Нерадиоактивно меченые олиго- и полинуклеотидные зонды - инструмент изучения структуры генома и диагностики

БИОЛОГИЯ НЕРАДИОАКТИВНО МЕЧЕНЫЕ ОЛИГО- И ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫЕ ЗОНДЫ – ИНСТРУМЕНТ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА И ДИАГНОСТИКИ Г. М. ДЫМШИЦ Новосибирский государственный университет

ВВЕДЕНИЕ

NON-RADIOACTIVELY LABELED OLIGO- AND POLYNUCLEOTIDE PROBES: TOOL FOR STUDYING GENOME STRUCTURE AND DIAGNOSTICS G. M. DYMSHITS

© Дымшиц Г.М., 2001

The use of non-radioactively labeled probes for the genome structure analysis, and for the diagnostics of contagious and inherited diseases, is described. Various kinds of molecular hybridization of nucleic acids and the means to introduce reporter (signal) compounds to oligo- and polynucleotide probes are discussed. The advantages of fluorescent and colorimetric detection of probe-target interaction are described.

30

В статье описано применение нерадиоактивно меченых зондов для анализа структуры генома и диагностики наследственных и инфекционных заболеваний. Рассмотрены разные виды молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот и способы введения в олиго- и полинуклеотидные зонды репортерных (сигнальных) соединений. Изложены достоинства флуоресцентной и колориметрической детекции результатов взаимодействия зонд-мишень.

www.issep.rssi.ru

В начале третьего тысячелетия в результате реализации международной программы “Геном человека”, стартовавшей в 1988 году и рассчитанной на 15 лет, завершается расшифровка нуклеотидных последовательностей всех молекул ДНК, содержащихся в ядре одной клетки человека, – его геном. Определение первичной структуры (секвенирование) генома человека, то есть выяснение последовательности расположения всех нуклеотидов в молекулах, являющихся основой его наследственности, вскрывает новый пласт информации, необходимой для познания молекулярных механизмов жизнедеятельности высших эукариот. Объем этой информации огромен. Если напечатать все нуклеотидные последовательности одной половой клетки человека, обозначая каждый нуклеотид буквой (А, Г, Т или Ц), на страницах, вмещающих по 2500 печатных знаков, они займут 1200 томов по 1000 страниц каждый. (Для сравнения: геном бактерии E. coli может быть записан всего в двух подобных томах.) Для того чтобы нуклеотидные последовательности, записанные мертвыми символами, «ожили и заговорили», нужно раскрыть их функции. Структурно-функциональный анализ генома позволяет установить, в каком именно месте и в какой хромосоме находится конкретный ген, какое влияние на экспрессию этого гена оказывают другие гены, расположенные как в той же хромосоме, так и в негомологичных хромосомах; какое значение имеют последовательности, не кодирующие белки (на их долю в некоторых районах хромосом приходится до 90–95% нуклеотидного материала); какие изменения в гене сказываются на фенотипе самого носителя мутации, а какие могут проявляться лишь у его потомков. Одним из основных экспериментальных подходов при изучении структурно-функциональной организации генома и механизмов генной экспрессии является

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. Он основан на возможности образования двуцепочечных гибридов между искусственно создаваемыми на основе одноцепочечных последовательностей (рибо- или дезоксирибо-, олиго- или полинуклеотидных) мечеными зондами и комплементарными им последовательностями в мишенях – анализируемых молекулах ДНК или РНК (рис. 1). Зонд метится какой-либо репортерной группой: радиоактивным изотопом, флуорохромом, ферментом, дающим окрашенный или люминесцирующий продукт, гаптеном, с которым связывается меченое антитело, и т.д. Выявляя гибрид благодаря наличию в зонде репортерной группы, исследователь может оценить число генов, кодирующих определенный вид РНК, определить долю нетранскрибируемой ДНК в геноме, установить сцепление определенных генов друг с другом и их точное расположение на хромосомах. Высокая чувствительность, то есть возможность выявить очень малое количество (10−15–10−19 М) меченого зонда и соответственно комплементарной ему последовательности в мишени, а также быстрота анализа (от нескольких часов до трех дней) позволяют использовать метод молекулярной гибридизации не только в исследовательской деятельности, но и для диагностики наследственных и инфекционных заболеваний в медицине, ветеринарии и растениеводстве.

Несмотря на непревзойденную чувствительность (10−19 М), использование радиоактивно меченых зондов ограничено, в первую очередь в прикладных областях для диагностических целей. Это связано с возможностью радиолиза как самого зонда, так и мишени, коротким (8–14 дней) временем полураспада большинства радионуклидов, а также связанной с ними опасностью для здоровья персонала. Кроме того, нельзя не учитывать психологические и экологические проблемы, возникающие при работе с радионуклидами и при утилизации отходов. В связи с этим в последние 20 лет во всем мире уделяется большое внимание разработке различных методов введения в олиго- и полинуклеотидные зонды нерадиоактивных репортерных групп и их выявления [1].

Рис. 1. Олигонуклеотидный зонд ТЦАГТЦЦЦТАГЦТАГ за счет присоединенной к нему испускающей сигнал репортерной группы позволяет выявить единственную комплементарную ему последовательность среди более чем 3 ⋅ 109 букв (нуклеотидов), составляющих текст генома человека

При диагностике инфекционных заболеваний часто используют метод дот-гибридизации (от англ. dot – точка). Этот метод применяется, когда необходимо установить факт наличия определенной нуклеотидной последовательности в исследуемых образцах и оценить

ВИДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ Метод молекулярной гибридизации включает следующие этапы: подготовку анализируемого образца, получение меченого зонда, саму процедуру гибридизации, выявление и анализ ее результатов. Способы выделения и подготовки анализируемого образца нуклеиновых кислот к гибридизации многообразны и определяются помимо цели и конкретной задачи исследователя спецификой изучаемого объекта. При картировании хромосом проводят гибридизацию in situ (на месте). Метафазные хромосомы фиксируют на стекле, входящие в их состав молекулы ДНК денатурируют и добавляют меченый зонд. Если меткой является радиоактивный изотоп, то результат гибридизации выявляют авторадиографией под световым микроскопом после проявления прозрачной фотоэмульсии. В случае использования флуоресцентно меченых зондов смотрят свечение хромосом под люминесцентным микроскопом. Существуют две модификации флуоресцентной гибридизации in situ: прямая флуоресцентная in situ гибридизация (direct fluorescence in situ hybridization или DFISH ) и непрямая – FISH. В последнем варианте флуорохромы несет не сам зонд, а белок, имеющий высокое сродство к репортерной группе зонда. Гибридизация in situ позволяет устанавливать локализацию в определенном районе хромосомы того или иного маркера. В качестве последнего могут выступать отдельный ген или его часть, не кодирующая белок нуклеотидная последовательность, нетранскрибируемые повторяющиеся последовательности различной длины, мобильные генетические элементы и т.д.

Д Ы М Ш И Ц Г . М . Н Е РА Д И О А К Т И В Н О М Е Ч Е Н Ы Е О Л И ГО - И П О Л И Н У К Л Е О Т И Д Н Ы Е З О Н Д Ы

31

БИОЛОГИЯ ее количество. Из подходящей ткани исследуемого организма (крови, амниотической жидкости, плаценты, удаленной опухоли или спермы человека; печени или хвоста мыши; листьев растения и т.д.) выделяют суммарную ДНК. Образцы ДНК наносят на микропористый (нитроцеллюлозный или капроновый) фильтр, денатурируют и иммобилизуют облучением ультрафиолетом, после чего инкубируют фильтр с меченым зондом. При этом на один фильтр могут быть нанесены десятки образцов нуклеиновых кислот, выделенных из биологических жидкостей разных пациентов. Меченые зонды, используемые в диагностике, комплементарны какойлибо последовательности ДНК или РНК (в случае заражения РНК-содержащими вирусами), специфичной для возбудителя заболевания. За несколько часов можно получить ответ, инфицирован ли пациент определенным вирусом или микроорганизмом и как много чужеродной нуклеиновой кислоты присутствует в образце. От результатов такого анализа зависит тактика лечения больного. В некоторых случаях, когда требуется более детальная информация о расположении выявляемой последовательности в геноме, применяется другая модификация метода молекулярной гибридизации – блотгибридизация (от англ. to blot – промакать фильтровальной бумагой). В этом случае расщепляют образец ДНК на фрагменты подходящими рестриктазами, разделяют фрагменты с помощью электрофореза в геле, переносят разделенные фрагменты на микропористый фильтр, наложенный на гель, иммобилизуют перенесенные и денатурированные фрагменты облучением ультрафиолетом и инкубируют с меченым зондом (рис. 2). После отмывания фильтра от несвязавшегося зонда выявляют результат гибридизации. Способ выявления определяется тем, какую именно репортерную группу несет зонд. Если в зонде содержится радиоактивная метка, фильтр в темноте накрывают рентгеновской пленкой, а по прошествии определенного времени (от нескольких часов до нескольких суток) ее проявляют и по засвеченным полосам определяют, в фрагментах какой длины находится комплементарная зонду нуклеотидная последовательность. Если зонд несет флуоресцентную метку, фильтр фотографируют в ультрафиолетовом свете. В некоторых случаях искомая нуклеотидная последовательность присутствует в недостаточном для обнаружения количестве. Содержание отдельных уникальных последовательностей в геноме может быть недостаточным для выявления гибридизацией in situ. Иные последовательности нуклеотидов могут присутствовать лишь в небольшой доле клеток пациента (например, ДНК и РНК вируса иммунодефицита человека – ВИЧ). Недостаточным может быть само количество ткани, доступной для проведения анализа. Во всех этих

32

Высокополимерная ДНК

Рестриктаза 1

Рестриктаза 2

Электрофорез в геле

Перенос, денатурация Гибридизация и иммобилизация с меченым на фильтре зондом и детекция

Рис. 2. Схема блот-гибридизации

случаях перед нанесением образца на фильтр прибегают к процедуре амплификации (умножения) нуклеотидного материала с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР ) [2]. Последняя возможна, если известна первичная структура хотя бы небольшого участка (порядка сотни нуклеотидов) анализируемой ДНК-мишени. На автоматическом синтезаторе получают олигонуклеотиды из 15–25 звеньев, комплементарные краям известной последовательности, гибридизуют их с денатурированной ДНК из анализируемого образца и с помощью термостабильного фермента – Taq-полимеразы, – выделенного из термофильной бактерии Termus aquaticus, проводят многократное удвоение синтезируемых цепей ДНК, до нескольких десятков циклов (принципиальная схема полимеразной цепной реакции будет рассмотрена ниже). За 2–3 ч работы на коммерческих амплификаторах можно достичь увеличения количества интересующей последовательности в десятки миллионов раз. Ее содержание при этом растет в геометрической прогрессии, в то время как содержание последовательностей, прилегающих к ней, – лишь в арифметической (рис. 3, а). Амплификация ничтожных количеств исходного биологического материала в сочетании с молекулярной гибридизацией позволяет обнаружить одну клетку, инфицированную ВИЧ, среди 105 неинфицированных клеток носителя СПИДа. Применение ПЦР делает возможным однозначное установление личности преступника по одному волосу, засохшей капле спермы, слюны или крови с использованием метода “геномной

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ а

б

3' 5'

5'

3'

5'

3'

5'

3'

Денатурация ДНК и гибридизация с затравками

Денатурация ДНК

3' 5'

3'

3'

5'

3'

3'

5'

5'

5'

5'

3' Гибридизация с олигонуклеотидной затравкой

Taq-полимераза + 4 дНТФ 5'

3' 3'

5'

5'

5'

3' 3'

5'

5'

3' 3' ДНК-полимераза + 4 дНТФ

3'

Денатурация ДНК и гибридизация с затравками

5'

3'

3'

5' 5'

3'

5' 5'

3'

в

3'

3'

3'

5'

3'

5'

5'

5'

5'

5' 3'

Обработка ДНКазой 3' 3'

5'

5'

3' ДНК-полимераза + 4 дНТФ

Taq-полимераза + 4 дНТФ 5'

3'

5'

5'

3'

5'

3'

3'

5' 3'

3'

5' 3' 5' 3' 5'

5' 3' 5' 3'

3' 5'

5' 3'

3' 5'

5' 3'

3' 5'

5' 3'

3' 5'

5'

Денатурация ДНК и гибридизация с затравками

Taq-полимераза + 4 дНТФ

3'

Рис. 3. Включение метки в полинуклеотидные зонды различными способами: а – полимеразной цепной реакцией; б – удлинением затравки; в – ник-трансляцией. Меченые нуклеотиды обозначены кружками

Д Ы М Ш И Ц Г . М . Н Е РА Д И О А К Т И В Н О М Е Ч Е Н Ы Е О Л И ГО - И П О Л И Н У К Л Е О Т И Д Н Ы Е З О Н Д Ы

33

БИОЛОГИЯ дактилоскопии”, также основанного на принципах молекулярной гибридизации [2]. С помощью ПЦР можно не только нарабатывать ДНК-мишень в количестве, достаточном для анализа с использованием меченых олигонуклеотидных зондов, но и получать значительные количества полинуклеотидных зондов, несущих радиоактивную или нерадиоактивную метку. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕНЫХ ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫХ ЗОНДОВ Среди методов нерадиоактивного мечения полинуклеотидных зондов наибольшее распространение получили хорошо отработанные ранее для радиоактивного мечения процедуры удлинения затравки (рис. 3, б ), никтрансляции (рис. 3, в) или полимеразной цепной реакции (см. рис. 3, а). Все эти способы основаны на способности ДНК-полимераз синтезировать полинуклеотидную цепочку, комплементарную одноцепочечной матрице, используя 3'-гидроксильный конец спаренного фрагмента ДНК в качестве затравки [3]. Удлинение затравки. Химическим путем синтезируют олигонуклеотид (менее 20 звеньев), комплементарный какому-либо известному участку анализируемой ДНК, гибридизуют его с денатурированной ДНК, по матрице которой синтезируется зонд, после чего в реакционную смесь добавляют ДНК-полимеразу и набор всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ), один из которых несет метку. Используя олигонуклеотид в качестве затравки, полимераза удлиняет его, встраивая в растущую цепь меченый нуклеотид. В результате образуется полинуклеотидный меченый зонд (см. рис. 3, б ). Полимеразная цепная реакция. ПЦР предусматривает наличие двух олигонуклеотидных затравок, комплементарных участкам, фланкирующим выбранный район ДНК. После денатурации двуцепочечной матрицы и гибридизации олигонукдеотидов с каждой из двух однонитевых цепей проводится полимеразная реакция, результатом которой является удвоенное количество последовательностей ДНК, заключенных между затравками (см. рис. 3, а). При повторении процедуры денатурации, гибридизации и полимеризации получают четыре копии, а за 30 циклов можно получить несколько миллионов меченых полинуклеотидов, используемых в качестве зондов. Ник-трансляция. Если последовательность нуклеотидов в анализируемой ДНК неизвестна, то меченый зонд получают процедурой, называемой ник-трансляцией (от англ. nick – разрез) (см. рис. 3, в). В ДНК вносят некоторое количество одноцепочечных разрывов

34

путем обработки ферментом ДНКазой. Образующиеся в местах разрезов свободные 3'-ОН концы используются ДНК-полимеразой для их наращивания. Фермент при этом расчищает себе дорогу, удаляя дНМФ с 5'конца стоящего рядом фрагмента ДНК. При этом он включает в растущую цепочку меченые нуклеотиды, идентичные только что отщепленным немеченым. В результате получают меченые полинуклеотиды, которые могут служить зондами для выявления ДНК, первичная структура которой неизвестна. В том случае, когда нужно получить большое количество нерадиоактивно меченого зонда, например, для проведения массовой диагностики, прибегают к химическим, а не ферментативным способам включения метки. В ДНК- или РНК-полинуклеотиды вводят реакционноспособные группы, к которым присоединяют тот или иной репортер. Химический способ более воспроизводим, так как не зависит от удельной активности лабильных ферментов; он не требует также синтеза дорогостоящих нуклеозидтрифосфатов, несущих сигнальное соединение. НЕРАДИОАКТИВНЫЕ МЕТКИ И ИХ ВЫЯВЛЕНИЕ Биотин. Наиболее распространенной нерадиоактивной репортерной группой, включаемой в состав олиго- и полинуклеотидных зондов, является витамин биотин (природный кофактор группы ферментов – карбоксилаз). Биотинилированное производное дУТФ (био-УТФ) включается в образуемые ДНК-полимеразами цепи вместо тимина и способно к комплементарным взаимодействиям с аденином. Биотин обладает чрезвычайно высоким сродством к содержащемуся в курином яйце белку авидину, а также к его бактериальному аналогу – стрептавидину (константа диссоциации комплекса биотин–авидин 10−15 М). Эти белки ковалентно сшивают (конъюгируют) либо с флуорохромами, либо с ферментами, катализирующими образование окрашенных продуктов. Как флуорохромы, так и ферменты можно сшивать и с антителами к (стрепт)авидину (рис. 4, а). Такие конъюгаты, прочно связываясь с биотином, введенным в олиго- или полинуклеотидный зонд, позволяют выявлять до 0,1 пг (1 пикограмм = = 10−12 г) ДНК-мишени. Наличие в биотине карбоксильной группы, не участвующей во взаимодействии со (стрепт)авидином, позволяет легко присоединять его ковалентно к различным молекулам, в том числе к мононуклеотидам и синтетическим олигонуклеотидам [4]. Помимо использования ДНК-полимеразы есть и другие способы введения биотина в зонд. Это может быть осуществлено при помощи терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы. Этот фермент, подобно

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ Субстрат

а Ф

Продукт

hν2

hν1

Субстрат

АТ Фл

Ф Продукт

Б

(С)А

Б

(С)А

Б

hν2

hν1

б Субстрат Ф

(С)А

Фл Продукт

АТ ДГ

АТ ДГ

Рис. 4. Различные способы выявления зондов, несущих биотин (а) и дигоксигенин (б ). Б – биотин; (С)А – (стрепт)авидин; ДГ – дигоксигенин; АТ – антитело; Ф – фермент, катализирующий образование окрашенного продукта; Фл – флуорохром, излучающий свет определенной длины волны

ДНК-полимеразе, удлиняет олигонуклеотид, однако осуществляет это при отсутствии матрицы. Кроме того, разработаны способы химического введения биотина в полинуклеотиды, содержащие модифицированные гетероциклические основания. Его присоединяют по таким положениям оснований, которые не принимают непосредственного участия в образовании водородных связей с комплементарными нуклеотидами [5]. Дигоксигенин. Подобно биотину, нерадиоактивной репортерной группой может служить дигоксигенин – стероид из растения наперстянки (Digitalis purpurea). Основной способ введения в зонд дигоксигенина такой же, как для биотина, – включение дНТФ, несущего это соединение, в полинуклеотид в ходе полимеразной реакции. И дигоксигенин и биотин являются гаптенами, то есть антигенными детерминантами, с которыми специфично и прочно связываются соответствующие антитела, конъюгированные с ферментом, образующим окрашенный продукт, или с каким-либо флуорохромом (рис. 4, б ). Флуорохромы. В отличие от биотина и дигоксигенина флуорохромы сами по себе являются сигнальными соединениями. Они способны излучать свет определенной длины волны при возбуждении их более коротковолновым светом. Так, флуоресцеин, один из наиболее распространенных красителей, при возбуждении

ультрафиолетом с длиной волны 485 нм имеет максимум испускания в видимой области – 515 нм и светится зеленым. Тот факт, что одна молекула флуоресцентного красителя способна многократно претерпевать цикл “возбуждение–излучение”, обеспечивает высокую чувствительность зондов, меченных флуорохромами. Использование нескольких зондов, несущих флуорохромы с отличающимися спектрами испускания, позволяет одновременно локализовать в хромосомах разные нуклеотидные последовательности гибридизацией in situ. Это невозможно проделать с радиоактивно мечеными зондами, выявляемыми авторадиографией. В качестве аналогии сравните цветную и черно-белую фотографии радуги. При кариологическом анализе пациентов с хромосомной патологией метод FISH позволяет надежно идентифицировать метафазные хромосомы и наличие в них перестроек (рис. 5, а), выяснять происхождение лишнего хромосомного материала (рис. 5, б ). В том случае, если необходимо избавиться от фоновой флуоресценции подложки, на которую нанесен анализируемый образец, используют разрешенную во времени флуориметрию. Она основана на том, что хелаты некоторых редкоземельных металлов характеризуются относительно долгим периодом затухания флуоресценции. Так, ионы европия сохраняют возбужденное состояние на несколько порядков дольше, чем большинство органических флуорофоров. Поэтому если возбуждать анализируемый образец короткими (наносекундными) лазерными импульсами, а регистрацию излучения начинать с задержкой в 100 нс, то будет регистрироваться лишь излучение возбужденных ионов Eu3+. В олигонуклеотидные зонды флуорохромы вводятся различными химическими способами [4], а в полинуклеотидные – либо химическим путем после модификации гетероциклических оснований [5], либо ферментативным в полимеразных реакциях, аналогичных описанным выше, с использованием флуорохромированных аналогов НТФ или дНТФ. Ферменты, используемые в качестве репортерных групп. В качестве репортерной группы используют также некоторые ферменты, способные катализировать образование большого числа молекул окрашенного продукта. Широко применяют, например, пероксидазу и щелочную фосфатазу. Первый фермент в присутствии перекиси водорода окисляет некоторые ароматические соединения до нерастворимых в воде темноокрашенных продуктов. Второй способен дефосфорилировать органические соединения, которые при этом превращаются в окисленные кислородом сильноокрашенные продукты. Если эти ферменты конъюгированы с синтетическими олигонуклеотидами, то они выступают

Д Ы М Ш И Ц Г . М . Н Е РА Д И О А К Т И В Н О М Е Ч Е Н Ы Е О Л И ГО - И П О Л И Н У К Л Е О Т И Д Н Ы Е З О Н Д Ы

35

БИОЛОГИЯ а

5

der(5)t(5; 20)

der(20)t(5; 20)

20

непосредственно как нерадиоактивные метки [4]. Однако их чаще используют для непрямого выявления зондов, меченных биотином или дигоксигенином (см. рис. 4). При дот-гибридизации темноокрашенные продукты видны невооруженным глазом, при гибридизации in situ – в световом микроскопе. Если нужна количественная оценка образовавшегося продукта, то проводят колориметрическую детекцию на фотоколориметре или денситометре. Наибольшая чувствительность (до 10−19 М) достигается с нерадиоактивными зондами, выявляемыми с помощью щелочной фосфатазы, в варианте хемилюминесценции. Субстрат щелочной фосфатазы адамантил1,2-диокситанфосфат после дефосфорилирования распадается с испусканием света при длине волны 470 нм. Детекция осуществляется предельно просто – экспозицией фотопленки от нескольких минут до нескольких часов.

б

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рис. 5. Флуоресцентная гибридизация in situ: а – анализ сбалансированной транслокации хромосом 5 и 20 человека. Зонды к хромосоме 5 мечены биотином и выявлялись конъюгатом авидин-флуоресцеин (зеленое свечение); зонды к хромосоме 20 мечены дигоксигенином и выявлялись конъюгатом антитело-цианиновый флуорохром (красное свечение). Стрелки указывают на нормальные хромосомы 5 и 20, а также на хромосомы, являющиеся результатом транслокации. Хромосома der (20) t (5; 20) содержит короткое плечо и небольшой прицентромерный район длинного плеча хромосомы 20, а также часть длинного плеча хромосомы 5. Хромосома der (5) t (5; 20) содержит материал хромосомы 5, за исключением части длинного плеча, а также часть длинного плеча хромосомы 20. Выявленная хромосомная аномалия у здорового мужчины указывает на необходимость дородовой диагностики его будущего ребенка. Любезно предоставлено Н.Б. Рубцовым (Институт цитологии и генетики, Новосибирск); б – анализ происхождения малой сверхчисленной хромосомы (МСХ) у человека. ДНК МСХ была амплифицирована с включением биотина, гибридизована на метафазные хромосомы пациента и детектирована конъюгатом авидин-флуоресцеин. Сигнал (зеленое свечение) был выявлен как на МСХ, так и в прицентромерных районах обеих хромосом 4. Любезно предоставлено Н.Б. Рубцовым

36

Нерадиоактивно меченые зонды для молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот являются важным инструментом изучения структурно-функциональной организации генома, позволяя выявлять нуклеотидные последовательности с большей точностью, скоростью и надежностью, чем их радиоактивно меченые аналоги. При картировании хромосом, когда детальное пространственное разрешение является необходимым требованием, зонды, несущие биотин, дигоксигенин или флуорохромы, в гибридизации in situ не могут быть заменены на меченные радиоактивными изотопами. Массовая диагностика инфекционных заболеваний человека, животных и растений сегодня не обходится без нерадиоактивных тест-систем, включающих ДНК- или РНК-зонды. Описание диагностики некоторых наследственных патологий, выявляемых с помощью метода молекулярной гибридизации еще до рождения ребенка на основе анализа генома в клетках амниотической жидкости, может составить материал отдельной статьи. Автор благодарен студенту НГУ М.К. Иванову за творческий подход к подготовке иллюстративного материала. ЛИТЕРАТУРА 1. Кнорре Д.Г. ДНК- и РНК-зонды как альтернатива и дополнение иммунохимического анализа // Журн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1989. Т. 34, № 1. С. 52–60. 2. Янковский Н.К. Молекулярно-генетические методы в руках детектива, или опыт исследования останков семьи последнего российского императора // Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 2. С. 21–27.

С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 7 , № 9 , 2 0 0 1

БИОЛОГИЯ 3. Фаворова О.О. Сохранение ДНК в ряду поколений: репликация ДНК // Там же. № 4. С. 11–17. 4. Коршун В.А., Берлин Ю.А. Введение нерадиоактивных репортерных групп в синтетические олигонуклеотиды и их детекция // Биоорган. химия. 1994. Т. 20, № 6. С. 565–616. 5. Адаричев В.А., Дымшиц Г.М., Калачиков С.М., Поздняков П.И., Салганик Р.И. Получение ДНК, несущей алифатические аминогруппы, и использование ее флуоресцентного производного в качестве зонда при молекулярной гибридизации // Там же. 1987. Т. 13. № 8. С. 1066–1069.

Рецензенты статьи В.А. Гвоздев, Л.И. Корочкин

*** Григорий Моисеевич Дымшиц, доктор биологических наук, профессор кафедры молекулярной биологии Новосибирского государственного университета, зав. лабораторией структуры генома Института цитологии и генетики СО РАН. Область научных интересов – структурно-функциональная организация генома, химическая модификация нуклеиновых кислот. Автор и соавтор более 140 научных публикаций. Соавтор и соредактор четырех учебников по общей биологии для общеобразовательных учреждений.

Д Ы М Ш И Ц Г . М . Н Е РА Д И О А К Т И В Н О М Е Ч Е Н Ы Е О Л И ГО - И П О Л И Н У К Л Е О Т И Д Н Ы Е З О Н Д Ы

37