаг раммной ленты 720 мм/час; ток д етектора – 110 мА ; объем пробы – 3 мл.

–

Вы полне ни е ра бот ы П од г отав лив ают прибор к работе, как указ ано в инструкции. В ш приц отбирают 3 м л пробы и в в од я т ее в колонку, прокалы в ая иглой ш прица пробкуд оз атора. П роиз в од я тз апись хроматог раммы . П ерв ы й пик основ ного компонента смеси з аписы в ают в положении тумблера чув ств ительности 64. П ри в ы ход е пера самописца на нулев ую линию мгнов енно переключают тумблер в положение 8. П ри прав ильном соблюд ении услов ий анализ а хроматог раф в ы писы в ает 6 пиков , од ин из них – пик углекислоты . Д ля ид ентификации углекислоты снимают в торую хроматог рамму, в в од я в колонку смесь 3,0 м л природ ног ог аз а и 0,1 м л углекислоты (чистой). П роисход ит ув еличение третьего пика хроматог раммы , что указ ы в аетнаприсутств ие в природ ном г аз е углекислоты . В ы числение процентног о сод ержания уг лекислоты произ в од я т по перв ой хроматограмме. Д ля э тог о в ы числя ют площ ад ь пика кажд ог о из компонентов поформуле: S = h · μ 0,5 , г д е h – в ы сота пика, μ0,5 – ш ирина пика на полов ине его в ы соты . П роцентное сод ержание углекислоты рассчиты в аютпоформуле:

х ,%( С О 2 ) =

S СО 2 ∑S

⋅100 ,

где Σ S – суммаплощ ад ей в сех пиков , SСО 2 – площ ад ьпикауг лекислоты . И О НО О БМ ЕННА Я Х РО М АТО ГРАФ И Я М етод ионообменной хроматог рафии основ ан на использ ов ании я в ления ионног о обмена межд у непод в ижной тв ерд ой фаз ой – ионообменником (сорбентом) и под в ижной жид кой фаз ой – раств ором, сод ержащ им ионы , обменив аем ы е с ионами сорбента. И онны й обмен – э тогетерог енны й процесс, при котором сорбент и наход я щ ийся с ним в контакте раств ор обратимо и стехиометрически обменив ается од ноименно(од ног ои тог оже з нака) з аря женны ми ионами. С орб е нт ы В ещ еств а, применя емы е в качеств е ионообменны х сорбентов , под раз д еля ются на д в а основ ны х класса: неорг анические и орг анические сорбенты , которы е мог ут бы ть естеств енног о и искусств енного происхожд ения .

33 И онообменны е сорбенты д олжны отв ечатьслед ующ им требов ания м : • облад атьмаксимальнов оз можной пог лотительной способностью; • облад ать из бирательной сорбцией по отнош ению к в ещ еств ам раз д еля емой смеси; • бы тьод нород ны м и, иметь степеньд исперсности, д остаточную д ля обеспечения необход имой скорости сорбции и рав номерног опрохожд ения раств орачерез колонкус требуемой скоростью; • иметь ограниченную набухаемость, облад ать механической прочностью. Н аиболее в ажны м пред став ителем группы минеральны х ионообменников я в ля ются це оли т ы , способны е к обмену катионов . Ц еолиты облад ают прав ильной пространств енной сетчатой структурой со срав нительнобольш им и расстоя ния ми межд ууз лам и реш етки. О ни мало набухают и под в ижность против оионов в их порах очень мала. У многих цеолитов ог раничена способностьпоглощ ать ря д крупны х неорг анических ионов . В се неорганические катионообменники, в том числе и синтетические, раз лаг аются кислотами, щ елочами и поэ тому мог ут применя ться тольков нейтральны х раств орах. Синтетические ионообменны е смолы пред став ля ют собой искусств еннополученны е органические в ы сокомолекуля рны е соед инения , ог раниченнонабухающ ие в в од ны х раств орах э лектролитов и облад ающ ие ионообменны ми св ойств ам и. И онообменники получают путем полимериз ации или конд енсации мономеров , причем в процессе синтез а или путем обработки г отов ог о полимера им прид ают ионообменны е св ойств а. И онообменники состоя т из матицы , в которой распред елены ионог енны е г руппы , в ключающ ие фиксиров анны е, прочно св я з анны е в матрице ионы и менее прочно св я з анны е против оионы (т.е. ионы против оположног оз нака), способны е к отщ еплению отионообменника и к переход ув раств ор. И онообменники, обменив ающ иеся катионам и раств ора, наз ы в аются ка т и онообме нни ка ми , а ионообменники, обменив ающ иеся анионам и раств ора, - а ни онообме нни ка ми . Амф от е рны е и онообме нни ки (а мф оли т ы ) способны обменив аться с раств ором как катионам и, так и анионам и. О т степени д иссоциации ионог енны х групп з ав исит, насколько сильно в ы ражены основ ны е или кислотны е св ойств а ионитов . В соотв етств ии с э тим раз личают след ующ ие г руппы ионообменников (табл.):

34 Т аблица Н екоторы е типы ионообменны х смол Т ип сорбента

И оногенная П од в ижны е И нтерв ал группа ионы рН обмена + Сильнокислотны й -SO3 H H 0-14 катионит Сред некислотны й -PO(OH)2 H+ 4-14 катионит Слабокислотны й -COOH, -OH H+ 7-14 катионит Сильнооснов ны й -CH2 N(CH3 )3+ Cl0-14 анионит Слабооснов ны й -NH3+OH OH0-7 анионит

М арка сорбента* К У -1, К У -2, СД В КФ К Б-2, К Б-4 А В -17, А В -18 А Н -23, А Н -2Ф

К У -катионообменник унив ерсальны й, СД В – стиролд ив инилбенз ол, К Ф – катионообменник фосфонов окислы й, К Б – катионообменник буферны й, А В – анионообменник в ы сокооснов ны й, А Н – анионообменник низ кооснов ны й.

*

О бменная емкость характериз ует способность ионообменников к ионном уобмену. О на опред еля ется числом ммоль обменив аемы х ионов , приход я щ ихся на1 гсухог оили на1 мл (1 см 3) набухш ег оионообменника. О бменная емкость з ав исит от природ ы и числа ионог енны х групп, их способности к иониз ации, тем пературы и некоторы х д ругих факторов . Д ля наиболее распространенны х ионообменников обменная ем кость рав на 2-10 ммоль/г . Ла б ора т орна я ра б от а № 1. О п ре де ле ни е соде рж а ни я суль фа т а на т ри я Ц е ль р а бот ы : опред еление сод ержания сульфата натрия анализ ируемом раств оре метод ом кислотно-основ ног о титров ания применением ионногообмена.

в с

С ущ ност ь ра бот ы . Через слой катионообменника в в од ород ной форме (RН ) или анионообменника в г ид роксильной форме (RО Н ) пропускают анализ ируемы й раств ор сульфата натрия . П ри э том происход итреакция обменамежд ураств ором и ионообменником : накатионообменнике 2RН + Na 2SO4 = 2RNa + H2 SO4 ; наанионообменнике 2ROH + Na2 SO4 = R2SO4 + 2NaOH О браз ов ав ш уюся в рез ультате реакции кислоту или щ елочь в количеств е, э кв ив алентном в з я той соли, оттитров ы в аютсоотв етств ующ им

35 станд артны м раств ором с инд икатором метилов ы м оранжев ы м или фенолфталеином. О боруд ов ание иреактив ы : 1. К олонка с катионообменником К У -2 (в Н -форме) анионообменником А В -17 (в О Н -форме). 2. М ерны е колбы ем костью 100,00 и 200,00 мл. 3. К онические колбы д ля титров ания емкостью 100,00 мл. 4. П ипетки ем костью 10,00 и20.00 мл. 5. Сульфатнатрия , Na2SО 4, 0,25 М раств ор. 6. Соля ная кислота, Н Сl, 0,05 М раств ор (или NаО Н ). 7. И нд икаторы метилов ы й оранжев ы й или фенолфталеин.

или

В ы полнение работы К олонку с ионообменной смолой промы в ают перед работой небольш им количеств ом д истиллиров анной в од ы . У ров ень жид кости в колонке, г отов ой к работе, д олжен бы ть на 0,3-0,5 см в ы ш е слоя ионообменника. Н еобход имо пом нить, что в слой ионообменника не д олжен попад атьв оз д ух! В мерную колбуемкостью 100,00 мл пипеткой отмеря ют 20,00 мл исход ного0,25 моль/л раств орасульфатанатрия . Д истиллиров анной в од ой д ов од я тобъем жид костид ометки и перемеш ив ают. П риг отов ленны й раств ор Na 2SO4 пропускают через слой ионообменника, прилив ая небольш ими порция м и. В ы текающ ий из колонки э люат собирают в мерную колбуемкостью 200,00 мл. Скорость пропускания раств ора д олжна бы ть около 2 м л/мин. М ерную колбу, в которой наход ился анализ ируем ы й раств ор, несколькораз ополаскив ают небольш им и порция ми д истиллиров анной в од ы и промы в ны е в од ы пропускают через ионообменник. Затем сорбент промы в ают 50-80 мл в од ы , объем в колбе с фильтратом д ов од я тд ометки и перемеш ив ают. В колбу д ля титров ания отбирают пипеткой емкостью 10,00 мл аликв отураств ора, прибав ля ют 2-3 капли инд икатора и титруют (Н Сl или NaOH) д оиз менения окраски. Т итров ание пров од я т 5-7 раз . П олученны е д анны е под в ерг ают статистической обработке и в ы числя ют количеств о сульфатанатрия поформуле:

m ( Na 2 SO4 ), мг=

Э ( Na 2 SO4 ) ⋅ М S ⋅ V S ⋅ V , V1

где М S, VS – моля рность и объем (мл) титранта; V1 – объем аликв оты , в з я той д ля титров ания (мл); V – объем э люента(м л).

36 Ла б ора т орна я ра б от а № 2. Ра зде ле ни е и онов ц и нка и ни ке ля на а ни онооб ме нни ке Ц е ль ра бот ы : раз д еление смеси катионов цинка Zn2+ и никеля Ni2+ на анионообменнике А В -17-8 в хлорид ной форме метод ом ионообменной хроматографии с послед ующ им опред елением комплексонометрическим титров анием. С ущ ност ь ра бот ы . В д анном метод е раз д еление катионов цинка и никеля основ анонаспособности ионов цинкаZn2+ образов ы в атьв раств оре хлористов од ород ной кислоты ком плексы состав а[ZnCl 3] -. И оны никеля 2+ Ni в э тих же услов ия х под обны х комплексов не образ уют. П ри пропускании через колонку с анионообменником в хлорид ной форме соля нокислог о раств ора, сод ержащ ег о комплексны е анионы [ZnCl3 ]- и 2+ катионы никеля Ni , перв ы е поглощ аются сорбентом, а катионы никеля остаются в раств оре. П ог лощ ение хлорид ного комплекса цинка анионообменником в хлорид ной форме можнопред став итьурав нением : RCl + [ZnCl3] - ⇔ R[ZnCl3 ] + Cl Н е поглощ енны е анионообменником катионы никеля , не з ад ержив ая сь, в ы ход я т из колонки. П ослед ующ ее из в лечение ионов цинка из анионообменника осущ еств ля ют, промы в ая ег о д истиллиров анной в од ой. П ри э том хлорид ны й комплекс цинкараз руш ается и катионы цинка д есорбируются (переход я тв фильтрат). О борудова ни е и ре а кт и вы : 1. Х роматог рафическая колонка в ы сотой не менее 30 см, д иаметр 1 см. 2. М ерны е колбы ем костью 25,00 мл(12 ш т.). 3. Стакан емкостью 100 м л. 4. А нионообменник А В -17-8 в хлорид ной форме. 5. Соля ная кислота, Н Сl, 2 М (300 мл) и 4 М (50 мл) раств оры . 6. Сульфатцинка, ZnSO4 , 0,25 М раств ор. 7. Сульфатникеля , NiSO4, 0,25 М раств ор. 8. Т рилон Б, 0,25 М раств ор. 9. Д иметилг лиоксим, (СН 3) 2C2N2 (OH)2. 10. А мм иак NH3, 5%-ны й раств ор. 11. Гексацианоферрат(II) калия , К 4[Fe(CN)6 ]. 12. А ммонийная буферная смесь. 13. А цетатная буферная смесь. 14. М урексид (сухой инд икатор – смесь с хлорид ом натрия в отнош ении 1:100). 15. К силенолов ы й оранжев ы й (сухой инд икатор – смесь с хлорид ом натрия в отнош ении 1:100).

37 Вы полне ни е ра бот ы В стакан емкостью 100 мл помещ ают по10,0 мл (пипеткой) 0,25 М раств оров ZnSО 4 и NiSО 4 и прилив ают 50 м л (цилинд ром) 4 М раств ора Н Сl. П олученны й раств ор я в ля ется 2 М похлористов од ород ной кислоте. И оны цинка наход я тся в нем в в ид е отрицательно з аря женны х комплексны х анионов . В колонку з агружают 15 мл анионообменника в Cl-форме и промы в ают его50 мл 2 М раств ора хлористов од ород ной кислоты , чтобы концентрация ее в колонке бы ла не менее 2 моль/л. У ров ень жид кости в колонке, готов ой к работе, д олжен бы ть на 0,3 см в ы ш е слоя ионообменника. (Н еобход имо пом нить, что в слой ионообменника не д олжен попад ать в оз д ух!). Затем через слой сорбентапропускают раств ор, сод ержащ ий ионы цинка и никеля , прилив ая ег о небольш ими порция м и. Скорость пропускания раств ора д олжна бы ть 1 мл/мин (1-2 капли в сек.). Стакан, в котором наход ился анализ ируемы й раств ор, несколько раз ополаскив ают небольш им и порция м и 2 М раств ора Н Сl и тоже пропускаютчерез ионообменник. В ы текающ ий из колонки раств ор собираютв мерны е колбы на25 мл и в кажд ой из них опред еля ют концентрацию ионов никеля комплексонометрическим метод ом. Д ля полног о в ы мы в ания Ni2+ из анионообменника через колонку пропускают 2 М раств ор Н Сl, которы й тоже собирают в мерны е колбы . П ромы в ку кислотой прекращ ают, как только в в ы текающ ем из колонки раств оре ионов никеля не буд ет обнаружено. П олноту в ы м ы в ания из анионообменника ионов никеля пров еря ют по реакции с д иметилглиоксимом. Д ля э того отбирают на часов ое стекло или в пробирку 1-2 капли в ы текающ ег о из колонки раств ора, добав ля ют 2-3 капли раств ора аммиака и каплю раств ора д иметилг лиоксима. В присутств ии ионов никеля в ы пад ает красны й осад ок д иметилг лиоксиматаникеля . Д ля из в лечения ионов цинка анионообменник промы в ают д истиллиров анной в од ой. Ф ильтраттакже собираютв мерны е колбы на25 мл и в них опред еля ют концентрацию ионов цинка метод ом комплексонометрии. П ромы в кув од ой слоя сорбента пров од я т д ополного уд аления из нег о ионов цинка. П олноту из в лечения ионов цинка из анионообменника пров еря ют реакцией с г ексацианоферратом(II) калия 2+ К 4 [Fe(CN) 6]. В присутств ии Zn в ы пад аетбелы й осад ок Zn2[Fe(CN)6 ]. К омплексонометрическое опред еление катионов никеля и цинка О пред еление ионов никеля Ni2+. К 10,0 мл фильтрата прибав ля ют 50 мл д истиллиров анной в од ы , 5 м л 5%-ног о раств ора амм иака (д ля нейтрализ ации кислоты ), 10 мл амм иачногобуферног ораств ора (рН ∼10), нем ног осухог оинд икатора мурексид а и титруют раств ором трилона Б д о переход ажелто-оранжев ой окраски раств орав я рко-сиренев ую. О пред еление ионов цинка Zn2+. К 5,0 м л фильтрата прибав ля ют 50 мл д истиллиров анной в од ы , 10 мл ацетатной буферной смеси (рН ∼5),

38 нем ног о сухог о инд икатора ксиленолов ог о оранжев ог о и титруют д о переход амалинов ой окраски раств орав желтую. Расчет концентрации ионов никеля и цинка в раств оре (ммоль/мл) пров од я тпоформуле: С х = Vт С т / Vх , где Vт – объем титранта (м л); Ст – концентрация титранта; Vх – объем титруемогораств ора. Рез ультаты титров ания ионов никеля и цинка пред став ля ют в в ид е таблицы : О бъем раств ора, прош ед ш ег очерез колонку, м л

О бъем раств ора К онцентрация ионов трилонаБ, пош ед ш ег о Ni2+ или Zn2+ в раств оре, натитров ание ммоль/мл аликв оты , м л

П о полученны м э кспериментальны м д анны м строя т в ы ход ную крив ую в коорд инатах Сф – V, г д е Сф – концентрация опред еля ем ы х ионов в фильтрате, V– объем раств ора, пропущ енны й через колонку. В ы ход ная крив ая д олжнаиметьд в апика, принад лежащ ие инд ив ид уальны м ионам. О б э ффекте раз д еления ионов никеля и цинка на анионообменнике А В -17-8 в хлорид ной форме можносуд ить, сопостав ив общ ие количеств а раз д еля емы х ионов , опред еленны е в фильтрате QZn и QNi с их количеств ам и, в з я ты ми д ля раз д еления QoZn и QoNi (ммоль), т.е. рассчитать массов ы й коэ ффициентраспред еления Dm=Q/Qo д ля ионов цинкаи никеля . Степень раз д еления д в ух ком понентов можно количеств енно оценитькритерием раз д еления К разд :

К р а зд =

V2 − V1 V2 − V1 = , W1 + W2 µ0, 5(1) + µ 0, 5( 2)

где W – ш ирина пика; µ0,5 – ш ирина пика на полов ине ег ов ы соты . Д ля успеш ног о раз д еления ионов критерий раз д еления д олжен бы ть больш е ед иницы .

39 БУ М А Ж НАЯ И ТО НКО С ЛО Й НАЯ Х РО М А ТО ГРАФ И Я К плоскостны м в ид ам хроматог рафии относя т бумажную (БХ ) и тонкослойную (Т СХ ). Э ти д в а в ид а жид костной хроматографии просты по технике в ы полнения , э кспрессны , не требуют д орог остоя щ его оборуд ов ания . Х роматог рафическое раз д еление в плоскостны х в ид ах хроматографии, как и в колонке, обуслов лено переносом компонентов под в ижной фаз ы в д ольслоя непод в ижной фаз ы с раз личны м и скоростя ми в соотв етств ии с коэ ффициентам и распред еления раз д еля емы х компонентов . Носи т е ли , ра ст вори т е ли В распред елительной хроматог рафии д олжны Н осители. применя ться такие носители, которы е хорош оуд ержив ают непод в ижны й раств оритель и инертны к под в ижном у раств орителю и хроматографируемы м в ещ еств ам. И д еальны х носителей не сущ еств ует. Более или менее уд ов летв оря ют э тим требов ания м особопод готов ленны е силикагель, крахмал, тальк, целлюлоз а и д р. В бумажном в арианте носителем я в ля ется фильтров альная бумага. П ри в ы боре сорбентов носителей напрактике исход я тиз св ойств раз д еля ем ы х в ещ еств . С и ли ка ге ль образ ует прочноприлипающ ий в ы сокоактив ны й кислы й слой носителя . Е г о получают д ейств ием м инеральны х кислот, например HCL, наконцентриров анны е раств оры силикатанатрия . О кси д а люми ни я образ ует прочноуд ержив ающ ийся слабооснов ной слой носителя , приг од ны й д ля раз д еления нейтральны х и основ ны х соед инений. Св ойств а э того сорбента можно из менить под бором раств орителя , суш кой и д обав кой примесей. Ки зе льгур д ает практически неактив ны й, прочно уд ержив ающ ийся слой носителя , пред наз наченны й д ля четкого раз д еления гид рофильны х соед инений, атакже амфотерны х ионов . Кра х ма л. Д ля распред елительной хроматог рафии применя ют очищ енны й крахмал. Сы рой картофельны й крахмал отмы в ают на в оронке д о отрицательной реакции с нингид рином, в ы суш ив ают при ком натной температуре, з атем промы в аютн-бутилов ы м спиртом, насы щ енны м в од ой. О чистку крахмала от з ольны х примесей пров од я т с помощ ью э лектрод иализ а. Ц е ллюлоза . В лабораторны х услов ия х целлюлозную массу можно приг отов итьиз фильтров альной бумаги марки «без з ольны й фильтр». Б ума га . Д ля распред елительной хроматог рафии применя ют специальную бумаг у, приг отов ленную из в ы сокосортног о хлопка. О на д олжнаотв ечатьслед ующ им требов ания м : • бы ть химически чистой. С э той целью бумагу пред в арительно обрабаты в ают раз личны ми реаг ентами (трилоном Б, 8-оксихинолином, аминоуксусной кислотой), которы е образ уют раств оримы е комплексны е

40 соед инения с неорг аническими примеся ми бумаги, которы е в ы мы в аются в од ой; • бы ть по в озможности хим ически и ад сорбционно инертной по отнош ению к хроматографируемому раств ору и под в ижном у раств орителю; • бы тьод нород ной поплотности; • д ав атьчеткое раз д еление станд артног онаборааминокислот; • обеспечив ать опред еленную скорость д в ижения раств орителя при нисход я щ ей хроматог рамме. Раств орители. П ри в ы боре раств орителя необход имо учиты в ать след ующ ие прав ила. В ы бираюттакой под в ижны й раств оритель, в котором компоненты , под в ерг ающ иеся раз д елению, имеют небольш ую раств оримость. В качеств е под в ижны х раств орителей д ля в од ораств оримы х в ещ еств использ уются органические раств орители или их смеси, насы щ енны е в од ой. Д ля в ещ еств , раств оримы х в орг анических раств орителя х, но нераств орим ы х в в од е, использ уют насы щ енны е раств оры органических раств орителей. Состав раств ора д олжен бы ть постоя нны м при д в ижении раств орителя по бумаг е. Раств оритель не д олжен бы ть в ред ны м в ещ еств ом. П ри под боре раств орителей след ует учиты в атьслед ующ ие требов ания : • раств оритель д олжен полностью раз д еля ть в ещ еств а близ кого строения , причем раз личие в в еличине Rf д олжнобы тьне менее 0,05; • из отерма распред еления в ещ еств а в в ы бранном раств орителе д олжна бы ть линейной, пя тна д олжны иметь круглую форму и после раз д еления з аниматьтуже площ ад ь, чтои при нанесении. Ф орма пя тен не д олжнаиз меня ться с концентрацией; • раств оритель не д олжен в ы з ы в ать химических из менений анализ ируем ы х в ещ еств ; • раств оритель не д олжен в з аимод ейств ов ать с реактив ом, применя емы м д ля проя в ления , или понижать чув ств ительность реакции проя в ления ; • состав раств орителя д олжен бы ть постоя нны м и легко в оспроиз в од имы м; • анализ ируем ы е в ещ еств а д олжны иметь раз личны е з начения Rf и распред еля ться пов сей д лине хроматограммы . Ка ч е ст ве нн ы й а на ли з П рощ е в сег оид ентификация в ещ еств а в Т СХ может бы ть сд елана, если пя тноопред еля емог ов ещ еств а имеет характерную окраску. О д нако числотаких в ещ еств , особенноорг анических, нев елико. Н аиболее общ ий под ход к качеств енному анализ у основ ан на з начения х Rf. Х роматог рафическая под в ижность я в ля ется чув ств ительной характеристикой в ещ еств а, од нако она сущ еств енно з ав исит от услов ий опред еления . Э та труд ность преод олев ается путем пров ед ения опы та в строг о фиксиров анны х станд артны х услов ия х, которы е регламентируют

41 раз мер пластин, толщ инуслоя сорбента, объем пробы , д линупути фронта раств орителя и д ругие факторы . П ри соблюд ении станд артны х услов ий получаются в оспроиз в од им ы е з начения Rf, которы е можноиспольз ов ать в аналитических целя х при срав нении с табличны ми, если они получены в тех же услов ия х опы та. Самы м над ежны м я в ля ется метод св ид етелей, когда на стартов ую линию ря д ом с пробой нанося тся инд ив ид уальны е в ещ еств а, соотв етств ующ ие пред полаг аемы м компонентам смеси. В лия ние раз личны х факторов на в се в ещ еств а буд ет од инаков ы м , поэ тому сов пад ение R f ком понента пробы и од ног оиз св ид етелей д ает основ ания д ля отожд еств ления в ещ еств . Н есов пад ение Rf указ ы в ает на отсутств ие в пробе соотв етств ующ егокомпонента. К ачеств енны й состав пробы в метод е бумажной хроматог рафии так же, как и в Т СХ , может бы ть установ лен или поспецифической окраске отд ельны х пя тен на хроматог рамме, или по числов ому з начению Rf кажд ог окомпонента. Коли ч е ст ве нны й а на ли з К оличеств енны е опред еления в Т СХ мог ут бы ть сд еланы или непосред ств еннона пластинке, или после уд аления в ещ еств а с нее. П ри непосред ств енном опред елении на пластинке из меря ют площ ад ь пя тна и по з аранее построенному г рад уиров очном у г рафику наход я т количеств о в ещ еств а. Н аиболее точны м считается метод , в котором в ещ еств о после раз д еления уд аля ется с пластинки и анализ ируется спектрофотометрическим или ины м метод ом. У д аление в ещ еств а с пластинки обы чно произ в од я т механическим путем или в ы м ы в ают под ход я щ им раств орителем. К оличеств енны е опред еления в бумажной хроматог рафии также в ы полня ются или по хроматог рафическим характеристикам (площ ад ь пя тна и интенсив ность егоокраски), или пометод ув ы мы в ания . Н еред ко хроматограмму раз рез ают на отд ельны е части по числу пя тен, кажд ое пя тно обрабаты в ают соотв етств ующ им э кстраг ентом и опред еля ют количеств о э кстраг иров анного в ещ еств а любы м под ход я щ им метод ом (фотометрическим, поля рографическим и т.д .). Ла б ора т орна я ра б от а № 1. О п ре де ле ни е п ри ме си ги дра зи на в и зони а зи де (ги дра зи де ки слот ы и зони кот и новой ) ме т одом хрома т огра фи и в т онком слое сорб е нт а (ТС Х ) Ц е ль ра бот ы : приобретение нав ы ков работы с оборуд ов анием д ля тонкослойной хроматог рафии; оз накомление с приемам и качеств енной и

42 количеств енной обработки хроматог рамм, полученны х на пластине д ля Т СХ . О борудова ни е и ре а кт и вы : 1. К амерад ля Т СХ с притертой кры ш кой. 2. М икрош прицы на10 мкл. 3. М ерны е колбы ем костью 10 м л. 4. М ерны й цилинд р емкостью 25 мл. 5. П ластины д ля Т СХ «Силуфол». 6. П ульв ериз атор. 7. Т ермостатв озд уш ны й (t=105 оС). 8. В есы аналитические. 9. К алька, м иллиметров ая бумаг а, линейка, лупа с д еления ми, каранд аш . 10. И з ониаз ид , С5 Н 4NCONHNH2 (технический). 11. Гид раз инасульфат, (N2 H6)SO4 («хч» или «чд а»). 12. А цетон, CH3COCH3 («ч»). 13. п-Д иметилам инобенз альд егид ,(СH3 )2NC6 H4 CHO, 1%-ны й раств ор в 95%-ном э тилов ом спирте. Вы полне ни е ра бот ы П риг отов ление э люентаи под готов какамеры д ля Т СХ Х роматографиров ание пров од я т в специальны х камерах д ля Т СХ – стекля нны х круглы х или пря моугольны х емкостя х с притертой кры ш кой. Н а д нокамеры налив ают под в ижную фаз у– э люент. Э люентом в д анной работе я в ля ется смесь ацетон – в од а в соотнош ении 49:1. Смесь г отов я т в колбе с притертой пробкой смеш ением 24,5 мл ацетона и 0,5 мл в од ы (можноприг отов итьсраз ув камере и перемеш ать). В ы сотаслоя э люента в камере д олжна бы ть около 0,5 см . К амера с э люентом, плотноз акры тая кры ш кой, д олжна некоторое в ремя постоя ть, чтобы пространств о насы тилось парами э люента д ля ускорения процесса хроматографиров ания . П риг отов ление раств орителя В качеств е раств орителя применя ют смесь ацетон – в од а 1:1 объемом 30 мл. Д ля э того в колбу с притертой пробкой отмерив ают цилинд ром 15 мл ацетонаи15 м л в од ы , в се хорош оперемеш ив ают. П риготов ление раств ораисслед уемог ов ещ еств а(из ониаз ид а) Н ав ескуиз ониаз ид амассой 1 г, в з я тую с точностью д о0,01 г в нося т в мерную колбу емкостью 10 мл и д ов од я т д о метки приг отов ленны м раств орителем (смесью ацетон-в од а). П олученны й раств ор тщ ательно перемеш ив ают. П риг отов ление станд артног ораств орапримеси Н ав еску г ид раз ина сульфата массой 0,05 г раств оря ют в мерной колбе емкостью 10 м л в смеси ацетон-в од а1:1. П олученны й раств ор имеет концентрацию пог ид раз инусульфату0,5 %.

43 П од г отов капластины д ля Т СХ П ластинуд ля Т СХ марки “ Силуфол”, “ А рмсорб” или аналогичную клад утнастол и просты м каранд аш ом, без нажима, легкопров од я тлинию, параллельную нижнем украю пластины на расстоя нии 1,5 см от края . Э та линия наз ы в ается «линией старта». Н алинии стартакаранд аш ом намечают 4 точки, рав ноотстоя щ ие д руготд руг а и от краев пластины . Ж елательно, чтобы расстоя ние межд у точками бы ло не менее 1,5 см. Раз метку пластины пров од я таккуратно, не наруш ая слой силикаг еля . Н анесение проб напластину В намеченны е точки м икрош прицем на 10 мкл нанося т приг отов ленны е раств оры в след ующ ем поря д ке: в о 2 точку – 2,5 мкл раств ора исслед уемого в ещ еств а (из ониаз ид а); в 1,3 и 4 точки – 0,5, 1, 2 мкл раств ора примеси (г ид раз ина сульфата), чтоэ кв ив алентно2,5; 5,0 и 10 мкгг ид раз инасоотв етств енно. Н анесение проб пров од я т лег ким прикоснов ением в ы д ав ленной из иг лы капли к точке на пластине. Н ужны й объем нанося т не сраз у, а в несколькокасаний так, чтобы д иаметр получив ш ег ося на пластине пя тна бы л как можно меньш е и не прев ы ш ал 0,5 см. П осле кажд ог о касания пя тно под суш ив ают и только после э тог о нанося т след ующ ую порцию раств ора. К ог д а в се 4 пробы буд ут нанесены и пя тна под сохнут, пластина готов ад ля пров ед ения хроматог рафиров ания . П ров ед ение хроматографиров ания П ластинус нанесенны м и пробами помещ ают в камеруд ля Т СХ так, чтобы линия старта с нанесенны ми пя тнам и бы ла в ы ш е уров ня э люента. К амеруз акры в ают кры ш кой и жд ут, ког д а э люент под нимется примерно на 2/3 в ы соты пластины . П ластину в ы нимают из камеры , отметив каранд аш ом в ы сотупод ъемафронтаэ люента, и суш атнав оз д ухе. П роя в ление хроматограммы Д ля проя в ления з он компонентов пластинуобрабаты в аютреаг ентом при помощ и пульв ериз атора. Д етектирующ им реаг ентом д ля опред еля ем ы х в ещ еств я в ля ется 1% раств ор пд иметилам инобенз альд ег ид ав 95%-ном э тилов ом спирте. П осле обработки пластинусуш ат при температуре 100-105 оС в термостате в течение 5 мин. Зоны анализ ируемого в ещ еств а и примесей проя в ля ются на пластине в в ид е пя тен кирпично-красног оцв ета. К ачеств енная обработкахроматог раммы Н а хроматог рамме анализ ируемог о в ещ еств а обнаружив ается не менее д в ух пя тен. О д но из них д олжно соотв етств ов ать основ ном у в ещ еств у– из ониаз ид у. В торое – примеси гид раз ина. П ров од я т качеств енны й анализ хроматог раммы – ид ентифицируют з оны основ ног ов ещ еств а и примеси пов еличине Rf. Rf в сех проя в ив ш ихся з он на хроматог рамме рассчиты в ают как отнош ение в ы соты под ъемаз оны компонента (расстоя ние от линии старта д о центра пя тна) к в ы соте под ъема фронта э люента (расстоя ние от линии старта д олинии фронта). В ы соты из меря ют линейкой и в ы ражают в од инаков ы х ед иницах д лины

44 (см или м м). Сов пад ение Rf од ной из з он анализ ируемог ов ещ еств ас Rf з он гид раз ина сульфата, нанесенны х в качеств е станд артов , поз в оля ет под тв ерд итьналичие д анной примеси в образ це. К оличеств енная обработкахроматог раммы 1. П ров од я т пред в арительную в из уальную оценкуз оны примеси на хроматограмме основ ног о в ещ еств а и на хроматог раммах станд артны х образ цов примеси. О ценкупров од я тпосов окупности раз меров пя тен и их интенсив ности. Зная сод ержание г ид раз ина в кажд ом из трех пя тен примесей, д елают в ы в од о примерном сод ержании г ид раз ина в исслед уемом в ещ еств е. 2. П ров од я т полуколичеств енную оценку сод ержания примеси гид раз инав образ це, оценив ая площ ад и хроматог рафических з он. П лощ ад ь кажд ог о пя тна рассчиты в ают как произ в ед ение ег о поперечной и прод ольной осей l-h, прирав нив ая ее к площ ад иэ ллипса: S = l·h (мм 2). Строя т г рафик з ав исимости полученны х площ ад ей (S) от сод ержания г ид раз ина в пробе (gr) д ля станд артны х раств оров гид раз ина (2,5; 5,0 и 10 мкг ). Рассчиты в ают площ ад ь пя тна гид раз ина в образ це из ониаз ид а и по графику оценив ают ег о сод ержание в мкг . Зная общ ее сод ержание анализ ируемог о в ещ еств а в нанесенной пробе (gu=1 мг или 1000 мкг), рассчиты в аютсод ержание в ней г ид раз инав % поформуле:

Сz =

gr ⋅ 100, gu

где gu=1000 мкг , а gr – cод ержание г ид раз ина в град уиров очномуг рафику(мкг ). О кончательная формуларасчетапринимаетв ид :

Сz =

из ониаз ид е по

gr (%) 10

К оличеств енное опред еление сод ержания примеси гид раз ина в образ це метод ом планиметрии. В основ е метод а лежит также из мерение площ ад ей з он на хроматограмме и построение град уиров очной з ав исимости в коорд инатах √s-lg gr д ля станд артны х образ ов гид раз ина. П лощ ад и з он из меря ют след ующ им образ ом. Н а хроматог рамму наклад ы в ают лист кальки и очерчив ают контур интересующ их нас з он (пя тен г ид раз ина в станд артны х и исслед уемом образ це). П олученное на кальке из ображение наклад ы в ают з атем на м иллиметров ую бумагу и под считы в аютплощ ад ьпя тен (S) в мм 2 . Строя тг рафик з ав исимости √s отlg gr (количеств аг ид раз инав станд артах). Зная площ ад ь пя тна гид раз ина в опред еля емом образ це пог рафику наход я т lg gr и з атем gr в нем, г д е gr – количеств ог ид раз ина в пробе, мкг . Д алее рассчиты в ают сод ержание г ид раз ина в из ониаз ид е в процентах как бы ло описано в ы ш е. И спольз ов ание з ав исимости √s-lg gr поз в оля ет

45 получить д остаточноточны е рез ультаты , ош ибка опред еления состав ля ет примерно5 %. Ла б ора т орна я ра б от а № 2. О п ре де ле ни е конц е нт ра ц и и и онов ни ке ля в ра ст воре ме т одом б ума ж ной хрома т огра фи и Ц е ль ра бот ы : количеств енное опред еление ионов никеля в раств оре метод ом бумажной хроматографии. При боры и ре а кт и вы : 1. Х роматог рафическая камера. 2. Х роматог рафическая бумаг а (фильтров альная бумага марки “ синя я лента”, пропитанная раств ором д иметилг лиоксима) 3. М икрош приц. 4. Раств оритель: 12%-ны й раств ор глицерина. 5. Раств оры нитратаникеля , Ni(NO3) 2, с концентрацией от0,05 д о 0,25 мг -э кв /л. Вы полне ни е ра бот ы Л ист фильтров альной бумаги марки «синя я лента» пропиты в ают 0,1%-ны м раств ором д иметилглиоксима и в ы суш ив ают на в озд ухе в в ертикальном положении. Затем на линию старта с помощ ью ш прица нанося т по 1 мкл станд артны х раств оров аз отнокислой соли никеля в интерв але концентраций от 0,05 д о0,25 мг -э кв /л и раств оры соли никеля неиз в естной концентрации. Бумаг упросуш ив аютнав озд ухе и помещ аютв камеруд ля раз в ития хроматог рамм. К амера пред став ля ет собою стакан емкостью 500 мл, на д но которогоналив аютпод в ижную фаз у– 12%-ны й раств ор г лицерина в в од е. П олоскубумаг и з акрепля ют в ш татив е и опускаютв раств ор г лицерина д о линии погружения . Раз в итие хроматог раммы происход ит в течение 20-30 мин. П од в ижны й раств оритель, под нимая сь по капилля рам бумаги, з ахв аты в ает ионы никеля , в след ств ие чего з оны в ы тя гив аются и принимаютформупиков (рис. 6). Через 30 минут лист фильтров альной бумаг и из в лекают из стакана, под суш ив ают и из меря ют в ы соту пиков анализ ируем ы х раств оров от центра основ ания д о в ерш ины . Затем строя т калибров очны й г рафик в коорд инатах количеств о в ещ еств а - в ы сота пика (рис. 7), по которому наход я тнеиз в естную концентрация анализ ируемог ораств орасоли никеля .

46

Рис.6. Х роматог рамма полуколичеств енног оопред еления 2+ Ni метод ом бумажной осад очной хроматографии.

Рис. 7. К алибров очны й г рафик 2+ опред еления ионов Ni метод ом осад очной бумажной хроматографии.

Ла б ора т орна я ра б от а № 3. Ка ч е ст ве нное оп ре де ле ни е а ми ноки слот в б е лковом ги дроли за т е ме т одом б ума ж ной хрома т огра фи и Ц е ль ра бот ы : раз д еление ам инокислот метод ом бумажной хроматографии и установ ление качеств енног о состав а белков ого гид ролиз ата. С ущ ност ь ра бот ы . О тход ы мя со- и птицекомбинатов , сод ержащ ие больш ое количеств о протеинов и белков ы х соед инений, под в ерг аются в озд ейств ию перегретог о пара в ав токлав ах. П олученны й г ид ролиз ат сод ержит более 15 аминокислот и служит э ффектив ной кормов ой д обав кой в жив отнов од ств е. П род олжительность и технические параметры гид ролиз а (д ав ление, тем пература), а также состав , норма и рацион кормов ы х д обав ок з ав ися т от аминокислотног о состав а белков ого гид ролиз ата. У станов ление качеств енног осостав а белков ог ог ид ролиз ата основ ано на раз личны х скоростя х перемещ ения по хроматографической бумаг е компонентов анализ ируемой пробы относительно фронта раств орителя . При боры и ре а кт и вы : 1. Х роматог рафическая камера 2. Х роматог рафическая бумаг а, в атман № 1. 3. М икропипеткаемкостью 0,1 м л. 4. П ульв ериз атор.

47 5. П инцет. 6. Суш ильны й ш каф. 7. Раств оритель: смесь бутилов ого спирта с уксусной кислотой и д истиллиров анной в од ой в объемном соотнош ении 4:1:5. 8. П роя в итель: 200 мгнинг ид рина в 100 млацетона. 9. А минокислоты : аланин, лиз ин, в алин, тирозин, аспарагинов ая и г лутам инов ая кислоты – станд артны е раств оры с концентрацией 0,01 моль/л. 10. А нализ ируемы й белков ы й гид ролиз ат. Вы полне ни е ра бот ы П од г отов ка хроматог рафической бумаг и. В ы рез ают полоски хроматографической бумаги д линой 30 см и ш ириной, соотв етств ующ ей ш ирине хроматог рафической камеры . Сниз у на расстоя нии 4 см каранд аш ом пров од я т стартов ую линию. О тступив от края линии на 2 см, отмечают перв ую точку. Станд артны е раств оры аминокислот и анализ ируем ы й белков ы й г ид ролиз ат нанося т на линию старта на расстоя нии 2-3 см д руготд руг а. объемом 0,01 мл нанося т Х роматографиров ание. П робы микропипеткой путем прикоснов ения к бумаге в д в а приема по0,005 мл в од нуи туже точку. Д иаметр капли набумаг е не д олжен прев ы ш ать3 м м. Х роматограммы под суш ив ают в суш ильном ш кафу и помещ ают в хроматографическую камеру с раств орителем. П ри э том нижний край хроматограмм пог ружают в раств оритель на 1-1,5 см. Раств оритель пропускают через бумаг у в течение 3 ч. Д ля раз д еления аминокислот необход имо 3-кратное пропускание раств орителя с период ическим в ы суш ив анием хроматог рамм. Затем хроматог раммы из в лекают из камеры , отмечают фронт д в ижения раств орителя и помещ ают в суш ильны й ш каф (70 оС) на 10-15 мин. Х роматог раммы проя в ля ют раств ором нингид рина в ацетоне (опры скив ают из пульв ериз атора), нижний край хроматограмм под д ержив ают пинцетом, чтобы лист бумаг и располагался в ертикально. П осле э тог охроматог раммы под суш ив аютв суш ильном ш кафупри 70 оС в течение 15 мин. П ри проя в лении хроматог рамм поя в ля ются пя тна сиренев о-фиолетов ог оцв етананекотором расстоя ниид руготд руг а. К ачеств енны й анализ ам инокислот пров од я т путем сопостав ления положения пя тен станд артны х раств оров аминокислот и анализ ируемого гид ролиз ата. Д ля э тог о рассчиты в ают в еличину Rf д ля кажд ой аминокислоты как отнош ение пути, пройд енног о аминокислотой (расстоя ние от линии старта д о центра пя тна), к пути, пройд енном у раств орителем (расстоя ние от линии старта д о г раницы смещ ения раств орителя ). К ажд ая ам инокислота при од инаков ы х услов ия х э ксперимента имеет постоя нную в еличину Rf. Срав нение э тих в еличин, характериз ующ их смещ ение з он аминокислотстанд артны х раств оров и

48 полученны е при хроматог рафиров ании белков ог огид ролиз ата, поз в оля ет сд елатьв ы в од окачеств енном состав е гид ролиз ата.

Рис. Х роматог рамма качеств енног о опред еления ам инокислот метод ом бумажной хроматог рафии. Ла б ора т орна я ра б от а № 4. Коли ч е ст ве нное оп ре де ле ни е а сп а ра ги новой , глут а ми новой ки слот и ва ли на в б е лковом ги дроли за т е ме т одом б ума ж ной хрома т огра фи и Ц е ль ра бот ы : раз д еление и количеств енное опред еление аминокислотв белков ом гид ролиз ате метод ом нисход я щ ей хроматог рафии набумаг е. П ри получении аминокислот необход им С ущ ност ь ра бот ы . постоя нны й и над ежны й контроль з а состав ом белков ы х гид ролиз атов . А нализ основ ан на раз д елении ком понентов в след ств ие их раз личны х скоростей перемещ ения по хроматог рафической бумаг е. К оличеств енно аминокислотопред еля ютфотометрически после перев ед ения компонентов в э танольны й раств ор. В качеств е фотометрическог ореактив а применя ют сульфатмед и (II). При боры и ре а кт и вы : 1. Х роматог рафическая камера. 2. Х роматог рафическая бумаг а, в атман № 2. 3. П ульв ериз атор. 4. М икропипеткаемкостью 0,1 м л. 5. П робирки емкостью 30 мл. 6. Ф отоэ лектроколориметр 7. К юв еты с толщ иной пог лощ ающ ег ослоя 1 см. 8. А налитические в есы . 9. Суш ильны й ш каф. 10. Э тилов ы й спирт, 96 %-ны й раств ор.

49 11. 8-г ид роксихинолин: 0,1 гпрепарата раств оря ют в 100 мл смеси бутилов ог оспиртас уксусной кислотой и в од ой (4:1:2). 12. Раств оритель: смесь бутилов ого спирта с уксусной кислотой и в од ой в объемном соотнош ении4:1:5. 13. П роя в итель: 200 мгнинг ид ринараств оря ютв 100 млацетона. 14. Э люент: 10 мл раств ора сульфата мед и с массов ой д олей 0,005 % в э тилов ом спирте раз бав ля ют 90 м л э тилов ог оспирта, получают -4 раств ор сульфатамед и с массов ой д олей 5⋅10 %. 15. А минокислоты : аспараг инов ая , г лутам инов ая , в алин – станд артны е в од ны е раств оры с концентрацией 0,01 моль/л. 16. А нализ ируемы й белков ы й гид ролиз ат. Вы полне ни е ра бот ы П од г отов ка хроматографической бумаги. Д ля раз д еления аминокислотприменя ютбумаг у, пред в арительнообработанную раств ором 8-г ид роксихинолина (при э том уд аля ются след ов ы е количеств а катионов металлов ). Л исты бумаг и, соотв етств ующ ие по раз меру хроматографической камере, помещ ают в раств ор 8-г ид роксихинолина. Через 1-2 мин бумагу под суш ив ают в суш ильном ш кафу при 105 оС (работаютв в ы тя жном ш кафу!), помещ аютв хроматог рафическую камеру, з акрепля ютод ин конец в кюв ете с под в ижны м раств орителем (э люентом). Раств оритель пропускают по бумаге св ерху в низ д о полного уд аления темноокраш енны х г ид роксихиноля тов в течение 36-48 ч. П ромы тую бумаг усуш атв в ы тя жном ш кафу. П остроение г рад уиров очног ог рафика. Готов я т в од ны е раств оры аминокислот с концентрацией 0,01 моль/л. Н ав ески ам инокислот, соотв етств ующ ие 10 мл раств ора э той концентрации, состав ля ют д ля аспарагинов ой кислоты 13,3, в алина11,7, г лутам инов ой кислоты 14,7 мг . -3 М икропипеткой нанося тнабумагу(5, 10, 15, 20)⋅10 млстанд артны х раств оров аминокислотпорция м и объемом по5⋅10-3 мл нарасстоя нии 5 см от края с таким расчетом, чтобы кажд ая точки град уиров очног ог рафика соотв етств ов ала 0,05; 0,10; 0,15 и 0,20 мгаминокислоты . Раств ор нанося т на бумагутолькопосле в ы суш ив ания пред ы д ущ их капель. О птимальной д ля в ы полнения работы я в ля ется сред а с рН 5-6, при э том устраня ется иониз ация ам инокислот. Х роматографиров ание. Раз д еление ам инокислот пров од я т нисход я щ им метод ом. К онец бумаги, на котором нанесены капли раств оров , помещ ают в кюв ету с под в ижны м раств орителем так, чтобы пя тна исслед уемы х раств оров не пог ружались в раств оритель. В качеств е под в ижног о раств орителя применя ют в ерхний слой смеси бутилов ого спиртас уксусной кислотой и в од ой. Н ижний слой смеси пред наз начен д ля насы щ ения камеры . Д ля раз в ития хроматог раммы раств оритель пропускают на 2/3 д лины бумаги, з атем хроматог рамму в ы суш ив ают и в торично пропускают через нее

50 под в ижны й раств оритель. Т аким образ ом, хроматог раммуобрабаты в ают 3 раз а. Затем полоску бумаг и в ы суш ив ают и проя в ля ют хроматог рамму раств ором нинг ид рина (опры скив ают из пульв ериз атора). П роя в ленную хроматограмму наг рев ают 15-20 мин при 60 оС в суш ильном ш кафу. Расположение з он ам инокислот по направ лению д в ижения раств орителя (св ерху в низ ) след ующ ее: аспараг инов ая кислота, г лутам инов ая кислота, в алин. П осле раз в ития хроматог раммы в ы рез ают участки пя тен, з анимаемы е аминокислотами, сбоку хроматограммы в ы рез ают контрольны е участки, не сод ержащ ие ам инокислот и рав ны е поплощ ад и з онам опред еля ем ы х соед инений. В ы рез анны е участки бумаг и из мельчают ножницами и помещ ают в пробирки. В кажд ую пробирку д обав ля ют по 10 мл э люента, объем д ов од я т д о20 мл э тилов ы м спиртом и в стря хив ают. Э люиров ание происход ит в рез ультате образ ов ания ком плексного соед инения ам инокислот с Cu(II) оранжев ого цв ета, раств оримого в э тилов ом спирте. П робирки с э люатами помещ ают в з атемненное местои остав ля ютна1 ч., период ически перемеш ив аютих сод ержимое. К оличеств енны й анализ . О птическую плотность э кстрактов из меря ют на фотоэ лектроколориметре при λ=530 нм. К онтрольны й раств ор сод ержит в се необход имы е реактив ы , кроме аминокислот. Строя т град уиров очны й г рафик в коорд инатах оптическая плотность – концентрация ам инокислот, моль/л. П о г рафику наход я т концентрацию аминокислотв анализ ируемом белков ом гид ролиз ате. Х РО М АТО ГРАФ И ЧЕС КИ Е М ЕТО ДЫ АНА ЛИ ЗА В Ф АРМ АЦ И И И Х И М И КО -Ф АРМ А Ц ЕВТИ ЧЕС КО Й ПРО М Ы Ш ЛЕННО С ТИ Ф армация относится к числу наиболее д рев них естеств енны х наук, объектами исслед ов ания которой уже в д алекие в ремена бы ли в больш инств е случаев объекты растительного или жив отного происхожд ения . Э ти природ ны е объекты или прод укты их простейш ей переработки – отв ары , э кстракты и т.п. – отличаются больш ой сложностью состав а, поскольку в ключают пред став ителей самы х раз нообраз ны х классов орг анических соед инений. О бнаружение, а тем более количеств енное опред еление в э тих сложны х объектах физ иолог ически актив ны х в ещ еств я в ля лось перв оочеред ной з ад ачей фармации, од нако реш алась она из -з а несов ерш енств а и труд оемкости сущ еств ов ав ш их д о в торой полов ины Х Х в . метод ов раз д еления крайне мед ленно. Реш ение проблемы в ы д еления инд ив ид уальны х природ ны х соед инений в качеств е лекарств енны х в ещ еств из природ ны х источников сы рья и проблем ы контроля чистоты поя в ив ш ихся в конце Х IX – начале XX в . синтетических лекарств енны х препаратов также сущ еств енносд ержив алось отсутств ием унив ерсальны х метод ов раз д еления сложны х смесей орг анических соед инений.

51 Т акие метод ы также сов ерш енно необход им ы при исслед ов ания х, св я з анны х с прев ращ ением лекарств енны х в ещ еств в орг аниз ме жив отны х и челов ека, т.е. д ля фармаколог ии и клинической фармаколог ии. Сложность состав а из в лечений из растительног осы рья , в ероя тно, и я в илась причиной тог о, что именно природ ны е объекты стали перв ы м и объектами, при исслед ов ании которы х бы ла соз д ана колоночная хроматография М .Ц в ета, тонкослойная хроматог рафия Н .А .И з майлов а и М .С.Ш райбер, распред елительная хроматог рафия на бумаг е Л .М артина и Синд жа. П ричем послед ние д в ахроматог рафических метод абы ли созд аны непосред ств еннод ля исслед ов ания лекарств енны х в ещ еств . И онны й обмен хотя и из в естен с г лубокой д рев ности, но начал рассматрив аться как основ а ионообменной хроматог рафии и получил ш ирокое раз в итие в начале 40-х г од ов Х Х в ., в св я з и с поя в лением синтетических ионообменников . Х им ико-фармацев тическая промы ш ленность сраз у же оценила в озможности ионообменной хроматографии. У же в серед ине 40-х г од ов сообщ ается опромы ш ленном применении ионообменны х установ ок д ля из в лечения таких лекарств енны х в ещ еств , как скополам ин и хинин, из э кстрактов растительного сы рья . И онообменная хроматог рафия сраз у же получила применение и в произ в од ств е таких нов ы х д ля св оего в ремени лекарств енны х в ещ еств , как антибиотики. С поя в лением метод ов ГЖ Х и В Э Ж Х они также прочно в ош ли в арсенал метод ов фармацев тическог о анализ а и стали использ ов аться д ля раз д еления раз личны х смесей, в том числе оптических из омеров , ид ентификации в ещ еств , их количеств енног оопред еления . Раз личны е в ид ы хроматог рафических метод ов и их мод ификации использ уются в фармации и в химико-фармацев тической промы ш ленности в след ующ их целя х: – д ля ид ентификации лекарств енны х в ещ еств , д ля обнаружения д опустим ы х примесей и оценки их количеств ; – д ля характеристики чистоты лекарств енны х в ещ еств – субстанций и в особенности в ещ еств -станд артов ; – д ля количеств енной характеристики очищ енны х фотохимических препаратов , я в ля ющ ихся ком поз ицией нескольких биологически актив ны х в ещ еств ; – д ля количеств енног оопред еления наиболее в ажны х биолог ически актив ны х компонентов в растительном сы рье, полупрод уктах его переработки или в сложны х г отов ы х формах; – д ля контроля технологических процессов в произ в од ств е синтетических лекарств енны х сред ств ; – как чув ств ительны й метод опред еления в озможны х потерь при раз работке количеств енны х метод ов , основ анны х на э кстракции, осажд ении и т.п. Сущ еств енную рольхроматог рафические метод ы иг рают при оценке стабильности лекарств енны х форм и в ы боре метод ик их оценки.

52 П убликации попрактическом уиспольз ов анию хроматографических метод ов в фармации поя в ля лись в такой послед ов ательности: хроматография набумаг е, ионообменная хроматог рафия , хроматография в тонком слое, г аз ожид костная хроматог рафия и, наконец, в ы сокоэ ффектив ная жид костная хроматог рафия под д ав лением. Т а же з акономерность прослежив ается , если рассматрив ать послед ов ательны е из д ания официальны х руков од ств по характеристике св ойств и метод ам исслед ов ания лекарств – Госуд арств енны е Ф армакопеи раз ны х стран. Ц ели, которы е став я тся перед хроматографическими метод ами, расш иря ются и усложня ются параллельно с раз в итием сам их метод ов . В начале э то только ид ентификация , з атем качеств енная оценка степени чистоты и, наконец, количеств енны е метод ы , в которы х хроматографическое раз д еление больш ей частью сочетается скаким и-либо инструментальны м и физ ико-химическими метод ами количеств енного опред еления . В настоя щ ее в рем я практически в се классы лекарств енны х в ещ еств , в каком бы поря д ке их не классифициров ать – по д ейств ию или по химическом устроению, исслед ов аны тем или ины м хроматографическим метод ом. В качеств е примеров использ ов ания хроматографических метод ов в практике фармацев тического анализ а и контроля произ в од ств а лекарств енны х в ещ еств можноуказ атьслед ующ ие. Х роматография на бумаге лежит в основ е количеств енного опред еления ланатоз ид аС в препарате целанид , атакже опред еления ег ов сы рье – трав е и листья х наперстя нкиш ерстистой. М етод тонкослойной хроматог рафии имеет ог ромное з начение д ля ид ентификации я д ов иты х в ещ еств и их метаболитов в из в лечения х из объектов (Т СХ -скрининг ) и с целью очистки в ы д еленны х в ещ еств от примесей э нд ог енны х соед инений, э кстрагируемы х из биологических объектов сов местнос я д ов иты ми в ещ еств ам и. К оличеств енное опред еление флав аноид ов в препаратах фламин и ликв иритон, антрахинонов ы х соед инений в препаратах круш ины лом кой, серд ечны х гликозид ов в препарате корг ликон метод ом тонкослойной хроматографии в ключенов техническую д окументацию на произ в од ств о э тих препаратов . К олоночная ад сорбционная хроматог рафия положена в основ у количеств енногоанализ аком понентов липофильной части маз ев ы х основ . А д сорбционная хроматог рафия на окиси алюм иния наш ла применение д ля в ы д еления таких серд ечно-сосуд исты х препаратов , как серд ечны е г ликозид ы (лантоз ид С и строфантин К , пастинацин), а также против оя з в енног о препарата алантон, сод ержащ его сескв итерпенов ы е лактоны . Х роматография на полиам ид ном сорбенте применя ется при получении ликв иритона и ликураз ид а из корней солод ки, при промы ш ленной переработке д альнев осточног оланд ы ш а д ля произ в од ств а препарата конв афлав ин, облад ающ ег ожелчегонны м д ейств ием. П ри э том

53 флав аноид ы , состав ля ющ ие конв афлав ин, отд еля ются от серд ечны х гликозид ов ланд ы ш а, которы е з атем в ы д еля ются с использ ов анием хроматографиинаокиси алюминия . Сополимеры стирола с д ив инилбенз олом использ уются в качеств е носителей обращ енной распред елительной хроматог рафии д ля раз д еления смесей лекарств енны х в ещ еств . Т ехнолог ические процессы , основ анны е на ионообменной хроматографии, раз работаны д ля в ы д еления из э кстрактов растительного сы рья ря д а алкалоид ов , сред и которы х морфин, гиосциамин, скополамин, пилокарпин, сальсолин, лобелин, алкалоид ы барв инка, раув ольфии. В э тих процессах ионообменная хроматог рафия применя ется од нов ременнои как метод очистки, и как метод концентриров ания . Больш ую роль ионообменная хроматог рафия иг рает в произ в од ств е таких антибиотиков , как стрептомицин, неомицин, канам ицин, тетрациклин. В больш инств е произ в од ств д ля сорбции антибиотиков использ уют карбоксильны е катионообменники, а д ля д еминерализ ации э люатов – сильносш иты е сульфокатионообменники, поглощ ающ ие ионы металлов , но практически не сорбирующ ие крупны е орг анические ионы антибиотиков . В д руг их случая х д ля очистки э люатов использ уют аниониты . Д ля произ в од ств а антибиотиков тетрациклинов ого ря д а использ уют сорбцию их на сульфокатионообменниках. В произ в од ств е норсульфаз ола ионообменная хроматог рафия использ уется д ля его из в лечения из маточны х раств оров . И онообменная хроматог рафия в послед ние г од ы применя ется также д ля в ы д еления и концентриров ания наркотических и од урманив ающ их в ещ еств из в од ны х раств оров и биолог ических жид костей. Гель-хроматог рафия использ уется в химико-токсиколог ическом анализ е д ля очистки из в лечений из трупног о материала и при исслед ов ании их набарбитураты . В фармакопейном анализ е ГЖ Х использ уют при контроле качеств а субстанций и лекарств енны х форм – чащ е в сего д ля ид ентификации и опред еления остаточны х летучих раств орителей, след ы которы х сохраня ются в препаратах при их получении. Т ак, например, опред еля ют ацетон и метанол в пилокарпина и сотанола гид рохлорид ах, в спиробромине, э танол – в калгеле и мелоксикаме, из опропанол – в амиод ароне, флуконаз оле, примеси в камфоре, бромкамфоре, э тилов ом э фире α -бромиз ов алерианов ой кислоты , в препаратах в итам ина Е и в о мног их д ругих лекарств енны х субстанция х и формах. М етод ами в ы сокоэ ффектив ной капилля рной ГЖ Х опред еля ют метаболические профили биолог ических сред – кров и, мочи, слюны . В Э Ж Х очень ш ирокоприменя ется д ля ид ентификации, раз д еления и опред еления самы х раз личны х в ещ еств : оптически актив ны х соед инений, белков , нуклеинов ы х и ам инокислот, полисахарид ов , лекарств енны х препаратов , биологических сред и т.д . М етод использ уют д ля пров ед ения профильног о хроматог рафическог о анализ а мед ицинско-биолог ических

54 объектах в случая х патолог ических отклонений от нормы – так наз ы в аемы й “ метод распознав ания образ ов ”. П ри технолог ическом и фармакопейном контроле качеств а лекарств енны х субстанций и лекарств енны х форм В Э Ж Х стала од ним из основ ны х метод ов опред еления как сам их фармаколог ически актив ны х в ещ еств , так и в спомогательны х компонентов и посторонних примесей. В настоя щ ее в ремя метод ики на основ е метод а В Э Ж Х раз работаны д ля лекарств енны х в ещ еств раз личны х фармакологических групп и число их непреры в норастет. Т ак, например, метод ом В Э Ж Х анализ ируют лекарств енны е препараты альд актон, ам из ол, в альпроат натрия , глиборал, д иклофенак натрия , коз аар, кофеин, лид окаина гид рохлорид , мелоксикам , месалаз ин, парацетамол, пилокарпина гид рохлорид , пирацетам, соталола и цетилпирид инагид рохлорид ы , флуконаз ол и многие д руг ие. У станов ление сроков год ности лекарств енны х в ещ еств -субстанций и их г отов ы х форм я в ля ется в ажной з ад ачей в фармации. Д ля э тих целей использ уется метод “ ускоренного старения ”, основ анны й на хранении объекта при пов ы ш енной тем пературе. Е сли по истечении в ремени хранения при пов ы ш енной температуре, э кв ив алентног о з начительно больш ем у отрез ку в ремени хранения при тем пературе 20оС, хроматограммы испы туемого препарата, хранив ш ег ося при пов ы ш енной о температуре и при 20 С, ид ентичны , то использ ов ание метод а “ ускоренног остарения ” прав омерно. П ров ед енны й краткий обз ор показ ы в ает, насколькош ироко, прочно и э ффектив но хроматог рафические метод ы в ош ли в практику фармацев тического анализ а, химико-фармацев тической промы ш ленности и фармаколог ии и получают в э тих областя х св ое д альнейш ее сов ерш енств ов ание и раз в итие. ЗА ДАЧИ ДЛЯ С АМ О КО НТРО ЛЯ рамме получены пики при 0,84 мин П ример 1. Н а хроматог (неуд ержив аем ы й ком понент Н ), при 10,60 мин (компонент Б) и 11,08 мин (компонент Г). Ш ирина пиков ком понентов Б и Г – 0,56 и 0,59 мин соотв етств енно. Д линаколонки – 28,3 см, объем стационарной фаз ы – 12,3 мл, под в ижной фаз ы – 17,6 мл. Рассчитайте: а)число теоретических тарелок колонки; б)в ы соту, э кв ив алентную теоретической тарелке, укажите, что характериз ует э та в еличина; в )коэ ффициент уд ержив ания д ля ком понентов Б и Г; г)коэ ффициенты распред еления компонентов Б и Г; д )коэффициент селектив ности и раз реш ение пиков ком понентов Б и Г. Ре ше ни е . а) Рассчитаем число теоретических тарелок д ля компонентов Б иГ поформуле (13): NБ = 16 ·(10,60 / 0,56)2 = 5,7·10 3; NГ = 16·(11,08 / 0,59)2= 5,6 ·10 3; Ncp = 5,7·10 3 .

55 Числотеоретических тарелок в сег д ацелое числои в еличинабез раз мерная . б) В ы сота, э кв ив алентная теоретической тарелке – Н , в ы числя ется по формуле Н =L/N: Н = 283/ 5681= 0,0496 мм. в ) К оэ ффициент уд ержив ания R рассчиты в ают как отнош ение в ремени неуд ержив аемог окомпонентаков ремени уд ержив ания в ещ еств а RБ = 0,84 /10,60 =0,079; RГ = 0,84 / 11,08 = 0,076 г ) К оэ ффициент распред еления в ещ еств а можно рассчитать, объед инив формулы (5) и (9), D=

Vm  1 − R    VS  R 

П од став ля я численны е з начения , наход им DБ = 16,7 и DГ =17,4 д ) К оэ ффициентселектив ности опред еля ется как α = DГ / DБ = 17,4 / 16,7=1,04 В еличина раз реш ения оценив ает степень раз д еления пиков , ее рассчиты в ают по формуле (19). П од став ля я численны е з начения , получаем : Rs = 2 (11,08-10,60) 0,59 + 0,56 =0,86 П олученная в еличинараз реш ения показ ы в ает, чтопики ком понентов Б и Г на хроматог рамме раз д елены частично. П олное раз д еление пиков д остиг ается , если з начение R s≥ 1,5. О пред еление уг лев од ород ов пров од или на П ример2. хроматографической колонке д линой 2 м, в арьируя скорость потока. Д ля трех раз личны х скоростей потокамертв ое в ремя колонки состав ля ло18,2, 8,0 и 5,0 соотв етств енно. П ри э том в ремя уд ержив ания д екана–2020, 888 и 558 с, а ш ирина ег о пика у основ ания – 223, 99 и 68с соотв етств енно. О пред елите: а) скорости потокаг аз а-носителя д ля кажд ог ослучая ; б)число теоретических тарелок N и в еличинуH; в )константы А ,В и С в урав нении В ан-Д еемтера. Ре ше ни е . а) скоростьпотокарассчиты в аем поформуле v=L/tm: 1) 11 см/c; 2) 25 см/с; 3) 40 см/с. б) П оформуле (13) рассчиты в аем N и получаем з начения : 1) 1310; 2) 1286; 3) 1068. П оформуле H=L/N рассчиты в аем в еличинуН : 1) 1,53 мм 2) 1,56 мм 3) 1,87 мм. в ) состав ля ем систем уурав нений: 0,153 = А +В /11+C·11, 0,156 = А +В /25+C·25, 0,187 = А +В /40+C·40. -3 Реш аем систем уи получаем А =0,059; В =0,699; С=2,8·10 . рафическог о пика, П ример 3. Cтанд артны е отклонения хроматог св я з анны е с некоторы ми факторами раз мы в ания , состав ля ют 0,0041;

56 0,0011; 0,0091; и 0,0470 см. В ы числите: а) станд артное отклонение ш ирины пика; б)э ффектив ность колонки (Н , мкм) д линой 15 см; в ) число теоретических тарелок, необход имое д ля 4σ-раз д еления д в ух в ещ еств , если коэ ффициентселектив ности рав ен 1,03. Ре ше ни е . У читы в ая ад д итив ность д исперсий, суммарно наблюд аем ую д исперсию ( σ на бл ) можносчитать рав ной сумме д исперсий, 2

св я з анны х с раз личны м и факторами в колонке ( σ кол ), при в в од е пробы 2

( σ пробы ), в д етекторе ( σ де т ) и д р.: 2

2

σ на2 бл = σ к2ол + σ п2робы + σ де2 т + ... = Σσ i2 σ 2набл= σ 21 + σ 22 + σ 2 3 + σ 24 = (0,0041)2 + (0,0011)2 + (0,0091) 2 + (0,047)2 -4 2 -2 2 σ набл = 24,296·10 см , σ=4,93·10 см 2 П оформуле Н = σ набл/L рассчиты в аем Н Н = 1,62 мкм. П оскольку 4σ-раз д еление – э то раз д еление д в ух ком понентов с раз реш ением 1, то сог ласно(23) 2 2 4 N = 16·1 ·[1,03 / (1,03-1)] = 1,9·10 П ример 4. П ри раз д елении углев од ород ов г аз ожид костной хроматографией бы лоустанов лено, чтона хроматографической колонке в опред еленны х услов ия х в ремя уд ержив ания в оз д уха (неуд ержив аемы й компонент) состав ля ет 1,72 мин, а углев од ород ов : д ля н-г ептана – 9,63 мин; 2-метилг ептана –12,40 мин; циклогептана – 13,19 мин; н-октана – 14,21 мин. Рассчитайте инд ексы уд ержив ания К ов ача д ля 2-метилгептана (М Г) и циклогептана(Ц Г). Ре ше ни е . Рассчитаем исправ ленны е в ремена углев од ород ов по формуле (2), они рав ны : н-гексана - 7,91 мин; н-октана - 12,49 мин; М Г10,68 мин; Ц Г – 11,47 мин. Д алее поформуле (25) рассчиты в аем з начения инд ексов К ов ача: I М Г = 100 ⋅ [7 +

I Ц Г = 100 ⋅ [7 +

lg 10,68 − lg 7,91 ] = 766, lg 12,49 − lg 11,47

lg 11, 47 − lg 7,91 ] = 781. lg12, 49 − lg11,47

П ример 5. Рассчитайте массов ую д олю (%) г ексана, г ептана, октана и нонанав смесипослед ующ им д анны м : Уг лев од ород S, см fi

Гексан 40 0,70

Гептан 55 0,72

О ктан 70 0,75

Н онан 45 0,80

57 Ре ше ни е . И спольз уя формулу(27), пров од им расчет: ∑ (S ifi) = 40 ·70 + 55·0,72 + 70·0,75 + 45·0,80 =156,1 ω 1 гексан , % = (40·0,70/ 156,1) 100 = 17,93; ω 1 гептан , % = (55·0,72/ 156,1) 100 = 25,37; ω 1 октан , % = (70·0,75/ 156,1) 100 = 33,63; ω 1 нонан , % = (45·0,80/ 156,1) 100 = 23,06. 1. П ик соед инения Х на хроматограмме обнаружен через 15 мин после в в ед ения пробы , пик неуд ержив аемог окомпонентаY поя в ился через 1,32 мин. П ик в ещ еств а Х имеет форму г ауссов ой крив ой с ш ириной у основ ания 24,2 с. Д линаколонки – 40,2 см. объем стационарной фаз ы – 9,9 мл, под в ижной – 12,3 мл. Рассчитайте: а) число теоретических тарелок колонки; б) в ы соту, э кв ив алентную теоретической тарелке (что характериз уетэ тав еличина?); в ) коэ ффициентуд ержив ания соед инения Х ; г) коэ ффициент распред еления соед инения Х ; д ) раз реш ение пиков соед инений Х и Z (Z уд ержив ается слабее), если коэ ффициент селектив ности Х по отнош ению к Z рав ен 1,011. Н арисуйте хроматограмму. О тв ет: N=2,2· 104; H=0,0183 мм; R=0,088; D=12,87; Rs=0,41. 2. П ики соед инений К и М нахроматог рамме поя в ились через 8,5 и 9,6 мин после пикасоед инения Р, неуд ержив аемог околонкой (он поя в ился через 1,5 мин после в в ед ения пробы ). Ш ирина пиков К и М уоснов ания рав на 0.36 и 0,39 мин соотв етств енно. Д лина колонки – 35,8 см. О бъем стационарной фаз ы – 0,5 мл. Расход под в ижной фаз ы –1,0 мл/мин. Рассчитайте: а)число теоретических тарелок в колонке; б) в ы соту, э кв ив алентную теоретической тарелке (чтохарактериз ует э та в еличина?); в ) коэ ффициенты (инд ексы ) уд ержив ания соед инений К и М ; г ) коэ ффициенты распред еления соед инений К и М ; д ) коэффициент селектив ности и раз реш ение пиков соед инений К и М . Н арисуйте хроматограмму. О тв ет: NК =1,2·104; NM=1,3·104; Ncр=1,3·104 ; H=2,8·10-3 мм; RК =0,15; Rм =0,135; DК =17,0; DМ =19,2; α К /м = 1,16; Rs=2,93. 3. Раз д еление спиртов метод ом г аз ожид костной хроматог рафии пров од или на хроматог рафической колонке д линой 1 м при трех скоростя х потока газ а-носителя . Бы ло установ лено, что мертв ое в ремя колонки в перв ом случае рав но 10 с, в о в тором – 20 с и в третьем 25 с. В ремя уд ержив ания э танола состав ля ло 155, 245 и 325 с, а ш ирина хроматографическог опика – 20, 30 и 40 с, соотв етств енно. О пред елите: а) скоростьпотокаг аз а-носителя д ля кажд огослучая ; б) числотеоретических тарелок N и в еличину Н ; в ) константы А ,В ,С в урав нении В ан-Д еемтера; г)оптимальную скорость потока. О тв ет: а) 10,5 и 4 см/c; б) N: 961;1067;1056; H: 0,104;0,094; 0,095 см; в ) А =8,4·10-3; В =0,056; С=0,004; г ) 3,7 см/c. 4. П ри раз д елении уг лев од ород ов г аз ожид костной хроматог рафии оказ алось, что хроматог рафическая колонка д линой 2 м имеет э ффектив ность 2500 тарелок при скорости потока 20 мл/мин и

58 э ффектив ность 2350 тарелок при скорости потока 40 мл/мин. Чемурав на оптимальная скоростьпотока? О тв ет: 26 мл/м ин. 5. Станд артны е отклонения хроматог рафическог опика, св я з анны е с некоторы ми факторами раз мы в ания , состав ля ют 0,0090; 0,0076; 0,0200 и 0,0370 см. В ы числите: а) станд артное отклонение ш ирины пика; б) э ффектив ность колонки (Н , мкм) д линой 20 см; в )число теоретических тарелок, необход имое д ля 4σ-раз д еления д в ух в ещ еств , если коэ ффициент селектив ности рав ен 1,2. О тв ет: σ=4,36·10-2 см; Н =0,95 мкм; N=5,8·102. 6. В ремена уд ержив ания д екана и унд екана в в ы бранны х услов ия х на хроматорафической колонке состав ля ют 22,5 и 26.8 мин соотв етств енно. Рассчитайте инд екс К ов ача д ля соед инения А , если его в ремя уд ержив ания состав ля ет 25,3 мин, а “ мертв ое в рем я ” колонки рав но 5,0 мин. О тв ет: 1070. 7. Рассчитайте массов ую д олю (%) ком понентов г аз ов ой смеси по след ующ им д анны м : Газ S, м м 2 fi

П ропан 205 0,63

Бутан 170 0,65

П ентан 165 0,69

Ц иклог ексан 40 0,85

О тв ет: пропан – 33,32%; бутан – 28,52%; пентан – 29,38; циклог ексан – 8,77%. 8. Рассчитайте массов ую д олю (%) компонентов г аз ов ой смеси по след ующ им д анны м : Газ S, м м 2 fi

Э тан 5 0,60

П ропан 7 0,77

Бутан 5 1,00

П ентан 4 1,11

О тв ет: э тан– 16,80%; пропан – 30,20%; бутан – 28,00%; пентан –24,90. ЛИ ТЕРА ТУ РА 1. Сакод ы нский К .И . А налитическая хроматография / К .И .Сакод ы нский, В .В .Бражников , С.А .В олков и д р. - М .:Х имия , 1993. 2. Д орохов а Е .Н . А налитическая химия . Ф из ико-хим ические метод ы анализ а/ Е .Н .Д орохов а, Г.В .П рохоров а.- М .:В ы сш ая ш кола, 1991. 3. П етерс Д . Х им ическое раз д еление и из мерение: В 2-х кн./ Д .П етерс, Д ж.Х айес, Г.Х ифтье. – М .: Х им ия , 1978. 4. Х аритонов Ю .Я . А налитическая химия (аналитика): В 2-х кн./ Ю .Я .Х аритонов .- М .: В ы сш .ш к.,2003. 5. Ю ингД . И нструментальны е метод ы химическог оанализ а.- М .: М ир, 1989.

59

Состав ители: Стоя нов аО льгаФ ед оров на Ш кутинаИ ринаВ икторов на М окш инаН ад ежд аЯ ков лев на Х охлов В лад имир Ю рьев ич В асильев аВ ераИ в анов на Селеменев В лад имир Ф ед оров ич Ред актор

Т ихомиров а О .А .